(57)【要約】  本発明は、以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法を提供する：１）十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること；２）増殖促進剤の濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること；および３）イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。  本方法は、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖期を、イソプレノイド化合物の生成期と分離することにより特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法：
１）十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること；
２）増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること；および
３）イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。
【請求項２】
イソプレノイド化合物生成微生物が、増殖促進剤逆依存性プロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
増殖促進剤が酸素である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
イソプレノイド化合物生成微生物が好気性微生物である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターが微好気誘導型プロモーターである、請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
微好気誘導型プロモーターが、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはα−アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
イソプレノイド化合物がモノテルペンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がモノテルペン生成微生物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
イソプレノイド化合物がリモネンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリモネン生成微生物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
イソプレノイド化合物がリナノールであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリナノール生成微生物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーであり、イソプレノイド化合物生成微生物がイソプレン生成微生物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法：
１’）イソプレノイド化合物生成微生物を含む液相、および気相を備える系における液相中に酸素を供給して、十分な濃度の溶存酸素の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること；
２’）液相中の溶存酸素濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を液相中で誘導すること；  
３’）イソプレン生成微生物を液相中で培養してイソプレノイド化合物を生成すること；および
４’）イソプレノイド化合物を回収すること。
【請求項１２】
上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
気相中の酸素濃度が液相中の溶存酸素濃度に依存して制御され、
液相中の溶存酸素濃度を減少させて、気相中でのイソプレン爆発を回避する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
２’）および３’）において、液相中の溶存酸素濃度が０．３４ｐｐｍ以下である、請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
誘導期のイソプレン生成速度が８０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下である、請求項１１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
増殖促進剤がリン化合物である、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターがリン欠乏型誘導プロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
リン欠乏誘導型プロモーターが、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはリン取り込み担体をコードする遺伝子のプロモーターである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
５０ｍｇ／Ｌ以下の総リン濃度の存在下でイソプレノイド生成微生物によるイソプレノイドの生成が誘導される、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
誘導期のイソプレノイド生成速度が６００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下である、請求項１１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
イソプレノイド化合物生成微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
イソプレノイド化合物生成微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
イソプレノイド化合物生成微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア属、エンテロバクター属またはエシェリヒア属に属する微生物である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア・アナナティス、エンテロバクター・アエロゲネスまたはエシェリヒア・コリである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）請求項１０〜２６のいずれか一項記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【請求項２８】
請求項１０〜２６のいずれか一項記載の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
【請求項２９】
請求項２８記載のポリマーを含むゴム組成物。
【請求項３０】
請求項２９記載のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレンモノマー等のイソプレノイド化合物の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤ及びゴム製造業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパームとの競合で農園拡大は容易でないことから天然ゴムの収量増加は見込みにくく、天然ゴムの需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがある。その原料は、イソプレンモノマー（本明細書中、単に「イソプレン」と呼ばれる）である。イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、主にナフサのクラッキング解により得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。【０００３】
このような要望に対して、イソプレン生産能を付与した微生物および誘導剤を用いてイソプレンを発酵法にて生産する方法が知られている（特許文献１）。
また、誘導剤の代わりに、光または温度等の環境因子を利用する方法が知られている。例えば、光を利用してイソプレンを生産する方法（非特許文献１）、および温度を利用して、目的タンパク質（例、インターフェロンγ、インスリン）を生産する方法が知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７６６７６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｉａ  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｓｕｎｇｓｏｏｎ  Ｐａｒｋ，Ａｎａｓｔａｓｉｏｓ  Ｍｅｌｉｓ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２（２０１０）：７０−７９
【非特許文献２】Ｎｏｒｍａ  Ａ  Ｖａｌｄｅｚ−Ｃｒｕｚ，Ｌｕｉｓ  Ｃａｓｐｅｔａ，Ｎeｓｔｏｒ  Ｏ  Ｐeｒｅｚ，Ｏｃｔａｖｉｏ  Ｔ  Ｒａｍiｒｅｚ，Ｍａｕｒｉｃｉｏ  Ａ  Ｔｒｕｊｉｌｌｏ−Ｒｏｌｄaｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１０，９：１８
【非特許文献３】ＴＬ  Ｓｉｖｙ，  Ｒ  Ｆａｌｌ，  ＴＮ  Ｒｏｓｅｎｓｔｉｅｌ，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｊａｎ  ２０１１；  ７５（１２）：  ２３７６−８３．
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉｎ  Ｖ，  Ｐｉｔｅｒａ  Ｄ，  Ｗｉｔｈｅｒｓ  Ｓ，  Ｎｅｗｍａｎ  Ｊ，  Ｋｅａｓｌｉｎｇ  Ｊ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２１，  ７９６−８０２，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１や非特許文献１−４に記載されるように、イソプレンを含むイソプレノイド化合物を微生物により生産する場合、メバロン酸（ＭＶＡ）経路やメチルエリスリトール（ＭＥＰ）経路が利用される。イソプレノイド化合物の生産量を向上させるためにＭＶＡ経路の代謝流量を増加させることにより、微生物の増殖が阻害され得る（非特許文献３，４）。微生物の増殖を回避するために、微生物の増殖期と物質の生成期を分ける方法が有効であり得る。発酵法による物質生産において、微生物の増殖と物質の生産を行う期間を分離する概念は知られたものである（発酵ハンドブック，財団法人バイオインダストリー協会、発酵と代謝研究会（編）、２００１年）。この概念を達成するためには、微生物の増殖期から物質の生成期への移行を行うための手段、及び、物質の生成期にて物質を生産し続けるための手段が要求される。イソプレン発酵においては、誘導剤を添加する事でイソプレンを生産する微生物を用いて、誘導剤非添加条件で増殖させ、充分の菌体量を確保した後に、誘導剤を添加し、イソプレンを生成させる例が知られている（特許文献１）。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）やテトラサイクリンなどが使用できる。ＩＰＴＧやテトラサイクリンが培養槽内に存在する場合に、微生物はイソプレンを製造する活性を持ち続けるが、やがて、ＩＰＴＧやテトラサイクリンが分解することにより微生物がイソプレンの生産能を保持できなくなる。そのため、継続的にＩＰＴＧやテトラサイクリンを添加しなくてはならない。しかし、これらの誘導剤は高価であり、イソプレンの製造費を上げる事から、誘導剤を添加しない製造プロセスの構築が望まれる。【０００７】
誘導剤を使用せずにイソプレン生成期へと移行する方法としては、強光下で転写活性が上昇するプロモーターを用いて、光の強度を上げる事によりイソプレン生産を誘導する手法が、藍藻などで報告されている（非特許文献１）。この方法を利用可能な微生物は、光応答型の代謝スイッチ機能を有する微生物や光合成が可能な微生物に限定される。【０００８】
イソプレンとは異なるが、誘導剤を使用しない物質生産の例としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉではインターフェロンγやインスリンなどのタンパク質を発酵法にて生産する際に、微生物の増殖期からタンパク質の生成期への移行を、培養温度を上昇させる（３０℃から４２℃）事で可能にしている（非特許文献２）。この方法はタンパク質生産に有効である一方、４２℃という培養温度はＥ．ｃｏｌｉの至適代謝速度を示す温度から乖離しており、グルコースなどの基質の消費速度を低下させる。本手法をイソプレン発酵に適用した場合、二つの培養温度条件を使用する発酵プロセスとなるため、菌体増殖、もしくは、イソプレン発酵を利用しようとする宿主の至適代謝速度から乖離した条件で培養することが要求される。その結果、発酵生産プロセス全体を見た場合、至適代謝速度を示す温度のみで培養を行う発酵生産プロセスと比較して、温度を上昇させる培養条件におけるイソプレン生産性は低下することが懸念される。【０００９】
このように、誘導剤を使用せずにイソプレンの生成期へ微生物を移行させる方法、及びその生成期にてイソプレンの生産活性を維持することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、先ず、増殖促進剤の十分な濃度下でイソプレノイド化合物生成微生物を増殖させ、次いで、増殖促進剤の濃度を減少させることにより、イソプレン等のイソプレノイド化合物を効率的に生成できることを見出した。本発明者らはまた、発酵微生物の酸素消費速度と発酵槽への酸素供給速度がほぼ等しい培養制御条件や培養液中に一定濃度以下のリン酸が存在する場合においてイソプレノイド化合物の生成を実現できる事などを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法：
１）十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること；
２）増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること；および
３）イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。
〔２〕イソプレノイド化合物生成微生物が、増殖促進剤逆依存性プロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力を有する、上記方法。
〔３〕増殖促進剤が酸素である、上記方法。
〔４〕イソプレノイド化合物生成微生物が好気性微生物である、上記方法。
〔５〕前記プロモーターが微好気誘導型プロモーターである、上記方法。
〔６〕微好気誘導型プロモーターが、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはα−アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターである、上記方法。
〔７〕イソプレノイド化合物がモノテルペンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がモノテルペン生成微生物である、上記方法。
〔８〕イソプレノイド化合物がリモネンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリモネン生成微生物である、上記方法。
〔９〕イソプレノイド化合物がリナノールであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリナノール生成微生物である、上記方法。
〔１０〕イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーであり、イソプレノイド化合物生成微生物がイソプレン生成微生物である、上記方法。
〔１１〕以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法：
１’）イソプレノイド化合物生成微生物を含む液相、および気相を備える系における液相中に酸素を供給して、十分な濃度の溶存酸素の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること；
２’）液相中の溶存酸素濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を液相中で誘導すること；  
３’）イソプレン生成微生物を液相中で培養してイソプレノイド化合物を生成すること；および
４’）イソプレノイド化合物を回収すること。
〔１２〕上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、上記方法。
〔１３〕気相中の酸素濃度が液相中の溶存酸素濃度に依存して制御され、
液相中の溶存酸素濃度を減少させて、気相中でのイソプレン爆発を回避する、上記方法。
〔１４〕２’）および３’）において、液相中の溶存酸素濃度が０．３４ｐｐｍ以下である、上記方法。
〔１５〕誘導期のイソプレン生成速度が８０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下である、上記方法。
〔１６〕増殖促進剤がリン化合物である、上記方法。
〔１７〕前記プロモーターがリン欠乏型誘導プロモーターである、上記方法。
〔１８〕リン欠乏誘導型プロモーターが、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはリン取り込み担体をコードする遺伝子のプロモーターである、上記方法。
〔１９〕５０ｍｇ／Ｌ以下の総リン濃度の存在下でイソプレノイド生成微生物によるイソプレノイドの生成が誘導される、上記方法。
〔２０〕誘導期のイソプレノイド生成速度が６００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下である、上記方法。
〔２１〕上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、上記方法。
〔２２〕イソプレノイド化合物生成微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記方法。
〔２３〕イソプレノイド化合物生成微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記方法。
〔２４〕イソプレノイド化合物生成微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、上記方法。
〔２５〕イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア属、エンテロバクター属またはエシェリヒア属に属する微生物である、上記方法。
〔２６〕イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア・アナナティス、エンテロバクター・アエロゲネスまたはエシェリヒア・コリである、上記方法。
〔２７〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）上記方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔２８〕上記方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
〔２９〕上記ポリマーを含むゴム組成物。
〔３０〕上記ゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高価な誘導剤を用いずに微生物の増殖期とイソプレノイド化合物の生成期とを分けてイソプレノイド化合物を安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）の培養における溶存酸素（ＤＯ）濃度の経時的測定を示す図である。
【図２】図２は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）の培養による、（Ａ）増殖、ならびに（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）を示す図である。
【図３】図３は、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）の培養における溶存酸素（ＤＯ）濃度の経時的測定を示す図である。
【図４】図４は、溶存酸素の各種濃度条件下における微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８／Ｐａｒａ）の培養による、（Ａ）増殖、ならびに（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）を示す図である。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを示す図である。
【図６】図６は、ｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳのマップを示す図である。
【図７】図７は、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳ染色体固定用プラスミドを示す図である。
【図８】図８は、（Ａ）ＰｌｌｄＤ、（Ｂ）ＰｐｈｏＣ、または（Ｃ）ＰｐｓｔＳの転写制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを示す図である。
【図９】図９は、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲベクターの構築の概要を示す図である。
【図１０】図１０は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ染色体固定用発現ベクターを示す図である。
【図１１】図１１は、化学合成により得られたＫＤｙＩオペロン中のコドン最適化を示す図である。
【図１２】図１２は、コドン最適化したＫＤｙＩオペロンを保持する、（Ａ）ｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体固定プラスミドを示す図である。
【図１３】図１３は、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドを示す図である。
【図１４】図１４は、（Ａ）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、（Ｂ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、および（Ｃ）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを示す図である。
【図１５】図１５は、（Ａ）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）、および（Ｂ）Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）のゲノム改変物のマップを示す図である。
【図１６】図１６は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｃ）ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体改変物のマップを示す図である。
【図１７】図１７は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ、および（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳの染色体改変物のマップを示す図である。
【図１８】図１８は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）の培養における総リン濃度の経時的測定を示す図である。
【図１９】図１９は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）の培養による、（Ａ）増殖、および（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）を示す図である。
【図２０】図２０は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）の培養における発酵ガス中のイソプレン濃度（ｐｐｍ）を示す図である。
【図２１】図２１は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養における溶存酸素（ＤＯ）濃度の経時的測定を示す図である。
【図２２】図２２は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養による、（Ａ）増殖、（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）、および（Ｃ）イソプレン生成量（ｐｐｍ）を示す図である。
【図２３】図２３は、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養における発酵ガス中のイソプレン濃度（ｐｐｍ）を示す図である。
【図２４】図２４は、気相（ヘッドスペース）中におけるイソプレンの爆発限界および臨界酸素濃度を示す図である（ＵＳ８４２０３６０Ｂ２より抜粋）。
【図２５】図２５は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｃｄ）遺伝子が破壊されたリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養による、（Ａ）増殖、および（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）を示す図である。
【図２６】図２６は、ｇｃｄ遺伝子が破壊されたリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ）の培養液中のグルコン酸蓄積の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、イソプレノイド化合物の製造方法を提供する。
【００１５】
イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ５Ｈ８）ｎを有する１以上のイソプレン単位からなる。イソプレン単位の前駆体は、イソペンテニルピロリン酸、またはジメチルアリルピロリン酸である。３０，０００種のイソプレノイド化合物が同定されており、新たな化合物が同定されている。イソプレノイド化合物は、「テルペン」または「テルペノイド」とも呼ばれる。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類される〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンとしては、例えば、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６７４〜６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，２８３〜２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，９３７〜９４７（２００５）；Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８）。不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されており、これらもイソプレノイド化合物に含まれる。「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」、および「テルペノイド化合物」という表現は、本明細書で互換的に使用される。
好ましくは、イソプレノイド化合物は、イソプレン（モノマー）である。
【００１６】
本発明の方法は、以下の１）〜３）を含む。
１）十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレン生成微生物を増殖させること；
２）増殖促進剤の濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること；および
３）イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。
【００１７】
イソプレノイド化合物合成の基質であるＩＰＰ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（メナキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７−１１４６）。本発明は、効率的なイソプレノイド化合物の製造の観点から、微生物の増殖期に対応する工程１）、およびイソプレノイド化合物の生成期に対応する工程３）が分離される。また、微生物の増殖期からイソプレノイド化合物の生成期に移行させるため、イソプレノイド化合物生成の誘導期に対応する工程２）を含む。
【００１８】
本発明では、増殖促進剤とは、微生物により消費され得る、微生物の増殖に必須の因子または微生物の増殖の促進作用を有する因子であって、微生物により消費され培地中の量が減少すると微生物の増殖が喪失または低減するものをいう。例えば、ある量の増殖促進剤を用いた場合、その量の増殖促進剤が消費されるまで微生物は増殖し続けるが、一旦増殖促進剤が全て消費されると、微生物は増殖し得ず、または増殖速度が低下し得る。したがって、増殖促進剤により、微生物の増殖の程度を調節することができる。このような増殖促進剤としては、例えば、酸素（ガス）等の物質；鉄、マグネシウム、カリウム、カルシウムのイオン等のミネラル；リン酸（例、モノリン酸、ニリン酸、ポリリン酸）またはその塩等のリン化合物；アンモニア、硝酸、亜硝酸、尿素等の窒素化合物（ガス）；硫酸アンモニウム、チオ硫酸等の硫黄化合物；ビタミン（例、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、アスコルビン酸）、およびアミノ酸（例、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチヂン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン）等の栄養素が挙げられる。本発明の方法では、１種の増殖促進剤を用いてもよいし、２種以上の増殖促進剤を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
本発明では、イソプレノイド化合物生成微生物とは、増殖促進剤に依存して増殖する能力、および増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力を有する、酵素反応によるイソプレノイド化合物合成能を付与された微生物をいい得る。イソプレノイド化合物生成微生物は、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、増殖できる。ここで、「十分な濃度」とは、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖に有効な濃度で増殖促進剤が用いられることをいい得る。表現「増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、イソプレノイド化合物を生成できず、またはイソプレノイド化合物の生成効率が低いが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、イソプレノイド化合物を生成できること、またはイソプレノイド化合物の生成効率が高いことを意味し得る。したがって、本発明で用いられるイソプレノイド化合物生成微生物は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、良好に増殖し得るが、イソプレノイド化合物を生成できず、またはイソプレノイド化合物の生成効率が低い。イソプレノイド化合物生成微生物はまた、不十分な濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、良好に増殖し得ないが、イソプレノイド化合物を生成でき、またはイソプレノイド化合物の生成効率が高い。好ましくは、イソプレノイド化合物生成微生物は、イソプレン生成微生物である。
【００２０】
このようなイソプレノイド化合物生成微生物では、イソプレノイド化合物合成酵素遺伝子が増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にあり得る。表現「増殖促進剤逆依存性プロモーター」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、転写活性を有しない、または低い転写活性を有するが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、転写活性を有する、または高い転写活性を有するプロモーターを意味し得る。したがって、増殖促進剤逆依存性プロモーターは、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、イソプレノイド化合物合成酵素遺伝子の発現を抑制でき、一方、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖に不十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、イソプレノイド化合物合成酵素遺伝子の発現を促進できる。具体的には、イソプレノイド化合物生成微生物は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にあるイソプレノイド化合物合成酵素遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物である。イソプレノイド化合物合成酵素遺伝子とは、イソプレノイド化合物の合成に関与する１以上の酵素をコードする１以上の遺伝子をいう。イソプレノイド化合物合成酵素遺伝子としては、例えば、イソプレンシンターゼ遺伝子、ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子、リナロールシンターゼ遺伝子、アモルファ−４，１１−ジエン合成酵素遺伝子、β−カリオフィレン合成酵素遺伝子、ゲルマクレンＡ合成酵素遺伝子、８−エピセドロール合成酵素遺伝子、バレンセン合成酵素遺伝子、（＋）−δ−カジネン合成酵素遺伝子、ゲルマクレンＣ合成酵素遺伝子、（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素遺伝子、カスベン合成酵素遺伝子、ベチスピラジエン合成酵素遺伝子、５−ｅｐｉ−アリストロケン合成酵素遺伝子、アリストロケン合成酵素遺伝子、フムレン合成酵素遺伝子、（Ｅ、Ｅ）−α−ファルネセン合成酵素遺伝子、（−）−β−ピネン合成酵素遺伝子、γ−テルピネン合成酵素遺伝子、リモネンサイクラーゼ遺伝子、リナロール合成酵素遺伝子、１、８−シネオール合成酵素遺伝子、サビネン合成酵素遺伝子、Ｅ−α−ビザボレン合成酵素遺伝子、（＋）−ボルニル二リン酸合成酵素遺伝子、レボピマラジエン合成酵素遺伝子、アビエタジエン合成酵素遺伝子、イソピマラジエン合成酵素遺伝子、（Ｅ）−γ−ビザボレン合成酵素遺伝子、タキサジエン合成酵素遺伝子、コパリルジホスファート合成酵素遺伝子、カウレン合成酵素遺伝子、ロンギホレン合成酵素遺伝子、γ−フムレン合成酵素遺伝子、δ−セリネン合成酵素遺伝子、β−フェランドレン合成酵素遺伝子、リモネン合成酵素遺伝子、ミルセン合成酵素遺伝子、テルピノレン合成酵素遺伝子、（−）−カンフェン合成酵素遺伝子、（＋）−３−カレン合成酵素遺伝子、ｓｙｎ‐コパリルジホスファート合成酵素遺伝子、α−テルピネオール合成酵素遺伝子、ｓｙｎ−ピマラ−７、１５、−ジエン合成酵素遺伝子、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエン合成酵素遺伝子、ステマル−１３−エン合成酵素遺伝子、Ｅ−β−オシメン合成酵素遺伝子、Ｓ−リナロール合成酵素遺伝子、ゲラニオール合成酵素遺伝子、ｅｐｉ−セドロール合成酵素遺伝子、α−ジンギベ��ン合成酵素遺伝子、グアイアジエン合成酵素遺伝子、カスカリラジエン合成酵素遺伝子、ｃｉｓ−ムウロラジエン合成酵素遺伝子、アフィジコラン−１６ｂ−オール合成酵素遺伝子、エリザベスアトリエン合成酵素遺伝子、サンタロール合成酵素遺伝子、パチュロール合成酵素遺伝子、ジンザノール合成酵素遺伝子、セドロール合成酵素遺伝子、スクラレオール合成酵素遺伝子、コパロール合成酵素遺伝子、マノオール合成酵素遺伝子、リモネンモノオキシゲナーゼ遺伝子、カルベオールデヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられるが、イソプレンシンターゼ遺伝子、ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子、リナロールシンターゼ遺伝子、及びリモネン合成酵素遺伝子が好ましい。
【００２１】
例えば、増殖促進剤が酸素である場合、微好気誘導型プロモーターを利用することができる。微好気誘導型プロモーターとは、微好気条件下で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。一般的に、飽和溶存酸素濃度は７．２２ｐｐｍである（気圧７６０ｍｍＨｇ、温度３３℃、酸素２０．９％の水蒸気が飽和した大気中）。微好気条件とは、（溶存）酸素濃度０．３５ｐｐｍ以下の条件をいい得る。微好気条件下の（溶存）酸素濃度は、０．３０ｐｐｍ以下、０．２５ｐｐｍ以下、０．２０ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、０．１０ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。微好気誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｄ−またはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ｌｌｄ、ｌｄｈＡ）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ａｄｈＥ）のプロモーター、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（例、ｐｆｌＢ）のプロモーター、およびα−アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子（例、ｂｕｄＡ）のプロモーターが挙げられる。
【００２２】
また、増殖促進剤がリン化合物である場合、リン欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。表現「リン欠乏誘導型プロモーター」とは、低濃度のリン化合物で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低濃度のリン化合物とは、（遊離）リン濃度１００ｍｇ／Ｌ下の条件をいい得る。表現「リン」は、表現「リン化合物」と同義であり、それらは交換可能な様式で使用され得る。総リン濃度は、溶液中の全種のリン化合物を、強酸あるいは酸化剤によってオルトリン酸態リンに分解して定量可能である。リン欠乏条件下の総リン濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。リン欠乏誘導型プロモーターとしては、例えば、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＡ）のプロモーター、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＣ）のプロモーター、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＲ）のプロモーター、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＢ）のプロモーター、およびリン取り込み担体をコードする遺伝子（例、ｐｓｔＳ）のプロモーターが挙げられる。
【００２３】
増殖促進剤がアミノ酸である場合、アミノ酸欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。アミノ酸欠乏誘導型プロモーターとは、低アミノ酸濃度で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低アミノ酸濃度とは、（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度が１００ｍｇ／Ｌ以下である条件をいい得る。アミノ酸欠乏条件下の（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。アミノ酸欠乏型プロモーターとしては、例えば、トリプトファンリーダーペプチドをコードする遺伝子（例、ｔｒｐＬ）のプロモーター、およびＮ−アセチルグルタメイトシンターゼをコードする遺伝子（例、ＡｒｇＡ）のプロモーターが挙げられる。
【００２４】
イソプレノイド化合物生成微生物は、イソプレンシンターゼ等のイソプレノイド化合物合成酵素発現ベクターで宿主微生物を形質転換することにより得ることができる。イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ  ｂｒａｃｔｅａｔａ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｒｉａ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、茶ノ木（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）由来のイソプレンシンターゼが挙げられる（例、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ６７  （４），１０２６−１０４０（２０１３）を参照）。イソプレノイド化合物合成酵素発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、イソプレノイド化合物合成酵素をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存プロモーターの制御下に配置され得る。
【００２５】
遺伝子、プロモーター等の核酸配列、またはタンパク質等のアミノ酸配列について本明細書中で用いられる語句「由来」は、微生物により天然またはネイティブに合成される、あるいは天然または野生型の微生物から単離され得る核酸配列またはアミノ酸配列を意味し得る。
【００２６】
イソプレノイド化合物生成微生物は、イソプレノイド化合物合成酵素に加えて、メバロン酸キナーゼをさらに発現していてもよい。したがって、イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸キナーゼ発現ベクターで形質転換されていてもよい。メバロン酸キナーゼ遺伝子としては、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）等のメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）等のメタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ）等のメタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、およびニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）等のニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物の遺伝子が挙げられる。メバロン酸キナーゼ発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。具体的には、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。構成型プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。
【００２７】
イソプレノイド化合物の前駆体（例、イソプレン合成の基質）であるＤＭＡＰＰは、通常、微生物が固有またはネイティブに有するメチルエリスリトールリン酸経路またはメバロン酸経路のいずれかにより生合成される。したがって、効率的なイソプレノイド化合物の製造のためのＤＭＡＰＰの供給の観点から、本発明で用いられるイソプレノイド化合物生成微生物は、後述するように、メチルエリスリトールリン酸経路および／またはメバロン酸経路が強化されていてもよい。
【００２８】
本発明で宿主として用いられるイソプレノイド化合物生成微生物は、細菌又は真菌であり得る。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。イソプレノイド化合物生成微生物としては、腸内細菌科に属する微生物、特に後述する微生物のうち腸内細菌科に属する微生物であり得る。
【００２９】
グラム陽性細菌としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
【００３０】
グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、パントエア・アナナティスＳＣ１７株（ＦＥＲＭＢＰ−１１９０２）、およびパントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株（ＶＫＰＭ  Ｂ−９２４６；Ｋａｔａｓｈｉｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９；１０：３４）が挙げられる。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７  Ｍａｒ  ２７；９８（２）：３４０−３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で国立研究開発法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６；現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ  ＮＩＴＥ）  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００３１】
真菌としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、例えば、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
【００３２】
イソプレノイド化合物生成微生物は、さらにイソプレノイド化合物の前駆体（例、イソプレンシンターゼの基質）であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、イソプレノイド化合物生成微生物に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、イソプレノイド化合物生成微生物に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、組込み型ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を一緒または個別に発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
【００３３】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００３４】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する１以上の酵素（例、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（好ましくはｍｖａＥ）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（好ましくはｍｖａＳ））をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつアセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性を有するタンパク質であり、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性とは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡおよび２ＮＡＤＰＨからメバロン酸ならびに２ＮＡＤＰおよびＨＳＣｏＡを生成する活性をいう。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性とは、アセトアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡおよびＨＳＣｏＡを生成する活性をいう。
【００３６】
アミノ酸配列の同一性％および後述するような塩基配列の同一性％は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡアルゴリズム（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼは、配列番号３２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつアセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性を有するタンパク質であり、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号３５のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個であり得る。
【００３８】
アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼは、同一条件で測定された場合、配列番号３２のアミノ酸配列からなるタンパク質のアセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼは、同一条件で測定された場合、配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質のヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
【００３９】
上記酵素では、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、上記酵素のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００４０】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号３３または配列番号３４の塩基配列と７０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含み、かつアセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよく、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号３６または配列番号３７の塩基配列と７０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含み、かつヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。塩基配列同一性％は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子は、配列番号３３または配列番号３４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよく、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、配列番号３６または配列番号３７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、このような条件は、高い同一性を有する実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００４３】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００４４】
更に、イソプレノイド化合物生成微生物において、イソプレノイド化合物の前駆体（例、イソプレンシンターゼの基質）であるジメチルアリル二リン酸やイソペンテニル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。このような酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。発現ベクターにおいて、ジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子は、上述したような構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。
【００４５】
上述したような遺伝子を含む発現ベクターによる宿主の形質転換は、１以上の公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００４６】
本発明の方法における工程１）では、イソプレノイド化合物生成微生物が、十分な濃度の増殖促進剤の存在下で増殖される。より具体的には、イソプレノイド化合物生成微生物の増殖は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、培地中でイソプレノイド化合物生成微生物を培養することにより行うことができる。
【００４７】
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレノイド化合物生成微生物は、好気性微生物であり得る。好気性微生物は、十分な濃度の酸素の存在下で良好に増殖することができるので、酸素は、好気性微生物に対する増殖促進剤として作用することができる。増殖促進剤が酸素である場合、１）において、好気性微生物の増殖に十分である培地中の溶存酸素の濃度は、好気性微生物の増殖を促進できる濃度である限り特に限定されず、例えば０．５０ｐｐｍ以上、１．００ｐｐｍ以上、１．５０ｐｐｍ以上、または２．００ｐｐｍ以上であってもよい。好気性微生物の増殖のための溶存酸素の濃度はまた、例えば７．００ｐｐｍ以下、５．００ｐｐｍ以下、または３．００ｐｐｍ以下であってもよい。
【００４８】
また、リン化合物もしくはアミノ酸が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレノイド化合物生成微生物は、十分な濃度のリン化合物もしくはアミノ酸の存在下で良好に増殖することができるので、リン化合物やアミノ酸は、増殖促進剤として作用することができる。増殖促進剤がリン化合物やアミノ酸である場合、１）において、増殖に十分なリン化合物やアミノ酸の濃度は、特に限定されないが、例えば２００ｍｇ／Ｌ以上、３００ｍｇ／Ｌ以上、５００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、または２０００ｍｇ／Ｌ以上であってもよい。増殖のためのリン化合物もしくはアミノ酸の濃度はまた、例えば２０ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、または５ｇ／Ｌ以下であってもよい。
【００４９】
本発明の方法における工程２）では、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成の誘導が、増殖促進剤の濃度を減少させることにより行われる。より具体的には、増殖促進剤の濃度の減少は、培地中への増殖促進剤の供給量を低下させることにより、行うことができる。増殖促進剤の濃度の減少はまた、培地中への増殖促進剤の供給量を１）２）を通じて一定にした場合であっても、微生物の増殖を利用して行うことができる。１）における微生物の増殖の初期では、微生物が十分に増殖しておらず、培地中の微生物数が少ないため、微生物による増殖促進剤の消費も相対的に少ない。したがって、増殖の初期では、培地中の増殖促進剤の濃度は、相対的に高い。一方、１）における微生物の増殖の後期では、微生物が十分に増殖しており、培地中の微生物数が多いため、微生物による増殖促進剤の消費も相対的に多い。したがって、増殖の後期では、培地中の増殖促進剤の濃度は、相対的に低くなる。このように、一定量の増殖促進剤を、１）２）を通じて培地中に供給し続けた場合、微生物の増殖と反比例して、培地中の増殖促進剤の濃度は減少する。この減少した濃度をトリガーとして、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物（例、イソプレンモノマー、リナロール、リモネン）の生成を誘導することができる。
【００５０】
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導できる培地中の溶存酸素の濃度は、例えば０．３５ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であり得る。培地中の溶存酸素の濃度はまた、上述したような微好気条件下の濃度であってもよい。
【００５１】
また、リン化合物またはアミノ酸が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導できる培地中のリン化合物またはアミノ酸の培地中の濃度は、例えば１００ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、または１０ｍｇ／Ｌ以下であり得る。
【００５２】
本発明の方法における工程３）では、イソプレノイド化合物の生成が、イソプレノイド化合物生成微生物を培養することにより行われる。より具体的には、イソプレノイド化合物の生成は、増殖促進剤の濃度が減少した２）の条件下において培地中でイソプレノイド化合物生成微生物を培養することにより行うことができる。培地中の増殖促進剤の濃度は、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を可能にするため、２）で上述したような濃度に維持され得る。３）において、培地中の生成イソプレノイド化合物濃度は、工程２）の条件下で培養培地中のイソプレノイド化合物生成微生物を培養後、例えば誘導後６時間以内、または誘導後５、４または３時間以内において、例えば、６００ｐｐｍ以上、７００ｐｐｍ以上、８００ｐｐｍ以上、または９００ｐｐｍ以上であり得る。
【００５３】
本発明の方法はまた、イソプレノイド化合物がイソプレンである場合、誘導期におけるイソプレン生成速度により特徴付けることができる。誘導期におけるイソプレン生成速度（ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ）は、ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅあたりの最大イソプレン濃度（ｐｐｍ／ｖｖｍ）をその誘導時間で除算することにより決定することができる、誘導効率の指標値である。ここで、誘導時間は、イソプレン生成開始（発酵ガス中のイソプレン濃度を５０ｐｐｍと定義する）から最大イソプレン濃度に到達するまでの時間である。「ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）」という値は、培養装置における培養溶液容積当たりの単位時間ガス通気量を示す。かかるイソプレン生成速度は、増殖促進剤の種類によって変動し得る。例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、かかるイソプレン生成速度は、２０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、４０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、５０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、６０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、または７０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上であり、また、１００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、９０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、または８０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下であり得る。リン化合物が増殖促進剤として用いられる場合、かかる速度は、５０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、１００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、１５０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、２００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上、または２５０ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以上であり、また、１０００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、９００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、または８００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、７００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下、または６００ｐｐｍ／ｖｖｍ／ｈ以下であり得る。
【００５４】
本発明の方法では、３）におけるイソプレノイド化合物生成微生物の培養期間を、１）のその期間よりも長く設定することも可能である。誘導剤を利用する従来の方法では、より多量のイソプレノイド化合物を得るためには、イソプレノイド化合物の生成期において誘導剤を用いて微生物を長期培養する必要があった。しかし、長期培養すると誘導剤が分解することから、微生物がイソプレノイド化合物の生産能を維持できなくなる。そのため、誘導剤を継続的に培養培地に添加する必要があるが、誘導剤は高価であり得、イソプレノイド化合物製造費が上昇し得る。したがって、イソプレノイド化合物の生成期において誘導剤を用いる微生物の長期培養は、その培養期間の長さに応じて、イソプレノイド化合物の製造費が上昇し得るという問題があった。一方、３）において誘導剤等の特定物質を用いない本発明の方法では、当該特定物質の分解を考慮する必要がなく、イソプレノイド化合物の生成期における長期培養がイソプレノイド化合物製造費の上昇を引き起こすという従来の問題も生じない。したがって、本発明の方法は、誘導剤を用いる従来の方法とは異なり、３）の期間を長く設定し易い。本発明の方法では、３）の期間を長く設定すればするほど、より多量のイソプレノイド化合物を製造することができる。
【００５５】
イソプレノイド化合物が揮発性のある物質である場合、本発明の方法は、液相および気相を備える系において、行うことができる。揮発性のある物質とは、２０℃において０．０１ｋＰａ以上の蒸気圧を有する化合物を意味する。蒸気圧の測定方法として、一般的に、静止法、沸点法、アイソテニスコープ法、気体流通法、ＤＳＣ法といった手法が知られている（特開２００９−１０３５８４）。揮発性のあるイソプレノイド化合物の一例としてイソプレンが挙げられる。このような系としては、生成するイソプレンの拡散による消失を回避するため、閉鎖されている系、例えば、発酵槽、発酵タンク等の反応器を利用することができる。液相としては、イソプレン生成微生物を含む培地を用いることができる。気相は、系における液相上部の空間であり、ヘッドスペースとも呼ばれ、発酵ガスを含む。イソプレンは、標準大気圧で沸点が３４℃であり、かつ水に対して難溶性（水に対する溶解性：０．６ｇ／Ｌ）で２０℃における蒸気圧が６０．８ｋＰａであることから（例、Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ（ＰＴＢ），２００８）、イソプレン生成微生物を３４℃以上の温度条件下の液相中で培養した場合、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得る。したがって、このような系を用いる場合、液相中で生成したイソプレンを、気相中から回収することができる。また、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得ることから、液相中のイソプレン生成微生物によるイソプレン生成反応（イソプレンシンターゼによる酵素反応）を、常に、イソプレン生成側に傾斜させることもできる。リモネンは、水に対して難溶性（水に対する溶解性：１３．８ｍｇ／Ｌ）で２０℃における蒸気圧が０．１９ｋＰａであることから（（Ｒ）−（＋）−リモネン  安全データシート  純正化学株式会社  ８２２０５ｊｉｓ−１，２０１４／０５／１９）、リモネン生成微生物を３４℃以上の温度条件下の液相中で培養した場合、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得る。リナロールは、水に対して難溶性（水に対する溶解性：０．１６ｇ／１００ｍＬ）で２５℃における蒸気圧が０．０２１Ｐａであることから（リナロール  安全データシート  東京化成工業株式会社  ２０１３／１２／１０）、リナロール生成微生物を３４℃以上の温度条件下の液相中で培養した場合、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得る。したがって、このような系を用いる場合、液相中で生成した揮発性のあるイソプレノイド化合物を、気相中から回収することができる。また、液相中で生成した揮発性のあるイソプレノイド化合物は容易に気相中に移行し得ることから、液相中のイソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物生成反応（イソプレノイド化合物合成酵素による酵素反応）を、常に、イソプレノイド化合物生成側に傾斜させることもできる。
【００５６】
液相および気相を備える系において本発明の方法が行われる場合、気相中の酸素濃度を制御することが望ましい。揮発性のある有機化合物の中には爆発性があるものが含まれる。例えば、イソプレンは爆発限界が１．０〜９．７％（ｗ／ｗ）（例、Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ（ＰＴＢ），２００８）であり爆発し易い性質を有すること、およびイソプレンは気相中での酸素との混合比率に応じて爆発範囲が変動することから（ＵＳ８４２０３６０Ｂ２、図２４を参照）、爆発の回避の観点から、気相中の酸素濃度を制御する必要があるためである。リモネンは爆発範囲が０．７〜６．１％（例、Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ（ＰＴＢ），２００８）であり爆発し易い性質を有することより、爆発の回避の観点から、気相中の酸素濃度を制御する必要があるためである。
気相中の酸素濃度の制御は、酸素濃度を調節した気体を系中に供給することにより行うことができる。系中に供給される気体は、窒素、二酸化炭素、アルゴン等の酸素以外の気体成分を含んでいてもよい。より具体的には酸素濃度が爆発範囲を持つガスの限界酸素濃度以下になるよう不活性ガスを加える事で気相中の酸素濃度を制御できる。酸素以外の気体成分として不活性ガスであることが望ましい。好ましくは、酸素濃度を調節した気体は液相中に供給され、それにより気相中の酸素濃度が間接的に制御される。気相中の酸素濃度は、以下のとおり、液相中の溶存酸素濃度の調節により制御できるためである。
液相中に供給された気体中の酸素は液相中に溶存し、やがて飽和濃度に達する。一方、微生物が存在する系においては、液相中の溶存酸素は、培養される微生物の代謝活動により消費され、その結果、溶存酸素濃度は飽和濃度以下に低下する。飽和濃度以下の酸素を含む液相において、気液平衡により気相中の酸素、あるいは新たに供給する気体中の酸素は液相への移動が可能である。すなわち、微生物の酸素消費速度に依存して、気相中の酸素濃度は低下する。また、培養される微生物の酸素消費速度を制御する事により、気相中の酸素濃度を制御することも可能である。
例えば、微生物の炭素源の代謝速度を上げることにより、酸素消費速度をあげ、気相中の酸素濃度を９％（ｖ／ｖ）以下（例、５％（ｖ／ｖ）以下、０．８％（ｖ／ｖ）以下、０．６％（ｖ／ｖ）以下、０．５％（ｖ／ｖ）以下、０．４％（ｖ／ｖ）以下、０．３％（ｖ／ｖ）以下、０．２％（ｖ／ｖ）以下、もしくは０．１％（ｖ／ｖ）以下）または実質的に０％（ｖ／ｖ）に設定することができる。あるいは、初期に供給する気体中の酸素濃度を、低く設定することでも成し得る。したがって、気相中の酸素濃度の設定は、液相中の微生物による酸素の消費速度と供給する気体中の酸素濃度を考慮した上で、設定ができる。
【００５７】
微生物の増殖期である１）では、液相中に溶存酸素が一定濃度で存在しない場合、微生物はその種類によっては液相中で良好に増殖することができない場合がある。また、１）では、イソプレンが未生成であるため、爆発の回避の観点から、気相中の酸素濃度を制御する必要は必ずしもない。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、好気性微生物等の微生物の増殖に好適である溶存酸素濃度が液相中で維持されるように、酸素濃度を調節した気体を液相中に供給することができる。液相中に供給された気体は、攪拌により液相中に溶存することができる。液相中の溶存酸素濃度は、イソプレン生成微生物の十分な増殖を可能にするものであれば特に限定されず、溶存酸素濃度は、好気性微生物等の利用される微生物の種類に依存して変動し得る。例えば、好気性微生物の増殖に十分である培地中の溶存酸素の濃度として上述したような濃度を採用することができる。具体的には、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレン生成微生物を含む液相、および気相を備える系における液相中に酸素を供給して、十分な濃度の溶存酸素の存在下でイソプレン生成微生物を増殖させることができる。
【００５８】
イソプレン生成の誘導期である２）では、微生物の液相中での増殖の観点よりも、誘導後の３）で生成するイソプレンと酸素との混合気体による爆発を回避する観点から、系中の酸素濃度が調節される。例えば、気相中の酸素濃度は、続く工程３）において生成するイソプレンと酸素との混合気体による爆発を回避する観点から、後述するように、３）と同様であってもよい。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合には、上述した観点、およびイソプレン生成微生物によるイソプレンモノマーの生成を液相中で誘導する観点から、系中の酸素濃度が調節される。例えば、液相中の溶存酸素濃度は、上記観点を達成できるようなものであれば特に限定されず、利用されるイソプレン生成微生物および利用されるプロモーターの種類等によっても異なるが、例えば０．３５ｐｐｍ以下、０．２５ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ、０．１０ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。液相中の溶存酸素濃度はまた、上述したような微好気条件下の濃度であってもよい。液相中の溶存酸素濃度の減少は、液相中への酸素の供給量を低下させることにより、行うことができる。液相中の溶存酸素濃度の減少はまた、液相中への酸素の供給量を１）２）を通じて一定にした場合であっても、培養される微生物の増殖を利用して行うことができる。１）における微生物の増殖の初期では、微生物が十分に増殖しておらず、培地中の微生物数が少ないため、微生物による酸素消費も相対的に少ない。したがって、増殖の初期では、液相中の溶存酸素濃度、および気相中の酸素濃度は、相対的に高い。一方、１）における微生物の増殖の後期では、微生物が十分に増殖しており、培地中の微生物数が相対的に多いため、微生物による酸素消費も相対的に多い。したがって、増殖の後期では、液相中の溶存酸素濃度、および気相中の酸素濃度は、相対的に低くなる。このように、一定濃度の酸素を含む気体を、１）２）を通じて液相中に供給し続けた場合、微生物の増殖と反比例して、液相中の溶存酸素濃度は減少する。この減少した液相中の酸素濃度をトリガーとして、イソプレン生成微生物によるイソプレンモノマーの生成を誘導することができる。
【００５９】
イソプレンの生成期である３）では、気相中の酸素濃度は、イソプレンと酸素との混合気体による爆発を回避できる濃度である限り特に限定されないが、このような混合気体中の酸素濃度が約９．５％（ｖ／ｖ）以下であれば気相中のイソプレン濃度によらず爆発を回避できることから（図２４を参照）、気相中の酸素濃度は約９．５％（ｖ／ｖ）以下であり得る。爆発に対する酸素濃度の安全域を確保する観点から、気相中の酸素濃度は、９％（ｖ／ｖ）以下、８％（ｖ／ｖ）以下、７％（ｖ／ｖ）以下、６％（ｖ／ｖ）以下、５％（ｖ／ｖ）以下、４％（ｖ／ｖ）以下、３％（ｖ／ｖ）以下、２％（ｖ／ｖ）以下、または１％（ｖ／ｖ）以下であり得る。３）では、このような酸素濃度が気相中で維持されるように、酸素濃度を調節した気体を液相中に供給することができる。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、２）で上述したような液相中の酸素濃度条件下でイソプレン生成微生物を液相中で培養することにより、イソプレンモノマーを生成することができる。この場合、２）で上述したような液相中の酸素濃度、および３）で上述したような気相中の酸素濃度を両立させることが所望される。液相中の微生物の種類およびその増殖の程度などを考慮しつつ、酸素を含む気体の供給量を調節することにより、２）で上述したような液相中の酸素濃度、および３）で上述したような気相中の酸素濃度を両立させることができる。
【００６０】
液相および気相を備える系においてイソプレンの生成が行われる場合、液相中で生成したイソプレンは、上述したとおり、気相（発酵ガス）中から回収することができる。気相からのイソプレンの回収は、公知の方法により行うことができる。気相からのイソプレンの回収法としては、例えば、吸収法、冷却法、圧力スイング吸着法（ＰＳＡ法）、膜分離法が挙げられる。気相は、これらの方法に付される前に、必要に応じて、脱水、昇圧、減圧等の予備処理に付されてもよい。
【００６１】
本発明の方法は、イソプレノイド化合物の生成量をさらに向上させる観点等から、他の方法と併用されてもよい。このような方法としては、例えば、光（Ｐｉａ  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｓｕｎｇｓｏｏｎ  Ｐａｒｋ，Ａｎａｓｔａｓｉｏｓ  Ｍｅｌｉｓ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２（２０１０）：７０−７９）または温度（Ｎｏｒｍａ  Ａ  Ｖａｌｄｅｚ−Ｃｒｕｚ，Ｌｕｉｓ  Ｃａｓｐｅｔａ，Ｎeｓｔｏｒ  Ｏ  Ｐeｒｅｚ，Ｏｃｔａｖｉｏ  Ｔ  Ｒａｍiｒｅｚ，Ｍａｕｒｉｃｉｏ  Ａ  Ｔｒｕｊｉｌｌｏ−Ｒｏｌｄaｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１０，９：１）等の環境因子を利用する方法、ｐＨの変化（ＥＰ  １２３３０６８  Ａ２）、界面活性剤の添加（ＪＰ  １１００９２９６  Ａ）、自己誘導法（ＷＯ２０１３／１５１１７４）が挙げられる。
【００６２】
本発明の方法で用いられる培地は、イソプレノイド化合物生成のための炭素源を含んでいてもよい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６３】
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β−１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
【００６４】
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
【００６５】
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
【００６６】
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質であり得、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００６７】
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は２以上の炭素原子を有する炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、上記の基「Ｒ」における２つの炭素原子間に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００６８】
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
【００６９】
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
【００７０】
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、炭素源は、前処理され得る。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
【００７１】
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
【００７２】
本発明の方法では、イソプレノイド化合物生成微生物を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【００７３】
培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン等のイソプレノイド化合物の産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
【００７４】
イソプレノイド化合物生成微生物の培養条件としては、上述したとおり増殖促進剤の濃度を調節すること以外は、標準的な培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜４０℃であり得、ｐＨが、約４．５〜約９．５であり得る。
また、イソプレノイド化合物生成微生物の宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。培養方法としては、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を適宜用いることができる。
【００７５】
本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【００７６】
工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、付加重合等の有機化学的な合成法）により行うことができる。
【００７７】
ゴム組成物の製造方法
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）、またはイソプレンモノマー単位およびイソプレンモノマー単位以外の１以上のモノマー単位を含む異種ポリマー（例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー）であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの製造方法により製造される同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）である。本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、および／または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、ならびに／または他の成分（例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤）と混合することにより調製することができる。
【００７８】
タイヤの製造方法
本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ね、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとする。次いで、このグリーンタイヤを常法に従って加熱加硫することにより、所望のタイヤ（例、空気式タイヤ）を製造することができる。
【実施例】
【００７９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８０】
実施例１：イソプレノイド化合物生成微生物（アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物：エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株、および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物：エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株）の構築【００８１】
１．１．ＧＩ０５（ＥＳ０４Δｌｌｄ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株）の構築
エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株から構築したＥＳ０４株（ＵＳ２０１０−０２９７７１６Ａ１）の染色体上のｌｌｄ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来（参考例１を参照）のＰｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０５（ＥＳ０４Δｌｌｄ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ）株を構築した。配列番号１にエンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株のｌｌｄ遺伝子の塩基配列を記載する。【００８２】
１．１．１．λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子断片の構築
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のＰｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子は、ｔａｃプロモーターの制御下にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のホスホメバロン酸キナーゼ（遺伝子名ＰＭＫ）とジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（遺伝子名ＭＶＤ）、更にはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（遺伝子名ｙＩＤＩ）がコードされている。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号２と配列番号３に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・４２０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、両端にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（遺伝子名ｌｌｄ）の組み換え配列を有したλａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子断片を得た。【００８３】
１．１．２．ＥＳ０４／ＲＳＦＲｅｄＴＥＲ株の構築
ＥＳ０４株（ＵＳ２０１００２９７７１６Ａ１）をＬＢ液体培地にて終夜培養した。その後、培養液１００μＬを新たなＬＢ液体培地４ｍＬに植菌し、３４℃で３時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、１０％グリセロールで３回洗浄したものをコンピテントセルとし、エレクトロポレーション法により、ＲＳＦＲｅｄＴＥＲを導入した（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）。尚、エレクトロポレーションはＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、電場強度２０ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で行った。ＳＯＣ培地（バクトトリプトン  ２０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、グルコース  １０ｇ／Ｌ）で２時間培養後、４０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に塗布し、１６時間培養を行った。その結果、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、ＥＳ０４／ＲＳＦＲｅｄＴＥＲ株と命名した。【００８４】
１．１．３．ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株の構築
ＥＳ０４／ＲＳＦＲｅｄＴＥＲ株をＬＢ液体培地にて終夜培養した。その後、培養液１ｍＬを、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと４０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地１００ｍＬに植菌して、３４℃で３時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、１０％グリセロールで３回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したλａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。ＳＯＣ培地で２時間培養後、テトラサイクリン３０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地に塗布し、１６時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号４と配列番号５に記載したプライマーを用いてコロニーＰＣＲ（ＴａＫａＲａ  Ｓｐｅｅｄ  ｓｔａｒ（登録商標），９２℃・１０ｓｅｃ．，５６℃・１０ｓｅｃ．，７２℃・６０ｓｅｃ．，４０ｃｙｃｌｅ）を行い、染色体上のｌｌｄ遺伝子がλａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ遺伝子に置換している事を確認した。得られた株を、１０％シュークロース、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地に塗布し、ＲＳＦＲｅｄＴＥＲプラスミドを脱落させ、ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株を得た。【００８５】
１．１．４．ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株からのテトラサイクリン耐性遺伝子除去
ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株からテトラサイクリン耐性遺伝子を除去する為に、ＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓ（ＵＳ２０１００２９７７１６Ａ１）プラスミドを用いた。ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株にＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓをエレクトロポレーション法で導入し、４０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に塗布後３０℃で培養し、ＥＳ０４Δｌｌｄ：：λａｔｔＬ−ＴｅｔＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓ株を得た。得られたプラスミド保持株を、４０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＬＢ培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、３０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを加えた培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、生育出来ない事を確認する事で、テトラサイクリン耐性遺伝子が除去された株である事を確認した。次に、得られた株からＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓプラスミドを脱落させるため、１０％シュークロース及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加したＬＢ培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール感受性を示した株をＧＩ０５（ＥＳ０４Δｌｌｄ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ）株と命名した。【００８６】
１．２．ＧＩ０６（ＧＩ０５  ΔｐｏｘＢ：：Ｐｔａｃ−ＰＭＫ）株の構築
エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０５株の染色体上のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子（遺伝子名ｐｏｘＢ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０６（ＥＳ０４Δｌｌｄ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩΔｐｏｘＢ：：Ｐｔａｃ−ＰＭＫ）株を構築した。配列番号６にエンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株のｐｏｘＢ遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。【００８７】
１．２．１．λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ遺伝子断片の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号７と配列番号８に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・１２０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、ＰＭＫのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片を取得した。また、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ（ＷＯ２００８０９０７７０Ａ１）を含むＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号９と配列番号１０に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・９０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、ＰＭＫのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片とλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号７と配列番号９に記載したプライマーを用いてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ−ＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・１８０ｓｅｃ．，３５ｃｙｃｌｅ）を行い、両端にピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（遺伝子名ｐｏｘＢ）の組み換え配列を有したλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ遺伝子断片を得た。【００８８】
１．２．２．λ−Ｒｅｄ法によるＧＩ０６株の取得
前述のＧＩ０５株を構築した手順と同様に、ＧＩ０５株にＲＳＦＲｅｄＴＥＲを導入し、λ−Ｒｅｄ法にてλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ遺伝子断片をｐｏｘＢに導入し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すＧＩ０５ΔｐｏｘＢ：：λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫを取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号１１と配列番号１２に記載したプライマーを用いてコロニーＰＣＲ（ＴａＫａＲａ  Ｓｐｅｅｄ  ｓｔａｒ（登録商標），９２℃・１０ｓｅｃ．，５６℃・１０ｓｅｃ．，７２℃・６０ｓｅｃ．，４０ｃｙｃｌｅ）を行い、染色体上のｐｏｘＢ遺伝子がλａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ遺伝子に置換している事を確認した。つづいてＲＳＦＲｅｄＴＥＲが脱落したＧＩ０５ΔｐｏｘＢ：：λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、ｐＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入し、ＧＩ０５株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をＧＩ０６（ＧＩ０５ΔｐｏｘＢ：：Ｐｔａｃ−ＰＭＫ）株と命名した。【００８９】
１．３．ＧＩ０７（ＧＩ０６  ΔｐｆｌＢ：：Ｐｔａｃ−ＭＶＤ）株の構築
エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０６株の染色体上のピルビン酸ギ酸リアーゼＢ遺伝子（遺伝子名ｐｆｌＢ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０７（ＧＩ０６  ΔｐｆｌＢ：：Ｐｔａｃ−ＭＶＤ）株を構築した。配列番号１３にエンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株のｐｆｌＢ遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。【００９０】
１．３．１．λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ遺伝子断片の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号１４と配列番号１５に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・１２０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、ＭＶＤのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片を取得した。また、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ（ＷＯ２００８０９０７７０Ａ１）を含むＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号１６と配列番号１７に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・９０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、ＭＶＤのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片とλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号１５と配列番号１６に記載したプライマーを用いてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ−ＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・２４０ｓｅｃ．，３５ｃｙｃｌｅ）を行い、両端にピルビン酸ギ酸リアーゼＢをコードする遺伝子（遺伝子名ｐｆｌＢ）の組み換え配列を有したλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ遺伝子断片を得た。【００９１】
１．３．２．λ−Ｒｅｄ法によるＧＩ０７株の取得
前述のＧＩ０５株を構築した手順と同様に、ＧＩ０６株にＲＳＦＲｅｄＴＥＲを導入し、λ−Ｒｅｄ法にてλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ遺伝子断片をｐｆｌＢに導入し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すＧＩ０６ΔｐｆｌＢ：：λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ株を取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号１８と配列番号１９に記載したプライマーを用いてコロニーＰＣＲ（ＴａＫａＲａ  Ｓｐｅｅｄ  ｓｔａｒ（登録商標），９２℃・１０ｓｅｃ．，５６℃・１０ｓｅｃ．，７２℃・６０ｓｅｃ．，４０ｃｙｃｌｅ）を行い、染色体上のｐｆｌＢ遺伝子がλａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ遺伝子に置換している事を確認した。つづいてＲＳＦＲｅｄＴＥＲが脱落したＧＩ０６ΔｐｆｌＢ：：λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＭＶＤ株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、ｐＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入し、ＧＩ０５株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をＧＩ０７（ＧＩ０６ΔｐｆｌＢ：：Ｐｔａｃ−ＭＶＤ）株と命名した。【００９２】
１．４．ＧＩ０８（ＧＩ０７  ΔｐｆｌＡ：：Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ）株の構築
エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０７株の染色体上のピルビン酸ギ酸リアーゼＡ遺伝子（遺伝子名ｐｆｌＡ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｙＩＤＩ）遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスＧＩ０８（ＧＩ０７  ΔｐｆｌＡ：：Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ）株を構築した。配列番号２０にエンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株のｐｆｌＡ遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。【００９３】
１．４．１．λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ遺伝子断片の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号２１と配列番号２２に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・１２０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、ｙＩＤＩのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片を取得した。また、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ（ＷＯ２００８０９０７７０Ａ１）を含むＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号２３と配列番号２４に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・９０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、ｙＩＤＩのＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片とλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号２３と配列番号２４に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・２４０ｓｅｃ．，３５ｃｙｃｌｅ）を行い、両端にピルビン酸ギ酸リアーゼＡをコードする遺伝子（遺伝子名ｐｆｌＡ）の組み換え配列を有したλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ遺伝子断片を得た。【００９４】
１．４．２．λ−Ｒｅｄ法によるＧＩ０８株の取得
前述のＧＩ０５株を構築した手順と同様に、ＧＩ０７株にＲＳＦＲｅｄＴＥＲを導入し、λ−Ｒｅｄ法にてλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ遺伝子断片をｐｆｌＡに導入し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すＧＩ０７ΔｐｆｌＡ：：λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ株を取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号２５と配列番号２６に記載したプライマーを用いてコロニーＰＣＲ（ＴａＫａＲａ  Ｓｐｅｅｄ  ｓｔａｒ（登録商標），９２℃・１０ｓｅｃ．，５６℃・１０ｓｅｃ．，７２℃・６０ｓｅｃ．，４０ｃｙｃｌｅ）を行い、染色体上のｐｆｌＡ遺伝子がλａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ遺伝子に置換している事を確認した。つづいてＲＳＦＲｅｄＴＥＲが脱落したＧＩ０７ΔｐｆｌＡ：：λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、ｐＲＳＦ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入し、ＧＩ０５株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をＧＩ０８（ＧＩ０７ΔｐｆｌＡ：：Ｐｔａｃ−ｙＩＤＩ）株と命名した。【００９５】
１．５．アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株（ＧＩ０８／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ）の構築
ＧＩ０８株にイソプレノイド化合物生産能を付与する為、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ（参考例２を参照）とｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ（ＷＯ２０１３／１７９７２２参照）をエレクトロポレーション法にて導入した。上記の方法に従った、ＧＩ０８株のコンピテントセルを調整後、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐとｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫをエレクトロポレーション法にて導入し、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌとクロラムフェニコール  ６０ｍｇ／ＬのＬＢ培地で選択をし、両プラスミドを保持したＧＩ０８株／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫをＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株と命名した。【００９６】
１．６．ｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳの構築
エンテロバクター・アエロゲネスは微好気条件下で２，３−ｂｕｔａｎｄｉｏｌを生成することが知られている（Ｃｏｎｖｅｒｔｉ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８２，３７０−３７７，２００３）。２，３−ｂｕｔａｎｄｉｏｌの生成経路と触媒反応に関わる酵素群は、既に明らかとなっており、エンテロバクター・アエロゲネスＫＣＴＣ２１９０のゲノム配列（ＮＣ＿０１５６６３）から、それらの遺伝子情報やアミノ酸配列も明らかである。２，３−ｂｕｔａｎｄｉｏｌ生成経路は、α−アセトラクテイトデカルボキシラーゼ（遺伝子名ｂｕｄＡ）、アセトラクテイトシンターゼ（遺伝子名ｂｕｄＢ）、更にはアセトインレダクターゼ（遺伝子名ｂｕｄＣ）より構成される。これらの遺伝子はゲノム配列上でオペロンを形成しており、その発現量を転写因子であるＢｕｄＲ（遺伝子名ｂｕｄＲ）が制御している。ＢｕｄＲとｂｕｄオペロンのプロモーター領域を以下の手順でｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐにクローニングした。ＢｕｄＲとｂｕｄオペロンのプロモーター領域を配列番号２９に示す。
エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２７と配列番号２８に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・１２０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、ＢｕｄＲのＯＲＦ領域とｂｕｄオペロンのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を取得した。
次に、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを鋳型に配列番号３０と配列番号３１に記載したプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＴａＫａＲａ  Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標），９４℃・１０ｓｅｃ．，５４℃・２０ｓｅｃ．，７２℃・２４０ｓｅｃ．，３０ｃｙｃｌｅ）を実施し、アラビノースプロモーターが欠落したｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片を取得した。上記、ＢｕｄＲのＯＲＦ領域とｂｕｄオペロンのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片とアラビノースプロモーターが欠落したｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。アラビノースプロモーターがＢｕｄＲのＯＲＦ領域とｂｕｄオペロンのプロモーター領域に置換されたプラスミドをｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと名付けた。【００９７】
１．７．微好気誘導型イソプレノイド化合物微生物ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株（ＧＩ０８／ｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ）の構築
ＧＩ０８株にイソプレノイド化合物生産能を付与する為、ｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐとｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ（ＷＯ２０１３／１７９７２２参照）をエレクトロポレーション法にて導入した。上記の方法に従った、ＧＩ０８株のコンピテントセルを調整後、ｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐとｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫをエレクトロポレーション法にて導入し、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌとクロラムフェニコール  ６０ｍｇ／ＬのＬＢ培地で選択をし、両プラスミドを保持したＧＩ０８株／ｐＭＷ−Ｐｂｕｄ−ｍｖａＥＳ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫをＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株と命名した。【００９８】
実施例２：イソプレノイド化合物生成微生物ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株とＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株のジャー培養条件
イソプレノイド化合物生成微生物ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株とＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株の菌体増殖のため、ジャー培養を行った。ジャー培養には１Ｌ容積の発酵槽（液相および気相を備える系）を使用した。グルコース培地は表１に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにイソプレノイド化合物生成微生物ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ株とＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ株を塗布し、３７℃にて１６時間培養を実施した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に増殖したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃であり、１５０ｍＬ／ｍｉｎ（酸素濃度：２０％（ｖ／ｖ）の空気を培地中に供給した。ガルバニ式ＤＯセンサーＳＤＯＵ型（エイブル株式会社）を用いて培養液中の溶存酸素（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｉｇｅｎ，ＤＯ）濃度を測定し、ＤＯが任意の濃度になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。ＯＤ値（微生物の増殖の指標）は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。【００９９】
ＤＯ濃度の測定に用いたガルバニ式ＤＯセンサーＳＤＯＵ型の検出限界は、０．００３ｐｐｍである。本明細書中以降、測定されたＤＯ濃度が検出限界以下である場合、「ＤＯ≒０ｐｐｍ」と表記する。【０１００】
【表１】
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【０１０１】
Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。【０１０２】
実施例３：イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生産
３．１．イソプレン生成期への誘導
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ）は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノースプロモーターにて発現させるため、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業）存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生成期への誘導のため、培養液を経時的に分析し、ＯＤ値が１６になった時点で終濃度２０ｍＭとなるようにＬ−アラビノースを添加した。
微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ）は、メバロン酸経路上流遺伝子を微好気誘導型プロモーターであるｂｕｄオペロンのプロモーターにて発現制御させるため、微好気条件下でイソプレン生産量が顕著に向上する。本実施例では、通気量と撹拌数を一定の条件で培養を行い、菌体の増加に伴って培地中の溶存酸素濃度を検出限界以下（ＤＯ≒０ｐｐｍ）とすることで、イソプレン生成期へ誘導した。
上記のとおりイソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレン生成を誘導した後、イソプレン生成のためイソプレノイド化合物生成微生物の培養を継続した。【０１０３】
３．２．発酵ガス中のイソプレン濃度測定
イソプレンは水に不溶性であり容易に揮発するため、液相（培地）中で生成したイソプレンは、速やかに気相中に発酵ガスとして移行する。したがって、生成したイソプレンの測定は、発酵ガス中のイソプレン濃度の定量により行った。具体的には、イソプレン誘導後から適時、発酵ガスをガスバッグにて収集し、ガスクロマトグラフィー（島津社製  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  ＡＦ）により、イソプレン濃度を定量した。イソプレンの検量線は以下のイソプレン標準試料を用いて作成した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。【０１０４】
イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（東京化成、比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。【０１０５】
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  Ｔｕｒｂｏ  Ｍａｔｒｉｘ  ４０）
バイアル保温温度  ４０℃
バイアル保温時間  ３０ｍｉｎ
加圧時間  ３．０ｍｉｎ
注入時間  ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度  ７０℃
トランスファー温度  ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）  １２４ｋＰａ【０１０６】
ガスクロマトグラフィー（島津社製  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ：  長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ  ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度  ３７℃
圧力  ２４．８ｋＰａ
カラム流量  ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法  スプリット  １：０（実測１：１８）
トランスファー流量  ９０ｍＬ
ＧＣ注入量  １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量  ０．１ｍＬ
注入口温度  ２５０℃
検出機  ＦＩＤ（水素  ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気  ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス  ヘリウム  ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度  ２５０℃【０１０７】
３．３．アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物の培養によるイソプレン生成
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ）を上記実施例２に記載されるジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図１で示すように培養中の撹拌数を調節する事により、ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫを培養した培地中の溶存酸素濃度は培養１４時間目から１．７ｐｐｍを維持し、ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫを培養した培地中の溶存酸素濃度は培養９時間目から検出限界以下（ＤＯ≒０ｐｐｍ）となった。図２（Ａ）に示すように、ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫおよび  ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫは、発酵槽（液相および気相を備える系）を用いたジャー培養条件下で良好に増殖した。図２（Ｂ）に示すようにＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫは培養１１時間目から、ＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫは培養８時間目からイソプレン生産が検出され、イソプレン生産が誘導されたことが示された。培養２１時間におけるイソプレンの生成量はＧＩ０８−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＫが６３ｍｇ、ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫが６６ｍｇであった。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物はアラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物と同等のイソプレン生産能を有していることが示された。【０１０８】
実施例４：各種溶存酸素条件下における微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレン生成量
酸素濃度２０％（ｖ／ｖ）の空気を培地中に供給し、培養中の撹拌数を調節することにより、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＧＩ０８−Ｐｂｕｄ／ｉｓｐＳＫ）をＤＯ≒０ｐｐｍ、ＤＯ＝０．７ｐｐｍ、ＤＯ＝１．７ｐｐｍ、ＤＯ＝３．４ｐｐｍの溶存酸素条件下で培養した。培地における溶存酸素濃度の経時変化を図３に示す。培養中のＯＤ値（微生物の増殖の指標）はそれぞれＤＯ≒０ｐｐｍ条件下で３５、ＤＯ＝０．７ｐｐｍ条件下で５５、ＤＯ＝１．７ｐｐｍ条件下で５７、ＤＯ＝３．４ｐｐｍ条件下で５７となり、ＤＯ≒０ｐｐｍ条件に比べて好気培養条件下でＯＤ値が高かった（図４）。ＤＯ≒０ｐｐｍ条件下ではＤＯ≒０ｐｐｍとなる培養９時間目以降でイソプレン生産が誘導され、ＯＤ値が頭打ちになる培養１３時間目以降で高いイソプレン生産性を示した。培養２１時間におけるイソプレン生成量は、ＤＯ≒０ｐｐｍ条件下で６６ｍｇ、ＤＯ＝０．７ｐｐｍ条件下で２１ｍｇ、ＤＯ＝１．７ｐｐｍ条件下で２４ｍｇ、ＤＯ＝３．４ｐｐｍ条件下で２５ｍｇであった（図４）。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物においては溶存酸素濃度が検出限界以下になることでイソプレン生成期に移行し、その後もイソプレン生産が維持されることが示された。【０１０９】
実施例５：微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ）及びリン酸欠乏誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ，ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ）、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ）の構築
５−１）ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
５−１−１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３２、及び配列番号３３にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号３４に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。【０１１０】
５−１−２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３５、及び配列番号３６にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号３７に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。【０１１１】
５−１−３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号３８と配列番号３９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号４０と配列番号４１に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号４２と配列番号４３に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３０６９６３４Ａ１）を鋳型として配列番号４４と配列番号４５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号３８と配列番号４１に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号４２と配列番号４５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。【０１１２】
５−２）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
５−２−１）
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。【０１１３】
ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図５）。【０１１４】
オペロンのプロモーター欠損バリアントを得るために、ｐＭＷ２１９−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、同じ組込み型ベクター中にサブクローニングした。得られたプラスミドのマップを、図６に示す。【０１１５】
異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを構築した。この目的のために、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含むポリリンカーを、ｍｖａＥＳ遺伝子の上流に位置する唯一のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位中に挿入した。この目的を達成するために、プライマー１および２（表２）とポリヌクレオチドキナーゼを用いてアニーリングを行った。得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ポリヌクレオチドキナーゼで５’リン酸化し、得られたリン酸化フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳプラスミドにライゲーション反応により挿入した。得られたｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳプラスミド（図７）は、ｍｖａＥＳ遺伝子の前で所望の配向性を保ちながらプロモーターをクローニングに都合が良いものである。ｌｌｄＤ、ｐｈｏＣおよびｐｓｔＳ遺伝子の調節領域を保持するＤＮＡフラグメントを、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ならびにプライマー３および４、プライマー５および６、ならびにプライマー７および８（表２）をそれぞれ用いて、ＰＣＲにより生成し、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳの適切な制限酵素認識部位中にクローニングした。得られたプラスミドを、図８に示す。クローニングされたプロモーターフラグメントの配列決定を行い、予想されるヌクレオチド配列に正確に対応することを確認した。【０１１６】
５−２−２）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体固定用プラスミドの構築
ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを、プライマー９および１０（表２）、ならびにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ  ＬＡおよびＲｏｓｅ  ＲＥ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲが得られた（図９）。【０１１７】
Ｐｔａｃプロモーターを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲベクター（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ認識部位に挿入した。その結果、染色体固定用発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃが構築された。クローニングしたプロモーターフラグメントの配列を決定し、設計通りの配列であることを確認した。ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃのマップを、図１０に示す。【０１１８】
ＡＴＧ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｇｅｎｅ（ロシア）により化学合成された、レアコドンを同義コドンに置換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙＩｄＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（図１１）を、染色体固定用ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ制限酵素認識部位中にサブクローニングした。化学合成されたＫＤｙＩオペロンを含むＤＮＡ配列を配列番号７０に示す。Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ発現カセットを保持する得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩを、図１２（Ａ）に示す。その後、薬剤耐性マーカー遺伝子を置換する目的でｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲにて対応するフラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを得た（図１２（Ｂ））。【０１１９】
古典的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ［完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照］由来の推定ｍｖｋ遺伝子のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメントを、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。ｍｖｋ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドのマップを、図１３に示す。【０１２０】
５−３）レシピエント株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築
ａｔｔＬｐｈｉ８０およびａｔｔＲｐｈｉ８０に隣接したｋａｎ遺伝子、ならびに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージｐｈｉ８０  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存的な除去（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド［Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３］を鋳型として用いて、プライマー１１および１２、ならびにプライマー１３および１４（表２）をプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨおよびａｍｐＣ遺伝子領域への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。プライマー１５および１６、ならびにプライマー１７および１８（表２）を、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。【０１２１】
並行して、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０  ３２０ｋｂメガプラスミド上に位置するｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）にしたがって行った。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、プライマー１９および２０（表２）を用いる反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と名付けた。プライマー２１および２２（表２）を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）。オリゴヌクレオチド２１および２２を、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図１４（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示す。【０１２２】
上記ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に組み込んだ。プラスミドの組込みを、プライマー２１および２３、ならびにプライマー２２および２４（表２）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図１５（Ａ）に示す。
その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）を介してＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の遺伝形質をＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０へ移行させた。得られた株はテトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＲＡをマーカーとして利用している。ｔｅｔＲＡマーカー遺伝子を含むｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分を、既報のｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミド［Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４］を用いて除去した。その結果、マーカー遺伝子欠損株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図１５（Ｂ）に示す。【０１２３】
５−４）ＳＷＩＴＣＨ株のセットの構築
ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがい、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３−ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍＲクローンを、プライマー１１および１５、ならびにプライマー１１および１７（表２）を用いたＰＣＲ反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０またはΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体改変物のマップを、図１６（Ａ）および（Ｂ）に示す。
ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ（ここで、Ｐｘは、以下の調節領域のうちの一つである：ａｒａＣ−Ｐａｒａ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＰｌｌｄＤ、ＰｐｈｏＣ、ＰｐｓｔＳ）を、既報のプロトコル［Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０］にしたがってｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）およびＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−１およびＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ染色体改変物のマップを図１７に示す。【０１２４】
【表２】
2016084963.tif 000003
【０１２５】
５−５）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
常法に従いＳＷＩＴＣＨ菌のコンピテントセルを作成し、エレクトロポレーションによりムクナ由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドであるｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（ＷＯ２０１３／１７９７２２）を導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭと命名した。【０１２６】
実施例６：リン酸欠乏誘導型イソプレノイド化合物生成微生物ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭおよびアラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭの培養
６−１）イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）の培養
イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）の培養には１Ｌ容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表３に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにこれらのイソプレノイド化合物生成微生物それぞれ塗布し、３４℃にて１６時間培養した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎとなるように通気した。好気培養を行う場合には、ガルバニ式ＤＯセンサーＳＤＯＵ型（エイブル株式会社）を用いて培養液中の酸素濃度（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｉｇｅｎ，ＤＯ）を測定し、ＤＯが任意の濃度になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。ＯＤは分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。【０１２７】
【表３】
2016084963.tif 000004
【０１２８】
Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。【０１２９】
６−２）イソプレン生産期への誘導方法
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業）存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生産期への誘導方法として、培養液を経時的に分析し、ＯＤ値が１６になった時点で終濃度２０ｍＭとなるようにＬ−アラビノースを添加した。
リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をリン欠乏型誘導プロモーターにて発現させるため、培地中のリンがある一定濃度以下になることでイソプレン生産量が顕著に向上する。【０１３０】
６−３）発酵ガス中のイソプレン濃度測定方法と培養液中の総リン濃度の測定方法
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製  Ｆ１０）を用いて測定した。培養液中の総リン濃度はホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。【０１３１】
６−４）アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物のジャー培養におけるイソプレン生成量
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭ）を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）、および発酵ガス中のイソプレン濃度（ｐｐｍ）を測定した（図１９、２０）。培養液中の総リン濃度は図１８に示すように培養９時間目でＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭともに５０ｍｇ／Ｌ以下となり、タイミングを同じくしてイソプレンの生産が検出された。ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭおよびＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭは、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭと比較してイソプレンの生成開始からイソプレン生成最大速度を示すまでの時間が短く、急激にイソプレン生成速度が増加した（図１９）。培養４８時間におけるイソプレンの生成量はＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭが５６３ｍｇ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ｉｓｐＳＭが８６９ｍｇ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ｉｓｐＳＭが８９８ｍｇであった（図１９）。この結果から、リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は総リン濃度が５０ｍｇ／Ｌ以下となる条件下でイソプレン生成が誘導され、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物よりも優れたイソプレン生産能を有していることが示された。【０１３２】
実施例７：微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ）の培養およびアラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ）の培養
７−１）イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養
イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）の培養は６−１）と同様の条件にて行った。【０１３３】
７−２）イソプレン生産期への誘導方法
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物は、６−２）と同様の方法にてイソプレン生産期へ誘導した。
微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）は、酸素濃度２０％（ｖ／ｖ）の空気を培地中に供給し培養中の撹拌数を調節することにより、培地中の溶存酸素をＤＯ≒０ｐｐｍとすることでイソプレン生産期へ誘導した。培地における溶存酸素濃度の経時変化を図２１に示す。【０１３４】
７−３）発酵ガス中のイソプレン濃度測定方法と培養液中の溶存酸素の測定方法
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製  Ｆ１０）を用いて測定した。培養液中の溶存酸素濃度はガルバニ式ＤＯセンサーＳＤＯＵ型（エイブル株式会社）を用いて測定した。【０１３５】
７−４）アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物のジャー培養におけるイソプレン生成量
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭ）および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ｌｌｄ／ｉｓｐＳＭ）を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）、および発酵ガス中のイソプレン濃度（ｐｐｍ）を測定した（図２２、２３）。培養液中の溶存酸素濃度は図２１に示すように培養８時間目でＤＯ≒０ｐｐｍとなり、間もなくしてイソプレンの生産が検出された。培養４８時間におけるイソプレンの生成量はＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ｉｓｐＳＭが５６３ｍｇ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ｉｓｐＳＭが６４２ｍｇであった（図２２）。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物はＤＯ≒０ｐｐｍ以下となる条件でイソプレンの生成が誘導され、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物と同等のイソプレン生産能を有していることが示された。【０１３６】
参考例１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株は、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株〔ＷＯ２０１３／１７９７２２の実施例７−５）を参照〕においてＥＲＧ１２遺伝子を欠損させることにより作製した。具体的には以下のとおりである。【０１３７】
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６をエレクトロポレーション法により導入した。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＫＤ４６を導入し、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、アンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤＤｙＩ株にｐＫＤ４６が導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤＤｙＩ／ｐＫＤ４６株と名付けた。ａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃ遺伝子断片（ＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号３８）を鋳型とし、ＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号３９と配列番号４０から成る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＭＶＫ遺伝子欠損用断片を取得した。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のコンピテントセルを調整後、精製したａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＭＶＫ遺伝子欠損用断片をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションの後、テトラサイクリン耐性を獲得したコロニーを取得した。ＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号４１と配列番号４２から成る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、染色体上のＥＲＧ１２遺伝子が欠損していることを確認した。得られた変異体をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩと名付けた。【０１３８】
参考例２）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクター（ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ）の構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクター（ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ）は次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型としてＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号４９と配列番号５０に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型としてＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号５１と配列番号５２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型としてＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号５３と配列番号５４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを鋳型（プラスミド源）としてＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号５５と配列番号５６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号４９と配列番号５２に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型としてＷＯ２０１３／１７９７２２の配列番号５３と配列番号５６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。【０１３９】
リン酸飢餓誘導
（背景）
本検討では細胞増殖期から物質生産期への移行をリン酸飢餓応答の代謝スイッチにより実現させようとしたものである。一般的に、増殖期と物質生産期では最適な代謝状態は異なっている。従来、各期で最適な代謝状態を実現する方法は知られているが、増殖期に最適な培養条件から物質生産期に最適な培養条件に切り替えても細胞活性の低下等の理由により切り替えがうまくいかないことが多い。【０１４０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて細胞内におけるリン酸濃度の低下は、ＡＴＰ獲得量の低下を引き起こす事が知られている（Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ，  Ｔ．，  Ｌoｆｆｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｈｕｒｌｅｒ，  Ｔ．，  Ｔａｋｏｒｓ，  Ｒ．，  ２０１４．  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ：  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１４．０４．０２５）。その為、ＡＴＰの要求量が高い代謝産物の生産においては、リン酸濃度の低下が代謝産物の生産速度を低下させる事が予測される。【０１４１】
イソプレンの生成経路であるメバロン酸経路ではＡＴＰを基質として多段階のリン酸化反応が存在する（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｃ  Ｙ  Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｊａｙ  Ｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，  ６７４  −  ６８１  （２００６））ため、イソプレン発酵はＡＴＰの要求量が高い代謝物の生産と考えられる。従って、メバロン酸経路を有するイソプレン生産菌を低リン酸濃度で培養することは、イソプレン生産量の低下を引き起こすが容易に懸念された。
リン酸飢餓応答が遺伝子の発現制御に対し迅速に作用する事は文献等で知られている（Ｂａｅｋ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｆｅｂ；１７（２）：２４４−５２；ＷＯ  ２００３０５４１４０  Ａ２）が、リン酸飢餓応答と恒常発現型の遺伝子発現制御を組み合わせた上で、酵素レベルでの阻害などが知られた条件において、リン酸飢餓応答により代謝が迅速に切り替わり、物質生産レベルで素早い応答が観測されることは容易に期待しえない。【０１４２】
（検討により観察された効果の例）
我々の構築したリン酸飢餓誘導型イソプレン生産菌では、対照であるアラビノース誘導型イソプレン生産菌よりも、高いイソプレン濃度が確認された。【０１４３】
また、予期せぬ効果として、応答性（最大イソプレン濃度に到達するまでの時間）が速い結果が観察された。（実施例６、図１９）。これまでのイソプレン発酵における先行事例では主に誘導剤としてＩＰＴＧが使用されている。（ＵＳ  ８，２８８，１４８  Ｂ２、ＵＳ８，３６１，７６２  Ｂ２、ＵＳ８，４７０，５８１  Ｂ２、ＵＳ  ８，５６９，０２６  Ｂ２、ＵＳ  ８，５０７，２３５  Ｂ２、ＵＳ  ８，４５５，２３６  Ｂ２、ＵＳ  ２０１０−０１８４１７８  Ａ１）。これらの事例においては誘導剤を添加後、菌体あたりのイソプレン生産能が最大値に達する、あるいは、イソプレン蓄積が最大値に達するまでの時間はおよそ８時間から２２時間かかっている。これに対し、実施例６に示すリン酸飢餓誘導の手法を用いると、リン酸欠乏後、反応容器内のイソプレンガス濃度の最大値に３から６時間以内に到達した。【０１４４】
【表４】
2016084963.tif 000005
【０１４５】
微好気誘導
（背景）
本検討では細胞増殖期から物質生産期への移行を溶存酸素濃度の欠乏により引き起こされる代謝の変化により実現させようとしたものである。一般的に、微生物が酸素を利用可能な培養条件と利用できない培養条件では細胞の代謝状態が大きく異なっていることが知られている（Ｍａｒｔiｎｅｚ  Ｉ．，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｇ．  Ｎ．，  Ｓａｎ  Ｋ．  Ｙ．．  ２０１０．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ａｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．  １２：４９９−５０９）。従来、好気的な条件や嫌気的な条件にて最適な代謝状態を実現する方法は知られている。このことを応用し、培養中の酸素濃度条件を変更する事により、増殖期に最適な培養条件から物質生産期に最適な培養条件に切り替える事は、コハク酸やアルコール発酵など本質的に嫌気条件の発酵を行うために検討されることが多い（Ｂｌｏｍｂａｃｈ  Ｂ，  Ｒｉｅｓｔｅｒ  Ｔ，  Ｗｉｅｓｃｈａｌｋａ  Ｓ，  Ｚｉｅｒｔ  Ｃ，  Ｙｏｕｎ  ＪＷ，  Ｗｅｎｄｉｓｃｈ  ＶＦ，  Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ＢＪ．  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｍａｙ；７７（１０）：３３００−１０）。これに対し、イソプレンやグルタミン酸など余剰還元力を酸素呼吸により再酸化する事が要求される発酵においては、溶存酸素濃度が欠乏した条件が物質生産に適した代謝状態をもたらす条件と見なさない為、同業他社が積極的に採用する細胞増殖期から物質生産期への移行方法ではない。【０１４６】
より詳細には次のとおりである。好気条件下では、通常、酸素が最終電子受容体として機能する事でＮＡＤＨの再酸化が行われる（呼吸）。微好気条件下などの低酸素濃度環境下では、酸素の供給量が律速となり、細胞内のＮＡＤＨ濃度が向上する。Ｅ．  ｃｏｌｉではこの余剰ＮＡＤＨの再酸化反応として、乳酸やエタノール合成経路が存在し、これらの物質を生産する過程でＮＡＤＨの再酸化を行う。Ｐ．  ａｎａｎａｔｉｓにおいても同様に、低酸素濃度環境下では２，３−ｂｕｔａｄｉｏｌ、乳酸、エタノール等を合成する事で細胞内の酸化還元バランスを維持する。つまり、低酸素濃度環境下では、これらの物質への代謝流量が増加する為、イソプレン生産量が低下する事が推察される。メバロン酸経路を介してグルコースからイソプレンを生産するとき、余剰のＮＡＤＨが生じることが理論収率の計算上明らかである（Ｙａｄａｖ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １４，  ２３３−２４１，  ２０１２）。通常このＮＡＤＨの再酸化には酸素が必要となる為、当業者はあえて、酸素濃度が低い環境下での培養を選択しない。実際、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるイソプレン生産の検討において、培養条件の比較検討の結果、溶存酸素濃度が欠乏した微好気条件下よりも十分な溶存酸素濃度を供給した好気条件下において、菌体生育とイソプレン生産能が向上する事知られている（Ｌｖ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８６，１２８−１３６，２０１４）。【０１４７】
（検討により観察された効果の例）
Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓをイソプレン生産菌の親株として用いた場合、ＧＩ０８／Ｐｂｕｄ／ＩｓｐＳＫは溶存酸素濃度（ＤＯ）がほぼゼロの場合に、成功裏に増殖期からイソプレン生産期に移行する事が示された（実施例４、図４）。【０１４８】
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓをイソプレン生産菌の親株として用いた場合、一定期間、溶存酸素濃度（ＤＯ）がほぼゼロの条件に曝すことにより増殖期からイソプレン生産期に移行し、イソプレン生産期では再び溶存酸素濃度を上昇する事により、イソプレン生産に適した代謝状態へ移行した（実施例７、図２２，２３）。図２３に示すように対照であるアラビノース誘導型イソプレン生産菌よりも、高いイソプレン濃度が確認された。【０１４９】
実施例８：ポリイソプレンの製造
イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した１００ｍＬガラス容器中で、窒素雰囲気下で３５ｇのヘキサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびに１０ｇのシリカゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２３６７７２）、および１０ｇのアルミナ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２６７７４０）と混合する。得られた混合液を、室温で５時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した５０ｍＬガラス容器中に加える。【０１５０】
一方で、グローブ・ボックスにおいて窒素雰囲気下、４０．０μｍｏｌのトリス［ビス（トリメチルシリル）アミド］ガドリニウム、１５０．０μｍｏｌのトリブチルアルミニウム、４０．０μｍｏｌのビス［２−（ジフェニルホスフィノ）フェニル］アミン、４０．０μｍｏｌのトリフェニルカーボニウム・テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート（Ｐｈ３ＣＢＣ６Ｆ５）４）をガラス溶液に用意し、これを５ｍＬのトルエン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２４５５１１）中に溶解させて、触媒液を得る。その後、触媒液をグローブ・ボックスから採り、モノマー液に加え、次いで、これをポリマー反応（５０℃で１２０分間）に供する。【０１５１】
ポリマー反応後、５質量％の２，２’−メチレン−ビス（４−エチル−６−ｔ−ブチルフェノール）（ＮＳ−５）を含む１ｍＬのイソプロパノール溶液を加えて、反応を停止させる。次いで、多量のメタノールをさらに加えて、ポリマーを単離し、７０℃で真空乾燥させて、ポリマーを得る。【０１５２】
実施例９：ゴム組成物の製造
表５に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、１４５℃で３５分間加硫処理する。【０１５３】
【表５】
2016084963.tif 000006
【０１５４】
実施例１０：ＳＣ１７（０）ΔｇｃｄとＳＷＩＴＣＨ−ＰｈｏＣΔｇｃｄの構築とイソプレンシンターゼの導入
Ｐ．アナナティスのｇｃｄ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼをコードしており、Ｐ．アナナティスは好気性増殖中にグルコン酸を蓄積することが知られている（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｍａｙ；３１８（１）：５５−６０）。
プライマーｇｃｄ−ａｔｔＬおよびｇｃｄ−ａｔｔＲ（表６）及び鋳型としてｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｋａｎ−ａｔｔＲプラスミドを用いるＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）により、ｇｃｄ遺伝子を欠損したＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株を構築する。組込み体を確認するため、プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２（表６）を用いる。
ＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株のゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ）を用いて単離し、既報の方法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがってＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ株のマーカーを含まない誘導体中に電気形質転換する。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−Δｇｃｄ（ＫｍＲ）株を得る。プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２を、得られた組込み体のＰＣＲ解析に用いる。カナマイシン耐性マーカー遺伝子を、標準的なλＩｎｇ／Ｘｉｓ媒介手法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがって得る。得られた株を、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株と命名する。
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株のコンピテントセルを標準的な方法にしたがって調製し、ムクナ由来のイソプレンシンターゼ発現用ベクターであるｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（ＷＯ２０１３／１７９７２２）をエレクトロポレーションにより導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物を、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＩｓｐＳＭと命名した。【０１５５】
【表６】
2016084963.tif 000007
【０１５６】
実施例１１：ＳＷＩＴＣＨ−ＰｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭの培養評価
１１−１）イソプレノイド化合物生成微生物のジャー培養条件
イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ）の培養には１Ｌ容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表７に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにこれらのイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ塗布し、３４℃にて１６時間培養した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ  ７.０（アンモニアガスにて制御）、温度３０℃、１５０  ｍＬ/ｍｉｎとなるように通気した。好期培養を行う場合には、ガルバニ式ＤＯセンサーＳＤＯＵ型（エイブル株式会社）を用いて培養液中の酸素濃度（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｉｇｅｎ，  ＤＯ）を測定し、ＤＯ値が５％になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０  ｇ/Ｌ以上になるよう５００  ｇ/Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。ＯＤは分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。４８時間の培養でＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭは、それぞれ６３．９ｇ、７７．８ｇのグルコースを消費した。【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。【０１５９】
１１−２）イソプレン生産期への誘導方法
リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をリン欠乏型誘導プロモーターにて発現させるため、培地中のリンがある一定濃度以下になることでイソプレン生産量が顕著に向上する。【０１６０】
１１−３）発酵ガス中のイソプレン濃度測定方法
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製  Ｆ１０）を用いて測定した。【０１６１】
１１−４）培養液中のグルコン酸濃度の測定方法
培養上清を純水で１０倍希釈し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速液体クロマトグラフ（日立ハイテクノロジーズ）ＥＬＩＴＥ  ＬａＣｈｒｏｍを用いて下記の方法に従って分析した。【０１６２】
＜分離条件＞
カラム  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈ（８ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍＬ）二本直列接続
ガードカラム  ＳＣＲ−１０２Ｈ（６ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍＬ）
移動相  ５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸
流量  ０．８ｍｌ／ｍｉｎ
温度  ５０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｖｏｌｕｍｅ  １０μｌ【０１６３】
＜検出条件＞
緩衝液  ５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸および１００μＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ水溶液
流量  ０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出器  ＣＤＤ−１０ＡＤ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ＋  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ＳＬＯＷ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ５３℃（カラム温度＋３℃）  ｓｃａｌｅ１×２４μＳ／ｃｍ【０１６４】
１１−５）イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ）のジャー培養におけるイソプレン生成量
イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ）を上記のジャー培養条件に従って培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭはイソプレン生成開始後にＯ.Ｄ.値が低下し（図２５（Ａ））、培養４８時間で２-ケトグルコン酸を３０.９g/L蓄積した（図２６）。ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭはイソプレン生成開始後もＯ.Ｄ.は一定の値を示し（図２５（Ａ））、培養４８時間の２-ケトグルコン酸蓄積は１.４g/Lと極めて低い値であった（図２６）。培養４８時間におけるイソプレンの生成量はＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭが１７７１ｍｇ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭが２５５３ｍｇであった（図２５（Ｂ））。この結果から、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭは２-ケトグルコン酸の生成が抑えられ、イソプレンの生成量が向上することが示された。【０１６５】
実施例１２：リナロール合成酵素発現プラスミドの構築
１２−１）Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ（サルナシ）由来リナロールシンターゼ遺伝子の取得
Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ由来リナロールシンターゼ（ＡａＬＩＮＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＧＱ３３８１５３）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  ＡＤＤ８１２９４）は既に知られている。Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ由来リナロールシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号７５、及び配列番号７６に示す。ＡａＬＩＮＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させるようにコドンを最適化し、さらに葉緑体移行シグナルが切断されたＡａＬＩＮＳ遺伝子を設計し、これをｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳの塩基配列を配列番号７７に示す。ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ遺伝子にｔａｃプロモーター領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）を付加したＤＮＡは化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳと名付けた。【０１６６】
１２−２）Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（コリアンダー）由来リナロールシンターゼ遺伝子の取得
Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来リナロールシンターゼ（ＣｓＬＩＮＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＫＦ７００７００）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  ＡＨＣ５４０５１）は既に知られている。Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来リナロールシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号７８、及び配列番号７９に示す。ＣｓＬＩＮＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させるようにコドンを最適化し、さらに葉緑体移行シグナルが切断されたＣｓＬＩＮＳ遺伝子を設計し、これをｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳの塩基配列を配列番号８０に示す。ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ遺伝子にｔａｃプロモーター領域（ｄｅＢｏｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）を付加したＤＮＡは化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳと名付けた。【０１６７】
１２−３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来変異型ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子の取得
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのファルネシル二リン酸シンターゼは、ｉｓｐＡ遺伝子（配列番号８１）によりコードされている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）  １０８：９９５−１０００．）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のファルネシル二リン酸シンターゼにおいて、菌体内のゲラニル二リン酸の濃度を高める変異が明らかにされている（Ｎａｒｉｔａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２６（３）：５６６−５７１．）。本知見を基にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのファルネシル二リン酸シンターゼにおいても、同様の変異体が作出されている（Ｒｅｉｌｉｎｇ  ＫＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２）  ２００−２１２．）。ゲラニル二リン酸生成活性の高いｉｓｐＡ変異体（Ｓ８０Ｆ）遺伝子を効率的に発現させるため、二次構造を解消させるようにコドンを最適化した配列を設計し、これをｉｓｐＡ＊と名付けた。ｉｓｐＡ＊の塩基配列を配列番号８２に示す。ｉｓｐＡ＊遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ＊と名付けた。【０１６８】
１２−４）ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ、及びｉｓｐＡ＊遺伝子の同時発現プラスミドの構築
配列番号８３に示したプライマーと配列番号８５に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳを鋳型にＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ断片を得た。さらに、配列番号８６に示したプライマーと配列番号８７に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ＊を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ＊断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ断片、及びｉｓｐＡ＊断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊を構築した。【０１６９】
１２−５）ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ、及びｉｓｐＡ＊遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号８３に示したプライマーと配列番号８８に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳを鋳型にＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ断片を得た。さらに、配列番号８９に示したプライマーと配列番号８７に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ＊を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ＊断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ断片、及びｉｓｐＡ＊断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊を構築した。【０１７０】
１２−６）リナロール生産株の作製
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄのコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡａＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊あるいはｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｓＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊を導入した。得られた株をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｓＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊と命名した。【０１７１】
実施例１３：ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株由来リナロールシンターゼ発現株のリナロール生産能の評価
実施例１２で得られたＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｓＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊株、及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株のグリセロールストックを融解し、各株の菌体懸濁液５０μＬを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６時間培養した。得られたプレート上の菌体を、イノキュレーティングループ１０μＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のループ部分１／４程度の量を掻き取り、ＡＧＣテクノグラス社製試験管（直径×長さ×肉厚（ｍｍ）＝２５×２００×１．２）中の、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む以下に記載の発酵培地５ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃、１２０ｒｐｍの条件にて２４時間培養した。【０１７２】
【表８】
2016084963.tif 000009
【０１７３】
滅菌完了後に上記Ａ区、Ｂ区、Ｃ区を混合した。試験管に分注した５ｍＬの発酵培地に対して、１ｍＬのミリスチン酸イソプロピル（東京化成工業社製）を添加した。【０１７４】
培養開始から２４時間後に、ミリスチン酸イソプロピル、及び培養上清中のリナロール濃度をガスクロマトグラフＧＣ−２０２５ＡＦ（島津製作所社製）を用いて以下の条件にて測定した。カラムはＤＢ−５（アジレント社製  長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を使用し、リナロール標準液は試薬リナロール（和光純薬社製）を用いて調整した。【０１７５】
気化室温度            ３６０．０℃
注入量                １．０μＬ
注入モード            スプリット  １：１０
キャリアガス          Ｈｅ
制御モード            線速度
圧力                  １２５．５ｋＰａ
全流量                ２０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム流量            １．５９ｍＬ／ｍｉｎ
線速度                ３６．３ｃｍ／ｓｅｃ
パージ流量            ３．０ｍＬ／ｍｉｎ【０１７６】
カラムオーブン温度プログラム  合計時間        ２１．５分
レート（℃／ｍｉｎ）      温度（℃）          ホールド時間（ｍｉｎ）
６５．０                    ５．０
５．０                    １０５．０                  ０．５
３５．０                  ２９７．５                  ２．５
検出器温度            ３７５．０℃
検出器                ＦＩＤ
メイクアップガス      Ｈｅ（３０．０ｍＬ／ｍｉｎ）
水素流量              ４０．０ｍＬ／ｍｉｎ
空気                  ４００．０ｍＬ／ｍｉｎ【０１７７】
リナロール濃度は培地量に換算した値として示す。試験管２本の結果の平均値を表９に示す。対照ベクターｐＡＣＹＣ１７７を導入した対照株ではリナロール生産は認められなかったが、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｓＬＩＮＳ−ｉｓｐＡ＊株においてリナロール生産が確認された。【０１７８】
【表９】
2016084963.tif 000010
【０１７９】
実施例１４：リモネン合成酵素発現プラスミドの構築
１４−１）Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ（アラスカトウヒ）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ由来リモネンシンターゼ（ＰｓＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＤＱ１９５２７５．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＡ８６２４８．１.）は、既に知られている。Ｐ．ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号９０、及び配列番号９１に示す。ＰｓＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳの塩基配列を配列番号９２に示す。ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳと名付けた。【０１８０】
１４−２）Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ（アメリカオオモミ）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来リモネンシンターゼ（ＡｇＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ００６１９３．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＢ７０９０７．１.）は既に知られている。Ａ．ｇｒａｎｄｉｓ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号９３、及び配列番号９４に示す。ＡｇＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳの塩基配列を配列番号９５に示す。ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳと名付けた。【０１８１】
１４−３）Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ（スペアミント）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ由来リモネンシンターゼ（ＭｓＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｌ１３４５９．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＣ３７３６６．１）は既に知られている。Ｍ．ｓｐｉｃａｔａ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号９６、及び配列番号９７に示す。ＭｓＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳの塩基配列を配列番号９８に示す。ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳと名付けた。【０１８２】
１４−４）Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ（ウンシュウミカン）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来リモネンシンターゼ（ＣｕＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ１１０６３７．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＤ２７２５７．１）は既に知られている。Ｃ．ｕｎｓｈｉｕ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号９９、及び配列番号１００に示す。ＣｕＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳの塩基配列を配列番号１０１に示す。ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳと名付けた。【０１８３】
１４−５）Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ（レモン）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来リモネンシンターゼ（ＣｌＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ５１４２８７．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＭ５３９４４．１．）は既に知られている。Ｃ．ｌｉｍｏｎ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号１０２、及び配列番号１０３に示す。ＣｌＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳの塩基配列を配列番号１０４に示す。ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳと名付けた。【０１８４】
１４−６）ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号１０５に示したプライマーと配列番号１０６に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号１０７に示したプライマーと配列番号１０６に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号１０８に示したプライマーと配列番号１０９に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。【０１８５】
１４−７）ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号１１０に示したプライマーと配列番号１１１に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号１０７に示したプライマーと配列番号１１１に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号１０８に示したプライマーと配列番号１０９に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。【０１８６】
１４−８）ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号１１２に示したプライマーと配列番号１１３に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号１０７に示したプライマーと配列番号１１３に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号１０８に示したプライマーと配列番号１０９に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。【０１８７】
１４−９）ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号１１４に示したプライマーと配列番号１１５に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号１０７に示したプライマーと配列番号１１５に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号１０８に示したプライマーと配列番号１０９に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。【０１８８】
１４−１０）ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号１１６に示したプライマーと配列番号１１７に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号１０７に示したプライマーと配列番号１１７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号１０８に示したプライマーと配列番号１０９に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。【０１８９】
１４−１１）リモネン生成株の構築
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄのコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*あるいはｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を導入した。得られた株をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株と命名した。【０１９０】
実施例１５：ＳＷＩＴＣＨ  ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ株由来リモネンシンターゼ発現株のリモネン生産能の評価
実施例１４で得られたＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株のグリセロールストックを融解し、１０μＬを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６時間培養した。得られたプレート上の菌体を、ＮｕｎｃTMディスポーザブルループ１μＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の１ループ程度の量を掻き取った。掻き取った菌体をヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）中の、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む以下の表１０に記載のリモネン発酵用培地１ｍＬに接種し、バイアルはヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）を用いて密栓した。往復振とう培養装置で３０℃、１２０ｒｐｍの条件にてＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株は４８時間培養した。ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株は同様に発酵を行い、これらの株の培養時間を７２時間とした。【０１９１】
【表１０】
2016084963.tif 000011
【０１９２】
滅菌完了後に上記Ａ区、Ｂ区、Ｃ区を混合した。【０１９３】
培養終了後に、ヘッドスペースサンプラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ＴｕｒｂｏＭａｔｒｉｘ  ４０）付きガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所社製  ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０）を用いてヘッドスペースバイアル中のリモネン濃度を測定した。分析条件の詳細を下記に記す。ＧＣのカラムとして、ＨＰ−５ｍｓ  Ｕｌｔｒａ  Ｉｎｅｒｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用し、リモネン標準液は試薬リモネン（東京化成工業製）を用いて調製した。【０１９４】
ヘッドスペースサンプラー
注入時間                ０．０２ｍｉｎ
オーブン温度            ８０℃
ニードル温度            ８０℃
トランスファー温度      ８０℃
ＧＣサイクル時間        ５ｍｉｎ
加圧時間                ３ｍｉｎ
引き上げ時間            ０．２ｍｉｎ
保温時間                ５ｍｉｎ
キャリアガス圧力        １２４ｋＰａ【０１９５】
ガスクロマトグラフィー部
キャリアガス            Ｈｅ
気化室温度              ２００．０℃
温度条件                １７５℃（定温）【０１９６】
質量分析部
イオン源温度            ２５０℃
インターフェイス温度    ２５０℃
検出器電圧              ０．１ｋＶ
検出イオン分子量        ６８
補助イオン分子量        ９３
フィラメント点灯時間    ２．０−３．５ｍｉｎ【０１９７】
リモネン濃度は培地量に換算した値として示した。バイアル２本の結果の平均値を表１１及び１２に示す。対照ベクターｐＡＣＹＣ１７７を導入した対照株ではリモネン生産は認められなかったが、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株においてリモネン生産が確認された。【０１９８】
【表１１】
2016084963.tif 000012
【０１９９】
【表１２】
2016084963.tif 000013
【０２００】
その好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、本願の一部として参照により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２０１】
本発明の方法は、イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造に有用である。
【図１】
2016084963.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
2016084963.tif 000017
【図５】
2016084963.tif 000018
【図６】
2016084963.tif 000019
【図７】
2016084963.tif 000020
【図８】
2016084963.tif 000021
【図９】
2016084963.tif 000022
【図１０】
2016084963.tif 000023
【図１１】
2016084963.tif 000024
【図１２】
2016084963.tif 000025
【図１３】
2016084963.tif 000026
【図１４】
2016084963.tif 000027
【図１５】
2016084963.tif 000028
【図１６】
2016084963.tif 000029
【図１７】
2016084963.tif 000030
【図１８】
2016084963.tif 000031
【図１９】
2016084963.tif 000032
【図２０】
2016084963.tif 000033
【図２１】
2016084963.tif 000034
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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