(57)【要約】  本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、タンパク質の製造方法に関する。
2015020159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、前記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを、いずれも前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、前記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドをＡ１〜Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、
前記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１〜Ａｎ／２−１及びＡｎ／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であり、
前記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１〜Ａ（ｎ＋１）／２−１及びＡ（ｎ−１）／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が７０ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１及びＡ２の２つの正規分布に波形分離し、Ａ１の面積をＡ２の面積で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記２つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅４７ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅８２ｃｍ−１）の２つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２及びＡ３の３つの正規分布に波形分離し、Ａ２の面積をＡ１及びＡ３の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８０ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）及びＡ３（ピーク位置１６３１ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５の５つの正規分布に波形分離し、Ａ３の面積をＡ１、Ａ２、Ａ４及びＡ５の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記５つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８５ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６４１ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）及びＡ５（ピーク位置１６２６ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）の５つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記指標値が、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が４４ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記指標値が、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記固定化リパーゼが、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有する、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記リパーゼが、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼである、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記指標値が、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が７５ｃｍ−１以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜する、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記指標値が、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．４５以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜する、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が６５ｃｍ−１以下となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記指標値が、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記抗体由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．９８以上となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記指標値が、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
前記波形分離は、前記抗体由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．８５以上となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記赤外吸収スペクトルが、減衰全反射法により測定されたものである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２５】
リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造する製造方法であって、
固定化リパーゼは、樹脂担体にリパーゼが固定化されたものであり、
前記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい前記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備える、再生固定化リパーゼの製造方法。
【請求項２６】
タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える、タンパク質活性評価方法。
【請求項２７】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項２８】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、前記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項２９】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドを、いずれも前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、前記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項３０】
前記指標値が、前記赤外吸収バンドをＡ１〜Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、
前記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１〜Ａｎ／２−１及びＡｎ／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であり、
前記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１〜Ａ（ｎ＋１）／２−１及びＡ（ｎ−１）／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
【請求項３３】
前記タンパク質が、抗体である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質及びその製造方法、並びにタンパク質活性評価方法に関する。本発明はまた、固定化リパーゼ及び再生固定化リパーゼ及びそれらの製造方法、並びにリパーゼ活性評価方法にも関する。本発明は更に、固定化ペルオキシダーゼ及びその製造方法、並びにペルオキシダーゼ活性評価方法にも関する。本発明は更にまた、抗体及びその製造方法、並びに抗体活性評価方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質の活性評価は、実際に触媒反応等を行いその活性を測定すること等によるものであった。【０００３】
例えば、脂肪酸等の各種カルボン酸と、モノアルコール及び多価アルコール等のアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応等の反応に工業的に幅広く使用されている固定化リパーゼは（例えば、特許文献１を参照）、その調製条件、反応への使用等により触媒活性が充分ではなくなることがあるが、固定化リパーゼの触媒活性の評価は、実際にエステル交換反応等を行い、その活性を測定すること等により行われている。【０００４】
一方、固定化リパーゼのリパーゼの高次構造を解析した例が知られている。例えば、非特許文献１には、円偏光二色性（ＣＤ）法、拡散反射フーリエ変換赤外分光（ＤＲＩＦＴ）法及びトリプトファン残基蛍光法による固体粒子上に固定化されたリパーゼの構造解析法が記載されている。非特許文献２には、酵素を用いたバイオディーゼル生産における、原料、水分の存在又は不在、及びバイオディーゼルとの接触が、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５の触媒的、酵素的及び物理的な安定性に及ぼす影響について解析したことが記載されている。非特許文献３には、固定化されたシュード・モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼの初期活性及び二次構造に対する、有機溶媒による予備処理の影響を解析したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２０７９７５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１０巻，ｐ．１４９２−１４９９（２００９年）
【非特許文献２】Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｄａｙ，２１３巻，ｐ．７３−８０（２０１３年）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５巻，ｐ．１１７６−１１８０（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在、タンパク質は工業的プロセスの触媒として、また医薬としても幅広く利用されている。タンパク質の活性が低下するとプロセス全体の効率の低下、治療効果の低下等につながるため、その活性を評価して充分な活性のあるタンパク質を提供することは極めて重要である。【０００８】
また、活性が充分ではないタンパク質には、例えばタンパク質の含水率を調整すること等により、活性を再生することができる場合（本明細書中、「可逆的変性」とも称する。）と、活性を再生することができない場合（本明細書中、「非可逆的変性」とも称する。）とがある。【０００９】
従来のタンパク質の活性の評価は、実際に触媒反応等を行いその活性を測定すること等によるものであった。このような評価方法では、タンパク質の活性が充分ではない場合に、可逆的変性と非可逆的変性のいずれに起因するか評価することは困難である。【００１０】
また、実際に触媒反応等を行うことなく、タンパク質の活性評価を行い得る方法の選択肢は未だ充分ではない。例えば、工業的に利用される固定化リパーゼの場合、非特許文献１〜３には、固定化リパーゼのリパーゼの高次構造と触媒活性との関係について記載されている。しかしながら、非特許文献１には、多孔性樹脂担体にリパーゼＣａｌＢを固定化したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）では、当該多孔性樹脂担体由来の強い吸収が、リパーゼ由来の吸収と隣接するため、赤外吸収スペクトル測定では構造解析は行えないと記載されている。【００１１】
また、非特許文献２には、定量的データではないものの、反応への使用によって活性が低下したリパーゼでは、α−へリックスが減少したこと、及びβ−シートが増大したことが記載されている。非特許文献３には、有機溶媒で処理することで、α−ヘリックス、及びβ−シートが構造変化したことが記載されているが、非特許文献２とは逆に、構造変化に伴い活性が向上したことが記載されている。【００１２】
このように、リパーゼの構造変化と触媒活性との相関について逆の報告がなされているのが現状であり、赤外吸収スペクトル測定から触媒能評価を行い得るか否かは明らかではない。また、非特許文献１〜３のいずれにも可逆的変性と非可逆的変性とを見分ける技術手段に関し、記載乃至示唆はされていない。【００１３】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、充分な活性を有するタンパク質を得ることができるタンパク質の製造方法及び当該製造方法により得られたタンパク質を提供することを目的とする。本発明はまた、実際に活性測定を行う必要なく、タンパク質の活性を評価することのできるタンパク質活性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおける特定の波数の赤外吸収バンドを正規分布で近似し、その正規分布に基づいて算出した赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値が、タンパク質の活性又はタンパク質の潜在的な活性を反映することを見出した。すなわち、当該指標値に基づいてタンパク質を選抜することにより、充分な活性があるタンパク質が得られることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づくものである。【００１５】
すなわち、本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（本明細書中、「吸収バンドＩＩ」ともいう。）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（本明細書中、「吸収バンドＩ」ともいう。）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、上記タンパク質の製造方法に関する。【００１６】
本発明のタンパク質の製造方法によれば、上記検査工程を備えているため、活性のあるタンパク質を製造することができる。また、タンパク質活性の可逆的変性と非可逆的変性とを見分けることができるため、活性を再生可能なタンパク質を得ることもできる。【００１７】
上記指標値は、上記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であってもよい。半値幅は上記赤外吸収バンドの広がりの度合いと相関するため、半値幅を指標値として、活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することが可能である。【００１８】
上記指標値は、上記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、上記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、上記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値（本明細書中、「吸収バンド面積比」ともいう。）であってもよい。吸収バンド面積比は上記赤外吸収バンドの広がりの度合いと相関するため、吸収バンド面積比を指標値として、活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することが可能である。【００１９】
吸収バンド面積比は、上記赤外吸収バンドを、いずれも上記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、上記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値であってもよい。【００２０】
吸収バンド面積比は、上記赤外吸収バンドをＡ１〜Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、上記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１〜Ａｎ／２−１及びＡｎ／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよく、上記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１〜Ａ（ｎ＋１）／２−１及びＡ（ｎ−１）／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。【００２１】
上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値によるタンパク質の選抜をより精度よく行うことができる。【００２２】
本発明はまた、上記タンパク質の製造方法により得られたタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、上記製造方法により得られたものであるため、活性を有する、又は充分な活性を再生可能である。【００２３】
本発明は、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼの製造方法であって、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、製造方法にも関する。【００２４】
本発明の固定化リパーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを選抜するステップを有しているため、触媒活性がある、又は触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。【００２５】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅（本明細書中、「指標値１」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７０ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００２６】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、２つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅４７ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅８２ｃｍ−１）の２つの正規分布に波形分離し、Ａ１の面積をＡ２の面積で割った値（本明細書中、「指標値２」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００２７】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８０ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）及びＡ３（ピーク位置１６３１ｃｍ−１、半値幅５０ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離し、Ａ２の面積をＡ１及びＡ３の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値３」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００２８】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、５つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８５ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６５６ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６４１ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）及びＡ５（ピーク位置１６２６ｃｍ−１、半値幅３０ｃｍ−１）の５つの正規分布に波形分離し、Ａ３の面積をＡ１、Ａ２、Ａ４及びＡ５の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値４」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００２９】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７及びＡ８の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値５」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００３０】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ−１、半値幅１９ｃｍ−１）の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値６」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００３１】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅（本明細書中、「指標値７」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が４４ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００３２】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩＩを、吸収バンドＩＩの面積と、３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ−１、半値幅３１ｃｍ−１）の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値８」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。【００３３】
上記固定化リパーゼは、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有するものであってもよい。【００３４】
上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化リパーゼの選抜をより精度よく行うことができる。【００３５】
上記リパーゼは、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼであってもよい。【００３６】
本発明はまた、上記固定化リパーゼの製造方法により得られた固定化リパーゼを提供する。本発明の固定化リパーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。【００３７】
本発明は、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼの製造方法であって、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、製造方法にも関する。【００３８】
本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを選抜するステップを有しているため、触媒活性がある、又は触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。【００３９】
本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法では、上記指標値が指標値７であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７５ｃｍ−１以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜してもよい。【００４０】
本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．４５以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜してもよい。【００４１】
上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化ペルオキシダーゼの選抜をより精度よく行うことができる。【００４２】
本発明はまた、上記固定化ペルオキシダーゼの製造方法により得られた固定化ペルオキシダーゼを提供する。本発明の固定化ペルオキシダーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。【００４３】
本発明は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、抗体の製造方法にも関する。【００４４】
本発明の抗体の製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を選抜するステップを有しているため、充分な力価のある抗体を得ることができる。【００４５】
本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値１であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が６５ｃｍ−１以下となる抗体を良品として選抜してもよい。【００４６】
本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値６であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９８以上となる抗体を良品として選抜してもよい。【００４７】
本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．８５以上となる抗体を良品として選抜してもよい。【００４８】
上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による抗体の選抜をより精度よく行うことができる。【００４９】
本発明はまた、上記抗体の製造方法により得られた抗体を提供する。本発明の抗体は、上記製造方法により得られたものであるため、充分な力価を有する。【００５０】
本発明はまた、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造する製造方法であって、固定化リパーゼは、樹脂担体にリパーゼが固定化されたものであり、上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備える、再生固定化リパーゼの製造方法にも関する。【００５１】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを選抜するステップを有しているため、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの中でも可逆的変性であるものを選抜することができる。すなわち、充分な触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。【００５２】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値１であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７０ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５３】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値２であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５４】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値３であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５５】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値４であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５６】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値５であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５７】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値６であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５８】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値７であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が４４ｃｍ−１以下となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００５９】
本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。【００６０】
上記再生固定化リパーゼの製造方法は、上記選抜工程で選抜された固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒にて処理する再生工程を備えていてもよい。上記選抜工程で選抜された固定化リパーゼは、上記再生工程を経ることによって、リパーゼ活性を再生できる。【００６１】
上記固定化リパーゼは、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有するものであってもよい。【００６２】
上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化リパーゼの選抜をより精度よく行うことができる。【００６３】
上記リパーゼは、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼであってもよい。【００６４】
本発明はまた、上記再生固定化リパーゼの製造方法により得られた再生固定化リパーゼを提供する。本発明の再生固定化リパーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、充分な触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。【００６５】
本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える、タンパク質活性評価方法ということもできる。【００６６】
本発明はまた、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法であって、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価する、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える、リパーゼ活性評価方法ということもできる。【００６７】
本発明は更に、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法であって、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える、ペルオキシダーゼ活性評価方法ということもできる。【００６８】
本発明は更にまた、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を活性のある抗体と評価するステップと、を含む評価工程を備える、抗体活性評価方法ということもできる。【００６９】
本発明は、本発明の固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼを用いた、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物の製造方法にも関する。上記固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼは、充分な触媒活性を有するか、又は充分な触媒活性を再生可能であるため、当該化合物の製造効率が向上する。【００７０】
上記化合物は、エステル交換反応又はエステル加水分解反応を経て製造されるものであってもよい。また、上記化合物は、ポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物であってもよい。
【発明の効果】
【００７１】
本発明によれば、充分な活性を有するタンパク質を得ることができるタンパク質の製造方法及び当該製造方法により得られたタンパク質を提供できる。また、本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、タンパク質の活性を評価することのできるタンパク質活性評価方法を提供できる。【００７２】
本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する固定化リパーゼを得ることができる固定化リパーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた固定化リパーゼを提供できる。【００７３】
また、本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する再生固定化リパーゼを得ることができる再生固定化リパーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた再生固定化リパーゼを提供できる。【００７４】
さらに、本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、リパーゼ活性のある固定化リパーゼ、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼを見分けることのできるリパーゼ活性評価方法を提供できる。【００７５】
本発明の固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼは、充分な触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能であるため、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物の製造用途に好適に用いられる。【００７６】
本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する固定化ペルオキシダーゼを得ることができる固定化ペルオキシダーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた固定化ペルオキシダーゼを提供できる。【００７７】
本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼ、又はペルオキシダーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化ペルオキシダーゼを見分けることのできるペルオキシダーゼ活性評価方法を提供できる。【００７８】
本発明によれば、充分な力価を有する抗体を得ることができる抗体の製造方法及び当該製造方法により得られた抗体を提供できる。【００７９】
本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、抗体の力価を評価することのできる抗体活性評価方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】吸収バンド面積比の算出方法を説明するための説明図である。
【図２】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。
【図３】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を２つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図４】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を３つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図５】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図６】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図７】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図８】リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図９】指標値１（半値幅）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１０】指標値１（半値幅）と指標値７（半値幅）との相関を示すグラフである。
【図１１】指標値１（半値幅）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１２】指標値２（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１３】指標値３（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１４】指標値４（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１５】指標値５（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１６】指標値６（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図１７】ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。
【図１８】ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）を３つの正規分布に波形分離した例を示す図である。
【図１９】指標値７（半値幅）とペルオキシダーゼの酸化反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図２０】指標値８（吸収バンド面積比）とペルオキシダーゼの酸化反応の比活性との相関を示すグラフである。
【図２１】抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ及び吸収バンドＩＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。
【図２２】抗体由来の赤外吸収バンドを８つの正規分布に波形分離した例（吸収バンドＩ）及び３つの正規分布に波形分離した例（吸収バンドＩＩ）を示す図である。
【図２３】各種処理を施した抗体の力価を測定した結果を示すグラフである。
【図２４】指標値１（半値幅）と抗体の力価との相関を示すグラフである。
【図２５】指標値６（吸収バンド面積比）及び指標値８（吸収バンド面積比）と抗体の力価との相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００８２】
〔タンパク質の製造方法〕
本実施形態に係るタンパク質の製造方法は、少なくとも検査工程を備えるものである。当該検査工程は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む。
【００８３】
本実施形態に係るタンパク質の製造方法により製造されるタンパク質に、特に制限はなく、任意のタンパク質であってよい。一方、本実施形態に係るタンパク質の製造方法によれば、検査工程において活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することができるため、製造されるタンパク質としては、機能性タンパク質であることが好ましい。ここで、機能性タンパク質とは、変性等を受けていない場合に活性を有するタンパク質を意味する。また、本明細書において、「活性」とは、触媒活性、受容体等との結合活性、抗体の力価等を含む。
【００８４】
活性のあるタンパク質として、例えば、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ等の触媒活性のあるタンパク質である酵素、インターフェロン、エリスロポエチン、インスリン等の医薬品としても用いられる受容体との結合活性のあるタンパク質、並びに抗体を挙げることができる。
【００８５】
製造されるタンパク質は、担体に担持されたタンパク質であってもよい。なお、本明細書において「担体」とは、タンパク質を吸着等により保持することができる樹脂担体（例えば、イオン交換樹脂）及び無機担体（例えば、シリカ担体）、タンパク質と混合される増量剤、並びにタンパク質溶液における溶媒及び溶質等を含む。
【００８６】
本実施形態に係る指標値は、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩの広がりの度合いを示す。図１は、指標値（ここでは、吸収バンド面積比）の算出方法を説明するための説明図である。以下、図１を参照しながら指標値の算出方法を説明する。なお、以下の算出方法はあくまで一例であり、種々の変形が可能である。
【００８７】
まず、タンパク質の赤外吸収スペクトルを測定する。ここで、タンパク質が担体に担持されたタンパク質である場合は、担体自体についても赤外吸収スペクトルを測定する。担体自体の赤外吸収スペクトルは、予め測定しておいてもよい。赤外吸収スペクトルの測定法は、透過法、拡散反射法、減衰全反射法（ＡＴＲ法）が好ましく、微量タンパク質に由来する吸収スペクトルを高感度で測定するという観点から、ＡＴＲ法がより好ましい。
【００８８】
図１（Ａ）は、担体に担持されたタンパク質として固定化リパーゼ（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）  ＶＰ  ＯＣ  １６００にＣａｌＢが担持されたＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５）を用いた場合の赤外吸収スペクトル、及び樹脂担体（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）ＶＰ  ＯＣ  １６００）自体の赤外吸収スペクトルを示す。両者の差スペクトルは、タンパク質（リパーゼ）由来の赤外吸収スペクトルとなる。ただし、個別に測定した赤外吸収スペクトルの差分算出には、吸収強度を規定する必要がある場合がある。
【００８９】
次に、担体由来の赤外吸収スペクトルをシミュレートする。すなわち、担体由来の赤外吸収スペクトルを正規分布で近似し、個別に測定した担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルのバックグラウンドスペクトルとして使用できるようにする。具体的には、強度を変化させることで個別に測定した担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、担体由来の赤外吸収スペクトルにフィットさせる。図１（Ｂ）は、担体由来の赤外吸収スペクトルのシミュレートの一例を示す。
【００９０】
次に、担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルと、担体由来の赤外吸収スペクトル（シミュレート）から、差スペクトルを算出し、担体に担持されたタンパク質中のタンパク質に由来する赤外吸収スペクトルを抽出する。図１（Ｃ）は、差スペクトルの算出の一例を示す。
【００９１】
差スペクトルの算出は、例えば、ガウス関数を用い、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）にて行うことができる。
【００９２】
次に、差スペクトルを用い、吸収バンドＩ又はＩＩを、１又は複数の正規分布で近似する。
【００９３】
差スペクトルの単一の正規分布での近似は、例えば、非線形最小二乗法により行うことができる。非線形最小二乗法は、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）のＳｏｌｖｅｒ機能を利用して、例えば、ピーク位置、半値幅及び強度を変数として行うことができる。
【００９４】
単一の正規分布で近似した場合の指標値は、例えば、該正規分布の半値幅（単位：ｃｍ−１）とすることができる。この場合、指標値（半値幅）が小さくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
【００９５】
差スペクトルの複数の正規分布での近似は、例えば、複数の正規分布に波形分離することにより行うことができる。波形分離は、例えば、ガウス関数を用い、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）にて行うことができる。具体的には、例えば、Ａ１〜Ａｎのｎ個の正規分布に波形分離する場合、Ｓｏｌｖｅｒ機能を利用し、Ａ１〜Ａｎの波数のバンド位置及び半値幅の初期値を指定し、非線形最小二乗法によって、Ａ１〜Ａｎの面積の総和と、差スペクトルの吸収バンドの面積との残差二乗和が最小になるように計算することで波形分離を行うことができる。Ａ１〜Ａｎの波数のバンド位置は、等間隔で指定してもよいし、異なる間隔で指定してもよい。また、Ａ１〜Ａｎのうち少なくとも２つに同一の波数のバンド位置を指定してもよい。
【００９６】
波形分離する正規分布の個数（すなわち、ｎの値）は特に制限がなく、目的に応じて適宜設定してよい。タンパク質を良品として選抜する精度がより一層向上するため、ｎは２〜２０であることが好ましく、２、３、５又は８であることがより好ましい。
【００９７】
例えば図１では、差スペクトルを用い、１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるタンパク質（リパーゼ）由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８（まとめてＡ１〜Ａ８とも記載する）の８つの正規分布に波形分離している。Ａ１〜Ａ８は、ピーク位置が約１０ｃｍ−１間隔で隣り合う、半値幅が約１９ｃｍ−１の８つの正規分布である。また、Ａ１〜Ａ８の面積の総和（波形分離成分の合計）が、差スペクトルの吸収バンドの面積となるべく等しくなるように波形分離する。図１（Ｄ）は、波形分離の一例を示す。
【００９８】
なお、図１における、Ａ１〜Ａ８は、フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６９２ｃｍ−１（Ａ１）、１６８２ｃｍ−１（Ａ２）、１６７０ｃｍ−１（Ａ３）、１６５８ｃｍ−１（Ａ４）、１６４８ｃｍ−１（Ａ５）、１６３８ｃｍ−１（Ａ６）、１６２９ｃｍ−１（Ａ７）及び１６１９ｃｍ−１（Ａ８）の８点とし、またそれぞれの半値幅を１９ｃｍ−１としたものである。
【００９９】
赤外吸収バンドを２つの正規分布に波形分離した場合の指標値は、例えば、赤外吸収バンドを、いずれも赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値とすることができる。２つの正規分布の波数のバンド位置は、互いに同一であってもよい。この場合、指標値が大きくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
【０１００】
複数（３以上）の正規分布で近似した場合の指標値は、例えば、赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値（吸収バンド面積比）とすることができる。この場合、指標値が大きくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
【０１０１】
赤外吸収バンドをＡ１〜Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離した場合、例えば、以下のようにして指標値を算出することができる。
（ｉ）ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１〜Ａｎ／２−１及びＡｎ／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値を指標値とする。
（ｉｉ）ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１〜Ａ（ｎ＋１）／２−１及びＡ（ｎ−１）／２＋２〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値を指標値とする。
【０１０２】
例えば、ｎが３の場合、指標値はＡ２／（Ａ１＋Ａ３）とすることができる。また、例えば、ｎが５の場合、指標値はＡ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ３＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ４）としてもよい。また、ｎが５以上の奇数の場合、上記（ｉｉ）で算出される指標値は、例えば、Ａ（ｎ＋１）／２−１〜Ａ（ｎ−１）／２＋２からなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和をＡ１〜Ａ（ｎ＋１）／２−２及びＡ（ｎ−１）／２＋３〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。
【０１０３】
例えば、ｎが８の場合、指標値は（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）としてもよいし、（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ６＋Ａ７＋Ａ８）としてもよい。また、ｎが６以上の偶数の場合、上記（ｉ）で算出される指標値は、例えば、Ａｎ／２−１〜Ａｎ／２＋２からなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和をＡ１〜Ａｎ／２−２及びＡｎ／２＋３〜Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。
【０１０４】
タンパク質を良品であるか否かを選抜するための閾値は、製造するタンパク質の種類、製造するタンパク質に求められる活性のレベル等に応じて適宜設定してよい。上記のようにして算出した指標値は、タンパク質の活性、又はタンパク質の潜在的な活性と線形近似可能な相関関係を有しているため、製造するタンパク質に求められる活性のレベルに応じて閾値を設定することができる。また、閾値を決定するため、製造するタンパク質について、予め指標値と活性の相関を解析しておくことが好ましい。
【０１０５】
閾値の例を説明する。図１に例示した固定化リパーゼの場合、指標値が（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）のときは、指標値（吸収バンド面積比）が１．２（閾値）以上である固定化リパーゼは、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価することができるか、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価することができる。閾値は１．３としてもよく、１．４としてもよく、１．５としてもよい。当該指標値は、通常大きくても５．０程度である。
【０１０６】
以上説明した指標値の算出方法は、タンパク質の種類に依存しない。すなわち、タンパク質が、例えば、リパーゼ、ペルオキシダーゼ及び抗体等の場合であっても、同様にして指標値を算出することができる。
【０１０７】
本実施形態に係るタンパク質の製造方法は、上述した検査工程に加えて、タンパク質を合成する工程を備えていてもよい。タンパク質の合成は、公知の手法を用いることができる。例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に組み換えた酵母、糸状菌、動物細胞、動物等を培養又は飼育することによりタンパク質を発現させ、細胞破砕物、培地、動物の乳等から発現したタンパク質を回収（精製）することでタンパク質を合成することができる。
【０１０８】
本実施形態に係るタンパク質の製造方法により得られたタンパク質は、上述した検査工程を経ているため、充分な活性を有する、又は充分な活性を再生可能であり、工業的用途、医薬用途等に好適に使用できる。
【０１０９】
〔タンパク質活性評価方法〕
本実施形態に係るタンパク質活性評価方法は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、当該指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える。
【０１１０】
本実施形態に係るタンパク質活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
【０１１１】
〔固定化リパーゼの製造方法〕
本明細書において、固定化リパーゼとは、樹脂担体にリパーゼを吸着等により担持させたものをいう。
【０１１２】
リパーゼは、エステル結合の加水分解反応を触媒する酵素であればよい。また、エステル合成反応も触媒する酵素であることが好ましい。具体的には、例えば、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）由来のクチナーゼ、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ（例えば、Ａｍａｎｏ  ＰＳ（アマノエンザイム社製））、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５（ノボザイム社製））、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  Ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐａｓｅ  ＴＬ（名糖産業社製））、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  Ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼが挙げられる。これらの中でも、バルクホルデリア・セパシア由来のリパーゼ、カンジダ・アンタークティカ由来のリパーゼが好ましい。
【０１１３】
上述したリパーゼは、上記微生物からリパーゼをコードする遺伝子を得て、酵母又は糸状菌等の適切な宿主を形質転換し、得られた遺伝子組換え体の培養物から得たものであってもよい。リパーゼの組換え発現のために使用される組換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。
【０１１４】
リパーゼは、上記微生物由来のリパーゼの変異体であってもよい。例えば、上記微生物由来のリパーゼのアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、かつ少なくともエステル結合の加水分解活性を有するリパーゼであってもよい。また、上記微生物由来のリパーゼに対しアミノ酸配列が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の配列同一性を示し、かつ少なくともエステル結合の加水分解活性を有するリパーゼであってもよい。
【０１１５】
樹脂担体は、大きな表面積を有することによりリパーゼの吸着量を高くできるという観点から、多孔質である多孔性樹脂担体であることが好ましい。樹脂担体としては、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。これらの中でも、特に酵素の吸着力が高いという観点から、疎水性吸着樹脂が好ましい。
【０１１６】
樹脂担体としては、酵素の固定化に汎用されている樹脂担体を用いることができる。具体的には、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド等を挙げることができる。これらは共重合体であってもよく、架橋されていてもよい。中でも、ポリスチレン−共重合体、ポリ−（メタ）アクリル酸エステル、（例えばジビニルベンゼンで架橋されたポリメチルメタアクリレート）であることが好ましい。これらの樹脂担体は、マクロポーラスであり、典型的には最頻度細孔径約５〜２０ｎｍを有し、かつ全表面積５０〜１０００ｍ２／ｇ（窒素吸着法による）を有する。
【０１１７】
疎水性吸着樹脂は、市販されているものを使用してもよい。具体的には、例えば、レワチット（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標））ＶＰ  ＯＣ  １６００（ランクセス社製、ドイツ）、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標））ＸＡＤ−７ＨＰ（オルガノ社製、日本）、ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学製、日本）が挙げられる。
【０１１８】
樹脂担体へのリパーゼの固定化は、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着等による担体結合法、網目構造を有する樹脂の格子にリパーゼを固定化する包括法等により行うことができる。中でも物理的吸着による担体結合法が簡便であるため好ましい。
【０１１９】
物理的吸着による固定化は、例えば、リパーゼの水性溶液を樹脂担体に接触させることにより行うことができる。また、リパーゼが樹脂担体に吸着し形成された固定化リパーゼを水相から分離し、次いで分離した固定化リパーゼを洗浄し、更に適切な含水率まで乾燥することを含んでもよい。
【０１２０】
物理的吸着により固定化する際の温度及びｐＨは、固定化するリパーゼの種類等に応じて適宜設定すればよい。多くのリパーゼでは、例えば、室温及び中性に近いｐＨで固定化することができる。樹脂担体とリパーゼの接触時間は、通常本質的に完全な吸着に対して必要とされるような時間が選ばれる。これは典型的には１〜２時間から２４時間である。
【０１２１】
固定化リパーゼを固定床カラム中での連続的エステル交換に用いる場合、固定化リパーゼは、球状でありかつ均一な粒子径であることが好ましい。当該粒子径は、１００〜５０００μｍであることが好ましく、３００〜１０００μｍであることがより好ましい。
【０１２２】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法は、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
【０１２３】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値１とした場合、指標値が７０ｃｍ−１（閾値）以下となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、６５ｃｍ−１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても５５ｃｍ−１程度である。
【０１２４】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値２とした場合、指標値が０．２７（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．４９であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．００程度である。
【０１２５】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値３とした場合、指標値が０．９（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．９程度である。
【０１２６】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値４とした場合、指標値が０．３５（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．４０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．４９程度である。
【０１２７】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値５とした場合、指標値が０．６（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．６５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．７０程度である。
【０１２８】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値６とした場合、指標値が１．２（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．３であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．４程度である。
【０１２９】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値７とした場合、指標値が４４ｃｍ−１（閾値）以下となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、４０ｃｍ−１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても３５ｃｍ−１程度である。
【０１３０】
本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が１．２（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．７程度である。
【０１３１】
上記固定化リパーゼの製造方法は、常法に従ってリパーゼを樹脂担体に担持させた固定化リパーゼを得る工程を含んでいてもよい。当該工程により得られる固定化リパーゼの中には、不可逆的変性又は可逆的変性により触媒活性の低いものも含まれ得るが、上記検査工程を経ることによって、不可逆的変性と可逆的変性とを見分けることが可能となる。
【０１３２】
可逆的変性の場合、見かけ上触媒活性が低いものであるが、例えば、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
【０１３３】
〔再生固定化リパーゼの製造方法〕
本実施形態に係る再生固定化リパーゼの製造方法は、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造するものである。当該製造方法は、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備えるものである。
【０１３４】
本実施形態に係る再生固定化リパーゼの製造方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
【０１３５】
選抜工程では、指標値を指標としているため、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの中でも可逆的変性であるものを選抜することができる。したがって、選抜工程で選抜した固定化リパーゼは、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
【０１３６】
上記再生固定化リパーゼの製造方法は、選抜工程で選抜されたリパーゼ活性が減少した固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒にて処理する再生工程を含んでいてもよい。再生工程を経ることにより、固定化リパーゼを適切な含水率に調整することができ、リパーゼ活性が再生する。なお、リパーゼ活性を再生できるのは、選抜工程で閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいものを選抜しているからである。
【０１３７】
水としては、超純水、蒸留水、イオン交換水、水道水、工業用水等を用いることができる。中でも、無機塩混入回避の観点から、イオン交換水、蒸留水を用いることが好ましい。含水有機溶媒としては、アセトン、エタノール、アセトニトリル、１−ブタノール等の有機溶媒に上述の水を含ませたものを用いることができる。含水有機溶媒の含水率は有機溶媒の種類により異なるが、例えば、有機溶媒としてアセトンを用いる場合、１．０％以上とすることができる。
【０１３８】
再生工程は、例えば、選抜工程で選抜された固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒に接触させることにより行うことができる。当該接触は、例えば、温度−１０〜５０℃の範囲内で、０．５〜４８時間の範囲内で、固定化リパーゼの含水率を指標として適宜設定して行うことができる。指標となる固定化リパーゼの含水率は、リパーゼの種類及び固定化量、樹脂担体の種類等によって異なるが、例えば、固定化リパーゼが３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔの場合、含水率５％以上であり、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５の場合、含水率０．０５％以上である。
【０１３９】
〔固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法〕
本実施形態に係る固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法は、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価する、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える。
【０１４０】
本実施形態に係る固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
【０１４１】
〔化合物の製造方法〕
本実施形態に係る化合物の製造方法は、上記固定化リパーゼの製造方法により得られた固定化リパーゼ、又は上記再生固定化リパーゼの製造方法により得られた再生固定化リパーゼを用いることを特徴とする。当該化合物は、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物である。
【０１４２】
上記化合物としては、エステル交換反応又はエステル加水分解反応を経て製造されるものであることが好ましく、例えば、油脂類とアルコールのエステル交換反応による燃料ディーゼル燃料、ポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。これらの化合物の中でもポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物がより好ましい。
【０１４３】
〔固定化ペルオキシダーゼの製造方法〕
本明細書において、固定化ペルオキシダーゼとは、シリカ担体にペルオキシダーゼを吸着等により担持させたものをいう。
【０１４４】
ペルオキシダーゼは、ペルオキシド（−Ｏ−Ｏ−）を酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する反応を触媒する酵素であればよい。具体的には、例えば、西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）由来のペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ（和光純薬社製））、シトクロムｃペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、西洋わさび由来のペルオキシダーゼが好ましい。
【０１４５】
上述したペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子を得て、酵母又は糸状菌等の適切な宿主を形質転換し、得られた遺伝子組換え体の培養物から得たものであってもよい。ペルオキシダーゼの組換え発現のために使用される組換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。
【０１４６】
ペルオキシダーゼは、上記ペルオキシダーゼの変異体であってもよい。例えば、上記ペルオキシダーゼのアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、かつ少なくともペルオキシドを酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する活性を有するペルオキシダーゼであってもよい。また、上記ペルオキシダーゼに対しアミノ酸配列が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の配列同一性を示し、かつ少なくともペルオキシドを酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する活性を有するペルオキシダーゼであってもよい。
【０１４７】
シリカ担体は、大きな表面積を有することによりペルオキシダーゼの吸着量を高くできるという観点から、多孔質である多孔性シリカ担体であることが好ましい。シリカ担体としては、例えば、ＭＣＦｓ、ＦＳＭ−１６、ＭＣＭ−４１、ＭＣＭ−４８、ＳＢＡ−１５等のメソポーラスシリカが挙げられる。これらの中でも、特に酵素の吸着量が多いという観点から、ＭＣＦｓが好ましい。
【０１４８】
シリカ担体へのペルオキシダーゼの固定化は、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着等による担体結合法等により行うことができる。中でも物理的吸着による担体結合法が簡便であるため好ましい。
【０１４９】
物理的吸着による固定化は、例えば、ペルオキシダーゼの水性溶液をシリカ担体に接触させることにより行うことができる。また、ペルオキシダーゼがシリカ担体に吸着し形成された固定化ペルオキシダーゼを水相から分離し、次いで分離した固定化ペルオキシダーゼを洗浄し、更に適切な含水率まで乾燥することを含んでもよい。
【０１５０】
物理的吸着により固定化する際の温度及びｐＨは、固定化するペルオキシダーゼの種類等に応じて適宜設定すればよい。多くのペルオキシダーゼでは、例えば、室温及び中性に近いｐＨで固定化することができる。シリカ担体とペルオキシダーゼの接触時間は、通常本質的に完全な吸着に対して必要とされるような時間が選ばれる。これは典型的には１〜２時間から２４時間である。
【０１５１】
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法は、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
【０１５２】
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法において、指標値を、指標値７とした場合、指標値が７５ｃｍ−１（閾値）以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、７０ｃｍ−１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても６５ｃｍ−１程度である。
【０１５３】
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が０．４５（閾値）以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．５０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．７０程度である。
【０１５４】
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法は、常法に従ってペルオキシダーゼをシリカ担体に担持させた固定化ペルオキシダーゼを得る工程を含んでいてもよい。当該工程により得られる固定化ペルオキシダーゼの中には、不可逆的変性又は可逆的変性により触媒活性の低いものも含まれ得るが、上記検査工程を経ることによって、不可逆的変性と可逆的変性とを見分けることが可能となる。
【０１５５】
可逆的変性の場合、見かけ上触媒活性が低いものであるが、例えば、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
【０１５６】
〔ペルオキシダーゼ活性評価方法〕
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法は、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える。
【０１５７】
本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化ペルオキシダーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
【０１５８】
〔抗体の製造方法〕
本明細書において、抗体とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよい。また、抗原結合能を保持した抗体のフラグメント（例えば、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２等）であってもよい。抗体はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体であってもよい。
【０１５９】
本実施形態に係る抗体の製造方法は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
【０１６０】
本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値１とした場合、指標値が６５ｃｍ−１（閾値）以下となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、６０ｃｍ−１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても５７ｃｍ−１程度である。
【０１６１】
本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値６とした場合、指標値が０．９８（閾値）以上となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．００であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．０９程度である。
【０１６２】
本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が０．８５（閾値）以上となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．９０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．９７程度である。
【０１６３】
本実施形態に係る抗体の製造方法は、常法に従って抗体を得る工程を含んでいてもよい。当該工程は、例えば、抗体をコードするＤＮＡを発現可能に組み換えた酵母、糸状菌、動物細胞、動物等を培養又は飼育することにより抗体を発現させ、細胞破砕物、培地、動物の乳等から発現した抗体を回収（精製）することにより行うことができる。本実施形態に係る抗体の製造方法で上記検査工程を経ることによって、充分な力価のある抗体を製造することが可能となる。
【０１６４】
〔抗体活性評価方法〕
本実施形態に係る抗体活性評価方法は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を活性のある抗体と評価するステップと、を含む評価工程を備える。ここでいう抗体活性とは、例えば、抗体力価である。
【０１６５】
本実施形態に係る抗体活性評価方法における指標値及び閾値については、上記抗体の製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
【実施例】
【０１６６】
以下、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【０１６７】
［１．固定化リパーゼの触媒活性評価］
＜ヘキシルアクリレートの定量方法＞
ヘキシルアクリレートは、ガスクロマトグラフィー（内部標準法）により定量した。ガスクロマトグラフィーによる測定条件は以下のとおりである。
・ガスクロマトグラフ装置（ＧＣ２０１４，株式会社島津製作所製）
・分析カラム：ＤＢ−５（３０ｍ×０．５３ｍｍ  ＩＤ  １．０μｍ，株式会社島津製作所製）
・カラム温度：６０℃→２分間保持→１０℃／分→２００℃→２分間保持
・注入口温度：２００℃
・検出口温度（ＦＩＤ）：２５０℃
・キャリアーガス：ヘリウム
・線速度：２９．４ｃｍ／秒
・スプリット比：１：５０
・注入量：１．０μＬ
・保持時間
ヘキシルアクリレート：９．３１分
テトラエチレングリコールジメチルエーテル（内部標準物質）：１５．６分【０１６８】
＜エステル交換反応の比活性の算出方法＞
上記の方法で定量した生成ヘキシルアクリレートの量を用いて、下記式に従い、各多孔性樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼのエステル交換反応の比活性を算出した。
【数１】
2015020159.tif 000003
【０１６９】
＜含水率測定方法＞
水分計（ＭＯＣ６３ｕ，乾燥重量法，株式会社島津製作所製）を用いて、測定条件：標準乾燥自動停止モード（１２０℃：水分変化率０．０５％）にて、試料約１．０ｇを用いて、２反復測定後平均値を算出した。【０１７０】
＜ＦＴ−ＩＲスペクトルの測定方法＞
各固定化リパーゼのＦＴ−ＩＲスペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴＳ７０００ｅ顕微ＵＭＡ６００；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定した。【０１７１】
〔試験例１：指標値の算出〕
＜吸収バンドＩ＞
ＦＴ−ＩＲスペクトルの１６００〜１７００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の吸収バンドＩから以下の手順により指標値１〜６を算出した。【０１７２】
（指標値１：単一の正規分布近似における半値幅）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて単一の正規分布で近似した。ＦＴ−ＩＲスペクトルを単一の正規分布で近似する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離した。その後、１６６０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドを、非線形最小二乗法によって単一の正規分布で近似し、指標値として半値幅を算出した。なお、非線形最小二乗法では、ピーク位置、半値幅及び強度を変数とした。【０１７３】
（指標値２：２つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ−ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６５６ｃｍ−１（Ａ１及びＡ２）の１点とし、また半値幅を４７ｃｍ−１（Ａ１）、８２ｃｍ−１（Ａ２）とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値２として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値２）＝Ａ１／Ａ２
式中、Ａ１及びＡ２は、各吸収バンドの面積である。【０１７４】
（指標値３：３つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ−ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６８０ｃｍ−１（Ａ１）、１６５６ｃｍ−１（Ａ２）、１６３１ｃｍ−１（Ａ３）の３点とし、またそれぞれの半値幅を５０ｃｍ−１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値３として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値３）＝Ａ２／（Ａ１＋Ａ３）
式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、各吸収バンドの面積である。【０１７５】
（指標値４：５つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ−ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６８５ｃｍ−１（Ａ１）、１６７０ｃｍ−１（Ａ２）、１６５６ｃｍ−１（Ａ３）、１６４１ｃｍ−１（Ａ４）及び１６２６ｃｍ−１（Ａ５）の５点とし、またそれぞれの半値幅を３０ｃｍ−１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値４として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値４）＝Ａ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ４＋Ａ５）
式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、各吸収バンドの面積である。【０１７６】
（指標値５及び指標値６：８つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ−ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６９２ｃｍ−１（Ａ１）、１６８２ｃｍ−１（Ａ２）、１６７０ｃｍ−１（Ａ３）、１６５８ｃｍ−１（Ａ４）、１６４８ｃｍ−１（Ａ５）、１６３８ｃｍ−１（Ａ６）、１６２９ｃｍ−１（Ａ７）及び１６１９ｃｍ−１（Ａ８）の８点とし、またそれぞれの半値幅を１９ｃｍ−１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値５及び指標値６として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値５）＝（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ６＋Ａ７＋Ａ８）
式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８は、各吸収バンドの面積である。
吸収バンド面積比（指標値６）＝（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）
式中、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５及びＡ８は、各吸収バンドの面積である。【０１７７】
＜吸収バンドＩＩ＞
ＦＴ−ＩＲスペクトルの１５００〜１６００ｃｍ−１付近に現れるリパーゼ由来の吸収バンドＩＩから以下の手順により指標値７〜８を算出した。【０１７８】
（指標値７：単一の正規分布近似における半値幅）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて単一の正規分布で近似した。ＦＴ−ＩＲスペクトルを単一の正規分布で近似する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１４００〜１５００ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離した。その後、１５００〜１５７０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドを、非線形最小二乗法によって単一の正規分布で近似し、指標値として半値幅を算出した。なお、非線形最小二乗法では、ピーク位置、半値幅及び強度を変数とした。【０１７９】
（指標値８：３つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ−ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ−ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１４００〜１５００ｃｍ−１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１５００〜１５７０ｃｍ−１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１５７０ｃｍ−１（Ｂ１）、１５４５ｃｍ−１（Ｂ２）、１５１８ｃｍ−１（Ｂ３）の３点とし、またそれぞれの半値幅を３１ｃｍ−１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値８として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値８）＝Ｂ２／（Ｂ１＋Ｂ３）
式中、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、各吸収バンドの面積である。【０１８０】
図２〜８にリパーゼ由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図２は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図３は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを２つの正規分布に波形分離した例を示す。図４は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。図５は、試験例３で触媒として使用した固定化リパーゼ（３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図６は、試験例１１で触媒として使用した固定化リパーゼ（３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図７は、試験例１４で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図８は、試験例１５で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）のＦＴ−ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。【０１８１】
〔試験例２：固定化リパーゼＰＳ（３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）の調製〕
リパーゼＰＳ「アマノ」ＳＤＨ（アマノエンザイム社製）１５０ｇに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．６Ｌと純水を加え溶解後、３Ｌに定容し、固定化液を調製した。そこに多孔性樹脂担体（ＬＥＷＡＴＩＴ  ＶＰＯＣ  １６００、ＬＡＮＸＥＳＳ社製）６００ｇを加え、６℃にて１２時間攪拌した。その後、デカンテーションにて担体を回収し、純水で洗浄後、減圧乾燥し、固定化リパーゼ（リパーゼ固定化量３．４ｗｔ％）３５２ｇを得た。この固定化リパーゼを「固定化リパーゼＰＳ」又は「３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ」と呼ぶ。【０１８２】
なお、リパーゼ固定化量は、固定化後上清中のタンパク濃度をＢＣＡ法によりＢＳＡ基準にてタンパク濃度を測定し、固定化前後のタンパク濃度減少分を、担体への固定化量として、総固定化タンパク量を算出した。【０１８３】
〔試験例３：ヘキシルアクリレートの合成〕
攪拌装置及び温度調節装置を備えた内容積２０ｍＬのガラス製試験管に、１−ヘキサノール０．２ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、アクリル酸メチル１．６ｇ（１８．６ｍｍｏｌ）、テトラエチレングリコールジメチルエーテル０．０４ｇ（０．２ｍｍｏｌ）、及び触媒として、含水率が７．１％の固定化リパーゼＰＳを加えて、撹拌しながら４０℃で反応させた。１時間後、反応液を取り出し、上述の方法によりエステル交換反応の比活性を算出した。エステル交換反応の比活性は２５９．３ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１だった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は、１．７５であった。【０１８４】
〔試験例４：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、含水率が１．０％の固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１６．５ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．７３であった。【０１８５】
〔試験例５：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のメタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を７１．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８９．８ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．４６であった。【０１８６】
〔試験例６：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のトルエンに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５０．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２１６．１ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．６８であった。【０１８７】
〔試験例７：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のアセトンに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５２．４％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１６９．７ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．４４であった。【０１８８】
〔試験例８：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のアセトニトリルに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５８．６％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１２７．４ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６３．５ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．３３であった。【０１８９】
〔試験例９：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃の１−ブタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を６５．５％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は７９．７ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．３８であった。【０１９０】
〔試験例１０：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のエタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を６０．２％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８７．０ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．２４であった。【０１９１】
〔試験例１１：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、大気中２３０℃で１時間保持し、その後精製水で洗浄して含水率を４０．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。生成物であるヘキシルアクリレートは観測されなかった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．９５であった。【０１９２】
〔試験例１２：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、固定床流通式エステル交換反応に３ヶ月使用し、トルエンで洗浄した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１３．６ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．２８であった。【０１９３】
〔試験例１３：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、実施例１２と同じ固定床流通式エステル交換反応に３ヶ月使用し、トルエンで洗浄した後、含水率５％のアセトンに６℃で一晩浸し、含水率を４６．１％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８８．２ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．３３であった。【０１９４】
〔試験例１４：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃の酢酸水溶液（ｐＨ２）に２時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を２５．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２０９．６ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．５５であった。【０１９５】
〔試験例１５：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃の塩酸水溶液（ｐＨ４）に１６時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を１２．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２２０．５ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．５１であった。【０１９６】
〔試験例１６：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、７０℃の塩酸水溶液（ｐＨ４）に１６時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を３３．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は５６．１ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．２１であった。【０１９７】
〔試験例１７：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、含水率が１．０％のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３４６．４ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．６ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．７２であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．８７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．４９であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．７０であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．４２であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は３７．６ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．７５であった。なお、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５は、多孔性樹脂担体にリパーゼＣａｌＢを固定化した固定化リパーゼである。【０１９８】
〔試験例１８：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のメタノールに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は９８．６ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．２６であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．８８であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．３１であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．５８であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．０６であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４４．７ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．１３であった。【０１９９】
〔試験例１９：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のトルエンに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３９２．６ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．９２であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は２．１０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．５０であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．６９であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．４８であった。【０２００】
〔試験例２０：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のアセトンに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３８４．４ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は１．０５であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は２．５０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．５３であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．７３であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．５８であった。【０２０１】
〔試験例２１：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃のアセトニトリルに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３７５．９ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．８８であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は２．２０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．４８であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．７４であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．５５であった。【０２０２】
〔試験例２２：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、大気中２３０℃で１時間保持し、含水率を０．１％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。生成物であるヘキシルアクリレートは観測されなかった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は８２．３ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．４７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．２５であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．４５であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．８５であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４７．０ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．５８であった。【０２０３】
〔試験例２３：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃の酢酸水溶液（ｐＨ＝２）に２時間浸した後、真空乾燥により含水率を９．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２２４．２ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．８ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．５９であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．６３であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．４５であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．６６であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．３９であった。【０２０４】
〔試験例２４：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、２５℃の塩酸水溶液（ｐＨ＝４）に１６時間浸した後、真空乾燥により含水率を３．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３５１．６ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．８ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．５５であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．９７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．５０であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０７０であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．４２であった。【０２０５】
〔試験例２５：ヘキシルアクリレートの合成〕
触媒として、７０℃の塩酸水溶液（ｐＨ＝４）に１６時間浸した後、真空乾燥により含水率を５．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１８７．８ｍｍｏｌ・ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ−１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）は０．４９であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．３８であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）は０．３７であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．６３であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．３１であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４０．０ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は１．６７であった。【０２０６】
上記の試験例の結果を下記表１にまとめた。また、図９〜１６に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及びリパーゼのエステル交換反応の比活性等をプロットしたグラフを示した。【０２０７】
図９は、試験例１７〜２５の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対してリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。【０２０８】
図１０は、試験例１７、１８、２２及び２５の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対して指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２０９】
図１１は、試験例３〜１６の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対してリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。なお、試験例４及び試験例１２の結果（図中、各試験例に対応する数字をプロットに付した。）については後述する。【０２１０】
図１２は、試験例１７〜２５の指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−２つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２１１】
図１３は、試験例１７〜２５の指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２１２】
図１４は、試験例１７〜２５の指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−５つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２１３】
図１５は、試験例１７〜２５の指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２１４】
図１６は、試験例３〜２５の指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２１５】
【表１】
2015020159.tif 000004
【０２１６】
表１及び図９〜１６から明らかなように、充分な含水率の固定化リパーゼ（可逆的変性を受けていないと考えられる）は、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と触媒活性（エステル交換反応の比活性）とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値（例えば、指標値６の場合は１．２以上）以上の固定化リパーゼは、触媒活性又は潜在的な触媒活性が充分であると評価することができる。【０２１７】
また、試験例１２及び試験例１３の対比から、含水有機溶媒を用いた処理により可逆的変性を解消することによって、吸収バンド面積比に対応した触媒活性を再生可能であることが理解できる。すなわち、試験例１３の固定化リパーゼは、試験例１２の固定化リパーゼを含水率５％のアセトンで処理したものである。表１の結果から明らかなように当該処理により触媒活性が再生され、例えば図１６に示したとおり、３．４ｗｔ％  Ａｍａｎｏ  ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔの線形近似曲線（図示せず）上に入った。試験例１３及び試験例１２の固定化リパーゼは、ほぼ同等の指標値（例えば、指標値１の半値幅はいずれも６１．１ｃｍ−１であり、指標値６の吸収バンド面積比は、それぞれ１．３３及び１．２８である。）を有するものである。【０２１８】
さらに、試験例３及び試験例４の対比からも可逆的変性を解消することによって、吸収バンド面積比に対応した触媒活性を再生可能であることが理解できる。試験例３及び試験例４の固定化リパーゼは、含水率のみが異なり（含水率の低い試験例４の固定化リパーゼは可逆的変性を受けていると考えられる）、同等の指標値を有している。【０２１９】
実際に触媒反応を行い触媒活性を測定することにより固定化リパーゼの触媒活性を評価する従来の方法では、例えば、試験例１２及び試験例４の固定化リパーゼは、触媒活性の再生が可能であるにも関わらず、不良品としてはじかれてしまう。一方、本発明の方法によれば、試験例１２及び試験例４の固定化リパーゼは、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上あるため、触媒活性を再生可能な固定化リパーゼとして選抜することができる。【０２２０】
［２．固定化ペルオキシダーゼの触媒活性評価］
＜ｏ−フェニレンジアミンの酸化物の定量方法＞
ｏ−フェニレンジアミンの酸化物は、紫外可視分光光度計でＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定することにより定量した。紫外可視分光光度計による測定条件は以下のとおりである。
・紫外可視分光光度計（ＵＶ２４５０、株式会社島津製作所製）
・ピーク波長：４２０ｎｍ【０２２１】
＜酸化反応の比活性の算出方法＞
上記の方法で測定したｏ−フェニレンジアミンの酸化物に由来するＵＶ−ｖｉｓスペクトルのピーク強度（４２０ｎｍにおける吸収強度）を用いて、下記式に従い、固定化ペルオキシダーゼの酸化反応の比活性を算出した。なお、オキシダーゼ重量は、ＢＣＡ法によりＢＳＡ基準にて求めたペルオキシダーゼの重量である。
【数２】
2015020159.tif 000005
【０２２２】
＜含水率測定方法＞
固定化リパーゼの場合と同様の方法で含水率を測定した。【０２２３】
〔試験例２６：指標値の算出〕
１８００及び１５４５ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行ったこと以外は、試験例１と同様にして指標値を算出した。【０２２４】
〔試験例２７：固定化ペルオキシダーゼ（２．６ｗｔ％  ＨＲＰ／ＭＣＦｓ）の調製〕
３３．２ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３に、２０％％ＨＣｌ水溶液及び精製水をそれぞれ４００ｇ及び２００ｇずつ加え、次いで、メシチレンを２３．５ｇ加えた。その後、４０℃に加熱したウォーターバスに浸し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３を十分に溶解させた。その後、テトラエトキシシランを７０．０ｇ加え、５分間撹拌した後、３０℃で２０時間静置させた。得られた白色スラリーに、フッ化アンモニウム水溶液（０．３８ｇ／４０ｇ−Ｈ２Ｏ）を加え、１００℃で２４時間熟成させた。その後、５００ｍＬの精製水−エタノール混合液で洗浄、濾過した後、１００℃のオーブンで一晩乾燥させた。得られた白色粉体を大気雰囲気下、５００℃まで５時間かけて昇温し、そのままの温度で５時間保持した。得られた白色粉末（Ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  Ｍｅｓｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｏａｍｓ，ＭＣＦｓ）を、「シリカ担体」又は「ＭＣＦｓ」と呼ぶ。窒素吸脱着測定によって求めたシリカ担体の比表面積及び平均細孔径は、それぞれ５９７ｍ２・ｇ−１及び２４．４ｎｍだった。【０２２５】
西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ，１００ｕｎｉｔｓ・ｍｇ−１、和光純薬製）８２ｍｇを、８．１ｇの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解させて固定化原液とした。固定化原液を７．０ｇ秤量し、そこに担体を０．３５ｇ添加した。得られたスラリーを７℃で２４時間攪拌した。ペルオキシダーゼ固定化量は、固定化原液のタンパク質濃度と、スラリーを遠心分離して得られた上澄み液中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ法により定量し、両者の差分から算出した。その結果、ペルオキシダーゼ固定化量は２．６ｗｔ％であった。この固定化ペルオキシダーゼを、「固定化ペルオキシダーゼ」又は「２．６ｗｔ％  ＨＲＰ／ＭＣＦｓ」と呼ぶ。【０２２６】
〔試験例２８：ｏ−フェニレンジアミンの酸化反応〕
攪拌装置及び温度調節装置を備えた内容積２０ｍＬのガラス製試験管に、０．１Ｍ  ｏ−フェニレンジアミンのトルエン溶液２．５ｍＬ、１．１Ｍ  ｔ−ブチルヒドロペルオキシドのデカン溶液０．６ｍＬ、及び触媒として、含水率が３４．９％の固定化ペルオキシダーゼを加えて、攪拌しながら３５℃で反応させた。１時間後、反応液を取り出し、上述の方法により酸化反応の比活性を算出した。酸化反応の比活性は、３８９９．９ｈ−１・ｇ−１だった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は６５．７ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．７０であった。【０２２７】
〔試験例２９：ｏ−フェニレンジアミンの酸化反応〕
触媒として、２５℃のメタノールに３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２２．７％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は１０１６．０ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７５．１ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．４０であった。【０２２８】
〔試験例３０：ｏ−フェニレンジアミンの酸化反応〕
触媒として、１１０℃のトルエンに３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２８．５％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は２８４１．５ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７１．１ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．６２であった。【０２２９】
〔試験例３１：ｏ−フェニレンジアミンの酸化反応〕
触媒として、６０℃のＨＣｌ水溶液（ｐＨ３．５）に３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２５．３％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は２３７４．８ｈ−１・ｇ−１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ−１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．５８であった。【０２３０】
試験例２８〜３１の結果を下記表２にまとめた。また、図１７〜１８にペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図１９〜２０に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及びペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフを示した。【０２３１】
図１７は、試験例２８で触媒として使用した固定化ペルオキシダーゼのＦＴ−ＩＲスペクトルと、ペルオキシダーゼ由来の吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図１８は、試験例２８で触媒として使用した固定化ペルオキシダーゼのＦＴ−ＩＲスペクトルと、ペルオキシダーゼ由来の吸収バンドＩＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。【０２３２】
図１９は、試験例２８〜３１の指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）に対してペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。【０２３３】
図２０は、試験例２８〜３１の指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）に対してペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。【０２３４】
【表２】
2015020159.tif 000006
【０２３５】
表２及び図１９〜２０から明らかなように、充分な含水率の固定化ペルオキシダーゼ（可逆的変性を受けていないと考えられる）は、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と触媒活性（酸化反応の比活性）とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上の固定化ペルオキシダーゼは、触媒活性又は潜在的な触媒活性が充分であると評価することができる。【０２３６】
［３．抗体の力価評価］
＜抗体の力価測定方法＞
抗体（ＩｇＧ）の力価は、直接吸着法ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）により測定した。【０２３７】
抗原（ニワトリＩｇＧ）５０μｇにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ）緩衝液を加え、１０００ｎｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。１０００ｎｇ／ｍＬの抗原溶液から、ＰＢＳにより２倍希釈により、１０００，５００，２５０，１２５，６３，３１，１６ｎｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。各抗原溶液５０μＬを９６穴プレートの各ウェルに加え、５分放置し、各ウェルに吸着させた。各ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、抗原が吸着した９６穴プレートを得た。【０２３８】
力価測定対象となる抗体を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで溶解希釈し、１μｇ／ｍＬの抗体溶液（１次抗体溶液という）とした。１次抗体溶液５０μＬを抗原が吸着した９６穴プレートの各ウェルに加え、５分間放置し、抗原に結合させた。各ウェルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した。【０２３９】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギ抗体５０μｇを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで溶解希釈し、１μｇ／ｍＬの抗体溶液（２次抗体溶液という）とした。２次抗体溶液５０μＬを１次抗体を結合させた９６穴プレートの各ウェルに加え、５分間放置し、１次抗体に結合させた。各ウェルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した。【０２４０】
酵素基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）５０μＬを２次抗体を結合させた９６穴プレートの各ウェルに加え、室温で５分間放置した後、マイクロプレートリーダー（テカン社製）で６５５ｎｍの吸光度を測定した。【０２４１】
〔試験例３２：指標値の算出〕
１７２０及び１４９０ｃｍ−１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行ったこと以外は、試験例１と同様にして指標値を算出した。【０２４２】
〔試験例３３：抗体力価の測定〕
抗ニワトリＩｇＧウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ｉｎｃ製）溶液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：平均分子量２０，０００）４５ｍｇを加え、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに溶解し、抗体溶液とした。抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取し、直ちに−２０℃で凍結乾燥させた。凍結乾燥後の抗体を力価測定、及び顕微ＡＴＲ法によるＦＴ−ＩＲスペクトル測定に用いた。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３３は、「−２０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．０ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．０９であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９７であった。【０２４３】
〔試験例３４：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３４は、「４℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．６ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．０３であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９２であった。【０２４４】
〔試験例３５：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２５℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３５は、「２５℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．７ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９４であった。【０２４５】
〔試験例３６：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３６は、「５０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．４ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．０２であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９３であった。【０２４６】
〔試験例３７：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、７５℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３７は、「７５℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６６．０ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．９６であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．８０であった。【０２４７】
〔試験例３８：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、９０℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３８は、「９０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．６ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．９２であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．７９であった。【０２４８】
〔試験例３９：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、１０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．９ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は０．９８であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９５であった。【０２４９】
〔試験例４０：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．７ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．０１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９７であった。【０２５０】
〔試験例４１：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．０ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９６であった。【０２５１】
〔試験例４２：抗体力価の測定〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．８ｃｍ−１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）は０．９３であった。【０２５２】
〔試験例４３：指標値の算出〕
抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体（Ａｎｔｉ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、コスモバイオ株式会社製）溶液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：平均分子量２０，０００）４５ｍｇを加え、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに溶解し、抗体溶液とした。抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取し、直ちに−２０℃で凍結乾燥させた。凍結乾燥後の抗体を顕微ＡＴＲ法によるＦＴ−ＩＲスペクトル測定に用いた。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．１ｃｍ−１であった。【０２５３】
〔試験例４４：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．４ｃｍ−１であった。【０２５４】
〔試験例４５：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２５℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．６ｃｍ−１であった。【０２５５】
〔試験例４６：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６２．５ｃｍ−１であった。【０２５６】
〔試験例４７：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、７５℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７２．５ｃｍ−１であった。【０２５７】
〔試験例４８：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、９０℃で２４時間静置してから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は９４．０ｃｍ−１であった。【０２５８】
〔試験例４９：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、１０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．４ｃｍ−１であった。【０２５９】
〔試験例５０：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５９．０ｃｍ−１であった。【０２６０】
〔試験例５１：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５９．９ｃｍ−１であった。【０２６１】
〔試験例５２：指標値の算出〕
抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから−２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６２．０ｃｍ−１であった。【０２６２】
試験例３３〜５２の結果を下記表３にまとめた。また、図２１〜２２に抗体由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図２４〜２５に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及び抗体力価をプロットしたグラフを示した。【０２６３】
図２１は、試験例３３で凍結乾燥した抗体のＦＴ−ＩＲスペクトルと、抗体由来の吸収バンドＩ及び吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図２２は、試験例３３で凍結乾燥した抗体のＦＴ−ＩＲスペクトルと、抗体由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した例、及び吸収バンドＩＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。【０２６４】
図２４は、試験例３３〜４２の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対して抗体の力価をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。【０２６５】
図２５は、試験例３３〜４２の指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比−８つの正規分布）、及び指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比−３つの正規分布）に対して抗体の力価をプロットしたグラフである。いずれの指標値においても線形近似可能な正の相関が認められる。【０２６６】
【表３】
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【０２６７】
表３及び図２４〜２５から明らかなように、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と抗体力価とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上の抗体は、力価が充分であると評価することができる。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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