(57)【要約】  本発明は、新規テルペノイド合成酵素遺伝子、当該新規テルペノイド合成酵素遺伝子を宿主細胞へ導入して形質転換体を得、形質転換体を培養することを含むテルペノイド化合物の製造方法、ならびに新規テルペノイド化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を導入し、該宿主細胞を培養することを特徴とする、テルペノイド化合物の製造方法。
【請求項２】
宿主細胞に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号５８、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号５９、配列番号２５、配列番号６０、配列番号２７、配列番号６１、配列番号２９、配列番号６２、配列番号３１、配列番号６３、配列番号３３、配列番号６４、配列番号３５、配列番号６５、および配列番号９２からなる群から選択される遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子を導入し、該宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項３】
宿主細胞に：
（１）配列番号３９のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；および
（２）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１または２に記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項４】
宿主細胞に：
（１）配列番号３８の遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；および
（２）配列番号１の遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項５】
宿主細胞に：
（１）配列番号４１のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；および
（２）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１または２に記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項６】
宿主細胞に：
（１）配列番号４０の遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；および
（２）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号５８、配列番号２７、配列番号６１、配列番号２９、配列番号６２、配列番号３１、配列番号６３、配列番号３３、配列番号６４、配列番号３５、配列番号６５、および配列番号９２からなる群から選択される遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１、２および５のいずれか１つに記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項７】
宿主細胞に：
（１）配列番号４３のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；および
（２）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１または２に記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項８】
宿主細胞に：
（１）配列番号４２の遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；および
（２）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号５９、配列番号２５、および配列番号６０からなる群から選択される遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子
を導入することを特徴とする、請求項１、２および７のいずれか１つに記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項９】
該宿主細胞にｒｐｓＪ（配列番号３７）をさらに導入することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項１０】
該宿主細胞がストレプトミセス属細菌、大腸菌、またはそれらの変異体であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載のテルペノイド化合物の製造方法。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号５８、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号５９、配列番号２５、配列番号６０、配列番号２７、配列番号６１、配列番号２９、配列番号６２、配列番号３１、配列番号６３、配列番号３３、配列番号６４、配列番号３５、配列番号６５、および配列番号９２からなる群から選択される遺伝子と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項１４】
【化１】
2015022798.tif 000207
【化２】
2015022798.tif 000208
【化３】
2015022798.tif 000209
【化４】
2015022798.tif 000210
【化５】
2015022798.tif 000211
【化６】
2015022798.tif 000212
【化７】
2015022798.tif 000213
【化８】
2015022798.tif 000214
【化９】
2015022798.tif 000215
からなる群から選択される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規テルペノイド化合物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノテルペン類、セスキテルペン類およびジテルペン類を含むテルペノイド代謝産物は、植物、苔類、および真菌類に存在し、また、相対的には少ないが原核生物にも存在する。テルペノイド代謝産物には、メントール、カンフル、アルテミシニンおよびタキソール等の、医薬や香料等およびそれらの原料として産業上有用なものが多数存在するものの、その大量生産はコストや労力の点から困難な場合が多い。近年、遺伝子組み換え微生物を利用したバイオテクノロジーによるテルペノイドの生産が研究されてきた。【０００３】
テルペノイドの生合成では、メバロン酸を生合成中間体とする「メバロン酸経路」またはメバロン酸が関与しない「非メバロン酸経路」を経て、イソペンテニル二リン酸（以後ＩＰＰと記載）およびジメチルアリル二リン酸（以後ＤＭＡＰＰと記載）が合成され、ＤＭＡＰＰに１個のＩＰＰが縮合して炭素数１０のゲラニル二リン酸（以後ＧＰＰと記載）が合成され、ＤＭＡＰＰに２個のＩＰＰが縮合して炭素数１５のファルネシル二リン酸（以下ＦＰＰと記載）が合成され、ＤＭＡＰＰに３個のＩＰＰが縮合して炭素数２０のゲラニルゲラニル二リン酸（以後ＧＧＰＰと記載）が合成され、テルペノイド合成酵素による触媒反応を介して、ＧＰＰ、ＦＰＰ、およびＧＧＰＰから、それぞれモノテルペノイド、セスキテルペノイド、およびジテルペノイドが合成される。
【化１】
2015022798.tif 000002
【０００４】
植物、真菌、および細菌由来のテルペノイド合成酵素についての研究結果から、これらの生物体由来のテルペノイド合成酵素は概して、下記の２つの高度保存金属結合モチーフ：酸性アミノ酸リッチモチーフ、−ＤＤｘｘ［ＤＥ］−または−ＤＤｘｘｘ［ＤＥ］−；およびそれより下流にあるトライアッドモチーフ、−［ＮＤ］Ｄｘｘ［ＳＴ］ｘｘ［ＫＲ］［ＤＥ］−を有することが知られている（非特許文献１）。これら２つのモチーフは、テルペノイドの生合成における環化カスケードを引き起こすために重要な、前駆体（ＧＰＰまたはＦＰＰ）の活性化に関与することが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。
上記の２つの高度保存金属結合モチーフに関して、細菌データベースからの隠れマルコフモデルおよびＰｆａｍサーチに基づくサーチ方法（非特許文献４）に基づいたバイオインフォマティクスにより、推定テルペノイド合成酵素の配列を得ることによって、２−メチルイソボルネオール（モノテルペン類）生成酵素が発見された（非特許文献５、非特許文献６）。【０００５】
テルペノイド合成酵素遺伝子候補を放線菌へ導入して評価する方法が研究されている（非特許文献７）。
たとえば、駆虫剤エバーメクチンの工業用産生株として汎用されている放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓは全ゲノムが解読されており、このＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓを遺伝子操作して得られた変異体（ＳＵＫＡシリーズ）が開発されている。この変異体は生育に必要な親Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの構成要素を合成し、かつ、生合成された最終生成物を輸送する能力を保持しているものの、内在性生合成遺伝子群の大部分（左テロメア周辺領域の１．５Ｍｂ）が削除されているため、生合成関連遺伝子の機能を評価するのに適している（非特許文献５、非特許文献８）。【０００６】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を遺伝子操作して、テルペノイド化合物を効率的に製造する方法も研究されている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。【０００７】
ＧＰＰ、ＦＰＰ、またはＧＧＰＰを合成するテルペノイド前駆体合成酵素の遺伝子を、対応するテルペノイド合成酵素遺伝子と共発現させることで、テルペノイド化合物の生産性が向上することが知られている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Felicetti, B. and Cane, D. E. (2004). Aristolochene synthase： Mechanistic analysis of active site residues by site-directed mutagenesis. J. Am. Chem. Soc., 126, 7212-7221.
【非特許文献２】Christianson, D.W. (2006). Structural biology and chemistry of the terpenoid cyclases. Chem. Rev., 106, 3412-3442
【非特許文献３】Christianson, D.W. (2008). Unearthing the roots of the terpenome, Curr. Opin. Chem. Biol., 12, 141-150.
【非特許文献４】Finn, R.D., Mistry, J., Tate, J., Coggill, P., Heger, A., Pollington, J.E., Gavin, O.L., Gunasekaran, P., Ceric, G., Forslund, K., Holm, L., Sonnhammer, E.L., Eddy, S.R. and Bateman, A. (2010).  The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res., 38, D211-222.
【非特許文献５】Komatsu, M., Tsuda, M., Omura, S., Oikawa, H. and Ikeda, H. (2008). Identification and functional analysis of genes controlling biosynthesis of 2-methylisoborneol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 7422-7427.
【非特許文献６】Giglio, S., Chou, W.K., Ikeda, H., Cane, D.E. and Monis, P.T. (2011). Biosynthesis of 2-methylisoborneol in cyanobacteria. Environ. Sci. Technol., 45, 992-998.
【非特許文献７】Yamada et al. Methods in Enzymology Vol. 515, pp123-162, 2012.
【非特許文献８】Komatsu, M., Uchiyama, T., Omura, S., Cane, D.E. and Ikeda, H. (2010). Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 2646-2651.
【非特許文献９】Harada, H., Yu, F., Okamoto, S., Kuzuyama, T., Utsumi, R., and Misawa, N. (2009) Efficient synthesis of functional isoprenoids from acetoacetate through metabolic pathway-engineered Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 81, 915-925
【非特許文献１０】Hu, Y., Chou, W.K.W., Hopson, R. and Cane, D.E. (2011). Genome mining in Streptomyces clavuligerus： Expression and biochemical characterization of two new cryptic sesquiterpene synthases. Chem. Biol., 18, 32-37.
【非特許文献１１】Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D. and Keasling, J.D. (2003). Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids, Nat. Biotechnol., 21, 796-802.
【非特許文献１２】Chou, WKW et al. J. Am. Chem. Soc. 132, 8850-8851, 2010.
【非特許文献１３】Ikeda, H.; Takada, Y.; Pang, C. H.; Tanaka, H.; Omura, S. J. Bacteriol. 1993, 175, 2077-2082.
【非特許文献１４】Alexeyev, MF et al. Gene 160, 63-67, 1995.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規テルペノイド合成酵素遺伝子、およびそれを利用したテルペノイド化合物の製造方法、ならびに新規テルペノイド化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく検討した結果、新規テルペノイド合成酵素遺伝子を同定することに成功した。【００１１】
具体的には、本発明は、下記の遺伝子を提供する：
モノテルペノイド合成酵素遺伝子：ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２（配列番号１）；
セスキテルペノイド合成酵素遺伝子：ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５（配列番号３）、ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７（配列番号５）、ｓｇｒ＿６０６５（配列番号７）、ｓｖｅｎ＿０５５２（配列番号９）、ｓｋ＿３０５１（配列番号１１）、ｓｌｔ＿１７１８（配列番号１３）、ｍｍａｒ＿３２２０（配列番号１５）、ｍｍａｒ＿３２２０Ａ（配列番号５８）、ｈａｕｒ＿２９８８（配列番号２７）、ｈａｕｒ＿２９８８Ａ（配列番号６１）、ｒｃａｓ＿０６２２（配列番号２９）、ｒｃａｓ＿０６２２Ａ（配列番号６２）、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９（配列番号３１）、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ（配列番号６３）、ｓｃｅ６３６９（配列番号３３）、ｓｃｅ６３６９Ａ（配列番号６４）、ｓｃｅ８５５２（配列番号３５）、ｓｃｅ８５５２Ａ（配列番号６５）、およびｓｌｔ＿１８８０（配列番号９２）；
ジテルペノイド合成酵素遺伝子：ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５（配列番号１７）、ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９（配列番号１９）、ｓｌｔ＿１０７８（配列番号２１）、ｒｘｙｌ＿０４９３（配列番号２３）、ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ（配列番号５９）、ｈａｕｒ＿２９８７（配列番号２５）、およびｈａｕｒ＿２９８７Ａ（配列番号６０）。
上記遺伝子とは配列は異なるが、コードするアミノ酸が同じである配列も本願発明のテルペノイド合成酵素遺伝子に含まれる。
さらに、上記の遺伝子と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子も、本願発明のテルペノイド合成酵素遺伝子に含まれる。【００１２】
本発明は、上記のテルペノイド合成酵素遺伝子によりコードされる以下のアミノ酸配列を提供する：
モノテルペノイド合成酵素タンパク質：配列番号２；
セスキテルペノイド合成酵素タンパク質：配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３；
ジテルペノイド合成酵素タンパク質：配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６。【００１３】
さらに本発明は、上記のテルペノイド合成酵素遺伝子を宿主細胞へ導入して形質転換体を得、当該形質転換体を培養することによって目的のテルペノイド化合物を得ることを特徴とする、テルペノイド化合物の製造方法を提供する。【００１４】
本発明の製造方法において、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子をテルペノイド合成酵素遺伝子と共に同一の宿主細胞に導入した形質転換体を用いることで、テルペノイド化合物を効率的に製造することができる。あるいはテルペノイド合成酵素遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られたテルペノイド合成酵素、形質転換体、またはその培養液もしくは培養液処理物をテルペノイド前駆体（ＧＰＰ、ＦＰＰ、またはＧＧＰＰ）へ適用してもよい。【００１５】
本発明の方法に使用する宿主には限定はなく、目的の遺伝子を発現できる宿主細胞であれば使用することができる。例えば、細菌（放線菌、大腸菌など）、酵母、真菌、担子菌、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを使用できる。【００１６】
本発明はまた、本発明の方法により製造される下記新規テルペノイドを提供する：
【化２】
2015022798.tif 000003
【化３】
2015022798.tif 000004
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【発明の効果】
【００１７】
本発明にかかる遺伝子は、種々のテルペノイド化合物の生合成に有用である。
本願発明によれば、種々のテルペノイド化合物を高い生産性でもって効率的に製造することができる。
さらに、本発明にかかる新規テルペノイド化合物は、医薬品（例えば、卵巣癌、白血病、結核、ハンセン病などを治療する医薬品）、医薬品原料、抗菌剤またはその原料、香料、および香料原料として使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＳＵＫＡ株およびｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析（Ａ）：上清、（Ｂ）：菌体
【図２】ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル
【図３】ＳＵＫＡ株およびｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図４】ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その１）
【図５】ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その２）
【図６】ＳＵＫＡ株およびｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図７】ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル
【図８】ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７：ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図９】ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７ ：ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図１０】ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７ ：ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図１１】ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７ ：ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図１２】ＳＵＫＡ株およびｓｇｒ６０６５導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図１３】ｓｇｒ６０６５形質転換体が生産する化合物および既知化合物のマススペクトル（その１）
【図１４】ｓｇｒ６０６５形質転換体が生産する化合物および既知化合物のマススペクトル（その２）
【図１５】ＳＵＫＡ株およびｓｖｅｎ＿０５５２導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図１６】ｓｖｅｎ＿０５５２形質転換体が生産する化合物および既知化合物のマススペクトル
【図１７】ＳＵＫＡ株およびｓｋ＿３０５１導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図１８】ｓｋ＿３０５１形質転換体が生産した化合物および既知化合物のマススペクトル  （その１）
【図１９】ｓｋ＿３０５１形質転換体が生産した化合物および既知化合物のマススペクトル  （その２）
【図２０】ＳＵＫＡ株およびｓｌｔ＿１７１８導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図２１】ｓｌｔ＿１７１８形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その１）
【図２２】ｓｌｔ＿１７１８形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その２）
【図２３】ｓｌｔ＿１７１８形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その３）
【図２４】ｓｌｔ＿１７１８形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その４）
【図２５】ＳＵＫＡ株およびｍｍａｒ＿−３２２０Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図２６】ｍｍａｒ＿０３２２０Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その１）
【図２７】ｍｍａｒ＿０３２２０Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その２）
【図２８】ＳＵＫＡ株およびｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図２９】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５形質転換体が生産したテルペン化合物のマススペクトル
【図３０】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図３１】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図３２】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図３３】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図３４】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図３５】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図３６】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図３７】ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５：ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図３８】ＳＵＫＡ株およびｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図３９】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９形質転換体が生産したテルペン化合物のマススペクトル
【図４０】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図４１】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図４２】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図４３】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図４４】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）の1Ｈ−1Ｈ  ＮＯＥＳＹスペクトル
【図４５】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図４６】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図４７】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図４８】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図４９】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）の1Ｈ−1Ｈ  ＮＯＥＳＹスペクトル
【図５０】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンの1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図５１】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンの1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図５２】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図５３】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図５４】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンの1Ｈ−1Ｈ  ＮＯＥＳＹスペクトル
【図５５】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢの1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図５６】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢの1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図５７】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図５８】ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９：ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図５９】ＳＵＫＡ株およびslt_1078導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図６０】ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物：シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンの1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図６１】ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物：シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンの1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図６２】ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物：シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図６３】ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物：シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンの1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図６４】ＳＵＫＡ株およびｒｘｙｌ＿０４９３Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図６５】ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物のマススペクトル
【図６６】ＳＵＫＡ株およびｈａｕｒ＿２９８７Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図６７】ｈａｕｒ＿２９８７Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物のマススペクトル
【図６８】ＳＵＫＡ株およびｈａｕｒ＿２９８８Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図６９】ｈａｕｒ＿２９８８Ａ形質転換体が生産するテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル
【図７０】ＳＵＫＡ株およびｒｃａｓ＿０６２２Ａ導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図７１】ｒｃａｓ＿０６２２Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および（＋）−Ｔ−ムウロロールのマススペクトル
【図７２】ＳＵＫＡ株およびｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図７３】ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および（＋）−Ｔ−ムウロロールのマススペクトル
【図７４】ＳＵＫＡ株およびｓｃｅ６３６９Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図７５】ｓｃｅ６３６９Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その１）
【図７６】ｓｃｅ６３６９Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物および既知化合物のマススペクトル（その２）
【図７７】ＳＵＫＡ株およびｓｃｅ８５５２Ａ導入株のヘキサン抽出液のＧＣ−ＭＳ解析
【図７８】ｓｃｅ８５５２Ａ形質転換体が生産したテルペン化合物およびエレモフィレンのマススペクトル
【図７９】ＳＵＫＡ株およびｓｌｔ＿１８８０導入株のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ解析
【図８０】ｓｌｔ＿１８８０：ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物の1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ
【図８１】ｓｌｔ＿１８８０：ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物の1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル
【図８２】ｓｌｔ＿１８８０：ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＱＣスペクトル
【図８３】ｓｌｔ＿１８８０：ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物の1Ｈ−13Ｃ  ＨＭＢＣスペクトル
【図８４】ベクターの模式図
【００１９】
本発明において、テルペノイド合成酵素とは、テルペノイド化合物を対応するテルペノイド前駆体から合成することができる酵素を意味し、モノテルペノイド合成酵素、セスキテルペノイド合成酵素、およびジテルペノイド合成酵素の総称として使用する。
モノテルペノイド合成酵素、セスキテルペノイド合成酵素、およびジテルペノイド合成酵素は、モノテルペノイド化合物、セスキテルペノイド化合物、およびジテルペノイド化合物をそれぞれ対応するテルペノイド前駆体：ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、およびゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から、合成することができる。【００２０】
本発明において、テルペノイド合成酵素遺伝子とは、テルペノイド合成酵素をコードする遺伝子を意味し、モノテルペノイド合成酵素遺伝子、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子、およびジテルペノイド合成酵素遺伝子の総称として使用する。
モノテルペノイド合成酵素遺伝子、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子、およびジテルペノイド合成酵素遺伝子はそれぞれ、モノテルペノイド合成酵素、セスキテルペノイド合成酵素、ジテルペノイド合成酵素をコードする遺伝子を意味する。【００２１】
宿主細胞
本発明の方法に使用する宿主には限定はなく、目的の遺伝子を発現できる宿主細胞であれば使用することができる。好ましい宿主の例は、放線菌（例えば、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）細菌）およびその変異体、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその変異体である。
宿主細胞は、テルペノイド前駆体の原料となるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を持っているものが好ましい。放線菌の多くは元々テルペノイド化合物を合成することができるため、テルペノイド化合物の合成に必要な機能を有しており、本願発明において好ましい宿主細胞である。遺伝子組み換え技術によりテルペノイド合成に適した大腸菌の変異体が開発されており（非特許文献１１）、このような大腸菌の変異体は本発明の宿主として好ましい。【００２２】
さらに好ましい宿主細胞の例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびその変異体である。本願発明におけるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの変異体の好ましい例には、Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの内在性生合成遺伝子群の大部分を削除して得られるＳＵＫＡシリーズ（例えばＳＵＫＡ１〜１７（非特許文献８））が挙げられ、特に好ましい例としてＳＵＫＡ１７が挙げられるが、これらに限られない。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの野生株はエバーメクチン等のテルペノイド化合物を産生するため、目的テルペノイド化合物を得るには不要なテルペノイド化合物を分離・精製する必要が生じうる。ＳＵＫＡ１７は、テルペノイド合成酵素遺伝子を欠損しているため、テルペノイド化合物を産生しない。ＳＵＫＡ１７を使用することで不要なテルペノイド化合物を分離・精製することなく、目的のテルペノイド化合物を得ることができる。【００２３】
形質転換
本発明の方法において、宿主細胞への目的遺伝子の導入は、当業者に知られる遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。例えば、直接ＤＮＡ断片を導入する手法、接合伝達法、およびトランスポゾン、ファージベクターまたはウィルスベクターなどのベクターを利用した遺伝子導入が挙げられる。【００２４】
本発明の方法において、目的遺伝子が宿主細胞中、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれた状態で宿主細胞に保持されることによって、宿主細胞を形質転換することができる。好ましくは宿主細胞の染色体へ導入される。
本発明の方法において、宿主細胞への目的遺伝子の導入は、ベクターを用いることが好ましい。【００２５】
本発明の方法において、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクターは、自己複製型であっても、あるいは相同組換えを起こす組込み型であってもよく、特に限定されない。本発明の方法において、目的遺伝子が宿主細胞の染色体へ導入される場合には、その方法は特に限定されないが、例えば組込み型ベクターを使用する方法が挙げられる。
当該ベクターには、目的遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列、ならびに選択マーカーを含んでいることが望ましい。【００２６】
当該ベクターは、形質転換する宿主に応じて適切に選択され得る。例えば、宿主として放線菌を用いる場合は、放線菌で機能し得るベクターが選択され、宿主として大腸菌を用いる場合は、大腸菌で機能し得るベクターが選択される。【００２７】
本発明の方法において、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクターは、当業者に周知の方法によって作成することができる。例えば、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子および／またはテルペノイド合成酵素遺伝子を適切なプライマーを用いて増幅してその両端に制限酵素部位を設け、これらを該制限酵素で切断したベクターに挿入することによって得られる。当該ベクターに目的遺伝子発現のためのプロモーターを目的遺伝子の上流に組み込んだ発現カセットとしてもよい。
宿主細胞に上記ベクターを導入するには、当業者に周知の方法を用いることができ、塩化カルシウム法、プロトプラスト形質転換、接合伝達法、エレクトロポレーションなどの方法が挙げられる。【００２８】
宿主細胞がストレプトミセス属細菌である場合、例えば、染色体組み込み型ベクターｐＫＵ４６０（非特許文献５、非特許文献１２）を使用することができる。
染色体組み込み型ベクターｐＫＵ４６０の宿主細胞への導入は、公知の方法によって行うことができるが、好ましい例として、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換（非特許文献１３）および接合伝達法が挙げられる。【００２９】
プロモーター
本発明のテルペノイド化合物の製造方法において、目的遺伝子は、当該遺伝子の転写を調節することが可能なプロモーターの下流に連結して導入されることが好ましい。
本願発明におけるプロモーターとしては、宿主細胞中で目的遺伝子（テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子および／またはテルペノイド合成酵素遺伝子）の転写を調節できるものであればよく、特に限定されない。
宿主細胞がストレプトミセス属細菌である場合、プロモーターとして、Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来の構成的強発現プロモーターであるｒｐｓＪ（配列番号３７）（非特許文献５）が好ましい。
【表１】
2015022798.tif 000012
【００３０】
本発明の方法において、宿主細胞への目的遺伝子の導入には、プロモーター、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子および／またはテルペノイド合成酵素遺伝子を含む発現カセットとして導入されてもよい。
本発明の方法において、発現カセットとは、プロモーターおよび目的遺伝子を含む核酸構築物を意味し、ターミネーター配列、イントロン、スペーサー配列、エンハンサー配列等を含んでいてもよい。【００３１】
本発明のテルペノイド化合物の製造方法において、好ましい発現カセットの例としては：
モノテルペノイドの合成には：ｒｐｓＪ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２、ｒｐｓＪ−ｇｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２；
セスキテルペノイドの合成には：
ｒｐｓＪ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｒｐｓＪ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｒｐｓＪ−ｓｇｒ＿６０６５、ｒｐｓＪ−ｓｖｅｎ＿０５５２、ｒｐｓＪ−ｓｋ＿３０５１、ｒｐｓＪ−ｓｌｔ＿１７１８、ｒｐｓＪ−ｍｍａｒ＿３２２０、ｒｐｓＪ−ｍｍａｒ＿３２２０Ａ、ｒｐｓＪ−ｈａｕｒ＿２９８８、ｒｐｓＪ−ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｒｐｓＪ−ｒｃａｓ＿０６２２、ｒｐｓＪ−ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｒｐｓＪ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９、ｒｐｓＪ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｒｐｓＪ−ｓｃｅ６３６９、ｒｐｓＪ−ｓｃｅ６３６９Ａ、ｒｐｓＪ−ｓｃｅ８５５２、ｒｐｓＪ−ｓｃｅ８５５２Ａ、ｒｐｓＪ−ｓｌｔ＿１８８０、
ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｇｒ＿６０６５、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｖｅｎ＿０５５２、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｋ＿３０５１、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１７１８、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｍｍａｒ＿３２２０、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｍｍａｒ＿３２２０Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｈａｕｒ＿２９８８、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｃａｓ＿０６２２、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ６３６９、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ６３６９Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ８５５２、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ８５５２Ａ、ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１８８０；
ジテルペノイドの合成には：
ｒｐｓＪ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｒｐｓＪ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｒｐｓＪ−ｓｌｔ＿１０７８、ｒｐｓＪ−ｒｘｙｌ＿０４９３、ｒｐｓＪ−ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、ｒｐｓＪ−ｈａｕｒ＿２９８７、ｒｐｓＪ−ｈａｕｒ＿２９８７Ａ
ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｌｔ＿１０７８、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｒｘｙｌ＿０４９３、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｈａｕｒ＿２９８７、ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｈａｕｒ＿２９８７Ａ；
が挙げられる。【００３２】
上記発現カセット中、ｇｐｓ（配列番号３８）はゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子であり、ｆｐｓ（配列番号４０）はファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子であり、ｇｇｓ（配列番号４２）はゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子である。
【化１１】
2015022798.tif 000013
【００３３】
培養
形質転換体の培養条件は、宿主細胞の種類ならびに製造されるテルペノイドの種類に基づいて適宜選択することができる。
また、テルペノイドを合成するための培養であるか、あるいは、テルペノイド合成酵素を製造するための培養であるかの目的によって、培養条件は異なることもあり、当業者は公知技術に基づいて培養条件を適宜選択することができる。【００３４】
テルペノイドを合成するための培地としては、形質転換体を培養することによってテルペノイドが合成される培地であれば特に限定されない。形質転換体のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）および／またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能が低い場合には、培地にＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰへ変換する前駆物質（グリセルアルデヒド３リン酸から１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル ４二リン酸までのＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路中間体）を添加しておくことが好ましい。テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子を用いない場合には、対応する前駆体を生成するような化合物（ファルネソール）が培地に添加されることが望ましい。【００３５】
宿主細胞がストレプトミセス属細菌であるとき、好ましい培地の例として、最少培地（培地１Ｌ中、Ｌ−アスパラギン  ０．５ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4  ０．５ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ；およびグルコース  １０ｇを含む）のような無機塩合成培地やトリプトンソーヤブロス（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ社）のような栄養源豊富な培地が挙げられる。加えて、培地１Ｌ中、グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび酵母エキス２ｇを含む培地、および、培地１Ｌ中、グルコース５ｇ、脱脂大豆粉１５ｇおよび酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇを含む培地も挙げられる。【００３６】
テルペノイド合成酵素を製造するための培地としては、形質転換体を培養することによってテルペノイド合成酵素が製造される培地であれば特に限定されず、当業者は公知技術に基づいて適宜選択することができる。得られた菌体、培養液、菌体を破砕または溶菌等した培養液処理物、得られた培養液中の菌体を公知の方法によって精製して得られたテルペノイド合成酵素をテルペノイド前駆体に適用することによってテルペノイド化合物を製造することができる。【００３７】
形質転換体の培養は、振とう培養、連続培養等の通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養方法等により適宜選択すればよく、形質転換体が増殖し、かつ、テルペノイド合成酵素が産生される条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のｐＨは４から１０、好ましくは６から８であり、温度は宿主細胞の生育に適した温度を適宜選択する。培養時間は、テルペノイド化合物が合成されるか、またはテルペノイド合成酵素が産生されば特に制限はなく、通常は１日から２０日、このましくは３日から１４日培養する。【００３８】
テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子
本発明において、テルペノイド前駆体合成酵素は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）から、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を合成する酵素を意味し、ゲラニル二リン酸合成酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、およびゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の総称として使用する。【００３９】
本発明において、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）１個とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）１個から炭素数１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を合成する酵素をゲラニル二リン酸合成酵素と呼び、その遺伝子をゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子という。
本発明において、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）１個とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）２個から炭素数１５のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を合成する酵素をファルネシル二リン酸合成酵素と呼び、その遺伝子をファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子という。【００４０】
本願発明において、ジメチルアリル二リン酸１個（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）３個から炭素数２０のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を合成する酵素をゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素と呼び、その遺伝子をゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子という。【００４１】
本発明の方法において、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子をそれぞれ同一の宿主細胞に導入した形質転換体を用いることが好ましく、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子はそれぞれ別のプロモーターによって転写が制御されていてもよく、あるいは、同一のプロモーターによって双方が制御されていてもよい。【００４２】
ｒｐｓＪ（配列番号３７）は、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子のそれぞれ単独のプロモーターとして使用でき、また、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子の共通のプロモーターとしても使用することができる。ｒｐｓＪにテルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子の両方を連結する場合、テルペノイド前駆体合成酵素遺伝子とテルペノイド合成酵素遺伝子の連結の順序は限定されない。【００４３】
本発明の方法において、ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子は、モノテルペノイド合成酵素遺伝子と共に使用される。
好ましいゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子は、表２に示すアミノ酸配列（配列番号３９）からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、更に好ましくは表２に示すｇｐｓ（配列番号３８）である。【００４４】
本発明のゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子には、表２に示すアミノ酸配列（配列番号３９）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれ、例えば、ｇｐｓ（配列番号３８）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【表２】
2015022798.tif 000014
【００４５】
本発明の方法において、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子は、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子と共に使用される。
好ましいファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子は、表３に示すアミノ酸配列（配列番号４１）からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、更に好ましくは表３に示すｆｐｓ（配列番号４０）である。【００４６】
本発明のファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子には、表３に示すアミノ酸配列（配列番号４１）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれ、例えば、ｆｐｓ（配列番号４０）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【表３】
2015022798.tif 000015
【００４７】
本発明の方法において、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子は、ジテルペノイド合成酵素遺伝子と共に使用される。
好ましいゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子は、表４に示すアミノ酸配列（配列番号４３）からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、更に好ましくは表４に示すｇｇｓ（配列番号４２）である。【００４８】
本発明のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子には、表４に示すアミノ酸配列（配列番号４３）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれ、たとえば、ｇｇｓ（配列番号４２）と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子も含まれる。
【表４】
2015022798.tif 000016
【００４９】
テルペノイド合成酵素遺伝子および生成テルペノイド化合物
表５〜２２および表Ａに、本発明のテルペノイド化合物の製造方法における、好ましいモノテルペノイド合成酵素遺伝子、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子、およびジテルペノイド合成酵素遺伝子を示す。【００５０】
これらテルペノイド合成酵素遺伝子によりコードされるアミノ酸配列も各表に記載する。これらのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子もまた本発明のテルペノイド化合物の製造方法において、使用することができ、本発明の範囲に含まれる。【００５１】
本発明において、モノテルペノイド合成酵素遺伝子、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子、ジテルペノイド合成酵素遺伝子は、宿主細胞での発現に適したコドンに最適化する場合もあり、当該コドンを最適化した遺伝子も本発明の範囲に含まれる。【００５２】
本発明のテルペノイド合成酵素遺伝子には、表５〜２２および表Ａに記載されるモノテルペノイド合成酵素遺伝子、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子、およびジテルペノイド合成酵素遺伝子の各塩基配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子も含まれ、当該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列も本願発明の範囲に含まれる。【００５３】
さらに、表５〜２２および表Ａにそれぞれ記載される各テルペノイド合成酵素遺伝子を用いて製造されるテルペノイド化合物も記載される。【００５４】
１−１．モノテルペノイド合成酵素遺伝子
１−１−１．ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来）
【表５】
2015022798.tif 000017
【００５５】
生成テルペノイド化合物
（１）カンフェン
【化１２】
2015022798.tif 000018
（２）β−ピネン
【化１３】
2015022798.tif 000019
（３）１，８−シネオール
【化１４】
2015022798.tif 000020
【００５６】
１−２．セスキテルペノイド合成酵素遺伝子（Ｉ）
１−２−１．ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来）
【表６】
2015022798.tif 000021
【００５７】
生成テルペノイド化合物
（１）アフリカン−２−エン（ａｆｒｉｃａｎ−２−ｅｎｅ）
【化１５】
2015022798.tif 000022
（２）アフリカン−１−エン（ａｆｒｉｃａｎ−１−ｅｎｅ）
【化１６】
2015022798.tif 000023
（３）α−グルジュネン（α−ｇｕｒｊｕｎｅｎｅ）
【化１７】
2015022798.tif 000024
（４）α−フムレン（α−ｈｕｍｕｌｅｎｅ）
【化１８】
2015022798.tif 000025
（５）β−カリオフィレン（β−ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ）
【化１９】
2015022798.tif 000026
【００５８】
１−２−２．ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来）
【表７】
2015022798.tif 000027
【００５９】
生成テルペノイド化合物
（１）１，３，６−トリメチル−２−メチレン−トリシクロ［５．４．０．０３，９］ウンデカン
【化２０】
2015022798.tif 000028
（２）ラクタン−１−エン
【化２１】
2015022798.tif 000029
【００６０】
１−２−３．ｓｇｒ＿６０６５  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ  １３３５０由来）
【表８】
2015022798.tif 000030
【００６１】
生成テルペノイド化合物
（１）α−コパエン（α−ｃｏｐａｅｎｅ）
【化２２】
2015022798.tif 000031
（２）カラレン（ｃａｌａｒｅｎｅ）
【化２３】
2015022798.tif 000032
（３）α−ムロレン（α−ｍｕｒｏｌｅｎｅ）
【化２４】
2015022798.tif 000033
（４）カジナ−１（１０），４−ジエン（ｃａｄｉｎａ−１（１０），４−ｄｉｅｎｅ）
【化２５】
2015022798.tif 000034
（５）カジナ−１，４−ジエン（ｃａｄｉｎａ−１，４−ｄｉｅｎｅ）
【化２６】
2015022798.tif 000035
（６）エピキュベノール（ｅｐｉｃｕｂｅｎｏｌ）
【化２７】
2015022798.tif 000036
【００６２】
１−２−４．ｓｖｅｎ＿０５５２  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＡＴＣＣ  １０７１２由来）
【表９】
2015022798.tif 000037
【００６３】
生成テルペノイド化合物
（１）α−カミグレン（α−ｃｈａｍｉｇｒｅｎｅ）
【化２８】
2015022798.tif 000038
（２）ダウカ−８，１１−ジエン（ｄａｕｃａ−８，１１−ｄｉｅｎｅ）
【化２９】
2015022798.tif 000039
【００６４】
１−２−５．ｓｋ＿３０５１  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＫ  １８９４由来）
【表１０】
2015022798.tif 000040
【００６５】
生成テルペノイド化合物
（１）β−マアリエン（β−ｍａａｌｉｅｎｅ）
【化３０】
2015022798.tif 000041
（２）セリナ−３，７（１１）−ジエン（ｓｅｌｉｎａ−３，７（１１）−ｄｉｅｎｅ）
【化３１】
2015022798.tif 000042
（３）セリナ−７（１１）−エン−４−オール（ｓｅｌｉｎａ−７（１１）−ｅｎｅ−４−ｏｌ）
【化３２】
2015022798.tif 000043
（４）ゲルマクレンＡ（ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ  Ａ）
【化３３】
2015022798.tif 000044
【００６６】
１−２−６．ｓｌｔ＿１７１８  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎａｅｕｓ由来）
【表１１】
2015022798.tif 000045
【００６７】
生成テルペノイド化合物
（１）β−エレメン（β−ｅｌｅｍｅｎｅ）
【化３４】
2015022798.tif 000046
（２）α−カジネン（α−ｃａｄｉｎｅｎｅ）
【化３５】
2015022798.tif 000047
（３）β−カジネン（β−ｃａｄｉｎｅｎｅ）
【化３６】
2015022798.tif 000048
（４）γ−カジネン（γ−ｃａｄｉｎｅｎｅ）
【化３７】
2015022798.tif 000049
（５）ゲルマクレンＤ  ４−オール（ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ  Ｄ  ４−ｏｌ）
【化３８】
2015022798.tif 000050
（６）α−コパエン（α−ｃｏｐａｅｎｅ）
【化３９】
2015022798.tif 000051
（７）α−キュベベン（α−ｃｕｂｅｂｅｎｅ）
【化４０】
2015022798.tif 000052
（８）β−キュベベン（β−ｃｕｂｅｂｅｎｅ）
【化４１】
2015022798.tif 000053
（９）β−アロマデンドレン（β−ａｒｏｍａｄｅｎｄｒｅｎｅ）
【化４２】
2015022798.tif 000054
（１０）Ｔ−カジノール（Ｔ−ｃａｄｉｎｏｌ）
【化４３】
2015022798.tif 000055
（１１）ビリディフロレン（ｖｉｒｉｄｉｆｌｏｒｅｎｅ）
【化４４】
2015022798.tif 000056
【００６８】
１−２−７．ｍｍａｒ＿３２２０（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ由来）
【表１２−１】
2015022798.tif 000057
【表１２−２】
2015022798.tif 000058
【００６９】
生成テルペノイド化合物
（１）β-オイデスモール（β-ｅｕｄｅｓｍｏｌ）
【化４５】
2015022798.tif 000059
（２）β-エレメン（β-ｅｌｅｍｅｎｅ）
【化４６】
2015022798.tif 000060
（３）γ-エレメン（γ-ｅｌｅｍｅｎｅ）
【化４７】
2015022798.tif 000061
【００７０】
１−３．ジテルペノイド合成酵素遺伝子【００７１】
１−３−１．ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来）
【表１３】
2015022798.tif 000062
【００７２】
生成テルペノイド化合物
（１）トリメチル−メチレンヘキサデカヒドロピレン
【化４８】
2015022798.tif 000063
（２）テトラメチルヘキサデカヒドロピレノール
【化４９】
2015022798.tif 000064
（３）イソエリサベタトリエン（ｉｓｏｅｌｉｓａｂｅｔｈａｔｒｉｅｎｅ）
【化５０】
2015022798.tif 000065
【００７３】
１−３−２．ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来）
【表１４】
2015022798.tif 000066
【００７４】
生成テルペノイド化合物
（１）クラブラトリエンＡ（ｃｌａｖｕｌａｔｒｉｅｎｅ  Ａ）
【化５１】
2015022798.tif 000067
（２）プレニル−β−エレメン（ｐｒｅｎｙｌ−β−ｅｌｅｍｅｎｅ）
【化５２】
2015022798.tif 000068
（３）プレニルゲルマクレン（ｐｒｅｎｙｌｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ）
【化５３】
2015022798.tif 000069
（４）ロボフィツミンＣ（ｌｏｂｏｐｈｙｔｕｍｉｎ  Ｃ）
【化５４】
2015022798.tif 000070
（５）クラブラトリエンＢ（ｃｌａｖｕｌａｔｒｉｅｎｅ  Ｂ）
【化５５】
2015022798.tif 000071
（６）プレニルゲルマクレンＢ（ｐｒｅｎｙｌｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ  Ｂ）
【化５６】
2015022798.tif 000072
【００７５】
１−３−３．ｓｌｔ＿１０７８  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎａｅｕｓ由来）
【表１５】
2015022798.tif 000073
【００７６】
生成テルペノイド化合物
（１）シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエン
【化５７】
2015022798.tif 000074
【００７７】
１−３−４．ｒｘｙｌ＿０４９３  （Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ９９４１由来）
【表１６−１】
2015022798.tif 000075
【表１６−２】
2015022798.tif 000076
【００７８】
生成テルペノイド化合物
（１）センブレンＣ（ｃｅｍｂｒｅｎｅ  Ｃ）
【化５８】
2015022798.tif 000077
【００７９】
１−３−５．ｈａｕｒ＿２９８７  （Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５由来）
【表１７−１】
2015022798.tif 000078
【表１７−２】
2015022798.tif 000079
【００８０】
生成テルペノイド化合物
（１）オブスクロナチン（ｏｂｓｃｕｒｏｎａｔｉｎ）
【化５９】
2015022798.tif 000080
【００８１】
１−４．セスキテルペノイド合成酵素遺伝子（ＩＩ）
１−４−１．ｈａｕｒ＿２９８８  （Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５由来）
【表１８−１】
2015022798.tif 000081
【表１８−２】
2015022798.tif 000082
【００８２】
生成テルペノイド化合物
（１）α−セリネン（α−ｓｅｒｉｎｅｎｅ）
【化６０】
2015022798.tif 000083
【００８３】
１−４−２．ｒｃａｓ＿０６２２  （Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ  ＤＳＭ  １３９４１由来）
【表１９−１】
2015022798.tif 000084
【表１９−２】
2015022798.tif 000085
【００８４】
生成テルペノイド化合物
（１）（＋）−Ｔ−ムウロロール（（＋）−Ｔ−ｍｕｕｒｏｌｏｌ）
【化６１】
2015022798.tif 000086
【００８５】
１−４−３．ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９  （Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．  ＲＳ−１由来）
【表２０−１】
2015022798.tif 000087
【表２０−２】
2015022798.tif 000088
【００８６】
生成テルペノイド化合物
（１）（＋）−Ｔ−ムウロロール（（＋）−Ｔ−ｍｕｕｒｏｌｏｌ）
【化６２】
2015022798.tif 000089
【００８７】
１−４−４．ｓｃｅ６３６９  （Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ  ‘Ｓｏ  ｃｅ  ５６’由来）
【表２１】
2015022798.tif 000090
【００８８】
生成テルペノイド化合物
（１）α−キュベベン（α−ｃｕｂｅｂｅｎｅ）
【化６３】
2015022798.tif 000091
（２）β−キュベベン（β−ｃｕｂｅｂｅｎｅ）
【化６４】
2015022798.tif 000092
（３）カジナ−３，５−ジエン（ｃａｄｉｎａ−３，５−ｄｉｅｎｅ）
【化６５】
2015022798.tif 000093
（４）ビシクロセスキフェランドレン（ｂｉｃｙｃｌｏｓｅｓｑｕｉｐｈｅｌｌａｎｄｒｅｎｅ）
【化６６】
2015022798.tif 000094
【００８９】
１−４−５．ｓｃｅ８５５２  （Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ  ‘Ｓｏ  ｃｅ  ５６’由来）
【表２２−１】
2015022798.tif 000095
【表２２−２】
2015022798.tif 000096
【００９０】
生成テルペノイド化合物
（１）エレモフィレン（ｅｒｅｍｏｐｈｉｌｅｎｅ）
【化６７】
2015022798.tif 000097
【００９１】
１−４−６．ｓｌｔ＿１８８０  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎａｅｕｓ由来）
【表Ａ】
2015022798.tif 000098
【００９２】
生成テルペノイド化合物
（１）ラクタン−４（５）−エン（Ｌａｃｔａｎ−４（５）−ｅｎｅ）
【化６８】
2015022798.tif 000099
【００９３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、テルペノイド合成酵素としての機能を有するタンパク質も、本願発明の範囲に含まれる。
本発明のテルペノイド合成酵素遺伝子には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれ、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号５８、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号５９、配列番号２５、配列番号６０、配列番号２７、配列番号６１、配列番号２９、配列番号６２、配列番号３１、配列番号６３、配列番号３３、配列番号６４、配列番号３５、配列番号６５、および配列番号９２からなる群から選択される遺伝子と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９４】
以下、本発明を製造例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。【００９５】
モノテルペノイドの合成
製造例１：ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２遺伝子（配列番号１）【００９６】
１．合成用染色体組み込み型ベクターの構築
（１）Ｓ．  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来のＤＮＡを鋳型として、下表のプライマー対：
2015022798.tif 000100
を使用して、ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、６０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした（ロシュ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｍｅｔｒａ  ＧｍｂＨ（ドイツ）；Ｔｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）。【００９７】
（２）増幅して得られたセグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断し、モノテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２を得た。【００９８】
ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐを非特許文献１２に記載の方法に従って作成した。なお、本明細書、請求の範囲、および図面で使用する「ｒｐｓＪ」および「ｒｐｓＪｐ」は、非特許文献１２に記載の「ｒｐｓＪｐ」と同義である。具体的には、ｐＢＳＬ１４１（非特許文献１４）を鋳型にフォーワードプライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧｃａａｔｔｇＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＧＴＡＡ−３’ （配列番号６６））とリバースプライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧｇｃｔａｇｃＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＧＴＴＡ−３’ （配列番号６７））を用い、変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、５０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。増幅したゲンタマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）Ｉを含む７９４−ｂｐの断片をＮｈｅＩとＭｆｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で切断した。【００９９】
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのｒｐｓＪ遺伝子を含むコスミドクローン  ＣＬ＿２１８＿Ｃ０１（ｈｔｔｐ：／／ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ．ｌｓ．ｋｉｔａｓａｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｃｏｓｍｉｄ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）を鋳型にフォーワードプライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧｃａａｔｔｇＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＧＴＡＡ−３’ （配列番号６８））とリバースプライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧｇｃｔａｇｃＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＧＴＴＡ−３’ （配列番号６９））を用い、変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、５０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。増幅したｒｐｓＪプロモーター配列を含む５７３−ｂｐの断片をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で切断した。【０１００】
ゲンタマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）Ｉを含むＮｈｅＩ／ＭｆｅＩ断片、ｒｐｓＪプロモーターを含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片、およびＮｈｅＩとＢａｍＨＩで切断したｐＫＵ４６０を混合し、ＡＴＰ存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって連結した。連結した断片を大腸菌に形質転換し、カナマシンおよびゲンタマイシンを含むＬＡ寒天培地に塗り広げた。生育したコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素（ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による切断によってｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐを得た。【０１０１】
ｇｐｓ遺伝子を保有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ−３９８８の染色体ＤＮＡを鋳型に、フォーワードプライマー：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−３’ （配列番号７０）（ＣＡＴＡＴＧ＝ＮｄｅＩ）；およびリバースプライマー：５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧ−３’ （配列番号７１）（ＴＣＴＡＧＡ＝ＸｂａＩ）；を用いて、ｇｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、７０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し、連結して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｐｓを構築した。【０１０２】
ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐ−ｇｐｓ（０．１μｇ）を、ＰＣＲで増幅した断片をＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られたモノテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２（０．２μｇ）と混合し、これに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し連結させ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２を構築した。【０１０３】
（３）  ライゲーション生成物５０〜１００ｎｇをエタノール沈殿によって塩を除去した後、５μＬの滅菌水に溶かし、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ５０μＬ（濃度１×１０9／ｍＬ）に加え、これを１ｍｍ間隙のセルに加えて、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて１８ＫＶ／ｃｍ（２００Ω、２５μＦ）の電気パルスをかけるエレクトロポレーション導入を行った。【０１０４】
得られた形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＡ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．２）で選択した。得られたコロニーからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出し、制限酵素ＸｂａIとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、目的断片が挿入されていることを確認した。
組換えプラスミド中のｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２配列をＤＮＡシークエンサ（ライフテクノロジーズ、ＡＢＩ３１００）で確認した。【０１０５】
２．Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＵＫＡ１７への染色体組み込み型ベクターの導入
非メチル化ＤＮＡを調製するために、組換えプラスミド：ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８２を、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０（非特許文献１３、非特許文献５）に上記と同様にエレクトロポレーションによって導入した。すなわち組換えプラスミドをエタノール沈殿によって塩を除去した後、滅菌水に溶かし、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０に加え、これを１ｍｍ間隙のセルに加えて、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて１８ＫＶ／ｃｍ（２００Ω、２５μＦ）の電気パルスをかけるエレクトロポレーション導入を行った。【０１０６】
得られた形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）含有ＬＡ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．２）で選択した。得られたコロニーからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。【０１０７】
１０ｍＬのＴＳＢ（トリプトソーヤブイヨン；日水製薬株式会社製）培地にＳＵＫＡ１７の胞子懸濁液を植菌し、３０℃で２晩培養し前培養液とした。終濃度０．４％のグリシンと５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＬのＴＳＢ培地に前培養液を０．５ｍＬ（１％）植菌し、３０℃で１６〜２０時間培養した。培養終了後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を回収した後、２０ｍＬのＰ１０培地（スクロース１０３ｇ、硫酸カリウム０．２５ｇ、塩化マグネシウム２．０３ｇ、および微量元素溶液（塩化亜鉛６水和物４０ｍｇ、塩化第二鉄６水和物２００ｍｇ、塩化第二銅２水和物１０ｍｇ、塩化マンガン４水和物１０ｍｇ、ホウ酸ナトリウム１０水和物１０ｍｇ、およびモリブデン酸アンモニウム４水和物１０ｍｇを１０００ｍＬの水に溶かしてフィルターろ過滅菌したもの）２ｍＬを水８００ｍＬに溶解し、高圧蒸気滅菌した。用時、別滅菌した０．５％リン酸一カリウム１０ｍＬ、３．６８％塩化カルシウム２水和物１００ｍＬ、０．２５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸、ｐＨ６．５）１００ｍＬを添加した）で２回洗浄した。【０１０８】
回収した菌体に３２ｍｇのリゾチームを含む３２ｍＬのＰ１０培地を加え、時折穏やかに振とうしながら３０℃で３０分間加温しプロトプラストを形成させた。さらに、４０ｍＬのＰ２０培地（スクロース２００ｇ、硫酸カリウム０．２５ｇ、塩化マグネシウム２．０３ｇ、および微量元素溶液２ｍＬを水８００ｍＬに溶解し、高圧蒸気滅菌した。用時、別滅菌した０．５％リン酸二カリウム１０ｍＬ、３．６８％塩化カルシウム２水和物１００ｍＬ、０．２５Ｍ  ＭＥＳ１００ｍＬを添加した）を加えて懸濁した後、棉栓ろ過器に通過させ菌糸を除去した。この通過液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、プロトプラストを回収した。１０ｍＬのＰ２０培地で穏やかに懸濁した後、再度遠心しプロトプラストを沈殿させた。この操作を２回繰り返した後、得られたプロトプラストに終濃度７％のＤＭＳＯを含む１ｍＬのＰ２０培地を加えて穏やかに懸濁し、５０μＬずつ分注し、−８０℃で凍結保存した。【０１０９】
大腸菌ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０で調製したＤＮＡ５μＬと作製したプロトプラスト５０μＬを混和し、５００μＬの２５％ＰＥＧ溶液（スクロース２．５ｇおよびポリエチレングリコール（＃６０００）２５ｇを水１００ｍＬに溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ９．０に調整し、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った。使用前に、別滅菌した０．５％リン酸二カリウム１０μＬ／ｍＬ、５Ｍ塩化カルシウム２０μＬ／ｍＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ８．０）５０μＬ／ｍＬを添加した）を加え混合した。１分間静置した後、４５０μＬのＰ２０培地を加え懸濁した。【０１１０】
その後、一部を２．５ｍＬのＲＭ１４軟寒天培地とともにＲＭ１４培地（スクロース２００ｇ、硫酸二カリウム０．２５ｇ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ、グルコース１０ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．１ｇ、Ｌ−プロリン３ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２ｇ、および微量元素溶液２ｍＬを水８７０ｍＬに溶解し、オートミール寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）３ｇおよび寒天２０ｇを加え高圧蒸気滅菌した。用時、別滅菌した０．５％リン酸一カリウム１０ｍＬ、３．６８％塩化カルシウム２水和物８０ｍＬ、０．２５Ｍ  ＭＥＳ４０ｍＬを添加した）に広げた。３０℃で１６〜２０時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む２．５ｍＬのＲＭ１４軟寒天培地（スクロース２００ｇ、硫酸二カリウム０．２５ｇ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ、グルコース１０ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．１ｇ、Ｌ−プロリン３ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２ｇ、および微量元素溶液２ｍＬを水８７０ｍＬに溶解し、オートミール寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）３ｇおよび寒天５ｇを加え高圧蒸気滅菌した。用時、別滅菌した０．５％リン酸一カリウム１０ｍＬ、３．６８％塩化カルシウム２水和物８０ｍＬ、０．２５Ｍ  ＭＥＳ４０ｍＬを添加した）を重層し、３０℃で５日間培養した。【０１１１】
得られたコロニーを１μｇ／ｍＬのネオマイシンを含むＹＭＳ＋＋培地にパッチ状に移植し培養した。耐性を示すコロニーの胞子を２００μＬの滅菌水に懸濁してＹＭＳ＋＋培地（酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）４ｇ、麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ、および可溶性デンプン４ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎの水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整後、寒天を２％になるように添加し、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った。用時、別滅菌した１Ｍ塩化マグネシウムおよび１Ｍ硝酸カリウムを終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、８ｍＭとなるように添加した）に塗布し、３０℃で５日間培養後、胞子を２０％グリセロールに懸濁し−３０℃で保存した。【０１１２】
３．モノテルペノイド化合物を合成するための培養および生成物の分析
１０ｍＬの種培地（グルコース５ｇ、脱脂大豆粉１５ｇおよび酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整後、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った）をスプリングコイル入り大試験管に分注し、ＳＵＫＡ１７の形質転換体の胞子懸濁液を接種し、３０℃で２日間振とう培養したものを種培養液とした。【０１１３】
１０ｍＬの生産培地（グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび酵母エキス２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後、１１０℃で１０分間の高圧蒸気滅菌を行った）を１２５ｍＬ容量のポリカーボネート三角フラスコに分注し、種培養液を０．１ｍＬ（１％）植菌し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間振とう培養した。【０１１４】
モノテルペノイド化合物は菌糸体中に蓄積したので、培養液を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、堆積した菌糸体をメタノール（５００ｍＬ）で、撹拌しながら抽出した。菌糸体の懸濁液をろ過し、澄明なメタノールろ液を更にｎ−ヘキサン（２５０ｍＬ）で２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせて、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（２５０ｍＬ）で２回洗浄して遊離脂肪酸を除去し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。有機層の一部をそのままＧＣ−ＭＳ分析し、ＧＣ−ＭＳの化合物ライブラリのチャートと比較することで同定した。【０１１５】
分析条件：
ＧＣ−ＭＳ  島津製作所製  ＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０Ａ；
カラム：Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｂｏｎｄ−５  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（３０ｍＸ０．２５ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）；
温度：開始温度５０℃、昇温５０−２５０℃（２５℃／分）；
測定時間：１２分。【０１１６】
３つの化合物がＧＣ−ＭＳで検出され、これらは、
β−ピネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ１３６、ｒｔ  ６．０２分）：
【化６９】
2015022798.tif 000101
；
カンフェン（Ｍ＋  ｍ／ｚ１３６、ｒｔ  ５．７３分）：
【化７０】
2015022798.tif 000102
；
１，８−シネオール（Ｍ＋  ｍ／ｚ１５４、ｒｔ  ６．５７分）：
【化７１】
2015022798.tif 000103
；
であった。【０１１７】
セスキテルペノイドの合成（Ｉ）
製造例２：ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５（配列番号３）、ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７（配列番号５）、ｓｇｒ＿６０６５（配列番号７）、ｓｖｅｎ＿０５５２（配列番号９）、ｓｋ＿３０５１（配列番号１１）、ｓｌｔ＿１７１８（配列番号１３）、およびｍｍａｒ＿３２２０Ａ（配列番号５８）【０１１８】
１．合成用染色体組み込み型ベクターの構築
セスキテルペノイドの合成用の染色体組み込み型ベクターを製造例１の方法に従って構築した。以下に製造例１の方法との操作の相違点を中心に染色体組み込み型ベクターの構築方法を記載する。【０１１９】
（１）  表２３中に示すＰＣＲ基本条件は製造例１と同一である。
表２４〜２９に各遺伝子についてのプライマー配列とＰＣＲの７２℃での伸長時間を示す。上段の配列はフォワードプライマーであり、下線はＸｂａＩサイトを示し、太字は開始コドンを示す。下段の配列はリバースプライマーであり、下線はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示し、太字は終止コドンを示す。ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５およびｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７はＳ．  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来のＤＮＡを鋳型とし、ｓｇｒ＿６０６５はＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ  １３３５０由来のＤＮＡを鋳型とし、ｓｖｅｎ＿０５５２はＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｒａｅ  ＡＴＣＣ  １０７１２由来のＤＮＡを鋳型とし、ｓｋ＿３０５１はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＫ１８９４由来のＤＮＡを鋳型とし、ｓｌｔ＿１７１８はＳ．ｌａｃｔａｃｙｃｔｉｎａｅｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした。
【表２３】
2015022798.tif 000104
【表２４】
2015022798.tif 000105
【表２５】
2015022798.tif 000106
【表２６】
2015022798.tif 000107
【表２７】
2015022798.tif 000108
【表２８】
2015022798.tif 000109
【表２９】
2015022798.tif 000110
【０１２０】
ｍｍａｒ＿３２２０Ａについては、開始コドン側にＸｂａＩ、終始コドン側にＨｉｎｄＩＩＩを付加したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｍｍａｒ＿３２２０を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ用にコドンを調整し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して、遺伝子を全合成した。
オペロンバイオテクノロジー株式会社から入手した当該遺伝子は下記の配列を有する。
【表３０】
2015022798.tif 000111
【０１２１】
（２）上記ＰＣＲ条件で増幅して得られたセグメント、またはオペロンバイオテクノロジー株式会社から入手したセグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｓｇｒ＿６０６５、ｓｖｅｎ＿０５５２、ｓｋ＿３０５１、ｓｌｔ＿１７１８、およびｍｍａｒ＿３２２０Ａをそれぞれ得た。【０１２２】
ｆｐｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０  （ＡＴＣＣ  ３１２６７、ＮＲＲＬ  ８１６５、ＮＣＢＩＭ  １２８０４、ＪＣＭ  ５０７０）の染色体ＤＮＡを鋳型に、
フォーワードプライマー  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴ−３’ （配列番号７２）  （ＣＡＴＡＴＧ＝ＮｄｅＩ）；および
リバースプライマー  ５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’  （配列番号７３）（ＴＣＴＡＧＡ＝ＸｂａＩ）；
を用いて、ｆｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、７０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。【０１２３】
得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し、連結して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを構築した。【０１２４】
製造例１と同様の方法で、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＰＣＲで増幅したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｓｇｒ＿６０６５、ｓｖｅｎ＿０５５２、ｓｋ＿３０５１、ｓｌｔ＿１７１８、または全合成したｍｍａｒ＿３２２０Ａをそれぞれ挿入して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｇｒ＿６０６５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｖｅｎ＿０５５２、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｋ＿３０５１、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１７１８、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｍｍａｒ＿３２２０Ａをそれぞれ構築した。【０１２５】
（３）製造例１と同様の方法で、上記のライゲーション生成物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入し、得られた組換えプラスミド中のｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｓｇｒ＿６０６５、ｓｖｅｎ＿０５５２、ｓｋ＿３０５１、ｓｌｔ＿１７１８、ｍｍａｒ＿３２２０Ａの各配列を確認した。【０１２６】
２．Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＵＫＡ１７への染色体組み込み型ベクターの導入
製造例１と同様にして、組換えプラスミド：ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０９８５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｇｒ＿６０６５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｖｅｎ＿０５５２、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｋ＿３０５１、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１７１８、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｍｍａｒ＿３２２０Ａを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０に、その後、ＳＵＫＡ１７にそれぞれ導入し、形質転換体を各々増殖させて、得られた胞子を２０％グリセロール（ｖ／ｖ）懸濁液として−３０°Ｃで貯蔵した。【０１２７】
３．セスキテルペノイド化合物を合成するための培養および生成物の分析
セスキテルペノイド化合物を製造するために、製造例１と同様にして、形質転換体を培養した。さらに、製造例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳで分析した。【０１２８】
ｓｃｌａｖ＿ｐ１４０７については、さらに、得られたヘキサン抽出物について、Ｎａ2ＳＯ4をろ紙を用いて除去した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮乾固し、２５０ｍｇのオイル状の粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を少量のｎ−ペンタンに溶解し、予めｎ−ペンタンで膨潤させたシリカゲル（１０ｇ）カラムに供した。ｎ−ペンタンで洗浄した後、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（５０：１〜０：１００溶媒組成）混合液で溶出した。
ｎ−ペンタン：ジクロロメタン＝２０：１で溶出される成分（ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物）を２．５１ｍｇ得た。なお、ＮＭＲの測定にはそれぞれの化合物を重水素標識したクロロホルムに溶解し、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＮＭ−ＥＣＰ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ＳＹＳＴＥＭ（1Ｈ−ＮＭＲ：５００  ＭＨｚ、13Ｃ−ＮＭＲ：１２５  ＭＨｚ）を用いて測定した。【０１２９】
ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物はＥＩ−ＭＳによる分析によってｍ／ｚ  ２０４［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、その分子式はＣ15Ｈ24であると推測し、不足水素指標が４と明らかになった。1Ｈ−ＮＭＲから２４個の水素シグナルが観測された。13Ｃ−ＮＭＲから１５個の炭素シグナルが観測され、それらのＤＥＰＴスペクトル解析より４個のメチル炭素、４個のメチレン炭素、４個のメチン炭素および３個の４級炭素が存在する。またそれらのうち低磁場にシフトした２つのシグナル（δ１５４．１および１２７．４ｐｐｍ）から１つの二重結合の存在が示唆された。このことから、本化合物は３環性セスキテルペノイド化合物であることが推測された。1Ｈ−1Ｈ−ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣスペクトルから1Ｈ−13Ｃの相関を詳細に解析した結果、２個のメチレン基（４１．２ｐｐｍ、２５．１ｐｐｍ）との相関が観測されなかったが、５−５−５員環を有するセスキテルペノイド化合物であると決定した。【０１３０】
ＧＣ−ＭＳで５．９０分に溶出される化合物のＮＭＲ解析結果
2015022798.tif 000112
【０１３１】
【表３１】
2015022798.tif 000113
【０１３２】
生成テルペノイド化合物
アフリカン−２−エン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ６．６８分）：
【化７２】
2015022798.tif 000114
；
アフリカン−１−エン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ６．７５分）：
【化７３】
2015022798.tif 000115
；
α−グルジュネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．０２分）：
【化７４】
2015022798.tif 000116
；
α−フムレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．２０分）：
【化７５】
2015022798.tif 000117
；
β−カリオフィレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．３０分）：
【化７６】
2015022798.tif 000118
。【０１３３】
【表３２】
2015022798.tif 000119
【０１３４】
生成テルペノイド化合物
１，３，６−トリメチル−２−メチレン−トリシクロ［５．４．０．０３，９］ウンデカン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ６．５６分）：
【化７７】
2015022798.tif 000120
；
ラクタン−１−エン  （Ｌａｃｔａｎ−１−ｅｎｅ）    （Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ５．９０分）：
【化７８】
2015022798.tif 000121
。【０１３５】
【表３３】
2015022798.tif 000122
【０１３６】
生成テルペノイド化合物
α−コパエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ６．７０分）：
【化７９】
2015022798.tif 000123
；
カラレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．１０  分）：
【化８０】
2015022798.tif 000124
；
α−ムロレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．４２分）：
【化８１】
2015022798.tif 000125
；
カジナ−１（１０），４−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．５５分）：
【化８２】
2015022798.tif 000126
；
カジナ−１，４−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．６１分）：
【化８３】
2015022798.tif 000127
；
エピキュベノール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  ８．１７分）：
【化８４】
2015022798.tif 000128
。
【表３４】
2015022798.tif 000129
【０１３７】
生成テルペノイド化合物
α−カミグレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．０２分）：
【化８５】
2015022798.tif 000130
；
ダウカ−８，１１−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．４８分）：
【化８６】
2015022798.tif 000131
。
【表３５】
2015022798.tif 000132
【０１３８】
生成テルペノイド化合物
β−マアリエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．６７分）：
【化８７】
2015022798.tif 000133
；
セリナ−３，７（１１）−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．７５分）：
【化８８】
2015022798.tif 000134
；
セリナ−７（１１）−エン−４−オール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  １１．８０分）：
【化８９】
2015022798.tif 000135
；
ゲルマクレン Ａ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．５５分、９．９１分）：
【化９０】
2015022798.tif 000136
。
【表３６】
2015022798.tif 000137
生成テルペノイド化合物
β−エレメン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．６２分）：
【化９１】
2015022798.tif 000138
；
α−カジネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．６８分）：
【化９２】
2015022798.tif 000139
；
β−カジネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．５５分）：
【化９３】
2015022798.tif 000140
；
γ−カジネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．５２分）：
【化９４】
2015022798.tif 000141
；
ゲルマクレンＤ  ４−オール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  １０．９８分）：
【化９５】
2015022798.tif 000142
；
α−コパエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．５３分）：
【化９６】
2015022798.tif 000143
；
α−キュベベン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．０５分）：
【化９７】
2015022798.tif 000144
；
β−キュベベン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．２１分）：
【化９８】
2015022798.tif 000145
；
β−アロマデンドレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．２５分）：
【化９９】
2015022798.tif 000146
；
Ｔ−カジノール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  １１．３９分）：
【化１００】
2015022798.tif 000147
；
ビリディフロレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．４１分）：
【化１０１】
2015022798.tif 000148
。
【表３７】
2015022798.tif 000149
【０１３９】
生成テルペノイド化合物
β-オイデスモール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １１．０８分）：
【化１０２】
2015022798.tif 000150
；
β-エレメン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．００分）：
【化１０３】
2015022798.tif 000151
；
γ-エレメン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．６０分）：
【化１０４】
2015022798.tif 000152
。【０１４０】
ジテルペノイドの合成
製造例３：ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５（配列番号１７）、ｓｃｌａｖ＿１１６９（配列番号１９）、ｓｌｔ＿１０７８（配列番号２１）、ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ（配列番号５９）、およびｈａｕｒ＿２９８７Ａ（配列番号６０）【０１４１】
（１）  表３８中に示すＰＣＲ基本条件は製造例１と同一である。
表３９〜４１に各遺伝子についてのプライマー配列とＰＣＲの７２℃での伸長時間を示す。上段の配列はフォワードプライマーであり、下線はＸｂａＩサイトを示し、太字は開始コドンを示す。下段の配列はリバースプライマーであり、下線はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示し、太字は終止コドンを示す。ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５およびｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９はＳ．  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４由来のＤＮＡを鋳型とし、ｓｌｔ＿１０７８はＳ．ｌａｃｔａｃｙｃｔｉｎａｅｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした。
【表３８】
2015022798.tif 000153
【表３９】
2015022798.tif 000154
【表４０】
2015022798.tif 000155
【表４１】
2015022798.tif 000156
【０１４２】
ｒｘｙｌ＿０４９３Ａおよびｈａｕｒ＿２９８７Ａについては、開始コドン側にＸｂａＩ、終始コドン側にＨｉｎｄＩＩＩを付加したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｒｘｙｌ＿０４９３およびｈａｕｒ＿２９８７を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ用にコドンを調整し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して、遺伝子を全合成した。
オペロンバイオテクノロジー株式会社から入手した当該遺伝子は下記の配列を有する。
【表４２】
2015022798.tif 000157
【表４３】
2015022798.tif 000158
【０１４３】
１．合成用染色体組み込み型ベクターの構築
ジテルペノイドの合成用の染色体組み込み型ベクターを製造例１の方法に従って構築した。以下に製造例１の方法との操作の相違点を中心に、染色体組み込み型ベクターの構築方法を記載する。【０１４４】
（１）  開始コドン側にＸｂａＩ、終始コドン側にＨｉｎｄＩＩＩを付加したジテルペノイド合成酵素遺伝子を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ用にコドンを調整し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して、遺伝子を全合成した。【０１４５】
（２）全合成して得られたセグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ジテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｓｌｔ＿１０７８、ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、およびｈａｕｒ＿２９８７Ａをそれぞれ得た。【０１４６】
ｇｇｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０の染色体ＤＮＡを鋳型に、
フォーワードプライマー：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＧＧＡＣ−３’ （配列番号７４）（ＣＡＴＡＴＧ＝ＮｄｅＩ）；および
リバースプライマー：５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＧＧＣＣＡＴ−３’ （配列番号７５）（ＴＣＴＡＧＡ＝ＸｂａＩ）；
を用いて、ｇｇｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、７０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し、連結して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓを構築した。【０１４７】
製造例１と同様の方法で、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたジテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｓｌｔ＿１０７８、ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、およびｈａｕｒ＿２９８７Ａをそれぞれ挿入して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｌｔ＿１０７８、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｈａｕｒ＿２９８７Ａをそれぞれ構築した。【０１４８】
（３）製造例１と同様の方法で、上記のライゲーション生成物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入し、得られた組換えプラスミド中のｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｓｌｔ＿１０７８、ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、およびｈａｕｒ＿２９８７Ａの各配列を確認した。【０１４９】
２．Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＵＫＡ１７への染色体組み込み型ベクターの導入
製造例１と同様にして、組換えプラスミド：ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｓｌｔ＿１０７８、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｇｇｓ−ｈａｕｒ＿２９８７ＡをＳＵＫＡ１７にそれぞれ導入し、形質転換体を各々増殖させて、得られた胞子を２０％グリセロール（ｖ／ｖ）懸濁液として−３０°Ｃで貯蔵した。【０１５０】
３．ジテルペノイド化合物を合成するための培養および生成物の分析
（１）ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５
１００ｍＬの種培地（グルコース５ｇ、脱脂大豆粉１５ｇ、および酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整後、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、ＳＵＫＡ１７株の形質転換体（ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ０７６５）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２日間振とう培養したものを種培養液とした。【０１５１】
１００ｍＬの生産培地（グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび、酵母エキス２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後、１１０℃で１０分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、種培養液を１ｍＬ（１％）植菌し、合計７５本の三角フラスコを２８℃、２００ｒｐｍで５日間振とう培養した。【０１５２】
培養液（７Ｌ）を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、堆積した菌糸体をメタノール（３Ｌ）で、撹拌しながら抽出した。菌糸体の懸濁液をろ過し、澄明なメタノールろ液を更にｎ−ヘキサン（１Ｌ）で２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせて、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１Ｌ）で２回洗浄して遊離脂肪酸を除去し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した（有機層の一部をそのままＧＣ−ＭＳ分析し、同定した）。ろ紙を用いてろ過した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮乾固し、３２４ｍｇのオイル状の粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を少量のｎ−ペンタンに溶解し、予めｎ−ペンタンで膨潤させたシリカゲル（２０ｇ）カラムに供した。ｎ−ペンタンで洗浄した後、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（５０：１〜０：１００溶媒組成）混合液で溶出した。【０１５３】
ｎ−ペンタン：ジクロロメタン＝２０：１で溶出される成分（ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物：トリメチル−メチレンヘキサデカヒドロピレン）を３．８７ｍｇ、ジクロロメタン１００％で溶出される成分（ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物：テトラメチルヘキサデカヒドロピレノール）を４．４０ｍｇ得た。なお、ＮＭＲの測定にはそれぞれの化合物を重水素標識したクロロホルムに溶解し、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＮＭ−ＥＣＰ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ＳＹＳＴＥＭ（1Ｈ−ＮＭＲ：５００  ＭＨｚ、13Ｃ−ＮＭＲ：１２５  ＭＨｚ）を用いて測定した。【０１５４】
ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物はＥＩ−ＭＳによる分析によってｍ／ｚ２７２［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、その分子式はＣ２０Ｈ３２であると推測し、不足水素指標が５と明らかになった。1Ｈ−ＮＭＲから３２個の水素シグナルが観測された。13Ｃ−ＮＭＲから２０個の炭素シグナルが観測され、それらのＤＥＰＴスペクトル解析より３個のメチル炭素、９個のメチレン炭素、５個のメチン炭素および３個の４級炭素が存在する。またそれらのうち低磁場にシフトした２つのシグナル（δ１０６．７および１５１．８ｐｐｍ）から１つの二重結合の存在が示唆された。このことから、本化合物は４環性ジテルペン化合物であることが推測された。1Ｈ−1Ｈ−ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣスペクトルから1Ｈ−13Ｃの相関を詳細に解析した結果、１個のメチレン基（１．４４ｐｐｍ、１８．４ｐｐｍ）との相関が観測されなかったが、６−６−６−６員環を有するジテルペン化合物、トリメチル−メチレンヘキサデカヒドロピレンであると決定した。【０１５５】
ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物のＮＭＲ解析結果
【表４４】
2015022798.tif 000159
【０１５６】
一方、ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物はＥＩ−ＭＳにおいてｍ／ｚ２９０［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、その分子式はＣ20Ｈ34Ｏであると推測し、不足水素指標が４と明らかになった。またマスフラグメンテーションパターンが化合物５と類似していることから、化合物５の水酸化体であることが推測された。1Ｈ−ＮＭＲから３２個の水素シグナルが観測された。13Ｃ−ＮＭＲから２０個の炭素シグナルが観測され、それらのＤＥＰＴスペクトル解析より４個のメチル炭素、８個のメチレン炭素、５個のメチン炭素および３個の４級炭素が存在する。ＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物で観測された低磁場にシフトされたシグナルが消失し、新たにメチル炭素ならびに酸素原子と直接結合した４級炭素が観測された。1Ｈ−1Ｈ−ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣスペクトルから1Ｈ−13Ｃの相関を詳細に解析した結果、化合物５と同様に１個のメチレン基（１．４１ｐｐｍ、１８．２ｐｐｍ：1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲ）との相関が観測されなかったため、表４５右上図に示す６−６員環を有する部分構造まで決定した。部分構造から、ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物はＧＣ−ＭＳで１３．８８分に溶出される化合物の水酸化体、テトラメチルヘキサデカヒドロピレノールであると決定した。【０１５７】
ＧＣ−ＭＳで１５．１１分に溶出される化合物のＮＭＲ解析結果
【表４５】
2015022798.tif 000160
【表４６】
2015022798.tif 000161
【０１５８】
生成テルペノイド化合物
トリメチル−メチレンヘキサデカヒドロピレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．８８    分）：
【化１０５】
2015022798.tif 000162
；
テトラメチルヘキサデカヒドロピレノール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２９０、ｒｔ  １５．１１分）：
【化１０６】
2015022798.tif 000163
；
イソエリサベタトリエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．１分）
【化１０７】
2015022798.tif 000164
。【０１５９】
（２）ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９
１００ｍＬの種培地（グルコース５ｇ、脱脂大豆粉１５ｇ、および酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整後、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、ＳＵＫＡ１７株の形質転換体（ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐ−ｇｇｓ−ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２日間振とう培養したものを種培養液とした。【０１６０】
１００ｍＬの生産培地（グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび、酵母エキス２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後、１１０℃で１０分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、種培養液を１ｍＬ（１％）植菌し、合計７５本の三角フラスコを２８℃、２００ｒｐｍで５日間振とう培養した。培養液（７Ｌ）を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、堆積した菌糸体をメタノール（２Ｌ）で、撹拌しながら抽出した。【０１６１】
菌糸体の懸濁液をろ過し、澄明なメタノールろ液を更にｎ−ヘキサン（１Ｌ）で２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせて、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１Ｌ）で２回洗浄して遊離脂肪酸を除去し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した（有機層の一部をそのままＧＣ−ＭＳ分析し、同定した）。ろ紙を用いてろ過した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮乾固し、３２３ｍｇのオイル状の粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を少量のｎ−ペンタンに溶解し、予めｎ−ペンタンで膨潤させたシリカゲル（２０ｇ）カラムに供し、ｎ−ペンタンで溶出される画分（３７ｍｇ）とｎ−ペンタン：ジクロロメタン（２０：１  溶媒組成）混合液で溶出される画分（２．８  ｍｇ）として回収した。【０１６２】
ｎ−ペンタンで溶出される画分は１０％硝酸銀処理したシリカゲル（２ｇ）カラムに供し、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（１：１）で溶出される画分（ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物：クラブラトリエンＢ、４．２ｍｇ）、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（１：２０）で溶出される画分（ＧＣ−ＭＳで１３．１１分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレン、１．１５ｍｇ）およびジクロロメタン：メタノール（１０：１）で溶出される画分（３０ｍｇ）を得た。ジクロロメタン：メタノール（１０：１）で溶出された画分は再度１０％硝酸銀処理シリカゲル（１．５ｇ）クロマトグラフィーに供し、ジクロロメタン：メタノール（５０：１）で３ｍＬずつ分画した。画分１０〜１３にはＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）２２．３ｍｇを画分１５〜２０にはＧＣ−ＭＳで１３．３８分に溶出される化合物（ロボフィツミンＣ）４．８ｍｇを得た。【０１６３】
一方、先のシリカゲルクロマトグラフィーの後半、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（２０：１）で溶出される画分（２．８ｍｇ）を１０％硝酸銀処理シリカゲルクロマトグラフィーに供し、ジクロロメタン：メタノール（２０：１）で溶出する画分（ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメン、０．９ｍｇ）とジクロロメタン：メタノール（１：１）で溶出する画分（ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢ、１．３ｍｇ）を得た。ＮＭＲの測定にはそれぞれの化合物を重水素標識したクロロホルムに溶解し、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＮＭ−ＥＣＰ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ＳＹＳＴＥＭ（1Ｈ−ＮＭＲ：５００  ＭＨｚ、13Ｃ−ＮＭＲ：１２５  ＭＨｚ）を用いて測定した。【０１６４】
ｓｃｌａｖ＿ｐ１１６９形質転換体の培養抽出液の解析の結果、６種類の特異的なピークが検出された。これらはｍ／ｚ２７２［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、ジテルペン炭化水素であることが推測された。なお、ＧＣ−ＭＳで１３．１１分に溶出される化合物と１３．３８分に溶出される化合物はＧＣ−ＭＳデーターベースから、それぞれプレニルゲルマクレンおよびロボフィツミンＣと同定した。ＧＣ−ＭＳデーターベースと一致しない化合物についてはＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）よって構造を解析した。【０１６５】
ＧＣ−ＭＳで１３．５７分に溶出される化合物（クラブラトリエンＢ）のＮＭＲ解析結果：
【表４７】
2015022798.tif 000165
【０１６６】
ＧＣ−ＭＳで１３．２２分に溶出される化合物（クラブラトリエンＡ）のＮＭＲ解析結果：
【表４８】
2015022798.tif 000166
【０１６７】
ＧＣ−ＭＳで１２．６３分に溶出される化合物：プレニル−β−エレメンのＮＭＲ解析結果：
【表４９】
2015022798.tif 000167
【０１６８】
ＧＣ−ＭＳで１２．７３分に溶出される化合物：プレニルゲルマクレンＢのＮＭＲ解析結果：
【表５０】
2015022798.tif 000168
【表５１】
2015022798.tif 000169
【０１６９】
生成テルペノイド化合物
クラブラトリエンＡ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．２２分）：
【化１０８】
2015022798.tif 000170
；
プレニル−β−エレメン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １２．６３分）：
【化１０９】
2015022798.tif 000171
；
プレニルゲルマクレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．１１分）：
【化１１０】
2015022798.tif 000172
；
ロボフィツミンＣ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．３８分）：
【化１１１】
2015022798.tif 000173
；
クラブラトリエンＢ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．５７分）：
【化１１２】
2015022798.tif 000174
；
プレニルゲルマクレンＢ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １２．７３分）：
【化１１３】
2015022798.tif 000175
。【０１７０】
（３）ｓｌｔ＿１０７８
１００ｍＬの種培地（グルコース５ｇ、脱脂大豆粉１５ｇ、および酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整後、１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、ＳＵＫＡ１７株の形質転換体（ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐ−ｇｇｓ−ｓｌｔ＿１０７８）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２日間振とう培養したものを種培養液とした。【０１７１】
１００ｍＬの生産培地（グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび、酵母エキス２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後、１１０℃で１０分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、種培養液を１ｍＬ（１％）植菌し、合計７５本の三角フラスコを２８℃、２００ｒｐｍで５日間振とう培養した。【０１７２】
培養液（７Ｌ）を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、堆積した菌糸体をメタノール（２Ｌ）で、撹拌しながら抽出した。菌糸体の懸濁液をろ過し、澄明なメタノールろ液を更にｎ−ヘキサン（１Ｌ）で２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせて、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１Ｌ）で２回洗浄して遊離脂肪酸を除去し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した（有機層の一部をそのままＧＣ−ＭＳ分析し、同定した）。ろ紙を用いてろ過した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮乾固し、３００ｍｇのオイル状の粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を少量のｎ−ペンタンに溶解し、予めｎ−ペンタンで膨潤させたシリカゲル（２０ｇ）カラムに供し、ｎ−ペンタンで洗浄後、ｎ−ペンタン：酢酸エチル（９：１）で溶出される画分２３．９ｍｇを得た。得られた画分はＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物のみを含んでおり、ＧＣ−ＭＳデーターベースとは一致しないため、さらにＮＭＲによって構造を確認した。【０１７３】
ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物のＥＩ−ＭＳはｍ／ｚ２７２［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、その分子式はＣ20Ｈ32のジテルペン炭化水素化合物であると推定された。1Ｈ−ＮＭＲから３２個の水素シグナルが観測された。13Ｃ−ＮＭＲから２０個の炭素シグナルが観測され、それらのＤＥＰＴスペクトル解析より５個のメチル炭素、６個のメチレン炭素、５個のメチン炭素および４個の４級炭素が存在する。またそれらのうち低磁場にシフトした４つのシグナル（δ１４１．９、１４０．１、１３９．８および１２４．０ｐｐｍ）から２つの二重結合の存在が示唆された。各炭素とそれに結合しているプロトンはＨＭＱＣによって帰属し、1Ｈ−1Ｈ−ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣスペクトルから1Ｈ−13Ｃの相関を詳細に解析することによって、７−８位および１０−１４位に二重結合を有する５−８−５員環のシクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンである決定した。【０１７４】
ＧＣ−ＭＳで９．３０分に溶出される化合物：シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエンのＮＭＲ解析結果：
【表５２】
2015022798.tif 000176
【表５３】
2015022798.tif 000177
【０１７５】
生成テルペノイド化合物
シクロオクタ−７（８），１０（１４）−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  ９．３０分）：
【化１１４】
2015022798.tif 000178
。【０１７６】
（４）ｒｘｙｌ＿０４９３Ａ
ジテルペノイド化合物を製造するために、製造例１と同様にして、形質変換体を培養した。さらに、製造例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳ分析し、同定した。
【表５４】
2015022798.tif 000179
【０１７７】
生成テルペノイド化合物
センブレンＣ（Ｍ＋  ｍ／ｚ２７２、ｒｔ  １３．６２分）：
【化１１５】
2015022798.tif 000180
。【０１７８】
（５）ｈａｕｒ＿２９８７Ａ
ジテルペノイド化合物を製造するために、製造例１と同様にして、形質変換体を培養した。さらに、製造例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳ分析し、同定した。
【表５５】
2015022798.tif 000181
【０１７９】
生成テルペノイド化合物
オブスクロナチン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２９０、ｒｔ  １３．８４分）：
【化１１６】
2015022798.tif 000182
。【０１８０】
セスキテルペノイドの合成（ＩＩ）
製造例４：ｈａｕｒ＿２９８８Ａ（配列番号６１）、ｒｃａｓ＿０６２２Ａ（配列番号６２）、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ（配列番号６３）、ｓｃｅ６３６９Ａ（配列番号６４）、およびｓｃｅ８５５２Ａ（配列番号６５）【０１８１】
１．合成用染色体組み込み型ベクターの構築
セスキテルペノイドの合成用の染色体組み込み型ベクターを製造例１の方法に従って構築した。以下に製造例１の方法との操作の相違点を中心に、染色体組み込み型ベクターの構築方法を記載する。【０１８２】
（１）  開始コドン側にＸｂａＩ、終始コドン側にＨｉｎｄＩＩＩを付加したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ用にコドンを調整し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して、遺伝子を全合成した。
【表５６】
2015022798.tif 000183
【表５７】
2015022798.tif 000184
【表５８】
2015022798.tif 000185
【表５９】
2015022798.tif 000186
【表６０】
2015022798.tif 000187
【０１８３】
（２）全合成して得られたセグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｓｃｅ６３６９Ａ、およびｓｃｅ８５５２Ａをそれぞれ得た。【０１８４】
ｆｐｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０の染色体ＤＮＡを鋳型に、
フォーワードプライマー  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴ−３’  （配列番号７６）（ＣＡＴＡＴＧ＝ＮｄｅＩ）；および
リバースプライマー  ５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’  （配列番号７７）（ＴＣＴＡＧＡ＝ＸｂａＩ）；
を用いて、ｆｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、７０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し、連結して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを構築した。【０１８５】
製造例１と同様の方法で、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、全合成したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子、ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｓｃｅ６３６９Ａ、およびｓｃｅ８５５２Ａをそれぞれ挿入して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ６３６９Ａ、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ８５５２Ａをそれぞれ構築した。【０１８６】
（３）製造例１と同様の方法で、上記のライゲーション生成物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入し、得られた組換えプラスミド中の、ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｓｃｅ６３６９Ａ、およびｓｃｅ８５５２Ａの各配列を確認した。【０１８７】
２．Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＵＫＡ１７への染色体組み込み型ベクターの導入
製造例１と同様にして、組換えプラスミド：ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｈａｕｒ＿２９８８Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｃａｓ＿０６２２Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｒｏｓｅＲＳ＿３５０９Ａ、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ６３６９Ａ、およびｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｃｅ８５５２ＡをＳＵＫＡ１７にそれぞれ導入し、形質転換体を各々増殖させて、得られた胞子を２０％グリセロール（ｖ／ｖ）懸濁液として−３０°Ｃで貯蔵した。【０１８８】
３．セスキテルペノイド化合物を合成するための培養および生成物の分析
セスキテルペノイド化合物を製造するために、製造例１と同様にして、形質変換体を培養した。さらに、製造例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳ分析し、ＧＣ−ＭＳの化合物ライブラリのチャートと比較することでセスキテルペノイド化合物を同定した。
【表６１】
2015022798.tif 000188
【０１８９】
生成テルペノイド化合物
α−セリネン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．４３分）：
【化１１７】
2015022798.tif 000189
。
【表６２】
2015022798.tif 000190
【０１９０】
生成テルペノイド化合物
（＋）−Ｔ−ムウロロール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  １１．３９分）：
【化１１８】
2015022798.tif 000191
。
【表６３】
2015022798.tif 000192
【０１９１】
生成テルペノイド化合物
（＋）−Ｔ−ムウロロール（Ｍ＋  ｍ／ｚ２２２、ｒｔ  １１．３９分）：
【化１１９】
2015022798.tif 000193
。
【表６４】
2015022798.tif 000194
【０１９２】
生成テルペノイド化合物
α−キュベベン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．６４分）：
【化１２０】
2015022798.tif 000195
；
β−キュベベン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ９．９３分）：
【化１２１】
2015022798.tif 000196
；
カジナ−３，５−ジエン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．０４分）：
【化１２２】
2015022798.tif 000197
；
ビシクロセスキフェランドレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  １０．１８分）：
【化１２３】
2015022798.tif 000198
。
【表６５】
2015022798.tif 000199
【０１９３】
生成テルペノイド化合物
エレモフィレン（Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ７．３７分）：
2015022798.tif 000200
。【０１９４】
セスキテルペノイドの合成（ＩＩＩ）
製造例５：ｓｌｔ＿１８８０（配列番号９２）【０１９５】
１．合成用染色体組み込み型ベクターの構築
セスキテルペノイドの合成用の染色体組み込み型ベクターを製造例１の方法に従って構築した。以下に製造例１の方法との操作の相違点を中心に染色体組み込み型ベクターの構築方法を記載する。【０１９６】
（１）  表６６中に示すＰＣＲ基本条件は製造例１と同一である。
表６７に各遺伝子についてのプライマー配列とＰＣＲの７２℃での伸長時間を示す。上段の配列はフォワードプライマーであり、下線はＸｂａＩサイトを示し、太字は開始コドンを示す。下段の配列はリバースプライマーであり、下線はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示し、太字は終止コドンを示す。Ｓ．ｌａｃｔａｃｙｃｔｉｎａｅｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした。
【表６６】
2015022798.tif 000201
【表６７】
2015022798.tif 000202
【０１９７】
（２）上記ＰＣＲ条件で増幅して得られたセグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、セスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｌｔ＿１８８０を得た。【０１９８】
ｆｐｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０  （ＡＴＣＣ  ３１２６７、ＮＲＲＬ  ８１６５、ＮＣＢＩＭ  １２８０４、ＪＣＭ  ５０７０）の染色体ＤＮＡを鋳型に、
フォーワードプライマー  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴ−３’ （配列番号７２）  （ＣＡＴＡＴＧ＝ＮｄｅＩ）；および
リバースプライマー  ５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’  （配列番号７３）（ＴＣＴＡＧＡ＝ＸｂａＩ）；
を用いて、ｆｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。変性工程（９８℃、２分）の後、増幅（９５℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、７０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間インキュベーションした。【０１９９】
得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩで切断したｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪｐに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ含有水溶液（１５μＬ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２５μＬ）加え、１４℃で一夜放置し、連結して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを構築した。【０２００】
製造例１と同様の方法で、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＰＣＲで増幅したセスキテルペノイド合成酵素遺伝子ｓｌｔ＿１８８０を挿入して、ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１８８０を構築した。【０２０１】
（３）製造例１と同様の方法で、上記のライゲーション生成物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入し、得られた組換えプラスミド中のｓｌｔ＿１８８０の各配列を確認した。【０２０２】
２．Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＵＫＡ１７への染色体組み込み型ベクターの導入
製造例１と同様にして、組換えプラスミド：ｐＫＵ４６０−ｒｐｓＪ−ｆｐｓ−ｓｌｔ＿１８８０を、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０に、その後、ＳＵＫＡ１７にそれぞれ導入し、形質転換体を各々増殖させて、得られた胞子を２０％グリセロール（ｖ／ｖ）懸濁液として−３０°Ｃで貯蔵した。【０２０３】
３．セスキテルペノイド化合物を合成するための培養および生成物の分析
（１）ｓｌｔ＿１８８０
１００ｍＬの生産培地（グルコース６０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、０．５％硫酸鉄七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸亜鉛七水和物１０ｍＬ、０．５％硫酸マンガン四水和物１０ｍＬ、１％硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＬ、硫酸アンモニウム２ｇおよび、酵母エキス２ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後、１１０℃で１０分間の高圧蒸気滅菌を行った）を５００ｍＬ容量の三角フラスコに分注し、種培養液を１ｍＬ（１％）植菌し、合計７５本の三角フラスコを２８℃、２００ｒｐｍで５日間振とう培養した。【０２０４】
培養液（７Ｌ）を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、堆積した菌糸体をメタノール（３Ｌ）で、撹拌しながら抽出した。菌糸体の懸濁液をろ過し、澄明なメタノールろ液を更にｎ−ヘキサン（１Ｌ）で２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせて、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１Ｌ）で２回洗浄して遊離脂肪酸を除去し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した（有機層の一部をそのままＧＣ−ＭＳ分析し、同定した）。ろ紙を用いてろ過した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮乾固し、１２４０ｍｇのオイル状の粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を少量のｎ−ペンタンに溶解し、予めｎ−ペンタンで膨潤させたシリカゲル（２０ｇ）カラムに供した。ｎ−ペンタンで洗浄した後、ｎ−ペンタン：ジクロロメタン（５０：１〜０：１００溶媒組成）混合液で溶出した。【０２０５】
ｎ−ペンタン：ジクロロメタン＝２０：１で溶出される成分（ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物：ラクタン-４（５）-エン）を４．２７ｍｇ得た。なお、ＮＭＲの測定には重水素標識したクロロホルムに溶解し、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＮＭ−ＥＣＰ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ＳＹＳＴＥＭ（1Ｈ−ＮＭＲ：５００  ＭＨｚ、13Ｃ−ＮＭＲ：１２５  ＭＨｚ）を用いて測定した。【０２０６】
ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物はＥＩ−ＭＳによる分析によってｍ／ｚ２０４［Ｍ＋］の分子イオンピークを示したことから、その分子式は：Ｃ15Ｈ24であると推測し、不足水素指標が４と明らかになった。1Ｈ−ＮＭＲから２４個の水素シグナルが観測された。13Ｃ−ＮＭＲから１５個の炭素シグナルが観測され、それらのＤＥＰＴスペクトル解析より４個のメチル炭素、４個のメチレン炭素、４個のメチン炭素および３個の４級炭素が存在する。またそれらのうち低磁場にシフトした２つのシグナル（δ  １４２．８および１２１．８ｐｐｍ）から１つの二重結合の存在が示唆された。このことから、本化合物は３環性セスキテルペノイド化合物であることが推測された。これらの結果から５−５−５員環を有するセスキテルペノイド化合物、ラクタン−４（５）−エン（Ｌａｃｔａｎ−４（５）−ｅｎｅ）であると決定した。【０２０７】
ＧＣ−ＭＳで６．３０分に溶出される化合物のＮＭＲ解析結果
【表６８】
2015022798.tif 000203
【表６９】
2015022798.tif 000204
【０２０８】
生成テルペノイド化合物
ラクタン-４（５）-エン  （Ｍ＋  ｍ／ｚ２０４、ｒｔ  ６．３０分）：
【化１２４】
2015022798.tif 000205
。【０２０９】
テルペノイド化合物のアッセイ
生物細胞に対する新規ジテルペン化合物の細胞毒性
以下の生物細胞株についてインビトロで試験を行った：ジャーカット（Ｔ−細胞リンパ芽球性白血病）、ＳＫＯＶ（卵巣癌）、及びマイコバクテリウム  スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ：結核菌と同属）。
ジャーカットとＳＫＯＶはＲＰＭＩ−１６４０培地（ライフテクノロジーズジャパン製）を用い、３７℃でＣＯ2インキュベータ内で増殖させた。マイコバクテリウムはＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（ＤＩＦＣＯ製）を用い、３７℃で増殖させた。【０２１０】
試験では、新規ジテルペン化合物は、１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を希釈液として使用し、以下の最終濃度で使用した：５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬ。細胞毒性は、ＭＴＴアッセイを用いて比色分析法によって測定した。５×１０4／ｍＬの濃度の生物細胞をザルスタット（Ｓａａｒｓｔｅｄ）平底９６ウェルプレートに接種し、新規ジテルペン化合物を含む１％ＤＭＳＯ溶液２０μＬを、ジテルペン化合物が上記最終濃度となるよう各ウェルに加え、プレートを標準的な温度及び圧力下で７２時間インキュベートした（各ジテルペン濃度は３点で試験した）。使用した対照は、新規ジテルペン無しの３つのウェルであり、３つのウェルに２０μＬの１％ＤＭＳＯを加えた。【０２１１】
インキュベーション後に、２０μＬのＭＴＴ溶液（ＳＩＧＭＡ製）を各ウェルに加え、３７℃で１０分間インキュベートし、プレートリーダーで、５４０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。ＭＴＴは、生きた細胞によって代謝され、水不溶性ホルマザンに変化し、それによって、生存細胞の量に比例して溶液の光学密度が黄色から暗青色に変化する。すべての実験は３点で行った。生存率は、（実験の平均ＯＤ／対照の平均ＯＤ）×１００％として決定した。
結果を以下に示す。
【表７０】
2015022798.tif 000206
【図１】
2015022798.tif 000216
【図２】
2015022798.tif 000217
【図３】
2015022798.tif 000218
【図４】
2015022798.tif 000219
【図５】
2015022798.tif 000220
【図６】
2015022798.tif 000221
【図７】
2015022798.tif 000222
【図８】
2015022798.tif 000223
【図９】
2015022798.tif 000224
【図１０】
2015022798.tif 000225
【図１１】
2015022798.tif 000226
【図１２】
2015022798.tif 000227
【図１３】
2015022798.tif 000228
【図１４】
2015022798.tif 000229
【図１５】
2015022798.tif 000230
【図１６】
2015022798.tif 000231
【図１７】
2015022798.tif 000232
【図１８】
2015022798.tif 000233
【図１９】
2015022798.tif 000234
【図２０】
2015022798.tif 000235
【図２１】
2015022798.tif 000236
【図２２】
2015022798.tif 000237
【図２３】
2015022798.tif 000238
【図２４】
2015022798.tif 000239
【図２５】
2015022798.tif 000240
【図２６】
2015022798.tif 000241
【図２７】
2015022798.tif 000242
【図２８】
2015022798.tif 000243
【図２９】
2015022798.tif 000244
【図３０】
2015022798.tif 000245
【図３１】
2015022798.tif 000246
【図３２】
2015022798.tif 000247
【図３３】
2015022798.tif 000248
【図３４】
2015022798.tif 000249
【図３５】
2015022798.tif 000250
【図３６】
2015022798.tif 000251
【図３７】
2015022798.tif 000252
【図３８】
2015022798.tif 000253
【図３９】
2015022798.tif 000254
【図４０】
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【図４１】
2015022798.tif 000256
【図４２】
2015022798.tif 000257
【図４３】
2015022798.tif 000258
【図４４】
2015022798.tif 000259
【図４５】
2015022798.tif 000260
【図４６】
2015022798.tif 000261
【図４７】
2015022798.tif 000262
【図４８】
2015022798.tif 000263
【図４９】
2015022798.tif 000264
【図５０】
2015022798.tif 000265
【図５１】
2015022798.tif 000266
【図５２】
2015022798.tif 000267
【図５３】
2015022798.tif 000268
【図５４】
2015022798.tif 000269
【図５５】
2015022798.tif 000270
【図５６】
2015022798.tif 000271
【図５７】
2015022798.tif 000272
【図５８】
2015022798.tif 000273
【図５９】
2015022798.tif 000274
【図６０】
2015022798.tif 000275
【図６１】
2015022798.tif 000276
【図６２】
2015022798.tif 000277
【図６３】
2015022798.tif 000278
【図６４】
2015022798.tif 000279
【図６５】
2015022798.tif 000280
【図６６】
2015022798.tif 000281
【図６７】
2015022798.tif 000282
【図６８】
2015022798.tif 000283
【図６９】
2015022798.tif 000284
【図７０】
2015022798.tif 000285
【図７１】
2015022798.tif 000286
【図７２】
2015022798.tif 000287
【図７３】
2015022798.tif 000288
【図７４】
2015022798.tif 000289
【図７５】
2015022798.tif 000290
【図７６】
2015022798.tif 000291
【図７７】
2015022798.tif 000292
【図７８】
2015022798.tif 000293
【図７９】
2015022798.tif 000294
【図８０】
2015022798.tif 000295
【図８１】
2015022798.tif 000296
【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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