(57)【要約】  細胞剥離装置１４０は、表面に細胞が付着した細胞培養膜７７に裏面側から振動を与えることで、細胞を細胞培養膜７７から剥離させる。細胞剥離装置１４０は、超音波振動する振動子１４１ａを有する超音波プローブ１４１と、振動子１４１ａを取り囲んで配置された枠体１４２と、枠体１４２に加わった所定方向の力を検知する第一検知部１４３と、を備えている。振動子１４１ａは細胞培養膜７７の表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。枠体１４２は第一検知部１４３による検知結果に基づいて細胞培養膜７７の裏面から枠体１４２に加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後、細胞培養膜７７の裏面に枠体１４２が当接した状態で振動子１４１ａが超音波振動する。
2015146952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離装置において、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブ
を備え、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする細胞剥離装置。
【請求項２】
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部
を備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離装置。
【請求項３】
剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置された細胞培養膜側枠体または前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動することで前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させ、
前記細胞培養膜側枠体または前記振動子側枠体は前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる間、常に前記細胞培養膜の裏面に接触する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
【請求項４】
前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面にまず押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
【請求項５】
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部と、
を備え、
前記振動子側枠体は前記第一検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする請求項４に記載の細胞剥離装置。
【請求項６】
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とは弾性部材を介して連結され、
前記細胞培養膜に前記枠体が接触していないときには、前記振動子の細胞培養膜側の端部は前記振動子側枠体の内方に収容され、
前記細胞培養膜に前記振動子側枠体を押しつけることで、前記振動子の細胞培養膜側の端部が前記振動子側枠体の外方に突出する
ことを特徴とする請求項３から５のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項７】
前記第一検知部又は第二検知部が接触式センサ、近接式センサ又は力センサである
ことを特徴とする請求項２または５に記載の細胞剥離装置。
【請求項８】
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも高くなっている
ことを特徴とする請求項３から６のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項９】
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも低くなっている
ことを特徴とする請求項３から６のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１０】
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とを、前記細胞培養膜の裏面に対し同時に垂直に駆動させる１つの昇降部を備える
ことを特徴とする請求項４、５、６、８、９のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１１】
前記振動子の細胞培養膜側の端部は、ローレット加工されている
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１２】
前記細胞培養膜から剥離される細胞が、培養又は継代に不要な不良細胞である
ことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１３】
前記細胞培養膜の表面に付着した細胞が、ｉＰＳ細胞又は分化細胞である
ことを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１４】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法において、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える
ことを特徴とする細胞剥離方法。
【請求項１５】
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備えたことを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離方法。
【請求項１６】
振動子側枠体または細胞培養膜側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体または細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離方法。
【請求項１７】
細胞培養膜側枠体を剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置するステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した振動子を超音波振動するステップは、前記細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離方法。
【請求項１８】
振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養膜から細胞を剥離するための細胞剥離装置及び細胞剥離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から培養容器内で細胞を培養し、培養容器に付着した細胞を剥離することが知られている。例えば特開２００６−３１４２０４号公報（以下、特許文献１という）では、細胞付着面の裏面側から当該培養容器に超音波振動を与えることにより、細胞を細胞付着面から剥離させることが開示されている。より具体的には、特許文献１では、一定の培養期間が経過して継代を行う際に、本体を天地させ、細胞付着面の裏面側の外面を上方に向ける。そして、この外面の全面に、超音波発生装置の振動子を当接させて、培養容器に超音波振動を与えることで、細胞を剥離することが開示されている。【０００３】
このように細胞を一様に培養容器から回収することの他に、何らしかの理由で上手く培養できなかった不良細胞等を選択的に剥離することも重要である。上述した特許文献１に開示された発明は、全面に超音波発生装置の振動子を当接させ、全ての細胞を回収するものであり、選択的に剥離することはできない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、超音波振動によって、不良細胞等の所定の細胞のみを選択的に剥離することができる細胞剥離装置及び細胞剥離方法を提供するものである。
【０００５】
本発明による細胞剥離装置は、
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離装置であって、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブ
を備え、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した前記振動子が超音波振動するものである。
【０００６】
本発明による細胞剥離装置は、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部
を備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動してもよい。
【０００７】
本発明による細胞剥離装置は、
剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置された細胞培養膜側枠体または前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動することで前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させ、
前記細胞培養膜側枠体または前記振動子側枠体は前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる間、常に前記細胞培養膜の裏面に接触してもよい。
【０００８】
本発明による細胞剥離装置は、
前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面にまず押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動してもよい。
【０００９】
本発明による細胞剥離装置は、
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部と、
を備え、
前記振動子側枠体は前記第一検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動してもよい。
【００１０】
本発明による細胞剥離装置において、
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とは弾性部材を介して連結され、
前記細胞培養膜に前記枠体が接触していないときには、前記振動子の細胞培養膜側の端部は前記振動子側枠体の内方に収容され、
前記細胞培養膜に前記振動子側枠体を押しつけることで、前記振動子の細胞培養膜側の端部が前記振動子側枠体の外方に突出してもよい。
【００１１】
本発明による細胞剥離装置において、
前記第一検知部又は第二検知部が接触式センサ、近接式センサ又は力センサであってもよい。
【００１２】
本発明による細胞剥離装置において、
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも高くなっていてもよい。
【００１３】
本発明による細胞剥離装置において、
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも低くなっていてもよい。
【００１４】
本発明による細胞剥離装置は、
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とを、前記細胞培養膜の裏面に対し同時に垂直に駆動させる１つの昇降部を備えてもよい。
【００１５】
本発明の第一態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
前記振動子を取り囲んで配置された枠体と、
を備え、
前記枠体が細胞培養膜の裏面にまず押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動するものである。
【００１６】
本発明の第二態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
前記振動子を取り囲んで配置された枠体と、
前記枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部と、
を備え、
前記枠体が前記第一検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動するものである。
【００１７】
本発明の第一態様、第二態様、第四態様、第五態様及び第六態様による細胞剥離装置において、
前記超音波プローブと前記枠体とは弾性部材を介して連結され、
前記細胞培養膜に前記枠体が接触していないときには、前記振動子の細胞培養膜側の端部は前記枠体の内方に収容され、
前記細胞培養膜に前記枠体を押しつけることで、前記振動子の細胞培養膜側の端部が前記枠体の外方に突出してもよい。
【００１８】
本発明の第二態様、第三態様、第四態様、第五態様及び第六態様による細胞剥離装置において、
前記第一検知部及び第二検知部は接触式センサ、近接式センサ又は力センサであり、
前記第一検知部及び第二検知部が接触式センサである場合には、前記枠体が前記接触式センサに接触した時点で前記枠体の前記細胞培養膜の裏面に対する押し込みが停止され、
前記第一検知部及び第二検知部が近接式センサである場合には、前記枠体が前記近接式センサから所定の距離となった時点で前記枠体の前記細胞培養膜の裏面に対する押し込みが停止され、
前記第一検知部及び第二検知部が力センサである場合には、前記枠体から前記力センサに加わる力が所定の大きさとなった時点で前記枠体の前記細胞培養膜の裏面に対する押し込みが停止されてもよい。
【００１９】
本発明の第一態様、第二態様、第四態様、第五態様及び第六態様による細胞剥離装置において、
前記枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の前記第一検知部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも高くなってもよい。
【００２０】
本発明の第一態様による細胞剥離装置において、
前記超音波プローブと前記枠体とは複数の弾性部材を介して連結され、
弾性部材の各々は均等な間隔で配置されてもよい。
【００２１】
本発明の第三態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部と、
を備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動するものである。
【００２２】
本発明の第四態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
前記振動子を取り囲んで配置された枠体と、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部と、
を備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動するものである。
【００２３】
本発明の第五態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
細胞培養膜の裏面上に保持された、または、細胞培養膜の裏面に接着された枠体と、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動することで前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させ、
前記枠体は前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる間、常に前記細胞培養膜の裏面に接触するものである。
【００２４】
本発明の第六態様による細胞剥離装置は、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブと、
剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置された枠体と、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部と、
を備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動することで前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させ、
前記枠体は前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる間、常に細胞培養膜の裏面に接触するものである。
【００２５】
本発明の第一態様、第二態様、第四態様、第五態様及び第六態様による細胞剥離装置において、
前記枠体は、弾性率の異なる複数個の部材によって構成されていてもよい。
【００２６】
本発明の第二態様、第三態様、第四態様及び第六態様による細胞剥離装置において、
前記第一検知部及び前記第二検知部は知見者によって任意に選択することができ、例えば接触式センサ、近接式センサ又は力センサを使用することができる。
【００２７】
本発明による細胞剥離装置は、前記超音波プローブの位置制御に対し、前記超音波プローブを前記細胞培養膜の裏面に対し垂直に駆動させる昇降部を備えていてもよい。
【００２８】
本発明による細胞剥離装置において、
前記振動子の細胞培養膜側の端部は、ローレット加工されていてもよい。
【００２９】
本発明による細胞剥離装置において、
前記細胞培養膜から剥離される細胞が、培養又は継代に不要な不良細胞であってもよい。
【００３０】
本発明による細胞剥離装置において、
前記細胞培養膜の表面に付着した細胞が、ｉＰＳ細胞又は分化細胞であってもよい。
【００３１】
本発明による細胞剥離方法は、
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法であって、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した前記振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００３２】
本発明による細胞剥離方法は、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備えてもよい。
【００３３】
本発明による細胞剥離方法は、
振動子側枠体または細胞培養膜側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体または細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われてもよい。
【００３４】
本発明による細胞剥離方法は、
細胞培養膜側枠体を剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置するステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した振動子を超音波振動するステップは、前記細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われてもよい。
【００３５】
本発明による細胞剥離方法は、
振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われてもよい。
【００３６】
本発明の第一態様による細胞剥離方法は、
枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００３７】
本発明の第二態様による細胞剥離方法は、
枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記枠体を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００３８】
本発明の第三態様による細胞剥離方法は、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００３９】
本発明の第四態様による細胞剥離方法は、
枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００４０】
本発明の第五態様による細胞剥離方法は、
枠体を剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置するステップと、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００４１】
本発明の第六態様による細胞剥離方法は、
枠体を剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置するステップと、
振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に前記振動子を押し込むステップと、
前記枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップと、
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。
【００４２】
本発明によれば、振動子が細胞培養膜の表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える。このため、特許文献１に開示された技術では実現が難しかった、不良細胞等の所定の細胞を超音波振動によって選択的に剥離することを実現することができる。
【００４３】
本発明の第一態様、第二態様、第四態様、第五態様及び第六態様では、枠体が振動子の周りで細胞培養膜の裏面を支持した状態で、振動子が超音波振動する。このように枠体が振動子の周縁外方で細胞培養膜の裏面に当接していることから、振動子の振動に起因する細胞培養膜の振動が枠体の周縁外方に広がることを防止することができる。このため、振動子による振動の影響を対象となっている不良細胞等の所定の細胞に極力限定することができ、当該不良細胞等の所定の細胞に隣接する良好な細胞が誤って剥離されることを防止することができる。
【００４４】
本発明の第二態様、第三態様、第四態様及び第六態様では、枠体に設置された第一検知部又は振動子に設置された第二検知部により、細胞培養膜へ超音波プローブを押し付ける強さを検知する機構を備えさせている。振動子が細胞培養膜の裏面に強く押し付けられるほど、より振動が遠方まで伝播し、所定の細胞以外の細胞まで剥離してしまう恐れが高まる。第一検知部又は第二検知部により、押し付ける強さを任意に設定し得るため、振動子による振動の影響を対象となっている不良細胞等の所定の細胞に極力限定することができ、当該不良細胞等の所定の細胞に隣接する良好な細胞が誤って剥離されることを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明の実施の形態による自動培養システムの構成を示す概略上方平面図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態による自動培養システムの制御ブロック図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態による細胞検査除去部の制御ブロック図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明による細胞剥離機構に密閉容器が保持された様子を示した斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおける細胞剥離機構の断面を示した図である。
【図５】図５は、本発明の第二態様による細胞剥離装置の斜視図である。
【図６】図６は、本発明の第二態様による細胞剥離装置がフィルムの裏面に接触した際の様子を示した概略断面図である。図６における細胞剥離装置は簡略化して示されていることから、図５で示した細胞剥離装置とは形状が異なったものとなっている。
【図７Ａ】図７Ａは、図６に対応した図であり、細胞剥離装置がフィルムの裏面に接触した状態からフィルムに押し込まれていく様子を示した概略断面図である。なお、第一検知部として接触式センサを採用した場合のものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図６に対応した図であり、細胞剥離装置がフィルムの裏面に接触した状態からフィルムに押し込まれていく様子を示した概略断面図である。なお、第一検知部として接触式センサを採用した場合のものである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図６に対応した図であり、細胞剥離装置がフィルムの裏面に接触した状態からフィルムに押し込まれていく様子を示した概略断面図である。なお、第一検知部として接触式センサを採用した場合のものである。
【図８】図８は、本発明の第二態様の変形例による細胞剥離装置の斜視図である。
【図９】図９は、本発明の第五態様による細胞剥離装置がフィルムの裏面に接触した際の様子を示した概略断面図である。
【図１０】図１０は、超音波プローブの上下方向の移動距離を横軸にとり、超音波プローブの平均の出力を縦軸にとったグラフである。
【図１１】図１１は、ローレット（knurling）加工されている振動子のフィルム側の端部を示した斜視図である。
【図１２】図１２は、第一枠体の弾性率が第二枠体の弾性率よりも低い変形例による細胞剥離装置の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本実施の形態の細胞剥離装置は、付着性（接着性）を有するあらゆる細胞に対して用いることができ、（ヒト）ｉＰＳ細胞、（ヒト）ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、骨髄間質細胞（ＭＳＣ）等の軟骨細胞、樹状細胞等の様々な細胞を培養する際に用いることができる。本実施の形態では、以下、ｉＰＳ細胞を自動で培養する自動培養システムを用いて説明するが、これはあくまでも一例であることには留意が必要である。
【００４７】
[全体構成]
次に、本実施の形態による自動培養システムの装置構成について説明する。
【００４８】
図１に示すように、本実施の形態の自動培養システムは、原料細胞を保管する原料保管装置１０と、細胞等を密閉状態で収容した第一密閉容器（図示せず）を搬送する容器搬送部６０と、容器搬送部６０で搬送された第一密閉容器を受け取り、第一密閉容器からOptiCell（商標）等からなる第二密閉容器７５を取り出し、取り出した第二密閉容器７５内で細胞を培養する自動培養装置２０，３０と、を備えている。
【００４９】
本実施の形態では、上述したようにｉＰＳ細胞を用いた態様で説明することから、原料保管装置１０はｉＰＳ細胞を樹立するｉＰＳ細胞樹立装置１１を含んでいる。なお、原料保管装置１０は、他にも、ユニット恒温槽、遠心分離機、自動血球計数装置、自動磁気細胞分離器、フローサイトメーター、遺伝子導入装置等を含んでいる。
【００５０】
本実施の形態の自動培養装置２０，３０は、ｉＰＳ細胞を自動で培養する複数（図１に示した態様では４つ）のｉＰＳ細胞自動培養装置２０と、ｉＰＳ細胞から分化した分化細胞を自動で培養する複数（図１に示した態様では８つ）の分化細胞自動培養装置３０と、を有している。なお、本実施の形態において、単に「自動培養装置」と述べたときは、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０、分化細胞自動培養装置３０、又は、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０及び分化細胞自動培養装置３０の両方のことを意味している。また、特に断りが無い限り、本実施の形態において単に「細胞」と述べたときは、ｉＰＳ細胞の元となる体細胞等の原料細胞、ｉＰＳ細胞、分化細胞、又は、原料細胞、ｉＰＳ細胞及び分化細胞のいずれか２つもしくは全部のことを意味している。
【００５１】
本実施の形態では、第一密閉容器の他に、上述した第二密閉容器７５が採用されている。第一密閉容器は第二密閉容器７５を載置するための複数の棚を有しており、各棚に第二密閉容器７５が載置される。そして、複数の第二密閉容器７５が第一密閉容器内に収容された状態で、第一密閉容器が容器搬送部６０によって搬送されることとなる。なお、第二密閉容器７５は、細胞だけではなく後述する資材のうち、液体培地、薬品等を収容してもよい。
【００５２】
ｉＰＳ細胞自動培養装置２０は、図１に示すように筐体２２と、図２に示すように、ｉＰＳ細胞の培養に伴って変化する液体培地成分を分析する培地分析部２４と、ｉＰＳ細胞を検査するとともに状態の悪いｉＰＳ細胞の除去を行う細胞検査除去部２５と、液体培地やタンパク質分解酵素を含む液体等を保管するとともに供給し、ｉＰＳ細胞を播種する前の前処理を行ったり、ｉＰＳ細胞を播種したり、ｉＰＳ細胞を回収したりする液体保管供給部２６と、第二密閉容器７５を保持し、温度、湿度及びガス濃度のいずれか一つ又はこれらの全てを自動で調整するインキュベータ部２７と、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０内で用いられた使用済み液体培地、使用済み洗浄液、使用済み試薬等を含む廃液を筐体２２から下方に排出するための排出部２８と、を有している。また、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０は、機内で第二密閉容器７５等を搬送する機内搬送部２３も有している。なお、上述した液体保管供給部２６は、第二密閉容器７５の上下を反転させる機能も有している。ちなみに、本実施の形態のように第二密閉容器７５を用いる場合には、インキュベータ部２７内の湿度の管理を特に行わなくてもよくなることから、細胞培養環境の管理を簡素化することができる。また、このような第二密閉容器７５を採用することで、空気中からのコンタミネーションが起こるおそれがなく、搬送も容易となる。
【００５３】
上述した液体保管供給部２６は、液体培地を流入口から第二密閉容器７５内に適宜供給することで、第二密閉容器７５内の古い液体培地を新しい液体培地に自動で入れ替える。また、細胞検査除去部２５は、取得されたｉＰＳ細胞の情報に基づいて、第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に塗られたＥＣＭ（Extracellular matrix）から不良ｉＰＳ細胞を選択的に剥離させる。その後で、液体培地を流入口から第二密閉容器７５内に供給することで、浮遊した不良ｉＰＳ細胞が流出口を介して第二密閉容器７５から押し出される。なお、第二密閉容器７５内のｉＰＳ細胞を選択的に剥離させる手法として、本実施の形態では、フィルム７７の裏面に超音波振動を与える。
【００５４】
また、液体保管供給部２６は、タンパク質分解酵素を流入口から第二密閉容器７５内に適宜供給することで第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に塗られたＥＣＭからｉＰＳ細胞を剥離させる。その後、液体培地を流入口から第二密閉容器７５内に供給することで、浮遊したｉＰＳ細胞が流出口を介して第二密閉容器７５から押し出される。押し出されたｉＰＳ細胞は、薄めて懸濁液とした後で複数の別の第二密閉容器７５内に収容される（播種される）。このようにして、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０はｉＰＳ細胞の継代を自動で行う。
【００５５】
ｉＰＳ細胞自動培養装置２０内の温度は、インキュベータ部２７によって、例えば温度が約３７℃となるように調整される。また、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０内のガス濃度は、インキュベータ部２７によって、空気にＣＯ２を適宜加えることで調整される。また、必要に応じて、インキュベータ部２７によって湿度が約１００％となるように調整されてもよい。
【００５６】
分化細胞自動培養装置３０は、図１に示すように筐体３２と、図２に示すように、分化細胞の培養に伴って変化する液体培地成分を分析する培地分析部３４と、分化細胞を検査するとともに状態の悪い分化細胞の除去を行う細胞検査除去部３５と、液体培地やタンパク質分解酵素を含む液体等を保管するとともに供給し、分化細胞を播種する前の前処理を行ったり、分化細胞を播種したり、分化細胞を回収したりする液体保管供給部３６と、第二密閉容器７５を保持し、温度、湿度及びガス濃度のいずれか一つ又はこれらの全てを自動で調整するインキュベータ部３７と、分化細胞自動培養装置３０内で用いられた使用済み液体培地、使用済み洗浄液、使用済み試薬等を含む廃液を筐体３２から下方に排出するための排出部３８と、を有している。また、分化細胞自動培養装置３０は、機内で第二密閉容器７５等を搬送する機内搬送部３３も有している。上述したように第二密閉容器７５を用いる場合には、インキュベータ部３７内の湿度の管理を特に行わなくてもよくなることから、細胞培養環境の管理を簡素化することができる。なお、液体保管供給部３６は、第二密閉容器７５の上下を反転させる機能も有している。
【００５７】
上述した液体保管供給部３６は、液体培地を流入口から第二密閉容器７５に適宜供給することで、第二密閉容器７５内の古い液体培地を新しい液体培地に自動で入れ替える。また、細胞検査除去部３５は、取得された分化細胞の情報に基づいて、第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に塗られたＥＣＭ（Extracellular matrix）から不良分化細胞を選択的に剥離させる。その後で、液体培地を流入口から第二密閉容器７５内に供給することで、浮遊した不良分化細胞が流出口を介して第二密閉容器７５から押し出される。なお、第二密閉容器７５内の分化細胞を選択的に剥離させる手法として、本実施の形態では、フィルム７７の裏面に超音波振動を与える。
【００５８】
また、液体保管供給部３６は、タンパク質分解酵素を流入口から第二密閉容器７５内に適宜供給することで第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に塗られたＥＣＭから分化細胞を剥離させる。その後、液体培地を流入口から第二密閉容器７５内に供給することで、浮遊した分化細胞が流出口を介して第二密閉容器７５から押し出される。押し出された分化細胞は、薄めて懸濁液とした後で複数の別の第二密閉容器７５内に収容される（播種される）。このようにして、分化細胞自動培養装置３０は分化細胞の継代を自動で行う。
【００５９】
分化細胞自動培養装置３０内の温度は、インキュベータ部３７によって、例えば温度が約３７℃となるように調整される。また、分化細胞自動培養装置３０内のガス濃度は、インキュベータ部３７によって、空気にＣＯ２を適宜加えることで調整される。なお、分化細胞自動培養装置３０の液体保管供給部３６は、分化を誘導させる際に、分化誘導因子を含む液体培地を供給してもよい。また、必要に応じて、インキュベータ部３７によって湿度が約１００％となるように調整されてもよい。
【００６０】
図２に示すように、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０は、培地分析部２４、細胞検査除去部２５、液体保管供給部２６、インキュベータ部２７、排出部２８、機内搬送部２３の各々に通信接続され、これらを制御する制御部２９を有する。この制御部２９は、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０に関して、ステータスを管理したり、ログを管理したり、培養スケジュールを管理したり、ユーザインターフェース機能を果たしたりする。また、分化細胞自動培養装置３０は、培地分析部３４、細胞検査除去部３５、液体保管供給部３６、インキュベータ部３７、排出部３８、機内搬送部３３の各々に通信接続され、これらを制御する制御部３９を有する。この制御部３９は、分化細胞自動培養装置３０に関して、ステータスを管理したり、ログを管理したり、培養スケジュールを管理したり、ユーザインターフェース機能を果たしたりする。
【００６１】
なお、上述したｉＰＳ細胞樹立装置１１も、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０及び分化細胞自動培養装置３０と同様の構成となっている。つまり、ｉＰＳ細胞樹立装置１１は、図１に示すように筐体１１ａと、図２に示すように、液体培地を分析する培地分析部１４と、原料細胞を検査するとともに状態の悪い原料細胞の除去を行う細胞検査除去部１５と、液体培地やタンパク質分解酵素を含む液体等を保管するとともに供給する液体保管供給部１６と、筐体１１ａ内の温度、湿度及びガス濃度のいずれか一つ又はこれらの全てを自動で調整するインキュベータ部１７と、ｉＰＳ細胞樹立装置１１内で用いられた使用済み液体培地、使用済み洗浄液、使用済み試薬等を含む廃液を筐体１１ａから下方に排出するための排出部１８と、を有している。また、ｉＰＳ細胞樹立装置１１は、機内で第二密閉容器７５等を搬送する機内搬送部１３も有している。また、ｉＰＳ細胞樹立装置１１は、培地分析部１４、細胞検査除去部１５、液体保管供給部１６、インキュベータ部１７、排出部１８、機内搬送部１３の各々に通信接続され、これらを制御する制御部１９を有する。なお、各制御部１９，２９，３９は、例えばパソコン等の外部装置９０に接続されている。
【００６２】
本実施の形態の容器搬送部６０は、第一密閉容器を下方にぶら下げるようにして保持する保持部を有し、天井に設けられたレール６５に沿って移動するようになっている。
【００６３】
図１に示すように、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０は、第一密閉容器から第二密閉容器７５を搬入するための搬入部２１を有している。この搬入部２１は、第二密閉容器７５に収容されたｉＰＳ細胞を搬入するとともに培養されたｉＰＳ細胞を搬出するための細胞用搬入出部（図示せず）と、第二密閉容器７５に収容された資材を搬入するための資材用搬入部（図示せず）と、を有していてもよい。同様に、図１に示すように、分化細胞自動培養装置３０は、第一密閉容器から第二密閉容器７５を搬入するための搬入部３１を有している。この搬入部３１も、第二密閉容器７５に収容されたｉＰＳ細胞を搬入するとともに培養された分化細胞を搬出するための細胞用搬入出部（図示せず）と、第二密閉容器７５に収容された資材を搬入するための資材用搬入部（図示せず）と、を有していてもよい。本実施の形態において資材とは、液体培地、試薬、洗浄液、培養プレート、バイアル、フィルター、針等である。また、図１に示すように、ｉＰＳ細胞樹立装置１１も、第一密閉容器を搬入するための搬入部１２を有している。
【００６４】
本実施の形態の自動培養システムは、図１に示すように、第一密閉容器内を殺菌するための殺菌装置１と、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０で培養されたｉＰＳ細胞を所定のタイミングで搬入部８１から受け取り、ｉＰＳ細胞を検査するｉＰＳ細胞分析装置８０と、分化細胞自動培養装置３０で培養された分化細胞を所定のタイミングで搬入部８６から受け取り、分化細胞を検査する分化細胞分析装置８５と、自動培養装置２０，３０で培養されたｉＰＳ細胞、分化細胞、又は、ｉＰＳ細胞及び分化細胞の両方を搬入部４１から受け取り冷凍保存する冷凍保存装置４０と、を備えている。なお、冷凍保存装置４０は複数個設けられていてもよいし、部屋全体が冷やされており部屋自体が冷凍庫として機能してもよい。そして、部屋に冷凍保存装置４０が複数個設けられている場合や部屋自体が冷凍庫として機能するような場合には、当該部屋の天井にレール６５が設けられ、このレール６５に沿って容器搬送部６０が移動できるようになってもよい。
【００６５】
上述した殺菌装置１の一例としては、第一密閉容器内に過酸化水素ガスや高温ガス等の殺菌ガスを供給することで殺菌するものを挙げることができる。また、殺菌装置１の別の例としては、第一密閉容器を閉状態としたまま外部から例えばγ線や紫外線を照射することで第一密閉容器内を殺菌するものも挙げることができる。ちなみに、外部から第一密閉容器が搬入される前に、第一密閉容器の内部が例えばγ線や紫外線を用いて殺菌されてもよい。なお、液体培地等はγ線や紫外線で破損してしまうタンパク質等を含有している場合がある。この場合は、過酸化水素ガスや高温ガス等の殺菌ガスで殺菌することが望ましい。
【００６６】
[細胞検査除去部２５，３５]
本実施の形態のｉＰＳ細胞自動培養装置２０及び分化細胞自動培養装置３０で用いられる細胞検査除去部２５，３５は同じ装置構成となっている。このため、以下では、ｉＰＳ細胞及び分化細胞を総称して「細胞」と呼び、ｉＰＳ細胞自動培養装置２０で用いられる細胞検査除去部２５及び分化細胞自動培養装置３０で用いられる細胞検査除去部３５についてまとめて説明する。
【００６７】
図３に示すように、本実施の形態の細胞検査除去部２５，３５は、細胞のコロニーを撮影し、細胞のコロニーの状況に基づいて良否を判断する細胞検査部１２０と、細胞検査部１２０で検出された不良細胞を剥離する細胞除去部１３０と、を備えている。
【００６８】
図３に示すように、細胞検査部１２０は、細胞のコロニーを観察するための位相差顕微鏡等の光学顕微鏡１２１と、当該光学顕微鏡１２１によって得られた画像に基づいて細胞のコロニーの位置を認識するとともに各コロニーの良否を自動で判断する判断部１２２と、不良細胞のコロニーが存在する場合にはその位置等の判断部１２２による判断結果を記憶する検査記憶部１２３と、保持した第二密閉容器７５を水平方向で自在に移動させるＸＹステージ１２４と、を有している。なお、細胞のコロニーの良否については、例えばｉＰＳ細胞の核染色像から得られた核染色パターンやｉＰＳ細胞の密度等に基づいて判断することができる。
【００６９】
図４Ａ及び図４Ｂに示すように、細胞除去部１３０は、第二密閉容器７５を保持する容器保持部１３１（１３１ａ，１３１ｂ，１３１ｃ，１３１ｄ）と、容器保持部１３１を水平方向で自在に移動させるＸＹステージ１３２と、容器保持部１３１及びＸＹステージ１３２の下方に載置され、容器保持部１３１によって保持された第二密閉容器７５のフィルム７７に裏面側から超音波振動を与えることで、第二密閉容器７５のフィルム７７の表面側に付着した細胞のコロニーを剥離させる細胞剥離装置１４０と、細胞剥離装置１４０を上下方向に移動させる昇降部１３４（図３参照）と、を有している。なお、この昇降部１３４は、後述する超音波プローブ１４１と後述する枠体１４２とをフィルム７７の裏面に対し同時に垂直に駆動させる１つの部材であってもよいが、超音波プローブ１４１と枠体１４２とをフィルム７７の裏面に対し個別に垂直に駆動させる２つの部材であってもよい。
【００７０】
図４Ａ及び図４Ｂに示すように、容器保持部１３１は、第二密閉容器７５の角を受け、ガイドとしての機能を果たす断面が略Ｌ字形状となった複数（図４Ａに示す態様では４つ）の受け部１３１ａと、水平方向で第二密閉容器７５を押圧する押圧部１３１ｂと、第二密閉容器７５の上方への浮き上がりを防止する浮き上がり防止部１３１ｃと、水平方向で第二密閉容器７５を押圧しつつ第二密閉容器７５の上方への浮き上がりを防止する押圧浮き上がり防止部１３１ｄと、を有している。なお、本実施の形態では、押圧部１３１ｂが、略矩形状の第二密閉容器７５の長辺側に位置しており、第二密閉容器７５の長辺を水平方向で押すようになっている。また、浮き上がり防止部１３１ｃが、第二密閉容器７５の短辺側（図４Ａ及び図４Ｂの右側）に位置しており、第二密閉容器７５の短辺の浮き上がりを防止するようになっている。また、押圧浮き上がり防止部１３１ｄが、第二密閉容器７５の短辺側（図４Ａ及び図４Ｂの左側）に位置しており、第二密閉容器７５の短辺の浮き上がりを防止しつつ第二密閉容器７５の短辺を水平方向で押すようになっている。
【００７１】
図５及び図６に示すように、本実施の形態の細胞剥離装置１４０は、上下方向（所定方向）で超音波振動する振動子１４１ａを有する超音波プローブ１４１と、超音波プローブ１４１を取り囲んで配置された枠体１４２（特許請求の範囲の「振動子側枠体」に対応する。）と、枠体１４２に加わった上下方向（所定方向）の力を検知する第一検知部１４３と、を有している。フィルム７７に枠体１４２が接触していないときには、振動子１４１ａのフィルム７７側の端部（本実施の形態では振動子１４１ａの上端）は枠体１４２の内方に収容されているが（図７Ａ参照）、フィルム７７に枠体１４２を押しつけることで振動子１４１ａのフィルム７７側の端部（本実施の形態では振動子１４１ａの上端）が枠体１４２の上方に突出する（図７Ｃ参照）。
【００７２】
図５に示すように本実施の形態の枠体１４２は上下方向で振動する振動子１４１ａを取り囲むように配置されており、容器保持部１３１が第二密閉容器７５を保持した状態で昇降部１３４により超音波プローブ１４１を上方に移動させると、枠体１４２がフィルム７７の裏面に当接することとなる（図７Ａ−図７Ｃ参照）。また、枠体１４２は、その先端がフィルム７７の裏面に当接される上下方向延在部１４２ａと、上下方向延在部１４２ａの下端から水平方向に延びた水平方向延在部１４２ｂと、を有している。本実施の形態では、水平方向延在部１４２ｂの下方に、超音波プローブ１４１の周縁を保持する、略矩形形状のプローブ保持部１３９が設けられている。そして、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂとプローブ保持部１３９との間にバネ等からなる複数（本実施の形態では４つ）の弾性部材１４５が設けられており、枠体１４２がフィルム７７に当接することで下方に移動したときには、当該弾性部材１４５によって枠体１４２に対して上方に向かって付勢力が働くようになっている。なお、図５では３つの弾性部材１４５しか示されていないが、枠体１４２の裏に１つの弾性部材１４５が設けられている。
【００７３】
また、プローブ保持部１３９に上述した第一検知部１４３が設けられており、この第一検知部１４３は枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下方に位置している。このため、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合には、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面と接触式センサの上端とが接触可能となり、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面に接触式センサの上端が接触した時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。また、第一検知部１４３として近接式センサを採用した場合には、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面と接触式センサの上端との間の距離を測定することができ、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面と近接式センサの上端との間が所定の距離となった時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。つまり、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合には、接触式センサの上端が枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面に当接した時点でフィルム７７の裏面から枠体１４２に所定の大きさの力が加わったと判断され、第一検知部１４３として近接式センサを採用した場合には、近接式センサの上端と枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面との間が所定の距離となった時点でフィルム７７の裏面から枠体１４２に所定の大きさの力が加わったと判断される。また、第一検知部１４３として力センサを採用した場合には、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面から力センサの上端に加わった力を測定することができ、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面から力センサの上端に加わった力が所定の大きさとなった時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。つまり、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合には、接触式センサの上端が枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面に当接した時点でフィルム７７の裏面から枠体１４２に所定の大きさの力が加わったと判断され、第一検知部１４３として近接式センサを採用した場合には、近接式センサの上端と枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面との間が所定の距離となった時点でフィルム７７の裏面から枠体１４２に所定の大きさの力が加わったと判断され、第一検知部１４３として力センサを採用した場合には、力センサの上端に枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面から所定の大きさの力が加わった時点でフィルム７７の裏面から枠体１４２に所定の大きさの力が加わったと判断される。ちなみに、図７Ａ−図７Ｃに示した態様は、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合のものである。ところで、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合であっても、必ずしも接触式センサの上端が枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面に当接した時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇を停止させる必要はなく、接触式センサの上端が枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの裏面に当接した箇所から所定量、超音波プローブ１４１を上方に押し込んでから超音波プローブ１４１の上昇を停止するようにしてもよい。
【００７４】
図５に示すように本実施の形態の枠体１４２の上端の横断面は矩形状となっているが、これに限られることはなく様々な形状を採用することができ、一例としては円形状とすることもできるし、矩形の角に位置する４つのピンが上方に突出しており当該ピンがフィルム７７の裏面に当接する態様にすることもできる。ちなみに、図５のように上端の横断面が矩形状となった枠体１４２を採用することで、振動子１４１ａの振動に起因するフィルム７７の振動が枠体１４２の周縁外方に広がることを効果的に防止することを期待できる。なお、枠体１４２の材料の一例としてはポリアセタール（ＰＯＭ）、硬質のプラスチック、ゴム等を挙げることができる。ところで、一例を挙げるとすれば、振動子１４１ａの先端の断面は直径が２ｍｍ程度の円形状となっており、枠体１４２の先端の断面は一辺が３ｍｍ〜４ｍｍ程度の正方形となっている。
【００７５】
また、枠体１４２を二つ以上の部位から形成してもよく、例えば図８に示すように、枠体１４２が、フィルム７７の裏面に当接する第一枠体１４２ａ１と、第一枠体１４２ａ１の下方側（基端側、第一検知部１４３側）に位置する第二枠体１４２ａ２とを有してもよい。
【００７６】
本実施の形態の枠体１４２は、フィルム７７の裏面から枠体１４２に加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれる。そして、このようにフィルム７７の裏面から枠体１４２に加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれた後で、超音波プローブ１４１がさらに上昇し、振動子１４１ａの上端がフィルム７７の裏面の一部に選択的に所定の力で当接され、上下方向で超音波振動されて、不良細胞のコロニーがフィルム７７の表面から剥離される。
【００７７】
なお、上記では本発明による第一態様及び第二態様を例に取って説明したが、これに限られることはなく、超音波プローブ１４１に加わったフィルム７７の裏面からの力又は振動子１４１ａとフィルム７７の裏面との間の距離を検知するための第二検知部１６３（図９参照）が設けられ、振動子１４１ａが第二検知部１６３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後、フィルム７７の裏面に当接した振動子１４１ａが超音波振動する態様（第三態様）を採用することもできる。また、第三態様において枠体１４２も採用し、振動子１４１ａが第二検知部１６３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後、フィルム７７の裏面に枠体１４２が当接した状態で、フィルム７７の裏面に当接した振動子１４１ａが超音波振動する態様（第四態様）を採用することもできる。
図８に示すように枠体１４２が第一枠体１４２ａ１及び第二枠体１４２ａ２を有する態様を採用した場合、第一枠体１４２ａ１の弾性率は第二枠体１４２ａ２の弾性率よりも低くなっていてもよい。具体的には、例えば、第一枠体１４２ａ１は弾性体（ゴム材等）から形成され、第二枠体１４２ａ２は硬質のプラスチックから形成され得る。このような態様では、枠体１４２がフィルム７７に当接する際に、第一枠体１４２ａ１がフィルム７７と第二枠体１４２ａ２との間に挟まれることで収縮され、第一枠体１４２ａ１の復元力によりフィルム７７の裏面に枠体１４２が当接した状態が確実に維持され得る。すなわち、第一枠体１４２ａ１が弾性部材１４５と同様の機能を果たし得る。従って、このような態様では、図１２に示すように、枠体１４２とプローブ保持部１３９との間から弾性部材１４５が省略され、枠体１４２とプローブ保持部１３９とが一体化（固定して連結）されてもよい。
【００７８】
また、第二検知部１６３の代わりに又は第一検知部１４３に加えて、超音波プローブ１４１の出力を検知する第三検知部１８３が設けられていてもよい（図６参照）。このように第三検知部１８３で超音波プローブ１４１の出力をモニターしながら、超音波プローブ１４１をフィルム７７の裏面に押し付けていくことで、超音波プローブ１４１のフィルム７７に対する押し付け距離を測定し、制御することができる。このような第三検知部１８３を採用した場合には、第一検知部１４３や第二検知部１６３等の他の検知部を用いることなく、超音波プローブ１４１のフィルム７７に対する押し付け距離を制御することができ、ひいては、フィルム７７から剥離される細胞の範囲を制御することができる。なお、振動子１４１ａが連続的に振動されながら超音波プローブ１４１が上方に移動されてもよいが、超音波プローブ１４１の出力を検知するときにだけ振動子１４１ａが振動され、それ以外の例えば超音波プローブ１４１を上方に移動させる際には振動子１４１ａは振動されていなくてもよい。
【００７９】
ちなみに、出力を一定にして超音波プローブ１４１をフィルム７７に押し付けた際、その押し付け距離に応じてフィルム７７から剥離される細胞の範囲が変化する。具体的には、押し付け距離が大きければ大きいほど、フィルム７７から剥離される細胞の範囲が広範囲となる。また、超音波プローブ１４１をフィルム７７に押し付けた際、その押し付け距離に応じて超音波プローブ１４１の出力も変化する（図１０参照）。具体的には、押し付け距離が大きければ大きいほど、超音波プローブ１４１の出力も大きくなる。このため、第三検知部１８３で超音波プローブ１４１の出力をモニターしながら超音波プローブ１４１をフィルム７７の裏面に押し付けていくことで、フィルム７７から剥離される細胞の範囲を制御することができる。なお、第三検知部１８３は、超音波プローブ１４１の先端がフィルム７７の裏面に接触することで変化する超音波プローブ１４１からの入射又は反射エネルギーを検知するようになっている。超音波プローブ１４１で消費されるエネルギーを処理時間（例えば５秒）で割った値を平均の出力としたときに、図１０は、超音波プローブ１４１の上下方向の移動距離を横軸にとり、超音波プローブ１４１の平均の出力を縦軸にとったグラフである。図１０のグラフでは３つ目のプロットと４つ目のプロットとの間でフィルム７７の裏面に超音波プローブ１４１の先端が接触した態様となっている。図１０に示すように、フィルム７７の裏面に超音波プローブ１４１の先端が接触する前では平均の出力はほぼ一定であるが、フィルム７７の裏面に超音波プローブ１４１の先端が接触した後では、超音波プローブ１４１を上方に移動させるにつれて平均の出力が大きくなっている。このように第三検知部１８３は超音波プローブ１４１の出力をモニターすることで、第二検知部と同様に、振動子１４１ａに加わったフィルム７７の裏面からの力あるいは振動子１４１ａとフィルム７７の裏面との接触を検知することができる。
【００８０】
《方法》
細胞検査除去部２５，３５によってフィルム７７の表面側に付着した培養又は継代に不要な不良細胞のコロニーを剥離させる際には、以下のような工程を経ることとなる。
【００８１】
インキュベータ部２７，３７で保持されていた第二密閉容器７５が、装置（ｉＰＳ細胞自動培養装置２０又は分化細胞自動培養装置３０）内の機内搬送部２３，３３によって、細胞検査部１２０に搬送される。
【００８２】
そして、細胞検査部１２０の光学顕微鏡１２１（図３参照）によって、フィルム７７の表面側に形成された細胞のコロニーが観察される。そして、当該光学顕微鏡１２１によって得られた画像に基づいて細胞のコロニーの位置を認識するとともに各コロニーの良否が判断部１２２によって判断される。そして、不良細胞のコロニーが存在する場合にはその位置等が検査記憶部１２３に記憶される。
【００８３】
不良細胞が存在する第二密閉容器７５は、装置（ｉＰＳ細胞自動培養装置２０又は分化細胞自動培養装置３０）内の機内搬送部２３，３３によって、細胞除去部１３０の容器保持部１３１まで搬送される（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。このように容器保持部１３１まで搬送された第二密閉容器７５は、４つの受け部１３１ａの内方に位置づけられる。その後、浮き上がり防止部１３１ｃが第二密閉容器７５の１つの短辺の上面を覆い、押圧浮き上がり防止部１３１ｄが第二密閉容器７５の別の短辺側の上面を覆うとともに水平方向で第二密閉容器７５の短辺側の側面を押圧し、押圧部１３１ｂが第二密閉容器７５の長辺側の側面を押圧する。この際、第二密閉容器７５は、そのフィルム７７が容器本体の下方にくるように位置づけられている。
【００８４】
次に、ＸＹステージ１３２によって第二密閉容器７５が移動されることで、取り除かれるべき不良細胞のコロニーが存在する箇所が超音波プローブ１４１の振動子１４１ａの上方に位置づけられる。
【００８５】
このように第二密閉容器７５が位置づけられると、昇降部１３４によって超音波プローブ１４１が上昇される。このように超音波プローブ１４１が上昇されると、まず、枠体１４２の上下方向延在部１４２ａの上端がフィルム７７の裏面に押し込まれる（図７Ａ参照）。さらに超音波プローブ１４１を上昇させることによって、弾性部材１４５がフィルム７７からの力を受けて縮み、超音波プローブ１４１に対して枠体１４２が相対的に下方に移動し、超音波プローブ１４１の振動子１４１ａの上端と枠体１４２の上端とが同一平面上に位置する（図７Ｂ参照）。さらに超音波プローブ１４１を上昇させることによって、超音波プローブ１４１の振動子１４１ａの上端が枠体１４２の上端の上方まで位置し（図７Ｃ参照）、第一検知部１４３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から枠体１４２及び振動子１４１ａの上端に加わる力が所定の大きさになったと判断されることで昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。その後、振動子１４１ａが上下方向で超音波振動することによって、第二密閉容器７５のフィルム７７に裏面側から超音波振動が加えられ、対象となっている不良細胞（ｉＰＳ細胞又は分化細胞）が容器本体側の表面から剥離される。
【００８６】
なお、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合には、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面と接触式センサの上端とが接触した時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。他方、第一検知部１４３として近接式センサを採用した場合には、枠体１４２の水平方向延在部１４２ｂの下面と近接式センサの上端との間が所定の距離となった時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇が停止される。
【００８７】
対象となっている第二密閉容器７５に関して複数の不良細胞のコロニーが存在する場合には、対象となっている不良細胞のコロニーがフィルム７７の表面から剥離された後で、ＸＹステージ１３２によって第二密閉容器７５が水平方向に移動され、取り除かれるべき次の不良細胞のコロニーが存在する箇所が振動子１４１ａの上方に位置づけられる。そして、当該不良細胞のコロニーが上述したのと同様の手法によってフィルム７７の表面から剥離される。そして、当該第二密閉容器７５に関して、取り除かれるべき不良細胞のコロニーが全てフィルム７７の表面から剥離されるまで、上述した工程が繰り返して行われる。
【００８８】
以上のようにして不良細胞の全てのコロニーが第二密閉容器７５のフィルム７７の表面から剥離されると、装置（ｉＰＳ細胞自動培養装置２０又は分化細胞自動培養装置３０）内の機内搬送部２３，３３によって、第二密閉容器７５が液体保管供給部２６，３６に運ばれる。その後で、液体培地が流入口から第二密閉容器７５内に供給されることで、剥離され浮遊した不良細胞が流出口を介して第二密閉容器７５から押し出されて、排出部２８，３８から排出される。なお、このように液体培地を交換するタイミングは、細胞検査除去部２５，３５にて細胞除去を行った直後であってもよいし、ある程度時間が経過した後であってもよい。
【００８９】
《効果》
次に、上述した構成からなる第一態様、第二態様、第三態様及び第四態様によって達成される効果であって、まだ述べていない効果又はとりわけ重要な効果について説明する。
【００９０】
第一態様、第二態様、第三態様及び第四態様によれば、振動子１４１ａが第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える（図７Ｃ参照）。このため、特許文献１に開示された技術では実現が難しかった、不良細胞等の所定の細胞のコロニーを超音波振動によって選択的に剥離することを実現することができる。
【００９１】
また、第二態様によれば、上下方向で超音波振動する振動子１４１ａが枠体１４２で取り囲まれ、振動子１４１ａを備える超音波プローブ１４１と枠体１４２は昇降部１３４により上昇し、それらの上端がフィルム７７の裏面に当接する。この際、枠体１４２に加わった上下方向の力が第一検知部１４３によって検知される。そして、枠体１４２が第一検知部１４３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から枠体１４２に加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後で、フィルム７７の裏面に枠体１４２の上端が当接した状態で振動子１４１ａの上端がフィルム７７の裏面に所定の力で当接する。そして、その後で、振動子１４１ａが超音波振動する。このため、第二密閉容器７５のフィルム７７を適切な強さの力で裏面側から枠体１４２によって押圧しつつ、当該フィルム７７の所定箇所に対して振動子１４１ａによって超音波振動を与えることができる。この結果、振動子１４１ａが強く押し当てられすぎて振動子１４１ａがフィルム７７を貫通してしまったり、フィルム７７への当接が不十分であるために振動子１４１ａから加わる振動が不均一となることで細胞のコロニーの剥離状況が不均一になることを防止したりすることができる。
【００９２】
第一態様、第二態様及び第四態様によれば振動子１４１ａの周りに枠体１４２が設けられている。そして、枠体１４２が振動子１４１ａの上端を取り囲んでおり、振動子１４１ａの上端の周りで第二密閉容器７５のフィルム７７の裏面を支持することができる。このため、振動子１４１ａのみでフィルム７７の裏面を支持する場合と比較してフィルム７７の裏面に加わる圧力を小さくすることができる。また、第二態様では、単に枠体１４２が振動子１４１ａの上端を取り囲んでいるだけでなく、枠体１４２が第一検知部１４３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から枠体１４２に加わる力を所定の大きさに留めることもできる。このため、振動子１４１ａ又は枠体１４２が強く押し当てられすぎて振動子１４１ａがフィルム７７を貫通することを防止することができる。また、第二態様では、フィルム７７の裏面から枠体１４２に加わる力を所定の大きさとしたうえで、振動子１４１ａがフィルム７７の裏面に当接して超音波振動する。このため、細胞のコロニーを剥離する際に、ほぼ均一の力で撓んだフィルム７７の裏面を枠体１４２の上端及び振動子１４１ａの上端で支持したうえで、当該フィルム７７の裏面に対して振動子１４１ａから振動を与えることができる。この結果、下方に撓むフィルム７７を枠体１４２により所定の力で支持したうえで、振動子１４１ａの上端がフィルム７７の裏面に所定の大きさの力で当接した状態とした後で、当該フィルム７７の裏面に超音波振動を与えることができ、ひいては、振動子１４１ａから加わる振動を均一なものとして、各回における細胞のコロニーの剥離状況を均一なものにすることができる。
【００９３】
また、第一態様、第二態様及び第四態様では、枠体１４２が振動子１４１ａの上端の周りで第二密閉容器７５のフィルム７７の裏面を支持した状態で、振動子１４１ａが超音波振動する。このように枠体１４２の上端が振動子１４１ａの周縁外方でフィルム７７の裏面に当接していることから、振動子１４１ａの振動に起因するフィルム７７の振動が枠体１４２の周縁外方に広がることを防止することができる。このため、振動子１４１ａによる振動の影響を対象となっている不良細胞のコロニーに極力限定することができ、当該不良細胞のコロニーに隣接する良好な細胞のコロニーが誤って剥離されることを防止することができる。
【００９４】
また、図７Ａ−図７Ｃに示す態様では、フィルム７７に枠体１４２が接触していないときには、振動子１４１ａの上端は枠体１４２の内方に収容されているが（図７Ａ参照）、フィルム７７に枠体１４２を押しつけることで振動子１４１ａの上端が枠体１４２の上方に突出するようになっている（図７Ｃ参照）。このため、フィルム７７の裏面にまず断面積の大きな枠体１４２の上端を当接させた後で断面積の小さな振動子１４１ａの上端を当接させることができ、フィルム７７に局所的に力が加わり過ぎて、フィルム７７が破れてしまうことを防止することができる。
【００９５】
また、第一検知部１４３として接触式センサを採用した場合には、水平方向延在部１４２ｂの下面と接触式センサの上端とが接触した時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇を停止し、また、第一検知部１４３として近接式センサを採用した場合には、水平方向延在部１４２ｂの下面と近接式センサの上端との間が所定の距離となった時点で昇降部１３４による超音波プローブ１４１の上昇を停止することができる。このため、水平方向延在部１４２ｂとプローブ保持部１３９との間の上下方向の距離を常に一定にした状態で超音波プローブ１４１の上昇を停止させることができ、ひいては、枠体１４２の上端から飛び出す振動子１４１ａの位置を常に一定のものとしたうえで、振動子１４１ａを超音波振動させることができる。つまり、振動子１４１ａが静止している状態において、フィルム７７と枠体１４２間にかかる力及びフィルム７７と振動子１４１ａ間にかかる力を常に一定とすることができる。このため、各回における第二密閉容器７５のフィルム７７の振動子１４１ａ及び枠体１４２に対する撓み具合を同様のものとすることでき、不良細胞を含むコロニーの剥離状況を各回において均一なものにすることができる。
【００９６】
なお、上述した第三検知部１８３（図６参照）を採用した場合には、第三検知部１８３で超音波プローブ１４１の出力をモニターしながら、超音波プローブ１４１をフィルム７７の裏面に押し付けていくことで、超音波プローブ１４１のフィルム７７に対する押し付け距離を測定し、制御することができ、ひいては、フィルム７７から剥離される細胞の範囲を制御することができる。
【００９７】
また、枠体１４２が、硬質のプラスチック、ゴム等から形成され、高い弾性率となっている場合には、弾性率の高い材料で振動子１４１ａの振動に起因するフィルム７７の振動の広がりを防止することができる。このため、振動子１４１ａによる振動の影響を対象となっている不良細胞のコロニーに、より確実に限定することができ、当該不良細胞のコロニーに隣接する良好な細胞のコロニーが誤って剥離されることをより確実に防止することができる。なお、図８に示すように枠体１４２が第一枠体１４２ａ１及び第二枠体１４２ａ２を有する態様を採用した場合であって、第一枠体１４２ａ１が硬質のプラスチック、ゴム等から形成され、第一枠体１４２ａ１の弾性率が高くなっている場合にも同様の効果を奏することができる。
【００９８】
また、図５に示す態様では、４つの弾性部材１４５が均等な間隔で配置されていることから、フィルム７７の裏面に当接した枠体１４２が偏った方向で傾くことなく、撓んだフィルム７７の法線方向に極力沿った方向でフィルム７７の裏面を押圧することができる。このため、各回における第二密閉容器７５のフィルム７７の振動子１４１ａ及び枠体１４２に対する撓み具合を同様のものとすることでき、ひいては、不良細胞を含むコロニーの剥離状況を各回において均一なものにすることができる。
【００９９】
第五態様及び第六態様は、フィルム７７の裏面に振動子１４１ａを当接させた際に当該振動子１４１ａの周縁方向外方でフィルム７７の裏面に当接する枠体１５０を採用したものである。枠体１５０は、フィルム７７の裏面において剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置されている。この枠体１５０は、容器保持部１３１で第二密閉容器７５を保持する際に、第二密閉容器７５の下方に載置されて、容器保持部１３１によって第二密閉容器７５と一緒に保持されてもよいし、あらかじめ各第二密閉容器７５に接着されていてもよい。
【０１００】
また、第五態様及び第六態様では、枠体に加わったフィルム７７の裏面からの力又は枠体とフィルム７７の裏面との間の距離を検知するための第一検知部１４３の代わりに、振動子１４１ａに加わったフィルム７７の裏面からの力又は振動子１４１ａとフィルム７７の裏面との間の距離を検知するための第二検知部１６３が設けられていてもよい（図９参照）。そして、振動子１４１ａは第二検知部１６３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後、フィルム７７の裏面に枠体１５０が当接した状態で振動子１４１ａが超音波振動することとなる。
【０１０１】
第五態様及び第六態様では、容器保持部１３１がこれら第二密閉容器７５及び枠体１５０を保持することで、枠体１５０がフィルム７７の裏面に当接される。次いで、枠体１５０に設けられた隙間を介して振動子１４１ａをフィルム７７の裏面に押し込む。この際、第二検知部１６３による検知結果に基づいて、フィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力が所定の大きさになるまで振動子１４１ａをフィルム７７の裏面に押し込む。次いで、枠体１５０をフィルム７７の裏面に当接した状態でフィルム７７の裏面に当接した振動子１４１ａを超音波振動する。この際、振動子１４１ａはフィルム７７の表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与えることとなる。
【０１０２】
第五態様及び第六態様において、その他の構成は、第二態様と略同一の態様となっている。第五態様及び第六態様において、第二態様と同一部分には同一符号を付して詳細な説明は省略する。
【０１０３】
第五態様及び第六態様では、第一態様、第二態様、第三態様及び第四態様で述べた効果と同様の効果を奏することができる。以下では、第五態様及び第六態様で達成される主な効果について説明する。
【０１０４】
第五態様及び第六態様によれば、振動子１４１ａが第二密閉容器７５のフィルム７７の表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与える（図７Ｃ参照）。このため、特許文献１に開示された技術では実現が難しかった、不良細胞等の所定の細胞のコロニーを超音波振動によって領域選択的に剥離することを実現することができる。
【０１０５】
また、第六態様によれば、上下方向で超音波振動する振動子１４１ａが枠体１５０の枠体ユニット１５１ａ，１５１ｂで取り囲まれ、振動子１４１ａを備える超音波プローブ１４１は昇降部１３４により上昇し、その上端がフィルム７７の裏面に当接する。この際、振動子１４１ａに加わった上下方向の力が第二検知部１６３によって検知される。そして、振動子１４１ａが第二検知部１６３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力が所定の大きさになるまで押し込まれ、その後で、フィルム７７の裏面に枠体１５０が当接した状態で振動子１４１ａの上端がフィルム７７の裏面に所定の力で当接した状態で超音波振動する。このため、第二密閉容器７５のフィルム７７を適切な強さの力で裏面側から振動子１４１ａによって押圧した後で、当該フィルム７７の所定箇所に対して振動子１４１ａによって超音波振動を与えることができる。この結果、振動子１４１ａが強く押し当てられすぎて振動子１４１ａがフィルム７７を貫通してしまったり、フィルム７７への当接が不十分であるために振動子１４１ａから加わる振動が不均一となることで細胞のコロニーの剥離状況が不均一になることを防止したりすることができる。
【０１０６】
この点について説明する。第六態様によれば振動子１４１ａの周りに枠体１５０の枠体ユニット１５１ａ，１５１ｂが載置されることとなる。そして、枠体１５０の枠体ユニット１５１ａ，１５１ｂが振動子１４１ａの上端を取り囲んでおり、振動子１４１ａの上端の周りで第二密閉容器７５のフィルム７７の裏面を支持することができる。このため、振動子１４１ａのみでフィルム７７の裏面を支持する場合と比較してフィルム７７の裏面に加わる圧力を小さくすることができる。また、第六態様では、第二検知部１６３による検知結果に基づいてフィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力を所定の大きさに留めることもできる。これらのことから、振動子１４１ａが強く押し当てられすぎて振動子１４１ａがフィルム７７を貫通することを防止することができる。また、第六態様では、フィルム７７の裏面から振動子１４１ａに加わる力を所定の大きさとした後で、振動子１４１ａがフィルム７７の裏面に当接して超音波振動する。このため、細胞のコロニーを剥離する際の各回において、ほぼ均一の力でフィルム７７の裏面に対して振動子１４１ａから振動を与えることができる。この結果、振動子１４１ａの上端がフィルム７７の裏面に所定の大きさの力で当接した状態とした後で、当該フィルム７７の裏面に超音波振動を与えることができ、ひいては、振動子１４１ａから加わる振動を均一なものとして、各回における細胞のコロニーの剥離状況を均一なものにすることができる。
【０１０７】
また、第五態様及び第六態様では、枠体１５０が振動子１４１ａの上端の周りで第二密閉容器７５のフィルム７７の裏面を支持した状態で、振動子１４１ａが超音波振動する。このように枠体１４２の上端が振動子１４１ａの周縁外方でフィルム７７の裏面に当接していることから、振動子１４１ａの振動に起因するフィルム７７の振動が枠体１４２の周縁外方に広がることを防止することができる。このため、振動子１４１ａによる振動の影響を対象となっている不良細胞のコロニーに極力限定することができ、当該不良細胞のコロニーに隣接する良好な細胞のコロニーが誤って剥離されることを防止することができる。
【０１０８】
なお、上述した各態様において、第二密閉容器７５のフィルム７７は、熱硬化性樹脂材料、とくに熱硬化性ゴム（たとえば、シリコーンゴム）から形成されていることが好ましい。フィルム７７が熱可塑性樹脂材料（たとえば、ポリスチレンフィルム）から形成されている場合、領域選択性が悪く、振動子１４１ａの当接領域だけでなく周囲の良好な細胞のコロニーも剥離されるおそれがある。また、振動子１４１ａの発振時間が長すぎたり、押し付けが強すぎたりすると、摩擦熱によりフィルム７７が溶けて穴が空き、液漏れが発生するおそれがある。一方、フィルム７７が熱硬化性材料、とくに熱硬化性ゴム（たとえば、シリコーンゴム）から形成されている場合、領域選択性が向上するとともに、摩擦熱によりフィルム７７が溶けて穴が空くことは無い。
【０１０９】
図１１に示すように、振動子１４１ａのフィルム７７側の端部は、ローレット（knurling）加工されていることが好ましい。振動子１４１ａのフィルム７７側の端部が平面状に形成されている場合、端部の中央部の超音波振動エネルギーが外周部に比べて強くなる。一方、振動子１４１ａのフィルム７７側の端部がローレット加工されている場合、端部の中央部に超音波振動エネルギーが集中することが抑えられ、端部における超音波振動エネルギーの分布が均一となる。これにより、フィルム７７の裏面に振動子１４１ａが当接される際に、超音波振動エネルギーが当接範囲の一部に過剰に供給されることを抑えることができ、フィルム７７が破れるリスクをさらに軽減することができる。
【０１１０】
本件発明者が、０．０５ｍｍ厚のシリコーンゴムをフィルム７７の基材としたOptiCell（商標）を用意し、ローレット加工された直径１．８ｍｍの振動子１４１ａの先端を、枠体１４２または１５０を使用せずにフィルム７７の裏面に当接させ、７０ｋＨｚで２秒間発振させたところ、実効剥離領域を、振動子１４１ａの先端の直径（１．８ｍｍ）＋０．８ｍｍに抑えることができた。ｉＰＳ細胞のコロニーは直径３．０ｍｍ程度以下で培養されることが未分化維持のために望ましいことを考慮すると、振動子１４１ａの先端の直径は２．２ｍｍ（３ｍｍ−０．８ｍｍ）以下であることが望ましい。また、ｉＰＳ細胞のコロニーは直径１ｍｍ以上まで培養する手法が広く用いられていることを考慮すると、振動子１４１ａの先端の直径は１ｍｍ以上であることが望ましい。また、本件発明者が、この振動子１４１ａをフィルム７７の裏面に１ｍｍ押し込んだ状態で発振させても、フィルム７７が破れることは無かった。また、本件発明者が、この振動子１４１ａをフォルム７７の裏面に当接させた状態で、７０ｋＨｚで１０秒間発振させても、フィルム７７が破れることは無かった。
【０１１１】
次に、本件発明者が、０．０７ｍｍ厚のポリスチレンフィルムをフィルム７７の基材としたOptiCell（商標）を用意し、ローレット加工されていない直径２ｍｍの振動子１４１ａの先端を、枠体１４２または１５０を使用せずにフィルム７７の裏面に当接させ、７０ｋＨｚで２秒間発振させたところ、実効剥離領域は、直径５ｍｍ以上であった。また、本件発明者が、この振動子１４１ａをフィルム７７の裏面に当接させた状態で、７０ｋＨｚで５秒間発振させたところ、フィルム７７が熱で溶けて穴が空き、培地が漏れてしまった。
【０１１２】
最後になったが、上述した実施の形態の記載及び図面の開示は、特許請求の範囲に記載された発明を説明するための一例に過ぎず、上述した実施の形態の記載又は図面の開示によって特許請求の範囲に記載された発明が限定されることはない。
【符号の説明】
【０１１３】
７５        第二密閉容器
７７        フィルム（細胞培養膜）
１４０      細胞剥離装置
１４１      超音波プローブ
１４１ａ    振動子
１４２      枠体
１４２ａ１    第一枠体
１４２ａ２    第二枠体
１４３      第一検知部
１４５      弾性部材
１５０      枠体
１５１ａ    枠体ユニット
１５１ｂ    枠体ユニット
【図１】
2015146952.tif 000003
【図２】
2015146952.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
2015146952.tif 000006
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2015146952.tif 000010
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月26日(2016.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離装置において、
超音波振動する振動子を有する超音波プローブ
を備え、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した前記振動子が超音波振動し、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部
を更に備え、
前記振動子は前記第二検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする細胞剥離装置。
【請求項２】
剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置された細胞培養膜側枠体または前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動することで前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させ、
前記細胞培養膜側枠体は前記振動子側枠体は前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる間、常に前記細胞培養膜の裏面に接触する
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離装置。
【請求項３】
前記振動子を取り囲んで配置された振動子側枠体
を備え、
前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面にまず押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離装置。
【請求項４】
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部と、
を備え、
前記振動子側枠体は前記第一検知部による検知結果に基づいて前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記細胞培養膜の裏面に押し込まれ、その後、前記細胞培養膜の裏面に前記振動子側枠体が当接した状態で前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子が超音波振動する
ことを特徴とする請求項３に記載の細胞剥離装置。
【請求項５】
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とは弾性部材を介して連結され、
前記細胞培養膜に前記枠体が接触していないときには、前記振動子の細胞培養膜側の端部は前記振動子側枠体の内方に収容され、
前記細胞培養膜に前記振動子側枠体を押しつけることで、前記振動子の細胞培養膜側の端部が前記振動子側枠体の外方に突出する
ことを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項６】
前記第一検知部又は第二検知部が接触式センサ、近接式センサ又は力センサである
ことを特徴とする請求項１または４に記載の細胞剥離装置。
【請求項７】
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも高くなっている
ことを特徴とする請求項２から５のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項８】
前記振動子側枠体は、前記細胞培養膜の裏面に当接する第一枠体と、前記第一枠体の基端部側に位置する第二枠体と、を有し、
前記第一枠体の弾性率は前記第二枠体の弾性率よりも低くなっている
ことを特徴とする請求項２から５のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項９】
前記超音波プローブと前記振動子側枠体とを、前記細胞培養膜の裏面に対し同時に垂直に駆動させる１つの昇降部を備える
ことを特徴とする請求項３、４、５、７、８のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１０】
前記振動子の細胞培養膜側の端部は、ローレット加工されている
ことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１１】
前記細胞培養膜から剥離される細胞が、培養又は継代に不要な不良細胞である
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１２】
前記細胞培養膜の表面に付着した細胞が、ｉＰＳ細胞又は分化細胞である
ことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞剥離装置。
【請求項１３】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法において、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与え、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を更に備えたことを特徴とする細胞剥離方法。
【請求項１４】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法において、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与え、
振動子側枠体または細胞培養膜側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を更に備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体または細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする細胞剥離方法。
【請求項１５】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法において、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与え、
細胞培養膜側枠体を剥離操作対象となる範囲を取り囲んで配置するステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第二検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を更に備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した振動子を超音波振動するステップは、前記細胞培養膜側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする細胞剥離方法。
【請求項１６】
表面に細胞が付着した細胞培養膜に裏面側から振動を与えることで、前記細胞を前記細胞培養膜から剥離させる細胞剥離方法において、
前記細胞培養膜の裏面の一部に選択的に当接した振動子を超音波振動するステップ
を備え、
前記振動子は前記細胞培養膜の前記表面に付着した所定の細胞に対して選択的に超音波振動を与え、
振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に当接させるステップと、
前記振動子側枠体に加わった前記細胞培養膜の裏面からの力又は前記振動子側枠体と前記細胞培養膜の裏面との間の距離を検知するための第一検知部による検知結果に基づいて、前記細胞培養膜の裏面から前記振動子側枠体に加わる力が所定の大きさになるまで前記振動子側枠体を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
前記振動子を前記細胞培養膜の裏面に押し込むステップと、
を更に備え、
前記細胞培養膜の裏面に当接した前記振動子を超音波振動するステップは、前記振動子側枠体が前記細胞培養膜の裏面に当接した状態で行われる
ことを特徴とする細胞剥離方法。
【国際調査報告】
2015146952.tif 000018
2015146952.tif 000019
2015146952.tif 000020
2015146952.tif 000021