(57)【要約】  本発明は、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、かかるセットを含むキットを提供することを目的とする。  配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである１種又は２種以上のフォワードプライマーと、配列番号１４、１７〜２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるプローブとを用いて、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、
前記セットが、１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、
前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、
前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列（caaggtatccc）を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７〜２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、セット。
【請求項２】
１種又は２種以上のフォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２７のヌクレオチド配列（caaggtatccctac）を含むヌクレオチド配列からなる１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のセット。
【請求項３】
１種又は２種以上のフォワードプライマーが、以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のセット：
（Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
（Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
【請求項４】
２種のフォワードプライマーを含み、前記２種のフォワードプライマーが、配列番号４〜７、１１及び１２から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセット。
【請求項５】
リバースプライマーの少なくとも１種が、配列番号１４のヌクレオチド番号３〜２０のヌクレオチド配列（wsccaaggcatccaccah）を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のセット。
【請求項６】
２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下の（Ｃ１）、（Ｃ２−１）、（Ｃ２−２）、（Ｃ２−３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）及び（Ｇ）から選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のセット：
（Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｃ２−１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｃ２−２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｃ２−３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２５個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２３個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
【請求項７】
２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下のオリゴヌクレオチドから選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のセット：
配列番号２１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２４のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
プローブが、配列番号３３のヌクレオチド番号７〜１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のセット。
【請求項９】
１種又は２種以上のプローブが、以下の（Ｈ）〜（Ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のセット：
（Ｈ）配列番号３４のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｉ）配列番号３５のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｊ）配列番号３６のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｋ）配列番号３７のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｌ）配列番号３８のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
【請求項１０】
１種又は２種以上のプローブが、以下の（ｈ）〜（ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のセット：
（ｈ）配列番号３９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｊ）配列番号４１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｋ）配列番号４２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｌ）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
プローブが、５’末端を蛍光物質で、３’末端を消光物質で修飾されているTaqMan（登録商標）プローブであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のセット。
【請求項１２】
マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキットであって、
前記キットが、請求項１〜１１のいずれかに記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されていることを特徴とする、キット。
【請求項１３】
マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
（ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
（ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
（ｃ）請求項１〜１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるプローブを用いて、上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在しているか否かを検出する工程ｃ：
を含む方法。
【請求項１４】
工程ｃにおける、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物の検出が、請求項１〜１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるプローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じるか否かを検出することによりなされることを特徴とする請求項１３に記載のマイコプラズマを検出する方法。
【請求項１５】
マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマの検出限界感度が１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のマイコプラズマを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマを検出する方法に関し、より詳細には、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、かかるセットを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ(Mycoplasma)は、モリクテス（Mollicutes）綱に分類される真正細菌の一属で、広義では、マイコプラズマ属の他、ウレアプラズマ（Ureaplasma）属、メソプラズマ（Mesoplasma）属、エントモプラズマ（Entomoplasma）属、スピロプラズマ（Spiroplasma）属、アコレプラズマ（Acholeplasma）属、アステロプラズマ（Asteroleplasma）属、及びサーモプラズマ（Thermoplasma）属も含めてマイコプラズマと呼ばれることもある。マイコプラズマは、自己増殖可能な最小の生物であり、現在、２００種類以上の種が知られている。マイコプラズマは、一般の真正細菌に見られるペプチドグリカン細胞壁を持たないため、細胞の形状は不定形で可塑性を有している。また、マイコプラズマは大きさが約０．２〜０．８μｍと小さく、また、形状も不定形であるので、０．２μｍ程度の濾過滅菌用フィルターを通過することができる。そのため、細胞培養用培地について濾過滅菌を行っても、マイコプラズマを除去することはできず、特に一部の種のマイコプラズマは、細胞培養における微生物汚染の代表的な原因菌として知られている。【０００３】
マイコプラズマは、細胞壁がないため、細胞培養に通常使用されるペニシリン系、セフェム系等の抗生物質による影響を受けない。また、マイコプラズマは、他の細菌汚染物質とは異なり、培地の濁度の上昇や培養細胞の変性等の可視的な変化を引き起こすことなく細胞培養上清中で増殖する。そのため、マイコプラズマの検出方法が実施されない限り、マイコプラズマ汚染は看過され、汚染を拡大させてしまう。マイコプラズマは、細胞膜に吸着して細胞の栄養素を枯渇させ、細胞の増殖を阻害したり、遺伝子発現を変化させるため、感染した培養物からの実験結果は信頼性の低いものとなる。したがって、研究を行う際には、マイコプラズマ汚染がないことを確認することは、重要な前提となる。また、細胞の培養を伴う再生医療、細胞治療の分野では、マイコプラズマに感染した細胞を治療に用いた場合、免疫系に悪影響を与えたり、肺炎、尿道炎、関節炎を引き起こす恐れもある。したがって、生物由来医薬品の製造や、再生医療、細胞治療の現場において、マイコプラズマ否定試験は必須とされている。【０００４】
マイコプラズマ否定試験法として、日本薬局方の参考情報には、培養法（寒天及び液体培地法）、指標細胞を用いたＤＮＡ染色法（指標細胞培養法）、２段階ＰＣＲ法、の３種類方法が提示されている。しかし、培養法には培養期間が２８日と長すぎるという問題点、ＤＮＡ染色法には低感度であるという問題点、２段階ＰＣＲ法（Nested PCR法）には増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性が生じ易いという問題点があり、３種類のいずれの試験法も、再生医療、細胞治療の安全性試験法としては実用性が不十分であった。したがって、より実用的なマイコプラズマの検出法の開発が進められている。【０００５】
例えば、特許文献１には、リアルタイムＰＣＲによりマイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー対や、該プライマー対を用いてマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅ターゲットとしている。また、非特許文献１には、リアルタイムＰＣＲによりマイコプラズマ等の遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー対や、該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブや、該プライマー対及びプローブを用いてマイコプラズマ等を検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマ等のtuf遺伝子を増幅ターゲットとしている。さらに、特許文献２には、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法という特殊な遺伝子増幅法により、マイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセットや、該プライマーセットによる増幅産物を検出するためのプローブや、該プライマーセット及びプローブを用いてマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅ターゲットとしている。さらに、特許文献３には、リアルタイム核酸増幅反応（リアルタイムＰＣＲ）によりマイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを含むキットや、該プライマーを用いて細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマのｒｐｏＢ遺伝子を増幅ターゲットとしている。これらのように、マイコプラズマの検出法については開発が進められているが、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できる、より実用的なマイコプラズマ検出法が求められている。【０００６】
なお、非特許文献２には、マイコプラズマを検出するための旧来の２段階ＰＣＲ法に用いるプライマーではあるが、マイコプラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域を増幅ターゲットとするプライマーが開示されている。しかし、旧来の２段階ＰＣＲは前述したように、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性が生じ易いという問題があった。【０００７】
ところで、一部の種のマイコプラズマは、肺炎の原因菌ともなることが知られている。そのため、例えば特許文献４には、肺炎患者の診断に際して、ＰＣＲなどにより、マイコプラズマ・ニューモニエなどの肺炎菌類の遺伝子を特異的に増幅して該肺炎菌類を検出する方法や、該方法に用いるためのプライマーや、該方法で生じる増幅産物に相補的なプローブなどが開示されている。この方法において、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する際の増幅ターゲットは、ＤｎａＪ１遺伝子であった。このように、マイコプラズマを原因とする肺炎を診断する目的においても、かかるマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できる、より実用的なマイコプラズマ検出法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３０５２０７号公報
【特許文献２】特開２０１２−６０９２５号公報
【特許文献３】特開２０１３−５１５４５８号公報
【特許文献４】国際公開２０１１／１２２０３４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】International Journal of Medical Microbiology (2009) 299, 291-300
【非特許文献２】Res. Microbiol. (1993) 144, 489-493
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討する中で、マイコプラズマに特異的な配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域のうち、特定の配列に対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーと、該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブとの組合せを複数設計し、かかるプライマー対とプローブとの複数の組合せを用いて、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行ったところ、多種のマイコプラズマを、迅速、簡便、高感度及び高精度に検出することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、
前記セットが、１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、
前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、
前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列（caaggtatccc）を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７〜２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、セットや、
（２）１種又は２種以上のフォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２７のヌクレオチド配列（caaggtatccctac）を含むヌクレオチド配列からなる１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）に記載のセットや、
（３）１種又は２種以上のフォワードプライマーが、以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のセット：
（Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
（Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：や、
（４）２種のフォワードプライマーを含み、前記２種のフォワードプライマーが、配列番号４〜７、１１及び１２から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のセットや、
（５）リバースプライマーの少なくとも１種が、配列番号１４のヌクレオチド番号３〜２０のヌクレオチド配列（wsccaaggcatccaccah）を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセットや、
（６）２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下の（Ｃ１）、（Ｃ２−１）、（Ｃ２−２）、（Ｃ２−３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）及び（Ｇ）から選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のセット：
（Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２−１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２−２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２−３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２５個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２３個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（７）２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下のオリゴヌクレオチドから選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載のセット：
配列番号２１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２４のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（８）プローブが、配列番号３３のヌクレオチド番号７〜１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載のセットや、
（９）１種又は２種以上のプローブが、以下の（Ｈ）〜（Ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載のセット：
（Ｈ）配列番号３４のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｉ）配列番号３５のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｊ）配列番号３６のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｋ）配列番号３７のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｌ）配列番号３８のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（１０）１種又は２種以上のプローブが、以下の（ｈ）〜（ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載のセット：
（ｈ）配列番号３９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｊ）配列番号４１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｋ）配列番号４２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｌ）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（１１）プローブが、５’末端を蛍光物質で、３’末端を消光物質で修飾されているTaqMan（登録商標）プローブであることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のセットに関する。【００１３】
また、本発明は、
（１２）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキットであって、
前記キットが、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されていることを特徴とする、キットに関する。【００１４】
さらに、本発明は、
（１３）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
（ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
（ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
（ｃ）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるプローブを用いて、上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在しているか否かを検出する工程ｃ：
を含む方法や、
（１４）工程ｃにおける、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物の検出が、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるプローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じるか否かを検出することによりなされることを特徴とする上記（１３）に記載のマイコプラズマを検出する方法や、
（１５）マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマの検出限界感度が１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であることを特徴とする上記（１３）又は（１４）に記載のマイコプラズマを検出する方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】上パネルは、本発明における各フォワードプライマーや各リバースプライマーが、マイコプラズマのゲノム上でどの位置に対応するかを示す図である。下パネルは、フォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーからなる各セット（組合せ）が、それぞれどのような種類のマイコプラズマをターゲットとしているかを示す図である。
【図２】本検出法（本発明の検出方法）と、参考論文記載の検出法（非特許文献１記載の検出法）とで、各種マイコプラズマに対する検出感度を測定した結果を示す図である。
【図３】本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法において、交差反応性が実際に否定された細菌、真菌及び哺乳類由来細胞を示す。
【図４】Ｆ１フォワードプライマー、そのバリエーションプライマー、Ｒ１リバースプライマー、及びそのバリエーションプライマーの各配列の位置関係を示す図である。
【図５】Ｆ１フォワードプライマーやそのバリエーションプライマーと、Ｒ１リバースプライマーやそのバリエーションプライマーとの組合せについて、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法を行った結果を示す図である。ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数であり、ｃｔ値が小さいほどその対象をより高感度で検出していることを表す。
【図６】マイコプラズマ（マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、スピロプラズマ・シトリ）と、マイコプラズマではないクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）とのゲノム配列を比較した結果の一部を示す図である。
【図７−１】本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。
【図７−２】本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。
【図７−３】本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセット）
本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセット（以下、単に「本発明のセット」とも表示する。）としては、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、前記セットが１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、前記プローブは、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７〜２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されない。
【００１８】
本発明におけるフォワードプライマーとしては、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個〜３０個（好ましくは１７個〜２６個、より好ましくは１７個〜２３個、さらに好ましくは１８個〜２２個、さらにより好ましくは１９〜２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されないが、マイコプラズマをより高感度又はより高精度に検出する観点から、これらのオリゴヌクレオチドの中でも、配列番号１のヌクレオチド番号１１〜２４のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドや、配列番号１のヌクレオチド番号１４〜２７のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１のヌクレオチド番号１１〜２７のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドがより好ましい。配列番号１のヌクレオチド番号２７のヌクレオチド「ｃ」は、マイコプラズマではきわめて高く保存されており、かつ、マイコプラズマ以外の細菌では「ｃ」以外のヌクレオチドであることが多いため、マイコプラズマに特徴的な配列となっている。
【００１９】
本発明のセットは、フォワードプライマーを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、少なくとも以下の（Ａ）、（Ｂ）の２種を含む、２種以上のフォワードプライマーを含んでいることが好ましく、以下の（Ａ）、（Ｂ）の２種のフォワードプライマーを含んでいることがより好ましい。
（Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド番号２４のヌクレオチドｓがｃであるヌクレオチド配列）のうち、１７個〜３０個（好ましくは１７個〜２６個、より好ましくは１７個〜２３個、さらに好ましくは１８個〜２２個、さらにより好ましくは１９〜２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：（Ｆ１系のフォワードプライマーの上位概念）
（Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド番号２４のヌクレオチドｓがｇであるヌクレオチド配列）のうち、１７個〜３０個（好ましくは１７個〜２６個、より好ましくは１７個〜２３個、さらに好ましくは１８個〜２２個、さらにより好ましくは１９〜２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４〜２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：（Ｆ２フォワードプライマーの上位概念）
【００２０】
本発明のセットが含む上記１種又は２種以上のフォワードプライマーのより具体的な例としては、以下の（Ａ１）〜（Ａ６）及び（Ｂ１）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーが好ましく、中でも、以下の（Ａ１）〜（Ａ６）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーと、以下の（Ｂ１）のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーとを含んでいることがより好ましい。
（Ａ１）：配列番号２のヌクレオチド番号８〜３０のヌクレオチド配列（Ｆ１フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個〜２１個（好ましくは１８個〜２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ２）：配列番号２のヌクレオチド番号９〜３０のヌクレオチド配列（Ｍ１フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に１塩基延ばした配列）のうち、１７個〜２１個（好ましくは１８個〜２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ３）：配列番号２のヌクレオチド番号６〜２８のヌクレオチド配列（ＴＦフォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個〜２１個（好ましくは１８個〜２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＦフォワードプライマーの上位概念）
（Ａ４）：配列番号２のヌクレオチド番号９〜３０のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ−１フォワードプライマーの５’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１８個〜２２個（好ましくは１９個〜２１個、より好ましくは２０個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ５）：配列番号２のヌクレオチド番号４〜２６のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ−５フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個〜２１個（好ましくは１８個〜２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−５フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ６）：配列番号２のヌクレオチド番号５〜２９のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ−６フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１９個〜２３個（好ましくは２０個〜２２個、より好ましくは２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−６フォワードプライマーの上位概念）
（Ｂ１）：配列番号３のヌクレオチド番号８〜３０のヌクレオチド配列（Ｆ２プライマーフォワードの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個〜２１個（好ましくは１８個〜２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ２フォワードプライマーの上位概念）
【００２１】
上記の（Ａ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ２）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ２）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ３）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ３）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ４）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ４）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ５）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ５）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ６）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ６）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ｂ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ｂ１）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ａ１）：配列番号４のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１０〜２８のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ１フォワードプライマー）
（ａ２）：配列番号５のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１１〜２９のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ１フォワードプライマー）
（ａ３）：配列番号６のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号８〜２６のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＦフォワードプライマー）
（ａ４）：配列番号７のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１１〜３０のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−１フォワードプライマー）
（ａ５）：配列番号１１のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号６〜２４のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−５フォワードプライマー）
（ａ６）：配列番号１２のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号７〜２７のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ−６フォワードプライマー）
（ｂ１）：配列番号１３のヌクレオチド配列（配列番号３のヌクレオチド番号１０〜２８のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ２フォワードプライマー）
【００２２】
上記のＦ１フォワードプライマー、Ｍ１フォワードプライマー、ＴＦフォワードプライマー、ＭｙＴＦ−１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−５フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−６フォワードプライマー（これらをまとめて、「Ｆ１系フォワードプライマー」とも表示する。）の中では、Ｆ１フォワードプライマー、Ｍ１フォワードプライマー、ＴＦフォワードプライマー、ＭｙＴＦ−１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−５フォワードプライマーが好ましく、中でも、Ｆ１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−５フォワードプライマーがより好ましい。
【００２３】
上記フォワードプライマー（Ａ）、（Ａ１）〜（Ａ６）及び（ａ１）〜（ａ６）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・シノビアエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエ、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適しており、上記フォワードプライマー（Ｂ）、（Ｂ１）及び（ｂ１）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適している。
【００２４】
本発明におけるリバースプライマーとしては、配列番号１４、１７〜２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７〜２６個（好ましくは１８個〜２５個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されない。本発明のセットは、リバースプライマーを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、好ましくは以下の（Ｃ）〜（Ｇ）［より好ましくは（Ｃ１）、（Ｃ２−１）、（Ｃ２−２）、（Ｃ２−３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）、（Ｇ）］から選択される２種以上（好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、より好ましくは６種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種以上、さらに好ましくは９種のリバースプライマーを含んでいることが好ましい。
（Ｃ）：配列番号１４のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１系及びＲ４系のリバースプライマーの上位概念）
（Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２６個、より好ましくは２０個〜２６個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ２リバースプライマーの上位概念）
（Ｅ）：配列番号１８のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個（好ましくは１８個〜２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３及びＲ６のリバースプライマーの上位概念）
（Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２５個（好ましくは１８個〜２５個、より好ましくは２０個〜２５個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ５リバースプライマーの上位概念）
（Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２３個（好ましくは１８個〜２３個、より好ましくは２０個〜２３個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ７リバースプライマーの上位概念）
【００２５】
上記の（Ｃ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｃ１）や（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１系のリバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２）：配列番号１６のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個（好ましくは２０個〜２６個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４系のリバースプライマーの上位概念）
【００２６】
上記（Ｃ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ｃ１−１）や、（ｃ１−２）や、（ｃ１−３）のオリゴヌクレオチドが好ましく、中でも、（ｃ１−１）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ｃ１−１）：配列番号２１のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号１〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１リバースプライマー）
（ｃ１−２）：配列番号２２のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号１〜２２のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ６−２リバースプライマー）
（ｃ１−３）：配列番号２４のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号３〜２０のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＲ−２リバースプライマー）
【００２７】
上記（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｃ２−１）や、（Ｃ２−２）や、（Ｃ２−３）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｃ２−１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０〜２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３０（aaaa）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−１リバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２−２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０〜２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３１（caaa）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−２リバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２−３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０〜２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３２（aata）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１８個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−３リバースプライマーの上位概念）
【００２８】
上記（Ｃ２−１）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２−１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｃ２−２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２−２）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｃ２−３）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２−３）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｃ２−１）：配列番号２５のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３〜２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−１リバースプライマー）
（ｃ２−２）：配列番号２６のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３〜２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−２リバースプライマー）
（ｃ２−３）：配列番号２７のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３〜２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４−３リバースプライマー）
【００２９】
上記の（Ｄ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｄ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｄ）配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ２リバースプライマー）
【００３０】
上記の（Ｅ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｅ１）や、（Ｅ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個（好ましくは１８個〜２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３リバースプライマーの上位概念）
（Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個〜２４個（好ましくは１８個〜２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ６リバースプライマーの上位概念）
【００３１】
上記の（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｅ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ｅ２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｅ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｅ１）：配列番号２８のヌクレオチド配列（配列番号１８のヌクレオチド番号５〜２４のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号９のｒがｇであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３リバースプライマー）
（ｅ２）：配列番号２９のヌクレオチド配列（配列番号１８のヌクレオチド番号５〜２４のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号９のｒがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ６リバースプライマー）
【００３２】
上記の（Ｆ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｆ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ５リバースプライマー）
【００３３】
上記の（Ｇ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｇ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｇ）配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ７リバースプライマー）
【００３４】
上記リバースプライマー（Ｃ１）、（ｃ１−１）、（ｃ１−２）及び（ｃ１−３）は、例えば、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２−１）及び（ｃ２−１）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２−２）及び（ｃ２−２）は、例えば、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２−３）及び（ｃ２−３）は、例えば、マイコプラズマ・ハイオリニスの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｄ）及び（ｄ）は、例えば、アコレプラズマ・レイドラウィイの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｅ１）及び（ｅ１）は、例えば、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｅ２）及び（ｅ２）は、例えば、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｆ）及び（ｆ）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｇ）及び（ｇ）は、例えば、マイコプラズマ・シノビアエの検出に適している。
【００３５】
本発明におけるプローブとしては、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個〜２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されないが、配列番号３３のヌクレオチド番号７〜１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号４４〜４８のヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドがより好ましい。本発明のセットは、プローブを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、好ましくは以下の（Ｈ）〜（Ｌ）から選択される２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上、さらにより好ましくは５種のプローブを含んでいることが好ましい。
（Ｈ）：配列番号３４のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがａであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１９個〜２５個、より好ましくは２０個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−１プローブの上位概念）
（Ｉ）：配列番号３５のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがｇであり、ｙがｔである配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１９個〜２５個、より好ましくは２０個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−２プローブの上位概念）
（Ｊ）：配列番号３６のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがａであり、ｙがｔである配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１９個〜２５個、より好ましくは２０個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−３プローブの上位概念）
（Ｋ）：配列番号３７のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがｇであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１９個〜２５個、より好ましくは２０個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−４プローブの上位概念）
（Ｌ）：配列番号３８のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｃであり、ｒがａであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個〜２６個（好ましくは１９個〜２５個、より好ましくは２０個〜２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ２プローブの上位概念）
【００３６】
上記の（Ｈ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｈ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｊ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｋ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｌ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｌ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｈ）：配列番号３９のヌクレオチド配列（配列番号３４のヌクレオチド番号２〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−１プローブ）
（ｉ）：配列番号４０のヌクレオチド配列（配列番号３５のヌクレオチド番号２〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−２プローブ）
（ｊ）：配列番号４１のヌクレオチド配列（配列番号３６のヌクレオチド番号２〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−３プローブ）
（ｋ）：配列番号４２のヌクレオチド配列（配列番号３７のヌクレオチド番号２〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１−４プローブ）
（ｌ）：配列番号４３のヌクレオチド配列（配列番号３８のヌクレオチド番号２〜２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ２プローブ）
【００３７】
上記プローブ（Ｈ）及び（ｈ）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・ハイオリニス、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出に適しており、中でも、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・ハイオリニス、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出により適している。また、上記プローブ（Ｉ）及び（ｉ）は、例えば、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適している。また、上記プローブ（Ｊ）及び（ｊ）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・シノビアエの検出に適しており、中でも、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・シノビアエの検出により適している。また、上記プローブ（Ｋ）及び（ｋ）は、例えば、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエの検出に適している。
上記プローブ（Ｌ）及び（ｌ）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適している。
【００３８】
本発明におけるフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブの好ましい組合せとしては、以下の表１の組合せＣＡ〜ＣＩを挙げることができる。本発明のセットは、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、かかる組合せＣＡ〜ＣＩから選択される２種（好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、より好ましくは６種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種以上、特に好ましくは９種）の組合せを含んでいることが好ましい。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
上記組合せＣＡは、検出対象として、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウムを含んでおり、上記組合せＣＢは、検出対象として、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタムを含んでおり、上記組合せＣＣは、検出対象として、マイコプラズマ・ハイオリニスを含んでおり、上記組合せＣＤは、検出対象として、マイコプラズマ・シノビアエを含んでおり、上記組合せＣＥは、検出対象として、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエを含んでおり、上記組合せＣＦは、検出対象として、アコレプラズマ・レイドラウィイを含んでおり、上記組合せＣＧは、検出対象として、マイコプラズマ・ガリセプティカムを含んでおり、上記組合せＣＨは、検出対象として、ウレアプラズマ・ウレアリティカムを含んでおり、上記組合せＣＩは、検出対象として、スピロプラズマ・シトリを含んでいる。
【００４１】
上記の各フォワードプライマーや各リバースプライマーは、それぞれのヌクレオチド配列において、１又は数個（例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されていても、それぞれが検出対象とするマイコプラズマ群に特異的な標的核酸を増幅することができるものであれば、本発明におけるプライマーとして使用することができる。本発明におけるフォワードプライマーやリバースプライマーは、リン酸トリエチル法や、リン酸ジエステル法等の常法により、通常用いられるＤＮＡ合成装置等を利用して合成することができる。
【００４２】
本発明におけるプローブは、対応するプライマー対による増幅産物（アンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることによって、二重鎖分子（ハイブリッド）を形成し得る一本鎖核酸である。かかる一本鎖核酸としては、プローブとしての安定性に優れていることから、一本鎖ＤＮＡが好ましく挙げられる。上記の各プローブは、それぞれのヌクレオチド配列と８５％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、それぞれが検出対象とするマイコプラズマ群の増幅産物に特異的にハイブリダイズすることができるものであれば、本発明におけるプローブとして使用することができる。本発明におけるプローブは、リン酸トリエチル法や、リン酸ジエステル法等の常法により、通常用いられるＤＮＡ合成装置等を利用して合成することができる。
【００４３】
本発明におけるプローブは、対応するプライマー対による増幅産物を検出するために標識物質で標識されていることが好ましく、迅速、高感度で検出する観点から、蛍光物質で標識されていることがより好ましく、蛍光物質と消光物質で二重標識されていることがより好ましく、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであることがさらに好ましい。ＴａｑＭａｎプローブは、通常、核酸プローブの５’末端を蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾し、３’末端を消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾する。レポーター蛍光色素の例としては６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）等のフルオレッセイン系蛍光色素が挙げられ、クエンチャー蛍光色素の例としては、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）等のローダミン系蛍光色素が挙げられるが、本発明においては、配列番号５の塩基配列を用いつつ、Ｔｍ値を対応するプライマー対のＴｍ値よりも８〜１０℃程度高くするために、非蛍光消光物質であるminor groove binder （ＭＧＢ）が好適に用いられる。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイムＰＣＲ用キットに含まれているのでそれを用いることができる。
【００４４】
（本発明におけるキット）
本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキット（以下、単に「本発明のキット」とも表示する。）としては、フォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されている限り特に制限されない。固体支持体上に固定されているプローブを用いると、増幅産物をより迅速に検出し得る点で好ましい。本発明における「固体支持体」とは、プローブのオリゴヌクレオチドを結合できる基材を意味し、例えば、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、膜（ナイロン、ニトロセルロースなど）、ビーズ（樹脂など）、金属微粒子、基板（ガラス、シリコン、樹脂など）などが挙げられる。固体支持体上へのプローブの固定化は、共有結合、非共有結合のいずれを利用してもよく、マイクロプレートを用いる場合、そのウェル内にプローブ溶液を滴下して単に乾燥させるだけであってもよい。
【００４５】
（マイコプラズマを検出する方法）
本発明のマイコプラズマを検出する方法は、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
（ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
（ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
（ｃ）上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在するか否かを検出する工程ｃ：
を含む方法である限り特に制限されない。かかる方法によって、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出することができる。
【００４６】
本発明における「マイコプラズマ」とは、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属に属する細菌だけでなく、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、メソプラズマ（Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ）属、エントモプラズマ（Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａ）属、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属、アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）属、アステロプラズマ（Ａｓｔｅｒｏｌｅｐｌａｓｍａ）属、及びサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属を包含するモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）綱に属する細菌を意味するが、中でも、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、スピロプラズマ属、アコレプラズマ属に属する細菌が好ましく挙げられ、中でも、マイコプラズマ属に属する細菌がより好ましく挙げられる。本発明の検出対象として特に好ましいマイコプラズマとしては、マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）、及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマが挙げられる。
【００４７】
本発明における「被検試料」としては特に制限されず、哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類等の動物や植物などの培養細胞、細胞培養上清、生体試料などが挙げられる。なお、被検試料からＤＮＡを抽出する前に、必要に応じて、濾過、不純物除去などの前処理を行ってもよい。
【００４８】
上記工程ａとしては、被検試料からＤＮＡを抽出する工程である限り特に制限されない。被検試料からＤＮＡを抽出する方法としては、常法を用いることができ、例えば、フェノール／クロロホルム法等の液−液抽出法や、担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、試薬メーカーにより市販されているQIAamp（登録商標）DNA Mini Kit（QIAGEN社製）、Loopamp（登録商標）SR DNA抽出キット（栄研化学株式会社製）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。
【００４９】
QIAamp（登録商標）DNA Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて被検試料からＤＮＡを抽出する方法の一例を以下に説明する。
マイクロチューブに、被検試料を２００μＬ採取する。マイクロチューブ内のサンプルに、２０μＬのプロテイナーゼＫ、及び、２００μＬのBuffer ALを添加した後、ボルテックスを用いて１５秒間撹拌する。マイクロチューブを、５６℃で１０分間保温する。サンプルに２００μＬのエタノール（１００％）を添加した後、ボルテックスを用いて１５秒間攪拌する。サンプルをQIAamp Mini spin Column（2mL collection tube付属）に移した後、室温及び６０００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移し、サンプルに５００μＬのBuffer AW1を加える。室温及び６０００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移し、サンプルに５００μＬのBuffer AW2を加える。室温及び２００００×ｇで３分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移した後、室温及び２００００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを1.5 mL tubeに移し、メンブレンに２００μＬのBuffer AEを加える。室温で１分間保温した後、室温及び６０００×ｇで１分間遠心し、ＤＮＡ抽出液を得る。カラムは廃棄する。
【００５０】
上記工程ｂとしては、上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程である限り特に制限されない。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲとは、リアルタイム定量ＰＣＲにおいて、複数（２対以上又は３対以上）のプライマー対を１つの増幅反応場において同時に用いるＰＣＲであり、リアルタイム定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）とは、ＰＣＲによる増幅産物の量をリアルタイムでモニターし解析する手法である。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲは、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。かかるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲは、上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いること以外は、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの通常の方法を用いることができる。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの通常の方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第４版」（Green及びSambrook、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２０１２年）や、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ用のキット（例えばBrilliant Multiplex QPCR Master Mix（アジレントテクノロジー社製）等）の取扱説明書などで説明されている。リアルタイム定量ＰＣＲにおいて、増幅産物を検出する方法としては、インターカレーター法とプローブ法が主に知られているが、マイコプラズマをより高感度、高精度に検出する観点から、プローブを用いて増幅産物を検出するプローブ法が好ましく挙げられる。
【００５１】
本発明におけるフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブの使用濃度としては、マイコプラズマの検出が可能である限り特に制限されず、当業者であれば使用濃度を適宜調整して用いることができるが、例えば、０．００５〜３μＭの範囲内を挙げることができ、０．０１〜１μＭの範囲内を好ましく挙げることができる。
【００５２】
マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法の好ましい方法として、例えば以下のＡ法やＢ法を挙げることができる。
【００５３】
（Ａ法）
０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、被検試料由来のＤＮＡ溶液を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行うことができる。ＰＣＲ用の反応液は、1×PCR Gold Buffer (１５ｍＭ Tris-HCl (ｐＨ８．０),  ５０ｍＭ  ＫＣｌ)（ＡＢＩ社製）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２ （ＡＢＩ社製）、６０ｍＭトレハロース、２００μＭ each dNTPs（Trilink社製））、１．２５Ｕのamplitaq Gold DNA polymerase、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４−１、０．１２５μＭのＲ４−２、０．１２５μＭのＲ４−３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１−１、０．０４５μＭのＰ１−２、０．０４５μＭのＰ１−３、０．０４５μＭのＰ１−４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製することができる。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の活性化の後、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）というサイクルを４５サイクル行うことができる。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出することができる。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いることができる。ネガティブコントロールにはDistilled WaterDeionized, Sterile（ニッポンジーン社製）を用いることができる。
【００５４】
（Ｂ法）
０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、被検試料由来のＤＮＡ溶液を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行うことができる。ＰＣＲ用の反応液は、1× PCR Buffer (７５ｍＭTris-HCl (ｐＨ８．８), ２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４,３ｍＭ  ＭｇＣｌ２, ０．０１％ (v/v) Tween 20, ２５０μＭ each dNTPs)、１．２５ＵのTaq DNA polymerase (Thermo scientific社製) 、５μｇのanti-taq high (TOYOBO社製)、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４−１、０．１２５μＭのＲ４−２、０．１２５μＭのＲ４−３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１−１、０．０４５μＭのＰ１−２、０．０４５μＭのＰ１−３、０．０４５μＭのＰ１−４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製することができる。ＰＣＲ条件は、９５℃、１分間のPreDenatureの後、９５℃、５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）を４５サイクル行うことができる。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出することができる。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いることができる。ネガティブコントロールにはDistilled WaterDeionized, Sterile（ニッポンジーン社製）を用いることができる。
【００５５】
マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの実施や、その増幅産物の検出は、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)などの、市販されているリアルタイムＰＣＲシステムを用いて行うことができる。
【００５６】
本発明のマイコプラズマを検出する方法における、マイコプラズマの検出限界感度は、通常１００ｃｆｕ／ｍＬ以下であり、好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｃｆｕ／ｍＬ以下である。特に、マイコプラズマ・アルギニニ（好ましくはＡＴＣＣ ２３８３８）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（好ましくはＮＢＲＣ１５８５４）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（好ましくはＮＢＲＣ１４８５５）、マイコプラズマ・ハイオリニス（好ましくはＮＢＲＣ１４８５８）、マイコプラズマ・オラーレ（好ましくはＮＢＲＣ１４４７７）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（好ましくはＮＢＲＣ１４４０１）、マイコプラズマ・シノビアエ（好ましくはＡＴＣＣ２５２０４）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（好ましくはＮＢＲＣ１４４００）、スピロプラズマ・シトリについての検出限界感度は、好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｃｆｕ／ｍＬ以下である。
【００５７】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
［マイコプラズマを検出するためのプライマー及びプローブの設計］
極めて多種のマイコプラズマを特異的に検出し得るプライマー及びプローブを設計するために、図１の下パネルの“Mollicutes species”に記載のマイコプラズマのゲノム配列と、図３に記載の他の細菌、真菌及び哺乳類のゲノム配列を収集してアラインメントを作成し、解析を行った。そして、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域のうち、特定の領域が、細菌の種類毎に特有な配列を有していながらも、マイコプラズマ間では比較的高度に保存されていることを見いだし、この特定の領域に基づいて、多種のマイコプラズマを特異的に検出し得るプライマー及びプローブの設計を行った。すなわち、マイコプラズマのその特定の領域のゲノム配列又はその相補配列にはアニールするが、他の細菌のそれらの配列にはアニールしない（ミスマッチが多い）と予想される配列をフォワードプライマー又はリバースプライマーとし、また、それらのプライマーによる増幅産物に含まれる別の特定の領域の配列又はその相補配列にはハイブリダイズするが、他の細菌のそれらの配列にはハイブリダイズしないと予想される配列をプローブとした（図１の上パネルや、図７−１〜図７−３参照）。一例として、マイコプラズマ（マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、スピロプラズマ・シトリ）と、マイコプラズマではないクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）とのゲノム配列を比較した結果の一部を図６に示す。【００５９】
図１の下パネルに示すように、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４−１リバースプライマー（配列番号２５）と、Ｐ１−１（配列番号３９）又はＰ１−３（配列番号４１）プローブとがセット（組合せＡ）（Group 1aのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４−２リバースプライマー（配列番号２６）と、Ｐ１−１（配列番号３９）又はＰ１−３（配列番号４１）プローブとがセット（組合せＢ）（Group 1bのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４−３リバースプライマー（配列番号２７）と、Ｐ１−１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＣ）（Group 1cのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ７リバースプライマー（配列番号２０）と、Ｐ１−３プローブ（配列番号４１）とがセット（組合せＤ）（Group 6のマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ１リバースプライマー（配列番号２１）と、Ｐ１−４プローブ（配列番号４２）とがセット（組合せＥ）（Group 2のマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ２リバースプライマー（配列番号１７）と、Ｐ１−１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＦ（Group 4のマイコプラズマを対象））となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ３リバースプライマー（配列番号２８）と、Ｐ１−１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＧ）（Group 3aのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ６リバースプライマー（配列番号２９）と、Ｐ１−２プローブ（配列番号４０）とがセット（組合せＨ）（Group 3bのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ２フォワードプライマー（配列番号１３）と、Ｒ５リバースプライマー（配列番号１９）と、Ｐ２プローブ（配列番号４３）とがセット（組合せＩ）（Group 5のマイコプラズマを対象）となる。なお、図１の下パネルから分かるように、上記組合せＡは、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、及び、マイコプラズマ・サリバリウムを検出ターゲットとしており、上記組合せＢは、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、及び、マイコプラズマ・プリマタムを検出ターゲットとしており、上記組合せＣは、マイコプラズマ・ハイオリニスを検出ターゲットとしており、上記組合せＤは、マイコプラズマ・シノビアエを検出ターゲットとしており、上記組合せＥは、マイコプラズマ・ゲニタリウム、及び、マイコプラズマ・ニューモニアエを検出ターゲットとしており、上記組合せＦは、アコレプラズマ・レイドラウィイを検出ターゲットとしており、上記組合せＧは、マイコプラズマ・ガリセプティカムを検出ターゲットとしており、上記組合せＨは、ウレアプラズマ・ウレアリティカムを検出ターゲットとしており、上記組合せＩは、スピロプラズマ・シトリを検出ターゲットとしている。上記セットＡ〜Ｉの各プライマー及びプローブを、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。
【実施例２】
【００６０】
［プライマー及びプローブのセットによるマイコプラズマ検出の感度測定試験］
実施例１で作製したセットＡ〜Ｉの各プライマー及びプローブが、各種マイコプラズマをどの程度の感度で測定し得るかを確認するために、以下のような、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験を行った。【００６１】
（材料）
マイコプラズマ・アルギニニ（ＡＴＣＣ２３８３８）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（ＮＢＲＣ１５８５４）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（ＮＢＲＣ１４８５５）、マイコプラズマ・ハイオリニス（ＮＢＲＣ１４８５８）、マイコプラズマ・オラーレ（ＮＢＲＣ１４４７７）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（ＮＢＲＣ１４４０１）、マイコプラズマ・シノビアエ（ＡＴＣＣ２５２０４）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（ＮＢＲＣ１４４００）、スピロプラズマ・シトリ（ＡＴＣＣ２７５５６）。
5 Units/μLのAmplitaq Gold DNA polymerase （ＡＢＩ社製）。
Ampitaq Gold付属試薬(ABI)：10×PCR Buffer (150 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM KCl), 25 mM MgCl2, 10 mM each dNTP mix。
Distilled Water, Deionized, Sterile（ニッポンジーン社製）。【００６２】
（方法：Ａ法）
０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、上記のいずれかのマイコプラズマのＤＮＡ溶液（５，１０，１００，又は１０００ｃｆｕ／reaction）を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ用の反応液は、1×PCR Gold Buffer (15 mM Tris-HCl (pH8.0),50 mM KCl)（ＡＢＩ社製）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＡＢＩ社製）、６０ｍＭトレハロース、２００μＭ each dNTPs（ＡＢＩ社製））、１．２５Ｕのamplitaq Gold DNA polymerase、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４−１、０．１２５μＭのＲ４−２、０．１２５μＭのＲ４−３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１−１、０．０４５μＭのＰ１−２、０．０４５μＭのＰ１−３、０．０４５μＭのＰ１−４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製した。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の活性化の後、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）というサイクルを４５サイクル行った。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出した。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いた。【００６３】
この試験の結果を図２の左側（「本検出法」）に示す。また、比較対象方法として、tuf遺伝子の保存領域を利用した従来公知のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法（非特許文献１）を実施した。その結果を図２の右側（「参考論文記載の検出法」）に示す。これらの結果から、本発明の検出法は、類似する従来の検出法と比較して、同等か又はそれより優れた検出感度が得られることが示された。例えば、比較対象方法では、５ｃｆｕ／reactionのマイコプラズマ・フェルメンタンスを３サンプルとも検出できなかったが（０／３）、本発明の検出法では、３サンプルとも検出することができた（３／３）。また、本発明の検出法では、マイコプラズマ・ガリセプティカム、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・シノビアエ、アコレプラズマ・レイドラウィイ及びスピロプラズマ・シトリに対して、比較対象方法よりも格段に優れた検出感度が得られることが示された。
【実施例３】
【００６４】
［マイコプラズマ以外の細菌との交差反応性の確認］
本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法におけるフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブについて、マイコプラズマ以外の他の種類の細菌、真菌及び哺乳類由来細胞に対する交差反応性を確認した。かかる他の種類の細菌等として、図３に列挙された細菌等について、実施例２の方法と同様の方法で本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法を行ったところ、蛍光プローブのシグナルは検出されなかった。このように、図３に列挙された細菌、真菌及び哺乳類由来細胞に対する交差反応性は否定された。また、この他に、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bartonella bacilliformis、Bartonella grahamii、Borrelia duttonii、Borrelia recurrentis、Campylobacter curvus、Campylobacter hominis、Chlamydia muridarum、Chlamydia trachomatis、Chlamydophilia pneumonia、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Corynebacterium diphtheriae、Erysipelothrix rhusiopathiae、Fusobacterium necrophorum、Haemophilus influenza、Helicobacter pylori、Kineococcus radiotolerans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus helveticus、Listeria monocytogenes、Listeria welshimeri serovar6b str、Micrococcus luteus、Moraxella catarrhalis、Moraxella lacunata、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis alpha 14、Nocardia carnea、Nocardia farcinica、Pediococcus pentosaceus、Pseudomonas putida、Rhodococcus jostii、Rickettsia africae、Rickettsia peacockii、Streptococcus sanguinis、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Treponema denticola、Treponema pallidumについて、公知の配列データベースから入手したそれらの細菌の遺伝子配列情報と、本発明のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの配列とを比較した結果、これらの細菌は、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法における、マイコプラズマに対する交差反応性が否定されると推定された。図３に示されるように、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法は、マイコプラズマ以外のきわめて多種の細菌等に対して交差反応性がない、あるいはないと推定され、マイコプラズマに対する特異性がきわめて高いことが示された。
【実施例４】
【００６５】
［バリエーションプライマーの感度及び交差反応性の確認］
Ｆ１フォワードプライマー、Ｒ１リバースプライマー、あるいはこれらを改変したバリエーションプライマーについて、マイコプラズマ検出の感度、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）に対する交差反応性の確認を試みた。【００６６】
また、Ｆ１フォワードプライマーのバリエーションとして、以下の表２記載のフォワードプライマーを設計し、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。なお、これらのバリエーションのプライマーのヌクレオチド数や、Ｆ１フォワードプライマーとの関係（Ｆ１フォワードプライマーに対して、５’末端側又は３’末端側に、何ヌクレオチド延伸又は短縮したか）を以下の表に示す。【００６７】
【表２】
2016038877.tif 000003
【００６８】
また、Ｒ１リバースプライマーのバリエーションとして、以下の表３記載のリバースプライマーを設計し、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。なお、これらのバリエーションのプライマーのヌクレオチド数や、Ｒ１リバースプライマーとの関係（Ｒ１リバースプライマーに対して、５’末端側又は３’末端側に、何ヌクレオチド延伸又は短縮したか）を以下の表３に示す。【００６９】
【表３】
2016038877.tif 000004
【００７０】
上記のＦ１フォワードプライマーやそのバリエーションプライマー、あるいは、上記のＲ１リバースプライマーのバリエーションプライマーの各配列の位置関係を図４に示す。なお、図４における移動度とは、基準となるプライマー（フォワードプライマーの場合はＦ１、リバースプライマーの場合はＲ１）の３’末端のヌクレオチドに対して、バリエーションプライマーの３’末端のヌクレオチドの位置がどちら側に何ヌクレオチド移動したかを表している。例えば、Ｍ１フォワードプライマーは、Ｆ１フォワードプライマーの３’末端側のヌクレオチドを１つ延伸しているため、移動度「＋１」となり、ＭｙＴＦ−６フォワードプライマーは、Ｆ１フォワードプライマーの３’末端側のヌクレオチドを１つ短縮しているため、移動度「−１」となる。【００７１】
Ｆ１フォワードプライマー及びそのバリエーションプライマーと、Ｒ１リバースプライマー及びそのバリエーションプライマーとの全ての組合せ（以下の表４参照）について、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法（上記実施例２参照）を行った。その際、細菌としては、マイコプラズマ・ゲニタリウム（約１０６ｃｆｕ／reaction）や、ラクトバチルス・ブルガリクス（約１０６ｃｆｕ／reaction）を用い、蛍光プローブとしては、Ｐ１−１，Ｐ１−２，Ｐ１−３，Ｐ１−４及びＰ２を混合したものを用いた。また、ネガティブコントロールには、Distilled WaterDeionized, Sterile (ニッポンジーン社製)を用いた。【００７２】
【表４】
2016038877.tif 000005
【００７３】
このマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験における各サンプルの検出結果を図５に示す。未検出の場合は「−」で表し、検出の場合はｃｔ値を示した。ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数であり、ｃｔ値が小さいほどその対象をより高感度で検出していることを表す。図５の結果から分かるように、フォワードプライマーとして、Ｍ１、Ｆ１、ＴＦ、ＭｙＴＦ−１、ＭｙＴＦ−５を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６−２、ＴＲ、ＴＲ−２、Ｒ１のいずれを用いた場合であっても、マイコプラズマではないラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなく、マイコプラズマ・ゲニタリウムを高感度で検出した。一方、フォワードプライマーとしてＭｙＴＦ−３、ＭｙＴＦ−４、ＭｙＴＦ−６を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６−２、ＴＲ−２、Ｒ１を用いた際にはラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなかったが、リバースプライマーとしてＴＲを用いた場合は、ラクトバチルス・ブルガリクスと交差反応性を示した。ただし、ＭｙＴＦ−３、ＭｙＴＦ−４、ＭｙＴＦ−６の３種のフォワードプライマーの中では、ラクトバチルス・ブルガリクスに対するＭｙＴＦ−６のｃｔ値は比較的高く（４２．２５）、ＭｙＴＦ−６はこれら３種のフォワードプライマーの中ではラクトバチルス・ブルガリクスに対する交差反応性が最も低かった。また、フォワードプライマーとしてＭｙＴＦ−２を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６−２を用いた際にはラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなかったものの、リバースプライマーとしてＴＲ、ＴＲ−２、Ｒ１を用いた場合は、ラクトバチルス・ブルガリクスと交差反応性を示した。【００７４】
以上の図５の結果から、フォワードプライマーとしては、Ｆ１、Ｍ１、ＴＦ、ＭｙＴＦ−１、ＭｙＴＦ−５及びＭｙＴＦ−６が好ましく、中でも、Ｆ１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ−５フォワードプライマーがより好ましいことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することができる。本発明は、生物由来医薬品や再生医療や細胞治療のための細胞培養の現場におけるマイコプラズマ汚染の検出の他、マイコプラズマ感染症の診断などにも利用することができる。
【図１】
2016038877.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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