(57)【要約】本発明の多糖誘導体は、下記一般式（１）で表される部分構造を有する。下記一般式（１）のＸ2を構成するアミノ酸の少なくとも１つが塩基性アミノ酸であることが好ましい。2016136707.tif 000017（式中、Ｘ1は、中性アミノ酸又はω−アミノアルカン酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ2は膜透過性ペプチドから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ3は、水酸基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を表し、ａは０又は１の数を表し、ｂは０〜５０の数を表す。）
2016136707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される部分構造を有する多糖誘導体。
【化１】
2016136707.tif 000014
（式中、Ｘ1は、中性アミノ酸又はω−アミノアルカン酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ2は膜透過性ペプチドから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ3は、水酸基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を表し、ａは０又は１の数を表し、ｂは０〜５０の数を表す。）
【請求項２】
前記一般式（１）のＸ2を構成するアミノ酸の少なくとも１つが塩基性アミノ酸である請求項１に記載の多糖誘導体。
【請求項３】
前記一般式（１）のａが０の数である請求項１又は２に記載の多糖誘導体。
【請求項４】
多糖誘導体の全糖単位に対して、前記一般式（１）で表される部分構造の割合が０．００１〜０．８である請求項１〜３の何れか１項に記載の多糖誘導体。
【請求項５】
前記一般式（１）で表される部分構造が、下記一般式（２）で表される部分構造である、請求項１〜４の何れか１項に記載の多糖誘導体。
【化２】
2016136707.tif 000015
（式中、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。）
【請求項６】
前記一般式（２）で表される部分構造を有する多糖誘導体が、下記一般式（３）で表される多糖誘導体である、請求項５に記載の多糖誘導体。
【化３】
2016136707.tif 000016
（式中、ｃ及びｄは、ｃ＋ｄが一般式（３）で表される多糖誘導体の重量平均分子量が５０００〜５０００万であり、ｄ／（ｃ＋ｄ）が０．００２〜１になる数を表し、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。但し、ｃのユニットとｄのユニットとはランダム状に連結している。）
【請求項７】
低膜透過性化合物を、細胞内又は粘膜内に導入するための導入剤であって、請求項１〜６の何れか１項に記載の多糖誘導体からなる導入剤。
【請求項８】
請求項７に記載の導入剤を使用する、低膜透過性化合物を、細胞内に導入するための方法。
【請求項９】
請求項７に記載の導入剤を使用する、低膜透過性化合物を、粘膜内に導入するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低膜透過性化合物を、細胞内又は粘膜内に導入する場合に有用な、多糖誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、合成ペプチドやタンパク質、さらにはＤＮＡや糖を細胞内に導入し、細胞内でのタンパク質相互作用を調節し、細胞内情報伝達や転写などをコントロールすることで、それらの機能を解明したり、特殊な機能を誘導したりする試みがなされている。このようなアプローチにより、今まで謎とされてきた遺伝情報の解明や、病原の解明、またその治療方法の開発が期待できる。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の開発により、核酸やタンパク質によって細胞機能をコントロールする技術はますます重要性を増している。【０００３】
一般に、ポリペプチド、核酸、糖等の水溶性高分子量物質は、高い親水性を有するため、細胞膜を通過することが困難である。そこで、これらを細胞内に導入する方法として、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクター法、膜透過性ペプチド法等が知られている。【０００４】
このうち、膜透過性ペプチド法は、膜透過性ペプチドが細胞のマクロピノサイトーシスを誘発するのを利用する方法である。膜透過性ペプチド法としては、細胞に導入しようとする目的化合物と膜透過性ペプチドを共有結合させて導入する方法（例えば、特許文献１及び２を参照）や膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物と細胞に導入しようとする目的化合物を共存させ、目的化合物のみを導入する方法（例えば、特許文献３及び４を参照）が知られている。目的化合物と膜透過性ペプチドとを共有結合させて導入する方法は、細胞へのダメージが少ないが、煩雑な前処理が必要である。一方、膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物を使用する方法は、簡便であるが、従来知られた膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物は、細胞毒性がやや高く、使用濃度に制限がでる場合があり、目的化合物の導入効率を向上させる場合に問題となっていた。【０００５】
また、膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子は、薬剤の上皮からの吸収性促進剤への応用（例えば、特許文献５を参照）も提案されているが、粘膜に対する刺激性があり実用化する場合の課題となっている。【０００６】
一方、カルボキシル基を有する多糖をポリアミンで架橋した化合物（例えば、特許文献６を参照）は、医療、医薬及び皮膚化粧料の分野において、増粘剤、滑沢剤、ゲル化剤等として有用であることが知られている。しかし、カルボキシル基を有する多糖と膜透過性ペプチドとを反応させた化合物は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ２００３／２２９２０２Ａ１
【特許文献２】特開２００５−０５２０８３号公報
【特許文献３】ＵＳ２０１０／１１３５５９Ａ１
【特許文献４】特開２０１１−２２９４９５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１００７８１号公報
【特許文献６】ＵＳ２００４／１６７０９８Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、核酸、タンパク質等の水溶性高分子量物質や、薬剤を、簡便な方法で、高い効率で、細胞内又は粘膜内に導入でき、細胞毒性や粘膜刺激性が低い化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、膜透過性ペプチド基を側鎖に有する多糖誘導体が細胞毒性や粘膜刺激性が少なく、そのような化合物を使用することにより、核酸、タンパク質等の水溶性高分子量物質や薬剤を細胞内や粘膜内に容易に導入できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、下記一般式（１）で表される部分構造を有する多糖誘導体である。
【化１】
2016136707.tif 000003
（式中、Ｘ1は、中性アミノ酸又はω−アミノアルカン酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ2は膜透過性ペプチドから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、Ｘ3は、水酸基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を表し、ａは０又は１の数を表し、ｂは０〜５０の数を表す。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、一般式（１）で表される部分構造を有する多糖誘導体は細胞毒性や粘膜刺激性が低く、煩雑な前処理を行わなくとも、低膜透過性化合物を高い効率で細胞内や粘膜内に導入できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態の一例について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されない。なお、本発明において、低膜透過性化合物とは、生物学的利用能（bioavailability）の低い化合物を意味し、具体的には、生物学的利用率（extent of bioavailability）が５０％以下の化合物を意味する。生物学的利用率は以下の式により算出することができる。
生物学的利用率（％）＝１００×（経口投与により血液中に到達した量）／（静脈投与により血液中に到達した量）
ここでいう「血液中に到達した量」は、血中濃度と横軸（時間軸）によって囲まれた部分の面積（薬物血中濃度−時間曲線下面積：AUC）として求められる。
【００１３】
一般式（１）で表される部分構造を有する多糖誘導体（以下、本発明の多糖誘導体という場合がある）は、膜透過性ペプチド残基を有しており、低膜透過性化合物を効率良く細胞に取り込ませることができる。膜透過性ペプチドが細胞に取り込まれる機構は、一般的には、膜透過性ペプチドが細胞のマクロピノサイトーシスを誘発して取り込まれるもので、周囲に低膜透過性化合物が存在する場合には、膜透過性ペプチドとともにこれらの低膜透過性化合物が取り込まれるものと考えられている。本発明の多糖誘導体では、膜透過性ペプチド残基により細胞の複数の箇所でマクロピノサイトーシスが誘発されるが、本発明の多糖誘導体は、巨大分子であり、また、本発明の多糖誘導体の１分子を細胞が複数の箇所から取り込むことも困難である。このため、本発明の多糖誘導体の周囲に低膜透過性化合物が存在する場合には、本発明の多糖誘導体によりマクロピノサイトーシスを誘発された細胞により、低膜透過性化合物が偶発的に、かつ継続的に取り込まれることになる。従って、膜透過性ペプチド残基と低膜透過性化合物との間の相互作用は、必ずしも必要とされず、本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物とを混合したものを細胞又は粘膜に接触させるだけで、低膜透過性化合物を細胞内又は粘膜内に導入できるものと考えられる。なお、本明細書で述べる機構は、いずれも推測であって、本発明を限定するものではない。
【００１４】
［一般式（１）で表される部分構造］
一般式（１）で表される部分構造について説明する。一般式（１）に示された糖単位は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよく、一般式（１）に示された糖単位と他の糖単位との結合は、α−グリコシド結合又はβ−グリコシド結合のいずれであってもよい。一般式（１）において、ａは０又は１の数を表す。ａが１である場合には、本発明の多糖誘導体の製法上、同一の糖単位に複数の膜透過性ペプチド残基が導入され、粘度増加によるハンドリング性の低下や低膜透過性化合物の導入効率の低下が起こる場合があることから、ａは０の数が好ましい。
【００１５】
一般式（１）において、Ｘ2は膜透過性ペプチドから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表す。本発明の多糖誘導体の膜透過性ペプチド残基は、細胞や粘膜、導入しようとする低膜透過性化合物に応じて適宜選択されてよいが、膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の少なくとも１つは塩基性アミノ酸であることが好ましい。また、塩基性アミノ酸は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよく、細胞や粘膜、導入しようとする低膜透過性化合物に応じて適宜選択されてよい。
【００１６】
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、オルニチン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン等が挙げられ、中でも、グアニジノ基含有アミノ酸が好ましく、アルギニンが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基中の塩基性アミノ酸の割合が高いほど、低膜透過性化合物の導入効率が上がることから、膜透過性ペプチドを構成する全アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の割合は、モル基準で、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸のうち、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸は、中性アミノ酸であることが好ましい。尚、本明細書中でアミノ酸と記載する場合、特に断らない限り、α―アミノ酸を意味する。
【００１７】
膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の数は、低膜透過性化合物の導入効率が上がることから、５〜３０であることが好ましく、６〜２０であることが更に好ましく、７〜１５であることが最も好ましい。
【００１８】
膜透過性ペプチドの好ましい具体例としては、７〜３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマー、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＨＩＶ−１ Ｔａｔ：配列番号１）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ：配列番号２）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＦＨＶ Ｃｏａｔ：配列番号３）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘ：配列番号４）、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＣＣＭＶ  Ｇａｇ：配列番号５）等の親水性の塩基性ペプチド；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称アンテナペディア：配列番号６）、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＢＭＷ Ｇａｇ：配列番号７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ペネトラチン：配列番号８）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称Ｐ２２Ｎ：配列番号９）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＶＰ２２：配列番号１０）等の両親媒性の塩基性ペプチド；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称トランスポータン：配列番号１１）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（通称ＴＰ−１０：配列番号１２）等の疎水性の塩基性ペプチドが挙げられる。これらの中で、低膜透過性化合物の導入効率が優れることから、親水性の塩基性ペプチドが好ましく、アルギニンオリゴマーが更に好ましい。アルギニンオリゴマーの中でも、アルギニンの繰り返し数は、７〜２０が好ましく、７〜１５が更に好ましく、７〜１０が最も好ましい。
【００１９】
Ｘ1は、中性アミノ酸又はω−アミノアルカン酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、ｂは０〜５０の数を表す。中性アミノ酸の場合は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよい。中性α−アミノ酸としては、例えば、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン等が挙げられ、ω−アミノアルカン酸としては、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸、１１−アミノウンデカン酸等が挙げられる。Ｘ1に適用される中性アミノ酸しては、低膜透過性化合物の導入効率が上がることから、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンが好ましく、グリシン、アラニン、セリンが更に好ましく、グリシンが最も好ましい。また低膜透過性化合物の導入効率の点や合成の容易さの点から、ｂは、１〜３０の数が好ましく、１〜２０の数が更に好ましく、１〜１０の数が最も好ましい。ｂが２〜５０の数の場合には、Ｘ1は、１種の中性アミノ酸残基でもよいし、２種以上の組合せでもよい。
【００２０】
一般式（１）において、Ｘ3は、水酸基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を表す。低膜透過性化合物の導入効率の点から、Ｘ3としては、水酸基、アミノ基、ｔ−ブトキシ基、ベンジルオキシ基が好ましく、水酸基、アミノ基が更に好ましく、アミノ基が最も好ましい。
【００２１】
本発明の多糖誘導体中、一般式（１）で表される部分構造が複数存在する場合、複数存在する（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−）a、（−ＮＨ−Ｘ1−ＣＯ−）b、Ｘ2及びＸ3はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。
【００２２】
一般式（１）で表される部分構造は、低膜透過性化合物の導入効率の点から、下記一般式（２）で表される部分構造であることが好ましい。
【化２】
2016136707.tif 000004
（式中、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。）
【００２３】
［本発明の多糖誘導体］
本発明の多糖誘導体について説明する。本発明の多糖誘導体は、一般式（１）で表される部分構造を有することに特徴があるが、一般式（１）で表される部分構造の割合があまりに少ない場合には、低膜透過性化合物の導入効率が低く、またあまりに多い場合には、本発明の多糖誘導体の製造が困難になるとともに、本発明の多糖誘導体が高粘度になり低膜透過性化合物の導入効率が低下することから、本発明の多糖誘導体中の、一般式（１）で表される部分構造の割合は、本発明の多糖誘導体の全糖単位に対して、０．００１〜０．８が好ましく、０．００５〜０．６が更に好ましく、０．０１〜０．５が最も好ましい。ここでいう割合とは、糖単位の数に対する部分構造の数の割合である。また、ここでいう糖単位とは、単糖単位を指す。
【００２４】
また、本発明の多糖誘導体の分子量があまりに小さい場合には、本発明の多糖誘導体自体が、細胞に取り込まれてしまう場合があり、またあまりに大きい場合には、高粘度になり低膜透過性化合物の導入効率が低下することから、本発明の多糖誘導体の分子量は、重量平均分子量で、５０００〜５０００万が好ましく１万〜４０００万が更に好ましく、５万〜３０００万が最も好ましい。なお、本発明において本発明の多糖誘導体の重量平均分子量とは、水系溶媒を用いてＧＰＣ分析を行った場合の、プルラン換算の重量平均分子量をいう（後述する一般式（１ａ）で表される部分構造を有する多糖誘導体も同様である）。
【００２５】
本発明の多糖誘導体の中でも、低膜透過性化合物の導入効率が高いことから、一般式（３）〜（５）のいずれかで表される多糖誘導体が好ましく、一般式（３）で表される多糖誘導体が更に好ましい。
【００２６】
【化３】
2016136707.tif 000005
（式中、ｃ及びｄは、ｃ＋ｄが一般式（３）で表される多糖誘導体の重量平均分子量が５０００〜５０００万であり、ｄ／（ｃ＋ｄ）が０．００２〜１になる数を表し、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。但し、ｃのユニットとｄのユニットとはランダム状に連結している。）
【００２７】
【化４】
2016136707.tif 000006
（式中、ｅ、ｆ及びｇは、ｅ＋ｆ＋ｇが一般式（４）で表される多糖誘導体の重量平均分子量が５０００〜５０００万となる数であり、ｇ／（ｅ＋ｆ＋ｇ）が０．００１〜１となる数を表し、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。但し、ｅのユニット、ｆのユニット及びｇのユニットはランダム状に連結している。）
【００２８】
【化５】
2016136707.tif 000007
（式中、ｈ、ｊ、ｋ及びｍは、ｈ＋ｊ＋ｋ＋ｍが一般式（５）で表される多糖誘導体の重量平均分子量が５０００〜５０００万となる数であり、（ｋ＋ｍ／（ｈ＋ｊ＋ｋ＋ｍ）が０．００１〜１となる数を表し、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。但し、ｈのユニット、ｊのユニット、ｋのユニット及びｍのユニットはランダム状に連結している。）
【００２９】
［本発明の多糖誘導体の製法］
本発明の多糖誘導体は、例えば、下記一般式（１ａ）で表される部分構造を有する多糖誘導体のカルボキシル基と、下記一般式（１ａ）で表されるペプチド化合物のアミノ基とをペプチド反応させることにより得ることができる。カルボキシル基とアミノ基との反応は、公知の方法を用いればよく、例えば、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドによりスクシイミドエステル化した後、アミノ基を反応させる方法等が挙げられる。
【００３０】
【化６】
2016136707.tif 000008
（式中、ａは一般式（１）と同義である。）
【００３１】
【化７】
2016136707.tif 000009
（式中、Ｘ1〜Ｘ3及びｂは一般式（１）と同義である。）
【００３２】
一般式（１ａ）で表される部分構造を有する多糖誘導体のうち、ａが０の化合物としては、ペクチン又はペクチン酸、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられ；ａが１の化合物としては、カルボキシメチル化デンプン、カルボキシメチル化セルロース、カルボキシメチル化βグルコース等のカルボキシメチル化多糖誘導体が挙げられる。なお、ヒアルロン酸からは一般式（３）で表される多糖誘導体、ペクチン又はペクチン酸からは一般式（４）で表される多糖誘導体、アルギン酸からは一般式（５）で表される多糖誘導体がそれぞれ得られる。
【００３３】
［低膜透過性化合物］
本発明の多糖誘導体は、低膜透過性化合物を細胞内や粘膜内に導入するための導入剤として使用することにより、種々の低膜透過性化合物が導入可能になる。このような低膜透過性化合物としては、例えば、インスリン及びインスリン分泌促進剤（例えば、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１）などのペプチド・タンパク性医薬品、ステロイドホルモン、非ステロイド系鎮痛抗炎症剤、精神安定剤、抗高血圧薬、虚血性心疾患治療薬、抗ヒスタミン薬、抗喘息薬、抗パーキンソン薬、脳循環改善薬、制吐剤、抗うつ薬、抗不整脈薬、抗凝固薬、抗痛風薬、抗真菌薬、抗痴呆薬、シェーングレン症候群治療薬、麻薬性鎮痛薬、ベータ遮断薬、β１作動薬、β２作動薬、副交感神経作動薬、抗腫瘍薬、利尿薬、抗血栓薬、ヒスタミンＨ１レセプター拮抗薬、ヒスタミンＨ２レセプター拮抗薬、抗アレルギー薬、禁煙補助薬、ビタミン等の医薬品；
【００３４】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）等の核酸化合物；酵素、抗体、糖タンパク質、転写因子等のペプチド化合物；
【００３５】
プルラン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、セルロース、デンプン、アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸等の多糖誘導体及びそれらの誘導体等が挙げられる。
本発明の多糖誘導体が、適用される細胞は、動物、植物、細菌等のいずれの細胞でもよいが、低膜透過性化合物の導入効率の点から、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。本発明の多糖誘導体が、適用される粘膜も、低膜透過性化合物の導入効率の点から、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。
【００３６】
［細胞］
本発明の多糖誘導体を使用することにより、種々の細胞内に低膜透過性化合物を導入することが可能であり、培養液（液体培地ともいう）等に分散された細胞、固定培地等に接着した細胞、生体組織の細胞等のいずれの細胞にも低膜透過性化合物を導入することが可能である。細胞は、組織細胞や神経細胞等を形成する接着系の細胞と、血球細胞等の浮遊系の細胞に大別できる。浮遊系の細胞に対しては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法は適用できず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクター法等が適用できたが、導入効率は満足できるものではなかった。本発明の導入方法は、接着系の細胞だけでなく、浮遊系の細胞に対しても、低膜透過性化合物を高い導入効率で導入することが可能である。
【００３７】
［細胞内への導入方法］
本発明の多糖誘導体を用いて、細胞内に低膜透過性化合物を導入する場合には、本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物を含有する水性溶液又は水性分散液を、細胞と接触させればよく、ウイルスベクター法や膜透過性ペプチドを用いた従来の導入方法のような煩雑な前処理を必要とせず、また細胞への悪影響をあまり与えることなく、細胞内に低膜透過性化合物を導入できる。
【００３８】
本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物とを溶解又は分散させ、これらを含有する水性溶液又は水性分散液となる水性媒体としては、蒸留水、細胞培養に一般的に用いられる培養液のほか、生理食塩水、５質量％ブドウ糖水溶液等の等張水が挙げられるが、細胞に対する影響が少ないことから培養液、生理食塩水及び５質量％ブドウ糖水溶液が好ましい。
【００３９】
細胞を水性溶液又は水性分散液に懸濁する場合には、低膜透過性化合物と本発明の多糖誘導体とを含有する水性溶液又は水性分散液に、細胞を懸濁させればよく、必要に応じて、これら３者を含有する懸濁液を撹拌や振盪してもよい。また、細胞が固体培地等に接着されていたり、細胞組織が大きかったり等の理由により、細胞を水性溶液又は水性分散液に懸濁できない場合には、低膜透過性化合物と本発明の多糖誘導体とを含有する水性溶液又は水性分散液に細胞を浸漬させればよい。
【００４０】
低膜透過性化合物を細胞内に導入する場合、本発明の多糖誘導体の使用濃度は、特に限定されないが、水性溶液又は水性分散液において０．１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとするのが好適である。また、導入する低膜透過性化合物の濃度も特に限定されないが、水性溶液又は水性分散液において０．５μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとするのが好適である。更に、細胞を、培養液若しくは生理食塩水等を媒体とする水性溶液又は水性分散液に懸濁させる場合の細胞の濃度も限定されないが、水性溶液又は水性分散液において１万〜２００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとするのが好適である。
【００４１】
本発明の多糖誘導体、導入しようとする低膜透過性化合物、及び細胞の３者を共存させる時間は特に限定されないが、３０分〜２４時間とするのが好適である。
【００４２】
［粘膜］
本発明の多糖誘導体を粘膜内に使用することにより、種々の粘膜内に低膜透過性化合物を導入することが可能である。粘膜としては、鼻粘膜、口腔粘膜、膣粘膜、直腸粘膜、眼粘膜、胃粘膜、腸管粘膜等が挙げられる。従来の膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物は粘膜への刺激性が大きかったことから、例えば、鼻粘膜に使用すると痒みが発生する場合があったが、本発明の多糖誘導体ではこのような痒みが軽減される。
【００４３】
［粘膜内への導入方法］
本発明の多糖誘導体を用いて、粘膜内に低膜透過性化合物を導入する場合には、本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物との混合物を粘膜に密着させればよく、この混合物が粘膜から剥離しにくい剤形であれば、剤形は限定されない。好ましい剤形は、粘膜によって異なるが、例えば、丸剤、錠剤、トローチ剤、貼付剤、坐薬、パップ剤等が挙げられる。本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物との混合物は、剤形により、液状、乳状、懸濁状、ゲル状、粉末状、固形状等の形状を選択すればよい。低膜透過性化合物は目的に応じて、１種のみを導入してもよく、２種以上を組み合わせてもよい。また、必要に応じて、賦形剤、乳化剤、分散剤、ゲル化剤、保湿剤等を併用してもよい。
【００４４】
［小突起アレイの利用］
本発明の多糖誘導体は低膜透過性化合物を、皮膚を経由して細胞内に導入することはできないが、小突起アレイ（シート上に微細な突起を配した薬剤送達部材。例えば、ＵＳ２００５０２５７７８Ａ１、特開２００８−００６１７８等を参照）を利用することにより、皮膚下の細胞内に低膜透過性化合物を導入することが可能になる。例えば、本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物との混合物を表面に塗布した小突起アレイ、又は本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物との混合物を含有する小突起を有する小突起アレイを、皮膚表面に貼り、微細な突起により皮膚を貫通させて、皮膚下に本発明の多糖誘導体と低膜透過性化合物とを浸透させることにより、皮膚下の細胞内に低膜透過性化合物を導入することが可能になる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。尚、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。【００４６】
＜製造例１：多糖誘導体１＞
１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に５０ｍｇのヒアルロン酸（重量平均分子量：５０００〜１５００００）を溶解した。この溶液へ０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した４７ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを添加し、更に０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した８２ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を添加して室温(２５℃)で２４時間攪拌し反応を行った。析出する固体をろ過によりろ別し、０．５ｍＬのＤＭＳＯを添加して、スクシンイミドエステル化されたヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液２．５ｍＬを得た。
スクシンイミドエステル化されたヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液１ｍＬへ、オクタアルギニンの末端カルボキシル基がアミド化された化合物（ＧＬ Biochem社製、商品名：ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ2，［Ｒ＝Ｄ−Ａｒｇ］ＴＦＡ  Ｓａｌｔ）のＤＭＳＯ溶液（５００ｍｇ／ｍＬ）０．４ｍＬを混合し、６０℃で２４時間攪拌し、反応を行った。反応の後、反応溶液をセルロース透析チューブ（シームレスセルロースチューブ，和光純薬社製）に入れ、チューブの両口を縛った後、イオン交換水を用いて２日間透析を行った。その後、チューブの内容物を凍結乾燥して、１０２ｍｇの本発明の多糖誘導体１を得た。多糖誘導体１は、一般式（３）のｂが０、Ｘ2がオクタアルギニンから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基、Ｘ3がアミノ基であり、ｄ／（ｃ＋ｄ）が０．５８である化合物である。なお、ｄ／（ｃ＋ｄ）の値はＮＭＲの積分値より求めた。このｄ／（ｃ＋ｄ）の値から、多糖誘導体１に係る全糖単位に対する一般式（１）で表される部分構造の割合は０．２９と算出された。多糖誘導体１の重量平均分子量は２２万であった。【００４７】
＜製造例２：多糖誘導体２＞
製造例１において、オクタアルギニンの末端カルボキシル基がアミド化された化合物のＤＭＳＯ溶液（５００ｍｇ／ｍＬ）０．４ｍＬの代わりに、一般式（１ｂ）において、ｂが４、Ｘ1がグリシンから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基、Ｘ2がオクタアルギニン残基、Ｘ3がアミノ基である化合物（ＲＳ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社製、商品名：Ｈ−（Ｇｌｙ）4−（Ｄ−Ａｒｇ）8−ＮＨ2（Ｐｕｒｉｔｙ：９０％), ＴＦＡ  Ｓａｌｔ）のＤＭＳＯ溶液（３２０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを使用した以外は、製造例１と同様の操作を行い６０ｍｇの本発明の多糖誘導体２を得た。多糖誘導体２は、一般式（３）のｂが４、Ｘ1がグリシンから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基、Ｘ2がオクタアルギニンから末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基、Ｘ3がアミノ基であり、ｄ／（ｃ＋ｄ）が１．０である化合物である。なお、ｄ／（ｃ＋ｄ）の値はＮＭＲの積分値より求めた。このｄ／（ｃ＋ｄ）の値から、多糖誘導体２に係る全糖単位に対する一般式（１）で表される部分構造の割合は０．５と算出された。また、多糖誘導体２の重量平均分子量は３７万であった。【００４８】
＜比較化合物１＞
特開２０１１−２２９４９５号公報の製造例１に準拠して製造し、比較化合物１を得た。比較化合物１は下記の構造を有する化合物である。（式中、Ｒはアルギニン残基を表す。）
【化８】
2016136707.tif 000010
【００４９】
＜比較化合物２＞
ＵＳ２０１０１１３５５９Ａ１の製造例に準拠し、重量平均分子量約１０万のキトサンを用いて、比較化合物２を製造した。比較化合物２は下記の構造を有する化合物である。（式中、Ｒはアルギニン残基を表し、ｘ：ｙ＝８０：２０）
【化９】
2016136707.tif 000011
【００５０】
＜細胞＞
ＣＨＯ細胞：チャイニーズハムスター卵巣由来細胞
＜培地＞
Ｈａｍ'ｓＦ１２培地（商品名、和光社製）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
＜試薬＞
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液：０．２５％のトリプシン、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ水溶液＜細胞毒性試験キット＞
Cell Counting Kit-8(商品名、同仁化学社製) 
＜低膜透過性化合物＞
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ：フルオレセイン標識−牛血清アルブミン（Sigma-Aldrich社製）
＜細胞内への導入効率＞
２４穴プレートの各ウエルにＣＨＯ細胞のＨａｍ'ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーターで２４時間、前培養した。上清の培地を除去した後、ＦＩＴＣ−ＢＳＡのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地溶液（１０μｇ／ｍＬ）２５０μＬを添加し、更に多糖誘導体１〜２、又は比較化合物１〜２のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地溶液（１００μｇ／ｍＬ）２５０μＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターで１時間培養した。上清の培地溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水５００μＬで２回洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液１００μＬを添加して、培養したＣＨＯ細胞をプレートから剥離、分散させた。次に、０．０８％トリパンブルー溶液１００μＬを添加し細胞を懸濁させ、マイクロチューブに回収した。回収した細胞懸濁液を、セルストレーナーを通過させ、フローサイトメトリーによりＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定した。また、多糖誘導体を使用しなかったものをブランクとした。結果を表１に示す。【００５１】
【表１】
2016136707.tif 000012
【００５２】
細胞外のＦＩＴＣ−ＢＳＡはトリパンブルーにより失活して蛍光を発せず、細胞内に導入されたＦＩＴＣ−ＢＳＡのみが蛍光を発する。ＭＦＩは細胞あたりの１ケあたりの蛍光強度の平均値を示すことから、ＭＦＩの値が大きいほど、水溶性高分子化合物であり低膜透過性化合物であるＦＩＴＣ−ＢＳＡが細胞内に取込まれたことを表している。表１の結果から、多糖誘導体１及び２は、水溶性高分子量物質の細胞内への導入効率が高いことが分かる。【００５３】
＜細胞毒性試験＞
９６穴プレートの各ウエルにＣＨＯ細胞のＨａｍ'ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーターで２４時間、前培養した。多糖誘導体１〜２、又は比較化合物１〜２のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地溶液（２ｇ／ｍＬ）を１０μＬ添加し、炭酸ガスインキュベーターで１時間培養し、更に、Cell Counting Kit-8を１０μＬ添加して炭酸ガスインキュベーターで１時間静置した。この後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、多糖誘導体１〜２、又は比較化合物１〜２を、入れない場合の吸光度に対する、入れた場合の吸光度の割合（％）を細胞生存率とした。結果を表２に示す。なお、細胞生存率が低いほど、細胞毒性が高いことを示す。【００５４】
【表２】
2016136707.tif 000013
【００５５】
表２の結果から、多糖誘導体１及び２は、比較化合物１及び２に比べて細胞生存率が高く、細胞毒性が低いことが分かる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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