(57)【要約】本発明は、がん特異的に発現している標的分子を見出し、この標的分子に特異的に作用してがんを治療できる抗がん剤を提供すること、及び、試料中の標的分子を測定する工程を含むがんの検査方法を提供することを課題とする。本発明は、抗transmembrane protein 180（TMEM-180）抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む抗がん剤を提供する。また、本発明は、被検者から採取された試料中のTMEM-180量を測定する工程を含む、がんの検査方法を提供する。
2016039321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗transmembrane protein 180（TMEM-180）抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む抗がん剤。
【請求項２】
抗がん活性を有する物質を結合させた抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む抗がん剤。
【請求項３】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFSLTRYNVH（配列番号：１）；
重鎖CDR2：VIWTGGSTD（配列番号：２）；
重鎖CDR3：DLGY（配列番号：３）；
軽鎖CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN（配列番号：４）；
軽鎖CDR2：QVSKLDS（配列番号：５）；及び
軽鎖CDR3：CQGSYSPHT（配列番号：６）。
【請求項４】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFSLTSYYMQ（配列番号：７）；
重鎖CDR2：FIRSGGSTE（配列番号：８）；
重鎖CDR3：AFYGGYYFDY（配列番号：９）；
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD（配列番号：１０）；
軽鎖CDR2：KASNRYT（配列番号：１１）；及び
軽鎖CDR3：MQSNTKYT（配列番号：１２）。
【請求項５】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFTFSDYAMA（配列番号：４０）；
重鎖CDR2：TIIYDGSST（配列番号：４１）；
重鎖CDR3：HWYWYFDF（配列番号：４２）；
軽鎖CDR1：LASEGISNDLA（配列番号：４３）；
軽鎖CDR2：AASRLQD（配列番号：４４）；及び
軽鎖CDR3：QQSYKYPLT（配列番号：４５）。
【請求項６】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：DCALN（配列番号：４８）；
重鎖CDR2：WINTQTGKPTYADDF（配列番号：４９）；
重鎖CDR3：EDYGYFDY（配列番号：５０）；
軽鎖CDR1：QASQNINKFIA（配列番号：５１）；
軽鎖CDR2：YTSTLVS（配列番号：５２）；及び
軽鎖CDR3：LQYDNLR（配列番号：５３）。
【請求項７】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：NYGMH（配列番号：５６）；
重鎖CDR2：SISPSGGSTYYRDSV（配列番号：５７）；
重鎖CDR3：SASITAYYYVMDA（配列番号：５８）；
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD（配列番号：５９）；
軽鎖CDR2：KASNRYT（配列番号：６０）；及び
軽鎖CDR3：MQSNSYPPT（配列番号：６１）。
【請求項８】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：NYWMT（配列番号：６４）；
重鎖CDR2：SITNTGGSTYYPDSV（配列番号：６５）；
重鎖CDR3：AGYSSYPDYFDY（配列番号：６６）；
軽鎖CDR1：KAGQNIYNYLA（配列番号：６７）；
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：６８）；及び
軽鎖CDR3：QQYSSGW（配列番号：６９）。
【請求項９】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：DYWVS（配列番号：７２）；
重鎖CDR2：EIYPNSGATNFNENFK（配列番号：７３）；
重鎖CDR3：DGTMGIAYYFDY（配列番号：７４）；
軽鎖CDR1：KASQNINRYLN（配列番号：７５）；
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：７６）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSWPYT（配列番号：７７）。
【請求項１０】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SYDIS（配列番号：８０）；
重鎖CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK（配列番号：８１）；
重鎖CDR3：IHGGYRYWFAY（配列番号：８２）；
軽鎖CDR1：RASSSVSYMH（配列番号：８３）；
軽鎖CDR2：DTSKLAS（配列番号：８４）；及び
軽鎖CDR3：LQRSSYPPT（配列番号：８５）。
【請求項１１】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：８８）；
重鎖CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS（配列番号：８９）；
重鎖CDR3：EYMGFDY（配列番号：９０）；
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９１）；
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：９２）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSYPRT（配列番号：９３）。
【請求項１２】
前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、請求項１又は２に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：９６）；
重鎖CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS（配列番号：９７）；
重鎖CDR3：EEKGFAY（配列番号：９８）；
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９９）；
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：１００）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSYPRA（配列番号：１０１）。
【請求項１３】
前記抗TMEM-180抗体は、
前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3の少なくとも1つに、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む；又は
前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3の少なくとも1つが、前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３から１２のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項１４】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項１５】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項１６】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項１７】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項１８】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項１９】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項２０】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項２１】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項２２】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項２３】
前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項２４】
前記抗TMEM-180抗体は、
Fc領域に1以上のN-結合型糖鎖が結合し、該N-結合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項１から２３のいずれか１項に抗がん剤。
【請求項２５】
TMEM-180を発現しているがんを対象とする、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項２６】
大腸がんを対象とする、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項２７】
配列番号１０４〜１７０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも１つ含む組成物を用いたがんワクチン療法と併用して投与される、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項２８】
請求項３から２４のいずれか１項に記載の抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
請求項３から１３のいずれか１項に記載の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のいずれか1つをコードする核酸。
【請求項３０】
請求項１４から２３のいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖のいずれか１つをコードする核酸。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の形質転換体で抗体を発現させる工程と、
前記抗体を回収する工程と、
を含む抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法。
【請求項３４】
被検者から採取された試料中のTMEM-180量を測定する工程を含む、がんの検査方法。
【請求項３５】
前記TMEM-180量の測定を、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを用いたイムノアッセイで行う、請求項３４に記載のがんの検査方法。
【請求項３６】
前記抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントが、請求項２８に記載の抗TMEM-180抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項３５に記載のがんの検査方法。
【請求項３７】
大腸がんを対象とする、請求項３４から３６のいずれか１項に記載のがんの検査方法。
【請求項３８】
治療後の再発又は転移の検査に用いられる、請求項３４から３７に記載のがんの検査方法。
【請求項３９】
抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを含むがんの検査用キット。
【請求項４０】
前記抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントが、請求項２８に記載の抗TMEM-180抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項３９に記載のがんの検査用キット。
【請求項４１】
大腸がんを対象とする、請求項３９又は４０に記載のがんの検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗TMEM-180抗体、抗TMEM-180抗体を含む抗がん剤、試料中のTMEM-180を測定するがんの検査方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗がん剤として、特定の分子に特異的に作用する分子標的薬が多数開発されている。特に、あるがん細胞に特異的に発現している分子や、がん細胞において発現が亢進している分子を抗原とした様々な抗体医薬の開発が進められている。このような抗体医薬の開発では、まず、手術の際に採取したがん組織におけるmRNA発現と、その近傍から採取した正常組織におけるmRNAの発現を比較して、がん組織のみに特異的に発現している分子や、がん組織において発現が亢進している分子を特定し、これを抗原として抗体を作製する。【０００３】
大腸がんは、大腸粘膜の細胞から発生するがんである。これまでに、上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）を標的とする抗体であるセツキシマブが開発され、大腸がんに使用されている（非特許文献１−３）。しかしながら、EGFRは正常組織でも発現しているため、セツキシマブは正常組織にも作用する可能性があり、より特異的に大腸がんに発現する分子を標的とした分子標的薬の開発が望まれていた。この点、大腸がんが発生する粘膜組織はわずかしか存在しないため、がん化した粘膜細胞と正常な粘膜細胞を比較して標的分子を特定することが難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cunningham D. et al., The New England Journal of Medicine., Vol.351, No.4, 2004, p.p.337-345.
【非特許文献２】Goldstein NI. Et al., Clin Cancer Res. Vol.1, 1311-1318, 1995.
【非特許文献３】Karapetis CS. Et al., The New Engl J Med. Vol.359, 1757-1765.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、がん特異的に発現している標的分子を見出し、この標的分子に特異的に作用することによってがんを治療できる抗がん剤を提供すること、及び、試料中の標的分子を測定する工程を含むがんの検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、各種大腸がん細胞株と、大腸内視鏡検査の際の洗浄液に含まれていた正常粘膜細胞とにおけるmRNAの発現をDNAマイクロアレイで解析して比較し、大腸がん細胞株でのみ発現している分子を探索した。その結果、すべての大腸がん細胞株で発現している一方、健常者の細胞では発現が認められないタンパク質としてtransmembrane protein 180（TMEM-180）を同定した。さらに、定量性PCRとin situ hybridization法により、TMEM-180が正常大腸組織には発現していないことを確認するとともに、主要な正常組織でTMEM-180が発現していないことを確認し、TMEM-180が抗がん剤の標的として、また、がんの検査における指標として理想的な分子であることを確認した。
そして、TMEM-180に対する抗体を作製し、この抗体が大腸がん細胞に対する殺細胞効果を示すこと、また、従前の大腸がんマーカーよりも特に再発を感度よく検出できることを確認して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕抗transmembrane protein 180（TMEM-180）抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む抗がん剤；
〔２〕抗がん活性を有する物質を結合させた抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む抗がん剤；
〔３〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFSLTRYNVH（配列番号：１）；
重鎖CDR2：VIWTGGSTD（配列番号：２）；
重鎖CDR3：DLGY（配列番号：３）；
軽鎖CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN（配列番号：４）；
軽鎖CDR2：QVSKLDS（配列番号：５）；及び
軽鎖CDR3：CQGSYSPHT（配列番号：６）；
〔４〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFSLTSYYMQ（配列番号：７）；
重鎖CDR2：FIRSGGSTE（配列番号：８）；
重鎖CDR3：AFYGGYYFDY（配列番号：９）；
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD（配列番号：１０）；
軽鎖CDR2：KASNRYT（配列番号：１１）；及び
軽鎖CDR3：MQSNTKYT（配列番号：１２）；
〔５〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：GFTFSDYAMA（配列番号：４０）；
重鎖CDR2：TIIYDGSST（配列番号：４１）；
重鎖CDR3：HWYWYFDF（配列番号：４２）；
軽鎖CDR1：LASEGISNDLA（配列番号：４３）；
軽鎖CDR2：AASRLQD（配列番号：４４）；及び
軽鎖CDR3：QQSYKYPLT（配列番号：４５）；
〔６〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：DCALN（配列番号：４８）；
重鎖CDR2：WINTQTGKPTYADDF（配列番号：４９）；
重鎖CDR3：EDYGYFDY（配列番号：５０）；
軽鎖CDR1：QASQNINKFIA（配列番号：５１）；
軽鎖CDR2：YTSTLVS（配列番号：５２）；及び
軽鎖CDR3：LQYDNLR（配列番号：５３）；
〔７〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：NYGMH（配列番号：５６）；
重鎖CDR2：SISPSGGSTYYRDSV（配列番号：５７）；
重鎖CDR3：SASITAYYYVMDA（配列番号：５８）；
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD（配列番号：５９）；
軽鎖CDR2：KASNRYT（配列番号：６０）；及び
軽鎖CDR3：MQSNSYPPT（配列番号：６１）；
〔８〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：NYWMT（配列番号：６４）；
重鎖CDR2：SITNTGGSTYYPDSV（配列番号：６５）；
重鎖CDR3：AGYSSYPDYFDY（配列番号：６６）；
軽鎖CDR1：KAGQNIYNYLA（配列番号：６７）；
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：６８）；及び
軽鎖CDR3：QQYSSGW（配列番号：６９）；
〔９〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：DYWVS（配列番号：７２）；
重鎖CDR2：EIYPNSGATNFNENFK（配列番号：７３）；
重鎖CDR3：DGTMGIAYYFDY（配列番号：７４）；
軽鎖CDR1：KASQNINRYLN（配列番号：７５）；
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：７６）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSWPYT（配列番号：７７）；
〔１０〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SYDIS（配列番号：８０）；
重鎖CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK（配列番号：８１）；
重鎖CDR3：IHGGYRYWFAY（配列番号：８２）；
軽鎖CDR1：RASSSVSYMH（配列番号：８３）；
軽鎖CDR2：DTSKLAS（配列番号：８４）；及び
軽鎖CDR3：LQRSSYPPT（配列番号：８５）；
〔１１〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：８８）；
重鎖CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS（配列番号：８９）；
重鎖CDR3：EYMGFDY（配列番号：９０）；
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９１）；
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：９２）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSYPRT（配列番号：９３）；
〔１２〕前記抗TMEM-180抗体が、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤：
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：９６）；
重鎖CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS（配列番号：９７）；
重鎖CDR3：EEKGFAY（配列番号：９８）；
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９９）；
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：１００）；及び
軽鎖CDR3：LQHNSYPRA（配列番号：１０１）；
〔１３〕前記抗TMEM-180抗体は、
前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3の少なくとも1つに、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む；又は
前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3の少なくとも1つが、前記重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記〔３〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の抗がん剤；
〔１４〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔１５〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔１６〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔１７〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔１８〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
〔１９〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔２０〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔２１〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔２２〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔２３〕前記抗TMEM-180抗体は、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；若しくは、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
及び／又は、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；若しくは、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗がん剤；
〔２４〕前記抗TMEM-180抗体は、
Fc領域に1以上のN-結合型糖鎖が結合し、該N-結合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、上記〔１〕から〔２３〕のいずれか１項に抗がん剤；
〔２５〕TMEM-180を発現しているがんを対象とする、上記〔１〕から〔２４〕のいずれか１項に記載の抗がん剤；
〔２６〕大腸がんを対象とする、上記〔１〕から〔２４〕のいずれか１項に記載の抗がん剤；
〔２７〕配列番号１０４〜１７０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも１つ含む組成物を用いたがんワクチン療法と併用して投与される、上記〔１〕から〔２４〕のいずれか１項に記載の抗がん剤；
〔２８〕上記〔３〕から〔２４〕のいずれか１項に記載の抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメント；
〔２９〕上記〔３〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のいずれか1つをコードする核酸；
〔３０〕上記〔１４〕から〔２３〕のいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖のいずれか１つをコードする核酸；
〔３１〕上記〔２９〕又は〔３０〕に記載の核酸を含む発現ベクター；
〔３２〕上記〔３１〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体；
〔３３〕上記〔３２〕に記載の形質転換体で抗体を発現させる工程と、
前記抗体を回収する工程と、
を含む抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法；
〔３４〕被検者から採取された試料中のTMEM-180量を測定する工程を含む、がんの検査方法；
〔３５〕前記TMEM-180量の測定を、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを用いたイムノアッセイで行う、上記〔３４〕に記載のがんの検査方法；
〔３６〕前記抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントが、上記〔２８〕に記載の抗TMEM-180抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、上記〔３５〕に記載のがんの検査方法；
〔３７〕大腸がんを対象とする、上記〔３４〕から〔３６〕のいずれか１項に記載のがんの検査方法；
〔３８〕治療後の再発又は転移の検査に用いられる、上記〔３４〕から〔３７〕に記載のがんの検査方法；
〔３９〕抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを含むがんの検査用キット；
〔４０〕前記抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントが、上記〔２８〕に記載の抗TMEM-180抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、上記〔３９〕に記載のがんの検査用キット；及び
〔４１〕大腸がんを対象とする、上記〔３９〕又は〔４０〕に記載のがんの検査用キット
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗がん剤は、特定のがんに特異的に発現し、正常組織には発現していないTMEM-180を標的とするので、がん細胞特異的に強い効果を得ることができる一方、副作用は少ないと考えられる。
TMEM-180は特定のがんに特異的に発現し、正常組織には発現していないので、本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるがんの検査方法及び検査用キットによれば、がんの検査を簡便に行うことができる。本発明に係るがんの検査方法及び検査用キットは、従来の大腸がんマーカーに比較して、特にがんの再発を感度よく検出することができる。
また、本発明に係る抗がん活性を有する物質を結合させた抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗がん剤によれば、TMEM-180を発現するがん細胞に、その抗がん剤を特異的に送達させることができるので、抗がん活性を有する物質として毒性の強い物質も利用しやすい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、DNAマイクロアレイにより、ヒト大腸がん細胞株と、健常者由来の大腸粘膜細胞とにおける網羅的発現解析の結果のうち、TMEM-180の発現量を示す。図１Ｂは、大腸がん細胞と隣接正常大腸組織におけるTMEM-180の発現を定量性PCRで解析した結果を示す。図１Ｃ及びＤは、in situ hybridizationにより、がん部及び正常部におけるTMEM-180の発現を調べた結果を示す。
【図２】図２Ａは、データベースを用いて、様々な正常組織におけるTMEM-180の発現を調べた結果を示す。図２Ｂは、図２Ａと同様の方法で、TMEM-180と従来抗がん剤の標的とされている分子について、さらに微量の発現を調べた結果を示す。
【図３】図３は、大腸がん、脳腫瘍、血液がんの各種細胞株について、98クローン、101クローン、及び212クローン抗TMEM-180抗体を用いて行ったフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図４】図４は、98クローン、101クローン、及び212クローン抗TMEM-180抗体による大腸がん細胞に対する蛍光免疫染色の結果を示す。なお、各クローンの抗体濃度は揃えていない。
【図５】図５は、98クローンラットIgM抗体と98クローンラット−ヒトキメラ抗体について、DLD-1大腸がん株とそのTMEM-180ノックアウト株に対する反応性をフローサイトメトリーで調べた結果を示す。
【図６】図６は、98クローンラットIgM抗体によりヒト大腸がんと近接正常部を染色した結果を示す。
【図７】図７は、98クローンラットIgM抗体産生ハイブリドーマ培養上清による細胞障害性試験の結果を示す。ハイブリドーマ培養上清中の抗体濃度は、IgM特異的抗体ELISAで測定した。
【図８】図８は、101クローンラットIgM抗体産生ハイブリドーマ培養上清による細胞障害性試験の結果を示す。ハイブリドーマ培養上清中の抗体濃度は、IgM特異的抗体ELISAで測定した。
【図９】図９は、がん細胞培養上清中のTMEM-180タンパク質濃度を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、ステージ4大腸がん患者4名について、血漿中のTMEM-180タンパク質濃度を測定した結果を示す。また、図中右の表に、同じ患者に由来する検体におけるCEA値の測定結果を示す。
【図１１】図１１は、ステージ3大腸がん患者3名について、術前、術後における血漿中のTMEM-180タンパク質濃度を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、各ステージの大腸がん患者について、術前、術後、及び再発時における血漿中のTMEM-180タンパク質濃度及びCEA濃度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（抗TMEM-180抗体及び抗がん剤）
本発明に係る抗がん剤の一態様は、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む。
本明細書において抗TMEM-180抗体とは、Transmembrane protein-180（TMEM-180）に特異的に結合する抗体をいう。本明細書おいて、TMEM-180という場合、どのような動物に由来するTMEM-180であってもよく、また、抗がん剤の標的となり、がんの検査方法の指標となる限り、その変異体であってもよい。TMEM-180の一例として、ヒトTMEM-180のアミノ酸配列を配列番号：１７に示す。
【００１０】
本明細書において「抗体」は、一対のジスルフィド結合で安定化された2本の重鎖（H鎖）と2本の軽鎖（L鎖）が会合した構造をとるタンパク質をいう。重鎖は、重鎖可変領域VH、重鎖定常領域CH1、CH2、CH3、及びCH1とCH2の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域VLと軽鎖定常領域CLとからなる。この中で、VHとVLからなる可変領域断片（Fv）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、VL、CL、VH、CH1からなる抗原結合領域をFab領域と呼び、ヒンジ領域、CH2、CH3からなる領域をFc領域と呼ぶ。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（complementarity-determining region: CDR）と呼ばれる。CDR以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（framework region: FR）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ3つのCDRが存在し、それぞれN末端側から順に、重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3と呼ばれる。
【００１１】
本発明に係る抗TMEM-180抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗TMEM-180抗体は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEのいずれのアイソタイプであってもよい。マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリなどの非ヒト動物を免疫して作製したものであってもよいし、組換え抗体であってもよく、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体等であってもよい。キメラ型抗体とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結された抗体をいう。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ4つのフレームワーク領域（FR）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、CDR移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。
【００１２】
本明細書において、抗TMEM-180抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗TMEM-180抗体のフラグメントであって、TMEM-180に結合するフラグメントをいう。具体的には、VL、VH、CL及びCH1領域からなるFab；2つのFabがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているF(ab')2；VL及びVHからなるFv；VL及びVHを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるscFvのほか、diabody型、scDb型、tandem scFv型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す98クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：GFSLTRYNVH（配列番号：１）
重鎖CDR2：VIWTGGSTD（配列番号：２）
重鎖CDR3：DLGY（配列番号：３）
軽鎖CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN（配列番号：４）
軽鎖CDR2：QVSKLDS（配列番号：５）
軽鎖CDR3：CQGSYSPHT（配列番号：６）
【００１４】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す101クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：GFSLTSYYMQ （配列番号：７）
重鎖CDR2：FIRSGGSTE （配列番号：８）
重鎖CDR3：AFYGGYYFDY （配列番号：９）
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD （配列番号：１０）
軽鎖CDR2：KASNRYT （配列番号：１１）
軽鎖CDR3：MQSNTKYT （配列番号：１２）
【００１５】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す212クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：GFTFSDYAMA（配列番号：４０）
重鎖CDR2：TIIYDGSST（配列番号：４１）
重鎖CDR3：HWYWYFDF（配列番号：４２）
軽鎖CDR1：LASEGISNDLA（配列番号：４３）
軽鎖CDR2：AASRLQD（配列番号：４４）
軽鎖CDR3：QQSYKYPLT（配列番号：４５）
【００１６】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す129クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：DCALN（配列番号：４８）
重鎖CDR2：WINTQTGKPTYADDF（配列番号：４９）
重鎖CDR3：EDYGYFDY（配列番号：５０）
軽鎖CDR1：QASQNINKFIA（配列番号：５１）
軽鎖CDR2：YTSTLVS（配列番号：５２）
軽鎖CDR3：LQYDNLR（配列番号：５３）
【００１７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す382クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：NYGMH（配列番号：５６）
重鎖CDR2：SISPSGGSTYYRDSV（配列番号：５７）
重鎖CDR3：SASITAYYYVMDA（配列番号：５８）
軽鎖CDR1：KASQNVGSNVD（配列番号：５９）
軽鎖CDR2：KASNRYT（配列番号：６０）
軽鎖CDR3：MQSNSYPPT（配列番号：６１）
【００１８】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す1361クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：NYWMT（配列番号：６４）
重鎖CDR2：SITNTGGSTYYPDSV（配列番号：６５）
重鎖CDR3：AGYSSYPDYFDY（配列番号：６６）
軽鎖CDR1：KAGQNIYNYLA（配列番号：６７）
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：６８）
軽鎖CDR3：QQYSSGW（配列番号：６９）
【００１９】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す669クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：DYWVS（配列番号：７２）
重鎖CDR2：EIYPNSGATNFNENFK（配列番号：７３）
重鎖CDR3：DGTMGIAYYFDY（配列番号：７４）
軽鎖CDR1：KASQNINRYLN（配列番号：７５）
軽鎖CDR2：NANSLQT（配列番号：７６）
軽鎖CDR3：LQHNSWPYT（配列番号：７７）
【００２０】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す699クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：SYDIS（配列番号：８０）
重鎖CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK（配列番号：８１）
重鎖CDR3：IHGGYRYWFAY（配列番号：８２）
軽鎖CDR1：RASSSVSYMH（配列番号：８３）
軽鎖CDR2：DTSKLAS（配列番号：８４）
軽鎖CDR3：LQRSSYPPT（配列番号：８５）
【００２１】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す1052クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：８８）
重鎖CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS（配列番号：８９）
重鎖CDR3：EYMGFDY（配列番号：９０）
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９１）
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：９２）
軽鎖CDR3：LQHNSYPRT（配列番号：９３）
【００２２】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の一態様は、以下の6つのCDRの少なくとも1つを有する。これらのCDRは、後述する実施例に示す1105クローン抗TMEM-180抗体のCDR配列である。
重鎖CDR1：SNGVG（配列番号：９６）
重鎖CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS（配列番号：９７）
重鎖CDR3：EEKGFAY（配列番号：９８）
軽鎖CDR1：KASQNVGINVG（配列番号：９９）
軽鎖CDR2：WASNRDT（配列番号：１００）
軽鎖CDR3：LQHNSYPRA（配列番号：１０１）
【００２３】
上記の各態様において、抗TMEM-180抗体は、本発明の効果を奏する限り、6つのCDRのうちいくつを含むものであってもよいが、例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、又は6つ含むものとすることができる。
【００２４】
上記の各態様において、重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3は、その少なくとも1つに、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含んでいてもよい。
【００２５】
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書においてアミノ酸又はその誘導体としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
本明細書において「1から数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるポリペプチドがCDRとしての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば、1個、2個、3個又は4個とすることができる。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のタンパク質性アミノ酸に加えて、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであってもよい。アミノ酸の欠失、置換又は付加の位置は、CDRとしての機能が保持される限り、もとのCDR配列のどこであってもよい。
【００２７】
上記の抗TMEM-180抗体の各態様において、重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3の少なくとも1つが、もとの重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものとなっていてもよい。
【００２８】
本明細書において、「80％以上の同一性を有する」とは、元の配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列と変異した配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、元の配列のアミノ酸数の80％以上であることを意味する。
同一性は、80％以上であって、CDRとしての機能を保持する限り何％であってもよく、例えば85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上とすることができる。
【００２９】
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列にアミノ酸を付加、置換、又は欠失させたアミノ酸配列からなるCDRや、重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するCDRは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、CDRウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。これらの方法によれば、ファージディスプレイ法によってCDRに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したCDRを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J. Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)。）。
【００３０】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列は、98クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３１】
本明細書において、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失という場合、付加、置換、又は欠失するアミノ酸の数は、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、又は10個とすることができる。その他の用語は、上述したとおりである。
【００３２】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列は、98クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３３】
本発明に係る抗TMEM-180抗体は、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列は、101クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３５】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列は、101クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３６】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００３７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列は、212クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３８】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列は、212クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３９】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００４０】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：５４で表されるアミノ酸配列は、129クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４１】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列は、129クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４２】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：５４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００４３】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列は、382クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４４】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列は、382クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４５】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：６３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：６３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：７０で表されるアミノ酸配列は、1361クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列は、1361クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４８】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：７０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：７０で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：７０で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：７１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：７１で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：７８で表されるアミノ酸配列は、669クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５０】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列は、669クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５１】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：７８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：７８で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：７８で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：７９で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：７９で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列は、699クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５３】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列は、699クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５４】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：８７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：８７で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００５５】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：９４で表されるアミノ酸配列は、1052クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５６】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列は、1052クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：９４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：９４で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：９４で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列は、1105クローン抗TMEM-180抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５９】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列は、1105クローン抗TMEM-180抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６０】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の別の一態様は、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖、又は配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明に係る抗TMEM-180抗体は、Fc領域に１以上のN-結合型糖鎖が結合し、該N-結合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体であってもよい。
例えばIgG抗体のFc領域には、N-結合型糖鎖の結合部位が2ヶ所存在し、この部位に複合型糖鎖が結合している。N-結合型糖鎖とは、Asn-X-Ser/Thr配列のAsnに結合する糖鎖をいい、共通した構造Man3GlcNAc2-Asnを有する。非還元末端の2つのマンノース（Man）に結合する糖鎖の種類により、高マンノース型、混成型、及び複合型等に分類される。
N-結合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）にはフコースが結合しうるが、このフコースが結合していない場合、結合している場合に比較してADCC活性が著しく上昇することが知られている。このことは例えば、国際公開第2002/031140号パンフレットに記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ADCC活性が著しく向上することにより、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくすることができるので、副作用を軽減させることが可能であると共に、治療費も低減させることができる。
【００６２】
本発明に係る抗がん剤の一態様は、抗がん活性を有する物質を結合させた抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む。この態様において、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントは、それ自体抗がん活性を有するものであってもよいし、TMEM-180への結合能のみを有し抗がん活性を有しないものであってもよい。
【００６３】
本明細書において、「抗がん活性を有する物質」とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる物質を意味する。具体的には、毒素、抗がん剤、ラジオアイソトープを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６４】
抗がん活性を有する毒素としては、例えば、緑膿菌外毒素（PE）又はその細胞障害性フラグメント（例えばPE38）、ジフテリア毒素、リシンA等が挙げられる。抗がん活性を有する毒素は、抗TMEM-180抗体が認識する細胞、即ちTMEM-180を発現しているがん細胞のみに毒性を発揮するので、周囲の細胞に悪影響を与えず、特異的に効果を得られるという利点がある。
【００６５】
抗がん剤としては、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、アクラシノマイシン、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミド、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、デキサメタゾン等の低分子化合物や、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン（例えば、ヒトインターロイキン2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン12）等のタンパク質が挙げられる。
【００６６】
抗がん活性を有するラジオアイソトープとしては、32P、14C、125I、3H、131I、211At、90Y等が挙げられる。
【００６７】
抗がん活性を有する物質は、公知の方法又はそれに準ずるによって抗TMEM-180抗体に直接又はリンカーを介して結合させることができる。抗がん活性を有する物質をミセルやリポソーム等の担体に封入し、当該リポソームを抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントに結合させてもよい。
【００６８】
上記抗がん活性を有する物質が蛋白質やポリペプチドの場合は、本発明の抗TMEM-180抗体をコードする核酸（後述）と抗がん活性を有する物質をコードするDNAを連結し、適当な発現ベクターに挿入することにより、抗がん活性を有する物質と抗TMEM-180抗体との融合タンパク質として発現させてもよい。
【００６９】
本明細書において「抗がん剤」は、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる医薬を意味する。
【００７０】
本発明に係る抗がん剤は、有効成分に加えて薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。
担体及び添加物の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、TMEM-180を発現しているがんの治療に有効である。TMEM-180を発現しているがんには、大腸がんと脳腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
本発明は、本発明に係る抗がん剤を投与することを含むがんの治療方法も包含する。
本発明の抗がん剤の投与量は、例えば、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントの投与量が、0.025〜50mg/kg、好ましくは0.1〜0mg/kgであり、より好ましくは0.1〜25mg/kg、さらに好ましくは0.1〜10mg/kg又は0.1〜3mg/kgとなる量とすることができるが、これに限定されない。
【００７４】
本発明に係る抗がん剤は、他のがん治療法と組合せてもよい。他のがん治療法としては、上述した別の抗がん剤の投与、放射線療法、外科的手術、がんワクチン療法などが挙げられる。
本明細書において「がんワクチン療法」とは、がん抗原を患者に投与して、又は患者由来の免疫細胞を体外においてがん抗原で刺激してから患者に戻すことによって、がん細胞に対する患者自身の免疫力を高めるがんの治療又は予防方法である。がんワクチン療法に用いられるがん抗原の一例として、がん細胞特異的に発現するタンパク質に由来するペプチド（がん抗原由来ペプチド）が用いられる。
【００７５】
がん抗原由来ペプチドは、樹状細胞などの抗原提示細胞表面のヒト白血球抗原（HLA）分子に結合して、細胞傷害性T細胞（CTL）に提示されことによってCTLを活性化する。活性化されたCTLは、当該ペプチドと同じ抗原を発現する癌細胞を攻撃して排除する。HLA分子は遺伝的多様性が高く、ヒトによって遺伝子型が異なる。あるがん抗原タンパク質に由来し、特定の遺伝子型のHLA分子に結合する可能性のあるペプチドの配列は、公知のソフトウエア等で決定することができる。
【００７６】
例えば、TMEM-180タンパク質に由来するペプチドであって、日本人に多いHLA type A2又はHLA type A24に結合する可能性のあるペプチドは以下のとおりである（米国国立衛生研究所 Bioinformatics and Molecular Analysis Sectionが公開しているHLAPeptide Binding Predictions（http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform）を使用して予測した。）。表中「Start Ppositions」は、配列番号：１７に示すアミノ酸配列における位置である。
これらのペプチドを用いたがんワクチン療法によれば、TMEM-180タンパク質を発現するがん細胞に対するCTLによる攻撃を活性化することができるので、TMEM-180を標的とする本発明に係る抗がん剤と併用することにより、がん細胞を効率よく攻撃することができ、がんを予防又は治療することが可能である。ペプチドを含むがんワクチン組成物は、公知の方法に従って、当業者が調製することができる。
【００７７】
【表１−１】
2016039321.tif 000003
【表１−２】
2016039321.tif 000004
【表２】
2016039321.tif 000005
【００７８】
（核酸）
本発明は、本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸も包含する。核酸は、天然の核酸であっても人工の核酸であってもよく、例えば、DNA、RNA、DNAとRNAのキメラが挙げられるがこれらに限定されない。抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸の塩基配列は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法に従って決定することができ、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。
本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸としては、例えば、98クローン抗TMEM-180抗体の重鎖又は軽鎖をコードするDNAを含む核酸、98クローン抗TMEM-180抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のいずれかをコードするDNAを含む核酸、101クローン抗TMEM-180抗体の重鎖又は軽鎖をコードするDNAを含む核酸、101クローン抗TMEM-180抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のいずれかをコードするDNAを含む核酸、212クローン抗TMEM-180抗体の重鎖又は軽鎖をコードするDNAを含む核酸、及び、212クローン抗TMEM-180抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のいずれかをコードするDNAを含む核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
（発現ベクター）
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む。発現ベクターは、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、カリフラワーモザイクウイルスベクターやタバコモザイクウイルスベクターなどの植物ウイルスベクター、コスミド、YAC、EBV由来エピソームなどが挙げられる。これらの発現ベクターには、公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、本発明の抗TMEM-180抗体をコードする核酸を挿入することができる。
【００８０】
本発明に係る発現ベクターは、さらに、抗体遺伝子の発現を調節するプロモーター、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモーター及び複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。
【００８１】
（形質転換体）
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを含む。形質転換体は、本発明のベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって得ることができる。宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞（CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞等）、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞や、大腸菌（E.Coli）、枯草菌などの原核細胞を用いることができる。
【００８２】
（抗体の製造方法）
本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法は限定されないが、例えば、抗TMEM-180モノクローナル抗体は、TMEM-180又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、抗TMEM-180ポリクローナル抗体は、TMEM-180又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。
【００８３】
本発明に係る抗TMEM-180抗体を遺伝子組換え法で作製する場合、例えば、本発明に係る核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製すればよい。
単離精製方法としては、例えば、プロテインA等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析が挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
【００８４】
ヒトキメラ抗体及びヒトCDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのmRNAから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
例えば、ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（LH）をPCRでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む5'プライマーを作製し、5'プライマーと可変部3'プライマーによって上記cDNAから、シグナル配列から可変領域の3'末端までをPCRでクローニングする。一方で、ヒトIgG1の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをPCRによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたDNAを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
【００８５】
CDR移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、CDRの塩基配列を改変する。フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
元の配列において、1又は2個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるCDRや、元の配列にX％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるCDRは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、CDRウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
これらの方法により、ファージディスプレイ法によってCDRに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したCDRを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J. Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)。）。本発明は、このような方法で成熟させたCDRを含む抗体も包含する。
【００８６】
その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンA処理ニワトリB細胞由来DT40細胞株から抗体産生株を取得するAdlib法（Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6:731-736, 2002）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるKMマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Itoh, K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92:1313-1321, 2001；Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151, 1998）等があり、これらも本発明に係る抗体の産生に応用することができる。
【００８７】
本発明に係る抗TMEM-180抗体の抗原結合フラグメントは、当該フラグメントをコードするDNAを用いて上述の方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体を得てからパパイン、ペプシン等の酵素で処理して断片化してもよい。
【００８８】
本発明に係る抗TMEM-180抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明は、かかる抗体も包含する。
【００８９】
本発明に係る抗TMEM-180抗体が、還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していないN-結合型糖鎖を有する抗体である場合、かかる抗体は公知の方法又はそれに準ずる方法に従って製造することができる。かかる抗体の製造方法は、例えば、国際公開第2002/031140号パンフレット、特開2009-225781号公報に記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、例えば、本発明に係る抗TMEM-180抗体をコードするDNAを含むベクターを用いて、GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα-1，6-フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養した後、目的とする抗TMEM-180抗体を精製することによって得ることができる。
GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、例えば、GDP-mannose 4,6-dehydratase（GMP）、GDP-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase,4-reductase（Fx）、GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase（GFPP）が挙げられる。
ここで、細胞は特に限定されないが、哺乳動物細胞が好ましく、例えば上記酵素活性を低下又は欠失されたCHO細胞を用いることができる。
上記方法によって得られる抗体組成物は、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の20重量％以下、好ましくは10重量％以下、さらに好ましくは5重量％以下、最も好ましくは3重量％以下である。
【００９０】
また、還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していないN-結合型糖鎖を有する抗体は、本発明に係る抗TMEM-180抗体をコードするDNAを含むベクターを昆虫卵に導入し、孵化させて昆虫を成長させ、必要に応じて交配を行ってトランスジェニック昆虫を作製し、当該トランスジェニック昆虫又はその分泌物から抗TMEM-180抗体を抽出することによっても得ることができる。昆虫としてはカイコを用いることができ、その場合、繭から抗体を抽出することができる。
この方法によって得られる抗体組成物も、還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の20重量％以下、好ましくは10重量％以下、さらに好ましくは5重量％以下、最も好ましくは3重量％以下である。
【００９１】
（本発明の抗体の活性）
抗体医薬の薬効メカニズムは、抗体が有する2つの生物活性に基づいている。1つは標的抗原特異的な結合活性であり、結合することによって標的抗原分子の機能を中和する活性である。標的抗原分子の機能の中和はFab領域を介して発揮される。
【００９２】
もう1つは、エフェクター活性と呼ばれる抗体の生物活性である。エフェクター活性は、抗体のFc領域を介して、抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC）、補体依存性細胞障害活性（complement-dependent cytotoxicity；CDC）、アポトーシスの直接誘導等の態様で発揮される。
本発明に係る抗TMEM-180抗体の活性は、以下の方法で測定することができる。
【００９３】
（1）結合活性
抗体の結合活性は公知の方法、例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）、蛍光抗体法、FACS法等で、測定することができる。
【００９４】
（2）ADCC活性
ADCC活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に本発明の抗体が結合した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（エフェクター細胞）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
ADCC活性は、TMEM-180を発現している標的細胞とエフェクター細胞と本発明の抗体を混合し、ADCCの程度を測定することによって知ることができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばTMEM-180陽性大腸がん粘膜細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ51Cr等で標識し、これに本発明の抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
【００９５】
（3）CDC活性
CDC活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。
CDC活性は、ADCC活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
【００９６】
（4）腫瘍増殖抑制活性
腫瘍増殖抑制活性は、腫瘍モデル動物を利用して測定することができる。例えば、マウスの皮下に腫瘍を移植し、本発明の抗体を投与する。非投与群と投与群における腫瘍組織の体積を比較することにより、腫瘍増殖抑制効果を測定することができる。
なお、本発明の腫瘍増殖抑制活性は、個々の細胞の増殖を抑制する結果生じるものであっても、細胞死を誘導する結果生じるものであってもよい。
【００９７】
（検査方法及び検査用キット）
上述のとおり、TMEM-180は特定のがん細胞のみにおいて発現している。従って、本発明に係るがんの検査方法は、被検者から採取された試料中のTMEM-180量を測定する工程を含む。
本明細書において、被検者から採取された試料は、がんの検査に適したあらゆる試料とすることができ、がん種によって当業者が適宜決定し採取することができる。例えば血清、血漿、全血、尿、糞便、体腔液、組織が挙げられるがこれらに限定されない。大腸がんの検査の場合、大腸内視鏡等によって被検者から採取した組織や、大腸内視鏡検査後の洗浄液に含まれる粘膜細胞を試料としてもよい。
【００９８】
従来、大腸がんマーカーとしては、がん胎児性抗原（Carcinoembryonic antigen; CEA）が広く用いられている。血漿CEA値は、手術によるがんの切除などの治療により低下するが、再発や転移に伴って再上昇するため、CEA値の測定は治療後の経過観察に用いられる。CEA値の再上昇が認められた場合には、腹部超音波検査や腹部CTによる精密検査が必要となる。しかしながら、大腸がん患者のうち、CEA値が上昇するのは45％にすぎず、CEA値が上昇しないタイプのがん患者は、経過観察のために毎回精密検査を受けなければならない。
【００９９】
これに対し、血漿TMEM-180値は、後述する実施例に示されるとおり、CEA値が上昇しない患者においても上昇が見られ、術後は術前より低下する。さらに、血漿TMEM-180値は、術後一旦低下した後、再発の際に有意な上昇が見られる。特に、再発の際にCEA値が上昇しない患者においても上昇が見られることが示された。したがって、がん患者に広く用いることができる極めて有用性の高いマーカーであると考えられる。
本発明に係るがんの検査方法は、がんの診断に用いてもよく、また術後など治療後の経過観察において、再発や転移の確認に用いてもよい。
【０１００】
本明細書において、「試料中のTMEM-180量を測定する工程」は、TMEM-180量を定量する工程のみならず、TMEM-180量の有無を検出する工程、TMEM-180量の増減を決定する工程、他の試料中のTMEM-180量と比較する工程も含む。
【０１０１】
試料中のTMEM-180量の測定は、試料中の特定のタンパク質量を測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができ、例えば、イムノアッセイ（凝集法、比濁法を含む）、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを用いたイムノアッセイが簡便で有用である。
TMEM-180は膜タンパク質であることから、市販の細胞溶解バッファー、非イオン性界面活性剤、膜タンパク質可溶化試薬等で処理し、膜タンパク質を可溶化してからその量を測定してもよい。
【０１０２】
イムノアッセイは、検出可能に標識した抗TMEM-180抗体、及び／又は検出可能に標識した抗TMEM-180抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（EIA又はELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）、蛍光酵素イムノアッセイ（FLEIA）、化学発光酵素イムノアッセイ（CLEIA）、電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
【０１０３】
ELISA法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、RIA法では、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、FPIA法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、CLIA法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
また、イムノアッセイでは、抗TMEM-180抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
【０１０４】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるELISA法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができる。
ELISA法には競合法とサンドイッチ法がある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを固定し、試料と酵素標識したTMEM-180を添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。試料中のTMEM-180が多ければ発色は弱くなり、試料中のTMEM-180が少なければ発色が強くなるので、検量線を用いてTMEM-180量を求めることができる。
サンドイッチ法では、固相担体に抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを固定し、試料を添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する抗TMEM-180抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、TMEM-180量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と試料中のTMEM-180を反応させた後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、3,3'−diaminobenzidine（DAB）、3,3'5,5'−tetramethylbenzidine（TMB）、o−phenylenediamine（OPD）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、p−nitropheny phosphate（NPP）等を用いることができる。
あるいは、試料中のTMEM-180抗原をマイクロタイタープレートなどの固相担体に直接固定し、必要なブロッキングを行った後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
【０１０５】
本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
【０１０６】
また、イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。
ラテックス粒子に抗TMEM-180抗体を結合させて適宜処理した試料に混合すると、TMEM-180が存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、サンプルに近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）又は散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。
【０１０７】
抗TMEM-180抗体又はその抗体結合フラグメントとしては、上述したCDR配列を有する本発明に係る抗TMEM-180抗体又はその抗体結合フラグメントを用いてもよい。
【０１０８】
本発明に係るがんの検査用キットは、上述した検査方法を使用してがんの検査を行うためのキットであり、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。本発明に係るがんの検査用キットは、抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメントに加え、イムノアッセイによって試料中のTMEM-180量を測定するために必要な試薬や装置を含んでいてもよい。
【０１０９】
検査用キットの一態様は、サンドイッチ法によってTMEM-180を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメント；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗TMEM-180抗体又はその抗原結合フラグメント；及び、アルカリホスファターゼ基質（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
捕捉用抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体を固定し、ここに試料を適宜希釈して添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識した抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、TMEM-180量を求めることができる。
【０１１０】
検査用キットの別の態様は、二次抗体を使用してサンドイッチ法によりTMEM-180を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗TMEM-180抗体；一次抗体としての抗TMEM-180抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗TMEM-180抗体；及び、アルカリホスファターゼ（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
捕捉用抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体を固定し、ここに試料を適宜希釈して添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、TMEM-180を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
【０１１１】
検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含んでいてもよい。
【０１１２】
標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（25I、131I、35S、3H等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。
【０１１３】
検査用キットのさらに別の態様として、ラテックス凝集法によってTMEM-180量を測定するものも挙げられる。このキットは、抗TMEM-180抗体感作ラテックスを含み、試料と抗TMEM-180抗体とを混合し、光学的方法で集塊を定量する。キットに凝集反応を可視化する凝集反応板が含まれていることも好ましい。
【０１１４】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【０１１６】
１．TMEM-180分子の同定
１）DNAマイクロアレイ解析
5種類のヒト大腸がん細胞株（HT29、SW480、LOVO、HCT116、DLD-1）と2種類のヒト健常者由来遊離大腸細胞由来のmRNA各々10μgを使用した。メーカー（Affymetrix）の指示に従いRNAから二本鎖cDNAを経由してビオチン標識されたcRNAを合成した。断片化後に、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix）とハイブリダイゼーションを行った。GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を用いてスキャンを行い、CELデータ取得後に統計処理を行い、各サンプルのシグナル値を算出した。５種類のヒト大腸がん細胞株で発現を認め、２種類の健常者大腸細胞で発現を認めなかった大腸がん細胞特異的表面マーカーとしてTMEM-180を選び出した（図１Ａ）。【０１１７】
２）定量性PCR法
5人の大腸がん患者手術標本について、隣接正常大腸組織を陰性コントロールとする大腸がん細胞組織サンプルcDNA（Clontech）をABI7500Fast（Applied Biosystems）で解析した。20μLの反応液で、10μL 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、1μL 20X TaqMan Gene Expression Assay（Applied Biosystems）を使用した。また、Fast runでAmpliTaq Gold Enzyme Activation 95度、20秒、40サイクル；Denature 95度、3秒；Anneal/Extend 62度、30秒の条件で行った。7500 Fast System SDS ソフトウエアVer.1.3で解析した。各症例について、正常組織でのRNA量に対する大腸がん組織でのRNA量の比を計算した結果を図１Ｂに示す。いずれの症例においてもTMEM-180が正常大腸組織に比べて大腸がん組織で強く発現していることを確認した。【０１１８】
３）in situ hybridization法
大腸がん組織パラフィン切片（Genostaff Co. Ltd.）をキシレンで脱ワックス処理後、エタノール、PBSで水和を行った。切片を４％パラホルムアルデヒド・PBSで15分間固定した。7μg/ml Protreinase K (Roche)を含んだPBSで処理後に、4％パラホルムアルデヒド・PBSで再固定した。0.25％無水酢酸0.1M TrisHCl PH8.0でアセチル化を行った。PBSで洗浄後、エタノールで脱水した。300ng/mlのdigoxigenin標識したTMEM-180のRNAプローブ(475bp, GeneBank登録番号 NM_024789の遺伝子配列1314から1789番目、Genostqaff Co. Ltd.)と60度で16時間のハイブリダイゼーション反応を行った。洗浄後に50μg/ml RNaseA・10mM TrisHCl PH8.0・0.1M NaCl・1mM EDTAで処理した。再洗浄後に、0.5％ブロッキング反応液（Roche）を用いて反応させた後、20％熱処理羊血清(Sigma)添加ブロッキング反応液で1時間反応させた。AP標識抗DIG抗体（Roche）を加え、室温で2時間の反応を行った。洗浄後にNBT/BCIP液（Roche）中で発色を行った。封入後顕微鏡で観察を行った結果を図１Ｃ及びＤに示す。TMEM-180が５種類の大腸がん組織で全て陽性で、正常大腸粘膜では陰性であることを確かめた。【０１１９】
２．TMEM-180の正常組織での発現解析
公的データベースPaxDB； a comprehensive absolute protein abundance database http://pax-db.org/#!home（各タンパク質に特異的なペプチドをLC/MS/MSにより解析することでその発現レベルを測定してある）により、TMEM-180で検索をかけて各正常組織での測定値を調べた。TMEM-180以外に、対照として以下の分子の発現も調べた。
βアクチン（βACT）（ハウスキーピング分子）
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）（ハウスキーピング分子）
上皮成長因子受容体（EGFR）（抗体医薬の標的分子）
HER2（抗体医薬の標的分子）
がん胎児性抗原（CEA）（代表的な腫瘍マーカー分子）
Excel(2010, Microsoft)ファイルにデータを入力してグラフを作成した結果を図２に示す。TMEM-180は正常にはほとんど発現しておらず（図２Ａ）、感度を上げると血小板での発現がわずかに認められたものの、従来の抗体医薬の標的分子であるEGFRやHER2よりはるかに少なく（図２Ｂ）、TMEM-180ががん組織特異的に発現していることが確認された。【０１２０】
３．抗体作製および各種がん細胞に対するFACS
１）抗原作製
［PCR反応］
pET21bに組み込まれているtag配列に対して、以下のプライマーを用いてPCR増幅を行った。
使用PCR酵素：PrimeStar HS DNA polymerase (takara  R010A)
免疫抗原１  作製用プライマー配列
(i) cagacctgcacctgaacgtggttgagagctgaggaattgacggtcactgagggactgtaatgctgcacttcgc（配列番号：１８）
(ii) caaccacgttcaggtgcaggtctgtcttcacgtgctgttgtactggctcgtgttcaagagttcaaactggaggacctg（配列番号：１９）
(iii) gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc（配列番号：２０）
(iv) tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg（配列番号：２１）
免疫抗原２  作製用プライマー配列
(i) gcgaagtgcagcattacagtccgatcatctgagtctgctgtgcctcttcattgc（配列番号：２２）
(ii) caggtcctccagtttgaactcagaagctgcttgcttacgatgattcagcaccaggtcctcgtctac（配列番号：２３）
(iii) gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc（配列番号：２４）
(iv) tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg（配列番号：２５）【０１２１】
［制限酵素処理］
発現用ベクターpET21b及びPCR産物に対し、NdeI(takara)、XhoI(takara)をメーカープロトコールに従い2時間反応させ、1% アガロースゲル電気泳動を行った後、promega wizard SV gal and PCR clean-up systemキットを用いて精製した。【０１２２】
［ライゲーション反応］
Ligation high(toyobo)を用いて30 min. ベクターとインサートを反応させた。【０１２３】
［形質転換］
Competent High DH5α(toyobo)を用いて形質転換させ、LB培地(50 μg/mL)プレートで培養した。【０１２４】
［遺伝子確認］
形質転換した大腸菌からプラスミドを抽出し、シーケンス解析を行い目的の配列を確認した。【０１２５】
［形質転換(大腸菌)］
BL21(DE3)を目的配列が挿入されたプラスミドで形質転換させた。【０１２６】
［培養］
10 mLのLB培地に植菌し、37℃、16時間培養した培地を1 LのLB培地に移し替え、37℃で培養した。OD 600 nmの値が0.6になったところで、終濃度1 mMになるようにIPTGを添加し、さらに4時間培養した。【０１２７】
［精製］
菌体破砕した大腸菌の沈殿を50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 6 M GdnHClで懸濁し、16時間揺らしたサンプルの上清を回収してニッケルカラムにて精製した。【０１２８】
[リフォールディング]
6 M GdnHClで溶かしているために目的抗原は変性しているので、透析法にてリフォールディング(タンパク質の巻き戻し)を行った。
リフォールディングの条件は次のステップで行った。
（１）50 mM Tris-HCl  pH8.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 M GdnHCl  ; 6 h
（２）50 mM Tris-HCl  pH8.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 2 M GdnHCl  ; 6 h
（３）  50 mM Tris-HCl  pH8.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 M GdnHCl  ; 12 h
（４）  50 mM Tris-HCl  pH8.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 M GdnHCl  ; 12 h
（５）  50 mM Tris-HCl  pH8.5, 150 mM NaCl, 50 mM L-Arg ; 6 h
（６）  50 mM Tris-HCl  pH8.5, 150 mM NaCl, 50 mM L-Arg ; 6 h
上記のサンプルに対し限外濾過膜(Amicon-Ultra 10K)を用いて50 mM リン酸緩衝液 pH8.0, 500 mM NaClに置換した。【０１２９】
［CD測定］
リフォールディングした免疫抗原が立体構造を保持しているのか、確認するために円2色性分散器(日本分光J-725)を用いて理論値に近いヘリックス含量であることを確認した。【０１３０】
２）抗体作製
PBS で100 μg/mLに希釈した免疫抗原１もしくは免疫抗原２とFreund complete adjuvantとを１：１で混合して調製したエマルジョンをラット（日本SLC、Wister、 メス、 6〜8週令）尾根部両脇に100 μLずつ投与した。免疫12日〜13日後にラット尾静脈から採血し調製した抗血清を用いて免疫抗原を固相としたELISAもしくはDLD-1細胞およびK562細胞に対するフローサイトメトリーで血清抗体価を評価し、細胞融合に用いる個体を選択した。免疫14日後に選択した個体から腸骨リンパ節、鼠径リンパ節、腋下リンパ節および膝下リンパ節を摘出し、PEG法にてリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞p3X63と融合した。融合10日〜14日後に培養上清を回収し、フローサイトメトリーにてDLD-1細胞に陽性、K562細胞に陰性を示す抗体産生ハイブリドーマ細胞を選択した。選択した抗体産生ハイブリドーマ細胞は限界希釈法にて単クローン化、樹立した。抗体のアイソタイプはアイソタイプ特異的ELISA（Bethyl）で判定した。
単クローン化されたクローンは、98クローン、101クローン、212クローン（以上IgM抗体）、129クローン、382クローン、1361クローン（以上IgG抗体）、669クローン、699クローン、1052クローン、1105クローン（以上IgM抗体）であった。【０１３１】
３）フローサイトメトリー
測定対象とするがん細胞を培地に懸濁し、1×105個/wellとなるようにV底96ウェルプレート(corning)に添加した。プレートを440×g、4℃、3分遠心してから上清を除き、細胞ペレットに抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体溶液を50 μL/wellで加えて懸濁した。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに二次抗体を50 μL/wellで加えて懸濁した。二次抗体としてAlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L)（Life Technologies）を0.1%BSA/2mM EDTA/PBSで400倍に希釈したものを用いた。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに50 ng/mL Propidium Iodide/0.1%BSA/2mM EDTA/PBSを250 μL/wellで加えて懸濁した。このように染色した細胞をGuava easyCyte 8HT（Merck Millipore）等のフローサイトメーターを用いて測定し、得られたデータをFlowJO（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。FACSには大腸がん、脳腫瘍、血液系腫瘍を用いて解析した。【０１３２】
取得した抗TMEM-180IgM抗体によるFACS解析の結果を図３に示す。98クローンは6種の全ての大腸がんおよび4種全ての脳腫瘍で陽性、101クローンは4種の大腸がんで陽性、脳腫瘍はすべて陰性であった。212クローンは6種全ての大腸がんで陽性であり、脳腫瘍では1種だけ陽性であった。いずれのクローンも血液系腫瘍は全て陰性であった。【０１３３】
４．DLD-1大腸がん細胞に対する蛍光免疫染色
DLD-1細胞を5×103個/wellとなるように96ウェルプレート（Corning、CellBIND）に添加し、2日間培養したものを細胞染色に供した。細胞の固定／透過処理は次のように行った。細胞培養プレートを200 μL/wellのPBSで2回洗浄後、洗浄液を除き、0.1％量のTriton X-100(Wako)を添加した4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（Wako）を氷冷下で100 μL/wellで加えて10分間固定した。固定液を除き、PBS 200 μL/wellで一回、1％FBS/PBS 200 μL/wellで一回洗浄し、細胞固定プレートとした。細胞染色は次のように行った。未固定の細胞培養プレートからは培地を、細胞固定プレートからは洗浄液を除き、抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体希釈液を50 μL/wellで添加した。氷上で1時間反応させた後、PBS 200 μL/wellで1回、1%FBS/PBS 200 μL/wellで2回洗浄した。洗浄液を除き5 μg/mL AlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L) /2 μg/mL Hoechst 33342 /1％FBS/PBSを50 μL/wellで添加した。氷上で1時間反応させた後、PBS 200 μL/wellで2回洗浄した。PBS を50 μL/wellで添加し、ArrayScan（Thermo Scientific）にて測定した。
抗TMEM-180IgM抗体の98、101及び212クローンによる蛍光免疫染色の結果を図４に示す。98クローンは膜中心に染色された。101と212は98クローンよりは蛍光強度が弱く、細胞質も染まった。【０１３４】
５．抗TMEM-180抗体によるDLD-1親株とTMEM-180ノックアウト株におけるFACS
1)ノックアウト細胞の作成
［トランスフェクション］
Sigma CRISPR/Cas9 System(HS0000468201) plasmid 2.5 ugを0.5 mLのOpti-MEM(invitrogen)で希釈し、Lipofectionamine LTXを11 uL添加した。室温で静置し30 分後、DLD1細胞(6.25 x 10^5 cells/well 6 wellプレート(corning))に DNA-Lipofection調整液を添加した。【０１３５】
[GFP発現細胞の選択]
トランスフェクション後に2日間培養した細胞に対してFACSAria セルソーター(BD)を用いてGFP発現細胞のみを取得した。【０１３６】
［クローニング]
GFP発現細胞を培養し、GFPの発現が行われなくなったことを確認したのち96ウェルプレートに限外希釈した。細胞のコロニーが単一であったwellに対してPureLink Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen)でゲノムを精製し、目的配列を確認することで、ノックアウト細胞を判定した。【０１３７】
２)フローサイトメトリー
フローサイトメトリーの手順は上記３．に準じた。一次抗体とした98クローンラットIgM抗体は、抗体産生ハイブリドーマ培養上清を1 μg/mLに希釈して用いた。陰性コントロールとした356クローンラットIgM抗体産生ハイブリドーマ培養上清を1 μg/mLに希釈して用いた。98クローンラット−ヒトキメラ化抗体はキメラ化抗体定常発現細胞の培養上清を2倍に希釈して用いた。陽性コントロールとしてラット抗ヒトTissue Factor抗体Clone hTF1849、ラット抗ヒトEpCAM抗体Clone B8-4、マウス抗ヒトCD44v6抗体Clone 2F10（MBL）、マウス−ヒトキメラ化抗EGFR抗体（商品名Erbitux）をそれぞれ1 μg/mLに希釈して用いた。それぞれの抗体の希釈にはRPMI/FBS10％を用いた。なおハイブリドーマ培養上清中の抗体濃度はラットIgM特異的ELISA（Bethyl）で測定した。また一次抗体の由来に応じ、二次抗体としてAlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L)、AlexaFluor647 Goat anti-Human IgG (H+L)もしくはAlexaFluor647 Goat anti-Mouse IgG(H+L)（Life Technologies）のいずれかを0.1%BSA/2mM EDTA/PBSで400倍に希釈して用いた。【０１３８】
３）ヒトキメラ抗体の作製
ハイブリドーマ細胞株から全RNAを抽出し、抗体H鎖の可変領域とL鎖の可変領域のcDNAをSMARTer RACE cDNA増幅キット(takara)を用いて5'末端RACE(rapid amplification of cDNA ends)法を用いて合成した。
合成したcDNAに対し、PCRで増幅し、pUC19(Invitrogen)にクローニングした。H鎖の可変領域及びL鎖の可変領域は後掲表３〜２２に示す。【０１３９】
H鎖及びL鎖の可変領域をPCRで増幅後、H鎖の可変領域は定常領域を組み込んだpQCxIP（クロンテック）、L鎖の可変領域は定常領域を組み込んだpQCxIH（クロンテック）に挿入し発現ベクターを完成させた。発現ベクターをリポフェクタミン2000(インビトロジェン)を用いて293T細胞にトランスフェクションを行った。ヒト型抗TMEM-180抗体定常発現細胞株は、ピュロマイシン(シグマ) 10μg /mL とハイグロマイシンB (インビトロジェン) 1 mg/mL で薬剤選択を行い、両耐性株を取得することで樹立された。樹立細胞株はDMEM (シグマ) 10%FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン(インビトロジェン)、ピュロマイシン10μg /mL、ハイグロマイシンB 1 mg/mLで維持培養を行った。【０１４０】
98クローンラットIgM抗体とヒトキメラIgG抗体を用いて、大腸がんDLD-1の親株とTMEM-180ノックアウト株でのFACSを行なった。結果を図５に示す。98クローンラットIgM抗体およびヒトキメラIgG抗体ともノックアウト細胞で著しい左方変位を示した。コントロールとして抗Tissue factor抗体、抗EpCAM抗体、抗CD44v6抗体、抗EGFR抗体を用いたFACSでは親株とノックアウト株で差がなかった。このことは、98クローンラットIgM抗体とヒトキメラIgG抗体のいずれも、TMEM-180を特異的に認識することを示す。【０１４１】
６．ヒト大腸がん手術標本ホルマリン固定切片における抗TMEM-180抗体による免疫染色
大腸がんホルマリン固定パラフィン切片に対し、抗TMEM-180 IgMラット抗体（98クローン）1μg/mlを反応させた。2次抗体はHRP標識抗ラット抗体を用い、DABで発色させ、ヘマトキシリンで後染色を行なった。結果を図６に示す。大腸がん特異的に染色された。大腸がんの膜だけでなく細胞質も染色された。【０１４２】
７．抗TMEM-180IgM抗体による殺細胞効果
DLD-1細胞ならびにK562細胞を1×103個/100 μL/wellで96ウェルプレートに添加し、24時間培養した。96ウェルプレートの各ウェルから培地50 μLを除き、抗体濃度を80 μg/mL、20 μg/mL、5 μg/mLに調製した98クローンラットIgM抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは101クローンラットIgM抗体産生ハイブリドーマ培養上清を50 μL/well で添加した。なお各培養条件のn数は3とし、対照として培地のみを添加したウェルを用意した。96時間培養後、WST-8（同仁化学、Cell Counting Kit-8）を10 μL/wellで添加し、3時間培養後にマイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。抗体濃度を横軸として、培地のみを添加したウェルの吸光度を１とした各抗体濃度の吸光度の相対値をプロットした。結果を図７及び８に示す。98クローンも101クローンも大腸がんDLD-1細胞にのみ殺細胞効果を示し、血液腫瘍K562には殺細胞効果を示さなかった。その他の大腸がん細胞のDiFi、Car1、SW480、Colo201にも殺細胞効果を認めた。また、脳腫瘍LN229および乳がんMCF7にも同様な効果を認めた。血液腫瘍以外ではかなりの広汎ながんに効果があると予想される。【０１４３】
８．各クローンの可変部遺伝子配列とCDR決定
１）total RNAの抽出
それぞれの抗体を産生するハイブリドーマからRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。【０１４４】
２）cDNAの作成
上記で得られたtotal RNAを用いてSMARTer RACE cDNA増幅キット(takara)を用いて5'末端RACE(rapid amplification of cDNA ends)法を用いてcDNAを合成した。【０１４５】
３）抗TMEM-180抗体遺伝子のクローニング
上記のcDNAに対して、PrimeStar HS DNA Polymerase(takara)を用いて目的遺伝子を増幅した。増幅条件はDenature 98℃、10秒；Anneal/Extend 72℃、90秒、5サイクル；Denature 98℃、10秒；Anneal 67℃、5秒；Extend 72℃、90秒、5サイクル；Denature 98℃、10秒；Anneal 62℃、5秒；Extend 72℃、90秒、25サイクルのタッチダウンPCR法を用いた。
PCR装置：Takara PCR Thermal Cycler Dice Gradient
使用したプライマー配列
H鎖用
フォワードプライマー：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号：２６）
フォワードプライマー：CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号：２７）
リバースプライマー：CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG（配列番号：２８）
L鎖用
フォワードプライマー：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号：２９）
フォワードプライマー：CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号：３０）
リバースプライマー：GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA（配列番号：３１）
増幅したH鎖及びL鎖のPCR産物をT4 polynucleotide Kinase (takara)を用いてリン酸化した。リン酸化したPCR産物をSmaIサイトで切断したpUC19(invitrogen)にLigation High(TOYOBO)試薬を用いて挿入した。挿入後、DH5α(TOYOBO)に形質転換し、シングルコロニーからプラスミドをPlasmid Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。【０１４６】
４）遺伝子の解析
クローニングしたH鎖、L鎖各々の遺伝子をABI PRISM 3100 Genetic Analyzerを用いて遺伝子の塩基配列を解析した。各クローンのH鎖可変領域及びL鎖可変領域の配列を表３〜２２に示す。
98クローン  H鎖（配列番号：１３）
【表３】
2016039321.tif 000006
98クローン  L鎖（配列番号：１４）
【表４】
2016039321.tif 000007
101クローン  H鎖（配列番号：１５）
【表５】
2016039321.tif 000008
101クローン  L鎖（配列番号：１６）
【表６】
2016039321.tif 000009
212クローン  H鎖（配列番号：４６）
【表７】
2016039321.tif 000010
212クローン  L鎖（配列番号：４７）
【表８】
2016039321.tif 000011
129クローン  H鎖（配列番号：５４）
【表９】
2016039321.tif 000012
129クローン  L鎖（配列番号：５５）
【表１０】
2016039321.tif 000013
382クローン  H鎖（配列番号：６２）
【表１１】
2016039321.tif 000014
382クローン  L鎖（配列番号：６３）
【表１２】
2016039321.tif 000015
1361クローン  H鎖（配列番号：７０）
【表１３】
2016039321.tif 000016
1361クローン  L鎖（配列番号：７１）
【表１４】
2016039321.tif 000017
669クローン  H鎖（配列番号：７８）
【表１５】
2016039321.tif 000018
669クローン  L鎖（配列番号：７９）
【表１６】
2016039321.tif 000019
699クローン  H鎖（配列番号：８６）
【表１７】
2016039321.tif 000020
699クローン  L鎖（配列番号：８７）
【表１８】
2016039321.tif 000021
1052クローン  H鎖（配列番号：９４）
【表１９】
2016039321.tif 000022
1052クローン  L鎖（配列番号：９５）
【表２０】
2016039321.tif 000023
1105クローン  H鎖（配列番号：１０２）
【表２１】
2016039321.tif 000024
1105クローン  L鎖（配列番号：１０３）
【表２２】
2016039321.tif 000025
【０１４７】
９．TMEM-180量を測定するがんの検査方法
１）ELISAプロトコール
まず、以下の実施例に用いたELISA法のプロトコールを以下に示す。
（試薬）
以下の試薬を用いた。
96ウェルプレート  C8 Maxi breakapart (NUNC #473768)
プレート洗浄液  PBS / 0.05% Tween 20
ブロッキング液  PBS / 1% BSA
抗体希釈液  PBS / 0.05% Tween 20 / 1% BSA
一次抗体  IgM 98（ハイブリドーマ培養上清）
二次抗体  polyclonal rabbit anti-rat immunoglobulins / HRP (Dako #P0450)
発色液  1-Step Slow TMB-ELISA (Thermo Scientific #34024)
停止液  2N H2SO4【０１４８】
（手順）
以下の手順にしたがった。
(i) 抗原固相化
50μl/wellの細胞培養液上清もしくはヒト血漿（1/10希釈と1/50希釈）を96ウェルプレートに添加し、4℃で一晩インキュベーションした。
(ii) ブロッキング
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を5回繰り返した。200μl/wellブロッキング液でブロッキングし、室温で1時間インキュベーションした。
(iii) 一次抗体反応
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を5回繰り返した。100μl/well、10μg/mlのIgM 98抗体液を添加し、室温で1時間インキュベーションした。
(iv) 二次抗体反応
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を5回繰り返した。100μl/well、4000倍希釈した二次抗体液を添加し、室温で1時間インキュベーションした。
(v) 発色・停止
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を5回繰り返した。100μl/wellの発色液を添加し、室温で15分間インキュベーションした。100μl/wellの停止液を添加した。
(vi) 測定
反応停止後、450 nmの吸光度を測定した。【０１４９】
２）がん細胞培養上清中のTMEM-180タンパク質量の測定
大腸がん細胞DLD-1株のTMEM-180強制発現株、親株、およびTMEM-18ノックダウン株を培養し、ほぼコンフルエント状態になったところで、PBSで洗浄した。無血清DMEM培地に置換して、一晩培養し、翌日に培養上清を回収した。この上清をサンプル抗原として96穴プレートに固相化し、１）の方法でELISAを行なった。また脳腫瘍株LN229でも同様の実験を行なった。
結果を図９に示す。正常（培地のみ）コントロールと比べ、すべてのサンプルでTMEM-180は高値を示した。大腸がんDLD-1においては強制発現株、親株、ノックダウン株の順に高値を示した。脳腫瘍でも高値を示した。【０１５０】
３）ステージIV大腸がん患者血漿中のTMEM-180タンパク質量の測定
EDTA採血のヒト血漿（ステージIVの4例と正常）を1/10と1/50に希釈後、それをサンプル抗原として96穴プレートに固相化し、１）の方法でELISAを行なった。
結果を図１０に示す。正常血漿に比べ、すべての患者サンプルで高値を示した。また、CEA陰性であった患者#2と#4においても、血漿TMEM-180は陽性（正常より高値）を示した。【０１５１】
４）ステージIII大腸癌患者の術前・術後の血漿中TMEM-180タンパク質量の測定
３）と同様の方法で、ステージIII大腸がん患者の術前術後の血漿につき、TMEM-180タンパク質量を測定した。
結果を図１１に示す。すべての患者において、TMEM-180値は、術前に比較して術後に低下した。【０１５２】
５）ステージIII、II、IV、及びIIIaの大腸がん患者の手術前後、及び再発時の血漿中TMEM-180タンパク質量と大腸がん腫瘍マーカーCEAをを測定した。TMEM-180の測定は、669クローンと1361クローンを使用したサンドイッチELISA法で行った。TMEM-180のカットオフ値は、患者サンプルと同様のELISA法で測定した8人分の正常血漿中の値の平均とした。CEAのカットオフ値は、国立研究開発法人国立がん研究センターで採用している正常値とした。
結果を図１２に示す。ステージIIの患者では、術前CEA値が陰性であるのに対し、TMEM-180は陽性を示した。また、ステージIIIaの患者では、CTで再発が確認された時点でもCEA値は陰性のままであったが、TMEM-180は再上昇していた。
なお、５）の実施例に用いたサンドイッチELISA法のプロトコールを以下に示す。
（試薬）
以下の試薬を用いた。
96ウェルプレート  Maxisoap (NUNC #442404)
0.1Mリン酸バッファー
プレート洗浄液  10 mM TBS (pH7.2)/ 0.05% Tween 20 / 140 mM NaCl
ブロッキング液  10 mM TBS (pH7.2)/ 0.05% Tween 20 / 140 mM NaCl / 1% BSA
希釈液  10 mM TBS (pH7.2)/ 0.05% Tween 20 / 140 mM NaCl / 1% BSA
固相化抗体  669クローン
標識抗体  1361クローン
ストレプトアビジンHRP（Vector #SA-5004）
発色液  1-Step Slow TMB-ELISA (Thermo Scientific #34024)
停止液  2N H2SO4
（手順）
以下の手順にしたがった。
(i) 固相化
固相化抗体669クローンを0.1 M リン酸バッファーで希釈したものを50μl/wellで96ウェルプレートに添加し、4℃で一晩インキュベーションした。
(ii) ブロッキング
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を3回繰り返した。200μl/wellブロッキング液でブロッキングし、室温で30分以上インキュベーションした。
(iii) 抗原添加
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を3回繰り返した。50μl/wellの測定試料を固相化済みプレートに加え、室温で1時間インキュベーションした。
(iv) 標識抗体反応
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を3回繰り返した。定法を用いて調製したビオチン標識1361クローンを希釈液で希釈したものを50μl/wellで96ウェルプレートに添加し、室温で1時間インキュベーションした。
(v) ストレプトアビジンHRP反応
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を3回繰り返した。ストレプトアビジンHRP希釈液を50μl/wellで添加し、室温で1時間インキュベーションした。
（vi）発色・停止
200μl/wellのプレート洗浄液により、固相化済みプレートの洗浄を3回繰り返した。100μl/wellの発色液を添加し、室温で20分間インキュベーションした。50μl/wellの停止液を添加した。
(vii) 測定
反応停止後、450 nmの吸光度を測定した。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号：１〜３は、それぞれ98クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４〜６は、それぞれ98クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７〜９は、それぞれ101クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０〜１２は、それぞれ101クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１３及び１４は、それぞれ98クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５及び１６は、それぞれ101クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１７はヒトTMEM-180タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１８〜２１は、それぞれ免疫抗原１作製用プライマー(i)〜(iv)を示す。
配列番号：２２〜２５は、それぞれ免疫抗原２作製用プライマー(i)〜(iv)を示す。
配列番号：２６〜３１は、抗TMEM-180抗体遺伝子のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号：４０〜４２は、それぞれ212クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４３〜４５は、それぞれ212クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４６及び４７は、それぞれ212クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４８〜５０は、それぞれ129クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５１〜５３は、それぞれ129クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５４及び５５は、それぞれ129クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５６〜５８は、それぞれ382クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５９〜６１は、それぞれ382クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６２及び６３は、それぞれ382クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６４〜６６は、それぞれ1361クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６７〜６９は、それぞれ1361クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７０及び７１は、それぞれ1361クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７２〜７４は、それぞれ669クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７５〜７７は、それぞれ669クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７８及び７９は、それぞれ669クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８０〜８２は、それぞれ699クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８３〜８５は、それぞれ699クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８６及び８７は、それぞれ699クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８８〜９０は、それぞれ1052クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９１〜９３は、それぞれ1052クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９４及び９５は、それぞれ1052クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９６〜９８は、それぞれ1105クローンの重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９９〜１０１は、それぞれ1105クローンの軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０２及び１０３は、それぞれ1105クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０４〜１５０は、HLAPeptide Binding Predictionsによって予測されたHLA type A2に結合するTMEM-180由来ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５１〜１７０は、HLAPeptide Binding Predictionsによって予測されたHLA type A24に結合するTMEM-180由来ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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