(57)【要約】  妊娠母体より採取された生体試料から得た染色体ＤＮＡを増幅して一次増幅産物を得る一次増幅工程と、一次増幅産物を鋳型として複数の目的領域の多重増幅を行い二次増幅産物を得る二次増幅工程と、二次増幅産物の両末端に標識を付加し標識された二次増幅産物を得る工程と、標識された二次増幅産物を鋳型として標識にアニールするプライマー対を用いて増幅を行い三次増幅産物を得る三次増幅工程と、三次増幅産物から複数の目的領域の塩基配列と増幅量とを決定する工程と、を含み、一次増幅工程がＤＮＡの総量を６０００倍〜３００００倍に増幅し、二次増幅工程がＤＮＡの総量を３倍〜１５０倍に増幅する、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠母体より採取された生体試料から得た染色体ＤＮＡを増幅して一次増幅産物を得る一次増幅工程と、
前記一次増幅産物を鋳型として、複数のプライマー対を用いて複数の目的領域の多重増幅を行い、二次増幅産物を得る二次増幅工程と、
前記二次増幅産物の両末端に、オリゴヌクレオチドである第一の標識を付加し、標識された二次増幅産物を得る第一付加工程と、
前記標識された二次増幅産物を鋳型として、前記第一の標識にアニールするプライマー対を用いて増幅を行い、三次増幅産物を得る三次増幅工程と、
前記三次増幅産物から前記複数の目的領域の塩基配列と増幅量とを決定する配列解析工程と、
を含み、
前記一次増幅工程が、ＤＮＡの総量を６０００倍以上３００００倍以下に増幅する工程であり、
前記二次増幅工程が、ＤＮＡの総量を３倍以上１５０倍以下に増幅する工程である、
胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項２】
前記三次増幅工程が、ＤＮＡの総量を６倍以上２４倍以下に増幅する工程である、請求項１に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項３】
前記配列解析工程が、次世代シークエンサーを用いて行われる、請求項１又は請求項２に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項４】
前記三次増幅産物の両末端に、オリゴヌクレオチドである第二の標識を付加し、標識された三次増幅産物を得る第二付加工程を、さらに含む、
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項５】
前記三次増幅工程で用いるプライマーが、前記第二の標識の塩基配列を５’末端に有し、
前記三次増幅工程を行うことにより、前記三次増幅産物の両末端に前記第二の標識が付加されて、前記標識された三次増幅産物が得られ、こうして前記三次増幅工程と前記第二付加工程とが共に行われる、
請求項４に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項６】
前記二次増幅工程で用いるプライマーが、前記第一の標識の塩基配列を５’末端に有し、
前記二次増幅工程を行うことにより、前記二次増幅産物の両末端に前記第一の標識が付加されて、前記標識された二次増幅産物が得られ、こうして前記二次増幅工程と前記第一付加工程とが共に行われる、
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項７】
前記一次増幅工程が、前記染色体ＤＮＡから全ゲノム増幅を行う工程である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項８】
前記染色体ＤＮＡが、１細胞から得た染色体ＤＮＡであり、前記一次増幅工程が、１細胞から全ゲノム増幅を行う工程である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項９】
前記生体試料が、血液であり、前記染色体ＤＮＡが、血液中の細胞から得た染色体ＤＮＡである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項１０】
前記血液中の細胞が有核赤血球である、請求項９に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【請求項１１】
前記血液中の細胞が、密度勾配遠心分離と画像解析とにより単離された細胞である、請求項９又は請求項１０に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前遺伝学的検査として、従来、羊水穿刺により採取した羊水から胎児由来細胞を単離し、胎児由来細胞中の染色体を調べる羊水染色体検査が行われてきた。しかし、羊水穿刺には流産を引き起こす危険性がある。【０００３】
一方、妊娠母体の血液中に存在する胎児由来の無細胞ＤＮＡ、又は、妊娠母体の血液中に存在する胎児由来細胞の染色体ＤＮＡを解析して、胎児染色体の異常を検出する検査が、非侵襲な出生前遺伝学的検査として知られている。【０００４】
非侵襲な出生前遺伝学的検査の中でも、胎児由来の無細胞ＤＮＡを解析する検査は、既に実用化されている。一方、胎児由来細胞の染色体ＤＮＡを解析する検査は、いまだ実用に至っていない。その理由として、胎児由来細胞（例えば、胎児由来の有核赤血球）が母体血数ｍｌ中に１個程度しか存在しない希少細胞であることが挙げられる。しかし、胎児由来細胞の染色体ＤＮＡを解析できれば、より検査精度に優れた非侵襲な出生前遺伝学的検査が期待できる。【０００５】
ただし、胎児由来細胞の染色体ＤＮＡを解析するためには、解析に十分な量のＤＮＡを得る目的で、微量の染色体ＤＮＡからＤＮＡを増幅する必要がある。その際、染色体の異数性（例えばトリソミー、モノソミー）を検出するためには、異数性を忠実に再現しながらＤＮＡを増幅することが求められる。【０００６】
ところで、ヒト末梢血からＤＮＡを採取し、多段階のＤＮＡ増幅を行って得た増幅産物から配列情報を得て、疾患の診断や親子鑑定をする方法が、例えば、特許第４４０４５５３号公報、特表２０１４−５０２８４５号公報、特表２００４−５１１２１５号公報、及び特開平６−３２７４７６号公報に開示されている。また、多重増幅反応を行って、複数の核酸量の初期比率を定量する方法が、特表２００６−５０５２６８号公報に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許第４４０４５５３号公報、特表２０１４−５０２８４５号公報、特表２００４−５１１２１５号公報、特開平６−３２７４７６号公報、及び特表２００６−５０５２６８号公報に開示されているように、試料中にわずかに存在するＤＮＡを増幅し、配列情報やＤＮＡ量比を解析する技術が知られている。しかし、上記文献に開示された技術は、染色体の異数性の検出力を向上させる観点でなされた技術ではない。また、上記文献のいずれにも、ＤＮＡを増幅させるポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数に関する記載はあっても、増幅前後のＤＮＡ量の倍率に関する記載はない。【０００８】
本発明の一実施形態は、上記状況のもとになされた。
本発明の一実施形態は、検出力に優れる、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
［１］  妊娠母体より採取された生体試料から得た染色体ＤＮＡを増幅して一次増幅産物を得る一次増幅工程と、一次増幅産物を鋳型として、複数のプライマー対を用いて複数の目的領域の多重増幅を行い、二次増幅産物を得る二次増幅工程と、二次増幅産物の両末端に、オリゴヌクレオチドである第一の標識を付加し、標識された二次増幅産物を得る第一付加工程と、標識された二次増幅産物を鋳型として、第一の標識にアニールするプライマー対を用いて増幅を行い、三次増幅産物を得る三次増幅工程と、三次増幅産物から複数の目的領域の塩基配列と増幅量とを決定する配列解析工程と、を含み、一次増幅工程が、ＤＮＡの総量を６０００倍以上３００００倍以下に増幅する工程であり、二次増幅工程が、ＤＮＡの総量を３倍以上１５０倍以下に増幅する工程である、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［２］  三次増幅工程が、ＤＮＡの総量を６倍以上２４倍以下に増幅する工程である、［１］に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［３］  配列解析工程が、次世代シークエンサーを用いて行われる、［１］又は［２］に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［４］  三次増幅産物の両末端に、オリゴヌクレオチドである第二の標識を付加し、標識された三次増幅産物を得る第二付加工程を、さらに含む、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［５］  三次増幅工程で用いるプライマーが、第二の標識の塩基配列を５’末端に有し、三次増幅工程を行うことにより、三次増幅産物の両末端に第二の標識が付加されて、標識された三次増幅産物が得られ、こうして三次増幅工程と第二付加工程とが共に行われる、［４］に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［６］  二次増幅工程で用いるプライマーが、第一の標識の塩基配列を５’末端に有し、二次増幅工程を行うことにより、二次増幅産物の両末端に第一の標識が付加されて、標識された二次増幅産物が得られ、こうして二次増幅工程と第一付加工程とが共に行われる、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［７］  一次増幅工程が、染色体ＤＮＡから全ゲノム増幅を行う工程である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［８］  染色体ＤＮＡが、１細胞から得た染色体ＤＮＡであり、一次増幅工程が、１細胞から全ゲノム増幅を行う工程である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［９］  生体試料が、血液であり、染色体ＤＮＡが、血液中の細胞から得た染色体ＤＮＡである、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［１０］  血液中の細胞が有核赤血球である、［９］に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
［１１］  血液中の細胞が、密度勾配遠心分離と画像解析とにより単離された細胞である、［９］又は［１０］に記載の、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一実施形態によれば、検出力に優れる、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００１３】
本開示の方法は、妊娠母体より採取された生体試料から染色体ＤＮＡを得て、染色体ＤＮＡ上の複数の領域を増幅し、胎児染色体の異数性の有無を検出する方法である。本開示の方法は、一次増幅工程、二次増幅工程、及び三次増幅工程により、ＤＮＡを多段階に増幅し、増幅産物の塩基配列と量とを決定して、胎児染色体の異数性の有無を検出する。本開示の方法は、例えば、１３番染色体、１８番染色体、及び２１番染色体のトリソミー；性染色体の過剰；等を検出する出生前遺伝学的検査に適用される。
【００１４】
本開示の方法において、一次増幅工程、二次増幅工程、及び三次増幅工程は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡを増幅する。一次増幅工程は、ＤＮＡの総量を６０００倍〜３００００倍に増幅する工程であり、二次増幅工程は、ＤＮＡの総量を３倍〜１５０倍に増幅する工程である。
本開示の方法は、一次増幅工程及び二次増幅工程における、ＤＮＡ総量の増幅倍率（増幅後のＤＮＡ総量÷増幅前のＤＮＡ総量）を上記の範囲とすることにより、胎児染色体の異数性の有無の検出力に優れる。その理由は、特定のメカニズムに拘束されるものではないが、以下に説明するメカニズムによるものと推測される。
【００１５】
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅は、増幅領域の塩基配列、増幅領域の長さ、プライマー配列の特異性、反応温度、反応時間などによって、増幅領域ごとに増幅され易さ（増幅効率）が相違し、増幅サイクルを重ねるたびに増幅効率の差が蓄積し、結果、増幅領域間の増幅産物量比がもとのＤＮＡ量比を再現しない場合がある。
また、ＤＮＡ増幅方法の一つであるポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction；ＰＣＲ）は、理論的にはサイクル数を重ねることでＤＮＡを指数関数的に増幅させる反応であるが、実際にはサイクル数を重ねるとＤＮＡ濃度（つまり増幅産物量）はプラトーに達する。そのため、サイクル数が過剰であると、もとのＤＮＡ量に差があっても増幅産物量はほぼ同じになってしまい、もとのＤＮＡ量比の情報が失われてしまう。
【００１６】
これに対して、本開示の方法においては、一次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率を３００００倍以下にする。増幅倍率が３００００倍超であると、この増幅倍率を実現するために相応の増幅サイクル数が必要になり、増幅サイクルを重ねるたびに増幅効率の差が蓄積し、結果、増幅領域間の増幅産物量比が、染色体におけるもとのＤＮＡ量比からかけ離れてしまう。それ故、本開示の方法において、一次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は３００００倍以下である。一次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率が３００００倍以下であると、一次増幅工程によって増幅される個々の増幅領域それぞれの増幅倍率もおよそ３００００倍以下の範囲に収まり、そして、増幅倍率の分布にばらつきが少なく、染色体の異数性の情報が保たれる。例えば、ＤＮＡ総量の増幅倍率が１００００倍の場合、個々の増幅領域それぞれの増幅倍率は１００００倍付近に分布しておりばらつきが少ない。
【００１７】
上記メカニズムと同じことが二次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率についても言える。それ故、本開示の方法において、二次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は１５０倍以下である。また、二次増幅工程は通常ＰＣＲで行われるところ、染色体の異数性の情報が過増幅により失われてしまうことを避ける観点でも、増幅サイクル数は多過ぎないことがよく、ＤＮＡ総量の増幅倍率は１５０倍以下である。二次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率が１５０倍以下であると、二次増幅工程によって増幅される個々の増幅領域それぞれの増幅倍率もおよそ１５０倍以下の範囲に収まり、そして、増幅倍率の分布にばらつきが少なく、染色体の異数性の情報が保たれる。例えば、ＤＮＡ総量の増幅倍率が１００倍の場合、個々の増幅領域それぞれの増幅倍率は１００倍付近に分布しておりばらつきが少ない。
【００１８】
一方で、生体試料中の微量な染色体ＤＮＡから解析に十分な量のＤＮＡを得る必要があるので、一次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は６０００倍以上であり、二次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は３倍以上である。
【００１９】
上記の理由により、一次増幅工程は、ＤＮＡの総量を６０００倍〜３００００倍に増幅する工程であり、より好ましくは６０００倍〜２５０００倍に増幅する工程であり、更に好ましくは６０００倍〜２００００倍に増幅する工程である。
上記の理由により、二次増幅工程は、ＤＮＡの総量を３倍〜１５０倍に増幅する工程であり、より好ましくは３倍〜１００倍に増幅する工程であり、更に好ましくは３倍〜６０倍に増幅する工程である。
【００２０】
本開示の方法において、三次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は、特に制限されるものではない。三次増幅工程は、鋳型となるＤＮＡの長さがある程度揃っており、また、使用するプライマー対が通常は１種に限られるので、一次増幅工程および二次増幅工程ほどはＤＮＡ増幅に関する前記問題が顕現化しないと考えられる。ただし、二次増幅工程と同じ理由及びメカニズムにより、三次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率は、６倍〜２４倍であることが好ましく、６倍〜２０倍であることがより好ましく、６倍〜１５倍であることが更に好ましい。三次増幅工程におけるＤＮＡ総量の増幅倍率が上記の範囲であると、胎児染色体の異数性の有無の検出力により優れる。
【００２１】
以上に説明した一次増幅工程、二次増幅工程、及び三次増幅工程によって多段階に増幅された最終の増幅産物、つまり三次増幅産物の全部又は一部が、配列解析工程で配列解析用装置にかけられる物質である。三次増幅産物は、いわばシークエンス用ライブラリーである。本開示の方法においては、複数の目的領域間の三次増幅産物量比が染色体ＤＮＡにおけるもとのＤＮＡ量比（即ち、染色体の異数性）をよく再現しており、したがって、本開示の方法によれば、染色体の異数性の有無を精度よく検出できる。
【００２２】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２３】
［一次増幅工程］
一次増幅工程は、妊娠母体より採取された生体試料から得た染色体ＤＮＡを増幅して、一次増幅産物を得る工程である。一次増幅工程は、ＤＮＡポリメラーゼが行う、ＤＮＡ鎖の合成反応であってよい。妊娠母体より採取された生体試料については、後述する。
【００２４】
一次増幅は、全ゲノム増幅（whole genome amplification；ＷＧＡ）にて行うことが好ましい。全ゲノム増幅は、例えば、生体試料に含まれる微量な染色体ＤＮＡ断片や、単一細胞から得た微量な染色体ＤＮＡを増幅することが可能であり、染色体ＤＮＡの解析を容易にする。
【００２５】
全ゲノム増幅の方法は、特に制限されず、公知の方法で行ってよい。全ゲノム増幅は、例えば、界面活性剤とタンパク質分解酵素を用いて細胞を溶解させる工程と、細胞から溶出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを増幅する工程と、を含む。
【００２６】
全ゲノム増幅は、市販の試薬を適用して行ってよい。ＰＣＲに基く試薬としては、例えば、PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit（Sigma-Aldrich社）、国際公開第２０１２／１６６４２５号に開示のＭＡＬＢＡＣ法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）に係る試薬が挙げられる。鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基く試薬としては、例えば、GenomiPhi DNA Amplification Kit（ＧＥヘルスケア社、GenomiPhiは登録商標）、REPLI-g Single Cell Kit（QIAGEN社、REPLI-gは登録商標）が挙げられる。本開示の方法においては、PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
【００２７】
PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）は、（ｉ）Sample Preparation、（ｉｉ）DNA Pre-Amplification、（ｉｉｉ）DNA Amplification、の３工程を１つの反応容器中で順次行うキットである。
工程（ｉ）は、ゲノムＤＮＡを１細胞から抽出する工程であり、界面活性剤及びタンパク質分解酵素を含有するバッファーを用いて細胞を溶解する。
工程（ｉｉ）は、細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ、ランダムプライマー、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡをプレ増幅する工程である。
工程（ｉｉｉ）は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅する工程である。
【００２８】
一次増幅工程にPicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）を適用する場合、ＤＮＡ総量が６０００倍〜３００００倍に増幅されるように、工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）を行い、工程（ｉｉｉ）を省略することが好ましく、さらに、工程（ｉｉ）の増幅サイクル数を調節することが好ましい。
【００２９】
一次増幅工程の終了後には、アガロースゲル電気泳動を行って、一次増幅産物の有無を確認することが好ましい。一次増幅産物は、精製することが好ましい。精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社、QIAquickは登録商標）を用いて行う。一次増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（登録商標、Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００３０】
［二次増幅工程、第一付加工程］
二次増幅工程は、一次増幅産物を鋳型として、複数のプライマー対を用いて、複数の目的領域の多重増幅を行い、二次増幅産物を得る工程である。二次増幅産物は、複数種類の増幅産物の混合物である。二次増幅工程は、ＰＣＲにより実現されることが好ましく、即ち多重ＰＣＲ（マルチプレックスＰＣＲ）が好ましい。
【００３１】
二次増幅工程に用いるプライマー対は、胎児染色体の異数性を検出する目的で設計されるプライマー対であり、複数箇所の染色体位置（目的領域）に対応する複数のプライマー対である。目的領域の長さ、即ち増幅される領域の長さは、例えば１００〜１８０塩基対である。プライマーにおける目的領域に相補的な塩基配列は、１５〜２５塩基が好ましく、２０塩基がより好ましい。
【００３２】
第一付加工程は、二次増幅産物の両末端に第一の標識を付加し、標識された二次増幅産物を得る工程である。第一の標識は、オリゴヌクレオチドであり、三次増幅工程に使用するプライマーがアニールする配列である。二次増幅産物の一方の末端に付加される第一の標識と、もう一方の末端に付加される第一の標識とは、塩基配列が同じでもよく異なっていてもよい。本開示においては、両者の塩基配列の異同にかかわらず、二次増幅産物の両末端に付加される標識は「第一の標識」と総称される。
【００３３】
第一の標識は、三次増幅工程に使用するプライマーがアニールする配列であるので、第一の標識を二次増幅産物間で共通にすることにより、三次増幅工程において１種のプライマー対でＰＣＲを行うことが可能になる。第一の標識は、１５〜２０塩基が好ましく、１７塩基がより好ましい。
【００３４】
第一の標識を二次増幅産物の両末端に付加する方法としては、例えば、ＤＮＡリガーゼによるライゲーション、ＰＣＲによる付加が挙げられ、本開示の方法においては、ＰＣＲによる付加が好ましい。ＰＣＲによる付加とは、つまり、第一の標識の塩基配列を５’末端に有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、両末端に第一の標識が付加された二次増幅産物を得ることである。この場合、二次増幅工程と第一付加工程とが共に行われることになる。
【００３５】
二次増幅工程に用いるプライマーが、第一の標識の塩基配列と、目的領域に相補的な塩基配列とを有する場合、プライマー全体の長さは、３０〜４５塩基が好ましく、３５〜４０塩基がより好ましく、３７塩基が更に好ましい。
【００３６】
二次増幅工程のマルチプレックスＰＣＲには、一般的なＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び反応バッファーを用いることが可能である。二次増幅工程に適用するＰＣＲ試薬としては、例えば、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ（株）社）、Multiplex PCR Assay Kit ver2（タカラバイオ（株）社）、KAPA Library Amplification Kit（日本ジェネティクス（株）社）、Platinum Multiplex PCR Master Mix Kit（ライフテクノロジーズ社、Platinumは登録商標）が挙げられる。本開示の方法においては、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ（株）社）を用いることが好ましい。マルチプレックスＰＣＲは、プライマー対ごとにアニーリングの至適温度が異なることがあるため、反応条件の検討をすることが好ましい。
【００３７】
染色体の異数性の有無を検出する本開示の方法においては、染色体の異数性の情報が過増幅により失われてしまうことを避けるため、二次増幅工程のＰＣＲのサイクル数は１０〜３０サイクルが好ましい。ＰＣＲのサイクル数は、リアルタイムＰＣＲによる検討を予め行って、その結果に基き設定することが好ましい。ＰＣＲは、その途中で、反応温度及び／又は反応時間を変更してもよい。
【００３８】
二次増幅産物は、精製することが好ましい。精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）、AMPure XP Kit（BECMAN COULTER社）を用いて行う。二次増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００３９】
［三次増幅、第二付加工程］
三次増幅工程は、標識された二次増幅産物を鋳型として、第一の標識にアニールするプライマー対を用いて増幅を行い、三次増幅産物を得る工程である。三次増幅工程は、ＰＣＲにより実現されることが好ましい。
【００４０】
三次増幅工程に用いるプライマーは、第一の標識にアニールするプライマーである。プライマーにおける、第一の標識にアニールする配列の塩基長は、第一の標識の塩基長と同じであることが好ましく、具体的には、１５〜２０塩基が好ましく、１７塩基がより好ましい。
【００４１】
第二付加工程は、三次増幅産物の両末端に第二の標識を付加し、標識された三次増幅産物を得る工程である。第二の標識は、オリゴヌクレオチドであり、増幅産物の解析を次世代シークエンサーで行うことを目的に三次増幅産物に付加される。三次増幅産物の一方の末端に付加される第二の標識と、もう一方の末端に付加される第二の標識とは、塩基配列が同じでもよく異なっていてもよい。本開示においては、両者の塩基配列の異同にかかわらず、三次増幅産物の両末端に付加される標識は「第二の標識」と総称される。
【００４２】
第二の標識は、増幅産物の解析を次世代シークエンサーで行うことを目的に三次増幅産物に付加されるオリゴヌクレオチドであるので、その塩基配列は、次世代シークエンサーの解析原理に従って設計される（次世代シークエンサーの詳細は後述する）。第二の標識の塩基長は、一例として５９〜６４塩基が挙げられる。
【００４３】
次世代シークエンサーとしてIllumina社のMiSeq又はHiSeq2000を使用する場合、第二の標識としては、例えば下記の一対のオリゴヌクレオチドが挙げられる。下記の２つのオリゴヌクレオチドの一方が、三次増幅産物の一方の末端に付加され、もう一方が、三次増幅産物のもう一方の末端に付加される。
・フローセル上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするＰ５配列と、６〜８塩基からなるサンプル識別配列（インデックス配列）と、シークエンスプライマーがアニールする配列（リード配列）と、を有するオリゴヌクレオチド。
・フローセル上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするＰ７配列と、６〜８塩基からなるサンプル識別配列（インデックス配列）と、シークエンスプライマーがアニールする配列（リード配列）と、を有するオリゴヌクレオチド。
インデックス配列は、対となる２つのオリゴヌクレオチドの少なくとも一方にあればよく、解析精度を上げる観点で両方にあることが好ましい。リード配列には、第一の標識をあてることができ、その場合はリード配列を別途設けなくてよい。
上記の例は一例であって、本開示の方法において、第二の標識が上記の例に限定されるものではない。
【００４４】
第二の標識を三次増幅産物の両末端に付加する方法としては、例えば、ＤＮＡリガーゼによるライゲーション、ＰＣＲによる付加が挙げられ、本開示の方法においては、ＰＣＲによる付加が好ましい。ＰＣＲによる付加とは、つまり、第二の標識の塩基配列を５’末端に有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、両末端に第二の標識が付加された三次増幅産物を得ることである。この場合、三次増幅工程と第二付加工程とが共に行われることになる。
以下、第二の標識をＰＣＲによって付加することを、「インデックス付加ＰＣＲ」ということがある。
【００４５】
三次増幅工程に適用するＰＣＲ試薬としては、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ（株）社）、Multiplex PCR Assay Kit ver2（タカラバイオ（株）社）、KAPA Library Amplification Kit（日本ジェネティクス（株）社）、Platinum Multiplex PCR Master Mix Kit（ライフテクノロジーズ社）が挙げられる。本開示の方法においては、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ（株）社）を用いることが好ましい。
【００４６】
染色体の異数性の有無を検出する本開示の方法においては、染色体の異数性の情報が過増幅により失われてしまうことを避けるため、三次増幅工程のＰＣＲのサイクル数は５〜１８サイクルが好ましい。ＰＣＲのサイクル数は、リアルタイムＰＣＲによる検討を予め行って、その結果に基き設定することが好ましい。ＰＣＲは、その途中で、反応温度及び／又は反応時間を変更してもよい。
【００４７】
三次増幅産物は、精製することが好ましい。精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）、AMPure XP Kit（BECMAN COULTER社）を用いて行う。三次増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）、KAPA Library Quantification Kits（日本ジェネティクス（株）社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００４８】
［配列解析工程］
配列解析工程は、三次増幅産物から複数の目的領域それぞれの塩基配列と増幅量とを決定する工程である。配列解析工程は、解析の精度及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で、次世代シークエンサーによって行われることが好ましい。
【００４９】
本開示において次世代シークエンサー（Next Generation Sequencer；ＮＧＳ）とは、サンガー法を利用したキャピラリーシークエンサー（第一世代シークエンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシークエンサーを意味する。次世代シークエンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシークエンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシークエンサーである。具体的には、MiSeq（Illumina社）、HiSeq2000（Illumina社、HiSeqは登録商標）、Roche454（Roche社）等が挙げられる。
【００５０】
本開示の方法において、次世代シークエンサーとしては、Illumina社のMiSeq及びHiSeq2000が好適である。MiSeqは、最大９６種類のＰＣＲ産物を１回で測定することが可能である。９６種類のＰＣＲ産物は、１つのマルチプレックスＰＣＲ産物でもよく、複数のマルチプレックスＰＣＲ産物の混合物でもよい。複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を混合してMiSeqで解析する場合には、それぞれのＰＣＲ産物を精度高く定量することが望ましい。定量は、例えば、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）又はKAPA Library Quantification Kits（日本ジェネティクス（株）社）を用いて行う。
【００５１】
MiSeq等の次世代シークエンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、SAMtools及びBEDtoolsが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び染色体数を解析することが好ましい。
【００５２】
配列解析工程で得た、目的領域の塩基配列と増幅量とから、染色体の異数性の有無が検出される。配列解析工程および異数性の検出方法の詳細については、母体血中の有核赤血球を試料にした場合を例にして後述する。
【００５３】
［妊娠母体より採取された生体試料］
妊娠母体より採取された生体試料は、母体血、臍帯血、羊水、絨毛組織、胎盤組織など、胎児由来細胞が存在することが知られている組織であればよい。生体試料としては、妊娠母体への侵襲性を極力抑える観点で、母体末梢血が好ましい。本開示において血液には、血液そのもの、及び、生理食塩水で希釈した血液；血液にグルコースや抗血液凝固剤等の添加剤を加えた保存血液；これらの分画物；などの血液試料が含まれる。
【００５４】
［妊娠母体の末梢血］
妊娠母体の末梢血には、母親由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球；母親由来の、核のない成熟した赤血球；母親由来の有核赤血球；胎児由来の有核赤血球；などの血液細胞が含まれる。本開示の方法においては、これらの血液細胞から胎児由来の有核赤血球を識別し、胎児由来の有核赤血球から染色体ＤＮＡを得ることが好ましい。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。したがって、本開示の方法における血液は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体より採取した末梢血、又は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体より採取した末梢血から調製した血液試料であることが好ましい。
【００５５】
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して母体の血液中に存在する、赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。有核赤血球には染色体が存在するため、胎児由来の有核赤血球を単離することで、胎児染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の約１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、妊娠母体の抹消血中には非常に存在確率が低い。
【００５６】
胎児由来の有核赤血球は、例えば、密度勾配遠心分離と画像解析とにより、妊娠母体より採取された血液中に存在するその他の血液細胞と識別され、単離され得る。
【００５７】
［有核赤血球の密度勾配遠心分離（有核赤血球の濃縮）］
有核赤血球は、密度勾配遠心分離により、血液中に存在する血漿成分やその他の血液細胞と分離され得る。有核赤血球を分離するための密度勾配遠心分離は、公知の方法を適用してよい。例えば、密度（比重）の異なる２種類の媒体を遠沈管に重層した不連続密度勾配の上に、生理食塩水で希釈した血液を重層して遠心を行うことにより、有核赤血球を分画し濃縮できる。
【００５８】
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065〜1.095ｇ／ｍＬ程度、母親の血球の密度は、赤血球が1.070〜1.120ｇ／ｍＬ程度、好酸球が1.090〜1.110ｇ／ｍＬ程度、好中球が1.075〜1.100ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が1.070〜1.080ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が1.060〜1.080ｇ／ｍＬ程度、単核球が1.060〜1.070ｇ／ｍＬ程度である。
【００５９】
密度1.065〜1.095ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、ほかの血液細胞と分離するために、積層する媒体の密度（比重）が設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は1.080ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度をはさむ２つの異なる密度の媒体を隣接して重層することで、その界面に胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、下層の媒体の密度を1.08ｇ／ｍＬ〜1.10ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.08ｇ／ｍＬ〜1.09ｇ／ｍＬ）、上層の媒体の密度を1.06ｇ／ｍＬ〜1.08ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.065ｇ／ｍＬ〜1.08ｇ／ｍＬ）とする。本開示の方法においては、下層の媒体と上層の媒体は同じ種類でも異なる種類でもよく、同じ種類の媒体を用いることが好ましい。
【００６０】
媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５ｎｍ〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll-Paque（登録商標）、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含むHistopaque（登録商標）等が挙げられる。本開示の方法においては、Percoll及び／又はHistopaqueを使用することが好ましい。Percollは、密度１．１３０の製品が市販されており、水で希釈することで密度勾配を調製することが可能である。Histopaqueは、市販されている密度１．０７７の媒体及び密度１．１１９の媒体と水とを用いて密度勾配を調製することが可能である。
【００６１】
２層の不連続密度勾配は、例えば以下のようにして遠沈管に形成する。まず、凝固点以上かつ１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度状態にある下層の媒体を遠沈管の底部に収容する、又は、下層の媒体を遠沈管の底部に収容したのち１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度下で保存して冷却する。次に、下層の媒体の上に上層の媒体を重層する。
【００６２】
［血液細胞の画像解析］
血液細胞の画像解析は、胎児由来の有核赤血球の候補を選ぶ目的で、基板（好ましくは透明基板）上の血液細胞の形態情報を取得して解析する。
【００６３】
血液細胞を画像解析するために、密度勾配遠心分離により得た有核赤血球を含む画分を、透明基板（好ましくはスライドガラス）上に塗布し乾燥させ、画像解析用の標本を作製する。この標本から血液細胞の形態情報を取得して解析し、胎児由来の有核赤血球の候補を選ぶ。
画像解析用の標本は、血液細胞の観察を容易にするために、血液細胞が染色されることが好ましい。血液細胞の染色法は、特に制限されず、公知の方法で行ってよい。血液細胞の染色法としては、例えば、ギムザ染色、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色が挙げられる。
【００６４】
血液細胞の形態情報は、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、制御用ＰＣ、及びディスプレイを装備したシステムによって、標本から取得され画像解析されることが好ましい。光学搬送系は、例えば、対物レンズとＣＣＤカメラを備える。画像処理用ＰＣは、例えば、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える。制御用ＰＣは、例えば、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える。
【００６５】
胎児由来の有核赤血球の候補は、細胞質の面積に対する核の面積の割合、核の円形度、核の面積、等によって識別可能である。確実性の観点で、細胞質の面積に対する核の面積の割合、及び核の円形度、の少なくとも一方の条件（好ましくは両方の条件）を満たす細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として識別することが好ましい。
【００６６】
細胞質の面積に対する核の面積の割合については、下記の式（ａ）を満たす細胞を選択することが好ましい。核の円形度については、下記の式（ｂ）を満たす細胞を選択することが好ましい。
（ａ）０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０
（ｂ）０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５
式中、Ｃは、細胞質の面積、Ｎは、核の面積、Ｌは、核の長径の長さ、又は、複雑な形をした核に外接する楕円の長径の長さ、である。
【００６７】
式（ａ）及び式（ｂ）を満たす細胞の中で、核の形状が真円あるいは楕円に近い順に順位をつけ、順位の高いものから優先して以降の工程に供してもよい。また、有核赤血球の由来を判別する工程まで行って、順位の高い複数個の中に胎児由来の細胞が含まれていなかった場合、次に順位の高い複数個の細胞を解析してもよい。
【００６８】
有核赤血球として識別された細胞は、例えば、ガラス器具を備えたマイクロマニピュレータで、透明基板上から１個ずつ回収される。回収された細胞から染色体ＤＮＡが抽出されて一次増幅工程の鋳型となる。
【００６９】
［胎児由来の有核赤血球の同定］
妊娠母体より採取された血液中の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とが混在しており、胎児由来の有核赤血球であることの同定が必要となる。遺伝子配列により個人を識別する方法としては、対立遺伝子を調べてそこに存在する遺伝子多型を検出する方法が挙げられる。一例として、父子関係の判別には、遺伝子多型の一種であるＳＴＲ（short tandem repeat）を検出する方法が適用されており、個人の識別には、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism、一塩基多型）を検出する方法が適用されている。本開示の方法においては、配列解析工程で得た配列情報に基き、例えば、対立遺伝子上のＳＴＲ及び／又はＳＮＰの差異により胎児由来細胞と母親由来細胞とを識別する。好ましくは、白血球（白血球は母親由来であることがほぼ確実である）を取得して、ＳＴＲ及び／又はＳＮＰを同様に解析することで、胎児由来細胞の同定の確実性を高めることが好ましい。
【００７０】
［男児の場合のＹ染色体検出］
妊娠母体の超音波検査で胎児が男児であると確認されている場合、単離した有核赤血球内にＹ染色体が存在することを確認すれば、胎児由来の有核赤血球であると同定し得る。細胞内のＹ染色体の有無を検出する方法としては、Ｙ染色体特異的な蛍光プローブを用いるＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization）法が知られている。ＦＩＳＨ法の検査キットの一例として、CEP X/Y DNA Probe Kit（Abbott社、CEPは登録商標）が挙げられる。本開示の方法においては、Ｙ染色体に特異的な塩基配列を有するプライマー対を作製しＰＣＲを用い、その増幅の有無を確認することにより、男児の胎児由来の有核赤血球であることを同定するのが好ましい。
【００７１】
［染色体の異数性の有無の検出］
胎児由来の有核赤血球と同定された細胞から得た染色体について、増幅産物量を例えば次世代シークエンサーで解析する。基準（あるいは参照）として、母親由来の有核赤血球と同定された細胞から得た染色体について、増幅産物量を例えば次世代シークエンサーで解析する。胎児が染色体の異数性を有しなければ、母親由来の増幅産物量と胎児由来の増幅産物量とは、ほぼ１：１の量比になると予想される。増幅領域が位置する染色体が胎児においてトリソミーである場合には、母親由来の増幅産物量と胎児由来の増幅産物量とは、ほぼ１：１．５（あるいは２：３）の量比になると予想される。
【００７２】
本開示の方法においては、下記の方法で、カットオフ値を予め決定しておき、このカットオフ値を解析結果の解釈に使用してもよい。
染色体の異数性を有しない胎児を妊娠したことが判明している複数母体より採取された生体試料から、本開示の方法によって母親由来の増幅産物量に対する胎児由来の増幅産物量の比を解析し、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠したことが判明している複数母体より採取された生体試料から、本開示の方法によって母親由来の増幅産物量に対する胎児由来の増幅産物量の比を解析し、その分布を求める。この２つの分布が重ならない領域をカットオフ値とする。このカットオフ値と、検査対象における母親由来の増幅産物量に対する胎児由来の増幅産物量の比とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば胎児はトリソミーでなく、その比がカットオフ値以上であれば胎児はトリソミーである、との解釈をなし得る。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。【００７４】
＜実施例１＞
［末梢血の採取］
抗凝固剤としてＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩１０．５ｍｇ入りの７ｍＬ採血管に、妊婦ボランティア１名から末梢血７ｍＬを採取した。その後、生理食塩水を用いて血液を希釈した。妊婦ボランティアからの採血は、インフォームドコンセントを得た上で行った。【００７５】
［密度勾配遠心分離による有核赤血球の濃縮］
Percoll液（シグマアルドリッチ社製）を使用して、密度１．０７０の液と密度１．０９５の液を調製し、遠沈管に密度１．０９５の液２ｍＬを入れ、４℃下に３０分間置き冷却した。その後、密度１．０９５の液の上に、密度１．０７０の液２ｍＬを、界面が乱れないようにゆっくり重層した。続けて、密度１．０７０の液の上に、希釈した血液１１ｍＬをゆっくり重層し、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。次いで、密度１．０７０の液と密度１．０９５の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。【００７６】
［基板への血液の塗布］
片手でスライドガラス１を保持し、その一端に、採取した画分を１滴点着した。もう一方の手で別のスライドガラス２を持ち、一端をスライドガラス１に３０度の角度で接触させ、スライドガラス２の接触下面を画分に触れさせ、毛管現象により２枚のスライドガラスに囲まれた空間に画分を広げた。次に上記角度を保ったまま、スライドガラス２を、スライドガラス１の画分を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス１上に画分を均一に塗布した。塗布後、送風により１時間以上かけて十分に乾燥させた。【００７７】
［血液細胞の染色］
画分を塗布したスライドガラス１をメイ・グリュンワルド染色液に３分間浸漬し、次いでリン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸緩衝液で希釈して濃度３％（v/v）とした）に１０分間浸漬した。次いで、純水で洗浄後、乾燥させた。こうして、画像解析用の標本スライドを複数枚作製した。【００７８】
［画像解析による有核赤血球の識別］
電動ＸＹステージ、対物レンズ及びＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡と、ＸＹステージ制御部及びＺ方向制御部を備えた制御部と、画像入力部、画像処理部、及びＸＹ位置記録部を備えた解析部と、を備えた画像解析システムを準備した。標本スライドをＸＹステージに乗せて、標本スライド上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡から画像を解析部に取り込み、有核赤血球を探索した。【００７９】
画像解析によって、下記の式（ａ）及び式（ｂ）を満たす細胞を検出し、有核赤血球候補として識別し、ＸＹ位置を記録した。
（ａ）０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０
（ｂ）０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５
式中、Ｃは、細胞質の面積、Ｎは、核の面積、Ｌは、核の長径の長さ、又は、複雑な形をした核に外接する楕円の長径の長さ、である。【００８０】
［有核赤血球の回収］
ガラス針とガラス管をマイクロマニピュレータで操作し、これらガラス器具を使って、識別した有核赤血球候補１１個を１個ずつ、標本スライド上から回収した。【００８１】
［一次増幅工程（全ゲノム増幅）］
回収した１１個の細胞それぞれについて、PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）を用いて全ゲノム増幅を行った。PicoPLEX WGA Kitの添付文書に則り、１細胞を収容したＰＣＲチューブに５μＬのCell Extraction Bufferを添加後、Extraction Cocktail（Extraction Enzyme Dilution Bufferを４．８μＬ、Cell Ectraction Enzymeを０．２μＬの混合液）を５μＬ加え、合計１０μＬとした。その後、７５℃／１０分及び９５℃／４分の細胞溶解反応を行った。次に、Pre-Amp Cocktail（Pre-Amp Reaction Mixを４．８μＬ、Pre-Amp Enzymeを０．２μＬの混合液）を調製し、細胞溶解後の反応液に５μＬ添加し、合計１５μＬとした。ＤＮＡの増幅反応として、PicoPLEX WGA Kitの工程（ｉｉ）にあたる反応を行った。即ち９５℃／２分でＤＮＡを変性した後、９５℃／１５秒、１５℃／５０秒、２５℃／４０秒、３５℃／３０秒、６５℃／４０秒、及び７５℃／４０秒を３０サイクル行った。【００８２】
得られた増幅産物は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて、プライマーやバッファー成分等の不純物を除去することで精製した。精製後の増幅産物の濃度を、Quantus Fluorometer dsDNA System（Promega社）を用いて測定し、各細胞の増幅産物量が４５ｎｇ〜９０ｎｇ（ヒト細胞１個の染色体ＤＮＡ量の９０００倍〜１８０００倍に相当）の範囲内にあることを確認した。【００８３】
［二次増幅工程および第一付加工程（マルチプレックスＰＣＲ）］
胎児由来細胞を同定する目的、並びに、染色体の異数性を解析する目的で、染色体上の１６箇所の領域を増幅する、１６対のプライマー対を設計した。１６箇所の領域は、内部にＳＮＰを有する領域とした。１６箇所の領域が位置する遺伝子名、及び１６箇所の領域の塩基長は、表１に示すとおりである。【００８４】
【表１】
2016038929.tif 000002
【００８５】
各プライマーは、第一の標識の塩基配列１７塩基と、目的領域に相補的な塩基配列２０塩基と、からなる計３７塩基のオリゴヌクレオチドであり、５’末端に第一の標識の塩基配列が位置している。フォワードプライマー上の第一の標識の塩基配列は、CGCTCTTCCGATCTCTG（配列番号１）とし、リバースプライマー上の第一の標識の塩基配列は、CGCTCTTCCGATCTGAC（配列番号２）とした。【００８６】
全プライマーを終濃度が各２５ｎｍｏｌ／Ｌとなるように混合し、プライマーミックス液を調製した。【００８７】
一次増幅産物（全ゲノム増幅産物）から１０ｎｇを二次増幅工程に使用した。マルチプレックスＰＣＲは、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ（株）社）を用いて反応を行った。各細胞から得た一次増幅産物を鋳型として１０ｎｇ、プライマーミックス液を８μＬ、Multiplex PCR Mix1を０．１２５μＬ、Multiplex PCR Mix2を１２．５μＬ、及び水を混合し反応液を調製した（最終液量２５μＬ）。ＰＣＲ反応は、９４℃／６０秒で変性した後、９４℃／３０秒、６０℃／９０秒、及び７２℃／３０秒を１５サイクル行った。ＰＣＲのサイクル数は、予めリアルタイムＰＣＲによる検討を行い、その結果に基づき設定した。【００８８】
得られた増幅産物は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて、プライマーやバッファー成分等の不純物を除去することで精製した。精製後の増幅産物の濃度を、Quantus Fluorometer dsDNA System（Promega社）を用いて測定した。各細胞の増幅産物量が３００ｎｇ〜６００ｎｇ（鋳型量の３０倍〜６０倍に相当）の範囲内にあることを確認した。【００８９】
［三次増幅工程および第二付加工程（インデックス付加ＰＣＲ）］
三次増幅に用いるプライマー対として、下記のオリゴヌクレオチドを設計した。
・５’末端から順に、フローセル結合用配列（Illumina社が提供しているＰ５配列）、サンプル識別用のインデックス配列、及び第一の標識にアニールする配列を有するオリゴヌクレオチド。インデックス配列としては、Illumina社が提供しているＤ５０１を用いた。
・５’末端から順に、フローセル結合用配列（Illumina社が提供しているＰ７配列）、サンプル識別用のインデックス配列、及び第一の標識にアニールする配列を有するオリゴヌクレオチド。インデックス配列としては、Illumina社が提供しているＤ７０１〜Ｄ７１１のいずれかを１１個の細胞ごとに用いた。【００９０】
標識された二次増幅産物から５ｎｇを三次増幅工程に使用した。ＰＣＲは、Multiplex PCR Assay kit（タカラバイオ（株）社）を用いて反応を行った。二次増幅産物を鋳型として５ｎｇ、プライマー（１．２５μｍｏｌ／Ｌ）を各１μＬ、Multiplex PCR Mix1を０．１２５μＬ、Multiplex PCR Mix2を１２．５μＬ、及び水を混合し反応液を調製した（最終液量２５μＬ）。ＰＣＲ反応は、９４℃／３分で変性した後、９４℃／４５秒、５０℃／６０秒、及び７２℃／３０秒を５サイクル行い、その後、９４℃／４５秒、５５℃／６０秒、及び７２℃／３０秒を１１サイクル行った。ＰＣＲのサイクル数は、予めリアルタイムＰＣＲによる検討を行い、その結果に基づき設定した。【００９１】
得られた増幅産物を、AMPure XP Kit（BECMAN COULTER社）を用いて精製した。精製後の増幅産物の濃度を、BioAnalyzer（Agilent社）を用いて測定した。より正確な増幅産物の定量として、KAPA Library Quantification Kits（日本ジェネティクス（株）社）を用いて定量を行った。各細胞の増幅産物量が、５０ｎｇ〜７５ｎｇ（鋳型量の１０倍〜１５倍に相当）の範囲内にあることを確認した。【００９２】
各増幅工程について、細胞１１個の増幅産物量及び増幅倍率をまとめると表２のとおりである。【００９３】
【表２】
2016038929.tif 000003
【００９４】
［配列解析工程］
１１個の細胞由来の三次増幅産物を混合し、MiSeq（Illumina社）及びMiSeq Reagent Kit v2 300 Cycle（Illumina社）を用いてシークエンスを行った。得られたFastQファイルを、ＢＷＡ（Burrows-Wheeler Aligner）を用いてヒトリファレンスゲノム（ｈｇ１９）へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出し、BEDtoolsにより各増幅領域のシークエンスリード数を算出することで解析を行った。【００９５】
［細胞の由来の同定］
１３番染色体、１８番染色体、及び２１番染色体から増幅した領域のＳＮＰを解析したところ、１１個の細胞のうち１個の細胞が異なるＳＮＰ情報を有することが確認された。別途、核の形状から白血球と予想される細胞を、標本スライド上からマイクロマニピュレータを用いて回収し、１１個の細胞と同様にしてＤＮＡを増幅しＳＮＰを調べたところ、上記１個の細胞以外の１０個の細胞のＳＮＰと、白血球と予想される細胞のＳＮＰとが一致することが確認された。以上の解析により、１個の細胞が胎児由来の有核赤血球であり、１０個の細胞が母親由来の有核細胞であることが確認された。【００９６】
［異数性の有無の検出］
胎児由来と同定された有核赤血球の２１番染色体の４領域の増幅産物量を、MiSeqを用いて決定した。また、母親由来と同定された有核細胞１０個の２１番染色体の４領域の増幅産物量を、MiSeqを用いて決定した。胎児由来の細胞と母親由来の各細胞との間で４領域の増幅産物量それぞれの量比を計算したところ、いずれにおいても１：１に近い値であり、胎児は２１番染色体に異数性を有しないことが推定された。
同様にして、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体についても、胎児は異数性を有しないことが推定された。【００９７】
＜比較例１＞
標本スライドから回収した１細胞を材料とした。一次増幅工程においてPicoPLEX WGA Kitの工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）を行って、ヒト細胞１個の染色体ＤＮＡ量の５０万倍の増幅産物を得たこと以外は、実施例１と同様にして、染色体の異数性の有無の検出を試みた。しかし、１６領域の増幅産物量の間にばらつきが大きく、異数性の有無を検出できるレベルから大きく外れた。【００９８】
＜比較例２＞
標本スライドから回収した１細胞を材料とした。二次増幅工程においてＰＣＲを３０サイクル行って、鋳型量の５００倍の増幅産物を得たこと以外は、実施例１と同様にして、染色体の異数性の有無の検出を試みた。しかし、１６領域の増幅産物量の間にばらつきが大きく、異数性の有無を検出できるレベルから大きく外れた。【００９９】
２０１４年９月１１日に出願された日本国特許出願２０１４−１８５０６０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
2016038929000001.app
【国際調査報告】
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