(57)【要約】  本発明は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、該キャプシドタンパク質をコードする核酸、該核酸を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する細胞、該細胞の製造方法を提供する。
2014103957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸。
【請求項２】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項１記載の核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸又は請求項４記載の組換えＤＮＡを含む細胞。
【請求項６】
配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子。
【請求項７】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項６記載のＡＡＶ粒子。
【請求項８】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項６記載のＡＡＶ粒子。
【請求項９】
配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
【請求項１０】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、当該キャプシドタンパク質の変異体を含むＡＡＶ粒子及び当該粒子を使用する遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＡＶは、ふたつのオープンリーディングフレームｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスである。ｒｅｐ遺伝子は、ゲノム複製に必要な４種のタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、ｃａｐ遺伝子は、ウイルスキャプシド形成のために集成する３種のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＡｓｓｅｍｂｌｙ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＡＰ）を発現する。自然界でのＡＡＶの複製はアデノウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に左右される。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームに維持されるか、又は宿主染色体に組込まれ潜伏状態となる。現在、１００を超えるＡＡＶ血清型、クレード（非特許文献１）が同定されているが、特にＡＡＶ２が遺伝子送達ベクターとして開発が進められている。【０００３】
１９８９年にＡＡＶ２を基に遺伝子送達ベクターシステムが初めて開発されている。ＡＡＶを基にしたベクターは、多くの利点を有することが示されている。野生型ＡＡＶは非病原性であり、いずれの既知の疾患とも病原学的関係を有さないので、ＡＡＶを基にしたベクターは極めて安全だと言われている。加えてＡＡＶは、効率の高い遺伝子導入能を有する。【０００４】
ＡＡＶ粒子の投与でさまざまな標的臓器、標的細胞に長期的に安定した遺伝子導入が可能である。現在までに、骨格筋、肝臓（肝細胞）、心臓（心筋細胞）、神経細胞、膵腺細胞、膵島細胞に高い効率で遺伝子を導入することが示されている。更にＡＡＶは、ヒト臨床試験において使用された実績を有する。一方で、ＡＡＶのキャプシドタンパク質を改変してＡＡＶの細胞指向性を変化させる試みや、中和抗体によるＡＡＶ粒子の除去を回避する試みが行われている。例えば、神経膠細胞、気道上皮細胞、冠動脈血管内皮細胞又は肺などの特定の臓器や細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製や、膠芽腫、メラノーマ、肺がん又は乳がんなどの腫瘍細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製が行われてきた（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇａｏ他、ジャーナル  オブ  ウイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７８巻、６３８１−６３８８頁、２００４年
【非特許文献２】Ａｄａｃｈｉ  Ｋ他、ジーン  セラピー  アンド  レギュレーション（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｒｅｇｕｌ．）、第５巻、３１−５５頁、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、心臓や免疫器官、特にリンパ節に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を提供し、リンパ節に効率的に遺伝子を導入する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を作製し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸、
［２］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［１］記載の核酸、
［３］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［１］記載の核酸、
［４］［１］〜［３］のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ、
［５］［１］〜［３］のいずれか１項に記載の核酸又は［４］記載の組換えＤＮＡを含む細胞、
［６］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子、
［７］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［６］記載のＡＡＶ粒子、
［８］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［６］記載のＡＡＶ粒子、
［９］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法、
［１０］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［９］記載の方法、
［１１］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［９］記載の方法、に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、心臓や免疫器官への遺伝子導入に有用な遺伝子導入システムが提供される。本発明のＡＡＶ粒子は免疫器官、特にリンパ節に対し高い細胞指向性を有し、導入した遺伝子を強く発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】キャプシドタンパク質にランダムペプチドを含有させる核酸構築物の作製方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する、ヒトを含む霊長目の動物やその他の哺乳類に感染する小型のウイルスを示す。以下、Ａｄｅｎｏ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓを省略してＡＡＶと記載する。ＡＡＶはエンベロープを持たない正２０面体の外殻（キャプシド）とその内部に１本の１本鎖ＤＮＡを有する。本明細書において、ＡＡＶは野生型ウイルス及びその派生物を含み、特に記載する場合を除き全ての血清型及びクレードを含む。
【００１２】
本明細書において「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含む又はポリヌクレオチドに会合して、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用することができる分子又は分子の会合体を意味する。例えば、プラスミドベクターやファージベクターなどのベクターＤＮＡ、ウイルスベクター粒子、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられ、これらは特に記載する場合を除き全てベクターに含まれる。
【００１３】
本明細書において「キャプシドタンパク質」は、ＡＡＶのゲノムに存在するｃａｐ遺伝子にコードされるタンパク質で、ＡＡＶのキャプシドを構成するタンパク質を意味する。野生型ＡＡＶゲノムは３種類のキャプシドタンパク質をコードし、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が存在する。本明細書においては、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもがキャプシドタンパク質に含まれる。
【００１４】
（１）ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸
本発明の核酸は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸である。
【００１５】
本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂなど）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１１）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶなど、任意のＡＡＶキャプシドタンパク質にペプチドを挿入するか、又はＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の一部をペプチドで置換する（すなわち、ＡＡＶキャプシドタンパク質にペプチドを含有させる）ことにより調製することができる。本発明においては、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質が特に好適に使用できる。
【００１６】
本発明の核酸において、ＡＡＶキャプシドタンパク質に含有させるペプチドは、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。さらに、前記のペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にスペーサー配列を付加させてもよい。スペーサー配列は１〜５アミノ酸残基が好適である。スペーサー配列のアミノ酸は特に限定は無いが、例えばグリシン、アラニン及びセリンからなる群より選択されるアミノ酸が使用できる。
【００１７】
ペプチドを含有させるＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもが使用できる。ＶＰ１のみ、ＶＰ２のみ又はＶＰ３のみにペプチドを含有させても良く、ＶＰ１〜ＶＰ３の全てのキャプシドタンパク質にペプチドを含有させても良い。さらに、ＶＰ１及びＶＰ２、ＶＰ２及びＶＰ３、ＶＰ１及びＶＰ３の組合せのように、２種類のキャプシドタンパク質に含有させても良い。ＶＰ１〜ＶＰ３は、ＡＡＶゲノムのｃａｐ遺伝子領域にコードされている。本発明の一態様として、ＶＰ１〜ＶＰ３に共通した領域にペプチドを含有させて、ＶＰ１〜ＶＰ３の全てに変異を導入することができる。また、別の態様として、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域とは別に、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３をコードする遺伝子を準備し、この遺伝子に変異を導入することができる。この場合、変異を導入した遺伝子にコードされるキャプシドタンパク質に対応するキャプシドタンパク質がＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域から発現しないような処置を行っても良い。
【００１８】
本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体においてペプチドを含有する位置は、ＡＡＶ２のＶＰ１の場合、アミノ酸番号５８８番に続く位置、すなわちアミノ酸番号５８８番の後ろが好ましい。ＡＡＶ２  ＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ２のＶＰ２のアミノ酸番号４５１番、ＡＡＶ２のＶＰ３のアミノ酸番号３８６番に相当する。さらに、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番のアミノ酸に対応する、ＡＡＶ２以外の血清型、クレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質のアミノ酸を、当業者は容易に特定することができる。例えば、Ｇａｏら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．）、第９９巻、第１８号、１１８５４−１１８５９頁、２００２年に記載されるＶＰ１のアミノ酸配列のアライメントを参照することができる。例えば、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ１では５８９番、ＡＡＶ７では５９０番、ＡＡＶ８では５９１番である。
【００１９】
本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質に、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列が保持されている以外に、１〜数個または複数のアミノ酸が挿入、付加、置換又は欠失されたタンパク質であっても良い。
【００２０】
本発明の核酸は、適切な制御配列と作動可能に連結してもよい。制御配列には、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが含まれる。プロモーター配列には、誘導性プロモーター配列、構成的プロモーター配列が含まれる。制御配列はキャプシドタンパク質の由来となるＡＡＶに固有のものであっても外来性のものであってもよく、天然配列であっても合成配列であってもよい。このような、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現可能な組換えＤＮＡも本発明に包含される。
【００２１】
本発明の組換えＤＮＡは、試験管内、生体外及び生体内の細胞へ本発明の核酸を送達し、当該細胞にＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する能力を付与するのに有用である。そして、本発明の核酸が送達された細胞はＡＡＶ粒子を製造するのに有用である。当該組換えＤＮＡは特に、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞へ本発明の核酸を送達又は導入するのに用いることができる。
【００２２】
本発明では、ベクターとして使用されているＤＮＡに本発明の核酸を保持させて本発明の組換えＤＮＡを作製することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、トランスポゾン、コスミドＤＮＡ、エピソーマルＤＮＡ、ウイルスゲノムが使用できる。
【００２３】
（２）本発明の核酸を含む細胞
本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記（１）の組換えＤＮＡを含む宿主細胞、例えば単離された宿主細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の宿主細胞は、以下に説明するように本発明のＡＡＶ粒子の製造に有用である。本発明の宿主細胞がＡＡＶ粒子を製造するために使用される場合、これは「パッケージング細胞」又は「プロデューサー細胞」と称することがある。本発明の宿主細胞は、前記（１）記載の本発明の組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれても良く、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えＤＮＡが細胞内に保持されていても良い。
【００２４】
宿主細胞への本発明の組換えＤＮＡの導入は、公知の方法により実施することができる。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、細胞への直接的微量注入法、リポソーム媒介型遺伝子導入法、高速微粒子銃を使用する核酸送達法などを使用できる。また、ウイルスベクターを使用する場合には、当該ベクターに適した感染法を選択すればよい。このような確立された技術を用いて、本発明の組換えＤＮＡは宿主細胞の染色体に安定的に、又は宿主細胞の細胞質に一過性に導入される。安定した形質転換のために、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードしている）などの周知の選択マーカーを本発明の組換えＤＮＡに連結することができる。
【００２５】
宿主細胞には、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの、様々な細胞が使用できる。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
【００２６】
（３）本発明の核酸にコードされるアミノ酸配列を含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子
本発明のＡＡＶ粒子は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子である。当該ＡＡＶ粒子は、前記（２）に記載される宿主細胞により製造することができる。本発明のＡＡＶ粒子は、心臓（心筋）、免疫器官（免疫細胞）、特にリンパ節に指向性を有し、傍大動脈リンパ節及び／又は大腿リンパ節への遺伝子導入に有用である。本発明のＡＡＶ粒子により導入された遺伝子は、前記組織、器官及び細胞で強く発現される。
【００２７】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子の製造に必要ないくつかの成分を含む細胞をパッケージング細胞として利用して製造することができる。第１の成分は、宿主細胞内で複製及びＡＡＶ粒子にパッケージングされ得る組換えＡＡＶのベクターゲノム（発現ベクターとも呼ばれる）である。組換えＡＡＶのベクターゲノムは、所望の異種ポリヌクレオチドと、その両側に、すなわち５’及び３’側にそれぞれＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が位置する。所望の異種ポリヌクレオチドは、その発現のための制御配列を有しうる。ＩＴＲ配列の塩基配列は公知であり、例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列については、Ｋｏｔｉｎ  Ｒ．Ｍら、ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、７９３−８０１頁、１９９４年を参照することができる。さらに、ＩＴＲ配列として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７など、様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来するＩＴＲ配列を使用することができる。本発明において使用されるＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ由来の配列でも良く、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されていても良い。ＩＴＲ配列は、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、組換えＡＡＶのベクターゲノムの複製を可能にし、ＡＡＶ粒子形成の際にキャプシド粒子内への組込みを可能にする。
【００２８】
本発明のＡＡＶ粒子に搭載可能な所望の異種ポリヌクレオチドは、一般にサイズが約５キロベース（ｋｂ）未満であり、例えばレシピエントに欠損した又は失われた所望のタンパク質をコードする遺伝子、所望の生物学的又は治療的作用（例えば、抗菌、抗ウイルス又は抗腫瘍作用）を有するタンパク質をコードする遺伝子、有害な又は望ましくないタンパク質の産生を阻害又は低下するＲＮＡをコードする所望のヌクレオチド配列、抗原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列など、目的に応じて適宜設定することができる。
【００２９】
本発明の一態様として、組換えＡＡＶのベクターゲノムは、ｃａｐ遺伝子領域及び／又はｒｅｐ遺伝子領域を欠いており、この態様の組換えＡＡＶのベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶ粒子は、感染した細胞内で単独で再度ＡＡＶ粒子に複製されない。
【００３０】
ＡＡＶ粒子の製造に必要な第２の成分は、ＡＡＶヘルパー機能を提供する構築物である。この構築物は、ＡＡＶ粒子の形成のために必要なＡＡＶ遺伝子産物を提供するＡＡＶ由来の遺伝子をコードしている。すなわち、主要なＡＡＶ  ＯＲＦであるｒｅｐ遺伝子領域及びｃａｐ遺伝子領域のコード領域の一方又は両方を含む。本発明のＡＡＶ粒子を製造するために、少なくとも配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸をｃａｐ遺伝子として使用する。この変異体を発現する能力を有している、前記（２）に記載される本発明の宿主細胞をＡＡＶ粒子の製造に使用することができる。ＡＡＶ粒子は多数のキャプシドタンパク質から構成される外殻を有するが、全てのキャプシドタンパク質が変異体であっても良く、その一部が変異体で残りが野生型のキャプシドタンパク質でもあっても良い。さらに、本発明のＡＡＶ粒子に含まれるキャプシドタンパク質変異体は１種類の変異体であっても良く、複数種の変異体であっても良い。
【００３１】
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子コード領域に含まれ、複製タンパク質Ｒｅｐ  ７８、Ｒｅｐ  ６８、Ｒｅｐ  ５２及びＲｅｐ  ４０をコードする遺伝子を含む。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＡＡＶ由来プロモーターの転写の変更を含む、多くの機能を有することが示されている。
【００３２】
ＡＡＶ粒子の製造に必要な第３の成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパーウイルス機能（アクセサリー機能とも呼ばれる）である。ヘルパー機能の導入には一般にアデノウイルスが使用されるが、例えば１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスも使用することができる。ウイルスを使用する場合は、宿主細胞にウイルスをヘルパーウイルスとして感染させる。例えば、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみがＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なので、後期遺伝子発現を呈さないアデノウイルスを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体（例えばｔｓ１００Ｋ又はｔｓ１４９アデノウイルス変異体）を使用することができる。あるいは、ヘルパーウイルスから単離したヘルパーウイルス機能に必要な核酸を使用し、ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物を作製して宿主細胞に導入することができる。ヘルパーウイルス機能を提供する構築物は、１種又は複数のヘルパーウイルス機能を提供するヌクレオチド配列を含み、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又は他のウイルスの形で宿主細胞に提供される。
【００３３】
ＡＡＶ粒子を製造するために、前記（ａ）第１の成分である組換えＡＡＶのベクターゲノムを宿主細胞に導入する工程、（ｂ）第２の成分であるＡＡＶヘルパー機能を提供する構築物を宿主細胞に導入する工程、（ｃ）第３の成分であるヘルパーウイルス機能を宿主細胞に導入する工程、を実施する。これらの工程は同時に実施されても良く、順番に実施されても良い。（ａ）〜（ｃ）の順番はどのような順番であっても良い。宿主細胞に第１〜第３の成分が導入されることにより、ｒｅｐ遺伝子の発現産物は、組換えＡＡＶのベクターゲノムを切出し、複製する。発現されたキャプシドタンパク質はキャプシドを形成し、組換えＡＡＶのベクターゲノムがキャプシドにパッケージングされてＡＡＶ粒子が産生される。そして、この宿主細胞がＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する場合、産生されたＡＡＶ粒子の外殻にはＡＡＶキャプシドタンパク質変異体が含まれている。
【００３４】
ＡＡＶ粒子は、宿主細胞の培養上清やその細胞溶解物から、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離のような様々な精製法を用いてＡＡＶ粒子を単離、精製することができる。前記（ｃ）工程にウイルスが使用される場合、例えば、ＡＡＶ粒子とヘルパーウイルスとを、サイズに基づいて分離する工程を加えてもよい。また、ヘパリンに対する親和性の差に基づいて、ＡＡＶ粒子をヘルパーウイルスから分離することもできる。さらに、残存するヘルパーウイルスは、公知の方法を用いて失活することができる。例えばアデノウイルスは、約６０℃の温度で、例えば２０分間又はそれ以上加熱することにより失活することができる。ＡＡＶ粒子は熱に極めて安定であるため、この処置はヘルパーウイルスとして使用したアデノウイルスの選択的除去に有効である。
【００３５】
（４）本発明の遺伝子導入細胞の製造方法
前記（３）により得られる本発明のＡＡＶ粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの細胞への送達のために使用される。一般にＡＡＶ粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで細胞へ導入される。インビトロで導入する場合、生体より取得された細胞にＡＡＶ粒子を接触させることにより導入する。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に導入する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術を利用できる。インビボで形質導入する場合は、ＡＡＶ粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路により投与する）。ＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含む。
【実施例】
【００３６】
調製例１  ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２の構築
ｐＡｓＲｅｄ２−Ｃ１  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）を鋳型として、ＣＭＶプロモーターの上流、及びｐｏｌｙＡシグナルの下流に制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を付加した約１．６ｋｂの断片をＰＣＲ法によって得た。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処理してインサートＤＮＡとした。一方ｐＡＡＶ−ＭＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＮｏｔＩで処理して約２．９ｋｂの断片を調製して、これをベクターとした。このベクターにインサートＤＮＡをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、これを用いてＥ．Ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られたクローンから抽出したプラスミドＤＮＡのうち、上流からＣＭＶプロモーター−ＡｓＲｅｄ２−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡシグナルの順に挿入されたものをｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２とした。【００３７】
実施例１  ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーの作製
ＡＡＶ２のゲノムを搭載したプラスミドベクターｐＡＶ１（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：３７２１５）を汎用宿主（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ）のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１より抽出した。抽出したプラスミドから制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）によりＡＡＶ２のゲノムＤＮＡ（約４．７ｋｂ）を切り出した。このゲノムＤＮＡをｐＵＣ１１８  ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８とした。【００３８】
ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８を制限酵素ＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、ｃａｐ遺伝子の１１９０番目から２０１７番目の塩基を含む約０．８ｋｂの断片を得た。この断片をｐＵＣ１１８  ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＣａｐ−ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８とした。次に、ＰＣＲ法を用いてＣａｐ−ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子の１７５９番目から１７６１番目の塩基配列ＡＡＣ（Ｎ）をＣＡＧ（Ｑ）に変換、１７６４番目と１７６５番目の塩基の間にスペーサーとしてＧＧＣ、スタッファーとしてＣＡＡＧ、さらにスペーサーとしてＧＣＣの１０塩基を挿入、１７６５番目から１７７３番目の塩基ＣＡＡ（Ｑ）ＧＣＡ（Ａ）ＧＣＴ（Ａ）をＣＡＧ（Ｑ）ＧＣＧ（Ａ）ＧＣＣ（Ａ）に変換、という一連の改変を実施した（カッコ内の文字はコードするアミノ酸を示す）。これによりに制限酵素ＳｆｉＩの認識部位が２か所とそのＳｆｉＩ認識部位に挟まれたスペーサー、スタッファー、スペーサーが挿入された。Ｃａｐ遺伝子の１７５６番目から１７７３番目の変換前後の塩基配列を図１に示し、変換前の塩基配列を配列表の配列番号１に、変換後の塩基配列を配列番号２に示す。塩基配列を変換した後のプラスミドＤＮＡをＣａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８とした。Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子部分をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＣｌｏｎｉｎｇのためにＰＣＲ法により増幅し、約０．８ｋｂの断片を得、これをインサートＤＮＡとした。【００３９】
ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８のアンピシリン耐性遺伝子内の制限酵素ＳｃａＩの認識部位、及びＲｅｐ遺伝子内にある制限酵素ＳｆｉＩの認識部位を、ＰＣＲ法によって塩基配列に変異を導入することにより、これら制限酵素が認識しない配列に改変した。ＳｃａＩ認識部位についてはアンピシリン耐性遺伝子の３０４番目から３０６番目の塩基配列ＧＡＧ（Ｅ）をＧＡＡ（Ｅ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号３に、変換後の塩基配列を配列番号４に示す。ＳｆｉＩの認識部位についてはＲｅｐ遺伝子の２１７番目〜２１９番目の塩基配列ＧＣＣ（Ａ）をＧＣＡ（Ａ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号５に、変換後の塩基配列を配列番号６に示す。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、Ｃａｐ遺伝子の一部である約０．８ｋｂが欠落した線状のベクターを得た。これをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇのための線状ベクターとした。【００４０】
次にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）とＣｌｏｎｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（クロンテック社製）を用いて前記の線状ベクターにインサートＤＮＡを挿入し、ディレクショナルクローニングを行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ−Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘとした。【００４１】
７アミノ酸のランダムペプチドをコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号７）を人工合成により作製し、プライマー（配列番号８）及びＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で３時間反応させることでオリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを調製した。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ（タカラバイオ社製）を用いて消化した。このＤＮＡをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いてＳｆｉＩで消化したＡＡＶ２ＷＧ−Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘに挿入したプラスミドをＡＡＶ２ＷＧ−ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘとし、ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーとして使用した。【００４２】
実施例２  ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの作製
（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
培養したＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を回収後、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（シグマ社製）で５×１０４細胞／ｍＬとなるように懸濁した。細胞培養用Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）にＡＡＶ２９３細胞を含む溶液を４０ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。【００４３】
（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
実施例１で得たＡＡＶ２ＷＧ−ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘ  ４００ｎｇ及びｐＨＥＬＰ（ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ社製）を４０μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いてＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ  ４０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。【００４４】
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの回収
培養中のＴ２２５ｃｍ２フラスコに、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを０．５ｍＬ添加して数分間静置した。その後、ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を剥離させて５０ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、１０分間遠心後、上清を除去した。フラスコ１枚あたり２ｍＬのＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）に細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで１５分間、３７℃のウォーターバスで１５分間、ボルテックス１分間の一連の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ−ランダムペプチドウイルスライブラリーを含む細胞破砕液を回収した。この溶液に、ＴＢＳ１ｍＬあたり、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を５μＬ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（メルク社製）を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡをＴＢＳ１ｍＬあたり６．５μＬ添加して反応を停止させた。この細胞破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶベクター溶液とした。【００４５】
（４）ＡＡＶベクター溶液のリアルタイムＰＣＲによる力価定量
ＡＡＶベクター溶液２μＬに、１０×ＤＮａｓｅＩバッファー２μＬ、注射用水（大塚製薬社製）１５．２μＬ、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）０．８μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理後、注射用水１５μＬ、１０×ＰｒｏＫバッファー［０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．８）、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、５％  ＳＤＳ］４μＬ、ＰｒｏＫ（タカラバイオ社製）１μＬを添加し、５５℃で１時間インキュベートした。その後、ＰｒｏＫを不活化するために９５℃１０分間処理した。このサンプルに対し、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ２（タカラバイオ社製）及びプライマー（配列番号９及び配列番号１０）を用いて、キットに添付の説明書に従いＡＡＶの力価定量を行った。なおサンプルは、注射用水で５０倍希釈した溶液を２μＬ用いた。また、標準品として、ｐＡＶ１を制限酵素で消化し、線状化したＤＮＡを用いた。【００４６】
実施例３  ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの精製
（１）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製１
超遠心用の４０ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ−ＫＯＫＩ社製）に、底から比重１．５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、比重１．２５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、実施例２−（４）で調製したＡＡＶベクター溶液を２８ｍＬの順に重層し、超遠心機ＨＩＭＡＣ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＫＯＫＩ社製）で２５０００ｒｐｍ、１６℃、３時間遠心した。遠心後、上から２８ｍＬの溶液を除き、続いて上から０．７ｍＬずつ溶液を採取して１．５ｍＬチューブにそれぞれ回収した。実施例２−（４）と同様の方法で、各回収液に含まれるＡＡＶベクターの力価を定量した。【００４７】
（２）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製２
実施例３−（１）で力価の高かった数フラクションに、比重１．３９に調製した塩化セシウム溶液を加えて、１０．５ｍＬにフィルアップした。この溶液を超遠心用１３ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ−ＫＯＫＩ社製）に添加し、超遠心機で３８０００ｒｐｍ、１８℃、１６時間遠心した。遠心後、チューブの上から順に０．７ｍＬずつ採取して内容液を回収した。各回収液のＡＡＶベクターの力価を実施例２−（４）と同様の方法で定量した。【００４８】
（３）透析による脱塩
実施例３−（２）で力価の高かった数フラクションを混合し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）に添加した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１Ｌにより４℃で３時間の透析を２回、ＰＢＳ／５％ソルビトール溶液５００ｍＬにより４℃で一晩透析を行うことで精製ＡＡＶ溶液の脱塩を行った。その後、溶液を回収し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で滅菌後、使用するまで−８０℃で保存した。また別途、精製ＡＡＶ溶液の力価を実施例２−（４）と同様の方法で定量した。【００４９】
実施例４  ＡＡＶ２ランダムペプチドライブラリーのスクリーニング
（１）マウスへの尾静脈投与
実施例３−（３）で得られた精製ＡＡＶ溶液を、１×１０１３ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｋｇとなるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈から投与した。投与７２時間後に鼠径リンパ節及び傍大動脈リンパ節を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド１）。【００５０】
（２）ＰＣＲによるランダムペプチド配列のリクローニング
実施例４−（１）で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてランダムペプチド配列をコードするＤＮＡを増幅した。プライマーはフォワードプライマー１（配列番号１１）及びリバースプライマー１（配列番号１２）を用いた。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃４０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。続いて、この反応液の１／２５量を用いてフォワードプライマー２（配列番号１３）及びリバースプライマー２（配列番号１４）を用いて同量の反応液を調製した。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１５秒を１サイクルとして３０サイクル実施した。この反応液からＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてＤＮＡを精製し、制限酵素ＢｇｌＩを用いて切断した。電気泳動後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて精製し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて、実施例１で調製したＡＡＶ２ＷＧ−Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘにリクローニングした。【００５１】
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造と精製
実施例４−（２）で得たプラスミドを使用し、実施例２及び実施例３と同様の方法で、ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造と精製を行った。【００５２】
（４）スクリーニング
実施例４−（１）と同様の方法でスクリーニングを行い、ゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド２）。さらに、抽出したゲノムＤＮＡを使用して、再度リクローニング、ライブラリー製造と精製及びスクリーニングを行いゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド３）。【００５３】
（５）ランダムペプチドのシークエンス
各スクリーニング段階（ラウンド１〜ラウンド３）のＡＡＶランダムペプチドプラスミドライブラリーのシークエンスを９０数クローンずつ行った。そのうち複数回出現したクローンのペプチド配列と出現回数を、傍大動脈リンパ節から回収したクローンについて表１に、大腿リンパ節から回収したクローンについて表２に示す。【００５４】
【表１】
2014103957.tif 000003
【００５５】
【表２】
2014103957.tif 000004
【００５６】
表１及び表２に示すように、両標的組織共に特定のペプチド配列が集積していることがわかった。特に傍大動脈リンパ節ではＶＥＥＧＲＲＧＱ（配列番号１５）及びＧＧＤＡＴＲＧ（配列番号１６）、大腿リンパ節ではＧＤＤＧＴＲＧ（配列番号３０）が集積しやすく、また両リンパ節でＧＡＭＧＧＳＶ（配列番号２４及び３４）が確認され、これらはリンパ節に感染しやすい配列であることが示唆された。【００５７】
実施例５  取得ペプチド配列を持つＡＡＶベクターの指向性評価
（１）ｐＲＣ−ＧＤＤＧＴＲＧの構築
実施例４−（５）で得られたＧＤＤＧＴＲＧ配列を持つＡＡＶ２ＷＧ−Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘクローンを制限酵素ＳｎａＢＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で消化して得た断片と、ｐＡＡＶＲＣ２ベクター（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＳｎａＢＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得たベクター断片を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）により連結し、ヘルパープラスミドｐＲＣ−ＧＤＤＧＴＲＧを得た。【００５８】
（２）ＡＡＶ２−ＡｓＲｅｄ２キャプシド変異体の製造と精製
調製例１で作製したｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２、ｐＨＥＬＰ及び実施例５−（１）で調製したｐＲＣ−ＧＤＤＧＴＲＧとをそれぞれ２５μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いてＴ２２５ｃｍ２に播種しておいたＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。なお、ｐＲＣ−ＧＤＤＧＴＲＧの代わりに野生型キャプシドを搭載したｐＡＡＶＲＣ２ベクターをトランスフェクションし、対照とした。トランスフェクションの６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ４０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。その後、実施例２−（３）、実施例３に示した方法で、２種類のＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２ベクターを製造・精製した。その後、実施例２−（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。【００５９】
（３）ＡＡＶ精製溶液のマウスへの投与
マウス一匹当たり１×１０１３ＶＧ／ｋｇとなるように、マウス尾静脈から実施例５−（２）で得た精製ＡＡＶ溶液を投与した。【００６０】
（４）リンパ節及びその他組織からのゲノムＤＮＡ調製及びＡＡＶゲノムの定量
実施例５−（３）でＡＡＶを投与したマウスを、１週間後、又は６週間後に安楽死させ、各組織を回収した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて、各組織からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをサンプルとしてリアルタイムＰＣＲを実施し、各組織中に含まれるＡＡＶベクターゲノム量を定量した。各組織中の全ゲノムＤＮＡ１μｇ当たりのＡＡＶゲノムＤＮＡの分子数を表３に示す。【００６１】
【表３】
2014103957.tif 000005
【００６２】
表３から、ＧＤＤＧＴＲＧの配列を有するキャプシドのＡＡＶベクターはリンパ節に移行しやすく、また、投与６週間後においてもＡＡＶゲノムが維持されていることが示された。【００６３】
（５）リンパ節及びその他組織からのＲＮＡ抽出及びＡｓＲｅｄ２発現量の定量
実施例５−（４）で得た各組織をＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（キアゲン社製）に浸して４℃で一晩反応させた。その後、バイオマッシャーＩＩ（ニッピ社製）を用いてホモジナイズを行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）でＲＮＡを抽出した。Ｏｎｅｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＡｓＲｅｄ２遺伝子（配列番号３８及び３９の配列を有するプライマー）の発現量及び補正用としてマウスＧＡＰＤＨ遺伝子（配列番号４０及び４１の配列を有するプライマー）の発現量を定量した。ＡｓＲｅｄ２発現量をＧＡＰＤＨ発現量で補正した結果を表４に記載する。【００６４】
【表４】
2014103957.tif 000006
【００６５】
上記の結果から、ＧＤＤＧＴＲＧが挿入された変異体キャプシドを持つＡＡＶベクターを用いると、野生型キャプシドを持つＡＡＶベクターと比較し、種々のリンパ節及び心臓で高い遺伝子発現効率が得られることが示された。【００６６】
実施例６  ＩＬ−１２遺伝子搭載ＡＡＶ２変異体による抗腫瘍活性の評価
（１）ｐＡＡＶ２−ＩＬ１２の構築
マウスＩＬ−１２ａ−ｐ３５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００８３５１）をｍＩＬ１２ａ−ｆｗｄプライマー（配列番号４２）及びｍＩＬ１２ａ−ｒｅｖプライマー（配列番号４３）により、マウス脾臓より調製したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により増幅した。得られた増幅断片と、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で消化し得たベクター断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２ａを得た。続いてマウスＩＬ−１２ｂ−ｐ４０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００８３５２）を、Ｔ２Ａ配列を組み込んだｍＩＬ１２ｂ−ｆｗｄプライマー（配列番号４４）及びｍＩＬ１２ｂ−ｒｅｖプライマー（配列番号４５）により、マウス脾臓より調製したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により増幅した。得られた増幅断片と、ｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２ａをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し得たベクター断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結しｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２を得た。すなわち、ｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２はＩＬ−１２ａ−ｐ３５遺伝子、Ｔ２Ａ、ＩＬ−１２ｂ−ｐ４０遺伝子の順に連結されたポリヌクレオチドを保持しており、成熟型ＩＬ１２タンパクを産生する。【００６７】
（２）ＡＡＶ２−ＩＬ１２ウイルスベクターの製造・精製
実施例６−（１）で調製したｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２、ｐＨＥＬＰ及び実施例５−（１）で調製したｐＲＣ−ＧＤＤＧＴＲＧのそれぞれ２５μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いて、Ｔ２２５ｃｍ２に播種しておいたＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。なお、ｐＡＡＶ２−ｍＩＬ１２の代わりにｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２をトランスフェクションし、コントロールとした。トランスフェクション６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ  ２０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。その後、実施例２−（３）、実施例３に示した方法で、ＡＡＶベクターを製造・精製した。その後、実施例２−（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。【００６８】
（３）マウスへの精製ＡＡＶ溶液の尾静脈投与及びＣＴ２６腫瘍細胞の皮下投与
マウス一匹当たり５×１０１３ＶＧ／ｋｇとなるように、マウス尾静脈から精製ＡＡＶ溶液を投与した。投与の２週間後、マウス背部皮下にＣＴ２６腫瘍細胞株をマウス一匹あたり１×１０６細胞投与した。その後、継時的に腫瘍サイズを定量した。各測定日における腫瘍サイズの平均値を表５に示す。【００６９】
【表５】
2014103957.tif 000007
【００７０】
表５に記載したとおり、ＧＤＤＧＴＲＧ変異キャプシドを持つＡＡＶ２−ＩＬ１２は抗腫瘍活性を持つことが示された。【００７１】
実施例７  取得ペプチド配列を持つＡＡＶベクターの指向性評価−２
（１）ｐＲＣ−ＧＧＤＡＴＲＧ、ｐＲＣ−ＧＡＭＧＧＳＶの構築
実施例４−（５）で得られたＧＧＤＡＴＲＧ配列（配列番号１６）あるいはＧＡＭＧＧＳＶ配列（配列番号２４）を持つＡＡＶ２ＷＧ−Ｃａｐ−ＳｃａＩ−Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘクローンから、実施例５−（１）と同様の方法によりヘルパープラスミドｐＲＣ−ＧＧＤＡＴＲＧ及びｐＲＣ−ＧＡＭＧＧＳＶを得た。【００７２】
（２）ＡＡＶ２−ＡｓＲｅｄ２キャプシド変異体の製造と精製
実施例７−（１）で調製したｐＲＣ−ＧＧＤＡＴＲＧあるいはｐＲＣ−ＧＡＭＧＧＳＶを用いて、実施例５−（２）で示した方法によりそれぞれのキャプシド変異を持つＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２ベクターを製造・精製した。その後、実施例２−（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。【００７３】
（３）精製ＡＡＶ溶液のマウスへの投与
マウス一匹当たり１×１０１１ＶＧとなるように、マウス尾静脈から精製ＡＡＶ溶液を投与した。この際、実施例５−（２）で調製した野生型あるいはＧＤＤＧＴＲＧ変異を持つＡＡＶベクターを投与した群を設定した。【００７４】
（４）リンパ節及びその他組織からのＲＮＡ抽出及びＡｓＲｅｄ２発現量の定量
実施例７−（３）でＡＡＶを投与したマウスを、６週間後に安楽死させ、各組織を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（キアゲン社製）に浸して４℃で一晩反応させた。その後、実施例５−（５）と同様の方法によりＲＮＡを調製し、Ｏｎｅｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＡｓＲｅｄ２遺伝子（配列番号３８及び３９の配列を有するプライマー）の発現量及び補正用としてマウスＧＡＰＤＨ遺伝子（配列番号４０及び４１の配列を有するプライマー）の発現量を定量した。ＡｓＲｅｄ２発現量をＧＡＰＤＨ発現量で補正した結果を表６に記載する。【００７５】
【表６】
2014103957.tif 000008
【００７６】
上記の結果から、ＧＧＤＡＴＲＧあるいはＧＡＭＧＧＳＶ変異体キャプシドを持つＡＡＶベクターを用いても、野生型キャプシドを持つＡＡＶベクターと比較し、種々のリンパ節及び心臓で高い遺伝子発現効率が得られることが示された。
また、上記の結果から、各スクリーニング段階（ラウンド１〜３）で、プラスミドライブラリーのシークエンスを９０数クローン行い、複数回出現したペプチド配列は、リンパ節又は心臓に高い指向性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、心臓及び免疫器官、特にリンパ節に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を提供され、リンパ節に効率的に遺伝子を導入する方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
SEQ ID NO:1: AAV2 capsid 586-591 coding sequence
SEQ ID NO:2: Converted AAV2 capsid coding sequence
SEQ ID NO:3: Ampicillin resistance gene before conversion
SEQ ID NO:4: Ampicillin resistance gene after conversion
SEQ ID NO:5: AAV2 rep gene before conversion
SEQ ID NO:6: AAV2 rep gene after conversion
SEQ ID NO:7: DNA sequence coding random peptide
SEQ ID NO:8: Primer for synthesizing double strand DNA
SEQ ID NO:9: Forward primer for quantitation of AAV titer
SEQ ID NO:10: Reverse primer for quantitation of AAV titer
SEQ ID NO:11: Forward primer1 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:12: Reverse primer1 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:13: Forward primer2 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:14: Reverse primer2 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:15: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:16: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:17: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:18: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:19: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:20: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:21: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:22: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:23: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:24: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:25: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:26: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:27: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:28: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:29: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:30: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:31: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:32: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:33: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:34: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:35: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:36: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:37: Peptide sequence comprised AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:38: Forward primer for amplifivation of AsRed2
SEQ ID NO:39: Reverse primer for amplifivation of AsRed2
SEQ ID NO:40: Forward primer for amplifivation of mouse GAPDH
SEQ ID NO:41: Reverse primer for amplifivation of mouse GAPDH
SEQ ID NO:42: mIL12a-fwd primer
SEQ ID NO:43: mIL12a-rev primer
SEQ ID NO:44: mIL12b-fwd primer
SEQ ID NO:45: mIL12b-rev primer
【図１】
2014103957.tif 000009
【配列表】
2014103957000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月25日(2016.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号３０、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸。
【請求項２】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項１記載の核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸又は請求項４記載の組換えＤＮＡを含む細胞。
【請求項６】
配列表の配列番号３０、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子。
【請求項７】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項６記載のＡＡＶ粒子。
【請求項８】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項６記載のＡＡＶ粒子。
【請求項９】
配列表の配列番号３０、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
【請求項１０】
ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項９記載の方法。
【国際調査報告】
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