(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンを検出する方法及び検出キットの提供を課題とする。  本発明は、「（１）１本鎖ＤＮＡに、（ｉ）周期表の６族、８族、９族及び１０族から選ばれる金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩並びに（ｉｉ）過硫酸、過カルボン酸又はこれらの塩から選ばれる過酸化物を接触させる工程、（２）（１）の処理を行った１本鎖ＤＮＡの特定領域を増幅処理する工程、（３）（２）で得られた目的の増幅物の有無を検出する工程、（４）（３）の結果に基づいて、ＤＮＡの特定領域中のヒドロキシメチル化シトシンの有無を判断する工程を含むことを特徴とするＤＮＡ中の、ヒドロキシメチル化シトシンの検出法」、「上記多価金属酸化物又は多価金属酸塩を含む試薬及び上記過酸化物を含む試薬を含んでなる、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンの検出用試薬キット」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンの検出方法：
（１）：１本鎖ＤＮＡに、（ｉ）周期表の６族、８族、９族及び１０族から選ばれる金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩並びに（ｉｉ）過硫酸、過カルボン酸及びこれらの塩から選ばれる過酸化物を接触させる工程、
（２）：（１）の処理を行った１本鎖ＤＮＡの特定領域を増幅処理する工程、
（３）：（２）で得られた目的の増幅物の有無を検出する工程、
（４）：（３）の結果に基づいて、ＤＮＡの特定領域中のヒドロキシメチル化シトシンの有無を判断する工程。
【請求項２】
前記（１）の工程が、（ｉ）１本鎖ＤＮＡに、前記金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩に接触させ、その後、前記過酸化物に接触させる工程、又は（ｉｉ）１本鎖ＤＮＡに、前記金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩と前記過酸化物とを同時に接触させる工程である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記金属原子が、モリブデン、タングステン、ルテニウム、オスミウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム及び白金から選ばれる金属原子である請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記金属原子が、モリブデン、タングステン、ルテニウム、オスミウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム及び白金から選ばれる金属原子であり、前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
前記金属原子が、モリブデン又はタングステンである請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
前記金属原子が、モリブデン又はタングステンであり、前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
（ｉ）周期表の６族、８族、９族及び１０族から選ばれる金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩を含む試薬並びに（ｉｉ）過硫酸、過カルボン酸及びこれらの塩から選ばれる過酸化物を含む試薬を含んでなる、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンの検出用試薬キット。
【請求項９】
前記金属原子が、モリブデン、タングステン、ルテニウム、オスミウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム及び白金から選ばれる金属である請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１０】
前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１１】
前記金属原子が、モリブデン、タングステン、ルテニウム、オスミウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム及び白金から選ばれる金属原子であり、前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１２】
前記金属原子が、モリブデン又はタングステンである請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１３】
前記金属原子が、モリブデン又はタングステンであり、前記過酸化物が、過硫酸又はその塩である請求項８に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンを検出する方法及び検出用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝情報を担うＤＮＡを構成する塩基の一つであるシトシンは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＮＴ）によりメチル化され、エピジェネティクスの代表的な遺伝子発現制御機構である、プロモーター領域のメチル化により遺伝子発現が抑制される。他方、メチル化シトシン（以下、「ｍＣ」と略記する場合がある）はＴｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ファミリーなどのヒドロキシラーゼによりヒドロキシ化されてヒドロキシメチル化シトシン（以下、「ｈｍＣ」と略記する場合がある）となり、遺伝子発現を促進すると考えられており、ＤＮＡ中におけるシトシン、ｍＣ及びｈｍＣを区別することは、遺伝情報の発現状況を調べる手がかりになると考えられている。
一方、ＤＮＡ中のｍＣの検出法としては、バイサルファイト法（特許文献１）があるが、この方法ではｍＣとｈｍＣの区別をすることはできない。また、両者を区別できるｈｍＣの検出法としては、酵素処理法（非特許文献１）、免疫沈降法（非特許文献２）、酸化法（非特許文献３、特許文献２）等がある。
酵素処理法は、５−ｈｍＣ残基中の５−ｈｍＣへＵＤＰ  Ｇｌｕｃｏｓｅからグルコースを特異的に転移する酵素であるＴ４−ＢＧＴを用いて、検出対象のＤＮＡをグルコシル化し、配列ＣＣＧＧを認識する制限酵素ＭｓｐＩを用いて、該ＤＮＡの制限酵素処理を行い、該ＤＮＡをＰＣＲによる増幅処理することで、得られた増幅産物の有無から、検出対象のＤＮＡ中のｈｍＣの有無を検出する方法である。
免疫沈降法は、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを超音波破砕又は制限酵素処理によって断片化し、抗ｈｍＣ抗体を用いて免疫沈降反応を行い、抗ｈｍＣ抗体が結合したＤＮＡ断片の配列をマイクロアレイ法によりシークエンス解析することにより、検出対象のＤＮＡ中のｈｍＣの有無を検出する方法である。
酸化法は、合成した１本鎖ＤＮＡをタングステン酸ナトリウム及び過酸化水素に同時に接触させて酸化し、その後シークエンサーを用いてＤＮＡの配列解析を行うというものである。上記の酸化反応により、シトシン４位のアミノ基の加水分解反応が起こることで、ｈｍＣはチミン誘導体へと変化する。よって、酸化反応後の１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡシークエンス解析を行うと、酸化反応前にｈｍＣがあった場所の相補鎖側にはアデニンが導入される。一方、シトシン及びｍＣではこの様な酸化反応が進まない為、酸化反応後であってもシトシン及びｍＣ、並びに酸化反応を行っていないｈｍＣの相補鎖側にはグアニンが導入される。即ち、このような酸化反応を行って、酸化反応前後のＤＮＡシークエンス解析の結果を比較することで、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無を検出し、且つその場所を特定することができるのである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特許文献１：ＷＯ２０１３／０８９０６３  Ａ１
特許文献２：ＷＯ２０１２／１４１３２４  Ａ１
【非特許文献】
【０００４】
非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，  １１２９−１１３３（２０１０）
非特許文献２：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏ．  ２９，  ６８−７２  （２０１１）
非特許文献３：Ｃｈｅｍ．ｃｏｍｍ．４７．  １１２３１−１１２３３（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＮＡ中のｈｍＣを検出するための上述の従来法には、後述するような問題点があり、本発明はこれらを解決した、ＤＮＡ中のｈｍＣを検出する方法及び検出キットの提供を課題とする。
即ち、酵素処理法には、（ｉ）制限酵素ＭｓｐＩを用いるため、酵素の至適条件を設定する必要があり、煩雑な操作を必要とする、（ｉｉ）制限酵素ＭｓｐＩはＤＮＡ中のＣＣＧＧ配列を認識するが、検出対象となるＤＮＡにおけるこの認識配列の出現頻度が少なく、また、認識配列を持たないＤＮＡではｈｍＣの有無を検出できない、（ｉｉｉ）酵素によるＤＮＡの切断が不十分な場合があり、再現性が低い、等の問題がある。
また、免疫沈降法は、抗ｈｍＣ抗体を用いてｈｍＣをｍＣと区別して検出する方法であるが、当該抗体のｈｍＣへの特異性が低い為、精度よく区別できない等の問題がある。
酸化法には、（ｉ）１塩基のみｈｍＣが存在する５０ｂａｓｅｓ程度の１本鎖合成ＤＮＡにおいて、ｈｍＣからチミン誘導体への変換率が６０−８０％程度と低い為、ｈｍＣの検出が正確ではない、（ｉｉ）ＤＮＡシークエンスを行う際、目的の配列をクローニングする必要がある為、煩雑な操作を伴う等の問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記従来法が有する問題を解決するために、鋭意研究を行った結果、１本鎖ＤＮＡを周期表の６族、８族、９族及び１０族から選ばれる金属の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩（以下、これらを「本発明に係る多価金属酸化物類」と略記する場合がある）並びに過硫酸、過カルボン酸及びこれらの塩から選ばれる過酸化物（以下、これらを「本発明に係る過酸化物」と略記する場合がある）に接触させ酸化反応を行うことで、ｈｍＣのみをＤＮＡ増幅反応が進まない酸化物に変化させ得ること、言い換えれば、当該酸化反応に付されたシトシン及びｍＣは増幅反応が進行し、当該酸化反応に付されたｈｍＣの酸化物は増幅反応が進行しないことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明の構成は以下の構成よりなる。
「１．以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンの検出方法：
（１）：１本鎖ＤＮＡに、（ｉ）周期表の６族、８族、９族及び１０族から選ばれる金属原子の、多価金属酸化物又は多価金属酸塩並びに（ｉｉ）過硫酸、過カルボン酸及びこれらの塩から選ばれる過酸化物を接触させる工程、
（２）：（１）の処理を行った１本鎖ＤＮＡの特定領域を増幅処理する工程、
（３）：（２）で得られた目的の増幅物の有無を検出する工程、
（４）：（３）の結果に基づいて、ＤＮＡの特定領域中のヒドロキシメチル化シトシンの有無を判断する工程。」
「２．本発明に係る多価酸化物類を含む試薬及び本発明に係る過酸化物を含む試薬を含んでなる、ＤＮＡ中のヒドロキシメチル化シトシンの検出用試薬キット。」
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、簡便に且つ精度よくＤＮＡ中のｈｍＣを検出することができる。即ち、従来法である酵素処理法、免疫沈降法、酸化法における上述した如き問題点を有さず、ＤＮＡシークエンスを必要とせず、簡便にＤＮＡ中のｈｍＣを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係るＤＮＡ酸化工程の分類を示す図である。
【図２】本発明に係る目的の増幅物、１本鎖ＤＮＡの特定領域、相補鎖の対応領域、検出対象領域、プライマー配列及びアダプター配列の関係を示す図である。
【図３】実施例１−２において、各種ＤＮＡをＰＣＲに付して得た産物をアガロースゲル電気泳動した図である。本発明に係る多価金属酸化物類として（Ａ）はタングステン酸ナトリウム、（Ｂ）はタングステン酸カリウムを用いた際の結果をそれぞれ示す。  レーン１はマーカー、レーン２、５、８、１１はシトシンを含むＤＮＡ、レーン３、６、９、１２はｍＣを含むＤＮＡ、レーン４、７、１０、１３はｈｍＣを含むＤＮＡを用いた場合の結果をそれぞれ示す。尚、レーン２〜レーン４はＰＣＲを１５サイクル、レーン５〜レーン７はＰＣＲを２０サイクル、レーン８〜レーン１０はＰＣＲを３０サイクル、レーン１１〜レーン１３はＰＣＲを３５サイクル行った産物を泳動したものである。
【図４】実施例３−４において、各種ＤＮＡをＰＣＲに付して得た産物をアガロースゲル電気泳動した図である。本発明に係る多価金属酸化物類として（Ａ）はタングステン酸、（Ｂ）はモリブデン酸ナトリウムを用いた際の結果をそれぞれ示す。  レーン１はマーカー、レーン２〜レーン４はＰＣＲを１５サイクル、レーン５〜レーン７はＰＣＲを２０サイクル行った産物を泳動した。  レーン２、５、はシトシンを含むＤＮＡ、レーン３、６はｍＣを含むＤＮＡ、レーン４、７はｈｍＣを含むＤＮＡを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明に係る多価金属酸化物類
本発明に係る多価金属酸化物類における、金属の価数は絶対値が通常２以上、好ましくは２〜８、より好ましくは６である。
このような金属原子としては、モリブデン（ＩＩ）、モリブデン（ＩＩＩ）、モリブデン（ＩＶ）、モリブデン（Ｖ）、モリブデン（ＶＩ）、モリブデン（−ＩＩ）等のモリブデン、タングステン（ＶＩ）タングステン（Ｖ）、タングステン（ＩＶ）、タングステン（ＩＩＩ）、タングステン（ＩＩ）、タングステン（−ＩＩ）等のタングステン、ルテニウム（ＶＩＩＩ）、ルテニウム（ＶＩＩ）、ルテニウム（ＶＩ）、ルテニウム（ＩＶ）、ルテニウム（ＩＩＩ）、ルテニウム（ＩＩ）、ルテニウム（−ＩＩ）等のルテニウム、オスミウム（ＶＩＩＩ）、オスミウム（ＶＩＩ）、オスミウム（ＶＩ）、オスミウム（Ｖ）、オスミウム（ＩＶ）、オスミウム（ＩＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）等のオスミウム、ロジウム（ＶＩ）、ロジウム（Ｖ）、ロジウム（ＩＶ）、ロジウム（ＩＩＩ）、ロジウム（ＩＩ）等のロジウム、イリジウム（ＶＩ）、イリジウム（Ｖ）、イリジウム（ＩＶ）、イリジウム（ＩＩＩ）、イリジウム（ＩＩ）、イリジウム（−ＩＩＩ）等のイリジウム、パラジウム（ＶＩ）、パラジウム（ＩＶ）、パラジウム（ＩＩ）等のパラジウム、白金（ＶＩ）、白金（Ｖ）、白金（ＩＶ）、白金（ＩＩＩ）、白金（ＩＩ）、白金（−ＩＩ）等の白金、ニッケル（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩＩ）等のニッケル、コバルト（ＩＩ）及びコバルト（ＩＩＩ）等のコバルト、クロム（ＶＩ）、クロム（Ｖ）、クロム（ＩＶ）、クロム（ＩＩＩ）、クロム（ＩＩ）、クロム（−ＩＩ）等のクロム等が挙げられ、モリブデン（ＩＩ）、モリブデン（ＩＩＩ）、モリブデン（ＩＶ）、モリブデン（Ｖ）、モリブデン（ＶＩ）、モリブデン（−ＩＩ）等のモリブデン、タングステン（ＶＩ）タングステン（Ｖ）、タングステン（ＩＶ）、タングステン（ＩＩＩ）、タングステン（ＩＩ）、タングステン（−ＩＩ）等のタングステンが好ましく、モリブデン（ＶＩ）及びタングステン（ＶＩ）がより好ましく、タングステン（ＶＩ）が特に好ましい。
【００１１】
また、本発明に係る多価金属酸化物としては、例えば、酸化クロム（ＩＩ）（ＣｒＯ）、酸化クロム（ＩＩＩ）（Ｃｒ２Ｏ３）、酸化クロム（ＩＶ）、（ＣｒＯ２）、酸化クロム（ＶＩ）（ＣｒＯ３）、酸化モリブデン（ＩＶ）（ＭｏＯ２）、酸化モリブデン（ＶＩ）（ＭｏＯ３）、酸化タングステン（ＩＩＩ）（Ｗ２Ｏ３）、酸化タングステン（ＩＶ）（ＷＯ２）、酸化タングステン（ＶＩ）（ＷＯ３）、酸化ルテニウム（ＩＶ）（ＲｕＯ２）、酸化ルテニウム（ＶＩＩＩ）（ＲｕＯ４）、酸化オスミウム（ＩＶ）（ＯｓＯ２）、酸化オスミウム（ＶＩＩＩ）（ＯｓＯ４）、酸化ロジウム（ＩＩＩ）（Ｒｈ２Ｏ３）、酸化ロジウム（ＩＶ）（ＲｈＯ２）、酸化イリジウム（ＩＩＩ）（Ｉｒ２Ｏ３）、酸化イリジウム（ＩＶ）（ＩｒＯ２）、酸化パラジウム（ＩＩ）（ＰｄＯ）、酸化ニッケル（ＩＩ）、酸化ニッケル（ＩＩＩ）、酸化コバルト（ＩＩ）、酸化コバルト（ＩＩＩ）及び酸化白金（ＩＩ）（ＰｔＯ）、タングステン酸（Ｈ２ＷＯ４）等が挙げられる。
【００１２】
本発明に係る多価金属酸塩とは、例えば多価金属酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩を意味する。該多価金属酸としては、例えば、タングステン酸（Ｈ２ＷＯ４）、モリブデン酸（Ｈ２ＭｏＯ４）等が挙げられ、タングステン酸（Ｈ２ＷＯ４）が好ましい。該アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム等が挙げられ、該アルカリ土類金属としては、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウム等が挙げられる。
アルカリ金属との塩としては、例えば、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ４）、タングステン酸カリウム（Ｋ２ＷＯ４）、モリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ４）等が挙げられ、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ４）、タングステン酸カリウム（Ｋ２ＷＯ４）等が好ましい。
アルカリ土類金属との塩としては、例えば、タングステン酸カルシウム（ＣａＷＯ４）、タングステン酸マグネシウム（ＭｇＷＯ４）、タングステン酸ストロンチウム（ＳｒＷＯ４）、タングステン酸バリウム（ＢａＷＯ４）、モリブデン酸カルシウム（ＣａＭｏＯ４）、モリブデン酸マグネシウム（ＭｇＭｏＯ４）、モリブデン酸ストロンチウム（ＳｒＭｏＯ４）等が挙げられる。
【００１３】
本発明に係る多価金属酸化物類の好ましい例としては、上述の具体例の中でも、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ４）、タングステン酸カリウム（Ｋ２ＷＯ４）、モリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ４）及びタングステン酸（Ｈ２ＷＯ４）等が挙げられ、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ４）、タングステン酸カリウム（Ｋ２ＷＯ４）及びタングステン酸（Ｈ２ＷＯ４）がより好ましい。
【００１４】
２．本発明に係る過酸化物
本発明に係る過酸化物は、過硫酸、過カルボン酸及びこれらの塩から選ばれるものである。
上記過カルボン酸とは、カルボキシ基を有する有機化合物であって、カルボキシ基のヒドロキシ基（−ＯＨ）が、ヒドロペルオキシ基（−ＯＯＨ）に置き換わった過酸であり、例えば過酸化ベンゾイル、過酢酸などが挙げられる。
上記過硫酸の塩及び上記過カルボン酸の塩としては、例えば、アルカリ金属との塩が挙げられ、具体的には、過硫酸水素ナトリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸水素カリウム、過硫酸カリウム、過酢酸ナトリウム、過酢酸カリウムなどが挙げられる。
本発明に係る過酸化物のうち、好ましいものとしては、過硫酸水素ナトリウム、過硫酸水素カリウムなどが挙げられる。
【００１５】
３．本発明に係るＤＮＡ
本発明においてｈｍＣの有無を検出し得るＤＮＡとしては、化学合成によるものでも、生体内にあるＤＮＡを抽出したものでもよい。生体内にあるＤＮＡを抽出したものとしては、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載のアルカリＳＤＳ法等の自体公知の方法により抽出したＤＮＡ等が挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡの抽出キットを用いて、細胞、微生物、ウイルス等から抽出したＤＮＡも、生体内にあるＤＮＡを抽出したものとして用いることができる。
本発明に係るＤＮＡの塩基対数としては、通常６０〜５００、好ましくは６０〜３００であり、本発明に係る１本鎖ＤＮＡのヌクレオチド数としては、通常６０〜５００、好ましくは６０〜３００である。
【００１６】
４．本発明の方法
本発明は、ＤＮＡ中のｈｍＣを検出する方法であり、以下の工程（１）〜（４）を含むことを特徴とする。
（１）：１本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類並びに本発明に係る過酸化物に接触させる工程（ＤＮＡ酸化工程）、
（２）：（１）の処理を行った１本鎖ＤＮＡの特定領域を増幅処理する工程（ＤＮＡ増幅工程）、
（３）：（２）で得られた目的の増幅物の有無を検出する工程（増幅物検出工程）、
（４）：（３）の結果に基づいて、ＤＮＡの特定領域中のｈｍＣの有無を判断する工程（判断工程）。
【００１７】
（１）ＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕
ＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕は、１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させて、１本鎖ＤＮＡ中のｈｍＣを酸化する工程（処理）である。
本発明に係るＤＮＡ酸化工程は、最終的に、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物を１本鎖ＤＮＡと接触させて酸化反応させることができればよく、例えば下記（Ｉ）の方法及び（ＩＩ）の方法が挙げられるが、（Ｉ）の方法が好ましい。
（Ｉ）：１本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類に接触させた後、さらに本発明に係る過酸化物に接触させる方法。
（ＩＩ）：１本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物と同時に接触させる方法。
【００１８】
本発明に係る多価金属酸化物類の使用濃度は、１本鎖ＤＮＡに接触させる際の反応溶液中の終濃度として、通常、下限が１００ｍＭ以上、好ましくは２００ｍＭ以上であり、上限が３０００ｍＭ以下、好ましくは２０００ｍＭ以下である。
本発明に係る過酸化物の使用濃度は、１本鎖ＤＮＡに接触させる際の反応溶液中の終濃度として、通常、下限が１０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭ以上であり、上限が３００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下である。
本発明に係る１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類又は／及び本発明に係る過酸化物に接触させる際の反応溶液中の１本鎖ＤＮＡ量としては、反応溶液１００μＬ中において、通常、下限が５０ｎｇ以上、好ましくは６０ｎｇ以上、上限が２００ｎｇ以下、好ましくは１９０ｎｇ以下である。
【００１９】
１本鎖ＤＮＡと本発明に係る多価金属酸化物類を接触させるには、例えば下限が通常１５℃以上、好ましくは２０℃以上であって、上限が通常９０℃以下、好ましくは４５℃以下で、通常５分〜４８０分、好ましくは１０分〜６０分インキュベートを行えばよい。尚、上記本発明に係る多価金属酸化物類は２種以上を適宜混合して使用してもよい。
１本鎖ＤＮＡと本発明に係る過酸化物を接触させる際には、例えば下限が通常３０℃以上、好ましくは５０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９０℃以下、最も好ましくは７０℃以下で、通常３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートを行えばよい。尚、上記本発明に係る過酸化物は２種以上を適宜混合して使用してもよい。
１本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類と同時に本発明に係る過酸化物に接触させる際には、例えば下限が通常３０℃以上、好ましくは５０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９０℃以下、最も好ましくは７０℃以下で、通常３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートを行えばよい。尚、上記本発明に係る過酸化物及び上記本発明に係る多価金属酸化物類は２種以上を適宜混合して使用してもよい。
【００２０】
本発明に係るＤＮＡが、２本鎖以上の鎖からなる場合には、自体公知の１本鎖化処理を行って得られる１本鎖ＤＮＡを用いればよい。
【００２１】
該ＤＮＡの１本鎖化処理としては、通常この分野で用いられる方法であればいずれでもよく、例えば、熱処理、アルカリ処理、及びウレア等のカオトロピック薬剤による処理等が挙げられる。
【００２２】
上記のうち、熱処理は、水、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等の溶媒にＤＮＡを溶解させた溶液（以下、「ＤＮＡ溶液」とする）を下限が通常８５℃以上、好ましくは９０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９５℃以下で、通常３０秒〜３０分、好ましくは１〜５分間インキュベートを行うことによりなされる。尚、該ＤＮＡ溶液には、本発明に係る多価金属酸化物類又は本発明に係る過酸化物が含まれていても良い。
【００２３】
上記アルカリ処理は、例えばアルカリ又はその水溶液を、ＤＮＡ溶液に添加し、該ＤＮＡ溶液を通常ｐＨ１０〜１４、好ましくは１２〜１４のアルカリ性にすることによりなされる。この様な目的で用いられるアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、アンモニア、アミン類が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、これらの中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。該アルカリ処理は、より具体的には、通常１ｎｇ〜３００ｎｇ、好ましくは５０ｎｇ〜２００ｎｇのＤＮＡを含むＤＮＡ溶液１μＬに対して０．５〜３Ｍのアルカリ水溶液を通常０．１〜１μＬ、好ましくは０．１〜０．５μＬ添加し、通常５〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、通常２５〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃で反応させることによりなされる。
１本鎖化処理においては、上記処理のうち、アルカリ処理が、次工程へ移行する際に一本鎖ＤＮＡが二本鎖に戻る可能性が低く好ましい。また、天然由来のゲノムＤＮＡを用いる場合には、アルカリ処理は熱処理に比べ、ゲノムＤＮＡに対する損傷が少ないことからもアルカリ処理の方が好ましい。
【００２４】
上記ウレア等のカオトロピック薬剤による処理としては、自体公知の方法に従って行えばよい。
【００２５】
本発明に係る１本鎖化処理は、上記ＤＮＡ酸化工程と同時に行ってもよい。即ち、１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類に接触させる工程と同時に１本鎖化処理を行ってもよく、本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に１本鎖ＤＮＡを接触させる工程と同時に１本鎖化処理を行ってもよい。
【００２６】
本発明に係るＤＮＡ酸化工程の具体的な方法を、以下の３つの場合に分類して説明する。
（Ａ）１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させる場合（当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖が存在しない場合）
（Ｂ）２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡを１本鎖化処理した後、当該１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させる場合（当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖が存在する場合）
（Ｃ）２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡの１本鎖化処理と同時に、本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させる場合（当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖が存在する場合）
尚、以上の（Ａ）〜（Ｃ）の各場合の概略を図１にまとめた。
【００２７】
上記（Ａ）の場合を以下に詳細に説明する。図１に示すように、上記（Ａ）は、以下の（Ｉ）−Ａ、（ＩＩ）−Ａの場合に分けられ、これらはそれぞれ以下のように行えばよい。
（Ｉ）−Ａ  １本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類に接触後、本発明に係る過酸化物に接触させる場合
例えば、上記１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液を、混合後の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように加えて混合し、下限が通常１５℃以上、好ましくは２０℃以上であって、上限が通常６０℃以下、好ましくは４５℃以下で、通常５分〜４８０分、好ましくは１０分〜６０分インキュベートを行う（溶液１とする）。
その後、溶液１に、本発明に係る過酸化物を含む水溶液を、混合後の終濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭとなるように加えて混合し、通常３０℃〜１００℃、好ましくは５０℃〜７０℃で通常３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートを行う。
尚、以上の反応全体の液量は通常５０μＬ〜１００μＬとなるように行う。
【００２８】
（ＩＩ）−Ａ  １本鎖ＤＮＡを、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に同時に接触させる場合
例えば、上記１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、混合後の本発明に係る多価金属酸化物類の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように、また、混合後の本発明に係る過酸化物の終濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭとなるように、本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液と本発明に係る過酸化物を含む水溶液とを加えて混合し、下限が通常３０℃以上、好ましくは５０℃以上であって、上限が通常９０℃以下、好ましくは７０℃以下で、３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートを行う。
尚、以上の反応全体の液量は通常５０μＬ〜１００μＬとなるように行う。
【００２９】
上記（Ｂ）の場合を以下に詳細に説明する。上記（Ｂ）は、以下の（Ｉ）−Ｂ１、（Ｉ）−Ｂ２、（ＩＩ）−Ｂ１、（ＩＩ）−Ｂ２のように分けられ、それぞれ以下のように行えばよい。
尚、（Ｉ）−Ｂ１及び（ＩＩ）−Ｂ１は一本鎖化をアルカリ処理により行っている場合であり、また、（Ｉ）−Ｂ２及び（ＩＩ）−Ｂ２は一本鎖化を熱処理により行っている場合であるが、これらの処理は自体公知のＤＮＡ１本鎖化処理方法に準じて行っている。
【００３０】
（Ｉ）−Ｂ１  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡをアルカリ処理した後、当該１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、アルカリ溶液を２０ｍｏｌ〜２００ｍｏｌ、好ましくは５０ｍｏｌ〜１００ｍｏｌ加えることでＤＮＡを含む溶液のｐＨを１０〜１４、好ましくは１２〜１４として通常５〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、通常２５〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃でインキュベートをおこない、ＤＮＡのアルカリ処理による１本鎖化処理を行う（（Ｉ）−Ｂ１溶液１とする）。
その後、上記「１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液」の代わりに、上記「（Ｉ）−Ｂ１溶液１」を用いて、（Ｉ）−Ａに記載の方法に従い、「（Ｉ）−Ｂ１溶液１」中の１本鎖ＤＮＡをまず本発明に係る多価金属酸化物類、次いで本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３１】
（Ｉ）−Ｂ２  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡを熱処理した後、当該１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液を、通常８５℃以上、好ましくは９０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９５℃以下で、通常３０秒〜３０分、好ましくは１〜５分間、ＤＮＡの熱処理による１本鎖化処理を行う（（Ｉ）−Ｂ２溶液１とする）。
その後、上記「１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液」の代わりに、上記「（Ｉ）−Ｂ２溶液１」を用いて、（Ｉ）−Ａに記載の方法に従い、「（Ｉ）−Ｂ２溶液１」中の１本鎖ＤＮＡをまず本発明に係る多価金属酸化物類、次いで本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３２】
（ＩＩ）−Ｂ１  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡをアルカリ処理した後、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に同時に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、アルカリ溶液を２０ｍｏｌ〜２００ｍｏｌ、好ましくは５０ｍｏｌ〜１００ｍｏｌ加えることでＤＮＡを含む溶液のｐＨを１０〜１４、好ましくは１２〜１４として通常５〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、通常２５〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃でインキュベートをおこない、ＤＮＡのアルカリ処理による１本鎖化処理を行う（（ＩＩ）−Ｂ１溶液１とする）。
その後、上記「１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液」の代わりに、上記「（ＩＩ）−Ｂ１溶液１」を用いて、（ＩＩ）−Ａに記載の方法に従い、「（ＩＩ）−Ｂ１溶液１」中の１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に同時に接触させる。
【００３３】
（ＩＩ）−Ｂ２  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡを熱処理した後、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に同時に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液を、通常８５℃以上、好ましくは９０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９５℃以下で、通常３０秒〜３０分、好ましくは１〜５分間、ＤＮＡの熱処理による１本鎖化処理を行う（（ＩＩ）−Ｂ２溶液１とする）。
その後、上記「１本鎖ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液」の代わりに、上記「（ＩＩ）−Ｂ２溶液１」を用いて、（ＩＩ）−Ａに記載の方法に従い、「（ＩＩ）−Ｂ２溶液１」中の１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類および本発明に係る過酸化物に同時に接触させる。
【００３４】
上記（Ｃ）の場合を以下に詳細に説明する。上記（Ｃ）は、以下の（Ｉ）−Ｃ１、（Ｉ）−Ｃ２、（ＩＩ）−Ｃ２、（ＩＩ）−Ｃ２のように分けられ、それぞれ以下のように行えばよい。
尚、（Ｉ）−Ｃ１及び（ＩＩ）−Ｃ１は一本鎖化をアルカリ処理により行っている場合であり、また、（Ｉ）−Ｃ２及び（ＩＩ）−Ｃ２は一本鎖化を熱処理により行っている場合であるが、これらの処理は自体公知のＤＮＡ１本鎖化処理方法に準じて行っている。
【００３５】
（Ｉ）−Ｃ１  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡのアルカリ処理と同時に、ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類に接触させ、その後本発明に係る過酸化物に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、混合後の本発明に係る多価金属酸化物類の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液を加えて混合し、これにアルカリ溶液を２０ｍｏｌ〜２００ｍｏｌ、好ましくは５０ｍｏｌ〜１００ｍｏｌ、加えることでＤＮＡを含む溶液のｐＨを１０〜１４、好ましくは１２〜１４とし、下限が通常１５℃以上、好ましくは３０℃以上であって、上限が通常６０℃以下、好ましくは４５℃以下で、通常５分〜４８０分、好ましくは１０分〜６０分インキュベートを行う（（Ｉ）−Ｃ１溶液１とする）。
その後、上記溶液１の代わりに、上記「（Ｉ）−Ｃ１溶液１」を用いて、（Ｉ）−Ａに記載の方法に従い、「（Ｉ）−Ｃ１溶液１」中の１本鎖ＤＮＡを本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３６】
（Ｉ）−Ｃ２  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡの熱処理と同時に、ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類に接触させ、その後本発明に係る過酸化物に接触させる場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、混合後の本発明に係る多価金属酸化物類の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液を加えて混合し、通常８５℃以上、好ましくは９０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９５℃以下で、通常３０秒〜３０分、好ましくは１〜５分間、ＤＮＡの熱処理による１本鎖化処理を行う（（Ｉ）−Ｃ２溶液１とする）。
次に、得られた上記「（Ｉ）−Ｃ２溶液１」を下限が通常１５℃以上、好ましくは３０℃以上であって、上限が通常６０℃以下、好ましくは４５℃以下で、通常５分〜４８０分、好ましくは１０分〜６０分インキュベートを行う（（Ｉ）−Ｃ２溶液２とする）。
その後、上記溶液１の代わりに、上記「（Ｉ）−Ｃ２溶液２」を用いて、（Ｉ）−Ａに記載の方法に従い、「（Ｉ）−Ｃ２溶液２」中の１本鎖ＤＮＡを本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３７】
（ＩＩ）−Ｃ１  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物の存在下でアルカリ処理を行う場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、混合後の本発明に係る多価金属酸化物類の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように、混合後の本発明に係る過酸化物の終濃度が１０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１５０ｍＭとなるように、本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液と本発明に係る過酸化物を含む水溶液とを加えて混合し、アルカリ溶液を２０ｍｏｌ〜２００ｍｏｌ、好ましくは５０ｍｏｌ〜１００ｍｏｌ加えることでＤＮＡを含む溶液のｐＨを１０〜１４、好ましくは１２〜１４とする（（ＩＩ）−Ｃ１溶液１とする）。
次いで、上記「（ＩＩ）−Ｃ１溶液１」を下限が通常３０℃以上、好ましくは５０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９０℃以下、最も好ましくは７０℃以下で、３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートをおこない、「（ＩＩ）−Ｃ１溶液１」中の１本鎖化されたＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３８】
（ＩＩ）−Ｃ２  ２本鎖以上の鎖からなるＤＮＡを多価金属酸化物類及び過酸化物の存在下で熱処理を行う場合
例えば、２本鎖以上の鎖からなる上記ＤＮＡ５０ｎｇ〜２００ｎｇを含む溶液に、混合後の本発明に係る多価金属酸化物類の終濃度が１００ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜２０００ｍＭとなるように、混合後の本発明に係る過酸化物の終濃度が１０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１５０ｍＭとなるように、本発明に係る多価金属酸化物類を含む水溶液及び本発明に係る過酸化物を含む水溶液を加えて混合し、通常８５℃以上、好ましくは９０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９５℃以下で、通常３０秒〜３０分、好ましくは１〜５分間、ＤＮＡの熱処理による１本鎖化処理を行う（（ＩＩ）−Ｃ２溶液１とする）。
その後、上記「（ＩＩ）−Ｃ２溶液１」を下限が通常３０℃以上、好ましくは５０℃以上であって、上限が通常１００℃以下、好ましくは９０℃以下、最も好ましくは７０℃以下で、３０分〜４８０分、好ましくは１２０分〜３００分インキュベートをおこない、「（ＩＩ）−Ｃ２溶液１」中の１本鎖化されたＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物に接触させる。
【００３９】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の具体例のうち、（Ｂ）及び（Ｃ）の方法が好ましく、（Ｂ）の方法が特に好ましい。
【００４０】
尚、本発明者らは、上述の公知の酸化法（非特許文献３、特許文献２）に記載された方法に従って生体内から抽出したＤＮＡの酸化反応を行っている。しかし、当該方法では、当該ＤＮＡの分解反応が起こってしまい、目的のｈｍＣの検出を行うことはできなかった。即ち、生体内から抽出したＤＮＡ、言い換えれば未修飾のＤＮＡは上述の公知の酸化法に用いる事ができず、ヌクレアーゼ耐性を有する架橋構造を分子内に有するＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾やＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾等を施した塩基を用いる必要がある。
【００４１】
他方、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物を用いた上記酸化処理によれば、天然由来のＤＮＡを酸化反応に付しても分解されることなく、ｈｍＣの検出を行えることが判った（後述の実施例５参照）。
また、上述の公知の酸化法を用いると、ｈｍＣはチミン誘導体になると考えられている（非特許文献３、特許文献２）。他方、本発明の方法を用いると、ｈｍＣは酸化によりシトシン誘導体になると推定された。
【００４２】
即ち、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（認識配列を構成する核酸の一つに、シトシン又はシトシン誘導体を持つ）を含むＤＮＡに対し本発明に係るＤＮＡ酸化工程を行った後、ＥｃｏＲＶを用いて制限酵素処理を行うと、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列は制限酵素ＥｃｏＲＶにより切断された。このことは、本発明の方法を用いると、ｈｍＣは酸化によりシトシン誘導体となること、言い換えれば、本発明の方法によるｈｍＣの酸化機構は、上述の公知の酸化法によるｈｍＣの酸化反応機構とは異なることを示唆している。
【００４３】
尚、本発明の方法では、ＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕を、１本鎖ＤＮＡを用いて行うこと、即ち、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物を１本鎖ＤＮＡと接触させることを特徴とする。一方、ＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕以後の工程においては、１本鎖ＤＮＡを用いても２本鎖ＤＮＡを用いてもよい。
【００４４】
（２）ＤＮＡ精製工程
本発明に係るＤＮＡ酸化工程の後、通常この分野で用いられている精製方法によりＤＮＡ酸化工程で得られたＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ又は２本鎖ＤＮＡ）を精製してもよい。このような精製方法としては、ＤＮＡを精製し得るものであれば特に限定されないが、例えばアルコール沈殿法、カラム精製法が挙げられる。
【００４５】
より具体的には、カラム精製法を行う場合、例えば以下のように行えばよい。即ち、本発明に係るＤＮＡ酸化工程により得られた反応液に、２Ｍ〜６Ｍのグアニジウム塩酸塩含有１ｍＭ〜１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．５〜７．５、好ましくはｐＨ６〜７）を３００μＬ〜５００μＬ加えて混合し、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎ（（株）ジーンデザイン製）に充填後、１００００×ｇで３０秒〜５分間、好ましくは１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を除去する。その後、５ｍＭ〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ含有８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）水溶液（ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７〜７．５）４００μＬ〜７５０μＬをＥｃｏｎｏＳｐｉｎに充填後、１００００×ｇで３０秒〜５分間、好ましくは１〜３分間、遠心分離し、フロースルー液を除去する。その後、１ｍＭ〜５０ｍＭの  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８〜９．５、好ましくはｐＨ８．５〜９）  ２０μＬ〜１００μＬ、好ましくは２５μＬ〜５０μＬをＥｃｏｎｏＳｐｉｎに充填後、１００００×ｇで３０秒〜５分間、好ましくは１〜３分間、遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたＤＮＡが得られる。
【００４６】
また、アルコール沈殿法により精製を行うには、例えば以下のように行えばよい。即ち、本発明に係るＤＮＡ酸化工程により得られた反応液１０μＬに対して、通常アルコール４０〜１１０μＬ、緩衝液３０〜１００μＬを添加し、遠心分離を行う。遠心分離後、上清を除去しアルコールで洗浄することにより、精製されたＤＮＡが得られる。上記アルコール及び緩衝液添加の際、分離後の上清の除去を容易にするために、上記ＤＮＡを含む溶液１０μＬに対して０．１〜１μＬの共沈剤やグリコーゲンを添加してもよい。上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられるが、イソプロパノールが特に好ましい。上記緩衝液としては、例えばＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられ、中でも、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、トリス緩衝液等が好ましく、トリス緩衝液が特に好ましい。これら緩衝液のｐＨは、通常７〜８、好ましくは７〜７．５であり、緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常０．１〜５  ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜２  ｍｏｌ／Ｌの範囲である。上記遠心分離は、通常この分野でなされる態様であれば特に限定されないが、通常１０，０００〜２２，０００ｇで１０〜３０分間なされる。
【００４７】
（３）ＤＮＡ増幅工程〔工程（２）〕
ＤＮＡ増幅工程は、本発明に係るＤＮＡ酸化工程で得られたＤＮＡ、要すれば更にＤＮＡ精製工程で得られたＤＮＡを増幅処理に付す工程である。
【００４８】
本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」は、本発明に係る判断工程においてｈｍＣの有無を判断するための検出対象領域であり、本発明に係るＤＮＡ酸化工程の処理を行った１本鎖ＤＮＡの全長又は一部の何れであってもよい。
言い換えれば、「一本鎖ＤＮＡの特定領域」が、本発明に係るＤＮＡ酸化工程を行った１本鎖ＤＮＡの全長である場合は、当該１本鎖ＤＮＡの全長が検出対象領域であり、「一本鎖ＤＮＡの特定領域」が、本発明に係るＤＮＡ酸化工程を行った１本鎖ＤＮＡの一部である場合は、当該１本鎖ＤＮＡの一部が検出対象領域となる。
【００４９】
また、本発明に係るＤＮＡ酸化工程において、増幅処理に付されるＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡの特定領域であるが、１本鎖ＤＮＡと当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖が存在する場合には、当該１本鎖ＤＮＡの特定領域だけでなく、当該「相補鎖の対応領域」をＤＮＡ増幅工程（増幅処理）に付してもよい。
【００５０】
ここで、「相補鎖の対応領域」とは、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」に相補的に結合する領域（「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の配列に相補的な配列）であり、当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖の全長または一部の何れであってもよい。
【００５１】
また、「１本鎖ＤＮＡの相補鎖」とは、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」に相補的に結合する領域（「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の配列に相補的な配列）を有する鎖であり、通常は１本鎖ＤＮＡの配列に相補的な配列を有するものである。
【００５２】
上記したように、本発明に係るＤＮＡ増幅工程において、当該「１本鎖ＤＮＡの特定領域」を増幅処理に付す場合、本発明に係る判断工程においてｈｍＣの有無を判断するための検出対象領域は、当該「１本鎖ＤＮＡの特定領域」であり、当該「１本鎖ＤＮＡの特定領域」および当該「相補鎖の対応領域」を増幅処理に付す場合、本発明に係る判断工程においてｈｍＣの有無を判断するための検出対象領域は、当該「１本鎖ＤＮＡの特定領域」だけでなく、これと当該「相補鎖の対応領域」の２つの領域である。
【００５３】
増幅処理としては、ＤＮＡを増幅し得る自体公知の方法であれば良く、例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、等温遺伝子増幅反応法等のＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応方法が挙げられる。これら公知の方法を用いた増幅処理は、自体公知の方法に準じて行えば足りる。
【００５４】
上記の方法のうち、ＰＣＲを用いる場合には、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列、３’末端側の塩基配列に相補的な配列、「相補鎖の対応領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列、又は／及び「相補鎖の対応領域」の３’末端側の塩基配列に相補的な配列をプライマー配列（後述）としてしてもよく、また、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’又は／及び３’末端にアダプター配列を、又は／及び「相補鎖の対応領域」の５’又は／及び３’末端にアダプター配列（後述）を付加してもよい。尚、アダプターを用いて増幅を行う場合には、例えばＷＯ２００９／０４４７８２号公報に開示された方法に準じて行えばよい。
ＰＣＲを用いて、増幅処理を行う方法としては、例えば以下のような方法が挙げられる。
【００５５】
（方法−１）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）及び「相補鎖の対応領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００５６】
（方法−２）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」及び「相補鎖の対応領域」の５’末端側に３’アダプター（後述）、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」及び「相補鎖の対応領域」の３’末端側に５’アダプター（後述）をそれぞれ付加し、配列の全部又は一部に、３’アダプターに相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）及び配列の全部又は一部に、３’アダプターに相補的な配列を含有するＲｉｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００５７】
（方法−３−１）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側に３’アダプター（後述）を付加し、配列の全部又は一部に、３’アダプターに相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）、「相補鎖の対応領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
（方法−３−２）「相補鎖の対応領域」の５’末端側に３’アダプター（後述）を付加し、配列の全部又は一部に、３’アダプターに相補的な配列を含有するＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００５８】
（方法−４）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）及びＰＣＲを１サイクル行った際に生成された相補鎖における「相補鎖の対応領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００５９】
（方法−５）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側に３’アダプター（後述）、３’末端側に５’アダプター（後述）をそれぞれ付加し、配列の全部又は一部に、３’アダプターに相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）及び配列の全部又は一部に５’アダプターの配列を含有する５’  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００６０】
（方法−６）１本鎖ＤＮＡの「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の３’末端端に５’アダプター（後述）を付加し、配列の全部又は一部に、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述）及び配列の全部又は一部に５’アダプターの配列を含有する５’  ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００６１】
（方法−７）「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（後述）を用いてＰＣＲを行う方法。
【００６２】
ＰＣＲ法は、自体公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，Ｖｏｌ．１９，３７４９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９４，  Ｖｏｌ．１６，  １１３４−１１３７に記載の方法に準じて行った場合を行えばよい。
以下に、具体的に記載する。
【００６３】
即ち、ＤＮＡ酸化工程、要すればＤＮＡ精製工程を行ったＤＮＡ１００ｐｇ〜５０ｎｇに、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（後述する）及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（後述する）をそれぞれ通常０．１〜０．５ｐｍｏｌ、好ましくは０．２〜０．３ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（後述する）を通常０．１〜５  Ｕｎｉｔｓ、好ましくは０．５〜２．５Ｕｎｉｔｓ、並びに４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（後述する）を通常５０〜５００μｍｏｌ、好ましくは、１００〜３００μｍｏｌ添加し、トリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ等の緩衝液１μＬ〜１０μＬを含む全量１０μＬ〜１００μＬ中で、例えば９０℃〜９８℃で１０秒〜５分加熱後、「９０℃〜９８℃で１０秒〜１分、４５℃〜６５℃で１０秒〜１分、６８℃〜７２℃で１０秒〜２分」を１サイクルとして１５サイクル〜４０サイクル行い、６８℃〜７２℃で３０秒〜５分、ＰＣＲを行えばよい。
【００６４】
上記ＰＣＲにおけるＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、及び５’  ｐｒｉｍｅｒについて、以下に述べる。これらのプライマーは、自体公知の方法に準じて適宜調製して用いればよい。
【００６５】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するもの、又は「１本鎖ＤＮＡの特定領域」の５’末端に３’アダプターを付加する方法の場合（上記方法２、３−１、５）においては、３’アダプターに相補的な配列を有するものであり、そのヌクレオチド数は通常１５〜３５、好ましくは１８〜３０、より好ましくは２０〜２８である。
【００６６】
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは、「相補鎖の対応領域」の５’末端側の塩基配列に相補的な配列を含有するもの、又は「相補鎖の対応領域」の５’末端に３’アダプターを付加する方法の場合（上記方法２、３−２）においては、３’アダプターに相補的な配列を含有するものであり、そのヌクレオチド数は通常１５〜３５、好ましくは１８〜３０、より好ましくは２０〜２８である。
【００６７】
５’  ｐｒｉｍｅｒは、配列の全部又は一部に５’アダプターの配列を含有するものであり、そのヌクレオチド数は通常１５〜３５、好ましくは１８〜３０、より好ましくは２０〜２８である。
【００６８】
上記Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、及び５’  ｐｒｉｍｅｒ（以下、プライマーと略記する）としては、プライマー及びプライマーが結合するＤＮＡ配列中にｈｍＣが含まれないこと、通常のＰＣＲに用いられるプライマーと同様、プライマーダイマーを形成しないこと、プライマーが上記の相補的な配列以外と結合しないこと、を満たす配列であることが望ましい。
【００６９】
上記プライマー配列とは、１本鎖ＤＮＡの特定領域又は／及び相補鎖の対応領域の５’側又は／及び３’側の配列である。そのヌクレオチド数は、通常１２〜３０、好ましくは１５〜２５、より好ましくは１８〜２２である。
【００７０】
上記５’アダプターについて、以下に述べる。
上記５’アダプターは、３’側のヒドロキシ基がリン酸基と反応しないように処理されており、その配列が既知のＤＮＡであればその配列はどのようなものであってもよいが、本発明に係るＤＮＡ中に存在しない配列からなるものが好ましい。そのヌクレオチド数は、通常１２〜３０、好ましくは１５〜２５、より好ましくは１８〜２２である。
【００７１】
上記３’側のヒドロキシ基がリン酸基と反応しないような処理としては、通常この分野で行われている方法であればよく、例えば３’末端の脱ヒドロキシル化、３’末端のヒドロキシ基にビオチン等を結合させる処理等が挙げられるが、中でも３’末端の脱ヒドロキシル化が好ましい。３’末端を脱ヒドロキシル化したものは、精製方法としてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出時に水溶液中に溶解するため、容易に抽出することが可能となる。
【００７２】
「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」の５’末端に３’アダプターを付加する方法としては、通常この分野で用いられている自体公知の方法により対象ＤＮＡ（「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」）の５’末端に本発明に係る３’アダプターを付加すればよく、市販のキット等を用いて行うこともできるが、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９８８，  Ｖｏｌ．  １６，  Ｎｏ．  ５  １９９９−２０１４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９８８，  Ｖｏｌ．  １６，  Ｎｏ．  １  ２６５−２７７に記載の方法に準じて行えばよく、具体的には、本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」に、３’アダプター通常１０〜１００ｐｍｏｌ、好ましくは１０〜５０ｐｍｏｌと、一本鎖ＤＮＡリガーゼ１〜５０ｕｎｉｔｓ、好ましくは５〜１５ｕｎｉｔｓ、ＨＥＰＥＳ、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ等の緩衝液中で、通常５０〜７０℃、好ましくは５０〜６０℃で３０〜９０分間、好ましくは３０〜６０分間反応させることによりなされる。これにより、３’アダプター付加が付加された「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」を得ることができる。該反応に於いて、通常このようなライゲーション時に用いられている、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）等の補酵素、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等還元剤、塩化マグネシウム、ＢＳＡ、塩化マンガン等の試薬を添加してもよく、これら試薬の濃度及び使用量は通常この分野で用いられている範囲から適宜選択される。
【００７３】
本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」に３’アダプターを付加する方法においては、その前に、上記ＤＮＡの精製工程を行い、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」の３’末端側のヒドロキシ基と反応しないように処理しておくのが好ましい。
【００７４】
その処理としては、通常この分野で行われている方法に準じて行えばよく、例えば精製による残存物の除去、脱リン酸化酵素による脱リン酸化処理等が挙げられる。具体的には、本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」が１００塩基以上であれば、通常この分野で用いられるシリカゲルメンブレン等のフィルターやカラム等を用いて上記残存物を除去する。また、市販の精製キットを用いて残存物を除去してもよい。本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」が１００塩基以下の場合には、上記フィルターやカラムによる残存物の除去は難しいため、残存物のリン酸基を脱リン酸化処理することによりなされる。ここで用いられる脱リン酸化酵素としては、上記工程１の説明における、工程１の前になされる脱リン酸化処理で用いられる脱リン酸化酵素と同じものが挙げられ、好ましいもの、失活・除去方法等も同じである。
【００７５】
「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」の５’末端に３’アダプターを付加した後、添加した一本鎖ＤＮＡリガーゼ等を失活させるのが好ましく、その方法は用いられる酵素に応じた自体公知の方法に準じて行えばよいが、例えば通常９０〜１００℃、好ましくは９０〜９５℃で通常５〜１５分間、好ましくは５〜１０分間の熱処理により行われればよい。また、酵素失活後、通常この分野で用いられている精製方法、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により、３’アダプターが付加された「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」を精製するのが好ましい。
【００７６】
尚、３’アダプターは、５’側のヒドロキシ基がリン酸基と反応しないように処理されており、その配列が既知のＤＮＡであればその配列はどのようなものであってもよいが、本発明に係る「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」中に存在しない配列からなるものが好ましい。そのヌクレオチド数は、通常１２〜３０、好ましくは１５〜２５、より好ましくは１８〜２２であり、具体的な付加方法は上記５’アダプターの付加方法に従えばよい。
【００７７】
上記アダプター配列とは、１本鎖ＤＮＡの特定領域又は／及び相補鎖の対応領域の５’末端又は／及び３’末端に付加される配列である。
そのヌクレオチド数は、通常１２〜３０、好ましくは１５〜２５、より好ましくは１８〜２２である。
尚、目的の増幅物（後述）には、１本鎖ＤＮＡの特定領域又は／及び相補鎖の対応領域に加え、上記アダプター配列が増幅処理された増幅物も含まれる。
【００７８】
上記ＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常この分野で用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば何れでもよく、例えばＧｅｎｅ  Ｔａｑ（（株）ニッポンジーン製）等のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等が挙げられる。
【００７９】
上記ｄＮＴＰｓは、通常この分野で用いられる４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合物であれば特に限定はされない。
【００８０】
本発明に係るＤＮＡ増幅工程により、目的の増幅物が得られる。
目的の増幅物としては、（ｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの、（ｉｉ）相補鎖の対応領域の全長を含むもの（ｉｉｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの及びその相補鎖の対応領域の全長を含むもの、（ｉｖ）又はこれらに更にアダプター配列を含むものが挙げられる（以下（ｉ）〜（ｉｖ）をまとめて、「本発明に係る目的の増幅物」と略記する場合がある）。
【００８１】
従って、目的の増幅物によって本発明に係る判断工程においてｈｍＣの有無を判断するための検出対象領域が異なることとなる。
即ち、上記の（ｉ）又は（ｉｉ）の場合は、検出対象領域は１本鎖ＤＮＡの特定領域であり、（ｉｉｉ）の場合は１本鎖ＤＮＡの特定領域及びその相補鎖の対応領域の２つの領域である。
【００８２】
言い換えれば、所望する検出対象領域の種類（１本鎖ＤＮＡの特定領域または当該特定領域と相補鎖の対応領域の２つの領域）と増幅処理方法に応じて、増幅物の種類〔上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の増幅物〕、ＤＮＡ増幅工程におけるＤＮＡの種類（１本鎖ＤＮＡの特定領域または当該特定領域と相補鎖の対応領域の２つの領域）、及びＤＮＡ酸化工程におけるＤＮＡの種類（相補鎖の有無）を適宜選択、決定すればよい。
これらの関係を以下の表１に示す。
【００８３】
【表１】
2014103980.tif 000002
尚、上記のＰＣＲを用いる増幅処理において、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」の３’又は／及び５’末端側の塩基配列に相補的な配列をプライマー配列とする場合には、当該プライマー配列は特定領域又は対応領域の一部であるため、目的の増幅物にも検出対象領域にも含まれることとなる。一方、「１本鎖ＤＮＡの特定領域」又は／及び「相補鎖の対応領域」の３’又は／及び５’末端にアダプター配列を付加する場合には、当該アダプター配列は目的の増幅物には含まれるものの、当該アダプター配列は特定領域又は対応領域の一部ではないため、検出対象領域には含まれない。
図２に、本発明に係る目的の増幅物、１本鎖ＤＮＡの特定領域、相補鎖の対応領域、検出対象領域、プライマー配列及びアダプター配列の関係を示す。
【００８４】
ＤＮＡ増幅工程は、例えば以下のように行えばよい。
例えば、ＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕、要すればＤＮＡ精製工程により得られたＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ又はこれとその相補鎖）を鋳型としてＰＣＲに付し、本発明に係る目的の増幅物が得られる。
即ち、ＤＮＡ酸化工程、要すればＤＮＡ精製工程を行ったＤＮＡ１００ｐｇ〜５０ｎｇに、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒをそれぞれ通常０．１〜０．５ｐｍｏｌ、好ましくは０．２〜０．３ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼを通常０．１〜５  Ｕｎｉｔｓ、好ましくは０．５〜２．５Ｕｎｉｔｓ、並びに４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（後述する）を通常５０〜５００μｍｏｌ、好ましくは、１００〜３００μｍｏｌ添加し、トリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ等の緩衝液１μＬ〜１０μＬを含む全量１０μＬ〜１００μＬ中で、例えば９０℃〜９８℃で１０秒〜５分加熱後、「９０℃〜９８℃で１０秒〜１分、４５℃〜６５℃で１０秒〜１分、６８℃〜７２℃で１０秒〜２分」を１サイクルとして１５サイクル〜４０サイクル行い、６８℃〜７２℃で３０秒〜５分、ＰＣＲを行うことでＤＮＡ酸化工程〔工程（１）〕を行った本発明に係る目的の増幅物が得られる。
【００８５】
（４）増幅物検出工程〔工程（３）〕
増幅物検出工程は、本発明に係るＤＮＡ増幅工程で得られた本発明に係る目的の増幅物の有無を検出する工程である。
【００８６】
本発明に係る「目的の増幅物」は、前述の通りである。
即ち、本発明に係る目的の増幅物は、上記ＤＮＡ増幅工程により得られた、（ｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの、（ｉｉ）相補鎖の対応領域の全長を含むもの、（ｉｉｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの及びその相補鎖の対応領域の全長を含むもの、（ｉｖ）又はこれらに更にアダプター配列を含むものである。
一方、上記以外の増幅物、例えば、増幅処理としてＰＣＲを用いた場合における、プライマーダイマーや上記特定領域や対応領域の配列のうち一部分しか含まない増幅物（特定領域や対応領域の全長を含まない増幅物）は、本発明に係る目的の増幅物から除かれる。
【００８７】
本発明に係る目的の増幅物の有無を検出する方法としては、通常この分野で用いられている増幅物の有無を検出する方法、例えば電気泳動法やクロマトグラフィー法、特に好ましくはアガロースゲル電気泳動法が挙げられる。
【００８８】
例えば、アガロースゲル電気泳動法であれば「バイオ実験イラステッドｉｉ遺伝子解析の基礎，２００６，ｐ．ｐ．５４−５８」に記載の「アガロースゲルの作成と電気移動」の項に開示されている方法等が挙げられる。即ち、０．６％〜２．０％のアガロースゲルを０．５×ＴＢＥまたは１×ＴＡＥバッファーで満たした電気泳動槽にセットし、工程（３）で増幅処理をした１／１０〜１／５量のＤＮＡを含む溶液とローディングバッファーを混合し、０．５×ＴＢＥバッファーを用いた場合は１００Ｖ、１×ＴＡＥバッファーを用いた場合は５０Ｖの電圧をかけ、サンプルが１／２〜１／３程度流れるまで電気泳動を行う。その後、通常この分野で用いられる染色液、例えばＧｅｌ  Ｒｅｄ等を用いてゲルを染色後、紫外線照射にて、目的の増幅物の有無を検出する。即ち、電気泳動後の移動度に基づいて目的の増幅物であるかを判断する。具体的には、例えば、一般に分子量と核酸の移動度は広義に反比例の関係にあることから、分子量マーカーを移動度の目安として電気泳動し、目的の増幅物の分子量から想定される移動度を元に、電気泳動により得られたバンドが目的の増幅物であるかを判断する。
【００８９】
（５）判断工程〔工程（４）〕
判断工程〔工程（４）〕は、本発明に係る増幅物検出工程で検出された目的の増幅物の有無の結果に基づき、検出対象領域（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は１本鎖ＤＮＡの特定領域とその相補鎖の対応領域）中のｈｍＣの有無を判断する工程である。
【００９０】
検出対象領域（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は１本鎖ＤＮＡの特定領域とその相補鎖の対応領域）中にｈｍＣが含まれている場合、ＤＮＡ増幅工程において本発明に係る目的の増幅物〔（ｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの、（ｉｉ）相補鎖の対応領域の全長を含むもの、（ｉｉｉ）１本鎖ＤＮＡの特定領域の全長を含むもの及びその相補鎖の対応領域の全長を含むもの、（ｉｖ）又はこれらに更にアダプター配列を含むもの〕の増幅反応が進まず、増幅物検出工程において本発明に係る目的の増幅物が検出されない。これは、ＤＮＡ増幅工程の増幅処理に付されるＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は／及び相補鎖の対応領域）中のｈｍＣの酸化物をＤＮＡポリメラーゼが認識することができず、伸長反応がｈｍＣの酸化物の位置で停止することによると考えられる。
他方、ＤＮＡ増幅工程の増幅処理に付されるＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は／及び相補鎖の対応領域）中にｈｍＣが含まれていない場合、ＤＮＡ増幅工程において本発明に係る目的の増幅物の増幅反応が進み、増幅物検出工程において本発明に係る目的の増幅物が検出される。
【００９１】
即ち、増幅物検出工程で本発明に係る目的の増幅物が検出された場合は、検出対象領域（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は１本鎖ＤＮＡの特定領域とその相補鎖の対応領域）中にｈｍＣが含まれていないと判断する。他方、増幅物検出工程で本発明に係る目的の増幅物が検出されなかった場合は、検出対象領域（１本鎖ＤＮＡの特定領域又は１本鎖ＤＮＡの特定領域とその相補鎖の対応領域）中にｈｍＣが含まれていると判断する。
【００９２】
５．本発明の試薬キット
本発明の試薬キットは、上記した如き本発明に係るＤＮＡ中のｈｍＣの検出方法を実施するために使用されるものである。
本発明に係るＤＮＡ中のｈｍＣの検出用試薬キットとしては、
（ｉ）本発明に係る多価金属酸化物類を含む試薬及び
（ｉｉ）本発明に係る過酸化物を含む試薬を含んでなるものが挙げられる。
これらの構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べたとおりである。
【００９３】
さらに、上記以外の試薬類を加えて、本発明のキットとすることもできる。即ち、このような試薬類として、例えば以下の如きａ）〜ｄ）を含んでもよいが、これらに限定されない。
ａ）核酸精製用のカラム（例えば、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎ（（株）ジーンデザイン製））、
ｂ）ＤＮＡ精製工程において用いられる緩衝液（例えば、キレート剤含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）
ｃ）ＰＣＲ用試薬（例えば、１種又は２種以上のプライマー、１種又は２種以上のアダプター）
ｄ）電気泳動用試薬（例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、Ｇｅｌ  Ｒｅｄ、臭化エチジウム染色用試薬）
【００９４】
また、当該キットには、前述した如き本発明に係るＤＮＡ中のｈｍＣの検出方法を実施するための説明書などを含ませておいても良い。当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴・原理・操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
【００９５】
本発明の試薬キットに含まれる試薬は、使用時にＤＮＡ溶液、アルカリ溶液等と混合されて希釈されるが、使用時の有効濃度が上述の本発明に係る多価金属酸化物類の濃度及び上述の本発明に係る過酸化物の濃度の範囲となればよい。
以下に実験例、実施例、比較例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例などにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
［実験例１］  鋳型ＤＮＡの増幅
ラムダＤＮＡ（（株）ニッポンジーン製）における配列番号１（５６６ｂｐの領域）をＤＮＡ鋳型として、ＰＣＲ法により増幅を行いシトシン、メチル化シトシン（ｍＣ）又はヒドロキシメチル化シトシン（ｈｍＣ）を有するポリヌクレオチドを得た。
即ち、次の（ａ）〜（ｉ）を混合し、全量５０μＬの３種の反応溶液を調製し、９４℃で３０秒加熱した後、「９４℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で２０秒」を１サイクルとして２５サイクル、次いで７２℃で１分、ＰＣＲを行った。
（ａ）ラムダＤＮＡ（（株）ニッポンジーン製）１ｎｇ含有水溶液  ３４．５μＬ
（ｂ）１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（（株）ニッポンジーン製）  ５μＬ
（ｃ）１０ｍＭ  ｄＡＴＰ（和光純薬工業（株）製）  １μＬ
（ｄ）１０ｍＭ  ｄＧＴＰ（和光純薬工業（株）製）  １μＬ
（ｅ）１０ｍＭ  ｄＴＴＰ（和光純薬工業（株）製）  １μＬ
（ｆ）５μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）（配列番号２）溶液  ３μＬ
（ｇ）５μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）（配列番号３）溶液  ３μＬ
（ｈ）５Ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  （（株）ニッポンジーン製）０．５μＬ
（ｉ）１０ｍＭ  ｄＣＴＰ（和光純薬工業（株）製）  １μＬ、１０ｍＭ  ｄｍＣＴＰ（メチル化ｄＣＴＰ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）  １μＬ又は１０ｍＭ  ｄｈｍＣＴＰ（ヒドロキシメチル化ｄＣＴＰ）（（株）ニッポンジーン製）  １μＬ
その後、得られた各ＰＣＲ増幅物を１．５％アガロースゲル（（株）ニッポンジーン製）にて電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業（株）製）で染色後、紫外線照射し、ＰＣＲによる「５６６ｂｐの増幅物」をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）ＱＩＡＧＥＮ）により当該ゲルから「５６６ｂｐの増幅物」を抽出した。
更に、３種類の「５６６ｂｐの増幅物」について、それぞれ分光光度計により抽出液の吸光度を測定し、各抽出液を「５６６ｂｐの増幅物」１００ｎｇが含まれる２６μＬの希釈溶液となるように蒸留水（大塚製薬（株）製）で希釈し、得られた３種類の希釈液を反応液１とした。
尚、上記配列番号１〜配列番号３は、以下の配列を有するＤＮＡである。
配列番号１：ラムダＤＮＡのＰＣＲにより増幅される５６６ｂｐの領域
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｊ０２４５９  ：  ２６６０４−２７１６９  （Ｓｔｒａｎｄ  ＝  Ｐｌｕｓ  ／  Ｍｉｎｕｓ）
配列番号２：Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０２４５９：２７１４４−２７１６９
ＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡＴＣＣ
配列番号３：Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０２４５９：２６６０４−２６６２６
ＣＡＡＴＧＴＣＧＧＣＴＡＡＴＣＧＡＴＴＴＧＧＣ【００９７】
［実施例１〜２］  ＤＮＡ中のｈｍＣの検出
（１）実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡの１本鎖化
実験例１で得られた  反応液１  ２６μＬに、１Ｍ  水酸化ナトリウム４μＬ加え、反応液のｐＨを１２〜１４とし、得られた溶液を反応液２とした。
（２）１本鎖ＤＮＡと多価金属酸化物類との接触（以下、ＤＮＡ酸化工程１−１と略記する場合がある）
（１）で得られた  反応液２に、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）水溶液２０μＬ（実施例１）又は２Ｍ  タングステン酸カリウム（和光純薬工業（株）製）水溶液２０μＬ（実施例２）を加えて混合し（全量５０μＬ）、３０℃で１０分間インキュベートした。得られた溶液を反応液３とした。
（３）１本鎖ＤＮＡと過酸化物との接触（以下、ＤＮＡ酸化工程１−２又は１−２と略記する場合がある）
上記（２）で得られた  反応液３に、３００ｍＭ  オキソン（和光純薬工業（株）製）５０μＬを加えて混合し（全量１００μＬ）、６０℃で４時間インキュベートし、得られた溶液を反応液４とした。
（４）ＤＮＡのカラム精製
上記（３）で得られた反応液４に、５．５Ｍ  グアニジウム塩酸塩（和光純薬工業（株）製）含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）緩衝液５００μＬを加えて混合し、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎ（（株）ジーンデザイン製）に充填し、１００００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルー液を除去した。次いで、８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）含有２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（（株）ジーンデザイン製）緩衝液６５０μＬをＥｃｏｎｏＳｐｉｎに充填後、１００００×ｇで１分間、遠心分離し、フロースルー液を除去した。更に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（（株）ニッポンジーン製）５０μＬをＥｃｏｎｏＳｐｉｎに充填し、１００００×ｇで１分間、遠心分離し、フロースルー液を回収し、精製ＤＮＡを得た。
（５）ＰＣＲ増幅（ＤＮＡ増幅工程〔工程（２）〕）
上記（４）で回収した、フロースルー液に含まれる精製ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ（配列番号４及びその相補鎖）をＰＣＲ法により増幅した。
即ち、次の（ａ）〜（ｇ）を混合し、全量２５μＬの反応溶液を調製し、９４℃で３０秒加熱した後、「９４℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で２０秒」を１サイクルとして２５サイクル、次いで７２℃で１分、ＰＣＲを行った。
（ａ）（４）で回収をした、ＤＮＡ２ｎｇ相当を含むフロースルー液１μＬ
（ｂ）蒸留水（大塚製薬（株）製）１６．３μＬ
（ｃ）１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（（株）ニッポンジーン製）２．５μＬ
（ｄ）２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（（株）ニッポンジーン製）２μＬ
（ｅ）５μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）（配列番号５）１．５μＬ
（ｆ）５μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）（配列番号６）１．５μＬ
（ｇ）Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ（５Ｕｎｉｔｓ／μＬ）（（株）ニッポンジーン製）０．２μＬ
尚、上記配列番号４〜配列番号６は、以下の配列を有するＤＮＡである。
配列番号４：Ｌａｍｄａ  ＤＮＡの１７７ｂｐの増幅領域
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｊ０２４５９  ：  ２６７９５−２６９７１  （Ｓｔｒａｎｄ  ＝  Ｐｌｕｓ  ／  Ｍｉｎｕｓ）
配列番号５：Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｊ０２４５９：２６９４５−２６９７１
ＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＡＧＧ
配列番号６：Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｊ０２４５９：２６７９５−２６８１９
ＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＣ
（６）電気泳動による増幅物の検出（増幅物検出工程〔工程（３）〕）
上記（５）で得られたＰＣＲ増幅物を２％アガロースゲル（（株）ニッポンジーン製）にて電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業（株）製）で染色後、紫外線照射にて目的の増幅物（１７７ｂｐ）の有無を確認し、その結果を図３に示す。
図３（Ａ）はタングステン酸ナトリウムを用いた場合の結果（実施例１）を、図３（Ｂ）はタングステン酸カリウムを用いた場合の結果（実施例２）の結果を示す。
図３から明らかなように、酸化処理後のシトシン又はｍＣを含むＤＮＡに対しＰＣＲを行った場合は、目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが認められたのに対し、酸化処理後のｈｍＣを含むＤＮＡに対し行ったＰＣＲでは、目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが認められなかった。
（７）ｈｍＣの有無の判断（判断工程〔工程（４）〕）
ＤＮＡ中にｈｍＣが含まれていない場合（シトシン又はｍＣを含むＤＮＡを使用した場合）、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドを検出した。
他方、ＤＮＡ中にｈｍＣを含む場合、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドは検出されなかった。
即ち、ＤＮＡ中にｈｍＣが含まれていない場合はポリメラーゼがシトシン又はｍＣを認識し、ＰＣＲが進行するのに対し、ＤＮＡ中にｈｍＣを含む場合、ポリメラーゼがｈｍＣを認識しできず、ＰＣＲが進行しないと考えられる。
従って、目的の増幅物（１７７ｂｐ）があれば、検出対象のＤＮＡ中にＤＮＡ中にｈｍＣが含まれておらず、目的の増幅物（１７７ｂｐ）が無ければ、検出対象のＤＮＡ中にＤＮＡ中にｈｍＣが含まれていると判断できる。
即ち、本発明の方法を用いれば、ＤＮＡの特定領域及びその相補鎖中のｈｍＣの有無を精度よく検出できることが判った。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【００９８】
［実施例３〜４］  ＤＮＡ中のｈｍＣの検出
多価金属酸化物類を含む水溶液として、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム水溶液  ２０μＬの代わりに、２Ｍ  タングステン酸水溶液  ２０μＬ（実施例３）又は２Ｍ  モリブデン酸ナトリウム水溶液  ２０μＬ（実施例４）を使用し、ＰＣＲのサイクル数を１５サイクル又は２０サイクル行った以外は、実施例１と同様の方法により、本発明の方法を実施した。得られた結果を図４（Ａ）、図４（Ｂ）にそれぞれ示す。
図４の結果から明らかなように、多価金属酸化物類としてタングステン酸又はモリブデン酸ナトリウムを用いた場合も、タングステン酸ナトリウムを用いた場合（実施例１）及びタングステン酸カリウムを用いた場合（実施例２）と同様に、ＤＮＡ中にｈｍＣが含まれていない場合、ＰＣＲによる増幅が進み、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが確認された。
また、ＤＮＡ中にｈｍＣを含む場合、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動に目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドとして確認されなかった。
即ち、多価金属酸化物類として、「周期表の６族の金属から選ばれる金属の多価金属酸塩」であるタングステン酸又はモリブデン酸ナトリウムを用いた場合もＤＮＡ中のｈｍＣの有無を精度よく検出できることが判った。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【００９９】
［実施例５］  ゲノムＤＮＡ中のｈｍＣの検出
本発明の方法により、天然由来のゲノムＤＮＡ中のｈｍＣの有無の検出が可能であるかを検討した。
即ち、脳の神経細胞おいてヒドロキシメチル化シトシンが多く存在すると考えられている上皮成長因子受容体、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）（２０１１年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２８６，  ２４６８５−２４６９３）のエキソン１及びエキソン２間のイントロン領域（配列番号７）を「１本鎖ＤＮＡの特定領域」としてｈｍＣの有無を検討した。
具体的には、実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡを含む反応液１  ２６μＬの代わりに、ヒトの神経芽細胞腫であるＩＭＲ−３２（理研  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）由来ＤＮＡにおける「１本鎖ＤＮＡの特定領域及びその相補鎖」１００ｎｇを用いて、ＰＣＲのサイクルを４０サイクルとしてＰＣＲを下記条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により本発明の方法を実施した。
尚、コントロールとしては、ヒトの腎細胞であるＨＥＫ２９３（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）由来ＤＮＡ、ヒトの肝癌細胞であるＨｅｐＧ２（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）由来ＤＮＡ又はヒトの慢性骨髄性白血病細胞であるＫ５６２（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）由来ＤＮＡをそれぞれ用い、上記ＩＭＲ−３２由来ＤＮＡと同様に実験を行った。
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
上記「１本鎖ＤＮＡの特定領域及びその相補鎖」１００ｎｇを含む水溶液２６μＬを用い、また、５μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号８）溶液  ３μＬ及び５μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ溶液Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号９）溶液３μＬを用いて、ＰＣＲのサイクルを４０サイクルとしてＰＣＲを行った以外は、実施例１と同様の方法により本発明の方法を実施した。
その結果、ｈｍＣが多く存在していると考えられているＩＭＲ−３２由来ＤＮＡを用いた場合、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１６３ｂｐ）のバンドは確認されなかった。
他方、コントロールとして用いた、ＨＥＫ２９３由来ＤＮＡ、ＨｅｐＧ２由来ＤＮＡ、Ｋ５６２由来ＤＮＡを用いた場合、ＰＣＲによる増幅が進み、電気泳動により目的の増幅物（１６３ｂｐ）のバンドが確認された。
即ち、本発明の方法によれば、天然の核酸が結合したＤＮＡであっても、ＤＮＡ中のｈｍＣを検出することができることが判った。結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。
尚、上記配列番号７〜配列番号９は、以下の配列を有するＤＮＡである。
配列番号７：ＥＧＦＲのＰＣＲ増幅領域（１６３ｂｐ）
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ５８８２４６：６５４４８−６５６１０
配列番号８：Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＹ５８８２４６：６５４４８−６５４７３
ＧＣＴＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＴＡＧＡＣＣ
配列番号９：
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＹ５８８２４６：６５５９０−６５６１０
ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＧ【０１００】
［実施例６］  ＤＮＡの熱処理による１本鎖処理及び同時酸化による、ＤＮＡ中のｈｍＣの検出
（１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖化
実験例１で得られた  反応液１  ２６μＬに、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）水溶液  ２０μＬ、３００ｍＭ  オキソン（和光純薬工業（株）製）５０μＬを加えて混合した。
次いで、９０℃で３分、インキュベートし、実験例１で得られた５６６ｂｐの増幅物の１本鎖化をおこない、反応液１とした。
（２）１本鎖ＤＮＡと多価金属酸化物類及び過酸化物との接触（以下、ＤＮＡ酸化工程
と略記する場合がある）
上記（１）で得られた  反応液１を、６０℃で４時間インキュベートし、得られた溶液を反応液２とした。
ＤＮＡのカラム精製からｈｍＣの有無の判断までは、反応液４の代わりに、上記（２）で得られた反応液２を用いて、実施例１の（４）から（７）と同様にして実験を行った。
その結果、１本鎖ＤＮＡをタングステン酸ナトリウムに接触後、オキソンに接触させて酸化する実施例１と同様に、ｈｍＣが含まれないＤＮＡの場合は、ＰＣＲによる増幅が進み、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが確認された。一方、ｈｍＣを含むＤＮＡの場合は、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが検出されなかった。
即ち、本発明の方法においては、１本鎖ＤＮＡに本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物を「同時」に接触させても、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無を検出できることが確認された。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１０１】
［比較例１〜２］  過マンガン酸カリウム又は過塩素酸ナトリウムを用いた検討
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム  ２０μＬの代わりに、１００ｍＭ若しくは１０ｍＭ  過マンガン酸カリウム  ２０μＬを使用し、
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２の温度条件を、
（イ）ＤＮＡ酸化工程１−１を３０℃、ＤＮＡ酸化工程１−２を６０℃で行う、又は
（ロ）ＤＮＡ酸化工程１−１及びＤＮＡ酸化工程１−２を氷上で行う
として実験を行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、比較例２の実験条件と併せて下記表２に記す。
尚、過マンガン酸カリウムは、「周期表の７族の金属から選ばれる金属の多価金属酸化物類（以下、「７族の金属の多価金属酸化物類」と略記する場合がある）」である。【０１０２】
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム  ２０μＬの代わりに、１Ｍ若しくは１００ｍＭ  過塩素酸ナトリウム  ２０μＬを使用し、
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２の温度条件を、
（イ）ＤＮＡ酸化工程１−１を３０℃、ＤＮＡ酸化工程１−２を６０℃で行う、又は
（ロ）ＤＮＡ酸化工程１−１及びＤＮＡ酸化工程１−２を氷上で行う
として実験を行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、比較例１の実験条件と併せて下記表２に記す。
尚、過塩素酸ナトリウムは、「周期表の１７族の元素の酸化物（以下、「１７族の元素の酸化物」と略記する場合がある）」である。【０１０３】
【表２】
2014103980.tif 000003
【０１０４】
上記の結果、酸化剤として過マンガン酸カリウム（比較例１）又は過塩素酸ナトリウム（比較例２）を用いた場合、反応時の温度、酸化剤の使用濃度にかかわらず、目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドは確認できなかった。
更に、ｈｍＣが存在しない場合であっても、目的の増幅物のバンドは確認できなかった。
これは、過マンガン酸カリウム（比較例１）又は過塩素酸ナトリウム（比較例２）の酸化力が強く、ＤＮＡが分解されたためと考えられた。
即ち、７族の金属の多価酸化物類又は１７族の元素の酸化物を用いた場合には、ｈｍＣの検出ができないこと、言い換えれば、本発明に係る多価金属酸化物類以外の酸化剤を用いた場合には、ｈｍＣの検出ができないことが判った。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１０５】
［比較例３〜７］  過ヨウ素酸ナトリウム、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、２−ヨードベンゼンスルホン酸、オルトバナジン酸ナトリウム、塩化銅を用いた検討
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム  ２０μＬの代わりに、２００ｍＭ  過ヨウ素酸ナトリウム  ２０μＬを使用し、
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２の温度条件を、
（イ）ＤＮＡ酸化工程１−１を３０℃、１−２を６０℃で行なう（以下、「比較例３―ａ」と略記する場合がある）又は
（ロ）ＤＮＡ酸化工程１−１及び１−２を氷上で行う（以下、「比較例３―ｂ」と略記する場合がある）
として実験を行った（比較例３）。
実施例１の条件と異なる点を、比較例４〜７の実験条件と併せて下記表３に記す。
尚、過ヨウ素酸ナトリウムは、「１７族の元素の酸化物」である。【０１０６】
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２Ｍ  タングステン酸ナトリウム  ２０μＬの代わりに、２Ｍ  ４−メチルモルホリンＮ−オキシド  ２０μＬ（比較例４）、２Ｍ  ２−ヨードベンゼンスルホン酸  ２０μＬ（比較例５）、２Ｍ  オルトバナジン酸ナトリウム  ２０μＬ（比較例６）、２Ｍ  塩化銅  ２０μＬ（比較例７）を使用して実験を行った。
実施例１の条件と異なる点を、比較例３の実験条件と併せて下記表３に記す。
尚、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（比較例４）及び２−ヨードベンゼンスルホン酸  ２０μＬ（比較例５）は酸化剤であり、オルトバナジン酸ナトリウム（比較例６）は「周期表の５族の金属から選ばれる金属の、多価金属酸化物類又は多価金属酸塩（以下、「５族の金属の多価金属酸化物類」と略記する）」であり、塩化銅  ２０μＬ（比較例７）は「周期表の１１族の元素の化合物（以下、「１１族の元素の化合物」と略記する）」である。【０１０７】
【表３】
2014103980.tif 000004
【０１０８】
その結果、「比較例３―ａ」では、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドは確認されなかった。
この原因は、過ヨウ素酸ナトリウムの酸化力が強く、ＤＮＡが分解されたことによると考えられた。
他方、「比較例３―ｂ」の結果、４−メチルモルホリンＮ−オキシドを用いた結果（比較例４）、２−ヨードベンゼンスルホン酸を用いた結果（比較例５）、オルトバナジン酸ナトリウムを用いた結果（比較例６）又は塩化銅（比較例７）を用いた結果においては、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが確認された。
即ち、「１７族の元素の酸化物」（比較例３−ｂ）、「５族の金属の多価金属酸化物類」（比較例６）、「１１族の元素の化合物」（比較例７）を用いた場合、（ｉ）多価金属酸化物類を用いた場合とは異なる反応機構でｈｍＣの酸化が進む、又は（ｉｉ）ｈｍＣの酸化が完全には進まないこと等の理由により、酸化反応後のｈｍＣの構造が多価金属酸化物類を用いた場合と異なる為、酸化処理したＤＮＡであってもＰＣＲによる増幅が進み、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが確認されたと考えられた。
また、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（比較例４）又は２−ヨードベンゼンスルホン酸（比較例５）を用いた場合、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（比較例４）又は２−ヨードベンゼンスルホン酸（比較例５）の立体構造がかさ高い為、立体障害が生じ、ｈｍＣの酸化が完全には進まないことにより、酸化後のｈｍＣの構造が多価金属酸化物類を用いた場合と異なって、ＤＮＡを酸化処理したもののＰＣＲによる増幅が進み、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドが確認されたとも考えられた。
即ち、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、２−ヨードベンゼンスルホン酸、５族の金属の多価金属酸化物類又は１１族の元素の化合物を用いた場合には、ｈｍＣの検出ができないこと、言い換えれば、本発明に係る多価金属酸化物類以外の酸化剤を用いた場合には、ｈｍＣの検出ができないことが判った。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１０９】
［比較例８］  過酸化水素を用いた検討
ＤＮＡの酸化工程１−１及び１−２を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、オキソンの代わりに１本鎖ＤＮＡを含有する反応液註の最終体積濃度が１％又は０．１％となるように３０％  過酸化水素を使用し、ＤＮＡ酸化工程１−１及び１−２の温度条件を、
（イ）ＤＮＡ酸化工程１−１を３０℃、１−２を５０℃で行なう、又は
（ロ）ＤＮＡ酸化工程１−１及び１−２を氷上で行う
として実験を行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、下記表４に記す。【０１１０】
【表４】
2014103980.tif 000005
その結果、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、また、上記の温度条件の差、過酸化水素の濃度によらず、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドとして確認されなかった。
この原因は、過酸化水素の酸化力が強く、ＤＮＡが分解されたことによると考えられた。
即ち、本発明に係る過酸化物以外の過酸化物を用いた場合には、ｈｍＣの検出ができないことが判った。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１１１】
［比較例９］  １本鎖ＤＮＡを過酸化物とのみ接触させる検討
ＤＮＡの酸化工程１−１を行わず、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２本鎖ＤＮＡの１本鎖化において、実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを含む反応液１  ２６μＬの代わりに、実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを含む反応液１  ２５μＬを使用し、１Ｍ  ＮａＯＨを４μＬの代わりに１Ｍ  ＮａＯＨを２０μＬ使用して実験を行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、下記表５に記す。【０１１２】
【表５】
2014103980.tif 000006
【０１１３】
その結果、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドとして確認されなかった。
即ち、１本鎖ＤＮＡを本発明に係る多価金属酸化物類に接触させる工程を行わず、オキソンのみと接触させた場合、１本鎖ＤＮＡが分解されたと考えられる。
以上より、１本鎖ＤＮＡを本発明に係る過酸化物に接触させる前に若しくは接触させる際に、１本鎖ＤＮＡの本発明に係る多価金属酸化物類との接触が必要であることが判った。
また、比較例９の実験結果と実施例１を比較すると、１本鎖ＤＮＡとオキソンが接触する前に若しくは接触させる際に、タングステン酸ナトリウムが共存していると、タングステン酸ナトリウムがＤＮＡと相互作用し、１本鎖ＤＮＡがオキソンから直接酸化されることを防ぐことができるため、本発明の方法は可能になっていると推定された。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１１４】
［比較例１０］  １本鎖ＤＮＡを過酸化水素とのみ接触させる検討
ＤＮＡ酸化工程１−１を行わず、下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、ＤＮＡ酸化工程１−２を、３００ｍＭオキソン５０μＬの代わりに、１本鎖ＤＮＡを含有する反応液中の最終体積濃度が５％、１％、又は０．１％となるように３０％  過酸化水素を使用し、６０℃でインキュベートする代わりに、氷上でインキュベートを行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、下記表６に記す。【０１１５】
【表６】
2014103980.tif 000007
【０１１６】
その結果、全ての検討において、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドとして確認されなかった。
即ち、ＤＮＡ酸化工程１−１を行わずにＤＮＡ酸化工程１−２において、過酸化水素を酸化剤として用いた場合、過酸化水素の濃度に関わらず、ｈｍＣの検出ができないことが判った。言い換えれば本発明に係る過酸化物以外の過酸化物を用いた場合、ｈｍＣの検出ができないことが判った。
尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１１７】
［比較例１１］  １本鎖ＤＮＡを多価金属酸化物類とのみ接触させる検討
下記に記載の条件で行った以外は、実施例１と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、２本鎖ＤＮＡの１本鎖化において、実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを含む反応液１  ２６μＬの代わりに、実験例１により得られた２本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを含む反応液１  ２５μＬを使用し、１Ｍ  ＮａＯＨを４μＬの代わりに１Ｍ  ＮａＯＨを２０μＬ使用し、ＤＮＡ酸化工程１−２において、３００ｍＭ  オキソン  ５０μＬの代わりに蒸留水５０μＬ（大塚製薬（株）製）を使用して実験を行った。
実施例１の実験条件と異なる点を、下記表７に記す。【０１１８】
【表７】
2014103980.tif 000008
【０１１９】
その結果、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、ＰＣＲによる増幅が進まず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドは確認されなかった。
即ち、本発明の方法において、１本鎖ＤＮＡと本発明に係る過酸化物の接触が必要、言い換えれば、ＤＮＡの酸化工程１−２を行わないとｈｍＣの検出ができないことが判った。
尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１２０】
［比較例１２］  実施例６においてオキソンの代わりに過酸化水素を用いた検討
ＤＮＡ酸化工程を、下記に記載の条件で行った以外は、実施例６と同様の方法により、ｈｍＣの検出を行った。
即ち、ＤＮＡ酸化工程において、３００ｍＭ  オキソン  ５０μＬの代わりに、３０％  過酸化水素を反応液中の最終体積濃度が５％、１％、又は０．１％となる量を使用し、
（イ）１本鎖ＤＮＡを多価金属酸化物類及び過酸化水素に６０℃で４時間接触させる又は
（ロ）１本鎖ＤＮＡを多価金属酸化物類及び過酸化水素に氷上で４時間接触させる
として実験を行った。
実施例６の実験条件と異なる点を、下記表８に記す。【０１２１】
【表８】
2014103980.tif 000009
【０１２２】
その結果、ＤＮＡ中のｈｍＣの有無にかかわらず、電気泳動により目的の増幅物（１７７ｂｐ）のバンドとして確認されなかった。
これは、過酸化水素の酸化力が強い為、ＤＮＡが分解されたことによると考えられた。
即ち、本発明に係る多価金属酸化物類と過酸水素を同時に１本鎖ＤＮＡと接触させても、ＤＮＡ中のｈｍＣの検出はできないことが判った。
以上のことから、本発明に係る多価酸化物類と本発明に係る過酸化物の両方を使用しなければ、ｈｍＣを検出できないことが判る。尚、結果をその他の実施例及び比較例と併せて下記表９に示す。【０１２３】
上記の実施例及び比較例の結果を表９にまとめた。
本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物の２つのものを使用しなければｈｍＣを検出できないこと、また、本発明に係る多価金属酸化物類と本発明に係る過酸化物は、１本鎖ＤＮＡに２段階で接触させても、同時に接触させても本発明の方法を実施できることが判った。また、本発明の方法は、合成ＤＮＡのみならず天然由来のＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）に対しても用いることができた。
他方、本発明に係る多価金属酸化物類以外のものや本発明に係る過酸化物以外のものは、ｈｍＣの検出ができないこと、また、本発明に係る多価金属酸化物類及び本発明に係る過酸化物の何れか一方のみではｈｍＣを検出できないことが判った。【０１２４】
【表９】
2014103980.tif 000010
2014103980.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の方法によれば、簡便に且つ精度よくＤＮＡ中のｈｍＣを検出することができる。
【図１】
2014103980.tif 000012
【図２】
2014103980.tif 000013
【図３】
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【図４】
2014103980.tif 000015
【配列表】
2014103980000001.app
【国際調査報告】
2014103980.tif 000016
2014103980.tif 000017
2014103980.tif 000018
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