(57)【要約】  ポリエチレンイミンや多価カチオン性抗菌剤といった抗菌物質を水不溶性担体に安定な形で結合させ、水溶液中の微生物菌体を長期間、連続して吸着除去する資材（抗菌資材）の開発を図る。  分子量200〜1000,000のポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させた結合体であって、前記結合体は微生物菌体を吸着する微生物菌体吸着媒とその製造方法を提供する。また、多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させた結合体であって、前記結合体は微生物菌体を吸着する微生物菌体吸着媒とその製造方法を提供する。
2016114280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量200〜1000,000のポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させた結合体であって、前記結合体は微生物菌体を吸着するものであることを特徴とする微生物菌体吸着媒。
【請求項２】
多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させた結合体であって、前記結合体は微生物菌体を吸着するものであることを特徴とする微生物菌体吸着媒。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物菌体吸着媒における前記水不溶性担体に、抗菌性を有する物質が結合されたことを特徴とする微生物菌体吸着媒。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか記載の微生物菌体吸着媒を微生物が繁殖し得る被保存物に接触させた状態で保存することを特徴とする微生物繁殖性被保存物の保存法。
【請求項５】
分子量200〜1000,000のポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させることにより、微生物菌体を吸着する結合体を得ることを特徴とする微生物菌体吸着媒の製造方法。
【請求項６】
多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させることにより、微生物菌体を吸着する結合体を得ることを特徴とする微生物菌体吸着媒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、微生物菌体を吸着除去させる資材及びその製造方法に関する。また、当該資材を用いた食品等の被保存物の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類の生命活動の中で、環境中の微生物を制御する事は極めて大きな意義を有している。人類は、微生物を利用することによって様々の利益を得て来たが、一方では微生物との戦いに勝利する事によって発展して来た歴史を持っており、殺菌・抗菌能を有する物質の開発とそれらの効率的な利用は人類にとって極めて重要な課題である。【０００３】
現在までに、抗生物質（生物が生産する抗菌物質）を始め、種々の微生物制御物質が開発され実用に供せられている。しかし、それらの物質は、何れも水溶性であり、水の存在する条件下で使用すると逸散してしまうので、工業生産の場で持続的に安定して効力を発揮させることが困難であった。【０００４】
抗菌・殺菌能を有する物質を水不溶性担体に結合させて持続的に抗菌・殺菌効果を保持させる技術も開発されているが（特許技術 １）、現在までに開発されている抗菌・殺菌物質を担持させた資材は、抗菌・殺菌物質の安定性や製品の安定性、価格、あるいは汎用性の面で改良の余地が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２７７９０１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】内田恵美子、岩田博夫、筏義人、ポリエチレンイミン吸着繊維の抗菌性、日本家政学会誌  ５３巻、３６１−３６７、2002年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、優れた抗菌効果、特に優れた除菌効果を発揮する微生物菌体吸着資材及びその製造方法を提供することを目的とする。
また、当該微生物菌体吸着資材を微生物菌体が繁殖し得る被保存物に接触させた状態で保存する被保存物の保存法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明は、安定性、殺菌活性及び価格的に、より優れた抗菌活性を有する水不溶性資材を提供するもので、その価値は既存の資材を遥かに凌駕する大きな意義を有している。
多価カチオン性物質の一種であるポリエチレンイミンが、従来、殺菌力を持つとされてきたが（非特許文献１）、その活性は実用に利用出来るものではなく、学問的に解析すれば殺菌活性を否定出来ない程度のものであった。【０００９】
本願発明者は、ポリエチレンイミンがアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）にて「間接食品添加物」として食品の包装に使用されていることに着目し、これに抗菌性を付与出来れば、機能性の包装材を製造出来るものと考えて検討を加え、水不溶性の物質に結合させて固定化すると、水溶液中の微生物菌体を吸着除去する機能を持たせ得ることを発見して、詳細な検討を加え本願発明を完成するに至った。【００１０】
本発明者らは、（１）分子量200〜1000,000のポリエチレンイミン（以下、PEIと称する）を水不溶性担体に結合させた結合体（以下、PEI-担体と称する）が微生物菌体を吸着する強い活性を有することを発見し、この知見に基づき本願発明を完成させた。すなわち、PEIを結合させた水不溶性担体が水を含む溶液中の細菌や酵母菌体を能動的に吸着して当該液体中から微生物を除去することを発見し、この知見に基づき本願発明を完成させた。水不溶性担体としては、セルロースを含有する物質、有機酸が結合したポリマー（より具体的にはペクチン、アルギン酸など）、カルボニル基を有する物質（より具体的には、ポリエステル、ポリアミド）、ウレタン結合を有する物質、ヒドロキシルを有する物質、ガラス質または粘度鉱物（より具体的にはケイ酸化合物など）を例示することができ、さらに具体的には、布、木材、ポリエステルなどのプラステイック類を例示することができる。【００１１】
また、本発明者らは、（２）多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させた結合体（以下、PAA-担体と称する）にあっても微生物を吸着する強い活性を有することを発見し、この知見に基づき本願発明を完成させた。多価カチオン性抗菌剤としては、ポリリジン、プロタミン、ハイジニア、キトサン、クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニジドなどを例示でき、１種又は２種以上を選択して用いることができる。【００１２】
さらに本発明者らは、（３）PEI-担体やPAA-担体に、抗菌性を有する物質を結合させることによって新規な微生物菌体吸着媒を提供するものである。
（３−１）抗菌性を有する物質としては、上述の多価カチオン性抗菌剤を含む。【００１３】
（３−２）抗菌性を有する物質としては、上記の多価カチオン性抗菌剤以外の物質も用いることができる。例えば、チンクピリチオン、ヒノキチオール、グルコサミン、アセチルグルコサミン、キチン、ポリアミン、タンニンなどを例示することができる。また、銀イオン、銀錯体、銅イオン、銅錯体、チタン化合物、チタン錯体など抗菌性の物質を用いることもできる。これらの抗菌性を有する物質は、１種又は２種以上を選択して用いることができる。【００１４】
本発明は、PEI-担体やPAA-担体が、これらの抗菌性を有する物質を含有することによって、新規な固定化抗菌材を製造することを可能とした点で極めて利用性の高い技術である。
（４）また、本発明はPEI-担体からなる微生物菌体吸着媒、抗菌性を有する物質を結合させたPEI-担体からなる微生物菌体吸着媒、PAA-担体からなる微生物菌体吸着媒、若しくは抗菌性を有する物質を結合させたPAA-担体からなる微生物菌体吸着媒を、食品などの微生物が繁殖し得る被保存物に接触させた状態で保存することを特徴とする新規有用な微生物繁殖性被保存物の保存法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の微生物菌体吸着媒は、水を含む溶液・気体中の微生物菌体を連続して吸着除去することができ、優れた抗菌効果、特に優れた除菌効果を発揮する。
本発明の微生物菌体吸着媒を、例えば、包装用資材として用いた場合にあっては、被保存物の微生物菌体の繁殖を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】水不溶性担体である綿布にPEIを結合させる際のPEI濃度とPEIの結合量、及び黄色ブドウ球菌の除去能との関係を示す写真である。
【図２】PEI-綿布による培地中の黄色ブドウ球菌の除去能を示す写真である。
【図３】PEI-綿布への大腸菌の吸着を確認するための試験手順を示す図である。
【図４】PEI-キッチンペーパー担体で細菌懸濁液を処理した場合の細菌の除菌効果を示す写真である。
【図５】オレンジ７溶液で染色した、PEI-オガクズ担体と対照の写真である。
【図６】PEI-担体複合体と対照のハロー試験の結果を示す写真である。
【図７】オレンジ７溶液で染色した、ポリリジン-綿布担体と対照の写真である。
【図８】オレンジ７溶液で染色した、キトサン-綿布担体と対照の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態の一例をとりあげて説明する。
ここで、「抗菌」とは菌の繁殖を抑制することを意味し、「殺菌」とは菌などの病原体を死滅させることを意味し、「除菌」とは菌を取り除くことを意味し、「静菌」とは菌の増殖を一時的に抑制することを意味する。
【００１８】
本発明の微生物菌体吸着媒は、分子量200〜1000,000のポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させた結合体である。また、本願発明の微生物菌体吸着媒は、多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させた結合体である。
本発明に用いられるポリエチレンイミンは、その分子量（平均分子量）が200〜1000,000である。この分子量に限られるものではないが、200以上であることが本願発明に係る機能および製造操作の点から好ましい。
【００１９】
本発明に用いられる多価カチオン性抗菌剤は、ポリリジン、プロタミン、ハイジニア、キトサン、クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニジドなどを例示することができる。多価カチオン性抗菌剤は、１種又は２種以上を選択して用いることができる。
本発明に用いられる水不溶性担体は、ポリエチレンイミンや多価カチオン性抗菌剤などのポリカチオン性化合物を結合させ得る水不溶性の物質であれば、何れの物質でも使用できるが、水不溶性のポリアニオン性物質、カルボニル化合物、ポリエステル化合物、ウレタン化合物など化学合成高分子物質、天然高分子物質の何れでも原料と出来る。形態とすれば、バルクポリマーもしくはフィルム、繊維、ウエブ、織布、布帛、不織布、繊維、シート、ダンボール、木材、粒状物（木材チップ、オガクズ、そば殻、モミガラなど）及びそれらを用いる構造物などポリカチオン性化合物を結合出来る資材であればいずれでも用いることができる。
【００２０】
ポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させて、微生物菌体を吸着する結合体、すなわち微生物菌体吸着媒を得る方法は、特に制限されない。例えば、ポリエチレンイミンを水に溶解したポリエチレンイミン溶液を用いて水不溶性担体に結合させる方法や、ポリエチレンイミンを樹脂等の水不溶性担体の原料に添加し成形して結合させる方法等が挙げられる。液状のポリエチレンイミンそのものに水不溶性担体を浸漬したり塗布したりしてポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させてもよい。
【００２１】
ここで、ポリエチレンイミンと水不溶性物質との結合のメカニズムは確定されてはいないが、化学結合による担持であると考えている。
ポリエチレンイミン溶液を用いて水不溶性担体に結合させる方法にあっては、ポリエチレンイミン溶液に水不溶性担体を一定時間浸漬させて結合させる方法や、ポリエチレンイミン溶液を水不溶性担体の表面に噴霧して結合させる方法、ポリエチレンイミン溶液を水不溶性担体の表面に塗布して結合させる方法等が挙げられる。その後、必要に応じて乾燥させる。乾燥の際の条件については、特に制限されない。
【００２２】
ポリエチレンイミン溶液を用いて水不溶性担体に結合させる場合、溶液のｐＨは9〜11の範囲であることが好ましい。溶液のｐＨが上記範囲を外れると、水を含む溶液に本発明の微生物菌体吸着媒を接触させた場合、水を含む溶液中で水不溶性担体に結合させたポリエチレンイミンが水不溶性担体から離脱し溶液に可溶する恐れがある。
【００２３】
また、ポリエチレンイミン溶液中のポリエチレンイミン濃度は、0.1〜20重量％の範囲であることが好ましく、0.2〜1.0重量％の範囲であることがより好ましい。0.25重量％以上の濃度であることが、十分な効果を得る点で有利である。また、ポリエチレンイミンを2.0重量％以上の濃度とすることも可能であるが、濃度を高めてもそれに見合う効果の向上が困難であると考えられる。
【００２４】
ポリエチレンイミンを樹脂等の水不溶性担体の原料に添加し成形して結合させる方法にあっては、ポリエチレンイミンと水不溶性担体の原料とを混練し、射出成型、押出し成形、ロール成形、圧縮成形等の成形方法にて、プレート、フィルム、シート、繊維、あるいは種々の形態に成形することができる。水不溶性担体の原料に対し5.0〜10重量％のポリエチレンイミンを混練することが好ましい。
【００２５】
多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させて、微生物菌体を吸着する結合体を得る方法は、ポリエチレンイミンを水不溶性担体に結合させて、微生物菌体を吸着する結合体を得る方法と同様の方法を用いることができる。
多価カチオン性抗菌剤と水不溶性担体との結合も、ポリエチレンイミンと水不溶性物質との結合と同様、化学結合による担持であると考えている。
【００２６】
多価カチオン性抗菌剤を水などに溶解した多価カチオン性抗菌剤溶液を用いて水不溶性担体に結合させる場合、溶液のｐＨは、多価カチオン性抗菌剤の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、多価カチオン性抗菌剤としてポリリジンを用いる場合にあっては、その溶液のｐＨを10以上とすることが好ましく、多価カチオン性抗菌剤としてキトサンを用いる場合にあっては、その溶液のｐＨを1.0〜6.0の範囲内とすることが好ましい。
【００２７】
また、多価カチオン性抗菌剤溶液中の多価カチオン性抗菌剤の濃度は、多価カチオン性抗菌剤の種類に応じて適宜設定すればよいが、例えば、多価カチオン性抗菌剤としてポリリジンを用いる場合にあっては、0.25〜1.0重量％であることが好ましく、例えば、多価カチオン性抗菌剤としてキトサンを用いる場合にあっては、0.25〜1.0重量％の範囲であることがより好ましい。
【００２８】
さらに、多価カチオン性抗菌剤を樹脂等の水不溶性担体の原料に添加し成形して結合させる方法にあっては、多価カチオン性抗菌剤と水不溶性担体の原料とを混練し、射出成型、押出し成形、ロール成形、圧縮成形等の成形方法にて、プレート、フィルム、シート、繊維、あるいは種々の形態に成形することができる。水不溶性担体の原料に対する多価カチオン性抗菌剤を混練する割合は、多価カチオン性抗菌剤の種類に応じて適宜設定すればよい。
【００２９】
なお、両方の結合について、その詳細なメカニズムは不明であるが、本発明者らは下記のメカニズムによるものと考えている。多価カチオン性抗菌剤にあってはその一例としてポリリジンを例に説明する。
１）リグニン等とアミンの反応
リグニン等のフェノール性水酸基を有する化合物はアミンと下式の反応をなす。
【００３０】
【化１】
2016114280.tif 000003
【００３１】
【化２】
2016114280.tif 000004
ポリエチレンイミンとは、下式の反応をなす。
【００３２】
【化３】
2016114280.tif 000005
２）綿繊維（セルロース）への吸着
セルロースを水酸化ナトリウムで処理すると、６位の水酸基（下記の式、化４中で〇で示した「ＯＨ」）部位の水素がＮａに入れ替わることが知られている。
【００３３】
【化４】
2016114280.tif 000006
そして、上記の事実からすると、アルカリ性においてセルロースはフェノールと同じような性質を有し、アミンと反応するものと考えらる。
【００３４】
【化５】
2016114280.tif 000007
【００３５】
【化６】
2016114280.tif 000008
また、セルロースと芳香族アミンを酸触媒の存在下に加熱することによって、セルロースのアミン誘導体が生成するとの報告がある（エヌオーケー株式会社、特開２０００−５３７０２号）。この場合も、６位の水酸基がアミンで修飾されたものと考えらるものであり、セルロースとキトサンの反応は、この反応であると考えられる。
【００３６】
３）カルボニル基とポリエチレンイミンの反応
ポリエチレンイミンはアルデヒド、ケトン、エステル、ウレタン結合等のカルボニル基と、下式の反応をなす。
【００３７】
【化７】
2016114280.tif 000009
４）カルボニル基とアミンの反応
アミンは弱酸性において、アルデヒド、ケトン、エステル、ウレタン結合等のカルボニル基と下式の反応をなす。
【００３８】
【化８】
2016114280.tif 000010
また、本発明の実施に際しては、ポリエチレンイミンを結合させた水不溶性担体（PEI-担体）や多価カチオン性抗菌剤を結合させた水不溶性担体（PAA-担体）に、抗菌性を有する物質を結合させてもよい。
【００３９】
抗菌性を有する物質には、上述の多価カチオン性抗菌剤を含む。また、抗菌性を有する物質として、上記の多価カチオン性抗菌剤以外の物質を用いることができる。例えば、チンクピリチオン、ヒノキチオール、グルコサミン、アセチルグルコサミン、キチン、ポリアミン、タンニンなどを用いることができる。また、銀イオン、銀錯体、銅イオン、銅錯体、チタン化合物、チタン錯体などの金属物質を用いることもできる。これらの抗菌性を有する物質は、１種又は２種以上を選択して用いることができる。
【００４０】
抗菌性を有する物質を水不溶性担体に結合させるには、水不溶性担体にポリエチレンイミンを結合させて微生物菌体を吸着する結合体を得る方法や、水不溶性担体に多価カチオン性抗菌剤を結合させて微生物菌体を吸着する結合体を得る方法と同様の方法を用いることができる。
【００４１】
抗菌性を有する物質を水不溶性担体に結合させるに際し、ポリエチレンイミンを結合させた水不溶性担体にさらに抗菌性を有する物質を結合させてもよいし、ポリエチレンイミンと抗菌性を有する物質とを同時に水不溶性担体に結合させてもよい。また、多価カチオン性抗菌剤を結合させた水不溶性担体にさらに抗菌性を有する物質を結合させてもよいし、多価カチオン性抗菌剤と抗菌性を有する物質を同時に水不溶性担体に結合させてもよい。
【００４２】
本発明の微生物菌体吸着媒は、水を含む溶液中の微生物菌体を吸着し除去することができる。また、微生物菌体は、水を含む溶液中以外に存在するものであってもよく、例えば、食品中の微生物菌体を吸着し除去することもできる。
ここで、水を含む溶液とは、水や水溶液等が挙げられる。また、本発明の微生物菌体は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、枯草菌等の菌類、カンジタ菌等の酵母菌体が挙げられる。
【００４３】
また、本発明の微生物菌体吸着媒を微生物菌体が繁殖し得る被保存物に接触させて保存することができる。
被保存物としては、おにぎりや総菜、エビ等の食品や花の球根等の植物等が挙げられる。また、この被保存物に対して用いられる本発明の微生物菌体吸着媒の形態としては、おにぎりなどの包装に使用するフィルムの形態を例示できる。また、エビ、花の球根などの包装に使用するオガクズの形態を例示し得る。これらの例示以外、被保存物の種類や態様に応じて、本発明の微生物菌体吸着媒は、本明細書に記載の種々の形態の水不溶性担体にPEIなどを結合させたものとして実施することができる。これにより、被保存物の微生物菌体の繁殖を抑え、ひいては被保存物の賞味期限や保存期限の延長も期待できる。
【実施例】
【００４４】
以下に本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、本願発明の抗微生物活性の評価に使用した微生物は、次の通りである。【００４５】
（１）大腸菌：Eschelichia coli IFO 03301
（２）黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus JCM 20624
（３）枯草菌：Bacillus subtilis JM101
（４）酵母：Candida albicans JCM 1542
（実施例１）PEI-担体の製造
PEIの水不溶性担体への結合の条件を検討し、本発明では次に述べる方法を確立し、以下、此の方法に準じて本発明を実施した。【００４６】
PEI（30wt％水溶液、日本触媒株式会社製、P-1000（粘度法による数平均分子量（Ｍｎ）は70,000））を炭酸水でpH 7.5に調整し、PEI濃度を0.5〜１％になるように蒸留水で希釈し、此れに水不溶性担体として綿布（綿100％ の一辺 5 cm の正方形）を浸漬して30分間、室温で静置した後、PEIが結合されたPEI-担体を取り出し、余剰のPEI液を水洗などで除去後、65℃で3時間乾燥させて、PEI担体を製造した。【００４７】
綿布に結合させたPEI量は、1.75％アシッドオレンジ7（和光純薬株式会社製）溶液（以下、オレンジ７溶液とする）による発色度で測定した。次に、細菌吸着活性による方法によりPEI結合量を測定した。すなわち、微生物菌体である黄色ブドウ球菌の水溶液（650〜660 nm における濁度:1.0）3 mlに100ｍgのPEI-担体を入れ、10 分間、室温で静置し、上清の濁度（650nm)の変化と、生菌数（cfu、コロニー形成数）をNutrient Broth(以下、NB培地、DIFCO社製）寒天平板上で30℃で24時間培養して測定した。対照として、PEIを結合させていない綿布を上記と同じ方法で処理した液を用いた。【００４８】
図１に、綿布にPEIを結合させる際のPEI濃度とPEIの結合量、及び黄色ブドウ球菌の除去能との関係を示す。
発色度測定の結果、PEI液中のPEI濃度に比例して綿布にPEIが結合されていることを確認した。【００４９】
上清の濁度（650nm)の変化は1.0以上であった。
また、PEI液中のPEI濃度が0.２５wt％以上のPEI液中で綿布にPEIを結合させたPEI担体にあっては、目視で確認したところ、測定培地上にコロニーが形成されておらず、上清の濁度の変化と相まって当該溶液中の黄色ブドウ球菌を吸着除去するものであると考えた。【００５０】
（試験例１）PEI-担体への微生物菌体吸着活性１
100 ml 容の三角フラスコに滅菌したNB培地40 mlを入れ、黄色ブドウ球菌を104cfu/mlとなるよう接種して30℃で24時間、振盪培養した。このNB培地に、実施例1の方法で製造したPEI-担体（PEI液中のPEI濃度0.5％ wt％、綿100％ の一辺 5 cm の正方形の綿布：PEI-綿布と称する）を無菌的に投入して、10分間、室温で振盪した。その結果を図２に示す。PEI-綿布を投入した三角フラスコ中の培地が透明であり、PEI-綿布を投入した場合、黄色ブドウ球菌はNB培地中から消失していることが観察され、対照であるPEIを結合させていない綿布を投入した三角フラスコ中の培地が濁っているのが観察されたことから、PEI-綿布が黄色ブドウ球菌を吸着除去する機能を持つと考えられた。【００５１】
（試験例２）PEI-担体への微生物菌体吸着活性２
この現象を更に明確にする目的で、次に述べる試験を行った。
100 ml 容の三角フラスコに滅菌した蒸留水20 mlを入れ、実施例1の方法で製造したPEI-担体（水溶液中のPEI濃度0.5wt％、綿100％ の一辺 5 cm の正方形の綿布：PEI-綿布と称する）を無菌的に投入した。これに培養液（30℃で24時間培養、104〜105 cfu/ml cfu/ml）を滅菌蒸留水で100倍に希釈して、その0.1 ml を接種して、25℃、120 rpmで30分間振盪培養した。培養液（Ｓ１）を適宜希釈し、NB寒天平板培地上に塗抹して25℃で24時間培養して形成されるコロニーを計測した。次に、100 ml 容の三角フラスコに滅菌した蒸留水20 mlを入れ、培養液（Ｓ１）から取り出したPEI-綿布を投入し、25℃、120 rpmで30分間振盪し、振盪後の蒸留水（Ｓ２）を適宜希釈し、NB寒天平板培地上に塗抹して25℃で24時間培養して形成されるコロニーを計測した。次に、100 ml 容の三角フラスコに滅菌した蒸留水20 mlを入れ、Ｓ２から取り出したPEI-綿布を投入し、25℃、120 rpmで30分間振盪し、振盪後の蒸留水（Ｓ３）を適宜希釈し、NB寒天平板培地上に塗抹して25℃で24時間培養して形成されるコロニーを計測した。次に、Ｓ３から取り出したPEI-綿布をNB培地20mlに浸漬し、25℃、120 rpmで一夜振盪培養し、振盪培養した培地（Ｓ４）の650nmにおける濁度を測定した。次に、Ｓ４から取り出したPEI-綿布をNB培地20mlに浸漬し、25℃、120 rpmで一夜振盪培養し、振盪培養した培地（Ｓ５）の650nmにおける濁度を測定した。対照として、PEIを結合させていない綿布を上記と同じ方法で処理した液を用いた。以下、図３に示す手順で処理し、PEI-担体は取り出してNB液体培地に浸漬し、25℃、150 rpmで一夜振盪培養して、菌の増殖をモニターしたところ、表１に示す結果が得られた。これらの結果は、PEI-担体は、黄色ブドウ球菌体を水溶液中から吸着除去し、吸着した細菌はPEI-担体を水洗しても溶出されないが、培地中に投入して培養すると吸着した菌体の一部は増殖することを示唆した。此の事実から、実用上では、PEI-担体は細菌の殺菌力より吸着除去力を活用することが有利であると推測される。【００５２】
【表１】
2016114280.tif 000011
（実施例 ２）種々の水不溶性担体へのPEIの結合
実施例１ の方法に準じて、種々の水不溶性担体を用いてPEI-担体の製造を試みたところ、表２に示す水不溶性担体などがPEI-担体を形成する好適な素材である事が明らかとなった。表２は、種々の水不溶性担体１ｇに結合させたPEI量を、オレンジ7溶液による発色度で測定し、１ｇの木綿布に結合させたPEI量を１００として種々の水不溶性担体１ｇに結合させたPEI量を比較したものである。【００５３】
すなわち、水不溶性担体としては、（ａ）ポリエチレンおよびポリエステル類あるいはそれらを含む織物、編み物、不織布（単織・混織布）、混紡の布帛、（ｂ）獣毛（例えば、羊毛）あるいはそれらを含む織物、編み物、不織布（単織・混織布）、混紡の布帛、（ｃ）木綿繊維を含む不織布、織物、編み物、布帛、（ｄ）絹糸あるいはそれらを含む織物、編み物、不織布（単織・混織布）、混紡の布帛、さらに（ｅ）モミガラ、ソバ殻、稲ワラ、麦ワラ、オガ屑、木材、ボール紙など紙製品などの木質系繊維類、（ｆ）ガラスなどケイ酸含有物、（ｇ）天然ゴム（ラッテクス）の群を好適に用い得ることが明確となった。これらの群は、１種又は複数種を併用することができ、各群中の物質に関しても１種又は複数種を併用することができる。さらにこれらの群に属する物質を含む物質を水不溶性担体として用いることもできる。なお、ポリエチレンおよびポリエステル類あるいはそれらを含むものにあっては、その形態が繊維に限られず、プレート、フィルム、シート等の形態であってもよい。  【００５４】
【表２】
2016114280.tif 000012
（実施例３・試験例３）PEI-担体への抗菌活性
種々のPEI-担体の一例として、水不溶性担体としてキッチンペーパー（セルロース製）を用いてPEI-担体（以下、PEI-キッチンペーパー担体）を製造し、その大腸菌と枯草菌に対する抗菌活性を試験した。すなわち、実施例１ の方法に準じてPEI-キッチンペーパー担体（PEI液中のPEI濃度0.5wt％、一辺 5 cm の正方形のキッチンペーパー）を製造し、この4cm2を切り取り、（Ａ）枯草菌あるいは（Ｂ）大腸菌の増殖を試験例１又は２で述べた方法に準じてモニターした。その結果を図４に示すが、PEI- キッチンペーパー担体を投入した培地では、菌のコロニーが全く形成されず、菌が存在しないことが明らかである一方、対照とした無処理のキッチンペーパーを投入した培地では、両菌株ともに正常な菌の増殖が認められた。この結果から、PEI-キッチンペーパーがグラム陰性、グラム陽性を問わず細菌を除菌する活性を持つことが明らかとなった。【００５５】
（実施例４）PEI-オガクズ担体の製造
実施例1の綿布に替えて、実施例１の方法に準じてオカクズを用いてPEI-オガクズ担体（PEI液中のPEI濃度0.5wt％、２００ｍｇのオガクズ）を製造した。オガクズに結合させたPEI量は、オレンジ7溶液による発色度で測定した。オレンジ７溶液で染色した、PEI-オガクズ担体と対照のPEIを結合させていないオガクズの写真を図５に示す。【００５６】
（試験例４）PEI-オガクズ担体の抗菌活性
このPEI-オガクズ担体の抗菌活性を評価する目的で、PEI-オガクズ担体200mg をNB培地中に添加し、これに大腸菌、黄色ブドウ球菌、あるいは酵母カンヂダ・アルビカンスを105 cfu/mlとなるように接種した。これらを25℃、120 rpmで一夜振盪培養し、650 nmで濁度を測定して、菌の増殖を評価した。その結果、表３に示す様に、PEI-オガクズ担体も抗菌活性を示すことが明らかになった。【００５７】
【表３】
2016114280.tif 000013
（実施例５）PEI-担体の抗菌力の増強
PEI-担体の抗（除）菌機能を増強させる目的で、殺菌活性が認められている銀-ヒスチジン錯体（Ag-His、日本曹達株式会社製)あるいは、ポリリジン（三栄源株式会社製）をPEI-担体に結合させてPEI-担体複合体を製造した。すなわち、実施例１に準じて作成したPEI-担体（水溶液中のPEI濃度0.5wt％、一辺 5 cm の正方形のキッチンペパー）を5重量％のAg-Hisあるいは1重量％ポリリジン水溶液（pH 9.5）に1時間浸漬した後、液中から取り出し、蒸留水による洗浄操作を２回繰り返した後60℃1時間で乾燥させた。また、PEIを結合させていないキッチンペパーを対照として同様の処理を施した。【００５８】
（試験例５ ）PEI-担体複合体の抗菌活性
こうして作成したPEI-担体複合体の殺菌活性は大腸菌を塗抹した寒天平板培地を用いて検定した。具体的には、大腸菌（104 cfu/ml）を塗抹した寒天平板培地の上にPEI-担体複合体と対照をそれぞれ載置し、25℃、24時間培養した（ハロー試験）。ハロー試験の結果を図６に示すが、PEI-担体（PEI-担体をディスク状に裁断したペーパーデイスク）に銀-ヒスチジン錯体あるいはポリリジンを結合させた場合に抗菌活性の増強が認められた。【００５９】
なお、図６において「ポリリジンのみ担持」の試験片の周囲には、ハローが確認されていない。これは、次の理由によると考えられる。ポリリジンは、微生物菌体と接触することによって細胞表層に損傷を与えることで抗菌効果を発揮する。したがって、水溶液の状態では菌がが死滅するが、担体と結合させるとポリリジンは担体外では菌との接触面が少なく、寒天培地表面での殺菌速度よりも増殖速度が大きいので、殺菌によるハローは検出することが出来ないと考えられる。一方、銀イオンの場合は、寒天との接触面での銀イオン濃度が大で、殺菌活性が菌の増殖速度より大きく培地中に浸出するため、ハローが検出できるものと考えられる。但し、銀イオンの場合、その担持濃度に比べると、ハローの形成は小さいものである。【００６０】
（実施例６）ポリリジン-綿布担体の製造
多価アニオン性抗菌剤の一つである、ポリリジン50％含有のサンキーパーNo. 381（三栄源株式会社製、サンキーパー381、ｐＨ9）を蒸留水に溶解し、水酸化カリウム液でpH 11以上に調製した後、蒸留水を加えてポリリジン1重量％溶液を調製した。この溶液に水不溶性担体として綿100％の綿布（精練品、5-cm 角の正方形）を浸漬して一夜室温で静置した。ポリリジンが結合されたポリリジン-綿布担体を取り出し、水洗により余剰のポリリジンを除去した後、60℃で3時間乾燥した。結合させたポリリジン量は、1.75％オレンジ7（和光純薬株式会社製）溶液による発色度で測定した。オレンジ７溶液で染色した、ポリリジン-綿布担体と対照であるポリリジンを結合させていない綿布の写真を図７に示す。【００６１】
（試験例６）ポリリジン-綿布担体の抗菌性
ポリリジン-綿布担体の抗菌性は、次の方法で測定した。すなわち、上記の方法で製造したポリリジン-綿布担体を20 mlの滅菌水に浸漬し、これらの浸漬液に大腸菌、黄色ブドウ球菌、あるいは酵母を、細胞数が103〜104 cfu/ml になる様に接種し、25℃、120 rpmで振盪した。１時間後と１２時間後との２度、培養液を0.1 ml採取し、それぞれをNB寒天培地上に接種し、30℃で24時間培養して寒天培地上に形成されたコロニーを計測してcfuとした。表４に示すように、ポリリジン-綿布担体は強い抗菌性を示し、この条件で何れの微生物も完全に殺滅されることが明らかになった。【００６２】
【表４】
2016114280.tif 000014
（実施例７）ポリリジンの種々の水不溶性担体への結合
実施例６の方法に準じて、実施例 6の綿布に替えて種々の水不溶性担体へのポリリジンの結合を調べたところ、PEI の場合と同様に、本願発明で開発した条件では、種々の水不溶性担体にポリリジンを結合させ得ることが明らかになった。表５に、本発明による方法での種々の水不溶性担体へのポリリジンの結合を示した。表５は、種々の水不溶性担体１ｇに結合させたポリリジン量を、オレンジ7溶液による発色度で測定し、１ｇの木綿布に結合させたPEI量を１００として種々の水不溶性担体１ｇに結合させたポリリジン量を比較したものである。【００６３】
【表５】
2016114280.tif 000015
（実施例８）キトサン-綿布担体の製造
キトサン（キミカキトサン、キミカ社製）1 gを、80 ml の蒸留水に懸濁し、撹拌しながら、これに炭酸ガスを通気してキトサンを溶解させて、キサトン溶液（ｐＨ3.0）に綿布（精練品、5-cm 角）を浸漬して室温で一夜静置した。この綿布を引き出して水洗で余剰のキトサンを除去した後、60℃で3時間乾燥した。この操作により、綿布にキトサンが吸着していることは、実施例1に述べた、色素染色法で確認した。オレンジ７溶液で染色した、キトサン-綿布担体と対照であるキトサンを結合させていない綿布の写真を図８に示す。【００６４】
（試験例７）キトサン-綿布担体の抗菌活性
このキトサン-綿布担体の大腸菌に対する抗菌活性を試験例6と同様の手法で測定して結果を表６に示す。これらの結果からキトサン-綿布担体は静菌活性を有するものと考えた。【００６５】
【表６】
2016114280.tif 000016
また、このキトサン-綿布担体をNB培地中に添加し、これに大腸菌を104 cfu/mlとなるように接種した。これらを25℃、120 rpmで12時間振盪培養した。此の液（NB培地）及びこれを生理食塩水を用いて10倍に希釈した液（10倍希釈NB培地）を作製した。これらの培養液１ mlを100 ml容の三角フラスコに取り、それぞれ20ml の蒸留水を添加して希釈した。此の大腸菌溶液に上記の方法で作製したキトサン担持綿布（５ｃｍ×５ｃｍ）2枚を投入して、25℃、120 rpm で30分間撹拌した後の上層液の650 nmにおける濁度を測定して、除菌活性を評価した。その結果、表７に示す様に、キトサン-綿布担体は除菌活性を示すことが明らかになった。【００６６】
【表７】
2016114280.tif 000017
（試験例８）キトサン-綿布担体の吸着能
次に微生物の吸着能に関して検討した。すなわち、
大腸菌、黄色ぶどう球菌、またはカンジダ・アルビカンスを104 cfu/mlとなるようにNB培地に接種して２５℃、１２０ｒｐｍにて一夜振盪培養した。これらの培養液を滅菌水で２０倍に希釈し、その２０ｍｌを１００ｍｌ容の三角フラスコに採取し、上記の方法で作製したキトサン-綿布担体（５ｃｍ×５ｃｍ）２枚を添加し、２５℃、１２０ｒｐｍにて３０分間振盪した。これらの液と、キトサン-綿布担体無添加の希釈培養液の650 nmの吸光度を測定、比較して微生物菌体の吸着能を測定した。【００６７】
その結果を表８に示すが、キトサン-綿布担体を添加して振盪したことによって、菌液の吸光度は著しく減少した。これらの結果から、キトサン-綿布担体は大腸菌、黄色ぶどう球菌、およびカンジダ・アルビカンスなど、細菌や酵母の菌体を吸着し除去する機能を有することが明らかになった。【００６８】
【表８】
2016114280.tif 000018
（実施例 ９）ポリリジン・PEI-綿布複合体の製造（1）
精練した綿布（使用綿糸番手：20番手[たて、よこ共]）、織物タイプ：平織り、サンプルの大きさ：幅8cm×長さ8cm、質量：0.68 g を実施例 １に示した方法で処理してPEI-担体を製造した（PEI液中のPEI濃度1wt％）。このPEI-担体を0.2重量％のポリリジン（三栄源株式会社製、サンキーパー381、pＨ9.5）水溶液に浸漬して30分間室温に放置した後、よく絞って余剰のポリリジン液を除去し、水洗、室温で風乾してポリリジン・PEI-綿布複合体（以下、ポリリジン・PEI-綿布複合体）を製造した。【００６９】
（試験例９）ポリリジン・PEI-綿布複合体の抗菌活性
このポリリジン・PEI-綿布複合体（１cm2)を20 mlの殺菌生理食塩水に浸漬して抗菌活性を測定した。すなわち、この浸漬液に大腸菌、黄色ブドウ球菌あるいは酵母を、細胞数が104〜105 cfu/ml になる様に接種し、25℃、120 rpmで1時間振盪培養した。この培養液を0.1 ml採取し、NB寒天培地上に接種し、30℃で24時間培養して寒天培地上に形成されたコロニーを計数してcfuとした。また、25℃、120 rpmで1時間振盪した培養液を一夜培養した後（1時間の振盪培養を含む）、650nm における濁度を測定して増殖度とした。その結果を表９に示すが、ポリリジン・PEI-綿布複合体を含む水中で３株の微生物菌体は完全に死滅した除菌状態を実現したことが明確になり、ポリリジン・PEI-複合体が抗菌材として有効であることが立証された。【００７０】
【表９】
2016114280.tif 000019
【００７１】
（試験例１０）ポリリジン・PEI-綿布複合体の安定性の評価（反復使用）
100-ml容の三角フラスコに蒸留水20mlを入れ、加圧滅菌した。この滅菌水に、予め75％エタノールで滅菌した300mgのポリリジン・PEI-綿布複合体（以下、検体と呼称する）を浸漬し、25℃、120rpmで振盪して、洗浄した（反復回数９回）。各回において、下記の方法で液中の抗菌活性を測定した。反復回数９回で、抗菌活性が検出されなくなった。【００７２】
各回の液中の抗菌活性の測定は、大腸菌（E.coli IFO 3301）を含む、表９に示す３種の被検体として用いた。被検体を細胞数が103〜104 cfu/ml になる様にNB培地に接種し、25℃で１夜振盪培養し、培養液を生理食塩水で1,000倍に希釈し、上記の洗浄液10ml に0.1mlを接種して25℃、120rpmで振盪培養した後、NB寒天培地上で培養してcfuを計測した。【００７３】
これによって、反復回数９回において抗菌活性の完全な消失を確認した上で、ポリリジン・PEI-綿布複合体の抗菌活性を計測したものである。
すなわち、上記の検体を20mlの滅菌水に浸漬して、これに被検菌を103〜104ヶ/mlになる様に植菌して、25℃、120rpmで1時間振盪し、NB寒天培地上でcfuを測定して抗菌活性を評価した。【００７４】
この測定の結果を表１０に示すが、この条件では８回まで、実用的には9回まで反復使用可能であるとする結果を得た。【００７５】
【表１０】
2016114280.tif 000020
PEIまたはポリリジンなどの多価カチオン性物質は、極めて安定な物質で、高い水溶性であるので、PEIやポリリジンなどの多価カチオン性抗菌剤を水不溶性担体に結合させた、本発明に係る微生物菌体吸着媒について、水分を多く含む食品の保存への効果を調べた。実施例３のPEI-キッチンペーパー担体及びポリリジン-キッチンペーパー担体で包装した「剥皮グレープフルーツ果肉」の表面の細菌数の推移を調べた結果、製造後2週間に亘って菌数の増加は認められなかった。ポリリジン-キッチンペーパー担体は、実施例６ の方法に準じて、実施例 ６の綿布に替えてキッチンペーパー（５ｃｍ角、セルロース製）にポリリジンを結合させたものである。【００７６】
また、試験例１０で示した様に、本発明に係る微生物菌体吸着媒は、反復して利用可能な従来に例を見ない新規な実用性の高い抗菌資材である。
【図１】
2016114280.tif 000021
【図２】
2016114280.tif 000022
【図３】
2016114280.tif 000023
【図４】
2016114280.tif 000024
【図５】
2016114280.tif 000025
【図６】
2016114280.tif 000026
【図７】
2016114280.tif 000027
【図８】
2016114280.tif 000028
【国際調査報告】
2016114280.tif 000029
2016114280.tif 000030
2016114280.tif 000031
2016114280.tif 000032
2016114280.tif 000033
2016114280.tif 000034