(57)【要約】発生初期の段階でトランスジェニック昆虫を簡便に、効率的に、かつ正確に判別するために、胚全体で標識遺伝子の発現を強力に誘導できるプロモーターを開発し、そのプロモーターを組み込んだ遺伝子発現ベクターを形質転換体判別マーカーとして提供することを目的とする。  配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプロモーターとして包含する外因性遺伝子発現ベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプロモーターとして包含する外因性遺伝子発現ベクター。
【請求項２】
チョウ目に属する種の形質転換用である、請求項１に記載の外因性遺伝子発現ベクター。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプロモーター、及びその下流に標識遺伝子又はその機能ヌクレオチド断片を含む遺伝子発現ベクターからなるチョウ目に属する種の形質転換体判別マーカー。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の外因性遺伝子発現ベクター又は請求項３に記載の形質転換体判別マーカーを有する形質転換体。
【請求項５】
前記外因性遺伝子発現ベクター又は前記形質転換体判別マーカーをゲノム内に有する、請求項４に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の遺伝子の発現を強力に誘導することのできるプロモーターを含む外因性遺伝子発現ベクター、それを利用した形質転換体判別マーカー、及びそれらを導入した形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術は、遺伝子の機能解析や有用タンパク質の生産を行う上で必須の技術である。有用タンパク質の生産にあたっては、従来、主に大腸菌や酵母が宿主として利用されてきたが、大量生産が困難であるという大きな問題があった。そこで、近年では、大量のタンパク質を短期間に合成することのできるカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）が、タンパク質の大量生産系として注目を集めている。カイコを宿主とする場合、外来遺伝子を細胞内に導入する形質転換体、すなわち組換えカイコ（トランスジェニックカイコ）の作製技術が重要となる。カイコでは、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃを用いて外来遺伝子をゲノム内で安定に維持させる技術が確立している（非特許文献１）。
ところで、遺伝子組換え技術では、形質転換体を作製する技術に加えて、導入した外来遺伝子を保有する形質転換体と、それを保有しない宿主（非形質転換体）とを正確かつ簡便に判別する技術が必要である。宿主が昆虫の場合、形質転換処理を行う際に目的の遺伝子と共に蛍光タンパク質等の標識遺伝子（マーカー遺伝子）並びにそれらの発現を制御するプロモーターを導入し、標識遺伝子の発現の有無に基づいて形質転換体か否かを判別する方法が採用されている。したがって、この方法では、標識遺伝子の発現を強力に、かつ広範囲で誘導することのできるプロモーターの選択が重要となる。
カイコでは、前記プロモーターとして、全身性のアクチンＡ３遺伝子プロモーター（非特許文献１及び２）、様々な生物種で汎用性の高いことが知られている眼特異的な３ｘＰ３プロモーター（非特許文献３）、及び最初期プロモーターであるＩＥ１プロモーター（非特許文献４）が主に使用されている。しかし、これらのプロモーターには、下記に示す問題点があった。
まず、Ａ３プロモーターでは、胚の時期にはプロモーターの活性が弱いことから、図１Ｂに示すように発生初期では形質転換体を判別することができない。それ故、標識遺伝子の発現が確認できる幼虫期まで、形質転換処理を行った個体の全てを一律に飼育する必要があった。そのため作業に多くの無駄や手間、そしてコストが生じていた。また幼虫は動きまわることから、標識遺伝子に基づく表現型が体色のように可視光下で肉眼にて判別できない場合には、選抜作業が行い辛いという問題もあった。例えば、標識遺伝子が蛍光タンパク質をコードする場合、動き回るカイコの幼虫に励起光を照射し続けながら蛍光を発する個体を選抜しなければならない。
次に、３ｘＰ３プロモーターの場合には、胚期からプロモーター活性を有するため、Ａ３プロモーターで見られた問題は発生しない。しかし、図１Ｄで示すように、発現部位が胚のごく一部分（図中の矢印で示す部分）に限られることから、その識別及び判断には技術的な習熟が必要であった。また、このプロモーターを有する発現ベクターが宿主ゲノム内に挿入される場合、挿入位置効果等によっては目的の遺伝子の発現が抑制されてしまい、その場合、習熟者でも判別が困難となっていた。さらに、発生初期の段階で標的遺伝子の発現を確認できる期間は、わずか１〜２日間に過ぎないという問題もあった。
そして、ＩＥ１プロモーターの場合には、脂肪体、精巣、卵巣では発現誘導活性が見られず、遺伝子発現誘導の活性が全身性ではないという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：８１−８４．
【非特許文献２】Ｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６５：１３２９−１３４０．
【非特許文献３】Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．−Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２：２４７−２５３．
【非特許文献４】Ｍａｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｅ４９３２３
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、発生初期の段階でトランスジェニック昆虫を簡便に、効率的に、かつ正確に判別するために、胚全体で標識遺伝子の発現を強力に誘導できるプロモーターを開発し、そのプロモーターを組み込んだ遺伝子発現ベクターを形質転換体判別マーカーとして提供することを目的とする。
また、前記プロモーターの活性を利用して、発生初期の段階から全発生ステージを通して所望のタンパク質をコードする遺伝子を強力に発現することのできる遺伝子発現ベクターを提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明者らは、トランスポゾンがゲノム中にランダムに挿入された膨大な数のカイコのエンハンサートラップ系統を作出した。そして、その中から当該課題解決のための所望の性質である発生初期の段階から全身でレポーター遺伝子を強く発現することのできる系統（ＡｙＦｉｂ−４３１ａ系統）を分離することに成功した。この系統のゲノム上におけるトランスポゾンの挿入位置を解析した結果、ｈｓｐ９０遺伝子の５’−ＵＴＲ内部に挿入されており、ｈｓｐ９０遺伝子プロモーターがトランスポゾン内のレポーター遺伝子の発現を誘導したことが明らかになった。
本発明は、当該知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプロモーターとして包含する外因性遺伝子発現ベクター。
（２）配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプロモーターとして包含する（１）に記載の外因性遺伝子発現ベクター。
（３）チョウ目に属する種の形質転換用である、（１）又は（２）に記載の外因性遺伝子発現ベクター。
（４）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプロモーター、及びその下流に標識遺伝子又はその機能ヌクレオチド断片を含む遺伝子発現ベクターからなるチョウ目に属する種の形質転換体判別マーカー。
（５）配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプロモーター、及びその制御下に標識遺伝子を含む遺伝子発現ベクターからなる、（４）に記載の形質転換体判別マーカー。
（６）（１）〜（３）に記載のいずれかの外因性遺伝子発現ベクター又は（４）又は（５）に記載の形質転換体判別マーカーを有する形質転換体。
（７）前記外因性遺伝子発現ベクター又は前記形質転換体判別マーカーをゲノム内に有する、（６）に記載の形質転換体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１６８６５５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、従来のプロモーターの下流に標識遺伝子を連結した形質転換体判別マーカーを保有するトランスジェニックカイコの胚を示す図である。Ａ及びＢは、全身性のアクチンＡ３遺伝子プロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を連結したトランスジェニックカイコである。Ｃ及びＤは、眼特異的な３ｘＰ３プロモーターの下流にＤｓＲｅｄ遺伝子を連結したトランスジェニックカイコである。Ａ及びＣは白色光での図であり、Ｂ及びＤはそれぞれＡ及びＣと同視野における蛍光図である。Ｄにおける矢印は、ＤｓＲｅｄの発現が認められる部分を示す。従来のプロモーターでは、発生初期の胚の段階では標識遺伝子の発現による形質転換体の判別が十分とは言い難い。
図２は、カイコのエンハンサートラップ系統群の中から選抜したＡｙＦｉｂ−４３１ａ系統におけるＤｓＲｅｄの発現を示す図である。Ａ及びＡ’は胚、Ｂ及びＢ’は幼虫、Ｃ及びＣ’は蛹、Ｄ及びＤ’は成虫を示す。また、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは白色光での図、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’は蛍光図である。胚から成虫の全発生ステージでＤｓＲｅｄの強い発現が認められる。なお、Ａ’において、矢印はエンハンサートラップに用いたトランスポゾンを含む胚（ＡｙＦｉｂ４３１ａ）を、矢頭はそれを含まない胚を示す。
図３は、実施例１で作製した本発明の外因性遺伝子発現ベクターの一例である。この図に示す外因性遺伝子発現ベクターでは、カイコのｈｓｐ９０遺伝子プロモーター由来であり、配列番号４で表される塩基配列を含むｇ２９００にＧＦＰ遺伝子を連結した構成を有する。
図４は、図３に示した外因性遺伝子発現ベクターを導入したトランスジェニックカイコにおけるＧＦＰの発現を示す図である。Ａ及びＡ’は胚、Ｂ及びＢ’は幼虫、Ｃ及びＣ’は蛹、Ｄ及びＤ’は成虫を示す。また、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは白色光での図であり、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’はＧＦＰ蛍光図である。図２に示したオリジナルのＡｙＦｉｂ−４３１ａ系統と同様に、胚から成虫の全発生ステージでＧＦＰの強い発現が認められた。Ａ’において、矢印は外因性遺伝子発現ベクターが導入された胚を、矢頭はそれが導入されていない胚を示す。
図５は、実施例３で用いた発現ベクターの図である。Ａ：カイコのｈｓｐ９０遺伝子プロモーター（Ｂｍ−ｈｓｐ９０）由来の部分配列にホタルルシフェラーゼを結合した本発明の外因性遺伝子発現ベクターの構成を有する発現ベクターである。この発現ベクターにおけるｈｓｐ９０遺伝子プロモーター由来の部分配列を後述する図６で示す様々な長さの部分配列に置き換えて、図７で示す各部分配列のプロモーター活性を検証している。Ｂ：ドクガＯｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａのｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ２（ＩＥ２）遺伝子プロモーターにウミシイタケルシフェラーゼを結合した補正用ベクターである。
図６は、図５Ａで示す発現ベクターに用いた様々な長さのカイコｈｓｐ９０遺伝子プロモーター由来の部分配列を示す図である。ｇ２９００を最長として、他のプロモーターは、その５’側（破線領域）を削り込んだものである。
図７は、図５Ａ及びＢで示した２つの発現ベクターをカイコ培養細胞に導入して、ルシフェラーゼの発現量を測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をウミシイタケルシフェラーゼの発現量で補正した結果、すなわちウミシイタケルシフェラーゼに対するホタルルシフェラーゼ活性の相対値（Ｌｕｃ／Ｒｌｕｃ）を示す図である。ｐＧＬ３は、プロモーター配列を含まないコントロール用ベクターである。
図８は、カイコｈｓｐ９０遺伝子プロモーター由来のｇ２９００と従来使用されてきたカイコアクチンＡ３遺伝子プロモーター（ＢｍＡ３）の活性の比較を示す図である。縦軸は、ウミシイタケルシフェラーゼに対するホタルルシフェラーゼ活性の相対値（Ｌｕｃ／Ｒｌｕｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
１．外因性遺伝子発現ベクター
１−１．概要
本発明の第１の態様は、外因性遺伝子発現ベクターである。本態様の外因性遺伝子発現ベクターは、エンハンサートラップによって得られたカイコ由来のプロモーターに基づく塩基配列を包含し、その下流に目的の遺伝子を組み込んで当該発現ベクターを昆虫の細胞内に導入することによって、前記目的の遺伝子を胚から成虫までの全ステージで、また全身で発現させることができる。
１−２．構成
本明細書で「遺伝子発現ベクター」とは、目的の遺伝子又はそのヌクレオチド断片（以下、本明細書ではしばしば「目的の遺伝子等」と表記する）を発現可能な状態で包含し、目的の遺伝子等の発現を誘導できる一つの発現系単位をいう。
また、本明細書で「外因性遺伝子発現ベクター」とは、人為的操作を介して外部から導入された外来性の遺伝子発現ベクターのことをいう。ただし、内因性の遺伝子発現ベクターであっても、トランスジェニック昆虫の後代のように、その起源が外因性遺伝子発現ベクターに由来する内因性遺伝子発現ベクターは、本発明の外因性遺伝子発現ベクターに含まれる。
本明細書で「発現可能な状態」とは、目的の遺伝子等を発現可能なように本態様の遺伝子発現ベクター内に組み込むことができること、又は組み込んでいることを意味する。具体的には、目的の遺伝子等が外因性遺伝子発現ベクター内のプロモーターの制御下に配置され得ること、又は配置されていることをいう。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターは、目的の遺伝子等の発現を制御するプロモーターを必須構成エレメントとして含む。また、目的の遺伝子等、エンハンサー、マルチクローニングサイト、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、シグナルペプチドＤＮＡ、ターミネーター、標識遺伝子、インスレーター、及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等を選択構成エレメントとして含むことができる。以下、本態様の遺伝子発現ベクターの各構成エレメントについて具体的に説明をする。
（１）プロモーター
プロモーターは、本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいて中核的役割を担う必須の構成エレメントである。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターの含むプロモーターは、１６４９塩基の配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを最小活性単位として含む。この塩基配列は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）におけるｈｓｐ９０遺伝子の発現を制御するプロモーター（ｈｓｐ９０遺伝子プロモーター）の配列に基づく。プロモーターの長さは、前記１６４９塩基以上であれば特に限定はしないが、好ましくは配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端側に、さらに２ｋｂ以内、１．５ｋｂ以内、１．３ｋｂ以内、１．２ｋｂ以内、１．０ｋｂ以内、５００ｂｐ以内、４００ｂｐ以内、３００ｂｐ以内、２５０ｂｐ以内、又は２００ｂｐ以内で延長した長さである。延長するプロモーターの塩基配列も前記１６４９塩基以外は特に限定はしないが、カイコのｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの塩基配列において、配列番号１で表される塩基配列の上流域（５’末端側）に隣接する塩基配列が好ましい。プロモーターの塩基配列において、特に好ましくは１８８４塩基の配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプロモーターである。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいてプロモーターは、その下流域（３’末端側）の制御領域範囲内に後述する目的の遺伝子等を配置できるように構成されている。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいて上記プロモーターは、後述する実施例で示すように、導入する昆虫の細胞内において、遺伝子やその断片の発現を胚発生初期から成虫時まで継続的に、かつユビキタスに制御することのできる構成的活性型プロモーターである。
（２）目的の遺伝子等
本明細書において「目的の遺伝子等（目的の遺伝子又はそのヌクレオチド断片）」とは、所望のタンパク質又はそのペプチド断片をコードする遺伝子又はそのヌクレオチド断片、あるいは機能性核酸をコードするポリヌクレオチドをいう。
本明細書において「所望のタンパク質又はそのペプチド断片」とは、本態様の外因性遺伝子発現ベクターを導入する宿主昆虫の細胞内で発現させるべき任意のタンパク質又はそのペプチド断片である。このタンパク質は、構造タンパク質又は機能タンパク質のいずれであってもよい。構造タンパク質の例としては、コラーゲン、アクチン、ミオシン、フィブロイン等の繊維タンパク質、ケラチン、ヒストン等が挙げられる。機能タンパク質の例としては、ペプチドホルモン（インスリン、カルシトニン、パラトルモン、成長ホルモン等）、サイトカイン（上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）等）、転写因子（ＧＡＬ４を含む）、免疫グロブリン、血清アルブミン、ヘモグロビン、酵素等が挙げられる。また、前記所望のタンパク質は、野生型タンパク質又は変異型タンパク質を問わない。例えば、機能獲得型のような変異型タンパク質であってもよい。さらに、前記タンパク質又はそのペプチド断片は、その活性の有無も問わない。不活性型の変異型タンパク質であっても本態様の遺伝子発現ベクターを導入した昆虫にドミナントネガティブ効果を付与することができるからである。ただし、通常は活性を有するタンパク質又はその活性ペプチド断片であることが好ましい。また、前記タンパク質は、異なる複数のタンパク質の全部又は一部を融合させたキメラタンパク質であってもよい。例えば、カイコの中部絹糸腺で特異的に発現するセリシンタンパク質のシグナルペプチドと後部絹糸腺で特異的に発現するフィブロインＨ鎖（ＦｉｂＨ）タンパク質のキメラ遺伝子が挙げられる。さらに、そのタンパク質の由来する生物種が本態様の外因性遺伝子発現ベクターを導入する宿主生物種と異なっていてもよい。例えば、本態様の外因性遺伝子発現ベクターにコードされたタンパク質がヒト由来のコラーゲンで、その外因性遺伝子発現ベクターに導入する宿主がカイコの場合が挙げられる。
本明細書において「機能性核酸」とは、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、転写、翻訳の阻害又は亢進）を有する核酸分子をいう。具体的には、例えば、ＲＮＡ干渉剤、核酸アプタマー（ＲＮＡアプタマー等）、リボザイム、Ｕ１アダプター、又は転写因子結合領域等が挙げられる。「ＲＮＡ干渉剤」とは、生体内においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ），ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）又はアンチセンスＲＮＡが挙げられる。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいて目的の遺伝子等は、複数含まれていてもよい。目的の遺伝子等がタンパク質をコードする場合、各目的の遺伝子等は同じタンパク質をコードする遺伝子等であってもよいし、異なるタンパク質をコードする遺伝子等であってもよい。ただし、この場合、外因性遺伝子発現ベクターにおいて各目的の遺伝子等は、前記プロモーターの制御領域範囲内に配置されていなければならない。また、目的の遺伝子等は、モノシストロニックｍＲＮＡをコードすることもできるし、ポリシストロニックｍＲＮＡをコードすることもできる。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいて目的の遺伝子等は、発現対象物であり、構成上重要な構成エレメントである。しかし、目的の遺伝子等は、必須構成エレメントではない。これは、目的の遺伝子等を組み込むべき領域が外因性遺伝子発現ベクター内で目的に応じて交換可能な「カセット領域」だからである。それ故、目的の遺伝子等が組み込まれるまで、そのカセット領域は、「空」の状態であっても構わない。ただし、そのカセット領域が空の状態の場合には、発現対象物が存在しないことから、本態様の外因性遺伝子発現ベクターとしての機能は発揮し得ない。したがって、目的の遺伝子等を組み込むべきカセット領域が空の状態の本態様の外因性遺伝子発現ベクターは、いわば静止状態にある外因性遺伝子発現ベクターと解することができる。
（３）マルチクローニングサイト
マルチクローニングサイトは、本態様の外因性遺伝子発現ベクターの選択構成エレメントである。構成する塩基配列や包含する制限酵素部位の種類及び数については、制限はしない。また、外因性遺伝子発現ベクターにおけるマルチクローニングサイトの数や配置される位置についても、制限はしないが、前記プロモーターの制御領域範囲内で、目的の遺伝子等を組み込むべきカセット領域周辺に配置することが好ましい。そのような位置に配置することで、クローニングした目的の遺伝子等を本態様の外因性遺伝子発現ベクターに簡便に導入することができるからである。
（４）５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、それ自身がタンパク質やその断片、又は機能性核酸をコードしない非翻訳領域からなるポリヌクレオチドである。本態様の外因性遺伝子発現ベクターでは、選択構成エレメントである。それぞれ目的の遺伝子等のｍＲＮＡコード領域の開始コドンの上流（５’末端側）及び終止コドンの下流（３’末端側）に配置される塩基配列で構成され、３’ＵＴＲは、ポリＡシグナルを含むことができる。
（５）シグナルペプチドＤＮＡ
シグナルペプチドＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、本態様の外因性遺伝子発現ベクターの選択構成エレメントである。シグナルペプチドは、目的の遺伝子等の発現によって生合成されたタンパク質又はその断片を細胞外に分泌させる場合に必要となる細胞外移行シグナルである。シグナルペプチドは、通常、分泌性タンパク質のＮ末端側に配置されており、分泌前にシグナルペプチダーゼによって切断除去される。したがって、本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいても所望のタンパク質又はそのペプチド断片がシグナルペプチドを有する場合には、シグナルペプチドは、所望のタンパク質又はそのペプチド断片のＮ末端側に配置される。シグナルペプチドは、通常、Ｎ末端側にＬｙｓやＡｒｇのような正電荷を有するアミノ酸を配し、それに続いてＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＰｈｅのような疎水性の高いアミノ酸配列を配する。また、シグナルペプチドのＣ末端側には、シグナルペプチドの切断と分泌を促進するシグナル配列後挿入配列及び／又は融合タンパク質からシグナルペプチドを切断するシグナルペプチダーゼ認識部位を含むアミノ酸配列を有することもできる。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、特に限定はしない。通常は、３〜６０アミノ酸の範囲内にあればよい。したがって、シグナルペプチドＤＮＡの塩基長も９〜１８０塩基の範囲にあればよい。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおけるシグナルペプチドＤＮＡとして、限定はしないが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン１シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン２シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号９で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン３シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号１１で示される塩基配列を含むＤＮＡ）が挙げられる。
（６）ターミネーター
ターミネーターは、本態様の外因性遺伝子発現ベクターにおいて目的の遺伝子等の発現時にその転写を終結できる塩基配列で構成される選択構成エレメントである。
（７）標識遺伝子
標識遺伝子は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、本態様の外因性遺伝子発現ベクターの選択構成エレメントである。標識タンパク質には、酵素、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質又は発光タンパク質が含まれる。この標識遺伝子及び標識タンパク質の構成については、第２態様で詳述することから、ここではその具体的な説明を省略する。
（８）インスレーター
インスレーターは、本態様の外因性遺伝子発現ベクターの選択構成エレメントであって、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのｃＨＳ４配列やショウジョウバエのｇｙｐｓｙ配列などが挙げられる。
（９）トランスポゾンの逆位末端反復配列
「トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、本態様の外因性遺伝子発現ベクターが相同組換え可能な発現ベクターの場合に含まれ得る選択構成エレメントである。逆位末端反復配列は、通常は２個１組で使用され、トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓ等を用いることができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９，２７７−２８１；Ｗａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９（２）：１４５−５５）。
（１０）遺伝子発現ベクター
本態様の外因性遺伝子発現ベクターは、様々な遺伝子発現ベクターを利用することができる。例えば、プラスミド若しくはバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）のような自律複製可能な発現ベクター、ウイルスベクター、又は染色体中に相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主のゲノム中に挿入したゲノムの一部が挙げられる。発現ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターとすることもできる。
１−３．用途
本態様の外因性遺伝子発現ベクターは、昆虫の細胞内に導入し、目的の遺伝子等をその昆虫細胞内で発現させることを目的とした形質転換用として用いることができる。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターを導入する昆虫の種類については、限定はしない。例えば、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、アミメカゲロウ目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、又はトビケラ目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）に属する種が挙げられる。好ましくは産業上利用可能な昆虫である。「産業上利用可能な昆虫」とは、人間社会において有益性のある昆虫をいう。例えば、絹糸を提供する絹糸虫、ハチミツやロイヤルゼリーを提供するミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）に属する種、シェラックを提供するラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ  ｌａｃｃａ）、花粉媒介用として有用なミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）に属する種、生物農薬として利用可能なハナカメムシ科（Ａｎｔｈｏｃｏｒｉｄａｅ）又はテントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）に属する肉食性の種が該当する。本明細書において「絹糸虫」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。通常は、幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種を指す。具体的には、チョウ目、ハチ目、アミメカゲロウ目、トビケラ目に属する種である。好ましくは、多量の絹糸を吐糸できるチョウ目に属する種である。カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、イボタガ科（Ｂｒａｈｍａｅｉｄａｅ）、オビガ科（Ｅｕｐｔｅｒｏｔｉｄａｅ）、カレハガ科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、ミノガ科（Ｐｓｙｃｈｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｈｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）等に属する種は本明細書の絹糸虫として好ましい。Ｂｏｍｂｙｘ属、Ｓａｍｉａ属、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｓａｔｕｒｎｉａ属、Ａｔｔａｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｉｎｉａ属に属する種、具体的には、カイコ、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ；エリサンＳａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、ヒメヤママユ（Ｓａｔｕｒｎｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オオミズアオ（Ａｃｔｉａｓ  ｇｎｏｍａ）等は、より好ましい。さらに、産業上の利用可能性に加えて、移動性が限定される昆虫及び／又は閉鎖空間内で飼育可能な昆虫は、本態様の遺伝子発現ベクターを導入する昆虫として特に好適である。カイコはその典型例である。
１−４．導入方法
本態様の外因性遺伝子発現ベクターの導入方法について、説明をする。
本態様の外因性遺伝子発現ベクターを導入する宿主は、昆虫由来の細胞（株化細胞を含む）、昆虫由来の組織、又は昆虫個体のいずれであってもよい。細胞若しくは組織の場合にはそれが採取された又はそれが由来する個体の発生ステージは問わない。同様に、個体の場合にはその個体の発生ステージは問わない。胚、幼虫、蛹、又は成虫のいずれのステージであってもよい。また、宿主の雌雄も問わない。
導入方法は、導入する外因性遺伝子発現ベクターの種類に応じて当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、導入する宿主がカイコで、外因性遺伝子発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ  ＡＭ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７５２０−５）を有するプラスミドの場合であれば、Ｔａｍｕｒａらの方法（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）を利用することができる。簡単に説明すると、本態様の外因性遺伝子発現ベクターと共にトランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するヘルパーベクターをカイコの初期胚にインジェクションすればよい。前記ヘルパーベクターとしては、例えば、ｐＨＡ３ＰＩＧが挙げられる。本態様の外因性遺伝子発現ベクターが目的の遺伝子等の一つとして標識遺伝子を含む場合には、その遺伝子等の発現に基づいて形質転換体を簡便に選抜することができる。これについては、第２態様で詳述する。
１−５．効果
本態様の外因性遺伝子発現ベクターによれば、それを昆虫細胞内に導入することで、胚から成虫に至る全ての発生ステージで、個体全身において目的の遺伝子を強力に発現を誘導できる。
２．形質転換体判別マーカー
２−１．概要
本発明の第２の態様は、形質転換体判別マーカーである。本態様の形質転換体判別マーカーを導入した昆虫、すなわち形質転換体は、初期胚の段階から容易に判別することができる。
２−２．構成
本態様の形質転換体判別マーカーの構成は、第１態様の外因性遺伝子発現ベクターと同一である。ただし、第１態様の外因性遺伝子発現ベクターでは、包含し得る目的の遺伝子等が任意のタンパク質又はそのペプチド断片をコードできたのに対して、本態様の形質転換体判別マーカーでは、第１態様の外因性遺伝子発現ベクターの目的の遺伝子等が標識遺伝子又はその機能ヌクレオチド断片に特定されている。つまり、本態様の形質転換体判別マーカーは、前記第１態様の外因性遺伝子発現ベクターの一実施形態とみなすことができる。基本構成が第１態様の外因性遺伝子発現ベクターと共通することから、ここでは本態様に特徴的な構成についてのみ、以下で具体的に説明をすることとする。
（１）標識遺伝子
本明細書において「標識遺伝子」とは、標識タンパク質をコードする遺伝子である。本明細書において「標識タンパク質」は、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。したがって、標識タンパク質の活性に基づいて、本態様の形質転換体判別マーカーを保有している形質転換体を容易に判別することができる。ここで「活性に基づいて」とは、活性の検出結果に基づいて、という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によってその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。好ましくは検出に際して形質転換体判別マーカーを保有する宿主、すなわち形質転換体に対する侵襲性の低い標識タンパク質である。例えば、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質、外部形態を制御するタンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質は、形質転換体の外部形態を変化させることなく特定の条件下で視覚的に検出可能なことから、形質転換体に対する侵襲性が非常に低く、また形質転換体の判別及び選抜が容易なことから特に好適である。
本明細書において「蛍光タンパク質」は、特定波長の励起光を照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ（３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄのような派生物を含む）、ＹＦＰ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＡＰＣ、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ、３ｘＰ３−ＥＧＦＰ等の派生物を含む）等が挙げられる。
本明細書において「色素合成タンパク質」は、色素の生合成に関与するタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。好ましくは個体の外部色彩として表れる色素である。例えば、メラニン系色素（ドーパミンメラニンを含む）、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
本明細書において「発光タンパク質」とは、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、基質タンパク質としてのルシフェリン又はイクオリン、酵素としてのルシフェラーゼが挙げられる。
本明細書において「外部分泌タンパク質」とは、細胞外又は体外に分泌されるタンパク質であり、外分泌性酵素の他、フィブロインのような繊維タンパク質やセリシンが該当する。外分泌性酵素には、ブラストサイジンのような薬剤の分解又は不活化に寄与し、宿主に薬剤耐性を付与する酵素の他、消化酵素が該当する。
標識遺伝子は、形質転換体判別マーカーにおいてプロモーターの下流に発現可能な状態で配置される。
（２）機能ヌクレオチド断片
機能ヌクレオチド断片は、前記標識遺伝子と同様に、形質転換体判別マーカーにおいてプロモーターの下流に発現可能な状態で配置される。
本明細書において「（その）機能ヌクレオチド断片」とは、標識遺伝子の断片であって、機能ペプチド断片をコードするヌクレオチドである。「機能ペプチド断片」とは、標識タンパク質の断片で、かつその活性を保持するペプチドをいう。機能ペプチド断片は、標識タンパク質の活性を保持する限り、そのアミノ酸長は問わない。
（３）その他
本態様の形質転換体判別マーカーにおいて、標識遺伝子及び／又は機能ヌクレオチド断片は、第１態様に記載のプロモーターの制御範囲内に２つ以上含まれていてもよい。この場合、各標識遺伝子や機能ヌクレオチドは同じ活性を有する標識タンパク質をコードするものであってもよいし、異なる活性を有する標識タンパク質をコードするものであってもよい。例えば、蛍光タンパク質であるＧＦＰをコードする遺伝子を２つ含む場合や、ＧＦＰをコードする遺伝子と色素合成タンパク質をコードする遺伝子を組み合わせて含む場合が挙げられる。前者の場合、形質転換体判別マーカーあたりの標識タンパク質の発現量を倍増することができ、形質転換体の判別感度を増強することができる利点がある。また、後者の場合、蛍光と色彩という異なる２つの視点から形質転換体を検出することができるため、判別精度を高めることができる利点がある。
本態様の形質転換体判別マーカーは、標識遺伝子及び／又は機能ヌクレオチド断片に加えて、プロモーターの制御範囲内に第１態様に記載の目的のタンパク質やそのペプチド断片、あるいは機能性核酸をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、ある変異型タンパク質を昆虫個体の全身で発現させて、その機能解析を行いたい場合に、その変異型タンパク質と標識タンパク質をコードする遺伝子をプロモーターの制御範囲内に配置した形質転換体判別マーカーを昆虫個体に導入することで、標識タンパク質による形質転換体の判別と変異型タンパク質の個体全身における機能解析を同時に行うことができる。
２−３．効果
本態様の形質転換体判別マーカーによれば、それを導入した宿主昆虫において、胚期から成虫期に至る全発生ステージにおいて、全身で包含する標識遺伝子又はその機能ヌクレオチド断片を強力に発現することができる。それ故に、従来方法では判別が困難であった発生初期の胚であっても、形質転換体を容易に判別することができる。
３．形質転換体
３−１．概要
本発明の第３の態様は形質転換体である。本態様の形質転換体は、第１態様の外因性遺伝子発現ベクター又は第２態様の形質転換体判別マーカーを含むことを特徴とする。本態様の形質転換体は、第１態様の外因性遺伝子発現ベクター又は第２態様の形質転換体判別マーカーに包含された目的の遺伝子等を全発生ステージにおいて、個体全体で発現することができる。
３−２．構成
本態様の形質転換体は、第１態様の外因性遺伝子発現ベクター又は第２態様の形質転換体判別マーカーを細胞内に包含する。すなわち、第１態様の外因性遺伝子発現ベクター又は第２態様の形質転換体判別マーカーの導入によって形質転換された宿主が本態様の形質転換体に該当する。前述のように、第２態様の形質転換体判別マーカーの基本構成は第１態様の外因性遺伝子発現ベクターと同一であり、第２態様の形質転換体判別マーカーは第１態様の外因性遺伝子発現ベクターの一実施形態とみなすことができることから、本態様では第２態様の形質転換体判別マーカーを第１態様の外因性遺伝子発現ベクターに包含することとする。したがって、本態様の形質転換体は、宿主及び第１態様の外因性遺伝子発現ベクターで構成されている。以下、具体的に説明をする。
（１）宿主
本態様の形質転換体を構成する宿主は、前記第１態様の「１−３．用途」に記載した昆虫と同じである。その種類は限定しないが、産業上の利用可能な昆虫であることが好ましく、さらに移動性が限定される昆虫及び／又は閉鎖空間内で飼育可能な昆虫は、より好ましい。例えば、カイコが好適な宿主として挙げられる。宿主の状態も「１−４．導入方法」に記載した宿主の状態と同じである。すなわち、昆虫由来の細胞（株化細胞を含む）、昆虫由来の組織、又は昆虫個体であり、いずれの場合にもその種類、発生ステージ、及び雌雄は問わない。
宿主は、後述する第１態様の外因性遺伝子発現ベクターを導入した形質転換体第１世代だけでなく、その後代を含む。本明細書において「後代」とは、形質転換体第１世代の子孫個体であって、第１態様の外因性遺伝子発現ベクターをその細胞内に保持している個体をいう。後代は、第１態様の外因性遺伝子発現ベクター保持する限りにおいてその世代数を問わない。
（２）第１態様の外因性遺伝子発現ベクター
第１態様の外因性遺伝子発現ベクターの具体的な構成については、第１態様に詳述していることから、ここではその説明を省略する。
第１態様の外因性遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で宿主ゲノム内に組み込まれた状態で存在することができ、また宿主ゲノムとは独立した状態で存在することもできる。宿主ゲノムとは独立した状態で存在する場合、その存在は一過的なものであってもよい。この場合、本態様の形質転換体は、一時的又は一世代限定的なものとなる。本態様の形質転換体を安定的かつ持続的なものとするためには、第１態様の外因性遺伝子発現ベクターが宿主ゲノム内に組み込まれていることが好ましい。
【実施例】
【０００７】
＜実施例１：外因性遺伝子発現ベクターを有するカイコ形質転換体の作出＞
（目的）
エンハンサートラップ系統群から分離されたカイコＡｙＦｉｂ−４３１ａ系統では、ｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの制御下に挿入されたレポーター遺伝子がカイコの胚期から成虫期まで、全身で強く発現を誘導することが明らかとなった。そこで、本発明の外因性遺伝子発現ベクターとして、このｈｓｐ９０遺伝子プロモーターを利用した発現ベクターを構築し、本発明の効果を奏することを確認する。
（方法）
（１）外因性遺伝子発現ベクターの構築
まず、ｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄベクター（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ，７５：８９−９７）のＢａｍＨＩ部位をＮｈｅＩ部位に改変したｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ（ＡＮＢ）ベクターを作製した。このベクターをＡｓｃＩ及びＸｂａＩで切断して、Ａ３ｄＧＡＬ４断片を除き、その部分にＰＣＲで増幅したＧＦＰ及びＳＶ４０ターミネーター配列を挿入してｐＢａｃＧＦＰ／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄベクターを作製した。
次に、カイコｈｓｐ９０遺伝子の転写開始点から上流約２．９ｋｂの領域（ｇ２９００：２８８４ｂｐ）をｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの候補領域として、フォワードプライマー（配列番号１２）及びリバースプライマー（配列番号１３）を用いて、カイコ白／Ｃ系統のゲノムを鋳型としてＰＣＲでその領域を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼには、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用した。ＰＣＲの反応条件は９４℃５分で熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３分を３５サイクルで行った。増幅産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に挿入してクローニングし、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００を得た。クローニングした領域の塩基配列をシーケンシングにより確認した後、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００を鋳型として、５’末端にＮｈｅＩ部位を配置した、フォワードプライマー（配列番号１４）及びリバースプライマー（配列番号１５）を用いて、ＰＣＲを行ってｇ２９００配列を再増幅した。
最後に、前記再増幅断片をｐＢａｃＧＦＰ／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄベクターのＧＦＰ遺伝子の上流に位置するＸｂａＩサイトに挿入して、図３に示す本発明の外因性遺伝子発現ベクター（形質転換判別マーカー）であるｐＢａｃｇ２９００ＧＦＰ／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄを得た。
（２）外因性遺伝子発現ベクターの精製
構築した外因性遺伝子発現ベクターは、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコルに従い、精製した。さらに、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製して、０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５ｍＭ塩化カリウムバッファーに溶解した。
（３）トランスジェニックカイコの作出
上記で作出した外因性遺伝子発現ベクターｐＢａｃｇ２９００ＧＦＰ／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄを、トランスポゼースを発現するヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８  ８１−８４）と１：１の割合で混合し、産卵後２〜８時間のカイコｗ１−ｐｎｄ系統（白眼・白卵・非休眠系統）の胚にインジェクションした。インジェクション後の胚は、穴を瞬間接着剤（コニシ＃３０５２３）で塞ぎ、加湿状態、２５℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫を飼育し、兄妹交配、あるいは非インジェクション個体との交配を行った。得られた胚を３ｘＰ３ＤｓＲｅｄの発現の有無で選抜し、本態様の外因性遺伝子発現ベクターを含むトランスジェニックカイコ系統を獲得した。
獲得した本発明の外因性遺伝子発現ベクターを含むトランスジェニックカイコ系統において、ｇ２９００のプロモーター活性を確認するために、ｇ２９００の下流に連結したＧＦＰ遺伝子の発現をＧＦＰ蛍光により確認した。ＧＦＰ蛍光の観察には蛍光実体顕微鏡（ＭＺ１６ＦＡ；ライカ社）を用いた。
（結果）
図４に結果を示す。ｇ２９００を含む本発明の外因性遺伝子発現ベクターは、オリジナルのＡｙＦｉｂ−４３１ａ系統と同様に、胚から成虫に至る全ての発生ステージで、個体全身において制御領域下のＧＦＰ遺伝子を強力に発現誘導でき、本発明の効果を奏し得ることが立証された。
＜実施例２：カイコｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの活性領域の決定＞
（目的）
実施例１の結果からｇ２９００がカイコのｈｓｐ９０遺伝子プロモーター活性を有することが明らかとなった。そこで、本実施例では、ｇ２９００に基づいて、本発明の外因性遺伝子発現ベクターのプロモーターとして機能し得るｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの最小活性領域を決定する。
（方法）
（１）外因性遺伝子発現ベクターの構築
ｇ２９００配列又はその部分配列のプロモーター活性の測定を行うために、図５Ａに示すホタル由来の発光酵素タンパク質ルシフェラーゼ遺伝子の上流に各プロモーター配列を挿入した外因性遺伝子発現ベクターを構築した。
ｇ２９００全長を挿入した外因性遺伝子発現ベクターについては、フォワードプライマー（配列番号１４）及びリバースプライマー（配列番号１５）を用いて、実施例１で作製したｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００を鋳型にｇ２９００配列としてＰＣＲで増幅した増幅断片を、ｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入することによって構築した。これをｐＧＬ３−ｇ２９００とした。
図６に示すｈｓｐ９０遺伝子プロモーターの部分配列であるｇ２９００Δ１−２、ｇ２９００Δ１−３、ｇ２９００Δ１−４、及びｇ２９００Δ１−５をそれぞれ挿入した外因性遺伝子発現ベクターについては、まず、ｇ２９００の５’末端から２０３３位に位置するＸｂａＩ部位の上流領域（２０３３ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。具体的には、各部分断片に特異的なフォワードプライマー（ｇ２９００Δ１−２：配列番号１６、ｇ２９００Δ１−３：配列番号１７、ｇ２９００Δ１−４：配列番号１８、及びｇ２９００Δ１−５：配列番号１９）と部分断片の全てに共通するリバースプライマー（配列番号２０）を用いた。それぞれの増幅産物を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩに挿入して、クローニングした領域の塩基配列をシーケンシングにより確認した。各プラスミドのＸｂａＩ部位にｐＧＬ３−ｇ２９００をＸｂａＩで切断して得られたｇ２９００の２０３３位以降を含む断片を挿入して、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００Δ１−２、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００Δ１−３、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００Δ１−４、及びｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｇ２９００Δ１−５を得た。これらのプラスミドをＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで切断してｇ２９００の部分配列を切り出し、ｐＧＬ３に挿入することでｐＧＬ３−ｇ２９００Δ１−２、ｐＧＬ３−ｇ２９００Δ１−３、ｐＧＬ３−ｇ２９００Δ１−４、及びｐＧＬ３−ｇ２９００Δ１−５を作製した。
（２）外因性遺伝子発現ベクターの精製
構築した外因性遺伝子発現ベクターは、実施例１と同様にＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコルに従い、精製した。さらに、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製して、０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５ｍＭ塩化カリウムバッファーに溶解した。
（３）補正用ベクター
培養細胞への遺伝子導入効率を補正するために補正用ベクターとして、図５Ｂに示すドクガＯｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａのｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ２（ＩＥ２）遺伝子プロモーター下でウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を発現するベクターｐＯｐＩＥ２−ｃｏｒｅ−Ｒｌｕｃ（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４２  ４７４−４８１）を用いた。
（４）カイコ培養細胞へのトランスフェクション
カイコの培養細胞にはＮＩＡＳ−Ｂｍ−ｏｙａｎａｇｉ２を使用した（農業生物資源研究所より入手）。１．６μｌのＦｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、０．１μｇの各外因性遺伝子発現ベクター、及び０．１μｇのｐＯｐＩＥ２−ｃｏｒｅ−Ｒｌｕｃコントロールベクターを混合し、４．５×１０４のＯｙａｎａｇｉ細胞に添加してトランスフェクションした。２５℃で７２時間インキュベートした後、５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により細胞を溶解し、−８０℃で保存した。
（５）ルシフェラーゼ活性測定
ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ活性測定には、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。（４）の細胞溶解液にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを懸濁したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩを加え、ルミノメーター（ニチオン社）によりホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）活性を測定した。その後、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを懸濁したＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｂｕｆｆｅｒを加えてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）活性を測定した。得られたウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づいて、それぞれの外因性遺伝子発現ベクターに由来するホタルルシフェラーゼ活性を補正して、各ｈｓｐ９０部分断片のプロモーター活性を得た。
（結果）
図７に結果を示す。ｇ２９００Δ１−２、ｇ２９００Δ１−３及びｇ２９００Δ１−４では高いホタルルシフェラーゼが見られ、ｇ２９００と同等以上の強いプロモーター活性を有することが明らかとなった。また、これらのプロモーターの中では配列番号２で表されるｇ２９００Δ１−３が最も強いプロモーター活性を有することも判明した。
一方、転写開始点から上流に１５５５ｂｐの配列を有する配列番号５で表されるｇ２９００Δ１−５では、プロモーター活性を有するものの、他の部分配列のプロモーター活性と比較して著しく低下することが明らかとなった。
以上の結果から、配列番号１で表され、カイコのｈｓｐ９０遺伝子の転写開始点から上流に１６４９ｂｐのｇ２９００Δ１−４が本発明の外因性遺伝子発現ベクターに必要とされるプロモーターとして必要かつ十分な活性を有することが判明した。
＜実施例３：遺伝子プロモーターの活性比較＞
（目的）カイコｈｓｐ９０遺伝子プロモーターと従来頻用されていた遺伝子プロモーターとの発現誘導活性を比較する。
（方法）
（１）外因性遺伝子発現ベクターの構築及び精製
外因性遺伝子発現ベクターの構築及び精製の基本的な方法は、実施例１に記載の方法に従った。カイコのｈｓｐ９０遺伝子プロモーターにはｇ２９００を用いた。また、陰性対照にはｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、さらに活性比較対照にはカイコの遺伝子組換えにおいて遺伝子プロモーターとして頻用されるアクチンＡ３遺伝子プロモーター（ＢｍＡ３）を使用した。ｇ２９００を挿入した外因性遺伝子発現ベクターについては、実施例２で作製した「ｐＧＬ３−ｇ２９００」を用いた。一方、ＢｍＡ３を挿入した外因性遺伝子発現ベクターｐＧＬ３−ＢｍＡ３については、以下のように作製した。まず、前記非特許文献１に記載されているｐＨＡ３ＰＩＧベクターを鋳型として、５’末端にＮｈｅＩ部位を配置したフォワードプライマー（ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＣＧ：配列番号２１）と、５’末端にＸｈｏＩ部位を配置したリバースプライマー（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡ：配列番号２２）を用いてＰＣＲを行い、ＢｍＡ３プロモーター領域を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼには、ＫＯＤｐｌｕｓ  （ＴＯＹＯＢＯ社）を使用した。ＰＣＲの反応条件は９５℃１分で熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃１分を３０サイクルで行った。次に、増幅産物をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、得られた断片をｐＧＬ３ベクターに挿入した。これをｐＧＬ３−ＢｍＡ３とした。
（２）補正用ベクター
培養細胞への遺伝子導入効率を補正するための補正用ベクターには、実施例２に記載のｐＯｐＩＥ２−ｃｏｒｅ−Ｒｌｕｃを用いた。
（３）カイコ培養細胞へのトランスフェクション
カイコ培養細胞へのトランスフェクションの具体的方法については実施例２に記載の方法に従った。
（４）ルシフェラーゼ活性測定
ルシフェラーゼ活性の測定については、実施例２に記載の方法に準じた。
（結果）
図８に結果を示す。本発明のカイコｈｓｐ９０遺伝子プロモーターに由来するｇ２９００は、当該分野で従来一般的に用いられていたカイコＡ３プロモーターの約２０倍も高い活性を示し、極めて活性効率の高いプロモーターであることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明の外因性遺伝子発現ベクターによれば、それを昆虫細胞内に導入することで、胚から成虫に至る全ての発生ステージで、個体全身において目的の遺伝子の発現を強力に誘導することができる。
本発明の形質転換判別マーカーによれば、それを昆虫細胞内に導入することで、胚から成虫に至る全ての発生ステージで、トランスジェニック昆虫を簡便に、効率的に、かつ正確に判別することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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