(57)【要約】  抗原−抗体反応を用いて微小粒子と測定物質との複合体を形成させ精製した後、分光法で測定する免疫分析法と、抗原−抗体反応を用いて微小粒子と測定物質との複合体を形成させ精製した後、質量分析計で測定する質量分析法を備えた場合、免疫分析法用の流路に流れた複合体および質量分析計用の流路に流れた複合体の量が未知であるため、免疫分析法で得られた情報と、質量分析法で得られた情報をマージしても測定物質を正確に定量できない。複合体形成後、質量分析法用の流路と免疫分析法用の流路に複合体を定量する機構を有する。
2016006398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料容器を搬送する試料搬送部と、
試薬容器を搬送する試薬搬送部と、
反応を行う反応容器を搬送する反応溶液搬送部と、
試料容器から試料を反応容器に吸引・吐出する試料プローブと、
試薬容器から試薬を反応容器に吸引・吐出する試薬プローブと、
反応容器内で反応した複合体を分離部に吸引・吐出する反応溶液プローブと、
複合体を免疫分析法用と質量分析法用に定量分離する分離部と、
質量分析法用に分離した複合体を質量分析計により測定する質量分析部と、
免疫分析法用に分離した複合体を光学的手法により測定する免疫分析部と、
データ処理を行う制御部を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の分析装置であって、
前記分離部が、反応容器プローブから吐出された複合体を分離部へ導入するインジェクターと、分岐部を有する流路と、流路に溶媒を送液するポンプと、流路の分岐部に位置するアクティブフロースプリッターと、インジェクターとアクティブフロースプリッターの間の流路上の複合体量をリアルタイムで測定できる粒子分布測定装置と、アクティブフロースプリッターの後段に位置し質量分析部に複合体を送液する質量分析法用流路と、アクティブフロースプリッターの後段に位置し免疫分析部に複合体を送液する免疫分析法用流路から構成されることを特徴とする分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の分析装置であって、
前記分離部が、反応容器プローブから吐出された複合体を分離部へ導入するインジェクターと、流路と、流路に溶媒を送液するポンプと、インジェクターの後段および流路の後段に設けられた２又に分岐した箇所の前段に設けられた粒子分布測定装置と、流路の後段に設けられた２又に分岐した片側の流路であり質量分析部に複合体を送液する質量分析法用流路と、もう片側の流路であり免疫分析部に複合体を送液する免疫分析法用流路と、質量分析法用流路の管の外側に配置された磁石と、免疫分析法用流路の管の外側に配置された磁石から構成されることを特徴とする分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の分析装置であって、
前記分離部が、反応容器プローブから吐出された複合体を分離部へ導入するインジェクターと、流路と、流路に溶媒を送液するポンプと、流路の分岐に位置するアクティブフロースプリッターと、アクティブフロースプリッターの後段に位置し質量分析部に複合体を送液する質量分析法用流路と、アクティブフロースプリッターの後段に位置し免疫分析部に複合体を送液する免疫分析法用流路と、質量分析法用流路に設けられたコールターカウンターと、免疫分析法用流路に設けられた粒子分布測定装置から構成されることを特徴とする分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の分析装置であって、
前記分離部が、反応容器プローブから吐出された複合体を受ける分離容器と、分離容器を搬送する分離容器搬送部と、分離容器から複合体を一定量吸引し、質量分析部および免疫分析部に導入する分離プローブから構成されることを特徴とする分析装置。
【請求項６】
請求項１から５に記載の分析装置のいずれかであって、
制御部は、質量分析部にて求めたデータおよび免疫分析部にて求めたデータから、測定物質の定量を行うことを特徴とする分析装置。
【請求項７】
請求項６に記載の分析装置であって、
質量分析部にて求めたデータは、複合体を構成する測定物質および類似化合物の総量であり、免疫分析部にて求めたデータは、複合体を構成する測定物質および類似化合物の比率であることを特徴とする分析装置。
【請求項８】
微小粒子と測定物質との複合体を形成する第１の工程と、複合体を既知量分離する第２の工程と、分離した複合体を免疫分析法により測定する第３の工程と、分離した複合体を質量分析法により測定する第４の工程と、第３の工程で取得したデータと第４の工程で取得したデータから測定物質の定量を行う第５の工程を備え、
前記第２の工程において、複合体量に基づき、流路を切り換えながら分離を行うことを特徴とする分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の分析方法であって、
第３の工程で得られるデータが複合体を構成する測定物質および類似化合物の総量であり、第４の工程で得られるデータが複合体を構成する測定物質および類似化合物の比率であり、第５の工程で複合体を構成する測定物質および類似化合物の総量および比率のデータから測定物質の定量値を算出することを
特徴とする分析方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の分析方法であって、
微小粒子が磁性ビーズと複数種類の抗体から構成され、複数の測定物質を同時に測定することを特徴とする分析方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の分析方法であって、
測定物質が２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3であり、類似化合物がビタミンＤ2、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2、ビタミンＤ3、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3のいずれかであることを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析装置および分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本技術分野の背景技術として、ＵＳ２００８／０２１７２５４（特許文献１）がある。この発明には、「キャピラリー流路上に配置された回転式の微小粒子（磁性ビーズ）捕捉部と、高速液体クロマトフィ-タンデム質量分析計を備え、微小粒子捕捉部において、抗体をあらかじめ結合させた微小粒子と測定物質が結合した複合体を補足し、洗浄、微小粒子から測定物質を溶出する自動化装置および方法」と記載されている。同じく、本技術分野の背景技術として、特開平１−１８７４５９がある。この発明には、「反応固相上に抗原−抗体反応を起こさせ、抗体をあらかじめ結合させた微小粒子と、抗原−抗体反応により測定物質が結合した複合体を反応固相から遊離させ、分光法により測定し、目的成分の定量を行う免疫分析方法」と記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＵＳ２００８／０２１７２５４
【特許文献２】特開平１−１８７４５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記特許文献１には、抗体をあらかじめ結合させた微小粒子と測定物質が結合した複合体を補足し、洗浄、微小粒子から測定物質の溶出処理後、高速液体クロマトフィ-タンデム質量分析計で測定する技術が記載されている（以降では本技術を質量分析法と記載する）。前記特許文献２には、反応固相上で抗原−抗体反応を起こさせ、抗体をあらかじめ結合させた微小粒子と、抗原−抗体反応により測定物質が結合した複合体を反応固相から遊離させ、分光法で測定する技術が記載されている（以降では本技術を免疫分析法と記載する）。【０００５】
これら２つの技術の精製処理は、抗原−抗体反応を用いて微小粒子と測定物質との複合体を形成させる工程は共通している。一方、測定により得られる情報は、免疫分析法では、微小粒子と測定物質が結合した複合体を分光法により測定することから、複合体と結合した測定物質の総量情報が得られる。免疫分析法は、簡便に高感度な測定技術であることから微量成分の定量測定に適しているが、交差反応性の問題がある。交差反応性は、抗体が本来認識すべき測定物質だけでなく、例えば測定物質の代謝物のように類似した構造を有する分子（類似化合物）も捕捉してしまう現象である。このことは、定量結果が真値より高くなり、測定物質を正確に定量できないことを意味している。質量分析法では、微小粒子と測定物質が結合した複合体から測定物質を溶出させ、質量分析計で測定することから測定物質の質量数の情報およびその質量数の分子のピーク強度が取得される。質量分析法では、類似した構造を有する分子の高精度分離が可能であるために、抗体をあらかじめ結合させた微小粒子と測定物質の交差反応が生じた場合でも測定物質を検出可能である。しかしながら、質量分析法は、測定物質をイオン化する必要がある。生体試料中の測定物質をイオン化する場合、生体試料中の夾雑物によるイオン化阻害（イオンサプレッション）が生じる。このイオンサプレッションが定量精度に大きく影響することから、イオン化効率が測定物質と同等で、かつあらかじめ濃度が既知である内部標準物質が必要である。多くの場合は、内部標準物質には測定物質の安定同位体標識物質が用いられるが、安定同位体標識物質は極めて高価である。【０００６】
本発明のような免疫分析法と質量分析法を組合せた分析装置はこれまで報告はない。免疫分析法と質量分析法を単に組合せただけでは、複合体形成後、質量分析法用の流路と免疫分析法用の流路に複合体を定量（既知量分離）する機構が備わっていない。そのため質量分析法で得られた情報と、免疫分析法で得られた情報をマージする場合、測定物質の正確な定量値を算出することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明の分析装置は試料容器を搬送する試料搬送部と、
試薬容器を搬送する試薬搬送部と、
反応を行う反応容器を搬送する反応溶液搬送部と、
試料容器から試料を反応容器に吸引・吐出する試料プローブと、
試薬容器から試薬を反応容器に吸引・吐出する試薬プローブと、
反応容器内で反応した複合体を分離部に吸引・吐出する反応溶液プローブと、
複合体を免疫分析法用と質量分析法用に定量分離する分離部と、
質量分析法用に分離した複合体を質量分析計により測定する質量分析部と、
免疫分析法用に分離した複合体を光学的手法により測定する免疫分析部と、
データ処理を行う制御部を備えている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、免疫測定法の交差反応性を解消し、質量分析法で高価な内部標準物質を用いることがない分析装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の工程の概要を示す概略構成図である。
【図２】本発明の分析装置の一実施形態に係る概要構成を示す概略図である。
【図３】本発明の分析装置の一実施形態に係る第１の工程を説明する図である。
【図４】本発明の分析装置の一実施形態に係る第２の工程を説明する図である。
【図５】本発明の分析装置の一実施形態に係る第３の工程を説明する図である。
【図６】本発明の分析装置の一実施形態に係る第４の工程を説明する図である。
【図７】本発明の分析装置の一実施形態に係る第５の工程を説明する図である。
【図８】本発明の実施例２に記載の分析装置の一実施形態に係る第２の工程を説明する図である。
【図９】本発明の実施例３に記載の分析装置の一実施形態に係る第２の工程を説明する図である。
【図１０】本発明の実施例４に記載の分析装置の一実施形態に係る概要構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施例の形態を説明するための全図において同一機構を有するものは原則として同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。
【実施例１】
【００１１】
本発明の典型的な一つの実施例として、ビタミンＤ代謝物を測定物質とした場合について図１〜７を用いて説明する。
〔ビタミンＤの説明〕
ビタミンＤは抗くる病因子として発見された脂溶性ビタミンであり、ヒト血中カルシウム濃度の恒常性維持に重要な役割を果たしている。ビタミンＤ3はヒトで生成される。ビタミンＤ2は植物や生合成で生成され、食物やサプリメントとして体内に摂取される。ビタミンＤ3代謝物について説明する。皮膚で７−デヒドロコレステロールから生合成されたビタミンＤ3は肝臓で２５−ヒドロキシビタミンＤ3（２５−ＯＨ  Ｄ3）に代謝され、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合して体内を循環する。血中カルシウム濃度が正常値以下となると２５−ＯＨ  Ｄ3は腎臓で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3［１α，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3］に代謝される。血中カルシウム濃度が回復すると１α位への水酸化は抑制され、２５−ＯＨ  Ｄ3は主として２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ［２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3］に代謝される。ビタミンＤ2もビタミンＤ3と同じ経路で代謝が行われる。つまり、血中の主なビタミンＤ代謝物としては、ビタミンＤ3，２５−ＯＨ  Ｄ3，１α，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3，２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3，ビタミンＤ2，２５−ＯＨ  Ｄ2，１α，２５−（ＯＨ）2  Ｄ2および２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ2の少なくとも８種類存在することになる。臨床の現場では、血中に高濃度で安定に存在する２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2の総量を、血中ビタミンＤ濃度を反映する指標として用いている。
〔従来の免疫分析法の説明〕
従来の免疫分析法を用いたビタミンＤ測定方法は、血中を循環している２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2の総量を測定し、血中ビタミンＤ濃度を反映する指標として用いている。免疫分析法の処理工程は以下のとおりである。生体試料中の測定物質である２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2はＤＢＰと結合しているため、酸、アルカリあるいは還元剤を添加して遊離させる。次に、磁性ビーズに測定物質を特異的に認識する抗体をあらかじめアビジン-ビオチン結合等により結合させ、処理した生体試料を反応させる。抗体が結合した磁性ビーズと測定物質が結合した複合体を磁石により集磁し、洗浄した後に、酵素標識した抗免疫グロブリン抗体によりサンドイッチアッセイを行う。次に、酵素の基質（発光あるいは発色試薬）を添加し、酵素反応の生成物を検出器で検出する。しかしながら、免疫分析法に用いる抗体の種類によっては測定物質のほかに類似化合物も捕捉されるため、定量結果が真値より高くなる場合がある。ここでいう「生体試料」の定義は、血清、血漿、全血、尿、唾液、胆汁、涙および細胞組織の生物学的な供給源由来の生体試料である。
〔従来の質量分析法の説明〕
一方、従来の質量分析法を用いたビタミンＤ測定方法は、血中を循環している２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2のそれぞれの濃度を定量している。定量はあらかじめ既知濃度の安定同位体物質を添加して相対定量を行っている。質量分析法の処理工程は以下のとおりである。生体試料に内部標準物質である２５−ＯＨ  Ｄ3の安定同位体標識物質（例えば２５−ＯＨ  Ｄ3−ｄ６）および２５−ＯＨ  Ｄ2（例えば２５−ＯＨ  Ｄ2−ｄ６）の安定同位体標識物質を既知量添加する。生体試料中の測定物質である２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2はＤＢＰと結合しているため、酸、アルカリあるいは還元剤を添加して遊離させる。次に、磁性ビーズに測定物質を特異的に認識する抗体をあらかじめアビジン-ビオチン結合等により結合させ、処理した生体試料を反応させる。抗体が結合した磁性ビーズと測定物質が結合した複合体を磁石により集磁し、洗浄した後に、酸、アルカリあるいは有機溶媒を添加し、抗体から遊離した測定物質および内部標準物質を質量分析計に供試する。２５−ＯＨ  Ｄ3の定量は２５−ＯＨ  Ｄ3と２５−ＯＨ  Ｄ3−ｄ６の比率を算出し、あらかじめ既知濃度の２５−ＯＨ  Ｄ3を含む検量線用の試料を測定し作成した検量線を用いて、２５−ＯＨ  Ｄ3の濃度を算出する。２５−ＯＨ  Ｄ2も同様に濃度を算出する。
〔組合せた場合の説明〕
本実施例は、図１に示すように、抗原−抗体反応を用いて微小粒子と測定物質との複合体を形成させ精製する第１の工程１０１と、第１の工程で精製した複合体を定量的に分離する第２の工程１０２と、分離した複合体の総量の情報を免疫分析法により取得する第３の工程１０３と、分離した複合体から測定物質および類似化合物を溶出させ、測定物質と類似化合物との比率の情報を質量分析法により取得する第４の工程１０４と、第３の工程で取得した複合体の総量と第４の工程で取得した測定物質と類似化合物との存在量比を用いて測定物質の正確な定量を行う第５の工程１０５から構成される。【００１２】
ここでいう「抗原−抗体反応」の定義は、抗原（測定対象成分）と抗体との結合反応を利用して、測定対象成分と不純物を分離する方法である。
〔分析装置についての説明〕
本実施例の装置構成について図２および３を用いて説明する。試料容器２０２を搬送する試料搬送部２０１と、試薬容器２０４を搬送する試薬搬送部２０３と、各種反応を行う反応容器２０６を搬送する反応溶液搬送部２０５と、試料容器２０２から試料を反応容器２０６に吸引・吐出する試料プローブ２０７と、試薬容器２０４から各種試薬を反応容器２０６に吸引・吐出する試薬プローブ２０８と、反応容器２０６内で反応した複合体を分離部２１０に吸引・吐出する反応溶液プローブ２０９と、複合体を免疫分析法用と質量分析法用に定量分離する分離部２１０と、質量分析法用に分離した複合体を質量分析計により測定する質量分析部２１１と、免疫分析法用に分離した複合体を光学的手法により測定する免疫分析部２１２と、本装置を構成している各々の部位の自動一括制御およびデータ処理を行う制御部２１３から構成される。試料搬送部２０１、試薬搬送部２０３および反応容器搬送部２０５は搬送機構として、無限軌道上を移送するディスク方式を例にして説明するが、それに限られず、Ｘ−Ｙ軸を移送する搬送機構、またはベルトコンベア方式の搬送機構であってもよい。なお、反応容器内での各種反応時に攪拌を行う攪拌部、各種プローブを洗浄する洗浄部は特に図示しないが装置内に設置されている。【００１３】
試料容器２０２には、生体試料、本実施例では検体である血清または血漿、キャリブレーター試料およびＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）試料が格納されている。試薬容器２０４には、測定物質であるビタミンＤ代謝物をＤＢＰから遊離させる試薬である１  ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウム、抗体結合済み磁性ビーズおよび洗浄溶液である１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）が格納されている。抗体結合済み磁
性ビーズは、磁性ビーズ３０１に抗ビタミンＤ抗体３０４を、あらかじめアビジン３０２およびビオチン３０３を用いたアビジン-ビオチン結合により構成される。本実施例では１０  μｇのＩｍｍｕｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｋ社の抗２５−ＯＨ  Ｄ3抗体を、５０  μＬの１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）にスラリー状に懸濁した直径３００  ｎｍの磁性ビーズ（１  ｍｇ相当）にアビジン−ビオチン反応で結合した抗体結合済み磁性ビーズを用いた。ＤＢＰから遊離させる試薬は、本実施例のように水酸化ナトリウムを用いるほかに、酸としてギ酸、トリフルオロ酢酸、還元剤としてジチオトレイトール、メルカプトエタノール、変性剤として尿素、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウムを用いることもできる。磁性ビーズの表面修飾は、本実施例のようにアビジン−ビオチン反応を行うアビジンで表面修飾されている磁性ビーズを用いるほかに、ハイドロキシサクシミド基、１，１−カルボニルジイミダゾール基、ｐｒｏｔｅｉｎＡ、ｐｒｏｔｅｉｎＧおよび抗マウス抗体で表面修飾された磁性ビーズを用いることもできる。洗浄溶液は、本実施例のようにリン酸緩衝生理食塩水を用いるほかに、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、水を用いることもできる。
〔第１の工程についての説明〕
本実施例の測定の流れについて説明する。第１の工程１０１について説明する。第１の工程１０１は、抗原−抗体反応を用いて磁性ビーズと測定物質との複合体を形成させることにより精製を行う。試料搬送部２０１および反応容器搬送部２０５が試料プローブ２０７下の所定位置まで回転する。そして、試料プローブ２０７を用いて、試料容器から１００  μＬの血清（またはキャリブレーター試料、またはＱＣ試料）を反応容器２０６に吸引・吐出する。次に、試薬搬送部２０３および反応容器搬送部２０５が試薬プローブ２０８下の所定位置まで回転する。そして、試薬プローブ２０８を用いて、試薬容器２０４から２０  μＬの１  ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウムを血清が格納された反応容器２０６に吸引・吐出する。次に、試薬プローブ２０８を用いて、試薬容器２０４から５０  μＬの１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）にスラリー状に懸濁した抗体結合済み磁性ビーズ（１  ｍｇ相当）を血清に水酸化ナトリウムが添加された反応容器２０６に吸引・吐出する。そして、反応容器２０６内にて、生体試料中の測定物質と抗体結合済み磁性ビーズを１０分間常温で反応させ、測定物質と抗体結合済み磁性ビーズが結合した複合体を形成する。次に、反応容器搬送部２０５が磁石２１４下の所定位置まで回転し、反応容器２０６内の複合体を集磁した後、試薬プローブ２０８を用いて、反応容器２０６から反応溶液を吸引し、廃液として吐出する。試薬搬送部２０３および反応容器搬送部２０５が試薬プローブ２０８下の所定位置まで回転する。そして、試薬プローブ２０８を用いて、試薬容器２０４から２００  μＬの１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）を吸引・吐出し、複合体の洗浄を行い、非特異反応を低減する。この集磁−洗浄動作は３回行う。次に、反応溶液搬送部２０５が反応溶液プローブ２０９下の所定位置まで回転する。そして、反応溶液プローブ２０９を用いて、反応容器２０６内の１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）にスラリー状に懸濁した複合体を分離部２１０に全量吸引・吐出する。
〔第２の工程についての説明〕
第２の工程１０２について説明する。第２の工程１０２は、第１の工程で精製した複合体を定量的に分離する。分離部２１０について図４を用いて説明する。分離部２１０は、反応容器プローブ２０９から吐出された複合体を分離部２１０へ導入するインジェクター４０１と、流路４０２と、インジェクター４０１の前段に位置し流路４０２に溶媒を送液するポンプ４０３と、流路４０２の後段に位置し流路４０２の分岐に位置するアクティブフロースプリッター４０４と、インジェクター４０１とアクティブフロースプリッター４０４の間の流路４０２上の複合体量をリアルタイムで測定できる粒子分布測定装置（例えば、コールターカウンター等）４０５と、アクティブフロースプリッター４０４の後段に位置し質量分析部２１１に複合体を送液する質量分析法用流路４０６と、アクティブフロースプリッター４０４の後段に位置し免疫分析部２１２に複合体を送液する免疫分析法用流路４０７から構成される。複合体量の測定に用いる粒子分布測定装置４０５は、流路４０２内に電解質溶液、本実施例では１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）が送液されており、コールターカウンター４０５内の細孔を複合体が通過した際の電気抵抗の変化を測定することで複合体量を検出する。分離部２１０は、粒子分布測定装置４０５の測定値、コールターカウンター４０５からアクティブフロースプリッター４０４までの距離、流路４０２の内径、流路４０２内を流れる電解質溶液の流速およびアクティブフロースプリッター４０４の切換時間に基づいて、質量分析法用流路４０６と免疫分析法用流路４０７へ送液された複合体量を算出する機構を備える。【００１４】
本実施例では、粒子分布測定装置４０５からアクティブフロースプリッター４０４までの距離を３０ｃｍ、流路４０２の内径を０．２  ｍｍ、流路４０２を流れる電解質溶液の速度を０．１  ｍＬ／ｍｉｎ、アクティブフロースプリッター４０４を免疫分析法用流路４０７方向に６秒間開き、複合体を送液した後に質量分析法用流路４０６に切換えるように設定し、等量の複合体が質量分析法用流路４０６と免疫分析法用の流路４０７に分離するようにした。質量分析法用流路４０６および免疫分析法用流路４０７に到達する複合体量は、アクティブフロースプリッター４０４の切換時間を変更することで調整する。
〔第３の工程についての説明〕
第３の工程１０３について説明する。第３の工程１０３は、分離した複合体の総量の情報を免疫分析法により取得する。免疫分析部２１２について図５を用いて説明する。免疫分析部２１２は、磁石５０１と、免疫分析法用流路４０７から送液された複合体および免疫分析法用試薬を保持する免疫分析法用試薬容器５０２と、免疫分析法用試薬容器５０２を搬送する免疫分析法用試薬搬送部５０３と、免疫分析法用試薬が保管された免疫分析法用試薬容器５０２から複合体が保管された免疫分析法用試薬容器５０２へ免疫分析法用試薬を吸引・吐出する免疫分析法用プローブ５０４と、反応槽５０５中の複合体に光を照射する光源５０５と、測光器５０６から構成される。免疫分析法用試薬には、１次抗体に選択的に結合する２次抗体である抗グロブリン抗体が用いられる。この２次抗体は蛍光標識済みであり、分光法で定量することができる。【００１５】
免疫分析部２１２の測定の流れについて説明する。免疫分析法用流路４０７から送液された複合体は空の免疫分析法用試薬容器５０２に保管される。免疫分析法用試薬搬送部５０３が免疫分析法用プローブ５０４下の所定位置まで回転する。そして、免疫分析法用プローブ５０４を用いて、試料容器から５０  μＬの１０  ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）に溶解した標識済みの２次抗体を、複合体が保管された免疫分析法用試薬容器５０２に吸引・吐出する。免疫分析法用試薬搬送部５０３が磁石５０１下の所定位置まで回転し、複合体−２次抗体を集磁し、複合体−２次抗体の洗浄が行われる。次に、免疫分析法用試薬搬送部５０３が光源５０５下の所定位置まで回転し、光源５０５から光が照射され、測光器５０６により測光される。第３の工程では免疫分析法により、第２の工程１０２で分離した複合体の総量のデータが算出される。本実施例で用いたＩｍｍｕｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｋ社の抗２５−ＯＨ  Ｄ3抗体は、２５−ＯＨ  Ｄ3が１００％、２５−ＯＨ  Ｄ2が６８％、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3が１００％、ビタミンＤ2が０．３％交差反応すると添付文書に記載がある。つまり、前記抗体を結合させた微小粒子と測定物質が結合した複合体を用いて免疫分析法を行う場合、測定物質である２５−ＯＨ  Ｄ3および２５−ＯＨ  Ｄ2の総量以外の２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2も結合することとなり、複合体を形成している２５−ＯＨ  Ｄ3、２５−ＯＨ  Ｄ2、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2の総量の定量値が算出される。
〔第４の工程についての説明〕
第４の工程１０４について説明する。第４の工程１０４は、分離した複合体から測定物質および類似化合物を溶出させ、測定物質と類似化合物の比率の情報を質量分析法により取得する。質量分析部２１１について図６を用いて説明する。質量分析部２１１は、質量分析法用流路４０６と連結している流路６０１と、流路６０１の管の外側に配置し、複合体を集磁する磁石６０２と、測定物質に高圧力と高電圧を印加しイオン化するイオン源６０３と、質量分析計６０４から構成される。流路６０１に送液された複合体は、流路６０１の管の外側に配置された磁石６０２で集磁し、流路６０１内の溶媒を溶出溶媒である０．１％グリシン塩酸塩に変更することで、複合体上の抗体と結合している測定物質および類似化合物を遊離させ、イオン源６０３に導入する。イオン源６０３でイオン化した後に質量分析計６０４で質量数が測定される。溶出溶媒は本実施例のようにグリシン塩酸塩を用いるほかに、ギ酸等の酸性水溶液、水酸化ナトリウム等の塩基性水溶液およびメタノール等の有機溶媒を用いることもできる。イオン源６０３でのイオン化方法は、本実施例では、本実施例では大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ；Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いた。他のイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ；Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いることもできる。質量分析計６０４は、本実施例では、三連四重極型質量分析計を用いて、ＳＲＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードにより測定対象成分の解析を行った。質量分析計６０４は、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計等を用いることもできる。第２の工程１０２で分離した複合体から遊離した測定物質である２５−ＯＨ  Ｄ2、２５−ＯＨ  Ｄ3、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2のトランジッションに基づいたピーク強度またはピーク面積のデータが算出される。本実施例では、三連四重極型質量分析計を用いてＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＲＭ)モードによりＭＳ／ＭＳ分析され、各測定物質のトランジッションは２５−ＯＨ  Ｄ3がＱ１／Ｑ３＝４０１．３／３８３．３、２５−ＯＨ  Ｄ2がＱ１／Ｑ３＝４１３．３／３９５．３、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3が４１７．３／３９９．３、ビタミンＤ2が３９７．３／３７９．３に設定し、ピーク強度のデータを得た。各ピーク強度またはピーク面積は、複合体に結合していた２５−ＯＨ  Ｄ2、２５−ＯＨ  Ｄ3、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2の存在量比を示す。【００１６】
抗体から遊離した測定物質および類似化合物を、液/液抽出または固相抽出の精製、または誘導体化の処理を行う場合もある。ここでいう「固相抽出」の定義は、溶液または懸濁液（移動相）に含まれる溶質が固体（固定相）の中を流れる間に、それぞれの親和性に応じて吸着したり、そのまま流れたりすることを利用して測定対象成分と不純物を分離する方法である。「液／液抽出」の定義は、溶液または懸濁液（移動相）に含まれる溶質と他の溶媒に対する溶解度の違い（主には水と非極性有機溶媒）を利用して測定対象成分と不純物を分離する方法である。誘導体化は、クックソン型試薬、例えば４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の誘導体化試薬を抗体から遊離した測定物質および内部標準物質に添加し、誘導体化することでイオン化効率を向上させる方法も用いられる。この場合、各測定物質のトランジッションは２５−ＯＨ  Ｄ3−ＰＴＡＤ誘導体がＱ１／Ｑ３＝５７６．３／２９８．３、２５−ＯＨ  Ｄ2−ＰＴＡＤ誘導体がＱ１／Ｑ３＝５８８．３／２９８．３、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3−ＰＴＡＤ誘導体が５９２．３／２９８．３、ビタミンＤ2−ＰＴＡＤ誘導体が５７２．３／２９８．３に設定される。ここでいう「誘導体化」の定義は、測定物質に官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなど、構造や性質を大幅に変えない程度の改変をすることである。誘導体化はＭＳの感度が不足する場合に、イオン化効率向上および測定物質の質量数を高質量域に変化させて夾雑物によるイオンサプレッションの抑制を行うために用いられる。誘導体化試薬として、ＰＴＡＤのほかには、例えば、１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＴＡＤ）、４−アミノ−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＡＴＡＤ）、４−ペンタフルオロベンジル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＦＢＴＡＤ）、４−［４−（６−メトキシ−２−ベンゾキサゾリル）フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＢＯＴＡＤ）および４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノザリル）エチル−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）がある。
〔第５の工程についての説明〕
第５の工程１０５について図７を用いて説明する。第５の工程１０５は、第３の工程で取得した複合体の総量のデータと第４の工程で取得した測定物質と類似化合物との存在量比のデータを用いて測定物質の正確な定量を行う。第３の工程１０３で免疫分析法により取得した定量値は３０  ｎｇ／ｍＬであった。一方、第４の工程１０４で質量分析法により取得したピーク面積値は、２５−ＯＨ  Ｄ3が１，４０４，０００、２５−ＯＨ  Ｄ2が１，１７０，０００、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3が２５，７４０、ビタミンＤ2が２６０であった。ピーク強度の存在量比は、２５−ＯＨ  Ｄ3が５４％、２５−ＯＨ  Ｄ2が４５％、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3が０．９９％、ビタミンＤ2が０．０１％となる。第２の工程１０２では等量の複合体が質量分析法用流路４０６と免疫分析法用流路４０７へ分離するように設定しており、質量分析部２１１と免疫分析部２１２に導入された複合体量は同量である。つまり、第３の工程１０３で取得した定量値と、第４の工程１０４で取得したピーク強度の存在比を用いて、２５−ＯＨ  Ｄ2、２５−ＯＨ  Ｄ3、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2の正確な定量値を算出すると、２５−ＯＨ  Ｄ3が１６．２  ｎｇ／ｍＬ、２５−ＯＨ  Ｄ2が１３．５  ｎｇ／ｍＬ、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3が０．２９７  ｎｇ／ｍＬ、ビタミンＤ2が０．００３  ｎｇ／ｍＬとなる。第３の工程１０３で免疫分析法により取得した定量値３０  ｎｇ／ｍＬは２５−ＯＨ  Ｄ2、２５−ＯＨ  Ｄ3、２４，２５−（ＯＨ）2  Ｄ3およびビタミンＤ2の総量を示すが、第５の工程１０５において第３の工程で取得した複合体の総量のデータと第４の工程で取得した測定物質と類似化合物との存在量比のデータを用いて測定物質の定量値を算出することで、正確な定量値を得ることができる。【００１７】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。【００１８】
また、上記の各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（ＳｏｌｉＤ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｒｉｖｅ） 等の記憶装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記憶媒体に置くことができる。【００１９】
また、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。【００２０】
以上、本実施例で説明したように、本発明は、第３の工程１０３で取得した免疫分析法の定量値と、第４の工程１０４で質量分析法により取得した測定物質と類似化合物とのピーク強度比に基づいて定量値を算出することで、免疫測定法の交差反応性を解消し、質量分析法で高価な内部標準物質を用いることがない分析装置を提供することができる。
【実施例２】
【００２１】
次に、本発明の実施例２である分析装置について図８を用いて説明する。図８は、本発明の実施例２に記載の分析装置の一実施形態に係る第２の工程を説明する図である。本実施例の分析装置の構成を、実施例１と異なる点について説明する。本実施例は、第２の工程１０２の分離部２１０において、質量分析法用流路４０６と免疫分析法用流路４０７の流路の切換に電磁石を用いる点が異なる。本実施例は実施例１と比べて、第２の工程１０２のみが異なり、そのほかの工程は同様である。本実施例の分析装置の構成を説明する。【００２２】
本実施における分離部２１０は、反応容器プローブ２０９から吐出された複合体を分離部２１０へ導入するインジェクター４０１と、流路４０２と、インジェクター４０１の前段に位置し流路４０２に溶媒を送液するポンプ４０３と、インジェクター４０１の後段および流路４０２の後段に設けられた２又に分岐した箇所の前段に設けられたコールターカウンター４０５と、流路４０２の後段に設けられた２又に分岐した片側の流路であり質量分析部２１１に複合体を送液する質量分析法用流路４０６と、もう片側の流路であり免疫分析部２１２に複合体を送液する免疫分析法用流路４０７と、質量分析法用流路４０６の管の外側に配置された電磁石８０１と、免疫分析法用流路４０７の管の外側に配置された電磁石８０２から構成される。電磁石８０１および電磁石８０２は、電磁石８０１および電磁石８０２を流れる電流のＯＮ/ＯＦＦで磁力を制御することで、質量分析法用流路４０６および免疫分析法用流路４０７を流れる複合体量を制御する仕組みである。【００２３】
分離部２１０は、粒子分布測定装置４０５の測定値、粒子分布測定装置４０５から電磁石８０１および電磁石８０２までの距離、流路４０２の内径、流路４０２内を流れる電解質溶液の流速および電磁石８０１および電磁石８０２の電流のＯＮ/ＯＦＦ時間に基づいて、質量分析法用流路４０６と免疫分析法用流路４０７へ送液された複合体量を算出する機構を備える。
【実施例３】
【００２４】
次に、本発明の実施例３である分析装置について図９を用いて説明する。図９は、本発明の実施例３に記載の分析装置の一実施形態に係る第２の工程を説明する図である。本実施例の分析装置の構成を、実施例１と異なる点について説明する。本実施例は、第２の工程１０２の分離部２１０において、複合体量の測定に用いる粒子分布測定装置が、質量分析法用流路４０６と免疫分析法用流路２０７の流路にそれぞれ設けられている点が異なる。本実施例は実施例１と比べて、第２の工程１０２のみが異なり、そのほかの工程は同様である。本実施例の分析装置の構成を説明する。【００２５】
本実施における分離部２１０は、反応容器プローブ２０９から吐出された複合体を分離部２１０へ導入するインジェクター４０１と、流路４０２と、インジェクター４０１の前段に位置し流路４０２に溶媒を送液するポンプ４０３と、流路４０２の分岐に位置するアクティブフロースプリッター４０４と、アクティブフロースプリッター４０４の後段に位置し質量分析部２１１に複合体を送液する質量分析法用流路４０６と、アクティブフロースプリッター４０４の後段に位置し免疫分析部２１２に複合体を送液する免疫分析法用流路４０７と、質量分析法用流路４０６に設けられた粒子分布測定装置９０１と、免疫分析法用流路４０７に設けられた粒子分布測定装置９０２から構成される。【００２６】
分離部２１０は、質量分析法用流路４０６および免疫分析法用流路４０７上に設けられた粒子分布測定装置９０１および粒子分布測定装置９０２で複合体量を測定し、質量分析部２１１および免疫分析部２１２へ導入された複合体量を算出する機構を備える。
【実施例４】
【００２７】
次に、本発明の実施例４である分析装置について図１０を用いて説明する。図１０は本発明の実施例４に記載の分析装置の一実施形態に係る概要構成を示す概略図である。本実施例の分析装置の構成を、実施例１と異なる点について説明する。本実施例は、第２の工程１０２の分離部２１０において、オフラインで専用の分離プローブ１００３を用いて反応容器２０６から複合体を分離容器１００２へ吸引・吐出することで分離する点が異なる。本実施例は実施例１と比べて、第２の工程１０２のみが異なり、そのほかの工程は同様である。本実施例の分析装置の構成を説明する。【００２８】
本実施における分離部２１０は、反応容器プローブ２０９から吐出された複合体を受ける分離容器１００２と、分離容器１００２を搬送する分離容器搬送部１００１と、分離容器１００２から複合体を一定量吸引し、質量分析部２１１および免疫分析部２１２に導入する分離プローブ１００３から構成される。【００２９】
本実施例の測定の流れについて説明する。反応容器搬送部２０５および分離容器搬送部１００１が反応容器プローブ２０９下の所定位置まで回転する。そして、試薬プローブ２０９を用いて、反応容器２０６からスラリー状に懸濁した複合体を全量、分離容器１００２に吸引・吐出する。次に、分離容器搬送部１００１が分離プローブ１００３下の所定位置まで回転し、分離プローブ１００３を用いて、分離容器１００２から複合体を一定量、質量分析部２１１および免疫分析部２１２に導入する。分離プローブ１００３は、複合体を一定量吸引・吐出できるため、質量分析部２１１および免疫分析部２１２へ導入された複合体量を算出することができる。
【実施例５】
【００３０】
次に、本発明の実施例５である分析装置について説明する。本実施例は、複数種類の抗体が結合した磁性ビーズを用いて、複数の測定物質を同時に測定する点が異なる。本実施例では、抗トリヨードサイロニン抗体（抗ＦＴ３抗体）が結合した磁性ビーズおよび抗サイロキシン抗体（抗ＦＴ４抗体）が結合した磁性ビーズを混合し、測定する。本実施例は実施例１と比べて、複数種類の抗体が結合した磁性ビーズを用いる点が異なり、そのほかの工程は同様である。まず、あらかじめ抗体を結合させた磁性ビーズとトリヨードサイロニン、サイロキシンおよび類似化合物が結合した複合体を形成する。そして、分離部２１０により免疫分析部２１１と、質量分析部２１２に複合体を分離し、複合体を測定することで、免疫分析部２１１ではトリヨードサイロニン、サイロキシンおよび類似化合物の総量が定量され、質量分析部２１２ではトリヨードサイロニン、サイロキシンおよび類似化合物のピーク強度比が測定される。トリヨードサイロニン、サイロキシンおよび類似化合物の総量とピーク強度比からトリヨードサイロニンおよびサイロキシンの定量が行われる。本実施例では、抗体の交差反応性を軽減したトリヨードサイロニンおよびサイロキシンの正確な定量値が算出されることで、精度良い甲状腺疾患のバイオマーカーのパネル検査が可能となる。また、これまでは免疫分析法を用いて、トリヨードサイロニンおよびサイロキシンをそれぞれ測定していたが、本実施例により同時測定が可能となりスループットが向上する。
【符号の説明】
【００３１】
１０１  第１の工程
１０２  第２の工程
１０３  第３の工程
１０４  第４の工程
１０５  第５の工程
２０１  試料搬送部
２０２  試料容器
２０３  試薬搬送部
２０４  試薬容器
２０５  反応溶液搬送部
２０６  反応容器
２０７  試料プローブ
２０８  試薬プローブ
２０９  反応容器プローブ
２１０  分離部
２１１  質量分析部
２１２  免疫分析部
２１３  制御部
２１４  磁石
３０１  磁性ビーズ
３０２  アビジン
３０３  ビオチン
３０４  抗ビタミンＤ抗体
３０５  測定物質
３０６  類似化合物
４０１  インジェクター
４０２  流路
４０３  ポンプ
４０４  アクティブフロースプリッター
４０５  粒子分布測定装置
４０６  質量分析法用流路
４０７  免疫分析法用流路
５０１  磁石
５０２  免疫分析法用試薬容器
５０３  免疫分析法用試薬容器搬送部
５０４  免疫分析法用プローブ
５０５  光源
５０６  測光部
６０１  流路
６０２  磁石
６０３  イオン源
６０４  質量分析計
８０１  電磁石（免疫分析法用流路）
８０２  電磁石（質量分析法用流路）
１００１  分離容器搬送部
１００２  分離容器
１００３  分離プローブ
【図１】
2016006398.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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