(57)【要約】【解決課題】  抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤を提供する。【解決手段】  ５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’からなる配列であるＣｐＧモチーフを２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアジュバンドであって，少なくとも２つのＣｐＧモチーフの３’側にホスホロチオエート結合された核酸塩基が接続され，５’末端及び３’末端は，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基であり，  前記オリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエート修飾されていない塩基を少なくともひとつ以上含むアジュバンド。配列番号６７で示されるオリゴヌクレオチドを含むアジュバンド。それらのアジュバンドを含む，抗アレルギー剤。【選択図】図１
2015108046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’からなる配列であるＣｐＧモチーフを２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアジュバンドであって，
前記ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧであり，
前記Ｘ１は，Ａ又はＴであり，
前記Ｘ２は，Ａ又はＴであり，
少なくとも２つのＣｐＧモチーフの３’側にホスホロチオエート結合された核酸塩基が接続され，
５’末端及び３’末端は，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基であり，
前記オリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエート修飾されていない塩基を少なくともひとつ以上含む，
アジュバンド。
【請求項２】
請求項１に記載のアジュバンドであって，
前記Ｘ１は，Ａであり，
前記Ｘ２は，Ｔであり，
前記ホスホロチオエート結合された核酸塩基は，ホスホロチオエート結合された第１のＳ化Ｔである，
アジュバンド。
【請求項３】
請求項２に記載のアジュバンドであって，
前記第１のＳ化Ｔの３’側にホスホロチオエート結合された第２のＳ化Ｔを含み，
５‘末端に隣接する塩基は，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基であり，
３’末端に隣接する塩基は，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基である，
アジュバンド。
【請求項４】
請求項１に記載のアジュバンドであって，
前記オリゴヌクレオチドは，配列番号４，５，９，１０，２０，２２，２３，２９，３０，３１，３９，５３，５４，５５，５９，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７４，７５，７６，７７,７８，８１又は８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである，
アジュバンド。
【請求項５】
請求項１に記載のアジュバンドであって，
前記オリゴヌクレオチドは，
以下式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド（配列番号６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）であるか，
式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドから１又は２個の塩基が欠失，置換，付加又は挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであって，抗アレルギー作用を有するオリゴヌクレオチドである，
アジュバンド。
ＴＳＰＣＳＰＧＡＣＧＴＴＳＰＴＳＰＴＳＰＧＡＣＧＴＴＳＰＴＳＰＴＳＰＧＡＣＧＳＰＴＳＰＴ  （式Ｉ）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアジュバンドを含む，抗アレルギー剤。
【請求項７】
請求項６に記載の抗アレルギー剤であって，アレルギー性鼻炎の治療剤である剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のアジュバンドを含み，
前記オリゴヌクレオチドを有効成分として含む，抗アレルギー剤。
【請求項９】
請求項８に記載の抗アレルギー剤であって，アレルギー性鼻炎の治療剤である剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤に関する。より詳しく説明すると，本発明は，ＰＳ構造とＰＯ構造とを有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むキラル核酸アジュバンドなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
特表２００２−５１３７６３号公報（特許文献１），特表２００２−５１４３９７号公報（特許文献２），及び特表２００２−５２１４８９号公報（特許文献３）には，ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びその製造方法が開示されている。【０００３】
特表２０１０−５０４７５０号公報（特許文献４）には，ＣｐＧモチーフの外側に親油性置換ヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドが，インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）産生を惹起する点が開示されている。【０００４】
下記非特許文献１には，三量体のＣｐＧオリゴヌクレオチドのＳ型立体異性体が，ＭＡＰＫシグナルを促進する旨が開示されている。【０００５】
下記非特許文献２には，全ての配列部分にホスホロチオエートが導入され，全ての配列部分がＳ型立体異性体であるＰＦ-３５１２６７６（配列番号１１９）が開示されている。天然のオリゴ核酸は生体内で容易に分解される。一方，オリゴ核酸のリン酸エステル結合（ＰＯ結合）をリン酸チオエステル結合（ＰＳ結合）に替えたＰＳ修飾体は，生体内で分解されにくいという特色を有する。【０００６】
下記非特許文献３は，ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ配列を有するオリゴヌクレオチド）がトル様受容体（ＴＬＲ９）を介してＴｈ１免疫経路を活性化することを開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは，Ａ−ｃｌａｓｓ〜Ｃ−ｃｌａｓｓの３種類に分類される。Ａ−ｃｌａｓｓに分類されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは，３’および５’-末端の１〜４塩基のリン酸結合部位がホスホロチオエート結合（ＰＳ結合）されており，強いＩＦＮ−α産生誘導能を示すものの，Ｂ細胞増殖に対する作用は弱い。Ｂ及びＣ−ｃｌａｓｓに分類されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは，全てのリン酸結合部位がＳ化されており，Ｂ細胞増殖作用は強いものの，ＩＦＮ−α産生能はそれほど強くない。なお，天然型のリン酸ジエステル結合（ＰＯ結合）を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドは，生体内で速やかに分解される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５１３７６３号公報
【特許文献２】特表２００２−５１４３９７号公報
【特許文献３】特表２００２−５２１４８９号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０４７５０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｕｔｈｕｒ  Ｍ．  Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＲＯＴＩＤＥＳ  １３：  ｐｐ．４９１−４９９（２００３）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.  ２００８  Ｊｕｌ  １５;１４(１４):４５３２-４２.
【非特許文献３】Ｋｒｉｅｇ,  ＡＭ.,  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  （２００７）１１７：１１８４-１１９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
例えば，非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドは，全ての配列にホスホロチオエートが導入される。このため，非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドは炎症を惹起する場合や，毒性反応を誘発する場合があるという問題があった。一方，非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート骨格修飾を除くと，ヌクレオチドの安定性が下がるという問題がある。さらに，天然型のＣｐＧオリゴヌクレオチドも，生体内で速やかに分解されるという問題がある。また，アジュバンドがアレルギー反応を抑制できれば様々な用途に応答できるほか，アジュバンドを抗アレルギー剤としても利用できる。【００１０】
そこで，本発明は，安定性に優れた抗アレルギー作用を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアジュバンドを提供することを目的とする。【００１１】
次に，本発明は，安定性に優れたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む抗アレルギー剤を提供することを目的とする。特に，本発明は，安定性に優れたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアレルギー性鼻炎の治療剤又はアレルギー性鼻炎の治療剤用のアジュバンドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は，基本的には，オリゴ核酸の立体構造を制御することにより，オリゴ核酸の生体内での安定性を高め，これにより全ての配列にＰＳ結合を導入しなくても，生体内で安定なオリゴヌクレオチドを提供できるという知見に基づく。このオリゴヌクレオチドは，全ての配列にはＰＳ結合修飾がなされていないため，生体親和性に優れる。そして，本発明のオリゴヌクレオチドは，後述する実施例で実証されたとおり，抗アレルギー作用をも有する。【００１３】
本発明の第１の側面は，アジュバンドに関する。このアジュバンドは，先に説明したとおり，生体親和性に優れ，しかも抗アレルギー作用を有する。本発明のアジュバンドが，上記の特質を有するため，本発明のアジュバンドは以下の特徴を有する。【００１４】
すなわち，本発明のアジュバンドは，５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’からなる配列であるＣｐＧモチーフを２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む。そして，上記したＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧである。Ｘ１は，Ａ又はＴであり，Ｘ２は，Ａ又はＴである。
上記のオリゴヌクレオチドは，少なくとも２つのＣｐＧモチーフの３’側にホスホロチオエート結合された核酸塩基が接続される。
そして，上記のオリゴヌクレオチドは，５’末端及び３’末端が，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基である。上記のオリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエート修飾されていない塩基を少なくともひとつ以上含む。ホスホロチオエート修飾されていない塩基は，上記したＣｐＧモチーフ以外の部分にも存在することが好ましい。【００１５】
本発明のアジュバンドの好ましい例は，Ｘ１がＡであり，Ｘ２がＴのものである。そして，ホスロチオエート結合された核酸塩基は，ホスホロチオエート結合された第１のＳ化Ｔである。すなわち，本発明のアジュバンドは，少なくとも２つのＣｐＧモチーフの３’側にホスホロチオエート結合された核酸塩基が接続される。その好ましい例は，５’−ＡＣｐＧＴ−３に隣接して，ＴＳＰ（ＴＳＰは，ホスホロチオエート結合が存在するＴ）が存在するものである。【００１６】
本発明のアジュバンドのさらに好ましい例は，第１のＳ化Ｔに隣接してさらに第２のＳ化Ｔが存在するもの（５’−ＡＣｐＧＴＴＳＰＴＳＰ−３）であり，さらに第２のＳ化Ｔに隣接して第３のＳ化Ｔが存在するもの（５’−ＡＣｐＧＴＴＳＰＴＳＰＴＳＰ−３）も好ましい。【００１７】
本発明のアジュバンドは，５‘末端に隣接する塩基が，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基であるものが好ましい。さらに，本発明のアジュバンドは，３’末端に隣接する塩基がホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基であるものが好ましい。【００１８】
本発明のアジュバンドの具体例は，オリゴヌクレオチドとして，配列番号４，５，９，１０，２０，２２，２３，２９，３０，３１，３９，５３，５４，５５，５９，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７４，７５，７６，７７,７８，８１又は８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むものである。【００１９】
すなわち，本発明のオリゴヌクレオチドは，以下のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。【００２０】
【表１】
2015108046.tif 000003
【００２１】
上記において＊は，硫黄原子によるリン酸骨格修飾による立体異性体を示す。上記の各配列における＊のうち少なくともひとつは，Ｓ型の立体配座を有するものである。【００２２】
本発明のアジュバンドは，配列番号４，５，９，１０，２０，２２，２３，２９，３０，３１，３９，５３，５４，５５，５９，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７４，７５，７６，７７,７８，８１又は８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから１又は２個の塩基が欠失，置換，付加又は挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであって，抗アレルギー作用を有するオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは，以下式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド（配列番号６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）が好ましい。もっとも，本発明の別の好ましいオリゴヌクレオチドは，式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドから１又は２個の塩基が欠失，置換，付加又は挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであって，抗アレルギー作用を有するオリゴヌクレオチドである。【００２４】
ＴＳＰＣＳＰＧＡＣＧＴＴＳＰＴＳＰＴＳＰＧＡＣＧＴＴＳＰＴＳＰＴＳＰＧＡＣＧＳＰＴＳＰＴ  （式Ｉ）【００２５】
式Ｉにおいて，ＳＰは，Ｓ型の立体配座を有する硫黄原子によるリン酸骨格修飾による立体異性体を示す。【００２６】
本発明の第２の側面は，抗アレルギー剤に関する。抗アレルギー剤は，アレルギー疾患の治療剤又は予防剤を意味する。本発明の抗アレルギー剤は，先に説明したいずれかのアジュバンドを含む。このような抗アレルギー剤は，抗アレルギー剤として公知の剤を有効成分として含んでもよい。その場合，アジュバンドも抗アレルギー作用を発揮するため，公知のアレルギー剤の効果を高めることができるし，公知のアレルギー剤によってアレルギー性疾患を改善できない患者に対しても，アレルギー疾患を改善できる場合がある。この抗アレルギー剤の好ましい例は，アレルギー性鼻炎の治療剤である。【００２７】
本発明の抗アレルギー剤は，先に説明した本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むものであってもよい。この場合，本発明の抗アレルギー剤は公知のアレルギー性疾患の治療剤と併用してもよいし，本発明のオリゴヌクレオチドのみを有効成分として含んでもよい。この場合も，抗アレルギー剤の好ましい例は，アレルギー性鼻炎の治療剤である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は，安定性に優れた抗アレルギー作用を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアジュバンドを提供できる。【００２９】
本発明は，安定性に優れたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む抗アレルギー剤を提供できる。本発明は，安定性に優れたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアレルギー性鼻炎を含むアレルギー性疾患の治療剤又はアレルギー性鼻炎を含むアレルギー性疾患の治療剤に用いられるアジュバンドを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は，ＯＶＡ誘発アレルギー性鼻炎モデルマウスのアレルギー症状に対するキラル核酸アジュバントの作用を示すグラフである。
【図２】図２は，ＯＶＡ誘発アレルギー性鼻炎モデルマウス血清中ＩｇＥ濃度に対するキラル核酸アジュバントの作用を示すグラフである。
【図３】図３は，マウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定を示すグラフである。
【図４】図４は，気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中白血球のカウントを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００３２】
本発明の第１の側面は，アジュバンドに関する。このアジュバンドは，先に説明したとおり，生体親和性に優れ，しかも抗アレルギー作用を有する。本発明のアジュバンドが，上記の特質を有するため，本発明のアジュバンドは以下の特徴を有する。本発明のアジュバンドは，抗アレルギー剤用のアジュバンドとして好ましく用いることができる。特に本発明のアジュバンドは，アレルギー性鼻炎の治療剤用のアジュバンドとして好ましく用いることができる。これらの場合，本発明のアジュバンドは，抗アレルギー剤の有効成分の機能を活性化または補助することで，より有効な抗アレルギー剤を提供できることとなる。
【００３３】
本発明のアジュバンドは，５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’からなる配列であるＣｐＧモチーフを２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む。そして，上記したＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧである。Ｘ１は，Ａ又はＴであり，Ｘ２は，Ａ又はＴである。上記のオリゴヌクレオチドは，少なくとも２つのＣｐＧモチーフの３’側にホスホロチオエート結合された核酸塩基が接続される。そして，上記のオリゴヌクレオチドは，５’末端及び３’末端が，ホスホロチオエート結合されたＳ型の核酸塩基である。上記のオリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエート修飾されていない塩基を少なくともひとつ以上含む。ホスホロチオエート修飾されていない塩基は，上記したＣｐＧモチーフ以外の部分にも存在することが好ましい。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は，複数のヌクレオチド（すなわち，ホスフェート基および置換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば，シトシン（Ｃ），チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））あるいは置換プリン（例えば，アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）に結合した糖（例えば，リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書において用いられるように，用語「オリゴヌクレオチド」は，オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）およびオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた，オリゴヌクレオシド（すなわち，ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含する。オリゴヌクレオチドは，既存の核酸源（例えば，ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得られ得るが，好ましくは合成である（例えば，オリゴヌクレオチド合成により産生される）。
【００３５】
ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを示す。Ｃは２’−デオキシシチジンである。Ｇは２’−デオキシグアノシンである。ｐはホスホジエステルからなるヌクレオシド間結合である。
【００３６】
このオリゴヌクレオチドは，５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’からなるＣｐＧモチーフ以外の部分にリン酸骨格修飾を有しても良い。一方，全てのヌクレオチド間のリン酸骨格がホスホロチオエート骨格修飾を有するものは先に説明した問題があるため，たとえば，リン酸骨格のうち２０％以上９５％以下において酸素原子が硫黄原子に置換されるものが好ましく，３０％以上９５％以下でも，２０％以上９０％以下でも，４０％以上９５％以下でも，４０％以上９０％以下でも，４０％以上８０％以下でも，５０％以上９５％以下でも，５０％以上９０％以下でも，５０％以上８０％以下でも，６０％以上９５％以下でもよい。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは，以下の配列のいずれかを含むか，以下のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
【表２】
2015108046.tif 000004
【００３９】
上記式中*は，リン酸骨格修飾による立体異性体を示す。上記式中  ５’−Ｘ１ＣｐＧＸ２−３’に対応する部位のＣＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを意味する。リン酸骨格修飾の例は，ホスホロチオエート骨格修飾，ホスホロジチオエート骨格修飾，又はホスホロアミデート骨格修飾である。これらの中では，ホスホロチオエート骨格修飾が好ましい。ホスホロチオエート骨格修飾は，隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個を硫黄原子に変換することを意味する。上記それぞれの式における少なくとも１つの*は，Ｓ型の立体異性体である。ここでＳ型とは，上記したとおり，酸素原子の替わりに導入された原子又は基を硫黄原子とした場合に，Ｓ型の立体配座を有するものを意味する。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは，上記したいずれかのものであって，ＣｐＧモチーフ以外の部分の少なくともひとつの部位に存在するリン酸骨格修飾は，ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドが好ましい。すなわち，先に説明したとおり，ＣｐＧ以外の部位においても，ホスホロチオエート骨格修飾を有するものが好ましい。この場合，先に説明したとおりＳ型の立体配座を有するものが好ましい。もっとも，本発明では，全ての配列間がホスホロチオエート骨格修飾されているのではなく，少なくとも１つ以上ホスホロチオエート骨格修飾が成されていない部分を有するものが好ましい。
【００４１】
ヌクレオチドの合成方法
ヌクレオチドの合成方法は公知である。よって，本発明のヌクレオチドは公知の方法に従って製造できる。本発明のヌクレオチドは，例えば特許４５８０８７０号，又は国際公開２０１０／０６４１４６号パンフレットに開示された方法を採用できる。
【００４２】
ヌクレオチドの合成の上記とは別の例は，特許４９４２６４６号公報に開示される方法や，米国特許第５９１２３３２号明細書に開示されている方法である。後者は，固体支持体付着リンカーをパラレル合成に使用するか，又は制御細孔ガラス（controlled  pore  glass）支持体に付着させたリン酸塩などの，汎用的な固体支持体を使用する。
【００４３】
また，ヌクレオチドは，例えば，特許４３８３５３４号公報に開示された方法により製造できる。例えば，β−シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９）；およびヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５１−４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４：５３９９−４０７；Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５５−８；Ｇａｆｆｎｅｙら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９：２６１９−２２）を使用して，新規に合成され得る。これらの化学物質は，市場において入手可能な種々の自動核酸合成機によって実施され得る。これらの核酸は，合成核酸と呼ばれる。あるいは，本発明の核酸を，プラスミド中にて大規模に生成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｔら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）。本発明の核酸は，そしてより小さい片へと分離され得るか，または全体として投与され得る。核酸は，公知技術（例えば，制限酵素，エキソヌクレアーゼ，またはエンドヌクレアーゼを使用する技術）を使用して，既存の核酸配列（例えば，ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列）から調製され得る。このようにして調製された核酸は，単離された核酸と呼ばれる。単離された核酸とは，一般的には，天然で通常関連している成分から分離された核酸を指す。例として，単離された核酸は，細胞から分離された核酸，核から分離された核酸，ミトコンドリアから分離された核酸，またはクロマチンから分離された核酸であり得る。本発明の組み合わせモチーフ核酸は，合成した組み合わせモチーフ核酸および単離された組み合わせモチーフ核酸の両方を包含する。
【００４４】
インビボでの用途の為に，この組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，必要に応じて，分解に対して比較的耐性を有する（例えば，安定化されている）ものが好ましい。「安定化された核酸分子」とは，インビボでの分解（例えば，エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）に対して比較的耐性である，核酸分子を意味する。核酸安定化は，リン酸骨格改変を介して達成され得る。本発明の好ましい安定化された核酸は，改変された骨格を有する。この核酸骨格の改変は，インビボで投与された場合のこの組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドの活性の増加を提供する。いくつかの場合，ホスホロチオエート結合を有する組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，最大の活性を提供し，そして細胞内エキソヌクレアーゼおよび細胞内エンドヌクレアーゼによる分解からその核酸を保護する。他の改変された核酸としては，改変されたホスホジエステル核酸，ホスホジエステル核酸とホスホロチオエート核酸の組み合わせ（すなわち，キメラ），メチルホスホネート，メチルホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，ｐ−エトキシ，およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４５】
改変された骨格（例えば，ホスホロチオエート）は，ホスホロアミデート化またはＨ−ホスホネート化のいずれかを使用する自動技術を使用して，合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは，例えば，米国特許第米国特許４，４６９，８６３号に記載されるようにして，生成され得る；そしてアルキルホスホトリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるように，荷電した酸素部分が，アルキル化されている）は，市販の試薬を使用して，自動固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格の改変および置換を行うための方法は，公開されている（例えば，Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ａ（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５を参照）。
【００４６】
合成により得られたオリゴヌクレオチドは，公知の方法により精製すればよい。例えば，逆相ＨＰＬＣにより精製し，脱保護し，脱塩し，透析する。このようにして，本発明のオリゴヌクレオチドを単離精製できる。
【００４７】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含む組成物をも提供する。この組成物は，医薬用組成物である。そして，この組成物は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを有効量含むとともに，公知の担体を適宜含んでも良い。担体は，水，アルコールといった溶媒であってもよい。また，担体は，任意の賦形剤，希釈剤，充てん剤，塩，緩衝剤，安定剤，可溶化剤，脂質，または医薬組成物への使用のために当該技術分野でよく知られているその他の物質であってもよい。
【００４８】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドをも提供する。ワクチンアジュバンドは，必要に応じて，薬学的に許容される担体を含んでも良い。特許第４１２６２５２号は，オリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドを開示する。本発明のオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドも，この公報に開示された要素を適宜含むことができる。
【００４９】
本発明の抗アレルギー作用に関するアレルギー疾患は，アナフィラキシーあるいはアナフィラキシー様反応，アレルギー性血管炎，肝炎，腎炎，鼻炎，関節炎，炎症性眼疾患（例えば，結膜炎等），炎症性腸疾患（例えば，好酸球性胃腸症等），脳・循環器系疾患，皮膚疾患（例えば，皮膚炎（例えば，アトピー性皮膚炎，接触皮膚炎，湿疹，蕁麻疹，掻痒症等）等），自己免疫性疾患（例えば，慢性関節リウマチ，全身性エリテマトーデス，糸球体腎炎，シェーグレン症候群等），移植臓器拒絶反応である。
【００５０】
アレルギー疾患は，Ｉ型〜ＩＶ型に分類することができる。
Ｉ型アレルギーの例は，アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支ぜん息、じんましん，アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、及びアナフィラキシーである。
ＩＩ型アレルギーの例は，自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、顆粒球減少症、新生児溶血性黄疸、悪性貧血、リウマチ熱、重症筋無力症、橋本病、及び円形脱毛症である。
ＩＩＩ型アレルギーの例は，血清病、過敏性肺炎、ループス腎炎（慢性糸球体腎炎）、全身性エリテマトーデス、急性糸球体腎炎、関節リウマチ、リウマチ性肺炎、多発性動脈炎、アレルギー性血管炎、及びシェーグレン症候群である。
ＩＶ型アレルギーの例は，接触皮膚炎、橋本病、ベーチェット病、臓器移植後の拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、及びギラン・バレー症候群である。
本発明の抗アレルギー作用の対象となるアレルギー疾患は，Ｉ型〜ＩＶ型の全てのアレルギーであるが，本発明は，特にＩ型アレルギーを抑えることができる。
【００５１】
後述する実施例により実証されたとおり，本発明のオリゴヌクレオチド及びそれを含むアジュバンドは，特にアレルギー性鼻炎の治療効果を有するため，アレルギー性鼻炎の治療剤や，アレルギー性鼻炎の治療剤用のアジュバンドとして有効である。
【００５２】
このオリゴヌクレオチドはまた，全身免疫応答および／または粘膜性免疫応答を誘導するためのアジュバントとしても有用である。本発明の組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，抗原に対する免疫応答の増強を誘導するように，抗原に曝露された被験体に送達され得る。従って，例えば，組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，ワクチンアジュバントとして有用である。アジュバンドが補助剤として機能する主剤の例は，各種のワクチンである。アジュバンドは，たとえば抗原が免疫細胞に取り込まれる効率を高めることができる。アジュバンドは，主剤の有効成分がもつ本来の作用を補助したり増強したり改良できるものが好ましい。対象となるワクチンの例はウィルス用ワクチン，Ｂ型肝炎，Ａ型肝炎，日本脳炎，小児用肺炎球菌，ジフテリア，百日せき，破傷風，はしか，風疹，おたふくかぜ，水疱瘡，結核(ＢＣＧワクチン）用のワクチンである。ウィルス用ワクチンの例は，インフルエンザワクチン，ポリオワクチン，ヒトパピローマウイルス用ワクチン，ロタウイルス用ワクチン，ヒブ用ワクチン，ポリオワクチン及びエイズワクチンである。本発明のオリゴヌクレオチドは極めて少量でアジュバンドとして機能する。このため本発明のオリゴヌクレオチドは，従来のアジュバンドに比べて細胞毒性が低く，副作用の怖れが極めて少ない。このことは多くの対象に投与されるワクチンにとっては極めて有益であるといえる。
【００５３】
このオリゴヌクレオチドはまた、１型ヘルパーT細胞（Th1）を強力に誘導するため、結果として２型ヘルパーT細胞（Th2）の作用を減弱させる。すなわち、Th2が活性化することによって引き起こされるＩ型アレルギーの病態を改善することが期待される。従来の抗アレルギー薬はアレルギー症状を改善するのみであり病態を治療することはできなかった。本薬はTh1とTh2のバランスがくずれることによって生じるアレルギー病態を正常な状態に回復させる作用を有する。Ｉ型アレルギーの例は、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支ぜん息、じんましん・アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、アナフィラキシーである。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは極めて少量で抗アレルギーアジュバンドとして機能する。このため本発明のオリゴヌクレオチドは，従来のアジュバンドに比べて細胞毒性が低く，副作用の怖れが極めて少ない。このことは、アレルギー治療薬として極めて有益であるといえる。
【００５４】
このオリゴヌクレオチドは，既存の抗アレルギー治療薬と組み合わせて投与され得る。抗アレルギー薬とはアレルギー症状を改善し得る，本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド以外の任意の分子または化合物である。抗アレルギー薬の例は、抗ヒスタミン薬、ステロイド、抗ロイコトリエン薬などが挙げられる。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドは，薬学的に受容可能なキャリア中の薬学的組成物として処方され得る。このオリゴヌクレオチドは，被験体に直接投与され得るか，または核酸送達複合体と組み合わせて投与され得る。核酸送達複合体とは，標的化手段（例えば，標的細胞（例えば，Ｂ細胞表面）へのより高親和性の結合および／または標的細胞による細胞取り込みの増加を生じる分子）と会合（例えば，イオン性結合もしくは共有結合，またはその手段にカプセル化）された，核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例は，ステロール（例えば，コレステロール）と会合した核酸，脂質（例えば，カチオン性脂質，ビロゾーム，またはリポソーム）と会合した核酸，または標的細胞特異的結合因子（例えば，標的細胞特異的レセプターにより認識されるリガンド）と会合した核酸である。好ましい複合体は，その標的細胞によるインターナリゼーションの前の有意な脱カップリングを防ぐために十分にインビボで安定であり得る。しかし，その複合体は，その核酸が機能的形態で放出されるように，その細胞中で適切な条件下で切断可能である。
【００５６】
このオリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤は，単独で（例えば，生理食塩水もしくは緩衝液中）で投与され得るか，または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用して投与され得る。
【００５７】
全身投与，粘膜送達もしくは局所送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量は，代表的には，０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，これは，その適用が毎日，毎週，または毎月投与，およびその間の他の任意の時間にされ得るかに依存する。より代表的には，全身用量，局所用量または粘膜用量は，１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり，２回の投与〜４回の投与が，数日間または数週間の間隔を空けられる。より代表的には，用量は，１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，１０μｇ／投与〜１ｍｇ／投与の範囲であり，毎日または毎週投与される。抗アレルギー作用を誘導するために非経口送達のための本明細書中に記載の化合物の被験体用量は，代表的には，ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用のための有効粘膜用量の５倍〜１０，０００倍多く，より代表的には１０倍〜１，０００倍多く，最も代表的には２０倍〜１００倍多い。このオリゴヌクレオチドが他の治療剤と組み合わせで，もしくは特殊な送達ベシクル（ビヒクル）中で投与される場合に，非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の用量は，代表的には，約０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，これは，その適用が毎日，毎週，または毎月投与，およびその間の他の任意の時間にされ得るかに依存する。より代表的には，これらの目的のための非経口用量は，約１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，約１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり，２回の投与〜４回の投与が，数日間または数週間の間隔を空けられる。しかし，いくつかの実施形態において，これらの目的のための非経口用量は，上記の代表的用量よりも５倍〜１０，０００倍多い範囲で使用され得る。
【００５８】
なお，鼻炎や気管支喘息といった呼吸器系アレルギー疾患の場合，本発明のオリゴヌクレオチドの投与量は１μｇ以上１０ｍｇ以下が好ましく，１０μｇ以上１ｍｇ以下でもよく，５０μｇ以上０．５ｍｇ以下でもよい。
【００５９】
本明細書中で使用される場合，「有効（な）量」とは，所望される生物学的効果を実現するために必要であるかまたは十分である量を指す。例えば，アレルギー疾患を処置するために有効な量のキラル核酸は，その疾患を処置するのに必要な量である。本明細書中に提供される教示と組み合わせると，種々の活性化合物および重み付け因子（例えば，効力，相対的バイオアベイラビリティー，患者の体重，有害な副作用の重篤度，および好ましい投与様式）を選択することによって，実質的な毒性を引き起こさないが特定の被験体を処置するに完全に有効である，有効な予防処置レジメンもしくは有効な治療処置レジメンが計画され得る。任意の特定の適用のための有効量は，処置される疾患もしくは状態，投与される特定のオリゴヌクレオチド，抗原，被験体の大きさ，またはその疾患もしくは状態の重篤度のような要因に依存して，変化し得る。当業者は，特定のオリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤の有効量を，過度の実験を必要とすることなく経験的に決定し得る。
【００６０】
本明細書中に記載される任意の化合物について，その治療上有効な量は，動物モデルからまず決定され得る。治療上有効な用量はまた，ヒトにおいて試験された（ヒト臨床試験が開始された）ＣｐＧオリゴヌクレオチドについてのヒトデータから，および同様の薬理学的活性を示すことが公知である化合物（例えば，他の粘膜アジュバント（例えば，ＬＴおよびワクチン接種用の他の抗原））について粘膜投与もしくは局所投与についてのデータから，決定され得る。より高用量が，非経口投与のために必要である。適用される用量は，投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティーおよび効力に基づいて，調整され得る。その用量を，上記の方法および他の方法に基づいて最大効力を達成するように調整することは，当該分野で周知であり，当業者の能力の範囲内に十分に存在する。
【００６１】
本発明の処方物は，薬学的に受容可能な溶液中で投与され，この溶液は，慣用的には，薬学的に受容可能な濃度の塩，緩衝化剤，保存剤，適合性キャリア，アジュバント，および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【００６２】
治療における使用のために，有効量のこのオリゴヌクレオチドが，所望される表面（例えば，粘膜表面，全身表面）にその核酸を送達する任意の様式によって，被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは，当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。好ましい投与経路としては，経口経路，非経口経路，筋肉内経路，鼻内経路，気管内経路，吸入経路，眼内経路，舌下経路，膣内経路，および直腸経路が挙げられるが，これらに限定されない。
【００６３】
経口投与のために，この化合物（すなわち，オリゴヌクレオチド，抗原，および他の治療剤）は，その活性化合物を，当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって，容易に処方され得る。そのようなキャリアは，本発明の化合物が，標的とされる被験体による経口摂取のための錠剤，ピル，糖剤，カプセル剤，液剤，ゲル剤，シロップ剤，スラリー剤，懸濁剤などとして処方されることを可能にする。経口用途のための薬学的調製物は，必要に応じて，望まれる場合は適切な助剤を添加した後に，生じた混合物を粉砕し，その顆粒混合物を処理して錠剤コアまたは糖剤コアを得ることによって，固体賦形剤として入手され得る。適切な賦形剤は，特に，充填剤（例えば，糖（ラクトース，スクロース，マンニトール，もしくはソルビトールが挙げられる）；セルロース調製物（例えば，トウモロコシスターチ，コムギスターチ，イネスターチ，ジャガイモスターチ，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチル−セルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム），および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））である。望まれる場合，崩壊剤（例えば，架橋ポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸もしくはその塩（例えば，アルギン酸ナトリウム））が，添加され得る。必要に応じて，その経口処方物はまた，内部酸性状態を中和するための生理食塩水もしくは緩衝液中で処方され得るか，またはいかなるキャリアも含まずに投与され得る。
【００６４】
糖剤コアは，適切なコーティングを備える。この目的のために，濃縮糖溶液が，使用され得，これは，必要に応じて，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。染料または色素が，異なる活性化合物用量の組み合わせを同定または特徴付けるために，錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【００６５】
経口的に使用され得る薬学的調製物の例は，ゼラチンから作製されたカプセル，およびゼラチンと可塑剤（例えば，グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟らかい密封カプセルである。このカプセルは，充填剤（例えば，ラクトース），結合剤（例えば，スターチ），および／または滑沢剤（例えば，タルクまたはステアリン酸マグネシウム），および必要に応じて安定化剤と混合して，活性成分を含み得る。この軟らかいカプセルにおいて，活性化合物は，適切な液体（例えば，脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに，安定化剤が添加され得る。経口投与のために処方されたミクロスフェアもまた，使用され得る。このようなミクロスフェアは，当該分野で十分に規定されている。経口投与のためのすべての処方物は，このような投与に適切な投与量である。
【００６６】
経頬投与のために，この組成物は，従来の様式で処方された，錠剤またはロゼンジの形態を採り得る。
【００６７】
吸入による投与のために，本発明に従う使用のための化合物は，加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で，適切な推進剤（例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適切な気体）を使用して，従来のように送達され得る。加圧エアロゾルの場合，その投与単位は，計量した量を送達するための弁を提供することによって，決定され得る。吸入器または注入器において使用するための例えば，ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが，その化合物と適切な粉末基剤（例えば，ラクトースまたはスターチ）との粉末混合物を含んで，処方され得る。
【００６８】
この化合物は，全身送達することが望ましい場合に，注入（例えば，ボーラス注入または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注入のための処方物は，単位投与形態で（例えば，アンプル中かまたは多用量容器にて），添加された保存剤とともに提示され得る。その組成物は，油状ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の懸濁物，溶液，またはエマルジョンのような形態を採り得，そして処方剤（例えば，懸濁剤，安定化剤，および／もしくは分散剤）を含み得る。
【００６９】
非経口投与のための薬学的処方物としては，水溶性形態のその活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに，その活性化合物の懸濁物が，適切な油状注入懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては，脂肪油（例えば，ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば，オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド），またはリポソームが挙げられる。水性注入懸濁物は，その懸濁物の粘度を増加する物質（例えば，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて，その懸濁物はまた，非常に濃縮された溶液の調製を可能にするために，適切な安定化剤またはその化合物の溶解度を増加する薬剤を含み得る。
【００７０】
あるいは，その活性化合物は，適切なビヒクル（例えば，発熱物質を含まない滅菌した水）を用いて使用前に構成するための，散剤形態であり得る。
【００７１】
この化合物はまた，直腸組成物または膣内組成物（例えば，（例えば，従来の坐剤基剤（例えば，ココアバターまたは他のグリセリド）を含む）坐剤または貯留浣腸）の状態で処方され得る。
【００７２】
上記の処方物に加えて，この化合物はまた，デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。そのような長期作用処方物は，適切なポリマー物質もしくは疎水性物質を用いて（例えば，受容可能な油中のエマルジョンとして）か，またはイオン交換樹脂を用いてか，または溶解性が乏しい誘導体（例えば，溶解性が乏しい塩）として，処方され得る。
【００７３】
この薬学的組成物はまた，適切な固相もしくはゲル相の，キャリアもしくは賦形剤を含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，スターチ，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリマー（例えば，ポリエチレングリコール）が挙げられるが，これらに限定されない。
【００７４】
適切な液体薬学的調製物形態または固体薬学的調製物形態は，例えば，マイクロカプセル化されるか，キレート化されるか，微視的金粒子上にコーティングされるか，リポソーム中に含まれるか，噴霧されるエアロゾル中に含まれるか，皮膚への移植用のペレット中に含まれるか，または皮膚中を引っ掻く鋭い物体上に乾燥された，吸入用の水性溶液もしくは生理食塩水溶液である。この薬学的組成物はまた，活性化合物を長期放出する，顆粒，散剤，錠剤，コーティングした錠剤，（マイクロ）カプセル剤，坐剤，シロップ剤，エマルジョン，懸濁剤，クリーム，ドロップ，または調製物を含み，その調製物において，賦形剤および添加剤および／もしくは補助剤（例えば，崩壊剤，結合剤，コーティング剤，甘味剤，滑沢剤，矯味矯臭剤，甘味料，または可溶化剤）が，上記のように慣用的に使用される。この薬学的組成物は，種々の薬物送達系における使用のために適切である。薬物送達のための方法の簡単な概説について，Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３（これは，本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７５】
このオリゴヌクレオチドおよび必要に応じて他の治療剤および／または抗原は，それ自体が（そのまま）投与され得るか，または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。薬物中で使用される場合，その塩は，薬学的に受容可能であるべきであるが，薬学的に受容可能ではない塩が，その薬学的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得る。そのような塩としては，以下の酸から調製された塩が挙げられるが，それらに限定されない：塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸，マレイン酸，酢酸，サリチル酸，ｐ−トルエンスルホン酸，酒石酸，クエン酸，メタンスルホン酸，ギ酸，マロン酸，コハク酸，ナフタレン−２−スルホン酸，およびベンゼンスルホン酸。また，そのような塩は，アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば，カルボン酸基のナトリウム塩，カリウム塩，もしくはカルシウム塩）として調製され得る。
【００７６】
適切な緩衝化剤としては，酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては，塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン類（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ），およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００７７】
本発明の薬学的組成物は，有効量のオリゴヌクレオチド，そして必要に応じて抗原および／または他の薬剤を，必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に含んでもよい。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは，ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切な，１つ以上の適合性の，固体もしくは液体の，充填剤，希釈剤，もしくはカプセル化剤を意味する。用語「キャリア」とは，活性成分がその適用を容易にするために合わせられる，天然もしくは合成の，有機成分もしくは無機成分を示す。その薬学的組成物の成分はまた，相互作用が存在しない様式で，本発明の化合物と，および互いと，混合可能である。
【００７８】
本発明の薬学的組成物は，被験体の処置のために，その化合物の活性，投与様式，その免疫の目的（すなわち，予防免疫または治療免疫），その障害の性質および重篤度，患者の年齢および体重に依存して，異なる用量が必要であり得る。所定の用量の投与は，個々の投与単位での単回投与によってか，またはより少量のいくつかの投与単位で，実行され得る。
【００７９】
他の送達系としては，時間放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）系，遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系，または徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系が挙げられ得る。そのような系は，その化合物の反復投与を回避し得，被験体および医師に対する簡便性を増加し得る。多くの型の放出送達系が，利用可能であり，そして当業者にとって公知である。それらとしては，ポリマーベースの系（例えば，ポリ（ラクチド−グリコリド），コポリオキサレート，ポリカプロラクトン，ポリエステルアミド，ポリオルトエステル，ポリヒドロキシ酪酸，およびポリ無水物が挙げられる。薬物を含む上記ポリマーのマイクロカプセルが，例えば，米国特許第５，０７５，１０９号に記載される。送達系としてはまた，非ポリマー系も挙げられ，これは，脂質（ステロール（例えば，コレステロール，コレステロールエステル），および脂肪酸もしくは天然脂肪（例えば，モノグリセリド，ジグリセリド，およびトリグリセリド）が挙げられる）；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ロウコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分融合した移植物などである。特定の例としては，（ａ）本発明の薬剤がマトリックス中にある形態で含まれる，侵食系（米国特許第４，４５２，７７５号，同第４，６７５，１８９号および同第５，７３６，１５２号に記載される系）；ならびに（ｂ）ポリマーから制御された速度で活性成分が浸透する，拡散系（米国特許第３，８５４，４８０号，同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載される）が挙げられるが，これらに限定されない。さらに，ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得，そのうちのいくつかは，移植のために適合される。
【００８０】
本発明は，以下の実施例によってさらに例証される。以下の実施例は，いかようにも，さらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された文献の全ての内容は本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００８１】
キラルＣｐＧオリゴ核酸の合成
ＣｐＧオリゴ核酸（ｍｉｘ体）
ホスホロアミダイト法を用いて合成し，ＨＰＬＣにて精製したオリゴ核酸（Ｍｉｘ体）をジーンデザイン社から購入した。【００８２】
立体制御ＣｐＧオリゴ核酸の合成
核酸の鎖長延長を以下の（ｉ）〜(ｉｖ)のステップを繰返すことにより行なった。
(ｉ)  ３％  ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）／ＣＨ２Ｃｌ２（１５秒），
（ｉｉ）  縮合（０．１Ｍ  モノマーのＭｅＣＮ溶液（下記参照）と１Ｍ  ＰｈＩＭＴ（１−フェニルイミダゾリウムトリフラート）のＭｅＣＮ溶液の１：１混合溶液，５分）
(ｉｉｉ)  キャップ化（０．５Ｍ  ＣＦ３ＣＯＩｍのＴＨＦ溶液と１Ｍ  ＤＭＡＮ（１,８−ビスジメチルアミノナフタレン）のＴＨＦ溶液の１：１混合液，３０秒），
(ｉｖ)  硫化（０．１Ｍ  ＤＤＴＴのＭｅＣＮ用液，９０秒）もしくは酸化（０．０２Ｍ  Ｉ２のＨ２Ｏ−ピリミジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ）−ＴＨＦ溶液，１５秒）。【００８３】
鎖長延長後，固相担体を１．５ｍＬマイクロチューブに回収し，濃アンモニア水（１．２  ｍＬ，５５℃，４８時間）で処理した。固相担体をろ別し，ろ液を減圧乾燥後，水（１．０  ｍＬ）に溶かし，逆相ＨＰＬＣにより分取・精製することでオリゴマーを得た。【００８４】
０．１Ｍ  モノマーのＭｅＣＮ溶液調整法（Ｒｐ−Ｔｈの場合）
チミジル酸Ｈ−ホスホネート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）モノエステル（２５マイクロｍｏｌ）を脱水ピリジン，脱水トルエンで共沸乾燥後，ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（Ｎ−シアノメチルピロリジン）混合液（９：１,ｖ/ｖ；２５０μＬ）に溶かした。溶液にＰｈ３ＰＣｌ２（６２．５マイクロｍｏｌ）を加え１０分間撹拌し，続いてＡＡ−Ｌ（３０マイクロｍｏｌ；Ｓｐ体の場合はＡＡ−Ｄ）を加えさらに１０分間撹拌することで，モノマー溶液を調整した。【００８５】
上記の説明において，ＤＤＴＴ，ＡＡ−Ｌ及びＡＡ−Ｄは，それぞれ以下の化合物の略称である。得られたオリゴ核酸を表1に示す。【００８６】
【化１】
2015108046.tif 000005
【００８７】
【表３】
2015108046.tif 000006
【００８８】
【表４】
2015108046.tif 000007
【００８９】
【表５】
2015108046.tif 000008
【００９０】
【表６】
2015108046.tif 000009
【００９１】
【表７】
2015108046.tif 000010
【００９２】
表中配列番号１１９で示されるオリゴヌクレオチドは，公知の化合物（化合物１１９）である。【００９３】
表１中，＊は，Ｓ型又はＲ型がランダムに導入されたホスホロチオエート骨格修飾を示す。表１中，ｓは，Ｓ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。表１中，ｒは，Ｒ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。
【実施例２】
【００９４】
サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導
Ｂウイルス陰性カニクイザル血液（株式会社新日本科学から購入）をハンクス平衡塩（Ｈａｎｋｓ‘Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で３倍希釈し，フィコール・パック・プラス（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ）比重液に重層後，遠心分離(２，６００  ｒｐｍ，３０  ｍｉｎ)を行い，末梢血単核球(ＰＢＭＣ)画分を採取した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地(＋１％  ペニシリン・ストレプトマイシン)で洗浄した後，ＲＰＭＩ培地(＋１０％ＦＢＳ，１％  ペニシリンストレプトマイシン)に細胞濃度が３×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬとなるように調製した。その後，９６ウェルＵ底プレートに播種し，種々のオリゴ核酸(オリゴＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ  １：３．２混合物)とともに５％ＣＯ２インキュベーターで１７〜２４時間培養した。培養終了後，遠心分離(５００ｒｐｍ,５ｍｉｎ)により，培養上清を回収した。培養上清中のＩＦＮ−アルファの濃度をエライザキット（ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）(ＰＢＬ社)を用いて測定した。【００９５】
測定結果を表２及び表３に示す。表２は，配列番号１〜４８で示されるオリゴヌクレオチドに関する実験により得られた，本発明のオリゴヌクレオチドのサル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導作用を示す。【００９６】
【表８】
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【００９７】
表３は，配列番号４９〜１１８で示されるオリゴヌクレオチドに関する実験により得られた，本発明のオリゴヌクレオチドのサル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導作用を示す。表３は，配列番号１１９で示される塩基配列（tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt）を有するヌクレオチド（従来のヌクレオチド：化合物１１９）との相対値を用いて示したものである。【００９８】
【表９】
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【００９９】
［比較例１］
配列番号１１９で示される塩基配列を有するヌクレオチド（従来のヌクレオチド：化合物１１９）について実施例２と同様に実験を行い，ＩＦＮ−アルファの濃度を測定した。その結果を表４に示す。【０１００】
【表１０】
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【実施例３】
【０１０１】
サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるサイトカイン産生プロファイル
Ｂウイルス陰性カニクイザル血液（株式会社新日本科学から購入）をハンクス平衡塩（Ｈａｎｃｋｓ’  Ｂａｌａｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２倍希釈し，フィコール・パックプラス（Ｆｉｃｏｌｌ-Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ）比重液に重層後，遠心分離（２，６００  ｒｐｍ，３０分）を行い，末梢血単核球（ＰＢＭＣ）画分を採取した。ＰＢＭＣを洗浄用培地：ＲＰＭＩ+１００  ＩＵ/ｍＬペニシリン+１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンで洗浄した後，アッセイ培地：ＲＰＭＩ+１０％ＦＢＳ+１００ＩＵ/ｍＬぺニシリン+１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンに細胞濃度が３×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬとなるように調製した。その後，96ウェルU底プレートに播種し，種々の化合物（ＣｐＧ  ＯＤＮ：DOTAP  1：3.2混合物）と共に5%CO2インキュベーターで１６〜２０時間培養した。培養終了後，遠心分離（５００  rpm,5分）し培養上清を回収した。培養上清中のサイトカインプロファイルは，Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｐａｎｅｌ（Ｍｅｒｃｋ）を用いてＩＦＮ−γ，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２/２３(ｐ４０)，ＩＬ−８，ＴＮＦ−αの7種のサイトカインを測定した。【０１０２】
実験結果
サイトカインの結果は対照化合物（化合物１１９）の値を１００％として表示した。いずれの化合物もサル末梢血単核球に対して，Ｔｈ１サイトカインの産生誘導作用は強いが，Ｔｈ２サイトカインに対してはほとんど影響を及ぼさず，Ｔｈ１／Ｔｈ２レシオは１以上を示した（表５）。【０１０３】
【表１１】
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【０１０４】
Ｌは，定量限界以下を示す。
【実施例４】
【０１０５】
アレルギー性鼻炎モデルマウスによるキラル核酸アジュバントの薬効評価試験
実験方法
モデルマウスの作製
7週齢のＢＡＬＢ/ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊにＯＶＡとＡＬＵＭあるいは本化合物および百日咳毒素の混合液を腹腔内投与して初回感作とし，さらにこの５日後に追加感作としてＯＶＡ溶液を背部皮下投与することで，ＯＶＡによる全身感作を行った。その後，初回感作１８日目以降から４日間，局所感作として１日１回OVA溶液を両側鼻腔にマイクロピペットで点鼻投与し，アレルギー症状を発症させた。【０１０６】
化合物の投与
１０μｇの配列番号６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（化合物６７）をＯＶＡ初回感作時あるいは局所感作の１時間前に皮下投与し，アレルギー症状発症への影響を確認した。【０１０７】
鼻掻き回数
OVA点鼻投与（局所感作）4日目の点鼻直後から1時間の鼻掻き回数を測定した。鼻掻き回数は，洗顔行動および前肢舐め行動等と区別し，マウスが前肢で鼻部を引っ掻いた行動のみを鼻掻き行動として測定した。その結果を表６及び図１に示す。【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
上記表において化合物６７Ｍｉｘは，化合物67において一部のＳｐ型部分がＲｐ型部分に置き換わったオリゴヌクレオチドを示す。【０１１０】
マウス血清中OVA特異的IgEの測定
局所感作5日後に採取した血液を用いて，製造業者の指示書に従い，Ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＥ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ,Ｉｎｃ.）を用いてOVA特異的ＩｇＥの測定を実施した。その結果を表７及び図２に示す。【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
実験結果
アレルギー症状の指標である鼻掻き回数に対して，化合物67投与群は陽性対象であるクロルフェニラミンより弱いものの，OVA投与群と比較して鼻掻き回数の減少傾向を示した。さらに，化合物67のSp型立体異性体および立体混合体（mix）は，Sp立体制御体の方がmix体に比較して鼻掻き行動の改善傾向を示した。また、血中IgE量に対しては、化合物67投与群では顕著に低下していたが、陽性対象であるクロルフェニラミンにはそのような作用は認められなかった。
【実施例５】
【０１１３】
アレルギー性鼻炎モデルマウスによるキラル核酸アジュバントの薬効評価試験
モデルマウスの作製（第3クール）
７週齢のＢＡＬＢ/ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊにＯＶＡのみ、あるいはＡＬＵＭの混合液を腹腔内投与して初回感作とし、さらにこの５日後に追加感作としてＯＶＡ溶液あるいはＯＶＡ溶液と本化合物（配列番号６７、Sp型立体異性体）の混合物を背部皮下投与することで、ＯＶＡによる全身感作を行った。その後、初回感作１８日目以降から４日間、局所感作として１日１回ＯＶＡ溶液を両側鼻腔にマイクロピペットで点鼻投与し、アレルギー症状を発症させた。【０１１４】
化合物の投与
化合物６７（１０μｇ）をＯＶＡ追加感作時、初回感作後１７日目あるいは局所感作１日目に皮下投与あるいは点鼻投与し、アレルギー症状発症への影響を確認した。【０１１５】
マウス血清中OVA特異的IgEの測定
局所感作５日後に採取した血液を用いて、製造業者の指示書に従い、Mouse Serum Anti-OVA IgE Antibody Assay Kit（Chondrex,Inc.）を用いてOVA特異的IgEの測定を実施した。その結果を下記表及び図３に示す。【０１１６】
【表１４】
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【０１１７】
気管支肺胞洗浄液（BALF）中白血球のカウント
剖検時（局所感作５日後）に採取したＢＡＬＦを遠心分離（4℃、800×g、10分間）し、上清を除去後、沈査を500μLのPBSで再懸濁した。細胞数に合わせて希釈率を適宜変更し、チュルク液と混合してカウントを実施した。その結果を下記表及び図４に示す。【０１１８】
【表１５】
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【０１１９】
Neut.は，好中球を示し，Eosi.は，好酸球を示し，Baso.は好塩基球を示し，Lymph.はリンパ球を示し，Mhg.はマクロファージを示す。【０１２０】
実験結果
化合物67のSp型立体異性体を局所感作前日（初回感作17日目）に投与した群では、陽性対象であるクロルフェニラミン、あるいはOVA投与群と比較してアレルギー症状の指標である血中IgEの顕著な低下を示した。さらに、気管支肺胞洗浄液（BALF）中における白血球数は化合物67のSp型立体異性体投与群全てにおいて、好中球の減少傾向を示したが、しては、化合物67投与群では顕著に低下していたが、陽性対象であるクロルフェニラミンにはそのような作用は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は製薬産業において利用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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