(57)【要約】本発明は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞をソースとして膵前駆細胞を分化誘導し、これを培養・増殖して、純度の高い膵前駆細胞を調製する方法に関する。具体的には、膵前駆細胞を、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵前駆細胞の増殖方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵前駆細胞を以下の工程（１）に付すことを特徴とする、膵前駆細胞の増殖方法：
（１）（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程。
【請求項２】
培地が、さらに（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む、請求項１記載の増殖方法。
【請求項３】
膵前駆細胞が、ＰＤＸ１陽性細胞を（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養することにより誘導された膵前駆細胞である、請求項１記載の増殖方法。
【請求項４】
（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む、膵前駆細胞の増殖用試薬。
【請求項５】
（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む、膵前駆細胞の増殖用キット。
【請求項６】
膵前駆細胞を増殖させるための、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤の使用。
【請求項７】
膵前駆細胞を、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養して増殖させる工程と、培養物中より膵前駆細胞を採取する工程とを含む、膵前駆細胞の製造方法。
【請求項８】
ＰＤＸ１陽性細胞を、（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導させる工程を含む、請求項７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は，日本特許出願２０１４−１５８４７０号（２０１４年８月４日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は膵前駆細胞の増殖方法、ならびに膵前駆細胞増殖用試薬およびキットに関する。より詳細には、膵前駆細胞をＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびにＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを特徴とする、膵前駆細胞の増殖方法、前記方法のための試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
膵臓は、内分泌腺（内分泌細胞）と外分泌腺（外分泌細胞）とを有し、内分泌細胞である膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、ＰＰ細胞からは、それぞれ、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチドといった膵ホルモンが分泌され、外分泌細胞からは膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼ等の消化酵素が分泌される。【０００４】
糖尿病は、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）とＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の２つに大きく分類されるが、このうちＩ型糖尿病は、インスリンを産生する膵β細胞の破壊による、インスリンの分泌不全によって生じる。Ｉ型糖尿病に対して近年試みられている治療法として、患者由来の膵β細胞を再生して移植する方法や、ＥＳ細胞あるいはｉＰＳ細胞から分化誘導した膵β細胞を移植する方法に加えて、膵前駆細胞を移植して糖尿病を減弱させる方法が知られている。【０００５】
上記治療法に関連して、内胚葉細胞の増殖方法や、得られた内胚葉細胞からのβ細胞の誘導方法（特許文献１）、ヒト多能性幹細胞からの増殖性内胚葉細胞の誘導方法（非特許文献１）、ヒト多能性幹細胞からの増殖性前腸内胚葉細胞の誘導方法（非特許文献２）に関する報告がある。【０００６】
膵前駆細胞から分化させた膵内分泌前駆細胞を増殖する方法（非特許文献３）に関する報告もあるが、膵内分泌前駆細胞を間充細胞と共培養するため、得られる膵内分泌前駆細胞の純度はあまり高くないことが予想される。また、この報告には、膵前駆細胞の増殖方法については記載されていない。【０００７】
ヒトＥＳ細胞を用いたＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の誘導方法、およびＮＫＸ６．１高発現膵前駆細胞による糖尿病の治療（非特許文献４）に関する報告があるが、膵前駆細胞の増殖方法については記載されていない。また、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導し、マウスに移植して糖尿病治療への応用を検討した報告もあるが、膵前駆細胞の増殖方法については記載されていない（非特許文献６および７）。【０００８】
生体から分離した膵前駆細胞は、継代培養時に増殖を停止することが多く、膵前駆細胞を生体外で効率よく増殖させることは難しい。Ｓｕｉらは、ＥＳ細胞由来の膵前駆細胞を、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβ阻害剤）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて増殖させる方法について報告している（非特許文献５）。しかし、この方法は、増殖速度が１０週で約３０倍、得られる膵前駆細胞の純度は約５０％であり、未だ十分なものとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ２０１０／００４１１５０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｘｉｎ  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １０（２０１２）３７１−３８４
【非特許文献２】Ｈａｎｎａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １（２０１３）２９３−３０６
【非特許文献３】Ｓｎｅｄｄｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４９１（２０１２）７６５−７７０
【非特許文献４】Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１（２０１３）２４３２−２４４２
【非特許文献５】Ｌｉｎａ  Ｓｕｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖａｎｄ  Ｒｅｐ  ９（２０１３）５６９−５７７
【非特許文献６】Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（２０１４）１１２１−１１３３
【非特許文献７】Ｐａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５９（２）（２０１４）４２８−４３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、膵前駆細胞をその機能を維持したまま生体外で効率よく増殖させることにある。とくに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞をソースとして膵前駆細胞を分化誘導し、これを培養・増殖して、純度の高い膵前駆細胞を調製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、膵前駆細胞をＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびにＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することにより、高効率で、高純度の膵前駆細胞が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］に関する。
［１］膵前駆細胞を以下の工程（１）に付すことを特徴とする、膵前駆細胞の増殖方法（本明細書中、本発明の増殖方法と略記することがある）：
（１）（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；
［２］培地が、さらに（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む、上記［１］記載の増殖方法；
［３］膵前駆細胞が、ＰＤＸ１陽性細胞を（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養することにより誘導された膵前駆細胞である、上記［１］または［２］記載の増殖方法；
［４］（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む、膵前駆細胞の増殖用試薬；
［５］（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む、膵前駆細胞の増殖用キット；
［６］膵前駆細胞を増殖させるための、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤の使用；
［７］膵前駆細胞を、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養して増殖させる工程と、培養物中より膵前駆細胞を採取する工程を含む、膵前駆細胞の製造方法；
［８］ＰＤＸ１陽性細胞を、（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導させる工程を含む、上記［７］記載の製造方法。
なお、上記［１］〜［８］において、膵前駆細胞およびＰＤＸ１陽性細胞は、好ましくはヒト膵前駆細胞およびヒトＰＤＸ１陽性細胞である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体外で増殖させることが難しい膵前駆細胞を、高効率かつ高純度で調製することができる。本発明の方法は、生体由来の膵前駆細胞に加えて、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導した膵前駆細胞にも適用することができる。得られた膵前駆細胞は、そのままあるいは膵β細胞等に分化誘導して、糖尿病の治療や糖尿病治療薬の試験方法等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で誘導した膵前駆細胞の染色像。（ｉ）コントロール、（ｉｉ）ＸＡＶ９３９、（ｉｉｉ）ｂＦＧＦ添加、（ｉｖ）ＸＡＶ９３９＋ｂＦＧＦ。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。ＸＡＶ９３９とｂＦＧＦを組み合わせて添加した場合に、最もＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性細胞の割合が高かった。
【図２】実施例２で誘導した膵前駆細胞の染色像。（ｉ）ＸＡＶ９３９、（ｉｉ）ＸＡＶ９３９＋ＥＧＦ、（ｉｉｉ）ＸＡＶ９３９＋Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、（ｉｖ）ＸＡＶ９３９＋ｂＦＧＦ。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。ｂＦＧＦとＸＡＶ９３９を組み合わせて添加した場合に加えて、ＥＧＦとＸＡＶ９３９を組み合わせて添加した場合やＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎとＸＡＶ９３９を組み合わせて添加した場合にＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性細胞の割合が高かった。
【図３】実施例３で２９７Ｌ細胞から誘導した膵前駆細胞の染色像。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。２９７Ｌ１細胞株を用いた場合においてもＸＡＶ９３９とｂＦＧＦを組み合わせて添加することで大部分の細胞をＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞に誘導できた。
【図４】（Ａ）継代１日後（左）と継代４日後（右）の細胞の写真を示す。膵前駆細胞（２９７Ｌ１由来、継代数４）を培養容器から剥がした後、細胞の一部を別の培養容器に継代して培養した。培養１日目においては細胞密度が低い状態であるが、培養４日目には細胞密度が高くなっている。（Ｂ）継代数の細胞量の関係を示す。膵前駆細胞を増殖させた後、一部の細胞を継代してまた増殖させるという操作を２１回続けた。各継代時の細胞量を測定することで、１つの細胞が継代数を重ねることで何倍の細胞数に増殖したかを算出した。細胞は安定的なスピードで増殖しており、継代を２１回重ねることで、１つの細胞が１ｘ１０１８の細胞へと増えるスピードで増殖していることが明らかとなった。
【図５】５回継代を行った膵前駆細胞（左）と６６回継代を行った膵前駆細胞（右）に対して抗ＰＤＸ１抗体と抗ＮＫＸ６．１抗体を用いた免疫蛍光染色を行った。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。５回継代した細胞においても６６回継代した細胞においても大部分の細胞はＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性であることがわかる。
【図６】継代を２８回繰り返した後の膵前駆細胞に対してカルノア固定を行った後に、Ｑバンドによる核型解析を実施した結果を示す。全ての染色体が正常に備わっていることがわかる。
【図７】継代数４４の膵前駆細胞を単一細胞状態とした後、図中の因子を含む培養液中に播種して２日間培養した後、抗ＰＤＸ１抗体と抗ＮＫＸ６．１抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。（ｉ）コントロール、（ｉｉ）Ｙ２７６３２、（ｉｉｉ）ｂＦＧＦ、（ｉｖ）ＸＡＶ９３９、（ｖ）ｂＦＧＦ＋Ｙ２７６３２、（ｖｉ）Ｙ２７６３２＋ＸＡＶ９３９、（ｖｉｉ）ｂＦＧＦ＋ＸＡＶ９３９、（ｖｉｉｉ）ｂＦＧＦ＋Ｙ２７６３２＋ＸＡＶ９３９。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。ｂＦＧＦとＹ２７６３２とＸＡＶ９３９を組み合わせて添加した場合に加えて、Ｙ２７６３２とｂＦＧＦを組み合わせて添加した場合やｂＦＧＦとＸＡＶ９３９を組み合わせた場合においてもＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が増殖している様子が観察された。
【図８】実施例６でＮＴＥ−１−７（左）、ＮＴＥ−１−８（中）、ＮＴＥ−１−９（右）の各ｉＰＳ細胞株から誘導した膵前駆細胞の染色像。ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。いずれのヒトｉＰＳ細胞から分化誘導させて２回継代した場合においても、大部分の細胞がＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性となっていることがわかる。
【図９】参考例３で誘導したＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞の染色像。コントロール（左）、Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩを含む培地を用いて培養した細胞（右）。ＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、ＮＫＸ６．１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈している。分化誘導因子であるＡｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩを含む培地を用いて培養することで、膵前駆細胞よりＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞が分化誘導されていることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．用語の説明
以下、本発明および本明細書内で用いられる用語について、説明する。
【００１７】
本発明にかかる「膵前駆細胞」とは、膵内分泌細胞および膵外分泌細胞に分化しうる内胚葉系の細胞であって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、およびＩＮＳ（ＩＮＳＵＬＩＮ）陰性によって特徴付けられる。本発明にかかる「膵前駆細胞」は哺乳動物由来であれば特に限定されないが、好ましくはヒト膵前駆細胞である。
【００１８】
膵前駆細胞は、適当な条件で培養することにより、インスリン産生能を有する「膵β細胞（本明細書中において「インスリン分泌細胞」と同義）」に分化誘導することができる。「膵β細胞」は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、およびＩＮＳ陽性で特徴付けられる。
【００１９】
本発明にかかる「ＰＤＸ１陽性細胞」とは、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性、およびＩＮＳ陰性によって特徴付けられる。「ＰＤＸ１陽性細胞」は、たとえば、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から、内胚葉細胞を経て分化誘導することができる。「内胚葉細胞」とは、内胚葉系の組織を構成する細胞に分化しうる細胞であって、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２陽性によって特徴付けられる。本発明にかかる「ＰＤＸ１陽性細胞」は哺乳動物由来であれば特に限定されないが、好ましくはヒトＰＤＸ１陽性細胞である。
【００２０】
「多能性幹細胞」とは、ＥＳ細胞と同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞で、多能性細胞で特異的に発現する転写因子であるＯｃｔ３／４陽性およびＮａｎｏｇ陽性によって特徴づけられる。
【００２１】
とくに、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入し、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミングされた細胞を「人工多能性幹細胞」と呼ぶ。
【００２２】
現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、Ｙａｍａｎａｋａらにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、初めて樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒトｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）も用いることができる。
【００２３】
また、ウィスコンシン大のＴｈｏｍｓｏｎらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、ハーバード大のＤａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、Ｓａｋｕｒａｄａらにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。
【００２４】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７−０６９６６６、ＷＯ２００８−１１８２２０、ＷＯ２００８−１２４１３３、ＷＯ２００８−１５１０５８、ＷＯ２００９−００６９３０、ＷＯ２００９−００６９９７、ＷＯ２００９−００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞も用いることができる。
【００２５】
人工多能性幹細胞は、本発明にかかるＰＤＸ１陽性細胞のソースとして好適に用いることができる。ＰＤＸ１陽性細胞は、例えば、ＷＯ２０１１−０８１２２２に記載の方法にしたがって、人工多能性幹細胞から分化誘導することで取得可能である。本発明で用いられる「多能性幹細胞」および「人工多能性幹細胞」は哺乳動物由来であれば特に限定されないが、好ましくはヒト多能性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞である。
【００２６】
本発明にかかる細胞は、いくつかのマーカーの発現によって特徴付けられる。
このうち、「ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ１）」はｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  １としても知られ、膵臓の発生およびβ細胞分化に重要な役割を有すると共に生体内の膵β細胞の機能維持にも関与している転写因子である。「ＮＫＸ６．１」も、ＰＤＸ１と同様に、β細胞分化に重要な役割を有すると共に生体内の膵β細胞の機能維持にも関与している転写因子である。一方、「ＩＮＳ（ＩＮＳＵＬＩＮ）」は細胞内インスリンを示し、膵前駆細胞から膵β細胞（インスリン産生細胞）への分化につれて発現が亢進する。
【００２７】
上記マーカーの発現は、抗体を用いた免疫染色や、ＲＴ−ＰＣＲ等によって定量的に検出することができる。
【００２８】
本発明にかかる「ＥＧＦシグナル伝達活性化因子」とは、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）受容体ファミリーを介したシグナル伝達経路を活性化するあらゆる物質を含み、例えば、ＥＧＦ（特に、ヒトＥＧＦ）、その機能的アナログ、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ等を挙げることができる。好ましくは、ＥＧＦシグナル伝達活性化因子はＥＧＦ（特に、ヒトＥＧＦ）またはＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎである。
【００２９】
本発明にかかる「ＦＧＦシグナル伝達活性化因子」とは、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）受容体ファミリーを介したシグナル伝達経路を活性化するあらゆる物質を含み、例えば、ａＦＧＦ（ＦＧＦ１）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、ＦＧＦ３〜２３、およびこれらの機能的アナログ等を挙げることができる。好ましくは、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子はｂＦＧＦ、特にヒトｂＦＧＦである。
【００３０】
本発明にかかる「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ  ＩとＲＯＣＫ  ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（本明細書中、Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（すなわち、Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（すなわち、Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１  ロヘカルボアミド（すなわち、Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（すなわち、ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（すなわち、ＧＳＫ４２９２８６Ａ）；ＲＯＣＫに対する抗体（機能的断片含む）、アンチセンス核酸、およびｓｉＲＮＡ；ＲＯＣＫのアンタゴニスト、ドミナントネガティブ型；その他公知のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、ＵＳ２００５−０２０９２６１、ＵＳ２００５−０１９２３０４、ＵＳ２００４−００１４７５５、ＵＳ２００４−０００２５０８、ＵＳ２００４−０００２５０７、ＵＳ２００３−０１２５３４４、ＷＯ２００３／０８２８０８、ＵＳ２００３−００８７９１９、ＷＯ２００５／０３５５０６、ＷＯ２００５／０７４６４３、ＷＯ２００４／０３９７９６、ＷＯ２００３／０６２２２７、ＷＯ２００３／０６２２２５、ＷＯ２００３／０５９９１３、ＷＯ２００２／０７６９７６、ＷＯ２００２／０７６９７７、ＷＯ０１／１７５６２、ＷＯ００／７８３５１、ＷＯ９８／０６４３３参照）を利用できる。好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤はＮ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（すなわち、Ｙ−２７６３２）である。
【００３１】
本発明にかかる「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔを介したシグナル伝達経路を阻害する物質であって、例えば、ＩＷＰ２、ＩＷＰ３、ＩＷＰ４、２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（本明細書中、ＸＡＶ９３９と称することもある）、ＩＷＲ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、抗Ｗｎｔ抗体、Ｗｎｔアゴニスト（Ｗｎｔ受容体阻害剤）、可溶型Ｗｎｔ受容体タンパク（Ｆｒｚｂ−１等）、ドミナントネガティブ体等が挙げられる。好ましくは、Ｗｎｔシグナル阻害剤は２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（すなわち、ＸＡＶ９３９）である。
【００３２】
２．膵前駆細胞の増殖方法
本発明の膵前駆細胞の増殖方法は、膵前駆細胞を、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを特徴とする。なお、上記増殖方法により膵前駆細胞を増殖させる工程を、本明細書では増殖工程と呼ぶことがある。
【００３３】
増殖工程で用いられる「培地」は、幹細胞の培養に用いられるものであれば特に限定されない。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。基礎培地は、好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、特に好ましくは、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地である。
【００３４】
培地は、血清および／または血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。「実質的に含まない」とは、血清の含量で、約１容量％未満、好ましくは約０．１容量％未満、さらに好ましくは約０．０１容量％未満であることを意味する。「無血清培地」とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当する。
【００３５】
培地は、「血清代替物」を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール等が挙げられる。培地中の濃度は、血清代替物がＢ−２７（登録商標）サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。
【００３６】
培地は、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む。
【００３７】
培地中のＥＧＦシグナル伝達活性化因子の濃度は、用いる物質（因子）の種類によって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その培地中の濃度は、約０．００５〜２．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約０．００５〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約０．０１〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。
【００３８】
培地に含まれるＦＧＦシグナル伝達活性化因子の例としては、先に例示した「ＦＧＦシグナル伝達活性化因子」が挙げられ、好ましくはｂＦＧＦ（特に、ヒトｂＦＧＦ）である。培地中のＦＧＦシグナル伝達活性化因子の濃度は、用いる物質（因子）の種類によって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＦＧＦの場合、その培地中の濃度は、約０．００５〜２．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約０．００５〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜５８ｎＭ）、より好ましくは約０．０１〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。なお、ＥＧＦシグナル伝達活性化因子とＦＧＦシグナル伝達活性化因子を組み合わせて使用する場合は、各因子を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００３９】
培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の例としては、先に例示した「ＲＯＣＫ阻害剤」が挙げられ、好ましくはＮ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（すなわち、Ｙ−２７６３２）である。
【００４０】
培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、用いる物質（因子）の種類によって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。Ｙ−２７６３２の場合、その培地中の濃度は、約０．１〜１００μＭ、好ましくは約１．０〜３０μＭ、より好ましくは約２．０〜２０μＭである。
【００４１】
培地は、さらにＷｎｔシグナル阻害剤を含んでいてもよい。
培地に含まれるＷｎｔシグナル阻害剤の例としては、先に例示した「Ｗｎｔシグナル阻害剤」が挙げられ、好ましくは２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（すなわち、ＸＡＶ９３９）である。
【００４２】
培地中のＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、用いる物質（因子）の種類によって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＸＡＶ９３９の場合、その培地中の濃度は、約０．１μＭ以上、好ましくは約０．１〜１０μＭ、より好ましくは約０．２〜５μＭである。
【００４３】
培地に用いる物質（因子）としては、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子が、ｂＦＧＦ（特に、ヒトｂＦＧＦ）であり、ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（すなわち、Ｙ−２７６３２）であることが好ましい。
【００４４】
培地は、さらにＷｎｔシグナル阻害剤を含んでいてもよく、その場合、Ｗｎｔシグナル阻害剤が、２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（すなわち、ＸＡＶ９３９）であることが好ましい。
【００４５】
ＥＧＦシグナル伝達活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、いずれも複数種を組み合わせて使用する場合は、各因子・阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００４６】
前記増殖工程における細胞の培養において、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物を実質的に含まないことが好ましい。「実質的に含まない」とは、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物の培地中の含量が約５容量％未満、好ましくは約１容量％未満、さらに好ましくは約０．０１容量％未満であることをいう。これにより、フィーダー細胞に由来する異物の混入を防止し、拒絶反応のリスクを回避することができる。
【００４７】
前記増殖工程で用いられる容器は、膵前駆細胞の培養が可能なものであれば、特に限定されない。容器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、およびローラーボトルが挙げられる。浮遊培養の場合、容器は疎水性の材質を用いたものや、ハイドロゲルや脂質など、細胞やタンパク質の吸着を防止する素材をコーティングしたものが好ましい。細胞の凝集塊を効率的に形成させるためには、容器はＵ字あるいはＶ字形状の底面を有することが望ましい。一方、接着培養の場合には、後述のとおり、容器は細胞接着性であることが望ましい。
【００４８】
本発明の増殖方法では、膵前駆細胞は接着培養または浮遊培養で誘導されうる。接着培養の場合、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどが使用されるが、容器は細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞支持用基質でコーティングされていることが好ましい。とくに、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社）、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどが好ましく用いられる。
【００４９】
培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約３〜８％であり得る。酸素分圧は、１〜１０％であり得る。
【００５０】
増殖された細胞が膵前駆細胞であることは、上述したＰＤＸ１とＮＫＸ６．１の発現を、免疫染色等を用いて検出することにより、確認することができる。
なお、増殖工程において、培地中のＲＯＣＫ阻害剤をＷｎｔシグナル阻害剤に置き換えた場合にも、膵前駆細胞を増殖させることができる。
【００５１】
３．ＰＤＸ１陽性細胞からの膵臓前駆細胞の誘導
膵前駆細胞としては、ＰＤＸ１陽性細胞を（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養することにより誘導された膵前駆細胞を使用することができる。なお、ＰＤＸ１陽性細胞を上記培地で培養することにより膵前駆細胞を誘導する工程を、本明細書では膵前駆細胞の分化誘導工程と呼ぶことがある。
【００５２】
膵前駆細胞の分化誘導工程で使用される培地（本明細書中、誘導培地と称することがある）は、幹細胞の培養に用いられるものであれば特に限定されない。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。好ましくは、基礎培地は無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、特に好ましくは、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地である。
【００５３】
誘導培地は、血清および／または血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。「実質的に含まない」とは、血清の含量で、約１容量％未満、好ましくは約０．１容量％未満、さらに好ましくは約０．０１容量％未満であることを意味する。「無血清培地」とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当する。
【００５４】
誘導培地は、「血清代替物」を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば、亜鉛、セレン）、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール等が挙げられる。培地中の濃度は、血清代替物がＢ−２７（登録商標）サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。
【００５５】
誘導培地は、（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む。
【００５６】
誘導培地中のＥＧＦシグナル伝達活性化因子の例としては、先に例示した「ＥＧＦシグナル伝達活性化因子」が挙げられ、好ましくはＥＧＦ（特に、ヒトＥＧＦ）およびＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎである。
【００５７】
誘導培地中のＥＧＦシグナル伝達活性化因子の濃度は、用いる物質（因子）の種類によって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その誘導培地中の濃度は、約０．００５〜２．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約０．００５〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約０．０１〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。
【００５８】
誘導培地中のＦＧＦシグナル伝達活性化因子の例としては、先に例示した「ＦＧＦシグナル伝達活性化因子」が挙げられ、好ましくはｂＦＧＦ（特に、ヒトｂＦＧＦ）である。
【００５９】
誘導培地中のＦＧＦシグナル伝達活性化因子の濃度は、用いる物質（因子）の種類やＰＤＸ１陽性細胞のタイプによって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＦＧＦの場合、その誘導培地中の濃度は、約０．００５〜２．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約０．００５〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜５８ｎＭ）、より好ましくは約０．０１〜１．０μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。である。なお、ＥＧＦシグナル伝達活性化因子とＦＧＦシグナル伝達活性化因子を組み合わせて使用する場合は、各因子を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００６０】
誘導培地中のＷｎｔシグナル阻害剤の例としては、先に例示した「Ｗｎｔシグナル阻害剤」が挙げられ、好ましくは２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（すなわち、ＸＡＶ９３９）である。
【００６１】
誘導培地中のＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、用いる物質（因子）の種類やＰＤＸ１陽性細胞のタイプによって適宜設定されるが、通常約０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＸＡＶ９３９の場合、その誘導培地中の濃度は、約０．０１μＭ以上、好ましくは約０．０１〜１０μＭ、より好ましくは約０．２〜５μＭである。
【００６２】
誘導培地に用いる物質（因子）としては、ＥＧＦシグナル伝達活性化因子が、ＥＧＦ（特に、ヒトＥＧＦ）またはＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎであり、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子が、ｂＦＧＦ（特に、ヒトｂＦＧＦ）であり、Ｗｎｔシグナル阻害剤が、２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（すなわち、ＸＡＶ９３９）であることが好ましい。
【００６３】
ＥＧＦシグナル伝達活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、いずれも複数種を組み合わせて使用する場合は、各因子・阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００６４】
膵前駆細胞の分化誘導工程における細胞の培養は、増殖工程と同様に、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないことが好ましい。また、細胞の培養に用いられる容器も、増殖工程で記載したものを使用することができる。
【００６５】
膵前駆細胞の分化誘導工程において、ＰＤＸ１陽性細胞は接着培養または浮遊培養で誘導されうる。接着培養の場合、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどが使用されるが、容器は細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞支持用基質でコーティングされていることが好ましい。とくに、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社）、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどが好ましく用いられる。
【００６６】
培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約３〜８％であり得る。酸素分圧は、１〜１０％であり得る。
【００６７】
分化誘導された細胞が膵前駆細胞であることは、上述したＰＤＸ１とＮＫＸ６．１の発現を、免疫染色等を用いて検出することにより、確認することができる。
【００６８】
４．膵前駆細胞の増殖用試薬・キット
本発明は、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む膵前駆細胞の増殖用試薬あるいはキットを提供する。
【００６９】
本発明の試薬は、上記（ｉ）および（ｉｉ）をあらかじめ混合して含んでもよいし、用時調製できるように別個の包装状態で含んでいてもよい。本発明の試薬は、さらに（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含んでいてもよい。また、必要に応じて、使用説明書を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明のキットは、上記（ｉ）および（ｉｉ）を含む試薬を必須の構成要素として含む。本発明のキットは、上記（ｉ）および（ｉｉ）を用時調製できるように別個の状態で含んでいることが望ましいが、あらかじめ混合した状態で含んでいてもよい。
【００７１】
本発明のキットは、上記（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル阻害剤をさらに含んでいてもよい。さらに、必要に応じて、培養用容器、培養用容器のコーティング剤、培地、培地添加成分、その他の器具、膵前駆細胞確認用試薬（抗ＰＤＸ１抗体、抗ＮＫＸ６．１抗体等）、使用説明書等を含んでいてもよい。
【００７２】
本発明の試薬およびキットの対象となる膵前駆細胞は、患者由来の細胞あるいは患者由来の細胞から再生させた膵前駆細胞でも、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導した膵前駆細胞であってもよい。
【００７３】
５．膵前駆細胞を増殖させるための使用
本発明は、膵前駆細胞を増殖させるための、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤の使用も提供する。
上記使用は、（ｉ）と（ｉｉ）を組み合わせて、膵前駆細胞を増殖させるために使用するという点に特徴がある。また、上記使用は、（ｉ）と（ｉｉ）に、さらにＷｎｔシグナル阻害剤を組合せたものであってもよい。使用される膵前駆細胞は特に限定されず、患者由来の細胞あるいは患者由来の細胞から再生させた膵前駆細胞でも、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導した膵前駆細胞であってもよい。
【００７４】
６．膵前駆細胞の製造方法
本発明は、膵前駆細胞を、（ｉ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養して増殖させる工程と、培養物中より膵前駆細胞を採取する工程を含む、膵前駆細胞の製造方法を提供する。
【００７５】
膵前駆細胞の培養、増殖工程は、上記「２．膵前駆細胞の増殖方法」の記載にしたがって実施できる。よって、培地はさらにＷｎｔシグナル阻害剤を含むものであってもよい。
【００７６】
培養物中からの膵前駆細胞の採取（回収）は、培養に用いる容器に応じて、通常の方法にしたがって実施する。例えば、培養物中の膵前駆細胞をＰＢＳ等のバッファーで洗浄した後、細胞を剥離するための酵素液（トリプシン溶液、アキュターゼ溶液等）を添加して一定時間反応させる。上記反応後、培養液等を添加した後、培養液を何度かピペッティングすることで膵前駆細胞を培養容器から剥離させ回収することができる。
【００７７】
本発明の製造方法は、さらに、上記増殖工程まえに、ＰＤＸ１陽性細胞を、（ａ）ＥＧＦシグナル伝達活性化因子および／またはＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ならびに（ｂ）Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導させる工程を含んでいてもよい。ＰＤＸ１陽性細胞から膵前駆細胞の分化誘導は、上記「３．ＰＤＸ１陽性細胞からの膵前駆細胞の誘導方法」の記載にしたがって実施できる。
【００７８】
７．膵前駆細胞の利用
本発明の増殖方法あるいは製造方法で得られた膵前駆細胞は、増殖能が高く、機能も保持され、純度も高い。また、フィーダー細胞や他の細胞と共培養をせず、実質的に血清や血清抽出物を含まない培地を使用して培養を行う場合、不純物を含まず、安全性の高い膵前駆細胞が得られる。
【００７９】
本発明の膵前駆細胞がゲノムへの遺伝子挿入を伴う手法で作製された人工多能性幹細胞から誘導された細胞である場合、当該膵前駆細胞は、人工多能性幹細胞由来の核初期化因子を保持すると言う点で、天然の膵前駆細胞とは区別されるが、その機能は自然の膵前駆細胞と変わるものではない。
【００８０】
以上のような特性から、本発明の方法で得られた膵前駆細胞は、糖尿病の細胞療法に有用である。例えば、膵前駆細胞を糖尿病患者に投与することにより、糖尿病を減弱させることが可能である（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１３  Ｎｏｖ；３１（１１）：２４３２−４２）。
【００８１】
また、本発明の方法で調製した膵前駆細胞は、従来公知の方法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２  ８，  ２７４−２８４）を使用して、ＩＮＳ陽性のインスリン産生細胞（膵β細胞）に分化誘導することができ、得られた膵β細胞を糖尿病患者に投与することで、糖尿病を治療することが可能である。こうした本発明の膵前駆細胞や、本発明の膵前駆細胞から誘導した膵β細胞を含む医薬（糖尿病治療のための細胞製剤）も、本発明の範囲に含まれる。
【００８２】
さらに、本発明の方法で得られた膵前駆細胞や、膵前駆細胞から誘導された膵β細胞は、生体内の細胞に類似した機能を保持しているため、糖尿病治療薬のスクリーニングや評価系においても有用である。
【００８３】
例えば、試験化合物の存在下および非存在下で本発明の膵前駆細胞または膵前駆細胞から誘導された膵β細胞を培養し、前記細胞内のインスリンあるいはそのｍＲＮＡの発現量または細胞外へのインスリン分泌量を測定し、試験化合物の存在下で前記発現量または分泌量が試験化合物の非存在下と比較して有意に増加している場合に、当該試験化合物を糖尿病治療薬候補として選択（スクリーニング）することができる。そのようなスクリーニングの方法や評価系も本発明の範囲に含まれる。
【００８４】
またスクリーニングの別例としては、本発明の膵前駆細胞から誘導された膵β細胞に対して糖尿病状態を模倣するストレスを負荷し、β細胞としての機能を低下させた状態に対する試験化合物の効果を評価する方法などが挙げられる。ここでは、β細胞の機能が回復した場合あるいはβ細胞の機能回復と関連性のあるマーカー発現が変動した場合に、当該試験化合物を糖尿病治療薬候補として選択（スクリーニング）することができる。そのようなスクリーニングの方法や評価系も本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００８５】
以下、参考例および実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８６】
（参考例１）ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１細胞を用いたＰＤＸ１陽性細胞の誘導
ヒトｉＰＳ細胞は２５３Ｇ１細胞（レトロウィルスによりＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作成されたｉＰＳ細胞株；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６，  １０１−１０６）を使用した。【００８７】
ヒトｉＰＳ細胞の培養は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコートした６−ｃｍ  ｄｉｓｈまたは１０−ｃｍ  ｄｉｓｈ（本明細書中、ビトロネクチンコートディッシュと称することがある）上で行った。継代時は、ヒトｉＰＳ細胞を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで処理して小さな細胞塊の状態に分散させ、ビトロネクチンコートディッシュに播種した。継代の割合は細胞の状態に依存して１：５〜１：１００で実施し、継代直後のみはＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地に１０μＭ  Ｙ２７６３２（和光純薬）を添加した培地を用いた。培養２日目以降はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地のみを用いて毎日培地交換を行い、継代は３〜７日毎に行った。【００８８】
分化誘導を行う際には、まず未分化なｉＰＳ細胞を９６穴プレートに播種した。細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞をＥＤＴＡ溶液で処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を、マトリゲルコート処理を施した９６穴プレートに１穴あたり２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ２７６３２を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を使用した。播種１日後にＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８のみの培地に交換し、コンフルエントな状態になるまでさらに１日培養した。【００８９】
次にｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化を誘導した。まず、コンフルエントとなった細胞をＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した後、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）（Ａｘｏｎ）、１％インスリン不含Ｂ−２７（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ培地を添加して４日間培養した。【００９０】
次に内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性細胞への分化誘導を行った。内胚葉細胞へと分化誘導した細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（本明細書中、ＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地と称することがある。）で洗浄後、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地に、ドーソモルフィン（１μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、レチノイン酸（２μＭ）（Ｓｉｇｍａ）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ）（和光純薬）を加えた培地に交換した。上記交換後、３または４日目に同じ培地で培地交換を行い、内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性細胞への分化誘導を合計７日間行った。【００９１】
（実施例１）ＰＤＸ１陽性細胞を用いた膵前駆細胞の誘導１
参考例１にしたがってマトリゲルコートディッシュ上で分化誘導したＰＤＸ１陽性細胞を、ＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＸＡＶ９３９（１μＭ）および／またはｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した培地でさらに７日間培養した。【００９２】
培養後の細胞におけるＰＤＸ１とＮＫＸ６．１タンパク質の発現を調べるため、抗ＰＤＸ１抗体と抗ＮＫＸ６．１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。具体的には、培養後の細胞に対して、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％ＰＦＡ）（和光純薬）を添加して３０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗ＰＤＸ１抗体（ＡＦ２４１９、Ｒ＆Ｄ社）と抗ＮＫＸ６．１抗体（５５Ｆ５５Ａ１２−ｃ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体あるいはＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（ともに、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１に示す。【００９３】
分化誘導因子としてＸＡＶ９３９とｂＦＧＦを組み合わせて添加した場合（図１（ｉｖ））に、大部分の細胞がＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を発現している様子が観察された。一方で、ＸＡＶ９３９を単独で添加した場合（図１（ｉｉ））やｂＦＧＦを単独で添加した場合（図１（ｉｉｉ））においては、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時に発現する細胞は少なかった。
以上の検討により、ＸＡＶ９３９とｂＦＧＦを添加した培地で培養することにより、効率的に膵前駆細胞を誘導できることが明らかとなった。【００９４】
（実施例２）ＰＤＸ１陽性細胞を用いた膵前駆細胞の誘導２
参考例１にしたがってマトリゲルコートディッシュ上で分化誘導したＰＤＸ１陽性細胞をＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（登録商標）と１μＭのＸＡＶ９３９を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ（４０ｎｇ／ｍｌ）、またはｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地に交換して、８日間培養した。培養後、実施例１に記載の免疫蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。【００９５】
ｂＦＧＦとＸＡＶ９３９を組み合わせて添加した場合（図２（ｉｖ））と同様に、ＥＧＦとＸＡＶ９３９（図２（ｉｉ））あるいはＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎとＸＡＶ９３９（図２（ｉｉｉ））を組み合わせて添加した場合においても多くの膵前駆細胞が誘導された。【００９６】
これらの結果より、ＥＧＦシグナル活性化促進剤またはＦＧＦシグナル活性化促進剤とＸＡＶ９３９などのＷｎｔシグナル阻害剤を添加した培地を用いることで効率的に膵前駆細胞を誘導できることが明らかとなった。【００９７】
（実施例３）ヒトｉＰＳ細胞２９７Ｌ１細胞を用いた膵前駆細胞の誘導
２９７Ｌ１細胞（ＮＨＤＦ−ｉＰＳ、新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたヒトｉＰＳ細胞株）（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ２００９；  ４（１２），  ｐ．ｅ８０６７  参照）を用い、参考例１にしたがってＰＤＸ１陽性細胞を誘導した。ＰＤＸ１陽性細胞をＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＸＡＶ９３９（１μＭ）とｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地を用いて、さらに７日間培養した。培養後、実施例１に記載の免疫蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図３に示す。【００９８】
２９７Ｌ１細胞を用いた場合でも、参考例１、実施例１および実施例２に記載した方法にしたがって、効率的に膵前駆細胞を誘導できることが確認された。【００９９】
（実施例４）膵前駆細胞の継代
実施例３で誘導した膵前駆細胞を、以下の手順で継代した。すなわち、ＰＢＳで洗浄した後、アキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて４分間インキュベートし、さらにピペッティングをすることで単一細胞状態とした。ＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で細胞を洗浄した後、継代前の１／４〜１／１０の細胞濃度で新しい培養容器に播種した。なお、培地としては、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＹ２７６３２（１０μＭ）、ＸＡＶ９３９（１μＭ）、およびｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、培養容器としては、マトリゲルコート処理を施したものを用いた。上記播種後、培地交換を毎日行った。【０１００】
上記播種後、３〜６日間で細胞は８０〜９０％コンフルエントに達した。細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した段階で、再度上記の手順を繰り返して継代を行った。継代数４の段階での継代後１日目の細胞の様子と継代後４日目の細胞の様子を図４Ａに示す。継代１日目では細胞密度が低いが、継代４日目になると細胞密度が高くなっている様子がわかる。このようにして継代を繰り返したところ、２１回の継代を経て、１つの細胞が１ｘ１０１８個の細胞へと増殖したことが明らかとなった（図４Ｂ）。【０１０１】
この結果から、継代数が２０を超えても膵前駆細胞が高い増殖能を維持していることが判明した。【０１０２】
継代を重ねた細胞においてＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現が維持されているか観察するため、継代数５あるいは継代数６６の細胞を実施例１に記載の免疫蛍光染色に付し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。【０１０３】
継代数５の細胞ならびに継代数６６の細胞とも、大部分がＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性であった。【０１０４】
以上の結果より、本発明の方法を用いることで、ＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の状態のまま増殖させられること、さらには継代することが可能であることが明らかとなった。【０１０５】
（参考例２）増殖させた膵前駆細胞の核型解析
継代を重ねた増殖膵前駆細胞が正常な核型を保持しているか解析した。２８回継代した膵前駆細胞をカルノア固定した後、簡易核型解析（Ｑ−Ｂａｎｄ）を実施した（株式会社ｃｈｒｏｍｏｃｅｎｔｅｒ）。その結果を図６に示す。その結果、膵前駆細胞は正常な核型を保持しており、長期に培養して継代を重ねても正常な核型が維持されていることが明らかとなった。【０１０６】
（実施例５）膵前駆細胞の増殖における添加因子の関与
実施例４で示したとおり、Ｙ２７６３２、ＸＡＶ９３９、ｂＦＧＦを添加した培地を用いて培養することで膵前駆細胞を安定的に増殖させることが可能であった。そこでこれらの因子のうち、どの因子の組み合わせが膵前駆細胞の増殖に必要であるかを検討した。【０１０７】
単一細胞状態にした継代数４４の膵前駆細胞を、マトリゲルコート処理を施したプレートに播種し、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地に各因子（ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＸＡＶ９３９（１μＭ）、Ｙ２７６３２（１０μＭ））を組み合わせて添加した培地で２日間培養した。培養開始後は、培地交換を毎日行った。培養後、実施例１に記載の免疫蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図７に示す。【０１０８】
ｂＦＧＦ、ＸＡＶ９３９、Ｙ２７６３２を組合せて添加した場合（図７（ｖｉｉｉ））に加えて、Ｙ２７６３２とｂＦＧＦを組み合わせて添加した場合（図７（ｖ））やｂＦＧＦとＸＡＶ９３９を組み合わせた場合（図７（ｖｉｉ））においてもＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が増殖する様子が観察された。【０１０９】
（実施例６）他のヒトｉＰＳ細胞株を用いた増殖可能な膵前駆細胞の誘導
他のヒトｉＰＳ細胞からも増殖可能な膵前駆細胞を誘導できるか否か検討した。まず、新たなヒトｉＰＳ細胞を、以下の方法で作製した。ヘパリンナトリウム含有採血管（テルモ）に採血した血液をＰＢＳで２倍希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に重層して２０℃、４００ｇで３０分間遠心を行い、ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）を分離した。Ｆｉｃｏｌｌと希釈血液は３：４の比率で使用した。回収したＰＢＭＣは、ＰＢＳを用いて遠心洗浄を行った後、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。または、セルバンカー３（日本全薬工業）を用いて凍結保存を行った。次に、ＰＢＭＣを６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｉｔ３  ｌｉｇａｎｄ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加（以下、ｎｏｎ−Ｔ  ｃｅｌｌ用培地）して６日間培養を行った。培養後増殖したｎｏｎ−Ｔ  ｃｅｌｌを回収し（約１．３×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＰｌａｓｍｉｄｓ  Ｅｐｉ５ＴＭ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｉＰＳＣ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のエピソーマルベクターを導入した。ベクター量としては、１．３×１０６  ｃｅｌｌｓ当たりＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｋｉｔ内のＥｐｉ５ＴＭＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ＶｅｃｔｏｒｓおよびＥｐｉ５ＴＭｐ５３  ＆  ＥＢＮＡＶｅｃｔｏｒｓをそれぞれ１．５μｇ（計３μｇ）使用し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）の導入プログラムはＵ−００８を使用した。導入後、細胞をｎｏｎ−Ｔ  ｃｅｌｌ用培地に再懸濁し、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコートした１０−ｃｍ  ｄｉｓｈ（培地量１０ｍｌ）に播種して２４時間培養した。翌日（Ｄａｙ１）、１％  Ｎ２（和光純薬）、２％  Ｂ−２７（登録商標）、１ｘＧｌｕｔａＭａｘＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘ  ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（和光純薬）培地を５ｍｌ／１０−ｃｍ  ｄｉｓｈ（計１５  ｍｌ）加え、その後５日間は同培地で毎日半量交換した。Ｄａｙ９においてＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地に全量置換し、その後隔日ごとに同培地で培地交換を行った。ｉＰＳ細胞のコロニーが観察された後、適宜ピックアップし、培養を継続してｉＰＳ細胞株を樹立した。【０１１０】
樹立した３つのヒトｉＰＳ細胞株（ＮＴＥ−１−７、ＮＴＥ−１−８，ＮＴＥ−１−９）を参考例１に示した方法に付して、ＰＤＸ１陽性細胞を誘導した。誘導後の細胞を、ＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＸＡＶ９３９（１μＭ）とｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地を用いて、さらに７日間培養することで、ＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を誘導した。このように誘導した細胞をＰＢＳで洗浄した後、アキュターゼを加えて４分間インキュベートした後、ピペッティングをすることで単一細胞状態とした。ＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で細胞を洗浄した後、継代前の１／４〜１／１０の細胞濃度で、マトリゲルコート処理を施した新しい培養容器に播種した。培地は１％のＢ−２７（登録商標）、Ｙ２７６３２（１０μＭ），ＸＡＶ９３９（１μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地を用いた。継代後は、毎日培地交換を行った。２度継代を繰り返した細胞に対して、実施例１に記載の免疫蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図８に示す。【０１１１】
いずれの細胞株を用いた場合においても、継代後の細胞は大部分がＰＤＸ１陽性かつＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞であったことから、本発明の方法の効果は、２９７Ｌ１細胞以外の細胞株でも見られることが明らかとなった。【０１１２】
（参考例３）増殖させた膵前駆細胞からのＩＮＳＵＬＩＮ産生細胞への分化誘導
増殖し継代を重ねた膵前駆細胞がＩＮＳＵＬＩＮ産生細胞へと分化する能力があるかどうか検討した。細胞としては２９７Ｌ１細胞由来の膵前駆細胞（継代数７）を用いた。アキュターゼを用いて単一細胞状態にした膵前駆細胞を、６ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、マトリゲルコート処理を施した９６穴プレートに播種した。培養液は、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＸＡＶ９３９（１μＭ）、Ｙ２７６３２（１０μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地を用いた。細胞を２日間培養することで細胞密度をコンフルエントにした。その後、細胞をＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地で細胞を洗浄した後、１％のＢ−２７（登録商標）を含むＩＭＥＭ−ｏｐｔｉｏｎ  Ｚｎ＋＋培地にＡＬＫ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩを添加した培地を用いて９日間培養した。ＡＬＫ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩはＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞を誘導することが知られている（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２８，  ２７４−２８４）。培養後の細胞に対して、４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。さらに、１次抗体として抗ＮＫＸ６．１抗体と抗ＩＮＳＵＬＩＮ抗体（ＤＡＫＯ、Ａ０５６４）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体あるいはＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図９に示す。ＡＬＫ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩを添加して培養することで、ＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞が出現する様子が観察された。これらの結果より、増殖させた膵前駆細胞はＩＮＳＵＬＩＮ陽性細胞への分化能を持った細胞であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、膵前駆細胞を、その機能を維持したまま、高効率かつ高純度で増殖させることができる。本発明の方法は、生体由来の膵前駆細胞に加えて、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導した膵前駆細胞にも適用することができる。得られた膵前駆細胞は、高機能、高純度で安全性が高く、そのままあるいは膵β細胞等に分化誘導して、糖尿病の治療や糖尿病治療薬の試験方法等に利用することができる。【０１１４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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