(57)【要約】  がんの新たな原因因子である融合体（融合タンパク質及びそれをコードする融合遺伝子）を解明し、この知見に基づき、新規の前記融合体、前記誘導体の検出方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び／又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物を提供する。  本発明の融合タンパク質は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又はＡＬＫ融合タンパク質である。本発明の検出方法では、被験者から得た試料中の、前記融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質。
【請求項２】
ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとの融合タンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、請求項３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記試料が、消化器由来試料である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記消化器が、消化管である、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記消化器が、下部消化管である、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記消化器が、大腸である、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１８】
ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
【請求項１９】
ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
【請求項２０】
ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
【請求項２１】
ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項２３】
ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
【請求項２４】
ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
【請求項２５】
前記他のタンパク質が、ＡＬＫタンパク質である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項２２に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項２２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
【請求項２７】
ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項２８】
配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
【請求項２９】
（１）請求項３に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療剤である、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
【請求項３２】
前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、請求項３に記載のポリペプチドである、請求項３１又は３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記がんが消化器がんである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記がんが消化管がんである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記がんが下部消化管がんである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記がんが大腸がんである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
被験者から得た消化器由来試料中の、ＡＬＫ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
【請求項３９】
前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質の切断、又は、ＡＬＫタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項３８に記載の検出方法。
【請求項４０】
前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項３８に記載の検出方法。
【請求項４１】
前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項４２】
前記消化器が、消化管である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項４３】
前記消化器が、下部消化管である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項４４】
前記消化器が、大腸である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項４５】
ＡＬＫ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
【請求項４６】
ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
【請求項４７】
ＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
【請求項４８】
ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体、及び、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
【請求項４９】
ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
【請求項５０】
前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療剤である、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項５１】
ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
【請求項５２】
前記ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ＡＬＫ融合タンパク質が、請求項３に記載のポリペプチドである、請求項５１又は５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記がんが消化器がんである、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記がんが消化管がんである、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記がんが下部消化管がんである、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記がんが大腸がんである、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＬＫキナーゼ領域を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、ＺＳＣＡＮ９の少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体転座又は逆位等の結果、本来は別々の遺伝子が融合して融合遺伝子が作られる。これまで慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合体や、肺がんにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体、肺がんを含む種々のがんにおけるＲＯＳ１融合体のように、キナーゼ遺伝子の一部を構成要素に含む融合遺伝子はしばしば発がんに本質的な役割を担い、その機能を抑制する薬剤は極めて有効な抗がん剤となることが知られている（非特許文献１、特許文献１及び特許文献２）。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。【０００３】
ＡＬＫ（anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase）は、受容体型チロシンキナーゼであり、インスリン受容体スーパーファミリーに属し、細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有する（非特許文献２）。ＡＬＫは上記ＥＭＬ４のみならず、種々の遺伝子と融合遺伝子を構成することが知られており、これらの融合遺伝子も、がんの原因遺伝子であることが示されている（非特許文献３、４）。
ＺＳＣＡＮ９（zinc finger and SCAN domain containing 9、ＺＮＦ１９３（zinc finger protein 193）ともいう。）は、krueppel C2H2-type zinc-finger タンパクファミリーに属し、５つのC2H2-type zinc fingerドメインと、１つのSCAN box domainを有する細胞内タンパクである（非特許文献５）。当該遺伝子が融合遺伝子を構成することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３０３３０３号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１６２２９５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lugo TG et al., Science. 1990 Mar 2;247(4946):1079-1082
【非特許文献２】Iwahara T et al. , Oncogene. 1997 Jan 30;14(4):439-449
【非特許文献３】Takeuchi K et al., Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-381
【非特許文献４】Takeuchi K et al., Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3143-3149
【非特許文献５】Lee PL et al., Genomics. 1997 Jul 15;43(2):191-201
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、がんの新たな原因因子である融合体（融合タンパク質及び融合遺伝子）を解明したことに基づき、融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法、当該検出方法を用いたがんの診断方法、がん治療用医薬組成物の適用対象者の判定方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び／又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物及び前記がん治療用医薬組成物を投与するがん治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、大腸がん患者から得た検体から、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の一部と、キナーゼであるＡＬＫ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１〜３）、当該融合遺伝子が大腸がん患者検体に存在することを見出した（実施例４〜７）。
本発明者は、これらの知見から、ＡＬＫ融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し（実施例４〜７）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＡＬＫ阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＡＬＫ阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し（実施例４〜７）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。【０００８】
本発明は、以下の発明に関する：
［１］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質。
［２］ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとの融合タンパク質。
［３］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［１］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［６］［５］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［７］被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［８］前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［７］に記載の検出方法。
［９］前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［７］に記載の検出方法。
［１０］前記融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１１］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［１２］前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［７］〜［１１］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１３］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［７］〜［１２］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１４］前記試料が、消化器由来試料である、［７］〜［１３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１５］前記消化器が、消化管由来試料である、［１４］に記載の検出方法。
［１６］前記消化器が、下部消化管である、［１４］に記載の検出方法。
［１７］前記消化器が、大腸である、［１４］に記載の検出方法。
［１８］ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［１９］ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［２０］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［２１］ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［２２］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［２３］ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
［２４］ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
［２５］前記他のタンパク質が、ＡＬＫタンパク質である、［２４］に記載のキット。
［２６］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［２２］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［２２］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［２７］ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［２８］配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［２９］（１）［３］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［３０］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療剤である、［２９］に記載のスクリーニング方法。
［３１］前記がんが消化器がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３２］前記がんが消化管がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３３］前記がんが下部消化管がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３４］前記がんが大腸がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３５］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［３６］前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［３５］に記載の医薬組成物。
［３７］前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、［３］に記載のポリペプチドである、［３５］又は［３６］に記載の医薬組成物。
［３８］前記がんが消化器がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３９］前記がんが消化管がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４０］前記がんが下部消化管がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４１］前記がんが大腸がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４２］ＡＬＫ融合タンパク質。
［４３］ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとの融合タンパク質。
［４４］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［４２］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［４５］［４２］〜［４４］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［４６］［４５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４７］［４６］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［４８］被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［４９］前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質の切断、又は、ＡＬＫタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５０］前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５１］前記融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質である、［４８］〜［５０］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５２］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、４８〜５１のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５３］前記ＡＬＫ融合遺伝子が、［４４］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［４８］〜［５２］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５４］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［４８］〜［５３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５５］前記試料が消化器である、［４８］〜［５４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５６］前記消化器が、消化管である、［５５］に記載の検出方法。
［５７］前記消化器が、下部消化管である、［５５］に記載の検出方法。
［５８］前記消化器が、大腸である、［５５］に記載の検出方法。
［５９］ＡＬＫ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６０］ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６１］ＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６２］ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６３］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［６４］ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体、及び、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
［６５］ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
［６６］前記他のタンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質である、［６５］に記載のキット。
［６７］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［６３］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［６３］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［６８］ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６９］配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［７０］（１）［４４］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［７１］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療剤である、［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７２］前記がんが消化器がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７３］前記がんが消化管がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７４］前記がんが下部消化管がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７５］前記がんが大腸がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７６］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［７７］前記ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［７６］に記載の医薬組成物。
［７８］前記ＡＬＫ融合タンパク質が、［４４］に記載のポリペプチドである、［７６］又は［７７］に記載の医薬組成物。
［７９］前記がんが消化器がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８０］前記がんが消化管がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８１］前記がんが下部消化管がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８２］前記がんが大腸がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８３］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療方法。
［８４］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
［８５］前記ポリペプチドを発現している細胞が、［６］に記載の形質転換細胞である、［２９］〜［３４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８６］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療方法。
［８７］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＡＬＫ融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
［８８］前記ポリペプチドを発現している細胞が、［４７］に記載の形質転換細胞である、［７０］〜［７５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法は、ＡＬＫ融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＡＬＫ融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＡＬＫ阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
本発明の検出方法は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＺＳＣＡＮ９阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１）を導入し、１１日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図２】３Ｔ３繊維芽細胞に遺伝子導入試薬のみを処理し、１１日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図３】融合遺伝子ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１０日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図４】遺伝子導入試薬のみの処理をおこなった３Ｔ３繊維芽細胞を、ヌードマウスの皮下に接種した後、１０日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図５】図３及び図４に示すヌードマウスにおける、接種後６乃至１７日後の腫瘍サイズの経時的変化を示すグラフである。
【図６】ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞における各ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ、ＣＨ５４２４８０２、ＴＡＥ６８４、ＡＳＰ３０２６）に対する感受性を示すグラフである。
【図７】ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞を各ＡＬＫ阻害剤で処理した後、各培養細胞由来の抽出物のウェスタンブロッティングを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪定義等≫
＜融合点＞
本明細書における「ＡＬＫ融合遺伝子における融合点」とは、ＡＬＫ融合遺伝子におけるＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、塩基配列の第５６８番塩基と第５６９番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＡＬＫ融合タンパク質における融合点」とは、ＡＬＫ融合タンパク質における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
【００１２】
本明細書における「ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における融合点」とは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子におけるＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、塩基配列の第５６８番塩基と第５６９番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における融合点」とは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
【００１３】
＜ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＡＬＫ遺伝子の切断」又は「ＡＬＫ遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＡＬＫ遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＡＬＫ遺伝子がＡＬＫキナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも２つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、ＡＬＫ遺伝子の切断点（break point）は、ＡＬＫ遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がＡＬＫキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
【００１４】
また、本明細書において、「ＡＬＫタンパク質の切断」又は「ＡＬＫタンパク質が切断されている」とは、ＡＬＫ遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＡＬＫタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＡＬＫタンパク質がＡＬＫキナーゼ領域を含むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドと、の少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＡＬＫタンパク質の切断点は、ＡＬＫタンパク質が切断されてできたポリペプチドの少なくとも一つがＡＬＫキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
【００１５】
＜ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＺＳＣＡＮ９遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。なお、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断点（break point）は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築する他の遺伝子によってコードされるＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の腫瘍形成能を保持する範囲で限定されない。
また、「ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
【００１６】
また、本明細書において、「ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９タンパク質が切断されている」とは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９タンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断点は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築する他のタンパク質の、融合タンパク質の腫瘍形成能を有するために必要な機能（例えば、当該他のタンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
【００１７】
＜５’末端側領域／３’末端側領域、Ｎ末端側領域／Ｃ末端側領域＞
５’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より５’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より５’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、５’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、５’末端側ゲノム領域ともいう。
３’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より３’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より３’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、３’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、３’末端側ゲノム領域ともいう。
Ｎ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＮ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＮ末端側のポリヌクレオチドを示す。
Ｃ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＣ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＣ末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、５’末端側領域は、第１番〜第５６８番、３’末端側領域は、第５６９番〜２２５９番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、Ｎ末端側領域は、前記５’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、Ｃ末端側領域は、前記３’末端側領域にコードされるポリペプチドである。
【００１８】
＜リファレンス配列＞
また、本明細書において、各由来遺伝子のｃＤＮＡリファレンス配列として、ＺＳＣＡＮ９はENST 00000252207、ＡＬＫはENST 00000389048を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ＺＳＣＡＮ９はENSP00000252207、ＡＬＫはENSP00000373700、を用いた。
【００１９】
＜ストリンジェントな条件＞
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００２０】
＜腫瘍形成能＞
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後述の実施例８の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。
【００２１】
《本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換細胞》
＜本発明のポリペプチド（１）＞
本発明のポリペプチドは、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド（「ＡＬＫ融合タンパク質」ともいう）であって、前記ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドは、ＡＬＫタンパク質における少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含み、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ＡＬＫキナーゼドメインを含むＡＬＫタンパク質の一部と融合することにより、ＡＬＫキナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたＡＬＫ融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ＡＬＫ融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質（以下、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。
【００２２】
＜本発明のポリペプチド（２）＞
本発明のポリペプチドは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド（「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質」ともいう）であって、前記ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、当該他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と融合することにより、当該他のタンパク質の有する機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、キナーゼドメインを有するタンパク質である融合タンパク質が好ましく、ＡＬＫタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、前記他のタンパク質がＡＬＫタンパク質である場合、少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質（以下、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。
【００２３】
本発明のポリペプチドの好適態様である「ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質」としては、下記（ａ）〜（ｄ）に記載のポリペプチドが特に好ましい：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）。
【００２４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１で表される塩基配列は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン３までとＡＬＫ遺伝子のエクソン２０からエクソン２９の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１で表される塩基配列の内、塩基番号１〜５６８の配列はＺＳＣＡＮ９遺伝子に由来し、塩基番号５６９〜２２５９の配列はＡＬＫ遺伝子に由来する。以下、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０と称する。
【００２５】
「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個である。
【００２６】
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００２７】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００２８】
＜本発明のポリヌクレオチド（１）＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（すなわち、ＡＬＫ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（「ＡＬＫ融合遺伝子」ともいう）である限り、特に限定されるものではない。なお、「ＡＬＫ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＡＬＫ融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＡＬＫ融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。
【００２９】
＜本発明のポリヌクレオチド（２）＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（すなわち、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（「ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子」ともいう）である限り、特に限定されるものではない。なお、「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。
【００３０】
＜本発明のベクター＞
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
【００３１】
＜本発明の形質転換細胞＞
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。
【００３２】
≪本発明の検出方法に係る試料≫
＜対象臓器＞
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位（対象臓器）としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。
【００３３】
＜被験者からの採取物＞
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。
【００３４】
＜採取物の調製＞
本発明に係るＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＡＬＫ融合遺伝子の検出とは、ＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
【００３５】
本発明に係るＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出とは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
【００３６】
≪本発明の検出方法に係る検出対象≫
＜ＡＬＫ融合体：ＡＬＫ融合遺伝子とＡＬＫ融合タンパク質＞
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合体の検出方法、すなわち、ＡＬＫキナーゼ領域を含む融合タンパク質（ＡＬＫ融合タンパク質）の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（ＡＬＫ融合遺伝子）の検出方法が含まれる。
＜ＺＳＣＡＮ９融合体：ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子とＺＳＣＡＮ９融合タンパク質＞
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９融合体の検出方法、すなわち、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子）の検出方法が含まれる。
【００３７】
≪本発明の検出方法の態様（融合タンパク質及び融合遺伝子の検出方法）≫
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、ＡＬＫ遺伝子の切断、又は、ＡＬＫ遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、ＡＬＫ遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
【００３８】
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
【００３９】
＜ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
ここで、正常試料（がんに罹患していない組織由来試料）には、ＡＬＫ融合体のみならずＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質も存在しないので、ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質自体の存在を検出することによってＡＬＫ融合体を検出することもできる。
【００４０】
〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されているとき、ＡＬＫ遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＡＬＫ遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出してもよい。
【００４１】
〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＡＬＫ遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出してもよい。
【００４２】
〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＡＬＫ融合体の形成過程において、ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＡＬＫ遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されている場合、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
【００４３】
〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合遺伝子における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９の場合、すなわちＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子である場合、第１のプローブはＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
【００４４】
〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合遺伝子における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
【００４５】
＜ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＡＬＫタンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されているとき、ＡＬＫ遺伝子にコードされるＡＬＫタンパク質も切断されることに基づき、ＡＬＫタンパク質が切断されている状態、すなわち、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。
【００４７】
〈ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＡＬＫタンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＡＬＫタンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構築しているＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。
【００４８】
〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質が、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合タンパク質における、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
【００４９】
〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質が、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合タンパク質における、前記融合点を含むＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
【００５０】
〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質の活性を指標にＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型ＡＬＫタンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型ＡＬＫタンパク質の活性を阻害した上で、ＡＬＫタンパク質のキナーゼ活性を測定し、ＡＬＫ融合タンパク質を含まない（野生型ＡＬＫタンパク質のみを含む）場合に比較して、活性が高いことを指標にＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。なお、ＡＬＫタンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＡＬＫによりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
【００５１】
なお、ＡＬＫ融合タンパク質の検出は、ＡＬＫ融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＡＬＫ融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
【００５２】
＜ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
【００５３】
〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されているとき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出してもよい。
【００５４】
〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出してもよい。
【００５５】
〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合体の形成過程において、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されている場合、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
【００５６】
〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子が、ＡＬＫの場合、すなわちＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子である場合、第１のプローブはＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
【００５７】
〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
【００５８】
＜ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＺＳＣＡＮ９タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されているとき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子にコードされるＺＳＣＡＮ９タンパク質も切断されることに基づき、ＺＳＣＡＮ９タンパク質が切断されている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。
【００６０】
〈ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築しているＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。
【００６１】
〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
【００６２】
〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、前記融合点を含むＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
【００６３】
〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性を指標にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共に融合タンパク質を構築するＺＳＣＡＮ９以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を含まない（野生型ＺＳＣＡＮ９タンパク質のみを含む）場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくはＡＬＫタンパク質）である場合、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
【００６４】
なお、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
【００６５】
≪検出方法に用いる技法≫
以下、ＡＬＫ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＡＬＫ融合タンパク質の検出、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。
【００６６】
＜融合遺伝子の検出＞
ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出は、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡの検出、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又はＺＳＣＡＮ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）を検出する技法としては、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（核酸プローブ等）を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、ＰＣＲ、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮＡプロテクション法、ＤＮＡシーケンス、ＲＮＡシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。
【００６７】
〔ゲノムＤＮＡの検出〕
ゲノムＤＮＡの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のＦＩＳＨ法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたフュージョンアッセイ（fusion assay）で実施することができる。好適には、実施例４又は５に記載のＦＩＳＨ法スプリットアッセイ、又は、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイで検出することができる。
【００６８】
あるいは、ゲノムＤＮＡの検出には、ＤＮＡシーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、従来のサンガー法に基づくシーケンサーを使用してもよいが、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
以下に、ゲノムＤＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉
ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例６で詳細に説明するように、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が孤在性に検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子の存在を検出している。
【００７０】
また、ＺＳＣＡＮ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例６で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＺＳＣＡＮ９遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が孤在性に検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の存在を検出している。
【００７１】
ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例６に示すように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせ、あるいは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することにより、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
【００７２】
〈ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ〉
ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。
【００７３】
また、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＺＳＣＡＮ９遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。
【００７４】
〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイとフュージョンアッセイの組み合わせ〉
上記、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイは、同一の病理切片に対して同時におこなうこともできる。
例えば、ＡＬＫ融合遺伝子またはＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例７で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識（例えば青色）したものと、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素（例えば赤色）で標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであってさらに別の蛍光色素（例えば緑色）で標識したものと、の組み合わせを使用することができる。すなわち、異なる３色の蛍光色素（例えば、青色、赤色、緑色）でそれぞれのプローブを標識して用いる。
【００７５】
正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域が連続（近接）しているため、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域と３’末端側ゲノム領域を標識したそれぞれ異なる蛍光標識の蛍光が重なったシグナル（例えば、赤色と緑色が重なった黄色）が検出され、かつ、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば青色）が、孤在性に検出される。
【００７６】
一方、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子が構成されている場合、遺伝子転座、欠失又は逆位等により、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域が、本来の位置から失われ、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域が連続（挿入塩基を間に含んで連続する場合もある）して、融合点を形成することになる。このため、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光とが重なったシグナル（例えば、青色と緑色が重なった青緑色）のみが、当該融合遺伝子構成部位において検出され、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば赤色）は、当該融合遺伝子構成部位においては検出されなくなる。
【００７７】
なお、このとき、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば赤色）は、孤在性に検出されるか、または、どこにも検出されないことになる。
フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを同一の病理切片に対して同時におこなう本ＦＩＳＨアッセイは、両手法の結果を一つの病理切片上で得られるため、効率性、および、判定の信頼性向上の観点から好適である。
【００７８】
一方、異なる蛍光色素で標識された２つのプローブを用い、前述の〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉と〈ＦＩＳＨフュージョンアッセイ〉によって、融合遺伝子を構築する２つの遺伝子の切断と融合をそれぞれ検出する場合、複数の病理切片が必要になる。
特に、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が染色体上の近い距離に位置する場合、フュージョンアッセイだけを行った場合では、遺伝子転座又は逆位等が起きていないにも関わらず、融合遺伝子を構成する一つの遺伝子の５’末端側領域と、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側領域が近い場合に、見る角度等によっては、近接したシグナル（例えば青緑色）が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側のシグナル（例えば赤色）が、融合遺伝子構成部位に、近接して検出されないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避することができるため、好ましい。
【００７９】
なお、融合遺伝子が構成された時に孤在性を示すシグナル（例えば赤色）のプローブは、例えば、融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ遺伝子の場合、ＡＬＫ遺伝子の５’末端領域に限らず、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域と、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域との間のゲノム領域内にハイブリダイズするよう設計すれば、同様の効果を得ることができる。
【００８０】
また、例えばＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、それぞれの構成遺伝子の５’末端側ゲノム領域および３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって、すべて異なる蛍光色素で標識された４種のプローブを同時に用いれば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子それぞれの切断、および、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域との融合を一つの病理切片上で検出することができる。
【００８１】
〈検出に用いるプローブ（ゲノム用）〉
ＡＬＫ融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００８２】
例えば、融合点を含むＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＡＬＫ融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
【００８３】
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００８４】
例えば、融合点を含むＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
【００８５】
例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のいずれか一方の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、残る一方の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例５で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。
【００８６】
一方、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＡＬＫ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ、あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例６で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。
【００８７】
〔ｍＲＮＡの検出〕
ｍＲＮＡの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりｍＲＮＡ自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりｍＲＮＡを鋳型として合成した、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を解析することにより行ってもよい。
上記ＲＮＡの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
【００８８】
〈遺伝子増幅反応方法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子又はＡＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、ｍＲＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
==ＰＣＲ法==
例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が存在していたことになる。このように、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００９０】
ＰＣＲ法は、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を定量的に検出することに適している。
従って、前述の<ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
【００９１】
なお、ＰＣＲ法、及び、これに用いるプライマー設計法は、公知の方法に従って当業者が行うことができる。
例えば、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
【００９２】
==リアルタイムＰＣＲ法==
更には、ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００９３】
より具体的には、例えばＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＡＬＫ融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＡＬＫ遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＡＬＫ遺伝子由来の任意の部分から設計する。
【００９４】
==マルチプレックスＰＣＲ==
ＡＬＫ融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＡＬＫ遺伝子と融合してＡＬＫ融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と融合してＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
【００９５】
==質量分析による検出==
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。
【００９６】
==検出に用いるプライマーセット==
本発明のＡＬＫ融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００９７】
〈ハイブリダイゼーション法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などが挙げられる。
【００９８】
==プローブ（ｍＲＮＡ用）==
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００９９】
＜融合タンパク質の検出＞
被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。
【０１００】
例えば、ＡＬＫ融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＡＬＫタンパク質、又は、ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構築するＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＡＬＫ融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
【０１０１】
例えば、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＺＳＣＡＮ９タンパク質、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築するＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
〔検出に用いる代表的な手法〕
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。
【０１０３】
〈免疫組織化学法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体及びＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
【０１０４】
〈ウェスタンブロッティング法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体及びＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗ＡＬＫ抗体と抗ＺＳＣＡＮ９抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗ＡＬＫ抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型ＡＬＫタンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗ＡＬＫ抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用い、抗ＡＬＫ抗体を用いた場合と同じ原理で、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。
【０１０５】
〈免疫沈降法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体又はＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＡＬＫと異なる質量の抗ＡＬＫ抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＺＳＣＡＮ９と異なる質量の抗ＺＳＣＡＮ９抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
【０１０６】
〔検出に用いる抗体〕
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。
【０１０７】
＜標識手法＞
上記遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、ＢＡＣクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、Roche Applied Science社製）を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。
【０１０８】
〔ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法〕
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である（Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149）。
【０１０９】
〔蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）〕
２つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、ＦＲＥＴ現象を利用したプローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質（ＣＦＰ等）で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質（ＹＦＰ等）で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、ＦＲＥＴ現象により、ＹＦＰが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、２つの抗体が近接していることを検出することができる。
【０１１０】
≪ＡＬＫ阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＡＬＫ融合遺伝子又は検出対象のＡＬＫ融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＡＬＫ融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＡＬＫ阻害物質による治療の適用対象となる。
【０１１１】
≪ＺＳＣＡＮ９阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又は検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＺＳＣＡＮ９阻害物質による治療の適用対象となる。
【０１１２】
≪検出用キット≫
本発明の検出用キットには、検出対象のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットが含まれる
本発明の検出対象のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ又はＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
また、本発明の検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。
【０１１３】
＜プローブ＞
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
【０１１４】
プローブとして、前述の≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプローブが例示できる。
例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、又は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、のいずれかのみを含んでも、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、及び、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブを含んでもよい。
【０１１５】
＜プライマーセット＞
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプライマーセットが例示できる。
【０１１６】
本発明のプライマーセットには、好ましくは、
（１）ＺＳＣＡＮ９をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット、が含まれる。
【０１１７】
また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）及び／又は（３）のプライマーセットが含まれる。
【０１１８】
（２）配列番号１（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０）の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号４）及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号５）のプライマーセット。
【０１１９】
（３）配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号４）及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号５）のプライマーセット。
【０１２０】
なお、配列番号１２で表されるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０）で表される融合遺伝子の塩基配列について、さらにその非翻訳領域（untranslated region;UTR）をも含む塩基配列である。
【０１２１】
これらのプライマーセット（１）〜（３）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【０１２２】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【０１２３】
＜抗体＞
本発明のＡＬＫ融合タンパク質の検出用キットには、ＡＬＫ融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットには、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
例えば、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、のいずれかのみを含んでも、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する１種類以上の抗体を含んでもよい。
【０１２４】
≪阻害物質のスクリーニング方法≫
＜ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程＞
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
（１）検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。
【０１２５】
本明細書において、「ポリペプチドの阻害」には、ポリペプチドの活性の阻害と、ポリペプチドの発現の阻害とが含まれる。また、「阻害」は、少なくとも一部の阻害を意味する。
【０１２６】
＜阻害物質スクリーニング工程とその指標＞
本発明のスクリーニング方法には、
（Ａ）精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｂ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｃ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。
【０１２７】
〔（Ａ）精製又は粗製ポリペプチドを用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ａ）には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかったポリペプチド）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
【０１２８】
〔（Ｂ）ポリペプチド発現細胞を用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｂ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
【０１２９】
〔（Ｃ）ポリペプチド発現細胞を用い、発現阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｃ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法を用いることができ、ｍＲＮＡ量の測定には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法を用いることができる。
【０１３０】
ここで、ＡＬＫ融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＡＬＫ融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
【０１３１】
前記確認工程は、公知の評価系を用いて実施することができ、例えば、培養細胞を用いるインビトロ評価系、腫瘍細胞を移植した担がんモデル動物を用いる評価系などを挙げることができる。
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition（2012）、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。具体的には、例えば、本発明のＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子であるｃＤＮＡを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞（形質転換細胞）を得ることができる。
【０１３２】
≪阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物≫
本発明の、ＡＬＫ融合体陽性のがん（例えば、消化器がん）の治療用医薬組成物は、ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
【０１３３】
＜ＡＬＫ融合遺伝子又は転写産物、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又は転写産物に対する阻害物質＞
ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＡＬＫ阻害物質、又は、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はその転写物質、あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子の少なくともいずれか一方に対する阻害物質を挙げることができる。例えば、前記もう一方の遺伝子がＡＬＫ遺伝子の場合、阻害物質としてキナーゼ阻害剤を例示できる。
【０１３４】
〔低分子化合物〕
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879（CAS148741-30-4）、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。
【０１３５】
また、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、例えば、クリゾチニブ（crizotinib、Pfizer Inc、製品名「Ｘａｌｋｏｒｉ」）、ＣＨ５４２４８０２（Chugai Pharmaceutical Co Ltd）、ＴＡＥ６８４（Novartis AG）、ＡＳＰ３０２６（Astellas Pharma Inc）、 ＬＤＫ−３７８（Novartis AG）、ＴＳＲ−０１１（Amgen Inc、TESARO Inc）、ＡＰ−２６１１３（ARIAD Pharmaceuticals Inc）、Ｘ−３７６／３９６（Xcovery Inc）、４ＳＣ−２０３（4SC AG; ProQinase GmbH）、ＮＭＳ−Ｅ６２８（Nerviano Medical Sciences Srl）、ＡＺＤ−３４６３（AstraZeneca plc）、ＣＥＰ−２８１２２（Cephalon Inc）、ＣＥＰ−３７４４０（Cephalon Inc）、ＫＲＡ−０００８（Korea Research Institute of Chemical Technology）を挙げることができる。
【０１３６】
〔二重鎖核酸〕
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅIIIエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Genes Dev. 15, 485-490, 2001）。３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
【０１３７】
二重鎖核酸の３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、ＡＬＫ融合遺伝子に対する阻害作用又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子に対する阻害作用を有するものであれば、特に限定されない。例えば、二重鎖部分が融合点を含むポリヌクレオチドの塩基配列、例えば、配列番号１の第５６８番〜第５６９番を含む塩基配列に基づいて設計することができる。あるいは、二重鎖部分が、キナーゼ部分をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。本発明の二重鎖核酸は、常法（例えば、J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; 及びMethods, 23, 206-217, 2001）により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社（例えば、ＲＮＡｉ社）は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。また、ｓｉＲＮＡ配列設計システム（商用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）、ＲＮＡｉ社）により、二重鎖核酸を設計することができる。
【０１３９】
〔タンパク質・抗体〕
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、ＡＬＫ融合遺伝子の転写産物又はＺＳＣＡＮ９遺伝子の転写産物、好ましくは、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。
【実施例】
【０１４０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【０１４１】
［実施例１］臨床検体でのＡＬＫ遺伝子異常のＦＩＳＨ法による検出
目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。ＦＩＳＨ法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ（split assay）と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド（TexasRed）（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は１つの黄色のシグナル（緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。【０１４２】
臨床検体でのＡＬＫ遺伝子異常をＦＩＳＨ法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、２０％ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された大腸がん組織を４μｍの厚さで切り、スライドガラス上に乗せ病理切片を作製した。ＦＩＳＨ法は文献（Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.）の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理し、続いて、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）クローン（クローン番号  RP11-984121、RP11-62B19）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-701P18）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。約１５００例の病理検体での検討から２例のＡＬＫ遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する検体（結腸がん患者由来）を見出した。【０１４３】
［実施例２］臨床検体でのＡＬＫ融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
ＦＩＳＨ法解析によりＡＬＫゲノム構造異常が示唆された組織由来のＲＮＡをテンプレートに、インバースＲＴ−ＰＣＲ法により、ＡＬＫ遺伝子キナーゼ領域の５’側に存在する遺伝子を調べた。
まず、逆転写及び二本鎖ｃＤＮＡ合成は、臨床検体由来のＲＮＡ０．５μｇと、ＡＬＫ遺伝子キナーゼコード領域に設計した逆転写プライマーＡＬＫＲＥＶｅｘ２２−２３（配列番号３）とを用いて、cDNA Synthesis System（Roche）により行った。合成した二本鎖ｃＤＮＡを High Pure PCR Product Purification Kit（Roche）により精製した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（TaKaRa）を用いて自己環状化（self-ligation）した。環状化ＤＮＡを鋳型として、第１回ＰＣＲ（フォワードプライマーＡＬＫＦＷＤｅｘ２０−２１（配列番号４）とリバースプライマーＡＬＫＲＥＶ３（配列番号５）との組合せ）と、第２回ＰＣＲ（フォワードプライマーＡＬＫＦＷＤｅｘ２１−２２（配列番号６）とリバースプライマーＡＬＫＲＥＶ４（配列番号７）との組合せ）とを行った後、得られたＰＣＲ産物を用いてダイレクトシークエンスを行った。本実施例及び以下の実施例で使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。
その結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の一部がＡＬＫ遺伝子キナーゼ領域の５’側に融合していることが明らかとなった。【０１４４】
【表１】
2015064620.tif 000002
【０１４５】
［実施例３］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離
ＦＩＳＨ法解析によりＡＬＫゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（PrimeStar HS DNAポリメラーゼ）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にクローニングした。プライマーセットとしては、フォワードプライマーＺＳＣＡＮ９−ＨｉｎｄIII（配列番号８）とリバースプライマーＡＬＫ−ＥｃｏＲＩ（配列番号９）との組合せを用いた。
得られた増幅産物の配列を確認した結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン３までと、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０からエクソン２９の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０；配列番号１）が取得できた。【０１４６】
なお、ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０がコードするアミノ酸配列（配列番号２）に関して、ＡＬＫ−００１の登録アミノ酸配列（Ensemble database, Protein ID: ENSP00000373700）との比較により、Ｉ５９３Ｖ、Ｋ６２３Ｒ、Ｄ６６１Ｅの３箇所のアミノ酸置換が認められた。なお、前記アミノ酸置換において、最初のアミノ酸（例：Ｉ５９３Ｖにおける「Ｉ」）は登録アミノ酸配列におけるアミノ酸を、その後のアミノ酸番号（例：Ｉ５９３Ｖにおける「５９３」）は配列番号２におけるアミノ酸番号を、最後のアミノ酸（例：Ｉ５９３Ｖにおける「Ｖ」）は配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸を、それぞれ、意味する。
なお、上記アミノ酸置換について、ＡＬＫ−００１の登録アミノ酸配列（Ensemble database, Protein ID: ENSP00000373700）における相当箇所のアミノ酸番号で示した場合、前記Ｉ５９３Ｖ、Ｋ６２３Ｒ、Ｄ６６１Ｅは、それぞれ、Ｉ１４６１Ｖ、Ｋ１４９１Ｒ、Ｄ１５２９Ｅ、と表すこともできる。これらのアミノ酸置換は、それぞれ一塩基多型（rs1670283、rs1881420、rs1881421）として報告されている。【０１４７】
［実施例４］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出
表１に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するＲＴ−ＰＣＲで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子ｃＤＮＡががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、ＺＳＣＡＮ９遺伝子上に設計したフォワードプライマーＺＳＣＡＮ９−３９４Ｆ（配列番号１０）とＡＬＫ遺伝子上に設計したリバースプライマーＡＬＫ３０７８ＲＲ（配列番号１１）とを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド（４９２ｂｐ）が観察され、臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。【０１４８】
［実施例５］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイによる検出
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイにて検出を行った。【０１４９】
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは染色体転座又は逆位等によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は赤と緑はそれぞれのシグナル（赤色と緑色のシグナルが離れて存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きることにより２つの遺伝子領域が近接している場合は、赤色と緑色のシグナルが重なり黄色として検出される。
具体的には、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  CTD-2382I15）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-984I21, RP11-62B19）との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（黄）が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。【０１５０】
［実施例６］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイによる検出
実施例１に記載の方法にしたがい、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例１と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理した。【０１５１】
ＺＳＣＡＮ９を対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、赤（TexasRed）の蛍光標識したＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  CTD-2382I15）と、緑（FITC）の蛍光標識したＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号   RP5-874C20）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、５’側のシグナル（本実施例では赤）が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。【０１５２】
ＡＬＫを対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、赤（TexasRed）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-701P18）と、緑（FITC）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-984I21、RP11-62B19）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、３’側のシグナル（実施例では緑）が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。【０１５３】
［実施例７］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイの組み合わせによる検出
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを、同一の病理切片に対しておこなった。病理切片の作製は、実施例１と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理した。【０１５４】
具体的には、青（Aqua）の蛍光標識をした、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 CTD-2382I15）と、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-701P18）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-984I21、RP11-62B19）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（青緑）と、このシグナルから離れた孤在性のＡＬＫ遺伝子５’末端側のシグナル（赤）が観察され、融合遺伝子の生成を伴うゲノム構造異常が示された。よって、この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使用できる。【０１５５】
フュージョンアッセイだけでは、遺伝子転座等が起きていないにも関わらず、見る角度等によっては、近接したシグナルが観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を形成することになる２つの遺伝子領域間に存在する遺伝子領域を標識したシグナルが、近接したシグナルが観察される部位に近接していないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避できる点で、本手法は好適である。【０１５６】
［実施例８］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの腫瘍形成能の検討
本実施例では、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１））を発現ベクターｐＬｅｎｔｉ６（Invitrogen（登録商標）、Life Technologies社）に挿入して得られたｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを用いて、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫをマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し１１日間培養したところ、図１（ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現）に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ（図２））及び、ＬａｃＺを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞（図示せず）においては、形質転換フォーカスは認められなかった。すなわち、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り形質転換フォーカスが観察された。【０１５７】
ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞又は遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）をヌードマウスの皮下に１×１０６個ずつ接種したところ、１０日以降には融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を接種したマウスにおいて腫瘍形成が確認された（図３）。遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）を接種したマウスにおいては、腫瘍形成は確認されなかった（図４）。接種６日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図５に示す。この結果より、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドはがんの原因遺伝子であることが示された。【０１５８】
［実施例９］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞の各ＡＬＫ阻害剤に対する感受性の検討
マウスリンパ系細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、増殖因子であるＩＬ−３依存性細胞株であり、その増殖にＩＬ−３を必要とするが、がん化遺伝子（例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子）を導入することにより、ＩＬ−３を添加しなくても増殖できるようになることが知られている（Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.）。
本実施例では、親株Ｂａ/Ｆ３細胞及び実施例７で作製したｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞について、細胞数２０００の状態から、所定濃度の各ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ、ＣＨ５４２４８０２、ＴＡＥ６８４、ＡＳＰ３０２６）を添加し、７２時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、各ＡＬＫ阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Ｋａｔａｙａｍａらの文献（Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17）を参照することができる。【０１５９】
結果を図６に示す。コントロールである親株Ｂａ／Ｆ３細胞（ＩＬ−３濃度＝０．５ｎｇ／ｍＬ）では、各ＡＬＫ阻害剤の濃度が細胞毒性を示す過剰量を超えない場合（ＡＳＰ３０２６以外の阻害剤は約１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下、ＡＳＰ３０２６は約１０００ｎｍｏｌ／Ｌ以下）には、細胞増殖能に影響は認められなかった。一方、ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞（ＩＬ−３非添加）では、いずれのＡＬＫ阻害剤においても、濃度依存的に細胞増殖が顕著に抑制された。
この結果は、ＡＬＫ阻害剤が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。【０１６０】
［実施例１０］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞における各ＡＬＫ阻害剤によるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの自己リン酸化抑制の検討
実施例８で確認した、各ＡＬＫ阻害剤によるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、各ＡＬＫ阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
結果を図７に示す。抗体としては、抗リン酸化ＡＬＫ抗体（図７におけるｐＡＬＫ；ｐＹ１６０４）、抗ＡＬＫ抗体（図７のＡＬＫ）を使用した。ＡＬＫのポリペプチド量については、各ＡＬＫ阻害剤の処理の有無（及び処理濃度）に関してほとんど差異は認められなかった。一方、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのリン酸化は、各ＡＬＫ阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの自己リン酸化が抑制されることが確認された。【０１６１】
以上より、本発明において、一部の消化器がん患者においてＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子が存在し、その遺伝子ががんの原因となっていることが明らかとなった。即ち、ＡＬＫ阻害薬物治療の対象となるがん患者を、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子を検出することで、好ましくは、ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０を検出することで選別できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明の検出方法は、ＡＬＫ融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。【０１６３】
本発明の検出方法は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６４】
配列表の配列番号３〜１１の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。
【図１】
2015064620.tif 000003
【図２】
2015064620.tif 000004
【図３】
2015064620.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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