(57)【要約】  本発明は、クロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程を行うことを含む効率良く膵前駆細胞から膵ホルモン産生細胞を誘導する方法を提供する。
2015020113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵前駆細胞をクロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程を含む、膵ホルモン産生細胞の製造方法。
【請求項２】
前記培地が、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤から成るからなる群より選択される少なくとも一種の薬剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種が、フォルスコリンである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステロイドがデキサメタゾンである、請求項２から４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｄ）TGFβ阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記膵前駆細胞が、以下の工程（１）および（２）を特徴とする工程によって、多能性幹細胞から製造された細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程、および
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）BMP阻害剤、および（ｃ）TGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程。
【請求項８】
前記アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（２）で用いられるTGFβ阻害剤が、SB431542である、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記BMP阻害剤が、ドーソモルフィン（Dorsomorphin）である、請求項７から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、および膵ポリペプチド産生細胞からなる群より選択されるいずれかである請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、および/またはグルカゴン産生細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記膵ホルモン産生細胞が、ヒト細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵ホルモン産生細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する外分泌腺および、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（PP）等の膵ホルモンを分泌する内分泌腺として機能している。近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。この膵ホルモンは、膵臓の中のα細胞、β細胞、δ細胞およびPP細胞の4種の細胞からなる膵島と呼ばれる細胞塊により産生されている。【０００３】
ここで、インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成および貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食事に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取や体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。【０００４】
糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。【０００５】
２型糖尿病は、インスリンに対する抵抗性を獲得することで発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣が発症メカニズムと考えられている糖尿病である。２型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くは２型糖尿病を罹患している。【０００６】
一方、１型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってβ細胞（インスリン産生細胞）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる疾患である。インスリンの投与による対症療法が主に行われているが、体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールして、患者の負担を軽くできる治療法として、膵臓移植又は膵島移植も行われている。この治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。【０００７】
１型糖尿病について試みられている治療法の一つに、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導した該インスリン産生細胞を患者の生体内に移植する方法が検討されている。例えば、患者の膵臓の組織幹細胞を分化させる、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる等の方法が知られている。これらの方法によって患者由来の細胞からインスリン産生細胞を誘導した場合には、患者由来の細胞であることから免疫拒絶反応の問題が解消される等、安全性の面で有利である。【０００８】
インスリン産生細胞を得る方法としては、胚性幹（ES）細胞や人工多能性幹（iPS）細胞などの多能性幹細胞を分化させる方法、膵臓の組織幹細胞を分化させる方法、膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる方法等が知られている。【０００９】
多能性幹細胞からインスリンを誘導させる方法として、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法などが例示される（特許文献１、非特許文献１から５）。この他にも、多能性幹細胞へＰＤＸ１を導入して培養する方法（特許文献２から３）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（特許文献４、非特許文献６）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−２２５６６１号公報
【特許文献２】米国特許７５３４６０８号公報
【特許文献３】特開２００６−０７５０２２号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１１／０８１２２２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４：４４３−４５２
【非特許文献２】Ｋ．Ａ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１１：１３９２−１４０１
【非特許文献３】Ｗ．Ｊｉａｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：３３３−３４４
【非特許文献４】Ｊ．Ｈ．Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００７）５０：１２２８−１２３８
【非特許文献５】Ｒ．Ｍａｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００９），ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．３７：１５７６８−１５７７３
【非特許文献６】Ｋｕｎｉｓａｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（２０１２）  ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２：２７４−２８４．（上記特許文献並びに非文献は引用により本願の一部を構成する）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、インビトロで膵ホルモン産生細胞をより効率的に製造する方法を提供することである。具体的には、多能性幹細胞をより効率的に膵ホルモン産生細胞へと分化誘導することによって膵ホルモン産生細胞を多量に安定して製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、既存のインスリン産生細胞を製造する方法（非特許文献６）において、さらにクロモグリク酸ナトリウムを添加することでさらに効率的に多能性幹細胞から膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させることが可能なことを見出して本発明を完成するに至った。【００１４】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］膵前駆細胞をクロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程を含む、膵ホルモン産生細胞の製造方法。
［２］前記培地が、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤から成るからなる群より選択される少なくとも一種の薬剤をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］前記培地が、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤をさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種が、フォルスコリンである、［２］または［３］に記載の方法。
［５］前記ステロイドがデキサメタゾンである、［２］から［４］いずれか１項に記載の方法。
［６］前記（ｄ）TGFβ阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、［２］から［４］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記膵前駆細胞が、以下の工程（１）および（２）を特徴とする工程によって、多能性幹細胞から製造された細胞である、［１］から［６］のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程、および
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）BMP阻害剤、および（ｃ）TGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程。
［８］前記アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、［７］に記載の方法。
［９］前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［７］または［８］に記載の方法。
［１０］前記工程（２）で用いられるTGFβ阻害剤が、SB431542である、［７］から［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］前記BMP阻害剤が、ドーソモルフィン（Dorsomorphin）である、［７］から［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、および膵ポリペプチド産生細胞からなる群より選択されるいずれかである［１］から［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、および/またはグルカゴン産生細胞である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記膵ホルモン産生細胞が、ヒト細胞である、［１］から［１３］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、効率的に膵前駆細胞から膵ホルモン産生細胞を製造することができる。本発明により製造された膵ホルモン産生細胞は、糖尿病等の膵ホルモン産生細胞の異常に起因する疾患の予防又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに、本発明の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞は、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】各濃度のクロモグリク酸ナトリウムを添加してヒトiPS細胞株201B7を分化誘導した場合の誘導23日目（クロモグリク酸ナトリウム添加後12日目）におけるインスリン陽性細胞の含有率を示す。
【図１Ｂ】0.001mMまたは10mMのクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合の抗インスリン抗体による免疫染色像を示す。
【図１Ｃ】各濃度のクロモグリク酸ナトリウムを添加してヒトiPS細胞201B7株を分化誘導した場合の誘導23日目におけるインスリン（上図）およびC-ペプチド（下図）の陽性細胞の含有率をフローサイトメーターで測定した結果を示す。
【図２Ａ】10ｍＭのクロモグリク酸ナトリウムを添加または非添加（対照）により各ヒトiPS細胞株（409B2、418C1および201B7）を分化誘導した場合の誘導23日目におけるインスリン陽性細胞の含有率を示す。
【図２Ｂ】10ｍＭクロモグリク酸ナトリウムを各期間（4日間、8日間、12日間、16日間および20日間）添加した後のインスリン陽性細胞の含有率を示す。
【図３】クロモグリク酸ナトリウムを添加または非添加（対照）によりiPS細胞株を分化誘導した場合での誘導23日目における抗Ki67抗体による免疫染色像を示す。
【図４】クロモグリク酸ナトリウムを添加または非添加（対照）によりiPS細胞株を分化誘導した場合の誘導23日目における抗インスリン抗体（INS）および抗グルカゴン抗体（GCG）による免疫染色像を示す。
【図５Ａ】多能性幹細胞からβ細胞を製造する工程の模式図を示す。
【図５Ｂ】各誘導日数後（Ｄａｙ０、Ｄａｙ５、Ｄａｙ１１、Ｄａｙ１９）の細胞におけるマーカー遺伝子（SOX１７、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３，ＩＳＬ-１、ＩＮＳ，ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＥ，ＭＡＦＡ）の発現を測定した結果を示す。
【図５Ｃ】誘導５日目におけるSOX１７またはＦＯＸＡ２、培養１１日目におけるＰＤＸ１，培養１５日目におけるＮＥＵＲＯＧ３、培養１９日目におけるＩＮＳＵＬＩＮまたはＣ−ｐｅｐｔｉｄｅの染色像を示す。
【図５Ｄ】４Ｆ（フォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ））のみ、または４Ｆとクロモグリク酸ナトリウムを添加した培地で培養した誘導１９日目における１細胞あたりのインスリン濃度を測定した結果を示す。
【図６Ａ】誘導１９日目におけるＩＮＳＵＬＩＮ、ＧＬＵＣＡＧＯＮ、ＧＨＲＥ（ＧＨＲＥＬＩＮ），ＳＳＴ(ＳＯＭＡＴＯＳＴＡＴＩＮ)、ＡＭＹ（ＡＭＹＬＡＳＥ）およびＣＫ１９の染色像を示す。
【図６Ｂ】誘導１９日目におけるＩＮＳ（ＩＮＳＵＬＩＮ）、ＧＣＧ（ＧＬＵＣＡＧＯＮ），ＳＳＴ、ＧＨＲＥ、ＡＭＹおよびＣＫ１９の陽性細胞率を測定した結果を示す。
【図７Ａ】マウス胎児の膵原基からインスリン産生細胞を誘導する工程の模式図を示す。
【図７Ｂ】Ｅ１２．５、Ｅ１４．５およびＥ１６．５の膵原基にそれぞれクロモグリク酸ナトリムを添加して培養（黒色）または添加せず培養（白色）したときのGFP（ＩＮＳＵＬＩＮ）陽性細胞率を測定した結果を示す。
【図７Ｃ】Ｅ１２．５、Ｅ１４．５およびＥ１６．５の膵原基を基本培地中で培養（ｍｅｄｉｕｍ  ｏｎｌｙ）、４Ｆ（フォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ））を添加した基本培地で培養、または４Ｆおよびクロモグリク酸ナトリウムを添加した基本培地で培養した後のＩｎｓｕｌｉｎまたはＮｅｕｒｏｇ３の発現を測定した結果を示す。図中、ＰＣは陽性対照を意味し、マウス成体膵臓細胞における発現量を示す。
【図８Ａ】多能性幹細胞からβ細胞を製造する工程の模式図を示す。
【図８Ｂ】クロモグリク酸ナトリウムを添加して培養（黒色）または添加せず培養（白色）したときのβＡＣＴＩＮの発現量に対するＩＮＳＵＬＩＮの発現量の割合を測定した結果を示す。
【図８Ｃ】クロモグリク酸ナトリウムを添加して培養（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｒｏｍｏｇｌｉｃａｔｅと示す）または添加せず培養（Ｍｅｄｉｕｍ  ｏｎｌｙと示す）したときのＩＮＳＵＬＩＮおよび核の染色像を示す。
【図８Ｄ】クロモグリク酸ナトリウムのみ（Ｘ）、ニコチンアミドのみ（Ｎ）、ニコチンアミドおよびクロモグリク酸ナトリウム（ＮＸ）、デキサメタゾンのみ（Ｄ）、デキサメタゾンおよびクロモグリク酸ナトリウム（ＤＸ）、フォルスコリンのみ（Ｆ）、フォルスコリンおよびクロモグリク酸ナトリウム（ＦＸ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩのみ（Ａ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩおよびクロモグリク酸ナトリウム（ＡＸ）、４Ｆ、４Ｆおよびクロモグリク酸ナトリウム（４ＦＸ）を加えた条件で培養した後の細胞におけるβＡＣＴＩＮの発現量に対するＩＮＳＵＬＩＮの発現量の割合を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、膵前駆細胞をクロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程を含む、膵ホルモン産生細胞の製造方法を提供する。
【００１８】
当該膵ホルモン産生細胞を製造する培地には、クロモグリク酸ナトリウムの他に、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤、（ｆ）KGF、（ｇ）EGFおよび（ｈ）BMP阻害剤から成るからなる群より選択される少なくとも一種の薬剤をさらに含んでいてもよく、好ましくは、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイドおよび（ｄ）TGFβ阻害剤をさらに含む。
【００１９】
本発明において用いられる培地は、基礎培地に適宜物質を添加して作成される。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Improved MEM（invitrogen）、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、StemPro34（invitrogen）およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地としては、血清含有培地であっても、無血清培地でもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、1-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００２０】
クロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程は、膵前駆細胞を浮遊培養または接着培養のいずれの培養方法を採用してもよい。培地は、上述した基礎培地へクロモグリク酸ナトリウムを添加することによって作製される。好ましい基礎培地は、Ｂ-27サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ培地である。
【００２１】
クロモグリク酸ナトリウムは、１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ヒドロキシプロパンのナトリウム塩であり、例えば、Sigma社、和光純薬工業等から入手可能である。工程３で用いるクロモグリク酸ナトリウムの培地中の濃度は、通常０．００１から１００ｍＭ、好ましくは０．０１から５０ｍＭ、より好ましくは、０．０１から２０ｍＭである。特に好ましくは、１０ｍMである。
【００２２】
本発明において、浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養する態様である。特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させるための処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）した培養皿を使用して行うことができる。
【００２３】
接着培養を行う場合、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて培養してもよい。ここで、フィーダー細胞とは、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものであり、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ、ＳＮＬ）等）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、これらの断片、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される物質の例としては、アデニル酸シクラーゼ活性を有する化合物、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性を有する化合物、およびアデニル酸シクラーゼ活性とｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性とを併せ持つ化合物等が挙げられる。より具体的には、フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ、ＰＡＣＡＰ２７(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide 27)、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）等が挙げられる。好ましくは、フォルスコリンである。
【００２５】
アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される物質としてフォルスコリンを用いる場合の培地中の濃度は、通常０．１から５０μＭ、好ましくは２から５０μＭである。
【００２６】
ニコチンアミドの培地中の濃度は、０．１から２０ｍＭ、好ましくは５から２０ｍＭである。
【００２７】
ステロイドは、例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン等が挙げられる。なかでもデキサメタゾンが好適に用いられる。ステロイドとしてデキサメタゾンを使用する場合の培地中の濃度は、通常０．１から５０μＭ、好ましくは２から５０μＭである。ステロイドとしてヒドロコルチゾンを使用する場合の培地中の濃度は、通常０．１から１００μＭ、好ましくは１から５０μＭである。ステロイドとしてベタメタゾンを使用する場合の培地中の濃度は、通常０．１から５０μＭ、好ましくは０．５から２０μＭである。ステロイドとしてベクロメタゾンを使用する場合の培地中の濃度は、通常０．１から５０μＭ、好ましくは０．２から２０μＭである。
【００２８】
TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、SB202190（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェノール）(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２−［３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］−１，５−ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［６−メチル−ピリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］−キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。クロモグリク酸ナトリウムを含む培地へ添加される好ましいTGFβ阻害剤は、ALK5阻害剤IIである。TGFβ阻害剤として、ALK5阻害剤IIを使用する場合の培地中の濃度は、通常０．５から１００μＭ、好ましくは１から５０μＭ、より好ましくは、１から１０μＭである。
【００２９】
KGFは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、FGF-7と呼ばれることもある。本発明で用いるKGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
【００３０】
EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。本発明で用いるEGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
【００３１】
BMP阻害剤は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN-193189（すなわち、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）が例示される。DorsomorphinおよびLDN-193189は市販されており、それぞれSigma-Aldrich社およびStemgent社から入手可能である。
【００３２】
培養日数は、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上の培養であり、好ましくは、４日以上２０日未満であり、より好ましくは、８日以上１６日以下である。
【００３３】
本発明における膵前駆細胞とは、膵ホルモン産生細胞へと誘導される能力を有する細胞を意味する。このような細胞は、PDX1を発現し、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリンが発現していない細胞として特徴づけることもできる。本発明において、膵前駆細胞は、生体内から単離することによって得られても良く、多能性幹細胞から誘導することによって得ても良い。
【００３４】
多能性幹細胞から膵前駆細胞を得る場合、次の（１）から（２）の工程を含む方法が例示される。
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程、および
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）BMP阻害剤、および（ｃ）TGFβ阻害剤からなる群より選択される１種を含む培地で培養する工程。
【００３５】
すなわち本発明は、次の（１）から（３）の工程を含む、多能性幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法も提供する。
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）BMP阻害剤、および（ｃ）TGFβ阻害剤からなる群より選択される１種を含む培地で培養する工程
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、（クロモグリク酸ナトリウムを含む培地で培養する工程。
【００３６】
多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。多能性幹細胞として胚の破壊を行わずに得られるという観点から、iPS細胞またはMuse細胞を用いることが好ましい。多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞である。
【００３７】
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
【００３８】
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)。
【００３９】
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４０】
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、5% CO2/95% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
【００４１】
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４２】
ヒトＥＳ細胞株は、種々の研究機関より入手可能である。例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
【００４３】
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４４】
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４５】
(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４６】
初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
【００４７】
タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００４８】
DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４９】
初期化因子がRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００５０】
iPS細胞誘導のための培養液は、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが例示される。
【００５１】
iPS細胞誘導の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
【００５２】
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、Laminin-10（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００５３】
この他にも、血清を含有しない培地を用いてiPS細胞を樹立する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００５４】
iPS細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool・ (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等が知られている。iPS細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
【００５５】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００５６】
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
【００５７】
本明細書ならびに請求の範囲で使用する「体細胞」なる用語は、精子、精母細胞、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化多能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全個体の体細胞もしくは疾患を有する個体の体細胞のいずれも包含される。また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は分化した細胞、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等が例示される。
【００５８】
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している  （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００５９】
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞である。詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞である。Muse細胞はSSEA-3およびCD105が陽性である。
【００６０】
膵ホルモン産生細胞とは、膵ホルモンを産生する能力を有する細胞を意味する。ここで、膵ホルモンとは、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリンが挙げられる。膵ホルモン産生細胞は常に膵ホルモンを産生している必要はなく、膵ホルモンの産生能力を有していればよい。また、産生される膵ホルモン量は特に限定されない。膵ホルモン産生細胞としては、例えば、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞および膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞が挙げられる。
【００６１】
多能性幹細胞から膵前駆細胞を誘導する方法は、以下の工程１および工程２を含む工程によって行い得る。
【００６２】
＜工程１＞多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
多能性幹細胞は通常接着培養にて培養された形態にて提供される。工程１において、多能性幹細胞を任意の方法で分離して浮遊培養を行っても、あるいはフィーダー細胞上やコーティング処理された培養皿を用いて接着培養を行ってもよい。
【００６３】
ヒト多能性幹細胞の分離方法としては、従来公知の接着培養細胞の分離方法を適宜採用すればよく、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Accutase(TM)）を用いてヒト多能性幹細胞を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。工程１に供されるヒト多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して80％以上コンフルエントになるまで培養されたコロニーであることが好ましい。
【００６４】
工程１において接着培養を行う場合、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて培養してもよい。ここで、フィーダー細胞とは、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものであり、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ、ＳＮＬ）等）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６５】
工程１は、培養中の多能性幹細胞の培地を交換する、または多能性幹細胞を分離して、所定の培地を投入した接着培養用もしくは浮遊培養用培養皿へ移すことによって開始される。培地は、上述した基礎培地へアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、およびＧＳＫ３阻害剤を添加することによって作製される。好ましい基礎培地は、B27サプリメントを含むRPMI 1640培地または血清を含むRPMI 1640培地である。
【００６６】
アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とは、ＡＬＫ−４および／又はＡＬＫ−７に対し活性化作用を有する物質であり、例えば、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが挙げられる。好ましくは、アクチビンである。アクチビンには、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢが知られているが、工程１においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンも使用することができる。工程１に用いるアクチビンとしては特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。工程１に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
【００６７】
工程１において、アクチビンを用いる場合、培地中の濃度は、通常０．１から２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５から１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０から１００ｎｇ／ｍｌである。
【００６８】
ＧＳＫ３阻害剤とは、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK−3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン）、SB415286（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。工程１で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００６９】
工程１において、CHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、特に好ましくは１μＭから５μＭである。
【００７０】
工程１において、さらにROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００７１】
本発明において、ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから50μM、さらに好ましくは、5μＭから20μMである。ROCK阻害剤は、培養開始時の細胞死を防ぐためとの意図、より詳細には、多能性幹細胞を分離時の細胞死を防ぐためとの意図から、培養期間を通して添加されている必要はなく、培養開始時の１日間または2日間に添加されることで良い。
【００７２】
工程１での培養日数は、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上の培養である。培養が長期にわたることによる特段の不都合は無く、培養日数の上限は特に無い。培養日数は例えば５日以上１２日以下であり、好ましくは、５日である。
【００７３】
＜工程２＞レチノイン酸受容体アゴニスト、BMP阻害剤、およびTGFβ阻害剤からなる群より選択される１種を含む培地で培養する工程
工程２は、前記工程１に続いて行われる。工程１にて得られた細胞を別の培養容器に移して培養しても、同じ培養容器にて培地を交換して培養してもよい。工程２においては浮遊培養、接着培養のいずれの培養方法を採用してもよい。工程１にて接着培養を行い、工程２を別の培養容器にて行う場合は、工程１で得られた細胞を任意の方法で分離して移せばよい。工程２の培地は、上述した基礎培地へレチノイン酸受容体アゴニスト、BMP阻害剤、およびTGFβ阻害剤を添加することによって作製される。好ましい基本培地は、Ｂ-27サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ培地である。
【００７４】
工程２において用いられるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストは、天然に存在するレチノイドであっても、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物やレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってもよい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス−レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９−シス−レチノイン酸（９−シスＲＡ）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号、米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Ａｍ８０、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ５５６４９が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要  ９：５５−６１、２００９年）。工程２で用いるＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、ＡＭ５８０（４−［［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］カルボキシアミド］ベンゾイックアシッド）、ＴＴＮＰＢ（４−［［Ｅ］−２−［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］−１−プロペニル］ベンゾイックアシッド）、ＡＣ５５６４９（４’−オクチル−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキシリックアシッド）であり、さらに好ましくはレチノイン酸である。
【００７５】
工程２において、ＲＡＲアゴニストとしてレチノイン酸を用いる場合の培地中の濃度は、通常０．１から１００μＭ、好ましくは０．５から１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＴＴＮＰＢを用いる場合の培地中の濃度は、通常０．０２から２０μＭ、好ましくは０．０５から１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＡＭ５８０を用いる場合の培地中の濃度は、通常０．０２から２０μＭ、好ましくは０．０５から１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＡＣ５５６４９を用いる場合の培地中の濃度は、通常０．０２から２０μＭ、好ましくは０．１から１０μＭである。
【００７６】
工程２において用いられ得るBMP阻害剤は、上述したBMP阻害剤が例示され、好ましくはDorsomorphinであり得る。
【００７７】
工程２において、BMP阻害剤としてDorsomorphinを用いる場合の培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１から１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから５μＭである。
【００７８】
工程２において用いられ得るTGFβ阻害剤は、上述したTGFβ阻害剤が例示され、好ましくは、SB431542であり得る。
【００７９】
工程２において、TGFβ阻害剤としてSB431542を用いる場合の培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１から５０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから２０μＭである。
【００８０】
工程２において、TGFβ阻害剤の代わりにKGFを用いることができる。工程２でKGFを用いる場合であっても、上述と同様に濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
【００８１】
工程２での培養日数は、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上の培養である。培養が長期にわたることによる特段の不都合は無く、培養日数の上限は特に無い。培養日数は例えば６日以上１２日以下であり、特に好ましくは、６日である。
【００８２】
本発明で得られる膵ホルモン産生細胞は、例えば、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、および膵ポリペプチド産生細胞からなる群より選択され、各細胞は産出される膵ホルモンを確認することによって同定され得る。得られた膵ホルモン産生細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてよい。あるいは、G6PC2をコードする表面タグに特異的に結合する抗体（ＷＯ２０１０／０３７７８４、本文献は引用により本願の一部を構成する）を用いて、沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法(例えば、MACS)、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等により純化された集団を作成して用いてもよい。
【００８３】
膵ホルモンの発現としては、膵ホルモンタンパク質、膵ホルモンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ｍＲＮＡなど）の発現を確認することによって確認できる。膵ホルモンタンパク質の分泌は、公知の方法、例えば、膵ホルモンタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中や培地中などに存在する前記膵ホルモンタンパク質を、ウエスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法又はそれに準じる方法等により測定することができる。
【００８４】
膵ホルモンの発現量としては、膵ホルモンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡの発現量を調べることによって確認可能である。ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、Ｓ１マッピング法、ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップあるいはアレイ法又はそれに準じる方法に従って行われる。
【００８５】
本発明では、さらに、膵ホルモン産生細胞の誘導効率を高める薬剤をスクリーニングする以下の方法を提供する。
（１）膵前駆細胞を、クロモグリク酸ナトリウムおよび候補薬剤を含む培地で培養する工程、
（２）前記（１）で得られた細胞と、候補薬剤を含まない以外は同じ培地で培養した細胞の膵ホルモン発現量を測定する工程、および
（３）候補薬剤を含まない培地で培養して得た細胞と比べて、候補薬剤を含む培地で培養して得た細胞の膵ホルモン産生細胞数または膵ホルモンの発現量が上昇した場合、当該候補薬剤を膵ホルモン産生細胞の誘導効率を高める薬剤として選択する工程。
【００８６】
工程（１）において、さらに（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイド、および（ｄ）TGFβ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種をさらに含む培地で培養しても良く、より好ましくは、（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ニコチンアミド、（ｃ）ステロイド、および（ｄ）TGFβ阻害剤をさらに含む培地で培養する工程である。
【００８７】
候補薬剤としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、又は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられる。
【００８８】
本発明では、さらに、膵ホルモン分泌促進剤をスクリーニングする以下の方法を提供する。
（１）本発明の方法で膵ホルモン産生細胞を候補薬剤を含む培地で培養する工程、
（２）前記工程（１）で得られた細胞と、候補薬剤を含まない以外は同じ培地で培養した細胞の膵ホルモン発現量を測定する工程、および
（３）候補薬剤を含まない培地で培養した細胞と比較して、候補薬剤を含む培地で培養して得た細胞の膵ホルモンの発現量が上昇した場合、当該候補薬剤を膵ホルモン分泌促進剤として選択する工程。
【００８９】
膵ホルモン分泌促進剤のスクリーニング方法において、候補薬剤、膵ホルモンの発現量の測定は、上記と同様の物質または方法を用いることができる。
【００９０】
本発明では、さらに、上記の工程を用いて得られた膵ホルモン産生細胞を患者に移植することによって膵臓疾患の治療に用いることができる。よって本発明の方法により得られた膵ホルモン産生細胞を含有する、膵臓疾患の治療のための組成物も本願発明に含まれる。当該細胞は、移植前に、放射線を照射する、または、マイトマイシンＣなどの細胞増殖を抑止する薬剤によって処理されても良い。
【００９１】
膵臓疾患の治療は得られた膵ホルモン産生細胞を含む細胞群を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液を、患者の膵臓、腸間膜、脾臓および肝臓へ直接移植することによって行い得る。移植の際、当該細胞は、ポリエチレングリコール、ゼラチン、またはコラーゲン等の足場材と共に投与しても良い。投与する細胞数は、例えば、１×１０８から１×１０１０細胞／個体、好ましくは、５×１０８から１×１０１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０９から１×１０１０細胞／個体である。
【００９２】
iPS細胞は移植用膵ホルモン産生細胞の材料として特に好適に用いられる。得られた膵ホルモン産生細胞を移植する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型と同一もしくは実質的に同一である体細胞から得たiPS細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
【実施例】
【００９３】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００９４】
クロモグリク酸ナトリウムの効果の検討
ヒトES細胞株KhES3は、京都大学より受領し、従来の方法で培養した（H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932、本文献は引用により本願の一部を構成する）。KhES3を次の工程に従ってインスリン産生細胞へと誘導した。分化誘導にあたり、ヒトES細胞株は、培養皿に対しておおよそ70％コンフルエントに増殖した細胞をCTK溶液（リプロセル）を用いて剥離させ、続いてAccutaseを用いて個々の細胞へと分離し、24well  plate （greiner）に2.0×105/wellにて播種して用いた。【００９５】
（第１工程）２％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）を添加して５日間培養した。この時、同じ培地で3日目と4日目に培地交換した。【００９６】
（第２工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)にDorsomorphin（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を添加して６日間培養した。この時、同じ培地で2日おきに培地交換した。【００９７】
（第３工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）（５μＭ）およびクロモグリク酸ナトリウム（０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ，１０ｍＭまたは２０μＭ）を添加してさらに１２日間培養した。この時、同じ培地で4日おきに培地交換した。【００９８】
得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗ブタ  インスリン・モルモットポリクローナル抗体/抗血清（Dako）を用いて染色しフローサイトメーターにてインスリン産生細胞数を検出したところ、クロモグリク酸ナトリウムを添加した場合、濃度依存的にインスリン陽性細胞の含有率が増加することが確認された。
【実施例２】
【００９９】
iPS細胞株での検討
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７（京都大学iPS細胞研究所より入手可能（Takahashi K et al, Cell. 2007 131:861-72.、本文献は引用により本願の一部を構成する））を用いて、次の工程に従ってインスリン産生細胞へと誘導した。分化誘導にあたり、ヒトiPS細胞株は、培養皿に対しておおよそ70％コンフルエントに増殖した細胞をCTK溶液を用いて剥離させ、続いてAccutaseを用いて個々の細胞へと分離し、24well  plateに2.0×105/wellにて播種して用いた。【０１００】
（第１工程）２％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）を添加して５日間培養した。この時、同じ培地で3日目と4日目に培地交換した。【０１０１】
（第２工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地にDorsomorphin（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を添加して６日間培養した。この時、同じ培地で2日おきに培地交換した。【０１０２】
（第３工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）およびクロモグリク酸ナトリウム（０.００１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ，１０ｍＭまたは２０ｍＭ）を用いてさらに１２日間培養した。この時、同じ培地で4日おきに培地交換した。【０１０３】
上述と同様の方法でインスリン陽性細胞の含有率をフローサイトメーターを用いて測定したところ、クロモグリク酸ナトリウムの濃度が、１ｍＭ以上において、含有率が高くなることが確認され、１０ｍＭにおいて含有率が最大になった（図１Ａ）。このとき、免疫染色像によりインスリンの産生が確認された（図１Ｂ）。さらに、プロインスリンからプロセシングにより得られるＣペプチドについても同様に、Anti C-Peptid,human（PENINSULA LABORATORIES LLC.）を用いて染色し、フローサイトメーターを用いて測定したところ、クロモグリク酸ナトリウムの濃度依存的に上昇することが確認された（図１Ｃ）。
【実施例３】
【０１０４】
各条件検討
３種の繊維芽細胞由来のiPS細胞株（４１８C１および４０９Ｂ２（Okita K, et al, Nat Methods. 2011 8:409-412）および２０１Ｂ７）は、京都大学iPS細胞研究所より入手可能である。京都大学より入手したこれらのiPS細胞株を用いて、上記と同様の工程（ただし、工程３におけるクロモグリク酸ナトリウムの濃度は、１０ｍＭとした）により、インスリン陽性細胞へと分化誘導した。【０１０５】
その結果、３種のiPS細胞株いずれから出発した場合においても、（第３工程）にてクロモグリク酸ナトリウムを添加によりインスリン陽性細胞の含有率が高くなった（図２Ａ）。【０１０６】
また、２０１Ｂ７を用いて、（第３工程）の期間を４日、８日、１２日、１６日および２０日間行ったところ、８日間、１２日間および１６日間行った場合にインスリン陽性細胞への分化誘導効率が高くなった。このとき１２日間行った場合が最も効率が高かった。一方、４日間行った場合においても、効率は低いが、クロモグリク酸ナトリウムの効果が少し見られた（図２Ｂ）。【０１０７】
同様に、２０１Ｂ７を用いて、（第３工程）を１２日間行った後の細胞をKi67で染色を行い、細胞の増殖能を評価した。その結果、細胞増殖マーカーであるKi67陽性細胞数に差が見られないことから、クロモグリク酸ナトリウムの添加によりインスリン陽性細胞の増殖能が高くなっている所見は見られなかった（図３）。また、この時の得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、monoclonal anti-glucagon cloneK79bB10（SIGMA）を用いてフローサイトメーターでグルカゴン陽性細胞数を調べたところ、クロモグリク酸ナトリウム添加によりインスリン陽性細胞およびグルカゴン陽性細胞の含有率が高くなっていることが確認された（図４）。【０１０８】
以上より、上記工程によるクロモグリク酸ナトリウムの添加により、インスリン産生細胞のみならずグルカゴン産生細胞の分化誘導も促進し、この効果はインスリン産生細胞の増殖によりもたらされる効果ではないことが確認された。
【実施例４】
【０１０９】
別工程での検討
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７を用いて、次の工程に従ってインスリン産生細胞へと誘導した。分化誘導にあたり、ヒトiPS細胞株は、培養皿に対しておおよそ80-90％コンフルエントに増殖した細胞をCTK溶液を用いて剥離させ、続いてAccutaseを用いて個々の細胞へと分離し、マトリゲルをコートした24well  plateに2.0×105/wellにて播種して用いた。【０１１０】
（第１工程）１％のＢ−２７を含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（1μＭ）、Ｙ−２７６３２（1０μＭ）を添加して２日間培養した。その後、１％のＢ−２７を含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（1μＭ）を添加した培地にてさらに３日間培養した（Ｄａｙ５）。この時、同じ培地で3日目（Ｄａｙ３）と4日目（Ｄａｙ４）に培地交換した。【０１１１】
（第２工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地にDorsomorphin（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を添加して６日間培養した（Ｄａｙ１１）。この時、同じ培地で2日おきに培地交換した。【０１１２】
（第３工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）およびクロモグリク酸ナトリウム（１０ｍＭ）を添加した培地を用いてさらに８日間培養した（Ｄａｙ１９）。この時、同じ培地で4日おきに培地交換した。これらの工程を図５Ａに示す。【０１１３】
各工程（Ｄａｙ０、Ｄａｙ５、Ｄａｙ１１、Ｄａｙ１９）で得られた細胞を回収し、ＰＣＲを用いて各マーカー遺伝子の発現を確認した（図５Ｂ）。第３工程でクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合では、ＮＧＮ３およびＧＨＲＥ（グレリン）の発現が確認された。また、ＳＳＴ（ソマトスタチン）の発現は、第３工程でクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合において添加しなかった場合と比べて発現が高いことが確認された。【０１１４】
さらに、免疫染色により各マーカー遺伝子のタンパク質の産生を確認した（図５Ｃ）。また、第３工程でクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合としなかった場合におけるにおけるインスリン産生量を比較したところ、クロモグリク酸ナトリウムを添加した方がその産生量が高いことが確認された（図５Ｄ）。【０１１５】
免疫染色により膵ホルモンの発現を確認した（図６ＡおよびＢ）。その結果、第３工程でクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの発現がより高くなることが確認された。【０１１６】
以上より、第３工程を8日間行った工程によっても、膵ホルモン産生細胞への誘導ができることが確認された。
【実施例５】
【０１１７】
胎児細胞からのインスリン産生細胞への誘導への影響の検討
Insulinのプロモーター下にGFPを発現するマウスの胎児E12.5、E14.5およびE16.5の膵原基を抽出し、それぞれを１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）およびクロモグリク酸ナトリウム（１０ｍＭ）を添加した培地中で、４日間浮遊培養した。その模式図を図７Ａに示す。【０１１８】
その結果、いずれの胎児膵原基においてもクロモグリク酸ナトリウムを添加した場合において、GFPの陽性細胞率が高くなることが確認された（図７Ｂ）。さらに、得られた細胞をPCRによりＩｎｓｕｌｉｎおよびＮｅｕｒｏｇ３の発現量を確認したところ、クロモグリク酸ナトリウムを添加した場合において発現量が高くなることが確認された（図７Ｃ）。【０１１９】
以上より、クロモグリク酸ナトリウムは、生体内の膵原基細胞からインスリン産生細胞への誘導を促進させる効果を有することが確認された。
【実施例６】
【０１２０】
クロモグリク酸ナトリウム単剤での効果の検討
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７を用いて、次の工程に従ってインスリン産生細胞へと誘導した。分化誘導にあたり、ヒトiPS細胞株は、培養皿に対しておおよそ80-90％コンフルエントに増殖した細胞をCTK溶液を用いて剥離させ、続いてAccutaseを用いて個々の細胞へと分離し、マトリゲルをコートした24well  plateに2.0×105/wellにて播種して用いた。【０１２１】
（第１工程）１％のＢ−２７を含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を添加して２日間培養した。その後、１％のＢ−２７を含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を添加して、さらに３日間培養した（Ｄａｙ５）。この時、同じ培地で3日目（Ｄａｙ３）と4日目（Ｄａｙ４）に培地交換した。【０１２２】
（第２工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地にDorsomorphin（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を添加して６日間培養した（Ｄａｙ１１）。この時、同じ培地で2日おきに培地交換した。【０１２３】
（第３工程）１％のＢ−２７を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)にクロモグリク酸ナトリウム（１０ｍＭ）を添加した培地を用いてさらに８日間培養した（Ｄａｙ１９）。この時、同じ培地で4日おきに培地交換した。これらの工程を図８Ａに示す。【０１２４】
得られた細胞を定量ＰＣＲを用いてβＡＣＴＩＮに対するＩＮＳＵＬＩＮの発現量を測定したところ、クロモグリク酸ナトリウムを添加した方がその発現量が高いことが確認された（図８Ｂ）。さらに、免疫染色においてもＩＮＳＵＬＩＮの陽性細胞が多いことが確認された（図８Ｃ）。【０１２５】
続いて、実施例４の第３工程で用いた４つの添加剤（フォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ））のうち１つの添加剤と組み合わせた場合の効果を確認したところ、発現量は少ないが、いずれの組み合わせにおいてもＩＮＳＵＬＩＮの発現が確認された。４つ全ての添加剤に対して添加した場合において、クロモグリク酸ナトリウムによるインスリン産生細胞への誘導効果がより高くなることが確認された。【０１２６】
以上より、クロモグリク酸ナトリウムは単剤で用いることでもインスリン産生細胞への誘導効率を高めることができると確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
以上詳述したように、本出願は、多能性幹細胞から膵ホルモン産生細胞を分化誘導する方法を提供する。本方法で製造された膵ホルモン産生細胞は、膵臓疾患、特に１型糖尿病の再生医療に使用され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【国際調査報告】
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