(57)【要約】  抗真菌活性を有する組成物の有効成分としてプロタミンの加水分解物とテルペンアルコールを組み合わせて用いることにより、抗真菌活性が更に増強されており、かつコストを抑えた産業化に好適である、プロタミン加水分解物としてのペプチドを有効成分として含む抗真菌活性を有する組成物を提供することができる。
2016039229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとを有効成分として含む、抗真菌活性を有する組成物。
【請求項２】
前記プロタミン加水分解物が、以下の配列番号：１〜３のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩からなるペプチド化合物の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の抗真菌活性を有する組成物。
配列番号：１
Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg
配列番号：２
Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
配列番号：３
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
【請求項３】
前記テルペンアルコールが、モノテルペンアルコールあるいはセスキテルペンアルコールから選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物。
【請求項４】
前記モノテルペンアルコールが、ヒノキチオールまたはゲラニオール、テルピネン-4-オール、メントール、メントール誘導体、リナロールである請求項３に記載の抗真菌活性を有する組成物。
【請求項５】
前記セスキテルペンアルコールが、パチュリアルコールまたはネロリドールである請求項４に記載の抗真菌活性を有する組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む抗真菌剤。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む食品。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む医薬品または医薬部外品。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む化粧品。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として食品又は化粧品の製造において使用する方法。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗真菌活性を有する組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として医薬品又は医薬部外品の製造において使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとの組み合せからなる抗真菌活性を有した組成物に関するものである。この抗真菌活性組成物は、真菌感染症の予防や治療をするための機能性食品、化粧品及び医薬品や医薬部外品等に広く利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
酵母および糸状菌は真核生物であり、原核生物である細菌に対して真菌と称される。これら真菌のうちある種はヒトに対して病原性を示し、真菌感染症の原因菌となっている。真菌の中でも、カンジダ属の真菌は、広くヒトの消化管に成育し、通常は病原性を示さないが、宿主生体防御能の低下に伴い、様々な感染症を引き起こすことが知られている。とくに、口腔および咽頭、食道カンジダ症は、唾液分泌の低下、糖尿病、抗生物質や免疫抑制剤の長期投与、口腔衛生管理の低下等にともない好発する疾患である。【０００３】
従来、内用抗真菌剤として真菌症の治療に使用される抗真菌剤については、ポリエン系のアムホテリシンＢ、フルオロピリジン系のフルシトシン、イミダゾール系（アゾール系）のミコナゾール及びトリアゾール系（アゾール系）のフルコナゾール、アゾール系のイトラコナゾール等が臨床で使用されている。これらの抗真菌剤の対象となる病原真菌の種類と薬剤感受性は、それぞれの抗真菌剤によって異なるが、これらの対象となる病原真菌の種類は、例えば、カンジダ属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、トリコフィトン属、マラセチア属、コキディオイデス属等が代表的なものである。しかし、これらの抗真菌剤を使用した治療では、真菌による感染が一時的には治癒するものの、多くは再発が見られることや、長期使用に伴い耐性菌が出現するなどの問題点があることから、新たな治療法の導入が求められている。また、高齢者、特に義歯装着者に見られる口腔カンジダ症などは、易感染性を引き起こす原因が取り去られない限り、一時的に治療効果があっても再発する疾患であり、抗真菌剤にかわる口内洗浄剤や機能性食品などの新たな予防法の開発が必要とされている（非特許文献１）。【０００４】
一方、プロタミンは、魚類の精巣（白子）から得られる抗菌活性を有する塩基性タンパク質であり、天然物由来の食品保存料である（特許文献１）。プロタミンの原料となる白子は、鍋物用の具材として食されるなど、古くからの食経験もあること、マウスに対する急性毒性試験やラットに対する亜慢性毒性試験等が実施され（非特許文献２）、その安全性が確認されていることなどから、プロタミンは安全面において優れている抗菌剤である（非特許文献３）。プロタミンは微生物の中でも、バシラス属や乳酸菌などのグラム陽性細菌に対して特に強い抗菌活性を示し（非特許文献４）、酵母や糸状菌に対する抗真菌活性は非常に弱いことが知られている（非特許文献５）。【０００５】
プロタミンの抗真菌活性を高めるために、プロタミンを加水分解する方法が知られており、その加水分解物に含まれる以下の（１）〜（３）の各ペプチドまたはその塩が抗真菌活性を有することが報告されている（特許文献１）。
（１）Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Argで示される配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
（２）Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Argで示される配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
（３）Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Argで示される配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。【０００６】
一方、プロタミンを加水分解することで得られる特定のアミノ酸配列を含むペプチドは、in vitroでは高い抗菌活性を示すものの、生体内におけるとくに高塩濃度下では活性が低下する傾向が認められていた（非特許文献１）。そこで、生体内での抗菌活性を高めるために、ペプチドを合成して環状化する方法が報告されている（非特許文献６）。【０００７】
一方、ある種の植物精油または精油成分が他の薬剤の皮膚浸透性を高めることが知られている。従来の抗真菌剤の治療効果を高めるために、抗真菌剤と抗真菌活性のある精油またはテルペンアルコールとを併用すると、薬剤の皮膚透過性が向上し、その血中濃度が著しく高まることが報告されている（特許文献２）。ここでいうテルペンアルコールとは、１分子中の炭素数が１０個のモノテルペンアルコールと、１５個のセスキテルペンアルコールを指す。例えば、パルマローザ油およびその主成分のゲラニオールは、皮膚に投与された抗真菌剤テルビナフィンの血中濃度をそれぞれ著しく高めることが知られ、また、ラベンダー油とその主成分のリナロール、パチュリ油とその主成分のパチュリアルコール、クロモジ油とその副成分のネロリドールについても、それぞれ程度の違いはあるものの同様の効果を有することが知られている（特許文献２）。【０００８】
皮膚や粘膜におけるカンジダ症、とくに高齢者における口腔カンジダ症、および女性における膣カンジダ症は、それぞれ発症頻度が非常に高く、一般的には抗真菌薬を直接患部に接触させることで治療がなされているが、難治性であり再発を繰り返しやすい。そのため、再発を抑えるために薬剤を長期間使用した結果、肝機能障害などの副作用が発生したり、耐性菌が出現するリスクが大きくなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４５２０４７７号明細書
【特許文献２】特開２０１０−１２６５３２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】安部茂：マウス口腔カンジダ症モデルの開発とその応用，真菌誌 45，227-231(2004)
【非特許文献２】多田幸恵ら：天然保存料しらこたん白のラットによる亜慢性毒性試験,東京都立衛生研究所研究年報，49，267‐276(1998)
【非特許文献３】庵原啓司，根本えりか：しらこたん白(プロタミン)の食品への利用，月刊フードケミカル4月号，24-32 (2006)
【非特許文献４】ブレチン・オブ・ザ・ジャパニーズ・ソサイアティー・オブ・サイエンティフィック・フィッシャーズ(Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries), 50, 1715(1984)
【非特許文献５】ブレチン・オブ・ザ・ジャパニーズ・ソサイアティー・オブ・サイエンティフィック・フィッシャーズ(Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries), 52, 1061(1986)
【非特許文献６】第57回日本医真菌学会総会・学術集会抄録集，98(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
プロタミンを加水分解することで得られるペプチドや精油成分を活用した治療は、副作用や耐性菌の出現といった危険が低い点がメリットであるが、該してこうした天然由来成分は、化学合成された非ペプチド化合物を有効成分とする抗真菌剤よりも、抗真菌活性が低い場合があり、このような場合には、抗真菌活性をより増強させることが必要となる。また、非特許文献６に開示されるように、生体内の高塩濃度下での活性を確保するためのペプチドの環状化は、環状化されたペプチドの合成にコストがかかるため、コストを抑えた抗真菌剤の産業化には適さない方法であった。
本発明の目的は、抗真菌活性が更に増強されており、かつコストを抑えた産業化に好適である、プロタミン加水分解物を有効成分として含む抗真菌活性を有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかる抗真菌活性を有する組成物（抗真菌組成物）は、プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとを有効成分として含むことを特徴とする。
本発明には更に以下の各態様が含まれる。
（１）上記の抗真菌組成物を含む抗真菌剤。
（２）上記の抗真菌組成物を含む食品。
（３）上記の抗真菌組成物を含む医薬品または医薬部外品。
（４）上記の抗真菌組成物を含む化粧品。
（５）上記の抗真菌組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として食品又は化粧品の製造において使用する方法。
（６）上記の抗真菌組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として医薬品又は医薬部外品の製造において使用する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、プロタミンの加水分解により得られるプロタミン加水分解物とテルペンアルコールとの相乗効果によって抗真菌活性が顕著に高められており、耐性菌の出現や副作用の問題が無く、かつ極めて安全性の高い抗真菌活性を有する組成物を提供することができる。抗真菌組成物としては、抗真菌効果を持つオーラルケア素材（含嗽剤、歯磨剤、義歯洗浄剤など）、褥瘡、膣カンジダ症や食道カンジダ症などを含む真菌感染症に対する医薬品（抗真菌剤）、医薬部外品（うがい剤、口腔洗浄剤、薬用歯磨き粉など）、化粧品（軟膏、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセルなど）としての利用が考えられる。口腔カンジダ症は、特に、高齢者やドライマウス患者にて発症する症状であり、今後の高齢化社会でのニーズは大きい。また、口腔カンジダ症だけでなく、褥瘡、膣カンジダ症や食道カンジダ症等のカンジダ症、マラセチア症、並びに、クリプトコッカス症等のその他の真菌感染症への効果的な適用も可能であり、それによる病状の改善、治療、及び感染の予防が可能である。また、プロタミンは食品保存料の既存添加物リストに収載されていることから、医薬品や医薬部外品としてだけでなく、口内洗浄剤や健康食品、特定保健用食品などの機能性食品としての利用も可能であり、患者にとっても入手しやすく使いやすいというメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図２】プロタミン加水分解物とテルピネン4-オールとの併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図３】プロタミン加水分解物とゲラニオールとの併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図４】プロタミン加水分解物とメントールとの併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図５】プロタミン加水分解物とシンナムアルデヒドとの併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図６】プロタミン加水分解物とカプリン酸との併用におけるin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図７】プロタミン加水分解物単独のin vitro評価での抗菌活性の相対値を示す図である。
【図８】プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用におけるin vivo評価での舌スコアの値を示す図である（＊：Ｓｔｅｅｌ  Ｄｗａｓｓの方法でｐ＜０．０５）。
【図９】プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用によるin vitro評価の結果を示す図である。
【図１０】プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用によるin vitro評価の結果を示す図である。
【図１１】各種プロタミン分解物のin vitro評価の結果を示す図である。
【図１２】プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用による舌組織切片の光学顕微鏡観察の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、上述の天然由来成分が抱える課題を解決するために、プロタミンを加水分解することで得られるプロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとを併用することによって、抗真菌活性が著しく増強され、その増強効果が単なる併用による相加効果を上回る相乗効果であることを見出だし、本発明に至った。
【００１６】
プロタミン加水分解物とテルペンアルコールは、それぞれが単独で抗カンジダ効果を発揮することは既に知られていたが、これらを併せて使用すると抗真菌活性が相乗的に高まるという知見は、これまで報告されたことがなかった。一般に、微生物に対して抗菌物質を併用した場合の相乗的効果の定義は、２剤の個別効果の和よりも有意に大きい効果を示した場合を指す。相乗効果の有無に対する評価の基準としては、一例として、２剤のMIC値から求められるFIC係数（fractional inhibitory concentration index）を挙げることができる。FIC係数は以下の式（１）によって求めることができる。
FIC係数の求め方
FIC係数＝A1/A0＋B1/B0・・・・（１）
A0：A剤単独のMIC
A1：A剤、B剤併用時のA剤のMIC
B0：B剤単独のMIC
B1：A剤、B剤併用時のB剤のMIC
FIC係数による併用効果の評価
FIC≦0.5        ：相乗効果
0.5＜FIC≦1.0  ：相加効果
1.0＜FIC≦2.0  ：不関
2.0＜FIC        ：拮抗作用
【００１７】
さらに本発明者らは、プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとの併用による抗真菌活性増強の相乗効果が、従来のin vitro評価系だけでなく、口腔カンジダ症モデルマウスを用いた生体モデルにおいても発揮されることを発見し、本発明を完成させた。即ち、マウスに口腔カンジダ症を発症させると、舌に白苔（カンジダの菌糸）が観察される現象を利用し、プロタミン加水分解物とテルペンアルコールとを併用して経口投与することによって、マウス舌への白苔の形成が有意に抑制され、抗真菌活性が相乗的に増強されていることを発見した。また、本発明者らは、プロタミン加水分解物がマラセチア属の真菌に対する抗菌活性を有することを確認した。
【００１８】
上述した相乗効果の検討に当たって、まず、プロタミン加水分解物と併用する候補素材の精油類をin vitro評価系にてスクリーニングした。その結果、プロタミン加水分解物と、ヒノキチオール、テルピネン-4-オール、ゲラニオール、メントールなどのテルペンアルコール類とを併用することによって、抗真菌活性が相乗的に増強されることが確認された。一方、シンナムアルデヒドやカプリン酸などのテルペンアルコールには分類されない精油類との併用では、抗真菌活性の増強は認められなかった。そこで、プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用を、口腔カンジダ症モデルマウスを用いた生体モデルで評価したところ、相乗効果による舌スコアの顕著な改善が認められ、生体内の高塩濃度下でも相乗活性を維持することが確認された。以上より、プロタミン加水分解物とテルペンアルコールとの併用は、従来のペプチド組成物や精油類を使用する場合の使用量と比較して、同程度あるいは遥かに低用量でも抗真菌活性が増強されることが見出だされたことから、本発明者らは実用面において従来技術よりも進歩性があると考え、本発明に至った。
【００１９】
次に、本発明について詳細に記載する。
プロタミン加水分解物の原料としてのプロタミンは、サケ、ニシン、マス等魚類の精子核中にデオキシリボ核酸と結合したヌクレオプロタミンとして存在する強塩基性蛋白質であり、原料の違いによって、例えばサルミン（サケ）、クルペイン（ニシン）等と称され、それぞれ若干構造は異なるが、何れのプロタミンも使用可能である。
【００２０】
プロタミンの加水分解方法としては、酸、アルカリ、蛋白質分解酵素を用いることができ、又それらの組合せによる分解も利用できるが、蛋白質分解酵素を用いることが望ましい。より詳細には次の通りである。
酸またはアルカリでの加水分解においては、強酸あるいは強アルカリ下でプロタミンを目的とする大きさ（長さ）のペプチドが得られる条件下で加熱処理した後、中和することで目的とする大きさ（長さ）のペプチドを得ることができる。
プロタミンに脱イオン水を加え、水酸化ナトリウム又は塩酸を加えてｐＨを酵素活性が得られるｐＨ、好ましくは至適ｐＨに調整する。反応溶液を酵素活性が得られる温度、好ましくは酵素の至適温度に加温した後、酵素を添加して、攪拌しながら酵素反応を行う。反応終了後、反応液を80〜100℃に加温して5〜60分間加熱失活させpHを中性域となるように調整後、反応液を凍結乾燥し、プロタミン加水分解物を得ることができる。加水分解酵素反応は、５〜１４程度のアミノ酸残基からなるアルギニンリッチなペプチドが得られるまで行い、酵素の加熱失活により停止させることが好ましい。
上記のようにして得られるプロタミン加水分解物中に含まれる各成分を抗真菌用組成物の有効成分として利用することができる。従って、プロタミン加水分解物は、以下に挙げる形態での利用が可能である。
（１）上記の酵素加熱失活後にｐＨ調整した反応液
（２）上記の反応液の凍結乾燥品
（３）上記の反応液または凍結乾燥品から酵素タンパクを除去して得られる調製物
（４）上記の反応液、凍結乾燥品または調製物中のペプチドを所望とする塩の形態に変換して得られる調製物。
【００２１】
本発明において加水分解に用いることのできる蛋白質分解酵素としては、例えばバシラス(Bacillus)属（例えばバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・サーモプロテオリティカス(Bacillus thermoproteolyticus)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)等の産生する酵素、アスペルギルス(Aspergillus)属（例えばアスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・メレウス(Aspergillus melleus)等）の産生する酵素、リゾパス(Rhizopus)属（例えばリゾパス・ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾパス・デレマー(Rhizopus delemar)等）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせても良い。また、蛋白質分解酵素は、蛋白質の内部配列を特異的に認識して切断するエンドペプチダーゼと、末端から１〜２個のアミノ酸残基ずつ切断するエキソペプチダーゼに分類される。従って、必要に応じて、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの組合せにより、様々なペプチド鎖を生成させることが可能である。酵素により加水分解する場合には、基質に対して、酵素0.001〜10質量％を添加し、溶液を使用される酵素の至適pHとして加水分解する。
【００２２】
プロタミン加水分解物中に含まれるペプチドは、必要に応じて無機酸若しくは有機酸との塩や無機塩基若しくは有機塩基との塩の形態として、抗真菌剤の有効成分として用いることができる。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、食品、化粧品、医薬品などへの用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、更にはシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、またはフマル酸等のジカルボン酸との塩、更に、酢酸、プロピオン酸、または酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。又、本発明で得られるペプチド化合物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ− 、ジ− 及びトリ− アルキルアミン塩、モノ− 、ジ− 及びトリ− ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、N−メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。ペプチド成分が塩の形態に変換されたプロタミン加水分解物も、本発明にかかるプロタミン加水分解物に含まれる。
【００２３】
本発明にかかる抗真菌活性を有する組成物、すなわち抗真菌組成物は、抗真菌活性の有効成分として、プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとを含み、抗真菌活性の有効成分がプロタミン加水分解物とテルペンアルコールからなるものであることが好ましい。
プロタミンの加水分解処理により得られる抗真菌活性を有するペプチドとしては、以下の（１）〜（６）に分類されるペプチドを挙げることができる。従って、テルペンアルコールと組み合わせるプロタミン加水分解物としては、以下の（１）〜（６）からなる群から選択された少なくとも１種のペプチド化合物（すなわち、ペプチドまたはその塩）を含むものが好ましい。
（１）Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Argで示される配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩。
（２）Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Argで示される配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩。
（３）Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Argで示される配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩。
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において１から６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩。
（５）配列番号：３のアミノ酸配列において1から4個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩。
（６）配列番号：３の欠失配列が、Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg（配列番号：４）、Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg（配列番号：５）、またはArg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg（配列番号：６）で示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩。
また、プロタミン加水分解物としては、上記（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも１種のペプチド化合物を含むものがより好ましく、上記（１）からなる群から選択された少なくとも１種のペプチド化合物と、上記（２）からなる群から選択された少なくとも１種のペプチド化合物と、上記（３）からなる群から選択された少なくとも１種のペプチド化合物を含むプロタミン加水分解物であることが、更に好ましい。
なお、異なる組成の抗真菌活性を有するプロタミン加水分解物の２種以上を混合して用いることもできる。
【００２４】
次に、本発明で用いるテルペンアルコールとしては、１分子中の炭素数が１０個のモノテルペンアルコール、又は１５個のセスキテルペンアルコールが好ましい。抗真菌活性のある精油および精油成分は他にもあるが、いずれも副作用が報告されており、安全性に問題がある。例えば、シナモンバーク油とその成分のシンナムアルデヒド、レモングラス油とその成分のシトラール、タイム油とその成分のチモール、オレガノ油とその成分のカルバクロールは、いずれも皮膚刺激性が強い。また、ローズマリー油とその成分のカンファー、スペアミント油とその成分のカルボンなどにも抗真菌活性があるが、いずれも中枢神経系への刺激作用が報告されている。しかしながら、ゲラニオール、リナロール、ネロリドールといったテルペンアルコールは、特に注意すべき副作用がなく、安全性が高い。また前述の通り抗真菌活性も高いため、プロタミン加水分解物との併用において最も適している。
【００２５】
本発明に用いられる植物精油とその成分は以下の通りである。ヒノキ油とその主成分であるヒノキチオール、ティートリー油とその主成分であるテルピネン-4-オール、パルマローザ油とその主成分のゲラニオール、ハッカ油とその主成分であるメントールおよびその誘導体、ラベンダー油とその主成分のリナロール、パチュリ油とその主成分のパチュリアルコール、クロモジ油とその副成分のネロリドール。なお、メントール誘導体としては、メンチルラクテート、メントキシプロパンジオール、メンチルヒドロキシブチレート、メントキシフラン、メンチルグルコシド等を挙げることができる。またローズウッド油、ローズゼラニウム油、レモンユーカリ油、ペパーミント油、ネロリ油といった植物精油も、それぞれ同様な効果を期待して用いることができる。
モノテルペンアルコールとしては、ヒノキチオール、ゲラニオール、テルピネン-4-オール、メントール、メントール誘導体及びリナロールからなる群から選択される少なくとも１種を用いることが好ましい。モノテルペンアルコールは、ヒノキチオール、ゲラニオール、テルピネン-4-オール、メントール、メントール誘導体またはリナロールであることが更に好ましい。
セスキテルペンアルコールは、パチュリアルコール及び／またはネロリドールであることが好ましい。
【００２６】
本発明にかかる抗真菌組成物は、例えば、精油または精油成分に、プロタミン加水分解物の原末（例えば、乾燥凍結品）を直接溶解または懸濁して得ることができる。このようにして得られる組成物を抗真菌剤として投与することも可能であるが、実用的には軟膏やゲル剤のような塗布剤、またはスプレー製品のような外用剤の形態が使いやすい。本発明にかかる抗真菌組成物は、その投与形態に応じて、賦形剤、希釈剤、担体（キャリアー）等の少なくとも１種を含有することができる。
精油または精油成分は、エタノールやプロピレングリコールのような適当な溶剤を用いることにより、完全に透明な液体として調製することができる。またジェルナチュレなどの水性ゲル剤やソルビライザーのような精油分散剤を使用して水に懸濁することも可能である。個人または家庭で使用する場合は、刺激性や経済性を考慮して精油または精油成分をキャリアーオイルに予め希釈して投与するのが実際的である。そのためのキャリアーオイルとして、ファーナス油、ホホバ油、スイートアーモンド油、ニーム油、セントジョンズワート油などの植物油があげられる。またお湯に抗真菌組成物を加えて足浴を施すことによっても同様の効果が期待される。
【００２７】
本発明に係るプロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとの両方を有効成分とする抗真菌組成物は、少なくとも一種の真菌に対して高い抗真菌活性を有するものであり、特に真菌感染症の原因菌となっているカンジダ（Candida）属、マラセチア（Malassezia）属の真菌が対象として好ましく、その他にも、例えば、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコフィトン（Trichophyton）属、コッキディオイデス（Coccidioides）属等も対象とすることが可能である。これらの属に属する真菌株を用い、常法により、例えば後述する実施例に挙げる方法に基づいて本発明にかかる抗真菌活性を確認することができる。
ペプチド化合物に対しては、薬剤耐性菌が出現し難いと考えられていることから、プロタミン加水分解物は、真菌症予防剤の主成分としてとして好適に用いられる。また、プロタミン加水分解物及びテルペンアルコールは、安全性が確認されているものであり、これらは、抗真菌組成物の有効成分として好適である。本発明にかかる抗真菌組成物は、抗真菌剤の有効成分として、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品に含有させることで、真菌感染症の予防、緩和あるいは治療等の効果を得ることが出来る。更に、本発明の抗真菌組成物は、真菌感染症の予防及び／または治療用の組成物の有効成分として利用することができる。本発明の抗真菌組成物は、本発明にかかる抗真菌組成物の有効量を、真菌感染症の予防及び／または治療対象者に投与することを含む真菌感染症の予防及び／または治療方法における有効成分として利用することができる。
【００２８】
抗真菌組成物の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤若しくは外用剤の典型的な形態として、軟膏、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、スプレー剤が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばPBS） 等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。抗真菌剤に含まれる担体は、抗真菌剤の形態に応じて異なる。なお、プロタミン加水分解物及びテルペンアルコール（有効成分）、更には種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製する製剤プロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, CorwinHansch 監修, Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
抗真菌組成物中の有効成分としての抗真菌活性を有するプロタミン加水分解物と、テルペンアルコールの含有量は、その用途に応じて、本発明において目的とするこれらの相乗効果が得られる範囲から選択することができる。更に、抗真菌剤として機能を付与する対象としての医薬品、医薬部外品、食品及び化粧品中でのこれらの有効成分の配合量も同様に相乗効果を得ることができる範囲から選択することができる。
【００２９】
本発明によって提供される抗真菌組成物は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、本発明によって提供される抗真菌組成物は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、皮膚表面、口腔内、膣内、或いは衛生陶器表面の消毒（殺菌）や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量のプロタミン加水分解物（例えば、ペプチド化合物の量として1〜100 mg/ml）を含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れたガーゼや布、紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と同じ形態、使用方法を適用することができる。例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者にとって、微生物による感染症の予防及び治療は重大な関心事である。ここで開示される抗真菌組成物は、感染症の原因たる真菌（例えば、カンジダ属の真菌）に対して高い抗真菌作用を示し得る。このため、本発明の抗真菌組成物は、抗真菌剤の主成分として有用である。
【００３０】
本発明に係る真菌感染症の予防、緩和あるいは治療等を行う手段として、食品、機能性食品、医薬品、医薬部外品、化粧品として使用することができ、ガム、顆粒菓、錠菓、フィルム、スプレー、健康食品、特定保健用食品、口腔又は歯科衛生用器具、義歯洗浄剤や義歯安定剤組成物への添加、うがい剤、口腔洗浄剤、薬用歯磨き粉、ローション、クリーム、パウダー、乳液、スプレー剤、塗布剤などの各種形態を挙げることができる。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について詳細に記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
以下の真菌株は以下の機関から公的に入手可能である。なお、抗菌性を試験するための真菌株は以下に示される株に限定されず、一般に用いられている菌株を利用することができる。
-Candida albicans NBRC1594
独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター
（連絡先：生物資源利用促進課）
・住所：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/）
-Candida albicans TIMM1768及びMalassezia fur fur TIMM10020
帝京大学  医真菌研究センター
住所：日本国  〒192-0395    東京都八王子市大塚359
（http://www.teikyo-u.ac.jp/timm/research/r01.html?page=research）【００３２】
（実施例１）
（プロタミンの酵素分解によるプロタミン加水分解物の調製）
シロサケ(オンコリンカス・ケタ(Oncorhynchus keta))の白子由来のプロタミン（プロザーブ；(株)マルハニチロ製）50 gに脱イオン水80mLを加え、水酸化ナトリウムを加えてpH8.0に調整した。65℃に加温した後、サーモライシン（ナカライテスク(株)製, バシラス・サーモプロテオティカス(Bacillus thermoproteolyticus )由来）1.5 mgを添加して、2時間攪拌しながら酵素反応を行った。反応終了後、反応液を95℃に加温して30分間加熱失活させpHを8.5に調整した。その後、反応液を凍結乾燥し、プロタミン加水分解物を得た。【００３３】
（実施例２）
（プロタミン加水分解物の活性画分の分取と活性ペプチドの解析）
実施例１に従って調製したプロタミン加水分解物を、脱イオン水を用いて50,000 ppm溶液に調製後、HPLCを用いて下記の分離条件で各画分を分取した。この画分の抗カンジダ活性をCandida albicans NBRC1594を用いて評価し、活性画分を2画分得た。さらに、この活性画分をLCMS-IT-TOF解析に供し、以下の３つのペプチドの構造を決定した。
（１）Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg (8残基；分子量1164.7541)
（２）Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (13残基；分子量1780.0966)
（３）Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (14残基；分子量1879.1650)。
＜HPLC分離条件＞
・HPLCシステム：(株)島津製作所製  Prominenceシリーズ（システムコントローラー：CBM-20A、オートサンプラー：SIL-10AF、送液ポンプ：LC-8A×2台、カラムオーブン：CTO-20A、PDA検出器：SPD-M20A（測定波長190〜400nm））
・流速：1.0 mL/ min
・移動相A：0.1%トリフルオロ酢酸
・移動相B：アセトニトリル
・カラム：Inertsil ODS-2  5μm 4.6mm×250mm(ジーエルサイエンス製)
・グラジエント：0〜60分にかけてB液0容量%からB液15容量%へのリニアグラジエント。
・検出波長：214nm。
＜LCMS-IT-TOF解析条件＞
・HPLCシステム：(株)島津製作所製  Prominenceシリーズ（システムコントローラー：CBM-20A、オートサンプラー：SIL-20A、送液ポンプ：LC-20AB Binary pump、カラムオーブン：CTO-20A、PDA検出器：SPD-M20A（測定波長190〜400nm））
・流速：0.2 mL/ min
・移動相A：0.1%ギ酸（関東化学製，LC-MS用）
・移動相B：アセトニトリル（関東化学製，LC-MS用）
・カラム：Atlantis HILIC Silica, 3μm Column (Waters製)
・グラジエント：0〜30分にかけてB液60容量%からB液0容量%へのリニアグラジエント。
・注入量：10μL
・IT-TOFMSシステム：(株)島津製作所製  LCMS-IT-TOF（イオン化モード：ESI-、霧化ガス流量：1.5 L/min、Drying gas圧 0.15Mpa、印加電圧 4.5kV、CDL温度：200℃、BH温度：200℃、測定範囲 MS：m/z 500〜2,000）。【００３４】
（実施例３）
（相乗効果素材のin vitroスクリーニング）
・菌株
Candida albicans TIMM1768
・試験物質
ヒノキチオール（(有)キセイテック製）、テルピネン-4-オール（東京化成工業(株)製）、ゲラニオール（関東化学(株)製）、メントール（和光純薬工業(株)製）、シンナムアルデヒド（和光純薬工業(株)製）、カプリン酸（和光純薬工業(株)製）の各々を試験物質中の濃度が0.008, 0.04, 0.2, 1 mg/mLとなるようにRPMI培地に溶解し、実施例１に従って調製したプロタミン加水分解物を、試験物質中のプロタミン加水分解物の濃度が0, 0.125, 2.0 mg/mLとなるように溶解して試験に供した。また、プロタミン加水分解物単独の0.002, 0.008, 0.031, 0.125, 0.5, 2, 8, 32 mg/mL溶液を試験に供した。
・評価方法
C. albicans TIMM1768株を2.5×105cells/wellとなるように96 wellマイクロプレートに200μLずつ添加し、5% CO2下、37℃で2.5〜3.5時間培養した。培養後、培地を吸引除去し、各試験物質を200μL/well添加した。37℃で10分間静置した後、サンプル溶液を吸引除去し、RPMI培地を200μL/well加えて、5% CO2下、37℃で2.5時間培養した。培養後、クリスタル・バイオレット染色して620 nmの吸光度を測定した。抗菌活性は、ブランクの吸光度を1としたときの各試験区の相対値で示した。
・結果
図１〜６にプロタミン加水分解物とテルペンアルコール類との併用によるin vitro評価の結果を、図７にプロタミン加水分解物単独でのin vitro評価の結果を示す。図１〜６において、◆はテルペンアルコール類単独、■はプロタミン加水分解物0.125mg/mlとの併用、▲はプロタミン加水分解物2.0mg/mlとの併用での結果をそれぞれ示す。
ヒノキチオールは単独でも抗菌活性を示し、プロタミン加水分解物との組み合せによる活性増強の相乗効果が認められたと考えられた。テルピネン-4-オールとゲラニオール、メントールは単独での活性は低かったものの、プロタミン加水分解物との併用により僅かに活性が増強したことから、相乗効果はあったものと考えられた。シンナムアルデヒド、カプリン酸は単独で殆ど抗菌活性を示しておらず、プロタミン加水分解物との併用による相乗効果も確認されなかった。尚、カプリン酸は強い抗真菌活性を示すことが知られているが、今回のin vitro評価系は生体内を模すために、薬剤と菌の接触時間を10分間と非常に短く設定したため、カプリン酸が十分な抗真菌作用を発揮できなかったと考えられた。
以上の結果から、プロタミン加水分解物は精油の中でもヒノキチオール、テルピネン-4-オール、ゲラニオールなどのテルペンアルコール類と相乗効果を示すことが確認された。【００３５】
（実施例４）
（in vivo評価系での効果確認）
・菌株
Candida albicans TIMM1768
・実験動物
ICRマウス、雌性、6週齢（日本チャールスリバー(株)）
・試験物質
実施例１に従って調製したプロタミン加水分解物
ヒノキチオール（(有)キセイテック製）
・群構成
陰性コントロール（1%メチルセルロース）6匹
プロタミン加水分解物 25 mg/mL（1% Tween 80）6匹
ヒノキチオール 0.4 mg/mL（1% Tween 80）6匹
ヒノキチオール 2 mg/mL（1% Tween 80）6匹
プロタミン加水分解物 25 mg/mL＋ヒノキチオール 0.4 mg/mL（1% Tween 80）6匹
プロタミン加水分解物 25 mg/mL＋ヒノキチオール 2  mg/mL（1% Tween 80）6匹
・評価方法
C. albicansの感染前日、免疫抑制剤（プレドニゾロン）を100 mg/kg皮下注射した。C. albicans以外の感染を防ぐため、水道水に塩酸クロルテトラサイクリンを15 mg/mL含有させ、自由摂取させた。感染当日、クロルプロマジン塩酸塩を14.4 mg/kg筋肉注射した後、C. albicansを2×108cells/mLとなるようにFBS-RPMI液体培地で希釈し、希釈した菌液をマウス口腔内に綿棒で塗布した。感染3, 24, 27時間後に、各試験物質を、経口ゾンデを用いて50μL投与した。感染48時間後、マウスを安楽死させ、舌症状のスコアリングを行った。尚、舌スコアは、目視で舌に全く白苔が確認されなければ0点、白苔が舌の20%以下の部分で確認されれば1点、21〜90%で2点、91%以上で3点、91%以上で且つ層状に白苔が確認されれば4点とした。
・結果
図８にプロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用によるin vivo評価の結果を示す。舌スコアは、プロタミン加水分解物 25 mg/mLとヒノキチオール 2.0 mg/mLの組み合せで有意なスコアの改善が認められ、それぞれ単独で投与した場合と比較して著しく舌スコアが改善し、相乗効果による抗真菌活性の増強が認められた。プロタミン加水分解物は低濃度では菌体表面に付着して静菌作用を示す作用機序が示唆されており、一方のヒノキチオールは膜機能の阻害と呼吸の抑制作用が報告されていることから、これらのメカニズムの違いによって、プロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用が単なる相加効果ではなく、相乗効果を発揮して抗菌活性を増強していると考えられた。【００３６】
（参考例１）
（マラセチア菌での効果確認）
・菌株
Malassezia fur fur TIMM10020
・評価方法
MLNA培地で培養したMalassezia fur furを生理食塩水でマクファーランド1.0に調製し、その調整液100μL、オリーブオイル50μLをMLNA寒天平板に塗り広げた。シャーレ中央に抗生物質検定用ペーパーディスク厚手8mmに試験試料（プロタミン加水分解物を滅菌水で40 mg/mLに調製）50μLを垂らし、7日間32℃で培養した。
・結果
プロタミン加水分解物40 mg/mLを50μL垂らしたペーパーディスクの周りに、14mm×14mm（ペーパーディスクは8mm）の阻止円が見られた。コントロールの滅菌水には阻止円は見られなかったことから、プロタミン加水分解物がマラセチア菌に対する抗菌効果を有することが確認された。【００３７】
（実施例５）
（ヒノキチオールとの併用に関する詳細解析）
・菌株
Candida albicans TIMM1768
・試験物質
ヒノキチオール（(有)キセイテック製）を、試験物質中の濃度が0, 0.004, 0.008, 0.016, 0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1μg/mLとなるようにRPMI培地に溶解し、実施例１に従って調製したプロタミン加水分解物を、試験物質中のプロタミン加水分解物の濃度が0、0.156, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10μg/mLとなるように溶解して試験に供した。
・評価方法
C. albicans TIMM1768株を5.0×103 cells/mLとなるようにRPMI培地にて希釈後、96 wellマイクロプレートに100μLずつ添加した。プロタミン加水分解物溶液を50μL/wellずつ添加後、ヒノキチオールを50μL/wellずつ添加した。5% CO2下、37℃で16時間培養後、クリスタル・バイオレット染色して620 nmの吸光度を測定した。阻害活性は、陰性コントロール（プロタミン加水分解物及びヒノキチオール未添加）の吸光度を１としたときの各試験区の相対値から算出した。また、表１に示す各濃度のヒノキチオール（(有)キセイテック製）及びプロタミン加水分解物「Pro」におけるFICindexも併せて算出した。
・結果
図９及び図１０にプロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用によるin vitro評価の結果を示す。表１にFICindexの算出結果を示す。【００３８】
【表１】
2016039229.tif 000003
【００３９】
結果、低濃度のヒノキチオールとプロタミン加水分解物との組み合わせにおいてFIC≦0.5の相乗効果を示した。
以上の結果から、プロタミン加水分解物はヒノキチオールと相乗効果を示すことが確認された。【００４０】
（実施例６）
（他魚種白子由来プロタミン加水分解物のin vitro評価）
・菌株
Candida albicans TIMM1768
・試験物質
実施例１に従って調製した各魚種（カラフトマス、ニシン）由来プロタミン加水分解物、及びサケ白子由来プロタミンのブロメライン分解物を、試験物質中のプロタミン加水分解物の濃度が0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160μg/mLとなるようにRPMI培地に溶解して試験に供した。
・評価方法
C. albicans TIMM1768株を5.0×103 cells/mLとなるようにRPMI培地にて希釈後、96 wellマイクロプレートに100μLずつ添加した。プロタミン加水分解物溶液を50μL/wellずつ添加後、RPMI培地を50μL/wellずつ添加した。5% CO2下、37℃で16時間培養後、クリスタル・バイオレット染色して620 nmの吸光度を測定した。阻害活性は、陰性コントロール（プロタミン加水分解物未添加）の吸光度を１としたときの各試験区の相対値から算出した。
・結果
図１１に各種プロタミン加水分解物のin vitro評価の結果を示す。
何れの試験物質もサケ白子由来プロタミン加水分解物と同等の活性を示した。この結果より、プロタミン分解物の魚種汎用性が示された。【００４１】
（実施例７）
（in vivo評価系での併用効果確認）
・菌株、実験動物、試験物質、群構成、評価方法
実施例４と同じ菌株、実験動物、試験物質、群構成及び評価方法を用いた。
感染48時間後に安楽死させたマウスから、常法により、舌組織切片を作製し、染色後、光学顕微鏡にて撮影して染色画像を得た。
・結果
図１２にプロタミン加水分解物とヒノキチオールとの併用による舌組織観察の結果を示す。舌組織画像においても、プロタミン分解物単独では舌表面の粘膜内に菌糸が残存しているが、組み合わせ試験区において菌糸の抑制がはっきりと確認された。
【図１】
2016039229.tif 000004
【図２】
2016039229.tif 000005
【図３】
2016039229.tif 000006
【図４】
2016039229.tif 000007
【図５】
2016039229.tif 000008
【図６】
2016039229.tif 000009
【図７】
2016039229.tif 000010
【図８】
2016039229.tif 000011
【図９】
2016039229.tif 000012
【図１０】
2016039229.tif 000013
【図１１】
2016039229.tif 000014
【図１２】
2016039229.tif 000015
【配列表】
2016039229000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月8日(2017.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロタミン加水分解物と、テルペンアルコールとを有効成分として含み、前記テルペンアルコールが、ヒノキチオール、ゲラニオール及びテルピネン−４−オールの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする抗真菌活性を有する組成物。
【請求項２】
前記プロタミン加水分解物が、以下の配列番号：１〜３のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩からなるペプチド化合物の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の抗真菌活性を有する組成物。
配列番号：１
Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg
配列番号：２
Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
配列番号：３
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む抗真菌剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む食品。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む医薬品または医薬部外品。
【請求項６】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を含む化粧品。
【請求項７】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として食品又は化粧品の製造において使用する方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の抗真菌活性を有する組成物を、抗真菌活性を得るための有効成分として医薬品又は医薬部外品の製造において使用する方法。
【国際調査報告】
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2016039229.tif 000018
2016039229.tif 000019
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