(57)【要約】  「白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配したとき、二塩化メチレンに分配される所定の分配物」、「所定の分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すとき、シリカゲルカラムから溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物」又はリナカンチンＣを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤、及び、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品。  本発明によれば、優れた神経細胞死抑制作用を有する神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤及び抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品を提供可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配するとき、
前記二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項２】
白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すとき、
シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
請求項２に記載の神経細胞死抑制剤において、
前記溶出溶媒は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：無水メタノール＝３：４：２の比率からなる溶出溶媒である神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
請求項３に記載の神経細胞死抑制剤において、
前記所定の分画物は、前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いるシリカゲルの体積に対して０．１倍〜４倍の体積の前記溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物である神経細胞死抑制剤。
【請求項５】
請求項４に記載の神経細胞死抑制剤において、
前記所定の分画物は、前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いる前記シリカゲルの体積に対して０．２倍〜２．５倍の体積の前記溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物である神経細胞死抑制剤。
【請求項６】
リナカンチンＣのみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有する抗アルツハイマー病剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有する抗脳機能低下剤。
【請求項９】
請求項７に記載の抗アルツハイマー病剤又は請求項８に記載の抗脳機能低下剤を含有し、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品。
【請求項１０】
白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、
前記エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、
前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物を得る第３工程とをこの順序で含む、前記所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法。
【請求項１１】
白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、
前記エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配して、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、
前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配して、前記二塩化メチレンに分配される分配物を得る第３工程と、
前記二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して、シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物を得る第４工程とをこの順序で含む、前記所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品及び神経細胞死抑制剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国の急激な高齢化に伴い、認知症の患者が増加している。認知症の患者数は、認知症に対する画期的な予防法及び治療法が確立されない限り、今後も増え続けると予想されている。このため、医学的な観点だけではなく、行政の観点からも認知症の予防法及び治療法が希求されている。【０００３】
ところで、認知症の原因となる疾患には様々なものがあるが、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症）、レビー小体型認知症及び脳血管性認知症の三種類がその多くを占めているとされる。その中でもアルツハイマー病は患者数が多く、かつ、根本的な予防法及び治療法が確立されていないため、現在もアルツハイマー病について様々な研究が行われている。【０００４】
アルツハイマー病のメカニズムとしては、アミロイドカスケード仮説が広く支持されている。アミロイドカスケード仮説とは、脳にアミロイドタンパク質であるアミロイドβが蓄積し、その結果、アルツハイマー神経原線維変化、直接的又は間接的な毒性による神経細胞の死滅や脱落等が発生し、それに伴って認知症の諸症状が発生するという仮説である。当該仮説は現在のところ広く支持されており、予防法及び治療法の開発研究における指針となっている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００５】
従来、アルツハイマー病の治療には、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン等が用いられている（例えば、非特許文献２参照。）。上記のような物質を有効成分として含有する抗アルツハイマー病剤によれば、認知症の症状の進行を抑制することが可能となる。【０００６】
ところで、白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ  (Ｌ．)  Ｋｕｒｚ。白鶴霊芝草ともいう。）は、インド南部デカン高原の原産とされるリナカンサス属キツネノマゴ科に属する常緑小低木である。白鶴霊芝の全草は駆虫、消炎、皮膚真菌に対する抗菌作用があることが知られ（例えば、非特許文献３参照。）、主に中国、台湾等において、また、最近では日本国において漢方薬や食品として用いられている。その他、本出願人による以前の出願で、白鶴霊芝に活性酸素消去能があること（例えば、特許文献１参照。）、排泄促進作用があること（例えば、特許文献２参照。）、抗アレルギー作用があること（例えば、特許文献３参照。）及び抗腫瘍作用があること（例えば、特許文献４参照。）等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１４３０９１号公報
【特許文献２】特開平９−１６９６６２号公報
【特許文献３】特開２００１−１０９６４号公報
【特許文献４】特開２００２−５３４８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】実験医学、Ｖｏｌ．２６  Ｎｏ．１６、２００８年１０月号、２５５０頁、羊土社、２００８年１０月１日発行
【非特許文献２】認知症の最新医療、Ｖｏｌ．４  Ｎｏ．２、２０１４年４月号、５８〜６３頁、フジメディカル出版、２０１４年４月２５日発行
【非特許文献３】原色牧野和漢薬草大図鑑、４９２頁、北隆館、１９８８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、白鶴霊芝の抽出物から所定の方法により得られる所定の分配物、所定の分画物又は白鶴霊芝に含有されるリナカンチンＣがアミロイドβの毒性に対する神経細胞死抑制作用を有することは知られていない。【００１０】
そこで、本発明は、優れた神経細胞死抑制作用を有する神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤及び抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品を提供することを目的とする。また、優れた神経細胞死抑制作用を有する神経細胞死抑制剤を製造することが可能な神経細胞死抑制剤の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アルツハイマー病の予防又は治療に用いることが可能であると考えられるものの１つである、アミロイドβの直接毒性に対する神経細胞死抑制作用を有するものについて鋭意研究を行った結果、白鶴霊芝の抽出物から所定の方法により得られる所定の分配物又は所定の分画物、及び、白鶴霊芝に含有されるリナカンチンＣに神経細胞死抑制作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、下記の事項により構成される。
なお、以下の説明において特段の記載がなければ、溶媒の比率は体積で示している。【００１２】
［１］白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配するとき、前記二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。【００１３】
［２］白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すとき、
シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。【００１４】
［３］上記［２］に記載の神経細胞死抑制剤において、前記溶出溶媒は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：無水メタノール＝３：４：２の比率からなる溶出溶媒である神経細胞死抑制剤。【００１５】
［４］上記［３］に記載の神経細胞死抑制剤において、前記所定の分画物は、前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いるシリカゲルの体積に対して０．１倍〜４倍の体積の前記溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物である神経細胞死抑制剤。【００１６】
［５］上記［４］に記載の神経細胞死抑制剤において、前記所定の分画物は、前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いる前記シリカゲルの体積に対して０．２倍〜２．５倍の体積の前記溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物である神経細胞死抑制剤。【００１７】
［６］リナカンチンＣのみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。【００１８】
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有する抗アルツハイマー病剤。【００１９】
［８］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有する抗脳機能低下剤。【００２０】
［９］上記［７］に記載の抗アルツハイマー病剤又は上記［８］に記載の抗脳機能低下剤を含有し、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品。【００２１】
［１０］白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、前記エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物を得る第３工程とをこの順序で含む、前記所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法。【００２２】
［１１］白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、前記エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配して、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配して、前記二塩化メチレンに分配される分配物を得る第３工程と、前記二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して、シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物を得る第４工程とをこの順序で含む、前記所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、後述する試験例からもわかるように、優れた神経細胞死抑制作用を有する神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品を提供することができる。
また、本発明によれば、優れた神経細胞死抑制作用を有する神経細胞死抑制剤の製造方法を提供することが可能となる。【００２４】
なお、上記［１］については、例えば、「以下の所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤を製造するための、前記所定の分配物の有効成分としての使用であって、白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配するとき、前記二塩化メチレンに分配される分配物である前記所定の分配物。」のように表現することもできる。
また、上記［２］については、例えば、「以下の所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤を製造するための、前記所定の分画物の有効成分としての使用であって、白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すとき、シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である前記所定の分画物。」のように表現することもできる。
また、上記［６］については、例えば、「リナカンチンＣのみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤を製造するための、前記リナカンチンＣの有効成分としての使用。」のように表現することもできる。
また、上記［７］については、例えば、「抗アルツハイマー病剤を製造するための、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤の有効成分としての使用。」のように表現することもできる。
また、上記［８］については、例えば、「抗脳機能低下剤を製造するための、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤の有効成分としての使用。」のように表現することもできる。
また、上記［９］については、例えば、「抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品を製造するための、上記［７］に記載の抗アルツハイマー病剤又は上記［８］に記載の抗脳機能低下剤の有効成分としての使用。」のように表現することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】白鶴霊芝から所定の分配物及び所定の分画物を分配・分画した手順を示すフローチャートである。
【図２】白鶴霊芝からリナカンチンＣを単離した手順を示すフローチャートである。
【図３】試験例の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の神経細胞死抑制剤、抗アルツハイマー病剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病作用又は抗脳機能低下作用を有する医薬品又は食品及び神経細胞死抑制剤の製造方法について説明する。
【００２７】
本発明の「白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配するとき、二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤」は、本発明の「白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、前記二塩化メチレンに分配される分配物である所定の分配物を得る第３工程とをこの順序で含む、所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法」により得ることができる。
【００２８】
本発明における所定の分配物は、記載された条件を満たす限り種々の条件で得ることができる。以下、用いることができる方法等について説明する。
なお、本明細書において「分配物」とは、精製物であって液−液分配により得られるもののことをいう。
また、本明細書において「所定の分配物のみを有効成分として含有する」とは、神経細胞死抑制作用を有する有効成分として所定の分配物のみを含有することをいい、有効成分ではない成分（各種溶媒や補助的な添加剤等）を含有することを否定しない。
【００２９】
白鶴霊芝については、原料である白鶴霊芝の葉、茎、根、花等を、適当な時期に採取した後、そのままのもの、又は、通常通風乾燥等の乾燥工程に付し、抽出原料としたものを用いることができる。抽出原料としての白鶴霊芝は、粉砕若しくは細切して用いることが好ましい。
【００３０】
エタノールによる抽出は、白鶴霊芝及びエタノールを用いる限り、通常工業的・実験的に用いられる公知の抽出方法（例えば、「ファイトメディシン、第１６巻、９２９〜９３４ページ、２００９年」を参照。）により行うことができる。当該抽出により、白鶴霊芝のエタノール抽出物を得ることができる。
【００３１】
なお、本明細書において単に「エタノール」という場合には、「エタノールを主成分とする（エタノールを５０％以上含有する）溶媒」のことをいう。つまり、「エタノール」には、いわゆる無水エタノールだけではなく、エタノールと他の溶媒との混合溶媒も含む。白鶴霊芝から抽出を行うときには、エタノールと水との混合溶媒（含水エタノール）を用いることが好ましく、特に９０％エタノールを用いることが一層好ましい。
抽出温度は、通常０〜１００℃、好ましくは５〜５０℃である。溶媒が沸騰するような条件で抽出を行う場合には、溶媒を還流させながら抽出を行うことが好ましい。抽出時間は、１時間〜１０日間程度であり、溶媒量は、乾燥原料あたり１回ごとに通常１〜３０倍重量、好ましくは５〜１０倍重量である。抽出操作は、攪拌であっても単なる浸漬であってもよい。抽出操作は、必要に応じて複数回繰り返してもよい。また、条件が異なる抽出操作を組み合わせてもよい。
さらに、上記の操作で得られた粗抽出液から不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除く操作を行うことが好ましい。
【００３２】
液−液分配についても、通常工業的・実験的に用いられる公知の方法により行うことができる。
液−液分配とは、二相分配、二相溶媒分配法、液−液抽出等ともいわれる方法であり、極性が異なる２種の溶媒を用い、溶解度の差により目的化合物を回収する方法である。
液−液分配の後には、溶媒を除去して乾固した状態の分配物を得ることが好ましい。ただし、溶媒の除去が使用目的上不要である場合にはこの限りではない。
【００３３】
なお、本明細書において単に「メタノール」という場合には、「メタノールを主成分とする（メタノールを５０％以上含有する）溶媒」のことをいう。つまり、「メタノール」には、いわゆる無水メタノールだけではなく、メタノールと他の溶媒との混合溶媒も含む。液−液分配を行うときには、メタノールと水との混合溶媒、特に９０％メタノールを用いることが好ましい。一方、本明細書において「無水メタノール」という場合には、無水メタノールのことをいい、メタノールを含む混合溶媒は含まない。
所定の分配物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法」により得ることができる。
【００３４】
また、本発明の「白鶴霊芝のエタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配し、メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配し、二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すとき、シリカゲルカラムから溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物のみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤」は「白鶴霊芝をエタノールで抽出してエタノール抽出物を得る第１工程と、エタノール抽出物をヘキサン及びメタノールで液−液分配して、前記メタノールに分配される分配物を得る第２工程と、メタノールに分配される分配物を二塩化メチレン及び水で液−液分配して、前記二塩化メチレンに分配される分配物を得る第３工程と、二塩化メチレンに分配される分配物をｎ−ヘキサン、酢酸エチル及び無水メタノールから構成される溶出溶媒を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して、シリカゲルカラムから前記溶出溶媒により溶出される分画物である所定の分画物を得る第４工程とをこの順序で含む、前記所定の分画物を有効成分として含有する神経細胞死抑制剤の製造方法」により得ることができる。
【００３５】
本発明における所定の分画物は、記載された条件を満たす限り種々の条件で得ることができる。以下、用いることができる方法等について説明する。
なお、本明細書において「分画物」とは、精製物であってカラムクロマトグラフィーでの分画により得られるもののことをいう。
また、本明細書において「所定の分画物のみを有効成分として含有する」とは、神経細胞死抑制作用を有する有効成分として所定の分画物のみを含有することをいい、有効成分ではない成分（各種溶媒や補助的な添加剤等）を含有することを否定しない。
抽出及び液−液分配については既に説明したので、再度の説明は省略する。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーの後には、溶出溶媒を除去して乾固した状態の分画物を得ることが好ましい。ただし、溶媒の除去が使用目的上不要である場合にはこの限りではない。
【００３６】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーについても、通常工業的・実験的に用いられる公知の方法により行うことができる。
溶出溶媒は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：無水メタノール＝３：４：２の比率からなる溶出溶媒であることが好ましい（後述の実験例参照。）。この場合、所定の分画物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いるシリカゲルの体積に対して０．１倍〜４倍の体積の溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物であることが一層好ましく、０．２倍〜２．５倍の体積の溶出溶媒を用いたときに溶出する分画物であることがより一層好ましい（後述の試験例参照。）。
【００３７】
所定の分配物及び所定の分画物は、本発明の目的を損なわない限り、上記以外の精製方法をさらに行って得たものであってもよい。
【００３８】
所定の分配物及び所定の分画物を得るために用いる溶媒及び混合溶媒は、同程度の極性を有する溶媒又は混合溶媒により代替可能であると考えられる。この場合、溶媒として使用可能なものであれば所定の分配物及び所定の分画物を得るために用いることができる。溶媒の例として、水、各種アルコール類、酢酸エチルのようなエステル類、直鎖状・分枝状・環状の各種炭化水素類、二塩化メチレン（ジクロロメタン）、クロロホルム、アセトン、各種エーテル類等を挙げることができ、使用可能な溶媒の中から、方法及び目的に合致するものを用いることができる。
【００３９】
なお、後述する実験例の結果から考えると、本発明における所定の分配物及び所定の分画物には、１成分としてリナカンチンＣが含有されていると考えられる。
【００４０】
本発明の「リナカンチンＣのみを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤」におけるリナカンチンＣは、白鶴霊芝を原料に抽出・精製することにより得てもよい（後述する実験例を参照。）し、その他の植物体から得てもよい。また、リナカンチンＣは、合成によって得てもよい。
リナカンチンＣとは、以下の化学式（１）により表される化合物である。
【化１】
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【００４１】
本発明のリナカンチンＣは、体内の作用機序においてリナカンチンＣであればよく、投与前においては、薬学上許容される塩の形態をとっていてもよい。
【００４２】
所定の分配物、所定の分画物及びリナカンチンＣは、後述する実験例に示すように、アミロイドβの毒性による神経細胞死を抑制する効果がある。このため、これらを有効成分とする本発明の神経細胞死抑制剤は、抗アルツハイマー病剤及び抗脳機能低下剤としての作用を有すると考えられる。
なお、本明細書における「抗アルツハイマー病剤」とは、アルツハイマー病の予防及び治療のうち少なくとも一方に用いることができるものである。また、「抗脳機能低下剤」とは、脳機能の低下の予防及び治療のうち少なくとも一方に用いることができるものである。
【００４３】
本発明の神経細胞死抑制剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病剤及び医薬品（ここでは、内用又は内服の医薬品）の投与経路は特に限定されないが、例えば、経口投与・直腸内投与等の経腸投与、経鼻投与などの粘膜投与、静脈内投与・皮下投与などの注射投与等を挙げることができる。剤型としては、いずれも投与方法に適した製剤の形態をとることができ、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末、丸剤、トローチ剤等の固形剤、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤などの液剤、ゲル状の製剤等を挙げることができる。本発明の神経細胞死抑制剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病剤及び医薬品は、そのまま投与してもよいが、薬理的に許容される賦形剤とともに投与しても良い。賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩類、油脂、蒸留水など、製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることもできる。
【００４４】
本発明の神経細胞死抑制剤、抗脳機能低下剤、抗アルツハイマー病剤及び医薬品の有効投与量は、投与経路、剤形、疾患の症状、対象者の年齢等により異なるが、所定の分配物、所定の分画物又はリナカンチンＣについて、通常成人一日あたり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．５〜３００ｍｇ、さらに好ましくは１〜１００ｍｇであると考えられる。所定の分配物、所定の分画物又はリナカンチンＣの含有量は、製剤の形態・有効投与量・製剤としての投与量のデータに基づき、各投与形態に最適な製剤中の有効成分含有量を設定することができる。
【００４５】
本発明の医薬品は、外用医薬品であってもよい。外用医薬品の形態は、特に限定されない。
外用医薬品の形態としては、例えば、軟膏剤、クリーム剤、発布剤、テープ剤、外用剤等を挙げることができる。本発明の外用医薬品は、所定の分配物、所定の分画物又はリナカンチンＣに、必要に応じて種々の医薬成分を含有することができる。また、結合剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることもできる。
【００４６】
本発明の食品としては、有効成分を加えたお茶としての形態の食品や、有効成分を配合した加工食品としての形態の食品を例示することができる。
【００４７】
お茶としては、白鶴霊芝の葉・茎若しくは根の乾燥物と混合して、又は、他の茶原料と混合して用いることが好ましい。茶原料としては、緑茶、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶、ほうじ茶、玄米茶、杜仲茶、柿の葉茶、桑の葉茶等、通常お茶として用いられるものであれば、どのようなものでも用いることができる。なお、白鶴霊芝の葉・茎または根の乾燥物は、他の茶原料と同様に焙煎して用いることもできる。
【００４８】
有効成分を配合した食品の形態としては、ドリンク剤、ゼリー、ビスケット、錠剤、丸剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等、通常食品として提供可能な形態であれば、いずれの形態も用いることができる。また、食品の副原料として、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることもできる。
【００４９】
本発明の食品の有効摂取量は、摂取形態、対象者の健康状態、対象者の年齢等により異なるが、所定の分配物、所定の分画物又はリナカンチンＣについて、通常成人一日あたり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．５〜３００ｍｇ、さらに好ましくは１〜１００ｍｇであると考えられる。
【００５０】
本発明の食品中の所定の分配物、所定の分画物又はリナカンチンＣの含有量は、食品の形態によっても異なるが、通常０．０００１〜１ｗｔ％、好ましくは０．００１〜０．５ｗｔ％、より好ましくは、０．０１〜０．１ｗｔ％であると考えられる。
【００５１】
［実験例］
以下、所定の分配物、所定の分画物及びリナカンチンＣの分配・分画・単離例や神経細胞死抑制作用に関する試験例により本発明をさらに詳しく説明する。なお、以下の実験例はいわば具体例であり、本発明は以下の実験例に制約されるものではない。
【００５２】
１．本発明の分配物、本発明の分画物及びリナカンチンＣの分配・分画・単離例
本発明の分配物及び本発明の分画物の分配・分画は、図１に示すフローに沿って行った。
まず、原料として白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ）の根の乾燥物２ｋｇを準備し、汎用のグラインダーで粉砕した。
続いて、９０％エタノールによる抽出を行った。抽出は、白鶴霊芝を２０Ｌの９０％エタノールに３日間浸漬し、その後、溶媒を１時間還流させることで行った。抽出液と抽出残渣とは、濾紙により分離した。当該抽出を同じ原料に対して計３回行い、減圧により抽出液から溶媒を取り除き、乾固したエタノール抽出物７７．８２ｇを得た。
【００５３】
上記エタノール抽出物から４ｇを分析用サンプルとして取り除いた後、残りのエタノール抽出物７３．８２ｇ全量について、ヘキサン及び９０％メタノールで液−液分配を行った。まず、エタノール抽出物に９０％メタノール５００ｍＬを加え、その後、ヘキサン５００ｍＬを加えて１分間振とうした。溶媒が分離するまで１０分程度待ち、９０％メタノール相を採取した。さらに２回同様の操作を繰り返し、得られた９０％メタノール相を併せた後、減圧により溶媒を取り除き、乾固した分配物５４．３２ｇを得た。
【００５４】
上記分配物から４ｇを分析用サンプルとして取り除いた後、残りの分配物５０．３２ｇ全量について、二塩化メチレン及び水で液−液分配を行った。まず、分配物に水（精製水）５００ｍＬを加え、その後、二塩化メチレン５００ｍＬを加えて１分間振とうした。溶媒が分離するまで１０分程度待ち、二塩化メチレン相を採取した。さらに２回同様の操作を繰り返し、得られた塩化メチレン相を併せた後、減圧により溶媒を取り除き、所定の分配物２７．５５ｇを得た。なお、以下の記載においては、ここで得られた所定の分配物を「所定の分配物Ａ」と記載する。
【００５５】
次に、上記所定の分配物Ａのうち２０．００ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。
まず、所定の分配物Ａ２０．００ｇとシリカゲル（０．０６３〜０．２ｍｍの汎用品）６０ｇとを混合した。その後、シリカゲル（０．０４０〜０．０６３ｍｍの汎用品）５００ｇを詰めたカラム（直径６ｃｍ、長さ３４ｃｍ、体積約２０４ｍＬのオープンカラム）を用意し、溶出溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：無水メタノール＝３：４：２）で平衡化させた後、所定の分配物Ａとシリカゲルとの混合物を乗せ、溶出溶媒による溶出を行った。なお、溶出溶媒１５００ｍＬを用いた後、アセトン５００ｍＬ及び無水エタノール５００ｍＬをこの順序でカラムに通し、シリカゲル吸着物を溶出した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては、約２０ｍＬずつに分けて試験管で採取し、ＴＬＣにより溶出のパターンを観察した。おおよその溶出のパターンにより、１〜６本目の試験管で得られたものを分画物１−１（溶媒量約０〜１２０ｍＬ）、７〜２４本目の試験管で得られたものを分画物１−２（溶媒量約１２０〜４８０ｍＬ）、２５〜３９本目の試験管で得られたものを分画物１−３（溶媒量約４８０〜７８０ｍＬ）、４０〜７０本目の試験管で得られたものを分画物１−４（溶媒量約７８０〜１４００ｍＬ）、残りの溶出溶媒、アセトン及び無水エタノールにより得られたものを分画物１−５とした。
なお、上記分画物１−１〜１−４が所定の分画物である。
【００５６】
リナカンチンＣの単離は、図２示すフローに沿って行った。所定の分画物Ａを得た方法とはシリカゲルカラムクロマトグラフィーの方法が異なるため、上記の方法とは異なる部分についてのみ説明する。
まず、所定の分配物Ａ２．５０ｇとシリカゲル（０．０６３〜０．２ｍｍの汎用品）１０ｇとを混合した。その後、シリカゲル（０．０４０〜０．０６３ｍｍの汎用品）２００ｇを詰めたカラム（直径２ｃｍ、長さ３０ｃｍ、体積約６０ｍＬのオープンカラム）を用意し、溶出溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で平衡化させた後、所定の分配物Ａとシリカゲルとの混合物を乗せ、溶出溶媒による溶出を行った。なお、溶出溶媒の量は５００ｍＬとした。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては、約１０ｍＬずつに分けて試験管で採取し、ＴＬＣにより溶出のパターンを観察した。おおよその溶出のパターンにより、１本目の試験管で得られたものを分画物２−１（溶媒量約０〜１０ｍＬ）、２〜３本目の試験管で得られたものを分画物２−２（溶媒量約１０〜３０ｍＬ）、４〜１０本目の試験管で得られたものを分画物２−３（溶媒量約３０〜１００ｍＬ）とした。
【００５７】
その後、分画物２−１〜２−３について１ＨＮＭＲ及び１３ＣＮＭＲのデータを文献値（ジャーナル  オブナチュラル  プロダクツ、５９巻、８０８〜８１１ページ、１９９６年）と比較することで構造の解析を行い、分画物２−２がリナカンチンＣであることを確認した。得られたリナカンチンＣの量は、４４４．２ｍｇであった。
【００５８】
なお、核磁気共鳴スペクトル装置としては、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＧＳＸ５００型核磁気共鳴スペクトル装置（日本電子株式会社製）を用いた。
【００５９】
２．所定の分配物、所定の分画物及びリナカンチンＣの神経細胞死抑制作用に関する試験例
当該試験例では、アミロイドβによる細胞毒性及び所定の分配物、所定の分画物及びリナカンチンＣの神経細胞死抑制作用についての試験を行った。アミロイドβの神経細胞毒性評価には、アミロイドβの神経毒性の作用中心として知られるアミロイドβ（２５−３５）を用いた。
【００６０】
本試験例では、神経細胞に対する作用（毒性や薬効）を評価する試験に汎く用いられているＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株）を用いた。ＰＣ１２細胞は、ＢＣＲＣ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、生物資源保存及研究中心、台湾）から入手したものを用いた。
入手したＰＣ１２細胞は、５％牛胎児血清、１０％馬血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（いずれも、インビトロジェン−ギブコ社から入手）を用い、５％炭酸ガス存在下、３７℃、飽和湿度下で培養した。
【００６１】
アミロイドβ（２５−３５）の細胞毒性の評価には、ポリ−Ｌ−リジンをコートした９６穴マイクロプレートを用いた。当該マイクロプレートに１穴あたり２×１０４／１００μＬのＰＣ１２細胞を播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃、飽和湿度下で培養した。
培養２４時間後に、コントロール区には０．１％ＤＭＳＯ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）、評価区には各サンプル（下記参照。）、ポジティブコントロール区には１０μＭ  ガランタミンハイドロブロマイド（抗アルツハイマー病剤であり、神経保護作用を有することが知られている。シグマ−アルドリッチ社を通じて入手。）を添加した。
【００６２】
全ての試験区について、アミロイドβ（２５−３５）（シグマ−アルドリッチ社を通じて入手）１５μＭを添加したものと、添加しないものとの両方について試験を行った（後述）。培養開始７２時間後に、ＭＴＴ（モレキュラー  プローブス社製）による所定の方法により、吸光度５７０ｎｍでの吸光度を測定することで試験区ごとの細胞生存率を算出した。
【００６３】
本試験例においては、まず、アミロイドβを添加しない状態でコントロール、ポジティブコントロール及び各サンプルについて細胞生存率を算出した。次に、アミロイドβを添加すること以外は同じ条件で各サンプルについて細胞生存率を算出した。そして、アミロイドβを添加したときの細胞生存率の数値を、アミロイドβを添加していないときの細胞生存率の数値で割る計算を行い、当該計算で算出した数値を１００倍して％単位とし、そこからからコントロールにおける細胞生存率を差し引いたものを細胞生存回復率とした。
この細胞生存回復率は、サンプルによる細胞生存率への影響を補正した状態において、コントロールよりも何％細胞生存率が回復したのかを示す指標である。
【００６４】
サンプルとしては、所定の分配物Ａ（二塩化メチレン分配物）、所定の分画物である分画物１−１、所定の分画物である分画物１−２、所定の分画物である分画物１−３、所定の分画物である分画物１−４、及び、リナカンチンＣ（分画物２−２）を用いた。なお、各サンプルの濃度については、事前に細胞毒性に関するスクリーニング等を行い、適切な濃度を決定した。
なお、ポジティブコントロールに関する実験と本発明の各サンプルに関する実験とは分けて行ったので、図３に示すように、それぞれでコントロールにおける細胞生存率の数値が異なっている。
【００６５】
試験例の結果を、図３に示す。図３（ａ）はポジティブコントロールに関する試験結果を示す表であり、図３（ｂ）は本発明の各サンプルに関する試験結果を示す表である。
図３に示すように、まず、アミロイドβはＰＣ１２細胞に対して高い毒性を有することが明らかになった（図３のコントロールの項目参照。）。また、所定の分配物Ａ、所定の分画物（分画物１−１〜１−４）及びリナカンチンＣは、高い細胞生存回復率を示すことが明らかになった。
分画物１−１及び分画物１−２による細胞生存回復率はガランタミンハイドロブロマイドに匹敵するものであった。
また、濃度は１μＭと低い値でありながら、リナカンチンＣによる細胞生存回復率は３０．２％である。１０μＭ  ガランタミンハイドロブロマイドによる細胞生存回復率が１７．２％であるため、リナカンチンＣは特に高い細胞生存回復率を示すという事実を見出すことができた。
【００６６】
上記試験例により、本発明の神経細胞死抑制剤は、アミロイドβの毒性による神経細胞死を抑制する良好な効果、つまり、優れた神経細胞死抑制効果を有することが確認できた。このため、これらを有効成分とする本発明の神経細胞死抑制剤は、抗アルツハイマー病剤及び抗脳機能低下剤としての作用を有すると考えられる。
【００６７】
［実施例］
以下の実施例により、本発明の神経細胞死抑制剤の有効成分であり、本発明の抗アルツハイマー病剤又は抗脳機能低下剤の有効成分でもあるリナカンチンＣを含有する医薬品及び食品の調製法について記載する。なお、リナカンチンＣの項目を所定の分配物や所定の分画物に変更することも当然可能である。
【００６８】
（１）錠剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方で錠剤を作製する。
リナカンチンＣ                                  ０．２ｇ
乳糖                                          ９５．８ｇ
乾燥コーンスターチ                              ２．０ｇ
タルク                                          １．８ｇ
ステアリン酸カルシウム                          ０．２ｇ
（調製法）
乳糖（９５．８ｇ）に、リナカンチンＣ（０．２ｇ）、乾燥コーンスターチ（２ｇ）、タルク（１．８ｇ）、ステアリン酸カルシウム（０．２ｇ）を添加して混合する。次いで、単発式打錠機を用いて常法により錠剤を作製する。
【００６９】
（２）ハードカプセル剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方でハードカプセル剤（１カプセルあたり３６０ｍｇ）を作製する。
リナカンチンＣ                                      ５ｍｇ
乳糖                                            ２２０ｍｇ
コーンスターチ                                  １１０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                      ２５ｍｇ
（調製法）
リナカンチンＣ（５ｇ）に、乳糖（２２０ｇ）及びコーンスターチ（１１０ｇ）を添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース（２５ｇ）の水溶液を添加して練合する。次いで、押し出し造粒機を用いて、常法により顆粒を製造する。この顆粒をゼラチンハードカプセルに充填することにより、ハードカプセル剤を作製する。
【００７０】
（３）ソフトカプセル剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方でソフトカプセル剤（１カプセルあたり１７０ｍｇ）を作製する。
リナカンチンＣ                                  ０．５ｍｇ
大豆油                                      １６９．５ｍｇ
（調製法）
大豆油（１６９．５ｇ）に、リナカンチンＣ（０．５ｇ）を添加して混合する。次いで、ロータリー・ダイズ式自動成型機を用いて、常法に従い、ソフトカプセルに充填することにより、ソフトカプセル剤を作製する。
【００７１】
（４）丸剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方で丸剤（１粒あたり１００ｍｇ）を作製する。
リナカンチンＣ                                  ０．５ｍｇ
モロヘイヤ末                                  ２０．０ｍｇ
デンプン                                      ３０．０ｍｇ
糖蜜                                          ２０．０ｍｇ
茶抽出物                                      １５．０ｍｇ
大豆ファイバー                                １４．０ｍｇ
セラック                                        ０．５ｍｇ
（調製法）
上記配合で原料を混合し、適量加水後、練合機で均質な練合物を製造し、得られた練合物を圧延し製丸機を用いて製丸後乾燥して丸剤を作製する。
【００７２】
（５）散剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方で常法により散剤（１包あたり１０００ｍｇ）を作製する。
リナカンチンＣ                                      １ｍｇ
乳糖                                            ７９９ｍｇ
コーンスターチ                                  ２００ｍｇ
【００７３】
（６）ゼリー
リナカンチンＣを用いて、次の処方で、常法によりゼリー（１００ｇ）を作製する。
リナカンチンＣ                              ０．００２ｇ
ゼラチン                                    ２．０ｇ
オレンジ果汁                              ２０．０ｇ
水                                        ７７．９９８ｇ
（調製法）
上記成分を混合し、９０℃へ加熱する。ゼラチンの溶解を確認してから容器に充填し、冷却する。ゼラチンを固化することでゼリーを作製する。
【００７４】
（７）軟膏
リナカンチンＣを用いて、次の処方で、常法により軟膏（１００ｇ）を作製する。
（油相成分）
リナカンチンＣ                                  ０．１ｇ
白色ワセリン                                  ２０．０ｇ
ミネラルオイル                                ２０．０ｇ
ステアリルアルコール                            ５．０ｇ
ステアレス−２                                  ３．０ｇ
プロピルパラベン                                ０．１ｇ
天然ビタミンＥ                                  ０．１ｇ
（水相成分）
１，３−ブチレングリコール                      ５．０ｇ
フェノキシエタノール                            ０．４ｇ
ポリソルベート  ６０                            ４．５ｇ
精製水                                        適量
全量  １００ｇ
（調製法）
油相成分及び水相成分をそれぞれ８０℃に熱して均一にし、水相を油相に攪拌しながら加え、乳化後冷却し軟膏を作製する。
【００７５】
（８）テープ剤
リナカンチンＣを用いて、次の処方で、常法によりテープ剤（１００ｇ）を作製する。
（粘着剤溶剤）
スチレン−イソプロピレン−スチレンブロック共重合体    ７．０ｇ
ピコライト                                          ２５．０ｇ
イソプロピレンゴム                                    ５．０ｇ
トルエン                                            １５．０ｇ
酢酸エチル                                          １４．２ｇ
ヘキサン                                            ２５．０ｇ
（薬効成分）
リナカンチンＣ                                        ０．１ｇ
エタノール                                            ５．０ｇ
（経皮吸収促進剤）
オレイルアルコール                                    ０．８ｇ
全量  １００ｇ
（調製法）
粘着剤溶剤及び薬効成分をそれぞれ均一にし、薬効成分及び経皮吸収促進剤を粘着剤溶剤に加え、室温で攪拌し組成物を作製する。この組成物をシリコーン処理したポリエステルフィルム上に延展し、１２０℃で乾燥させ冷却後、ポリエチレンフィルムへ粘着剤層を転写させ、テープ剤を作製する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2017006407.tif 000008
2017006407.tif 000009
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