(57)【要約】【課題】分子間求核付加−解離平衡反応による蛍光発光特性を利用した新規な超解像蛍光イメージング用プローブ、及び当該プローブを用いた超解像蛍光イメージング方法の提供。【解決手段】以下の式（Ｉ）で表される化合物【化１】2016136718.tif 000043〔式中、Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。〕又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、−ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加−解離平衡反応を行うことを特徴とする、該超解像蛍光イメージング用プローブ。【選択図】なし
2016136718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物
【化１】
2016136718.tif 000041
〔式中、
Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。）〕
又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、−ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加−解離平衡反応を行うことを特徴とする、
該超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項２】
前記求核付加−解離平衡反応が、Ｒ１が結合する炭素原子において行われる、請求項１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項３】
前記求核付加−解離平衡反応における解離定数が、０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲内であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項４】
前記求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、１〜１．０ｘ１０６ｓ−１であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項５】
Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項６】
Ｒａ及びＲｂが、いずれもメチル基である、請求項５に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項７】
Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である（ただし、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）、請求項１〜６のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項８】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項９】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれもメチル基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項１０】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項１１】
前記−ＳＨ基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項１２】
前記−ＳＨ基を含有する化合物が、グルタチオンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、請求項１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
【化２】
2016136718.tif 000042
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
生体分子にプローブ分子を結合させ、−ＳＨ基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子間求核付加−解離平衡反応による蛍光発光特性を利用した新規な超解像蛍光イメージング用プローブ、及び当該プローブを用いた超解像蛍光イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、光の回折により点像は波長の半分程度に広がってしまうため、光学顕微鏡の空間分解能は、Ａｂｂｅの回折限界に制限され、点像の広がりよりも近接に位置する２点を分離してイメージングすることは不可能と考えられてきた。しかしながら、１９９０年代から回折限界を上回る分解能での超解像イメージング手法がいくつか報告されてきており（例えば、非特許文献１等）、生細胞に適用することで従来法では観測できなかった生物学的現象を捉える可能性が広がりつつある。【０００３】
超解像イメージング法の１種であるＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）やＰＡＬＭ（ｐｈｏｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）に代表されるＳＭＬＭ法（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）では、試料内にある蛍光分子を十分距離が離れた１分子ずつ確率的に発光させ、各分子の位置を正確に特定し、重ね合わせることで数１０ｎｍの解像度の蛍光画像を構築することができる（例えば、特許文献１等）。【０００４】
このようなＳＭＬＭでは、主に、市販の蛍光色素や蛍光蛋白質が用いられている。しかしながら、このような市販の有機蛍光色素を確率的に発光させるためには、一般的に１０〜１００ｍＭ程度のチオール存在下で、０．８ｋＷ/ｃｍ２程度の高強度のレーザーにより励起し、三重項等の長寿命の無蛍光状態を作り出すことが必須であり、このような条件は生細胞におけるイメージングには適さない。【０００５】
また、これまでの、超解像蛍光イメージング法の開発は、主に光学系や解析ソフトウェアの観点からの開発がほとんどであり、重要な蛍光プローブの開発が遅れているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Ｚｈｕａｎｇら、米国特許公開公報ＵＳ２００８/００３２４１４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍ.Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｕａｒｅｚら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９,９２９，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、プローブ化合物以外の添加物が不要であって、また、データ取得前に蛍光性のプローブを無蛍光性状態にするために必要であったレーザー照射を省くことができ、かつ低出力のレーザー照射でも機能する超解像蛍光イメージングに適した蛍光プローブ化合物を開発し、生細胞にも適用可能な超解像蛍光イメージング手法を提供することを課題とするものである。さらに、かかる蛍光プローブ化合物を用いて、同一視野で観察可能な多色での超解像イメージング手法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、生細胞内に内在的に存在する求核性化合物であるグルタチオン等の−ＳＨ基含有化合物と、ピロニン及びピロニン類似骨格（以下、まとめて「ピロニン骨格」という。）を有する蛍光団との分子間求核付加−解離平衡反応に着目し、当該反応による光明滅を動作原理とすることで、生細胞にも適用可能な条件下における超解像蛍光イメージングを可能とする蛍光プローブ分子を見出した。より具体的には、上記求核付加−解離平衡反応における解離定数及び求核付加反応速度を最適化することによって、従来のような高濃度のチオール添加や高強度のレーザー照射に依らずに、生細胞内におけるグルタチオンの濃度範囲で超解像蛍光イメージングに適した確率的な発光が得られることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。【００１０】
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）以下の式（Ｉ）で表される化合物
【化１】
2016136718.tif 000003
〔式中、
Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。）
又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、−ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加−解離平衡反応を行うことを特徴とする、
該超解像蛍光イメージング用プローブ；
（２）前記求核付加−解離平衡反応が、Ｒ１が結合する炭素原子において行われる、上記（１）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（３）前記求核付加−解離平衡反応における解離定数が、０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲内であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（４）前記求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、１〜１．０ｘ１０６ｓ−１であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（５）Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、上記（１）〜（４）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（６）Ｒａ及びＲｂが、いずれもメチル基である、上記（５）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（７）Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である（ただし、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（８）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子である、上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（９）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれもメチル基である、上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１０）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１１）前記−ＳＨ基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、上記（１）〜（１０）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１２）前記−ＳＨ基を含有する化合物が、グルタチオンである、上記（１）〜（１０）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；及び
（１３）式（Ｉ）で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、上記（１）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ
2016136718.tif 000004
を提供するものである。【００１１】
別の態様において、本発明は、
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
生体分子にプローブ分子を結合させ、−ＳＨ基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、グルタチオン等の細胞内物質とプローブ分子の分子間平衡反応を確率的な蛍光発光の原理とするため、従来法のように高濃度のチオールを別途添加する必要はなく、データ取得前に蛍光性のプローブを無蛍光性状態にするために必要であったレーザー照射を省くことができ、かつ、レーザー強度を従来の１／１０程度まで低減した条件下で使用することができ，細胞毒性を低減することができる。また、本発明の蛍光プローブ化合物を組み合わせることで、同一視野で観察可能な多色での超解像イメージング手法を提供することもできる。【００１３】
さらに、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブが、その分子内にタンパク質等への結合部位（カルボキシル基等）を有する場合には、目標タンパク質等へのラベル化にも適しており、固定細胞だけでなく、生細胞系における広範な研究に利用できると期待できる。また、当該プローブに基づく超解像蛍光イメージング法は、市販の顕微鏡を光学系として利用することができるため、汎用性の高い手法であると考えられる。このように、開発したプローブの基礎研究上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きいものといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図２】図２は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物５の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図３】図３は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図４】図４は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１４の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図５】図５は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１６の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図６】図６は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２８の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図７】図７は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物３２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。
【図８】図８は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１７でラベル化した抗体を用いた、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図８ａにおける右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。図８ｂは、図８ａの平均化画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｃは、図８ａの平均化画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｄは、図８ａの超解像度画像の上図を構成する輝点に関してその位置決定精度の度数分布を示したものである。
【図９】図９は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物３３でラベル化した抗体を用いた、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図９における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。
【図１０】図１０は、化合物１７でラベル化した抗体及び化合物３３でラベル化した抗体を組み合わせて用いることによって得られた、固定ベロ細胞中における微小管及びミトコンドリアの２色でのＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図１０における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１６】
１．定義
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００１７】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数３〜１５個（Ｃ３〜１５）、炭素数５〜１０個（Ｃ５〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００１８】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環及び縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２−又は３−チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２−ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３−イソチアゾリル基、３−イソオキサゾリル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−インデニル基、２−インデニル基、２，３−ジヒドロインデン−１−イル基、２，３−ジヒドロインデン−２−イル基、２−アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２−ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００２０】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２１】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル−）及びＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００２２】
本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル−）及びＲＣＯＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ−）の両方を含む。
【００２３】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、及びピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造及びそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
【００２４】
２．超解像蛍光イメージング用プローブ
本発明の超解像蛍光イメージング用プローブは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
【化２】
2016136718.tif 000005
【００２５】
上記一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表す。Ｘの置換により励起波長がシフトするため、一般的なレーザーで励起可能な多色イメージングプローブの提供が可能となる。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す。Ｒａ及びＲｂが、アルキル基である場合、それらは１以上の置換基を有することができ、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であることが好ましい。また、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは互いに結合して環構造を形成していてもよい。例えば、Ｒａ及びＲｂがともにアルキル基である場合に、Ｒａ及びＲｂが互いに結合してスピロ環を形成することができる。形成される環は、例えば５ないし８員環程度であることが好ましい。
【００２６】
Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表す。置換されていてもよいアリールにおける置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、当該置換基を１個又は２個以上有していてもよい。好ましくは、Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である。ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置（すなわち、Ｒ１がベンゼン環上の置換基としてのキサンテン環部分に対してオルト位になる位置）に置換基を有しないことが求核性化合物との反応性の観点から好ましい。Ｒ１が水素原子の場合、一般式（Ｉ）の化合物はピロニンに類似する構造を有し、Ｒ１がフェニルの場合、一般式（Ｉ）の化合物はロザミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）に類似する構造を有する。
【００２７】
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表す。好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子である。場合によっては、Ｒ２及びＲ３のいずれかが、後述するタンパク質等の生体分子と共有結合し得るラベル化置換基を含むこともできる。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。
【００２８】
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成するものであることができる。Ｒ４及びＲ５がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基であることが−ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加反応速度の観点から好ましく、Ｒ４及びＲ５がいずれも水素原子であるか、またはいずれもメチル基である場合がさらに好ましい。Ｒ４又はＲ５の一方が水素原子であって、他方がカルボニル基であることも好ましい。この場合、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）はアミド結合を形成する。カルボニル基に結合する他の置換基は特に限定されないが、アルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。場合によっては、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）が、タンパク質等の生体分子と共有結合又は非共有結合等により結合し得る置換基（ラベル化置換基）を含むことが好ましい。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。例えば、Ｒ４とＲ５のいずれか又は両方がＮ-ヒドロキシスクシンイミド等の脱離基やＳＮＡＰ−ｔａｇの基質であるベンジルグアニン誘導体やＨａｌｏＴａｇ（登録商標）で用いられるリガンドを含む置換基で置換されていてもよい。又は、微小管と結合するパクリタキセルやドセタキセル等のタキサン類やアクチンフィラメントに結合するファロイジン等の環状ペプチドを含む置換基で置換されていてもよい。又は、細胞膜に存在するタンパク質のリジン残基等のアミノ基と結合を形成するＮ-ヒドロキシスクシンイミドで置換されていてもよい。さらには、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドを介したアミノ基との結合等により、タンパク質に導入したアルキン構造とクリックケミストリーにより共有結合を形成するアジド基で置換されていてもよい。そのようなラベル化置換基は、特に限定されず、当該技術分野において公知のものであれば用いることができる。
【００２９】
また、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ４とＲ２、又はＲ５とＲ２の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。
【００３０】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基を示し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成するものであることができる。Ｒ６及びＲ７がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基であることが好ましく、Ｒ６及びＲ７がいずれも水素原子であるか、またはいずれもメチル基である場合がさらに好ましい。Ｒ６又はＲ７の一方が水素原子であって、他方がカルボニル基であることも好ましい。この場合、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）はアミド結合を形成する。カルボニル基に結合する他の置換基は特に限定されないが、アルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。場合によっては、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）が、上述したラベル化置換基を含むことが好ましい。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。上述のとおり、そのようなラベル化置換基は、特に限定されず、当該技術分野において公知のものであれば用いることができる。
【００３１】
また、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ６とＲ３、又はＲ７とＲ３の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。
【００３２】
上記各置換基の好ましい組み合わせとしては、例えば、Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）であり、Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であり、Ｒ１が水素原子又はフェニル基であり、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子又はいずれもメチル基である場合が挙げられる。同様に、Ｘが、酸素原子であり、Ｒ１が水素原子又はフェニル基であり、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子又はいずれもメチル基である場合も好ましい。
【００３３】
本発明の超解像蛍光イメージング用プローブとして代表的な式（Ｉ）の化合物の具体例としては、
【化３】
2016136718.tif 000006
を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。また、当該化合物は、任意の位置にラベル化置換基を有することができる。
【００３４】
上記式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒ６及びＲ７が連結するＮ原子において１価の正電荷を有するため、通常は塩として存在する。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、トリフルオロ酢酸塩などのカルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【００３５】
式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３６】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００３７】
上記の蛍光プローブは、必要に応じて、生理的環境で用いるための添加剤を配合して組成物として用いてもよい。そのような添加剤としては、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
【００３８】
本明細書の実施例には、式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００３９】
３．本発明のプローブを用いた超解像蛍光イメージング方法
本発明の超解像蛍光イメージング方法は、生体分子に上記で説明した式（Ｉ）のプローブ分子を接触させ、−ＳＨ基を含有する化合物の存在下で、これにレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影したＣＣＤカメラ等によって画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含むものである。観測対象となる生体分子としては、細胞膜（脂質）、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。
【００４０】
かかるイメージング方法としては、典型的には、ＳＭＬＭ（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による超解像蛍光イメージングを用いることができ、その原理については、非特許文献１に詳述されている。従って、本発明の超解像蛍光イメージング方法における基本手順は、式（Ｉ）のプローブを用いる点以外は、当該文献に記載された超解像蛍光イメージング手法を参照することができる。
【００４１】
本発明の超解像蛍光イメージング方法は、水溶液中の式（Ｉ）の化合物が、グルタチオン等の−ＳＨ基含有化合物の求核付加を受けると可視光領域の吸収及び蛍光が消失し、当該付加した−ＳＨ基含有化合物が解離すると吸収及び蛍光が回復する現象を光明滅機構として利用するものである。かかる求核付加−解離平衡反応の機構を以下に示す。
【化４】
2016136718.tif 000007
【００４２】
反応前（左側）の化合物（Ｉ）では４００〜７００ｎｍ程度の励起光を吸収して強い蛍光を発光するのに対し、求核性化合物（ここで、グルタチオン等の-ＳＨ基を含有する化合物を「Ｒ−ＳＨ」と示している。）によりキサンテン様の縮合環の９位が求核攻撃されると化合物（ＩＩ）では可視光領域の吸収及び蛍光とも消失する。そして、この分子間の求核付加反応が、可逆性を有する求核付加−解離平衡反応となることから、所定の解離定数及び求核付加反応速度となるプローブ分子を用いることで、超解像蛍光イメージングに適した蛍光明滅が得られることを利用したものである。なお、かかる求核付加−解離平衡反応をもたらす求核性化合物としては、ここで示した−ＳＨ基含有化合物以外にも、例えば、水や水酸化物イオン等の−ＯＨ基を含有する化合物、或いはタンパク質におけるリジン残基等の−ＮＨ基含有化合物を用いることができる。
【００４３】
特に、グルタチオンは、細胞内に数ｍＭオーダー前後の濃度で存在することが知られているため、かかる濃度範囲のグルタチオンの存在下で上記平衡反応による好ましい蛍光明滅が一般に用いられる検出器であるＣＣＤカメラ等のフレームレートに最適化することによって、従来のように高濃度のチオール又は還元剤の別途添加や高強度のレーザー照射など、プローブ分子を無蛍光状態とするために外部刺激を用いることなく、生理的条件下の生細胞中において超解像蛍光イメージングを行うことができる。
【００４４】
さらに、本発明では、用いるレーザーの強度を従来の１／１０程度で行うことができるため、細胞毒性を低減することができるという利点も有する。当該レーザーの強度は、０．０００１〜１０ｋＷ/ｃｍ２程度であることが好ましく、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）や細胞毒性等の観点から、０．０１〜０．５ｋＷ/ｃｍ２程度であることがより好ましい。
【００４５】
ＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングでは、光の回折限界よりも近接した場所において蛍光プローブ分子が発光することは好ましくないため、一度の測定において蛍光を発する状態のプローブ分子は、一定割合以下である必要がある。従って、上記平衡における化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の存在比は、中性条件の水系溶液中において、室温で、１：１００００〜１：１０であることが好ましく、１：１０００〜１：１００がより好ましい。特に、プローブ分子と求核付加−解離平衡反応を行う求核性化合物が、細胞内に数ｍＭオーダー前後の濃度で存在するグルタチオンである場合、このような存在比となるためには、上記求核付加−解離平衡の解離定数Ｋdが、０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲内が好ましく、ラベル化密度の向上の観点から０．１〜１００μＭの範囲内となることがより好ましい。当該解離定数は、Ｋd＝［平衡状態における（Ｉ）の濃度］[グルタチオンの濃度]／［平衡状態における（ＩＩ）の濃度］で表され、当該技術分野における周知の手法によって実験的に算出することができる。
【００４６】
また、検出器であるＣＣＤカメラ等のフレームレートに対応させるためには、蛍光状態の式（Ｉ）の化合物の寿命は、１マイクロ秒〜１秒の範囲であることが好ましく、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）の向上の観点から１ミリ秒〜１秒の範囲であることがより好ましい。そのような寿命の範囲となるためには、上記平衡における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、室温で、１〜１．０ｘ１０６ｓ−１の範囲であることが好ましく、１〜１０００ｓ−１の範囲であることがより好ましい。当該反応速度については、当該技術分野において公知のレーザーフラッシュフォトリシス等のシステムを用いて、ナノ秒レーザーによって蛍光プローブを励起し、ナノ秒〜ミリ秒オーダーの過渡吸収を測定することによって算出することができる。
【００４７】
上記求核付加−解離平衡反応において求核性分子として機能する化合物は、−ＳＨ基を含有する化合物であって、好ましくは、細胞内に存在する求核性分子であるグルタチオンである。ただし、ここで挙げたグルタチオンに限らず、分子内に−ＳＨ基を有する分子であれば、広くシステイン残基を有する化合物やペプチドを含むことができ、上記平衡反応が得られる限り、これらの化合物等についても本発明において用いることが可能である。また、上述のとおり、−ＳＨ基を含有する化合物に代えて、分子内に−ＯＨ基や−ＮＨ基等の求核性官能基を有する化合物、例えば、水、リジン残基等を有する化合物やペプチドを含むことができ、上記平衡反応が得られるものであれば本発明における求核性化合物として用いることが可能である。
【００４８】
上述のとおり、これら解離定数及び求核付加反応速度定数は、式（Ｉ）の化合物における置換基等として適切な組み合わせを選択する分子設計によって、より最適な解離定数及び反応速度を得ることもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
１．プローブ分子の合成
以下に示すとおり、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２、５、１２、１４、１６、１７、２８、３２、３３、３４、及び３５をそれぞれ合成した。【００５１】
［化合物2の合成］
以下のスキームに従って化合物2を合成した。なお、化合物１はKushida K et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (2012) 3908-3911に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
【化５】
2016136718.tif 000008
【００５２】
化合物1（23.8 mg, 0.056 mmol, 1 eq.）をTHF（5 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、-78 °Cで撹拌した。1.9 M フェニルリチウム ジブチルエーテル溶液（200 μl, 0.380 mmol, 7 eq.）をゆっくり加え、室温で1時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで3回抽出し、得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた化合物をメタノール（2 ml）に溶かし、水素化ホウ素ナトリウムを溶液の色が淡黄色になるまで加えた。水を加えて反応を停止し、ジクロロメタンで２回抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた化合物を脱酸素したジクロロメタン（5 ml）に溶かし、1,3-ジメチルバルビツール酸（185 mg, 1.17 mmol, 21 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（11 mg, 9 μmol, 0.2 eq.）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた化合物をクロラニル（23 mg, 0.094 mmol, 1.7 eq.）を加えて室温にて5分撹拌し、濃青紫色の反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 80/20）にて分離し、青紫色のフラクションを回収して溶媒を減圧留去し、さらにHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（1回目：A/B = 90/10 to 10/90, 25 min、2回目：A/B = 70/30 to 30/70, 25 min）、目的化合物2 (10.2 mg, 41%)を青紫色固体として得た。【００５３】
［化合物 4の合成］  
以下のスキームに従って化合物4を合成した。なお、化合物3及び化合物4の合成については、Y. Koide et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5029-5031.に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
【化６】
2016136718.tif 000009
化合物3（1.80 g, 4.37 mmol, 1 eq.）をTHF（100 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、−78 °Cで15分間撹拌した。1.1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液（9 ml, 9.9 mmol, 2.3 eq.）を15分間かけてゆっくり加えた。次いでジクロロジメチルシラン（700 μl, 5.75 mmol, 1.3 eq.）をTHF（5 ml）に希釈して加えて徐々に室温に戻し、2時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層を酢酸エチルで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 95/5 to 80/20）、目的化合物4 (852 mg, 63%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.28 (s, 3H) , 2.96 (s, 12H), 3.98 (s, 2H), 6.76 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.6, 39.3, 41.3, 114.2, 117.7, 128.6, 135.3, 136.2, 148.8.【００５４】
[化合物5の合成]
以下のスキームに従って化合物5を合成した。
【化７】
2016136718.tif 000010
化合物4（36.5 mg, 0.115 mmol, 1 eq.）をクロラニル（27 mg, 0.115 mmol, 1 eq.）を加えて室温にて10分撹拌し、濃青色の反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 80/20）にて分離し、青色のフラクションを回収して溶媒を減圧留去し、さらにHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 10/90, 25 min）、目的化合物5 (53.6 mg, 96%)を青色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ 0.50 (s, 6H), 3.30 (s, 12H), 6.89 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.80 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 309.17815, Found, 309.17801 (-0.1 mmu).【００５５】
[化合物6の合成]
以下のスキームに従って化合物6を合成した。
【化８】
2016136718.tif 000011
炭酸カリウム（7.46 g, 54.0 mmol, 2.0 eq.）をアセトニトリル（20 ml）に懸濁させ、3-ブロモ-N-メチルアニリン（4.96 g, 26.7 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（3.87 g, 31.3 mmol, 1.2 eq.）を加え、撹拌しながら90 °Cで終夜加熱還流した。反応混合物をセライトで濾過した後、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 98/2）、目的化合物6 (5.98 g, 99 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.95 (s, 3H), 3.91-3.93 (m, 2H), 5.15-5.21 (m, 2H), 5.79-5.89 (m, 1H), 6.63-6.65 (m, 1H), 6.82-6.86 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 38.1, 55.0, 110.9, 115.0, 116.4, 119.1, 123.5, 130.4, 133.1, 150.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 226.02259, Found, 226.02210 (-0.5 mmu).【００５６】
[化合物7の合成]
以下のスキームに従って化合物7を合成した。
【化９】
2016136718.tif 000012
化合物6（4.60 g, 20.4 mmol, 1 eq.）及び3-ブロモ-N,N-ジメチルアニリン（5.00 g, 25.0 mmol, 1.2 eq.）を酢酸（10 ml）に溶かし、37 % ホルムアルデヒド水溶液（6.30 ml, 227 mmol, 11 eq.）を加え、80 °Cまで徐々に昇温させた後、3時間加熱した。反応混合液から酢酸を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/ジクロロメタン = 80/20 to 70/30 to 60/40 to 50/50）、目的化合物7を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.92 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.88-3.90 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 5.15-5.20 (m, 2H), 5.83 (ddt, 1H, J = 14.8, 12.6, 4.9 Hz), 6.57-6.62 (m, 2H), 6.85 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.88 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 2.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, THF-d8): δ 38.2, 40.5, 40.6, 55.7, 112.6, 112.7, 116.3, 116.7, 116.8, 126.16, 126.17, 127.6, 127.7, 131.5, 131.6, 134.7, 150.1, 151.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.02225, Found, 437.02225 (±0.0 mmu).【００５７】
[化合物8の合成]
以下のスキームに従って化合物8を合成した。
【化１０】
2016136718.tif 000013
化合物7（900 mg, 2.05mmol, 1 eq.）をTHF（60 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、−78 °Cで15分間撹拌した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液（6.50 ml, 6.50 mmol, 3.2 eq.）を８分間かけてゆっくり加え、22分間撹拌した。次いでジクロロジメチルシラン（500 μl, 4.18 mmol, 2.0 eq.）のTHF（13 ml）溶液を加えて徐々に室温に戻し、3時間撹拌した。2 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 94/6）、目的化合物8 (382 mg, 55 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.927-2.93 (m, 9H), 3.90-3.91 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 5.12-5.20 (m, 2H), 5.85 (ddt, 1H, J = 17.2, 10.2, 5.2 Hz), 6.69-6.74 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 38.3, 39.2, 41.2, 55.9, 114.0, 114.2, 116.4, 117.4, 117.6, 128.56, 128.58, 134.3, 134.9, 135.3, 136.09, 136.13, 147.5, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 337.20945, Found, 337.20957 (+0.1 mmu).【００５８】
[化合物9の合成]
以下のスキームに従って化合物9を合成した。
【化１１】
2016136718.tif 000014
化合物8 (382 mg, 1.13 mmol, 1 eq.)を脱酸素したジクロロメタン（14 ml）に溶かし、1,3-ジメチルバルビツール酸（1.48 g, 9.48 mmol, 8.4 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（274 mg, 237 μmol, 0.2 eq.）を加え、室温にて終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 91/9 to 70/30）、目的化合物9 (289 mg, 86 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.85 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.94 (s, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 8.1, 2.6 Hz), 6.73 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 31.2, 39.4, 41.3, 113.3, 114.3, 117.4, 117.7, 128.6, 128.7, 135.4, 135.7, 136.1, 136.4, 147.1, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 297.17815, Found, 297.17853 (+0.4 mmu).【００５９】
[化合物11の合成]
以下のスキームに従って化合物11を合成した。なお、化合物10の合成については、J. Le Notre et al., Adv. Synth. Catal. 349, 432 (2007).に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
【化１２】
2016136718.tif 000015
化合物9（102.8 mg, 0.347 mmol, 1 eq.）及び化合物10（756.9 mg, 2.94 mmol, 8.5 eq.）をアセトニトリル（4 ml）に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（512 μl, 2.94 mmol, 8.5 eq.）及び少量のヨウ化カリウムを加え、80 °Cで5.5時間加熱還流した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 86/14 to 65/35）、目的化合物11 (91.7 mg, 56 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.45 (s, 6H), 1.93 (quin, 2H, J = 7.2 Hz), 2.41 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.90 (s, 3H), 2.94 (s, 6H), 3.34 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.95 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 6.68 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.74 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.31-7.36 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 22.4, 31.8, 38.6, 39.2, 41.2, 52.4, 66.4, 113.8, 114.2, 117.2, 117.3, 117.7, 128.3, 128.4, 128.5, 128.65, 128.67, 134.8, 136.0, 136.1, 136.2, 147.3, 148.8, 173.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 473.26188, Found, 473.26185 (-0.0 mmu).【００６０】
[化合物12の合成]
以下のスキームに従って化合物12を合成した。
【化１３】
2016136718.tif 000016
化合物11（171 mg, 0.361 mmol, 1 eq.）をメタノールに溶かし、パラジウム炭素を加え、水素雰囲気下、室温で2日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン（180.3 mg, 0.794 mmol, 2.2 eq.）を加え、室温で終夜撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物12 (110 mg, 61 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.54 (s, 6H), 1.95-2.02 (m, 2H), 2.45 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.73-3.77 (m, 2H), 6.98 (dd, 1H, J = 9.2, 2.7 Hz), 7.02 (dd, 1H, J = 9.1, 2.6 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.51 (m, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H, g), 7.87 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3CN): δ -1.3, 23.0, 31.1, 39.8, 41.4, 53.1, 115.06, 115.12, 122.3, 122.4, 128.25, 128.31, 144.0, 144.1, 148.42, 148.44, 155.68, 156.17, 160.6, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 381.19928, Found, 381.19929 (+0.0 mmu).【００６１】
[化合物14の合成]
以下のスキームに従って化合物14を合成した。なお、化合物13の合成については、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００３，  ２１，８６−８９に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
【化１４】
2016136718.tif 000017
化合物12（9.40 mg, 0.0190 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶かし、化合物13（7.5 mg, 0.0277 mmol, 1.5 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（9.1 mg, 0.0594 mmol, 3.1 eq.）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（6.6 mg. 0.0344 mmol, 1.8 eq.）、及びトリエチルアミン（10 μl, 0.0717 mmol, 3.8 eq.）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で21時間撹拌した後、化合物13（2.3 mg, 0.00850 mmol, 0.45 eq.）を加え、さらに24時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物14 (7.5 mg, 53 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.52 (s, 6H), 1.99-2.06 (m, 2H), 2.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.33 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.70-3.74 (m, 2H), 4.41 (s, 2H), 5.63 (s, 2H), 6.96-7.00 (m, 2H), 7.31 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.35 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.52 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.68-7.72 (m, 2H), 7.86 (s, 1H), 8.33 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 33.1, 39.5, 41.0, 43.8, 53.4, 70.8, 108.2, 115.3, 122.3, 122.4, 128.86, 128.95, 128.98, 130.2, 135.4, 141.0, 143.5, 144.5, 144.6, 149.0, 149.1, 153.7, 156.2, 156.8, 158.3, 161.09, 161.11, 161.7, 174.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 633.31163, Found, 633.31169 (+0.1 mmu).【００６２】
[化合物16の合成]
以下のスキームに従って化合物16を合成した。なお、化合物15の合成については、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，６１８４−６１９１に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
【化１５】
2016136718.tif 000018
化合物12（11.3 mg, 0.0228 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（1.5 ml）に溶かし、化合物15（9.1 mg, 0.0407 mmol, 1.8 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（6.1 mg, 0.0451 mmol, 2.0 eq.）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（7.2 mg. 0.0375 mmol, 1.6 eq.）、及びトリエチルアミン（14.3 μl, 0.103 mmol, 4.5 eq.）を0 °Cで加え、アルゴン雰囲気下で徐々に室温に戻し、終夜撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物16 (9.21 mg, 58 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 6H), 1.32-1.44 (m, 4H), 1.55 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.72 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.33 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.44 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.50-3.60 (m, 10H), 3.73 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 6.98-7.03 (m, 2H), 7.33 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H), 7.88 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 26.5, 27.7, 30.5, 33.2, 33.7, 39.6, 40.4, 41.0, 45.7, 53.4, 70.5, 71.21, 71.24, 72.2, 115.26, 115.29, 122.3, 122.4, 128.97, 129.00, 144.57, 144.60, 149.0, 149.1, 156.2, 156.8, 161.1, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 586.32262, Found, 586.32267 (+0.0 mmu).【００６３】
[化合物17の合成]
以下のスキームに従って化合物17を合成した。
【化１６】
2016136718.tif 000019
化合物12（7.0 mg, 0.0142 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（5 ml）に溶かし、N-ヒドロキシコハク酸イミド（8.7 mg, 0.0756 mmol, 5.3 eq.）及び1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（6.1 mg. 0.0318 mmol, 2.2 eq.）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で33時間撹拌した後、N-ヒドロキシコハク酸イミド（9.8 mg, 0.0852 mmol, 6.0 eq.）及び1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（11.1 mg. 0.0579 mmol, 4.1 eq.）を加え、さらに43時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物17 (1.7 mg, 20 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.53 (s, 6H), 2.10-2.17 (m, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.87 (s, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.80-3.84 (m, 2H), 6.98-7.04 (m, 2H), 7.34 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.71-7.74 (m, 2H), 7.89 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.5, 23.2, 26.5, 28.7, 39.5, 41.1, 52.6, 115.3, 115.4, 122.1, 122.4, 129.0, 129.1, 144.6, 144.8, 148.9, 149.4, 156.1, 156.9, 161.4, 170.2, 171.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 478.21566, Found, 478.21559 (-0.1 mmu).【００６４】
［化合物19の合成］
以下のスキームに従って化合物19を合成した。
【化１７】
2016136718.tif 000020
炭酸カリウム（11.96 g, 86.54 mmol, 2.5 eq.）をアセトニトリル(40 ml)に懸濁させ、3-ブロモアニリン（5.96 g, 34.65 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（21.89 g, 180.9 mmol, 5.2 eq.）を加え、撹拌しながら80 °Cで26時間加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 89/11）、目的化合物19（5.68 g, 22.5 mmol, 65 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.93-3.95 (m, 4H), 5.20-5.25 (m, 4H), 5.83-5.93 (m, 2H), 6.64-6.67 (m, 1H), 6.84-6.89 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.9, 115.0, 116.3, 119.1, 123.4, 130.3, 133.3, 149.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 252.03824, Found, 252.03819 (-0.1 mmu).【００６５】
[化合物21の合成]
以下のスキームに従って化合物21を合成した。
【化１８】
2016136718.tif 000021
アルゴンガスを封入したフラスコ内で化合物20（1.57 g, 6.22 mmol, 1 eq.）をトルエン（10 ml）に溶かし、N,N-ジメチルホルムアミド（700 μl, 9.04 mmol, 1.5 eq.）及び塩化ホスホリル（700 μl, 7.51 mmol, 1.2 eq.）を加え、80 °Cで3.5時間撹拌した。室温に戻した後、2N水酸化ナトリウム水溶液を加え、混合溶液からトルエンを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をメタノールに溶かし、0 °C下で水素化ホウ素ナトリウム(376.5 mg, 9.95 mmol, 1.6 eq.)を加え、10分間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 83/17 to 62/38）、目的化合物21（740 mg, 2.62 mmol, 42 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.89-3.90 (m, 4H), 4.59 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.0, 10.5, 4.8 Hz), 6.60 (dd, 1H, J = 8.5, 2.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 8.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 64.8, 111.4, 115.9, 116.4, 124.3, 127.1, 130.3, 133.2, 149.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 304.03075, Found, 304.03081 (+0.1 mmu).【００６６】
[化合物23の合成]
以下のスキームに従って化合物23を合成した。
【化１９】
2016136718.tif 000022
炭酸カリウム（9.53 g, 68.97 mmol, 2.1 eq.）をアセトニトリル（30 ml）に懸濁させ、アニリン（3.07 g, 32.96 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（10.28 g, 85.01 mmol, 2.6 eq.）を加え、撹拌しながら80 °Cで5時間加熱還流した。臭化アリル（2.58 g, 21.29 mmol, 0.6 eq.）を追加した後、80 °Cでさらに13時間撹拌及び加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 97/3）、目的化合物23（5.35 g, 30.9 mmol, 94 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.86-3.88 (m, 4H), 5.10-5.18 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.2, 10.3, 4.9 Hz), 6.64-6.68 (m, 3H), 7.14-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.8, 112.4, 116.0, 116.4, 129.1, 134.1, 148.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 174.12773, Found, 174.12867 (+0.9 mmu).【００６７】
[化合物25の合成]
以下のスキームに従って化合物25を合成した。
【化２０】
2016136718.tif 000023
化合物21（386.0 mg, 1.368 mmol, 1.1 eq.）及び化合物23（218.8 mg, 1.263 mmol, 1 eq.）を脱水ジクロロメタン（10 ml）に溶かし、0 °C下で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（500 μl, 4.051 mmol, 3.2 eq.）を少しずつ加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに3時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 88/12）、目的化合物25（395.2 mg, 0.903 mmol, 72 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.90-3.94 (m, 10H), 5.17-5.25 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.60 (dd, 1H, J = 8.6, 2.7 Hz), 6.67-6.70 (m, 2H), 6.93 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.9, 53.0, 111.9, 112.6, 116.06, 116.12, 116.3, 125.5, 128.4, 128.6, 129.6, 131.1, 133.7, 134.4, 147.2, 148.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15869, Found, 437.15873 (+0.0 mmu).【００６８】
[化合物26の合成]
以下のスキームに従って化合物26を合成した。
【化２１】
2016136718.tif 000024
アルゴンを封入したフラスコ内で化合物25（208.5 mg, 0.477 mmol, 1 eq.）を脱水テトラヒドロフラン（15 ml）に溶かし、撹拌しながら-78 °Cに冷却した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/ノルマルヘキサン溶液（1.0 ml, 1.0 mmol, 2.1 eq.）を少しずつ加え、10分間撹拌した。次いで脱水アセトン（210 μl, 2.85 mmol, 6.0 eq.）を少しずつ加え、-78 °Cのまま15分間撹拌した後、室温に戻し、さらに5時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、テトラヒドロフランを減圧除去した。得られた水相をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 89/11 to 68/32）、目的化合物26（125.8 mg, 0.302 mmol, 63 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.61 (s, 6H), 1.77 (s, 1H), 3.87-3.89 (m, 4H), 3.91-3.92 (m, 4H), 4.17 (s, 2H), 5.12-5.23 (m, 8H), 5.80-5.92 (m, 4H), 6.57 (dd, 1H, J = 8.5, 2.7 Hz), 6.62 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.94-6.98 (m, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 31.9, 38.0, 53.0, 53.2, 74.3, 110.3, 111.4, 112.7, 116.1, 116.2, 126.5, 129.4, 130.9, 134.0, 134.5, 134.6, 146.6, 146.9, 147.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 417.29004, Found, 417.29000 (-0.0 mmu).【００６９】
[化合物27の合成]
以下のスキームに従って化合物27を合成した。
【化２２】
2016136718.tif 000025
0 °C下で化合物26（188.5 mg, 0.452 mmol, 1 eq.）に80 %硫酸を加え、30分間撹拌した後、室温に戻し、さらに30分間激しく撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（177.2 mg, 0.445 mmol, 98 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.49 (s, 6H), 3.80 (s, 2H), 3.91-3.93 (m, 8H), 5.12-5.21 (m, 8H), 5.89 (ddt, 4H, J = 17.2, 10.3, 5.0 Hz), 6.57 (dd, 2H, J = 8.3, 2.6 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.6 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.3 Hz); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 29.4, 34.6, 40.6, 54.6, 110.7, 112.2, 116.3, 126.0, 129.1, 136.1, 146.7, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 399.27948, Found, 399.27955 (+0.1 mmu).【００７０】
[化合物28の合成]
以下のスキームに従って化合物28を合成した。
【化２３】
2016136718.tif 000026
1,3-ジメチルバルビツール酸（60.55 mg, 0.388 mmol, 27 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（7.8 mg, 0.00675 mmol, 0.47 eq.）を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン（7 ml）に溶かした化合物27（5.7 mg, 0.0143 mmol, 1 eq.）を加え、室温で終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、p-クロラニル（20.0 mg, 0.0813 mmol, 5.7 eq.）を加え、室温で1時間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物28（2.1 mg, 0.00599 mmol, 42 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.63 (s, 6H), 6.77 (dd, 2H, J = 8.7, 2.0 Hz), 7.08 (dd, 2H, J = 2.0, 0.8 Hz), 7.63 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 33.5, 42.6, 114.1, 116.0, 122.1, 141.6, 156.2, 159.5, 161.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 237.13862, Found, 237.13854 (-0.1 mmu).【００７１】
[化合物29の合成]
以下のスキームに従って化合物29を合成した。
【化２４】
2016136718.tif 000027
1,3-ジメチルバルビツール酸（2.99 g, 19.14 mmol, 25 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（181.0 mg, 0.157 mmol, 0.2 eq.）を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン（15 ml）に溶かした化合物27（307.0 mg, 0.770 mmol, 1 eq.）を加え、室温で4時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物29（157.0 mg, 0.65 mmol, 86 %）を得た。【００７２】
[化合物31の合成]
以下のスキームに従って化合物31を合成した。
【化２５】
2016136718.tif 000028
4-ブロモ酪酸（2.57 g, 15.39 mmol, 1 eq.）をジクロロメタン（20 ml）に溶かし、硫酸マグネシウム（7.74 g, 64.30 mmol, 4.2 eq.）、tert-ブチルアルコール（5.70 g, 76.95 mmol, 5 eq.）、及び濃硫酸（0.25 ml）を加え、室温で2日間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 50/50）、目的化合物31（1.17 g, 5.24 mmol, 47 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.27 (s, 9H), 1.91-1.98 (m, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 27.9, 28.0, 32.8, 33.7, 80.5, 171.7.【００７３】
[化合物32の合成]
以下のスキームに従って化合物32を合成した。
【化２６】
2016136718.tif 000029
化合物29（31.0 mg, 0.130 mmol, 1 eq.）をアセトニトリル（2 ml）に溶かし、化合物31（22.3 mg, 0.100 mmol, 0.8 eq.）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (113.3μl, 0.650 mmol, 5 eq.)、及び少量のヨウ化カリウムを加え、60 °Cで21時間撹拌した後、80 °Cでさらに7時間撹拌した。室温に戻した後、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン（10 ml）に溶かし、トリフルオロ酢酸（2 ml）を加え、室温で2時間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン（5 ml）及びメタノール（2 ml）に溶かし、p-クロラニル（34.1 mg, 0.139 mmol, 1.1 eq.）を加え、室温で30分間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物29（11.7 mg, 0.0268 mmol, 21 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.65 (s, 6H), 1.94-2.01 (m, 2H), 2.46 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.50 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.15 (br s, 1H), 7.61-7.66 (m, 2H), 8.05 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.2, 31.7,33.6, 43.5, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.4, 155.9, 159.6, 161.2, 176.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 323.17540, Found, 323.17538 (-0.0 mmu).【００７４】
[化合物33の合成]
以下のスキームに従って化合物33を合成した。
【化２７】
2016136718.tif 000030
化合物32（1.1 mg, 0.00252 mmol, 1 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（2 ml）に溶かし、0 °C下で3-アジドプロピルアミン（0.74 μl, 0.00756 mmol, 3 eq.）、 N,N-ジイソプロピルアミン（8.8 μl, 0.0504 mmol, 20 eq.）、及び O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（5.9 mg, 0.0155 mmol, 6.1 eq.）を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに13時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物33（1.0 mg, 0.00193 mmol, 77 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.66 (s, 6H), 1.76 (qui, 2H, J = 6.7 Hz), 1.99 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.35 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.35 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.1, 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.11 (brs, 1H), 7.62-7.67 (m, 2H), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.9, 29.7, 33.6, 33.8, 37.8, 40.4, 43.7, 43.7, 50.1, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.5, 155.9, 159.5, 161.3, 175.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 405.24028, Found, 405.23991 (-0.4 mmu).【００７５】
[化合物34の合成]
以下のスキームに従って化合物34を合成した。
【化２８】
2016136718.tif 000031
化合物32（1.15 mg, 0.00356 mmol, 1 eq.）及び化合物13（3.6 mg, 0.0133 mmol, 3.3 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（1.5 ml）に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（4.5 mg, 0.0235 mmol, 6.6 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.0 mg, 0.0148 mmol, 4.2 eq.）、及びトリエチルアミン（4.96 μl, 0.0356, 10 eq.）を加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに22時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物34（1.3 mg, 0.00189 mmol, 72 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.44-3.48 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 5.59 (s, 2H), 6.75-6.81 (m, 2H), 7.06-7.08 (m, 2H), 7.33 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.49 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.60-7.65 (m, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.16 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H, f), 1.98-2.05 (m, 2H, l), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz, m), 3.44-3.48 (m, 2H, k), 4.39 (s, 2H, o), 5.59 (s, 2H, r), 6.74-6.79 (m, 2H, c, h), 7.06-7.08 (m, 2H, b, i), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz, q), 7.48 (d, 2H, J = 8.0 Hz, p), 7.59-7.64 (m, 2H, d, g), 8.00 (s, 1H, t), 8.02 (s, 1H, e),; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).【００７６】
[化合物35の合成]
以下のスキームに従って化合物35を合成した。
【化２９】
2016136718.tif 000032
化合物32（2.3 mg, 0.00711 mmol, 1 eq.）及び化合物15（5.3 mg, 0.0237 mmol, 3.3 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（2 ml）に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（3.2 mg, 0.0167 mmol, 2.3 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.0 mg, 0.0222 mmol, 3.1 eq.）、及びトリエチルアミン（9.9 μl, 0.0711, 10 eq.）を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに2日間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物35（1.2 mg, 0.00187 mmol, 36 % yield）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.29-1.43 (m, 4H), 1.563 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 1.66 (s, 6H), 1.69-1.77 (m, 2H), 2.00 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.36 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.37-3.61 (m, 14H), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.8 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.62-7.64 (m, 2H), 8.06 (s, 1H);  HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 528.29875, Found, 528.29876 (+0.0 mmu).
【実施例２】
【００７７】
解離定数の算出
本発明のプローブ化合物について、グルタチオン添加に伴う吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化を測定し、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加−解離平衡反応における解離定数を算出した。【００７８】
図１〜５に、化合物２、５、１２、１４、１６の吸収スペクトル変化（左図）、蛍光スペクトル変化（中央図；励起波長：化合物２は５７０ｎｍ、化合物５、１４及び１６は６２０ｎｍ、化合物１２は６００ｎｍ）、及び吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）をそれぞれ示す。測定は、プローブ化合物が１μＭの１％ＤＭＳＯ水溶液で行った。得られた解離定数の値を以下の表１−１に示す。
【表１−１】
2016136718.tif 000033
【００７９】
同様に、図６及び７に、化合物２８及び３２の吸収スペクトル変化（左図）、蛍光スペクトル変化（中央図；励起波長５３０ｎｍ）、及び吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）をそれぞれ示す。測定は、プローブ化合物が１μＭの１％ＤＭＳＯ水溶液で行った。得られた解離定数の値を以下の表１−２に示す。
【表１−２】
2016136718.tif 000034
【００８０】
これら化合物の解離定数は、いずれも１〜１００μＭの範囲であり、細胞内と同程度である数ｍＭのグルタチオン濃度下において、その大部分が無蛍光性求核付加体として存在することが分かった。このことは、蛍光を発光する未反応のプローブ化合物と、グルタチオンと反応して消光した化合物との存在比率がＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングに適した範囲内であることを示している。
【実施例３】
【００８１】
反応速度の算出
レーザーフラッシュフォトリシスにより、種々のグルタチオン濃度における本発明のプローブ化合物の過渡吸収の経時変化を測定することによって、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数ｋ、求核付加反応速度時定数τを算出した。溶液条件は、１％ＤＭＳＯ水溶液、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＮａＰｉバッファー）である。測定条件は２９５Ｋで、光源は１０ｍＪ/ｐｕｌｓｅのＸｅＣｌエキシマーレーザー（３０８ｎｍ）である。化合物２、５、１２、２８、及び３２について得られた結果をそれぞれ表２〜６に示す。
【表２】
2016136718.tif 000035
【表３】
2016136718.tif 000036
【表４】
2016136718.tif 000037
【表５】
2016136718.tif 000038
【表６】
2016136718.tif 000039
【００８２】
表２〜表６の結果より、本発明のプローブ化合物は、グルタチオンとの間の求核付加がミリ秒オーダーの時定数で進行すること、及び、従来の１／１０以下の強度のレーザー照射下で超解像蛍光イメージングに適した蛍光明滅を示すことが明らかとなった。
【実施例４】
【００８３】
蛍光量子収率の測定
本発明のプローブ化合物について、蛍光量子収率を測定した。溶液条件は、プローブ化合物１μＭ、１％ＤＭＳＯ水溶液、ｐＨ７．４（２００ｍＭ  ＮａＰｉバッファー）である。化合物５、１２、１４、１６、１７、２８、及び３２について得られた結果を表７に示す。本発明のプローブ化合物は、ＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングに適した高い蛍光量子収率を示すことが明らかとなった。
【表７】
2016136718.tif 000040
【実施例５】
【００８４】
超解像多色イメージング
本発明のプローブ化合物でラベル化した抗体を用いて、細胞の超解像イメージングを行った。【００８５】
１．抗体へのプローブのラベル化
化合物５の末端にスクシンイミジルエステルを導入したプローブ化合物である化合物１７をＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭ及び１０ｍＭのストック溶液を調製した。β−チューブリンの間接免疫染色のためのヤギ由来・抗マウス二次抗体（ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＴｏｍ２０の間接免疫染色のためのヤギ由来・抗ウサギ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をそれぞれ、０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中で化合物１７と混和した（室温、３０分間）。プローブ化合物でラベル化した抗体を、溶離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  ＴＭ  Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。抗体に対するプローブ化合物の標識度（ＤＯＬ）として、プローブ化合物［ｍｏｌ］／抗体分子［ｍｏｌ］の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング（ＳＭＬＭ）においては、標識度が２．１であるラベル化抗マウス抗体及び標識度が１．３であるラベル化抗ウサギ抗体を使用した。【００８６】
化合物２８の末端にアジド基を導入したプローブ化合物である化合物３３についても、同様に抗体へのラベル化を行った。化合物３３及びジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭのストック溶液を調製した。β−チューブリンの間接免疫染色のためのヤギ由来・抗マウス二次抗体（ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中でＤＢＣＯ−ＮＨＳと混和した（室温、３０分間）。ＤＢＣＯ−ＮＨＳでラベル化した抗体（ＤＢＣＯ−ＩｇＧ）を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  ＴＭ  Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。次いで、得られたＤＢＣＯ−ＩｇＧを含む溶離液に、化合物３３のストック溶液を加え、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）中で混和した（室温、３０分間）。プローブ化合物でラベル化した抗体（ＤＢＣＯ−ＩｇＧ）を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  ＴＭ  Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。
抗体に対するプローブ化合物の標識度（ＤＯＬ）として、プローブ化合物［ｍｏｌ］／抗体分子［ｍｏｌ］の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング（ＳＭＬＭ）においては、標識度が１．４であるラベル化抗体を使用した。【００８７】
２．細胞固定及び免疫染色
アフリカミドリザルの腎臓に由来するベロ細胞を、フェノールレッド不含かつＬ−グルタミン含有のダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（ＧＩＢＣＯ社）にウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（和光純薬工業社）を添加した培地中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。イメージングを行う前日に、当該細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  ８ウェルチャンバーのカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に播種した。以下に挙げる文献を参考に、固定と免疫染色を以下のとおり行った。
・M. Bates, G. T. Dempsey, K. H. Chen, X. Zhuang, Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry 13, 99-107 (2012)
・B. Huang, S. A. Jones, B. Brandenburg, X. Zhuang, Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature methods 5, 1047-1052 (2008)
・C. Dellagiacoma et al., Targeted photoswitchable probe for nanoscopy of biological structures. Chembiochem 11, 1361-1363 (2010)
・D. R. Whelan, T. D. Bell, Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Scientific reports 5, 7924 (2015)【００８８】
メタノールによる固定及びβ−チューブリンの免疫染色は以下のとおり行った。事前に３７℃に温めたＰＢＳで細胞を洗浄し、５ｍＭのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む−２０℃のメタノールで５〜１０分間固定した。ＢＲＢ８０（１ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＥＧＴＡを含む８０ｍＭカリウムＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ６．８）で２〜３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で２０分間ブロッキングした後、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗β−チューブリン抗体（ＴＵＢ２．１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ４０２６、１／１００希釈）を加え、１時間振盪した。ＢＲＢ８０で５分間ずつ２回洗浄し、ブロッキングバッファーで２０分間ブロッキングした。次いで、ブロッキングバッファーで希釈したラベル化二次抗体（１０〜２０μｇ／ｍＬ）で３０分間染色し、ＢＲＢ８０又はＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。ＳＭＬＭイメージングを行う前に、バッファーを１〜１０ｍＭのＧＳＨ（和光純薬工業社）を含む０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換した。【００８９】
パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドによる固定、及びβ−チューブリン及びＴｏｍ２０の免疫染色は以下のとおり行った。事前に３７℃に温めたＰＢＳで細胞を洗浄し、３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間室温で固定した。直前に調製した０．１％水素化ホウ素ナトリウムのＰＢＳ溶液により、未反応のアルデヒド基及び固定操作の間に生成した蛍光性生成物を還元処理した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ及び０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液）で２０分間ブロッキング及び膜透過処理した。次いで、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗β−チューブリン抗体（ＴＵＢ２．１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ４０２６、／１００希釈）及び／又はウサギ抗Ｔｏｍ２０抗体(Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ１１４１５、１／５０希釈)を加え、３０分間振盪した。その後、試料を洗浄バッファー（０．２％ＢＳＡ及び０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液）で、１０分間ずつ３回洗浄した。ブロッキングバッファーで希釈したラベル化二次抗体（β−チューブリンでは１０〜２０μｇ／ｍＬ；Ｔｏｍ２０では１０μｇ／ｍＬ）で３０分間染色した。洗浄バッファーで１０分間ずつ３回洗浄し、さらにＰＢＳで１０分間洗浄し、３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで室温で１０分間、後固定した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。ＳＭＬＭイメージングを行う前に、バッファーを１〜１０ｍＭのＧＳＨ（和光純薬工業社）を含む０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換した。【００９０】
３．ＳＭＬＭイメージング
Ｎ−ＳＴＯＲＭ装置（ニコン社）を用いて、室温でＳＭＬＭイメージングを行った。プローブ化合物である化合物１７及び化合物３３の励起は、それぞれ６４７ｎｍ（４０〜５００Ｗ／ｃｍ２）及び５６１ｎｍ（４０〜５００Ｗ／ｃｍ２）のレーザー光を用いた全反射照明または全反射照明に近い遮光照明により行った。画像データは、１５ｍｓ／フレームまたは３０ｍｓ／フレームで記録し、画像統合ソフトウェア（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ニコン社）により解析することで超解像度画像を構築した。超解像度画像の表示にあたっては、１５０フォトン以上又は２００フォトン以上が検出された輝点のみを表示した。【００９１】
化合物１７でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングを行った結果を図８に示す。図８ａにおける右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。図８ｂは、図８ａの平均化画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｃは、図８ａの平均化画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｄは、図８ａの超解像度画像の上図を構成する輝点に関してその位置決定精度の度数分布を示したものである。【００９２】
図８に示した結果は、化合物１７でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管の超解像度イメージングを実証したものである。超解像度画像は、微小管の線幅及び近接する微小管どうしの分離において、平均化画像よりも高い空間分解能を示した。【００９３】
化合物３３でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングを行った結果を図９に示す。図９における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。【００９４】
図９に示した結果は、化合物３３でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管の超解像度イメージングを実証したものである。超解像度画像は、微小管の線幅及び近接する微小管どうしの分離において、平均化画像よりも高い空間分解能を示した。【００９５】
化合物１７でラベル化した抗体及び化合物３３でラベル化した抗体を組み合わせて用いることにより、固定ベロ細胞中における微小管及びミトコンドリアの２色でのＳＭＬＭイメージングを行った結果を図１０に示す。図１０における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。化合物３３でラベル化した抗体が緑色で示される微小管を染色しており、一方、化合物１７でラベル化した抗体は赤色で示されるミトコンドリアを染色している。これらの画像をマージすることによって、赤色及び緑色で示される２色での超解像画像が得られた。【００９６】
図１０の結果は、上記式（Ｉ）におけるＸの原子を変えた２種類の本発明のプローブ化合物を用いることによって、２色の超解像イメージングに適用できることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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