(57)【要約】  本発明は、細胞周期異常が生じる根源的な原因を突き止め、異常状態が発生する上流側においてその原因を除去することによって効率的かつ確実に細胞周期異常ならびにこれから生じるがんの発生を阻止することを目的する。本発明は、ヒトCDC6 mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD、並びに該レンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤、がん抑制剤および医薬組成物である。
2015020215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒ卜CDC6 mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD。
【請求項２】
請求項１に記載のレンチウイルスベクターTHTDにおいて、
pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tから選択されるいずれか１つ又は複数のレンチウイルスRNAを、感染した細胞に導入するレンチウイルスベクターTHTD。
【請求項３】
pRBL002が、HIVウイルスゲノムのvif由来のタンパク質を含有する、請求項２に記載のレンチウイルスベクターTHTD。
【請求項４】
pRBL2013Tが、HIV-1ウイルスゲノムのVPR由来のタンパク質を含有する、請求項２に記載のレンチウイルスベクターTHTD。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含むがん抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含む医薬組成物。
【請求項８】
がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるためのがん抑制遺伝子および／またはがん抑制遺伝子産物からなる、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質。
【請求項９】
レンチウイルスベクターTHTDを細胞に感染させてCDC6 shRNAを生産する遺伝子を導入する工程と、
前記遺伝子が導入された細胞を培養する工程と、
細胞外に放出された、レンチウイルス由来のRNAを含むウイルス様中空粒子を集める工程と
を備えたウイルス様中空粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターTHTDが、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tから選択されるいずれか１つ又は複数のレンチウイルスRNAを感染した細胞に導入する、請求項９に記載のウイルス様中空粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レンチウイルスベクターTHTD、該THTDを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は、生体の細胞の細胞周期の異常によって起きる。従って、細胞周期の異常現象を食い止め、正常な状態に戻す、ないしは、異常な細胞を適切にアポトーシスすることによりがんの発生を抑制、あるいは阻止することができると考えられ、そのための技術が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2013-56930号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、効率的かつ確実に細胞周期異常の発生、ならびに細胞周期異常から生じるがんの発生を阻止することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述したように、がん細胞は細胞周期の異常によって起きる。そこで、本発明者は、細胞周期異常が生じる根源的な原因を突き止め、異常状態が発生する上流側においてその原因を除去することによって効率的かつ確実に細胞周期異常の発生を阻止し、ひいてはがんの発生を阻止することができることを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。【０００６】
すなわち本発明は以下に関する。
[1] ヒトCDC6mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD。
[2] 上記レンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤。
[3] がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるためのがん抑制遺伝子および／またはがん抑制遺伝子産物からなる、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、および該タンパク質を含む医薬品、医薬組成物、並びに前記タンパク質、前記医薬品、及び前記医薬組成物の製造方法。
ここで、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子からなる、レンチウイルスRNAから構築されるウイルス様中空粒子は、以下の工程を含む方法により製造される。
すなわち、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子から成るレンチウイルスRNAから構成されるウイルス様中空粒子を、細胞外に放出するレンチウイルスベクターを用いて、インビトロで導入遺伝子が導入された細胞を培養する工程、および放出されたウイルス様中空粒子を集める工程。
前記レンチウイルスRNAは、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tを含む。また、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの構造タンパク質遺伝子が欠損している導入遺伝子であり、レンチウイルスゲノム配列に含まれるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）の遺伝子プロモーターに制御される導入遺伝子から成る。【０００７】
pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tが組み込まれた細胞はcdc6の枯渇をもたらし、cdc6の枯渇は、腫瘍抑制遺伝子産生タンパク質（抗腫瘍タンパク質ともいう。）であるp16INK4aの活性化をもたらす。
cdc6の枯渇によるP16INK4aの活性化に加え、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは、p16腫瘍抑制遺伝子（GENEbank accession No ．L27211 ）をがん細胞にトランスフェクションさせることができる。p16腫瘍抑制遺伝子のがん細胞へのトランスフェクションによって細胞周期のG1／S期の移行を阻害する。また、細胞周期のcdk4/6、サイクリンDのインヒビターとなる。
細胞老化を起こした細胞の多くが細胞周期のG1期を停止してDNA合成を開始することができないことが知られているが、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tはそれを可能とする。
CDK4／6、サイクリンDが複合体を形成するとRBタンパク質の機能が失活する。これは、RBタンパク質のリン酸化に起因する。pRBL002によって脱リン酸化されたRB蛋白質はサイクリン（転写因子）を捕らえる。これにより細胞周期は、G1期にとどまることが確認された。
要するに、pRBL001、pRBL002、pRBL2013TによってP16遺伝子およびP16遺伝子産生産物が細胞に発現することで、RBタンパク質の機能を活性化してがん細胞の細胞周期のG1/S期への移行を捕捉し、これによりがん細胞の老化を誘導する。【０００８】
pRBL002は、［PRBLVIF］を含有しており、これは、HIVウイルスゲノムのvif由来のタンパク質である。
p53の欠乏と、がん細胞およびがん細胞前駆体でのCDC6の強力なリン酸化が原因で、CDC6がより安定し、細胞のアポトーシスが回避される。このようなCDC6とp53の相関関係に対して、pRBL002のvifは、p53のインヒビターMDMの中央部分に結合しp53を活性化する。
また、pRBL002の［PRBLVIF］は、がん細胞の細胞周期のG2期M期移行を阻害する【０００９】
pRBL2013Tは、「PRBLVPR」を含有している。これは、HIV-1ゲノムのVPRに由来するタンパク質である。VPRはpRBL2013Tに遺伝子導入されたPTENを核内に移送する。PTENは、細胞膜下におけるPIK3-AKTの経路において脱リン酸化の酵素として細胞増殖のシグナルを負に制御することが知られている。
また、pRBL2013Tはテロメラーゼ鋳型配列を含有している。さらに、HTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）プロモーターの下流にヒトPTEN遺伝子をエンコードしたDNAを含有している。ヒトPTEN mRNAの配列は[GENEbank accession No．NM_000314]を利用している。
pRBL2013Tは、細胞に侵入後、PTEN遺伝子のcDNAは［PRBLVPR］との結合によって核内に移動して染色体に組み込まれる。
pRBL2013TによってPTEN遺伝子産物の産生を活性化する。
pRBL2013Tは、細胞に侵入後、PTEN遺伝子のcDNAは［PRBLVPR］との結合によって核内に移動して染色体に組み込まれる。pRBL2013TによってPTEN遺伝子産物の産生を活性化する。
がん患者において、PTENはp53についで変異の多い腫瘍抑制因子である。
pRBL2013T に遺伝子導入されたPTENはAKTの活性化に関わる脂質のPIP3からリン酸基を取り除く酵素である。  
AKTは細胞増殖を促進し幾つかのメカニズムでアポトーシスを阻害する。
PTENによって、AKTの活性化を阻害すると細胞増殖を抑制してアポトーシスを促進する。
PTENがPIP3を脱リン酸化することによって、その下流のAKTの活性を阻害する。
Forkhead  box（FOX）転写因子は、細胞周期の抑制に関わるINK4B、p21、p27、ARF、アポトーシスに関わることが知られている。
また、Bim、FasL、糖新生に関わるG6P、その他血管新生や分化に関わるものなど多岐にわたる。【００１０】
AKTを通じて活性化されたIISはFoxOの機能を抑制する。
哺乳類には４種類のFoxO転写因子、FoxO1、3、4、6が存在している。いずれも、AKTによるリン酸化を受けて機能が抑制される。FoxO1、3、4はリン酸化されると14-3-3と結合し、核外へ移送される。リン酸化されたFOXO1,FOX3AがMDM2によりユビキチン化され分解される。HSC（造血幹細胞）でFoxOの欠失は、ARFやP27の発現低下を通じて細胞の過剰な増殖とアポトーシスへの抵抗性を誘導し、がんの発生を促進する。細胞のアポトーシスには、いくつかの経路とメカニズムによって実行される。ミトコンドリアの経路によるいくつかのアポトーシス誘導因子の内、活性化したAKTは、アポトーシス促進性のBaxタンパクに結合してアポトーシスを阻害する。FoxO3を欠失するとT細胞ではNF-KBが活性化して過剰な炎症反応が起こる。NF-KBの活性化は、がん細胞の特徴である新生血管の形成を促進する。
pRBL2013Tは、上述の生物活性の発現に寄与するPI3K（ホスファチジルイノシトール３キナーゼ）によって細胞内で合成されるプロテインキナーゼB（AKT）の活性化を阻害する方法を提供する。
ここで、PI3KのセカンドメッセンジャーであるPIP3がリン酸化されることでAKTは活性化する。pRBL2013Tは、PIP3の脱リン酸化することでAKTを負に制御することで、細胞増殖のシグナルを阻害し、AKTの下流に影響を与えることでアポトーシス誘導因子や転写因子に影響を与え、がん細胞を老化もしくはプログラム細胞死の指令を出す。
細胞膜直下でpRBL2013Tに含まれるGagタンパク質とRTが複合体を形成して細胞内の小胞体の遊離に関与するタンパク質群と結合してPTENのエキソソームを形成し細胞外へ遊離しレピシエント細胞にPTENタンパク質を輸送する。【００１１】
Cdc6 shRNAの作用によって、CDC6が枯渇すると、ミトコンドリアのアポトーシス経路におけるMOMP（mitochondrial outer membrane permeabilization）ミトコンドリア外膜透過性亢進が促進される。pRBL001によるRNA干渉によって引き起こされたCDC6の枯渇は、アポトーシス促進性BCL-2エフェクター（Pro-apoptoicBCL-2effector）のBAXの発現を促進する。また、pRBL001によって引き起こされたCDC6の枯渇は、抗アポトーシス性BCL-2タンパク質（anti-apoptoicBCL-2 protein）の発現を低下させ、MOMPを阻害し、アポトーシスを抑制する機構を負に制御する。
pRBL001は、BCL-2のサブファミリーのBH3-only proteinのBIM、BADなどの発現を促進しMOMPとアポトーシスを促進する。pRBL001によって活性化されたBCL-2のサブファミリーのBH-3 only proteinのいくつかは、BCL-2エフェクターを活性化させる。
pRBL001は、CDC6 shRNAによるRNA干渉によってCDC6の枯渇を引き起こすが、多くのがん細胞においてCDC6は高度に発現していることが確認されている。
がん細胞の85%〜90%で活性化しているHtertをプロモーターにすることとCDC6の発現をターゲット（標的）Cdc6 mRNAにすることでがん細胞の特異性を認識できる。
現在の分子標的薬は、がん細胞の膜タンパク上に特異的に発現している分子＝レセプター（受容体）を標的にしている。しかしながら、がん細胞の核内からは多種多様な分子が発現しているために１つの標的分子による治療ではがん細胞に対して優位な治療を継続することができない。また、継続的な治療はやがて受容体に対する耐性を作る。
pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは、エンベロープを持たないウイルスタンパクの形態であり、細胞膜に融合にしてエンドサイトーシス（Endocytosis）を利用する。非分裂性の細胞にも侵入できる。また、TERTの発現の高い幹細胞にも侵入でき、遺伝子導入もしくは、遺伝子産生産物を発現できる。
pRBL2013Tは、腫瘍抑制因子であるPTENを含有している。PTENは、細胞質と核の両方に存在するが、エキソソーム（Exosomes）となって細胞外に分泌し受け手（レシピエント）細胞に取り込まれ、その細胞のAktのリン酸化を低下させ、細胞増殖を抑制するという効果を発揮する。
PTENの変異を持つ患者は、脳、乳がん、前立腺、皮膚の腫瘍を起こすことが知られている。
PTENエキソソームは、後記エンドソームや多少胞体（multivesicular bodies;MVBs）由来の小胞である。MVBsが細胞膜と融合することにより細胞外分泌を担う。
エキソソームは、その内容物として、遺伝子の産生産物としてのタンパク、DNA、microRNAを受け手ての細胞に輸送して細胞の生理状態を変えることができる。
pRBL2013TにPTEN遺伝子導入し、HEK293T細胞から遠心プロトコールによってPTENエキソソームの大量生産の方法を提供する。
このエキソソームは、VLP（ウイルス様中空粒子）であり、導入される遺伝子は、PTENに限らない。【００１２】
本発明に係る医薬品または医薬組成物は、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択されるがんの治療に使用される。これらのがんは、正常よりも高度に発現したCDC6を含むことが確認されている。
本発明に係る医薬品または医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含んでも良い。【００１３】
本発明に係る医薬品または医薬組成物をがんの治療に用いる場合は、遺伝子または遺伝子産物が導入されたウイルス様中空粒子をがん患者もしくは該患者とは別のヒトの間葉系幹細胞及び／または造血幹細胞（Stem cell）に感作させ、感作した幹細胞を培養した際の上清液をがん患者に導入する。
これにより、ウイルス様中空粒子化した遺伝子または遺伝子産物が前がん状態に対する、がん化の予防効果が得られる。前がん状態とは、がん抑制遺伝子rbが不活性になることにより、がん細胞及びがん前駆体細胞の分裂が促進した状態をいう。この状態はがん細胞の分裂が促進している状態であり、rb-cドメインの701〜928のバンドで、s807,s811,t821,t826,s780のリン酸化を伴う。これらのリン酸化によりがん抑制遺伝子rbの活性・不活性を確認することができる。がん抑制遺伝子rbの活性・不活性は、後述する周知の方法で検査可能であり、導入前後の状態をこの方法で比較し、脱リン酸化していることで確認できる。【００１４】
[4] [3]に記載の製造方法において、導入遺伝子が導入された細胞が、少なくとも１つの構造タンパク質遺伝子を持たない、製造方法。
[5] [3]または[4]に記載の方法において、レンチウイルスベクターが、env遺伝子を欠損している製造方法。
[6] [3]〜[5] のいずれかに記載の方法において、TERT遺伝子プロモーターが、ヒトTERT遺伝子プロモーターである製造方法。
[7] [6]に記載の方法において、ヒトTERT遺伝子プロモーターが、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列と90％以上、好ましくは95％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む製造方法。
[8] [3]〜[7]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスRNAが導入遺伝子の上流のTERT遺伝子プロモーター配列を含む製造方法。
[9] [3]〜[8]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターが、下記の(i)〜(iii)のいずれかである製造方法。
(i) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAベクター
(ii) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクター
(iii) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAを担持するウイルス粒子
[10] [3] 〜[8]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスのゲノム配列が、TERT遺伝子プロモーターと導入遺伝子の間のTERT転写領域の少なくとも一部を含む製造方法。
ここで、TERT転写領域の少なくとも一部がSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列と90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。【００１５】
[11] [3]〜[10]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスのゲノム配列が、HIVのゲノム配列である製造方法。この場合、前記HIVゲノム配列はHIV-1ゲノム配列であることが好ましい。HIV-1ゲノム配列は、5 'LTR; パッケージング信号ψ; gag遺伝子; pol遺伝子; VIF遺伝子; VPR遺伝子; tat遺伝子; rev遺伝子; VPU遺伝子;および3 'LTRを含む。
[12] [3]〜[11]のいずれかに記載の方法において、導入遺伝子がタンパク質またはRNAをコードする製造方法。
[13] [3]〜[12]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターを含む導入遺伝子ががん抑制遺伝子である製造方法。この場合、がん抑制遺伝子は、PTENまたはp16遺伝子であることが好ましい。
[14] [3]〜[13]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターが、短ヘアピンRNA（shRNA）をコード化する導入遺伝子を含む製造方法。ここで、前記shRNAは、細胞増殖調節因子をコードする遺伝子を標的とする。前記細胞増殖調節因子は例えばCDC6である。
[15] [3]〜[14]のいずれかに記載の方法において、前記細胞がヒト細胞である製造方法。この場合、前記細胞は腎臓由来細胞であり、特に、ヒト胚性腎臓293T細胞である。【００１６】
[16] 細胞内へ導入遺伝子を導入し、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNA（pRBL001、pRBL002、pRBL2013T）から成るウイルス様中空粒子と標的細胞を接触させ、それらを融合することにより、遺伝子を導入する方法。
[17] [16]に記載の方法において、標的細胞が、インビトロでウイルス様中空粒子と接触される遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、効果的にがんを予防し、又は発生したがんを消去するがん抑制剤等の薬剤、医薬品または医薬組成物を提供することができる。
なお、図１３〜図５４は本発明の作用および効果を説明する図である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】pTHTKベクターの図。
【図２】下:遺伝子組換レンチウイルス導入遺伝子ベクタ-pRBL001の図。上:プラスミドDNAマッピングを示すアガロースゲルの図。
【図３】LM-PCRの検知及びLTR-Tag試験のためのBpm I部位の生成を説明する図。
【図４】PCRメソッド、TR-Tag技術分析を説明する図。
【図５】THTKプロウイルスcDNAを検知するLM-PCRを説明する図。
【図６】CDC6 shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターに感染した細胞内におけるCdc6の発現阻止を示すウエスタンブロット。
【図７】Cdc6の欠乏がヒト乳がん細胞のアポトーシスをもたらすことを示す図。
【図８】ヒ卜乳がん細胞の老化を示す図。
【図９】Cdc6が欠乏したMCF7細砲が老化することを示す図（がん細胞の核における特別な染色体構造の変化が起こる、すなわちSAHFの形成）。
【図１０】生体外におけるCdk4タンパク質キナーゼ反応を示すカーボン画像。
【図１１】MCF7細胞はCdc6ノックダウンのためにTHTDに感染しているか、又は感染多重度1.0で偽感染していることを示す図。
【図１２】MCF7細胞はTHTD （レーン 5）若しくはTHTP（レーン 4）に感染するか、又は偽感染（レーン 3）していることを示す図。
【図１３】発明を説明するための他の図。
【図１４】発明を説明するための他の図。
【図１５】発明を説明するための他の図。
【図１６】発明を説明するための他の図。
【図１７】発明を説明するための他の図。
【図１８】発明を説明するための他の図。
【図１９】発明を説明するための他の図。
【図２０】発明を説明するための他の図。
【図２１】発明を説明するための他の図。
【図２２】発明を説明するための他の図。
【図２３】発明を説明するための他の図。
【図２４】発明を説明するための他の図。
【図２５】発明を説明するための他の図。
【図２６】発明を説明するための他の図。
【図２７】発明を説明するための他の図。
【図２８】発明を説明するための他の図。
【図２９】発明を説明するための他の図。
【図３０】発明を説明するための他の図。
【図３１】発明を説明するための他の図。
【図３２】発明を説明するための他の図。
【図３３】発明を説明するための他の図。
【図３４】発明を説明するための他の図。
【図３５】発明を説明するための他の図。
【図３６】発明を説明するための他の図。
【図３７】発明を説明するための他の図。
【図３８】発明を説明するための他の図。
【図３９】発明を説明するための他の図。
【図４０】発明を説明するための他の図。
【図４１】発明を説明するための他の図。
【図４２】発明を説明するための他の図。
【図４３】発明を説明するための他の図。
【図４４】発明を説明するための他の図。
【図４５】発明を説明するための他の図。
【図４６】発明を説明するための他の図。
【図４７】発明を説明するための他の図。
【図４８】発明を説明するための他の図。
【図４９】発明を説明するための他の図。
【図５０】発明を説明するための他の図。
【図５１】発明を説明するための他の図。
【図５２】発明を説明するための他の図。
【図５３】発明を説明するための他の図。
【図５４】発明を説明するための他の図。
【図５５】p53抗体検査において高値を示す患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。
【図５６】卵巣がんを全摘出術後６ヶ月を経過した患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。
【図５７】卵巣がんを全摘出術後６ヶ月を経過した患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。
【図５８Ａ】乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。
【図５８Ｂ】乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。
【図５８Ｃ】乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。
【図５９】乳房温存治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明のいくつかの実施の形態について説明する。なお、本発明はこれら実施の形態に何等限定されるものでなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施しえる。
【００２０】
＜発明の概要＞
The RNTEIN BIOTECH JAPAN Corporationは、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターであるpRBL001由来のヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1ウイルス）を作製した。染色体外遺伝子であるpRBL001は、培養されたヒト胎児由来腎臓細胞293TへのDNAトランスフェクションによる生体外導入が可能であり、複製不能な感染レンチウイルス粒子THTDを精製することができる。遺伝子組み換えレンチウイルス粒子であるTHTDは、生体外で様々な種類のヒト細胞株に感染可能である。レンチウイルスベクターTHTDは、感染した細胞内における遺伝子導入によって、ヒトCDC6 mRNAに対する短へアピンRNA （CDC6 shRNA） を生産することができる。感染した細胞内におけるCDC6 shRNAの生産は、CDC6 mRNAの分解を特異的に引き起こす。
【００２１】
RNA干渉（RNAi）によるCDC6 mRNAの分解は、DNA複製導入因子であるCdc6のノックダウンをもたらす。THTD遺伝子組み換えレンチウイルスベクター感染及びRNAiによるCdc6のノックダウンは、ヒト神経芽細胞腫のアポトーシスを引き起こし、ヒト乳がんMCF7細胞の老化をもたらす。
【００２２】
THTD遺伝子組み換えレンチウイルスベクターは、分子治療に適用可能であり、その商業的名称をAJS2010という。ヌードマウス実験では、AJS2010を用いたヒト乳がんBap-37腫瘍移植片の直接注射（腫瘍を有するヌードマウスあたり、精製したウイルス粒子の含有タンパク質275μg）により、腫瘍成長が34.7％阻害された。AJS2010は、東京及び日本のその他の都市で、進行したがん患者の治療において試験された。
【００２３】
＜実施の形態＞
DNA複製は複製前複合体（pre-RC）を組み込むことによって開始し、DNA複製タンパク質Cdc6 （細胞分裂周期6）は、DNA複製の開始において中心的な役割を果たす。細胞が有糸分裂からG1期に入ると、Cdc6はCdtlと共に、複製起点認識複合体（ORC）の6個の構成要素と結合した複製起点に補充される。
【００２４】
複製前ORC複合体は、微小染色体維持タンパク質（MCM）を他の複製タンパク質と共に複製起点に積み重ねることによって形成され、Cdc6がこの積み重ねを制御する。G1期におけるCdc6の安定性は、pre-RCの組み込みを調整するための鍵である。
【００２５】
Cdc6は、G1期において、後期促進複合体（APC）によるユビキチン依存性タンパク質分解を標的とする。サイクリンE-Cdk2キナーゼは、ヒトアミノ末端Cdc6のリン酸化にとって重要であり、リン酸化されたCdc6は安定する。サイクリントCdk2キナーゼによるCdc6のリン酸化は、複製起点がS期において始動することを保証し、DNAはS期に一度だけ複製される。
【００２６】
ヒト細胞内において、Cdc6のレベルは様々なストレスに応答して著しく変化する。Cdc6及びCdt1が過発現している正常細胞又は腫瘍細胞においては、p53の活性化と共にDNAの再複製が観察されている。近年になって、DNAの損傷に応答してp53がCdc6を減少させるという報告が、Cdc6とp53を介した複製ストレス応答とを直接結びつけた。
【００２７】
p53を介したCdc6の減少は、検知可能な細胞周期の再分配を引き起こすことなく発生する。しかしながら、Cdc6ノックダウンによる内因性Cdc6の阻害はS期細胞分画の減少、p53の欠乏と共に、Gl期細胞の増加をもたらす。ヒ卜の腫瘍の約50％で、p53遺伝子の突然変異が発見され、多くの腫瘍細胞は、p53機能の低下によって細胞周期停止とアポトーシスの減少に陥っている。
【００２８】
P53の欠乏と、サイクリンE-Cdk2キナーゼによって活性化されるCdc6の強力なリン酸化が原因で、Cdc6は腫瘍細胞内ではより安定する可能性がある。Cdc6の枯渇は、ヒトがん細胞におけるアポトーシスをもたらすことが発見されている。Cdc6の枯渇を介したRNA（siRNA）は、Orc2、Cdt1、MCM7といった他の複製タンパク質を損傷することなく顕著に発生する。
【００２９】
その上、Cdc6の枯渇によってアポトーシスが引き起こされるのはヒトがん細胞のみであり、正常な細胞では起こらない。高レベルのCdc6はヒ卜がんにおける発がん作用と関係があり、ヒト肺がん細胞株においては、Cdc6とp16INK4aのタンパク質レベルは相反関係にある。
【００３０】
Cdc6の過剰発現は、野性型INK4/ARF部位を有するプライマリMEF細胞におけるコロニ一形成の増大をもたらす。INK4a/ARF-/-MEFにおいて顕著な発がん効果を有さないため、Cdc6は、INK4a/ARF部位を抑制することにより、腫瘍発生を促進する。
【００３１】
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの構築＞
RNtein Biotech Japan Corporationによって作製された染色体外遺伝子pRBL001を、pTHTKの中に構築する（詳細は後述する）。
【００３２】
pTHTKはHIV-1株のNL4-3ゲノム構築物、pUC19-NL4-3から作製され、NL4-3の配列割り当て索引番号は、M19921である。pTHTKにおいては、HIV-1ゲノムDNA内の6342番目のヌクレオチドから7512番目のヌクレオチドまでの領域が削除され、Kpn1（6342番目）とBgl 11（7512番目）の末端が平滑化され、取り除かれる。この改変によってHIV-1エンベロープ遺伝子が欠損する（図１）。
【００３３】
pTHTKにおいては、もともとのHpa1部位が改変され、Mlu1リンカーが遺伝子導入DNA断片を付加するためにそこに追加されている。遺伝子導入DNA断片はMlu1とXho1（又はSal 1）の分解によって調製可能であり、精製されたDNA断片は、pTHTKベクターのMlu1及び、Xho1部位に挿入することができる。遺伝子導入断片の結誌によって、HIV-1nef遺伝子の翻訳領域遺伝子が破壊されしたがって、クローン化されたレンチウイルスベクターは、野生型HIV-1株NL4-3とは異なり、他のウイルスの助けなしには、感染力のあるウイルス粒子を生産することができない。
【００３４】
結紮を介したPCRメソッドは、LTR-Tagsを生産し、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターが感染した細胞内で複製可能か否かを検出するために用いられている（詳細は後述図３及び図４を参照）。pTHTKベクターは、それ自身でレンチウイルス粒子を生産することができなかった。pTHTKプラスミドと、水痘性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質を提供するpCMV-VSV/Gと、を用いた293T細胞の同時導入による偽型遺伝子組み換えレンチウイルス粒子は、感染した細胞内で複製を行うことができなかった。しかしながら、プロウイルスcDNAは、宿主細胞染色体に組み込み可能である。感染した細胞から隔離されたゲノムDNAは、LM-PCRにおいて信頼でき、LTR-Tagsを示した（図４、図５）。
【００３５】
偽感染、あるいは「再感染」が行われ、その際には感染した細胞培養の培地が集められ、孔径0.45μmのフィルターで濾過され、新たに培養された細胞に付け加えられる（図５）。
【００３６】
すでに述べたとおり、組み込まれたプ口ウイルスcDNAは感染した細胞内で感染力のあるウイルス粒子を生産することができず、感染した細胞の培地には感染力のあるウイルス粒子は存在しない、したがって、「再感染」においては、感染力のあるウイルス粒子が集められて培養されることはない。「再感染した」細胞は、染色体に組み込んだプ口ウイルスcDNAを全く持っていない。このようなゲノムDNAはLM-PCRテストにおいて信頼できず、LTR-Tagsは示されない（図５）。
【００３７】
遺伝子組み換えレンチウイルスベクターが感染した細胞内で無能力か否かを調べるLM-PCRテストは、結果は完全に反復可能で正確であり、偽陽性や、HIV-1配列の直接的なPCR増幅における汚染を回避することができる。
【００３８】
＜ヒトテロメラーゼ逆転写酵素による遺伝子導入の制御＞
hTERTは、DNA複製中に、テ口メア反復配列を合成する。また、hTERTは、細胞増殖の段階と関係している。そして、hTERTは、増速中の細臨内では活発に活動し、静止した細胞内ではあまり活動しない。ヒトのがんの約90%で、hTERTの活動が活性化している。hTERT遺伝子発現は、主に転写レベルで制御される。したがって、hTERTプロモーターは、ヒトの細胞内のhTERTの活動を制御する主要な要素である。
【００３９】
その上、hTERTプロモーターはほとんどのヒトがん細胞内で活性化しているので、がん細胞でのみ異種遺伝子発現を制御するための特定の転写スイッチとしても用いることができる。
【００４０】
hTERTプロモーター構築pGL-1375は、京哲（きょう  さとる）博士（金沢大学）から提供されたものである。プラスミドpGL-1375内で、1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片をMLu I及びBg l II部位に挿入する。プロモーターは、ベクタ一内で、ルシフェラーゼ遺伝子発現を増幅させる。hTERT5'上流配列のGeneBank割り当て番号は、AF128893である。pGL-1375ベクター内では、1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片は、hTERT遺伝子配列の最初のエクソンを含んでいる。
【００４１】
pGL-1375ベクター内では、1.4kbのhTERTプロモーター配列の3'末端の+6から+45ヌクレオチドにダウンストリームEボックスがある。1.4kbのhTERTプロモーター配列の3'末端の+6から+45ヌクレオチドにおけるこのダウンストリームEボックスは、ヒト造血幹細胞、又は第3染色体トランスフェクションを行ったヒトがん細胞内で、転写抑制の役割を果たす。
【００４２】
多くのヒトのがんやがん細胞系統においては、この転写抑制作用が、遺伝子の不安定性や、遺伝子の突然変異や、何らかの不明な理由によって失われており、それによって、このEボックスは、転写活性因子となる。
【００４３】
1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片は、遺伝子組み換えレンチウイルスベクタ-pRBL001において組み立てられる。
【００４４】
＜CDC6 shRNAを生産する遺伝子組換えレンチウイルスベクタ-THTDの生産＞
遺伝子組み換えレンチウイルスTHTDは、レンチウイルス導入遺伝子プラスミドベクタ-pRBL001から作製される。プラスミドpRBL001においては、CDC6 shRNAのために合成された二重鎖のオリゴヌクレオチドが複製され、転写のためにhTERTプロモーターの制御下に置かれる。
【００４５】
CDC6 mRNAのGeneBank割り当て番号は、NMOO1254である。
【００４６】
pRBL001においては、合成されたオリゴヌクレオチドCdc6-5-Aの配列は:
GATCCCCAGGCACTTGCTACCAGCAATTCAAGAGATTGCTGGTAGCAAGTGCCT TTTTTGGAAA
であり、Cdc6-3-Aの配列は:
AGCTTTTCCAAAAAAGGCACTTGCTACCAGCAATCTCTTGAATTGCTGGTAGCAAGTGCCT GGG
である。
【００４７】
二重鎖のオリゴヌクレオチドを作るために、等量のCdc6-5-AとCdc6-3-Aが混合されて変性され、再び徐冷される。末端を平滑化した後、二重鎖オリゴヌクレオチドは、EcoR V部位のサブクローンベクターであるpBlueScriptに挿入される。DNA配列は、正しくクローンするために行われる。
【００４８】
サブクローンはXba I部位において直線化によって改変され、末端を平滑化されてMlu Iリンカーによって移管される。Mlu I及びBgl IIによるpGL3-1375の分解によって、hTERTプロモーター配列を含む1.4kbのDNA断片は精製され、Cdc6の二重鎖オリゴヌクレオチドをMlu I及びBamH I部位に運ぶサブクローンベクターにクローンされる。
【００４９】
正しいサブクローンにおいては、Mlu IとXho Iの二重分解がhTERTプロモーターを含む1.5kbのDNA断片とCdc6オリゴヌクレオチドを切断する。pRBL0O1を作るために、分解された1.5kbの断片が精製されてpTHTKベクターに挿入される。
【００５０】
293T細胞のプラスミドDNA同時転写によって、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDがpRBL0O1とpCMV-VSV/Gを細胞内に導入することで生成される。偽感染ウイルス粒子は、感染力のあるウイルス粒子となる。
【００５１】
遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDは、増殖中か分化型か非分化型かにかかわらず、多くの異なる種類のヒト細胞に感染可能である。野生型HIV-1株NL4-3とは異なり、THTDは感染した細胞内で複製できない。
【００５２】
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDの生物学的機能の実験及び特定＞
感染した細胞においては、hTERTプロモーターは、CDC6 shRNAの前駆物質の転写を開始させる。これらの前駆物質が二重鎖shRNAを形成し、CDC6 mRNAを分解するための特定のRNA干渉物質として完成する。感染した細胞内におけるTHTDを介した遺伝子導入は、CDC6 shRNAの機能によってCDC6 mRNAの分解を引き起こし、Cdc6タンパク質の98％が使い尽くされる（図６）。
【００５３】
感染した細胞内におけるTHTDを介した遺伝子導入によって、Cdc6ノックダウンは、ヒト神経芽細胞腫LA-N-2細胞とCHLA-255細胞のアポ卜ーシスを引き起こす（図７）。
【００５４】
THTDを介した遺伝子導入はヒト乳がんMCF7細胞の大規模な細胞死を引き起こすことはできなかったが、代わりに、Cdc6ノックダウンによってがん細胞が老化した（図８、図９）。
【００５５】
CDC6 shRNAの機能によるCdc6ノックダウンは、ヒト乳がんMCF7細胞の老化を引き起こすことが示された（図８）。
【００５６】
CDC6 shRNAの機能によるMCF7の老化は、細胞老化特異的ヘテロクロマチン構造の形成を引き起こし、細胞増殖作用が失われた。Cdc6ノックダウンは、偽感染MCF7細胞と共に、H3K9me2に対する抗体と結び付けられる。
【００５７】
間接的な免疫蛍光染色により、これら偽感染細胞と比較して、Cdc6ノックダウンMCF7細胞の核におけるH3K9me2の陽性染色の、全体にわたる増大が明らかになる。
共焦点蛍光顕微鏡により、集積したH3K9me2を有する灰色の構造の核が明らかになる。この変化は、偽感染細胞と対照的であり、偽感染細胞の核では均一に分散したH3K9me2染色が観察される（図９）。
【００５８】
CDC6 shRNAの機能によるCDC6 mRNA発現の阻害は、MCF7がん細胞内のCdc6の枯渇をもたらす（Cdc6タンパク質の70〜98％が枯渇した）。しかしながら、細胞は生きており、大規模な細胞死は、p53がプラスミド転写によって細胞内に導入された時に起きる（図８）。
【００５９】
親のMCF7がん細胞内では、Cdc6が抗腫瘍タンパク質であるp16INK4aを阻害し、腫瘍細胞の増殖を促進させる。親のMCF7がん細胞内では、p16INK4aレベルの上昇が示されたが、Cdkタンパク質の阻害作用は不活性であった。親のMCF7がん細胞内では、サイクリンCdk4キナーゼの活動が異常に活性化していた。
【００６０】
Japan Lapian's Corporationは、DタイプサイクリンCdk4活性の阻害においてp16INK4aを検知するタンパク質キナーゼアッセイのインピト口方法を用いた（詳細は後述。図１０及び図１１参照）。
【００６１】
親のMCF7がん細胞内では、DタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼの活発な活動が、網膜芽細胞腫タンパク質のC末端のリン酸化を引き起こした。リン酸化が進んだ網膜芽細胞腫タンパク質は転写因子であるE2Fを制御できなくなり、Rb-E2Fが転写抑制因子から活性化因子に変化した。
【００６２】
THTDを介したMCF7細胞の遺伝子導入においては、Cdc6の欠乏がp16INK4aの再活性化をもたらした。THTDを介した遺伝子導入におけるp16INK4aの再活性化は、サイクリンCdk4キナーゼの活動再開を阻害する機能を有し、サイクリンCdk4キナーゼによって網膜芽細胞腫タンパク質がリン酸化することを防ぐ（図１１ レーン 3、レーン 4）。
【００６３】
Cdc6 shRNAによるCdc6欠乏の生物学的効果はMCF7細胞内において非常に優勢であるため、DNA転写によるCdk4タンパク質の過生成でさえも、再活性化したp16INK4aによるCdk阻害作用に打ち勝つことはできない。このことは、がん細胞の増殖抑制は、Cdc6 mRNAの発現抑制とCdc6タンパク質の欠乏によって達成可能であることを示している。
【００６４】
＜ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍に対するAJS2010の直接接種＞
AJS2010、すなわちCDC6 shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDの商業名を、ヌードマウスに移植されたヒト乳がんBap-7腫瘍細胞に対して直接接種する動物実験が行われた。それぞれのグループのマウスは、週に2回、3週間腫瘍病巣の複数の場所に接種され、最終接種から48時間後、頸椎脱臼による安楽死処分となった。
【００６５】
偽薬の投与を受けた対照群のマウスは、腫瘍病巣に、1倍のリン酸生理食塩緩衝液を接種された。接種後、週に2目、それぞれの腫瘍の長さと幅が計られた。計測にはstandard caliperが用いられ、マウスは腫瘍が切除されて計られる前に頸椎脱臼によって安楽死させられ、病理観察が行われた。一体あたりAJS2010中のタンパク質の275μgが用いられた場合、移植された腫瘍の増殖は34.70％阻害され、腫瘍の平均重量は、陰性対照の場合と比べて明らかに小さかった（P<0.02）。
「+++」の組織切片が、腫瘍組織の病理の評価において最大の繊維増多を示した。AJS2010中のタンパク質275μgの接種は、腫瘍組織内で強力な線維化をもたらし、腫瘍の成長を抑制した。
【００６６】
＜遺伝子組換えレンチウイルスベクターとウイルスプラスミドDNAマッピング＞
図１は、pTHTKベクターの図である。pTHTKにおいては、ほとんどのHIV-1ウイルス遺伝子が保たれている。6342番目のKpn I部位から7512番目のBgl II部位までのDNA断片が削除され、これによってHIV-1エンベロープ遺伝子が欠損する。
【００６７】
Mlu Iリンカーは、太い短い縦線で示されている。図２の下側は遺伝子組み換えレンチウイルス導入遺伝子ベクターpRBLO01の図解であり、上側はプラスミドDNAマッピングを示すアガ口ースゲルの図である。図中において、hTERTプロモーターは、転写方向を示す矢印と共に長方形で表されている。灰色の長方形は、CDC6 shRNAを生み出すヌクレオチドを表している。
【００６８】
制限酵素の部位は、RI: EcoR I， Sal: Sal I， Mlu: Mlu 1， Nhe: Nhe I，and Xho: Xho Iのように示されている。2つのLTRボックスは、HIV-1の長い末端反復を表している。
【００６９】
＜III-2. 遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの複製無能力を確かめるためのLM-PCR及びLTRタグ法＞
図３は、LM-PCRの検知及びLTR-Tag試験のためのBpm I部位の生成を示す。Bpm Iはclass II S制限酵素であり、ポジション16ヌクレオチドの下流において、認識部位を認識して切り取ることができる。Bpm Iは5' LTRのU5領域の3' endに位置しており、最後に保存された5'-CA-3'二重ヌクレオチドが保たれている。Bpm I部位はHIV-1 cDNA分解後に3' LTRのU5領域にコピー可能であり、組み込み部位の宿主染色体DNAに隣接している。
【００７０】
したがって、Bpm Iは、ポジション14ヌクレオチドにおいて、染色体DNAをプロウイルスcDNAの3' endにおける5'-CA-3'二重ヌクレオチドに切り分ける。
【００７１】
図４は、遺伝子組み換えウイルスベクターの感染及び組み込みがあるか否か、及び、感染した細胞内に感染力のあるウイルスベクターが生産されているか否かを検知するためのLM-PCR法、すなわちTR-Tag技術分析である。感染した細胞内の遺伝子組み換えレンチウイルスベクターのプ口ウイルスcDNAからLTR-Tagが検出された。PCRゲル図において、「−」は、LTR-Tagの陰性対照、すなわち反応においてテンプレートDNAが存在しないことを示し、「＋」は、LTR-Tagの陽性対照を示す。この反応においては、クローンされたLTR-TagテンプレートDNAが付け加えられる。PCR反応の全てにおいては、テンプレートの一方の末端は遺伝子組み換えレンチウイルスcDNAであり、他方の末端はリンカーアダプタ一由来の配列であり、それらの間には、組み込み部位の宿主染色体由来の14-bpのランダムなゲノムDNAが存在する。PCRの中から異なる順方向プライマーが選択されるためLTR-Tagの長さは様々である、他方、逆方向プライマーは、配列がリンカーアダプターに由来しているため、常に一定である。
【００７２】
図５は、THTKプロウイルスcDNAを検知するLM-PCRである。HeLa/tat細胞は、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTKに感染している。細胞は、感染後、異なる時点において培養される。ゲノムDNAは隔離され、LM-PCR検出のためにLTR-Tagが準備される。PCRプライマーはBHU5-S2とHDA/SBOTであり、PCR増幅は138bpのDNA断片を示す（矢印で示す） 。
【００７３】
THTKに感染した細胞内及び安定的な細胞系統においてはLTR-Tagが検出可能である。しかしながら、「偽感染」すなわちTHTKに感染したHeLa/tat細胞から集められ、新鮮な培養細胞によって培養された（再感染）培地は、LM-PCRにおいて負の結果を示す。138bpのLTR-Tagは、「偽感染」の細胞から異なる時点、で集められた隔離されたゲノムDNAから増幅することができなかった。この結果は、THTKが感染した細胞内において無力であることを示している。
【００７４】
＜III-3. ヒト神経芽細胞種LA-N-2及びCHLA255細胞とヒト乳がんMCF7細胞のTHTD感染によるCdc6ノックダウン＞
図６は、CDC6shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターに感染した細胞内におけるCdc6の発現阻害を示すウエスタンブロットである。LA-N-2細胞、CHLA255細胞、及びMCF7細胞は、THTDに感染している。これらの細胞はまた、対照としてスクランプル配列を生み出すTHTPに感染し、偽感染させられている。感染後48時間で、細胞が培養されて細胞抽出液が準備される。それぞれの感染細胞から同量の抽出液内タンパク質がSDSポリアクリルアミドゲル上に分離される。
【００７５】
ウエスタンブロットにおいては、Cdc6の発現を証明するために抗ヒトCdc6モノク口一ナル抗体が用いられる。ウエスタンプロットの結果は、Cdc6の発現は、偽感染した細胞及びTHTPに感染した細胞においては影響を受けないことを示した。
【００７６】
しかしながら、THTDに感染した細胞内のCdc6発現は、CDC6 shRNAによるCDC6 mRNAの分解により、98％も減少した。図７は、Cdc6の欠乏がヒト乳がん細胞のアポトーシスをもたらすことを示す。LA-N-2細胞はCDC6 shRNAを生み出すTHTD細胞、又はスクランブル配列を生み出すTHTP、又は偽感染させられる。感染から48時間後、Annex V及び7-AAD染色のために細胞が培養される。染色された細胞は、フローサイトメトリー機械によって分析される。偽感染した細胞では、Annex V染色はわずか3.6％であり、THTPに感染した細胞では、10.0％であった。
【００７７】
しかしながら、THTDに感染した細胞においては、31％ものAnnex V染色が表れた。このことは、プログラムされた細胞の死を示している。細胞抽出物から同量のタンパク質がSDSポリアクリルアミドゲル上に分離され、ウエスタンプロットによって、THTDに感染した細胞においてはアポトーシス促進性タンパク質であるBaxが増加しており、抗アポトーシス性のBcl-2は減少し、死んだタンパク質であるBim及びミトコンドリア外膜透過（MOMP）の活動と関連するBadには変化がないことが示された。
【００７８】
図８は、Cdc6の欠乏がヒト乳がんMCF7細砲に老化をもたらすことを示す図である。MCF7細胞は最初にスライド上に播かれ、THTD、THTPに感染、及び偽感染させられる。感染から48時間後、スライドはSA-β-GaL試薬によって染色される前に1×PBSで洗浄され、ホルムアルデヒドで固定される。染色された細胞は、蛍光顕微鏡で観察される。偽感染及びTHTPに感染したMCF7細胞は背景と同じ染色を示しており、他方、THTDに感染したMCF7細胞は、緑色又は青色で染色されている。これは細胞増殖の老化を示している。
【００７９】
老化した細胞は生きているが、大規模な細胞死が、腫瘍抑制因子p53タンパク質を生み出すプラスミドによる細胞転写の後に起きる。空のプラスミドによる細胞の転写は、大規模な細胞死を示さない。
【００８０】
図９は、Cdc6が欠乏したMCF7細胞が老化することを示す図であり、がん細胞の核における特別な染色体構造の変化が起こる、すなわちSAHFの形成である。まずMCF7細胞をスライド上に蒔種し（100mm２あたり細胞0.1×10４個）、THTD、THTPに感染させ、及び偽感染させる。感染の48時間後、まずスライドを1×PBSで洗浄し、その後ホルムアルデヒドで固定する。間接的な免疫蛍光染色が抗H3K9me2抗体を用いて行われる。THTDに感染した細胞の核においては、SAHFが粒状構造を示し、他方偽感染した細胞においては、核は均一に染色されている。
【００８１】
図１０は、生体外におけるCdk4タンパク質キナーゼ反応を示すカーボン画像である。（上）：キナーゼ反応において基質として用いられる遺伝子組み換えタンパク質Rh-C（帯）は、複数のCdk4タンパク質キナーゼ反応部位を含む（点）。（下）：反応チューブ内においてＤタイプサイクリンCdk4錯体を含むp16INK4a抗体免疫沈降（IP） を、Rb-C基質及びATP分子と共に添加する。タンパク質キナーゼ反応の後、SDS-ポリアクリルアミドゲル分離を行う。部位特異的リン酸化Rb-Cに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行う。信号が強ければ強いほど、Rb-Cのリン酸化が激しい。
【００８２】
図１１では、MCF7細胞はCdc6ノックダウンのためにTHTDに感染しているか、又は感染多重度1.0で偽感染している。感染2日後、細胞抽出液を調製する。全細胞抽出液（約1000μgのタンパク質）を、抗P16INK4aモノク口ーナル抗体と混合する。
【００８３】
免疫沈降（IP）を4℃で一晩進行させる。インビト口でのキナーゼ反応を、Rb-C基質及びATPと混合したIPビーズの1/4を用いて準備し、製造元の指示に従って反応を37℃で30分間インキュベートする。特定のRb-Cリン酸化を、抗Phospho Ser780抗体（上パネル）、又は抗Phospho Ser807/811抗体（中パネル）を用いたウエスタンブロッティングで決定する。マウスIgG信号をIP対照として提示する（下パネル）。
【００８４】
レーン 1では、マウスIgGを用いてIPを行う。MCF7親細胞における極めて高いＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性は明らかであり、これは、Rb-Cの強いリン酸化を示す（レーン 2）。THTD感染によるCdc6ノックダウンはCdc6の枯渇を引き起こし、これは、ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性を阻害し、Rb-Cリン酸化信号は極めて弱くなる（レーン 3及びレーン 4）。
【００８５】
図１２では、MCF7細胞はTHTD（レーン 5）若しくはTHTP（レーン 4）に感染するか、又は偽感染（レーン 3）する。感染２日後、細胞をpSK-J3を用いてトランスフェク卜する（Cdk4-HA生成のため;レーン 3〜5） か、又はpSK-HAを用いてトランスフェク卜する（HA-tag対照;レーン６）。細胞抽出液を調製し、様々な抗体を用いたIPに供する。
上パネル:各IP試料をキナーゼ反応に添加し、インビトロRb-Cリン酸化を実施する。リン酸化Rb-Cを、抗Phospho ser807/811抗体を用いたウエスタンブロッティングで試験する。
下パネル:マウスIgGを負荷対照として提示した。HA-Cdk4の過剰発現により、内因性Cdk4にわたる持続可能なRb-Cリン酸化が起こる（比較レーン 3及びレーン 7）。
【００８６】
しかしながら、HA-Cdk4の強制的な過剰発現によって持続可能なレベルのRb-Cリン酸化を起こすことができない場合でさえ、p16INK4a Cdk阻害性の再活性化は、ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性より優勢である（レーン 5）。非特異的ヌクレオチドを生成する遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTPは、HA-Cdk4によるRb-Cリン酸化に何の影響も示さない（レーン 4）。
【００８７】
しかしながら、Cdc6の枯渇を引き起こし、P16INK4aの再活性化を誘発するTHTD感染は、Rb-Cリン酸化におけるHA-Cdk4タンパク質キナーゼ活性を強く阻害し（レーン 5）、これは、Cdc6欠乏によるP16INK4aの再活性化の際のがん細胞増殖の抑制を示す。
＜本発明の実験方法および材料＞
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの生成＞
＜プラスミドDNAトランスフェクション＞
【００８８】
クラスIIの安全キャビネット中で、15mlのDMEM/高グルコース（米国ユタ州、Hyclone社製）完全培地（ウシ胎児血清10％及び適切な抗生物質を補充）をT75フラスコに加え、ヒト胎児由来腎臓293T細胞に接種する。
【００８９】
5％C02インキユベータにおいてこの293T細胞を37℃で成長させ、培養物を10個のT75フラスコに増幅する。
【００９０】
オートクレーブ処理した1.5ml微量遠心管に170μlのpRBL001、30μlの1μg/ml pCMV/VSV/G 、50μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.3）を添加し、続いて1mlの100％エタノールを添加し、溶液を混合して、-80℃で60分間冷却する。
【００９１】
13000rpmで15分間遠心脱水し、溶液を捨て、1mlの70％エタノールを添加し、13000rpmで5分間違心脱水する。工タノールを注意深く捨て、DNAペレットを空気乾燥する。
500μlのオートクレーブ処理したdd H2Oを添加して、DNAを溶解させる。
【００９２】
クラスIIの安全キャビネット中で、50mlの清浄な試験管に以下:
a） 500μlのプラスミドDNA
b） 1650μlのオートクレーブ処理したdd H2O
c） 350μlの2M CaCl2
を添加し、溶液を優しく混合した後、2500μlの2×HEPBSを、一滴ずつ優しく撹拌しながら滴加する。大きな沈降物の形成を回避する。
2× HEPBS 100 ml :
HEPES（酸性塩） 1g
NaCl 1.6g
Na2HP04 （0.25M）0.75ml
KCl（1M）1ml
NaOH （5M）を用いてpHを6.9に調整し、続いてNaOH（1M）を用いてpHを7.12〜7.14に微調整する。クラスIIの安全キャビネット中で、孔径O.22μmのシリンジフィルタに溶液を通過させた後、2×HEPBSを使用する。
【００９３】
試験管を室温に20分間置く。
293T細胞のT75フラスコ10個を取り出し、培地を捨て、続いて各フラスコに12mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
500μlのトランスフェクション混合物を各フラスコにゆっくり添加し、培養物を5％C02インキュベータ内で37℃で8時間インキュベートし、続いて培地を捨て、各フラスコに15mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で36時間インキュベートする。
【００９４】
＜ウイルス培地の回収及びp24アッセイの実施＞
トランスフェクシヨンの36、72、及び96時間後、クラスIIの安全キャビネット中で培養培地を回収する。トランスフェクションの36及び72時間後に培地を回収した後、各フラスコに15mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加するが、96時間後に回収したものには添加せず、細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で成長させ続ける。
【００９５】
トランスフェクションの96時間後、培地を回収して各フラスコの10％の漂白剤を添加し、30分後に溶液を捨て、フラスコ及び使用したピペットをオートクレープ処理に供する。
【００９６】
回収した培地を含む50ml試験管それぞれを、3000rpmで4℃で5分間遠心脱水する。
【００９７】
200 μlのウイルス培地を採取し、1×PBSを添加して50〜200倍に希釈し、その後p24 ELISAアッセイを行ってウイルスベクターの力価を決定する。
【００９８】
p24 ELISAキットは、米国フ口リダ州マイアミのCoulter Inc.製である。
10×PBS 1000 ml:
塩化カリウム（Sigma P9333） 2g
リン酸カリウム、一塩基性（ACROS 205925000） 2g
NaCl （Sigma S7653-1KG） 80g
リン酸ナトリウム、二塩基性（ACROS 204855000） 11.5g
ddH2Oを添加し、最終的な体積を1000mlとする。
【００９９】
＜AJS2010の濃縮及び精製＞
清浄した培地を250ml高速遠心分離ピンに回収し、9000×g及び4℃で60分間遠心脱水する。
Vivaspin 20 （米国ニューヨーク州、Sartoriu製）を用いて培地を限外濾過し（1000kDa mw. co.）、体積を1/5に削減する。
【０１００】
沈殿したウイルスベクターにMMPを添加し、4℃で一晩保つ。
MMP溶液300ml：
PEG 8000 （遺伝子工学グレード） 90g
NaCl（超高純度） （5M） 30ml
オートクレーブ処理したddH2Oを添加し、300mlにする。
9000×g及び4℃で30分間遠心脱水する。
浮遊物を捨て、ペレットを10 mlの1×PBS中で再懸濁する。
Slide-A-Lyzerカセット（20kDa mw. co. 米国イリノイ州、Thermo Scientific製）を用いて、再懸濁した溶液を1×PBS について4℃で透析し、1×PBSを24時間毎に2日間交換する。
AmiconUltra15（100 kDa mw. Co. 米国マサチューセッツ州、Millipore製）を用いて、ウイルス溶液を30倍に濃縮する。
精製したウイルス溶液を孔径0.45μmのシリンジフィルタに通過させ、調製物を-80℃で貯蔵する。
【０１０１】
＜RT-PCRによる遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの感染の検知＞
クラスIIの安全キャビネット中で、MCF7細胞を1ウェルあたり2×105個の細胞となるように6ウェルプレートに蒔種し、3ml/wellのDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
【０１０２】
細胞をインキュベータ内で、37℃及び5％ CO2で24時間成長させる。倒立顕微鏡で細胞を観察する。細胞成長は約80％の集密度であるものとする。
【０１０３】
プレートを取り出し、クラスIIの安全キャビネット中で培地を捨て、2ml/wellの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。1×PBSを用いて、適切に希釈されたウイルス溶液を作製する。
【０１０４】
続いて、特定のウェルに以下を添加する:
A1：1×PBS  20μl；
A2及びA3：1：102希釈ウイルス培地  20μl；
B1及びB2：1：101希釈ウイルス培地  20μl；
B3：20μl非希釈ウイルス培地
【０１０５】
細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で8時間インキュベー卜する。倒立顕微鏡で細胞を観察する。細胞は健康であり、視認できるいかなる汚染も存在しないものとする。
【０１０６】
クラスIIの安全キャビネット中で丁寧に培地を捨て、3ml/wellの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。細胞をインキュベータ内で、37℃及び5％CO2で、48時間成長させる。
【０１０７】
細胞を1×PBSを用いて3回洗浄し、細胞をウェルの表面からラバーポリスマンを用いて掻き取り、細胞を15ml低速遠心分離チューブ内に回収し、1×PBSを12mlになるまで添加し、3000rpmの遠心分離を行う。溶液を捨て、細胞ペレットをドライアイスで30分間冷凍する。
【０１０８】
1000μlのGTC緩衝液を各試験管に添加し、細胞抽出液を18 G1/2針に5回通過させることにより細胞をホモジナイズし、その後各試験管に1000μlの水飽和フェノール、1000μlのク口口フォルムを添加し、ボルテックスして混合する。
【０１０９】
続いて、各試験管に3mlの1M酢酸ナトリウム（pH5.3）を添加し、ボルテックスして混合する。試験管を9000×9及び4DCで10分間違心脱水する。上相の溶液を新鮮かつ清浄な50ml試験管に移し、0.6〜1.0体積のイソプロパノールを添加し、試験管を5回ひっくり返すことにより溶液を混合し、室温で一晩置く。9000×9及び4℃で15分間遠心脱水し、溶液を捨て、RNAピペットを75％イソプ口パノールで洗浄して、RNAを-80℃で貯蔵する。
【０１１０】
GTC緩衝液300ml：
チオシアン酸グアニジン（mw. 118.16） 6M 212g
クエン酸ナトリウム（mw. 294.1） 25mM 2.2g
サルコシル（10％w/v） 0.5％ 12ml
使用前に、1.4mlのβ-メル力プトエタノールをGTC溶液20ml毎に添加する。
【０１１１】
RNA試料を採取する際、試験管を30秒間ボルテックスし、200〜30OμlのRNA溶液を採取し、これをオートクレーブ処理した1.5ml微量遠心管に移し、13000rpm及び4℃で15分間遠心脱水する。
【０１１２】
溶液を捨て、75％エタノールを1ml添加してペレットを洗浄し、13OOOrpm及び4℃で5分間遠心脱水する。
【０１１３】
溶液を捨て、RNAペレットを空気乾燥する。RNAを10μlのオートクレーブ処理したddH20に再び溶解させる。
【０１１４】
2μlの10×DNase I緩衝液、5μlのオートクレープ処理したdd H2O 、1μlの1:5に希釈したDNase Iを添加し、室温で3O分間インキュベー卜する。
【０１１５】
2μlの10％ SDSを添加し、68℃で15分間インキュベートする。
【０１１６】
150μlのTE（pH8.0）を添加し、続いて2μlの5M NaCl、100μlのフェノール、100μlのク口口フォルムを添加し、ボルテックスして混合し、13000rpmで5分間遠心脱水する。
【０１１７】
TE緩衝液50ml：
10mM Tris-HCI、pH8.0 1M 500μl
1mM EDTA 500mM 100μl
オートクレーブ処理したdd H2Oを50mlになるまで加える。
【０１１８】
上相の溶液を新鮮かつ清浄な試験管に注意深く移し、各試験管に1μlの10mg/mlグリコーゲン、次に1000μlの無水エタノールを添加し、-20℃で一晩又は-80℃で30分間冷却する。
【０１１９】
13000rpm及び4℃で15分間遠心脱水し、溶液を捨て、1000μlの75％エタノールを添加し、13000rpmで5分間遠心脱水する。溶液を注意深く捨て、RNAペレットを空気乾燥する。
【０１２０】
cDNAを増幅する逆転写反応及びPCRのために、RNAを20μlのオートクレーブ処理したdd H2Oに再び溶解させる。
【０１２１】
RT-PCR試料は、各逆転写につきRNA200μgとなる。
【０１２２】
逆転写（RT）反応における第1のストランドcDNA合成は、以下の通りである:
10μlのDNase 消化済みRNA（約200μg）に、1μlの10mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック、1μlのRNasin （30単位/μl、Promega製）、2μlの10×PCR緩衝液、1μlのO.1μg/μlランダムプライマ（ランダムヘキサマ）、1μlの50 mM MgCl2を添加し、優しく混合した後、1μlのMo-MuLV逆転写酵素（200単位/μl）を添加し、回転により2秒間混合し、まず室温で10分間、続いて42℃で60分間インキュベー卜する。
【０１２３】
これが終わると、RT反応試験管を1OO℃の水浴で15分間煮沸し、氷上で5分間冷却する。溶液を4本の試験管に分け（各試験管に等しく50μgのRNA）、-80℃で貯蔵するか、更なる使用に供する。
【０１２４】
PCR反応：プライマHIV-1 NL4-3 2205（20μM）、25μl、プライマHIV-1 NL4-3 2868 （20μM） 2.5μl、RT反応、5μl、PCR混合物、40μl、PCR反応のためにThermal Cycle （Applied Biosystems製）を使用する。
【０１２５】
PCR混合物（6つの試料について）：
10mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック  6μl
10×PCR緩衝液  30μl
Taq DNAポリメラーゼ（5単位/μL）  3μl
オートクレーブ処理したddH2O  201μl
最終体積  240μl
【０１２６】
プライマ-HIV-1 NL4-3 2205ヌクレオチド配列: 5' CTCTC AGAAG CAGGA GCCGA TAG 3' 及び、プライマHIV-1 NL4-3 2868ヌクレオチド配列: 5'GCATC GCCCA CATCC AGTAC TGT 3'。
【０１２７】
PCRの後、10μlの反応物を各試験管から取り、3μlの負荷緩衝液を添加し、PCR試料を1.5％のアガロースゲルに負荷し、1×TBE内でゲルを走らせる。ゲルをエチジウムプロモフェノール（EB）溶液で染色し、ゲル上のDNAを紫外線（UV）光ボックス下で観察する。完全なPCR産物は約660bpであるものとする。pRBL001プラスミドDNA（20ng）を、PCR中で陽性対照として用いることができ、その一方でトランスフェクションされていない293T細胞由来のRNAをRT-PCR中で陰性対照として用いることができる。
【０１２８】
50 × TAE緩衝液1000ml
Tris Base （分子生物学グレード） 242g
氷酢酸（分子生物学グレード） 57.1ml
EDTA、pH 8.0 （分子生物学グレード） 100ml
ddH2Oを1000mlになるまで添加する。
【０１２９】
＜LM-PCRによる遺伝子組換えレンチウイルスベクターのコンピテンスの検知＞
＜THTKにおけるBpm Ｉ部位の生成＞
LM-PCRを実施するために、まずpTHTKを改変して新規のBpm I部位をHIV-1ゲノムに作成する。HIV-1 5'LTR領域には、3つの要素：U3、R及びU5が存在する。Bpm I部位は、PCRをU5要素の3'末端で重ね合わせることによって生成される。Bpm IはクラスIIS制限酵素である（図３）。
【０１３０】
Bpm Iは5'-CTGGAG-3'を認識するが、DNAを16番目のヌクレオチドの下流においてその最上位ストランドで、また、14番目のヌクレオチドの下流においてその最下位ストランドで切り取ることができ、2ヌクレオチド3'オーバーハンガを作成する。
【０１３１】
この5'LTRのBpm I部位を、U5要素の3'末端の3'LTRに、感染細胞のプ口ウイルスcDNAの合成として複製する。
【０１３２】
HIV-1ゲノムに作成された新規のBpm I部位は、THTKビリオン集合、ウイルスベクター感染、及び感染細胞へのプロバイラルcDNA組み込みに何ら影響を与えない。
【０１３３】
コピーしたBpm I部位は、2つの保存された"5-CA-3"HIV-1の3'末端内にあり、Bpm I酵素は、ホスト細胞染色体DNAをその組み込み部位である14番目のヌクレオチドにおいて、その上流のHIV-1DNA末端に切り分ける（図３）。
【０１３４】
＜LTR-Tagsの調製＞
THTK感染細胞由来のゲノムDNAを単離する。DNAをKas I及びXho I 二重分解に供する。Kas I（637）は、HIV-1ゲノムに固有の部位である。Kas I分解により、Bpm I切断配列（629-645）が5'LTRにおいて分解される。
【０１３５】
Xho I（8892）は、HIV-1ゲノムに固有の別の部位である。Xho I分解は、HIV-1プ口パイラルcDNAの3'末端から分離したHIV-1上流プ口バイラルcDNAと、組み込み部位のホスト細胞染色体DNAとを有する。
【０１３６】
DNA断片を含む組み込み部位のために、特別なDNA拡張を実施するがDNA拡張のためのプライマはビオチン標識ヌクレオチド、B-NLR8950であり、そのヌクレオチド配列は5'-B-GTG CCT GGC TAG AAG CAC AAG-3'である。配列はHIV-1染色NL4-3ゲノム、DNA8950-8970由来であるo
ストレプトアビジン磁性ビーズ（Dynabeads M-280）との結合によってビオチン化DNA拡張産物を精製する。
【０１３７】
DNA拡張反応は、有意に強化されたDNA断片を含むH1V -l組み込み部位を有し、また、汚染されたDNA、特に上流HIV-1プロバイラルcDNA由来の汚染されたDNAは劇的に減少している。
DNA拡張反応:
B-NLR8950 50 μM
Kas 1+ Xho 分解DN A 10 μg
dNTPs 200 μM
Taq DNAポリメラーゼ5単位の試験管を94℃で5分、55℃で5分、及び72℃で30分インキュベートする。
【０１３８】
約5ピコモルのビオチン化DNAを、40ピコモルのDynabeadsM-2 80と混合し、室温で30分でインキユベートする。試験管を磁性スタンド（Dynal MPC standz）上に配置し、2分間静置した後、TE（pH8. 0）緩衝液でビーズを洗浄する。毎回1mlのTEを用いてさらに２回洗浄を繰り返す。2秒間遠心脱水し、浮遊物を捨てる。
【０１３９】
次に、ビオチン化DNAをBpm I分解に供する。Bpm I分解を37℃で一晩行い、DNAをDynabeads M-280によって精製した後、二重鎖オリゴリンカーと結紮する。
【０１４０】
二重鎖オリゴリンカーは、以下の特徴を有する:一端は2'ヌクレオチド3'オーバーハンガであり、Bpm I分解末端に対して相補的であり;他端は3'ヌクレオチド5'オーバーハンガであり、リンカーが自己結紮するのを効率的に防止する。
【０１４１】
二重鎖リンカーのヌクレオチド配列は、HD-A （カリフォルニア大学、UCLAのDr. Sam Chowから提供） : 5'ーCAC GCG TCG CAT CAT ATC TCC AGG TGT GAC AG-3'
、及び、HS-S （カリフォルニア大学、UCLAのDr. Sam Chow から提供）: 5'ーCCT CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG ATG CGA CGC GTG NN-3'である（詳細は段落062及び図III-2-2参照）。
【０１４２】
リンカーの結紮は、室温で16時間行われる。
結紮反応をDynabeads M-280によって精製する。
【０１４３】
＜LTR-Tagsを増幅するためのPCR反応＞
LTR-TagsをPCR増幅で検知することができる。
【０１４４】
順方向プライマBHU5-S2:5'-GAG TGC TCA AAG TAG TGT GT-3'、ヌクレオチド配列はHI V-lゲノムDNA 9617-963に由来する。逆方向プライマHDA/SBOT:5'-CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG AT-3' ヌクレオチドシーケンスは、二重鎖オリゴリンカーHD-Sの最下位ストランドに由来する（詳細は記述部分及び図４参照）。
【０１４５】
PCR反応（プライマが異なる以外は段落117及び118に記載したものと同じ条件）において、ビチオン化DNA/リン力一又はLTR-TagsはテンプレートDNAである。
【０１４６】
PCRの後、核反応から5μlの試料を取り、ゲル（2.0％アガロース）にl×TAE中を走らせる。ゲル上で約138塩基対のDNAバンドを観察することができる（詳細は記述部分及び図４及び図５参照）。
【０１４７】
＜インビ卜口での非放射性タンパク質キナーゼ反応＞
反応は、遺伝子組み換えタンパク質Rb-C上でのDタイプサイクリンCdk 4タンパク質キナーゼ活性を調べるためのものである（図１０）。
【０１４８】
腫瘍抑制因子P16 INK4aは、Cdk4/Cdk6と関連することができ、P16INK4aに対する抗体は、免疫沈降（IP）においてCdk4/Cdk6タンパク質キナーゼ錯体を単離することができる。
【０１４９】
ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼは、網膜芽細胞腫タンパク質の複数のセリン及びC末端（Rb -C） のトレオニン残留部位を特異的にリン酸化する（詳細は記述部分及び図１０参照）。
【０１５０】
インビト口でのキナーゼ反応では、以下:基質Rb-C、DタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ錯体を含むP16INK4 a IPビーズ、及びATPを試験管に添加し、37℃で30分間インキュベー卜する。
【０１５１】
SDS-ポリアクリルアミドゲルを走らせてタンパク質を分離する。ウエスタンブロッティングでは、特異的アミノ酸残留部位においてphosphor-Rb-Cに対する抗体を用いる（詳細は記述部分及び図１０及び図１１参照）。
【０１５２】
ウエスタンブロッッティングに使用する抗体は:Cell Sinaling Technology （米国マサチューセッツ州ダンバーズ）製の、抗Phospho Ser780及び抗Phospho Ser807/811である。
【０１５３】
＜その他の発明＞
ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）を組換え、レンチウイルスベクター由来のpRBL001ウイルスベクターを開発した。RNA内部には特殊な配列が含まれ、RNAの逆転写過程中に1種の三重螺旋のcDNA構造（Central DNA Flap） を形成し、その被膜成分は、現在広く用いられている水痘性口内炎ウイルスＧ（VSV-G）タンパク質より生まれる。共同トランスフェクション（Co-transfection） 法によって、遺伝子工学的に改造したプラスミド（Plasmid）とVSV-G遺伝子のプラスミドをパッケージング細胞内へ引き入れ、高活性の核酸タンパク質複合体が産生される。pRBL001は、DNAトランスフェクションを介してinvitroで、培養したヒト胚性腎臓293T細胞に導入することができ、複製無能感染性レンチウイルス粒子を生成することができる。
【０１５４】
pRBL001組換えレンチウイルス粒子は、in vitroでのヒト細胞株の様々ながん細胞に感染することができる。
レンチウイルスベクタ-pRBL001が感染した細胞内での遺伝子伝達を介したヒトCDC6タンパク質mRNA（CDC6 shRNA）に対する短いへアピンRNAを生成する;
pRBL001 の感染細胞内でCDC6mRNAの分解を引き起こすことを可能とする;
DNA複製開始点を認識してCDC6のノックダウンにおけるRNA干渉（RNAi） の結果、CDC6 mRNAを分解する。これによってがん細胞の無限増殖機能を停止させる。
【０１５５】
DNA複製開始点を認識したpRBL001組換えレンチウイルスベクターは、細胞内への感染を介してCDC6をノックダウンする:pRBL001のRNAiによって神経芽腫細胞ではアポトーシスを引き起こし、ヒト乳がんMCF7細砲では、老化につながる。
【０１５６】
pRBL001はヒーラ細胞（40×O.6）を7日で、消滅させる。
pRBL001組み換えレンチウイルスベクターは、正常細胞に無侵襲ながん分子標的療法を可能とする。これは、ヒトテロメラーゼをプロモーターとする。
ヌードマウスの実験では、腫瘍の成長が（がんヌードマウス1あたりのウイルス粒子275μg精製したタンパク質含有量）によるヒト乳がんMCF'7腫瘍に直接注入によって4.7％が阻害されています。
【０１５７】
pRBL001は乳がんの成長を阻害することができる。
【０１５８】
ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）を組換え、レンチウイルスベクター由来のpRBL002を開発することができる。
【０１５９】
pRBL002が感染した細胞内での遺伝子伝達を介しサイクリンD、CDK4/6を阻害し、PRBタンパク質を活性化しE2F蛋白を抑制するために細胞周期のG1/S期を停止する。
【０１６０】
pRBL002は、TGF （トランスフォーミング増殖因子）-βシグナルの標的となるCDK4/6のインヒビターである遺伝子にコードして、これらのキナーゼを抑制し、CDK4/6に結合している大量のp27を引き離して、CDK2複合体を抑制できるようにすることでがん細胞のG1/S期を停止させる。
【０１６１】
pRBL2013Tが感染した細胞内での遺伝子伝達を介し、PTENを活性化させPIK3を介した経路の脱リン酸化の触媒として機能する。これによって分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（MAPK） 経路、AKT・哺乳類ラパマイシン標的蛋白（mTOR）経路の活性化を阻害する。pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tいずれも、一種の低分子のウイルス・タンパク質で「PRBLVPR」を含有し、抗がん作用を有する。
「PRBLVPR」は96個のアミノ酸残基を有しているだけで、その分子量は14kDとなる。研究の結果「PRBLVPR」は多種の生物学的な機能を有しており、細胞の増殖周期を遮断し、細胞がアポトーシスに入るのを誘発する。
「PRBLVPR」は、G2からM期における増殖周期を特異的に遮断できる。研究の結果、以下のことが認められた。M期の駆動タンパク質は相互に作用し、駆動タンパク質の活性を抑制して、細胞周期の停滞をもたらす。一方では、「PRBLVPR」はCdc2細胞周期プ口テインキナーゼの活性化を阻害でき、DNAの複製を遅延させ遮断することさえもできる。
【０１６２】
別の一面では、「PRBLVPR」とタンパク質リン酸化酵素2A（PP2A）は複合体を形成し、G2期にタンパク質Cdc25の脱リン酸化反応の調整コントロールを増強し、Cdc25の機能を抑制させるので、駆動タンパク質は刺激活性されず、細胞周期は遮断されるに至る。
【０１６３】
「PRBLVPR」の作用下で、細胞は長時間のG2期の遮断を経ても、M期に入ることができるが、ただ多極紡錘体（MultipolarSpindles） を産生するだけで正常の有糸分裂を産生できない。この種のG2期からM期を遮断された細胞内では、染色体中心体（Centrosoma） が継続して倍増するが、染色体DNA断片の形成を伴わない。
【０１６４】
しかしながら、「PRBLVPR」が細胞増殖周期を遮断した後に、もしがん細胞がなお成長シグナルの刺激を受けると、まもなくアポトーシスを誘発する。
【０１６５】
pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは，テ口メラーゼ鋳型配列を含有している。
ヒトテ口メラーゼ逆転写酵素（HTERT Human Telomerase Reverse RNA）で、重要な逆転写酵素を促進する成分を有しており、テロメアRNAを鋳型にし、ヌクレオチドを複製した染色体DNAの末端に逐一加入させ、重複するTTAGGG配列を含有する特殊なDNA構造を形成する。
【０１６６】
逆転写酵素HTERTとは「HTERT」の活性は人体細胞内で厳しいコント口ールを受けていて、[Hter]遺伝子転写も「HTERT」酵素活性をコントロールする一つのキーポイントの場所で、「HTERT」のmRNA発現水準と状態は「HTERT」の細胞中の活性と特異な関係を有している。研究の結果、以下のことが分かった。
多くのテロメア複製酵素陰性の細胞内では、検出するとテロメア配列の[Hter]遺伝子転写のmRNAを含有しているが、「HTERT」のmRNAは腫瘍細胞中のみで大量の転写がある。そして「HTERT」酵素は不死化細胞（Inmmortalized Cells）および90％近くのヒ卜のがん細胞中で活性が増強する。
【０１６７】
これに反して、増殖周期GO期の正常体細胞内部では「HTERT」のメッセンジャーRNA（mRNA）は検出できず「HTERT」の活性もない。しかしながら「HTERT」自身はがんになれない。それはがん化するのに必要な染色体遺伝子の悪性変化を造れないことによる。がん細胞の無限の増殖は「HTERT」に依存しており、遺伝子複写の調節コントロールを通して「HTERT」遺伝子の発現を抑制し、頼粒球性白血病細胞（HL-60） の増殖を停止させ、細胞分化を発生させ、がん細胞の悪性度を次第に消失させることができる。
【０１６８】
「HTERT」遺伝子を分析すると、5'上流に1400bpの長さの遺伝子プロモーターが明らかになる。それはGC配列を豊富に含有し、その380bpのプロモーターの中心に、数多くの転写タンパク質SP1の結合位置が存在している。SP1は「管理者」の身分を担い、「HTERT」遺伝子転写の基本活動を始めるが、異なった「主管者」の配備も受け、遺伝子転写活性を細胞増殖状態に応じて協同活動させる。細胞内のがん抑制遺伝子Rbは、細胞周期を厳重に監督し、正常細胞をG0期に置き、染色体を調節しアセチル化過程にしてSP1の転写作用を減弱させる。
【０１６９】
細胞が増殖シグナル刺激を受けた時に、細胞内に別の１つのタンパク質であるがんタンパク質MycがSP1を促進して、大分子転写複合体を形成したり「超過激な活性」作用を産生し、「HTERT」遺伝子転写水準を急激に増加させる。
【０１７０】
380bpのプロモーターの中心内にさらに2つのCACGTGで高度な保守の「Ｅボックス」と称されるものが配置されMyc/MaxあるいはMad/Maxの結合位置を転写調整コントロールしている。
【０１７１】
Myc/Max結合がこの１個のＥボックス上にある時、遺伝子プロモーターは活性化され、高水準の遺伝子転写を産生する。そしてMad/Max結合がＥボックス上にある時、遺伝子プロモーターは活性を失い、遺伝子転写はそれゆえに抑制されあるいは低水準に置かれる。「HTERT」遺伝子のプロモーターは、十分に有効なコントロールシステムで、その調節を通して「HTERT」遺伝子転写をコントロールでき、細胞増殖あるいは細胞増殖の目的をコントロールできる。
【０１７２】
がん細胞中において染色体DNAの悪性変化によりRbがん抑制遺伝子は機能を喪失し、細胞周期は不断の増殖過程に入いり細胞増殖を伴い、Mycタンパク質は不断にSPIが「超過激な活性」反応を発生するのを促進し、Myc/Max対Mad/Maxの比は大きく増加しMyc/Maxはそれによって「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性を有効に増強させる。
【０１７３】
「HTERT」遺伝子のプロモーターががん細胞内で活性化状態にあるので、遺伝子工学の方法によってこのプロモーターと特殊な検測遺伝子成分を連結し、がん細胞に特異的な発現作用を産生できる「HTERT」遺伝子のプロモーターを組み込んだLacZ の発現により、それは特異的にがん細胞中にLacZ遺伝子を発現でき、大量のLacZタンパク質を産生し同様の担体は正常細胞内では「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性がなく、それでLacZの遺伝子発現もなく、LacZタンパク質を検出しない。
【０１７４】
「HTERT」遺伝子プロモーターとウイルスVPRゲノムはつながり、がん細胞中でVPR のRNAを転写でき、「pRBLVpr」タンパク質を産生し、それによってがん細胞の増殖周期を遮断し、有効ながん遺伝子治療となる。
【０１７５】
正常細胞内において、「HTERT」遺伝子プロモーターは活性を有しないか活性が極めて低い。
【０１７６】
このため、「pRBLVpr」の発現がなく細胞周期は遮断されない、以上のことからも、（p RBL001、pRBL002、pRBL2013 T ）はがん細胞に対して特異な作用を有していると分かる。
【０１７７】
「HTERT」遺伝子のプロモーターを組み込んだLacZの発現により、それは特異的にがん細胞中にLacZ遺伝子を発現でき、大量のLacZタンパク質を産生し同様の担体は正常細胞内では「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性がなく、それでLacZの遺伝子発現もなく、LacZタンパク質を検出しない。
【０１７８】
「HTERT」遺伝子プロモーターとウイルスVPRゲノムはつながり、がん細胞中でpRBLVPR のRNAを転写でき、「p RBLVpr」タンパク質を産生し、それによってがん細胞の増殖周期を遮断し、有効ながん遺伝子治療となる。
【０１７９】
正常細胞内において、「HTERT」遺伝子プロモーターは活性を有しないか活性が極めて低い。このため、「pRBLVpr」の発現がなく細胞周期は遮断されない。以上のことからも、（ pRBL001、pRBL002、pRBL2013T） はがん細胞に対して特異な作用を有していると分かる。
【０１８０】
pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tががん細胞の増殖周期を遮断することにより、がんの無限増殖を有効に制止し、近隣の正常組織に浸潤し拡散するがん細砲に破壊されることなく、がん細胞の悪性増殖により作られる「悪疫質」を大幅に減少させることが、この遺伝子がん治療と標準がん治療の明確な相違であり、この生物学的に高度な遺伝科学技術を駆使し、腫瘍に対して「遺伝子治療」を実施することは、治療を受ける患者の身体環境の安全を確保し、治癒作用を維持する。
【０１８１】
pRBL2013Tウイルスベクターは、ナノ粒子アセンブリーのために使用される。材料は、非細胞毒性である。生体適合性、生分解性親水性の外殻を形成する活性化PEGである。
血液中の循環時間を増加し、最小化する免疫反応ポリカチオンポリマ-polyethylenenimine（PEI）は、負に帯電し、DNAまたはRNAを満たす。約80ナノ粒子で形成されているこれは、DNAや酵素分解からRNAを保護する構造を有する。ナノ粒子で組み立て哺乳類に発現するベクターの新しいタイプである。標的（Target）の細胞の核に対して、遺伝子を封入されたナノデバイスとして有効に効率的な遺伝子導入を行う。pRBL2013Tは、mRNAを同時に標的にして多くのCDKのインヒビターであり、サイクリンD、転写因子E2Fを標的とする。これによってがん抑制機能を持つ。
【０１８２】
DNA複製は、複製前複合体（プレRC）を組み立てることによって開始し、DNAの複製タンパク質複製開始点認識（Cdc6）は、DNAの複製の開始（mailandとDiffley、2005）において中心的な役割を果たしている。細胞が有糸分裂、複製開始点認識から、G1に入ると一緒にCDT1と起点認識複合体（ORC）（Duttaとベル、1997）の6つのコンポーネントにバインド複製起源に動員されている。プレRCが、起源および複製開始点認識コントロールローディング上に複製し、他のタンパク質と一緒にminichromosomalメンテナンスタンパク質（MCM）をロードすることによって形成される。G1中の複製開始点認識の安定性は、プレRC組立を規制する重要なステップである。CDC6はG1の複合体（APC）を推進後期によってユビキチン媒介タンパク質分解を対象としている。サイクリンE-Cdk2複合キナーゼは、ヒトアミノ末端複製開始点認識のリン酸化を担当し、リン酸化された複製開始点認識し（Jiangら、1999;  mailandとDiffley、2005）、安定化される。サイクリンE-Cdk2複合によって複製開始点認識複合リン酸化は、その原点はS期で分解され、DNAが（mailandとDiffLey、2005）S期ごとに1回だけ複製されることが保証される。
【０１８３】
ヒトの細胞では、CDC6のレベルは様々なストレスに反応して著しく変化する。DNA再複製は、それらのCDC6とCDT1過剰発現の細胞または腫瘍細胞で、p53の活性化細胞と一緒に見られる。さらに最近では、そのp53が複製開始点を認識し、その下方の遺伝子を修飾してDNA複製ストレス応答に直接複製開始点を認識する複合タンパクとしてDNA損傷へリンクする。そのリンクに対応してCDC6発現が低下されるため、DNA修復の機能として発現したp53は、検出可能な細胞周期上で再度発現を引き起こすことはない。
【０１８４】
＜さらに別の発明＞
本発明は、がん細胞を更正するタンパク質及びその製造方法を提供する。がん細胞を更正するタンパク質とは、がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるがん抑制遺伝子または遺伝子産生産物を発現するウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質であり、遺伝子導入されたウイルス様中空粒子、もしくは導入遺伝子産物を放出するウイルス様中空粒子の形態をとる。
また、本発明は、ウイルス様中空粒子で包装されたがん抑制遺伝子を造血幹細胞系に導入することにより、遺伝子が組み換えられた造血幹細胞による核酸療法を提供する
【０１８５】
p16タンパク質（p16INK4aとも呼ばれる）は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤として知られている。
例えば、p16遺伝子は、SEQ ID NO:23（GenBank  アクセッション番号：L27211）のヌクレオチド配列を含むか、もしくは、前記ヌクレオチド配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば、99.5％又は99.9％又はこれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
p16遺伝子はまた、SEQ ID NO:24のアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。
。
p16遺伝子は、好ましくはCDK阻害活性を有するタンパク質をコードする。
p16遺伝子の例としては、SEQ ID NO:25のヌクレオチド配列の434から480の位置のヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。
【０１８６】
さらに、p53遺伝子は、SEQ ID NO:26（GenBank アクセッション番号BC003596）のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
p53遺伝子はまた、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、またはが  アミノ酸配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。
p53遺伝子は、好ましくは、転写因子活性を有するタンパク質をコードする。
別の実施形態において、導入遺伝子は、shRNAをコードしてもよい。
【０１８７】
shRNAは一本鎖RNAである。一本鎖RNAのアンチセンス配列は標的配列に相補的であり、該アンチセンス配列に相補的なセンス配列（典型的には3 '末端にポリUオーバーハングを有する）はリンカーを介して連結される。
shRNAは、分子内二本鎖形成を介してヘアピン構造を形成する。
そのようなshRNAは、細胞内でsiRNAへの二本鎖部分で切断され、次に、RNAiは、標的配列を含む標的遺伝子の発現を抑制させることができる。
【０１８８】
本明細書においては、shRNAの前駆体は、導入遺伝子から転写され、次いで編集が施されていてもよい。また、shRNAを形成するための処理を行う。その場合でも、導入遺伝子はshRNAをコードする。
shRNAの標的としてもよいが、細胞増殖調節因子をコードする遺伝子はこれらに限定されない。
【０１８９】
細胞増殖調節剤の例としては、DNA複製や、CDC6、サイクリンE、CDK2、CDT1、ORC2及びMCM7のような細胞周期の調節に関与するタンパク質が含まれる。好ましくは、細胞増殖調節剤は、CDC6であってもよい。
CDC6は、DNA複製の開始において中心的な役割を果たすタンパク質である。CDC6ノックダウンは、ヒトがん細胞のアポトーシスをもたらすことが見出されている (Feng, et al., Cancer Res., 2003, Vol. 63, p. 7356-7364; Lau et al., EMBO Rep., 2006, Vol. 7, p. 425-430; and Feng et al., Mol. Cell. Biochem., 2008, Vol. 311, p. 189-197)。
CDC6遺伝子は、SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる場合がある。
CDC6のshRNAをコードする導入遺伝子は、SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれていても良い。
【０１９０】
典型的には、CDC6のshRNAは、SEQ ID NO:19のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるCDC6 shRNAのアンチセンス配列；SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して80％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるリンカー；及びアンチセンス配列に相補的な配列からなるセンス配列、そして2以上の塩基および3 'ポリUオーバーハング。
から成る。
導入遺伝子産物は、上述のように、導入遺伝子からのRNAを含んでいてもよく、導入遺伝子からのRNAから翻訳されたタンパク質を含んでもよい。
各々のレンチウイルスベクターは、少なくとも一つの導入遺伝子を含んでもよい。
二つ以上の導入遺伝子は、一つのレンチウイルスベクターを用いて、または二つ以上のレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入されてもよい。
【０１９１】
好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、CDC6のshRNAをコードする導入遺伝子、および／またはp16タンパク質、PTENタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
本発明に係る導入遺伝子は、インビトロでレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入される。
本発明において使用される細胞の生物種は、好ましくは、製造されるウイルス様中空粒子のレシピエントと同じ種である。細胞は、哺乳動物細胞、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、あるいはサルまたはヒトなどの霊長類の細胞であるが、これらに限定されない。好ましくはヒト細胞である。また好ましくは、細胞は、腎臓由来細胞、子宮由来細胞、リンパ球由来の細胞または線維芽細胞である。
細胞は、ヒト胚性腎臓293T細胞、ヒト子宮頸がんHeLa細胞、ヒトリンパ球CEM細胞、N144繊維芽細胞および他のヒト細胞株を含むことができるが、好ましくは、細胞は、ヒト胚性腎臓293T細胞又はヒト子宮頸がんHeLa細胞である。
【０１９２】
レンチウイルスベクターを用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。レンチウイルスベクターなどのRNAベクター又はDNAベクターを用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、その他当技術分野で知られている方法により行うことができ、例えば、リポフェクタミン（R）2000（Invitrogen）およびFuGene（R）6（Roche社）として市販されているトランスフェクション試薬を用いて行うことができる。
【０１９３】
レンチウイルスベクターなどのウイルス粒子を用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、ウイルスによって細胞に感染する細胞の培養培地中にウイルス粒子を添加することにより行うことができる。
レンチウイルスベクターに加えて、付加的な発現ベクターを細胞に導入してもよい。
このような発現ベクターは、プロモーターの制御下で、ウイルス様中空粒子に封入されるタンパク質またはRNAをコードする導入遺伝子を含んでもよい。
このようにして導入遺伝子が導入された細胞は培養される。
培養は、細胞に応じて適切な方法によって行うことができる。
例えば、培養は、１〜５日間、例えば２〜４日間、特には３６時間から９６時間、あるいは３６時間から７２時間、10％ウシ胎児血清および適切な抗生物質を補充したDMEM /高グルコース完全培地中で行うことができる。
レンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子が導入された細胞において、レンチウイルスDNA（逆転写酵素の作用により、レンチウイルスRNAから産生される）は、プロウイルスDNAを形成するために、インテグラーゼ等の作用により細胞内のゲノムに組み込まれる。
このプロウイルスDNAから、レンチウイルスRNAは、細胞内のRNAポリメラーゼIIによる媒介転写によって産生される。
このようにして製造されたレンチウイルスRNAから、導入遺伝子産物は、通常、RNAスプライシングおよび／またはタンパク質翻訳を介して生成される。
導入遺伝子産物および／またはこのようにして細胞内で産生されたレンチウイルスRNAがウイルス様中空粒子に組み込まれる。
培養中に細胞はこのようなウイルス様中空粒子を細胞外に放出し、その結果、ウイルス様中空粒子は、培地中に蓄積される。
好ましくは、本発明において使用されるレンチウイルスベクターは構造タンパク質遺伝子を欠損しており、それゆえウイルス様中空粒子を形成せず、ウイルス様中空粒子は培地中に蓄積されていない。
【０１９４】
本発明に係るウイルス様中空粒子を製造するための方法は、放出されたウイルス様中空粒子を回収する工程を含む。ウイルス様中空粒子の回収は、細胞培養培地を回収することによって行うことができる。
こうして回収されたウイルス様中空粒子は、更に精製することができる。例えば、より大きい小胞を、1,000〜10,000×g（好ましい実施形態において、9,000×g）の遠心分離により除去し、それによって回収されたウイルス様中空粒子を精製することができる。そのような遠心分離は、１回以上行ってもよく、好ましくは、異なる遠心力で遠心分離を行う。代替的に又は付加的に、例えば、1,000 kDaの分子量でカットオフできる膜を用いた限外濾過によりウイルス様中空粒子を精製することができる。
【０１９５】
さらに、ウイルス様中空粒子は、PEG/NaCl溶液と混合し、遠心分離と混合することによって沈殿させ、それによって精製することができる。このようにして精製した後、ウイルス様中空粒子に、ポリエチレングリコール構造が付加（PEG化）することがある。
ウイルス様中空粒子のPEG化は、PEG化試薬の種々のタイプを用いて行うことができる。例えば、メトキシPEGスクシンイミジルカーボネートNHS（methoxy PEG succinimidyl carbonate NHS(mPEG-NHS)）を用いて行うことができる（Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-921）。
例えば、メトキシPEGスクシンイミジルカーボネートNHS（mPEG-NHS、分子量10K（NANOCS、USA））をウイルス様中空粒子を含有する溶液に添加する。そして、この混合物を、回転プラットフォーム上で60分間室温でインキュベートし、それによって、ウイルス様中空粒子をペグ化することができる。
【０１９６】
PEG化または非PEG化ウイルス様中空粒子は、次いで透析（例えば、1×PBSを用いる）によるバッファ交換、シリンジフィルター（例えば、0.45 mmの孔径を有する）を介した限外濾過および濾過による濃縮に供されてもよい。
本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAから成る。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の上流TERT遺伝子プロモーター配列を含むことができる。
導入遺伝子は、TERT遺伝子プロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入され、それによって宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込み、およびその発現を促進し、さらに、細胞からのウイルス様中空粒子の放出を増強する。したがって、ウイルス様中空粒子を効率よく製造することができる。
【０１９７】
一実施形態において、本発明は、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含むウイルス様中空粒子を製造する方法に関し、以下の工程を含む：
インビトロにおけるレンチウイルスベクターを用いた導入遺伝子の細胞への導入工程；ここで、前記レンチウイルスベクターは少なくとも1つの構造タンパク質遺伝子が欠損しており、レンチウイルスゲノム配列中のテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、
導入遺伝子産物を含むウイルス様中空粒子および／または導入遺伝子から成るレンチウイルスRNAを細胞外に放出するために細胞を培養する工程、および
放出されたウイルス様中空粒子を集める工程。
【０１９８】
＜本発明の方法により製造される、がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質＞
本発明はまた、導入遺伝子産物を含むがん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質に関する。
がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質は、本発明の方法により産生される遺伝子を含むレンチウイルスRNAである
本発明に係るウイルス様中空粒子は、細胞により産生され、細胞外に放出又は落下する、大きさが5nm〜5mm、好ましくは10nm〜1mm、より好ましくは20nm〜500nmのウイルス様中空粒子を意味する。
ウイルス様中空粒子の大きさは、電子顕微鏡法により決定することができる。
ウイルス様中空粒子の例としては、一般に、エキソソーム、取り除かれている（shedding）ウイルス様中空粒子およびアポトーシス小体が挙げられるが、これらに限定されない。
典型的には、本発明のウイルス様中空粒子はエキソソームである。エキソソームは、脂質二重層から成る膜小胞である。エキソソームは、150nmもしくはそれよりも小さく、典型的には、20〜120nm又は40〜100nmのサイズを有する。
エキソソームは、細胞外に分泌され、エンドソーム膜の内向き出芽を介して形成された多小体（MVB）の細胞膜融合に起因するエキソサイトーシスにより製造される。
【０１９９】
本発明に係るウイルス様中空粒子は、タンパク質および／または、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAのようなRNAを含んでいてもよい。RNAは、宿主細胞から輸送され、その中でカプセル化される。
ウイルス様中空粒子中に含まれ得るRNAの例には、mRNA、miRNA、shRNA、siRNAおよびレンチウイルスRNA（レンチウイルスRNAの種々のスプライシング変異体を含む。）が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルス様中空粒子中に含まれ得るタンパク質の例には、ウイルスタンパク質（例えば、HIV-1のVpuタンパク質および逆転写酵素（RT）タンパク質）、細胞の内因性タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質、シグナル伝達タンパク質及び酵素）及び外来導入遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、エキソソームは、一般に、細胞骨格タンパク質（例えば、チューブリン、アクチンおよびアクチン結合タンパク質）、膜輸送関連タンパク質（例えば、アネキシンおよびRabタンパク質）、シグナル伝達タンパク質（例えば、プロテインキナーゼおよび14-3-3）、代謝酵素（例えば、GAPDH、ATPアーゼおよびエノラーゼ）、テトラスパニンファミリー（例えば、CD9 、CD63、CD81およびCD82）、熱ショックタンパク質（例えば、HSP90およびHSP70）、MVB生合成タンパク質（例えば、アリックスおよびTSG101）、免疫調節分子（例えば、MHCI及びMHCII）などを含んでいてもよい。
【０２００】
上述の導入遺伝子を含むレンチウイルスゲノム配列を含むレンチウイルスDNA（プロウイルスDNA）は、本発明の方法により細胞に導入され、宿主ゲノムに組み込まれる。
本発明のウイルス様中空粒子中に含まれるレンチウイルスRNAは、このプロウイルスDNAから転写される。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の上流の5 '末端にTERT遺伝子プロモーター（例えば、hTERTプロモーター）のRNA配列を含んでいてもよい。
特に好ましい実施形態において、本発明のウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物として、PTENおよびp16タンパク質のような腫瘍抑制タンパク質、および／またはCDC6のshRNAもしくはその前駆体RNA等のようなshRNAを含むことができる。
本発明のウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれる導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを送達する他の細胞によって、該細胞に取り込まれ得る。
【０２０１】
＜本発明のウイルス様中空粒子を用いた遺伝子導入の方法＞
本発明はまた、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含むウイルス様中空粒子と標的細胞を接触させてそれらを融合する工程を含み、それにより導入遺伝子を細胞に導入する遺伝子導入方法に関し、このようにしてウイルス様中空粒子は本発明の方法により産生される。
一実施形態において、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス様中空粒子と接触させることができる。
ウイルス様中空粒子、特にエキソソームは、細胞−細胞相互作用に参加するために、その隣接する他の細胞に浸透することができる。
【０２０２】
ウイルス様中空粒子は、膜融合を介して、またはエンドサイトーシスのような方法を介して標的細胞の内部に到達することができると考えられているが、本発明はこの理論に限定されるものではない。
本発明の遺伝子導入方法において、ウイルス様中空粒子と標的細胞との接触は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、ウイルス様中空粒子と標的細胞のインビトロでの接触は、細胞培養培地中にウイルス様中空粒子を添加することによって為すことができる。
ウイルス様中空粒子と標的細胞のインビボでの接触は、例えば、ウイルス様中空粒子の経口投与によって、または標的部位（例えば、肝臓内、関節内、脳室内および鼻腔内のサイト）へのウイルス様中空粒子の直接適用または注射などの非経口投与により為されてもよい。
使用され得る他のインビボの投与方法および投与部位は、医薬組成物の投与方法及び投与部位に関連して後述する。
本発明の遺伝子導入の方法は、標的細胞に、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれる遺伝子を含むレンチウイルスのRNAを効率的に、送達することができる。
【０２０３】
＜本発明のウイルス様中空粒子を含む組成物＞
本発明はまた、本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を含む組成物に関する。
組成物は、その意図される用途に応じてウイルス様中空粒子以外の任意の成分を含むことができる。
組成物は、遺伝子導入において使用されるものであってもよい。
その場合、組成物は、遺伝子形質導入を促進する薬剤および／または核酸を安定化する薬剤などを含んでいてもよい。
【０２０４】
＜本発明のウイルス様中空粒子を含む医薬組成物および治療方法＞
本発明はまた、本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を含む医薬組成物に関する。
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、がん、糖尿病、神経変性疾患、免疫機能障害、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓や感染症などの疾患の治療に使用するためのものであってもよい。
好ましくは、医薬組成物は、がんの治療に使用するためのものである。
具体的には、がんは、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択される。
一実施形態において、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物は、CDC6の発現低下を引き起こす可能性がある。
例えば、導入遺伝子産物は、CDC6を標的とするshRNAである。その場合には、治療する疾患、例えば、がんは、CDC6の発現の上昇を伴っているものがよい。
医薬組成物中にウイルス様中空粒子を用いた場合には、ウイルス様中空粒子に含まれる導入遺伝子または導入遺伝子産物は、本発明におうじて、疾患を予防および／または治療するために機能する。例えば、そのような導入遺伝子は、PTENやp16遺伝子のような腫瘍抑制遺伝子であってもよく、および／または細胞増殖調節剤又はその前駆体をコードする遺伝子を標的とするshRNAをコードする遺伝子であってもよい。
【０２０５】
一実施形態において、導入遺伝子は、PTEN遺伝子および／またはCDC6shRNAをコードしている遺伝子である。この実施形態では、医薬組成物は、本発明の方法によって製造される、導入遺伝子がPTEN遺伝子であるウイルス様中空粒子、および導入遺伝子が、組み合わせてCDC6のshRNAをコードする遺伝子であるウイルス様中空粒子を含んでもよい。
別の実施形態において、導入遺伝子は、p16遺伝子および／またはCDC6のshRNAをコードしている遺伝子である。
この実施形態において、医薬組成物は、例えば、本発明の方法により製造された、導入遺伝子がp16遺伝子であるウイルス様中空粒子、および、導入遺伝子が、組み合わせてCDC6のshRNAをコードする遺伝子であるウイルス様中空粒子を含んでもよい。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、本発明のウイルス様中空粒子に加えて、液体培地を含む。
液体培地としては、水、生理的に許容される緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水など）、および、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの生体適合性水性媒体を含む。
必要であれば、このような媒体は、望ましくは滅菌し、好ましくは血液と等張になるように調整される。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。
「薬学的に許容される担体」とは、製薬技術の分野で通常に使用される添加剤を意味する。薬学的に許容される担体の例としては、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および防腐剤が挙げられる。そのような担体は、成形を容易にし、投薬形態および薬物効果を維持するために主に使用され、必要に応じて適切に使用される。
例えば、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースおよびラウリル硫酸ナトリウムが、懸濁化剤として使用することができる。
等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の例は、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液が挙げられる。
防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラヒドロキシ安息香酸、クロロブタノールが挙げられる。
医薬組成物はまた、上述したものに加えて、矯味剤、増粘剤、可溶化剤、pH調整剤、希釈剤、界面活性剤、膨張剤、安定剤、吸収促進剤、湿潤剤、保湿剤、吸着剤加えて、コーティング剤、着色剤、酸化防止剤、香味剤、甘味料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流れ制御添加剤、潤滑剤等を必要に応じて含むことができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のウイルス様中空粒子が有する薬理効果を失うことなく、追加の薬物を含有することができる。例えば、医薬組成物は、所定量の抗生物質を含有することができる。
【０２０７】
医薬組成物の剤形は限定されず、ウイルス様中空粒子を不活性化することも、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれるレンチウイルスRNAを不活性化することもない任意の形態とすることができる。
医薬組成物の剤形は、例えば、液体、固体または半固体の形態であってもよい。剤形の具体例としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、点眼剤、点鼻薬、軟膏剤、硬膏剤、パッチ剤、坐剤等の非経口剤形や、液体製剤、カプセル剤、舌下製剤、トローチ、粉末、錠剤、顆粒剤などの経口剤形が挙げられる。
医薬組成物の剤形は、好ましくは、注射のような液体製剤である。
医薬組成物は、標的疾患の治療のための薬学的に有効な量で生物に投与することができる。
レシピエント生物は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類や爬虫類等の脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物である。
哺乳類の例としては、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウスおよびラットなどの非霊長類や、ヒト、チンパンジーおよびゴリラなどの霊長類が挙げられるが、好ましくはヒトである。
【０２０８】
本明細書中の「薬学的有効量」は、宿主に対して有害な副作用がほとんど無い、あるいは全く無い状態で標的疾患を阻止あるいは治療したり症状を軽減したりするために、本発明の医薬組成物中に含まれるウイルス様中空粒子に必要とされる用量を指す。具体的な用量は、治療すべき疾患の種類、疾患の発生の根底にある作用機序は、使用される剤形、被験体に関する情報および投与経路等によって異なる。
薬学的有効量の範囲、およびヒトに投与される医薬組成物の好ましい投与経路は、一般に、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータに基づいて設定される。最終用量は、個々の被験体に応じて、例えば、医師の判断により決定され、調整される。その場合に考慮される被験者についての情報は、疾患の進行の程度あるいは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、薬物感受性および治療に対する抵抗性等を含む。
【０２０９】
一実施形態において、導入遺伝子がタンパク質をコードするとき、本発明の医薬組成物は、１×１０４〜１×１０５トランスフェクションユニット（TU）/ kg体重の用量で１回または複数回投与することができ、例えば、単回投与当たり、１×１０５ 〜１×１０７t.u./kg体重、または２×１０５〜５×１０６t.u./kg体重の用量で、罹患部位への直接注射または静脈内注射することができる。
ここで、トランスフェクションユニットは、本発明のレンチウイルスベクター（例えば、プラスミドベクター（pRBL2013T等）のようなDNAベクター）として、例えば、DNAベクターを10μgを用いて、導入遺伝子を細胞（例えば、ヒト胚性腎臓293T細胞）に導入する工程、ELISAアッセイに基づいて、細胞から放出されるウイルス様中空粒子の断片中の導入遺伝子産物（例えば、PTENタンパク質などのタンパク質）の量を決定する工程、および１トランスフェクションユニットとして決定された量（トランスフェクション効率）を正規化する工程によって決定することができる。ここで、１トランスフェクションユニットとは、1000細胞あたりの導入遺伝子産物（例えば、タンパク質）の20 PGと同等である。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、所定の時間間隔で2回またはそれ以上投与されてもよい。所定の時間間隔とは、例えば、１時間毎、３時間毎、６時間毎または１２時間毎、あるいは、毎日、２日毎、３日毎または７日毎、１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎または１２ヶ月毎である。
他の非経口投与または経口投与は、上記のものに従う量で行うことができる。
特に重症の場合には、用量は症状に応じて増加させることができる。
【０２１１】
医薬組成物の投与は、全身投与または局所投与であってもよく、疾患の種類、疾患が起こる部位、または進行の程度に応じて適宜選択することができる。
疾患が局所部位で起こる場合、医薬組成物は、好ましくは、注射または留置カテーテルなどを用いてローカルサイト（例えば、腫瘍）およびその近傍への直接投与により局所的に投与される。これは、本発明のウイルス様中空粒子は、処置されるべき部位（組織または器官）に十分な量で投与し、他の組織に影響を与えないことができるからである。
一方、転移性がんのように、治療すべき部位が同定されないか、疾患が全身的に起こり得る場合がある。その場合には、静脈内注射等により全身投与することが好ましい。
【０２１２】
これは、本発明のウイルス様中空粒子は、血流を介して全身に広がることができるためであり、それによって、たとえ診断によって発見することができない病変にも投与することが可能になる。
医薬組成物は、その中に含まれる活性成分を不活性化しない任意の適切な方法によって投与することができる。
例えば、投与は、非経口（例えば、注射、エアロゾル、アプリケーション、点眼、点鼻または留置カテーテル）または経口によりなされる。注射が好ましい。
注射による投与の場合、注射部位は、本発明のウイルス様中空粒子がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達成することができる非限定的な部位でよい。
注射部位の例としては、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内および舌下の部位が挙げられる。
１つの実施形態として、腫瘍への直接投与も好ましい。
【０２１３】
本発明の医薬組成物は、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物等により、疾患の予防および／または治療を効果的に達成するために使用することができる。
従って、本発明はまた、導入遺伝子または導入遺伝子産物の導入を必要とする患者に本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を投与する工程を含む、患者を治療するための方法を提供する。
患者は、がん、糖尿病、神経変性疾患、免疫不全、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓または感染を患っていてもよいが、好ましくは、がんを患っている。より具体的には、がんは、例えば、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択され得る。
一実施形態では、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物は、CDC6の発現低下を引き起こす可能性がある。
例えば、導入遺伝子産物は、CDC6を標的とするshRNAであってもよい。その場合には、治療する疾患、例えば、がんは、CDC6の発現の上昇を伴ってもよい。
【０２１４】
患者に対するウイルス様中空粒子の投与方法および投与部位は、上記のように医薬組成物の投与方法及び投与部位に関連して使用することができる。
本発明の治療方法は、患者のがんのような疾患を効果的に治療することができる。好ましい一実施形態では、本発明の治療方法は、腫瘍の増殖を阻害する（減らす）ことができる。
【０２１５】
以下、本発明に係る治療剤を用いた結果について以下に説明する。
【０２１６】
［効果１］
p53遺伝子異常を有する固形がんでは、タンパク質の高次構造が変化する結果、半減期が延長するために変異したp53タンパク質の過剰発現が認められる。その結果、がん患者の血清中にIgG抗体が出現する。p53腫瘍マーカーは2007年より保険収載されている新規腫瘍マーカーであり、p53抗体の基準値は1.3U/mlである。
そこで、画像検診などでがんと診断されていないが、p53抗体検査において高値を示す２人の患者に対してpRBL001、pRBL002をそれぞれ週2回のインターバルで点滴治療を10週間連続投与した。投与には、pRBL001、pRBL002ともに、タンパク質の量として0.4mgを200mlの0.9％Naclに溶解したものを用いた。
【０２１７】
その結果を図５５に示す。図５５中、ケース(1)はpRBL001を投与した患者の結果、ケース(2)はpRBL002を投与した患者の結果を示す。図５５から分かるように、ケース(1)では投与開始から10週間経過後にp53抗体検査の数値が基準値以内に収まった。また、ケース(2)では投与開始から14週間経過後にp53抗体検査の数値が基準値以内に収まった。
【０２１８】
［効果２］
卵巣がん全摘出術後6ケ月を経過した患者の腫瘍増殖因子のmRNAをRT-PCR法によって観察した。1回目のmRNAの検査後2週間の間に、pRBL001、pRBL002を、それぞれ5回投与した。投与には、pRBL001、pRBL002ともに、タンパク質の量として0.4mgを200ml/0.9％Naclに溶解したものを用いた。その後、3週間後、mRNAの変化を観察したところ、増殖因子のmRNAの低下が顕著に観察された。その結果を図５６に示す。
【０２１９】
［効果３］
卵巣がんの全摘出後患者においてp53の突然変異を確認した。
2週間でpRBL001、pRBL002をそれぞれタンパク質の量として0.4mgを200ｍｌ/0.9％Naclに溶解して5回投与。その後、3週間後、観察したところp53の突然変異は解消された。また、MDM2のmRNAの発現量も低下していた。その結果を図５７に示す。
【０２２０】
［効果４］
乳房全摘出術前治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）（HER2陽性）のSTAGE2の患者に対して、術前にpRBL001、pRBL002をそれぞれ0.4mgとpRBL2013Tを0.85mg混合し200ml/0.9％Naclで溶解して6回投与した。術前に3.0cmの大きさであった腫瘍は、術後は1.5cmまで縮小された。図５８Ａ〜５８Ｃは腫瘍縮小効果を示す画像である。図５８Ａの(ａ）〜（ｄ）および図５８Ｂの(ｅ）〜（ｇ）は術前、図５８Ｃの（ｈ）〜（ｍ）は術後の状態である。
【０２２１】
［効果５］
乳房温存治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）（HER2陽性）のSTAGE2の患者に対して、１回につき、pRBL001、pRBL002をそれぞれ0.4mgとpRBL2013T 0.85mgを5ml0.9％Naclに溶解して10日に1回のインターバルで腫瘍に直接穿刺した。また、同量のpRBL001、pRBL002、pRBL2013Tを点滴として投与した。腫瘍縮小効果を図５９に示す。図５９の(ａ）および（ｂ）は術前、図５９の（ｃ）および（ｄ）は術後の状態である。
【図１】
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【図２０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５９】
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【国際調査報告】
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