(57)【要約】  受精卵の体外培養において、発生を停止させることなく、胚盤胞のステージまで正常に進行させる体外培養培地を提供する。  受精卵の正常発生率向上剤として、下記式（Ｉ）（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）で示される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩を利用することにより受精卵の正常発生率が向上する。【化１】2016006260.tif 000025
2016006260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有することを特徴とする受精卵の正常発生率向上剤。
【化１】
2016006260.tif 000021
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする請求項１記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項３】
さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項４】
鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項３記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項５】
受胎率を高めることができることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項６】
受精卵が、体外受精又は体内受精による受精卵であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項７】
さらに哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含む受精卵発生率向上用培地であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤に受精卵を接触させることを特徴とする受精卵の正常発生率を向上する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤を対象雌親に投与することを特徴とする受精卵の正常発生率を向上する方法。
【請求項１０】
ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
【化２】
2016006260.tif 000022
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を含む受精卵の正常発生率を向上するためのキット。
【請求項１１】
さらに、ｃ）哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含むことを特徴とする請求項１０記載の受精卵の正常発生率を向上するためのキット。
【請求項１２】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、受精卵の正常発生率向上剤を調製するための使用。
【化３】
2016006260.tif 000023
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項１３】
式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物とを用いることを特徴とする請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物と哺乳動物の受精卵の体外培養培地とを用いることを特徴とする請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
受精卵の正常発生率の向上に用いるための下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
【化４】
2016006260.tif 000024
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸類又はその塩（ＡＬＡ類）を含有する受精卵の正常発生率向上剤や受精卵の正常発生率を向上するためのキット、受精卵をＡＬＡ類に接触させて受精卵の正常発生率を向上する方法や、受精卵の正常発生率向上のために使用するＡＬＡ類や、受精卵の正常発生率向上剤を調製するためのＡＬＡ類の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
優れた遺伝的形質を有する雌畜の卵を、同じく優れた遺伝的形質を有する雄畜の精子で媒精し、受精卵を体外培養後に他の雌畜（レシピエント）の子宮に移植する胚移植の技術は、効率よく、優良種家畜や実験動物を産出する技術として広く行われてきた。例えば、ドナー（受精卵の供給動物）から採取した受精卵を、ホルモン処理等により擬妊娠状態にする同期化処置をしたレシピエント（受精卵の受容動物）に移植して妊娠させ、産仔を得る体内受精卵移植や、食肉処理場で得られる肉質等の良否が判明した家畜の卵巣から未成熟卵子を取り出して体外で卵子の成熟・受精・発生培養を行うことで生産された、子宮内移植が可能な状態の受精卵を用いる体外受精卵移植が広く行われるようになっている。【０００３】
ヒトにおいては、Edwards博士とSteptoe博士により、インビトロの培養液内において卵子と精子を受精させ、体外培養された胚を子宮内に移植する体外受精（in vitro fertilization：ＩＶＦ）−胚移植（embryo transfer：ＥＴ）法の成功が１９７８年に報告された（例えば、非特許文献１参照)。さらに、ヒト体外受精用の培地として、受精の場であるヒト卵管液の電解質組成に近似した組成を有するＨＴＦ培地（Human Tubal Fluid Medium）が開発されたこと（例えば、非特許文献２参照)を端緒として、従前より使用されていたハムＦ−１０培地等の汎用性のある培地に代わる体外受精用培地について検討が行われるようになった。【０００４】
かかる体外受精用培地としては、セリシンを含有し、体内人工授精により採取した胚、又は体外受精により作出した胚を培養できる人工受精用培地組成物（例えば、特許文献１参照）や、キサントフィルを含有する人工受精用培地組成物（例えば、特許文献２参照）や、ピルビン酸若しくは乳酸又はこれらの塩、及び、タウリン又はその前駆物質を必須成分として含むブタ胚の体外培養用培地（例えば、特許文献３参照）や、哺乳動物受精卵の発生培地に対し、血管内皮成長因子を添加して支持細胞との共培養を行い、受精卵の正常発生率を高める哺乳動物受精卵の発生率向上方法（例えば、特許文献４参照）や、Ｌ−グルタミン又は加水分解してＬ−グルタミンを生成し得るその誘導体を実質的に含まないアミノ酸含有体外受精用培地組成物（例えば、特許文献５参照）や、卵胞液に含まれる２１種類のアミノ酸又は加水分解してそのようなアミノ酸を生成し得るその誘導体を遊離形又はその薬理学的に許容される塩の形で含有する、哺乳類の卵子又は初期胚の培養あるいは精子の調製又は培養に使用できる体外受精用培地組成物（例えば、特許文献６参照）や、乳酸又はその可溶性塩、ピルビン酸又はその可溶性塩、塩基性線維芽細胞成長因子及び腫瘍成長因子−β１を含有する低グルコース濃度ＴＣＭ１９９培地からなるウシ受精卵の体外培養用無血清培地（例えば、特許文献７参照）や、雄の精子や雌の卵子又はこれらから得られる受精卵に磁力を作用させる受胎率の向上方法（例えば、特許文献８参照）等が提案されている。【０００５】
さらに、上記ＩＶＦ法の一態様として、精子注入用ピペットに精子を吸引し、卵細胞質の中に精子を注入する卵細胞質内精子注入法（intracytoplasmic sperm injection：ＩＣＳＩ）が開発された。この方法は、一個の精子さえあれば、高率に受精卵が得られるため、重症な乏精子症をはじめとした男性不妊症を原因とする不妊についても有効である。このように、インビトロでの受精卵の培養は一般的な手段となってきたが、培養された受精卵が、胚盤胞のステージまで至らず、桑実胚以前で停止する割合が高いことが知られている。この理由として、何らかの因子によって初期発生の停止が引き起こされるのではないかということが指摘されているがメカニズムは明らかにされていない。例えば、ヒトの場合、体外受精の妊娠率は全体外受精数の約２０〜２５％、さらに出生にまで至るのは５〜１５％にとどまるとされ、またウシにおいても、受精卵を体外培養すると、８細胞期から１６細胞期で発生が頻繁に停止することが報告されている(例えば、非特許文献３参照)。【０００６】
一方、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、動物や植物や菌類に広く存在するテトラピロール生合成経路の中間体として知られており、通常５−アミノレブリン酸合成酵素により、スクシニルＣｏＡとグリシンとから生合成される。５−ＡＬＡを用いた光線力学的療法又は光動力学的治療（ＡＬＡ−ＰＤＴ）も開発され、侵襲性が低くＱＯＬが保たれる治療法として注目されており、ＡＬＡ等を用いた腫瘍診断・治療剤等が報告されている。また、５−ＡＬＡは、成人病、がん、男性不妊の予防改善剤や治療剤として有用であることも知られている（例えば、特許文献９〜１１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１０５５８５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８７６２９号公報
【特許文献３】特開２００３−０２４０５５号公報
【特許文献４】特開２００２−２７２３１５号公報
【特許文献５】特開２００１−０１７１６０号公報
【特許文献６】特開平０９−０７０２４０号公報
【特許文献７】特開平０８−２８９７７９号公報
【特許文献８】特開平０６−１８９６５０号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２０１０／０５０１７９号パンフレット
【特許文献１０】特開２０１１−１６７５３号公報
【特許文献１１】国際公開ＷＯ２００９／１３９１５６号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日医大誌、第６６巻、第１号４５〜４８頁
【非特許文献２】Quinn, P. J. et al., Fertility and Sterility, 44, 493-498, 1985
【非特許文献３】Wright et al., J. Anim. Sci., 53, 702-729, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、受精卵の体外培養において、発生を停止させることなく、胚盤胞のステージまで正常に進行させる体外培養培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、様々な培地成分を用いて検討を重ねてきたが、実際にマウスの受精卵を５−ＡＬＡを添加した体外培養培地において体外培養したところ、受精卵の正常発生率が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の事項に特定されるものである。
（１）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有することを特徴とする受精卵の正常発生率向上剤；
【化１】
2016006260.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
（２）Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする上記（１）記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（３）さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（４）鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記（３）記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（５）受胎率を高めることができることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（６）受精卵が、体外受精又は体内受精による受精卵であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（７）さらに哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含む受精卵発生率向上用培地であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤；
（８）上記（１）〜（７）のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤に受精卵を接触させることを特徴とする受精卵の正常発生率を向上する方法；
（９）上記（１）〜（７）のいずれか記載の受精卵の正常発生率向上剤を対象雌親に投与することを特徴とする受精卵の正常発生率を向上する方法；
（１０）ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；及びｂ）鉄化合物；を含む受精卵の正常発生率を向上するためのキット；
（１１）さらに、ｃ）哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含むことを特徴とする上記（１０）記載の受精卵の正常発生率を向上するためのキット；
（１２）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、受精卵の正常発生率向上剤を調製するための使用；
（１３）式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物とを用いることを特徴とする上記（１２）記載の使用；
（１４）式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物と哺乳動物の受精卵の体外培養培地とを用いることを特徴とする上記（１３）記載の使用；
（１５）受精卵の正常発生率の向上に用いるための上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトや家畜において、人工授精による発生率や受胎率、自然妊娠における受胎率を向上させることができ、家畜繁殖における生産性や品種改良の効率を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の受精卵について、それぞれのステージにおいて正常に発生が進行した胚の数をカウントし、０時間の受精卵の数を１００％とした場合の発生率をグラフに示した図である。
【図２】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の受精卵について、それぞれのステージにおいて正常に発生が進行した胚の数をカウントし、受精卵の培養開始後２４時間後の２細胞期の卵の数を１００％とした場合の発生率をグラフに示した図である。
【図３】ＢＤＦ２系統の雌マウスとＢＤＦ１系統の雄マウスとの交配による受精卵について、０時間の受精卵の数を１００％とした場合の発生率をグラフに示した図である。
【図４】ＢＤＦ２系統の雌マウスとＢＤＦ１系統の雄マウスとの交配による受精卵について、それぞれのステージにおいて正常に発生が進行した胚の数をカウントし、受精卵の培養開始後２４時間後の２細胞期の卵の数を１００％とした場合の発生率をグラフに示した図である。
【図５】ＫＳＯＭにおける受精卵（０時間）の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（自然交配受精卵）をグラフに示した図である。
【図６】ＫＳＯＭにおける受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（自然交配受精卵）をグラフに示した図である。
【図７】ｍＷＭにおける受精卵（０時間）の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（自然交配受精卵）をグラフに示した図である。
【図８】ｍＷＭにおける受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（自然交配受精卵）をグラフに示した図である。
【図９】ＫＳＯＭでの受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率への培養温度の影響（体外受精卵）をグラフに示した図である。
【図１０】ｍＷＭでの受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率への培養温度の影響（体外受精卵）をグラフに示した図である。
【図１１】ＫＳＯＭでの３５℃培養における受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（体外受精卵）をグラフに示した図である。
【図１２】ｍＷＭでの３５．５℃培養における受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（体外受精卵）をグラフに示した図である。
【図１３】ｍＷＭでの３５℃培養における受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の発生率の経時変化（体外受精卵）をグラフに示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の受精卵の正常発生率向上剤としては、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）を含むものであれば特に制限されないが、哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含む人工授精に適した受精卵発生率向上用培地として用いることもでき、また、ＡＬＡ類に加えて鉄化合物を含有させることが好ましく、さらに、受胎率を高めることができることが好ましい。本発明における受精卵が由来する生物種としては、哺乳動物が好ましく、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を例示することができる。
【００１５】
上記ＡＬＡ類の中でも式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子の場合である５−ＡＬＡ又はその塩を好適に例示することができる。５−ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。また、５−ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、５−ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。
【００１６】
式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。
【００１７】
式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。
【００１８】
式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。
【００１９】
式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。
【００２１】
上記５−ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましく、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せなどを好適に例示することができる。
【００２２】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）の５−ＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、又は生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）としてのエステル投与することができる。例えば、５−ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【００２３】
以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、５−ＡＬＡ、及び５−ＡＬＡメチルエステル、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩であり、５−ＡＬＡ塩酸塩や５−ＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。
【００２４】
上記ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２５】
上記鉄化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、硫化グリシン鉄を挙げることができるが、中でもクエン酸第一鉄ナトリウムやクエン酸鉄ナトリウムが好ましい。
【００２６】
上記鉄化合物は、それぞれ単独でも、２種以上を混合して用いてもよい。鉄化合物の使用量（添加量・投与量）としては、ＡＬＡ類の投与量（５−ＡＬＡ換算）に対してモル比で０．０１〜１００倍であればよく、０．０５倍〜１０倍が望ましく、０．１倍〜８倍がより望ましい。
【００２７】
本発明のＡＬＡ類と鉄化合物とを併用する受精卵の正常発生率向上剤は、ＡＬＡ類と鉄化合物とを含有する組成物として、あるいは、それぞれ単独で同時又は前後して用いることもできる。それぞれ単独で使用する場合は同時に使用することが好ましいが、それぞれ単独で前後して使用する場合は、ＡＬＡ類と鉄化合物との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように使用することが好ましい。
【００２８】
本発明において受精卵とは、精子が卵子内に進入し、精子の核と卵子の核が融合する受精より形成された、体細胞分裂により成長可能な一細胞をいう。受精卵を取得する方法としては、体内受精した受精卵を体外へ採取（採卵）する方法や、体外受精によって受精卵を得る方法や、これらの方法により得られた受精卵を凍結保存後解凍して用いる方法を挙げることができる。
【００２９】
上記体内受精としては、成熟に差しかかった卵子が卵巣から放出（排卵）されて卵管に入り、成熟をすすめながら卵管を下る途中で精子と出会うことにより行われる、体内における受精を挙げることができる。体内受精された受精卵の取得方法としては、例えば、マウスの場合、受精卵を有するマウスを適当な方法で安楽死させ、卵管を常法により取り出し、卵管膨大部を注射針で切り裂き、受精卵の塊をヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を取り除くことによって受精卵を取得する方法を挙げることができる。
【００３０】
上記体外受精としては、上記受精を人為的に体外において行うことを挙げることができ、体外受精の方法としては、体外に取り出した卵子と精子とを共培養させることにより行う方法や、透明帯開口法、囲卵腔内精子注入法、卵細胞質内精子注入法（intracytoplasmic sperm injection :ＩＣＳＩ）等の顕微授精法を挙げることができ、中でも極細ピペットを用いて、顕微鏡下で精子を卵子の細胞質内へ注入するＩＣＳＩを好適に例示することができる。
【００３１】
上記体外受精において使用される卵子としては、排卵された卵子又は排卵近くまで成熟した卵胞内卵子を、体外に採取した採卵卵子や、体外に採取された未熟な卵子を常法により培養して成熟させた成熟培養卵子や、これらを冷凍保存後に解凍した卵子等を挙げることができる。卵胞内卵子を体外に採取する方法としては、卵胞に注射針を指して吸引する注射器吸引法や、卵胞を切開後に内容を掻きだす小卵胞切開法や、卵巣の表面を細切りする卵巣細切法等を挙げることができる。例えば、豚の場合、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、体内成熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌豚から採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００３２】
上記体外受精において使用される精子としては、採精、精巣内精子採取法、顕微鏡下精巣上体精子採取法、経皮的精巣上体精子採取法、精子濃縮洗浄法等により取得された精子や、該精子を前培養した精子や、これらを冷凍保存後に解凍した精子などを挙げることができる。
【００３３】
本発明において、受精卵が正常に発生する確率（正常発生率）としては、上記受精卵が、体内又は体外で体細胞分裂をすることにより、２細胞期の胚、好ましくは４細胞期の胚、より好ましくは８細胞期の胚、さらに好ましくは桑実胚、特に好ましくは胚盤胞（期の胚）へと、細胞分裂を停止することなく、また、当業者に周知の通常予定されている分割態様と異なる卵割がなされることなく、上記各ステージの胚へと順次変化していく割合を挙げることができ、また本発明において、正常発生率が向上するとは、少なくとも８細胞期以降の胚において正常発生率が向上することをいう。上記桑実胚は、細胞数が増加するが、個々の細胞が確認できる１６〜３２個程度の細胞数を有する胚をいう。上記胚盤胞は、卵割腔を形成して、外細胞層（Trophectoderm：ＴＥ）と内細胞塊（inner cell mass：ＩＣＭ）とにわかれた構造を有する胚をいい、自然妊娠の場合には子宮内膜への着床前の構造に相当する胚（体内発生胚）であって、体外受精の場合においても胚盤胞まで正常に発生した胚（体外発生胚）を移植すると受胎率が高くなるとされているが、胚移植の時期は胚盤胞に限定されるものではない。このように発生には、受精卵が体外で体細胞分裂をする体外発生（体外培養）と、受精卵が体内で体細胞分裂をする体内発生がある。したがって、受精と発生の組合せは、体内受精−体外発生、体内受精−体内発生、体外受精−体内発生、体外受精−体外発生の４通りがある。
【００３４】
本発明の受精卵の正常発生率向上剤を用いて体外発生における正常発生率を向上する方法としては、正常発生率向上剤と受精卵を接触する方法、好ましくはＡＬＡ類と鉄化合物を含む哺乳動物の受精卵の体外培養培地である受精卵発生率向上用培地中で受精卵をインキュベートする方法の他、採卵卵子の体外成熟を行うための培養培地への正常発生率向上剤を添加する方法、卵子の凍結保存剤への正常発生率向上剤を添加する方法等を挙げることができる。また、本発明の受精卵の正常発生率向上剤を用いて体内発生における正常発生率を向上する方法としては、卵子が由来するヒトや非ヒト動物の雌親に正常発生率向上剤を経口、舌下、皮下、静脈内、筋肉内、鼻、卵胞、膣投与する方法を挙げることができる。本発明の正常発生率向上剤を使用した場合には、本発明の受精卵の正常発生率向上剤を用いない場合と比較して、受精卵の正常発生率が有意に向上し、ひいては受胎率が有意に向上する。
【００３５】
本発明の受精卵の正常発生率向上剤が受精卵発生率向上用培地である場合に用いられる上記哺乳動物の受精卵の体外培養培地としては、哺乳動物の受精卵が培養できる培地であれば特に制限されないが、ＨＴＦ培地、ｍ−ＨＴＦ培地、ハム培地、ハムＦ−１０培地、ＭＥＭ培地、１９９培地、ＢＭＥ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、マッコイ−５Ａ培地、ウェイマウス培地、トロウェルＴ−８培地、ライボビッツＬ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、ウィリアムス−Ｅ培地、ケイン・アンド・フット（Kane and Foote）培地、ブリンスター（Brinster）培地、ｍ−タイロード培地、ＢＷＷ培地、ウィッテン（WK Whitten）培地、ＴＹＨ培地、ホップス・アンド・ピット（Hoppes ＆ Pitts）培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＢＯ培地、Ｔ６培地、ＧＰＭ培地、ＫＳＯＭ、ＨＥＣＭ培地、及びこれらの修正培地を例示することができ、また、ＣＡＲＤ ＭＥＤＩＵＭマウス体外受精用培地、ブタ培養胚発生用培地（ＰＺＭ−５）（機能性ペプチド研究所社製）等の市販の専用体外受精用培地を用いることもできる。具体的には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、乳酸カルシウム、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＢＳＡを含む培地を好適に挙げることができ、マウスの受精卵の回収・操作する実験でもっとも繁用される合成培地である以下の表１に示すＭ１６培地を特に好適に挙げることができる。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
本発明の受精卵の正常発生率向上剤の体外発生における使用量としては、受精卵の正常発生率向上効果が得られる限り特に制限されないが、哺乳動物の受精卵の体外培養培地に添加する場合は、５−ＡＬＡ換算で０．０５μＭ〜５μＭ、好ましくは０．０８μＭ〜２μＭ、より好ましくは０．１μＭ〜１.５μＭを挙げることができる。また、本発明の受精卵の正常発生率向上剤の体内発生における投与量としては、受精卵の正常発生率向上効果が得られる限り特に制限されないが、５−ＡＬＡ換算で０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ・日、より好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ・日である。
【００３８】
本発明の受精卵の正常発生率を向上するための体外発生又は体内発生用のキットとしては、ＡＬＡ類と鉄化合物を含むものであれば特に制限されず、さらに、１種又は２種以上の哺乳動物の受精卵の体外培養培地を含むものを用いることができる。また本発明は、体外発生又は体内発生用の受精卵の正常発生率向上剤を調製するためのＡＬＡ類、好ましくはＡＬＡ類と鉄化合物や、ＡＬＡ類と鉄化合物と体外培養培地の使用に関する。さらに本発明は、受精卵の正常発生率を向上するために用いるＡＬＡ類、好ましくはＡＬＡ類と鉄化合物や、ＡＬＡ類と鉄化合物と体外培養培地に関する。
【００３９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
［自然交配による受精卵の採取と体外培養（１）］
（マウスの交配）
受精卵を採取する雌マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雌マウス（２１週齢〜２７週齢、体重２１．０〜２４．５ｇ）を用いた。交配用の雄マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雄マウス（３２〜３８週齢、体重３０．０〜３５．５ｇ）を用いた。過排卵誘導の常法にしたがって、５Ｕ（ユニット）のウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（血清性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社製）を各雌マウスの腹腔内に投与し、４５〜４８時間後に５Ｕ（ユニット）のゴナトロピン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社製）を各雌マウスの腹腔内に投与した。ゴナトロピン投与直後の各雌マウスと、上記各雄マウスとを交配した。【００４１】
（受精卵の回収）
翌日、交配した雌マウスにおいて、乳白色で樹脂様の膣栓の有無を判定し、膣栓が有ることを確認した雌マウスから卵管を採取した。採取された卵管は１５分程度、生理食塩水（０．９％(ｗ/ｖ)ＮａＣｌ）中に静置後、卵丘細胞除去処理を行うため、約３００μｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（シグマ社製)を添加したＭ１６培地中に卵管を移した。卵管を切開して受精卵を取り出し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて、５〜１０分間静置後、卵丘細胞が分離している受精卵は回収され、ヒアルロニダーゼ未添加のＭ１６培地で洗浄して、ヒアルロニダーゼを除去した。かかる卵丘細胞除去受精卵は、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて静置された。【００４２】
（体外培養）
別途、３５ｍｍシャーレに、ミネラルオイル（シグマ社製）が重層し、かつ、最終濃度が０μＭ（コントロール）、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭのいずれかのＡＬＡ塩酸塩（ＳＢＩファーマ社製）を添加した、１００μＬのＭ１６培地のドロップを作製し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて静置した。かかるドロップに、２９個又は３０個の上記卵丘細胞除去受精卵を移し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて、体外培養を行った。【００４３】
（胚発生）
ドロップ内での体外培養開始時（０時間）から、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間経過後に、実体顕微鏡観察により、各胚の発生ステージを判定し、正常に発生が進行している胚の数・発生率の変化を算出した。具体的には、培養開始２４時間後では２細胞期の卵の数を、４８時間後では３細胞期、４細胞期及び８細胞期の卵の数を、７２時間後では桑実胚及び胚盤胞の数を、９６時間後では胚盤胞の数を、それぞれのステージにおいて正常に発生が進行した胚としてカウントした。各ステージの胚の数を表２に、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合の発生率を表３及び図１のグラフに示す。また、発生率の評価は、受精卵（０時間）の卵の数を１００％として、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後に正常に発生が進行した胚の数の割合を算出し、正常発生率とした。また、自然交配のため、回収された受精卵（０時間）の数にはある程度の未受精卵が含まれており、同一の実験で回収された受精卵（０時間）の集団であっても、各条件群間で分配された受精卵（０時間）集団において、未受精卵の含有率が偶然に変動する可能性がある。受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％として算出した発生率は、各条件群間で、偶然に変動する未受精卵の含有率の影響を排除するため算出した。すなわち、胚発生が確実に開始された卵の数を基礎として発生率を算出するため、２４時間後の２細胞期の卵の数を１００％とした場合の発生率を表４及び図２のグラフに示す。各結果の統計解析はχ（カイ）二乗検定により行い、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）を統計学的有意差があるとした。【００４４】
【表２】
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【００４５】
【表３】
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【００４６】
＜ＡＬＡ添加による発生率への影響＞
表２、表３及び図１から明らかなとおり、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合、ＡＬＡ未添加のコントロールと比較して、ＡＬＡを０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭのいずれかを添加した場合においても、発生率が上昇したことを確認した。特に、ＡＬＡを０．１μＭ添加した場合、７２時間後の発生率は４７％、９６時間後の発生率は２３％であり、ＡＬＡを０．５μＭ添加した場合、７２時間後の発生率は４８％であって、コントロールの値と比較して発生率は有意に高かった。また、ＡＬＡを０．５μＭ添加した場合、９６時間後の発生率は４５％であり、ＡＬＡを１μＭ添加した場合、７２時間後の発生率は５２％、９６時間後の発生率は４５％であって、コントロールの値と比較して発生率は顕著に高かった。【００４７】
【表４】
2016006260.tif 000007
【００４８】
表４及び図２から明らかなとおり、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合、ＡＬＡ未添加のコントロールと比較して、ＡＬＡを０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭのいずれか添加することにより、発生率が上昇したことを確認した。特に、ＡＬＡを０．１μＭ添加した場合、９６時間後の発生率は３２％であって、コントロールの値と比較して発生率は有意に高かった。ＡＬＡを０．５μＭ添加した場合は、９６時間後の発生率は５４％であって、コントロールの値と比較して発生率は顕著に高かった。また、ＡＬＡを１μＭ添加した場合、７２時間後の発生率は７９％、９６時間後の発生率は６８％であって、コントロールの値と比較して発生率は顕著に高かった。
【実施例２】
【００４９】
［自然交配による受精卵の採取と体外培養（２）］
受精卵を採取する雌マウスとして、ＢＤＦ１系統（Ｃ５７ＢＬ／６雌 × ＤＢＡ/２雄のＦ１)の雌と雄との交配で得られたＢＤＦ２系統の雌マウス（５〜２４週齢、体重１６〜２５ｇ）を用い、交配用の雄マウスとして、ＢＤＦ１系統（Ｃ５７ＢＬ／６雌 × ＤＢＡ/２雄のＦ１)系統の雄マウス（４６〜５２週齢、体重３０〜４５ｇ）を用い、１μＭのＡＬＡについて検討したこと以外は、実施例１と同様の検討を行った。結果を以下の表５〜表７、図３及び図４に示す。【００５０】
【表５】
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【００５１】
【表６】
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【００５２】
＜ＡＬＡ添加による発生率への影響＞
表５、表６及び図３から明らかなとおり、ＢＤＦ２系統の雌マウスとＢＤＦ１系統の雄マウスとの交配による受精卵（０時間）の数を１００％とした場合、ＡＬＡ未添加のコントロールと比較して、ＡＬＡを１μＭ添加することにより、発生率が上昇したことを確認した。【００５３】
【表７】
2016006260.tif 000010
【００５４】
表７及び図４から明らかなとおり、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合、ＡＬＡ未添加のコントロールと比較して、ＡＬＡを１μＭ添加することにより、発生率が上昇したことを確認した。特に、ＡＬＡを１μＭ添加した場合、７２時間後及び９６時間後の発生率は９８％であって、コントロールの値と比較して発生率は顕著に高かった。【００５５】
次に、マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊの、自然交配及び体外受精から得られる受精卵の体外（in vitro）培養系での、低温培養に対するＡＬＡの胚発生促進効果について調べた。
【実施例３】
【００５６】
［自然交配による受精卵の採取と体外培養（３）］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雌マウス（４週齢〜６週齢）に対し、過排卵誘  導の定法にしたがい、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（血清性性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社）５Ｕ（ユニット）を腹腔内に投与し、４５〜４８時間後にゴナトロピン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社）５Ｕ（ユニット）を腹腔内に投与した。ゴナトロピン投与直後の雌マウス一匹ずつをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統、雄マウス一匹ずつと交配し、翌朝、膣栓の確認できた雌マウスから卵管を生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）に回収し、ヒアルロニダーゼ（約３００μｇ／ｍｌ，Sigma)入りＫＳＯＭ又はｍＷＭ（ともにアークリソース株式会社より購入，http://www.ark-resource.co.jp/seihin/cryopreservation-liquid/)で卵管を還流し、得られた受精卵の卵丘細胞が除去されるのをまって、受精卵を回収した。ヒアルロニダーゼを除くため、受精卵をＫＳＯＭ又はｍＷＭの各培地で洗浄し、全ての雌マウスから受精卵を回収するまで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内でＫＳＯＭ中又はｍＷＭ（アークリソース株式会社）で維持した。なお、使用した２種の培地はマウス胚培養に用いられる代表的な培地であり、ＫＳＯＭは、代表的な低グルコース含有培地であるのに対し、ｍＷＭは高グルコース含有培地である。【００５７】
回収した受精卵２０〜５０個を、ＡＬＡ未添加又はＡＬＡ添加（１μＭ又は３μＭ）培地（ＫＳＯＭ又はｍＷＭ）１００μｌからなるドロップ（ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）を重層している）へ移した。これ以降は、培養条件として、３７℃、５％ＣＯ２と３５℃、５％ＣＯ２、の二つの条件下で培養を行った。受精卵採取から２４時間後に、２細胞期の卵の数を数え、９６時間後の胚盤胞の数を数えた。発生率の評価は実施例１と同様に行った。ＫＳＯＭにおける結果を表８〜表１０、図５及び図６に、ｍＷＭにおける結果を表１１〜表１３、図７及び図８にそれぞれ示す。【００５８】
【表８】
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【００５９】
【表９】
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【００６０】
【表１０】
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【００６１】
【表１１】
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【００６２】
【表１２】
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【００６３】
【表１３】
2016006260.tif 000016
【００６４】
＜低温（３５℃）培養条件下での発生率への影響＞
ＡＬＡ未添加群のコントロールにおける３７℃培養と３５℃培養の発生率を比較すると、ＫＳＯＭを用いた場合（表９・図５，表１０・図６）、培養９６時間後での胚盤胞への発生率は、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合（表９）は２３％から４％へと、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合（表１０）は５６％から６％へと、それぞれ有意に低下し、ｍＷＭを用いた場合（表１２・図７，表１３・図８）でも、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合（表１２）は３５％から２３％へと、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合（表１３）は７１％から４９％へと、それぞれ有意に低下した。これらの結果から、本実験条件でのＣ５７ＢＬ／６Ｊ受精卵の低温培養では発生の進行が障害されることが明らかとなった。【００６５】
＜低温（３５℃）培養条件下でのＡＬＡ添加の発生率への影響＞
３５℃培養条件下では、ＫＳＯＭを用いた場合、ＡＬＡ未添加群のコントロールにおける培養９６時間後での胚盤胞への発生率は、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合は４％（表９）、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合は６％（表１０）であるのに対し、１μＭ  ＡＬＡ添加群の発生率は、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合は１０％（表９）、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合は１５％（表１０）となり、それぞれ有意に上昇した。一方、ｍＷＭを用いた場合、ＡＬＡ未添加群のコントロールにおける培養９６時間後での胚盤胞への発生率は、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合は２３％（表１２）、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合は４９％（表１３）であるのに対し、３μＭ  ＡＬＡ添加群の発生率は、受精卵（０時間）の数を１００％とした場合は３２％（表１２）、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合は６５％（表１３）となり、それぞれ有意に上昇したが、ＫＳＯＭと異なり、１μＭ  ＡＬＡ添加群の発生率では、有意な上昇は認められなかった（表１２，１３）。
【実施例４】
【００６６】
［体外受精による受精卵の採取と体外培養］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雌マウス（３．９週齢〜４．０週齢）にウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（血清性性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社）５Ｕ（ユニット）を腹腔内に投与し、４５〜４８時間後にゴナトロピン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）（あすか製薬株式会社）５Ｕ（ユニット）を腹腔内に投与し過排卵誘起を行った。ゴナトロピン投与１５時間後に、開腹して卵管を回収した。ミネラルオイル中で、解剖針により卵管膨大部を切開し、卵子をｍＨＴＦ培地（アークリソース株式会社）のドロップ中へ回収した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、ｍＨＴＦ培地中で４０分から１時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行い、キャパシテーションを行った。回収した卵子の入った培地ドロップに精子を含むｍＨＴＦ培地を２μｌから４μｌ加え媒精し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。媒精後４時間から６時間後、受精卵をＫＳＯＭ（アークリソース株式会社）又はｍＷＭ（アークリソース株式会社）で洗浄し、卵丘細胞や精子を取り除いた。一旦、全ての受精卵を回収するまで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内でＫＳＯＭ又はｍＷＭで培養した。【００６７】
ＡＬＡ未添加又はＡＬＡ添加（１μＭ又は３μＭ）の培地（ＫＳＯＭ又はｍＷＭ）１００μｌからなるドロップ（ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）を重層している）へドロップあたり受精卵２５個を移した。以後、３７℃、５％ＣＯ２と３５℃、５％ＣＯ２と３５．５℃、５％ＣＯ２、の３つの条件下で培養を行った。卵子回収２４時間後に２細胞期の胚の個数を、９６時間後の胚盤胞の個数を計測した。なお、体外受精から得られた受精卵の発生はやや遅いため、卵子回収１２０時間後での胚盤胞の個数も計測した。受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合を基準に、各培養時間での胚の発生率を算出した。ＫＳＯＭにおける結果を表１４、表１５、図９及び図１１に、ｍＷＭにおける結果を表１６、表１７、図１０、図１２及び図１３にそれぞれ示す。【００６８】
【表１４】
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【００６９】
【表１５】
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【００７０】
【表１６】
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【００７１】
【表１７】
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【００７２】
＜低温（３５℃及び３５．５℃）培養条件下での発生率への影響＞
ＡＬＡ未添加群のコントロールである３７℃、３５．５℃、３５℃での培養の発生率を比較すると、ＫＳＯＭを用いた場合（表１５，図９）、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の培養１２０時間後での胚盤胞への発生率は、３７℃で７４％から、３５．５℃で４１％、３５℃で２４％へと、有意に低下した。ｍＷＭを用いた場合（表１７、図１０）も同様に、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の培養９６時間後での胚盤胞への発生率は、３７℃で８３％から、３５．５℃で５３％、３５℃で２５％へと、温度に依存して有意に低下した。これらの結果から、本実験条件でのＣ５７ＢＬ／６Ｊの体外受精卵の低温培養では、自然交配から得られた受精卵と同様に、発生の進行が抑制されることが明らかとなった。【００７３】
＜低温（３５℃及び３５．５℃）培養条件下でのＡＬＡ添加の発生率への影響＞
ＫＳＯＭを用いた場合（表１４及び表１５）、３５℃培養条件下（図１１）では、ＡＬＡ未添加群の培養１２０時間後での、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の胚盤胞への発生率は２４％であるのに対し、１μＭ  ＡＬＡ添加群で３６％、３μＭ  ＡＬＡ添加群で２７％となり、３５℃培養で１μＭ  ＡＬＡを添加した場合に、胚盤胞への発生率が有意に上昇した。【００７４】
次に、ｍＷＭを用いた場合（表１６及び表１７）、３５．５℃培養条件下（図１２）では、ＡＬＡ未添加群の培養９６時間後での、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の胚盤胞への発生率は５３％であるのに対し、１μＭ  ＡＬＡ添加群で７０％、３μＭ  ＡＬＡ添加群で７５％となり、ＡＬＡ添加により胚盤胞への発生率が有意に上昇した。また、３５℃培養条件下（図１３）でも、ＡＬＡ未添加群の培養９６時間後での、受精後２４時間後の２細胞期の胚の数を１００％とした場合の胚盤胞への発生率は２５％であるのに対し、１μＭ  ＡＬＡ添加群で５３％、３μＭ  ＡＬＡ添加群で３８％となり、３５℃培養で１μＭ  ＡＬＡを添加した場合に、胚盤胞への発生率が有意に上昇した。【００７５】
（考察）
＜ＡＬＡによる発生率への影響＞
発生が正常に進まない受精卵や胚においては、細胞内ヘム合成量の低下、すなわち、内在性の５−ＡＬＡとも供給不全によってエネルギー産生障害が惹起することで初期発生停止が引き起こされているのではないかということが考えられる。５−ＡＬＡ、さらには鉄を補充することにより、発生率や受胎率を高めることができると考えられる。【００７６】
＜低温培養の胚発生への影響＞
自然交配及び体外受精の両方から得られたＣ５７／ＢＬ６受精卵の体外（in vitro）発生系において、３７℃での正常培養と比較して、３５．５℃及び３５℃の低温培養において、胚盤胞への発生率が低下し、発生抑制が認められた。特に、体外受精卵の胚培養において、温度依存的に胚盤胞への発生抑制が観察され（図９及び図１０）、この系が低体温症による不妊モデルになりうることが示された。【００７７】
＜低温培養条件でのＡＬＡの胚発生への促進効果＞
本実験条件で、低温培養でのマウス胚発生へのＡＬＡの効果を検討したところ、自然交配から得られた受精卵及び体外受精卵のin vitro発生において、低温培養において、ＡＬＡが発生促進作用を示すことが確認された。特に、ｍＷＭを用いた場合に、強い促進作用を観察した。ｍＷＭは高グルコース培地であるのに対し、ＫＳＯＭは低グルコース培地であることから、ＡＬＡの作用がグルコース依存的である可能性が考えられる。【００７８】
＜ヒト不妊症治療薬としてのＡＬＡの可能性＞
本実験はマウス受精卵を用いたものであるが、低温での受精卵の発生は、不妊の原因の一つとされる低体温症と、類似したストレスが掛かった状態と推定され、ＡＬＡの服用が、低体温によるヒト不妊症の改善に有効である可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によると、受精卵から母体に胚移植するために適した胚を作製する効率を高めることができることから、畜産や不妊治療の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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