(57)【要約】  測定チップの金属膜上に血液に由来する検体が存在する状態で、励起光の反射光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を測定し、得られた測定値を用いて全血のヘマトクリット値を求める。求めた全血のヘマトクリット値を用いて、検体中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を、検体の液体成分中の被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する。
2015129615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する方法であって、
入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有する測定チップの前記金属膜上に前記検体を提供して、前記検体に含まれる被測定物質と前記捕捉体とを結合させる工程と、
前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射して、前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を測定し、得られた測定値を用いて前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定するとともに、前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、得られた測定値を用いて前記全血のヘマトクリット値を求める工程と、
前記被測定物質と前記捕捉体とが結合しており、かつ前記金属膜上に前記検体が存在しない状態で、前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射して、前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される蛍光の光量、または前記成膜面で反射した励起光の光量を測定して、前記検体中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る工程と、
前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合、前記全血のヘマトクリット値を用いて、前記第１のシグナル値を、前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する工程と、
を含む、測定方法。
【請求項２】
前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する工程では、
前記検体が希釈をしていない全血の場合は、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃ１を掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換し、
前記検体が全血の希釈液の場合は、前記第１のシグナル値に、以下の式（２）で表される変換係数ｃ２を掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する、
請求項１に記載の測定方法。
【数１】
2015129615.tif 000015
【数２】
2015129615.tif 000016
［上記式（１）および（２）において、Ｈｔは前記ヘマトクリット値であり、ｄｆは前記希釈液の希釈率である。］
【請求項３】
表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する装置であって、
入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に形成された金属膜と、前記金属膜上に配置された捕捉体とを有する測定チップを保持するためのホルダーと、
前記入射面に向かって励起光を照射する励起光照射部と、
前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される光の光量、または前記プリズムの前記成膜面で反射した励起光の光量を検出する光検出部と、
前記光検出部の検出結果から前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定し、かつ前記光検出部の検出結果から前記検体中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出し、かつ前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、前記光検出部の検出結果から前記全血のヘマトクリット値を算出するとともに、前記全血のヘマトクリット値を用いて前記第１のシグナル値を前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する処理部と、
を有し、
前記処理部は、前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記励起光照射部が前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が測定した前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を用いて前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定するとともに、前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、前記光検出部が測定した前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を用いて前記全血のヘマトクリット値を求める、
測定装置。
【請求項４】
前記処理部は、
前記検体が希釈をしていない全血の場合は、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃ１を掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換し、
前記検体が全血の希釈液の場合は、前記第１のシグナル値に、以下の式（２）で表される変換係数ｃ２を掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する、
請求項３に記載の測定装置。
【数３】
2015129615.tif 000017
【数４】
2015129615.tif 000018
［上記式（１）および（２）において、Ｈｔは前記ヘマトクリット値であり、ｄｆは前記希釈液の希釈率である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、血液中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、血液中の被測定物質を高感度かつ定量的に測定できる方法が求められている。【０００３】
血液中の被測定物質を高感度に測定できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）法および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。これらの方法では、所定の条件で光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることを利用する（例えば特許文献１参照）。【０００４】
たとえば、ＳＰＦＳでは、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被測定物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、被測定物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被測定物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被測定物質を測定することができる。【０００５】
一方、ＳＰＲ法やＳＰＦＳなどに限らず、各種測定方法で液体中の被測定物質を測定する場合、通常、測定値は、液体の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。したがって、検体として血液を用いる場合、測定値は、血液中の液体成分（血漿または血清）の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。血液中の液体成分の割合は個々人で異なるため、全血（血液）の測定値を一律に液体成分の測定値に変換することはできない。このため、検体として全血を用いる場合は、その全血のヘマトクリット値（血液中の血球の体積の割合）を測定し、ヘマトクリット値を用いて全血の測定値を液体成分（血漿または血清）の測定値に変換することが行われている。従来のヘマトクリット値の測定方法としては、血液を遠心分離するミクロヘマトクリット法や、血液の電気伝導度からヘマトクリット値を求める方法、溶血させた血液のヘモグロビン濃度からヘマトクリット値を求める方法（例えば特許文献２参照）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２７２４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＳＰＲ法やＳＰＦＳなどのＳＰＲを利用する測定方法および測定装置において、上記従来のヘマトクリット値の測定方法を採用すると、遠心分離機や電気伝導度またはヘモグロビン濃度の測定装置などのヘマトクリット値を測定するための装置を新たに用意しなければならず、製造コストおよび測定コストが増大してしまう。【０００８】
本発明の目的は、ＳＰＲを利用する測定方法および測定装置であって、新たな装置を追加することなくヘマトクリット値を用いて測定値の補正を行うことができる測定方法および測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する方法であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有する測定チップの前記金属膜上に前記検体を提供して、前記検体に含まれる被測定物質と前記捕捉体とを結合させる工程と、前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射して、前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を測定し、得られた測定値を用いて前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定するとともに、前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、得られた測定値を用いて前記全血のヘマトクリット値を求める工程と、前記被測定物質と前記捕捉体とが結合しており、かつ前記金属膜上に前記検体が存在しない状態で、前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射して、前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される蛍光の光量、または前記成膜面で反射した励起光の光量を測定して、前記検体中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る工程と、前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合、前記全血のヘマトクリット値を用いて、前記第１のシグナル値を、前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する工程と、を含む。【００１０】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定装置は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する装置であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に形成された金属膜と、前記金属膜上に配置された捕捉体とを有する測定チップを保持するためのホルダーと、前記入射面に向かって励起光を照射する励起光照射部と、前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される光の光量、または前記プリズムの前記成膜面で反射した励起光の光量を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果から前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定し、かつ前記光検出部の検出結果から前記検体中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出し、かつ前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、前記光検出部の検出結果から前記全血のヘマトクリット値を算出するとともに、前記全血のヘマトクリット値を用いて前記第１のシグナル値を前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する処理部と、を有し、前記処理部は、前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記励起光照射部が前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が測定した前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を用いて前記検体が全血または全血の希釈液であるか否かを判定するとともに、前記検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、前記光検出部が測定した前記成膜面で反射した励起光の光量、励起光の共鳴角、プラズモン散乱光の光量または励起光の増強角を用いて前記全血のヘマトクリット値を求める。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＳＰＲを利用する測定方法および測定装置において、新たな装置を追加することなく、ヘマトクリット値を正確に測定することができる。したがって、本発明によれば、血液の少なくとも一部を含む検体の液体成分中の被測定物質の量を低コスト、高感度かつ高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置の構成を示す模式図である。
【図２】図１に示される装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図３】血漿希釈液の測定値と全血希釈液の測定値との関係を示すグラフである。
【図４】図４Ａ，Ｂは、検量線を示すグラフである。
【図５】図５Ａ，Ｂは、血漿希釈液の測定値と、全血希釈液の測定値から変換した測定値との関係を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、全血希釈液および血漿希釈液のΔプラズモン散乱光量を示すグラフである。図６Ｂは、全血希釈液および血漿希釈液のΔプラズモン共鳴角を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置の代表例として、血液の少なくとも一部を含む検体に含まれる被測定物質の量を測定する表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。検体の例には、全血（分離および希釈をしていない血液）、血漿、血清、これらの希釈液が含まれる。
【００１４】
図１は、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、反射光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５２に測定チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、測定チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１５】
測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、測定チップ１０は、分析のたびに交換される。測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００１６】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射して反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射して反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
【００１７】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
【００１８】
入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００１９】
なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２０】
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２１】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。
【００２２】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２３】
また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被測定物質を選択的に測定することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被測定物質に特異的な抗体またはその断片である。
【００２４】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。液体の例には、被測定物質を含む検体（全血、血漿、血清またはこれらの希釈液）や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、基準液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。
【００２５】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２６】
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被測定物質の量を測定する。
【００２７】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、反射光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。
【００２８】
励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５２に保持された測定チップ１０に励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００２９】
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００３０】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３１】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００３２】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００３３】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３４】
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
【００３５】
たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３６】
前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。測定チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
【００３７】
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００３８】
反射光検出ユニット１２０は、共鳴角の測定や検体のヘマトクリット値の測定などを行うために、測定チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出ユニット１２０は、受光センサー１２１、角度調整機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
【００３９】
受光センサー１２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。
【００４０】
角度調整機構１２２は、金属膜３０に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー１２１の位置（角度）を調整する。角度調整機構１２２は、反射光βが受光センサー１２１に入射するように、受光センサー１２１とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
【００４１】
センサー制御部１２３は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４２】
蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出ユニット１３０は、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。
【００４３】
受光ユニット１３１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。
【００４４】
第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。
【００４５】
光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【００４６】
受光センサー１３７は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１３７は、微小量の被測定物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４７】
位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。
【００４８】
センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４９】
送液ユニット１４０は、チップホルダー１５２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、検体や標識液、基準液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、液体チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。
【００５０】
液体チップ１４１は、検体や標識液、基準液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
【００５１】
シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。
【００５２】
送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００５３】
送液ユニット１４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、測定チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、測定チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、測定チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。
【００５４】
流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、液体チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被測定物質を配置することができる。
【００５５】
搬送ユニット１５０は、測定チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出ユニット１２０または蛍光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５１およびチップホルダー１５２を含む。チップホルダー１５２は、搬送ステージ１５１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５２の形状は、測定チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５１は、チップホルダー１５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００５６】
制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、角度調整機構１２２、センサー制御部１２３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５１を制御する。また、制御部１６０は、反射光検出ユニット１２０および／または蛍光検出ユニット１３０の検出結果に基づいて、検体が全血を含む検体であるか否か、すなわち全血または全血の希釈液であるか否かを判定する処理部としても機能する。さらに、制御部１６０は、検体が全血または全血の希釈液であると判定した場合に、反射光検出ユニット１２０および／または蛍光検出ユニット１３０の検出結果に基づいて、検体に含まれる全血のヘマトクリット値を算出する処理部としても機能する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５７】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の一実施の形態に係る測定方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【００５８】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５９】
次いで、後の工程（工程Ｓ３０）で使用する基準値を測定する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、液体チップ１４１内の基準液を測定チップ１０の流路４１内に導入する。基準液は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）やトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）などの緩衝液である。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０と、反射光検出ユニット１２０または蛍光検出ユニット１３０とを操作して、ヘマトクリット値を測定するための基準値を測定する。ここで測定する基準値は、反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量および励起光αの増強角からなる群から選択される１または２以上のパラメーター値であり、この後の工程Ｓ３０で測定するパラメーター値と同じものである。ここで「反射光βの光量」とは、励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の出射面２３から出射される反射光βの光量の最小値を意味する。また、「プラズモン散乱光δの光量」とは、特定の入射角（通常は増強角）で励起光αを金属膜に照射した場合に、測定チップ１０の上方に放出されるプラズモン散乱光δの光量を意味する。
【００６０】
たとえば、反射光βの光量または励起光αの共鳴角を測定する場合は、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査させつつ、反射光検出ユニット１２０を操作して反射光βの光量を測定させる。プラズモン散乱光δの光量を測定する場合は、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して所定の入射角で励起光αを照射させつつ、蛍光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光δの光量を測定させる。励起光αの増強角を測定する場合は、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査させつつ、蛍光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光δの光量を測定させる。測定された基準値は、制御部１６０に記録される。
【００６１】
次いで、検体が全血を含む検体（例えば、全血または全血の希釈液）であるか、それ以外の検体（例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液）であるかを判定する。また、検体が全血を含む検体である場合は、検体に含まれる全血のヘマトクリット値を測定する（工程Ｓ３０）。また、この工程を行うことにより、流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に被測定物質が捕捉される（１次反応；工程Ｓ４０）。なお、検体の種類の判定（工程Ｓ３０）を行う前に１次反応（工程Ｓ４０）を行ってもよい。
【００６２】
具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、測定チップ１０の流路４１内の基準液を除去するとともに、液体チップ１４１内の検体を流路４１内に導入する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に被測定物質が捕捉される（１次反応）。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０と、反射光検出ユニット１２０または蛍光検出ユニット１３０とを操作して、反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量または励起光αの増強角を測定する。反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量および励起光αの増強角の測定手順は、基準値の測定（工程Ｓ２０）と同じである。測定値は、制御部１６０に記録される。
【００６３】
この後、制御部１６０は、測定値から工程Ｓ２０で得られた基準値を引き、検体が血球成分を含むか否かを示す変化値（Δ反射光量、Δ共鳴角、Δプラズモン散乱光量またはΔ増強角）を算出する。次いで、制御部１６０は、この変化値を指標として、検体が全血を含む検体（例えば、全血または全血の希釈液）であるか、それ以外の検体（例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液）であるかを判定する。判定結果は、制御部１６０に記録される。
【００６４】
検体が全血を含む検体である場合は、さらに、制御部１６０は、前述の変化値（Δ反射光量、Δ共鳴角、Δプラズモン散乱光量またはΔ増強角）を指標として、検体に含まれる全血のヘマトクリット値を算出する。前述の変化値は、検体に含まれる全血のヘマトクリット値に対応するため、制御部１６０は、あらかじめ準備されている検量線に前述の変化値を当てはめて、検体に含まれる全血のヘマトクリット値を算出する。
【００６５】
検量線は、全血のヘマトクリット値と、上記変化値（Δ反射光量、Δ共鳴角、Δプラズモン散乱光量またはΔ増強角）との関係を示すグラフである。図４Ａは、全血のヘマトクリット値とΔプラズモン散乱光量との関係を示すグラフ（検量線）の一例であり、図４Ｂは、全血のヘマトクリット値とΔ共鳴角との関係を示すグラフ（検量線）の一例である。同じ測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００を使用する場合は、検量線は、同じものを使用することが可能であり、例えば制御部１６０に記録されている。
【００６６】
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ５０）。ここで「光学ブランク値」とは、蛍光γの測定（工程Ｓ７０）において測定チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、測定チップ１０の流路４１内の検体を除去するとともに、液体チップ１４１内の洗浄液を用いて流路４１内を洗浄する。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、金属膜３０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。測定された光学ブランク値は、制御部１６０に記録される。
【００６７】
次いで、金属膜３０上に捕捉されている被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体（標識液）を測定チップ１０の流路４１内に導入する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に捕捉されている被測定物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。
【００６８】
次いで、蛍光βの光量を測定して、検体中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る（工程Ｓ７０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、金属膜３０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出する。第１のシグナル値は、必要に応じて、被測定物質の量や濃度などに換算される。第１のシグナル値は、制御部１６０に記録される。
【００６９】
次いで、検体が全血を含む検体（例えば、全血または全血の希釈液）であるか、それ以外の検体（例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液）であるかを判定する（工程Ｓ８０）。この工程では、工程Ｓ３０の判定結果をそのまま利用すればよい。検体が全血を含む検体（例えば、全血または全血の希釈液）である場合は、ヘマトクリット値を用いてシグナル値を変換する工程（工程Ｓ９０）に進む。一方、検体がそれ以外の検体（例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液）である場合は、ヘマトクリット値を用いたシグナル値の変換は不要であるため、検出動作を終了する。
【００７０】
検体が全血を含む検体である場合は、工程Ｓ３０で測定された全血のヘマトクリット値を用いて、工程Ｓ７０で測定された第１のシグナル値を、検体の液体成分中の被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する（工程Ｓ９０）。具体的には、検体が希釈をしていない全血の場合は、第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃ１を掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換する。一方、検体が全血の希釈液の場合は、第１のシグナル値に、以下の式（２）で表される変換係数ｃ２を掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換する。このとき、第１のシグナル値および第２のシグナル値は、蛍光βの光量であってもよいし、被測定物質の量や濃度などの換算値であってもよい。
【数１】
2015129615.tif 000003
【数２】
2015129615.tif 000004
［上記式（１）および（２）において、Ｈｔは前記ヘマトクリット値であり、ｄｆは希釈液の希釈率である。］
【００７１】
以上の手順により、検体の液体成分中の被測定物質の量を測定することができる。
【００７２】
上記の説明では、基準値の測定（工程Ｓ２０）の後に、検体を導入した状態での反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量または励起光αの増強角の測定（工程Ｓ３０）を行った。しかしながら、基準値の測定（工程Ｓ２０）の前に、検体を導入した状態での反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量または励起光αの増強角の測定（工程Ｓ３０）を行ってもよい。また、基準値の測定（工程Ｓ２０）は、１次反応（工程Ｓ４０）または光学ブランク値の測定（工程Ｓ５０）の後に行ってもよい。また、光学ブランク値の測定（工程Ｓ５０）は、基準値の測定（工程Ｓ２０）の後に行ってもよい。
【００７３】
また、基準値を用いることなく、反射光βの光量、励起光αの共鳴角、プラズモン散乱光δの光量または励起光αの増強角の測定値をそのまま用いて、検体の種類の判定およびヘマトクリット値の算出を行ってもよい（工程Ｓ３０）。この場合は、基準値の測定（工程Ｓ２０）は不要である。
【００７４】
なお、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置は、ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置に限定されない。たとえば、本発明に係る測定方法および測定装置は、ＳＰＲ法を利用する測定方法および測定装置であってもよい。この場合、測定装置１００は、蛍光γの光量を測定せずに、第１のシグナル値として反射光βの光量を測定することで被測定物質を測定する。したがって、光学ブランク値の測定（工程Ｓ５０）および２次反応（工程Ｓ６０）は不要である。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。【００７６】
１．全血の測定値と血漿の測定値との対比
まず、図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、全血の希釈液および血漿の希釈液中の心筋トロポニンＩの濃度を測定した。検体としては、６人の被験者から採取された全血（Ａ〜Ｆ）の３倍希釈液と、これらの全血のそれぞれを遠心分離（１６００ｇ、１５分間）して得られた血漿（Ａ〜Ｆ）の３倍希釈液を準備した。検体の希釈には、後述する基準液（界面活性剤を含むトリス緩衝液）を使用した。膜厚約４０ｎｍの金薄膜（金属膜３０）の上に抗心筋トロポニンＩ抗体を固定化し、反応場を形成した。流路４１内に検体を提供し、検体中の心筋トロポニンＩと固定化された抗体とを十分に反応させた後、洗浄した。蛍光色素（Hylyte Fluor 647）で標識された抗心筋トロポニンＩ抗体含有液（標識液）を提供し、捕捉された心筋トロポニンＩと標識抗体とを十分に反応させた後、再度洗浄した。この後、励起光α（波長６５０ｎｍ）の入射角が増強角である場合の蛍光γの光量を測定した。なお、抗体を標識する蛍光色素の種類は、上記のものに限定されず、金属膜３０による吸光に起因して完全に消光しなければ公知の蛍光色素から適宜選択されうる。【００７７】
各検体について測定された蛍光γの光量を表１に示す。また、図３は、各被験者（検体）についての、血漿希釈液の測定値と全血希釈液の測定値との関係を示すグラフである。このグラフにおいて、各プロットの近似直線を引くと、近似直線の傾きは０.７３９６であった。このことから、全血希釈液の測定値と血漿希釈液の測定値とでは、大きく異なることがわかる。また、各プロットが近似直線からずれていることから、全血希釈液の測定値に一律に変換係数を掛けることでは精度よく血漿希釈液の測定値に変換できないこと、すなわち被験者（検体）ごとに変換係数が異なることもわかる。【００７８】
【表１】
2015129615.tif 000005
【００７９】
２．検量線の作成
ヘマトクリット値が既知の全血を希釈または濃縮してヘマトクリット値が互いに異なる４種類の試料液を調製した。また、ヘマトクリット値が０％の血液として、血漿も準備した。また、基準液として、トリス緩衝液（ｐＨ７.４、Ｐ２０を０.０５％含有）も準備した。【００８０】
図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、各検体（基準液、血漿および試料液１〜４）の３倍希釈液を流路４１内に導入した状態におけるプラズモン散乱光量および共鳴角を測定した。各検体のヘマトクリット値と、各検体希釈液のプラズモン散乱光量およびΔプラズモン散乱光量（当該検体希釈液を導入した状態のプラズモン散乱光量と基準液を導入した状態のプラズモン散乱光量との差）との関係を表２に示す。また、各検体のヘマトクリット値と、各検体希釈液のプラズモン共鳴角およびΔプラズモン共鳴角（当該検体希釈液を導入した状態のプラズモン共鳴角と基準液を導入した状態のプラズモン共鳴角との差）との関係を表３に示す。なお、表２に記載のプラズモン散乱光量は、各検体希釈液の増強角において測定した値であるが、プラズモン散乱光量の測定時の入射角は、統一された入射角であれば増強角とは異なる角度であってもよい。【００８１】
【表２】
2015129615.tif 000006
【００８２】
【表３】
2015129615.tif 000007
【００８３】
図４Ａは、表２に示される各検体のヘマトクリット値および対応する各検体希釈液のΔプラズモン散乱光量から作成した検量線を示すグラフである。この検量線（近似直線）のＲ２値は、０.９９３３であった。また、図４Ｂは、表３に示される各検体のヘマトクリット値および対応する各検体希釈液のΔプラズモン共鳴角から作成した検量線を示すグラフである。この検量線（２次の近似曲線）のＲ２値は、０.９９１８であった。【００８４】
３．検量線を用いたヘマトクリット値の算出
図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、前述の全血（Ａ〜Ｆ）の希釈液または基準液を導入した状態のプラズモン散乱光量および共鳴角を測定し、各全血希釈液についてΔプラズモン散乱光量およびΔプラズモン共鳴角を求めた。次いで、図４Ａに示される検量線を用いて、各全血希釈液のΔプラズモン散乱光量から元の全血のヘマトクリット値を算出した。また、図４Ｂに示される検量線を用いて、各血液希釈液のΔプラズモン共鳴角から元の全血のヘマトクリット値を算出した。Δプラズモン散乱光量から算出した各全血のヘマトクリット値を表４に示す。また、Δプラズモン共鳴角から算出した各全血のヘマトクリット値を表５に示す。【００８５】
【表４】
2015129615.tif 000008
【００８６】
【表５】
2015129615.tif 000009
【００８７】
４．算出されたヘマトクリット値を用いた測定値の変換
各全血希釈液についての変換係数Ｃ２を、表４に記載のヘマトクリット値（Δプラズモン散乱光量から算出したヘマトクリット値）および前述の式（２）を用いて算出した。得られた変換係数Ｃ２を用いて、表１に示される全血希釈液の測定値を、血漿希釈液の測定値に変換した。各全血希釈液の変換係数および変換後の全血希釈液の測定値を表６に示す。【００８８】
【表６】
2015129615.tif 000010
【００８９】
図５Ａは、各被験者（検体）についての、血漿希釈液の測定値（表１参照）と、全血希釈液の測定値から変換した測定値（表６参照）との関係を示すグラフである。このグラフにおいて、各プロットの近似直線（実線）を引くと、近似直線の傾きは０.９９７７であり、切片の値も非常に小さかった。このことから、血漿希釈液の測定値と、変換後の全血希釈液の測定値とは、ほぼ同じことがわかる。また、被験者（検体）ごとに変換係数が異なることもわかる。【００９０】
同様に、各全血希釈液についての変換係数Ｃ２を、表５に記載のヘマトクリット値（Δプラズモン共鳴角から算出したヘマトクリット値）および前述の式（２）を用いて算出した。得られた変換係数を用いて、表１に示される全血希釈液の測定値を、血漿希釈液の測定値に変換した。各全血希釈液の変換係数および変換後の全血希釈液の測定値を表７に示す。【００９１】
【表７】
2015129615.tif 000011
【００９２】
図５Ｂは、各被験者（検体）についての、血漿希釈液の測定値（表１参照）と、全血希釈液の測定値から変換した測定値（表７参照）との関係を示すグラフである。このグラフにおいて、各プロットの近似直線（実線）を引くと、近似直線の傾きは０.９７１８であり、切片の値も非常に小さかった。このことから、血漿希釈液の測定値と、変換後の全血希釈液の測定値とは、ほぼ同じことがわかる。また、被験者（検体）ごとに変換係数が異なることもわかる。【００９３】
表８に、各検体についての、Δプラズモン散乱光量から算出したヘマトクリット値と、Δプラズモン共鳴角から算出したヘマトクリット値と、ミクロヘマトクリット法で測定したヘマトクリット値を示す。表８から、Δプラズモン散乱光量から算出したヘマトクリット値と、Δプラズモン共鳴角から算出したヘマトクリット値は、ミクロヘマトクリット法で測定したヘマトクリット値とほぼ同じであることがわかる。【００９４】
【表８】
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【００９５】
５．検体の種類の区別
検体として、前述の全血の３倍希釈液と、血漿の３倍希釈液を準備した。図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、検体を導入した状態のプラズモン散乱光量および共鳴角を測定し、各検体についてΔプラズモン散乱光量およびΔプラズモン共鳴角を求めた。各検体のΔプラズモン散乱光量を表９に示す。また、各検体のΔプラズモン共鳴角を表１０に示す。【００９６】
【表９】
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【００９７】
【表１０】
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【００９８】
図６Ａは、各被験者（検体）についての、全血希釈液および血漿希釈液のΔプラズモン散乱光量（表９参照）を示すグラフである。図６Ｂは、各被験者（検体）についての、全血希釈液および血漿希釈液のΔプラズモン共鳴角（表１０参照）を示すグラフである。これらのグラフから、同じ被験者であっても、全血（希釈液）と血漿（希釈液）とでΔプラズモン散乱光量およびΔプラズモン共鳴角が大きく異なることがわかる。したがって、検体のΔプラズモン散乱光量またはΔプラズモン共鳴角を測定することで、その検体が全血（血球成分）を含む検体であるか否かを判別できることがわかる。【００９９】
本出願は、２０１４年２月２５日出願の特願２０１４−０３３９６１に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明に係る測定方法および測定装置は、血液中の被測定物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【０１０１】
１０  測定チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  流路
１００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光照射ユニット
１１１  光源ユニット
１１２  角度調整機構
１１３  光源制御部
１２０  反射光検出ユニット
１２１  受光センサー
１２２  角度調整機構
１２３  センサー制御部
１３０  蛍光検出ユニット
１３１  受光ユニット
１３２  位置切り替え機構
１３３  センサー制御部
１３４  第１レンズ
１３５  光学フィルター
１３６  第２レンズ
１３７  受光センサー
１４０  送液ユニット
１４１  液体チップ
１４２  シリンジポンプ
１４３  送液ポンプ駆動機構
１４４  シリンジ
１４５  プランジャー
１５０  搬送ユニット
１５１  搬送ステージ
１５２  チップホルダー
１６０  制御部
α  励起光
β  反射光
γ  蛍光
δ  プラズモン散乱光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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