(57)【要約】  正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供すること。  水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマーを用いる。
2015129901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
【請求項２】
ポリマーを構成するモノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ブチルメタクリレート、Ｎ−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアクリルアミドから選択される少なくとも１種を含むものである、請求項１記載のポリマー。
【請求項３】
水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部が下式（Ａ）及び／又は下式（Ｂ）なる構造であり、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
式（Ａ）
【化１】
2015129901.tif 000024
（式中、Ｒ1は、
【化２】
2015129901.tif 000025
を表し、
Ｒ２は、  Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
式（Ｂ）
【化３】
2015129901.tif 000026
（式中、Ｒ３は、
【化４】
2015129901.tif 000027
を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
【請求項４】
水との親和性を有するポリマーを構成するものが、少なくともポリエチレングリコール、ポリ−Ｎ−アクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含むものである、請求項３記載のポリマー。
【請求項５】
水との親和性が変化するポリマーを構成するものが、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項６】
アミノ酸誘導体モノマーが光学異性体を有するアミノ酸誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項７】
少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーとしてイオン性基を有する化合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項８】
蛍光物質が親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質である、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項９】
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質又はクマリン系蛍光物質である、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項１０】
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質である、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項１１】
少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなる、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマー。
【請求項１２】
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。
【請求項１３】
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーが、温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーである、請求項１２に記載の測定方法。
【請求項１４】
蛍光発生成分を有する物質が、蛋白質、オリゴペプチド又はポリペプチドである、請求項１２及び１３のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１５】
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーが、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリマーである、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水の温度を測定する工程を含む、水の温度の測定方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法。
【請求項１８】
測定対象を含有するか又は含有することが予想される水（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水（ｙ）中で、請求項４に記載のポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながら測定し、水（ｘ）での測定結果を水（ｙ）での測定結果を比較することにより、水（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリマーであって、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブ。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマーであって、細胞のアミノ酸トランスポーターと特異的に結合する、蛍光プローブ。
【請求項２１】
アミノ酸トランスポーターがＬＡＴ１である、請求項２０記載の蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸を側鎖に有するアミノ酸誘導体蛍光ポリマー及びそれを利用した蛍光プローブに関する。特に、温度やｐＨといった周囲環境の変化によって蛍光強度が変化したり、特定の立体構造の存在によって蛍光強度の変化のパターンが変化するポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての生命活動は、蛋白質を中心とした生体分子の相互作用によって担われている。即ち、細胞内においては、特定の生体分子が他の物質と相互作用を行い、これによって反応が進行している。従って、蛋白質間相互作用、あるいは蛋白質と他の分子との相互作用を研究し、解明することは、生物の発生・分化・増殖などの生体反応や薬理機構の解明といった領域、さらにはバイオセンサー・新薬の開発といった領域への展開も期待できる。【０００３】
生命科学研究の発展とゲノム解読の進展により、細胞内情報伝達物質やその物質を認識する分子が次々と同定され、試験管内での性質が明らかにされてきた。次の目標として残ったのは、実際に発現している遺伝子 (主にタンパク質) の生理的条件での機能の解明である。これらの情報は遺伝子情報だけでは解明できず、細胞の“生きたまま”の機能を調べることが必要とされる。蛍光イメージングは、これらを解明するための基盤技術として注目されている。すなわち生体分子が、どの細胞内小器官に、どの細胞に、どの臓器に、というような“場”の情報、そしてどのような時間経過で発現し消長するかという時間情報を得るために、蛍光イメージングは重要な手法と言える。現在、蛍光イメージング研究が精力的に行われているが、in vitroでのものが中心である。中には、細胞膜透過性が低い蛍光プローブもあり、マイクロインジェクション法などの細胞侵襲的な方法を用いて細胞へプローブを導入しているものもある（非特許文献１）。今後のイメージング研究は、in vivoで扱うことを指向した設計が必要と言える。【０００４】
このような背景から、研究では、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブの開発を目指した。そこで、生体内において分子認識能の高いアミノ酸の誘導体モノマーを導入した三元ポリマーを開発し、温度制御型の細胞への取り込み能を評価した。また、がん細胞が正常細胞より高温かつ低pH環境下にあることに着目し、NIPAAmにpH応答性モノマーであるacryloyl sulfamethazine誘導体モノマーを共重合し、温度及びpH制御型の細胞への取り込み能を評価した。蛍光ポリマーは温度及びpHに応答して蛍光シグナルを変化できることは既往研究で確認しており（非特許文献２）、生体内の物理化学的変化をイメージングする際に有用なツールになると考えられる。【０００５】
また、前述したように、蛍光イメージングには“場”の情報を提供するツールとして重要である。通常、ナノサイズのキャリアではエンドサイトーシスという小胞輸送系経路で取り込まれる（非特許文献３）(Fig. 3-1)。中山らは、温度応答性ポリマーを修飾したナノキャリアであるPNIPAAm-PLAミセルは、細胞内に取り込まれた後、一般的なナノ粒子に見られる細胞内ライソソームでの局在は見られず、ゴルジ体及び小胞体に分布していることを確認している（非特許文献４、非特許文献５）。また、河野らは、サクシニル基とNIPAAmを結合させたポリグリシドール (NIPAM-Suc-HPG) を表面に修飾し薬物を封入したリポソームにおいて、それらはエンドサイトーシスで取り込まれ、ライソソームに移行する前のエンドソーム膜と融合し、薬物を放出することを確認している（非特許文献６、非特許文献７）。このように、ナノキャリア表面に修飾した温度応答性ポリマー鎖が細胞への取り込みに何らかの影響を及ぼしていることが示唆され、詳細な細胞内移行メカニズムは分かっていないが、核酸やタンパク質などのライソソーム環境で分解されやすいバイオ医薬品の細胞内デリバリーを実現する上で、温度応答性高分子を修飾したナノキャリアは有用なツールとして期待される。以上の背景から、本発明者らは温度応答性ポリマーを修飾した蛍光ポリマーにおける細胞内取り込み経路及び局在化の検討を行った。【０００６】
また、病態細胞と正常細胞を見分けるために、温度という指標以外にも病態細胞特異的な標的指標を考える必要がある。そこで、本発明者らはがん細胞特異的に発現するシステムLアミノ酸トランスポーター 1 (L-type Amino acid Transporter; LAT) に着目した。LAT1はがん細胞特異的に発現するトランスポーターであり、ヒト腫瘍組織を用いた検討により、多くのがん組織でLAT1の発現が亢進していることが知られている。Cell Lineでのがん細胞においてはOST、C6 glioma、HeLa、T3M4などにLAT1の発現が多いことが知られている。またLAT1の基質としては側鎖の疎水性の高い中性必須アミノ酸であり、分子内にαカルボキシル基、αアミノ基を持つものの特異性が高いとされる。そこでN-acryloyl-L-phenylalanineをNIPAAmと共重合させ、HeLa細胞におけるLAT1への細胞認識能を評価した。N-acryloyl-L-phenylalanineはLAT1により取り込まれる多発性骨髄腫治療薬のメルファランの基本構造であるL-phenylalanineの誘導体であり、これまで作製したN-acryloyl-L-phenylalanine-OMeなどのモノマーとは異なり、αカルボキシル基が存在することによってLAT1選択性が高いと考えられる。【０００７】
上記のような研究には、生体内の状況や物質の変化を可視化する技術の開発が必須である。実際、そのような可視化の技術を伴う研究が盛んになされている。一例を挙げると、理化学研究所の宮脇敦史らのグループによる、増殖期にある細胞と休止期にある細胞との識別技術がある（非特許文献８）。宮脇らは、増殖期と休止期とで、細胞内には異なる蛋白質が増えることに着目し、その異なる蛋白質のそれぞれに別々の色調を示す蛍光物質を結合させ、蛍光の色によって細胞が何れの時期にあるかを見分けられるようにした。【０００８】
また、小林久隆らの米国国立衛生研究所と東京大学との研究チームは、新たな蛍光物質を開発した（非特許文献９）。これらの蛍光物質は、従来のものと比べて強く発光する。従って、これらの蛍光物質を癌細胞に取り込ませたり癌細胞の表面に結合させることにより、小さな癌が発見できるようになると期待されている。【０００９】
上記のように、高感度での測定では、蛍光が利用されている。そのような蛍光の利用技術の一つとして、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer:FRET）も知られている。ＦＲＥＴは、蛍光成分を有する物質、例えば蛋白質の空間パターンや時間的変動など、生理現象のより本質的な理解に有用な情報を提供し得ると考えられる。【００１０】
ところで、従来の蛍光物質は、一度蛍光を発すると、その状態における測定ができるのみであった。一方、インテリジェント・マテリアルと呼ばれ、環境の変化（光、熱、ｐＨ、電気的刺激等）を感知しそれに対応して自身の機能をコントロールするような刺激感受性ポリマーが知られており、中でも、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（Poly-N-isopropylacrylamide；PNIPAAm）は、温度応答性材料として有用である。ＰＮＩＰＡＡｍは、水素結合性部位をもっている。そのため、水中において、環境温度が低い場合にはポリマー鎖のまわりに水分子が強く付着し、その結果ＰＮＩＰＡＡｍが水に溶解する。しかし、温度を上げると水素結合が切断されポリマーは裸となり、水と相分離し、不溶性となって沈殿する。このような温度応答性を蛍光物質に付与すれば、蛍光物質に新たな用途が加わると考えられる。【００１１】
特許文献１（特開２００７−２３８４６７）には、温度応答性ポリマーの分子中に蛍光物質であるベンゾクロメノン化合物を結合させること、より具体的には、ベンゾクロメノン化合物が結合されてなる温度応答性ポリマーを含む蛍光試薬等が開示されている。特許文献１によると、ベンゾクロメノンイル基を有するこのポリマーの蛍光波長は極性溶媒中で４６０ｎｍ以上であり、従って、測定系に共存する芳香環による影響を受けにくいという特性を有するとのことである（段落番号［００３３］）。また、特許文献１は、このような蛍光試薬の用途として、当該試薬を含む溶液中の環境変化又は当該化合物で標識化した分子の変化の追跡を挙げている（段落番号［００３３］）。【００１２】
さらに、特許文献２（特開２００６−１６２５１２）には、温度応答性を有する蛍光性温度プローブであって、二つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーやグラフトポリマーが開示されている。しかし、特許文献２には、温度の変化に応じて発明に係るプローブの蛍光強度がどのように変化したかについて、実験結果が全く示されておらず、当該プローブのセンサー機能についても、センシングに使用できる可能性が示されているにすぎない。すなわち、特許文献２は、具体的にどのようなポリマー合成したら、どのような条件でどのようなプローブとして使用できるかに関し、具体的な記載を欠くものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−２３８４６７
【特許文献２】特開２００６−１６２５１２
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Okabe, I. Noriko, C. Goto, Y. Harada, T. Funatsu, S. Uchiyam a. Intracellular temperature mapping with a fluorescent polymeric thermometer and fluorescence lifetime imaging microscopy.: Nature Communications, 3, 705, (2012)
【非特許文献２】嶋村美来. 蛍光イメージングへの適用を目指した環境応答型蛍光ポリマーの開発 : 慶應義塾大学 薬学部 2011年度修士論文, (2012)
【非特許文献３】米田悦啓. 細胞内輸送がわかる タンパク質・核酸輸送の基本から最新の分子イメージング技術まで. 羊土社, (2002)
【非特許文献４】J. Akimoto, M. Nakayama, K. Sakai, T. Okano.Temperature-Induced Intracellular Uptake of Thermoresponsive Polymeric Micelles: Biomacromolecules, 10, 1331, (2009)
【非特許文献５】中山正道. 温度応答性薬物キャリア. : Drug Delivery System 25, 5, 483-492, 日本医学館, (2010)
【非特許文献６】河野健司. リポソームを機能化するための高分子材料. : Drug Delivery System 23, 6, 645-653, 日本医学館, (2008)
【非特許文献７】T. Kaiden, E. Yuba, A. Harada, Y. Sakanishi, K. Kono. Dual Signal-Responsive Liposomes for Temperature-Controlled Cytoplasmic Delivery. 出版地不明 : Bioconjugate Chem., 22, 1909-1915, (2011)
【非特許文献８】Sakaue-Sawano A.,et al.,Cell,132,487-498(2008)
【非特許文献９】Urano Y.,et al.,Nat.Med.,15,104-109(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このような背景から、本発明の目的は、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供することにある。【００１６】
また、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨが変化することにより蛍光強度に変化が生じる蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを提供することにある。【００１７】
本発明の他の目的は、蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、蛍光共鳴エネルギー移動の原理を利用して蛍光発生成分を有する物質等を測定する方法を提供することにある。ここで、蛍光発生成分とは、例えば芳香環を有する化合物であり、本発明の方法は、測定系に共存する芳香環を積極的に利用しようとするものである。【００１８】
本発明のさらに他の目的は、特定の蛍光性温度応答性ポリマーを用い、水系溶媒の温度を測定する方法を提供することと、特定の蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用い、水系溶媒のｐＨを測定する方法を提供することにある。【００１９】
本発明のさらに他の目的は、光学異性体を有するモノマー成分を含む蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、これと共存する測定対象の三次元高次構造、又は、当該測定対象の有無を判定する方法を提供することにある。【００２０】
本発明のさらに他の目的は、上記の蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを含む蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部アミノ酸残基を有し、かつ蛍光物質が結合されてなるポリマーが上記課題を解決するために有用であることを見いだした。本発明はかかる知見に基づいてなされたものである。【００２２】
即ち、本発明は以下に示される。
［１］
水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
［２］
ポリマーを構成するモノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ブチルメタクリレート、Ｎ−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアクリルアミドから選択される少なくとも１種を含むものである、［１］記載のポリマー。
［３］
水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部が下式（Ａ）及び／又は下式（Ｂ）なる構造であり、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
式（Ａ）【００２３】
【化１】
2015129901.tif 000003
（式中、Ｒ1は、【００２４】
【化２】
2015129901.tif 000004
を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
式（Ｂ）【００２５】
【化３】
2015129901.tif 000005
（式中、Ｒ３は、【００２６】
【化４】
2015129901.tif 000006
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
［４］
水との親和性を有するポリマーを構成するものが、少なくともポリエチレングリコール、ポリ−Ｎ−アクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含むものである、［３］記載のポリマー。
［５］
水との親和性が変化するポリマーを構成するものが、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである、［１］記載のポリマー。
［６］
アミノ酸誘導体モノマーが光学異性体を有するアミノ酸誘導体である、［１］〜［５］のいずれか１項記載のポリマー。
［７］
少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーとしてイオン性基を有する化合物を含む、［１］〜［６］のいずれか１項記載のポリマー。
［８］
蛍光物質が親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質である、［１］〜［７］のいずれか１項記載のポリマー。
［９］
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質又はクマリン系蛍光物質である、［１］〜［８］のいずれか１項記載のポリマー。
［１０］
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質である、［１］〜［８］のいずれか１項記載のポリマー。
［１１］
少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなる、［１］〜［９］のいずれか１項記載のポリマー。
［１２］
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。
［１３］
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーが、温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーである、［１２］に記載の測定方法。
［１４］
蛍光発生成分を有する物質が、蛋白質、オリゴペプチド又はポリペプチドである、［１２］及び［１３］のいずれか１項記載の測定方法。
［１５］
温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーが、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマーである、［１２］〜［１４］のいずれか１項記載の測定方法。
［１６］
［１］〜［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水の温度を測定する工程を含む、水の温度の測定方法。
［１７］
［１］〜［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法。
［１８］
測定対象を含有するか又は含有することが予想される水（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水（ｙ）中で、請求項４に記載のポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながら測定し、水（ｘ）での測定結果を水（ｙ）での測定結果を比較することにより、水（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法。
［１９］
［１］〜［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブ。
［２０］
［１］〜［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、細胞のアミノ酸トランスポーターと特異的に結合する、蛍光プローブ。
［２１］
アミノ酸トランスポーターがＬＡＴ１である、［２０］記載の蛍光プローブ。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨを変化させることにより、繰返して、且つ、異なる条件下においても蛍光測定が行える、新たな蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーが提供される。このポリマーは、単独で、又は、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性、担体等に結合させた状態で、蛍光温度センサー、蛍光ｐＨセンター、蛍光プローブとしての利用が可能である。また、イメージング・プローブや診断用プローブとして、臨床検査や疾病の診断領域での利用も可能である。すなわち、本発明により、生体内分子の動的挙動の解明に有用な、バイオイメージングのための新たな分子ラベルが提供される。【００２８】
また、本発明により、蛍光共鳴エネルギー移動を用いた蛍光発生成分を有する物質等の測定方法が提供される。本発明によれば、蛋白質間相互作用等に基づく生体内における変化を、蛍光強度に基づいて、リアルタイムで知ることができるようになる。【００２９】
さらに、本発明により、蛍光性温度応答性ポリマーを用いる、水系溶媒の温度を測定する方法と、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用いる、水系溶媒のｐＨを測定する方法が提供される。本発明によれば、微小空間における温度やｐＨ等の環境変化を測定、感知することが可能となる。【００３０】
本発明に係るポリマーであって、その構成モノマーの少なくとも一部として光学異性体を有するアミノ酸誘導体を含むものを使用すると、水系溶媒中において、ある測定対象（蛋白質、オリゴ−又はポリペプチド、低分子生理活性物質等）が存在するか否か、又は、その測定対象の三次元高次構造を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図２】N-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図３】N-acryloyl-L-phenylalanine の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図４】N-acryloyl-sulfamethazine の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3,DMSO）の結果を示すチャートである。
【図５】ＬＣＳＴに及ぼすコポリマーのモル比の影響を示すグラフ及び表である。
【図６】PNIPAAm の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。
【図７】P(NIPAAm-co-BMA3%) の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。
【図８】P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。
【図９】P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図１０】P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図１１】P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図１２】P(NIPAAm-co-L-Phe5%) の 1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。
【図１３】(a) H2O 溶液及びPBS 溶液（0.5 w/v%）中におけるポリマー溶液の光透過率の温度依存性を示すグラフである。
【図１４】5 mM Na2H PO4(NaH2PO4)/150 mM NaCl 溶液(0.5 w/v%) 中における(a) PNIPAAm 及び (b) P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) のの光透過率の温度依存性を示すグラフである。各ゲラフにおけるpH値は次の通りである。pH = (◇) 6.4, (□) 7.0, (△) 7.4, (×) 7.8, (○) 8.4。
【図１５】(a) H2O 及び(b) PBS 溶液（200mg/mL）中における動的光散乱による粒子径測定の結果を示すグラフである。各ゲラフにおける符号は次の化合物を意味する。(◇) PNIPAAm, (□) P(NIPAAm-co-BMA3%), (△) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%), (×) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%), (○) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%), (＊) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)。
【図１６】5 mM Na2H PO4(NaH2PO4)/150 mM NaCl 溶液中におけるP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) の 光透過性の pH 依存性を示すグラフである。
【図１７】PBS 溶液（0.5 w/v%）中におけるポリマー（□）と蛍光ポリマー（○）の光透過率の温度依存性を示すグラフである。図中、各符号は次の化合物を意味する。(上段左のグラフの□) PNIPAAm, (上段左のグラフの●) PNIPAAm-FL, (上段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-BMA3%), (上段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-BMA3%)-FL, (中段左のグラフの□) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%), (中段左のグラフの●) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL, (中段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%), (中段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL, (下段左のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%), (下段左のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL, (下段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Phe5%), (下段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FL。
【図１８】各ポリマー溶液 (PBS) の表面電位を計測した結果を示すグラフである。図中、各符号は次の化合物を意味する。(◇) PNIPAAm-FL，(□) P(NIPAAm-co-BMA3%)-FL，(△) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL，(×) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL，(○) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL，(＊) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)。
【図１９】本発明の蛍光ポリマーの例を示す説明図である。
【図２０】上段はアミノ酸誘導体の合成スキームを、下段は三元ポリマー（ternary polymer）の合成スキームの一例を示す図である。
【図２１】本発明の三元ポリマーの特徴を示す表及びグラフである。三元ポリマーのＬＣＳＴは、ＰＮＩＰＡＡｍが３２．１℃、Ｌ-Ｐｈｅ−ＯＭｅ１．３Ｄ３が３７．９℃、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ１．５Ｄ３が３７．５℃であり、モノマーの組成により、ＬＣＳＴを高温側に調節することが可能である。また、三元ポリマーのＬＣＳＴ付近のサイズは、ＰＮＩＰＡＡｍが１３０ｎｍ、Ｌ-Ｐｈｅ−ＯＭｅ１．３Ｄ３が１１０ｎｍ、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ１．５Ｄ３が１００ｎｍであり、ＬＣＳＴに対応した粒子径変化が可能である。
【図２２】上段は三元ポリマーの細胞取込みを説明する模式図を、下段は細胞取込みの手順を示す説明図である。
【図２３】Ｌ-Ｐｈｅ−ＯＭｅ１．３Ｄ３−ＦＬ及びＬ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ１．５Ｄ３−ＦＬの三元蛍光ポリマーで処理したＲＡＷ２６４．７細胞の取込みの状態及びフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。いずれの蛍光ポリマーも、ＬＣＳＴ以下の環境下で細胞内への取り込みが確認されなかったが、ＬＣＳＴ以上の環境下で細胞内の取り込みが確認された。
【図２４】Ｌ-Ｐｈｅ−ＯＭｅ１．３Ｄ３−ＦＬ及びＬ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ１．５Ｄ３−ＦＬの三成分系ポリマーで処理したＨｅＬａ細胞の取込みの状態及びフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。がん細胞においてもＬＣＳＴを境とする温度制御による細胞取り込みが可能であることが示された。
【図２５】細胞取込みの経路及びポリマー取り込みの阻害を示す図である。
【図２６】ＲＡＷ２６４．７細胞及びＨｅＬａ細胞のＬ-Ｐｈｅ−ＯＭｅ１．３Ｄ３−ＦＬ及びＬ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ１．５Ｄ３−ＦＬの蛍光ポリマー取り込みの状態を説明する図及びグラフである。ＲＡＷ２６４．７細胞において蛍光ポリマーはクラスリン依存性エンドサイトーシスにより、細胞内へ取り込まれる可能性が示唆された。ＨｅＬａ細胞においてはライソゾームに局在する可能性が示唆された。
【図２７】がん細胞標的ポリマーの説明図である。がん細胞に選択性を持たせるため、がん細胞に特異的に発現するアミノ酸トランスポーター１（Lat1:L-type Amino-acid Transporter 1）を標的とした温度応答性ポリマーを作成した。細胞内に取り込まれた三元ポリマーとは異なり、アミノ酸誘導体モノマーのα−カルボキシル基が存在していることでＬＣＳＴによらない細胞認識能が期待される。
【図２８】ＬＡＴ１標的ポリマーの特性を示すグラフである。このポリマーは、ＬＣＳＴは５３．５℃であり、アミノ酸誘導体のカルボキシル基がイオン化していることから、細胞取り込み実験を行う温度では常に親水的状態である。また、このポリマーは、細胞取り込み実験を行う温度における粒子径は２５ｎｍ以下であり、ＬＣＳＴに対応した粒子径変化を示す。
【図２９】ＨｅＬａ細胞における細胞取込みを説明する図である。ＨｅＬａ細胞において、ｈＬＡＴ１発現が確認された。また、ＨｅＬａ細胞に膜上にＬＡＴ１発現が観察された。更に、ＬＣＳＴ以下で蛍光ポリマーによる蛍光が確認された。
【図３０】ＨｅＬａ細胞によるＬ−［３Ｈ］ロイシンの取り込みの阻害を説明するグラフである。Ｌ−［３Ｈ］ロイシン細胞内取り込みが蛍光ポリマーによって阻害された（＜３０％）。したがって、蛍光ポリマーがＬＡＴ１に対して親和性（affinity）を有する可能性が示唆された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明のポリマーは、それ自体が温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるものである。
【００３３】
本発明における「ポリマー」は、モノポリマー（単独重合体）及びコポリマー（２種以上の化学的に異なったモノマーを含む共重合体）の双方を意味する。
【００３４】
本発明において使用される温度応答性ポリマーとして、例えば、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明に用いられる水に親和性を有するポリマーとしては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水高分子などが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００３６】
ここで、「水系溶媒」には、水の他、各種緩衝液等の無機塩水溶液や、３０容量％程度までの量で有機溶媒を含有する水を主成分とする液体も包含される。水を主成分とし、当該溶液中で、温度及び／又はｐＨの変化に伴う第一の発明のポリマーの蛍光強度の変化を測定できる限り、「水系溶媒」である。
【００３７】
本発明のポリマーの例としては、（１）アクリルアミド系モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（２）アクリルアミド系モノマーとアクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（３）アクリルアミド系モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（４）アクリロイル基含有モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（５）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（６）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（７）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（８）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（９）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（１０）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（１１）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、及び（１２）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）が挙げられる。
【００３８】
主鎖をポリエチレンとするために使用される主たる構成モノマーの例として、アクリルアミド、メタクリルアミド（以下、まとめて「（メタ）アクリルアミド」ということがある）、アクリルアミド誘導体（例えばアルキル（メタ）アクリルアミド）等の（メタ）アクリルアミド系モノマー類、アクリロイル基又はメタクリロイル基含有化合物（以下、まとめて「（メタ）アクリロイル基含有化合物」ということがある）等が挙げられる。
【００３９】
上記ポリマーの製造に使用される（メタ）アクリルアミド系モノマーの例としては、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド及び（メタ）アクリロイルピロリジンが挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーの中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーに加えて、コモノマーとして、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）アクリレートやメチルメタクリレート、エチルメタクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルビロリドン、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、スチレン等を使用してもよい。なお、アルキルアクリレートやアルキルメタクリレート（以下、まとめて「アルキル（メタ）アクリレート」ということがある）をコモノマーとして使用する場合には、その量は、アクリルアミド系モノマーとアルキル（メタ）アクリレートとの合計の５乃至６０％程度が好ましい。
【００４０】
（メタ）アクリロイル基含有化合物であるモノマーの具体例としては、Ｎ−（メタ）アクリロイルプロリンのアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）エステル等の（メタ）アクリロイル基含有アミノ酸誘導体、（メタ）アクリロイルピリジン等が挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物の中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物とともに、上記コモノマーを使用してもよい。
【００４１】
本発明に係るポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、例えばＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルのような光学異性体を有する化合物、より具体的には光学活性アミノ酸誘導体を使用することができる。光学活性アミノ酸誘導体は、ポリマー主鎖の構成モノマーの全て（但し、蛍光物質に由来する部分を除く）であってもよいし、一部であってもよい。また、構成モノマーとして、光学活性アミノ酸誘導体の一方の光学異性体のみを使用してもよいし、光学異性体二種を、例えばブロック子ポリマーとなるように使用してもよい。
【００４２】
光学異性体の一方のみをポリマー主鎖の構成モノマーの全てとして使用して、本発明のポリマーを合成することができる。また、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１１０６（２００６）、１５２−１５８ページに記載されている、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルとの共重合体も、これに蛍光物質を結合させることで、本発明のポリマーとして使用することができる。
【００４３】
主鎖の構成モノマーとして、イオン性基を有するモノマーを使用すると、本発明に係るポリマーが、ｐＨの変化により水系溶媒中での親和性が変化するものとなる。そのようなイオン性基を有するモノマーの例として、イオン性基であるカルボキシル基を有し且つエチレン性不飽和基を有するアクリル酸やメタクリル酸が挙げられる。カルゴキシル基以外のイオン性基の例としては、アンモニウム基、スルホニウム基、テトラメチルアンモニウム基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００４４】
本発明に係るポリマーをｐＨ応答性にするためには、主鎖の構成モノマーの０．１乃至３０モル％程度、好ましくは０．５乃至２０モル％程度、さらに好ましくは１乃至１０モル％程度を、イオン性基を有するモノマーとすることが好ましい。また、イオン性基を有するモノマーとして、一般的には、カチオン性基を有する化合物とアニオン性基を有する化合物の中、いずれかのみを使用する。
【００４５】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、４−アミノフルオレセイン、ジクロロフルオレセイン、スルホンフルオレセイン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドフルオレセイン、オレゴングリーン、トーキョーグリーン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート等のフルオレセイン系化合物や、これらのフルオレセイン系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。フルオレセイン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。
【００４６】
なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、主鎖を構成するモノマーとして上記したイオン性基が使用されていなくても、ｐＨの変化に応じて蛍光強度に変化が生じる。これは、フルオレセインがｐＨの変化によってその化学構造を変え、それに伴って蛍光強度に大きな変化がもたらされるからである。
【００４７】
本発明に示されるポリマーを構成するモノマーとして、アミノ酸誘導体モノマーが挙げられる。その構造はモノマー中にアミノ酸構造を有するものであれば特に限定されるものではないが、たとえば、アミノ酸中のアミノ基に対しビニル基を有するモノマーを反応させる方法、或いはアミノ酸中のカルボキシル基、アミノ基以外の部位に対しビニル基を有するモノマーを反応させる方法等で得られる。その際に使用されるものは特に限定されるものではなく、たとえば、下記［化５］、［化７］、［化９］のものが挙げられる。
式（Ａ）
【００４８】
【化５】
2015129901.tif 000007
（式中、Ｒ1は、
【００４９】
【化６】
2015129901.tif 000008
を表し、
Ｒ２は、  Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
式（Ｂ）
【００５０】
【化７】
2015129901.tif 000009
（式中、Ｒ３は、
【００５１】
【化８】
2015129901.tif 000010
を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
【００５２】
上記式の−ＣＯＯＲ２におけるＲ２の定義から明らかなように、アミノ酸のカルボキシル基はエステル化（メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、等）されていてもよい。 
【００５３】
また、アミノ酸誘導体モノマーとしては下記式で表される化合物であってもよい。
【００５４】
【化９】
2015129901.tif 000011
（式中、Ｒａは、アルケニル基を表し、Ｒｂは、アミノ酸又はアミノ酸のエステルからＮＨ２を除いた基を表す）
【００５５】
Ｒａとしては、例えば、ビニル基（ＣＨ２＝ＣＨ−）、１−メチルビニル基（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−）等のアルケニル基が挙げられるがこれに限定されない。また、Ｒｂとしては、例えば、フェニルアラニン又はフェニルアラニンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、トリプトファン又はトリプトファンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、プロリン又はプロリンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、アラニン又はアラニンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、等が挙げられる。
【００５６】
また、本発明に示されるポリマーは、上述のようにアミノ酸誘導体モノマーを重合させることでアミノ酸残基を有するポリマーとして得る方法だけではなく、あらかじめポリマーを作製し、その後、側鎖としてアミノ酸を反応させる方法でもよい。例えば、上記式（Ａ）あるいは式（Ｂ）で示される基が挙げられる。
【００５７】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質の他の例としては、クマリン系化合物、ベンゾクロメノン化合物、スチルベン系化合物等や、これらの化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。クマリン系蛍光物質の具体例としては、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド等が挙げられる。ベンゾクロメノン系蛍光物質の具体例としては、２−（モルフォリン−４−イル）−ベンゾ［ｈ］クロメン−４−オン等が挙げられる。スチルベン系蛍光物質の具体例としては、レスベラトロール等が挙げられる。
【００５８】
フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。ここで、「より強い蛍光」とは、蛍光強度の測定において、消光状態の蛍光強度の例えば２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上の蛍光強度をいう。
【００５９】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質のさらに他の例としては、ダンシル  アミノエチルアクリルアミド、 ダンシル  クロリド、ダンシル  エチレンジアミン等のダンシル系化合物であって、これらのダンシル系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。ダンシル系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが疎水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。また、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール等のベンゾフラザン系蛍光物質も、疎水性でより強い蛍光を発する。
【００６０】
主鎖構成モノマーの重合又は共重合体の末端に蛍光物質を結合させる場合には、ポリマーの末端に反応性の基を導入することもでき、そのような場合には、蛍光物質として、反応性の基が導入されてなるものを使用しなくともよい。また、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリロイル基含有化合物との共重合に適する基の例としては、アクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を含む基が挙げられる。
【００６１】
本発明のポリマーは、末端に蛍光物質が結合されてなる単独重合体であってもよいし、主鎖が蛍光物質以外のモノマー成分と蛍光物質とから構成される共重合体であってもよい。また、主鎖を構成する蛍光物質以外のモノマー成分も、一種類とは限らず、二種以上が使用されていてもよい。本発明のポリマーが共重合体である場合、それは、ランダム共重合体であっても、ブロック共重合体（グラフト共重合体等を包含する）であってもよい。特に共重合体とする場合には、モノマー成分のモル比により、また、ランダム共重合かブロック共重合かにより、そのポリマーが示す水系溶媒中での蛍光強度の変化挙動が変わり得る。従って、特に後記する第五の発明において使用する本発明のポリマーは、測定対象との関係を考慮し、分子設計をすることとなる。
【００６２】
本発明のポリマーの分子量は、特に限定されないが、モノマーの重合度（ｎ）で表して、１０乃至１、０００程度であることが好ましく、ｎ＝１０乃至５００程度であることがさらに好ましく、ｎ＝１０乃至２００程度であることが特に好ましい。蛍光物質の導入割合も、特に限定されないが、モノマー成分中の蛍光物質の割合が、０．００１乃至２０モル％であることが好ましく、０．０１乃至１０モル％であることが好ましい。なお、一般的には、ポリマーの重合度が大きくなる（分子量が大きくなる）に従い、蛍光物質の導入割合は小さくなる。
【００６３】
次に、上記ポリマーの製造方法の例を説明する。先ず、片末端にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
【００６４】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＮＩＰＡＡｍ」ということがある）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（以下、「ＭＰＡ」ということがある）とを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（以下、「ＡＩＢＮ」ということがある）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」ということがある）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、片末端に連鎖移動剤に由来する基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、ＮＩＰＡＡｍとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００６５】
次いで、得られたＰＮＩＰＡＡｍをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」ということがある）と、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」ということがある）及び酢酸エチルの存在下で、約２５℃にて反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４−ジオキサンの存在下で、約２５℃にて、フルオレセイン系蛍光物質である４−アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４−アミノフルオレセインが接合されたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が製造される。
【００６６】
中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、フルオレセイン系蛍光物質であるフルオレセイン  ｏ−アクリレートを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムにフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとフルオレセイン  ｏ−アクリレートとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００６７】
上記した製造例では、ポリマー末端がカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えば、リン脂質、蛋白質、担体等）に結合させることもできる。一例を挙げると、カルボキシル基をホスファチジルエタノールアミン等のアミノ基を有するリン脂質と結合させることができる。この場合、ポリマー末端のリン脂質部分が細胞膜のリン脂質部分に接近又は埋め込まれるようになる。また、上記ポリマー末端のカルボキシル基に、予め末端にアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを結合させることができる。この場合、ポリマー末端のイムノグロブリン部分が、例えば抗原抗体反応結合体部分に親和性を示すと考えられる。さらに、上記カルボキシル基で上記ポリマーを固体表面に結合させた場合には、このポリマーを、その蛍光を観察することに基づくセンサーとして使用することも可能であると考えられる。
【００６８】
ところで、温度応答性ポリマーは、水素結合が切断されると水に不溶性となり、沈殿する。このような現象を下限臨界溶解現象といい、相転移が生じる温度を下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature：LCST）と呼ぶ。この下限臨界溶解温度は、ポリマーを構成するモノマーの選択や、コモノマーの利用（種類や使用する割合）によって調節することができる。例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界溶解温度を有するが、下限臨界温度を３２℃超にするためには、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどのコモノマーを共重合させるとよい。一方、下限臨界溶解温度を３２℃未満にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどのコモノマーと共重合させるとよい。なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側でより強い蛍光を発し、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
【００６９】
中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーを合成する場合には、フルオレセイン系蛍光物質の親和性の程度や、その導入割合によって、得られる蛍光性温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度が変化することを考慮する必要がある。
【００７０】
次に、中間に蛍光物質であるダンシル  アミノエチルアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
【００７１】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、ダンシル  アミノエチルアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシル  アミノエチルアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとダンシル  アミノエチルアクリルアミドとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００７２】
上記した製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、段落［００３９］に示された製造例の場合と同様である。
【００７３】
ダンシル  アミノエチルアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が小さく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が上昇する。
【００７４】
次に、中間に蛍光物質である７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
【００７５】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−７−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｏｕｍａｒｉｎａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００７６】
上記した製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、段落［００３９］に示された製造例の場合と同様である。
【００７７】
７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が大きく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
【００７８】
次に、片末端に蛍光物質である４−アミノフルオレセインが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
【００７９】
まずは、Ｄ−又はＬ−プロリンのメチルエステル化を行う。次いで、得られたＤ−又はＬ−プロリンのメチルエステルに塩化アクリロイルを反応させ、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルを合成する。このＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルを、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約８０℃にて反応させる。これにより、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルの重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）」ということがある））が得られる。ポリマーの分子量は、モノマーとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００８０】
次いで、Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）を、ＮＨＳ、ＤＣＣ及び酢酸エチルの存在下で反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４−ジオキサンの存在下で、フルオレセイン系蛍光物質である４−アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４−アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリ（Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステル）が製造される。
【００８１】
上記の例において、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルの一部をＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）に変えることで、主鎖がＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステル由来部分とＮ−イソプロピルアクリルアミド由来部分とのランダム共重合体であり、４−アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリマーを得ることができる。
【００８２】
以上説明した本発明に係るポリマーは、それが温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性温度応答性ポリマー」と、また、それがｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性ｐＨ応答性ポリマー」と呼称される。
【００８３】
本発明に係るポリマーの製造に使用される連鎖移動剤の例としては、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトエタノール、及び２−メルカプトエチルアミンが挙げられる。連鎖移動剤は、これらに限定されず、チオール基を含有する各種化合物や四塩化炭素も使用可能である。また、連鎖移動剤に由来する末端部分に蛍光物質を結合させるために、蛍光物質に導入される基としては、アミノ基、カルボキシル基、オキシエチレン基等が挙げられる。
【００８４】
次に、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法について説明する。当該方法は、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法であって、任意の蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性のポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む方法に関する。
【００８５】
蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法では、使用する蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、温度及び／又はｐＨ応答性であり、且つ、蛍光物質が結合されてなるポリマーである限り、特に限定されないが、本発明のポリマーを使用することが好ましい。
【００８６】
蛍光発生成分を有する物質の変化の測定とは、蛍光発生成分（例えば芳香環化合物）を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）自体の変化、具体的には熱変性や立体構造の変化、凝集等が生じたか否かを、蛍光発生成分と蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、認識することをいう。また、蛍光発生成分を有する物質の周囲環境の変化の測定とは、前記熱変性や立体構造の変化、凝集等が周囲環境の変化によって生じている場合に、その周囲環境の変化が引き起こした蛍光発生成分を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）の変化を、前記蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、周囲環境の変化を認識することをいう。
【００８７】
ここで、蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。ドナーとなる分子（本発明における「蛍光発生成分を有する物質」又は「蛍光発生成分」）の蛍光スペクトルと、アクセプターとなる分子（本発明における「蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質」）の励起スペクトルに重なりがあり、これら二つの分子が約１００ｎｍ以内、好ましくは１０ｎｍ以内の距離に近づいた場合、ドナーを励起するとエネルギーがアクセプターに移動し、アクセプターとなる分子が励起される現象が生じる。これが、蛍光共鳴エネルギー移動である。従って、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせるためには、通常はドナーの励起波長で光を照射し、検出は、ドナーあるいはアクセプターの蛍光強度測定で行う。ドナーの蛍光強度は、二分子間の距離が近いとアクセプターに光が吸収されるために低くなり、距離が離れると高くなる。アクセプターの蛍光強度は、この逆となる。なお、前記したように、ドナーとなる分子の蛍光スペクトルとアクセプターとなる分子の励起スペクトルとに重なりがあることが必要であるので、好ましい例である、アクセプターである蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質の発する蛍光強度を測定する場合には、変化の測定対象である蛍光発生成分を有する物質（蛋白質等）の蛍光スペクトルを考慮し、その蛍光波長よりも１０乃至５０ｎｍ程度長波長側に励起波長がある蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用することが好ましい。
【００８８】
蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法では、水系溶媒中で、蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを蛋白質等の蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分からポリマー中の蛍光物質への蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる。例えば、蛋白質自体の発する蛍光強度が、バックグラウンド蛍光と区別できなかったり、蛋白質の変化に伴う蛍光強度の変化が小さいために、蛍光強度を測定してもその変化を認識することができない場合であっても、蛋白質中の蛍光発生成分（トリプトファン等の芳香環化合物）の励起波長で光を照射すると、エネルギーが蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質へ移動し（蛍光共鳴エネルギー移動が生じ）、このとき、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質が励起されて発光する蛍光の強度は大きいため、この蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質が発する蛍光の強度を測定すれば、蛋白質等やその周囲環境の変化を認識することができる。なお、「水系溶媒」とは、水、各種の緩衝液等の水溶液、水とメタノールやエタノール等の極性溶媒との混合物であって、水を主成分とするもの等をいう。水系溶媒を使用すると、バックグラウンド蛍光の強度は、一般的には小さい傾向にある。
【００８９】
さらに、本発明のポリマー中、温度応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法について説明する。
【００９０】
蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有する。これらのポリマーは、下限臨界溶解温度未満では親水的環境下にあり、一方、下限臨界溶解温度を超えると疎水性環境下におかれる。すなわち、溶解性が急激に低下する。蛍光性温度応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、下限臨界溶解温度未満、すなわち親水的環境下において強い蛍光を発するが、この温度を超えると蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、下限臨界溶解温度未満では蛍光が弱く、この温度を超えると蛍光強度は著しく大きくなる。本発明のポリマー中、温度応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法は、蛍光性温度応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性温度応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境の温度を特定するものである。
【００９１】
蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有するので、測定したい温度に応じて、適する蛍光性温度応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
【００９２】
また、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
【００９３】
さらに、本発明のポリマー中、ｐＨ応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法について説明する。
【００９４】
蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の相転移ｐＨ（水系溶媒に対する溶解性が急激に変化するｐＨ）を有する。蛍光性ｐＨ応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、親水的環境下（このとき、ポリマーは水系溶媒中に溶解している）において強い蛍光を発するが、疎水性環境下（このとき、ポリマーの水系溶媒に対する溶解度は低い）では蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、親水的環境下では蛍光が弱く、疎水性環境下では蛍光強度は著しく大きくなる。本発明のポリマー中、ｐＨ応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法は、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境のｐＨを特定するものである。
【００９５】
蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の溶解性に著しい変化が生じる（すなわち相転移）ｐＨを有するので、測定したいｐＨに応じて、適する蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
【００９６】
また、蛍光性ｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
【００９７】
第一の発明のポリマー中、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用する方法について説明する。当該方法においては、測定対象を含有するか又は含有することが予想される水系溶媒（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水系溶媒（ｙ）中で、上記ポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながらを測定し、水系溶媒（ｘ）での測定結果を水系溶媒（ｙ）での測定結果を比較することにより、水系溶媒（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水系溶媒（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する。
【００９８】
ここで、「測定対象」とは、例えば、生体中に存在する蛋白質（プロテインＡ、Ｇ蛋白質等）、オリゴ−又はポリペプチド（アンギオテンシン、バソプレッシン等）、多糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン等）、及び各種アミノ酸、ホルモン様物質、ステロイド類等の低分子生理活性物質等をいう。ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、「測定対象」と共存することにより、そのポリマーの温度応答挙動及び／又はｐＨ応答挙動に変化が生じ得る。そのような変化の有無に基づき、特定の「測定対象」が存在するか否か、あるいは、特定の「測定対象」がどのような三次元高次構造を取っているかを判定する。
【００９９】
ここで、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン重合体を用い、また、本発明のポリマーとして、その主鎖の構成モノマーとして光学活性を有するプロリンを含む蛍光性温度応答性ポリマー（Ｌ−プロリンのみを含むものとＤ−プロリンのみを含むもの）を使用して、測定対象が共存するか否かにより、本発明の蛍光性温度応答性ポリマーの温度と蛍光強度との関係が影響を受けるか否かを測定した実験（実施例９）について言及する。
【０１００】
例えば、主鎖構成モノマーがＬ−プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ａ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ−プロリン重合体が共存する（試料（ｂ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、異なる傾向が示されていることがわかる。一方、主鎖構成モノマーがＤ−プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ｃ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ−プロイン重合体が共存する（試料（ｄ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、ほぼ同様の傾向が示されていることがわかる。このような相違に基づき、ある試料中に、あるいは例えば生体内のある個所に、「測定対象」が存在するか否か、また、存在する場合、その「測定対象」の三次元高次構造はどのようであるかを判定することができるのである。
【０１０１】
この実験では、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン重合体を使用した。ここで、Ｌ−プロリン重合体とＤ−プロリン重合体とは、三次元高次構造が異なっていることが知られている。従って、上記実験は、「測定対象」をプロリン重合体とする場合には、その三次元高次構造（より具体的にはＬ−プロリン重合体であるかＤ−プロリン重合体でるか）を判定することになる。ここでは、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン単独重合体を使用したが、たとえばポリヌクレオチド中のプロリンがＬ体であるかＤ体であるかの相違により、ポリヌクレオチド自体の三次元高次構造が異なるものとなる場合もあり、そのような場合には、上記方法により、ポリヌクレオチド（測定対象）の三次元高次構造を判定することができるのである。
【０１０２】
次に、蛍光プローブについて説明する。この蛍光プローブは、本発明のポリマー中、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる。このような蛍光プローブは、本発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有イムノグロブリンのアミノ基を反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。また、第一の発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有リン脂質のアミノ基反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。
【０１０３】
先に述べたように、本発明のポリマーの中、その末端がカルボキシル基となっているものは、このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることができる。その一例を説明する。この例では、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中においてアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを反応させることにより、イムノグロブリン接合Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）が得られる。また、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）を活性エステルに変換し、その活性エステル化体を、１，４−ジオキサン中でアミノ基が導入されてなるリン脂質と反応させることもできる。
【０１０４】
このような蛍光プローブは、例えば、このプローブを構成する蛋白質やリン脂質、あるいは低分子生理活性物質と親和性のある環境に移動して留まるため、バイオイメージングに利用することができる。また、担体を有する本発明の蛍光プローブの近傍には、そのポリマー部分に親和性を有する物質が留まり、その結果、蛍光プローブの温度又はｐＨ応答性の挙動に変化が生じ得るので、その変化に基づき、蛍光プローブの近傍に留まった物質が何であるか、又はどのような三次元高次構造を取っているか等を、判定することができる。
【０１０５】
先に述べたように、PNIPAAmはLCSTを境に、低温側では親水性となり膨潤し高温側では疎水性となり収縮する。N-isopropylacrylamideの親水性のアミド基の部分と疎水性のイソプロピル基のバランスがPNIPAAmの鋭敏な温度応答性の要因となっており、LCST以下の低温では分子中のアミド基と水分子間で強い水素結合が働き、ポリマーは水和しランダムコイル状のコンフォメーションをとる。LCST以上の高温になると水素結合が不安定となり脱水和が起こり、ポリマー鎖が凝集してグロビュール状に変化する。このLCSTはポリマーの共重合体組成により自由に制御可能である。つまり、共重合を行う際、導入するNIPAAmモノマー、疎水性モノマーや親水性モノマーのバランスを調整することで、得られるコポリマーのLCSTを制御することができる。疎水性モノマーを共重合させると疎水性相互作用が強くなり、その結果32℃であったNIPAAmのLCSTは低温側へシフトする。逆にアクリル酸などの親水性モノマーをPNIPAAmと共重合させると、LCSTが高温側にシフトすることが知られている。また、PNIPAAmへ他分子を導入することによる影響は、LCST以外の機能にも影響を及ぼすことが確認されている。カチオン性モノマーであるDMAPAAmをPNIPAAmと共重合させることで、 LCSTが高温にシフトすることが知られており、さらにポリマーの表面荷電密度が温度制御可能となる例や、アクリル酸またはジメチルアミノメタクリレートを導入したpH感受性ポリマーの報告がある。これらをHPLC充填剤表面に修飾し、温度変化に伴い荷電性と疎水性の2つの相互作用を制御し、荷電基を有する生理活性物質を水系条件下で分離する手法を開発した例もある。また、PNIPAAmに蛍光分子を導入し、ポリマーの物性評価や蛍光温度計として利用する研究が行われている。安中らは、温度に応答して体積や特性を変化させることのできる“くし型”PNIPAAmヒドロゲルのメカニズムの研究において、ゲルにダンシル基をラベル化し、温度変化によるゲルの収縮をダンシル基の極大蛍光波長の変化を指標に観察している。内山らはPNIPAAmとN-アルキルアクリルアミド及び蛍光物質であるベンゾフラゾンを用いてナノゲル温度計を作製し、マイクロインジェクション法を用いて細胞に注入し、カンプトテシンを添加後、細胞に化学刺激を与えた際の温度変化を定量化することに成功したという報告もある。しかし、PNIPAAmを本格的に病態細胞イメージングへ適用した例はほとんどない。
【０１０６】
以上の背景から、本発明者らは、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、温度応答性ポリマーに蛍光分子を導入した蛍光ポリマーの開発を行った。病態細胞特異性を持たせるために生体内において分子認識能の高いL体アミノ酸に着目し、アミノ酸誘導体モノマーを導入した温度応答性ポリマーに極性感受性の蛍光分子である5-amino fluoresceinを修飾することで、LCSTより低温側の親水的環境下では発光し、LCSTより高温側の疎水的環境下では蛍光を発しない蛍光ポリマーを作製した。5-amino fluoresceinのpKaは6.4であり, pH5〜9 の範囲でpH依存性の吸収と蛍光放出を示すことから、温度応答性に加えてpH応答性も併せ持つ蛍光ポリマーの開発が可能となる。また、がん細胞が正常細胞より高温かつ低pH環境下にあることに着目し、NIPAAmにpH応答性モノマーであるacryloyl sulfamethazine誘導体モノマーと親水性モノマーであるN,N-dimethylacrylamide (DMAAm) を共重合し、温度に加えpHにも依存してポリマーの親水/疎水性が変化するポリマーを開発した。さらに、がん細胞特異的に発現することが知られているアミノ酸トランスポーター1 (L-type amino-acid transporter 1; LAT1) を標的としたポリマーを開発した。
【０１０７】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【実施例】
【０１０８】
【実施例１】
【０１０９】
１．モノマー合成
１−１．試薬及び装置
試薬
L-Tryptophan: ペプチド研究所
L-Phenylalanine: ペプチド研究所
Sulfamethazine: TCI
Thionyl chloride: 関東化学株式会社
Acryloyl chloride: TCI
Triethylamine: 和光純薬工業
Dichloromethane      : 和光純薬工業
NaHCO3: 和光純薬工業
Ethyl acetate: 和光純薬工業
Hexane: 関東化学株式会社
Acetone: 和光純薬株式会社，関東化学株式会社
Methanol: W和光純薬株式会社，関東化学株式会社
CDCl3: 東京化成工業株式会社
Dimethyl sulfoxide(DMSO): 関東化学株式会社
装置
1H-NMRスペクトル: Varian Inc, UI500 Model 500 Unity Inova【０１１０】
１−２．実験項
１−２−１．モノマー合成
[1] N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの合成
L-Tryptophan methyl esterの合成
L-Tryptophan (25.1 g, 122 mmol) をMeOH (200 mL) に溶解し、氷冷下、thionyl chloride (10.6 mL, 147 mmol) を滴下し、撹拌した。反応液を室温に戻し、4 h加熱還流後、次いで溶媒を留去し、L-tryptophan methyl ester 塩酸塩を得た。この塩酸塩をH2Oに溶解し、氷冷下、10%NaOH (33 mL) を滴下し中和反応を行った。反応液をCH2Cl2及び飽和NaHCO3で分液抽出し、有機層を無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を留去し、L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 74.2%) を得た。【０１１１】
N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの合成
N-Acryloyl-L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 98 mmol) をCH2Cl2に溶解し、NEt3 (16.3 mL, 117.6 mmol) 及びacryloyl chloride (8.7 mL, 107.8 mmol) を-20℃で滴下後、撹拌した。反応終了後、H2O及びCH2Cl2で分液抽出した。有機層を無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[移動相AcOEt−Hexane (1:1) ]に付して白色固体としてN-acryloyl-L-tryptophan-methyl ester (24.1 g, 97.1%) を得た。
1H-NMR (500MHz，CDCl3) δ8.34 (s, 1H)，7.6-7.1 (m, 5H)，7.0 (s, 1H)，6.29 (dd, 1H, J = 1.5, 17.0)，6.21 (d, 1H , J = 8.0), 6.04 (dd, 1H, J = 10.5, 17.0), 5.6 (dd, 1H , J = 1.5, 13.0), 5.05 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.40 (m, 2H)．【０１１２】
[2] N-acryloyl-L-phenylalanine methyl esterの合成
L-phenylalanine methyl esterの合成
L-phenylalanine (10.4 g) を出発物質とし、L-tryptophan methyl esterと同様の工程で合成した。thionyl chloride (4.24 mL) 及びMeOH (80 mL) 、10%NaOH (13.2 mL)を使用し、L-Phenylalanine methyl ester (9.90 g, 88.1%)を得た。【０１１３】
N-acryloyl-L-phenylalanine methyl esterの合成
L-phenylalanine methyl ester (9.90 g, 55.8mmol)を出発物質とし、N-Acryloyl-L-tryptophan methyl esterと同様の工程で合成した。CH2Cl2、NEt3 (9.41 mL, 66.9mmol) 及びacryloyl chloride (4.96mL, 61.3mmol) を用いてN-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester (9.91 g, 81.2%) を得た。ただし結晶性が良く、カラム抽出は行わなかった。
1H-NMR (500MHz，CDCl3) δ7.2-7.1 (m, 5H), 6.3 (dd, 1H, J = 1.5, 17.5), 6.1 (dd, 1H, J = 10.5, 17.0), 5.65 (dd, 1H, J = 1.0, 10.5), 4.95 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 1.9 (s, br,1H)．【０１１４】
[3] N-Acryloyl-L-Phenylalanineの合成
L-phenylalanine (3.0 g, 18 mmol) をNaOH aq (36 mmol) に溶解し、acryloyl chlori
de (1.5 mL, 21.6 mmol) を氷冷下で滴下後、撹拌した。溶媒を留去し、N-acryloyl-L-phenylalanine (1.2 g, 32.0%) を白色固体として得た。
1H-NMR (500MHz、DMSO) δ8.5 (d, 1H, J = 8), 7.2 (m, 5H), 6.26 (dd, 1H, J = 10.0, 17.0), 6.05 (dd, 1H, J = 2.0, 17.0), 5.58 (dd, 1H, J = 1.5, 10), 4.50 (m, 1H), 3.40 (s, 1H), 3.10 (m, 1H), 2.89 (m,1H)．【０１１５】
[4] N-acryloyl-sulfamethazineの合成
Sulfamethazine (SMZ) (5.4 g, 20 mmol) をNaOH aq (22 mmol) - acetone (1:1)に溶
解し、acryloyl chloride (1.8 mL, 22 mmol) を滴下し、撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し、N-acryloyl-sulfamethazine (3.2 g, 51.4%) を得た。
1H-NMR (CDCl3、DMSO) :11.6 (s, 1H), 10.5 (s, 1H), 7.96-7.8 (m, 4H), 6.8 (s, 1H), 6.4 (dd, 1H, J = 10.0, 17.0), 6.3 (dd, 1H, J = 1.5, 17.0), 5.8 (dd, 1H, J = 2.0, 10.0), 2.2 (s, 6H)．【０１１６】
１−２−２．モノマー評価
1H-NMRの測定
アミノ酸誘導体モノマーの構造確認は、合成モノマーの重クロロホルム溶液を測定試料とし、1H-NMR測定より行った。【０１１７】
１−３．結果・考察
Phenylalanine、tryptophanのアミノ酸やsulfamethazineをNIPAAmと共重合するため、acryloyl基の導入を試みた。Tryptophanはカルボキシル基のmethyl ester化を行ったもの、phenylalanineについてはmethyl ester化を行ったものとLAT1トランスポーターによる認識を期待してmethyl ester化を行わなかったものを用いた。その後、acryloyl chlorideを作用させることで重合官能基を導入し、誘導体モノマーを得た (下記Scheme.2-1〜Scheme.2-3 を参照)。1H-NMR測定の結果、合成が確認された(図１〜図４を参照)。【０１１８】
【化１０】
2015129901.tif 000012
【０１１９】
【化１１】
2015129901.tif 000013
【０１２０】
【化１２】
2015129901.tif 000014
【０１２１】
２．温度応答性ポリマーの合成
２−１．試薬及び装置
試薬
N-isopropylacrylamide (NIPAAm):興人
N,N-dimethylaminopropylacrylamide (DMAPAAm): 興人
Butylmethacrylate (BMA): 和光純薬工業
3-mercaptopropionic acid (MPA): 和光純薬工業
(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid): Sigma Aldrich
2,2’ -azobisisobutyronitrile (AIBN): 和光純薬工業
n-hexane: 和光純薬工業
N,N’ -dimethylformamide (DMF): 関東化学
液体窒素(liquid-nitrogen): 寿産業株式会社
Diethyl ether: 和光純薬工業
Acetone dehydrated: 和光純薬工業
1,4-dioxane dehydrated: 和光純薬工業
Ethyl acetate dehydrated: 和光純薬工業
N,N’ -dicyclohexylcarbodiimide (DCC): 関東化学
N-hydroxysuccinimide (NHS): Merck
5-aminofluorescein (FL): SIGMA-ALDRICH
Dulbecco's phosphate-buffered salines (PBS): Life Technologies
H2O: Milli-Q water purification system から精製【０１２２】
装置
透過率測定: 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) + MCB-100型水冷ペルチェ式恒温
セルホルダ(JASCO) + 電動式ペルチェ温度自動調節機(KRUSS PT31)
蛍光強度及び蛍光スペクトル測定: 蛍光光度計(Spectrofluorometer FP-6300：JASCO) + ETC-273T型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ+ KRUSS PT31
GPC測定: GPC-8020シリーズ(TOSOH)【０１２３】
２−２．実験項
２−２−１．温度応答性ポリマーの合成
[1] PNIPAAmの合成
NIPAAm(10.0 g, 88.4 mmol)、MPA(4.86 mmol ;NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.35 mmol ;NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)をDMF（20mL）でナス型フラスコ中に溶解させた。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、PNIPAAm(10.7 g, Quant)を白色固体として得た。【０１２４】
[2] P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成
BMAの導入率がポリマー全体に対して3 mol%となるように、P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成を行った。NIPAAm(15.0g, 133 mmol)、BMA(0.58 g, 4.11 mmol)をDMFに溶解し、MPA(7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(13.5 g, 86.7%)を白色固体として得た。【０１２５】
[3] P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成
DMAPAAmの導入率が2 mol%になるように、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成を行った。NIPAAm(15.0 g, 133 mmol)、DMAPAAm(0.42 g, 2.71 mmol)をDMFに溶解し、MPA(7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(14.7 g, 95.3%)を白色固体として得た。【０１２６】
[4] P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)の合成
N-Acryloyl-L-Phenylalanine methyl esterの導入率が1.3mol%、DMAPAAmの導入率が3 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)を合成した。NIPAAm(15.0 g, 133 mmol)、N-Acryloyl-L-Phenylalanine methyl ester(0.42 g, 1.81 mmol)、DMAPAAm(0.65 g, 4.17 mmol)をDMFに溶解し、MPA (7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(14.3 g, 89.0%)を白色固体として得た。【０１２７】
[5] P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)の合成
N-Acryloyl-L-Tryptophan methyl esterの導入率が1.5 mol%、DMAPAAmの導入率が3 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)を合成した。NIPAAm(3.00 g, 26.5 mmol)、N-Acryloyl-L-Tryptophan methyl ester(0.11 g, 0.42 mmol)、DMAPAAm(0.13 g, 0.83 mmol)をDMFに溶解し、MPA (1.46 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN (0.11 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(3.16 g, 97.5%)を白色固体として得た。【０１２８】
[6] P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)の合成  N-acryloyl-sulfamethazine（ＳＭＺ）の導入率が10 mol%、DMAAmの導入率が48 mol%になるように、P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)を合成した。NIPAAm(0.646 g, 5.7 mmol)、DMAAm (0.647 g, 6.5 mmol)、N-acryloyl-sulfamethazine (0.378 g, 1.4 mmol)をDMFに溶解し、RAFT剤(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) (0.076 mmol)及びAIBN(0.03 mmol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(1.64 mg, 98.0%)を白色固体として得た。【０１２９】
[7] P(NIPAAm-co-L-Phe5%)の合成
N-Acryloyl-L-Phenylalanineの導入率がポリマー全体に対して5 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Phenylalanine5%)を合成した。NIPAAm(2.00 g, 17.7 mmol)、N-Acryloyl-L-Phenylalanine(0.20 g, 0.93 mmol)をDMFに溶解し、RAFT剤(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) (0.2 mmol ;1/75 eq)及びAIBN(0.09 mmol ; 0.4/75 eq)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyletherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(2.21 g, Quant)を白色固体として得た。【０１３０】
２−２−２．温度応答性ポリマーの物理化学的性質の評価
[1] 1H-NMRの測定
モノマーの導入率は、合成ポリマーの重クロロホルム溶液を測定試料とし、1H-NMR測定より算出した。【０１３１】
[2] 分子量測定
ポリマーの分子量は、ポリマーの0.05 w/v% DMF溶液をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料とし、GPCを用いて測定した。測定器には東ソーGPC8020シリーズを用いた。
検出器；示差屈折率検出器；RI-8020、紫外吸光度検出器；UV-8020、カラム；TSK-GEL α-M (7.8 mmI.D.×300 mm), 移動相；10 mM LiCl/DMF, 流速；1.0 mL/min, 温度；40℃、
検量線；1000−272000 (内部標準物質:ポリエチレングリコール)。 【０１３２】
[3] LCST測定
ポリマーのLCSTは透過率測定により算出した。5 mg/mLになるようにポリマー水溶液(H2OまたはPBS) を調製し、0.1℃/minの温度勾配で昇温して、透過率が50%となる温度をLCSTとした。P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)は5 mM Na2H PO4/ 150 mM NaCl水溶液及び5 mM NaH2PO4/ 150 mM NaCl水溶液をもとに作成したpH緩衝液を用いて5 mg/mLになるように調整した。
装置; 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) にETC-717型氷冷ペルチェ式恒温セルホルダ（JASCO）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（KRUSS PT31）．測定波長; 500 nm 【０１３３】
[4] 表面電位(Zeta potential) の計測
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)の表面電位は、合成したポリマーの200 mg/mL溶液(pH緩衝液) をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料としてゼータサイザーを用いて測定した【０１３４】
２−２−３．蛍光ポリマーの合成
[1] PNIPAAm-FLの合成
PNIPAAmのスクシニル化
PNIPAAm(0.50 g, 1.00 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.05 g, 2.50 mmol ; 2.50 eq)及びNHS(0.03 g, 2.50 mmol ; 2.50 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し再沈精製を行い、白色固体として目的物(0.40 g, 68.8%)を得た。【０１３５】
PNIPAAm-FLの合成
上記PNIPAAmのスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(0.09 g, 0.02 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、5-aminofluorescein(0.02 g, 0.05 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ない状態まで透析した。その後、溶媒を留去し橙色固体としてPNIPAAm-FL(0.08 g, 80.0%)を得た。【０１３６】
[2] P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成
P(NIPAAm-co-BMA3%)のスクシニル化
P(NIPAAm-co-BMA) (10.0 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(25.0 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(25.0 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し再沈精製を行い、白色固体として目的物を得た。【０１３７】
P(NIPAAm-co-BMA3%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co-BMA3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(10.0 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、5-aminofluorescein(25.0 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500)で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。その後、溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-BMA3%)-FLを得た。【０１３８】
[3] P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成
P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)のスクシニル化
コポリマー(10.0 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(25.0 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(25.0 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。【０１３９】
P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(10.0 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(25.0 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ない状態まで透析した。さらに溶媒を留去し橙色の固体としてP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FLを得た。【０１４０】
[4] P(NIPAAm-co--L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化
コポリマー(6.00 g, 1.20 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.62 g, 3.00 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(0.35 g, 3.00 mmol ;2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色固体として目的物(4.90 g, 70.3%)を得た。【０１４１】
P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(1.50 g, 0.30 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein (0.11 g, 7.50 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL(1.50 g, 93.2%)を得た。【０１４２】
[5] P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化
コポリマー(2.50 g, 0.50 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.26 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(0.14 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマー(2.30 g, 79.3%)を得た。【０１４３】
P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(2.30 g, 0.50 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(0.43 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL(2.20 g, 80.6%)を得た。【０１４４】
[6] P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のスクシニル化
コポリマー(150 mg, 0.50 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(257mg, 1.25 mmol ;2.5 eq)及びNHS(143 mg, 1.25 mmol ;2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。【０１４５】
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(152 mg, 0.01 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(8.8 mg, 0.025 mmol ;2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し薄黄色固体としてP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FL (91.4 mg, 60.0 %)を得た。【０１４６】
[7] P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-L-Phe5%)のスクシニル化
コポリマー(0.5 g, 0.10 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC (0.11 mmol ; 1.1 eq)及びNHS(0.11 mmol ; 1.1 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。【０１４７】
P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FLの合成
上記P(NIPAAm-co-L-Phe5%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(0.5 g, 0.10 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(0.09 g, 0.25 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FL (0.49 g, 83.1 %)を得た。【０１４８】
２−２−４．温度応答性蛍光ポリマーの物理化学的性質の評価
[1] LCST測定
ポリマーのLCSTは透過率測定により算出した。ポリマーの5 mg/mL溶液(PBS) を調製し、0.1℃/minの温度勾配で昇温して、透過率が50%となる温度をLCSTとした。
装置; 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) にETC-717型氷冷ペルチェ式恒温セルホルダ(JASCO）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（KRUSS PT31）．測定波長; 600 nm【０１４９】
[2] 表面電位(Zeta potential) の計測
蛍光ポリマーの表面電位は、合成した蛍光ポリマーの200 mg/mL溶液(PBS) をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料とし、ゼータサイザーを用いて測定した。【０１５０】
２−３．結果・考察
２−３−１．温度応答性ポリマーの合成
連鎖移動剤としてMPA、ラジカル開始剤としてAIBNを用いて、DMF中、70℃で重合を行い、PNIPAAm、NIPAAmに疎水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-BMA3%)、親水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)、上記で合成したアミノ酸誘導体モノマーと親水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)及びP(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)をいずれも白色固体として得た(下記Scheme.2-4〜Scheme.2-8 を参照) 。アミノ酸誘導体モノマーを含む共重合三元ポリマーは共重合二元ポリマーのLCSTを参考にモノマーの組成比を検討した(図５)。なお、図５において、(A)はBMA, (B)はL-Phe-OMe, (C)はL-Trp-OMe, (D)はDMAPAAm copolymer に関するグラフである。図５において、(◇)は1%, (□)は2%, (△)は3%, (×)は4%, (○)は5%をそれぞれ意味する。また、連鎖移動剤としてMPA、RAFT剤として(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) を用いて、DMF中、70℃で重合を行い、P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)及びP(NIPAAm-co-L-Phe5%)を白色固体として得た(下記Scheme.2-9、Scheme.2-10 を参照) 。これらのポリマーの片末端はMPA由来のカルボキシ基を有しており、これをもとに蛍光分子の修飾が可能である。【０１５１】
【化１３】
2015129901.tif 000015
【０１５２】
【化１４】
2015129901.tif 000016
【０１５３】
【化１５】
2015129901.tif 000017
【０１５４】
【化１６】
2015129901.tif 000018
【０１５５】
【化１７】
2015129901.tif 000019
【０１５６】
【化１８】
2015129901.tif 000020
【０１５７】
【化１９】
2015129901.tif 000021
【０１５８】
２−３−２．温度応答性ポリマーの物理化学的性質の評価
1HNMR測定により共重合モノマーの導入率を算出した(表１, 図６〜図１２)。また、合成したそれぞれのポリマーの数平均及び質量平均分子量(Mn，Mw) はGPCにより決定した(下記表１を参照)。PNIPAAm、P(NIPAAm-co-BMA 3％)、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) 、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)の分子量分布は1.9〜2.5前後であった。ラジカル重合法は開始・生長反応のみならず、移動・停止反応と呼ばれる副反応が起こるため、生成ポリマーは様々な分子量のポリマーの混合物となっている。そのため, 分子量分布がどのポリマーも大きくなってしまっている。一方、精密重合法であるRAFT重合で合成したP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)及びP(NIPAAm-co-L-Phe5%)の分子量分布はいずれも1.3前後であった。RAFT重合は開始反応、生長反応のみからなっており、副反応が存在せずポリマーの分子量が制御できるため、狭い分子量分布のポリマーが得られた。【０１５９】
合成したポリマーの温度応答性を確認するため、LCSTの測定を行った図１３)。今回作製したポリマーのLCSTはH2O中で、PNIPAAmは32.2℃、P(NIPAAm-co-BMA3%)は26.7℃、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)は37.7℃、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)は37.9℃、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)は37.5℃だった。正常細胞と病態細胞を見分けることが目的であるため、目的の37℃前後にLCSTをもつアミノ酸誘導体ポリマーが合成できたように見受けられたが、ポリマーの凝集がイオンの影響を受けることはポリマーのイオン間相互作用の研究において示唆された。蛍光ポリマーの細胞取り込み実験は培地中で行うため、MEM無血清培地及び細胞等張液であるPBSでポリマーのLCSTを測定した。PBS中におけるポリマーのLCSTは、PNIPAAmでは29.7℃、P(NIPAAm-co-BMA3%)では26.7℃、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)では32.4℃、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)では32.9℃、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)では31.0℃であり、すべてのポリマーにおいてLCSTの低下がみられた。PBSとMEM無血清培地では差が見られなかったため、以後の測定においてはPBSを用いた。特にDMAPAAmを共重合したポリマーにおいてLCSTの低下が顕著であり、これはカチオン性であるDMAPAAmがイオンの影響を受けやすいためであると考えられる。また、DMAPAAmはアルブミンのマイナスチャージとの相互作用によってLCSTが低下することも分かった。血清入り培地で取り込み実験をする際には10%FBS入りMEM培地で細胞を24h incubateした所に蛍光ポリマーを添加するため、この溶液を回収し、上清を取り除いた溶液(活性FBSが10%以下になっていると予想される培地) でLCSTを測定したところ、PBSで測定した際と差が見られなかった。そのため、今回の系ではLCSTについてはFBSの影響を受けにくいと仮定し、PBS中におけるLCSTをもとに細胞取り込み実験の温度を決定することにした。温度応答性に加えてpH応答性を期待したP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のLCSTはpH = 6.4では29.3℃、pH = 7.0では34.5℃、pH = 7.4では42.0℃、pH = 7.8では44.5℃、pH = 8.4では46.3℃であった(PNIPAAmではpH応答性なし) 。生体内の正常pHが7.4であり、がん細胞付近のpHは6.8~7.0とされているため、がん細胞と正常細胞を識別するのに最適なLCSTを有していた(図１４)。LAT1選択性を目的とするP(NIPAAm-co-L-Phe5%)のLCSTはH2O/PBS中で30.0℃/50.2℃であった。L-phenylalanineのpKaは5.5であるが、PBSのpHは7.4であるのに対し、H2OのpHは空気中のCO2を吸収し酸性側に傾いている。そのため、PBS中ではN-Acryloyl-L-Phenylalanineのカルボキシル基がイオン化し、LCSTが上昇すると考えられる。【０１６０】
動的光散乱による粒子径測定をH2O及びPBS溶液で行った(図１５) 。どちらの溶液中においてもLCST以上においてポリマーの粒子径の増大が見られた(P(NIPAAm-co-L-Phe5%)/H2O以外)。中でも、H2O水溶液ではカチオンチャージを持つポリマーであるP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) のLCST以上における粒子径の増大が他のポリマーに比べ亢進した。PBS溶液ではポリマーはイオンとの相互作用を受けて粒子径の増大が顕著であった。細胞取り込み実験は培地中で行うため、それに近い環境下でポリマーの粒子径を的確に測定することがポリマーの取り込み経路を判断する上で重要である。【０１６１】
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のゼータ電位を測定したところ、pHが上昇するにつれてLCST上昇およびzeta potential低下が見られ、これらの相関関係が示唆された(図１６)。【０１６２】
【表１】
2015129901.tif 000022
【０１６３】
２−３−３．温度応答性蛍光ポリマーの合成
前項で合成した温度応答性ポリマーを蛍光分子に結合させるため、NHSとDCCを用いて、ポリマーの末端カルボキシル基を活性エステルに変換した。このスクシニル化ポリマーを蛍光分子である5-aminofluorescein (FL) と反応させた. 得られた粗生成物を透析にて精製し、ポリマー末端にFLを有する蛍光ポリマーをそれぞれ合成し, いずれも黄色固体として得た (下記Scheme.2-11 を参照)。 【０１６４】
【化２０】
2015129901.tif 000023
【０１６５】
２−３−４．温度応答性蛍光ポリマーの物理化学的性質の評価
蛍光ポリマーの温度応答性を評価するためLCSTの測定を行った(図１７)。いずれの蛍光ポリマーも温度応答性ポリマー由来の温度応答性を保持したまま作製できたことが確認された。蛍光基修飾前後のポリマーのLCSTを比較したところ、ほぼ同じ温度付近にLCSTを有していたことから, ポリマー末端にFLを導入してもLCSTにほとんど影響を及ぼさないことが分かった。また、ポリマー溶液(PBS) の表面電位を計測したところ(図１８)、PNIPAAm-FLはLCST前後で電位の変化は見られなかった。P(NIPAAm-co-BMA3%)-FLはLCST以上では負に帯電した。P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL、P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL , 2P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLはLCST以上では正に帯電しており、細胞膜付着性を期待してポリマー鎖中に導入したDMAPAAmユニットによるものであると考えられる。【０１６６】
３．アミノ酸誘導体ポリマーにおける細胞実験
３−１. 試薬及び装置
試薬
RAW 264.7 培養細胞株: 理化学研究所
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株式会社
Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
0.02mol/L EDTA水溶液: 和光純薬工業株式会社
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
LysoTracker(R) Red DND-99: invitrogen
Hoechst33258: invitrogen
FluoromountTM水性マウンティング媒体: SIGMA ALDRICH
VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI: Vector Laboratries
Propidium iodide: 同仁化学研究所
Fillipin III: CAYMAN CHEMICAL COMPANY
Cytochalasin D: 和光純薬工業株式会社
Chlorpromazine: SIGMA ALDRICH
Sucrose: 和光純薬工業株式会社【０１６７】
装置
Infinite M1000; テカンジャパン株式会社
BIOREVO BZ-9000; 株式会社キーエンス
FACS Calibur; 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社【０１６８】
３−２． 実験項
３−２−１． 細胞の培養
RAW264.7細胞は10% FBS, 1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、 細胞はセルスクレーパーで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間固定化した。【０１６９】
HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。
３−２−２．経時変化及び最適濃度検討
RAW264.7細胞は24ウェルプレート(1×105 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーはPBS中に溶解して異なる濃度 (0.1、0.5、1、2 mg/mL) に調製した。これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10, 50, 100, 200 mg/mLとした。それぞれ1、2、4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。【０１７０】
HeLa細胞は24ウェルプレート(2.5×104cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーはPBS中に溶解して異なる濃度 (0.1、0.5、1、2, 4 mg/mL) に調製した. これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10, 50, 100, 200, 400 mg/mLとした。それぞれ1、2、4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Size: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms【０１７１】
３−２−３．培養温度による細胞取り込みの効果
プレートリーダー
RAW264.7細胞は24-wellプレート(1×105 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーは2 mg/mLに調製した. これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。【０１７２】
HeLa細胞は24-wellプレート(2.5×104 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーは4 mg/mLに調製した。これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。4 h放置後、ウェル内を2mM EDTA/PBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、2mM EDTA/PBSで2回洗浄した。2mM EDTA/PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Size: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms
Flow cytometry analysis【０１７３】
RAW264.7細胞は6-well プレート(2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、2mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。2mM EDTA/PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。【０１７４】
HeLa細胞は6-well プレート(5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 m g/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、2mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。
測定条件; RAW 264.7 cell ; FSC: E00, SSC: 580, FL1: 540, FL2: 550, FL3: 650
HeLa cell ; FSC: E00, SSC: 520, FL1: 450, FL2: 550, FL3: 600【０１７５】
蛍光顕微鏡における観察
RAW264.7細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１７６】
HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTMSystem 4-well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を培養細胞に対し100 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。FluoromountTM水性マウンティング媒体を用いて封入し、蛍光顕微鏡による観察
を行った。【０１７７】
３−２−４．蛍光ポリマーの細胞内における局在
RAW264.7細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。PBSで1回洗浄し、Hoechst33258溶液(5 mg/mL) を2 mL添加し、15 min放置した。PBSで2回洗浄し、さらにPBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１７８】
HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System 4-well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を培養細胞に対し100 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを用いて封入し、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１７９】
３−２−５．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
RAW264.7細胞はマルチウェルプレート (1×105 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。血清入り培地を除去し、ウェル内をPBSで一回洗浄し、無血清培地を加えた。無血清培地で希釈した阻害剤を添加後、450 μM sucrose、10 μg/mL chlorpromazineのマルチウェルプレートは1 h、10 μg/mL Fillipin、10 μM Cytochalasin Dを添加したマルチウェルプレートは30 minインキュベートした。蛍光ポリマーをPBSに溶解して2 mg/mLに調製し、培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Siz
e: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms【０１８０】
３−３． 結果・考察
３−３−１． RAW 264.7 cellにおける検討
３−３−１−１．経時変化及び最適濃度検討
蛍光ポリマーを細胞イメージングへ適用するために、イメージングに最適な細胞への蛍光ポリマー添加濃度及び培養時間について検討した。細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10、50、100、200 mg/mLになるよう調製して培養細胞へ添加した。37℃で1、2、4 h放置後、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。いずれの蛍光ポリマーにおいても、 濃度及び時間の増加に応じて高い蛍光強度を発することが確認され, 以降のRAW 264.7 cellにおける実験では細胞溶液中の蛍光ポリマー濃度を200 mg/mL、培養時間を4hに設定した。FBS(-)とFBS(+)における細胞取り込み実験では顕著な差は見られなかった。【０１８１】
３−３−１−２．培養温度による細胞取り込みの効果
蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へ蛍光未修飾ポリマー及び蛍光ポリマー溶液を添加し、LCST以下(27℃、BMA3%-FLのみ25℃) 及びLCST以上(37℃) の温度で4 h放置後、プレートリーダーによる測定、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。プレートリーダーによる測定ではいずれの蛍光ポリマーもLCST以下では蛍光強度が低くLCST以上では蛍光強度が増大した。これは、LCST以上になるとPNIPAAm鎖が疎水性変化を示し蛍光ポリマーの疎水性度が増大することから、蛍光ポリマーの細胞取り込みが促進するためと考えられる。フローサイトメトリー解析においては、FBS(+)に比べ、FBS(-)では蛍光ポリマーのバックグラウンドが高い傾向が見られたが、FBSの有無にかかわらずLCST以上と以下で蛍光ポリマーの取り込み実験を行った結果には差が見られた。蛍光顕微鏡における観察では、LCST以下で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、LCST以上で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が3次元的にも確認された。またLCST以上の細胞内では、いずれの蛍光ポリマーにおいてもドット状に分布していることが確認された。これは蛍光ポリマーが凝集したためであると考えられる. 蛍光ポリマーの粒径は前章で調べているが、その結果からも蛍光ポリマーにおける凝集を確認している。以上のことから, 既往研究と一致する結果となり、アミノ酸誘導体を用いることでも細胞取り込みは温度依存的な挙動を示すことが確認された。 【０１８２】
３−３−１−３。蛍光ポリマーの細胞における局在
蛍光ポリマーの細胞における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるHoechst33342を用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃、5% CO2濃度で4h培養し、次いでライソソーム及び核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察を行った。いずれの蛍光ポリマー (緑) も、核(青) には局在しておらず、ライソソーム (赤) にもほとんど局在していないことが確認された。通常、ナノサイズの物質が細胞外から細胞内へ物質が取り込まれる際にはエンドサイトーシスという小胞輸送経路により取り込まれ、ライソソームと融合し、ライソソーム内の様々な消化酵素により分解を受ける。しかし今回、ライソソームにおいて蛍光ポリマーの局在がほとんど確認されなかったことから、蛍光ポリマーがプロトンスポンジ効果によるエンドソームからの離脱、有用物あるいは不要物として認識され残余小体として細胞質にとどまっている、またはゴルジ体への局在等の可能性が示唆される。緒言でも述べたように温度応答性ポリマーを修飾したナノキャリアにおいて、エンドサイトーシス経路で取り込まれた後、ライソソーム以外の部位で局在が確認されており、表面に修飾した温度応答性ポリマー鎖が細胞への取り込みに何らかの影響を及ぼしていると考えられている。蛍光ポリマーが細胞内のどこに分布しているのかを正確に解明するためには、細胞の他の部位を染めるような試薬等を用いたり, 他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用いたりする必要性がある。【０１８３】
３−３−１−４．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
細胞の取り込み経路に関わる因子を阻害薬により阻害することにより、蛍光ポリマーの細胞取り込み経路の探索を行った。カベオラ仲介型エンドサイトーシス阻害剤としてfillipin III、ファゴサイトーシス阻害剤としてcytochaiasin D、クラスリン依存性エンドサイトーシスとしてchlorpromazine、scroseを用いた。いずれの蛍光ポリマーにおいてもクラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤であるchlorpromazine及びscroseを添加した細胞において取り込みが抑制された。このことから本研究で作製した蛍光ポリマーは、クラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞へ取り込まれていることが示唆された。クラスリン依存性エンドサイトーシスとは、クラスリンと形質膜を貫通する受容体タンパク等が100〜150 nmの被覆ピットを作り、さらに膜を球状に変化させクラスリン被覆小胞を形成することにより、細胞外の様々な物質を細胞内へと輸送する機構である。前章より、本蛍光ポリマーのLCST時のサイズは、100〜150 nmであることから、サイズと細胞取り込み経路との相関にも今回の結果は一致したと考えられる。しかし、細胞取り込み経路については未だ解明されていない部分も多く、サイズだけが取り込みに関与しているとは言い難い。今回の検討を明確なものにするためには、他の阻害剤等も使用しさらなる検討を重ねていく必要があると考えられる。【０１８４】
３−３−２． HeLa cellにおける検討
３−３−２−１．経時変化及び最適濃度検討
蛍光ポリマーを細胞イメージングへ適用するために、イメージングに最適な細胞への蛍光ポリマー添加濃度及び取り込み時間について検討した。RAW 264.7 cellにおける実験ではPBSを洗浄液として用いたが、蛍光ポリマーがHeLa cellの表面に吸着しやすいためかPBSによる洗浄ではバックグラウンドが出てLCST以上と以下と差が見られない結果になってしまった。そのため、2mM EDTA/PBSを洗浄液とした。細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10、 50、100、200、400 mg/mLになるよう調製して培養細胞へ添加した。37℃で1、2、4 h放置後、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。いずれの蛍光ポリマーにおいても, 濃度及び時間の増加に応じて高い蛍光強度を発することが確認され、以降のHeLa cellにおける実験では細胞溶液中の蛍光ポリマー濃度を400 mg/mL、取り込み時間を4hに設定した。FBS(-)とFBS(+)における取り込み実験では顕著な差は見られなかった。【０１８５】
３−３−２−２．培養温度による細胞取り込みの効果
蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へ蛍光未修飾ポリマー及び蛍光ポリマー溶液を添加し、LCST以下(27℃、BMA3%-FLのみ25℃) 及びLCST以上(37℃) の温度で4 h放置後、プレートリーダーによる測定、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。プレートリーダーによる測定ではいずれの蛍光ポリマーもLCST以下では蛍光強度が低くLCST以上では蛍光強度が増大した。フローサイトメトリー解析においては、2mM EDTA/PBSで洗浄を行ってもFBS(-)では蛍光ポリマーのバックグラウンドを消すことができず、LCST以下と以上で同じ結果が生じた。一方、FBS(+)ではLCST以上と以下で蛍光ポリマーの取り込み実験を行った結果には差が見られた。これにより、FBS存在下において蛍光ポリマーの非特異的な吸着をブロックできる可能性が示唆された。蛍光顕微鏡における観察では、LCST以下で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、LCST以上で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が3次元的にも確認された。またLCST以上の細胞内では、いずれの蛍光ポリマーにおいてもドット状に分布していることが確認された。以上のことから、がん細胞においても細胞取り込みは温度依存的な挙動を示すことが確認された。【０１８６】
３−３−２−３．蛍光ポリマーの細胞における局在
蛍光ポリマーの細胞内における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃で4h放置し、次いでライソソーム及び核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察を行った. いずれの蛍光ポリマー (緑) もライソソーム(赤) における局在が確認され (黄)、RAW 264.7 cellとは異なる局在をしている可能性が示唆された。 HeLa細胞におけるナノ粒子の細胞内取り込み実験において、25 nm以下の粒子は非古典的経路以外の経路で取り込まれゴルジ周辺に局在していたのに対し、42 nm以上の粒子はクラスリンやカベオラ依存性エンドサイトーシスで取り込まれライソソームに局在していたという報告があるが、本結果はこの報告に一致するものであった。また、本研究で用いた5-aminofluoresceinのpKaは6.4であり、pH 6.4以下ではラクトン構造を有しているのに対し、pH 6.4以上の塩基性環境下では加水分解によりラクトンの開環が生じ、分子全体が平面構造をとるため、強い蛍光を発する性質を有することが知られている。蛍光ポリマーのpH応答性はこの蛍光基の性質に由来するものであることは既に報告しているが、ライソソーム内はpH5.5あるいはより酸性に保たれているため、観察された以外にもライソソーム内に蛍光ポリマーが存在しているにもかかわらず、光っていない可能性も考えられる。そのため、他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用い、検討する必要性がある。【０１８７】
３−３−２−４．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
細胞の取り込み経路に関わる因子を阻害薬により阻害することにより、蛍光ポリマーの細胞取り込み経路の探索を行った。カベオラ仲介型エンドサイトーシス阻害剤としてfillipin III、クラスリン依存性エンドサイトーシスとしてchlorpromazine、scrose、マクロピノサイトーシス阻害剤としてcytochaiasin Bを用いた。【０１８８】
HeLa cellにおいてクラスリン及びカベオラ依存性エンドサイトーシスを阻害するとマクロピノサイトーシスが亢進されるという報告もある。【０１８９】
４．pH応答性ポリマーにおける細胞評価
４−１． 試薬及び装置
試薬
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株
式会社Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
HCl: 和光純薬株式会社
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
LysoTracker(R) Red DND-99: invitrogen
Hoechst33258: invitrogen
Propidium iodide: 同仁化学研究所【０１９０】
装置
FACS Calibur; 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社
BIOREVO BZ-9000; 株式会社キーエンス【０１９１】
４−２．実験項
４−２−１． 細胞の培養
HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。【０１９２】
４−２−２． 培養温度による細胞取り込みの効果
Flow cytometry analysis
HeLa細胞は6-well プレート(5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 m g/mLとした。pH = 6.8及び7.4で4 h放置後、2 mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。pH = 6.8の培地はMEM培地にHClを滴下し、Ekicrodisc(R)25 0.2 mm HT-Tuffryn(R)に通導したものを用いた。
測定条件; FSC: E00, SSC: 520, FL1: 450, FL2: 550, FL3: 600【０１９３】
蛍光顕微鏡における観察
HeLa細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、2mM EDTA/PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、2mM EDTA/PBSで2回洗浄した。2mM EDTA/PBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１９４】
４−２−３． 蛍光ポリマーの細胞における局在
HeLa細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、Hoechst33258溶液(5 mg/mL) を2 mL添加し、15 min放置した。PBSで2回洗浄し、さらにPBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１９５】
４−３．結果・考察
４−３−１． 培養温度による細胞取り込みの効果
蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へID48S10-FL溶液を添加し、pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。フローサイトメトリー解析においては、3.2.3.2.2.項におけるBMA-FLにおける結果と同じような挙動を示した (Fig. 3-13)。これらのポリマーはゼータ電位の測定においてともに負電荷を示しており (Fig. 2-16, 2-18) 、正電荷をもつ蛍光ポリマーと比較すると細胞膜付着性が弱い可能性が示唆された 。DMAAmに加えてカチオン性を有するDMAPAAmやアミノ酸等を導入することによって細胞膜付着性が改善されると考えられる。蛍光顕微鏡における観察では、pH = 7.4で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、pH = 6.8で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が確認された。このことから細胞取り込みはpH依存的な挙動を示すことが確認された。【０１９６】
４−３−２．蛍光ポリマーの細胞における局在
蛍光ポリマーの細胞における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるHoechst33258を用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、pH = 6.8及び7.4で37℃、4h放置し、次いでライソソーム及び核染色を行い、 蛍光顕微鏡で観察を行った (Fig. 3-14)。3.2.3.2.2.項でも述べたように蛍光ポリマー (緑) はライソソーム (赤) における局在が確認された (黄)。細胞内動態を確認するには他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用いる必要性があるが、当研究室ではナノ粒子やDDSにおける研究も行っており、細胞内に取り込まれた後に低pH環境である細胞内器官において薬物放出をするナノ粒子やリポソーム表面に修飾することによって低pH環境であるがん細胞付近で崩壊するリポソームなどへの応用も考えられる。【０１９７】
５． LAT1標的ポリマーにおける細胞評価
５−１．試薬及び装置
試薬
RAW 264.7培養細胞株: 理化学研究所
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
HEK 293培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株
式会社Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
PierceTMBCA Assay Kit: Thermo Fisher Scientific Inc.
Sodium Lauryl Sulfate: Nacalai tesque
β-mercaptoethanol: SIGMA-ALDRICH
Glycine: Nacalai tesque
Glycerol: Nacalai tesque
HCl: Nacalai tesque
NaCl: Nacalai tesque
TritonX-100: 関東化学
Tween 20: SIGMA ALDRICH
Bromophenol Blue: 関東化学
Mini-PROTEIN(R)TGX Precast Gels 10% 15mL/well: D.R.C.
SpectraTMMulticolor Broad Range Protein Ladder: Thermo Fisher Scientific Inc.
MeOH: Nacalai tesque
Immobilon-P (PVDF Pore size 0.45mm): MILLIPORE
CHROMATOGRAPHY PAPER Grade: 3MM CHR: GE Healthcare
Extra Thick Blot Paper: BIO-RAD
スキムミルク: 雪印
Anti human L-type amino acid transpoter 1 (LAT1) polyclonal antibody rabbit: 株式会社トランスジェニック
Anti beta-actin antibody rabbit: SIGMA ALDRICH
ECL anti-rabbit IgG, HRP-Linked Whole Antibody: GE Healthcare
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent: GE Healthcare
Alexa Fluor(R) 594-labeled donkey anti-rabbit IgG antibodies: Invitrogen
FluoromountTM水性マウンティング媒体: SIGMA-ALDRICH
VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI: Vector Labolatories
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
Albumin, from Human Serum: SIGMA-ALDRICH
L-Leucine, [4,5-3H]:Moravek Biochemicals, Inc.
2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH): SIGMA-ALDRICH
NaCl: 和光純薬株式会社
KCl: 和光純薬株式会社
(+)-Glucose: 和光純薬株式会社
CaCl2: 和光純薬株式会社
KH2PO4: 和光純薬株式会社
MgSO4: 和光純薬株式会社
HEPES: 同仁化学研究所
1N NaOH: 和光純薬株式会社
5N HCl: 和光純薬株式会社
Clear-solＩ: Nacalai tesque【０１９８】
装置
Infinite M1000; テカンジャパン株式会社
NEO SHAKER NS-LR
電気泳動装置 BE-280
電源装置 POWER PAC 200
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell
Image Quant LAS 4000
Water bath; TAITEC
ホットプレート: Fast Gene, Dry Bath Incubator
Liquid scintillation analyzer TRL-CARB 317TR/SL: Packard
BIOREVO BZ-9000: 株式会社キーエンス【０１９９】
５−２．実験項
５−２−１．細胞の培養
RAW 264.7細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）を添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はセルスクレーパーで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間固定化した。【０２００】
HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。
HEK 293細胞は10% FBS、50 units/mL penicillin及び50 mg/mL streptomycin、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で3-5日間培養した。【０２０１】
５−２−２．Western Blot Analysis
RAW 264.7細胞、HeLa細胞及びHEK 293細胞は回収後、Lysis buffer (1M Tris-HCl、5N NaCl、500nM EDTA、20%TritonX-100、complete mini-EDTA-free) で溶解する。超音波破砕をし、氷中に10 minおいた後、16,000×g、4℃、10 minで遠心し、上清を回収した。PierceTM BCA Assay Kitを用いてBCA法でタンパク定量を行い、560 nmのフィルターで測定した。結果をもとに細胞溶解液をLysis bufferで薄め。次いでSDSサンプルbuffer (sodium dodecyl sulfate、2-mercaptoethanol、1M Tris-HCl) を加え98℃で5 min 加熱し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。タンパク質分離後、PVDF転写膜に転写した。一次抗体として抗ヒトL型アミノ酸トランスポーター (hLAT1) ポリクローナル抗体 (1/500) または抗βアクチン抗体(1/1000) を90min作用させ、TBST buffer (Tris-HCl、Tween20、5N NaCl、H2O) で洗浄した。次いで二次抗体として抗ウサギIgG、HRP-Linked全抗体(1/10000) を60min作用させた。TBST及びTBSで洗浄後、ECL Prime に浸し、Image Quant LAS 4000で観察した。【０２０２】
５−２−３． 免疫蛍光染色
HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System (2.5×104cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。血清入り培地を除去し、ウェル内をPBSで一回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで30 min固定化した。PBSで洗浄後、冷MeOHで-20℃、30 min浸透処理を行った。次いでブロッキングとして1%HAS含有PBS中で30 minインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。一次抗体として抗ヒトL型アミノ酸トランスポーター (LAT1) ポリクローナル抗体 (1/100) を4℃、overnightでインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。次いで二次抗体としてAlexa Fluor(R) 594修飾抗ウサギIgG抗体 (1/1000) を室温で60minインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。スライドガラスにVECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを滴下し、蛍光顕微鏡で観察した。【０２０３】
５−２−４．L- [3H] leucine細胞内取り込みの阻害効果
HeLa細胞はマルチウェルプレート(2.5×104 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。37℃に設定したホットプレート上にプレートを乗せ、血清入り培地を除去し、温buffer (125mM NaCl, 4.8mM KCl, 5.6mM (+)-Glucose, 1.2mM CaCl2・2H2O, 1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4, 25mM HEPES) でウェル内を洗浄し、10 min プレインキュベートした。Bufferを吸引しsampleを加え、取り込み時間終了後、ウェルからsampleを除去し、冷bufferでウェル内を洗浄した。1% Triton X/1N NaOHを加え、冷蔵庫で一晩放置した。翌日、1N HClを加えた後、Clear-sol Ｉの入ったvialに加え、液体シンチレーションカウンターで測定した。Sample; L-[3H] leucine: 2, 5, 10 min, L-[3H] leucine + 2mM BCH: 10 min, L-[3H] leucine: 2, 10 min.【０２０４】
５−２−５．蛍光顕微鏡における観察
HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System 4well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。37℃で60 min 放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを用いて封入し、蛍光顕
微鏡による観察を行った。【０２０５】
５−３． 結果・考察
５−３−１．Western Blot Analysis
RAW 264.7細胞、HeLa細胞及びHEK 293細胞を用いてWestern Blot Analysisを行い、ヒトL型アミノ酸トランスポーター (hLAT1) の発現を調べた。HeLa細胞においては抗hLAT1 ポリクローナル抗体のバンドが38-kDaに観察された。125-kDaに観察されたバンドは2-mercaptoethanolによるジスルフィド結合の還元不足により検出されたLAT1と4F2hcの二量体と考えられる。また、RAW 264.7細胞、HEK 293細胞においてはバンドが観察されなかった。HEK 293細胞についてはHeLa細胞よりもhLAT1の発現量が少ないためと考えられるが、RAW 264.7細胞についてはマウス由来の細胞であるため、マウスL型アミノ酸トランスポーター (mLat1) が発現していたとしても今回用いた抗体によって認識されなかった可能性が考えられる。【０２０６】
５−３−２．免疫蛍光染色
HeLa細胞のLAT1を免疫染色し、核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った。蛍光顕微鏡で観察を行ったところ、LAT1は細胞膜上に観察された。さらに、抗4F2hc抗体を用いて発現部位を観察することによって、細胞表面アミノ酸トランスポーターとしてLAT1と4F2hcが二量体を形成し、機能していることが確認できる。【０２０７】
５−３−３．LAT1標的ポリマーのL- [3H] leucine細胞内取り込み阻害効果
HeLa細胞においてLAT1経由で取り込まれるL- [3H]-leucine量に対するポリマーの作用について検討するために、L- [3H] -leucine細胞内取り込み量をLAT1阻害剤として知られるBCH及びLAT1標的ポリマーであるL-Phe5%の存在下において測定した。10 min における取り込み結果より、L-[3H]-leucine細胞内取り込み量はL-Phe5%によって有意に阻害されることが確認され、作製したL-Phe5%はLAT1を認識する可能性が示唆された今後、LAT1標的設計していないポリマーを用いて細胞内取り込み量を測定し比較することによって、よりその効果が確かなものとなると考えられる。【０２０８】
５−３−４．蛍光顕微鏡における観察
蛍光ポリマーの細胞における作用部位を確認するため、HeLa細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃で60 min 放置し、核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った. 蛍光顕微鏡において観察したところ、L-Phe5%-FL (緑) は細胞表面において蛍光が確認された。しかし、3.4.3.2.項の結果と比較するとその局在が異なるように見えるため、洗い等の実験操作について条件検討を行う必要がある。LAT1に対する物質の結合力は、LAT1結合部位と物質のα-アミノ基の正電荷及びα-カルボキシル基の負電荷との相互作用に依存する。しかし、阻害定数 (Ki) が低値であっても側鎖との疎水性相互作用が十分に強い時には高い親和性
を示すことが知られている。今回作製したL-Phe5%-FLはN-acryloyl-L-phenylalanine-OMeを導入し細胞内に取り込まれたポリマーとは異なり、α-カルボキシル基が存在することによってLAT1選択性が高いと考えられる。今後、α-アミノ基が存在するポリマーやその他の認識部位も持つようなポリマーなど分子設計を検討し、よりLAT1認識能の強いポリマーを作製し比較する必要もある。また、Brasilicardin Aの報告にもあるように、本ポリマーの側鎖の分子量から検討してもLAT1によって細胞内に取り込まれるのではなく、阻害効果を示すと考えられる。本ポリマーは、その分子設計によってLAT1との相互作用を調節できる可能性が示唆される。【０２０９】
結語
・三元ポリマーの開発
作製した三元ポリマーはLCSTを病態細胞内温度の37℃付近に制御した。
RAW264.7細胞およびHeLa細胞、共にLCSTを境に温度制御による細胞取り込みが見られた。
アミノ酸誘導体を用いることでも温度による細胞取り込み制御が可能であり、より生体にとって分子認識能の高い新規温度応答性蛍光ポリマーの設計に繋がる結果となった。【０２１０】
・pH応答性蛍光ポリマーの開発
がん細胞と正常細胞を識別するために最適なpHを有していた。
HeLa細胞においてpH制御による細胞取り込みが見られた。【０２１１】
・がん細胞標的化温度応答性蛍光ポリマーの開発
作製したポリマーは三元ポリマーとは異なり、LCST以下でも細胞に認識された。【０２１２】
LCST以下において、両細胞共に、三元ポリマーでのアミノ酸誘導体ユニットであるN-acryloyl-L-Phenylalanine-OMeは認識しなかったが、新たに作製したポリマーのN-acryloyl-L-Phenylalanineユニットは認識されたことからアミノ酸トランスポーターの基質選択性が高まった。
【実施例２】
【０２１３】
市販の細胞培養器材に癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０を培養した（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）。３日後、培養基材上の癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０がコンフルエントになったことを確認した後、通常のトリプシン処理することで個々の癌細胞を得た。癌細胞数５×１０５個を１０頭のヌードマウスの背部皮下に移植した。生体内で癌組織を増殖させた後、その担癌動物から患部から癌組織を切除し、（１）癌組織そのものへ直接、本発明のＬ−Ｐｈｅ５％−ＦＬを作用させること、（２）癌組織から常法によって癌細胞を得て、その後、培養（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）することで得た癌細胞へ本発明のＬ−Ｐｈｅ５％−ＦＬを作用させることを行った。その結果、いずれの方法においても本発明の蛍光プローブが細胞に取り込まれ、蛍光顕微鏡下で観察できることが分かった。
【実施例３】
【０２１４】
細胞培養器材に温度応答性ポリマーであるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を２．０μｇ／ｃｍ２被覆し、癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０を培養した（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）。３日後、培養基材上の癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０がコンフルエントになったことを確認した後、アクリル板にフィブリンゲルを塗布した培養細胞移動治具を培養細胞シート上に静置させ培養癌細胞を接着して、細胞培養基材を２０℃下で６０分間冷却した。冷却後、剥離させた細胞シートはフィブリンゲルと共に冶具から採取し、細胞シートの付着したゲル（７ｍｍ×１７ｍｍ×２ｍｍ、細胞数５×１０５個）を１０頭のヌードマウスの背部皮下に移植した。生体内で癌組織を増殖させた後、その担癌動物から患部から癌組織を切除し、（１）癌組織そのものへ直接、本発明のＬ−Ｐｈｅ５％−ＦＬを作用させること、（２）癌組織から常法によって癌細胞を得て、その後、培養（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）することで得た癌細胞へ本発明のＬ−Ｐｈｅ５％−ＦＬを作用させることを行った。その結果、いずれの方法においても本発明の蛍光プローブが細胞に取り込まれ、蛍光顕微鏡下で観察できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明によれば、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供することが可能であり、本発明により作製したポリマーは温度やｐＨによる細胞取り込みの制御が可能である。したがって、本発明は細胞環境の物理化学的変化を追跡する蛍光イメージング技術等しての応用が期待され、医学、生物学分野など広範囲の技術分野において産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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