(57)【要約】本発明は、ＳＬＣ６Ａ６又はその細胞外領域に結合する新規なモノクローナル抗体に化学治療剤をコンジュゲートさせた、がん治療用医薬組成物、及び、モノクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体と化学治療剤をコンジュゲートさせた治療薬と化学治療薬との併用による治療方法の提供に関する。本発明により、従来よりも親和性が高く、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６又はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を、がんなどの過剰増殖性疾患に対して活性を有する抗がん剤等とコンジュゲートさせた抗体コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、がん治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体は、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープがコンジュゲートされているものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされた抗体コンジュゲートを含む、がん治療用医薬組成物。
【請求項４】
前記エピトープが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号２４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号２６の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｂ）配列番号２８の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３０の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｃ）配列番号３２の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３４の４８〜５８番目、７４〜８０番目および１１３〜１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体
（ｄ）配列番号３６の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３８の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｅ）配列番号４０の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４２の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、および
（ｆ）配列番号４４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４６の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、請求項５に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合するものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、キメラ化抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記トキシンが、ジフテリアトキシン、シュードモナスエンドトキシンおよびエキソトキシン、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ、真菌、植物、抗ウィルス性タンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦トキシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質、モモルディカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗がん剤が、大腸がん、乳がん、または子宮がんを治療するための薬剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
大腸がん、乳がん、または子宮がんを治療するための医薬組成物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの抗がん剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物に関する。具体的には、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を、がんなどの過剰増殖性疾患に対して活性を有する抗がん剤等とコンジュゲートさせた抗体コンジュゲート、および当該コンジュゲートを含む、大腸がんをはじめとするがん治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界的にも死因の上位を占めており、中でも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約６万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さとなっている。大腸がんは、大腸のみにとどまる場合には５年生存率は約９０％以上であり、早期発見が治癒率の高さに繋がるがんとして知られている。それにもかかわらず大腸がんが死亡数の多いがんである理由は、高い罹患率に加え、リンパ節への転移が起きると５年生存率が７０％、肺や肝臓へ遠隔転移すると２５％以下と、がんの進行に伴って急激に死亡率が悪化する点が挙げられる。これら大腸がんに対する治療法としては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、がん特異的な新たな治療法が模索されるようになった。【０００３】
大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）や上皮成長因子（ＥＧＦ）という増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。【０００４】
アービタックスは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、ＥＧＦによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させることを狙いとする。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。【０００５】
がん細胞は、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすという特徴を持っている。近年、がん組織の中のがん細胞全てがこのような性質を持つのではなく、一部の限られた細胞がこのような性質を持つと考えられるようになった。すなわち、これらの一部のがん細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能という、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に共通して見られる特徴を有し、これらの特徴によってがん組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもとになっていると考えられている。このような一部のがん細胞は、がん幹細胞と呼ばれており、がんはこの幹細胞様の細胞から発生・進行するという仮説（がん幹細胞仮説）が提唱されている。【０００６】
現在のところ、がん幹細胞マーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４などの分子マーカーが知られている（非特許文献１：ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ，１３８，２１５１−２１６２，２０１０）が、これらに対する抗体は、一部のがん幹細胞に結合するにしか過ぎず、治療薬として有効性がないといわれている。また、ＬＧＲ５はＲ−スポンジンと相互作用し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルを活性化する機構を持っており、がん幹細胞マーカーとして利用できる可能性が示唆されている（特許文献１：特表２０１０−５３２１６９公報）。【０００７】
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的にすることの重要性が指摘されている。しかし、腫瘍組織内におけるがん幹細胞の比率はわずかしかなく、がん幹細胞のみをターゲットとした治療薬では、がん細胞全体を殺傷することが出来ないとも考えられている。すなわち、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているようなマーカーを標的とする新たな治療法の開発が、がん医療にとって重要な課題である。【０００８】
抗体に代表される分子標的薬は、がんを特異的に認識すればがん細胞を殺傷する点で優れた物質である。しかし、抗体が正常細胞にも結合した場合、重篤な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では、正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている（非特許文献２：Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６）。さらに、ハーセプチンはＨｅｒ２を標的とした抗体医薬品であるため、Ｈｅｒ２を発現している患者にしか奏効性を示さないという課題が残されている。【０００９】
大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である（非特許文献３：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７）。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する（非特許文献４：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４）。また、ＥＧＦＲ下流のシグナル変化（例えばＫ−ｒａｓ変異）によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。【００１０】
抗体等の分子標的薬が細胞表面に結合する性質を利用し、薬剤を輸送するドラッグデリバリ―システムも広く知られている。特に近年では、がん細胞の表面まで効果的に薬剤を運搬した後、より効果的にがん細胞を殺傷する方法として、抗体分子を細胞内に取り込ませる方法が取られる。抗体分子は細胞膜を透過できないために、通常は細胞内へ取り込まれない。ところが、ある種の抗体は、細胞膜上の膜タンパク質分子と結合することで、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ（内在化）という機構を介して、細胞内へ取り込まれることが知られている。【００１１】
ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）はそのリガンド（受容体に結合する分子）であるＥＧＦと結合すると、クラスリンを介したエンドサイトーシス等により細胞内へ輸送され、エンドソームに集められて、リソソームで分解される（非特許文献５：Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，２，１１，２００７）。ここで、ある種の抗体はＥＧＦ受容体と結合すると、リガンドが結合した場合と同様に細胞内に取り込まれることが知られている。この機構を利用して、抗体に薬剤を結合させ、抗体を細胞内に効率良く輸送する治療法が開発されるようになった。【００１２】
膜タンパク質には、リガンドと結合する受容体だけでなく、アミノ酸や糖等の低分子化合物を能動的あるいは受動的に輸送する輸送タンパク質（以下、トランスポーターと記載する）も存在する。これらの分子は、細胞の内外の分子を透過させる役割を持つため、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを起こさないと考えられてきた。【００１３】
国際公開公報第２０１２／０２９９９０号（特許文献２）には、ＳＬＣ６Ａ６が大腸がんに発現し、その細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体によって、大腸がんを検出でき、診断薬として利用できることが示されている。ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）は、６２０アミノ酸からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）にＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［ＲｅｆＳｅｑ］ＩＤ：ＮＭ＿００３０４３、ＮＰ＿００３０３４．２として登録されている（配列番号１：塩基配列（ＣＤＳ：２９６〜２１５８）、配列番号２：アミノ酸配列）。ＳＬＣ６Ａ６はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。【００１４】
さらに、特許文献２は、ＳＬＣ６Ａ６の遺伝子は、５症例の大腸がん組織全てで発現している一方で、５症例の正常組織には遺伝子の転写がみられないことをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で明らかにしている。さらに、取得されたモノクローナル抗体の２種類のクローン（４Ｂ９ｂ及び５Ｈ１２ｄ）は、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の１４５番目〜２１３番目までのアミノ酸残基の間にエピトープが存在することが記載されている。【００１５】
がんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、がん特異的な分子標的及び副作用が少ない医薬品の新たな開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表２０１０−５３２１６９公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１２／０２９９９０号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ，１３８，２１５１−２１６２，２０１０
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，２，１１，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
一般的にがんの手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、既存の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さないがんが存在する。そこで、がん特異的な分子標的及び副作用の少ない新たな医薬品の開発が求められていた。【００１９】
本発明は、抗体あるいはその抗原結合断片を含む医薬組成物、具体的には抗体またはその抗原結合断片に、一または複数の化学療法剤を組み合わせた抗体コンジュゲートを含む医薬組成物、特にがん治療用の医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、国際公開公報第２０１２／０２９９９０号（ＷＯ２０１２／０２９９９０）記載の抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体と同じ領域にエピトープを含み、かつ親和性を高めた新たなモノクローナル抗体を取得した。がん組織において過剰発現される膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６は、がんマーカーとしても有用である。本発明者は、ＳＬＣ６Ａ６が、通常のがん細胞よりもがんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見を見出した。また、当該抗体単独ではがん細胞を殺傷する効果は示さ無いが、ＳＬＣ６Ａ６と結合した抗体が細胞内へ取り込まれることを見出した。そして、当該抗体に化学療法剤を結合させたコンジュゲートを作り出すことで、効果的にがん細胞を殺傷できることを見出して、本発明を完成させた。【００２１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、がん治療用医薬組成物。
［２］  前記モノクローナル抗体は、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープがコンジュゲートされているものである、［１］に記載の医薬組成物。
［３］  ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされた抗体コンジュゲートを含む、がん治療用医薬組成物。
［４］  前記エピトープが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるポリペプチドを含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド。
［５］  モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号２４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号２６の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｂ）配列番号２８の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３０の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｃ）配列番号３２の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３４の４８〜５８番目、７４〜８０番目および１１３〜１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体
（ｄ）配列番号３６の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３８の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｅ）配列番号４０の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４２の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、および
（ｆ）配列番号４４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４６の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む抗体、
からなる群から選択される少なくとも１つである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［６］  前記モノクローナル抗体が、［５］に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合するものである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７］  前記モノクローナル抗体が、キメラ化抗体又はヒト化抗体である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８］  上記トキシンが、ジフテリアトキシン、シュードモナスエンドトキシンおよびエキソトキシン、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ、真菌、植物、抗ウィルス性タンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦トキシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質、モモルディカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセンからなる群から選択される少なくとも一つである、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９］  前記抗がん剤が、大腸がん、乳がん、または子宮がんを治療するための薬剤である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０］  大腸がん、乳がん、または子宮がんを治療するための医薬組成物である、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１１］  少なくとも１つの抗がん剤をさらに含む、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明により、少なくとも１種類の抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープに結合されている抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体または抗原結合断片を含む抗体コンジュゲート、当該抗体コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と特異的に結合し、内在化するため、本発明の抗体コンジュゲートおよび医薬組成物は、がん治療、特に大腸がん治療用医薬組成物として有用である。当該抗体は、ヒト化、またはキメラ化されたものでもよいため、ヒトに適用された際の副作用を軽減することができる。【００２３】
また、ＳＬＣ６Ａ６は、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているため、本発明によって、がん幹細胞だけを標的とするのでなく、がん細胞全体をも標的とする新たながんの治療薬または治療法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】モノクローナル抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０に関して、２種類の大腸がん細胞（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ）を免疫組織染色した図である。
【図２】ハイブリドーマ細胞が生産するモノクローナル抗体の活性をヒト腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞を用いてＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。
【図３】大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）を用いて、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０をＦＡＣＳ解析した図である。
【図４】２種類の大腸がん細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ−２９）を用いて、抗体クローン２０５、４１９、４０２、及び４３０をＦＡＣＳ解析した図である。
【図５】５１症例の大腸がん組織（Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）と８症例の正常大腸粘膜（Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ）を、抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体（抗体クローン４１９）で免疫組織染色した結果（代表例）である。
【図６】乳がん及び子宮がんの組織（Ｃａｎｃｅｒ）と、それぞれ正常臓器の組織（Ｎｏｒｍａｌ）を免疫組織染色した結果である。
【図７】抗体クローン４０２が大腸がん細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６に結合する反応が、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を部分タンパク質（大腸菌組換え体）によって競争阻害されることを解析した結果である。
【図８】ヒト大腸がん細胞にＳＬＣ６Ａ６を一過性に発現させた場合のＳｉｄｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞の数を解析した結果である。線で囲んだ画分がＳＰ細胞を示し、各パネル中の数字はＳＰ細胞が含まれる割合（％）を示す。ＳＬＣ６Ａ６の遺伝子を過剰発現させることで、ＳＰ細胞の数が増加することを示す図である。
【図９】ＳＰ細胞及び非ＳＰ細胞の集団において、ＳＬＣ６Ａ６の発現量を比較解析した結果である。
【図１０】タウリンを培地に添加した場合のＳＰ細胞の割合を解析した結果である。
【図１１Ａ】抗体が細胞内に取り込まれていることを解析した結果である。
【図１１Ｂ】ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６細胞あるいはヒト乳がん細胞であるＳＫ−ＢＲ３細胞に反応したｃ４０２抗体（４０２ヒト−マウスキメラ抗体）がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるかどうかを解析した図である。
【図１２】ｃ４０２抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎがＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ）によって阻害されるかを解析した図である。
【図１３Ａ】ｃ４０２抗体を直接蛍光色素で標識した場合のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを解析した図である。
【図１３Ｂ】直接蛍光色素で標識した「アイソタイプコントロール（Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」（ネガティブコントロールとしてＷｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧを使用）、「セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）」、「４０２ヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４０２）」、「４３０ヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４３０）」、「４Ｂ９ｂヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４Ｂ９ｂ）」のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎについて解析した図である。
【図１４Ａ】モノクローナル抗体がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎすることにより、細胞内毒性を発揮するという結果を示す図である。
【図１４Ｂ】リボソーム阻害毒素であるサポリンを結合させた抗マウス抗体と４０２抗体、４３０抗体及びモノクローナル抗体マウスＩｇＧ化した４Ｂ９ｂ抗体とを反応させ、抗体がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎすることにより細胞内に取り込まれた際に毒性を発揮するという結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。また、本明細書において引用された特許、特許出願および文献を含むすべての参考文献は、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００２６】
本発明は、膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、処置の対象として有用なマーカーであるという知見に基づくものである。さらに、ＳＬＣ６Ａ６が、通常のがん細胞よりも、がんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見に基づくものである。本発明において、従来の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体よりも高い親和性を有する抗体が提供される。そして、このような本発明の抗体を利用すれば、抗がん剤等をがん細胞に効果的に運搬でき、さらに細胞内に取り込ませることが可能となることが明らかとなった。
【００２７】
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）と呼ばれる分子の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。ＳＬＣ６Ａ６は大腸がんで発現するため、この抗体は、特に大腸がん細胞に特異的に結合する。
【００２８】
より具体的には、本発明は、化学療法剤などの抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープを結合（以下ではコンジュゲートと記載）させた当該抗体を含む抗体コンジュゲートを用いることで、化学療法剤等ががん細胞の内部に取り込まれることを作用機序とする、抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。従って、本発明の医薬組成物はがん、特に大腸癌の治療に有用である。
【００２９】
１．本発明のモノクローナル抗体
（１）本発明のモノクローナル抗体
本発明の医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体（以下「本発明のモノクローナル抗体」ともいう）は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有するインタクトな立体構造の状態にあることをいう。
【００３０】
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識することができる。詳しくは、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合する。特に、細胞外領域として、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号４）を認識することができる。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個もしくは数個（例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号４に示すアミノ酸配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上の相同性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
【００３２】
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドであって、配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドまたは配列番号３に記載の塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう。
【００３３】
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、タウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測される。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ，７６，１−１５，１９８３）で解析することにより確認することができるであろう。
【００３４】
あるいは、本発明のモノクローナル抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明のモノクローナル抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
変異型ポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００３５】
また、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどで比較することにより確認することができる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、ＷＯ２０１２／０２９９９０公報に記載されるサブクラスＩｇＭのＳＬＣ６Ａ６抗体とは異なり、サブクラスＩｇＧであり、免疫組織染色及び／またはフローサイトメーターによる解析から、ＳＬＣ６Ａ６へのより高い親和性を有していることが示される。また、本発明のモノクローナル抗体はＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎと呼ばれる機構を経て細胞内に取り込まれる性質を有している。
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体は、ｓｌｃ６ａ６のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のＳＬＣ６Ａ６だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。
【００３８】
本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗原結合断片、例えば、抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、あるいはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、ＤｉＡｂｏｄｙ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、標識抗体などが挙げられる。いずれも、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体が認識するＳＬＣ６Ａ６は、検出対象となる細胞集団において、正常細胞では発現せず、がん細胞で発現し、さらにがん細胞に比べがん幹細胞で発現の高い分子マーカーである。したがって、当該抗体は、がん及びがん幹細胞の両方に結合し、かつがん幹細胞により多く結合する。
【００４０】
本発明における「がん細胞」とは、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすなどの特徴を持っている細胞集団のことをいう。
【００４１】
本発明における「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞である。幹細胞とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、Ｓｉｄｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）画分に濃縮される細胞として認識される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるＭａｉｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分または染色の弱い画分のことを指す（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７８，４，１８０５−１８１３，２０１１）。
【００４２】
本発明における「正常細胞」とは、生体または組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。
【００４３】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、複数のがん種のがん細胞に共通して発現し、かつがん幹細胞により強く結合するものであり、複数のがん種に結合することが出来る。好ましくは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの細胞または組織由来の複数のがん種であり、より好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんのがん細胞である。
【００４４】
さらに本発明のモノクローナル抗体は、正常細胞においては結合しない。好ましくは、例えば、心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、骨髄、大腸および末梢血単核球などの少なくとも１つ以上において、正常細胞に結合しない。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体を産生する好ましい細胞株（ハイブリドーマ）は、例えば：
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２０４」（以下「２０４」という）、
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２０５」（以下「２０５」という）、
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３０３」（以下「３０３」という）、
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４１９」（以下「４１９」という）
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４０２」（以下「４０２」という）、
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４２２」（以下「４２２」という）、および「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４３０」（以下「４３０」という）である。本発明は、当該ハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
【００４６】
２０５の産生する抗体は、配列番号２４の２１〜１３５番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２６の２１〜１２７番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、２０５の産生する抗体は、配列番号２４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号２６の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００４７】
４０２の産生する抗体は、配列番号２８の２１〜１３６番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３０の２３〜１３０番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、４０２の産生する抗体は、配列番号２８の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３０の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００４８】
４１９の産生する抗体は、配列番号３２の２１〜１３８番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３４の２５〜１３１番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、４１９の産生する抗体は、配列番号３２の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３４の４８〜５８番目、７４〜８０番目および１１３〜１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００４９】
３０３の産生する抗体は、配列番号３６の２１〜１４１番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３８の２１〜１２７番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、２０５の産生する抗体は、配列番号３６の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号３８の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
４２２の産生する抗体は、配列番号４０の２１〜１３９番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４２の２１〜１２７番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、２０５の産生する抗体は、配列番号４０の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４２の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００５１】
４３０の産生する抗体は、配列番号４４の２１〜１３６番目のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４６の２３〜１３０番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
また、２０５の産生する抗体は、配列番号４４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、および配列番号４６の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域を含む。
【００５２】
本発明のモノクローナル抗体は、重鎖が配列番号２４、２８、３２、３６、４０または４４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列であり、軽鎖が２６、３０、３４、３８、４２または４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列である抗体であってもよい。
【００５３】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、
重鎖可変領域が、配列番号２４の２１〜１３５番目のアミノ酸配列、配列番号２８の２１〜１３６番目のアミノ酸配列、配列番号３２の２１〜１３８番目のアミノ酸配列、配列番号３６の２１〜１４１番目のアミノ酸配列、配列番号４０の２１〜１３９番目のアミノ酸配列または配列番号４４の２１〜１３６番目のアミノ酸配列と、少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号２６の２１〜１２７番目のアミノ酸配列、配列番号３０の２３〜１３０番目のアミノ酸配列、配列番号３４の２５〜１３１番目のアミノ酸配列、配列番号３８の２１〜１２７番目のアミノ酸配列、配列番号４２の２１〜１２７番目のアミノ酸配列または配列番号４６の２３〜１３０番目のアミノ酸配列と、少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ含む抗体であってもよい。
【００５４】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、
重鎖可変領域が、配列番号２４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２５番目のアミノ酸配列、配列番号２８の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列、配列番号３２の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２８番目のアミノ酸配列、配列番号３６の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１３１番目のアミノ酸配列、配列番号４０の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２９番目のアミノ酸配列または配列番号４４の５０〜５４番目、６９〜８６番目および１１８〜１２６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、
軽鎖可変領域が、配列番号２６の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列、配列番号３０の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列、配列番号３４の４８〜５８番目、７４〜８０番目および１１３〜１２０番目のアミノ酸配列、配列番号３８の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列、配列番号４２の４４〜５４番目、７０〜７６番目および１０９〜１１６番目のアミノ酸配列または配列番号４６の４６〜５７番目、７３〜７９番目および１１２〜１１９番目のアミノ酸配列と、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む抗体であってもよい。
【００５５】
また、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６のアミノ酸配列と所定の同一性を有するアミノ酸配列は、それぞれ配列２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５の塩基配列と所定の同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する塩基配列によってコードされてもよい。
【００５６】
これらの特徴を有する本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、ＷＯ２０１０／０９８４７１に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得られるものである。当業者において一般的に実施されている製法では作製が困難であることが予想される。それは、
（１）抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、
（２）細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない、
などの理由による。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明者らが抗体の製法（特に免疫方法）に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、以下の特徴を有する。
本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６が本来有する立体構造をもとに作製された故に、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体（ＨＰＡ０１５０２８）と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６と十分に結合することができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体（ｓｃ−１６６６４０）に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができ、治療薬あるいは抗がん剤のキャリアとして利用することが可能である。
【００５８】
加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体はがんの治療に利用することが出来る。
【００５９】
また、本発明におけるモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマ２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２または４３０により産生されるＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体（それぞれ２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２または４３０抗体）が好ましく、特に４０２抗体または４３０抗体がより好ましい。さらに、本発明においては、上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体そのものに限られず、抗体がこれらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列のうち、第１４５番目から第２１３番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。
【００６０】
ＳＬＣ６Ａ６に対する本発明のモノクローナル抗体は、キメラ化抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。ヒト化抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖（Ｈ鎖）定常領域をヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＬＣ６Ａ６タンパク質をＷＯ２０１０／０９８４７１に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
【００６１】
したがって、上記ハイブリドーマ２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２または４３０により産生されるＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体のヒト−マウスキメラ化抗体も、本発明の範囲に含まれる。例えば、ヒト−マウスキメラ化抗体２０５は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ化抗体４０２は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ化抗体４１９は、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ化抗体３０３は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ化抗体４２２は、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ化抗体４３０は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである。同様に、ヒト−マウスキメラ化抗体は、マウス抗体由来のＣＤＲを含む重鎖可変領域と、マウス抗体由来のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むヒト−キメラ化抗体であってもよい。
【００６２】
（２）本発明の抗体コンジュゲート
本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体（その抗原結合断片を含む）は、少なくとも１種類の抗がん剤、トキシン、またはラジオアイソトープにコンジュゲートされる、このような抗がん剤、トキシン、またはラジオアイソトープでコンジュゲートされた本発明のモノクローナル抗体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明のモノクローナル抗体および少なくとも１種類の抗がん剤、トキシン、またはラジオアイソトープを含む抗体コンジュゲート（以下、本発明の抗体コンジュゲートともいう）も、本発明の範囲に含まれる。本発明の抗体コンジュゲートに使用される本発明のモノクローナル抗体は、例えば、２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２もしくは４３０抗体またはそれらのキメラ化抗体が好ましく、４０２抗体もしくは４３０抗体またはそれらのキメラ化抗体がより好ましい。
【００６３】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体とラジオアイソトープを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が検出可能なラジオアイソトープとコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。検出可能なラジオアイソトープは、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍである。
【００６４】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体と抗がん剤またはトキシンとを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が抗がん剤またはトキシンとコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。前記抗がん剤は好ましくは化学療法剤である。また、トキシンは、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ）トキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エンドトキシンおよびエキソトキシン、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ、真菌（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスカミン、ヨウシュウヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ））、抗ウィルス性タンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦トキシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン等である。
【００６５】
作用機構には限定されず、「化学療法剤」は癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の種類には、限定するものではないが、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アンチメタボライ、紡錘体阻害剤植物アルカロイド、細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、抗体、光増感剤及びキナーゼ阻害薬が含まれる。化学療法剤は、「ターゲティング療法」と従来の化学療法とに用いられる化合物を含む。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５‐フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９，Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペントアザ二環式［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキシアミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標），ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブト−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミド，ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標），ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標），ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ及びラパマイシンが含まれる。
【００６６】
化学療法剤の他の例には、ＤＭ１（Ｎ２’−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ４（Ｎ２’−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（４−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｏｘｏｐｅｎｔｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標），ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，国際公開２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋインヒビター，ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ  ＴＭ，ＳＣＨ  ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＮ−３８、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ  ＴＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ  ＴＭ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ），パクリタキセルのアルブミン−変更ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ，ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、及びシクロフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレ���ホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びバイゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭ１を含む）；エレトロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ダイネミシンＡ（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎＡ）；クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）などのビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質発光団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗−代謝産物；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）のような葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）のようなピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）のようなメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリデンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）及びアングイデン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体が含まれる。
【００６７】
また、「化学療法剤」の定義には、（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）など、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンクエン酸塩）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン）；（ｉｉ）アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（メゲストロールアセテート）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン，Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタイン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ゾロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ））、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）プロテインキナーゼインヒビター、例えばＭＥＫインヒビター（国際公開２００７／０４４５１５）；（ｖ）脂質キナーゼインヒビター；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓ、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標），Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃ．）；（ｖｉｉ）リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））及びＨＥＲ２発現インヒビター；（ｖｉｉｉ）遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）及びＶＡＸＩＤ（登録商標）などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）などのトポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｉｘ）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗血管形成剤；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、「化学療法剤」の定義には、治療的抗体、例として、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標），Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標），Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ  ＴＭ，２Ｃ４，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標���，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ，Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬剤コンジュゲート、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）が含まれる。
【００６８】
ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体及びそれと組み合わされる化学療法剤としての治療的能力を有するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体には、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・メルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、パーツズマブ、パキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブおよびビシリズマブが含まれる。
本発明の抗体コンジュゲートにおいて、好ましい抗がん剤は、５−ＦＵ、ドキソルビシン（Ｄｘｏｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、またはＳＮ−３８である。
【００６９】
「代謝産物」は、特定の化合物又は塩の体内の代謝によって生産される生成物である。化合物の代謝産物は当分野で公知の慣例技術を使用して同定されてもよく、それらの活性は本明細書中に記載のものなどの試験を用いて決定されてもよい。このような生成物は、例えば、投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、アミド分解、エステル化、エステル分解、酵素の切断などから生じうる。したがって、本発明は、代謝産物が得られるために十分な時間、本発明の化合物を哺乳動物と接触させることを含む方法によって産生される化合物を含む、本発明の化合物の代謝産物を含む。
【００７０】
コンジュゲートの作製法には、本発明が属する分野の当業者に周知の様々な方法が利用できる。例えば、まず抗体上の反応性部分、たとえばリジンのアミノ基、またはシステイン基（天然ジスルフィド結合の還元により、または分子生物学的方法を用いて工学的に非天然システイン残基を付加することにより生成）を修飾することにより作製される。あるいは、抗体をヘテロ二官能性リンカー試薬、たとえばＳＰＤＢ、ＳＭＣＣおよびＳＩＡＢ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，９１３，７５８およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５０１６９９３３）でまず修飾して、反応性基、たとえば混合ピリジルジスルフィド、マレイミドまたはハロアセトアミドをもつリンカーを取り込ませる。抗体に取り込まれた反応性リンカー基を、次いで反応性部分、たとえばチオール基を含む細胞毒薬とコンジュゲートさせる。またあるいは、チオール反応性基（たとえばハロアセトアミドまたはマレイミド）を含む細胞毒薬誘導体と細胞結合剤上のチオール基との反応によるものである。さらに、抗体のアミノ基あるいはカルボキシル基と反応するＮスクシニルイミドやマレイミドを介して結合させることが出きる。あるいは、抗体をオキシダントと反応させて、アルデヒドを持つ抗体を形成し、アルデヒドを持つ抗体をＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーと反応させてチオール反応性抗体を形成し、そしてチオール反応性抗体をチオール化シグナル発生部分と反応させて抗体−シグナル発生部分コンジュゲートを形成することを含む。特定の態様では、抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成することは、抗体のグリコシル化領域を酸化して（過ヨウ素酸塩、臭素またはヨウ素を用いるような）、アルデヒドを持つ抗体を形成することを含む。
【００７１】
本発明のモノクローナル抗体は、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープと直接または間接的に結合（コンジュゲーション）することができる。間接的な結合には、リンカーを介した結合や本発明のモノクローナル抗体に結合する抗体または抗体断片を介する結合が含まれる。例えば、蛍光標識などの標識物質でコンジュゲートされた抗体と本発明のモノクローナル抗体との結合によって形成された抗体コンジュゲートも、本発明に含まれる。
【００７２】
２．本発明の医薬組成物
本発明において、本発明のモノクローナル抗体（抗原結合断片を含む）を含む医薬組成物が提供される。ここで、前述のように、本発明のモノクローナル抗体は、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされている。したがって、本発明の別の態様において、本発明の抗体コンジュゲートを含む、医薬組成物が提供される。
【００７３】
本発明のモノクローナル抗体はがん細胞に発現するＳＬＣ６Ａ６を認識し、結合後に内在化されるため、本発明のモノクローナル抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。
【００７４】
また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤としても使用することができる。本発明のがん治療剤には、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされたＳＬＣ６Ａ６抗体もしくは抗体コンジュゲート、あるいは、必要に応じて薬学的に許容される抗がん剤や担体を適宜ＳＬＣ６Ａ６抗体に組み合わせたものが含まれる。あるいは本発明の癌治療剤は他の治療様式と組み合わせて用いることができる。
【００７５】
また、本発明のモノクローナル抗体は、がん細胞に発現するＳＬＣ６Ａ６を認識し、かつ、細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６に結合した後、インターナリゼーションの機構を介して、細胞内に取り込まれる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を殺傷するためやラジオアイソトープによる癌細胞の標識に使用することが可能である。特に、化学療法剤と本発明のモノクローナル抗体を含む抗体コンジュゲートを含む場合、抗体にコンジュゲートした化学療法剤もがん細胞に取り込まれ得るため、本発明の医薬組成物は、がん患者におけるがん細胞を殺傷するために有用である。
【００７６】
本発明において、がんの治療には、がん細胞を殺傷すること、がんの大きさを減少させること、がんの増殖速度を抑制もしくは停止させること、またはがんの進行を抑制もしくは停止させることなどが含まれる。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの抗がん剤をさらに含むこともできる。併用させる抗がん剤として、本発明の医薬組成物に含まれる化学療法剤と同じものを用いてもよいし、あるいは異なる化学療法剤を用いてもよい。抗がん剤の投与量および投与方法は、当業者であれば適宜設定することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物の投与対象のがんの種類は特に限定されず、ＳＬＣ６Ａ６を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん（肝臓がん）、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんである。
【００７９】
本発明の医薬組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、または患部への直接投与などが挙げられる。
【００８０】
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。有効成分としては、本発明のモノクローナル抗体にコンジュゲートされる抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープ等が挙げられる。
【００８１】
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
【００８２】
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
【００８３】
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分（抗体の場合）は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２〜１２ｍｇ／日である。
【００８４】
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明は、がん、例えば大腸がんを治療するための本発明のモノクローナル抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされた本発明のモノクローナル抗体を含むものであれば、それを構成する材料は特に限定されない。抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされた本発明のモノクローナル抗体のほか、水、緩衝液、容器、シリンジ、取扱説明書などを具備すればよい。本発明のモノクローナル抗体は、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製してもよい。また、本発明のキットは、少なくとも１つのさらなる抗がん剤を含んでもよい。本発明のキットを用いることにより、がんを効果的に治療することが可能となる。
【００８７】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を対象に投与することを含む、がんの治療方法も提供する。本発明の治療方法において、本発明のモノクローナル抗体は抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートを形成している。すなわち、本発明の治療方法は、本発明の抗体コンジュゲートを対象に投与することを含むものであってもよい。また、本発明のがん治療方法において、さらなる抗がん剤を併用してもよい。さらに、本発明はがんの治療に使用される本発明のモノクローナル抗体を含み、本発明のモノクローナル抗体は抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープとコンジュゲートされているものである。また本発明はがんの治療に使用される本発明のコンジュゲートをも含む。
【００８８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８９】
抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体の取得
（１）細胞
本願の実施例においては、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６、Ｃｏｌｏ３２０及びＷｉＤｒはＤＳファーマより入手した。Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＨＣＴ１５、ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、２９３Ｔ、およびＭＤＡ−ＭＢ２３１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ受託番号  ＨＴＢ−２６）より入手した。【００９０】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０１、およびＣｏｌｏ３２０を、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）で、ＷｉＤｒはＥ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＣＴ１１６はＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０、２９３Ｔ及び残りの細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。【００９１】
（２）免疫用細胞
ＷＯ２０１２／０２９９９０公報実施例２に記載されたのと同じ方法で、ｐＥＦ６ベクターにヒトＳＬＣ６Ａ６遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを作製した。このＳＬＣ６Ａ６発現ベクターを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いてＭＤＡ−ＭＢ２３１へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、３〜５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＳＬＣ６Ａ６を過剰発現している細胞を選び出すため、遺伝子導入を行っていない細胞、及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。【００９２】
培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。【００９３】
抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【００９４】
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【００９５】
最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍＭのリン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）に希釈し、この溶液の２，０００分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、遺伝子導入を行っていないＭＤＡ−ＭＢ２３１よりもシグナルの高い株を選択し、最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。【００９６】
（３）細胞の移植
１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）を用いて回収し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。【００９７】
生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。【００９８】
（４）スクリーニング用ＳＬＣ６Ａ６部分タンパク質の発現と精製
実施例１（２）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号４）をコードするＤＮＡ（配列番号３）をｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングした。以下のプライマーを用いてＰＣＲを行なった。
プライマー配列
2015108203.tif 000002
【００９９】
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分間のプレインキュベーションを行なった後、９８℃、１０秒間のデナチュレーション、５８℃、３０秒間のアニーリング、および６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて、ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ組み込んだ。【０１００】
増幅断片の塩基配列をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。【０１０１】
このベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。【０１０２】
約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応物を１ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ  酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を得た。【０１０３】
（５）抗血清の解析
上記（４）で得た組換えタンパク質１０μｇ／ｍｌを１００μＬずつ、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ７．４）で洗浄した後、５％となるようＴＢＳ−Ｔで希釈したスキムミルク（ＧＩＢＣＯ社）を入れ、３０分室温でブロッキングを行った。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をＴＢＳ−Ｔで１／２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【０１０４】
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【０１０５】
最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）に希釈し、この溶液の２０００分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。【０１０６】
（６）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号  ＣＲＬ−１５８０）と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞と０．２５×１０８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。【０１０７】
融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり５〜１２個のコロニーが形成された。【０１０８】
（７）モノクローナル抗体の取得
移植３〜７ヶ月後にマウスから脾臓細胞を取り出し、上記（６）に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。ＳＬＣ６Ａ６を認識する抗体を選択するために、上記（５）記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ１ポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識、抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識、抗マウスＩｇＧ２ｂポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（Ｂｅｔｈｙｌ社）をそれぞれ等量混合し、ＴＢＳＴで１０００００倍希釈した溶液を用い、サブクラスＩｇＧのクローンのみが検出されるようにして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択した。【０１０９】
取得したモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、１０ｃｍ  ｄｉｓｈ  １０枚に９０％コンフルエントとなるよう培養し、ＨＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＥＸ  ＣＥＬＬ  Ｓｐ２／０（ニチレイバイオサイエンス社製）とを１：１で混合した培地で１０日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。培養上清１００ｍＬに対し、０．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳ（−）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１〜３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。次に、１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）あるいは０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０））で抗体タンパク質を溶出させ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０〜７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳ（−）に置換した。得られた７つのハイブリドーマのクローンから得られた抗体クローンおよびＷＯ２０１２／０２９９９０公報記載の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体である「４Ｂ９ｂ」及び「５Ｈ１２ｄ」のサブクラスおよび上記（５）記載の方法で測定したＥＬＩＳＡの結果を表１にまとめる。【０１１０】
【表１】
2015108203.tif 000003
【０１１１】
抗体「４Ｂ９ｂ」を産生するハイブリドーマ「４Ｂ９ｂ」は、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１  千葉県流山市東深井１０５番地）により、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３」として、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、「５Ｈ１２ｄ」を産生するハイブリドーマ「５Ｈ１２ｄ」は、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１  千葉県流山市東深井１０５番地）により、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４」として、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されている（上記日付はいずれも原寄託日を示す）。マウスＩｇＧ化した抗体「４Ｂ９ｂ」を発現するための、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターはＰＣＴ／ＪＰ２０１３／５６８８４公報記載の方法により取得したものを使用した。ヒトＩｇＧ化した「マウス−ヒトキメラ４Ｂ９ｂ抗体」を発現するための、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターはＰＣＴ／ＪＰ２０１３／５６８８４公報記載の方法により取得したものを使用した。【０１１２】
（８）免疫細胞染色
上記記載（７）で得られた７種類の抗体クローン「２０４」「２０５」、「３０３」、「４１９」、「４０２」、「４２２」及び「４３０」と、大腸がん細胞（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ）との反応性を解析した。また、比較対象として、ＷＯ２０１２／０２９９９０公報記載の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体である「４Ｂ９ｂ」及び「５Ｈ１２ｄ」を同様に解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。【０１１３】
ＨＴ−２９及びＬｏＶｏを８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社）でコートしたカバーガラス上へ播種した。２日間培養後、１０％中性緩衝ホルマリン（ＷＡＫＯ社）を用いて細胞を固定した。カバーガラスを０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを含むＴＢＳＴで処理した後、上記（７）で精製した抗体を１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識あるいは抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で室温３０分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄ社）でカバーガラスを封入した。【０１１４】
図１は、各抗体について同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。全てのクローン（２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２および４３０）でシグナルが観察され、特にクローン２０４、２０５、３０３、４１９、および４０２で明確にシグナルが観察された。４Ｂ９ｂや５Ｈ１２ｄのようなサブクラスＩｇＭの抗体と比較した場合、クローン２０５、３０３、４１９抗体のシグナルは明らかに高く、親和性が高いという結果が示された。本実施例により、従来のＳＬＣ６Ａ６抗体よりも力価の高いクローンが取得できた。
【実施例２】
【０１１５】
（１）ＦＡＣＳ解析
ヒト胎児腎臓細胞である２９３Ｔを９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、１．５ｍＬチューブに回収した。２０４、２０５及び４１９抗体をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようチューブに添加し、６０分間反応させた。比較対象として、４Ｂ９ｂを同様の濃度で添加し、反応させた。
２％ＦＢＳを添加したＰＢＳ（−）（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞を２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１／１０００希釈して添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ社）で解析を行った。結果を図２に示す。【０１１６】
図２示すように、２０４、２０５及び４１９抗体は、４Ｂ９ｂよりも強く２９３Ｔ細胞に反応した。２９３Ｔ細胞はＳＬＣ６Ａ６を発現することから、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、ネイティブな構造のＳＬＣ６Ａ６を認識することが示された。また、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、従来のＳＬＣ６Ａ６抗体よりも高い親和性でネイティブなＳＬＣ６Ａ６に結合し得ることが示された。
【実施例３】
【０１１７】
ＦＡＣＳ解析
実施例１（７）で得られたモノクローナル抗体に関して、ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６に対して、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０抗体との反応性を実施例２と同様の方法で解析した。結果を図３に示す。【０１１８】
図３から、ヒト大腸がん細胞ＨＣＴ１１６に対し、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０抗体が明確に反応することが示された。【０１１９】
ヒト大腸がん細胞であるＳＷ４８０及びＨＴ−２９に対して、抗体クローン２０５、４１９、４０２及び４３０抗体との反応性を実施例２と同様の方法で解析した。結果を図４に示す。【０１２０】
図４から、２種類の細胞株に対しても、抗体クローン２０５、４１９、４０２及び４３０抗体が明確に反応することが示された。【０１２１】
モノクローナル抗体を抗がん剤、トキシン、ラジオアイソトープなどとのコンジュゲートであるＡＤＣとして利用する場合には、タンパク質のネイティブな構造をより強く認識する抗体が好ましい。これは、がん組織において細胞は生きた状態で存在し、よってがん細胞が発現するＳＬＣ６Ａ６もネイティブな構造を保持しているためである。すなわち、実施例１（５）あるいは（８）で示した方法よりも、実施例３のＦＡＣＳ解析の方が、ＡＤＣに適した抗体クローンを選択するのに適切な方法であろう。
【実施例４】
【０１２２】
（１）免疫組織染色
５１症例の大腸がん組織と８症例の正常大腸粘膜をマウス抗体（クローン２０５）を用いて免疫組織染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社）をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで親水化した。得られた組織を０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで３７℃、１５分間処理し、抗原賦活化を行った。ヒストファインＳＡＢ−ＰＯユニバーサルキット（ニチレイ社）を用い、添付のプロトコールに従って染色を行った。一次抗体の反応では、１０μｇ／ｍＬの２０５抗体を添加し、３７℃、１時間反応させた。発色の際には、ＩｍｍＰＡＣＴ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ社）で５分間発色させた。蒸留水で水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＷＡＫＯ）を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。【０１２３】
図５は、大腸がん組織（Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）と正常組織（Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ）とを染色した結果（代表例）を掲載した。染色像として、強陽性に染まっている場合を＋＋＋、陽性に染まっている場合を＋＋、正常と区別される弱陽性を＋とし、染色されていない場合または正常組織を−と記載した。なお、判断がつかない場合を＋／−と記載した。大腸がん組織においては、弱陽性と陽性と強陽性とを合わせると、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体により約８４％（４３症例）が染色された。表２は、実施例４で用いたサンプルの由来および結果についてまとめた表である。【０１２４】
【表２】
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【実施例５】
【０１２５】
免疫組織染色
上記、実施例４に記載した方法と同様に、マウス抗体（２０５クローン）を用いて乳がん及び子宮がんのがん組織（Ｃａｎｃｅｒ）、及び正常組織（Ｎｏｒｍａｌ）を免疫組織染色した。その結果を図６に示す。乳がん及び子宮がんにおいても、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体によって、がん部が明確に染色されることが示された。乳がんでは３症例中３症例で陽性（１００％）であり、子宮がんでは３症例中２症例が強陽性（６６％）であることが示された。
【実施例６】
【０１２６】
競合阻害試験
上記で得られたモノクローナル抗体の中で、抗体クローン４０２がＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインに結合しているか解析を行った。１０μｇ／ｍＬの抗体クローン４０２と実施例１（４）で作製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質１５μｇ／ｍＬとを混合し、３７℃で１時間反応させた。組み換えタンパク質を加えていないサンプルをコントロールとして同様に準備した。ガラス上で培養したＨＣＴ１１６細胞と４℃で１時間反応した後、実施例１（８）記載の方法で二次抗体と反応させ、検出を行った。結果を図７に示す。図７において「Ｐｈａｓｅ」は、位相差顕微鏡を用いた可視光による画像である。【０１２７】
図７は、ＨＣＴ１１６に抗体クローン４０２が結合して生じる蛍光が、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を添加した場合に消失することを示している。このことから、抗体クローン４０２は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域と反応することが示された。すなわち、抗体クローン４０２はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域と特異的に反応することが示された。
【実施例７】
【０１２８】
キメラ抗体の作製
（１）遺伝子のクローニング
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。【０１２９】
抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号７と配列番号８、配列番号９のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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【０１３０】
抗体のＬ鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、配列番号７と配列番号８、配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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【０１３１】
精製したＰＣＲ増幅断片を１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社）及び２×ＧｏＴａｑ  Ｍａｘｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と混合し、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。【０１３２】
（ｉ）Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を増幅するために、配列番号１１で示されるオリゴＤＮＡを化学合成し、配列番号１２と配列番号１３のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、６０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行ってヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域断片を得た。【０１３３】
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【０１３４】
次に、ｐＥＦ６−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＭｌｕＩ認識配列を破壊し、配列番号１４と配列番号１５のオリゴヌクレオチドをアニーリング後、制限酵素（ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ）を用いて導入した（このベクターをｐＥＦ６−Ｌｅａｄｅｒと呼ぶ。）。
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【０１３５】
次に、増幅したヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域を制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ）を用いて、ｐＥＦ６−Ｌｅａｄｅｒに導入した（このベクターをｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇと呼ぶ。）。【０１３６】
次に、ｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに２０５抗体のＨ鎖可変領域断片を導入するために、ＴＡクローニング法によりクローニングしたＨ鎖可変領域断片を鋳型にして、配列番号１６と配列番号１７のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）によりＨ鎖可変領域断片を得た。
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【０１３７】
続いて、増幅したＨ鎖可変領域断片を制限酵素（ＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ）を用いて、ｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに導入した（以下、２０５キメラＨ鎖発現ベクターと呼ぶ。）。【０１３８】
（ｉｉ）Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトｋａｐｐａ鎖定常領域を増幅するために、配列番号１８で示されるオリゴＤＮＡを化学合成し、配列番号１９と配列番号２０のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行ってヒトｋａｐｐａ鎖定常領域断片を得た。【０１３９】
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【０１４０】
次に、ｐＥＦ１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ）を用いて、増幅したヒトｋａｐｐａ鎖定常領域を導入した。（このベクターをｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇと呼ぶ。）【０１４１】
次に、ｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに２０５抗体のＬ鎖シグナル配列と可変部を導入するために、ＴＡクローニング法によりクローニングしたＬ鎖シグナル配列と可変領域断片を鋳型にして、配列番号２１と配列番号２２のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行って２０５抗体のＬ鎖シグナル配列と可変部断片を得た。
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【０１４２】
次に、ｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに、制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ）を用いて、増幅したＬ鎖シグナル配列と可変領域断片を導入した（これを２０５キメラＬ鎖発現ベクターと呼ぶ。）。【０１４３】
ヒト‐マウスキメラ化した２０５抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２３、アミノ酸配列は配列番号２４で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２５、アミノ酸配列は配列番号２６で示される。【０１４４】
また、その他の抗体についても同様に、ヒト‐マウスキメラ抗体を作製した。ヒト‐マウスキメラ化した４０２抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２７、アミノ酸配列は配列番号２８で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２９、アミノ酸配列は配列番号３０で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４１９抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３１、アミノ酸配列は配列番号３２で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号３３、アミノ酸配列は配列番号３４で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した３０３抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３５、アミノ酸配列は配列番号３６で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号３７、アミノ酸配列は配列番号３８で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４２２抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３９、アミノ酸配列は配列番号４０で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号４１、アミノ酸配列は配列番号４２で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４３０抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号４３、アミノ酸配列は配列番号４４で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号４５、アミノ酸配列は配列番号４６で示される。【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５４】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
上記で得られた各ヒト−マウスキメラ抗体の可変領域およびＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列の情報は以下の表３および４に示される。可変領域およびＣＤＲ１〜３に記載された数字は、配列番号で示されるアミノ酸配列において該当するアミノ酸の番号を示す。【０１７０】
【表３】
2015108203.tif 000049
【０１７１】
【表４】
2015108203.tif 000050
【０１７２】
さらに、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０７０４１８公報に記載された抗体クローン４Ｂ９ｂに関しても同様に、抗体Ｈ鎖及び抗体Ｌ鎖の定常領域をヒト化したヒト−マウスキメラ抗体を作製した。【０１７３】
（２）ヒトＩｇＧ化抗体の発現
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに９０％コンフルエントとなるようＣＨＯ細胞を培養し、（１）で作製したＨ鎖及びＬ鎖発現用ベクターをＣＨＯ細胞へＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。２４時間後にＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社）に交換し、で４日間培養を行った。培養上清を回収し、遠心分離により細胞を除き、上清を回収した。抗体の精製は実施例１（７）記載の方法と同様に行った。【０１７４】
あるいは、以下の方法でヒト化ＩｇＧ抗体を発現させた。抗体タンパク質の発現には、Ｅｘｐｉｉ２９３Ｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った。１２５ｍＬのベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社）を用い、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した細胞溶液３０ｍＬを３７℃、８％ＣＯ２下で２４時間旋回培養（１２５ｒｐｍ）した。
次に、８１μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  ｒｅａｇｅｎｔを１．４１９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ社）と混合し、５分間静置した後、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖遺伝子それぞれをコードする遺伝子がクローニングされたプラスミドを各１５μｇとなるよう添加し、２０分間室温で静置した。
上記で準備した２９３Ｆ細胞を２．９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう、２５．５ｍＬの培地に再懸濁し、プラスミド溶液３ｍＬを添加して培養を開始した。培養開始後２０時間後に１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｉｎｅ  ２９３  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  １と１．５ｍＬのｅｎｈａｎｃｅｒ  ２を添加し、３日間培養し、培養上清を回収した。【０１７５】
（３）ヒトＩｇＧ化抗体の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を用いた抗体の精製は実施例１（７）記載の方法と同様に行うか、ハイドロキシアパタイト担体を用いた精製を行った。
ハイドロキシアパタイトを用いた精製法では、実施例７（２）記載の方法と同様の方法で培養した培養上清１２ｍｌに対し２５０ｍｇのｃｈｅｒａｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ、２０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。ハイドロキシアパタイト担体を１０ｍＭリン酸緩衝液（１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ６．７））で平衡化し、抗体タンパク質を含む培養上清の１２ｍＬに対し、３６ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液を添加した。この希釈した培養上清に、平衡化したハイドロキシアパタイト担体を添加し、１８時間４℃で撹拌した。担体をエコノパックカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に充填し、１０倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭリン酸緩衝液に５０、３００、５００、７００、８００、１０００、１３００ｍＭとなるよう塩化ナトリウムを添加した溶液で分離を実施した。５００〜７００ｍＭの塩化ナトリウム濃度の間で溶出してきたタンパク質の９５％以上が抗体タンパク質であった。【０１７６】
なお、精製したヒト−マウスキメラ化について、２０５抗体を例に用いて実施例１（７）と同様の方法で結合活性を測定した。この際、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬとした。二次抗体としては、２０５抗体の場合は抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識を、キメラ抗体の場合は抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識をそれぞれ用いた。その結果、２０５抗体をヒト−マウスキメラ化抗体した場合にも、ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１５及びＨＴ−２９細胞におけるＳＬＣ６Ａ６に対する結合能が保存されていることが確認された。
【実施例８】
【０１７７】
（１）ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の一過性発現
実施例１（２）に記載のｐＥＦ６ベクターにＳＬＣ６Ａ６遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いてＨＣＴ１５及び、ＨＴ−２９、およびＳＷ４８０へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。【０１７８】
（２）ＳＬＣ６Ａ６の過剰発現によるＳｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞の変化
幹細胞は、様々な表面マーカーを用いて分離されているが、由来する組織により表面マーカーが異なることや、存在する割合が少ないことから、幹細胞の解析は非常に困難である。そこで、その分離・同定方法として、Ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞が注目されている。幹細胞は薬剤排出能が高く、様々な物質を細胞外に放出する特性を持っており、この幹細胞の特性を利用してＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の排出を指標に解析する技術が広く用いられている。この技術において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の染色パターン中、発色が弱い細胞分画が、ＳＰ細胞と呼ばれる。がん細胞に関してもこのようなＳＰ細胞が存在することが明らかになり、ＳＰ細胞は、非ＳＰ細胞に比べ明確に腫瘍形成能が高いことが報告され、がん幹細胞が濃縮される分画として知られるようになった（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５，６５，ｐ．６２０７−６２１９）。【０１７９】
上記、実施例８（１）記載の方法で遺伝子を導入後、２日目にＤＩＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ  ＢＵＦＦＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞を剥離した。ＰＢＳ（−）に１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２となるよう調製した溶液で、３７℃、１時間細胞を染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いてＶｉｏｌｅｔレーザー（励起波長４０７ｎｍ）を用いて解析した。また、ＳＰ分画を同定するために、薬剤排出トランスポーターの阻害剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌを３０μｇ／ｍＬ添加した実験を行った。結果を図８に示す。【０１８０】
図８は、コントロールベクター（「Ｍｏｃｋ」）に比べ、ＳＬＣ６Ａ６を一過性発現させた場合（「ＳＬＣ６Ａ６」）にＳＰ細胞の割合が上昇している結果を示す。すなわち、ＳＬＣ６Ａ６は、幹細胞集団が濃縮されるＳＰ分画の増加に直接関与していることが示された。
【実施例９】
【０１８１】
（１）ＳＰ分画におけるＳＬＣ６Ａ６の発現
ヒト大腸がん細胞であるＳＷ４８０細胞のＳＰ分画及び非ＳＰ分画（Ｍａｊｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＭＰ）分画）に関して、ＳＬＣ６Ａ６の発現を解析した。実施例８（２）記載の方法と同様にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞を染色し、その後、ＰｒｏｔｅｉｎＧで精製しｐＨ３．０の溶出液で溶出した１μｇ／ｍＬの４３０抗体と細胞を４℃、１時間染色し、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で染色した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて解析を行った。その結果を図９に示す。【０１８２】
図９は、ＳＬＣ６Ａ６でＳＰ及びＭＰ細胞を染色した場合、ＭＰ細胞よりもＳＰ細胞の方が抗体により強く染色されることを示している。つまり、ＳＰ細胞はＭＰ細胞に比べ、ＳＬＣ６Ａ６がより多く発現していることが示された。なお、抗体を添加しない場合は、ＳＰ細胞及びＭＰ細胞ともにシグナルのシフトがみられなかったことから、４３０抗体はＳＬＣ６Ａ６に特異的に反応していることが示された。さらに、ｖｅｒａｐａｍｉｌを添加した場合にはＳＰ細胞は見られなかったため、ＳＰ細胞として分離した分画がＳＰ細胞であることが確認された。
【実施例１０】
【０１８３】
タウリンの添加によるＳＰ細胞の割合
上記実施例９で示されているように、ＳＬＣ６Ａ６の発現は、がん幹細胞が濃縮される集団であるＳＰ細胞の形成に直接関与している。一方で、ＳＬＣ６Ａ６はタウリンを輸送するトランスポーターであることが報告されている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  １９９３，３１８，ｐ．１３９−１４４）。そこで、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞に対し、タウリンを作用させた場合、細胞集団におけるＳＰ細胞の割合が変化するかを解析した。【０１８４】
解析にはヒト大腸がん細胞であるＣｏｌｏ３２０細胞にＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞を用い、培地にタウリンを０．０５及び０．１、０．５、１、５ｍＭそれぞれ添加して２日間培養を行った後、実施例１（３）記載の方法でＳＰ細胞を解析した。結果を図１０に示す。【０１８５】
図１０は、Ｃｏｌｏ３２０にベクターのみを導入した細胞であるＣｏｌｏ３２０−Ｍｏｃｋ、及びＳＬＣ６Ａ６を安定的に発現するＣｏｌｏ３２０−ＳＬＣ６Ａ６−ＯＥｘの両方で、タウリンの添加濃度依存的にＳＰ細胞の数が増えることを示している。タウリンの作用は、特にＣｏｌｏ３２０−ＳＬＣ６Ａ６−ＯＥｘで顕著であり、その割合は５ｍＭのタウリンを加えた場合に、加えない場合（０ｍＭ）と比較して約２．５倍（１７．０％から２６．７％）増加していた。すなわち、ＳＬＣ６Ａ６の発現が亢進するとタウリンの取り込みが増加する、あるいは、タウリンの濃度が増加するに従ってＳＰ細胞が増えることを示した。ＳＰ細胞は、がん幹細胞が濃縮される分画であることから、ＳＬＣ６Ａ６ががん細胞の幹細胞化に関与している可能性が示された。
【実施例１１】
【０１８６】
内在化の解析
（１）ＨＴ−２９あるいはＳＷ４８０を９０％コンフルエントになるよう培養し、Ｇｌａｓｓ  Ｂａｓｅ  Ｄｉｓｈに播種した。細胞を２４時間培養後、氷冷したＰＢＳで洗浄し、発現後ｐＨ３．０で精製した４１９、４０２、または４３０抗体１０μｇ／ｍｌと１時間、４℃で反応させた。細胞をＰＢＳで洗浄後、４℃もしくは３７℃で２０分間培養を行った後、１０％中性緩衝ホルマリンで１０分間固定した。反応後の細胞を５００倍希釈した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識と室温で３０分間反応させた後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）で解析した。結果を図１１Ａに示す。【０１８７】
図１１Ａは、４℃で反応させた場合、つまり細胞の活動が停止して細胞内輸送機構が機能せず、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが起きない条件では、細胞膜が染色されていることを示す。この結果は抗体が細胞膜上に存在することを示す。一方、３７℃でｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを起こさせた場合には、細胞膜が染色されなかったことを示す。この結果は、細胞表面に結合した抗体はインターナリゼーションによって細胞内に移動していることを示している。細胞内に取り込まれた抗体はエンドソーム及びリソソームに集められるため、細胞内では、濃い斑点状のシグナルが観察された。【０１８８】
（２）上記実施例７で作製した抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体が細胞表面上に結合した後、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎにより細胞内に取り込まれるかを解析した。
ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６細胞あるいはヒト乳がん細胞であるＳＫ−ＢＲ３をＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社）上に、１×１０４個／ｗｅｌｌとなるよう細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。培地を除去後、氷上に冷却した培地を添加し、氷上で２０分間静置した。培地を除去後、ＰｒｏｔｅｉｎＧで精製しｐＨ３．０の溶出液で溶出した４０２ヒト−マウスキメラ抗体を２０μｇ／ｍＬとなるよう培地で調製した一次抗体を添加し、氷上で３０分間反応させた。培地を用いて２回洗浄後、二次抗体として抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で氷上３０分反応させた。培地で２回洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２下で０、１５、３０、６０、１２０分間培養を行ない、ＰＢＳ（−）で２回洗浄た後に蛍光顕微鏡（ＢＺ８１００、キーエンス社）を用いて解析を行った。結果を図１１Ｂに示す。
図１１Ｂは、ＨＣＴ１１６あるいはＳＫ−ＢＲ３において、抗体が経時的に細胞に取り込まれることを示している。０分すなわち染色直後はほとんどの抗体が細胞膜上に結合しているが、１５分以降では細胞内に取り込まれてゆき、６０分以降ではほとんどの抗体が細胞内に取り込まれていた。すなわち、４０２ヒト−マウスキメラ抗体は、細胞表面上のＳＬＣ６Ａ６と結合した後、細胞内に取り込まれることが確認された。
【実施例１２】
【０１８９】
内在化機構の解析
Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎは細胞のエンドサイトーシスによって行われる。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞分子の違いによって異なるが大きく分けて、クラスリン依存性エンドサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、ピノサイトーシスに分類されている。
受容体のような膜タンパク質の多くはクラスリン依存性エンドサイトーシスによって取り込まれ、その解析にはエンドサイトーシス阻害剤が利用される。【０１９０】
クラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用い、実施例１１で観察された４０２ヒト−マウスキメラ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが阻害されるかを解析した。【０１９１】
（１）二次抗体を用いた解析
上記実施例１１（２）記載の方法と同様にＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ上で培養したＨＣＴ１１６細胞に０．５ｍｇ／ｍＬとなるようＣｏｎＡを混合した培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６０分間培養を行った。培地で２回洗浄後、実施例１３（２）記載の方法と同様に一次抗体、二次抗体を用いて細胞を染色し、０、１５、３０、６０、１２０分後に蛍光顕微鏡を用いて解析を行った。【０１９２】
図１２は、ＣｏｎＡで前処理することにより、４０２ヒト−マウスキメラ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが観察した期間中において阻害されることを示している。左のパネルはＣｏｎＡを含まない場合の経時的な変化を示しており、右のパネルはＣｏｎＡを含んだ場合の結果を示している。ＣｏｎＡで前処理することにより、本来細胞の内部に抗体が輸送される培養時間においても、抗体が細胞表面上に留まっていることが示された。このことから、細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６に結合した４０２ヒト−マウスキメラ抗体は、クラスリン依存性エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることが確認された。【０１９３】
（２）蛍光標識抗体を用いた解析
４０２ヒト−マウスキメラ抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を用いて標識を行った。ＨＣＴ１１６細胞をＣｏｎＡ処理した場合としなかった場合それぞれを準備し、氷上で２０分間静置した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識した４０２ヒト−マウスキメラ抗体を３０μｇ／ｍＬとなるよう培地で希釈した溶液と氷上で３０分間反応させ、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に蛍光顕微鏡で解析を行った（図１３Ａ）。【０１９４】
同様にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識した、アイソタイプコントロール（ネガティブコントロールとしてＷｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧを使用）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、４０２ヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４０２）、４３０ヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４３０）、４Ｂ９ｂヒト−マウスキメラ抗体（キメラ４Ｂ９ｂ）を対象として、次の二通りの方法で処理した細胞を用いたフローサイトメトリーにより、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを解析した。【０１９５】
第一の方法として以下の操作を実施した。培養ディッシュから解離させた細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［ＰＢＳ（−）−３％ウシ胎児血清］に懸濁した。この細胞懸濁液に、細胞内に取り込まれた後にリソソーム内で抗体が分解されることを防ぐため、プロテアーゼの阻害剤を加えた（終濃度１０μｇ／ｍＬロイペプチン、５μＭペプスタチン）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗体を終濃度３０μｇ／ｍＬで細胞懸濁液に加えた後、室温にて１時間ローテーターでローテーションした。さらに３７℃にてローテーターで３時間ローテーションした後にＳｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した細胞に対して、蛍光シグナルをフローサイトメトリーにより測定した（図１３Ｂ；アイソタイプコントロール、キメラ抗体）。【０１９６】
第二の方法は、第一の方法で得た細胞の蛍光が細胞内に取り込まれた抗体に結合した色素によるものであることを確認するために、第一の方法で得た細胞に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合し蛍光を消光させる抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体）を終濃度５０μｇ／ｍＬ、４℃で１時間反応させて、蛍光強度の変化を観察した（図１３Ｂ；表面消光）。この方法では細胞表面に残存する抗体の蛍光は抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体により消光されるが、細胞の内部に移行された抗体は抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体によって消光されない。【０１９７】
従って、二通りの方法で得た細胞の蛍光量の差によって細胞膜上で結合した抗体がどの程度細胞内に取り込まれたかを知ることができる。【０１９８】
図１３Ａは、直接標識した４０２ヒト−マウスキメラ抗体（ｃ４０２）が、氷上でも細胞内に取り込まれることを示している。ＣｏｎＡ処理せず氷上で３０分間反応させた場合、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の蛍光は、そのほとんどが細胞の内部に見られた。一方、ＣｏｎＡ処理した細胞の場合は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の蛍光は細胞膜表面上に留まっていた。このことから、４０２ヒト−マウスキメラ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎは、氷上（約１℃）においても進むことが確認された。【０１９９】
図１３Ｂでは、フローサイトメトリーで測定することで、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを解析した。アイソタイプコントロールのシグナルが、抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体の添加（表面消光）により、非染色細胞のシグナルまで低下した。このことは細胞表面上の蛍光はＡｎｔｉ−Ａｌｅｘａ４８８抗体により消光されることを示している。また、抗ＥＧＦＲ抗体であり、薬物を結合させてｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎによりがん細胞に取り込ませることが熱心に研究されているセツキシマブ（登録商標アービタックス）においては、抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体を反応させること（表面消光）で蛍光が一部消失していた。一方で、４０２、４３０、及び４Ｂ９ｂのマウス−ヒトキメラ抗体においては、抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体の添加による蛍光の消失が見られなかった。これらの結果は、本願発明の抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体は、単に細胞表面上のＳＬＣ６Ａ６に結合しているわけではなく、細胞内に内在化していること、また、セツキシマブの場合よりも多くの抗体が細胞内に取り込まれていることを意味している。さらに、４０２と４３０のヒトーマウスキメラ抗体は、４Ｂ９ｂヒト−マウスキメラ抗体よりも、より多く細胞内に取り込まれた。【０２００】
本実施例におけるこれらの結果から、抗体に結合させるのを色素ではなく毒素や放射性物質などの細胞障害活性を持った物質にした場合には、本発明の抗体コンジュゲートはより大きな細胞障害活性を示すことが期待される。したがって、本発明の抗体コンジュゲート及び当該コンジュゲートを含む組成物は、医薬品（例えば癌治療用医薬品）としての効果が大きいことが想定される。【０２０１】
また、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎする抗体として解析の進んでいる抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）では、氷上で反応させた場合に細胞内に取り込まれることは報告されていないことから、４０２ヒト−マウスキメラ抗体のＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎは極めて効率よく進んでいると考えられる。すなわち、取り込まれる効率が極めて良いことによって、低濃度の抗体−薬剤コンジュゲートでもがん細胞を殺傷出来ると考えられる。
【実施例１３】
【０２０２】
（１）抗体−薬剤複合体による影響
細胞内に抗体が取り込まれることを利用して、がん細胞の増殖を抑制できるか解析した。ＨＴ−２９またはＳＷ４８０細胞を１０μｇ／ｍＬのｐＨ３．０で精製した４１９抗体と１時間、４℃で反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。ここにサポリン標識された抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）あるいは未標識の抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を１０ｎＭとなるよう添加し、３０分間、４℃で反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。サポリンはリボソーム不活性化活性を有しており、細胞内に取り込まれた場合にのみ細胞増殖を抑制する。これらの細胞を３７℃で３日間培養を行った後、細胞の増殖をＷＳＴ−８（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて測定した。図１４Ａにその結果を示す。【０２０３】
図１４Ａにおいて、黒色はサポリン標識された二次抗体を含まない場合の細胞増殖を、灰色はサポリン抗体を１０ｎＭとなるよう添加した場合の細胞増殖を示す。図１４Ａは、サポリン標識した二次抗体を添加した場合に、ＨＴ−２９及びＳＷ４８０の両方で細胞の増殖が抑制されていることが示されている。つまり、リボソーム阻害毒素であるｓａｐｏｒｉｎを結合させた抗マウス抗体とマウスモノクローナル抗体とを反応させ、これらの抗体が細胞内に取り込まれることにより、がん細胞の増殖が抑制されることが示された。【０２０４】
（２）Ｓａｐｏｒｉｎ標識二次抗体を用いた影響
抗体が細胞内に取り込まれることを利用して、がん細胞の増殖を抑制できるか解析した。ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６細胞を９６ｗｅｌｌプレートに、２．５×１０３個／ｗｅｌｌとなるよう細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。ＨＣＴ１１６細胞に、終濃度が０．１あるいは０．３μＭのマウス抗体と９ｎＭのｓａｐｏｒｉｎ標識された抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）になるように調製した混合溶液を添加した。ｓａｐｏｒｉｎはリボソーム不活性化活性を有しており、細胞内に取り込まれた場合にのみ細胞増殖を抑制する。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養を行った後、細胞の増殖をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて測定した。図１４にその結果を示す。【０２０５】
図１４には、マウス４０２と４３０抗体をＨＣＴ１１６細胞に添加した場合のみ抗体濃度依存的に増殖が抑制されていることが示されている。つまり、リボソーム阻害毒素であるｓａｐｏｒｉｎを結合させた抗マウス抗体とマウス４０２、４３０抗体とを反応させ、これらの抗体が細胞内に取り込まれることにより、がん細胞の増殖が抑制されることが示された。この結果より４０２、４３０抗体に薬剤を結合させたコンジュゲートを用いた場合に高い細胞障害活性を持つことが示され、医薬品にした場合に高い抗腫瘍効果を持つことが期待される。【０２０６】
配列番号１：ヒトＳＬＣ６Ａ６をコードする塩基配列。
配列番号２：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列。
配列番号３：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３〜２１６のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号４：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３〜２１６のアミノ配列。
配列番号５：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号６：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号７：プライマー配列、Ｌｏｎｇ
配列番号８：プライマー配列、Ｓｈｏｒｔ
配列番号９：プライマー配列、ｍＩｇＧ２ａ＿ＣＨ１＿ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号１０：プライマー配列、ｍＩｇｋａｐｐａ＿Ｒ３
配列番号１１：オリゴＤＮＡ配列、ｈＨｃｈａｉｎ
配列番号１２：プライマー配列、ｈＣｇ１＿Ｆ
配列番号１３：プライマー配列、ｈＣｇＩ＿Ｒ
配列番号１４：プライマー配列、Ｈｃｈａｉｎ＿ｓｉｇｎａｌ＿ｔｏｐ
配列番号１５：プライマー配列、Ｈｃｈａｉｎ＿ｓｉｇｎａｌ＿ｂｏｔｔｏｍ
配列番号１６：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号１７：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号１８：オリゴＤＮＡ配列、ｈＬｃｈａｉｎ
配列番号１９：プライマー配列、ｈＣｋ＿Ｆ
配列番号２０：プライマー配列、ｈＣｋ＿Ｒ
配列番号２１：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ２
配列番号２２：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ２
配列番号２３：ヒト‐マウスキメラ化２０５抗体の重鎖の塩基配列
配列番号２４：ヒト‐マウスキメラ化２０５抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒト‐マウスキメラ化２０５抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号２６：ヒト‐マウスキメラ化２０５抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２７：ヒト‐マウスキメラ化４０２抗体の重鎖の塩基配列
配列番号２８：ヒト‐マウスキメラ化４０２抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２９：ヒト‐マウスキメラ化４０２抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号３０：ヒト‐マウスキメラ化４０２抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３１：ヒト‐マウスキメラ化４１９抗体の重鎖の塩基配列
配列番号３２：ヒト‐マウスキメラ化４１９抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３３：ヒト‐マウスキメラ化４１９抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号３４：ヒト‐マウスキメラ化４１９抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３５：ヒト‐マウスキメラ化３０３抗体の重鎖の塩基配列
配列番号３６：ヒト‐マウスキメラ化３０３抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３７：ヒト‐マウスキメラ化３０３抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号３８：ヒト‐マウスキメラ化３０３抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３９：ヒト‐マウスキメラ化４２２抗体の重鎖の塩基配列
配列番号４０：ヒト‐マウスキメラ化４２２抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号４１：ヒト‐マウスキメラ化４２２抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号４２：ヒト‐マウスキメラ化４２２抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４３：ヒト‐マウスキメラ化４３０抗体の重鎖の塩基配列
配列番号４４：ヒト‐マウスキメラ化４３０抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号４５：ヒト‐マウスキメラ化４３０抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号４６：ヒト‐マウスキメラ化４３０抗体の軽鎖のアミノ酸配列
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明により、少なくとも１種類の抗がん剤、トキシンまたはラジオアイソトープに結合されている抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体または抗原結合断片を含む抗体コンジュゲート、当該抗体コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と特異的に結合し、内在化するため、本発明の抗体コンジュゲートおよび医薬組成物は、がん治療、特に大腸がん治療用医薬組成物として有用である。当該抗体は、ヒト化、またはキメラ化されたものでもよいため、ヒトに適用された際の副作用を軽減することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２０８】
配列番号５〜４６：合成ＤＮＡ
［配列表］
2015108203.tif 000051
2015108203.tif 000052
2015108203.tif 000053
2015108203.tif 000054
2015108203.tif 000055
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2015108203.tif 000060
2015108203.tif 000061
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2015108203.tif 000069
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2015108203.tif 000085
2015108203.tif 000086
【図１】
2015108203.tif 000087
【図２】
2015108203.tif 000088
【図３】
2015108203.tif 000089
【図４】
2015108203.tif 000090
【図５】
2015108203.tif 000091
【図６】
2015108203.tif 000092
【図７】
2015108203.tif 000093
【図８】
2015108203.tif 000094
【図９】
2015108203.tif 000095
【図１０】
2015108203.tif 000096
【図１１Ａ】
2015108203.tif 000097
【図１１Ｂ】
2015108203.tif 000098
【図１２】
2015108203.tif 000099
【図１３Ａ】
2015108203.tif 000100
【図１３Ｂ】
2015108203.tif 000101
【図１４Ａ】
2015108203.tif 000102
【図１４Ｂ】
2015108203.tif 000103
【国際調査報告】
2015108203.tif 000104
2015108203.tif 000105
2015108203.tif 000106
2015108203.tif 000107