(57)【要約】  本発明は、全身暴露による副作用を回避することが可能であり、後眼部疾患等に有用で安定性に優れた（Ｒ）−（−）−２−（４−ブロモ−２−フルオロベンジル）−１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−４−スピロ−３’−ピロリジン−１，２’，３，５’−テトラオン含有点眼用懸濁製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−（−）−２−（４−ブロモ−２−フルオロベンジル）−１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−４−スピロ−３’−ピロリジン−１，２’，３，５’−テトラオン（以下、「化合物Ａ」という）またはその生理的に許容される塩を含有する点眼用懸濁製剤。
【請求項２】
化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が分散媒中に懸濁している懸濁液である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
懸濁液中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が、１ｎｍ以上２０μｍ以下である請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
懸濁液中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が、１０ｎｍ以上２０μｍ以下である請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
分散媒が水系の分散媒である請求項２〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
分散媒が分散剤及び／又は界面活性剤を含む請求項２〜５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
分散媒が分散剤及び界面活性剤を含む請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
懸濁液のｐＨが３〜９である請求項２〜７のいずれかに記載の製剤。
【請求項９】
懸濁液の浸透圧が２０〜１０００ｍＯｓｍである請求項２〜８のいずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
懸濁液１ｍＬ中に化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を１〜５００ｍｇ含む請求項２〜９のいずれかに記載の製剤。
【請求項１１】
懸濁液中に溶解している化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の割合が製剤に含まれる全ての化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の０．００１％〜１０％である請求項２〜１０のいずれかに記載の製剤。
【請求項１２】
懸濁液中に溶解している化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の割合が製剤に含まれる全ての化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の０．００１％〜１％である請求項２〜１１のいずれかに記載の製剤。
【請求項１３】
前眼部疾患及び／又は後眼部疾患を治療するための請求項１〜１２のいずれかに記載の製剤。
【請求項１４】
疾患が、ＶＥＧＦが関連する疾患である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、近視性脈絡膜新生血管、網膜静脈閉塞症及び／又は白内障である請求項１３又は１４に記載の製剤。
【請求項１６】
（１）化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を含有する製剤と、（２）分散媒を含む製剤を組み合わせてなるキット。
【請求項１７】
製剤（１）における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が１ｎｍ以上２０μｍ以下である請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
製剤（１）における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が１０ｎｍ以上２０μｍ以下である請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
製剤（１）または製剤（２）が、分散剤及び／又は界面活性剤を含んでもよい請求項１６〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
前眼部疾患及び／又は後眼部疾患を治療するための請求項１６〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を含有する、ＶＥＧＦが関連する疾患の治療剤。
【請求項２２】
疾患が加齢黄斑変性及び／又は糖尿病網膜症である請求項２１に記載の治療剤。
【請求項２３】
懸濁液中に分散剤及び／又は界面活性剤を含む請求項２〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項２４】
懸濁液中に分散剤及び界面活性剤を含む請求項２３に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に後眼部疾患に対し有用な（Ｒ）−（−）−２−（４−ブロモ−２−フルオロベンジル）−１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−４−スピロ−３’−ピロリジン−１，２’，３，５’−テトラオン含有点眼用懸濁製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
硝子体、網膜、脈絡膜、強膜などといった後眼部組織は、視機能の中心を担う領域であり、この領域が侵されると、著しい視力の低下や失明に至るケースも少なくない。代表的な後眼部疾患としては加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、黄斑浮腫、近視性脈絡膜新生血管、網膜静脈閉塞症、脈絡膜新生血管、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、増殖性硝子体網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症などが挙げられる。特に、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症は、欧米諸国や日本などの先進国での壮年から老年期における失明の主要原因疾患となっており、眼科臨床及び社会的にも非常に問題視される疾患とされている。（特許文献１）。【０００３】
一般に網膜などの後眼部への薬物送達は、血液経由の場合は後眼部の血液網膜関門（blood−retinal barrier；BRB）によって著しく制限されている。点眼した場合は、大部分が涙液のターンオーバーによって薬物は眼表面から速やかに排出されて、さらには鼻涙管を介して全身循環の血流に移行する（非特許文献１）。そのため、点眼剤における薬物送達は、点眼剤中の薬物を１００とすると組織中最も移行する角膜で０．１〜０．５、前房水・虹彩および毛様体では０．０１〜０．１、水晶体や硝子体では０．０００１程度と極めて低いことが知られている（非特許文献２）。そして、後眼部は水晶体や硝子体よりさらに奥に存在するため、一般にはほとんど点眼によって後眼部に薬物を送達させることは出来ないと考えられる。また、薬物の水への溶解性が低いために利用される懸濁点眼剤は、薬物が水に溶解されていないため一般的に眼内部に吸収されにくく（非特許文献３）、懸濁させた点眼剤における後眼部への薬物送達については、通常、溶液点眼剤に比べてさらに困難であると考えられる。臨床の場においても、懸濁点眼剤は存在するものの、結膜炎等の前眼部疾患への適用に限られている。また、後眼部への薬物送達のためには硝子体内注射や手術の他、全身循環血を介した経路以外は困難と考えられている（特許文献４、非特許文献４）。【０００４】
後眼部疾患は重篤な症状を引き起こす眼疾患にもかかわらず、有効な治療薬は乏しく、また後眼部という薬剤が到達しにくい部位がターゲットであることから投与手段も限定的で、現在抗血管内皮細胞増殖因子（抗ＶＥＧＦ）薬の硝子体内注射、ステロイドの硝子体内注射やテノン嚢下注射、光線力学療法（ＰＤＴ）、硝子体手術等による治療が行われている。しかし、これらいずれの治療方法においても、眼内への注射など患者にとって極めて侵襲的で苦痛を伴う方法が取られており、点眼投与のような新たな投与法の開発が切望されている。【０００５】
（Ｒ）−（−）−２−（４−ブロモ−２−フルオロベンジル）−１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−４−スピロ−３’−ピロリジン−１，２’，３，５’−テトラオン（ラニレスタット）（以下「化合物Ａ」と記載する）は強力なアルドースリダクターゼ阻害作用を有し、かつ毒性の低い化合物であり、糖尿病性合併症治療薬として有用である（特許文献２、特許文献３）。
【化１】
2016039422.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特許公開第２００９−１９６９７３号
【特許文献２】日本特許第２５１６１４７号
【特許文献３】国際公開第１９９９／２０２７６号
【特許文献４】日本特許公開第２００５−９７２７５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「網膜へのドラッグデリバリーの現状と課題」高島由季、薬剤学、７２（２）、１１７−１２１（２０１２）
【非特許文献２】スタンダード薬学シリーズ７「製剤化のサイエンス」日本薬学会編、東京化学同人出版、第４章「代表的な製剤」２２・２点眼剤、１０３頁−１０５頁
【非特許文献３】「点眼剤の適正使用ハンドブック−Ｑ＆Ａ−」 社団法人東京医薬品工業協会 点眼剤研究会他 作成、社団法人日本眼科医会 監修、平成２３年９月初版、５頁
【非特許文献４】「網膜疾患治療剤の開発を指向した経口投与可能なカルパイン阻害剤の探索研究」白崎仁久、金沢大学大学院自然科学研究科、博士学位論文要旨 論文内容の要旨および論文審査結果の要旨、６０５頁−６１０頁、２００７年９月発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
全身循環血を介して後眼部に有効濃度の薬物を送達するためには、血液網膜関門（ＢＲＢ）の存在から非常に高投与量で全身循環する血中の薬物濃度を高める必要があると考えられる。従って、本発明が解決しようとする課題は、後眼部疾患に対し有用で、高濃度全身暴露による副作用を回避でき、かつ化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の安定な点眼用製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を分散媒中に懸濁させ、点眼投与することで、薬物の安定性を保持しながら、全身暴露量を抑制しつつ、後眼部への治療に必要な高い移行性を達成できることを見出し、更に化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が加齢黄斑変性などの眼疾患に有効な薬理活性を有することを見出した。すなわち、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を点眼剤として懸濁させることで、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
[項１]
（Ｒ）−（−）−２−（４−ブロモ−２−フルオロベンジル）−１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−４−スピロ−３’−ピロリジン−１，２’，３，５’−テトラオン（以下、「化合物Ａ」という）またはその生理的に許容される塩を含有する点眼用懸濁製剤。
[項２]
化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が分散媒中に懸濁している懸濁液である項１に記載の製剤。
[項３]
懸濁液中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が、１ｎｍ以上２０μｍ以下である項２に記載の製剤。
[項４]
懸濁液中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が、１０ｎｍ以上２０μｍ以下である項３に記載の製剤。
[項５]
分散媒が水系の分散媒である項２〜４のいずれかに記載の製剤。
[項６]
分散媒が分散剤及び／又は界面活性剤を含む項２〜５のいずれかに記載の製剤。
[項７]
分散媒が分散剤及び界面活性剤を含む項６に記載の製剤。
[項８]
懸濁液のｐＨが３〜９である項２〜７のいずれかに記載の製剤。
[項９]
懸濁液の浸透圧が２０〜１０００ｍＯｓｍである項２〜８のいずれかに記載の製剤。
[項１０]
懸濁液１ｍＬ中に化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を１〜５００ｍｇ含む項２〜９のいずれかに記載の製剤。
[項１１]
懸濁液中に溶解している化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の割合が製剤に含まれる全ての化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の０．００１％〜１０％である項２〜１０のいずれかに記載の製剤。
[項１２]
懸濁液中に溶解している化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の割合が製剤に含まれる全ての化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の０．００１％〜１％である項２〜１１のいずれかに記載の製剤。
[項１３]
前眼部疾患及び／又は後眼部疾患を治療するための項１〜１２のいずれかに記載の製剤。
[項１４]
疾患が、ＶＥＧＦが関連する疾患である、項１３に記載の製剤。
[項１５]
疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、近視性脈絡膜新生血管、網膜静脈閉塞症及び／又は白内障である項１３又は１４に記載の製剤。
[項１６]
（１）化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を含有する製剤と、（２）分散媒を含む製剤を組み合わせてなるキット。
[項１７]
製剤（１）における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が１ｎｍ以上２０μｍ以下である項１６に記載のキット。
[項１８]
製剤（１）における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径が１０ｎｍ以上２０μｍ以下である項１７に記載のキット。
[項１９]
製剤（１）または製剤（２）が、分散剤及び／又は界面活性剤を含んでもよい項１６〜１８のいずれかに記載のキット。
[項２０]
前眼部疾患及び／又は後眼部疾患を治療するための項１６〜１９のいずれかに記載のキット。
[項２１]
化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を含有する、ＶＥＧＦが関連する疾患の治療剤。
[項２２]
疾患が加齢黄斑変性及び／又は糖尿病網膜症である項２１に記載の治療剤。
[項２３]
懸濁液中に分散剤及び／又は界面活性剤を含む項２〜４のいずれかに記載の製剤。
[項２４]
懸濁液中に分散剤及び界面活性剤を含む項２３に記載の製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前眼部疾患だけでなく後眼部疾患に対しても治療効果を有し、高濃度全身暴露による副作用を回避することが可能となり、かつ化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の安定な点眼用製剤を提供できる。また、化合物Ａは水への溶解性は低く、溶液製剤としては低い濃度の製剤を選択せざるを得ないが、懸濁製剤とすることで、高濃度の製剤が可能となり、現実的な投与回数、たとえば１日あたり１回から６回の投与で治療に十分な量の患部への薬物送達が期待できる。更に、化合物Ａは溶液状態での安定性が非常に低く時間単位での分解という課題があったが、懸濁製剤とすることで現実的な保存に十分耐えられる保存安定性にも優れた点眼用製剤を提供できる。この点眼用製剤により、現在、主に侵襲的な治療法しか行われていない後眼部疾患においても、患者に負担の少ない形態での画期的な治療を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】点眼用懸濁製剤中の化合物Ａの保存安定性および化合物Ａの粒子径の保存安定性評価を示す。上図の縦軸は懸濁製剤中の化合物Ａの含量（％）を、横軸は時間（ｈｒ）を示す。下図の縦軸は懸濁製剤中の化合物Ａの平均粒子径（ｎｍ）を、横軸は時間（ｄａｙ）を示す。
【図２】ラットを用いた後眼部への移行性評価（Ｉ−１）を示す。４つの図のうち、上の３つの図について、縦軸は、各組織中の化合物Ａ濃度を示す（上図から順に点眼剤Ａ１、点眼剤Ｚ、経口投与）。縦軸の単位は、網膜及び角膜中濃度についてはμｇ／ｇ、血漿中濃度についてはμｇ／ｍＬである。横軸は各組織（左から順に網膜、角膜、血漿）を示す。４つの図のうち、最も下の図では、縦軸は網膜／血漿比率を、横軸は投与した製剤を示す（左から順に経口、点眼剤Ｚ、点眼剤Ａ１）。なお、網膜／血漿比率は、「網膜中化合物Ａ濃度（μｇ／ｇ）÷血漿中化合物Ａ濃度（μｇ／ｍＬ）」を表す。
【図３】ラットを用いた後眼部への移行性評価（Ｉ−２）を示す。図中、縦軸は各組織中の化合物Ａ濃度（上図から順に網膜、角膜、血漿）を示す。縦軸の単位は、網膜及び角膜中濃度についてはμｇ／ｇ、血漿中濃度についてはμｇ／ｍＬである。横軸は投与した製剤を示す（左から順に点眼剤Ｚ、点眼剤Ａ１）。
【図４】ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＩ）を示す。図中、縦軸は各組織中の化合物Ａ濃度（上図から順に網膜、角膜、血漿）を示す。横軸は点眼回数を示す（左から順に１回／眼、３回／眼、５回／眼）。
【図５】ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＩＩ）を示す。４つの図のうち、上の３つの図について、縦軸は各組織中の化合物Ａ濃度（上図から順に網膜、角膜、血漿）を示す。横軸は投与した懸濁製剤と、懸濁製剤中の化合物Ａの平均粒子径（ｎｍ）を示す。４つの図のうち、最も下の図では、縦軸は網膜／血漿比率を、横軸は投与した懸濁製剤と、懸濁製剤中の化合物Ａの平均粒子径（ｎｍ）を示す。なお、網膜／血漿比率は、「網膜中化合物Ａ濃度（μｇ／ｇ）÷血漿中化合物Ａ濃度（μｇ／ｍＬ）」を表す。
【図６】ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＶ）を示す。図中、縦軸は各組織中の化合物Ａ濃度（上図から順に網膜、角膜、血漿）を示す。縦軸の単位は、網膜及び角膜中濃度についてはμｇ／ｇ、血漿中濃度についてはμｇ／ｍＬである。横軸は投与した懸濁製剤と、懸濁製剤のｐＨを示す。
【図７】ラットを用いた後眼部への移行性評価（Ｖ）を示す。図中、縦軸は網膜中の各化合物濃度を示す（μｇ／ｇ）。横軸は投与した懸濁製剤と懸濁製剤中の化合物Ａ、ＢまたはＣの平均粒子径（ｎｍ）を示す。
【図８】化合物Ａの抗ＶＥＧＦ作用の効果を示す。図中、縦軸はＨＲＥＣの遊走距離（創傷直後の創傷幅の長さに対する遊走距離（％））を示す。横軸は各試験条件（ＤＭＳＯ（％）、添加した薬物（アルドース還元酵素阻害剤またはＬｕｃｅｎｔｉｓ／ルセンティス（登録商標）（一般名：ラニビズマブ））と添加量、ＶＥＧＦ濃度（ｎｇ／ｍＬ））を示す。
【図９】ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＩＩ−２）を示す。縦軸は各組織中の化合物Ａ濃度（上図から順に網膜、角膜、血漿）を示す。横軸は投与した懸濁製剤の濃度を示す。  なお、図２、図３、図４〜図９の図面の右上に示すｍｅａｎ±ｓｅは、各群の値は検体のｍｅａｎ（平均値）を、また、誤差範囲としてｓｅ（標準誤差）を示すことを表している。ｎ数は１群当たりの検体数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の製剤は、点眼用製剤であり、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩（以下、まとめて「本薬物」と言う場合がある）が分散媒中に懸濁していることを特徴とする。該製剤は、化合物Ａ又はその生理的に許容される塩と分散媒を含有する点眼用懸濁液、又は化合物Ａ又はその生理的の許容される塩と分散媒とを使用時に分散媒に懸濁させる用時調製型のキットなどである。
本発明の製剤において、活性成分として含有する化合物Ａは、フリー体であっても、その生理的に、すなわち薬学的に許容される無機及び有機塩基との塩であってもよい。無機及び有機塩基の具体例としては、アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム）、水酸化アンモニウム、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、リジン等との塩が挙げられる。また、本発明における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩は、水和物および溶媒和物の形で存在することもあるので、それらの化合物も本発明における化合物Ａまたはその生理的に許容される塩に含まれる。それらの詳細については、特許文献２に記載される。化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の製造方法は、例えば、特許文献２に記載の方法に従って製造することができる。
本発明における「懸濁」とは、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が分散媒中に固体で存在して分散できる状態をいい、本薬物が一部分散媒中に溶解しているものも含む。保存により、本薬物が沈降や凝集した場合に、使用前に軽く振とうすることにより元の懸濁状態に戻るものも含む。リポソームやエマルジョン製剤のような、油脂系の液滴に薬物を分散、乳化あるいは封入させたものは含まない。詳しくは発明の製剤において、本薬物の粒子を脂質もしくは油成分で被覆（コーティング）する必要はなく、例えば本薬物がリポソーム中に封入された懸濁製剤、本薬物が油脂系の液滴中に包含され、当該液滴が水中に分散された水中油型エマルジョン製剤は本発明に含まれない。
溶解している化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の割合は、懸濁製剤中に含まれる全ての化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の通常０．００１％〜１０％であり、後眼網膜への移行性、化学的安定性、粒子径等の物理的安定性の観点から好ましくは０．００１％〜５％であり、更に好ましくは０．００１％〜２％であり、より好ましくは０．００１％〜１％であり、更に好ましくは０．００１％〜０．５％であり、特に好ましくは０．００１％〜０．１％である。すなわち、好ましくは本発明の製剤は、添加剤として、本薬物の溶解度を向上させる溶解補助効果を有する成分を含まないが、本薬物の溶解度に影響を与えない程度の量であれば溶解補助効果を有する成分を含んでいても良い。当該溶解補助効果を有する成分として、例えばシクロデキストリン等を挙げることができる。
本発明における「分散」とは、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が分散媒中に均一に浮遊している状態をいい、点眼剤として使用する際に支障のない限り、一時的な浮遊や、一部凝集しているもの、又は一部浮遊しているものも含む。
【００１４】
懸濁製剤中に懸濁している固体の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径は、特に限定はないが、製造時の取扱いの容易性および後眼部移行性の観点から、好ましくは２０μｍ以下であり、より好ましくは２μｍ以下であり、さらに好ましくは７００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは６５０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは４６０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは３００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは２３０ｎｍ以下であり、特に好ましくは２００ｎｍ以下である。
また、本懸濁製剤中に懸濁している固体の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径は、好ましくは１ｎｍ以上であり、より好ましくは５ｎｍ以上であり、更に好ましくは１０ｎｍ以上である。平均粒子径の範囲は、好ましくは１０ｎｍ以上２０μｍ以下もしくは１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、より好ましくは１０ｎｍ以上２μｍ以下もしくは１ｎｍ以上２μｍ以下であり、より好ましくは１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下もしくは１ｎｍ以上７００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上６５０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上４６０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下もしくは５ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上２３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５ｎｍ以上２３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下もしくは１０ｎｍ以上２３０ｎｍ以下である。
なお、本明細書中における平均粒子径とは、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩、粉砕後の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩、あるいは懸濁製剤中に懸濁している固体の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の平均粒子径の値であり、懸濁製剤中の本薬物の平均粒子径とは、懸濁液中に固体の状態で存在する本薬物の平均粒子径を意味する。本明細書において、平均粒子径は、以下に記載する装置および方法で算出された平均粒子径の値を意味する。懸濁製剤中で測定する場合は、測定できる程度の濃度に希釈して測定することができる。
【００１５】
上記粒子径を満たす化合物Ａまたはその生理的に許容される塩は、湿式粉砕または乾式粉砕により調製することができる。
湿式粉砕の場合、攪拌機やホモジナイザー等を用い、適当な溶媒（粉砕溶媒）中で撹拌または分散して製造することができる。また、ボールミル、ビーズミル、ホモミキサー、ホモジナイザーのほか、スターバースト等の湿式ジェットミル等の粉砕機を用いて適当な溶媒（粉砕溶媒）中で粉砕して製造することができ、例えば、伊藤製作所社製の遊星ボールミル（ＬＰ−４／２）を用いて、粉砕溶媒中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の含量が１〜５００ｍｇ／ｍＬ、３０〜３７０ｒｐｍで粉砕することができる。
乾式粉砕の場合、スパイラルジェットミル、ジェット・オー・ミル、カウンタージェットミル、ジェットミル等の気流粉砕機、ハンマーミル、スクリーンミル、サンプルミル等のせん断型粉砕機、ボールミル、ビーズミル等の転動ボールミル類等で製造することができる。
また、本発明で使用する粉砕した化合物Ａまたはその生理的に許容される塩は、分散や粉砕等により粒子を小さくするブレイクダウン法の他、スプレードライや晶析、凍結乾燥を用いたビルドアップ法等により製造することができる。
【００１６】
本発明の製剤は、最終的に懸濁液剤の形態で点眼できればよい。例えば、乾式粉砕を用いて本発明の製剤を作る場合、上記の粉砕装置を用いて化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を必要な粒子径、具体的には上述の平均粒子径を有する粒子に粉砕し、分散媒に懸濁させて製剤を調製することができる。化合物Ａまたはその生理的に許容される塩と分散媒を個々に提供し、使用時に化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を分散媒に懸濁させる用時調製型の形態（すなわち、キット）も含む。
湿式粉砕を用いて本発明の製剤を作る場合、上記の粉砕装置に化合物Ａまたはその生理的に許容される塩と粉砕溶媒を添加して化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を粉砕したものを、凍結乾燥等で粉砕溶媒を除いて凍結乾燥品とし、分散媒に凍結乾燥品を懸濁させて製剤を調製することができる。凍結乾燥品と分散媒を個々に提供し、使用時に凍結乾燥品を分散媒に懸濁させる用時調製型の形態（キット）も含む。すなわち、（１）本薬物を含む組成物の凍結乾燥品、および（２）分散媒を含むキットも又、本発明の態様である。下記に示すように化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を界面活性剤、分散剤等の添加剤を含んだ粉砕溶媒を用いて粉砕し、凍結乾燥等で粉砕溶媒を除いた場合は、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の凍結乾燥品が界面活性剤、分散剤等の添加剤を含む場合もあり、更に粉砕溶媒の一部を含む場合もある。
また、上記の場合、実施例の様に、粉砕溶媒として分散媒を加え、粉砕した後の懸濁液を凍結乾燥せずに、そのまま、または必要に応じて希釈して、本発明の製剤を提供することもできる。
本発明の製剤には、１回や１週間等の単位で使い切る製剤や、用時懸濁後の使用期間が１週間や１か月等に限られている製剤も含む。
【００１７】
本明細書における分散媒とは、生体で使用でき、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を液中に分散させることができる溶媒であり、好ましくは、化合物Ａの溶解度が０．４ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以下の溶媒であれば、その組成は一成分でも複数成分の混合物でもよい。具体的には水の他、ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、流動パラフィンのような油等の溶媒が挙げられる。またこれら溶媒の２種類以上の混合物でもよい。
分散媒は好ましくは水系の分散媒である。ここで水系の分散媒とは、分散媒として用いられる溶媒の総量のうち９０重量％以上が水であるものをいい、好ましくは分散媒の総量のうち９５重量％以上が水であり、更に好ましくは総量のうち９９重量％以上が水である水系の溶媒である。分散媒として用いられる溶媒は、特に好ましくは水である。
尚、水系の分散媒に含まれる水以外の溶媒としては、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ウイキョウ油、フェニルエチルアルコール、モノエタノールアミン、酢酸、氷酢酸、塩酸、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール等が挙げられるが、前述のとおり、ここでいう分散媒には、本薬物が油脂系の液滴中に包含され、当該液滴が水中に分散された水中油型エマルジョン製剤となるものは含まれない。
分散媒は、分散剤、界面活性剤、湿潤剤、等張化剤、緩衝化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤等の添加剤を含んでもよい。好ましくは、分散媒は界面活性剤及び又は分散剤を含む。
好ましい分散媒としては、水が挙げられ、より好ましくは、分散媒は水に界面活性剤または分散剤のいずれかを含むものであり、さらに好ましくは、水に界面活性剤及び分散剤の両方を含むものである。
また、好ましい分散媒として、水系の溶媒に界面活性剤または分散剤のいずれかを含むもの、水系の溶媒に界面活性剤及び分散剤の両方を含むものも挙げられる。
また、分散媒のｐＨは、通常３〜９であり、好ましくは３〜８、さらに好ましくは４〜７、特に好ましくは４〜６である。分散媒のｐＨは、下記のｐＨ調整剤により調整することができる。
【００１８】
本明細書における粉砕溶媒とは、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を湿式粉砕する際に用いる溶媒であり、化合物Ａの溶解度が好ましくは０．４ｍｇ／ｍＬ以下の溶媒である。具体的には水、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のポリアルコール等、ヘプタンまたはヘキサン等が挙げられる。またこれら溶媒の２種類以上の混合物でもよい。混合溶媒として好ましくは総量のうち９０重量％以上が水であり、適宜前記のポリアルコールを含んでいる水系の溶媒であり、より好ましくは総量のうち９５重量％以上が水である水系の溶媒であり、特に好ましくは総量のうち９９重量％以上が水である水系の溶媒である。粉砕溶媒は、好ましくは水であり、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の粉砕を助けるため、必要に応じて界面活性剤、分散剤、塩等の添加剤を含んでいてもよい。また、前述の分散媒を粉砕溶媒として用いることも可能である。
【００１９】
本発明の製剤は、滅菌して提供してもよく、例えば、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を分散媒に分散させた懸濁液をろ過滅菌または放射線滅菌または高圧蒸気滅菌することができる。必要に応じて、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩、懸濁液の凍結乾燥品または分散媒、必要に応じて添加剤を、それぞれ別々に滅菌してもよい。また、本発明の点眼用製剤の全製造工程または一部製造工程を無菌環境下で製造することもできる。
【００２０】
本発明における粒子径の測定は、これらに限定されないが、粒子の状態、粒子径の大きさ等を考慮し、例えば以下の方法で行った。
懸濁製剤中に分散している固体の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の粒子径は、１ｎｍ〜５μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５μｍの粒子径のものについては、懸濁製剤中の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の含量を２００〜５００μｇ／ｍＬ程度になるように分散媒で希釈したサンプルを測定器；Zeta Sizer nano S (Malvern Instruments Ltd, Malvern UK)を用いて行った。算出法としては、動的光散乱法を用いて、Material RI及びDispersant RIを１．３３とし、算出した粒子径のZ-average値の平均値を示した。
【００２１】
懸濁製剤中に分散している固体の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の粒子径は、５μｍ以上の粒子径のものについては、懸濁製剤中の化合物Ａの含量を１０〜５０μｇ／ｍＬ程度に分散媒で希釈したサンプルを超音波１５秒間、スターラー速度１２００ｒｐｍで分散させ、レーザー回折式粒度分布測定装置；HEROS/BR-multi及び湿式分散ユニットCUVETTE（Sympatec GmbH）にて、レンジＲ３、５０ｍＬセルを用い、トリガー条件（タイムベース：１０００．００ｍｓ、測定：１０ｓ実時間）で測定し、計算モードＨＲＬＤで算出した粒子径のＸ５０値を示した。
【００２２】
乾式粉砕した化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置；HEROS/BR-multi及び乾式分散ユニット（Sympatec GmbH）を用い、レンジＲ３、トリガー条件（開始：ｃｈ．２５≧０．５％、停止：ｃｈ．２５≦０．５％が２秒間または実時間１０秒間）、分散圧２．０ｂａｒで測定し、計算モードＬＤで算出した粒子径のＸ５０値を示した。
【００２３】
本製剤に使用できる界面活性剤としては、分子内に親水基および疎水基（親油基）を持つ物質で、一定濃度以上でミセルやベシクル、ラメラ構造を形成し、極性物質と非極性物質を均一に混合させ、表面張力を弱める作用を持つ分子量６０００以下の物質で、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩のナノ化粒子の湿潤に寄与する添加剤である。具体的にはポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、ステアリン酸ポリオキシル４０、グリセリン、プロピレングリコール、コンドロイチン硫酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、アルキルアリルポリエーテルアルコール、コレステロール、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンセスキオレイン酸エステル、スクワラン、ステアリルアルコール、セタノール、セトマクロゴール１０００、セバシン酸ジエチル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、トリオレイン酸ソルビタン、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、マクロゴール４００、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００、モノオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウロマクロゴール、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテル、リン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテルなどが挙げられる。
好ましくは、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、ステアリン酸ポリオキシル４０、グリセリン、プロピレングリコール、コンドロイチン硫酸ナトリウムおよびモノステアリン酸アルミニウム、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００が挙げられ、より好ましくはポリソルベート８０、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が挙げられる。また、２種以上、好ましくは２〜３種類の界面活性剤を添加してもよい。
界面活性剤の含量は、懸濁液の総量の０．００１〜５重量％が好ましい。
【００２４】
本製剤に使用できる分散剤としては、分子量６０００を超える高分子で、ナノ粒子の間に入って凝集防止に寄与する添加剤である。具体的にはカルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム（カルメロースナトリウム）、チロキサポール、ガディガム、アラビアゴム、アラビアゴム末、カラヤガム、キサンタンガム、アミノアルキルメタクリレートポリマーＲＳ、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルスターチナトリウム、カンテン末、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、デキストリンなどが挙げられる。
好ましくは、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース）、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム（カルメロースナトリウム）およびチロキサポールが挙げられ、より好ましくは、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース）およびポリビニルアルコールが挙げられる。また、２種以上の分散剤を添加してもよい。
分散剤の含量は、懸濁液の総量の０．００１〜５重量％が好ましい。
【００２５】
湿潤剤としてはエタノール、オレイン酸、ケイ酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、コリンリン酸塩などが挙げられる。
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、ブドウ糖、ショ糖、Ｄ-マンニトール、エタノール、オレイン酸、ケイ酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、コリンリン酸塩などが挙げられる。好ましくは塩化ナトリウムが挙げられる。
緩衝化剤としては、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トロメタモールなどが挙げられる。好ましくは、リン酸水素二ナトリウム及びクエン酸が挙げられる。
防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどの第４級アンモニウム塩、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸およびその塩、グルコン酸クロルヘキシジン液などが挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、氷酢酸、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム水和物などが挙げられる。
【００２６】
必要に応じて上記添加剤を含む本発明の点眼用懸濁製剤は、通常分散媒１ｍＬに対して化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を１〜５００ｍｇ、好ましくは５〜３００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜３００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜２００ｍｇ、特に好ましくは２０〜３００ｍｇ、２５〜３００ｍｇ、１０〜１５０ｍｇ、又は２５〜２３０ｍｇ含有するように、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を加えて調製されるが、必ずしもこの量の範囲に限定されるものではない。
【００２７】
本発明の製剤の懸濁液のｐＨは、通常３〜９であり、好ましくは３〜８、さらに好ましくは４〜７、特に好ましくは４〜６である。懸濁液のｐＨは、上記のｐＨ調整剤により調整することができる。
【００２８】
本発明の製剤の懸濁液の浸透圧は、通常２０〜１０００ｍＯｓｍであり、好ましくは１００〜７００ｍＯｓｍであり、より好ましくは１８０〜５００ｍＯｓｍであり、特に好ましくは２００〜３６０ｍＯｓｍである。懸濁液の浸透圧は、上記の等張化剤により調整することができる。
【００２９】
上記懸濁液の浸透圧は、懸濁液を遠心分離等して回収した上澄み液を測定することで得ることができ、例えば、アークレイ株式会社製の浸透圧測定装置「オズモスタットＯＭ−６０４０」を用いて測定することができる。
【００３０】
本発明の製剤は、薬理効果を阻害しない範囲で、他の有効成分を含有することができる。
【００３１】
本発明によれば、以下の試験例で示すように、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩が、ＶＥＧＦ刺激による細胞遊走亢進作用に対して抑制作用を有することが判明した。従って、本発明の製剤に含まれる化合物Ａまたはその生理的に許容される塩は、アルドースリダクターゼ阻害作用、ＶＥＧＦ産生抑制作用およびＶＥＧＦ刺激による細胞遊走亢進作用の抑制作用を有することから、種々の眼疾患に対して治療効果を有することが期待される。そして、本発明の化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の懸濁製剤は、特に後眼部移行性に優れるため、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、黄斑浮腫、近視性脈絡膜新生血管、網膜静脈閉塞症、脈絡膜新生血管、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、増殖性硝子体網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症などの後眼部に薬物を投与する必要がある疾患（後眼部疾患）に適用することも期待できるが、これらに限定されない。
本発明の製剤は、特にＶＥＧＦが関連する疾患、ＶＥＧＦが関連して発症する疾患、またはＶＥＧＦが関連する発症後の疾患に適用することが期待できる。
【００３２】
また、角膜炎、結膜炎、血管新生緑内障、ドライアイ、白内障など、前眼部に薬物を投与する必要がある疾患または血液房水関門（blood−aqueous barrier；BAB）や角膜を透過させる必要がある疾患に本発明の製剤を適用しても、十分な治療効果が期待できる。
【００３３】
本発明の点眼用懸濁製剤の用法・用量は、薬効、投与経路、症状、年齢、体重などによって適宜定められる。例えば、１〜５００ｍｇ／ｍＬの化合物Ａまたはその生理的に許容される塩を含む懸濁製剤を１回量１〜２滴、１日１〜６回程度、各眼ごとに点眼することが好ましい。通常、一滴あたりの点眼量は２０〜８０μＬ、好ましくは３０〜５０μＬである。また、本発明の製剤の投与期間は、症状の程度等により異なるが、例えば、1週間以上、好ましくは約１〜４週間、より好ましくは約４週間以上である。
【００３４】
また、本発明の製剤は、ヒトに限らず、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳類などの眼疾患の治療にも用いることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例、参考例、比較例、試験例等により説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【００３６】
参考例１：化合物Ａの製造
T. Negoro et. al. J. Med. Chem. 1998, 41, 4118-4129に記載の方法により得られた化合物Ａの粗生成物（１０ｇ）に活性炭（５０％ｗｅｔ、０．８ｇ）および２−プロパノール（１０１ｇ）を加え、反応液を還流温度（約８４℃）まで加熱し、３０分間保温した。同温度でろ過後、２−プロパノール（１３．８ｇ）で洗浄し、得られた溶液を７５℃以上で加温し、反応液を６０℃まで冷却し、１時間保温後、０℃まで冷却した。析出した固体をろ取、減圧乾燥し、化合物Ａの白色結晶を得た（９．３ｇ）。ＸＲＤ  ；  ２θ＝１１．５，  １５．４，  １５．７，  １６．３，  １６．９，  １８．２，  １９．３，  ２０．１，  ２０．９，  ２１．６，  ２２．２，  ２３．３，  ２４．０，  ２４．７，  ２５．１，  ２６．４，  ２７．５，  ２８．４，  ２８．８，  ２９．６，  ２９．９，  ３０．９，  ３１．９，  ３２．４  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）において、補外融解開始温度が１８６．７℃である吸熱ピークを示した。【００３７】
なお、上記粉末Ｘ線回折測定には、Powder X-ray diffraction system XRD-6100 (Shimadzu Corp.)を用い、Ｘ線管球をＣｕＫα（波長：１．５４オングストローム）、管電圧を３０．０ｋＶ、管電流を２０．０ｍＡ、駆動軸をθ〜２θ、測定範囲を５〜４０度、ステップ幅を０．０２０度、速度を２．００（度/分）、計数時間を０．６０秒間の条件で測定した。また、上記示差走査熱量測定（ＤＳＣ）には、Thermo Plus 2 (Rigaku Corporation)を用い、アルミニウム製容器に試料約１０ｍｇを秤量し、空気気流下、昇温速度毎分５℃で２５℃〜２５０℃までの条件で測定した。【００３８】
上記製法で得られた化合物Ａをジェットミルにて種々の条件で粉砕し、平均粒子径の異なる３サイズの化合物Ａを得た。得られた化合物Ａの平均粒子径は、それぞれ、１．４３μｍ、６．２９μｍ、２１．９８μｍであった。【００３９】
なお、上記ジェットミルにて粉砕（乾式粉砕）した化合物Ａの平均粒子径は、前記のレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定し、計算モードＬＤで算出した粒子径のＸ５０値を示した。【００４０】
参考例２：分散媒（ｐＨ５．０）の調製
０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ａ）に、０．０１ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ｂ）をｐＨ＝５．０になるまで添加し（添加割合：（ａ）：（ｂ）＝約１：１）、ｐＨ５．０−クエン酸−リン酸緩衝液を得た。ヒドロキシプロピルメチルセルロース２０ｇを精製水３８０ｇに溶解させて５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を４００ｇ調製し、これにｐＨ５．０−クエン酸−リン酸緩衝液１６００ｇを加えて２０００ｇとし、１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を得た。１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液４００ｇに２７〜３３％塩酸アルキルジアミノエチルグリシン水溶液を５００ｍｇ加えて溶解させ、さらにポリソルベート８０を２．５ｇ加えて溶解させた。１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を加えて全量を５００ｇとし、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ５．０に調整し、分散媒（ｐＨ５．０）を得た。上記で調製した分散媒（ｐＨ５．０）の組成を以下に示す。【００４１】
【表１】
2016039422.tif 000003
【００４２】
実施例１：点眼用懸濁製剤の調製
ジェットミルで粉砕した化合物Ａ（平均粒子径：１．４３μｍ）４ｇおよび参考例２で得られた分散媒（ｐＨ５．０）１２ｍＬをスクリュー管に加え、スターラーで３０分間撹拌した。粉砕ポットに撹拌後のサンプル全量を加え、スクリュー管に付着したサンプルを分散媒４ｍＬで洗い込んだ。粉砕ポットに以下に記載した各直径サイズのジルコニア製ビーズを５０ｇ加えた。伊藤製作所社製の遊星ボールミル（ＬＰ−４／２）に粉砕ポットをセットし、３００ｒｐｍで２時間粉砕した。篩で粉砕液をろ過してビーズを取り除いた後、シンキー社製の撹拌・脱泡機「あわとり練太郎ＡＲ―２５０」で３０秒間撹拌、３０秒間脱泡し、懸濁製剤Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ〜Ｄを得た。
懸濁製剤Ａ１、Ａ２、Ａ３：ビーズの直径サイズは０．５ｍｍを使用
懸濁製剤Ｂ：ビーズの直径サイズは２．０ｍｍを使用
懸濁製剤Ｃ：ビーズの直径サイズは３．０ｍｍを使用
懸濁製剤Ｄ：ビーズの直径サイズは５．０ｍｍを使用【００４３】
ジェットミルで粉砕した化合物Ａ（平均粒子径：各１．４３μｍ、６．２９μｍまたは２１．９８μｍ）２．２ｇおよび分散媒（ｐＨ５．０）１０ｍＬをスクリュー管に添加し、スターラーで１０分間撹拌して懸濁製剤Ｅ、Ｆ、Ｇを得た。【００４４】
懸濁製剤Ａ１〜Ａ３、Ｂ〜Ｇ中に懸濁している化合物Ａの平均粒子径を上記に記載の方法でそれぞれ測定した。得られた平均粒子径は、以下のとおりであった。【００４５】
懸濁製剤Ａ１：２０９．０ｎｍ
懸濁製剤Ａ２：１９５．２ｎｍ
懸濁製剤Ａ３：２２７．０ｎｍ
懸濁製剤Ｂ：４５１．２ｎｍ
懸濁製剤Ｃ：６０９．９ｎｍ
懸濁製剤Ｄ：８０１．２ｎｍ
懸濁製剤Ｅ：１９４４ｎｍ
懸濁製剤Ｆ：９５６０ｎｍ
懸濁製剤Ｇ：２０４３０ｎｍ【００４６】
参考例３：各点眼用懸濁製剤の薬物含量測定
点眼用懸濁製剤Ａ１〜Ａ３、Ｂ〜Ｇ各１００μＬに１％ＨＰＭＣ８００μＬとアセトニトリル１００μＬを加え、ボルテックスで振とうした。その１００μＬを１０ｍＬ容メスフラスコにとり、１％ＨＰＭＣ／アセトニトリル（１：１）を加え完全に溶解させ正確に１０ｍＬとし、点眼用懸濁製剤の含量測定サンプルとした。ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製の超高速液体クロマトグラフ、カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ５μｍ １５０×４．６ｍｍを用いて点眼用懸濁製剤Ａ１〜Ａ３、Ｂ〜Ｇの化合物Ａ含量（溶解している化合物Ａおよび懸濁している化合物Ａを合わせた含量）を測定したところ、以下のとおりであった。【００４７】
懸濁製剤Ａ１：２００．１ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ａ２：２１６．２ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ａ３：２０７．１ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｂ：２１１．０ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｃ：１９５．６ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｄ：２１８．８ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｅ：１３５．４ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｆ：２０１．８ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｇ：２２４．５ｍｇ／ｍＬ【００４８】
参考例４：分散媒（ｐＨ３．０）の調製
０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ｃ）に、０．０１ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ｄ）をｐＨ＝３．０になるまで添加し（添加割合：（ｃ）：（ｄ）＝約２：８）、ｐＨ３．０−クエン酸−リン酸緩衝液を得た。得られたｐＨ３．０−クエン酸−リン酸緩衝液を上記ｐＨ５．０−クエン酸−リン酸緩衝液場合と同様の方法により処理し、分散媒（ｐＨ３．０）を得た。上記で調製した分散媒（ｐＨ３．０）の組成を以下に示す。【００４９】
【表２】
2016039422.tif 000004
【００５０】
参考例５：分散媒（ｐＨ８．０）の調製
０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ｅ）に、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した水溶液（ｆ）をｐＨ＝８．０になるまで添加し（添加割合：（ｅ）：（ｆ）＝約１９：１）、ｐＨ８．０−リン酸緩衝液を得た。得られたｐＨ８．０−クエン酸−リン酸緩衝液を上記ｐＨ５．０−クエン酸−リン酸緩衝液場合と同様の方法（ただし、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸の代わりに１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いた）により処理し、分散媒（ｐＨ８．０）を得た。上記で調製した分散媒（ｐＨ８．０）の組成を以下に示す。【００５１】
【表３】
2016039422.tif 000005
【００５２】
実施例２：点眼用懸濁製剤の調製
直径１．０ｍｍのビーズおよび参考例４に記載のｐＨ３．０、参考例２に記載のｐＨ５．０又は参考例５に記載のｐＨ８．０の分散媒を用い、実施例１と同様の方法で点眼用懸濁製剤Ｈ、Ｉ、Ｊを得た。得られた点眼用懸濁製剤のｐＨはそれぞれ、以下のとおりであった。【００５３】
懸濁製剤Ｈ(ｐＨ３)：３．０９
懸濁製剤Ｉ(ｐＨ５)：５．０７
懸濁製剤Ｊ(ｐＨ７)：７．１０【００５４】
点眼用懸濁製剤Ｈ、Ｉ、Ｊ中に懸濁している化合物Ａの平均粒子径を上記に記載の方法でそれぞれ測定した。得られた平均粒子径は、以下のとおりであった。【００５５】
懸濁製剤Ｈ(ｐＨ３)：３５２．１ｎｍ
懸濁製剤Ｉ(ｐＨ５)：２６３．２ｎｍ
懸濁製剤Ｊ(ｐＨ７)：２５６．０ｎｍ
また、点眼用懸濁製剤Ｈ、Ｉ、Ｊの化合物Ａの含量を上記に記載の方法でそれぞれ測定したところ、以下のとおりであった。【００５６】
懸濁製剤Ｈ（ｐＨ３）：２１７．９ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｉ（ｐＨ５）：２２０．０ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｊ（ｐＨ７）：２２２．４ｍｇ／ｍＬ【００５７】
比較例１：化合物Ａの点眼用溶解製剤の調製
０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した溶液に、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム水溶液に塩化ナトリウムを０．９％（ｗ／ｖ）添加した溶液を加え、ｐＨを８．０に調整し、精製水で１．２５倍に希釈した（以下、「ｐＨ８．０の溶解液」と記載）。得られた溶液１ｍＬに対してジェットミルで粉砕した化合物Ａを４００μｇ、エタノールを０．０８ｍＬ添加して化合物Ａを溶解させ、点眼用溶解製剤Ｚを得た。【００５８】
比較例２：［５−［（１Ｚ，２Ｅ）−２−メチル−３−フェニルアリリデン］−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル］酢酸および（２Ｓ，４Ｓ）−６−フルオロ−２’，５’−ジオキソスピロ［クロマン−４，４’−イミダゾリジン］−２−カルボアミドの点眼用懸濁製剤の調製
［５−［（１Ｚ，２Ｅ）−２−メチル−３−フェニルアリリデン］−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル］酢酸（以下「化合物Ｂ」と記載する）２ｇおよび参考例２に記載の分散媒（ｐＨ５．０）６ｍＬをスクリュー管に加え、スターラーで３０分間撹拌した。粉砕ポットに撹拌後のサンプル全量を加え、スクリュー管に付着したサンプルを分散媒２ｍＬで洗い込んだ。粉砕ポットに直径１．０ｍｍのビーズを５０ｇ加えた。伊藤製作所社製の遊星ボールミル（ＬＰ−４／２）に粉砕ポットをセットし、３００ｒｐｍで６時間粉砕した。篩で粉砕液をろ過してビーズを取り除いた後、シンキー社製の撹拌・脱泡機「あわとり練太郎ＡＲ―２５０」３０秒間撹拌、３０秒間脱泡し、点眼用懸濁製剤Ｘ１を得た。また、（２Ｓ，４Ｓ）−６−フルオロ−２’，５’−ジオキソスピロ［クロマン−４，４’−イミダゾリジン］−２−カルボアミド（以下「化合物Ｃ」と記載する）１．８４ｇおよび参考例２に記載の分散媒(ｐＨ５．０）６ｍＬをスクリュー管に加え、スターラーで３０分間撹拌した。得られた撹拌後のサンプルを上記化合物Ｂと同様に取り扱い点眼用懸濁製剤Ｙ１を得た。【００５９】
化合物Ｂ  １．１ｇおよび参考例２に記載の分散媒（ｐＨ５．０）５ｍＬをスクリュー管に添加し、スターラーで１０分間撹拌して点眼用懸濁製剤Ｘ２を得た。化合物Ｃについても同様の手順で撹拌し、点眼用懸濁製剤Ｙ２を得た。【００６０】
懸濁製剤Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２中に懸濁している化合物Ｂおよび化合物Ｃの平均粒子径を化合物Ａの平均粒子径を測定した場合と同様の方法で測定した。平均粒子径は、以下のとおりであった。【００６１】
懸濁製剤Ｘ１：５５５．７ｎｍ
懸濁製剤Ｙ１：２９０．８ｎｍ
懸濁製剤Ｘ２：８９７０ｎｍ
懸濁製剤Ｙ２：５４３０ｎｍ
また、懸濁製剤Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２の化合物Ｂおよび化合物Ｃ含量を上記に記載の方法で測定したところ、以下のとおりであった。【００６２】
懸濁製剤Ｘ１：２１５．４ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｙ１：２１４．１ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｘ２：１８７．７ｍｇ／ｍＬ
懸濁製剤Ｙ２：１９６．８ｍｇ／ｍＬ【００６３】
本明細書中に記載の実施例および比較例のまとめを下記に示す。【００６４】
【表４】
2016039422.tif 000006
【００６５】
試験例１：化合物Ａの点眼用懸濁製剤の保存安定性評価
点眼用懸濁製剤について、３７℃で保存したときの化合物Ａの含量推移及び２５℃で保存したときの粒子径の推移を以下の手順で評価した。【００６６】
実施例１に記載した手順に従い、分散媒（ｐＨ５．０）及び直径０．５ｍｍのビーズを用いて、点眼用懸濁製剤を調製した。得られた点眼用懸濁製剤中の化合物Ａの含量及び懸濁している化合物Ａの平均粒子径を上記に記載の方法で測定したところ、それぞれ２２０．９５ｍｇ／ｍＬ、１７０．２ｎｍであった。調製した点眼用懸濁製剤を３７℃で一定時間保存後、超音波照射して均一化した点眼用懸濁製剤１００μＬに１％ＨＰＭＣ８００μＬとアセトニトリル１００μＬを加え、ボルテックスで振とうした。その１００μＬを１０ｍＬ容メスフラスコにとり、１％ＨＰＭＣ／アセトニトリル（１：１）で正確に１０ｍＬとし、点眼用懸濁製剤中の化合物Ａの含量測定サンプルとした。ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製の超高速液体クロマトグラフ、カラムＹＭＣ-Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ５μｍ １５０×４．６ｍｍを用いてそれぞれのサンプルを測定した。結果を図１に示す。【００６７】
次に、実施例１に記載した手順に従い、分散媒（ｐＨ５．０）を用いて、点眼用懸濁製剤を調製した。なお、ビーズは直径０．５ｍｍを用いて２時間粉砕した後、０．０２ｍｍのビーズに変えてさらに２時間粉砕した。得られた点眼用懸濁製剤中の化合物Ａの含量及び懸濁している化合物Ａの平均粒子径を上記に記載の方法で測定したところ、それぞれ１６８．５ｍｇ／ｍＬ、１８０．５ｎｍであった。調製した点眼用懸濁製剤を２５℃で保存し、保存中の平均粒子径を上記に記載の方法で測定した。結果を図１に示す。【００６８】
図１より、本発明の点眼用懸濁製剤は７２時間保存後も化合物Ａの含量の大きな低下は見られなかった。また、１４日間保存後も平均粒子径の変化は見られなかった。このことから、本発明の点眼用製剤は、化学的にも物理的にも安定であり、冷所保存の必要もなく、常温で保存が可能であることが分かった。【００６９】
試験例２：ラットを用いた後眼部への移行性評価（Ｉ−１）および（Ｉ−２）
糖尿病モデルラットの両眼に、一般に懸濁剤として投与可能な含有量である化合物Ａを懸濁させた点眼用懸濁製剤Ａ１（２００ｍｇ/ｍＬ）および化合物Ａを溶解させた点眼用溶解製剤Ｚ（４００μｇ/ｍＬ）を、５分間おきに片眼５μＬ（ラットに点眼投与可能な最大量）ずつ、計５回点眼投与した。投与６０分後の角膜中、網膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した。
なお、他の剤形と異なり、点眼剤では、１回に点眼投与可能な液量に制限があり、点眼可能な最大量での薬物の組織への移行量が重要である。その液量は動物種によって異なるが、ラットの場合、最大で片眼５μＬである。
点眼用溶解製剤としては、化合物Ａの水に対する溶解度は非常に低いため、添加剤の添加により本来の溶解度よりも高い濃度である４００μｇ／ｍＬの化合物Ａを溶解させたものを点眼用溶解製剤Ｚとして用いた。
また、Diabetic Retinopathy, INTECH, Phapter 15 「Prophylactic Medical Treatment of Diabetic Retinopathy」, Akihiro Kakehashi et al.に記載のＳＤＴラットへの経口反復投与で網膜毛細血管の脆弱化及び網膜でのＶＥＧＦ産生抑制が確認された投与量である１．０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを１日１回、２１日間経口反復投与した。最終投与６０分後の角膜中、網膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した。結果を図２および図３に示す。【００７０】
図２に、点眼用懸濁製剤Ａ１の点眼投与、点眼用溶解製剤Ｚの点眼投与および経口反復投与による血漿中、角膜中、網膜中への化合物Ａの移行量（濃度）を示す。血漿中、角膜中、網膜中への化合物Ａの移行の割合は以下の通りであった。
点眼用懸濁製剤Ａ１の点眼投与による化合物Ａの各組織中濃度は、およそ血漿中：角膜中：網膜中＝１：１０１：３３．５
点眼用溶解製剤Ｚの点眼投与による化合物Ａの各組織中濃度は、およそ血漿中：角膜中：網膜中＝１：１６８９：１
また、経口反復投与による化合物Ａの各組織中濃度は、およそ血漿中：角膜中：網膜中＝１：１：１
また、各投与群における網膜／血漿比率（網膜／血漿比率＝網膜中化合物Ａ濃度（μｇ／ｇ）÷血漿中化合物Ａ濃度（μｇ／ｍＬ））は以下の通りであった。
点眼用懸濁製剤Ａ１投与群の網膜／血漿比率＝３３．５
点眼用溶解製剤Ｚ投与群の網膜／血漿比率＝１．１
経口反復投与群の網膜／血漿比率＝１．０
点眼用溶解製剤Ｚを点眼投与したラットでは、網膜／血漿比率は１．１であり、化合物Ａを経口投与したラットの網膜／血漿比率（１．０）とほぼ同じであったことから、点眼用溶解製剤Ｚではほとんどが鼻涙管などを介して全身循環血流から網膜に到達したと推測される。
一方、本発明の点眼用懸濁製剤Ａ１を投与したラットでは、網膜／血漿比率は３３．５であり、ＳＤＴラットにおける糖尿病網膜症の薬効用量を経口投与した場合の網膜／血漿比率（１．０）や点眼用溶解製剤Ｚを投与した場合の網膜／血漿比率（１．１）の３０倍以上高かった。このことから、点眼用懸濁製剤では、網膜への直接的な移行経路による移行が示唆された。【００７１】
試験例２で得られた、点眼用懸濁製剤Ａ１および点眼用溶解製剤Ｚを投与したラットの化合物Ａの濃度を、各組織別に並べると図３のようになった。
点眼用溶解製剤Ｚを点眼投与したラットでは、化合物Ａ本来の溶解度に比べて高い濃度（４００μｇ／ｍＬ）を溶解させたにも関わらず網膜への移行は０．０４７３μｇ／ｇと低く、治療効果は期待できない程度であった。一方、点眼用懸濁製剤Ａ１を投与したラットでは、一般に懸濁剤として投与可能な含量（２００ｍｇ／ｍＬ）で、治療効果が十分に期待できる高い網膜への移行性（３４２μｇ／ｇ）が示された。
また、その量は、懸濁した場合が溶解した場合の５００倍［（２００ｍｇ／ｍＬ）／（４００μｇ／ｍＬ）］を点眼しているにもかかわらず、溶解した場合の７２３０倍［（３４２μｇ／ｇ）／（０．０４７３μｇ／ｇ）］と非常に大きいものであった。一方、前眼部の角膜中および血漿中へは、懸濁した場合が溶解した場合の５００倍量を点眼したにもかかわらず、懸濁した場合はそれぞれ溶解した場合の１４倍および２３２倍程度しか移行が見られなかった。【００７２】
化合物Ａの点眼用懸濁製剤は、全身循環血流を介する経口投与や点眼用溶解製剤の点眼投与の場合よりも、治療に十分な濃度の化合物Ａが移行することが明らかとなった。したがって、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の点眼用懸濁製剤は、効果と副作用を乖離し、安全に網膜を含む後眼部疾患の治療を可能にすると考えられる。【００７３】
試験例３：ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＩ）
ＳＤラットの両眼に、点眼用製剤Ａ２を、片眼５μＬずつ、５分間おきに１回または３回または５回点眼投与し、６０分間後の角膜中、網膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した。その結果を図４に示す。【００７４】
図４より、点眼用懸濁製剤において、投与回数の増加に伴い、血漿中濃度の増加が見られた。一方、網膜では、投与回数の影響は見られず、１回の投与で薬効に必要な量の化合物Ａが網膜へ移行した。このことから、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩の点眼用懸濁製剤は、少ない点眼回数で血中濃度の上昇を回避できる一方、網膜中には十分な移行性を示すことがわかった。【００７５】
試験例４：ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＩＩ）
ＳＤラットの両眼に、点眼用製剤Ａ３、点眼用製剤Ｂ〜Ｇを、片眼５μＬずつ１回点眼投与し、６０分間後の角膜中、網膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した。その結果を図５に示す。
また、点眼用製剤Ａ３を分散媒で希釈し、濃度の異なる点眼用懸濁製剤（２０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、上記と同様にＳＤラットに投与し、６０分間後の網膜中、角膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した（ＩＩＩ−２）。その結果を図９に示す。【００７６】
図５より、平均粒子径が小さくなるに従い、網膜中の化合物Ａの濃度の上昇が見られるが、角膜中および血漿中では平均粒子径が９５６０ｎｍ以下の場合は大きな違いは見られなかった。また、いずれの平均粒子径の点眼用懸濁製剤でも経口投与あるいは溶液の点眼投与の場合の網膜／血漿比率（経口投与：１．０、溶液の点眼投与：１．１）に比べて高い網膜／血漿比率（約４〜１２）を示した。さらに７００ｎｍ以下の平均粒子径の化合物Ａ点眼用懸濁製剤では、網膜中濃度と血漿中濃度の乖離がより大きくなった。この結果より、高い効果の発現と副作用の軽減の両立がより可能となると考えられる。
図９より、化合物Ａの懸濁濃度の増加に伴い、網膜中の化合物Ａの濃度の上昇が見られた。通常、後眼部への薬物送達は、水に溶解している成分量に依存していると考えられていたが、驚くべきことに、化合物Ａの網膜移行量は、溶解している成分量にかかわらず、懸濁状態として存在する化合物Ａの濃度に伴い増加した。また、懸濁濃度によらず、経口投与あるいは溶液の点眼投与の場合の網膜／血漿比率（経口投与：１．０、溶液の点眼投与：１．１）に比べて高い網膜／血漿比率（約１２）を示した。【００７７】
試験例５：ラットを用いた後眼部への移行性評価（ＩＶ）
ＳＤラットの両眼に、点眼用製剤Ｈ（ｐＨ３）、点眼用製剤Ｉ（ｐＨ５）または点眼用製剤Ｊ（ｐＨ７）を、片眼５μＬずつ１回点眼投与し、６０分間後の角膜中、網膜中および血漿中の化合物Ａの濃度を測定した。その結果を図６に示す。【００７８】
図６より、点眼用製剤Ｉ（ｐＨ５）、点眼用製剤Ｈ（ｐＨ３）および点眼用製剤Ｊ（ｐＨ７）のいずれにおいても、後眼疾患の治療が可能と考えられる程度の網膜への移行が見られた。特に、点眼用製剤Ｉ（ｐＨ５）では、非常に高い網膜移行性が見られた。一方、角膜および血漿中への移行はｐＨによって大きな違いは見られなかった。【００７９】
試験例６：ラットを用いた後眼部への移行性評価（Ｖ）
ＳＤラットの両眼に、点眼用製剤Ｉ、点眼用製剤Ｆ、点眼用製剤Ｇ、点眼用製剤Ｘ１、点眼用製剤Ｘ２、点眼用製剤Ｙ１または点眼用製剤Ｙ２を、片眼５μＬずつ１回点眼投与し、６０分間後の網膜中のそれぞれの薬物濃度を測定した。その結果を図７に示す。【００８０】
図７より、化合物Ａの点眼用懸濁製剤は、薬効メカニズムが同様のアルドースリダクターゼ阻害剤である化合物Ｂ及び化合物Ｃの点眼用懸濁製剤と比較して、網膜への移行性が格段に高かった。化合物Ａは９５６０ｎｍの平均粒子径の点眼用懸濁製剤においても、薬効に必要な量の化合物Ａが網膜へ到達しているのに対し、化合物Ｂ及び化合物Ｃでは、いずれの平均粒子径においても、僅かしか網膜へ到達しなかった。【００８１】
試験例７：化合物ＡのＶＥＧＦ刺激による細胞遊走亢進作用に対する抑制作用
化合物Ａによる抗ＶＥＧＦ作用について、J Diabetes Complications. 2012 ;26(5):369-77に記載された、細胞遊走能の実験方法に準じて検討した。実験には、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社より購入した正常ヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＥＣ）を使用し、細胞培養液はＣＳ−Ｃ培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社）を使用した。化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、ＤＭＳＯ濃度が０．１％になるように細胞培養液で希釈して使用した。ルセンティスは製剤原液５０μＬあたり４ｍＬの細胞培養液で希釈して使用した。ＨＲＥＣを６ウェルプレートに播種し、培養密度が８０−９０％になるまで培養した。ＶＥＧＦの刺激による細胞遊走能評価の２０−２４時間前に、ウシ胎児血清濃度を０．１％含む細胞培養液に交換した。その後、単層培養細胞層を各ウェルにつき１か所、２００μＬのピペットチップで創傷させ、創傷幅の長さを顕微鏡下で測定した。創傷後、それぞれの試験条件に応じて、ＶＥＧＦ、各種アルドース還元酵素阻害剤（化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ）またはルセンティスを含む細胞培養液に交換した。培地を交換して約１８時間後に、創傷幅の長さを顕微鏡下で測定し、創傷直後との比較により抗ＶＥＧＦ作用を評価した。結果を図８に示す。【００８２】
図８に示すように、ＶＥＧＦ刺激によるＨＲＥＣの遊走亢進が確認され、ルセンティス及びアルドース還元酵素阻害剤による遊走抑制作用が確認された。１ｎＭ（（０．４２ｎｇ／ｍＬ）Ｌ）の化合物Ａ添加によるＨＲＥＣの遊走抑制作用は、１００ｎＭ（（２８ｎｇ／ｍＬ）／Ｌ）の化合物Ｃによる遊走抑制作用と同程度であり、１０００ｎＭ（（３２０ｎｇ／ｍＬ）／Ｌ）の化合物Ｂによる遊走抑制作用より強かった。さらに、この化合物Ａの遊走抑制作用は、下表に示す各アルドース還元酵素の酵素阻害作用比から類推される作用比よりも強かった。また、１ｎＭ化合物Ａの遊走抑制作用は、抗ＶＥＧＦ抗体であるルセンティスと同程度であった。【００８３】
【表５】
2016039422.tif 000007
【００８４】
Diabetic Retinopathy, INTECH, Phapter 15, 「Prophylactic Medical Treatment of Diabetic Retinopathy」, Akihiro Kakehashi et alによると、化合物Ａを非肥満２型糖尿病モデルであるＳＤＴラットへ経口で反復投与すると、網膜毛細血管の脆弱化及び網膜でのＶＥＧＦ産生が抑制されたことが示されており、これにより、ＶＥＧＦが関連する疾患に対して、ＶＥＧＦ産生が亢進する前からの予防投与によって、ある程度進行抑制が期待されることが示唆されている。しかしながら、化合物Ａがすでに産生されたＶＥＧＦの作用を減弱することにより、発症後の治療に有効であることは明らかではなかった。また、非特許文献１は経口投与におけるデータが示されているのみであり、点眼投与による進行抑制の可能性は示されていなかった。
本試験より、化合物Ａまたはその生理的に許容される塩は、ＶＥＧＦ刺激による細胞遊走亢進作用に対して抑制作用を示し、すでに産生されたＶＥＧＦに対しても抗ＶＥＧＦ作用を示すことが明確に明らかとなった。すなわち、ＶＥＧＦが関連する発症後の加齢黄斑変性や糖尿病網膜症等の治療の可能性が示された。なお、この抗ＶＥＧＦ作用は他のアルドース還元酵素阻害剤に比べ強力であり、抗ＶＥＧＦ抗体製剤であるルセンティスと同程度の効力であった。【００８５】
参考例６：懸濁製剤サンプル(１)〜(４)の調製
サンプル(１)の調製：実施例１に記載した手順に従い、分散媒（ｐＨ５．０）及び直径０．５ｍｍのビーズを用いて、化合物Ａを含有する点眼用懸濁製剤（２５０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
サンプル(２)の調製：ポリソルベート８０の代わりにポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を用いて、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油０．３％を含む分散媒（ｐＨ５．０）を参考例２に従い調製した。この分散媒１５ｍＬと化合物Ａ ５ｇをスクリュー管に加え、５分間超音波照射し、スギノマシン製スターバーストミニの粉砕用シリンジに全量を加えた。スクリュー管に付着したサンプルは分散媒５ｍＬで洗い込んだ。粉砕圧２４５ＭＰaで３０分間粉砕し、化合物Ａを含有する点眼用懸濁製剤（２５０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
サンプル(３)の調製：ジェットミルで粉砕した化合物Ａ１ｇをグリセリン１０ｇに添加し、スターラーで1時間撹拌し、化合物Ａを含有する懸濁製剤を調製した。
サンプル(４)の調製：ジェットミルで粉砕した化合物Ａ１ｇを水１０ｇに添加し、スターラーで1時間撹拌し、化合物Ａを含有する懸濁製剤を調製した。【００８６】
試験例８：化合物Ａの溶解度測定
サンプル(１)〜(４)各５００μＬを日立工機社製の遠心分離機ＨＩＴＡＣＨ−ＧＸを用いて遠心分離（１５０,０００ｒｐｍ、１０分、５℃）し、得られた上澄み１００μＬに１％ＨＰＭＣ８００μＬとアセトニトリルまたは水１００μＬを加え、ボルテックスで振とうし、含量測定サンプルとした。ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製の超高速液体クロマトグラフ、カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ５μｍ １５０×４．６ｍｍを用いて溶解している化合物Ａの量を測定した。その結果を表６に示す。表６より、水系の懸濁液中で溶解している化合物Ａの割合は、極僅かであった。
【表６】
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なお、サンプル(１)、(２)に懸濁している化合物Ａの平均粒子径を上記に記載の方法で測定したところ、それぞれ２４４．２ｎｍ、２７６．７ｎｍであった。またサンプル(２)を２５℃で１ヶ月および２ヶ月保存した時の粒子径はそれぞれ２７７．３ｎｍ、２５６．９ｎｍであった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
これらの実施例、参考例、比較例、試験例等により、本発明の点眼用製剤は、優れた後眼部移行性を有し、後眼部疾患を初めとする眼疾患への治療に好適に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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