(57)【要約】  １，４−ジオキサン最大比分解速度に優れる構成型１，４−ジオキサン分解菌を提供することを課題とする。解決手段として、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌。
【請求項２】
請求項１に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌を含む懸濁液。
【請求項３】
請求項１に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌、または請求項２に記載の懸濁液を用いることを特徴とする水中の環状エーテル処理方法。
【請求項４】
請求項１に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌、または請求項２に記載の懸濁液を用いることを特徴とする土壌中の環状エーテル処理方法。
【請求項５】
前記環状エーテルが、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランの１種以上であることを特徴とする請求項３または４に記載の環状エーテル処理方法。
【請求項６】
ジエチレングリコールの存在下で行うことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の環状エーテル処理方法。
【請求項７】
１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸の１種以上を含有する培地を用いて培養することを特徴とする受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
【請求項８】
１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を含有する培地を用いて培養することを特徴とする受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成型１，４−ジオキサン分解菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。【０００３】
【化１】
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【０００４】
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。【０００５】
また、非特許文献１には、１，４−ジオキサンを含む産業排水には、１，４−ジオキサンの他に１，３−ジオキソラン及び２−メチル−１，３−ジオキソランといった環状エーテルが含まれていることが報告されている。特に１，３−ジオキソランは、急性毒性等の毒性が確認されており、１，３−ジオキソランを含む汚染水等は適切に処理しなければならない。【０００６】
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサン等の環状エーテルを十分に除去することができない。例えば、１，４−ジオキサンは、過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコスト及びランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献２には、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下することが報告されている。【０００７】
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサン等の環状エーテルを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献３では、１，４−ジオキサン分解菌による１，４−ジオキサン処理が提案されている。１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解する菌（資化菌）と、テトラヒドロフラン等の特定の基質の存在下にて１，４−ジオキサンを分解できる菌（共代謝菌）の２種類に大別される。そのため、地下水や排水等に含まれる１，４−ジオキサンを１，４−ジオキサン分解菌で処理する場合、特定の基質を添加する必要がない資化菌を活用する方が効率的である。【０００８】
資化菌はさらに１，４−ジオキサン分解酵素の誘導の有無によって、誘導型と構成型に分けられる。非特許文献４に記載されているように、誘導型１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンなどの誘導物質が存在することで分解酵素の生産・分泌がされるため、１，４−ジオキサン処理に用いる前に予め馴養する必要がある。一方、構成型１，４−ジオキサン分解菌は、常時、分解酵素を生産しているため、馴養することなく、直ちに１，４−ジオキサン処理に用いることができる。【０００９】
しかしながら、非特許文献３に記載されているように、構成型１，４−ジオキサン分解菌の１，４−ジオキサン最大比分解速度は、誘導型１，４−ジオキサン分解菌と比較して低いという問題がある。また、特許文献１、非特許文献３、４に開示されている１，４−ジオキサン分解菌が、１，４−ジオキサンの存在下において、その他の環状エーテルを分解できるか否かは知られていない。【００１０】
本願発明者らによる特許文献２には、ジエチレングリコールを含む培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やす１，４−ジオキサン分解菌の培養方法が提案されている。１，４−ジオキサン分解菌はジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコールを含有する培地を用いることにより、滅菌処理を行うことなく、他の微生物が生息している条件下でも優先的に増殖できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【特許文献２】特許第５８７７９１８号
【００１２】
【非特許文献１】CD. Adams, PA. Scaclan and ND. Secrist: Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-dioxane using hydrogen peroxide and ozone, Environ. Sci. Technol., 28(11), pp.1812-1818, 1994.
【非特許文献２】K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献３】清和成、池道彦：１，４−ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化技術の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011.
【非特許文献４】K. Sei, K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukasako, D. Inoue and M. Ike: Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source, Biodegradation, 24, 5, pp.665-674, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
１，４−ジオキサン最大比分解速度に優れる構成型１，４−ジオキサン分解菌を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１．受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌。
２．１．に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌を含む懸濁液。
３．１．に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌、または２．に記載の懸濁液を用いることを特徴とする水中の環状エーテル処理方法。
４．１．に記載の構成型１，４−ジオキサン分解菌、または２．に記載の懸濁液を用いることを特徴とする土壌中の環状エーテル処理方法。
５．前記環状エーテルが、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランの１種以上であることを特徴とする３．または４．に記載の環状エーテル処理方法。
６．ジエチレングリコールの存在下で行うことを特徴とする３．〜５．のいずれかに記載の環状エーテル処理方法。
７．１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸の１種以上を含有する培地を用いて培養することを特徴とする受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
８．１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を含有する培地を用いて培養することを特徴とする受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株である構成型１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
【発明の効果】
【００１５】
Ｎ２３株は、構成型１，４−ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産している。Ｎ２３株はこれまでに報告されている構成型の分解菌の中で最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有しており、ジオキサン分解能力に優れている。Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４−ジオキサンを処理することができる。また、１，４−ジオキサンのみならず、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテルの処理能力にも優れており、複数の環状エーテルを同時に処理することもできる。【００１６】
Ｎ２３株を用いて、水中、または土壌中の環状エーテルを処理することができる。構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株は、馴養することなく直ちに高い環状エーテル処理能力を発揮することができるため、簡易的で処理能力の高い汚染処理プロセスを構築することができる。Ｎ２３株はジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコールの存在下では、他の微生物が存在していてもＮ２３株の菌体量を高く維持することができる。そのため、ジエチレングリコールの存在下で環状エーテル処理を行うと、環状エーテル処理能力を高く保つことができる。また、ジエチレングリコールの存在下では、環状エーテル濃度が変動しても、環状エーテル処理能力を安定して高く保つことができる。【００１７】
炭素源としてジエチレングリコールを含む培地を用いると、１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物が存在していても、Ｎ２３株が優先的に増殖する。ジエチレングリコールを含む培地を用いることにより、Ｎ２３株を容易に、かつ、大量に培養することができ、環状エーテルで汚染された汚染水や汚染土壌等の処理に必要とされる大量の菌体を供給することができる。また、滅菌のための設備や薬品が不要なため、Ｎ２３株を非常に低コストで培養することができる。【００１８】
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸を、炭素源として利用する能力に優れており、これらを１種以上含有する培地を用いることにより、Ｎ２３株の増殖速度を速くすることができる。
さらに、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物と比較して、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として利用する能力に優れているため、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を主たる炭素源として含む培地を用いることにより、他の微生物を滅菌することなくＮ２３株を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｎ２３株のＳＥＭ画像。
【図２】Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列。
【図３】Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて作成した系統樹。
【図４】実施例２における１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図。
【図５】実施例３における初期の１，４−ジオキサン濃度と細胞収率の関係を示す図。
【図６】実施例４におけるＮ２３株（ａ）とＣＢ１１９０株（ｂ）を用いた系における１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図。
【図７】実施例５における初期の１，４−ジオキサン濃度に対する比分解速度を示す図。
【図８】実施例６における環状エーテル濃度の経時変化を示す図。
【図９】実施例７における炭素源毎の培養終了時の菌体濃度を示す図。
【図１０】実施例８における炭素源毎の培養終了時の菌体濃度を示す図。
【図１１】実施例８における炭素源毎の培養終了時の残存有機炭素濃度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
１，４−ジオキサン分解菌は自然界に存在しており、１，４−ジオキサンで汚染された水中や土壌中から採取した汚泥等を、炭素源として１，４−ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。上記したように、１，４−ジオキサン分解菌は、資化菌と共代謝菌の２種類に大別され、資化菌はさらに誘導型と構成型とに分けられる。
【００２１】
本発明の構成型１，４−ジオキサン分解菌（以下、Ｎ２３株という。）を１，４−ジオキサン汚染地下水から単離した。Ｎ２３株は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１５年４月１０日付で国際寄託されている。Ｎ２３株のＳＥＭ画像を図１に示す。Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。
【００２２】
Ｎ２３株は構成型１，４−ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産している。一般に構成型１，４−ジオキサン分解菌は誘導型１，４−ジオキサン分解菌と比較して低い１，４−ジオキサン最大比分解速度を示すが、Ｎ２３株はこれまでに報告されている構成型１，４−ジオキサン分解菌の中で最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有し、その値は誘導型１，４−ジオキサン分解菌と同等以上である。また、Ｎ２３株は１，４−ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４−ジオキサンを処理することができる。Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン等を用いて馴養する必要がなく、高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有し、１，４−ジオキサンを極低濃度まで分解することができ、高濃度の１，４−ジオキサンを処理することができるため、１，４−ジオキサンの生物処理に好適に利用することができる。
【００２３】
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンだけでなく、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテルを効率よく分解することができる。また、複数の環状エーテルを同時に処理することもできる。そのため、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテルの生物処理に好適に利用することができる。
【００２４】
Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡを、８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）とＵ１４９２Ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）とをプライマーとしたＰＣＲ増幅を行い、得られた生成増幅産物のシーケンス解析を行った。Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列を図２、及び配列表の配列番号１に示す。
【００２５】
Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列に対してＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）のＢＬＡＳＴ検索を行い相同性検索を行ったところ、Ｎ２３株は、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1（以下、Ｋ１株という。）と９９％と高い相同性を示した。ここで、Ｋ１株は１，４−ジオキサンを共代謝にて分解する共代謝菌である（S. Mahendra and L. Alvarez-Cohen: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria, Environ. Sci. Technol., 40 (17)
, pp 5435-5442, 2006.）。それに対し、Ｎ２３株は１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解する資化菌である。よって、Ｎ２３株は、Ｋ１株と９９％と高い相同性を示すが、Ｋ１株とは明らかに別種の菌である。１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて作成した系統樹を図３に示す。
【００２６】
Ｎ２３株を培養する培地としては、液体培地、または固体培地が挙げられる。培地としては、Ｎ２３株を培養できるものであれば特に限定されず、ＭＧＹ培地やＣＧＹ培地等の公知の培地を使用することができる。Ｎ２３株を大量に培養するためには液体培地を使用することが好ましく、液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量のＮ２３株を含む培養液を取り出す連続培養を行うことがさらに好ましい。
【００２７】
Ｎ２３株を培養する際には、必要な無機物質や有機物質を添加することができる。微生物の活動量は、必要な栄養素等の因子のうち、最も少ない因子によって制限されるため、不足する栄養素を添加することで、増殖を促進することができる。添加する無機物質としては特に制限されず、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌなどが挙げられる。また、添加する有機物質としては特に制限されないが、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンなどが好ましい。
【００２８】
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸を、炭素源として利用する能力に優れている。１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸の１種以上を含有する培地を用いることにより、Ｎ２３株の増殖速度を速くすることができる。培地中の上記した化合物の総濃度は特に限定されないが、１．０×１０−８ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下が好ましい。総濃度の下限値は、０．１ｗｔ％以上であることがより好ましく、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。総濃度の上限値は９．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、８．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、７．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。また、上記した化合物の総計が、培地中の全有機化合物量に対して、６０ｗｔ％以上であることが好ましく、８０ｗｔ％以上であることがより好ましく、９５ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、９９．９ｗｔ％以上であることが最も好ましい。
【００２９】
さらに、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物と比較して、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として利用する能力に優れているため、培地が、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を主たる炭素源として含むことがさらに好ましい。１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの総計が、培地中の全有機化合物量に対して、６０ｗｔ％以上であることが好ましく、８０ｗｔ％以上であることがより好ましく、９５ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、９９．９ｗｔ％以上であることが最も好ましい。
【００３０】
１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物は、Ｎ２３株と比較して、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として利用する能力に劣るため、これらを含む培地を用いてＮ２３株と１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物とを培養すると、Ｎ２３株が優先的に増殖する。すなわち、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を主たる炭素源として含む培地を用いてＮ２３株を培養すると、事前に滅菌処理を施さずとも、Ｎ２３株を培養することができる。滅菌が必要な培養方法は、装置の隅々まで滅菌することが困難であるため、大容量の装置を用いて培養を行うことが難しい。
それに対し、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を主たる炭素源として含む培地を用いたＮ２３株の培養は滅菌処理が不要なため、大規模スケールで培養することができ、環状エーテルで汚染された汚染水や汚染土壌等の処理に必要とされる大量の菌体を供給することができる。１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの１種以上を主たる炭素源として含む培地を用いると、他の微生物による汚染（コンタミネーション）が起こらないため、Ｎ２３株を容易に培養することができる。また、滅菌のための設備や薬品が不要なため、非常に低コストで培養することができる。
【００３１】
本発明のＮ２３株を用いて、工場排水、一般下水、地下水等の汚染水中、または産業廃棄物処理場、工場、不法投棄サイト等の汚染土壌中に含まれる環状エーテルを処理することができる。Ｎ２３株は、構成型１，４−ジオキサン分解菌であり、常時分解酵素を生産しているため、直ちに環状エーテル処理を開始することができる。Ｎ２３株は、培養液からろ別した菌体、凍結保存した菌体、Ｌ−乾燥保存した菌体、凍結乾燥した菌体、Ｎ２３株を樹脂等に固定化した固定化担体、あるいは培養液やその濃縮液等のＮ２３株を含む懸濁液等の任意の形態で環状エーテル処理に用いることができる。Ｎ２３株を環状エーテルで汚染された被処理物に接触させるだけで環状エーテルを処理することができるため、簡易的で処理能力の高い汚染処理プロセスを構築することができる。
【００３２】
Ｎ２３株により、汚染水中の環状エーテルを処理することができる。Ｎ２３株を用いた汚染水中の環状エーテル処理の方法は特に制限されず、例えば、曝気槽を用いる標準活性汚泥法における汚染水処理において、曝気槽にＮ２３株を、固定化担体や懸濁液等の形態で加えるだけで汚染水中の環状エーテルを処理することができる。Ｎ２３株を曝気槽に加えるだけで、環状エーテルの生物処理を行うことができるため、従来の標準活性汚泥法で用いられる設備をほとんどそのまま活用することができる。また、ジエチレングリコールを含む培地を用いることにより、Ｎ２３株を市販の装置を用いて容易に培養することができるため、汚染水処理現場で上記した連続培養を行い、Ｎ２３株を含む培養液を汚染水に連続的に注入することができる。
【００３３】
Ｎ２３株で処理される汚染水にジエチレングリコールを加えてもよい。この際、汚染水中におけるジエチレングリコール濃度が１．０×１０−８ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下となるように注入することが好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、０．１ｗｔ％以上であることがより好ましく、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は６．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、３．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、２．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。生物処理を行う汚染水中には多種多様な微生物が存在しているが、汚染水中にジエチレングリコールを加えることにより、汚染水中の全バイオマスに対するＮ２３株菌体量の割合を高く維持することができ、環状エーテルの処理能力を高く保つことができる。また、環状エーテル濃度が変動する汚染水中では、環状エーテル濃度が低くなるとＮ２３株の菌体量が減少するため、その後、環状エーテル濃度が高くなったときにＮ２３株の菌体量が不足して、汚染水中の環状エーテルが処理しきれないことがある。汚染水にジエチレングリコールを加えることにより、環状エーテル濃度が変動しても環状エーテル処理能力を安定して高く保つことができる。なお、ジエチレングリコールによる環境への悪影響はほとんど存在しない。
【００３４】
Ｎ２３株により、汚染土壌中の環状エーテルを処理することができる。この際、汚染土壌中におけるジエチレングリコール濃度が０．１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるように加えることが好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１ｗｔ％以上であることがより好ましく、２ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は８ｗｔ％以下であることがより好ましく、７ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、５ｗｔ％以下であることが最も好ましい。Ｎ２３株を用いた汚染土壌中の環状エーテル処理の方法は特に制限されず、汚染土にＮ２３株を加えて混合撹拌する、汚染土壌中にＮ２３株を含む懸濁液を注入する等の方法を挙げることができる。現場プラントの建設、土壌の掘削、無害化、埋め戻し等の工程が不要なため、土壌中にＮ２３株を含む懸濁液を注入することが好ましい。一般に土壌中には栄養素が不足しているため、汚染土壌中に炭素源、無機塩類等を注入することが好ましく、炭素源としてジエチレングリコールを注入することがさらに好ましい。土壌中にジエチレングリコールを加えることにより、土壌中の環状エーテルの処理を早めることができる。
【実施例】
【００３５】
［実施例１］
「Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列決定」
Ｎ２３株をＣＧＹ液体培地（カシトン５ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ）を用いて７日間培養した（２８℃、１２０ｒｐｍ）。この培養液を、１００００×ｇ、４℃、３分間遠心分離して集菌し、０．９％生理食塩水を用いて２回洗浄した。得られた洗浄菌体から、「西郷薫、佐野弓子共訳：分子生物学実験プロトコールＩ細菌ゲノムＤＮＡの調整 basic protocol 細菌ゲノムＤＮＡの少量調整（ミニレップ）, pp36-37, 丸善株式会社, 1997.」の記載に準じてＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。プライマーとして、８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）とＵ１４９２Ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いた。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１０分間保持した後、変性（９４℃、１分）、アニーリング（５８℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル行い、最後に１０分間、７２℃で保持した。
得られた増幅産物を、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。その後、標的のバンドを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit（QUIAGEN）を用いて精製を行い、得られた生成増幅産物に対してシーケンス解析を実施した。Ｎ２３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は図２に示した通りである。【００３６】
得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列に対してＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ検索を行い、相同性検索を行った。その結果、Ｎ２３株は、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1（Ｋ１株）と高い相同性を示し、その値は９９％であった。【００３７】
［実施例２］
「Ｎ２３株の１，４−ジオキサンの分解特性調査」
３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコにＣＧＹ培地（カシトン５ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ）を１００ｍＬ添加し、オートクレーブにて滅菌処理（１２１℃、１５分）を行った。その後、５００ｍｇ／Ｌになるように１，４−ジオキサンを添加してから、Ｎ２３株を一白金耳量植菌し、回転振盪培養（２８℃、１２０ｒｐｍ）を７日間行った（前々培養）。
培養後、５００ｍｇ／Ｌの１，４−ジオキサンを含んだＣＧＹ培地に植え継ぎ、同様の条件にて培養を行った（前培養）。
前培養にて得られた培養液を遠心分離によって集菌・回収し、無機塩培地（組成：１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ：７．３）を加えて、菌体の洗浄を行った。【００３８】
無機塩培地にて菌体を懸濁したものを植菌液とした。
１００ｍＬ無機塩培地に植菌液を添加した後、１．２５ｍｇ／Ｌになるように１，４−ジオキサンを添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて回転振盪培養を行った（ｎ＝３）。なお、事前に植菌液におけるタンパク質濃度をPR.Meyersらの方法に準じて測定し（PR. Meyers, WR. Bourn, LM. Steyn, PD. van Helden, AD. Beyers, and GD. Brown: Novel method for rapid measurement of growth of mycobacteria in detergent-free media, J Clin Microbiol., 36(9),  pp.2752-2754, 1998）、試験開始時のタンパク質濃度を３０ｍｇ／Ｌになるように調製した。培養は１２時間行い、２時間ごとに溶液中の１，４−ジオキサン濃度をヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所：ＧＣ／ＭＳ−ＱＰ２０１０  ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ  ＨＳ４０  以下、ヘッドスペースＧＣ／ＭＣという。）にて測定した。また、比較としてＮ２３株を添加していない実験系も実施した。【００３９】
図４に、１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す。Ｎ２３株を添加した実験系では、時間の経過とともに１，４−ジオキサン濃度の低下が確認され、培養１０時間後には０．０３３ｍｇ／Ｌ、１２時間後には０．０１７ｍｇ／Ｌとなった。それに対し、Ｎ２３株を添加していない実験系では、１，４−ジオキサン濃度はほとんど減少せず、培養１２時間後の濃度は１．１５ｍｇ／Ｌであった。このことから、Ｎ２３株は１，４−ジオキサンを極低濃度域まで分解できる１，４−ジオキサン分解菌であることが確かめられた。【００４０】
［実施例３］
「１，４−ジオキサンによるＮ２３株の増殖性確認」
実施例２で作製したＮ２３株の植菌液１ｍＬを、無機塩培地１９ｍＬに添加した後、所定の濃度になるように１，４−ジオキサンを添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて回転振盪培養を行った（ｎ＝３）。培養は６時間行い、培養前後における１，４−ジオキサン濃度をヘッドスペースＧＣ／ＭＳにて測定するとともに、実施例２で示した方法に準じてタンパク質濃度を測定した。１，４−ジオキサンの分解量に対する増加したタンパク質量の割合を細胞収率として算出した。図５に、初期の１，４−ジオキサン濃度と細胞収率の関係を示す。【００４１】
全ての実験系においてタンパク質量の増加が確認でき、Ｎ２３株が、１，４−ジオキサンを炭素源として増殖していることが確かめられた。特に、初期１，４−ジオキサン濃度が約５４０ｍｇ／Ｌの実験系において、０．３７ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｇ−１，４−ｄｉｏｘａｎｅと優れた増殖性を示した。また、初期１，４−ジオキサン濃度が約５２００ｍｇ／Ｌの実験系において、細胞収率の値は０．０２５ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｇ−１，４−ｄｉｏｘａｎｅを示し、Ｎ２３株が高濃度の１，４−ジオキサン条件下でも増殖していることが確かめられた。すなわち、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンを高濃度で含んだ汚染水を処理できることが明らかとなった。
以上の結果から、Ｎ２３株は１，４−ジオキサンを単一炭素源として増殖できる資化菌であることが示された。実施例１の結果から、Ｎ２３株は、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1と類菌種と推定されたが、Ｎ２３株は資化菌、Ｋ１株は共代謝菌であるため、Ｎ２３株とＫ１株とは異なる菌である。【００４２】
［実施例４］
「Ｎ２３株の１，４−ジオキサン分解酵素の誘導性調査」
実施例２に記載の前培養において１，４−ジオキサンを添加する系（誘導系）と、添加しない系（非誘導系）で、作成した植菌液を用いて分解試験を実施した。１，４−ジオキサン分解菌として、Ｎ２３株と、公知の誘導型１，４−ジオキサン分解菌であるPseudonocardia dioxanivorans CB1190（以下、ＣＢ１１９０株という。）を用いた。なお、ＣＢ１１９０株は、米国ＡＴＣＣから購入した（ＡＴＣＣ  ５５４８６）。【００４３】
実施例２で示した方法に準じ、試験開始時のタンパク質濃度が１０ｍｇ／Ｌになるように植菌液を調製した。１９ｍＬ無機塩培地に植菌液１ｍＬを添加した後、所定の濃度になるように１，４−ジオキサンを添加した（ｎ＝３）。実験期間中には、適宜サンプリングを行い、ヘッドスペースＧＣ／ＭＳを用いて１，４−ジオキサン濃度を測定した。図６（ａ）にＮ２３株、図６（ｂ）にＣＢ１１９０株を用いた系における１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す。【００４４】
図６（ｂ）に示すように、ＣＢ１１９０株を１，４−ジオキサンを添加しないＣＧＹ培地にて培養した系（非誘導系）では、緩やかな１，４−ジオキサン濃度の低下が確認できた。一方で、１，４−ジオキサンを添加して培養した系（誘導系）では、非誘導系と比べて１，４−ジオキサン濃度は低い値を示し、分解速度が速いことが確認された。この分解速度の違いは、前培養における１，４−ジオキサンによる分解酵素の誘導の有無によって生じたものであると考えられ、ＣＢ１１９０株の１，４−ジオキサン分解酵素は誘導酵素であることが確かめられた。ＣＢ１１９０株の分解酵素の誘導性についてはＫｅｌｌｅｙらによっても報告されている（SL. Kelley, EW. Aitchison, M. Deshpande, JL. Schnoor, PJ. Alvarez.: Biodegradation of 1,4-dioxane in planted and unplanted soil: effect of bioaugmentation with Amycolatasp. CB1190, Water Res. , 35(16), pp.3791-800, 2001.）。【００４５】
一方、図６（ａ）に示すように、Ｎ２３株は、非誘導系及び誘導系において、１，４−ジオキサン濃度の推移に顕著な差は確認できなかった。同様の結果については、上記非特許文献４で報告されており、このような挙動を示す菌は構成型に分類される。そのため、Ｎ２３株は、構成型の１，４−ジオキサン分解菌であることが確かめられた。また、Ｎ２３株は、誘導系のＣＢ１１９０株と比較して、１，４−ジオキサン分解能に優れていた。【００４６】
［実施例５］
「Ｎ２３株の１，４−ジオキサン最大比分解速度測定」
実施例２の手順で作成した植菌液を用いて分解試験を行った。１９ｍＬ無機塩培地に植菌液１ｍＬ添加した後、所定濃度になるように１，４−ジオキサンを添加し、２８℃、１２０ｒｍｐにて回転振盪培養を８時間行った。実験は、初期の１，４−ジオキサン濃度を１１、１０７、２５８、５６４及び１１３６ｍｇ／Ｌとし、各系においてｎ＝２にて実施した。実験期間中には１時間もしくは２時間ごとにサンプリングを行い、１，４−ジオキサン濃度をヘッドスペースＧＣ／ＭＳにて測定した。それらの平均値から１，４−ジオキサン濃度の経時変化をグラフ化し、それぞれの傾き（時間あたりの１，４−ジオキサン分解量）に対して実験開始時のタンパク質量で割ることにより比分解速度を求めた。なお、比分解速度は、Ｎ２３株を添加していない実験系を実施し、揮発による１，４−ジオキサンの減少量を差し引いて算出した。実施例２で示した方法に準じ、初期のタンパク質濃度は、１２８〜２０６ｍｇ／Ｌとした。また、ＣＢ１１９０株に対しても同様に測定した。【００４７】
図７に、初期の１，４−ジオキサン濃度に対する比分解速度を示す。
基質が低濃度のときは濃度に比例的に増加するが、基質濃度がある程度まで高くなると頭打ちとなり、最大比分解速度に漸近していくような、典型的なMonod式に従うことが明らかになった。この解析結果から、各菌株における最大比分解速度を求めたところ、ＣＢ１１９０株における最大比分解速度は、０．０５１ｍｇ−１，４−ｄｉｏｘａｎｅ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｈを示した。一方で、Ｎ２３株の最大比分解速度は、０．２１６ｍｇ−１，４−ｄｉｏｘａｎｅ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｈを示し、ＣＢ１１９０株のおよそ４．２倍の値であった。また、上記非特許文献３において、清らは、１，４−ジオキサン分解菌の最大比分解速度の調査を実施している。表１に、実施例５の結果、及び上記非特許文献３に記載されている各菌株とそのタイプ、及び最大比分解速度を示す。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４−ジオキサン分解菌よりも２．３〜４．２倍も高い最大比分解速度を有していた。また、その値は誘導型１，４−ジオキサン分解菌と同等以上であった。Ｎ２３株は、これまで報告されている構成型の１，４−ジオキサン分解菌と比較して高い最大比分解速度を有する菌株であることが確かめられた。【００４８】
【表１】
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【００４９】
［実施例６］
「Ｎ２３株による１，３−ジオキソラン及び２−メチル−１，３−ジオキソランの分解調査」
構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株が、１，３−ジオキソランと２−メチル−１，３−ジオキソランとを分解可能であるか確認する実験を行った。分解試験では、１９ｍＬ無機塩培地に植菌液１ｍＬを添加した後、所定の濃度になるように１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン及び２−メチル−１，３−ジオキソランの３種の環状エーテルを添加した（ｎ＝３）。実験期間中には、適宜サンプリングを行い、ヘッドスペースＧＣ／ＭＳを用いて１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソランの濃度を測定した。なお、実施例２で示した方法に準じて、試験開始時のタンパク質濃度がおよそ９０ｍｇ／Ｌになるように事前に植菌液を調製した。【００５０】
図８に、各環状エーテル濃度の経時変化を示す。実験開始直後から、全ての環状エーテル濃度が低下することが確かめられた。すなわち、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソランを同時に分解することができ、複数種の環状エーテルの処理に利用できることが確認できた。【００５１】
［実施例７］
「炭素源の違いによるＮ２３株の増殖性確認」
Ｎ２３株をＣＧＹ液体培地（カシトン５ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ）を用いて７日間培養した（２８℃、１２０ｒｐｍ）。この培養液を、１００００×ｇ、４℃、３分間遠心分離して集菌し、０．９％生理食塩水を用いて２回洗浄した。その後、０．９％生理食塩水を用いて、所定濃度になるように菌体を懸濁して植菌液を作成した。【００５２】
３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに、無機塩培地（組成：１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ：７．３）を１００ｍＬ添加し、１２１℃、１５分間、オートクレーブを行った。その後、１ｇ／Ｌになるように炭素源を加えてから、Ｎ２３株の植菌液を添加し（初期菌体濃度：２４４ｍｇ−ｄｒｙ／Ｌ）、２８℃、１２０ｒｐｍにて、回転振盪培養を行った（ｎ＝２）。なお、炭素源としては、１，４−ジオキサン、ジエチレングリコール、グルコース、乳酸をそれぞれ用いた。試験開始から４日目に培養を終了し、吸引ろ過にて溶液中の菌体をろ物として回収し、１０５℃で一晩乾燥させた後、菌体重量を測定することで培養終了時の菌体濃度（ｍｇ／Ｌ）を求めた。図９に炭素源毎の培養終了時の菌体濃度を示す。【００５３】
全ての炭素源においてＮ２３株の増殖が確認でき、特にグルコースで培養した系において、培養４日後の菌体濃度が最も高くなった。しかしながら、グルコースは他の微生物も増殖基質として利用可能であることから、他の微生物が存在する環境下においてグルコースを炭素源としてＮ２３株を優先的に増殖することは困難である。一方、ジエチレングリコールは、上記特許文献２で報告されているように、１，４−ジオキサン分解菌を特異的に増殖させることが可能である。Ｎ２３株は、ジエチレングリコールを炭素源として利用可能であるから、ジエチレングリコールを用いてＮ２３株を他の微生物よりも優先的に増殖させることができる。【００５４】
［実施例８］
「炭素源の違いによるＮ２３株の増殖性確認２」
Ｎ２３株を、ＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ、ｐＨ  ７．３）を用いて２週間培養した。この培養液を、１００００×ｇ、４℃、３分間遠心分離して集菌し、無機塩培地（組成：１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ：７．３）を用いて二回洗浄した。
５０ｍｌ容量のバイアル瓶に、炭素源を１００ｍｇ−Ｃ／Ｌ含む無機塩培地を２０ｍＬ添加した後、Ｎ２３株を５０ｍｇ−ｃｅｌｌ／Ｌになるように添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて、回転振盪培養を行った（ｎ＝３）。炭素源としては、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、グリオキサール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、フェノール、テトラヒドロフラン、グルコース及び酢酸を用いた。
７日間培養後、ガラス繊維ろ紙  （ＧＦ／Ｂ，  Ｗｈａｔｍａｎ，  直径  ４７ｍｍ）を用いて、培養液中の固形分を回収し、１０５℃にて乾燥させて菌体濃度を測定した。また、ろ過によって回収した溶液に残存する全有機炭素濃度をＴＯＣ計により測定した。なお、比較として炭素源を添加しないブランク系も同様に試験を行った。菌体濃度を図１０に、残存有機炭素濃度を図１１に示す。【００５５】
培養７日後における菌体濃度は、グリオキサール、トリエチレングリコール及びフェノールを用いた実験以外は、大きく上昇した。特に、１，４−ジオキサン、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール及びグルコースにおいては、高い菌体濃度を示した。また、残存有機炭素濃度は、明確な菌体増殖を確認できた実験系では、低い値を示した。以上の結果から、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース及び酢酸を炭素源として用いて増殖できることが示された。そのため、これらの炭素源を用いることで、Ｎ２３株を効率良く培養できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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