(57)【要約】本発明は、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片と、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片と、リンカーペプチドとを含み、該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片とが結合することによってホタルルシフェラーゼ活性を回復する、分割型組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらを用いる解析方法を提供する。
2016038750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片と、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片と、
リンカーペプチドとを含む分割型組換えタンパク質であって、
該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片とが結合することによってホタルルシフェラーゼ活性を回復する、分割型組換えタンパク質。
【請求項２】
前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片が、互いに異なる種類のホタルのホタルルシフェラーゼに由来する、請求項１に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項３】
前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片が、それぞれ、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  Ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）及びシブイロヒゲボタル（Ｓｔｅｎｏｃｌａｄｉｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｎｎｉｓ）からなる群より選択されるホタルのホタルルシフェラーゼに由来する、請求項１又は２に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項４】
前記Ｎ末端側断片が、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）のホタルルシフェラーゼに由来する、請求項３に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項５】
前記Ｎ末端側断片がＣ末端側に配置されており、前記Ｃ末端側断片がＮ末端側に配置されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項６】
前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に、カルシウム結合領域と、該カルシウム結合領域と可逆的に結合又は解離できる相互作用領域とを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項７】
前記カルシウム結合領域が、カルモジュリン由来であり、前記相互作用領域が、Ｍ１３ペプチドである、請求項６に記載の分割型組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分割型組換えタンパク質をコードする、遺伝子。
【請求項９】
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された請求項８に記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１１】
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された請求項６又は７に記載の分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を経時的に測定する工程と、
該発光測定工程で検出した発光量の変動に基づき、該細胞内におけるカルシウムイオン濃度の変動を解析する工程と、
を含む、細胞内カルシウムイオンの解析方法。
【請求項１２】
互いに異なる発光色を有する前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む２以上のベクターを用いる、請求項１１に記載の細胞内カルシウムイオンの解析方法。
【請求項１３】
１細胞内のカルシウムイオン濃度の変動を解析する、請求項１１又は１２に記載の細胞内カルシウムイオンの解析方法。
【請求項１４】
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された目的遺伝子及び請求項１〜５のいずれか１項に記載の分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を測定する工程と、
該発光量に基づき、該細胞内における該目的遺伝子の発現量を解析する工程と、
を含む、細胞内遺伝子発現の解析方法。
【請求項１５】
互いに異なる発光色を有する前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む２以上のベクターを用いる、請求項１４に記載の細胞内遺伝子発現の解析方法。
【請求項１６】
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片をコードする遺伝子が、一方のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片をコードする遺伝子が、別のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
を含む、ベクターセット。
【請求項１７】
前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片が、互いに異なる種類のホタルのホタルルシフェラーゼに由来する、請求項１６に記載のベクターセット。
【請求項１８】
いずれか一方のプロモーター遺伝子が、誘導性プロモーター遺伝子である、請求項１６又は１７に記載のベクターセット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターセットを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
前記誘導性プロモーター遺伝子を刺激する誘導物質を添加する工程と、
該細胞における発光量を測定する工程と、
該発光量に基づき、該細胞内における該誘導性プロモーター遺伝子の活性を解析する工程と、
を含む、細胞内遺伝子発現の解析方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターセットを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらを用いた解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、種々の生命現象を観察する目的で、レポーターアッセイ技術や細胞イメージング技術が使用されてきた。特に、細胞イメージング技術では、蛍光タンパク質や発光タンパク質をコードする遺伝子を使用して生物細胞を改変し、蛍光や発光を指標として、生物細胞における種々の生命現象を解析することが行われている。しかし、蛍光タンパク質を用いる細胞イメージング技術では、細胞が自己蛍光を発するためバックグラウンドが高くシグナル／ノイズ比が低いという問題、ダイナミックレンジが狭いため利用可能な測定対象の範囲が狭いという問題等を有している。【０００３】
そこで、近年、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光を用いた細胞イメージング技術が開発されている。例えば、特許文献１では、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のスプリットルシフェラーゼを用いた、細胞特異的な遺伝子発現イメージング法が開示されている。特許文献２では、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子、及びカルシウム依存的に相互作用するカルモジュリン遺伝子とＭ１３遺伝子を用いた、カルシウム濃度依存的に発光強度を変化させるカルシウムインジケータ及びイメージング方法が開示されている。【０００４】
また、特許文献３では、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子、及びカルシウム依存的に構造変化するカルモジュリン遺伝子を用いた、カルシウム濃度依存的に発光強度を変化させるカルシウムインジケータが開示されている。特許文献４では、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼを用いた、様々な発光強度をもつスプリットルシフェラーゼが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１５５５５８号公報
【特許文献２】特開２０１２−５１８２４号公報
【特許文献３】特開２０１２−９０６３５号公報
【特許文献４】米国特許第７，６０１，５１７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ，Ｌｌｏｐｉｓ  Ｊ，Ｈｅｉｍ  Ｒ，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ＪＭ，Ａｄａｍｓ  ＪＡ，Ｉｋｕｒａ  Ｍ，Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ２＋  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３８８（６６４５），ｐｐ．８８２−８８７，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来技術で用いられている北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のホタルルシフェラーゼは、発光強度が弱く、また発光色が単色であるため、外来遺伝子の発現が弱い細胞におけるイメージング、１細胞イメージング、高速イメージング、多色イメージングなどへの使用が困難であった。【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、分割型組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらを用いた解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたＮ末端側断片と、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼＣ末端側断片とが結合すると、従来技術で用いられている北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のホタルルシフェラーゼのものと比較して、明らかに発光強度が強いホタルルシフェラーゼ活性を回復できることを見出した。また、ホタルの種類、前記Ｃ末端側断片が保持するアミノ酸の数、それらの組み合わせにより、回復したホタルルシフェラーゼ活性が様々な発光色を呈示できることを見出した。本発明は、これら知見に基づき、鋭意研究を行うことにより、実現されたものである。【００１０】
すなわち、本発明の分割型組換えタンパク質は、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片と、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片と、
リンカーペプチドとを含む分割型組換えタンパク質であって、
該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片とが結合することによってホタルルシフェラーゼ活性を回復することを特徴とする。【００１１】
本発明の分割型組換えタンパク質は、前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片が、互いに異なる種類のホタルのホタルルシフェラーゼに由来してもよい。【００１２】
本発明の分割型組換えタンパク質は、前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片が、それぞれ、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  Ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）及びシブイロヒゲボタル（Ｓｔｅｎｏｃｌａｄｉｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｎｎｉｓ）からなる群より選択されるホタルのホタルルシフェラーゼに由来することが好ましい。【００１３】
本発明の分割型組換えタンパク質は、前記Ｎ末端側断片が、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）由来のホタルルシフェラーゼに由来することが好ましい。【００１４】
本発明の分割型組換えタンパク質は、前記Ｎ末端側断片がＣ末端側に配置されており、前記Ｃ末端側断片がＮ末端側に配置されていることが好ましい。【００１５】
本発明の分割型組換えタンパク質は、前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に、カルシウム結合領域と、該カルシウム結合領域と可逆的に結合又は解離できる相互作用領域とを更に含むことが好ましい。前記カルシウム結合領域が、カルモジュリン由来であり、前記相互作用領域が、Ｍ１３ペプチドであることが、より好ましい。【００１６】
本発明の遺伝子は、前記分割型組換えタンパク質をコードする。【００１７】
本発明のベクターは、プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された前記遺伝子を含む。【００１８】
本発明の細胞は、前記ベクターを含む。【００１９】
本発明の細胞内カルシウムイオンの解析方法は、
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を経時的に測定する工程と、
該発光測定工程で検出した発光量の変動に基づき、該細胞内におけるカルシウムイオン濃度の変動を解析する工程と、
を含み、該分割型組換えタンパク質が、前記カルシウム結合領域及び前記相互作用領域を含む。前記解析方法は、互いに異なる発光色を有する前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む２以上のベクターを用いることもできる。前記解析方法は、１細胞内のカルシウムイオン濃度の変動を解析することもできる。【００２０】
本発明の細胞内遺伝子発現の解析方法は、
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された目的遺伝子及び前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を経時的に測定する工程と、
該発光量の変動に基づき、該細胞内における該目的遺伝子の発現量の変動を解析する工程と、
を含む。前記解析方法は、互いに異なる発光色を有する前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む２以上のベクターを用いることもできる。【００２１】
本発明のベクターセットは、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片をコードする遺伝子が、一方のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するＣ末端側断片をコードする遺伝子が、別のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
を含むことを特徴とする。【００２２】
本発明のベクターセットは、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片が別種のホタルのホタルルシフェラーゼに由来してもよい。また、いずれか一方の前記プロモーター遺伝子が、誘導性プロモーター遺伝子であってもよい。【００２３】
また、本発明の細胞内遺伝子発現の解析方法は、
いずれか一方の前記プロモーター遺伝子が誘導性プロモーター遺伝子である前記ベクターセットを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞に、該細胞外から前記誘導性プロモーター遺伝子を刺激する誘導物質を添加する工程と、
該細胞における発光量を経時的に測定する工程と、
該発光量の変動に基づき、該細胞内における該誘導性プロモーター遺伝子の活性の変動を解析する工程と、
を含む。【００２４】
本発明の細胞は、本発明のベクターセットを含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、発光強度が強く且つ様々な発光色を有する、新規な分割型組換えタンパク質及びその遺伝子を提供することができる。また、本発明によれば、前記分割型組換えタンパク質及びその遺伝子を用いることにより、シグナル／ノイズ比が高い発光を指標とする、細胞内カルシウムイオンの解析方法及び細胞内遺伝子発現の解析方法を提供することができる。これらの解析方法は、外来遺伝子の発現が弱い細胞におけるイメージング、１細胞イメージング、高速イメージング、多色イメージングなどに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ｎ末端側断片（ＮＬｕｃ）及びＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）を説明する模式図である。
【図２】Ｎ末端側断片（ＮＬｕｃ）がＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）のＣ末端側に配置された、本発明の一実施形態に係る分割型組換えタンパク質の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る分割型組換えタンパク質のホタルルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図４】置換型ルシフェラーゼの大腸菌内及びＨＥＫ２９３細胞内における活性波長の測定結果（実験３）を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る分割型組換えタンパク質のＮ末端側断片とＣ末端側断片とを、細胞内において別々のベクターで発現させて、ホタルルシフェラーゼ活性を回復させた実験の結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るベクターセットを用いたＨＥＫ２９３細胞内プロモーター遺伝子発現イメージングの結果を示す画像である。
【図７】本発明の一実施形態に係るベクターセットを用いたＨＥＫ２９３細胞内プロモーター遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係るベクターセットを用いた神経細胞内プロモーター遺伝子発現イメージングの結果を示す画像である。
【図９】本発明の一実施形態に係るベクターセットを用いた神経細胞内プロモーター遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る分割型組換えタンパク質（発光カルシウムインジケータ）の模式図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る分割型組換えタンパク質（発光カルシウムインジケータ）による発光量の比較結果を示す図である。
【図１２】発光カルシウムインジケータのカルシウムキャリブレーション（実験８）の結果を示す図である。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ刺激時の細胞内カルシウム濃度の解析（実験９）の結果を示す図である。
【図１４】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ刺激時の発光カルシウムイメージング（実験１０）の結果を示す画像及びグラフである。
【図１５】ＨＥＫ２９３細胞でのカルシウム濃度変動の高速発光イメージング（実験１１）の結果を示す画像及びグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を、その実施形態に基づき具体的に例示説明する。
【００２８】
＜分割型組換えタンパク質＞
本発明の分割型組換えタンパク質は、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片と、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個の〜７８個のアミノ酸を保持するＣ末端側断片と、
をリンカーポリペプチドで連結して含む分割型組換えタンパク質であって、
該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片とが結合することによってホタルルシフェラーゼ活性を回復することを特徴とする。
【００２９】
ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するもの及びバクテリアに由来するものが取得されているが、両者は、タンパク質構造や基質などにおいて大きく異なる。本発明は、ホタルに由来するルシフェラーゼであるホタルルシフェラーゼに関する。ホタルルシフェラーゼの基質は、ホタルルシフェリンである。好ましくは、ホタルルシフェリンは、Ｄ−ルシフェリンである。本発明において、ルシフェラーゼ活性とは、ＡＴＰの存在下、基質であるルシフェリンが起こす化学変化を触媒して発光を引き起こす能力を意味する。すなわち、本発明において、ホタルルシフェラーゼ活性とは、ＡＴＰの存在下、基質であるホタルルシフェリンが起こす化学変化を触媒して発光を引き起こす能力を意味する。
【００３０】
特定の位置でＮ末端側断片とＣ末端側断片とに２分割すると失活し、それら両断片は、それぞれ単独ではルシフェラーゼ活性を示さないが、互いに結合してタンパク質を再構成するとルシフェラーゼ活性を回復することができるルシフェラーゼの存在が知られている（例えば、特許文献１及び４）。このように分割されたルシフェラーゼのＮ末端側断片及びＣ末端側断片は、総称して「スプリットルシフェラーゼ」とも呼ばれている。ここで、本発明に関して用いられる「結合」という用語は、特に限定されず、共有結合であっても、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、疎水結合のような非共有結合でもあってもよい。２つ以上の「結合」対象物が、互いに「接近」、「接触」、「会合」又は「相互作用」する状態も含まれ得る。具体的には、該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片との「結合」は、特に限定されず、共有結合であっても、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、疎水結合のような非共有結合でもあってもよい。該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片との「結合」の態様は、ルシフェラーゼの機能を果たし得る程度に「接近」、「接触」、「会合」又は「相互作用」する態様も含まれ得る。ただし、該Ｎ末端側断片と該Ｃ末端側断片とがリンカーペプチドを介する連結のみ有する態様は含まれない。
【００３１】
本発明において、ホタルとは、節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科に属する昆虫を意味する。
本発明に用いることができるホタルルシフェラーゼが由来するホタルの種類としては、特に限定されず、例えば、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  Ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）、シブイロヒゲボタル（Ｓｔｅｎｏｃｌａｄｉｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｎｎｉｓ）、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）、ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  Ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、東ヨーロッパ産ホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、ツチボタル（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）等が挙げられる。中でも、オキナワマドボタル、クメジマミナミボタル、シブロイヒゲボタルが好ましい。
【００３２】
ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、一般に、由来するボタルの種類に固有であるため、由来するホタルの種類によって異なり得る。互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するようにＮ末端側断片とＣ末端側断片とに２分割される「分割位置」は、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる位置であれば、特に限定されず、また、ホタルルシフェラーゼの種類が由来するホタルの種類によっても異なり得る。当業者であれば、本技術分野における公知の方法を用いて、ホタルルシフェラーゼにおける前記分割位置を決定することができる。また、公知の分割位置の情報を利用することもできる。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれる「Ｎ末端側断片」及び「Ｃ末端側断片」のアミノ酸配列も、ホタルルシフェラーゼが由来するホタルの種類によって異なり得る。
【００３３】
本発明の分割型組換えタンパク質に含まれる「Ｎ末端側断片」は、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側の断片であり、該ホタルルシフェラーゼをコードするアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から前記「分割位置」に隣接するＮ末端側のアミノ酸までのアミノ酸配列を有する。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれる「Ｃ末端側断片」は、Ｎ末端側断片のホタルルシフェラーゼが由来するホタルと異なる種類のホタル由来のホタルルシフェラーゼに由来する。該「Ｃ末端側断片」は、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５３個〜７８個のアミノ酸を保持するＣ末端側断片である。これら「Ｎ末端側断片」及び「Ｃ末端側断片」は、野生型のホタルルシフェラーゼに由来するものでもよく、また、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復できる限りにおいて、１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加といった変異を有してもよい。
【００３４】
例えば、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）由来の野生型ホタルルシフェラーゼは、配列番号１の塩基配列でコードされた５６２個のアミノ酸からなり、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一例として、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように、１番目〜４１６番目のアミノ酸を有するＮ末端側断片（配列番号３）と４１７番目〜５６２番目のアミノ酸を有するＣ末端側断片（配列番号４）とに２分割することができる。よって、本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるオキナワマドボタル由来の「Ｎ末端側断片」は、オキナワマドボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの１番目から４１６番目までのアミノ酸配列を有し得る。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるオキナワマドボタル由来の「Ｃ末端側断片」は、オキナワマドボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの３３９番目〜３５９番目のアミノ酸から始まって５６２番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列を有し得る。
【００３５】
クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  Ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）由来の野生型ホタルルシフェラーゼは、配列番号５の塩基配列でコードされた５４７個のアミノ酸からなり、配列番号６のアミノ酸配列を有する。一例として、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように、１番目〜４１６番目のアミノ酸配列を有するＮ末端側断片（配列番号７）と４１７番目〜５４７番目のアミノ酸配列を有するＣ末端側断片（配列番号８）とに２分割することができる。よって、本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるクメジマミナミボタル由来の「Ｎ末端側断片」は、クメジマミナミボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの１番目から４１６番目までのアミノ酸配列を有し得る。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるクメジマミナミボタル由来の「Ｃ末端側断片」は、クメジマミナミボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの３３９番目〜３５９番目のアミノ酸から始まって５４７番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列を有し得る。
【００３６】
シブイロヒゲボタル（Ｓｔｅｎｏｃｌａｄｉｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｎｎｉｓ）由来の野生型ホタルルシフェラーゼは、配列番号９の塩基配列でコードされた５５５個のアミノ酸からなり、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。一例として、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように、１番目〜４２４番目のアミノ酸（配列番号１１）を有するＮ末端側断片と４２５番目〜５５５番目のアミノ酸（配列番号１２）を有するＣ末端側断片とに２分割することができる。よって、本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるシブイロヒゲボタル由来の「Ｎ末端側断片」は、シブイロヒゲボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの１番目から４２４番目までのアミノ酸配列を有し得る。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれるシブイロヒゲボタル由来の「Ｃ末端側断片」は、シブイロヒゲボタルの野生型ホタルルシフェラーゼの３４７番目〜３６７番目のアミノ酸から始まって５５５番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列を有し得る。
【００３７】
北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来の野生型ホタルルシフェラーゼは、５５０個のアミノ酸からなる。一例として、互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように、１番目〜４１６番目のアミノ酸を有するＮ末端側断片と４１７番目〜５５０番目のアミノ酸を有するＣ末端側断片とに２分割することができる。よって、本発明の分割型組換えタンパク質に含まれる北アメリカ産ホタル由来の「Ｎ末端側断片」は、北アメリカ産ホタルの野生型ホタルルシフェラーゼの１番目から４１６番目までのアミノ酸配列を有し得る。本発明の分割型組換えタンパク質に含まれる北アメリカ産ホタル由来の「Ｃ末端側断片」は、北アメリカ産ホタルの野生型ホタルルシフェラーゼの３３９番目〜３６４番目のアミノ酸から始まって５５０番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列を有し得る。
【００３８】
本発明の分割型組換えタンパク質は、「Ｎ末端側断片」と「Ｃ末端側断片」とが互いに「結合」することによってタンパク質を再構成すると、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、数倍以上の発光強度のホタルルシフェラーゼ活性を回復することができる。Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片は、同種のホタルのホタルルシフェラーゼに由来してもよく、別種のホタルのホタルルシフェラーゼに由来してもよい。Ｎ末端側断片のホタルルシフェラーゼが由来するホタルとＣ末端側断片のホタルルシフェラーゼが由来するホタルとの組み合わせは、特に限定されないが、オキナワマドボタル、クメジマミナミボタル及びシブロイヒゲボタルからなる群より選択されることが好ましい。また、Ｎ末端側断片が由来するホタルの種類は、特に限定されないが、オキナワマドボタルであることが好ましい。
【００３９】
また、回復したホタルルシフェラーゼ活性は、Ｎ末端側断片のホタルルシフェラーゼ及びＣ末端側断片のホタルルシフェラーゼが由来するホタルの種類、Ｃ末端側断片が保持するＮ末端側のアミノ酸の数、又はそれらの組み合わせによって、様々な発光色、すなわち、異なるピーク波長を有する発光を呈示する。その具体例は、実施例の実験３で示されている（図４）。
【００４０】
本発明の分割型組換えタンパク質は、本発明のＮ末端側断片及びＣ末端側断片以外に、リンカーペプチドを含む。該リンカーペプチドは、本発明のＮ末端側断片及びＣ末端側断片を、又は、本発明のＮ末端側断片又はＣ末端側断片と、何らかの機能を有する他のタンパク質、ポリペプチド又はそれらの断片とを、それらの機能を損なうことなく連結できるものであれば、リンカーペプチドを構成するアミノ酸の数及び種類において、特に限定されない。本発明において、分割型とは、「Ｎ末端側断片」及び「Ｃ末端側断片」が、それぞれ単独ではホタルルシフェラーゼ活性を示さないが、互いに結合してタンパク質を再構成することにより、ホタルルシフェラーゼ活性を回復することができることを意味する。
【００４１】
本発明の分割型組換えタンパク質において、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片は、それぞれ、ホタルルシフェラーゼにおける本来の配置をとってもよい、すなわち、Ｎ末端側断片がＣ末端側断片のＮ末端側に位置していてもよい。あるいは、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片が、ホタルルシフェラーゼにおける本来の配置から円順列置換した配置、すなわち、Ｎ末端側断片がＣ末端側断片のＣ末端側に位置していてもよい。
【００４２】
本発明の分割型組換えタンパク質は、本発明のＮ末端側断片、Ｃ末端側断片、リンカーペプチドの他に、何らかの機能を有する１つ以上のタンパク質、ポリペプチド又はそれらの断片を含むこともできる。そのようなタンパク質は、一般に、融合タンパク質とも呼ばれる。本発明において、それら他のタンパク質、ポリペプチド又はそれらの断片であるペプチド部分を「領域」とも称する。そのような機能を有する領域の一例としては、特に限定されないが、カルシウム結合領域、サイクリックＡＭＰ結合領域、サイクリックＧＭＰ結合領域、それらに対する相互作用領域などが挙げられる。それらの領域は、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片との間に配置されるのが好ましい。
【００４３】
一例として、カルシウム結合領域と、カルシウム結合領域と相互作用することができる相互作用領域とを含む、分割型組み換えタンパク質について説明する。ここで、カルシウム結合領域とは、細胞内にてカルシウムイオン（Ｃａ２＋）と可逆的に結合及び解離できるペプチド部分を意味する。カルシウム結合領域と相互作用することができる相互作用領域とは、細胞内においてカルシウム結合領域と可逆的に結合及び解離できるペプチド部分を意味する。カルシウム結合領域としては、例えば、カルモジュリン（ＣａＭ）又はその断片が挙げられる。前記相互作用領域は、カルシウムイオンと結合したカルシウム結合領域と結合することができ、カルシウムイオンが解離したカルシウム結合領域から解離することができる。カルシウム結合領域と相互作用することができる相互作用領域としては、例えば、Ｍ１３ペプチドが挙げられる。カルシウム結合領域及び相互作用領域を含む分割型組換えタンパク質は、例えば、細胞内で発現させることによって、細胞内におけるカルシウムイオン動態を解析することができる。
【００４４】
カルシウム結合領域及び相互作用領域として、それぞれ、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）及びカルシウムイオンと結合したカルモジュリンと結合するＭ１３とが一連に繋がったペプチドを使用することができる（非特許文献１）。非特許文献１では、この一連に繋がった連結化ペプチドを用いて、ＣａＭ及びＭ１３が２種の蛍光タンパク質に挟まれた構造を有するカルシウムセンサータンパク質を作製しており、この蛍光センサータンパク質を「カメレオンタンパク質」（以下、カメレオンとも称する）と呼んでいる。特に、カルシウム結合領域及び相互作用領域として、カメレオンの２３０番目から４０６番目のアミノ酸配列に対応するペプチド、２３０番目から３９６番目に対応するペプチド、２３０番目から４０１番目に対応するペプチド、２３０番目から４１１番目に対応するペプチド又は２３０番目から４１６番目に対応するペプチドを使用することができる。これらの具体的な配列が示されたペプチドは、それらの機能を失わない限り、例えば感度の改良のための変異を含んだものであっても、本発明の分割型組換えタンパク質に使用することができる。
【００４５】
＜遺伝子＞
本発明は、分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子、Ｎ末端側断片をコードする遺伝子、及びＣ末端側断片をコードする遺伝子にも関する。本発明において、タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの断片をコードする「遺伝子」は、ＤＮＡ鎖であってもＲＮＡ鎖であってもよく、細胞内などにおいて、該タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの断片を発現することができる塩基配列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖を意味する。該ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖は、該タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの断片のアミノ酸配列をコードする塩基配列のみで構成されていてもよく、又は、前記塩基配列に加えて、該タンパク質の機能及び発現を損なわない限りにおいて、付加的な塩基配列を有していてもよい。それら塩基配列は、該タンパク質の機能及び発現を損なわない限りにおいて、１個以上の塩基配列の置換、欠失又は付加といった変異を有していてもよい。
【００４６】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、分割型組換えタンパク質、Ｎ末端側断片、又はＣ末端側断片が発現可能な態様で、該分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子、該Ｎ末端側断片をコードする遺伝子、又は該Ｃ末端側断片をコードする遺伝子を含む、発現ベクターである。本発明において、発現ベクターとは、発現対象遺伝子（分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子、Ｎ末端側断片をコードする遺伝子、Ｃ末端側断片をコードする遺伝子、目的遺伝子など）が発現可能にベクターに連結されていることを意味する。例えば、発現ベクター内において、分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子、Ｎ末端側断片をコードする遺伝子、及びＣ末端側断片をコードする遺伝子が、プロモーター遺伝子領域の下流に、発現可能に連結されている。使用できるベクターの種類は、特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドなどが挙げられる。当業者であれば、技術常識に照らして、クローニングサイト、プロモーター遺伝子、発現対象物（分割型組換えタンパク質、Ｎ末端側断片、Ｃ末端側断片）、発現細胞などの諸条件に基づき、適切なベクターを選択し、常法に従って、所望する発現ベクターを構築することができる。プロモーター遺伝子も、研究目的などに応じて、適宜選択することができる。プロモーター遺伝子は、構成性プロモーター遺伝子、誘導性プロモーター遺伝子、組織特異性プロモーター遺伝子であってもよい。
【００４７】
＜ベクターセット＞
本発明の別の一実施形態は、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割されたホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片をコードする遺伝子が、一方のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
互いに結合することによりホタルルシフェラーゼ活性が回復するように２分割できる分割位置からＮ末端側の５８個〜７８個のアミノ酸を保持するホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片をコードする遺伝子が、別のプロモーター遺伝子と発現可能に連結されているベクターと、
を含むベクターセットである。
【００４８】
このベクターセットにおいて、前記Ｎ末端側断片及び前記Ｃ末端側断片は、同種のホタルのホタルルシフェラーゼに由来するものでもよく、互いに異なる種類のホタルのホタルルシフェラーゼに由来するものでもよい。前記ベクターセットは、別のプロモーター遺伝子に別のＮ末端側断片又はＣ末端側断片を発現可能に連結した別のベクターを更に含んでもよい。また、前記ベクターセットを、Ｎ末端側断片、Ｃ末端側断片又はプロモーター遺伝子のうちの少なくとも一つが異なる別のベクターセットと組み合わせて使用することもできる。このようなベクターセットは、技術常識に照らし、研究目的や諸条件に基づいて、常法によって、適宜構築することができる。ベクターセットに用いられるプロモーター遺伝子の一方を、誘導性プロモーター遺伝子とすることもできる。このようなベクターセットは、例えば、下記で説明する細胞内遺伝子発現の解析方法に使用することができる。
【００４９】
＜細胞＞
本発明の細胞は、本発明のベクター、すなわち、プロモーター遺伝子と、分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子、Ｎ末端側断片をコードする遺伝子、又はＣ末端側断片をコードする遺伝子とが発現可能に連結されているベクター、又は上述のベクターセットを含む。本発明の細胞は、発現ベクターの発現対象物を発現できるものであればよく、動物細胞であっても植物細胞であってもよい。使用できる細胞の由来は、特に限定されず、研究目的などに応じて、適宜選択することができる。前記発現ベクターを細胞内に導入する方法は、特に限定されず、例えば、トランスフェクション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージング、凍結融解法、エレクトロポレーションなどが挙げられるが、使用するベクター及び細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００５０】
＜解析方法＞
本発明の分割型組換えタンパク質の再構成によるホタルルシフェラーゼ活性の回復現象は、様々な解析方法に用いることができる。例えば、強い発光強度を指標とすることができ且つ様々な発光色を利用できるため、生細胞内における、カルシウムイオン動態、目的とする遺伝子やプロモーターの遺伝子発現、タンパク質相互作用、受容体相互作用などを、高精度で、１細胞ごとに、又は複数の細胞若しくは遺伝子を比較して、解析することができる。よって、本発明の解析方法は、外来遺伝子の発現が弱い細胞におけるイメージング、１細胞イメージング、高速イメージング、多色イメージングなどに用いることができる。
以下で、解析方法の実施形態の一例について説明する。
【００５１】
＜細胞内カルシウムイオンの解析方法＞
本発明の一実施形態は、
プロモーター遺伝子と、該プロモーター遺伝子に発現可能に連結された分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を測定する工程と、
該測定した発光量に基づき、該細胞内におけるカルシウムイオン濃度を解析する工程と、を含む細胞内カルシウムイオンの解析方法である。ここで、前記分割型組換えタンパク質は、カルシウム結合領域と、カルシウム結合領域と相互作用する相互作用領域とを含む。本明細書において、この分割型組換えタンパク質を、発光カルシウムインジケータとも称する。
【００５２】
前記細胞を作製する工程において、研究目的や諸条件に応じて適切に構築された前記発現ベクターを、上述するように、研究目的や諸条件に応じて適切に選択された細胞に導入すればよい。このようにして作製した細胞内では、発光カルシウムインジケータが発現される。プロモーター遺伝子が構成性プロモーター遺伝子である場合には、誘導物質の添加といった刺激なしに、発光カルシウムインジケータが発現される。プロモーター遺伝子が誘導性プロモーター遺伝子である場合には、誘導物質の添加といった刺激の存在下で、発光カルシウムインジケータが発現される。プロモーター遺伝子が組織特異的プロモーター遺伝子である場合には、特定組織由来の細胞内においてのみ、発光カルシウムインジケータが発現される。
【００５３】
作製した細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程において、細胞外からホタルルシフェリンを添加すると、ホタルルシフェリンは、細胞膜を透過して細胞内に侵入することができる。ホタルルシフェリンの存在下、発光カルシウムインジケータは、カルシウムイオンの存在に応じて、ホタルルシフェラーゼ活性を回復又は喪失することができる。発光カルシウムインジケータがタンパク質全体としてどのような立体構造をとるかによって、カルシウムイオンが存在する場合にホタルルシフェラーゼ活性を回復するか喪失するかが決定される。
【００５４】
一例として、Ｎ末端側から順に、Ｃ末端側断片、カメレオンのＣａＭ−Ｍ１３断片（２３０番目から４０６番目）、及びＮ末端側断片が配置された発光カルシウムインジケータについて説明する。カルシウムイオンが存在していない場合、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片とは適度に接近して結合しホタルルシフェラーゼ活性を回復し、発光する。一方、カルシウムイオンが存在すると、カルシウム結合領域（ＣａＭ）にカルシウムイオンが結合し、さらにそこへ相互作用領域（Ｍ１３）が結合することで、前記発光カルシウムインジケータのタンパク質全体としての構造が変化してホタルルシフェラーゼ活性を喪失し、発光しなくなる。このような機構に基づいて、細胞内のカルシウムイオン濃度は、ホタルルシフェラーゼによる発光量に反映される。
【００５５】
該測定した発光量に基づき、該細胞内におけるカルシウムイオン濃度を解析することができる。発光量を経時的に測定することにより、発光量の変動を指標として、細胞内のカルシウムイオン濃度の変動を解析することができる。発光量の測定及びそれに基づく解析を行う装置類、解析ソフトなどは、特に限定されず、一般的なものを使用することができる。測定は、撮像によって行ってもよい。そのような装置としては、例えば、ルミノメーター、発光顕微鏡、発光イメージャー、発光検出装置などが挙げられる。
【００５６】
＜細胞内遺伝子発現の解析方法＞
本発明の別の一実施形態は、
目的遺伝子と分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
該細胞における発光量を測定する工程と、
該発光量に基づき、該細胞内における該目的遺伝子の発現量を解析する工程と、を含む細胞内遺伝子発現の解析方法である。
【００５７】
前記細胞を作製する工程において、研究目的や諸条件に応じて適切に構築された前記発現ベクターを、上述するように、研究目的や諸条件に応じて適切に選択された細胞に導入すればよい。目的遺伝子は、プロモーター遺伝子であってもよい。このようにして作製した細胞内では、目的遺伝子及び分割型組換えタンパク質が発現される。目的遺伝子は、分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子に含まれていてもよい。プロモーター遺伝子が構成性プロモーター遺伝子である場合には、誘導物質の添加といった刺激なしに、目的遺伝子及び分割型組換えタンパク質が発現される。プロモーター遺伝子が誘導性プロモーター遺伝子である場合には、誘導物質の添加といった刺激の存在下で、目的遺伝子及び分割型組換えタンパク質が発現される。プロモーター遺伝子が組織特異的プロモーター遺伝子である場合には、特定組織由来の細胞内においてのみ、目的遺伝子及び分割型組換えタンパク質が発現される。
【００５８】
作製した細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程において、細胞外からホタルルシフェリンを添加すると、ホタルルシフェリンは、細胞膜を透過して細胞内に侵入することができる。ホタルルシフェリンの存在下、目的遺伝子及び分割型組換えタンパク質が発現していれば、分割型組換えタンパク質がホタルルシフェラーゼ活性を回復して、発光が測定される。
【００５９】
該測定した発光量に基づき、該細胞内における目的遺伝子の発現量を解析することができる。発光量を経時的に測定することにより、発光量の変動を指標として、細胞内の目的遺伝子発現量の変動を解析することができる。発光量の測定及びそれに基づく解析を行う装置類、解析ソフトなどは、特に限定されず、上述の細胞内カルシウムイオンの解析方法に使用できるものを用いることができる。
【００６０】
上述する解析法において、互いに異なる発光色を有する前記分割型組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む２以上の発現ベクターを使用することができる。それら２以上の発現ベクターをそれぞれ別々の細胞内に導入することにより、導入した発現ベクターが発現する分割型組換えタンパク質に固有の発色光を測定することによって、細胞間で細胞内カルシウムイオン濃度や細胞内遺伝子発現量を比較することができる。また、それら２以上の発現ベクターを１細胞内に導入することにより、細胞内において、細胞内カルシウムイオン濃度や細胞内遺伝子発現量を比較することができる。
【００６１】
＜ベクターセットを用いた細胞内遺伝子発現の解析方法＞
本発明の別の実施形態は、
いずれか一方の前記プロモーター遺伝子が誘導性プロモーター遺伝子である前記ベクターセットを含む細胞を作製する工程と、
該細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程と、
前記誘導性プロモーター遺伝子を刺激する誘導物質を添加する工程と、
該細胞における発光量を経時的に測定する工程と、
該発光量の変動に基づき、該細胞内における該プロモーター遺伝子の活性の変動を解析する工程と、を含む細胞内遺伝子発現の解析方法である。
【００６２】
前記細胞を作製する工程において、研究目的や諸条件に応じて適切に構築された前記発現ベクターを、上述するように、研究目的や諸条件に応じて適切に選択された細胞に導入すればよい。このようにして作製した細胞内では、このようにして作製した細胞内では、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが別々のプロモーター遺伝子の制御下で別々に発現される。構成性プロモーター遺伝子に連結された断片は、誘導物質の添加といった刺激なしに発現される。一方、誘導性プロモーター遺伝子に連結された断片は、誘導物質の添加といった刺激の存在下で、Ｎ末端側断片又はＣ末端側断片が発現される。プロモーター遺伝子が組織特異的プロモーター遺伝子である場合には、特定組織由来の細胞内においてのみ、Ｎ末端側断片又はＣ末端側断片が発現される。
【００６３】
作製した細胞に、該細胞外からホタルルシフェリンを添加する工程において、細胞外からホタルルシフェリンを添加すると、ホタルルシフェリンは、細胞膜を透過して細胞内に侵入することができる。ホタルルシフェリンの存在下、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片の両方が発現していれば、分割型組換えタンパク質を再構成して、ホタルルシフェラーゼ活性を回復することができ、発光が測定される。前記解析方法では、一方のプロモーター遺伝子が誘導性プロモーター遺伝子であるため、誘導性プロモーター遺伝子によって制御されるいずれか一方の分割型組換えタンパク質断片は、誘導性プロモーター遺伝子を刺激する誘導物質の存在下でのみ、発現される。
【００６４】
よって、前記解析方法は、誘導性プロモーター遺伝子を刺激する誘導物質を添加する工程を含む。適切な誘導物質が添加されると、誘導性プロモーター遺伝子が刺激されて発現し、その制御下の分割型組換えタンパク質断片が発現される。その結果、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片の両方が細胞内に存在することによって、分割型組換えタンパク質を再構成して、ホタルルシフェラーゼ活性を回復することができ、発光が測定される。誘導物質が、細胞内代謝などにより消失すると、誘導性プロモーター遺伝子の発現が停止し、その制御下の分割型組換えタンパク質断片の発現も停止する。
【００６５】
このようにして、測定した発光量に基づき、該細胞内における誘導性プロモーター遺伝子の発現量を解析することができる。発光量を経時的に測定することにより、発光量の変動を指標として、細胞内の誘導性プロモーター遺伝子の発現量の変動を解析することができる。発光量の測定及びそれに基づく解析を行う装置類、解析ソフトなどは、特に限定されず、上述の細胞内カルシウムイオンの解析法及び細胞内遺伝子発現の解析方法に使用できるものを用いることができる。
【００６６】
上述する解析法において、前記ベクターセットが、別のプロモーター遺伝子に別のＮ末端側断片又はＣ末端側断片を発現可能に連結した別のベクターを更に含んでもよい。また、前記ベクターセットを、Ｎ末端側断片、Ｃ末端側断片、プロモーター遺伝子のいずれか１つが異なる別のベクターセットと組み合わせて使用してもよい。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。また実施例において、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片が同種のホタルのホタルルシフェラーゼ由来であり、Ｎ末端側断片がＣ末端側断片のＣ末端側に配置された分割型組換えタンパク質を、置換型ホタルルシフェラーゼとも呼ぶ。また、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片が異なるホタルのホタルルシフェラーゼ由来であり、Ｎ末端側断片がＣ末端側断片のＣ末端側に配置された分割型組換えタンパク質を、異種置換型ホタルルシフェラーゼとも呼ぶ。【００６８】
［前準備その１：置換型ホタルルシフェラーゼ作製用のホタルルシフェラーゼのＮ末側断片遺伝子とＣ末側断片遺伝子のクローニング］
［手順１］
オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ；以下、ＯＫＩとも表される）、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  Ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ；以下、ＫＵＭＥとも表される）、シブイロヒゲボタル（Ｓｔｅｎｏｃｌａｄｉｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｎｎｉｓ；以下、ＳｆＲＥとも表される）に由来する各ホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片（ＮＬｕｃ）遺伝子及びＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）遺伝子を作製するため、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを、以下に示す配列で調製した。【００６９】
＜ＯＫＩルシフェラーゼ断片作製用合成オリゴＤＮＡ＞
2016038750.tif 000003
2016038750.tif 000004
【００７０】
＜ＫＵＭＥルシフェラーゼ断片作製用合成オリゴＤＮＡ＞
2016038750.tif 000005
2016038750.tif 000006
【００７１】
＜ＳｆＲＥルシフェラーゼ断片作製用合成オリゴＤＮＡ＞
2016038750.tif 000007
2016038750.tif 000008
【００７２】
［手順２］（ホタルルシフェラーゼ断片のＰＣＲクローニング）
ＯＫＩ遺伝子を鋳型として、置換型ホタルルシフェラーゼ作製用のＮ末端側断片遺伝子（ＯＫＩ−Ｎ：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）、及び、アミノ酸数の異なるＣ末端側断片遺伝子（ＯＫＩ３９９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３９４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３８９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３８４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３７９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３７４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。：ＯＫＩ３６９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３６４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３５９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３５４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３４９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３４９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３４４：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３４４番目から５６２番目のアミノ酸を含む。；ＯＫＩ３３９：ＯＫＩ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３３９番目から５６２番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。【００７３】
また、ＫＵＭＥ遺伝子を鋳型として、置換型ホタルルシフェラーゼ作製用のＮ末端側断片遺伝子（ＫＵＭＥ−Ｎ：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）、及び、アミノ酸数の異なるＣ末端側断片遺伝子（ＫＵＭＥ３９９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３９４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３８９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３８４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３７９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３７４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３６９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３６４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３５９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３５４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３４９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３４９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３４４：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３４４番目から５４７番目のアミノ酸を含む。；ＫＵＭＥ３３９：ＫＵＭＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３３９番目から５４７番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。【００７４】
また、ＳｆＲＥ遺伝子を鋳型として、置換型ホタルルシフェラーゼ作製用のＮ末端側断片遺伝子（ＳｆＲＥ−Ｎ：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の１番目から４２４番目のアミノ酸を含む。）、及び、アミノ酸数の異なるＣ末端側断片遺伝子（ＳｆＲＥ４０７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の４０７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ４０２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の４０２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３９７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３９２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３９２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３８７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３８２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３８２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３７７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３７２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３７２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３６７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３６２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３６２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３５７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３５２：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３５２番目から５５５番目のアミノ酸を含む。；ＳｆＲＥ３４７：ＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ遺伝子の３４７番目から５５５番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。【００７５】
［前準備その２：置換型ホタルルシフェラーゼの大腸菌用発現プラスミドの作製］
［手順］
ＰＣＲで増幅させたＮ末端側断片遺伝子を大腸菌発現プラスミドであるｐＲＳＥＴ／Ａ（インビトロジェン社製）のＢｇＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、さらに同種のホタル由来のＣ末端側断片遺伝子をＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入して、置換型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の大腸菌発現用プラスミドを作製した。このプラスミドにおいては、Ｃ末端側断片遺伝子がＮ末端側断片遺伝子の５’側に配置されており、発現した置換型ホタルルシフェラーゼにおいては、Ｎ末端側断片がＣ末端側断片のＣ末端側に配置されており、Ｃ末端側断片がＮ末端側断片のＮ末端側に配置されている。【００７６】
［実験１：置換型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の活性測定］
［手順］
置換型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＥＴベクターをＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、３７℃で一晩培養した。培養液５０μＬに、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）５０μＬを加えて室温で５分間静置し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）を用いて、１０秒間の発光量を測定した。【００７７】
［実験１の結果］
作製した発現ベクターを大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））へトランスフォームして、ＬＢ中で一晩培養した。５０μＬの培養液に、等量のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏを加えて室温で５分間静置した。反応液の発光量は、ルミノメーターで１０秒間でのカウント値を用いた。対照には、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ由来の置換型ルシフェラーゼ（ＧＬ４）を用いた。ＧＬ４及びＯＫＩ由来の置換型ルシフェラーゼの活性を、ＧＬ４の活性を１として、図３に示した。図３の縦軸は、相対発光量を示す。置換型ルシフェラーゼの中で、ＯＫＩ由来の置換型ルシフェラーゼであるＯＫＩ３５９、ＯＫＩ３５４、ＯＫＩ３４９、ＯＫＩ３４４、ＯＫＩ３３９において高い発光活性を示すことが明らかになり、さらにＯＫＩ３４９、ＯＫＩ３４４、ＯＫＩ３３９がＧＬ４よりも高活性を示すことが明らかになった。ＫＵＭＥ又はＳｆＲＥ由来の置換型ルシフェラーゼでは、発光活性が見られなかった（図示せず）。【００７８】
［前準備その３：異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子の大腸菌用発現プラスミドの作製］
［手順］
ＰＣＲで増幅させたＯＫＩ由来のＮ末端側断片（ＯＫＩ−Ｎ）遺伝子を大腸菌発現プラスミドであるｐＲＳＥＴ／Ａ（インビトロジェン社製）のＢｇＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、さらにＫＵＭＥ又はＳｆＲＥ由来のＣ末端側断片遺伝子をＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入して、異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子の大腸菌発現用プラスミドを作製した。このプラスミドにおいては、ＫＵＭＥ又はＳｆＲＥ由来のＣ末端側断片遺伝子がＯＫＩ由来のＮ末端側断片遺伝子の５’側に配置されており、発現した置換型ホタルルシフェラーゼにおいては、ＯＫＩ由来のＮ末端側断片がＫＵＭＥ又はＳｆＲＥ由来のＣ末端側断片のＣ末端側に配置されており、ＫＵＭＥ又はＳｆＲＥ由来のＣ末端側断片がＯＫＩ由来のＮ末端側断片のＮ末端側に配置されている。【００７９】
［実験２：異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子の発光活性測定］
［手順］
異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＥＴベクターを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、ＬＢ中で３７℃にて一晩培養した。培養液５０μＬに、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）５０μＬを加えて室温で５分間静置し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）を用いて、１０秒間の発光量を測定した。【００８０】
［実験２の結果］
ＯＫＩのＮＬｕｃ遺伝子とＫＵＭＥ又はＳｆＲＥのＣＬｕｃ遺伝子をベクター上で組み合わせて、各ルシフェラーゼ由来の異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターを作製した。作製した異種置換型ルシフェラーゼ発現ベクターを大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））へトランスフォームして、ＬＢ中で一晩培養した。５０μＬの培養液に、等量のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏを加えて室温で５分間静置した。反応液の発光量は、ルミノメーターで１０秒間でのカウント値を用いた。対照として北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼＧＬ４由来の置換型ルシフェラーゼ（ＧＬ４）を用い、ＧＬ４の活性を１として図３に示した。図３の縦軸は、相対発光量を示す。ＫＵＭＥ及びＳｆＲＥ由来のＣＬｕｃ遺伝子とＯＫＩ由来のＮＬｕｃ遺伝子を用いた異種置換型ルシフェラーゼにおいても強い発光活性を示すことが明らかになった。【００８１】
［前準備その４：置換型ルシフェラーゼ遺伝子の動物細胞用発現プラスミドの作製］
［手順］
ｐＲＳＥＴに組み込まれた置換型ルシフェラーゼ遺伝子又は異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子をＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位で切断して精製し、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドを作製した。【００８２】
［実験３：大腸菌内及びＨＥＫ２９３細胞内での置換型ルシフェラーゼの発光波長測定］
［手順１］（大腸菌内の置換型ルシフェラーゼ遺伝子の発光波長測定）
置換型ルシフェラーゼ遺伝子又は異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＥＴベクターをＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、３７℃で一晩培養した。培養液１００μＬに、ルシフェリン１ｍＭを加えて室温で５分間静置し、ルミフルスペクトロキャプチャー（ＡＢ−１８５０：アトー社製）を用いて、発光波長を測定した。【００８３】
［手順２］（ＨＥＫ２９３細胞の培養）
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ及び１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。【００８４】
［手順３］（ルシフェラーゼ断片発現プラスミドのＨＥＫ２９３細胞への導入）
置換型ルシフェラーゼ遺伝子又は異種置換型ルシフェラーゼ遺伝子の動物細胞発現用プラスミドを、エレクトロポレーター（ネッパジーン社製スーパーエレクトロポレーターＮＥＰＡ２１）を用いてエレクトロポレーションを行い、ＨＥＫ２９３細胞へ導入した。遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞は、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【００８５】
［手順４］（ＨＥＫ２９３細胞内の置換型ルシフェラーゼの活性波長測定）
培地中にルシフェリン１ｍＭを加えて室温で５分間静置し、ルミフルスペクトロキャプチャー（ＡＢ−１８５０：アトー社製）を用いて、発光波長を測定した。【００８６】
［実験３の結果］
置換型ルシフェラーゼ及び異種置換型ルシフェラーゼの大腸菌内、及びＨＥＫ２９３細胞内での発光波長を測定して図４に示した。図４の縦軸は相対発光量であり、横軸は発光波長を示す。上側の図は、大腸菌内での発光波長を示し、下側の図は、ＨＥＫ２９３細胞内での発光波長を示す。それぞれの発光波長の極大は、ＯＫＩ−ＣとＯＫＩ−Ｎの置換型ルシフェラーゼが６０３ｎｍ（大腸菌）と６０３ｎｍ（ＨＥＫ２９３細胞）、ＫＵＭＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎの異種置換型ルシフェラーゼが５８３ｎｍ（大腸菌）と５６８ｎｍ（ＨＥＫ２９３細胞）、ＳｆＲＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎの異種置換型ルシフェラーゼが５６８ｎｍ（大腸菌）と５６８ｎｍ（ＨＥＫ２９３細胞）、ＧＬ４−ＣとＧＬ４−Ｎの置換型ルシフェラーゼが５８３ｎｍ（大腸菌）と６１２ｎｍ（ＨＥＫ２９３細胞）であった。これらの結果から、ＨＥＫ２９３細胞内ではＧＬ４ベースの置換型ルシフェラーゼに対して、ＯＫＩ、ＫＵＭＥ、ＳｆＲＥベースの置換型ルシフェラーゼでは、発光波長が青側に９〜４４ｎｍずれていることがわかった。さらに、ＯＫＩベースとＳｆＲＥベースの発光インジケータでは、発光波長が大腸菌とＨＥＫ２９３細胞において変わらなかったが、ＫＵＭＥベースの発光インジケータではＨＥＫ２９３細胞においてブルーシフトしており、ＧＬ４ベースの発光インジケータではＨＥＫ２９３細胞においてレッドシフトしていた。【００８７】
［前準備その５：ルシフェラーゼ断片遺伝子の動物細胞用発現プラスミドの作製］
［手順］
ｐＲＳＥＴに組み込まれたＯＫＩのＮ末端側断片遺伝子をＢｇＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位で切断して精製し、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドを作製した。また、ｐＲＳＥＴに組み込まれたＯＫＩのＣ末側断片遺伝子及びＫＵＭＥのＣ末側断片遺伝子及びＳｆＲＥのＣ末側断片遺伝子をＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位で切断して精製し、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドを作製した。【００８８】
［実験４：ＨＥＫ２９３細胞内でのルシフェラーゼ断片の再構成による発光の回復］
［手順１］（ルシフェラーゼ断片発現プラスミドのＨＥＫ２９３細胞への導入）
ＯＫＩのＮ末側断片発現用プラスミド及びＯＫＩのＣ末側断片発現用プラスミド、又はＯＫＩのＮ末側断片発現用プラスミド及びＫＵＭＥのＣ末側断片発現用プラスミド、又はＯＫＩのＮ末側断片発現用プラスミド及びＳｆＲＥのＣ末側断片発現用プラスミドを混合し、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社製）を用いてエレクトロポレーションを行ってＨＥＫ２９３細胞へ導入した。遺伝子導入の内部コントロールとして、ヒトＥＦ１αプロモーターに発現誘導されるレニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ）遺伝子を用いた。遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞は９６ウェルマルチフプレートに１×１０４個／ウェルの割合でまき、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【００８９】
［手順２］（ルシフェラーゼ断片を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性測定）
培地中にルシフェリン１ｍＭ（和光純薬社製）を加えて室温で１５分間静置し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）を用いて、１０秒間の発光量を測定した。次に、セレンテラジン１０μＭを加えて、４７０−４９０ｎｍのバンドパスフィルターを通して１０秒間の発光量を測定し、ウェル間の遺伝子導入効率による実験誤差を是正した。【００９０】
［実験４の結果］
ルシフェラーゼ断片を別々に発現させたときの生細胞内での発光強度を比較するため、ＨＥＫ２９３細胞にＯＫＩ−Ｎ遺伝子発現用プラスミド及びＯＫＩ−Ｃ遺伝子発現用プラスミド、又はＯＫＩ−Ｎ遺伝子発現用プラスミド及びＫＵＭＥ−Ｃ遺伝子発現用プラスミド、又はＯＫＩ−Ｎ遺伝子発現用プラスミド及びＳｆＲＥ−Ｃ遺伝子発現用プラスミドを導入し、ルシフェリン（終濃度１ｍＭ）を加えた後の発光強度を測定した。その結果を、図５に示す。図５の縦軸は、ＧＬ４の発光量を１として表示した相対発光量を示す。図５から分かるように、生細胞内においてＯＫＩ−ＮとＫＵＭＥ３５４の組合せを除く、全ての組合せにおいてＧＬ４ベースのルシフェラーゼ断片の組合せより発光強度が高かった。【００９１】
［前準備その６：ｃ−ｆｏｓプロモーターに誘導されるルシフェラーゼ断片発現ベクターの作製］
［手順１］
ｃ−ｆｏｓプロモーター領域のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを調整した。合成オリゴＤＮＡの配列を以下に示す。
（ｃ−ｆｏｓプロモーター領域作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
2016038750.tif 000009
【００９２】
［手順２］
ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｆｗ及びｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ヒトのｃ−ｆｏｓプロモーター領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした。【００９３】
［手順３］
ｃ−ｆｏｓプロモーターによってＯＫＩ−Ｎが発現誘導されるように構成された、ｃ−ｆｏｓプロモーター領域に発現可能に連結されたＯＫＩ−Ｎ遺伝子を含む発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）を次のように構築した。すなわち、ｐＧＬ４．１０中のＬｕｃ２遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＸｂａＩ部位で切り出し、あらかじめＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位で消化しておいたＯＫＩ−Ｎ遺伝子を挿入した。つぎに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングされたｃ−ｆｏｓプロモーター領域をＸｈｏＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位で消化し、ＯＫＩ−Ｎ遺伝子の上流に存在するＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入した。これにより、ｃ−ｆｏｓプロモーター誘導型ＯＫＩ−Ｎ遺伝子発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）を作製した。【００９４】
［実験５：ＨＥＫ２９３細胞でのフォルスコリン刺激によるｃ−ｆｏｓプロモーター活性変化のイメージング］
［手順１］
ＣＭＶプロモーターに発現誘導される第一のベクター（ｐＣＭＶ／ＯＫＩ３５９）及びｃ−ｆｏｓプロモーターに発現誘導される第２のベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）を、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社製）を用いてエレクトロポレーションを行い、ＨＥＫ２９３細胞へ導入した。遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞は、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【００９５】
［手順２］
一晩の培養後、培地を無血清のＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培養液（インビトロジェン社製）に交換し、４時間インキュベートした。その後、ルシフェリンを終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに１時間インキュベートした。【００９６】
［手順３］
細胞を含む培養ディッシュを発光顕微鏡（ＬＶ−２００；オリンパス社製）にセットした。撮像装置として、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ；Ａｎｄｏｒ社製）を用いて発光画像の取得を行った。取得した画像は、パーソナルコンピュータに取り込んだ。刺激として、ｃＡＭＰの合成促進剤であるフォルスコリン（終濃度５μＭ）で刺激を行った。刺激直後から、ＬＶ−２００によって発光画像を１０分おきに連続的に取得した。発光画像の解析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。【００９７】
［結果５］
ＣＭＶプロモーターによって発現誘導されるＣ末側ルシフェラーゼ断片遺伝子を含む第１の発現ベクター（ｐＣＭＶ／ＯＫＩ３５９又はｐＣＭＶ／ＫＵＭＥ３５９又はｐＣＭＶ／ＳｆＲＥ３５２）と、第２の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）とを導入したＨＥＫ２９３細胞において得られた発光画像を図６に示す。左図はフォルスコリン刺激前の発光画像を示し、右図はフォルスコリン刺激から６時間後の発光画像を示す。
また、取得した発光画像に基づいて、ＨＥＫ２９３細胞におけるフォルスコリン刺激に伴う一細胞のｃ−ｆｏｓプロモーター活性を表す発光強度の変化を解析した。この発光強度変化を図７に示す。図７において横軸は時間であり、縦軸は、相対的な発光強度を表す。図７における曲線は、細胞の発光強度変化を示す。
図７に示されるように、ＨＥＫ２９３細胞では、いずれのルシフェラーゼ断片の組合せを用いても、フォルスコリン刺激後直ちにｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇していく様子が観察された。【００９８】
［前準備その７：シナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーターに誘導されるルシフェラーゼ断片発現ベクターの作製］
［手順１］
ＳＹＮプロモーター領域のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを調整した。合成オリゴＤＮＡの配列を以下に示す。
（ＳＹＮプロモーター領域作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
2016038750.tif 000010
【００９９】
［手順２］
ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＮ＿ｐｒｏ＿Ｆｗ及びＳＹＮ＿ｐｒｏ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ヒトのＳＹＮプロモーター領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした。【０１００】
［手順３］
ＳＹＮプロモーターによってＯＫＩのＣ末端側断片（ＯＫＩ３５９）が発現誘導されるように構成された、ＳＹＮプロモーター領域に発現可能に連結されたＯＫＩ３５９遺伝子を含む発現ベクター（ｐＳＹＮ／ＯＫＩ３５９）を次のように構築した。すなわち、ｐＧＬ４．１０中のＬｕｃ２遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＸｂａＩ部位で切り出し、あらかじめＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位で消化しておいたＯＫＩ３５９遺伝子を挿入した。つぎに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングされたＳＹＮプロモーター領域をＸｈｏＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位で消化し、ＯＫＩ−Ｎ遺伝子の上流に存在するＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入した。これにより、ＳＹＮプロモーター誘導型ＯＫＩ３５９遺伝子発現ベクター（ｐＳＹＮ／ＯＫＩ３５９）を作製した。【０１０１】
［実験６：ラット脳スライス培養でのフォルスコリン刺激によるｃ−ｆｏｓプロモーター活性変化のイメージング］
複数種類の神経細胞が混在している試料として、ラットの海馬のスライス試料を用いた。すなわち、本測定では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに近い状態で、神経細胞のｃ−ｆｏｓプロモーター活性測定を行った。【０１０２】
［手順１］
まず、７−９日齢のＳＤラットから全脳を採取し、海馬を含む部位を、リニアスライサーＰｒｏ７（堂坂イーエム社製）を用いて４００μｍの厚さにスライスした。海馬スライスはミリセルカルチャーインサート（ミリポア社製）上に置いて、２５％の馬血清及び２５％のＨａｎｋ’ｓ液を含むＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地中にて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養開始から５−７日後にラット海馬切片の神経細胞に、エレクトロポレーション法により、第１の発現ベクター（ｐＳＹＮ／ＯＫＩ３５９）及び第２の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）を遺伝子導入した。遺伝子導入した切片サンプルを、２５％の馬血清及び２５％のＨａｎｋ’ｓ液を含むＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地中にて５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【０１０３】
［手順２］
一晩の培養後、培地を無血清のＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培養液（インビトロジェン社製）に交換し、４時間インキュベートした。その後、ルシフェリンを終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに１時間インキュベートした。【０１０４】
［手順３］
切片を含む培養ディッシュを発光顕微鏡（ＬＶ−２００；オリンパス社製）にセットした。撮像装置として、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ；Ａｎｄｏｒ社製）を用いて発光画像の取得を行った。取得した画像はパーソナルコンピュータに取り込んだ。刺激として、ｃＡＭＰの合成促進剤であるフォルスコリン（終濃度５μＭ）で刺激を行った。刺激直後から、ＬＶ−２００によって発光画像を１０分おきに連続的に取得した。発光画像の解析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。【０１０５】
［実験６の結果］
神経細胞特異的プロモーター（ＳＹＮプロモ−ター）によって発現誘導されるＣ末端側ルシフェラーゼ断片遺伝子を含む第１の発現ベクター（ｐＳＹＮ／ＯＫＩ３５９）と、第２の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＯＫＩ−Ｎ）とを導入した培養海馬切片において得られた発光画像を図８に示す。左図はフォルスコリン刺激前の発光画像を示し、右図はフォルスコリン刺激から８時間後の発光画像を示す。
また、取得した発光画像に基づいて、神経細胞におけるフォルスコリン刺激に伴う細胞毎のｃ−ｆｏｓプロモーター活性を表す発光強度の変化を解析した。この発光強度変化を図９に示す。図９において横軸は時間であり、縦軸は、相対的な発光強度を表す。図９における各曲線は、各細胞の発光強度変化を示す。
図９に示されるように、神経細胞では、フォルスコリン刺激後直ちにｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇していく細胞と、フォルスコリン刺激後６時間程たってからｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇していく細胞とが存在した。このように、神経細胞では、フォルスロリン刺激後のｃ−ｆｏｓプロモーター活性の経時変化について細胞間での差が大きかった。【０１０６】
［前準備その８：発光カルシウムインジケータの発現ベクターの作製］
［手順１］
カルモジュリン及びＭ１３のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
2016038750.tif 000011
【０１０７】
［手順２］（ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子のＰＣＲクローニング）
カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）及びカルモジュリンと可逆的に結合又は解離できるペプチド（Ｍ１３）を含む領域を、カメレオン遺伝子（ＹＣ２．１）（非特許文献１）のｃＤＮＡを鋳型とし、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより、ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４０６番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）を増幅した。【０１０８】
［手順３］（発光カルシウムインジケータ遺伝子の発現ベクターの作製）
ＰＣＲで増幅させたＣａＭ−Ｍ１３遺伝子をＸｈｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位で消化し、置換ルシフェラーゼ遺伝子又は異種置換ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＥＴのＸｈｏＩ部位とＢｇＩＩＩ部位の間に挿入し、発光カルシウムインジケータ遺伝子の大腸菌発現用ベクターを作製した。さらに、発光カルシウムインジケータ遺伝子をＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位で消化し、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、発光カルシウムインジケータの動物細胞用発現プラスミドを作製した。【０１０９】
［実験７：発光カルシウムインジケータの発光活性測定］
［手順１］（発光カルシウムインジケータ発現ベクターのＨＥＫ２９３細胞への導入）
発光カルシウムインジケータの発現ベクターを、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社製）を用いてエレクトロポレーションを行ってＨＥＫ２９３細胞へ導入した。遺伝子導入の内部コントロールとして、ヒトＥＦ１αプロモーターに誘導されるレニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ）を用いた。遺伝子導入を行ったＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルマルチプレートに１×１０４個／ウェルの割合で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【０１１０】
［手順２］（発光カルシウムインジケータを発現するＨＥＫ２９３細胞の発光活性測定）
培地中にルシフェリン１ｍＭ（和光純薬社製）を加えて室温で１５分間静置し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）を用いて、１０秒間の発光量を測定した。次に、セレンテラジン１０μＭを加えて、４７０−４９０ｎｍのバンドパスフィルターを通して１０秒間の発光量を測定し、ウェル間の遺伝子導入効率による実験誤差を是正した。【０１１１】
［実験７の結果］
哺乳類の生細胞内での発光強度を比較するため、ＨＥＫ２９３細胞に各発光カルシウムインジケータ遺伝子を導入し、ルシフェリン（終濃度１ｍＭ）を加えた後の発光強度を測定した。その結果を図１１に示す。縦軸は相対的な発光強度を示す。図１１から分かるように、生細胞内において、ｃｐＯＫＩ３４４−ＣａＭ、ｃｐＫＵＭＥ３３９−ＣａＭ、ｃｐＳｆＲＥ３５７−ＣａＭを除く全ての発光カルシウムインジケータがＧＬ４ベースのカルシウムインジケータ（ｃｐＧＬ４−ＣａＭ）より発光強度が高いことを見出した。【０１１２】
［実験８：発光カルシウムインジケータのカルシウムキャリブレーション］
［手順１］
発光カルシウムインジケータ遺伝子を含むｐＲＳＥＴベクターをＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（キアゲン社製）を用いて、Ｈｉｓタグ発現タンパクを精製した。【０１１３】
［手順２］
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製）を用いてタンパク質定量を行い、１μｇ／μＬとなるように希釈した。【０１１４】
［手順３］
希釈したルシフェラーゼ溶液５μＬ（タンパク質５μｇ）に、０μＭ、０．０１７μＭ、０．０３８μＭ、０．０６５μＭ、０．１０μＭ、０．１５μＭ、０．２３μＭ、０．３５μＭ、０．６０μＭ、１．３５μＭ、３．５０μＭのＣａ２＋バッファー溶液（Ｃａ２＋  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；インビトロゲン社製）を３５μＬ加えて室温で１５分静置した。【０１１５】
［手順４］
Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）４０μＬを加えて室温で１５分間静置し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）を用いて、室温で１０秒間の発光量を測定した。【０１１６】
［実験８の結果］
各発光カルシウムインジケータのカルシウムに対する感受性を調べるため、Ｃａ２＋  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｋｉｔを用いて溶液中のＣａ２＋濃度に対する発光活性への影響を調べた。その結果を図１２に示す。図１２の縦軸は相対的な発光強度であり、横軸はカルシウムイオン濃度である。図１２に示したようにいずれの発光カルシウムインジケータにおいても、Ｃａ２＋濃度の増加に応じて発光強度が低くなることが明らかになった。
また、発光カルシウムインジケータのＣａ２＋に対するＫｄ値は、２１２−２８８ｎＭであり、ｃｐＧＬ４−ＣａＭ（Ｋｄ＝１６５ｎＭ）のそれよりも若干親和性が低かった。しかし、これらは市販のＣａ２＋インジケータの中でも高親和性のものと同程度であり、作製した発光カルシウムインジケータは、細胞質のＣａ２＋濃度変化を捉えることができることを示している。さらに、ＫＵＭＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎ、又はＳｆＲＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎを含む発光カルシウムインジケータではカルシウム結合型と非結合型での発光強度の差が、ＧＬ４やＯＫＩのルシフェラーゼ断片からなる発光カルシウムインジケータと比較して大きいことが明らかになった（Ｃａ２＋非結合型：Ｃａ２＋結合型の発光強度の比が、ＫＵＭＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎを含む発光カルシウムインジケータでは１：０．１７、ＳｆＲＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎを含む発光カルシウムインジケータでは１：０．１６、ＯＫＩを含む発光カルシウムインジケータでは１：０．４２、ＧＬ４を含む発光カルシウムインジケータでは１：０．４８）。ＫＵＭＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎ、又はＳｆＲＥ−ＣとＯＫＩ−Ｎを含む発光カルシウムインジケータは、Ｃａ２＋濃度変化に伴ってより大きく発光強度を変化させうることが示された。【０１１７】
［実験９：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ刺激時の細胞内カルシウム変動の発光測定］
［手順１］
ＨＥＫ２９３細胞（１×１０６個）を遠心して集め、発光カルシウムインジケータの発現ベクターを、ＮＥＰＡ２１を用いて、エレクトロポレーションにより遺伝子導入した。遺伝子導入を行ったＨＥＫ２９３細胞は２４ウェルマルチフプレートに１×１０５個／ウェルの割合でまき、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【０１１８】
［手順２］
細胞をＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培地で２回リンスした後に、終濃度１ｍＭのＤ−ルシフェリンを含むＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培地を２００μＬ加えて１５分間静置した。【０１１９】
［手順３］
プレートをルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＩＩ：アトー社製）にセットし、ＡＴＰ（２００μＭ）刺激前後の発光強度を経時的に測定した。【０１２０】
［実験９の結果］
発光カルシウムインジケータをＨＥＫ２９３細胞へ遺伝子導入して一晩培養後、細胞をＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培地でリンスし、ルシフェリンを終濃度２ｍＭとなるようにＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｔ培地に添加して１５分静置後にルミノメーターで発光強度を測定した。ＡＴＰ（２００μＭ）刺激の前後での発光強度を経時的に測定して図１３に示すようにグラフにプロットした。図１３の縦軸は相対的な発光強度であり、横軸は時間である。
ＡＴＰ刺激により、全ての発光インジケータの発光強度が低下しており、細胞内カルシウムの濃度変化を発光強度の変化として捉えられることが明らかになった。また、ＫＵＭＥやＳｆＲＥ由来のルシフェラーゼ配列を含むインジケータでは、ＧＬ４由来のインジケータよりもカルシウム濃度変化に対する発光強度変化が大きいことが明らかになった。この結果は、図１２に示したカルシウムキャリブレーションのデータとよく合致している。【０１２１】
［実験１０：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ刺激時の発光カルシウムイメージング］
［手順１］（ＨＥＫ２９３細胞の培養）
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ社より入手し、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、及び、１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。【０１２２】
［手順２］（発光カルシウムインジケータ発現ベクターの導入）
培養したＨＥＫ２９３細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、発光カルシウムインジケータ発現用プラスミドを、ＮＥＰＡ２１を用いてエレクトロポレーションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【０１２３】
［手順３］（発光画像の撮像）
培地中にルシフェリン２ｍＭ（和光純薬社製）を加えて１時間静置してから、培養ディッシュを発光顕微鏡ＬＶ−２００（オリンパス社製）にセットし、１０秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は５秒、ビニングは１×１とした。ＣＣＤカメラとしてＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用い、画像解析装置として構成したパーソナルコンピュータに発光画像を取り込んだ。【０１２４】
［実験１０の結果］
培地中にＡＴＰを添加した時の細胞内カルシウムの濃度変化に対する発光カルシウムインジケータの発光強度変化をイメージングした。ＥＭゲインは１０００に、露光時間は５秒間に設定することで一細胞レベルでの発光を観察することができた。発光画像は１０秒ごとにＰＣへ取り込んだ。図１４に示した画像は、左の画像が刺激前の画像、右の画像がＡＴＰ刺激後の画像である。その結果、図１４に示したように細胞の発光強度がＡＴＰ刺激により減少する様子が観察できた。また、個々の細胞の発光強度変化を継時的にグラフへプロットすると、図１４に示したようにＡＴＰ刺激による発光強度変化が一過的である様子も観察できた。図１４の縦軸は刺激前の発光強度を１としたときの相対的な発光強度であり、横軸は時間（分）である。これらの結果は、発光カルシウムインジケータが、細胞内のカルシウム濃度をモニターできていることを示している。【０１２５】
［前準備その９：５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子のクローニング］
［手順１］
ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の作製のために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
2016038750.tif 000012
【０１２６】
［手順２］（ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子のＰＣＲクローニング）
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ社製）を鋳型として、５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子（ヒトの５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。【０１２７】
［手順３］（ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の動物細胞発現用プラスミドの作製）
クローニングした遺伝子を哺乳類細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）へ組み込み、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを作製した。【０１２８】
［実験１１：ＨＥＫ２９３細胞でのカルシウム濃度変動の高速発光イメージング］
［手順１］（ＨＥＫ２９３細胞の培養）
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ社より入手し、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、及び、１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。【０１２９】
［手順２］（発光カルシウムインジケータ発現ベクターの導入）
手順１で培養した細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲ、及び発光カルシウムインジケータ発現用プラスミドを、ＮＥＰＡ２１を用いてエレクトロポレーションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【０１３０】
［手順３］（発光画像の撮像）
手順２の培養物の培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置してから、発光顕微鏡ＬＶ−２００（オリンパス社製）にセットし、５００ミリ秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は２００ミリ秒間、ビニングは２×２、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用いて発光画像をパーソナルコンピュータに取り込んだ。【０１３１】
［手順４］（セロトニン刺激による発光画像のタイムラプス撮像）
タイムラプス撮影開始から３０秒後、５ＨＴ（最終濃度１０μＭ）で刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。【０１３２】
［手順５］
手順３で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し、また、手順４で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩを指定した。次いで、指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の経時変化をグラフで表示した。発光画像の解析は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。【０１３３】
［実験１１の結果］
従来の発光カルシウムインジケータ（ｃｐＧＬ４−ＣａＭ）よりも発光強度が強くなったインジケータを用いて、受容体刺激時の細胞内カルシウムの速い濃度変化をとらえることができるがどうか検討を行った。ｃｐＳｆＲＥ５５−ＣａＭを、５ＨＴ２Ａ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞に導入し、ＬＶ−２００を用いて発光画像を取得したところ、ＥＭゲインは１０００に、露光時間を２００ミリ秒、ビニングを２×２に設定することで１細胞レベルでの発光を観察することができた。発光画像を５００ミリ秒ごとにＰＣへ取り込みながら、細胞を５ＨＴ（１０μＭ）で刺激した。結果を図１５に示す。図１５の右側のグラフの縦軸は、刺激前の発光強度を１としたときの相対的な発光強度であり、横軸は、時間（分）である。刺激前後の発光画像を解析すると、図１５に示したように一過性の発光強度減少を示す細胞のほかに、オシレーションを起こしている細胞をとらえることができた。この結果は、新規の発光カルシウムインジケータを用いることで、高速カルシウムイメージング（１秒以下の露光時間）にも適用できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の分割型組換えタンパク質、遺伝子、ベクター、細胞及びベクターセットは、細胞内におけるカルシウムイオン動態、遺伝子発現、タンパク質相互作用、受容体相互作用の解析方法に好適に使用することができる。本発明の解析方法は、外来遺伝子の発現が弱い細胞におけるイメージング、１細胞イメージング、高速イメージング、多色イメージングなどに好適に使用することができる。
［配列表］
2016038750.tif 000013
2016038750.tif 000014
2016038750.tif 000015
2016038750.tif 000016
2016038750.tif 000017
2016038750.tif 000018
2016038750.tif 000019
2016038750.tif 000020
2016038750.tif 000021
2016038750.tif 000022
2016038750.tif 000023
2016038750.tif 000024
2016038750.tif 000025
2016038750.tif 000026
2016038750.tif 000027
2016038750.tif 000028
2016038750.tif 000029
2016038750.tif 000030
2016038750.tif 000031
2016038750.tif 000032
2016038750.tif 000033
2016038750.tif 000034
2016038750.tif 000035
2016038750.tif 000036
2016038750.tif 000037
2016038750.tif 000038
2016038750.tif 000039
2016038750.tif 000040
2016038750.tif 000041
2016038750.tif 000042
2016038750.tif 000043
2016038750.tif 000044
【図１】
2016038750.tif 000045
【図２】
2016038750.tif 000046
【図３】
2016038750.tif 000047
【図４】
2016038750.tif 000048
【図５】
2016038750.tif 000049
【図６】
2016038750.tif 000050
【図７】
2016038750.tif 000051
【図８】
2016038750.tif 000052
【図９】
2016038750.tif 000053
【図１０】
2016038750.tif 000054
【図１１】
2016038750.tif 000055
【図１２】
2016038750.tif 000056
【図１３】
2016038750.tif 000057
【図１４】
2016038750.tif 000058
【図１５】
2016038750.tif 000059
【国際調査報告】
2016038750.tif 000060
2016038750.tif 000061
2016038750.tif 000062
2016038750.tif 000063