(57)【要約】  結合核酸分子を使用して、容易にターゲットの分析を行える新たな方法およびそれに用いる分析キットを提供する。  本発明の分析方法は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含む。
2015045593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、
前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、
前記酵素反応を検出する検出工程、および、
前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とするターゲットの分析方法。
【請求項２】
前記複合体形成工程の後、
さらに、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を有する、請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記分離工程において、前記複合体形成の反応系と、固定化した結合物質とを接触させ、前記結合物質に前記複合体を結合させることで、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離し、
前記結合物質が、前記ターゲットに結合する結合物質である、請求項２記載の分析方法。
【請求項４】
前記分離工程において、前記結合物質に前記複合体を結合させた後、前記固定化した結合物質を洗浄し、未反応の前記結合核酸分子を除去する、請求項３記載の分析方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体画分をヌクレアーゼ処理し、前記複合体から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項２記載の分析方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体以外の画分をヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項２記載の分析方法。
【請求項７】
前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、
前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、
前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項８記載の分析方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系を、ヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
【請求項１１】
前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
【請求項１２】
前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリッド形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
【請求項１３】
前記複合体形成工程後、さらに、前記複合体形成工程の反応系から、遊離された前記一本鎖核酸分子を分離する分離工程を有し、
前記ヌクレアーゼ処理工程において、分離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１２記載の分析方法。
【請求項１４】
前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１５】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１７】
前記アデノシンヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である、請求項１６記載の分析方法。
【請求項１８】
前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１９】
前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２０】
前記酵素処理工程において、試薬の存在下、前記酵素反応を行い、
前記試薬が、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２１】
前記検出工程において、前記酵素反応により生じるシグナル、または、前記酵素反応により消失するシグナルを検出する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である、請求項２０または２１記載の分析方法。
【請求項２３】
前記担体が、ビーズまたはプレートである、請求項８、９および１２のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２４】
ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、請求項１から２３のいずれか一項に記載のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする分析キット。
【請求項２５】
前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項２４記載の分析キット。
【請求項２６】
前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である、請求項２４または２５記載の分析キット。
【請求項２７】
前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、
前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項２６記載の分析キット。
【請求項２８】
前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する、請求項２４記載の分析キット。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである、請求項２８記載の分析キット。
【請求項３０】
前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する、請求項２４記載の分析キット。
【請求項３１】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項３２】
前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドである、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項３３】
前記アデノシンヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である、請求項３２記載の分析キット。
【請求項３４】
前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項３５】
前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項２４から３４のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項３６】
さらに、試薬を含み、
前記試薬が、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である、請求項２４から３５のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項３７】
前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である、請求項３６記載の分析キット。
【請求項３８】
前記担体が、ビーズまたはプレートである、請求項２６、２７および３０のいずれか一項に記載の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットの分析方法および分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲットの検出において、近年、ターゲットに特異的に結合する抗体に代えて、ターゲットに特異的に結合する結合核酸分子（いわゆるアプタマー）を備えるセンサの利用が試みられている。前記センサとしては、例えば、前記結合核酸分子へのターゲットの結合を判断するために、前記結合核酸分子と、酸化還元反応の触媒能を示すＤＮＡ（以下、ＤＮＡｚｙｍｅという）とを連結したセンサが報告されている（非特許文献１）。このセンサは、ターゲット非存在下では、前記結合核酸分子とＤＮＡｚｙｍｅとが自己会合して、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を阻害され（ＯＦＦ）、ターゲット存在下では、ターゲットと前記アプタマーとの接触により、前記自己会合が解除され、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能が生起される（ＯＮ）。このため、ターゲットが存在すれば、触媒能が生起されたＤＮＡｚｙｍｅにより、酸化還元反応が生じるため、前記反応を測定することで、間接的にターゲットを分析できる。【０００３】
しかしながら、前記センサは、前記センサにおけるＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存在下およびターゲットの非存在下で、ＯＮ−ＯＦＦに制御する必要がある。また、前記センサを用いた分析において、分析感度をさらに向上させるには、例えば、より強い触媒能を示すＤＮＡｚｙｍｅを使用する必要がある。【０００４】
また、前記結合核酸分子（アプタマー）を使用するＥＬＡＡ（Enzyme‐linked  Aptamer  Assay）は、たとえばビオチンで標識した前記結合核酸分子を使用し、ストレプトアビジンを融合した西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を、前記ビオチン標識化核酸分子に結合させ、各酵素の基質を検出することで、前記結合核酸分子へのターゲットの結合を分析する方法である。しかしながら、前記結合核酸分子への標識化が必須であり、また、分析感度をさらに向上させるには、例えば、様々な条件設定改良が必要となる。【０００５】
このように、前記センサを使用する場合、さらに優れた形態とするには、様々な改良が必要となる。【０００６】
このため、前記結合核酸分子を用いて、容易にターゲットを検出でき、また、分析感度の向上も容易に実現できる方法の提供が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Carsten  Tellerら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００９，  ８１，  ９１１４−９１１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、結合核酸分子を使用して、容易にターゲットの分析を行える新たな方法およびそれに用いる分析キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のターゲットの分析方法は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の分析キットは、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の分析方法によれば、前記ターゲットと前記結合核酸分子との複合体を形成させ、前記複合体の画分または前記複合体以外の画分からの核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素反応を行うことで、容易に、ターゲットを検出できる。この方法によれば、例えば、前述のようにアプタマーにＤＮＡｚｙｍｅを連結させる必要がなく、このため、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存否によってＯＮ−ＯＦＦ制御することも不要である。また、本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に実施できる。本発明は、アプタマーを使用するターゲットの検出方法であるため、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の分析方法の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。
【図４】図４は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。
【図５】図５は、実施例１における発光量を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２における発光量を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３における発光量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の分析方法は、例えば、前記複合体形成工程の後、さらに、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を有する。
【００１５】
本発明の分析方法は、例えば、前記分離工程において、前記複合体形成の反応系と、固定化した結合物質とを接触させ、前記結合物質に前記複合体を結合させることで、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離し、前記結合物質が、前記ターゲットに結合する結合物質である。
【００１６】
本発明の分析方法は、例えば、前記分離工程において、前記結合物質に前記複合体を結合させた後、前記固定化した結合物質を洗浄し、未反応の前記結合核酸分子を除去する。
【００１７】
本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体画分をヌクレアーゼ処理し、前記複合体から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００１８】
本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体以外の画分をヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００１９】
本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
【００２０】
本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である。
【００２１】
本発明の分析方法は、例えば、前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系を、ヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００２３】
本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００２４】
本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリッド形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００２５】
本発明の分析方法は、例えば、前記複合体形成工程後、さらに、前記複合体形成工程の反応系から、遊離された前記一本鎖核酸分子を分離する分離工程を有し、前記ヌクレアーゼ処理工程において、分離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
【００２６】
本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである。
【００２７】
本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである。
【００２８】
本発明の分析方法は、例えば、前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドであり、前記アデノシンヌクレオチドが、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である。
【００２９】
本発明の分析方法は、例えば、前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体例は、ルシフェラーゼである。
【００３０】
本発明の分析方法は、例えば、前記酵素処理工程において、試薬の存在下、前記酵素反応を行い、前記試薬が、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である。
【００３１】
本発明の分析方法は、例えば、前記検出工程において、前記酵素反応により生じるシグナル、または、前記酵素反応により消失するシグナルを検出する。
【００３２】
本発明の分析方法は、例えば、前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である。
【００３３】
本発明の分析方法は、例えば、前記担体が、ビーズまたはプレートである。
【００３４】
本発明の分析キットは、例えば、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。
【００３５】
本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
【００３６】
本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である。
【００３７】
本発明の分析キットは、例えば、前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
【００３８】
本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する。
【００３９】
本発明の分析キットは、例えば、前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである。
【００４０】
本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する。
【００４１】
本発明の分析キットは、例えば、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである。
【００４２】
本発明の分析キットは、例えば、前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドであり、前記アデノシンヌクレオチドが、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である。
【００４３】
本発明の分析キットは、例えば、前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体例として、ルシフェラーゼである。
【００４４】
本発明の分析キットは、例えば、さらに、試薬を含み、前記試薬が、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である。
【００４５】
本発明の分析キットは、例えば、前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である。
【００４６】
本発明の分析キットは、例えば、前記担体が、ビーズまたはプレートである。
【００４７】
＜ターゲットの分析方法＞
本発明のターゲットの分析方法は、前述のように、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
【００４８】
前記複合体形成工程において、前記結合核酸分子は、特に制限されず、ターゲットに結合する核酸分子であればよい。前記結合核酸分子は、例えば、アプタマーともいう。
【００４９】
前記ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を使用すればよい。前記ターゲットは、例えば、微生物、ウイルス、低分子化合物、食物アレルゲン、農薬、カビ毒等が例示できる。
【００５０】
前記結合核酸分子は、例えば、一本鎖でもよいし二本鎖でもよく、好ましくは一本鎖である。前記結合核酸分子の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１８塩基長、２０塩基長、２４塩基長であり、上限は、例えば、１２０塩基長、６０塩基長、２６塩基長である。
【００５１】
前記複合体形成工程において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、ターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。
【００５２】
前記ヌクレアーゼ処理工程は、例えば、前記複合体の画分のみにヌクレアーゼ処理を行ってもよいし、前記複合体以外の画分のみにヌクレアーゼ処理を行ってもよいし、前記複合体形成工程における反応系（すなわち、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との混合系）にヌクレアーゼ処理を行ってもよい。
【００５３】
前記複合体の画分のみ、または、前記複合体以外の画分のみにヌクレアーゼ処理を行う場合、本発明は、前記複合体形成工程の後、前記ヌクレアーゼ処理工程の前に、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を含むことが好ましい。
【００５４】
前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する方法は、特に制限されず、例えば、担体と複合体とを結合させ、前記担体の回収により、前記複合体の画分を回収し、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離することができる。前記担体と前記複合体との結合は、例えば、直接的な結合でもよいし、間接的な結合でもよい。前者は、例えば、予め前記結合核酸分子を担持させた前記担体を使用できる。この場合、前記担体に担持された前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成することにより、前記担体に、前記複合体を直接的に結合できる。また、後者は、例えば、前記ターゲットに結合する結合物質を担持させた前記担体が使用できる。この場合、前記ターゲットと前記結合核酸分子とが複合体を形成し、前記担体に担持された前記結合物質に、前記複合体における前記結合核酸分子が結合することにより、前記担体に、前記結合物質を介して、前記複合体を間接的に結合できる。
【００５５】
前記担体は、特に制限されず、例えば、ビーズ、プレート等の容器等があげられる。前記結合物質は、特に制限されず、例えば、前記結合核酸分子に対する結合核酸分子、抗体等があげられる。
【００５６】
前記担体を使用する場合、前記複合体の画分とそれ以外の画分との分離方法は、特に制限されず、例えば、固液分離があげられる。前記担体が前記容器の場合、前記容器内から、液体画分を採取することで、前記容器内の残存各分を、前記複合体の画分、採取した液体画分を、前記複合体以外の画分とすることができる。また、前記担体が前記ビーズの場合、前記反応系を固体画分と液体画分とに分離することで、前者を、前記複合体の画分、後者を、前記複合体以外の画分とすることができる。前記固体画分と前記液体画分との分離は、例えば、ろ過による分離、遠心分離、静置による分離等があげられる。
【００５７】
本発明が前記分離工程を含み、前記複合体の画分についてヌクレアーゼ処理を行う場合、本発明は、例えば、さらに、前記分離工程と前記ヌクレアーゼ処理工程との間に、前記複合体の画分を洗浄する工程を含んでもよい。前記複合体の画分を洗浄することによって、例えば、複合体の形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子の混入を抑制し、さらに精度に優れる分析が可能になる。
【００５８】
前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記ヌクレアーゼは、特に制限されず、ポリヌクレオチドから核酸モノマーを遊離する酵素であればよい。前記ヌクレアーゼは、例えば、前記ポリヌクレオチドの末端から核酸モノマーを遊離するエキソヌクレアーゼが好ましく、前記ポリヌクレオチドの３’末端からの遊離でもよいし、前記ポリヌクレオチドの５’末端からの遊離でもよい。前記エキソヌクレアーゼとしては、例えば、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＢＡＬ３１、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  III、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  VII、λエキソヌクレアーゼ等があげられる。前記ヌクレアーゼは、例えば、ＲＮＡに作用するリボヌクレアーゼ、ＤＮＡに作用するデオキシリボヌクレアーゼ、両方に作用するヌクレアーゼのいずれでもよい。
【００５９】
前記ヌクレアーゼによって切り出される核酸モノマーは、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における糖残基は、例えば、リボース残基でも、デオキシリボース残基でもよく、前者の場合、前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基であり、後者の場合、前記ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等があげられる。また、前記ヌクレオチド残基におけるリン酸基は、特に制限されず、例えば、一リン酸でも、二リン酸があげられる。前記核酸モノマーの具体例としては、例えば、ＡＭＰ、デオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）等があげられる。
【００６０】
前記酵素処理工程において、前記酵素は、特に制限されず、前記核酸モノマーを基質とする反応を触媒するタンパク質であればよい。前記酵素は、特に制限されず、例えば、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質等があげられ、好ましくはルシフェラーゼである。
【００６１】
前記酵素は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程で切り出される核酸モノマーの種類に応じて、適宜設定できる。
【００６２】
前記酵素処理工程は、例えば、試薬の存在下で、前記酵素反応を行ってもよい。前記試薬は、例えば、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬でもよいし、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬でもよい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルでもよいし、電気的シグナルでもよい。
【００６３】
前記ヌクレアーゼ処理工程と前記酵素処理工程との順序は、特に制限されず、前記ヌクレアーゼ処理工程の後に前記酵素処理工程を行ってもよいし、前記両工程を同時に行ってもよい。
【００６４】
また、本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記ヌクレアーゼ処理工程で切り出された前記核酸モノマーについて、リン酸基が三リン酸であるヌクレオチドへの変換処理工程を含むことが好ましい。具体的には、前記ヌクレアーゼ処理工程で、一リン酸または二リン酸のヌクレオチドが前記核酸モノマーとして切り出された場合、例えば、前記変換処理工程において、前記核酸モノマーを、三リン酸のヌクレオチドに変換する。前記変換処理工程を含むことによって、さらに感度を向上できる。
【００６５】
前記変換処理工程において、前記三リン酸のヌクレオチドへの変換は、例えば、一リン酸または二リン酸のヌクレオチドを三リン酸のヌクレオチドに変換する変換酵素が使用できる。前記変換酵素は、特に制限されず、例えば、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ等があげられる。
【００６６】
前記変換処理工程において、前記核酸モノマーを三リン酸のヌクレオチドに変換した場合、前記酵素処理工程においては、前記三リン酸のヌクレオチドを基質とする酵素を使用することが好ましい。前記三リン酸のヌクレオチドを基質とする酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ等が使用できる。
【００６７】
前記ヌクレアーゼ処理工程と前記変換処理工程と前記酵素処理工程との順序は、特に制限されず、この順序で行ってもよいし、前記ヌクレアーゼ処理工程と前記変換処理工程を同時に行ってもよいし、前記変換処理工程と前記酵素処理工程を同時に行ってもよいし、前記３工程を同時に行ってもよい。
【００６８】
前記検出工程において、前記酵素の酵素反応の検出は、特に制限されない。前記検出は、例えば、前記酵素反応による前記基質の減少を、直接的または間接的に検出することで行うことができる。後者は、例えば、前記酵素反応により生じるシグナルの検出であり、具体例として、例えば、前記酵素反応により前記試薬から生じたシグナルでもよい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルでもよいし、電気的シグナルでもよい。
【００６９】
前記光学的シグナルは、例えば、発光、蛍光、発色等のシグナルがあげられる。前記光学シグナルは、例えば、発光、蛍光、発色等を目視観察で検出してもよいし、発光強度、蛍光強度、吸光度、反射率等をシグナルとして、光学的手法で検出することもできる。
【００７０】
前記電気的シグナルは、例えば、電流等があげられる。前記電気的シグナルは、例えば、電気的手法により検出できる。
【００７１】
前記分析工程は、前記検出工程における前記酵素反応の検出結果から、前記複合体画分に含まれる前記ターゲットを分析する工程である。前記酵素反応の検出結果は、例えば、前記複合体の画分に対する酵素反応の結果でもよいし、前記複合体以外の画分に対する酵素反応の結果でもよいし、前記複合体形成工程における反応系（すなわち、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との混合系）に対する酵素反応の結果でもよい。
【００７２】
本発明の分析方法の具体例として、以下に、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との分離を行う実施形態１と、前記２つの画分の分離を行わない実施形態２と、前記結合核酸分子と、前記結合核酸分子に対する相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する実施形態３をあげて説明する。なお、本発明は、これらの実施形態には制限されない。また、各実施形態は、特に示さない限り、他の実施形態にも援用できる。
【００７３】
（１）実施形態１
本発明の実施形態１は、前述のように、前記複合体形成工程後、前記複合体形成工程の反応系から、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する形態であり、例えば、以下の実施形態１Ａ、１Ｂおよび１Ｃが例示できる。
【００７４】
まず、本発明の実施形態１Ａは、前記複合体の画分についてヌクレアーゼ処理を施す形態であり、具体的には、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程、前記複合体の画分から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００７５】
本実施形態１Ａでは、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離していることから、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体における前記結合核酸分子から核酸モノマーが遊離され、酵素処理工程において、前記遊離した前記核酸モノマーを基質として酵素反応が行われる。このため、前記検出工程における前記酵素反応の検出結果は、前記複合体の検出結果となり、間接的に、前記複合体に含まれるターゲットの検出結果となる。
【００７６】
本実施形態１Ａにおいては、前記結合核酸分子として、ポリヌクレオチド（以下、付加ポリヌクレオチドともいう）が付加された結合核酸分子を使用することが好ましい。前記ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用することにより、例えば、前記複合体における前記結合核酸分子から遊離される核酸モノマーの数を増加できる。前記遊離した核酸モノマーは、前記酵素処理工程における基質となるため、遊離される前記核酸モノマーの数の増加に伴って、検出感度をさらに向上できる。
【００７７】
前記結合核酸分子に付加されたポリヌクレオチドは、特に制限されない。前記付加ポリヌクレオチドの長さは、下限が、例えば、０塩基、１０塩基、２０塩基であり、上限が、例えば、１０００塩基、２００塩基、２０塩基である。
【００７８】
前記付加ポリヌクレオチドを構成する核酸モノマーの種類は、特に制限されず、例えば、前記酵素処理工程で使用する酵素の基質特異性に応じて、適宜決定できる。前記付加ポリヌクレオチドにおいて、前記核酸モノマーは、それぞれ、例えば、ホスホジエステル結合により連結されている。前記核酸モノマーは、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における糖残基は、例えば、リボース残基でも、デオキシリボース残基でもよく、前者の場合、前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基であり、後者の場合、前記ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等があげられる。また、前記ヌクレオチド残基におけるリン酸基は、特に制限されず、例えば、一リン酸でも、二リン酸でも、三リン酸でもよい。前記核酸モノマーの具体例としては、例えば、ＡＭＰ、デオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）等があげられる。前記付加ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。前記付加ポリヌクレオチドは、中でも、ＡＭＰおよびデオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）の少なくとも一方から構成されていることが好ましく、より好ましくは、いずれか一種類のヌクレオチド残基から構成されている。
【００７９】
前記付加ポリヌクレオチドは、例えば、前記結合核酸分子の３’末端に付加されてもよいし、前記結合核酸分子の５’末端に付加されてもよい。前記結合核酸分子における付加の位置は、例えば、前記ヌクレアーゼの特性に応じて適宜決定できる。前記ヌクレアーゼが、例えば、５’末端から３’末端の方向に、前記核酸モノマーを遊離していく場合、前記付加ポリヌクレオチドは、前記結合核酸分子の５’末端に付加されていることが好ましく、前記ヌクレアーゼが、例えば、３’末端から５’末端の方向に、前記核酸モノマーを遊離していく場合、前記付加ポリヌクレオチドは、前記結合核酸分子の３’末端に付加されていることが好ましい。
【００８０】
本実施形態１Ａについて、図１を参照して、前記付加ポリヌクレオチドを付加した結合核酸分子を使用する例を説明する。図１は、本発明の実施形態１Ａの概略を示す模式図であり、（Ａ）−（Ｄ）は、各工程を示す。なお、図１は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記付加ポリヌクレオチドの大きさ等の条件は、これには制限されない。
【００８１】
まず、前記複合体形成工程において、図１（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料と、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２とを接触させる。これによって、図１（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記試料中のターゲット１１と、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２とが、複合体を形成する。この際、前記複合体形成に関与しなかった未反応の結合核酸分子１２も、前記反応液に共存する。
【００８２】
そして、前記分離工程において、図１（Ｃ）に示すように、前記反応液を、担体１４に固定化した結合物質１５と接触させる。結合物質１５は、ターゲット１１に結合する物質である。このため、図１（Ｃ）に示すように、前記反応液に含まれる前記複合体が、ターゲット１１と結合物質１５との結合を介して、担体１４に結合する。この際、前記未反応の結合核酸分子１２は、担体１４に結合することなく、前記反応液中で遊離状態となる。
【００８３】
つぎに、前記反応液について、前記複合体が結合した担体１４と、それ以外の画分とを分離する。具体的には、例えば、担体１４から液体画分を除去する。そして、担体１４にヌクレアーゼを添加し、ヌクレアーゼ処理を行う。これによって、図１（Ｄ）の左図に示すように、担体１４に結合した前記複合体における付加ポリヌクレオチド１３が分解され、核酸モノマー１３’が切り出される。
【００８４】
そして、付加ポリヌクレオチド１３から切り出された核酸モノマー１３’を、核酸モノマーを基質とする酵素で処理し、その酵素反応を検出する。これによって、前記試料中のターゲットを分析できる。
【００８５】
つぎに、本発明の実施形態１Ｂは、前記複合体以外の画分についてヌクレアーゼ処理を施す形態であり、具体的に、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程、前記複合体以外の画分から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００８６】
本実施形態１Ｂは、前記結合核酸分子への前記付加ポリヌクレオチドの付加が任意であり、前記複合体以外の画分についてヌクレアーゼ処理を行い、それにより遊離した核酸モノマーについて酵素処理を行い、前記酵素反応を検出する以外は、前記実施形態１Ａと同様にして行うことができ、前記実施形態１Ａの記載を援用できる。
【００８７】
本実施形態１Ｂの場合、前記複合体以外の画分には、前記複合体形成に関与しなかった未反応の前記結合核酸分子が含まれる。したがって、この未反応の前記結合核酸分子をヌクレアーゼ処理し、それにより遊離した核酸モノマーを検出することで、未反応の前記結合核酸分子を分析できる。未反応の前記結合核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
【００８８】
本実施形態１Ｂは、前記結合核酸分子として、前記付加ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用することが好ましい。前記ポリヌクレオチドが付加されていることにより、例えば、前記複合体における前記結合核酸分子から遊離される核酸モノマーの数を増加できる。前記遊離した核酸モノマーは、前記酵素処理工程における基質となるため、遊離される前記核酸モノマーの数の増加に伴って、検出感度をさらに向上できる。前記付加ポリヌクレオチドの条件は、特に制限されず、前記実施形態１Ａの例示を援用できる。
【００８９】
本実施形態１Ｂは、前記実施形態１Ａと同様に、図１を参照できる。前記実施形態１Ａと同様にして、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分を分離する。そして、前記複合体以外の画分に対してヌクレアーゼ処理を行うことによって、図１（Ｄ）の右図に示すように、未反応の核酸分子１２に付加された付加ポリヌクレオチド１３から、核酸モノマー１３’が切り出される。そして、この核酸モノマー１３’を、前記実施形態１Ａと同様に、酵素処理し、その酵素反応を検出する。これによって、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
【００９０】
前記実施形態１Ａおよび１Ｂについて、図１では、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２を示したが、前記実施形態１Ｂは、これには制限されず、例えば、付加ポリヌクレオチド１３が付加されていない結合核酸分子１２であってもよい。
【００９１】
つぎに、本発明の実施形態１Ｃは、前記結合核酸分子として、担体に担持された結合核酸分子を使用する形態であり、それ以外は、例えば、前記実施形態１Ａおよび１Ｂと同様である。
【００９２】
本実施形態１Ｃにおいて、前記担体に担持される結合核酸分子の個数は、特に制限されず、１分子でもよいし、２分子以上の複数分子であってもよい。ヌクレアーゼ処理によって遊離される核酸モノマー量を増加できることから、前記担体には、複数分子の前記結合核酸分子が担持されていることが好ましい。
【００９３】
前記担体は、例えば、結合核酸分子のみを担持してもよいし、ヌクレアーゼ処理によって遊離される核酸モノマー量を増加できることから、さらに、ポリヌクレオチドを担持してもよい。前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、前記実施形態１Ａに示すポリヌクレオチドが例示できる。
【００９４】
前記担体は、特に制限されず、前述のような担体が例示でき、中でも、ビーズが好ましい。
【００９５】
本実施形態１Ｃについて、図２を参照して、前記担体に担持された結合核酸分子を使用する例を説明する。図２は、本発明の実施形態１Ｃの概略を示す模式図であり、（Ａ）−（Ｄ）は、各工程を示す。なお、図２は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記付加ポリヌクレオチドの大きさ等の条件は、これには制限されない。
【００９６】
本実施形態１Ｃでは、前記複合体形成工程において、図２（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料と、担体２０とを接触させる。担体２０は、複数の結合核酸分子１２および複数のポリヌクレオチド１３を担持している。これによって、図２（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記試料中のターゲット１１と、担体２０が担持する結合核酸分子１２とが、複合体を形成する。この際、前記複合体形成に関与しなかった未反応の結合核酸分子１２も、前記反応液に共存する。その後は、前記実施形態１Ａおよび１Ｂと同様である。
【００９７】
図２に示すように、担体２０は、複数の結合核酸分子１２および複数のポリヌクレオチド１３を担持していることから、例えば、前記実施形態１Ａにおける前記複合体の画分のヌクレアーゼ処理によっても、前記実施形態１Ｂにおける前記複合体以外の画分のヌクレアーゼ処理によっても、多くの核酸モノマーを遊離できる。このため、より感度の高い分析が可能になる。
【００９８】
（２）実施形態２
本発明の実施形態２は、前述のように、前記複合体形成工程後、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離することなく、前記複合体形成工程の反応系についてヌクレアーゼ処理を施す形態である。
【００９９】
すなわち、本実施形態２は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【０１００】
本実施形態２においては、前記複合体と、前記複合体形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子とが共存する反応系について、前記ヌクレアーゼ処理を行う。しかしながら、前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成すると、前記複合体における前記結合核酸分子は、物理的障害が原因となり、前記ヌクレアーゼによって分解され難くなる。このため、前記反応系のヌクレアーゼ処理において、前記ヌクレアーゼによって、前記ターゲットに結合した前記結合核酸分子からは核酸モノマーが遊離せず、前記複合体形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子のみから核酸モノマーが遊離する。したがって、本実施形態２では、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分との分離が不要である。また、未反応の前記結合核酸分子のみから核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーを検出することで、未反応の前記結合核酸分子を分析できる。未反応の前記結合核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
【０１０１】
本実施形態においては、前記付加ポリヌクレオチドが付加されていない前記結合核酸分子を使用することが好ましい。前記付加ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用する場合、前記付加ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されないが、上限が、例えば、５塩基、３塩基、１塩基である。
【０１０２】
（３）実施形態３
本発明の実施形態３は、前述のように、前記結合核酸分子と、前記結合核酸分子に対する相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する形態であり、例えば、以下の実施形態３Ａおよび３Ｂが例示できる。
【０１０３】
まず、本発明の実施形態３Ａは、前述のように、前記結合核酸分子が、相補配列を含む前記一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体である形態であり、具体的には、前記ハイブリット形成体と試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリット形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させる複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【０１０４】
本実施形態３Ａでは、前記ヌクレアーゼ処理工程において、一本鎖の核酸を基質とするヌクレアーゼを使用することで、前記複合体からは核酸モノマーを遊離させることなく、前記ハイブリッド形成体より遊離した前記一本鎖核酸分子のみから、前記核酸モノマーを遊離することができる。そして、前記遊離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、それにより遊離した核酸モノマーを検出することで、前記ハイブリット形成体から遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できる。遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
【０１０５】
前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子に対する相補配列を有しており、前記結合核酸分子にハイブリダイズできればよい。前記一本鎖核酸分子の長さは、特に制限されず、前記結合核酸分子に応じて適宜設定できる。前記結合核酸分子の長さと前記一本鎖核酸分子の長さの比は、特に制限されず制限されず、前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子に対して、例えば、１分の１〜１０００分の１である。前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子のいずれの領域に結合してもよい。
【０１０６】
本実施形態３で使用するヌクレアーゼは、前述のように、一本鎖の核酸を基質とするヌクレアーゼであればよい。
【０１０７】
本実施形態３Ａについて、図３を参照して、前記結合核酸分子と前記一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する例を説明する。図３は、本発明の実施形態３の概略を示す模式図である。なお、図３は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記一本鎖核酸分子の大きさ等の条件は、これには制限されない。
【０１０８】
本実施形態３Ａでは、前記複合体形成工程において、図３（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料を、結合核酸分子１２と一本鎖核酸分子３０とのハイブリット形成体と接触させる。これによって、図３（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記ハイブリッド形成体における結合核酸分子１２は、前記試料中のターゲット１１と結合し、前記ハイブリット形成体における一本鎖核酸分子３０は、遊離する。そして、前記複合体と遊離した一本鎖核酸３０とを含む前記反応液を、一本鎖核酸を基質とするヌクレアーゼで処理することによって、図３（Ｃ）に示すように、前記複合体からは核酸モノマーが遊離せず、一本鎖核酸分子３０のみから核酸モノマー３０’が切り出される。そして、一本鎖核酸分子３０から遊離した核酸モノマー３０’について、酵素処理し、酵素反応を検出する。これによって、遊離した一本鎖核酸分子３０を検出でき、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
【０１０９】
つぎに、本実施形態３Ｂは、前記ハイブリッド形成体が、担体に担持された形態である。本実施形態３Ｂは、前記担体に担持された前記ハイブリット形成体を使用し、前記複合体形成工程後に、前記担体を含む固体画分と液体画分とを分離し、前記液体画分について、前記ヌクレオチド処理および酵素処理を行う以外は、前記実施形態３Ａと同様である。
【０１１０】
本実施形態３Ｂにおいては、前記固体画分、すなわち、前記担体を含む画分には、担持した結合核酸分子がターゲットと結合して複合体を形成した担体と、担持した結合核酸分子がターゲットと結合していない未反応の担体とが含まれ、他方、液体画分には、遊離した前記一本鎖核酸分子が含まれる。このため、前記液体画分をヌクレアーゼ処理し、核酸モノマーを遊離させ、これを酵素処理して、酵素反応を検出することで、前記ハイブリット形成体から遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できる。遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
【０１１１】
本実施形態３Ｂについて、図４を参照して、前記結合核酸分子と前記一本鎖核酸分子とのハイブリッド形成体を担持した担体を使用する例を説明する。図４は、本発明の実施形態３Ｂの概略を示す模式図である。なお、図４は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記一本鎖核酸分子の大きさ等の条件は、これには制限されない。
【０１１２】
本実施形態３Ｂでは、前記複合体形成工程において、図４（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料を、結合核酸分子１２と一本鎖核酸分子３０とのハイブリット形成体を担持する担体２０と接触させる。これによって、図４（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記ハイブリッド形成体における結合核酸分子１２は、前記試料中のターゲット１１と結合し、前記ハイブリット形成体における一本鎖核酸分子３０は、遊離する。つぎに、前記反応液を、担体２０を含む固体画分と、遊離した一本鎖核酸分子３０を含む液体画分に分離する。そして、遊離した一本鎖核酸分子３０をヌクレアーゼで処理することによって、図４（Ｄ）に示すように、一本鎖核酸分子３０から核酸モノマー３０’が切り出される。そして、一本鎖核酸分子３０から遊離した核酸モノマー３０’について、酵素処理し、酵素反応を検出する。これによって、遊離した一本鎖核酸分子３０を検出でき、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
【０１１３】
＜ターゲットの分析キット＞
本発明のターゲットの分析キットは、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に行うことができる。なお、本発明の分析キットは、前記本発明の分析方法の記載を援用できる。
【実施例】
【０１１４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１１５】
［実施例１］
ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーをルシフェラーゼで検出した。【０１１６】
核酸分子として、下記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｎ３０−０７９）を使用した。【０１１７】
Ｎ３０−０７９（配列番号１）
5’−GGATTGAACGCCGCCCTTATAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCAGGTCCAGTGCTCTCGTATAG−3’【０１１８】
前記核酸分子とＤＮＡエンドヌクレアーゼ（商品名ＢＡＬ３１  Ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＫＡＲＡ社製）とを下記表１の割合で混合し、３０℃で３０分間インキュベートすることによって、前記核酸分子から核酸モノマーを遊離した。【０１１９】
【表１】
2015045593.tif 000003
【０１２０】
前記ヌクレアーゼ処理後の反応液を、超純水で、所定倍率（１０１倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍または１０５倍）に希釈し、希釈試料を作製した。そして、前記希釈試料を、ＡＭＰ検査キット（商品名ルシパックペン、キッコーマン社製）に添加し、測定装置（商品名ルミテスターＰＤ−２０、キッコーマン社製）を用いて、前記希釈試料の相対的発光量を測定した。ネガティブコントロールは、１μｍｏｌ／ＬのＮ３０−０７９を前記ヌクレアーゼ処理しなかった以外は、同様にして相対的発光量を測定した。また、コントロールは、前記核酸分子に代えて、前記２×ＢＡＬ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた以外は、同様にして相対的発光量を測定した（Ｎ＝３）。【０１２１】
これらの結果を図５に示す。図５は、相対的発光量を示すグラフである。図５において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、相対的発光量を示し、図中の数値は、各サンプルの相対的発光量を示す。図５に示すように、ネガティブコントロールおよびコントロールでは、発光が測定されなかった。これに対し、前記希釈試料では、いずれの核酸分子を用いた場合においても、強い発光が測定された。これらの結果から、ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素と反応させることで、発光を測定できることがわかった。【０１２２】
［実施例２］
ヌクレアーゼとルシフェラーゼとを共存させることによって、核酸分子からの核酸モノマーの遊離と前記遊離した核酸モノマーの検出とを同時に行った。【０１２３】
Ｎ３０−０７９と前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとを、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１Ｕｎｉｔとした以外は、前記表１と同様の割合で混合し、試料とした。つぎに、前記試料を前記ＡＭＰ検査キットに添加し、２０分間静置した。そして、前記測定装置を用いて、１５秒毎に、前記試料の相対的発光量を測定した。【０１２４】
これらの結果を図６に示す。図６は、相対的発光量を示すグラフである。図６において、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、相対的発光量を示す。なお、前記反応時間は、前記試料を前記ＡＭＰ検査キットに添加した時を基準としている。図６に示すように、いずれの時間においても、強い発光が測定された。これらの結果から、ヌクレアーゼ処理工程と酵素処理工程とを同時に行っても、核酸分子を検出できることがわかった。【０１２５】
［実施例３］
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に結合する結合核酸分子（アプタマー）とＨＡとの複合体を形成し、ヌクレアーゼ処理によって前記複合体から核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーをルシフェラーゼで検出した。【０１２６】
インフルエンザウイルスのＨＡに結合するアプタマー（ＲＨＡ０００６）として、下記配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを使用した。前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリｄＡを付加した。つぎに、前記アプタマーを、１００ｎｍｏｌ／ＬとなるようにＴＢＳ緩衝液に混合した。前記ＴＢＳ緩衝液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、ｐＨ７．４とした。そして、前記アプタマー液を９５度で５分間熱処理し、さらに、５分間氷上で静置した。【０１２７】
ＲＨＡ０００６（配列番号２）
5’−GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA−3’【０１２８】
次に、ＨＡとして、インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）由来ＨＡを使用した。前記ＨＡを、ＴＢＳ緩衝液で、所定濃度（０、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５ｐｍｏｌ／Ｌ）となるように希釈し、希釈試料とした。【０１２９】
９６穴プレート（商品名  Nunc-Immuno（登録商標）  plate，  Maxisorp（登録商標）、Nunc社）に、前記希釈試料を、ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で１６時間吸着させた。前記ウェルを２００μＬの前記ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｅｅ（ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を２００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記静置後のアプタマー液を１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。そして、前記ウェルを２００μＬの前記ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。【０１３０】
次に、ＢＡＬ３１  Ｎｕｃｌｅａｓｅをウェルあたり２０μＬ（３Ｕｎｉｔｓ／ｗｅｌｌ）添加し、室温で２０分間インキュベートした。前記インキュベート後、前記ウェルの溶液をＡＭＰ検査キットに添加し、前記実施例１と同様に、相対的発光量を測定した（Ｎ＝３）。【０１３１】
これらの結果を図７に示す。図７は、相対的発光量を示すグラフである。図７において、横軸は、前記希釈試料におけるＨＡの濃度を示し、縦軸は、相対的発光量を示す。図７に示すように、０ｐｍｏｌ／Ｌの希釈試料では、発光が測定されないのに対し、前記希釈試料では、いずれのＨＡ濃度においても、発光が測定された。これらの結果から、結合核酸分子とターゲットとの複合体の画分から、ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素と反応させることで、発光を測定できることがわかった。【０１３２】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１３３】
この出願は、２０１３年９月３０日に出願された日本出願特願２０１３−２０５０５１を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明によれば、前記ターゲットと前記結合核酸分子との複合体を形成させ、前記複合体の画分または前記複合体以外の画分からの核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素反応を行うことで、容易に、ターゲットを検出できる。この方法によれば、例えば、前述のようにアプタマーにＤＮＡｚｙｍｅを連結させる必要がなく、このため、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存否によってＯＮ−ＯＦＦ制御することも不要である。また、本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に実施できる。本発明は、アプタマーを使用するターゲットの検出方法であるため、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
【図１】
2015045593.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2015045593000001.app
【国際調査報告】
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