(57)【要約】  本発明は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、蛍光タンパク質などを提供する。
2015080178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、蛍光タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載の蛍光タンパク質と他のタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の融合タンパク質の細胞内における蛍光の位置を測定することを含む、該融合タンパク質の細胞内における局在または動態を検出する方法。
【請求項７】
請求項５に記載の２以上の同一または異なる融合タンパク質によって形成される複合体の最大蛍光波長を測定することを含む、該融合タンパク質の複合体形成を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規蛍光タンパク質、該蛍光タンパク質をコードする核酸、発現ベクター、形質転換体、および該形質転換体を培養することを含む、該蛍光タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Green Fluorescent Protein (GFP)とは、2008年に下村脩、Marty Chalfy、Roger Tsienがノーベル化学賞を授賞したことで社会的にも有名になったタンパク質である。該タンパク質は、蛍光を発するオワンクラゲ(Aequorea victoria)が持つ蛍光タンパク質として下村が1979年に発見した。また、1994年にChalfyらがGFP遺伝子をクローンするだけで、大腸菌と線虫で蛍光タンパク質が生成されることを発見し、GFPを細胞生物学の有用なツールとして用いることができることを見出した。その後、GFPは酸化されるだけで蛍光を発するようになることが明らかになり、Tsienらが、多くの変異を導入することによって有用なGFPを開発し、蛍光発光の機構を明らかにした。【０００３】
現在では、サンゴやウナギなどの様々な発光生物から類似の構造を持つ蛍光タンパク質が発見されている。それらをコードする遺伝子を標的遺伝子と融合させることによって得られる融合タンパク質は、標的遺伝子にコードされるタンパク質の分布や挙動を光学的に観察したり、細胞内におけるpHやredox potentialの観察を可能にした。このように、現在多くのGFPとその類似体がレポーター分子として用いられている。【０００４】
GFPとその類似体は、Fluorescent Protein (FP)と総称される。FPは、β canと呼ばれるβ sheetで取り囲まれた円筒構造内に、蛍光基を構成する数個のアミノ酸残基が閉じ込められた独特の構造を持つ。例えば、Aequorea victoria GFPでは、Ser65-Tyr66-Gly67からなるアミノ酸によって蛍光基が構成される。つまり、FP mRNAがポリペプチドとして翻訳された後、1)β can構造が形成（構造形成は翻訳中においても一部生じる）され、2)β can構造が酸化されることによって蛍光基が形成される。様々なFPの蛍光基の形成過程は非特許文献１〜３に記載されている。【０００５】
1分子の蛍光基からの蛍光強度は、蛍光基の「モル吸光係数×量子効率」に比例するが、ほとんどのFPのモル吸光係数や量子効率はオーダー的に差が少なく数倍程度である。従って、細胞中のFPの蛍光強度は、FPの種類よりも成熟した蛍光基の数や濃度により強く依存する。まず、FPの細胞内タンパク質としての絶対量は、発現定常期では、発現と構造形成のrateと分解rateで決定される。蛍光が強いFPの一つとしてSuper Folder GFP（非特許文献４）が報告されており、該タンパク質は翻訳後のポリペプチド鎖の巻き戻り（β can構造形成）が最適となるようにコドンが選択されている。これは、巻き戻り速度がFPの蛍光強度に関係することを示す証拠である。しかし、ある程度巻き戻りが早い場合、蛍光基の形成がFPの蛍光強度を決定するファクターとなる。この蛍光基は全ての場合酸化反応によって形成されるので、FPが蛍光を生じるためには、細胞は酸化環境に有ることが望ましい。しかし、分裂を盛んに行っている細胞は還元環境にあり、蛍光基の形成が遅くなっている可能性がある。大腸菌内で発現させたFPについても、増殖期では暗く、静止期では明るくなることがよく知られている。Tsienが作成した改変GFP(Ser65をThr65に置換)はこの蛍光基の形成過程が早くなっており、結果として該改変GFPは明るくなっている。このことは、蛍光基の形成がFPの蛍光強度に関係することを示す証拠である。【０００６】
また、励起を続けると全ての蛍光基は、遅かれ早かれ光化学反応を起こして退色(photo-bleaching)する。ほとんどの場合、光化学反応は非可逆的反応なので、光酸化反応の一種と推定されている（非特許文献１、５、６）。この退色を防ぐには、例えば、有機色素の場合、酸素分子との接触を断つために、有機色素を樹脂の中に包埋するなどの手段を採用する必要がある。しかし、水溶液中でしか構造が維持できないFPの場合、そのような手段をとることは不可能である。有機色素に比べれば、FPは蛍光基がβ can構造で保護されているために退色しにくいが、それでも数秒程度で退色する。蛍光顕微鏡を用いた実験では、焦点を合わせる操作に数秒を要するため、その間に多くのFPは退色してしまい、蛍光観察には不都合であった。従って、現状では、in vitroやin vivoにおいて退色が遅く、蛍光強度が強いFPの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zimmer, M., Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior. Chem. Rev.2002, 102, 759-781.
【非特許文献２】Mizuno, H. et al., Photo-Induced Peptide Cleavage in the Green-to-Red Conversion of a Fluorescent Protein. Mol. Cell 2003, 12, 1051-1058.
【非特許文献３】Bourgeois, D. et al., Reversible Photoswitching in Fluorescent Proteins: a Mechanistic View. IUBMB Life 2012, 64, 482-491.
【非特許文献４】Pedelacq, J.-D. et al., Engineering and Characterization of a Superfolder Green Fluorescent Protein. Nat. Biotechnol.2005, 24, 79-88.
【非特許文献５】Ito, Y. et al., A Novel Mutant of Green Fluorescent Protein with Enhanced Sensitivity for Microanalysis at 488 Nm Excitation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 264, 556-560.
【非特許文献６】Nagai, T. et al., A Variant of Yellow Fluorescent Protein with Fast and Efficient Maturation for Cell-Biological Applications. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 87-90.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来のFPよりも退色時間、蛍光強度に優れる新規蛍光タンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、redox potentialに感受性のある、蛍光強度の強いGFPを開発する過程で、偶然、他のGFPにない特色を持つ新規蛍光タンパク質を見出した。該新規蛍光タンパク質は、例えば、以下のような特徴を備える。(1)顕著に退色しにくい、(2)最大励起波長が493nm、最大蛍光波長が513nm、(3)二量体形成に伴い、単量体の場合に比べて、最大蛍光波長が12nm長くなる、(4)公知の蛍光強度の強いGFPであるGFP-UV4やVenusと同等の明るさをもつなど。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、蛍光タンパク質；
［２］［１］に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸；
［３］［２］に記載の核酸を含む、発現ベクター；
［４］［３］に記載の発現ベクターを含む、形質転換体；
［５］［１］に記載の蛍光タンパク質と他のタンパク質を含む、融合タンパク質；
［６］［５］に記載の融合タンパク質の細胞内における蛍光の位置を測定することを含む、該融合タンパク質の細胞内における局在または動態を検出する方法；
［７］［５］に記載の２以上の同一または異なる融合タンパク質によって形成される複合体の最大蛍光波長を測定することを含む、該融合タンパク質の複合体形成を検出する方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の蛍光タンパク質は、退色するまでの時間が長く、蛍光強度も強いため、in vivo またはin vitroでの試料中の蛍光観察が容易である。また、最大励起波長が493nm、最大蛍光波長が513nmであるため、標準的なB励起用ミラーセットで本発明の蛍光タンパク質の蛍光を観察することができる。さらに、二量体形成を介して、最大蛍光波長が12nm長くなるため、標的分子の二量体形成を確認するための有効なツールとして期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】改変pTrcプロモーター (pTrc-doプロモーター)の塩基配列（配列番号：４）を示す。一重下線部は左から-35 box, -10 box, 転写開始部位, 翻訳開始部位を示す。二重下線部は改変されたオペレータ部分を示す。
【図２】２−メルカプトエタノール処理(2-Me(+))または未処理(2-Me(-))のB-maggioをSDSポリアクリルアミドゲルで分離した後の染色ゲルを示す。
【図３】B-maggioの最大励起波長(493nm)および最大蛍光波長(513nm)ならびにTwin B-maggioの最大励起波長(510nm)および最大蛍光波長(525nm)を示す。
【図４】左図は、各波長の励起光によって励起されたB-maggioまたはTwin B-maggioの長波長側off-peak蛍光スペクトルを示す図である。右図は、各波長の励起光によって励起されたrpsB遺伝子(ribosome タンパクS2)にB-maggio遺伝子が挿入された大腸菌変異株(S2-B-maggio株)またはrpsJ遺伝子(ribosome タンパクS10)にB-maggio遺伝子が挿入された大腸菌変異株(S10-B-maggio株)の長波長側off-peak蛍光スペクトルを示す図である。蛍光スペクトルの強度は、各試料のV励起光より長波長側での最も強い蛍光のピークを１とした場合の相対強度で示されている。図中の数字は各励起光の波長を示す。G励起光による励起後の観察波長(>575 nm)における相対蛍光量は、Twin B-maggioおよびS10-B-maggio株の方がB-maggioおよびS2-B-maggio株より多いことを示している。
【図５】右図はE. coliの100Sリボソームの構造概念図を示す。30Sサブユニットと50Sサブユニットから70Sリボソームが構成され、その二量体が100Sリボソームとなる。30Sサブユニット中の２つのタンパク質のS2、S10は、共に二量体の接触面に存在する。S2にB-maggioを融合させると、100Sリボソームの形成が阻害されるが、S10では阻害されない。中央図は、クライオ電子顕微鏡法(cryoEM)を用いて、電子顕微鏡トモグラフィーで得られた、低解像度のリボソームの二量体構造に、高解像度のリボソーム結晶構造(PDB3V22)を、最適になるようにフィッティングした再構成図を示す。左図は70Sリボソームが二量体化した場合における、S10タンパク質融合B-maggioの空間配置を示す。S=SはB-maggio間のジスルフィド結合の位置を示す。
【図６】増殖期(培地に接種後３時間)または静止期(培地に接種後１８時間)のS10-B-maggio株が発する蛍光を各波長の励起光で励起することによって光学的に検出したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、蛍光タンパク質（以下、本発明の蛍光タンパク質ともいう）を提供する。該蛍光タンパク質は、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００１４】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸(Phe, Trp, Tyr)、脂肪族アミノ酸(Ala, Leu, Ile, Val)、極性アミノ酸(Gln, Asn)、塩基性アミノ酸(Lys, Arg, His）、酸性アミノ酸（Glu, Asp)、水酸基を有するアミノ酸(Ser, Thr)、側鎖の小さいアミノ酸(Gly, Ala, Ser, Thr, Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら, Science, 247: 1306-1310 (1990)を参照）。
【００１５】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら,J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の特性を有するタンパク質などが好ましい。ここで「特性」とは、退色時間、蛍光強度、最大励起波長、最大蛍光波長、ならびに二量体形成に伴う最大励起波長および最大蛍光波長のシフトなどをいう。二量体形成に伴う最大励起波長および最大蛍光波長のシフトについて、より詳細には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質は、単量体の場合、最大励起波長が493nm、最大蛍光波長が513nmであり、二量体の場合、最大励起波長が510nm、最大蛍光波長が525nmである。従って、本発明の蛍光タンパク質同士が二量体を含む複合体を形成した場合、単量体に比べて、最大励起波長が17nm、最大蛍光波長が12nm長くなる。また、「実質的に同質」とは、それらの特性が定性的（例えば、生化学的または生理学的）に同じであることを示す。したがって、前記特性は同等であることが好ましいが、これらの特性の程度（例えば、退色時間、蛍光強度の場合、約0.1〜約10倍、好ましくは約0.5〜約2倍に収まる。また、最大励起波長、最大蛍光波長の場合は、±10nm、好ましくは±5nmに収まる。最大励起波長のシフトの場合、約10nm〜約25nm、好ましくは約15nm〜約20nmに収まる。最大蛍光波長のシフトの場合、約5nm〜約20nm、好ましくは約10nm〜約15nmに収まる。）は異なっていてもよい。
前記特性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１７】
また、本発明の蛍光タンパク質には、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列も含まれる。アミノ酸配列が置換されている場合、その置換の位置は、本発明の蛍光タンパク質の前記特性が保持される限り特に限定されないが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４８番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号６４番目のアミノ酸（Leu）、アミノ酸番号６５番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１５３番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１６３番目のアミノ酸（Ala）、アミノ酸番号２０４番目のアミノ酸（Cys）、アミノ酸番号２０５番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号２０６番目のアミノ酸（Ala）、アミノ酸番号２０７番目のアミノ酸（Leu）またはアミノ酸番号２０８番目のアミノ酸（Ser）が好ましく、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４８番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号６４番目のアミノ酸（Leu）、アミノ酸番号６５番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１５３番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１６３番目のアミノ酸（Ala）またはアミノ酸番号２０４番目のアミノ酸（Cys）がより好ましい。従って、より詳細には、本発明の蛍光タンパク質には、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４８番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号６４番目のアミノ酸（Leu）、アミノ酸番号６５番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１５３番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１６３番目のアミノ酸（Ala）、アミノ酸番号２０４番目のアミノ酸（Cys）、アミノ酸番号２０５番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号２０６番目のアミノ酸（Ala）、アミノ酸番号２０７番目のアミノ酸（Leu）およびアミノ酸番号２０８番目のアミノ酸（Ser）（好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４８番目のアミノ酸（Ser）、アミノ酸番号６４番目のアミノ酸（Leu）、アミノ酸番号６５番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１５３番目のアミノ酸（Thr）、アミノ酸番号１６３番目のアミノ酸（Ala）およびアミノ酸番号２０４番目のアミノ酸（Cys））からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が置換されたタンパク質を含み、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の特性を有するタンパク質も含まれる。
あるいは、アミノ酸配列の置換位置としては、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１４６番目のアミノ酸（Asn）、アミノ酸番号１４７番目のアミノ酸（Ser）であってもよい。この場合、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０４番目のCysはGlnに置換されていることが好ましい。従って、より詳細には、本発明の蛍光タンパク質には、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１４６番目のアミノ酸（Asn）、アミノ酸番号１４７番目のアミノ酸（Ser）の少なくとも１つのアミノ酸が置換されたタンパク質を含み、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の特性を有するタンパク質も含まれてよい。特に、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０４番目のCysをGlnに置換し、かつアミノ酸番号１４７番目のSerをCysに置換したタンパク質は、二量体形成による最大蛍光波長のシフトについて、光感受性が高い。なお、置換に用いられるアミノ酸としては、上記の「類似アミノ酸」が好ましく用いられる。
【００１８】
そのほか、本発明の蛍光タンパク質には、例えば、（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入または欠失されている場合、その挿入または欠失の位置は、本発明の蛍光タンパク質の特性が保持される限り特に限定されない。
【００１９】
本発明の蛍光タンパク質は、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明の蛍光タンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛍光タンパク質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
（２）SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
【００２０】
このようにして得られた本発明の蛍光タンパク質は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる本発明の蛍光タンパク質が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に本発明の蛍光タンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２１】
さらに、本発明の蛍光タンパク質は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から蛍光タンパク質を分離精製することによって製造することもできる。本発明の蛍光タンパク質をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の細胞もしくは組織より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅した全長GFP cDNA(例えば、GenBank Accession No. U17997のヌクレオチド番号289-1005など)を、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（TAKARA BIO INC.）、MutanTM-K（TAKARA BIO INC.）等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００２２】
本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含むDNAなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むDNAとしては、例えば、（１）配列番号：１で表される塩基配列において、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を変化させないような変異(silent mutation）を有する塩基配列を含むDNA、または（２）配列番号：１で表される塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記した本発明の蛍光タンパク質と実質的に同質の特性を有するタンパク質をコードするDNAなどが含まれる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００２３】
本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAは、前記の通り、オワンクラゲ由来の全RNAもしくはmRNAを鋳型として用い、RT-PCR法によって直接増幅した全長GFP cDNAを、該cDNAの塩基配列の一部分であって、所望の変異を有する合成DNAプライマーを用いて、上記の方法に従い増幅することによってクローニングすることができる。
【００２４】
本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、前記の蛍光タンパク質をコードするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。あるいは、後述の実施例の通り、GFPUVをコードするDNAを含む発現ベクター(配列番号：３)を鋳型として、配列番号：５〜１２のプライマーで増幅することによって得られる、発現ベクターを含むDNA断片を混合し、配列番号：５及び６のプライマーセットを用いて増幅した断片を直接大腸菌に形質転換することによって、本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを取得することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pTrc）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110, pTP5, pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19, pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pSRα, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV, AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、β-アクチンプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、trcプロモーター、trc改変プロモーターなどが用いられる。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAの５’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
【００２６】
上記した蛍光タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛍光タンパク質を製造することができる。
宿主としては、例えば、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物などの発現に適したものが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1，エシェリヒア・コリJM103，エシェリヒア・コリJA221，エシェリヒア・コリHB101，エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHst08などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114，バチルス・サブチルス207-21などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
【００２７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。
【００２８】
動物細胞としては、例えば、COS-7, Vero, CHO, CHO(dhfr-), CHO-K1, L, AtT-20, GH3, FL, HEK293, NIH3T3, Balb3T3, FM3A, L929, SP2/0, P3U1, B16, P388などの細胞が用いられる。
動物としては、トランスジェニック系の確立した哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ）もしくはニワトリなどが挙げられる。
【００２９】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻，2110 (1972)やGene， 17巻，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology, 194巻, 182-187 (1991) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology, 6巻, 47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology，52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
動物は、例えば、トランスジェニック動物の開発（シーエムシー出版）, (2001) に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００３０】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。転換体の培養は、通常約１５〜約４３℃で、約３〜約２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。形質転換体の培養は、通常約30〜約40℃で、約6〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20〜約35℃で、約24〜約72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Mediumに非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜約5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM），ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM），RPMI 1640培地，199培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物である場合、遺伝子導入した受精卵から、常法に従ってトランスジェニック動物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動物の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に本発明の蛍光タンパク質を製造せしめることができる。
【００３１】
前記形質転換体を培養して得られる培養物から本発明の蛍光タンパク質を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、本発明の蛍光タンパク質を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、本発明の蛍光タンパク質が菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれる本発明の蛍光タンパク質の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００３２】
かくして得られる本発明の蛍光タンパク質の存在は、該蛍光タンパク質に対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の蛍光タンパク質と他のタンパク質を含む、融合タンパク質（以下、本発明の融合タンパク質ともいう）を提供する。本発明の融合タンパク質の取得方法については特に制限はなく、本発明の蛍光タンパク質と同様、化学的または生化学的に合成されたタンパク質でもよいし、形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００３４】
本発明の融合タンパク質は、本発明の蛍光タンパク質と他のタンパク質を含む限りどのような構成であってもよいが、例えば、本発明の蛍光タンパク質−他のタンパク質または他のタンパク質−本発明の蛍光タンパク質の順番で融合されていてよい。また、両タンパク質の間は公知の適当なリンカー配列で連結されていてもよい。また、本発明の融合タンパク質が形質転換体から産生される場合は、本発明の蛍光タンパク質と同様、本発明の融合タンパク質をコードするDNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結し、適当な宿主細胞に形質転換することにより産生することができる。
【００３５】
本発明の蛍光タンパク質と融合させる他のタンパク質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞質基質、細胞内オルガネラ（例、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなど）または細胞膜などに局在するタンパク質、複合体を形成するタンパク質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。
【００３６】
また、本発明の蛍光タンパク質は、レポータータンパク質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光タンパク質をコードするDNAが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光タンパク質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
【００３７】
上記のようにして得た、本発明の融合タンパク質または該タンパク質を発現する発現ベクターを細胞内に導入し、細胞内における蛍光の位置を測定することにより、該融合タンパク質の細胞内における局在または動態を検出することが可能になる。
【００３８】
例えば、本発明の蛍光タンパク質と融合させる他のタンパク質として細胞内オルガネラに特異的なタンパク質を用いて、細胞内において蛍光を検出できる位置を調べることによって、該タンパク質の核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどにおける分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
【００３９】
あるいは、２以上の同一または異なる本発明の融合タンパク質または該タンパク質を発現する発現ベクターを細胞内に導入し、細胞内における最大蛍光波長のシフト（最大蛍光波長が単量体の場合と比べて約5nm〜約20nm、好ましくは約10nm〜約15nm、最も好ましくは約12nm長くなる）を検出することにより、該融合タンパク質の複合体形成を検出することが可能になる。また、本方法は、試験管内などにおける２以上の同一または異なる本発明の融合タンパク質を観察することによっても該融合タンパク質の複合体形成を検出することができる。
【００４０】
例えば、本発明の蛍光タンパク質と融合させる他のタンパク質として複合体を構成するタンパク質を用いて、最大蛍光波長が長くなっているか否かを調べることによって、細胞内または試験管内で該タンパク質の複合体形成を観察できる。
【００４１】
本発明の蛍光タンパク質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（Olympus/IX71）や画像解析装置（Princeton Instruments/WinSpec 32）などを用いて行うことが可能である。顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズまたは油浸レンズを用いることができる。
【００４２】
フィルターセットは蛍光タンパク質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光タンパク質は、単量体の場合、最大励起波長が493nm、最大蛍光波長が513nmであり、二量体の場合、最大励起波長が510nm、最大蛍光波長が525nmであることから、励起光470-495nm、蛍光510-550nm程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべく、高感度冷却CCDカメラを使用することが好ましい。冷却CCDカメラは、CCDを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
【００４３】
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光タンパク質、融合タンパク質、DNA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は複合体形成の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
【００４４】
蛍光タンパク質又はDNAなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。【００４６】
実施例１  変異蛍光タンパク質発現ベクターの作成
本発明のGFP遺伝子(以下、B-maggio遺伝子;配列番号：１)を持つプラスミド(pTrc-do-b-maggio)を作成した。まず、pTrc99Aベクターのプロモーターを改変したpTrc-doベクターに、GFPuv遺伝子を連結したベクター(pTrc-do-gfpuv)(配列番号：３)を作成した。なお、pTrc-doプロモーター（図１;配列番号：４）は、lac由来のLacIレプレッサーが結合するoperatorに2塩基の変異を入れてLacIが結合しないように改変されたプロモーターである。pTrc-do-gfpuvを鋳型として、以下のプライマーセットを用いたPCRにより４つの変異が入ったDNA断片を増幅した。
プライマーセット１(gfp_C48S_R, gfp_Q204C_F)
プライマーセット２(gfp_C48S_F, gfp_FS65LT_R)
プライマーセット３(gfp_FS65LT_F, gfp_F99S_R)
プライマーセット４(gfp_F99S_F, gfp_Q204C_R)【００４７】
【表１】
2015080178.tif 000003
【００４８】
増幅した4つの断片を、電気泳動で確認し、目的のDNA断片を精製した。4つのDNA断片を混合し、gfp_C48S_Rおよびgfp_C48S_FのプライマーセットでPCRにより増幅したDNA断片を大腸菌HST08にエレクトロポレーションにより形質転換し、アンピシリンにより選択した。得られたコロニーのほとんどは、既知のGFPと比べて強い蛍光を発した。【００４９】
実施例２  蛍光タンパク質のin vitro退色時間
精製した各GFP（B-maggio（配列番号：２）、S65TGFP、Venus）溶液（50mM リン酸buffer(pH7.2)）をガラス板に挟み（OD<<0.05であるため自己光吸収によるシールド効果や拡散は無視出来る）、常温で前記GFPの光量を測定した。蛍光顕微鏡として、Olympus PlanApoUVx100の油浸対物レンズを備えたOlympusIX-71を用いた。またミラーセットとしては、NIBFユニット（励起475-495 nm, ダイクロイック505 nm, 透過510-550 nm）を用いた。光量はEMCCD Princeton E2V96B で16bit測定し、Image Jを用いて、Kaleida Graphで、光量の時間変化I(t)を、I(t) = a+bt+cexp(-t/d) にfit、収束条件を残差変化＜1%としてa、b、c、dを求めた。aは背景光強度、bは熱膨張等による、消光過程よりもゆっくりした光学系の機械的ドリフトによる時間変化、cは消光するGFPの最大蛍光強度（光路中の分子数に比例）、dが退色時間(decay time)を示す。得られた退色時間を表２に示す。B-maggioは、Venusに比べて、in vitroで２５０倍長く蛍光が続くことが分かった。【００５０】
【表２】
2015080178.tif 000004
【００５１】
実施例３  蛍光タンパク質のin vivo退色時間
前記pTrc-do-b-maggioに加えて、各GFP（Venus、GFPUV、GFPUV4、Super Folder）遺伝子を持つプラスミドを作成した。前記GFP遺伝子は、B-maggio遺伝子と同様に、pTrc-doベクターに連結し、遺伝子発現するように設計した。前記プラスミドで大腸菌Hst08株を形質転換し、得られた各形質転換株を、LB Lenox培地で36 hr 培養した。培養液をアミノコートスライドガラス（Matsunami MAS S9441）に10分間接触させ、水洗した後、カバーガラスで封入して実施例２と同じ測光系で常温にて光量を測定した。また実施例２と同様に解析を行った。得られた退色時間を表３に示す。B-maggioは、Venusに比べて、in vivoで１１０倍長く蛍光が続くことが分かった。【００５２】
【表３】
2015080178.tif 000005
【００５３】
実施例４  複合体形成
精製したB-maggioを２−メルカプトエタノールで処理(2-Me(+))または処理せず(2-Me(-))に、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルを染色した（図２）。その結果、２−メルカプトエタノールで処理しなかったB-maggio(28.5Kda)には、２種類の分子量（50〜60Kda付近、25〜30Kda付近）のタンパク質が確認された。一方、２−メルカプトエタノールで処理したB-maggioには、１種類の分子量（25〜30Kda付近）のタンパク質のみが確認された。従って、B-maggioは、ジスルフィド結合による二量体を形成することが示唆された。【００５４】
実施例５  二量体形成に伴う赤色蛍光の放出
B-maggioは励起スペクトルとして493nmにピークを有し、蛍光スペクトルとして513nmにピークを有することが確認できた(図３)。緑色蛍光は、蛍光顕微鏡を用いてB励起用のミラーセットで容易に観察できた。しかし、B-maggioをG励起用ミラーセット(例：Olympus MWIG2、励起530-550nm, 570nmダイクロイックミラー, 575nm付近を透過)を用いて観察した場合、赤色蛍光をほとんど観察出来なかった。また同様に、B-maggioを強発現させた大腸菌においても、前記G励起用ミラーセットでは赤色蛍光はほとんど見られなかった。しかし、B-maggioを強発現させた大腸菌を、より短波長のB励起光やＶ励起光で励起した後に、前記G励起用ミラーセットを用いて観察した場合、赤色蛍光を観察できるようになった。さらに、B-maggioを強発現させた大腸菌を培養する際に、２−メルカプトエタノールと同じ還元剤であるジチオトレイトール(DTT)を培地に加えた場合、赤色蛍光は観察できなかった。従って、B-maggioは二量体形成を通じて、B励起光やＶ励起光で励起することによって赤色蛍光を放出する可能性が示された。【００５５】
実施例６  二量体B-maggioの最大蛍光波長の遷移
上記の可能性を検証するために、２分子のB-maggioをリンカー配列で連結したTwin B-maggioを作製した。具体的には、一方のB-maggioのC末端の10残基と他方のB-maggioのN末端の5残基が、二量体構造を持つ蛍光タンパク質であるtdTomatoのリンカー配列20残基で置換・連結された二量体B-maggioを発現する発現ベクターを設計した。Twin B-maggioは、単量体B-maggioに対して、最大蛍光波長が12 nm長くなっていた（図３）。また、G励起光による励起後の観察波長(>575 nm：赤色)における相対蛍光量は、Twin B-maggio の方がB-maggioより多かった。また、リンカー配列を介した二量体であるため、20 mM ２−メルカプトエタノールの有無によらず赤色蛍光を観察できた。以上の点から、単量体B-maggioは、二量体形成を通じて、赤色蛍光を放出することが証明された。【００５６】
実施例７  B-maggioのhighliter proteinとしての検証
細菌は、静止期において70Sリボソームの二量体を形成することが知られている。しかし、この二量体形成は、超遠心分析によってのみ検出され、顕微鏡下の1細胞生物学では、いままで検出することができなかった。今まで蓄積された構造生物学の知見(70SリボソームとGFPの構造)から、B-maggioを70SリボソームのS10タンパク質のC末端に融合すると、70Sリボソームの二量体形成を通じて、融合した２つのB-maggioが互いに二量体形成と似た空間配置を取る可能性が考えられた（図５）。
そこで、染色体のrpsJ遺伝子(ribosome タンパクS10)にB-maggio遺伝子を挿入した大腸菌変異株(S10-B-maggio株)および染色体のrpsB遺伝子(ribosome タンパクS2)にB-maggio遺伝子を挿入した大腸菌変異株(S2-B-maggio株)を作製した。S10-B-maggio株は、野生株と同様に増殖したが、S2-B-maggio株は静止期が短縮されるため早期に死滅した。増殖期には100Sリボソームは形成されないため、B励起光でS10-B-maggio株を励起した後に、G励起光で励起し、観察しても赤色蛍光は検出出来なかった(図６)。しかし、100Sリボソーム形成がおこる静止期には、B-maggioの二量体が形成されている可能性が構造生物学から示される。そこで、この時期にB励起光でS10-B-maggio株を励起した後に、G励起光で励起して細胞懸濁液の蛍光を測定してみると、赤色の蛍光が観察された。また、同じ処理をした、100Sリボソーム形成の出来ないS2-B-maggio株では、この蛍光は同時期でも観察出来なかった。この赤色蛍光は、B、ＶまたはＵ励起光での励起が必要条件であった。すなわち、二量体を形成したB-maggioは、予めB、ＶまたはＵ励起光で励起後、G励起光で励起することによって赤色蛍光が観察された。また、S10-B-maggio株をLB培地で培養、リボソームが100Sを形成している時間帯の細胞を採取し、M9培地に懸濁し、1mm x 1mm セルで観察を行った。その結果、100Sを形成出来ないS2-B-maggio株に比べて、G励起光による励起後の観察波長(>575 nm)における相対蛍光量が多かった。従って、細胞内においても単量体B-maggioは、二量体形成を通じて、赤色蛍光を放出することが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の蛍光タンパク質を用いることにより、in vivo またはin vitroでの試料中の蛍光観察を容易にすることができる。また、該蛍光タンパク質の蛍光は、標準的なB励起用ミラーセットで観察可能である。さらに、二量体形成を介して、最大蛍光波長が12nm長くなるため、標的分子の二量体形成を容易に確認することができる。
本出願は、日本で出願された特願2013-246642（出願日：平成25年11月28日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
2015080178.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015080178.tif 000010
【図６】
2015080178.tif 000011
【配列表】
2015080178000001.app
【国際調査報告】
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2015080178.tif 000013
2015080178.tif 000014
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