(57)【要約】（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドおよび（２Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−２−メトキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドから選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する医薬組成物は、強い抗菌活性を示し、水に対して溶解性が優れ、医薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドおよび（２Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−２−メトキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドから選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する医薬組成物。
【請求項２】
可溶化剤が、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ヒドロキサム酸誘導体が、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス−２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンから選ばれる一種または二種以上である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンから選ばれる一種または二種以上である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物が、液剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
液剤のｐＨが、３〜８である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が、凍結液剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
解凍された凍結液剤のｐＨが、３〜８である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物が、凍結乾燥製剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
凍結乾燥製剤の水溶液のｐＨが、３〜８である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
可溶化剤が、モノアルコール類、多価アルコール類、アミド類、スルホキシド類、アミノ酸類、界面活性剤、酸類および塩基類から選ばれる一種または二種以上である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ヒドロキサム酸誘導体が、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
モノアルコール類が、炭素数１〜６のアルコールであり；多価アルコール類が、ジオールであり；酸類が、有機酸である、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
可溶化剤が、炭素数１〜６のアルコール、ジオール、アミノ酸類および有機酸から選ばれる一種または二種以上ならびにアミド類の組み合わせである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物が、液剤である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
医薬組成物が、ＬｐｘＣ阻害剤として用いられる医薬組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
医薬組成物が、抗菌剤として用いられる医薬組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドおよび（２Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−２−メトキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドから選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を水に溶解し、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩の水溶液を得たのち、必要に応じて、得られた水溶液のｐＨを３〜８に調整することを特徴とする、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する液剤の製造法。
【請求項２０】
可溶化剤が、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体である、請求項１９に記載の製造法。
【請求項２１】
ヒドロキサム酸誘導体が、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミドである、請求項１９または２０に記載の製造法。
【請求項２２】
シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス−２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンから選ばれる一種または二種以上である、請求項２０または２１に記載の製造法。
【請求項２３】
シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンから選ばれる一種または二種以上である、請求項２０または２１に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒドロキサム酸誘導体またはその塩を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性菌は、グラム陽性菌には存在しない脂質二重層からなる外膜を有するため、グラム陽性菌と比較して薬剤抵抗性が強い傾向にある。また、グラム陰性菌は、複数の薬剤排出蛋白を有し、この薬剤排出蛋白が、薬剤抵抗性に関与していることが知られている（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２００２年、Ｍａｒ  １、３４、第６３４−６４０頁）。
グラム陰性菌の中でも、特に、緑膿菌は、各種の抗菌薬に自然耐性を示す傾向が強い。近年、医療現場において、カルバペネム系薬剤、キノロン系薬剤またはアミノ配糖体系薬剤などに耐性を獲得した緑膿菌が、しばしば分離されている（Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００３年、第５１巻、第３４７−３５２頁）。さらに、多剤耐性緑膿菌も分離されており（Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２００６年、第５９巻、第５号、第３５５−３６３頁）、世界的に大きな問題となっている。【０００３】
ＵＤＰ−３−Ｏ−アシル−Ｎ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ（ＬｐｘＣ）は、リピドＡ（外膜の構成成分であるＬＰＳの疎水性アンカー）の合成を担う酵素である。
リピドＡ生合成は、１０段階の反応からなり、ＬｐｘＣは、その第２段階を触媒し、ＵＤＰ−３−Ｏ−アシル−Ｎ−アセチルグルコサミンのアセチル基を離脱させる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、第２７０巻、第３０３８４−３０３９１頁）。リピドＡは、外膜形成に必須な成分であり、グラム陰性菌の生存に必須である（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８７年、第１６９巻、第５４０８−５４１５頁）。ＬｐｘＣは、リピドＡ生合成過程において律速となる重要な酵素の一つであり、リピドＡ生合成に必須な酵素である。従って、ＬｐｘＣの活性を阻害する薬剤は、緑膿菌を含むグラム陰性菌、特に従来薬剤と異なる作用機序を有することから薬剤耐性緑膿菌に対して有効な抗菌剤になり得ることが強く期待される。
これまでに、ＬｐｘＣ阻害活性を有する化合物が知られている（特許文献１〜７）。【０００４】
薬物が薬効を発揮するためには、薬物が吸収部位で溶解することが必要である。そのため、水に溶解しにくい薬物を経口投与した場合、消化管からの吸収が十分でなく、薬効を発揮しにくいことがある。また、非経口投与、特に静脈内投与の場合、薬物は溶解した形で投与される必要がある。
シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と称することがある。）またはシクロデキストリン誘導体（以下、「ＣＤ誘導体」と称することがある。）は、化合物の可溶化に用いられることが知られている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．、２０１３年、第４５３巻、第１６７−１８０頁；Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ、２０１２年、第１３２巻、第１号、第８５−１０５頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０４／０６２６０１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０７／０６９０２０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０８／１５４６４２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第１０／０３１７５０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１０／０１７０６０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第１０／０３２１４７号パンフレット
【特許文献７】国際公開第１１／１３２７１２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＬｐｘＣを阻害することによって緑膿菌をはじめとするグラム陰性菌およびその薬剤耐性菌に対して強い抗菌活性を示し、水に対して溶解性が優れる、医薬組成物を提供することにある。さらに、本発明の課題は、安定性に優れる、医薬組成物を含有する液剤の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況下において、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（以下、「化合物Ａ」と称することがある。）、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（以下、「化合物Ｂ」と称することがある。）および（２Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−２−メトキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（以下、「化合物Ｃ」と称することがある。）から選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する医薬組成物が、強い抗菌活性および優れた溶解性を有し、医薬として有用であることを見出した。さらに、本発明者らは、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩および可溶化剤の水溶液を得たのち、必要に応じて、得られた水溶液のｐＨを３〜８に調整することにより、安定性に優れる液剤を製造できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］  化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃから選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する医薬組成物。
［２］  可溶化剤が、ＣＤまたはＣＤ誘導体である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］  ヒドロキサム酸誘導体が、化合物Ａである、［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］  ＣＤまたはＣＤ誘導体が、α−シクロデキストリン（以下、「αＣＤ」と称することがある。）、γ−シクロデキストリン（以下、「γＣＤ」と称することがある。）、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン（以下、「ＨＰαＣＤ」と称することがある。）、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン（以下、「ＳＢＥβＣＤ」と称することがある。）、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（以下、「ＨＰβＣＤ」と称することがある。）、ヘプタキス−２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（以下、「ＤＭβＣＤ」と称することがある。）、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（以下、「ＨＰγＣＤ」と称することがある。）から選ばれる一種または二種以上である、［２］または［３］に記載の医薬組成物。
［５］  ＣＤまたはＣＤ誘導体が、αＣＤ、γＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、ＨＰβＣＤおよびＨＰγＣＤから選ばれる一種または二種以上である、［２］または［３］に記載の医薬組成物。
［６］  医薬組成物が、液剤である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［７］  液剤のｐＨが、３〜８である、［６］に記載の医薬組成物。
［８］  医薬組成物が、凍結液剤である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［９］  解凍された凍結液剤のｐＨが、３〜８である、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］  医薬組成物が、凍結乾燥製剤である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［１１］  凍結乾燥製剤の水溶液のｐＨが、３〜８である、［１０］に記載の医薬組成物。【０００９】
［１２］  可溶化剤が、モノアルコール類、多価アルコール類、アミド類、スルホキシド類、アミノ酸類、界面活性剤、酸類および塩基類から選ばれる一種または二種以上である、［１］に記載の医薬組成物。
［１３］  ヒドロキサム酸誘導体が、化合物Ａである、［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］  モノアルコール類が、炭素数１〜６のアルコールであり；多価アルコール類が、ジオールであり；酸類が、有機酸である、［１２］または［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］  可溶化剤が、炭素数１〜６のアルコール、ジオール、アミノ酸類および有機酸から選ばれる一種または二種以上ならびにアミド類の組み合わせである、［１２］または［１３］に記載の医薬組成物。
［１６］  医薬組成物が、液剤である、［１２］〜［１５］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［１７］  医薬組成物が、ＬｐｘＣ阻害剤として用いられる医薬組成物である、［１］〜［１６］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［１８］  医薬組成物が、抗菌剤として用いられる医薬組成物である、［１］〜［１６］のいずれか一に記載の医薬組成物。【００１０】
［１９］  化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃから選ばれるヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を水に溶解し、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩の水溶液を得たのち、必要に応じて、得られた水溶液のｐＨを３〜８に調整することを特徴とする、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩ならびに可溶化剤を含有する液剤の製造法。
［２０］  可溶化剤が、ＣＤまたはＣＤ誘導体である、［１９］に記載の製造法。
［２１］  ヒドロキサム酸誘導体が、化合物Ａである、［１９］または［２０］に記載の製造法。
［２２］  ＣＤまたはＣＤ誘導体が、αＣＤ、γＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ＨＰβＣＤ、ＤＭβＣＤ、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンおよびＨＰγＣＤから選ばれる一種または二種以上である、［２０］または［２１］に記載の製造法。
［２３］  ＣＤまたはＣＤ誘導体が、αＣＤ、γＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、ＨＰβＣＤおよびＨＰγＣＤから選ばれる一種または二種以上である、［２０］または［２１］に記載の製造法。【００１１】
本発明は、また、以下を提供する。
［２４］  さらに、ｐＨ調整剤を含有する、［１］〜［１１］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［２５］  ｐＨ調整剤が、鉱酸、有機酸、無機塩基および有機塩基から選ばれる一種または二種以上である、［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］  鉱酸が、塩酸、硫酸、リン酸および硝酸であり；有機酸が、マレイン酸、安息香酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸およびアジピン酸であり；無機塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウムおよびアンモニアであり；有機塩基が、クエン酸二ナトリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トロメタモール、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジンおよびメグルミンである、［２５］に記載の医薬組成物。
［２７］  鉱酸が、塩酸および硫酸であり；有機酸が、酢酸およびクエン酸であり；無機塩基が、水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムであり；有機塩基が、トロメタモールおよびメグルミンである、［２５］に記載の医薬組成物。
［２８］  医薬組成物が、液剤である、［２４］〜［２７］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［２９］  液剤のｐＨが、３〜８である、［２８］に記載の医薬組成物。
［３０］  医薬組成物が、凍結液剤である、［２４］〜［２７］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［３１］  解凍された凍結液剤のｐＨが、３〜８である、［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］  医薬組成物が、凍結乾燥製剤である、［２４］〜［２７］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［３３］  凍結乾燥製剤から調製される注射用製剤のｐＨが、３〜８である、［３２］に記載の医薬組成物。
［３４］  医薬組成物が、ＬｐｘＣ阻害剤として用いられる医薬組成物である、［２４］〜［３３］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［３５］  医薬組成物が、抗菌剤として用いられる医薬組成物である、［２４］〜［３３］のいずれか一に記載の医薬組成物。
［３６］  医薬組成物が、グラム陰性菌による感染症の処置に用いられる医薬組成物である、［１］〜［１６］または［２４］〜［３３］のいずれか一に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のヒドロキサム酸誘導体またはその塩および可溶化剤を含有する医薬組成物は、強い抗菌活性を示し、水に対して溶解性が優れ、医薬として有用である。さらに、本発明の製造法は、安定性に優れる、医薬組成物を含有する液剤の製造法として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳述する。
本明細書において、特に断らない限り、「％」は、「質量％」を意味する。
処置とは、疾患に対する予防または治療などを意味する。
【００１４】
＜ヒドロキサム酸誘導体＞
ヒドロキサム酸誘導体としては、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃから選ばれるヒドロキサム酸誘導体が挙げられ、化合物Ａが好ましい。
ヒドロキサム酸誘導体は、たとえば、後述する製造例に従って製造することができる。
【００１５】
ヒドロキサム酸誘導体またはその塩において、異性体（たとえば、光学異性体、幾何異性体および互変異性体など）が存在する場合、本発明は、それらの異性体を包含し、また、溶媒和物、水和物および種々の形状の結晶を包含する。
ヒドロキサム酸誘導体の塩としては、たとえば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
上記した塩の中で、好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられる。
【００１６】
ヒドロキサム酸誘導体またはその塩の投与方法、投与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（たとえば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日、0.01〜1000mg／kgを１回から数回に分割して投与すればよい。
【００１７】
＜可溶化剤＞
本発明では、可溶化剤を使用することによって、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩の優れた溶解性を達成することができる。
可溶化剤としては、たとえば、モノアルコール類、多価アルコール類、アミド類、スルホキシド類、アミノ酸類、界面活性剤、酸類、塩基類、ＣＤおよびＣＤ誘導体が挙げられる。
【００１８】
モノアルコール類としては、たとえば、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、ブタノールおよびクロロブタノールなどの炭素数１〜６のアルコール；３−インドールプロパノール、ベンジルアルコール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、ヘプタデシルアルコールおよびステアリルアルコールなどの炭素数７〜２０のアルコール；ならびに、オレイルアルコール、リノレイルアルコールおよびリノレニルアルコールなどの不飽和の炭素数７〜２０のアルコールが挙げられる。
好ましいモノアルコール類としては、炭素数１〜６のアルコールおよび炭素数７〜２０のアルコールが挙げられ、炭素数１〜６のアルコールおよびベンジルアルコールが好ましく、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、ブタノールおよびベンジルアルコールがより好ましく、エタノールおよびベンジルアルコールがさらに好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００１９】
多価アルコール類としては、たとえば、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、ジプロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール４０００およびアルファチオグリセリンなどのジオール；ならびに、グリセリンなどのトリオールが挙げられる。
好ましい多価アルコール類としては、ジオールが挙げられ、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオール、ジプロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１５００およびポリエチレングリコール４０００がより好ましく、トリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール４００がさらに好ましい。
【００２０】
アミド類としては、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ポリビニルピロリドン、尿素、エチル尿素およびニコチン酸アミドが挙げられる。
好ましいアミド類としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、尿素、エチル尿素およびニコチン酸アミドが挙げられ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびニコチン酸アミドがより好ましい。
【００２１】
スルホキシド類としては、たとえば、ジメチルスルホキシドが挙げられる。
【００２２】
アミノ酸類としては、たとえば、グリシン、アラニン、βアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、シスチン、Ｌ−グルタミン酸Ｌ−リジン、タウリン、β−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびフェニルアラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルなどのアミノ酸およびその誘導体ならびにそれらの塩が挙げられる。
好ましいアミノ酸類としては、グリシン、アラニン、βアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、フェニルアラニン、トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、タウリン、β−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびフェニルアラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルが挙げられ、βアラニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファン、プロリン、タウリン、β−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびフェニルアラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルがより好ましく、βアラニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンがさらに好ましい。
【００２３】
界面活性剤としては、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、クレモホールおよびショ糖脂肪酸エステルが挙げられる。
好ましい界面活性剤としては、ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、クレモホールおよびショ糖脂肪酸エステルが挙げられる。
【００２４】
酸類としては、たとえば、マレイン酸、安息香酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アジピン酸、コハク酸、チオグリコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、エデト酸、サリチル酸、メタスルホ安息香酸、桂皮酸、３−フェニルプロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ベシル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、糖酸およびコンドロイチン硫酸などの有機酸；カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸およびステアリン酸などの飽和の炭素数８〜２０の脂肪酸；シトロネル酸、ウンデシレン酸、リンデル酸、抹香酸、ゾマーリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸およびリノール酸などの不飽和の炭素数８〜２０の脂肪酸；ならびに、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸二水素カリウムなどの無機酸が挙げられる。
好ましい酸類としては、有機酸が挙げられ、マレイン酸、安息香酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アジピン酸、チオグリコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、サリチル酸、メタスルホ安息香酸、桂皮酸、３−フェニルプロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ベシル酸およびｐ−トルエンスルホン酸がより好ましく、安息香酸、クエン酸、桂皮酸、３−フェニルプロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸およびｐ−トルエンスルホン酸がさらに好ましく、安息香酸が特に好ましい。
【００２５】
塩基類としては、たとえば、クエン酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、糖酸カルシウムおよび安息香酸ナトリウムなどの有機酸の塩；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トロメタモール、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、エチレンジアミンおよびメグルミンなどの有機塩基；ならびに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウムおよびアンモニアなどの無機塩基が挙げられる。
好ましい塩基類としては、クエン酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、糖酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、ジエタノールアミン、トロメタモール、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸三ナトリウムが挙げられ、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、トロメタモール、メグルミンおよび水酸化ナトリウムがより好ましい。
【００２６】
ＣＤとしては、たとえば、αＣＤ、β―シクロデキストリン（以下、「βＣＤ」と称することがある。）またはγＣＤが挙げられる。
ＣＤ誘導体としては、たとえば、ＨＰαＣＤ、ジメチル−β−シクロデキストリン、ＳＢＥβＣＤ、２，３，６−トリアセチル−β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ＨＰβＣＤ、ＤＭβＣＤ、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、モノアセチル−β−シクロデキストリン、モノクロロトリアジノ−β−シクロデキストリンまたはＨＰγＣＤが挙げられる。
好ましいＣＤまたはＣＤ誘導体としては、αＣＤ、γＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β―シクロデキストリン、ＨＰβＣＤ、ＤＭβＣＤ、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンまたはＨＰγＣＤが挙げられ、αＣＤ、γＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、ＨＰβＣＤまたはＨＰγＣＤがより好ましい。
【００２７】
本発明の好ましい可溶化剤としては、ＣＤおよびＣＤ誘導体が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の好ましい可溶化剤としては、モノアルコール類、多価アルコール類、アミド類、スルホキシド類、アミノ酸類、界面活性剤、酸類および塩基類から選ばれる一種または二種以上が挙げられ、炭素数１〜６のアルコール、ジオール、アミノ酸類および有機酸から選ばれる一種または二種以上ならびにアミド類の組み合わせが、より好ましい。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、液剤、凍結液剤または凍結乾燥製剤として提供される。
次に、本発明の医薬組成物の製造法について説明する。
【００３０】
製造法１  液剤
ヒドロキサム酸誘導体またはその塩および可溶化剤を水に溶解することにより、液剤を製造することができる。
ヒドロキサム酸誘導体としては、化合物Ａが好ましい。
可溶化剤としてはＣＤまたはＣＤ誘導体が好ましい。
可溶化剤の量は、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩を溶解するに足る量あればよく、通常、ヒドロキサム酸誘導体またはその塩に対して、１〜20倍モルであればよく、好ましくは、1.2〜10倍モル、より好ましくは、1.5〜5倍モルである。
別の態様として、可溶化剤としては、モノアルコール類、多価アルコール類、アミド類、スルホキシド類、アミノ酸類、界面活性剤、酸類および塩基類から選ばれる一種または二種以上が好ましい。
なお、本発明の液剤の製造において、滅菌処理などは、通常行われる手順に従って実施すればよい。
【００３１】
本発明の液剤は、液剤のpHが3〜8であることが好ましく、3.5〜7.5であることがより好ましく、4.0〜6.5であることがさらに好ましい。
必要に応じて、pH調整剤を加え、液剤のpHを3〜8に調整することが好ましく、3.5〜7.5に調整することがより好ましく、4.0〜6.5に調整することがさらに好ましい。
使用されるpH調整剤としては、たとえば、鉱酸、有機酸、無機塩基および有機塩基から選ばれる一種または二種以上が挙げられる。
pH調整剤として使用される鉱酸としては、たとえば、塩酸、硫酸、リン酸および硝酸などが挙げられ、塩酸、硫酸およびリン酸が好ましく、塩酸および硫酸がより好ましい。
pH調整剤として使用される有機酸としては、たとえば、マレイン酸、安息香酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸およびアジピン酸などが挙げられ、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、酢酸、クエン酸およびアスパラギン酸が好ましく、酢酸およびクエン酸がより好ましい。
pH調整剤として使用される無機塩基としては、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウムおよびアンモニアなどが挙げられ、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよびリン酸三ナトリウムが好ましく、水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムがより好ましい。
pH調整剤として使用される有機塩基としては、たとえば、クエン酸二ナトリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トロメタモール、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジンおよびメグルミンなどが挙げられ、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トロメタモール、トリエタノールアミンおよびメグルミンが好ましく、トロメタモールおよびメグルミンがより好ましい。
【００３２】
本発明の液剤には、必要に応じ、通常使用される浸透圧調節剤、安定化剤、界面活性剤、無痛化剤、賦形剤および／または保存剤などの添加剤を添加してもよい。
浸透圧調節剤としては、たとえば、ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリンおよびプロピレングリコールなどが挙げられる。
安定化剤としては、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、メタスルホ安息香酸ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、エチレンジアミン、エデト酸ナトリウム、チオグリコール酸、グルコン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸カリウム、Ｌ−リジン−Ｌ−グルタマート、コンドロイチン硫酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システインおよびジブチルヒドロキシトルエンなどが挙げられる。
界面活性剤としては、たとえば、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール共重合体などが挙げられる。
無痛化剤としては、たとえば、リドカイン、プロカイン、メプリルカインおよびベンジルアルコールなどが挙げられる。
賦形剤としては、たとえば、トレハロース、マルトース、ブドウ糖、乳糖、白糖、果糖などの糖類、Ｄ−ソルビトール、キシリトール、イノシトールおよびＤ−マンニトールなどの糖アルコール類またはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、タウリン、ＤＬ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、アセチルトリプトファンおよびＬ−ヒスチジンなどのアミノ酸類が挙げられる。
保存剤としては、たとえば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、エデト酸ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クロロブタノール、クロルヘキシジングルコン酸、ベンザルコニウム塩化物およびベンゼトニウム塩化物などが挙げられる。
【００３３】
本発明の液剤は、注射用液剤として提供することができる。
本発明の液剤中のヒドロキサム酸誘導体の含有量は、1〜100mg/mLであることが好ましく、2〜50mg/mLであることがより好ましい。
ヒドロキサム酸誘導体の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜決定されるが、通常成人に対して1日0.1〜1000mg/kgを投与すればよい。
【００３４】
製造法２  凍結液剤
製造法１に記載の方法で得られた液剤を凍結することにより、凍結液剤を製造することができる。
凍結工程の温度は、液剤を凍結できる温度であればよく、-78〜-15℃が好ましい。
凍結工程の時間は、特に限定されないが、1〜24時間であればよい。
なお、本発明の凍結液剤の製造において、滅菌処理などは、通常行われる手順に従って実施すればよい。
【００３５】
本発明の凍結液剤は、解凍することにより、注射用液剤として提供することができる。
解凍された凍結液剤のpHが3〜8であることが好ましく、3.5〜7.5であることがより好ましく、4.0〜6.5であることがさらに好ましい。
解凍された凍結液剤中のヒドロキサム酸誘導体の含有量は、1〜100mg/mLであることが好ましく、2〜50mg/mLであることがより好ましい。
ヒドロキサム酸誘導体の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜決定されるが、通常成人に対して1日0.1〜1000mg/kgを投与すればよい。
【００３６】
製造法３  凍結乾燥製剤
製造法１に記載の方法で得られた液剤を凍結乾燥することにより、凍結乾燥製剤とすることができる。
この工程は、通常実施される凍結乾燥の方法に従って行えばよい。たとえば、「医薬品の実際」第１１巻、製剤の単位操作と機械、仲井由宣編、第３８８〜３９６頁（１９８８年、廣川書店）に記載の「１５．２凍結乾燥の実際」に従い、行うことができる。
【００３７】
本発明の凍結乾燥製剤には、溶解性および／または外観の改良のための添加物を加えることができる。
添加物としては、アミノ酸類、ポリエチレングリコール類、糖類、糖アルコール類、尿素、エチル尿素、クレアチニン、トロメタモール、精製大豆レシチンおよびポリソルベート８０などが挙げられ、これらは、一種または二種以上を混合して用いることができる。
好ましい添加物としては、アミノ酸類、ポリエチレングリコール類、糖類および糖アルコール類が挙げられ、アミノ酸類、糖類および糖アルコール類がより好ましく、糖アルコール類がさらに好ましい。
【００３８】
添加物として使用されるアミノ酸類としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、タウリン、ＤＬ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、アセチルトリプトファンおよびＬ−ヒスチジンなどが挙げられ、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンが好ましく、グリシンがより好ましい。
添加物として使用されるポリエチレングリコール類としては、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール４０００およびポリエチレングリコール６０００などが挙げられ、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール６００およびポリエチレングリコール４０００が好ましい。
添加物として使用される糖類としては、トレハロース、マルトース、ブドウ糖、乳糖、白糖、果糖およびデキストランなどが挙げられ、トレハロース、ブドウ糖、白糖および果糖が好ましい。
添加物として使用される糖アルコール類としては、Ｄ−ソルビトール、キシリトール、イノシトールおよびＤ−マンニトールなどが挙げられ、Ｄ−ソルビトール、キシリトールおよびＤ−マンニトールが好ましい。
【００３９】
本発明の凍結乾燥製剤の製造において、滅菌処理などは、通常行われる手順に従って実施すればよい。
本発明の凍結乾燥製剤は、注射用水などで溶解し、注射用製剤として提供することができる。
凍結乾燥製剤から調製される注射用製剤のpHが3〜8であることが好ましく、3.5〜7.5であることがより好ましく、4.0〜6.5であることがさらに好ましい。
凍結乾燥製剤から調製される注射用製剤中のヒドロキサム酸誘導体の含有量は、1〜100mg/mLであることが好ましく、2〜50mg/mLであることがより好ましい。
ヒドロキサム酸誘導体の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜決定されるが、通常成人に対して1日0.1〜1000mg/kgを投与すればよい。
【００４０】
本発明の液剤、凍結液剤および凍結乾燥製剤の製造は、有機溶媒を使用しないことが好ましい。そのため、これらの製剤には、残留溶媒が存在せず、人体に対して安全である。
【００４１】
本発明を製造例、実施例および試験例で説明するが、本発明はこれらにより、限定されるものではない。
【００４２】
特に記載のない場合、シリカゲルカラムクロマトグラフィーはフラッシュカラムクロマトグラフィーであり、その担体は、富士シリシア化学株式会社、Ｂ．Ｗ．シリカゲル、ＢＷ−３００である。
溶離液における混合比は、容量比である。
【００４３】
凍結乾燥の条件は、以下のとおりである。
バイアルを‐60℃に冷却し、内容物を凍結する。その後、真空下（50Pa以下）、棚温度‐10℃に昇温し、同圧力、同温度で一次乾燥を行う。品温が‐10℃以上になった後、棚温度を20℃に昇温し、同圧力、同温度で二次乾燥を行う。品温と設定温度がほぼ一致し、品温の変化がなくなったところで乾燥終了とする。
【００４４】
各略号は、以下の意味を有する。
ＤＭＳＯ−ｄ６：重ジメチルスルホキシド
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化法
ＩＰＥ：ジイソプロピルエーテル
Ｍｅ：メチル
ＴＢＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＨＰ：テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル
ｓ：シングレット
ｄ：ダブレット
ｄｄ：ダブルダブレット
ｍ：マルチプレット
【００４５】
ＮＭＲスペクトルにおいて、たとえば、[1.81],1.82(3H,s)の記載は、ジアステレオマー混合物の各ジアステレオマー由来のピークが、1.81および1.82にシングレットとして観測され、総プロトン数が3Hであることを示す。
【００４６】
製造例１
2016039433.tif 000002
Ｎ−メチルベンジルアミン421gおよび２−ブロモ−２−メチルマロン酸ジエチル400gをＮ−メチルピロリドン1000mLに加え、100℃で1時間撹拌した後、反応混合物を冷却した。トルエン1.5Lおよび水1.5Lを順次加えた後、塩酸70mLを加えた。有機層を分取し、減圧下溶媒を留去して無色油状物499gを得た。
得られた油状物400gに酢酸エチル2.0L、10%パラジウム‐炭素（50%wet）32gおよび酢酸81.9gを順次加え、水素雰囲気下（0.5MPa）45℃で18時間30分間撹拌した。反応混合物を冷却し、セライト濾過した後、残渣を酢酸エチル400mLで洗浄した。濾液に水1200mLを加え、塩酸でpH2以下に調整し、水層を分取した。得られた水槽に酢酸エチル1200mLを加え、20%水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整した。有機層を分取し、溶媒を減圧留去して、無色油状物204gを得た。
得られた油状物200gにアセトニトリル1.0Lおよび炭酸水素ナトリウム198gを加えた。次いで、氷冷下にてクロロギ酸ベンジル168gを25分間かけて滴下した。反応混合物を室温まで昇温し、7時間45分間撹拌して終夜静置した。次いで反応混合物を40〜45℃で1時間30分間撹拌し、冷却した後、不溶物を濾去した。残渣をアセトニトリル200mLで洗浄した。濾液と洗浄液を併せ、減圧下濃縮して無色油状物324gを得た。
水1968mLにリン酸二水素ナトリウム二水和物15.36gを加え、0.05mol/L水酸化ナトリウム水溶液1125mLを加えた。この水溶液に、得られた油状物120gおよびアセトニトリル360mLの混合物を24℃で加え、同温度で2時間45分間撹拌した後、終夜静置した。さらに反応混合物を同温度で6時間撹拌した後、22時間静置した。次いでブタ肝臓エステラーゼ2.9g（20ユニット/mg）に0.05mol/Lリン酸緩衝液30mL（pH7.4）を加え30分間超音波照射した懸濁液を、25℃で反応混合物へ加えた。反応混合物を1mol/L水酸化ナトリウム水溶液でpH6.7〜7.1の範囲に調整して26℃で5時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチル1200mLを加え、氷冷下で塩酸37mL、塩化ナトリウム300gおよびセルピュア48gを順次加えた。同温度で1時間撹拌した後、不溶物を濾去した。残渣を酢酸エチル240mLで洗浄し、濾液と洗浄液を併せた。有機層を分取し、水層を酢酸エチル180mLで抽出した。有機層および抽出液を併せ、無水硫酸ナトリウム48gおよび活性炭1.2gを加え、30分間撹拌した後にセライト濾過した。残渣を酢酸エチル180mLで洗浄し、濾液と洗浄液を併せ、溶媒を減圧下で1540mL留去した。得られた残留物にヘプタン240mLを加え、2時間かけて18℃に冷却した。固形物を濾取し、ヘプタン120mLで2回洗浄し、（（（（（２Ｒ）−２−カルボキシ−１−エトキシ−１−オキソプロパン−２−イル）（メチル）カルバモイル）オキシ）メチル）ベンゼン88.18g（＞99.9％ee）を無色結晶として得た。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ値：1.15-1.20(3H,m),1.61(3H,s),2.86(3H,s),3.95-4.15(2H,m),5.07(2H,s),7.28-7.43(5H,m)
【００４７】
HPLC測定条件
カラム：4.6×150mm CHIRALPAK IA 5μm
測定波長：210nm
カラム温度：40℃
移動相：ヘキサン：エタノール＝95：5（0.1%トリフルオロ酢酸）
流速：0.7mL/分
【００４８】
製造例２
2016039433.tif 000003
（（（（（２Ｒ）−２−カルボキシ−１−エトキシ−１−オキソプロパン−２−イル）（メチル）カルバモイル）オキシ）メチル）ベンゼン250gに酢酸エチル1300mLおよびＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド1.0mLを加え、5℃で塩化オキザリル133gを20分間かけて滴下した後、酢酸エチル200mLを加えた。反応混合物を20℃に昇温し、4時間撹拌した。溶媒を減圧下で1395mL留去し、得られた残留物にテトラヒドロフラン1000mLを加え、8℃に冷却した。同温度で、トリエチルアミン94.1gおよびＯ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン109gを順次加え、3時間かけて20℃まで昇温しながら撹拌した。反応混合物を終夜静置した後、アセトン225mLを加え40分間撹拌した。次いでトルエン750mLおよび水1000mLを加え、10℃に冷却した後、塩酸62mLを加えた。さらに6mol/L塩酸および20％水酸化ナトリウム水溶液でpH3に調整して、水層を分取した。得られた水層に酢酸エチル1250mLを加え、20％水酸化ナトリウム水溶液210mLを加えた。次いで、塩化ナトリウム1450gを加え、30℃まで昇温した。有機層を分取し、水層を酢酸エチル750mLで抽出した。有機層および抽出液を併せ、溶媒を減圧下留去した。得られた残留物にトルエン250mLを加え、溶媒を減圧下留去して橙色油状物215gを得た。
得られた油状物213gに室温で40％メチルアミン/メタノール溶液を加え、40〜43℃で8時間30分間撹拌した後、終夜静置した。さらに、45℃で5時間撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。得られた残留物にトルエンを加え、溶媒を減圧下留去した。次いで、得られた残留物にテトラヒドロフランを加え、溶媒を減圧下留去して黄色油状物203gを得た。
得られた油状物203gにテトラヒドロフラン1400mLを加え、35℃で炭酸水素ナトリウム117gを加えた。次いで、同温度で４−ヨードベンゾイルクロリド168gおよびテトラヒドロフラン200mLの混合物ならびにテトラヒドロフラン100mLを加え、5時間撹拌した。同温度で、反応混合物に炭酸水素ナトリウム58.2gおよびモルホリン29mLを加え2時間撹拌した後、室温で終夜静置した。反応混合物に酢酸エチル1370mL、水1700mLおよび塩化ナトリウム170gを順次加え、有機層を分取した。得られた有機層に水860mLおよび塩化ナトリウム42.7gを加え15分間撹拌した後、有機層を分取した。得られた有機層を濾過し、濾液の溶媒を減圧下留去した。得られた残留物に酢酸エチル300mLおよびトルエン300mLを加え、30℃で1時間撹拌した後、終夜静置した。固形物を濾取し、酢酸エチル／トルエン混合液（1：1、300mL）で洗浄して、褐色固体206gを得た。得られた褐色固体に酢酸エチル2000mLを加え、40℃で1時間撹拌した後、氷冷下冷却し、固形物を濾取した。固形物を酢酸エチルで洗浄し、（２Ｓ）−２−（（４−ヨードベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド148.9g（＞99.9％ee）を無色結晶として得た。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ値：1.40-1.75(6H,m),1.61(3H,s),[2.62]2.63(3H,d,J=3.7Hz),2.99(3H,d,J=2.7Hz),3.40-3.60(1H,m),[3.82-3.92]3.92-4.02(1H,m),[4.74-4.80]4.80-4.86(1H,m),[7.31]7.33(2H,d,J=8.2Hz),7.85(2H,d,J=8.3Hz),[8.25-8.33]8.35-8.43(1H,m),11.52(1H,s)
【００４９】
HPLC測定条件
カラム：4.6×250mm CHIRALPAK ID 5μm
測定波長：230nm
カラム温度：40℃
移動相：ヘキサン：エタノール＝85：15
流速：1.0mL/分
【００５０】
製造例３
2016039433.tif 000004
（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）エタン−１，２−ジオール1.08g、ビストリフェニルホスフィンパラジウム（II）ジクロリド350mg、ヨウ化銅（I）190mgおよび酢酸ブチル10mLの混合物に、窒素雰囲気下、トリイソプロピルシリルアセチレン7.8mLおよびトリエチルアミン7.0mLを加え、還流下1時間攪拌した。反応混合物を冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え6mol/L塩酸でpH6.2に調整した後、セルピュアおよび酢酸エチルを加え、不溶物を濾去した。濾液の有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；酢酸エチル：へキサン＝40：60→45：55］に付し、黄色油状物1.32gを得た。
得られた黄色油状物1.32gおよびテトラヒドロフラン13mLの混合物に、氷冷にて、1mol/Lテトラブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液6.2mLを加え、同温度で30分間攪拌した後、室温にて45分間攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、1mol/L塩酸でpH2.0に調整した後、酢酸エチルを加えた。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで2回抽出した。有機層および抽出液を併せ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；酢酸エチル：へキサン＝50：50→70：30］で精製し、淡褐色固体513mgを得た。これにヘキサンを加え、固形物を濾取し（１Ｓ）−１−（４−エチニルフェニル）エタン−１，２−ジオール466mgを淡褐色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.97-2.07(1H,m),2.56(1H,d,J=3.4Hz),3.08(1H,s),3.56-3.70(1H,m),3.71-3.82(1H,m),4.79-4.88(1H,m),7.34(2H,d,J=8.3Hz),7.49(2H,d,J=8.3Hz)
【００５１】
製造例４
2016039433.tif 000005
（２Ｓ）−２−（（４−ヨードベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド587mg、（１Ｓ）−１−（４−エチニルフェニル）エタン−１，２−ジオール253mg、ビストリフェニルホスフィンパラジウム（II）ジクロリド84mg、ヨウ化銅（I）46mgおよびテトラヒドロフラン6.0mLの混合物に、窒素雰囲気下、氷冷にて、トリエチルアミン0.59mLを加え、同温度にて2時間攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを加え、1mol/L塩酸でpH6.4に調整した。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層および抽出液を併せ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；アセトン：クロロホルム＝40：60］で精製し、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド767mgを淡黄色泡状固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.50-1.68(3H,m),1.71-1.92(3H,m),[1.82],1.83(3H,s),2.08-2.14(1H,m),2.63-2.68(1H,m),[2.86],2.87(3H,d,J=4.1Hz),[3.17],3.20(3H,s),3.53-3.83(3H,m),3.83-4.07(1H,m),4.83-4.89(1H,m),4.93-5.03(1H,m),7.37(2H,d,J=8.0Hz),7.48-7.61(6H,m),[6.97-7.04],7.61-7.67(1H,m),[10.10],10.51(1H,s)
【００５２】
製造例５
2016039433.tif 000006
（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド767mgおよびメタノール6.0mLの混合物に、氷冷にてｐ−トルエンスルホン酸一水和物46mgを加え、同温度にて40分間攪拌した後、室温にて1時間攪拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。有機層を分取し、水層に酢酸エチルおよび塩化ナトリウムを加え、固形物を濾取した。濾液の有機層を分取し、水層に酢酸エチルおよび塩化ナトリウムを加え、固形物を濾取した。濾液の有機層を分取し、これまでに得られた有機層および固形物を併せ、溶媒を減圧下留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；メタノール：クロロホルム＝10：90→15：85］で精製し、黄色泡状固体585mgを得た。これに酢酸エチルおよびＩＰＥを加え、固形物を濾取し、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（化合物Ａ）463mgを黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ値：1.77(3H,s),2.79(3H,s),3.17(3H,s),3.55-3.68(2H,m),4.67-4.74(1H,m),7.41(2H,d,J=8.3Hz),7.51(2H,d,J=8.3Hz),7.55(2H,d,J=8.5Hz),7.68(2H,d,J=8.5Hz)；MS（ESI）：462[M+Na]+,438[M-H]-
【００５３】
製造例６
2016039433.tif 000007
製造例３と同様の手法により、（１Ｒ）−１−（４−ブロモフェニル）エタン−１，２−ジオール1.09gから（１Ｒ）−１−（４−エチニルフェニル）エタン−１，２−ジオール558mgを白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：2.00(1H,dd,J=7.1,4.9Hz),2.54(1H,d,J=3.4Hz),3.08(1H,s),3.60-3.68(1H,m),3.73-3.81(1H,m),4.80-4.88(1H,m),7.34(2H,d,J=8.1Hz),7.49(2H,d,J=8.0Hz)
【００５４】
製造例７
2016039433.tif 000008
製造例４と同様の手法により、（２Ｓ）−２−（（４−ヨードベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド587mgおよび（１Ｒ）−１−（４−エチニルフェニル）エタン−１，２−ジオール291mgから（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド797mgを淡褐色泡状固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.53-1.69(3H,m),1.76-1.92(3H,m),[1.81],1.82(3H,s),2.27-2.37(1H,m）,2.83-2.91(4H,m),[3.17],3.19(3H,s),3.53-3.83(3H,m),[3.83-3.92],3.98-4.08(1H,m),4.81-4.88(1H,m),4.94-5.04(1H,m),7.35(2H,d,J=8.1Hz),7.45-7.59(6H,m),[6.96-7.06],7.59-7.68(1H,m),[10.14],10.56(1H,s)
【００５５】
製造例８
2016039433.tif 000009
（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド797mgおよびメタノール6.3mLの混合物に、氷冷にてｐ−トルエンスルホン酸一水和物46mgを加え、同温度で30分間攪拌した後、室温にて45分間攪拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで2回抽出した。水層に塩化ナトリウムを加え、固形物を濾取した。濾液に塩化ナトリウムおよび酢酸エチルを加え、固形物を濾取した。濾液の有機層を分取し、これまでに得られた有機層、抽出液および固形物を併せ、溶媒を減圧下留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；メタノール：クロロホルム＝10：90→15：85］で精製し、黄色泡状固体556mgを得た。これに酢酸エチルおよびＩＰＥを加え、固形物を濾取し、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（化合物Ｂ）458mgを黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ値：1.78(3H,s),2.80(3H,s),3.17(3H,s),3.57-3.67(2H,m),4.68-4.74(1H,m),7.42(2H,d,J=8.3Hz),7.52(2H,d,J=8.3Hz),7.56(2H,d,J=8.6Hz),7.61(2H,d,J=8.6Hz)；MS（ESI）：462[M+Na]+,438[M-H]-
【００５６】
製造例９
2016039433.tif 000010
製造例３と同様の手法で得た（１Ｓ）−１−（４−（（トリイソプロピルシリル）エチニル）フェニル）エタン−１，２−ジオール2.79g、ジクロロメタン28mL、トリエチルアミン2.7mLおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン213mgの混合物に、窒素雰囲気下、氷冷にてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド1.45gを加え、室温にて2時間攪拌し、同温度にて終夜静置した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを加え、6mol/L塩酸でpH4.0に調整した。有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、褐色油状物3.70gを得た。
得られた褐色油状物3.70gにジクロロメタン28mLおよびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム439mgを加え、氷冷にて、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン2.4mLを加えた後、室温にて5時間攪拌した。反応混合物にトリエチルアミン3.0mLを加え、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物に水および酢酸エチルを加えた。有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；ジエチルエーテル：ヘキサン＝10：90］で精製し、黄色油状物3.65gを得た。
得られた黄色油状物3.65gにテトラヒドロフラン18mLを加え、氷冷下にて、1mol/Lテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液17mLを加え、室温にて1時間攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを加えた。有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；酢酸エチル：へキサン＝30：70→40：60］で精製し、（２Ｓ）−２−（４−エチニルフェニル）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エタノール1.78gを白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.40-1.93(6H,m),2.11-2.20(1H,m),[3.06],3.07(1H,s),3.51-3.61(1H,m),3.62-3.76(2H,m),[3.25-3.34],3.92-4.07(1H,m),[4.48-4.53],4.79-4.86(1H,m),[4.70-4.75],4.87-4.93(1H,m),[7.29],7.35(2H,d,J=8.3Hz),7.45(2H,d,J=8.0Hz)
【００５７】
製造例１０
2016039433.tif 000011
（２Ｓ）−２−（４−エチニルフェニル）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エタノール800mg、ジメチルスルホキシド4.0mLおよびヨウ化メチル0.4mLの混合物に、窒素雰囲気下、氷冷にて水酸化カリウム545mgを加え、室温にて1時間30分間攪拌した。反応混合物にトルエンおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、6mol/L塩酸でpH6.1に調整した。有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；酢酸エチル：ヘキサン＝10：90］で精製し、２−（（１Ｓ）−１−（４−エチニルフェニル）−２−メトキシエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン836mgを無色油状物として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.40-1.94(6H,m),[3.05],3.07(1H,s),[3.36],3.39(3H,s),3.45-3.56(2H,m),[3.56-3.62],3.62-3.69(1H,m),[3.28-3.35],3.97-4.06(1H,m),[4.80-4.85],4.91-4.97(1H,m),[4.41-4.46],4.97-5.01(1H,m),[7.30],7.37(2H,d,J=8.4Hz),7.44-7.51(2H,m)
【００５８】
製造例１１
2016039433.tif 000012
２−（（１Ｓ）−１−（４−エチニルフェニル）−２−メトキシエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン478mg、テトラヒドロフラン3.0mL、（２Ｓ）−２−（（４−ヨードベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド300mg、ビストリフェニルホスフィンパラジウム（II）ジクロリド43mgおよびヨウ化銅（I）23mgの混合物に、窒素雰囲気下、氷冷にて、トリエチルアミン0.51mLを加え、同温度にて2時間30分間攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを加え、6mol/L塩酸でpH6.0に調整した。有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；アセトン：クロロホルム＝10：90］で精製して、（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−２−メトキシ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド485mgを褐色泡状固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ値：1.42-1.94(12H,m),[1.81],1.82(3H,s),[2.85],2.86(3H,d,J=4.4Hz),[3.17],3.20(3H,s),[3.37],3.40(3H,s),3.47-3.72(4H,m),[3.29-3.36],3.83-3.91(1H,m),3.97-4.07(1H,m),[4.43-4.48],4.93-4.98(1H,m),[4.84],4.95(1H,dd,J=7.3,4.2Hz),4.98-5.03(1H,m),[7.34],7.41(2H,d,J=8.3Hz),7.44-7.61(6H,m),[6.96-7.04],7.62-7.72(1H,m),[10.01],10.53(1H,s)
【００５９】
製造例１２
2016039433.tif 000013
（２Ｓ）−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−２−メトキシ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ，２−ジメチル−Ｎ’−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）マロンアミド485mgおよびメタノール4.8mLの混合物に、氷冷にてｐ−トルエンスルホン酸一水和物23mgを加え、同温度にて10分間攪拌した後、室温にて1時間攪拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。有機層を分取し、得られた水層を酢酸エチルで抽出した。水層に塩化ナトリウムを加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層および抽出液を併せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液；メタノール：クロロホルム＝4：96→6：94］で精製し、褐色固体288mgを得た。これに酢酸エチルおよびＩＰＥを加え、固形物を濾取し、（２Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−２−（（４−（（４−（（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−２−メトキシエチル）フェニル）エチニル）ベンゾイル）（メチル）アミノ）−Ｎ’，２−ジメチルマロンアミド（化合物Ｃ）240mgを褐色固体として得た。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ値：1.77(3H,s),2.79(3H,s),3.17(3H,s),3.37(3H,s),3.50(2H,d,J=5.9Hz),7.41(2H,d,J=8.3Hz),7.47-7.65(6H,m)；MS（ESI）：476[M+Na]+,452[M-H]-
【００６０】
実施例１
ＨＰβＣＤ（ＨＰＢ−ＥＣ、日本食品化工）72.0gの注射用水130mL溶液に、化合物Ａ１水和物7.2gを加えた後、室温で撹拌し、化合物Ａの水溶液を得た。この溶液に注射用水を加え、全量を200mLとし、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、4.5であった。
【００６１】
実施例２
実施例１で得られた液剤10mLに0.1mol/L塩酸50μLおよび0.01mol/L塩酸250μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、3.0であった。
【００６２】
実施例３
実施例１で得られた液剤10mLに0.01mol/L塩酸70μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、4.0であった。
【００６３】
実施例４
実施例１で得られた液剤10mLに0.01mol/L水酸化ナトリウム水溶液20μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、5.1であった。
【００６４】
実施例５
実施例１で得られた液剤10mLに0.01mol/L水酸化ナトリウム水溶液160μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、6.0であった。
【００６５】
実施例６
実施例１で得られた液剤10mLに0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液90μLおよび0.01mol/L水酸化ナトリウム水溶液50μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、7.0であった。
【００６６】
実施例７
実施例１で得られた液剤10mLに1mol/L水酸化ナトリウム水溶液60μLおよび0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液80μLを加え、0.22μmのメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、8.0であった。
【００６７】
実施例８
実施例１で得られた液剤10mLに10%クエン酸１水和物水溶液40μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、3.0であった。
【００６８】
実施例９
実施例１で得られた液剤10mLに10%クエン酸１水和物水溶液2μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、3.９であった。
【００６９】
実施例１０
実施例１で得られた液剤10mLに1%メグルミン水溶液5μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、5.1であった。
【００７０】
実施例１１
実施例１で得られた液剤10mLに1%メグルミン水溶液25μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、5.9であった。
【００７１】
実施例１２
実施例１で得られた液剤10mLに10%メグルミン水溶液20μLを加え、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、6.9であった。
【００７２】
実施例１３
実施例１で得られた液剤10mLにメグルミン19mgを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、液剤を得た。この液剤のpHは、8.0であった。
【００７３】
実施例１４
ＨＰβＣＤ（ＨＰＢ−ＥＣ、日本食品化工）14.4gの注射用水25mL溶液に、化合物Ａ１水和物1.44gを加えた後、室温で撹拌し、化合物Ａの水溶液を得た。この溶液に注射用水を加え、全量を40mLとし、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液5mLに5％ブドウ糖水溶液（大塚糖液5％、大塚製薬工場）を加え、全量を100mLとした。この調製液を‐78℃で凍結させ、凍結液剤を得た。
【００７４】
実施例１５
実施例１４で得られた調製液10mLに5％ブドウ糖水溶液（大塚糖液5％、大塚製薬工場）を加え、全量を100mLとした。この調製液を‐78℃で凍結させ、凍結液剤を得た。
【００７５】
実施例１６
実施例１４で得られた調製液20mLに5％ブドウ糖水溶液（大塚糖液5％、大塚製薬工場）を加え、全量を100mLとした。この調製液を‐78℃で凍結させ、凍結液剤を得た。
【００７６】
実施例１７
ＨＰβＣＤ（ＨＰＢ−ＥＣ、日本食品化工）115.0gの注射用水200mL溶液に、化合物Ａ１水和物11.5gを加えた後、室温で撹拌し、化合物Ａの水溶液を得た。この溶液に注射用水を加え、全量を320mLとし、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００７７】
実施例１８
実施例１７で得られた調製液23mLにＤ−マンニトール2.31gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００７８】
実施例１９
実施例１７で得られた調製液23mLにＤ−ソルビトール2.31gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００７９】
実施例２０
実施例１７で得られた調製液23mLにキシリトール2.31gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８０】
実施例２１
実施例１７で得られた調製液23mLにトレハロース2.30gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８１】
実施例２２
実施例１７で得られた調製液23mLにブドウ糖2.29gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８２】
実施例２３
実施例１７で得られた調製液23mLに果糖2.31gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８３】
実施例２４
実施例１７で得られた調製液23mLに白糖2.30gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８４】
実施例２５
実施例１７で得られた調製液23mLにグリシン2.29gを加え、撹拌した後、0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８５】
実施例２６
実施例１７と同様な方法で得られた調製液24mLに0.01mol/L水酸化ナトリウム水溶液40μLを加えた。この水溶液のpHは、5.0であった。この水溶液を0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８６】
実施例２７
実施例１７と同様な方法で得られた調製液24mLに0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液100μL、0.01mol/L水酸化ナトリウム水溶液40μLおよび0.1mol/L塩酸95μLを加えた。この水溶液のpHは、5.0であった。この水溶液を0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８７】
実施例２８
実施例１７と同様な方法で得られた調製液24mLに1%メグルミン水溶液10μLを加えた。この水溶液のpHは、5.0であった。この水溶液を0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８８】
実施例２９
実施例１７と同様な方法で得られた調製液24mLに10%メグルミン水溶液20μL、1%メグルミン水溶液5μLおよび0.1mol/L塩酸10μLを加えた。この水溶液のpHは、5.0であった。この水溶液を0.22μmメンブランフィルターでろ過し、調製液を得た。この調製液2mLをバイアルに充填し、凍結乾燥した後、密栓し、凍結乾燥製剤を得た。
【００８９】
実施例３０
実施例１で得られた液剤10mLに1mol/L塩酸50μLおよび0.1mol/L塩酸350μLを加え、液剤を得た。この液剤のpHは、pH2.0であった。
【００９０】
実施例３１
実施例１で得られた液剤10mLに1mol/L水酸化ナトリウム水溶液300μLを加え、液剤を得た。この液剤のpHは、9.0であった。
【００９１】
実施例３２
実施例１で得られた液剤10mLにクエン酸１水和物20mgおよび10%クエン酸１水和物水溶液225μLを加え、液剤を得た。この液剤のpHは、2.0であった。
【００９２】
実施例３３
実施例１で得られた液剤10mLにメグルミン100mgを加え、液剤を得た。この液剤のpHは、9.0であった。
【００９３】
実施例３４〜７５
以下の実験手順に従って、実施例３４〜７５の液剤を得た。
表中の各略号は、以下の意味を有する。
Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ：Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
ＢｎＯＨ：ベンジルアルコール
ＤＭＡｃ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＢｕ（ｔ）ＨＣｌ：Ｌ−フェニルアラニンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｔｒｐ：トリプトファン
β−Ａｌａ−ＯＢｕ（ｔ）ＨＣｌ：β−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩
【００９４】
実験手順Ａ
化合物Ａ１水和物、生理食塩水または注射用水、および、可溶化剤を混合した後、室温で撹拌し、液剤を得た。この液剤を室温で2時間静置したところ、析出物は認められなかった。
【００９５】
実験手順Ｂ
化合物Ａ１水和物、生理食塩水または注射用水、および、可溶化剤を混合し、超音波処理を行って分散させた。この混合物を40〜50℃に加温し、化合物Ａ１水和物を溶解させた後、室温まで放置し、液剤を得た。この液剤を室温で2時間静置したところ、析出物は認められなかった。
【００９６】
【表１】
2016039433.tif 000014
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
【表４】
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【０１００】
【表５】
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【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
試験例１  緑膿菌ＬｐｘＣ酵素阻害活性評価試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
緑膿菌ＬｐｘＣ酵素活性は、ＬｐｘＣとその基質であるＵＤＰ−３−Ｏ−（Ｒ−３−ヒドロキシデカノイル）−Ｎ−アセチルグルコサミンを反応させ、その反応生成物の量を生成物に存在するアミノ基を定量することによって測定した。この測定は、国際公開第１１／１３２７１２号パンフレットなどに記載された方法またはそれに準じた方法にしたがって実施した。
具体的には、緑膿菌ＬｐｘＣ酵素（緑膿菌から染色体ＤＮＡを調製し、ＬｐｘＣ特異的プライマーを用いたＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）により緑膿菌ＬｐｘＣ遺伝子を取得し、これをベクターに組み込み、大腸菌を用いて発現して取得した。）に20μmol/LのＵＤＰ−３−Ｏ−（Ｒ−３−ヒドロキシデカノイル）−Ｎ−アセチルグルコサミン（和光純薬）を加え、25℃で1時間インキュベートした。この反応は、0.02％ブリッジ３５および80μmol/L−ジチオトレイトールを含む40mmol/L−ヘペス緩衝液（pH8.0）中で実施した。反応液に20％酢酸（終濃度として0.95％）を添加して反応を終了後、無水ジオキサンに溶解したフルオレサミン（終濃度として1.6mg/mL）を添加し、反応生成物の量を励起波長/蛍光波長＝390nm/495nmで検出した。様々な濃度の試験化合物を前記反応中に共存させることにより、阻害曲線を得た。その阻害曲線から反応生成物の量が50％抑制される際の試験化合物の濃度（IC50値）を求め、緑膿菌ＬｐｘＣ酵素阻害活性の指標とした。
その結果、試験化合物のIC50値は、いずれも50nM未満であった。
試験化合物は、優れた緑膿菌ＬｐｘＣ酵素阻害活性を示した。
【０１０３】
試験例２  抗菌活性評価試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
最小発育阻止濃度（MIC）測定は、ＣＬＳＩ（クリニカル  アンド  ラボラトリー  スタンダーズ  インスティテュート）標準法に準じ、下記に示す微量液体希釈法を用いた。
細菌として、緑膿菌ATCC27853株を用いた。
ミューラーヒントン寒天培地で一晩培養した被検菌体を掻き取り、マクファーランド 0.5相当に懸濁し、これを10倍に希釈して接種菌液とした。接種菌液0.005mLを、試験化合物を含むカチオン調整ミューラーヒントン培地に接種し、35℃で16〜20時間培養した。菌の発育が肉眼的に認められない最小の薬剤濃度をMICとした。
その結果、試験化合物のMICは、いずれも1μg/mLであった。
試験化合物は、緑膿菌に対し、優れた抗菌活性を示した。
【０１０４】
試験例３  緑膿菌を用いたマウス全身感染防御試験
試験化合物として、化合物Ａおよび化合物Ｂを用いた。
マウスは、ＩＣＲ系雄性ＳＰＦマウス（4週齢：1群5匹）を使用した。
接種菌液は、ミュラー・ヒントン・アガー（Mueller-Hinton agar）平板上にて37℃で一夜培養した緑膿菌臨床分離株（S-3232株）をカチオン調整ミューラーヒントン培地で4時間培養後、10％ムチン／リン酸緩衝液で10倍に希釈し、調製した。
感染は、接種菌液0.5mL（約104CFU/mouse）をマウスの腹腔内に接種し、惹起した。試験化合物は、10％ＨＰβＣＤ／2.5％マンニトール水溶液で溶解し、12.5mg/kgを感染1時間後に一回皮下投与した。感染3日後に生存匹数を記録した。
その結果、試験化合物を投与しない対照群は、全例死亡したが、試験化合物を投与した群は、菌接種3日後において80％以上のマウスの生存が認められ、in vivoでの抗緑膿菌活性が認められた。また、試験化合物6.25mg/kgを投与した群は、菌接種3日後において80％以上のマウスの生存が認められ、in vivoでの優れた抗緑膿菌活性が認められた。
【０１０５】
試験例４  多剤耐性緑膿菌を用いたマウス全身感染防御試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
マウスは、ＩＣＲ系雄性ＳＰＦマウス（4週齢：1群5匹）を使用した。
種菌液は、ミュラー・ヒントン・アガー（Mueller-Hinton agar）平板上にて37℃一夜培養した多剤耐性緑膿菌臨床分離株（S-2838株）をカチオン調整ミューラーヒントン培地で5時間培養後、10％ムチン／リン酸緩衝液で10倍に希釈し、調製した。
感染は、接種菌液0.5mL（約106CFU/mouse）をマウスの腹腔内に接種し、惹起した。試験化合物は、10％ＨＰβＣＤ／2.5％マンニトール水溶液で溶解し、50mg/kgを感染1時間後に一回尾静脈内投与した。感染3日後に生存匹数を記録した。
その結果、試験化合物を投与しない対照群は、全例死亡したが、試験化合物を投与した群は、いずれも菌接種3日後において100％のマウスの生存が認められ、in vivoでの抗多剤耐性緑膿菌活性が認められた。また、試験化合物Ａを25mg/kgを投与した群は、菌接種3日後において60％以上のマウスの生存が認められ、in vivoでの優れた抗多剤耐性緑膿菌活性が認められた。
【０１０６】
試験例５  マウスにおける多剤耐性緑膿菌尿路感染モデル試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
マウスはＩＣＲ系雌性ＳＰＦマウス（5週齢：1群5匹）を使用した。
接種菌液は、ミュラー・ヒントン・アガー（Mueller-Hinton agar）平板上にて37℃一夜培養した緑膿菌臨床分離株（S-2838株）を滅菌生理食塩液に懸濁し、調製した。
感染は、接種菌液0.2mL（約103CFU/mouse）をマウスの尿道内に接種し、惹起した。試験化合物は、10％ＨＰβＣＤ／2.5％マンニトール水溶液で溶解し、25mg/kgを感染2時間後に一回尾静脈内投与した。感染翌日の腎内生菌数を記録して平均値を算出した。
その結果、試験化合物を投与した群は、試験化合物を投与しない対照群に比べ、いずれも2log CFU/kidney以上の腎内生菌数の低下が認められ、尿路感染モデルでの抗緑膿菌活性が認められた。また、試験化合物Ａを12.5mg/kgを投与した群は、試験化合物を投与しない対照群に比べ、2log CFU/kidney以上の腎内生菌数の低下が認められ、尿路感染モデルでの優れた抗緑膿菌活性が認められた。
【０１０７】
試験例６  マウスにおける多剤耐性緑膿菌肺感染モデル試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
マウスは、ＩＣＲ系雄性ＳＰＦマウス（感染時4.5週齢：1群5匹）を使用し、一過的な易感染状態にするため、感染4日前にシクロフォスファミド200mg/kgを腹腔内投与した。
接種菌液は、ミュラー・ヒントン・アガー（Mueller-Hinton agar）平板上にて37℃一夜培養した緑膿菌臨床分離株（S-2838株）を滅菌生理食塩液に懸濁し、調製した。
感染は、接種菌液0.05mL（約105CFU/mouse）をマウスの鼻腔内に接種し、惹起した。試験化合物は、10％ＨＰβＣＤ／2.5％マンニトール水溶液で溶解し、50mg/kgを感染2および8時間後に二回尾静脈内投与した。感染翌日の肺内生菌数を記録して平均値を算出した。
その結果、試験化合物を投与した群は、試験化合物を投与しない対照群に比べ、いずれも2log CFU/lung以上の肺内生菌数の低下が認められ、肺感染モデルでの抗緑膿菌活性が認められた。また、試験化合物Ａを25mg/kgを投与した群は、試験化合物を投与しない対照群に比べ、2log CFU/lung以上の肺内生菌数の低下が認められ、肺感染モデルでの優れた抗緑膿菌活性が認められた。
【０１０８】
試験例７  ベロ（Vero）細胞増殖抑制試験
試験化合物として、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃを用いた。
試験化合物をジメチルスルホキシドで溶解し、E’MEMを用いて各濃度に調製した後に96ウエルマイクロプレートの各ウエルに0.1mLずつ分注した。Vero細胞懸濁液は、20％FBS添加E’MEMで3×104cells/mLに調製し、0.1mLを各ウエルに播種し、5％CO2、37℃で3日間培養した。培養終了時に1mg/mL ２，３−ビス−（２−メトシキ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−（（フェニルアミノ）カルボニル）−２Ｈ−テトラゾリウム＝インナーソルト＝モノナトリウム塩（XTT）および25μM フェナジン＝メトサルフェート（PMS）添加PBSを作製し、各ウエルに50μL添加した。約2時間後にマイクロプレートリーダーを用いて、450nmの吸光度を測定した。
試験化合物非添加コントロールおよび各々のウエルの吸光度比を計算し、細胞増殖を50％阻害する化合物の濃度（CC50；μg/mL）を計算した。
その結果、試験化合物のCC50は、いずれも100μg/mL以上であった。
【０１０９】
試験例８  hERG阻害活性の評価
試験化合物として、化合物Ａおよび化合物Ｃを用いた。
hERG遺伝子（human ether-a-go-go related gene）を導入したHEK 293細胞（human embryo kidney 293 cell，CYTOMYX社）を用いた。
培養液は、10％牛胎児血清および1％非必須アミノ酸を含むMEM培地にGeneticinを400μg/mLの濃度になるよう加えたものを用いた。細胞は、炭酸ガス培養機中（37.0℃，5％CO2）で培養した。
hERG電流の測定は、ホールセルクランプ法により行った。測定用細胞を接着させたカバーガラスをディッシュに入れ、灌流液（組成（mmol/L）：NaCl 137，KCl 4，HEPES 10，CaCl2 1.8，MgCl2 1，glucose 10，pH 7.4）を2mL/minの速度で灌流した。灌流槽内の温度は、25℃に維持した。内液（組成（mmol/L）：KCl 130，MgCl2 1，EGTA 5，HEPES 10，MgATP 5，pH 7.2）を充填したガラス電極（2.0〜8.0MΩ）に細胞を接触させ、パッチ膜を破った後、パッチクランプソフトpClamp 10（Molecular Devices Corporation）を介してパッチクランプアンプ（EPC-7 Plus，HEKA）によりhERG電流を測定した。パルスプロトコールは、保持電位-80mV、脱分極パルス+20mVで1.5秒間、再分極パルス-50mVで1.5秒間とし、安定した電流波形が得られることを確認した後、試験化合物を適用した。
適用前および適用10分後のhERG電流波形におけるTail電流のピーク値を解析し、適用前に対する適用10分後の比率（相対値，％）を算出した。
その結果、試験化合物は、いずれも300μmol/LまでhERG阻害活性を示さなかった。
【０１１０】
試験例９  遺伝毒性の有無を調べるためのin vitro小核試験
試験化合物として、化合物Ａを用いた。
試験化合物の培養細胞に対する染色体異常誘発性の有無を調べるため、in vitro小核試験を実施した。試験は、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞（CHL/IU細胞）を用い、短時間処理法（代謝活性化系存在下および非存在下）および30時間処理法で実施した。なお、試験化合物の濃度は、「医薬品の遺伝毒性試験及び解釈に関するガイダンス」を参考に1.00mmol/Lを最高用量に設定した。標本観察は、0.25、0.50および1.00mmol/Lの用量について実施した。
60mmディッシュ（IWAKI）に15×104の細胞を播種し、10％新生仔ウシ血清（Sigma-Aldrich Co.）および50U/mL・50μg/mLのPenicillin・Streptomycin（Sigma-Aldrich Co.）を含むＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich Co.）を用いて37℃、5％CO2で24時間前培養した。前培養終了後に媒体（DMSO）または試験化合物を添加した。短時間処理法では、6時間培養後にPBS(-)（Sigma-Aldrich Co.）で細胞を洗浄した後、新しい培地と交換し、さらに24時間培養した。30時間処理法では、試験化合物を添加後、30時間培養した。培養終了後に0.05％トリプシン−EDTA溶液（Sigma-Aldrich Co.）で細胞を剥離した。遠心分離後に上清を除去し、0.075mol/L塩化カリウム水溶液を3mL加え、室温で5分間低張処理を行った後、氷冷した固定液（メタノール：酢酸＝19：1）で細胞を固定し、スライドグラス標本（ギムザ染色（Merck））を作製した。1用量当たり2000個の細胞を観察し、小核を有する細胞数を計測した。試験化合物群の小核出現頻度が、媒体対照群と比較して統計学的有意に増加した場合を陽性とし、媒体対照と同等な場合を陰性とした。
その結果、いずれの処理方法においても、試験化合物は、1mmol/L以下の用量で陰性であった。
【０１１１】
試験例１０  血漿中タンパク結合率測定
試験化合物として、化合物Ａおよび化合物Ｃを用いた。
ヒト血清に試験化合物を加えて、1μg/mLの化合物添加血清を調製し、室温で1時間以上静置した。遠心限外ろ過法（分画分子量10,000、1500×g、25℃、10分間）により、ろ液を20μL採取し、ヒト血清および内標準溶液（フロセミド−アセトニトリル溶液）を加えた。化合物添加血清には、PBSおよび内標準溶液を加えた。攪拌後、遠心分離し、上清中の濃度をLC-MS/MSにて定量した。
下記の計算式を用いて蛋白結合率を求めた。
蛋白結合率（％）＝（１−（ろ液の濃度）／（化合物添加血清の濃度））×１００
その結果、試験化合物のタンパク結合率は、いずれも80％以下であった。
【０１１２】
試験例１１  ヒトにおける肝薬物代謝酵素の阻害作用
試験化合物として、化合物Ａおよび化合物Ｃを用いた。
ヒトのプールド肝ミクロソームを用いた。基質およびその最終添加濃度、陽性対照およびその最終添加濃度は、表７および８の通りである。反応は、リン酸緩衝液中（100mmol/L、pH7.4）で行い、反応系の最終濃度は、ヒト肝ミクロソームタンパク0.5mg/mL、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（NADP+）1.55mmol/L、グルコース６リン酸3.3mmol/L、塩化マグネシウム3.3mmol/L、グルコース６リン酸脱水素酵素（G6PDH）0.4Units/mLとした。反応液中の各化合物の最終濃度は100μMとした。これらの反応液を37℃で30分間プレインキュベーションした後、基質を添加して37℃で10分間反応させた。1.5倍容積の内標準物質溶液（0.25mmol/L dextrorpHan, 2％ formic acidアセトニトリル溶液）で反応を停止後、遠心分離し、上清中の代謝物濃度をLC-MS/MSにて定量した。
下記の計算式を用いて阻害剤添加時の阻害活性率を求めた。
阻害活性率（％）＝（１−（試験化合物存在下でのCYP代謝物濃度）／（試験化合物非存在下でのCYP代謝物濃度））×１００
その結果、試験化合物の阻害活性率は、いずれも30％以下であった。
【０１１３】
【表７】
2016039433.tif 000020
【０１１４】
【表８】
2016039433.tif 000021
【０１１５】
試験例１２  安定性試験
実施例２〜１３および３０〜３３で得られた液剤を25℃、24時間保存した。保存後の化合物Ａの濃度をＨＰＬＣ法により測定し、残存率を求めた。また、保存後のpHを測定した。
結果を表９に示す。
【０１１６】
残存率は、以下の式によって求めた。
残存率（％）＝（保存後の化合物Ａの濃度／試験開始時の化合物Ａの濃度）×100
【０１１７】
＜ＨＰＬＣ測定条件＞
検出器：ＬＣ−２０１０ＣＨＴ（島津製作所）
測定波長：254nm
カラム：XBridge C18 4.6×150mm（Waters）
プレカラム：Develosil ODS-HG 4.0×10mm(野村化学)
カラム温度：40℃
流速：1.0mL/分
移動相Ａ：水/（0.2mol/Lギ酸緩衝液(pH3)）＝90/10
移動相Ｂ：アセトニトリル/（0.2mol/Lギ酸緩衝液(pH3)）＝90/10
グラジエントサイクル:0min（Ａ液/Ｂ液＝90/10）、15min（Ａ液/Ｂ液＝70/30）、20min（Ａ液/Ｂ液＝0/100）、30min（Ａ液/Ｂ液＝0/100）
【０１１８】
【表９】
2016039433.tif 000022
【０１１９】
実施例の液剤の残存率は、90％以上であった。特に、pHが3〜8である実施例の液剤の残存率は、95％以上であった。実施例の液剤は、安定であった。
【０１２０】
試験例１３  溶解度試験
試験化合物として、化合物Ａ１水和物を用いた。
ＣＤまたはＣＤ誘導体の10％溶液5mLに、化合物Ａ１水和物約100mgを加え、室温で24時間撹拌した。αＣＤ、ＨＰαＣＤ、ＤＭβＣＤおよびメチル−β−シクロデキストリンを用いた溶液には、6時間後に化合物Ａ１水和物約100mgを追加した。遠心分離（3000rpm、10分）した後、上澄みをフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ法により溶解度を測定した。
結果を表１０に示す。
【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
ＣＤまたはＣＤ誘導体によって、化合物Ａは、優れた溶解性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のヒドロキサム酸誘導体またはその塩および可溶化剤を含有する医薬組成物は、強い抗菌活性を示し、優れた溶解性を有し、医薬として有用である。
【国際調査報告】
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