(57)【要約】  HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、（２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質；及び該キメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。本発明のキメラタンパク質を含有するワクチンは、宿主における発現量が増加し、免疫能力が増強しており（早期の抗体誘導）、多くのHPV型に有効な広いスペクトルを持ったワクチンである。
2014103608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、
（２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質。
【請求項２】
HPV-L2ペプチドが、コア配列領域からなる、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号３）で示される配列である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記コア配列領域が、下記（１）〜（６）から選択されるアミノ酸を有する配列である、請求項３に記載のキメラタンパク質。
（１）X1aaが、Thr又はSerである、
（２）X2aaが、Ser, Thr又はAlaである、
（３）X3aaが、Thr又はSerである、
（４）X4aaが、Ser, Thr又はAlaである
（５）X5aaが、Ile又はValである、及び
（６）X6aaが、Leu又はIleである
【請求項５】
前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）からなるアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記キメラタンパク質が、１〜11個のHPV-L2ペプチドを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドが、HBsタンパク質のN末端アミノ酸、配列番号２の127-128位、又はC末端アミノ酸の少なくとも一箇所に付加又は挿入された、請求項１ないし６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記ペプチドが、HBsタンパク質のC末端アミノ酸に付加された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入及びC末端アミノ酸に付加された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、20アミノ酸からなり、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）なるアミノ酸配列に対する相同性が50-100%、70-100%又は80-100％である、前記キメラタンパク質。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
【請求項１３】
前記DNA断片にコードされるキメラタンパク質を発現することができる発現ベクター。
【請求項１４】
前記発現ベクターで形質転換したキメラタンパク質産生宿主。
【請求項１５】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
【請求項１６】
請求項８に記載のキメラタンパク質及び請求項９に記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
【請求項１７】
請求項１３に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用DNAワクチン。
【請求項１８】
下記（１）ないし（５）の工程を含む、ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチンの製造方法；
（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるHPV-L2ペプチド、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のHPV-L2ペプチド、または、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片を調製する工程、
（２）前記（１）のDNA断片を有する発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（３）前記（２）により得られる形質転換宿主をGeneticin及びMTXの存在下で培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
（４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
（５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤を添加して、ワクチンとする工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus：HPV）由来のペプチドとヒトＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分とするワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus：HPV）は、パピローマウイルス科に属する小型の環状二本鎖DNAウイルスで、ヒト乳頭腫ウイルスとも呼ばれる。HPVは、ウイルスゲノムが外郭タンパク質（カプシドタンパク質：Capsid protein）で覆われた直径 50-55nmの正二十面体構造を取るが、カプシドを覆うエンベロープは存在しない。ゲノムサイズは種類により異なるが約8,000塩基ほどで、この中に初期タンパク質（E1, E2, E4, E5, E6及びE7）と後期タンパク質（L1及びL2）がコードされている。L1とL2でHPV粒子のカプシドが形成され、L2はカプシド形成に補助的に働いている。【０００３】
HPVの宿主域は厳格でヒト以外の動物に感染しない。HPVは、接触感染により皮膚や粘膜に潜伏持続感染し、子宮頸がん（扁平上皮がん、腺がん）及びその前駆病変[cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 及び3]、尖圭コンジローマ等を惹き起こす。日本では、年間19000人が子宮頸がんを発症し、5600人が死亡している（非特許文献５参照)。WHOによる推定では、世界の女性の悪性腫瘍の13％（53万人）にHPVの感染が関わっており、3億人がHPVのキャリアーであるとみられている（非特許文献４参照）。【０００４】
ウイルス増殖に関する研究では、HPV感染細胞の分裂時にHPVゲノムは複製し、娘細胞に分配される。潜伏感染細胞が表皮形成の分化を始めると、分化終盤でウイルス増殖が起こる。しかしながら、HPVは、ウイルス粒子として分離されることは珍しく、ゲノムDNAのみがクローニングされている。これまでにHPVはカプシドタンパク質（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて、100種類以上の遺伝子型に分類されている。HPVは、その遺伝子型により感染部位や発症する病気が異なり、皮膚病変に検出されるもの（上皮型）と粘膜病変に検出されるもの（粘膜型）に大別され、更に、粘膜型のHPVは、種々の癌に検出される高リスク型と良性の尖形コンジローマ等の原因となる低リスク型に分類される。高リスク型HPVには、子宮頸がん、肛門周囲がん及び陰茎がんなどから検出される16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82型が含まれ、低リスク型HPVには、6及び11型等が含まれる（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。【０００５】
HPV感染予防ワクチンに関しては、2006年6月に米国メルク社により開発されたHPV6, 11, 16, 18型のウイルス様粒子（VLP）を混合したワクチン「商品名Gardasil（登録商標）（ガーダシル）」がアメリカ食品医薬品局（FDA）により承認され、2007年5月に英国グラクソ・スミスクライン社により開発されたHPV16, 18型のVLPを混合したワクチン「商品名Cervarix（サーバリクス）」が、オーストラリアの医薬品審査当局（TGA）により承認された。日本では、2009年10月にCervarix、2011年7月にGardasilが承認されている。【０００６】
これらは第一世代ワクチンと呼ばれ、L1タンパク質をコードする遺伝子を酵母菌や昆虫細胞に発現させ、VLPを作らせ、これにアジュバントを加えたものである（非特許文献６参照）。いずれも特定の遺伝子型により引き起こされる癌に対して承認されたものであり、Gardasilなら6、11、16及び18型、Cervarix なら16及び18型以外では、ごく一部の型に対する予防効果しか認定されていない（非特許文献新１２）。したがって、HPV感染阻止、その後に誘発される癌の発症をより効率良く抑制するために、あらゆる種類の型のHPV感染に有効に働くワクチンの開発が求められる（非特許文献５及び非特許文献６参照）。【０００７】
かかる試みの一つとして、神田らの報告がある。彼らは、HPV16型のL2の64-81位及び108-120位のアミノ酸配列中に高リスク型HPVに共通の中和エピトープが存在すること、及びHPV16型のL2由来のペプチドを16型HPVのL1に挿入したキメラ蛋白の集合体であるVLPは、HPV16型、18型、31型、33型、35型、52型及び6型の感染を阻害することを明らかにした（特許文献１及び特許文献２参照）。更に、18-38位、56-75位及び96-115位の各L2ペプチドをL1に挿入したキメラタンパク質からなるVLPについても同様の報告を行っている（非特許文献１３参照）。一方で、挿入ペプチドの長さが、エピトープ部分の抗原としての提示に影響することも報告している（特許文献１）。【０００８】
HPVのL1以外に、種々の粒子形成能を有するタンパク質に外来ペプチドを付加又は挿入して得られるキメラタンパク質の粒子形成やワクチンとしての有用性に関する研究が報告されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の表面タンパク質（HBsタンパク質）のN末又はC末にHPV16型のL2の一部からなるペプチド（N末より50−220アミノ酸領域及び100−220アミノ酸領域）を付加したキメラ蛋白質をマウスに免疫し、ELISAでL2及びHBsに対する抗体の上昇があることを確認している（特許文献７参照）。その他、HBsタンパク質の親水性領域やHBsAg-Sの外側ループ内の露出部位に外来遺伝子を挿入して得られるキメラタンパク質（特許文献３及び特許文献４参照）、及びHBsタンパク質のN末側に外来ペプチドを結合させたキメラタンパク質のVLP形成に関する報告がある（特許文献５及び特許文献６参照）。【０００９】
HBsタンパク質は、酵母由来の組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンの有効成分として使用されるなど、ワクチンとしての効果や安全性が高いことが実証されている（非特許文献７参照）。しかしながら、外来ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質からなるVLPは、挿入される外来ペプチドの種類や長さの違いにより、VLPの安定性、細胞からの発現効率、発現されたものの構造変化等に影響を及ぼすこともあり（特許文献４参照）、必ずしも、ワクチンとしての有用性が担保されるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2005/097987号公報
【特許文献２】特開2007-45746号公報
【特許文献３】特開平8-198897号公報
【特許文献４】特表2004-504067号公報
【特許文献５】特開2011-115042号公報
【特許文献６】特開2007-209343号公報
【特許文献７】WO2010/001409号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ウイルス第56巻第2号，pp219-230, 2006
【非特許文献２】医学のあゆみVol.224 No9:669-680, 2008
【非特許文献３】Munoz, N. et al.: New Engl J Med, 348, 518-527, 2003.
【非特許文献４】Monitoring of Cancer Incidence in Japan MCIJ2007 March 2012
【非特許文献５】ウイルス第58巻第2号, pp155-164，2008
【非特許文献６】産科と婦人科 73（2）:217-225，2006
【非特許文献７】国立感染症研究所  Ｂ型肝炎ワクチンに関するファクトシート（平成２２年７月７日版）
【非特許文献８】Kawana. K, et al.: Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999（L2の106-121）
【非特許文献９】Ivonne Rubio et al. : Potent anti-HPV immune responses induced by tandem repeats of the HPV16 L2 (20-38) peptide displayed on bacterial thioredoxin. Vaccine, 27, 1949-1956, 2009
【非特許文献１０】Fujiyama, A. et al.: Nuc. Acid Res., 11(13), 4601-4610, 1983
【非特許文献１１】Christophe, M. et al.: Emer. Inf. Dis., 14(11), 1777-1780, 2008
【非特許文献１２】日本耳鼻咽喉科学会会報 Vol. 115 No. 2, 73-84, 2012
【非特許文献１３】Kondo, K et al.: Journal of Medical Virology 80:841-846 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本願発明の目的は、HPVのカプシド構成要素の一つでL2と呼ばれるタンパク質（以下、「L2タンパク質」と称することもある）の特定領域の20個のアミノ酸配列からなるペプチドを、HBsタンパク質のN末側又はC末側に付加又はHBsタンパク質内部に挿入して得られるキメラタンパク質を有効成分とする、ヒトパピローマウイルス感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、HPV16型のL2タンパク質の56-75位のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号４；Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu）を、HBsタンパク質のN末側又はC末側に付加して得られるキメラタンパク質、及びHBsタンパク質内部に挿入して得られるキメラタンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)を形成し、HBsタンパク質及び該ペプチドに対する（中和）抗体を誘導することを発見した。特にC末側に付加したキメラタンパク質により産生された抗体は、該ペプチドに対する抗体を早期に誘導すること、HBsタンパク質及び該ペプチドの両方に強く結合すること、且つ該抗体は、多種のHPV型由来のL2ペプチドと結合すること、また、HBs内部に挿入されたキメラタンパク質により産生された抗体は、該ペプチド内の２箇所のアミノ酸配列（Ｎ末側及びＣ末側エピトープ）を認識する抗体を誘導することを見出し、本願発明を完成するに至った。【００１４】
本願発明に従えば、HPV L2タンパク質の特定領域の7〜20個のアミノ酸配列を含むペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質、該キメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断片、該DNA断片が組み込まれた発現ベクター（ウイルスベクターを含む）、該発現ベクターを有する宿主、該キメラタンパク質及び該DNA断片を用いたHPV感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチン、並びに該ワクチンの製造方法が提供される。【００１５】
本願発明のキメラタンパク質及び該キメラタンパク質をコードするDNAを有する発現ベクターは、Ｂ型肝炎及び／又はHPV感染症の予防や治療に有効に利用され得るものである。したがって、本願発明は、以下の通りである。
〔１〕ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、（２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質。
〔２〕HPV-L2ペプチドが、コア配列領域からなる、〔１〕に記載のキメラタンパク質。
〔３〕前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号３）で示される配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔４〕前記コア配列領域が、下記（１）〜（６）から選択されるアミノ酸を有する配列である、〔３〕に記載のキメラタンパク質。
（１）X1aaが、Thr又はSerである、
（２）X2aaが、Ser, Thr又はAlaである、
（３）X3aaが、Thr又はSerである、
（４）X4aaが、Ser, Thr又はAlaである
（５）X5aaが、Ile又はValである、及び
（６）X6aaが、Leu又はIleである
〔５〕前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）からなるアミノ酸配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔６〕前記キメラタンパク質が、１〜11個のHPV-L2ペプチドを含む、〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔７〕前記ペプチドが、HBsタンパク質のN末端アミノ酸、配列番号２の127-128位、又はC末端アミノ酸の少なくとも一箇所に付加又は挿入された、〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔８〕前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔９〕前記ペプチドが、HBsタンパク質のC末端アミノ酸に付加された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔１０〕前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入及びC末端アミノ酸に付加された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔１１〕ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、20アミノ酸からなり、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）なるアミノ酸配列に対する相同性が50-100%、70-100%又は80-100％である、前記キメラタンパク質。
〔１２〕〔１〕ないし〔１１〕のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
〔１３〕前記DNA断片にコードされるキメラタンパク質を発現することができる発現ベクター。
〔１４〕前記発現ベクターで形質転換したキメラタンパク質産生宿主。
〔１５〕〔１〕ないし〔１１〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
〔１６〕〔８〕に記載のキメラタンパク質及び〔９〕に記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
〔１７〕〔１３〕に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用DNAワクチン。
〔１８〕下記（１）ないし（５）の工程を含む、ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチンの製造方法；
（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるHPV-L2ペプチド、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のHPV-L2ペプチド、または、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片を調製する工程、
（２）前記（１）のDNA断片を有する発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（３）前記（２）により得られる形質転換宿主をGeneticin及びMTXの存在下で培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
（４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
（５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤を添加して、ワクチンとする工程。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明の態様の一つであるGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-LeuからなるペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質は、該ペプチドとHBsタンパク質の両方の抗体産生能を有するので、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎の予防薬の好適な材料となり得る。特に、該ペプチドをHBsタンパク質のC末側に付加させた場合、宿主における発現量の増加だけでなく、該ペプチドの免疫能力の増強（早期の抗体誘導）が認められ、また、HBsタンパク質の内部に挿入した場合、該ペプチド内の少なくとも２箇所のアミノ酸配列に対する抗体を誘導することができる点において、ワクチンの生産性を高め、品質を向上させるのに有用である。【００１７】
また、上記ペプチドのN末側６個のアミノ酸配列は、HPVの株間でよく保存されており、多くのHPV型に有効である。事実、実施例に示されるように、本願発明のキメラタンパク質により誘導される抗体は多くの型のHPVと反応する。したがって、本願発明に従えば、従来の型特異的なワクチンとは異なり、より広いスペクトルを持ったワクチンの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、抗HBsモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAにより、形質転換細胞の培養上清中のキメラタンパク質濃度を測定した結果を示す図面である。
【図２】図２は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と同じ遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。
【図３】図３は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（個体別血清）と同じ遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。
【図４】図４は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と異なる遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。
【図５】図５は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）中のHBs抗体価の測定結果を示す図面である。
【図６】図６は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）のエピトープ解析を行った結果を示す図面である。
【図７】図７は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と異なる遺伝子型由来のHPV-ウイルス様粒子（VLP）との反応性を示す図面である。
【図８−１】図８-1は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV16-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。
【図８−２】図８-2は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV18-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。
【図８−３】図８-3は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV35-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本願発明の特徴は、HPV群間で極めてよく保存されたHPVのL2タンパク質由来のペプチドとＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチンの有効成分とすることにある。
【００２０】
前述したように、HPVはウイルス粒子として回収することが難しく、カプシド（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて遺伝子型が決定されており、これまでに100種類以上の遺伝子型が分離されている。例えば、HPVの16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82型が高リスク型のHPV群に、HPVの6及び11型が低リスク型のHPV群に分類される。HPVのL2タンパク質には、高リスク型のHPV群間で極めてよく保存されたアミノ酸配列からなる領域（以下、「コア配列領域」と称することもある）が存在しており、低リスク型のHPV群においても同様のコア配列領域が存在する。該コア配列領域からなるHPV L2タンパク質由来のペプチド（以下、「HPV-L2ペプチド」と称することもある）が本願発明に使用される。このようなコア配列領域として、HPV16，31及び35型では56〜75番目の20アミノ酸、HPV39，45，51，52，56，58，66及び6型では55〜74番目の20アミノ酸、HPV73型では57〜76番目の20アミノ酸、及びHPV11型では54〜73番目の20アミノ酸が挙げられる。これらの20アミノ酸の配列は、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）なる式で表示できる（配列番号３）。前記の任意のアミノ酸は、HPV株の型間で変異が認められる部位であり、
（１）X1aaはThr又はSer、
（２）X2aaはSer, Thr又はAla、
（３）X3aaはThr又はSer、
（４）X4aaはSer, Thr又はAla、
（５）X5aaはIle又はVal、及び
（６）X6aaはLeu又はIle
から選択される。
【００２１】
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるHPV-L2ペプチドを、動物に免疫して得られた抗体は、一部に変異を有するコア配列領域のペプチドとも反応することから、HPV株の型間で全く変異が見られないN末側から6個のアミノ酸配列（Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly）に共通のエピトープが存在することは容易に推認される（実施例６参照）。したがって、本願発明に用いられるHPV-L2ペプチドは、20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチドに加えて、該6アミノ酸からなるペプチド及び該6アミノ酸からなるペプチドのN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された種々のコア配列領域内のペプチドを包含する。
【００２２】
さらに、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加されたペプチドも本願発明に使用することが可能であり、HPV-L2ペプチドはこれらのペプチドを包含する。好ましくは、該HPV-L2ペプチドのアミノ酸の総数は70個以下である。
【００２３】
該共通エピトープを有するコア配列領域からなるHPV-L2ペプチドは、いずれも本願発明に使用できるが、配列番号４のアミノ酸配列に対して50-100%、70-100%又は80-100%の相同性を有する、20アミノ酸からなるペプチドを用いるのが好ましい。更に好ましくは、上記の式（配列番号３）で示されるHPV-L2ペプチドのアミノ酸置換体が用いられる。最も好ましくは、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるHPV-L2ペプチドである。
【００２４】
また、HPV-L2ペプチドは、後述の条件（抗原活性及び粒子形態の維持）を満たすものであれば、上記6アミノ酸又は該6アミノ酸のN末側及び／又はC末側にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された7〜19アミノ酸、及び20アミノ酸からなるコア配列領域のN末側又はC末側に更にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加されたものも包含する。
【００２５】
上記のアミノ酸置換体とは別に、HPV-L2ペプチドにシステイン(Cys)を付加又は挿入したHPV-L2ペプチド改変体も本願発明の一態様である。一般に、ペプチド単独で動物を免疫した場合は強い免疫効果を得ることは難しいので、キャリア（例えば、KLH）と結合させ、更にはアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）を添加し使用する。あるいは、ペプチド自体の免疫付与能力を高めるために該ペプチドのN末側、C末側、及び／又は内部にシステイン（Cys）を付加又は挿入することが行われる（WO 2010/044464 A1及びWO 2011/024748 A1参照）。例えば、インフルエンザウイルスA型のM2のアミノ酸配列のうち、2〜24番目の23アミノ酸から成るペプチドにシステイン残基を挿入したM2ペプチドは、未修飾のM2ペプチドよりも高い免疫原性（2倍から20倍）を有することが報告されている（WO 2011/024748 A1参照）。Cysへの置換やCysの付加により同様の効果が期待される場合は、本願発明のHPV-L2ペプチドにおいてもHPV群間の共通エピトープが保存される条件下でHPV-L2ペプチドの１〜数個のアミノ酸をCysに置換又は付加しても良い。具体的には、HPV-L2ペプチドは、N末側6個のアミノ酸はHPV群間で全く同じ配列を有するので、該アミノ酸配列以外の部位にCysを付加又は挿入するのが好ましい。以下、改変、未改変の区別が不要な場合は、これらを総合して、単に、HPV-L2ペプチドと称することもある。
【００２６】
HPV-L2ペプチドのHBsタンパク質への付加又は挿入部位は、HPV-L2ペプチド及びHBsタンパク質に対する免疫原性が維持されるのであれば、いずれの部位であっても良い。好ましくは、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質が粒子を形成し、且つ、HPV-L2ペプチドが該粒子の表面に位置することが好ましい。かかる候補として、HBsタンパク質のN末端側、C末端側、及びHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）が挙げられる。好ましくは、HPV-L2ペプチドは、HBsタンパク質のC末端側に付加及び／又はHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入される。
【００２７】
HBsタンパク質のC末端側に該ペプチドを付加することにより、該ペプチドに対する抗体を早期に誘導することができ、HBsに対する高い抗体価も維持できる（実施例１及び実施例７）。また、HBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入することにより、HBsに対する抗体誘導は低下するものの、該ペプチド内の２箇所のアミノ酸配列（２つのエピトープ）を認識する抗体が誘導される。これは、種々のHPV株に対して、よりスペクトルの広い抗体が誘導されることを意味する（実施例８）。したがって、より効果的にHPVに対する抗体を誘導するためには、HPV-L2ペプチドをHBsタンパク質のC末端側に付加し、且つHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入するのが好ましい。同様の効果は、HPV-L2ペプチドをHBsタンパク質のC末端側に付加したキメラタンパク質と該ペプチドをHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入したキメラタンパク質の混合物を免疫原とすることにより得られる。この場合、HBsタンパク質に対して、より高い抗体価の誘導が期待される。最適な効果を得るための両キメラタンパク質の混合比は、通常の方法により適宜調節すれば良い。
【００２８】
外来ペプチドをHBsタンパク質のN末端側に付加する場合、該ペプチドは20〜70個のアミノ酸であることが好ましい。このサイズより大きいと粒子形成に影響を与える可能性があり、このサイズより小さいと抗原としての活性が低下する可能性がある。したがって、本願発明では抗原活性及び粒子形態が維持されるのであれば、HPV-L2ペプチドを連結して用いることができる。コア配列領域からなるHPV-L2ペプチド（20アミノ酸）の場合、2〜3個を連結して用いることができる。
【００２９】
前述したように、本願発明にはコア配列領域からなるHPV-L2ペプチドのN末側又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された、全長21〜70個のアミノ酸からなるペプチドを使用することができるが、アミノ酸の数が21〜35個の場合、該HPV-L2ペプチドを２個連結することができる。
【００３０】
また、コア配列領域内の共通エピトープ配列（Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly）及び該共通エピトープ配列を有する6〜19アミノ酸からなるペプチドの場合、アミノ酸の総数が20〜70個となるようにペプチドサイズに応じて2〜11個のHPV-L2ペプチドを連結して用いることができる。
【００３１】
また、付加または挿入ペプチドのサイズが70アミノ酸までの範囲内ならば、HPV-L2ペプチドに加えて、他のペプチドを付加又は挿入しても良い。例えば、前述のM2ペプチドを付加又は挿入することにより、HPV感染症、Ｂ型肝炎及びインフルエンザに有効な三価ワクチンとすることができる。
【００３２】
本願発明のHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質は以下の方法により、取得することができる。まず、キメラタンパク質の母体となるHBsタンパク質をコードする遺伝子（HBs遺伝子）が作製される。HBs遺伝子の塩基配列は、これまでに多くの特許文献、非特許文献及びデーターベース（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）に開示されているので、該HBs遺伝子の塩基配列に基づいてSambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）を利用して容易に取得することができる。また、使用するHBs抗原は、Large、middle及びsmallのいずれを使用しても良い。
【００３３】
次に、PCR法やDNA合成を用いた方法により、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片（以下、「キメラタンパク質DNA断片」と称することもある）が調製される。例えば、PCR法により、HBsタンパク質のN末側又はC末側にHPV-L2ペプチドを付加したキメラタンパク質DNA断片を調製するときは、HPV-L2ペプチドをコードする塩基配列及びHBs遺伝子の一部の塩基配列からなるプライマーとHBs遺伝子のもう一方のプライマー（どちらがN末側にくるかで、プライマーの方向が決定される）が用いられる。HBsタンパク質の内部にHPV-L2ペプチドを付加したキメラタンパク質DNA断片を調整する場合も同様の操作が行われる。
【００３４】
HPV-L2ペプチドをコードする塩基配列及びHBs遺伝子の塩基配列に基づき設計されるPCR用プライマーは、DNA合成受託機関（例えば、QIAGEN 社）などに依頼すれば容易に入手可能である。このとき、目的に応じて5'側に KOZAK 配列（Kozak M, J.Mol.Biol., 196, 947 (1987)）や5'及び3'末側に適切な制限酵素認識部位の塩基配列が付加される。PCRにより増幅したDNA断片は、クローニングベクター、例えば、pUC119（タカラバイオ社）、pBlueScript（アジレント・テクノロジー社）、又はpCRII-TOPO（Invitrogen社）等にクローニングし、DNAシークエンサー（ABI Prism 377  アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列の決定が行われる。目的のキメラタンパク質DNA断片の確認は、得られた塩基配列の結果と、設計されたPCR用プライマー配列及び既存のHBs遺伝子の塩基配列とを比較することにより行われる。
【００３５】
こうして得られた本願発明のキメラタンパク質DNA断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入することによって、キメラタンパク質DNA断片の発現が行なわれる。発現ベクターとしては、プラスミドやウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、Lac、tac、pho5、adh、SV40初期、SV40後期、及びβアクチンなどのプロモーターから選択することができる。宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが常用されるが、使用目的にあわせて選択すればよい。宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すれば良い。
【００３６】
本願発明では、国立感染症研究所（神田博士及び森博士）から分与された組換えバキュロウイルスベクター（調製例参照）を制限酵素で切断することにより、目的のキメラタンパク質遺伝子、すなわち、HBsタンパク質のN末端、C末端及び内部（配列番号２の127-128位の間）のいずれかにHPV-L2ペプチド（配列番号１の56〜75番目の20アミノ酸）が付加又は挿入されたキメラタンパク質DNA断片を取得した。次いで、各キメラタンパク質DNA断片を動物細胞用発現プラスミドpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo（WO2003/004641参照）に組み込み、該発現プラスミドをリン酸カルシウム法変法によりチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の形質転換処理を行った。
【００３７】
本願発明のキメラタンパク質を発現している形質転換細胞は、以下の２段階の方法でスクリーニングされる。まず、形質転換処理を行った細胞を10〜1,000 nmolのLメトトレキサート（MTX）と100〜1,000 μg/mLのジェネティシン（Geneticin G418 sulfate）を含む培地で一定期間培養して生存する細胞を選択／増殖させることにより形質転換細胞を選択する。ついで、得られた形質転換細胞中にキメラタンパク質が発現している該細胞が選択される。具体的には、本発明のキメラタンパク質は、培養上清や細胞破砕物につき、HPV-L2ペプチド又はHBsタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてELISAやWB等を行うことにより確認される。
【００３８】
形質転換細胞の培養には、通常の細胞を培養するときに用いられる条件を用いれば良い。すなわち、T7m培地、Ex-cell SP2/0培地、YMM-01B培地、YMM-01C培地、OptiCHO培地、Ex-cell 302培地等、あるいはこれらのいくつかを混合した培地が使用される。これに、ウシ胎児血清、カルシウム、マグネシウム、アミノ酸、ビタミン等を添加することもある。培養温度は32℃〜38℃、培養期間は2〜20日間である。医薬品を製造する段階では、キメラタンパク質発現細胞を無血清培地で維持するのが好ましい。  
【００３９】
本願発明のキメラタンパク質の精製は、タンパク質化学において通常使用される方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などを適宜組み合わせることにより達成される。得られたキメラタンパク質の量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、プロテインアッセイキット（日本バイオ・ラッド株式会社）などを用いて測定される。
【００４０】
本発明のキメラタンパク質は、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質を個別に発現させるか化学合成した後、それらを化学的に結合させたものであっても構わない。個別に発現させる際には、化学合成したDNA配列やプラスミドに挿入されたDNA配列を鋳型として、公知の遺伝子増幅方法で増幅させ、上記の方法でそれぞれの発現プラスミドを構築することが可能である。発現プラスミドは上記のように宿主に導入して、目的のペプチドやタンパク質を入手することが可能である。
【００４１】
化学的に結合させる場合にはクロスリンカーを用いて結合させる方法が例示される。その場合、タンパク質やペプチドに存在するアミノ基、チオール基（SH基）、糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。さらにビオチンやアビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合すること方法も例示される。
【００４２】
本願発明のキメラタンパク質のワクチンとしての評価は、抗原を小動物、例えば、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、又はサルなどに免疫した後、in vitroの系においては、免疫動物から採血後、血清を分離し、当該血清中の本発明のキメラタンパク質に対する抗体力価やHPV及びＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫動物に擬似HPVを投与し、その後免疫動物の生死、病状等を観察することにより行われる。一般にin vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。より具体的には、B型肝炎ウイルスに対する中和抗体はHBs抗体を測定することにより、また、HPVに対する中和抗体は、ウイルス様粒子（Virus like particle：VLP）や感染性偽ウイルス（Buck C B等、Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.）との結合能を測定することにより行われる。
【００４３】
免疫方法（例えば、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経口、及び舌下等の投与部位、及び免疫期間等）は、ワクチン等の免疫原性を調べる時に常用される一般的な免疫手法が用いられる。免疫に用いる抗原には、その免疫能を高めるためにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、CpGオリゴヌクレオチド、MDP、QS21、MPL+TDMエマルジョン等、ヒトに対して使用できるものであればいずれのアジュバントを添加しても良い。更に抗原の安定性や形状維持のために医薬品の用途として許容できる種々の添加剤を加えることもある。このような添加剤として、安定化剤（アルギニン、ポリソルベート80、マクロゴール4000など）、賦型剤（マンニトール、ソルビトール、ショ糖、及び乳糖）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウムなど）、保存剤（チメロサール、フェノキシエタノールなど）、不活化剤（ホルマリン、β−プロピオラクトンなど）等が挙げられる。
【００４４】
こうして得られる本発明のキメラタンパク質は、HPV感染及びＢ型肝炎の増殖阻止に有効な抗体産生能を有するものであり、HPV感染及びＢ型肝炎の予防薬の材料として、あるいはHPV及びB型肝炎ウイルスの検出系（例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、及びドットブロット法等の抗体測定法による検出系）を構築するための材料として使用することができる。
【００４５】
また、キメラタンパク質をコードするDNA断片が、生体内に投与されたときに該キメラタンパク質を発現できる発現ベクターを用いてDNAワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして大腸菌由来のプラスミドが挙げられる。該プラスミドには哺乳類の細胞内で遺伝子を発現させるため、その上流に真核生物における強力なプロモーター、例えば、サイトメガロウイルスのIE(immediate-early)プロモーター、β-actinプロモーター、CAGプロモーター等が配される。また、該DNA断片をウイルスや細菌などに導入すれば、生ワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして、ウイルス（ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻しんウイルスベクター等）、細菌（サルモネラベクター等）、原虫（マラリア原虫ベクター等）等が挙げられる。例えば、本発明のキメラタンパク質をコードするDNA断片が組み込まれたワクシニアウイルスベクター（LC16m8株）を用いた場合、弱毒生ワクチンとしての機能だけでなく、痘瘡ワクチンとしての効果が期待できる。弱毒生ワクチンは、ワクチン材料の精製工程が簡略化でき、製造コストの低減に繋がる。HBsタンパク質が組み込まれた組換えワクシニアウイルスは、HBsタンパク質のみで構成された粒子を発現する（Vaccine 1987 Mar;5(1):65-70）。したがって、本願発明のキメラタンパク質DNA断片が組み込まれた組換えワクシニアウイルス（LC16m8株）は、同様に粒子を形成することが予測され、HPV-L2ペプチドの強い免疫原性が保持された弱毒生ワクチンとなることが期待される。
【００４６】
また、本願発明のキメラタンパク質を有効成分とするワクチンは、単独でHPV感染及びＢ型肝炎を予防するための二価ワクチンとして使用してもよく、他のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス等）、細菌（例えば、ヘモフィルスインフルエンザ菌、破傷風菌、ジフテリア菌等）及び原虫（例えば、マラリア等）感染症に対するワクチンよりなる群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることにより多価混合ワクチンとして使用することもできる。
以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４７】
（調製例）
《HPV L2 56/75−HBsキメラ遺伝子の構築〜バキュロウイルス発現プラスミド構築》
HPV16型のカプシドL2のアミノ酸番号56から75の20アミノ酸をHBsのN末、アミノ酸番号127と128の間、C末に導入する3種のキメラタンパク質をコードする遺伝子及び対照のHBs遺伝子を構築し、バキュロウイルス発現プラスミドに導入した。
【００４８】
（１）N末導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nの構築
HBs酵母発現プラスミドpYG100L（T. Imamura, et al., J. Virol. , 61, 3543-3549p, 1987）をテンプレートに以下のPrimer NF、Primer Rを用いてPCRにより増幅した。
Primer NF；5'-gtcgacATGGGTGGGTTAGGAATTGGAACAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGAGAACACAACATCAGGATT（配列番号18）
Primer R；5'-ctgcagTTAAATGTATACCCAAAGAC（配列番号19）
【００４９】
アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約750bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1 (Invitrogen)の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質のN末端にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56〜75番目の20アミノ酸）が付加されたキメラタンパク質（以下、「56/75-N末導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有する発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nを構築した。
【００５０】
（２）HBs アミノ酸127-128位導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-127の構築
先述のpYG100Lをテンプレートに、以下に記したPrimer F及びPrimer 127RでPCR増幅した断片、及びPrimer 127Fと先述のPrimer RでPCR増幅した断片を得た。Primer F、Primer 127R、Primer 127Fの配列を以下に示した。
Primer F；
5'-gtcgacATGGAGAACACAACATCAGG（配列番号20）
Primer 127R；
5'-TCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCA（配列番号21）
Primer 127F；
5'-CAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGCTCAAGGAACCTCTATGT（配列番号22）
【００５１】
それぞれ増幅した断片を等量混合し、プライマーFとプライマーRで再度PCR増幅することでそれぞれの断片を接続した約750 bpの遺伝子断片を得た。この遺伝子を制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質の内部（配列番号２の127-128位の間）にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56〜75番目の20アミノ酸）が挿入されたキメラタンパク質（以下、「56/75-127位導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有するpFB1-HBsS56/75-127を構築した。
【００５２】
（３）C末導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nの構築
先述のpYG100Lをテンプレートに、先述のPrimer Fと以下に示したPrimer CRを用いてPCR増幅した。
Primer CR；
5'-ctgcagTTACAATGGAATATACCCAGTGCGTCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAATGTATACCCAAAGACAAA（配列番号23）
【００５３】
アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約750 bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質のC末端にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56〜75番目の20アミノ酸）が付加されたキメラタンパク質（以下、「56/75-C末導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有する発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nを構築した。
【００５４】
（４）HBs遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsSの構築
対照のHBs遺伝子に関しても遺伝子両端に制限酵素認識部位を導入する目的で、先述のpYG100Lをテンプレートに、Primer FとPrimer Rを用いてPCR増幅した。アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約690 bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質をコードするDNA断片を有する、HBs発現プラスミドpFB1-HBsSを構築した。
【実施例１】
【００５５】
《動物細胞発現プラスミドの構築》
調製例に記載の（１）〜（４）の発現プラスミドを制限酵素Sal I、Xho Iで消化し、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片及びHBsタンパク質をコードするDNA断片をアガロース電気泳動にて抽出した。（１）〜（４）から得られたDNA断片をそれぞれ56/75-N末導入キメラDNA断片、56/75-127位導入キメラDNA断片、56/75-C末導入キメラDNA断片、及びHBsDNA断片と称する。【００５６】
次いで、上記の各DNA断片と、予め制限酵素 Sal Iで消化し、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ処理により末端脱リン酸化した動物細胞用発現プラスミドpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo（WO2003/004641）をLigation High（東洋紡）で連結環状化し、56/75-N末導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-N.dhfr.neo）、56/75-127位導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-127.dhfr.neo）、56/75-C末導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-C.dhfr.neo）及びHBs動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-N.dhfr. neo）を構築した。
【実施例２】
【００５７】
《チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いたキメラ遺伝子の発現》
実施例１で得た4種の動物細胞発現プラスミドをそれぞれ制限酵素Pvu Iで消化し線状化した。この線状化したプラスミドを用いて、CHO K1（FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968）をリン酸カルシウム法変法（C. Chen et al. , Mol. Cell. Biol. , 7, 2745- 2752p, 1987）で形質転換処理した。形質転換処理後、100、200、500 nmol/Lメトトレキサート（MTX）と500 μg/mLのジェネティシンを含む透析ウシ胎児血清、及びカルシウム、マグネシウム添加したYMM-01C培地（核酸不含MEMアルファ培地にアミノ酸、ビタミンを強化し、カルシウム、マグネシウムを含まない自家調製培地；以下、「選択培地」と称する）で形質転換体を選択した。
得られた形質転換体を、0.25%トリプシンを用いて細胞剥離し、先述の選択培地を用いて細胞の拡張を行った。拡張後、PBS(-)で洗浄し、無血清培地（T7m:Ex-cell SP2/0;YMM-01B 3種混合培地（SAFC社製特注培地））に培地交換した。37℃で11日間培養後、培養上清中の発現タンパク質の濃度を抗HBsモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAで定量した。その結果、56/75-C末導入キメラの発現量が最も多く、次いで56/75-127位導入キメラ、56/75-N末導入キメラの順であった。56/75-C末導入キメラの発現量は、対照とした未導入HBsタンパク質の2倍以上であった（図１）。
【実施例３】
【００５８】
《細胞培養上清からキメラタンパク質の精製》
実施例２により得られた3種のキメラタンパク質及びHBsタンパク質を発現するCHO K1細胞を選択培地を用いて拡張した。拡張後、PBS(-)で洗浄後、無血清培地（T7m；Ex-cell SP2/0；YMM-01B 3種混合培地）に培地交換し、37℃、10日間以上培養した。培養液を遠心分離で清澄化した後、ベンゾナーゼ（Merck社製）共存下、排除限界1,000 kDaのカートリッジ式UF（ビバセル100；ザルトリウス製）で培養上清を濃縮した。濃縮後、PBS(-)にバッファ置換を実施し、塩化セシウムを1.2 g/Lの密度となるように添加した後、4℃、23,000×gで超遠心分離を行った。キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300ｋDaのUFカートリッジ（ビバスピン；ザルトリウス社製）による脱塩、PBS(-)へのバッファ置換後、60%、50%、40%、20%ショ糖を含むPBS(-)を重層した遠心管にキメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むPBS(-)を加えた不連続密度勾配ショ糖の超遠心分離を行った。4℃、120,000×gの遠心条件で分離を行った後、キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300 kDaのUFカートリッジで脱糖、PBS(-)へのバッファ交換を行った。得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質は、いずれもウイルス様粒子(VPL)を形成していた。
【実施例４】
【００５９】
《キメラタンパク質のマウスへの免疫》
実施例３で得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質にアルミニウムアジュバントを加えて50μg/mlの各免疫原を調製し、各0.1 mlをメスBalb/cマウスの大腿部に筋注した（各群10匹ずつ）。接種後、4週目で採血して得た抗血清（１次免疫血清）及び初回接種から４週目に同免疫原を上記と同様に接種後、８週目で採血して得た抗血清（２次免疫血清）を得た。対照として、非投与群、及びHPV-L2由来配列（配列番号4）のN末端にCysを付加させた合成ペプチドとKLHとのコンジュゲートにアルミニウムアジュバントを添加した免疫原を投与した群を用いた。
【実施例５】
【００６０】
《同遺伝子型由来HPV-L2ペプチドと抗血清の反応性》
実施例４で得られた個体別の１次免疫血清又はこれらのプール抗血清（個体別の抗血清を等量ずつ混合）を用いて、ELISAにより、同遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドに対する抗体産生能を評価した。より具体的には、96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したHPVの16型のL2タンパク質（配列番号１）の56〜75番目の20アミノ配列からなる合成ペプチド（配列番号４）(1.0 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（1% BSA、0.05% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100に希釈した各血清を、固相化したペプチドと室温で2時間反応させた。PBST（0.05% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG抗体（Santa Cruz: sc-2031）を加え、室温で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（TMB＋（DAKO社製））を加え、室温で10分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、56/75-C末導入キメラ免疫群では早期に抗体が誘導され、このプール血清は、KLHコンジュゲート免疫群より5倍程度高い抗体価を示した（図２）。また、個体別の抗血清で得られた抗体価の平均値を用いてｔ検定による検証を行った結果、両者間に有意差が認められた(p<0.05)（図３）。また、56/75-127位導入キメラ免疫群及び56/75-N末導入キメラ免疫群の抗血清中にも該合成ペプチドと結合する抗体が確認された。
【実施例６】
【００６１】
《異なる遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドと抗血清の反応性》
実施例４で得られた個体別の１次免疫血清又はこれらのプール抗血清（個体別の抗血清を等量ずつ混合）を用いて、実施例５と同様の方法により、異なる遺伝子型由来の共通領域のHPV-L2ペプチドに対する結合能を評価した（HPV18型、HPV59型及びHPV68型は、HPVの16型と同じ配列を有する）。以下のアミノ酸配列で示される合成ペプチドを使用した。なお、以下のアミノ酸配列において、*印はHPV16型と同じアミノ酸であることを示す。【００６２】
高リスク型
HPV16-L2-56/75  56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL                     （配列番号4）
HPV31-L2-56/75  56-******S**********V** （2アミノ酸置換）（配列番号5）
HPV33-L2-55/74  55-**********S******V*I （3アミノ酸置換）（配列番号6）
HPV35-L2-56/75  56-******S*******S**V** （3アミノ酸置換）（配列番号7）
HPV39-L2-55/74  55-********T*********** （1アミノ酸置換）（配列番号8）
HPV45-L2-55/74  55-**********S******V** （2アミノ酸置換）（配列番号9）
HPV51-L2-55/74  55-**********S********* （1アミノ酸置換）（配列番号10）
HPV52-L2-55/74  55-********A*S***A**V** （4アミノ酸置換）（配列番号11）
HPV56-L2-55/74  55-********T*S***A**V** （4アミノ酸置換）（配列番号12）
HPV58-L2-55/74  55-*****************V** （1アミノ酸置換）（配列番号13）
HPV66-L2-55/74  55-**********S***A**V** （3アミノ酸置換）（配列番号14）
HPV73-L2-57/76  57-******S***S******V** （3アミノ酸置換）（配列番号15）
計12種【００６３】
低リスク型
HPV6-L2-55/74   55-*****************V** （1アミノ酸置換）（配列番号16）
HPV11-L2-54/73  54-********A*S***A***** （3アミノ酸置換）（配列番号17）
計2種【００６４】
キメラタンパク質免疫群の抗血清は、いずれも上記の全ての合成ペプチドと反応することが確認された。特に56/75-C末導入キメラ免疫群では、他の群と比べ高い抗体価を示した（図４）。
【実施例７】
【００６５】
《抗血清中のHBs抗体価の測定》
実施例４で得られた個体別の１次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、HBsタンパク質に対する抗体価を測定した。該プール抗血清をPBS(-)で10倍段階希釈して（10、100、1,000倍）、B型肝炎ウイルス表面抗体キットEテスト「TOSOH」II（HBsAb；東ソー株式会社）を用いて、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA-360にて抗体価を測定した。【００６６】
いずれのキメラタンパク質免疫群においても、HBsタンパク質に反応する抗体が検出された。56/75-N末導入キメラ免疫群及び56/75-C末導入キメラ免疫群は、HBsタンパク質単独免疫群と同様の高い抗体価が得られたが、56/75-127位導入キメラ免疫群では抗体価上昇が約1/10に抑えられていた（図５）。
【実施例８】
【００６７】
《抗血清のエピトープ解析》
実施例４で得られた個体別の２次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下のアミノ酸配列で示される合成ペプチドを用いたELISAにより、HPV-L2ペプチドに対する結合能を評価した。具体的には、HPV16 L2のアミノ酸53から75の配列に、欠失、あるいはアラニン置換をもつ変異ペプチドを、N末端に付加したシステインを介してBSAに結合させたものを抗原として用いた。96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したBSA結合ペプチド(500 ng/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（5% スキムミルク、0.1% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100から1:2500まで段階希釈した各血清を、固相化したペプチドと室温で2時間反応させた。PBST（0.1% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG抗体（Santa Cruz: sc-2031）を加え、室温で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（2mg/mlのo-フェニレンジアミン、及び、0.0065%の過酸化水素水を含む0.1Mクエン酸3ナトリウム、pH4.8）を加え、室温で10分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。【００６８】
HPV16-L2-14/27  14-SATQLYKTCKQAGT              (配列番号24)
HPV16-L2-53/73  53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTGYI    (配列番号25)
HPV16-L2-53/70  53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTAAA    (配列番号26)
HPV16-L2-53/67  53-VFFGGLGIGTGSGTGAAAAAA    (配列番号27)
HPV16-L2-53/64  53-VFFGGLGIGTGSAAAAAAAAA    (配列番号28)
HPV16-L2-55/75  55-FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPL    (配列番号29)
HPV16-L2-58/75  58-AAALGIGTGSGTGGRTGYIPL    (配列番号30)
HPV16-L2-60/75  60-AAAAAAGTGSGTGGRTGYIPL    (配列番号31)
HPV16-L2-64/75  64-AAAAAAAAASGTGGRTGYIPL    (配列番号32)【００６９】
その結果、いずれの免疫群も高い抗体価を有し、56/75-127位導入キメラ免疫群では、コア配列領域（20アミノ酸）のN末側及びC末側の２箇所のアミノ酸配列（N末側及びC末側エピトープ）を認識する抗体が誘導され、56/75-N末導入キメラ免疫群及び56/75-C末導入キメラ免疫群では、C末側のアミノ酸配列（C末側エピトープ）を認識する抗体が誘導されることが示された（図６）。
【実施例９】
【００７０】
《異なる遺伝子型由来のHPV-ウイルス様粒子（VLP）と抗血清の反応性》
実施例４で得られた個体別の２次免疫血清（56/75-127位導入キメラ免疫群）を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-VLPに対する結合能を評価した。【００７１】
（１）VLPの作製
HPV16、18、31、33、35、51、52、または58のL1、及び、L2発現プラスミドを293FT細胞（Invitrogen）にトランスフェクションした。2日後、細胞をLysis Buffer（0.35% Brij58、0.9mM CaCl2、10mM MgCl2、1μl Benzonaseを含むPBS）に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。終濃度0.8Mになるように5M NaClを加え氷中に10分間静置した後、10,000g、4℃、10分間遠心し、上清を回収した。上清を、27%、33%、39%のiodixanol (0.8M NaCl in PBSで調整)の上に重層し、50,000rpm、16℃、3.5時間超遠心した。超遠心後、VLPを含むフラクションを回収した。【００７２】
（２）ELISA
96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したVLP(100 ng/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（5% スキムミルク、0.1% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:20から1:20000まで段階希釈した各血清を、固相化したVLPと室温で2時間反応させた。その後、ペプチドを抗原とするELISAと同様の方法で、VLPに結合した抗体を検出した。その結果、全てのHPV-VLPと結合し、HPVに対して広いスペクトルを有することが示された（図７）。
【実施例１０】
【００７３】
《異なる遺伝子型由来のHPV-偽ウイルス（PsV）と抗血清の反応性》
実施例４で得られた個体別の２次免疫血清（56/75-127位導入キメラ免疫群）を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-PsVに対する中和能を評価した。【００７４】
（１）PsVの作製
HPV16、18、または35のL1、及び、L2発現プラスミドと分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)発現プラスミドを混合し、293FT細胞にトランスフェクションした。2日後に、VLPと同様の方法でPsVを精製した。【００７５】
（２）中和試験
細胞培養用培地(10%FBSを含むフェノールレッド不含DMEM)で希釈したPsVと、1:12.5から1:400まで同培地で段階希釈した各血清を等量ずつ混和し、4℃で1時間反応させた。その後、予め96ウェルプレートに準備した293FT細胞（1 × 104個/well）に感染させた。3日後に、培養上清中のSEAP活性を、Great EscAPe SEAP Assay Kit (Clontech)とプレートリーダー（ARVO MX, PerkinElmer）を用いて測定した。その結果、いずれの偽ウイルスに対しても明確な中和活性が認められた（図８-1〜図８-3）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本願発明のキメラタンパク質は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症及びＢ型肝炎に対する予防薬の材料に利用され得る。
【図１】
2014103608.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014103608.tif 000009
【図８−１】
2014103608.tif 000010
【図８−２】
2014103608.tif 000011
【図８−３】
2014103608.tif 000012
【配列表】
2014103608000001.app
【国際調査報告】
2014103608.tif 000013
2014103608.tif 000014
2014103608.tif 000015
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