(57)【要約】  本発明は、比活性が高いギ酸脱水素酵素を提供し、またメタノールを使わずに効率的にギ酸脱水素酵素を製造する方法を提供することを目的とする。本発明は、新規ギ酸脱水素酵素、該ギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子、該ギ酸脱水素酵素の製造方法、および該ギ酸脱水素酵素を用いた補酵素再生方法に関する。
2015064517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項２または３記載の遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
宿主が大腸菌である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６記載の形質転換体を培養し、培養物からギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、ギ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
酵素的還元反応系に、請求項１記載のタンパク質、または請求項５もしくは６記載の形質転換体もしくはその処理物を共存させて補酵素を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はギ酸脱水素酵素、該酵素をコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造と利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品原薬中間体を製造する際、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を必要とする。しかし、これらの補酵素は高価であるため、医薬品原薬中間体を効率的に製造するためには、これら補酵素の再生が不可欠である。【０００３】
従来、補酵素を還元するために、特許文献１に記載されるようなグルコース脱水素酵素を使用した例や特許文献２に記載されるようなギ酸脱水素酵素を使用した例が報告されている。しかしながら、グルコース脱水素酵素はグルコースからグルコン酸への変換を行うため、目的とする医薬品原薬中間体と等量のグルコン酸が生じてしまう問題があった。【０００４】
一方、ギ酸脱水素酵素（ＥＣ．１．２．１．２）は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）、ギ酸および水の存在下で、ＮＡＤ+を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に還元するとともにギ酸を二酸化炭素に酸化する。よって、副生成物を生じることなく医薬品原薬中間体を作ることができる。【０００５】
しかし、ギ酸脱水素酵素を使用することの欠点は、酵素の比活性が低いために、補酵素を再生する際の酵素の添加量が多くなることであった。例えば特許文献３に記載されるようなカンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（ＡＴＣＣ３２１９５）由来のギ酸脱水素酵素は、比活性が低いため、ギ酸脱水素酵素を用いた補酵素の再生には不十分である。【０００６】
また、ピキア・メタノリカのようなメタノール資化酵母でギ酸脱水素酵素を発現させる場合は、メタノールで誘導する必要があり、大量製造する場合には防爆設備等が必要であり、製造コストがかかるというデメリットがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２３６８８３号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３９５号公報
【特許文献３】特開２００３−１８０３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、比活性が高いギ酸脱水素酵素を提供し、またメタノールを使わずに効率的にギ酸脱水素酵素を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、広くギ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた性質を有するギ酸脱水素酵素を高生産するピキア・メタノリカ株を見出した。そして、該ピキア・メタノリカ株からギ酸脱水素酵素を単離、精製し、ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現に成功した。そして、該ギ酸脱水素酵素が高い比活性を有すること、該酵素を大腸菌にて発現させることにより、酵母発現系とは異なりメタノールを使わずに安価にかつ効率的にギ酸脱水素酵素を製造できることを見出した。さらに、このギ酸脱水素酵素が補酵素の再生に有用であることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。【００１１】
（１）以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。【００１２】
（２）（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。【００１３】
（３）以下の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【００１４】
（４）（２）または（３）記載の遺伝子を含む組換えベクター。【００１５】
（５）（２）または（３）記載の遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体。【００１６】
（６）宿主が大腸菌である、（５）記載の形質転換体。【００１７】
（７）（５）または（６）記載の形質転換体を培養し、培養物からギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、ギ酸脱水素酵素の製造方法。【００１８】
（８）酵素的還元反応系に、（１）記載のタンパク質、または（５）もしくは（６）記載の形質転換体もしくはその処理物を共存させて補酵素を再生する方法。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-223317号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のギ酸脱水素酵素は、比活性が高いという特徴を有している。本発明に係るギ酸脱水素酵素を利用することによって、高価な補酵素を少ない酵素量で再生することができる。また、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を大腸菌にて発現させることで、メタノールを使わずに、安価にかつ効率的にギ酸脱水素酵素を製造することが可能になる。さらに、本発明のギ酸脱水素酵素は、アルコール、アミン、アルデヒド等の還元反応において、補酵素を効率よく再生させ、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】プラスミドｐＴＲＰ−ｐｍｆｄｈの構築図を示す。
【図２】組換えＰｍＦＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図３】組換えＰｍＦＤＨの至適ｐＨを測定した結果を示すグラフである。
【図４】組換えＰｍＦＤＨの温度安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】組換えＰｍＦＤＨの至適温度を測定した結果を示すグラフである。
【図６】組換えＰｍＦＤＨの５０℃での温度安定性を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ギ酸脱水素酵素（酵素番号ＥＣ１．２．１．２）は、ギ酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）より、二酸化炭素と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生成する反応を触媒する酵素である。ギ酸脱水素酵素は、ＮＡＤＨ依存型の酵素反応において補酵素再生に利用した場合、安価なギ酸を利用できること、副産物が二酸化炭素であり系内に蓄積しないこと等の利点をもつ有用な酵素である。
【００２３】
一実施形態において本発明は、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、すなわちギ酸脱水素酵素に関する。本発明のギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質として、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質も、本発明のタンパク質に包含される。さらに、配列番号１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質も、本発明のタンパク質に包含される。数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個をさす。「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法等、当業者に周知の方法により、アミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより取得可能である。
【００２４】
ギ酸脱水素酵素活性の測定は、２０ｍＭ  ギ酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮＡＤ+を含む０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．５）中で、２５℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより実施できる。
【００２５】
ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質とは、上記のような活性測定条件において、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すタンパク質のことをいう。
【００２６】
本発明のタンパク質は、好ましくはピキア・メタノリカ、例えば、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  ＩＡＭ  １２９０１）株から取得できる。この株は、東京大学分子細胞生物学研究所  ＩＡＭ  カルチャーコレクションに保存され、現在は、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）に移管されている。
【００２７】
本発明のギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質は、上記のような微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。
【００２８】
本発明はまた、ギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ギ酸脱水素酵素遺伝子）に関する。本発明のギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子として、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。遺伝子には、核酸、および１本鎖、２本鎖または３本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。配列番号２の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子、例えば、配列番号２の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に包含される。さらに、配列番号２の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に包含される。数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個をさす。
【００２９】
配列番号２の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子には、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、高ストリンジェントな条件が好ましい。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで洗浄する条件である。
【００３０】
所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量のＤＮＡを得ることができる。
【００３１】
遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
【００３２】
本発明のギ酸脱水素酵素の製造方法は、宿主に上記ギ酸脱水素酵素遺伝子を導入してなる形質転換体を培養し、培養物からギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする。宿主にギ酸脱水素酵素遺伝子を導入してなる形質転換体は、当技術分野で公知の方法で製造できる。本発明において、遺伝子の導入は、遺伝子の機能を有するポリヌクレオチドを組換え核酸として宿主に導入する全ての場合を含む。ポリヌクレオチドは、核酸、および１本鎖、２本鎖または３本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。遺伝子の導入には、組換えベクターによって導入する場合や、ＰＣＲ等で合成した核酸を用いて相同組換えによって導入する場合が含まれる。
【００３３】
遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、または動物もしくは植物の生細胞を任意に選択できるが、本発明においては、微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。宿主大腸菌は通常遺伝子工学に用いられる大腸菌Ｋ−１２株の中から適切なものを選択する。代表的なものとしてＪＭ１０５やＪＭ１０９が挙げられるが、ＤＨ５あるいは誘導型の発現系に用いられるＢＬ２１、Ｎ９９ｃＩ+などを使用してもよい。
【００３４】
遺伝子は、より好ましくは、遺伝子の発現を強化する発現ベクターによって導入される。発現ベクターは、導入しようとする遺伝子を、その発現を強化する種々のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片と融合させたものである。好ましくは、発現ベクターは、遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるための転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含み得る。所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３５】
ベクターとしては、限定はされないが、大腸菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミド、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９８、ｐＶＣ１８、ｐＶＣ１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＭａｌ−ｃ２、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＴＲＰ等を好ましく使用でき、その他にもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合によく利用されるＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４０４、ｐＡＵＲ１０１、ｐＫＧ１等も利用でき、枯草菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４等も利用できる。更に、ｐＢＩ１２２、ｐＢＩ１１０１その他の各種のものも限定なく使用できる。
【００３６】
大腸菌での発現用の転写プロモーターとして、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、あるいはこれらを融合したｔａｃおよびｔｒｃプロモーター、λファージＰＬおよびＰＲプロモーター、Ｔ７ファージのプロモーター等が例として挙げられる。しかし、プロモーターが強力すぎると目的タンパク質の大腸菌内における発現が過多となり、その結果、目的タンパク質が封入体を形成しやすくなり、その後の分離および精製工程が困難となる。ゆえに可溶性画分への発現あるいは培養上清中へのタンパク質の分泌を可能にすべく最適なプロモーターを選択する必要があり、このような点を考慮するとトリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）が望ましい。トリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）を有する発現ベクターとしては、ｐＴＲＰ（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２３７，４３−５８（１９９５））等が挙げられる。
【００３７】
選択マーカーの例としては、ホルムアルデヒド耐性マーカー、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００３８】
一般的な組換えベクターの構築方法としては、例えば、ＰＣＲ法等で調製した遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いて組換えベクターに組み込む方法が挙げられる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００３９】
遺伝子の導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法、コンピテントセル法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。具体的には、大腸菌への遺伝子の導入には、ハナハンの方法等を利用でき、酵母への遺伝子の導入には、リチウムイオン法等を利用できる。
【００４０】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
【００４１】
一般的に形質転換体を利用する目的物の生産方法において認められることであるが、本発明のギ酸脱水素酵素の製造方法においても、導入遺伝子の選択、導入すべき宿主の選択、発現ベクターの導入手段とそれに適したＤＮＡまたはＲＮＡの構築方法の選択、培地もしくはこれに対する添加物の種類や濃度の選択、形質転換体の培養条件または生育条件の選択等の要因が、ギ酸脱水素酵素の生産量に影響する場合がある。
【００４２】
上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４３】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グリセリンなどのポリオール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００４４】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で培養を行う。培養期間中、培地のｐＨは宿主の発育が可能で、生産されたギ酸脱水素酵素の活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ４〜８程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
続いて、形質転換体の培養により可溶化発現したギ酸脱水素酵素を、培養物から採取する。培養物には、培養液、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞または菌体の破砕物が包含される。採取方法は、通常行われる細胞または菌体の破砕物からの抽出だけでなく、場合によっては、適当な抽出溶媒を用いて培養液からも直接抽出できる。利用する宿主の種類によっては、ギ酸脱水素酵素の少なくとも一部が宿主細胞内または細胞表面に止まる場合があるが、細胞膜または細胞壁の破壊や、適宜な抽出溶媒による抽出等の公知の各種操作を経て、採取することができる。
【００４６】
宿主の対数増殖期を過ぎたときに上記温度範囲に設定することでギ酸脱水素酵素遺伝子が発現し、宿主内に非常に高い比活性を示すギ酸脱水素酵素を製造することができる。培養後、目的のギ酸脱水素酵素が宿主内に生産されるため菌体または細胞を破砕し、粗酵素懸濁液を調製する。この粗酵素懸濁液には、非常に高い比活性を示すギ酸脱水素酵素が含まれる。したがって、得られた粗酵素懸濁液をそのまま利用してもよい。なお、得られた粗酵素懸濁液からギ酸脱水素酵素を単離精製することもできる。このとき、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。単離精製されたギ酸脱水素酵素は、所定のｐＨの緩衝液等に懸濁された状態で利用することができる。
【００４７】
酵素的還元反応系に、上記タンパク質、または該タンパク質を生産する形質転換体もしくはその処理物を共存させて補酵素を再生することができる。つまり、酵素的還元反応系に、本発明で得られたギ酸脱水素酵素を共存させて補酵素を効率良く再生することができる。形質転換体の処理物とは、例えば、粗抽出液、粗酵素懸濁液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の磨砕物等を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して用いてもよい。固定化は当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で実施できる。反応は、１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜６０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５．５〜９．５で行う。また、基質の仕込み濃度は０．１％〜９０％（ｗ／ｖ）であるが、基質を連続的に添加することもできる。反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。以上のように、本発明によれば、アルコール、アミン、アルデヒド等を酵素的に製造するための還元反応において、補酵素を効率よく再生させ、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。
【００４８】
次に本発明を、実施例を参照することにより説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。実施例では、本発明に係るタンパク質を「組換えＰｍＦＤＨ」と呼ぶ。
【実施例】
【００４９】
〔実施例１：組換えＰｍＦＤＨ発現系の構築〕
ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）のアミノ酸配列がすでに報告されているメチロトローフ酵母カンジダ・ボイジニイ（Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ２４５９３４）と出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ７５２９６．１）のＦＤＨ配列をアライメントし、相同性の高い配列としてＴＰＦＨＰＡＹおよびＤＹＰＲＱＤＩＩの２ヶ所を見出した。両アミノ酸配列をもとに２種類のＰＣＲプライマー、ＦＤＨ−ｉｎｆ（５’−ＧＧＴＡＡＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡ−３’）（配列番号３）およびＦＤＨ−ｉｎｒ（５’―ＴＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＴＣ−３’）（配列番号４）を作製した。鋳型となるピキア・メタノリカのゲノムＤＮＡは、ＧｅｎとるくんＴＭ（酵母用）Ｈｉｇｈ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。作製した両プライマーを用いてＰＣＲを行った結果、約１，０００ｂｐの増幅断片を得ることができた。【００５０】
ＰＣＲ反応は、（５０μＬあたり）１Ｕ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）、１０ｐｇ  鋳型ＤＮＡ、０．３μＭ  センスプライマー、０．３μＭ  アンチセンスプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０×バッファーにて、９４℃／１５秒（変性）、５０℃／３０秒（アニーリング）、６８℃／１分３０秒（伸長）を３０サイクル繰り返した。【００５１】
得られたＦＤＨの内部配列から、ＤＮＡ  Ｗａｌｋｉｎｇ  ＳｐｅｅｄＵＰＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ社製）を用いることで、全長ピキア・メタノリカ由来ＦＤＨ配列を獲得した。具体的には、Ｎ末端配列解析用としてＰＣＲプライマー，ｐｍｆｄｈ−ｗｋｆ１（５’−ＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’：１ｓｔ  ＰＣＲ用）（配列番号５）およびｐｍｆｄｈ−ｗｋｆ２（５’−ＡＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＣＣ−３’：２ｎｄ  ＰＣＲ用）（配列番号６）を、Ｃ末端解析用としてｐｍｆｄｈ−ｗｋｒ（５’−ＣＣＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧ−３’：１ｓｔ  ＰＣＲ用）（配列番号７）およびｐｍｆｄｈ−ｗｋｒ２（５’−ＴＡＡＴＧＴＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴ−３’：２ｎｄ  ＰＣＲ用）（配列番号８）を用いた。【００５２】
こうして得られたピキア・メタノリカ由来のＦＤＨ遺伝子の塩基配列を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号１に示す。【００５３】
ピキア・メタノリカ由来のＦＤＨ遺伝子を大腸菌で発現させるために、ＦＤＨ遺伝子を挿入したプラスミドｐＴＲＰ−ｐｍｆｄｈを、図１に示す構築図にしたがって作製した。まず、ピキア・メタノリカの染色体ＤＮＡを鋳型にして、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＦＤＨ遺伝子を増幅させ、アガロース電気泳動により約１．１ｋｂのＦＤＨ遺伝子のＤＮＡ断片を確認した。
センスプライマー（ＳａｃＩ−ｐｍｆｄｈ）：
５’−ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴ−３’（配列番号９）
アンチセンスプライマー（ｐｍｆｄｈ−ＳａｌＩ）：
５’−ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＣＡ−３’（配列番号１０）【００５４】
ＰＣＲ反応は、（５０μＬあたり）１Ｕ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）、１０ｐｇ  鋳型ＤＮＡ、０．３μＭ  センスプライマー、０．３μＭ  アンチセンスプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０×バッファーにて、９４℃／２分（変性）、５５℃／３０秒（アニーリング）、６８℃／１分３０秒（伸長）を３０サイクル繰り返した。【００５５】
得られたＦＤＨ遺伝子のＰＣＲ産物をそれぞれ制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロース電気泳動後、ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収した断片は、ＬｉｇａＦａｓｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、予め制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ（２．９ｋｂ）に導入した。次いで、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、組換え体ｐＴＲＰ−ｐｍｆｄｈ／ＨＢ１０１を得た。【００５６】
〔実施例２：組換えＰｍＦＤＨのフラスコ培養〕
形質転換体のバッチ培養によるピキア・メタノリカ由来の組換えＰｍＦＤＨの生産を以下の方法で実施した。【００５７】
プラスミドｐＴＲＰ−ｐｍｆｄｈを形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株について、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地２Ｌを用いて３７℃、１６０ｒｐｍで９時間バッチ培養を行った。菌体の増殖は、培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して調べた。その結果、プラスミドｐＴＲＰ−ｐｍｆｄｈで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株のバッチ培養菌体を得ることができた。【００５８】
発現量を確認するため、この培養液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃、ベックマン・コールター社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、湿菌体を回収した。そして、得られた湿菌体５ｇを３ｍＬの抽出バッファー（１０ｍＭ  リン酸バッファー、ｐＨ７．５）で懸濁し、超音波破砕後（ＭＩＳＯＮＩＸ社製  ａｓｔｒａｓｏｎ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＴＲ  ＸＬ）、遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃、ベックマン・コールター社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、粗抽出液を調製した。【００５９】
組換えＰｍＦＤＨの活性測定は次のような方法で行った。リン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）、ＮＡＤ+（１ｍＭ、オリエンタル酵母工業社製）、ギ酸ナトリウム（２０ｍＭ、ナカライテスク社製）から構成される反応液に組換えＰｍＦＤＨを添加したのち、２５℃で３４０ｎｍの吸光度変化を測定し、組換えＰｍＦＤＨのギ酸脱水素酵素活性を算出した。この反応条件における１分間あたりの１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成量を１単位とし、ギ酸脱水素酵素活性とした。得られた酵素液のギ酸脱水素酵素活性を測定したところ、培地１ｍＬあたり０．２４Ｕ／ｍＬの活性が確認できた。【００６０】
〔実施例３：組換えＰｍＦＤＨの精製〕
大量精製を行うため、６Ｌの培養液から得られた湿菌体を１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．５）に懸濁したのち、超音波破砕にて菌体破砕を行い、得られた破砕画分を遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃、ベックマン・コールター社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液を用いて以下の方法で精製を行った。【００６１】
バッファーＡ（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（チッソ社製）に通じ、バッファーＡで洗浄後、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニア・グラジエントで目的タンパク質を溶出させた。得られた目的画分を、最終的に１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．５）で透析し、比活性３．３Ｕ／ｍｇタンパクである組換えＰｍＦＤＨの精製標品を得た。【００６２】
〔実施例４：組換えＰｍＦＤＨの酵素学的基礎性能評価〕
実施例３で得られた組換えＰｍＦＤＨの酵素学的基礎性能を評価した。ギ酸脱水素酵素活性は、特に記載した条件以外は、実施例２と同様の方法で測定した。【００６３】
ｐＨ安定性：
以下のバッファーを用い、３０℃、７日後の残存活性を測定した。
ｐＨ４．５〜６．０：０．１Ｍ  クエン酸−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ６．０〜７．５：０．１Ｍ  リン酸（Ｋ−Ｐｉ）バッファー
ｐＨ６．０〜７．５：０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ７．５〜９．０：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
ｐＨ９．０〜９．５：０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨバッファー【００６４】
結果を図２に示す。各バッファーにおける０日の活性を１００とし、相対活性として表した。【００６５】
至適ｐＨ：
以下のバッファーを用い、ギ酸脱水素酵素活性を測定した。
ｐＨ４．５〜６．０：０．１Ｍ  クエン酸−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ６．０〜７．５：０．１Ｍ  リン酸（Ｋ−Ｐｉ）バッファー
ｐＨ６．０〜７．５：０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ７．５〜９．０：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
ｐＨ９．０〜９．５：０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨバッファー【００６６】
結果を図３に示す。０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．５）での活性を１００とし、相対活性として表した。【００６７】
温度安定性：
４、２５、３０、３７、４０、４５、５０、６０、７０℃の温度で２０分間インキュベートしたのち、ギ酸脱水素酵素活性を測定した。結果を図４に示す。４℃での活性を１００とし、相対活性として表した。【００６８】
至適温度：
２５、３０、３７、４０、４５、５０、５５、６０、７０℃の温度でギ酸脱水素酵素活性を測定した。結果を図５に示す。５０℃での活性を１００とし、相対活性として表した。【００６９】
５０℃での温度安定性：
５０℃にて２４時間反応させた際の残存活性を測定した。結果を図６に示す。０時間の活性を１００として、相対活性として表した。【００７０】
上記結果から得られた組換えＰｍＦＤＨの酵素学的基礎性能を以下の表１にまとめる。
【表１】
2015064517.tif 000003
【００７１】
〔実施例５：組換えＰｍＦＤＨによるエタノール生産〕
実施例３で得られた組換えＰｍＦＤＨを用いて、ＮＡＤ+を補酵素とした場合にアセトアルデヒドからエタノールが生産できるかを確認した。具体的には、アセトアルデヒド（２％、メルク社製）及びアルコール脱水素酵素（１０Ｕ／ｍＬ、オリエンタル酵母工業社製）、ＮＡＤ+（０．３ｍＭ、オリエンタル酵母工業社製）、ギ酸ナトリウム（１００      ｍＭ、ナカライテスク社製）、リン酸バッファー（２５０ｍＭ、ｐＨ７．０）から構成される反応溶液に組換えＰｍＦＤＨを添加して、３０℃で２４時間反応させた。生成したエタノールは９９．５％エタノール（和光純薬工業社製）を標準品として、アルコールオキシダーゼ（０．２Ｕ／ｍＬ、シグマ社製）及び西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（５Ｕ／ｍＬ、オリエンタル酵母工業社製）、４−アミノアンチピリン（０．０４％、和光純薬工業社製）、フェノール（０．２４％、和光純薬工業社製）で構成される反応液を用いて３０℃で５００ｎｍの吸光度変化から算出した。【００７２】
結果として、組換えＰｍＦＤＨを添加しない反応液ではエタノールは生成されなかったが、組換えＰｍＦＤＨを添加した系では０．７２％のエタノール（変換率：３５％）を生成させることができた。また、ＮＡＤ+及びギ酸ナトリウム、組換えＰｍＦＤＨの代わりにＮＡＤＨ（０．３ｍＭ、オリエンタル酵母工業社製）を添加した場合では０．０２％のエタノール生成であった。【００７３】
これらの結果により、本発明の組換えＰｍＦＤＨが、アセトアルデヒドからエタノールへの酵素的還元反応において、補酵素ＮＡＤ+を効率よく再生させることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により効率良くギ酸脱水素酵素を生産することが可能になる。また、本発明により作製されたギ酸脱水素酵素は補酵素再生系酵素として極めて有用である。【００７５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年4月27日(2016.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２の塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項２または３記載の遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
宿主が大腸菌である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６記載の形質転換体を培養し、培養物からギ酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、ギ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
酵素的還元反応系に、請求項１記載のタンパク質、または請求項５もしくは６記載の形質転換体もしくはその処理物を共存させて補酵素を再生する方法。
【国際調査報告】
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