(57)【要約】  マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供する。また、マイクロベシクルに対して結合能を有するアプタマーを用いたマイクロベシクルの検出／単離方法および薬物送達システムを提供する。５’−Ｘ１−Ｍｓ−Ｘ２−３’（Ｍｓは、ＹＲＣＧＧＮＧＧＷＧＴＷＧＧＧＧＲ（配列番号２０９）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｘ１およびＸ２は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）、または、５’−Ｘ３−（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎ−Ｘ４−３’（Ｍｋは、ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）もしくはＲＶＤＤＧＧＧＨＴＣＴＡＣ（配列番号２１１）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、ｍおよびｎは、それぞれ０から２０までのいずれかの整数であり、Ｘ３およびＸ４は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）を含む核酸アプタマー。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の塩基配列：
５’−Ｘ１−Ｍｓ−Ｘ２−３’
（ここで、Ｍｓは、ＹＲＣＧＧＨＧＧＷＲＷＫＧＧＧＲＮ（配列番号２０７）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｙは、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、それぞれ独立に、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ１およびＸ２は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）
を含む、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項２】
前記Ｍｓが、配列番号２０７と９０％以上の同一性を有する塩基配列である、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
前記Ｍｓが、配列番号２０７に示される塩基配列である、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
下記の塩基配列：
５’−Ｘ３−（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎ−Ｘ４−３’
（ここで、Ｍｋは、ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）またはＲＶＤＤＧＧＧＨＴＣＴＡＣ（配列番号２１１）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｄは、それぞれ独立に、Ａ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、
ｍは、０から２０までのいずれかの整数であり、
ｎは、０から２０までのいずれかの整数であり、
Ｘ３およびＸ４は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ３およびＸ４は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）
を含む、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項５】
前記Ｍｋが、配列番号２０８または配列番号２１１と９０％以上の同一性を有する塩基配列である、請求項４に記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
前記Ｍｋが、配列番号２０８または配列番号２１１に示される塩基配列である、請求項４に記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
前記ステムがミスマッチまたはバルジを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項８】
前記Ｍｓまたは前記ＭｋがＧカルテット構造を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項９】
（ａ）配列番号１０７〜２０６からなる群から選択される塩基配列、または、
（ｂ）配列番号１０７〜２０６からなる群から選択される塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列
を含む、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項１０】
３’および／または５’末端が修飾されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項１１】
前記マイクロベシクルの直径が１０〜２００ｎｍである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項１２】
前記マイクロベシクルがエキソソームである請求項１１に記載の核酸アプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを用いて、マイクロベシクルを検出する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを用いて、マイクロベシクルを単離する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸アプタマーと、薬物とを含む、薬物送達システム。
【請求項１６】
マイクロベシクルをさらに含む、請求項１５に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。本発明は、特には、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを用いてマイクロベシクルを検出する方法、マイクロベシクルを単離する方法、および、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを含有する薬物送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロベシクルとは、細胞から分泌される直径約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの大きさの小胞である。その中で、直径が約３０〜１００ｎｍの大きさであり、かつ、エンドソームに由来するものがエキソソームである。エキソソームは、セラミドを多く含む脂質膜により構成されており、非常に硬い構造を有している。エキソソームは、多胞性エンドソームの中で産生され、多胞性エンドソームが細胞膜と融合することにより細胞外に分泌される。そのため、ＣＤ６３などのエンドソーム特異的マーカーを膜上に含む。【０００３】
エキソソームに代表されるマイクロベシクルは、種々の細胞から分泌され、血液、尿、唾液などの体液中に観察される。近年、マイクロベシクルを分泌した細胞に由来するｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などの様々な生体分子がマイクロベシクル内に含まれていることが報告され、マイクロベシクルが細胞間の情報伝達に重要な役割を担っている可能性が指摘されている。そのため、マイクロベシクルを体液から単離し、マイクロベシクルに含まれる生体分子情報を解析することにより、疾患の診断に応用しようと研究が盛んに行われている。【０００４】
マイクロベシクルを検出・単離する従来の方法としては、例えば、超遠心分離法が知られている。しかし、超遠心分離法によりマイクロベシクルを分離する場合には、マイクロベシクルを含有するサンプルを大量に用意する必要があるため、時間と労力を要するという問題がある。また、超遠心分離を実施するための設備が必要となり、経済的にもコストがかかる。エキソソームを検出・単離する従来の方法としては、エキソソームに特異的な抗原を認識する抗体を用いる方法が知られている。しかし、エキソソームに特異的な抗原にはＣＤ６３など限られたものしかない上、抗体を作製するためには多大な時間的・経済的コストがかかるという問題がある。【０００５】
また、近年では、体内の薬物分布を量的・空間的・時間的に制御し、治療対象となる組織や細胞のみに薬物を作用させ、薬物の効果を最大限発揮させるための薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム、ＤＤＳ）の研究が行われている。従来の薬物送達システムとしては、例えば、リポソームを用いた方法（非特許文献１）、ナノパーティクルを用いた方法（非特許文献２）などが知られている。しかし、これらの手法の場合、薬物は主に肝臓へと送達され、目的とする標的組織への送達が難しい。さらに、人工脂質を用いているため、細胞毒性が問題となる。【０００６】
一方、マイクロベシクルは、生体物質から構成されているため細胞毒性がなく、安定な構造を有する膜小胞であり、薬物送達システムに適している。そのため、マイクロベシクルに薬物を結合させることができれば、目的とする標的組織や疾患部位、がん腫瘍などへの薬物送達が可能になると考えられており（非特許文献３）、マイクロベシクルを用いた薬物送達システムの開発に期待が寄せられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｖｏｌ．１５８，  ｐｐ．３６２−３７０，  ２０１２
【非特許文献２】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌ．３３，  ｐｐ．７１３８−７１５０，  ２０１２
【非特許文献３】Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，  Ｖｏｌ．３３，  ｐｐ．７３７−７４１，  ２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような従来技術の諸問題を解消するためになされたものであり、マイクロベシクルに対して優れた結合能を有し、安定性が高く、かつ、様々な用途に加工性の優れた核酸アプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを得ることに成功した。【００１０】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、塩基配列：５’−Ｘ１−Ｍｓ−Ｘ２−３’（ここで、Ｍｓは、ＹＲＣＧＧＨＧＧＷＲＷＫＧＧＧＲＮ（配列番号２０７）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｙは、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、それぞれ独立に、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ１およびＸ２は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）を含む、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供するものである。【００１１】
前記Ｍｓは、配列番号２０７と９０％以上の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。【００１２】
前記Ｍｓは、配列番号２０７に示される塩基配列であることが好ましい。【００１３】
また、本発明は、一実施形態によれば、塩基配列：５’−Ｘ３−（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎ−Ｘ４−３’（ここで、Ｍｋは、ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）またはＲＶＤＤＧＧＧＨＴＣＴＡＣ（配列番号２１１）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｄは、それぞれ独立に、Ａ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、ｍは、０から２０までのいずれかの整数であり、ｎは、０から２０までのいずれかの整数であり、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ３およびＸ４は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）を含む、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供するものである。【００１４】
前記Ｍｋは、配列番号２０８または配列番号２１１と９０％以上の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。【００１５】
前記Ｍｋは、配列番号２０８または配列番号２１１に示される塩基配列であることが好ましい。【００１６】
前記ステムは、ミスマッチまたはバルジを含むことができる。【００１７】
前記Ｍｓまたは前記ＭｋがＧカルテット構造を形成することが好ましい。【００１８】
また、本発明は、一実施形態によれば、（ａ）配列番号１０７〜２０６からなる群から選択される塩基配列、または、（ｂ）配列番号１０７〜２０６からなる群から選択される塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供するものである。【００１９】
前記核酸アプタマーは、３’および／または５’末端が修飾されていることが好ましい。【００２０】
前記マイクロベシクルは、直径が１０〜２００ｎｍのものであることが好ましい。【００２１】
前記マイクロベシクルは、エキソソームであることが好ましい。【００２２】
また、本発明は、別の実施形態によれば、上記核酸アプタマーを用いてマイクロベシクルを検出する方法およびマイクロベシクルを単離する方法、ならびに、上記核酸アプタマーを含む薬物送達システムを提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るマイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーは、既存の抗マイクロベシクル抗体と同等またはそれ以上の高い結合能を有し、既存の抗マイクロベシクル抗体の代替物としての使用が可能である。また、核酸を原料としているため、（１）化学合成が容易であり、安価に大量に調製することが可能である、（２）アプタマー自身の抗原性が低く、安全性が高い、（３）安定性が高く、長期保存が可能である、（４）修飾核酸を用いることにより、アプタマーのさらなる改良が容易である、といった点で抗体よりも優れている。さらに、核酸アプタマーの場合、抗体を作製できない抗原性の低いエピトープをも標的として調製することができるため、既存の抗マイクロベシクル抗体よりも優れた結合能を有する核酸アプタマーを調製できる可能性がある。【００２４】
また、本発明に係るマイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーは、マイクロベシクルの検出および単離、ならびに薬物送達システムのために使用し得る。また、本発明に係るマイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーは、マイクロベシクルに対して結合能を有する新規の核酸アプタマーについてさらなるスクリーニングを行う際、ブロッキング剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＥＬＥＸ法により選択されたアプタマーについて、保存されたモチーフ配列をＭＥＭＥ  Ｓｕｉｔｅにより検索した結果を示す図である。
【図２】Ｓプールから濃縮されたアプタマーの配列整列を示す図である。
【図３】Ｋプールから濃縮されたアプタマーの配列整列を示す図である。
【図４】配列番号１１４のアプタマーについて、二次構造を予測した結果を示す図である。
【図５】配列番号１５９のアプタマーについて、二次構造を予測した結果を示す図である。
【図６】ＳモチーフアプタマーまたはＫモチーフアプタマーとマイクロベシクルとの結合を確認したフィルターバインディングアッセイの結果を示す図である。
【図７】Ｓモチーフアプタマーのマイクロベシクルに対する結合能を評価したドットブロットの結果を示す図である。
【図８】Ｓモチーフアプタマーと２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクルとの結合を示すセンサーグラムである。
【図９】ＳモチーフアプタマーとＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のマイクロベシクルとの結合を示すセンサーグラムである。
【図１０】Ｋモチーフアプタマーと２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクルとの結合を示すセンサーグラムである。
【図１１】ＫモチーフアプタマーとＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のマイクロベシクルとの結合を示すセンサーグラムである。
【図１２】トリス／ナトリウム／カルシウム／マグネシウムバッファーに種々の量の塩化カリウムを加えたときの、ＳモチーフアプタマーのＣＤスペクトルである。
【図１３】トリス／ナトリウム／カルシウム／マグネシウムバッファーに種々の量の塩化カリウムを加えたときの、ＫモチーフアプタマーのＣＤスペクトルである。
【図１４】トリスバッファーに種々の量の塩化カリウムを加えたときの、ＳモチーフアプタマーのＣＤスペクトルである。
【図１５】トリスバッファーに種々の量の塩化カリウムを加えたときの、ＫモチーフアプタマーのＣＤスペクトルである。
【図１６】トリス／ナトリウム／カルシウム／マグネシウム／カリウムバッファーにおける、Ｓモチーフアプタマーの融解温度測定試験の結果を示す図である。
【図１７】トリス／ナトリウム／カルシウム／マグネシウム／カリウムバッファーにおける、Ｋモチーフアプタマーの融解温度測定試験の結果を示す図である。
【図１８】トリス／カリウムバッファーにおける、Ｓモチーフアプタマーの融解温度測定試験の結果を示す図である。
【図１９】トリス／カリウムバッファーにおける、Ｋモチーフアプタマーの融解温度測定試験の結果を示す図である。
【図２０】ＳモチーフアプタマーまたはＫモチーフアプタマーと２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクルとの結合能に対するカリウムイオンの影響を確認した図である。
【図２１】マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーの立体構造の予測図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２７】
本発明は、第一の態様によれば、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーである。以降、本明細書では、マイクロベシクルに対して結合能を有する核酸アプタマーを「マイクロベシクル結合性核酸アプタマー」と記載する。
【００２８】
「核酸アプタマー」とは、高い親和性で標的分子と特異的に結合できるオリゴ核酸を意味する。オリゴ核酸の長さは、特に限定されないが、好ましくは１０〜２００塩基であり、より好ましくは１７〜１００塩基であり得る。核酸アプタマーは、短いものの方が容易かつ安価に製造でき、安定性も高いため、好ましい。しかし、核酸アプタマーの長さが１０塩基より短いと、マイクロベシクルに対する結合能を維持できなくなる場合がある。
【００２９】
アプタマーを構成する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、人工核酸（Ｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．３１，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．４５３−４５７，  ２０１３）、修飾核酸（例えばアミノ酸側鎖を付加したもの）などであってよく、部分的にこれらの核酸を混合したものであってもよい。各核酸は、必要に応じてフッ素やメチル基などにより修飾された塩基を含んでいてもよいし、リン酸部分にチオ化などの修飾を含んでいてもよい。なお、本明細書では、アプタマーを構成する核酸をＲＮＡとして説明するが、適宜、ＤＮＡなどの他の核酸に読み替えることができる。また、その際、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は適宜相互に置換され得る。
【００３０】
「マイクロベシクル」とは、細胞から分泌される脂質二重膜小胞のうち、直径が約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの大きさのものを意味する。マイクロベシクルは、例えば培養細胞から培養液中に分泌されたものであってもよいし、生体内の細胞から血液などの体液中に分泌されたものであってもよい。マイクロベシクルを分泌する細胞は、特に限定されないが、例えば樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、上皮細胞、上皮細胞、神経細胞、脳血液関門上皮細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、幹細胞などであってよい。また、これらの細胞は、いかなる動物種由来のものであってよい。
【００３１】
第一の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、塩基配列：５’−Ｘ１−Ｍｓ−Ｘ２−３’（ここで、Ｍｓは、ＹＲＣＧＧＨＧＧＷＲＷＫＧＧＧＲＮ（配列番号２０７）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｙは、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、それぞれ独立に、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ１およびＸ２は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）を含む。上記アプタマーは、Ｍｓはループ部分とする構造を有し、マイクロベシクルに対し高い結合親和性を有する。また、一般に、標的分子に対する高い結合親和性を有する核酸アプタマーとして取得された配列については、変異を導入し、さらなる塩基配列の最適化を行うことが可能である。すなわち、Ｍｓについて、８０％以上の同一性を有する範囲で変異を導入し、塩基配列の最適化を行った核酸アプタマーも、Ｍｓをループ部分とするアプタマーと同等またはそれ以上の、マイクロベシクルに対する高い結合親和性を有する。「８０％以上の同一性」とは、２つの塩基配列を整列比較した場合に、少なくとも８０％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の塩基が同一である塩基配列を意味する。本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、配列番号２０７に示される塩基配列と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは１００％の同一性を有する塩基配列を含む。なお、最適化のために導入される変異は、１〜数個の塩基の欠失または挿入を含んでもよい。最適化により欠失または挿入される塩基の数は、特に限定されないが、好ましくは５塩基以内、４塩基以内、３塩基以内であり、特に好ましくは２塩基または１塩基である。
【００３２】
第一の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのＸ１とＸ２には、長さ０〜５０ヌクレオチドの任意の塩基配列を用いることができる。一般に、核酸アプタマーは、ステムループ構造、グアニン（Ｇ）カルテット構造、シュードノット構造、といった立体構造を形成し、この特定の立体構造が、核酸アプタマーの標的分子に対する認識能および結合能を決定することが知られ、核酸アプタマーの立体構造が維持される限り、核酸アプタマーの標的分子に対する認識能および結合能も維持されることが周知である。すなわち、核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能が維持されるためには、Ｍｓのループ部分の構造が維持されればよく、また同時に、Ｘ１とＸ２は、特定の塩基配列には限定されないことが理解される。
【００３３】
Ｘ１とＸ２は、それぞれ長さ０〜５０ヌクレオチドの任意の塩基配列であり、かつ、Ｘ１とＸ２は、相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する。Ｘ１とＸ２とは、互いに同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。また、Ｘ１とＸ２とは、完全に相補的であってもよいし、部分的に相補的であってもよい。ステム部分の長さは、自由に変更することができる。さらに、ステム部分がない場合、すなわちＸ１またはＸ２が０ヌクレオチドの長さである場合であっても、Ｍｓのループ部分が維持されることができ、核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能は維持され得る。本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのステムの長さは、特に限定されないが、好ましくは、５〜４５、１０〜４０、１０〜３５、または１０〜３０塩基対であり、より好ましくは５〜２５塩基対であり得る。
【００３４】
第二の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、塩基配列：５’−Ｘ３−（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎ−Ｘ４−３’（ここで、Ｍｋは、ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）またはＲＶＤＤＧＧＧＨＴＣＴＡＣ（配列番号２１１）と８０％以上の同一性を有する塩基配列であり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｄは、それぞれ独立に、Ａ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴもしくはＵであり、ｍは、９から１５までのいずれかの整数であり、ｎは、０から４までのいずれかの整数であり、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ３およびＸ４は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）を含む。上記アプタマーは、（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎはループ部分とする構造を有し、マイクロベシクルに対し高い結合親和性を有する。また、Ｍｋについて、８０％以上の同一性を有する範囲で変異を導入し、塩基配列の最適化を行った核酸アプタマーも、Ｍｋをループ部分に含むアプタマーと同等またはそれ以上の、マイクロベシクルに対する高い結合親和性を有する。本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、配列番号２０８または配列番号２１１に示される塩基配列と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは１００％の同一性を有する塩基配列を含む。なお、最適化のために導入される変異は、１〜数個の塩基の欠失または挿入を含んでもよい。最適化により欠失または挿入される塩基の数は、特に限定されないが、好ましくは５塩基以内、４塩基以内、３塩基以内であり、特に好ましくは２塩基または１塩基である。
【００３５】
第二の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのループ部分は、Ｍｋを含み、その両端に、任意の塩基配列からなる（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎを含む。（Ｎ）ｍの長さは、０から２０ヌクレオチドであり、好ましくは７〜１７ヌクレオチドである。（Ｎ）ｎの長さは、０から２０ヌクレオチドであり、好ましくは０〜１０ヌクレオチドである。（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎからなるループ部分のうち、Ｍｋの構造が本マイクロベシクルに対する認識能および結合能に重要であり、Ｍｋの構造が維持されれば、核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能は維持され得る。すなわち、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎは、Ｘ３とＸ４とにより形成されるステム部分とのリンカーに相当するものであり、特定の塩基配列からなるヌクレオチド鎖には限定されない。また、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎは、非ヌクレオチド鎖であってもよい。非ヌクレオチド鎖は、例えば、置換または無置換の直鎖アルキル鎖、エチレングリコール鎖、アミノリンカー、ペプチド鎖、糖鎖などの有機基からなるものであり得る。
【００３６】
第二の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのＸ３とＸ４には、長さ０〜５０ヌクレオチドの任意の塩基配列を用いることができる。（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎからなるループ部分の構造が本実施形態の核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能に重要であり、Ｘ３とＸ４は、特定の塩基配列には限定されないことが理解される。
【００３７】
Ｘ３とＸ４は、それぞれ長さ０〜５０ヌクレオチドの任意の塩基配列であり、かつ、Ｘ３とＸ４は、相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する。Ｘ３とＸ４とは、互いに同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。また、Ｘ３とＸ４とは、完全に相補的であってもよいし、部分的に相補的であってもよい。ステム部分の長さは、自由に変更することができる。さらに、ステム部分がない場合、すなわちＸ３またはＸ４が０ヌクレオチドの長さである場合であっても、Ｍｋの構造が維持されることができ、核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能は維持され得る。本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのステムの長さは、特に限定されないが、好ましくは、５〜４５、１０〜４０、１０〜３５、または１０〜３０塩基対であり、より好ましくは５〜２５塩基対であり得る。
【００３８】
本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのステム部分は、ミスマッチまたはバルジを含むことができる。一般に、ステム部分は、核酸アプタマーの標的分子に対する認識能および結合能に対する影響が小さいことが周知であり、ステム部分の塩基配列には、少数のヌクレオチド、例えば、限定されないが、１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドの、欠失、挿入、置換があってもよいことが周知である。本実施形態の核酸アプタマーのマイクロベシクルに対する認識能および結合能は、Ｍｓおよび（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎのループ部分の構造によって決定されるものであり、ステム部分の構造によっては影響されない。すなわち、本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのＸ１とＸ２、または、Ｘ３とＸ４は、完全に相補的に結合するものでなくてもよく、ミスマッチまたはバルジを含むものであってよい。
【００３９】
本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、好ましくは、ＭｓまたはＭｋがＧカルテット構造を形成する。Ｇカルテット構造は、４つのグアニンが四量体となって形成される正方形の平面構造であり、これが２面以上重なってグアニン四重鎖構造（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成する。ＭｓまたはＭｋがＧカルテット構造を形成する核酸アプタマーは、マイクロベシクルに対する認識能および高い結合能を有することができる。
【００４０】
第三の実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、配列番号１０７〜２０６からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含む。配列番号１０７〜２０６からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含むアプタマーは、マイクロベシクルに対し高い結合親和性を有する。
【００４１】
本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、好ましくは、配列番号１０７〜２０６からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列を含む。一般に、標的分子に対する高い結合親和性を有する核酸アプタマーとして取得された配列については、変異を導入し、さらなる塩基配列の最適化を行うことが可能である。すなわち、配列番号１０７〜２０６のいずれかの塩基配列を含むマイクロベシクル結合性核酸アプタマーについて、１〜数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加することにより最適化された核酸アプタマーも、マイクロベシクルに対し高い結合親和性を有することができる。最適化により置換、欠失、挿入または付加される塩基の数は、特に限定されないが、好ましくは５塩基以内、４塩基以内、３塩基以内であり、特に好ましくは２塩基または１塩基である。
【００４２】
なお、本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、配上記特定の塩基配列のみからなる核酸に限定されない。すなわち、上記特定の塩基配列を含み、マイクロベシクルに対して結合能を有する限り、任意の塩基配列が付加された核酸であってよい。また、アプタマーを構成する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、人工核酸、修飾核酸（例えばアミノ酸側鎖を付加したもの）などであってよく、部分的にこれらの核酸を混合したものであってもよい。また、各核酸は、必要に応じてフッ素やメチル基などにより修飾された塩基を含んでいてもよいし、リン酸部分にチオ化などの修飾を含んでいてもよい。
【００４３】
本発明に係る核酸アプタマーは、３’末端と５’末端のいずれか一方またはそれらの両方が修飾されていてもよい。核酸の安定性を改善するためである。上述の通り、一般に、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は、核酸アプタマー立体構造によりもたらされるので、その立体構造が維持される限り、核酸アプタマーの末端に他の塩基配列や修飾物質が付加されていても、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は維持されることが周知である。末端修飾の例としては、ビオチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、蛍光物質、発光物質、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ペプチド、アミノ酸、脂質などが挙げられる。また、上記修飾は、スペーサー配列を介して核酸アプタマーに対して結合されてもよい。スペーサー配列は任意の長さであり得るが、好ましくは０〜２０塩基であり得る。
【００４４】
本発明に係る核酸アプタマーは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法により取得することができる（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２４９，  ｐｐ．５０５−５１０，  １９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列を含む核酸ライブラリーから、標的分子と結合する核酸を選択し増幅するサイクルを複数回、例えば５〜２０回繰り返すことによって、標的分子と高い親和性で結合する核酸のみを選別する方法である。すなわち、本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、マイクロベシクルを標的分子としてＳＥＬＥＸ法を実施することにより取得することができる。
【００４５】
上記標的分子として使用されるマイクロベシクルは、生体試料や細胞培養液から得ることができる。マイクロベシクルは、限外ろ過法、密度勾配遠心分離法、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、免疫沈降法、液体クロマトグラフィーなどによって得たものを用いることができる。
【００４６】
本発明に係る核酸アプタマーが標的とするマイクロベシクルは、好ましくは、その直径が１０〜２００ｎｍのものであり、特に好ましくはエキソソームである。「エキソソーム」とは、細胞から分泌される脂質二重膜小胞のうち、エンドソームに由来し、かつ、その直径が約３０〜１００ｎｍの大きさのものを意味する。
【００４７】
ＳＥＬＥＸ法により取得した核酸アプタマーは、その塩基配列を決定した後、従来公知の種々の合成法によって調製することができる。例えば、核酸アプタマーは、化学合成法によって調製することができる。化学合成法は、同一の核酸アプタマーを大量に調製できる点で好ましい。
【００４８】
本実施形態のマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、マイクロベシクルに対して、既存の抗マイクロベシクル抗体と同等の結合親和性を有する。そのため、マイクロベシクルの検出、単離などの用途に有用である。
【００４９】
本発明は、第二の態様によれば、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いて、マイクロベシクルを検出する方法である。
【００５０】
本実施形態の検出方法は、抗体の代わりにマイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。したがって、既存の抗マイクロベシクル抗体に代えて、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いることにより、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学的染色法などの方法と同様の手順により、マイクロベシクルの検出を行うことができる。また、マイクロ流路を組み合わせた方法や、表面プラズモン共鳴を用いた方法によっても行うことができる。
【００５１】
本発明は、第三の態様によれば、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いて、マイクロベシクルを単離する方法である。
【００５２】
本実施形態の単離方法は、抗体の代わりにマイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。したがって、既存の抗マイクロベシクル抗体に代えて、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーを用いることにより、例えば、免疫沈降法、アフィニティーカラムによる精製、フローサイトメトリーによるソーティングなどにより、マイクロベシクルを単離することができる。
【００５３】
本発明は、第四の態様によれば、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーと薬物とを含む、薬物送達システムである。本態様の薬物送達システムは、１つ以上の薬物をコンジュゲートさせたマイクロベシクル結合性核酸アプタマーを含有する。本態様の薬物送達システムは、薬物送達システムを投与した対象の生体内、例えば、血中のマイクロベシクルに対して結合することにより、薬物の生体内における安定性および滞留性を改善するとともに、マイクロベシクルが標的とする細胞にのみ特異的に薬物を送達するものである。
【００５４】
本態様の薬物送達システムに含まれる薬物は、通常の薬剤成分であってよく、例えば、抗がん剤、抗炎症剤、または、感染症、免疫疾患、神経疾患もしくは変性疾患の治療薬などが挙げられる。本態様の薬物送達システムは、１つ以上の薬物を、マイクロベシクル結合性核酸アプタマーにコンジュゲートさせたものを含むことができる。薬剤が、たとえばｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸などの核酸医薬を成分とする場合には、核酸アプタマーに直接連結させてもよい。マイクロベシクル結合性核酸アプタマーと薬物とは、１：１〜１：１００のモル比で結合させることができる。
【００５５】
本態様の薬物送達システムは、あらかじめ外来性のマイクロベシクルを含むものであってもよい。この場合には、薬物送達の標的となる組織や細胞に応じて、適宜好ましい細胞種に由来する外来性のマイクロベシクルを選択することができる。外来性のマイクロベシクルには、任意の動物種または細胞種に由来するマイクロベシクルを用いることができる。
【００５６】
本態様の薬物送達システムは、マイクロベシクルと結合することにより、薬剤の生体内での安定性および滞留性を改善することができるため、薬剤の投与量・回数を減らすことができ、副作用の低減にも有用である。また、薬物送達の標的となる組織や細胞に応じて選択したマイクロベシクルと結合させることにより、マイクロベシクルが標的とする細胞にのみ選択的に薬物を送達することができ、標的とする細胞に対してのみ薬物を作用させることができるために有用である。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を挙げ、本発明について更に説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５８】
＜実施例１：マイクロベシクルの精製＞
培養液中のマイクロベシクルはＳｏｋｏｌｏｖａらの方法（Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，  Ｖｏｌ．８７，  ｐｐ．１４６−１５０，  ２０１１）に基づき、若干の改変を加えて調製した。１０ｃｍシャーレで培養した２９３Ｔ細胞の培養液（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を、無血清のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社製）に置換し、３日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を０．２２μｍの孔径のフィルターでろ過し、２００ｎｍ以上の物質を除いた。続いて、１０ｋＤａの孔径の限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、ミリポア社製）を用いて、４０ｍｌのＰＢＳ（−）により３回バッファー交換を行った後、サンプル溶液量を約１ｍｌに濃縮した。その後、１００ｋＤａの孔径の限外ろ過フィルター（ＶＩＶＡＣＯＮ  ５００、ザルトリウス・ステディム社製）を用いて、５００μｌのＰＢＳ（−）により３回バッファー交換を行った。得られたサンプルを、セファロース２Ｂ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を充填したカラムで分画し、マイクロベシクル画分を取得した。タンパク質量のプロファイルと、抗ＣＤ６３抗体によるドットブロットの結果から、得られたマイクロベシクルの大半がエキソソームであることが確認された（図５）。【００５９】
＜実施例２：ＳＥＬＥＸ法によるマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのスクリーニング＞
マイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法により作製した。ＳＥＬＥＸ法は、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，ＡＤ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，ＪＷ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３４６，  ｐｐ．８１８−８２２，  １９９０）およびＧｏｌｄらの方法（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２４９，  ｐｐ．５０５−５１０，  １９９０）を参考にし、西川らの方法に基づいて行った（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｆ．，  Ｎｏｄａ，Ｋ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，  Ｐｒｉｏｎ，  Ｖｏｌ．２，  ｐｐ．７３−８０，  ２００８）。【００６０】
最初のラウンドで使用したＲＮＡプールは、化学合成されたＤＮＡを鋳型とし、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてインビトロ転写を行うことにより調製した。ＲＮＡプールは、５５ｍｅｒのランダム化領域（ｎ５５）の両端に各２１ｍｅｒの領域を含むＤＮＡを鋳型としたもの（Ｓプール）と、３０ｍｅｒのランダム化領域（ｎ３０）の両端に各１５ｍｅｒの領域を含むＤＮＡを鋳型としたもの（Ｋプール）の２種類を調製した。【００６１】
鋳型ＤＮＡとプライマーの配列は、以下の通りである。
（Ｓプール）
鋳型ＤＮＡ（Ｓ）：  ５’−ｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｃｔｇａａｇｇａｇａ−ｎ５５−ａｃｔｔｃｇｃａａｔｃｇｃｔｃｔａｃｇｃａ−３’（配列番号１）
フォワード（Ｆｗｄ）プライマー（Ｓ）：  ５’−ｔｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｃｔｇａａｇｇａｇａ−３’（配列番号２）
リバース（Ｒｅｖ）プライマー（Ｓ）：  ５’−ｔｇｃｇｔａｇａｇｃｇａｔｔｇｃｇａａｇｔ−３’（配列番号３）
（Ｋプール）
鋳型ＤＮＡ（Ｋ）：  ５’−ｇｇｔａｇａｔａｃｇａｔｇｇａ−ｎ３０−ｃａｔｇａｃｇｃｇｃａｇｃｃａ−３’（配列番号４）
フォワード（Ｆｗｄ）プライマー（Ｋ）：  ５’−ｔｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｔａｇａｔａｃｇａｔｇｇａ−３’（配列番号５）
リバース（Ｒｅｖ）プライマー（Ｋ）：  ５’−ｔｇｇｃｔｇｃｇｃｇｔｃａｔｇ−３’（配列番号６）
ｎは、ａ，ｃ，ｇまたはｔを示す。Ｆｗｄプライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。【００６２】
上記鋳型ＤＮＡとプライマーに、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属のバッファー、終濃度１０ｍＭのＤＴＴ、終濃度各５ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、２’−Ｆ−ｒＣＴＰおよび２’−Ｆ−ｒＵＴＰ、ならびに逆転写酵素を加え、３７℃で６時間反応させた。その後、同Ｋｉｔに付属のＤＮａｓｅを加え、３７℃で１５分反応させることにより、鋳型ＤＮＡを分解した。得られたＲＮＡ産物は、バイオゲルＰ−３０充填マイクロバイオスピンカラム（バイオ・ラッド社製）により精製した。【００６３】
得られたＲＮＡは、ピリミジンヌクレオチド（ｃおよびｕ）のリボースの２’位がフルオロ化されたものである。また、得られたＲＮＡプールに含まれるＲＮＡのバリエーションは、Ｓプールについては１×１０３３、Ｋプールについては１×１０１８である。【００６４】
続いて、実施例１において調製したマイクロベシクルと、上記ＲＮＡプールの結合反応を行った。結合反応は、結合バッファー（２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭ塩化カルシウム）を用い、必要に応じて競合物質（ｔＲＮＡ）の存在下、下記の表１の条件により、室温にて行った。反応後、０．４５μｍ孔径ニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過することにより、マイクロベシクル−ＲＮＡ複合体を膜上に回収した。この膜を、７Ｍ尿素／１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液に入れ、９８℃で５分間加熱した後、溶液を回収し、エタノール沈殿によりＲＮＡを精製した。【００６５】
精製されたＲＮＡについて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １本鎖ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応を行った。具体的には、上記精製したＲＮＡ（〜数十μｇ）に、ｄＮＴＰを１．２５μｍｏｌ、ＦｗｄプライマーおよびＲｅｖプライマーを各２５ｐｍｏｌ加え、６５℃で５分間反応させた後、４℃に冷却した。その後、キットに付属のバッファー、ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素（１００Ｕ）を加え、３０℃で１０分間、３７℃で１０分間、４２℃で４０分間、５２℃で３０分間、９８℃で５分間反応させた。【００６６】
得られた逆転写産物について、ＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡを増幅した。具体的には、逆転写産物（〜数十μｇ）に、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）に付属のバッファー、終濃度０．８ｍＭのｄＮＴＰ、終濃度１．２５μＭのＦｗｄプライマーおよびＲｅｖプライマー、０．５ＵのＥｘ  Ｔａｑを加え、９４℃６０秒間の反応の後、９８℃１０秒間、５５℃３０秒間、７２℃６０秒間のサイクルを繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。サイクル数は、アガロースゲル電気泳動により、増幅産物を確認することにより決定した。【００６７】
得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製した。精製されたＰＣＲ産物から、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いたインビトロ転写により、逆転写ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡ産物は、バイオゲルＰ−３０充填マイクロバイオスピンカラム（バイオ・ラッド社製）により精製した。【００６８】
精製ＲＮＡ産物から所望でないニトロセルロース膜結合性ＲＮＡを除去するために、精製ＲＮＡ産物をニトロセルロース膜に通過させた（負の選択）。【００６９】
上記工程を１ラウンドとして、１０回のスクリーニングラウンドを繰り返した。各スクリーニングラウンドにおける詳細な反応条件を、以下の表１に示す。【００７０】
【表１】
2015083731.tif 000002
【００７１】
１０回のスクリーニングラウンドを繰り返して得られたＤＮＡプールについて、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）とそのキットＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２を用いて、塩基配列を包括的に解析した。【００７２】
得られた塩基配列を表２および表３に示す。【００７３】
【表２】
2015083731.tif 000003
【００７４】
【表３】
2015083731.tif 000004
【００７５】
実際のアプタマーの配列は、Ｆｗｄプライマー配列（ただし、Ｔ７プロモーターの転写開始点より上流の配列：ＵＧＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡを除く）−ランダム化領域配列−Ｒｅｖプライマーの逆向き相補配列である。また、アプタマー中、すべての塩基の糖はリボースであり、ｔは２’−Ｆ−Ｕであり、ｃは２’−Ｆ−Ｃである。【００７６】
実際のＲＮＡアプタマーの塩基配列を表４および表５に示す。【００７７】
【表４Ａ】
2015083731.tif 000005
【００７８】
【表４Ｂ】
2015083731.tif 000006
【００７９】
【表５Ａ】
2015083731.tif 000007
【００８０】
【表５Ｂ】
2015083731.tif 000008
【００８１】
＜実施例３：モチーフ検索＞
上記ＳプールおよびＫプールから得られたアプタマーの上位５０配列に対して、ＭＥＭＥ  Ｓｕｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｎｂｃｒ．ｎｅｔ／ｍｅｍｅ／）を使用してモチーフ検索を行った。【００８２】
結果を図１に示す。図１は、ＭＥＭＥに準拠した表示であり、縦軸はモチーフ配列の各位置における塩基の出現頻度（ビットスコア）を示し、横軸は塩基配列を示す。図１（ａ）は、Ｓプールから得られたアプタマーの上位５０配列に対する解析結果を示す。図１（ｂ）〜図１（ｄ）は、Ｋプールから得られたアプタマーの上位５０配列に対する解析結果を示す。この結果から、Ｓプールから濃縮されたアプタマーとＫプールから濃縮されたアプタマーの両方に保存されたモチーフＭｓ：ＹＲＣＧＧＨＧＧＷＲＷＫＧＧＧＲＮ（配列番号２０７）と、Ｋプールから濃縮されたアプタマーのみに保存されたモチーフＭｋ：ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）またはＲＶＤＤＧＧＧＨＴＣＴＡＣ（配列番号２１１）が存在することが明らかになった。【００８３】
図１（ａ）の結果をもとに、Ｓプールから濃縮されたアプタマーについてアラインメントを行い整列した結果を図２に、図１（ｃ）の結果をもとに、Ｋプールから濃縮されたアプタマーについてアラインメントを行い整列した結果を図３に示す。この結果から、Ｓプールから得られたアプタマーは共通してモチーフＭｓを有し、Ｋプールから濃縮されたアプタマーは共通してモチーフＭｋを有していることが確認された。【００８４】
＜実施例４：モチーフの二次構造予測＞
続いて、上記のモチーフＭｓおよびＭｋの二次構造予測を行った。モチーフＭｓを有するアプタマーである配列番号１１４、および、モチーフＭｋを有するアプタマーである配列番号１５９について、ＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄプログラム（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．３７（Ｓｕｐｐｌ．２），  ｐｐ．Ｗ２７７−Ｗ２８０，  ２００９）により二次構造を予測した。【００８５】
結果を図４および図５に示す。配列番号１１４と配列番号１５９のアプタマーは、いずれもステムループ構造を形成し、モチーフＭｓとモチーフＭｋは、いずれもループ構造を形成するものであることが示された。【００８６】
実施例３および４の結果に基づき、推定されるアプタマーの構造は以下の通りである。
モチーフＭｓを有するアプタマー：
５’−Ｘ１−Ｍｓ−Ｘ２−３’（ここで、Ｍｓは、ＹＲＣＧＧＨＧＧＷＲＷＫＧＧＧＲＮ（配列番号２０７）であり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、それぞれ独立に、ＡまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ１およびＸ２は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）
モチーフＭｋを有するアプタマー：
５’−Ｘ３−（Ｎ）ｍ−Ｍｋ−（Ｎ）ｎ−Ｘ４−３’（ここで、Ｍｋは、ＲＲＲＤＤＲＮＤＲＧＲＫＷ（配列番号２０８）であり、Ｒは、それぞれ独立に、ＡまたはＧであり、Ｄは、それぞれ独立に、Ａ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｋは、ＧまたはＴもしくはＵであり、Ｗは、ＡまたはＴもしくはＵであり、ｍは、９から１５までのいずれかの整数であり、ｎは、０から４までのいずれかの整数であり、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ０〜５０個のヌクレオチドを表し、かつ、Ｘ３およびＸ４は相補的に結合して０〜５０塩基対のステムを形成する）【００８７】
＜実施例５：モチーフのマイクロベシクルに対する結合能評価＞
実施例３および４の結果から予測されたモチーフのうち、マイクロベシクル結合能に重要であるループ構造部分についてさらに詳細に解析するために、ステム構造部分を短くした以下のアプタマーを合成した。５’末端にはビオチン標識を導入した。
Ｓモチーフアプタマー：  ５’−ｇｇｃｃＡＣＧＡＣＧＣＧＧＡＧＧＵＧＵＧＧＧＧＧＡＵＣＧＵｇｇｃｃ−３’（配列番号２０９）
Ｋモチーフアプタマー：  ５’−ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＵＵＣＵＡＣＣ−３’（配列番号２１０）
（ここで、小文字はＤＮＡを、大文字はＲＮＡを表す。また、ＵとＣはフッ素により修飾されている。また、下線は、モチーフＭｓ（配列番号２０７）またはモチーフＭｋ（配列番号２０８）に相当する部分を示す。）【００８８】
フィルターバインディングアッセイにより、上記アプタマーのマイクロベシクルに対する結合能を評価した。ＳモチーフアプタマーまたはＫモチーフアプタマー（各１００ｐｍｏｌ）と実施例１において調製したマイクロベシクル（１０ｍｇ）とを、実施例２で用いた結合バッファーに０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたバッファー（以下、「０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファー」と記載する）中にて、室温で２時間反応させた。その後、反応液を０．４５μｍ孔径ニトロセルロース膜（ミリポア社製）により濾過した。その後、５ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーを通過させることにより、フィルターを洗浄した。洗浄後のフィルターを、１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡを含む３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーでフィルターをブロッキングし、４．５ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーにより１０分間１回洗浄した後、０．３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーにより１／１０００希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン（サーモサイエンティフィック社）と、室温で１時間反応させた。その後、ＥＣＬキット（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて化学発光反応を行い、結合の検出を行った。【００８９】
結果を図６に示す。ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーのいずれも、マイクロベシクルに対する結合能を有するものであることが示された。【００９０】
＜実施例６：モチーフと抗マイクロベシクル抗体のマイクロベシクルに対する結合能の比較＞
Ｓモチーフアプタマーと、市販の抗マイクロベシクル抗体のマイクロベシクルに対する結合能を比較するために、ドットブロットを行った。抗マイクロベシクル抗体として、抗ＣＤ６３抗体（ＭＸ−４９．１２９．５、サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を用いた。ＣＤ６３はエキソソームのマーカータンパク質として知られており、抗ＣＤ６３抗体は、エキソソームの検出・単離のために一般的に使用されている。【００９１】
ニトロセルロース膜上に、実施例１で得られたマイクロベシクル画分（フラクション３〜１０）を２μｌ滴下し、室温で３０分風乾させることによって、マイクロベシクルを固定し、その後、１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡを含有する１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファー（以下、「ブロッキングバッファー」と記載する）にて、室温で１時間、ブロッキングを行った。その後、ニトロセルロース膜を、Ｓモチーフアプタマー／ブロッキングバッファー（終濃度２００ｎＭ）中にて、室温で１時間インキュベーションすることにより、結合反応を行った。反応後のニトロセルロース膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーにより洗浄した後、ＵＶ架橋により、マイクロベシクルに結合したＳモチーフアプタマーを固定した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーにより１／４０００希釈されたＨＲＰ標識アビジン（サーモサイエンティフィック社）と、室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有結合バッファーによる３回の洗浄後、ＥＣＬキット（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて化学発光反応を行い、結合の検出を行った。【００９２】
マイクロベシクルと抗ＣＤ６３抗体との結合反応については、３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳによる室温で１時間のブロッキング後、上記の抗ＣＤ６３抗体を一次抗体として用い（１：１０００希釈／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）、室温で１時間インキュベーションすることにより、結合反応を行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳにより１５分３回洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用い（１：２０００希釈／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）、室温で１時間インキュベーションすることにより、結合反応を行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳにより１５分３回洗浄後、Ｓモチーフアプタマーと同様に、化学発光により、マイクロベシクルに対する抗ＣＤ６３抗体の結合を検出した。【００９３】
結果を図７（ａ）に示す。Ｓモチーフアプタマーのマイクロベシクルに対する検出感度は、市販の抗ＣＤ６３抗体と同等であった。【００９４】
Ｓモチーフアプタマーがマイクロベシクルに対して結合していることをさらに確認するために、変性処理したマイクロベシクルサンプルに対するドットブロットを行った。変性処理したマイクロベシクルサンプルとして、実施例１において調製したマイクロベシクルを、（１）結合バッファー中で２分間煮沸したものと、（２）２％ＳＤＳ含有サンプルバッファー中で２分間煮沸したものを作製した。なお、（１）の条件によれば部分的に、（２）の条件によれば完全にマイクロベシクルを変性させることができる。ドットブロットは、上記と同様の手順により行った。【００９５】
結果を図７（ｂ）に示す。変性処理をしていないマイクロベシクルサンプル（レーン１）と比較して、マイクロベシクルを緩やかに変性させたサンプル（上記（１）、レーン２）ではＳモチーフアプタマーの結合が減少し、マイクロベシクルを完全に変性させたサンプル（上記（２）、レーン３）ではＳモチーフアプタマーの結合が完全に消失した。この結果から、Ｓモチーフアプタマーはマイクロベシクルに対して特異的に結合していることが確認された。【００９６】
＜実施例７：表面プラズモン共鳴法によるアプタマーのマイクロベシクルに対する結合能の評価＞
Ｓモチーフアプタマー（配列番号２０９）とＫモチーフアプタマー（配列番号２１０）の、マイクロベシクルに対する結合能を、表面プラズモン共鳴法により評価した。具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）とストレプトアビジンでコートされたセンサーチップ（センサーチップＳＡ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を使用した。約１５０ＲＵのＳモチーフアプタマーまたはＫモチーフアプタマーをチップに結合させた。アナライトとなる２９３Ｔ細胞由来またはＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のマイクロベシクルは、実施例１と同様の手順により調製したものについて、約６ｍｇ／ｍｌを１として、１／４０、１／８０、１／１２０、１／１４０、および１／１６０の濃度に調製し、結合レベルの測定に使用した。ランニングバッファーには、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０／結合バッファーを用いた（流速１０μｌ／ｍｌ）。【００９７】
結果を図８〜１１に示す。結合反応曲線から求めた解離定数（Ｋｄ）は、Ｓモチーフアプタマーと２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクルとのＫｄは２．３７×１０２μｇ／ｍｌ、ＳモチーフアプタマーとＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のマイクロベシクルとのＫｄは１．２３×１０２μｇ／ｍｌ、Ｋモチーフアプタマーと２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクルとのＫｄは１．３８×１０２μｇ／ｍｌ、ＫモチーフアプタマーとＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のマイクロベシクルとのＫｄは０．５７×１０２μｇ／ｍｌであった。この値から、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーのいずれも、マイクロベシクルに対し、一般的な抗体以上の極めて高い結合親和性を有するものであることが明らかになった。【００９８】
＜実施例８：円偏光二色性スペクトル測定によるアプタマーの構造解析＞
Ｓモチーフアプタマー（配列番号２０９）とＫモチーフアプタマー（配列番号２１０）について、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定することにより、モチーフの立体構造を解析した。具体的には、Ｊ−８２０（日本分光社製）により、０．１ｃｍ光路長の石英セルを用いて、２５℃、２２０〜３２０ｎｍにて測定した。バッファーは、２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭ塩化カルシウムをベースとし、塩化カリウムを終濃度０．０、０．１、０．３、１．０、５．０、１０．０、５０．０および１００ｍＭになるように加えた。また、バッファーを２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）とし、塩化カリウムを終濃度０．０、０．１、０．３、１．０、５．０、１０．０、５０．０および１００ｍＭになるように加えた場合も評価した。【００９９】
次いで、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーの融解温度を求めた。具体的には、バッファー（２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化カリウム）において、温度を２５℃から９５℃まで変化させながら、２７０ｎｍの蛍光強度を測定することにより求めた。また、バッファーを、２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウムとした場合も同様に測定した。【０１００】
ＣＤスペクトルの測定結果を図１２〜１５に示す。図１２および図１４に示すように、Ｓモチーフアプタマーは、カリウムイオン濃度依存的に構造が変化し、カリウムイオン濃度が上昇するにつれて、楕円率θの極大値（２６０〜２８０ｎｍ付近）が上昇した。Ｋモチーフアプタマーについても、Ｓモチーフアプタマーと同様のカリウムイオン濃度依存的な構造変化が見られた（図１３および図１５）。また、図１５の結果から、カリウムイオン濃度が０．１ｍＭ以上の場合に、楕円率θの極大が長波長側へとシフトすることが明らかになった。これらの結果から、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーはいずれも、カリウムイオン依存的に平行グアニン四重鎖構造（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成することが示唆された。【０１０１】
融解温度測定の結果を図１６〜１９に示す。ＳモチーフアプタマーもＫモチーフアプタマーも、７０〜８０℃の高温において楕円率θが極小を示しており、このことは、モチーフが単純な二重鎖構造ではない熱安定性の高い構造を形成していることを示唆するものである（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，  Ｖｏｌ．１７７（２３），  ｐｐ．６８９６−６９０５）。すなわち、この結果から、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーはいずれも平行四重鎖構造を形成していることが示唆された。また、低温域に極大が見られることから、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーのいずれも、アプタマーの両末端の塩基配列が二重鎖構造を形成していることが予想された。【０１０２】
＜実施例９：アプタマーのマイクロベシクルに対する結合能に対するカリウムイオン濃度の影響＞
次いで、Ｓモチーフアプタマー（配列番号２０９）とＫモチーフアプタマー（配列番号２１０）のマイクロベシクルに対する結合能が、カリウムイオン濃度依存的に変化するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により解析した。実施例１と同様の手順により調製した２９３Ｔ細胞由来のマイクロベシクル（８１ｍｇ／ｍｌ）と、１０ｍＭ塩化カリウムを含むまたは含まない結合バッファーとを用い、実施例７と同様の条件にて測定を行った。【０１０３】
結果を図２０に示す。カリウムイオン存在下における結合反応曲線を実線、カリウムイオン不在下における結合反応曲線を破線により示す。Ｓモチーフアプタマー（図２０上段）とＫモチーフアプタマー（図２０下段）はいずれも、カリウムイオン依存的にマイクロベシクルに対する結合能が増加することが示された。この結果から、ＳモチーフアプタマーとＫモチーフアプタマーはいずれも平行グアニン四重鎖構造を形成し、この平行グアニン四重鎖構造がカリウムイオン濃度依存的に安定化されることにより、アプタマーのマイクロベシクルに対する結合能が増強されることが示唆された。【０１０４】
以上の結果から想定される、本発明に係るマイクロベシクル結合性核酸アプタマーの立体構造を図２１に示す。矢印は、核酸の５’→３’方向を示しており、二点鎖線は、４つのグアニンにより形成された四量体平面（Ｇカルテット構造）を示す。本発明に係るマイクロベシクル結合性核酸アプタマーのモチーフ部分は、２面のＧカルテット構造が重なった平行グアニン四重鎖構造をとり、この平行グアニン四重鎖構造を介してマイクロベシクルに結合する。【０１０５】
このように、本発明に係るマイクロベシクル結合性核酸アプタマーは、マイクロベシクルに対し高い結合親和性を有しており、マイクロベシクルを捕捉できるものであることが確認された。また、本発明に係るマイクロベシクル結合性核酸アプタマーを使用することにより、マイクロベシクルの検出方法および単離方法、ならびに薬物送達システムを提供することができることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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