(57)【要約】本発明は、ナノファイバー化したキチンおよび／またはナノファイバー化したキトサンを含む植物の病害抵抗性誘導剤、ならびにナノファイバー化したキチンおよび／またはナノファイバー化したキトサンを植物に適用することを特徴とする植物の病害抵抗性誘導方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを含む、植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項２】
キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項３】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項２記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項４】
キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項２または３記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項５】
キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項６】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項５記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項７】
キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項５または６記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項８】
キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項９】
キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項１０】
キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを植物に適用することを特徴とする、植物の病害抵抗性誘導方法。
【請求項１１】
キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
植物の病害抵抗性誘導剤を製造するための、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用。
【請求項２０】
キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項２０または２１記載の使用。
【請求項２３】
キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２４】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項２３または２４記載の使用。
【請求項２６】
キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１９記載の使用。
【請求項２７】
キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１９記載の使用。
【請求項２８】
植物の病害抵抗性を誘導するための、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用。
【請求項２９】
キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項２９または３０記載の使用。
【請求項３２】
キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項２８記載の使用。
【請求項３３】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項３２または３３記載の使用。
【請求項３５】
キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項２８記載の使用。
【請求項３６】
キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項２８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の病害抵抗性誘導技術に関する。詳細には、ナノファイバー化したキチンおよび／またはナノファイバー化したキトサンを含む植物の病害抵抗性誘導剤、ならびにナノファイバー化したキチンおよび／またはナノファイバー化したキトサンを植物に適用することを特徴とする植物の病害抵抗性誘導方法に関する。なお、本願は、平成２５年（２０１３年）１０月３１日出願の日本国特許出願第２０１３−２２７２８２号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１３−２２７２８２号の全内容を本願に取り入れる。
【背景技術】
【０００２】
植物の病害を防止するために、一般的には薬剤の散布などの方法が採られているが、植物だけでなくそれを利用する人々に対して有害な場合もある。そこで、エリシターと呼ばれる植物の病害抵抗性を高める物質の探索が行われてきた。これまでにエリシターとして様々な化合物、重金属、紫外線、微生物菌体からの生産物などが同定されているが、生産量が少ない、高価である、ヒトに対しても有害であるなどの問題があった。【０００３】
毒性の問題がないと考えられるいくつかの天然物についてもエリシター活性が報告されている。例えばナノファイバー化していないキチン・キトサンは、植物の病害抵抗性を誘導できるエリシターとしても知られており（特許文献１、２、非特許文献１、２等参照）、植物病害防除剤として市販されているものもある。しかしながら、ナノファイバー化していないキチン・キトサンによる病害抵抗性誘導能が低い植物が多くあるという問題がある。また、キチンは水に対して不溶であることから、混合や成形などの加工性に問題があり、キトサンも強い酸性条件下でしか溶解しないため、酸による副作用も懸念される。これらの問題から、ナノファイバー化していないキチン・キトサンは、農薬に代わるような病害抵抗性誘導剤として広く利用されるには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−１４３０１３号公報
【特許文献２】特開昭６３−３３３１０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】A. Miya et al., PNAS, Vol. 104, No. 49, 19613-19618 (December 4, 2007)
【非特許文献２】K. Kishimoto et al., The Plant Journal, Vol. 64, 343-354 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毒性や副作用の問題がなく安全で、製造コストが低く、加工性に優れ、しかも広範な植物において強力な病害抵抗性を誘導する剤を開発することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ナノファイバー化したキチン・キトサンが格別顕著な植物の病害抵抗性誘導効果を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。なお、本明細書および図面において、「ナノファイバー化したキチン」を「キチンナノファイバー」あるいは「キチンＮＦ」と称することがある。また、本明細書において、「ナノファイバー化したキトサン」を「キトサンナノファイバー」あるいは「キトサンＮＦ」と称することがある。【０００８】
すなわち、本発明は以下のものに関するものである：
（１）キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを含む、植物の病害抵抗性誘導剤。
（２）キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（３）解繊工程が酸の存在下で行われる（２）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（４）キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（２）または（３）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（５）キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（６）解繊工程が酸の存在下で行われる（５）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（７）キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（５）または（６）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（８）キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（９）キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１）記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
（１０）キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを植物に適用することを特徴とする、植物の病害抵抗性誘導方法。
（１１）キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１０）記載の方法。
（１２）解繊工程が酸の存在下で行われる（１１）記載の方法。
（１３）キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（１１）または（１２）記載の方法。
（１４）キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１０）記載の方法。
（１５）解繊工程が酸の存在下で行われる（１４）記載の方法。
（１６）キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（１４）または（１５）記載の方法。
（１７）キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１０）記載の方法。
（１８）キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１０）記載の方法。
（１９）植物の病害抵抗性誘導剤を製造するための、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用。
（２０）キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１９）記載の使用。
（２１）解繊工程が酸の存在下で行われる（２０）記載の使用。
（２２）キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（２０）または（２１）記載の使用。
（２３）キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１９）記載の使用。
（２４）解繊工程が酸の存在下で行われる（２３）記載の使用。
（２５）キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（２３）または（２４）記載の使用。
（２６）キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１９）記載の使用。
（２７）キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（１９）記載の使用。
（２８）植物の病害抵抗性を誘導するための、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用。
（２９）キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（２８）記載の使用。
（３０）解繊工程が酸の存在下で行われる（２９）記載の使用。
（３１）キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（２９）または（３０）記載の使用。
（３２）キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（２８）記載の使用。
（３３）解繊工程が酸の存在下で行われる（３２）記載の使用。
（３４）キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる（３２）または（３３）記載の使用。
（３５）キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（２８）記載の使用。
（３６）キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、（２８）記載の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微量のキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを植物に適用することで、安全、安価、簡単に、しかも極めて効果的に植物の病害抵抗性を誘導することができる。また本発明の植物の病害抵抗性誘導剤は水の分散液などの形状にすることができることで、取り扱いや植物への適用が容易であり、かつ溶媒による副作用を無くすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、植物（シロイヌナズナ）におけるキチンナノファイバー、キトサンナノファイバー、ナノファイバー化していないキトサン、キチン２〜６量体の病害抵抗性誘導能を、植物体内で産生される活性酸素の発生量を指標に解析した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、植物（イネ）におけるキチンナノファイバー、キトサンナノファイバー、ナノファイバー化していないキトサン、キチン２〜６量体の病害抵抗性誘導能を、植物体内で産生される活性酸素の発生量を指標に解析した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、キチンナノファイバーあるいはキチン２〜６量体を適用したシロイヌナズナにトマト斑葉細菌病菌を接種した場合の葉内細菌増殖率を示すグラフである。
【図４】図４は、キチンナノファイバーあるいはキトサンナノファイバーを適用したイネにイネいもち病菌を接種した場合の植物体の写真である。ＤＷは蒸留水である。
【図５】図５は、キチンナノファイバーあるいはキトサンナノファイバーを適用したイネにイネいもち病菌を接種した場合の罹病度を示すグラフである。ＤＷは蒸留水である。
【図６】図６は、キチンナノファイバーあるいはキトサンナノファイバーを適用したトマトにトマト萎凋病菌を接種した場合の罹病度を示すグラフである。上のパネルは外部病徴指数を、下のパネルは内部病徴指数を示す。ＤＷは蒸留水である。
【図７】図７は、キチンナノファイバーあるいはキトサンナノファイバーを適用したキュウリにウリ類炭疽病菌の胞子懸濁液を接種した場合の病斑直径を示すグラフである。
【図８】図８は、キチンナノファイバーあるいはキトサンナノファイバーを適用したナシ果実にナシ黒斑病菌を接種した場合の果実上の壊死病斑面積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１つの態様において、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを含む、植物の病害抵抗性誘導剤に関するものである。
【００１２】
本明細書において、「病害抵抗性誘導」とは、感染症に対する植物の抵抗性を高めることをいう。感染症は微生物等によるものを包含し、特に限定されない。感染症の例としては、イネいもち病、イネ白葉枯病、オオムギうどんこ病、コムギ赤かび病、トマト萎凋病、トマト斑葉細菌病、ナス科青枯病、ウリ類炭疽病、ウリ類モザイク病、アブラナ科類炭疽病、アブラナ科根こぶ病、ナシ黒斑病、ダイズ茎疫病、灰色カビ病、根頭がん腫病、サクラてんぐ巣病などが挙げられる。また、「病害抵抗性誘導」は、病害を未然に防止するための抵抗性誘導である。
【００１３】
本発明の剤を適用する植物の種類は特に限定されず、食用作物、園芸品種、草本、樹木などの別を問わないが、キチン、キトサンをエリシターとしている植物が好ましい。このような植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、ハトムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、タケ、ササ、サトウキビ、ヨシ、シバなどのイネ科植物；キュウリ、スイカ、カボチャ、ヒョウタン、ヘチマ、トウガン、テッポウウリ、ユウガオ、ニガウリ、メロン、ゴーヤなどのウリ科植物、トマト、ナス、トウガラシ、ピーマン、タバコ、ジャガイモ、ホオズキ、ペチュニア、クコなどのナス科植物、ダイコン、コマツナ、キャベツ、チンゲンサイなどのアブラナ科、イチゴ、リンゴ、ナシなどのバラ科、ダイズ、エンドウ、ソラマメ等のマメ科などが挙げられるが、これらに限らない。
【００１４】
本発明の植物の病害抵抗性誘導剤の有効成分はキチンナノファイバーおよび／またはナキトサンナノファイバーである。キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーは、キチン含有材料から製造することができる。
【００１５】
本発明の剤に用いられるキチンナノファイバーは、ファイバーの長さが約１μｍ以上であり、平均脱アセチル化度が約５％以下、幅（または径）が比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば、約２ｎｍ〜約２０ｎｍである。また、本発明の剤に使用されるキチンナノファイバーのアスペクト比は、好ましくは約５０以上、より好ましくは約１００以上である。好ましくは、その繊維は伸びきり鎖微結晶であることが好ましい。本明細書において、例えば、「キチンナノファイバーの幅（または径）は約２ｎｍ〜約２０ｎｍ」とは、走査型プローブ顕微鏡にて観察した場合に、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２０ｎｍ以下であるファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。さらに、後述するキトサンナノファイバーの幅（または径）についていう場合も同様である。このようなキチンナノファイバーの製造方法は当業者に公知であり、例えば、カニやエビの殻を原料とし、精製によって得られたキチンを酸性水溶液中において石臼式摩砕機、湿式高圧微粒化装置、高速ブレンダーなどを用いて微細化しナノファイバーに変換する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明の剤に使用されるキトサンナノファイバーは、ナノファイバーの長さが約１μｍ以上であり、ナノファイバー全体の平均脱アセチル化度は約５％以上であり、幅（または径）が比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍであり、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば約５ｎｍ〜約２０ｎｍである。また、本発明の剤に使用されるキトサンナノファイバーのアスペクト比は、好ましくは約５０以上、より好ましくは約１００以上である。好ましくは、その繊維は伸びきり鎖微結晶であることが好ましい。このようなキトサンナノファイバーは、上記のキチンナノファイバーのＮ−アセチル基の表面のみを選択的に脱アセチル化しても良い。このようなキトサンナノファイバーの製造方法は当業者に公知であり、例えば、カニやエビの殻を原料とし、精製によって得られたキチンを濃アルカリ水溶液中において還流下処理して脱アセチル化反応を行いキトサンに変換する。このキトサンを中性あるいは酸性水溶液中で、石臼式摩砕機、湿式高圧微粒化装置、高速ブレンダーなどを用いて微細化してナノファイバーに変換する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明のキチンナノファイバーは天然界から、例えばキチン含有生物由来の材料から得ることができる。キチン含有生物としては、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類またはオキアミなどが例示されるが、これらに限定されない。好ましくは、キチン含量の多い生物、例えばエビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮から本発明のキチンナノファイバーを得てもよい。ただし、生体中のキチンナノファイバーは、その周囲および間隙に存在する蛋白および炭酸カルシウムを含むマトリクスを有しているので、脱マトリクス処理を行わなければ得ることができない。ナノファイバー化されるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。エビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮は大量に存在し、しかも食品製造業において大量に廃棄されているので、安定かつ安価なキチンナノファイバーの供給源である。
【００１８】
本発明の剤に使用されるキチンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよい。例えば、市販のキチン粉末を水に懸濁し、湿式高圧ホモジナイザー処理を行うことによりキチンナノファイバーを得てもよい。また例えば、キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法によって製造されたものが好ましい。上記の好ましいキチンナノファイバーの製造方法および該製造方法により得られるキチンナノファイバーについて以下に説明する（国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書も参照のこと、参照により本明細書にその内容を一体化させる）。
【００１９】
脱蛋白により、キチンナノファイバーを囲んでマトリックスを形成している蛋白が除去される。脱蛋白処理には、アルカリ処理法、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素法などがあるが、アルカリ処理法が好適である。アルカリ処理による脱蛋白において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムなどのアルカリの水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約２〜約１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約３〜約７％（ｗ／ｖ）、例えば約５％（ｗ／ｖ）である。アルカリ処理による脱蛋白の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約８０℃以上、好ましくは約９０℃以上、さらに好ましくはアルカリ水溶液を還流しながら行う。処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は数時間〜約３日間、好ましくは数時間〜約２日間行ってもよい。
【００２０】
脱灰により、キチンナノファイバーを囲んでいる灰分、主に炭酸カルシウムが除去される。脱灰処理には、酸処理法、エチレンジアミン４酢酸処理法などがあるが、酸処理法が好適である。酸処理による脱灰において、塩酸の酸の水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約４〜約１２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約５〜約１０％（ｗ／ｖ）である。酸処理による脱蛋白の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約１０〜約５０℃、好ましくは約２０〜約３０℃、例えば室温であってもよい。酸処理による脱灰時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は数時間〜数日間、好ましくは約１〜約３日、例えば２日間行ってもよい。
【００２１】
次いで、上記工程で得られた外皮（ほとんどがキチンナノファイバーとなっている）を解繊処理し、目的のキチンナノファイバーを得る。キチンナノファイバーは乾燥すると水素結合して強固に凝集するため、本発明のキチンナノファイバーの製造方法の各工程を、材料を常に乾燥させずに行うことが好ましい。解繊処理には、石臼式摩砕器、高圧ホモジナイザー、凍結粉砕装置などの装置を用いることができ、好ましくは石臼式磨砕機などによりグラインダー処理を行う。石臼式磨砕機などのような、より強い負荷をかけることができる装置を用いれば、カニやエビなどの殻由来のアルファキチンでも速やかに解繊することができる。
【００２２】
上記のキチンナノファイバーの製造方法において、必要に応じて脱色工程を行ってもよい。脱色工程は、上記方法のいずれの段階において行ってもよいが、好ましくは、脱蛋白および脱灰処理が終わった後に行う。脱色はいずれの方法で行ってもよいが、アルコール等の有機溶剤による抽出、塩素系漂白剤や酸素系漂白剤、還元系漂白剤の使用が好ましく、例えば、酢酸緩衝液などの緩衝液中約１〜約２％の次亜塩素酸ナトリウムを用いて、約７０〜約９０℃で数時間行ってもよい。
【００２３】
さらに、脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程、解繊工程および以下に説明する酸性試薬での処理を効率よく行うために、粉砕工程を行ってもよい。粉砕工程は、上記方法のいずれの段階において行ってもよいが、好ましくは、解繊工程の直前に行う。粉砕工程はいずれの方法で行ってもよいが、ホモジナイザー処理やミキサー処理などの方法が好ましい。
【００２４】
上記の脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程、粉砕工程などの工程は、繰り返し、複数回、あるいは交互に行ってもよい。また、それぞれの行程は順序を問わない。
【００２５】
さらに、必要ならば、あるいは所望により、脱灰処理されたキチン含有材料を酸性試薬にて処理することにより、キチンナノファイバーの水分散性を向上させてもよい。酸性試薬にて処理を行うことによって、解繊工程で得られるキチンナノファイバー繊維が細く均一なものとなるので、キチンナノファイバーの水分散性が向上する。繊維が細くなり、水分散性が向上すると、植物に均一に適用することができる。酸性試薬はキチン繊維表面に正の電荷を生じさせるため、強固に凝集したキチン繊維を効率的にほぐすために都合がよい。よって、酸性試薬を用いることにより、上記の脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程を行った後、乾燥して得られるキチン凝集体も容易に解すことが可能である。酸性試薬での処理方法は特に限定されず、材料に酸性試薬を浸透させる方法であればよい。酸性試薬での処理は、典型的には酸の水溶液に脱灰処理されたキチン含有材料を浸漬することにより行うことができる。この工程では、水分散性の向上のみならず、キチンナノファイバーの繊維の幅（または径）のばらつきを抑えることもできる。この工程に使用できる酸はいずれの酸であってもよく特に限定されないが、弱酸が好ましい。弱酸としては、酢酸、蟻酸、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、クエン酸、マロン酸、アスコルビン酸などが挙げられるがこれらに限らない。この工程に使用される好ましい弱酸は酢酸である。この工程において弱酸の水溶液のｐＨを通常は約２〜約５、好ましくは約２．５〜約４．５、例えば、約３〜約４に調節する。この工程の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約１０〜約５０℃、好ましくは約２０〜約３０℃、例えば、室温であってもよい。この工程の処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は１時間〜約１日、好ましくは約３〜約１２時間、例えば、一晩であってもよい。この酸による処理工程は、解繊工程の前であればいずれの段階で行ってもよいが、脱蛋白および脱灰の後、キチンナノファイバーの精製がある程度進んだ段階で行うことが好ましく、例えば、解繊工程の直前に行ってもよい。好ましくは、酸の存在下で解繊工程を行う。本発明の剤を植物に適用するにあたり、剤に酸が残存していると植物に悪影響を与える場合もある。酸による影響をなくすために、解繊工程後にキチンナノファイバーを水で洗浄して酸を除去することが好ましい。
【００２６】
なお、キチンナノファイバーの凝集を避けるために、上で説明したキチンナノファイバーの製造方法の各工程を、材料を常に乾燥させずに行うことが好ましい。
【００２７】
上記製造方法により得ることのできるキチンナノファイバーは、細くて均質であり、しかも極めて長く、繊維が伸びきり鎖結晶である。上記製造方法により得られるキチンナノファイバーの幅（または径）は比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約２０ｎｍである。上記製造方法により、約１μｍ以上の長さのキチンナノファイバーを得ることができる。
【００２８】
さらに本発明の剤において、上記キチンナノファイバーに代えて、あるいは上記キチンナノファイバーとともに、キトサンナノファイバーを用いることもできる。キトサンナノファイバーはキチンナノファイバーの脱アセチル化物であり、部分的に脱アセチル化されていてもよく、完全に脱アセチル化されていてもよい。
【００２９】
本発明の剤に使用されるキトサンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよい。例えば、上で説明したようなキチンナノファイバーを脱アセチル化することにより、キトサンナノファイバーを得てもよい。また例えば、キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法によって製造されたものが好ましい。上記の好ましいキトサンナノファイバーの製造方法および該製造方法により得られるキトサンナノファイバーについて以下に説明する（国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書も参照のこと）。
【００３０】
キチン含有材料、脱蛋白工程、脱灰工程、解繊工程については、キチンナノファイバーの製造に関して上で説明したのと同様である。なお、脱蛋白工程と脱アセチル化工程を同時に行うことも可能である。さらに、既に脱蛋白工程および脱灰工程を行った市販のキチン粉末を脱アセチル化工程に付し、例えば湿式高圧ホモジナイザーにて処理することによって、キトサンナノファイバーを製造することも可能である。
【００３１】
脱アセチル化方法はいくつかの方法が公知であるが、アルカリ処理法が好適である。アルカリ処理による脱アセチル化において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムなどのアルカリの水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、通常は約２０〜約５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約３０〜約４０％（ｗ／ｖ）、例えば約４０％（ｗ／ｖ）である。アルカリ処理による脱アセチル化の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約８０℃以上、好ましくは約９０℃以上、さらに好ましくはアルカリ水溶液を還流しながら行う。処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は３０分〜約３日間、好ましくは３０分〜一晩行ってもよい。なお、キトサンナノファイバーの凝集を避けるために、上で説明したキトサンナノファイバーの製造方法の各工程を、材料を常に乾燥させずに行うことが好ましい。
【００３２】
上記製造方法により製造されるキトサンナノファイバーの幅（または径）は比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍであり、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば約５ｎｍ〜約２０ｎｍであり、繊維状態が伸びきり鎖結晶である。上記製造方法により、約１μｍ以上の長さのキトサンナノファイバーを得ることができる。
【００３３】
本発明の剤に用いるキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーは修飾または誘導体化されていてもよく、塩（例えば塩酸塩など）の形態であってもよい。例えば、糖の３位の水酸基、６位の水酸基、または糖鎖の末端の水酸基の水素が、アルキル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいは糖の２位のアセチル基中のメチル基が、エチル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいはキトサンの糖の２位のアミノ基の水素はアルキル基などの他の基で置換されていてもよく、ハロゲン化物イオンなどの陰イオンとの間で塩を形成してもよい。これらの修飾および誘導体あるいは塩はあくまでも例示であり、限定的なものではない。本明細書では、これらの修飾および誘導体あるいは塩もキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーに包含されるものとする。このような誘導体および修飾体あるいは塩は当業者に知られており、それらの製造方法も公知である。
【００３４】
キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーはカニやエビなどに含まれる天然物であり、安全性が非常に高い。加えて、酸ではなく水に分散させることができるため、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含む本発明の剤は植物に対する副作用がないか、あったとしても問題ないレベルである。そして、本発明の剤はヒトなどの動物に対しても毒性がなく、あったとしても問題ないレベルである。したがって、本発明の剤は、植物に対する適用量の幅が広く、適用期間や回数についても特に制限はない。長期にわたり植物に適用しても、繰り返し適用しても、あるいは多量適用しても、植物および動物に対して安全性が非常に高い。本発明の剤は環境に優しいものともいえる。
【００３５】
このような利点から、本発明の剤は、農薬に代わる新たな植物の病害抵抗性誘導剤となるものである。
【００３６】
本発明の剤の植物への適用方法は特に限定されず、あらゆる公知の方法を用いることができる。例えば、スプレー、散布、塗布などの方法により植物体に直接適用してもよく、土壌と混合する、土壌に散布、水耕栽培の養液へ混合するなどの方法により土壌に適用してもよい。また、かん水への添加剤として本発明の剤を用いることもできる。植物体への適用部位は、葉、枝、果実、根などであり、特に限定されない。
【００３７】
本発明の剤の植物への適用量は上述のごとく特に限定されない。対象とする植物および望まれる病害抵抗性誘導効果などの因子に応じて適宜変更、決定することができる。例えば１ｍｌの水にキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバー約１００μｇ以上（例：約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇなど）を分散させて調製した本発明の剤を植物体にスプレーする、あるいは土容量１００ｍｌあたり約０．１ｇ以上（例：約０．５ｇ、約１ｇなど）のキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを混ぜ込むことが可能である。
【００３８】
本発明の剤は様々な剤形にすることができる。ナノファイバー化していないキチンは水に対して不溶であることから混合や成形などの加工性に問題がある。キトサンも強い酸性条件下でないと溶解しないので、酸による植物への副作用も懸念される。本発明の剤の有効成分たるキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーはこれらの状況を打開するものである。キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーは容易に水に均一に分散するので、本発明の剤を、例えば取り扱いが容易な分散液あるいは懸濁液の剤形にすることができる。そのような剤形にすることによって、植物や土壌への適用が容易となる。また例えば、本発明の剤を濃厚な分散液あるいは懸濁液として調製しておいて、使用時に水で適宜希釈することもできる。
【００３９】
本発明の剤はキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーのいずれかを含むものであってもよく、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの両方を含むものであってもよい。植物の種類および病害の種類によってはキチンナノファイバーがより有効である場合と、キトサンナノファイバーがより有効である場合がある。当業者は、本発明の剤に含まれるキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの割合や量を決定することができる。また、本発明の剤を他の公知の植物の病害抵抗性誘導剤と併用してもよい。
【００４０】
本発明は、もう１つの態様において、キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを植物に適用することを特徴とする、植物の病害抵抗性誘導方法に関するものである。本発明の方法については、上の本発明の剤に関する説明があてはまる。
【００４１】
本発明は、さらなる態様において、植物の病害抵抗性誘導剤を製造するためのキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用、ならびに植物の病害抵抗性を誘導するためのキチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーの使用に関する。これらの使用についても、上の本発明の剤に関する説明があてはまる。
【００４２】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４３】
実施例１．シロイヌナズナを用いた病害モデルにおけるキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーによる病害抵抗性誘導試験
シロイヌナズナを用いて試験を行った。植物の病害抵抗性誘導能は、エリシターとの反応により植物体内で産生される活性酸素の発生量を指標に解析を行った。エリシターとして、キチンナノファイバー（調製法は後述）、キトサンナノファイバー（調製法は後述）、キチン２〜６量体（焼津水産化学工業社製「ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ」）およびキトサン（東京化成工業社製「Ｃ０８３１」）を用いた。実際には、ナノファイバー化していないキチン・キトサンによる病害抵抗性誘導能が低いシロイヌナズナの実生を用い、ルミノール反応を利用することで化学発光量から植物体内の活性酸素量を算出した。【００４４】
試験に用いたキチンナノファイバーを以下に説明する方法により得た。
乾燥カニ殻（カナダ産、川井肥料より購入、１００ｇ）を５％  ＫＯＨ水溶液に加え、６時間還流し、カニ殻中のタンパク質を除去した。処理したカニ殻を濾過した後、中性になるまで水でよく洗浄した。カニ殻を７％  ＨＣｌ水溶液で室温下、２日間撹拌し、カニ殻中の灰分を除いた。再びカニ殻を濾過して中性になるまで水でよく洗浄した。１．７％のＮａＣｌＯ２の０．３Ｍ酢酸ソーダ緩衝溶液に処理カニ殻を加え、８０℃、６時間撹拌し、カニ殻に含まれる色素分を除去した。再びカニ殻を濾過して中性になるまで水でよく洗浄した。カニ殻を水に分散させ、分散液を家庭用ミキサーで砕いた後、酢酸を添加してｐＨを３〜４に調整し、一晩撹拌した。酢酸処理されたカニ殻を石臼式摩砕機（スーパーマスコロイダー（ＭＫＣＡ  ６−２））に供し、キチンナノファイバーに解繊させた。キチンナノファイバーの収率は１２％であった。また、元素分析により得られたキチンナノファイバーのＮ−アセチル化率は９５％であった。【００４５】
得られたキチンナノファイバーを走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）（ＪＳＭ−６７００Ｆ、ＪＥＯＬ）にて観察した。繊維の大部分は幅約２０ｎｍ以下で、幅１０ｎｍ程度の非常に細くて長い均質なナノファイバーが多く認められた。赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ）を用いて得られたナノファイバーの評価を行ったところ、タンパク質や炭酸カルシウム分の無い精製されたキチンであることが確かめられた。Ｘ線散乱測定装置（ＸＲＤ６０００、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて得られたキチンナノファイバーの評価を行ったところ、α型の結晶性ナノファイバーであることが確かめられた。【００４６】
試験に用いたキトサンナノファイバーを以下に説明する方法により得た。
市販されている精製済みの乾燥キチン粉末（カニ殻由来ナカライテスク社製）に２０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、窒素ガスを絶えず吹き込みながら、６時間還流し、脱アセチル化を行った後、濾過して中性になるまで水でよく洗浄した。生成物をアスコルビン酸水溶液（ｐＨ５）に分散させ、分散液を家庭用ミキサーで砕いた後、石臼式摩砕機（スーパーマスコロイダー（ＭＫＣＡ  ６−２））に供し、キトサンナノファイバーに解繊させた。得られたキトサンナノファイバーを走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）（ＪＳＭ−６７００Ｆ、ＪＥＯＬ）にて観察した。繊維の大部分は幅約２〜約４０ｎｍで、平均約２０ｎｍ程度の均質なナノファイバーが多く認められた。また、元素分析の結果より得られたキトサンナノファイバーの脱アセチル化度はおよそ１０％であった。得られたキトサンナノファイバーの結晶構造はキチンナノファイバーと同様であった。すなわち、得られたキトサンナノファイバーの内部はキチンの結晶構造が保持されており、ナノファイバーの表面のみが脱アセチル化されていた。【００４７】
試験方法・手順を以下に示す。工程１〜５は植物体の準備、工程６〜１０は活性酸素の測定を説明する。植物体は野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−８）を用いた。
１．  ６穴プレートに種子を３０粒ずつ加えた（種子の大きさを揃えた）。
２．  １００ｍｌのハイター（登録商標）に４ｍｌの塩酸を加え、デシケーター内で塩素ガスを発生させ、ガス滅菌した（３ｈ）。必ずドラフト内で行った。
３．  ガス滅菌後、プレートをクリーンベンチ内で開け、塩素ガスを除去した（３０分〜一晩）。
４．  ６穴プレートの場合、８ｍｌのＭＧＲＬ，０．１％ショ糖液体培地を加え、４℃、２日間春化処理を行った。
５．  春化後、２２℃、continuous light条件下で１０日、生育させた。
６．  １０日後、生育したseedlingをピンセットを用いて、９６ウェルプレートに移した。１ウェルあたり、１ seedling入れた。傷を付けないよう、細心の注意を払って入れた。傷が付いた個体は除去した。
７．  ＭＧＲＬ，０．１％ショ糖液体培地に終濃度１００μＭになるようにＬ−０１２  （Wako）を加えた。（光で分解するため、常に遮光した）。
８．  ＭＧＲＬ，０．１％ショ糖，１００μＭ  Ｌ−０１２培地を２００μｌずつ各ウェルに加え、２時間、２２℃で静置した。（アルミホイルなどで遮光した）。
９．  化学発光測定装置ＴｒｉＳｔａｒ２  ＬＢ９４２（BERTHOLD Technologies）の電源を入れた。計測条件は１ウェルあたり１秒間計測（１分間に１度計測）とした。
１０．  ＭＧＲＬ，０．１％ショ糖液体培地に、各エリシター（キチンＮＦ、キトサンＮＦ、キトサン、キチン２〜６量体）を処理濃度になるよう添加しておいた。
１１．  プレートからＬ−０１２入りのＭＧＲＬ，０．１％ショ糖培地を除いた後（植物を傷つけないように）、エリシターを加えたＭＧＲＬ，０．１％ショ糖を加え、すぐさまプレートリーダーにセットし、測定を開始した。  【００４８】
試験結果
結果を図１に示す。シロイヌナズナにおいては、キトサンナノファイバー（１００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ）を適用した場合に活性酸素産生量が著しく増大した。キチンナノファイバーを適用した場合にも、キトサンナノファイバー（１００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ）を適用した場合の約３分の１の活性酸素産生量となった。１００μｇ／ｍｌのキチンナノファイバーを適用した場合には、１ｍｇ／ｍｌのキチン２〜６量体を適用した場合と同程度かそれ以上の活性酸素産生量となった。キトサン（１ｍｇ／ｍｌ）を適用した場合は活性酸素の産生がほとんど認められなかった。１ｍｇ／ｍｌのキトサンナノファイバーを適用した場合の活性酸素産生量は、１ｍｇ／ｍｌのキトサンを適用した場合よりも圧倒的に多かった。また、１ｍｇ／ｍｌのキチンナノファイバーを適用した場合の活性酸素産生量は、１ｍｇ／ｍｌのキチン２〜６量体を適用した場合の約３倍であった。
これらの結果から、キチン、キトサンをナノファイバー化することによって、病害抵抗性誘導能が著しく増大することが確認された。
【実施例２】
【００４９】
実施例２．イネを用いた病害モデルにおけるキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーによる病害抵抗性誘導試験
イネの培養細胞を用いて試験を行った。活性酸素産生量を指標として植物の病害抵抗性誘導能を調べたことは、実施例１と同様である。エリシターとして、キチンナノファイバー（調製法は上述）、キトサンナノファイバー（調製法は上述）、キチン２〜６量体（焼津水産化学工業社製「ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ」）およびキトサン（東京化成工業社製「Ｃ０８３１」）を用いた。【００５０】
試験方法・手順を以下に示す。工程１〜３は培養細胞の準備、工程４〜１０は活性酸素の測定を説明する。植物としてイネ培養細胞（O. sativa cv. Nipponbare）を用いた。
１．  イネ培養細胞は、一週間ごとに増えた細胞（２ｍｌ）を新しい培地（３００ｍｌ三角フラスコに９０ｍｌのＬ培地）に移植し、２５℃、１２０  ｒｐｍで暗下培養した。
２．  隔週で、滅菌済みの漏斗、茶こし、スパチュラを用いて裏ごし操作を行い、培養細胞の大きさを一定にした。
３．  実験には、濾した後２週間の培養細胞（植え継ぎ４日目）を用いた。
４．  植え継ぎ後４日目の培養細胞の培地を新しい培地に交換し、１時間振とうした。
５．  ９６ウェルプレートの１ウェルあたりの培養細胞の生重量４０ｍｇになるよう、１処理区当たり６ウェルに分注した。重量で合わせているため、処理区を増やすことでデータを安定させた。
６．  上清を除いた後、終濃度１ｍＭになるようＬ−０１２（Wako）を加えたＬ液体培地を各ウェル１００μｌずつ加えた。その後、プレートシェーカー（エッペンドルフ：ＭｉｘＭａｔｅ）を用い、７５０ｒｐｍ、２時間、２５℃、暗黒下で振とうした。
７．  化学発光測定装置ＴｒｉＳｔａｒ２  ＬＢ９４２（BERTHOLD Technologies）の電源を入れた。計測条件は１ウェルあたり１秒間計測（１分間に１度計測）とした。
８．  Ｌ液体培地に、各エリシター（キチンＮＦ、キトサンＮＦ、キトサン、キチン２〜６量体）を処理濃度になるよう添加しておいた。
９．  ２時間後、上清を除去した後、パーオキシダーゼ（１０μｌ：ファイナル１ユニット）とファイナル１ｍｇ／ｍｌになるよう各ＭＡＭＰを加えた（４０μｌになるよう調整）。（培養細胞１４０μｌ  ＋  パーオキシダーゼ１０μｌ  ＋  ＭＡＭＰ  ５０μｌ  ＝  ２００μｌ）
１０．  エリシターを加えたＬ液体培地を加え、すぐさまプレートリーダーにセットし、測定を開始した。  【００５１】
試験結果
結果を図２に示す。イネにおいては、キチンナノファイバー（１００μｇ／ｍｌ）を適用した場合に活性酸素産生量が著しく増大した。キチンナノファイバーを適用した場合の活性酸素産生量は、キチン２〜６量体を適用した場合の約４倍であり、キトサン、キトサンナノファイバーを適用した場合の約３倍であった。キトサン（１００μｇ／ｍｌ）を適用した場合はキトサンナノファイバーを適用した場合よりも活性酸素産生量がわずかに多かった。キチン２〜６量体（１００μｇ／ｍｌ）を適用した場合が最も活性酸素産生量が少なかった。
これらの結果から、ナノファイバー化したキチンを植物に適用することによって、病害抵抗性誘導能が著しく増大することが確認された。
【実施例３】
【００５２】
実施例３．シロイヌナズナへの病原菌接種実験
キチンナノファイバーまたはキチン２〜６量体をシロイヌナズナ植物体全体にスプレーした後にトマト斑葉細菌病菌を葉内に注入して感染させ、植物の病状を観察した。供試菌はトマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000株）であった。【００５３】
実験方法を以下に示す。
１．  シロイヌナズナの培養
屋内２２℃、明期８時間の条件下で培養し、培養８週目の植物を用いた。
２．  供試薬剤の処理
キチンナノファイバー分散液、各０．１または０．０１％を０．０１％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７で調製し、植物体全体にスプレー処理した。  あるいはキチン２〜６量体０．１％溶液を０．０１％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７で調製し、スプレー処理した。
３．  病原菌の接種
ナノファイバー処理２４時間後に菌を接種した。Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（５ｘ１０５  ｃｆｕ／ｍｌ）を針なしシリンジを用いて葉内へ強制注入した。
４．  罹病度の評価
接種３日後の罹病葉を摩砕し、葉内の菌を回収した。菌液をＫｉｎｇ‘ｓＢ培地上へ塗布し、２日後に出現したコロニー数を計測した。なお、一回の試験あたり、各処理区について３個体の植物を供試した。蒸留水前処理葉における菌の増殖量を１００％とした相対値で結果を算出した。【００５４】
試験結果
結果を図３に示す。キチンナノファイバー０．０１％を適用した場合は、葉内の細菌増殖率の低下はほとんど見られなかったが、キチンナノファイバー０．１％を適用した場合は、葉内の細菌増殖率の低下が確認された（対照区の約７３％）。キチン２〜６量体０．１％を適用した場合にも葉内の細菌増殖率の低下が見られたが、キチンナノファイバー０．１％を適用した場合よりも低下が抑制されていた。これらの結果から、キチンナノファイバーは、トマト斑葉細菌病菌から植物を防御することがわかった。
【実施例４】
【００５５】
実施例４．イネへの病原菌接種試験
キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーをイネの葉に直接適用した後にイネいもち病菌を接種して、植物の病状を観察した。供試植物はイネ（Oryza sativa）、品種はコシヒカリであった。供試菌はイネいもち病菌（Pyricularia oryzae）Ｎａｇａ６９−１５０菌株であった。【００５６】
試験方法を以下に示す。
１．  イネの培養
屋内の植物培養室（２８℃、明期１６時間）条件下で培養した。葉が２葉展開したものを供試植物とした。
２．  供試薬剤の処理
キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー分散液、各０．１または０．０１％に０．０１％ Tween２０で調製し、葉全体にスプレー処理した。
３．  病原菌の接種
ナノファイバー処理２４時間後に菌を接種した。いもち病菌の胞子懸濁液（５ｘ１０５個／ｍｌ）を０．０１％ Tween２０で調製し、葉全体にスプレー接種した。
４．  罹病度の評価
接種１週間後に植物の罹病状態を観察した。接種１週間後に罹病植物体数を計測し、全植物個体数に対する、無病徴、病斑形成有り、完全枯死個体の割合を算出した。なお、一回の試験あたり、各処理区について１０個体の植物を供試した。全データの平均値を算出した。【００５７】
試験結果
結果を図４に示す。キチンナノファイバー（０．０１％、０．１％）およびキトサンナノファイバー（０．１％）を適用した場合は、植物はいもち病菌から完全に防御され、枯れた部分がなかった。０．０１％のキトサンナノファイバーを適用した場合は枯れた部分が増加した。コントロール（ＤＷ）では植物全体が枯れてしまった。【００５８】
イネへの接種試験における罹病度を図５に示す。キチンナノファイバー（０．０１％、０．１％）およびキトサンナノファイバー（０．１％）を適用した場合は防御効果が顕著であり、植物は無病徴であった。０．０１％のキトサンナノファイバーを適用した場合においても、蒸留水適用群と比較して若干の防御効果が見られた。【００５９】
これらの結果から、キチンナノファイバーは、いもち病からイネを効果的に防御することがわかった。キトサンナノファイバーにも防御効果あることがわかった。
【実施例５】
【００６０】
実施例５．トマトへの病原菌接種実験
トマトの栽培土壌にキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを混ぜ込んだ後、植物基部周辺に病原菌を接種して、罹病度を調べた。供試植物はトマト（Solanum lycopersicum）、品種は桃太郎であった。供試菌はトマト萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici），レース２，ＪＣＭ１２５７５菌株であった。【００６１】
試験方法
１．  トマトの培養
屋内の植物培養室（２５℃、明期１４時間）条件下で培養した。本葉が３葉展開したものを供試植物とした。
２．  供試薬剤の処理
トマト萎凋病菌の感染を促進させるため、金属製のヘラを土中に数回突き刺すことで、トマト根部を傷つけた。各１％のキチンあるいはキトサンナノファイバーの処理量は、１ポット（土容量１００  ｍｌ）あたり１０ｍｌとし、土に混ぜ込んだ。なお、薬剤の漏出を防ぐため、ポットの底穴はテープで塞いだ。
３．  病原菌の接種
ナノファイバー処理２４時間後に菌を接種した。トマト萎凋病菌の芽胞状菌体（bud cell）  の懸濁液（１ｘ１０７個／ｍｌ）を５ｍｌ植物基部周辺に接種した。
４．  罹病度の評価
接種３週間後に罹病程度を診断した。罹病度は、外部病徴と内部病徴（植物基部導管内の病徴）を以下に記す病徴指数０−５で評価した。なお、一回の試験あたり、各処理区について５個体の植物を供試した。全データの平均値を算出した。
〈外部病徴指数〉
０：無病徴、１：下位葉の黄化、２：下位葉が黄化、萎凋しているが、植物体の上葉に病徴は認められない、３：植物体上部の葉まで黄化、萎凋している、４：植物体全体で黄化、萎凋が認められる、５：完全に枯死している
〈内部病徴指数〉
０：無病徴、１：導管が１本褐変している、２：導管が２本褐変している、３：導管が３本褐変している、４：導管が４本もしくは維管束全体が褐変、５：完全に枯死している【００６２】
試験結果
結果を図６に示す。外部病徴指数、内部病徴指数とも、キトサンナノファイバーを適用した場合に低下が顕著であり、植物が病気から効果的に防御されたことが確認された。キチンナノファイバーを適用した場合にも、外部病徴指数、内部病徴指数とも低下し、植物が病気から防御されたことが確認された。
【実施例６】
【００６３】
実施例６．キュウリへの病原菌接種実験
キチンナノファイバー、キトサンナノファイバー、キチン粉体を葉全体にスプレーした後にウリ類炭疽病菌を葉に接種して、病斑を観察した。供試菌はウリ類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）１０４−Ｔ菌株であった。【００６４】
実験方法を以下に示す。
１．  キュウリの培養
屋内の植物培養室（２５℃、明期１４時間）条件下で培養した。本葉が３葉展開したものを供試植物とした。
２．  供試薬剤の処理
キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー分散液、各０．１または０．０１％に０．０１％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７で調製し、葉全体にスプレー処理した。あるいはキチン紛体０．１％懸濁液を、０．０１％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７で調製し、葉全体に塗布した。
３．  病原菌の接種
ナノファイバー処理２４時間後に菌を接種した。ウリ類炭疽病菌の胞子懸濁液４０μｌ（５ｘ１０５個／ｍｌ）を葉上へ滴下接種した。
４．  罹病度の評価
接種１週間後に植物の罹病状態を観察した。葉上に形成された病斑直径を測定した。なお、一回の試験あたり、各処理区について３個体の植物を供試した。全データの平均値を算出した。【００６５】
試験結果
結果を図７に示す。キチン粉体を適用した場合は、病斑直径は対照区と変わりなかった。キチンナノファイバー０．０１％を適用した場合は、病斑直径の減少が確認された。キチンナノファイバー０．１％を適用した場合は、病斑直径が著しく減少し、対照区のほぼ半分となった。キトサンナノファイバー（０．１％、０．０１％）を適用した場合も病斑直径が大幅に減少し、対照区のほぼ６割となった。これらの結果から、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーがウリ類炭疽病菌から植物を防御することがわかった。
【実施例７】
【００６６】
実施例７．ナシへの病原菌接種実験
ナシ果実をキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー分散液に浸漬した後に、ナシ黒斑病菌を接種し、果実上の壊死病斑面積を調べた。供試菌はナシ黒斑病菌（Alternaria alternata Japanese pear pathotype）Ｏ−２７６菌株であった。【００６７】
実験方法を以下に示す。
１．  ナシ果実の準備
屋外のナシ園で栽培されているナシ幼果を供試植物とした。
２．  供試薬剤の処理
キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー分散液、各１％を市販の展着剤（アプローチＢＩ）０．１％で調製し、果実をＮＦ分散液中へ浸漬して処理した。
３．  病原菌の接種
ナノファイバー処理２４時間後に菌を接種した。ナシ黒斑病菌の胞子懸濁液（５ｘ１０５個／ｍｌ）を０．０１％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７で調製し、１０  μｌを果実の蒂窪部へ滴下接種した。
４．  罹病度の評価
接種１週間後に植物の罹病状態を観察した。出現した壊死病斑の面積を計測し、蒸留水処理区果実上の壊死病斑面積を１００％とした相対値で結果を算出した。なお、一回の試験あたり、各処理区について３個体の果実を供試した。【００６８】
試験結果
結果を図８に示す。キチンナノファイバーを適用した場合、およびキトサンナノファイバーを適用した場合に、顕著な壊死病斑面積の減少が見られた。したがって、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーは、ナシ黒斑病から植物を効果的に防御することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、毒性の問題がなく、安価で、しかも格別顕著な効果を有する植物の病害抵抗性誘導剤および植物の病害抵抗性誘導方法が提供される。したがって、本発明は、農業、林業、園芸、食品産業、薬用植物の栽培などにおいて利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月27日(2015.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンナノファイバーおよび／またはキトサンナノファイバーを含む、植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項２】
キチンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項３】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項２記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項４】
キチンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項２または３記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項５】
キトサンナノファイバーが下記方法：
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、脱アセチル化によって得られるキトサンを解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項６】
解繊工程が酸の存在下で行われる請求項５記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項７】
キトサンナノファイバーの製造方法の各工程が、材料を常に乾燥させずに行われる請求項５または６記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項８】
キチンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項９】
キトサンナノファイバーの幅が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、長さが約１μｍ以上である、請求項１記載の植物の病害抵抗性誘導剤。
【国際調査報告】
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