(57)【要約】魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する組織接着剤とする。
2014112208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、
前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有することを特徴とする組織接着剤。
【請求項２】
前記接着成分の前記魚由来ゼラチンが、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンであることを特徴とする請求項１に記載の組織接着剤。
【請求項３】
前記魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖としていることを特徴とする請求項１に記載の組織接着剤。
【請求項４】
前記疎水化魚由来ゼラチンはＬｙｓを含み、かつ、Ｌｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されていることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
【請求項５】
前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
【請求項６】
前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラに由来する魚由来ゼラチンであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項７】
前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満であることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
【請求項８】
前記水溶性架橋用分子が、Polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate、Pentaerythritol poly（ethylene glycol） ether tetrasuccinimidyl glutarate、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸の群から選ばれる１種または２種以上の組合せであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項９】
前記魚由来ゼラチン水溶液に用いる水溶媒および前記水溶性架橋用分子水溶液に用いる水溶媒は、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項１０】
前記接着成分として、さらに、疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有することを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
【請求項１１】
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液が、常温で液体状であることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
【請求項１２】
構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して疎水化魚由来ゼラチン水溶液を得て、この疎水化魚由来ゼラチン水溶液含む接着成分を調製する工程と、
分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
を含むことを特徴とする組織接着剤の製造方法。
【請求項１３】
前記接着成分を調製する工程は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組織接着剤の製造方法。
【請求項１４】
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記魚由来ゼラチン水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として混合することを特徴とする請求項１３に記載の組織接着剤の製造方法。
【請求項１５】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、
分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合する工程を含むことを特徴とする組織接着剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織接着剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織接着剤とは、心臓血管外科等の手術の際、血管、皮膚等の生体組織（以下、組織）を行う組織接着剤のことである。これを用いることにより、血液の漏出等を防止でき、手術の安全性を高めることができる。【０００３】
組織接着剤として、以下の３種類がある。第１の組織接着剤は、シアノアクリレート系組織接着剤であり、製品としてはＤＥＲＭＡＢＯＮＤがある。この組織接着剤は、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。第２の組織接着剤は、バイオポリマーとアルデヒド系の組織接着剤であり、製品としてはＧＲＦ  ｇｌｕｅがある。この組織接着剤も、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。第３の組織接着剤は、フィブリン系組織接着剤であり、製品としてはボルヒール（Ｂｏｌｈｅａｌ）がある。この組織接着剤は、逆に、生体親和性は高いが、接着強度が低いという課題がある。【０００４】
近年、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：以下、ＨＳＡ）と架橋剤とからなる組織接着剤の接着強度が高いことが分かってきた（非特許文献１）。【０００５】
ＨＳＡは、血液製剤から作られる血清タンパク質であり、分子量６９０００、直径約１０ｎｍの球状タンパク質である。また、マイナスチャージを持った酸性タンパク質である。また、架橋剤としては、酒石酸（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｔａｒｔａｒａｔｅ：以下、ＤＳＴ）が用いられている。【０００６】
しかし、血液製剤を使うと医薬品の分類となるため、承認認可の面で多大な労力を必要とする。また、医薬品となる場合には、認可後も、使用履歴を２０年間継続して残さねばならず、多大な労力を必要とするという課題がある。【０００７】
そのため、ＨＳＡに代わり、非血液製剤であるゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を用いることが考えられる。例えば、特許文献１は、ゼラチンをスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸により架橋して調製する医用材料が開示されている。また、特許文献２は、組織接着フィルムに関するものであり、ゼラチンまたはコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）から作成される組織接着フィルムが開示されている。しかし、これらは、接着力が十分でないという課題がある。【０００８】
また、特許文献３は、組織接着構成物に関するものであり、粒子形態の合成および／または架橋性の材料と、粒子状材料とが混合された組織接着構成物が開示されている。しかし、この組織接着構成物も、接着力が十分でないという課題がある。【０００９】
また、側鎖にアルキル基を導入したゼラチンに関する論文がある（非特許文献２、３）。さらに、側鎖にコレステリル基を導入したゼラチンと酒石酸架橋剤から成る論文がある（非特許文献４）
ＨＳＡに代わり、分子量が１００００以上５００００未満のゼラチンに疎水性官能基を導入した疎水化ゼラチンを用いることで、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い組織接着剤を提供することができる可能性がある。【００１０】
しかし、ゼラチンの分子量を高めれば、接着性を向上させることができるにもかかわらず、ブタ由来のゼラチンを用いた場合には、その分子量を２００００程度にしても、組織接着剤が液体状とならず、ゲル状に固まり、組織接着剤として使用する際に接着部に均一に塗ることができず、塗布性の点で取り扱いが困難となる場合があった。また、常温で放置しておくと、ゼリー状となる場合があった。【００１１】
また、酒石酸等の水に不溶性の分子を水溶媒に混合すると、これらの分子を水溶媒中で均一に分散させることができなかった。これらの分子が均一に分散されていない組織接着剤は、接着強度及び接着安定性等の接着特性にバラツキを発生させた。【００１２】
一方、水溶性架橋剤Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｄｉ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  （ＰＥＧ−（ＳＳ）２）とＨＳＡからなる組織接着剤は、製品名ＰｒｏＧＥＬとしてアメリカで認可されているので、ＰＥＧ系のポリマーについては、組織接着剤の構成成分として問題なく使用できる可能性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平９―１０３４７９号公報
【特許文献２】特開２００８−２８４２５６号公報
【特許文献３】特表２００６−５２３１１３号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．，２４，５４６−５５９（２００９）
【非特許文献２】Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ａ，２７２，２００６，８−１４
【非特許文献３】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，１０５，２００７，３３７１−３３７７
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ｂ，９１，４８−５６（２０１２）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、接着強度が高く、安定した接着特性を有し、塗布性に優れた組織接着剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、疎水化魚由来ゼラチン水溶液からなる接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液からなる硬化成分とからなり、前記接着成分と硬化成分を混合して組織に塗布する組織接着剤において、魚由来のゼラチンを用いて調製した疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子と用いることにより、前記接着成分と硬化成分を混合したときに、水溶液中でこれらを均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより安定した接着特性を有する組織接着剤を製造できることを見出した。この組織接着剤は、接着強度が高く、硬化前はゲル状ではなく液体状であるため、加温することなく均一に組織に塗布することができ、塗布性に優れた組織接着剤であることを発見し、本発明を完成した。【００１７】
本発明の組織接着剤は、以下のことを特徴としている。【００１８】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する。【００１９】
前記接着成分の前記魚由来ゼラチンが、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンである。【００２０】
前記魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖としている。【００２１】
前記疎水化魚由来ゼラチンはＬｙｓを含み、かつ、Ｌｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されている。【００２２】
前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせである。【００２３】
前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラに由来する魚由来ゼラチンである。【００２４】
前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満である。【００２５】
前記水溶性架橋用分子が、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｄｉ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｅｔｈｅｒ  ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せである。【００２６】
前記魚由来ゼラチン水溶液に用いる水溶媒および前記水溶性架橋用分子水溶液に用いる水溶媒は、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）である。【００２７】
前記接着成分として、さらに、疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有する。【００２８】
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液が、常温で液体状である。【００２９】
本発明の組織接着剤の製造方法は、以下のことを特徴としている。【００３０】
構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して疎水化魚由来ゼラチン水溶液を得て、この疎水化魚由来ゼラチン水溶液含む接着成分を調製する工程と、
分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
を含む。【００３１】
前記接着成分を調製する工程は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含む。【００３２】
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記魚由来ゼラチン水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として混合する。【００３３】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、
分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分と
を混合する工程を含む。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の組織接着剤は、水溶液中で疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。また、分子量を大きくすること、及び、前記疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士を架橋用分子の活性エステル基あるいは酸無水物あるいはアルデヒド基で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更にまた、前記疎水性官能基を組織浸透させ（アンカーリングして）、物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができるとともに、前記疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。【００３５】
本発明の組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。【００３６】
本発明の組織接着剤の製造方法は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含むことが好ましく、これによって、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。また、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の組織接着剤の一例を示す概略図である。
【図２】本発明の組織接着剤を用いた接着の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の組織接着剤の一例を示す概略図である。
【図４】接着試験の概要図である。
【図５】接着試験の概要図である。
【図６】接着試験の概要図である。
【図７】接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ−ＰＥＧ）の濃度依存性のグラフである。
【図８】接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性のグラフである。
【図９】試験例２−１の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２−１の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ６．０）である。
【図１０】試験例２−２の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２−２の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ６．５）である。
【図１１】試験例２−３の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２−３の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．０）である。
【図１２】試験例２−４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２−４の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．５）である。
【図１３】ＧＲＦを用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。
【図１４】接着強度の接着時間依存性のグラフである。
【図１５】接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性のグラフである。
【図１６】接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図１７】実施例３−１の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−１の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝０：１０  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図１８】実施例３−２の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−２の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝１：９  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図１９】実施例３−３の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−３の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝３：７  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図２０】実施例３−４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−４の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝５：５  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図２１】実施例３−５の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−５の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝７：３  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図２２】実施例３−６の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３−６の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝９：１  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。
【図２３】接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図２４】接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図２５】接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図２６】接着強度の２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図２７】接着強度の７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。
【図２８】重量比１：９の組織接着剤の接着強度の疎水基導入率依存性を示すグラフである。
【図２９】コレステリル化による疎水基導入率が4.9mol%、7.5mol%、12.2mol%の疎水化タラゼラチンを接着成分として使用した場合における、ブタ大動脈中膜の破断面の様子を示した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（本発明の実施形態）
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である組織接着剤及びその製造方法について説明する。
【００３９】
本発明の実施形態である組織接着剤は、魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤である。なかでも、魚由来ゼラチンとして、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンを使用することが好ましい。
【００４０】
図１では、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子とを有する形態を例示している。
【００４１】
前記疎水化魚由来ゼラチンは、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子である。前記アミノ酸として含まれるＬｙｓのアミノ基の一部が前記疎水性官能基で置換されている。Ｌｙｓは、タンパク質を構成するα−アミノ酸の一つであり、必須アミノ酸である。側鎖にε−アミノ基を持つアミノ酸である。
【００４２】
Ｌｙｓのアミノ基の一部は、疎水性官能基で容易に置換でき、疎水化魚由来ゼラチンのＬｙｓのアミノ基の一部は疎水性官能基で置換されている。
【００４３】
前記疎水化魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たり、次式（１）に示すヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖とし、その側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えていることが好ましい。
【００４４】
【化１】
2014112208.tif 000003
【００４５】
魚由来ゼラチン骨格を用いることにより、酵素により容易に分解させることができ、生体親和性が高くできる。また、水溶媒への分散性を高めることができる。
【００４６】
魚由来ゼラチンは、ティラピア、タイまたはタラのいずれかの魚由来ゼラチンであることが好ましい。これにより、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。
【００４７】
疎水化魚由来ゼラチンの分子量は、５００００以上１０００００未満であることが好ましい。分子量を５００００以上とすることにより、接着強度を向上させることができる。また、疎水化魚由来ゼラチンは、魚ゼラチンを主骨格とするので、水溶媒への分散性が高く、分子量を５００００以上としても、ゲル化せず、液体状に保持できる。
【００４８】
魚由来ゼラチンに導入した疎水性官能基は組織にアンカーリングして、魚由来ゼラチンを組織に強固に固定することができる。これにより、疎水化魚由来ゼラチンを組織に物理的に強固に接着させることができ、接着強度を向上させることができる。
【００４９】
疎水性官能基として、例えば、次式（２）に示すコレステリル基を挙げることができる。
【００５０】
【化２】
2014112208.tif 000004
【００５１】
疎水性官能基としては、飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせを挙げることができる。これにより、疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。
【００５２】
水溶性架橋用分子は、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する。
【００５３】
水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有することにより、高い水溶性を示し、水溶媒中で分散性を高くすることができる。一分子内に２個以上の活性エステル基あるいは酸無水物あるいはアルデヒド基を有することにより、これらの水溶性架橋用分子は、疎水化魚由来ゼラチンの２つのアミノ基と反応して、結合することができ、２個以上の疎水化魚由来ゼラチンを架橋して、強固な接着構造体を形成することができる。
【００５４】
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基の１種または２種以上の組み合わせであることが好ましい。スクシンイミドは、生体内の代謝経路に存在するコハク酸の誘導体であり、アメリカ食品医薬品局で認可された組織接着剤（シーラント）に使用されている実績があるためである。
【００５５】
水溶性架橋用分子は、４Ｓ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−（ＳＳ）２、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せを挙げることができる。
【００５６】
例えば、水溶性架橋用分子として、次式（３）に示すＰｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｅｔｈｅｒ  ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ（略称：４Ｓ−ＰＥＧ）を挙げることができる。ｎは、６０以下が好ましい。分子量は１０，０００程度とすることが好ましい。
【００５７】
【化３】
2014112208.tif 000005
【００５８】
水溶媒はリン酸緩衝液を用いることができる。そのｐＨ値は５〜９とすることが好ましく、６〜８とすることがより好ましい。これにより、生体組織を接着する際に、水溶媒を介して、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子とを効率よく架橋反応させることができる。
＜本実施形態の組織接着剤を用いた組織の接着について＞
次に、本実施形態の組織接着剤を用いた組織の接着について説明する。
【００５９】
まず、２枚の平面視略矩形状（例えば、長さ１ｃｍ×幅１ｃｍ、高さ０．５ｃｍ）の組織を用意する。組織としては、疑似皮膚としてｃｏｌｌａｇｅｎ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ｇｌｙｃｅｒｉｎ等の成分から成るコラーゲンケーシングを用いることができる。
【００６０】
次に、液状の接着成分と液状の硬化成分と、ダブルシリンジ注射器を用いて、一方の組織の一面に塗布してから、前記一面上でこれらを混合する。
【００６１】
次に、他方の組織を、前記接着剤の塗布部分を覆うように押しつけてから、その他面側に重りを置いて加重を付加した状態で一定時間放置する。
【００６２】
なお、前記放置時間は、組織接着剤が固化するのに必要な時間であり、組織接着剤中の構成材料の割合によって適宜設定する。最大で１０分程度とすることが好ましい。また、この際、例えば、３７℃以下の温度で加熱してインキュベートすることが好ましい。これにより、硬化速度を上げることができる。なお、接着後固化するまで室温で放置してもよい。
【００６３】
なお、組織接着剤は使用前に３７℃以下の温度にプレインキュベートしてから、塗布することが好ましい。
【００６４】
図２は、本発明の実施形態である組織接着剤を用いた組織の接着の一例を示す概略図である。
【００６５】
次式（４）で表される加水分解反応により、疎水化魚由来ゼラチンのアミノ基と架橋用分子の一の活性エステル基が反応して、アミド結合が形成する。その際、活性エステル基中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドが遊離する。式（４）において、−ＣＯＯＲは、水溶性架橋用分子の活性エステル、−ＮＨ２は、疎水化魚由来ゼラチン中のアミノ基を示す。
【００６６】
【化４】
2014112208.tif 000006
【００６７】
この架橋反応が連鎖的に行われることにより、複数の疎水化魚由来ゼラチンが水溶性架橋用分子により化学的に強固に結合された構造体が形成される。
【００６８】
なお、この水溶性架橋用分子の活性エステル基は、疎水化魚由来ゼラチンおよび生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基とも反応して、アミド結合を形成する。これにより、より化学的に強固に結合された構造体が形成される。
【００６９】
また、図２に示すように、疎水的な相互作用により、一定の分子量及び大きさを有する疎水性官能基が組織に浸透し、疎水化魚由来ゼラチンは、強固に組織に固定される。これにより、前記構造体は、物理的に強固に、組織の表面に接着される。
【００７０】
さらに、接着成分は、疎水化魚由来ゼラチンと疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有することがより好ましい。これによって、疎水基の凝集を阻害することができ、組織接着剤の接着強度を高めることができる。
＜組織接着剤の製造方法＞
次に、本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の一例について説明する。
【００７１】
本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合する工程を含む。
【００７２】
また、本発明の組織接着剤の製造方法は、より好ましくは、疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１と、接着成分調製工程Ｓ２と、硬化成分調製工程Ｓ３と、を有する。
（疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１）
まず、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液に、アミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する。
【００７３】
例えば、有機溶媒に溶解した魚由来ゼラチンにトリエチルアミン存在下で、アミノ基に反応性を有する疎水性官能基を有する酸クロライドを混合して、混合溶液を容器に調製する。
【００７４】
有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いる。
【００７５】
有機分子としては、例えば、次式（５）に示すコレステリルクロロフォルメイトを挙げることができる。
【００７６】
次に、前記混合溶液を、不活性ガス雰囲気下、加熱し、攪拌する。例えば、窒素雰囲気下、加熱温度は８０℃とし、攪拌時間は一昼夜とする。
【００７７】
【化５】
2014112208.tif 000007
【００７８】
次に、この混合溶液を、氷冷したエタノール溶媒中に滴下する。次に、この溶液をガラスフィルター等で濾過する。
【００７９】
更に、濾過物を有機溶媒で洗浄する。これにより、濾過物中の不純物を除去することができ、疎水化魚由来ゼラチンの純度を向上させることができる。この洗浄用の有機溶媒としては、例えば、エタノールあるいは酢酸エチルを用いる。
【００８０】
以上の工程により、魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を疎水性官能基で置換した疎水化魚由来ゼラチンを生成できる。
（接着成分調製工程Ｓ２）
前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する。
【００８１】
リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６〜８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
（硬化成分調製工程Ｓ３）
水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する。
【００８２】
リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６〜８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
【００８３】
以上の工程により、本発明の実施形態である組織接着剤を容易に製造できる。
【００８４】
前記接着成分と、前記硬化成分とを混合して、組織に塗布してから、別の組織を張り合わせることにより、２つの組織を容易に接着できる。
＜組織接着剤の製造方法（別の一例）＞
次に、本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の別の一例について説明する。
【００８５】
本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の別の一例は、疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１１と、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１２と、魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１３と、接着成分調製工程とＳ１４と、硬化成分調製工程Ｓ１５と、を有する。
【００８６】
疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１１は、先に記載した疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１と同一の工程である。
【００８７】
疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１２は、先に記載した接着成分調製工程Ｓ２と同一の工程である。
（魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１３）
魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する。
【００８８】
リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６〜８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
（接着成分調製工程とＳ１４）
前記疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液と、前記魚由来ゼラチンを含む水溶液とを混合して、混合溶液からなる接着成分を調製する。
重量比は１：９〜５：５にすることが好ましく、１：９とすることがより好ましい。これにより、分散性を高めることができ、凝集を抑制できる。
【００８９】
硬化成分調製工程Ｓ１５は、先に記載した硬化成分調製工程Ｓ３と同一の工程である。
【００９０】
以上の工程により、本発明の実施形態である組織接着剤を容易に製造できる。
【００９１】
前記接着成分と、前記硬化成分とを混合して、組織に塗布してから、別の組織を張り合わせることにより、２つの組織を容易に接着できる。
【００９２】
前記接着成分と、前記硬化成分との体積比は１：１程度にすることが好ましい。分散性を高めることができる。
【００９３】
本発明の実施形態である組織接着剤は、水溶液中で疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。また、分子量を大きくすること、及び、前記疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士を架橋用分子の活性エステル基あるいは酸無水物で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更にまた、前記疎水性官能基を組織浸透させ（アンカーリングして）、物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができるとともに、前記疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。
【００９４】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水化魚由来ゼラチンが、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であって、前記アミノ酸として含まれるＬｙｓのアミノ基の一部が前記疎水性官能基で置換されている構成なので、疎水化ゼラチン中に存在するアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができ、接着強度を高くすることができるとともに、疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。
【００９５】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせである構成なので、疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。
【００９６】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラのいずれかの魚由来ゼラチンである構成なので、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。
【００９７】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満である構成なので、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。
【００９８】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記水溶性架橋用分子が、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｄｉ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｅｔｈｅｒ  ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せである構成なので、水溶媒中で分散性高く溶解させることができる。また、疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士および生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基または酸無水物で架橋して、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。
【００９９】
本発明の実施形態である組織接着剤は、前記水溶液に用いる水溶媒が、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）である構成なので、固化までの時間を適宜設定することができる。
【０１００】
本発明の実施形態である組織接着剤は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを有する構成なので、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
【０１０１】
本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。
【０１０２】
本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する工程と、前記魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液と、前記魚由来ゼラチンを含む水溶液とを混合して、混合溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。また、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
【０１０３】
本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、前記疎水化魚由来ゼラチンを含む溶液と魚由来ゼラチンを含む水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として、前記混合溶液からなる接着成分を調製する構成なので、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
【０１０４】
本発明の実施形態である組織接着剤及びその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０５】
（試験例１）
＜水溶性架橋用分子（４Ｓ−ＰＥＧ）濃度依存性評価用Ｇｌｔｎ／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、魚ゼラチンとしてティラピア鱗由来魚ゼラチン（略称：Ｇｌｔｎ、ＭＷ：７０，０００、ヒドロキシプロリン含量：アミノ酸１０００個当たり７９個、新田ゼラチン製）、水溶性架橋用分子としてＰｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｅｔｈｅｒ  ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ（略称：４Ｓ−ＰＥＧ、ＭＷ：１０，０００、日油製）、生理食塩水（大塚製薬製）を用意した。
次に、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、略称：ＰＢＳ）を調製した。
次に、Ｇｌｔｎ濃度が４０ｗｔ％となるようにＧｌｔｎを０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解して、ゼラチン溶液（Ｇｌｔｎ溶液）を調製した。【０１０６】
次に、所定量の４Ｓ−ＰＥＧを０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解して、５、７．５、１０、１５、１７ｍＭの５種の４Ｓ−ＰＥＧ溶液を調製した。【０１０７】
次に、Ｇｌｔｎ溶液と５種の４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ体積比１：１で混合して、試験例１−１〜１−５の組織接着剤を調製した。【０１０８】
次に、これらの組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
＜接着試験（せん断引張測定）＞
組織接着剤のせん断引張測定による接着試験を行った。【０１０９】
図４〜６は、接着試験の概要図である。【０１１０】
まず、１０ｍｍ×３０ｍｍのブタ血管膜５０を２枚用意した。ブタ血管膜５０は一面側が中膜５１とされ、他面側が外膜５２とされている。【０１１１】
次に、図４に示すように、１枚のブタ血管膜５０の一端側の中膜５１上に、１辺が約１２ｍｍの平面視正方形状で、厚さ０．５ｍｍのシリコンシートからなるマスク５３を配置した。マスク５３には、直径１０ｍｍの平面視円形状の孔部５４が設けられている。また、マスク５３の一辺側には、孔部５４につながるスリットが設けられている。【０１１２】
次に、孔部５４から露出する中膜５１上に、組織接着剤６０を滴下した。【０１１３】
その後、すぐに、もう１枚のブタ血管膜５０の一端側を、組織接着剤６０を介して中膜５１同士が重ね合うように配置した。【０１１４】
次に、図５に示すように、重ね合わせたブタ血管膜５０の上に、重さ５０ｇの分銅５５を載せた。【０１１５】
次に、インキュベータにおいて、３７℃で１０分間静置して、インキュベートした。【０１１６】
次に、インキュベート後すぐに、図６に示すように、支持部６２、６３にブタ血管膜５０の他端側を挟みこみ固定してから、互いに逆方向に引っ張り、Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（英弘精機社製）にて、せん断引張測定を行った。
＜接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ−ＰＥＧ）濃度依存性評価結果＞
水溶性架橋用分子として用いた４Ｓ−ＰＥＧは、塩存在下において塩析が生じ、架橋後のバルク強度が落ちることが想定される。そのため、接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ−ＰＥＧ）の濃度依存性を測定した。ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）は、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒に溶解した。【０１１７】
図７に示す結果（接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ−ＰＥＧ）の濃度依存性）が得られた。図７に示すように、４Ｓ−ＰＥＧ濃度が１５ｍＭのときに接着強度は極大値を示した。【０１１８】
なお、Ｇｌｔｎの残存アミノ基はトリニトロベンゼンスルホン酸法により、１６９．６４μｍｏｌ／ｇであることから、アミノ基：スクシンイミジル基＝１：１となる条件は、４Ｓ−ＰＥＧ濃度１７ｍＭのときであるので、アミノ基：スクシンイミジル基＝１：１となるように架橋された状態となることにより、接着強度が極大となったものと推察された。
（試験例２）
＜溶媒ｐＨ値依存性評価用Ｇｌｔｎ／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５のいずれかとした溶媒を用いて調製した。  【０１１９】
次に、４．５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５のいずれかとした溶媒を用いて調製した。【０１２０】
次に、同じｐＨ値のＧｌｔｎ溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、体積比１：１で混合して、試験例２−１〜２−４の組織接着剤を調製した。【０１２１】
次に、これらの組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１２２】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性評価結果＞
本組織接着剤の架橋反応はゼラチンのアミノ基が４Ｓ−ＰＥＧの活性エステルに対しての求核置換反応であり、反応速度はアミノ基のプロトネーション、つまり溶媒のｐＨ値に依存している。そのため、接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性を測定した。【０１２３】
図８に示す結果（接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性）が得られた。図８に示すように、溶媒（ＰＢＳ）のｐＨ値が７．０のときに接着強度は極大値を示した。【０１２４】
また、図９〜図１２は、それぞれ試験例２−１〜２−４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。各接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ６．０（試験例２−１）、６．５（試験例２−２）、７．０（試験例２−３）、７．５（試験例２−４））である。【０１２５】
また、比較のため、図１３に、ＧＲＦを用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像を示している。【０１２６】
図９〜図１３ではいずれも、観察された接着剤硬化物（上部）が破壊していた。
（実施例１）
＜４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（１：９）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、Ｇｌｔｎ中の全アミノ基に対する疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が４ｍｏｌ％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。【０１２７】
次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１２８】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１２９】
次に、Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９の混合比（重量比）となるように混合溶液を調製した。【０１３０】
次に、１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１３１】
次に、混合溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、体積比１：１で混合して、実施例１の組織接着剤を調製した。【０１３２】
次に、この組織接着剤を、あらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着時間１、３、５、１０、１５、３０、４５（ｍｉｎ）での接着強度を測定した。
＜接着強度の接着時間依存性評価結果＞
図１４に示す結果（接着強度の接着時間依存性）が得られた。図１４に示すように、接着時間が１０分で、接着強度はほぼ最大値となり、飽和して、これ以後接着時間を長くしても、接着強度はあまり変化しなかった。
（実施例２）
＜０、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、Ｇｌｔｎ中の全アミノ基に対する疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率が４、７、２３、７０ｍｏｌ％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。また、疎水化していないティラピア鱗由来魚ゼラチンも評価したが、これは０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎと表記している。【０１３３】
次に、これらの疎水化していないティラピア鱗由来魚ゼラチン（０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）及び疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）の４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１３４】
次に、４．５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１３５】
次に、上記５種のＣｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例２−１〜２−５の組織接着剤を調製した。【０１３６】
次に、この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１３７】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性評価結果＞
本研究は疎水基（Ｃｈｏｌ基）がＥＣＭの疎水性領域に対しての組織浸透能を持ったＣｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／４Ｓ−ＰＥＧの創製を指向したものである。そのため、０、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液を体積比１：１で混合させた組織接着剤の接着強度評価を行い、接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性を評価した。【０１３８】
図１５に示す結果（接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性）が得られた。【０１３９】
図１５に示すように、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎは０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎに比較して低い接着強度を示した。また、疎水化ゼラチンの中で、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎの接着強度が最も高く、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ及び２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎがそれに次ぐ接着強度であった。
この結果は、導入したＣｈｏｌ基が凝集し、組織浸透性に寄与し得なかったこと、及び、その凝集によって組織接着剤のバルク強度が低下したことによると考えられる。【０１４０】
Ｃｈｏｌ−ＧｌｔｎにＧｌｔｎを混合することにより、Ｃｈｏｌ基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる可能性がある。よって、実施例５、６で、Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の混合比を変える実験を行った。
（実施例３）
＜４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０〜９：１）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１４１】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１４２】
次に、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。【０１４３】
次に、４．５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１４４】
次に、６種のＣｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合した。【０１４５】
これにより、実施例３−１〜３−６の組織接着剤を調製した。【０１４６】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１４７】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図１６に示す結果（接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１４８】
図１６に示すように、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。また、５：５（重量比）は、Ｇｌｔｎ単独のものに比較して高い接着強度を示した。【０１４９】
図１７〜２２は、それぞれ実施例３−１〜３−５の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。【０１５０】
各接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝０：１０（実施例３−１）、１：９（実施例３−２）、３：７（実施例３−３）、５：５（実施例３−４）、７：３（実施例３−５）、９：１（実施例３−６）  ４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）、４Ｓ−ＰＥＧ  ４．５ｍＭ（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４）である。【０１５１】
図１７〜図２２ではいずれも、観察された接着剤硬化物（上部）が破壊していた。
（実施例４）
＜７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０〜９：１）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ、Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１５２】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１５３】
次に、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。【０１５４】
次に、４．５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。【０１５５】
次に、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。【０１５６】
次に、６種のＣｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例４−１〜４−６の組織接着剤を調製した。【０１５７】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１５８】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図２３に示す結果（接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１５９】
図２３に示すように、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。また、５：５（重量比）は、Ｇｌｔｎ単独のものに比較して高い接着強度を示した。
（実施例５）
＜４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が４％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。【０１６０】
次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１６１】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１６２】
次に、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。【０１６３】
次に、１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１６４】
次に、３種の混合溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例５−１〜５−３の組織接着剤を調製した。【０１６５】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１６６】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図２４に示す結果（接着強度の４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１６７】
図２４に示すように、４Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。
（実施例６）
＜７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が７％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。【０１６８】
次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１６９】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１７０】
次に、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。【０１７１】
次に、１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１７２】
次に、３種の混合溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例６−１〜６−３の組織接着剤を調製した。【０１７３】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１７４】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図２５に示す結果（接着強度の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１７５】
図２５に示すように、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。
（実施例７）
＜２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が２３％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。【０１７６】
次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１７７】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１７８】
次に、２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。【０１７９】
次に、１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１８０】
次に、３種の混合溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例７−１〜７−３の組織接着剤を調製した。【０１８１】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１８２】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図２６に示す結果（接着強度の２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１８３】
図２６に示すように、２３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０（重量比）の時に最も高い接着強度を示した
（実施例８）
＜７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ−ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が７０％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）を調製した。【０１８４】
次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１８５】
次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１８６】
次に、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。【０１８７】
次に、１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。【０１８８】
次に、３種の混合溶液と４Ｓ−ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例８−１〜８−３の組織接着剤を調製した。【０１８９】
この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。【０１９０】
なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
図２７に示す結果（接着強度の７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。【０１９１】
図２７に示すように、７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０（重量比）の時に最も高い接着強度を示した
図７−２７の結果から、４−７０Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎは重量比１：９の組織接着剤が重量比５：５の組織接着剤に比較して高い接着強度を示した。【０１９２】
図２８は、重量比１：９の組織接着剤の接着強度の疎水基導入率依存性を示すグラフである。【０１９３】
図２８から分かるように、重量比１：９では、７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎの組織接着剤の接着強度が極大値を取った。【０１９４】
実施例で調製した組織接着剤はすべて、ゲル状ではなく、液体状のままで使用でき、分子量２００００程度としたブタゼラチンを用いた組織接着剤に比べて、取り扱い容易性が非常に高いものであった。【０１９５】
また、重量比１：９の７Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液（０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）と１５ｍＭの４Ｓ−ＰＥＧ溶液（０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）の混合溶液を用いて調製した組織接着剤が最も高い接着強度を示したが、他の実施例で調製した組織接着剤も、市販のＧＲＦに比べて、高い接着強度を示した。【０１９６】
表１〜５に、各試験例、実施例の調製条件、試験条件をまとめた。【０１９７】
【表１】
2014112208.tif 000008
【０１９８】
【表２】
2014112208.tif 000009
【０１９９】
【表３】
2014112208.tif 000010
【０２００】
【表４】
2014112208.tif 000011
【０２０１】
【表５】
2014112208.tif 000012
【０２０２】
（実施例９）疎水化タラゼラチンと4S-PEGとからなる組織接着剤のシーリング効果の評価
（１）ブタ大動脈に対する耐圧強度測定
（１−１）実験方法
タラゼラチン(cGltn)のアミノ基を一部ヘキサノイル化したHx−cGltnと4S-PEGとからなる組織接着剤のブタ大動脈に対する接着強度を検討した。【０２０３】
具体的には、タラゼラチンは、分子量：153,000、ヒドロキシプロリン含量：アミノ酸1000個当たり50個のものを使用した。【０２０４】
そして、疎水化していない40％cGltnを接着成分として調整し（Org-cGltn溶液またはOrgと記載する）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調整し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とをそれぞれ200μlずつ混合することで、厚さ1.0mmシーラント（組織接着剤）の調製を行った。【０２０５】
同様に、ヘキサノイル基導入率が2.1mol%、8.5mol%、18.3mol%の疎水化cGltnを接着成分として調製し（2.1Hx、8.5Hx、18.3Hxと記載する）、この接着成分と硬化成分とをそれぞれ200μlずつ混合することで、厚さ1.0mmシーラント（組織接着剤）の調製を行った。【０２０６】
なお、4S-PEGの濃度は、cGltnあるいは疎水化cGltn中のアミノ基と4S-PEG中のスクシンイミド基が1対1となるように設定した。【０２０７】
そして、それぞれのシーラント（組織接着剤）の塗布後、5.0 g/mm2の荷重により10分間の圧着を行い、耐圧試験を行った。シーラント（組織接着剤）の耐圧試験はASTM (F2392-04, Standard Test Method for Burst Strength of Surgical Sealants)に従い、ブタ大動脈に対する耐圧強度の測定を行った。
（１−２）結果
結果を表６に示す。【０２０８】
【表６】
2014112208.tif 000013
【０２０９】
表６から、疎水化していないOrg-cGltnを接着成分として使用した場合と比較して、疎水化cGltnを接着成分として使用した場合は、2.1Hx、8.5Hx、18.3Hxのすべてにおいて、約2倍以上の耐圧強度を示した。2.1Hxにおいても高い値を示したことから、少ない疎水基導入率でも組織との強い界面強度が得られたと考えられる。【０２１０】
タラゼラチンにおいては、疎水化することが接着強度の向上に極めて有効であることが確認された。【０２１１】
（実施例１０）ラット臓器に対するシーラントの定性的評価
疎水化していない40％cGltnを接着成分として調整し（Org-cGltn溶液）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調整し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とを混合して、シーラント（組織接着剤）を調整した。このシーラント（組織接着剤）をラットの臓器表面に対して50μl滴下した。37℃生理食塩水中に3日間静置し、残存している接着剤量によって定性的に評価した。【０２１２】
同様に、疎水基導入率が2.1mol%の疎水化cGltnを接着成分として調整し（2.1Hx）、この接着成分と硬化成分とを混合して、シーラント（組織接着剤）を調製した。このシーラント（組織接着剤）をラットの臓器表面に対して50μl滴下した。37℃生理食塩水中に3日間静置し、残存している接着剤量によって定性的に評価した。【０２１３】
その結果、接着成分として疎水化cGltn（2.1Hx）を用いることにより、特に肺表面および腎臓表面への接着性が向上することが明らかとなった。一方、接着成分としてOrg-cGltn溶液を用いた場合には、臓器に対する接着性はほとんど確認されなかった。【０２１４】
（実施例１１）疎水基導入率の影響の検討
（１）実験方法
（１−１）タラゼラチン(cGltn)のアミノ基を一部コレステリル化したChol-cGltnを接着成分として調製し（Org-cGltn溶液またはOrgと記載する）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調製し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とを混合することで、シーラント（組織接着剤）の調製を行った。【０２１５】
同様に、コレステリル化による疎水基導入率が4.9mol%、7.5mol%、12.2mol%の疎水化cGltnを接着成分として調整し、この接着成分と硬化成分とを混合することでシーラント（組織接着剤）の調製を行った。【０２１６】
被着体には新鮮なブタ大動脈中膜を用い、このブタ大動脈中膜にシーラント（組織接着剤）を適用して、圧着後、接着面に対して垂直方向に剥離するときの強度を接着強度とした。
（１−２）詳細な条件は、下記の通りである。
・Applied force（圧着荷重）5.0 g/ mm2
・Contact time  （圧着時間）  5 min
・solution pH : 0.1M PBS (pH8)
・NH2/4S-PEG中のNHS比 =1/0.85 (NHS:N-hydroxysuccinimide)
・Chol-cGltn、cGltn濃度：40w/v%
・Control：市販品のGRFグルー
（２）結果
接着強度は、コレステリル基を導入に伴い、7.5mol%まで増加し、その後減少した。最大接着強度は、未修飾のcGltn（Org）と比較して1.5倍、市販品と比較して13.8倍の高かった。また、図２９に示した破断面の様子から、7.5 mol%のChol-cGltnの場合、組織界面に接着剤が残存していることから、コレステリル化により高い界面接着性を有していることが明らかとなった。
（３）その他の疎水基
上記（１）と同様の条件で、プロピル基（Pro）、ヘキサノイル基（Hx）、ラウリル基（Lau）についても疎水基導入率が接着強度に与える影響について検討した。【０２１７】
結果を表７に示す。表７では、上記のコレステリル基による結果も併せて記載している。【０２１８】
【表７】
2014112208.tif 000014
【０２１９】
表７に示したように、タラゼラチンにおいては、各種の疎水基によって疎水化することが接着強度の向上に極めて有効であることが確認された。また、プロピル基（Pro）、ヘキサノイル基（Hx）、ラウリル基（Lau）では、疎水基導入率に依存して接着強度が高まることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明の組織接着剤及びその製造方法は、接着強度を高めるとともに、ゲル状ではなく、液体状のままで使用でき、取り扱い容易性を高めた組織接着剤に関するものなので、組織接着剤、組織封止剤（Ｓｅａｌａｎｔ）、止血剤等を必要とする産業等において利用可能性がある。
【符号の説明】
【０２２１】
１１  疎水化魚由来ゼラチン
１２  疎水基（コレステリル基）
１３  アミノ基
１４  ヒドロキシクロリン
２１  水溶性架橋用分子
２２  架橋部  
３１、３２  組織
４１  組織接着剤
５０  ブタ血管膜
５１  中膜
５２  外膜
５３  マスク
５４  孔部
５５  重り
６０  組織接着剤
６２、６３  支持部
【図１】
2014112208.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月25日(2016.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、
前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有し、
前記魚由来ゼラチン水溶液は、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンと、疎水化されていない魚由来ゼラチンとを含み、
前記疎水化魚由来ゼラチンは、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％であり、
前記魚由来ゼラチン水溶液中の前記疎水化魚由来ゼラチンの含有率が１０％以下であることを特徴とする組織接着剤。
【請求項２】
前記魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖としていることを特徴とする請求項１に記載の組織接着剤。
【請求項３】
前記疎水化魚由来ゼラチンはＬｙｓを含み、かつ、Ｌｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されていることを特徴とする請求項１または２に記載の組織接着剤。
【請求項４】
前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項５】
前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラに由来する魚由来ゼラチンであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項６】
前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項７】
前記水溶性架橋用分子が、Polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate、Pentaerythritol poly（ethylene glycol） ether tetrasuccinimidyl glutarate、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸の群から選ばれる１種または２種以上の組合せであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項８】
前記魚由来ゼラチン水溶液に用いる水溶媒および前記水溶性架橋用分子水溶液に用いる水溶媒は、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項９】
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液が、常温で液体状であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の組織接着剤。
【請求項１０】
構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％である疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチンと疎水化されていない魚由来ゼラチンをそれぞれリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液を調製する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、前記疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液とを、重量比で、１：９以下として混合して、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液とを含有する接着成分を調整する工程と、
分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
を含むことを特徴とする組織接着剤の製造方法。
【請求項１１】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、硬化成分とを混合する工程を含み、
前記魚由来ゼラチン水溶液は、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンと、疎水化されていない魚由来ゼラチンとを含み、
前記疎水化魚由来ゼラチンは、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％であり、
前記魚由来ゼラチン水溶液中の前記疎水化魚由来ゼラチンの含有率が１０％以下であり、
前記硬化成分は、分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液であることを特徴とする組織接着剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
組織接着剤とは、心臓血管外科等の手術の際、血管、皮膚等の生体組織（以下、組織）の閉鎖を行う組織接着剤のことである。これを用いることにより、血液の漏出等を防止でき、手術の安全性を高めることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有し、前記魚由来ゼラチン水溶液は、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンと、疎水化されていない魚由来ゼラチンとを含み、前記疎水化魚由来ゼラチンは、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％であり、前記魚由来ゼラチン水溶液中の疎水化魚由来ゼラチンの含有率が１０％以下である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％である疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチンと前記疎水化されていない魚由来ゼラチンをそれぞれリン酸緩衝液に分散して、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、前記疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液を調製する工程と、
前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、前記疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液とを、重量比で、１：９以下として混合して、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記疎水化されていない魚由来ゼラチン水溶液とを含有する接着成分を調整する工程と、
分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、硬化成分とを混合する工程を含み、
前記魚由来ゼラチン水溶液は、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンと、疎水化されていない魚由来ゼラチンとを含み、
前記疎水化魚由来ゼラチンは、全アミノ基に対する疎水性官能基の導入率が４〜７ｍｏｌ％であり、
前記魚由来ゼラチン水溶液中の前記疎水化魚由来ゼラチンの含有率が１０％以下であり、
前記硬化成分は、分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液である。
【国際調査報告】
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2014112208.tif 000045
2014112208.tif 000046
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