(57)【要約】  本発明は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制するための、または、心筋細胞をin vitroで維持するための組成物、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体をin vitroで心筋細胞に投与することを含む、該心筋細胞の細胞死を抑制するための方法、ならびに、心筋細胞を、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の存在下でインキュベートするステップを含む、心筋細胞をin vitroで維持する方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制するための組成物。
【請求項２】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞をin vitroで維持するための組成物。
【請求項３】
心筋細胞が、非株化細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
液性因子がタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体をin vitroで心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞の細胞死を抑制するための方法。
【請求項６】
心筋細胞を、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の存在下でインキュベートするステップを含む、心筋細胞をin vitroで維持する方法。
【請求項７】
骨格筋芽細胞由来の液性因子の投与が、骨格筋芽細胞の培養上清を心筋細胞に投与すること、または、骨格筋芽細胞と心筋細胞とを共培養することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
骨格筋芽細胞由来の液性因子の存在下でのインキュベーションが、骨格筋芽細胞の培養上清を心筋細胞のインキュベーション媒体に添加すること、または、骨格筋芽細胞と心筋細胞とを共インキュベーションすることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
心筋細胞が、非株化細胞である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
液性因子がタンパク質である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（１）骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体を候補物質として提供する工程、
（２）心筋細胞を、前記候補物質の存在下で培養する工程、および
（３）心筋細胞の生存および／または細胞死を評価する工程、
を含む、心筋細胞の生存および／または細胞死を調節する物質をスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞のin vitro維持方法、心筋細胞の細胞死抑制方法、心筋細胞のin vitro維持または細胞死抑制のための組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、心臓に関する研究のために、心筋から単離した心筋細胞をin vitroで維持し、実験に利用する試みが行われている。in vitroでの細胞実験は、実験動物を用いたin vivoの実験よりはるかに低コストで行うことができ、実験期間も短く、実験手法も豊富なため、かかる実験系に対するニーズは高い。しかしながら、生体組織から単離された心筋細胞はアポトーシスなどの細胞死により短期間で減少してしまうため、長期間維持することは難しく、可能な実験の範囲が制限されているのが実情である（非特許文献１）。【０００３】
このような状況を受け、心筋細胞のin vitroでの維持期間を延長するための研究が進められており、ブレビスタチンやＮ−ベンジル−ｐ−トルエンスルホンアミド（ＢＴＳ）などのミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼの特異的阻害剤が、この目的のために有用であることが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kato et al., Jpn Circ J. 2001;65(8):743-8
【非特許文献２】Abi-Gerges et al., J Mol Cell Cardiol. 2013;64:108-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、心筋細胞をin vitroで維持する方法、心筋細胞の細胞死を抑制する方法、心筋細胞のin vitro維持または細胞死抑制のための組成物などの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、骨格筋芽細胞から分泌される液性成分が、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制することを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制するための組成物。
＜２＞骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞をin vitroで維持するための組成物。
＜３＞心筋細胞が、非株化細胞である、＜１＞または＜２＞に記載の組成物。
＜４＞液性因子がタンパク質である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜５＞骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体をin vitroで心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞の細胞死を抑制するための方法。【０００８】
＜６＞心筋細胞を、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の存在下でインキュベートするステップを含む、心筋細胞をin vitroで維持する方法。
＜７＞骨格筋芽細胞由来の液性因子の投与が、骨格筋芽細胞の培養上清を心筋細胞に投与すること、または、骨格筋芽細胞と心筋細胞とを共培養することを含む、＜５＞に記載の方法。
＜８＞骨格筋芽細胞由来の液性因子の存在下でのインキュベーションが、骨格筋芽細胞の培養上清を心筋細胞のインキュベーション媒体に添加すること、または、骨格筋芽細胞と心筋細胞とを共インキュベーションすることを含む、＜６＞に記載の方法。
＜９＞心筋細胞が、非株化細胞である、＜５＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１０＞液性因子がタンパク質である、＜５＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の方法。【０００９】
＜１１＞（１）骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体を候補物質として提供する工程、
（２）心筋細胞 を、前記候補物質の存在下で培養する工程、および
（３）心筋細胞の生存および／または細胞死を評価する工程、
を含む、心筋細胞の生存および／または細胞死を調節する物質をスクリーニングするための方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、心筋細胞をin vitroで長期間維持することが可能となり、心臓に関する研究への寄与が期待できる。本発明は、結果の取得にある程度の期間を要する実験などに特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒト骨格筋芽細胞から分泌される液性成分のヒト胎児心筋細胞の細胞数への影響を示したグラフである。
【図２】図２は、ヒト骨格筋芽細胞から分泌される液性成分のヒト成人心筋細胞の細胞数への影響を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１３】
本発明の一側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制するための組成物または剤（以下、「細胞死抑制用組成物」または「細胞死抑制剤」と略す場合がある）に関する。
【００１４】
本明細書において、骨格筋芽細胞は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法により調製することもできるし（例えば、特開2007-89442号公報に記載の方法など）、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ミオゲニンなどのマーカーにより同定することができる。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。
【００１５】
骨格筋芽細胞は、液性因子を作用させる心筋細胞と同一の生物種に由来しても、異なる生物種に由来してもよい。また、同一の生物種に由来する場合、同一の個体に由来しても（自家由来）、異なる個体に由来してもよい（同種他家由来）。一態様において、骨格筋芽細胞は、細胞死を抑制する心筋細胞と同種の哺乳動物に由来する。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞であり、細胞死を抑制する心筋細胞は、ヒト心筋細胞である。
【００１６】
骨格筋芽細胞由来の液性因子（以下、単に「液性因子」と略す場合もある）には、骨格筋芽細胞が分泌し得る任意の液性因子（例えば、タンパク質等）が含まれる。当該液性因子は、骨格筋芽細胞を培養することにより得ることができる。培養条件としては、特に限定されずに、例えば、約４℃〜約４５℃、約１０℃〜約４２℃、約１５℃〜約４０℃、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３８℃、約３０℃〜約３７℃などの温度での、約１時間〜約１０日間、約３時間〜約８日間、約６時間〜約７日間、約１２時間〜約５日間、約１日〜約３日間などにわたる培養が挙げられる。
【００１７】
骨格筋芽細胞の培養には、骨格筋芽細胞が生存し得る任意の媒体、限定されずに、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）などの液体媒体を用いることができる。液体媒体は、血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよい。液性因子は、骨格筋芽細胞の培養上清を採取して、これを直接、または、溶媒除去などの精製処理の後に用いてもよい。
【００１８】
液性因子としては、限定されずに、例えば、アンジオゲニン、アンジオポエチン（例えば、アンジオポエチン−２等）、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ（例えば、ｂＦＧＦ等）、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ等）、ＰＩＧＦ、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ等）、ＶＥＧＦ、レプチン、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３等）、ＴＩＭＰ（例えば、ＴＩＭＰ−４等）などのタンパク質、およびこれらの組合せなどが挙げられる。
【００１９】
上記以外の液性因子は、例えば、骨格筋芽細胞の培養上清を分析することなどにより同定することができる。培養上清に含まれる液性因子の分析手法としては様々なものが知られており、これらの分析手法を適宜用いることができる。分析手法の非限定例としては、例えば、液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、質量分析法、ペプチドマスフィンガープリント法、プロテインシーケンサー法、免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radioimmunoassay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、ＲＡＳＴ（radioallergosorbent test）、ＲＩＳＴ（radioimmunosorbent test）など）、ウェスタンブロッティング法、これらの手法の組合せなどが挙げられる。例えば、液体クロマトグラフィー法または電気泳動法により分離したタンパク質を、質量分析法で解析し、その結果を基にペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質を同定することが可能である。また、骨格筋芽細胞が発現する遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡなど）を種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法または種々のＰＣＲ法などにより検出し、その中から分泌されることが知られているタンパク質を選定し、これに対する抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロッティング法などを用いて、培養上清中に前記タンパク質が実際に存在するかを確認することにより、培養上清に含まれる液性因子を特定することもできる。
【００２０】
液性因子の機能的変異体は、骨格筋芽細胞が分泌する液性因子とは物質として異なるが、当該液性因子と同等の活性を有する物質を意味する。例えば、液性因子がタンパク質である場合、当該液性因子の機能的変異体は、当該液性因子とはアミノ酸配列などが異なるが、これと同等の活性を有するタンパク質を意味する。例えば、液性因子がアンジオゲニンである場合、この機能的変異体は、アンジオゲニンとはアミノ酸配列が異なるが、アンジオゲニンと同等の活性を有するタンパク質、アンジオゲニンと同等の活性を有するアンジオゲニンの修飾体などを意味する。かかる機能的変異体は、例えば、対応するタンパク質のアミノ酸配列を改変し、当該改変体を元のタンパク質が有する活性について試験することなどにより得ることができる。かかる機能的変異体の一態様は、元のタンパク質のアミノ酸配列に対し、１個または２個以上、例えば、１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有する。
【００２１】
液性因子の給源としては、限定されずに、例えば、骨格筋芽細胞、骨格筋芽細胞と同等の分泌活性を有する細胞、液性因子がタンパク質である場合は、当該液性因子および／またはその機能的変異体をコードする核酸、これを含むベクター、当該ベクターで形質転換された宿主細胞などが挙げられる。骨格筋芽細胞と同等の分泌活性を有する非骨格筋芽細胞としては、限定されずに、例えば、骨格筋芽細胞と同等の分泌活性を有する、骨格筋芽細胞系の細胞などが挙げられる。液性因子および／またはその機能的変異体をコードする核酸、これを含むベクター、および当該ベクターで形質転換された宿主細胞は、液性因子の既知の配列情報などから、適宜作製することが可能である。
【００２２】
液性因子および／またはその機能的変異体が作用する心筋細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋細胞は哺乳動物の心筋細胞である。特定の態様において、心筋細胞はヒト心筋細胞である。心筋細胞はいずれの成長段階のものであってもよく、限定されずに、例えば、胎児心筋細胞、成体心筋細胞などを含む。一態様において、心筋細胞は成体心筋細胞、例えば、哺乳動物成体心筋細胞、特にヒト成体心筋細胞である。別の態様において、心筋細胞は胎児心筋細胞、例えば、哺乳動物胎児心筋細胞、特にヒト胎児心筋細胞である。
【００２３】
心筋細胞は、生体または心筋から単離後培養を経ていない初代細胞、生体または心筋から単離後培養を行ったが、継代はしていない初代培養細胞、生体または心筋から単離後継代培養を行った継代細胞、さらには、株化された細胞などを含む。一態様において、心筋細胞は、非株化細胞、例えば、初代細胞、初代培養細胞または継代細胞である。特定の態様において、心筋細胞は、初代細胞または初代培養細胞である。
【００２４】
心筋細胞は心筋ミオシンの発現を特徴としており、これに基づいて同定することができる。心筋ミオシンは重鎖および軽鎖から構成され、これらのいずれかまたは両方の発現を検出対象とすることができる。心筋ミオシン重鎖および軽鎖の遺伝子配列やアミノ酸配列は様々な動物について公知であり、これらを検出するための抗体なども市販されている。
【００２５】
本明細書において、「組成物」および「剤」は互換可能に用いられ、複数の成分（例えば、化合物）の混合物を意味する。「剤」および「組成物」は、特定の用途に向けられたものであってもよく、その場合、当該用途に適した成分を適宜含んでもよい。
【００２６】
本発明の細胞死抑制用組成物は、心筋細胞が存在する媒体に適量添加して用いる。組成物が細胞（例えば、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体の給源細胞など）を含む場合は、当該細胞が単離された心筋細胞に直接接触しない態様、例えば、組成物を、液性因子は通過するが、細胞は通過できない半透過性の容器内に入れ、組成物由来の細胞が分泌する液性因子を、媒体を介して心筋細胞に作用させるなどの態様で用いてもよい。
【００２７】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞をin vitroで維持するための組成物または剤（以下、「心筋細胞維持用組成物」または「心筋細胞維持剤」と略す場合がある）に関する。
【００２８】
心筋細胞は、生体または心筋組織から単離後、in vitro環境下で長期間維持することは難しく、比較的短期間で死滅する。本発明の心筋細胞維持用組成物を単離された心筋細胞に作用させることにより、in vitroでの心筋細胞の生存などを維持し、心筋細胞の減少を抑制することができる。本発明の心筋細胞維持用組成物の構成成分や使用法は、本発明の細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００２９】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、in vitroで心臓非心筋細胞の増殖を促進するための組成物または剤（以下、「増殖促進用組成物」または「増殖促進剤」と略す場合がある）に関する。
【００３０】
心臓非心筋細胞は、心臓、特に心筋組織に存在する心筋細胞以外の細胞を意味し、限定されずに、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞などを含む。一態様において、心臓非心筋細胞は、心線維芽細胞である。心臓非心筋細胞は、生体または心筋から単離後培養を経ていない初代細胞、生体または心筋から単離後培養を行ったが、継代はしていない初代培養細胞、生体または心筋から単離後継代培養を行った継代細胞、さらには、株化された細胞などを含む。一態様において、心臓非心筋細胞は、非株化細胞、例えば、初代細胞、初代培養細胞または継代細胞である。特定の態様において、心臓非心筋細胞は、初代細胞または初代培養細胞である。
【００３１】
本発明の増殖促進用組成物は、これを作用させない場合に比べ、心臓非心筋細胞の増殖を促進することができる。促進の程度は、増殖率を、当該組成物を作用させなかった場合に比べ、限定されずに、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上増加させるものであってもよい。
【００３２】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体をin vitroで心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞の細胞死を抑制するための方法（以下、「細胞死抑制方法」と略す場合がある）に関する。
【００３３】
心筋細胞への骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の投与は、当該有効成分が心筋細胞と作用し得る任意の態様で行ってもよい。より具体的には、限定されずに、例えば、心筋細胞が存在する生理緩衝液や、培地などの媒体に、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体、液性因子がタンパク質である場合は、当該液性因子および／もしくはその機能的変異体をコードする核酸、またはこれを含むベクターなどを添加して行ってもよいし、心筋細胞と、骨格筋芽細胞、骨格筋芽細胞と同等の分泌活性を有する細胞、液性因子がタンパク質である場合は、当該液性因子および／またはその機能的変異体をコードする核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞などの、液性因子および／またはその機能的変異体の給源となる細胞とを共培養してもよい。骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体を、その給源細胞との共培養により投与する場合は、給源細胞が心筋細胞に直接接触しない態様、例えば、給源細胞を、液性因子は通過するが、給源細胞は通過できない半透過性の容器内（例えば、細孔を有するカルチャーインサート）に入れ、給源細胞が分泌する液性因子を、媒体を介して心筋細胞に作用させるなどの態様で行ってもよい。
【００３４】
本発明の別の側面は、心筋細胞を、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の存在下でインキュベートするステップを含む、心筋細胞をin vitroで維持する方法（以下、「心筋細胞維持方法」と略す場合がある）に関する。
【００３５】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の存在下でのインキュベーションは、当該液性因子および／またはその機能的変異体が心筋細胞に作用し得る任意の態様で行うことができる。かかるインキュベーションは、例えば、心筋細胞をインキュベートする生理緩衝液や培地などのインキュベーション媒体に、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体、液性因子がタンパク質である場合は、当該液性因子および／もしくはその機能的変異体をコードする核酸、またはこれを含むベクターなどを添加して行ってもよいし、心筋細胞と、骨格筋芽細胞、骨格筋芽細胞と同等の分泌活性を有する細胞、液性因子がタンパク質である場合は、当該液性因子および／またはその機能的変異体をコードする核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞などの、液性因子および／またはその機能的変異体の給源となる細胞とを共インキュベートしてもよい。骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体を、その給源細胞との共培養により投与する場合は、給源細胞が心筋細胞に直接接触しない態様、例えば、給源細胞を、液性因子は通過するが、給源細胞は通過できない半透過性の容器内（例えば、細孔を有するカルチャーインサート）に入れ、給源細胞が分泌する液性因子を、媒体を介して心筋細胞に作用させるなどの態様で行ってもよい。
【００３６】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体をin vitroで心臓非心筋細胞に投与することを含む、該細胞の増殖を促進するための方法（以下、「増殖促進方法」と略す場合がある）に関する。心臓非心筋細胞への骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体の投与は、当該有効成分が心臓非心筋細胞と作用し得る任意の態様で行うことができる。投与方法の非限定例は、本発明の細胞死抑制方法について上記したとおりである。
【００３７】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を有効成分として含む、in vivoで心筋細胞の細胞死を抑制するための組成物または剤（以下、「in vivo細胞死抑制用組成物」または「in vivo細胞死抑制剤」と略す場合がある）に関する。
【００３８】
本発明のin vivo細胞死抑制用組成物は、有効成分が心筋細胞に到達し得る、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などを参照）。
【００３９】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であってもよい。
【００４０】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、心筋細胞の細胞死に関連する疾患を処置するための組成物または剤（以下、「疾患処置用組成物」または「疾患処置剤」と略す場合がある）に関する。
【００４１】
心筋細胞の細胞死に関連する疾患は、心筋細胞の細胞死を抑制することにより改善し得る任意の疾患、限定されずに、例えば、心筋傷害および心筋症などを含む。心筋傷害は、心臓外傷に起因するものや、心筋梗塞、心筋炎および心筋虚血からなる群から選択される疾患に起因するものを含む。また、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症および拘束型心筋症を含む。肥大型心筋症は拡張相肥大型心筋症を含む。
【００４２】
本発明の疾患処置用組成物（例えば医薬組成物）は、１または２以上の薬学的に許容し得る添加物（例えば、界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤など）を含んでもよい。薬学的に許容し得る添加物は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。本発明の疾患処置用組成物の投与経路や剤形は、本発明のin vivo細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００４３】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体、および／またはその給源を含む、in vivoで心臓非心筋細胞の増殖を促進するための組成物または剤（以下、「in vivo増殖促進用組成物」または「in vivo増殖促進剤」と略す場合がある）に関する。心臓非心筋細胞、増殖促進の程度などは、本発明の増殖促進用組成物について上記したとおりである。本発明のin vivo増殖促進用組成物は、有効成分が心臓非心筋細胞に到達し得る、経口および非経口の両方を包含する種々の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。投与経路および剤形の非限定例は、本発明のin vivo細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００４４】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビター、および／またはその給源を含む、心臓非心筋細胞の増殖を阻害するための組成物または剤（以下、「増殖阻害用組成物」または「増殖阻害剤」と略す場合がある）に関する。
【００４５】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビターは、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体の産生、分泌および／または活性を阻害する物質であれば特に限定されず、液性因子がタンパク質である場合は、例えば、当該タンパク質の機能を阻害する抗体もしくはその断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片等）、ドミナントネガティブ変異体、当該タンパク質の発現および／またはシグナル伝達を阻害する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などのＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸等）、これらの組合せなどが挙げられる。骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビターのさらなる例は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体の産生、分泌および／または活性を阻害する化合物、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体を産生する細胞の活性および／または増殖を阻害する化合物、および、該細胞の細胞死を誘導する化合物などを含む。これらの化合物は、低分子化合物および高分子化合物を含む。骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビターの給源としては、インヒビターがタンパク質または核酸である場合は、例えば、限定されずに、当該タンパク質または核酸をコードする核酸、これを含むベクター、当該ベクターで形質転換された宿主細胞などが挙げられる。
【００４６】
本発明の増殖阻害用組成物において、心臓非心筋細胞は、生体から単離されていても、生体内に存在していてもよい。生体から単離されている場合、心臓非心筋細胞は、生体から単離された心筋組織内に存在していても、心筋組織からさらに単離されていてもよい。したがって、本発明の増殖阻害用組成物は、in vivo、ex vivoまたはin vitroで用いてもよい。
【００４７】
in vivoで用いる場合、本発明の増殖阻害用組成物は、有効成分が心臓非心筋細胞に到達し得る、経口および非経口の両方を包含する種々の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。投与経路および剤形の非限定例は、本発明のin vivo細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００４８】
ex vivoまたはin vitroで用いる場合、本発明の増殖阻害用組成物は、限定されずに、例えば、心筋組織や単離された心臓非心筋細胞が存在する媒体に適量添加して用いてもよい。組成物が細胞を含む場合は、細胞が心筋組織や単離された心臓非心筋細胞に直接接触しない態様、例えば、組成物を、液性因子は通過するが、細胞は通過できない半透過性の容器内に入れ、細胞が分泌する液性因子を、媒体を介して心筋組織や単離された心臓非心筋細胞に作用させるなどの態様で用いてもよい。
【００４９】
本発明の増殖阻害用組成物は、これを作用させない場合に比べ、心臓非心筋細胞の増殖を阻害することができる。阻害の程度は、増殖率を、当該組成物を作用させなかった場合に比べ、限定されずに、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上低下させるものであってもよい。なお、増殖率の１００％を超える低下は、細胞死などにより細胞数が減少することを意味する。
【００５０】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源を対象に投与することを含む、in vivoで心筋細胞の細胞死を抑制するための方法（以下、「in vivo細胞死抑制方法」と略す場合がある）に関する。
【００５１】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体が対象における心筋細胞に到達し得る、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよい。また、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源の投与は、本発明のin vivo細胞死抑制用組成物を対象に投与することにより行ってもよい。
【００５２】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源を、それを必要とする対象に投与すること含む、対象において成体心筋細胞の細胞死に関連する疾患を処置するための方法（以下、「疾患処置方法」と略す場合がある）に関する。
【００５３】
本発明の疾患処置方法における骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源の投与は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体が対象における心筋細胞と作用し得る任意の態様で行ってもよい。これは、例えば、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源、あるいはこれを含む組成物（例えば、本発明の疾患処置用組成物など）を、心筋細胞が存在する対象に投与することにより行うことができる。
【００５４】
本発明の疾患処置方法において投与される骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源の量は、疾患の処置のための有効量であってもよい。本発明の疾患処置方法における有効量は、例えば、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。当該有効量は、投与による利益を超える悪影響が生じないものが好ましい。当該有効量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や、疾患モデル動物における試験に基づき適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
【００５５】
本発明の方法において対象に投与する骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源の具体的な用量は、投与を要する対象に関する種々の条件、例えば、治療内容、疾患の種類、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の組成物の１日総投与量は、限定されずに、液性因子および／またはその機能的変異体の量として、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約１００μg／ｋｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。あるいは、投与量は対象の表面積に基づいて計算してもよい。
【００５６】
投与経路としては、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体が対象における心筋細胞に到達し得る、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
【００５７】
投与頻度は、用いる製剤または組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００５８】
本明細書において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本発明において、対象は健常（例えば、特定のまたは任意の疾患を有しない）であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００５９】
本明細書において、「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、本明細書における「処置」は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００６０】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源を対象に投与することを含む、in vivoで心臓非心筋細胞の増殖を促進するための方法（以下、「in vivo増殖促進方法」と略す場合がある）に関する。対象への骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体および／またはその給源の投与は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体が対象における心臓非心筋細胞と作用し得る任意の態様で行ってもよい。投与態様の非限定例は、本発明のin vivo細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００６１】
本発明の別の側面は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビター、および／またはその給源を心臓非心筋細胞に投与することを含む、心臓非心筋細胞の増殖を阻害するための方法（以下、「増殖阻害方法」と略す場合がある）に関する。心臓非心筋細胞への骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体のインヒビター、および／またはその給源の投与は、骨格筋芽細胞由来の液性因子および／もしくはその機能的変異体が心臓非心筋細胞と作用し得る任意の態様で行うことができる。投与方法の非限定例は、投与対象細胞が心筋細胞の代わりに心臓非心筋細胞となる以外は、本発明の細胞死抑制方法およびin vivo細胞死抑制方法について上記したとおりである。
【００６２】
本発明の別の側面は、
（１）骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体を候補物質として提供する工程、
（２）心筋細胞および／または心臓非心筋細胞を、前記候補物質の存在下で培養する工程、および
（３）心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を評価する工程、
を含む、心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を調節する物質をスクリーニングするための方法（以下、「スクリーニング方法」と略す場合がある）に関する。
【００６３】
骨格筋芽細胞由来の液性因子および／またはその機能的変異体を候補物質として提供する工程は、骨格筋芽細胞由来の液性因子、例えば、アンジオゲニン、アンジオポエチン（例えば、アンジオポエチン−２等）、ＥＧＦ、ＦＧＦ（例えば、ｂＦＧＦ等）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ等）、ＰＩＧＦ、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ等）、ＶＥＧＦ、レプチン、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３等）、ＴＩＭＰ（例えば、ＴＩＭＰ−４等）などのタンパク質、これらの機能的変異体、これらの組合せなどを入手または調製することを含む。また、前記工程は、骨格筋芽細胞の培養上清を分析することなどにより骨格筋芽細胞由来の液性因子を同定し、同定された液性因子および／またはその機能的変異体を入手または調製することを含んでもよい。培養上清に含まれる液性因子の分析手法の非限定例は、本発明の細胞死抑制用組成物について上記したとおりである。
【００６４】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞を、前記候補物質の存在下で培養する工程は、限定されずに、前記細胞の培養系に、候補物質を添加することを含んでもよい。培養系は、心筋細胞および心臓非心筋細胞のいずれか一方または心筋細胞と心臓非心筋細胞とを含む細胞集団を含んでいてもよい。心筋細胞と心臓非心筋細胞とは、例えば、特異的マーカーの発現の有無などにより区別することができる。より具体的には、例えば心臓由来の細胞のうち、心筋ミオシン陽性細胞を心筋細胞、心筋ミオシン陰性細胞を心臓非心筋細胞として区別できる。候補物質は、単一の種類を添加しても、複数の種類の組合せを添加してもよい。添加濃度は特に限定されず、１０−１５Ｍ〜１０−３Ｍ、１０−１４Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−１３Ｍ〜１０−５Ｍ、１０−１２Ｍ〜１０−６Ｍ等であってよく、複数の濃度で試験してもよい。複数の濃度で試験することにより、濃度依存性について評価することができる。
【００６５】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の培養条件は、前記細胞の生存を許容する任意の条件を含み、これには、限定されずに、例えば、前記細胞が生存し得る媒体中、５％ＣＯ２、室温〜４０℃（例えば、３７℃）での培養などが含まれる。媒体は、基礎培地や生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）のみであっても、これに血清や成長因子などが添加されたものであってもよい。培養期間は、前記細胞の生存や、増殖、細胞死を観察し得る期間であれば特に限定されず、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日またはそれ以上であってもよい。
【００６６】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を評価する工程において、前記細胞の生存は、限定されずに、例えば、生細胞数の計数（例えば、トリパンブルー法等）などにより評価することができる。前記細胞の増殖は、限定されずに、例えば、経時的な生細胞数の計数、ＤＮＡ合成量の測定、ＷＳＴ−１法、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）法、３Ｈチミジン取込み法などにより評価することができる。前記細胞の細胞死は、限定されずに、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化などのアポトーシス特有の現象の検出や、ＴＵＮＥＬ染色、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、エチジウムホモダイマーＩ、エチジウムホモダイマーＩＩＩ、７−ＡＡＤ、ＤＡＰＩによる染色などにより評価することができる。細胞の生存、増殖および細胞死は、一緒に評価しても、別々に評価してもよい。例えば、生細胞数を経時的に計数後、同じ細胞集団について死細胞を検出することにより、細胞の生存、増殖および細胞死を一緒に評価することができる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法において、「調節する」は、「促進（増大）する」、「維持する」、および「抑制（阻害、低減）する」を含む。促進（増大）の程度は、限定されずに、例えば、前記細胞の増殖率を、候補物質を作用させなかった場合に比べ、限定されずに、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上増加させるものであってもよい。抑制（阻害、低減）の程度は、限定されずに、例えば、前記細胞の増殖率を、候補物質を作用させなかった場合に比べ、限定されずに、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上減少させるものであってもよい。また、維持の程度は、限定されずに、例えば、前記細胞の増殖率を、候補物質を作用させなかった場合に比べ、限定されずに、例えば、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満変動（増大または低減）するものであってもよい。
【００６８】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を評価する工程において、候補物質の存在下での生存の程度（例えば生存率など）が、当該候補物質の非存在下での生存の程度より大きかった場合、候補物質の存在下では生存の程度が維持されたが、当該候補物質の非存在下では生存の程度が低減した場合、より高い濃度の候補物質の存在下での生存の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での生存の程度より大きかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存を維持する物質であると判定される。逆に、候補物質の存在下での生存の程度が、当該候補物質の非存在下での生存の程度より小さかった場合、候補物質の非存在下では生存の程度が維持されたが、当該候補物質の存在下では生存の程度が低減した場合、より高い濃度の候補物質の存在下での生存の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での生存の程度より小さかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存を阻害する物質であると判定される。
【００６９】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の増殖および／または細胞死を評価する工程において、候補物質の存在下での増殖の程度が、当該候補物質の非存在下での増殖の程度より大きかった場合、候補物質の存在下では増殖したが、当該候補物質の非存在下では増殖しなかった場合、より高い濃度の候補物質の存在下での増殖の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での増殖の程度より大きかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の増殖を促進する物質であると判定される。逆に、候補物質の存在下での増殖の程度が、当該候補物質の非存在下での増殖の程度より小さかった場合、候補物質の非存在下では増殖したが、当該候補物質の存在下では増殖しなかった場合、より高い濃度の候補物質の存在下での増殖の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での増殖の程度より小さかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の増殖を阻害する物質であると判定される。
【００７０】
心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を評価する工程において、候補物質の存在下での細胞死の程度が、当該候補物質の非存在下での細胞死の程度より小さかった場合、候補物質の存在下では細胞死が生じなかったが、当該候補物質の非存在下では細胞死が生じた場合、より高い濃度の候補物質の存在下での細胞死の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での細胞死の程度より小さかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の細胞死を抑制する物質であると判定される。逆に、候補物質の存在下での細胞死の程度が、当該候補物質の非存在下での細胞死の程度より大きかった場合、候補物質の存在下では細胞死が生じたが、当該候補物質の非存在下では細胞死が生じなかった場合、より高い濃度の候補物質の存在下での細胞死の程度が、より低い濃度の候補物質の存在下での細胞死の程度より大きかった場合、その候補化合物は心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の細胞死を促進する物質であると判定される。
【００７１】
一態様において、本発明のスクリーニング方法は、心筋細胞の生存を維持する物質をスクリーニングするためのものである。特定の態様において、本発明のスクリーニング方法は、心筋細胞のin vitroでの生存を維持する物質をスクリーニングするためのものである。別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、心筋細胞の細胞死を抑制する物質をスクリーニングするためのものである。特定の態様において、本発明のスクリーニング方法は、心筋細胞のin vitroでの細胞死を抑制する物質をスクリーニングするためのものである。別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、心筋細胞の生存を維持し、細胞死を抑制する物質をスクリーニングするためのものである。別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、心臓非心筋細胞の増殖を促進する物質をスクリーニングするためのものである。
【００７２】
本発明の別の側面は、本発明のスクリーニング方法に用いる一部またはすべての要素を含む、心筋細胞および／または心臓非心筋細胞の生存、増殖および／または細胞死を調節する物質をスクリーニングするためのキット（セットまたはパック）に関する（以下、「キット」と略す場合がある）。本明細書において、用語「セット」および「パック」は「キット」と互換可能に用いられ、本明細書における「キット」に関する記載は「セット」および「パック」にも適用されるものとする。
【００７３】
本発明のキットに含まれる具体的な要素は、本発明のスクリーニング方法に係る上記記載を参照すれば明らかであろうから、ここで全てを列挙することはしない。一態様において、本発明のキットは、限定されずに、例えば、心筋細胞および／または心臓非心筋細胞、細胞の生存、増殖および／または細胞死を検出するための剤（例えば、トリパンブルー、３Ｈチミジン、ＢｒｄＵ、抗ＢｒｄＵ抗体、ＷＳＴ−１試薬、ＤＮＡ断片化検出試薬（例えば、抗ヒストン抗体等）、アネキシンＶ（例えば、ＦＩＴＣなどの標識で標識されたアネキシンＶ等）、ミトコンドリア膜電位測定試薬（例えば、テトラメチルローダミンエチルエステル、テトラメチルローダミンメチルエステル、ＪＣ−１等）、活性化カスパーゼ検出試薬（例えば、活性化カスパーゼや切断されたＰＡＲＰに対する抗体、カスパーゼ活性を測定するためのカスパーゼ基質等）、ＴＵＮＥＬ染色試薬（ＴｄＴ、ｄＮＴＰ、標識等）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、エチジウムホモダイマーＩ、エチジウムホモダイマーＩＩＩ、７−ＡＡＤ、ＤＡＰＩなど）、培養液、培養皿、洗浄液、心筋細胞と心臓非心筋細胞とを区別するための剤（例えば、心筋ミオシン検出試薬等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、スクリーニング方法に関する指示（例えば、使用説明書、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７４】
以下に、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。【００７５】
実施例１  ヒト胎児心筋細胞とヒト骨格筋芽細胞との共培養
２４ウェルマルチプレート（BD、Cat# 353047）に乾熱滅菌済みの丸型カバーグラス（Fisher、Cat#12-545-80）を敷き、ラミニンコート（５μｇ／ｃｍ２）を施した（マウスラミニン、BD、Cat# 354232）。ラミニンコートは、ＰＢＳで５０μｇ／ｍＬに希釈したラミニン溶液を、カバーグラスを入れたウェルに添加し、冷蔵庫中で1時間〜１晩処理することにより行った。次いで、ヒト胎児心筋細胞（Human Cardiac Myocytes (HCM)、ScienCell Research Laboratories、Cat#6200）を培地１（Cardiac Myocyte Medium、ScienCell Research Laboratories、Cat#6201）に懸濁し、５０００個／ｃｍ２の密度で、ウェル内のラミニンコートカバーグラス上に播種した。ヒト骨格筋芽細胞（Lonza、Cat# CC-2580）およびヒト心線維芽細胞（ScienCell Research Laboratories、Cat#6300）は、ヒト骨格筋芽細胞用培地（Lonza、SkGM-2 BulletKit、Cat#CC-3245）およびヒト心線維芽細胞用培地（ScienCell Research Laboratories、Cat# 2301）にそれぞれ懸濁し、２４ウェルセルカルチャーインサート（孔径１．０μｍ、BD、Cat#353104）に、１．０６×１０５個／インサートの密度で播種した。播種後の各細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。なお、いずれの細胞も初代培養細胞である。【００７６】
播種の翌日、所定のウェルから心筋細胞が付着したカバーグラスを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定して（室温で５分間）、Day 1のサンプルとした。残りの心筋細胞は、培地を培地1または培地2（Cardiac Myocyte Medium（ScienCell Research Laboratories、Cat#6201）のbasal medium１００ｍＬおよびpenicillin/streptomycin solution１ｍＬと、ＢＳＡ（SIGMA）０．１％とを含む）のいずれかと置換した。次いで、ヒト骨格筋芽細胞またはヒト心線維芽細胞が播種されたセルカルチャーインサートを心筋細胞が播種されたウェルにセットし、共培養を開始した。なお、インサートをセットする前に、インサート内の培地をウェル内の培地と同じもの（すなわち、培地１または培地２）に置換した。また、コントロールとして、共培養を行わない群も設けた。共培養開始の翌日（Day 2）および翌々日（Day 3）に、Day 1と同様に心筋細胞のサンプリングを行った。【００７７】
調製した各サンプルに含まれる心筋細胞を同定するため、カバーグラスに付着した細胞集団を心筋ミオシン抗体で免疫染色した。まずＰＢＳ中の０．１％Triton X-100で、室温にて１０分間透過処理を行い、次いでＰＢＳ中の１０％Normal Goat Serumで、室温にて３０分間ブロッキングした。１次抗体としてheavy chain cardiac Myosin antibody（Clone 3-48、ab15、abcam,、ＰＢＳ中の１％Normal Goat Serumで１００倍希釈）を４℃で１晩作用させた後、２次抗体としてAnti-mouse IgG (Whole Molecule) FITC conjugate（F2012、SIGMA、ＰＢＳ中の１％Normal Goat Serumで６４倍希釈）を室温で１時間作用させた。最後に０．１〜１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（同仁化学研究所、製品コードD212）を用いて室温で５分間核染色を行った。染色後、蛍光顕微鏡下で各サンプルにおける総細胞数および心筋ミオシン陽性細胞（心筋細胞）数をカウントした。結果を下表１および図１に示す。なお、細胞数は、５視野（倍率２００倍）の合計数を示してある。【００７８】
【表１】
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【００７９】
Day 3における総細胞数は、培地１、培地２ともにヒト骨格筋芽細胞と共培養した群において他の群よりも顕著に多かった。一方、心筋ミオシン陽性細胞数は、いずれの群においても経時的に低下した。以上の結果は、ヒト骨格筋芽細胞から分泌される液性因子がヒト胎児心筋から初代培養により得られた細胞群のうち心筋ミオシン陰性の非心筋細胞の増殖を促進させることを示すものである。【００８０】
実施例２  ヒト成人心筋細胞とヒト骨格筋芽細胞との共培養
ヒト胎児心筋細胞の代わりに初代培養ヒト成人心筋細胞（Human Cardiac Myocytes-adult (HCMa)、ScienCell Research Laboratories、Cat#6210）を用いた以外は、実施例１と同様に共培養、サンプリング、免疫染色および細胞のカウントを行った。結果を下表２および図２に示す。【００８１】
【表２】
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【００８２】
Day 3における総細胞数は、培地１、培地２ともにヒト骨格筋芽細胞と共培養した群およびヒト心線維芽細胞と共培養した群において、ヒト成人心筋細胞のみで培養した群よりも多かった。一方、心筋ミオシン陽性細胞数は、ヒト心線維芽細胞と共培養した群およびヒト成人心筋細胞のみで培養した群においては、実施例１と同様経時的に低下したが、ヒト骨格筋芽細胞と共培養した群については、培地1で培養された群ではDay 3まで、培地２で培養された群ではDay 2まで、心筋ミオシン陽性細胞数は概ね維持された。これらの結果は、ヒト骨格筋芽細胞から産生される液性因子が、ヒト成人心筋から初代培養により得られた細胞群のうち心筋ミオシン陰性の非心筋細胞の増殖を促進させるとともに、心筋ミオシン陽性の心筋細胞の細胞死を抑制することを示すものである。【００８３】
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
2015146697.tif 000004
【図２】
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【国際調査報告】
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