(57)【要約】  【課題】  治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物を提供することを目的とする。  【解決手段】  ＡＬＡ類を含むことを特徴とする、光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化１】
2015125732.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を含むことを特徴とする、
光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の予防用又は治療用組成物であって、
前記治療抵抗性がん細胞が、がん幹細胞を含むことを特徴とする、
予防用又は治療用組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の予防用又は治療用組成物であって、
前記がん幹細胞が、脳腫瘍幹細胞であることを特徴とする、
予防用又は治療用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の予防用又は治療用組成物であって、
前記光線力学的療法が、対象における治療抵抗性がん細胞に対して２回以上実施されることを特徴とする、
予防用又は治療用組成物。
【請求項５】
同時または順次に投与される、（１）請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防用又は治療用組成物と（２）抗がん剤とを組み合わせてなることを特徴とする、治療抵抗性がんの予防用又は治療用医薬。
【請求項６】
請求項５に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記抗がん剤が、チロシンキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項７】
請求項６に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、チロシン残基を有する分子に対するチロシンキナーゼ阻害剤であり、
前記チロシン残基を有する分子が、幹細胞因子受容体（ＫＩＴ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、コロニー刺激因子受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、Ｓｒｃファミリー、ＪＡＫ、Ｆａｋ、ＺＡＰ、Ｂｔｋ、Ｆｐｓ／Ｆｅｓ、および、Ｂｃｒ−Ａｂｌからなる群から選択されることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＡＢＣＧ２阻害剤であることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記組み合わせの態様が、配合剤であるか、または、キットであることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項１０】
抗がん剤と同時または順次に併用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防用又は治療用組成物。
【請求項１１】
治療抵抗性がんの治療のための、（１）請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防用又は治療用組成物と（２）抗がん剤との組み合わせであって、
前記（１）治療用組成物と前記（２）抗がん剤が、同時または順次に投与されることを特徴とする、
組み合わせ。
【請求項１２】
対象における治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防又は治療方法であって、
（Ｉ）治療抵抗性がんを患っているか、患う恐れのある対象に対して、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化２】
2015125732.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を投与するステップ；および、
（ＩＩ）前記対象における前記がん細胞に対して、光線力学的療法を実施するステップ
を含む、
予防又は治療方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の予防又は治療方法であって、
前記ステップ（ＩＩ）は、前記治療抵抗性がん細胞に対して、前記光線力学的療法を２回以上実施することを特徴とする、
予防又は治療方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の予防又は治療方法であって、
前記ステップ（Ｉ）または（ＩＩ）の実施の前、間、または、後において、前記対象に対して、抗がん剤を、同時または順次に、さらに投与するステップ
を含む、
予防又は治療方法。
【請求項１５】
光線力学的療法における、治療抵抗性がんの予防用又は治療用医薬の製造のための、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化３】
2015125732.tif 000009
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩の使用。
【請求項１６】
同時または順次に投与される、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化４】
2015125732.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩と、
（Ｂ）チロシンキナーゼ阻害剤又はＡＢＣＧ２阻害剤と
を組み合わせてなることを特徴とする、
光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの診断用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤治療や放射線療法とは異なるがん治療の選択肢の１つとして、光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）が挙げられる。ＰＤＴは非侵襲的かつ治療跡が残りにくい治療法であるため、近年注目を集めている。
現在、医療現場で実施されているＰＤＴに関しては、肺、食道、胃、子宮頚部の早期がんに対して、特定の波長のレーザー光に反応する、腫瘍親和性の光増感剤であるフォトフリンを投与して、がん細胞に集積させた後に、レーザー光線を照射してがん細胞内部から破壊する治療法が挙げられる。しかしながら、かかる治療法では、フォトフリンの排泄速度が遅く、体内に蓄積しやすいので、部屋の光やその他の光によって患者が光線過敏症を引き起こす。そのため、患者の体内から光増感剤が排除されるまで（投与後、約数週間〜約１ヶ月間）は、暗室内で患者が過ごさなくてはならないという難点がある。【０００３】
これに対して、ポルフィリンの前駆物質であり、生体物質である５−アミノレブリン酸類（本明細書において、「ＡＬＡ類」ともいう）を対象に投与し、ＰＤＴと組み合わせる、いわゆる「ＡＬＡ−ＰＤＴ」が知られており、ＡＬＡ類を投与することにより、安全且つ効率的に、がんを光線力学的に治療することが検討されている。
ＡＬＡ類それ自体には光感受性はないものの、ＡＬＡ類は、細胞内で、ヘム生合成経路の一連の酵素群により代謝活性化されてポルフィリン（主としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ））となることが知られている。そして、ＰｐＩＸは、４１０ｎｍ、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍ、６３０ｎｍ等にピークを有する光増感剤として知られている。ＡＬＡは生体内で代謝され、４８時間以内に排泄されるため、全身の光感受性にはほとんど影響しないという特徴がある。そのため、フォトフリンよりもＡＬＡの方が臨床上の安全性が高い。【０００４】
これまでのところ、悪性脳腫瘍の外科的手術を行うにあたって、ＡＬＡを対象に投与して光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ＰＤＤ）を行うことが実施されている（いわゆる「ＡＬＡ−ＰＤＤ」）。
一方、ＡＬＡを投与した悪性脳腫瘍のＰＤＴは、未だ、臨床的には行われていない。その理由の１つに、悪性脳腫瘍細胞からのＰｐＩＸ排出によるＰｐＩＸ蓄積の低下が挙げられる。また、がん細胞から排出されるＰｐＩＸによって、がん組織とその周りにある正常組織との境界が不鮮明になる結果、腫瘍が正常脳組織の中に浸潤した部分を切除できなくなり、悪性脳腫瘍の外科手術による摘出の成功率が低下するという問題があった。【０００５】
さらに、外科的切除が可能な初期のがんを除き、がんの完全治癒は依然として大きな課題である。外科的手術が困難であったり、望ましくないがんの多くは、抗がん剤治療や放射線療法で治療されているが、完全に腫瘍細胞を排除することは極めて難しい。したがって、多くの場合、治療抵抗性を獲得したがん細胞（耐性がん細胞）が出現する。
また、再発・転移の原因として近年提唱されているのが、がん幹細胞仮説である。がん幹細胞仮説では、腫瘍組織中にがん幹細胞が存在し、その細胞は自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力を有すると考えられている。さらに、がん幹細胞は抗がん剤や放射線への抵抗性を有しているため、治療の際に残存しやすく、再発・転移の原因となっていると考えられている。【０００６】
したがって、従来のがん治療によって大部分のがん細胞を除いたとしても、治療後に残存した、これらの治療抵抗性がん細胞（がん幹細胞、耐性がん細胞など）から再びがん細胞が生じることになるので、これらの治療抵抗性がん細胞は、がん転移およびがん再発の原因となり得る。すなわち、従来のがん治療においては、がん治療によってがん細胞が死滅し、がんが治癒したと思われる場合であっても、多くの場合、ごく少数の治療抵抗性がん細胞が残存しており、がんの根本的な治療とはなり得なかった。
したがって、治療抵抗性がん細胞を標的とした治療法を確立することで、再発、転移のリスクの少ないがん治療を実現することが、長い間、社会から切望されている。
しかしながら、治療抵抗性がん細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴ、ＡＬＡ−ＰＤＤに関しては、これまで研究されておらず、その有効性は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−１２１９７号公報
【特許文献２】特表平１１−５０１９１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抗がん剤治療や放射線療法とは、細胞に対する作用メカニズムが異なるＡＬＡ−ＰＤＴに着目した。鋭意検討の結果、非常に驚くべきことに、ＡＬＡ−ＰＤＴが、治療抵抗性がん細胞に対して有効であることを見出した。【００１０】
さらに、本発明者らは、治療抵抗性がん細胞に対して、複数回（多段階）のＡＬＡ−ＰＤＴを実施することで、より効率的に治療抵抗性がん細胞を死滅させることに想到した。すなわち、複数回のＡＬＡ−ＰＤＴを実施すると、例えば、第２段階以降のＡＬＡ−ＰＤＴにおいては、第１段階のＡＬＡ−ＰＤＴ後も残存している、治療抵抗性がん細胞を根絶することができることに想到した。【００１１】
次いで、本発明者らは、上記の通り、医学上、極めて重要な課題を解決したのみならず、さらなる重要な課題の解決に取り組んだ。すなわち、本発明者らは、ＡＬＡ−ＰＤＴを利用しても、治療抵抗性がん細胞に対する効果が十分に得られないケースを想定した。例えば、固形腫瘍の深部などでは、治療標的となるがん細胞まで光が到達せず、治療効果が十分に得られない可能性に着目した。また、仮に腫瘍深部まで光が到達するような方法を用いたとしても、治療抵抗性がん細胞を死滅させることができなければ、がんの根本的治療とは言えない。
これに関連して、ＡＬＡから生合成されたＰｐＩＸはがん細胞から排出されるために、光増感剤であるＰｐＩＸのがん細胞内の蓄積が抑制されて、がん組織に対するＰＤＴの効率の低下が引き起こされることもわかってきていた。
本発明者らは、したがって、これらの重要な課題の解決のために、細胞内のＰｐＩＸの蓄積の促進に着目し、試行錯誤を続けた。その結果、治療抵抗性がん細胞において、ＡＬＡの細胞内取り込みを行なうトランスポーターＰＥＰＴ１およびＰＥＰＴ２の発現、並びにポルフィリン合成酵素やＡＢＣＢ６遺伝子の発現等が亢進している事を見出した。また、本発明者らは、治療抵抗性がん細胞において、チロシンキナーゼ阻害剤がＰｐＩＸの排出に関与するＡＢＣＧ２を阻害することを見出した。これらに鑑み、本発明者らは、ＡＢＣＧ２を阻害すると、細胞内ＰｐＩＸの蓄積が向上し、治療抵抗性がん細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの効果が増強できることに想到した。すなわち、本発明者らは、ＰｐＩＸの作用機序に着目した上で、治療抵抗性がん細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの治療効果を増強させる化合物を見出し、それにより、治療抵抗性がん細胞を一層さらに、増殖阻害／死滅させることをも実現した。
さらに、本発明者らは、ＡＢＣＧ２を阻害できる薬剤（好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤）をＡＬＡ類と共に併用することによって、がん組織と正常組織の境界を鮮明にして、がん細胞に蓄積したＰｐＩＸの蛍光に従って、治療抵抗性がん細胞を含むがん組織を検出できることに、驚くべきことに想到した。【００１２】
（１）すなわち、一実施態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化１】
2015125732.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を含むことを特徴とする、
光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防用又は治療用組成物に関する。
（２）また、本発明は、一実施態様において、前記治療抵抗性がん細胞が、がん幹細胞を含むことを特徴とする、予防用又は治療用組成物に関する。
（３）また、本発明は、一実施態様において、前記がん幹細胞が、脳腫瘍幹細胞であることを特徴とする、予防用又は治療用組成物に関する。
（４）また、本発明は、一実施態様において、前記光線力学的療法が、対象における治療抵抗性がん細胞に対して２回以上実施されることを特徴とする、予防用又は治療用組成物に関する。
（５）さらに、本発明は、別の実施態様において、同時または順次に投与される、（ｉ）上述の予防用又は治療用組成物と（ｉｉ）抗がん剤とを組み合わせてなることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（６）また、本発明は、一実施態様において、前記抗がん剤が、チロシンキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（７）また、本発明は、一実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤が、チロシン残基を有する分子に対するチロシンキナーゼ阻害剤であり、
前記チロシン残基を有する分子が、幹細胞因子受容体（ＫＩＴ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、コロニー刺激因子受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、Ｓｒｃファミリー、ＪＡＫ、Ｆａｋ、ＺＡＰ、Ｂｔｋ、Ｆｐｓ／Ｆｅｓ、および、Ｂｃｒ−Ａｂｌからなる群から選択されることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（８）また、本発明は、一実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＡＢＣＧ２阻害剤であることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（９）また、本発明は、一実施態様において、前記組み合わせの態様が、配合剤であるか、または、キットであることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（１０）さらに、本発明は、別の実施態様において、抗がん剤と同時または順次に併用される、上述の予防用又は治療用組成物に関する。
（１１）さらに、本発明は、別の実施態様において、治療抵抗性がんの治療のための、（ｉ）上述の予防用又は治療用組成物と（ｉｉ）抗がん剤との組み合わせであって、
前記（ｉ）治療用組成物と前記（ｉｉ）抗がん剤が、同時または順次に投与されることを特徴とする、組み合わせに関する。
（１２）さらに、本発明は、別の実施態様において、対象における治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの予防又は治療方法であって、
（Ｉ）治療抵抗性がんを患っているか、患う恐れのある対象に対して、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩
を投与するステップ；および、
（ＩＩ）前記対象における前記がん細胞に対して、光線力学的療法を実施するステップ
を含む、予防又は治療方法に関する。
（１３）また、本発明は、一実施態様において、前記ステップ（ＩＩ）は、前記治療抵抗性がん細胞に対して、前記光線力学的療法を２回以上実施することを特徴とする、予防又は治療方法に関する。
（１４）また、本発明は、一実施態様において、前記ステップ（Ｉ）または（ＩＩ）の実施の前、間、または、後において、前記対象に対して、抗がん剤を、同時または順次に、さらに投与するステップを含む、予防又は治療方法に関する。
（１５）さらに、本発明は、別の実施態様において、光線力学的療法における、治療抵抗性がんの予防用又は治療用医薬の製造のための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の使用に関する。
（１６）さらに、本発明は、別の実施態様において、同時または順次に投与される、
（Ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、
（Ｂ）チロシンキナーゼ阻害剤又はＡＢＣＧ２阻害剤と
を組み合わせてなることを特徴とする、
光線力学的療法における、治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの診断用医薬に関する。
（１７）以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、技術的に矛盾しない限り、本発明の範囲に含まれるのは当然である。
【発明の効果】
【００１３】
一態様において、ＡＬＡ−ＰＤＴにおいて、本発明の予防用又は治療用組成物を使用することで、治療抵抗性がんを予防し、又は、治療することが可能となる。また、場合により、複数回（多段階）のＡＬＡ−ＰＤＴを実施することで、治療抵抗性がんの治療又は予防がいっそうさらに効率化する。
また、別の態様において、本発明の予防用又は治療用組成物は、場合により、抗がん剤、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤と同時または順次に組み合わせて使用することで、治療抵抗性がんに対するＡＬＡ−ＰＤＴの効果をいっそうさらに増強させることができる。
また、本発明は、別の態様において、治療の過程において治療抵抗性の耐性がん細胞を生じさせるリスクを減らし、あるいは、元々治療抵抗性を有するがん幹細胞をも死滅させることも可能とするので、いわゆる難治性がんに対しても有効であり、また、がんの再発および転移を伴うことがない根本的ながん治療をも可能とし得る。また、がんの再発および転移の原因となる治療抵抗性がん細胞を死滅させることにより、がんの再発および転移を予防することも可能とし得る。
また、別の態様において、本発明により、ＡＬＡ−ＰＤＤにおいて、ＡＢＣＧ２を阻害できる薬剤（好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤）をＡＬＡ類と共に併用することによって、がん組織と正常組織の境界を鮮明にして、がん組織に蓄積したＰｐＩＸの蛍光に従って、治療抵抗性がん細胞を含むがん組織を外科的に切除することを容易にし得る。
すなわち、本発明は、医学上極めて重要な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】脳腫瘍幹細胞（ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳ細胞）の顕微鏡写真を示す図である。図１Ａは、牛胎児血清（ＦＣＳ）と共に細胞を培養した写真を示す（ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型）。図１Ｂは、ＦＣＳを含まない培養液で細胞を培養した写真を示す（ｓｐｈｅｒｅ型）。
【図２】脳腫瘍幹細胞（ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳ細胞）のＡＬＡ−ＰＤＴに対する感受性を示す図である。ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳ細胞を１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で培養し、０．３ｍＭ  ＡＬＡと共に４時間インキュベートした後、４０５ｎｍのレーザー光を照射した。レーザー光の強度を測定し、細胞の生存率との関係をプロットした。図２Ａは、ＦＣＳと共に細胞を培養した（ドット）プロットを示す（ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型）。図２Ｂは、ＦＣＳを含まない培養液で細胞を培養した（ドット）プロットを示す（ｓｐｈｅｒｅ型）。細胞の生存率を５０％にする光強度（ＩＣ５０）を矢印で示す。
【図３】脳腫瘍細胞（Ａ１７２細胞）の顕微鏡写真とＡＬＡ−ＰＤＴに対する光感受性を示す図である。図３Ａは、ＦＣＳと共に細胞を培養した図を示す。図３Ｂは、ＦＣＳなしで細胞を培養した図を示し、細胞は幹細胞に特徴的な塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成した。Ａ１７２細胞をそれぞれ１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で培養し、０．３ｍＭ  ＡＬＡと共に４時間インキュベートした後、４０５ｎｍのレーザー光を照射した。レーザー光の強度を測定し、細胞の生存率との関係をプロットした。細胞の生存率を５０％にする光強度（ＩＣ５０）を矢印で示す。
【図４】脳腫瘍細胞（Ａ１７２細胞）のＡＬＡ−ＰＤＴに対する光感受性を細胞増殖能力の観点から示す図である。Ａ１７２細胞を１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で培養し、０．３ｍＭ  ＡＬＡと共に４時間インキュベートした後、４０５ｎｍのレーザー光を照射した。その後、光線量（Ｊ／ｃｍ２）に対する細胞増殖能力をコロニー形成能力として調べた。
【図５】脳腫瘍細胞（Ａ１７２細胞）におけるポルフィリン生合成に関与する酵素とトランスポーターのｍＲＮＡレベルを示す図である。Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のｍＲＮＡレベルを対照にして、各遺伝子のｍＲＮＡレベルを正規化した。測定した遺伝子：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  １  ａｎｄ  ２（ＰＥＰＴ１  ａｎｄ  ＰＥＰＴ２），  ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２（ＡＬＡＳ１  ａｎｄ  ＡＬＡＳ２），  ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＡＬＡＤ），  ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＵＲＯＳ），  ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＵＲＯＤ），  ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＣＰＯＸ），  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯＸ），  ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ（ＦＥＣＨ），  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（ＡＢＣＢ６  ａｎｄ  ＡＢＣＧ２）
【図６】チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＢＣＧ２の輸送機能阻害のスクリーニング結果を示す図である。ＡＢＣＧ２阻害剤としてＥｒｌｏｔｉｎｉｂ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、そして、コントロールとしてＶｅｒａｐａｍｉｌを用いて、ＡＢＣＧ２の輸送機能阻害スクリーニングを実施した。阻害剤の濃度は０から１００μＭの範囲で、ＡＢＣＧ２によるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の細胞外輸送を測定した。
【図７】ＬａｐａｔｉｎｉｂまたはＧｅｆｉｔｉｎｉｂによる、ＰｐＩＸの細胞内蓄積に対する影響を示す図である。上段はアッセイの模式図を示し、下段は結果を示す。
【図８】ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞を用いた実験において、Ｌａｐａｔｉｎｉｂの添加により、ＡＬＡ−ＰＤＴの効果が上昇したことを示す図である。
【図９】Ｌａｐａｔｉｎｉｂの併用投与によるＡＬＡ−ＰＤＴに対する効果を、ヌードマウスにおける腫瘍の重量の違いから測定した結果を示す図である。
【図１０】ヌードマウスを用いた実験において、Ｌａｐａｔｉｎｉｂの併用投与により、ＡＬＡ−ＰＤＴの効果が向上したことを示す図である。図中、上段の「ＡＬＡ＋ＴＫＩ‐Ｘ」はＡＬＡとＬａｐａｔｉｎｉｂを併用投与した結果を示し；中段の「ＡＬＡ」はＡＬＡ単独を投与した結果を示す。
【図１１】抗がん剤未投与のＨｅＬａにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率を示す図である。図１１ａはＡＬＡの濃度依存的な細胞生存率の減少を示し、図１１ｂは図１１ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。
【図１２】Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ８ｎＭ  投与後のＨｅＬａにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率を示す図である。図１２ａはＡＬＡの濃度依存的な細胞生存率の減少を示し、図１２ｂは図１２ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。
【図１３】Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  １μＭ  投与後のＨｅＬａにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率を示す図である。図１３ａはＡＬＡの濃度依存的な細胞生存率の減少を示し、図１３ｂは図１３ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。
【図１４】Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ０．４μＭ  投与後のＨｅＬａにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率を示す図である。図１４ａはＡＬＡの濃度依存的な細胞生存率の減少を示し、図１４ｂは図１４ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。
【図１５】５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ４μＭ  投与後のＨｅＬａにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率を示す図である。図１５ａはＡＬＡの濃度依存的な細胞生存率の減少を示し、図１５ｂは図１５ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、ＡＬＡ類とは、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。
【００１６】
本明細書において、ＡＬＡは、５−アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。
【００１７】
ＡＬＡ誘導体としては、下記式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。なお、式（Ｉ）において、ＡＬＡは、Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合に相当する。
【化２】
2015125732.tif 000003
【００１８】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することもできる。
【００１９】
式（Ｉ）のＲ１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）のＲ２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。
【００２１】
式（Ｉ）のＲ２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。
【００２２】
式（Ｉ）のＲ２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。
【００２３】
式（Ｉ）のＲ２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。
【００２４】
好ましいＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。
【００２５】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【００２６】
以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、及び、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。
【００２７】
上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。
【００２８】
上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
【００２９】
一態様において、本発明の予防用又は治療用組成物は、生体等に許容できない悪影響を与えず、本発明の目的及び課題を達成できる限り、金属含有化合物を含んでもよい。このような金属含有化合物における金属部分としては、限定はされないが、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、バナジウム、コバルト、銅、クロム、モリブデン等を挙げることができる。当業者は、本発明の目的及び課題に照らして、適宜、金属含有化合物の適切な投与量を選択し、ＡＬＡ類と共に投与できる。
例えば、本発明の予防用又は治療用組成物と金属含有化合物は、ＡＬＡ類と金属含有化合物とを含む組成物として、あるいは、それぞれ単独で投与することができる。それぞれ単独で投与する場合、同時に投与してよい。ここで、同時とは、同時刻に行われることのみならず、同時刻でなくともＡＬＡ類と金属含有化合物との投与が、生体に相加的効果、好ましくは相乗的効果を与えることができるように、両者間で相当の間隔をおかずに行われることを意味する。
【００３０】
本明細書において、ＡＬＡ−ＰＤＴとはＡＬＡ類を用いる光線力学的療法（ＰＤＴ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＴを意味する。また、ＡＬＡ−ＰＤＤとはＡＬＡ類を用いる光線力学的診断（ＰＤＤ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＤを意味する。
【００３１】
上記ＡＬＡ−ＰＤＴは、光に反応する化合物を投与し、光線を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を投与し、色素生合成経路を経て誘導されたポルフィリン（主にＰｐＩＸ）を治療抵抗性がん細胞を含むがん細胞に集積させ、蓄積したＰｐＩＸを励起させることで、周囲の酸素分子を光励起し、その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有することを利用する。ＡＬＡ−ＰＤＴには、４００ｎｍ〜４２０ｎｍにピークを持つ光線、又は、６００ｎｍ〜６５０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。
一方、上記ＡＬＡ−ＰＤＤは、治療抵抗性がん細胞を含むがん細胞に蓄積したＰｐＩＸを光線で励起させて蛍光を検出することで、治療抵抗性がん細胞を含むがん組織の存在の有無を検出もしくは診断することに利用できる。ＡＬＡ−ＰＤＤには４００ｎｍ〜４２０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。
【００３２】
本明細書において、治療抵抗性がん細胞とは、従来の抗がん剤治療や放射線療法等に対して治療抵抗性を後発的に獲得した、進行がん、転移がん、再発がん等にみられる、がん細胞（耐性がん細胞）等や、抗がん剤治療や放射線療法等に対して先天的に抵抗性を有する、がん幹細胞、がん幹細胞の特性を一部または全部保持する細胞（本明細書において、「がん幹細胞様細胞」ともいう）、分化の程度が低いがん細胞、分裂が遅いがん細胞、難治性がん細胞等を意味する。本発明における治療抵抗性がん細胞は、従来の抗がん剤治療や放射線療法に高感受性を有するがん細胞とは、別の概念として当業者に理解される。ただし、抗がん剤治療や放射線療法に高感受性を有するがん細胞であっても、突然変異により、後発的に耐性がん細胞となった場合には、本発明における治療抵抗性がん細胞に含まれることは言うまでもない。また、一態様において、治療抵抗性がん細胞から分裂・増殖したがん細胞も、本発明における治療抵抗性がん細胞に含まれることは言うまでもない。
また、本明細書において、治療抵抗性がんとは、上述した治療抵抗性がん細胞を含むか、もしくは、伴うがんを意味する。
【００３３】
がん細胞は、正常な体細胞と比較すると、高い増殖力、細胞の不死化、周辺組織への浸潤や、体内の離れた部位への転移、という特徴を有するが、がん組織を構成しているがん細胞のすべてが、これらの特徴をすべて兼ね備えているわけではないことが報告されており、実際にこれらの特徴を併せ持ち、ヒトや動物にがんを生じさせ、進行させる能力を有するがん細胞は、全体のごく一部であることがわかってきている。
本明細書において、がん幹細胞とは、典型的には、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能と、移植した場合に元のがんと同じ表現型のがんを形成できる能力を有し、がん組織中で、自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出す元になる細胞を指してよい。がん幹細胞は、典型的には、自己複製能、多分化能、テロメラーゼ活性、抗アポトーシス経路の活性化、及び／又は、細胞膜の担体輸送の活性化が観察できる。
【００３４】
あるがん細胞が、がん幹細胞又はがん幹細胞様細胞であるか否かの判別は、当業者が公知の方法に従って判定することができる。例えば、当該細胞が形態学的に公知のがん幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）や体性幹細胞に同等であることを確認して、がん幹細胞と判定することもできる。当該細胞を免疫不全マウスの皮下に移植し、所定の期間経過後に形成される腫瘍組織を解析して、がん幹細胞と判定してもよい。
あるいは、当該細胞において、公知のがん幹細胞に高発現しているマーカー遺伝子が、同様に高発現していることを確認して、がん幹細胞であると判定してもよい。そのようなマーカー遺伝子には、限定はされないが、Ｄｃｌｋ１（Nakanishi et al., Nature Gen. 2012.）等が挙げられる。また、限定はされないが、具体的には、例えば、ＣＤ１３３＋（ヒト脳腫瘍幹細胞）、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏｗＥＳＡ＋（ヒト乳癌幹細胞、ＥＳＡ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＤ４４＋インテグリンα２β１ｈｉＣＤ１３３＋、又は、Ｓｃａ−１＋（ヒト前立腺癌幹細胞）、ＣＤ１３３＋（ヒト大腸癌幹細胞）、ＣＤ４４＋（ヒト頭頸部扁平上皮癌幹細胞）、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋（ヒト膵臓癌幹細胞、ＥＳＡ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）を指標として、がん幹細胞又はがん幹細胞様細胞であるか否かを判別してもよい。
あるいは、胚性幹細胞や体性幹細胞で特異的に発現しているマーカー遺伝子等、未分化マーカーが発現していることを確認して、がん幹細胞であると判定してもよい。未分化マーカーとしては、アルカリフォスファターゼも挙げられ、アルカリフォスファターゼ染色が陽性となることを確認して、細胞が未分化状態であることを判定することもできる。
また、ゲノムワイドな遺伝子の発現パターンをマイクロアレイ等で検出し、公知のがん幹細胞、胚性幹細胞又は体性幹細胞の発現パターンと相関の高いものを、がん幹細胞と判定してもよい。
細胞の表面抗原の発現特性を公知のがん幹細胞、胚性幹細胞又は体性幹細胞のそれと比較し、相関の高いものをがん幹細胞と判定することもできる。
さらに、当該細胞におけるＤＮＡのメチル化を検出して公知のがん幹細胞、胚性幹細胞又は体性幹細胞と比較してもよい。
がん幹細胞またはがん幹細胞様細胞であるか否かの判定は、上記方法の少なくとも一つによって行うことができるが、２つ以上を組み合わせて判定することもできる。
例えば、標的とするがん細胞を低血清もしくは無血清培地で培養した場合に、当該細胞が、胚性幹細胞や体性幹細胞の形態のように、ｓｐｈｅｒｅ型の形態になった場合には、当該細胞はがん幹細胞又は少なくともがん幹細胞様細胞に変化したと判定してよい。この場合、当該ｓｐｈｅｒｅ型の細胞は、治療抵抗性を後発的に獲得したことを当業者は理解できる。
【００３５】
本明細書において、治療抵抗性がんは、悪性であるのが好ましく、限定はされないが、脳腫瘍、脊髄腫瘍、上顎洞癌、膵液腺癌、歯肉癌、舌癌、口唇癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肺癌、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、胆管癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣腫瘍、副腎癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、外陰癌、卵巣癌、骨腫瘍、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、基底細胞腫、リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫及び線維肉腫を含む、原発性又は転移性の、かつ、浸潤性又は非浸潤性の、癌又は肉腫等であってよい。治療抵抗性がんは、脳腫瘍が特に好ましい。また、治療抵抗性がんは、固形がんであることが好ましい。本発明における治療抵抗性がん細胞ががん幹細胞である場合には、当該がん幹細胞は、上述の癌又は肉腫由来であってよい。
【００３６】
ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの効果を増強させる化合物としては、例えば、ＡＬＡの細胞内取り込みを行うトランスポーター（ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等）の発現を促進する分子や、ＡＬＡ及びポルフィリン合成酵素（ＡＬＡＳ１、ＡＬＡＳ２、ＵＲＯＳ等）の発現を促進する分子、ポルフィリンの細胞外への排出を行うトランスポーター（ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＢ６等）の発現を低下させる分子であってもよい（図５を参照）。限定する意図はないが、ＡＢＣＧ２を阻害できる分子が好ましい。そのような分子には、化合物単独で治療効果がある抗がん剤のみならず、化合物単独では抗がん作用を有さないがＡＢＣＧ２を阻害できる化合物や抗体等の分子も挙げられることは言うまでもない。
そのようなＡＢＣＧ２阻害剤としては、例えば、ＷＯ２００９／０７２２６７やInt J Biochem Mol Biol 2012;3(1):1-27に挙げられたものを用いてよい。ＡＢＣＧ２阻害剤は、限定はされないが、例えば、
topoisomerase II inhibitor (Mitoxantrone、Bisantrene、Etoposide、Becatecarin、NB-506,J-107088など);
Anthracyclines (Daunorubicin、Doxobucincin、Epirubicin、Pirarubicinなど);
Camptothecin analogs(topoisomerase I inhibitor) (Topotecan、SN-38、CPT-11、9-aminocamptothecin、NX211、DX-8951f、Homocamptothecins、BN80915(diflomotecan)、Gimatecan、Belotecanなど);
チロシンキナーゼ阻害剤(後述するものの他、Dasatinib、Vandetanib、Nilotinib、Sorafenib、Tandutinib、CI1033 (Pan-HER TKI)、CP-724,714 (HER2 TKI)、Symadex (fms-like tyrosine kinase 3 inhibitor)など);
Antimetabolites(MTX, MTX diglutamate, MTX triglutamate (antifolate)、GW1843, Tomudex (antifolates)、Trimetrexatte, piritrexim, metoprine, pyrimethamine (lipophilic antifolates)、5-fluorouracil (pyrimidine analog)、CdAMP (nucleotide), cladribine (nucleoside)など);cyclin-dependent kinase inhibitor(Flavopiridolなど);
CDK and aurora kinases inhibitor(JNJ-7706621など);
non-steroidal anti-androgen(Bicalutamideなど);
PEITC(Phenethyl isothiocyanateなど);
indazole-based tubulin inhibitors(TH-337など);
Sufate and glucuronide conjugates of xenobiotics (Estrone 3-sulfate (E1S)、17beta-estradiol sulfate、DHEAS、4[35S]-methylumbelliferone sulfate、E3040 sulfate、Troglitazone sulfate、3-O-sulfate conjugate of 17alpha-ethinylestradiol、SN-38-glucuronide、[3H]17beta-estradiol-17beta-D-glucuronide、[14C]4-methylumbelliferone glucuronide、BP-3-sulfate、BP-3-glucuronide、Phenolic MPA glucuronideなど);
Natural compounds and toxins （Folic acid、Urate、Genistein、Riboflavin (vitamin B2)、plumbagin (Vitamin K3)、Glutathione (GSH)、Sphingosine 1-phosphate、PhIP (carcinogen)など）;
その他([(125)I]lodoarylazidoprazosin (IAAP), [(3)H]azidopine; Sulfasalazine (anti-inflammatory); Erythromycin (macrolide antibiotic); Ciprofloxacin、ofloxacin、norfloxacin、enrofloxacin、grepafloxacin、ulifloxacin(fluoroquinolone antibiotics); Nitrofurantoin (urinary tract antibiotic); Moxidectin (parasiticide); Albendazole suloxide and oxfendazole (anthelmintics); Ganciclovir (antiviral drug); Zidovudine、Lamivudine (NRTI); Leflunomide、A771726 (antirheumatic drugs); Diclofenac (analgesic and anti-inflammatory drug); Cimetidine (histamine H2-receptor antagonist); ME3277 (hydrophilic glycoprotein IIb/IIIa antagonist); Pitavastatin、Rosuvastatin (HMG-CoA reductase inhibitor); Dipyridamole (thromboxane synthase inhibitor); Glyburide (hypoglycemic agent); Nicardipine、nifedipine、nitrendipine (Ca2+ channel blocker); Olmesartan medoxomil (angiotensin II AT1-R antagonist); Befloxatone (selective monoamine oxidase inhibitor); Prazosin (alpha-1-adrenergic receptor antagonist); Riluzole (Na+ channels blocker); Amyloid-beta Zoledronic acid (osteotropic compound); Hesperetin conjugates、Kaempferol (flavonoid、WO2004/069233も参照); FTC (Fumitremorgin C)誘導体 (Mol. Cancer Ther.,2002,1:417-425参照); エストロゲンや抗エストロゲン(Mol. Cancer Ther.,2003,2:105-112参照); novobiocin (Int.J.Cancer,2004,108:146-151参照); ジフェニルアクリロニトリル誘導体（ＷＯ２００４／０６９２４３参照）; 複素環を有するアクリロニトリル誘導体（ＷＯ２００６／１０６７７８、ＷＯ２００９／０７２２６７参照）等が挙げられる。ＡＢＣＧ２阻害剤としては、化合物単独で抗がん作用があり、かつ、ＡＢＣＧ２を阻害できる分子が好ましい。
【００３７】
また、本発明における抗がん剤としては、当業者に公知の抗がん剤であれば特に限定されず、例えば、アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミド等）；ニトロソウレア類等）；白金化合物（シスプラチン等）；代謝拮抗薬（５−フルオロウラシル等）；葉酸代謝拮抗薬（ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬等）；ピリミジン代謝阻害薬；プリン代謝阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ヌクレオチドアナログ（プリンアナログ、ピリミジンアナログ等）；トポイソメラーゼ阻害薬（Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤；ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤等）；微小管阻害薬（微小管重合阻害薬；微小管脱重合阻害薬等）；抗腫瘍性抗生物質；内分泌療法；ワクチン療法；分子標的薬（低分子医薬品（チロシンキナーゼ阻害剤；Ｒａｆキナーゼ阻害薬；プロテアソーム阻害剤等）；抗体医薬品等）が挙げられる。これらの抗がん剤は、ＡＬＡ−ＰＤＴとは作用メカニズムが根本的に異なると考えられるため、相加的な、また、場合によっては、相乗的な効果が期待できる。
本発明者らは、がん幹細胞などの治療抵抗性がん細胞においてＰｐＩＸの排出に関与するＡＢＣＧ２をチロシンキナーゼ阻害剤が阻害できること、それにより、ＡＬＡ−ＰＤＴによる治療抵抗性がん細胞の増殖阻害／死滅の効果が増強できることに想到した。
したがって、一実施態様において、抗がん剤としては、ＡＢＣＧ２を阻害できる抗がん剤が好ましく、チロシンキナーゼ阻害剤がさらに好ましい。
チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定はされないが、チロシン残基を有する分子に対するチロシンキナーゼ阻害剤であって、前記チロシン残基を有する分子が、幹細胞因子受容体（ＫＩＴ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、コロニー刺激因子受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、Ｓｒｃファミリー（Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｆｇｒ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｒｋ）、ＪＡＫ、Ｆａｋ、ＺＡＰ、Ｂｔｋ、Ｆｐｓ／Ｆｅｓ、および、Ｂｃｒ−Ａｂｌからなる群から選択されるものが好ましい。
一態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、以下の式（Ａ）：
【化３】
2015125732.tif 000004
（式中、Ｒは、ハロゲン、好ましくはＣｌ、Ｃ２−５アルキニル、好ましくはエチニル、又はフェニル‐Ｃ１‐５アルコキシ、好ましくはフェニルメトキシであり、同一でも異なっていてもよく、フェニルはハロゲン、好ましくはＦで置換されていてもよく、ｎは１〜５の整数、好ましくは１または２であり、Ｘ及びＹは、有機基または水素、好ましくは２−メトキシエトキシ、又は、２−メチルスルホニルエチルアミノ‐メチル‐２‐フリンであり、同一でも異なっていてもよい）で表される化合物またはその塩
であってもよい。当該化合物は、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ（n-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]phenyl]-6-[5-[(2-methylsulfonylethylamino)methyl]-2-furyl]quinazolin-4-amine）、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ（N-(3-ethynylphenyl)-6,7- bis(2-methoxyethoxy)-4-quinazolinamine）、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine）であるのが好ましく、Ｌａｐａｔｉｎｉｂがより好ましい。
【００３８】
本発明の予防用又は治療用組成物の適用対象は、典型的にはヒトであるが、愛玩動物、実験動物、家畜など非ヒト動物である場合も含む。また、好ましくない場合には、対象からヒトを除いてもよい。前記対象には、治療抵抗性がんを患っている対象のみならず、治療抵抗性がんを患う、もしくは、患っている恐れのある対象も含まれる。
【００３９】
本発明の予防用又は治療用組成物の、対象（生体等）への投与経路としては、全身投与であっても、局所投与であってもよい。限定はされないが、舌下投与も含む経口投与、あるいは吸入投与、カテーテルによる、標的組織又は臓器に対する直接投与、点滴を含む静脈内投与、パップ剤等による経皮投与、座薬、又は、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。
【００４０】
本発明の予防用又は治療用組成物の剤型としては、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座薬剤等を挙げることができる。
【００４１】
本発明の予防用又は治療用組成物を調製するために、必要に応じて、例えば、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加してよく、さらに、それらによって、本発明の予防用又は治療用組成物の吸収性や血中濃度に影響を及ぼし、体内動態の変化をもたらしてもよい。具体的には、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリン等を例示することができる。
【００４２】
本発明の、予防用又は治療用医薬、診断用医薬とは、２以上の物質や組成物の組み合わせであって、その組み合わせの態様を限定しない医薬を意味する。
【００４３】
本発明に係る、予防用又は治療用医薬、診断用医薬は、必要に応じて他の薬効成分、栄養剤、担体等の他の任意成分を加えることができるのは言うまでもない。任意成分として、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコール等の、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
【００４４】
本発明の予防用又は治療用組成物の投与量は、対象とする治療抵抗性がん細胞へのＰｐＩＸの集積量がＡＬＡ−ＰＤＴにおける有効量であればよく、当業者は適宜、決定できる。もっとも、対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間としては、対象の年齢、体重、症状や状態、あるいは、予防または治療しようとする対象内の細胞、組織又は臓器の状態や投与のしやすさ等により異なる。
ＡＬＡ類のヒトへの投与量は、例えば治療抵抗性がんの治療のための経口投与の場合、ＡＬＡ類による光増感効果が得られる限り特に限定はされないが、ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇであってもよい。治療及び投与の態様としては、例えば、ＷＯ２０１３／１８７０６９（発明の名称：ＰＤＴ効果増強剤）を参酌してもよい。また、治療抵抗性がんの予防方法の場合には、治療抵抗性がんの治療方法と比較して、典型的には、より少ないＡＬＡ類の投与量であることが理解される。ＡＬＡ類のヒトへの投与量は、例えば治療抵抗性がんの予防のための経口投与の場合、ＡＬＡ類による光増感効果が得られる限り特に限定はされないが、ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは２．５ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜１５ｍｇ、さらに好ましくは７．５ｍｇ〜１２．５ｍｇであってもよい。局所投与は、全身投与よりも、少ないＡＬＡ類を要求するであろう。
ＡＬＡ類の投与頻度としては、一日一回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。
ＡＬＡ類の投与期間は、例えば、対象の、予防又は治療しようとする症状又は状態等に鑑みて、種々の臨床学的指標等に基づいて、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することができる。
また、ＡＬＡ類の投与量、タイミング、投与頻度、投与期間等を考慮しながら、対象の治療抵抗性がんに対して、ＡＬＡ−ＰＤＴを１回又は複数回（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上）実施して、治療抵抗性がんの予防又は治療を行ってもよい。例えば、ＡＬＡ類を投与後に、特定波長の光線を照射してＰＤＴを施した後で、再度、光線照射によるＰＤＴを実施することにより、初回のＰＤＴでは効果が得られない、腫瘍深部の治療抵抗性がん細胞をも死滅させることが可能となる。また、ＡＬＡ類を複数回投与する場合にも、各投与の間にＰＤＴを複数回実施してもよい。また、従来の抗がん剤治療等により、大部分のがん細胞を死滅又は除去した後で、残存する（治療抵抗性）がん細胞に対して、又は、（治療抵抗性）がん細胞が残存する恐れがある組織に対して、ＡＬＡ−ＰＤＴを１回又は複数回実施してもよい。
例えば、ＡＬＡ類を用いて特定波長の光を照射することによりＰＤＴを実施した後で、再度、（同様の）ＰＤＴを実施することにより、初回のＰＤＴでは効果が得られない、腫瘍深部の治療抵抗性がん細胞を死滅させることが挙げられる。また、例えば、最初に従来のがん治療（例えば、腫瘍の外科的切除、抗がん剤治療、放射線治療等）を実施し、大部分のがん細胞を死滅させた後に、ＡＬＡ類を用いたＰＤＴにより、残存したがん細胞を死滅させ、又は、がんの再発や転移を予防することが挙げられる。この場合、最初に施した従来のがん治療を継続させて実施してもよい。
【００４５】
好ましい一態様において、ＡＬＡ−ＰＤＴを行う場合、ＡＬＡ類に抗がん剤を組み合わせて、同時または順次に、対象に投与してもよい。ＡＬＡ類の投与方法と、抗がん剤の投与方法とは、同じでもよく、異なってもよい。例えば、ＡＬＡ類を対象に経口投与し、抗がん剤を静脈内投与してもよい。
抗がん剤の対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等としては、抗がん剤の性質、種類も考慮しつつ、ＡＬＡ類と同様に、当業者は適宜決定できるのは言うまでもない。
【００４６】
同様にして、抗がん剤の代わりにＡＢＣＧ２阻害剤を用いてもよい。一実施態様において、抗がん剤がＡＢＣＧ２阻害作用をも有するのが好ましい。
【００４７】
一態様において、本発明の予防用又は治療用組成物に含有されるＡＬＡ類と、抗がん剤とは、予防用又は治療用医薬として、ＡＬＡ類と抗がん剤とを含む組成物（配合剤）、又は、別々のキットとして使用してもよい。あるいは、それぞれ単独で投与してもよい。それぞれ単独で投与する場合、同時また順次に投与してよい。ここで、同時とは、同時刻に行われることのみならず、同時刻でなくともＡＬＡ類と抗がん剤との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように、両者間で相当の間隔をおかずに行われることを意味してよい。
ＡＬＡ−ＰＤＴと抗がん剤とを組み合わせて、治療抵抗性がんの予防又は治療を行う場合には、例えば、抗がん剤を投与後に、ＡＬＡ類を投与して、ＰＤＴを１回又は複数回実施してもよいし；ＡＬＡ類を投与後に、抗がん剤を投与して、次いで、ＰＤＴを１回又は複数回実施してもよいし；ＡＬＡ類を投与して、ＰＤＴを１回又は複数回実施した後に、抗がん剤を投与してもよい。このように、１回又は複数回のＡＬＡ類の投与、１回又は複数回の抗がん剤の投与、１回又は複数回のＰＤＴの実施等のあらゆる組み合わせが、本発明の範囲内に含まれることは言うまでもない。
【００４８】
また、例えば、最初に、従来のがん治療（例えば、腫瘍の外科的切除、抗がん剤治療、放射線治療等）を施し、大部分のがん細胞を死滅させた後に、ＡＬＡ−ＰＤＴを実施して、残存したがん細胞を死滅させてもよい。この場合、最初に施した従来のがん治療をその後も継続して実施してもよいし、あるいは、抗がん剤（好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤）を併用させてもよい。
【００４９】
別の態様において、本発明の診断用医薬を用いてＡＬＡ−ＰＤＤを実施することにより、治療抵抗性がん細胞を含むがん細胞に選択的に蓄積するＰｐＩＸから励起した蛍光を検出して、治療抵抗性がん細胞を含むがん組織の存在の有無を決定もしくは診断することが可能である。特に、チロシンキナーゼ阻害剤又はＡＢＣＧ２阻害剤をＡＬＡ類と共に併用することによって、がん細胞からのＰｐＩＸの流出を低減させて、がん組織と正常組織の境界を鮮明にできるので、がん組織に蓄積したＰｐＩＸの蛍光に従ってがん組織をより正確に診断、検出し、外科的に切除することが可能となる。
【００５０】
本発明の診断用医薬が対象とする、治療抵抗性がん細胞、治療抵抗性がん、チロシンキナーゼ阻害剤、ＡＢＣＧ２阻害剤の種類等は、本発明の予防用又は治療用医薬に関して上述したものと同様のものが企図されてよい。例えば、治療抵抗性がんは、脳腫瘍が特に好ましい。
【００５１】
また、本発明の診断用医薬の使用条件を、当業者は、対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等を考慮して、本発明の予防用又は治療用医薬のそれらと同様に、適宜、検討し実施できる。この際、１回又は複数回のＡＬＡ類の投与、１回又は複数回のチロシンキナーゼ阻害剤又はＡＢＣＧ２阻害剤の投与、１回又は複数回のＰＤＤの実施を、適宜、組み合わせてもよい。
ＡＬＡ類のヒトへの投与量は、例えば治療抵抗性がんの診断のための経口投与の場合、ＡＬＡ類により誘導されたＰｐＩＸを光線で励起させて蛍光を検出することでがん細胞の存在の有無を識別できる限り特に限定はされないが、ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇであってもよい。診断及び投与の態様としては、例えば、ＷＯ２０１３／１５０７４５（発明の名称：センチネルリンパ節がん転移識別装置）を参酌してもよい。
したがって、本発明は、一態様において、対象における治療抵抗性がん細胞を伴う治療抵抗性がんの診断方法に関してもよい。診断方法は、治療抵抗性がんを患っているか、患っている恐れのある対象に対して、ＡＬＡ類を投与する前、同時、又は、後において、チロシンキナーゼ阻害剤又はＡＢＣＧ２阻害剤を併用して投与した後に、前記対象においてがんが存在するか、存在すると予想される部位に、光線を照射してＰＤＤを実施し、治療抵抗性がん細胞を含むがん細胞に選択的に蓄積するＰｐＩＸから励起した蛍光を検出することで、対象が、治療抵抗性がんを患っているかどうかを決定もしくは診断してもよい。
【００５２】
［本発明のその他の効果］
がん幹細胞を含む治療抵抗性がん細胞では、ＡＢＣＧ２の発現が亢進しているので、ＡＢＣＧ２阻害剤（好ましくはＡＢＣＧ２を阻害できる抗がん剤）をＡＬＡ類と共に併用することによって、治療抵抗性がん細胞内のＰｐＩＸ蓄積を促進させ、悪性脳腫瘍をはじめとする多様ながん（肺がん、胃がん、大腸がん、乳がんなど）のＡＬＡ−ＰＤＴの効率を向上させることができるので有利である。
また、外科手術によって切除することが困難な浸潤性がん組織（例えば、多型膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、グレードＩＶ）に対しては、外科的切除の後、光ファイバーなどを使って局所的に光線を照射する事により、正常組織に浸潤したがん細胞（治療抵抗性がん細胞を含む）を殺傷することができるので有利である。
また、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの数時間前に行なってもよい、ＡＢＣＧ２の発現を阻害できるチロシンキナーゼ阻害剤の単回又は数回投与では、長期間の反復投与に見られる副作用（骨髄抑制、白血球・好中球・血小板減少、皮膚及び肝臓の障害など）は現れにくい。したがって、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤと組み合わせる、単回又は数回投与のチロシンキナーゼ阻害剤の安全性は高いので有利である。
【００５３】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００５４】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００５５】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００５６】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
【００５７】
第１の、第２の、・・・等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、技術的に矛盾しない限り、本発明の範囲を逸脱することなく可能であることが理解される。
【００５８】
本明細書において、例えば、「炭素数１〜８のアルカノイル基」と表現されている場合、当業者は、当該表現が、炭素数が１、２、３、４、５、６、７又は８のアルキル基を個別具体的に指すことを理解する。
【００５９】
本明細書において、成分含有量や数値範囲を示すのに用いられるあらゆる数値は、特に明示がない限り、用語「約」の意味を包含するものとして解釈される。
【００６０】
本明細書中に引用される文献は、それらのすべての開示が、本明細書中に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの先行技術文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解する。
【００６１】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００６２】
<実施例１>
がん幹細胞の培養
実験方法
正常組織幹細胞の濃縮、分離方法を応用してがん幹細胞研究が進められており、白血病幹細胞の研究においては、がん幹細胞を標的とした治療法の探索・マウスモデルでの治療の段階まで研究が進んでいる。一方、固形がんにおいては、分離、濃縮方法の確立もまだ不十分であるが、近年、悪性脳腫瘍の患者から脳腫瘍幹細胞を単離して培養することが可能になった。これらの方法に基づいて脳腫瘍の患者から単離し樹立された幹細胞株を用いた（Hemmati HD, Nakano I, Lazareff JA, Masterman-Smith M, Geschwind DH, Bronner-Fraser M, Kornblum HI. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(25):15178-5183, 2003.；Nakano I, Kornblum HI. Methods for analysis of brain tumor stem cell and neural stem cell self-renewal. Methods Mol Biol. 568:37-56, 2009.）。
具体的には、脳腫瘍患者から単離して樹立した脳腫瘍ｇｌｉｏｍａ幹細胞の株３種類（ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳ細胞）を用いて、ＡＬＡ−ＰＤＴに対する光感受性を検証する実験を行なった。その実験に備えて、まず、これらの細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液と、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｌ−グルタミン，ヘパリン，Ｂ２７，ＥＧＦ，ｂＦＧＦを含む）でそれぞれ培養して、その形態を検証した。【００６３】
結果
ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液でｇｌｉｏｍａ幹細胞を培養すると、細胞はいずれも幹細胞に特徴的な３次元的な塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成した。図１に示すように、細胞の塊（ｓｐｈｅｒｅ）の直径は数百μｍであった。一方、細胞を１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養すると、ｓｐｈｅｒｅを形成せず、細胞は平面的に増殖した。【００６４】
<実施例２>  
がん幹細胞のＡＬＡ−ＰＤＴに対する光感受性
実験方法
ｓｐｈｅｒｅ型およびｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型に増殖した脳腫瘍幹細胞（ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳ細胞）をトリプシン処理して、それぞれ１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で０．３ｍＭ  ＡＬＡと共に、４時間インキュベートした後、４０５ｎｍのレーザー光を照射した。そして、さらに７日間培養した後、細胞の生存率を、水溶性テトラゾリウム塩（Ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔｓ）を発色試薬として用いた、生細胞数測定法（ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ）で測定した。【００６５】
結果
図２は、レーザー光の強度と細胞の生存率との関係をプロットしたものである。ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｌ−グルタミン，ヘパリン，Ｂ２７，ＥＧＦ，ｂＦＧＦを含む）で培養したｓｐｈｅｒｅ型の細胞（図２Ｂ）は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養したｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型の細胞（図２Ａ）よりも、ＡＬＡ−ＰＤＴに対して感受性が高かった。表１は、細胞の生存率を５０％にする光強度（ＩＣ５０）をまとめたものである。ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型の細胞に比べて、ｓｐｈｅｒｅ型の細胞（幹細胞、または、幹細胞様細胞）では感受性が約２倍高まっていたことが判明した。
【表１】
2015125732.tif 000005
【００６６】
<実施例３>  
脳腫瘍細胞のＡＬＡ−ＰＤＴに対する光感受性
実験方法
脳腫瘍細胞株Ａ１７２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｌ−グルタミン，ヘパリン，Ｂ２７，ＥＧＦ，ｂＦＧＦを含む）で培養すると、細胞は幹細胞に類似したｓｐｈｅｒｅを形成した。一方、細胞を１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養すると、細胞はｓｐｈｅｒｅ型を形成せず、平面的に増殖した。ｓｐｈｅｒｅ型およびｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型に増殖した細胞をトリプシン処理した。次いで、それぞれ１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で０．３ｍＭ  ＡＬＡと共に、４時間インキュベートした後、４０５ｎｍのレーザー光を照射した。そして、さらに７日間培養した後、細胞の生存率を、実施例２と同様に、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙで測定した。
また、ＡＬＡ−ＰＤＴを実施したＡ１７２細胞から、それぞれ、５００細胞を取り出した後、１０％ＦＣＳと抗生物質とを含むＤ−ＭＥＭ寒天培地に播種して、１４日間培養した。その後、１０％ホルマリンを含むＴｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅで処理して細胞コロニーを固定・染色した。５０細胞以上からなるコロニーの数を、立体顕微鏡を用いてカウントした。【００６７】
結果
脳腫瘍細胞株Ａ１７２細胞を、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｌ−グルタミン，ヘパリン，Ｂ２７，ＥＧＦ，ｂＦＧＦを含む）で培養すると、細胞は幹細胞に類似したｓｐｈｅｒｅを形成した（図３Ｂ）。さらに、脳腫瘍幹細胞のマーカーであるＣＤ１３３とＳｏｘ−２蛋白質の発現も上昇した（図示せず）。また、脳腫瘍幹細胞ＭＤ１３，ＭＤ３０，１５７ＮＳに対して実施例２で行なったのと同様に、ｓｐｈｅｒｅ型およびｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型のＡ１７２細胞の、ＡＬＡ−ＰＤＴに対する感受性をそれぞれ調べた結果、ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型と比較して、ｓｐｈｅｒｅ型は光感受性がより高いことが判明した（図３）。
前述したＷＳＴ−８  ａｓｓａｙでは、ミトコンドリアのＮＡＤ（Ｐ）Ｈによる還元反応に基づいて細胞生存率を測定できる。一方、コロニー形成アッセイでは、細胞の増殖能力を測定できる。図４に示すように、コロニー形成アッセイで調べた結果、ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型と比較して、ｓｐｈｅｒｅ型は光感受性がより顕著に高いことが判明した。すなわち、細胞増殖能力の観点において、ｓｐｈｅｒｅ型（がん幹細胞）は、光感受性が極めて高いといえる。【００６８】
<実施例４>
脳腫瘍細胞における、ポルフィリン生合成に関与する酵素とトランスポーター
実験方法
脳腫瘍細胞株Ａ１７２細胞は、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｌ−グルタミン，ヘパリン，Ｂ２７，ＥＧＦ，ｂＦＧＦを含む）で培養すると、幹細胞に類似したｓｐｈｅｒｅを形成して、且つ、ＡＬＡ−ＰＤＴに対する感受性が高くなった（図３、図４）。その理由を解明するために、ポルフィリン生合成に関与する酵素とトランスポーター遺伝子のｍＲＮＡレベルを、定量的ＰＣＲで測定した。ｓｐｈｅｒｅ型およびｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型のＡ１７２細胞から、Ｍａｇｎａ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ぞれぞれ、トータルＲＮＡを抽出した。そして、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使って、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。定量的ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ３（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて実施した。【００６９】
結果
ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型の細胞と比較して、がん幹細胞に類似したｓｐｈｅｒｅ型の細胞では、ＡＬＡの細胞内取り込みを行なうトランスポーターＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２の発現、並びにポルフィリン合成酵素やＡＢＣＢ６遺伝子の発現が亢進していた（図５）。さらに、細胞内ＰｐＩＸレベルに関しても、ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ型の細胞と比較して、ｓｐｈｅｒｅ型の細胞では２倍以上高くなっていた（図示せず）。【００７０】
<実施例５>
チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＢＣＧ２の輸送機能阻害
実験方法
ヒトゲノムＤＮＡの中には４８種類のＡＢＣトランスポーター遺伝子がコードされている。このうち、ＡＢＣＧ２は、細胞内のＰｐＩＸを細胞外へ生理的に輸送する能力を有する。
また、ＡＢＣＧ２は、幹細胞での発現が顕著に高く、フローサイトメトリー法で幹細胞やＳＰ（ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）細胞を単離する際に使うＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を、ＡＢＣＧ２が細胞外に能動的に排出していることが報告されている（Zhou S, Schuetz JD, Bunting KD, Colapietro AM, Sampath J, Morris JJ, Lagutina I, Grosveld GC, Osawa M, Nakauchi H, Sorrentino BP. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7(9):1028-1034, 2001.）。
これまでに、本発明者らは、ＡＢＣＧ２の輸送機能を阻害する化合物と薬を探索する高速スクリーニング系を開発し、効率的な阻害剤分子を探索した（Saito H, Hirano H, Nakagawa H, Fukami T, Oosumi K, Murakami K, Kimura H, Kouchi T, Konomi M, Tao E, Tsujikawa N, Tarui S, Nagakura M, Osumi M and Ishikawa T. A new strategy of high-speed screening and quantitative structure-activity relationship analysis to evaluate human ATP-binding cassette transporter ABCG2-drug interactions. J. Pharmacol. Exp. Ther. 317(3), 1114-1124, 2006.）。その結果、チロシンキナーゼ阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂがＡＢＣＧ２を効果的に阻害することを実験的に発見した（An R, Hagiya Y, Tamura A, Li S, Saito H, Tokushima D, and Ishikawa T. Cellular phototoxicity evoked through the inhibition of human ABC transporter ABCG2 by cyclin-dependent kinase inhibitors in vitro. Pharm Res. 26(2), 449-458, 2009.）。
本実験においては、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、及び、複数のチロシンキナーゼ阻害剤を用いて、ＡＢＣＧ２の阻害剤スクリーニング実験を実施した。
具体的には、チロシンキナーゼ阻害剤として、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂを用い、また、コントロールとして、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌを用いて、ＡＢＣＧ２の輸送機能阻害スクリーニングを実施した。
ヒトＡＢＣＧ２を発現するＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞（Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３／ＡＢＣＧ２細胞）を、ＡＢＣＧ２の基質であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２と前記チロシンキナーゼ阻害剤と共にそれぞれ一定時間培養した。その後、個々の細胞中に蓄積されているＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２のレベルをＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。ＡＢＣＧ２に特異的な阻害であることを裏付けるために、同様の実験をＦｌｐ−Ｉｎ−２９３／Ｍｏｃｋ（ＡＢＣＧ２を発現していない）細胞でも実施した。具体的な実験手順は以下の通りである。
Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３／Ｍｏｃｋ、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３／ＡＢＣＧ２をＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡにより剥離した。１０６細胞をＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ）に懸濁した。ついで、５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を単独で添加するか、または、５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２と１ｎＭ〜１００μＭの濃度の各種阻害剤とを併用して添加してから、３７℃で９０分間培養した。培養後、冷ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄し、再び冷ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）に懸濁した後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）により細胞内蛍光強度を測定した。１回の測定あたり５０，０００細胞を測定した。細胞内に蓄積したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２をＵＶレーザーにより励起し、その蛍光６７５ｎｍを検出して、測定した細胞の有する蛍光の平均強度（ＭＦＩ）を算出した。その結果に基づいて、ＡＢＣＧ２の阻害率を算出した。【００７１】
結果
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２単独添加時のＦｌｐ−Ｉｎ−２９３／Ｍｏｃｋ細胞及びＦｌｐ−Ｉｎ−２９３／ＡＢＣＧ２細胞のＭＦＩを、それぞれ１００％及び０％とした時の各添加群のＭＦＩを図６に示す。縦軸はチロシンキナーゼ阻害剤によるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の排出阻害率（ＡＢＣＧ２機能の阻害を反映）を示し、横軸はチロシンキナーゼ阻害剤の濃度を示す。この結果から、試験したチロシンキナーゼ阻害剤の中で、Ｌａｐａｔｉｎｉｂが最も強くＡＢＣＧ２を阻害し、ＥｒｌｏｔｉｎｉｂとＧｅｆｉｔｉｎｉｂは、ほぼ同等のＡＢＣＧ２阻害能力を持つことが判明した。【００７２】
<実施例６>
Ｌａｐａｔｉｎｉｂによる、ＡＢＣＧ２の輸送阻害とＡＬＡから生合成されたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の細胞内蓄積
実験方法
ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞を、２ｍＭ  ＡＬＡと様々な濃度のＬａｐａｔｉｎｉｂとともに４時間培養して、その間にＡＬＡから生合成されて細胞内に蓄積したＰｐＩＸの蛍光強度（ＭＦＩ値）をＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。具体的な実験手順は以下の通りである。
Ｕ８７ＭＧ細胞をＰＢＳで２回洗浄後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡにより剥離した。１０６細胞を低血清のＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ）に懸濁した。ついで、２ｍＭ  ＡＬＡを単独で添加するか、または、２ｍＭ  ＡＬＡと１ｎＭ〜１００μＭの濃度のＬａｐａｔｉｎｉｂもしくはＧｅｆｉｔｉｎｉｂとを併用して添加してから、３７℃で４時間培養した。培養後、氷冷ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄し、再び冷ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）に懸濁した後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）により細胞内蛍光強度を測定した。１回の測定あたり５０，０００細胞を測定した。細胞内に蓄積したＰｐＩＸをＵＶレーザー（３２５ｎｍ）により励起し、その蛍光５７５ｎＭを検出し、測定した細胞の有する蛍光の平均強度（ＭＦＩ）を算出した。その結果に基づいて、ＰｐＩＸの細胞内蓄積を相対的に算出し、ＬａｐａｔｉｎｉｂまたはＧｅｆｉｔｉｎｉｂによるＡＢＣＧ２のＰｐＩＸ輸送阻害を推算した。【００７３】
結果
ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞は、ＡＬＡと培養する事によりＰｐＩＸを生合成する。２ｍＭ  ＡＬＡと様々な濃度のＬａｐａｔｉｎｉｂとともに４時間培養すると、細胞内に蓄積したＰｐＩＸの蛍光強度が増加した。ＰｐＩＸ蛍光強度の増加はＬａｐａｔｉｎｉｂの濃度に依存し、１〜１００μＭの濃度で顕著に増加した。１０ｎＭ以上の濃度領域でＬａｐａｔｉｎｉｂがＡＢＣＧ２を有意に阻害し、ＡＬＡから生合成されたＰｐＩＸが細胞内に蓄積したことが判明した。一方、ＧｅｆｉｎｉｔｉｂでＡＢＣＧ２を阻害してもＰｐＩＸの細胞内蓄積は観察されたが、Ｌａｐａｔｉｎｉｂほどは蓄積されなかった（図７）。その理由として、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂはＬａｐａｔｉｎｉｂと比較してＡＢＣＧ２阻害活性が弱いことも反映したとも考えられる（図６も参照）他、培養条件の相違等も考えられる。【００７４】
<実施例７>
ＬａｐａｔｉｎｉｂによるＡＢＣＧ２の輸送阻害とＡＬＡ−ＰＤＴの効果：培養細胞を用いた実験
実験方法
ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞（１０６細胞）をＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ）に懸濁後、１０ｍＭ  ＡＬＡを単独で添加するか、または、１０ｍＭ  ＡＬＡと１ｎＭ〜３００μＭの濃度のＬａｐａｔｉｎｉｂとを併用して添加してから、３７℃で４時間培養した。６３５ｎｍにピークを持つＬＥＤで細胞を照射（１２Ｊ／ｃｍ２）して、その後の細胞生存率をＭＴＴ法で測定した。なお、ＭＴＴ法は、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙと測定原理は同じであり、ＭＴＴをホルマザン色素（紫色）へ還元する酵素活性を測定する比色定量法である。【００７５】
結果
ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞は、ＡＬＡを単独で添加して培養した後、ＬＥＤで細胞を照射（１２Ｊ／ｃｍ２）する事により、約５０％の細胞が死滅した（図８において、Ｌａｐａｔｉｎｉｂの濃度が０の場合に相当）。
一方、１０ｍＭ  ＡＬＡと共に様々な濃度のＬａｐａｔｉｎｉｂでＵ８７ＭＧ細胞を培養する事によって、細胞のＬＥＤ照射（１２Ｊ／ｃｍ２）に対する感受性が濃度依存的に増加した（細胞が死滅しやすくなった）。この事は、ＬａｐａｔｉｎｉｂがＡＢＣＧ２を阻害する事により、ＡＬＡから生合成されたＰｐＩＸが細胞内に蓄積して、細胞の光照射に対する感受性が増加したことを示す（図８）。【００７６】
<実施例８>
ＬａｐａｔｉｎｉｂによるＡＢＣＧ２の輸送阻害とＡＬＡ−ＰＤＴの効果：ヌードマウスを用いた実験
実験方法
ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマＵ８７ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養したあと、Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅを用いて生存細胞の数を計測した。次いで、Ｕ８７ＭＧ細胞（５ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）をＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウスの背部の皮下に注射して移植した。３日後、ヌードマウスに、ＡＬＡ単独（３０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，ｐ．ｏ．）またはＡＬＡ（３０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，ｐ．ｏ．）とＬａｐａｔｉｎｉｂ（１００ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，ｐ．ｏ．）との併用で経口投与した。次いで、３時間後に６３５ｎｍに発光ピークを有するＬＥＤを腫瘍移植部分に照射した。照射後一週間後に腫瘍を摘出し、その重さをそれぞれ測った。【００７７】
結果
ＡＬＡ（３０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，ｐ．ｏ．）とＬａｐａｔｉｎｉｂ（１００ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，ｐ．ｏ．）とを併用で経口投与してＡＬＡ−ＰＤＴを実施したマウスでは、コントロールのマウスおよびＡＬＡ（３０  ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，  ｐ．ｏ．）単独投与のマウスと比較して、顕著に腫瘍の成長が抑制された（図９、図１０）。【００７８】
<実施例９>
ＰＤＴの複数回実施の効果
実験方法
ＨｅＬａ細胞（ヒト由来子宮頸部がん細胞株）１ｘ１０５ｃｅｌｌｓを６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種し２４時間培養後、培養液に抗がん剤を投与した。投与した抗がん剤の種類、および、培養液中の抗がん剤の濃度を表２に示した。抗がん剤投与７２時間後にトリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を回収し、回収した細胞の一部を用いて、トリパンブルー染色法によって生存細胞数を確認した。生存していた細胞を、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５ｘ１０３ｃｅｌｌｓを播種した。本実施例においては、抗がん剤投与７２時間後に生き残っていたこれらの細胞を、治療抵抗性がんとして用いた。
【表２】
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【００７９】
９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへの播種から２４時間後、５−アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ）を投与し、４時間培養後、合計６０  Ｊ／ｃｍ２になるように１〜３回、６３１ｎｍ  ＬＥＤ光を照射した。複数回光照射する場合は、光照射の間隔を２時間ずつ空けた。光照射２４時間後にＰＢＳで２回洗浄した後に、ＷＳＴ８  ａｓｓａｙで細胞生存率を測定した。なお、ＰＤＴの方法は、Ｐｈｏｔｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎ  Ｔｈｅｒ．  ９（３）：２０４−１４（２０１２）を参考にした。【００８０】
結果
抗がん剤未投与、治療抵抗性がんにおけるＡＬＡ−ＰＤＴ  ２４時間後の細胞生存率の変化を図１１〜１５に示す。図１１ａ，図１２ａ，図１３ａ，図１４ａ，図１５ａの横軸は、投与したＡＬＡの濃度を示す。図１１ｂ，図１２ｂ，図１３ｂ，図１４ｂ，図１５ｂは、それぞれ図１１ａ，図１２ａ，図１３ａ，図１４ａ，図１５ａのグラフにおいて、ＡＬＡを２５０μＭ投与した時の結果を抜粋したものである。それぞれの図の縦軸は、ＡＬＡを投与しなかったこと以外は同じ条件で実験を行った場合の細胞生存率を１００％とした場合の、実験群における細胞生存率の割合を示す。【００８１】
抗がん剤未投与のＨｅＬａ細胞、各種抗がん剤投与後に生き残ったＨｅＬａ細胞（治療抵抗性がん）のいずれにおいても、ＨｅＬａ細胞はＡＬＡ  １２５μＭ以上で、細胞生存率が低下した。また、ＡＬＡ  １２５〜２５０μＭを投与した時に、光照射の回数依存的に細胞生存率が低下した。この結果から、同じ照射エネルギーの光照射を実施した場合において、単回のＡＬＡ−ＰＤＴよりも複数回のＡＬＡ−ＰＤＴのほうが、治療効果が高いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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