(57)【要約】  受胎性を反映する簡易な精子の検査方法及び装置を開発することを課題とする。精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定し、精子の品質指標の値に基づき、精子集団を層別化し、層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価することで、受胎性との相関の高い簡易な精子の検査方法及び装置を提供できる。この基準は、さらに精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフを用いることで、より精度高く受胎性を予測できる。精子の品質指標は、好ましくは精子運動性を用いる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程、
前記精子の品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する工程、及び
層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程
を備えることを特徴とする精子の検査方法。
【請求項２】
前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項１に記載の精子の検査方法。
【請求項３】
前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項２に記載の精子の検査方法。
【請求項４】
前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項５】
前記検査液は、ｐＨが７．２〜８．２であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項６】
前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項７】
前記懸濁の時間は、懸濁直後〜３０分間であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項８】
前記精子の品質を評価する工程が、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項９】
前記精子の品質を評価する工程が、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求める工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
【請求項１０】
検査液に懸濁された精子集団の個々の精子の品質指標の値を測定する精子品質測定手段と、前記精子の品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する層別化手段と、層別化された精子集団の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する精子品質評価手段とを備えることを特徴とする精子の検査装置。
【請求項１１】
前記精子品質評価手段が、前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項１０に記載の精子の検査方法。
【請求項１２】
前記精子品質評価手段が、前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項１１に記載の精子の検査方法。
【請求項１３】
前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１４】
前記検査液は、ｐＨが７．２〜８．２であることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１５】
前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１６】
前記懸濁の時間は、懸濁直後〜３０分間であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１７】
前記精子品質評価手段が、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１８】
前記精子品質評価手段が、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
【請求項１９】
出力部と、記憶部とを含む情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラムであって、
精子集団における個々の精子の品質指標の値を前記記憶部に記憶し、
前記記憶された品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、
当該層別化された集団の品質指標の値に基づき精子の品質を決定し、
精子の品質の結果を前記出力部に出力する
ことを前記情報処理装置に実行させることを特徴とする、前記制御プログラム。
【請求項２０】
前記情報処理装置は、撮像部をさらに有し、
前記撮像部が複数枚の経時的画像を取得し、
複数の画像に基づいて前記品質指標を決定する
ことを特徴とする、請求項１９に記載の制御プログラム。
【請求項２１】
前記精子の品質を決定が、前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の制御プログラム。
【請求項２２】
前記精子の品質を決定が、前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項２１に記載の制御プログラム。
【請求項２３】
前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の制御プログラム。
【請求項２４】
前記精子の品質を評価するが、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定することを含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の制御プログラム。
【請求項２５】
前記精子の品質を評価するが、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の制御プログラム。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の制御プログラムをコードするコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受胎性を予測できる精子の検査方法及び装置、情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラム、並びに当該制御プログラムをコードするコンピュータ可読媒体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
すべての動物の精子において、簡易な方法で受胎性を予測することができることは、労力やコストの面から極めて有用である。例えば、家畜では、効率的に受胎させて産仔を得ることが必要であり、受胎性が保証された精液を供給することは重要なことである。そのような観点から、受胎性を正確に反映した精子の品質評価法の開発が望まれている。【０００３】
例えば、牛の繁殖においては、我が国では人工授精の普及率がほぼ１００％になっているが、その受胎率は年々低下している。乳用種では、１９８９年の初回授精の受胎率が６２．４％、１〜３回授精の受胎率が６２．０％であったところ、２０１１年では初回授精の受胎率が４５．６％、１〜３回授精の受胎率が４４．４％にまで低下している（非特許文献１：社団法人家畜改良事業団，平成２３年受胎調査成績（２０１３年））。このように受胎率が低下傾向にある現状においては、受胎性が保証された精液を供給することは生産効率の観点から極めて有用なことである。【０００４】
これまで精子の品質検査では、精子生存率、精子運動率、精子運動性維持率、ミトコンドリア正常率、アクロソーム正常率、精子形態正常率等が検査されている（特許文献１：特許５０９２１４９号公報、非特許文献２：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ．，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｏｍｅｓｔ  Ａｎｉｍ．４１，Ｓｕｐｐｌ  ２，２−１０  （２００６年））。しかし、これらの検査法と受胎性との相関関係はすべての項目で高いわけではなく、精子の側から受胎性を反映する簡易な指標とはなっていない。これらの検査法と受胎性との相関関係が高くない原因は、雌体内での精子の挙動や受精時の環境を反映した検査法ではないからと考えられる。
卵管膨大部に到達した精子は、雌の排卵時期に運動性が顕著に上昇し、超活性化様運動を示したものが受精できると考えられている（非特許文献３：Ｓｕａｒｅｚ  ＳＳ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．５２（５−６），４５５−６２  （２００８年））。そこで、実際に雌体内の条件を反映させた検査法も考案されている（非特許文献４：Ｈａｍａｎｏら、日本畜産学会北陸支部会報８１，６３−６８  （２０００年））。また、実際に精子を卵子と受精させる体外受精試験を用いて検査することもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許５０９２１４９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】社団法人家畜改良事業団，平成２３年受胎調査成績（２０１３年）
【非特許文献２】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ．，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｏｍｅｓｔ  Ａｎｉｍ．４１，Ｓｕｐｐｌ  ２，２−１０  （２００６年）
【非特許文献３】Ｓｕａｒｅｚ  ＳＳ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．５２（５−６），４５５−６２  （２００８年）
【非特許文献４】Ｈａｍａｎｏら、日本畜産学会北陸支部会報８１，６３−６８  （２０００年）
【非特許文献５】Ｋｉｎｕｋａｗａ  Ｍ．，博士論文，Ｈｔｔｐ：／／ｈｄｌ．ｈａｎｄｌｅ．ｎｅｔ／２２６１／１１９  （２００５年）
【非特許文献６】Ｇｕｔｈｒｉｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６７，  １８１１−１８１６  （２００２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献４の方法や体外受精試験は、大きな労力やコストが発生するため、すべての供給しようとする精液に対して簡易かつ低コストで検査を行うことは困難である。また、完全に雌体内の環境を模倣した信頼性の高い検査とはいえない。そこで、雌体内での受精環境を体外で簡易に再現し、精子の受胎性を反映する簡易な精子の検査方法及び装置を開発することが望まれている。【０００８】
本発明は、斯かる問題点に鑑みてなされたものであり、上記問題点を解決する精子の検査方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、受胎性の判明している精液を用いて、精子の品質検査について鋭意研究を行った結果、精子の品質指標の値が極めて高い精子の割合やその数を判定することで、受胎性と相関が高い精子の品質評価ができた。さらに精子の品質評価の値に基づき、精子集団を層別化し、層別化された集団の１又は複数の群の品質評価の値に基づいて精子の品質を評価することで、受胎性と相関が高い簡易な精子の品質評価ができた。これにより、本発明は、精子の検査方法、精子の検査装置、情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラム、及び当該制御プログラムをコードする記録媒体に関する。【００１０】
したがって、本発明は、以下に掲げる構成とした。
本発明の精子の検査方法は、精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程と、前記品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程とを備えることを特徴とする。
また、精子の品質を評価する工程は、品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価することを特徴とする。
また、層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化が、品質指標の値に基づいて、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位２０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが６．０〜９．０であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．２〜８．２であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．４〜７．８であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が２３０〜４００ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）であることを特徴とする。
また、前記検査液は、３３〜４３℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、３６〜４０℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び／又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンＫ−９０であることを特徴とする。
また、前記懸濁の時間は、懸濁直後〜３０分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、ＶＡＰ、ＶＣＬ、ＡＬＨ及び／又はＢＣＦであることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する工程を含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが１５０μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、ＶＣＬ１５０μｍ／秒、１７５μｍ/秒、及び２００μｍ／秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が１％以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が０．７％以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が０．３％以上であることを特徴とする。
また、精子数が１ストローあたり３０万精子以上であることを特徴とする。
また、精子数が１ストローあたり１０万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。【００１１】
本発明の精子の検査装置は、検査液に懸濁された精子集団の個々の精子の品質指標の値を測定する精子品質測定手段と、前記品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する精子品質評価手段とを備えることを特徴とする。
また、精子品質評価手段は、品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価することを特徴とする。
また層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化が、品質指標の値に基づいて、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位２０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが６．０〜９．０であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．２〜８．２であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．４〜７．８であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が２３０〜４００ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）であることを特徴とする。
また、前記検査液は、３３〜４３℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、３６〜４０℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び／又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンＫ−９０であることを特徴とする。
また、前記懸濁の時間は、懸濁直後〜３０分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、ＶＡＰ、ＶＣＬ、ＡＬＨ及び／又はＢＣＦであることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する手段を含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが１５０μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、ＶＣＬ１５０μｍ／秒、１７５μｍ/秒、及び２００μｍ／秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記所定の品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が１％以上であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が０．３％以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が１ストローあたり３０万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が１ストローあたり１０万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。【００１２】
本発明の制御プログラムは、出力部と、記憶部とを含む情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラムであって、
検査液中の精子集団における個々の精子の品質指標の値を前記記憶部に記憶し、
前記記憶された品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、
当該層別化された集団の品質指標の値に基づき精子の品質を決定し、
精子の品質の結果を前記出力部に出力する
ことを前記情報処理装置に実行させることを特徴とする。
また、前記情報処理装置は、撮像部をさらに有し、以下の：
前記撮像部が経時的に複数枚の画像を取得し、
複数の画像に基づいて前記品質指標を決定することを特徴とする。
また、前記層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づき精子の品質の決定が、さらに以下の：
層別化された集団の品質指標の値から、品質決定値を算出し、
前記品質決定値に基づき精子の品質を決定する
ことを含むことを特徴とする。
また層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化された集団として、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位２０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１０％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位１％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．５％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位０．３％以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが６．０〜９．０であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．２〜８．２であることを特徴とする。
また、前記検査液は、ｐＨが７．４〜７．８であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が２３０〜４００ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）であることを特徴とする。
また、前記検査液は、３３〜４３℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、３６〜４０℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び／又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンＫ−９０であることを特徴とする。
また、前記検査液への精子の懸濁の時間は、懸濁直後〜３０分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、ＶＡＰ、ＶＣＬ、ＡＬＨ及び／又はＢＣＦであることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、１又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定することを含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが１５０μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、ＶＣＬ１５０μｍ／秒、１７５μｍ/秒、及び２００μｍ／秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記所定の品質指標の基準値は、ＶＣＬが２００μｍ／秒であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が１％以上であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が０．３％以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が１ストローあたり３０万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が１ストローあたり１０万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、品質上位群の品質指標の値に基づいた品質決定値により受胎性との相関が高い簡易な精子の検査方法を提供できる。本発明の検査方法によれば、簡易に受胎性を予測できるため、使用する精液を事前に調べることにより、受胎性の高い精子を効率的に供給できるようになる。また、冷蔵又は凍結保存用の希釈液の開発における正確な精子の品質指標とすることができるため、より効率的に開発を進めることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、品質指標となりうる精子運動性の解析に用いるパラメーターを説明する図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態に係る精子の検査装置の構成図である。
【図３】図３は、精子の品質を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、検査液のｐＨを６．０〜９．０の範囲で変更した場合のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示すグラフである。値は、平均値で示す（ｎ＝４）。ｐＨ７．２〜８．２において、推進力が顕著に高い精子を検出することができる。
【図５】図５は、検査液の懸濁時間を変更した場合のＶＣＬ１５０μｍ／秒以上及び２００μｍ／秒以上の精子の割合を示すグラフである。値は、平均値で示す（ｎ＝６）。懸濁直後から３０分において、推進力が顕著に高い精子を検出することができる。
【図６Ａ】図６Ａは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＡＰ５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を示すグラフである。ＶＡＰ５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係は高くない。
【図６Ｂ】図６Ｂは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を示すグラフである。ＶＣＬ５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係は高くない。
【図６Ｃ】図６Ｃは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ１００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を示すグラフである。ＶＣＬ１００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係は高くない。
【図６Ｄ】図６Ｄは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ１５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を示すグラフである。ＶＣＬ１５０μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との間に相関関係が確認できる。
【図６Ｅ】図６Ｅは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を示すグラフである。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との間に高い相関関係が確認できる。
【図７】図７は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係を対数近似で示すグラフである。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との間に高い相関関係（ｒ＝０．６７６５、ｐ＜０．００１）が確認できる。
【図８Ａ】図８Ａは、受胎率の判明している種雄牛２９頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎にＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を比較したグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す。受胎率が高いものはＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が高いことが確認できる。
【図８Ｂ】図８Ｂは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎にＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を比較したグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す。受胎率が高いものはＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が高いことが確認できる。
【図９】図９は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数と受胎率との相関関係を示すグラフである。１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数と受胎率との間に高い相関関係（ｒ＝０．７３０６、ｐ＜０．００１）が確認できる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、受胎率の判明している種雄牛２９頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数を比較したグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す。受胎率が高いものは１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数が多いことが確認できる。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数を比較したグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す。受胎率が高いものは１ストロー中のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数が多いことが確認できる。
【図１１Ａ】図１１Ａは、受胎率の判明している種雄牛２９頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ値に基づき６の群に分け、各群毎の精子の割合を示すグラフである。値は平均値で示す。低受胎サンプルでは、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が少なく、１００〜１５０μｍ／秒の精子の割合が高い。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、ＶＣＬ値に基づき９の群に分け、各群毎の精子の割合を示すグラフである。値は平均値で示す。受胎率が低くなるとＶＣＬ１７５μｍ／秒以上の精子の割合が少ない。受胎率４０％未満のサンプルでは、ＶＣＬ７５〜１５０μｍ／秒の精子の割合が高い。受胎率４０％未満及び受胎率４０〜５５％のサンプルでは、ＶＣＬ２５〜７５μｍ／秒の精子の割合が高い。
【図１２Ａ】図１２Ａは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に上位７５％の精子のＶＣＬ値を降順に並べた値を示したグラフである。値は、平均値で示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に上位１０％の精子のＶＣＬ値を降順に並べた値を示したグラフである。値は、平均値で示す。受胎率６５％以上の区のみ標準偏差を示す。上位１０％以上のＶＣＬ値を比較することで、精子の受胎性の評価が可能である。標準偏差を考慮すると、５％、３％以上のＶＣＬ値を比較することで、高い精度で精子の受胎性を評価することが可能である。
【図１３】図１３は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に全精子のＶＣＬ値を降順に並べたグラフに対して３次関数で近似した近似線を示したグラフである。近似線のｙ切片の値を比較することで、高い精度で精子の受胎性の評価が可能である。
【図１４】図１４は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、受胎率のカテゴリ毎に全精子のＶＣＬ値を降順に並べたグラフに対して直線で近似した近似線を示したグラフである。近似線の傾きの値を比較することで、高い精度で精子の受胎性の評価が可能である。
【図１５】図１５は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、精子集団を上位８％毎の９の群に分けて重回帰分析を行い、これらの式から算出された推定受胎率と実際の受胎率との相関関係を示したものである。（ｒ＝０．７１１１、Ｐ＜０．００１）。曲線は３０頭人工授精を行った場合の９５％信頼区間の上下限を示す。
【図１６】図１６は、受胎率の判明している種雄牛４０頭の精子に対して、各３ロットの測定を行い、精子集団のＶＣＬの値を５の群に分けて重回帰分析を行い、これらの式から算出された推定受胎率と実際の受胎率との相関関係を示したものである。（ｒ＝０．７０８７、Ｐ＜０．００１）。曲線は３０頭人工授精を行った場合の９５％信頼区間の上下限を示す。
【図１７】図１７は、新鮮精液及び凍結精液について、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示すグラフである。値は、平均値で示す（ｎ＝１５）。凍結精液は新鮮精液と比較して、有意にＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が低下した（対応のあるｔ検定、ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、精子集団の上位の品質指標の値を基準として精子の品質を評価する精子の検査方法、検査装置、情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラム、並びに当該制御プログラムをコードするコンピュータ可読媒体に関する。以下、本発明に係る精子の検査方法及び装置の実施の形態について説明する。
【００１６】
実施の形態１．
本発明の精子の検査方法は、以下の工程から構成される。
（１）精子の品質指標の値を測定する工程（Ｓ１００）
精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程である。
（２）精子の品質を評価する工程（Ｓ２００）
精子集団の上位の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程である。
【００１７】
（１）精子の品質指標の値を測定する工程は、さらに以下の：
（１−１）精子の画像を経時的に複数枚取得する工程（Ｓ１０１）
（１−２）複数枚の画像に基づいて精子の品質指標の値を測定する工程（Ｓ１０２）
を含んでもよい。品質指標の値を測定する工程（Ｓ１００）は、予め取得され、記憶された品質指標の値の読み出しを行う工程（Ｓ１９９）を行うことで、省略することもできる。
（２）精子の品質を評価する工程は、さらに以下の：
（２−１）品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する工程（Ｓ２０１）
（２−２）層別化された集団の品質指標の値から、品質決定値を算出する工程（Ｓ２０２）
（２−３）品質決定値から精子の品質を決定する工程（Ｓ２０３）
のうちの１以上、好ましくは全てを含む。
【００１８】
品質を評価する工程（２）の後に、（３）任意に精子の品質を出力する工程（Ｓ３００）を含んでもよい。
【００１９】
本発明の実施の形態１にかかる方法は、精子の検査技師や研究員等により手動で行われてもよいし、検査装置や本発明の制御プログラムをインストールされた情報処理装置により自動的に行われてもよいし、半自動で行われてもよい。
【００２０】
本発明の精子の検査方法に供する精子は、任意の動物由来の精子を用いることができる。動物は、例えば、ヒトを含む任意の哺乳動物、例えば家畜動物、愛玩動物、動物園動物、実験動物が挙げられる。家畜動物として、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。愛玩動物として、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。動物園動物として、パンダ等の絶滅が恐れられている種等が挙げられる。実験動物として、マウス、ハムスター、ラット、ウニ、ヒトデ等が挙げられる。精子は、精巣、精巣上体、射出精液、幹細胞、精巣幹細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞等由来の任意の精子を用いることができる。また、精子は、冷蔵保存や凍結保存したものでもよい。好ましくは新鮮精液及び凍結精液であり、人工授精、体外受精、顕微授精等に供される直前の品質が反映される精子である。
【００２１】
精子を取得する方法は、例えば、精巣由来の精子であれば精巣を採取し精子を吸い出す方法等、精巣上体由来の精子であれば精巣上体を採取し精子を吸い出す若しくは掻き出す方法等、射出精液由来の精子であれば雌体内への射精後に回収する方法や電気刺激や人工腟を用いて採取する方法等、幹細胞、精巣幹細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞であれば細胞培養を行って回収する方法等が挙げられる。取得した精子は、取得直後の精漿に浮遊した状態でも、水溶液等でさらに希釈又は洗浄されていてもよい。
【００２２】
本発明の精子集団は、複数の精子を含むものである。上記の精子を取得する方法で取得した場合は、通常は精子集団として回収される。精子集団は、精子集団の一部を選択又は分取した後のサブ精子集団も含む。サブ精子集団の選択は、例えば精子の品質指標の測定結果から、精子運動解析装置等で測定した精子運動性が一定の値以上や一定の範囲の精子集団、フローサイトメーターやヌクレオカウンター等で測定した生存している精子集団、フローサイトメーターや蛍光顕微鏡等で測定した精子構成蛋白質の品質が一定の値以上や一定の範囲の精子集団等を選択することが挙げられる。サブ精子集団の分取は、例えばフローサイトメーターでＸ精子若しくはＹ精子を分取した後の精子集団、スイムアップ法やガラスビーズを用いた方法等で運動精子を分取した後の精子集団等を分取することが挙げられる。一の態様では、精子集団に含まれる精子は生存していることが好ましい。
【００２３】
本発明の品質指標は、精子集団の個々の精子の品質を判定する指標である。品質指標として、例えば、精子運動性、精子生存性、ミトコンドリア活性、アクロソーム正常性、精子形態正常性、レクチン染色や免疫染色等による精子構成蛋白質正常性の評価等の任意の分子生物学的や生化学的に細胞を評価できる指標が挙げられる。これらの品質指標は、通常は精子運動解析装置、高速カメラ、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、偏光顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の顕微鏡、フローサイトメーター、ヌクレオカウンター、ルミノメーター、吸光リーダー、蛍光リーダー、蛍光偏向リーダー、化学発光リーダー等を用いて測定する。
【００２４】
本発明の品質指標は、好ましくは精子運動性を用いる。精子の品質指標としては、例えば、ＶＳＬ（直線進行速度、μｍ／秒）、ＶＡＰ（細胞経路の平均速度、μｍ／秒）、ＶＣＬ（前進曲線速度、μｍ／秒）、ＡＬＨ（頭部の振幅、μｍ）、ＳＴＲ（直進性、ＶＳＬ／ＶＡＰ）、ＬＩＮ（直線性、ＶＳＬ／ＶＣＬ）及び／又はＢＣＦ（頭部の振動数、Ｈｚ）といった指標を精子運動解析装置（ＣＡＳＡ）や高速カメラ等で測定することができ、撮影時のフレームレートにより各数値が決定される。取得されるフレームレートは任意の数値であってよく、一般的に精子の観察に用いられる１０〜２０００フレーム/秒の任意のフレームレート、例えば３０フレーム/秒、６０フレーム／秒、１００フレーム／秒、５００フレーム／秒、１０００フレーム／秒を用いることができる。これらのパラメーターについては、図１に記載されるとともに、非特許文献５（Ｋｉｎｕｋａｗａ  Ｍ．，博士論文，Ｈｔｔｐ：／／ｈｄｌ．ｈａｎｄｌｅ．ｎｅｔ／２２６１／１１９  （２００５年））に説明される。精子運動性の指標は、好ましくはＶＡＰ、ＶＣＬ、ＡＬＨ及び／又はＢＣＦを用いることができる。これらの指標のうち、ＶＡＰ、ＶＣＬ、及びＡＬＨは、どれも精子運動性に関わっており、その数値については互いに異なるものの、集団の分布に関する限り同じ傾向を有する。本発明で用いられる精子運動性指標のうち、ＶＣＬは、実際に精子が移動した軌跡の速度であり、ＶＡＰは、軌跡を平滑化して得た経路の速度である。精子運動性の指標として、ＶＡＰを用いる場合には例えば１００μｍ／秒以上、ＶＣＬを用いる場合には例えばＶＣＬ１５０μｍ／秒以上、好ましくは２００μｍ／秒以上、ＡＬＨを用いる場合には例えば９μｍ以上、好ましくは１２μｍ以上、ＢＣＦを用いる場合には例えば１０〜４０Ｈｚ、好ましくは２０〜３０Ｈｚを用いる。
【００２５】
本発明の品質指標として精子運動性を用いる場合、精子運動性に関連する品質指標も用いることができる。例えば、精子鞭毛の動き、ｃＡＭＰやカルシウムといった精子細胞内濃度、ダイニンやアデニル酸シクラーゼ、アデニル酸キナーゼ、蛋白質リン酸化酵素、蛋白質脱リン酸化酵素等の精子構成蛋白質の品質及び量、精子の超活性化と並行して起こる受精能獲得や先体反応に関連する細胞膜性状の変化等も品質指標として挙げられる。
【００２６】
本発明の検査液は、精子集団の個々の精子に対して品質評価ができるものであれば任意の溶液を用いることができる。溶液は、通常は水溶液である。精巣、精巣上体、射出精液、幹細胞、精巣幹細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞等由来の精子であれば、精子と共に回収された液そのものを検査液として用いることもできる。検査液は、好ましくは緩衝剤、糖及び／又は塩を含む水溶液からなる。さらに好ましくは、この検査液は、子宮、卵管、卵管膨大部等の雌性生殖道環境に存在する液又は模倣する液である。雌性生殖道環境を模倣するとは、精子が雌生殖道内で受精に至るまでの環境やそこに存在する液を模倣することである。例えば、繊毛による水流、子宮頸管粘液や卵子周囲の高粘性環境、卵管液や卵胞液等の成分やｐＨを模倣した液が挙げられる。
【００２７】
本発明の検査液のｐＨは、精子の品質評価ができるｐＨであれば任意のｐＨであってもよく、通常は６．０〜９．０である。好ましくは７．２〜８．２であり、さらに好ましくは７．４〜８．２である。本発明の検査液における成分濃度は、水溶液のｐＨが上記範囲となるように決定される。
【００２８】
本発明の検査液の浸透圧は、精子の品質評価ができる浸透圧であれば任意の浸透圧であってもよいが、通常は２３０〜４００ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。この範囲は、非特許文献６（Ｇｕｔｈｒｉｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６７，  １８１１−１８１６  （２００２年））の記載により、精子の運動性を維持できる範囲として特定されている。水溶液の浸透圧は、好ましくは２５０〜３５０ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）、さらに好ましくは２６０〜３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。浸透圧は、溶質の濃度、解離度等から理論値を計算することもできるが、溶液を構成する物質の相互作用等を考慮して、浸透圧計（オズモメーター）を用いて決定される。本発明の検査液における成分濃度は、水溶液の浸透圧が上記範囲となるように決定される。
【００２９】
本発明の検査液には、所望のｐＨを達成するものであれば、任意の緩衝剤を含めることができる。緩衝剤として、中性付近に緩衝作用を持つ緩衝剤であれば任意のものを選択でき、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、メス、ヘペス、テス、トリシン等のグッド緩衝剤、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。また、所望のｐＨを達成するため酸又は塩基を用いることができる。好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びクエン酸を用いる。より具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの濃度は好ましくは５０〜３００ｍＭであり、さらに好ましくは７５〜２００ｍＭである。クエン酸濃度は好ましくは２０〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは２５〜７５ｍＭである。
【００３０】
本発明の検査液には、精子のエネルギー源となる物質であれば、任意の糖やエネルギー源を含めることができる。糖やエネルギー源として、例えば、グルコース、キシロース、ラムロース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、メレチロース、スタキオース、デキストリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、ＡＴＰ、ＡＤＰ等が挙げられる。好ましくは、グルコースを用いる。グルコース濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭであり、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００３１】
本発明の検査液には、浸透圧を調節する目的で用いるのであれば、任意の塩を含めることができる。塩として、例えば、塩化物塩、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、アミノ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩等を用いることができる。好ましくは、塩化物塩を用いる。より好ましくは、塩化ナトリウムを用いることができる。具体的に、塩化ナトリウム濃度は５０〜２００ｍＭであり、好ましくは５０〜１５０ｍＭであり、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭである。
【００３２】
本発明の検査液には、精子を活性化させる活性化剤等の任意の生物活性物質を含めることができる。生物活性物質として、例えば、カルシウム、マグネシウム、セレン、亜鉛、カテキン、カフェイン、テオフィリン、ペントキシフィリン、プロカイン、リドカイン、ブピバカイン、イミダゾール、ピルビン酸ナトリウム、ハイポタウリン、ポリフェノール、Ｌ−グルタミン、ＳＯＤ、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド、スペルミン、βカロテン、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、カルニチン、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、グルコースホスフェートＤデヒドロゲナーゼ、コレステロール、脂肪酸、ホスファチジルコリン、ＡＴＰ等が挙げられる。活性化剤等を検査液に含めることで、精子の運動性等を活性化し、精子の品質評価の値を際立たせて評価することができる。例えば、通常はプロカインであれば０．１〜４０ｍＭ、カフェインであれば０．１〜４０ｍＭ、テオフィリンであれば０．１〜４０ｍＭである。
【００３３】
本発明の検査液には、粘性等によって精子の運動性に負荷を与える目的で任意の負荷剤を含めることができる。負荷剤として、例えば、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、フィコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、アルギン酸、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ゼラチン等を用いることができる。好ましくは、ポリビニルピロリドンＫ−９０を用いる。具体的に、ポリビニルピロリドンＫ−９０濃度は０．５〜１６％（Ｗ／Ｖ）であり、好ましくは１〜８％（Ｗ／Ｖ）である。
【００３４】
本発明の検査液には、細菌の繁殖を防ぐ目的で任意の抗生物質を含めることができる。抗生物質として、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン等が挙げられる。さらに、検査液の調製には、細菌の繁殖を防ぐため滅菌操作を含めることができる。滅菌操作として、例えば、孔径０．２μｍや０．４５μｍフィルターでの処理、オートクレーブ等が挙げられる。
【００３５】
精子に対して本発明の検査液に懸濁を行うには、検査液を移すことができれば任意の方法を用いることができる。例えば、手動ピペット、自動ピペット、ディスペンサー等を用いて行うことができる。
【００３６】
精子に対して本発明の検査液に懸濁を行う時間は、精子の品質指標の値を測定できる時間であれば任意の時間であってもよい。例えば、精子運動性を評価する場合は、通常は懸濁直後〜６時間であり、好ましくは懸濁直後〜３時間であり、さらに好ましくは懸濁直後〜１時間であり、特に好ましくは懸濁直後〜３０分である。
【００３７】
精子に対して本発明の検査液で懸濁を行う際の温度は、精子の品質指標の値を測定できる温度であれば任意の温度であってもよい。通常は、インキュベータ装置等を用いて、０〜５０℃の範囲で測定をすることができる。好ましくは、精子の由来する動物の体温付近の温度である２５〜４５℃、さらに好ましくは３３〜４３℃、特に好ましくは３６〜４０℃を維持して測定する。
【００３８】
本発明の精子の品質を評価する工程では、品質指標の値に基づき、精子集団を層別化することが含まれる。層別化とは、精子の品質指標の値に基づき２以上の集団へと分類することをいう。集団数は任意に選択できるが、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０の集団に分類することができる。層別化のための基準は、使用する品質指標の値に基づき任意に選択することができ、各群毎に精子の割合や精子数が一定数になるように選択されてもよいし、適宜数値を設定して分類してもよい。例えば、精子集団での品質指標の値が上位２０％毎、上位１０％毎、上位５％毎、上位３％毎、上位１％毎といった形で精子集団を層別化することができるし、例えば精子集団での品質指標の値が上位８０％以内、上位５０％以内、上位３０％以内、上位１０％以内、上位２０〜８０％、上位１０〜５０％、上位１〜５％というように、任意の範囲で層別化することができる。別の態様では、精子集団での品質指標の値を基準に層別化することもできる。例えば、品質指標がＶＣＬである場合、２００μｍ／秒以上、１００μｍ／秒以上、１７５〜２００μｍ／秒、１５０〜２００μｍ／秒、１００〜１５０μｍ／秒、０〜７５μｍ／秒といった範囲で層別化することができる。このように層別化された各集団のうち、全ての群における品質指標の値から、品質決定値を算出することもできるし、各集団のうち、任意に選択された１以上の群の品質指標の値から算出することもできる。一の態様では、層別化された各集団のうち、品質上位群の品質指標の平均値、中央値、又は最頻値から、品質決定値を算出することができる。
【００３９】
本発明の精子集団の上位群の品質指標の値とは、上記の精子を取得する方法で取得した精子であれば、通常は精子の品質指標の値が精子集団内の良い方から５０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内、さらに好ましくは３％以内、さらに好ましくは１％以内、さらに好ましくは０．３％以内の値である。特に好ましくは、精子の品質指標の個々の精子の値を順に配列して求めたグラフからこれらの値を予測する。精子集団は、検査液に懸濁した全精子であってもよいし、一定の領域に存在する精子を任意に選択してもよい。ただし、上位の尺度は、精子集団によって任意に変更できるものである。例えば、精子集団の一部を選択又は分取した後のサブ精子集団であれば、射出精液等から取得した精子集団のより上位の品質指標の値を有する精子を選択的に取得している場合もあるため、精子集団の全精子の値を用いることもある。
【００４０】
品質指標の値に基づいて精子の品質を評価するとは、品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、層別化された集団の品質指標の値から、品質決定値を決定し、品質決定値から品質を決定することである。品質決定値は、以下の：
（１）層別化された集団の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値；
（２）層別化された集団において所定の品質指標の基準値を超える又は一定の範囲の基準値の精子の割合又は精子数；及び
（３）層別化された集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから得られる近似線、切片、係数又は傾きからなる群から選択される。（１）〜（３）は各々組み合わせることもできる。品質決定値を、精子集団のサンプル間同士で比較してもよいし、予め受胎性などの精子の品質と相関が示された品質指標の基準値と比較するか、又は予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された推定式にあてはめることで、精子の品質を評価することができる。
【００４１】
上記（１）〜（３）の品質決定値を用いて、精子の品質を決定する方法を具体的に説明する。
（１）品質決定値が、層別化された集団の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値である場合
一例として、品質指標がＶＣＬであり、層別化された集団のうち、品質上位群として１０％を選択するが、品質指標及び層別化された集団が、これらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）に基づき精子集団の上位１０％の品質上位群を選択し；
品質上位群の品質指標の値（ＶＣＬ）の平均値、中央値、又は最頻値を算出し；
ＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値に基づき、精子の品質を決定する。
算出された平均値、中央値、又は最頻値は、予め受胎性との相関が示された品質指標の基準値、例えば２００μｍ／秒、１７５μｍ/秒、１５０μｍ/秒などと比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、算出されたＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値を、予め受胎性と、上位１０％の品質上位群のＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値との関係を示す推定式と当てはめることにより、精子の品質を決定することができる。
【００４２】
（２）品質決定値が、層別化された集団において所定の品質指標の基準値を超える又は一定の範囲の基準値の精子の割合又は精子数である場合
一例として、品質指標としてＶＣＬを選択し、品質指標の基準値として２００μｍ／秒を選択するが、品質指標及び基準値がこれらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）の基準値（２００μｍ／秒）を超える品質指標の値（ＶＣＬ）を有する品質上位群を選択し；
品質上位群の精子数又は精子の割合を算出し；
精子数又は精子の割合に基づき、精子の品質を決定する。
算出された精子数又は精子の割合は、予め受胎性との相関が示された精子数又は精子の割合と比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、精子数又は精子の割合を、予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された精子数又は精子の割合と、受胎性との推定式に当てはめることで、その精子集団の受胎性を決定することができる。
【００４３】
（３）品質決定値が、層別化された集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから得られる近似線、切片、係数又は傾きである場合
一例として、品質指標がＶＣＬであり、品質上位群として１０％を選択するが、品質指標や上位群をこれらのものに限定することを意図するものではない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）に基づき精子集団の上位１０％の品質上位群を選択し；
品質上位群の品質指標の値（ＶＣＬ）を昇順または降順に配列し、Ｙ軸に品質指標の値、Ｘ軸に順位をプロットして得られたグラフの近似線、切片、係数又は傾きを算出し；
近似線、切片、係数又は傾きに基づき、精子の品質を決定する。切片、係数又は傾きは近似線から求めることもできる。なおＸ軸とＹ軸へのプロットは逆にプロットしてもよい。近似線は、精子の品質指標の個々の精子の値を順に配列した場合に、概形を把握するための式であり、例えば線形近似、多項式近似、指数近似、対数近似、累乗近似、移動平均、漸近線、接線等が挙げられる。順に配列するとは、個々の精子の値を昇順又は降順に配置することをいい、品質上位群、例えば上位３０％以上、好ましくは上位２０％以上、より好ましくは上位１０％以上、さらにより好ましくは上位８％以上の精子を配列して、近似線を求めることができる。近似線は、主に最小二乗法等の統計学的手法を用いて回帰分析を行って回帰式を算出し、直線、関数、対数、指数、シグモイド曲線等で表す。このような近似線を用いることで、受胎性の予測値を出すことができる。また、予測値は、近似線の切片、係数又は傾きを用いて出すこともできる。さらに、例えば、ＶＣＬとＡＬＨといった複数の品質指標を基準として用いる場合には、重回帰分析等の多変量解析を行って受胎性の推定式を算出することができる。
【００４４】
上述の通り、（１）から（３）において用いられる層別化された集団は、品質上位群について検討されてもよいし、品質上位群における品質指標の値の検討ののちに、別の群における品質指標の値の検討を加味することもできる。また、別の態様では、品質上位群のみならず、別の群における品質指標の値に基づいて、品質決定値を算出することができる。１の群において品質指標の値に基づいて品質決定値の算出後に、別の群において品質指標の値に基づいて品質決定値を算出する場合、品質決定値は、上記（１）〜（３）に用いられる同一の品質決定値を用いることもできるし、異なる品質決定値を用いることもできる。複数の群における品質指標の値に基づき、品質決定値を算出する例を以下に説明する。
【００４５】
（１）品質決定値が、層別化された集団の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値である場合
一例として、品質指標がＶＣＬであり、層別化された精子集団として品質指標の値が上位８０％を１０％毎に区切った群を選択するが、品質指標及び精子集団の各群が、これらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）に基づき精子集団での上位８０％の品質上位群を１０％毎に区切って８個の群を選択し；
８個の群毎の品質指標の値（ＶＣＬ）の平均値、中央値、又は最頻値を算出し；
各々のＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値に基づき、精子の品質を決定する。
算出された各々の平均値、中央値、又は最頻値は、予め受胎性との相関が示された品質指標の基準値、例えば２００μｍ／秒、１７５μｍ/秒、１５０μｍ/秒などと比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、算出されたＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値を、予め受胎性と、精子集団の全体を１０％毎に区切った８個の群のＶＣＬの平均値、中央値、又は最頻値との関係を示す推定式や重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式を用いて、精子の品質を決定することができる。
【００４６】
（２）品質決定値が、層別化された集団において所定の品質指標の値の基準値を超える又は一定の範囲の基準値の精子の割合又は精子数である場合
一例として、品質指標としてＶＣＬを選択し、層別化の基準値が２００μｍ／秒以上、１５０〜２００μｍ／秒、１００〜１５０μｍ／秒、５０〜１００μｍ／秒の場合を選択するが、品質指標及び層別化の基準値がこれらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）の基準値を２００μｍ／秒以上、１５０〜２００μｍ／秒、１００〜１５０μｍ／秒、５０〜１００μｍ／秒に区切って４個の群を選択し；
４個の群毎の精子数又は精子の割合を算出し；
各々の精子数又は精子の割合に基づき、精子の品質を決定する。
算出された精子数又は精子の割合は、予め受胎性との相関が示された精子数又は精子の割合と比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、精子数又は精子の割合を、予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された精子数又は精子の割合と、受胎性との近似線や重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式に当てはめることで、その精子集団の受胎性を決定することができる。
【００４７】
（３）品質決定値が、層別化された集団において精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列して求めた１又は複数のグラフから得られる近似線、切片、係数又は傾きである場合
一例として、品質指標がＶＣＬであり、層別化された精子集団として品質指標の値が上位８０％を１０％毎に区切った場合を選択するが、品質指標及び精子集団の各群をこれらのものに限定することを意図するものではない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる：
品質指標の値（ＶＣＬ）に基づき精子集団での上位８０％の品質上位群を１０％毎に区切って８個の群を選択し；
８個の群毎の品質指標の値（ＶＣＬ）を昇順または降順に配列し、Ｙ軸に品質指標の値、Ｘ軸に順位をプロットして得られたグラフの近似線、切片、係数又は傾きを算出し；
近似線、切片、係数又は傾きに基づき、精子の品質を決定する。切片、係数又は傾きは近似線から求めることもできる。なおＸ軸とＹ軸へのプロットは逆にプロットしてもよい。近似線は、精子の品質指標の個々の精子の値を順に配列した場合に、概形を把握するための式であり、例えば線形近似、多項式近似、指数近似、対数近似、累乗近似、移動平均、漸近線、接線等が挙げられる。順に配列するとは、個々の精子の値を昇順又は降順に配置することをいう。近似線は、主に最小二乗法等の統計学的手法を用いて回帰分析を行って回帰式を算出し、直線、関数、対数、指数、シグモイド曲線等で表す。さらに、例えば、ＶＣＬとＡＬＨといった複数の品質指標を基準として用いる場合には、重回帰分析等の多変量解析を行って推定式を算出することができる。このようにして算出された推定式を、予め受胎性と、精子集団の全体を１０％毎に区切った８個の群との関係を示す推定式や、さらに重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式を用いて、精子の品質を決定することができる。
【００４８】
実施の形態２．
本発明の精子の検査装置の構成を図２に示す。精子の検査装置１０は、精子の品質指標の値を測定する精子品質測定部１１（精子品質測定手段）、測定したデータや演算処理の指示等を与える入力部１２（入力手段）、測定したデータや演算処理結果等を記憶する記憶部１３（記憶手段）、測定した精子の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する精子品質評価部１４（精子品質評価手段）、精子品質の評価結果を出力する出力部１５（出力手段）を主に備えている。
【００４９】
精子品質測定部１１は、実施の形態１で説明した精子の品質指標の値を測定する工程を行う。精子品質測定部１１は、検査液に懸濁された精子集団の個々の精子の品質指標の値を測定するための構成部位である。具体的に、精子品質測定部１１は、精子運動解析装置、高速カメラ、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、偏光顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の顕微鏡、フローサイトメーター、ヌクレオカウンター、ルミノメーター、吸光リーダー、蛍光リーダー、蛍光偏向リーダー、化学発光リーダー等の機能を有し、精子集団に対して個々の精子の品質指標の値を測定する測定手段である。精子品質測定部１１は、精子の検査装置１０とは別に構成されていてもよく、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を用いて入力部１２を介して入力してもよい。
【００５０】
入力部１２は、インターフェイス等であり、キーボード、マウス等の操作部も含む。これにより、入力部１２は、精子品質測定部１１で測定したデータ、精子品質評価部１４で行う演算処理の指示等を入力することができる。また、入力部１２は、例えば精子品質測定部１１が外部にある場合は、操作部とは別に、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を介して入力することができるインターフェイス部を含んでもよい。
【００５１】
記憶部１３は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等のメモリ装置、ハードディスクドライブ等の固定ディスク装置、又はフレキシブルディスク、光ディスク等の可搬用の記憶装置などを有する。記憶部１３は、精子品質測定部１１で測定したデータ、入力部１２から入力された指示、精子品質評価部１４で行った演算処理結果等の他、情報処理装置の各種処理に用いられるコンピュータプログラム、データベースなどを記憶する。コンピュータプログラムは、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能なカーン型記録媒体や、インターネットを介してインストールされてもよい。コンピュータプログラムは、公知のセットアッププログラム等を用いて記憶部１３にインストールされる。
【００５２】
精子品質評価部１４は、実施の形態１で説明した精子の品質を評価する工程を行う。精子品質評価部１４は、精子集団の上位の品質指標の値を基準として精子の品質を評価するための構成部位である。このために、記憶部１３に記憶しているプログラムに従って、精子品質測定部１１で測定され記憶部１３に記憶されたデータに対して、各種の演算処理を実行する。演算処理は、精子品質評価部１４に含まれるＣＰＵによりおこなわれる。このＣＰＵは、精子品質測定部１１、入力部１２、記憶部１３、及び出力部１５を制御する機能モジュールを含み、各種の制御を行うことができる。これらの各部は、それぞれ独立した集積回路、マイクロプロセッサ、ファームウェアなどで構成されてもよい。
【００５３】
出力部１５は、液晶ディスプレイ等の表示装置、プリンタ等の出力手段も含む。精子品質評価部１４で演算処理を行った結果である精子品質の評価結果の値、受胎性指標値、予測受胎率等で出力する。
【００５４】
以下に実施例を挙げて、本発明の精子の検査方法及び装置を具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術分野において通常の変更をすることができる。
【００５５】
実施例１．検査液のｐＨの検討
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して１４０．６ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業）、４５．３ｍＭのクエン酸（和光純薬工業）、１６．７ｍＭのグルコース（和光純薬工業）、７９．２ｍＭの塩化ナトリウム（和光純薬工業）、２ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬工業）、０．３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（和光純薬工業）、６５０Ｕ／ｍｌのペニシリンＧカリウム（万有製薬）、０．７ｍｇ（力価）／ｍｌのストレプトマイシン（明治製薬）、ｐＨを６．０〜９．０まで０．２刻みになるよう１Ｎ水酸化ナトリウム又は１Ｎ塩酸を用いて調製した検査液を２５０μｌ添加した。そして、３８℃で１０分間インキュベーションを行った。４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０（和光純薬工業）を添加した各々のｐＨの上記検査液を等量混合し、予め３８℃に温めた厚さ２０μｍのスライドチャンバー（Ｌｅｊａ）に滴下し、１／６０秒の撮像速度で精子運動解析装置Ｃｅｒｏｓ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ）を用いて測定した。
【００５６】
測定を行った結果を図４に示す。ｐＨ６．０〜８．６の範囲で測定は可能であり、ｐＨ７．２〜８．２の範囲で高推進力を有する精子を検出することができた。最も高推進力を示す精子の割合が高かったのは、ｐＨ７．６であった。
【００５７】
実施例２．懸濁時間の検討
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対してｐＨ７．６に調整した実施例１に記載の検査液を２５０μｌ添加した。３８℃でインキュベーションを行った。懸濁直後（０）、１０、３０、６０分間経過後、４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０を添加した上記検査液を等量混合し、実施例１に記載の方法で測定した。
【００５８】
図５に、ＶＣＬ１５０μｍ／秒以上及び２００μｍ／秒以上の精子の割合（％）を示す。懸濁直後〜３０分において、高推進力を有する精子を検出することができた。
【００５９】
実施例３．精子の受胎性の検出
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛（ｎ＝２９又は４０）の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例２に記載の検査液を２５０μｌ添加した。そして、３８℃で１０分間インキュベーションを行った。４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０を添加した上記検査液を等量混合し、実施例１に記載の方法で測定した。従来の検査例である精子運動性の指標は、凍結融解後の精子について精子運動解析装置を用いて３８℃においてＶＡＰ５０μｍ／秒以上の精子の割合（％）で示した。
【００６０】
ＶＡＰ５０μｍ／秒以上の精子の割合を図６Ａに示す。従来の精子運動性の指標は、受胎率との相関関係は認められなかった。次に、ＶＣＬのカットオフ値を変えて測定を行った結果を図６Ｂ〜Ｅに示す。ＶＣＬ５０μｍ／秒以上の精子の割合を図６Ｂに、ＶＣＬ１００μｍ／秒以上の精子の割合を図６Ｃに、ＶＣＬ１５０μｍ／秒以上の精子の割合を図６Ｄに、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を図６Ｅに示す。受胎率が４０％以下の低受胎サンプルでは、カットオフ値が高くなるに従って、精子の割合が減少することが確認できた。そのため、カットオフ値を高くして、より高推進力を示す精子を検出することによって、受胎性が予測できることが判明した。
【００６１】
図７に、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率との相関関係について対数近似を用いて計算した結果を示す。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、受胎率と高い相関関係が確認できた。この予測式から、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が０．３％以下であると顕著な低受胎が予測され、０．７％以下であると受胎率５０％を下回ることが予測された。図８Ａ及びＢに、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合と受胎率のカテゴリ毎の比較を示す。受胎率が高い群であるほど、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が上昇した。
【００６２】
図９に、１ストローあたりのＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数と受胎率との相関関係について対数近似を用いて計算した結果を示す。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数は、受胎率と高い相関関係が確認できた。この予測式から、１ストローあたりＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数が１０万以下であると顕著な低受胎が予測され、３０万以下であると受胎率４０％を下回ることが予測された。図１０Ａ及びＢに、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数と受胎率のカテゴリ毎の比較を示す（図１０Ａ：ｎ＝２９；図１０Ｂ：ｎ＝４０）。受胎率が高い群であるほど、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の数が上昇した。
【００６３】
凍結融解後の全精子に対する各ＶＣＬの速度のカテゴリ毎のヒストグラムを図１１に示した（図１１Ａ：ｎ＝２９；図１１Ｂ：ｎ＝４０）。低受胎精液では、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は顕著に低く、ＶＣＬ１００〜１５０μｍ／秒の精子の割合は高かった。各ＶＣＬの速度のカテゴリ毎の構成も加味することによって、より信頼性の高い精子の受胎性の検出ができた。
【００６４】
図１１Ｂの結果から、（１）ＶＣＬ１５０μｍ／秒以上では、受胎率が高いとその割合が高かった。（２）ＶＣＬ７５〜１５０μｍ／秒では、受胎率４０％未満の区で正常な受胎率の牛よりも割合が高かった。このことは、顕著な低受胎牛は、ＶＣＬが中間的な精子の割合が高いことが示された。（３）ＶＣＬ２５〜７５μｍ／秒では、受胎率が低いとその割合が高かった。このことは、受胎が低い牛では、ＶＣＬが低い精子の割合が高いことが示された。（４）ＶＣＬヒストグラムのピークは、概ね受胎率６５％以上の区では１２５〜１７５μｍ／秒、受胎率５５〜６５％の区では５０〜１５０μｍ／秒、受胎率４０〜５５％の区では５０〜７５μｍ／秒に位置し、受胎率が高いほどピークの値は高い傾向があった。一方、受胎率４０％未満の区と受胎率４０〜５５％の区を比較すると、ＶＣＬが低い０〜７５μｍ／秒の割合は同様であったが、受胎率４０％未満の区では７５〜１５０μｍ／秒でその割合が最も高いことが特徴であった。総じて、受胎率が高いとＶＣＬが高い精子の割合が高く、受胎率が低いとＶＣＬが低い精子の割合が低く、さらに、顕著な低受胎牛のＶＣＬでは、中間的な精子の割合が高かった。このように受胎率のカテゴリ毎に精子集団の構成に特徴があることが示された。
【００６５】
実施例４．全精子のＶＣＬ値を降順に並べた値の検討
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛（ｎ＝４０）の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例２に記載の検査液を２５０μｌ添加した。そして、３８℃で１０分間インキュベーションを行った。４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０を添加した上記検査液を等量混合し、実施例１に記載の方法で測定した。受胎率６５％以上（１０頭）、５５〜６５％（１０頭）、５５％以下（１０頭）、低受胎牛（受胎率４０％未満：１０頭）について、各３ロット測定した。
【００６６】
図１２Ａは、縦軸にＶＣＬ値、横軸に精子集団内の上位７５％までを降順で表示した結果を示す。受胎率の区毎に精子集団の構成に特徴があることが示された。
図１２Ｂは、縦軸にＶＣＬ値、横軸に精子集団内の上位１０％までを降順で表示し、受胎率６５％以上の区は標準偏差を表示した結果を示す。上位０．３〜６％のＶＣＬ値は、受胎率６５％以上、５５〜６５％、４０〜５５％において、受胎率４０％未満の低受胎牛の値を上回っていた。このことから、上位０．３〜６％の任意の値のＶＣＬ値を比較することで受胎率を予測できた。また、上位３％、２％、１％、０．５％、０．３％以上といったより上位のＶＣＬ値を比較することで、より精度高く受胎性を予測できた。
【００６７】
図１３は、縦軸にＶＣＬ値、横軸に精子集団内の上位１０％までを降順で表示し、３次関数で近似して近似線を計算した結果を示す。３次関数のｙ切片は受胎率６５％以上、５５〜６５％、４０〜５５％の正常牛において各々２１６．５７、２１６．９３、２１３．０４であり、受胎率４０％未満では２００．２３であり、低受胎牛は低い値を示した。図１４は、縦軸にＶＣＬ値、横軸に精子集団内の上位２０％までを降順で表示し、直線で近似して近似線を計算した結果を示す。直線の傾きは受胎率６５％以上、５５〜６５％、４０〜５５％の正常牛において各々−３４７．４、−３９５．１３、−４２１．６２であり、受胎率４０％未満の低受胎牛では−３０７．０４であり、顕著な低受胎サンプルでは緩やかな傾きを示した。このことから、近似線のｙ切片や傾きを用いることで、より精度高く受胎性を予測できることが判明した。
【００６８】
実施例５．精子集団の構成を反映した精子の受胎性の検出
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛（ｎ＝４０）の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例２に記載の検査液を２５０μｌ添加した。そして、３８℃で１０分間インキュベーションを行った。４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０を添加した上記検査液を等量混合し、実施例１に記載の方法で測定した。層別化された集団の１又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価する。
【００６９】
凍結精液１ロットの精子集団におけるＶＣＬの値が上位７２％の精子に対して、上位０〜８、８〜１６、１６〜２４、２４〜３２、３２〜４０、４０〜４８、４８〜５６、５６〜６４、６４〜７２％の上位８％毎の９の群に分けて各々についてＶＣＬの値を算出し、受胎率の判明している種雄牛４０頭を用いて重回帰分析を行った。図１５は、縦軸に重回帰分析から得られた推定式から算出された推定受胎率、横軸に実際の受胎率を表示し、直線で近似した結果を示す。層別化された精子集団の複数の群の品質指標の値に基づいて評価することにより、実際の受胎率との間に高い相関関係が認められた。
【００７０】
凍結精液１ロットの精子集団におけるＶＣＬの値を０〜７５μｍ／秒、７５〜１５０μｍ／秒、１５０〜１７５μｍ／秒、１７５〜２００μｍ／秒、２００μｍ／秒以上の５の群に分けて各々について精子の割合を算出し、受胎率の判明している種雄牛４０頭を用いて重回帰分析を行った。図１６は、縦軸に重回帰分析から得られた推定式から算出された推定受胎率、横軸に実際の受胎率を表示し、直線で近似した結果を示す。層別化された精子集団の複数の群の品質指標の値に基づいて評価することにより、実際の受胎率との間に高い相関関係が認められた。
【００７１】
実施例６．新鮮精液及び凍結精液の比較
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した新鮮射出精液及び常法に従って融解した凍結精液について、１０００万精子に対して２０００ｒｐｍ、室温、５分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例２に記載の検査液を２５０μｌ添加した。そして、３８℃で１０分間インキュベーションを行った。４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０を添加した上記検査液を等量混合し、実施例１に記載の方法で測定した。
【００７２】
ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を図１７に示す。新鮮精液及び凍結精液の双方で測定が可能であり、凍結精液で有意にＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が低下した。このことから、凍結精液作製時の希釈液等の技術開発において、精子の品質指標として用いることができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の精子の検査方法は、精子の品質指標の値が極めて高い精子の割合や数を判定することで、受胎率との相関が高い精子の評価を得ることができるため、生産現場から高品質の精子の供給を行うことができる。また、受胎性を反映した精子の供給を行うことができるため、例えばフィールドでの牛人工授精による受胎性の向上も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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