(57)【要約】【課題】  抗腫瘍効果を向上させるとともに、副作用、特に骨髄抑制が低い核酸代謝拮抗剤の高分子化プロドラッグを提供することを課題とする。特に、腫瘍増殖阻害効果を長期に亘り発揮しつつ、骨髄抑制を遷延化しない核酸代謝拮抗剤を提供する。【解決手段】  多分岐高分子担体の末端官能基に、核酸代謝拮抗剤が結合した複数のコハク酸モノアミドユニット及びポリエチレングリコールセグメントを含む置換基を適切に具備することを特徴とする核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。当該多分岐化合物は、生体内に投与すると血中に滞留して体内分布しつつ、結合していた核酸代謝拮抗剤を適切な放出プロファイルにて作用させることができ、薬効を向上させつつ、副作用を回避することができる。特に核酸代謝拮抗剤の主たる副作用である骨髄抑制の遷延化を回避した薬剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が一般式（１）
【化１】
2016093352.tif 000047
［式中、［Ｑ］は（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）個の末端官能基化された多分岐高分子担体であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数であり、［Ｆ］は前記末端官能基であってアミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基、及び／又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾された、アミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であり、Ｆは前記末端官能基から水素原子又は水酸基が除かれた結合基であり、Ｒ１は核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基であり、Ｒ２はポリエチレングリコールセグメントを含む置換基であり、Ｒ３はコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基であり、ｍは０〜１９９の整数であり、ｎは１〜２００の整数であり、ｏは０〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９９の整数である。］で示される核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項２】
前記核酸代謝拮抗剤が核酸塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤であり、該核酸代謝拮抗剤はコハク酸モノアミドのカルボキシ基に該アミノ基によるアミド結合を介して結合している請求項１に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項３】
前記核酸代謝拮抗剤の質量含有率が、２質量％以上６０質量％以下である請求項１又は２に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項４】
前記核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物におけるポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が２０質量％以上９０質量％以下であり、ポリエチレングリコールセグメントが２〜１００ユニット結合している請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項５】
Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、一般式（２）及び／又は（３）
【化２】
2016093352.tif 000048
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｘ４は末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ７は水素原子、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、置換基を有していても良い芳香族基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸残基からなる群から選択される１種以上の基である。］である請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項６】
Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸誘導体である請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項７】
Ｒ１のポリアスパラギン酸誘導体が一般式（４）又は（５）
【化３】
2016093352.tif 000049
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１２は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）であり、該Ｒ１４及び該Ｒ１５は同一でも異なってもいてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１３は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｘ２は末端官能基Ｆとの結合基であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ａ＋ｂ）は１〜３０の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１２が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］である請求項６に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項８】
Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基である請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項９】
Ｒ１の前記結合型置換基が、ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸セグメントが結合したブロック共重合体型置換基であって、一般式（６）又は（７）
【化４】
2016093352.tif 000050
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１６はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ１７は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）であり、該Ｒ１８及び該Ｒ１９は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｘ３は末端官能基Ｆとの結合基であり、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ及びｊはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ｆ＋ｇ）は１〜３０の整数を示し、ポリアミノ酸誘導体の総重合数である（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１７が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］である請求項８に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項１０】
Ｒ２のポリエチレングリコールセグメントが、一般式（８）
【化５】
2016093352.tif 000051
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］である請求項１〜９の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項１１】
Ｒ３のコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基が、一般式（９）、（１０）及び（１１）
【化６】
2016093352.tif 000052
［式中、Ｘ４は末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ９は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）を示し、Ｒ１０、Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は前記と同義である。］からなる置換基群から選ばれる１種以上の基である請求項１〜１０の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項１２】
核酸代謝拮抗剤が式（１２）：
【化７】
2016093352.tif 000053
［式中、−Ｒｆは、式（１３）：
【化８】
2016093352.tif 000054
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］で表されるいずれか１種以上の核酸代謝拮抗剤である、請求項１〜１１の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項１３】
核酸代謝拮抗剤が式（１４）：
【化９】
2016093352.tif 000055
［式中、−Ｒｆは、式（１５）：
【化１０】
2016093352.tif 000056
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］で表されるいずれか１種以上の核酸代謝拮抗剤である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸代謝拮抗剤が結合した多分岐化合物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍あるいはウイルス性疾患の治療を目的として、種々の核酸代謝拮抗剤の開発が行なわれている。例えば、抗腫瘍剤（抗癌剤）としては、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）等がある。また、抗ウイルス剤としては、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）等が臨床で使用されている。【０００３】
これらの核酸代謝拮抗剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価において極めて強力な薬理活性を有する。しかしながら、これらの薬剤は生体内において代謝・排泄を受けやすく、ｉｎ  ｖｉｖｏの評価では本来の薬剤が持つ薬効を十分に発揮できない課題がある。これらの薬剤は、臨床上の治療用法において高用量を要するものが多い。例えば、ゲムシタビンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制活性評価（ＩＣ５０値）がパクリタキセルやドキソルビシン等の強力な抗腫瘍剤に匹敵する強い活性を有している。一方、ゲムシタビンの臨床用法は、体表面積あたりの用法として１，０００ｍｇ／ｍ２の高用量投与が必要である。これは、２’−デオキシシチジンの代謝酵素であるシチジン脱アミノ化酵素によって、ゲムシタビンの核酸塩基部分の４位アミノ基が代謝され失活されることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ利用率が低くなるためと考えられている（非特許文献１）。【０００４】
薬剤の代謝・失活を抑制して生物学的利用能を改善する目的で、高分子担体に薬剤を結合させた高分子化薬剤が研究されている。該高分子化薬剤は、高分子量化に基づき薬物動態が変化して、治療効果が向上することが期待される。非特許文献２には、平均分子量約３０キロダルトンのポリグルタミン酸類に、核酸代謝拮抗剤であるシタラビンを結合させた高分子化誘導体が記載されている。しかしながら、薬剤の高分子化誘導体は、生体で異物認識されやすく肝臓等の貪食系組織へ多くの薬剤が捕捉されてしまう懸念がある。また、免疫を惹起して過敏反応を引き起こす場合があり、その様な場合には、薬剤として繰返し投与ができなくなる懸念がある。【０００５】
高分子化誘導体の異物認識を回避する方法として、ポリエチレングリコールを利用する方法が知られている。例えば、特許文献１には、ポリエチレングリコール類にシチジン系誘導体を結合させた高分子化誘導体が記載されている。また非特許文献３には、ポリエチレングリコール類の両末端にアスパラギン酸を分枝状に置換させ、それにシタラビンを結合させた高分子化誘導体が記載されている。さらに、特許文献２には、ポリエチレングリコール鎖の末端にアミノ酸を用い分岐させ、その各分岐がベンジル脱離反応を受けた後に薬剤を放出する構造を持つ高分子化誘導体が記載されている。【０００６】
特許文献３及び特許文献４には、ポリエチレングリコール類とポリ酸性アミノ酸とのブロック共重合体の末端官能基に、核酸代謝拮抗剤及び疎水性置換基を結合させた高分子化誘導体が記載されている。特許文献５には、ポリエチレングリコール類とポリ酸性アミノ酸とのブロック共重合体の末端官能基に、疎水性置換基を有するリンカーを介して核酸代謝拮抗を結合させた高分子化誘導体が記載されている。
これらの核酸代謝拮抗剤の高分子結合体は、末端官能基に疎水性置換基が導入された疎水性セグメントと、親水性セグメントであるポリエチレングリコールを併せ持つ双極性高分子である。このため、該核酸代謝拮抗剤の高分子結合体は、水溶液中において疎水性セグメントの分子間凝集により、疎水性セグメントを内核にして親水性セグメントを外側にした自己会合体を形成すると考えられる。【０００７】
特許文献６には、分岐型ジアミン化合物であるリシンによるポリリシンデンドリマーを担体として用い、最外殻の末端官能基にポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤を結合させた高分子誘導体が記載されている。
このデンドリマーを用いた高分子誘導体は、核酸代謝拮抗剤としてゲムシタビンを用いている。該ゲムシタビンは、リンカーとしてグルタル酸を介して、ゲムシタビンの５’−水酸基とエステル結合にてデンドリマー担体に導入させている。【０００８】
上記様々なポリエチレングリコールを有する該核酸代謝拮抗剤の高分子結合体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液において加水分解を受け、結合していた核酸代謝拮抗剤を緩やかに解離する物性を有する。したがって、これらの高分子化核酸代謝拮抗剤は、従来の核酸代謝拮抗剤と比較して低投与量で長期に亘り腫瘍増殖阻害効果を発揮し続ける特徴を有する。しかしながら、薬効と同作用機作で生じる副作用も、長期に亘り発現させてしまうことが懸念される。核酸代謝拮抗剤は、白血球減少等の発現として認められる骨髄抑制が副作用として問題となっている。当該高分子化核酸代謝拮抗剤は、治療効果の向上と副作用の低減を両立させた有用な治療方法を確立する上で、大きな課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００３−５２４０２８号公報
【特許文献２】特表２００４−５３２２８９号公報
【特許文献３】国際公開２００６／１２０９１４号
【特許文献４】国際公開２００８／０５６５９６号
【特許文献５】国際公開２００８／０５６６５４号
【特許文献６】国際公開２０１２／１６７３０９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．９５、ｐ．１０５−１１１（２００４）「キャンサー・サイエンス」、日本癌学会発行、２００４年、第９５巻、１０５−１１１頁
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．４４、ｐ．２５−３０（１９８４）「キャンサー・リサーチ」（米国）、米国癌学会発行、１９８４年、第４４巻、２５−３０頁
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｖｏｌ．７９、ｐ．５５−７０（２００２）「ジャーナル オブ コントロールドリリース」（英国）、エルゼヴィア発行、２００２年、第７９巻、５５−７０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、抗腫瘍効果の向上とともに、副作用の低減、特に骨髄抑制が低下した核酸代謝拮抗剤を提供することである。具体的には、腫瘍増殖阻害効果を長期に亘り発揮しつつ、骨髄抑制を遷延化しない核酸代謝拮抗剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、多分岐高分子担体の末端官能基に、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットとポリエチレングリコールセグメントを結合させた核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が、抗腫瘍効果の向上とともに、副作用である骨髄抑制の遷延化を回避できることを見出した。【００１３】
即ち、本発明は次の［１］〜［１４］に関する。
［１］核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が一般式（１）
【化１】
2016093352.tif 000002
［式中、［Ｑ］は（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）個の末端官能基化された多分岐高分子担体であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数であり、［Ｆ］は前記末端官能基であってアミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基、及び／又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾された、アミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であり、Ｆは前記末端官能基から水素原子又は水酸基が除かれた結合基であり、Ｒ１は核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基であり、Ｒ２はポリエチレングリコールセグメントを含む置換基であり、Ｒ３はコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基であり、ｍは０〜１９９の整数であり、ｎは１〜２００の整数であり、ｏは０〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９９の整数である。］で示される核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
本発明は、一般式（１）におけるＲ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを必須の置換基として具備し、Ｒ２、Ｒ３及び［Ｆ］に係る置換基を任意に具備する核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物である。
なお、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基を具備することが好ましい。該ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基は、一般式（１）においてＲ２として具備していても良く、Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットに該ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基を具備させてもいても良い。
また、前記［Ｆ］は、多分岐高分子担体［Ｑ］の末端官能基であっても良く、また該末端官能基が置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基の修飾体であっても良く、末端官能基とその保護基修飾体の混合体で存在している態様を含む。【００１４】
［２］前記核酸代謝拮抗剤が核酸塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤であり、該核酸代謝拮抗剤はコハク酸モノアミドのカルボキシ基に該アミノ基によるアミド結合を介して結合している前記［１］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の核酸代謝拮抗剤の結合様式をアミド結合にそろえることで、所望の薬物放出プロファイルを達成することができ、薬効の持続的発揮と副作用の低減に関する本発明の効果を安定的に得る事ができる。【００１５】
［３］前記核酸代謝拮抗剤の質量含有率が、２質量％以上６０質量％以下である前記［１］又は［２］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。【００１６】
［４］前記核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物におけるポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が２０質量％以上９０質量％以下であり、ポリエチレングリコールセグメントが２〜１００ユニット結合している前記［１］〜［３］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、ポリエチレングリコールセグメントを適当量保持させることにより適切な体内動態が得られ、薬効発現と副作用の軽減を達成させることができる。【００１７】
［５］Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、一般式（２）及び／又は（３）
【化２】
2016093352.tif 000003
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｘ４は末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ７は水素原子、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、置換基を有していても良い芳香族基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸残基からなる群から選択される１種以上の基である。］である前記［１］〜［４］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
すなわち、該［５］の発明態様は、前記一般式（１）において、前記Ｒ１に係る前記コハク酸モノアミドユニットが、アスパラギン酸モノアミドユニットを用いることが好ましい。この場合、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物にポリエチレングリコールセグメントを具備させる場合は、Ｒ２へポリエチレングリコールセグメントを含む置換基を導入する態様である。【００１８】
［６］Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸誘導体である前記［１］〜［５］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
すなわち、該コハク酸モノアミドユニットとして、ポリアスパラギン酸を用いても良い。該ポリアスパラギン酸を用いることにより、１つのＲ１置換基に複数の核酸代謝拮抗剤を具備させることができることから好ましい。【００１９】
［７］Ｒ１のポリアスパラギン酸誘導体が一般式（４）又は（５）
【化３】
2016093352.tif 000004
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１２は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）であり、該Ｒ１４及び該Ｒ１５は同一でも異なってもいてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１３は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｘ２は末端官能基Ｆとの結合基であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ａ＋ｂ）は１〜３０の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１２が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］である前記［６］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。【００２０】
［８］Ｒ１の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基である前記［１］〜［４］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
すなわち、前記一般式（１）のＲ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットは、ポリエチレングリコールセグメントを具備する置換基であっても良い。このような２つの官能基を一体化した置換基を用いることにより、ポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの比率を一定にすることができることから好ましい。また、多分岐高分子担体の末端官能基を効率的に使用することができることから好ましい。【００２１】
［９］Ｒ１の前記結合型置換基が、ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸セグメントが結合したブロック共重合体型置換基であって、一般式（６）又は（７）
【化４】
2016093352.tif 000005
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１６はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ１７は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）であり、該Ｒ１８及び該Ｒ１９は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｘ３は末端官能基Ｆとの結合基であり、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ及びｊはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ｆ＋ｇ）は１〜３０の整数を示し、ポリアミノ酸誘導体の総重合数である（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１７が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］である前記［８］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
ポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが結合して一体となった置換基において、コハク酸モノアミドユニットとしてポリアスパラギン酸を用いることにより、１つの置換基に複数の核酸代謝拮抗剤を具備させることができることから好ましい。【００２２】
［１０］Ｒ２のポリエチレングリコールセグメントが、一般式（８）
【化５】
2016093352.tif 000006
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］である前記［１］〜［９］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。【００２３】
［１１］Ｒ３のコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基が、一般式（９）、（１０）及び（１１）
【化６】
2016093352.tif 000007
［式中、Ｘ４は末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ９は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）を示し、Ｒ１０、Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は前記と同義である。］からなる置換基群から選ばれる１種以上の基である前記［１］〜［１０］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。
Ｒ３のコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基が、アスパラギン酸モノアミド由来の残基又はイミド残基であることが好ましい。該Ｒ３は、前記一般式（２）及び／又は（３）で示される核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基から、該核酸代謝拮抗剤が解離した残基の態様を示す。
すなわち、本発明は一般式（１）において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基（Ｒ１）と、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）並びにコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）の少なくとも３種類の置換基が、それぞれ別の置換基として具備する態様であって良い。【００２４】
［１２］核酸代謝拮抗剤が式（１２）：
【化７】
2016093352.tif 000008
［式中、−Ｒｆは、式（１３）：
【化８】
2016093352.tif 000009
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］で表されるいずれか１種以上の核酸代謝拮抗剤である、前記［１］〜［１１］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。【００２５】
［１３］核酸代謝拮抗剤が式（１４）：
【化９】
2016093352.tif 000010
［式中、−Ｒｆは、式（１５）：
【化１０】
2016093352.tif 000011
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］で表されるいずれか１種以上の核酸代謝拮抗剤である、前記［１］〜［１２］の何れか一項に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。【００２６】
［１４］前記［１］〜［１３］に記載の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を含有する医薬。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、多分岐高分子担体の末端官能基に、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基、並びに核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基を具備することを特徴とする。当該多分岐化合物は、生体内に投与すると血中に滞留して体内分布しつつ、結合していた核酸代謝拮抗剤を適切な放出プロファイルにて遊離させて薬理活性作用を発揮させることができる。その結果、薬効を向上させつつ、副作用を回避することができる。特に核酸代謝拮抗剤の主たる副作用である骨髄抑制の遷延化がなく、薬効が持続的に発揮される核酸代謝拮抗剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、多分岐高分子担体を用い、この複数個有する末端基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基を具備した核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物に関する。以下に、本発明の詳細について説明する。
【００２９】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、一般式（１）
【化１１】
2016093352.tif 000012
［式中、［Ｑ］は（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）個の末端官能基化された多分岐高分子担体であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数であり、［Ｆ］は前記末端官能基であってアミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基、及び／又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾された、アミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であり、Ｆは前記末端官能基から水素原子又は水酸基が除かれた結合基であり、Ｒ１は核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基であり、Ｒ２はポリエチレングリコールセグメントを含む置換基であり、Ｒ３はコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基であり、ｍは０〜１９９の整数であり、ｎは１〜２００の整数であり、ｏは０〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９９の整数である。］で示される核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物。である。
【００３０】
すなわち、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、一般式（１６）
【化１２】
2016093352.tif 000013
［式中、［Ｆ］は末端官能基であってアミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であり、［Ｑ］、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは前述と同義である。］で表される多分岐高分子担体に、Ｒ１で表される核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基を具備し、更に、任意にＲ２で表されるポリエチレングリコールセグメントを含む置換基、並びにＲ３で表されるコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基を結合させた核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物である。
【００３１】
前記一般式（１６）で示される多分岐高分子担体は、複数単位の末端官能基を含有する多分岐担体をポリマーコアとする高分子化合物である。該末端官能基は、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基、並びにコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基を結合させるための結合性官能基として用いられる。
【００３２】
前記多分岐高分子担体は、コア分子種から任意の形状の分岐構造を有する複数の分岐鎖を具備し、該分岐鎖の末端は前記［Ｆ］で表される複数の反応性官能基を具備する、分子量１キロダルトン以上の分子種である。
該分岐鎖の分岐点は特に制限はなく、該コア分子種から複数の分子鎖が伸長した構造のいわゆる星状高分子構造であっても良く、１以上の分岐点を有する分岐鎖が該コア分子種から伸長した構造の分子種であっても良い。
該分岐鎖は、コア分子種から２以上で伸長した構造である。該コア分子種から伸長する複数の分子鎖は、互いに同じであっても異なるものであっても良い。末端反応性官能基が同一であることが好ましいことから、同じ分子鎖を用いることが好ましい。
【００３３】
該分岐鎖が複数の分岐点を有する分岐鎖である場合、当該多分岐高分子担体は、デンドリマー又は超分岐ポリマーと称される分子種であることが好ましい。デンドリマー又は超分岐ポリマーは樹状ポリマーとも呼ばれ、コア分子種から複数の規則的に分岐した分岐鎖が伸長したポリマー構造である。これらはコア分子種を中心に略球型構造又は放射状構造を取り、外殻に該分岐鎖末端の反応性官能基を具備した分子種である。なお、デンドリマーが有する超分岐構造単位の繰り返し単位はデンドロンと呼ばれる。デンドリマーは、規則的な繰り返し分岐構造体を称する。一方、超分岐ポリマーは、繰り返し分岐構造の規則性がデンドリマーほど精密でなく、分子量や分岐度の異なる不規則な繰り返し分岐構造を有しているものを称する。
【００３４】
当該多分岐高分子担体の分岐骨格として、それぞれアミド結合で分岐させたポリアミド構造、３級アミンを分岐させたポリアミン構造、エステル結合で分岐させたポリエステル構造、エーテル結合で分岐させたポリエーテル構造あるいはその混合構造有する構造などが挙げられる。
デンドリマーや超分岐ポリマーにおいて、分岐構造の繰り返し数を世代（Ｇ）と称し、コア分子種（Ｇ０）から伸長する分岐官能基化数を世代数として、末端反応性官能基数や分子量数の物性値として表す。本発明において、多分岐高分子担体としてデンドリマー又は超分岐ポリマーを用いる場合、その世代数に特に制限はないが、世代数はＧ２〜Ｇ６が好ましく、さらに好ましくはＧ３〜Ｇ５である。
【００３５】
当該多分岐高分子担体の末端反応性官能基は、アミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基である。これらの官能基は多分岐高分子担体の最外殻に分布し、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットやポリエチレングリコールセグメント等による外殻構造の化学修飾のための結合基として用いられる。
一般式（１）のＦは、アミノ基、水酸基若しくはメルカプト基から水素原子が除かれた結合基であるか、又はカルボキシ基から水酸基が除かれた結合基である。該多分岐高分子担体において、該末端反応性官能基数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４以上で２００以下で存在する。好ましくは、末端反応性官能基は４以上で１５０以下であり、特に好ましくは８以上で１００以下の末端反応性反応基を有する。本発明で用いる多分岐高分子担体であるデンドリマーや超分岐ポリマーは、世代数に応じて末端官能基数が倍数的に増加する。デンドリマーや超分岐ポリマーは公知であり、それを適宜選択して用いれば良い。
該末端反応性官能基は、同一の官能基であっても、異なる官能基が混在していても良い。しかしながら、該末端反応性官能基は、核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドやポリエチレングリコールセグメントによる化学修飾を行う結合基であるため、同一の官能基であることが好ましい。該末端反応性官能基としては、水酸基又はカルボキシ基が好ましい。
【００３６】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、高分子担体を用いることによる薬物動態の制御を目的としているため、該高分子担体には適当な分子量の範囲が設定される。該多分岐高分子担体は、分子量が１キロダルトン以上であり１００キロダルトン以下の分子であることが好ましい。より好ましくは、３キロダルトン以上であり７０キロダルトン以下の多分岐高分子担体である。
【００３７】
前記多分岐高分子担体は、公知の方法により調製することができる。すなわち、コア部を基に複数の枝部を具備させた高分子担体を合成する方法として、コアとなる分子にジェネレーションごとに分子を順次結合させ枝分かれさせていくダイバージェント法、又はあらかじめ枝の部分を合成して、最後に枝部をコア分子と反応させるコンバージェント法の２通りの合成法が知られている。本発明に用いる多分岐高分子担体は、何れの合成方法によっても調製することができる。
【００３８】
当該多分岐高分子担体として用いられるデンドリマー、デンドロン及び超分岐ポリマーは、市販品を用いても良い。デンドリマーは、例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ０〜７、末端官能基として、水酸基、アミノ基、カルボキシ基、トリメトキシシリル基等数種）（シグマ−アルドリッチ社）を用いても良い。デンドロンとしては、ポリエステル−ポリ−ヒドロキシ−１−アセチレン  ビス−ＭＰＡデンドロン（ヒドロキシ基；８〜３２、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ３〜５）、ポリエステル−ポリ−ヒドロキシ−１−カルボキシ  ビス−ＭＰＡデンドロン（水酸基；８〜３２、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ３〜５）（シグマ−アルドリッチ社）を用いても良い。超分岐ポリマーとしては、ハイパーブランチド  ビス−ＭＰＡ  ポリエステル−ポリ−ヒドロキシ（水酸基１６〜６４、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２〜４）（シグマ−アルドリッチ社）を用いても良い。
なお、市販の多分岐高分子担体を用い、これらの末端反応性官能基を通常の有機反応による化学修飾によって任意の官能基に変換したものを用いても良い。例えば、末端反応性官能基が水酸基やアミノ基の多分岐高分子担体を、末端カルボキシ基の多分岐高分子担体に変換する場合は、例えば、任意の酸無水物化合物と反応させることにより、エステル化反応又はアミド化反応を経由して、末端反応性官能基をカルボキシ基にすることができる。
【００３９】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、コハク酸モノアミドユニットのカルボキシ基に核酸代謝拮抗剤がアミド結合及び／又はエステル結合を介して結合している。好ましくは、アミノ基及び／又は水酸基を有する核酸代謝拮抗剤を用い、該アミノ基による該カルボキシ基とのアミド結合又は該水酸基による該カルボキシ基とのエステル結合にて結合させた構造ユニットである。結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合、又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、コハク酸モノアミドのカルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【００４０】
一般式（１）のＲ１で示される前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットは、下記一般式（１７）及び／又は（１８）
【化１３】
2016093352.tif 000014
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｘは前記末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｙは酸素原子又はＮ−Ｒ４であり、前記Ｒ４並びにＲ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ７は水素原子、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、置換基を有していても良い芳香族基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸残基からなる群から選択される１種以上の基である。］で示される核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが好ましい。
前記一般式（１７）及び（１８）で示されるコハク酸モノアミドユニットは、光学活性体であっても良く、光学活性体の任意の混合物であっても良い。
【００４１】
前記一般式（１７）又は（１８）で示すコハク酸モノアミドユニットにおいて、式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６における、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基である。
直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。
分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。
環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００４２】
前記一般式（１７）又は（１８）に係るＲ７は、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、置換基を有していても良い芳香族基である。
ここで有しても良い置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換又は無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基又はシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でも良い。
また、ポリエチレングリコールセグメントを置換基として具備していても良い。Ｒ７が、ポリエチレングリコールセグメントを置換基として有する、炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、芳香族基からなる群から選択される基である場合、一般式（１）に係るＲ１は、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含み、且つポリエチレングリコールセグメントを併せ持つ置換基となる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ｎ−オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族基としては、例えば、フェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基等が挙げられる。
【００４３】
また、前記Ｒ７は、カルボキシ基が保護されたアミノ酸残基であっても良い。カルボキシ基が保護されたアミノ酸残基としては、例えば、グリシニル−メチルエステル基、アラニル−メチルエステル基、ロイシニル−メチルエステル基、バリニル−メチルエステル基、フェニルアラニル−メチルエステル基、アラニル−エチルエステル基、ロイシニル−エチルエステル基、アラニル−ブチルエステル基、ロイシニル−ブチルエステル基等が挙げられる。
若しくは、カルボキシ基にポリエチレングリコールセグメントがアミド結合又はエステル結合にて結合したアミノ酸残基であっても良い。
【００４４】
前記核酸代謝拮抗剤が結合するコハク酸モノアミドユニットは、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体であっても良い。すなわち、コハク酸モノアミドユニットとしてアスパラギン酸モノアミドユニットである場合、ポリアスパラギン酸誘導体を用いても良い。ポリアスパラギン酸を用いると、自ずと一方のカルボキシ基がモノアミド体となることから、好ましい置換基として挙げることができる。
前記コハク酸モノアミドユニットの重合体である場合、重合数が１〜５０の重合体であることが好ましい。より好ましくは、重合数が２〜３０である。該コハク酸モノアミドユニットの重合体の重合形式は、α−アミド結合による重合体であっても、β−アミド結合による重合体であっても、α及びβ−アミド結合の混合による重合体であってもいずれであっても良い。
【００４５】
前記核酸代謝拮抗剤が結合するコハク酸モノアミドユニットとして、コハク酸モノアミドユニットの重合体を用いる場合、核酸代謝拮抗剤は該重合体置換基に対して１分子以上が結合していれば良く、２以上の複数分子が結合していても良い。複数の核酸代謝拮抗剤を結合させることで薬剤含量を高めることができることから有利な態様である。この場合の該核酸代謝拮抗剤の結合様式としては、前記と同様であって、アミド結合及び／又はエステル結合を介して結合している。
前記コハク酸モノアミドユニットの重合体のＣ末カルボキシ基は、適当な保護基で修飾されていることが好ましい。例えば、メチルエステル基、エチルエステル基、ブチルエステル基、ベンジルエステル基等のエステル保護基、若しくは、メチルアミド基、エチルアミド基、ブチルアミド基、ベンジルアミド基等のアミド保護基が挙げられる。
若しくは、カルボキシ基にポリエチレングリコールセグメントがアミド結合又はエステル結合にて結合したアミノ酸残基であっても良い。この場合、一般式（１）に係るＲ１は、複数の核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含み、且つポリエチレングリコールセグメントを併せ持つ置換基となる。
【００４６】
前記Ｙが酸素原子である場合、前記コハク酸モノアミドユニットはリンゴ酸を基本骨格とするユニットである。一方、前記ＹがＮ−Ｒ４である場合、前記コハク酸モノアミドユニットはアスパラギン酸を基本骨格とするユニットである。すなわち、前記Ｒ５及びＲ６が水素原子である場合、前記コハク酸モノアミドユニットはリンゴ酸モノアミド誘導体又はアスパラギン酸モノアミド誘導体を用いることができる。前記コハク酸モノアミドユニットとしてはアスパラギン酸モノアミド誘導体が好ましい。
【００４７】
前記一般式（１７）及び／又は（１８）におけるＸは、前記Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基と多分岐高分子担体の末端反応性官能基［Ｆ］を結合させる結合基である。該結合基としては、該コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基の酸素原子又はＮ−Ｒ４と、末端反応性官能基［Ｆ］に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有する結合基であれば、特に限定されるものではない。
【００４８】
該Ｘに係る結合基は、該コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合、一方の末端基がエーテル結合様式、エステル結合、ウレタン結合又はカーボネート結合する結合性官能基を有する。一方、該コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基がＮ−Ｒ４である場合、一方の末端基がアミン結合様式、アミド結合、ウレア結合又はウレタン結合する結合性官能基を有する。そして、もう一方の末端基が、末端反応性官能基［Ｆ］とエステル結合、アミド結合、チオエステル結合、ウレア結合又はウレタン結合することができる結合性官能基を有する。すなわち、該Ｘに係る結合基は、前記の末端官能基を有する、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基である。
【００４９】
該Ｘに係る結合基としては、前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合にエーテル結合し、若しくは末端官能基がＮ−Ｒ４でアミノ結合様式となり、もう一方が末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合にエステル結合し、若しくは末端官能基がＮ−Ｒ４でアミド結合様式となり、もう一方が末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合にウレタン結合し、若しくは末端官能基がＮ−Ｒ４でウレア結合様式となり、もう一方が末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
また、前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合にカーボネート結合し、若しくは末端官能基がＮ−Ｒ４でウレタン結合様式となり、もう一方が末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−（ｘは１〜８の整数を示す）等を挙げることができる。
該Ｘとして、好ましくは前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子である場合にエーテル結合し、若しくは末端官能基がＮ−Ｒ４でアミノ結合様式となり、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合する結合基であり、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）である。
【００５０】
また、該Ｘに係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いても良い。アミノ酸誘導体を結合基とする場合の結合基の使用態様としては、アミノ酸誘導体のＮ末アミノ基が、前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、Ｃ末カルボキシ基が、該コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が酸素原子でエステル結合又は末端官能基がＮ−Ｒ４でアミド結合する態様である。
該Ｘに係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。
【００５１】
また、該Ｘは「結合」であってよい。「結合」とは、特に結合基を介せず、前記多分岐高分子担体の末端反応性官能基と前記コハク酸モノアミドユニットを含む置換基の末端官能基が、直接エステル結合又はアミド結合をしている態様を指す。
【００５２】
前記一般式（１７）又は（１８）に係る［Ｄ］は、核酸代謝拮抗剤の結合残基である。該核酸代謝拮抗剤は分子中にアミノ基及び／又は水酸基を有するものであり、該核酸代謝拮抗剤がコハク酸モノアミドユニットのカルボキシ基にアミド結合及び／又はエステル結合を介して結合する。すなわち、該［Ｄ］は該核酸代謝拮抗剤のアミド結合残基及び／又はエステル結合残基である。核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合又はエステル結合のみの場合、若しくはアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【００５３】
本発明に用いられる核酸代謝拮抗剤は、抗腫瘍活性又は抗ウイルス活性等の薬理活性を有するヌクレオシド誘導体である。該核酸代謝拮抗剤としては、ピリミジン塩基ヌクレオシド誘導体、プリン塩基ヌクレオシド誘導体、トリアジン塩基ヌクレオシド誘導体等を用いることが好ましい。また、該核酸代謝拮抗剤は、分子内にアミノ基及び／又は水酸基を有する化合物を用いることが好ましい。このような核酸代謝拮抗剤は、該アミノ基及び／又は水酸基によりアミド結合及び／又はエステル結合を介して、前述のコハク酸モノアミドユニットのカルボキシ基に導入できることから好ましい。
【００５４】
特に、ヌクレオシドの核酸塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤を用いることが好ましく、アミノ基を有するピリミジン塩基ヌクレオシド誘導体、アミノ基を有するプリン塩基ヌクレオシド誘導体、アミノ基を有するトリアジン塩基ヌクレオシド誘導体が好ましい。アミノ基を有する核酸代謝拮抗剤は、該アミノ基によるアミド結合で前述のコハク酸モノアミドユニットのカルボキシ基に導入することができることから好ましい。
【００５５】
核酸代謝拮抗剤として、抗腫瘍活性や抗ウイルス活性を有する複数の化合物が知られており、これらを適宜選択して使用して良い。用いることができる核酸代謝拮抗剤としては、アミノ基及び／又は水酸基を有する核酸代謝拮抗剤が好ましく、該核酸代謝拮抗剤としては、例えば、ピリミジン系代謝拮抗剤、プリン系代謝拮抗剤、トリアジン系代謝拮抗剤等が挙げられる。
【００５６】
当該核酸代謝拮抗剤は、核酸塩基部分が下記式（１２）から選択されるいずれか１種以上であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１３）から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。
【化１４】
2016093352.tif 000015
［式中、−Ｒｆは、式（１３）：
【化１５】
2016093352.tif 000016
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基残基を示す。］。
【００５７】
前記Ｒ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、炭素数（Ｃ４〜Ｃ３０）の炭化水素のモノカルボン酸がエステル結合したアシル残基である。炭素数（Ｃ４〜Ｃ３０）の炭化水素は、飽和炭化水素である飽和脂肪酸であっても良く、１以上の二重結合を含む不飽和炭化水素である不飽和脂肪酸であってもよい。これらの脂肪酸エステルは、当該核酸代謝拮抗剤の脂溶性誘導体として知られており、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の有効成分として使用することができる。
前記Ｒ２０としての脂肪酸エステルのアシル基残基の脂肪酸において、前記飽和脂肪酸としては、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸等が挙げられる。
また前記不飽和脂肪酸としては、９−ヘキサデセン酸、ｃｉｓ−９−オクタデセン酸、ｔｒａｎｓ−９−オクタデセン酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸等が挙げられる。
【００５８】
当該核酸代謝拮抗剤として公知の化合物を用いても良い。例えば、下記式（１９）に構造を示すシタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）、２’−メチリデン−２’−デオキシシチジン（ＤＭＤＣ）、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、３’−エチニルシチジン（Ｅｔｈｙｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、２’−デオキシ−５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５’−フルオロ−２’−デオキシシチジン（ＮＳＣ−４８００６)、４’−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＯＳＩ−７８３６）、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（Ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）又はフルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シタラビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４０５５）、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４１２６）、アザシチジン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４２００）等を挙げることができる。本発明の多分岐化合物に用いられる核酸代謝拮抗剤は、これらの化合物に限定されるものではないが、適用する好ましい化合物として挙げることができる。
【００５９】
【化１６】
2016093352.tif 000017
【００６０】
本発明における核酸代謝拮抗剤は、シチジン系代謝拮抗剤を用いることが好ましく、核酸塩基部分が下記式（１４）で示されるシチジン塩基であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１５）の置換基群から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。ここで、Ｒ２０は水酸基又は脂肪酸エステルのアシル基で表される化合物である。
【００６１】
【化１７】
2016093352.tif 000018
［式中、−Ｒｆは、式（１５）：
【化１８】
2016093352.tif 000019
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］。一般式（１５）のＲ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、前述と同義である。
【００６２】
これらのシチジン系代謝拮抗剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、並びに３’−エチニルシチジン（Ｅｔｈｙｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体である。脂肪酸エステル誘導体として、シタラビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４０５５）、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４１２６）等である。
【００６３】
一般式（１）において、前記Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合するコハク酸モノアミドユニットは本発明において必須の構成である。したがって、該Ｒ１基の置換基結合数であるｎは１〜２００の整数である。該Ｒ１基を多く具備することにより、多分岐担体１分子当たりの核酸代謝拮抗剤の含量を高めることができる。一方、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を医薬品として用いることを踏まえ、水溶性や薬物動態特性の最適化を考慮すると、該Ｒ１基の置換基結合数であるｎは２〜１００であることが好ましい。特に好ましくは、ｎは５〜５０である。
【００６４】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基が結合している。一般式（１）におけるＲ２は、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基である。該ポリエチレングリコールセグメントは、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造を有するセグメントである。好ましくはエチレンオキシ基単位重合度が５〜１０，０００ユニット、より好ましくは重合度が５〜２，５００ユニットであり、特に好ましくは１０〜１，０００ユニットであり、殊更好ましくは２０〜５００ユニットのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
すなわち該ポリエチレングリコールセグメントとは、ポリエチレングリコール相当の分子量として０．２キロダルトン以上で５００キロダルトン以下のセグメントであることが好ましく、より好ましくは分子量として０．２キロダルトン以上で１５０キロダルトン以下の構造部分であり、特に好ましくは分子量として０．５キロダルトン以上で５０キロダルトン以下である。分子量が１キロダルトン以上で２０キロダルトン以下のポリエチレングリコールセグメントであることが、殊更好ましい。
なお、本発明で用いるポリエチレングリコールセグメントの分子量とは、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製する際において、用いるポリエチレングリコールセグメント構造化合物の、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる平均分子量を採用する。
【００６５】
該ポリエチレングリコールセグメントの末端基は、一方が前記多分岐高分子担体との結合側であり、他方は本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の外殻側である。
前記多分岐高分子担体との結合側の末端基は特に限定されるものではないが、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の酸素原子が末端基となることが好ましい。該Ｒ２に係るポリエチレングリコールセグメントを含む置換基において、前記多分岐高分子担体の末端反応性官能基との結合基は、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコールセグメントの該末端基及び前記多分岐高分子担体の末端反応性官能基に対して結合可能な官能基を有した、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキレン基であることが好ましい。
【００６６】
一方、該ポリエチレングリコールセグメントの外殻側の末端基は、特に限定されるものではなく、水素原子、水酸基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルオキシ基等を用いることができる。
【００６７】
該末端基における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基としては、直鎖、分岐鎖又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、２−メチルブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、１−エチルプロポキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、４−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロペンチルオキシ基又はシクロヘキシルオキシ基等が挙げられる。好ましくは炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基又はｔ−ブトキシ基等であり、特に好ましくはメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基又はイソプロポキシ基である。
有していても良い置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基等が挙げられる。
【００６８】
該末端基における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルオキシ基としては、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖又は分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、４−フェニルブチルオキシ基、３−フェニルブチルオキシ基、５−フェニルペンチルオキシ基、６−フェニルへキシルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。好ましくはベンジルオキシ基、４−フェニルブチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基である。
有していても良い置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基等が挙げられる。
【００６９】
一般式（１）における前記Ｒ２は、一般式（８）
【化１９】
2016093352.tif 000020
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］を用いることが好ましい。
すなわち、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造によるエチレンオキシ基単位重合度が５〜２，５００ユニットのポリエチレングリコールセグメントであり、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として０．２キロダルトン〜１５０キロダルトンのセグメント部であることが好ましい。より好ましくは重合度が１０〜１，０００ユニットであり、平均分子量として０．５キロダルトン〜５０キロダルトンであり、更に好ましくは重合度が２０〜５００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜２０キロダルトンであり、殊更好ましくは重合度が２０〜３００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜１２キロダルトンのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
【００７０】
前記Ｒ８における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基は、例えば、直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−デシル基等を挙げることができる。分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
有していても良い置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基等が挙げられる。
【００７１】
前記一般式（８）におけるＸ１は、前記Ｒ２に係るポリエチレングリコールセグメントを含む置換基と多分岐高分子担体の末端反応性官能基［Ｆ］を結合させる結合基である。該結合基としては、該ポリエチレングリコールセグメント末端基の酸素原子と、末端反応性官能基［Ｆ］に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有する結合基であれば、特に限定されるものではない。
【００７２】
該Ｘ１に係る結合基は、一方の末端基が、該ポリエチレングリコールセグメントの末端酸素原子とエーテル結合様式、エステル結合、ウレタン結合又はカーボネート結合する結合性官能基を有し、もう一方の末端基が、末端反応性官能基［Ｆ］とエステル結合、アミド結合、チオエステル結合、ウレア結合又はウレタン結合することができる結合性官能基を有する、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基である。
【００７３】
該Ｘ１に係る結合基としては、ポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
ポリエチレングリコールセグメントとエステル結合し、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
ポリエチレングリコールセグメントとウレタン結合し、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）等が挙げられる。
また、ポリエチレングリコールセグメントとカーボネート結合し、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ｘは１〜８の整数を示す）、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−（ｘは１〜８の整数を示す）等を挙げることができる。
該Ｘ１として、好ましくはポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合する結合基であり、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ｘは１〜８の整数を示す）である。
【００７４】
また、該Ｘ１に係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いても良い。アミノ酸誘導体を結合基とする場合の結合基の使用態様としては、アミノ酸誘導体のＮ末アミノ基が、前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、Ｃ末カルボキシ基が、該ポリエチレングリコールセグメントの末端酸素原子とエステル結合する態様である。
該Ｘ１に係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。
【００７５】
また、該Ｘ１は「結合」であってよい。「結合」とは、特に結合基を介せず、前記多分岐高分子担体の末端反応性官能基と該ポリエチレングリコールセグメントの末端酸素原子が、直接エステル結合している態様を指す。
【００７６】
一般式（１）において、前記Ｒ２で表されるポリエチレングリコールセグメントを含む置換基は、多分岐高分子担体に複数個存在する末端反応性官能基に対し０〜１９９ユニットが結合している。すなわち、該Ｒ２基の置換基結合数であるｏは０〜１９９の整数である。
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は医薬品として使用される。このため、ポリエチレングリコールセグメントを具備させることにより、水溶性を付与できることから好ましい。本発明において、多分岐高分子担体にポリエチレングリコールセグメントを具備することが好ましい。該ポリエチレングリコールセグメントは、該Ｒ２として具備しても良く、又は該Ｒ１の核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドに置換基として結合させていても良い。若しくは、Ｒ１とＲ２の両方にポリエチレングリコールセグメントを具備させていても良い。
本発明において、該Ｒ１にポリエチレングリコールセグメントを有さない場合、該Ｒ２に係るポリエチレングリコールセグメントを含む置換基は必須の置換基であり、該Ｒ２基の置換基結合数であるｏは１〜１９９の整数である。該Ｒ２基でポリエチレングリコールセグメントを具備させる場合、複数ユニットを結合させることが好ましい。したがって、該Ｒ２基の置換基結合数であるｏは、より好ましくは２〜１００の整数であり、特に好ましくは２〜５０である。
【００７７】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、多分岐高分子担体の末端反応性官能基に、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基とポリエチレングリコールセグメントを含む置換基が結合し、更に、任意にコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基が結合した化合物であっても良い。
すなわち、一般式（１）において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが結合した置換基（Ｒ１）と、ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）が結合し、更に、コハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）を具備していても良い。
なお、Ｒ３に係るコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基は、Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基から、該核酸代謝拮抗剤が解離した残基である。
【００７８】
前記Ｒ３は、好ましくは一般式（２０）、（２１）及び（２２）
【化２０】
2016093352.tif 000021
［式中、Ｘは前記末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｙは酸素原子又はＮ−Ｒ４であり、Ｒ９は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）を示し、Ｒ１０、Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基を示し、Ｘ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、一般式（１７）及び（１８）に記載した置換基と同義である。］からなる置換基群から選ばれる１種以上の基である。
【００７９】
該Ｒ１０及びＲ１１における三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、シクロへキシル基が挙げられる。
該三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基としては、例えば、２−ジメチルアミノエチル基、３−ジメチルアミノプロピル基、５−ジメチルアミノペンチル基、６−ジメチルアミノヘキシル基等が挙げられる。
該Ｒ１０及びＲ１１として好ましくは、エチル基、イソプロピル基、シクロへキシル基、３−ジメチルアミノプロピル基が挙げられる。
【００８０】
前記Ｒ９が水酸基である場合、カルボン酸の態様を示す。また、そのカルボン酸の任意の塩態様であっても良い。
前記Ｒ９は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）であるが、水酸基のみである場合、水酸基及び−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）が共存する場合、若しくは−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）のみである場合の態様を取り得る。水酸基と−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）の存在比率は任意に設定されて良い。
【００８１】
一般式（１）において、前記Ｒ３で表されるコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基は、前記Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットから核酸代謝拮抗剤が解離した残基であるため、任意に存在して良い基である。該Ｒ３基の置換基結合数であるｐは０〜１９９の整数である。
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、水溶液中において経時的に核酸代謝拮抗剤を解離する物性を有する。したがって、Ｒ１に係る置換基は核酸代謝拮抗剤を解離して、Ｒ３に係る置換基に変換されるため、Ｒ１とＲ３の結合数は経時変化を伴うものである。該Ｒ３に係る置換基は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の製造中や医薬品用製剤の製造中、並びに医薬製剤保存中や医薬品として使用時において、核酸代謝拮抗剤の解離に伴い、随時、生成し得る。該Ｒ３基の置換基結合数であるｐは０〜８０の整数であることが好ましく、０〜５０であることがより好ましい。
【００８２】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基、前記ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基、並びに前記コハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基が結合していない末端官能基を含んでいても良い。その場合、これらの末端官能基は、一般式（１）における［Ｆ］で表されるアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の末端官能基である。
【００８３】
また、前記末端官能基が、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾されたアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であっても良い。すなわち、一般式（１）における［Ｆ］は、末端反応性官能基のままであっても良く、末端反応性官能基の保護基修飾体であっても良く、これらが混在した基であっても良い。
前記保護基における前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基等が挙げられる。
前記保護基における有していても良い置換基とは、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアルキルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアリール基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアシルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシカルボニルアミノ基等を挙げることができる。水溶性を有し且つ正電荷や負電荷を具備しない炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシ基を置換基として有する保護基であることが好ましい。
【００８４】
前記保護基修飾体としては、末端反応性官能基であるアミノ基、水酸基、カルボキシ基又はメルカプト基に対して結合可能な様式であれば特に限定されることなく使用することができる。すなわち、対応する末端反応性官能基に応じて、アミド結合、アルコキシカルボニルアミド結合、エステル結合、カーボネート結合、チオエステル結合、アルコキシチオカルボニル結合等を適宜選択して用いることができる。
【００８５】
前記末端反応性官能基の保護基修飾体の好ましい例としては、末端官能基がアミノ基、水酸基、メルカプト基の場合は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、メトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
末端官能基がカルボキシ基の場合、エチルアミノ基、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、メトキシエトキシエチルアミノ基等のアミド結合体、若しくはエトキシ基、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシメトキシ基等のエステル結合体が挙げられる。
【００８６】
一般式（１）の末端官能基［Ｆ］の数を示すｍは０〜１９９の整数である。該ｍは、多分岐高分子担体において、前記Ｒ１〜Ｒ３が結合した残部であり、特にその官能基数が規定されるべき理由はなく、適宜設定されて良い。好ましくは、ｍは０〜１５０であり、０〜１００がより好ましい。
当該末端反応性官能基の保護基修飾体は、任意に存在して良く０基以上であり１９９基以下で存在する。当該保護基修飾体は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の表面電荷等を制御することができ、水溶性や自己会合性等の物性制御をすることができることから、具備することが好ましい。このため、当該保護基修飾体が４基以上であり１５０基以下で存在することが好ましく、６基以上であり１００基以下で存在することがより好ましい。
【００８７】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、核酸代謝拮抗剤の質量含有率やポリエチレングリコールセグメントの質量含量が、薬効発現及び副作用発現に影響を及ぼすことがある。そこで、これらの部分構造の質量含有率の算出方法について説明する。
核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、該多分岐化合物の構成部分の各構成分子量を合算した計算値を当該「核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量」として採用する。すなわち、（１）多分岐高分子担体の分子量、（２）ポリエチレングリコールセグメントの分子量にその結合数を乗じたポリエチレングリコールセグメントの総分子量、（３）核酸代謝拮抗剤の結合残基分子量にその結合数を乗じた核酸代謝拮抗剤の総分子量、（４）核酸代謝拮抗剤を結合させるためのコハク酸モノアミドユニット分子量にその結合数を乗じた該コハク酸モノアミドユニットの総分子量を合算した計算値を当該分子量とする。
【００８８】
当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、キロダルトン単位での精度による分子量規定が求められるものである。したがって、前記各構成部分の分析方法は、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物のキロダルトン単位（×１０３オーダー）での分子量測定において、十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではなく、様々な分析方法を適宜選択して良い。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げる。
【００８９】
前記（１）多分岐高分子担体の分子量は、デンドリマー、デンドロン及び超分岐ポリマーといった化学構造が明確な担体を用いる場合は、その化学構造式から算出される計算分子量を採用する。用いた担体の末端官能基を、更に化学修飾した多分岐高分子担体を用いた場合には、修飾した化合物残基の分子量を、末端官能基数及び末端官能基への化合物残基の導入率で乗じた値を加えることにより多分岐高分子担体の分子量として採用する。該導入率は１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された変換率により算出される値を用いることができる。該多分岐高分子担体が、単一の化合物残基により修飾させられる場合は、１Ｈ−ＮＭＲの分析が簡便であり好ましく、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された変換率を用いて算出することが好ましい。
【００９０】
前記（２）ポリエチレングリコールセグメントの総分子量は、ポリエチレングリコールセグメントの分子量にその結合量を乗じた計算値である。ポリエチレングリコールセグメントの分子量は、用いるポリエチレングリコールセグメント構造化合物の、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる平均分子量を採用する。
ポリエチレングリコールセグメントの結合量は、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物から、ポリエチレングリコールセグメントを開裂させて、遊離するポリエチレングリコールセグメントを定量分析することにより求める方法、若しくは当該多分岐高分子単体に対しポリエチレングリコールセグメントを導入する反応において、ポリエチレングリコールセグメントの消費率から算出する方法であっても良い。
【００９１】
前記（３）核酸代謝拮抗剤の総分子量は、核酸代謝拮抗剤の結合残基分子量にその結合数を乗じた計算値である。該核酸代謝拮抗剤の結合数は、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を加水分解し、遊離する核酸代謝拮抗剤を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量分析することによって算出された値である。
なお、前記（４）のコハク酸モノアミドユニットの総分子量は、該コハク酸モノアミドユニットの分子量に、その結合数を乗じた計算値である。該結合基の結合数は、前述の核酸代謝拮抗剤の結合数と同じであり、その値を用いることで算出できる。
【００９２】
一方、コハク酸モノアミドユニットとして前記のコハク酸モノアミドユニットの重合体を用いる場合、前記（４）のコハク酸モノアミドユニットの総分子量は、コハク酸モノアミドユニット重合体の分子量に、その結合した数を乗じた値を採用する。
コハク酸モノアミドユニットの重合体の分子量は、重合モノマー単位の分子量にその重合数を乗じた計算値である。該重合数は、重合反応後の生成物における１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数や、アミノ酸分析により算出される重合数、あるいはアスパラギン酸の側鎖カルボン酸が保護されたモノマーを用いて重合した場合、該反応の生成物に対し脱保護を行ったときに発生する除去された保護基成分を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量分析することによって算出された重合数を用いることができる。
【００９３】
該ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率は、前述の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量に対する、前記（２）のポリエチレングリコールセグメントの総分子量の含有比率により算出することができる。すなわち、ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率は、以下の式で算出する。
ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率（％）＝（ポリエチレングリコールセグメント総分子量／核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物）×１００
前記ポリエチレングリコールセグメントの質量分子量率は、２０質量％以上９０質量％以下であり、４０質量％以上８０質量％以下であることが好ましい。より好ましくは、５０質量％以上８０質量％以下である。
ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が２０質量％より少ない場合、骨髄抑制が強く発現する傾向がある。十分な薬効と副作用の低減を達成するために、ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率を設定することが好ましい。
【００９４】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、該多分岐化合物における核酸代謝拮抗剤の質量含有率が、２質量％以上６０質量％以下であることが好ましい。
核酸代謝拮抗剤の含有率が２質量％より少ないと、核酸代謝拮抗剤の有効量を確保するために当該多分岐化合物の総投与量が多くなり、投与利便性が低下するため好ましくない。一方、核酸代謝拮抗剤の含有率が６０質量％より多い場合、骨髄抑制が強く発現する傾向がある。投与利便性を確保し、十分な薬効と副作用の低減を達成するために、核酸代謝拮抗剤の含有量を設定することが好ましい。
該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物における核酸代謝拮抗剤の質量含有率は、該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物分子量に対する、前記（３）核酸代謝拮抗剤の総分子量の含有比率により算出することができる。核酸代謝拮抗剤の含有量のより好ましい範囲は、５質量％以上で４０質量％以下である。核酸代謝拮抗剤含量が５質量％以上で２０質量％以下であることが特に好ましい。
【００９５】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、該多分岐化合物の分子量が１０キロダルトン以上で２００キロダルトン以下であることが望ましい。より好ましくは、分子量が２０キロダルトン以上であり１６０キロダルトン以下である。該多分岐化合物の分子量は、上記の構成部分の各構成分子量を合算した計算値を当該「核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量」として採用する。すなわち、前記（１）〜（４）の各構成分子量を合算した計算値を当該分子量とする。
【００９６】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、多分岐高分子担体の末端反応性官能基；［Ｆ］に、核酸代謝拮抗剤を放出する機能を有する核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットを具備することを特徴とする。更に、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、ポリエチレングリコールセグメントを具備することが好ましい。すなわち、本発明の好ましい態様は、核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットとポリエチレングリコールセグメントの２種類の機能性置換基を含む核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物である。
本発明の実施態様は、該多分岐高分子担体に対して、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットとポリエチレングリコールセグメントの結合様式によって、その構造に基づいて以下の２タイプに分類できる。
［タイプ１］：前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットと前記ポリエチレングリコールセグメントが、それぞれ別の置換基として該多分岐高分子担体の末端反応性官能基に結合する実施態様。
［タイプ２］：前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットと前記ポリエチレングリコールセグメントが連結して一体となった置換基が該多分岐高分子担体の末端反応性官能基に結合する実施態様。該コハク酸モノアミドユニットとは、複数の該コハク酸モノアミドユニットの重合体セグメントであっても良い。
なお、前記［タイプ１］において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットである場合（［タイプ１−１］）と、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体である場合（［タイプ１−２］）を挙げることができる。
【００９７】
本発明の具体例について、以下にそれぞれの実施態様に分けて説明する。
初めに、前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットと前記ポリエチレングリコールセグメントが、それぞれ別の置換基として該多分岐高分子担体の末端反応性官能基に結合する実施態様［タイプ１］について説明する。
【００９８】
該［タイプ１］は、前述の一般式（１）において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基（Ｒ１）及びポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）の両方が必須の置換基である実施態様であって、一般式（１）
【化２１】
2016093352.tif 000022
［式中、［Ｑ］は（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）個の末端官能基化された多分岐高分子担体であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数であり、［Ｆ］は前記末端官能基であってアミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基、及び／又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾された、アミノ基、水酸基、カルボキシ基及びメルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であり、Ｆは前記末端官能基から水素原子又は水酸基が除かれた結合基であり、Ｒ１は核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基であり、Ｒ２はポリエチレングリコールセグメントを含む置換基であり、Ｒ３はコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基であり、ｍは０〜１９８の整数であり、ｎは１〜１９９の整数であり、ｏは１〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９８の整数である。］で示される核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物である。
【００９９】
該［タイプ１］の実施態様は、Ｒ１である核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基の結合量（ｎ）により、核酸代謝拮抗剤の含有量を制御することができる。また、Ｒ２であるポリエチレングリコールセグメントを含む置換基の結合量（ｏ）、並びに用いるポリエチレングリコールセグメントの分子量により、ポリエチレングリコール含有量を制御することができ、結果として、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の水溶性や自己会合性といった物性を制御することができる点で有利な構造である。
【０１００】
該［タイプ１］において、Ｒ２のポリエチレングリコールセグメントとしては、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造を有するセグメントである。好ましくはエチレンオキシ基単位重合度が５〜１０，０００ユニット、より好ましくは重合度が５〜２，５００ユニットであり、特に好ましくは１０〜１，０００ユニットであり、殊更好ましくは２０〜５００ユニットのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
すなわち該ポリエチレングリコールセグメントは、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として０．２キロダルトン〜５００キロダルトンのセグメント部であることが好ましく、より好ましくは平均分子量として０．２キロダルトン〜１５０キロダルトンの構造部分であり、特に好ましくは平均分子量として０．５キロダルトン〜５０キロダルトンである。平均分子量として１キロダルトン〜２０キロダルトンのポリエチレングリコールセグメントであることが、殊更好ましい。
なお、本発明で用いるポリエチレングリコールセグメントの平均分子量とは、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製する際において、用いるポリエチレングリコールセグメント構造化合物の、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる平均分子量である。
【０１０１】
該［タイプ１］におけるＲ２は、一般式（８）
【化２２】
2016093352.tif 000023
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］を用いることが好ましい。
すなわち、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造によるエチレンオキシ基単位重合度が５〜２，５００ユニットのポリエチレングリコールセグメントであり、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として０．２キロダルトン〜１５０キロダルトンのセグメント部であることが好ましい。より好ましくは重合度が１０〜１，０００ユニットであり、平均分子量として０．５キロダルトン〜５０キロダルトンであり、更に好ましくは重合度が２０〜５００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜２０キロダルトンであり、殊更好ましくは重合度が２０〜３００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜１２キロダルトンのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
なお、該Ｒ８及び該Ｘ１は、前述のＲ２に係るポリエチレングリコールセグメントの記載と同義である。
【０１０２】
次に、前記［タイプ１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、一般式（１）のＲ１が核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットである［タイプ１−１］について説明する。
【０１０３】
該［タイプ１−１］の好ましい実施態様として、Ｒ１で示される核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが一般式（２）及び／又は（３）
【化２３】
2016093352.tif 000024
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｘ４は前記末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ７は水素原子、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基、置換基を有していても良い芳香族基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸残基からなる群から選択される１種以上の基である。］で示される核酸代謝拮抗剤が結合したアスパラギン酸モノアミドユニットであることが好ましい。
核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合、又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、側鎖カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【０１０４】
前記一般式（２）又は（３）で示すアスパラギン酸モノアミドユニットにおいて、式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６における、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基である。
直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。
分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。
環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【０１０５】
前記一般式（２）又は（３）に係るＲ７において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ｎ−オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族基としては、例えば、フェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基等が挙げられる。
【０１０６】
また、前記Ｒ７は、カルボキシ基が保護されたアミノ酸残基であっても良い。カルボキシ基が保護されたアミノ酸残基としては、例えば、グリシニル−メチルエステル基、アラニル−メチルエステル基、ロイシニル−メチルエステル基、バリニル−メチルエステル基、フェニルアラニル−メチルエステル基、アラニル−エチルエステル基、ロイシニル−エチルエステル基、アラニル−ブチルエステル基、ロイシニル−ブチルエステル基等が挙げられる。
【０１０７】
前記Ｘ４は、前記Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基と多分岐高分子担体の末端反応性官能基［Ｆ］を結合させる結合基である。該Ｘ４は、前述の一般式（１７）及び／又は（１８）におけるＸと同義である。
【０１０８】
前記［Ｄ］の核酸代謝拮抗剤の結合残基は、前述の核酸代謝拮抗剤が、アスパラギン酸モノアミドユニットの側鎖カルボキシ基にアミド結合及び／又はエステル結合を介して結合している態様であって、該核酸代謝拮抗剤のアミド結合残基及び／又はエステル結合残基である。核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、側鎖カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【０１０９】
前記［Ｄ］の核酸代謝拮抗剤は前述と同義であり、例えば、ピリミジン系代謝拮抗剤、プリン系代謝拮抗剤、トリアジン系代謝拮抗剤等が挙げられる。アミノ基及び／又は水酸基を有する核酸代謝拮抗剤を用いる事が好ましい。より好ましくは、ヌクレオシド塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤であり、該アミノ基によりコハク酸モノアミドユニットのカルボキシ基にアミド結合できる核酸代謝拮抗剤であることが好ましい。
【０１１０】
核酸代謝拮抗剤は、核酸塩基部分が下記式（１２）から選択されるいずれか１種以上であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１３）から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。
【化２４】
2016093352.tif 000025
［式中、−Ｒｆは、式（１３）：
【化２５】
2016093352.tif 000026
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基残基を示す。］。ここでＲ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、前述と同義である。
【０１１１】
該核酸代謝拮抗剤は、シチジン系代謝拮抗剤を用いることが好ましく、核酸塩基部分が下記式（１４）で示されるシチジン塩基であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１５）の置換基群から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。ここで、Ｒ２０は水酸基又は脂肪酸エステルのアシル基で表される化合物である。
【０１１２】
【化２６】
2016093352.tif 000027
［式中、−Ｒｆは、式（１５）：
【化２７】
2016093352.tif 000028
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］。Ｒ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、前述と同義である。
【０１１３】
これらのシチジン系代謝拮抗剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、並びに３’−エチニルシチジン（Ｅｔｈｙｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体である。脂肪酸エステル誘導体として、シタラビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４０５５）、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４１２６）等であり、本発明において好適に用いられる。
【０１１４】
前記［タイプ１−１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、一般式（１）のＲ３で示されるコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基が、一般式（９）、（１０）及び（１１）
【化２８】
2016093352.tif 000029
［式中、Ｘ４は前記末端官能基Ｆとの結合基であり、Ｒ９は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１０）ＣＯＮＨ（Ｒ１１）を示し、Ｒ１０、Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は前述の［タイプ１−１］のＲ１で用いられる一般式（２）及び（３）と同義である。］からなる置換基群から選ばれる１種以上の基であることが好ましい。ここで、Ｘ４、Ｒ１０及びＲ１１は前述と同義である。
前記Ｒ３で表されるコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基は、前記Ｒ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットから核酸代謝拮抗剤が解離した残基であるため、任意に存在して良い基である。しかしながら、該Ｒ３に係る置換基は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の製造中や医薬品用製剤の製造中、並びに医薬製剤保存中や医薬品として使用時において、核酸代謝拮抗剤の解離に伴い、随時、生成し得ることになる。
【０１１５】
該［タイプ１−１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットを含む置換基（Ｒ１）、前記ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）、並びに前記コハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）が結合していない末端官能基［Ｆ］を含んでいても良い。該［Ｆ］はアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の末端官能基である。また、前記末端官能基が、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾されたアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であっても良い。すなわち、該［タイプ１−１］は、一般式（１）における［Ｆ］が末端反応性官能基のままであっても良く、末端反応性官能基の保護基修飾体であっても良く、これらが混在した基であっても良い。
【０１１６】
前記末端反応性官能基［Ｆ］の保護基における、前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基は前述と同義であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基等が挙げられる。
前記保護基における有していても良い置換基とは、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルカルボニルアルキルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアリール基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアシルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシカルボニルアミノ基等を挙げることができる。水溶性を有し且つ正電荷や負電荷を具備しない炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルコキシ基を置換基として有する保護基であることが好ましい。
【０１１７】
前記末端反応性官能基の保護基修飾体の好ましい例としては、末端官能基がアミノ基、水酸基、メルカプト基の場合は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、メトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
末端官能基がカルボキシ基の場合、エチルアミノ基、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、メトキシエトキシエチルアミノ基等のアミド結合体、若しくはエトキシ基、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシメトキシ基等のエステル結合体が挙げられる。
【０１１８】
当該末端反応性官能基の保護基修飾体は、任意に存在して良く０基以上であり１９９基以下で存在する。当該保護基修飾体は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の表面電荷等を制御することができ、水溶性や自己会合性等の物性制御をすることができることから、具備することが好ましい。このため、当該保護基修飾体が４基以上であり１５０基以下で存在することが好ましく、６基以上であり１００基以下で存在することがより好ましい。
【０１１９】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が前記［タイプ１−１］である場合、一般式（１）におけるそれぞれの置換基結合数は、ｍは０〜１９８の整数であり、ｎは１〜１９９の整数であり、ｏは１〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９８の整数である。好ましくは、ｍは０〜１２０の整数であり、ｎは２〜１００の整数であり、ｏは２〜１００の整数であり、ｐは０〜８０の整数である。より好ましくは、ｍは０〜８０の整数であり、ｎは５〜５０の整数であり、ｏは５〜５０の整数であり、ｐは０〜５０の整数である。また、多分岐高分子担体の末端置換基総数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数である。好ましくは４〜１５０であり、より好ましくは８〜１００である。
Ｒ１で示される核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニット及びＲ２で示されるポリエチレングリコールセグメントの結合数は、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の薬物動態特性や、核酸代謝拮抗剤の解離速度を踏まえ、適宜設定されるべきである。
【０１２０】
本発明に係る［タイプ１］の別の実施態様として、一般式（１）におけるＲ１が、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体である［タイプ１−２］が挙げられる。以下、この［タイプ１−２］について説明する。
【０１２１】
該［タイプ１−２］は、前記Ｒ１がコハク酸モノアミドユニットの重合体であって、この側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が１分子以上結合している態様を指す。該Ｒ１のコハク酸モノアミドユニットの重合体は、２分子以上の複数分子の核酸代謝拮抗剤が結合していることが好ましい。該［タイプ１−２］は、置換基当りの核酸代謝拮抗剤の結合数を増加させることができるため、薬剤含量を高める場合において有利な構造である。
【０１２２】
該コハク酸モノアミドユニットの重合体は、重合数が１〜５０のコハク酸モノアミドユニットの重合体であることが好ましい。より好ましくは、重合数が２〜３０である。該コハク酸モノアミドユニットの重合体の重合形式は、α−アミド結合による重合体であっても、β−アミド結合による重合体であっても、α及びβ−アミド結合の混合による重合体であってもいずれであっても良い。
【０１２３】
前記コハク酸モノアミドユニットの重合体に結合する核酸代謝拮抗剤は、前述と同義であり、例えば、ピリミジン系代謝拮抗剤、プリン系代謝拮抗剤、トリアジン系代謝拮抗剤等が挙げられる。アミノ基及び／又は水酸基を有する核酸代謝拮抗剤を用いる事が好ましい。より好ましくは、ヌクレオシド塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤であり、該アミノ基によりアスパラギン酸のカルボキシ基にアミド結合できる核酸代謝拮抗剤であることが好ましい。
【０１２４】
該［タイプ１−２］におけるＲ１は、コハク酸モノアミドユニットの重合体の側鎖カルボキシ基に、前記核酸代謝拮抗剤がアミド結合及び／又はエステル結合を介して、１分子以上、好ましくは２分子以上の複数分子で結合している置換基である。核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合、又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、側鎖カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
核酸代謝拮抗剤は、該コハク酸モノアミドユニットの重合体における１以上の側鎖カルボキシ基に結合していればよい。２以上の側鎖カルボキシ基に該核酸代謝拮抗剤がそれぞれ結合しているコハク酸モノアミドユニットの重合体が好ましい。すなわち、総側鎖カルボキシ基に対する核酸代謝拮抗剤結合率は１０〜９０％の重合体であることが好ましい。
【０１２５】
該［タイプ１−２］におけるＲ１はポリアスパラギン酸誘導体であって、一般式（４）又は（５）
【化２９】
2016093352.tif 000030
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１２は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）であり、該Ｒ１４及び該Ｒ１５は同一でも異なってもいてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１３は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｘ２は末端官能基Ｆとの結合基であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ａ＋ｂ）は１〜３０の整数を示し、ポリアミノ酸誘導体の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１２が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示される置換基であることが好ましい。
【０１２６】
前記［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、該核酸代謝拮抗剤結合残基とは前記［タイプ１−１］における該［Ｄ］の記載と同義である。
【０１２７】
Ｒ１２は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）である。該Ｒ１４及び該Ｒ１５における、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、シクロへキシル基が挙げられる。
該三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基としては、例えば、２−ジメチルアミノエチル基、３−ジメチルアミノプロピル基、５−ジメチルアミノペンチル基、６−ジメチルアミノヘキシル基等が挙げられる。
該Ｒ１４及びＲ１５として好ましくは、エチル基、イソプロピル基、シクロへキシル基、３−ジメチルアミノプロピル基が挙げられる。
【０１２８】
前記Ｒ１２が水酸基である場合、カルボン酸の態様を示す。また、そのカルボン酸の任意の塩態様であっても良い。
前記Ｒ１２は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）であるが、水酸基のみである場合、水酸基及び−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）が共存する場合、若しくは−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）のみである場合の態様を取り得る。水酸基と−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）の存在比率は任意に設定されて良い。
【０１２９】
前記Ｒ１３における炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基である。例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
前記Ｒ１３における炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基である。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる
【０１３０】
前記Ｘ２は、一般式（４）又は（５）で表されるＲ１と、多分岐高分子担体の末端反応性官能基［Ｆ］との結合基である。該結合基Ｘ２としては、該Ｒ１の末端基と、末端反応性官能基［Ｆ］に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有する結合基であれば、特に限定されるものではない。
【０１３１】
該Ｘ２は、一方の末端基が該Ｒ１の末端基と結合して、もう一方の末端基が、末端反応性官能基［Ｆ］とエステル結合、アミド結合、チオエステル結合、ウレア結合又はウレタン結合することができる結合性官能基を有する、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基が好ましい。
該Ｘ２に係る結合基としては、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−Ｏ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ−（ｙは０〜８の整数を示す）等が挙げられる。
【０１３２】
また、該Ｘ２は「結合」であってもよい。「結合」とは、特に結合基を介せず、多分岐高分子担体の末端反応性官能基と前記Ｒ２に係る末端基が直接結合している態様を指す。
【０１３３】
一般式（４）又は（５）で表されるポリアスパラギン酸誘導体置換基は、総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１〜３０である。好ましくは重合数が４〜３０のポリアスパラギン酸誘導体置換基であり、重合数５〜２５が好ましい。
アスパラギン酸誘導体ユニットの各構成数を示すａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜３０の整数である。しかしながら、前記核酸代謝拮抗剤［Ｄ］が結合したアスパラギン酸誘導体ユニットは必須の構成であり、（ａ＋ｂ）は１〜３０の整数を示す。好ましくは（ａ＋ｂ）は４〜２５の整数であり、５〜２０であることがより好ましい。また、水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１４）ＣＯＮＨ（Ｒ１５）であるＲ１２が結合したアスパラギン酸誘導体ユニット数である（ｃ＋ｄ）及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸誘導体ユニット数であるｅは任意の構成であり、（ｃ＋ｄ）及びｅは０〜２９である。
【０１３４】
また、一般式（４）又は（５）で表されるポリアスパラギン酸誘導体置換基は、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１２が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、局在化した配列の態様であっても良く、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であっても良く、つまり、その側鎖修飾体の配列順序において特に規則性のない配列である。
【０１３５】
該［タイプ１−２］におけるＲ２は、ポリエチレングリコールセグメントを含有する置換基である。該ポリエチレングリコールセグメントを含有する置換基とは、前記［タイプ１］に記載の同義である。
該Ｒ２は、一般式（８）
【化３０】
2016093352.tif 000031
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］で示されるポリエチレングリコールセグメントであることが好ましい。ここで、Ｒ８、ｋ及びＸ１は前述と同義である。
【０１３６】
該［タイプ１−２］に係る核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体セグメント（Ｒ１）及びポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）以外に、更に、任意のコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）が結合していても良い。これらの任意の置換基は、Ｒ２に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体セグメントから、該核酸代謝拮抗剤が解離した残基である。
該［タイプ１−２］のＲ１に係る核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体セグメントが、一般式（４）又は（５）で示されるポリアスパラギン酸誘導体である場合、該Ｒ３は、前記一般式（４）又は（５）において、核酸代謝拮抗剤；［Ｄ］を具備するアスパラギン酸ユニットが欠如したポリアスパラギン酸誘導体となる。すなわち一般式（４）又は（５）において、ａ及びｂが０であり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｘ２、ｃ、ｄ及びｅが前述と同義である置換基である。
【０１３７】
該［タイプ１−２］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体（Ｒ１）、前記ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）、並びに前記コハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）が結合していない末端官能基［Ｆ］を含んでいても良い。該［Ｆ］はアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の末端官能基である。また、前記末端官能基が、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾されたアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であっても良い。すなわち、一般式（１）における［Ｆ］は、末端反応性官能基のままであっても良く、末端反応性官能基の保護基修飾体であっても良く、これらが混在した基であっても良い。該［Ｆ］に係る末端官能基は、前記［タイプ１−１］と同義である。
【０１３８】
前記末端反応性官能基の保護基修飾体の好ましい例としては、末端官能基がアミノ基、水酸基、メルカプト基の場合は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、メトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
末端官能基がカルボキシ基の場合、エチルアミノ基、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、メトキシエトキシエチルアミノ基等のアミド結合体、若しくはエトキシ基、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシメトキシ基等のエステル結合体が挙げられる。
【０１３９】
当該末端反応性官能基の保護基修飾体は、任意に存在して良く０基以上であり１９９基以下で存在する。当該保護基修飾体は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の表面電荷等を制御することができ、水溶性や自己会合性等の物性制御をすることができることから、具備することが好ましい。このため、当該保護基修飾体が４基以上であり１５０基以下で存在することが好ましく、６基以上であり１００基以下で存在することがより好ましい。
【０１４０】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が前記［タイプ１−２］である場合、一般式（１）におけるそれぞれの置換基結合数は、ｍは０〜１９８の整数であり、ｎは１〜１９９の整数であり、ｏは１〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９８の整数である。好ましくは、ｍは０〜１２０の整数であり、ｎは２〜１００の整数であり、ｏは２〜１００の整数であり、ｐは０〜８０の整数である。より好ましくは、ｍは０〜８０の整数であり、ｎは５〜５０の整数であり、ｏは５〜５０の整数であり、ｐは０〜５０の整数である。また、多分岐高分子担体の末端置換基総数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数である。好ましくは４〜１５０であり、より好ましくは８〜１００である。
Ｒ１で示される核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニット及びＲ２で示されるポリエチレングリコールセグメントの結合数は、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の薬物動態特性や、核酸代謝拮抗剤の解離速度を踏まえ、適宜設定されるべきである。
該［タイプ１−２］は、該Ｒ１がコハク酸モノアミド重合体を用いるため、１つの置換基に複数の核酸代謝拮抗剤を結合させることができる。このため、核酸代謝拮抗剤含量を高くすることができることから、前述の［タイプ１−１］より、Ｒ１の結合数；ｎを低くすることも可能である。
【０１４１】
次に本発明に係る核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の別の実施態様である、前記ポリエチレングリコールセグメントと前記核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットが連結して一体となった置換基が該多分岐高分子担体の末端反応性官能基に結合する［タイプ２］の実施態様について説明する。
該［タイプ２］は、前記一般式（１）におけるＲ１が、ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基である。
【０１４２】
前記［タイプ２］における前記ポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基は、下記一般式（２５）及び／又は（２６）
【化３１】
2016093352.tif 000032
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｙは多分岐高分子担体との結合基であって酸素原子又はＮ−Ｒ４であり、前記Ｒ４並びにＲ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ１６はポリエチレングリコールセグメントである。］で示されるポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基が好ましい。
核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合、又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、側鎖カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【０１４３】
前記一般式（２５）及び（２６）で示される前記ポリエチレングリコールセグメントとコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基は、光学活性体であっても良く、それらの任意の混合物であっても良い。
該Ｒ４、Ｒ５及びＲ６、並びに［Ｄ］に係る核酸代謝拮抗剤は前述と同義である。
前記一般式（２５）及び（２６）で示される置換基としては、ＹがＮ−Ｒ４であることが好ましい。すなわち、ポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤が結合したアスパラギン酸モノアミドユニットであることが好ましい。この場合の該Ｒ４、Ｒ５及びＲ６、並びに［Ｄ］に係る核酸代謝拮抗剤も前述と同義である。
【０１４４】
また、該［タイプ２］において、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットは、複数の該コハク酸モノアミドユニットの重合体セグメントであっても良い。この場合、前記核酸代謝拮抗剤は、コハク酸モノアミドユニットの重合体の側鎖カルボキシ基にアミド結合及び／又はエステル結合を介して、１分子以上、好ましくは２分子以上の複数分子で結合している置換基である。
核酸代謝拮抗剤の結合様式は、アミド結合のみの場合、エステル結合のみの場合、又はアミド結合とエステル結合との混合体の場合の何れでも良い。用いる核酸代謝拮抗剤の結合性官能基に応じて、側鎖カルボキシ基への結合様式を適宜選択して良い。
【０１４５】
該［タイプ２］における核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの重合体であるセグメントは、核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸セグメントを用いることが好ましい。すなわち、側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤がアミド結合及び／又はエステル結合により結合したポリアスパラギン酸セグメントが好ましい。該ポリアスパラギン酸は，α型重合体であってもβ型重合体であっても良く、α型とβ型が混在した重合体であっても良い。
核酸代謝拮抗剤は、該コハク酸モノアミドユニットの重合体における１以上の側鎖カルボキシ基に結合していれば良い。２以上の側鎖カルボキシ基に該核酸代謝拮抗剤が結合しているコハク酸モノアミドユニットの重合体が好ましい。すなわち、総側鎖カルボキシ基に対する核酸代謝拮抗剤結合率は１０〜９０％の重合体が好ましい。
【０１４６】
該［タイプ２］におけるポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合様式は特に限定されるものではなく、両置換基がそれぞれの末端基で直接結合しても良く、また、適当な結合基を介して結合しても良い。適当な結合基を介して連結した置換基であることが好ましい。
該［タイプ２］のポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットの結合型置換基の多分岐高分子担体との結合様式としては、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットと多分岐高分子担体の末端反応性官能基が結合し、ポリエチレングリコールセグメントが、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の外殻層を形成する構造であることが好ましい。
【０１４７】
該［タイプ２］の一般式（２５）及び（２６）におけるＲ１６で示されるポリエチレングリコールセグメントは、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造を有するセグメントである。好ましくはエチレンオキシ基単位重合度が５〜１０，０００ユニット、より好ましくは重合度が５〜２，５００ユニットであり、特に好ましくは１０〜１，０００ユニットであり、殊更好ましくは２０〜５０ユニットのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
すなわち該ポリエチレングリコールセグメントは、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として０．２キロダルトン〜５００キロダルトンのセグメント部であることが好ましく、より好ましくは平均分子量として０．２キロダルトン〜１５０キロダルトンの構造部分であり、特に好ましくは平均分子量として０．５キロダルトン〜５０キロダルトンである。平均分子量として１キロダルトン〜２０キロダルトンのポリエチレングリコールセグメントであることが、殊更好ましい。
【０１４８】
前記一般式（２５）及び（２６）におけるＲ１６のポリエチレングリコールセグメントは、一般式（２３）
【化３２】
2016093352.tif 000033
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ５は側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットとの結合基を示す。］を用いることが好ましい。
すなわち、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造によるエチレンオキシ基単位重合度が５〜２，５００ユニットのポリエチレングリコールセグメントであり、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として２００ダルトン〜１５０キロダルトンのセグメント部であることが好ましい。より好ましくは重合度が２０〜１，５００ユニットであり、平均分子量として１キロダルトン〜５０キロダルトンのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。なお、該Ｒ８は前述と同義である。
【０１４９】
前記一般式（２３）におけるＸ５は側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸モノアミドユニットとの結合基を示す。該コハク酸モノアミドユニットと前記ポリエチレングリコールセグメントの結合部位は該コハク酸の一方のカルボキシ基に対して、アミド結合する態様である。したがって、該Ｘ５の一方の末端基は該アミド結合に結合し、もう一方の末端基は前記ポリエチレングリコールセグメントの酸素原子とエーテル結合、エステル結合、ウレタン結合又はカーボネート結合ができる結合性官能基を有する。よって、該Ｘ５は前記末端基を有する置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキレン基であることが好ましい。
【０１５０】
該Ｘ５に係る結合基としては、ポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、コハク酸モノアミドユニットのアミド結合と連結する結合基として、−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）が挙げられる。ポリエチレングリコールセグメントとエステル結合し、コハク酸モノアミドユニットのアミド結合と連結する結合基として、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）が挙げられる。ポリエチレングリコールセグメントとウレタン結合し、コハク酸モノアミドユニットのアミド結合と連結する結合基として、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）が挙げられる。
また、ポリエチレングリコールセグメントとカーボネート結合し、コハク酸モノアミドユニットのアミド結合と連結する結合基として、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）を挙げることができる。
該Ｘ５として、好ましくはポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、コハク酸モノアミドユニットのアミド結合と連結する結合基であり、−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）である。
【０１５１】
該［タイプ２］において、一般式（１）におけるＲ１がポリエチレングリコールセグメントと側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸誘導体セグメントのブロック共重合体であって、一般式（６）又は（７）
【化３３】
2016093352.tif 000034
［式中、［Ｄ］は核酸代謝拮抗剤の結合残基であり、Ｒ１６はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ１７は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）であり、該Ｒ１８及び該Ｒ１９は同一でも異なっていてもよく、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｘ３は末端官能基Ｆとの結合基であり、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ及びｊはそれぞれ独立して０〜３０の整数を示し、（ｆ＋ｇ）は１〜３０の整数を示し、ポリアミノ酸誘導体の総重合数である（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）は１〜３０であり、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１７が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示される置換基であることが好ましい。
【０１５２】
該［Ｄ］の核酸代謝拮抗剤は前述と同義であり、例えば、ピリミジン系代謝拮抗剤、プリン系代謝拮抗剤、トリアジン系代謝拮抗剤等が挙げられる。アミノ基及び／又は水酸基を有する核酸代謝拮抗剤を用いる事が好ましい。より好ましくは、ヌクレオシド塩基にアミノ基を有する核酸代謝拮抗剤であり、該アミノ基によりアスパラギン酸ユニットのカルボキシ基にアミド結合できる核酸代謝拮抗剤であることが好ましい。
【０１５３】
核酸代謝拮抗剤は、核酸塩基部分が下記式（１２）から選択されるいずれか１種以上であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１３）から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。
【化３４】
2016093352.tif 000035
［式中、−Ｒｆは、式（１３）：
【化３５】
2016093352.tif 000036
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基残基を示す。］。ここでＲ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、前述と同義である。
【０１５４】
該核酸代謝拮抗剤は、シチジン系代謝拮抗剤を用いることが好ましく、核酸塩基部分が下記式（１４）で示されるシチジン塩基であり、それに結合している基（Ｒｆ）が下記式（１５）の置換基群から選択されるいずれか１種以上の組み合せである核酸代謝拮抗剤であることが特に好ましい。ここで、Ｒ２０は水酸基又は脂肪酸エステルのアシル基で表される化合物である。
【０１５５】
【化３６】
2016093352.tif 000037
［式中、−Ｒｆは、式（１４）：
【化３７】
2016093352.tif 000038
の置換基群より選ばれる基を示し、Ｒ２０は水素原子又は脂肪酸エステルのアシル基を示す。］。Ｒ２０における脂肪酸エステルのアシル基は、前述と同義である。
【０１５６】
これらのシチジン系代謝拮抗剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体、並びに３’−エチニルシチジン（Ｅｔｈｙｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びその脂肪酸エステル誘導体である。脂肪酸エステル誘導体として、シタラビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４０５５）、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（ＣＰ−４１２６）等であり、本発明において好適に用いられる。
【０１５７】
Ｒ１７は、水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）である。該Ｒ１８及びＲ１９における、三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、シクロへキシル基が挙げられる。
該三級アミノ基で置換されていても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基としては、例えば、２−ジメチルアミノエチル基、３−ジメチルアミノプロピル基、５−ジメチルアミノペンチル基、６−ジメチルアミノヘキシル基等が挙げられる。
該Ｒ１８及びＲ１９として好ましくは、エチル基、イソプロピル基、シクロへキシル基、３−ジメチルアミノプロピル基が挙げられる。
【０１５８】
前記Ｒ１７が水酸基である場合、カルボン酸の態様を示す。また、そのカルボン酸の任意の塩態様であっても良い。
前記Ｒ１７は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）であるが、水酸基のみである場合、水酸基及び−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）が共存する場合、若しくは−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）のみである場合の態様を取り得る。水酸基と−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）の存在比率は任意に設定されて良い。
【０１５９】
前記一般式（６）及び（７）におけるＲ１６のポリエチレングリコールセグメントは、一般式（２４）
【化３８】
2016093352.tif 000039
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ５’は側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸セグメントとの結合基を示す。］を用いることが好ましい。
すなわち、エチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造によるエチレンオキシ基単位重合度が５〜２，５００ユニットのポリエチレングリコールセグメントであり、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として０．２キロダルトン〜１５０キロダルトンのセグメント部であることが好ましい。より好ましくは重合度が１０〜１，０００ユニットであり、平均分子量として０．５キロダルトン〜５０キロダルトンであり、更に好ましくは重合度が２０〜５００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜２０キロダルトンであり、殊更好ましくは重合度が２０〜３００ユニットで、平均分子量として１キロダルトン〜１２キロダルトンのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。なお、該Ｒ８の詳細は前述と同義である。
【０１６０】
前記一般式（２４）におけるＸ５’は側鎖カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤が結合したポリアスパラギン酸セグメントとの結合基を示す。該ポリアスパラギン酸セグメントと前記ポリエチレングリコールセグメントの結合部位は窒素官能基であり、該Ｘ５’の一方の末端基は該窒素官能基と連結できる結合性官能基であり、もう一方の末端基は前記ポリエチレングリコールセグメントの酸素原子とエーテル結合、エステル結合、ウレタン結合又はカーボネート結合ができる結合性官能基を有する。よって、該Ｘ５’は前記末端基を有する置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキレン基であることが好ましい。
【０１６１】
該Ｘ５’に係る結合基としては、ポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、ポリアスパラギン酸セグメントと結合する結合基として、−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）、が挙げられる。ポリエチレングリコールセグメントとエステル結合し、ポリアスパラギン酸セグメントと結合する結合基として、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）が挙げられる。ポリエチレングリコールセグメントとウレタン結合し、ポリアスパラギン酸セグメントと結合結合する結合基として、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）が挙げられる。
また、ポリエチレングリコールセグメントとカーボネート結合し、ポリアスパラギン酸セグメントと結合する結合基として、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）を挙げることができる。
該Ｘ５として、好ましくはポリエチレングリコールセグメントとエーテル結合し、ポリアスパラギン酸セグメントと結合する結合基であり、−（ＣＨ２）ｘ−（ｘは１〜８の整数を示す）である。
【０１６２】
前記Ｘ３は、一般式（６）又は（７）で表されるポリアスパラギン酸誘導体セグメントと多分岐高分子担体の末端反応性官能基［Ｆ］との結合基である。該結合基Ｘ３としては、該Ｒ１の末端基と、末端反応性官能基［Ｆ］に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有する結合基であれば、特に限定されるものではない。
【０１６３】
該Ｘ３は、一方の末端基が該ポリアスパラギン酸誘導体セグメントの末端基と結合して、もう一方の末端基が、末端反応性官能基［Ｆ］とエステル結合、アミド結合、チオエステル結合、ウレア結合又はウレタン結合することができる結合性官能基を有する、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基である。
該Ｘ３に係る結合基としては、末端反応性官能基［Ｆ］とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する結合基として、例えば、−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−Ｏ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ−（ｙは０〜８の整数を示す）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ−（ｙは０〜８の整数を示す）等が挙げられる。
【０１６４】
また、該Ｘ３は「結合」であってよい。「結合」とは、特に結合基を介せず、多分岐高分子担体の末端反応性官能基と前記ポリアスパラギン酸誘導体セグメントに係る末端基が直接結合している態様を指す。
【０１６５】
一般式（６）又は（７）で表されるポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸誘導体セグメントのブロック共重合体である置換基は、総重合数である（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）は１〜３０である。好ましくは重合数が４〜３０のポリアスパラギン酸誘導体セグメントであり、重合数５〜２５のセグメント構造が好ましい。
アスパラギン酸誘導体ユニットの各構成数を示すｆ、ｇ、ｈ、ｉ及びｊはそれぞれ独立して０〜３０の整数である。しかしながら、前記核酸代謝拮抗剤［Ｄ］が結合したアスパラギン酸誘導体ユニットは必須の構成であり、（ｆ＋ｇ）は１〜３０の整数を示す。好ましくは（ｆ＋ｇ）は４〜２５の整数であり、５〜２０であることがより好ましい。また、水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１８）ＣＯＮＨ（Ｒ１９）であるＲ１７が結合したアスパラギン酸誘導体ユニット数である（ｈ＋ｉ）及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸誘導体ユニット数であるｊは任意の構成であり、（ｈ＋ｉ）及びｊは０〜２９である。
また、一般式（６）又は（７）で表される置換基は、前記［Ｄ］が結合したアスパラギン酸単位、前記Ｒ１７が結合したアスパラギン酸単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型のアスパラギン酸単位が、局在化した配列の態様であっても良く、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であっても良く、つまり、その側鎖修飾体の配列順序において特に規則性のない配列である。
【０１６６】
該［タイプ２］に係る核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、一般式（１）のＲ２で示されるポリエチレングリコールセグメントを含む置換基を備えていても良い。該ポリエチレングリコールセグメントを含有する置換基とは、前記［タイプ１］に記載の同義である。
該Ｒ２は、一般式（８）
【化３９】
2016093352.tif 000040
［式中、Ｒ８は水素原子又は置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、ｋは５〜２，５００の整数であり、Ｘ１は末端官能基Ｆとの結合基を示す。］で示されるポリエチレングリコールセグメントであることが好ましい。ここで、Ｒ８、ｋ及びＸ１は前述と同義である。
【０１６７】
該［タイプ２］に係る核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、ポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットが連結した置換基（Ｒ１）及び、任意のポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）、並びに、更に任意のコハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）が結合していても良い。これらの任意の置換基は、Ｒ１に係るポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットが連結した置換基から、該核酸代謝拮抗剤が解離した残基である。
該［タイプ２］のＲ１に係るポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットが連結した置換基が、一般式（６）又は（７）で示されるポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸誘導体のブロック共重合体である場合、該Ｒ３は、前記一般式（６）又は（７）において、核酸代謝拮抗剤；［Ｄ］を具備するアスパラギン酸ユニットが欠如したポリアスパラギン酸誘導体となる。すなわち一般式（６）又は（７）において、ｆ及びｇが０であり、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｘ３、ｈ、ｉ及びｊが前述と同義である置換基である。
【０１６８】
該［タイプ２］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物において、前記ポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットが連結した置換基（Ｒ１）、前記ポリエチレングリコールセグメントを含む置換基（Ｒ２）、並びに前記コハク酸モノアミド誘導体残基及び／又はコハク酸イミド残基を含む置換基（Ｒ３）が結合していない末端官能基［Ｆ］を含んでいても良い。
該［Ｆ］はアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の末端官能基である。また、前記末端官能基が、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を有する保護基で修飾されたアミノ基、水酸基、カルボキシ基、メルカプト基からなる群から選択される１種以上の官能基であっても良い。すなわち、一般式（１）における［Ｆ］は、末端反応性官能基のままであっても良く、末端反応性官能基の保護基修飾体であっても良く、これらが混在した基であっても良い。該［Ｆ］に係る末端官能基は、前記［タイプ１−１］と同義である。
【０１６９】
前記末端反応性官能基の保護基修飾体の好ましい例としては、末端官能基がアミノ基、水酸基、メルカプト基の場合は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、メトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
末端官能基がカルボキシ基の場合、エチルアミノ基、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、メトキシエトキシエチルアミノ基等のアミド結合体、若しくはエトキシ基、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシメトキシ基等のエステル結合体が挙げられる。
【０１７０】
当該末端反応性官能基の保護基修飾体は、任意に存在して良く０基以上であり１９９基以下で存在する。当該保護基修飾体は、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の表面電荷等を制御することができ、水溶性や自己会合性等の物性制御をすることができることから、具備することが好ましい。このため、当該保護基修飾体が４基以上であり１５０基以下で存在することが好ましく、６基以上であり１００基以下で存在することがより好ましい。
【０１７１】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物が前記［タイプ２］である場合、一般式（１）におけるそれぞれの置換基結合数は、ｍは０〜１９９の整数であり、ｎは１〜２００の整数であり、ｏは０〜１９９の整数であり、ｐは０〜１９９の整数である。好ましくは、ｍは０〜１２０の整数であり、ｎは２〜１００の整数であり、ｏは０〜１００の整数であり、ｐは０〜８０の整数である。より好ましくは、ｍは０〜８０の整数であり、ｎは５〜５０の整数であり、ｏは０〜５０の整数であり、ｐは０〜５０の整数である。また、多分岐高分子担体の末端置換基総数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ）は４〜２００の整数である。好ましくは４〜１５０であり、より好ましくは８〜１００である。
Ｒ１で示されるポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットが連結した置換基の結合数は、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の薬物動態特性や、核酸代謝拮抗剤の解離速度を踏まえ、適宜設定されるべきである。
該［タイプ２］は、該Ｒ１がポリエチレングリコールセグメントと核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドの２種類の機能性官能基を一体化した置換基を用いるため、多分岐化合物において、少ない置換基数で所望の物性を得ることができる。更に、核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドをその重合体とすることで、１つの置換基に複数の核酸代謝拮抗剤を結合させることができる。このため、核酸代謝拮抗剤含量を高くすることができて好ましい。したがって、Ｒ１の結合数；ｎを低くすることも可能である。
【０１７２】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、該多分岐化合物の水溶液を調製して、非経口的に投与して用いることが好ましい。該水溶液は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）、５％ブドウ糖水溶液等により溶解して調製される。
【０１７３】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、薬効の発現と骨髄抑制といった副作用と相関することが考えられる。一般的に、分子量が１０キロダルトン以下であると、非経口的に投与した後、生体内からの排泄が速やかに行われる。該形態においては、薬効を発現するより先に体外に排出され、所望の薬効が得られないことが考えられる。一方で、分子量が２００キロダルトン以上であると、生体内における化合物の貯留時間が延長しすぎて核酸代謝拮抗剤の副作用を増強させてしまうことが考えられる。したがって、本発明の多分岐化合物は、核酸代謝拮抗剤をコハク酸モノアミドを介して具備させ、且つ分子量は１０キロダルトン以上２００キロダルトン以下とすることで、優れた薬効を維持しつつ、副作用の少ない治療効果の高い医薬品を提供することができる。該多分岐化合物における分子量は２０キロダルトン以上１６０キロダルトン以下であることが、より好ましい。
【０１７４】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、該水溶液において、自己会合性を示さない物性であることが好ましい。ここで自己会合性とは、当該多分岐化合物が１０分子より多くの分子で自己会合して凝集体を形成する物性であることを示す。したがって、本発明における「自己会合性を示さない物性」とは、水溶液中における当該多分岐化合物が単分子体で存在するか、若しくは１０分子以下の自己会合体を形成する態様を示す。
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の自己会合性の指標として、レーザー光を用いた光散乱強度を用いることが有効である。すなわち、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の水溶液中での自己会合性を、レーザー光散乱強度を指標として確認することができる。その際、トルエンを光散乱強度標準試料として、トルエンに対する相対強度を指標として、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の水溶液中での自己会合性を確認する方法が有効である。
本発明において、当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の濃度が１ｍｇ／ｍＬの水溶液をレーザー光散乱光度計にて計測し、光散乱強度がトルエンの光散乱強度に対する相対強度として５倍以下である場合、自己会合性を示さない物性であり、水溶液中においてほぼ単分子体〜数分子程度の会合体で分散していると考えられる。好ましくは、光散乱強度がトルエンの光散乱強度に対する相対強度として３倍以下となる多分岐化合物である。
【０１７５】
前記レーザー光散乱光度計としては、例えば、大塚電子社製ダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ−８０００ＤＬ（測定温度２５℃、測定角度：９０°、波長：６３２．８ｎｍ、ＮＤフィルター：５％、ＰＨ１：ＯＰＥＮ、ＰＨ２：ＳＬＩＴ、サンプル濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を用い、当該多分岐化合物の濃度が１ｍｇ／ｍＬの水溶液を、レーザー光散乱光度計にて光散乱強度を計測する測定方法を挙げることができる。  なお、光散乱強度測定の標準物質して用いるトルエンは、試薬レベルの純度であれば特に限定されるものではなく用いることができる。光散乱分析の試料調製において通常行う、前処理濾過を行ったトルエンを用いることが好ましい。
当該核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は，この測定方法において、光散乱強度がトルエンの光散乱強度に対する相対強度として５倍以下である場合が好ましく，より好ましくは３倍以下である。この場合、下限値は特に限定されるものではなく、明確な光散乱強度を示さない場合であり、水溶液中において自己会合性を示さない状態であり、水溶液中において、ほぼ単分子体〜数分子程度の会合体で分散していることを示している。
【０１７６】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の、水溶液中における自己会合性の有無は、骨髄抑制といった副作用と相関する。核酸代謝拮抗剤は、副作用として白血球減少等の骨髄抑制が発現し、該治療剤を用いた治療継続を困難とする問題がある。このため、骨髄抑制の少ない核酸代謝拮抗剤治療剤を提供することは、悪性腫瘍等の治療方法において、非常に有用である。
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、水溶液中の物性として粒径が小さい多分岐高分子担体を用いて、核酸代謝拮抗剤のプロドラッグを調製するとともに、ポリエチレングリコールセグメントを配することにより自己会合性の低い物性の高分子化プロドラッグを調製したものである。該誘導体は、水溶液中における自己会合性を示さない物性となり、結果として骨髄抑制が少ない治療効果の高い医薬品を提供することができる。
【０１７７】
次に、本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の製造方法について説明する。
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、末端反応性官能基を有する多分岐高分子担体を用い、これにポリエチレングリコールセグメント、並びに核酸代謝拮抗剤を結合させたコハク酸モノアミドユニットを含む置換基を結合させることで調製することができる。
当該多分岐化合物の製造方法としては、多分岐高分子担体にポリエチレングリコールセグメント及びコハク酸モノアミドユニットを同時に反応させて、その後、核酸代謝拮抗剤を化学結合させる方法や、あらかじめコハク酸モノアミドユニットに核酸代謝拮抗剤を結合させた化合物を調製し、多分岐高分子担体にポリエチレングリコールセグメント及びあらかじめ調製した核酸代謝拮抗剤を結合させたコハク酸モノアミドユニットの化合物を同時に反応させる方法が挙げられる。又は、ポリエチレングリコールセグメントを多分岐高分子担体に反応させ、その後、これにコハク酸モノアミドユニットを化学結合させ、最後に、核酸代謝拮抗剤を化学結合させる方法でも製造することができる。若しくは、ポリエチレングリコールセグメントを多分岐高分子担体に反応させ、その後、核酸代謝拮抗剤を結合させたコハク酸モノアミドユニットを含む化合物を反応させる方法などが挙げられる。当該製造方法としては、該ポリエチレングリコールセグメント導入量及び該核酸代謝拮抗剤の結合量を制御しやすいことから、２種の置換基を順次結合させる後者で示した２つの方法を用いることが好ましい。
前記反応終了後、任意に精製工程を施しても良く、医薬品として適用することができるポリエチレングリコールセグメント及び核酸代謝拮抗剤を末端官能基に導入した多分岐化合物を製造することができる。
【０１７８】
以下の、本発明に係る核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の製造方法例について、２つのタイプ別に説明する。
前記［タイプ１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製する場合は、末端反応性官能基を有する多分岐高分子担体に対し、該末端反応性官能基と結合し得る官能基を有するポリエチレングリコールセグメント化合物、並びに該末端反応性官能基と結合し得る官能基を有する核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットを含む化合物を、順次又は同時に反応させることで、目的の［タイプ１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製することができる。ポリエチレングリコールセグメント化合物と核酸代謝拮抗剤結合コハク酸モノアミドユニットを含む化合物の結合性官能基は、同じ種類の官能基を用いても、異種の官能基を用いても何れであっても良いが、同種の官能基を用いた方が好ましい。
【０１７９】
例えば、末端反応性官能基がカルボキシ基の多分岐高分子担体を用い、これにアミノ基を有するポリエチレングリコールセグメント化合物と、カルボキシ基に核酸代謝拮抗剤を結合させたアスパラギン酸誘導体を、アミド縮合反応条件下で反応させることにより、目的の［タイプ１］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製することができる。この際、それぞれの反応量を制御することにより、所望のポリエチレングリコールセグメント含有量や、核酸代謝拮抗剤含有量の化合物を調製することができる。該反応終了後、任意に精製工程を施しても良く、医薬品として適用することができる当該化合物を製造することができる。
【０１８０】
一方、前記［タイプ２］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製する場合は、末端反応性官能基を有する多分岐高分子担体に対し、該末端反応性官能基と結合し得る官能基を有するポリエチレングリコールセグメント−核酸代謝拮抗剤結合（ポリ）アスパラギン酸が連結した化合物を反応させることにより達成できる。
例えば、アミノ基を有するポリエチレングリコールセグメント化合物を反応開始剤として、Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物を開環重合させることにより、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸を得る。これのアスパラギン酸側鎖カルボキシ基に、核酸代謝拮抗剤を結合させることにより、ポリエチレングリコールセグメント−核酸代謝拮抗剤結合（ポリ）アスパラギン酸結合化合物を調製することができる。これを末端反応性官能基がカルボキシ基の多分岐高分子担体に対して、アミド縮合反応条件下で反応させることにより、目的の［タイプ２］の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を調製することができる。該反応終了後、任意に精製工程を施しても良く、医薬品として適用することができる当該化合物を製造することができる。
【０１８１】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、生体内に投与後、核酸代謝拮抗剤を徐々に遊離する性質を有し、該核酸代謝拮抗剤を有効成分とする医薬としての用途を有する。
【０１８２】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の医薬品としての用途は、該核酸代謝拮抗剤により治療効果を奏する疾病であれば特に限定されるものではない。例えば、悪性腫瘍、ウイルス疾患等の治療に用いられる医薬に適する。特に好ましくは、悪性腫瘍の治療用医薬である。悪性腫瘍としては、非小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫等を挙げることができる。
【０１８３】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を含む医薬は、医薬品として通常容認される他の添加剤を有していても良い。該添加剤としては、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等が挙げられる。
【０１８４】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を含む医薬は、治療用の医薬品製剤として調製されても良い。該製剤としては、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、臓器の灌流液に混合、患部臓器への局所投与等いずれの投与方法でも可能であるが、好ましくは非経口的投与であり、より好ましくは注射による静脈内投与、動脈内投与又は患部臓器への局所投与である。
【０１８５】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を含む医薬の投与量は、病状、投与方法、患者の状態、年齢、体重等により異なるが、通常、核酸代謝拮抗剤換算で体表面積１ｍ２あたり１ｍｇ〜５，０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜２，０００ｍｇである。投与用法としては、１日１回又は数回に分けて投与しても良い。投与は連日行なうこともできるが、数日から数ヶ月の間をおいて反復投与を行なっても良い。必要に応じて前記以外の投与方法、投与量、投与スケジュールを用いることができる。
【実施例】
【０１８６】
以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１から８の「核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量」は、以下の計算式により算出した。
［核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体の分子量］  ＋［（ポリエチレングリコールセグメント  ＋  ポリエチレングリコールの結合基残基）分子量  ×  結合数］  ＋  ［核酸代謝拮抗剤の結合残基分子量  ×  結合数］  ＋  ［アスパラギン酸モノアミドの結合残基分子量  ×  結合数］【０１８７】
本実施例において「ポリエチレングリコールセグメント」はポリエチレングリコールセグメントに結合基であるプロピレンアミンが一体となったポリエチレングリコールセグメント化合物を用いており、これらを合算してポリエチレングリコールセグメント分子量とした。
したがって、本実施例の「核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量」は、主要構成である、“多分岐高分子担体の分子量”、“（ポリエチレングリコールセグメント＋該結合基残基）の総分子量”及び“核酸代謝拮抗剤の総分子量”、並びに“アスパラギン酸モノアミドユニット残基の総分子量”を足し合わせた計算値を用いた。【０１８８】
ポリエチレングリコールセグメントの分子量は、導入反応前のポリエチレングリコールセグメント化合物において、ポリエチレングリコール標準物質を基準としたＧＰＣ分析におけるピークトップ分子量を採用した。【０１８９】
ポリエチレングリコールセグメントの結合数は、多分岐高分子担体とポリエチレングリコールセグメント化合物の結合反応において、ポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込み量に対する、該反応における消費率から算出した。
前記ポリエチレングリコール化合物の消費量は、以下の計算式により算出した。
多分岐高分子担体とポリエチレングリコールセグメント化合物の結合反応における、反応開始前（ジイソプロピルカルボジイミド添加前）の反応液１０μＬを１％リン酸９０μＬで希釈し、ＨＰＬＣ（使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ、ＧＥヘルスケア社製、検出器：示唆屈折検出分析器（ＲＩ））にて分析した。
この時のポリエチレングリコールセグメント化合物に相当するピーク面積をＡｓとし、反応終了時の反応液１０μＬを、１％リン酸９０μＬで希釈しＨＰＬＣにて分析したときのポリエチレングリコール化合物に相当するピーク面積をＡｔとした。
そして、以下の式によりポリエチレングリコールセグメントの消費率を算出した。
［ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率］  ＝  １  −  Ａｔ  ／  Ａｓ【０１９０】
核酸代謝拮抗剤の含有率及び結合数は、得られた実施例及び比較例の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物を１０ｍｇ精秤し、アセトニトリル１ｍＬを加えて溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えて混合し、３０分間撹拌することで加水分解した。
この加水分解溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１ｍＬを加え、水／アセトニトリル混液（１：１）を加えて正確に１０ｍＬとした。この溶液を、ＨＰＬＣを用いて遊離する核酸代謝拮抗剤を定量分析することにより、核酸代謝拮抗剤の含有率を算出した。
核酸代謝拮抗剤の結合数は、上記核酸代謝拮抗剤含有率に基づき核酸代謝拮抗剤分子量及び多分岐高分子担体分子量から算出した。
また、核酸代謝拮抗剤結合の総分子量は以下の式より算出した。
［核酸代謝拮抗剤結合の総分子量］＝［核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物１分子あたりの核酸代謝拮抗剤の結合数］  ×  ［核酸代謝拮抗剤の分子量］【０１９１】
実施例及び比較例の「ポリエチレングリコールセグメントの含有率」は、以下の計算式で算出した。
［ポリエチレングリコールセグメント含有率（％）］＝［ポリエチレングリコールセグメント総分子量］  ／  ［核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物分子量］×１００
該「ポリエチレングリコールセグメント総分子量」は、前記ポリエチレングリコールセグメントの分子量に前記ポリエチレングリコールセグメントの結合数を乗じて算出した数値を用いた。
該「核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物分子量」は、前記の各構成部分の分子量の総和により算出した数値を用いた。【０１９２】
実施例及び比較例の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の散乱強度測定は、大塚電子社製ダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ−８０００ＤＬ（測定温度２５℃、測定角度：９０°、波長：６３２．８ｎｍ、ＮＤフィルター：５％、ＰＨ１：ＯＰＥＮ、ＰＨ２：ＳＬＩＴ）にて行った。
散乱強度測定の測定サンプルは、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物濃度１ｍｇ／ｍＬになるように５％ブドウ糖注射液を加え、氷冷下にて超音波を３分間照射し調製した溶液を用いた。
光散乱強度の測定に用いるトルエン（純正化学社製、特級）は、０．２μｍメンブレンフィルターで３回濾過した後に使用した。
前記光散乱強度計により測定されたトルエン標準液の光散乱強度は、１２，９３４ｃｐｓであった。【０１９３】
実施例及び比較例の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の、測定サンプル溶液中における会合分子数は以下の計算式で算出した。
［会合分子数］＝［ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量］  ／  ［核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物分子量］
なお、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ＤＡＷＮ  ＥＯＳ（光散乱検出器）及びＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ（ＲＩ検出器）にて行い、ｄｎ／ｄｃはポリエチレングリコールの値（０．１３５）を用い算出した。
使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥヘルスケア社製
測定サンプルは、核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物１ｍｇ／ｍＬになるように５％ブドウ糖注射液を加え、氷冷下にて超音波を３分間照射し調製した溶液を用いた。【０１９４】
［合成例１］末端官能基数３２の多分岐高分子担体（ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシル）の合成（化合物１）
ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−ヒドロキシル（５．０ｇ、末端官能基数３２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、コハク酸無水物（２２．２ｇ）と、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１．１ｇ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解後、外温９０℃にて８時間撹拌した。室温まで降温し、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５０ｍＬ）を加え１時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾過により除去した。濾液を５０％アセトニトリル／精製水にて透析し、その後、内液を減圧下濃縮しアセトニトリルを除去し、凍結乾燥して化合物１に係る標記化合物（８．７２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４，ｐｐｍ）：１．１５−１．４１（ｂｒ，８４Ｈ）、２．５２−２．７７（ｂｒ，１２８Ｈ）、３．４２−３．９０（ｂｒ，１６Ｈ）、３．９５−４．６１（ｂｒ，１２０Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲの面積比より、原料である多分岐高分子担体末端のアルコールはすべてカルボン酸に変換されたことが確認された。したがって、化合物１の分子量は以下の式により、６．８キロダルトンと算出された。
［化合物１の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体前駆体の分子量］  ＋  ［（多分岐高分子担体前駆体の末端官能基数  ×  コハク酸分子量）］【０１９５】
［合成例２］末端官能基数６４の多分岐高分子担体（ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−６４−カルボキシル）の合成（化合物２）
ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−６４−ヒドロキシル（３．０ｇ、末端官能基数６４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、コハク酸無水物（１３．１ｇ）と、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．６４ｇ）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解後、外温９０℃にて８時間撹拌した。室温まで降温し、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、３０ｍＬ）を加え１時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾過により除去した。濾液を５０％アセトニトリル／精製水にて透析し、その後、内液を減圧下濃縮しアセトニトリルを除去し、凍結乾燥して化合物２に係る標記化合物（５．５３ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４，ｐｐｍ）：１．１５−１．５２（ｂｒ，１８０Ｈ）、２．３９−３．００（ｂｒ，２５６Ｈ）、３．４２−３．９０（ｂｒ，１６Ｈ）、３．９５−４．７５（ｂｒ，２４０Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲの面積比より、原料である多分岐高分子担体末端のアルコールはすべてカルボン酸に変換されたことが確認された。したがって、化合物２の分子量は以下の式により、１３．７キロダルトンと算出された。
［化合物２の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体前駆体の分子量］  ＋  ［（多分岐高分子担体前駆体の末端官能基数  ×  コハク酸分子量）］【０１９６】
［合成例３］  アスパラギン酸−１−アラニンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドの合成（化合物３）
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）アスパラギン酸−４−ベンジルエステル（１５．０ｇ）と、Ｌ−アラニンメチルエステル（６．５ｇ）をＤＭＦ（１６０ｍＬ）に溶解後、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＷＳＣＤ）塩酸塩（１３．３ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（８．５３ｇ）、トリエチルアミン（６．５ｍＬ）を加え、氷浴下にて４時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルにて抽出し、５％クエン酸水溶液，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下、酢酸エチルを留去し真空乾燥して油状物（１３．９ｇ）得た。
この油状物（１３．９ｇ）をメタノール（３５０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（水分含有量５０％）（１．３９ｇ）を加えた後、系内を水素置換し、室温にて３時間攪拌した。１０％パラジウム炭素を濾過し、メタノール（５０ｍＬ）で洗浄後、減圧下、メタノールを留去し真空乾燥して油状物（１０．６ｇ）を得た。
この油状物とゲムシタビン（３．０ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）を、ＤＭＦ（５６ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（２．１ｇ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（３．３ｇ）を加え、０℃から室温に昇温させ、一夜撹拌した。反応液に精製水を加え、酢酸エチル（１７０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を、飽和食塩水を用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、油状物（３．９ｇ）を得た。
この油状物を酢酸エチル（４１ｍＬ）に溶解させ、４規定の塩酸−酢酸エチル溶液（３１ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（８０ｍＬ）及びｎ−ヘキサン（２０ｍＬ）の混合溶媒を加え、沈析物を濾取し、真空乾燥させ、化合物３（２．９９ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：１．２０（ｄ，３Ｈ）、２．９５−３．１０（ｍ，２Ｈ）、３．６３（ｓ，３Ｈ）、３．６７（ｄｄ，１Ｈ）、３．９０−４．０２（ｍ，５Ｈ）、４．１８−４．３１（ｍ，３Ｈ）、６．１８（ｄｄ，１Ｈ）、７．２２（ｄ，１Ｈ）、８．２５（ｓ，２Ｈ）、８．９２（ｄ，１Ｈ）、１１．３（ｂｒ，１Ｈ）【０１９７】
［合成例４］  アスパラギン酸−１−ロイシンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドの合成（化合物４）
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｌ−アスパラギン酸−４−ベンジルエステル（渡辺化学工業社製、４．９ｇ）及びＬ−ロイシン−メチルエステル塩酸塩（国産化学社製、２．７ｇ）をＤＭＦ（７５ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（２．８ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（２．６ｍＬ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（４．３ｇ）を加え、０℃にて２時間攪拌した。反応液に精製水を加え、酢酸エチル（２５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、油状物（６．８ｇ）を得た。
この油状物をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解後、１０質量％パラジウム炭素を加え、水素雰囲気化で２時間攪拌した。反応液を濾過後、濾液を真空乾燥し、油状物（５．３７ｇ）を得た。
この油状物とゲムシタビン（３．０ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）をＤＭＦ（５７ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（２．１ｇ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（３．３ｇ）を加え、０℃から室温に昇温させ、一夜撹拌した。反応液に精製水を加え、酢酸エチル（１７０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を、飽和食塩水を用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、油状物（４．９ｇ）を得た。
この油状物を酢酸エチル（４４ｍＬ）に溶解させ、４規定の塩酸酢酸エチル溶液（３３ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（８０ｍＬ）及びｎ−ヘキサン（２０ｍＬ）の混合溶媒を加え、沈析物を濾取し、真空乾燥させ、化合物４（３．６２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：０．８９（ｄｄ，６Ｈ）、１．４９−１．７１（ｍ，３Ｈ）、２．９７−３．１７（ｍ，４Ｈ）、３．６３（ｓ，３Ｈ）、３．６６（ｄｄ，１Ｈ）、３．８０−３．９３（ｍ，２Ｈ）、４．１０−４．２８（ｍ，４Ｈ）、６．１８（ｄｄ，１Ｈ）、７．２２（ｄ，１Ｈ）、８．３２（ｓ，２Ｈ）、８．９１（ｄ，１Ｈ）、１１．３（ｂｒ，１Ｈ）【０１９８】
［合成例５］  アスパラギン酸−１−イソロイシンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドの合成（化合物５）
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｌ−アスパラギン酸−４−ベンジルエステル（国産化学社製、４．９ｇ）及びＬ−イソロイシン−メチルエステル塩酸塩（東京化成工業社製、２．７ｇ）をジクロロメタン（７５ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（２．８ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（３．１ｍＬ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（４．３ｇ）を加え、室温にて４時間攪拌した。反応液に精製水を加え、有機層を飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にてジクロロメタンを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、油状物（７．０ｇ）を得た。
この油状物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解後、５質量％パラジウム炭素を加え、水素雰囲気化で１７時間攪拌した。反応液を濾過後、濾液を真空乾燥し、油状物（５．４２ｇ）を得た。
この油状物とゲムシタビン（３．０ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）をＤＭＦ（５７ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（２．１ｇ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（３．３ｇ）を加え、０℃から室温に昇温させ、一夜撹拌した。反応液に精製水を加え、酢酸エチル（１７０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を、飽和食塩水を用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、油状物（４．５ｇ）を得た。
この油状物を酢酸エチル（２７ｍＬ）に溶解させ、４規定の塩酸酢酸エチル溶液（２０ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（４８ｍＬ）及びｎ−ヘキサン（１２ｍＬ）の混合溶媒を加え、沈析物を濾取し、真空乾燥させ、化合物５（２．０６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４，ｐｐｍ）： ０．８９−１．０１（ｍ，６Ｈ）、１．２７−１．３６（ｍ，１Ｈ）、１．４４−１．５５（ｍ，１Ｈ）、１．９１−２．００（ｍ，１Ｈ）、３．０８（ｄｄ，１Ｈ）、３．２５（ｄｄ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，３Ｈ）、３．８４（ｄｄ，１Ｈ）、３．９７−４．０３（ｍ，２Ｈ）、４．２８−４．３６（ｍ，１Ｈ）、４．４２（ｄｄ，１Ｈ）、４．４７（ｄ，１Ｈ）、６．２９（ｄｄ，１Ｈ）、７．２９（ｄ，１Ｈ）、８．４５（ｄ，１Ｈ）【０１９９】
［合成例６］３−アミノプロピル−ポリ−α−アスパラギン酸（重合数約１１）の合成（化合物６）
Ｎ−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（８０ｍｇ、東京化成社製）をＤＭＳＯ（４０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、３．０ｇ、ＩＳＯＣＨＥＭ社製）を加え、３２．５℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（１００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（９００ｍＬ）の混合溶媒中に１５分かけて滴下し、室温にて３時間攪拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し固形物を得た。
この固形物（２．０１ｇ）をＤＭＩ（４０ｍＬ）に溶解後、無水酢酸（４ｍＬ）を加え２０℃にて一夜攪拌した。反応液を、酢酸エチル（１００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（９００ｍＬ）の混合溶媒中に１５分かけて滴下し、室温にて２時間攪拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し固形物を得た。
この固形物（１．４３ｇ）にジクロロメタン（０．３ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（１．２ｍＬ）を加え室温にて１時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）を加え、析出した固体を濾取後、真空乾燥し化合物６（１．３８ｇ）を得た。
アスパラギン酸の重合数は、アルカリ加水分解後、遊離したベンジルアルコールを高速液体体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより算出した。その結果ベンジルアルコール含量は４８％であり、重合数は１１．６と算出された。【０２００】
［合成例７］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと３−アミノプロピル−ポリ−α−アスパラギン酸（重合数約１１）及び平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコールのアミド結合体の合成（化合物７）
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、０．６９ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（５．１ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（３２ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２５℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．４８ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．０ｍＬ）を加えて、３．５時間撹拌した。その後、合成例６で得られた化合物６（１．５０ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．５０ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、ＤＩＰＣＩ（０．５０ｍＬ）と２−メトキシエチレンアミン（０．２８ｍＬ）加え３時間撹拌した。その後、酢酸エチル（４３ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（４３０ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて２５分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をＤＭＦ（１６ｍＬ）及び精製水（０．１６ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、８ｍＬ）を加えた。１．５時間撹拌後、濾過し、減圧下濃縮を行って化合物７前駆体（７．５０ｇ）を得た。【０２０１】
得られた化合物７前駆体において、ポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より１０分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は５０キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．３１当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝１であった。【０２０２】
化合物７前駆体におけるアスパラギン酸ユニットの含有量総数は、該化合物７前駆体をアルカリ加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを高速液体体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより算出した。その結果ベンジルアルコール含量は９．９％であり、アスパラギン酸単位の結合総数は６４．９と算出された。
また、化合物６の１分子あたりのアスパラギン酸の重合数は１１．６であるので、多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物６の数は、以下の式より５．６分子と算出された。
多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物６の数  ＝  ６４．９  ／  １１．６  ＝  ５．６【０２０３】
得られた化合物７前駆体をＤＭＦ（６５ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（０．７５ｇ、ナカライテスク社製）を加え、水素雰囲気下で一夜撹拌した。パラジウム炭素を濾別後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物７（５．７３ｇ）を得た。
化合物７の分子量は以下の式より６４キロダルトンと算出された。
［化合物７の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体分子量］  ＋  ［総ポリエチレングリコールセグメント分子量］  ＋  ［（ポリアスパラギン酸単位分子量）  ×  （アスパラギン酸単位の結合総数）］
なお、ポリアスパラギン酸単位分子の分子量は１１５．０９を用いた。【０２０４】
［合成例８］平均分子量２キロダルトンのメトキシポリエチレングリコールとポリ−α−アスパラギン酸（重合数約５）とのブロック共重合体の合成（化合物８）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（４．５２ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日油社製、平均分子量２キロダルトン）をＤＭＳＯ（４０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、３．１０ｇ、ＩＳＯＣＨＥＭ社製）を加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液を、精製水（５ｍＬ）で希釈し、外液アセトニトリルにて透析し、内液のアセトニトリルを減圧下除去し、凍結乾燥して化合物８（６．０６ｇ）を得た。
得られた化合物８のアスパラギン酸の重合数は、これをアルカリ加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを高速液体体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより算出した。その結果ベンジルアルコール含量は１６．７％であり、重合数は４．５と算出された。したがって、化合物８の１分子あたりのアスパラギン酸重合数は４．５であり、また、ポリエチレングリコールセグメント分子量は２キロダルトンである。【０２０５】
［合成例９］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと平均分子量２キロダルトンのモノメトキシポリエチレングリコール−ブロック−ポリ−α−アスパラギン酸（重合数約５）のアミド結合体の合成（化合物９）
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、０．８６ｇ）と、合成例８で得られた化合物８をＤＭＦ（８０ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２５℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．５７２ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．０ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、ＤＩＰＣＩ（０．４２ｍＬ）と２−メトキシエチレンアミン（０．２４ｍＬ）加え３時間撹拌した。その後、酢酸エチル（１６０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１．６Ｌ）に３０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をＤＭＦ（４０ｍＬ）及び精製水（０．４ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、２０ｍＬ）を加えた。１時間撹拌後、酢酸エチル（８０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物９前駆体を固形物として得た。
この化合物９前駆体におけるアスパラギン酸ユニットの結合総数は、アルカリ加水分解後、遊離したベンジルアルコールを高速液体体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより算出した。その結果ベンジルアルコール含量は１５％であり、はアスパラギン酸ユニットの結合総数は７２と算出された。
また、化合物８の１分子あたりのアスパラギン酸の重合数は４．５であるので、化合物９前駆体１分子あたりに結合した化合物８の数は、以下の式より１６分子と算出された。
多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物８の数  ＝  ７２  ／  ４．５  ＝  １６【０２０６】
化合物９前駆体をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（０．３４ｇ、ナカライテスク社製）を加え、水素雰囲気下で一夜撹拌した。パラジウム炭素を濾別後、酢酸エチル（８０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物９（２．９９ｇ）を得た。
化合物９の分子量は以下の式より４７キロダルトンと算出された。
［化合物９の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体分子量］  ＋  （多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物８の数）  ×  ［（化合物８の１分子あたりのポリエチレングリコールセグメント分子量）  ＋  （ポリアスパラギン酸単位分子量）  ×  （化合物８の１分子あたりのアスパラギン酸重合数）］
なお、ポリアスパラギン酸単位分子の分子量は１１５．０９を用いた。【０２０７】
［合成例１０］Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−ポリ−β−Ｌ−アスパラギン酸ベンジルエステル（重合数５）の合成（化合物１０）
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｌ−アスパラギン酸−１−ベンジルエステル（渡辺化学工業社製、１５．４ｇ）と９−フルオレニルメタノール（東京化成社製、１８．４ｇ）をＤＭＦ（９５．２ｍｇ）に溶解後、ＤＭＡＰ（１．１６ｇ）及びＷＳＣＤ塩酸塩（１３．６ｇ）を加え、室温にて３時間攪拌した。その後、反応液に精製水を加え、酢酸エチル（３００ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥後、固形物（８．４ｇ）を得た。
この固形物（８．４ｇ）を酢酸エチル（８４ｍＬ）に溶解後、４規定の塩酸−酢酸エチル溶液（８４ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液中に析出した固形物をろ過し真空乾燥を行い、固形物（６．９ｇ）を得た。
この固形物（６．７ｇ）とＮ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｌ−アスパラギン酸−１−ベンジル（渡辺化学工業社製、５．４ｇ）をＤＭＦに溶解後、ジイソプロピルエチルアミン（２．９ｍＬ）、ＨＯＢｔ（２．８ｇ）、ＷＳＣＤ塩酸塩（４．８ｇ）を加え、室温にて６時間した。反応液に精製水を加え、ジクロロメタンを用いて抽出した。有機層を、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。減圧濃縮にてジクロロメタンを除去後、真空乾燥を行い、固形物（１１．０ｇ）を得た。
この固形物に対し、上記の４規定の塩酸酢酸エチル溶液によるｔ−ブトキシカルボニル基の除去及び縮合剤としてＷＳＣＤ塩酸塩、縮合補助剤としてＨＯＢｔを用いたＮ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｌ−アスパラギン酸−１−ベンジルとの縮合反応を３回繰り返した後、得た固形物をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．２７μＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。その後、反応液をジイソプロピルエーテル（１Ｌ）に滴下し、析出した沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物１０（２．７ｇ）を得た。
ＭＳ： ｍ／ｚ  １１４５(Ｍ＋Ｈ)＋  Ｃ６０Ｈ６６Ｎ５Ｏ１８（Ｍ＋Ｈ)＋としての計算値 １１４５
ｍ／ｚ  １１４３(Ｍ−Ｈ)−  Ｃ６０Ｈ６４Ｎ５Ｏ１８（Ｍ−Ｈ)−としての計算値 １１４３【０２０８】
［合成例１１］平均分子量５キロダルトンのモノメトキシポリエチレングリコール−ブロック−ポリ−β−アスパラギン（重合数５）のアミド結合体の合成（化合物１１）
化合物１０（２．５ｇ）及び片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（１２．１ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解後、ＨＯＢｔ（０．４０ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．４２ｍＬ）を加え３０℃で９時間撹拌した。その後、その後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１Ｌ）中に１５分かけて滴下し、室温にて一晩撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテルで洗浄し、固形物（１４．３ｇ）を得た。
得られた固形物（１４．２ｇ）をジクロロメタン（９ｍＬ）に溶解後、トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ）を加え、室温にて２時間撹拌した。その後、減圧下ジクロロメタンを除去し、残渣をジイソプロピルエーテル（１Ｌ）中に３０分かけて滴下した。室温にて３０分撹拌後、沈析物を濾取してジイソプロピルエーテルで洗浄し、固形物を得た。得た固形物をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、外液メタノールにて透析した。その後、内液を精製水３００ｍＬにて希釈後、減圧濃縮によりメタノールを除去し、凍結乾燥して化合物１１（１２．６ｇ）を得た。
なお、化合物１１の１分子あたりのポリエチレングリコールセグメント分子量は５キロダルトンであり、アスパラギン酸重合数は５である。【０２０９】
［合成例１２］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと平均分子量５キロダルトンのモノメトキシポリエチレングリコール−ブロック−ポリ−β−アスパラギン酸（重合数５）のアミド結合体の合成（化合物１２）
合成例１１で得られた化合物１１（１０．２ｇ）及び合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、１．４ｇ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に３５℃にて溶解し、３０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１．１ｇ）とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（２．１５ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．３２ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、ＤＩＰＣＩ（１．０８ｍＬ）と２−メトキシエチレンアミン（０．５７ｍＬ）加え３時間撹拌した。その後、酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１．５Ｌ）に３０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、２５ｍＬ）を加えた。１時間撹拌後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１Ｌ）に３０分かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物１２前駆体である固形物（９．０２ｇ）を得た。【０２１０】
この化合物１２前駆体におけるアスパラギン酸ユニットの結合総数は、アルカリ加水分解後、遊離したベンジルアルコールを高速液体体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより算出した。その結果ベンジルアルコール含量は７．７％であり、はアスパラギン酸ユニットの結合総数は４０と算出された。
また、化合物１１の１分子あたりのアスパラギン酸の重合数は５であるので、多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物１１の数は、以下の式より８分子と算出された。
多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物８の数  ＝  ４０  ／  ５  ＝  ８【０２１１】
この化合物１２前駆体（９．０ｇ）をＤＭＦ（９０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（０．９０ｇ、ナカライテスク社製）を加え、水素雰囲気下で一夜撹拌した。パラジウム炭素を濾別後、酢酸エチル（９０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１．５Ｌ）に１時間かけて滴下し、室温にて一晩撹拌した。沈析物を濾取後、真空乾燥し化合物１２（５．０１ｇ）を得た。
化合物１２の分子量は以下の式より５２キロダルトンと算出された。
［化合物１２の分子量］  ＝  ［多分岐高分子担体分子量］  ＋  （多分岐高分子担体１分子あたりに結合した化合物１１の数）  ×  ［（化合物１１の１分子あたりのポリエチレングリコールセグメント分子量）  ＋  （ポリアスパラギン酸単位分子量）  ×  （化合物１１の１分子あたりのアスパラギン酸重合数）］
なお、ポリアスパラギン酸単位分子の分子量は１１５．０９を用いた。【０２１２】
［実施例１］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数３２）と平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−アラニンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体の合成
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、０．６０ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（３．５ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（２８ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．４７ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．４２ｍＬ）を加えて、４．５時間撹拌した。その後、合成例３で得られた化合物３（０．８４ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．４２ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．３２ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（５４ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（５４０ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（１０６ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５３ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例１に係る標記化合物（４．６９ｇ）を得た。【０２１３】
実施例１の化合物をアルカリ加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、実施例１におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例１におけるゲムシタビン含有量は７．４質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数３２に対するゲムシタビン結合率は４６．６％と算出された。
この結果、実施例１のゲムシタビン総分子量は３．９キロダルトンと算出された。【０２１４】
実施例１のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より８分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は４０キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．２５当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝１であった。【０２１５】
上記の化合物１の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例１の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、５３キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、７５質量％と算出された。
また、実施例１の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は５，９８６ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．４６倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は８１，７５０であり、会合分子数は１．５であった。【０２１６】
［実施例２］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数３２）と平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−ロイシンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体の合成
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、０．５９ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（３．５ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（２８ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．４７ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．４１ｍＬ）を加えて、５時間撹拌した。その後、合成例４で得られた化合物４（０．９０ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．４１ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．３２ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（５６ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（５６０ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（５３ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５３ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例２に係る標記化合物（４．３９ｇ）を得た。【０２１７】
実施例２の化合物をアルカリ加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例２におけるゲムシタビン含有量は６．５質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数３２に対する結合率は４０．９％と算出された。
この結果、実施例２のゲムシタビン総分子量は３．４キロダルトンであった。【０２１８】
実施例２のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より７．９分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は４０キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．２５当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝０．９９３であった。【０２１９】
上記の化合物１の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例２の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、５３キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、７５質量％と算出された。
また、実施例２の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は７，０３０ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．５４倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は８５，４１０であり、会合分子数は１．６であった。【０２２０】
［実施例３］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数３２）と平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−イソロイシンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体の合成
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、０．７７ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（４．５ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（３６ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．６１ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．５４ｍＬ）を加えて、７時間撹拌した。その後、合成例５で得られた化合物５（１．１７ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．５４ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．６９ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（７２ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（７２０ｍＬ）に１５分かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（７０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（６４ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、６４ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例３に係る標記化合物（５．７３ｇ）を得た。【０２２１】
実施例３の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例３におけるゲムシタビン含有量は７．７質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数３２に対する結合率は４９．８％と算出された。
この結果、実施例３のゲムシタビン総分子量は４．２キロダルトンであった。【０２２２】
実施例３のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より８分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は４０キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．２５当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝０．９９９であった。【０２２３】
上記の化合物１の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例３の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、５４キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、７４質量％と算出された。
また、実施例３の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は８，５６０ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．６６倍であった。
また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は８，５６０であり、会合分子数は２．６であった。【０２２４】
［実施例４］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数６４）と平均分子量２キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−ロイシンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体の合成
合成例２で得られた化合物２（分子量１３．７キロダルトン、０．５３ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（１．７ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日油社製、平均分子量２キロダルトン）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．３１ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．３６ｍＬ）を加えて、４時間撹拌した。その後、合成例４で得られた化合物４（０．８０ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．３６ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（６０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、４０ｍＬ）を加えた。２０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例４に係る標記化合物（２．４２ｇ）を得た。【０２２５】
実施例４の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例４におけるゲムシタビン含有量は１０．２質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数６４に対する結合率は３７．５％と算出された。
この結果、実施例４のゲムシタビン総分子量は６．３キロダルトンであった。【０２２６】
実施例４のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より１８．３分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は３６．６キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．３１当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝０．９２０であった。【０２２７】
上記の化合物２の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例４の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、６２キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、５９質量％と算出された。
また、実施例４の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は５，７４６ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．４４倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は７２，０７０であり、会合分子数は１．２であった。【０２２８】
［実施例５］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数６４）と平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−アラニンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体の合成の合成
合成例２で得られた化合物２（分子量１３．７キロダルトン、０．５５ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（１．６ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．３２ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．４０ｍＬ）を加えて、４時間撹拌した。その後、合成例３で得られた化合物３（１．１５ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．４０ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．４５ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（１２０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５０ｍＬ）を加えた。２０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例５に係る標記化合物（２．８６ｇ）を得た。【０２２９】
実施例５の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例５におけるゲムシタビン含有量は１５．７質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数６４に対する結合率は５９．４％と算出された。
この結果、実施例５のゲムシタビン総分子量は１０．０キロダルトンであった。【０２３０】
実施例５のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より６．６分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は３３キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．１２５当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝０．８２５であった。【０２３１】
上記の化合物２の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例５の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、６４キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、５２質量％と算出された。
また、実施例５の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は３１，８６５ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は２．４６倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は２２０，５００であり、会合分子数は３．５であった。【０２３２】
［実施例６］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと３−アミノプロピル−ポリ−α−アスパラギン酸（重合数約１１）及び平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコールのアミド結合体へのゲムシタビンの導入
合成例７で得られた化合物７（５．７ｇ）とゲムシタビン（１．２ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）を、ＤＭＦ（２９ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２５℃にて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．９６ｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（２．０ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。反応液を酢酸エチル（４５ｍＬ）で希釈し、ジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（６０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、２８ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例６に係る標記化合物（６．２６ｇ）を得た。【０２３３】
実施例６の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例６におけるゲムシタビン含有量は９．６質量％であった。したがってアスパラギン酸単位の結合総数６４．９に対する結合率は４０％（結合数２６）と算出された。
この結果、実施例６のゲムシタビン総分子量は６．８キロダルトンであった。【０２３４】
実施例６の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、化合物７の分子量及び結合ゲムシタビン総分子量から、７１キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、７０質量％と算出された。
また、実施例６の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は１７，７４０ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は１．３７倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は１７９，６００であり、会合分子数は２．５であった【０２３５】
［実施例７］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと平均分子量２キロダルトンのモノメトキシポリエチレングリコール−ブロック−ポリ−α−アスパラギン酸（重合数約５）のアミド結合体へのゲムシタビンの導入
合成例９で得られた化合物９（３．０ｇ）とゲムシタビン（０．９７ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）を、ＤＭＦ（３１ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃にて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．８５ｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．７ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。反応液を酢酸エチル（３５ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（３５０ｍＬ）の混合溶媒中に３０分かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（６０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、３０ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例７に係る標記化合物（５．９３ｇ）を得た。【０２３６】
実施例７の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例７におけるゲムシタビン含有量は１２．６質量％であった。したがってアスパラギン酸単位の結合総数７２に対する結合率は３６％（結合数２６）と算出された。
この結果、実施例７のゲムシタビン総分子量は６．８キロダルトンであった。【０２３７】
実施例７の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、化合物９の分子量及び結合ゲムシタビン総分子量から、５７キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、５６質量％と算出された。
また、実施例７の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は８，９１７ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．６９倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は１２７，８００であり、会合分子数は２．２であった【０２３８】
［実施例８］ハイパーブランチ・２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ポリエステル−３２−カルボキシルと平均分子量５キロダルトンのモノメトキシポリエチレングリコール−ブロック−ポリ−β−アスパラギン酸（重合数５）のアミド結合体へのゲムシタビンの導入
合成例１２で得られた化合物１２（４．９ｇ）とゲムシタビン（０．７９ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）を、ＤＭＦ（２５ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃にて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．６３ｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．３ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。反応液を酢酸エチル（５０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１Ｌ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（５０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、２５ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例８に係る標記化合物（４．３ｇ）を得た。【０２３９】
実施例８の化合物をアルカリ加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例８におけるゲムシタビン含有量は８．７質量％であった。したがってアスパラギン酸単位の結合総数４０に対する結合率は４７％（結合数１９）と算出された。
この結果、実施例８のゲムシタビン総分子量は４．９キロダルトンであった。【０２４０】
実施例８の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、化合物１２の分子量及び結合ゲムシタビン総分子量から、５７キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、７１質量％と算出された。
また、実施例８の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は１７，８８７ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は１．３８倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は９０，６１０であり、会合分子数は１．６であった。【０２４１】
［実施例９］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数６４）と平均分子量２キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−アラニンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体（ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が２４％）の合成
合成例２で得られた化合物２（分子量１３．７キロダルトン、０．６０ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（０．３７ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日油社製、平均分子量２キロダルトン）をＤＭＦ（１９ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．４７ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（０．４１ｍＬ）を加えて、７．０時間撹拌した。その後、合成例３で得られた化合物３（０．７８ｇ）とＤＩＰＣＩ（０．４１ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（４３ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（４１９ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（２５０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（１１０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５０ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例９に係る標記化合物（１．６９ｇ）を得た。【０２４２】
実施例９の化合物をアルカリ加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、実施例９におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例９におけるゲムシタビン含有量は２０．３質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数６４に対するゲムシタビン結合率は３９．９％と算出された。
この結果、実施例９のゲムシタビン総分子量は６．７キロダルトンと算出された。【０２４３】
実施例９のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より４分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は８キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．０６３当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝１であった。【０２４４】
上記の化合物２の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例９の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、３３キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、２４質量％と算出された。
また、実施例９の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は１，３０６，４３８ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は１０１．０１倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は９，９１７，０００であり、会合分子数は３００．３であった。【０２４５】
［実施例１０］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数６４）と平均分子量２キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びアスパラギン酸−１−アラニンメチルエステル−４−ゲムシタビンアミドのアミド結合体（ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が４４％）の合成
合成例２で得られた化合物２（分子量１３．７キロダルトン、１．９３ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（２．１１ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日油社製、平均分子量２キロダルトン）をＤＭＦ（８１ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１．５１ｇ）と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．３４ｍＬ）を加えて、４．５時間撹拌した。その後、合成例３で得られた化合物３（０．９１ｇ）とＤＩＰＣＩ（１．３４ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（０．７８ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。その後、酢酸エチル（１８７ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１８２７ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（１０００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（６００ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、２０３ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、実施例１０に係る標記化合物（４．３５ｇ）を得た。【０２４６】
実施例１０の化合物をアルカリ加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、実施例１０におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、実施例１０におけるゲムシタビン含有量は８．３質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数６４に対するゲムシタビン結合率は１５．７％と算出された。
この結果、実施例１０のゲムシタビン総分子量は２．７キロダルトンと算出された。【０２４７】
実施例１０のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より７分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は１４キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．１０９当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝１であった。【０２４８】
上記の化合物２の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量、結合ゲムシタビン総分子量及びアスパラギン酸ユニット残基の総分子量から、実施例１０の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、３２キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、４４質量％と算出された。
また、実施例１０の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は１７，０４０ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は１．３２倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は２０９，０００であり、会合分子数は６．５であった。【０２４９】
［比較例１］多分岐高分子担体（末端カルボン酸数３２）と平均分子量５キロダルトンの片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール及びゲムシタビンの結合体の合成
合成例１で得られた化合物１（分子量６．８キロダルトン、１．００ｇ）と、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール化合物（５．９ｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製、平均分子量５キロダルトン）をＤＭＦ（４７ｍＬ）に３５℃にて溶解し、２０℃に降温し、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．８７ｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（１．７４ｍＬ）及びゲムシタビン（１．４８ｇ、ＳＣＩＮＯ  ＰＨＡＲＭ社製）を加えて、３２時間撹拌した。その後、酢酸エチル（５６ｍＬ）を加え希釈し、反応液をジイソプロピルエーテル（１１２８ｍＬ）に３０分かけて滴下し、室温にて３０分撹拌した。沈析物を濾取してジイソプロピルエーテル（５６４ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を精製水（２００ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、１２０ｍＬ）を加えた。３０分撹拌後、濾過し、凍結乾燥を行い、比較例１に係る標記化合物（８．５７ｇ）を得た。【０２５０】
比較例１の化合物をアルカリ加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、比較例１におけるゲムシタビン含有量を求めた。その結果、比較例１におけるゲムシタビン含有量は６．８質量％であった。したがって、多分岐高分子担体の末端カルボン酸数３２に対するゲムシタビン結合率は４０．２％と算出された。
この結果、比較例１のゲムシタビン総分子量は３．４キロダルトンと算出された。【０２５１】
比較例１のポリエチレングリコール化合物の結合量は、ポリエチレングリコール化合物の仕込当量及びポリエチレングリコール化合物の消費率より８分子であった。したがって、総ポリエチレングリコールセグメント分子量は４０キロダルトンであった。
なお、本反応における多分岐高分子担体の末端カルボキシ基に対するポリエチレングリコールセグメント化合物の仕込当量＝０．２５当量であり、ポリエチレングリコールセグメント化合物の消費率＝１であった。【０２５２】
上記の化合物１の分子量、結合ポリエチレングリコールセグメント分子量及び結合ゲムシタビン総分子量から、比較例１の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の分子量は、５０キロダルトンと算出された。
また、ポリエチレングリコールセグメント含有量は、８０質量％と算出された。
また、比較例１の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物の会合度をレーザー光散乱強度により測定したところ、光散乱強度は６，１９９ｃｐｓであった。したがって、トルエンの光散乱強度との相対比率は０．４８倍であった。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定分子量は７７，２７０であり、会合分子数は１．６であった。【０２５３】
［試験例１］  非担癌マウスに対する血液毒性評価    
実施例１、２、５、６、８、９及び比較例１の化合物並びに対照薬として塩酸ゲムシタビンを用いて、非担癌マウス（ＩＣＲ系マウス（Ｃｒｌｊ：ＣＤ−１））に対する血液毒性評価試験を実施した。
実施例１、２、５、６、８、９及び比較例１の化合物は、５％ブドウ糖注射液に溶解して調製した。投与量は各化合物において予め確認した最大耐用量（ＭＴＤ  maximum tolerated dose）以下を設定した。対照薬として塩酸ゲムシタビンを生理食塩液に溶解して調製した。各化合物及び対照薬は、各々静脈内に単回投与した。また、溶媒（５％ブドウ糖注射液、あるいは生理食塩液、１０ｍＬ／ｋｇ）を投与した群を設定し、実施例１、２、５、６、８、９及び比較例１の化合物に対しては５％ブドウ糖注射液投与群を，塩酸ゲムシタビンに対しては生理食塩液投与群をそれぞれ対照群とした。
投与後７日あるいは５日に採血し、網状赤血球数を血球分析装置（ＸＴ−２０００ｉＶ）により測定した。投与後７日あるいは５日における溶媒対照群の網状赤血球数（１００）に対する各化合物投与群の相対値を算出した。その結果を表１及び２に示した。【０２５４】
【表１】
2016093352.tif 000041
【０２５５】
【表２】
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【０２５６】
試験例１の結果、比較例１の化合物は投与量が低いにも関わらず、対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して、網状赤血球数を著しく低下させており、血液毒性の発現が認められた。この現象は、投与５日後であっても、網状赤血球数の回復が遅延していることを示し、血液毒性の遷延化現象であると考えられる。これに対し、本発明の実施例１、２、５、６、８及び９に係る化合物は、投与後７日時点において網状赤血球数の低下が確認されておらず、対象薬の塩酸ゲムシタビンと同様に血液毒性が認められていないことが示された。
この理由として、比較例１の化合物は、長期に亘り血中に滞留したため、血液毒性が遷延化したと考えられる。本発明の化合物は、核酸代謝拮抗剤が結合したコハク酸アミドユニットを具備しているのに対し、比較例１の化合物は、該コハク酸アミドユニットを具備していない。したがって、実施例１、２、５、６、８及び９に係る化合物は、核酸代謝拮抗剤を適切な結合様式で多分岐高分子担体に結合させたことにより、塩酸ゲムシタビンが持つ副作用である血液毒性は同程度であり、高分子化代謝拮抗剤にすることで懸念される血液毒性の発現及びその遷延化はないことが確認された。【０２５７】
［試験例２］ヒト膵がん移植ヌードマウスに対する抗腫瘍効果試験
実施例１、２、５、６、８、９及び比較例１の化合物の抗腫瘍効果試験を実施した。
ヌードマウス皮下で継代したヒト膵がんＡｓＰＣ−１の腫瘍塊を、約３ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。腫瘍移植後、平均腫瘍体積が３００ｍｍ３以上になった時点で投与を開始した。
実施例１、２、５、６、８、９及び比較例１の化合物は５％ブドウ糖注射液に溶解して調製した。投与量は予め確認した各化合物の最大耐用量（ＭＴＤ）以下を設定した。対照薬として塩酸ゲムシタビンを生理食塩液に溶解して調製した。各化合物及び対照薬は、３日間隔で４回、尾静脈内に投与した。
投与開始日及び評価日（投与開始後１６日目又は１７日目）の腫瘍体積から相対腫瘍体積を求め、抗腫瘍効果の指標とした。なお、腫瘍体積は、腫瘍の長径（Ｌ：ｍｍ）及び短径（Ｗ：ｍｍ）を計測して、（Ｌ×Ｗ２）／２の計算式にて算出した。試験は４回に分けて行った。結果を表３、４、５及び６に示した。【０２５８】
【表３】
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【０２５９】
【表４】
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【０２６０】
【表５】
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【０２６１】
【表６】
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【０２６２】
試験例２の結果、本発明の実施例１、２、５、６、８及び９に係る化合物は対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して、強力な抗腫瘍効果を示すと共にその効果持続性が認められた。【０２６３】
本発明の核酸代謝拮抗剤結合多分岐化合物は、多分岐高分子担体の末端官能基に、複数のポリエチレングリコールセグメント及び核酸代謝拮抗剤が結合した複数のコハク酸モノアミドユニットを含む置換基を適切に具備させたことにより、血中に滞留して体内分布しつつ、結合していた核酸代謝拮抗剤を適切な放出プロファイルにて作用させることができたため、核酸代謝拮抗剤の副作用である骨髄抑制の遷延化を回避しつつ、抗腫瘍効果の増強を達成したと考察された。
【国際調査報告】
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