(57)【要約】  本発明は、IRF5の発現抑制活性を有する核酸、該核酸を含む医薬組成物および該核酸を含む全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫性疾患の予防または治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号1〜79から成る群から選択される標的IRF5 mRNA配列と相補的である、irf5遺伝子の発現を減少させる二本鎖核酸。
【請求項２】
前記二重鎖領域が17〜27個の塩基対であり、配列番号1〜79から成る群から選択される標的IRF5 mRNA配列と相補的である前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的IRF5 mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補する、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項３】
前記センス鎖のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端から1番目と2番目のヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項４】
前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、請求項３に記載の二本鎖核酸。
【請求項５】
前記センス鎖は、25ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖は、27ヌクレオチド長である、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖は、配列番号159〜237から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項７】
前記センス鎖は、配列番号80〜158から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項８】
配列番号83／配列番号162、配列番号85／配列番号164、配列番号86／配列番号165、配列番号88／配列番号167、配列番号97／配列番号176、配列番号99／配列番号178、配列番号100／配列番号179、配列番号101／配列番号180、配列番号104／配列番号183、配列番号105／配列番号184、配列番号106／配列番号185、配列番号107／配列番号186、配列番号108／配列番号187、配列番号110／配列番号189、配列番号112／配列番号191、配列番号117／配列番号196、配列番号118／配列番号197、配列番号119／配列番号198、配列番号120／配列番号199、配列番号121／配列番号200、配列番号124／配列番号203、配列番号126／配列番号205、配列番号127／配列番号206、配列番号128／配列番号207、配列番号129／配列番号208、配列番号130／配列番号209、配列番号131／配列番号210、配列番号132／配列番号211、配列番号133／配列番号212、配列番号134／配列番号213、配列番号138／配列番号217、配列番号147／配列番号226、配列番号149／配列番号228、配列番号150／配列番号229、配列番号151／配列番号230、配列番号155／配列番号234、配列番号156／配列番号235、および配列番号157／配列番号236から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸を含有する、医薬組成物。
【請求項１０】
自己免疫疾患を治療する方法であって、治療上有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸 、または請求項９に記載の医薬組成物を、該治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患の治療用である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患の治療に用いるための、請求項１〜８のいずれかに記載の二本鎖核酸。
【請求項１５】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、請求項１４に記載の二本鎖核酸。
【請求項１６】
自己免疫疾患の治療剤を製造するための、請求項１〜８のいずれかに記載の二本鎖核酸の使用。
【請求項１７】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IRF5の発現抑制に用いるための核酸または該核酸を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は細菌やウイルスが感染した時、また組織が傷ついた時に体を守るために重要な働きをしている。一方で、その炎症が過剰に働くと、全身性エリテマトーデスや関節リウマチなどの自己免疫疾患を引き起こすことが知られている。免疫細胞の一つであるマクロファージは炎症を惹起したり、抑制する役割を持つが、マクロファージの炎症作用を司るスイッチとしてIRF5(Interferon Regulatory Factor 5)が特定されている。ウイルスを使いヒトのマクロファージにIRF5をより多く生成させることで炎症を促進させ、siRNAによってIRF5の生成を抑えると炎症が抑制されることが示されている。また遺伝子欠損変異によってIRF5を生成できないマウスを使うと、炎症を促進する伝達物質の量が減少することが知られている(特許文献１、非特許文献1)。【０００３】
IRF5は転写因子であり、ウィルス感染やTLR7/8/9刺激を受けてリン酸化され、核内移行し、I型インターフェロン(type I interferon [IFN], IFNα, βなど)、IL-6、IL-12、TNFα、ケモカイン、アポトーシス関連遺伝子など、多数の遺伝子を誘導する(非特許文献2)。全身性エリテマトーデス患者の血清中では、type I interferonの高濃度発現が見られ、IRF5と全身性エリテマトーデスとの関連性が示唆されている(非特許文献3-7)。【０００４】
IRF5の発現を抑制する方法として、RNA干渉(RNA interference、以下、RNAiともいう)を利用した方法等が知られている。例えば、21〜23塩基の長さの二本鎖RNAを細胞に導入することにより、IRF5の発現が抑制されることが知られている。RNA干渉によってタンパク等の発現を抑制する、例えば、21〜23塩基の長さの二本鎖RNAは、small interfering RNA(siRNA)と名づけられている。ヒトのirf5遺伝子をターゲットとするsiRNA配列の一部は開示されているが(特許文献2、特許文献3、非特許文献8-12)、いずれも本発明の二本鎖RNAとは異なる配列を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2012/093258号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2012/005898号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2005/018534号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat. Immun., 12(3), 231-238 (2011)
【非特許文献２】Genes. Immun., 8, 445-455 (2007)
【非特許文献３】Nat. Genet., 38, 550-555 (2006)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104, 6758-6763 (2007)
【非特許文献５】Arthritis. Rheum., 56, 1234-1241 (2007)
【非特許文献６】Arthritis. Rheum., 58, 826-834 (2008)
【非特許文献７】Arthritis. Rheum., 60, 1845-1850 (2009)
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 280(17), 17005-17012 (2005)
【非特許文献９】Cancer Res., 65(16), 7403-7412 (2005)
【非特許文献１０】Blood, 115(22), 4421-4430 (2010)
【非特許文献１１】Nat. Immunol., 12(3), 231-238 (2011)
【非特許文献１２】J. Virol., 79(18), 11671-11676 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インターフェロン調節因子として働くIRF5の発現を抑制することが可能な核酸を提供することを目的とする。また本発明は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の(1)〜(17)に関する。
(1)センス鎖およびアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号1〜79から成る群から選択される標的IRF5 mRNA配列と相補的である、irf5遺伝子の発現を減少させる二本鎖核酸。
(2)前記二重鎖領域が17〜27個の塩基対であり、配列番号1〜79から成る群から選択される標的IRF5 mRNA配列と相補的である前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的IRF5 mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補する、(1)に記載の二本鎖核酸。
(3)前記センス鎖のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端から1番目と2番目のヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、(1)に記載の二本鎖核酸。
(4)前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、(3)に記載の二本鎖核酸。
(5)前記センス鎖は、25ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖は、27ヌクレオチド長である、(1)に記載の二本鎖核酸。
(6)前記アンチセンス鎖は、配列番号159〜237から成る群から選択される配列を含む、(1)に記載の二本鎖核酸。
(7)前記センス鎖は、配列番号80〜158から成る群から選択される配列を含む、(1)に記載の二本鎖核酸。
(8)配列番号83／配列番号162、配列番号85／配列番号164、配列番号86／配列番号165、配列番号88／配列番号167、配列番号97／配列番号176、配列番号99／配列番号178、配列番号100／配列番号179、配列番号101／配列番号180、配列番号104／配列番号183、配列番号105／配列番号184、配列番号106／配列番号185、配列番号107／配列番号186、配列番号108／配列番号187、配列番号110／配列番号189、配列番号112／配列番号191、配列番号117／配列番号196、配列番号118／配列番号197、配列番号119／配列番号198、配列番号120／配列番号199、配列番号121／配列番号200、配列番号124／配列番号203、配列番号126／配列番号205、配列番号127／配列番号206、配列番号128／配列番号207、配列番号129／配列番号208、配列番号130／配列番号209、配列番号131／配列番号210、配列番号132／配列番号211、配列番号133／配列番号212、配列番号134／配列番号213、配列番号138／配列番号217、配列番号147／配列番号226、配列番号149／配列番号228、配列番号150／配列番号229、配列番号151／配列番号230、配列番号155／配列番号234、配列番号156／配列番号235、および配列番号157／配列番号236から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、(1)に記載の二本鎖核酸。
(9) (1)〜(8)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸を含有する、医薬組成物。
(10)自己免疫疾患を治療する方法であって、治療上有効量の(1)〜(8)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸 、または(9)に記載の医薬組成物を、該治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
(11)自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、(10)に記載の方法。
(12)自己免疫疾患の治療用である、(9)に記載の医薬組成物。
(13)自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、(12)に記載の医薬組成物。
(14)自己免疫疾患の治療に用いるための、(1)〜(8)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
(15)自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、(14)に記載の二本鎖核酸。
(16)自己免疫疾患の治療剤を製造するための、(1)〜(8)のいずれかに記載の二本鎖核酸の使用。
(17)自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチである、(16)に記載の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のIRF5の発現抑制活性を有する核酸、該核酸をコードするベクター、該核酸または該ベクターを含む医薬組成物を提供することによって、インターフェロン調節因子の発現を抑制することが可能となる。本発明は、特に、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療および／または予防に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の核酸が標的とするirf5遺伝子（IRF5をコードする遺伝子)としては、例えばGenbank  Accession  No.NM_032643として登録されているIRF5 cDNA (配列番号238)に対応するirf5の完全長mRNAを産生する遺伝子があげられる。
【００１１】
１．本発明の核酸
本発明において、IRF5 mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。本明細書において「本発明の核酸」という場合、特にことわらない限り、アンチセンス鎖核酸、センス鎖核酸、並びにセンス鎖及びアンチセンス鎖核酸が対形成した二本鎖核酸を包含する意味で用いられる。
【００１２】
本発明の核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。またウラシル（U）は、チミン（T）に一義的に読み替えることができる。
【００１３】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【００１４】
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００１５】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
【００１６】
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチド、好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチド、より好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドがあげられる。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy 基および2-cyanoethoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等もあげられる。
【００１７】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)があげられ、具体的には、2'位の酸素原子と4'位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等もあげられる。
【００１８】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
【００１９】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものがあげられる。
【００２０】
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
【００２１】
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【００２２】
本発明の核酸は、核酸の分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
【００２３】
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として２重螺旋構造をとるものをいう。
【００２４】
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該ヌクレオチド配列間で0〜30％、0〜20％または0〜10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、IRF5 mRNAに対して相補的なアンチセンス鎖は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。例えば、アンチセンス鎖が27塩基長の場合には、標的遺伝子の標的配列に対して8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれの配列の5’末端または3’末端であってもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、一つまたは複数の塩基の付加および／または欠失を含んでもよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖の塩基の付加および／または欠失により、標的IRF5 mRNA配列に対して1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。
【００２５】
本発明の核酸は、IRF5 mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。本発明の二本鎖核酸は、標的IRF5 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成する配列の長さは、通常11〜35塩基であり、15〜30塩基が好ましく、17〜25塩基がより好ましく、17〜23塩基がさらに好ましく、19〜23塩基が特に好ましい。
【００２６】
また、一態様において、本発明の核酸は、Dicer-Substrate siRNA（DsiRNA）であり得る。DicerはRNA干渉において機能する主要な因子の一つであり、二本鎖RNA分子をプロセシングして21塩基のsiRNAを産生する。産生されたsiRNAはRISC複合体へ取り込まれ、該複合体内で標的mRNA分子の分解が起きる。DsiRNAは、DicerによるプロセシングおよびRISC複合体への取り込みのために最適化された二本鎖RNAであり、27塩基のリボヌクレオチドからなるアンチセンス鎖と、25塩基のリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドからなるセンス鎖が、二本鎖を形成した構造を有する。センス鎖におけるデオキシリボヌクレオチドは、3’末端から１番目と２番目に位置する。DsiRNAはDicerによるプロセシングをうけると21塩基のsiRNA（19塩基対）を生じる。DsiRNAは、siRNAよりもRNA干渉の効果が大きいことが知られているため、本発明の核酸として好適に使用し得る。
【００２７】
本発明のアンチセンス鎖核酸としては、標的IRF5 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
【００２８】
IRF5の発現を抑制する核酸としては、標的IRF5 mRNA配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を含み、かつIRF5の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的IRF5 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつIRF5の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
【００２９】
本発明において二本鎖核酸とは、二本のヌクレオチド鎖が対合し二重鎖領域を有する核酸をいう。二重鎖領域とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖領域は、通常11〜35塩基対であり、15〜30塩基対が好ましく、17〜25塩基対がより好ましく、17〜23塩基対がさらに好ましく、19〜23塩基対が特に好ましい。
【００３０】
二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましく、19〜21塩基からなることが最も好ましい。
【００３１】
本発明の二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
【００３２】
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばdTdTまたはUUからなる突出部を有するものがあげられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、本発明において、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。なお、アンチセンス鎖は、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において、表1に記載された群から選択される標的IRF5 mRNA配列と相補的である。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により上記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3’末端や5’末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459)などを用いることもできる。
【００３３】
本発明の二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の5’末端または3’末端が1〜4塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
【００３４】
本発明の二本鎖核酸は、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA（dsRNA）、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA（dsDNA）、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA（dsRNA）である。
【００３５】
本発明のアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜7番目が、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から2〜7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜11番目が、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から2〜11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、本発明の核酸におけるアンチセンス鎖の5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から9〜13番目が、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から9〜13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から7〜15番目が、標的IRF5 mRNA配列の3’末端から7〜15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上の核酸を得るのが望ましい。二本鎖核酸の場合には、合成および精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖1当量に対して、センス鎖0.1〜10当量、好ましくは0.5〜2当量、より好ましくは0.9〜1.1当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖核酸を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、94℃程度で5分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明の核酸を製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法があげられる。
【００３７】
本発明の核酸は、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入することもできる。
【００３８】
本発明の核酸は、5'末端、3'末端および／または配列内部が１つ以上のリガンドや蛍光団により修飾されていてもよく、リガンドや蛍光団により修飾された核酸をコンジュゲート核酸とも呼ぶ。固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5'末端、3'末端および／または配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾化剤を作用させることでコンジュゲート核酸を得ることもできる。リガンドとしては、生体分子と親和性のある分子であれば良いが、例えば、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、VHHなどの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、あるいは核酸アプタマーなどがあげられ、これらを組み合わせて用いることもできる。蛍光団としてはCy3シリーズ, Alexaシリーズ、ブラックホールクエンチャーなどがあげられる。
【００３９】
本発明の核酸の代わりに、細胞内に導入してこれらが発現されるようなベクターを用いてもよい。具体的には、本発明の核酸をコードする配列を発現ベクター内のプロモーター下流に挿入して発現ベクターを構築し、細胞に導入することにより該核酸等を発現させることができる。発現ベクターとしては、pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen社製)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion社製)、pSINsi-hH1 DNA(タカラバイオ社製)、pSINsi-hU6 DNA(タカラバイオ社製)、pENTR/U6(Invitrogen社製)等をあげることができる。
【００４０】
また、本発明の核酸をコードする配列をウイルスベクター内のプロモーター下流に挿入し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して生産した組換えウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどがあげられる。
【００４１】
２．IRF5の発現抑制活性を有する核酸
本発明のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、例えば、Genbank  Accession  No.NM_032643として登録されているヒトirf5の完全長mRNAのcDNA（センス鎖）の塩基配列(配列番号238)に基づいて設計することができる。
【００４２】
IRF5の発現抑制活性を有する核酸としては、IRF5 mRNAに対して相補的な塩基配列を含む本発明のアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む本発明のセンス鎖核酸とからなり、かつIRF5の発現抑制活性を有する二本鎖核酸があげられる。該二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましく、19〜21塩基からなることが最も好ましい。該二本鎖核酸は通常11〜35塩基対、好ましくは15〜30塩基対、より好ましくは17〜25塩基対、さらに好ましくは17〜23塩基対、特に好ましくは19〜23塩基対からなる二重鎖領域を有している。
【００４３】
これらの二本鎖核酸を細胞に導入することにより、IRF5の発現を抑制することができる。例えば本発明の二本鎖核酸は、数百pM〜数nMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でIRF5のmRNAの発現を抑制することができる。
【００４４】
また、本発明の二本鎖核酸のIRF5 mRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるIRF5のmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。
【００４５】
３．本発明の医薬組成物
本発明はまた、上記の二本鎖核酸を有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療剤または予防剤として用いることができる。
【００４６】
該医薬組成物は、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体があげられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどがあげられる。また、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性ポリマーとしては、JetSI(Qbiogene社)、Jet-PEI(ポリエチレンイミン;Qbiogene社)などが好ましく用いられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、GenomeOne(HVJ-Eリポソーム;石原産業社)などが好ましく用いられる。
【００４７】
本発明の核酸と上記担体を含む組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液と核酸溶液とを混合して調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、核酸は通常、水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって容易に調製することができる。該組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などがあげられる。また、該組成物を調製する際のpHおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。
【００４８】
該組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。担体と核酸とを含む組成物の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、当業者であれば用いる担体に最適な方法を選択できる。
【００４９】
また、本発明の医薬組成物としては、例えば核酸とリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成される組成物も、好適に用いられる。リード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等があげられ、好ましくはリポソームが用いられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
【００５０】
該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば非カチオン性脂質、粒子の凝縮を阻止する脂質およびカチオン性脂質等を構成成分とするものがあげられる。
【００５１】
該組成物は、例えば国際公開特許公報2006/080118号パンフレット等に記載の方法に従って調製することができる。
【００５２】
本発明の医薬組成物に含まれる核酸と担体との配合比は、核酸の1重量部に対して担体1〜200重量部が適当である。好ましくは、核酸の1重量部に対して担体2.5〜100重量部、さらに好ましくは担体7〜25重量部である。
【００５３】
本発明の医薬組成物の大きさは、平均粒子径が約10nm〜300nmであるのが好ましく、約30nm〜200nmであるのがより好ましく、約50nm〜150nmであるのがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、疾患の治療または予防に有効な量の該複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、吸入用などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤等であってもよい。
【００５６】
液剤の場合、本発明の医薬組成物中の有効成分の濃度範囲は通常、0.001〜25%(w／v)であり、好ましくは0.1〜10%(w／v)であり、より好ましくは0.5〜5%(w／v)である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、pH調整剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
【００５７】
該溶液のpHは、通常、約5.0〜約8.5、好ましくは約6.0〜約8.0に調整され、好ましくは、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行う。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、凍結乾燥製剤として調製することもできる。凍結乾燥製剤は、核酸と担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約-40〜-20℃の条件で予備乾燥を約2時間程度行い、約0〜10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15〜25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００５９】
凍結乾燥製剤は、任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液などをあげることができる。この溶液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5〜2倍量、または500ml以下が好ましい。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与など、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等があげられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は核酸の質量として、成人に対して1日当たり、0.1mg〜10g／日、好ましくは1mg〜500mg／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また1日1回〜数回投与することもでき、1日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。
【００６２】
４．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、自己免疫疾患を治療する方法であって、治療上有効量の本発明の核酸または本発明の医薬組成物を、該治療を必要とするヒトに投与することが特徴である。その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００６３】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の医薬組成物の投与方法、用量、調製方法等を援用できる。
【００６４】
本明細書中、自己免疫疾患は、全身性自己免疫疾患及び臓器特異性自己免疫疾患を含む。自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、IgG4関連疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群及び混合性結合組織病などの全身性自己免疫疾患、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、1型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症及び習慣性流産などの臓器特異性自己免疫疾患が挙げられる。好ましくは、自己免疫疾患は、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスである。
【００６５】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１  二本鎖核酸の調製
IDT社(Integrated DNA Technologies, Inc.)に依頼して、表1に示すセンス鎖（配列番号80〜158）、アンチセンス鎖（配列番号159〜237）およびそれらをアニーリングさせた二本鎖核酸DsiKKC-01〜79を合成した。表1中で大文字はリボヌクレオチド、小文字はデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ示す。【００６７】
実施例２  IRF5 mRNAのノックダウン活性の測定
表1に記載の二本鎖核酸とDharmafect 1 siRNAトランスフェクション試薬(サーモフィッシャー社製、カタログ番号:T-2001)をOpti-MEM 培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11058-021 )で希釈して、最終濃度10nM の二本鎖核酸と0.5% Dharmafect 1 siRNAトランスフェクション試薬となるようにsiRNA／Dharmafect 1混合液を調製した。50μLのsiRNA／Dharmafect 1混合液を各々96ウェルの培養プレートに分注し、各ウェルに白血病由来のヒト免疫細胞であるTHP-1細胞(ATCCカタログ番号 TIB-202)を、50,000細胞数/50μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で2時間培養した。その後、培養上清を取り除き新しい完全培地[10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11875-093)]に再懸濁し、さらに、37℃、5%CO2条件下で2日間インキュベートした。その後、THP-1細胞中のIRF5のmRNA量を、Affymetrix  Quantigene 2.0(Affymetrix社製、カタログ番号 ♯12773)を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従い定量した。定量には、IRF5 mRNAにハイブリダイズさせるプローブ(Affymetrix社製、カタログ番号  ♯SA-50356)とPPIB mRNAにハイブリダイズさせるプローブ(Affymetrix社製、カタログ番号  ♯SA-50205)を用いた。
表2に各々の二本鎖核酸によるIRF5 mRNAのノックダウン率を示した。Mockは、siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでTHP-1細胞を処理した時のmRNAノックダウン率を示す。mRNAノックダウン率は、以下の式に従って計算した値に100を乗じて算出した。表1に記載の二本鎖核酸による、IRF5 mRNAのノックダウン活性が認められた。中でも、DsiKKC-28、DsiKKC-29、DsiKKC-38およびDsiKKC-42は高いノックダウン活性を示した。【００６８】
mRNAノックダウン率=1-{[(IRF5testsiRNA-IRF5background)/(PPIBtestsiRNA-PPIBbackground)]/[(IRF5siKKC3-IRF5background)/(PPIBsiKKC3-PPIBbackground)]}
内部対照として、構成的発現遺伝子であるPPIB(peptidylprolyl isomerase B)を用いた。また、陰性対照としてヒトのいずれの遺伝子とも交差しないsiKKC3(Qiagen社製、カタログ番号  ♯1027280)を用いた。各反応系において、THP-1細胞を用いないこと以外は同様の操作を行った反応系における定量値を、各反応系における定量値から差し引くことでバックグランド補正を行った。【００６９】
【表１−１】
2015137459.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
2015137459.tif 000003
【００７１】
【表２−１】
2015137459.tif 000004
【００７２】
【表２−２】
2015137459.tif 000005
【００７３】
【表２−３】
2015137459.tif 000006
【００７４】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【００７５】
本出願は、米国で出願された米国仮出願６１／９５２，４２６（出願日：２０１４年３月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、IRF5の発現抑制活性を有する核酸、該核酸を有効成分とする医薬組成物などが提供される。本発明の核酸および医薬組成物は、IRF5の発現を抑制し、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患などの疾患の治療に有用である。
【配列表】
2015137459000001.app
【国際調査報告】
2015137459.tif 000007
2015137459.tif 000008
2015137459.tif 000009
2015137459.tif 000010
2015137459.tif 000011
2015137459.tif 000012