(57)【要約】  被験者由来の生物学的試料中のリトコール酸（以下、ＬＣＡと略称する）の濃度を指標にして肝障害タイプを判別する検査方法を提供する。すなわち、被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡの濃度の測定を行い、測定されたＬＣＡ濃度を指標にして、肝細胞障害型、胆汁鬱滞型、およびそれらの混合型の肝障害のタイプを判別する検査方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生物学的試料中のリトコール酸（以下、ＬＣＡと略称する）濃度を測定することを含む、ＬＣＡ濃度を指標とする肝障害タイプを判別する検査方法。
【請求項２】
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項６】
ウルソデオキシコール酸（以下、ＵＤＣＡと略称する）およびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定されたＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
【請求項７】
デオキシコール酸（以下、ＤＣＡと略称する）、血清硫酸抱合型胆汁酸（ｓｅｒｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ；以下、ＳＳＢＡと略称する）、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸（以下、ＨＡと略称する）、および活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；以下、ＲＯＳと略称する）のいずれか１以上の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法：
（４）ＤＣＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカット
オフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカ
ットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラ
ーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ
値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカット
オフ値以上である。
【請求項８】
ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＩＶ型コラーゲン濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項９】
予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値が、ＬＣＡ濃度の受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ；以下、ＲＯＣ曲線と称する）から算出されるものである、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１０】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項３、５、６、または８に記載の検査方法。
【請求項１１】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項４、５、６、または８に記載の検査方法。
【請求項１２】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＵＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、および予め定めた肝細胞障害型の肝疾患に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項６に記載の検査方法。
【請求項１３】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＳＳＢＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＨＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＲＯＳ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項７に記載の検査方法。
【請求項１４】
前記生物学的試料が血液試料である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料が血清試料である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝障害の検査方法、詳しくは肝障害のタイプを判別する検査方法に関する。より詳しくは、本発明は、被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡの濃度を測定し、測定されたＬＣＡ濃度を指標にして肝障害タイプを判別する検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は消化管に付属する腺組織であり、胆汁の生成分泌、解毒作用、糖質代謝、タンパク質代謝、血液凝固因子の生成、ホルモン調節作用、並びに脂肪、グリコーゲン、タンパク質、およびビタミン等の各種生体構成要素の貯蔵等、生体にとって重要な数々の機能を有している。そのため、これら機能が、ウイルス感染、薬物や毒物、アルコールの過剰摂取等の原因により急性的あるいは慢性的な障害を受けると、肝臓機能の恒常性の保持が崩され、重大な健康障害が生じる。人間ドック等において発見される疾病のうち肝機能障害が占める割合は高く、日本人成人の約３０％が肝機能障害を持つと言われている。【０００３】
肝疾患に含まれる疾病は、その原因や臨床症候による分類がなされている。例えば、その原因により、ウイルス性肝炎、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、自己免疫性肝障害、代謝障害性肝障害等に分類することができる。また、その臨床症候別に、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型に分類することができる。肝細胞障害は、ウイルス性肝炎、中毒性肝障害、脂肪肝、肝硬変等でみられる。肝細胞障害は、肝細胞の壊死、脂肪化、多核細胞化、核の空胞変性化等により生じる。肝細胞は、肝実質細胞とも言い、肝臓を構成する細胞の１つであり、肝臓のほとんど大部分を占める。肝細胞は、胆汁を分泌する外分泌細胞であると同時に、血漿タンパク質を頂端膜側に分泌し、グリコーゲンを蓄えて血糖を調節する内分泌細胞でもある。そのため、肝細胞が障害を受けると肝機能の著しい低下が引き起こされる。胆汁鬱滞は、肝臓からの胆汁の排泄が何らかの原因により妨げられることにより生じ、その結果、肝内または肝外の胆道系の一部あるいは全般にわたって胆汁の流出異常をきたし、肝臓および血中に胆汁が貯留して黄疸や肝炎等の諸症状を引き起こす。【０００４】
現在、肝疾患の診断および治療は、患者の症状および血清生化学パラメーターの値を指標にして、医師が経験に基づいて肝障害のタイプを診断し治療を開始するといった手法で進められている（非特許文献１）。生化学パラメーターとしては、肝細胞の障害により肝細胞から逸脱する酵素、具体的にはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＳＴと略称する；グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）ともいう）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＬＴと略称する；グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）ともいう）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、γ−ＧＴＰと略称する）、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する）等が用いられている。【０００５】
また、一般的に非臨床ならびに臨床においては、総胆汁酸（ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ；以下、ＴＢＡと略称する）の測定が行われている。胆汁酸は、哺乳類の胆汁に広範に認められるステロイド誘導体でコラン酸骨格を持つ化合物の総称であり、脂肪の消化吸収に重要な役割を果たす胆汁の主要な成分である。胆汁酸は、肝臓の肝細胞でコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）代謝により生成され（図１）、グリシンやタウリン（アミノ酸エチルスルホン酸）等と抱合した後、胆汁として分泌される。胆汁酸は、一次胆汁酸と二次胆汁酸とに大別される。一次胆汁酸は、肝臓で合成される胆汁酸であり、コール酸（以下、ＣＡと略称することがある）、ケノデオキシコール酸（以下、ＣＤＣＡと略称することがある）、およびＣＤＣＡと異性体の関係にあるウルソデオキシコール酸（以下、ＵＤＣＡと略称することがある）等を例示できる。二次胆汁酸は、一次胆汁酸が胆管経由で腸管に排出されて腸内細菌による脱水酸化反応、脱水素反応、水素化反応、および脱抱合反応により生成される胆汁酸であり、デオキシコール酸（以下、ＤＣＡと略称することがある）やＬＣＡ等を例示できる。これら例示した５種類の胆汁酸分画には、それぞれ、遊離型、グリシン抱合型、タウリン抱合型の３型が存在する。その他、一部の胆汁酸分画には、硫酸抱合型若しくはグルクロン酸抱合型が存在する。ヒトを含め多くの動物種では、一次胆汁酸として、コラン酸骨格の３、７、１２位に水酸基を有したＣＡおよびＣＤＣＡが生成される。一方、一部の動物はその種に特有の胆汁酸を生成する。マウスではα−ムリコール酸（以下、αＭＣＡと略称することがある）やβ−ムリコール酸（以下、βＭＣＡと略称することがある）、並びにブタではヒオコール酸（以下、ＨＣＡと略称することがある）等、ヒトでは極少ない各動物種に特徴的な胆汁酸が見られる。αＭＣＡおよびβＭＣＡは一次胆汁酸であり、タウリン抱合型も知られている。ＨＣＡは一次胆汁酸であり、腸内においてその７α−脱水酸化によりヒオデオキシコール酸（以下、ＨＤＣＡ）が生成される。これら胆汁酸分画にもグリシン抱合型やタウリン抱合型が存在する。【０００６】
肝疾患の治療において肝障害の各タイプに適した治療を選択するためには、そのタイプの判別が重要である。従来、生化学パラメーターを基準に肝障害のタイプが判断されてきた。例えば、肝細胞障害型ではＡＬＴやＡＳＴの上昇を、また、胆汁鬱滞型ではＡＬＰやγ−ＧＴＰの上昇を一つの指標として、肝障害のタイプが判定されている。しかしながら、生化学パラメーターを基準とする判定方法では、肝障害のタイプの判断を誤る場合もあった。そのため、胆汁酸を構成する多くの分画の血清中の各濃度を測定し、その結果に基づいて肝障害のタイプを判別し、更に治療方針を決定する試みが行われてきている。【０００７】
今までに、肝障害の原因別分類と胆汁酸分画の濃度との間に種々の関係が報告されている（非特許文献２〜６）が、一定の見解は得られておらず、臨床応用には至っていない。【０００８】
また、肝障害の臨床症候別分類と胆汁酸分画の濃度との関連についてもいくつか報告されている（非特許文献６〜８）が、原因別分類と同様に、複数の結果が得られており、一定の見解は示されていない。一方、薬剤性肝障害における臨床症候別分類は、胆汁酸分画ではなく生化学パラメーターでの評価法が提唱されており（非特許文献９）、これに基づいて日本肝臓学会でも薬物性肝障害のスコアリングを提唱している（非特許文献１０）。また、本発明者らは、ラットへの薬剤投与において生じた肝疾患と、胆管結紮処理や１−ナフチル  イソチオシアネート（ＡＮＩＴ）投与等による代表的な胆汁鬱滞モデルとを比較し、胆汁酸分画濃度の測定により肝疾患の障害のタイプを判別できる可能性があることを報告している（非特許文献１１）。しかしながら、臨床において、毛細胆管レベルの肝内胆汁鬱滞を早期に診断する明確なバイオマーカーは現状では報告されておらず、治療方針の決定が難しい場合が少なくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】重篤副作用疾患別対応マニュアル薬物性肝障害:10-30（平成20年4月、厚生労働省）
【非特許文献２】IA Bouchier, CR Pennington, Serumbile acids in hepatobiliary disease. Gut. Jun;19(6):492-6 (1978).
【非特許文献３】Fischer, S, Beuers, U, Spengler,U, Zwiebel, FM, Koebe, H-G, Hepatic levels of bile acids in end-stage chroniccholestatic liver disease. Clinica Chimica Acta. 251(2):173-86 (1993).
【非特許文献４】Williams CN, Bile-acid metabolismand the liver. Clin Biochem. 9(3):149-52 (1976).
【非特許文献５】Berr F, Pratschke E, Fischer S,Paumgartner G. Disorders of bile acid metabolism in cholesterol gallstonedisease. J Clin Invest. 90(3):859-68 (1992).
【非特許文献６】Ostrow JD, Metabolism of bilesalts in cholestasis in humans. In: Tavoloni, N, Berk, PD (Eds), Hepatictransport and bile secretion. Raven, New  York, pp.673-712 (1993).
【非特許文献７】Burkard I, von Eckardstein A,Rentsch KM, Differentiated quantification of human bile acids in serum byhigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 826 (1-2):147-59 (2005).
【非特許文献８】Palmeira CM, Rolo AP,Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids. Toxicology. 203(1-3):1-15(2004).
【非特許文献９】Danan G, Benichou C. Causalityassessment of adverse reactions to drugs--I. A novel method based on theconclusions of international consensus meetings: application to drug-inducedliver injuries. J Clin Epidemiol. 46(11):1323-30 (1993).
【非特許文献１０】滝川 一、DDW-J 2004 ワークショップ薬物性肝障害診断基準の提案肝臓 46(2):85-90 (2005)
【非特許文献１１】桝渕 紀子（Noriko Masubuchi）ら、日本薬物動態学会第24回年会、第305頁、第2-P-43番、2009年。
【非特許文献１２】A. Stiehl, Bile Salt Sulphatesin Cholestasis. European Journal of Clinical Investigation. 4 (1):59-63 (1974).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
肝障害は、臨床症候別に、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型に分類することができ、各タイプに適した治療を選択するためにそのタイプの判別は重要であるにも関わらず、これらのタイプを判定できる技術は確立していない。そのため、現状では治療を進めながら医師らの経験に基づく総合的な判断により、投薬等の治療が施されている。従来、生化学パラメーターを基準に肝障害のタイプを判断する場合、肝細胞障害型ではＡＬＴやＡＳＴの上昇を、また、胆汁鬱滞型ではＡＬＰやγ−ＧＴＰの上昇を一つの指標としてきたが、これだけでは判断を誤ることがある。したがって、肝疾患発症の初期段階で肝障害のタイプをより明確に判別できるマーカーがあれば、治療方針の決定が早期に可能になる。【００１１】
本発明の課題は、肝障害タイプの早期診断を可能にするために有用なバイオマーカーを見出し、該バイオマーカーを指標にした肝障害タイプの判別方法または肝障害タイプの判別を補助する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、臨床血清検体を使用して２４種の胆汁酸分画、肝線維化マーカー、酸化ストレスマーカーの濃度を測定し、得られた測定データの多変量解析により、リトコール酸の濃度が、肝障害タイプと関連することを見出した。具体的には、リトコール酸の濃度は、肝障害患者集団において、肝細胞障害型の肝障害では高い傾向を示し、逆に胆汁鬱滞型の肝障害では低い傾向を示した。更に、肝細胞障害型の肝障害では、ウルソデオキシコール酸の濃度が低い傾向を示し、また肝線維化マーカーであるＩＶ型コラーゲンの濃度は高い傾向が認められた。一方、胆汁鬱滞型の肝障害では、デオキシコール酸の濃度は低い傾向を示し、血清硫酸抱合型胆汁酸（ｓｅｒｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ；以下、ＳＳＢＡと略称する）、肝線維化マーカーであるＩＶ型コラーゲンおよびヒアルロン酸（以下、ＨＡと略称する）、並びに酸化ストレスマーカーである活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；以下、ＲＯＳと略称する）は高い傾向を示した。また、各種胆汁酸のタウリン抱合体およびグリシン抱合体も、その遊離型分画の濃度と同様の傾向を示した。肝障害のタイプによって特徴的な傾向を示すこれら胆汁酸分画を含むバイオマーカーを利用することにより、肝障害のタイプを判別することができることを明らかにし、本発明を達成した。【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡ濃度を測定することを含む、ＬＣＡ濃度を指標とする肝障害タイプを判別する検査方法。
２．測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
３．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
４．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
５．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
６．ＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定されたＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
７．ＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳのいずれか１以上の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法：
（４）ＤＣＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカット
オフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカ
ットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラ
ーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ
値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカット
オフ値以上である。
８．ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＩＶ型コラーゲン濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
９．予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値が、ＬＣＡ濃度の受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ；以下、ＲＯＣ曲線と称する）から算出されるものである、前記２．の検査方法。
１０．予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記３．、５．、６．、または８．に記載の検査方法。
１１．予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記４．、５．、６．、または８．に記載の検査方法。
１２．予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＵＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、および予め定めた肝細胞障害型の肝疾患に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記６．に記載の検査方法。
１３．予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＳＳＢＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＨＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＲＯＳ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記７．に記載の検査方法。
１４．前記生物学的試料が血液試料である、前記１．から１３．のいずれか１つに記載の検査方法。
１５．前記生物学的試料が血清試料である、前記１．から１４．のいずれか１つに記載の検査方法。
１６．前記１．から１５．のいずれか１つに記載の検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡの濃度の測定を行い、測定されたＬＣＡ濃度を指標にして肝障害タイプを判別する検査方法を提供することができる。【００１５】
本発明に係る検査方法は、単独で、または従来実施されてきた生化学パラメーターの測定と併せて使用することにより、臨床症候による肝障害タイプ、具体的には肝細胞障害型、胆汁鬱滞型、およびそれらの混合型の早期診断および治療方針の早期決定を可能とする。本発明に係る検査方法は、肝疾患の検査に使用することができ、肝疾患の診断および治療を補助する方法として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】胆汁酸の代謝経路を示す図である。
【図２】ＬＣＡ濃度のカットオフ値による肝障害タイプの判別方法を説明する図である。
【図３】肝細胞障害型の肝障害では、胆汁酸分画の中でＬＣＡの濃度は有意に上昇傾向を示し、ＵＤＣＡの濃度は有意に低下傾向を示したことを説明する模式図である。ＣＡやＵＤＣＡと異性体の関係にあるＣＤＣＡの濃度は有意差はないものの低下傾向を示し、ＤＣＡの濃度は有意差はないものの上昇傾向を示した。
【図４】胆汁鬱滞型の肝障害では、胆汁酸分画の中でＬＣＡおよびＤＣＡの濃度はいずれも有意に上昇傾向を示したことを説明する模式図である。ＣＤＣＡ、ＵＤＣＡ、およびＣＡの濃度は有意差はないもののいずれも低下傾向を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で使用する胆汁酸分画の各略称を表１に示す。本明細書において、胆汁酸分画の名称を表１に示した略称で記載することがある。
【００１８】
【表１】
2015019976.tif 000002
【００１９】
本発明は、肝障害の検査方法、より詳しくは肝障害タイプを判別する検査方法に関する。本発明に係る検査方法は、被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡの濃度を測定し、測定されたＬＣＡ濃度を指標にして肝障害タイプを判別するものである。ＬＣＡ濃度を指標にして肝障害タイプを判別することは、測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することにより実施できる。本発明に係る検査方法として、被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡ濃度を測定すること、および、測定されたＬＣＡ濃度を予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、肝障害タイプを判別する検査方法を例示できる。
【００２０】
本発明に係る検査方法において、ＬＣＡ濃度に加えて、ＬＣＡとは別のバイオマーカーであって肝障害のタイプに関連するバイオマーカーの濃度を測定してもよく、ＬＣＡ濃度および該バイオマーカーの濃度を指標にして、肝障害のタイプを判別することができる。
【００２１】
ＬＣＡとは別のバイオマーカーであって肝障害のタイプに関連するバイオマーカーとして、肝細胞障害型の肝障害に関連するＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンを例示できる。また、胆汁鬱滞型の肝障害に関連するバイオマーカーとして、ＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳを例示できる。
【００２２】
本発明に係る検査方法は、単独で実施することもできるし、あるいは従来実施されてきた生化学パラメーターの測定等の種々の検査方法と併せて実施することができる。
【００２３】
本明細書において「肝障害のタイプ」とは、肝障害の症候によって分類されるタイプを意味する。肝障害の症候とは、肝障害の患者が示す様々な訴えや診察所見をいう。具体的には「肝障害のタイプ」として、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型を挙げることができる。肝細胞障害型では、肝臓を構成する細胞の１つであって肝臓のほとんど大部分を占める肝実質細胞が障害を受けて、肝機能の著しい低下が引き起こされる。胆汁鬱滞型は、肝臓からの胆汁の排泄が何らかの原因により妨げられることにより生じ、その結果、肝内または肝外の胆道系の一部あるいは全般にわたって胆汁の流出異常をきたし、肝臓および血中に胆汁が貯留して黄疸や肝炎等の諸症状を引き起こす。
【００２４】
本発明に係る検査方法では、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型を判別することができ、また、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型の両方に分類されるタイプ、すなわち混合型を判別することができる。
【００２５】
本発明に係る検査方法の対象となる「被験者」は、肝機能障害があると診断された者、または／および何らかの検査結果により肝機能障害があると疑われる者を意味し、ウイルス性肝炎、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、自己免疫性肝障害、代謝障害性肝障害等に分類される肝疾患を有する、または／および該肝疾患を有すると疑われる者を包含する。好ましくは肝機能障害があると診断された者である。
【００２６】
本明細書において「生物学的試料」は、胆汁酸分画が含まれているものであれば特に限定されず、胆汁酸分画に加えて、肝繊維化マーカーおよび／または酸化ストレスマーカーが含まれ得るものを好ましくは挙げることができる。具体的には、被験者から単離された血液、該血液から調製された血清や血漿、好ましくは血清を例示できる。
【００２７】
本明細書において「肝障害治療剤」、「肝障害の治療方法」とは、例えば、重篤副作用疾患別対応マニュアル薬物性肝障害に記載されている肝障害治療剤および肝障害の治療方法、各医療施設において行われている投薬方法および治療方法等が挙げられる。肝細胞障害型の場合、例えば、グリチルリチン製剤で抗アレルギー作用のある強力ネオミノファーゲンシー製剤の静注や、肝細胞膜保護作用を有するＵＤＣＡの経口投与を行う。肝細胞障害が重症化し、劇症肝炎に陥った場合、例えば、中心静脈栄養法（ＩＶＨ）や人工肝補助療法を用いる。胆汁鬱滞型の場合、例えば、脂溶性ビタミンの不足を補うため、ビタミンＡやビタミンＫを投与し、次に薬物治療としてＵＤＣＡ、プレドニゾロン、フェノバルビタール、タウリン、コレスチミドなどを使用する。
【００２８】
ＬＣＡは、胆汁酸の一種である。胆汁酸は、肝臓の肝細胞でコレステロール代謝により生成され、グリシンやタウリン（アミノ酸エチルスルホン酸）等と抱合した後、胆汁として分泌され、脂肪の消化吸収に重要な役割を果たす。ＬＣＡは、肝臓で合成された一次胆汁酸の一つであるＣＤＣＡが、胆管経由で腸管に排出され、７−αデヒドロキシラーゼによる脱水酸化反応を受けて生成された二次胆汁酸である。
【００２９】
肝障害患者集団において、肝細胞障害型の肝障害患者と胆汁鬱滞型の肝障害患者との間で血清中のＬＣＡ濃度の比較を行ったところ、ＬＣＡの濃度は、肝細胞障害型の肝障害患者では高い傾向を示し、逆に胆汁鬱滞型の肝障害患者では低い傾向を示した。更に、胆汁鬱滞型の肝障害では、血清中のＤＣＡの濃度は低い傾向を示し、ＳＳＢＡの濃度は高い傾向を示した。一方、肝細胞障害型の肝障害では、血清中のＵＤＣＡの濃度は低い傾向を示した。また、各種胆汁酸のタウリン抱合体およびグリシン抱合体も、その遊離型分画の濃度と同様の傾向を示した。胆汁鬱滞型の肝障害では、胆汁鬱滞によりＤＣＡやＬＣＡの生成が抑えられ、これに伴ってＣＡ、ＣＤＣＡ、およびＵＤＣＡの濃度は上昇し、これとは逆に肝細胞障害型の肝障害では、脂溶性の高いＤＣＡやＬＣＡの生成が亢進し、ＣＡ、ＣＤＣＡおよびＵＤＣＡの生成が抑えられると考えることができる。
【００３０】
また、ＬＣＡ以外にも、胆汁鬱滞型の肝障害では、肝線維化マーカーであるＩＶ型コラーゲンおよびＨＡ、並びに酸化ストレスマーカーであるＲＯＳの血清中の濃度が高い傾向を示した。一方、肝細胞障害型の肝障害では、ＩＶ型コラーゲンの血清中の濃度が高い傾向を示した。
【００３１】
肝障害のタイプの判別は、各測定項目について、予め設定されたカットオフ値と比較することにより実施できる。「カットオフ値」とは、陽性と陰性の範囲を区別する値をいう。各測定項目のカットオフ値は、肝障害のタイプにより個別に設定することができる。カットオフ値の設定は、自体公知の方法によって実施できる。例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析により、カットオフ値の設定を行うことができる。ＲＯＣ解析では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を縦軸に、ＦＰＦ（Ｆａｌｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ、偽陽性率：１−特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線では、全く診断能のない検査は、対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、対角線が左上方に弧を描くような曲線となり、診断能１００％の検査は、左辺−上辺上を通る曲線となる。カットオフ値の設定としては、例えば、感度と特異度の優れた独立変数のＲＯＣ曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法がある。また、ＲＯＣ曲線における曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣと略称される）が０．５００となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法、つまり、（感度＋特異度−１）を計算して、その最大値となるポイントであるヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値に設定することもできる。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。更に、別の方法として、各測定項目と肝障害のタイプの頻度との関係から、カットオフ値を定量的に設定することも可能である。
【００３２】
本発明に係る検査方法による肝障害のタイプの判別を、図２を用いて説明する。ＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定する。ＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定する。また、ＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えるものであって、かつ胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型の両方のタイプ、すなわち混合型であると判定する。更に、より詳しく判別するならば、ＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えるものであるとき、肝障害のタイプは混合型を含まない肝細胞障害型であると判定する。また、ＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは混合型を含まない胆汁鬱滞型であると判定する。
【００３３】
本発明に係る検査方法において、ＬＣＡの濃度の測定に加えて、ＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定してもよく、測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度を予め設定されたそれぞれのカットオフ値と比較し、測定されたＬＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することができる：（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、および（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
【００３４】
本発明に係る検査方法において、ＬＣＡの濃度の測定に加えて、ＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳのいずれか１以上の濃度を測定してもよく、各測定値を予め設定されたそれぞれのカットオフ値と比較し、測定されたＬＣＡ濃度が予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することができる：（４）ＤＣＡ濃度が予め設定されたＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定されたＳＳＢＡ濃度のカットオフ値以上である、（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定されたＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、（７）ＨＡ濃度が予め設定されたＨＡ濃度のカットオフ値以上である、および（８）ＲＯＳ濃度が予め設定されたＲＯＳ濃度のカットオフ値以上である。
【００３５】
本発明に係る検査方法においてはまた、ＬＣＡの濃度の測定に加えて、ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定し、各測定値を予め設定されたそれぞれのカットオフ値と比較し、測定されたＬＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えるものであり、かつ胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が予め設定されたＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することができる。
【００３６】
本発明に係る検査方法において使用する各測定項目のカットオフ値の具体例を表２−１および表２−２に示す。表２−１は肝細胞障害型の肝障害を識別するバイオマーカーのカットオフ値の具体例である。表２−２は胆汁鬱滞型の肝障害を識別するバイオマーカーのカットオフ値の具体例である。例示したカットオフ値は、後述する実施例において、肝障害治療薬の適用がない肝障害患者を対象にし、該肝障害患者から採取された血清試料を生物学的試料として用いて各バイオマーカーの濃度を測定し、測定された各バイオマーカー濃度について、肝障害患者集団と肝細胞障害型肝障害患者または胆汁鬱滞型肝障害患者との比較を、ＲＯＣ解析を使用して行い、ヨーデン指標を求めることにより予め定めたカットオフ値である。カットオフ値は、測定施設や測定する母集団ごとに設定することも可能である。上記同様の試料を対象にして目的のバイオマーカー濃度の測定データを蓄積し、上記同様の解析手法で解析を行うことにより、その設定を適宜変更することもできる。また、血清試料とは別の試料を使用してバイオマーカーの濃度の測定を行うときは、該使用する試料を対象にした各バイオマーカー濃度の測定データについて、上記同様の解析手法で解析を行うことにより、カットオフ値を適宜設定できる。
【００３７】
【表２−１】
2015019976.tif 000003
【００３８】
【表２−２】
2015019976.tif 000004
【００３９】
本発明に係る検査方法を、上記表２−１および表２−２に例示した具体的なカットオフ値を使用して実施する場合の具体例を説明する。
【００４０】
本発明に係る検査方法の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定する工程を含み、
ここで、該カットオフ値が０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４１】
また、別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定する工程を含み、
ここで該カットオフ値が０．０２４１ｎｍｏｌ／Ｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４２】
更に別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定する工程を含み、
ここで、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌであり、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０２４１ｎｍｏｌ／Ｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４３】
また、別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、
更に、ＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定する工程、
測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定する工程：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定されたＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
を含み、
ここで、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌであり、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値が０．９０３ｎｍｏｌ／Ｌであり、かつ予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が１２８ｎｇ／ｍｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４４】
また、別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、
更に、ＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳのいずれか１以上の濃度を測定する工程、
前記更なる測定により得られた各測定値を予め設定されたそれぞれのカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定する工程：
（４）ＤＣＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値以上である。
を含み、
ここで、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０２４１ｎｍｏｌ／Ｌであり、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値が０．１７５ｎｍｏｌ／Ｌであり、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値が２１．１ｎｍｏｌ／Ｌであり、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が２８８ｎｇ／ｍｌであり、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値が４７ｎｇ／ｍｌであり、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が２１６Ｕである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４５】
また、別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、
更に、該血清試料中のＩＶ型コラーゲンの濃度を測定する工程、
ＩＶ型コラーゲンの測定値を予め設定されたＩＶ型コラーゲンのカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定する工程
を含み、
ここで、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値がそれぞれ０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌおよび０．０２４１ｎｍｏｌ／Ｌであり、かつ、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値が２８８ｎｇ／ｍｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【００４６】
胆汁酸分画の濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法やガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法を挙げることができる。また、胆汁酸や硫酸抱合型胆汁酸の濃度は、市販の胆汁酸測定キットを使用してその測定を実施できる。例えば、硫酸抱合型胆汁酸の濃度の測定はユーバスティック・オート、胆汁酸（ＵＳＢＡ）キット（（株）エル・ピーエス）を用いて実施できる。測定方法はこれらに限定されず、胆汁酸やその分画の測定が可能であればいずれの方法も使用できる。
【００４７】
ＩＶ型コラーゲンの濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、市販のＩＶ型コラーゲン測定用試薬キットを使用して、ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定することができる。かかる方法として、ＩＶ型コラーゲンに対する抗体を使用した酵素免疫法（ＥＩＡ）や酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）を例示できる。具体的には、生物学的試料に抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体を添加してＩＶ型コラーゲン・７Ｓ−抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体複合体（複合体１）を形成させ、その後、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）等の放射性同位体で標識したトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ（標識抗原）を加え、当該試料中のＩＶ型コラーゲン・７Ｓと結合し得なかった抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体と複合体（複合体２）を形成させ、更に抗ウサギγ−グロブリンヤギ血清（ヤギ抗体）を加えて、抗ウサギγ−グロブリンヤギ血清（ヤギ抗体）を加えると、ヤギ抗体は複合体２と反応し、標識抗原−抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体−ヤギ抗体複合体を形成させ、生じた沈澱を回収して沈殿物の放射活性を測定することにより、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ濃度を測定することができる。
【００４８】
ＨＡの濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、市販のＨＡ測定用試薬キットを使用して、ＨＡの濃度を測定することができる。かかる方法として、ＨＡに対する抗体を使用した酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）を例示できる。
【００４９】
ＲＯＳの濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、市販のＲＯＳ測定用試薬キットを使用して、ＲＯＳの濃度を測定することができる。具体的には、鉄等の金属イオンを触媒とするフェントン反応を利用し、過酸化物（ＲＯＯＨ）からフリーラジカル（ＲＯＯ・やＲＯ・）を発生させ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレン−ジアミン硫酸塩（ＤＥＰＰＤと略称する）と反応させ、該反応により生成したＤＥＰＰＤ・＋を波長５０５ｎｍの吸収を測定することによりフリーラジカルを生成する物質の総量を測定することができる。
【００５０】
本発明には、本発明に係る検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法が包含される。
【００５１】
また、本発明には、本発明に係る検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた治療を行う治療方法が包含される。
【００５２】
肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤や肝障害の治療方法としては、例えば、重篤副作用疾患別対応マニュアル薬物性肝障害に記載されている肝障害治療剤および肝障害の治療方法、各医療施設において行われている投薬方法および治療方法等が挙げられる。肝細胞障害型の場合、例えば、グリチルリチン製剤で抗アレルギー作用のある強力ネオミノファーゲンシー製剤の静注や、ＵＤＣＡの経口投与を行う。肝細胞障害が重症化し、劇症肝炎に陥った場合、例えば、中心静脈栄養法（ＩＶＨ）や人工肝補助療法を用いる。胆汁鬱滞型の場合、例えば、脂溶性ビタミンの不足を補うため、ビタミンＡやビタミンＫを投与し、次に薬物治療としてＵＤＣＡ、プレドニゾロン、フェノバルビタール、タウリン、コレスチミドなどを使用する。
【００５３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。
【実施例１】
【００５４】
肝障害タイプの早期診断を可能にするために有用なバイオマーカーを見出すことを目的として、肝障害患者および健常ボランティアより得た血清試料を使用して、胆汁酸分画濃度、並びに酸化ストレスマーカーおよび肝線維マーカーの測定を行った。血清試料の採取および一連の実験は、試料提供者である患者および健常ボランティアの同意を得て行なったものである。【００５５】
１．対象試料
第一三共株式会社および慈恵医科大学内の倫理委員会の承認に基づき、約２年間において、ウイルス性、自己免疫性、アルコール性、遺伝性等の肝障害の疑いのある患者１５０例より血清サンプル３０４検体を採取した。また、健常者由来の血清試料をボランティアより採血して用いた。血清試料は、バイオマーカー測定まで−８０℃で保存した【００５６】
２．評価項目
各胆汁酸分画、具体的にはＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＵＤＣＡ、ＬＣＡ、１２＿ＫＬＣＡ、αＭＣＡ、βＭＣＡ、ＨＤＣＡ、ＧＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＨＣＡ、ＧＨＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴβＭＣＡ、ＴＨＣＡ、およびＴＨＤＣＡの２４種の胆汁酸分画、並びに硫酸抱合型胆汁酸ＳＳＢＡの濃度を測定した。【００５７】
また、生化学パラメーターであるＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、γ−ＧＴＰ、総ビリルビン（以下、Ｔ．ＢＩＬと略称する）、直接ビリルビン（以下、Ｄ．ＢＩＬと略称する）、ＴＢＡ、アルブミン（以下、ＡＬＢと略称する）、プロトロンビン時間（以下、ＰＴと略称する）の濃度を測定した。更に、酸化ストレスマーカーである８−ＯＨｄＧおよびＲＯＳ、並びに肝線維化マーカーであるＩＶ型コラーゲンおよびＨＡの濃度を測定した。【００５８】
３．測定方法
全２４種の胆汁酸分画は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により測定した。定量下限は、１２−ＫＬＣＡのみを０．０３ｎｍｏｌ／ｍＬとし、その他の測定対象物質を０．０１ｎｍｏｌ／ｍＬとした。定量上限は、１２−ＫＬＣＡおよびＣＡのみを１０ｎｍｏｌ／ｍＬとし、その他の測定対象物質を３０ｎｍｏｌ／ｍＬとした。内部標準（ＩＳ）にはナプタラムを用いた。カラムにはＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７ｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、移動相には０．１％ギ酸とアセトニトリルを用い、それらの比を測定時間により変化させた。イオン化法はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩと略称する）法ネガティブを、検出法は選択イオンレコーディング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ；ＳＩＲと略称する）を選択した。前処理方法は除タンパク法とした。硫酸抱合型胆汁酸濃度は３００μＬ 血清およびユーバスティック・オート、胆汁酸（ＵＳＢＡ）キット（（株）エル・ピーエス）を用いて、ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ２２５０（ＪＥＯＬ）により測定した。【００５９】
酸化ストレスマーカーである８−ＯＨｄＧおよびＲＯＳの測定は次のように実施した。８−ＯＨｄＧは日本老化制御研究所販売の試薬キットを用いて測定した。ＲＯＳは鉄等の金属イオンを触媒とするフェントン反応を利用し、過酸化物（ＲＯＯＨ）からフリーラジカル（ＲＯＯ・やＲＯ・）を発生させ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレン−ジアミン硫酸塩（ＤＥＰＰＤと略称する）と反応させた。生成したＤＥＰＰＤ・＋は、波長５０５ｎｍに吸収をもち、この吸光度を測定することによりフリーラジカルを生成する物質の総量を測定した。【００６０】
生化学パラメーターは、臨床検査において通常実施されている方法により測定した。【００６１】
肝線維化マーカーであるＩＶ型コラーゲン・７ＳおよびＨＡの測定は次のように実施した。ＩＶ型コラーゲン・７Ｓは抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体と反応し、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ−抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体複合体（複合体１）を形成する。ヨウ素１２５（１２５Ｉ）標識ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ（標識抗原）を加えると、検体中のＩＶ型コラーゲン・７Ｓと結合し得なかった抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体は標識抗原と反応し、標識抗原−抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体複合体（複合体２）を形成し、更に、抗ウサギγ−グロブリンヤギ血清（ヤギ抗体）を加えると、ヤギ抗体は複合体２と反応し、標識抗原−抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体−ヤギ抗体複合体を形成し、沈殿する。未反応の標識抗原を除去した後、沈殿物の放射能を測定し、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ濃度を求めた。ＨＡは、ＨＡ  ＥＬＩＳＡキット（コスモ・バイオ株式会社製）を用いて測定した。【００６２】
４．データ解析方法
各種バイオマーカーの変動と総合的に判断された肝障害の症候との相関を解析した。肝障害患者１５０例より得られた血清サンプル３０４検体を解析対象とし、背景情報の要約統計量を算出した。同一症例の検体間の相関は考慮せずに解析を実施した。【００６３】
肝障害の症候別タイプ識別に関連するバイオマーカーを検討するために、患者背景因子を調整因子とした多変量ロジスティック回帰モデルを用いて、バイオマーカー候補因子の総合的に判断された肝障害症候（肝細胞障害あるいは胆汁鬱滞）に対するオッズ比とその９５％信頼区間を算出した。バイオマーカー候補因子は、胆汁酸分画濃度、酸化ストレスマーカー、肝繊維化マーカーとした。患者背景因子は、性別、年齢、ＢＭＩ、飲酒、肝障害治療薬（抗ウイルス剤、肝庇護剤、胆汁酸製剤、アミノ酸製剤・低アルブミン血漿改善薬、ビタミンＫ製剤）、合併症（脂質異常症、糖尿病、閉塞性黄疸、胆石）とした。【００６４】
肝障害症候の有無は、独立な３人の評価者による判定結果に基づき、２人以上が判定した結果を採用した。集計解析単位は検体とし、同一症例の検体間の相関は考慮しないこととした。統計学的検定を行う際の有意水準は両側５％とした。【００６５】
上記バイオマーカー解析において、基準値がない指標については、健常者の測定値の９７．５％点（正規分布であれば平均＋２ＳＤに相当）を基準値として設定し、基準値を超えた値を高値、基準値以下である値を低値に区分した。【００６６】
次に、肝障害の症候に関連すると認められたバイオマーカーについて客観的な評価尺度を求めるために、肝障害治療薬の適用がない患者由来の血清試料を対象にし、各バイオマーカーの肝障害症候の有無を識別するカットオフ値を算出した。カットオフ値の算出には様々な手法があるが、肝障害症候の有無に対するＲＯＣ解析に基づき、感度と特異度の和が最大となる値とした。【００６７】
５．結果
血清サンプルを得た患者の背景情報を表３に示した。【００６８】
【表３】
2015019976.tif 000005
【００６９】
タイプ識別された肝障害の症候を規定するバイオマーカーについて、共変量調整による多変量解析を行った結果を表４および表５に示した。【００７０】
【表４】
2015019976.tif 000006
【００７１】
【表５】
2015019976.tif 000007
【００７２】
肝細胞障害型で有意に関連のあると認められた因子は、ＬＣＡ（ＯＲ＝２．０６、Ｐ＝０．０１４０）、ＵＤＣＡ（ＯＲ＝０．３１、Ｐ＝０．０１１２）およびＩＶ型コラーゲン（ＯＲ＝２．１９、Ｐ＝０．０３５７）である。ＬＣＡおよびＩＶ型コラーゲンの濃度は高い傾向を示し、ＵＤＣＡの濃度は低い傾向を示した（表４）。ＵＤＣＡと異性体の関係にあるＣＤＣＡ（ＯＲ＝０．５０、Ｐ＝０．０９５０）や同様に一次胆汁酸であるＣＡ（ＯＲ＝０．７５、Ｐ＝０．４７０２）の濃度は、関連性は弱いが低い傾向を示した（図３）。胆汁酸のタウリン抱合体およびグリシン抱合体を考慮すると、ＴＣＤＣＡ（ＯＲ＝２．３１、Ｐ＝０．０１５２）、ＧＤＣＡ（ＯＲ＝７．３４、Ｐ＝０．００１７）、ＴＤＣＡ（ＯＲ＝３．６０、Ｐ＝０．０１３１）、ＧＬＣＡ（ＯＲ＝２．１７、Ｐ＝０．０１９５）およびＴＬＣＡ（ＯＲ＝４．６８、Ｐ＝０．０００３）の濃度が有意に高く、ＧＵＤＣＡ（ＯＲ＝０．１６、Ｐ＝０．０００９）は有意に低い傾向を示した。【００７３】
一方、胆汁鬱滞型で有意に関連のあると認められた因子は、ＬＣＡ（ＯＲ＝０．２９、Ｐ＜０．０００１）、ＤＣＡ（ＯＲ＝０．２６、Ｐ＝０．００１０）、ＳＳＢＡ（ＯＲ＝５．０５、Ｐ＜０．０００１）、ＩＶ型コラーゲン（ＯＲ＝３．５４、Ｐ＝０．００１５）、ＨＡ（ＯＲ＝３．６６、Ｐ＝０．００２４）、およびＲＯＳ（ＯＲ＝２．６８、Ｐ＝０．００１０）である。ＬＣＡおよびＤＣＡの濃度は低い傾向を示し、これら以外の因子の濃度は高い傾向を示した（表４）。一方、関連は弱いが、ＣＤＣＡ（ＯＲ＝１．９８、Ｐ＝０．０９９１）、ＵＤＣＡ（ＯＲ＝１．６９、Ｐ＝０．２３５３）およびＣＡ（ＯＲ＝１．３６、Ｐ＝０．４２６９）の濃度は高い傾向が認められ、肝細胞障害型と対照的な結果が得られた（図４）。胆汁酸のタウリン抱合体およびグリシン抱合体を考慮すると、ＧＣＤＣＡ（ＯＲ＝４．２５、Ｐ＜０．０００１）、ＴＣＤＣＡ（ＯＲ＝３．３２、Ｐ＝０．０００２）、ＧＣＡ（ＯＲ＝６．１１、Ｐ＜０．０００１）、ＴＣＡ（ＯＲ＝７．５４、Ｐ＜０．０００１）、およびＴＵＤＣＡ（ＯＲ＝３．２０、Ｐ＝０．０２２１）の濃度は有意に高く、ＧＤＣＡ（ＯＲ＝０．３５、Ｐ＝０．０１８２）は低い傾向を示した。ＩＶ型コラーゲンは肝線維化の指標であるが、胆汁鬱滞型でも肝細胞障害型と同様に濃度が高い傾向が認められた。【００７４】
肝障害の症候に関連すると認められたバイオマーカーについて、肝障害治療薬の適用がない患者由来の血清試料を対象にし、肝障害のタイプの判定の基準として用いることのできるカットオフ値を算出した結果は、表２−１および表２−２に示した。表２−１は肝細胞障害型の肝障害を識別するバイオマーカーのカットオフ値である。表２−２は胆汁鬱滞型の肝障害を識別するバイオマーカーのカットオフ値である。【００７５】
上記多変量解析の結果を、肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との間で比較すると、ＬＣＡが前者は増加、後者は低下と対照的な結果が得られた。この結果から、ＬＣＡが肝障害症候の判別に有用なマーカーとなることが示唆された。肝細胞障害型では、二次胆汁酸であるＬＣＡが高値を示し、この代謝亢進に伴い、ＬＣＡの親化合物であるＣＤＣＡの異性体のＵＤＣＡが低値を示したと考えることができる。これに対し、胆汁鬱滞においては、鬱滞により一次胆汁酸のＣＤＣＡやＣＡが関連は弱いものの上昇傾向にあり、これに伴い、胆汁酸の腸管への排出が抑制されて、ＤＣＡやＬＣＡの濃度が低下したと考えることができる。また、肝細胞障害型では、ＴＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＧＬＣＡ、およびＴＬＣＡが有意に上昇し、ＧＵＤＣＡは有意に低下した。これはＬＣＡの有意な上昇や有意差はないものの上昇傾向が認められたＤＣＡの変化に伴い、その抱合体の生成も亢進したと考えることができる。ＧＵＤＣＡはＵＤＣＡの低下とともに減少傾向にあったが、ＣＤＣＡのタウリン抱合体であるＴＣＤＣＡは上昇傾向にあった。上記結果から、肝細胞障害型では一次胆汁酸から脂溶性の高い二次胆汁酸への代謝が亢進することが示唆された。胆汁鬱滞型では、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、およびＴＵＤＣＡで有意な上昇が認められ、ＧＤＣＡは低下した。このことから、胆汁鬱滞によりＣＤＣＡおよびＣＡの両抱合反応が亢進したと考えることができる。ＳＳＢＡは、胆道性疾患で上昇が報告されており（非特許文献１２）、本試験においても高値を示したが、肝細胞障害型では有意な変動は認められなかった。【００７６】
測定した肝線維化マーカーは、肝細胞障害型および胆汁鬱滞型でともに有意な上昇が認められた。測定した酸化ストレスマーカーのうち、８−ＯＨｄＧは肝細胞障害型で有意な低下傾向を示したが、健常者集団に比べてその値に大きな変化がなく、カットオフ値を超えた患者集団の例数が少ないため、肝細胞障害型との関連について明確な判断はできなかった。また、活性酸素のＲＯＳが胆汁鬱滞型で高値を示したが、肝細胞障害型では有意な変化は認められなかった。【００７７】
従来から肝疾患の検査に用いられている生化学パラメーターは、今回測定したバイオマーカーとの相関は低く、これら生化学パラメーターのみでは肝障害症候の判別を的確に行うことは困難である。【００７８】
以上の結果より、ＬＣＡの濃度は肝細胞障害型および胆汁鬱滞型のそれぞれに特有でありかつ有意な変化を示すことから、肝障害症候別タイプを判別するマーカーとして有用であることが示唆された。また、一次胆汁酸やＳＳＢＡについても、ＬＣＡの濃度による肝障害症候別タイプの判別を補完し得るマーカーとして、肝細胞障害型、胆汁鬱滞型混合型、およびこれらの混合型の判定に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
以上説明したとおり、本発明は肝障害タイプを判別する検査方法を提供するものであり、本発明により臨床症候による肝障害タイプ、具体的には肝細胞障害型、胆汁鬱滞型、およびそれらの混合型の早期診断および治療方針の早期決定が可能になる。このように、本発明は、肝疾患の検査の分野において極めて有用である。
【図２】
2015019976.tif 000008
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月28日(2016.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生物学的試料中のリトコール酸（以下、ＬＣＡと略称する）濃度を測定することを含む、ＬＣＡ濃度を指標とする肝障害タイプを判別する検査方法。
【請求項２】
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項６】
ウルソデオキシコール酸（以下、ＵＤＣＡと略称する）およびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
【請求項７】
デオキシコール酸（以下、ＤＣＡと略称する）、血清硫酸抱合型胆汁酸（ｓｅｒｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ；以下、ＳＳＢＡと略称する）、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸（以下、ＨＡと略称する）、および活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；以下、ＲＯＳと略称する）のいずれか１以上の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法：
（４）ＤＣＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値以上である。
【請求項８】
ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＩＶ型コラーゲン濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項９】
予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値が、ＬＣＡ濃度の受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ；以下、ＲＯＣ曲線と称する）から算出されるものである、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１０】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項３、５、６、または８に記載の検査方法。
【請求項１１】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項４、５、６、または８に記載の検査方法。
【請求項１２】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＵＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、および予め定めた肝細胞障害型の肝疾患に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項６に記載の検査方法。
【請求項１３】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＳＳＢＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＨＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＲＯＳ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項７に記載の検査方法。
【請求項１４】
前記生物学的試料が血液試料である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料が血清試料である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法。
【請求項１７】
被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡ濃度の測定値を用いることを含む、ＬＣＡ濃度を指標とする肝障害タイプを判別する検査方法。
【請求項１８】
予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法。
【請求項１９】
前記ＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法。
【請求項２０】
前記ＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法。
【請求項２１】
前記ＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法。
【請求項２２】
前記ＬＣＡ濃度の測定値に加えて、前記生物学的試料中のＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度の測定値を指標とすることを含み、ＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度の測定値が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法：
（１）ＵＤＣＡ濃度の測定値が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度の測定値が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度の測定値が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度の測定値が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
【請求項２３】
前記ＬＣＡ濃度の測定値に加えて、前記生物学的試料中のＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳのいずれか１以上の濃度の測定値を指標とすることを含み、ＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度の測定値が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法：
（４）ＤＣＡ濃度の測定値が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度の測定値が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度の測定値が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度の測定値が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度の測定値が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値以上である。
【請求項２４】
前記ＬＣＡ濃度の測定値に加えて、前記生物学的試料中のＩＶ型コラーゲン濃度の測定値を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度の測定値が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更にＩＶ型コラーゲンの濃度の測定値が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、請求項１７に記載の検査方法。
【請求項２５】
予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値が、ＬＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項請求項１８に記載の検査方法。
【請求項２６】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項１９、２１、２２、または２４に記載の検査方法。
【請求項２７】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項２０、２１、２２、または２４に記載の検査方法。
【請求項２８】
予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＵＤＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、および予め定めた肝細胞障害型の肝疾患に関するＩＶ型コラーゲン濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項２２に記載の検査方法。
【請求項２９】
予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＤＣＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＳＳＢＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＩＶ型コラーゲン濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＨＡ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＲＯＳ濃度の測定値のＲＯＣ曲線から算出されるものである、請求項２３に記載の検査方法。
【請求項３０】
前記生物学的試料が血液試料である、請求項１７から２９のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項３１】
前記生物学的試料が血清試料である、請求項１７から３０のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項３２】
請求項１７から３１のいずれか１項に記載の検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．被験者から採取された生物学的試料中のＬＣＡ濃度を測定することを含む、ＬＣＡ濃度を指標とする肝障害タイプを判別する検査方法。
２．測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
３．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
４．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
５．測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
６．ＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である。
７．ＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳのいずれか１以上の濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつ測定されたＤＣＡ、ＳＳＢＡ、ＩＶ型コラーゲン、ＨＡ、およびＲＯＳの濃度が、下記いずれか１または２以上であるとき、肝障害のタイプは胆汁鬱滞型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法：
（４）ＤＣＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカット
オフ値以下である、
（５）ＳＳＢＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカ
ットオフ値以上である、
（６）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラ
ーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（７）ＨＡ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ
値以上である、
（８）ＲＯＳ濃度が予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカット
オフ値以上である。
８．ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定し、ＬＣＡ濃度に加えてＩＶ型コラーゲン濃度を指標とすることを含み、
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するカットオフ値未満であり、更に測定されたＩＶ型コラーゲンの濃度が、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲンのカットオフ値以上であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定することを更に含む、前記１．に記載の検査方法。
９．予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値が、ＬＣＡ濃度の受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ；以下、ＲＯＣ曲線と称する）から算出されるものである、前記２．の検査方法。
１０．予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記３．、５．、６．、または８．に記載の検査方法。
１１．予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記４．、５．、６．、または８．に記載の検査方法。
１２．予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた肝細胞障害型の肝障害に関するＵＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、および予め定めた肝細胞障害型の肝疾患に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記６．に記載の検査方法。
１３．予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＤＣＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＳＳＢＡ濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値、予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＨＡ濃度のカットオフ値、および予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＲＯＳ濃度のカットオフ値が、それぞれ、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＬＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＤＣＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＳＳＢＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＩＶ型コラーゲン濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＨＡ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるもの、予め定めた胆汁鬱滞型の肝障害に関するＲＯＳ濃度のＲＯＣ曲線から算出されるものである、前記７．に記載の検査方法。
１４．前記生物学的試料が血液試料である、前記１．から１３．のいずれか１つに記載の検査方法。
１５．前記生物学的試料が血清試料である、前記１．から１４．のいずれか１つに記載の検査方法。
１６．前記１．から１５．のいずれか１つに記載の検査方法によって肝障害のタイプが判定された被験者に対して、その肝障害のタイプに応じた肝障害治療剤を選択する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
更に別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値を超えており、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値未満であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型と胆汁鬱滞型との混合型であると判定する工程を含み、
ここで、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌであり、かつ予め設定された胆汁鬱滞型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０２４１ｎｍｏｌ／Ｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
また、別の具体例として、
被験者から採取された血清試料中のＬＣＡ濃度を測定する工程、
測定されたＬＣＡ濃度を、予め設定されたＬＣＡ濃度のカットオフ値と比較する工程、
更に、ＵＤＣＡおよびＩＶ型コラーゲンのいずれか１または両方の濃度を測定する工程、
測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度を、予め設定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度のカットオフ値と比較する工程、および
測定されたＬＣＡ濃度が、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値以上であり、かつ測定されたＵＤＣＡおよび／またはＩＶ型コラーゲンの濃度が、下記いずれか１であるとき、肝障害のタイプは肝細胞障害型であると判定する工程：
（１）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下である、
（２）ＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
（３）ＵＤＣＡ濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値以下であり、かつＩＶ型コラーゲン濃度が予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値以上である、
を含み、
ここで、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＬＣＡ濃度のカットオフ値が０．０１９５ｎｍｏｌ／Ｌであり、予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＵＤＣＡ濃度のカットオフ値が０．９０３ｎｍｏｌ／Ｌであり、かつ予め設定された肝細胞障害型の肝障害を識別するＩＶ型コラーゲン濃度のカットオフ値が１２８ｎｇ／ｍｌである、
肝障害タイプを判別する検査方法を挙げることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
胆汁酸分画の濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法やガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法を挙げることができる。また、胆汁酸や硫酸抱合型胆汁酸の濃度は、市販の胆汁酸測定キットを使用してその測定を実施できる。例えば、硫酸抱合型胆汁酸の濃度の測定はユーバスティック・オート、胆汁酸（ＵＢＡＳ）キット（（株）エル・ビー・エス）を用いて実施できる。測定方法はこれらに限定されず、胆汁酸やその分画の測定が可能であればいずれの方法も使用できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＩＶ型コラーゲンの濃度の測定は、該測定に従来より使用されている方法を使用して実施できる。例えば、市販のＩＶ型コラーゲン測定用試薬キットを使用して、ＩＶ型コラーゲンの濃度を測定することができる。かかる方法として、ＩＶ型コラーゲンに対する抗体を使用した酵素免疫法（ＥＩＡ）や酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）を例示できる。具体的には、生物学的試料に抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体を添加してＩＶ型コラーゲン・７Ｓ−抗ヒトＩＶ型コラーゲン  ウサギポリクローナル抗体複合体（複合体１）を形成させ、その後、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）等の放射性同位体で標識したヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ（標識抗原）を加え、当該試料中のＩＶ型コラーゲン・７Ｓと結合し得なかった抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体と複合体（複合体２）を形成させ、更に抗ウサギγ−グロブリンヤギ血清（ヤギ抗体）を加えると、ヤギ抗体は複合体２と反応し、標識抗原−抗ヒトＩＶ型コラーゲン・７Ｓ  ウサギポリクローナル抗体−ヤギ抗体複合体を形成させ、生じた沈澱を回収して沈殿物の放射活性を測定することにより、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ濃度を測定することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
３．測定方法
全２４種の胆汁酸分画は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により測定した。定量下限は、１２−ＫＬＣＡのみを０．０３ｎｍｏｌ／ｍＬとし、その他の測定対象物質を０．０１ｎｍｏｌ／ｍＬとした。定量上限は、１２−ＫＬＣＡおよびＣＡのみを１０ｎｍｏｌ／ｍＬとし、その他の測定対象物質を３０ｎｍｏｌ／ｍＬとした。内部標準（ＩＳ）にはナプタラムを用いた。カラムにはＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７ｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、移動相には０．１％ギ酸とアセトニトリルを用い、それらの比を測定時間により変化させた。イオン化法はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩと略称する）法ネガティブを、検出法は選択イオンレコーディング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ；ＳＩＲと略称する）を選択した。前処理方法は除タンパク法とした。硫酸抱合型胆汁酸濃度は３００μＬ 血清およびユーバスティック・オート、胆汁酸（ＵＢＡＳ）キット（（株）エル・ビー・エス）を用いて、ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ２２５０（ＪＥＯＬ）により測定した。
【国際調査報告】
2015019976.tif 000012
2015019976.tif 000013
2015019976.tif 000014
2015019976.tif 000015
2015019976.tif 000016
2015019976.tif 000017
2015019976.tif 000018