(57)【要約】  本発明によれば、配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するオーランチオキトリウム属に属する微生物、オーランチオキトリウムエスピー ＯＨ４株、これらの微生物を親株として得られる変異株であって、該親株よりもＤＨＡの生産能が高い微生物、又はオーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株を提供することができる。  また、これらの微生物を用いた発酵法によるＤＨＡ含有組成物、ＤＨＡ及びＤＨＡアルキルエステルの製造法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するオーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属に属する微生物。
【請求項２】
オーランチオキトリウム  エスピー（Aurantiochytrium sp.）ＯＨ４株（受託番号 FERM BP-11524）。
【請求項３】
請求項１または２の微生物を親株として得られる変異株であって、該親株よりもドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）の生産能が高い微生物。
【請求項４】
オーランチオキトリウム  エスピー（Aurantiochytrium sp.）ＬＴＲ２３株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＤＨＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物中からＤＨＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＤＨＡ含有組成物の製造法。
【請求項６】
請求項５で採取されるＤＨＡ含有組成物から、ＤＨＡを分離して採取することを特徴とする、ＤＨＡの製造法。
【請求項７】
請求項５で採取されるＤＨＡ含有組成物から、ＤＨＡアルキルエステルを分離して採取することを特徴とする、ＤＨＡアルキルエステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）を生産する新規微生物、該微生物を用いたＤＨＡ含有組成物、ＤＨＡ及びＤＨＡアルキルエステルの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＡはヒトを含む哺乳類の脳などのリン脂質に豊富に含まれる多価不飽和脂肪酸であり、脳機能の維持や発達に重要な役割を果たしていることが知られている。ヒトはＤＨＡをリノレン酸から合成する能力を有しているが、その量は必要量に比べると圧倒的に少なく、外部からＤＨＡを摂取する必要があることが知られている。このため、ＤＨＡを含む食品やサプリメント、乳児用ミルクが多く販売されている。
これらの製品に含まれるＤＨＡは、魚油から抽出して得られるものを挙げることができる。魚油は安価でＤＨＡに富むため良質なＤＨＡの供給源であるが、昨今のＤＨＡの需要の高まりと、海洋汚染に伴うＰＣＢ、重金属の魚への蓄積などを考えるとより安全で安定に供給されるＤＨＡが求められている。【０００３】
魚油から抽出して得られるＤＨＡ以外には、微生物を用いた発酵法によって製造されるＤＨＡを挙げることができる。海洋性の微細藻類がＤＨＡを含有する脂質を生産することは古くから知られていた(非特許文献１)。しかしながら、微細藻類に含まれるＤＨＡ量が微量であること、高密度培養が困難であることなどが課題となり、商業レベルでの生産は行われていなかった。
商業レベルでのＤＨＡの発酵による製造法としては、渦鞭毛藻類クリプテコディニウムコニー（Crypthecodinium cohnii）を用いた例が初めてとなる (特許文献１並びに非特許文献２及び３)。その後もＤＨＡの生産能を有する複数の微生物が発見されたが、最も高いＤＨＡの生産能を示す微生物はラビリンチュラ類微生物であり、そのような微生物としては、シゾキトリウム エスピー(Schizochytrium sp.)ATCC20888株とその派生株（特許文献２及び３）、オーランチオキトリウム リマシナム(Aurantiochytrium limacinum、元はSchizochytrium limacinumと分類)SR21株（特許文献４〜６及び非特許文献４）、ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株（特許文献７）、スラウストキトリウム エスピー(Thraustochytrium sp.) LEF株（特許文献８）などが挙げられる。
これらのラビリンチュラ類微生物の中でも、最も高いＤＨＡの生産能を示すのはシゾキトリウム エスピー S31株（ATCC20888株)である（特許文献９）。該微生物のＤＨＡの生産能は他の報告と比べると圧倒的に高く、該微生物を用いたＤＨＡの発酵法は最もコストの低い発酵生産のプロセスといえよう。
しかしながら、該発酵生産のプロセスをもってしても魚油からの抽出法に比べるとコスト高であり、さらなる生産性の向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平５−５０３４２５号
【特許文献２】特表平８−５０２４０５号
【特許文献３】特表平８−５０９３５５号
【特許文献４】特開平９−０００２８４号
【特許文献５】特開平１０−０７２５９０号
【特許文献６】特開平１０−３１０５５６号
【特許文献７】特開２００６−２３０４０３号
【特許文献８】特開２００５−１０２６８０号
【特許文献９】特表２００４−５０１６０３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Protozoal (1970), Vol.17, p213−219
【非特許文献２】Single Cell Oils AOCS Press (2005), Vol.6, p.86-98
【非特許文献３】Single Cell Oils AOCS Press (2005), Vol.8, p.107-123
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotechnol. (1998), Vol.49, p.72-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来よりもＤＨＡの生産能が高い微生物を提供すること、該微生物を用いた効率的なＤＨＡ含有組成物、ＤＨＡ及びＤＨＡアルキルエステルの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［７］に関する。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属する微生物。
［２］オーランチオキトリウム  エスピー（Aurantiochytrium sp.）ＯＨ４株（受託番号FERM BP-11524）。
［３］上記［１］または［２］の微生物を親株として得られる変異株であって、該親株よりもＤＨＡの生産能が高い微生物。
［４］オーランチオキトリウム  エスピー（Aurantiochytrium sp.）ＬＴＲ２３株。
［５］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＤＨＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物中からＤＨＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＤＨＡ含有組成物の製造法。
［６］上記［５］で採取されるＤＨＡ含有組成物から、ＤＨＡを分離して採取することを特徴とする、ＤＨＡの製造法。
［７］上記［５］で採取されるＤＨＡ含有組成物から、ＤＨＡアルキルエステルを分離して採取することを特徴とする、ＤＨＡアルキルエステルの製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するオーランチオキトリウム属に属する微生物、並びに該微生物を用いた発酵法によるＤＨＡ含有組成物、ＤＨＡ及びＤＨＡアルキルエステルの製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】沖縄沿岸部より採取したＤＨＡ生産微生物のＤＨＡ生産量と総脂肪酸に対するＤＨＡの比率を示す図である。
【図２】オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株の顕微鏡写真である。
【図３】図１に、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株のＤＨＡ生産量と総脂肪酸に対するＤＨＡの比率を加えたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の微生物
本発明の微生物は、配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を１つ以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するオーランチオキトリウム属に属する微生物であり、最も好ましくは、配列番号１〜５で表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全てを有するオーランチオキトリウム属に属する微生物である。  本発明の微生物は、後述する形態学的性質および分子生物学的性質から、クロミスタ界（Kingdom Chromista）、不等毛門（Phyrum Heterokonta）に属し、ラビリンチュラ鋼（Class Labyrinthulea）、ラビリンチュラ目（Order Labyrinthulida）に属すると考えられる。科（Family）以下の分類群に関しては、その生理形態的性質と１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を考慮すると、ヤブレツボカビ科（Family Thraustochytriaceae）、オーランチオキトリウム属(Genus Aurantiochytrium)に属すると考えられる。
【００１１】
本発明の微生物の例としては、オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株（受託番号FERM BP-11524）などが挙げられる。また、本発明の微生物を親株して得られる変異株であって、該親株よりもＤＨＡの生産能が高い微生物もまた、本発明の微生物に含まれる。そのような微生物の例としては、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株などが挙げられる。
上記のオーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センターに寄託された。受領日（寄託日）は平成２５年（西暦２０１３年）１月１１日であり、受託番号はFERM BP-11524である。
本明細書において親株とは、変異導入又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換等の対象となる元株のことをいう。組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換等の対象となる元株は宿主株ともいう。
本明細書において変異株とは、本発明の微生物を親株として、通常の突然変異導入法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて取得できる微生物をいう。
本明細書において、親株よりもＤＨＡの生産能が高い微生物とは、親株と変異株を同じ培養条件で培養したときに、全培養物中から取得できるＤＨＡ含有組成物またはＤＨＡの量が多い微生物をいう。
ＤＨＡ含有組成物の例としては、ＤＨＡ含有油脂またはＤＨＡ含有リン脂質を、好ましくはＤＨＡ含有油脂を挙げることができる。
オーランチオキトリウム属に属する微生物は数多くの種がこれまでに見出されているが、本発明の微生物は、それらの微生物とは１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が異なり、かつ、後述する実施例に示すように該微生物を培養したときの乾燥微生物重量及びＤＨＡ含量がＤＨＡ高生産微生物として報告されている既知の微生物よりも有意に高いことから、既知のオーランチオキトリウム属に属する微生物と明確に区別することができる。
２．本発明の微生物の取得方法
本発明の微生物は、以下の方法によって取得することができる。
【００１２】
海洋中から、好ましくは汽水域から、最も好ましくはマングローブ林床から採取した落葉から、サンプルを採取する。
該サンプルを抗生物質、好ましくは、ペニシリンＧおよびストレプトマイシンを含有する人工海水に浸漬したのち、人工海水の上澄みを該抗生物質を含有する寒天培地上に置き、２０〜４０℃で、好ましくは２５℃で数日間培養する。そうすることで、環境中に多く存在する原核生物は増殖できないので、真核生物である本発明の微生物を濃縮することができる。
コロニーを分離し、液体培地で培養した培養物から常法によりゲノムＤＮＡを抽出する。該ゲノムＤＮＡを鋳型として、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができる配列番号６および７で表される塩基配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行う。
ここで、上記のプライマーセットのうち一方は、「高速シーケンス解析受託  アプリケーションＮｏ．０１ １６Ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲサンプルの解析」（タカラバイオ社パンフレット）に従い、複数検体を同時に解析するための３〜６塩基、好ましくは４〜５塩基、最も好ましくは４塩基からなるタグを付加する。また、いずれのプライマーにもＧＳ ＦＬＸシーケンサー（ロシュ・ダイアグノスティックス社）で解析するために必要なオリゴヌクレオチドを付加する。
上記のＰＣＲ反応産物を用いてＧＳ ＦＬＸシーケンサーで配列決定することにより、例えば上記したタグを４塩基に設定して最大２５６種類のタグ配列を用いた場合、２５６種類の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、クローニング操作を要することなく１回のシーケンスで配列決定することができる。具体的には、２５６種類のＰＣＲ産物を混合してＧＳ ＦＬＸシーケンサーで塩基配列を決定し、決定後の塩基配列をタグ配列を指標として２５６種類に分類する。
ＰＣＲ反応の鋳型に供するゲノムＤＮＡは、単一の株から抽出したゲノムＤＮＡであってもよく、複数の株から抽出したゲノムＤＮＡを混合してもよいが、複数の株から抽出したゲノムＤＮＡを混合したほうが、後述する方法を組み合わせることにより多数の株を簡便にスクリーニングすることができる。
例えば、１００種類の株から抽出したゲノムＤＮＡを混合して、ＰＣＲ反応の鋳型として用いて、上記のプライマーセットを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の領域を増幅する。
該ＰＣＲ産物をＧＳ ＦＬＸシーケンサーで塩基配列を決定し、配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が存在した場合には、該１００種類の株の中に本発明の微生物が少なくとも１株存在することがわかる。一方、該１８ＳｒＲＮＡ遺伝子が存在しない場合には、該１００種類の株の中には本発明の微生物が存在しないことがわかる。
該１００種類の株の中に本発明の微生物が存在した場合、該微生物を特定することは、上記のＧＳ ＦＬＸシーケンサーを用いる方法によって１回のシーケンスで特定することができる。
【００１３】
すなわち、上記方法を用いればタグ配列を４塩基に設定した場合は、１回目のシーケンスで最大２５６種類の混合ゲノムＤＮＡの解析をすることができ、２回目のシーケンスで最大２５６種類の微生物の中から本発明の微生物を特定することができるので、最大６５，５３６種類の微生物についてクローニング操作を要することなく、わずか２回のシーケンスによって本発明の微生物であるか否かを判定することができる。
【００１４】
なお、タグ配列を５塩基に設定した場合は、１回目のシーケンスで最大１，０２４種類の混合ゲノムＤＮＡの解析をすることができ、２回目のシーケンスで最大１，０２４種類の微生物の中から本発明の微生物を特定することができるので、最大１，０４８，５７６種類の微生物について、クローニング操作を要することなくわずか２回のシーケンスによって、本発明の微生物であるか否かを判定することができる。
【００１５】
上記のシーケンス解析に供する微生物は、あらかじめＤＨＡを生産することを確認してもよい。そうすることで、解析対象株が少ない場合には、従来のサンガー法によるシーケンスによっても本発明の微生物であるか否かを判定することができる。
本発明の変異株は、本発明の微生物を親株として通常の突然変異処理法を用いて、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理や紫外線照射処理によって、微生物の死滅率が９８％、好ましくは９９％、最も好ましくは９９．９％になるように変異処理を行い、生き残ってきたコロニーを分離してＤＨＡの生産性を調べることにより、親株よりもＤＨＡ生産能が高い変異株を取得することができる。
ＤＨＡ生産性は、培養液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（Bligh EG and Dyer WJ, Can.J.Biochem.Physiol. 37 911 (1959)）を用いて脂質を抽出して減圧下で乾燥させた後、乾燥させた脂質を脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク社）を用いて脂肪酸のメチル化を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンにより抽出し、ガスクロマトグラフィーを用いて分析する方法により調べることができる。
３．本発明のＤＨＡ含有組成物の製造法
本発明の微生物を培地に培養し、培養物中にＤＨＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物中からＤＨＡ含有組成物を採取することにより、ＤＨＡ含有組成物を製造することができる。
【００１６】
本発明の微生物の培養物は、当該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０〜３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費しつくしたのちに、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、ＤＨＡ含有組成物の生産量を増大させることができる。
【００１７】
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素を使用することができる。
無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【００１８】
上記した各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０〜９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
培養温度は、一般的には１０〜４５℃であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養温度は、ＤＨＡ含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的には３．５〜９．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには５．０〜８．０である。
【００１９】
培養期間は、例えば２〜７日間とすることができ、通気攪拌培養などで培養を行なうことができる。
上記のようにして本発明の微生物を培養することにより、培地１リットル当たりの乾燥微生物重量にして一般的には５０〜２００ｇ、好ましくは１００〜２００ｇ含む培養物を得ることができる。
培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができる。
【００２０】
上記の培養物から分離した微生物を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ＤＨＡ含有組成物を得ることができる。
本発明のＤＨＡ含有組成物の製造法では、乾燥微生物重量１００ｇ当たりのＤＨＡ含有組成物が５〜１００ｇ、好ましくは１０〜８０ｇであるＤＨＡ含有組成物を得ることができる。
【００２１】
上記の製造法で製造されるＤＨＡ含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法〔高橋是太郎，油化学，40：931-941(1991)〕又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法〔高橋是太郎，油化学，40：931-941(1991)〕等の方法により、ＤＨＡ含有組成物を濃縮して、ＤＨＡ含量が高いＤＨＡ含有組成物を得ることができる。
４．本発明のＤＨＡの製造法
本発明のＤＨＡの製造法は、上記３の製造法で得られるＤＨＡ含有組成物からＤＨＡを分離して採取することを特徴とする。
【００２２】
ＤＨＡ含有組成物からＤＨＡを分離して採取するには、例えば加水分解法によりＤＨＡ含有組成物からＤＨＡを含有する混合脂肪酸を調製した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＤＨＡを分離して採取することにより行うことができる。
５．本発明のＤＨＡアルキルエステルの製造法
本発明のＤＨＡアルキルエステルの製造法は、上記３の製造法で得られるＤＨＡ含有組成物からＤＨＡアルキルエステルを分離して採取することを特徴とする。
【００２３】
ＤＨＡアルキルエステルは、ＤＨＡアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、ＤＨＡメチルエステル又はＤＨＡエチルエステルを、より好ましくは、ＤＨＡエチルエステルを挙げることができる。
ＤＨＡ含有組成物からＤＨＡアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりＤＨＡ含有組成物からＤＨＡアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調製した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＤＨＡアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
以下に、本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
本発明の微生物の取得（１）
１．本発明の微生物の単離
本発明の微生物を単離する試料として、沖縄県沿岸部近くのマングローブ林床（汽水域）から採集した落葉を用いた。落葉をペニシリンＧおよびストレプトマイシンを300mg/L含有する人工海水に浸漬したのち、人工海水の上澄みをペニシリンＧおよびストレプトマイシン（各300ｍｇ/L）を含む単離用の寒天培地上に置き、２５℃で数日間培養した。
単離用の寒天培地には、０．２％  グルコース、０．０２％  酵母エキス、５０％  人工海水、０．０５％  グルタミン酸ナトリウム、１．５％  アガロースを組成とする寒天培地を用いた。
寒天プレート上に多数のコロニーの出現を確認した後、コロニーを分離し、評価用の液体培地にて３０℃、４８時間で培養を行った。
評価用の液体培地には、９％  グルコース、１％  酵母エキス、１％ ペプトン、５０％人工海水を組成とする液体培地を用いた。
培養液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（Bligh EG and Dyer WJ, Can.J.Biochem.Physiol.37 911 (1959)）を用いて脂質を抽出し、減圧下で乾燥させた。ナカライテスク社の脂肪酸メチル化キットを用いて乾燥させた脂質の脂肪酸のメチル化を行い、この処理によって得られた脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンにより抽出した。脂肪酸メチルエステルは、ガスクロマトグラフィーにより分析し、培養液中の脂肪酸量と組成を調べた。
ガスクロマトグラフの条件は以下のとおりに設定した。
・カラム：ＨＲ−ＳＳ−１０ （信和化工）  ０．２５ｍｍ×２５ｍ
・キャリアーガス：Ｈｅ  ３０ｍｌ/ｍｉｎ
・カラム温度：１９０℃
・検出：ＦＩＤ
上記操作により、５０００株以上のマングローブ由来生物から１２３９株のＤＨＡ生産微生物を得ることができた。
この時に得られたＤＨＡ生産微生物の培養物中のＤＨＡ含量と総脂肪酸に対するＤＨＡの比率を図１に示す。図１から一般的にＤＨＡ比率が向上すると生育が悪化し、総脂質量が低下し、ＤＨＡ含量は低下する傾向にあることが確認され、これまで知られていたように、脂質生産量の多い株のＤＨＡ比率は３０％から４０％前後に集中していることが確認された。このうち、生育がよく、かつＤＨＡ生産性が高い株を選抜し、ＯＨ４株と命名した。
２．ＯＨ４株の形態学的性質
ＯＨ４株は単細胞性であり、ペニシリンＧおよびストレプトマイシン存在下での生育が可能であることから単細胞性真核生物であると結論した。さらに、マングローブの林床に由来する試料から単離されたこと、ＤＨＡ含量が非常に高いことから不等毛類（Heteroconta）に属するヤブレツボカビ類（thraustochytrid）であることが予想された。
ＯＨ４株は、上記の単離用の寒天培地において，直径10〜20μmの球状の細胞から伸長した外質ネットを観察することができ、クロミスタ界（Kingdom Chromista）ラビリンチュラ綱（Class Labyrinthulea）ヤブレツボカビ科（Family Thraustochytriaceae）に属することが認められた。また、栄養細胞は球形であり、微生物の２分裂により増殖することが認められた。このような生活史はオーランチオキトリウム属（Genera Aurantiochytrium）に特徴的である（Yokoyama R et. al. Mycoscience 48:329-341; 本多大輔, ラビリンチュラ類の系統と分類. 海洋と生物 23:7-18, 2001）。ＯＨ４株の顕微鏡写真を図２に示す。
３．ＯＨ４株の分子生物学的性質
上記の評価用の液体培地を用いて培養したＯＨ４株を対数増殖期において回収し、ガラスビーズとフェノール・クロロホルムを用いて常法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をサンガー法により塩基配列を決定した。
ここで、ＯＨ４株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定する過程で、当該分子が多型性を有することを見出した。ラビリンチュラ類微生物の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に多型性があることは既に知られた現象である (特許文献７)。ＯＨ４株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１〜５に示す。
また、表１に各多型の配列の違いを示す。塩基の番号は最も長い配列となる配列番号４を基準とした。【００２５】
【表１】
2014112574.tif 000002
【００２６】
配列番号１から５に示される塩基配列を、Karlinand AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) （http://www.ncbi.nlm.nih.gov）]により検索した。その結果、オーランチオキトリウム属ＫＲＳ１０１株およびオーランチオキトリウム属ＢＬ１１株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とそれぞれ９９％の同一性（identity）を示した。
一方でＮＣＢIのデータベースには配列番号１から５に示されるいずれの塩基配列とも完全に一致する配列は見出されなかった。
以上の形態学的性質及び分子生物学的性質に基づき、ＯＨ４株は、オーランチオキトリウム属に属する新規微生物と結論し、オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株と命名し、2013年1月11日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号はFERM BP-11524として寄託した。
なお、分類については今後も研究の進展によって変更される可能性はあるが、本発明の微生物が新規微生物であることに変わりはない。
【実施例２】
【００２７】
本発明の微生物の取得（２）
１．オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株を親株とする変異株の取得
オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で死滅率が９９．９％になるように変異処理を行い、生き残ってきたコロニーを分離し、評価用の液体培地にて３０℃、４８時間で培養を行った。その結果、ＤＨＡ比率が約１．６倍に向上し、それに伴いＤＨＡ含量が約３倍に向上した株が取得できた。この株をオーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株と命名した。
図３は、図１にオーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株の培養物中のＤＨＡ含量と総脂肪酸に対するＤＨＡの比率を加えたものである。図３から、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株は自然分離株と比較した場合でもＤＨＡ比率が高く、かつＤＨＡ含量も高いことが確認できた。
【実施例３】
【００２８】
本発明のＤＨＡ含有組成物の工業的な製造
１．オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＬＴＲ２３株の培養
オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＬＴＲ２３株を、ジャーファーメンターにて培養した。また、比較のため、ＤＨＡ高生産微生物として報告されているオーランチオキトリウム リマシナム ＳＲ２１株（特許文献４−６及び非特許文献４）、及びシゾキトリウム エスピー Ｓ３１株（特許文献９）を同条件にて培養した。
オーランチオキトリウム リマシナム ＳＲ２１株（ATCC MYA-1381）及びシゾキトリウム エスピー Ｓ３１株（ATCC 20888）はアメリカンタイプカルチャーコレクション (ＡＴＣＣ)より入手した。
凍結保存した上記の微生物株を実施例１で用いた単離用の寒天培地に植菌し、十分生育したことを確認したのちに、微生物をかきとり、実施例１で用いた評価用の液体培地に植菌し、シード培養とした。シード培養で十分生育な生育を確認し、３Ｌジャーファーメンターに植菌した。３Ｌジャーファーメンターの培地組成は特許文献９にならった。【００２９】
すなわち、硫酸ナトリウム １２ｇ／Ｌ；ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２ｇ／Ｌ；Ｈｏｄａｇ Ｋ−６０消泡剤 ０．３５ｇ／Ｌ；Ｋ２ＳＯ４０．６５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１７ｇ／Ｌ；；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ；チアミン ９．５ｍｇ／Ｌ；ビタミンＢ１２ ０．１５ｍｇ／Ｌおよびパントテン酸カルシウム ３．２ｍｇ／Ｌからなる培地を作製した。
変更点としてオーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＬＴＲ２３株は糖消費が旺盛であるためグルコースの濃度を１２０ｇ/Lとし、さらに、窒素源として２８％ ＮＨ４ＯＨ溶液を用いた。培地中の１２０ｇ/Ｌのグルコースを消費しきった段階で、６５％濃度のグルコース溶液を追加でフィードし、８５時間まで連続培養を行った。
得られた培養物から、実施例１と同様にＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質を抽出し、メチル化を行い、ガスクロマトグラフィーにて脂質の分析を行った。
得られた微生物を−８０℃で凍結し、凍結乾燥することで乾燥微生物を得た。この乾燥微生物の重量を測定し、元の培養液量に換算することで培養物中の乾燥微生物重量(Dry Cell Weight, DCW)を算出した。
培養の結果を以下の表２に示す。【００３０】
【表２】
2014112574.tif 000003
【００３１】
培養の結果、オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株は、乾燥微生物重量が１４５．３ｇ/リットルカルチャーであり、ＤＨＡ含量が２６ｇ/リットルカルチャーと、ＤＨＡ高生産微生物として報告されている微生物よりも有意に高い結果となった。乾燥微生物重量が高いことは、ＤＨＡは微生物の細胞中に蓄積することから、最終的に採取することができるＤＨＡ量が多くなるという利点がある。【００３２】
さらに、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株は、ＤＨＡ含量が４４ｇ/リットルカルチャーであり、総脂肪酸中のＤＨＡ組成が５２％であり、ＤＨＡの生産性が０．５０５ｇ/リットル/時と、オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＤＨＡ高生産微生物として報告されている微生物を凌駕することが示された。
２．オーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＬＴＲ２３株の脂肪酸組成
ジャーファーメンターで培養したオーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株及びＬＴＲ２３株の脂肪酸組成を以下の表３に示す。シゾキトリウム エスピー Ｓ３１株の値は非特許文献２より転載した。【００３３】
【表３】
2014112574.tif 000004
【００３４】
以上の結果から、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株の脂肪酸組成はパルミチン酸、短鎖の飽和脂肪酸が減少し、ＤＨＡ、２２：５ (n-6)などの多価不飽和脂肪酸が増加していることが示された。飽和脂肪酸はＬＤＬコレステロール及び総コレステロール/ＨＤＬコレステロール比を上昇させることが知られており、糖尿病のリスクを上昇させる可能性が指摘されていることから、栄養学的な観点からもオーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株の有意性が示された。
３．オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株の安定性
オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株は突然変異の導入によって取得されたため、その形質が不安定であることが懸念された。そのため、複数回継代を繰り返し、継代した株を用いて、上記１と同様の方法で培養することで形質の安定性を調べた。結果を以下の表４に示す。【００３５】
【表４】
2014112574.tif 000005
【００３６】
ＤＨＡの生産量、ＤＨＡ比率ともに１０％以下の変動係数であり、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株の安定性に問題のないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により、従来よりもＤＨＡの生産能が高い微生物を提供することができる。また、該微生物を用いた効率的なＤＨＡ含有組成物、ＤＨＡ及びＤＨＡアルキルエステルの製造法を提供することができる。
【符号の説明】
【００３８】
図１及び３において、○は、沖縄県沿岸部近くのマングローブ林床（汽水域）から採集したＤＨＡ生産微生物を示す。
図３において、■は、オーランチオキトリウム エスピー ＬＴＲ２３株を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2014112574.tif 000006
【図２】
2014112574.tif 000007
【図３】
2014112574.tif 000008
【配列表】
2014112574000001.app
【国際調査報告】
2014112574.tif 000009
2014112574.tif 000010
2014112574.tif 000011
2014112574.tif 000012