(57)【要約】本発明は、幹細胞のエピジェネティックな状態を詳細に解析する方法を提供することを目的とする。  本発明は、被検幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについて、メチル化及び脱メチル化のパターンを解析し、解析されたパターンと前記被検幹細胞の性質とを関連づけることを特徴とする幹細胞の識別方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについて、メチル化及び脱メチル化のパターンを解析し、解析されたパターンと前記被検幹細胞の性質とを関連づけることを特徴とする幹細胞の識別方法。
【請求項２】
メチル化及び脱メチル化のパターンの解析は、免疫沈降、マイクロアレイを用いたハイブイダイゼーション処理、当該処理により得られたシグナルデータの確率値処理、及び当該確率値のマッピングにより行われるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
確率値のマッピングは、マイクロアレイ上の各プローブのメチル化確率値Ｐｍ及び脱メチル化確率値Ｐｈｍを、プローブ番号に割り当てることにより行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記確率値のマッピングは、
（１）被検幹細胞のプローブ番号ｎ（ｎは整数）と、該プローブ番号に対応する基準幹細胞のマイクロアレイプローブ番号ｎ’（ｎ’は整数）とを選定する工程、
（２）プローブ番号ｎに割り当てられた確率値Ｐ（ｎ）の、プローブ番号ｎ’に割り当てられた確率値Ｐ（ｎ’）に対する比率ｒ＝Ｐ（ｎ）／Ｐ（ｎ’）を求める工程、
（３）工程（１）を連続するプローブ番号ｎからｎ＋ｉ（ｉは整数）について繰り返し、０．５〜１．５の範囲にある比率ｒの個数Ｓｒをカウントする工程、並びに
（４）メチル化確率値及び脱メチル化確率値のそれぞれについて、相関率
Ｒ（％）＝｛Ｓｒ／（ｉ＋１）｝ｘ１００
を求める工程、
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞の性質は継代又は分化のステージを特徴づけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
メチル化及び脱メチル化のパターンの解析が自動化装置により行われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
幹細胞が外胚葉、内胚葉又は中胚葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
解析されたパターンと被検幹細胞の性質との関連づけは、以下の（ａ）〜（ｄ）の判定基準に基づいて行われるものである、請求項４に記載の方法。
（ａ）メチル化相関率Ｒｍが７０％以上、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に類似の状態にあると決定される。
（ｂ）メチル化相関率Ｒｍが７０％未満、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、脱メチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｃ）メチル化相関率Ｒｍが７０％以上、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化は類似の状態にあるが、脱メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｄ）メチル化相関率Ｒｍが７０％未満、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に非類似の状態にあると決定される。
【請求項１０】
解析されたパターンと被検幹細胞の性質との関連づけは、以下の（ａ’）〜（ｄ’）の判定基準に基づいて行われるものである、請求項４に記載の方法。
（ａ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが０．７以上、かつ脱メチル化相関係数Ｒ’ｈｍが０．７以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に類似の状態にあると決定される。
（ｂ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが０．７未満、かつ脱メチル化相関係数Ｒ’ｈｍが０．７以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、脱メチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｃ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが０．７以上、かつ脱メチル化相関係数Ｒ’ｈｍが０．７未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化は類似の状態にあるが、脱メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｄ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが０．７未満、かつ脱メチル化相関係数Ｒ’ｈｍが０．７未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に非類似の状態にあると決定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについてエピジェネティクな変化を解析し、得られたデータをパターン化することにより幹細胞を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来幹細胞を識別する方法としては、（ｉ）顕微鏡観察による形態的変化の識別、（ｉｉ）ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの細胞表面マーカーを抗体で細胞を蛍光染色する方法、（ｉｉｉ）アルカリファスファターゼ活性などの細胞の持つ酵素活性を利用して細胞を色素染色する方法などが知られている。【０００３】
多能性幹細胞を継代培養すると、幹細胞の形態学的な性状に異変が検出されないまま細胞の性質は変化することが頻繁に観察される。
性質の変化としては、例えば、（ａ）分化誘導操作による分化傾向の変化、（ｂ）細胞増殖速度の変化、（ｃ）癌化に対する耐性の変化などが挙げられる。
しかしながら、上に挙げた従来の識別方法では、細胞の性状変化（ａ）〜（ｃ）を識別することができない。【０００４】
従来の識別方法の限界を示す例としては、例えば、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅによる報告（非特許文献１）が挙げられる。Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅは、世界各国の１７の研究施設より提供された５９種類のヒトＥＳ細胞について幹細胞特有の抗原であるＳＳＥＡ３，ＳＳＥＡ４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１，ＧＣＴＭ３４３，ＣＤ９，ＣＤ９０，ＡＬＰ．Ｃｌａｓｓ１  ＨＬＡ等の発現、及び幹細胞特有の遺伝子であるＮＡＮＯＧ，ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４），ＴＤＧＦ１，ＤＮＭＴ３Ｂ，ＧＤＦ３等の遺伝子発現につき検討を行った（非特許文献１）。この結果、すべての５９種類のヒト幹細胞は、これらの抗原および関連遺伝子について、いくつかの例外はあるものの、すべて類似の発現を示したと報告されている。このことからも、形態学的な観察では、幹細胞の株間の性状の違いを把握することができないことが分かる。【０００５】
そこで、次のステージとして遺伝子レベルで細胞の変化をとらえる試みがなされた。
そのような試みとして、まず、各種幹細胞において、ｍＲＮＡの発現解析と染色体ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）解析が行われた。多数の幹細胞株が解析されたが、遺伝子発現パターンおよびＳＮＰにおいて株間に差異を見いだすことができず、細胞の性状変化（ａ）〜（ｃ）の原因となる遺伝子群を特定するまではいたらなかった。【０００６】
次に、遺伝子発現の調節機構を根本から調べる手段としてエピジェネティクス解析に期待が寄せられた（非特許文献３）。
エピジェネティクス解析の対象としては、特に染色体ＤＮＡのメチル化修飾（５−メチルシトシン（５ｍＣ））とヒストンタンパク質の修飾が注目された。ＤＮＡのメチル化は、１９８０年代から遺伝子発現の制御と深く関係することが示唆されていた。長年、メチル化検出法の開発が試行錯誤され、２０００年頃から５ｍＣ修飾の検出法として、バイサルファイト法が使用されるようになった。【０００７】
バイサルファイト法は、染色体ＤＮＡと亜硫酸ナトリウム（バイサルファイト）とを反応させ、非修飾のシトシン残基をウラシルに変換（バイサルファイト変換）させる方法である。また、バイサルファイト変換とアレル特異的ＰＣＲや制限酵素処理を組み合わせた方法も開発され、個々の遺伝子に対する解析が進められた。
さらにその改良版として、バイサルファイト法とマイクロアレイとを組み合わせた解析方法（非特許文献２）や、バイサルファイト法と次世代シークエンス法とを組み合わせた解析方法（Ｂｉｓ−ｓｅｑ法）（非特許文献４）が開発され、これらの方法により網羅的に幹細胞の染色体ＤＮＡの状態を解析することが可能となった。【０００８】
特に、Ｂｉｓ−ｓｅｑ法は一塩基ベースでメチル化パターンを解析することが可能である。ただし、Ｂｉｓ−ｓｅｑ法はメチル化修飾の有無を定性的に検出するが、メチル化の可能性を定量的に検出することができないという検出限界がある。さらに、Ｂｉｓ−ｓｅｑ法は同一サンプルを１０回以上の繰り返しシークエンスする必要があり、非常に手間がかかり、そのうえ費用も高額なものになるというデメリットがある。これらの理由からＢｉｓ−ｓｅｑ法を行える研究室は限られたものであった。【０００９】
ところで、近年、シトシンの修飾には５ｍＣばかりでなく、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）も存在することが確認されている（非特許文献２）。また、５ｍＣがバイサルファイト変換に耐性を有する（すなわち、バイサルファイト処理によってもウラシルに変換されない）のと同様に、５ｈｍＣもバイサルファイト変換に対して耐性であることが報告されている（非特許文献５および６）。
この報告からすると、バイサルファイト処理したＤＮＡの配列解析を行った場合、非修飾シトシンはウラシル（すなわちチミン）として解読され、他方、５ｍＣと５ｈｍＣはいずれもシトシンとして解読されることになる。つまり、従来のＢｉｓ−ｓｅｑ解析では５ｍＣと５ｈｍＣとは区別されておらず、得られたデータには両者が混在していることが分かってきた。【００１０】
５ｈｍＣは染色体ＤＮＡの脱メチル化機構に重要な役割を果たすことが指摘され、メチルシトシンから非修飾シトシンへ移行する反応における中間体であると考えられている。
Ｂｉｓ−ｓｅｑ法は５ｍＣと５ｈｍＣとを区別することができないため、細胞のエピジェネティックな変化をトレースするには十分な解析法であるとはいえない。【００１１】
一方、５ｍＣを認識するＭＢＤタンパク質を利用して、メチル化ＤＮＡ断片を濃縮し、得られた断片を次世代シークエンサーで解析するＭＢＤ−ｓｅｑ法が開発された（非特許文献７）。しかし、濃縮ＤＮＡ断片を読み取る際に濃縮ピークが二峰性をとるため、予想修飾位置が毎回１００−２００ｂｐｓ程度ずれることが知られている。メチル化が検出されたＤＮＡ領域の近傍遺伝子領域を制御遺伝子と仮定することで、候補遺伝子を絞り込んでいるが、明確な遺伝子特定ができていないという限界点がある。
また、ＭＢＤタンパク質で濃縮した５ｍＣのＤＮＡ断片をマイクロアレイで解析するＭＩＲＡ法（非特許文献８）も開発された。この方法は、正確に５ｍＣ断片のみを濃縮でき、Ｂｉｓ−ｓｅｑ法より正確なデータが得られると思われる。しかし、ＭＩＲＡ法も（ｉ）ＭＢＤ−ｓｅｑ同様にメチル化領域の近傍遺伝子を候補遺伝子とするのみでメチル化によって制御を受ける遺伝子を特定することができず、さらにメチル化の可能性を定量的に検出することができない点、ならびに（ｉｉ）５ｍＣのみを解析対象とし、５ｈｍＣの変化をとられていないという点で、幹細胞の微妙な性状を明確に識別することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２５，Ｎｏ．７，８０３−８１６，２００７
【非特許文献２】Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，８２３−８４０（２０１２）
【非特許文献３】Ｋｏｉｃｈｉｒｏ  Ｎｉｓｈｉｎｏ，ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ１３０１７（２０１０）
【非特許文献４】Ｊｕｌｉａ  Ａｒａｎｄ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  ｏｎｅ，８，ｅ１００２７５０（２０１２）
【非特許文献５】Ｃｏｌｍ  Ｎｅｓｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  ４８，３１７−３１９（２０１０）
【非特許文献６】Ｙｕｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ８８８８（２０１０）
【非特許文献７】Ｌｉ  Ｎ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，５２，２０３−２１２（２０１０）
【非特許文献８】Ｊｏｓｈｕａ  Ｄ．Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１０９，１２５４４−１２５４９（２０１２）
【発明の開示】
【００１３】
上記の状況に鑑み、本発明は、幹細胞において、その品質・特性を正確に把握するための識別方法を提供することを課題とする。
【００１４】
本発明者らはプレシジョン・システム・サイエンス社（以下、「ＰＳＳ社」）が開発した装置ＳＸ−８Ｇ  Ｃｏｍｐａｃｔを用いて幹細胞のエピジェネティク解析を行い、継代数の異なる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から抽出した染色体ＤＮＡサンプルに対し、オートメチル化ＤＮＡ免疫沈降（Ａｕｔｏ  ＭｅＤＩＰ）及びオートヒドロキシメチル化ＤＮＡ免疫沈降（Ａｕｔｏ  ｈ−ＭｅＤＩＰ）を同時に行い、得られたサンプルに対しマイクロアレイ解析を行った（ＭｅＤＩＰ／ｈ−ＭｅＤＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐ）。
得られたマイクロアレイデータにアルゴリズムによる数値処理を行ったのち、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒによるマッピングを行いそれぞれの遺伝子のメチル化パターンの解析を行った。
本発明者らはこの結果から、従来の方法では識別不可能であった継代初期と後期のＥＳ細胞を遺伝子のメチル化及びハイドロキシルメチル化パターンにより明確に識別できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  被検幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについて、メチル化及び脱メチル化のパターンを解析し、解析されたパターンと前記被検幹細胞の性質とを関連づけることを特徴とする幹細胞の識別方法。
［２］  メチル化及び脱メチル化のパターンの解析は、免疫沈降、マイクロアレイを用いたハイブイダイゼーション処理、当該処理により得られたシグナルデータの確率値処理、及び当該確率値のマッピングにより行われるものである前記［１］に記載の方法。
［３］  確率値のマッピングは、マイクロアレイ上の各プローブのメチル化確率値Ｐｍ及び脱メチル化確率値Ｐｈｍを、プローブ番号に割り当てることにより行われる、前記［２］に記載の方法。
［４］  前記確率値のマッピングは、
（１）被検幹細胞のプローブ番号ｎ（ｎは整数）と、該プローブ番号に対応する基準幹細胞のマイクロアレイプローブ番号ｎ’（ｎ’は整数）とを選定する工程、
（２）プローブ番号ｎに割り当てられた確率値Ｐ（ｎ）の、プローブ番号ｎ’に割り当てられた確率値Ｐ（ｎ’）に対する比率ｒ＝Ｐ（ｎ）／Ｐ（ｎ’）を求める工程、
（３）工程（１）を連続するプローブ番号ｎからｎ＋ｉ（ｉは整数）について繰り返し、０．５〜１．５の範囲にある比率ｒの個数Ｓｒをカウントする工程、並びに
（４）メチル化確率値及び脱メチル化確率値のそれぞれについて、相関率
Ｒ（％）＝｛Ｓｒ／（ｉ＋１）｝ｘ１００
を求める工程、
をさらに含む、前記［３］に記載の方法。
［５］  幹細胞の性質は継代又は分化のステージを特徴づけるものである、前記［１］に記載の方法。
［６］  メチル化及び脱メチル化のパターンの解析が自動化装置により行われるものである、前記［１］に記載の方法。
［７］  幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、前記［１］に記載の方法。
［８］  幹細胞が外胚葉、内胚葉又は中胚葉系幹細胞である、前記［１］に記載の方法。
［９］  解析されたパターンと被検幹細胞の性質との関連づけは、以下の（ａ）〜（ｄ）の判定基準に基づいて行われるものである、前記［４］に記載の方法。
（ａ）メチル化相関率Ｒｍが７０％以上、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に類似の状態にあると決定される。
（ｂ）メチル化相関率Ｒｍが７０％未満、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、脱メチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｃ）メチル化相関率Ｒｍが７０％以上、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化は類似の状態にあるが、脱メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｄ）メチル化相関率Ｒｍが７０％未満、かつ脱メチル化相関率Ｒｈｍが７０％未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及び脱メチル化が共に非類似の状態にあると決定される。
【００１６】
本発明により、ｉＰＳ細胞をはじめとする種々の幹細胞のメチル化およびヒドロキシメチル化を解析し、同幹細胞のエピジェネティク変化を把握又はトレースすることが可能である。
すなわち、本発明は、抗体染色、遺伝子発現では区別できない細胞の内的な性質および状態を、エピジェネティック解析により、明確に区別することを可能にする。未分化と分化の区別のみならず、同じ未分化状態の２種類の細胞グループを、抗体染色、遺伝子発現では区別できない程度の差であっても、本発明により識別することができる。
したがって、本発明の方法により株間のエピジェネティック状態の類似性又は非類似性を識別することにより、創薬研究又は医療行為に供する幹細胞を選定することが可能である。
加えて、本発明の方法は、幹細胞の品質評価、品質管理など、再生医療分野の産業化に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の方法に係るＭｅＤＩＰ法を説明する模式図である。
【図２】メチル化確率Ｐｍ値の仮想データを示す図である。
【図３】ヒドロキシメチル化確率Ｐｈｍ値の仮想データを示す図である。
【図４】幹細胞から精製した染色体ＤＮＡの電気泳動図である。
【図５】ＭｅＤＩＰ法で濃縮したＤＮＡ断片の電気泳動図である。
【図６】ｉＰＳ細胞のメチル化Ｐｍ値のマッピンググラフである。
【図７】ｉＰＳ細胞のメチル化Ｐｍ値のマッピンググラフである。
【図８】ｉＰＳ細胞のメチル化Ｐｍ値のマッピンググラフである。
【図９】ｉＰＳ細胞のメチル化Ｐｍ値のマッピンググラフである。
【図１０】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値及びヒドロキシメチル化Ｐｈｍ値のマッピンググラフである。
【図１１】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値及びヒドロキシメチル化Ｐｈｍ値のマッピンググラフである。
【図１２】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値及びヒドロキシメチル化Ｐｈｍ値のマッピンググラフである。
【図１３】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値及びヒドロキシメチル化Ｐｈｍ値のマッピンググラフである。
【図１４】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値のマッピンググラフである。
【図１５】ＥＳ細胞のメチル化Ｐｍ値の数値データをまとめた表である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１３年１月１６日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１３−００５５９４号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。【００１９】
用語
本願では、メチル化又はヒドロキシメチル化の確率値Ｐ、確率値Ｐの比ｒ、相関率Ｒ、相関係数Ｒ’等の記号について、これらの記号がメチル化又はヒドロキシメチル化のいずれに関するものであるのかを明確に区別するため、メチル化を表す「ｍ」及びヒドロキシメチル化を表す「ｈｍ」の符号を右下付きで付け加える場合もある。あるいは文脈上、上記記号がメチル化又はヒドロキシメチル化のいずれに関するものであるのか明らかな場合は、上記符号を省略する場合もある。【００２０】
１．  幹細胞の識別方法
本発明は、２種類以上の幹細胞株の染色体（ゲノム）ＤＮＡをエピジェネティック解析することにより、前記幹細胞の株間の性状の差を明確に区別することが可能な、幹細胞の識別方法を提供する。
具体的には、本発明は、被検幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについて、メチル化及び脱メチル化（「ヒドロキシメチル化」ともいう）のパターンを解析し、解析されたパターンと前記被検幹細胞の性質とを関連づけることを特徴とする幹細胞の識別方法を提供する。【００２１】
幹細胞における分化及び脱分化（リプログラミング）のプロセスは基本的に遺伝子配列の変化を伴わないエピジェネティクな変化であり、特にこの中でもＤＮＡのメチル化及び脱メチル化は分化及び脱分化の中核をなす変化である。【００２２】
メチル化
ＤＮＡのメチル化は、ＤＮＡを構成するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）の４種類のヌクレオチドのうちシトシンに生じる。メチル化を受けたシトシン（メチルシトシン）は、以下の式に示すとおり、そのピリジン環の第５位炭素がメチル基（−ＣＨ３）で置換されている。
【化１】
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【００２３】
脱メチル化
染色体ＤＮＡにおいて、５−メチルシトシンのメチル基は、常に存在するわけではなく、脱メチル化に伴って失われる。脱メチル化過程の中間体として、５−ヒドロキシメチルシトシンが生じる。５−ヒドロキシメチルシトシンでは、ピリジン環の第５位炭素がヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）で置換されている（下記式参照）。
【化２】
2014112655.tif 000004
【００２４】
ＤＮＡのメチル化状態および脱メチル化状態は流動的に変化し、特に幹細胞において著しく変化することが知られている。
そこで、本発明の識別方法は幹細胞を対象とする。【００２５】
本発明の対象となる「幹細胞」は、成体幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のいずれでもよい。【００２６】
また、前記幹細胞は、哺乳動物に由来するものであればよい。哺乳動物の例としては、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、マウスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様において前記幹細胞はヒト由来のものであり、別の実施態様では非ヒト哺乳動物、例えば、マウス由来のものである。【００２７】
成体幹細胞は、外胚葉、内胚葉又は中胚葉系幹細胞のいずれであってもよく、多分化能を有していても有していなくてもよい。成体幹細胞の例としては、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等が挙げられる。【００２８】
ＥＳ細胞は、胚の内部細胞塊から採取された多分化能を有する幹細胞である（Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．９：６２３−６２９．）。本発明において、ＥＳ細胞は内部細胞塊から採取された初代細胞株に限定されるものではなく、すでにセルライン化されたＥＳ細胞株であってもよい。セルライン化されたＥＳ細胞株の例としては、すでに樹立されたＥＳ細胞株を増殖させて得られた細胞集団から分与された細胞株、あるいは凍結保存された状態から溶解して培養されたＥＳ細胞株等が挙げられる。セルライン化されたＥＳ細胞株であれば、受精卵を崩壊させる工程を経ることなく入手することが可能である。
あるいはＥＳ細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて、胚の発生能を損なうことなく樹立されたものであってもよい。このＥＳ細胞であれば受精卵を破壊せずに得られるからである（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：４８１−４８５；ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１１３−１１７）。
ヒト由来ＥＳ細胞の培養方法は、理研ＣＤＢ・ヒト幹細胞研究支援室プロトコール（２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ（２００７），Ｎｏｖ  ３０：１３１，ｐｐ．８６１−８７２）及びＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）Ｎｏｖ  ６：２８２，ｐｐ．１１４５−１１４７）に記載されている。【００２９】
ｉＰＳ細胞とは、哺乳動物（ヒトを含む）の体細胞（線維芽細胞、上皮細胞等）に初期化遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８等の遺伝子）を導入することにより得られる未分化状態の多能性幹細胞をいう。ｉＰＳ細胞は、初期化遺伝子の導入によって染色体ＤＮＡがリプログラミングされており、基本的にＥＳ細胞と同様の多分化能を有している（特開２００９−１６５４７８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６；ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２）。
ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と同様の方法により培養することができる。【００３０】
ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞等の未分化細胞は、特に染色体ＤＮＡのメチル化状態が不安定である。例えば、２株以上のｉＰＳ細胞が存在し、全ての株がＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ４及び／又はＮＡＮＯＧ等の未分化マーカータンパク質若しくは遺伝子を発現していたとしても、その染色体ＤＮＡのメチル化状態は株間で異なる場合が多い。そして、メチル化状態の差により、株間で増殖能、分化能（特定の系統あるいは組織への分化能）に差が生じるものと考えられる。
本発明は、未分化マーカーの発現解析だけでは検出することのできない染色体ＤＮＡのメチル化状態の差異を検出可能にするものである。本発明の方法により、被検幹細胞のメチル化状態を解析し、その解析結果を、良好な未分化状態維持能、良好な増殖能または良好な分化能を有する基準幹細胞のメチル化状態と比較することにより、被検幹細胞の性質（未分化状態維持能、増殖能、分化能等）を判断することができる。【００３１】
メチル化およびヒドロキシメチル化のパターン解析
まず、上記被検幹細胞から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡは、アルカリＳＤＳ法、プロテアーゼＫ消化法又はカオトロピックイオン溶解法等によって細胞を溶解した後に、当該溶解物からシリカビーズ法、シリカメンブレン法、陰イオン交換樹脂カラム法、ＤＥＡＥ練り込み型メンブレン法、シリカ磁気ビーズ法、−ＯＨ系磁気ビーズ法又はイオン交換性磁気ビーズ法等によって抽出することができる。抽出した染色体ＤＮＡはエタノール沈殿法等によってさらに精製してもよい。【００３２】
次に、得られた染色体ＤＮＡ上のどの領域がメチル化およびヒドロキシメチル化を受けているのかを解析する。ＤＮＡのメチル化およびヒドロキシメチル化の解析に関しては種々の方法が確立している。
メチル化の解析方法としては、例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ：Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）が挙げられ、その他にもＭＩＡＭＩ法（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒｓ）、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（イルミナ）を用いた方法などが挙げられる。【００３３】
また、ヒドロキシメチル化の解析方法としては、例えば、ヒドロキシメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ｈＭｅＤＩＰ：ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）が挙げられ、その他にもＨｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ又はＥｐｉｍａｒｋＴＭ  ５−ｍＣ  ＆  ５−ｈｍＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた方法や、ｏｘＢＳ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＴＡＢ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法などが挙げられる。
好ましくは、メチル化の解析方法はＭｅＤＩＰ法であり、ヒドロキシメチル化の解析方法はｈＭｅＤＩＰ法である。
以下、ＭｅＤＩＰ法およびｈＭｅＤＩＰ法を例にとって、解析方法を具体的に説明する（図１を参照）。【００３４】
ＭｅＤＩＰ法
（Ａ）  断片化
得られた染色体ＤＮＡを、超音波破砕又は適切な制限酵素で処理することにより断片化する（図１：工程Ａ）。これにより、様々な染色体ＤＮＡ断片を含む混合物が得られる。この混合物の一部（混合物１）をインプットＤＮＡサンプルとして取り、残りの混合物（混合物２）を抗メチルシトシン抗体を用いた免疫沈降に供する。インプットＤＮＡサンプルとは、ＭｅＤＩＰ法で濃縮したメチル化ＤＮＡ断片をマイクロアレイプローブにハイブリダイズさせる際に同メチル化ＤＮＡ断片と競合的にマイクロアレイプローブにハイブリダイズさせるためのサンプルを意味する。
インプットＤＮＡサンプルには、メチル化ＤＮＡ断片および非メチル化ＤＮＡ断片が混在している。
インプットＤＮＡサンプルを用いることにより、ＭｅＤＩＰ法で濃縮したメチル化ＤＮＡ断片がマイクロアレイプローブに対して非特異的に結合し、偽陽性を生じるリスクを低下させることができる。【００３５】
（Ｂ〜Ｄ）  免疫沈降
混合物２のＤＮＡ断片を変性によって一本鎖化する（図１：工程Ｂ）。得られた一本鎖ＤＮＡ断片を抗メチルシトシン抗体と反応させ、抗体とメチル化ＤＮＡ断片とからなる複合体を遠心分離又は磁気分離によって濃縮し、抽出する（図１：工程Ｃ）。
抽出された抗体とメチル化ＤＮＡ断片とからなる複合体をプロテアーゼ処理して抗体やＤＮＡ結合タンパク質を取り除き、メチル化ＤＮＡ断片を精製する（図１：工程Ｄ）。【００３６】
（Ｅ）  メチル化ＤＮＡ断片の蛍光標識
精製したメチル化ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（図１：工程Ｅ）。ＰＣＲ増幅にはランダムプローブを用いる。その際に、ＰＣＲ産物を第１の蛍光標識（Ｃｙ５等）で標識する。これにより、蛍光標識されたメチル化ＤＮＡ断片（以下、「ＭｅＤＩＰ断片」）が得られる。図１の例ではメチル化ＤＮＡ断片はＣｙ５で標識されているが、他の適切な蛍光標識を用いてもよい。【００３７】
（Ｆ）  インプットＤＮＡの蛍光標識
先の工程「（Ａ）断片化」で取り分けたインプットＤＮＡにプロテアーゼ処理等を施すことによりＤＮＡ断片を精製する。精製されたＤＮＡ断片には、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片の両方が含まれる。次に、生成されたインプットＤＮＡをＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅にはランダムプローブを用いる。その際にＰＣＲ産物を第２の蛍光標識（第１の蛍光標識とは異なる励起波長・放出波長を有する蛍光標識）で標識する（図１：工程Ｆ）。
これにより、第２の蛍光標識で標識されたメチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片の混合物（以下、「インプット断片」）が得られる。図１の例ではインプット断片はＣｙ３で標識されているが、他の適切な蛍光標識を用いてもよい。【００３８】
（Ｇ）  マイクロアレイ解析
得られたＭｅＤＩＰ断片をマイクロアレイで解析する。マイクロアレイではプローブ位置が固定されているため、位置情報に関する誤差やアルゴリズムの差が出にくく、より正確に遺伝子を同定することができる。また、マイクロアレイは次世代シークエンス法等の配列解析方法と比較してはるかに低コストである。さらに、マイクロアレイは、データ解析も短時間で容易に行うことが出来るため、幹細胞の識別法としてより優れていると考えられる。
さらに、マイクロアレイの場合、容易にプローブの設計および変更を行うことができるため、例えば、検出するＤＮＡの領域が一部重複するようにプローブを設計することができ（例えば、タイリングアレイ等）、それによって、メチル化およびヒドロキシメチル化部位を詳細に特定することができる。
具体的な手順として、まず、蛍光標識されたＭｅＤＩＰ断片とインプット断片とを競合的にマイクロアレイプローブと反応させる（図１：工程Ｇ）。
好ましくは、マイクロアレイはＳｔａｎｆｏｒｄ型のものが用いられる。
また、競合反応は、ＭｅＤＩＰ断片：インプット断片の比が、１：２〜１：５０、好ましくは１：５〜１：３０、さらに好ましくは１：７〜１：２０、１：８〜１：１０または１：１０で行われる。【００３９】
すでに述べたとおり、インプット断片は、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片とを鋳型としたＰＣＲ増幅により得られる。これに対し、ＭｅＤＩＰ断片は、濃縮されたメチル化ＤＮＡ断片を鋳型としたＰＣＲ増幅により得られる。したがって、総ＤＮＡ量（または総ＤＮＡ濃度）を等しく調整した状態でインプット断片とＭｅＤＩＰ断片とを比較すると、メチル化ＤＮＡ断片についてはＭｅＤＩＰ断片の方が高い濃度を示す。
そこで、インプット断片とＭｅＤＩＰ断片とを競合的に反応させると、（ｉ）メチル化されいていないＤＮＡ領域に対応するプローブにはインプット断片が結合し、（ｉｉ）メチル化されたＤＮＡ領域に対応するプローブにはＭｅＤＩＰ断片が優先的に結合する。
従って、インプット断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはメチル化されていない可能性が高く（つまりメチル化されている可能性が低く）、ＭｅＤＩＰ断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはメチル化されている可能性が高い。【００４０】
蛍光強度の解析は、ＡＣＭＥ（ＲソフトのＧＳＥＡ（Ｇｅｎ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ））、ＭＥＤＭＥ（ＲソフトのＧＳＥＡ（Ｇｅｎ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ））又はＢａｔｍａｎなどのプログラムを用いて行うことができる。【００４１】
ｈＭｅＤＩＰ法
抗メチルシトシン抗体の代わりに抗ヒドロキシメチルシトシン抗体を用いて、上記工程（Ａ）〜（Ｇ）を行うことによりｈＭｅＤＩＰを実施することができる。
この場合、インプット断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはヒドロキシメチル化されていない可能性が高く（つまりヒドロキシメチル化されている可能性が低く）、ｈＭｅＤＩＰ断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはヒドロキシメチル化されている可能性が高い。【００４２】
シグナルデータの確率処理
上記通り、インプット断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはメチル化されている可能性が低く、ＭｅＤＩＰ断片の蛍光強度が高いプローブ領域では染色体ＤＮＡはメチル化されている可能性が高い。
そこでプローブから放出されるインプット断片の蛍光強度とＭｅＤＩＰ断片の蛍光強度とを比較してその強度差を解析することにより、そのプローブに対応するＤＮＡ領域がメチル化されている確率Ｐｍを求めることができる。
同様にして、プローブに対応するＤＮＡ領域がヒドロキシルメチル化されている確率Ｐｈｍを求めることができる。【００４３】
確率ＰｍおよびＰｈｍは、種々の計算手法によって求めることができるが、好ましくはχ２検定またはベイズ検定により求められる。
χ２検定およびベイズ検定は、それぞれマイクロアレイ解析用のアルゴリズムであるＡＣＭＥ（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｓｃａｃｈｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００６；４１１：２７０−８２．）およびＢａｔｍａｎ（Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｒａｋｙａｎ  ＶＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １８：１５１８−１５２９）を使用して行うことができる。【００４４】
上記ＭｅＤＩＰ解析及びｈＭｅＤＩＰ解析は、オートメーション化することができる。例えば、ＭｅＤＩＰおよびｈＭｅＤＩＰの解析が自動化装置の例としては、ＳＸ−８Ｇ  Ｃｏｍｐａｃｔ（ＰＳＳ社）、ＳＸ−８Ｇ（ＰＳＳ社）、６ＧＣ（ＰＳＳ社）、１２ＧＣ（ＰＳＳ社）、１２ＧＣ  Ｐｌｕｓ（ＰＣＣ）、ＥＺ１（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔａｒｇｅｔ  Ａｎｇｌｅｒ（多摩川精機）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
好ましい態様では、自動化装置はＳＸ−８Ｇ  Ｃｏｍｐａｃｔ（ＰＳＳ社）が用いられる。【００４５】
ＳＸ−８Ｇ  Ｃｏｍｐａｃｔは、本発明者らが基本的自動化プロトコール、ソフトウエア、自動化試薬と共に開発した自動化装置であり、これを用いてエピジェネティクス免疫沈降（ＭｅＤＩＰ，ｈＭｅＤＩＰ，ＣｈＩＰ等）の実験操作をオートメーション化することが可能である。
実験操作をオートメーション化することにより、手作業により生じるデータのばらつきやノイズによる誤認識などを回避することができる。その結果、データに高い再現性と信頼性が与えられる。【００４６】
確率値のマッピング
得られたメチル化確率値Ｐｍをマイクロアレイの各プローブ番号に割り当てることにより、確率値Ｐｍのマッピングをおこなう（図２参照）。マッピングは、ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ等の適切なブラウザを用いて行うことができるが、他にもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ＩＧＢ）（Ｎｉｃｏｌ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９  Ａｕｇ  ４［１］；Ｈｅｌｔ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９  Ａｕｇ  ２５；１０（１）：２６６．［２］）、Ｓｉｇｎａｌ  Ｍａｐ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ（Ａｇｉｌｅｎｔ）などを用いることができる。
図２は、縦軸をＰ値、横軸をプローブ番号としてマッピングを行ったときに示されるマッピンググラフの模式図である（グラフＡ：被検幹細胞のＰｍ値、グラフＢ：基準幹細胞のＰｍ値）。横軸のプローブ番号は染色体上の位置に対応する。図２に示すデータは仮想のものであるが、以下、この仮想データの例を参照しながら本発明のデータ処理工程を説明する。【００４７】
マッピングによってメチル化確率値Ｐｍとプローブ番号が対応する。そこで、以下のように対応するプローブ番号について被検幹細胞のＰｍ値と基準幹細胞のＰｍ値との比を求め、メチル化のパターンについて被検幹細胞と基準幹細胞との相関率Ｒを求めることができる。【００４８】
本発明において、被検幹細胞の解析に用いたマイクロアレイのプローブ番号ｎ（ｎは自然数）と、基準幹細胞の解析に用いたマイクロアレイのプローブ番号ｎ’（ｎ’は自然数）とは対応（一致）しているものとする。
被検幹細胞のプローブ番号ｎのメチル化確率Ｐｍ（ｎ）と、基準幹細胞の対応するプローブ番号ｎ’のメチル化確率Ｐｍ（ｎ’）から、比率ｒ（ｎ）＝Ｐｍ（ｎ）／Ｐｍ（ｎ’）を求める。同様にプローブ番号ｎ＋１、ｎ＋２、・・・ｎ＋ｉ（ｉは整数）について（基準幹細胞についてはｎ’＋１、ｎ’＋２、・・・ｎ’＋ｉについて）、比率ｒ（ｎ＋１）、ｒ（ｎ＋２）、・・・ｒ（ｎ＋ｉ）を求める。
ここで、番号ｎ〜ｎ＋ｉ（およびｎ’〜ｎ’＋ｉ）の各プローブは、染色体ＤＮＡの連続する領域（例えば１種類のプロモーター領域等）に対応するものである。
例として、グラフＡにプローブ番号ｎ〜ｎ＋３のメチル化確率Ｐｍ（ｎ）〜Ｐｍ（ｎ＋３）を示す。同様に、グラフＢプローブ番号ｎ’〜ｎ’＋３のメチル化確率Ｐｍ（ｎ’）〜Ｐｍ（ｎ’＋３）を示す。
図２の例の場合、被検幹細胞ではＰｍ（ｎ）＝１．０、Ｐｍ（ｎ＋１）＝０．５、Ｐｍ（ｎ＋２）＝０．８、Ｐｍ（ｎ＋３）＝０．４であり、他方、基準幹細胞ではＰｍ（ｎ’）＝０．９、Ｐｍ（ｎ’＋１）＝０．２５、Ｐｍ（ｎ’＋２）＝０．６、Ｐｍ（ｎ’＋３）＝１．０である。
この例では、比率ｒ（ｎ）＝Ｐｍ（ｎ）／Ｐｍ（ｎ’）＝１．０／０．９＝１．１１となり、同様に、ｒ（ｎ＋１）＝０．５／０．２５＝２、ｒ（ｎ＋２）＝０．８／０．６＝１．３３、ｒ（ｎ＋３）＝０．４／１．０＝０．４である。【００４９】
得られたｒ（ｎ）、ｒ（ｎ＋１）・・・ｒ（ｎ＋ｉ）のうち、値が一定の範囲内にある比率ｒの個数Ｓｒをカウントする。Ｓｒカウントされる比率ｒの数値範囲は、ある態様では０．５≦ｒ≦１．５であり、別の態様では、０．６≦ｒ≦１．４、０．７≦ｒ≦１．３、０．８≦ｒ≦１．２、０．９≦ｒ≦１．１である。
得られたＳｒから、相関率Ｒ（％）＝｛Ｓｒ／（ｉ＋１）｝ｘ１００を求める。
図２の例の場合、比率ｒ（ｎ）＝１．１１、ｒ（ｎ＋１）＝２、ｒ（ｎ＋２）＝１．３３、ｒ（ｎ＋３）＝０．４である。０．５≦ｒ≦１．５の範囲に含まれるのはｒ（ｎ）＝１．１１およびｒ（ｎ＋２）＝１．３３である。したがって、この場合、Ｓｒ＝２である。
そこで、相関率Ｒ（％）を求めると、
Ｒ（％）＝｛Ｓｒ／（ｉ＋１）｝ｘ１００＝｛２／（３＋１）｝ｘ１００＝５０％となる。【００５０】
同様にして、ヒドロキシメチル化についても、任意のプローブ番号におけるＰｈｍ値に関し、比率ｒ、値が一定の範囲内にある比率ｒの個数Ｓｒ、および相関率Ｒ（％）を求めることができる。
図３にその例を示す（グラフＣ：被検幹細胞のＰｈｍ値、グラフＤ：基準幹細胞のＰｈｍ値）。
図３の例の場合、被検幹細胞ではＰｈｍ（ｎ）＝０．８、Ｐｈｍ（ｎ＋１）＝０．５、Ｐｈｍ（ｎ＋２）＝０．４、Ｐｈｍ（ｎ＋３）＝０．９であり、他方、基準幹細胞ではＰｈｍ（ｎ’）＝０．９、Ｐｈｍ（ｎ’＋１）＝０．６、Ｐｈｍ（ｎ’＋２）＝０．３、Ｐｈｍ（ｎ’＋３）＝１．０である。
この例では、比率ｒ（ｎ）＝Ｐｈｍ（ｎ）／Ｐｈｍ（ｎ’）＝０．８／０．９＝０．９９となり、同様に、ｒ（ｎ＋１）＝０．５／０．６＝０．８３、ｒ（ｎ＋２）＝０．４／０．３＝１．３３、ｒ（ｎ＋３）＝０．９／１．０＝０．９である。
０．５≦ｒ≦１．５の範囲に含まれるのはｒ（ｎ）＝０．９９、ｒ（ｎ＋１）＝０．８３、ｒ（ｎ＋２）＝１．３３、ｒ（ｎ＋３）＝０．９である。したがって、この場合、Ｓｒ＝４である。
そこで、相関率Ｒ（％）を求めると、
Ｒ（％）＝｛Ｓｒ／（３＋１）｝ｘ１００＝｛４／（３＋１）｝ｘ１００＝１００％となる。
以下、メチル化およびヒドロキシメチル化の相関率をそれぞれＲｍおよびＲｈｍとする。【００５１】
解析されたパターンと性質との関連付け
上記のようにして求められた相関率Ｒ（％）の数値は、以下の基準に従って被検幹細胞の性質（特にエピジェネティックな状態）と関連付けることができる。
即ち、
（ａ）メチル化相関率Ｒｍが基準値Ｘ以上、かつヒドロキシメチル化相関率Ｒｈｍが前記基準値Ｘ以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及びヒドロキシメチル化が共に類似の状態にあると決定される。
（ｂ）メチル化相関率Ｒｍが基準値Ｘ未満、かつヒドロキシメチル化相関率Ｒ（ｈｍ）が前記基準値Ｘ以上のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、ヒドロキシメチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｃ）メチル化相関率Ｒｍが基準値Ｘ以上、かつヒドロキシメチル化相関率Ｒｈｍが前記基準値Ｘ未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化は類似の状態にあるが、ヒドロキシメチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｄ）メチル化相関率Ｒｍが基準値Ｘ未満、かつヒドロキシメチル化相関率Ｒｈｍが前記基準値Ｘ未満のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及びヒドロキシメチル化が共に非類似の状態にあると決定される。【００５２】
上記基準（ａ）〜（ｄ）において、「基準値Ｘ」は、被検幹細胞と基準幹細胞の種類、分化ステージ及び継代ステージに応じて適宜選択することが可能であり、ある実施態様では基準値Ｘは６０％に設定され、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、９０％または９５％に設定される。【００５３】
図２及び図３に示す仮想データの例では、Ｒｍ＝５０％、かつＲｈｍ＝１００％である。
基準値Ｘを６０％に設定した場合、図２及び図３の仮想データは、上記「（ｂ）メチル化相関率Ｒｍが６０％未満、かつヒドロキシメチル化相関率Ｒｈｍが６０％以上」のケースに該当するので、被検幹細胞と基準幹細胞とは、ヒドロキシメチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。【００５４】
相関係数Ｒ’を用いた態様
第二の態様として、被検幹細胞と基準幹細胞との間でＰ値のマッピンググラフの波形を比較して相関係数Ｒ’を求めることもできる。相関係数Ｒ’は、Ｒなどのフリーソフトウェアや、ＳＡＳ（ＳＡＳ）、ＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ）、Ｓｔａｔ（インフォーマティック）、ＳｔａｔＶｉｅｗ（ＳＡＳ）、ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ（スタットソフト）、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（ＨＵＬＩＮＫＳ）、ＳＹＳＴＡＴ（ＨＵＬＩＮＫＳ）、ＭＩＮＩＴＡＢ（インフォーマティック）、Ｐｒｉｓｍ（エムデーエフ）、ＪＭＰ（ＳＡＳ）、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）等の市販のソフトウェア等を用いて求めることができる。【００５５】
この場合、相関係数Ｒ’の数値は、以下の基準（ａ’）〜（ｄ’）に従って被検幹細胞の性質と関連付けることができる。
即ち、
（ａ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが基準値Ｘ’≦Ｒ’ｍ≦１．０（基準値Ｘ’は０＜Ｘ’＜１）であり、かつヒドロキシメチル化相関係数Ｒ’ｈｍが前記基準値Ｘ’≦Ｒ’ｈｍ≦１．０のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及びヒドロキシメチル化が共に類似の状態にあると決定される。
（ｂ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍがＲ’ｍ＜基準値Ｘ’であり、かつヒドロキシメチル化相関係数Ｒ’ｈｍが前記基準値Ｘ’≦Ｒ’ｈｍ≦１．０のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、ヒドロキシメチル化は類似の状態にあるが、メチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｃ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍが基準値Ｘ’≦Ｒ’ｍ≦１．０であり、かつヒドロキシメチル化相関係数Ｒ’ｈｍがＲ’ｈｍ＜前記基準値Ｘ’のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化は類似の状態にあるが、ヒドロキシメチル化は非類似の状態にあると決定される。
（ｄ’）メチル化相関係数Ｒ’ｍがＲ’ｍ＜基準値Ｘ’であり、かつヒドロキシメチル化相関係数Ｒ’ｈｍがＲ’ｈｍ＜前記基準値Ｘ’のとき、前記被検幹細胞と基準幹細胞とは、メチル化及びヒドロキシメチル化が共に非類似の状態にあると決定される。【００５６】
上記基準（ａ’）〜（ｄ’）において、「基準値Ｘ’」は、被検幹細胞と基準幹細胞の種類、分化ステージ及び継代ステージに応じて適宜選択することが可能であり、ある実施態様では基準値Ｘ’は０．７に設定され、好ましくは０．８、より好ましくは０．８５、０．９または０．９５に設定される。【００５７】
相関率Ｒ（％）（または相関係数Ｒ’）は、任意の染色体ＤＮＡの領域について求めることができる。例えば、１個の遺伝子のプロモーター領域について相関率Ｒ（％）（または相関係数Ｒ’）を求めてもよく、あるいは、複数の遺伝子を包含する遺伝子領域または遺伝子を含まない反復領域（マイクロサテライト領域等）について相関率Ｒ（％）（または相関係数Ｒ’）を求めることができる。【００５８】
本発明では、上記の通り、確率値を基にメチル化状態およびヒドロキシメチル化状態を決定する。したがって、メチル化およびヒドロキシメチル化の確率値は正確な値であることが好ましい。
そこで、本発明の方法では、好ましくはメチル化およびヒドロキシメチル化のパターン解析は、自動化装置によりオートメーションで行われる。
オートメーションでパターン解析を行えば、手作業で生じ得る実験誤差（溶液量、反応時間、攪拌条件等における誤差）を回避することができる。
自動化装置についてはすでに述べたとおりである。【００５９】
上記のようにして、被検幹細胞と基準幹細胞との間でメチル化およびヒドロキシメチル化の類似性または非類似性が決定されると、これを基に被検幹細胞の細胞学的特性を識別することができる。本発明の方法により識別できる細胞学的特性として継代ステージおよび分化ステージが挙げられる。【００６０】
（１）ｉＰＳ細胞の継代ステージの識別
基準幹細胞として良好な未分化状態および増殖能を維持したｉＰＳ細胞株を用い、被検幹細胞１及び２は、上記基準幹細胞を培養・増殖させ、複数回の継代を得たｉＰＳ細胞株（未分化マーカー遺伝子の発現は陽性）であるものと仮定する。
また、被検幹細胞と基準幹細胞とで未分化マーカー遺伝子（Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ４、Ｎａｎｏｇ等）のプロモーター領域について解析し、被検幹細胞１は同プロモーター領域のヒドロキシメチル化状態は類似であり、メチル化状態が非類似と決定され、被検幹細胞２はメチル化状態およびヒドロキシメチル化状態の両者が類似であると決定されるものと仮定する。
この場合、被検幹細胞１と基準幹細胞とでメチル化確率値Ｐｍを比較し、全体的に被検幹細胞１がより高いＰｍ値を示す場合、被検幹細胞１では一応未分化マーカー遺伝子が発現しているが、そのプロモーター領域は徐々にメチル化修飾を受けていると判断できる。したがって、被検幹細胞１は、今後、未分化マーカー遺伝子がオフ状態になり、未分化状態を維持できなくなる傾向にあると判断できる。
これに対し、被検幹細胞２は基準幹細胞とメチル化状態およびヒドロキシメチル化状態の両者が類似であり、今後も良好な未分化状態および増殖能を維持する傾向にあるものと判断できる。【００６１】
（２）神経幹細胞への分化ステージの識別
基準幹細胞として良好な増殖能および神経細胞への分化能を有する神経幹細胞株を用い、被検幹細胞１及び２は、ｉＰＳ細胞から神経幹細胞へ分化誘導する過程にある細胞株であり、現時点では神経幹細胞マーカー遺伝子（Ｎｅｓｔｉｎ、ＮＣＡＭ等）の発現は検出されていないものと仮定する。
また、被検幹細胞と基準幹細胞とで神経幹細胞マーカー遺伝子（Ｎｅｓｔｉｎ、ＮＣＡＭ等）のプロモーター領域について解析したところ、被検幹細胞１は同プロモーター領域のヒドロキシメチル化状態は類似であり、メチル化状態が非類似のものと決定され、被検幹細胞２は基準幹細胞とメチル化状態は同じであるが、ヒドロキシメチル化が非類似の状態にあると決定されるものと仮定する。
この場合、被検幹細胞１と基準幹細胞とでメチル化確率値Ｐｍを比較し、全体的に被検幹細胞１がより高いＰｍ値を示す場合、被検幹細胞１では現在、神経幹細胞マーカー遺伝子の発現が抑制されていることが分かる。そして、ヒドロキシメチル化の状態は、基準幹細胞と同じであることから、被検幹細胞１が基準幹細胞と比べて脱メチル化の傾向が高いとはいえない。したがって、被検幹細胞１では同プロモーター領域のメチルシトシンが脱メチル化する徴候はないといえる。
よって、被検幹細胞１は、ｉＰＳ細胞から神経幹細胞への分化誘導において分化初期ステージにあるものと判断することができる。
一方、被検幹細胞２は基準幹細胞とメチル化状態は同じであるため、神経幹細胞マーカー遺伝子の発現は強い抑制は受けていないことが分かる。また、ヒドロキシメチル化の状態は異なっているので、被検幹細胞２と基準幹細胞とでヒドロキシメチル化確率値Ｐｈｍを比較し、全体的に被検幹細胞２がより高いＰｈｍ値を示す場合、被検幹細胞２では現在、神経幹細胞マーカー遺伝子は発現のスイッチがオンに移行しつつあることが分かる。
したがって、被検幹細胞２はｉＰＳ細胞から神経幹細胞への分化誘導において分化後期ステージにあるものと判断することができる。【００６２】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
［実験手順］
メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）及びヒドロキシルメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ｈ−ＭｅＤＩＰ）の同時比較による幹細胞のメチル化／ヒドロキシルメチル化解析（ＭｅＤＩＰ／ｈ−ＭｅＤＩＰ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ）【００６４】
１．染色体ＤＮＡの調製及び濃度・サイズ測定
摂氏−８０℃で保存されたヒトＥＳ細胞ｋｈＥＳ−１及びｋｈＥＳ−３の細胞ペレット（京都大学）及びヒトｉＰＳ細胞ペレット（株式会社リプロセルより入手）を解凍し、０．９％ＮａＣｌ溶液を１００〜２００ｕＬに懸濁し、細胞濃度を１ｘ１０６細胞／１００μＬとした。
上記１００μＬを１．５ｍＬチューブに分注し、自動核酸精製装置１２ＧＣ（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）にセットした。染色体ＤＮＡ精製試薬のｗｅｌｌ１０に１０μｇ／ｍＬのＲｎａｓｅ  １μＬを添加し、調製試薬とした。
また、染色体ＤＮＡ調製プロトコールとしては、ＭａｇＤＥＡ  ＤＮＡ  ２００１２ＧＣ  ｖ３  ｗｉｔｈ  Ｒｎａｓｅｖｅｒ０．１（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）を用いた。約４０分後に、染色体ＤＮＡ溶液２０−５０μＬを得た（溶出容量設定により、溶出量は異なる）。
小型分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐに染色体ＤＮＡ溶液を２μＬ重層し、濃度とＡ２６０／Ａ２８０を測定した。結果、濃度６０〜１２０μｇ／μＬ，２０〜５０μＬ，Ａ２６０／Ａ２８０  １．８〜１．９程度の染色体ＤＮＡを得た。
次に１ｘＴＡＥ緩衝溶液系で１％アガロース電気泳動を行った。マーカーとして、Ｗｉｄｅ  ｒａｎｇｅ  ｍａｒｋｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）とＬａｍｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）２μＬを用いた。染色体ＤＮＡのサイズは、約２０Ｋｂｐｓ程度の単一バンドであった（図４：レーンＡ）。【００６５】
２．超音波による染色体ＤＮＡの断片化
精製したＤＮＡ溶液に適量の２ｘＴＥとＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水を添加し、１ｘＴＥに溶解した５０ｎｇ／μｌの染色体ＤＮＡ溶液を調製した。１．５ｍＬチューブに、上記５０ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ，２００μＬを添加し、以下の条件で破砕した。超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒ  ＵＣＤ−２５０（東湘電気社製）を冷却し、４℃の冷却水中で出力ｍｅｄｉｕｍ，１５ｓｅｃ  ＯＮ／１５ｓｅｃ  ＯＦＦの条件で破砕した。１％アガロース電気泳動で破砕された染色体ＤＮＡのサイズを確認した。結果、約２００〜８００ｂｐｓの破砕ＤＮＡ断片を得た（図４：レーンＢ）。【００６６】
３Ａ．メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）
自動エピジェネティクスシステム（プレシジョン・システム・サイエンス社製）を使用して自動免疫沈降を行った。試薬としてＡｕｔｏ  ＭｅＤＩＰ  Ｋｉｔ試薬（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社製）を用いた。
ＷｅｌｌにＡｕｔｏ  ＭａｇＤＥＡ−ＩＰ  ｋｉｔ（プレシジョン・システム・サイエンス社製）のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを添加した。工程２で破砕した染色体ＤＮＡ１μｇを、９５℃、３分加熱後、氷水で急冷し、一本鎖ＤＮＡに変性させた。その後、変性したＤＮＡ溶液に抗５−メチルシトシン抗体  １μｇ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社製）を添加し、ＳＸ−８Ｇ  システムをもちいて自動免疫沈降を行った。ＣｈＩＰ  Ｔｙｐｅ  Ｂプロトコールを用いて、抗５−メチルシトシン抗体、磁気ビースと破砕した染色体ＤＮＡが共存した状態で撹拌した。夾雑物を除くため、磁気ビーズと抗体とＤＮＡの免疫複合体を２種類の洗浄溶液で４回、自動的に洗浄を行った。【００６７】
３Ｂ．ヒドロキシルメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ｈ−ＭｅＤＩＰ）
工程３Ａと同一の装置を使用し、試薬としてＡｕｔｏ  ｈ−ＭｅＤＩＰ  Ｋｉｔ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社製）及びＡｕｔｏ  ＭａｇＤＥＡ−ＩＰ  ｋｉｔのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて自動免疫沈降を行った。工程２で破砕した染色体ＤＮＡ１μｇを、９５℃、１０分加熱後、氷水で急冷し、一本鎖とした。その後、変性したＤＮＡ溶液に抗５−ヒドロキシメチルシトシン抗体  １μｇを添加し、自動化システムにより自動免疫沈降を行った。ＣｈＩＰ  Ｔｙｐｅ  Ａプロトコール（間接型免疫沈降法）用いて、抗５−ヒドロキシメチルシトシン抗体と染色体ＤＮＡの複合体を形成させた後、磁気ビースで抗体とＤＮＡの免疫複合体複合体を補足した。夾雑物を除くため、磁気ビーズと抗体とＤＮＡの免疫複合体を２種類の洗浄溶液で４回、自動的に洗浄を行った。【００６８】
４．プロテアーゼＫ処理
免疫沈降が終了した磁気ビーズ懸濁溶液（免疫沈降濃縮サンプル）に、プロテアーゼＫ溶液（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社製）１μＬを添加した。また、９０μＬのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに１０μＬの免疫沈降前のサンプルを添加し、インプットサンプルとした。インプットサンプルにも、プロテアーゼＫ１μＬを添加した。次に、免疫沈降濃縮サンプルとインプットサンプルに蓋をして、５８℃で１５分加熱し、上記免疫複合体のタンパク質を消化しさせた。そして、プロテアーゼＫの酵素活性を失活させるために、各サンプルを９５℃、１５分加熱した。加熱後、遠心（１０００ｒｐｍ、２５℃、１分）し、蓋に付着した水滴を回収した。【００６９】
５．ＤＮＡ断片の自動精製及び濃度測定
工程４で得た溶液を自動エピジェネティクス装置ＳＸ−８Ｇにセットし、ＤＮＡ断片を精製した。試薬としては、Ａｕｔｏ  ＭａｇＤＥＡ−ＩＰ  Ｋｉｔを、精製プロトコールとしてはＭａｇＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ８＿ｖ２．ＨＤＬまたはＭａｇＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ１６＿ｖ２−１．ＨＤＬを用いた。精製ＤＮＡとして、１０〜１３μＬの溶液を回収した。
次に小型分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐに染色体ＤＮＡ溶液を２μＬ重層し、濃度とＡ２６０／Ａ２８０を測定した。濃度は１〜２ｎｇ／μｌであった。【００７０】
６．濃縮ＤＮＡ断片の増幅・精製
ＷＧＡ２キット（シグマ社製）を用いて、５−１０ｎｇの濃縮ＤＮＡ断片を増幅した。Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加後、熱変性させずにＬｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒとＥｎｚｙｍｅを加え、ユニバーサルリンカーを付加した。
次にＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＷＧＡ２キットの残存するユニバーサル・プライマーを除去した。１ｘＴＡＥ緩衝溶液系で１％アガロース電気泳動を行った。マーカーとして、Ｗｉｄｅ  ｒａｎｇｅ  ｍａｋｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ社製）とＬａｍｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）２μＬを用いた。ＤＮＡサンプル２μＬにＷａｔｅｒ６μＬ、５ｘＤｙｅ２μＬを添加し、１００Ｖ，２５ｍｉｎ電気泳動した。ＷＧＡ２増幅断片は５００−２０００ｂｐｓの領域で増幅されたことを確認した（図５）。【００７１】
７．マイクロアレイ解析
免疫沈降で濃縮したＤＮＡサンプルとインプットサンプルを、それぞれ、蛍光色素Ｃｙ５とＣｙ３でラベルした。ラベル化後、各社マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製及びＮｉｍｂｌｅｇｅｎ社製）上で、１：１０濃度比の競合ハイブリダイゼーションを行った。１６時間ハイブリダイゼーションの後、洗浄溶液で洗浄し、蛍光スキャナーでシグナルを検出した。色素間補正後、シグナル強度をテキストデータとして、保存した。【００７２】
８．シグナルデータの数値処理
メチル化領域のＰ値算出には、Ｂａｔｍａｎアルゴリズム（Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｄｏｗｎ作成）とＡＣＭＥアルゴリズム（Ｓｅａｎ  Ｄａｖｉｓ作成）を利用した。Ａｇｉｌｅｎｔ社製マイクロアレイには、解析ソフトＧｅｎｏｍｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋ  Ｂｅｎｃｈ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）内のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ内のＢａｔｍａｎプログラムを用いた。また、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ社製マイクロアレイにはＡＣＭＥプログラムを用いた。【００７３】
９．各Ｐ値のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ上でのマッピング
ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ上で各プローブ位置でのＰ値をマッピングした。継代の異なる各ステージの幹細胞（ｋｈＥＳ  １株）、すなわち、継代初期（Ｅ１）、継代後期（Ｅ２）、及びＥ１のレチノイン酸による分化細胞（Ｅ３）に対して、ＭｅＤＩＰとｈＭｅＤＩＰによるＰ値を比較しながら、マッピングを行った。ＭｅＤＩＰの結果を５−メチルシトシンによるメチル化の指標として、ｈＭｅＤＩＰによる結果を５−ヒドロキシシトシンによる脱メチル化の指標とした。【００７４】
１０．メチル化／ヒドロキシメチル化パターン解析
以下の手順により、シトシン残基のメチル化およびヒドロキシメチル化のパターン解析を行った。
（１）近傍の５プローブ（これを１つの「プローブ群」とする）に関して、Ｐ値の比ｒ＝株１／株２をとる。
（２）値が１．３−０．７に含まれる比ｒを選択し、その個数Ｓｒをカウントする。
（３）相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を計算し、８０−１００％の領域を類似パターンと判断する。【００７５】
［実施例１］
ｉＰＳ細胞のメチル化／ヒドロキシメチル化パターン解析
ヒトｉＰＳ細胞（以下、「ｈｉＰＳ細胞」）に対して上記工程１〜１０の解析を行ったところ、図６〜９のマッピンググラフが得られた。
図６〜９のマッピンググラフにおいて、上向きのグラフはメチル化Ｐ値のパターンであり、下向きのグラフは非メチル化Ｐ値のパターンである。図６〜９の各図において、上パネル及び下パネルのグラフは、それぞれｈｉＰＳ細胞の株１及び株２の同一のＤＮＡ領域におけるパターンを示す。また、図６〜９はそれぞれ異なるＤＮＡ領域におけるパターンを示す。
図６〜９のマッピンググラフのメチル化Ｐ値のパターンの数値データをそれぞれ表１〜４に示す。
表１
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表２
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表３
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表４
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表１のｓｅｔ１株およびｓｅｔ５株のメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝ｓｅｔ１／ｓｅｔ５を求めた。
次に、連続する５つプローブ（プローブ群）の比ｒのうち、値が１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
例えば、表１において、最初のプローブ群の比ｒ（即ち、０．８６３、０．３５２、０．４４４、０．３７７及び０．７４９）のうち、値が１．３−０．７に含まれる比ｒ（即ち、０．８６３及び０．７４９）を選択し、その個数Ｓｒ（＝２）をカウントし、相関率Ｒ（％）＝（２／５）ｘ１００＝４０％を算出した。同様に、他のプローブ群に関して相関率を算出した。
表１において、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率が８０％以上となっており、メチル化のパターンが類似するといえる。
なお、表１の「ｓｅｔ１」及び「ｓｅｔ５」に示すメチル化Ｐ値のパターンについて相関係数Ｒ’を求めたところ、０．９２０という高い値が得られた。【００７６】
同様に、表２のｓｅｔ１株およびｓｅｔ５株のメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝ｓｅｔ１／ｓｅｔ５を求めた。
次に、連続する５つプローブ（プローブ群）の比ｒのうち、値が１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表２において、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率が８０％以上となっており、メチル化のパターンが類似する。
なお、表２の「ｓｅｔ１」及び「ｓｅｔ５」に示すメチル化Ｐ値のパターンについて相関係数Ｒ’を求めたところ、０．９１２という高い値が得られた。【００７７】
表３のｓｅｔ１株およびｓｅｔ５株のメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝ｓｅｔ１／ｓｅｔ５を求めた。
次に、連続する５つプローブ（プローブ群）の比ｒのうち、値が１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表３では、相関率が８０％以上となるプローブ群は存在しなかった。
表３の「ｓｅｔ１」及び「ｓｅｔ５」に示すメチル化Ｐ値のパターンについて相関係数Ｒ’を求めたところ、０．７０１という値が得られた。【００７８】
また、表４のｓｅｔ１株およびｓｅｔ５株のメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝ｓｅｔ１／ｓｅｔ５を求めた。
次に、連続する５つプローブ（プローブ群）の比ｒのうち、値が１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表４では、相関率が８０％以上となるプローブ群は存在しなかった。
表４の「ｓｅｔ１」及び「ｓｅｔ５」に示すメチル化Ｐ値のパターンについて相関係数Ｒ’を求めたところ、０．３０３という値が得られた。【００７９】
［実施例２］
ＥＳ細胞のメチル化／ヒドロキシメチル化パターン解析
ヒトＥＳ細胞に対して上記工程１〜１０の解析を行ったところ、図１０〜１３のマッピンググラフが得られた。
図１０〜１３のマッピンググラフにおいて、上パネルのグラフはメチル化Ｐｍ値のパターンであり、下パネルのグラフはヒドロキシメチル化Ｐｈｍ値のパターンである。図１０〜１３の各図に示すグラフは、それぞれヒトＥＳ細胞の株１及び株２の同一のＤＮＡ領域におけるパターンを示す。また、図１０〜１３はそれぞれ異なるＤＮＡ領域におけるパターンを示す。
図１０〜１３のマッピンググラフのメチル化Ｐ値のパターン（５ｍＣ）及びヒドロキシメチル化Ｐ値パターン（５ｈｍＣ）の数値データをそれぞれ表５〜８に示す。
表５
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表６
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表７
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表８
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【００８０】
表５の「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の各欄において「Ａ０２株」及び「Ａ０３株」に示す数値は、それぞれメチル化Ｐ値及びヒドロキシメチル化Ｐ値を示す。
各プローブのメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０２株／Ａ０３株を求めた。同様に、ヒドロキシメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０２株／Ａ０３株を求めた。
次に、メチル化ｒ値及びヒドロキシメチル化ｒ値のそれぞれについて、１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。メチル化及びヒドロキシメチル化の相関率Ｒをそれぞれ示す。
表５のメチル化パターン（５ｍＣ）において、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率Ｒが８０％以上となっており、メチル化のパターンが類似するといえる。
また、表５のヒドロキシメチル化パターン（５ｈｍＣ）において、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率Ｒが８０％以上であり、ヒドロキシメチル化のパターンが類似するといえる。
なお、表５のメチル化Ｐ値のパターンについてＡ０２株とＡ０３株との間で相関係数Ｒ’を求めたところ、０．９５３という高い値が得られ、ヒドロキシメチル化Ｐ値のパターンについては相関係数Ｒ’＝０．９２１という値が得られた。【００８１】
表６の「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の欄は、それぞれメチル化及びヒドロキシメチル化を表す。また、「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の各欄において「Ａ０２株」及び「Ａ０３株」に示す数値は、それぞれメチル化Ｐ値及びヒドロキシメチル化Ｐ値を示す。
各プローブのメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０２株／Ａ０３株を求めた。同様に、ヒドロキシメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０２株／Ａ０３株を求めた。
次に、メチル化ｒ値及びヒドロキシメチル化ｒ値のそれぞれについて、１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表６のメチル化パターンにおいて、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率Ｒが８０％以上であり、メチル化のパターンが類似するといえる。
他方、表６のヒドロキシメチル化パターンにおいて、相関率Ｒが８０％以上のプローブ群は認められなかった。
なお、表６のメチル化Ｐ値のパターンについてＡ０２株とＡ０３株との間で相関係数Ｒ’を求めたところ、０．９７３という高い値が得られ、ヒドロキシメチル化Ｐ値のパターンについては相関係数Ｒ’＝０．５８８という値が得られた。【００８２】
表７の「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の欄は、それぞれメチル化及びヒドロキシメチル化を表す。また、「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の各欄において「Ａ０１株」及び「Ａ０３株」に示す数値は、それぞれメチル化Ｐ値及びヒドロキシメチル化Ｐ値を示す。
各プローブのメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０１株／Ａ０３株を求めた。同様に、ヒドロキシメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０１株／Ａ０３株を求めた。
次に、メチル化ｒ値及びヒドロキシメチル化ｒ値のそれぞれについて、１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表７のメチル化パターンにおいて、相関率Ｒが８０％以上のプローブ群は認められなかった。
他方、表７のヒドロキシメチル化パターンにおいて、枠で囲った各プローブ群では、それぞれ相関率Ｒが８０％以上となっており、ヒドロキシメチル化のパターンが類似するといえる。
なお、表７のメチル化Ｐ値のパターンについてＡ０１株とＡ０３株との間で相関係数Ｒ’を求めたところ、−０．２８２という値が得られ、ヒドロキシメチル化Ｐ値のパターンについては相関係数Ｒ’＝０．９８８という値が得られた。【００８３】
表８の「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の欄は、それぞれメチル化及びヒドロキシメチル化を表す。また、「５ｍＣ」及び「５ｈｍＣ」の各欄において「Ａ０１株」及び「Ａ０３株」に示す数値は、それぞれメチル化Ｐ値及びヒドロキシメチル化Ｐ値を示す。
各プローブのメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０１株／Ａ０３株を求めた。同様に、ヒドロキシメチル化Ｐ値について、Ｐ値の比ｒ＝Ａ０１株／Ａ０３株を求めた。
次に、メチル化ｒ値及びヒドロキシメチル化ｒ値のそれぞれについて、１．３−０．７に含まれるものを選択し、その個数Ｓｒをカウントし、相関率Ｒ（％）＝（Ｓｒ／５）ｘ１００を求めた。
表８のメチル化パターンにおいて、相関率が８０％のプローブ群は認められなかった。同様に、ヒドロキシメチル化パターンにおいても、相関率Ｒが８０％のプローブ群は認められなかった。
なお、表８のメチル化Ｐ値のパターンについてＡ０１株とＡ０３株との間で相関係数Ｒ’を求めたところ、０．７９６という値が得られ、ヒドロキシメチル化Ｐ値のパターンについては相関係数Ｒ’＝−０．１２５という値が得られた。【００８４】
［実施例３］
相関係数Ｒ’を用いた識別方法
３株のＥＳ細胞（Ａ０１〜Ａ０３）に対し、上記実験手順に示す工程１〜９を行い、メチル化Ｐｍ値のマッピンググラフを得た（図１４）。図１４の例（Ｃａｓｅ）１〜３は、それぞれ異なるＤＮＡ領域のマッピンググラフである。メチル化シトシンの修飾のＰ値を、１０−２０個からなる各プローブセットを単位として、細胞群間での相関係数Ｒ’を求めた。相関係数Ｒ’＝０．８〜１．０の群を類似すると判断した。【００８５】
図１４の例１で判定法を説明する。１０〜２０個の連続するプローブのセットごとに、系統１と系統２、系統２と系統３、系統３と系統１のＰ値における相関係数を求めた。図１５に示す３つの囲み部分はそれぞれ例１、２、３におけるＰ値の数値データである。
下記表９に示すように、それぞれの相関係数は０．２９、０．９４、０．１７と計算された。系統２と系統３はＰ値のヒストグラムの上昇傾向に類似性がみられた。系統２と系統３において、Ｐ値の上昇パターンが類似していることが、相関係数で確認された。具体的な数値データを図１５に示す。
例２の場合、相関係数は０．２４、０．１１、−０．３４と計算され、Ｐ値のヒストグラムにも類似性がみられなかった。
同様に、例３では系統３と系統１間で、相関係数が０．９４と計算された。パターンも類似していることが確認できた。一方、系統１と系統２、系統２と系統３ではそれぞれ相関係数が−０．１２、−０．１４となり、Ｐ値の上昇パターンにも類似性が見いだされなかった。
表９
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【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の方法に従ってメチル化及び脱メチル化Ｐ値パターンを比較することで幹細胞の性状をより簡便で明確に識別することが可能になった。また、本発明の方法を実施するに当たり、本発明者らが開発した自動化エピジェネティクシステムを用いることで、さらに実験に要する操作を単純化し、再現性、信頼性の高いデータが得られることが証明された。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
2014112655.tif 000029
2014112655.tif 000030