(57)【要約】  本発明は、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することにより、化学的に定義された条件下で哺乳動物栄養膜幹細胞を樹立する方法を提供する。また、本発明は、哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することにより、化学的に定義された条件下で哺乳動物栄養膜幹細胞を維持培養する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することを含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の製造方法。
【請求項２】
栄養外胚葉を含む哺乳動物胚を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養する、請求項1記載の製造方法。
【請求項３】
エピブラストを含まない、単離された胚体外外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養する、請求項1記載の製造方法。
【請求項４】
培地が更にROCK阻害剤を含む、請求項1〜3のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉が、細胞外マトリクスコートした培養器上で培養される、請求項1〜4のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
培養がフィーダー無しで行われる、請求項1〜5のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
培地が、化学的に定義されている、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項８】
栄養膜幹細胞が、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項９】
Wntシグナル阻害剤が、XAV939である、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１０】
ROCK阻害剤が、Y27632である、請求項4〜9のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１１】
哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することを含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
FGFがFGF2である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
FGFがFGF4である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
培地が、更にヘパリンを含む、請求項11〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
培地が、更にROCK阻害剤を含む、請求項11〜14のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
培養がフィーダー無しで行われる、請求項11〜15のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
培地が、化学的に定義されている、請求項11〜16のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物栄養膜幹細胞が、細胞外マトリクスコートした培養器上で培養される、請求項11〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
栄養膜幹細胞が、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する、請求項11〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
Wntシグナル阻害剤が、XAV939である、請求項11〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
ROCK阻害剤が、Y27632である、請求項15〜20のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物栄養膜幹細胞、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞調製物。
【請求項２３】
FGFがFGF2又はFGF4である、請求項22記載の調製物。
【請求項２４】
更にROCK阻害剤を含む、請求項22又は23記載の調製物。
【請求項２５】
FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、化学的に定義された培地。
【請求項２６】
FGFがFGF2又はFGF4である、請求項25記載の培地。
【請求項２７】
更にROCK阻害剤を含む、請求項25又は26記載の培地。
【請求項２８】
哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用又は維持培養用である、請求項25〜27のいずれか１項記載の培地。
【請求項２９】
FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用又は維持培養用培地添加剤。
【請求項３０】
FGFがFGF2又はFGF4である、請求項29記載の培地添加剤。
【請求項３１】
更にROCK阻害剤を含む、請求項29又は30記載の培地添加剤。
【請求項３２】
FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導用又は維持用培地。
【請求項３３】
FGFがFGF2又はFGF4である、請求項32記載の培地。
【請求項３４】
更にROCK阻害剤を含む、請求項32又は33記載の培地。
【請求項３５】
請求項1〜10のいずれか１項記載の製造方法により製造される哺乳動物栄養膜幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロにおいて、栄養膜幹細胞を樹立し維持する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物において、胎盤は、子宮における胎仔発生のために重要な臓器（vital organ）である。胎盤は、胎仔と母体環境との間の接合部分として機能し、ガス、栄養、及び排泄産物の交換を促進するのみならず、妊娠関連ホルモン産生及び胎仔の免疫防御を促進している。この組織の主要な構造的及び機能的構成因子は、栄養膜系列の細胞からなる。この系列は、子宮内への着床前に、胚体を形成する内部細胞塊（ICM）系列から分離し、胎盤の胎仔部分の形成に制限される(非特許文献1)。過去数十年にわたり、ICM由来の胚性幹（ES）細胞及び栄養外胚葉（TE）由来の栄養膜幹（TS）細胞は、初期胚及び胎盤発生の分子メカニズムの我々の理解を実質的に進展させてきた。ES細胞が最初に記載されて以来(非特許文献2、3)、ES細胞は、フィーダー細胞、馴化培地、血清、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、及びペプチドの多様な経験的組み合わせを用いて誘導され維持されてきた(非特許文献2〜7)。現在では、膨大なトライ・アンド・エラーの結果、未分化多能性幹細胞を、白血球阻害因子（LIF）及び／又は低分子化合物（即ち、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、CHIR99021等）の存在下、化学的に定義された培養条件下で効率的に誘導し維持することができる(非特許文献8、9)。一方、TS細胞が最初に記載されて以来(非特許文献10)、TS細胞は、初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）、馴化培地、ウシ胎仔血清、線維芽細胞増殖因子4（FGF4）、及びヘパリンの多様な組み合わせを用いて誘導及び維持されてきた（特許文献1）。【０００３】
いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進されることが報告されている(非特許文献8、9、11)。また、エピブラスト幹細胞（EpiSC）の未分化状態を支持することができる、改変されたEpiSC培養条件が報告されている(非特許文献4)。【０００４】
特許文献2（US 2006/0211110）には、ヒトTS細胞をbFGFで処理すると、Oct4及びfgfr2発現が減少することが記載されている。【０００５】
マウスES細胞は、初期胚中に移植することにより、キメラにおいて、生殖系列を含む全ての型の胎生細胞に寄与することができ、四倍体キメラ形成によってほとんど全てがES細胞由来の個体を生み出すことができる(非特許文献12)。しかしながら、受精卵又は初期胚を用いずにES細胞から個体を生み出すことについては未だ報告されていない。【０００６】
この現象は、ES細胞が栄養膜系列を生み出すことができないということで、合理的に説明される。しかしながら、いままでに、ES細胞とTS細胞の凝集によってはこの問題を解決することができていない。ES細胞とTS細胞からの初期胚の再構成に向かって進むためには、TS細胞の分子状態及びES細胞‐TS細胞間相互作用を正確に描写し精査するための定義されたプラットフォームを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US 6,630,349 B1
【特許文献２】US 2006/0211110 A1
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.
【非特許文献２】Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.
【非特許文献３】Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78(12): 7634-7638.
【非特許文献４】Smith, A. G., Heath, J. K., Donaldson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides', nature 336: 688-690.
【非特許文献５】Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A. and Gough, N. M. (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.
【非特許文献６】Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.
【非特許文献７】Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 9(5): 471-7.
【非特許文献８】Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal', nature 453(7194): 519-23.
【非特許文献９】Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136(19): 3215-22.
【非特許文献１０】Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075.
【非特許文献１１】Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. (2009) 'Generation of rat and human inducedpluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4(1): 16-9.
【非特許文献１２】Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E. M., Prideaux, V. R., Ivanyi,E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able tosupport fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、化学的に定義された条件下で、哺乳動物TS細胞を樹立し維持する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討の結果、培養物中へFGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤を添加することにより、化学的に定義された培養条件下で胚盤胞及び胚体外外胚葉からTS細胞を誘導することに成功した。ROCK阻害剤の要求性は、マトリゲル等の細胞外マトリクスの使用により回避することができた。更に、これらのTS細胞誘導条件下で、未分化TS細胞を安定に維持し、増殖することができた。FGF2に代えて、FGF4とヘパリンの組み合わせを使用しても、未分化TS細胞を維持し、増殖することができた。これらの方法により樹立された細胞は、各種のTS細胞マーカー遺伝子を発現し、インビトロで全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜）へ分化し、且つキメラ動物において栄養膜系列へ独占的に寄与した。【００１１】
発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：【００１２】
［1］哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することを含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の製造方法。
［2］栄養外胚葉を含む哺乳動物胚を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養する、［1］記載の製造方法。
［3］エピブラストを含まない、単離された胚体外外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養する、［1］記載の製造方法。
［4］培地が更にROCK阻害剤を含む、［1］〜［3］のいずれか記載の製造方法。
［5］哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉が、細胞外マトリクスコートした培養器上で培養される、［1］〜［4］のいずれか記載の製造方法。
［6］培養がフィーダー無しで行われる、［1］〜［5］のいずれか記載の製造方法。
［7］培地が、化学的に定義されている、［1］〜［6］のいずれか記載の製造方法。
［8］栄養膜幹細胞が、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する、［1］〜［7］のいずれか記載の製造方法。
［9］Wntシグナル阻害剤が、XAV939である、［1］〜［8］のいずれか記載の製造方法。
［10］ROCK阻害剤が、Y27632である、［4］〜［9］のいずれか記載の製造方法。
［11］哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することを含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の培養方法。
［12］FGFがFGF2である、［11］記載の方法。
［13］FGFがFGF4である、［11］記載の方法。
［14］培地が、更にヘパリンを含む、［11］〜［13］のいずれか記載の方法。
［15］培地が、更にROCK阻害剤を含む、［11］〜［14］のいずれか記載の方法。
［16］培養がフィーダー無しで行われる、［11］〜［15］のいずれか記載の方法。
［17］培地が、化学的に定義されている、［11］〜［16］のいずれか記載の方法。
［18］哺乳動物栄養膜幹細胞が、細胞外マトリクスコートした培養器上で培養される、［11］〜［17］のいずれか記載の方法。
［19］栄養膜幹細胞が、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する、［11］〜［18］のいずれか記載の方法。
［20］Wntシグナル阻害剤が、XAV939である、［11］〜［19］のいずれか記載の方法。
［21］ROCK阻害剤が、Y27632である、［15］〜［20］のいずれか記載の方法。
［22］哺乳動物栄養膜幹細胞、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞調製物。
［23］FGFがFGF2又はFGF4である、［22］記載の調製物。
［24］更にROCK阻害剤を含む、［22］又は［23］記載の調製物。
［25］FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、化学的に定義された培地。
［26］FGFがFGF2又はFGF4である、［25］記載の培地。
［27］更にROCK阻害剤を含む、［25］又は［26］記載の培地。
［28］哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用又は維持培養用である、［25］〜［27］のいずれか記載の培地。
［29］FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用又は維持培養用培地添加剤。
［30］FGFがFGF2又はFGF4である、［29］記載の培地添加剤。
［31］更にROCK阻害剤を含む、［29］又は［30］記載の培地添加剤。
［32］FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導用又は維持用培地。
［33］FGFがFGF2又はFGF4である、［32］記載の培地。
［34］更にROCK阻害剤を含む、［32］又は［33］記載の培地。
［35］［1］〜［10］のいずれか記載の製造方法により製造される哺乳動物栄養膜幹細胞。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、化学的に定義された無フィーダー、無血清の培養条件下において、未分化なTS細胞を樹立し、安定的に維持培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】GOF18-EGFP (Oct3/4-EGFP)レポーター導入遺伝子を有するE3.5胚盤胞。スケールバー、50μm。
【図２】CDM/LIF/2i（左）及びCDM/FAXY (FGF2、12.5 ng/ml)（右）中で5日目に生じた増殖物。スケールバー、100μm。
【図３】継代1日目（上）、2日目（中）、及び3日目（下）におけるTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。
【図４】E3.5胚盤胞（左）及びE6.5 ExE（右）から誘導されたTS細胞。スケールバー、100μm。
【図５】フィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ上のTS細胞の免疫蛍光染色。スケールバー、100μm。
【図６】CDM/LIF/2i中のES細胞（赤）及びCDM/FAXY 中のE3.5胚盤胞由来TS細胞（青）の増殖。
【図７】ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、ES細胞特異的遺伝子、普遍的に発現している遺伝子、及びTS細胞特異的遺伝子の発現レベルの比較。
【図８】ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、外胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子、及び内胚葉遺伝子の発現レベルの比較。
【図９】12.5 ng/ml、25 ng/ml、及び50 ng/mlにおける、FGF2のTS細胞マーカー遺伝子及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルに対する用量依存的効果。
【図１０】ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGFリガンドファミリー遺伝子の発現レベルの比較。
【図１１】ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGF受容体遺伝子の発現レベルの比較。
【図１２】FGF2 (-F、左から2番目)、アクチビンA (-A、右から2番目)、又はXAV939(-X、右)の除去時のTS細胞の形態学的変化。FAXYはコントロールとして未分化TS細胞を表す（左）。スケールバー、100μm。
【図１３】FGF2 (-F)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１４】アクチビンA (-A)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１５】XAV939 (-X) の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１６】FGF2 (-F)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１７】アクチビンA (-A)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１８】XAV939 (-X) の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１９】FAM-FLICAによる、蛍光ベースでのポリカスパーゼ陽性細胞の検出。未分化コントロール(FAXY、左)及びY27632除去(-Y、右)。スケールバー、100μm。
【図２０】ポリカスパーゼ陽性細胞の定量、百分率（％）で示す。
【図２１】フィブロネクチン（左）及びマトリゲル（右）上のTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。
【図２２】E14.5胚におけるTS細胞の胎盤特異的寄与。
【図２３】E14.5における胎盤切片のDAPI染色（灰色）及びEGFP蛍光（緑）の共焦点マージイメージ。de、脱落膜；gi、巨細胞；sp、海綿状栄養膜細胞；la、ラビリンス；ch、絨毛膜。スケールバー、200μm。
【図２４】培養したTS細胞の形態を示す。左の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF4及びヘパリンを添加した、従来技術の培地中で培養したTS細胞、右の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した培地中で培養したTS細胞を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から哺乳動物栄養膜幹細胞を製造する方法、及び当該方法により得られる哺乳動物栄養膜幹細胞を提供する。本発明はまた、哺乳動物栄養膜幹細胞の培養方法を提供する。
【００１６】
1．用語の定義
本明細書において、栄養膜幹（TS）細胞は、以下の4つ全ての形質を備える細胞を意味する：
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力。
【００１７】
（1）の自己複製能は、（2）〜（4）の形質を維持したまま、細胞が増殖する能力を意味する。
【００１８】
（2）のTS細胞マーカーとしては、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2、Tcfap2c等が挙げられる。本発明においては、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cからなる群から選択される少なくとも1つのTS細胞マーカーを発現している場合、「TS細胞マーカー遺伝子発現陽性」と判断する。一態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cの全てのTS細胞マーカー遺伝子発現が陽性である。TS細胞マーカー遺伝子の発現は、定量的RT-PCRにより決定することができる。
【００１９】
TS細胞は、他の系列マーカー遺伝子発現陰性により更に特徴付けられてもよい。一態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4及びKlf4からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）のES細胞マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、Nestin、Sox1及びNcamからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の外胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、Hoxa1、Hoxb1、Flk1及びTからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の中胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、Gata4、Gata6、Afp及びFoxa2からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の内胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。
【００２０】
（3）のインビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力は、インビトロにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜サブタイプへ分化する能力を意味する。各栄養膜サブタイプへの分化は、各栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子発現により確認することができる。栄養膜サブタイプへ分化する能力は、評価対象の細胞を、栄養膜サブタイプへの分化条件化で培養したときに、栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子の発現が誘導されるか否かを指標に評価することができる。栄養膜巨細胞のマーカー遺伝子としては、PL-1、Hand1等を挙げることができる。海綿状栄養膜のマーカー遺伝子としては、Mash2、Tpbp/-4311等を挙げることができる。ラビリンス栄養膜のマーカー遺伝子としては、Esx1、Dlx3等を挙げることができる。特定の栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子のうち少なくとも1つが上昇した場合、当該栄養膜サブタイプへの分化が誘導されたと評価する。栄養膜サブタイプへの分化条件としては、後述する実施例におけるCDM-FAXY条件から、FGF2又はアクチビンAのいずれかを除去した条件を挙げることができる。
【００２１】
ここで、本明細書において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有するTS細胞を「未分化のTS細胞」と称する。一方、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される一部（即ち、1又は2）の栄養膜サブタイプへのみ分化する能力を有するTS細胞を「分化したTS細胞」と称する。好ましい態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞及び本発明の方法において培養されるTS細胞は、未分化のTS細胞である。
【００２２】
（4）のキメラにおいて、胎盤へ寄与する能力は、評価対象の細胞を胚盤胞中へ注入し、偽妊娠動物の子宮角へ移入したときに、評価対象の細胞が発生キメラ子孫動物の胎盤の胎仔部位へ寄与するか否かを試験することにより評価することができる。胎盤の胎仔部位において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜系列への寄与がある場合、評価対象の細胞は、キメラにおいて胎盤へ寄与する能力を有すると評価することができる。
【００２３】
栄養外胚葉とは、胚盤胞において、内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞をいう。
【００２４】
胚体外外胚葉とは、胚盤葉のうち胚体域の周辺にあって胚体の形成に寄与しない部位をいう。胚体外外胚葉は着床後に、栄養外胚葉から形成される。
【００２５】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）である。尚、ヒト胚の破壊を伴うプロセスは、倫理的に実施困難であるが、倫理的問題が生じない限り、本発明は、ヒト栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのヒト栄養膜幹細胞の製造、ヒト栄養膜幹細胞の培養に適用可能であることは明らかである。
【００２６】
哺乳動物の系統は特に限定されないが、例えば、マウスの系統としては、純系としてC57BL/6系統、BALB/c系統、C3H系統、FVB系統、DBA2系統など、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、ICR系統などを、ラットの系統としては、Wistar、SDなどを挙げることができる。
【００２７】
FGFは、公知のサイトカインであり、ヒト及びマウスにおいては、FGF1〜FGF23が確認されている。ヒトFGF19はマウスFGF15のオルソログであるので、ヒト及びマウスのFGFファミリーは22のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、FGFの呼称はヒトFGFのノメンクラチャに従うものとする。本発明において用いられるFGFは、栄養外胚葉又は胚体外胚葉から栄養膜幹細胞への分化、或いは栄養膜幹細胞の維持培養を可能とするものであれば、特に限定されないが、好ましくは、FGF2又はFGF4である。本発明に用いるFGF（例、FGF2、FGF4）は、通常哺乳動物のFGFである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。FGF（例、FGF2、FGF4）は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）を用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。ここで、例えば、マウスFGF2とは、FGF2が、マウスが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。
【００２８】
FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。マウスFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_032032.1（2014年2月18日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-9）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF2アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。
【００２９】
マウスFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_034332.2（2014年5月26日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-29）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001998.1（2014年4月20日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-30）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。
【００３０】
アクチビンシグナル経路作用物質としては、アクチビン、作動性抗アクチビン受容体抗体、アクチビン受容体アゴニスト等を挙げることができる。アクチビンは公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるアクチビンは、通常哺乳動物のアクチビンである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。アクチビンは、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のアクチビンを用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のアクチビンが用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のアクチビンが用いられる。アクチビンは、通常二量体構造を有し、これを構成するサブユニット（βサブユニットとよばれる）としては、哺乳動物においては４種類（βA、βB、βC、βE）が知られている。アクチビンとしては、アクチビンA（βA‐βA）、アクチビンAB（βA‐βB）、アクチビンB（βB‐βB）、アクチビンC（βC‐βC）、アクチビンE（βE‐βE）などを挙げることができる。これらのアクチビンは、全てアクチビン受容体を介して細胞へ作用する。尚、本明細書においては、前記の組み合わせ以外のサブユニットの組み合わせであっても、アクチビン受容体を介してその下流のシグナルを活性化できるものは、全てアクチビンに包含されるものとする。アクチビンシグナル経路作用物質は、好ましくはアクチビン（例、アクチビンA）である。
【００３１】
本発明において使用されるFGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンは、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
【００３２】
Wntシグナル阻害剤は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、例えば、XAV939（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、IWR-1-end（4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide）等のタンキラーゼ阻害剤、IWP-2（N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide）、CKI-7（N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide）、D4476（4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受容体阻害剤、可溶型Wnt受容体、Wnt抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、Wntに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、XAV939等のタンキラーゼ阻害剤が好ましい。XAV939は、古典的なWntシグナル阻害剤であり、ポリADPリボシル化酵素であるタンキラーゼ1及びタンキラーゼ2の阻害を介して、アキシンの安定化によるβカテニン分解を活性化する(Huang et al.、2008)。
【００３３】
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y27632（(R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide）（Ishizakiら, Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiyaら, Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine）（Uehataら, Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline）（Sasakiら, Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（[(+)-(R)-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl) benzamide）（Nakajimaら, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もまた使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、1種又は2種以上のROCK阻害剤が使用され得る。ROCK阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、Y27632が好ましい。
【００３４】
2．栄養膜幹細胞の製造方法
本発明の栄養膜幹細胞の製造方法は、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、生体外において、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地中で培養することを含む。
【００３５】
哺乳動物栄養外胚葉は、胚から単離された栄養外胚葉として、又は栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供することができる。単離された栄養外胚葉は、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）から、内部細胞塊（ICM）を除去することにより、得ることができる。栄養外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養すると良好に増殖しTS細胞が誘導されるのに対して、ICMを同培地中で培養してもほとんど増殖しない。従って、栄養外胚葉及び内部細胞塊を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）を、そのまま培養に供すると、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊から誘導された細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となる。従って、操作容易の観点から、一態様において、栄養外胚葉を、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供するのが好ましい。
【００３６】
哺乳動物胚体外外胚葉は、胚から単離された胚体外外胚葉として、又は胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚として、培養に供することができる。単離された胚体外外胚葉は、胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚から、エピブラストを除去することにより、得ることができる。胚体外外胚葉と同様に、エピブラストを、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤）を含む培地中で培養すると、良好に増殖し、エピブラスト幹細胞が樹立される。従って、エピブラスト幹細胞の混入を抑制する観点から、胚体外外胚葉を、胚から単離された胚体外外胚葉として、培養に供するのが好ましい。一態様において、エピブラストを含まない、単離された胚体外外胚葉が、培養に供される。
【００３７】
栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、動物種により異なるため、一概に規定することはできないが、各種哺乳動物の胚発生について詳細に報告されているので、当業者であれば、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む適切な胎生日齢の胚を容易に得ることができる。マウスについては、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、通常E2〜10日、好ましくはE3.5〜6.5日である。
【００３８】
FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地の組成について説明する。本発明は、当該培地をも提供する。本発明の培地は、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用及び維持培養用として、本発明の製造方法及び下記の本発明の培養方法において好適に使用され得る。
【００３９】
培地中における、FGF2の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、12.5 ng/ml以上、より好ましくは25 ng/ml以上、更に好ましくは50 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF2濃度を25 ng/ml以上、好ましくは50 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは12.5〜500 ng/ml、より好ましくは25〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜500 ng/mlである。FGF2は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。
【００４０】
培地中における、アクチビンシグナル経路作用物質の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。アクチビンシグナル経路作用物質としてアクチビンAを用いる場合、その培地中濃度は、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。細胞増殖への悪影響がない限りアクチビンA濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のアクチビンA濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、より好ましくは20〜500ng/mlである。アクチビンシグナル経路作用物質は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。
【００４１】
培地中における、Wntシグナル阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としてXAV939を用いる場合、その濃度は、通常0.1 nM以上、好ましくは3 nM以上、より好ましくは10 nM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りXAV939濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常50μM以下、好ましくは5μM以下、より好ましくは、500 nM以下である。一態様において、培地中のXAV939濃度は、通常0.1 nM〜50μM、好ましくは3 nM〜5μM、より好ましくは10〜500 nMである。Wntシグナル阻害剤は、特に、TS細胞の未分化状態の維持に寄与する。
【００４２】
培養に用いる培地は、ROCK阻害剤を含んでいても良い。ROCK阻害剤は、特に、誘導されたTS細胞の生存の維持に寄与する。
【００４３】
培地中における、ROCK阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。ROCK阻害剤としてY27632を用いる場合、その濃度は、通常0.1 μM以上、好ましくは1μM以上、より好ましくは5 μM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りY27632濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常1000 μM以下、好ましくは100 μM以下、より好ましくは、50 μM以下である。一態様において、培地中のY27632濃度は、通常0.1 〜1000 μM、好ましくは1〜100 μM、より好ましくは5〜50 μMである。ROCK阻害剤としてFasudil／HA1077を用いる場合、目安としてY27632の上記濃度の約2倍の濃度で用いることができ、ROCK阻害剤としてH−1152を用いる場合には、目安としてY27632の上記濃度の約1／50倍の濃度で用いることができる。
【００４４】
FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。
【００４５】
培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。
【００４６】
培養に使用する培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham’s F−12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、Neurobasal：DMEM：Ham’s F−12＝2：0．8〜1．2：0．8〜1．2である。
【００４７】
培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、無血清条件でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００４８】
培養に用いる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物としては、N2、B27、KSR等を挙げることができる。N2は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、公知の血清代替用組成物である。B27の組成は、J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993、Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989等に記載されている。KSRは、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。N2、B27及びKSRは、Invitrogen等から購入可能である。培地中に添加される血清代替物の量は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、Invitrogen社製のN2サプリメント及びB27サプリメントであれば、それぞれ、培地全体の容量の1/500〜1/10容量が添加される。好適な態様において、培養に用いられる培地は、N2及びB27を含む。
【００４９】
培養に用いられる培地は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL−グルタミン等）、還元剤（例えば1−チオグリコレート、2−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
培養に用いられる培地は、好適には、化学的に定義された培地である。「化学的に定義された培地」とは、血清、馴化培地等の組成が化学的に未決定な因子を含まず、化学的に組成が定義された因子のみから構成された培地を意味する。
【００５１】
一態様において、本発明の製造方法において用いられる培地は、基礎培地中に、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、、N2、及びB27（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、ROCK阻害剤、N2、及びB27）を含む。アクチビンシグナル経路作用物質は、好適にはアクチビン（例、アクチビンA）である。Wntシグナル阻害剤は、好適にはタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。ROCK阻害剤は、好適にはY27632である。基礎培地は、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地でありうる。該培地は、好適には化学的に定義された培地である。
【００５２】
一態様において、本発明の製造方法において用いられる培地は、FGF4を含有しない。従来、MEF、馴化培地、血清、FGF4、ヘパリンを含む培地中で、TS細胞を樹立し、維持する方法が知られているが、本発明においては、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、FGF4を含有しない培地中でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。フィーダー細胞とは、TS細胞と共に培養された際に、TS細胞としての能力を維持した状態でのTS細胞の増殖を補助する環境を提供する、非TS細胞（例、線維芽細胞）をいう。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下での培養が可能となる。本発明においては、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００５４】
培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００５５】
TS細胞の製造又は維持における培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。
【００５６】
細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子をいう。細胞外マトリクスとしては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン等が挙げられ、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはフィブロネクチン、ラミニンである。一態様において、細胞外マトリクスとして、基底膜調製物を用いることができる。基底膜調製物としては、その上に未分化なTS細胞を播腫して培養した場合に、未分化状態を維持したまま、その生存を維持する機能を有する基底膜構成成分を含むものであれば、その由来する細胞の種類は特に限定されない。基底膜調製物は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液等を用いて除去することで作成することができる。細胞外マトリクスとしては市販のものが利用でき、例えば、マトリゲル（BD Bioscience）などが挙げられる。マトリゲルは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてTGF−β、線維芽細胞増殖因子（FGF）、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。
【００５７】
細胞外マトリクスを培養器にコーティングする方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。例えば、培養器中に、細胞外マトリクスを含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）を加え、静置することにより、細胞外マトリクスを培養器の表面に非共有結合により不溶性担体に結合させることが出来る。
【００５８】
特に、ROCK阻害剤を含まない培地中でTS細胞を誘導する場合には、誘導されたTS細胞の生存維持の観点から、細胞外マトリクスコートされた培養器中で培養を行うことが好ましい。
【００５９】
その他の培養条件は、通常の哺乳動物細胞の培養条件に準じて、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養温度は、通常約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、通常約1〜10％、好ましくは約2〜5％である。湿度は通常約70〜100％の範囲であり、好ましくは約95〜100％である。
【００６０】
本発明のTS細胞の製造方法を、更に詳細に説明すると、以下の通りである。
【００６１】
生体より分離された桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、培養器中に播種し、FGF2、アクチビンA、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養する。該培養器は、通常の細胞培養において使用されるものを用いることができるが、好ましくは、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉、或いはこれから誘導された細胞の容器への接着を促進させるために、細胞接着性の培養器（例、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスでコートされた培養器）が用いられる。以下の培養に用いる培養器も同様である。
【００６２】
当該培養の結果、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉が増殖物（outgrowth）を形成し、初代外植片（primary explant）を得る。培養条件にもよるが、増殖物の形成は、培養の開始から、通常3〜7日後に生じる。
【００６３】
このようにして得られた初代外植片を、そのまま培養することによってもTS細胞を樹立することは可能であるが、好ましくはこの初代外植片を、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。外植片の分散は、適宜な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)又はアキュターゼ(MILLIPORE)等の市販品が入手可能である。分散された細胞を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。
【００６４】
培養を継続すると、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導された細胞は、培養条件によっても異なるが、継代後通常1週間以内に、培養器の底面にコロニーを形成する。このコロニーがTS細胞のコロニーである。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。このコロニーを、回収し、上述と同様に単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、更にFGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導されたTS細胞は、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で良好に増殖するのに対して、ICMに由来する細胞は、ほとんど増殖しない。従って、この継代操作を繰り返すことにより、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊に由来する細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となり、最終的に、ICMに由来する細胞を含まない、TS細胞からなる細胞集団を構成するに至る。
【００６５】
尚、TS細胞コロニーに加えて、エピブラスト幹細胞のコロニーの混入が生じる場合がある。従って、必要に応じて、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去することにより、TS細胞を精製してもよい。一態様において、本発明の製造方法は、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去し、TS細胞を単離する工程を含む。TS細胞コロニーは、コンパクトで、ドーム状の特徴的な形態を呈しているので、エピブラスト幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。従って、このようなTS細胞コロニーに特徴的な形態を指標に、例えば、顕微鏡下でTS細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップすることにより、TS細胞を単離することができる。また、限界希釈法によって、TS細胞のコロニーのみを生じたウェルから細胞を採集することによっても、TS細胞を単離することができる。あるいはTS細胞の細胞表面マーカー等を指標にして、セルソーター等を用いてTS細胞を単離してもよい。「単離されたTS細胞」の純度（総細胞数に占めるTS細胞の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
【００６６】
本発明の製造方法により製造されるTS細胞は、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、栄養膜幹細胞としての形質を維持しながら増殖する。
【００６７】
本発明の製造方法により得られた細胞が、TS細胞としての形質、即ち、
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、及び
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力
を維持しているか否か確認してもよい。一態様において、本発明の製造方法は、このような確認工程を含む。確認工程は、得られた細胞から一部の細胞をサンプルとして分離すること、該サンプルがTS細胞としての形質を維持しているか否か試験すること、及び該サンプルがTS細胞としての形質を維持していることが確認された場合、サンプルが由来する細胞をTS細胞として取得することを含む。
【００６８】
確認工程においては、上記形質のうち、（2）〜（4）の全ての形質を、サンプルが有しているか否か試験する。（2）〜（4）の形質の確認方法は、上記「1．用語の定義」の項に記載した通りである。（1）の形質については、継代培養後の細胞について、（2）〜（4）の形質を有していることをもって、サンプルが（1）の形質を有していると判定可能である。
【００６９】
好ましい態様において、本発明の製造方法により製造されるTS細胞は、未分化であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。
【００７０】
本発明の製造方法により得られるTS細胞は、理論的には永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該TS細胞は凍結保存・融解後もTS細胞としての形質を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA−IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−80〜−200℃、好ましくは−196℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。
【００７１】
本発明の製造方法により得られるTS細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。一度起眠した当該TS細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞のTS細胞としての形質は維持される。
【００７２】
本発明の製造方法により得られるTS細胞は、長期間にわたって、TS細胞としての形質を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該TS細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入されたTS細胞や、特定の遺伝子を欠損したTS細胞等の遺伝子改変TS細胞を製造することができる。
【００７３】
3．栄養膜幹細胞の培養方法
本発明は、哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤）を含む培地中で培養することを含む、哺乳動物栄養膜幹細胞の培養方法を提供する。本発明の培養方法は、栄養膜幹細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代又は増殖する方法である。従って、本発明の培養方法は、培養した細胞を回収し、これを播種することを含み得る。
【００７４】
本発明の培養方法において培養される栄養膜幹細胞には、上記本発明の製造方法により製造された栄養膜幹細胞のみならず、それ以外の方法により樹立された栄養膜幹細胞も包含される。本発明の培養方法において培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、単離されている。本発明の培養方法において培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。本発明の培養方法によれば、このような未分化な状態を維持したまま、栄養膜幹細胞を継代培養することが可能である。従来の方法（Tanaka, 1998）によると、継代後のコロニーの端に巨細胞が現れるなど、一部の細胞の分化が避けられなかったところ、本発明により、このような巨細胞の出現を回避し、分化したTS細胞や栄養膜サブタイプの混入を抑制しながら、未分化なTS細胞を継代培養することが可能となった。従って、一態様において、本発明の培養方法により得られる培養物には、巨細胞が含まれず、細胞として栄養膜幹細胞（好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞）のみが含まれる。
【００７５】
本発明の培養方法に用いられる培地の態様は、FGFの種類がFGF2に限定されないことを除き、上記2．において記載した、本発明の製造方法に用いられる培地の態様と同一である。FGFは、好ましくはFGF2又はFGF4である。FGFとして、FGF2を用いる場合、培地中のFGF2濃度は、上記2．において記載した、本発明の製造方法に用いられる培地の態様と同一である。FGFとして、FGF4を用いる場合、FGF4の濃度は、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したままでの、TS細胞の継代又は増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF4濃度を20 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF4濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、300 ng/ml以下、より好ましくは50 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF4濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜300 ng/ml、より好ましくは20〜50 ng/mlである。
【００７６】
本発明の培養方法に用いられる培地が、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、本発明の培養方法に用いられる培地が、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含まない。本発明の培養方法に用いられる培地が、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、本発明の培養方法に用いられる培地が、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含まない。
【００７７】
本発明の培養方法に用いられる培地は、ヘパリンを含んでいてもよい。ヘパリンは、特にTS細胞の未分化性維持に有効である。特に、FGFとしてFGF4を用いる場合、ヘパリンと組み合わせて培地に添加することが好ましい。培地中のヘパリン濃度は、TS細胞の未分化性維持等の所望の効果を達成し得る濃度である限り特に限定されないが、通常、0.1 ng/ml以上、好ましくは1 ng/ml以上である。TS細胞の維持、増殖へ悪影響がない限り、ヘパリン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常、1000 ng/ml以下、好ましくは、100 ng/ml以下である。一態様において、培地中のヘパリン濃度は、通常0.1〜1000 ng/ml、好ましくは1〜100 ng/ml、より好ましくは5〜20 ng/mlである。
【００７８】
本発明の培養方法に用いられる該培地は、好ましくは無血清培地である。該培地は、好ましくは化学的に定義された培地である。
【００７９】
一態様において、本発明の培養方法に用いられる培地は、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤に加えて、ROCK阻害剤を含む。
【００８０】
一態様において、本発明の培養方法に用いられる培地は、ROCK阻害剤を含まない。
【００８１】
本発明の培養方法においては、哺乳動物TS細胞を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下でのTS細胞の維持培養が可能となる。本発明においては、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の組み合わせを用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の維持培養が可能となる。
【００８２】
培養に用いる培養器としては、上記本発明の製造方法において用いることができる培養器と同一のものを使用することができる。
【００８３】
TS細胞の維持培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。
【００８４】
ここで、ROCK阻害剤を含む培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしては、上記本発明の製造方法において用いることができる細胞外マトリクス（例、フィブロネクチン）と同一のものを使用することができる。
【００８５】
一方、ROCK阻害剤を含まない培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしてマトリゲル等の基底膜調製物を用いることが好ましい。マトリゲルでコートされた培養器上で、TS細胞を接着培養することにより、ROCK阻害剤がなくても、TS細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代培養することが可能となる。
【００８６】
本発明の培養方法におけるその他の細胞培養条件は、特に断りのない限り、上記本発明の製造方法における、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を培養する際の培養条件、或いはこれらから誘導されたTS細胞を維持する際の培養条件と同様である。
【００８７】
即ち、TS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で培養する。この培養により、TS細胞は、培養器の底面にコロニーを形成する。増殖したTS細胞コロニーを回収し、適宜な細胞解離液により単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散したTS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に再び懸濁し、新たな培養器中で培養する。この操作を繰り返すことにより、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したまま、継代培養することが可能となる。
【００８８】
FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。
【００８９】
培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。
【００９０】
本発明の培養方法により、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、TS細胞としての形質を維持しながらTS細胞を継代培養することが可能である。
【００９１】
本発明の培養方法により、TS細胞を、長期間にわたって、TS細胞としての形質を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該TS細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入されたTS細胞や、特定の遺伝子を欠損したTS細胞等の遺伝子改変TS細胞を製造することができる。
【００９２】
本項における、用語の定義、培養条件等の態様は、特にことわりのない限り、上記「2．栄養膜幹細胞の製造方法」の項に記載したものと同一である。
【００９３】
4．栄養膜幹細胞調製物
本発明は、本発明の製造方法及び／又は本発明の培養方法により得られる細胞調製物を提供する。本発明の細胞調製物は、哺乳動物栄養膜幹細胞及びFGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤）を含む。本発明の細胞調製物は、ヘパリンを更に含んでいてもよい。哺乳動物栄養膜幹細胞は好ましくは単離されている。哺乳動物栄養膜幹細胞は、好ましくは未分化であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。一態様において、本発明の細胞調製物は、巨細胞を含まない。一態様において、本発明の細胞調製物は、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁された哺乳動物栄養膜幹細胞を含む。該培地は、ヘパリンを更に含んでいてもよい。該培地の態様は、上記2．又は3.において記載した、本発明の製造方法に用いられる培地又は本発明の培養方法に用いられる培地の態様と同一である。該培地は、好ましくは無血清培地である。該培地は、好ましくは化学的に定義された培地である。該培地が、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含まなくてもよい。該培地が、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含まなくてもよい。好ましくは、本発明の細胞調製物には、フィーダー細胞が含まれない。一態様において、本発明の細胞調製物は、培養器中に収容されている。該培養器は、好適には、表面が細胞外マトリクス（例、フィブロネクチン）でコートされている。
【００９４】
本発明の細胞調製物は、上記本発明の製造方法及び本発明の培養方法の実施に有用である。
【００９５】
本項における、用語の定義、培養条件、因子の組み合わせ等の態様は、特にことわりのない限り、上記「2．栄養膜幹細胞の製造方法」及び「3．栄養膜幹細胞の培養方法」の項に記載したものと同一である。
【００９６】
5．培地添加剤
本発明は、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤）を含む培地添加剤を提供する。該培地添加剤は、ヘパリンを更に含んでいてもよい。本発明の培地添加剤は、哺乳動物栄養膜幹細胞の誘導培養用及び／又は維持培養用として、本発明の製造方法及び本発明の培養方法において好適に使用され得る。
【００９７】
一態様において、本発明の培地添加剤は、組成物である。該組成物には、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤）に加えて、ヘパリンが含まれていてもよい。また、該組成物にはこれらの因子に加えて、上記本発明の製造方法又は本発明の培養方法において、培地に添加される成分（血清代替物（N2、B27等）、還元剤等の上述した因子）が含まれていても良い。
【００９８】
一態様において、本発明の培地添加剤は、キットである。該キットは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤）及び任意的な他の成分（例、ヘパリン）を個別に（即ち、非混合様式で）含むものであり得る。例えば、本発明のキットは、各成分を個別の容器に格納した形態で提供され得る。本発明のキットに含まれ得る他の成分としては、例えば、本発明の組成物に含まれ得る上述の他の成分、細胞外マトリクス（フィブロネクチン等）、基礎培地、培養器等を挙げることができる。
【００９９】
本項における、用語の定義、培養条件、因子の組み合わせ等の態様は、特にことわりのない限り、上記「2．栄養膜幹細胞の製造方法」及び「3．栄養膜幹細胞の培養方法」の項に記載したものと同一である。
【０１００】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１０１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
［実施例１］
［材料及び方法］
（TS細胞の誘導）
以下の条件（CDM/FAXYと称す）を、着床前E3.5胚盤胞及び着床後E6.5胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導及び維持に用いた。CDM/FAXYは、250 mlのNeurobasal (Invitrogen)、250 mlのDMEM/F12 (Ham’s) (1:1) (Invitrogen)、2.5 ml N2 サプリメント (Invitrogen)、B27 サプリメント (Invitrogen)、5 ml ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液(Invitrogen)、ウシ血清アルブミン (Sigma、最終濃度0.05%)、1-チオグリコレート(Sigma、最終濃度1.5 × 10-4M)、組み換え型マウスbasic FGF (R&D、最終濃度12.5-50 ng/ml)、組み換え型 ヒトアクチビンA (R&D、最終濃度20 ng/ml)、XAV939 (Calbiochem、最終濃度10 nM)、及びY27632 (Stemgent、最終濃度5 μM)を配合することにより調製した。E3.5胚盤胞及びE6.5胚体外外胚葉を、15 μg/mlヒト血漿フィブロネクチン(Millipore)で37℃にて少なくとも1時間コートした96穴プレート上、CDM/FAXY中にまいた。増殖したTS細胞の初期増殖物は、5日目までには明らかとなった。まいてから5〜8日後に、これらの増殖物をTripLE Select (Invitrogen)により単一細胞へ分散させた。新たに樹立された細胞株をフィブロネクチンコートしたディッシュ上で更にTripLE Selectにより増殖させ、その後、Cellbanker 2 (Mitsubishi Chemical Medience)を用いて凍結させるか、更なる解析に用いた。培地は2日おきに交換した。CDM/FAXYに、KnockOutTM serum replacement (Invitrogen、1% final concentration)を用いることができ、正の細胞接着効果をもたらした。Y27632を加えない場合には、0.2% マトリゲル (BD Biosciences)をコートしたディッシュをTS細胞培養に用いた。【０１０３】
（定量的PCR (qPCR)解析）
RNeasy Mini kits (Qiagen)を用いて細胞から全RNAを精製した。逆転写のため、ReverTra Ace (Toyobo)及びoligo (dT)20プライマーを用いた。qPCR解析のため、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)及びCFX384 Real-Time System (Bio-Rad)を用いた。転写レベルはトリプリケートの反応で定義し、対応するGapdhに対して規準化した。【０１０４】
（免疫蛍光染色）
細胞をフィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ(35 mm μ-Dish; ibidi)上で2日間増殖させ、4%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で室温にて1時間固定し、その後0.1% Triton X100/PBSで3回洗浄した。細胞をブロッキング溶液(0.5% 正常ヤギ血清 [Vector]を含むPBS + 0.1% Triton X-100 [PBST])でブロックし、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした。次に、細胞をPBSTにより3回洗浄し、Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1:500; A11036、Invitrogen)とともに室温にて1時間インキュベートし、PBST中で洗浄し、DAPI (1 μg/ml; Invitrogen)により対比染色し、画像化した。ウサギ抗Cdx2抗体(ab76541、Abcam)は、1:500希釈で用いた。【０１０５】
（アポトーシス解析）
アポトーシス細胞は、FAM-FLICA Poly Caspase Assay Kit (ImmunoChemistry Technologies)を用いて検出し、細胞をHoechst 33342 (200 μg/ml、ImmunoChemistry Technologies)により対比染色した。【０１０６】
（画像化）
画像は、DP72カメラ(Olympus)を備えたIX71倒立顕微鏡(Olympus)、DP71カメラ(Olympus)を備えたSZX12解剖顕微鏡(Olympus)、又はFV1000倒立共焦点顕微鏡を用いて得た。【０１０７】
（レンチウイルス産生及び感染）
293FTを100 mmディッシュにつき4 × 106個まき、一晩インキュベートした。細胞を、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、pLV-CAG1.1-EGFP、pMDL g/p、pREV、及びpVSVG ベクター(Okada et al.、2007)でトランスフェクトした。トランスフェクションから48及び72時間後、トランスフェクタントからの培養液を回収し、0.45-μm孔セルロースアセテートフィルター(Millipore)を通して濾過し、ろ液をウイルス上清として用いた。トランスダクションの1日前に、TS細胞を6穴プレート(Greiner Bio One)に1ウェルあたり1 × 105個まいた。トランスダクションの日に、培地を4 mg/mlポリブレン(Nacalai Tesque)を添加したウイルス上清に交換し、次に24時間インキュベートした。【０１０８】
（胚盤胞注入）
キメラマウスを作成するため、TS細胞をC57BL/6 胚盤胞中へ注入し、CD1偽妊娠マウスの子宮角へ移入した。全ての動物試験は、実験動物の管理と使用に関するガイドライン（RIKEN神戸研究所）に適合したものであり、機関の動物実験委員会により承認されたものである。【０１０９】
［結果］
（化学的に定義された条件におけるTS細胞の樹立及び自己複製）
主要なシグナル経路の活性化（例、BMP、アクチビン、TGFβ、FGF、WNT等）に対する胎盤胞の反応を観察するため、本発明者らは、最初に、BMP4、BMP7、LDN-193189、Dorsomorphin、アクチビンA、TGFβs1、GDF3、SB431542、A-83-01、LIF、FGF2、FGF4、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、WNT3、CHIR99021、XAV939、GF109203X、及びY27632の多様な組み合わせを含有する化学的に定義された培地（CDM）中で、マウス胚盤胞を培養した。その結果、CDM中におけるFGF2、アクチビンA、XAV939、及びY27632の組み合わせが、E3.5胎盤胞からの早いTE増殖を引き起こすことが示された。この目的のため、本発明者らはOct3/4-EGFPレポーターを内部にもつ、CD1 × B6 F1 GOF18 胚盤胞（図1）(Yoshimizu et al.、1999)を、LIF、PD0325901（MEK阻害剤）、及びCHIR99021（GSK3阻害剤）を含有するCDM（CDM／L2i、ES細胞培養条件）、又はFAXYを含有するCDM（12.5 ng/ml FGF2、20 ng/ml activin A、10 nM XAV939、5 μM Y27632）(CDM/FAXY、TS細胞培養条件)中で培養した。5日後、CDM/L2i中で増殖した内部細胞塊（ICM）は、Oct3/4-EGFP陽性の増殖物（outgrowth）を生じた（図2、左）。対照的に、CDM/FAXY中で増殖した胚盤胞の外層（栄養膜外胚葉、TE）は、Oct3/4-EGFP陰性の増殖物を形成した（図2、右）。これらの初代TE外植片は、マウスES細胞の継代に用いるプロトコールに沿った単一細胞分散により、増殖させることができた。継代した細胞は、最初にコンパクトでドーム状のコロニーを形成し、その後次第に形状が変化し、TS細胞の特徴的形態となった（図3）。次に、本発明者らは桑実胚及び胚盤胞（CD1 × B6 F1、CD1 × CD1、or 129 × B6 F1）を採集し、FGF2、FGF4、アクチビンA、XAV939、及びY27632の多様な組み合わせを含むCDM中で培養した。全ての遺伝学的バックグラウンドにおいて、TS細胞株は、FAXYを含有するCDM中でのみ効率的に誘導することができた（表1）。しばしば、エピブラスト幹細胞（EpiSC）(Brons et al.、2007; Tesar et al.、2007)様の非TS細胞が外植片の初期継代物中に現れた（表1）。これらの細胞は、最初にTS細胞と共存するが、TS細胞よりも速く増殖するため、最終的にTS細胞より優勢となった。更に、本発明者らは、CDM/FAXY中で培養した、原腸陥入後 (E6.5) 129 × B6 F1胚から切り出した胚体外外胚葉 (ExE)から、TS細胞株を誘導することができた（図4、表1）。【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
（TS細胞の分子的特性）
22継代後のTS細胞の免疫蛍光染色の結果、ほとんどすべての細胞において、栄養膜幹細胞マーカーであるcaudal-type homeobox protein 2 (Cdx2)の核局在が認められた（図5）。TS細胞とES細胞の増殖速度を比較するため、本発明者らは、各継代時（即ち、2日間隔）に2 × 105個の細胞をまいた。ES細胞の増殖速度（およそ8．9時間）は、TS細胞のそれ（およそ、9．2時間）よりも速かった（図6）。TS細胞は、少なくとも30継代まで維持することができた。【０１１２】
分子状態を解析するため、本発明者らは、定量的PCR（qPCR）により、TS細胞及びES細胞における遺伝子発現の特徴づけ及び比較を行った。TS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4、及びKlf4を含むES細胞特異的マーカー遺伝子をほとんど発現していなかった（図7）。反対に、それらの細胞は、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、及びCdx2を含むTS細胞マーカー遺伝子を高いレベルで発現していた。これらの遺伝子はES細胞においてはほとんど発現されていなかった（図7）。ES細胞と比較して、TS細胞は、estrogen-related receptor beta (Esrrb)及びtranscription factor activating enhancer-binding protein 2 gamma (Tcfap2c)を高いレベルで発現し、Kruppel-like factor 5 (Klf5)、retinoic acid-regulated zinc-finger gene (Rex1) (Rogers et al.、1991)、E-cadherin (Cdh1)、SRY-related HMG-box 2 (Sox2)、及びT-box transcription factor 3 (Tbx3)を同等のレベルで発現していた（図7）。E3.5 胚盤胞由来TS細胞及びE6.5 ExE由来TS細胞は、これらの遺伝子について極めて類似した発現パターンを示した（図7）。TS細胞及びES細胞の両方とも、外胚葉マーカー(Nestin、Sox1、Ncam)、中胚葉マーカー(Hoxa1、Hoxb1、Flk1、T)、及び内胚葉マーカー(Gata4、Gata6、Afp、Foxa2)をほとんど発現していなかった（図8）。【０１１３】
（FGF2、アクチビンA、及びXAV939の必要性）
TS細胞を未分化状態で維持するためのFGF2の最適濃度を調べるため、本発明者らは、E3.5 胚盤胞由来TS細胞(129 × B6 F1 バックグラウンド)を、12.5、25、又は50 ng/ml FGF2を含有するCDM/FAXY中で培養した。FGF2の濃度はTS細胞マーカー遺伝子 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Klf5、Elf5、及びTcfap2c)の発現レベルに影響を与えなかったが、FGF2は、分化した栄養膜系列マーカー（栄養膜巨細胞 (placental lactogen 1 [PL-1]、及びHomo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 1 [Hand1])、海綿状栄養膜細胞 (mammalian achaete-scute homologous protein 2 [Mash2] 及びtorophoblast specific protein alpha [Tpbp/4311])、及びラビリンス栄養膜(extraembryonic spermatogenesis homeobox 1 [Esx1]、glial cells missing homolog 1 [Gcm1]、及びdistal-less homeobox 3 [Dlx3])）の発現を用量依存的に抑制した（図9）。【０１１４】
本発明者らは、次にTS細胞及びES細胞におけるFGFリガンド類の発現レベルを比較した。脊椎動物においてはFGFファミリーは少なくとも23のメンバーからなる(Itoh and Ornitz、2008)。FGF4のみが、ES細胞において高いレベルで発現していた（図10）。本発明者らは、また、TS細胞及びES細胞におけるFGF受容体遺伝子の発現レベルを解析した。TS細胞は、Fgfr1及びFgfr2を高いレベルで発現していた。これらは、二倍体栄養膜において強く発現している(Haffner-Krausz et al.、1999)。TS細胞は、Fgfr3を低いレベルで発現していた（図11）。ES細胞はFgfr1のみを高いレベルで発現していた。【０１１５】
どの因子が、TS細胞の密な幹細胞様コロニー形態の維持に必要であるかを定義するため、本発明者らは、FGF2、アクチビンA、またはXAV939を除いた時のTS細胞における形態変化を観察した。これらの試験の前の5回の継代については、TS細胞の未分化状態をCDM-FAXY (50 ng/ml FGF2)中で維持した。FGF2又はアクチビンAの除去により、劇的に増殖速度が減少し、主に平らな上皮細胞への分化が誘導された（図12）。XAV939の除去により、コロニーの端に分化した細胞の一貫した出現が生じた（図12）。【０１１６】
次に、本発明者らは、TS細胞及びその分化した子孫の特徴づけをqPCRにより行った。特に、本発明者らは、各種マーカー（栄養膜幹細胞 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Elf5、Tcfap2c)、栄養膜巨細胞(PL-1、Hand1)、海綿状栄養膜細胞 (Mash2、Tpbp/-4311)、及びラビリンス栄養膜 (Esx1、Gcm1、Dlx3)）の発現を解析した。FGF2又はアクチビンAの除去により、Tcfap2cを除くTS細胞マーカー遺伝子の発現の急速な下方制御（図13、14）、及びラビリンス栄養膜マーカーであるGcm1を除く、全ての栄養膜細胞系列マーカーの急速な上方制御が生じた（図14、17）。XAV939の不在により、Cdx2及びTcfap2cの発現レベルにほとんど影響はなかったが、4日後において、この化合物の除去により、Eomes、Sox2、Esrrb、及びElf5の発現の抑制（図15）；Mash2、Dlx3、及びGcm1の上方制御；及びPL-1及びTpbp/4311の下方制御（図18）が生じた。【０１１７】
（Y27632の必要性）
Y27632の必要性について検証するため、Y27632のみを培養から除き、その影響を調べた。Y27632の除去から24時間後において、FGF2、アクチビンA、又はXAV939を除いた時とは対照的に、約60％の細胞がポリカスパーゼ陽性アポトーシス細胞であり、非常に少数の細胞が生存していた（図19、20）。また、本発明者らは、Y27632除去後においてもTS細胞の生存を維持できる細胞外マトリクスを検索した。本発明者らは、TS細胞がY27632不在下で、マトリゲルコートしたディッシュ上で、少なくとも20継代維持できることを見出した。これらの細胞は、コンパクトでドーム形状をしたコロニー形態を呈した（図21）。【０１１８】
（キメラマウスにおける胎盤へ寄与する能力）
TS細胞が胎盤へ寄与する能力を解析するため、これらの細胞をC57BL/6 胚盤胞胚(n=100)へ注入した。ドナーTS細胞の可視化のため、注入した細胞は、最初に、レンチウイルス感染によりCAG-EGFPにより標識された(Okada et al.、2007)。ドナーTS細胞は、E14.5のみにおいて、胎盤の胎仔部位へ寄与した(6/69、8.7%)(図22)。TS細胞は全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）へ分化した（図23）。母体の脱落膜又は胚体外中胚葉絨毛膜中には、TE由来細胞はなかった。【０１１９】
過去の検討では、従来のTS細胞は、初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）のフィーダー層上で、FGF4、ヘパリン、血清、及び馴化培地の存在下で樹立され維持されてきた。この方法は、固い上皮様形態のコロニーの継代を可能にする。この系においては、FGF4、ヘパリン、又はMEFの除去によって、増殖の急速な低下、及びその後の巨細胞様形質を有する細胞への分化を生じる(Tanaka、1998)。この細胞株の継続的な維持のためには、線維芽細胞馴化培地をも要する(Tanaka、1998)。最適条件下でさえ、継代後のコロニーの端にいくつかの巨細胞が常に現れることから、小さいパーセントの細胞が分化していることが示唆される(Tanaka、1998)。一方、新たなTS細胞は、FGF4不在化で、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含有する培地中で樹立し、維持することができる。この条件は、典型的なTS細胞様上皮様形態及び幹細胞性を有するコロニーの継代を可能にした。50 ng/ml FGF4、20 ng/ml アクチビンA、10 nM XAV939、及び5 μM Y27632を含有するCDMは、TS細胞株を生じさせることはできなかった（表1）。【０１２０】
従来のTS細胞培養条件（即ち、未定義の血清因子及びフィーダー細胞を含有する）からFGF4を除くと、その後、巨細胞様形質を有する細胞への分化が生じる(Tanaka、1998)。対照的に、CDM/FAXYからFGF2又はアクチビンAを除くと、増殖が急速に減少し、その後、全ての栄養膜細胞系列の細胞（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）への分化を生じた(図12、13、14、16、17)。この偏りのない分化能力は、新たなTS細胞がインビトロにおいて実質的に未分化状態を維持していることを示唆する。XAV939の除去により、ゆっくりとした分化、いくつかのTS細胞マーカー遺伝子の下方制御、及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化が生じた(図12、15、18)。これらの結果は、Wntシグナル阻害剤がTS細胞の未分化状態を安定的に維持するために必要であり、この化合物がFGF2及びアクチビンAとは異なる伝達経路を介して作用することを示す。TS細胞生存へのY27632の要求性は、マトリゲルでコートしたディッシュ上で細胞を培養することで回避することができたが、結果として得られた細胞は、典型的なTS細胞のコロニーとは異なるコロニー形態を有していた（図21）。【０１２１】
いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進される(Ying et al.、2008; Li et al.、2009; Nichols et al.、2009)。対照的に、本発明者らの結果は、FGF2によるFgfシグナルの活性化、アクチビンAによるアクチビンシグナルの活性化、及びXAV939によるWntシグナルの抑制によって、化学的に定義された条件中でTS細胞の誘導及び維持を可能とすることを示した。従って、ES細胞とTS細胞は、ICM及びTEの初期胚特性をそれぞれ反映するが、異なるシグナル条件下で誘導及び維持される。【０１２２】
CDM/FAXYを用いて樹立されたTS細胞は、全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜 巨細胞 (gi)、海綿状栄養膜細胞 (sp)、及びラビリンス栄養膜 (la)）へ寄与することができた（図22、23）。この偏りのない分化能力は、キメラにおけるインビボでの栄養膜系列特異的寄与とともに、TS細胞が実質的に未分化な状態を維持していることを示唆する。【０１２３】
本発明者らの結果は、新たに樹立されたTS細胞が、未分化栄養膜幹細胞の全ての基準（自己複製能力、マーカー遺伝子発現、全ての栄養膜サブタイプへインビトロにおいて分化する能力、及びキメラにおいて胎盤へ寄与する能力）を満たすことを示す。TS細胞を維持するシグナル経路を定義したことは、初期栄養膜発生に鍵となる洞察を与え、TEとICMとの間の分子相互作用を明らかにし、TS及びES細胞を用いた技術の発展を加速させる。【０１２４】
［実施例２］
TS細胞の維持培養を、以下の２条件で行い、その形態を比較した。
１．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF4（50 ng/ml）及びヘパリン（10 ng/ml）を添加した、従来の培地（Manipulating mouse embryo third edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 8th chapter, protocol 8-9）。
２．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF2（50ng/ml）、ヘパリン（10 ng/ml）、アクチビンA（20 ng/ml）、XAV939（20 μM）を添加した培地。【０１２５】
結果を図24に示す。FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した条件（図24、左）においては、未分化なTS細胞の特徴である、滑らかな辺縁を持つコロニーが多く形成され、巨細胞等の分化した細胞の出現が抑制された。この結果から、これらの因子の添加は、血清を含むMEF条件培地中においてもTS細胞の未分化性を維持し、培養することに有効であることが示された。【０１２６】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。【０１２７】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１２８】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明によれば、化学的に定義された無フィーダー、無血清の培養条件下において、未分化なTS細胞を樹立し、安定的に維持培養することができる。本発明は再生医療の技術革新に貢献する。【０１３０】
本出願は日本で出願された特願２０１４−０３２３１４（出願日：２０１４年２月２１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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