(57)【要約】  検出チップは、収容部、金属膜、第１の反応場および第２の反応場を有する。収容部は、液体を収容する。金属膜は、その一方の面が収容部内に向くように収容部の底部に配置されている。第１の反応場および第２の反応場は、金属膜の一方の面において互いに異なる領域に配置されている。第１の反応場および第２の反応場には、捕捉体が固定化されている。また、収容部内に液体を収容したときに、第１の反応場上の液体の深さは、第２の反応場上の液体の深さと異なる。
2016093039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップであって、
液体を収容するための収容部と、
その一方の面が前記収容部内に向くように、前記収容部の底部に配置された金属膜と、
前記金属膜の前記一方の面に配置され、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている第１の反応場と、
前記金属膜の前記一方の面において前記第１の反応場と異なる領域に配置され、前記捕捉体が固定化されている第２の反応場と、
を有し、
前記収容部内に液体を収容したときに、前記第１の反応場上の前記液体の深さは、前記第２の反応場上の前記液体の深さと異なる、
検出チップ。
【請求項２】
前記収容部は、第１の底面と、前記第１の底面と異なる高さに配置された第２の底面とを有しており、
前記第１の反応場は、前記第１の底面上において前記金属膜上に配置されており、
前記第２の反応場は、前記第２の底面上において前記金属膜上に配置されている、
請求項１に記載の検出チップ。
【請求項３】
前記収容部は、第１の天面と、前記第１の天面と異なる高さに配置された第２の天面とを有しており、
前記第１の反応場は、前記第１の天面に対向する位置において前記金属膜上に配置されており、
前記第２の反応場は、前記第２の天面に対向する位置において前記金属膜上に配置されている、
請求項１に記載の検出チップ。
【請求項４】
前記収容部の底面は、傾斜面を含み、
前記第１の反応場および前記第２の反応場は、前記傾斜面上において前記金属膜上に配置されている、
請求項１に記載の検出チップ。
【請求項５】
前記収容部は、前記底面に対する傾斜面を含む天面を有し、
前記第１の反応場および前記第２の反応場は、前記傾斜面に対向する位置において前記金属膜上に配置されている、
請求項１に記載の検出チップ。
【請求項６】
前記金属膜は、前記第１の反応場に対応する領域および前記第２の反応場に対応する領域に回折格子を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項７】
誘電体からなるプリズムをさらに有し、
前記金属膜は、前記収容部の底面となる前記プリズムの一面上に配置されている、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項８】
表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出する検出方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出チップの収容部内において、前記第１の反応場および前記第２の反応場の前記捕捉体に、蛍光物質で標識された被検出物質を結合させる第１工程と、
前記第１の反応場上の前記液体の深さが第１の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記第１の反応場の下に位置する前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記第１の反応場上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第２工程と、
前記第２の反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記第２の反応場の下に位置する前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記第２の反応場上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第３工程と、
前記第２工程および前記第３工程で得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する第４工程と、
を有する、検出方法。
【請求項９】
前記検出チップは、請求項６に記載の前記検出チップであり、
前記第２工程および前記第３工程では、前記回折格子に励起光を照射し、
前記第４工程では、前記第２工程で得られた検出値Ｉaと、前記第３工程で得られた検出値Ｉｂとに基づいて、以下の式（１）で表される被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ１を算出する、
請求項８に記載の検出方法。
【数１】
2016093039.tif 000010
［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
【請求項１０】
前記検出チップは、請求項７に記載の前記検出チップであり、
前記第２工程では、前記プリズムを介して前記第１の反応場に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射し、
前記第３工程では、前記プリズムを介して前記第２の反応場に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射し、
前記第４工程では、前記第２工程で得られた検出値Ｉaと、前記第３工程で得られた検出値Ｉｂとに基づいて、以下の式（２）で表される被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ１を算出する、
請求項８に記載の検出方法。
【数２】
2016093039.tif 000011
［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
【請求項１１】
前記第４工程では、以下の式（３）により、前記蛍光に含まれ、前記プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ２をさらに算出する、請求項９または請求項１０に記載の検出方法。
【数３】
2016093039.tif 000012
【請求項１２】
前記第２工程および前記第３工程では、前記蛍光を継続して検出し、
前記第４工程では、前記第２工程および前記第３工程で得られた検出値に基づいて、前記シグナル値を継続して算出する
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップ、およびこの検出チップを使用する検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。【０００３】
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射することで生じる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）を利用する（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
まず、ＳＰＦＳでは、被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば、１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場で捕捉体に結合する。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば、２次抗体）を反応場に提供すると、反応場で捕捉体に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。【０００５】
しかし、蛍光検出時に、被検出物質を標識していない未反応の蛍光物質が金属膜上に存在するとバックグラウンドノイズとなってしまう。このため、正確に被検出物質を検出するために、あらかじめ未反応の蛍光物質を洗浄により除去しておくことが好ましい。【０００６】
ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、検出装置の小型化の点で課題を有している。【０００７】
これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（例えば、特許文献２参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて検出装置を小型化することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５８３６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、ＧＣ−ＳＰＦＳは、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて検出装置を小型化することができるという利点を有するが、ＧＣ−ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ−ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する検出装置および検出方法には、検出感度に改善の余地がある。【００１０】
また、ＧＣ−ＳＰＦＳおよびＰＣ−ＳＰＦＳのいずれにおいても、未反応の蛍光物質によるバックグラウンドノイズの影響で、被検出物質を正確に検出できないおそれがある。バックグラウンドノイズの影響を除去するために、洗浄を行った場合、洗浄工程の間に被検出物質と、金属膜（または１次抗体）との結合状態が変化してしまうため、反応過程のリアルタイム測定ができないという問題がある。【００１１】
本発明の目的は、金属膜上に未反応の蛍光物質が存在していたとしても、ＳＰＦＳを利用して被検出物質の存在または量を正確に検出するために使用される検出チップ、およびこの検出チップを使用する検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出チップは、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップであって、液体を収容するための収容部と、その一方の面が前記収容部内に向くように、前記収容部の底部に配置された金属膜と、前記金属膜の前記一方の面に配置され、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている第１の反応場と、前記金属膜の前記一方の面において前記第１の反応場と異なる領域に配置され、前記捕捉体が固定化されている第２の反応場と、を有し、前記収容部内に液体を収容したときに、前記第１の反応場上の前記液体の深さは、前記第２の反応場上の前記液体の深さと異なる。【００１３】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出する検出方法であって、本発明の検出チップの収容部内において、前記第１の反応場および前記第２の反応場の前記捕捉体に、蛍光物質で標識された被検出物質を結合させる第１工程と、前記第１の反応場上の前記液体の深さが第１の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記第１の反応場の下に位置する前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記第１の反応場上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第２工程と、前記第２の反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記第２の反応場の下に位置する前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記第２の反応場上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第３工程と、前記第２工程および前記第３工程で得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する第４工程と、を有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＳＰＦＳを利用して被検出物質を検出するための検出チップおよび検出方法において、被検出物質を正確かつ簡単に検出することができる。また、本発明によれば、被検出物質をリアルタイムで検出することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、実施の形態１、２に係る検出チップの構成を示す断面図であり、図１Ｂは、実施の形態１、２に係る検出チップの平面図である。
【図２】図２は、実施の形態１、２に係る検出チップの回折格子の斜視図である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、実施の形態１、２に係る検出チップの他の態様を示す断面模式図である。
【図４】図４は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
【図５】図５は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＳＰＦＳ装置による被検出物質の検出原理を説明するための模式図である。
【図７】図７Ａは、変形例１に係る検出チップの構成を示す断面図であり、図７Ｂは、変形例２に係る検出チップの構成を示す断面図であり、図７Ｃは、変形例３に係る検出チップの構成を示す断面図である。
【図８】図８は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の他の例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１７】
［実施の形態１］
（検出チップの構成）
図１Ａは、本実施の形態に係る検出チップ１０の断面図であり、図１Ｂは、検出チップ１０の平面図である。図１Ａに示される断面図は、図１ＢにおけるＡ−Ａ線の断面図を示している。図２は、本実施の形態に係る検出チップ１０における回折格子１３の斜視図である。以下、図１Ａ、Ｂおよび図２に示されるように、検出チップ１０の高さ方向をｚ方向とし、回折格子１３の周期的構造の配列方向をｘ方向とし、ｚ方向とｘ方向に垂直な方向をｙ方向とする。
【００１８】
図１Ａ、Ｂに示されるように、検出チップ１０は、基板１１と、基板１１上に形成された金属膜１２と、基板１１上に配置された枠体１４とを有する。基板１１上に枠体１４を配置することで液体を収容するための収容部１５が形成される。詳細については後述するが、本実施の形態に係る検出チップ１０では、収容部１５内に液体を収容したときに、互いに異なる深さ（第１の深さｈ１および第２の深さｈ２）で液体を収容する。また、金属膜１２は、回折格子１３を含み、回折格子１３には捕捉体１６（例えば１次抗体）が固定化される。したがって、回折格子１３の表面は、捕捉体１６と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。
【００１９】
基板１１は、金属膜１２の支持部材である。基板１１の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、基板１１は、１つの段部を有し、基板１１上には、２つの段差面が形成されている。段部の向きおよび高さは、励起光αおよび蛍光βの光路の妨げとならなければ特に限定されない。たとえば、段部の壁面は、ｙｚ平面と平行であってもよいし、ｘｚ面と平行であってもよい。また、基板１１の材料は、金属膜１２を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。また、基板１１の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料；アクリル樹脂、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
【００２０】
金属膜１２は、その一方の面を収容部１５内に向けて、収容部１５の底部に配置されている。本実施の形態では、金属膜１２は、上段側の段差面および下段側の段差面の両方において、収容部１５内に露出するように基板１１上に配置されている。前述のとおり、金属膜１２は、回折格子１３を含む。これにより、金属膜１２に所定の入射角で光を照射すると、金属膜１２中に生じる表面プラズモンと、回折格子１３により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じる。また、金属膜１２の厚みは、特に限定されない。金属膜１２の厚みは、例えば、３０〜５００ｎｍであり、好ましくは１００〜３００ｎｍである。金属膜１２の材料は、表面プラズモンを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１２の材料の例には、金、銀、アルミニウム、プラチナ、銅、これらの合金が含まれる。
【００２１】
回折格子１３は、金属膜１２に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子１３の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子１３は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。図２に示されるように、本実施の形態では、回折格子１３は、１次元回折格子であり、金属膜１２の表面に、互いに平行な複数の凸条（および凹条）が所定の間隔で形成されている。また、回折格子１３の断面形状も特に限定されない。回折格子１３の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。本実施の形態では、回折格子１３の断面形状は、矩形波形状である。なお、後述する励起光αの光軸は、ｘｚ平面に平行である。回折格子１３の溝（凹条）のピッチおよび深さは、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されず、照射される光の波長に応じて適宜設定されうる。たとえば、回折格子１３の溝のピッチは、１００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲内であることが好ましく、回折格子１３の溝の深さは、１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００２２】
回折格子１３には、被検出物質を捕捉するための捕捉体１６が固定化される。ここで、回折格子１３（金属膜１２）上において、捕捉体１６が固定化されている領域を、特に「反応場」という。捕捉体１６は、被検出物質に特異的に結合する。これにより、被検出物質は、金属膜１２（回折格子１３）に固定される。本実施の形態では、上段側の段差面および下段側の段差面の両方において、捕捉体１６が略均一に固定化されている。本実施の形態では、図１Ａに示されるように、金属膜１２の一方の面には、収容部１５に液体が収容されたときに、その上の液体の深さが第１の深さｈ１となる第１の反応場１７と、その上の液体の深さが第２の深さｈ２となる第２の反応場１８とが、配置されている。第２の反応場１８は、第１の反応場１７と異なる領域に配置されている。第１の反応場１７は、上段側の段差面上に配置され、第２の反応場１８は、下段側の段差面上に配置されている。第１の反応場１７および第２の反応場１８には、同じ種類の捕捉体が同じ濃度で固定化されている。
【００２３】
捕捉体１６の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体１６は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００２４】
回折格子１３は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常、回折格子１３は、液体を収容可能な空間に配置される。本実施の形態では、回折格子１３は、収容部１５の底部に配置されている。図３Ａ、Ｂは、本実施の形態に係る検出チップ１０の他の態様を示す断面模式図である。図１Ａ、Ｂに示されるように、回折格子１３は、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ａ、Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。図１Ａ、Ｂに示される検出チップ１０は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、バルクと金属膜１２表面との間の物質移動解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）や、増強電場空間スケール（ｚ軸方向）の測定などにも好適である。図３Ａ、Ｂに示される検出チップ１０は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、金属膜１２表面に固定化された分子（捕捉体）に対する、別の分子（被検出物質）の反応定数解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）などにも好適である。このとき、段部は、図３Ａに示されるように、その壁面が流路内の液体の流れ方向に対して直交するように形成されていてもよいし、図３Ｂに示されるように、その壁面が流路内の液体の流れ方向に沿って形成されていてもよい。
【００２５】
枠体１４は、図１Ｂに示されるように、貫通孔を有する板であり、基板１１上に配置される。貫通孔の内面は、収容部１５の側面となる。枠体１４の厚みは、特に限定されず、収容部１５に収容する液体の量に応じて設計される。
【００２６】
収容部１５は、金属膜１２（または基板１１）上に配置され、液体を収容する。本実施の形態では、図１Ａに示されるように、収容部１５は、互いに異なる高さに配置されている第１の底面と、第２の底面とを有する。前述した第１の反応場１７は、第１の底面上において金属膜１２上に配置されており、第２の反応場１８は、第２の底面上において金属膜１２上に配置されている。収容部１５は、第１の反応場１７（第１の底面）上において第１の深さｈ１で液体を収容し、第２の反応場１８（第２の底面）上において第２の深さｈ２で液体を収容することができる。収容部１５内に収容される液体の深さは、特に限定されないが、第１の深さｈ１および第２の深さｈ２は、１０μｍ〜１ｃｍの範囲内にあることが好ましい。第１の深さｈ１に対する第２の深さｈ２の比をｍ（ｈ２／ｈ１）とおくと、ｍは、０．９〜１．１を除く、０．１〜１０の範囲内にあることが好ましい。収容部１５の形状や大きさなどは、所望の量の液体を収容することができれば、特に限定されず、用途に応じて適宜設計されうる。前述のとおり、収容部１５は、枠体１４を基板１１上に配置することで形成されているが、収容部１５を形成する方法は、これに限定されない。収容部１５を形成する方法の他の例には、その下面に凹部を形成された蓋を基板１１上に配置することが含まれる（例えば、図３Ａ、Ｂ参照）。
【００２７】
収容部１５に収容される液体の種類は、特に限定されない。液体の種類の例には、被検出物質を含む検体や、蛍光物質を含む標識液、緩衝液などが含まれる。通常、液体の屈折率および誘電率は、水の屈折率および誘電率と同程度である。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００２８】
（検出チップの製造方法）
次に、本実施の形態に係る検出チップ１０の製造方法について説明する。検出チップ１０の製造方法は、特に限定されない。以下、本実施の形態に係る検出チップ１０の製造方法の一例について説明する。
【００２９】
本実施の形態に係る検出チップ１０は、例えば、１）段部と複数の溝が形成された基板１１および枠体１４を準備する第１工程と、２）基板１１上に金属膜１２および反応場（第１の反応場１７および第２の反応場１８）を形成する第２工程と、３）反応場が形成された基板１１と、枠体１４とを互いに固定する第３工程と、を行うことにより製造されうる。以下、各工程について説明する。
【００３０】
第１工程では、段部と複数の溝が形成された基板１１と、枠体１４とを準備する。具体的には、樹脂からなる平板状の基板１１に、段部と、複数の溝とを形成する。複数の溝は、回折格子１３となる。基板１１に段部および溝を形成する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、金型成形法やリソグラフィ法などにより基板１１上に段部を形成すればよい。また、凹凸が形成された原版を用いてプレス加工を行うことにより基板１１上に溝を形成すればよい。
【００３１】
第２工程では、基板１１上に金属膜１２および反応場を形成する。具体的には、基板１１上の、溝が形成されている領域の少なくとも一部に金属膜１２を形成し、金属膜１２上に捕捉体を固定化すればよい。これにより、回折格子１３を有する金属膜１２を基板１１上に配置することができる。金属膜１２の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。
【００３２】
また、捕捉体１６の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子１３の上に、捕捉体１６を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体１６に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子１３に固定化し、この高分子に捕捉体１６を結合させてもよい。
【００３３】
なお、金属膜１２の形成と、回折格子１３の形成との順番は、上記の方法に限定されない。たとえば、平板状の基板１１上に金属膜１２を形成した後、金属膜１２に凹凸形状を付与してもよい。
【００３４】
第３工程では、基板１１と、枠体１４とを固定する。枠体１４を基板１１上に固定する方法は、特に限定されない。たとえば、基板１１と枠体１４とを固定する方法の例には、両面テープや接着剤などによる接着、レーザー溶着、および超音波溶着が含まれる。
【００３５】
以上の手順により、本実施の形態に係る検出チップ１０を製造することができる。なお、上記第２工程と上記第３工程とを行う順番は、これに限定されない。たとえば、基板１１上に枠体１４を固定した後に、金属膜１２および反応場を形成してもよい。
【００３６】
（被検出物質の検出方法）
次に、本実施の形態に係る検出チップ１０を使用した被検出物質の検出方法について説明する。たとえば、次に説明する検出装置（ＳＰＦＳ装置）１００を用いて、被検出物質を検出することができる。
【００３７】
図４は、検出チップ１０を使用して被検出物質を検出するための検出装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。先に、ＳＰＦＳ装置１００の構成について説明し、その後に検出チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００を用いた被検出物質の検出方法について説明する。
【００３８】
図４に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部１２０、搬送部１３０および制御部１４０を有する。検出チップ１０は、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１３２に装着された状態で使用される。
【００３９】
励起光照射部１１０は、波長および光量が一定の励起光αを、検出チップ１０の金属膜１２（回折格子１３）に照射する。このとき、励起光照射部１１０は、金属膜１２中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子１３で生じるように、金属膜１２の表面に対するｐ偏光の光を金属膜１２（回折格子１３）に照射する。励起光αの光軸は、回折格子１３における周期的構造の配列方向（図４におけるｘ軸方向）に沿う。したがって、励起光αの光軸はｘｚ平面に平行である（図４参照）。励起光αは、金属膜１２の表面に対するｐ偏光の光であることから、励起光αの電界の振動方向は、励起光αの光軸および金属膜１２の表面に対する法線を含むｘｚ平面に平行である。
【００４０】
励起光照射部１１０は、少なくとも光源１１１を有する。励起光照射部１１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。光源１１１は、検出チップ１０の回折格子１３に向けて励起光αを出射する。光源１１１の種類は、特に限定されない。光源１１１の種類の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、光源１１１は、レーザーダイオードである。たとえば、光源１１１から出射される励起光αの波長は、４００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内である。また、照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。
【００４１】
金属膜１２に対する励起光αの入射角θ１（図４参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度であることが好ましい。励起光αの入射角θ１は、回折格子１３の溝のピッチや励起光αの波長、金属膜１２を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。励起光αの最適な入射角θ１は、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸と検出チップ１０とを相対的に回転させることで入射角θ１を調整する第１の角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１の角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を中心として、励起光照射部１１０または検出チップ１０を回転させればよい。
【００４２】
図４に示されるように、励起光照射部１１０は、回折格子１３（金属膜１２）に所定の入射角θ１で励起光αを照射する。照射領域では、金属膜１２で生じた表面プラズモンと、回折格子１３により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。前述のとおり、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、ＰＣ−ＳＰＦＳと異なり、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。たとえば、蛍光βの出射角θ２は、２θ１で近似される。なお、ＳＰＲが生じる条件では、励起光αの反射光γは、ほとんど生じない。
【００４３】
蛍光検出部１２０は、金属膜１２（回折格子１３）上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも２回検出する。より具体的には、蛍光検出部１２０は、第１の反応場１７上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で、第１の反応場１７上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出し、かつ第２の反応場１８上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で第２の反応場１８上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出する。蛍光検出部１２０は、励起光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を通り、かつ金属膜１２の表面に対する法線を挟むように配置されている。
【００４４】
蛍光検出部１２０は、少なくとも受光センサー１２１を有する。蛍光検出部１２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。受光センサー１２１は、金属膜１２上に存在する蛍光物質から放出される蛍光βを検出して、金属膜１２上の蛍光像を検出する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されず、例えば、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管であり、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサーなどであってもよい。
【００４５】
ＧＣ−ＳＰＦＳでは、金属膜１２上で固定されている蛍光物質から放出される蛍光βは、回折格子１３（反応場）から特定の方向に指向性を持って出射されることがわかっている。この場合、金属膜１２表面の法線に対する蛍光検出部１２０の光軸の角度は、蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出部１２０の光軸と検出チップ１０とを相対的に回転させることで蛍光検出部１２０の光軸の角度を調整する第２の角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２の角度調整部は、蛍光検出部１２０の光軸と金属膜１２との交点を中心として、蛍光検出部１２０または検出チップ１０を回転させればよい。
【００４６】
搬送部１３０は、検出チップ１０の位置を移動させる。搬送部１３０は、搬送ステージ１３１およびチップホルダー１３２を有する。チップホルダー１３２は、搬送ステージ１３１に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１３２の形状は、検出チップ１０を保持することができ、かつ励起光αおよび蛍光βの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１３１は、チップホルダー１３２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１３１の形状も、励起光αおよび蛍光βの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１３１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００４７】
制御部１４０は、励起光照射部１１０（光源１１１および第１の角度調整部）、蛍光検出部１２０（受光センサー１２１および第２の角度調整部）および搬送部１３０（搬送ステージ１３１）の動作を制御する。また、制御部１４０は、蛍光検出部１２０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部１２０（受光センサー１２１）が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値、および必要に応じてノイズ値を算出する。制御部１４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
【００４８】
（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図５は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。ここでは、捕捉体１６として１次抗体を使用し、１次抗体に捕捉された被検出物質に蛍光物質で標識された２次抗体を結合させることで被検出物質を蛍光物質で標識する例について説明する
【００４９】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、検出チップ１０を準備して、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１３２に検出チップ１０を設置する。また、検出チップ１０の金属膜１２上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜１２上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５０】
次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを結合させる（１次反応；工程Ｓ１２０）。具体的には、金属膜１２上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は、１次抗体に結合する。
【００５１】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜１２上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。このとき、液体（例えば、緩衝液や蛍光標識液）は、第１の反応場１７上に第１の深さｈ１となるように、かつ第２の反応場１８上に第２の深さｈ２となるように収容される。この後説明するように、本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。しかしながら、蛍光物質で標識した後は、金属膜１２上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。
【００５２】
なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１２上に提供してもよい。また、金属膜１２上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００５３】
次いで、励起光αを第１の反応場１７の下に位置する回折格子１３（金属膜１２）に照射しつつ、第１の反応場１７（金属膜１２）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する（工程Ｓ１４０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、第１の反応場１７が配置されている回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２１の検出値Ｉａを記録する。このとき、第１の反応場１７上には、液体が第１の深さｈ１で収容されている。
【００５４】
次いで、検出対象とする反応場を切り替える（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、搬送ステージ１３１を操作して、検出チップ１０を移動させる。これにより、励起光照射部１１０が第２の反応場１８に励起光αを照射できるようにする。
【００５５】
次いで、励起光αを第２の反応場１８の下に位置する回折格子１３（金属膜１２）に照射しつつ、第２の反応場１８（金属膜１２）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、第２の反応場１８が配置されている回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２１の出力値Ｉｂを記録する。このとき、第２の反応場１８上には、液体が第２の深さｈ２で収容されている。
【００５６】
２次反応（工程Ｓ１３０）の後に収容部１５内の蛍光標識液を、２次抗体を含まない緩衝液に置換して収容部１５内を洗浄した場合であっても、被検出物質に結合した２次抗体の一部は緩衝液中に離脱する。また、２次反応（工程Ｓ１３０）の後に洗浄を行わなかった場合は、収容部１５内には蛍光標識液がそのまま存在していることになる。したがって、いずれの場合においても、工程Ｓ１４０での検出値Ｉａおよび工程Ｓ１６０での検出値Ｉｂは、ＳＰＲに起因する増強電場により励起された蛍光物質（主として１次抗体に捕捉された被検出物質を標識している蛍光物質）から放出された蛍光βの成分と、ＳＰＲに起因する増強電場以外の光（励起光αおよび外部光）により励起された蛍光物質（主として収容部１５内の液体中に遊離している蛍光物質）から放出された蛍光βの成分とを含む。
【００５７】
最後に、制御部（処理部）１４０は、工程Ｓ１４０〜Ｓ１６０において蛍光検出部１２０により得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１７０）。以下、当該シグナル値の算出方法について説明する。
【００５８】
図６Ａおよび図６Ｂは、ＳＰＦＳ装置１００による被検出物質の検出原理を説明するための模式図である。図６Ａは、第１の反応場１７上に第１の深さｈ１で液体が存在している状態を示し、図６Ｂは、第２の反応場１８上に第２の深さｈ２で液体が存在している状態を示している。また、図６Ａおよび図６Ｂにおいて、白色の星は、蛍光物質を示している。
【００５９】
図６Ａに示されるように、第１の深さｈ１で液体が存在する状態で、第１の反応場１７から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光とが含まれる。すなわち、蛍光βを検出したときの検出値は、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光による成分Ｉ１（シグナル成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光による成分Ｉ２（ノイズ成分）とを含む。このとき、Ｉ１は、主として１次抗体に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光βに因り、Ｉ２は、主として収容部１５内の液体に遊離している蛍光物質からの蛍光βに因る。したがって、Ｉ１は、被検出物質の存在または量を示すシグナル値であり、Ｉ２は、ノイズ値である。以上より、工程Ｓ１４０において、第１の反応場１７上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ｉａは、以下の式（１）で表される。
【数１】
2016093039.tif 000003
【００６０】
また、図６Ｂに示されるように、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で、第２の反応場１８から放出された蛍光βにも、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光とが含まれる。このとき、ＳＰＲに起因する増強電場の影響が及ぶ、回折格子１３の表面からの距離は、収容部１５内に収容されている液体の深さによらず、一定である。このため、第１の深さｈ１で液体が存在している状態と、第２の深さｈ２で液体が存在している状態とにおいて、Ｉ１の大きさは、同じである。
【００６１】
一方、第１の深さｈ１に対する第２の深さｈ２の比がｍであるとき、第２の反応場１８上には、第１の反応場１７上のｍ倍の量の液体が存在し、ｍ倍の量の蛍光物質が存在することとなる。このとき、液体の深さ（数μｍ〜数ｃｍ）と比較すると、ＳＰＲに起因する増強電場の影響が及ぶ距離は、１００ｎｍ以下であり、無視できるほど小さい。このため、ｍは、その深さが第１の深さｈ１である液体中のＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けない領域の高さに対する、その深さが第２の深さｈ２である液体中のＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けない領域の高さの比に等しいと近似することができる。したがって、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で放出された蛍光βには、第１の深さｈ１で液体が存在している状態で放出された蛍光βに含まれるＩ２がｍ倍の量含まれることとなる。したがって、工程Ｓ１６０において、第２の反応場１８上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ｉｂは、以下の式（２）で表される。
【数２】
2016093039.tif 000004
【００６２】
制御部（処理部）１４０は、上記の式（１）および式（２）でそれぞれ表される検出値Ｉａ、Ｉｂに基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値として、以下の式（５）で表されるＩ１を算出する。
【数３】
2016093039.tif 000005
【００６３】
さらに、必要に応じて制御部（処理部）１４０は、以下の式（４）でそれぞれ表される被検出物質の存在または量を示さないノイズ値Ｉ２をさらに算出することもできる。
【数４】
2016093039.tif 000006
【００６４】
以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。本発明では、上記の手順によりノイズの除去をすることができるため、ブランク値の測定を必ずしも行わなくてもよい。
【００６５】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ１０を使用することで、金属膜１２上に未反応の蛍光物質が存在していたとしても、バックグラウンドノイズを除去して、被検出物質の存在または量を高感度に、簡単に、かつ正確に検出することができる。
【００６６】
また、本実施の形態に係る検出方法では、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ１３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。
【００６７】
なお、本実施の形態において、１回目の蛍光βを検出する工程（工程Ｓ１４０）と、２回目の蛍光βを検出する工程（工程Ｓ１６０）との順番は、これに限定されない。すなわち、第２の反応場１８上から放出される蛍光βの検出を行った後に、第１の反応場１７上から放出される蛍光βの検出を行ってもよい。
【００６８】
また、本実施の形態では、収容部１５が第１の底面および第２の底面を有する検出チップ１０について説明したが、本発明に係る検出チップは、この態様に限定されない。たとえば、図７Ａ〜Ｃに示される検出チップ１０ａ、１０ｂおよび１０ｃであってもよい。図７Ａは、変形例１に係る検出チップ１０ａの構成を示す断面図であり、図７Ｂは、変形例２に係る検出チップ１０ｂの構成を示す断面図であり、図７Ｃは、変形例３に係る検出チップ１０ｃの構成を示す断面図である。
【００６９】
図７Ａに示されるように、変形例１に係る検出チップ１０ａでは、収容部１５ａの底面は、傾斜面を含む。これにより、検出チップ１０ａでは、第１の反応場１７および第２の反応場１８は、傾斜面上における任意の異なる領域に配置される。また、図７Ｂに示されるように、変形例２に係る検出チップ１０ｂは、収容部１５ｂの上部に配置される蓋１９ｂをさらに有する。蓋１９ｂの形状は、収容部１５ｂ内に液体を収容したときに、液体を第１の深さｈ１および第２の深さｈ２で収容することができれば特に限定されない。本実施の形態では、蓋１９ｂは、段部を有する。これにより、蓋１９ｂを枠体１４上に配置したときに、収容部１５ｂは、互いに異なる高さに配置された第１の天面および第２の天面を有する。このとき、第１の反応場１７は、第１の天面に対向する位置において金属膜１２上に配置され、第２の反応場１８は、第２の天面に対向する位置において金属膜１２上に配置される。さらに、図７Ｃに示されるように、変形例３に係る検出チップ１０ｃは、収容部１５ｃの上部に配置され、収容部１５ｃの底面に対する傾斜面を含む蓋１９ｃをさらに有する。検出チップ１０ｃでは、第１の反応場１７および第２の反応場１８は、傾斜面に対向する位置において、金属膜１２上の任意の異なる領域に配置される。いずれの検出チップ１０ａ、１０ｂおよび１０ｃも、検出チップ１０と同様に使用することができる。
【００７０】
変形例２、３に係る検出チップ１０ｂおよび検出チップ１０ｃのように、本発明に係る検出チップは、蓋を有していてもよい。蓋は、励起光αおよび蛍光βに対して透明な材料からなることが好ましい。蓋の材料の例には、樹脂が含まれる。励起光αおよび蛍光βが通過する部分が励起光αおよび蛍光βに対して透明であれば、蓋の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。蓋は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより枠体に接合されている。
【００７１】
さらに、本実施の形態に係る検出チップ１０および変形例２に係る検出チップ１０ｂは、収容部１５の底部または天部に２つの段差面を有するが、段差面の数は、これらに限定されない。たとえば、段差面の数は、３つ以上であってもよい。
【００７２】
［実施の形態２］
実施の形態２における検出チップ１０’は、実施の形態１に係る検出チップ１０と同じ構成であり、実施の形態２に係る検出チップ１０’を使用するＳＰＦＳ装置１００’も、実施の形態１におけるＳＰＦＳ装置１００と同じ構成である。一方、実施の形態２に係る検出方法は、リアルタイム測定を行う点で実施の形態１に係る検出方法と異なる。そこで、検出チップ１０’およびＳＰＦＳ装置１００’の構成については説明を省略し、ＳＰＦＳ装置１００’の動作手順についてのみ説明する。
【００７３】
本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００’は、第１の反応場１７および第２の反応場１８の下に位置する回折格子１３に励起光αを継続して照射し、蛍光物質から放出された蛍光βを継続して検出する。ここで「継続」とは、連続して動作を行うことだけでなく、断続的に動作を行うことも含む。したがって、「励起光を継続して照射する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で励起光αを照射することを意味する。「蛍光を継続して検出する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で蛍光βを検出することを意味する。
【００７４】
たとえば、励起光αの継続的な照射は、励起光αを連続して照射することであってもよいし、励起光αを断続的に照射することであってもよい。蛍光物質の退色を防ぐ観点からは、励起光αの継続的な照射は、励起光αの断続的な照射であることが好ましい。この場合、励起光αの照射間隔は、一定であってもよいし、不定（任意）であってもよい。また、励起光αの照射間隔は、例えばプログラムによる自動算出のような、一定の条件に基づいて自動的に決められてもよいし、予備実験などによって経験的に決められてもよいし、ユーザーによって任意に決められてもよい。
【００７５】
励起光αの照射間隔は、蛍光強度の検出結果に応じて決められてもよい。たとえば、蛍光強度の検出値が小さい場合には、励起光αの照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値が大きい場合には、励起光αの照射間隔をより長くしてもよい。また、蛍光強度の検出値の経時的な変化が大きい場合には、励起光αの照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値の経時的な変化が小さい場合には、励起光αの照射の間隔をより長くしてもよい。このような励起光αの照射間隔の調整は、例えば、蛍光強度の検出値に係る閾値を適宜に設定し、蛍光強度の検出値に基づくフィードバック制御によって行うことが可能である。このような励起光αの照射間隔の調整は、被検出物質に係る経時的な変化をより精密に観測する観点から好ましい。
【００７６】
蛍光βの継続的な検出のタイミングについても同様である。
【００７７】
図８は、実施の形態２におけるＳＰＦＳ装置１００’の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜１２上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
【００７８】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１１０’）。具体的には、検出チップ１０’を準備して、ＳＰＦＳ装置１００’のチップホルダー１３２に検出チップ１０’を設置する。実施の形態１と同様に、必要に応じて金属膜１２上を洗浄する。
【００７９】
次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１２０’）。具体的には、金属膜１２上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜１２上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。
【００８０】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１３０’）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜１２上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。実施の形態１と同様に、ＳＰＦＳ装置１００’では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質を測定することができる。また、このとき、液体（例えば緩衝液や蛍光標識液）は、第１の反応場１７上に第１の深さｈ１となるように、かつ第２の反応場１８上に第２の深さｈ２となるように収容される。
【００８１】
なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１２上に提供してもよい。また、金属膜１２上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００８２】
次いで、励起光αを第１の反応場１７の下に位置する金属膜１２に照射しつつ、第１の反応場１７（金属膜１２）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出し（工程Ｓ１４０’）、検出チップ１０’を移動させ、励起光照射部１１０が第２の反応場１８の下に位置する金属膜１２に励起光αを照射できるようにし（工程Ｓ１５０’）、励起光αを第２の反応場１８の下に位置する金属膜１２に照射しつつ、第２の反応場１８（金属膜１２）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出し（工程Ｓ１６０’）、そして、工程Ｓ１４０’および工程Ｓ１５０’における蛍光検出の結果に基づいて被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１７０’）。これら工程Ｓ１４０’〜工程Ｓ１７０’を１サイクルとして所定の回数だけ繰り返す（工程Ｓ１８０’）。これにより、第１の深さｈ１で液体が存在する状態における、第１の反応場１７上に存在する蛍光物質から放出される蛍光βの検出と、第２の深さｈ２で液体が存在する状態における、第２の反応場１８上に存在する蛍光物質から放出される蛍光βの検出とが交互に複数回繰り返され、蛍光検出部１２０による検出値Ｉａ、Ｉｂを、それぞれ継続して（断続的に）得つつ、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を継続して（断続的に）算出することができる。
【００８３】
具体的には、工程Ｓ１４０’では、制御部１４０は、光源１１１に励起光αを連続して、または所定の間隔で断続的に（すなわち「継続して」）出射させる。「所定の間隔」とは、例えば、後述する検出対象とする反応場の切り替えの間隔である。同時に、制御部１４０は、蛍光検出部１２０に金属膜１２上に存在する蛍光物質から放出される蛍光βを継続して検出させる。蛍光βの継続的な検出のタイミングは、励起光αの経時的な照射のタイミングと同期していてもよいし、異なっていてもよい。
【００８４】
実施の形態１で説明したように、第１の深さｈ１で液体が存在する状態で、第１の反応場１７上から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光とが含まれる。すなわち、蛍光βを検出したときの検出値Ｉａは、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光による成分Ｉ１（シグナル成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光による成分Ｉ２（ノイズ成分）とを含む（図５Ａ参照）。したがって、工程Ｓ１４０’において、第１の反応場１７上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ｉａは、以下の式（５）で表される。
【数５】
2016093039.tif 000007
【００８５】
工程Ｓ１６０’では、制御部１４０は、光源１１１に励起光αを依然として継続して出射させる。同時に、制御部１４０は、蛍光検出部１２０に金属膜１２からの蛍光βを継続して検出させる。
【００８６】
実施の形態１で説明したように、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で、第２の反応場１８から放出された蛍光βにも、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光とが含まれる。すなわち、蛍光βを検出したときの検出値Ｉｂは、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光による成分Ｉ１（シグナル成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光による成分Ｉ２（ノイズ成分）とを含む（図６Ｂ参照）。実施の形態２においても、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で蛍光βを検出したときのノイズ成分Ｉ２は、第１の深さｈ１で液体が存在する状態で蛍光βを検出したときのノイズ成分のｍ（ｈ２／ｈ１）倍の量含む。したがって、工程Ｓ１６０’において、第２の反応場１８上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ｉｂは、以下の式（６）で表される。
【数６】
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【００８７】
なお、第１の蛍光検出（工程Ｓ１４０’）と、第２の蛍光検出（工程Ｓ１６０’）の順番は、これに限定されない。すなわち、第２の反応場１８上から放出される蛍光βの検出（第２の蛍光検出）を行った後に、第１の反応場１７上から放出される蛍光βの検出（第１の蛍光検出）を行ってもよい。
【００８８】
工程Ｓ１７０’では、制御部（処理部）１４０は、上記式（５）および式（６）でそれぞれ表される蛍光検出部１２０で得られた検出値Ｉａ、Ｉｂに基づいて、以下の式（７）で表される、被検出物質の存在または被検出物質の量を示すシグナル値Ｉ１を算出する（工程Ｓ１８０’）。なお、必要であればノイズ値Ｉ２を算出することもできる。
【数７】
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［上記式において、ｍは前記第１の深さｈ１に対する前記第２の深さｈ２の比であり、１以外の正の実数である。］
【００８９】
工程Ｓ１８０’では、例えば、制御部１４０は、第２の蛍光βの検出の回数（Ｃ２）を数え、Ｃ２が設定値（例えばＮ回）に達していない場合には、第１の反応場１７を検出対象となるように再び調整し、工程Ｓ１４０’に戻って第１の蛍光βの検出を行う。前記Ｃ２がＮ回に達した場合には、検出を終了する。
【００９０】
なお、シグナル値を算出する工程（工程Ｓ１７０’）は、蛍光検出（工程Ｓ１４０’および工程Ｓ１６０’）を行う毎に行ったが、これに限定されない。たとえば、前記Ｃ２がＮ回に達し、蛍光βの検出を終えた後に、シグナル値の算出を行ってもよい。
【００９１】
以上より、経時的に変化するシグナル値をリアルタイムで算出することも可能である。
【００９２】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ１０’を使用することで、金属膜１２上に未反応の蛍光物質が存在していたとしても、バックグラウンドノイズを除去して、被検出物質の存在または量をリアルタイムで検出することができる。このため、本実施の形態に係る検出チップ１０’を使用して被検出物質の検出を行うと、高感度に、簡単に、かつ正確にリアルタイム測定を行うことができる。
【００９３】
また、ＳＰＦＳ装置１００’は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ１３０’）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。
【００９４】
したがって、上記各実施の形態に係る検出方法によれば、新規の生体物質の生合成による粗生成物や、臨床検査で採取された原サンプルなどの未精製のサンプル中の被検出物質を高い精度で経時的に、そして簡易に検出することが可能である。
【００９５】
なお、上記各実施の形態においては、ブランク値の測定を行わない態様について説明したが、必要に応じて２次反応（工程Ｓ１３０、Ｓ１３０’）の前にブランク値の測定を行ってもよい。この場合、具体的には、収容部１５内の液体中に蛍光物質が存在しない状態で、工程Ｓ１４０〜Ｓ１６０、Ｓ１４０’〜Ｓ１６０’と同様の手順でブランク値Ｉａ’およびＩｂ’をあらかじめ得ておく。この場合、工程Ｓ１７０、Ｓ１７０’において、各検出値ＩａおよびＩｂから各ブランク値Ｉａ’およびＩｂ’をそれぞれ引いた上で、上記の算出方法によりシグナル値Ｉ１、および必要に応じてノイズ値Ｉ２の算出を行う。
【００９６】
また、上記各実施の形態では、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用した検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出方法は、ＰＣ−ＳＰＦＳを利用してもよい。この場合、検出チップは、誘電体からなるプリズムを有し、金属膜１２は、基板１１の代わりにプリズムの上に配置される。また、金属膜１２は、回折格子１３を有しない。さらに、励起光αは、プリズムを介して反応場（第１の反応場１７および第２の反応場１８）に対応した金属膜１２の裏面に照射される。
【００９７】
また、本実施の形態では、金属膜１２側から励起光αを検出チップ１０、１０’に照射する例について説明したが、基板１１側から励起光αを検出チップ１０、１０’に照射してもよい。
【００９８】
さらに、変形例に係る検出チップ１０ａ〜１０ｃは、実施の形態２に係る検出方法（リアルタイム測定）にも使用されうる。
【００９９】
本出願は、２０１４年１２月９日出願の特願２０１４−２４９０４４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明に係る検出チップおよび検出方法によれば、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。【０１０１】
また、本発明に係る検出チップおよび検出方法によれば、蛍光標識液などを提供した後に金属膜表面を洗浄しなくても、被検出物質を高い信頼性で検出することもできる。よって、検出時間の短縮化が図られるだけでなく、小型化可能な定量免疫測定装置ならびに非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
【符号の説明】
【０１０２】
１０、１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０’  検出チップ
１１  基板
１２  金属膜
１３  回折格子
１４  枠体
１５、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ  収容部
１６  捕捉体
１７  第１の反応場
１８  第２の反応場
１９ｂ、１９ｃ  蓋
１００、１００’  表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０  励起光照射部
１１１  光源
１２０  蛍光検出部
１２１  受光センサー
１３０  搬送部
１３１  搬送ステージ
１３２  チップホルダー
１４０  制御部（処理部）
ｈ１  第１の深さ
ｈ２  第２の深さ
α  励起光
β  蛍光
γ  反射光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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