(57)【要約】  担体を用いた核酸回収法において、ポリアクリルアミドでは達成できない極めて低濃度の核酸を含む液体からの核酸の回収を実現する。  カオトロピック塩およびアルコールの存在下、アニオン性高分子を共存させて、核酸を担体に吸着させることを特徴とする核酸抽出方法。アニオン性高分子、カオトロピック塩、アルコールおよび担体を含む核酸抽出試薬。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カオトロピック塩およびアルコールの存在下、アニオン性高分子を共存させて、核酸を担体に吸着させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
アニオン性高分子が、側鎖にカルボキシル基を有するポリマーである請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
アニオン性高分子が、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリル酸を含むコポリマー、カルボキシル基を有するポリアクリルアミド誘導体、ポリシラン誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ポリグルタミン酸、ポリグルタミン酸塩、ポリグルタミン酸誘導体及びポリグルタミン酸を含むコポリマーからなる群より選択される少なくとも１種類のポリマーである請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
アルコールが、エタノール、イソプロピルアルコール、n-プロパノール、n-ブタノール及び2-ブタノールからなる群より選択される少なくとも１種類のアルコールである請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
カオトロピック塩が、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジン、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック塩である請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
担体が、親水性官能基を表層に有する固体である請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
親水性官能基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、ニトロ基及びシラノール基からなる群より選択される少なくとも１種類の官能基である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
担体が磁性粒子である請求項６に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
自動装置で制御される請求項１〜８のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
担体が磁性粒子であり、磁性粒子懸濁がディスポーザブルチップによってハンドリングされ、チップの外壁面に磁石を当てることで磁性粒子をチップ内壁面に補足して、固液分離を行う請求項９記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
アニオン性高分子、カオトロピック塩、アルコールおよび担体を含む核酸抽出試薬。
【請求項１２】
さらに、バッファーを含む請求項１１に記載の核酸抽出試薬。
【請求項１３】
カートリッジに封入されるキットに含まれる請求項１１又は１２記載の核酸抽出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法及び試薬に関し、より詳細には、担体を用いた核酸抽出方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は、ウイルスや病原菌の同定検査、感染初期の病原微生物の検出、感染源調査、さらに白血病や腫瘍の遺伝子レベルの診断など、近年、多岐に渡って応用されている。中でも、感染症診断を目的とした病原微生物の核酸の検出は、感染の早期発見や処置後の経過を確認する為の数少ない手法のひとつである。この場合、非常に低濃度の標的核酸を体液などの試料から抽出、回収することが必要である。【０００３】
微量核酸を試料から抽出、回収する為に、キャリアーを用いることがある。キャリアーとてしては、核酸、あるいは核酸の電荷や分子サイズなどの化学的性質が近い物質が用いられる。具体的には、poly(A)、poly(dIdC)、tRNAなどの核酸キャリアー、グリコーゲンなどの生体高分子キャリアーが知られている（非特許文献１及び２）。生体分子をキャリアーとして用いる場合、検出に影響する可能性を持つ天然の核酸が次工程に混入することが懸念される。その為、キャリアーは生体分子ではないことが望ましい。【０００４】
また、近年、シリカなどの担体に核酸が結合する性質を利用して、核酸を抽出する方法が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gaillard, C. and Strauss, F., Nucleic Acid Research, Vol. 18, 378 (1990)
【非特許文献２】Sambrook, J. and Russell, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., A8.12 (2001)
【非特許文献３】B.Vogelstein and D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(2), 615-619 (1979)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非生体物質キャリアーとして、ポリアクリルアミドが知られているが、これは核酸を担体に結合させる手法ではなく、エタノール沈殿など遠心分離機を利用した手法で用いられる。本発明は、担体を用いた核酸回収法において、ポリアクリルアミドでは達成できない極めて低濃度の核酸を含む液体からの核酸の回収を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意努力した結果、担体を用いた核酸抽出過程において、非生体物質であるアニオン性高分子を核酸と共存させることで、核酸回収量を向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕カオトロピック塩およびアルコールの存在下、アニオン性高分子を共存させて、核酸を担体に吸着させることを特徴とする核酸抽出方法。
〔２〕アニオン性高分子が、側鎖にカルボキシル基を有するポリマーである〔１〕に記載の核酸抽出方法。
〔３〕アニオン性高分子が、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリル酸を含むコポリマー、カルボキシル基を有するポリアクリルアミド誘導体、ポリシラン誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ポリグルタミン酸、ポリグルタミン酸塩、ポリグルタミン酸誘導体及びポリグルタミン酸を含むコポリマーからなる群より選択される少なくとも１種類のポリマーである〔１〕に記載の核酸抽出方法。
〔４〕アルコールが、エタノール、イソプロピルアルコール、n-プロパノール、n-ブタノール及び2-ブタノールからなる群より選択される少なくとも１種類のアルコールである〔１〕１に記載の核酸抽出方法。
〔５〕カオトロピック塩が、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジン、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック塩である〔１〕に記載の核酸抽出方法。
〔６〕担体が、親水性官能基を表層に有する固体である〔１〕に記載の核酸抽出方法。
〔７〕親水性官能基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、ニトロ基及びシラノール基からなる群より選択される少なくとも１種類の官能基である〔６〕に記載の方法。
〔８〕担体が磁性粒子である〔６〕に記載の核酸抽出方法。
〔９〕自動装置で制御される〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の核酸抽出方法。
〔１０〕担体が磁性粒子であり、磁性粒子懸濁がディスポーザブルチップによってハンドリングされ、チップの外壁面に磁石を当てることで磁性粒子をチップ内壁面に補足して、固液分離を行う〔９〕記載の核酸抽出方法。
〔１１〕アニオン性高分子、カオトロピック塩、アルコールおよび担体を含む核酸抽出試薬。
〔１２〕さらに、バッファーを含む〔１１〕に記載の核酸抽出試薬。
〔１３〕カートリッジに封入されるキットに含まれる〔１１〕又は〔１２〕記載の核酸抽出試薬。
【発明の効果】
【０００９】
担体に核酸を結合させる効果をアニオン性高分子が増強する。本発明により、極めて低い濃度の核酸を含む液体からの核酸の回収が可能となった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2014‐063407の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】左：キャリアー効果のポリアクリル酸（PAAc）分子量依存性（いずれも0.1 %(w/v)）、キャリアーの代わりに蒸留水(DW)を用いたものはCt値が得られなかった。右：PAAcのキャリアー効果の濃度依存性。
【図２】各polymerのCarrier効果  1。
【図３】各polymerのCarrier効果  2。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、カオトロピック塩およびアルコールの存在下、アニオン性高分子を共存させて、核酸を担体に吸着させることを特徴とする核酸抽出方法を提供する。
【００１３】
核酸は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、RNAのいずれであってもよく、生体組織、細胞、ウイルスなどに由来する天然のものであっても、合成されたものであってもよい。核酸を含む溶液とは、生体組織の一部又はその破砕物、体液（例えば、血液（全血、血清、血漿など）、尿、唾液、羊水、母乳、髄液、滑液、腹水、胸水、耳漏、鼻汁、膿、胆汁、喀痰、汗など）、粘膜、糞、細胞などの試料を溶解処理したものを含む溶液、植物、酵素処理液、PCR産物などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
本発明の方法は、極めて低濃度の核酸を含む液体からの核酸の抽出、回収を可能とする。
【００１４】
アニオン性高分子は、水溶液中で負電荷に帯電するポリマーであるとよく、さらに、核酸抽出工程の後に行われる核酸の検出や定量を阻害しないもの、核酸抽出工程で担体を凝集させないものであるとよい。アニオン性高分子としては、側鎖にカルボキシル基を有するポリマーが好ましく、ポリマーは水溶性高分子であるとよい。
【００１５】
アニオン性高分子としては、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩（ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸カリウム、ポリアクリル酸カルシウムなど）、ポリアクリル酸誘導体（ポリアクリル酸エチル、ポリアクリル酸エステルなど）、ポリアクリル酸を含むコポリマー（アクリル酸とマレイン酸との共重合体、スチレン-アクリル酸共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、ポリオキシエチレン-ポリアクリル酸共重合体など）、カルボキシル基を有するポリアクリルアミド誘導体（ポリアクリルアミド-ポリアクリル酸共重合体など）、ポリシラン誘導体（ポリカルボシラン、ポリフェニルシランなど）、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩（カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシシメチルセルロースカリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど））、ポリグルタミン酸、ポリグルタミン酸塩（ポリグルタミン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸カリウム、ポリグルタミン酸カルシウムなど）、ポリグルタミン酸誘導体（ポリグルタミン酸エステル、ポリグルタミン酸ベンジルなど）、ポリグルタミン酸を含むコポリマー（ポリオキシエチレン-ポリグルタミン酸共重合体、ポリスチレン-ポリグルタミン酸共重合体など）、それらの組み合わせなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００１６】
アニオン性高分子の添加量（濃度）は、特に限定されないが、例えば、ポリアクリル酸の場合には、反応液中のキャリアーの最終濃度で0.02〜0.2 %(v/v)が適当であり、0.02〜0.1 %(v/v)が好ましい。
【００１７】
担体は、核酸を吸着可能なものであればよく、その材質は特に限定されないが、親水性官能基を表層に有する固体であることが好ましい。親水性官能基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、ニトロ基、シラノール基などを例示することができる。担体を表面処理することにより、親水性官能基を付与することができる。例えば、シリカ被覆により、担体表面はシラノール基を有することになる。
【００１８】
担体の一態様として、コアが被覆された構造をとる場合、コア成分が金属酸化物（シリカ、アルミナ、フェライト、マグネタイトなど）、高分子（ポリスチレン、アクリル樹脂、セルロース、デキストランなど）のいずれかであり、被覆成分が、金属酸化物（シリカ、アルミナなど）、高分子（セルロース、デキストラン、ポリアクリル酸など）、カップリング剤（シラン系、チタネート系、アルミネート系など）のいずれかであるとよい。被覆成分は、コア成分と同じ成分でもよい。
【００１９】
担体は、シート、シーブ、メンブラン、不定形粒子、球（ビーズ）、糸（ストランド）、磁性ビーズなどのいかなる形状であってもよいが、球状であることが好ましい。担体は磁性粒子であることが好ましい。
【００２０】
球（ビーズ）は、大きさは1mm程度で、プラスチックやセラミックなどの材質のものであるとよく、このような球（ビーズ）は、特開2000-346842号公報、特表平14-534657号公報などに記載されている。
【００２１】
磁性ビーズは、大きさは数十μmで、プラスチックやセラミックなどに鉄粉等を混ぜ、磁気化したものであるとよい。このような磁性ビーズは、特開平8-62224号公報（特許第3115501号明細書）、国際公開WO96/29602パンフレット、国際公開WO97/44671パンフレットなどに記載されている。
【００２２】
糸（ストランド）は、大きさは直径0.1mm程度で、樹脂系の材質のものであるとよく、このような糸は、特開2006-214759号公報、国際公開WO01/53831パンフレット、国際公開WO2003/7901パンフレットなどに記載されている。
【００２３】
核酸は、共有結合、化学吸着、物理吸着、電気的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス力、水素結合などにより、担体に吸着されうる。
【００２４】
カオトロピック塩およびアルコールによって、核酸が不溶化することで担体に吸着させることができる。
【００２５】
アルコールは、核酸を不溶化できるものであるとよく、エタノール、イソプロピルアルコール、n-プロパノール、n-ブタノール、2-ブタノール、それらの組み合わせなどを例示することができる。
【００２６】
カオトロピック塩としては、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジン、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、それらの組み合わせなどを例示することができる。
【００２７】
担体に吸着された核酸は、洗浄した後、溶出液中に溶出させ、回収することができる。回収した核酸を検出、定量することにより、ウイルスや病原菌の同定検査、感染初期の病原微生物の検出、感染源調査、さらに白血病や腫瘍の遺伝子レベルの診断などの様々な遺伝子検査を行うことができる。
【００２８】
本発明の核酸抽出方法は、自動装置において、制御されて、用いられてもよい。全自動核酸抽出装置としては、Magtration（登録商標） System 6GC、12GC及び12GC PLUSが市販されており（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）、これらを用いることができる。Magtrationとは、「磁石によるふるい分け」という意味を表す”Magnetic Filtration”を縮めた造語で、磁性体粒子の反応を自動化するために開発された技術（磁性体粒子ハンドリング技術）である。磁性粒子懸濁がディスポーザブルチップによってハンドリングされ、チップの外壁面に磁石を当てることで磁性粒子をチップ内壁面に補足して、固液分離を行うことができる。
【００２９】
本発明は、また、アニオン性高分子、カオトロピック塩、アルコールおよび担体を含む核酸抽出試薬を提供する。
【００３０】
アニオン性高分子、カオトロピック塩、アルコールおよび担体については、上述した。
【００３１】
本発明の核酸抽出試薬は、さらに、バッファーを含んでもよい。バッファーとしては、Tris-HCl、TE (Tris-HCl, EDTA)、リン酸緩衝液などを例示することができる。
【００３２】
本発明の核酸抽出試薬は、さらに、タンパク質分解酵素（例えば、Proteinase K）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、水、抗生物質（例えば、ProClin 300）、アジ化ナトリウムなどを含んでもよい。これらの成分は１つ又は２つ以上のウェル中に単一成分又は混合物として含有させ、プレパック試薬とすることができる。プレパック試薬は、さらに、他の消耗品（例えば、チップ、チップホルダー、スクリューキャップチューブなど）と組み合わせて、試薬キットとしてもよい。
【００３３】
プレパック試薬は、自動装置を用いて自動的に試料と各試薬を混合してもよい。磁石が設置された自動装置を用いて、磁性粒子を含む担体を液体と分離する自動工程を含んでもよい。
【００３４】
また、本発明の試薬は、カートリッジに封入されるキットとしてもよい。
【００３５】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されることはない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
[概要]
血清、生理食塩水からウイルス核酸を回収する為のより効果的なキャリアーとして、ポリアクリル酸（Poly (acrylic acid)）（以下、PAAc）が有効であることを見出した。
核酸抽出工程は、次の手順による。(1) 核酸を含む検体をグアニジン塩を含むLysis solutionで処理する。(2) 処理物を表層にヒドロキシル基やカルボキシル基またはシリカを有する担体およびアルコールを含むBinding bufferと混合する。このとき、担体に核酸が結合する。(3) 担体と液体成分を分離し、担体のみを得る。(4) 2-propanolを含む緩衝液を用いて担体を洗浄する。(5) 担体と液体成分を分離し、担体のみを得る。(6) 担体を溶出液（蒸留水またはTris-HCl）と混合し、溶出液中に核酸を得る（以下、「回収液」と記す）。
キャリアーは、上述の工程の(2)で添加し、核酸と担体の結合を補助、促進させる機能によって核酸回収効率を向上させる。
核酸抽出工程は、Magtration System 12GC PLUS（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いて行った。【００３７】
[実験方法・手順]
（キャリアーの評価）
コンセーラ（コントロール血清；ニッスイ）および生理食塩水180 μlに200 copies/μlのM13（大腸菌に感染するバクテリオファージ）をそれぞれ20 μl添加し、20 copies/μlとなった試料から、上記核酸抽出工程により、回収液を得た。このとき、キャリアー0.1 %(w/v)を核酸抽出工程(2)で添加した。得られたそれぞれの回収液から、下記 PCR条件によってreal time PCRでCt値を得た。また、対照として、キャリアーの代わりに蒸留水（DW）を用いて核酸抽出を行った。
（M13 DNAのreal time PCR）
コンセーラもしくは生理食塩水に添加されたウイルス200 μlを試料として、上記の核酸抽出操作を行った。得られたそれぞれの回収液につき、以下の条件で、real time PCRを行い、Ct値およびTmを得た。Templateは、抽出したM13KO7 DNAまたはM13KO7を用いた。
Real time PCR試薬SsoAdvanced SYBR Green SuperMix (BIORAD, 172-5261)を用い、次のプライマーを用いた。Forward Primer M13KO7-F 4984: 5’-GCTATCAGTTCGCGCATTAAAGAC-3’（配列番号１）（eurofins operon）、Reverse Primer M13KO7-R 5110: 5’-CATTGGCAGATTCACCAGTCACA-3’ （配列番号２） （eurofins operon）。Thermal cyclerとして、Applied Biosystems 7500 Fast real time PCRsystem : LifetechnologiesおよびThermal Cycler Dice Real Time System: TaKaRa TP800 S/N R-1387を用いた。PCR時の試薬調製および温度コントロールについて以下のように設定した。Thresholdは、Auto設定を用いた。【００３８】
【表１】
2015146737.tif 000003
【００３９】
【表２】
2015146737.tif 000004
【００４０】
（PAAc分子量分布と濃度）
平均分子量25000, 15000, 8000, 5100, 2100, 1200のPAAc（Sigma-Aldrich,16-1858, 416037, 416029, 81132, 81130）を、0.1 %(w/v) になるように最終濃度1/2000のProClin 300（Sigma-Aldrich, 48912-U）と10 mM Tris-HCl (pH 7.5)で調製した。各PAAc溶液を用いて、核酸抽出操作を行った。得られた回収液を、上述のPCR条件に従ってreal time PCRを行い、Ct値を得た。
平均分子量15000、8000、2100のPAAcは、2, 1, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 %(w/v)になるように最終濃度1/2000のProClin 300と10 mM Tris-HCl (pH 7.5)で調製した。各PAAc溶液を用いて、核酸抽出操作を行った。得られた回収液を、上述のPCR条件に従ってreal time PCRを行い、Ct値を得た。【００４１】
[結果・考察]
（PAAc分子量分布と濃度）
PAAc分子量について、平均分子量が1.2k, 2.1k, 5.1k, 8k, 15k, 25kのPAAcをそれぞれ0.1 %(w/v)に10 mM Tris HCl (pH 7.5)とProClin 300 (最終濃度0.05 % (x 2,000))で溶解し、生理食塩水中にスパイクしたM13 (20 copies/μl)の回収によってキャリアーとしての効果を確認した。図１左で示したように、分子量1200から25000の間で、分子量依存性は見られず、いずれの分子量においてもキャリアー効果を発揮したといえる。キャリアーの代わりにDWを用いたものはCt値が得られなかった。
また、分子量2.1k, 8k, 15kの三種で濃度依存性を評価したところ、いずれも0.1-1 %(w/v)でキャリアー効果を得られた（図１右）。PAAc濃度0.5 %(w/v)以下では、PAAc濃度の減少に伴ってCt値が向上した。2 %(w/v)ではCt値が最も高いキャリアー効果を得られた0.1〜1 %(w/v)の場合よりもCt値が2〜3高くなった。【００４２】
（実施例２）
本実施例では、ポリアクリル酸ナトリウムと類似の骨格を持つ高分子や性質が異なる高分子を用いて、核酸抽出における核酸キャリアーとしての効果を評価した。【００４３】
[実験方法・手順]
Table 1に示した各高分子を0.15 %(w/v)に蒸留水で調製し、PAAcの代わりに使用して、実施例１と同様の方法で核酸抽出操作を行った。【００４４】
【表３】
2015146737.tif 000005
M13 DNAのreal time PCRは、生理食塩水200 μlを試料とし、Lisis solutionに2×103cp/μl のM13KO7を10μl 添加して、核酸抽出操作を行い、PCR時の試薬調製を下記のように設定した（Thresholdは、100,000とした。）他は、実施例１と同様の方法でreal time PCRを行った。【００４５】
【表４】
2015146737.tif 000006
【００４６】
[結果・考察]
Poly (acrylic acid sodium salt)を含む13種類のポリマーをPoly (acrylic acid sodium salt)の代わりに使用し、核酸抽出を行った。Real-time PCRからCt値を得た（Table 2, 図２）。各高分子を用いて得られたCt値とキャリアーを用いずに抽出操作を行って得られたCt値（Ct without carrier）の差を算出した。また、この差が-1.0以下で、キャリアー効果を+、-1.0〜-0.5を+w、-0.5〜+0.5を±、+0.5以上を-と判定した。
Table 2の結果から、-COOHを官能基とするPoly (acrylic acid sodium salt)とCarboxy methyl cellulose sodium saltで＋と判定され、高いCarrier効果が得られた。アミノ基を多く持ち水溶液中で正電荷に帯電するPoly ethylene imineとpoly-L-lysineは、核酸の回収を阻害した。その他の骨格を持つものは核酸の回収に大きく影響しなかった。
さらに、水溶液中で負電荷に帯電するポリマーを用いて、同様にCt値を得た（Table 3, 図３）。同じく-COOHを官能基として持つPolyanetholesulfonic acid sodium salt、Poly(acrylic acid-co-maleic acid) solution、Poly-L-glutamic acid sodium saltの3つの高分子はいずれも＋として判定され、キャリアー効果として有効であることを示した。Poly ethylene-co-ethyl acrylate-co-maleic anhydrideやポリマロンのようなマレイン酸ポリマーは、±判定であり、-COOHを有する化合物であったとしてもマレイン酸のようにジカルボキシとなっているものではキャリアー効果が弱いことが明確となった。【００４７】
【表５】
2015146737.tif 000007
【００４８】
【表６】
2015146737.tif 000008
【００４９】
（実施例３）
キャリアーを添加するタイミングについて、PAAcを核酸と担体を結合させる直前で混合液に加えた工程（Original）、サンプルにPAAcを直接投与した工程（Carrier in sample）の2つの工程で核酸抽出操作を行い、PCRによって標的遺伝子を増幅した（N=3）。PAAcの投与タイミング以外については、実施例１と同じ条件で、試料を準備し、核酸抽出、PCRを行った。
PCR結果を表７に示した。Originalでは、Ct値が25.03±0.14だったのに対し、キャリアーを試料に添加した場合、26.79±0.04と、キャリアーとして効果を示さなかった。【００５０】
【表７】
2015146737.tif 000009
【００５１】
（実施例４）
本試薬組成において、担体に核酸を結合させるためにはアルコールを必要とする。キャリアーの使用によって、アルコールの必要性に対する影響を検討した。キャリアーが核酸回収能力をサポートする機能を発揮する条件として、使用するBinding buffer中の2-propanolを含む工程（Original）、含まない工程（Binding buffer without 2-propanol）でそれぞれ核酸抽出操作を行い、PCRによって標的遺伝子を増幅した（N=3）。2-propanolの有無以外については、実施例１と同じ条件で、試料を準備し、核酸抽出、PCRを行った。
PCR結果を表８に示した。Originalでは、Ct値が25.03±0.14だったのに対し、2-propanolを含まない場合、31.91±0.31と、キャリアーとして効果を示さなかった。キャリアーの効果を発揮する為には、Binding bufferとしてアルコールを含むことが必要であるといえる。【００５２】
【表８】
2015146737.tif 000010
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、担体を用いた核酸回収法において、核酸抽出効率を向上させることができる。本発明は、ウイルスや病原菌の同定検査、感染初期の病原微生物の検出、感染源調査、さらに白血病や腫瘍の遺伝子レベルの診断などの遺伝子検査に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
＜配列番号１＞
Forward Primer M13KO7-F 4984のヌクレオチド配列を示す。
5’-GCTATCAGTTCGCGCATTAAAGAC-3’
＜配列番号２＞
Reverse Primer M13KO7-R 5110のヌクレオチド配列を示す。
5’-CATTGGCAGATTCACCAGTCACA-3’
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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