(57)【要約】【課題】生体試料中の測定対象物質の免疫学的測定法における、ヘモグロビンの影響を回避する方法を提供すること。【解決手段】測定対象成分の存在が疑われる試料と該測定対象成分に結合する抗体とを配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの存在下に反応させることにより、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンを含有する試料中に存在することが疑われる、試料中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する抗体とを、配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの存在下に反応させることを特徴とする、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法。
【請求項２】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＥＳおよびＴｒｉｓから選択される１以上の緩衝成分の存在下に反応させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗体が、不溶性担体に固定化されていることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
不溶性担体が、ラテックス粒子、金属コロイド粒子である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
粒子凝集測定法を利用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法により試料中の測定対象成分を検出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料が、尿、全血、血清又は血漿である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
測定対象成分が、Ｌ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分を該測定対象成分に結合する抗体により検出する方法におけるヘモグロビンの影響回避方法であって、
測定対象成分の存在が疑われる試料と該測定対象成分に結合する抗体とを
配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの存在下に反応させることを特徴とする
前記ヘモグロビンの影響回避方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学的測定におけるヘモグロビンの影響回避方法及びそのための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体試料中の微量物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法、イムノクロマト法等多くの方法がある。全血を試料とする場合、溶血により試料に混入するヘモグロビン等の血球成分や血球の膜成分が、光学的な検出系に影響したり、免疫反応を阻害したり、測定対象物質を吸着したりすることにより、測定に影響がでるという問題がある。例えば、ヘモグロビンは、酸化還元酵素、色素発色系を用いた免疫学的測定において、測定試薬中の成分等によって酸化されることにより、ヘモグロビン自体の吸収波長の変化が起こり、生体試料中の測定対象物質の測定値に誤差を与えてしまうことが広く知られている。各種界面活性剤等を用いたヘモグロビンの影響の回避方法は、多くの場合、酸化還元酵素、色素発色系を用いた免疫学的測定に適用するものである。【０００３】
一方、ラテックス免疫比濁法は、測定波長が長波長であり、ヘモグロビンの吸収波長と重ならないことから、ヘモグロビンの吸収波長の変化の影響を受けないと考えられる。しかし、実際はヘモグロビンを含む試料の測定において、測定値が真値と異なる場合があることが知られている。【０００４】
特許文献１には、正味の正電荷性のために陰電荷ラテックス粒子に非特異的に吸引される、天然の未変性ヘモグロビン（ヘモグロビンAo）の存在によるものであると考えられている非特異的凝集を排除する方法が記載されている。反応混合物のpHを約8.5以上に保持することによって、ヘモグロビンAoの正味の電荷を中性化して、ラテックス粒子に対する静電気的吸引力による凝集を抑制することで、全血試料に関して行なわれるラテックス凝集イムノアッセイにおける非特異的凝集を排除する。【０００５】
また、特許文献２には、血漿等の生体由来試料中の測定対象物質の免疫学的測定法において、ヘモグロビンの影響を回避する目的で、カリックスアレーン類等の大環状化合物の存在下に反応を行うことが記載されている。特に、実施例においては、カリックスアレーン類の存在下でラテックス凝集法を行うことにより、ヘモグロビンの影響を回避できることが記されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−１５０８５７号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／００１６１９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、生体試料中の測定対象物質の免疫学的測定法における、ヘモグロビンの影響を回避する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［１］
ヘモグロビンを含有する試料中に存在することが疑われる、試料中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する抗体とを、配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの存在下に反応させることを特徴とする、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法。
［２］
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＥＳおよびＴｒｉｓから選択される１以上の緩衝成分の存在下に反応させる［１］に記載の方法。
［３］
抗体が、不溶性担体に固定化されていることを特徴とする［１］または［２］に記載の方法。
［４］
不溶性担体が、ラテックス粒子、金属コロイド粒子である［３］に記載の方法。
［５］
粒子凝集測定法を利用する、［４］に記載の方法。
［６］
抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法により試料中の測定対象成分を検出する、［６］に記載の方法。
［８］
試料が、尿、全血、血清又は血漿である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
測定対象成分が、Ｌ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）である［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分を該測定対象成分に結合する抗体により検出する方法におけるヘモグロビンの影響回避方法であって、
測定対象成分の存在が疑われる試料と該測定対象成分に結合する抗体とを
配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの存在下に反応させることを特徴とする
前記ヘモグロビンの影響回避方法。
［１１］
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＥＳおよびＴｒｉｓから選択される１以上の緩衝成分の存在下に反応させる［１０］に記載の方法。
［１２］
抗体が、不溶性担体に固定化されていることを特徴とする［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
不溶性担体が、ラテックス粒子、金属コロイド粒子である［１２］に記載の方法。
［１４］
粒子凝集測定法を利用する、［１３］に記載の方法。
［１５］
抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、［１０］〜［１４］に記載の方法。
［１６］
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法により試料中の測定対象成分を検出する、［１５］に記載の方法。
［１７］
試料が、尿、全血、血清又は血漿である［１０］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
測定対象成分が、Ｌ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）である［１０］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体試料中のヘモグロビンの影響が回避できるので、該試料がヘモグロビンを含有する場合であっても正確な測定が可能となる。本発明により、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の正確な測定を可能とする免疫測定法および免疫測定用試薬、ならびに、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響回避方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（試料）
本発明に用いる生体試料としては、尿、血液（全血、血漿又は血清）、腎臓、心臓、肝臓などの組織、及び該組織からの抽出液等が挙げられる。測定対象物質の存在が疑われる試料であれば、健常者由来の試料、患者由来の試料、罹病を疑われる者由来の試料等、いずれの試料も用いることができる。
【００１１】
（測定対象物質）
本発明により測定される測定対象物質には特に制限はない。
【００１２】
以下、試料として尿、測定対象物質として肝臓型脂肪酸結合蛋白質（Ｌ−ＦＡＢＰ）を例として本発明を説明する。
【００１３】
（抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体）
本発明に用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は、臓器、細胞、体液等から精製した天然のＬ−ＦＡＢＰを免疫原（抗原）として調製することができる。Ｌ−ＦＡＢＰは、主に肝臓又は腎臓に分布しているので、それらの臓器等から精製、単離することができる。また、Ｌ−ＦＡＢＰは、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット間でホモロジーが高く、アミノ酸レベルで９０％以上のホモロジーがあることが知られているので、ヒトのＬ−ＦＡＢＰと結合する抗体を得るために、例えばマウスＬ−ＦＡＢＰを抗原として用いることもできる。
【００１４】
天然のＬ−ＦＡＢＰの精製は、Kelvinらの文献（J. Biol. Chem.、第263巻、第15762-15768頁、1988年）記載の方法等に準じて実施できる。すなわち、摘出した臓器をホモジナイズした後、超遠心して得られる細胞質画分を、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により分画し、分子量や脂肪酸結合活性を指標としてＬ−ＦＡＢＰを含有する画分を選択して単離、精製する。前記選択された画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、精製蛋白質が単一のバンドとなっていること確認し、必要であればさらに精製を行う。精製蛋白質について、アミノ酸組成やＮ末端側アミノ酸配列を決定し、報告された組成や配列と比較することにより、目的とする分子種であることを確認できる。
【００１５】
抗原として用いるＬ−ＦＡＢＰは、遺伝子工学的手法によって製造されたリコンビナント蛋白質であってもよい。Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Veerkamp and Maatman、Prog. Lipid Res.、第34巻、第17-52頁、1995年）ので、例えば、それらをもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングすることができる。これを用いて遺伝子組換えを行うことにより、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰを調製することができる。また、抗原として、Ｌ−ＦＡＢＰの断片、又はその部分配列を有する合成ペプチド等を、必要に応じてキャリア高分子物質（ＢＳＡ、ヘモシアニン等）と結合させて用いることもできる。
【００１６】
Ｌ−ＦＡＢＰと特異的に結合する抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等のいずれであってもよい。
【００１７】
抗体は、高い特異性を有するものが好ましく、例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であれば、Ｈ−ＦＡＢＰとは実質的に交差反応しないことが望ましい。より特異性の高い抗体を取得するためには、より高度に精製され純度の高い抗原を用いることが望ましい。抗体の調製に際しては、ヒト以外の温血動物に、前記のごとく調製した精製抗原を接種して免疫する。免疫するヒト以外の温血動物としては、哺乳動物（ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ブタ等）、鳥類（ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）が挙げられる。ウサギの場合、例えば、抗原 １００μg〜１ｍｇ程度を約１ｍＬの生理食塩水及びフロイントの完全アジュバント中に乳化したものを、背部又は後肢掌皮下に接種し、２回目以降はアジュバントをフロイントの不完全アジュバントにかえて、これを２〜４週間おきに３〜８回接種して免疫し、最終接種の約７〜１２日後に産生された抗体を使用する。マウスの場合、１ 回あたり１０〜３０μg／匹の抗原を、通常、皮下、腹腔内、静脈内に、約２週間隔で３〜８回接種して免疫し、最終接種の約２〜４日後に産生された抗体を使用する。
【００１８】
ポリクローナル抗体は、前記のように免疫した動物から採血し、血清（抗血清）を分取して、得られた抗血清からＩｇ画分を回収して調製できる。例えば、抗血清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー等によりＩｇＧ画分を回収してポリクローナルＩｇＧを得ることができる。
【００１９】
モノクローナル抗体は、免疫動物から採取した抗体産生細胞を、不死化細胞と融合させて得られるハイブリドーマにより産生される。モノクローナル抗体のための免疫動物としてはマウス及びラットが好適に用いられる。ハイブリドーマの作製は、ケーラー及びミルシュタインの方法（Kohler & Milstein、Nature、第256巻、第495〜897頁、1975年）に準じて以下のように実施できる。前記のように免疫した動物から抗体産生細胞（例えば脾細胞又はリンパ節細胞等）を採取し、これを適当な不死化細胞と細胞融合させる。不死化細胞としては、例えば骨髄腫細胞の細胞株（NSI- Ag4/1、Sp2/O-Agl4等）が好適に用いられる。骨髄腫細胞は、それ自身が抗体又は免疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖を産生しない非分泌型であることが好ましい。また、未融合の骨髄腫細胞と融合したハイブリドーマとを選択培地中で選別し得るような選択マーカーを有していることが好ましい。例えば選択マーカーとして、8-アザグアニン耐性（ヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損）、チミジンキナーゼ欠損等を有する細胞株がよく使用される。細胞融合は、ポリエチレングリコール等、適当な融合促進剤を添加して行う。細胞融合は、不死化細胞当たり約１０の抗体産生細胞となる比率で行うことが好ましく、またおよそ抗体産生細胞１０6個／ｍＬの細胞密度で好適に実施できる。
【００２０】
融合処理した細胞を、適当に希釈した後、選択培地中で１〜２週間培養する。例えば、8-アザグアニンに耐性の骨髄腫細胞を用いる場合、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中で培養すると、未融合骨髄腫細胞は死滅し、また未融合の抗体産生細胞も分裂サイクルが限られているため死滅するが、融合細胞だけは選択培地中で分裂を続け生存できる。選択培地中での培養後、その上清について例えば抗原を固相に固定化したＥＬＩＳＡ等を行って目的とする抗体の有無を検出し、限界希釈法によってクローニングすることにより、目的抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択できる。選択に際しては、抗体価、抗体のクラス、サブクラス、抗原との親和性、特異性、エピトープ等、所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択できる。モノクローナル抗体のクラスとしては一般にＩｇＧが好ましい。
【００２１】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、免疫に使用した動物と同種の動物の腹腔内に移植し、一定期間経過後、当該動物から腹水を採取し、目的のモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、ハイブリドーマを適当な動物細胞培養用の培地中で培養し、その培養液からモノクローナル抗体を単離することもできる。また、一旦目的のハイブリドーマを得たら、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を取得し、通常の遺伝子組換え技術により適当な宿主（例えばカイコ等）において目的のモノクローナル抗体を発現させ産生させることができる。抗体の分離・精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を必要に応じて組合せた通常の精製法に従って行うことができる。
【００２２】
本発明に使用される抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。特に限定されないが、市販の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体である、Santa Cruz Biotechnology社のC-4（カタログＮｏ．sc-374537）、F-9 （カタログＮｏ．sc-271591）、R&D systems社の328607（カタログＮｏ．MAB2964）、Hycult biotech社のL2B10（カタログＮｏ．HA2049-IA）、Lifespan Biosciences社の2G4（カタログＮｏ．LS-B3001）等が利用可能である。
【００２３】
本発明における「抗体」には、完全な免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等、本技術分野において公知の抗原結合能を有する抗体断片又は抗体誘導体が含まれる。
【００２４】
（検出）
本発明の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰを検出する方法は、免疫測定法である。より具体的には、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）等の粒子免疫凝集測定法、ＥＬＩＳＡ、化学発光検出法、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフロー式、フロースルー式）が挙げられるが、これらの例に限定されない。なかでも、Ｂ／Ｆ分離のための工程を含まない免疫測定法（ホモジニアス免疫測定法）がより好ましい。
なお、本明細書において測定方法としてＬＴＩＡを記述する場合、その検出方法は、透過光（吸光度）の変化の測定、散乱光の変化の測定、粒子径の変化の測定等、公知の検出方法のいずれを用いても差し支えないものとして記述している。
さらに、「検出」又は「測定」という用語は、Ｌ−ＦＡＢＰの存在の証明及び／又は定量等を含めて最も広義に解釈する必要があり、限定的に解釈してはならない。
【００２５】
（不溶性担体）
本発明で使用する不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂等の高分子基材、ガラス等の無機基材、セルロースやアガロース等の多糖類基材等からなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、ビーズあるいは粒子状（例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子）、板あるいはシート状（例えば、多孔性メンブレン、イムノプレート）、筒状（例えば、試験管）等、採用する測定法に応じた任意の形状を選択できる。
【００２６】
粒子の例としては、粒子免疫凝集測定法で一般的に用いられるポリスチレンを主成分とするラテックス粒子の他に、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー等を基材とする粒子が挙げられる。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することもできる。本発明で用いる担体粒子は同一種類の材質、あるいは二種類以上の材質を用いることができる。
担体粒子の粒子径としては、０．１５〜０．４５μｍ程度が好ましく、より好ましくは、０．２〜０．４μｍである。また、平均粒子径の異なる二種類以上の担体粒子を組み合わせて用いることもできる。
【００２７】
多孔性メンブレンとしては、公知のものが使用でき、また、任意の材質のものが使用できる。多孔性メンブレンの材質としては、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体等の多糖類あるいはセラミックス等が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社等より販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙等がある。
【００２８】
プレート（イムノプレート）としては、公知のものが使用でき、また、任意の材質のものが使用できる。プレートの材質としては、例えば、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィンエラストマー等の合成高分子化合物のほか、ガラス等も利用することができるが、これらに限定されない。
【００２９】
（不溶性担体への抗体の固定化）
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を不溶性担体上に固定化する方法としては特に制限はなく、公知の方法を使用することができる
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を粒子上に固定化する場合、例えば、粒子と抗体を混合することによりおこる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジイミド等のカップリング剤により、粒子表面のカルボキシ基やアミノ基と抗体分子を化学的に結合させる化学結合法が用いられる。また、抗体分子はスペーサー分子を介して粒子に固定化させてもよい。さらに、アルブミン等の他のタンパク質に化学結合法を用いて抗体を結合させた後に、そのタンパク質を粒子に物理的あるいは化学的に固定化してもよい。
また、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を多孔性メンブレン上に固定化する場合、例えば、抗体を含む溶液を一定量、ライン状、点あるいは、＋等の特定のシンボル状に、多孔性メンブレンに塗布することで固定化できる。
【００３０】
本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。
【００３１】
（標識抗体）
抗体を標識するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。また標識物質と抗体との結合方法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法等の方法を用いることができる。標識物質、結合方法のいずれも、上記に限定されることなく公知の方法を用いることができる。
標識の検出は、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、例えば1,2-フェニレンジアミンあるいは3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルホスフェート等）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともビオチン以外の標識物質で標識されたアビジンを反応させるのが一般的である。
【００３２】
（ＢＰＦ）
大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔとも呼称される。以下「ＢＰＦ」ということがある。）は、免疫学的測定方法における新規なブロッキング用物質としてＷＯ２００５／００３１５５号パンフレットおよび高分子学会予稿集:55巻2 Disk1号5211-5212頁(2006年),Polymer Preprints, Japan Vol. 55, No.2, 5211-5212 (2006)に開示され、市販もされている。
本発明方法等に使用するＢＰＦは、ＷＯ２００５／００３１５５号パンフレットの記載に従い調製することができる。また、市販品（東洋紡社製、カタログ番号ＢＰＦ−３０１）を使用してもよい。
【００３３】
本発明の方法等におけるＢＰＦの使用濃度としては、測定用試薬あるいは検体希釈液中の濃度として、０．０５〜５％（ｗ／ｖ％）が好適であり、より好適には０．０７５〜５％、さらに好適には０．１〜３％を例示することができる。当業者であれば、保存対象タンパク質の性状や濃度（量）などを考慮し、実験的に最適なＢＰＦの濃度を決定することができる。
例えば、分子量約２２０００のＢＰＦ−３０１を用いた場合、０．０２２ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌが好適であり、より好適には０．０３４ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好適には０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３６ｍｍｏｌ／Ｌを例示することができる。
【００３４】
（Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、及びＢＰＦを接触させる方法）
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、及びＢＰＦを接触させる工程は、Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料とＢＰＦを接触させる工程の後、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と接触させる工程の順に行われることを限度として、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、及びＢＰＦとを接触させる方法としては、例えば抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が固定化された粒子及びＢＰＦを含有する液状の試薬と試料とを混合する方法を挙げることができる。また、別の方法としては、ＢＰＦを浸潤させた多孔性メンブレン等の不溶性担体に、Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料を供給することによって接触させる方法を挙げることができる。当業者であれば、測定用試薬の構成等を考慮して適宜設定することができる。
さらに試料中のＬ−ＦＡＢＰは、ＢＰＦと接触した後、又は接触と同時に、不溶性担体に固定化された抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と公知の適宜な方法により接触される。
【００３５】
（緩衝剤）
本発明の分子内に下記［化学式１］で表される基をもつ化合物又はその塩からなる緩衝剤としては、下記一般式［I］で表される化合物を例示することができる。
一般式[I]
【化１】
2016136918.tif 000002
一般式［I］中のＲ１，Ｒ２は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基等をあげることができる。上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基としては、直鎖又は分枝上の炭素数が１〜６のアルキル基をあげることができ、該直鎖又は分枝上の炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を具体的に例示することができる。
一般式［Ｉ］中のＲ３、Ｒ４としては、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ（カルボキシアルキル）アルキル基、トリ（カルボキシアルキル）アルキル基、スルホアルキル基、ジ（スルホアルキル）アルキル基、トリ（スルホアルキル）アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基、トリ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基等を挙げることができる。
上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ（カルボキシアルキル）アルキル基、トリ（カルボキシアルキル）アルキル基、スルホアルキル基、ジ（スルホアルキル）アルキル基、トリ（スルホアルキル）アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基、及びトリ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基におけるアルキル基としては、直鎖又は分枝状の炭素数が１〜６のアルキル基を挙げることができ、該直鎖又は分枝状の炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を具体的に例示することができる。
また、一般式［Ｉ］中のＲ３、Ｒ４としては、Ｒ３，Ｒ４が窒素原子と共に環状構造を形成し、置換もしくは無置換のピペラジニル基、置換もしくは無置換のモルホリノ基、又は置換もしくは無置換のピペリジノ基を形成する基を挙げることができ、該置換ピペラジニル基、置換モルホリノ基、及び置換ピペリジノ基における置換基としては、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ（カルボキシアルキル）アルキル基、トリ（カルボキシアルキル）アルキル基、スルホアルキル基、ジ（スルホアルキル）アルキル基、トリ（スルホアルキル）アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基、トリ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基等を挙げることができる。
上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ（カルボキシアルキル）アルキル基、トリ（カルボキシアルキル）アルキル基、スルホアルキル基、ジ（スルホアルキル）アルキル基、トリ（スルホアルキル）アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基、及びトリ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基におけるアルキル基としては、前記の直鎖又は分枝状の炭素数が１〜６のアルキル基を挙げることができる。
前記ヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシヘキシル基等を、ジ（ヒドロキシアルキル）アルキル基としては、ジ（ヒドロキシメチル）メチル基、ジ（２−ヒドロキシエチル）メチル基等を、トリ（ヒドロキシアルキル）アルキル基としては、トリ（ヒドロキシメチル）メチル基、トリ（２−ヒドロキシエチル）メチル基等を、カルボキシアルキル基としては、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基等を、ジ（カルボキシアルキル）アルキル基としては、ジ（カルボキシメチル）メチル基、ジ（２−カルボキシエチル）メチル基等を、トリ（カルボキシアルキル）アルキル基としては、トリ（カルボキシメチル）メチル基、トリ（２−カルボキシエチル）メチル基等を、それぞれ具体的に例示することができる。
また、前記スルホアルキル基としては、スルホメチル基、２−スルホエチル基等を、ジ（スルホアルキル）アルキル基としては、ジ（スルホメチル）メチル基、ジ（２−スルホエチル）メチル基等を、トリ（スルホアルキル）アルキル基としては、トリ（スルホメチル）メチル基、トリ（２−スルホエチル）メチル基等を、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基としては、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基、３−ヒドロキシ−４−スルホプロピル基等を、ジ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基としては、ジ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）メチル基、ジ（３−ヒドロキシ−４−スルホプロピル）メチル基等を、トリ（スルホ−ヒドロキシ−アルキル）アルキル基としては、トリ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）メチル基、トリ（３−ヒドロキシ−４−スルホプロピル）メチル基等を、それぞれ具体的に例示することができる。
【００３６】
本発明で用いられる緩衝剤として、具体的には、Ｂｉｃｉｎｅ（CAS番号：150-25-4）、ＢＥＳ（CAS番号：10191-18-1）、ＢｉｓＴｒｉｓ（CAS番号：6976-37-0）、ＤＩＰＳＯ（CAS番号：68399-80-4）、ＨＥＰＥＳ（CAS番号：7365-45-9）、ＨＥＰＰＳ（CAS番号：16052-06-5）、ＨＥＰＰＳＯ Ｈｙｄｒａｔｅ（CAS番号：68399-78-0）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（CAS番号：5704-04-1）、ＴＥＳ（CAS番号：7365-44-8）、ＴＡＰ（CAS番号：29915-38-6）、ＴＡＰＳＯ（CAS番号：68399-81-5）、Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ プロパン（CAS番号：64431-96-5）、トリス塩酸塩（CAS番号：1185-53-1）、トリス塩基（CAS番号：77-86-1）、ＴＥＳナトリウム水和物（CAS番号：70331-82-7）等が挙げられる。特に、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ，トリスが好ましい。
【００３７】
（測定キット）
本発明により提供される測定キットの構成物は、Ｌ−ＦＡＢＰを免疫学的に測定できることを限度として、特に限定されるものではない。以下、サンドイッチＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフィー及びＬＴＩＡを例にそれぞれを説明する。
【００３８】
＜サンドイッチＥＬＩＳＡ＞
サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、測定用キットは少なくとも、（ａ）本発明の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を固定化した不溶性担体及び（ｂ）標識物質で標識され、Ｌ−ＦＡＢＰと反応する性質を有する抗体、を含む。この場合、不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。
【００３９】
不溶性担体に固定化された抗体は、試料中のＬ−ＦＡＢＰを捕捉し、不溶性担体上で複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉されたＬ−ＦＡＢＰに結合して前述の複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のＬ−ＦＡＢＰを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定方法、ヘテロジーニアスな測定方法のいずれも構成することが可能であるが、ホモジーニアスな測定方法がより好適である。
【００４０】
ＢＰＦは、例えば、試料希釈液や抗原抗体反応を行う溶液に添加することで、試料中のＬ−ＦＡＢＰと接触させることができる。
【００４１】
＜イムノクロマトグラフィー＞
一般的なイムノクロマトグラフィーでは、多孔性メンブレン等のシート状の不溶性担体上に、試料を含む溶液の展開方向に順に「１．試料供給部位」、「２．標識抗体を保持する部位（標識抗体保持部位）」、「３．標識抗体とＬ−ＦＡＢＰ抗体により形成された複合体を捕捉するための抗体を固定化する部位（捕捉抗体部位）」を具備した試験片が使用され、試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するように構成されている。イムノクロマトグラフィーでは、測定用キットは、上記のような試験片を少なくとも含む。
【００４２】
具体的には、Ｌ−ＦＡＢＰを含む試料を試料供給部位に所定量添加すると、試料は毛細管現象により標識保持部位に侵入し、Ｌ−ＦＡＢＰと標識抗体とが結合して複合体を形成する。該複合体は、メンブレンを展開し、捕捉抗体部位に侵入すると、メンブレンに固定化された抗体（捕捉抗体）に捕捉され、捕捉抗体−Ｌ−ＦＡＢＰ−標識抗体の三元複合体が形成される。そして標識を任意の方法（例えば、金コロイド粒子等の可視化可能な標識の場合にはその凝集像、酵素の場合には、基質を添加することによる発色反応）で検出することで、Ｌ−ＦＡＢＰの存在を検出することができる。
【００４３】
ＢＰＦは、例えば、試料希釈液等に添加しておいたり、試料供給部位や標識保持部位に含有させておいたりすることで、試料中のＬ−ＦＡＢＰと接触させることができる。
【００４４】
＜ラテックス免疫凝集測定法＞
ラテックス免疫凝集測定法では、測定用キットは少なくとも抗体が固定化されたラテックス粒子を含む。ラテックス免疫凝集測定法に使用される抗体としては、「抗原に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナル抗体」、「ポリクローナル抗体」、又は「モノクローナル抗体とポリクローナル抗体」のいずれの組合せも用いることが出来る。この場合、ラテックス粒子は、抗体を固定化する不溶性担体であると同時に、標識物質である。
【００４５】
これらの測定用試薬に使用されるラテックス粒子は、感度向上等の所望の性能を得るため、粒子径や材質を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スルフォン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等を基材とする粒子が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体とＬ−ＦＡＢＰとの凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。なお、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
【００４６】
臨床検査で使用される一般的なＬＴＩＡ用の測定キットは、通常、第一試薬、第二試薬の形態で提供される。ＢＰＦ及び抗体を固定化したラテックス粒子は、第一試薬あるいは第二試薬に含有させることができる。一般には抗体を固定化したラテックス粒子を第二試薬に含有させることが好適であるが、第一試薬に含ませることもできる。また、ラテックス粒子は、第一試薬、第二試薬の両方に含有させることも可能である。
【００４７】
本発明のキットは、測定感度向上や非特異的反応抑制の目的で、必要に応じて糖類やタンパク質等を含む。例えば、抗原抗体反応を促進する成分（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマー等の高分子化合物等）、タンパク質やペプチド（アルブミン、カゼイン等）、アミノ酸、糖類（ショ糖、シクロデキストリン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム、ＰｒｏＣｌｉｎ３００等）が挙げられる。
【００４８】
また、試料測定における標準物質（Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質）として、肝臓、腎臓等の各組織由来の天然のＬ−ＦＡＢＰが使用できるが、遺伝子工学的手法によって製造されたリコンビナント蛋白質であってもよい。Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Veerkamp and Maatman、Prog. Lipid Res.、第34巻、第17-52頁、1995年）ので、例えば、それらをもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングすることができる。これを用いて遺伝子組換え技術より、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰを調製することができる。標準物質として、構造が安定したリコンビナント蛋白質を用いることがより好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００５０】
（抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液）
（１）ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 ＣｌｏｎｅＬ（シミックホールディングス社製）を０．３６ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬに、平均粒径０．２１μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液１３ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析して、ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
（２）Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 Ｃｌｏｎｅ１（シミックホールディングス社製）を０．５４ｍｇ／ｍＬ含む５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬに、平均粒径０．３２μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液８ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析してＣｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。【００５１】
（Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質は、特開平１１−２４２０２６号公報の記載に従い、遺伝子組換えにより得た。【００５２】
（Ｌ−ＦＡＢＰ基準測定方法：基準方法）
ＥＬＩＳＡによる体外診断用医薬品（レナプロ（登録商標）Ｌ−ＦＡＢＰテスト ＴＭＢ）を基準方法とした。【００５３】
（第一試薬：標準物質希釈液を兼ねる）
３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
各濃度 ＢＰＦ（東洋紡社製、BPF-103）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
３９０ｍｍｏｌ／Ｌ ベンズアミジン塩酸塩
０．４％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ＢＬ１０３
（第二試薬）
５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
３．７５Ａｂｓ／ｍＬ ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
１．２５Ａｂｓ／ｍＬ Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
（注）Ａｂｓは２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
（標準液）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質を、標準物質希釈液を用いて所望濃度に調整し、標準液とした。
（凍結融解尿）
採取後、−３０℃で凍結保存されていた部分尿を、一度だけ融解して測定に使用した。予め基準方法にて凍結融解尿中のＬ−ＦＡＢＰを測定したところ、１０ｎｇ／ｍＬであった。
（検体）
ヘモグロビンの濃度が０〜１０００ｍｇ／ｄＬとなるよう干渉チェックＡプラス（シスメックス社製）を調整した。前記調整済み干渉チェックＡプラスと上記凍結融解尿とを等量混和して、各濃度のヘモグロビンが共存する検体とした。【００５４】
（ＬＴＩＡの測定条件）
（１）分析装置：日立７１７０型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）
（２）試料量及び試薬量：試料３μＬ、第一試薬１５０μＬ、第二試薬５０μＬ
（３）反応時間（反応温度）：第一試薬５分（３７℃）、第二試薬５分（３７℃）
（４）測光ポイント及び測光対象：第二試薬添加直後と添加５分後の間の吸光度変化量【００５５】
［実施例１〜４］ＢＰＦによるヘモグロビンの影響回避
ＢＰＦによる、ヘモグロビンの影響回避効果を確認した。
１．操作
（１）検量線の作成
標準液を試料として、上記第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。測定された吸光度から、Ｌ−ＦＡＢＰ ０ｎｇ／ｍＬ試料の吸光度（ブランク吸光度）を差し引いて正味吸光度を算出した。Ｌ−ＦＡＢＰ濃度をｘ軸、正味吸光度をｙ軸として、検量線を作成した。
（２）実施例１〜４
表１の濃度のＢＰＦを含む上記の第一試薬と第二試薬を用いて、検体中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。
【表１】
2016136918.tif 000003
（３）対照例
ＢＰＦを含まない第一試薬と、第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。【００５６】
２．結果
実施例１〜４及び対照例において測定された吸光度から、（１）の検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度を算出した。各ヘモグロビン濃度において算出された測定値を、ヘモグロビンが０ｍｇ／ｄＬの測定値で除して比率（％）を求め表２に示した。
【表２】
2016136918.tif 000004
【００５７】
ＢＰＦを添加しない場合１００ｍｇ/ｄＬのヘモグロビン共存で既に１５０％付近の比率であった。一方、ＢＰＦを添加した場合には、ＢＰＦの濃度依存的に比率が低下し、表２に示すように、網掛け部では１５％以内の変動であった。すなわち、１００ｍｇ/ｄＬのヘモグロビン濃度では、±１５％以内の変動となり、ヘモグロビンの影響を回避できることを確認した。同様に、２００〜５００ｍｇ/ｄＬのヘモグロビン濃度においても、ＢＰＦの濃度依存的に比率が低下することが確認できた。【００５８】
実施例５〜９については、以下の材料を用い、以下の条件にて測定を行った。【００５９】
（抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液）
（１）ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 ＣｌｏｎｅＬ（シミックホールディングス社製）を０．３６ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬに、平均粒径０．２７μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液１３ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析して、ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
（２）Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 Ｃｌｏｎｅ１（シミックホールディングス社製）を０．５４ｍｇ／ｍＬ含む５ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬに、平均粒径０．２５μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液８ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む５ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析してＣｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。【００６０】
（Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質は、特許文献１の記載に従い、遺伝子組換えにより得た。【００６１】
（Ｌ−ＦＡＢＰ基準測定方法：基準方法）
ＥＬＩＳＡによる体外診断用医薬品（レナプロ（登録商標）Ｌ−ＦＡＢＰテスト ＴＭＢ）を基準方法とした。【００６２】
（第一試薬）
３００ｍｍｏｌ／Ｌ   緩衝液
０．1％ ＢＰＦ（東洋紡社製、BPF-103）
３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
３９０ｍｍｏｌ／Ｌ ベンズアミジン塩酸塩
０．７２０％〜１．０２０％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ＢＬ１０３
（第二試薬）
５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
３．７５Ａｂｓ／ｍＬ ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
１．２５Ａｂｓ／ｍＬ Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
（注）Ａｂｓは２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
（標準物質希釈液）
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１％  ＢＰＦ（東洋紡社製、BPF-103）
（標準液）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質を、標準物質希釈液を用いて所望濃度に調整し、標準液とした。
（凍結融解尿）
採取後、−３０℃で凍結保存されていた部分尿を、一度だけ融解して測定に使用した。【００６３】
（ＬＴＩＡの測定条件）
（１）分析装置：日立７１７０型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）
（２）試料量及び試薬量：試料３μＬ、第一試薬１５０μＬ、第二試薬５０μＬ
（３）反応時間（反応温度）：第一試薬５分（３７℃）、第二試薬５分（３７℃）
（４）測光ポイント及び測光対象：第二試薬添加直後と添加５分後の間の吸光度変化量
（５）測定波長５７０ｎｍ／８００ｎｍ【００６４】
［実施例５〜９］ヘモグロビンの影響回避
第一試薬に表３に記載の各緩衝液を用い、ヘモグロビンの影響回避効果を確認した。
１．操作
（１）検体の調整
ヘモグロビンの濃度が２００ｍｇ／ｄＬとなるよう干渉チェックＡプラス（シスメックス社製）を調整した。前記調整済み干渉チェックＡプラスと上記凍結融解尿とを等量混和して、１００ｍｇ／ｄＬヘモグロビンが共存する検体とした。また、ヘモグロビンの濃度が０ｍｇ／ｄＬの検体は、上記凍結融解尿をそのまま用いた。
（２）検量線の作成
標準液を試料として、上記第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。測定された吸光度から、Ｌ−ＦＡＢＰ ０ｎｇ／ｍＬ試料の吸光度（ブランク吸光度）を差し引いて正味吸光度を算出した。Ｌ−ＦＡＢＰ濃度をｘ軸、正味吸光度をｙ軸として、検量線を作成した。
（３）実施例５〜９
表３の緩衝液を含む上記の第一試薬と、第二試薬を用いて、検体中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。【００６５】
２．結果
実施例５〜９において測定された吸光度から、（２）の検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度を算出した。算出された測定値を、ヘモグロビンが０ｍｇ／ｄＬの測定値で除して比率（％）を求め表３に示した。【００６６】
【表３】
2016136918.tif 000005
【００６７】
表３に記載のＢＰＦを含むいずれの緩衝液においても正確性は±１５％以内の変動となり、ヘモグロビンの影響を回避できることを確認した。なお、ＢＰＦ濃度２．０％を含む上記緩衝液についても同様の試験を行ったところ、いずれの緩衝液を用いた場合でも５００ｍｇ／ｄLヘモグロビンの影響を回避することができた（結果示さず）。【００６８】
［実施例１０］ヘモグロビンの影響回避
第一試薬に、表４に記載の緩衝液、第二試薬に、２．５Ａｂｓ／ｍＬ ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液及び  ２．５Ａｂｓ／ｍＬ Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（Ａｂｓは２８０ｎｍにおける吸光度を示す）を用いて、ヘモグロビンの影響回避効果を確認した。それら以外、条件は実施例２〜９と同じである。【００６９】
１．操作
（１）検体の調整
ヘモグロビンの濃度が２００ｍｇ／ｄＬとなるよう干渉チェックＡプラス（シスメックス社製）を調整した。前記調整済み干渉チェックＡプラスと上記凍結融解尿とを等量混和して、１００ｍｇ／ｄＬヘモグロビンが共存する検体とした。また、ヘモグロビンの濃度が０ｍｇ／ｄＬの検体は、上記凍結融解尿をそのまま用いた。
（２）検量線の作成
標準液を試料として、上記第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。測定された吸光度から、Ｌ−ＦＡＢＰ ０ｎｇ／ｍＬ試料の吸光度（ブランク吸光度）を差し引いて正味吸光度を算出した。Ｌ−ＦＡＢＰ濃度をｘ軸、正味吸光度をｙ軸として、検量線を作成した。
（３）実施例１０
表４の緩衝液を含む上記の第一試薬と、第二試薬を用いて、検体中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。【００７０】
２．結果
実施例１０において測定された吸光度から、（２）の検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度を算出した。算出された測定値を、ヘモグロビンが０ｍｇ／ｄＬの測定値で除して比率（％）を求め表4に示した。
【表４】
2016136918.tif 000006
【００７１】
正確性は±１５％以内の変動となり、ヘモグロビンの影響を回避できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、ＢＰＦを用いることでＬＴＩＡに与えるヘモグロビンの影響を回避することができる。
【配列表】
2016136918000001.app
【国際調査報告】
2016136918.tif 000007
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