(57)【要約】  本発明は、（１）目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更するステップ、および、（２）変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取するステップを含む、目的細胞の純度の高い細胞集団を製造する方法、前記方法で製造された、目的細胞の純度が高い細胞集団、前記細胞集団を、シート状に培養するステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法、前記細胞集団を含む、シート状細胞培養物、前記細胞集団および前記シート状細胞培養物からなる群から選択される有効成分を含む医薬組成物、前記細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記対象における疾患の処置方法などに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更するステップ、および
（２）変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取するステップ
を含む、目的細胞の純度の高い細胞集団を製造する方法。
【請求項２】
混入細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形質が、細胞の形状、サイズ、比重、表面電荷、付着能、マーカーからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的細胞が骨格筋芽細胞または間葉系幹細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法で製造された、目的細胞の純度が高い細胞集団。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞集団を、シート状に培養するステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞集団を含む、シート状細胞培養物。
【請求項８】
請求項５に記載の細胞集団および請求項７に記載のシート状細胞培養物からなる群から選択される有効成分を含む、医薬組成物。
【請求項９】
組織の異常に関連する疾患を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５に記載の細胞集団、請求項７に記載シート状細胞培養物または請求項８もしくは９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記対象における疾患の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的細胞の純度が高い細胞集団を製造する方法、同方法で得られた細胞集団、同細胞集団を含む医薬組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１）。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。【０００４】
細胞移植に用いる細胞は、拒絶反応などの有害事象を回避するために、通常移植する対象の組織から分離して得るが、組織中には、目的細胞以外の細胞が含まれている場合が多く、目的細胞を純化せずに組織から得られた細胞を培養すると、目的細胞以外の細胞も増殖してしまい、移植に用いられる細胞に占める目的細胞の割合が低いものとなる。しかしながら、目的細胞以外の細胞を移植しても、目的細胞を移植した場合ほどの治療効果は得られない。したがって、目的細胞の純度が低い場合には、組織から得られた細胞を移植しても、十分な治療効果が得られない可能性がある。【０００５】
組織から分離された細胞集団に含まれる目的細胞の割合を高める方策としては、例えば、骨格筋組織から骨格筋芽細胞を分離する際に、骨格筋組織をタンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液を廃棄した後に、再度タンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液に含まれる細胞を回収する方法などが知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２００７−８９４４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団から、目的細胞の純度の高い細胞集団を製造する方法、特にかかる細胞集団を簡便かつ効率的に製造する方法、該方法によって得られる目的細胞の純度の高い細胞集団、該細胞集団を含む医薬組成物などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更し、変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取することにより、目的細胞の純度が高い細胞集団を製造できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞  （１）目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更するステップ、および
（２）変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取するステップ
を含む、目的細胞の純度の高い細胞集団を製造する方法。
＜２＞  混入細胞が線維芽細胞である、上記＜１＞に記載の方法。
＜３＞  形質が、細胞の形状、サイズ、比重、表面電荷、付着能、マーカーからなる群から選択される、上記＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞  目的細胞が骨格筋芽細胞または間葉系幹細胞である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の方法。【００１１】
＜５＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法で製造された、目的細胞の純度が高い細胞集団。
＜６＞  上記＜５＞に記載の細胞集団を、シート状に培養するステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法。
＜７＞  上記＜５＞に記載の細胞集団を含む、シート状細胞培養物。
＜８＞  上記＜５＞に記載の細胞集団および上記＜７＞に記載のシート状細胞培養物からなる群から選択される有効成分を含む、医薬組成物。
＜９＞  組織の異常に関連する疾患を処置するための、上記＜８＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞  上記＜５＞に記載の細胞集団、上記＜７＞に記載シート状細胞培養物または上記＜８＞もしくは＜９＞に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記対象における疾患の処置方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、生体から採取した複数種の細胞を含む細胞集団に含まれる目的細胞の純度を高めることが可能となり、細胞移植等による治療効果が高まると共に、かかる治療に用いる細胞組成物の製造を効率化できる。また、変更する形質として、細胞サイズ、比重、表面電荷などを選択することにより、ろ過、遠心分離などの、簡便で、一度に大量の細胞を処理できる手法を用いることが可能となり、目的細胞を効率的に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の基本的な概念を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１５】
本発明の一側面は、（１）目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更するステップ、および（２）変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取するステップを含む、目的細胞の純度が高い細胞集団を製造する方法（以下、「細胞集団製造方法」と略す場合もある）に関する。
【００１６】
本発明において、目的細胞および混入細胞は、得られる細胞集団の用途などに応じて任意に設定することができる。目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団は、典型的には生体から採取した組織から調製されるため、目的細胞および混入細胞は、典型的には同一組織に存在する細胞から選択される。例えば、骨格筋組織から調製される細胞集団は主として骨格筋芽細胞と線維芽細胞から構成されるため、このうちのいずれか一方を目的細胞、他方を混入細胞とすることができる。したがって、本発明の一態様において、目的細胞は骨格筋芽細胞、混入細胞は線維芽細胞であり、本発明の別の態様において、目的細胞は線維芽細胞、混入細胞は骨格筋芽細胞である。また、骨髄組織から調製される細胞集団は主として間葉系幹細胞、造血幹細胞、血液前駆細胞および線維芽細胞などから構成されるため、このうちのいずれか１つまたは２つ以上を目的細胞、他を混入細胞とすることができる。したがって、本発明の一態様においては、限定されずに、例えば、目的細胞が間葉系幹細胞、混入細胞が造血幹細胞、血液前駆細胞、および線維芽細胞であっても、目的細胞が間葉系幹細胞および造血幹細胞、混入細胞が血液前駆細胞および線維芽細胞であってもよい。
【００１７】
目的細胞および混入細胞は、生体の組織に存在する細胞種の一部から選択することもできる。すなわち、生体の組織に存在するすべての細胞種を、本発明における目的細胞と混入細胞とに振り分ける必要はなく、形質を変更することなく、目的細胞と容易に分離できる細胞種を前処理により事前に除去しておき、前処理後に残った細胞種から、目的細胞および混入細胞を選択することもできる。前処理としては、限定されずに、例えば、ろ過（例えば、フィルター、マイクロ流路などによるろ過）、遠心分離（例えば、密度勾配遠心法、等密度遠心法、対向流遠心分離（Countercurrent centrifugal elutriation：CCE）等）、接着培養による接着細胞と浮遊細胞との分離などが挙げられる。より具体的には、例えば、骨髄組織から目的細胞である間葉系幹細胞の純度が高い細胞集団を製造する場合、まず骨髄組織に含まれる浮遊細胞（例えば、造血幹細胞、血液前駆細胞、血球系細胞等）を、接着培養などの前処理により除去し、残った接着細胞集団に主に含まれる、間葉系幹細胞との分離が困難な線維芽細胞を、本発明における混入細胞（すなわち、形質を変更させる細胞）として選択することができる。したがって、本発明の細胞集団製造方法は、混入細胞の形質を変更するステップの前に、生体から採取した組織から、目的細胞および混入細胞以外の細胞を除去するステップをさらに含んでもよい。
【００１８】
細胞集団を医療用途（限定されずに、例えば、疾患の処置、移植医療、再生医療などの用途を含む）に用いる場合、目的細胞は、限定されずに、例えば、血液疾患などの治療に用いる造血幹細胞、免疫療法などに用いるリンパ球、樹状細胞などの免疫細胞、シート状細胞培養物を形成し得る細胞、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等から選択することができる。この場合、混入細胞は上記目的細胞が存在する組織に存在する目的細胞以外の細胞、特に、目的細胞との分離が困難であり、増殖能および／または当該組織における存在比率が高い細胞から選択することができる。
本発明の一態様において、混入細胞は線維芽細胞である。本発明の一態様において、目的細胞は筋芽細胞、好ましくは骨格筋芽細胞である。本発明の好ましい態様において、目的細胞は骨格筋芽細胞であり、混入細胞は線維芽細胞である。本発明の別の態様において、目的細胞は間葉系幹細胞である。本発明の好ましい態様において、目的細胞は間葉系幹細胞であり、混入細胞は線維芽細胞である。
【００１９】
変更される混入細胞の形質としては、既知の任意の形質の１または２以上を選択することができるが、変更後の形質が、目的細胞との分離に有用であるものが好ましい。かかる形質としては、限定されずに、例えば、細胞のサイズ、比重、表面電荷、マーカー発現の有無、付着能、増殖能、走化性などが挙げられる。形質の変更は、既知の任意の手法またはその組み合わせによって行うことができる。例えば、ある細胞種を、転写因子などの遺伝子の導入や薬物の投与により別の細胞種に転換できることが知られている（例えば、Nizzardo et al., Cell Transplant. 2013;22(6):921-44、Zhu et al., Cell Reprogram. 2012 Apr;14(2):99-105など）。したがって、本発明における混入細胞の形質を変更するステップは、かかる手法を用いて、混入細胞を、目的細胞からの分離が容易な細胞種に転換することを包含する。
【００２０】
例えば、線維芽細胞を、脂肪細胞、巨核球、血小板、肝細胞様細胞、マクロファージ様細胞、神経細胞、心筋細胞などに転換する手法は知られているため（例えば、上記Nizzardo et al., 2013、Zhu et al., 2012、Ono et al., Blood. 2012 Nov 1;120(18):3812-21など）、混入細胞としての線維芽細胞を、所望の目的細胞、例えば骨格筋芽細胞もしくは間葉系幹細胞とは形質が異なるこれらのいずれかの細胞に転換し、転換後の混入細胞を、形質の違いをもとに骨格筋芽細胞もしくは間葉系幹細胞から分離、除去すること、および／または、骨格筋芽細胞もしくは間葉系幹細胞を転換後の混入細胞から分離、除去することができる。例えば、骨格筋芽細胞の細胞径は約１１〜１８μｍであるが、巨核球の細胞径は約３５〜１６０μｍ、血小板の細胞径は約２〜４μｍ、肝細胞の細胞径は約２０〜３０μｍ、マクロファージの細胞径は約２５〜５０μｍであるため、線維芽細胞をこれらの細胞に転換すれば、細胞の大きさの違いを利用して、骨格筋芽細胞と分離することができる。また、脂肪細胞は、骨格筋芽細胞もしくは間葉系幹細胞と比重が異なるため、線維芽細胞を脂肪細胞に転換すれば、細胞の比重の違いを利用して、骨格筋芽細胞もしくは間葉系幹細胞と分離することができる。
【００２１】
線維芽細胞の脂肪細胞への転換は、限定されずに、例えば、ＰＰＡＲγ（Tontonoz et al., Cell. 1994 Dec 30;79(7):1147-56）、Ｃ／ＥＢＰα（Freytag et al., Genes Dev. 1994 Jul 15;8(14):1654-63）、ＡＤＤ１／ＳＲＥＢＰ−１（Kim and Spiegelman, Genes Dev. 1996 May 1;10(9):1096-107）などの因子の導入や、ＴＧＦβシグナル伝達インヒビター（例えば、ＳＢ４３１５４２等のＴＧＦ−βＲＩキナーゼインヒビターなど）とＲＯＣＫシグナル伝達インヒビター（例えば、チアゾビビンなど）との組み合わせによる処理（上記Zhu et al., 2012）などによって行うことができる。線維芽細胞の肝細胞様細胞への転換は、限定されずに、例えば、Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１αおよびＦｏｘａ３の導入と、ｐ１９Ａｒｆの不活化との組み合わせ（Huang et al., Nature. 2011 May 11;475(7356):386-9）、Ｈｎｆ４αと、Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２またはＦｏｘａ３との導入（Sekiya and Suzuki, Nature. 2011 Jun 29;475(7356):390-3）などによって行うことができる。線維芽細胞のマクロファージ様細胞への転換は、限定されずに、例えば、ＰＵ．１と、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰβとの導入（Feng et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Apr 22;105(16):6057-62）などによって行うことができる。線維芽細胞の巨核球および血小板への転換は、限定されずに、例えば、ｐ４５ＮＦ−Ｅ２、Ｍａｆ  ＧおよびＭａｆ  Ｋの導入（上記Ono et al., 2012）などによって行うことができる。線維芽細胞の神経細胞への転換は、限定されずに、例えば、Ａｓｃ１１、Ｂｒｎ２およびＭｙｔｌｌの導入、Ａｓｃ１１、Ｂｒｎ２、ＭｙｔｌｌおよびＮｅｕｒｏＤ１の導入、ｍｉＲ−９／９、ｍｉＲ−１２４、ＮｅｕｒｏＤ２、Ａｓｃ１１およびＭｙｔｌｌの導入、Ｍａｓｈ１、Ｎｕｒｒ１およびＬｍｘ１ａの導入、Ａｓｃ１１、Ｐｉｔｘ３、Ｌｍｘ１ａ、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２およびＥＮ１の導入、Ａｓｃ１１、Ｂｒｎ２、Ｎｙｔ１１、Ｌｈｘ３、Ｈｂ９、Ｉｓ１１、Ｎｇｎ２およびＮＥＵＲＯＤ１の導入（上記Nizzardo et al., 2013）などによって行うことができる。線維芽細胞の心筋細胞への転換は、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５およびＭｅｆ２ｃの導入、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの導入（上記Nizzardo et al., 2013）などによって行うことができる。
【００２２】
混入細胞の形質を変更する他の手法としては、限定されずに、例えば、所望のマーカーの発現または発現抑制、ｉＰＳ細胞への転換と、その後の所望の細胞への分化誘導などが挙げられる。所望のマーカーとしては、限定されずに、例えば、細胞表面マーカー、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。マーカーの発現または発現抑制は既知の任意の手法で行うことができる。マーカーの発現手法としては、例えば、マーカーをコードする核酸の混入細胞への導入などが挙げられる。核酸の導入には、限定されずに、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。マーカーの発現抑制手法としては、限定されずに、例えば、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法などが挙げられる。ＲＮＡｉ法は、ＲＮＡｉ分子の混入細胞への導入を含んでいてもよく、アンチセンス法は、アンチセンス核酸の混入細胞への導入を含んでいてもよい。
【００２３】
ｉＰＳ細胞への転換は、細胞にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＧＬＩＳ１等の遺伝子を導入することなどにより行うことができる（例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣの組合せ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧの組合せ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＧＬＩＳ１の組合せ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４の組合せ、ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２の組合せなど）。ｉＰＳ細胞への転換方法は当該技術分野において周知であり（例えば、Miyazaki et al., Jpn J Clin Oncol. 2012 Sep;42(9):773-9、Bayart and Cohen-Haguenauer, Curr Gene Ther. 2013 Apr;13(2):73-92など参照）、任意の既知の転換方法またはその変法を本発明に用いることができる。
【００２４】
ｉＰＳ細胞から他の細胞種への転換方法についても当該技術分野において周知であり、任意の既知の転換方法またはその変法を本発明に用いることができるｉＰＳ細胞から巨核球や血小板への転換方法としては、例えば、STEMspan-ACF、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培地、次いで、STEM-diff APEL Medium、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびヘパリンを含む培地、次いでSTEMspan-ACF、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびヘパリンを含む培地中で、細胞を順次培養する方法（Feng et al., Stem Cell Reports. 2014 Nov 11;3(5):817-31）などが、ｉＰＳ細胞から肝細胞様細胞への転換方法としては、例えば、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３、ＦＧＦ４、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＫＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭなどの因子の存在下で細胞を順次培養する方法（Subba Rao et al., World J Gastroenterol. 2013 Jun 14;19(22):3385-96）などが知られている。
【００２５】
本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、既知の配列情報などに基づいて設計、作製することが可能である。また、本明細書で用いる場合アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
【００２６】
核酸（例えば、マーカーをコードする核酸、ＲＮＡｉ分子またはこれをコードする核酸）や薬物を混入細胞に適用する際には、当該混入細胞に特異的な送達手法を用いることができる。かかる送達手法には、例えば、混入細胞に特異的な標的化剤（例えば、標的化リガンドなど）を利用したアクティブターゲティング（Marcucci and Lefoulon, Drug Discov Today. 2004 Mar 1;9(5):219-28、Torchilin, Eur J Pharm Sci. 2000 Oct;11 Suppl 2:S81-91等）などが含まれる。特定の細胞に特異的な標的化剤は多数知られている。アクティブターゲティングにより、核酸や薬物を目的細胞には作用させずに、混入細胞にのみ作用させることができるため、例えば、目的細胞と混入細胞の両方に同じ作用（例えば、同じ細胞種への転換）をもたらす核酸や薬物の利用が可能となる。線維芽細胞に特異的な標的化剤としては、限定されずに、例えば、線維芽細胞特異的な細胞表面マーカーであるＴＥ−７（例えば、Rosendaal et al., J Cell Sci. 1994 Jan;107 (Pt 1):29-37、Goodpaster et al., J Histochem Cytochem. 2008 Apr;56(4):347-58など参照）に特異的に結合する物質、例えば、ＴＥ−７に対する抗体または抗原認識部位を含む当該抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片等）などが挙げられる。
【００２７】
核酸を混入細胞内で発現させて使用する際には、混入細胞特異的な発現のために、核酸を当該混入細胞に特異的な調節配列の制御下に配置することができる。かかる手法を用いることにより、核酸を目的細胞では発現させずに、混入細胞でのみ発現させることができるため、例えば、目的細胞と混入細胞の両方に同じ作用（例えば、同じ細胞種への転換）をもたらす核酸の利用が可能となる。特定の細胞に特異的な調節配列は多数知られている。核酸の線維芽細胞での特異的な発現に用いることができる調節配列としては、限定されずに、例えば、ＳＴ２遺伝子近位プロモーター（Iwahana et al., Eur J Biochem. 1999 Sep;264(2):397-406）、α１１インテグリンプロモーター（Lu et al., Matrix Biol. 2010 Apr;29(3):166-76）、ＦＳＰ１遺伝子プロモーター（Okada et al., Am J Physiol. 1998 Aug;275(2 Pt 2):F306-14）、ｐｒｏα２（Ｉ）コラーゲンエンハンサー（Bou-Gharios et al., J Cell Biol. 1996 Sep;134(5):1333-44）などが挙げられる。かかる調節配列と、前記アクティブターゲティングとを併用することにより、細胞特異性などをさらに向上させることができる。
【００２８】
変更される混入細胞の形質は、１つであっても、２つ以上の組み合わせであってもよい。例えば、混入細胞を別の細胞種に転換する場合、複数の形質が同時に変更されることがある。また、同時に複数のマーカーを発現させたり、複数のマーカーの発現を抑制したりすることもできる。
【００２９】
混入細胞の除去または目的細胞の採取は、対象となる形質に応じた、既知の任意の手法により行うことができる。例えば、変更される形質が細胞サイズである場合、適切なサイズのフィルター（例えば、ナイロンメッシュフィルター）やマイクロ流路などによるろ過、遠心分離などを利用して、混入細胞を除去または目的細胞を採取することができる。変更される形質が細胞比重である場合、遠心分離（例えば、密度勾配遠心法、等密度遠心法、対向流遠心分離等）などを利用して、混入細胞を除去または目的細胞を採取することができる。変更される形質が細胞表面マーカーである場合、フローサイトメトリー法、アフィニティー分離法（例えば、アフィニティーカラム法、磁気細胞分離法、イムノパニング等）などを利用して、混入細胞を除去または目的細胞を採取することができる。変更後の形質が蛍光タンパク質の発現である場合、フローサイトメトリー法などを利用して、混入細胞を除去または目的細胞を採取することができる。変更される形質が表面電荷である場合、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動法、誘電泳動法などを利用して、混入細胞を除去または目的細胞を採取することができる。これらのうち、精製操作の簡便性や、一度に精製できる細胞量の多さなどの観点から、細胞サイズ、比重および表面電荷からなる群から選択される形質の変更が好ましい。
【００３０】
上記手法は、同一試料について１回のみ適用しても、複数回適用してもよい。また、同じ形質について２以上の手法が存在する場合は、いずれか１つのみを適用しても、２以上を組み合わせて適用してもよい。さらに、変更される形質が複数存在する場合は、このうちのいずれか１つに着目して混入細胞の除去または目的細胞の採取を行っても、２以上に着目して混入細胞の除去または目的細胞の採取を行ってもよい。
【００３１】
本発明において、「目的細胞の純度が高い」とは、天然の組織における目的細胞の純度より高いことを意味する。本発明の方法を実施した後の目的細胞の純度は、例えば、天然の組織における純度が５０％である場合、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であり得、最も好ましくは１００％である。目的細胞の純度は、任意の既知の手法を用いて決定することができる。かかる手法としては、例えば、目的細胞を同細胞に特異的な抗体で標識し、抗体が結合した陽性細胞数を、計数した総細胞数で除すことなどが挙げられる。細胞の計数は、特異的抗体で染色した標本の顕微鏡観察、顕微鏡像の画像解析、特異的抗体で染色した細胞集団のフローサイトメトリー解析などによって行うことができる。目的細胞が骨格筋芽細胞である場合、同細胞に特異的なマーカーとしては、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ｍｙｏｇｅｎｉｎなどが、目的細胞が間葉系幹細胞である場合、同細胞に特異的なマーカーとしては、限定されずに、例えば、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６などが挙げられる。
【００３２】
本発明の細胞集団製造方法は、採取した目的細胞を培養するステップ、培養した細胞を継代するステップをさらに含んでもよい。細胞の培養および継代は、既知の任意の方法を用いて行うことができる。本発明の細胞集団製造方法はさらに、採取した細胞に遺伝子を導入するステップをさらに含んでもよい。導入する遺伝子は、治療する疾患の治療に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦなどのサイトカインであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などの既知の任意の方法を用いて行うことができる。
【００３３】
本発明の別の側面は、本発明の細胞集団製造方法で製造された、目的細胞の純度が高い細胞集団（以下、「高純度細胞集団」と略す場合もある）に関する。本発明の高純度細胞集団は、本発明の細胞集団製造方法によって得られ、目的細胞純度が高い。目的細胞純度の高さの程度については、上記で既に説明したとおりである。本発明の高純度細胞集団は、目的細胞を高い比率で含むため、医療用途などに用いる当該細胞の給源として有用である。本発明の高純度細胞集団は無菌であることが好ましい。また、本発明の高純度細胞集団は、培養容器に付着していても、生理的に許容し得る液体中に浮遊していても、凍結保存された状態であってもよい。
【００３４】
本発明の別の側面は、本発明の高純度細胞集団を、シート状に培養するステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法（以下、「シート状細胞培養物製造方法」と略す場合もある）に関する。
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００３５】
本発明のシート状細胞培養物は、生体適合性や治療効果の高さなどの観点から、スキャフォールド（支持体）を含まないことが好ましい。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明の好ましいシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものである。また、本発明のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００３６】
本発明の高純度細胞集団をシート状に培養するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、特許文献１、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されたものが挙げられる。高純度細胞集団をシート状に培養するステップは、当該細胞集団を培養基材上に播種するステップ、および、播種した細胞集団をシート化するステップを含んでもよい。
【００３７】
培養基材は、細胞集団がその上でシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。
【００３８】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着したシート状細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本発明の製造方法に使用することができる。
【００３９】
培養基材への細胞集団の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞集団の播種は、例えば、細胞集団を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００４０】
播種した細胞集団をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されている。細胞集団のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞集団を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。当業者であれば、播種する細胞集団の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞集団をシート化するための培養を、「シート化培養」と呼ぶ場合もある。
【００４１】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と呼ぶ場合もある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。培養液としては、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００４２】
細胞集団の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
【００４３】
本発明のシート状細胞培養物製造方法は、シート状細胞培養物を回収するステップをさらに含んでもよい。シート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞集団を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養してシート状細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
【００４４】
本発明のシート状細胞培養物製造方法の特に好ましい態様は、以下のステップを含む：
（１）対象から採取した目的細胞と混入細胞とを含む細胞集団において、混入細胞の形質を変更するステップ、
（２）変更された形質に基づいて混入細胞を除去、および／または、目的細胞を採取し、目的細胞の純度の高い細胞集団を得るステップ、
（３）前記細胞集団を凍結するステップ、
（４）凍結した細胞集団を解凍するステップ、
（５）細胞集団をシート状に培養し、シート状細胞培養物を形成するステップ、
（６）形成されたシート状細胞培養物を回収するステップ。
（１）〜（２）、（５）〜（６）のステップについては、すでに上記したとおりである。上記態様において、目的細胞は好ましくは筋芽細胞（特に骨格筋芽細胞）もしくは間葉系幹細胞であり、混入細胞は好ましくは線維芽細胞である。
【００４５】
ステップ（３）は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞集団を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には０℃以下、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−４０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて−８０℃に達するまで１〜５時間、好ましくは２〜４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞集団を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）などを用いることができる。
【００４６】
凍結操作は、細胞集団を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、本発明のシート状培養物製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
【００４７】
凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して２〜２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本発明の範囲内である。
【００４９】
ステップ（４）は、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞集団を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞集団を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞集団を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には４〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には２分以内であり、特に２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。
【００５０】
上記シート状細胞培養物製造方法は、ステップ（４）とステップ（５）との間に細胞集団を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞集団の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞集団を液体（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液または生理緩衝液など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞集団を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞集団を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本発明の一態様において、細胞集団を洗浄するステップは、凍結した細胞集団を解凍するステップ（４）の直後に行われる。
【００５１】
一態様において、本発明の製造方法（細胞集団製造方法、シート状細胞培養物製造方法を含む）はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本発明の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞集団または細胞集団の給源となる組織を採取するステップを含む。一態様において、本発明の製造方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られる細胞集団またはシート状細胞培養物が実質的に無菌となるように行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られる細胞集団またはシート状細胞培養物が無菌となるように行われる。
【００５２】
本発明の別の側面は、本発明の高純度細胞集団を含む、シート状細胞培養物（以下、「シート状細胞培養物」と略す場合もある）に関する。
本発明のシート状細胞培養物は、目的細胞の純度が高い。純度の高さは、本発明の高純度細胞集団に関して上記したとおりである。目的細胞は、好ましくは筋芽細胞、特に骨格筋芽細胞、もしくは間葉系幹細胞である。本発明のシート状細胞培養物は、本発明のシート状細胞培養物製造方法によって製造されたものであってもよい。本発明のシート状細胞培養物は無菌であることが好ましい。本発明のシート状細胞培養物は、目的細胞を高い純度で含むため、本発明の高純度細胞集団を含まないシート状細胞培養物に比べ、治療効果などが高い。
【００５３】
本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物は、種々の疾患、特に組織の異常に関連する疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物は、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳、骨髄などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）、骨髄疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、免疫不全疾患など）が挙げられる。
【００５４】
本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Arauchi et al., Tissue Eng Part A. 2009 Dec;15(12):3943-9、Ito et al., Tissue Eng. 2005 Mar-Apr;11(3-4):489-96、Yaji et al., Biomaterials. 2009 Feb;30(5):797-803、Yaguchi et al., Acta Otolaryngol. 2007 Oct;127(10):1038-44、Watanabe et al., Transplantation. 2011 Apr 15;91(7):700-6、Shimizu et al., Biomaterials. 2009 Oct;30(30):5943-9、Ebihara et al., Biomaterials. 2012 May;33(15):3846-51、Takagi et al., World J Gastroenterol. 2012 Oct 7;18(37):5145-50などに記載されている。
【００５５】
本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物は、処置の対象となる組織に適用し、これを修復、再生するために使用することもできるが、ホルモンなどの生理活性物質の給源として、処置の対象となる組織以外の部位（例えば、皮下組織など）に移植することもできる（例えば、Arauchi et al., Tissue Eng Part A. 2009 Dec;15(12):3943-9、Shimizu et al., Biomaterials. 2009 Oct;30(30):5943-9など）。また、本発明のシート状細胞培養物を注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008 Feb 1;77(3):515-24）。
【００５６】
本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物は、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、高純度細胞集団および／またはシート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などをさらに含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物は、高純度細胞集団および／またはシート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
【００５７】
本発明の別の側面は、本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物からなる群から選択される有効成分を含む、医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、本発明の高純度細胞集団および／またはシート状細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、高純度細胞集団および／またはシート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の医薬組成物は、高純度細胞集団および／またはシート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本発明の医薬組成物は、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物について上記したとおりである。
【００５８】
本発明の別の側面は、本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または組成物（例えば、医薬組成物）等の製造に用いる一部またはすべての要素を含む、本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または組成物（例えば、医薬組成物）等を製造するための、または、疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患等）を処置するためのキット（セットまたはパック）に関する（以下、「本発明の製造キット」と称することがある）。本明細書において、用語「セット」および「パック」は「キット」と互換可能に用いられ、本明細書における「キット」に関する記載は「セット」および「パック」にも適用されるものとする。
【００５９】
本発明のキットに含まれる具体的な要素は、本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物等の製造に係る上記記載を参照すれば明らかであろうから、ここで全てを列挙することはしない。一態様において、本発明のキットは、限定されずに、例えば、混入細胞の形質を変更するための剤（例えば、細胞種を転換するための剤、マーカーを発現または発現抑制するための剤、ｉＰＳ細胞への転換のための剤、ｉＰＳ細胞を他の細胞種に分化誘導するための剤等）、高純度細胞集団の製造に用いる細胞集団（例えば、生体から単離した細胞集団等）、シート状細胞培養物の培養に用いる細胞（例えば、本発明の高純度細胞集団等）、培養液、培養皿、洗浄液、目的細胞の精製および／または混入細胞の排除に用いる剤（例えば、抗体、洗浄液等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット、ビーズ、アフィニティカラム、フィルター等）、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または組成物等の製造方法や使用方法に関する指示（例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
【００６０】
特定の態様において、本発明の高純度細胞集団またはこれを含む組成物を製造するためのキットは、混入細胞の形質を変更するための剤、および、目的細胞の精製および／または混入細胞の排除に用いる剤を含む。別の特定の態様において、本発明の高純度細胞集団またはこれを含む組成物を製造するためのキットは、生体から単離した細胞集団、混入細胞の形質を変更するための剤、および、目的細胞の精製および／または混入細胞の排除に用いる剤を含む。別の特定の態様において、本発明のシート状細胞培養物またはこれを含む組成物を製造するためのキットは、本発明の高純度細胞集団、培養液および培養皿を含む。別の特定の態様において、本発明のシート状細胞培養物またはこれを含む組成物を製造するためのキットは、生体から単離した細胞集団、混入細胞の形質を変更するための剤、目的細胞の精製および／または混入細胞の排除に用いる剤、培養液および培養皿を含む。
【００６１】
本発明の別の側面は、対象において疾患を処置する方法であって、本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物の有効量をそれ必要とする対象に投与するステップを含む方法（以下、「処置方法」と略す場合もある）に関する。本発明の処置方法の対象となる組織や疾患は、本発明の高純度細胞集団およびシート状細胞培養物について上記したとおりである。また、本発明の処置方法においては、高純度細胞集団および／または細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物と併用することができる。
【００６２】
本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物を製造するステップの前に、対象から高純度細胞集団を製造するための全血、細胞または細胞の給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、全血および／または細胞もしくは細胞の給源となる組織を採取する対象は、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、全血および／または細胞もしくは細胞の給源となる組織を採取する対象は、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、全血および／または細胞もしくは細胞の給源となる組織を採取する対象は、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物の投与を受ける対象とは異種の個体である。
【００６３】
本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００６４】
本発明において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物に含まれる細胞数、シート状細胞培養物のサイズ、重量など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００６５】
本発明の高純度細胞集団、シート状細胞培養物または医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の種々の経路から投与することができる。シート状細胞培養物またはこれを含む医薬組成物の場合は、投与方法として、典型的には組織への直接的な適用が挙げられるが、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。
投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。
【００６６】
実施例
例1：線維芽細胞の脂肪細胞への転換による骨格筋芽細胞の精製
骨格筋から単離した細胞集団の細胞懸濁液を０．８×１０５個／ウェルとなるように細胞培養プレートへ播種し、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養する。マイクロチューブに無血清培地を３０μＬ入れ、これに、ＰＰＡＲγ発現アデノウィルスベクター（AdRGD-PPARγ、Gastroenterology. 2003 May;124(5):1315-24）を１．０μｇ添加し、ピペッティングにより混合した後、HilyMax溶液（同仁化学研究所製）を５μＬ添加し、室温にて１５分間静置して、AdRGD-PPARγ-HilyMax複合体を調製する。培養後の細胞集団に、AdRGD-PPARγ-HilyMax複合体を添加し、プレートを穏やかに振とうする。ＣＯ２インキュベーターにて細胞を２４時間培養する。細胞集団をＰＢＳで洗浄、遠心後、２〜３×１０４個／ｃｍ２の密度で８０ｃｍ２フラスコに播種し、１５ｍＬの培地（脂肪細胞分化誘導用メディウム：コスモ・バイオ製）で５〜７日間培養する。培養後、培養表面をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理にて得られた細胞集団を孔径７０μｍのメッシュ（セルストレーナー：Corning製)でろ過し、メッシュを通過した細胞集団を目的とする細胞集団として得る。得られた細胞集団を抗ＣＤ５６抗体でラベルし、フローサイトメーターを用い、ＣＤ５６陽性細胞の割合（骨格筋芽細胞純度）を測定する。
【００６７】
多数の様々な改変が、本発明の精神から逸脱せずになされ得ることを当業者は理解する。したがって、本明細書に記載された本発明の形態は例示にすぎず、本発明の範囲を制限する意図がないことを理解すべきである。
【図１】
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【国際調査報告】
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