(57)【要約】  母体血から胎児由来の有核赤血球を選別する有核赤血球の選別方法を提供する。選別する有核赤血球を特定する有核赤血球特定工程と、有核赤血球を含む探索範囲を規定し、探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択する参照赤血球選択工程と、有核赤血球と参照赤血球と、のヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する。
2016021309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選別する有核赤血球を特定する有核赤血球特定工程と、
前記有核赤血球を含む探索範囲を設定し、前記探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択する参照赤血球選択工程と、
前記有核赤血球と前記参照赤血球と、のヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、前記有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法。
【請求項２】
前記探索範囲は、前記選別する有核赤血球の細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、
前記参照赤血球選択工程は、前記探索範囲内の前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、
選択された前記参照赤血球の数により前記探索範囲を広げる請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項３】
前記探索範囲は、前記有核赤血球からの距離が最も短い前記核を有さない赤血球から順次、前記距離が長くなる前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、前記参照赤血球の数が２個以上２０個以下となる範囲である請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項４】
前記分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域に含まれる波長における吸光度である請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項５】
前記分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域から選択される２種類以上の単色光における吸光度である請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項６】
前記分光特性は、前記胎児由来の有核赤血球の吸光度が前記母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、前記母体由来の有核赤血球の吸光度が前記胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定する請求項４または５に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項７】
前記第１の光波長域は、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満の波長域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長域であり、前記第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域である請求項６に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項８】
前記選別工程は、前記有核赤血球と、前記参照赤血球と、の前記吸光度の比、または、差分に基づいて、前記胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつける請求項４から７のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有核赤血球の選別方法に係り、特に、光学的な情報を利用して、妊娠母体の血液中の胎児由来の有核赤血球を特定する有核赤血球の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが問題として指摘されている。【０００３】
一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性の低い、より安全な出生前診断を実現することができることとなる。【０００４】
しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ（１ｍＬ＝１０−６ｍ３）中に１個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞（有核赤血球）を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。【０００５】
母体血中から胎児細胞を取得するため、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児由来の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などを用いて、胎児細胞を取得することが行われている。【０００６】
これらの方法は、血液中の胎児由来の有核赤血球の濃度を増加させ、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。しかしながら、胎児由来の有核赤血球の周りには、依然として母体由来の血液細胞が存在するため、確実に短時間で胎児由来の有核赤血球を取得できていなかった。【０００７】
また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、特許文献１には、細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成し、細胞質と核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。また、特許文献２には、ヘモグロビンの最大波長域付近の波長の光を用いて測定を行い、血球の種別を判別する血球種判別装置が記載されている。特許文献３には、生体組織の光学的性質を利用した生体情報分析装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５１４３０４号公報
【特許文献２】特開昭５８−１１５３４６号公報
【特許文献３】特開２０１４−１４４８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１〜３は、光学的な情報を用いて細胞の種類を識別し、求める細胞を分離する技術に関するものであるが、母体および胎児の異なる固体由来の有核赤血球の分離については開示されていなかった。母体由来の有核赤血球または胎児由来の有核赤血球であるかは、染色体を検査するまでわからず、検査を行った細胞が母体由来の有核赤血球であった場合、胎児由来の有核赤血球を選別するまで、染色体の検査を行う必要があり、再度、検査を行うため時間がかかっていた。したがって、依然として、胎児由来の有核赤血球を確実に分離するという課題が存在していた。【００１０】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、母体血から確実に胎児由来の有核赤血球を分離することができる、有核赤血球の選別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は前記目的を達成するために、選別する有核赤血球を特定する有核赤血球特定工程と、有核赤血球を含む探索範囲を設定し、探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択する参照赤血球選択工程と、有核赤血球と参照赤血球と、のヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法を提供する。【００１２】
本発明の有核赤血球の選別方法によれば、選別する有核赤血球を含む範囲を探索範囲として規定し、探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択し、選別する有核赤血球と参照赤血球と、を分光特性により選別している。参照赤血球は、母体由来の血液成分であるので、有核赤血球と参照赤血球の分光特性を比較することで、参照赤血球に近い分光特性を有する有核赤血球を母体由来、参照赤血球と異なる分光特性を有する有核赤血球を胎児由来と選別することができる。【００１３】
本発明の別の態様においては、探索範囲は、選別する有核赤血球の細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、参照赤血球選択工程は、探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択し、選択された参照赤血球の数により探索範囲を広げることが好ましい。【００１４】
この態様は、探索範囲を設定する方法を規定したものであり、探索範囲は、選別する有核赤血球の細胞の大きさにより段階的に設定することができる。探索範囲を段階的に設定し、最初に設定した探索範囲内で、所望の参照赤血球の数を選択することができない場合は、探索範囲を段階的に広げることで、参照赤血球の数を所望の値とすることができる。参照赤血球の数を増やすことで、参照赤血球の光学的な情報を平均することができるので、選別する有核赤血球との差異となる基準を平均することができ、ばらつきをおさえることができる。【００１５】
本発明の別の態様においては、探索範囲は、有核赤血球からの距離が最も短い核を有さない赤血球から順次距離が長くなる核を有さない赤血球を参照赤血球として選択し、参照赤血球の数が２個以上２０個以下となる範囲であることが好ましい。【００１６】
この態様は、探索範囲を設定する別の方法を規定したものであり、探索範囲は選別する有核赤血球からの距離が最も短い核を有さない有核赤血球から順次参照赤血球として選択することができる。参照赤血球の数としては、２個以上２０個以下である。この範囲とすることで、参照赤血球の光学的な情報を平均化することができ、また、参照赤血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので好ましいが、数が多くなると参照赤血球の測定に時間がかかるので、３個以上１０個以下とすることがより好ましい。【００１７】
本発明の別の態様においては、分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域に含まれる波長における吸光度であることが好ましい。【００１８】
この態様によれば、分光特性を４００〜６５０ｎｍの波長域に含まれる波長における吸光度としている。酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンは、４００〜６５０ｎｍの波長域において、異なる吸光度を示すため、この波長域に含まれる波長において、吸光度を測定することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とを選別することができる。【００１９】
本発明の別の態様においては、分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域から選択される２種類以上の単色光における吸光度であることが好ましい。【００２０】
この態様によれば、分光特性を４００〜６５０ｎｍの波長域から選択される２種類以上の単色光を用いて吸光度を測定することで、異なる吸光度を示す波長で分光特性を測定することができる。したがって、分光特性の差異を明確にすることができ、有核赤血球を精度良く選別することができる。【００２１】
本発明の別の態様においては、分光特性は、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定することが好ましい。【００２２】
この態様によれば、まず、第一に、選別する有核赤血球（胎児由来の有核赤血球の候補となる細胞）が、ヘモグロビンの吸収係数を有するかどうかの選別が可能となり、ヘモグロビンの吸収係数をもたない白血球由来の細胞を除外することが可能となる。次に、ヘモグロビンの吸収係数をもつ細胞において、分光特性の測定に用いられる波長を、胎児由来の有核赤血球の吸光度が、母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長と、から選ばれる各々の波長で測定することで、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とで、第１の光波長域の吸光度の大きさと第２の光波長域の吸光度の大きさとが逆転することになる。したがって、各々の波長で測定した吸光度を比較することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との差を明確にすることができ、精度良く、有核赤血球の選別を行うことができる。例えば、各々の波長で測定した吸光度の比を求めることで、胎児由来の有核赤血球における吸光度の比と、胎児由来の有核赤血球の吸光度の比と、の差が大きくなるので、有核赤血球を選別することができる。【００２３】
本発明の別の態様においては、第１の光波長域は、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満の波長域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長域であり、第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域であることが好ましい。【００２４】
この態様は、第１の光波長域、および、第２の光波長域を具体的に規定したものであり、この範囲の光波長域の波長を用いることで、吸光度の大きさを逆転させることができ、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との光学特性の差異を明確にすることができる。【００２５】
本発明の別の態様においては、選別工程は、有核赤血球と、参照赤血球と、の吸光度の比、または、差分に基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることが好ましい。【００２６】
この態様によれば、有核赤血球と参照赤血球との吸光度の比、または、吸光度の差分に基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることができる。参照赤血球は、母体由来の血液成分であるので、有核赤血球の吸光度と参照赤血球の吸光度との比が、「１」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球として、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることができる。また、吸光度の差分に基づいて、順位をつける場合は、有核赤血球と参照赤血球との差分が最も大きい有核赤血球を、胎児由来の有核赤血球である可能性の高い有核赤血球とし、有核赤血球と参照赤血球との差分が最も小さい有核赤血球を、母体由来の有核赤血球の可能性の高い有核赤血球として順位をつけることができる。そして、この順位に基づいて、有核赤血球の検査を行うことで、複数の有核赤血球の候補細胞の中から胎児由来の有核赤血球を精度良く選別することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の有核赤血球の選別方法によれば、選別する有核赤血球を含む範囲を探索範囲として規定し、探索範囲内の参照赤血球と、選別する有核赤血球と、の分光特性を比較することで、有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に精度よく選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。
【図２】図２は、有核赤血球選別工程の手順を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、有核赤血球特定工程の手順を示すフローチャート図である。
【図４Ａ】図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、除きたい細胞の形状を示す模式図である。
【図５】図５は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。
【図６】図６は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。
【図７】図７は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示すフローチャート図である。
【図８】図８は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。
【図９】図９は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
【図１０】図１０は、光学特性による有核赤血球を選別する選別工程の手順を示すフローチャート図である。
【図１１】図１１は、吸収係数を測定する際の波長の選択方法を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、添付図面に従って、本発明に係る有核赤血球の選別方法ついて説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００３０】
［胎児の染色体の検査方法］
まず、本発明に係る有核赤血球の選別方法を用いた実施形態の一例として胎児の染色体の検査方法について説明する。
【００３１】
図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。胎児の染色体の検査方法は、妊娠母体から母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、本発明の有核赤血球の選別方法である、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、４００〜６５０ｎｍの光波長域における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する有核赤血球選別工程（ステップＳ１６）と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程（ステップＳ１８）と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程（ステップＳ２０）と、確定した増幅産物の量を、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程（ステップＳ２２）と、を有する。
【００３２】
＜採取工程（ステップＳ１２）＞
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
【００３３】
母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査する。
【００３４】
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
【００３５】
＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
【００３６】
〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第１の媒体および第２の媒体を選択することで、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の界面に目的の成分（本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球）を集めることができる。そして、この第１の媒体と第２の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
【００３７】
具体的には、遠沈管の底部に第１の媒体を注入する工程と、第１の媒体を収めた遠沈管を冷却する工程と、遠沈管内の冷却された第１の媒体の上に第２の媒体を積層する工程と、遠沈管内の第２の媒体の上に血液試料である母体の末梢血を積層する工程と、遠沈管に収容された第１の媒体、第２の媒体および血液試料を遠心分離にかける工程と、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の層から、胎児由来の有核赤血球を含む画分を採取する工程と、を含む方法で有核赤血球の濃縮を行うことができる。
【００３８】
国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が、１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が、１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が、１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。密度の数値に関して、グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］で表される単位からＳＩ単位系への換算は容易であり、１グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］は、１０００キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］である。
【００３９】
積層する媒体（第１の媒体および第２の媒体）の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第１の媒体と、第２の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
【００４０】
濃縮工程で用いられる、第１の媒体および第２の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll（登録商標）-Paque、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるHistopaque（登録商標）等の媒体を使用することができる。本実施形態では、Percoll（登録商標）、およびHistopaque（登録商標）を好ましく使用することができる。Percoll（登録商標）は、密度（比重）１．１３０の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度（比重）の媒体を調製することが可能である。Histopaque(登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の媒体および第２の媒体を所望の密度に調製することが可能である。
【００４１】
〔他の濃縮方法〕
有核赤血球を濃縮する方法として、上記の密度勾配遠心分離法の他に、通常の白血球の抗原であるＣＤ４５（CD: Cluster of Differentiation）（ＣＤ分類に基づくモノクローナル抗体の分類番号）に特異的に結合する抗体を利用し、磁気効果を用いて、白血球を分離することで、有核赤血球を濃縮することもできる。
【００４２】
＜有核赤血球選別工程（ステップＳ１６）＞
有核赤血球選別工程は、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状および分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する工程である。
【００４３】
濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血には、有核赤血球の他に、白血球などの他の血液成分も含まれる。白血球などの血液成分は、濃縮工程により、母体血から除くことができるが、完全に除去することは困難であるため、選別工程において、核の形状により選別を行う有核赤血球特定工程と、分光特性により選別を行う選別工程により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。
【００４４】
有核赤血球選別工程は、濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布し、分析用の標本を作製し、分析用の標本を用いて行われる。有核赤血球選別工程については後述する。
【００４５】
＜増幅工程（ステップＳ１８）＞
増幅工程は、選別工程により選別された少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。
【００４６】
選別工程により、選別された胎児由来の有核赤血球は、マイクロマニュピュレータを用いて標本から分離される。標本から分離され取得された細胞からＤＮＡを抽出して、全ゲノム増幅を行う。全ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
【００４７】
本実施形態で用いる全ゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
【００４８】
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: polymerase chain reaction)に基づく試薬Single cell WGA kit（New England Biolabs社）、 GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit（Sigma-Aldrich社）、ＭＡＬＢＡＣ法（MALBAC: Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）（国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号公報に掲載）を用いることが出来る。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬GenomiPhi（ＧＥヘルスケア社）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（QIAGEN社）も同様に用いることが出来る。本実施形態では、Single cell WGA kit（New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
【００４９】
全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。更に、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製することが好ましい。
【００５０】
また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）を用いて測定することが好ましい。
【００５１】
増幅工程においては、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に存在する核酸であるＤＮＡを増幅する。増幅工程の対象物である胎児由来の有核赤血球の数は、少なくとも１つでよいが、複数の胎児由来の有核赤血球から取得した核酸を増幅することが好ましい。更には、後の決定工程で胎児の染色体の数的異常を決定するために、増幅産物の量を比較する基準として、数的異常が存在しない母体由来の有核赤血球の染色体を選択することも好ましい態様である。母体由来の有核赤血球を基準と比較する場合、選別工程により選別した母体由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅することも好ましい態様の一つである。
【００５２】
＜確定工程（ステップＳ２０）＞
確定工程は、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する工程である。
【００５３】
（核酸断片の数の決定）
胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された１００〜１５０ｂｐ（base pair：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシークエンサーで求める。本発明においては、胎児由来の有核赤血球の染色体であり、数的異常を検査する対象となる染色体は、好ましくは１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される。
【００５４】
＜決定工程（ステップＳ２２）＞
決定工程は、確定工程により確定したＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
【００５５】
胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準（あるいは参照）として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された１００〜１５０ｂｐの領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準となる染色体（基準染色体）としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の中から数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも１つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
【００５６】
次に、数的異常の検査の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量との比率により、胎児由来の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。正常であれば２本である染色体が３本存在するトリソミーである数的異常である場合には、１．０：１．５（あるいは２：３）の比になると予想される。
【００５７】
また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、ＤＮＡの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、ＤＮＡの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
【００５８】
≪有核赤血球選別工程の説明≫
次に、本発明の有核赤血球の選別方法である、有核赤血球選別工程について説明する。図２は、有核赤血球選別工程の手順を示すフローチャート図である。有核赤血球選別工程は、細胞の形状および核の形状により、選別する有核赤血球（胎児由来の有核赤血球の候補細胞）を特定する有核赤血球特定工程（ステップＳ３２）と、次の選別工程で有核赤血球を選別する際の基準となる参照赤血球を選択する参照赤血球選択工程（ステップＳ３４）と、有核赤血球と参照赤血球との分光特性の比較により、有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程（ステップＳ３６）と、を有する。
【００５９】
（細胞の形状の情報による選別）
有核赤血球選別工程は、上述した分析用の標本を用いて、まず細胞の形状の情報（以下、「細胞の形状」ともいう）により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別する。
【００６０】
細胞の形状による選別としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い、核領域の面積、核の明度、核のつぶれ方、などを挙げることができる。なかでも、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および、核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。細胞質の面積、及び核領域の面積は、分析用の標本の観察される面における面積である。
【００６１】
図３は、有核赤血球選別工程における細胞の形状（核の形状）により選別を行う有核赤血球特定工程の一例の手順を示したフローチャート図である。
【００６２】
細胞の形状による選別は、まず、細胞を抽出する（ステップＳ４２）。細胞であるか否かの判断は、２値化画像を用いて行われる。白色光光源を用いて分析用の標本を撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値を用いて２値化画像を生成し、生成された２値化画像から点状および島状の連続領域を有するもの、すなわち、任意の閉曲線で閉じられている領域を細胞として抽出する。なお、２値化した画像は、Ｅｒｏｓｉｏｎ・Ｄｉｌａｔｉｏｎなどのモルフォロジー処理を施して、連続領域の形状を整えた上で、大きさを求めてもよい。
【００６３】
次に、ステップＳ４２で抽出した細胞を核の有無により選別する（ステップＳ４４）。核の有無は、細胞内に核（点状物）が存在するかにより選別する。核の有無の判断にも２値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
【００６４】
次に、細胞の核の大きさ（点状および島状の連続領域の大きさ）が、１〜５μｍのものを抽出する（ステップＳ４６）。１〜５μｍの大きさの核を有する細胞を選択することは有核赤血球を選別するのに有効である。なお、「点状および島状の連続領域の大きさ」とは、核の外形を表す閉曲線を円形、又は楕円形に近似し、核の外形を近似した円形の直径、又は核の外形を近似した楕円形の長径とすることができる。
【００６５】
核の外形を近似した円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する円形のうち直径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した楕円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する楕円形のうち長径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した円形の直径、または、核の外形を近似した楕円形の長径が１〜５μｍのものを抽出する。
【００６６】
次に、核の形状により細胞を選別する（ステップＳ４８）。図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図４Ｂは除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う方法、および、核の円形度合いにより選別を行う方法を説明する。細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記（１）式を満たす場合に、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の核の面積をＮとした場合、Ｃに対するＮの割合が０．２５を超え１．０未満の核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。
【００６７】
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０      （１）
また、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記（２）式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をＬとしたとき、核の直径又は核の長径の平方に対する核の面積の割合が０．６５を超え０．７８５未満である核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップＳ４４で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
【００６８】
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５      （２）
細胞の形状による選別は、ステップＳ４２〜ステップＳ４６による第１の工程で、粗ふるいし、ステップＳ４８による第２の工程で、核の形状により選別を行うことで、画像処理により選別を行う胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の数を減らすことができ、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の選別を効率良く行うことができる。
【００６９】
形状による選別は、ステップＳ４２〜ステップＳ４８のすべての条件を満たす必要がある。ステップＳ４２〜ステップＳ４８の条件のうち、一つでも満たさないものは、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択されない。
【００７０】
細胞の形状の情報を用いて胎児由来の有核赤血球の候補なる有核赤血球を選別するシステムの構成例としては、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ（personal computer）、制御ＰＣ、ディスプレイを装備しているシステムを挙げることができる。光学搬送系は、対物レンズとＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラを備え、画像処理ＰＣは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える構成が挙げられる。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える構成が挙げられる。
【００７１】
（光学特性による選別）
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図５は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である（特開２０１４−１４８５号公報に記載）。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図５に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
【００７２】
光学特性による選別においては、胎児由来の有核赤血球が、母親の赤血球、および、わずかに存在する母体由来の有核赤血球に対して、ヘモグロビンの酸素親和性が異なることを利用して母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、を選別する。例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球と、この有核赤血球の近傍に存在する赤血球との分光特性の差異を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別するものである。
【００７３】
分光特性とは、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンとの吸収係数の差異の存在する波長域で差を検出するものである。成人の赤血球中のヘモグロビンは、４量体α２β２（ＨｂＡ）である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、２本のα鎖と２本のγ鎖によって作られた４量体α２γ２（ＨｂＦ）であり、生後、大部分を占めるＨｂＡと少数のＨｂＦからなるＨｂＡ２に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。そして、成人の血液中の赤血球に含まれるヘモグロビン（ＨｂＡ）は、４量体α２β２であるが、胎児型のヘモグロビン（ＨｂＦ）はα２γ２であり、ＨｂＡに比べて酸素親和性が高いという特徴を有する。出生前診断においては、血液試料として妊娠母体の末梢血を採取し、検査を行うことが好ましい。末梢血は、通常、静脈から採取するものであり、静脈中の血液の酸素の量は、動脈中の酸素の量より乏しくなる。健常人では、中心静脈血の酸素飽和度は、６０〜８０％が正常値といわれており、この値は、全身の酸素需要により上下する。ＨｂＡとＨｂＦは、酸素親和性が異なるため、静脈血中においても、ＨｂＡとＨｂＦの酸素結合量が異なり、ＨｂＦの酸素結合量がＨｂＡの酸素結合量よりも高くなるという特徴を有している。
【００７４】
母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）と胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）においても、静脈中で酸素親和性に差があり、図５に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球の吸光度の差を用いて選別する。吸光度の測定には、４００〜６５０ｎｍの光波長域が適用される。この光波長域から選択される波長を有する少なくとも１つの単色光を用いて吸光度が測定される。
【００７５】
また、吸光度の測定は、異なる波長の複数の単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、４００〜５００ｎｍの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。また、光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。２種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図５に示すように、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と還元ヘモグロビン（Ｈｂ）とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
【００７６】
また、光学特性により選別する光波長域は、図５に示すグラフの吸収係数が還元ヘモグロビンの吸収係数と酸化ヘモグロビンの吸収係数の大きさが逆転する波長を挟んでそれぞれの光波長域の波長で測定することが好ましい。すなわち、胎児由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が高い）の吸収係数が、母体由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が低い）の吸収係数より高い第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸収係数が胎児由来の有核赤血球の吸収係数より高い第２の光波長域の波長と、で吸光度を測定する。そして、第１の光波長域の波長で測定した吸光度と、第２の光波長域の波長で測定した吸光度の割合を求め、比較することで、胎児由来の有核赤血球の割合と母体由来の有核赤血球の割合の差を大きくすることができるので、胎児由来の有核赤血球の選別を確実に行うことができる。
【００７７】
第１の光波長域としては、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。また、第２の光波長域としては、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。
【００７８】
また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それら吸光度の平均値を用いて選別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
【００７９】
分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球の吸光度を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
【００８０】
＜参照赤血球の選択方法＞
参照赤血球の選択は次の方法により行うことができる。図６〜９は、参照赤血球を選択する方法を説明する図であり、図６は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図７は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。また、図８は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図９は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
【００８１】
｛参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法｝
図６、７は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、選別対象の有核赤血球候補３０を決定する（図７のステップＳ７２）。選別対象の有核赤血球候補３０は、先に説明したように有核赤血球特定工程により決定することができる。次に、探索する参照血球数を設定する（図７のステップＳ７４）。図６には、探索する参照赤血球を５個とした場合を説明する。次に、選別対象の有核赤血球候補３０を中心に、設定された探索する参照血球の数になるまで、参照赤血球３２を選択する（図７のステップＳ７６）。参照赤血球３２は、選別対象の有核赤血球候補３０の中心から、参照赤血球３２の中心までの距離Ｄが短い順に選択される。
【００８２】
有核赤血球候補３０の中心は有核赤血球候補３０の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。同様に、参照赤血球３２の中心は、参照赤血球３２の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。以下の説明においても同様である。また、有核赤血球候補３０の重心から、参照赤血球３２の重心までの距離が短い順に参照赤血球を選択してもよい。
【００８３】
なお、図６においては、参照赤血球の選択数を５個で説明しているが、参照赤血球の選択数は２個以上２０個以下であることが好ましい。参照赤血球の選択数を上記範囲とし、複数の参照赤血球の光学的な情報を取得して平均することで、選別対象の有核赤血球候補との差異となる基準を、ばらつきなく決定することができる。また、参照赤血球の選択数は、３個以上１０個以下とすることがより好ましい。参照赤血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので、好ましいが、数が多くなると参照赤血球の測定に時間がかかるので、上記範囲とすることが好ましい。
【００８４】
｛選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法｝
図８、９は、選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。かかる方法においても、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法と同様に、まず、選別対象の有核赤血球候補３０を決定する（図９のステップＳ８２）。次に、参照赤血球３２の探索範囲３６を設定する（図９のステップＳ８４）。図８において、探索範囲３６は実線により図示する。図８に図示した探索範囲３６は、選別対象の有核赤血球候補３０の１００細胞分（１０×１０細胞分）とする。
【００８５】
探索範囲３６は、選別対象の有核赤血球候補３０を中心とした１辺が有核赤血球候補３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とすることが好ましい。また、探索範囲３６は、段階的に設定しておき、探索範囲３６内に参照赤血球が見つからない場合は、探索範囲３６を広げていくことが好ましい。例えば、探索範囲３６を、一辺が有核赤血球候補３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とした場合に、参照赤血球３２が見つからない場合は、更に、１辺が２０細胞分の正方形、または、直径が２０細胞分の円形まで探索範囲を広げて、参照赤血球を決定することが好ましい。
【００８６】
次に、探索範囲３６内の核のない赤血球を参照赤血球３２として探索する（図９のステップＳ８６）。参照赤血球３２として選択する基準は、参照赤血球３２の中心、または、重心が探索範囲３６内に入っているか否かで判断する。
【００８７】
なお、参照赤血球３２の選択数、および、探索範囲３６の面積については特に限定されず、任意に設定することが可能である。
【００８８】
図１０は、参照赤血球３２を選択した後、選別対象の有核赤血球を選別する手順を示すフローチャート図である。図１１は、吸光度を測定する際の波長の選択方法の説明図である。
【００８９】
選別対象の有核赤血球に対して、光学特性により選別を行うために、吸光度を測定する波長を２種類選択する。例えば、図１１の波長λ１、及び波長λ４を選択する。一方の波長λ１で吸光度１を測定する。同様に、他方の波長λ４で吸光度２を測定する。
【００９０】
吸光度１、吸光度２は、それぞれ１つの波長、波長λ１、および、波長λ４で測定した吸光度とすることができるが、複数の波長で吸光度を測定し、その平均とすることもできる。例えば、図１１に示すように、吸光度を測定する波長を２種類λ１、及びλ４を選択した後、波長λ１からずらした波長λ２および波長λ３、波長λ４からずらした波長λ５および波長λ６のそれぞれについても吸光度を測定する。波長λ１、波長λ２、及び波長λ３で測定した吸光度の平均値を求め、この平均値を吸光度１とし、波長λ４、波長λ５、及び波長λ６で測定した吸光度の平均を求め、この平均値を吸光度２とすることができる。このように、複数の波長で測定した吸光度の平均値を吸光度１、および、吸光度２とすることで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
【００９１】
参照赤血球３２を選択した後、（１）選別対象の有核赤血球候補３０、（２）参照赤血球３２、（３）選別対象の有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４（図６、８に破線で示す）を、選択した波長で吸光度２を測定する（図１０のステップＳ９２）。選別する有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４とは、図６、８においては、対象となる赤血球の周囲の９細胞分（３×３細胞分）の範囲である。同様に、図１０のステップＳ９２で選択した波長と異なる波長で、（１）選別する有核赤血球候補３０、（２）参照赤血球３２、（３）選別する有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４の吸光度１を測定する（ステップＳ９４）。
【００９２】
吸光度１、２を測定後、有核赤血球候補３０から有核赤血球候補３０の周囲３４の吸光度を引くことで、（４）有核赤血球候補３０の吸光度１、２の真値を求める。また、参照赤血球３２の吸光度から、参照赤血球３２のそれぞれ赤血球の周囲３４の吸光度を引くことで、（５）参照赤血球３２の吸光度１、２の真値を求める（ステップＳ９６）。
【００９３】
有核赤血球候補３０の吸光度１および吸光度２から、有核赤血球候補３０が、実際にヘモグロビンを有するかの判別を行う（ステップＳ９８）。ヘモグロビンの有無は、既知のヘモグロビンの波長に対する吸光度と比較することにより判別する。ヘモグロビンを有することで、有核赤血球候補３０が有核赤血球であることを確定する。
【００９４】
次に、有核赤血球の吸光度の比、参照赤血球の吸光度の比を求める（ステップＳ１００）。有核赤血球の吸光度の比は、「吸光度１の真値／吸光度２の真値」により求める。また、参照赤血球の吸光度の比は、複数の参照赤血球の吸光度１の真値の平均値、および、吸光度２の真値の平均値を求め、この「吸光度１の真値の平均値／吸光度２の真値の平均値」により求めることができる。
【００９５】
最後に、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」を求める（ステップＳ１０２）。参照赤血球は、母体由来の有核赤血球であるため、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」の値が、「１」からの差が小さいほど、有核赤血球は、母体由来の有核赤血球である可能性が高く、「１」からの差が大きいほど、胎児由来の有核赤血球である可能性が高く、胎児由来の有核赤血球として選別することができる（ステップＳ１０４）。このように、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」を求め、この値の「１」からの差が一番大きく異なる有核赤血球から胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることで、胎児由来の有核赤血球の選別を行うことができる。
【００９６】
また、上記では、有核赤血球の吸光度の比と、参照赤血球の吸光度の比と、の割合（比）を求めることで、選別対象の有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する方法を説明したが、選別対象の有核赤血球の吸光度の比と参照赤血球の吸光度の比とで差分を取ることで、有核赤血球の選別を行うこともできる。この場合、選別対象の有核赤血球の吸光度の比と参照赤血球の吸光度の比との差分を取り、その数値の絶対値が小さい有核赤血球は、母体由来の有核赤血球である可能性が高く、その数値の絶対値が大きい有核赤血球は胎児由来の有核赤血球である可能性が高いとして、順位をつけることができる。
【００９７】
参照赤血球を選択する方法としては、図６及び図７に図示した参照赤血球数に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法、図８及び図９に図示した選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法を例示したが、これに限定されず、これらを組み合わせた方法で選別することも可能である。例えば、選別対象の有核赤血球の面積により探索範囲を決定しておき、この範囲内に含まれる赤血球数が予め設定した個数を上回る場合には、すべてを測定することも可能であり、予め設定した個数を選択して測定することも可能である。選択する方法としては、上述したように、選別対象の有核赤血球と参照赤血球との中心同士の距離が短いもの、または、重心同士の距離が短いものから、順次選択する。また、探索範囲内の参照赤血球の数が、予め設定した個数を下回る場合には、下回ることが判明した時点で、探索範囲を拡大して、拡大したことにより増加した面積に含まれる参照赤血球を検出する。この操作を、予め決められた個数の赤血球が得られるまで、繰り返すことが好ましい。
【００９８】
また、参照赤血球との比較により選別する場合は、複数の波長で測定した吸光度の比を用いて選別する方法に限定されず、１種類の波長で吸光度を測定し、選別する有核赤血球と参照赤血球を比較することで判別することもできる。参照赤血球は、母体由来の赤血球であるので、参照赤血球と吸光度の値が近い有核赤血球を母体由来として、吸光度の値が遠い有核赤血球を胎児由来として判別することができる。
【００９９】
以上の方法により、選別工程により、母体血液中に存在する有核赤血球を胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とに選別することができる。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。【０１０１】
（取得工程［末梢血液試料取得工程］）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。【０１０２】
（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
Ｐｅｒｃｏｌｌ液（登録商標）を使用して、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５ｇ／ｍＬの液２ｍＬを添加した。続けて、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０ｇ／ｍＬの液２ｍＬを重層した。その後、密度１．０７０ｇ／ｍＬの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍ（回転数毎分）で２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９０ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第１のガラス基板を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２ガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。【０１０３】
（細胞の形状に基づき選別する工程）
ガラス基板上に塗布した濃縮処理後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ（以下、ＸＹステージと記載する。）と、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、垂直方向（以下、Ｚ方向と記載する）移動機構を制御するＺ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した、ガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。【０１０４】
画像解析は、以下の式（１）、式（２）の条件を満たす細胞を検出し、解析対象の画像に直交する二軸からなる座標系を設定し、二軸の一方をＸ軸、二軸の他方をＹ軸とした場合の、検出された細胞のＸ方向の細胞の位置、及びＹ方向の位置を記録した。【０１０５】
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０      （１）
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５      （２）
ここで、Ｃは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積（解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積）、Ｎは、画像解析をおこなう細胞の核の面積（解析画像における細胞の核を表す領域の面積）、Ｌは、画像解析する細胞の核の長径又は直径（解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径）、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら（１）、（２）を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選択し、次の工程の胎児由来の有核赤血球の候補とした。【０１０６】
（光学特性に基づき有核赤血球を選別する工程）
形状の情報により選択された胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の１０個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球１０個を特定し、そのうちの１つの有核赤血球に対して、波長が４６０ｎｍの単色光の吸光度１、および波長が５６０ｎｍの単色光の吸光度２を測定し、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を５個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算し、平均値を計算した。【０１０７】
同様の方法で、ガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の残りの９個の細胞に対しても同様の計算を行った。この計算結果から、（有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比の平均値）を求め、この値の「１」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球と見なして細胞Ａとし、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球と見なして細胞Ｂとした。【０１０８】
（細胞単離工程）
上記工程で決定された細胞Ａ、細胞Ｂを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。【０１０９】
（増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］）
有核赤血球の、胎児由来と識別された細胞Ａと、母体由来と識別された細胞Ｂを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。【０１１０】
（確定工程［母体由来または胎児由来の確定工程］）
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（SNP: Single Nucleotide Polymorphism）（SNP  ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、細胞Ａと細胞ＢのＳＮＰが異なることが確認出来た。別途、白血球と予想される細胞Ｃをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞Ａ、細胞Ｂと同様にしてＳＮＰを調べたところ、細胞ＢのＳＮＰと一致することが確認された。以上より、細胞Ａが胎児由来の有核赤血球、細胞Ｂが、母親由来の有核赤血球であることが確認された。【０１１１】
（決定工程［数的異常の決定工程］）
細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれから増幅したＤＮＡの増幅産物を等分割した残りの一方を用いて、胎児由来の有核赤血球が２１トリソミーであるかを判別した。細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれから得られたＤＮＡの増幅産物を用いて、SureSelect target enrich system（Human All exon v5 アジレント社製）を用いて、説明書記載に則り夫々の細胞のexon部分のみを濃縮しILLUMINA社製ゲノムアナライザーHiseqで、exon部分のシーケンスリード数を算出、細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれにおける２１番染色体のexon部分で算出されたシーケンスリード数を比較することにより２１トリソミーを検出することが可能であった。【０１１２】
以上のごとく、妊娠母体から得られた血液から胎児由来の有核赤血球を同定でき、胎児の染色体の数的異常の解析も可能であることがわかり、本発明の効果が確認された。【０１１３】
（実施例２）
実施例１において、（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）を、以下に記載の方法で行い、ガラス基板を作製した以外は、実施例１と同様に行い、本発明の効果を確認した。【０１１４】
（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
Histopaque液（登録商標）を使用して、密度１．０９５の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液３ｍＬを添加した。その後、密度１．０９５の媒体の上に、採血した血液の希釈液１２ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０９５と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第１のガラス基板を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板２（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２のガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。【０１１５】
（実施例３）
実施例１において、別の母体から得られた細胞を用いて、実施例１で行った、母体由来または胎児由来の確定の方法において、Ｙ染色体のsex-determining factor (SRY)遺伝子領域で作製したPCRプライマーを用いてタカラバイオ社製Multiplex PCR  Assay Kitを用いてPCRを行い、Y染色体のPCR増幅物の有無を一般的なアガロースゲル電気泳動法で確認し、実施例１の胎児有核赤血球の選別工程で、別の母体から得た胎児由来と識別した細胞が男児の胎児由来の細胞であることを確認した以外は、実施例１と同様に実験を行い、本発明の効果を確認した。
【符号の説明】
【０１１６】
３０…有核赤血球候補、３２…参照赤血球、３４…周囲、３６…探索範囲
【図１】
2016021309.tif 000003
【図２】
2016021309.tif 000004
【図３】
2016021309.tif 000005
【図４Ａ】
2016021309.tif 000006
【図４Ｂ】
2016021309.tif 000007
【図５】
2016021309.tif 000008
【図６】
2016021309.tif 000009
【図７】
2016021309.tif 000010
【図８】
2016021309.tif 000011
【図９】
2016021309.tif 000012
【図１０】
2016021309.tif 000013
【図１１】
2016021309.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月12日(2015.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選別する有核赤血球を特定する有核赤血球特定工程と、
前記有核赤血球を含む探索範囲を設定し、前記探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択する参照赤血球選択工程と、
前記有核赤血球と前記参照赤血球と、のヘモグロビンの酸素親和性に起因する吸収係数の差異により、前記有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法。
【請求項２】
前記探索範囲は、前記選別する有核赤血球の細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、
前記参照赤血球選択工程は、前記探索範囲内の前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、
選択された前記参照赤血球の数により前記探索範囲を広げる請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項３】
前記探索範囲は、前記有核赤血球からの距離が最も短い前記核を有さない赤血球から順次、前記距離が長くなる前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、前記参照赤血球の数が２個以上２０個以下となる範囲である請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項４】
前記分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域に含まれる波長における吸光度である請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項５】
前記分光特性は、４００〜６５０ｎｍの波長域から選択される２種類以上の単色光における吸光度である請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項６】
前記分光特性は、前記胎児由来の有核赤血球の吸光度が前記母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、前記母体由来の有核赤血球の吸光度が前記胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定する請求項４または５に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項７】
前記第１の光波長域は、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満の波長域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長域であり、前記第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域である請求項６に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項８】
前記選別工程は、前記有核赤血球と、前記参照赤血球と、の前記吸光度の比、または、差分に基づいて、前記胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつける請求項４から７のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月2日(2017.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
母体血中から胎児細胞を取得するため、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児由来の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などが行われている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
この態様は、探索範囲を設定する別の方法を規定したものであり、探索範囲は選別する有核赤血球からの距離が最も短い核を有さない赤血球から順次参照赤血球として選択することができる。参照赤血球の数としては、２個以上２０個以下である。この範囲とすることで、参照赤血球の光学的な情報を平均化することができ、また、参照赤血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので好ましいが、数が多くなると参照赤血球の測定に時間がかかるので、３個以上１０個以下とすることがより好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
この態様によれば、まず、第一に、選別する有核赤血球（胎児由来の有核赤血球の候補となる細胞）が、ヘモグロビンの吸収係数を有するかどうかの選別が可能となり、ヘモグロビンの吸収係数をもたない白血球由来の細胞を除外することが可能となる。次に、ヘモグロビンの吸収係数をもつ細胞において、分光特性の測定に用いられる波長を、胎児由来の有核赤血球の吸光度が、母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長と、から選ばれる各々の波長で測定することで、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とで、第１の光波長域の吸光度の大きさと第２の光波長域の吸光度の大きさとが逆転することになる。したがって、各々の波長で測定した吸光度を比較することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との差を明確にすることができ、精度良く、有核赤血球の選別を行うことができる。例えば、各々の波長で測定した吸光度の比を求めることで、胎児由来の有核赤血球における吸光度の比と、母体由来の有核赤血球の吸光度の比と、の差が大きくなるので、有核赤血球を選別することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１】図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。
【図２】図２は、有核赤血球選別工程の手順を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、有核赤血球特定工程の手順を示すフローチャート図である。
【図４Ａ】図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、除きたい細胞の形状を示す模式図である。
【図５】図５は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。
【図６】図６は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。
【図７】図７は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示すフローチャート図である。
【図８】図８は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。
【図９】図９は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
【図１０】図１０は、光学特性による有核赤血球を選別する選別工程の手順を示すフローチャート図である。
【図１１】図１１は、吸光度を測定する際の波長の選択方法を説明する説明図である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
積層する媒体（第１の媒体および第２の媒体）の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第１の媒体と、第２の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: polymerase chain reaction)に基づく試薬Single cell WGA kit（New England Biolabs社）、及び GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit（Sigma-Aldrich社）を用いることができ、全ゲノム増幅法としては、ＭＡＬＢＡＣ法（MALBAC: Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）（国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号公報に掲載）を用いることが出来る。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬GenomiPhi（ＧＥヘルスケア社）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（QIAGEN社）も同様に用いることが出来る。本実施形態では、Single cell WGA kit（New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
次に、ステップＳ４２で抽出した細胞を核の有無により選別する（ステップＳ４４）。核の有無は、細胞内に核（点状物）が存在するかにより決定する。核の有無の判断にも２値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
次に、核の形状により細胞を選別する（ステップＳ４８）。図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図４Ｂは除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う方法、および、核の円形度合いにより選別を行う方法を説明する。細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記（１）式を満たす場合に、細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の核の面積をＮとした場合、Ｃに対するＮの割合が０．２５を超え１．０未満の核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
また、吸光度の測定は、異なる波長の複数の単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、４００〜５００ｎｍの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別する。また、光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。２種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図５に示すように、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と還元ヘモグロビン（Ｈｂ）とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
｛参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法｝
図６、７は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、選別対象の有核赤血球候補３０を決定する（図７のステップＳ７２）。選別対象の有核赤血球候補３０は、先に説明したように有核赤血球特定工程により決定することができる。次に、探索する参照赤血球数を設定する（図７のステップＳ７４）。図６には、探索する参照赤血球を５個とした場合を説明する。次に、選別対象の有核赤血球候補３０を中心に、設定された探索する参照赤血球の数になるまで、参照赤血球３２を選択する（図７のステップＳ７６）。参照赤血球３２は、選別対象の有核赤血球候補３０の中心から、参照赤血球３２の中心までの距離Ｄが短い順に選択される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
吸光度１、２を測定後、有核赤血球候補３０の吸光度から有核赤血球候補３０の周囲３４の吸光度を引くことで、（４）有核赤血球候補３０の吸光度１、２の真値を求める。また、参照赤血球３２の吸光度から、参照赤血球３２のそれぞれ赤血球の周囲３４の吸光度を引くことで、（５）参照赤血球３２の吸光度１、２の真値を求める（ステップＳ９６）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
Ｐｅｒｃｏｌｌ液（登録商標）を使用して、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液を調製し、遠沈管の底部に密度１．０９５ｇ／ｍＬの液２ｍＬを添加した。続けて、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０ｇ／ｍＬの液２ｍＬを重層した。その後、密度１．０７０ｇ／ｍＬの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍ（回転数毎分）で２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９０ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。片手で第１のガラス基板を保持し、その１端にこのように採取した血液の画分を１滴置いた。もう一方の手で別のガラス基板（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２ガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
Histopaque液（登録商標）を使用して、密度１．０９５の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液３ｍＬを添加した。その後、密度１．０９５の媒体の上に、採血した血液の希釈液１２ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０９５の液と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。片手で第１のガラス基板を保持し、その１端にこのように採取した血液の画分を１滴置いた。もう一方の手で別のガラス基板２（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２のガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選別する有核赤血球を特定する有核赤血球特定工程と、
前記有核赤血球を含む探索範囲を設定し、前記探索範囲内の核を有さない赤血球を参照赤血球として選択する参照赤血球選択工程と、
前記有核赤血球と前記参照赤血球と、のヘモグロビンの酸素親和性に起因する吸収係数の差異により、前記有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法。
【請求項２】
前記探索範囲は、前記選別する有核赤血球の細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、
前記参照赤血球選択工程は、前記探索範囲内の前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、
選択された前記参照赤血球の数により前記探索範囲を広げる請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項３】
前記探索範囲は、前記有核赤血球からの距離が最も短い前記核を有さない赤血球から順次、前記距離が長くなる前記核を有さない赤血球を前記参照赤血球として選択し、前記参照赤血球の数が２個以上２０個以下となる範囲である請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項４】
前記吸収係数の差異は、４００〜６５０ｎｍの波長域に含まれる波長における吸光度である請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項５】
前記吸収係数の差異は、４００〜６５０ｎｍの波長域から選択される２種類以上の単色光における吸光度である請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項６】
前記吸収係数の差異は、前記胎児由来の有核赤血球の吸光度が前記母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、前記母体由来の有核赤血球の吸光度が前記胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定する請求項４または５に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項７】
前記第１の光波長域は、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満の波長域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長域の少なくとも１つであり、前記第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域である請求項６に記載の有核赤血球の選別方法。
【請求項８】
前記選別工程は、前記有核赤血球と、前記参照赤血球と、の前記吸光度の比、または、差分に基づいて、前記胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつける請求項４から７のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
【国際調査報告】
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