(57)【要約】  本発明は、アニオン性官能基を有する高分子化合物に含まれる２価金属カチオンを予め除き、当該高分子化合物の乾燥粉末を調製し、該乾燥粉末と培地とを混合する培地組成物の製造方法等を提供する。また、本発明は、アニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法であって、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、２価金属カチオンを１価金属カチオンに交換するカチオン交換体と混合し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ることを特徴とする、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物と培地を混合することを含む、培地組成物の製造方法。
【請求項２】
細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、アニオン性官能基を有する高分子化合物を２価金属カチオン除去処理に付し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ること、当該高分子化合物と培地を混合することを含む、培地組成物の製造方法。
【請求項３】
２価金属カチオン除去処理が、キレート剤又はカチオン交換体により行われる、請求項２に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項４】
２価金属カチオン除去処理が、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、カチオン交換体と混合することにより行われる、請求項２に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項５】
１０〜７０℃にて、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、カチオン交換体と混合する、請求項４に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項６】
前記２価金属カチオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも１種選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項７】
高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項８】
前記高分子化合物の水溶液と培地の水溶液を混合することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項９】
混合する前に当該各水溶液をろ過滅菌することを特徴とする請求項８に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記高分子化合物の水溶液をオートクレーブ滅菌することを特徴とする請求項８に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記高分子化合物の水溶液と培地の水溶液を攪拌しながら混合することを特徴とする請求項８に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１２】
ホモミキサーで攪拌しながら混合することを特徴とする請求項８に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１３】
キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、請求項３に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１４】
カチオン交換体がナトリウム型である、請求項３に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項１５】
細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤であって、
２価金属カチオンを実質的に含有せず、かつ滅菌された状態であるアニオン性官能基を有する高分子化合物を含有する培地添加剤。
【請求項１６】
水溶液であることを特徴とする請求項１５に記載の培地添加剤。
【請求項１７】
前記アニオン性官能基を有する高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする請求項１５に記載の培地添加剤。
【請求項１８】
細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤の製造方法であって、
アニオン性官能基を有する高分子化合物を２価金属カチオン除去処理に付し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ること、当該高分子化合物をスプレードライまたは凍結乾燥で乾燥させることを含む、培地添加剤の製造方法。
【請求項１９】
前記アニオン性官能基を有する高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする請求項１８に記載の培地添加剤の製造方法。
【請求項２０】
アニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法であって、
アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、２価金属カチオンを１価金属カチオンに交換するカチオン交換体と混合し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ることを特徴とする、方法。
【請求項２１】
前記カチオン交換体がナトリウム型である、請求項２０に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【請求項２２】
１０〜７０℃にて、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、前記カチオン交換体と混合する、請求項２０又は２１に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【請求項２３】
前記２価金属カチオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも１種選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【請求項２４】
高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【請求項２５】
水中懸濁物中のアニオン性官能基を有する高分子化合物の含有量が、０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水への溶解性を高めたアニオン性官能基を有する高分子化合物を用いて、動植物細胞及び／又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。【０００３】
動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及びスフェア培養等が知られている。【０００４】
単層培養は、ガラス或いは種々の表面処理を行った合成高分子材料から成る培養容器や、フィーダー細胞と呼ばれる補助的な細胞を足場として目的の細胞を単層状に培養する方法であり、最も一般的に普及している。例えば、ポリスチレンに対して種々の表面処理（プラズマ処理、コロナ処理等）を施したもの、コラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着因子をコーティングしたもの、或いはフィーダー細胞を予め播種したもの等、種々の形状又は性状の培養容器を用いた培養方法が開発されている。しかしながら、単層培養は、その二次元的培養環境が生体内での環境と全く異なるために細胞が生体内で有している特異的な機能を長期間維持することができない、生体内と同様な組織を再構築する事ができない、一定面積当たりの細胞数が制限されるため細胞の大量培養には向かない、等が問題となっている（特許文献１）。また、フィーダー細胞上にて目的の細胞を培養する方法は、フィーダー細胞と目的の細胞との分離が問題となる場合がある（非特許文献１）。【０００５】
分散培養は、培地中に細胞を播いた後、細胞の付着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて、その培養液を撹拌し続けることにより細胞の培養容器への接着を阻害し、浮遊状態で接着細胞を培養する方法である。しかしながら、当該方法で培養される接着細胞は足場への接着ができないため、細胞増殖のために足場への接着を必須とする細胞には応用できない。また、せん断力で常時破砕されることにより本来の細胞機能を発揮できないため、機能を有する細胞を大量に培養することができない場合がある（非特許文献２）。【０００６】
包埋培養は、寒天、メチルセルロース、コラーゲンゲル、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形或いは半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。当該方法は、細胞を生体内に近い形で三次元的に培養することを可能とし、ゲル基材そのものが細胞の増殖や分化を促進する場合もあるため単層培養や分散培養と比較して、細胞の機能を維持したまま細胞を高密度に培養することが可能である（特許文献２、３）。更に、これらのゲル基材に細胞を埋め込んだ状態で大きさ１００〜３００μｍのマイクロカプセルを作成し、当該マイクロカプセルを分散させながら水溶液培地で細胞を培養する方法も開発されている（非特許文献３）。しかしながら、これらの方法は、ゲル基材が可視光を透過しない場合は培養細胞の継時的な観察ができない、ゲル基材を含む培地やマイクロカプセルは粘度が高いため当該培地中から細胞を回収するために酵素処理（例えば、コラーゲンゲルの場合はコラゲナーゼ処理）等の煩雑かつ細胞に障害を与える操作を必要とする、長期間培養する際に必要な培地交換が困難である等の問題を有している。近年、熱やせん断力などの処理によりゲル基材から細胞回収が可能となる技術が開発されているが、熱やせん断力等は細胞機能に悪影響を与えることがある上に、当該ゲル基材の生体に対する安全性については未だ明らかにはなっていない（特許文献４、５、非特許文献４、５、６、７）。また、小さくカットした果実や野菜等の粒状食品を均一に分散、浮遊させ、その沈殿や浮上を防ぐためのゾル状食品が食品分野にて開発されているが、当該ゾル状食品は分散させた粒状食品を回収することは考慮しておらず、細胞や組織を浮遊状態で培養できるかどうかの検討もなされていない（特許文献６）。【０００７】
マイクロキャリア培養は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。通常、当該方法で用いるマイクロキャリアは、直径１００〜３００μｍ、表面積３０００〜６０００ｃｍ２／ｇ、比重１．０３〜１．０５の球状粒子であり、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸あるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基を付与することもできる。当該方法は、培養面積を極めて増大させることが可能になるため、細胞の大量培養に応用されている（特許文献７、８）。しかしながら、全てのマイクロキャリアで目的とする細胞をほぼ均一に付着させることは困難であり、また、撹拌中のせん断力により細胞がマイクロキャリアから脱離する、細胞が障害を受ける等が問題となっている（非特許文献８）。【０００８】
スフェア培養は、目的の細胞が、数十〜数百個から成る凝集塊（以下、スフェアともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置或いは振とうして培養する方法である。スフェアは、細胞密度が高く、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、単層培養、分散培養法よりも細胞機能を長期的に維持したまま培養できることが知られている（非特許文献９、１０）。しかしながら、スフェア培養は、スフェアのサイズが大きすぎる場合、スフェア内部の栄養分の供給と老廃物の排出が困難となるため、大きなスフェアを形成させることができない。また、形成したスフェアは培養容器の底面において分散状態で培養する必要があるため、一定体積あたりのスフェア数を増やすことが困難であり、大量培養には向かない。さらに、スフェアの作成方法としては、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、細胞の足場を利用した培養、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などが知られているが、これらの方法は操作が煩雑、スフェアの回収が困難、サイズの制御と大量生産が困難、細胞に対する影響が不明、特殊な専用容器や装置が必要である等が問題となっている（特許文献９）。【０００９】
一方、植物に関しても細胞、細胞壁を除去したプロトプラストあるいは植物の葉、茎、根、成長点、種子、胚、花粉などの器官、組織、カルスを無菌の状態で培養して増やすことができる。このような植物の組織や細胞の培養技術を用いて、植物の品種改良や有用物質生産も可能となっている。植物の細胞や組織を短期間で大量に増殖させるための手法として、植物細胞や組織を液体培地で懸濁培養する方法が知られている（非特許文献１１）。それらの良好な増殖を達成するためには、十分な酸素の供給と均一な混合状態の維持、さらに細胞の破損を防ぐ等が重要である。培養液への酸素の供給と細胞や組織の懸濁は、通気と機械的攪拌とを組み合わせて行なわれる場合と、通気のみにより行なわれる場合とがあるが、前者は、攪拌による細胞や組織の破損が原因で増殖不良を招く場合があり、一方、後者は細胞や組織の剪断は少ないが、高密度培養では均一な混合状態を維持することが困難となる場合があるため、細胞や組織が沈降して増殖効率が低下する等の問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１２８６６０号公報
【特許文献２】特開昭６２−１７１６８０号公報
【特許文献３】特開昭６３−２０９５８１号公報
【特許文献４】特開２００９−２９９６７号公報
【特許文献５】特開２００５−６０５７０号公報
【特許文献６】特開平８−２３８９３号公報
【特許文献７】特開２００４−２３６５５３号公報
【特許文献８】国際公開第２０１０／０５９７７５号
【特許文献９】特開２０１２−６５５５５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら，Ｌａｎｃｅｔ  ２００５，３６５：１６３６−１６４１
【非特許文献２】Ｋｉｎｇら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００７，１１：３９４−３９８．
【非特許文献３】Ｍｕｒｕａら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ２００８，１３２：７６−８３．
【非特許文献４】Ｍｅｎｄｅｓ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００８，３７：２５１２−２５２９
【非特許文献５】Ｍｏｏｎら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２０１２，４１：４８６０−４８８３
【非特許文献６】Ｐｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，３：６７１−６７５
【非特許文献７】Ｌｉｕら，Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１１，７：５４３０−５４３６
【非特許文献８】Ｌｅｕｎｇら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２０１１，１７：１６５−１７２
【非特許文献９】Ｓｔａｈｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．  ２００４，３２２：６８４−６９２
【非特許文献１０】Ｌｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２００８，３：１１７２−１１８４
【非特許文献１１】Ｗｅａｔｈｅｒｓら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０，８５：１３３９−１３５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記問題を解決するために、本発明者らは鋭意検討の結果、脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物を含む構造体を液体培地中に混合することにより、該液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養し得ること、この培地組成物を用いて培養することにより細胞の増殖活性が亢進することを見出した。【００１３】
この培地組成物を開発する過程で、脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物の水への溶解性が低く、所望の培地組成物を得るためには、高温条件等でアニオン性官能基を有する高分子化合物を水性溶媒へ溶解しなければならないという、新たな問題点を見出した。【００１４】
そこで、本発明は、上記のアニオン性官能基を有する高分子化合物の水への溶解性を高め、前記化合物の培地との混合及び溶解をより簡便にした培地組成物の製造方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、アニオン性官能基を有する高分子化合物中に微量に混入する２価金属カチオンが、水への溶解性を低下させる原因であることを見出した。そして、キレート剤やイオン交換樹脂で処理して混入した２価金属カチオンを予め除くことで、当該高分子化合物を乾燥させた粉末が、室温の水や冷水にも溶解すること、このようにして得た水溶液を液体培地と混合することにより、当該液体培地の粘度を実質的に高めることなく細胞及び／又は組織を浮遊状態で均一に分散させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
すなわち、本発明は下記のとおりである：【００１７】
（１）細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物と培地を混合することを含む、培地組成物の製造方法。
（２）細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、アニオン性官能基を有する高分子化合物を２価金属カチオン除去処理に付し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ること、当該高分子化合物と培地を混合することを含む、培地組成物の製造方法。
（３）２価金属カチオン除去処理が、キレート剤又はカチオン交換体により行われる、（２）に記載の培地組成物の製造方法。
（４）２価金属カチオン除去処理が、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、カチオン交換体と混合することにより行われる、（２）に記載の培地組成物の製造方法。
（５）１０〜７０℃にて、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、カチオン交換体と混合する、（４）に記載の培地組成物の製造方法。
（６）前記２価金属カチオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも１種選択される、（１）〜（５）のいずれかに記載の培地組成物の製造方法。
（７）高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、（１）〜（６）のいずれかに記載の培地組成物の製造方法。
（８）前記高分子化合物の水溶液と培地の水溶液を混合することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の培地組成物の製造方法。
（９）混合する前に当該各水溶液をろ過滅菌することを特徴とする（８）に記載の培地組成物の製造方法。
（１０）前記高分子化合物の水溶液をオートクレーブ滅菌することを特徴とする（８）に記載の培地組成物の製造方法。
（１１）前記高分子化合物の水溶液と培地の水溶液を攪拌しながら混合することを特徴とする（８）記載の培地組成物の製造方法。
（１２）ホモミキサーで撹拌しながら混合することを特徴とする、（８）に記載の培地組成物の製造方法。
（１３）キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、（３）記載の培地組成物の製造方法。
（１４）カチオン交換体がナトリウム型である、（３）に記載の培地組成物の製造方法。
（１５）細胞または組織を浮遊させて培養することができる培養組成物を調製するための培地添加剤であって、
２価金属カチオンを実質的に含有せず、かつ滅菌された状態であるアニオン性官能基を有する高分子化合物を含有する培地添加剤。
（１６）水溶液であることを特徴とする（１５）に記載の培地添加剤。
（１７）前記アニオン性官能基を有する高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする（１５）に記載の培地添加剤。
（１８）細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤の製造方法であって、
アニオン性官能基を有する高分子化合物を２価金属カチオン除去処理に付し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ること、当該高分子化合物をスプレードライまたは凍結乾燥で乾燥させることを含む、培地添加剤の製造方法。
（１９）前記アニオン性官能基を有する高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする（１８）に記載の培地添加剤の製造方法。
（２０）アニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法であって、
アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、２価金属カチオンを１価金属カチオンに交換するカチオン交換体と混合し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得ることを特徴とする、方法。
（２１）前記カチオン交換体がナトリウム型である、（２０）に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
（２２）１０〜７０℃にて、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、前記カチオン交換体と混合する、（２０）又は（２１）に記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
（２３）前記２価金属カチオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも１種選択される、（２０）〜（２２）のいずれかに記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
（２４）高分子化合物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、（２０）〜（２３）のいずれかに記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
（２５）水中懸濁物中のアニオン性官能基を有する高分子化合物の含有量が、０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）である、（２０）〜（２４）のいずれかに記載のアニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、２価金属カチオンを除くことで水への溶解性が向上したアニオン性官能基を有する高分子化合物を乾燥させて得られる粉末と培地とを混合する培地組成物の製造方法等を提供する。本発明の製造方法を用いることにより、オートクレーブ処理等の加熱処理を要することなく、簡便に、液体培地の粘度を実質的に高めることなく細胞及び／又は組織を浮遊状態で均一に分散させることができる、培地組成物を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】培地組成物でＨｅｐＧ２細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。
【図２】培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。
【図３】培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養し、本スフェアを顕微鏡観察したところ、既存の培地に比べてスフェア同士の会合が抑えられることを示す図である。
【図４】培地組成物でＨｅｐＧ２細胞を付着させたマイクロキャリアを培養したところ、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリア上で増殖できることを示す図である。
【図５】培地組成物にＨｅＬａ細胞のスフェアを添加した際に、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にあることを示す図である。
【図６】培地組成物によりＨｅＬａ細胞のスフェアが形成されることを示す図である。
【図７】構造体の一態様であるフィルムを示す図である。培地組成物に対する脱アシル化ジェランガムの濃度は、０．０２％（重量／容量）。
【図８】培地組成物によりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが形成されることを示す図である。
【図９】ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。
【図１０】ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。
【図１１】ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。
【図１２】培地組成物でイネ由来カルスを培養した際の浮遊状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
【００２１】
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
【００２２】
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
【００２３】
本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。
【００２４】
細胞及び／又は組織を培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、または形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
【００２５】
本発明における細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも５〜６０分、１時間〜２４時間、１日〜２１日、が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【００２６】
本発明の製造方法により製造される培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）構造体と培地を含有する組成物である。
当該培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開２００４−１２９５９６号公報）、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
【００２７】
また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。
当該構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が０．２μｍ乃至２００μｍのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、１μｍを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは５μｍを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、１００μｍ以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは７０μｍ以下のものである。
「特定化合物」とは、液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の製造方法により製造される培地組成物の粘度）は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ−２２型粘度計、機種：ＴＶＥ−２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ  １°３４’×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。
【００２８】
「特定化合物」の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
アニオン性の官能基としては、カルボン酸、スルホン酸、リン酸及びそれらの塩が挙げられ、カルボン酸またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より１種又は２種以上から構成されるものを使用できる。
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸又はリン酸を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。
ここでいう塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩；等が挙げられる。
これらの高分子化合物または多糖類の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
【００２９】
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ−カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「特定化合物」の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。
本発明における脱アシル化ジェランガムとは、１−３結合したグルコース、１−４結合したグルクロン酸、１−４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
前記構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属カチオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属カチオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明の培地組成物の粘度は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。
【００３１】
【化１】
2015111685.tif 000002
【００３２】
「特定化合物」は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１−３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液−液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ−ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。
【００３３】
培地中での特定化合物の濃度は、０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは  ０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。
【００３４】
上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５〜０．０２％（重量／容量）、好ましくは０．０１〜０．０２％（重量／容量）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．００５〜０．４％（重量／容量）、好ましくは０．１〜０．４％（重量／容量）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５〜０．０２％（好ましくは０．０１〜０．０２％）（重量／容量）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１〜０．４％（重量／容量）
アルギン酸ナトリウム：０．１〜０．４％（重量／容量）（好ましくは０．０００１〜０．４％（重量／容量））
ネイティブジェランガム：０．０００１〜０．４％（重量／容量）
ローカストビーンガム：０．１〜０．４％（重量／容量）
メチルセルロース：０．１〜０．４％（重量／容量）（好ましくは０．２〜０．４％（重量／容量））
カラギーナン：０．０５〜０．１％（重量／容量）
ダイユータンガム：０．０５〜０．１％（重量／容量）
【００３５】
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
【００３６】
前記化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１及び／又はＲ２に当たる水酸基を、Ｃ１−３アルコキシ基、Ｃ１−３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、１−ｅｔｈｙｌ−３−(３−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ)ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
【００３７】
本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３８】
本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在しもよい。本発明の化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
【００３９】
本発明の培地組成物には、金属カチオン、例えば２価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオンを含有する。一態様において、金属カチオンが含まれることにより、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介して集合し；アニオン性官能基を有する高分子化合物が三次元ネットワークを形成し；或いは、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することにより、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体が形成されるからである。
【００４０】
本発明の製造方法により製造される培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
【００４１】
本発明は、当該培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法、得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法、当該培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法も含まれる。
【００４２】
本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び／又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び／又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び／又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。
【００４３】
本発明の方法により培養されたヒト由来の細胞及び／又は組織は、疾患や障害を有する患者に対し治療目的にて移植することができる。この際、治療の対象とする疾患や障害の種類、前処置方法並びに細胞移植方法は、当事者により適宜選択される。移植された細胞のレシピエントへの生着と疾患や障害からの回復や、移植に伴う副作用の有無、治療の効果は、移植治療における一般的な方法により適宜検査され、判断することができる。
【００４４】
さらに、細胞及び／又は組織が効率よく増殖されるため、本発明の製造方法により製造される培地組成物は細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞や組織の分化や増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅できるだけでなく、効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、本発明化合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
【００４５】
本発明の培養方法を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理等）を施してもよい。更に、これらの培養器材に対しては、予め細胞外マトリックスや細胞接着分子などをコーティングしてもよい。このようなコーティング材料としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリン、ヒアルロン酸、スーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。これらのコーティング材料は、遺伝子組換え技術によりアミノ酸配列を人為的に改変させたものも使用することできる。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、シリコン、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００４６】
細胞及び／又は組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の培養方法に用いることができる。
【００４７】
本発明における特定化合物を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と、上述の２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物とを混合して培地組成物を調製することができる。本発明は当該培地組成物の製造方法を提供する。
【００４８】
培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
【００４９】
細胞及び／又は組織が植物由来である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。
【００５０】
上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００５１】
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００５２】
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
【００５３】
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
【００５４】
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
【００５５】
好ましい態様において培地は、金属カチオン（例えば２価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオン）を含有する。カルシウムイオンは０．１〜１０ｍＭ好ましくは０．５〜３．０ｍＭ含有される。金属カチオンが含まれることにより、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介して集合し；アニオン性官能基を有する高分子化合物が三次元ネットワークを形成し；或いは、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することにより、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体が形成されるからである。
【００５６】
本発明の製造方法は、アニオン性官能基を有する高分子化合物として、２価金属カチオン混入量を低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）を用いることを特徴とする。市販されているアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）は、一般に、水に難溶解性であるため、これを水に溶解するために、オートクレーブ等の加熱処理を要する場合がある。本発明者らは、この難水溶性の原因を追究し、当該高分子化合物に混入する２価金属カチオンがこの原因であり、２価金属カチオン混入物を除去することにより、アニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）の水溶性を向上させ、液体培地中に添加した際に、容易に細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成させることに成功した。
【００５７】
２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等を挙げることができる。中でも、カルシウムイオンの混入量が低減されている。
【００５８】
一態様において、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）が用いられる。「２価金属カチオンを実質的に含有しない」とは、処理後の該高分子化合物中の全体の２価金属カチオンが９００ｐｐｍ以下、好ましくは６００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下、最も好ましくは、２価金属カチオンを含有しないことをいう。特に、Ｃａが、通常５００ｐｐｍ以下、好ましくは３００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下であり、且つＭｇが、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下である。更なる局面において、カルシウムイオン混入量は、例えば７５０ｐｐｍ以下、好ましくは５００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、最も好ましくは５０ｐｐｍ以下であり、マグネシウムイオン混入量は、例えば３００ｐｐｍ以下、好ましくはＭｇが２００ｐｐｍ以下、より好ましくはＭｇが１００ｐｐｍ以下、更に好ましくは５０ｐｐｍ以下、最も好ましくは２５ｐｐｍ以下である。
２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物中の２価金属カチオン混入量は、ＤＡＧを用いる場合、処理ＤＡＧ中のＣａが、通常５００ｐｐｍ以下、好ましくは３００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下であり、且つＭｇが、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、さらに好ましくはＭｇが１００ｐｐｍ以下である。更なる局面において、処理ＤＡＧ中のカルシウムイオン混入量は、例えば７５０ｐｐｍ以下、好ましくは５００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、最も好ましくは５０ｐｐｍ以下であり、マグネシウムイオン混入量は、例えば３００ｐｐｍ以下、好ましくはＭｇが２００ｐｐｍ以下、より好ましくはＭｇが１００ｐｐｍ以下、更に好ましくは５０ｐｐｍ以下、最も好ましくは２５ｐｐｍ以下である。処理ＤＡＧは、最も好ましくは、２価金属カチオンを含有しない。
【００５９】
このように、２価金属カチオンの混入量を低減することにより、例えば、脱アシル化ジェランガムであれば、１００ｍｌの純水中に、２５℃にて、１５００ｍｇ以上の脱アシル化ジェランガム粉末が完全に溶解可能となる。
【００６０】
一般に、市販されているアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）には、少なからず２価金属カチオンが混入しているため、ここから、２価金属カチオンを除去する必要がある。従って、一態様において、本発明の製造方法は、アニオン性官能基を有する高分子化合物を２価金属カチオン除去処理に付す工程を含む。この２価金属カチオン除去処理により、２価金属カチオン混入量を低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）を得ることができる。
【００６１】
２価金属カチオンを除去する方法としては、カチオン交換体処理、キレート剤処理、沈殿法、溶媒抽出法、イオン交換膜法などが挙げられるが、これらに限定されない。
培地組成物への混入を考慮すると、カチオン交換体処理することが好ましい。
カチオン交換体は、２価金属カチオンを１価金属カチオンに交換するカチオン交換体であり得る。
カチオン交換体としては、弱酸性カチオン交換樹脂、強酸性カチオン交換樹脂、キレート樹脂等が挙げられる。
これらカチオン交換樹脂は、特に限定されるものではないが、水素型、ナトリウム型、が使用でき、操作性を考慮すると、ナトリウム型が好ましい。また、水素型のカチオン交換樹脂を用いると、処理後の高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）中のアニオン性官能基が塩ではなく、酸の構造を呈することとなるため、この処理後の高分子化合物の水溶液が酸性となり、当該高分子化合物の酸による加水分解を生じるリスクがある。そのため、水素型のカチオン交換樹脂による処理後には、通常、アルカリによる中和処理を要する。これに対して、ナトリウム型のカチオン交換樹脂を用いると、処理後の高分子化合物中のアニオン性官能基がナトリウム塩の構造を呈するので、中和処理なしでも処理後の高分子化合物の水溶液が強い酸性とはならず、当該高分子化合物の酸による加水分解のリスクを低減することが可能である。
また、水素型、ナトリウム型カチオン交換樹脂をカリウム型やアンモニウム型に変換して使用することもできる。
高分子化合物とイオン交換樹脂とを接触させる手法は、特に限定されるものではないが、カラム式とバッチ式の手法がある。
カラム式は、カチオン交換樹脂をカラムに充填し、高分子化合物の溶液を流し、溶出した液を採取する。バッチ式は、カチオン交換樹脂と高分子化合物の溶液を、樹脂が浮遊する程度の強さで攪拌又は振盪し、所定の時間反応させた後、上澄み液又は樹脂を除いたろ液を採取する。
【００６２】
カチオン交換体処理は、アニオン性官能基を有する高分子化合物をカチオン交換体と混合し、該高分子化合物中に混入する２価金属カチオンをカチオン交換体に吸着させ、混合物から２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物を単離することにより行うことができる。カチオン交換体は、当業者に周知であり、常用のものを使用することができる。
例えば、ナトリウム型カチオン交換樹脂（バッチ式）の場合、該カチオン交換樹脂と高分子化合物とを混合して加温し、室温で放冷した後、上澄み液又は樹脂を除いたろ液を採取し、低級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）に加えて生じる浮遊性の固形分を絞って水分を除去し、乾燥させることで（例えば、真空オーブン中）２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の乾燥粉末を得ることができる。
また、ナトリウム型カチオン交換樹脂（カラム式）の場合、カチオン交換樹脂をカラムに充填し、該分子化合物の溶液を流し、溶出した液を採取し、低級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）に加えて生じる浮遊性の固形分を絞って水分を除去し、乾燥させることで（例えば、真空オーブン中）２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の乾燥粉末を得ることができる。
また、水素型カチオン交換樹脂（バッチ式）の場合、該カチオン交換樹脂と高分子化合物とを混合して加温し、室温で放冷した後アルカリで中和し（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムの１価の水酸化物塩の水溶液等）、低級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）に加えて生じる浮遊性の固形分を絞って水分を除去し、乾燥させることで（例えば、真空オーブン中）２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の乾燥粉末を得ることができる。
【００６３】
弱酸性カチオン交換樹脂としては、Amberlite（登録商標）（CG-50 TypeI、IRC50、IRC76、IRC86、IRP64）、Diaion TM（CWK30/S、WK10、WK20、WK40、WK100、WT01S）、DOWEX（登録商標）（MAC-3）などが挙げられるが、これらに限定されない。
強酸性カチオン交換樹脂としては、Amberlite（登録商標）（200、200C、IR120H、IR122Na、15、1200H、IRN77、CG-120、IRP69）、Amberjet（登録商標）(1200)、Amberlyst（登録商標）(15(Dry)、16、36)、Diaion（登録商標）（EXC04、HPK25、PK208、PK212、PK216、PK220、PK228L、RCP160M、SK1B、SK1BS、SK104、SK110、SK112、SK116、UBK510L、UBK555）、DOWEX（登録商標）（50Wx2、50Wx4、50Wx8、DR-2030、DR-G8、HCR-W2、MSC、650C、650C UPW、G-26、88、88、M-31、99K/320、99K/350、Marathon C、N-406）、Lewatit（登録商標）(MonoPlusS100、MonoPlusSP112)などが挙げられるが、これらに限定されない。
キレート樹脂としては、Amberlite（登録商標）（IRC-748）、Ambersep（登録商標）(GT74) Sumichelate（登録商標）(MC700、MC760、MC850、MC900、MC960、CR2)、Diaion TM（CR11）、DOWEX（登録商標）（M4195）、Duolite（登録商標）(C467、GT73、C548、C747)、Lewatit（登録商標）(TP207、TO208、TP260)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
バッチ式処理では、例えば高分子化合物としてＤＡＧを用いた場合、樹脂量は、ＤＡＧ  １ｇに対して、通常０．５〜１０ｍｌであり、好ましくは１〜１０ｍｌであり、より好ましくは１〜５ｍｌであり、更に好ましくは２〜４ｍＬであり、ＤＡＧ処理濃度は、０．００１％〜５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜２．０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、更に好ましくは０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）であり、処理温度は、通常１０〜１２０℃、好ましくは２５〜１２０℃、より好ましくは４０〜７０℃であり、処理時間は、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜２時間、より好ましくは０．５時間〜１時間である。
カラム式処理では、高分子としてＤＡＧを用いた場合、樹脂量は、ＤＡＧ  １ｇに対して、１〜１０ｍｌであり、好ましくは１〜５ｍｌであり、より好ましくは２〜４ｍＬであり、ＤＡＧ処理濃度は、０．００１％〜５．０％、好ましくは０．１〜１．０％であり、処理温度は、５〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃であり、処理時間は、０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜１時間である。
【００６５】
一態様において、アニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）の水中懸濁物を、カチオン交換体（例、カチオン交換樹脂）と混合し、樹脂が浮遊する程度の強さで攪拌又は振盪する（バッチ法）。前記懸濁物は、アニオン性官能基を有する高分子化合物の不溶物を含む。本態様は、アニオン性官能基を有する高分子化合物が水に完全に溶けきらず、懸濁状態のまま、当該懸濁物とカチオン交換体とを混合する点に特徴を有する。該懸濁物中のアニオン性官能基を有する高分子化合物は、２価金属カチオン混入物を含むことにより水に難溶解性であり得る。水に難溶解性なアニオン性官能基を有する高分子化合物には、例えば、２０００ｐｐｍ（例、２７００ｐｐｍ）を超える２価金属カチオン（例、カルシウムイオン）が含まれ得る。カチオン交換体としては、上述のものを用いることができるが、好適にはナトリウム型のカチオン交換体（例、カチオン交換樹脂）が用いられる。上述の通り、中和処理なしでも処理後の高分子化合物の水溶液が強い酸性とはならず、当該高分子化合物の酸による加水分解のリスクを低減することが可能だからである。また、プロトン型のカチオン交換体で処理をすると、特に低温（３０℃以下）では、高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）がゲル化し易く、交換体を除去する際のろ紙が目詰まりする等、操作性の低下をきたす場合があるが、ナトリウム型のカチオン交換体を用いることによりそのようなリスクを回避することが可能である。アニオン性官能基を有する高分子化合物とカチオン交換樹脂との混合は、２価金属カチオンの除去が効率的に進むように、加熱条件下で行ってもよいが、必須ではない。該温度は、通常１０〜９０℃、好ましくは、１０〜７０℃、２０〜７０℃、３０〜７０℃、３０〜６０℃、３０〜５０℃、又は３０〜４０℃である。特に、３０〜７０℃の温度においては、２価金属カチオンの除去効率が優れている。アニオン性官能基を有する高分子化合物の不溶物を含まない、該高分子化合物の水溶液をカチオン交換樹脂で処理する場合には、アニオン性官能基を有する高分子化合物を水へ溶解する際と、カチオン交換樹脂で処理する際の計２回、加熱処理を要する。これに対して、本態様においては、アニオン性官能基を有する高分子化合物の懸濁液をカチオン交換樹脂で直接処理するので、懸濁液中の２価金属カチオンがカチオン交換樹脂により除去される反応と、２価金属カチオンの除去により水溶性を増したアニオン性官能基を有する高分子化合物の水への溶解が同時に進行するので、加熱処理を行うとしても１回で済み、処理時間の短縮及び処理作業の簡素化が達成される。更に、アニオン性官能基を有する高分子化合物の不溶物を含まない、該高分子化合物の水溶液をカチオン交換樹脂で処理する場合には、水に難溶解性なアニオン性官能基を有する高分子化合物をまず水に溶解する際に、高温（例、９０℃以上）での加熱を要する場合があるが、本態様においては、そこまでの加熱を要さず、より穏和な条件（例えば、１０〜７０℃）で、２価金属カチオンのカチオン交換樹脂による除去と、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水への溶解が同時に進行する。そのため、加熱によるアニオン性官能基を有する高分子化合物の分解を回避することができる。また、アニオン性官能基を有する高分子化合物の不溶物を含まない、該高分子化合物の水溶液をカチオン交換樹脂で処理する場合、例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、処理対象の水溶液中の脱アシル化ジェランガム濃度を０．５％（ｗ／ｖ）程度にまでしか上昇させることが困難であったところ、本態様においては、処理対象の懸濁液中の脱アシル化ジェランガム含有量を、０．５％（ｗ／ｖ）超、例えば、０．６％（ｗ／ｖ）以上、０．７％（ｗ／ｖ）以上、０．８％（ｗ／ｖ）以上にまで上げることができる。上限値は、カチオン交換樹脂処理後に、アニオン性官能基を有する高分子化合物の全部が水に溶解し得る限り、特に限定されないが、例えば２．５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは２．０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以下である。本態様の方法を用いることで、２価金属カチオン除去工程の容積効率を改善することができる。本態様における、カチオン交換樹脂による処理時間は、特に限定されないが、通常0.5時間〜24時間、好ましくは0.5時間〜2時間、より好ましくは0.5時間〜1時間である。本態様の方法による処理により、２価金属カチオンが除去されたアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）の水溶液を得ることができる。本発明は、このような、アニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）からの２価金属カチオン（例、カルシウムイオン）の除去方法をも提供する。該方法は、アニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）の精製方法、或いは２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、脱アシル化ジェランガム）の製造方法であり得る。
【００６６】
２価金属カチオンが除去された高分子化合物の上記取り出し方法としては、カチオン交換体処理後の溶液を乾燥させて２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の粉末を得ることができる。また該溶液を低級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）に加えて生じる浮遊性の固形分を絞って水分を除去し、乾燥させることで（例えば、真空オーブン中）２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の粉末を得ることができる。例えば、高分子化合物としてDAGを用いた場合、該イソプロピルアルコール量は、DAG溶液に対して2〜10倍、好ましくは3〜5倍であり、DAGの処理濃度は、0.001%〜5.0%、好ましくは0.1〜1.0%であり、処理温度は、０〜４０℃、好ましくは１０〜２５℃であり、処理時間は、0.5時間〜12時間、好ましくは0.5時間〜１時間である。
得られた固形分の乾燥方法としては、スプレードライ、凍結乾燥、薄膜遠心蒸発器による乾燥、攪拌乾燥、静置乾燥等が挙げられる。乾燥後の粉体は、粉砕して使用してもよい。
乾燥後の水への溶解性を考慮すると、スプレードライ、凍結乾燥が好ましい。また、乾燥後の粉砕が必要ない点を考慮するとスプレードライが好ましい。
【００６７】
キレート剤処理は、アニオン性官能基を有する高分子化合物をキレート剤と混合し、該高分子化合物中に混入する２価金属カチオンをキレート剤に吸着して錯体を形成させ、混合物から２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物を単離することにより行うことができる。キレート剤としては、２価金属カチオンと錯体を形成し、これをアニオン性官能基を有する高分子化合物からを除くことができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、有機系のアミノカルボン酸塩等が挙げられる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）などが挙げられるが、好ましくはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）である。
【００６８】
例えば、上記高分子化合物をキレート剤と水中で反応させる。当該混合液を室温で放冷した後アルカリで中和し（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムの１価の水酸化物塩の水溶液等）、低級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）に加えて生じる浮遊性の固形分を絞って水分を除去し、乾燥させる（例えば、真空オーブン中）。２価金属カチオンとキレート剤との錯体及び過剰なキレート剤は、水中に溶解したままなので、この一連の操作により、２価金属カチオンが除去された上記高分子化合物の乾燥粉末を得ることができる。
【００６９】
任意の形状の２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）を、培地と混合することにより、細胞又は組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物が製造される。当該高分子化合物の形状は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
また、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ乃至１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ乃至１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ乃至０．５μｍである。これらの滅菌処理は、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
【００７０】
一態様において、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）の水溶液（これを、培地添加剤とする。）が、本発明の製造方法に用いられる。当該水溶液は、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物の固体（例、粉末）を、生理的な水性溶媒に溶解することにより、得ることができる。上述の通り、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物は、水への溶解性が高いので、加熱処理を要することなく、水性溶媒に溶解することができる。特にＤＡＧの場合、水溶液中のＤＡＧの濃度が１．０〜１．５％（重量／容量）という高濃度溶液を作製することができる（市販のDAGは溶解に加熱処理を必須とするだけでなく、１％以上の高濃度では加熱処理により溶解させ室温まで放冷するとゲル化してしまうことから、操作性が悪いという難点がある。）。
溶解時の温度は、例えば、水に対して、５〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは１０〜３０℃である。
水性溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。水性溶媒としては、水が好ましい。
水性溶媒中には、適切な緩衝剤や塩が含まれていてもよい。該水性溶媒には、２価金属カチオンが含まれていてもいなくてもよいが、好ましい態様において、２価金属カチオンが含まれない。水性溶媒中に２価金属カチオンを含まない場合、該水溶液中でアニオン性官能基を有する高分子化合物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成し難く、水に溶解した状態で安定して保存することが可能だからである。
水溶液中のアニオン性官能基を有する高分子化合物の濃度は、当該高分子化合物が安定に溶解可能であれば特に限定されないが、例えば、０．０００１％乃至１．５％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．３％（重量／容量）である。
【００７１】
上記培地添加剤には、アニオン性官能基を有する高分子化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の多糖類を１種以上混合することができる。
【００７２】
アニオン性官能基を有する高分子化合物の水溶液を滅菌（ろ過、オートクレーブ滅菌等）してもよい。滅菌した前記水溶液を、液体培地（培地の水溶液）と混合して使用してよい。あるいは、前記高分子化合物の水溶液と、粉末培地を水に溶かして調製した液体培地（培地の水溶液）とを混合した後に、滅菌して使用してもよい。前記水溶液と液体培地の滅菌は、混合する前に、別々に行ってもよい。
滅菌方法は、上述の方法が挙げられるが、ろ過滅菌が好ましい。ろ過滅菌の細孔の大きさは上述の通りであるが、通常はろ過滅菌工程には孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターが用いられる。好ましくは、孔径０．１μｍである。
例えば、高分子化合物としてDAGを用いた場合、DAG水溶液のろ過滅菌できる濃度範囲は、０．０００１〜２%、現実的には０．０００１〜１％が好ましい。
【００７３】
一態様において、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、ＤＡＧ）（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）の水溶液をオートクレーブ滅菌し、これを無菌の液体培地と混合する。２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（例、ＤＡＧ）の水溶液を用いることにより、低濃度（例、０．０３％（重量／容量）以下、好ましくは、０．００１％〜０．０３％（重量／容量）、より好ましくは０．００５〜０．０３％（重量／容量））にてオートクレーブ滅菌した時に、液体培地と混合した際に細胞及び／又は組織を浮遊状態で維持する機能の低下を生じるリスクを回避することができる。
【００７４】
そして、培地組成物中のアニオン性官能基を有する高分子化合物の濃度が、液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度となるように、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）を、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と、混合する。好ましくは、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水溶液を滅菌し、液体培地（培地の水溶液）と混合する。
混合比率は、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水溶液：液体培地（培地の水溶液）が、１：９９〜９９：１、好ましくは１０：９０〜９０：１０、より好ましくは、２０：８０〜８０：２０である。
混合順序は、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水溶液を液体培地（培地の水溶液）に添加してもよいし、液体培地（培地の水溶液）をアニオン性官能基を有する高分子化合物の水溶液に添加してもよい。
このようなアニオン性官能基を有する高分子化合物の濃度は、上述の通りである。例えば、培地組成物中でのアニオン性官能基を有する高分子化合物濃度として０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）を、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と、混合する。
例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
【００７５】
２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）と、培地との混合により、培地中に細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体が形成され、本発明の培地組成物を得ることができる。培地には通常、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介して集合し；アニオン性官能基を有する高分子化合物が三次元ネットワークを形成し；或いは、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成するのに十分な濃度の金属カチオンが含まれるので、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を培地に添加するのみで、本発明の培地組成物を得ることができる。
【００７６】
本発明の培地組成物の製造方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しないアニオン性官能基を有する高分子化合物）をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度（例えば、５〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは１０〜３０℃）で撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。
溶解後、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌、フィルター濾過）を行う。静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
【００７７】
例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．０００１％乃至１．５％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．３％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に２価金属カチオン混入量が低減した脱アシル化ジェランガム（好ましくは、２価金属カチオンを実質的に含有しない脱アシル化ジェランガム）を添加する。そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、５〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは１０〜３０℃にて撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、例えば１２１℃にて２０分間オートクレーブ、又はフィルター濾過により、滅菌を行う。例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等の液体培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が０．０１５％の場合は０．３％水溶液：培地の比率は１：２０）、均一に混合させる。または、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等の液体培地を本水溶液に所望の最終濃度となるようにピペットで添加し（例えば終濃度が０．０１５％の場合は０．３％水溶液：培地の比率は１：２０）、ピペッティングで均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
【００７８】
本発明の方法で培養する細胞及び／又は組織の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、細胞及び／又は組織が単独で培地組成物中に分散した状態、細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態等が、より好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が、さらに好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が挙げられる。これらの状態の内、細胞塊（スフェア）を形成した状態は、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、本発明の方法で培養する最も好ましい状態として挙げることができる。
【００７９】
細胞及び／又は組織を表面上に担持させる担体としては、種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ、セラミックスビーズ等が挙げられる。当該高分子の例としては、ビニル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、アニリン樹脂、アイオノマー樹脂、ポリカーボネート、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、セルロース、アルギン酸塩及びこれらの混合物等が使用できる。当該担体は、細胞の接着を高める、或いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、２種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び／又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数１０μｍから数１００μｍ、より好ましくは１００μｍから２００μｍであり、その比重は、１に近いことが好ましく、より好ましくは０．９〜１．２、特に好ましくは約１．０である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ２（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２（登録商標）、（以上、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（登録商標）（ＮＵＮＣ）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｇ（登録商標）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓ（登録商標）（以上、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＨＩＬＬＥＸＣＴ（登録商標）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ−ＣＯＡＴＥＤ（登録商標）、及びＨＩＬＬＥＸＩＩ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）等が挙げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び／又は組織を表面上に担持させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。
【００８０】
細胞及び／又は組織を担体内部に包埋する際、種々の高分子から構成された材料を当該担体として選択することができる。この様な高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、ポリウレタンフォーム等のスポンジ、ＤｓｅＡ―３Ｄ（登録商標）、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させることも可能である。また更に、細胞及び／又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を１種以上混合することができる。
【００８１】
これらの担体に細胞及び／又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、２５Ｇ〜１９Ｇ程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数１０μｍから数１０００μｍ、より好ましくは１００μｍから２０００μｍである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約２０００μｍのビーズ状担体の場合、５００万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び／又は組織を包埋させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。
【００８２】
細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ−（２−ハイドロキシ−エチルメタクリレート）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
【００８３】
また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ  ２０１０，３６１−３６６、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９−７００、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２−５７９、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７−１１１、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８−２５９等に記載された方法を用いることもできる。
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ジブチルリルｃＡＭＰなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ― メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン−５’−ホスホセレン酸、Ｓｅ―アデノシルセレノメチオニン、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６等のＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
【００８４】
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
さらに、本発明の特定化合物の構造体を含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該特定化合物の濃度は、０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．３％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。スフェアは、当該特定化合物の構造体を含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、３日間乃至１０日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。
【００８５】
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍの直径を有する。
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。
スフェアの静置培養に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養されたスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。
【００８６】
植物由来の細胞及び／又は組織を静置培養する際の方法として、分化していない植物細胞塊であるカルスを培養することができる。カルスの誘導は、使用する植物種についてそれぞれ公知の方法により行うことができる。例えば、分化した植物体の一部の組織（例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等）表面を、必要に応じて７０％アルコールや１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、メス等を用いて適当な大きさの組織片（例えば、約１〜約５ｍｍ角の根切片）を切り出し、クリーンベンチ等を用いた無菌操作により、当該組織片を予め滅菌したカルス誘導培地に播種して適当な条件下で無菌培養する。ここで誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に付されてもよいし、あるいは継代用培地で継代培養することにより種株として維持することもできる。継代培養は、液体培地及び固形培地のいずれを用いて行ってもよい。
本発明の培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式（回分培養、流加培養、連続培養等）、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、本発明の培地組成物に対する細胞塊の湿重量が４〜８（重量／容積（ｗ／ｖ））％、好ましくは５〜７（ｗ／ｖ）％となるように本発明の培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は３ｍｍ乃至４０ｍｍ、好ましくは３ｍｍ乃至２０ｍｍ、より好ましくは５ｍｍ乃至１５ｍｍである。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。
【００８７】
細胞及び／又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６％体積が好ましい。培養期間は通常３乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０乃至３０℃であり、光が必要であれば照度２０００〜８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。培養期間は通常３乃至７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
【００８８】
本発明の方法で細胞及び／又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞及び／又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織と培地組成物を分離した後、新しい培地組成物を細胞及び／又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び／又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
【００８９】
また、本発明は、アニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法を提供する。
詳述すると、アニオン性官能基を有する高分子化合物の水中懸濁物を、２価金属カチオンを１価金属カチオンに交換するカチオン交換体により処理し、２価金属カチオン混入量が低減したアニオン性官能基を有する高分子化合物を得る、アニオン性官能基を有する高分子化合物の精製方法である。
本発明の精製方法の好ましい態様は、上述の２価金属カチオンを除去する方法と同様である。
【００９０】
以下に本発明の培地組成物の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
参考例１  高温加熱処理した脱アシル化ジェランガムを含む培地の粘度測定及び細胞浮遊試験
脱アシル化ジェランガム含有培地の調製及び粘度測定
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌しながら室温まで放冷し、１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０ｍＬと滅菌水４７．５ｍＬを入れ、室温でホモミキサー（３０００ｒｐｍ）で攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液２．５ｍＬを添加し、そのまま１分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０１％培地組成物を調製した。同様に終濃度が０．０２、０．０３、０．０５％（ｗ／ｖ）となるよう脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＴＶＥ−２２Ｌ、標準ロータ１°３４’×Ｒ２４）を用いて、回転数１００ｒｐｍで５分間測定した。【００９２】
脱アシル化ジェランガム含有培地の細胞浮遊試験
ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ  ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で３日間培養した。ここで得られたスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液１．０ｍＬを調製した。引き続き、上記で調製した脱アシル化ジェランガム含有培地を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに１．０ｍＬずつ入れ、更にＨｅＬａ細胞スフェア懸濁液１０μＬを加えた。タッピングにより細胞塊を分散させ、３７℃でインキュベートし、１時間後の細胞の分散状態を目視にて観察した。【００９３】
【表１】
2015111685.tif 000003
【００９４】
参考比較例  メチルセルロース、コラーゲン含有培地の調製
メチルセルロース含有培地の調製
２００ｍＬナスフラスコにＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍＬを入れ、メチルセルロース（Ｍ０３８７、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．１ｇを加えた。氷浴にて冷却しながら攪拌し、メチルセルロースを溶解させた。本溶液を用いて終濃度が０．１、０．３、０．６、１．０％（ｗ／ｖ）となるようメチルセルロース水溶液を添加した培地組成物を調製した。
コラーゲン含有培地の調製
０．３％セルマトリックスタイプＩ−Ａ（新田ゼラチン社製）６．５ｍＬに１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｍＬ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）１ｍＬ及び純水１．５ｍＬを入れ、氷中にて撹拌しながら０．２％のコラーゲン含有培地を調製した。同様に、終濃度が０．０１、０．０５、０．１、０．２％（ｗ／ｖ）となるようコラーゲンを添加した培地組成物を調製した。
上記で調製した培地組成物についても脱アシル化ジェランガム含有培地と同様にＨｅＬａ細胞スフェアの浮遊試験および粘度測定を実施した。ただし、１．０％（ｗ／ｖ）メチルセルロースの粘度は、装置の測定範囲より５０ｒｐｍにて測定した。【００９５】
【表２】
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【００９６】
【表３】
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【００９７】
参考試験例
以下の参考試験例では、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。【００９８】
参考試験例１：単一の細胞を分散させた際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清及び１０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト白血病細胞株ＵＴ７／ＴＰＯを、２００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬなるように分注した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、２００００細胞／ｍＬとなるように１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬなるように分注した。これらの細胞懸濁液をＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。【００９９】
その結果、ＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞は、上記培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。浮遊静置培養３日間後のＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞数を表４に示す。【０１００】
【表４】
2015111685.tif 000006
【０１０１】
参考試験例２：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ  ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ  ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。ここで得られたそれぞれの細胞株のスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液２．５ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた。引き続き、本スフェア（約８００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地に添加することにより調製した。【０１０２】
３７℃で３日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（２００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。ここで、スフェアの一部を分取し、光学顕微鏡（ＯＬＭＰＵＳ社製、ＣＫ３０−Ｆ１００）にてその形状を観察した。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。【０１０３】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアは上記培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、既存の培地と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。更に、培養したスフェアの形状を光学顕微鏡にて観察したところ、該培地組成物ではスフェア同士の会合が見られないのに対し、既存の培地ではスフェア同士の会合が観察された。
ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表５に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表６に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１及び図２にそれぞれ示す。さらに、培養したＨｅＬａ細胞のスフェアの形状を図３に示す。【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
参考試験例３：マイクロキャリア上に付着した細胞株を培養した際の細胞増殖試験
マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）をＰＢＳに０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し１晩静置後、上清を捨てて新たなＰＢＳで本マイクロキャリアを２回洗浄した。その後、再度ＰＢＳで０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。引き続き、本マイクロキャリアを７０％エタノールにて２回、ＰＢＳにて３回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）にて０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁した。本マイクロキャリア懸濁液を用いて、１２０ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１及び４００００００個のＨｅｐＧ２細胞を含むＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清含有）２０ｍＬを調製し、本細胞懸濁液を予めシリコンコーティング剤（旭テクノグラス社製）で処理したビーカー中にて３７℃、６時間、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。ここで、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリアに接着していることを顕微鏡にて確認した。引き続き、細胞が接着したマイクロキャリアを１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて２回洗浄し、同培地３ｍＬにて懸濁した。【０１０７】
１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地２０ｍＬ或いは本培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に、上記のマイクロキャリア懸濁液３００μＬをそれぞれ添加し、３日間、３７℃にて培養した。この際、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。培養後は、顕微鏡にてマイクロキャリア上の細胞の付着状態を確認した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）でマイクロキャリアを沈降させた。ＰＢＳ１０ｍＬで本マイクロキャリアを洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を９ｍＬ添加した後、メッシュサイズ７０μｍのセルストレーナー（ＢＤファルコン社製）を用いてマイクロキャリアを除去した。ここで得られたろ液から遠心処理（２００Ｇ、５分）により細胞を回収した。本細胞を５００μＬの培地に懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は１２３，０００個の細胞を含んでいたが、脱アシル化ジェランガムを含む培養液は１，３２０，０００個の細胞を含んでいた。上記のとおり、該特定化合物の構造体を含む培地組成物は、マイクロキャリアを用いて細胞培養を実施しても、既存の培地と比べて細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。該特定化合物の構造体を含む培地組成物を用いてマイクロキャリア培養を３日間実施した際の、ＨｅｐＧ２細胞の付着状態を図４に示す。【０１０８】
参考試験例４：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ  ＣＧ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、キサンタンガムについて終濃度が０．１、０．１５、０．２％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、０．２％（ｗ／ｖ）のκ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ  ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）及び０．２％（ｗ／ｖ）のローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ  ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０３、０．０４、０．０５％（ｗ／ｖ）のκ−カラギーナンとローカストビーンガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。【０１０９】
参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、本細胞懸濁液に等量の培地を添加した後、遠心処理（３００乃至４００Ｇ、５分）によりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、回収できることを確認した。ＨｅＬａ細胞のスフェアを該培地組成物にて培養した際の浮遊状態を図５にそれぞれ示す。また、分析例１と同様の方法で測定した粘度を表７、８に示す。【０１１０】
【表７】
2015111685.tif 000009
【０１１１】
【表８】
2015111685.tif 000010
【０１１２】
参考試験例５：フィルターろ過した培地組成物を用いた細胞浮遊試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。引き続き、本培地組成物１ｍＬを７０μｍ、４０μｍのフィルター（ＢＤファルコン社製）、３０μｍ、２０μｍのフィルター（アズワン社製）、１０μｍのフィルター（Ｐａｒｔｅｃ社製）、５μｍ、１．２μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製）を用いてそれぞれろ過した。参考試験例２と同様の方法を用いて作成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、上記のろ液に対して約数十個添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、１０μｍ以上のフィルターを透過した培地組成物においては浮遊状態にて維持されるが、５μｍ以下のフィルターを透過した培地組成物においては沈殿することを確認した。更に、ここで浮遊状態にあるＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、室温にて３００Ｇ、５分間の遠心処理、或いは等量の培地を加えた後室温にて２００Ｇ、５分間の遠心処理を施すことにより沈降し、回収できることを確認した。【０１１３】
参考試験例６：スフェア形成試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅＬａ細胞を、１０００個／ｍＬの濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に分注した。本プレートを９日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、１７００００個／ｍＬまでＨｅＬａ細胞が増えていることが確認された。該培地組成物にて形成したＨｅＬａ細胞のスフェアを図６に示す。【０１１４】
参考試験例７：構造体の光学顕微鏡観察
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）９５ｍＬを入れ、室温でマグネチックスターラーにて攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液５ｍＬを添加し、そのまま５分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０２％培地組成物を調製した。さらに当培地組成物をホモミキサー（３０００ｒｐｍ）により５分間攪拌した。調製した培地組成物を光学顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００）により観察した。観察された構造体を図７に示す。【０１１５】
参考試験例８：粉培地とＤＡＧの混合過熱による調製
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）２０ｍｇと、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１．５８ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（Ｓｉｚｅ  ２００μｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表９に示す。【０１１６】
【表９】
2015111685.tif 000011
【０１１７】
参考試験例９：多糖類を混合した培地組成物の調製
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ  ＣＧ、三晶株式会社製）を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度となるように純水に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にアルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ  ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）、κ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ  ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）、ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ  ＣＲＥＴＥ  ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製）について、０．５％（ｗ／ｖ）の水溶液を作製した。
本水溶液と０．２もしくは０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）他の多糖を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、脱アシル化ジェランガムを含む培地を前記同様に調製した後、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）の粉末を添加した。氷浴にて攪拌し、メチルセルロースを溶解させ、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）他のメチルセルロースを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。【０１１８】
上記にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表１０に示す。【０１１９】
【表１０】
2015111685.tif 000012
【０１２０】
参考試験例１０：多糖類を混合した培地組成物の粘度測定
参考試験例９の多糖混合系と同様の方法で、終濃度が０．００５、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと他の多糖を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を調製した。多糖は最終濃度がキサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムは０．１％（ｗ／ｖ）、メチルセルロースは０．２％（ｗ／ｖ）、κ−カラギーナンとダイユータンガムは０．０５％（ｗ／ｖ）となるように調製した。それぞれの培地組成物の状態と分析例１と同様の方法で測定した粘度を表１１〜１６に示す。【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
【表１２】
2015111685.tif 000014
【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
【表１４】
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【０１２５】
【表１５】
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【０１２６】
【表１６】
2015111685.tif 000018
【０１２７】
参考試験例１１：２価金属カチオン濃度を変更した培地組成物の調製
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用し、参考試験例８の方法と同様に０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、終濃度がＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の規定量になるよう、塩化カルシウムまたは硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の規定組成より、それぞれの終濃度は塩化カルシウム０．１１６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．０４９ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム０．０６１ｇ／Ｌとした。
調製した培地組成物にデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、２日後にビーズの分散を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表１７に示す。【０１２８】
【表１７】
2015111685.tif 000019
【０１２９】
参考試験例１２：２価金属カチオンを後添加した培地組成物の調製
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と５倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム不含、Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、塩化カルシウム１１６７ｍｇ、硫酸マグネシウム４８９ｍｇ、塩化マグネシウム２８７ｍｇを純水３００ｍＬに溶解させた塩溶液を調製した。２００ｍＬのトールビーカーに脱アシル化ジェランガム水溶液と純水を入れ、イカリ型攪拌羽を用いて２００ｒｐｍで溶液を攪拌した。培地液と水を混合したＡ液を添加し、そのまま１０分攪拌した。次いで塩溶液を添加、さらに７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を１．６ｍＬ添加し、終濃度０．０２％の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。それぞれの液の混合量を表に示す。調製４時間後に、６本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとＣｙｔｏｄｅｘ１の分散評価を行なった。結果を表１８、１９に示す。【０１３０】
【表１８】
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【０１３１】
【表１９】
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【０１３２】
参考試験例１３：各種培地組成物の調製
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と高濃度の培地液を調製した。高濃度の培地液は１０倍濃度のＭＥＭ（Ｍ０２６８、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ６５０４、Ａｌｄｒｉｃｈ製）と５倍濃度のＤＭＥＭ（高圧滅菌対応培地、ニッスイ製）を調製した。０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と各高濃度培地、濃度調整用の純水を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２、０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム含有する培地組成物をそれぞれ調製した。
調製した９本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１の浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表２０、２１に示す。【０１３３】
【表２０】
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【０１３４】
【表２１】
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【０１３５】
参考試験例１４：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の粒度分布測定
参考例１に倣い、０．０３８％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。培地はホモミキサーを用いて３０００ｒｐｍと６０００ｒｐｍにて１分攪拌し調製した。本培地組成物の粒度分布について、ベックマンコールター（株）製Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４（コールター原理による精密粒度分布測定装置）を用いて測定し、体積基準粒度分布のメジアン径（ｄ５０）を求めた。結果を表２２に示す。【０１３６】
【表２２】
2015111685.tif 000024
【０１３７】
参考試験例１５：脱アシル化ジェランガムのリン酸化
ガラス製の１００ｍＬ試験管に、脱アシル化ジェランガム１ｇと、純水４０ｍＬを秤りとり、１００℃で３０分加熱し、懸濁液を調製した。この懸濁液に、リン酸水溶液（８５％）１gを添加し、５時間加熱還流した。その後、１２時間撹拌しながら、室温まで放冷することで得た白色懸濁液を、９９％エタノール（５００ｍＬ）に注いだ。生じた綿状の白色固体を、ろ取後、乾燥させることで、脱アシル化ジェランガムのリン酸化物として、淡褐色固体（０．４ｇ）を得た。リン酸基が導入されたことは、フーリエ変換赤外分光分析（株式会社島津製作所製、ＩＲ−Ｐｒｅｓｔａｇｅ２１）によって確認した（１７００ｃｍ−１；Ｐ−ＯＨ、１２９６ｃｍ−１、１２６５ｃｍ−１；Ｐ＝Ｏ）。淡褐色固体をマイクロ波加熱分解装置（ETHOS TC, マイルストーンゼネラル製）によって分解した後に、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー社製)によってリン原子の含有率を測定した結果、３．５ｗｔ％（ｎ＝２）であった。【０１３８】
参考試験例１６：リン酸化した脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製
任意量のリン酸化した脱アシル化ジェランガム（３０ｍｇ）と、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ライフテクノロジーズ社製）１．５６ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０３％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。０．０３％（ｗ／ｖ）のリン酸化した脱アシル化シェランガム濃度において、ビーズの分散状態が認められた。【０１３９】
参考試験例１７：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製
脱アシル化ジェランガム水溶液と培地溶液とを下表に示す割合で添加することで混合して、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製したときのポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）の分散状態を評価した。結果を表２３、２４に示す。１日以上静置することで、全ての条件で、スチレンビーズが分散した。【０１４０】
【表２３】
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【０１４１】
【表２４】
2015111685.tif 000026
【０１４２】
参考試験例１８：フィルターを用いた培地組成物の調製
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を最終濃度が０．０２或いは０．０４％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて３０分間或いは１２１℃にて２０分間加熱することにより溶解した。更に、本水溶液１００ｍＬを孔径が０．２２μｍのポリエーテルスルホン製メンブレンフィルター（コーニング社製）にてろ過した。引き続き、本ろ液を２乃至４倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ・アルドリッチ社製）と混合した後、マイルドミキサー（ＳＩ−２４、タイテック社製）にて１時間振とうし、最終濃度０．０１或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物をそれぞれ調製した（例えば、０．０２％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム水溶液と２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を２５ｍＬずつ混合し、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム培地組成物を５０ｍＬ調製した）。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表２５に示す。【０１４３】
【表２５】
2015111685.tif 000027
【０１４４】
参考試験例１９：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ  ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で２日間培養した。ここで得られたＨＥＫ２９３細胞のスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた後、１ｍＬに懸濁した。引き続き、本スフェア懸濁液２００μＬ（細胞数は約２０００００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地に添加することにより調製した。【０１４５】
３７℃で５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（５００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。【０１４６】
その結果、ＨＥＫ２９３細胞のスフェアは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。
ＨＥＫ２９３細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表２６に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表２７に示す。【０１４７】
【表２６】
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【０１４８】
【表２７】
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【０１４９】
参考試験例２０：昆虫細胞を培養した際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｆ−９００（登録商標）IIIＳＦＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（ギブコ社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をインキュベーター内にて２５℃で５日間静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。【０１５０】
その結果、Ｓｆ９細胞は、該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。浮遊静置培養５日間後のＳｆ９細胞の細胞数を表２８に示す。【０１５１】
【表２８】
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【０１５２】
参考試験例２１：ＣＤ３４陽性細胞を培養した際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム、２０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）及び１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ、ＷＡＫＯ社製）を添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（ロンザ社製）を、１００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液を３７℃で７日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。また、残りの培養液に３倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことにより全ての細胞を沈降させた。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。【０１５３】
その結果、ＣＤ３４陽性細胞は、該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて同等以上の細胞増殖促進効果を有することが確認された。また、遠心処理により細胞が沈降し、細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの、浮遊静置培養７日間後におけるＣＤ３４陽性細胞から増殖した細胞の相対的細胞数を表２９に示す。【０１５４】
【表２９】
2015111685.tif 000031
【０１５５】
参考試験例２２：スフェア形成試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅｐＧ２細胞を、１５０００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に１ｍＬ分注した。本プレートを７日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞は、該培地組成物にてスフェアを形成し、また細胞数も８０８００個／ｍＬまでが増えていることが確認された。該培地組成物にて形成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを図８に示す。【０１５６】
参考試験例２３：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験
ダイユータンガム（ＫＥＬＫＯ−ＣＲＥＴＥ  ＤＧ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、ダイユータンガムについて終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、０．５％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガム（ケルコゲル  ＨＴ、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０５、０．１％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。【０１５７】
参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．１％（ｗ／ｖ）のダイユータンガムを含む本細胞懸濁液を遠心処理（２００Ｇ、５分）することによりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを確認した。【０１５８】
参考試験例２４：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験１
ラミニン或いはフィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス株式会社製）懸濁溶液を５００μＬずつ１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分注し、磁石スタンド（ＴＡ４８９９Ｎ１２、多摩川精機株式会社製）を使用して上記ＧＥＭ懸濁溶液からＧＥＭを集積させて溶媒を除去した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）５００μＬによりＧＥＭを２回洗浄した後、同上培地５００μＬに懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、同上培地にて最終容量を５００μＬ／ウェルとした。本細胞懸濁液を手動にて撹拌した後、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した。ＧＥＭ上での細胞の接着を顕微鏡にて確認した後、細胞懸濁液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンドを用いて細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。【０１５９】
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製したＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭ（ラミニン或いはフィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを６日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。【０１６０】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を接着させたＧＥＭは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより該培地組成物からＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭからＨｅｐＧ２細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をＧＥＭ上で６日間培養した際の細胞数を表３０に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図９に示す。【０１６１】
【表３０】
2015111685.tif 000032
【０１６２】
参考試験例２５：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験２
参考試験例２４と同様に、フィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス株式会社製）をＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）に懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、参考試験例２４と同様に、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置させて間葉系幹細胞が接着したＧＥＭを調製した。【０１６３】
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製した間葉系幹細胞付着ＧＥＭ（フィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを４日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。【０１６４】
その結果、間葉系幹細胞を接着させたＧＥＭは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより該培地組成物から間葉系幹細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭから間葉系幹細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にて間葉系幹細胞をＧＥＭ上で４日間培養した際の細胞数を表３１に示す。【０１６５】
【表３１】
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【０１６６】
参考試験例２６：アルギン酸ビーズを用いた細胞浮遊試験
以下の試験は、株式会社ＰＧリサーチ製アルギン酸三次元培養キットの方法に準じて実施した。別途調製したＨｅｐＧ２細胞を４０００００細胞／ｍＬとなる様にアルギン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）２．５ｍＬに添加し、更にヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、細胞懸濁液を調製した。本細胞懸濁液についてゾンデを装着した５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）で回収した後、本シリンジに２２Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した。引き続き、塩化カルシウム水溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）が２ｍＬずつ添加してある２４ウェル平底マイクロプレート（株式会社ＰＧリサーチ製）のウェルに対して、本細胞懸濁液を１０滴ずつ添加した。１０分間、室温にて静置してからアルギン酸ビーズの形成を確認した後、塩化カルシウム溶液を除去し、ＰＢＳ２ｍＬを添加して室温で１５分静置した。更に、ＰＢＳを除去した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）２ｍＬを添加し室温で１５分静置した。培地を除去した後、参考試験例２と同様の方法を用いて調製した０．０３％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを各ウェルに添加し、８日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。なお、培地交換は、培養４日目に実施した。【０１６７】
培養したアルギン酸ビーズを１ｍＬ容量のチップを用いて１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移した後、クエン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）１ｍＬを各チューブに添加し、室温１５分間攪拌してアルギン酸ビーズを溶解させた。引き続き、３００Ｇ、３分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。【０１６８】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をアルギン酸ビーズ内で８日間培養した際の細胞数を表３２に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１０に示す。【０１６９】
【表３２】
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【０１７０】
参考試験例２７：コラーゲンゲルカプセルを用いた細胞浮遊試験
Ａ：組織培養用コラーゲンＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）ＴｙｐｅＩ‐Ａ(セルマトリックス、新田ゼラチン株式会社製)、Ｂ：１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｃ：再構成用緩衝液（０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬに炭酸水素ナトリウム２．２ｇ、ＨＥＰＥＳ（４‐(２‐ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ)‐１‐ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））４．７７ｇを加えてろ過滅菌したもの）のそれぞれを氷中にて冷却しながらＡ：Ｂ：Ｃ＝８：１：１となるように混合した。更に、ヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、コラーゲン混合溶液５００μＬを調製した。本混合溶液に対して別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２０００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、２５Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した１．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）を用いて全量を回収した。引き続き、３７℃にて予め保温した１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）１０ｍＬを添加した平底チューブ（ＢＭ機器社製）に対して、上記シリンジを用いて１滴ずつ細胞懸濁液を滴下した。３７℃水浴中にて１０分間保温して、直径２ｍｍ程度の不定形なコラーゲンゲルカプセルの形成を確認した後、参考試験例２と同様の方法にて最終濃度０．０４％となるように脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加し、軽く撹拌して上記カプセルを浮遊させた。引き続き、５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で本チューブを静置培養した。【０１７１】
コラーゲンゲルカプセルを含む培養液に対してＰＢＳ２５ｍＬを添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりコラーゲンゲルカプセルを沈降させ、上清を除去した。再度、ＰＢＳ２５ｍＬを加えて遠心処理を行い、残量が５ｍＬとなるように上清を除去した。本液に対して１％（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン株式会社製）２０μＬを添加した後、３７℃にて２時間振とうした。コラーゲンゲルの溶解を確認した後、ＰＢＳ１０ｍＬを加え、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を４ｍＬ添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。得られた細胞を２ｍＬの同上培地にて懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。【０１７２】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をコラーゲンゲルカプセル内で５日間培養した際の細胞数を表３３に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１１に示す。【０１７３】
【表３３】
2015111685.tif 000035
【０１７４】
参考試験例２８：フィルターを用いたスフェアの回収試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。また、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地を調製した。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ８６０００個の細胞数となるようにスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。更に、メッシュサイズが４０μｍのセルストレーナー（ベクトン・ディッキントン社製）上に本細胞懸濁液を添加し、スフェアをフィルター上に捕捉した。引き続き、フィルターの裏面からＰＢＳ１０ｍＬを流し込むことによりスフェアを１５ｍＬチューブに回収し、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェアを沈降させた。上清を除去した後、スフェアに対して５００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物において浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．０１５％の脱アシル化ジェランガムを含む本スフェア懸濁液をフィルター処理することにより、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、脱アシル化ジェランガムを含まない培地と同等の回収率にて細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地を用いてフィルターにて回収されたＨｅｐＧ２細胞数を１としたときの、脱アシル化ジェランガムを含む培地から回収された相対的細胞数を表３４に示す。【０１７５】
【表３４】
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【０１７６】
参考試験例２９：各種多糖類の混合剤を用いたスフェアの細胞浮遊試験
参考試験例９と同様の方法を用いて、キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ  ＣＧ、三晶株式会社製）、アルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ  ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）、κ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ  ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）、ペクチン（ＧＥＮＵ  ｐｅｃｔｉｎ  ＬＭ−１０２ＡＳ、三晶株式会社製）或いはダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ  ＣＲＥＴＥ  ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製）と脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を組み合わせて混合したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表３５及び表３６に示す。なお、表中の−は未実施を示す。【０１７７】
【表３５】
2015111685.tif 000037
【０１７８】
【表３６】
2015111685.tif 000038
【０１７９】
ビーズと細胞の分散性比較１
上記（比較例）にて調製した脱アシル化ジェランガム含有培地とメチルセルロース含有培地について、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態を比較した。結果を表に示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ１とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、Ｃｙｔｏｄｅｘ１を細胞スフェアモデルとして使用することができる。【０１８０】
【表３７】
2015111685.tif 000039
【０１８１】
【表３８】
2015111685.tif 000040
【０１８２】
ビーズと細胞の分散性比較２
参考試験例９にて調製した多糖および脱アシル化ジェランガム含有培地について、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）とＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態を比較した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表に示す。ポリスチレンビーズとＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、ポリスチレンビーズを細胞スフェアモデルとして使用することができる。【０１８３】
【表３９】
2015111685.tif 000041
【０１８４】
参考試験例３０：イネ由来植物カルスの浮遊培養試験
塩水選にて精選されたイネ日本晴の完熟種子（湖東農業協同組合より購入）５０粒を５０ｍＬポリスチレンチューブ（ＢＤファルコン社製)に移し、滅菌水５０ｍＬにて洗浄した後、７０％エタノール水３０ｍＬ中にて１分間撹拌した。エタノール水を除去した後、キッチンハイター（花王株式会社製）３０ｍＬを添加し、１時間撹拌した。キッチンハイターを除去した後、滅菌水５０ｍＬにて４回洗浄した。ここで滅菌した種子を、２μｇ／ｍＬの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）及び寒天を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）１．５ｍＬ／ウェル（２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製））上に置床した。３０℃、１６時間暗所／８時間暗所の条件にて３週間培養し、種子の胚盤上で増殖したクリーム色のカルス（１〜２ｍｍ）を採取した。【０１８５】
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて、２μｇ／ｍＬの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）に終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。上記にて調製したカルス１５個を本培地組成物１０ｍＬ／平底チューブ（ＢＭ機器社製）に添加し、７日間、２５℃にて振とう培養を行った。その結果、イネ由来カルスは当該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物にてカルスが維持されることが確認された。イネ由来カルスを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１２に示す。【０１８６】
実施例１  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ＥＤＴＡ・２Ｎａ処理ＮａＯＨ中和）
３００ｍＬのナスフラスコ中に、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）１．０ｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（純正化学株式会社製）０．７４ｇ、および純水２００ｍＬを加えて懸濁し、１１０℃に設定したオイルバスで、３０分加熱した。室温で、１時間放冷した後、１規定水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨ試験紙で確認しながら中和した。この中和溶液を、２００ｍＬのイソプロピルアルコールの入った５００ｍＬビーカーへ少しずつ加えた。生じた浮遊性の固形分を、５８μｍのメッシュで絞ることで水分を除去し、得られた固体を、５０℃に設定した真空オーブン中で、乾燥することで、目的の固体を０．８６ｇ得た。【０１８７】
実施例２  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ＥＤＴＡ・２Ｎａ処理ＫＯＨ又はＬｉＯＨ中和）
３００ｍＬのナスフラスコ中に、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）１．０ｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（純正化学株式会社製）０．７４ｇ、および純水２００ｍＬを加えて懸濁し、１１０℃に設定したオイルバスで、３０分加熱した。室温で、１時間放冷した後、１規定水酸化カリウム又はリチウム水溶液を用いて、ｐＨ試験紙で確認しながら中和した。この中和溶液を、２００ｍＬのイソプロピルアルコールの入った５００ｍＬビーカーへ少しずつ加えた。生じた浮遊性の固形分を、５８μｍのメッシュで絞ることで水分を除去し、得られた固体を、５０℃に設定した真空オーブン中で、乾燥することで、水酸化カリウム中和では０．８８ｇ、水酸化リチウム中和では１．０４ｇの白色固体を得た。【０１８８】
実施例３  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（水素型カチオン交換樹脂、バッチ式）
２００ｍＬのナスフラスコ中に、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）０．５ｇ、および純水１００ｍＬを加えて懸濁し、１１０℃に設定したオイルバスで、３０分加熱した。５０℃まで放冷した後に、カチオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ｘ８（ダウ・ケミカル株式会社製）１０ｇを加え、５０℃以上を保ちながら、水酸化カリウム水溶液で中和した。室温で、１時間放冷した後、この中和溶液を、２００ｍＬのイソプロピルアルコールの入った５００ｍＬビーカーへ少しずつ加えた。生じた浮遊性の固形分を、５８μｍのメッシュで絞ることで水分を除去し、得られた固体を、５０℃に設定した真空オーブン中で、乾燥することで、目的の固体を０．３１ｇ得た。【０１８９】
実施例４  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ナトリウム型カチオン交換樹脂、カラム式）
イオン交換樹脂５ｍＬを詰めたカラムに、０．５％脱アシル化ジェランガム水溶液５０ｍＬを１時間掛けて流した。イオン交換樹脂はナトリウム型のＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ８（ダウ・ケミカル株式会社）、スミキレートＭＣ７００（住化ケムテックス社製）、デュオライトＣ４６７（住化ケムテックス社製）を用いた。溶出液を２００ｍＬのイソプロピルアルコールに滴下し、析出したゲル状固体をろ過により採取した。生じたゲル状固体を、５８μｍのメッシュで絞ることで水分を除去し、得られた固体を、５０℃に設定した真空オーブン中で、乾燥することで、白色固体を得た。白色固体濃度が１％となるよう、白色固体２０ｍｇへ超純水２ｍＬを加え、室温（２５℃）にて１時間ボルテックス処理し、水への溶解性を調べた。白色固体の収量および溶解試験の結果を以下に示した。【０１９０】
デュオライトＣ４６７の金属定量結果
サンプル溶液を適宜希釈し、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES；SPS 5520、SIIナノテクノロジー社製）にて定量した。【０１９１】
【表４０】
2015111685.tif 000042
【０１９２】
【表４１】
2015111685.tif 000043
【０１９３】
【表４２】
2015111685.tif 000044
【０１９４】
実施例５  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式）
０．５％脱アシル化ジェランガム水溶液２００ｍＬとデュオライトＣ４６７  ５ｍＬ量を入れ、時々攪拌しながら７０℃にて２４時間静置した。吸引ろ過によりデュオライトＣ４６７を除去し、ろ液をイソプロピルアルコールに滴下した。析出したゲル状固体をろ過により採取し、５０℃にて真空乾燥した。白色固体濃度が１％となるよう、白色固体２０ｍｇへ超純水２ｍＬを加え、室温（２５℃）にて３０分間ボルテックス処理したところ、溶解した。【０１９５】
デュオライトＣ４６７の金属定量結果
サンプル溶液を適宜希釈し、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES；SPS 5520、SIIナノテクノロジー社製）にて定量した。【０１９６】
【表４３】
2015111685.tif 000045
【０１９７】
実施例６  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ナトリウム型カチオン交換樹脂、カラム式、スプレードライ法による乾燥）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）２５ｇとイオン交換水４９７５ｍＬをビーカーに入れ、９５℃に加熱し溶解させ０．５％脱アシル化ジェランガム溶液を作製した。脱アシル化ジェランガム溶液をデュオライトＣ４６７（商品名：住化ケムテックス社製）５００ｍｌを詰めたカラムに流速８０ｍｌ／ｍｉｎで通した。溶出液をスプレードライＦＯＣ−２０−ＬＳ型（大川原化工機株式会社製）により噴霧乾燥し、球状粉体を得た。このとき、脱アシル化ジェランガム溶液は１０ｋｇ／ｈで供給し、アトマイザー回転数は１０，０００−２２，０００ｒｐｍ、乾燥送風温度は１３０℃とした。レーザー回折散乱法粒度分布計（ＬＳ１３  ３２０：ベックマンコールター社製）にて測定したところ、粉体の粒径ｄ５０は７−１２μｍであった。【０１９８】
実施例７  上記ＤＡＧを用いたＤＭＥＭ培地の作成（ろ過滅菌）
実施例１の処理を施した脱アシル化ジェランガム１７ｍｇを純水１００ｍＬに、室温（２５℃）で溶解させた。この溶液を、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて滅菌し、他方、ＤＭＥＭの粉末培地（ライフテクノロジー社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の１０分の１量に当たる純水を加え、１０倍の濃度で１０ｍＬ水溶液を調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて滅菌した。先に滅菌した脱アシル化ジェランガム溶液９０ｍＬを滅菌した培地瓶にはかりとり、これに１０倍濃度のＤＭＥＭ培地を加えた後に、瓶をふって、充分に混合することで、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的のＤＭＥＭ培地１００ｍＬを調製した。【０１９９】
実施例８  上記ＤＡＧを用いたＤＭＥＭ培地の作成（オートクレーブ滅菌）
実施例２の処理を施した脱アシル化ジェランガム３００ｍｇを純水２０ｍＬに、室温（２５℃）で溶解させた後、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌した。ＲＰＭＩ１６４０液体培地（ライフテクノロジー社）１９８ｍＬを５００ｍＬのトールビーカーに入れ、オートクレーブ処理した先の脱アシル化ジェランガム水溶液２ｍＬを、ホモミキサーで激しく攪拌（３０００ｒｐｍ）しながら加えた。ホモミキサーで、更に３０００ｒｐｍで１分間攪拌することで、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的のＲＰＭＩ１６４０培地２０２ｍＬを調製した。【０２００】
実施例９  Ａ５４９細胞を分散させた際の細胞増殖試験
実施例１および２で調製した２価イオン除去脱アシル化ジェランガムをそれぞれ０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、３７℃にて加熱しながら溶解した。その後、０．２２μｍ径フィルター(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製)で濾過滅菌した。
本溶液を１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に添加し、ピペッティングにより混和して終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の上記脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、２００００細胞／ｍＬとなるように上記の培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、比較対象として２価イオン除去処理をしていない脱アシル化ジェランガムを同濃度添加した培地組成物にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。また、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて５日間静置状態で培養した。５日間培養後の培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。【０２０１】
その結果、Ａ５４９細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。この際、２価イオンを除去した脱アシル化ジェランガムと無処理の脱アシル化ジェランガムとの間で、細胞増殖に対する効果に関して差は見られなかった。静置培養５日間後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ５４９細胞の細胞数に相当する）を表４４に示す。また、細胞凝集塊を光学顕微鏡（ＯＬＭＰＵＳ社製、ＣＫ３０−Ｆ１００）にて観察し、浮遊分散状態を○、沈降状態を×として評価した結果を表４４に示す。【０２０２】
【表４４】
2015111685.tif 000046
【０２０３】
実施例１０  Ａ５４９細胞を分散させた際の細胞増殖試験
実施例４（デュオライトＣ４６７処理）で調製した２価イオン除去脱アシル化ジェランガムをそれぞれ０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、２５℃にてスターラーで攪拌しながら溶解し、０．２２μｍ径フィルター(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製)で濾過滅菌した。本溶液を１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に添加し、ピペッティングにより混和して終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の上記脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、比較対象として２価イオン除去処理をしていない脱アシル化ジェランガムを同濃度添加した培地組成物にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。また、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて６日間静置状態で培養した。６日間培養後の培養液に対してＡＴＰ測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）、プロメガ社製）を１００μＬ添加した後、１５分間２５℃にてインキュベートし、マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３）にて発光量（ＲＬＵ）を測定し、培地のみのＲＬＵを差し引くことにより生細胞の数を測定した。【０２０４】
その結果、Ａ５４９細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。この際、２価イオンを除去した脱アシル化ジェランガムと無処理の脱アシル化ジェランガムとの間で、細胞増殖に対する効果に関して差は見られなかった。静置培養６日間後のＲＬＵ（Ａ５４９細胞の細胞数に相当する）を表４５に示す。【０２０５】
【表４５】
2015111685.tif 000047
【０２０６】
実施例１１  上記ＤＡＧ及び他の多糖類を用いた培地組成物の作成
キサンタンガム（サンエースＮＸＧ−Ｃ、三栄源株式会社製）を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度となるように純水に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にグアーガム（ビストップＤ−２０２９、三栄源株式会社製）について、０．５％（ｗ／ｖ）の水溶液を作製した。本水溶液と０．２もしくは０．１％（ｗ／ｖ）の脱二価カチオン処理ＤＡＧ溶液と１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、濃度調製のための水を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）他の多糖を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。【０２０７】
実施例１２  ビーズ分散試験
実施例１１にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。【０２０８】
【表４６】
2015111685.tif 000048
【０２０９】
比較例１  未処理ＤＡＧを用いた培地の製造方法（ろ過滅菌）
脱アシル化ジェランガム含有ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地の作成
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）１２０ｍｇを純水７２ｍＬに懸濁させ、９０℃にて１時間加熱攪拌し溶解させた。これに、純水を加えて、脱アシル化ジェランガムが０．０１７％（ｗ／ｖ）の溶液７２０ｍＬを調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて、滅菌した。他方、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２等量混合の粉末培地（ライフテクノロジー社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の１０分の１量に当たる純水を加え、１０倍の濃度で８０ｍＬ水溶液を調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて、滅菌した。これらを、滅菌条件下、２５℃で、攪拌しながら混合することで、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的の培地８００ｍＬを調製した。【０２１０】
比較例２  未処理ＤＡＧを用いた培地の製造方法（オートクレーブ滅菌）
脱アシル化ジェランガム含有ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地の作成
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）０．３０ｇを純水２００ｍＬに懸濁させ、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で加熱滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）の水溶液を調製した。ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２等量混合の粉末培地（ライフテクノロジー社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の９０％に当たる純水を加え、やや高い濃度で液体培地１８０ｍＬを調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて、滅菌した。これをホモミキサーで激しく攪拌しながら（３０００ｒｐｍ）、先に調製した脱アシル化ジェランガム水溶液２０ｍＬを約１０秒で添加し、さらに３０００ｒｐｍで１分間攪拌しながら混合することで、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である培地２００ｍＬを調製した。【０２１１】
実施例１３  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式、ＤＡＧの溶解とカチオン交換樹脂処理とを同時進行）
脱アシル化ジェランガム濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）１．０ｇと純水２００ｍＬ、キレート樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ４６７（Ｎａ）（住化ケムテックス）４ｍＬを入れた。７０℃に加温し、トルネード撹拌器を用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。また、撹拌時の温度を５０℃、３０℃、２３℃、１０℃として同様の操作を行い、白色固体を得た。【０２１２】
実施例１４  脱２価塩ＤＡＧの調製方法  ＤＡＧの濃度を増加させた場合（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式、ＤＡＧの溶解とカチオン交換樹脂処理とを同時進行）
脱アシル化ジェランガム濃度が１％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）２．０ｇと純水２００ｍＬ、キレート樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ４６７（Ｎａ）（住化ケムテックス）４ｍＬを入れた。７０℃に加温し、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。また、脱アシル化ジェランガムの量を、４．０ｇとして同様の操作を行い、白色固体を得た。【０２１３】
実施例１５  脱２価塩ＤＡＧの調製方法  樹脂使用量を増やした場合（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式、ＤＡＧの溶解とカチオン交換樹脂処理とを同時進行）
脱アシル化ジェランガム濃度が２％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）４．０ｇと純水２００ｍＬ、キレート樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ４６７（Ｎａ）（住化ケムテックス）８ｍＬを入れた。７０℃に加温し、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。また、脱アシル化ジェランガムの量を、５．０ｇとして同様の操作を行い、白色固体を得た。【０２１４】
実施例１６  脱２価塩ＤＡＧの調製方法  樹脂使用量を減らした場合（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式、ＤＡＧの溶解とカチオン交換樹脂処理とを同時進行）
脱アシル化ジェランガム濃度が１．０％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）２．０ｇと純水２００ｍＬ、キレート樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ４６７（Ｎａ）（住化ケムテックス）１ｍＬを入れた。７０℃に加温し、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。【０２１５】
実施例１７  脱２価塩ＤＡＧの調製方法  樹脂による処理時間を長くした場合（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式、ＤＡＧの溶解とカチオン交換樹脂処理とを同時進行）
脱アシル化ジェランガム濃度が１．０％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）1．０ｇと純水２００ｍＬ、キレート樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ４６７（Ｎａ）（住化ケムテックス）８ｍＬを入れた。２３℃で、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて５時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。【０２１６】
比較例３
脱アシル化ジェランガム濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）１．０ｇと純水２００ｍＬを入れた。１００℃に加温し、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いてろ過し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだ。析出した繊維状の固体を回収し、５０℃にて真空乾燥した。その後、ミキサーを用いて粉砕し、白色粉末を得た。【０２１７】
比較例４
脱アシル化ジェランガム濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）1．０ｇと純水２００ｍＬ、強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ型）ＤＯＷＥＸTM（ダウ・ケミカル社）４ｍＬを入れた。１００℃で、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別し、ろ液を５００ｍＬのイソプロピルアルコールに注いだが、固体の析出が見られなかった。【０２１８】
比較例５
脱アシル化ジェランガム濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう、３００ｍＬの四つ口フラスコに脱アシル化ジェランガム（ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社）1．０ｇと純水２００ｍＬ、強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ型）ＤＯＷＥＸTM（ダウ・ケミカル社）４ｍＬを入れた。２３℃で、メカニカルスターラーを用いて１００ｒｐｍにて１時間攪拌した。次いで、桐山ろ紙５Ｂを用いて樹脂をろ別を試みたが、ろ紙が目詰まりし、ろ別操作を完結出来なかった。【０２１９】
実施例１３乃至１７、並びに比較例３乃至５についての収量を以下に示す。【０２２０】
【表４７】
2015111685.tif 000049
【０２２１】
溶解性試験
実施例１３乃至１７、並びに比較例３の、それぞれの処理により得られたＤＡＧ粉末について、室温における水への溶解性を調べた。マルエムスクリュー管Ｎｏ．１にそれぞれの粉末２０ｍｇと純水２ｍＬを入れ、室温にて１時間ボルテックスにより攪拌した。溶解性は目視により確認した。結果を以下に示す。【０２２２】
【表４８】
2015111685.tif 000050
【０２２３】
金属定量
実施例１３乃至１７、並びに比較例３の、それぞれの処理により得られたＤＡＧ粉末に酸を加え加熱分解し、超純水にて適宜希釈した溶液を誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー)にて分析した。結果を以下に示す。【０２２４】
【表４９】
2015111685.tif 000051
【０２２５】
実施例１８  脱２価塩ＤＡＧの調製方法（ナトリウム型カチオン交換樹脂、バッチ式  透析処理）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を３００ｍｇ、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）３０ｍＬ、デュオライトＣ４６７を０．５ｇ加え、７０℃にて１時間加熱撹拌することで溶解させた。その後室温まで放冷し、吸引ろ過によりデュオライトＣ４６７を除去した。ろ液を水にて１日透析を行った。得られた水溶液に対して凍結乾燥を行い、１８７ｍｇの白色固体を得た。【０２２６】
実施例１９  脱２価塩脱アシル化ジェランガムを用いたＤＭＥＭ培地の作成  （フィルター滅菌）
実施例１８にて調製した脱２価塩脱アシル化ジェランガムを０．３％となるように水に加え、１００℃で加熱分散させた。その後室温にて静置した。溶液を滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて滅菌した。
他方、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の粉末培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の２分の１量に当たる純水を加え、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて滅菌した。
脱アシル化ジェランガム溶液、ＭｉｌｌｉＱ水と培地を１：９：１０の体積比で混合させ、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。【０２２７】
実施例２０  脱２価塩脱アシル化ジェランガムを用いたＤＭＥＭ培地の作成  （オートクレーブ滅菌）
実施例１８にて調製した脱２価塩脱アシル化ジェランガムを０．３％となるように水に加え、１００℃で加熱分散させた。その後室温にて静置した。得られた溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。
他方、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の粉末培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の２分の１量に当たる純水を加え、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて滅菌した。
脱アシル化ジェランガム溶液、ＭｉｌｌｉＱ水と滅菌した培地を１：９：１０の体積比で混合させ、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。【０２２８】
実施例２１  ビーズ分散試験
実施例１９および２０にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ２００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。【０２２９】
【表５０】
2015111685.tif 000052
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
本発明は、アニオン性官能基を有する高分子化合物を用いる培地組成物において、当該高分子化合物の水への溶解性を高め、前記化合物と培地との混合をより簡便に行う培地組成物の製造方法を提供する。当該方法により、細胞及び／又は組織を浮遊培養することのできる培地組成物をより簡便に製造することができるため、本発明は産業上極めて有用な発明である。【０２３１】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０２３２】
本出願は日本で出願された特願２０１４−０１０８４１（出願日：２０１４年１月２３日）、及び特願２０１４−１７０９９２（出願日：２０１４年８月２５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2015111685.tif 000053
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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