(57)【要約】  グリオーマの診断マーカーは、シアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、Ｆｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、Ｆｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８並びにＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるグリオーマの診断マーカー。
【請求項２】
前記糖鎖は、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとを判別するために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項３】
前記糖鎖は、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖であり、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとを判別するために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項４】
前記糖鎖は、モノアンテナ型糖鎖であり、
グリオーマのＷＨＯグレードＩの診断のために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項５】
前記糖鎖は、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖及びフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断のために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項６】
前記糖鎖は、コア２型Ｏ−結合型糖鎖及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃより少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断のために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項７】
前記糖鎖は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断のために用いられる、
ことを特徴とする請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項８】
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる、グリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカー。
【請求項９】
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカー。
【請求項１０】
β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカー。
【請求項１１】
総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカー。
【請求項１２】
Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカー。
【請求項１３】
フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカー。
【請求項１４】
被験者由来の試料中の（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとの判別方法。
【請求項１５】
被験者由来の試料中の（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとの判別方法。
【請求項１６】
被験者由来の試料中のβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断方法。
【請求項１７】
被験者由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断方法。
【請求項１８】
被験者由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断方法。
【請求項１９】
被験者由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断方法。
【請求項２０】
被験者由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含むグリオーマの診断方法。
【請求項２１】
細胞に２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に細胞を癌化させる過程において、前記遺伝子導入後の各段階の細胞に発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を定性定量する工程と、
前記過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動を解析する工程と、
前記遺伝子導入と、前記過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動と、の間の相関性に基づき、糖鎖マーカーを選択する工程と、
を含む腫瘍の進行度を評価するための糖鎖マーカーを検出する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法で得られた糖鎖マーカー。
【請求項２３】
グリオーマの診断のために用いられる、
ことを特徴とする請求項２２に記載の糖鎖マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリオーマの診断マーカー、判別方法、診断方法、糖鎖マーカーを検出する方法及び糖鎖マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌をはじめとする種々の疾患において、糖鎖の発現量や構造に変動が認められることについては多くの報告がある（非特許文献１）。実際に、ＦＤＡや厚生労働省の認可する腫瘍マーカーの多くが複合糖質や糖鎖であり、また再生医療領域で重要な未分化マーカーの多くも複合糖質や糖鎖である。このように、糖鎖を標的とした疾患関連マーカー探索が世界中で進められている状況にある。【０００３】
糖鎖関連マーカー探索は、古くは、腫瘍部位と非腫瘍部位との間で、糖鎖発現量を、主に免疫化学的な手法によって比較することで行われてきた。近年では、分析機器や糖鎖解析技術の進展によって、質量分析法などにより直接糖鎖構造を比較する方法も汎用されるようになってきた。解析対象は、血清や病理組織等が一般に用いられ、健常人と患者との間の糖鎖発現量の違いを探索する方法が一般的である。【０００４】
一方、疾患に伴うバイオマーカー候補分子群の変動は、常に再現されるわけではない。このことは、疾患マーカー探索における障壁となっており、糖鎖に関しても同様のことがいえる。この原因として、例えば癌の場合、個体差の他に、発症機序の多様性が挙げられる。【０００５】
癌遺伝子及び癌抑制遺伝子による糖鎖遺伝子の制御に関する研究は、１９８０年代の初期から盛んになり、これまで、癌遺伝子の導入やウイルス感染による一部の糖鎖の構造変化などが報告されている。例えば、癌の進行との相関が認められているβ１，６分岐糖鎖の生合成に関わるＡｌｐｈａ−１，６−ｍａｎｎｏｓｙｌｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ６−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ  Ａ（Ｍｇａｔ５）は、ｓｒｃ（非特許文献２）、ＥｒｂＢ２（非特許文献３）、ｖ−ｓｉｓ（非特許文献４）、Ｒａｓ（非特許文献５−６）等の癌遺伝子によって発現増大することが報告されている。また、６’−ｓｉａｌｙｌ化糖鎖を生合成するα２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）は、Ｎ−ｒａｓ及びＨ−ｒａｓによってＲａｌＧＥＦシグナリングを介して制御されることが報告されている（非特許文献７−１０）。【０００６】
悪性腫瘍の克服は現在医療において最も重要な課題の１つであり、特に脳腫瘍の中の悪性グリオーマは平均生存期間が約１年と最も予後の悪い腫瘍である。グリオーマをはじめとする悪性腫瘍に伴う糖鎖の発現変動について、種々の報告がなされている。【０００７】
幹細胞や癌細胞でパウチマンノース型糖鎖が比較的高発現することが報告されている（非特許文献１１）。また、ＧＤ３は、初期の発癌性形質変換で発現が増大し、浸潤、血管新生、アポトーシス及び免疫抑制の誘導に関与する可能性が報告されている（非特許文献１２）。また、グリオーマにおいて、フコシル化糖鎖が増大することが報告されている（非特許文献１３）。また、アストロサイトーマで種々のＧｇ系列糖鎖が減少し、Ｇｂ系列糖鎖が増大することが報告されている（非特許文献１４）。また、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞はＧｂ系列糖鎖を高発現し、分化に伴いＧｇ系列糖鎖へスイッチングすることが報告されている（非特許文献１５）。また、グリオーマにおいてＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型のＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが報告されている（非特許文献１６）。また、６’−ｓｉａｌｙｌ化糖鎖を生合成するＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、Ｎ−ｒａｓ及びＨ−ｒａｓによってＲａｆＧＥＦシグナリングを介して制御されることが報告されている（非特許文献１７−２０）。また、ＳＳＥＡ−４はグリオーマのマーカー候補として報告されている（非特許文献２１）。また、グリオーマにおいてフコシル化糖鎖が増大することが報告されている（非特許文献２２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｈａｏ  ＹＹ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，  Ｇｕ  ＪＧ，  Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｅ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ａ，  Ｋｉｔａｚｕｍｅ  Ｓ，  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｎ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ２００８  ９９：１３０４−１３１０．
【非特許文献２】Ｐ．  Ｂｕｃｋｈａｕｌｔｓ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｎ．  Ｆｒｅｇｉｅｎ，  Ｍ．  Ｐｉｅｒｃｅ：  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｒｃ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  １９５７５−１９５８１  （１９９７）
【非特許文献３】Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｎ．  Ｆｒｅｇｉｅｎ，  Ｍ．  Ｐｉｅｒｃｅ：  Ｔｈｅ  ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，  ２０８７−２０９３  （１９９８）
【非特許文献４】Ｈ．  Ｂ．  Ｇｕｏ，  Ｑ．  Ｓ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｃｈｅｎ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｈ−ｒａｓ  ａｎｄ  ｖ−ｓｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２６，  ２６３−２７０  （２０００）
【非特許文献５】Ｙ．  Ｌｕ，  Ｗ．  Ｃｈａｎｅｙ：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ  ｂｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｒ  ｐｒｏｔｏ−Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２２，  ８５−９２  （１９９３）
【非特許文献６】Ｄ．  Ｃ．  Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｉｃｚ，  Ｐ．  Ｙ．  Ｐａｒｋ，  Ｒ．  Ｖ．  Ｄａｔｔａ，  Ｐ．  Ｂ．  Ｐａｔｙ：  ＣＥＡ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ＰＨＡ−Ｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｋ−ｒａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｄ  ａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄ  ｔｕｍｏｒｓｉｎｋｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｏｎ  ＣＥＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７３，  １４７−１５３  （２０００）
【非特許文献７】Ｍ．  Ｄａｌｚｉｅｌ，  Ｆ．  Ｄａｌｌ’Ｏｌｉｏ，  Ａ．  Ｍｕｎｇｕｌ，  Ｖ．  Ｐｉｌｌｅｒ，  Ｆ．  Ｐｉｌｌｅｒ：  Ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｓｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ａｌａｃｔｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ）  ｖｉａ  ａ  ＲａｌＧＥＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７１，  ３６２３−３６３４  （２００４）
【非特許文献８】Ｅ．  Ｗ．  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｂｏｌｓｃｈｅｒ，  Ｄ．  Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｆｏｒｍｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｒａｓ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，  ２１６７４−２１６８０  （１９９１）
【非特許文献９】Ｎ．  Ｌｅ  Ｍａｒｅｒ，  Ｖ．  Ｌａｕｄｅｔ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，  Ｈ．  Ｃａｚｌａｒｉｓ，  Ｂ．  Ｖａｎ  Ｈｉｌｌｅ，  Ｃ．  Ｌａｇｒｏｕ，  Ｄ．  Ｓｔｅｈｅｌｉｎ，  Ｊ．  Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ，  Ａ．  Ｖｅｒｂｅｒｔ，  Ｐ．  Ｄｅｌａｎｎｏｙ：  Ｔｈｅ  ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  α−２，  ６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  （ＦＲ３Ｔ３）  ｃｅｌｌｓ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２，  ４９−５６  （１９９２）
【非特許文献１０】Ｐ．  Ｄｅｌａｎｎｏｙ，  Ｈ．  Ｐｅｌｃｚａｒ，  Ｖ．  Ｖａｎｄａｍｍｅ，  Ａ．  Ｖｅｒｂｅｒｔ：Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＦＲ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ：  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｇａｌ  β１−３ＧａｌＮＡｃ  α−２，３−  ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １０，  ９１−９８  （１９９３）
【非特許文献１１】Ｚｉｐｓｅｒ  Ｂ，  Ｂｅｌｌｏ−ＤｅＯｃａｍｐｏ  Ｄ，  Ｄｉｅｓｔｅｌ  Ｓ，  Ｔａｉａ  Ｍ−Ｈ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｂ．  Ｍａｎｎｉｔｏｕ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ，  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ，  ｓｔｅｍｎｅｓｓ，  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ．  ２０１２；  ３１：  ５０４−５１８．
【非特許文献１２】Ｂｉｒｋｓ  ＳＭ，  Ｄａｎｑｕａｈ  ＪＯ，  Ｋｉｎｇ  Ｌ，  Ｖｌａｓａｋ  Ｒ，  Ｇｏｒｅｃｋｉ  ＤＣ，  Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ  ＧＪ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＧＤ３  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１１  １３：  ９５０−６０
【非特許文献１３】Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｎ，  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｒ，  Ｙａｊｉｍａ  Ｎ，  Ｈｏｍｍａ  Ｊ，  Ｓａｎｏ  Ｍ，  Ｋｏｍａｔａ  Ｔ，  Ｉｋｅｄａ  Ｔ，  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｈ，  Ｔａｎａｋａ  Ｒ，  Ｉｋｅｎａｋａ  Ｋ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００５；  ２７：１２３１−１２３９．
【非特許文献１４】Ｙａｔｅｓ  ＡＪ，  Ｃｏｍａｓ  Ｔ，  Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ  ＢＷ，  Ｂｕｒｇｅｒ  ＰＣ，  Ｐｅａｒｌ  ＤＫ．  Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９９９  ５８：１２５０−６２．
【非特許文献１５】Ｌｉａｎｇ  ＹＪ，  Ｋｕｏ  ＨＨ，  Ｌｉｎ  ＣＨ，  Ｃｈｅｎ  ＹＹ，  Ｙａｎｇ  ＢＣ，  Ｃｈｅｎｇ  ＹＹ，  Ｙｕ  ＡＬ，  Ｋｈｏｏ  ＫＨ，  Ｙｕ  Ｊ．  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｇｌｏｂｏ−  ａｎｄ  ｌａｃｔｏ−  ｔｏ  ｇａｎｇｌｉｏ−ｓｅｒｉｅｓ  ｕｐｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  Ｄｅｃ  ２８；１０７（５２）：２２５６４−９
【非特許文献１６】Ｒｅｂｂａａ  Ａ１，  Ｃｈｏｕ  ＰＭ，  Ｖｕｃｉｃ  Ｉ，  Ｍｉｒｋｉｎ  ＢＬ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，  Ｂｒｅｍｅｒ  ＥＧ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９９；  ５：３６６１−３６６８．
【非特許文献１７】Ｍ．  Ｄａｌｚｉｅｌ，  Ｆ．  Ｄａｌｌ’Ｏｌｉｏ，  Ａ．  Ｍｕｎｇｕｌ，  Ｖ．  Ｐｉｌｌｅｒ，  Ｆ．  Ｐｉｌｌｅｒ：  Ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｓｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ａｌａｃｔｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ）  ｖｉａ  ａ  ＲａｌＧＥＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７１，  ３６２３−３６３４  （２００４）
【非特許文献１８】Ｅ．  Ｗ．  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｂｏｌｓｃｈｅｒ，  Ｄ．  Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｆｏｒｍｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｒａｓ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，  ２１６７４−２１６８０  （１９９１）
【非特許文献１９】Ｎ．  Ｌｅ  Ｍａｒｅｒ，  Ｖ．  Ｌａｕｄｅｔ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，  Ｈ．  Ｃａｚｌａｒｉｓ，  Ｂ．  Ｖａｎ  Ｈｉｌｌｅ，  Ｃ．  Ｌａｇｒｏｕ，  Ｄ．  Ｓｔｅｈｅｌｉｎ，  Ｊ．  Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ，  Ａ．  Ｖｅｒｂｅｒｔ，  Ｐ．  Ｄｅｌａｎｎｏｙ：  Ｔｈｅ  ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  α−２，  ６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  （ＦＲ３Ｔ３）  ｃｅｌｌｓ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２，  ４９−５６  （１９９２）
【非特許文献２０】Ｐ．  Ｄｅｌａｎｎｏｙ，  Ｈ．  Ｐｅｌｃｚａｒ，  Ｖ．  Ｖａｎｄａｍｍｅ，  Ａ．  Ｖｅｒｂｅｒｔ：Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＦＲ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ：  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｇａｌ  β１−３ＧａｌＮＡｃ  α−２，３−  ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １０，  ９１−９８  （１９９３）
【非特許文献２１】Ｌｏｕ  ＹＷ，  Ｗａｎｇ  ＰＹ，  Ｙｅｈ  ＳＣ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＰＫ，  Ｌｉ  ＳＴ，  Ｗｕ  ＣＹ，  Ｋｈｏｏ  ＫＨ，  Ｈｓｉａｏ  Ｍ，  Ｈｓｕ  ＴＬ，  Ｗｏｎｇ  ＣＨ．  Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−４  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１４；１１１：２４８２−２４８７．
【非特許文献２２】Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｎ，  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｒ，  Ｙａｊｉｍａ  Ｎ，  Ｈｏｍｍａ  Ｊ，  Ｓａｎｏ  Ｍ，  Ｋｏｍａｔａ  Ｔ，  Ｉｋｅｄａ  Ｔ，  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｈ，  Ｔａｎａｋａ  Ｒ，  Ｉｋｅｎａｋａ  Ｋ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００５；  ２７：１２３１−１２３９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１１−２２では、腫瘍の発生から進行の全過程にわたって糖鎖発現動態をシステマティックに評価しているわけではなく、多様な癌化のメカニズムの原因となる遺伝子の変異と糖鎖発現との因果関係が明らかにされてはいない。癌の診断、予後の予測などに対してより有用な糖鎖マーカーが求められていた。【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、十分な感度及び特異度をもってグリオーマを診断することのできる診断マーカー、判別方法及び診断方法、並びに腫瘍の進行度を評価するための糖鎖マーカー及び糖鎖マーカーを検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るグリオーマの診断マーカーは、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８並びにＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００１２】
例えば、前記糖鎖は、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとを判別するために用いられる。【００１３】
例えば、前記糖鎖は、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖であり、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとを判別するために用いられる。【００１４】
例えば、前記糖鎖は、モノアンテナ型糖鎖であり、
グリオーマのＷＨＯグレードＩの診断のために用いられる。【００１５】
例えば、前記糖鎖は、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖及びフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断のために用いられる。【００１６】
例えば、前記糖鎖は、コア２型Ｏ−結合型糖鎖及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃより少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断のために用いられる。【００１７】
例えば、前記糖鎖は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択され、
グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断のために用いられる。【００１８】
本発明の第２の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカーは、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００１９】
本発明の第３の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカーは、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる。【００２０】
本発明の第４の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカーは、
β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００２１】
本発明の第５の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカーは、
総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００２２】
本発明の第６の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカーは、
Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００２３】
本発明の第７の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカーは、
フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。【００２４】
本発明の第８の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとの判別方法は、
被験者由来の試料中の（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋ｃｏｒｅ、及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００２５】
本発明の第９の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとの判別方法は、
被験者由来の試料中の（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋ｃｏｒｅ及び（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）３＋ｃｏｒｅからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００２６】
本発明の第１０の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断方法は、
被験者由来の試料中のβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００２７】
本発明の第１１の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断方法は、
被験者由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００２８】
本発明の第１２の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断方法は、
被験者由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００２９】
本発明の第１３の観点に係るグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断方法は、
被験者由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００３０】
本発明の第１４の観点に係るグリオーマの診断方法は、
被験者由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。【００３１】
本発明の第１５の観点に係る腫瘍の進行度を評価するための糖鎖マーカーを検出する方法は、
細胞に２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に細胞を癌化させる過程において、前記遺伝子導入後の各段階の細胞に発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を定性定量する工程と、
前記過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動を解析する工程と、
前記遺伝子導入と、前記過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動と、の間の相関性に基づき、糖鎖マーカーを選択する工程と、
を含む。【００３２】
本発明の第１６の観点に係る糖鎖マーカーは、
本発明の第１５の観点に係る方法で得られる。【００３３】
例えば、前記糖鎖マーカーは、グリオーマの診断のために用いられる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、十分な感度及び特異度をもってグリオーマを診断することのできる診断マーカー、判別方法及び診断方法、並びに糖鎖マーカーを検出する方法及び糖鎖マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＮＨＡに、ｈＴＥＲＴ（Ｔ）、ＳＶ４０ＥＲ（Ｓ）、Ｈ−ＲａｓＶ１２（Ｒ）及びｍｙｒＡＫＴ（Ａ）遺伝子をそれぞれ段階的に導入して樹立したグリオーマモデル細胞を表す図である。
【図２】Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定性・定量的発現解析方法を表す図である。
【図３】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現量を表す図であり、（ｂ）はβ１，６分岐糖鎖の生合成に関わるＭｇａｔ５の発現量を表す図であり、（ｃ）はβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の相対量を表す図である。
【図４】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はパウチマンノース型糖鎖の発現量を表す図であり、（ｂ）はモノアンテナ型糖鎖の発現量を表す図である。
【図５】パウチマンノース型糖鎖の生合成経路を表す図である。
【図６】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。ＧＤ３の発現量を表す図である。
【図７】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）は総Ｎ−結合型糖鎖量を表す図であり、（ｂ）は総ＧＳＬ糖鎖量を表す図である。
【図８】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。２つ以上のフコースによる修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現量を表す図である。
【図９】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図であり、（ｂ）はＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図であり、（ｃ）は（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図である。
【図１０】各細胞について、（ａ）はＢ４ＧＡＬＴ１の発現量を表す図であり、（ｂ）はＳＴ３ＧＡＬ２の発現量を表す図であり、（ｃ）はＡ４ＧＡＬＴの発現量を表す図であり、（ｄ）はＢ３ＧＮＴ５の発現量を表す図である。
【図１１】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はフコース修飾を受けていない（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図であり、（ｂ）は１個フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図であり、（ｃ）は２個フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図であり、（ｄ）は３個フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量を表す図である。
【図１２】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の発現量を表す図である。
【図１３】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を表す図であり、（ｂ）はＭｇａｔ３の発現量を表す図である。
【図１４】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はＡ１又はＡ２に結合するシアル酸についてα２，６結合した割合を表す図であり、（ｂ）はＡ１Ｆ又はＡ２Ｆに結合するシアル酸についてα２，６結合した割合を表す図である。
【図１５】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。コア２型Ｏ−結合型糖鎖の発現量を表す図である。
【図１６】ムチン型Ｏ結合型糖鎖の生合成経路を表す図である。
【図１７】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はＳＳＥＡ−３の発現量を表す図であり、（ｂ）はＳＳＥＡ−４の発現量を表す図である。
【図１８】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現量を表す図である。
【図１９】各細胞について、（ａ）はＦＵＴ１の発現量を表す図であり、（ｂ）はＦＵＴ２の発現量を表す図であり、（ｃ）はＦＵＴ３の発現量を表す図であり、（ｄ）はＦＵＴ４の発現量を表す図であり、（ｅ）はＦＵＴ５の発現量を表す図であり、（ｆ）はＦＵＴ６の発現量を表す図であり、（ｇ）はＦＵＴ７の発現量を表す図であり、（ｈ）はＦＵＴ８の発現量を表す図であり、（ｉ）はＦＵＴ９の発現量を表す図である。
【図２０】各細胞について、糖鎖の定量的解析を行った結果を表す図である。（ａ）はＧＳＬ−２１の発現量を表す図であり、（ｂ）はＧＳＬ−３３の発現量を表す図であり、（ｃ）はＧＳＬ−３５の発現量を表す図であり、（ｄ）はＧＳＬ−３８の発現量を表す図であり、（ｅ）はＧＳＬ−４７の発現量を表す図である。
【図２１】ＮＨＡについての（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップを表す図である。
【図２２】ＮＨＡ−Ｔについての（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップを表す図である。
【図２３】ＮＨＡ−ＴＳについての（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップを表す図である。
【図２４】ＮＨＡ−ＴＳＡＲについての（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップを表す図である。
【図２５】ＮＨＡ−ＴＳＡＲＡについての（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップを表す図である。
【図２６】個々の糖鎖の発現変動について、遺伝子の発現変動との因果関係を示した図である。
【図２７】クラスター解析の結果を示す図である。
【図２８】クラスター解析の結果を示す図である。
【図２９】シアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を示す図である。（ａ）は、２２０１０Ｃ、（ｂ）は２２０２０Ｃ、（ｃ）は２２１１０Ｃ、（ｄ）は２２１２０Ｃ、（ｅ）は３３０１０Ｃ、（ｆ）は３３０２０Ｃ、（ｇ）は３３０３０Ｃ、（ｈ）は３３１１０Ｃ、（ｊ）は３３１２０Ｃ、（ｊ）は３３１３０Ｃ、（ｋ）は４４０１０Ｃ、（ｌ）は４４０２０Ｃ、（ｍ）は４４０３０Ｃ、（ｎ）は４４０４０Ｃ、（ｏ）は４４１１０Ｃ、（ｐ）は４４１２０Ｃ、（ｑ）は４４１３０Ｃ、（ｒ）は４４１４０Ｃの発現量を示す図である。
【図３０】バイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を示す図である。（ａ）は２３０００Ｃ、（ｂ）は２３１００Ｃ、（ｃ）は２３１１０Ｃ、（ｄ）は２３１２０Ｃ、（ｅ）は３４０００Ｃ、（ｆ）は３４１００Ｃの発現量を示す図である。
【図３１】クラスター解析の結果を示す図である。
【図３２】Ｆｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型糖鎖及びＦｕｃを有する中性のハイブリッド型糖鎖の発現量を示す図である。（ａ）は１２２００Ｃ、（ｂ）は２２２００Ｃ、（ｃ）は２１２００Ｃ、（ｄ）は３１１００Ｃ、（ｅ）は３１２００Ｃ、（ｆ）は３２２００Ｃ、（ｇ）は３２１００Ｃの発現量を示す図である。
【図３３】複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を示す図である。（ａ）は１３２００Ｃ、（ｂ）は１４２００Ｃ、（ｃ）は２３２００Ｃ、（ｄ）は２３３００Ｃ、（ｅ）は２４２００Ｃの発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
まず、本発明による糖鎖マーカーを検出する方法について詳細に説明する。
【００３７】
該方法は、腫瘍の進行度を評価するための糖鎖マーカーを検出する方法である。
【００３８】
本明細書において、「腫瘍」には、特に限定されることなく、グリオーマ（ｇｌｉｏｍａ）、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）、副腎皮質癌（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌（Ａｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌（Ｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（Ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頚癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、ユーイング腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢癌（Ｇａｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、下咽頭癌（Ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（Ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口唇口腔癌（Ｌｉｐ  ａｎｄ  Ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（Ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  −  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ）、非ホジキンリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ  −  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）、黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍａ）、中皮腫（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）等が含まれる。
【００３９】
本明細書において、「腫瘍の進行度」は、例えば、ＴＮＭ分類、ステージ分類等といった公知のスケールで表され、グリオーマの場合、例えば、ＷＨＯグレード（グレードＩ〜ＩＶ）で表される。
【００４０】
本明細書において、「糖鎖マーカー」は、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を含む糖鎖からなるバイオマーカーを表す。Ｎ−結合型糖鎖とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド中のアスパラギンの側鎖の中のアミド窒素原子に結合している糖鎖である。Ｏ−結合型糖鎖とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド中のセリン又はスレオニンの側鎖の酸素原子に結合している糖鎖である。ＧＳＬ糖鎖とは、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）のセラミドの頭部に修飾された糖鎖を示す。本明細書において、「糖鎖マーカー」は、例えば、ＧＳＬ糖鎖の場合、“Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ”といった特定の糖鎖を表し；また、例えば、Ｎ−結合型糖鎖の場合、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖といった特定のグループの糖鎖を表し；また、“総Ｎ−結合型糖鎖”のようにＮ−結合型糖鎖全体を包含したもの、及び“総ＧＳＬ糖鎖” のように総ＧＳＬ糖鎖全体を包含したものを表す。
【００４１】
本明細書において、Ｎ−結合型糖鎖を５桁の数字で表す場合があり、この５桁の数字は、（Ｈｅｘ）ａ（ＨｅｘＮＡｃ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｄ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｅ＋ｃｏｒｅ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のａ〜ｅを表している。例えば、「１２２１０Ｃ」で表されるＮ−結合型糖鎖は、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の構造を有する。
【００４２】
Ｎ−結合型糖鎖としては、以下が例示される。
【００４３】
【表１】
2016021729.tif 000002
【００４４】
Ｏ−結合型糖鎖としては、以下が例示される。
【００４５】
【表２】
2016021729.tif 000003
【００４６】
ＧＳＬ糖鎖としては、以下が例示される。
【００４７】
【表３】
2016021729.tif 000004
【００４８】
本発明による糖鎖マーカーを検出する方法は、
（ａ）細胞に２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に細胞を癌化させる過程において、遺伝子導入後の各段階の細胞に発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を定性定量する工程と、
（ｂ）段階的に細胞を癌化させる過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動を解析する工程と、
（ｃ）遺伝子導入と、段階的に細胞を癌化させる過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動と、の間の相関性に基づき、糖鎖マーカーを選択する工程と、
を含む。
【００４９】
工程（ａ）の「細胞に２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に細胞を癌化させる過程」について説明する。この過程では、細胞に多段階にわたって遺伝子を導入することで細胞を癌化させる。癌の発生・進行に関しては、様々な遺伝子の変異による不死化、癌抑制遺伝子や癌原遺伝子の異常、アポトーシスの抑制などの諸段階を経て、足場非依存性増殖能や造腫瘍能を獲得するとする多段階発生説が広く受け入れられている。ここで用いられる細胞及び遺伝子には特に制限はなく、２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に癌化させるモデルを作ることのできる細胞及び遺伝子であれば適宜選択され得る。
【００５０】
前述の、２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に癌化させるモデルとして、例えば、グリオーマの場合、ＮＨＡ（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）に、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＥＲ、Ｈ−ＲａｓＶ１２及びｍｙｒＡＫＴ遺伝子をそれぞれ段階的に導入してグリオーマモデル細胞（ＮＨＡ−Ｔ、ＮＨＡ−ＴＳ、ＮＨＡ−ＴＳＲ及びＮＨＡ−ＴＳＲＡ）を樹立したモデルを例示することができる（Ｓａｓａｉ  Ｋ，Ａｋａｇｉ  Ｔ，Ａｏｙａｎａｇｉ  Ｅ，Ｔａｂｕ  Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ．Ｏ６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７；６：３６．）（図１）。不死化は癌化の必要条件であり、テロメラーゼの発現は体細胞では極めて低いか、皆無であるが、ＥＳ細胞や生殖細胞、増殖組織中の幹細胞、及び９０％以上のヒト腫瘍では高発現している。ｈＴＥＲＴの異所性発現は、しばしば細胞の無限増殖（不死化）を引き起こすことが明らかにされている。細胞の不死化の効率は、ｈＴＥＲＴとともにＳＶ４０ＥＲを導入するとさらに高まる。ＳＶ４０ＥＲはｓｍａｌｌ−ｔａｎｔｉｇｅｎとｌａｒｇｅ−Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎをコードしており、前者はプロテインホスファターゼ２Ａ（約半分のヒトグリオーマでダウンレギュレート）のサプレッサーであり、後者は癌抑制遺伝子産物であるｐ５３、ｐＲＢ、ｐ１０７、ｐ１３０に直接結合して不活化する。癌遺伝子産物であるＨ−ｒａｓの活性型変異体Ｈ−ＲａｓＶ１２をさらに導入したＮＨＡ−ＴＳＲは、足場非依存性増殖能や造腫瘍能の獲得により癌化する。ｍｙｒＡＫＴの導入により、ＰＩ３Ｋシグナル伝達が恒常的に活性化され、細胞のアポトーシスからの回避及びその増殖の活性化を引き起こし、悪性度の顕著な増大が認められる。なお、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＮＨＡ−Ｔ細胞はＷＨＯグレードＩに相当する、癌化していないが不死化している状態を模倣している。また、ＮＨＡ−ＴＳ細胞は、ＷＨＯグレードＩＩに相当する、良性グリオーマを模倣している。また、ＮＨＡ−ＴＳＲ細胞は、ＷＨＯグレードＩＩＩ相当の悪性グリオーマを形成する。また、ＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞は、ＷＨＯグレードＩＶ相当のグリオブラストーマを形成する。
【００５１】
また、２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に癌化させるモデルとして、前述のモデルの他に、グリオーマの場合、例えば、遺伝子操作としてＥＧＦＲ増幅、ＴＰ５３変異、ＰＴＥＮ変異、ＣＤＫＮ２Ａ＝ｐ１６ＩＮＫ４ａ欠失を行ったＰｒｉｍａｒｙ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、遺伝子操作としてＩＤＨ１／２変異、ＴＰ５３変異、ＡＴＲＸ変異、ＣＤＫＮ２Ａ＝ｐ１６ＩＮＫ４ａ欠失、ＥＧＦＲ増幅、ＰＴＥＮ変異を行ったＳｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａのモデル（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９（４）：７６４−７７２，２０１３；ＡＪＰ  １７０（５）：１４４５−１４５３，２００７）を挙げることができる。また、肺癌のモデルとしては、例えば、正常ヒト小気道上皮細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＨＳＡＥＣｓ）に、遺伝子操作としてｈＴＥＲＴ過剰発現、ｐＲＢ及びｐ５３のドミナントネガティブ変異、ＫＲＡＳ活性化型変異（ＫＲＡＳＶ１２）等を行ったモデル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１（７）：２５４１−２５４９，２０１１）が挙げられる。２又は３回以上遺伝子導入を行うことで段階的に癌化させることのできる癌細胞モデルであれば、適宜採用することができる。
【００５２】
工程（ａ）の「遺伝子導入後の各段階の細胞に発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を定性定量する」ことについて説明する。「遺伝子導入後の各段階の細胞」とは、前述のグリオーマモデルの場合、ｈＴＥＲＴ導入後のＮＨＡ−Ｔ細胞、ＳＶ４０ＥＲ導入後のＮＨＡ−ＴＳ細胞、Ｈ−ＲａｓＶ１２導入後のＮＨＡ−ＴＳＲ細胞、ｍｙｒＡＫＴ導入後のＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞を指す。「遺伝子導入後の各段階の細胞に発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を定性定量する」とは、前述のグリオーマモデルの場合、ＮＨＡ−Ｔ細胞、ＮＨＡ−ＴＳ細胞、ＮＨＡ−ＴＳＲ細胞及びＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞の各々について、発現しているＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を同定し、その発現量を測定することをいう。定性定量されるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の種類は、例えば、Ｎ−結合型糖鎖１０４種、Ｏ−結合型糖鎖１２種及びＧＳＬ糖鎖４６種である。Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定性定量には、公知の方法が用いられるが、例えば、各細胞に特徴的な糖鎖構造を網羅的に取得する観点から、Ｆｕｊｉｔａｎｉ  Ｎ，  Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｊ，  Ａｒａｋｉ  Ｋ，  Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｔ，  Ｔａｋｅｇａｗａ  Ｙ，  Ｐｉａｏ  Ｊ，  Ｎｉｓｈｉｏｋａ  Ｔ，  Ｔａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｔ，  Ｉｔｏ  Ｍ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｙ．  Ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１３；１１０：２１０５−２１１０．に記載の方法を用いてもよい。Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖を組み合わせて解析することで、解析対象の糖鎖の種類を増大させることができ、また、三者間で糖鎖変動の比較を行うことができる。このため、癌化の過程において１遺伝子変異が細胞の糖鎖発現変動に与える影響をより詳細に検証でき、癌の発生から進行の全過程にわたる糖質発現動態をよりシステマティックに明らかにすることができる。
【００５３】
前述の工程（ｂ）の「段階的に細胞を癌化させる過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動を解析する」とは、前述のグリオーマモデルの場合、ＮＨＡ−Ｔ細胞、ＮＨＡ−ＴＳ細胞、ＮＨＡ−ＴＳＲ細胞及びＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞の各々についてのＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量を、各細胞間で比較すること等をいう。
【００５４】
前述の工程（ｃ）の「遺伝子導入と、段階的に細胞を癌化させる過程におけるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の発現量の変動と、の間の相関性に基づき、糖鎖マーカーを選択する」とは、例えば前述のグリオーマモデルの場合、例えばＧＳＬ糖鎖であるＧＳＬ−２１（後述）の発現量変動をＮＨＡ−Ｔ細胞からＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞まで追跡した結果、ＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞において発現が顕著に高い場合には、ｍｙｒＡＫＴ遺伝子導入とＧＳＬ−２１の発現量増大との間に相関性があると判断して、ＧＳＬ−２１を糖鎖マーカーとして選択することをいう。この場合、ＧＳＬ−２１は、グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断に対して用いることができる。このように、本発明の方法よれば、腫瘍の進行度を評価するための糖鎖マーカーを検出することができる。
【００５５】
次に、本発明による診断マーカーについて詳細に説明する。該「診断マーカー」は、前述の「糖鎖マーカー」と同義である。本発明による診断マーカーは、グリオーマの診断のために、又はグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの診断のために用いられる。
【００５６】
本発明によるグリオーマの診断マーカーは、モノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７からなる群より１つ選択される糖鎖からなる。
【００５７】
“モノアンテナ型糖鎖”は、Ｇｎ−Ｍ３（Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇｎ−Ｍ４（Ｍａｎα１−３／６Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇｎ−Ｍ５（Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）といったＮ−結合型糖鎖を包含し、構造上パウチマンノース型糖鎖の前駆体であると考えられる。
【００５８】
“総Ｎ−結合型糖鎖”は、前述の通り、Ｎ−結合型糖鎖全体を包含したものであり、多種類（例えば、１０４種）のＮ−結合型糖鎖を包含するものである。
【００５９】
“総ＧＳＬ糖鎖”は、前述の通り、ＧＳＬ糖鎖全体を包含したものであり、多種類（例えば、４６種）のＧＳＬ糖鎖を包含するものである。
【００６０】
“フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖”は、フコシル化されたｌａｃｔｏ系列ＧＳＬ糖鎖であり、フコースを１つ、２つ、３つ等有する構造の（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖を含む。（Ｇａｌ）ａ（ＧｌｃＮＡｃ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｄ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｅ＋ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（コア構造がＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）（ただし、ｃは１以上）の構造を有する。
【００６１】
“コア２型Ｏ−結合型糖鎖”は、ＧａｌＮＡｃからＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃを経て合成される糖鎖である（図１６において「Ｃｏｒｅ２」で示される）。
【００６２】
“Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ”は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の一つである。
【００６３】
“（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖”は、ｌａｃｔｏ系列ＧＳＬ糖鎖全般を包含するものである。（Ｇａｌ）ａ（ＧｌｃＮＡｃ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｄ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｅ＋ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（コア構造がＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）の構造を有する。
【００６４】
“ＧＳＬ−２１”は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖であり、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００６５】
“ＧＳＬ−３３” は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖であり、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００６６】
“ＧＳＬ−３５” は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｆｕｃα１−３（Ｇａｌβ１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００６７】
“ＧＳＬ−３８” は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖であり、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−２）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ又はＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００６８】
“ＧＳＬ−４７” は、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖であり、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００６９】
本発明による、グリオーマの診断に用いられる診断マーカーにおいて、モノアンテナ型糖鎖の発現増大、総Ｎ−結合型糖鎖の発現減少、総ＧＳＬ糖鎖の発現減少、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現増大、コア２型Ｏ−結合型糖鎖の発現減少、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現増大、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現増大、ＧＳＬ−２１の発現増大、ＧＳＬ−３３の発現増大、ＧＳＬ−３５の発現増大、ＧＳＬ−３８の発現増大、及びＧＳＬ−４７の発現増大がみられた場合に、グリオーマに罹患していると診断することができる。
【００７０】
上述した糖鎖のうち、モノアンテナ型糖鎖は、後述するように、グリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカーとして用いられてもよい。
【００７１】
また、上述した糖鎖のうち、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖及びフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖は、後述するように、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカーとして用いられてもよい。
【００７２】
また、上述した糖鎖のうち、コア２型Ｏ−結合型糖鎖及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃより少なくとも１つ選択される糖鎖は、後述するように、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカーとして用いられてもよい。
【００７３】
また、上述した糖鎖のうち、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖は、後述するように、グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカーとして用いられてもよい。
【００７４】
本発明によるグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカーには、上記の他、β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖が含まれる。
【００７５】
また、本発明によるグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカーには、上記の他、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖が含まれる。
【００７６】
また、本発明によるグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカーには、上記の他、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖が含まれる。
【００７７】
また、本発明によるグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカーには、上記の他、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖が含まれる。  
【００７８】
“β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖”は、β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素により合成される構造を有するＮ−結合型糖鎖である。ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎα１−６Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃの構造を有する（“ＧｌｃＮＡｃβ１−６”がβ１−６分岐ＧｌｃＮＡｃである）。
【００７９】
“パウチマンノース型糖鎖”は、Ｍ１（（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２）、Ｍ２（（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２）、Ｍ３（（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）、Ｍ４（（Ｍａｎ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）といったＮ−結合型糖鎖を包含し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニザーゼより合成される構造を有するものである。パウチマンノース型糖鎖は無脊椎動物では広く認められるが、ヒトを含む脊椎動物では存在しないか、あっても微量しか存在しないと考えられている。非脊椎動物においてパウチマンノース型糖鎖を産生するのに必要なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニザーゼが脊椎動物では発見されていないため、脊椎動物における産生機序は不明である。
【００８０】
“ＧＤ３”とは、（（Ｈｅｘ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２）より構成される糖鎖である。
【００８１】
“フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖”は、フコシル化されたＮ−結合型糖鎖であり、フコースを２つ以上有する構造のＮ−結合型糖鎖を含む。（Ｇａｌ）ａ（Ｍａｎ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）ｄ（ＧａｌＮＡｃ）ｅ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｆ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｇ（ＳＯ３Ｈ）ｈ  ＋  Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（コア構造がＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）（ただしｃは１以上）の構造を有し、例えば、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２等が例示される。
【００８２】
“Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖”は、ＧＭ３（（Ｈｅｘ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）１）、ＧＭ２（（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１）、ＧＭ１（（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１）、ＧＤ３（（Ｈｅｘ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）２）、ＧＤ１（（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２）といったｇａｎｇｌｏ系列ＧＳＬ糖鎖全般を包含するものである。
【００８３】
“Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖”は、Ｇｂ３（Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、Ｇｂ４（ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ＳＳＥＡ−４（後述）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃといったｇｌｏｂｏ系列ＧＳＬ糖鎖全般を包含するものである。
【００８４】
“Ｎｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グライコリルノイラミン酸）含有糖鎖”は、非ヒト型のシアル酸であるＮｅｕ５Ｇｃを取り込んだ糖鎖である。Ｎｅｕ５Ｇｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と同様に、糖鎖を構成する単糖（酸性糖）である。多くの哺乳類ではＮｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃが糖鎖に含まれているが、ヒトでは、Ｎｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへと変換する酵素が欠損しているため、Ｎｅｕ５Ｇｃを含む糖鎖は通常では発現していないといわれている。
【００８５】
“α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖”は、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（α２，６−シアル酸転移酵素）により合成される構造を有するＮ−結合型糖鎖である。
【００８６】
“Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖”は、枝分かれ構造にＮ−アセチルグルコサミンが結合した糖鎖である。ＧｌｃＮＡｃβ１−２  ａｎｄ／ｏｒ  １−６Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２  ａｎｄ／ｏｒ  １−６Ｍａｎα１−３）（ＧｌｃＮＡｃβ１−４）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃを部分構造とする糖鎖であり（“ＧｌｃＮＡｃβ１−４”がＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃである）、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２等が例示される。
【００８７】
“ＳＳＥＡ−３”は、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖の一つであり、下記のＳＳＥＡ−４の前駆体である。Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００８８】
“ＳＳＥＡ−４”は、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖の一つである。ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの構造を有する。
【００８９】
“コアフコース”は、（Ｇａｌ）ａ（Ｍａｎ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）ｄ（ＧａｌＮＡｃ）ｅ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｆ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｇ（ＳＯ３Ｈ）ｈ＋Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃの構造を有する（コア構造の根元にＦｕｃが結合したＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃに、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、硫酸（ＳＯ３Ｈ）が付き得る）。
【００９０】
“Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖”は、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖である。
【００９１】
“Ｌｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖” は、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖である。
【００９２】
上記の本発明によるグリオーマの診断マーカー並びにグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの診断マーカーは、前述の本発明の糖鎖マーカーを検出する方法によって得られてもよい。
【００９３】
本発明による、グリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの診断に用いられる診断マーカーについて以下詳述する。
【００９４】
β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３は、テロメラーゼの活性化を反映するため、単独又は２以上の組み合わせにより、グリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカーとして用いることができる。より具体的には、これらの糖鎖の発現が増大している場合に、グリオーマのＷＨＯグレードＩに罹患していると診断することができる。
【００９５】
また、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖は、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活性化を反映するため、単独又は２以上の組み合わせにより、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカーとして用いることができる。より具体的には、総Ｎ−結合型糖鎖及び総ＧＳＬ糖鎖の発現減少、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現増大、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現減少、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現増大、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現増大、及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の発現増大がみられた場合に、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩに罹患していると診断することができる。
【００９６】
また、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型のＯ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースは、Ｒａｓの活性化を反映するため、単独又は２以上の組み合わせにより、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカーとして用いることができる。より具体的には、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現増大、コア２型のＯ−結合型糖鎖の発現減少、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現減少、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現増大、ＳＳＥＡ−３の発現増大、ＳＳＥＡ−４の発現増大、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現増大、及びコアフコースの発現増大がみられた場合に、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩに罹患していると診断することができる。
【００９７】
また、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖は、ＡＫＴの活性化を反映するため、単独又は２以上の組み合わせにより、グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカーとして用いることができる。より具体的には、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７の発現増大、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖及びα２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖の発現減少、並びにＬｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖の発現増大がみられた場合に、グリオーマのＷＨＯグレードＩＶに罹患していると診断することができる。
【００９８】
２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ及び３３１３０Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、１２２００Ｃ及び２２２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖は、グリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカーとして用いることができる。
【００９９】
より具体的には、２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ及び３３１３０Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１００】
また、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１０１】
また、１２２００Ｃ及び２２２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。１２２００Ｃ及び２２２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１０２】
また、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１０３】
また、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１０４】
２３２００Ｃ及び２３３００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖は、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとを判別するための診断マーカーとして用いることができる。より具体的には、２３２００Ｃ及び２３３００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現が増大している場合にはグレードＩＩと診断することができ、上記糖鎖の発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２３２００Ｃ及び２３３００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１０５】
なお、シアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖である２２０１０Ｃ、２２１１０Ｃ、２２１２０Ｃ、３３０１０Ｃ、３３０２０Ｃ、３３１１０Ｃ、３３１２０Ｃ、４４０２０Ｃ、４４０３０Ｃ、４４０４０Ｃ、４４１１０Ｃ、４４１２０Ｃについてもグリオーマの診断マーカーとして用いることができる。また、バイセクト型Ｎ−結合型糖鎖である２３０００Ｃ、２３１００Ｃについてもグリオーマの診断マーカーとして用いることができる。
【０１０６】
次に、本発明によるグリオーマの診断方法について詳細に説明する。
【０１０７】
本発明によるグリオーマの診断方法は、被験者由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖、総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１０８】
「被験者」とは、グリオーマに罹患しているか診断を要する、ヒトを含む哺乳動物全般を指す。
【０１０９】
「被験者由来の試料」とは、例えば、被験者から得られた生体液サンプル（血液、血清、血漿、胃粘液、十二指腸液、膵液、胆汁、腹水、喀痰、気管支肺胞洗浄液等）、組織又は細胞サンプル（胃、十二指腸、大腸、膵、胆嚢、胆管、気管支、肺等の癌の組織又は細胞）、などが挙げられる。
【０１１０】
「糖鎖の発現量を測定する」方法としては、公知の方法が用いられるが、例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。
【０１１１】
グリオーマの診断は、被験者由来の試料中の上記糖鎖量を指標として行われる。糖鎖の発現量が一定基準を上回る場合、又は、糖鎖の発現量が一定基準を下回る場合、当該被験者はグリオーマに罹患していると診断することができる。この場合、上記糖鎖の単独の発現量を指標としてもよいし、２以上の組み合わせでの糖鎖の発現量を指標としてもよい。
【０１１２】
本発明によるグリオーマの診断方法において、例えば、被験者由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象（ヒトを含む哺乳動物全般、以下同様）由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中の総ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の総ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のコア２型Ｏ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のコア２型Ｏ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中の（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−２１の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−２１の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３３の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３３の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３５の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３５の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３８の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３８の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−４７の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−４７の発現量に比して多いことを確認した場合に、被験者がグリオーマに罹患していると診断することができる。
【０１１３】
次に、本発明によるグリオーマの進行度（ＷＨＯグレードＩ〜ＩＶ）を診断する方法について詳細に説明する。
【０１１４】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断方法は、被験者由来の試料中のβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型糖鎖、モノアンテナ型糖鎖及びＧＤ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１１５】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩの診断方法において、例えば、被験者由来の試料中のβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のパウチマンノース型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のパウチマンノース型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のモノアンテナ型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合：被験者由来の試料中のＧＤ３の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＤ３の発現量に比して多いことを確認した場合に、被験者がＷＨＯグレードＩのグリオーマに罹患していると診断することができる。
【０１１６】
また、本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断方法は、被験者由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖、総ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖及びＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１１７】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断方法において、例えば、被験者由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の総Ｎ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中の総ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の総ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合に、被験者がＷＨＯグレードＩＩのグリオーマに罹患していると診断することができる。
【０１１８】
また、本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断方法は、被験者由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型Ｏ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースからなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１１９】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断方法において、例えば、被験者由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のコア２型のＯ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のコア２型のＯ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＳＳＥＡ−３の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＳＳＥＡ−３の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＳＳＥＡ−４の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＳＳＥＡ−４の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のコアフコースの発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のコアフコースの発現量に比して多いことを確認した場合に、被験者がＷＨＯグレードＩＩＩのグリオーマに罹患していると診断することができる。
【０１２０】
また、本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断方法は、被験者由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８、ＧＳＬ−４７、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１２１】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断方法において、例えば、被験者由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中の（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のフコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−２１の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−２１の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３３の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３３の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３５の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３５の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−３８の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−３８の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＧＳＬ−４７の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＧＳＬ−４７の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のα２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のα２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖の発現量に比して少ないことを確認した場合；被験者由来の試料中のＬｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＬｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合；被験者由来の試料中のＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中のＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖の発現量に比して多いことを確認した場合に、被験者がＷＨＯグレードＩＶのグリオーマに罹患していることを診断することができる。
【０１２２】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩ及びＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶとの判別方法は、被験者由来の試料中の２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ及び３３１３０Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖、１２２００Ｃ及び２２２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖、並びに１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１２３】
より具体的には、被験者由来の試料中の２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ及び３３１３０Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より低いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量と同等若しくは当該基準量より低いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１２４】
また、被験者由来の試料中の２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より低いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量と同等若しくは当該基準量より低いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ及び３４１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１２５】
また、１２２００Ｃ及び２２２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より低いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、ある所定の基準量と同等若しくは当該発現量より少ないことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。１２２００Ｃ及び２２２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１２６】
また、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択されるＦｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より低いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、ある所定の基準量と同等若しくは当該発現量より少ないことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ及び３２１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１２７】
また、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より低いことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、ある所定の基準量と同等若しくは当該基準量より少ないことを確認した場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができる。１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１２８】
本発明のグリオーマのＷＨＯグレードＩＩとグリオーマのＷＨＯグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶとの判別方法は被験者由来の試料中の２３２００Ｃ及び２３３００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量を測定する工程を含む。
【０１２９】
より具体的には、被験者由来の試料中の２３２００Ｃ及び２３３００Ｃからなる群より少なくとも１つ選択される複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現量が、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩと診断することができ、グリオーマに罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量と同等若しくは当該発現量より少ないことを確認した場合にはグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶと診断することができ；又は被験者由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ある所定の基準量より多いことを確認した場合にはグレードＩＩと診断することができ、ある所定の基準量と同等若しくは当該基準量より低いことを確認した場合にはグレードＩ、ＩＩＩ及びＩＶと診断することができる。２３２００Ｃ及び２３３００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用である。
【０１３０】
以上説明したように、本発明の糖鎖マーカーを検出する方法によれば、癌化に関与する遺伝子の変異が糖鎖の発現変動に与える影響を系統的に解明することができ、癌の発生から進行の全過程にわたる糖質発現動態をよりシステマティックに検証することができるため、十分な感度及び特異度をもって腫瘍の進行度を評価することのできる糖鎖マーカーを得ることができる。
【０１３１】
また、本発明による診断マーカー及び診断方法によれば、十分な感度及び特異度をもってグリオーマを診断することができ、グリオーマの進行度の評価も行うことができる。このため、例えば、診断結果に基づき薬剤選択を含めた治療ストラテジーを検証することができ、また、良性腫瘍発症後及び悪性腫瘍初発後の長期フォローにも用いることができる。また、本発明による診断マーカーを、外科的手術の方針の決定に役立てることができる。例えば、術前にグリオーマ患者の血液中の糖鎖量を測定してグリオーマの進行度を予測し、さらに術中にグリオーマ腫瘍組織での糖鎖量を測定することで腫瘍の切除領域を決定することができる。
【実施例】
【０１３２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１３３】
（実施例１）
以下の通り、ヒト正常アストロサイト（ＮＨＡ）に遺伝子操作を行い、不死化・癌化モデル細胞を作製した。【０１３４】
既報（Ｓａｓａｉ  Ｋ，Ａｋａｇｉ  Ｔ，Ａｏｙａｎａｇｉ  Ｅ，Ｔａｂｕ  Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ．Ｏ６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７；６：３６．）の方法に従い、ＮＨＡに、ｈＴＥＲＴ（Ｔ）、ＳＶ４０ＥＲ（Ｓ）、Ｈ−ＲａｓＶ１２（Ｒ）及びｍｙｒＡＫＴ（Ａ）遺伝子をそれぞれ段階的に導入してグリオーマモデル細胞（ＮＨＡ−Ｔ、ＮＨＡ−ＴＳ、ＮＨＡ−ＴＳＲ及びＮＨＡ−ＴＳＲＡ）を樹立した（図１）。以下、当該細胞の樹立方法（レトロウイルスベクターによる遺伝子導入）について詳述する。【０１３５】
ヒトグリオーマの実験モデル細胞を作製するために、正常ヒトアストロサイト（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ：ＮＨＡ）にマウスｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた後、ｈＴＥＲＴ（Ｔ）、ＳＶ４０ＥＲ（Ｓ）、Ｈ−ＲａｓＶ１２（Ｒ）及びｍｙｒＡｋｔ（Ａ）を発現させるためのウイルスベクターを導入し、各遺伝子の安定過剰発現細胞を樹立した。以下、組換えレトロウイルスの作製、標的細胞への感染及び感染細胞の選択の詳細について説明する。【０１３６】
（組換えレトロウイルスの作製）
（Ｄａｙ１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．２×１０６  ｃｅｌｌｓ／４ｍＬ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を６０ｍｍコラーゲンＩコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ；＃１１−０１８−００４）に播種した。
（Ｄａｙ２）
２４時間後、以下のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（ＴＡＫＡＲＡ，＃６１６０）
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（ＴＡＫＡＲＡ，＃６１６１）【０１３７】
（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現）
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ                      ２００μＬ
ｐＥ  ａｍｐｈｏ                          ２μｇ
ｐＧＰ                                    ２μｇ
ｐＣＸ４−ｒｅｄＥＸ−ＥｃｏＶＲ          ４μｇ
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ                      ２４μＬ【０１３８】
（ｈＴＥＲＴの発現）
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ                      ２００μＬ
ｐＥ  ｅｃｏ                              ２μｇ
ｐＧＰ                                    ２μｇ
ｐＣＸ４−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ              ４μｇ
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ                      ２４μＬ【０１３９】
（ＳＶ４０の発現）
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ                      ２００μＬ
ｐＥ  ｅｃｏ                              ２μｇ
ｐＧＰ                                    ２μｇ
ｐＣＸ４−ｂｓｒ−ＳＶ４０                ４μｇ
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ                      ２４μＬ【０１４０】
（Ｈ−ＲａｓＶ１２の発現）
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ                      ２００μＬ
ｐＥ  ｅｃｏ                              ２μｇ
ｐＧＰ                                    ２μｇ
ｐＣＸ４−ｐｕｒｏ−ＲａｓＶ１２          ４μｇ
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ                      ２４μＬ【０１４１】
（ｍｙｒ−ＡＫＴの発現）
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ                      ２００μＬ
ｐＥ  ｅｃｏ                              ２μｇ
ｐＧＰ                                    ２μｇ
ｐＣＸ４−ｂｌｅｏ−ｍｙｒ−Ａｋｔ        ４μｇ
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ                      ２４μＬ【０１４２】
トランスフェクション６時間後に培地を交換した（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ及びｈＴＥＲＴ発現用：Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＢＭ）、ＳＶ４０ＥＲ、Ｈ−ＲａｓＶ１２及びｍｙｒ−ＡＫＴ発現用：ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）。【０１４３】
（標的細胞への感染）
（Ｄａｙ３）
感染させる標的細胞（ＮＨＡ、ＮＨＡ−Ｅｃｏ、ＮＨＡ−Ｔ、ＮＨＡ−ＴＳ、ＮＨＡ−ＴＳＲ）をｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるような細胞密度で、１０ｃｍ  ｄｉｓｈに播種した。
（Ｄａｙ４）
トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清（ウイルス溶液）を、０．４５μｍフィルターで濾過後、標的細胞の入ったｄｉｓｈに加えた。この際、ウイルスの吸着促進剤としてｐｏｌｙｂｒｅｎｅを最終濃度４μｇ／ｍｌになるように加えた。１．５〜３時間後、細胞を培地で２回洗浄し、新しい培地に置換した。
（Ｄａｙ５）
必要に応じてＤａｙ４と同様に、ウイルス感染を繰り返した。【０１４４】
（感染細胞の選択）
（Ｄａｙ６）
感染細胞は、導入した薬剤耐性遺伝子の種類に応じて、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，１．０ｍｇ／ｍＬ）、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，２０μｇ／ｍＬ）、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，０．５μｇ／ｍＬ）、ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ（Ｚｅｏｃｉｎｅ，０．５ｍｇ／ｍＬ）で２週間薬剤選択を行い、感染細胞を選別した。導入した遺伝子のタンパク発現量は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＮＨＡ−Ｔ細胞はＷＨＯグレードＩに相当する、癌化していないが不死化している状態を模倣している。また、ＮＨＡ−ＴＳ細胞は、ＷＨＯ  グレードＩＩに相当する、良性グリオーマを模倣している。また、ＮＨＡ−ＴＳＲ細胞は、ＷＨＯグレードＩＩＩ相当の悪性グリオーマを形成する。また、ＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞は、ＷＨＯグレードＩＶ相当のグリオブラストーマを形成する。【０１４６】
（実施例２）
以下の通り、各細胞について糖鎖の定性・定量的発現解析を行い、各細胞に特徴的な糖鎖構造を網羅的に取得した。【０１４７】
（糖鎖の解析手法）
上記４種類の細胞（ＮＨＡ−Ｔ、ＮＨＡ−ＴＳ、ＮＨＡ−ＴＳＲ及びＮＨＡ−ＴＳＲＡ）とＮＨＡについて、細胞表面の抗原として最も重要な３種類の複合糖質糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖（Ｎ−ｇｌｙｃａｎ）、Ｏ−結合型糖鎖（Ｏ−ｇｌｙｃａｎ）及び糖脂質（ＧＳＬ）糖鎖（ＧＳＬ−ｇｌｙｃａｎ））の定性・定量的発現解析を、既報（Ｆｕｊｉｔａｎｉ  Ｎ，Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｊ，Ａｒａｋｉ  Ｋ，Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｔ，  Ｔａｋｅｇａｗａ  Ｙ，Ｐｉａｏ  Ｊ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ  Ｔ，Ｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｔ，Ｉｔｏ  Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｙ．Ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０：２１０５−２１１０．）の手法（図２）により詳細に解析した。Ｎ−結合型糖鎖で１０４種（表１）、Ｏ−結合型糖鎖で１２種（表２）、ＧＳＬ糖鎖で４６種（表３）の定量的解析を行った。以下、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の解析法について各々詳述する。【０１４８】
（Ｎ−結合型糖鎖の解析法）
（１）１×１０６個からなる細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００マイクロリットル）で、超音波処理（５秒間照射＋１０秒間インターバルを４セット）により溶解した。
（２）２μＬの０．５Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（終濃度約１００  ｍＭ）と２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化した（室温、３０分間）。
（３）４７２μＬ（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃、２時間）を行った。
（４）沈殿を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む重炭酸アンモニウム水溶液９５マイクロリットルに溶解し、５μＬのトリプシン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）でタンパク質を消化した（終夜、３７℃）。トリプシン失活後（９０℃、１０分間）、ペプチドＮグリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ，２Ｕ、３７℃、終夜）により糖鎖をタンパク質から切断した。
（５）調製したＮ−結合型糖鎖を含むサンプルは、内部標準に非天然型糖鎖であるＡ２ＧＮ１を加えた後、糖鎖のみをグライコブロッティング法によって精製後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）を用いた定量解析を行った（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０：２１０５−２１１０．を参照）。【０１４９】
（Ｏ−結合型糖鎖の解析法）
（１）１×１０６個からなる細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００μＬ）で、超音波処理（５秒間照射＋１０秒間インターバルを４セット）により溶解した。
（２）２μＬの０．５Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（終濃度約１００  ｍＭ）と２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化した（室温、３０分間）。
（３）４７２μＬ（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃、２時間）を行った。
（４）遠心分離（２００００×ｇ、１０分間、４℃）により、沈殿（タンパク質画分）と上清に分けた。沈殿をＯ−結合型糖鎖解析に使用した。
（５）沈殿を超純水に溶解し、Ａｍｉｃｏｎにより分子量３０００以上の画分とした。後に濃縮乾固した。
（６）沈殿物を１００μＬの超純水で再溶解し、２００μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え、マイクロ波発生装置（Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００、アントンパール社）を用いて、１２０℃で２時間反応した。反応後、１２．５ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオースを添加した後ＨＣｌにより中和し、クロロホルムを加え洗浄することで過剰試薬を除去した後、グラファイトカーボン及びイアトロビーズにより糖鎖部分を精製した。
（７）精製したサンプルを２、５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。【０１５０】
（ＧＳＬ糖鎖の解析法）
（１）（規定個数を含む）細胞ペレットをクロロホルム：メタノール＝２：１の組成の溶液（４５０μＬ）中で超音波（１０秒間照射＋１０秒間インターバルを６回。合計照射時間１分間）により破砕した。
（２）次に、メタノールを１５０μＬ加え（この時点での溶媒組成はクロロホルム：メタノール＝１：１である）、同様に超音波処理を施した。
（３）メタノールをさらに３００μＬ加え（この時点での溶媒組成はクロロホルム：メタノール＝１：２である）、同様に超音波処理を施した。
（４）上記１〜３の手順で得られた溶液を、２００００ｇ、１０分間の遠心分離によりタンパク質画分を沈殿させ、得られた上清をスフィンゴ糖脂質を含む総脂質抽出物として新しいサンプルチューブに回収した。回収された溶液は遠心エバポレーターで溶媒を除去した。
（５）得られた細胞由来の総脂質画分を、４０μＬの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、これに２５ｍＵのＲｈｏｄｏｃｏｓｓｕｓ属由来のエンドグルコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）Ｉ及びＩＩを加えてスフィンゴ脂質から糖鎖を切断した（３７℃、終夜）。
（６）調製したＧＳＬ糖鎖を含むサンプルは、内部標準に非天然型糖鎖であるＡ２ＧＮ１を加えた後、糖鎖のみをグライコブロッティング法によって精製後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）を用いた定量解析を行った（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０：２１０５−２１１０．を参照）。【０１５１】
（結果）
（１．テロメラーゼの活性化を反映する糖鎖マーカー）
ｈＴＥＲＴを導入したＮＨＡ−Ｔ細胞について、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定量的解析を行い、以下の通り、テロメラーゼの活性化を反映する糖鎖マーカーを見出した。【０１５２】
（β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖）
テロメラーゼの活性化に伴い、β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが示された（図３（ａ））。また、β１，６分岐糖鎖の生合成に関わる（Ｍｇａｔ５）の発現も増大していることも示された（図３（ｂ））。なお、４本分岐糖鎖が総複合型糖鎖に占める割合は、グレードＩＩ以降で増加傾向にある（図３（ｃ））。Ｍｇａｔ５の遺伝子レベルでは、Ｈ−ＲａｓＶ１２導入で３．２倍の発現上昇が認められる（図３（ｂ））。【０１５３】
なお、Ｍｇａｔ５の発現量の検討には、リアルタイムＰＣＲ法を用いた。各細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡへの逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲには、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。Ｍｇａｔ５のプライマーは以下のものを使用した。
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＧＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＧＴＣＣＡＴＡ（配列番号２）【０１５４】
癌化に伴い、β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現が増大することは、様々な癌で報告されている有名な発現変動であり、この構造を合成する責任酵素の遺伝子であるＭｇａｔ５はｓｒｃ、ＥｒｂＢ２、ｖ−ｓｉｓ、Ｒａｓ等の癌遺伝子を単独で強発現したときに発現増大することが報告されているが、今回の結果、少なくともアストロサイトにおいてはβ１，６分岐したＮ−結合型糖鎖の発現の増大は、テロメラーゼ活性と相関することが糖鎖発現（図３（ａ））及び遺伝子（Ｍｇａｔ５）発現解析（図３（ｂ））から明らかになった。【０１５５】
（パウチマンノース型及びモノアンテナ型糖鎖）
テロメラーゼの活性化に伴い、Ｎ−結合型糖鎖であるパウチマンノース型糖鎖及びモノアンテナ型糖鎖の発現が増大することが示された（図４（ａ）、図４（ｂ））。【０１５６】
パウチマンノース型糖鎖は無脊椎動物では広く認められるが、ヒトを含む脊椎動物では存在しないか、あっても微量しか存在しないと考えられている。非脊椎動物においてパウチマンノース型糖鎖を産生するのに必要なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニザーゼが脊椎動物では発見されていないため、脊椎動物における産生機序は不明である。近年、パウチマンノース型糖鎖が幹細胞や癌細胞で比較的高発現することが報告されている（非特許文献１１）。モノアンテナ型糖鎖は、構造上、パウチマンノース型糖鎖の前駆体であると考えられ（図５）、今回の結果、モノアンテナ型糖鎖についてもテロメラーゼの活性化に伴い増大することが明らかになった。【０１５７】
（ＧＤ３）
テロメラーゼの活性化に伴い、ＧＳＬ糖鎖であるＧＤ３の発現が増大することが示された（図６）。【０１５８】
ＧＤ３は、初期の発癌性形質変換で発現が増大し、浸潤、血管新生、アポトーシス及び免疫抑制の誘導に関与する可能性が報告されている（非特許文献１２）が、今回の結果から、ＧＤ３の発現増大はテロメラーゼの活性化の結果であることが明らかになった。【０１５９】
以上より、β１，６分岐したＮ−結合型糖鎖、パウチマンノース型及びモノアンテナ型糖鎖並びにＧＤ３は、テロメラーゼの活性化を反映することから、グリオーマのＷＨＯグレードＩの診断マーカーとして使用可能であることが示唆された。【０１６０】
（２．ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化を反映する糖鎖マーカー）
ＳＶ４０ＥＲを導入したＮＨＡ−ＴＳ細胞について、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定量的解析を行い、以下の通り、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化を反映する糖鎖マーカーを見出した。【０１６１】
（総Ｎ−結合型糖鎖量及び総ＧＳＬ糖鎖量）
癌抑制遺伝子の不活性化に伴い、総Ｎ−結合型糖鎖量及び総ＧＳＬ糖鎖量が半減することが示された（図７（ａ）、図７（ｂ））。【０１６２】
（フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖）
癌抑制遺伝子の不活性化に伴い、複数のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが示された（図８）。【０１６３】
グリオーマにおいてフコシル化糖鎖が増大することは報告されていたが（非特許文献１３）、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化がその原因の１つであることが明らかになった。【０１６４】
（Ｇａｎｇｌｉｏ（Ｇｇ）系列ＧＳＬ糖鎖及びＧｌｏｂｏ（Ｇｂ）系列ＧＳＬ糖鎖）
癌抑制遺伝子の不活性化に伴い、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ３等のＧｇ系列ＧＳＬ糖鎖が激減（図９（ａ））し、Ｇｂ３、Ｇｂ４等のＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖が激増することが示された（図９（ｂ））。
アストロサイトーマで種々のＧｇ系列糖鎖が減少し、Ｇｂ系列糖鎖が増大することが報告されている（非特許文献１４）が、今回の結果から、その原因の１つがｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化にあることが明らかになった。ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞はＧｂ系列糖鎖を高発現し、分化に伴いＧｇ系列糖鎖へスイッチングすることが報告されている（非特許文献１５）が、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化及び後述するＲａｓ、ＡＫＴの活性化は、逆にＧｇ系列糖鎖からＧｂ系列糖鎖へのスイッチングを引き起こすことが明らかになった。これらの変動は、ＬａｃＣｅｒ（Ｇｇ系列糖鎖、Ｇｂ系列糖鎖、Ｌａｃｔ（（ｎ）Ｌｃ）系列ＧＳＬ糖鎖の共通のプレカーサー）からＧｇ系列糖鎖に生合成する責任酵素であるＢｅｔａ−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（Ｂ４ＧＡＬＴ１）及びｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ａｌｐｈａ−２，３−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２（ＳＴ３ＧＡＬ２）、ＬａｃＣｅｒからＧｂ系列糖鎖に生合成する責任酵素であるａｌｐｈａ−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ａ４ＧＡＬＴ）の遺伝子発現とよく相関していた（図１０（ａ）〜（ｄ））。【０１６５】
なお、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＴ３ＧＡＬ２、Ａ４ＧＡＬＴの発現量の検討には、リアルタイムＰＣＲ法を用いた。各細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡへの逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲには、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。各プライマーは以下のものを使用した。
Ｂ４ＧＡＬＴ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＣＣＧＣ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＴ（配列番号４）
ＳＴ３ＧＡＬ２：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＧＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧ（配列番号６）
Ａ４ＧＡＬＴ：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＧＣＣ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴ（配列番号８）【０１６６】
（フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖）
癌抑制遺伝子の不活性化に伴い、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖が増大することが示された（図１１（ｂ）〜（ｄ））。【０１６７】
フコシル化（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖は、ＮＨＡ及びＮＨＡ−Ｔにはほとんど存在しないが、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化に応じて発現することが明らかになった。【０１６８】
（Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖）
癌抑制遺伝子の不活性化に伴い、Ｎｅｕ５Ｇｃの取り込み効率が激増することが示された（図１２）。特に、ＧＳＬ糖鎖のＮｅｕ５Ｇｃの取り込み効率が増加していた。【０１６９】
非ヒト型のシアル酸であるＮｅｕ５Ｇｃは、微量ながらヒトに存在し、特に幹細胞や癌細胞に取り込まれる効率が高いことが報告されているが、その原因となる遺伝子変異に関する報告はなかった。【０１７０】
以上より、総Ｎ−結合型糖鎖量及び総ＧＳＬ糖鎖量、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖及びＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖並びにＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖は、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化を反映することから、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩの診断マーカーとして使用可能であることが示唆された。【０１７１】
（３．Ｒａｓの活性化を反映する糖鎖マーカー）
ＲＡＳＶ１２を導入したＮＨＡ−ＴＳＲ細胞について、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定量的解析を行い、以下の通り、Ｒａｓの活性化を反映する糖鎖マーカーを見出した。【０１７２】
（Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖）
Ｒａｓの活性化に伴い、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現が増大することが示された（図１３（ａ））。また、Ｍｇａｔ３の発現も増大していることも示された（図１３（ｂ））。なお、Ｍｇａｔ３の発現量の検討については、前述のＭｇａｔ５の発現量の検討と同様に行ったが、Ｍｇａｔ３のプライマーについては以下のものを使用した。
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＣＣＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＡ（配列番号１０）【０１７３】
グリオーマにおいてＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型のＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが報告されている（非特許文献１６）が、今回の結果より、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型のＮ−結合型糖鎖の発現変動は、Ｒａｓの活性化と相関することが初めて明らかになった。【０１７４】
（α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖）
Ｒａｓの活性化に伴い、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが示された（Ａ１及びＡ２：図１４（ａ）、Ａ１Ｆ及びＡ２Ｆ：図１４（ｂ））。【０１７５】
６’−ｓｉａｌｙｌ化糖鎖を生合成するＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、Ｎ−ｒａｓ及びＨ−ｒａｓによってＲａｆＧＥＦシグナリングを介して制御されることが報告されている（非特許文献１７−２０）が、その結果を支持するように、Ｒａｓの活性化により、６’−ｓｉａｌｙｌ化糖鎖の発現が増大する結果が得られた。【０１７６】
（コア２型のＯ−結合型糖鎖）
Ｒａｓの活性化に伴い、コア２型Ｏ−結合型糖鎖の発現が大幅に低下することが示された（図１５）。【０１７７】
コア２型糖鎖の激減（図１５）はコア２型Ｏ−結合型糖鎖の生合成が抑制された結果と考えられ、コア２構造のプレカーサーであるＴ抗原の蓄積が、ｄｉ−ｓｉａｌｙｌ  Ｔ抗原の発現増大につながる（図１６）。コア２型からＴ抗原への構造変化については、乳癌においても報告があり、これもＲａｓの活性化の結果である可能性が今回の結果から示唆される。【０１７８】
（Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖及びＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖）
Ｒａｓの活性化に伴い、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖（ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ３等）が激減し、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖（Ｇｂ３、Ｇｂ４等）が激増することが示された（図９（ａ）、図９（ｂ））。【０１７９】
ＳＶ４０ＥＲの導入に引き続き、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖からＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖へのスイッチングは、不死化から癌化の過程で継続して起きることが示された。【０１８０】
（ＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）、ＳＳＥＡ−４及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）
Ｒａｓの活性化に伴いＧＳＬ糖鎖であるＳＳＥＡ−３（Ｇｂ−５、ＳＳＥＡ−４の前駆体）、ＳＳＥＡ−４及びＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの発現が増大することが示された（図１７（ａ）、図１７（ｂ）、図１８）。【０１８１】
ＳＳＥＡ−４はグリオーマのマーカー候補として報告されている（非特許文献２１）が、Ｒａｓの活性化に伴い発現増大することが明らかになった（図１７（ｂ））。また、ＳＳＥＡ−３（ＳＳＥＡ−４の前駆体）も、ＳＳＥＡ−４と同様に、Ｒａｓで発現が激増することが明らかになった（図１７（ａ））。ＳＳＥＡ−３／４と類似した発現動態を示す糖脂質として、Ｇｂ系列ＧＳＬ糖鎖のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが同定された（図１８）。【０１８２】
（コアフコース）
ＦＵＴ１〜ＦＵＴ９（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １〜９）の発現量を検証した結果、Ｒａｓの活性化に伴い、Ｎ−結合型糖鎖のコアフコシル化の責任酵素であるＦＵＴ８（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ８）の発現増大がみられた（図１９（ｈ））。このことから、Ｒａｓの活性化に伴い、コアフコース（フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖）の発現が増大することが示唆された。【０１８３】
なお、ＦＵＴ１〜９（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １〜９）の発現量の検討には、リアルタイムＰＣＲ法を用いた。各細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡへの逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲには、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。各プライマーは以下のものを使用した。
ＦＵＴ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ（配列番号１２）
ＦＵＴ２：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＧＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＴＴＡＣＣＧ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＣＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧ（配列番号１４）
ＦＵＴ３：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣ（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＴＡＧ（配列番号１６）
ＦＵＴ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＧＴＣＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴＴＣＣ（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＧＴＴＣＣＧＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＣ（配列番号１８）
ＦＵＴ５：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＴ（配列番号１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＣＡＴＡＧＴＧ（配列番号２０）
ＦＵＴ６：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＡＡＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧ（配列番号２２）
ＦＵＴ７：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＧＡＡＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴ（配列番号２３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣ（配列番号２４）
ＦＵＴ８：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＡＡＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＴＴＣＴＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６）
ＦＵＴ９：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧ（配列番号２７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣ（配列番号２８）【０１８４】
以上より、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、コア２型のＯ−結合型糖鎖、Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖及びＧｂ系列ＧＳＬ糖鎖、並びにＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ及びコアフコースは、Ｒａｓの活性化を反映することから、グリオーマのＷＨＯグレードＩＩＩの診断マーカーとして使用可能であることが示唆された。【０１８５】
（４．ＡＫＴの活性化を反映する糖鎖マーカー）
ＡＫＴを導入したＮＨＡ−ＴＳＲＡ細胞について、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖及びＧＳＬ糖鎖の定量的解析を行い、以下の通り、ＡＫＴの活性化を反映する糖鎖マーカーを見出した。【０１８６】
（フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖）
ＡＫＴの活性化に伴い、複数のフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖の発現が増大することが示された（図８）。【０１８７】
グリオーマにおいてフコシル化糖鎖が増大することは報告されていた（非特許文献２２が、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子の不活化に加え、ＡＫＴの活性化がその大きな原因の１つであることが明らかになった。【０１８８】
（（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖）
ＡＫＴの活性化に伴い、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖が激増することが示された（図７（ｂ）、図９（ｃ））。【０１８９】
（フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖）
ＡＫＴの活性化に伴い、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖のフコシル化が激増することが示された（図１１（ｂ）〜（ｄ））。【０１９０】
グリオーマにおいてＮ−結合型糖鎖のフコシル化糖鎖が増大することは報告されていた（非特許文献２２）が、ＧＳＬ糖鎖のフコシル化の発現増大に関する報告はされていない。【０１９１】
（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖についてさらに詳細に検証した結果、ＡＫＴの活性化に伴い、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７の発現が増大することが示された（図２０（ａ）〜（ｅ））。【０１９２】
（Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖及びα２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖）
ＡＫＴの活性化に伴い、Ｒａｓの活性化で一旦上昇したＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖及びα２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖の発現が激減することが示された（図１３（ａ）、図１３（ｂ）、図１４（ａ）、図１４（ｂ））。【０１９３】
Ｒａｓの活性化に伴い発現量が増大したこれらの糖鎖は、ＡＫＴの活性化に伴う悪性度の増大に伴い、一転して激減する。胃癌の場合、Ｂｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖の発現の増大と、細胞−細胞間接着の増大と、の間に相関のあることが報告されている。また、結腸癌及び乳癌の場合、６’−ｓｉａｌｙｌ化糖鎖の発現の増大と、細胞−ＥＣＭ間接着の増大と、の間に相関のあることが報告されている。癌化の過程で、細胞間接着、細胞−ＥＣＭ間接着の制御の一端が、これら糖鎖修飾を介して行われている構図が示唆される。【０１９４】
（Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖）
ＦＵＴ１〜ＦＵＴ９の発現量を検証した結果、ＡＫＴの活性化に伴い、α１，２による末端のフコシル化に関与するＦＵＴ１、α１，３／４によるフコシル化に関与するＦＵＴ３、及びα１，３結合に関与するＦＵＴ５の発現増大がみられた（図１９（ａ）、（ｃ）、（ｅ））。このことから、ＡＫＴの活性化に伴い、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）（いずれもフコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖）の発現が増大することが示唆された。【０１９５】
なお、ＦＵＴ１〜ＦＵＴ９の発現量の検討は、前述と同様に行った。【０１９６】
以上より、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖、（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、フコース修飾を受けた（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖、ＧＳＬ−２１、ＧＳＬ−３３、ＧＳＬ−３５、ＧＳＬ−３８及びＧＳＬ−４７、並びにＢｉｓｅｃｔ  ＧｌｃＮＡｃ型Ｎ−結合型糖鎖、α２，６結合したシアル酸を有するＮ−結合型糖鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｂ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖及びＬｅｗｉｓ  Ｙ［（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ）］構造を有する糖鎖は、ＡＫＴの活性化を反映することから、グリオーマのＷＨＯグレードＩＶの診断マーカーとして使用可能であることが示唆された。【０１９７】
（各細胞の（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップ作成）
（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖について、各細胞で検出された糖鎖の種類から代謝マップを作成した（ＮＨＡ：図２１、ＮＨＡ−Ｔ：図２２、ＮＨＡ−ＴＳ：図２３、ＮＨＡ−ＴＳＡＲ：図２４、ＮＨＡ−ＴＳＡＲＡ：図２５）。【０１９８】
細胞間の代謝マップを比較することで、糖鎖の発現変動を個々の糖鎖ではなく、代謝経路の流れの中で理解することができる。（ｎ）ＬＣ系列ＧＳＬ糖鎖の場合、ＮＨＡではｓｉａｌｙ−（ｎ）Ｌｃ４が最も主要な糖鎖で、次いでＬｃ５及びＬｃ６並びにその伸長又は分岐してｐｏｌｙＬａｃＮＡｃ構造を有する糖鎖、さらにシアリル化を受けた糖鎖及び微量のフコシル化を受けた糖鎖で構成されていた。ｈＴＥＲＴの導入が（ｎ）Ｌｃ系列ＧＳＬ糖鎖の代謝マップに与える影響は比較的軽微だが、フコシル化糖鎖が消失することがわかる。ＳＶ４０ＥＲの導入によって、種々のフコシル化を受けた糖鎖の発現を認め、Ｈ−ＲａｓＶ１２の導入で伸長又は分岐したＰｏｌｙＮＡｃ構造が減少した。ｍｙｒＡＫＴの導入はｐｏｌｙＬＡｃ構造の増大をもたらし、フコシル化の増大により構造のバリエーションを大幅に増大することが視覚的に理解できる。【０１９９】
（各糖鎖の発現変動）
上述の通り、グリオーマにおいて、糖鎖の発現変動の多くを、不死化・癌化モデルアストロサイトで検出することができた。また、個々の糖鎖の発現変動について、遺伝子の発現変動との因果関係を明らかにすることができた（図２６）。【０２００】
以上より、本実施例で得られた糖鎖マーカーは、グリオーマの診断マーカーとして有用であることが示唆された。【０２０１】
（実施例３）
臨床検体を用いて悪性グリオーマの糖鎖関連マーカー（Ｎ−結合型糖鎖）を探索した。【０２０２】
臨床検体の試料について、以下に示す。【０２０３】
【表４】
2016021729.tif 000005
【０２０４】
計１０７個のＮ−結合型糖鎖を定量解析し、相対定量の結果をクラスター解析した。【０２０５】
階層型クラスタリング分析法について説明する。クラスタリング分析は、階層型クラスター化法（Ｅｉｓｅｎ  ＭＢ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１９９８）を用いて行った。検体のクラスタリングについては、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ３．０ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｓｅｎｌａｂ．ｏｒｇ／ｅｉｓｅｎ／）用いて、細胞間で、検出されたすべての糖鎖の測定値に基づき、類似性を計算した。デンドログラム及びヒートマップは、ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウエアｖｅｒｓｉｏｎ  １．６０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｓｅｎｌａｂ．ｏｒｇ／ｅｉｓｅｎ／）を用いて作成した。【０２０６】
図２７〜３３において、Ｎ−結合型糖鎖は５桁の数字で表され、この５桁の数字は、（Ｈｅｘ）ａ（ＨｅｘＮＡｃ）ｂ（Ｆｕｃ）ｃ（Ｎｅｕ５Ａｃ）ｄ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ｅ＋ｃｏｒｅ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のａ〜ｅを表している。例えば、図中「１２２１０Ｃ」で表されるＮ−結合型糖鎖は、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋ｃｏｒｅ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の構造を有する。Ｎ−結合型糖鎖を表す５桁の数字については、以下の明細書において同様である。【０２０７】
図２９、図３０、図３２−図３３において、横軸については、左端のカラムから順に以下の内容を表す。
「Ｃｔｒｌ＝購入した非ＧＢＭ組織の非腫瘍部位」
「１＿ＩＩ＝症例番号１、ステージＩＩ（初発時）」
「１＿ＩＶ＝症例番号１、ステージＩＶ（悪性転化時）」
「２＿ＩＩ＝症例番号２、ステージＩＩ（初発時）」
「２＿ＩＶ＝症例番号２、ステージＩＶ（悪性転化時）」
「３＿ＩＩＩ＝症例番号３、ステージＩＩＩ（初発時）」
「３＿ＩＶ＝症例番号３、ステージＩＶ（悪性転化時）」
「４＿ＩＩＩ＝症例番号４、ステージＩＩＩ（初発時）」
「４＿ＩＶ＝症例番号４、ステージＩＶ（悪性転化時）」
「５ＩＶ＿１＝症例番号５、ステージＩＶ（初発時）」
「５ＩＶ＿２＝症例番号５、ステージＩＶ（再発時）」
「６ＩＶ＝症例番号６、ステージＩＶ（初発時）」
「７ＩＶ＿１＝症例番号７、ステージＩＶ（初発時）」
「７ＩＶ＿２＝症例番号７、ステージＩＶ（再発時）」
「８ＩＶ＿１＝症例番号８、ステージＩＶ（初発時）」
「８＿ＩＶ２＝症例番号８、ステージＩＶ（再発時）」【０２０８】
クラスター解析の結果を図２７に示す。グレードＩＩ（症例番号１の初発時及び症例番号２の初発時の２例）は相互に良く似ており、非腫瘍部位の近くに分類された。グレードＩＶは相互に良く似ており、グレードＩＩ及び非腫瘍部位とは明らかに異なった。グレードＩＩＩ（症例番号３の初発時及び症例番号４の初発時の２例）のうち、１例はグレードＩＩ／非腫瘍部と、他の一例はグレードＩＶのグループに分類された。このように、Ｎ−結合型糖鎖のプロファイリングによってグレードＩＩとグレードＩＶとは明瞭に区別された。【０２０９】
悪性化に伴い増加するＮ−結合型糖鎖について、図２８−３０に示す。【０２１０】
クラスター解析において、図２８の枠で囲った部分のＮ−結合型糖鎖は、腫瘍部位（グレードＩＩ）及び正常部位での発現が少なく、腫瘍部位（グレードＩＶ）での発現が高いものとして分類することができた。この中には図２９に示すようなシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖が多数含まれていた。図２９に、個々のシアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現変動を示す。特に、２２０２０Ｃ（図２９（ｂ））、３３０３０Ｃ（図２９（ｇ））、３３１３０Ｃ（図２９（ｊ））等は、グレードＩＩからグレードＩＩＩへの変化で発現が増大していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、シアリル化複合型Ｎ−結合型糖鎖である２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、２２０２０Ｃ、３３０３０Ｃ、３３１３０Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。【０２１１】
また、クラスター解析において、図２８の枠で囲った部分のＮ−結合型糖鎖は、前述の通り、腫瘍部位（グレードＩＩ）及び正常部位での発現が少なく、腫瘍部位（グレードＩＶ）での発現が高いものとして分類することができた。この中には図３０に示すようなバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖が含まれていた。図３０に、個々のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現変動を示す。特に、中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖である、２３１１０Ｃ（図３０（ｃ））、２３１２０Ｃ（図３０（ｄ））、３４０００Ｃ（図３０（ｅ））、３４１００Ｃ（図３０（ｆ））は、グレードＩＩからグレードＩＩＩへの変化で発現が増大していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖である２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ、３４１００Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ、３４１００Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ、３４１００Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、２３１１０Ｃ、２３１２０Ｃ、３４０００Ｃ、３４１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。実施例２でのモデル細胞を用いた検討においても、バイセクト型Ｎ−結合型糖鎖は、グレードＩＩ（ＴＳ）からグレードＩＩＩ（ＴＳＲ）への変化で発現が増大することが示されており（図１３（ａ））、これは本実施例での結果と一致するものであった。【０２１２】
悪性化に伴い減少するＮ−結合型糖鎖について、図３１−３３に示す。【０２１３】
クラスター解析において、図３１の枠で囲った部分のＮ−結合型糖鎖は、腫瘍部位（グレードＩＩ）や正常部位での発現が高く、腫瘍部位（グレードＩＶ）での発現の低いものとして分類することができた。この中には図３２に示すようなＦｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型糖鎖及びＦｕｃを有する中性のハイブリッド型糖鎖、並びに図３３に示すような複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型糖鎖が含まれていた。【０２１４】
図３２（ａ）、（ｂ）に、Ｆｕｃを２つ有する中性の２本鎖複合型Ｎ−結合型糖鎖の発現変動を示す。中性のＦｕｃを２つ有する２本鎖複合型糖鎖である１２２００Ｃ（図３２（ａ））、２２２００Ｃ（図３２（ｂ））は、グレードＩＩからグレードＩＩＩへの変化で発現が低減していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、１２２００Ｃ、２２２００Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、１２２００Ｃ、２２２００Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、１２２００Ｃ、２２２００Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、１２２００Ｃ、２２２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。実施例２でのモデル細胞を用いた検討においても、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖は、グレードＩＩ（ＴＳ）からグレードＩＩＩ（ＴＳＲ）への変化で発現が低減することが示されており（図８）、これは本実施例での結果と一致するものであった。【０２１５】
図３２（ｃ）−（ｇ）に、Ｆｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖の発現変動を示す。Ｆｕｃを有する中性のハイブリッド型Ｎ−結合型糖鎖である２１２００Ｃ（図３２（ｃ））、３１１００Ｃ（図３２（ｄ））、３１２００Ｃ（図３２（ｅ））、３２２００Ｃ（図３２（ｆ））、３２１００Ｃ（図３２（ｇ））は、グレードＩＩからグレードＩＩＩ／ＩＶへの変化で発現が低減していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ、３２１００Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ、３２１００Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ、３２１００Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、２１２００Ｃ、３１１００Ｃ、３１２００Ｃ、３２２００Ｃ、３２１００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。実施例２でのモデル細胞を用いた検討においても、フコース修飾を受けたＮ−結合型糖鎖は、グレードＩＩ（ＴＳ）からグレードＩＩＩ（ＴＳＲ）への変化で発現が低減することが示されており（図８）、これは本実施例での結果と一致するものであった。【０２１６】
図３３に、複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖の発現変動を示す。Ｆｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖である１３２００Ｃ（図３３（ａ））、１４２００Ｃ（図３３（ｂ））、及び２４２００Ｃ（図３３（ｅ））は、グレードＩＩからグレードＩＩＩ／ＩＶへの変化で発現が低減していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩ／ＩＩと診断することができ、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、１３２００Ｃ、１４２００Ｃ及び２４２００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。【０２１７】
また、複数のＦｕｃを有する中性のバイセクト型Ｎ−結合型糖鎖である２３２００Ｃ（図３３（ｃ））及び２３３００Ｃ（図３３（ｄ））は、グレードＩＩで一過性に発現が大幅に増大していることから、特異性が高いマーカー候補として期待できる。以上より、２３２００Ｃ及び２３３００Ｃの発現が増大している場合にはグレードＩＩと診断することができ、２３２００Ｃ及び２３３００Ｃの発現が低減している場合にはグレードＩ／ＩＩＩ／ＩＶと診断することができ、２３２００Ｃ及び２３３００Ｃはグリオーマの進行度の評価に有用であることが示唆された。また、２３２００Ｃ及び２３３００Ｃは、特に、グリオーマのグレードＩＩとグレードＩＩＩとの判別に有用であることが示された。【０２１８】
なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０２１９】
本出願は、２０１４年８月８日に出願された日本国特許出願２０１４−１６３２２２号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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