(57)【要約】本発明は、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法を提供する。本発明の流体デバイス（１）は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部（２）と、生体分子精製部（３）と、生体分子検出部（４）と、前記エキソソーム精製部（２）と前記生体分子精製部（３）を繋ぐ第一の流路（５）と、前記生体分子精製部（３）と前記生体分子検出部（４）を繋ぐ第二の流路（６）と、を備えたことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、
疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部と、
生体分子精製部と、
生体分子検出部と、
前記エキソソーム精製部と前記生体分子精製部を繋ぐ第一の流路と、
前記生体分子精製部と前記生体分子検出部を繋ぐ第二の流路と、
を備えたことを特徴とする流体デバイス。
【請求項２】
前記エキソソーム精製部は、前記エキソソームの固定と、前記エキソソームの破砕とを行う請求項１に記載の流体デバイス。
【請求項３】
前記エキソソーム精製部は、
インレットと、
前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
を備えた請求項１又は２に記載の流体デバイス。
【請求項４】
前記インレットは、
サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレット
を備えた請求項１〜３のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項５】
前記第一の流路は、前記生体分子を含む前記エキソソームの破砕液を前記エキソソーム精製部から前記生体分子精製部に送液する流路であり、
前記第二の流路は、精製された前記生体分子を含む溶液を前記生体分子検出部に送液する流路である請求項１〜４のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項６】
更に廃液槽と、
前記廃液槽と前記エキソソーム精製部を繋ぐ第三の流路と、
前記廃液槽と前記生体分子精製部を繋ぐ第四の流路と、
前記廃液槽と前記生体分子検出部を繋ぐ第五の流路と、
を備えた請求項１〜５のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項７】
前記生体分子精製部は、
生体分子回収液導入用インレットと、
生体分子固定部と、
を備えた請求項１〜６のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項８】
前記生体分子検出部は、前記生体分子に親和性を有する物質が固定されてなる基板を備えた請求項１〜７のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項９】
前記生体分子はｍｉＲＮＡであり、前記生体分子検出部は、標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板を備えた請求項１〜８のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１０】
前記生体分子検出部は、
標的ｍｉＲＮＡを第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定されてなる基板と、
検出プローブ導入用インレットと、を備え、
前記検出プローブは、二本鎖を形成する二つのステム部と、該二つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
標的ｍｉＲＮＡを第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第二の部分とハイブリダイズし得る配列を有し、５’突出末端又は３’突出末端を有する請求項１〜９のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１１】
前記エキソソーム精製部は、前記エキソソームを固定後、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１２】
前記インレットは、エキソソーム表面の生体分子を検出する検出溶液の導入用インレットを含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１３】
サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、
サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレットと、
前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
を備えたことを特徴とする流体デバイス。
【請求項１４】
疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有することを特徴とするエキソソームの分析方法。
【請求項１５】
更に、前記破砕されたエキソソームから流出する生体分子を精製し、検出する工程を有する請求項１４に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１６】
（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする生体分子分析方法。
【請求項１７】
前記精製工程（ｃ）は、
（ｃ１）前記生体分子を捕捉部に捕捉する工程と、
（ｃ２）前記生体分子を捕捉部から溶出させる工程と、
を有する請求項１６に記載の生体分子分析方法。
【請求項１８】
工程ｃ１において、前記生体分子を含む前記破砕液を前記捕捉部に送液し、前記破砕液に含まれる前記生体分子を捕捉する請求項１７に記載の生体分子分析方法。
【請求項１９】
前記工程（ａ）の後、前記エキソソームが結合した基板上で、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う工程を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の生体分子分析方法。
【請求項２０】
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームは、直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。【０００３】
がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、マイクロＲＮＡなどを発現している。そして、体液中に分泌されるエキソソームも、分泌元の細胞由来のマイクロＲＮＡなどを発現している。
そのため、体液中のエキソソームの膜内部に存在する生体分子を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。
なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。【０００４】
このような期待に対して、生物学的サンプルからマイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡともいう。）を含んでなるがん細胞由来エキソソームを単離し、がん細胞由来エキソソーム中の所定のｍｉＲＮＡの発現量と、被検体由来のエキソソーム中のｍｉＲＮＡの発現量と、を比較して、被検体ががん細胞を有するかを評価するエキソソームの分析方法が提案されている（特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−１０２７６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１には、研究者がエキソソームを単離して、該エキソームからｍｉＲＮＡを精製し、該ｍｉＲＮＡを分析に供する各工程について記載されているが、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる技術については何ら開示されておらず、改良の余地がある。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部を用いることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（５）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、
疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部と、
生体分子精製部と、
生体分子検出部と、
前記エキソソーム精製部と前記生体分子精製部を繋ぐ第一の流路と、
前記生体分子精製部と前記生体分子検出部を繋ぐ第二の流路と、
を備えたことを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、
サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレットと、
前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
を備えたことを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるエキソソームの分析方法は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有することを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における生体分子分析方法は、
（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における生体分子検出方法は、
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図２】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図３】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図４】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図５】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの定量結果である。
【図６】実施例における精製したｍｉＲＮＡの定量結果である。
【図７Ａ】実施例におけるｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板を備えた検出部、を有する流体デバイスを用いたｍｉＲＮＡ検出結果である。
【図７Ｂ】図７（Ａ）の画像のスポットに対応した、蛍光が観察されるべきスポットを示す図である。図中、網掛けで示したスポットが、標的ｍｉＲＮＡに対応するスポットで、各アルファベットは下記のｍｉＲＮＡに対応している： A：141、B：143、C：1275、D：107、E：181a-2*、F：484、S：let-7a、T：let-7b、U：let-7d。
【図８】本実施形態における流体デバイスの基板の一態様の模式図である。
【図９Ａ】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図９Ｂ】実施例における流体デバイス中のバルブの制御の詳細を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪流体デバイス≫
［第一実施形態］
図１に示すように、本実施形態の流体デバイス（たとえばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部２と、生体分子精製部３と、生体分子検出部４と、エキソソーム精製部２と生体分子精製部３を繋ぐ第一の流路５と、生体分子精製部３と生体分子検出部４を繋ぐ第二の流路６と、を備えている。
本実施形態の流体デバイス１は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出するデバイスである。
本実施形態において、第一の流路５は、生体分子を含むエキソソームの破砕液をエキソソーム精製部２から生体分子精製部３に送液する流路であり、第二の流路６は、精製された生体分子を含む溶液を生体分子検出部４に送液する流路である。
また、たとえば、本実施形態の流体デバイス１は後述する図９（Ａ）に示すような構成によって、サンプルを導入し、エキソソームを破砕し、生体分子を精製し、生体分子を検出するデバイスである。
【００１２】
エキソソームは、脂質二重膜で囲まれた直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
エキソソームは、細胞の分泌物であり、分泌元の細胞由来の生体分子、例えばタンパク質、核酸、ｍｉＲＮＡなどを内包している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、ｍｉＲＮＡなどを発現している。
そのため、エキソソームに内包される生体分子を分析することで分泌元の細胞の異常を検出することができる。エキソソームに内包される生体分子を取り出す（抽出する）手段として、一例にはエキソソームの脂質二重膜の破砕などが挙げられる。
更に、エキソソームは、生体内で循環している血液、尿、唾液などの体液中で検出されるため、エキソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
【００１３】
分析に用いるサンプルによる二次感染を防止する観点から、本実施形態の流体デバイス１は、更に廃液槽を備えていることが好ましい。一例として、図２に示すように、本実施形態の流体デバイスは、第一の廃液槽７、第二の廃液槽８、第三の廃液槽９を備え、第一の廃液槽７とエキソソーム精製部２を繋ぐ第三の流路１０、第二の廃液槽８と生体分子精製部３を繋ぐ第四の流路１１、第三の廃液槽９と生体分子検出部４を繋ぐ第五の流路１２を備えたものであることが好ましい。
尚、図２においては三つの廃液槽を示しているが一つ又は二つの廃液槽にまとめたものであってもよい。
後述するように、エキソソーム精製部２からの廃液が第三の流路１０を通って第一の廃液槽７に送られる。生体分子精製部３からの廃液が第四の流路１１を通って第二の廃液槽８に送られる。生体分子検出部４からの廃液が第五の流路１２を通って第三の廃液槽９に送られる。
【００１４】
本実施形態の流体デバイス１における各構成の一例について、図３を用いて説明する。
エキソソーム精製部２は、エキソソームの固定と、エキソソームの破砕を行うものであり、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部２ｄを備える。図３に示すように、エキソソーム精製部２は、導入する試薬別にインレットを備えることが好ましい。即ち、エキソソーム精製部２は、サンプル導入用インレット２ｂと破砕液導入用インレット２ｃを備えることが好ましく、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
【００１５】
エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。係る化合物を用いることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に脂質二重膜を有するエキソソームを固定することができる。
尚、本明細書において、「エキソソーム固定部２ｄ上にエキソソームを固定する」とは、エキソソーム固定部にエキソソームを吸着させることも意味する。サンプル中からのエキソソームの単離が可能である。
【００１６】
疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。
飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数６〜２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。
中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
【００１７】
親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、ＰＥＧが好ましい。係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することが特に好ましい。
【００１８】
即ち、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、脂質−ＰＥＧ誘導体が好ましい。脂質−ＰＥＧ誘導体は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる。ＢＡＭとしては、例えば下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１９】
【化１】
2015045666.tif 000002
【００２０】
［式中、ｎは１以上の整数である。］
エキソソーム固定部２ｄの層として用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００２１】
本実施形態の流体デバイス１における液体の駆動は、外部吸引ポンプによってなされ、液体の流れはバルブの開閉によって制御される。バルブは一例として空圧式バルブであり、バルブの開閉は、流体デバイス１に連結した外部空圧装置によって駆動・制御される。
【００２２】
図３に示すように、エキソソームの分析において、まず上述したエキソソーム精製部において、サンプル導入用インレット２ｂにサンプルを注入し、流路２ｉのバルブ２ｆを開き、吸引によりサンプルをエキソソーム固定部２ｄに導入する。
分析に用いられるサンプル量としては、一例として数μＬから数ｍＬであり、例えば１ｍＬ程度である。
【００２３】
サンプルとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエキソソームを含有するものであれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、エキソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エキソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。
また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
【００２４】
検出対象の細胞としては、エキソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよいが、本実施形態においては、エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
【００２５】
エキソソーム固定部２ｄにエキソソームを特異的に結合させる観点から、エキソソーム固定部２ｄに非特異的吸着抑制部を設けることが好ましい。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理することが挙げられる。
【００２６】
エキソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエキソソームは、上述した疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、サンプルをエキソソーム固定部２ｄに静置する必要はなく、連続的にエキソソーム固定部２ｄ上をサンプルが通過すると同時にサンプル中のエキソソームがエキソソーム固定部２ｄ上に捕捉される。
一例として、エキソソーム捕捉時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、捕捉に要する時間は１５秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した溶液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
【００２７】
本実施形態の流体デバイス１において、エキソソーム固定部２ｄの天井高を低く設計しておくことが好ましい。これにより、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物と、エキソソームとの接触の機会を増し、エキソソームの捕捉効率を高めることができる。
【００２８】
血液中には、エキソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞もエキソソーム固定部２ｄに固定される可能性がある。エキソソーム固定部２ｄからこれらの細胞外小胞を除去する観点から、エキソソーム固定部２ｄ上のエキソソームを洗浄することが好ましい。
一例として、図３に示すように、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、エキソソーム固定部２ｄに導入する。
本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエキソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、ＰＢＳ洗浄液５００μＬを吸引圧力１〜３０ｋＰａで１５秒程度送液することにより洗浄される。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
【００２９】
次いで、エキソソーム固定部２ｄに固定されたエキソソームを破砕する。図３に示すように、流路２ｊ上のバルブ２ｇを開き、破砕液導入用インレット２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエキソソーム固定部２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエキソソーム固定部２ｄを通ることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される生体分子が放出される。
一例として、エキソソーム破砕時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、破砕に要する時間は３０秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
【００３０】
図３に示すように、生体分子精製部３は、生体分子回収液導入用インレット３ｂと、生体分子固定部３ｃとを備えることが好ましく、更に生体分子洗浄液導入用インレット３ａを備えることがより好ましい。
生体分子固定部３ｃは、生体分子を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として生体分子が核酸である場合には核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エキソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。近年、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
本実施形態において、生体分子固定部３ｃが固定する生体分子はｍｉＲＮＡであることが好ましい。生体分子固定部３ｃとしては、上述したように、流路上に埋め込まれたシリカメンブレンが挙げられる。
生体分子固定部３ｃをエキソソーム破砕液が通過することにより、生体分子固定部３ｃ上に生体分子が捕捉される。
一例として、エキソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。
【００３１】
生体分子固定部３ｃに生体分子を固定した後、生体分子固定部３ｃを洗浄し、目的とする生体分子以外の夾雑物を取り除くことが好ましい。
図３に示すように、流路３ｅ上のバルブ３ｄを開き、生体分子洗浄液導入用インレット３ａに洗浄液を注入し、吸引により洗浄液を生体分子固定部３ｃへ導入する。洗浄液としては、例えば７０％〜８０％程度のエタノールが挙げられる。
一例として、洗浄時の洗浄液使用量は１ｍＬ程度であり、吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、洗浄液の送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
【００３２】
生体分子検出部への生体分子洗浄液の持ち込みを防止するために、生体分子固定部３ｃを洗浄した後、生体分子固定部３ｃを乾燥させることが好ましい。
図３に示すように、生体分子洗浄液導入用インレット３ａから空気を吸引し、生体分子固定部３ｃを通過させることにより乾燥させる。
一例として、生体分子固定部３ｃ乾燥時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、乾燥に要する時間は２分程度である。
【００３３】
次いで、生体分子固定部３ｃに固定された生体分子を溶出させる。生体分子の回収率を向上させるために、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入した後、一定時間保持させることが好ましい。
図３に示すように、流路３ｇのバルブ３ｆを開け、生体分子回収液導入用インレット３ｂに生体分子回収液を注入し、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入する。
一例として、生体分子回収液は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒであり、該回収液の使用量は３０μＬであり、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで回収液を吸引し、回収液が生体分子固定部３ｃに到達した時点で吸引を停止させ、３分程度保持する。
【００３４】
次いで、生体分子固定部３ｃから生体分子を回収する。一例として、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで回収液を３０秒かけて回収する。
生体分子は第二の流路６を通り、生体分子検出部４へ送られる。一例として、生体分子検出部４への生体分子の吸引圧力は、６ｋＰａ以下であり、３０秒程度かけて送液する。
【００３５】
生体分子検出部４は、一例として、生体分子に親和性を有する物質が固定されてなる基板を備えている。一例として、生体分子を核酸とする場合には核酸アレイを備えていることが好ましく、生体分子をタンパク質とする場合にはプロテインアレイを備えていることが好ましい。生体分子をｍｉＲＮＡとする場合には、標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板４ｃを備えていることが好ましい（図３参照。）。標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板としては、例えば従来公知のＤＮＡチップが挙げられる。
【００３６】
更に、特異的にかつ高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出するという観点から、生体分子検出部４は、以下の構成を備えていることが好ましい。
図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示すように、生体分子検出部４は、標的ｍｉＲＮＡ３３を第一の部分３１と第二の部分３２に分割した場合に、第一の部分３１とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ３４が固定されてなる基板と、検出プローブ導入用インレット４ａ（図３参照。）と、を備えていることが好ましい。
検出プローブ３５は、二本鎖を形成する二つのステム部３５ｃ，３５ｄと、該二つのステム部３５ｃ，３５ｄ間の領域であり、標識物質３５ａにより標識されているループ部３５ｅと、標的ｍｉＲＮＡ３３を第一の部分３１と第二の部分３２に分割した場合に、第二の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂを有し、５’突出末端又は３’突出末端を有する。
【００３７】
捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１及び第２の部分３２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第１の部分３１及び第２の部分３２の長さは、５〜１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７〜１５塩基がより好ましい。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ３３の５’側の部分を第１の部分３１とし、ｍｉＲＮＡ３３の３’側の部分を第２の部分３２とする。
【００３８】
尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる捕捉プローブ及び検出プローブの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
【００３９】
捕捉プローブ３４は、５’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１とハイブリダイズし得る配列を含む。
ｍｉＲＮＡ３３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ３４は、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板３６に固定された捕捉プローブ３４が、ｍｉＲＮＡ３３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ３４は、基板３６と結合する３’末端にスペーサー３４ａを有していることが好ましい。スペーサー３４ａの長さとしては、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー３４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
捕捉プローブ３４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第１の部分３１及びスペーサー３４ａの塩基数を勘案し、３〜５０塩基が好ましく、５〜４０塩基がより好ましい。
【００４０】
捕捉プローブ３４は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡ３３との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、捕捉プローブ３４は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
【００４１】
捕捉プローブ３４を固定するために用いられる基板３６としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ３４を基板３６上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
【００４２】
本実施形態において、検出プローブ３５は、３’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂを含む。
ｍｉＲＮＡ３３を高精度に定量する観点から、検出プローブ３５は、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
【００４３】
検出プローブ３５は、ステムループ構造を形成する。ステムループ構造とは、一本鎖核酸において、分子内で離れた二箇所の領域に相補的な配列がある場合、核酸の塩基対間の相互作用によって二本鎖（ステム構造）を形成するとともに、その二箇所の領域に狭まれた配列がループ構造を形成するものをいい、ヘアピンループとも称される。
本実施形態において、検出プローブ３５は、５’末端側から、二本鎖を形成する二つのステム部３５ｃ，３５ｄと、該２つのステム部３５ｃ，３５ｄ間の領域であるループ部３５ｅと、第２の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂとからなる。即ち、検出プローブ３５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
【００４４】
検出プローブ３５におけるステム部の長さは、ループ部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２０塩基がより好ましい。
検出プローブ３５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３〜２００塩基が好ましく、５〜１００塩基がより好ましい。
検出プローブ３５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第２の部分３２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４〜２００塩基が好ましく、２４〜１５０塩基がより好ましい。
【００４５】
検出プローブ３５は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、検出プローブ３５は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
【００４６】
検出プローブ３５は、標識物質３５ａにより標識されている。標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを検出することができる。
【００４７】
また、図３に示すように、生体分子検出部４は、更に洗浄液導入用インレット４ｂを備えていることが好ましい。また、生体分子検出部４は、図３のように液が循環する流路と、図示略のポンプバルブとで構成される回転式混合器を含む。
【００４８】
生体分子が生体分子検出部４へ送られた後、バルブ４ｄを開け、検出プローブ導入用インレット４ａに検出プローブ溶解液を注入する。
一例として、検出プローブ溶解液の組成は、１００〜２００ｎＭ検出プローブ、１００〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５〜２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０〜３０ｍＭ  ＤＴＴ、５〜２０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅであり、係る検出プローブ溶解液を吸引圧力６ｋＰａ以下、３０秒程度かけて送液する。
【００４９】
次いで、生体分子と検出プローブ溶解液を生体分子検出部内で循環させ、混合する。一例として図示略のポンプバルブの開閉を１０分間程度継続させる。液を循環させることにより短時間で効率よく複合体（ｍｉＲＮＡ３３―検出プローブ３５−捕捉プローブ３４複合体）が基板上に形成される（図９（Ａ）及び図９（Ｂ）参照。）。
【００５０】
次いで、捕捉プローブが固定されてなる基板（図３における基板４ｃ）を洗浄し、該基板上の非特異的吸着物を取り除くことが好ましい。バルブ４ｅを開け、洗浄液導入用インレット４ｂに洗浄液を注入し、基板４ｃに導入する。
一例として、洗浄液は０．２×ＳＳＣバッファーであり、使用量は５００μＬであり、該洗浄液を吸引圧力６ｋＰａ以下、１分かけて送液して洗浄を行う。
基板４ｃを通過した廃液は、バルブ１２ａを介して第五の流路１２を通り、第三の廃液槽９へ送られる。
【００５１】
次いで、基板４ｃ上に形成された複合体の標識物質の強度を測定する。標識物質の強度は、生体分子の存在量を反映するため、本実施形態によれば、サンプル中に含まれる生体分子の量を定量することができる。
標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
【００５２】
本実施形態によれば、従来は１日以上要したエキソソームの分析をわずか一時間程度で迅速に行うことができる。
【００５３】
また、本デバイスのエキソソーム精製部で上述のようにエキソソームを固定した後、エキソソーム精製部においてエキソソームの表面に存在する生体分子を検出してもよい。
基板に固定されたエキソソームの表面に存在する生体分子の検出方法は、エキソソームの表面に存在する生体分子と該生体分子と特異的に結合する第１の分子とを相互作用させて複合体を形成し、基板上の複合体（第１の分子−エキソソーム複合体）を検出することを含む。
第１の分子−エキソソーム複合体を検出する方法は、例えば蛍光標識した第１の分子−エキソソーム複合体の蛍光を検出する工程である。一例として、第１の分子として抗体を用いる場合、第１の分子である抗体に対する二次抗体を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識したもの、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識したものを用いることが好ましい。
量子ドットとしては、ＣｄＳｅやＣｄＴｅが挙げられる。これらの量子ドットは、従来の有機系色素や蛍光タンパク質と比べて明るく光退色しにくい点で優れている。
また、ＥＬＩＳＡによる検出方法を利用してもよい。一例としては、酵素標識された二次抗体を一次抗体に作用させ、発色性の基質を加え、酵素反応生成物の発色を検出する方法が挙げられる。この場合においても、上記蛍光標識の場合と同様に、エキソソームの検出が可能である。
【００５４】
本デバイスのエキソソーム精製部は、一例としてエキソソーム表面の生体分子を検出する検出溶液の導入用インレットを含む。その検出溶液は第１の分子および二次抗体を含む溶液である。
【００５５】
エキソソームは、細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来の生体分子、例えば、タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質などを発現している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質などを発現している。
そのため、エキソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エキソソームの表面とは、細胞から分泌される膜小胞の膜表面であって、分泌されたエキソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
【００５６】
第１の分子とエキソソームの相互作用の一例として、例えば抗原−抗体反応といった結合反応が挙げられる。
エキソソームを分泌する異常細胞は、その細胞表面に、生体分子として特有のタンパク質を発現しているか、又は、該異常細胞において、特有のタンパク質の発現が欠損している。従って、正常細胞と比較して、発現パターンの異なるタンパク質を抗原とする抗体を第１の分子として用いることで、細胞の異常を検出できる。
係る観点から、用いられる抗体は、異常細胞又は正常細胞に高発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることが好ましく、異常細胞特異的又は正常細胞特異的に発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることがより好ましい。
また、第１の分子としては、抗体に限られず、アプタマーも好適に用いられる。アプタマーの一例として、核酸アプタマーやペプチドアプタマーが挙げられる。
【００５７】
上記のようなエキソソームの表面に存在する生体分子の検出と、そのエキソソームに内包されるｍｉＲＮＡの検出とを本デバイス上で行うことによって、エキソソームを二段階で分析することができる。一例として、乳がんの場合、乳がん細胞由来のエキソソームは表面に膜タンパクとしてＭＵＣ１、ＣＤ２４、ＡＤＡＭ１０を発現している。これらの膜タンパクにはそれぞれ、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＡＤＡＭ１０抗体が結合する。また、乳がん細胞由来のエキソソームには、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ２１が内包される。したがって、乳がんの検査の場合、本デバイスを用いて、膜タンパクとｍｉＲＮＡとを分析することで、より精度や信頼性の高い検査が実現できる。本デバイスは、乳がん以外においても同様に、疾患に対応するエキソソーム表面の膜タンパクとエキソソームに内包されるｍｉＲＮＡとを検出することでエキソソームを二段階に分析することができる。
【００５８】
［第二実施形態］
図４に示されるように、本実施形態の流体デバイス２０は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、サンプル導入用インレット２ｂ及びエキソソーム破砕液導入用インレット２ｃと、前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部２ｄと、を備える。
また、図４に示されるように、本実施形態の流体デバイス２０は、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
本実施形態の流体デバイス２０における各構成については、第一実施形態における各構成と重複するため説明を省略する。
本実施形態によれば、簡便に効率よくエキソソーム中の生体分子を精製することができる。
【００５９】
≪エキソソームの分析方法≫
本実施形態のエキソソームの分析方法は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有する。
更に、本実施形態のエキソソームの分析方法は、前記破砕されたエキソソームから流出する生体分子を精製し、検出する工程を有することが好ましい。検出する工程は、流体デバイス内で行われなくともよい。一例として、ＤＮＡシーケンサーを用いてエキソソーム中の核酸を分析する工程が挙げられる。
その他の詳細については、≪流体デバイス≫の第一実施形態で述べたため省略する。
【００６０】
≪生体分子分析方法≫
本実施形態の生体分子分析方法は、
（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有する。
【００６１】
本実施形態の生体分子分析方法は、分析対象をエキソソーム中の生体分子としたものである。工程（ｄ）は、流体デバイス内で行われなくともよい。一例として、ＤＮＡシーケンサーを用いてエキソソーム中の核酸を分析する工程が挙げられる。
【００６２】
また、前記工程前記精製工程（ｃ）は、
（ｃ１）前記生体分子を捕捉部に捕捉する工程と、
（ｃ２）前記生体分子を捕捉部から溶出させる工程と、
を有することが好ましい。
【００６３】
本実施形態において、工程（ｃ１）は、前記工程（ｂ）において得られる生体分子を含む破砕液を捕捉部に送液し、破砕液に含まれる生体分子を捕捉する工程であることが好ましい。
捕捉部としては、生体分子を捕捉できるものであれば特に限定されず、一例として上述した生体分子固定部３ｃが挙げられる。
細胞中の生体分子の分析の場合には、通常、破砕液と、シリカメンブレン等の捕捉部への捕捉液は同一組成ではない。破砕にはフェノールや界面活性剤を用いることが多いが、その場合捕捉部への捕捉に必要なエタノールを追加混合する必要がある。本発明者は、エキソソームは細胞に比べ破砕が容易であることを確認したため、本実施形態においては、破砕と捕捉を同一の組成で行うことが可能となった。本実施形態によれば、デバイスの構成の簡略化が可能である。
また、本実施形態において、一例には、前記エキソソームが結合した基板上で、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う。
その他の詳細については、≪流体デバイス≫の第一実施形態で述べたため省略する。
【００６４】
≪生体分子検出方法≫
本実施形態の生体分子検出方法は、
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有する。
本実施形態に係る工程（ａ）において、対象はエキソソームに限られない。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板は、脂質二重層を捕捉する性質があるため、白血球等の脂質二重層で囲まれた構造体も捕捉することができる。
また、対象がエキソソームではなく細胞や白血球などの脂質二重層で囲まれた構造体を破砕する破砕液は、一例にはフェノールや界面活性剤である。その場合には、脂質二重層で囲まれた構造体に内包される核酸をシリカメンブレン等に捕捉するにあたって、一例にはエタノールを追加混合する。
【００６５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
［エキソソームの精製］
ガラス表面に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下、ＡＰＴＥＳともいう。）を修飾し、ＡＰＴＥＳ末端にエキソソームを固定化する前記式（１）で表されるＰＥＧ脂質誘導体、非特異吸着を抑制するメトキシＰＥＧを修飾した。乳がん細胞株ＭＣＦ−７の培養上清を超遠心し回収したエキソソーム懸濁液およびヒト血清中のエキソソームをデバイス内で固定した。
エキソソームの固定の評価は、ＡＦＭで固定粒子密度を計測して行った。
デバイス内で固定化されたエキソソームのＡＦＭ像と固定密度を図５に示す。まず、ＡＦＭ像より３０−２００ｎｍの直径を持つ粒子が固定化されていることを確認した。
次に、固定層からの距離に対し、固定密度が指数関数的に減少することを確認した。また、ヒト血清から直接固定化した場合の固定量が、精製済みエキソソームを固定した場合の７４%であることから、メトキシＰＥＧが非特異吸着の抑制に寄与していると考えられる。
［エキソソームの破砕］
エキソソームの破砕効率は、エキソソームから放出されたｍｉＲＮＡ量を定量することにより評価した。
精製されたエキソソームを破砕液と接触させて、エキソソームから放出されたｍｉＲＮＡ量を定量リアルタイムＰＣＲにより求めた。また、破砕効率の比較として、細胞からｍｉＲＮＡを抽出する製品であるＱＩＡＧＥＮ社ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いた。破砕効率の比較結果を図６に示す。【００６７】
［ｍｉＲＮＡ精製］
流路内に小型化したシリカメンブレンを固定し、ｍｉＲＮＡの精製を行った。ｍｉＲＮＡを含むエキソソーム破砕液を吸引操作し、シリカメンブレンを通過させた。続いてシリカメンブレンの洗浄、乾燥を行った後、ｍｉＲＮＡ溶出液を導入しｍｉＲＮＡを回収した。ｍｉＲＮＡ回収量は定量リアルタイムＰＣＲにより求めた。また、一般的なスピンカラム法との比較として、ＱＩＡＧＥＮ社ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
ｍｉＲＮＡの回収結果を図６に示す。本ユニットではシリカメンブレンのサイズを小型化することによって、所要時間の短縮と使用試薬の低減が達成された。また、サイズの小型化に伴い、少量の溶出液でｍｉＲＮＡを回収することできるようになり、ｍｉＲＮＡ溶液の濃縮が可能となった。【００６８】
［ｍｉＲＮＡ検出］
本デバイスは、標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｌｅｔ−７ｄ，ｌｅｔ−７ｆを検出する。それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する検出プローブ合計１２種の核酸プローブを設計・合成した。一方、それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する捕捉プローブをガラス基板上で合成し、スポット状に配置した。
なお、ｍｉＲ−１４１は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−１４３は慢性心疾患由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−１２７５は乳がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−１０７は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−１８１ａ−２＊は前立腺がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−４８４は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−２１は前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、または肺がん由来のエキソソームに内包される。ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂは大腸がん、肺がん、胃がん、卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｌｅｔ−７ｄ，ｌｅｔ−７ｆは胃がん、卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ−３９は線虫由来のコントロールスポットである。
標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１４１
［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ２：ｍｉＲ−１４３
［配列：５’−ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣ−３’］ （配列番号２：２１ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ３：ｍｉＲ−１２７５
［配列：５’− ＧＵＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＵＧＵＣ−３’］ （配列番号３：１７ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ４：ｍｉＲ−１０７
［配列：５’− ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡ−３’］ （配列番号４：２３ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ５：ｍｉＲ−１８１ａ−２＊
［配列：５’− ＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣ−３’］ （配列番号５：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ６：ｍｉＲ−４８４
［配列：５’− ＵＣＡＧＧＣＵＣＡＧＵＣＣＣＣＵＣＣＣＧＡＵ−３’］ （配列番号６：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ７：ｍｉＲ−２１
［配列：５’− ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ−３’］ （配列番号７：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ８：ｌｅｔ−７ａ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号８：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ９：ｌｅｔ−７ｂ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ−３’］ （配列番号９：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１０：ｌｅｔ−７ｄ
［配列：５’− ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号１０：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１１：ｌｅｔ−７ｆ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号１１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１２：ｍｉＲ−３９
［配列：５’− ＵＣＡＣＣＧＧＧＵＧＵＡＡＡＵＣＡＧＣＵＵＧ−３’］ （配列番号１２：２２ｍｅｒ）【００６９】
（２）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’−ｐ−Ｘ１−ｆＳ−３’］
Ｘ１は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−フルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１３：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ２（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ１：ＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号１４：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ３（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ１：ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１５：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ４（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ１：ＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１６：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ５（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ１：ＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１７：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ６（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ１：ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１８：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ７（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ１：ＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１９：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ８（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２０：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ９（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ１：ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２１：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１０（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１１（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ１：ＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２３：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１２（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ１：ＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２４：６０ｍｅｒ）【００７０】
（３）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’−ｐ−Ｘ２−Ａｌ−Ｘ３−３’］
Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７−ＡｍｉｎｏＣ６−ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号２６：２６ｍｅｒ）
検出プローブ２（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡ（配列番号２７：２６ｍｅｒ）
検出プローブ３（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号２８：２６ｍｅｒ）
検出プローブ４（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＴＡＧＣＣ（配列番号２９：２６ｍｅｒ）
検出プローブ５（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴ（配列番号３０：２６ｍｅｒ）
検出プローブ６（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＣＧＧＧＡＧ（配列番号３１：２６ｍｅｒ）
検出プローブ７（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＣＡＴＣ（配列番号３２：２６ｍｅｒ）
検出プローブ８（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣ（配列番号３３：２６ｍｅｒ）
検出プローブ９（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号３４：２７ｍｅｒ）
検出プローブ１０（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣ（配列番号３５：２６ｍｅｒ）
検出プローブ１１（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：)ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣＡ（配列番号３６：２７ｍｅｒ）
検出プローブ１２（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：（配列番号３７：２６ｍｅｒ）【００７１】
上述した捕捉プローブを固定したＤＮＡマイクロアレイ基板を、表１の溶液に接触させながら室温で９０分放置した。ＤＮＡマイクロアレイ基板を超純水で洗浄・乾燥後、回転式混合器（生体分子検出部）に設置した。
表１中、Ｔａｋａｒａ  １０×ｂｕｆｆｅｒの組成は、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴである。【００７２】
【表１】
2015045666.tif 000003
【００７３】
さらに、任意の濃度のｍｉＲＮＡ溶液を表２のように調製し、検出プローブ１を含有するハイブリダイゼーション反応溶液を表３のように調製した。【００７４】
【表２】
2015045666.tif 000004
【００７５】
【表３】
2015045666.tif 000005
【００７６】
調製したｍｉＲＮＡ溶液とハイブリダイゼーション反応溶液とをそれぞれ別のインレットから導入し、回転式混合器で１０分間循環させてハイブリダイゼーションさせた。【００７７】
ハイブリダイゼーション反応終了後、上記のインレットから０．３Ｍ  ＮａＣｌと３０ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含む洗浄液を５００μｌ流してＤＮＡマイクロアレイ基板を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。
結果を図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）は、ｍｉＲＮＡ検出結果を示す基板の画像である。図７（Ｂ）は、左の画像のスポットに対応しており、網掛けで示したスポットが、標的ｍｉＲＮＡに対応するスポットで、蛍光が観察されるべきスポットである。各アルファベットは下記のｍｉＲＮＡに対応している。
A：141、B：143、C：1275、D：107、E：181a-2*、F：484、S：let-7a、T：let-7b、U：let-7d。
導入したｍｉＲＮＡに対応するプローブを固定した各スポットにおいて、Ａｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察された。なお、「C」のｍｉＲ-１２７５は、検出限界濃度を確認するため他のｍｉＲＮＡの１０００分の１の濃度で入れたため、蛍光が暗くなっている。また、プローブの配列ごとに明るさが異なるのは、プローブの親和性が異なるためである。
このことから、ｍｉＲＮＡを配列依存的に検出できることが確認された。【００７８】
［流体デバイスにおけるバルブの開閉］
本実施例におけるバルブの開閉動作を説明するための流体デバイスの模式図を図９（Ａ）に示す。本デバイスは、エキソソーム精製ユニット（エキソソーム精製部２）、ｍｉＲＮＡ精製ユニット（生体分子精製部３）、ＤＮＡチップ（生体分子検出部４）、廃液槽７、廃液槽８、廃液槽９を備える。廃液槽は吸引口を備える。
図９（Ｂ）に示すような、各工程におけるバルブの開閉制御により、流体の流れを制御できることが確認された。たとえば、上清導入の際には、図９（Ａ）のバルブ１番（１）、バルブ３番（３）、バルブ５番（５）、バルブ７番（７）、バルブ８番（８）、バルブ１０番（１０）、バルブ１３番（１３）を開き、上清廃液槽の吸引口Ａから溶液を吸引する。【００７９】
以上の結果から、本実施形態によれば、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる。
【符号の説明】
【００８０】
１，２０…流体デバイス、２…エキソソーム精製部、２ａ…洗浄液導入用インレット、２ｂ…サンプル導入用インレット、２ｃ…破砕液導入用インレット、２ｄ…エキソソーム固定部、２ｅ，２ｆ，２ｇ，３ｄ，３ｆ，５ａ，１０ａ，１１ａ，…バルブ、２ｈ，２ｉ，２ｊ，３ｅ，３ｇ…流路、３…生体分子精製部、３ｂ…生体分子回収液導入用インレット、３ｃ…生体分子固定部、４…生体分子検出部、４ａ…検出プローブ導入用インレット、４ｂ…洗浄液導入用インレット、４ｃ…基板、５…第一の流路、６…第二の流路、７…第一の廃液槽、８…第二の廃液槽、９…第三の廃液槽、１０…第三の流路、１１…第四の流路、１２…第五の流路、３３…ｍｉＲＮＡ、３１…第一の部分、３２…第二の部分、３４…捕捉プローブ、３４ａ…スペーサー、３５…検出プローブ、３５ａ…標識物質、３５ｂ…配列、３５ｃ，３５ｄ…ステム部、３６…基板。
【図１】
2015045666.tif 000006
【図２】
2015045666.tif 000007
【図３】
2015045666.tif 000008
【図４】
2015045666.tif 000009
【図８】
2015045666.tif 000010
【図５】
2015045666.tif 000011
【図６】
2015045666.tif 000012
【図７Ａ】
2015045666.tif 000013
【図７Ｂ】
2015045666.tif 000014
【図９Ａ】
2015045666.tif 000015
【図９Ｂ】
2015045666.tif 000016
【配列表】
2015045666000001.app
【国際調査報告】
2015045666.tif 000017
2015045666.tif 000018
2015045666.tif 000019
2015045666.tif 000020