(57)【要約】本発明は、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーを、安定して保存するための保存用試料を調製する方法、及び当該保存用試料を調製するためのキットを提供することを目的とする。本発明の十二指腸液試料の保存方法は、（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において調製された希釈済の十二指腸液試料を、液体の状態で保存する工程と、を有し、前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈した保存用試料を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された保存用試料を、液体の状態で保存する工程と、を有し、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である、十二指腸液試料の保存方法。
【請求項２】
前記希釈用溶液が、プロテアーゼ阻害剤を更に含有する、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において、被検者から採取された十二指腸液試料を、プロテアーゼ阻害剤と混合した後、前記希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈したものを保存用試料とする、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼ阻害剤が固体である、又は、前記被検者から採取された十二指腸液試料と前記プロテアーゼ阻害剤との混合物の容量が、前記被検者から採取された十二指腸液試料の２倍容量以下である、請求項３に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項５】
前記被検者から採取された十二指腸液試料を前記プロテアーゼ阻害剤と混合した後、１〜３０分間経過した後に、前記希釈用溶液を添加して希釈する、請求項３又は４に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項６】
前記保存用試料が、タンパク質マーカーの検出に供されるものであり、
前記タンパク質が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応系に対して不活性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項７】
前記タンパク質マーカーが、膵疾患マーカーである、請求項６に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項８】
前記希釈用溶液が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応用溶液である、請求項６又は７に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項９】
前記希釈用溶液が、界面活性剤を含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）において、保存期間が６時間〜１４日間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項１１】
被検者から採取された十二指腸液試料を回収する回収用容器と、希釈用溶液とを備え、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液であり、
前記回収用容器に回収された十二指腸液試料に前記希釈用溶液を混合して保存用試料を調製するために用いられる、キット。
【請求項１２】
前記回収用容器内に、プロテアーゼ阻害剤が収容されている、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記希釈用溶液がプロテアーゼ阻害剤を更に含有する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
さらに、前記被験者から十二指腸液を採取するための採取具を備える、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーを、安定して保存するための保存用試料を調製する方法、及び当該保存用試料を調製するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
十二指腸液は、膵臓から排出される膵液、胆管から排出される胆汁、及び十二指腸で分泌される粘液の混合体液である。十二指腸液の採取は、内視鏡を十二指腸まで挿入し、その場で吸引するだけで可能であり、膵管からの膵液採取に比べて低侵襲かつより簡便な手技で実施できる。このため、十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することにより、膵疾患を検査することができる。【０００３】
一方で、十二指腸液には、膵液や腸液由来のプロテアーゼと、胆汁や腸液由来の細菌が多く含まれており、これらの働きにより、十二指腸液中に含まれるタンパク質等の各種生体分子は分解されやすい。このため、十二指腸液を生体試料とし、当該生体試料中のタンパク質マーカーを定量的に検出する場合、当該生体試料中のタンパク質マーカーがプロテアーゼや細菌の影響を受け、正確に測定できないことが懸念される。そこで、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーを、検査に供されるまで安定して保存することが重要になる。【０００４】
採取された十二指腸液試料中のタンパク質マーカーの分解を抑制して保存する効果的な方法としては、十二指腸液を採取後迅速に凍結させ、タンパク質マーカーの検査まで冷凍保存する方法が挙げられる。しかしながら、十二指腸液は一般的に内視鏡検査時に採取されるが、内視鏡検査室には一般的に、冷凍設備や液体窒素等の生体試料を急速凍結させるための設備はなく、当該方法の実施は困難である。【０００５】
採取された十二指腸液を、膵液由来の生体成分の分解が抑制された状態で保存する方法としては、十二指腸液試料のｐＨを２〜５に調整した保存用試料として保存する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。ｐＨを２〜５に調整することにより、十二指腸液試料中のプロテアーゼの活性を抑制することができる。その他、生体試料中のタンパク質を安定して保存するために、当該生体試料中のプロテアーゼの活性を抑制する方法として、血清等の生体試料に、尿素や塩酸グアニジン等の変性剤や、ＳＤＳ等の陰イオン系界面活性剤を含有させる方法も開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２３００７３号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９２１４号公報
【特許文献３】特開２００６−３０８５７６号公報
【特許文献４】特開２０１１−５００９号公報公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pancreas,1994, vol.9, No.6,p741−747
【非特許文献２】Pancreas, 2002, vol.24, No.54, p344−347
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１及び２の方法は、いずれも生体試料中のプロテアーゼの活性を抑制させることを目的とする方法である。しかし、単にプロテアーゼの活性のみを抑制させるだけでは、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーの測定精度を担保するためには充分ではなかった。特に、内視鏡検査時には、胃粘膜の観察を行うために、胃の粘膜を排除するための強力なプロテアーゼを事前に経口投与されるため、内視鏡検査時に採取される十二指腸液中には、非常に多くの強力なプロテアーゼが含まれており、タンパク質マーカーはより分解されやすいという問題がある。  すなわち、本発明は、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーを、安定して保存するための保存用試料を調製する方法、及び当該保存用試料を調製するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、被検者から採取された十二指腸液試料を不活性なタンパク質を多量に含有している水溶液で希釈した状態で保存することにより、冷凍保存せずとも、十二指腸液試料中のタンパク質マーカーをより安定的に保存できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明に係る十二指腸液試料の保存方法及びキットは、下記［１］〜［１４］である。
［１］  （ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈した保存用試料を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された保存用試料を、液体の状態で保存する工程と、を有し、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である、十二指腸液試料の保存方法。
［２］  前記希釈用溶液が、プロテアーゼ阻害剤を更に含有する、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
［３］  前記工程（ａ）において、被検者から採取された十二指腸液試料を、プロテアーゼ阻害剤と混合した後、前記希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈したものを保存用試料とする、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
［４］  前記プロテアーゼ阻害剤が固体である、又は、前記被検者から採取された十二指腸液試料と前記プロテアーゼ阻害剤との混合物の容量が、前記被検者から採取された十二指腸液試料の２倍容量以下である、前記［３］の十二指腸液試料の保存方法。
［５］  前記被検者から採取された十二指腸液試料を前記プロテアーゼ阻害剤と混合した後、１〜３０分間経過した後に、前記希釈用溶液を添加して希釈する、前記［３］又は［４］の十二指腸液試料の保存方法。
［６］  前記保存用試料が、タンパク質マーカーの検出に供されるものであり、
前記タンパク質が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応系に対して不活性である、前記［１］〜［５］のいずれかの十二指腸液試料の保存方法。
［７］  前記タンパク質マーカーが、膵疾患マーカーである、前記［６］の十二指腸液試料の保存方法。
［８］  前記希釈用溶液が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応用溶液である、前記［６］又は［７］の十二指腸液試料の保存方法。
［９］  前記希釈用溶液が、界面活性剤を含有する、前記［１］〜［８］のいずれかの十二指腸液試料の保存方法。
［１０］  前記工程（ｂ）において、保存期間が６時間〜１４日間である、前記［１］〜［９］のいずれかの十二指腸液試料の保存方法。
［１１］    被検者から採取された十二指腸液試料を回収する回収用容器と、希釈用溶液とを備え、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液であり、
前記回収用容器に回収された十二指腸液試料に前記希釈用溶液を混合して保存用試料を調製するために用いられる、キット。
［１２］  前記回収用容器内に、プロテアーゼ阻害剤が収容されている、前記［１１］のキット。
［１３］  前記希釈用溶液がプロテアーゼ阻害剤を更に含有する、前記［１１］のキット。
［１４］  さらに、前記被験者から十二指腸液を採取するための採取具を備える、前記［１１］のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る十二指腸液試料の保存方法により、十二指腸液試料を、当該試料中に含まれるタンパク質マーカーの分解・変性を充分に抑制しつつ、液体の状態で安定的に保存することができる。
また、本発明に係る十二指腸液試料から保存用試料を調製するためのキットを用いることにより、被験者から採取された十二指腸液から、タンパク質マーカーをより安定的に保存することができる保存用試料を、より簡便に調製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜十二指腸液試料の保存方法＞
本発明に係る十二指腸液試料の保存方法（以下、「本発明に係る保存方法」ということがある）は、被験者から採取された十二指腸液に元々含まれているタンパク質を安定的に保存するための方法である。このため、当該保存方法は、十二指腸液に含まれているタンパク質を測定するための検査に供される十二指腸液試料の保存方法として用いられる。
以下において、当該保存方法により保存された後の十二指腸液試料が供される検査において測定対象となるタンパク質を、「目的タンパク質」ということがある。
【００１３】
本発明において、「目的タンパク質」は、タンパク質マーカーであることが好ましい。
タンパク質マーカーを検出するための検査に供される十二指腸液試料を本発明に係る保存方法を用いて保存することにより、保存期間中におけるタンパク質の分解や変性を効果的に抑制することができ、より信頼性の高い検査結果が期待できる。
【００１４】
なお、本発明及び本願明細書において、タンパク質マーカーとは、体液中におけるその濃度が、何等かの疾患の存在や進行度の指標となるタンパク質を意味する。具体的には、疾患の非罹患者の場合と比較して、疾患に罹患している患者から採取された生体試料中の濃度が有意に高くなる又は低くなるタンパク質を意味する。なお、疾患の非罹患者は、当該疾患に罹患していなければよく、健常者に限らず、当該疾患以外の疾患の罹患者を含んでもよい。
【００１５】
十二指腸液試料は、膵疾患の検査試料として好適である。このため、本発明に係る保存方法は、特に膵疾患マーカーを目的タンパク質とすることが好ましい。当該膵疾患マーカーとしては、例えば、膵癌、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、ＭＣＮ（粘液性嚢胞腫瘍）、ＳＣＮ（漿液性嚢胞腫瘍）、ＮＥＴ（膵内分泌腫瘍）、慢性膵炎（ＣＰ）、急性膵炎等のタンパク質マーカーが好ましい。膵疾患マーカーとしては、具体的には、Ｓ１００タンパク質（Ｓ１００Ｐ）、ＮＧＡＬ、ＭＩＣ−１、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９（例えば、非特許文献１を参照）、ＭＵＣ−１（ＫＬ−６）（例えば、特許文献３等を参照）、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）（例えば、非特許文献２を参照）、ＭＭＰ７（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−７）等が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る十二指腸液試料の保存方法は、被検者から採取された十二指腸液試料を、多量の不活性なタンパク質の存在下、希釈された状態で保存することを特徴とする。タンパク質は、水溶液中では、濃度が低いと不安定になりやすいため、タンパク質溶液を保存する場合には、一般的に限外濾過膜処理等により濃縮した状態で保存する。にもかかわらず、十二指腸液試料では、採取されたものをそのまま保存する場合よりも、１０倍容量以上に希釈した状態で保存したほうが、十二指腸液試料中のタンパク質の保存安定性が良好である。この理由は明らかではないが、希釈することに加えて多量の不活性なタンパク質を共存させることにより、プロテアーゼや細菌と接触する機会が減る結果、タンパク質がプロテアーゼや細菌による分解や変性を受けにくくなったためと推察される。本発明に係る保存方法とは異なり、単にプロテアーゼ阻害剤のみを添加して保存する方法が十二指腸液試料の保存安定性の点から不充分であった理由としては、プロテアーゼ阻害剤のみでは、細菌によるタンパク質の分解や変性を抑制できないことが考えられる。まず、希釈により、十二指腸液に由来する細菌が、同じく十二指腸液試料に由来する目的タンパク質と接触する機会が減り、かつ十二指腸液に由来する細菌が、目的タンパク質ではなく、その周囲に多量に存在する不活性なタンパク質に対して働く結果、目的タンパク質の分解や変性が防止されると考えられる。
【００１７】
具体的には、本発明に係る十二指腸液試料の保存方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を有する。
（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈した保存用試料を調製する工程。
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された保存用試料を、液体の状態で保存する工程。
【００１８】
本発明において用いられる希釈用溶液は、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である。十二指腸液試料に、０．０２質量％以上という高濃度のタンパク質を含有させることにより、当該タンパク質が物理的な障壁となり、十二指腸液試料に元々含まれているタンパク質が、同じく十二指腸液試料に元々含まれているプロテアーゼや細菌と接触し難くなる結果、目的タンパク質の保存安定性が高まる。当該希釈用溶液のタンパク質含有量は、多いほど十二指腸液試料中のタンパク質の保存安定性は高くなる傾向にあるが、タンパク質濃度が高すぎると溶解性が悪くなるおそれがある。このため、本発明において用いられる希釈用溶液のタンパク質濃度としては、０．０２〜１０質量％であることが好ましく、０．１〜１０質量％であることがより好ましく、０．５〜１０質量％であることがさらに好ましく、１〜１０質量％であることがよりさらに好ましい。
【００１９】
希釈用溶液に含有させるタンパク質は、十二指腸液試料に元々含まれている目的タンパク質に対して不活性であり、かつ当該目的タンパク質の検出反応の反応系に対して不活性であるものを用いる。このような不活性なタンパク質としては、血清アルブミン、卵白アルブミン等のアルブミンや、グロブリンタンパク質、スキムミルク等が挙げられる。本発明においては、より反応系に与える影響が小さく、かつ汎用されており取扱いが容易であることから、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。
【００２０】
「タンパク質に対して不活性である」とは、当該タンパク質を分解・変性させることがなく、かつ当該タンパク質の活性にも影響を与えないことを意味する。不活性なタンパク質としては、十二指腸液試料中の各種プロテアーゼや細菌によって分解や変性されるものであってもよい。また、「反応系に対して不活性である」とは、当該反応系内に存在した場合に、目的の反応に対して影響を与えないことを意味する。
【００２１】
本発明において用いられる希釈用溶液は、不活性なタンパク質を水に溶解させた溶液であってもよく、不活性なタンパク質を緩衝液に溶解させた溶液であってもよい。ｐＨは、細菌の活性やプロテアーゼの活性に影響を与えるため、試料間の差を小さくするため、緩衝液に不活性なタンパク質を溶解させた溶液を希釈用溶液とすることが好ましい。当該緩衝液としては、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー等のようなタンパク質や核酸の検出のための反応液調製に用いられるバッファーを用いることができる。
【００２２】
本発明において用いられる希釈用溶液は、目的タンパク質の保存安定性を阻害せず、かつ保存後に供される目的タンパク質の検査等を阻害しない限度において、不活性なタンパク質以外のその他の成分を含有していてもよい。当該その他の成分としては、例えば、プロテアーゼ阻害剤や界面活性剤、塩類等が挙げられる。
【００２３】
当該プロテアーゼ阻害剤としては、ロイペプチン、アプロチニン、メシル酸カモスタット（フォイパン）、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）、ＴＬＣＫ（Ｎ−ａ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン）、ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド））、ｐ−ＡＰＭＳＦ（ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォニルフオライド塩酸塩）、４−(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５５−２６−５）、３−(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５４−９５−５）、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３９２−８６−９）、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３６８−５０−３）、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：９８−６２−４）、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：４３３−９８−７）、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９−７８−０）、４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９−９６−２）等が挙げられる。本発明において用いられる希釈用溶液が含有するプロテアーゼ阻害剤は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２４】
当該界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であってもよく、陰イオン性界面活性剤であってもよく、陽イオン性界面活性剤であってもよく、両性界面活性剤であってもよい。非イオン性界面活性剤として、例えば、サポニン、ジギトニン、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチフェニルエーテル）等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に代表されるアルキル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルサルコシン等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、例えば、ＣＤＡＢに代表されるアルキル４級化アンモニウム等が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えば、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）等が挙げられる。本発明において用いられる希釈用溶液が含有する界面活性剤は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２５】
本発明に係る保存方法により保存された十二指腸液試料は、被験者から採取された十二指腸液を少なくとも１０倍容量以上となるように希釈された保存用試料である。このため、目的タンパク質を検出するための反応系に持ち込まれる保存用試料の容量は、従来の希釈されずに保存された十二指腸液試料よりも多くなる。そこで、本発明において用いられる希釈用溶液が、目的タンパク質検出のための反応系に影響を及ぼすおそれのある成分を含有する場合には、希釈用溶液の当該成分の濃度は、当該希釈用溶液を多量反応系に持ち込んだ場合でも検出反応を阻害しないように抑えておくことが好ましい。例えば、反応系の界面活性剤の濃度は、タンパク質の検出反応の多くにおいて影響を及ぼす。このため、希釈用溶液が界面活性剤を含有する場合には、検出反応の反応系に持ち込まれる量が、検出反応を阻害しない濃度に抑えられるように適宜調節する必要がある。
【００２６】
本発明において用いられる希釈用溶液としては、目的タンパク質の検出反応の反応用溶液である、すなわち、反応用溶液と同じ組成であることが好ましい。希釈用溶液が反応用溶液と同じ組成であれば、反応系に持ち込まれる希釈用溶液の量の多寡は検出反応に影響を与えないためである。例えば、目的タンパク質の検出をＥＬＩＳＡ法で行う場合には、希釈用溶液として、市販のＥＬＩＳＡ用バッファーを用いることができる。
【００２７】
工程（ａ）において、本発明に係る保存方法に供される十二指腸液試料は、被験者から採取された十二指腸液自体であってもよく、採取された十二指腸液に各種添加剤を添加したものであってもよい。添加剤としては、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ｐＨ調整剤等の、十二指腸液試料中の成分の分解や変性を抑制するための試薬等が挙げられる。
【００２８】
十二指腸液は、被験者から常法により採取することができる。例えば、十二指腸液を内視鏡カテーテルに接続したシリンジや真空ポンプなどの吸引手段にて採取することができる。具体的には、内視鏡を口腔から十二指腸まで挿入し、鉗子チャネルを挿通して挿入したカテーテルを用いて、十二指腸の第二・第三ポーションに存在する十二指腸液を吸引し採取する。例えば、いわゆる胃カメラとしての胃・十二指腸の内視鏡検査（上部内視鏡検査）のついでに、十二指腸の腸管内に貯留している十二指腸液を採取してもよい。
【００２９】
プロテアーゼ阻害剤が効率よくプロテアーゼを阻害するためには、充分量のプロテアーゼ阻害剤が存在していることが必要であり、プロテアーゼ阻害剤の濃度が重要である。そこで、希釈用溶液にプロテアーゼ阻害剤を含有させることに代えて、被検者から採取された十二指腸液試料を、プロテアーゼ阻害剤と混合した後、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈したものを保存用試料とすることも好ましい。希釈用溶液によって希釈される前の十二指腸液試料にプロテアーゼ阻害剤を混合することにより、より少量のプロテアーゼ阻害剤で充分な阻害効果を得ることができる。
【００３０】
希釈前の十二指腸液試料にプロテアーゼ阻害剤を添加する場合、添加後の全体の容量は多くないほうが、同じ量のプロテアーゼ阻害剤を添加した場合に、十二指腸液試料中のプロテアーゼ阻害剤濃度をより高くすることができて好ましい。このため、本発明においては、希釈前の十二指腸液試料に添加するプロテアーゼ阻害剤は、固体であることが好ましい。また、プロテアーゼ阻害剤が液体の場合には、被検者から採取された十二指腸液試料とプロテアーゼ阻害剤との混合物の容量が、プロテアーゼ阻害剤を混合する前の十二指腸液試料の２倍容量以下に抑えられていることが好ましい。
【００３１】
希釈前の十二指腸液試料にプロテアーゼ阻害剤を添加する場合、十二指腸液試料とプロテアーゼ阻害剤を混合した後、得られた混合物は、希釈用溶液を添加する前に、一定期間静置又はインキュベートすることが好ましい。これにより、プロテアーゼ阻害剤が、十二指腸液試料中のプロテアーゼを充分に阻害することができる。静置又はインキュベートする時間は特に限定されるものではなく、例えば、十二指腸液試料にプロテアーゼ阻害剤混合後、１〜３０分間経過した後に希釈用溶液を添加して希釈することができる。
【００３２】
ヌクレアーゼ阻害剤等のプロテアーゼ阻害剤以外の添加剤を、希釈用溶液による希釈前に被検者から採取された十二指腸液自体に添加する場合も同様に、被検者から採取された十二指腸液試料と添加剤との混合物の容量が、プロテアーゼ阻害剤を混合する前の十二指腸液試料の２倍容量以下に抑えられていることが好ましく、当該混合物は必要に応じて一定期間静置又はインキュベートすることが好ましい。
【００３３】
工程（ａ）においては、十二指腸液試料を希釈用溶液で希釈する希釈倍率は、１０倍容量以上であれば特に限定されるものではないが、５０倍以上が好ましい。また、希釈倍率が大きくなりすぎると、目的タンパク質の検出が難しくなるおそれがあるため、当該希釈倍率は、５００倍容量以下であることが好ましく、３００倍容量以下がより好ましく、２００倍容量以下がさらに好ましい。
【００３４】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）において調製された保存用試料を、凍結せずに、液体の状態で保存する。保存温度は、当該保存用試料が凝固しない温度であれば特に限定されるものではなく、温度制御された特別な環境である必要はない。例えば、保存用試料は、冷蔵保存してもよく、常温（１５〜２５℃）保存してもよく、室温（１〜３０℃）保存してもよい。また、恒温装置等を用いて、温度を０〜３５℃のうちの一定の範囲内に保つように制御された環境下で保存してもよい。
【００３５】
工程（ｂ）において、保存用試料を保存する保存期間は、特に限定されるものではない。本発明においては、当該保存期間としては、６時間〜１４日間が好ましく、６時間〜７日間がより好ましく、６時間〜３日間がさらに好ましい。例えば、工程（ａ）において調製された保存用試料を、目的タンパク質の検査を行う施設等に輸送する場合には、この輸送期間を工程（ｂ）における保存期間とすることができる。
【００３６】
本発明に係る保存方法により保存された保存用試料は、従来法により調製された十二指腸液試料と同様に、各種検査に供することができる。保存用試料中の目的タンパク質を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、化学発光免疫測定法などの免疫学的な測定法、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法等が挙げられる。これらの方法は常法により行うことができる。
【００３７】
＜十二指腸液試料から保存用試料を調製するためのキット＞
本発明に係るキットは、本発明に係る保存方法の工程（ａ）を実施するために用いられるキットである。すなわち、本発明に係るキットは、被検者から採取された十二指腸液試料を回収する回収用容器と、前記希釈用溶液とを備え、当該回収用容器に回収された十二指腸液試料に希釈用溶液を混合して保存用試料を調製するために用いられる。当該キットを用いることにより、前記工程（ａ）をより簡便に実施することができる。
【００３８】
本発明に係るキットとしては、希釈用溶液そのものを備えていてもよく、不活性のタンパク質と、当該タンパク質を添加することにより希釈用溶液となる溶液とを、別個の容器に収容していてもよい。不活性のタンパク質を希釈用溶液とは分けて備えている場合、当該タンパク質は、水や緩衝液に溶解させた溶液であってもよいが、キットの長期保存安定性の点から粉末等の固体であることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るキットとしては、プロテアーゼ阻害剤を含有する希釈用溶液を備えていてもよく、希釈用溶液とは別個の容器に入れた状態のプロテアーゼ阻害剤を備えておき、十二指腸液試料に添加する直前に希釈用溶液にプロテアーゼ阻害剤を混合する構成としてもよい。
【００４０】
本発明に係るキットとしては、回収用容器内に、プロテアーゼ阻害剤が収容されていることも好ましい。被験者から採取された十二指腸液は回収用容器に収容されるため、回収用容器内にプロテアーゼ阻害剤を収容することにより、被験者の体外に出された十二指腸液は速やかに回収用容器内でプロテアーゼ阻害剤と混合される。回収用容器内に収容されたプロテアーゼ阻害剤は、水や緩衝液に溶解させた溶液であってもよいが、キットの長期保存安定性の点から粉末等の固体であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るキットは、その他、回収用容器に回収された十二指腸液試料と希釈用溶液を入れて保存用試料を調製するための容器、ヌクレアーゼ阻害剤等の各種添加剤、希釈用溶液を回収用容器に回収された十二指腸液試料に添加すること等のキットの使用方法が記載された説明書等を備えていてもよい。
【００４２】
また、十二指腸液試料は、経内視鏡的に採取することが一般的である。そこで、本発明に係るキットの構成品として、十二指腸液試料を経内視鏡的に採取する採取具を含めてもよい。当該採取具としては、例えば、内視鏡装置に挿入可能なカテーテルにシリンジを組合せたものや、内視鏡装置に挿入可能な吸収体を先端に備えたプローブ等がある。内視鏡装置に挿入可能なカテーテルとしては、例えば、特許文献４に記載されている標本採取キューブ等が挙げられる。被検者から採取された十二指腸液試料が回収される回収用容器は、これらの採取具と取り外し可能に接続されていてもよく、採取具中に設けられている貯留部から回収した十二指腸液を収容する、採取具とは別個の容器であってもよい。所定の採取具と回収用容器、希釈用容器がキット化されていることで、採取手技と保存方法が統一化され、より精度の高い検査を実施することができる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４４】
［実施例１］
４名の被験者（被検者ａ〜ｄ）から採取した十二指腸液試料について、各種条件で保存し、保存後の試料中のＳ１００Ｐ濃度を測定した。採取後直ちに凍結して−８０℃で保存した試料のＳ１００Ｐ濃度を基準として、測定結果を比較した。【００４５】
被検者からの十二指腸液試料の採取は、予め１０ｍｇの粉末のプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＰＭＳＦ、及びＴＬＣＫの混合物）を収容した保存用容器を着脱可能に設置した採取具を用いて経内視鏡的に行った。なお、採取された十二指腸液試料とプロテアーゼ阻害剤との混合時間から、後述のＥＬＩＳＡバッファーによる希釈までの時間長は１〜３分程度であった。【００４６】
各被検者から採取され、プロテアーゼ阻害剤と混合した十二指腸液試料から２０μＬずつを６本の容器に分取し、このうち３サンプルはそのまま保存し、残りの３サンプルは、ＣｉｒｃｕＬｅｘ  Ｓ１００Ｐ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ−８０６０）に添付のＥＬＩＳＡバッファーで１００倍容量となるように希釈して保存した。希釈せずに保存した３サンプルの保存条件は、それぞれ、−８０℃で１週間、４℃で１日間、又は室温で１日間とした。希釈して保存した３サンプルの保存条件は、それぞれ、４℃で１日間、４℃で１週間、又は室温で１日間とした。なお、当該ＥＬＩＳＡバッファーには、ＢＳＡが１〜５％含有されている。【００４７】
保存後の各サンプルの全量中のＳ１００Ｐ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、ＣｉｒｃｕＬｅｘ  Ｓ１００Ｐ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ−８０６０）を用いて測定した。【００４８】
各サンプルのＳ１００Ｐ濃度について、−８０℃で１週間保存したサンプルのＳ１００Ｐ濃度を１００％とした相対値（％）をＳ１００Ｐの残存率（％）として求めた。結果を表１に示す。この結果、いずれの被験者のサンプルも、保存温度と保存期間が同じ場合には、希釈されたサンプルのほうが希釈されていないサンプルよりもＳ１００Ｐの残存率が明らかに高く、希釈した状態で保存するほうが、十二指腸液試料中のタンパク質の保存安定性が高い事が確認された。【００４９】
【表１】
2017081946.tif 000002
【００５０】
［実施例２］
実施例１の被験者ａ〜ｄから採取され、１０ｍｇの粉末のプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＰＭＳＦ、及びＴＬＣＫの混合物）と混合した十二指腸液試料について、Ｓ１００Ｐの残存率（％）に対する希釈用溶液の成分の違いによる影響を調べた。【００５１】
具体的には、各被検者から採取され、プロテアーゼ阻害剤と混合した十二指腸液試料から２０μＬずつを１２本の容器に分取し、このうちの５サンプルについて、ＰＢＳ、０．１質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．１％）、０．０２質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．０２％）、０．１質量％のＢＳＡと０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．１％＋ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）、又は実施例１で用いたＥＬＩＳＡバッファーで、それぞれ１００倍容量に希釈した後、室温で１日間保存した。残りの６サンプルは、希釈せずに−８０℃で１日間保存した。【００５２】
保存後の各サンプルの全量中のＳ１００Ｐ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、実施例１と同様にして測定した。ただし、希釈せずに−８０℃で１日間保存した５サンプルのうち、４サンプルについては、それぞれ、ＰＢＳ、０．１質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳ、０．０２質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳ、０．１質量％のＢＳＡと０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有させたＰＢＳ、又は実施例１で用いたＥＬＩＳＡバッファーで１０倍容量に希釈した後にＳ１００Ｐ濃度を測定した。【００５３】
−８０℃で保存した後に各希釈用溶液で１００倍希釈したサンプルのＳ１００Ｐ濃度について、−８０℃で保存し希釈せずにＳ１００Ｐ濃度を測定したサンプルのＳ１００Ｐ濃度を１００％とした相対値（％）をＳ１００Ｐの残存率（％）として求めた。このＳ１００Ｐの残存率は、希釈用溶液のＥＬＩＳＡの反応系への持ち込みの影響を表す。結果を表２に示す。Ｓ１００Ｐの残存率が低くなった希釈用溶液は、反応系へ持ち込まれることにより、ＥＬＩＳＡの反応を阻害してしまうことを意味する。この結果、０．１質量％のＢＳＡと０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０を含有させたＰＢＳで希釈したサンプルでは、Ｓ１００Ｐの残存率が６９％と明らかに低かった。これは、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０は、ＥＬＩＳＡ反応に適切な界面活性剤の濃度よりも高く、このためにＥＬＩＳＡ反応が抑制されてしまったためと推察される。界面活性剤を含有する希釈用溶液を用いる場合には、ＥＬＩＳＡの反応系に負の影響を与える恐れがあり、このため、予め希釈用溶液が反応系に持ち込まれることによる影響を調べておくことが好ましい。【００５４】
【表２】
2017081946.tif 000003
【００５５】
希釈して保存した各サンプルのＳ１００Ｐ濃度について、−８０℃で保存したサンプルのＳ１００Ｐ濃度を１００％とした相対値（％）をＳ１００Ｐの残存率（％）として求めた。結果を表３に示す。この結果、ＰＢＳで希釈したサンプルと、０．１質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳで希釈したサンプルと、０．０２質量％のＢＳＡを含有させたＰＢＳで希釈したサンプルと、ＥＬＩＳＡバッファーで希釈したサンプルの結果を比較すると、希釈用溶液のＢＳＡ含有量が多いほど、Ｓ１００Ｐの残存率が高くなる傾向にあった。ただし、ＥＬＩＳＡの反応系への持ち込みにより負の影響があった０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０を含有する希釈用溶液で希釈したサンプルでは、Ｓ１００Ｐの残存率が非常に低かった。【００５６】
【表３】
2017081946.tif 000004
【００５７】
［実施例３］
実施例１の被験者ａ〜ｄから採取され、１０ｍｇの粉末のプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＰＭＳＦ、及びＴＬＣＫの混合物）と混合した十二指腸液試料について、Ｓ１００Ｐの残存率（％）に対する希釈倍率の影響を調べた。【００５８】
具体的には、各被検者から採取され、プロテアーゼ阻害剤と混合した十二指腸液試料から２０μＬずつを４本の容器に分取し、このうちの３サンプルについて、実施例１で用いたＥＬＩＳＡバッファーで、それぞれ５、２０、又は１００倍容量に希釈した後、室温で１日間保存した。残りの１サンプルは、希釈せずに−８０℃で１日間保存した。【００５９】
各サンプルのＳ１００Ｐ濃度について、−８０℃で保存したサンプルのＳ１００Ｐ濃度を１００％とした相対値（％）をＳ１００Ｐの残存率（％）として求めた。結果を表４に示す。この結果、いずれの被験者においても、ＥＬＩＳＡバッファーによる希釈倍率が高くなるほど、Ｓ１００Ｐの残存率が高く、Ｓ１００Ｐの保存安定性が良好であった。これは、希釈倍率が高くなるほど、サンプル中のＳ１００Ｐが、プロテアーゼや細菌と接触する頻度が減少するためと推察された。【００６０】
【表４】
2017081946.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月8日(2017.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、プロテアーゼ阻害剤と混合した後、１〜３０分間経過した後に、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈することによって保存用試料を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された保存用試料を、液体の状態で保存する工程と、を有し、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である、十二指腸液試料の保存方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ阻害剤が固体である、又は、前記被検者から採取された十二指腸液試料と前記プロテアーゼ阻害剤との混合物の容量が、前記被検者から採取された十二指腸液試料の２倍容量以下である、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項３】
前記保存用試料が、タンパク質マーカーの検出に供されるものであり、
前記タンパク質が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応系に対して不活性である、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項４】
前記タンパク質マーカーが、膵疾患マーカーである、請求項３に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項５】
前記希釈用溶液が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応用溶液である、請求項３に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項６】
前記希釈用溶液が、界面活性剤を含有する、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において、保存期間が６時間〜１４日間である、請求項１に記載の十二指腸液試料の保存方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明に係る十二指腸液試料の保存方法は、下記［１］〜［７］である。
［１］  （ａ）被検者から採取された十二指腸液試料を、プロテアーゼ阻害剤と混合した後、１〜３０分間経過した後に、希釈用溶液で１０倍容量以上に希釈することによって保存用試料を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された保存用試料を、液体の状態で保存する工程と、を有し、
前記希釈用溶液が、０．０２質量％以上のタンパク質を含有する水溶液である、十二指腸液試料の保存方法。
［２］  前記プロテアーゼ阻害剤が固体である、又は、前記被検者から採取された十二指腸液試料と前記プロテアーゼ阻害剤との混合物の容量が、前記被検者から採取された十二指腸液試料の２倍容量以下である、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
［３］  前記保存用試料が、タンパク質マーカーの検出に供されるものであり、
前記タンパク質が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応系に対して不活性である、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
［４］  前記タンパク質マーカーが、膵疾患マーカーである、前記［３］の十二指腸液試料の保存方法。
［５］  前記希釈用溶液が、前記タンパク質マーカーの検出反応の反応用溶液である、前記［３］の十二指腸液試料の保存方法。
［６］  前記希釈用溶液が、界面活性剤を含有する、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
［７］  前記工程（ｂ）において、保存期間が６時間〜１４日間である、前記［１］の十二指腸液試料の保存方法。
【国際調査報告】
2017081946.tif 000006
2017081946.tif 000007
2017081946.tif 000008
2017081946.tif 000009