(57)【要約】成長期におけるステロイドの投与により誘発される成長障害を軽減及び／又は改善するための医薬であり、少なくとも一種類のナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）アゴニストを有効成分として含有するステロイド剤投与で誘発される成長障害の軽減及び／又は改善剤等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド剤の継続的な投与が必要な成長期の個体に対して投与されることを特徴とする、少なくとも一種類のナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）アゴニストを有効成分として含有する、ステロイド剤投与により誘発される成長障害を軽減及び/又は改善するための医薬。
【請求項２】
ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、その活性断片、それらの変異体、それらの誘導体又はそれらの修飾体、或いは、抗ＮＰＲ−Ｂ抗体である、請求項１の医薬。
【請求項３】
ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、ｈＣＮＰ−２２（配列番号１）、ｈＣＮＰ６−２２（配列番号１のアミノ酸番号６乃至２２）又はｈＣＮＰ−５３（配列番号２）、それらの変異体、それらの誘導体又はそれらの修飾体であることを特徴とする請求項１の医薬。
【請求項４】
ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、ｈＣＮＰ−２２またはｈＣＮＰ６−２２の誘導体又は修飾体であることを特徴とする請求項１の医薬。
【請求項５】
誘導体が、免疫グロブリンＦｃ部由来のペプチド、血清アルブミン及びグレリンのＣ末端側部分ペプチド、から選択される少なくとも一つの付加ペプチドが、ｈＣＮＰ−２２またはｈＣＮＰ６−２２のＮ末端、Ｃ末端またはその両方に結合したペプチドであることを特徴とする請求項２〜４のいずれかの医薬。
【請求項６】
誘導体が、配列番号６乃至１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項２〜４のいずれかの医薬。
【請求項７】
誘導体が、配列番号８、１３又は１５のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項６の医薬。
【請求項８】
修飾体が、ＰＥＧまたはその類縁物質親水性ポリマーが、ｈＣＮＰ−２２、ｈＣＮＰ６−２２、またはｈＣＮＰ−５３のＮ末端、Ｃ末端またはその両方に結合したものであることを特徴とする請求項２〜４のいずれかの医薬。
【請求項９】
ステロイド剤療法の開始時又は期間中に投与され、成長障害を軽減及び／又は改善することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの医薬。
【請求項１０】
ステロイド剤療法の期間中又は終了後において、ステロイド剤投与で誘発される成長障害によって生じた低身長症の治療のために投与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）またはＣＮＰ誘導体に代表されるナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）アゴニストを有効成分として含有するステロイド剤投与で誘発される成長障害を軽減及び／または改善する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ステロイド剤」とは、ステロイドホルモンあるいはその改変型の化学合成品を配合した薬品を示す総称であり、多くの場合は糖質コルチコイドまたはその改変型の化学合成品を配合した医薬品を意味する。ステロイド剤には、抗炎症作用、免疫抑制作用、リンパ球障害作用、血管収縮作用、気管支拡張作用などの薬理作用があり、多様な病気に対して劇的に奏功することが知られている。一方で、ステロイド剤による治療には重大な副作用の発現リスクが報告されており、代表的なものとしては、過剰な免疫抑制作用による感染症の発症または悪化、クッシング症候群、副腎皮質機能不全、糖尿病、骨粗しょう症及び消化性潰瘍などが知られている（非特許文献１、非特許文献２など）。加えて、前述したようなステロイド剤治療による副作用の発現を恐れるあまりに、医師の指示通りの使用を怠った場合には、治療対象となる原疾患の病状を悪化（リバウンド）させるのみでなく、吐き気、頭痛、倦怠感、血圧低下などのいわゆる「ステロイド離脱症候群」を発症する危険性が指摘されている（非特許文献３）。【０００３】
小児においては、それらに加えてステロイド剤の長期使用による成長障害発生のリスクが伴う。小児において長期間に亘ってステロイド剤による治療を行うと、体内で過剰になった糖質コルチコイド類により、成長ホルモン（ＧＲＯＷＴＨ  ＨＯＲＭＯＮＥ）やインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）の生成及び分泌が妨げられたり、それらホルモンに対する感受性も低下したりする。その結果、小児の正常な発育が抑制された状態、いわゆる「成長障害」を引き起こし、同年齢の児童の標準成長曲線と比較して有意に背が低い状態、いわゆる「低身長症」と診断されるに至る可能性がある（非特許文献４）。小児において比較的長期間に亘ってステロイド剤での治療が必要となる疾患には、喘息、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱 、若年性特発性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症筋無力症、ギランバレー症候群、肺ヘモジデローシス、小児 IgA 腎症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、急性リンパ性白血病、先天性副腎過形成などがある。これらの少なくとも一部は、ステロイド剤での治療を中止することがむずかしく、重症化した場合は死に至る可能性も想定される重篤な疾患である。そのため、目的とする効果が十分に得られる範囲の中でステロイド剤を使用し続けながら、尚且つ、種々の副作用の発現を最小限に抑えることが求められる。【０００４】
ステロイド剤投与で誘発される成長障害は、その後の投薬を中止したり減量したりすることにより、少なくとも一部は回復するが（非特許文献５）、その一方で、小児の成長期間は限られており、思春期をむかえて骨端の成長板が閉鎖してしまえば、ステロイド剤の使用の有無に関わらず、もはやそれ以上の成長は期待できない。そのため、小児期に生命に関わるような重篤な疾患のため、ステロイド剤による継続治療が必要となり、長期間に亘って投薬中止や投与量の減量ができない対象では、生涯に亘って十分な成長が期待できずに低身長症となる可能性が生じる。【０００５】
以上のことから、ステロイド剤での治療を必要とする小児において、ステロイド剤の治療効果を減弱したり、成長障害以外の副作用を悪化させることなく、ステロイド剤治療によって生じる成長障害を軽減及び／または改善しうる薬剤、あるいは、ステロイド剤の治療により低身長をきたした小児の成長を促進し、低身長症を治療しうる薬剤があれば、対象の生涯に渡るＱＯＬ向上が期待できる。さらに、成長障害のリスクが軽減することで原疾患に対して十分量のステロイド剤による治療ができるようになり、結果として原疾患に対する治療成績の向上にもつながるものと期待される。【０００６】
現在、一部の疾患に起因する低身長症の治療薬として、ＧＲＯＷＴＨ ＨＯＲＭＯＮＥやＩＧＦ−１等が使用されているが、これらの薬剤は非常に高価であると共に、種々の副作用の発現が懸念される（非特許文献６）。そのため、ステロイド剤投与で誘発される成長障害に対して予防的にあるいは治療的に投与することはリスクとベネフィットの考えからも推奨されていない。【０００７】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｃ-Ｔｙｐｅ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ: 以後、ＣＮＰと記載する）は、グアニレートサイクレースを含むナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂ、略称：ＮＰＲ−Ｂ、別称：ＧＣ−Ｂ）に特異的に結合して、グアニレートサイクレースを活性化させ、細胞内ｃＧＭＰレベルを調整することで様々な生理活性を発現するＮＰＲ−Ｂのアゴニストである。ＣＮＰは、軟骨細胞に作用して骨成長において重要な役割を担う（非特許文献７、非特許文献８など）。肝臓特異的ＣＮＰトランスジェニックマウス、あるいは正常マウスに対するＣＮＰ−２２の持続静脈内投与によって、骨伸長が促進される（非特許文献９、非特許文献１０）。また、初期の基礎的な研究では、軟骨組織以外にも骨芽細胞における発現や骨吸収に対する作用が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。成長板の組織化学的解析により、ＣＮＰトランスジェニックマウスでは、１）増殖軟骨細胞層及び肥大軟骨細胞層の伸長により成長板が厚くなる、２）増殖軟骨細胞層の細胞外マトリクスが増大する、３）成熟肥大軟骨細胞の大きさが増大することが確認されている。同マウスの成長板にある肥大軟骨細胞層において、ＢｒｄＵ染色で示される軟骨細胞の増殖には明らかな変化が観察されなかったことから、ＣＮＰは成長板の軟骨細胞の分化あるいは増殖に寄与するというよりは、成長板の各分化段階における軟骨細胞の分化形質の発現を促進していると考えられている（非特許文献８）。さらに、低身長及び四肢長管骨短縮の表現系を示す軟骨無形成症モデルマウスのフェノタイプが、軟骨特異的ＣＮＰトランスジェニックマウスとの交配によりレスキューされた（非特許文献８）。このことから、ＣＮＰは発生又は成長過程における軟骨形成不全とそれに伴う諸症状を改善する効果があると考えられ、中でも軟骨無形成症をはじめとした低身長症の治療薬としての臨床応用の可能性が期待されている（非特許文献１３）。【０００８】
これまで、ステロイド剤投与で誘発される成長障害に対するＣＮＰの有用性に関してはあきらかではなかった。加えて、ステロイド剤がＣＮＰの生成、分泌及びそのシグナル伝達経路にどのような影響を及ぼすかはほとんど解明されていない。これまでに為された報告としては、内因性ＣＮＰの分泌マーカーであるＮＴｐｒｏＣＮＰの血漿中濃度が、急性リンパ性白血病の小児（２-９歳）に治療目的でデキサメタゾンあるいはプレドニゾロンを投与したときの骨毒性のバイオマーカーとなりうること（非特許文献１４）。デキサメタゾンを培養されたマウスの軟骨細胞に添加すると、ＣＮＰの発現量が増加する一方で、軟骨細胞数及びＧＣ−Ｂ受容体の発現量は低下すること（非特許文献１５）、等の報告がある。しかしながら、これらの報告はいずれも、内因性ＣＮＰやＮＴｐｒｏＣＮＰ濃度がステロイド剤による治療によって成長障害が発生したことの指標となりうることを示しているのみである。もともと成長障害の指標となりうる骨代謝マーカーはこれら以外にも、骨型アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲンＮ−プロペプチド及びＩ型コラーゲンＣ−プロペプチド等、複数存在する。生理的・病理的現象に伴う遺伝子／タンパク質の発現変動が、必ずしも当該遺伝子／タンパク質の薬理効果を示唆するものではないことはこれまで数多くの分子において確立された通りであり、これらの報告からステロイド剤の投与により誘発される成長障害に対する医薬としてのＣＮＰあるいはＮＰＲ−Ｂ受容体アゴニストの有用性を推定することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hanaoka BY ら著、Rev Clin Immunol. (2012)、8巻、8号、695-697頁
【非特許文献２】Curtis JR ら著、Arthritis Rheum. (2006)、55巻、3号、420-426頁
【非特許文献３】Bhattacharyya A ら著、Eur J Endocrinol. (2005)、153巻、2号、207-210頁
【非特許文献４】Allen DBら著、 Endocrinol Metab Clin North Am . (1996)、25巻、699-717頁
【非特許文献５】Allen DBら著、J Clin Endocrinol Metab.  (1998年)、83巻8号、2824-2829頁
【非特許文献６】Bell Jら著、J Clin Endocrinol Metab. (2010年)、95巻、1号、167-177頁
【非特許文献７】Chusho Hら著、  Proc Nat Acad Sci. (2001年)、98巻、7号、4016-4021頁
【非特許文献８】Yasoda Aら著、Nat Med.(2004年)、10巻、1号、80-86頁
【非特許文献９】Kake Tら著、Am J Physiol Endocrinol Metab. (2009年)、297巻、6号、E1339- E1348頁
【非特許文献１０】Yasoda Aら著、Endocrinology (2009年)、150巻、7号、3138-3144頁
【非特許文献１１】Suda Mら著、Biochem Biophys Res Commun. (1996年)、223巻、1号、1-6頁
【非特許文献１２】Holiday LSら著、J Biol Chem.(1995年)、270巻、32号、18983-18989頁
【非特許文献１３】Yasoda A,ら著、Endocr J. (2010年)、57巻、8号、659-666頁
【非特許文献１４】Prickett TCら著、Peptides (2012年)、36巻、1号、54-59頁
【非特許文献１５】Agoston Hら著、BMC Musculoskeletal Disorders. (2006年)、7巻、87-93頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ステロイド剤投与で誘発される成長障害を軽減及び／または改善する医薬、及びステロイド剤投与で誘発された成長障害によって生じた低身長症を治療する医薬、を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、ラットに薬効用量のステロイド剤を持続皮下投与することで、ヒトで報告されているのと同様の成長障害が発現する事を確認した。さらに、ステロイド剤を持続皮下投与して成長障害を発生させたラットに、ＣＮＰ誘導体を併用投与することでステロイド剤によって引き起こされた成長障害を軽減及び／または改善することを見出した。ステロイド剤によって引き起こされた成長障害に対するＣＮＰ誘導体の軽減効果は、既存の低身長治療薬である成長ホルモンの同量投与よりも明らかに強力なものであった。さらに、ＣＮＰ誘導体の成長障害を軽減及び／または改善する作用が、特定のステロイド剤によって誘発される成長障害に限り認められるものではないことを確認した。また、すでにステロイド剤投与によって生じた成長障害をＣＮＰ誘導体の投与によって軽減し、成長障害によって生じた低身長症をも治療しうることを確認した。これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。【００１２】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）ステロイド剤の継続的な投与が必要な成長期の個体に対して投与されることを特徴とする、少なくとも一種類のナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）アゴニストを有効成分として含有する、ステロイド剤投与により誘発される成長障害を軽減及び／または改善するための医薬。
（２）ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、その活性断片、それらの変異体、それらの誘導体又はそれらの修飾体、或いは、抗ＮＰＲ−Ｂ抗体である、（１）の医薬。
（３）ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、ｈＣＮＰ−２２（配列番号１）、ｈＣＮＰ６−２２（配列番号１のアミノ酸番号６乃至２２）又はｈＣＮＰ−５３（配列番号２）、それらの変異体、それらの誘導体又はそれらの修飾体であることを特徴とする（２）の医薬。
（４）ＮＰＲ−Ｂアゴニストが、ｈＣＮＰ−２２またはｈＣＮＰ６−２２の誘導体又は修飾体であることを特徴とする（２）の医薬。
（５）誘導体が、免疫グロブリンＦｃ部由来のペプチド、血清アルブミン及びグレリンのＣ末端側部分ペプチド、から選択される少なくとも一つの付加ペプチドが、ｈＣＮＰ−２２またはｈＣＮＰ６−２２のＮ末端、Ｃ末端またはその両方に結合したペプチドであることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかの医薬。
（６）誘導体が、配列番号６乃至１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（２）〜（５）のいずれかの医薬。
（７）誘導体が、配列番号８、１３又は１５のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（６）の医薬。
（８）修飾体が、ＰＥＧまたはその類縁物質親水性ポリマーが、ｈＣＮＰ−２２、ｈＣＮＰ６−２２、またはｈＣＮＰ−５３のＮ末端、Ｃ末端またはその両方に結合したものであることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかの医薬。
（９）  ステロイド剤療法の開始時又は期間中に投与され、成長障害を軽減、及び／又は、改善することを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかの医薬。
（１０）  ステロイド剤療法の期間中又は終了後において、ステロイド剤投与で誘発された成長障害によって生じた低身長症の治療のために投与されることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかの医薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストは、ステロイド剤の投与で誘発される成長障害を軽減及び／または改善し、当該成長障害の結果生じる低身長症を治療する。さらに、従来のステロイド剤治療において、当該成長障害の発生の懸念から治療効果が得られる十分な用量、又は、期間での投与ができなかった小児に対して、ステロイド剤治療に本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストを組み合わせることで、ステロイド剤投与で誘発される成長障害を軽減及び／または改善することで、ステロイド剤による治療効果が十分に得られる用量または投与期間の採用を可能とし、原疾患の治療成績を向上しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、７週齢の雄性Ｃｒｌ：ＣＤ(ＳＤ)ラットにデキサメタゾンを２８日間持続皮下投与したときの体重推移（○△◇は平均値±標準偏差、n=4〜5）を示したグラフである。第１群（○）は正常対照群、第２群（△）は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン溶液を、第３群（◇）は１ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン溶液をそれぞれ０．２５μｌ／ｈｒの速度で２８日間持続皮下投与した。正常対照群（第１群）との間で有意差があった場合、p<0.05であれば「＊」を、p<0.01であれば「**」を、それぞれ示す。
【図２】図２は、７週齢の雄性Ｃｒｌ：ＣＤ(ＳＤ)ラットにデキサメタゾンを２８日間持続皮下投与後に大腿骨の長さの分布（×は個別データ、○△◇は平均値±標準偏差）を示したグラフである。第１群（○）は正常対照群、第２群（△）は０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン溶液を、第３群（◇）は１ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン溶液をそれぞれ０．２５μｌ／ｈｒの速度で２８日間持続皮下投与した。「＊」を付したデータは、正常対照群との間で有意差があった（p<0.05）ことを示す。
【図３】図３は、４週齢の雄性Ｃｒｌ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾンの０．６７ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２５μｌ／ｈｒの速度で２８日間（グラフ下の黒のバーの期間）持続皮下投与し、尚且つ、デキサメタゾンによる明確な成長障害が確認された投与開始１４日目からはＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用持続皮下投与を開始し、28日間（グラフ下の灰色のバーの期間）継続したときの体重（図３Ａ）、体長（図３Ｂ）及び尾長（図３Ｃ）の推移（各データは、平均値±標準偏差、n=5）を示したグラフである。第１群（○）は正常対照群、第２群（△）はデキサメタゾン単独投与群、第３群（▲）はデキサメタゾンとＣＮＰ誘導体（Ａ）を併用投与した群である。デキサメタゾンの投与は２８日間継続し、ＣＮＰ誘導体（Ａ）は１５ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２５μｌ／ｈｒの速度でデキサメタゾン投与開始１４日目から２８日間持続皮下投与した。
【図４】図４は、４週齢の雄性Ｃｒｌ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾンの０．６７ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２５μｌ／ｈｒの速度で２８日間持続皮下投与し、尚且つ、デキサメタゾンによる明確な成長障害が確認された投与開始１４日目からはＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用持続皮下投与を開始したときの試験終了時の大腿骨長の分布（×は個別データ、◇△▲は平均値±標準偏差）を示したものである。第１群（○）は正常対照群、第２群（△）はデキサメタゾン単独投与群、第３群（▲）はデキサメタゾンとＣＮＰ誘導体（Ａ）を併用投与した群である。デキサメタゾンの投与は２８日間継続し、ＣＮＰ誘導体（Ａ）は１５ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２５μｌ／ｈｒの速度でデキサメタゾン投与開始１４日目から２８日間持続皮下投与した。「**」を付したデータは、対照群（第２群）との間で有意差があった（p<0.01）ことを示す。
【図５】図５は、４週齢の雄性Ｃｒｌ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾンの０．６７ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２５μｌ／ｈｒの速度で２８日間持続皮下投与し、尚且つ、第３群にはＣＮＰ誘導体（Ａ）を、第４群にはヒト型成長ホルモンを、それぞれ一日一回２８日間併用反復皮下投与したときの試験終了時の大腿骨骨端部の成長板組織像（トルイジンブルー染色）を示したものである。投与を施さなかった正常群を第１群、デキサメタゾン単独投与群を第２群とした。組織像中、増殖軟骨層を白の両矢印で、肥大化軟骨層を灰色の両矢印で、それぞれ示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、少なくとも一種類のナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）アゴニストを有効成分として含有する、ステロイド剤投与で誘発される成長障害を軽減及び／または改善する医薬及びステロイド剤投与で誘発された成長障害によって生じた低身長症を治療する医薬に関する。
＜ＮＰＲ−Ｂアゴニスト＞
【００１７】
本発明において、「ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂアゴニスト」とは、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド受容体ＮＰＲ−Ｂ（Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂ、別称：Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ｂ（ＧＣ−Ｂ），以下、単に「ＮＰＲ−Ｂ」と表記する場合もある）に結合し、そのグアニレートシクラーゼを活性化する作用（以下、「ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性」）を有する物質、を意味し、本明細書においては単に「ＮＰＲ−Ｂアゴニスト」と表記される場合もある。代表的なＮＰＲ−Ｂアゴニストとしては、例えば、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｃ-Ｔｙｐｅ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ: ＣＮＰ）が挙げられる。本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストは、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有する物質であれば特に限定されず、ＣＮＰ、その活性断片及びそれらの変異体、それらの誘導体並びにそれらの修飾体などを用いることができる。また、ＣＮＰとは構造上の共通性を有しないペプチドや低分子化合物であっても、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するものであれば、本発明のアゴニストに包含される。
本発明におけるＣＮＰとしては、２２個のアミノ酸よりなるヒト由来ＣＮＰ−２２（ｈＣＮＰ−２２：ＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬ ＧＣ：配列番号１、ブタ及びラット等哺乳類では共通のアミノ酸配列を有する）、ヒト由来ＣＮＰ−５３（ｈＣＮＰ−５３、アミノ酸配列：ＤＬＲＶＤＴＫＳＲＡ  ＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰ  ＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫ  ＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬ  ＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧ  ＬＧＣ：配列番号２）、ニワトリ由来ＣＮＰ−２２（ＧＬＳＲＳＣＦＧＶＫ ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬ ＧＣ：配列番号３）、カエル由来ＣＮＰ−２２（ＧＹＳＲＧＣＦＧＶＫ ＬＤＲＩＧＡＦＳＧＬ ＧＣ：配列番号４）など、が挙げられる。
【００１８】
各種のＣＮＰにおいて、配列中に含まれる２つのＣ残基間のジスルフィド結合により形成されるリング構造（例えば、ｈＣＮＰ−２２では、配列番号１の６位Ｃと22位Ｃの間でジスルフィド結合しリング構造を形成）がＮＰＲ−Ｂ受容体への結合と活性発現に重要と考えられている（Ｆｕｒｕｙａ  Ｍ  ら著,  Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ. （１９９２）, １８３巻,  ３号,  ９６４-９６９頁、  Ｓｉｌｖｅｒ   ＭＡ 著,  Ｃｕｒｒ. Ｏｐｉｎ.  Ｎｅｐｈｒｏｌ. Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ. （２００６）,  １５巻,  １４-２１頁、  Ｃａｌｄｅｒｏｎｅ  Ａ 著,  Ｍｉｎｅｒｖａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ.（２００４）, ２９巻,  １１３-１２７頁）。Ｆｕｒｕｙａらの報告によれば、リング構造のみからなるペプチドであるＣＮＰ６−２２（配列番号１のアミノ酸番号６乃至２２からなるペプチド）やリング構造のＮ末端とＣ末端に夫々ＡＮＰのリング構造のＮ末端側、Ｃ末端側の配列を付加しても、ｈＣＮＰ−２２とほぼ同程度のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を示すこと、ｈＣＮＰ−２２の９位Ｌと１０位Ｋに変異を有するペプチドでは活性が減弱するが、それ以外の部位（例えば、１６位Ｓ、１７位Ｍ）に変異を有するペプチドやＡＮＰの１０乃至１２位のアミノ酸配列を対応するｈＣＮＰ−２２の配列であるＬ−Ｋ−Ｌ（配列番号１の９位乃至１１位）に置換したペプチドは、ｈＣＮＰ−２２とほぼ同程度のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を示すこと、などが報告されている。これらの知見から、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性に重要なリング構造のアミノ酸配列は、ＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧ -Ｘａａ１ -Ｘａａ２ -ＳＧＬＧＣ（ここで、Ｘａａ１は、ＳまたはＡ、Ｘａａ２はＭ、ＦまたはＥを示す：配列番号５）であり、この配列を「リング構造配列」という。
【００１９】
本発明において、生物活性を有するペプチド又はタンパク質の「活性断片」とは、当該ペプチド又はタンパク質の生物活性に関連する部位からなり、且つ、当該ペプチド又はタンパク質の有する生物活性の少なくとも一部を保持するもの、を意味する。本発明におけるＣＮＰの活性断片として、配列番号１乃至４の何れかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列からなり、且つ、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するペプチドを用いることができる。そのような活性断片としては、上述のリング構造配列（配列番号５のアミノ酸配列）からなるペプチドを挙げることができ、その具体例としては、ｈＣＮＰ６−２２、配列番号１、３又は４のアミノ酸配列の1位乃至５位において、1位を含む連続するアミノ酸が一部又は全て欠損したペプチド、配列番号２のアミノ酸配列の1位乃至３１位において、1位を含む連続するアミノ酸が一部又は全て欠損したペプチド、などが挙げられるが、これに限定されず、リング構造配列を有し、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するものは、本発明のＣＮＰの活性断片として採用することができる。
【００２０】
本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとしては、上述した活性断片そのものを採用することもでき、また、活性断片のＮ末端、Ｃ末端又はその両方に１乃至複数のアミノ酸が付加したようなペプチド（活性断片の誘導体）であっても、所望のアゴニスト活性を保持する限り、採用することができる。このようなペプチドとしては、ｈＣＮＰ６−２２のＮ末端、Ｃ末端及びその両方に、ＡＮＰのＣ末端、及びＮ末端に由来する配列を付加したペプチド（Ｆｕｒｕｙａ  Ｍ ら著, Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ., （１９９２）,  １８３巻,  ３号, ９６４-９６９頁）などを挙げることができる。
【００２１】
本発明において、生物活性を有するペプチド又はタンパク質の「変異体」とは、当該ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の一箇所から数箇所において、一つから数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は、付加（以下、「置換等」という）されたものであって、且つ、当該ペプチド又はタンパク質の有する生物活性の少なくとも一部を保持するもの、を意味する。「数箇所」とは、通常３箇所、好ましくは２箇所である。「数個」とは、通常１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、さらに好ましくは２個である。複数箇所で置換等される場合には、置換、欠失、挿入及び付加の何れか一つであっても良く、二つ以上が組み合わされていても良い。また、置換等されるアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、そのアシル化体等の修飾物であってもよく、人工的に合成されたアミノ酸類似体であってもよい。また、置換等される部位は、元となるペプチド又はタンパク質の活性の一部が保持される限り、どの部位を選択してもよいが、当該元ペプチド又はタンパク質の活性部位又は受容体結合部位、以外の箇所が置換等されたものが好ましい。
【００２２】
例えばＣＮＰの変異体としては、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性が保持される限り、所望の部位において置換等されたものが採用できるが、好ましくは、上述したリング構造配列が保持され、それ以外の部位で置換等されたペプチドを挙げることができる。具体的なＣＮＰの変異体としては、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有する限り、配列番号１乃至４に記載のアミノ酸配列中の所望の1つから複数の箇所において１から数個のアミノ酸が置換等されていても良いが、好ましくは、配列番号１乃至４の何れかに記載のアミノ酸配列中の配列番号５に表示されたアミノ酸以外のアミノ酸において1箇所〜数箇所で一つ〜数個のアミノ酸が置換等されたものであり、より好ましくは配列番号１、３又は４に記載のアミノ酸配列の１乃至５位の何れか1箇所〜数箇所で一つから数個のアミノ酸が置換等されたもの、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１乃至３１位の何れか1箇所〜数箇所で一つから数個のアミノ酸が置換等されたものである。
【００２３】
本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとしては、上述した変異体そのものを採用することもでき、またそのＮ末端、Ｃ末端又はその両方に１乃至複数のアミノ酸が付加したようなペプチド（変異体の誘導体）であっても、所望のアゴニスト活性を保持する限り、採用することができる。  
【００２４】
ＣＮＰの変異体の具体例としては、ｈＣＮＰ−２２の１７位と１８位に変異を有するペプチドがｈＣＮＰ−２２と同一のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有すること、そのような変異体のリング構造部分のＮ末端とＣ末端をＡＮＰ由来の配列におきかえた変異体の誘導体でもｈＣＮＰ−２２の活性の９０％程度のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を示すこと、９位から１１位の何れか一箇所に変異を有するペプチドがｈＣＮＰ−２２の５０％以上のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を示すこと、１０位と１１位の両方に変異を有するペプチドがｈＣＮＰ−２２の４０％以上のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有することなどが報告されている（Ｆｕｒｕｙａ  Ｍら著, Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ.,（１９９２）, １８３巻,  ３号, ９６４-９６９頁）。また、別の文献では、ｈＣＮＰ−２２の各種変異体が、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を保持することや、その中にはさらに、ＣＮＰの分解酵素である中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）による切断への耐性を有することなどが記載されている（ＷＯ２００９／０６７６３９号パンフレット）。
【００２５】
本発明において、生物活性を有するペプチド又はタンパク質の「誘導体」とは、当該ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み、さらに別のペプチド又はタンパク質が付加された融合ペプチドであり、且つ、当該生理活性ペプチド又はタンパク質の有する生物活性の少なくとも一部を保持する融合ペプチドを意味する。このような生物活性（本発明においては、ＮＰＲ−Ｂに結合し、そのグアニレートシクラーゼを活性化する作用）の少なくとも一部を有する融合ペプチドを、生理活性ペプチドの誘導体ともいう。本発明の誘導体において、元となる生理活性ペプチド又はタンパク質の、Ｃ末端又はＮ末端の一方に付加ペプチドが融合されていてもよく、Ｃ末端及びＮ末端の両方に付加ペプチドが融合されたものであっても良い。付加されるペプチドとしては、特に限定されないが、そのペプチド自身が生理活性を有さないものが好ましい。また、付加ペプチドは直接結合していてもよく、１から数個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して結合していても良い。リンカー配列としては、様々なものが知られているが、Ｇ、Ｓ等を多く含むものが良く使用される。そのような付加ペプチドとしては、免疫グロブリン（好ましくはＩｇＧ）のＦｃ部位、血清アルブミン、グレリンのＣ末端側部分配列などを挙げることができる。本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとして用いられる誘導体としては、ＣＮＰ（好ましくはｈＣＮＰ−２２又はｈＣＮＰ−５３）の誘導体、ＣＮＰの活性断片（好ましくは、ｈＣＮＰ６−２２）の誘導体などを例示することができ、好ましくはｈＣＮＰ−２２の誘導体またはｈＣＮＰ６−２２の誘導体である。
【００２６】
ＣＮＰの誘導体の具体例としては、例えば、米国特許公開ＵＳ２０１０−３０５０３１号公報（対応国際特許公開ＷＯ２００９／１４２Ｃ３０７号）に開示された各種のＣＮＰ誘導体（当該米国特許公開公報における配列番号１０９、１１０、１２４から１３０、１５７及び１５８：本明細書の配列表における配列番号６〜１４））などを挙げることができる。ここでは、ＡＮＰ、ＣＮＰ、モチリンなどの生理活性ペプチドに、グレリンのＣ末端側に由来する部分配列を付加した誘導体において、元ペプチドの生理活性を保持したまま、血中滞留性が改善されたことが報告されている。この報告では、ＣＮＰのＮ末端又はＣ末端の何れか一方及びそれらの両方にグレリンのC末端に由来するWk-Xl-Y-Zm-Wn（ここで、WはLys、Arg等の塩基性アミノ酸、YはAsp、Glu等の酸性アミノ酸、XとZは同一でも、異なっていてもよく、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸を除くどのようなアミノ酸であっても良い。K及びｎは互いに独立して、１又は２の整数を示し、ｌ及びｍは、互いに独立して０、１又は２の自然数を示す。このような配列として、好ましくは、RKESKK、RKDSKK、RKSEKK、RKSDKK等が挙げられる）を含むペプチドを付加した多様な誘導体のいずれにおいても、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性が保持され、その血中半減期が延長された。本発明の実施例に用いられるＣＮＰ誘導体（Ａ）（配列番号１３）、ＣＮＰ誘導体（Ｃ）（配列番号８）は、いずれも当該公報において作成されたＣＮＰ誘導体の代表例である。当該公報の記載は、全て本明細書の記載に含まれるものである。
【００２７】
また、ＣＮＰまたはその活性断片の誘導体として、ｈＣＮＰ−２２のＣ末端にＡＮＰのＣ末端部分が付加したペプチドや、ｈＣＮＰ６−２２のＮ末端及びＣ末端にＡＮＰのＮ末端部分及びＣ末端部分が付加したペプチド（ＣＮＰ活性断片の誘導体）においても、ｈＣＮＰ−２２と同程度のＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性が保持されていた（Ｆｕｒｕｙａ  Ｍ  ら著, Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ., （１９９２）, １８３巻, ３号, ９６４−９６９頁）。さらに、別の文献において、ｈＣＮＰ−２２及びｈＣＮＰ−５３の各種誘導体が、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を保持することや、その中の複数の誘導体がさらにＮＥＰ分解耐性を有することなどが記載されている（ＷＯ２００９／０６７６３９号パンフレット）。この国際公開公報に記載された誘導体の中でも本明細書においてＣＮＰ誘導体（Ｂ）と定義される、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（配列番号１５）のアミノ酸配列からなる誘導体の軟骨無形成症モデルマウスに対する薬理効果が報告されている（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｌら著，  Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，  （２０１２），  ９１巻，６号，  １１０８−１１１４頁、本文：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000292971200537X: Supplement：：http://download.cell.com/AJHG/mmcs/journals/0002-9297/PIIS000292971200537X.mmc1.pdf）。
【００２８】
さらにまた、本発明のＣＮＰ−２２の誘導体としては、ｈｕｍａｎＣＮＰ−５３のアミノ酸配列（配列番号２）において、Ｎ末端から連続する１個以上３０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、具体的には、ＣＮＰ−３６（配列番号２のアミノ酸番号１８〜５３）など、を挙げることができる。このような誘導体として、好ましくは、ｈＣＮＰ−５３（配列番号２）のＮ末端から連続する１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドであり、より好ましくは、ｈＣＮＰ−５３のＮ末端から連続する１７個のアミノ酸が欠失したｈＣＮＰ−３６（配列番号２のアミノ酸番号１８〜５３のアミノ酸配列からなるペプチド）である。
【００２９】
これらの様々なＣＮＰ誘導体及びＣＮＰ活性断片の誘導体は、本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとして好ましく利用することができる。より好ましくは、配列番号２において、Ｎ末端から1個以上３０個以下（好ましくは２５個以下、さらに好ましくは２０個以下）の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる誘導体、又は、配列番号６乃至１５から選択されるいずれかの誘導体であり、さらに好ましくはＣＮＰ誘導体（Ａ）（配列番号１３）、ＣＮＰ誘導体（Ｃ）（配列番号８）、又は、ＣＮＰ誘導体（Ｂ）（配列番号１５）である。
【００３０】
本発明において、生物活性を有するペプチド又はタンパク質の「修飾体」とは、当該ペプチド又はタンパク質に含まれるアミノ酸の１箇所から数箇所が、別の化学物質との化学反応により修飾されたもので、且つ、当該ペプチド又はタンパク質の有する生物活性の少なくとも一部を保持するもの、を意味する。修飾を受ける部位は、元となるペプチド又はタンパク質の活性を保持する限り、いずれの部位を選択してもよい。
【００３１】
例えばポリマーのようなある程度大きな化学物質を付加する修飾では、ペプチド又はタンパク質の活性部位、又は、受容体結合部位以外の箇所において修飾されることが好ましい。また、分解酵素による切断を防止するための修飾の場合、当該切断を受ける箇所が修飾されるのが好ましい。
【００３２】
例えば、ＣＮＰの修飾体は、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有する限り、配列番号1乃至４の何れかのアミノ酸配列中の所望の1つから複数の箇所において修飾されていても良いが、好ましくは、配列番号１乃至４の何れかのアミノ酸配列中の配列番号５に表示されたアミノ酸以外のアミノ酸において1箇所から数箇所で修飾されたものであり、より好ましくは配列番号１、３又は４のアミノ酸配列の１乃至５位の何れか1箇所〜数箇所で修飾されたものである。また、ＮＥＰによる切断への耐性を付与する修飾の場合は、各種ＣＮＰペプチドに含まれる、リング構造において配列番号５の1位Ｃと２位Ｆの間で切断されることが知られている為、この結合を修飾することもできる。
【００３３】
さらに、上述したＣＮＰの活性断片、変異体及びそれらの誘導体の修飾体も本発明に含まれる。このような各種修飾体もＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を保持する限り、本発明に用いることができる。  
【００３４】
化学修飾の方法としては、様々な方法が知られているが、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）など製薬技術において利用される（薬理上用いられる）高分子ポリマーを付加する方法や、Ｋ残基等の側鎖のアミノ基にリンカーとなる化合物を付加させ、それを介して別のタンパク質等（例えば血清アルブミン）と結合させる方法などが知られているが、これらに限定されず、様々な方法を採用することができる。
【００３５】
このようなＣＮＰ、その活性断片、それらの変異体及びそれらの誘導体の修飾体の具体例としては、例えばＷＯ２００９／０６７６３９号パンフレットにおいて、ｈＣＮＰ−２２及びｈＣＮＰ−５３にＰＥＧ等の各種親水性ポリマーを結合させた修飾体や、ｈＣＮＰ−２２においてＮＥＰによる切断部位であるＣｙｓ６-Ｐｈｅ７のペプチド結合が−ＣＨ２−ＮＨ−や−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert-ブチル基などの低級アルキル基）などの偽ペプチド結合に置換された修飾体の複数が、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を保持し、また、その多くがｈＣＮＰ−２２よりも改善された血中滞留性を有することが開示されている。また、様々な生理活性ペプチドの修飾体の製造方法については、例えば、米国特許公開ＵＳ２００９-０１７５８２１号などを参考に、適宜作製することができる。
【００３６】
ＣＮＰとＮＰＲ−Ｂ受容体との結合は、リング構造が重要であるため、特に末端部に別の配列又は物質が結合した誘導体や修飾体は、その付加ペプチドや修飾物がリング構造に影響を与えることが少なく、ＮＰＲ−Ｂ受容体との結合を阻害することなくＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を保持することが十分に期待される。このことは、上述の多くの文献により実証されている。
【００３７】
上記のＣＮＰ、その活性断片、それらの変異体、それらの誘導体及びそれらの修飾体は、天然の細胞又は組織から採取されたものでもよく、遺伝子工学的、細胞工学的な手法を用いて生産したものであってもよく、化学合成されたものであってもよく、さらにはそれらを酵素処理や化学処理してアミノ酸残基を修飾又はアミノ酸配列の一部を除去したものであってもよい。このような物質は、本明細書の記載、引用文献を参考に、常法に従って適宜製造する事ができる。
【００３８】
ある物質が、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するか否かについては、当業者であれば従来知られている方法により容易に測定することができる。具体的には、ＮＰＲ−Ｂ（Ｓｕｇａ Ｓ  ら著, Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９２）, １３０巻，１号,  ２２９−２３９頁）を強制発現させた培養細胞に物質を添加し、細胞内ｃＧＭＰレベルを測定することで可能である。ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性の一部が保持されるとは、同一の試験系を用いて、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト物質とＣＮＰとを並べてＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を測定した場合に、ｃＧＭＰ上昇活性のピークが、少なくともＣＮＰが示すｃＧＭＰ上昇活性ピークの１０％以上を保持することを意味するが、好ましくは３０％以上を保持することであり、より好ましくは５０％以上を保持することであり、さらに好ましくは７０％以上を保持することを意味する。また、ピークにおいて活性の上昇が大きくなくても、生体に投与した場合の活性持続時間・血中滞留性において良好な結果を示すものは、本発明に用いることができる。
【００３９】
また、このような評価系に対して、低分子の化合物を添加し、ｃＧＭＰ産生能が向上するような化合物であれば、ナトリウム利尿ペプチドと共通する構造を有しないもの（例えば、低分子化合物）であっても、ＮＰＲ−Ｂアゴニストとして、本発明に用いることができる。
【００４０】
さらに、ＮＰＲ−Ｂのリガンド結合部位を含むタンパク質を抗原として用い、動物を免疫して作製された抗体について、上述の方法でＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するものを選別することは、本技術分野の通常の知識により実施することができる。このようにして作製される、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有する抗ＮＰＲ−Ｂ抗体も、本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとして利用することができる。また、このように使用される抗体は、免疫原動物が産生する抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など、公知の様々な形態で作製することができる。またそれら抗体に基づき作製された、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片を利用することもできる。
【００４１】
本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストとして好ましいものは、ＣＮＰ、そのリング構造配列を有する活性断片、若しくは、そのリング構造配列以外において置換等された変異体、それらの誘導体又は修飾体であり、より好ましくはｈＣＮＰ−２２、ｈＣＮＰ−５３、ｈＣＮＰ６−２２、それらの誘導体又はそれらの修飾体であり、さらにより好ましくは、ｈＣＮＰ−５３、ＣＮＰ誘導体（Ａ）：ＣＮＰ（１−２２）Ｇｈｒｅｌｉｎ(１２−２８,Ｅ１７Ｄ、配列番号１３)、ＣＮＰ誘導体（Ｂ）：Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（配列番号１５）、びＣＮＰ誘導体（Ｃ）：ＣＮＰ（１−２２）Ｇｈｒｅｌｉｎ(１２−２８、配列番号８)及びそれらの部分ペプチドなどがあげられる。
＜投与対象＞
【００４２】
本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストは、ステロイド剤の継続的な投与が必要な成長期の個体に対して投与されることで、当該対象におけるステロイド剤投与により誘発される成長障害を軽減及び／又は改善するための医薬の有効成分として用いることができる。
【００４３】
本発明において、「ステロイド剤の継続的な投与が必要な成長期の個体」とは、ステロイド剤により治療され得る疾患を罹患し、正常な成長における骨伸長を抑制若しくは阻害しうる投与量及び／又は投与期間でのステロイド剤の投与を予定する、投与中である、または、投与を完了した成長期の対象を意味する。本発明の医薬の投与対象は、哺乳動物であれば、特に限定されず、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマなどであり、好ましくはヒトである。本発明において、「成長期」とは、対象の長骨の骨端線が閉鎖されずに成長板が維持されている時期を意味し、ヒトである場合は、個人差があるものの、通常は１８歳以下であり、好ましくは１５歳以下であり、より好ましくは１２歳以下である。本発明の医薬は、成長障害を軽減及び／または改善することから、成長速度が速い時期の対象に投与されることで、その効果が顕著に得られ易い。
【００４４】
本発明において、「ステロイド剤」とは、医療の現場において、疾患の治療を目的に利用される糖質コルチコイド類又はそれらの類縁化合物を有効成分とする薬剤である。代表的なものとしては、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾンなどを有効成分とする薬剤（Ｐａｙｎｅ ら著、Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ．，（２００１），２巻，１４５−１５０頁、    Ｐｅｌａｉａ Ｇ ら著、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，（２００３）， ７２巻， １４号、１５４９−１５６１頁)があるが、これらに限定されるものではない。本発明のステロイド剤は、経口剤、注射剤、外用剤など製剤形態は限定されない。
【００４５】
本発明において、「ステロイド剤投与により誘発される成長障害」とは、以下のような事象の発生、進行、その結果として発現される表現形、の全体を意味する。成長期の対象に対するステロイド剤の長期使用には成長障害発生のリスクが伴う。成長期において長期間に亘ってステロイド剤による治療を行うと、体内で過剰になった糖質コルチコイド類により、成長ホルモン（ＧＲＯＷＴＨ  ＨＯＲＭＯＮＥ）やインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）の生成及び分泌が妨げられたり、それらホルモンに対する感受性も低下したりする。その結果、正常な発育が抑制された状態、いわゆる「成長障害」を引き起こし、その結果として、同年齢の対象の標準成長曲線と比較して有意に背が低い状態、いわゆる「低身長症」と診断されるに至る可能性がある（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｈら著，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ． （２００１），２５巻，１２号，２７３５−２７４３頁）。
【００４６】
成長期の対象において比較的長期間に亘ってステロイド剤での治療が必要となる疾患、すなわち、本発明の医薬が投与されうる対象が罹患している、又は、過去に罹患した疾患として、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱 、若年性特発性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症筋無力症、ギランバレー症候群、肺ヘモジデローシス、小児 ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、急性リンパ性白血病、先天性副腎過形成などが挙げられる。これらの少なくとも一部は、ステロイド剤での治療を中止することがむずかしく、重症化した場合は死に至る可能性も想定される重篤な疾患である。そのため、目的とする効果が十分に得られる範囲の中でステロイド剤を使用し続けながら、尚且つ、種々の副作用の発現を最小限に抑えることが求められる。
【００４７】
本発明において、当該成長障害を「軽減する」とは、障害の発生を抑制すること、障害の進行を緩和・遅延させること、障害の程度を軽減させること、などの効果の少なくとも一つ以上が発現されることにより、成長障害の結果として生じうる低身長が生じない、又は、低身長の程度が緩和されることが期待される経過を辿ることを意味する。成長障害を軽減させる目的において、本発明の医薬は、ステロイド剤治療の開始直前、開始と同時、又は、治療期間中に投与を開始することが望ましく、さらにステロイド剤治療の終了時又はその一定期間経過後まで継続的に投与されることが好ましい。
【００４８】
本発明において、当該成長障害を「改善する」とは、投与対象における成長率を同年齢の標準成長率と同程度又はそれ以上に改善させること、成長障害の進行過程において低身長を生じさせないこと、生じた低身長を回復させること、障害を誘発する事象の終了後において、結果として生じた障害状態を正常状態に近づける方向に回復させること、などの効果の少なくとも一つ以上が発現されることにより、対象の身長を同年齢の（個体の）標準身長域に近づけることを意味する。成長障害を改善する目的において、本発明の医薬は、ステロイド剤治療を一定期間受けた、又は、当該治療を終了した対象で、低身長の傾向がある、又は、低身長症である成長期の対象に対して、投与を開始することとなる。ステロイド剤治療の期間中に投与される場合は、軽減効果と改善効果の両方が現れることが期待される。
【００４９】
本発明の医薬は、ステロイド剤の継続的な投与が必要な成長期の対象に対して、当該対象におけるステロイド剤投与で誘発される成長障害を軽減する及び／または改善する、または成長障害によって生じた低身長症を治療することを目的として処方される、本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニストを有効成分として含有する医薬であれば、特に限定されないが、医薬品に添付された文書に、ステロイド剤療法を受けている対象に投与できること、それによってステロイド剤投与により成長障害が発生する恐れがある対象、若しくは成長障害が発生した対象に投与すること、本発明の医薬が当該成長障害を軽減及び／又は改善し、または当該成長障害の結果生じた低身長症の・治療を目的として投与されること、などが記載されていることが好ましい。
＜医薬の形態＞
【００５０】
本発明の医薬は、本投与対象において、ステロイド剤療法の開始直前、開始と同時又は期間中に投与が開始され、ステロイド剤療法の期間中投与が継続されることで、ステロイド剤投与により誘発される成長障害を軽減及び／又は改善し、若しくは、成長障害によって生じた低身長症を治療し得る。この場合において、本発明において、本発明の医薬が、「ステロイド剤療法の期間中継続して投与される」とは、ある一定期間において、被投与対象が、全ての有効成分（ステロイド剤及び本発明のＮＰＲ−Ｂアゴニスト）をその体内に取り込むことを意味する。全ての有効成分が単一製剤中に含まれた製剤が投与されてもよく、またそれぞれの有効成分が別々に製剤化され、別々にそれらの全てが投与されても良い。別々に製剤化される場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に、又は、異なる日に、投与されても良い。なお、複数の有効成分又は薬剤が「組み合わせて投与される」には、ＮＰＲ−Ｂアゴニストとして作用する複数の活性物質が単独で投与されることも含まれる。複数の有効成分が、それぞれ異なる時間又は日に投与される場合、有効成分の投与の順番は特に限定されない。通常、それぞれの製剤は、それぞれの投与方法に従って投与されるため、それらの投与は、同一回数となる場合もあり、異なる回数となる場合もある。また、それぞれの有効成分が別々に製剤化される場合、各製剤の投与方法（投与経路）は同じであってもよく、異なる投与方法（投与経路）で投与されてもよい。また、全ての有効成分が同時に体内に存在する必要は無く、ある一定期間（例えば一ヶ月間、好ましくは１週間、さらに好ましくは数日間、さらにより好ましくは１日間）の間に、全ての有効成分が体内に取り込まれていればよく、一つの有効成分の投与時に別の有効成分が体内から消失していてもよい。
【００５１】
また、本発明の医薬は、ステロイド剤療法の期間中または終了後において投与されることで、ステロイド剤投与で誘発される成長障害によって生じた低身長症を治療し得る。「低身長症」とは、一般的には同人種同性同年齢の身長に比して、標準身長−２ＳＤ以下、もしくは２年間の成長速度が−１．５ＳＤ以下である場合に低身長症と定義される。この場合の投与は、対象が成長期の期間中であって、通常は、当該対象の年齢における標準身長+２ＳＤを超えない範囲でおこなわれる。また、上記の低身長症の定義に合致しない場合であっても、継続的なステロイド治療を受けえている又は治療歴のある成長期の患者であって、同人種同性同年齢の標準身長より明らかに低い身長である場合、又は、成長速度が顕著に低下している場合には、成長障害が疑われるため、本発明の医薬の投与対象となりうる。
【００５２】
さらに、上述したような本発明の医薬の作用によって、ステロイド剤投薬による成長障害のリスクが低減した結果、原疾患の治療に要するステロイド剤の使用量の増加または治療期間の延長が可能になることで、原疾患の治療成績を向上させる可能性があり、本発明はこのような薬剤をも提供するものである。
【００５３】
本発明の医薬の有効成分として用い得る物質は、上述したＮＰＲ−Ｂアゴニストの薬学的に許容される塩であってもよい。すなわち、本発明においては、上述したＮＰＲ−Ｂアゴニストの、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、又は有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等の酸付加塩を、有効成分として使用することもできる。あるいは、本発明においては、上述したＮＰＲ−Ｂアゴニストの、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態を有効成分として使用することもできる。また、本発明に係る医薬組成物は、その有効成分に係る物質の遊離形としても、又はその薬学上に許容し得る塩であってもよい。
本発明の医薬組成物は、ＮＰＲ−Ｂアゴニストまたはその薬学上許容される塩を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤、希釈剤などを用いて調製される。製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
【００５４】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。  
【００５５】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。  
【００５６】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。  
【００５７】
本発明の医薬組成物は、医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は、経粘膜投与、静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。有効成分がＮＰＲ−Ｂアゴニスト抗体である場合には通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
【００５８】
有効成分がペプチド性物質の場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分であるペプチドをリボゾーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は坐剤、点鼻スプレー、吸入薬、舌下錠といった形態で個体に投与することができる。
【００５９】
本発明に係る医薬組成物の有効成分として用い得る物質の投与量は、原疾患の種類、個体（対象）の年齢、体重、症状の程度及び投与経路などによっても異なるが、ヒトに対しては、一般的に１日当りの投与量の上限としては、例えば約１００ｍｇ／ｋｇ以下であり、好ましくは約５０ｍｇ／ｋｇ以下であり、さらに好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下である。また、一日あたりの投与量の下限としては、例えば約０．００５μｇ／ｋｇ以上であり、好ましくは０．０２５μｇ／ｋｇ以上であり、より好ましくは、０．１μｇ／ｋｇ以上である。
【００６０】
本発明のＣＮＰの投与量は、対象個体の体重、適応疾患、症状などにより異なるが、局所投与では組織レベルで１０-15Ｍから１０-6Ｍ程度であり、好ましくは１０-12Ｍから１０-8Ｍ程度である。全身投与では０．０１μｇ／ｈｅａｄから１００００μｇ／ｈｅａｄ程度であり、好ましくは１μｇ／ｈｅａｄから５０００μｇ／ｈｅａｄである。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、ステロイド剤との併用、あるいは、過去にステロイド剤を投薬された対象へ投与されるものである。また、本発明の医薬組成物は、他の骨形成促進剤、骨吸収抑制剤または低身長症治療薬と併用してもよい。このような併用相手の薬剤としては、例えばビスフォスフォネート製剤、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)製剤、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）製剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）製剤、抗破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）抗体製剤、成長ホルモン（ＧＲＯＷＴＨ  ＨＯＲＭＯＮＥ）製剤やインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）製剤などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
また、本発明の治療剤を遺伝子治療に用いる場合にはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等公知の遺伝子治療に適した媒体に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ  ｐｒｏｐｏｔｅｒ)等、の下流に、ＮＰＲ−Ｂアゴニストペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を組み込んだものを用いることができる。ＣＮＰをコードする遺伝子としては、配列番号１乃至５の何れかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子を用いればよい。具体的な遺伝子治療の方法については、実験医学，１２巻，３０３頁，１９９４年に記載の方法又はそれに引用されている文献の方法等を用いればよい。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の実施態様の一例を示すものであって、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００６４】
なお、本実施例において用いるＣＮＰ誘導体（Ａ）（配列番号１３）及びＣＮＰ誘導体（Ｃ）（配列番号８）は、米国特許公開ＵＳ２０１０−３０５０３１号公報の記載に基づき調製された。また、ＣＮＰ誘導体（Ｂ）（配列番号１５）は、ＷＯ２００９／０６７６３９号パンフレットの記載に基づき調製された。
＜実施例１＞：デキサメタゾン誘発成長障害モデルラットの作製
［方法］
浸透圧ポンプ（ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ ＰＵＭＰ Ｍｏｄｅｌ２００４、ＤＵＲＥＣＴ社製、流量：０．２５μｌ／ｈｒ、２８日用)に０．５ｍｇ／ｍｌ（第２群）または１ｍｇ／ｍｌ（第３群）濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製）を充填し、７週齢の雄性Ｃｒｌ：ＣＤ(ＳＤ)ラット（５匹／群、合計１０匹）の背部皮下に１つずつ埋め込んだ。加えて、コントロール群(第１群、５匹)には、生理食塩水を充填した浸透圧ポンプ（同上) を背部皮下に１つずつ埋め込んだ。その後２８日間飼育し、２-３回／週の頻度で体重を測定した。また、最終日には、イソフルラン麻酔下で採血致死させてから右大腿骨を摘出し、長さを測量した。採取した血液は血漿としたのち、コレステロールＥ−テストワコー(和光純薬工業株式会社製) を用いてコレステロール濃度を、及びＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、ＡｓｓａｙＭａｘ（９６ｗｅｌｌ）（ＥＣ３００１−１、ＡＳＳＡＹＰＲＯ社製）を用いて血漿中のコルチコステロン濃度をそれぞれ測定した。
［結果］  
デキサメタゾン投与期間中のラットの体重推移を図１に、最終日の右大腿骨長を図２に示した。デキサメタゾンの持続皮下投与により、体重が用量依存的に低下すると共に大腿骨長が用量依存的に短縮した。また、最終日に採取した血漿中のコルチコステロン及びコレステロール濃度を表１に示した。デキサメタゾンの持続皮下投与により、第２群及び第３群においてコルチコステロン濃度が第１群と比べて有意に低下し、第３群においてはコルチコステロンの生合成に利用されるコレステロール濃度の上昇が認められた。
本試験において、デキサメタゾンの投与量は０．００９〜０．０２７ｍｇ／ｋｇ／日であり（表２)、デキサメタゾン注「ＫＳ」の添付文書に記載されている犬・猫への投与量（体重１ｋｇ当たりデキサメタゾンとして、０．０５〜０．１ｍｇを１日１回皮下又は筋肉内に注射する）よりも低かった。デキサメタゾンは、ラットにおいても薬効用量で成長障害を誘発することを確認した。
［表１：雄性Ｃｒｌ：ＣＤ(ＳＤ)ラットにデキサメタゾンの２８日間持続皮下投与終了時の血漿中コルチコステロン及びコレステロール濃度］【００６５】
【表１】
2015129812.tif 000002
【００６６】
［表２：各群のデキサメタゾンの平均投与量］【００６７】
【表２】
2015129812.tif 000003
【００６８】
＜実施例２＞デキサメタゾンで誘発されたラット成長障害に対するＣＮＰ誘導体（Ａ）の同時併用投与試験
［方法］
浸透圧ポンプ（ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ ＰＵＭＰ Ｍｏｄｅｌ２００４、ＤＵＲＥＣＴ社製、流量：０．２５μｌ／ｈｒ、２８日用)に１ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製、第２群及び第３群）または、コントロールとして生理食塩水（第１群）を充填し、７週齢の雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットの背部皮下に１つずつ埋め込んだ。その際、第３群にはＣＮＰ誘導体（Ａ）の２０ｍｇ／ｍｌ溶液、第１群及び第２群には媒体１(０．０３ ｍｏｌ/ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／１％ベンジルアルコール／１０％精製白糖)を充填した浸透圧ポンプ（同上)を、デキサメタゾンまたは生理食塩水を含有したポンプと同時に背部皮下に１つずつ埋め込んだ。その後２８日間飼育し、最終日に、体重、体長（鼻の先から肛門までの長さ）及び尾長を測定し、イソフルラン麻酔下で腹大動脈より採血後に、右大腿骨及び主要組織（脾臓、胸腺、肝臓、心臓及び肺）を摘出した。大腿骨については、ノギスを用いて骨長及び骨幅を測定し、主要組織については重量を測定した。採取した血液は血漿としたのち、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）及びＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ(R) ＥＬＩＳＡ  Ｍｏｕｓｅ/Ｒａｔ ＩＧＦ-Ｉ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＧ１００，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてコレステロール及びＩＧＦ−１濃度を測定した。
［結果］  
デキサメタゾン及びＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与したときの最終日の体重、体長及び尾長を表３に、大腿骨の長さと太さを表４にそれぞれ示した。最終日の体重はデキサメタゾンを投与した第２群及び第３群で第１群よりも有意に低下し(ｐ＜０．０１)、ＣＮＰ誘導体（Ａ）併用投与の影響は認められなかった。一方で、体長、尾長及び大腿骨長はデキサメタゾンの単独投与（第２群）で有意に短縮し (ｐ＜０．０１)、ＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用（第３群）で第１群と同レベルまで回復した。大腿骨幅に関しては、デキサメタゾン投与で短縮する傾向はあったが、有意差はなく(ｐ＞０．０５)、ＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用の影響も認められなかった。最終日のコレステロール濃度、IGF-1濃度を表５に示した。最終日に採取した血漿中のコレステロール濃度は、デキサメタゾンの単独投与（第２群）により有意に上昇した(ｐ＜０．０１)。第３群は個体間でばらつきが認められ、第１及び第２群のどちらとも有意差はなかった。血漿中ＩＧＦ-１濃度は、デキサメタゾンを投与した第２群及び第３群で第１群よりも有意に低下していた(ｐ＜０．０５）。
最終日の主要組織重量を表６に示した。デキサメタゾンを投与した第２及び第３群の脾臓及び胸腺重量（体重比（％））は第１群と比べて有意に低下し、ＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用投与の影響は認められなかったことから、デキサメタゾンの免疫抑制効果はＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用投与により阻害されないものと考えられた。
以上のように、デキサメタゾン投与（第２、３群）によって誘発された骨伸長抑制はＣＮＰ誘導体の併用投与(第３群)により明らかに改善することが示された。一方で、ラットにデキサメタゾンを投与すると、体重減少、血漿中コレステロール濃度上昇、ＩＧＦ−１濃度低下、脾臓及び胸腺重量低下等の症状が観察されたが、それらについてＣＮＰ誘導体（Ａ）を併用投与した影響は認められなかった。
［表３：雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及びＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与終了時の体重、体長及び尾長］【００６９】
【表３】
2015129812.tif 000004
【００７０】
［表４  雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及びＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与終了時の右大腿骨の長さ及び太さ］【００７１】
【表４】
2015129812.tif 000005
【００７２】
［表５  雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及びＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与終了時の血漿中コレステロール及びＩＧＦ−１濃度］【００７３】
【表５】
2015129812.tif 000006
【００７４】
［表６   雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及びＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与終了時の主要組織重量］         【００７５】
【表６】
2015129812.tif 000007
【００７６】
＜実施例３＞デキサメタゾン誘発成長障害モデルラットにおけるヒト型ＣＮＰ−５３または各種ＣＮＰ誘導体の同時併用投与試験
［方法］
浸透圧ポンプ（ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ ＰＵＭＰ Ｍｏｄｅｌ２００４、ＤＵＲＥＣＴ社製、流量：０．２５μｌ／ｈｒ、２８日用)に０．６７ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製）を充填し、５週齢の雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラット（５匹／群、第２〜第６群、計２５匹）の背部皮下に１つずつ埋め込んだ。その際、第３群にはそれぞれＣＮＰ誘導体（Ａ）、第４群にはヒト型ＣＮＰ−５３、第５群にはＣＮＰ誘導体（Ｂ）及び第６群にはＣＮＰ誘導体（Ｃ）の１５ｍｇ／ｍｌ溶液を充填した浸透圧ポンプ（同上)をそれぞれ同時に背部皮下に１つずつ埋め込んだ。正常対照群（第１群、５匹）には、何も投与しなかった。その後、２８日間飼育して体重、体長及び尾長推移を測定した。最終日に、イソフルラン麻酔下で腹大動脈より採血致死させ、採取した血液は血漿としたのちにラボアッセイTMコレステロール（和光純薬工業株式会社製）を用いてコレステロール濃度を測定した。また、採血致死後に右大腿骨及び胸腺を摘出し、右大腿骨長及び胸腺重量を測定した。
［結果］  
デキサメタゾンの持続皮下投与と同時期に、ヒト型ＣＮＰ−５３、ＣＮＰ誘導体（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかを２８日間併用持続皮下投与したときの最終日の体重、体長尾長及び大腿骨長を表７に示した。デキサメタゾンの単独投与群(第２群)では、ラットの体重の増加、並びに体長及び尾長の伸長が有意に抑制され、ヒト型ＣＮＰ−５３、ＣＮＰ誘導体（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかを併用投与した群（第３〜第６群）では、デキサメタゾンを単独投与した群（第２群）と比べて体長及び尾長の伸長が有意に促進した（ｐ＜０．０５または０．０１）。大腿骨長はデキサメタゾンの投与で有意に短縮し、ヒト型ＣＮＰ−５３、ＣＮＰ誘導体（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかを併用投与した群（第３〜第６群）では、デキサメタゾンを単独投与した群（第２群）よりも長くなる傾向が認められた。一方で血漿中コレステロール濃度や胸腺重量は、デキサメタゾンを単独投与した群(第２群)とヒト型ＣＮＰ−５３、ＣＮＰ誘導体（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかを併用投与した群（第３群〜第６群）の間で、明らかな差は認められなかった（表８)。
［表７：  ５週齢の雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及び各種ＣＮＰ誘導体を２８日間持続皮下投与したときの投与終了時の体重、身長、尾長及び右大腿骨長］【００７７】
【表７】
2015129812.tif 000008
【００７８】
［表８：  ５週齢の雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン及び各種ＣＮＰ誘導体を２８日間持続皮下投与したときの投与終了時の血漿中コレステロール濃度及び胸腺重量］【００７９】
【表８】
2015129812.tif 000009
【００８０】
＜実施例４＞デキサメタゾンで誘発されたラット成長障害に対するＣＮＰ誘導体（Ａ）の後追い投与試験
［方法］
浸透圧ポンプ（ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ ＰＵＭＰ Ｍｏｄｅｌ２００４、ＤＵＲＥＣＴ社製、流量：０．２５μｌ／ｈｒ、２８日用)に０．６７ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製）を充填し、４週齢の雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラット（５匹／群、第２及び第３群）の背部皮下に１つずつ埋め込み、１４日間飼育した。デキサメタゾンの投与により有意な矮小化（体重低下、体長及び尾長縮小）を確認した後に第３群のみにＣＮＰ誘導体（Ａ）の１５ｍｇ／ｍｌ溶液を充填した浸透圧ポンプ（同上)を追加で背部皮下に埋め込み、さらに２８日間飼育した。飼育期間中の体重、体長及び尾長推移を測定するとともに、最終日に、イソフルラン麻酔下で腹大動脈より採血致死させて右大腿骨を摘出し、長さを測定した。
［結果］  
試験期間中のラットの体重、体長及び尾長の推移を図３に示した。デキサメタゾンの投与開始１４日後には、第１群と比べて第２群で有意な体重低下、体長及び尾長の縮小を観察した(表９)。その後、第３群のみでＣＮＰ誘導体（Ａ）の投与を開始したところ、投与しない群（第２群）に比べて、体長及び尾長の伸びが大きくなり、ＣＮＰ誘導体（Ａ）投与開始２８日後の体長及び尾長は、第３群で第２群よりも有意に長かった（ｐ＜０．０１）。また、ＣＮＰ誘導体（Ａ）投与開始２８日後の大腿骨も、併用しなかった群よりも有意に長く（ｐ＜０．０１）（図４）、体重推移にはＣＮＰ誘導体（Ａ）の併用投与による有意な変化は認められなかった。
［表９  デキサメタゾンの持続皮下投与により成長障害を誘発した雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにＣＮＰ誘導体（Ａ）を２８日間持続皮下投与したときの体重、体長尾長及び大腿骨長］【００８１】
【表９】
2015129812.tif 000010
【００８２】
＜実施例５＞ラットにおける各種ステロイド剤とＣＮＰ誘導体（Ａ）の同時併用投与試験
［方法］
０．３ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製を生理食塩水で希釈）、０．１％ポリソルベート含有食塩水に懸濁したこはく酸プレドニゾロン（和光純薬工業株式会社製、プレドニゾロンとして５ｍｇ／ｍｌ濃度）、または０．１％ポリソルベート含有食塩水に懸濁した二プロピオン酸ベタメタゾン（和光純薬工業株式会社製、ベタメタゾンとして０．３ｍｇ／ｍｌ濃度）を、４週齢の雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラット  各１０匹の背部皮下に１ｍＬ／ｋｇの容量で１日１回２８日間投与した。コントロール群(５匹、１群)には、何も投与しなかった。その際、各１０匹のうち５匹（第２、第４、第６群）には、媒体（０．０３ ｍｏｌ/ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／１％ベンジルアルコール／１０％精製白糖）を、残りの５匹（第３、第５、第７群）にはＣＮＰ誘導体（Ａ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を背部皮下に１ｍＬ／ｋｇの容量で１日１回２８日間併用投与した。最終投与翌日にイソフルラン麻酔下で体重、体長及び尾長を測定後、腹大動脈より採血致死させ、右大腿骨を摘出し、大腿骨長を測定した。
［結果］  
デキサメタゾン、プレドニゾロン及びベタメタゾンのいずれにおいても、２８日間の反復投与により、ラットの体重の増加の有意な抑制、並びに体長、尾長及び大腿骨の伸長の有意な低下が観察された（ｐ＜０．０５または０．０１）（表１０）ことより、これらのステロイド剤は、ラットにおいて成長障害を誘発するものと考えられた。これらのステロイド剤を反復投与したのと同じ時期にＣＮＰ誘導体（Ａ）を１ｍｇ／ｋｇの用量で併用反復皮下投与した結果、ＣＮＰ誘導体（Ａ）を投与しなかった群と比較して、体長、尾長及び大腿骨の有意な伸長が確認された（ｐ＜０．０５または０．０１）。これらのことから、ＣＮＰ誘導体（Ａ）はデキサメタゾンのみでなく、プレドニゾロンやベタメタゾンのような他のステロイド剤の投薬によって誘発された成長障害を軽減及び／又は改善することが示された。
［表１０   雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾン、プレドニゾロンまたはベタメタゾンを一日１回２８日間反復皮下投与した後の体重、体長、尾長及び右大腿骨長］【００８３】
【表１０】
2015129812.tif 000011
【００８４】
＜実施例６＞デキサメタゾンで誘発されたラット成長障害に対するＣＮＰ誘導体（Ａ）とヒト成長ホルモンの作用比較試験
［方法］
浸透圧ポンプ（ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ ＰＵＭＰ Ｍｏｄｅｌ２００４、ＤＵＲＥＣＴ社製、流量：０．２５μｌ／ｈｒ、２８日用)に０．６７ｍｇ／ｍｌ濃度のデキサメタゾン（デキサメタゾン注「ＫＳ」、共立製薬株式会社製）を充填し、４週齢の雄性Ｃｒlｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラット（５匹／群、第２〜第４群、計１５匹）の背部皮下に１つずつ埋め込んだ。また、第３群にはＣＮＰ誘導体（Ａ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液（媒体は０．０３ ｍｏｌ/ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／１％ベンジルアルコール／１０％精製白糖）を、第４群にはヒト型成長ホルモン製剤（ソマトロピンＢＳ皮下注１０ｍｇ「サンド」）をリン酸緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈した溶液をラット  各５匹の背部皮下に２ｍＬ／ｋｇの容量で１日１回２８日間投与した。正常対照群(５匹、１群)には、何も投与しなかった。最終日に、体重、体長及び尾長を測定後、イソフルラン麻酔下で腹大動脈より採血致死させた後に左大腿骨を摘出して骨長を計測後、骨端部の病理組織標本を作製した。【００８５】
［結果］  
デキサメタゾンとＣＮＰ誘導体（Ａ）またはヒト型成長ホルモンを併用投与したときの体重、体長、尾長及び左大腿骨長を表１１に示した。デキサメタゾンの単独投与群(第２群)では、体重の増加、並びに体長及び尾長の伸長が有意に抑制された（ｐ＜０．０１）。ＣＮＰ誘導体（Ａ）を併用投与した群（第３群）では、デキサメタゾンを単独投与した群（第２群）と比べて、体長及び尾長の伸長障害が有意に改善した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）。ヒト型成長ホルモンを併用投与した群（第４群）では、デキサメタゾンを単独投与した群（第２群）と比べて体長及び尾長の伸長に有意な差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。最終日の左大腿骨長は、第１群と比較して、デキサメタゾンの投与（第２群）で有意に短く（ｐ＜０．０１）、ＣＮＰ誘導体（Ａ）を併用投与した群（第３群）では、デキサメタゾンを単独投与した群（第２群）よりも有意に長かった（ｐ＜０．０１）。ヒト型成長ホルモンを併用投与した群（第４群）とデキサメタゾンを単独投与した群（第２群）との間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。左大腿骨の骨端部の成長板軟骨層は、デキサメタゾンの単独投与により狭小化し、ＣＮＰ誘導体（Ａ）またはヒト型成長ホルモンの併用投与により、デキサメタゾンを単独投与時にくらべて肥厚する傾向が確認された（図５）。
［表１１：  ４週齢の雄性Ｃｒｌｊ：ＷＩ(Ｗｉｓｔａｒ)ラットにデキサメタゾンを２８日間持続皮下投与したときの投与終了時の体重、身長、尾長及び右大腿骨長とそれに対するＣＮＰ誘導体（Ａ）またはヒト型成長ホルモン併用反復皮下投与の影響【００８６】
【表１１】
2015129812.tif 000012
【図１】
2015129812.tif 000013
【図２】
2015129812.tif 000014
【図３】
2015129812.tif 000015
【図４】
2015129812.tif 000016
【図５】
2015129812.tif 000017
【配列表】
2015129812000001.app
【国際調査報告】
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