(57)【要約】【課題】専用の分析装置を必要としない高感度な測定を実現するイムノクロマトグラフキットを提供する。【解決手段】試料液を展開させる不溶性担体(２)、被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド(３)、第１の増幅液(４１)を不溶性担体(２)に送液する送液用パッド(４)、および不溶性担体(２)の他端に接触して配置された吸収パッド(５)を備え、不溶性担体(２)の標識保持パッド(３)と吸収パッド(５)との間に、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域(Ｌ１)、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域(Ｌ２)、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域(Ｌ３)を標識保持パッド側から順に有する検査用ストリップ(１)と、送液用パッド(４)の下方に配置された、第１の増幅液(４１)を封入した第１のポット(４０)と、吸収パッド(５)の上方に配置された、第２の増幅液(５１)を封入した第２のポット(５０)とをハウジングケース(９)内に備える。【選択図】図１
2016114122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
前記試料液を展開させる不溶性担体、該不溶性担体上に固定された前記被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、前記不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を前記不溶性担体に送液する送液用パッド、および前記不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、前記不溶性担体の前記標識保持パッドと前記吸収パッドとの間に、前記被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、前記第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、前記第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を前記標識保持パッド側から順に有する検査用ストリップと、
前記送液用パッドの下方に配置された、前記第１の増幅液を封入した第１のポットと、
前記吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
前記検査用ストリップ、前記第１のポット、および前記第２のポットを内包し、前記標識保持パッドを臨む試料液滴下用開孔を有するハウジングケースとを備えたイムノクロマトグラフキット。
【請求項２】
前記ハウジングケースが、前記試料液滴下用開孔を有する上部ケースと、前記検査用ストリップが配置される収容部を有する下部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される中間部材とを備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を流下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有する請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項３】
前記第１のポットおよび前記第２のポットが、それぞれシート部材を備えた一面を有している請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項４】
前記ハウジングケースが、前記試料液滴下用開孔を有する上部ケースと、前記検査用ストリップが配置される収容部を有する下部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される中間部材とを備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を流下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有し、
前記第１のポットおよび前記第２のポットが、それぞれシート部材を備えた一面を有しており、
前記中間部材の前記ポット収容部内に、前記第２のポットの前記シート部材を破断する突起部を、前記第２のポットの前記シート部材に面して備え、
前記突起部により前記シート部材が破断される位置まで、前記第２のポットを前記突起部に対して相対的に移動させる可動部材を備えた請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項５】
前記第１のポットの前記シート部材を備えた一面が前記送液用パッドに面して配置されており、
前記送液用パッドを介して前記第１のポットの前記シート部材と対向する位置に配置され、外部からの押圧力により、前記送液用パッドを押圧して変位させて、前記第１のポットの前記シート部材を破断させて前記第１のポットの内部に前記送液用パッドを押し込む可動部材を備えた請求項３または４に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項６】
前記標識保持パッドの少なくとも２辺がフィルム状固定部材により覆われて前記不溶性担体に固定されており、
前記標識保持パッドの、前記ハウジングケースの前記試料液滴下用開孔に臨む領域は、前記フィルム状固定部材に覆われていない請求項１から５のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項７】
前記第１の増幅液が、銀イオンのための還元剤液であり、
前記第２の増幅液が、銀イオンを含む溶液である請求項１から６のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項８】
前記第１の増幅液が、２価の鉄イオンを含む溶液である請求項１から７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項９】
前記第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質である請求項１から８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１０】
前記標識物質が金属コロイドである請求項１から９のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１１】
試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
前記試料液を展開させる不溶性担体、該不溶性担体上に固定された前記被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、前記不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を前記不溶性担体に送液する送液用パッド、および前記不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、前記不溶性担体上の前記標識保持パッドと前記吸収パッドとの間に、前記被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域を有する検査用ストリップと、
前記送液用パッドの下方に配置された、前記第１の増幅液を封入した第１のポットと、
前記吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
前記検査用ストリップ、前記第１のポット、および前記第２のポットを内包するハウジングケースとを備え、
前記ハウジングケースが、前記検査用ストリップが配置される収容部を備えた下部ケースと、該下部ケースと嵌合する上部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される流路形成部材とを備え、
前記流路形成部材は、前記不溶性担体の表面との間に、該不溶性担体上に滴下される前記第２の増幅液を前記検査領域上に導く間隙を形成する一面を有するものであり、
前記吸収パッドの吸水力が４５μL/分以上９０μL/分以下であり、
前記検査用ストリップにおいて前記送液用パッド側を上流、前記吸収パッド側を下流としたとき、前記不溶性担体の前記一端と前記吸収パッドの上流側の端との距離が４４ｍｍ以上６４ｍｍ以下であり、
前記流路形成部材の前記一面の上流側の端と、前記標識保持パッドの下流側の端との距離が１ｍｍ以上１９ｍｍ以下であるイムノクロマトグラフキット。
【請求項１２】
前記間隙が、０．０１ｍｍ以上１．００ｍｍ以下である請求項１１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１３】
前記標識保持パッドの上流側の端と前記送液用パッドの下流側の端との距離が１２ｍｍ以上３０ｍｍ以下である請求項１１または１２に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１４】
前記不溶性担体の前記一端と前記吸収パッドの上流側の端との距離が４９ｍｍ以上５９ｍｍ以下である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１５】
前記吸収パッドの吸水力が６５μL/分以上７５μL/分以下である請求項１１から１４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１６】
前記不溶性担体上の前記検査領域と前記吸収パッドとの間に、前記第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、前記第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を前記検査領域側から順に有する請求項１から５のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１７】
前記第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質である請求項１６に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１８】
前記上部ケースと前記下部ケースとの間に配置される中間部材を備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を前記不溶性担体上に滴下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有する請求項１１から１７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１９】
前記中間部材が、前記流路形成部材と一体的に形成されている請求項１８記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２０】
前記第２の増幅液が、前記不溶性担体の前記検査領域よりも下流側に滴下される請求項１から９いずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２１】
前記第１の増幅液が、銀イオンのための還元剤液であり、
前記第２の増幅液が、銀イオンを含む溶液である請求項１１から２０のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２２】
前記第１の増幅液が、２価の鉄イオンを含む溶液である請求項１１から２１のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２３】
前記標識物質が金属コロイドである請求項１１から２２のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出感度を高めるためのシグナル増幅操作を行うイムノクロマトグラフキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、簡易な被検物質検出方法として一般に広く利用されている。【０００３】
イムノクロマトグラフ法においては、被検物質が含まれているにも関わらず感度が低いために検出されず偽陰性を示すという問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる技術が提案されている。検出シグナルを増幅させる方法としては、増幅を触媒する液と増幅を行う液の２種類の液を用いる方法が知られている。特に、金属コロイドあるいは金属硫化物などからなる標識に、銀イオンを含む溶液および銀イオン還元剤を含む溶液を反応させて増感する方法が、高感度で簡便に被検物質量を測定する技術として有望である。このような増幅を用いたイムノクロマトグラフ法が特許文献１〜４などに記載されている。【０００４】
上記した検出シグナルの増幅方法においては、銀イオン還元剤を含む溶液のような増幅を触媒する液と、銀イオンを含む溶液のような増幅を行う液との２種類の液を供給するタイミング、液を供給する方法や供給位置を制御する必要がある。液の流れる方向や液の供給タイミングを規定しないと増幅反応が正常に行われなかったり、バックグラウンドシグナルが増大したりし、被検物質を適切に検出することができない場合がある。したがって、２種類の液を供給するタイミング、方法、位置を精度よく制御するには、専用装置を使用して測定を制御することが繰り返し再現性などの精度を保証する上で好ましい。【０００５】
特許文献１においては、増幅を行う液の展開方向を検体溶液の展開方向に対して９０°とする方法が採用されているが、液の供給タイミングについての詳細は言及されていない。他方、特許文献２には、上記の液の供給タイミングを規定して、再現性よく、高感度な検出を可能とする専用の分析装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−９９７２４号公報
【特許文献２】特開２０１２−１０３１５０号公報
【特許文献３】特開２０１３−２１３８０３号公報
【特許文献４】特開２０１４−０６６６７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載のような分析装置は、緊急災害時などの電気のインフラが停止した状況や、電気の通じていない環境では使用できない。したがって、このような非常時、あるいは分析装置が設置されていない環境下において、複数の液を利用した増幅技術による高感度な測定を行っても、良好な繰り返し再現性や精度よい測定が実現できないという問題がある。【０００８】
シグナル増幅のためには、イムノクロマトグラフ担体上の増幅させたい部位が上述の２液のうちの第１の液で満たされた後に、第２の液を供給して増幅させる場合がある。特許文献３には、第２の液の供給タイミングのずれによる増幅不良が生じることを防止するために、クロマトグラフ担体上の増幅させたい部位が第１の液で満たされていることを容易に確認できるように、第１の液を検出するための領域を設けたクロマトグラフキットが開示されている。
また、特許文献４には、特許文献３と同様の構成のクロマトグラフキットにおいて、被検試料のクロマトグラフ担体への添加と第１の液の添加タイミングを規定することにより、正常な増幅反応を行うことを可能とする方法が開示されている。【０００９】
一方で、特許文献３、４に記載のクロマトグラフキットにおいて、シグナル増幅のための第１および第２の液は、クロマトグラフキットのクロマトグラフ担体を内包するハウジングケースに設けられた充填孔から注入される構成となっており、第１および第２の液はハウジングケース内に一体としては構成されていない。【００１０】
しかしながら、イムノクロマトグラフキットとして、少なくとも測定に必要な化学物質として増幅のための液がキットに一体として構成されていないと、上述したような緊急災害時や、各種のインフラが停止した状況や、電気の通じていない環境や装置を設置していない環境などにおいての高感度な測定を実現することは難しい。【００１１】
第１の本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、専用の分析装置を必要としない高感度な測定を実現するイムノクロマトグラフキットを提供することを目的とする。【００１２】
また、上述のような信号増幅を行うイムノクロマトグラフ法においては、試料液、増幅のための２種類の液をイムノクロマトグラフ担体に供給する必要があり、増幅しない測定法の場合と比べて供給される液量が多い。したがって、イムノクロマトストリップの長さや液体を吸収するパッド（吸収パッド）の吸水力によっては、不当に検査時間が長くなってしまうという問題がある。病院など、診療現場で測定を行うＰＯＣＴ（Point of care testing）では、検査時間が長くなってしまうことは望ましくない。【００１３】
第２の本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、専用の分析装置を必要としない高感度な測定を、適切な検査時間内に実現するイムノクロマトグラフキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットは、試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
試料液を展開させる不溶性担体、不溶性担体上に固定された被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を不溶性担体に送液する送液用パッド、および不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、不溶性担体の標識保持パッドと吸収パッドとの間に、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を標識保持パッド側から順に有する検査用ストリップと、
送液用パッドの下方に配置された、第１の増幅液を封入した第１のポットと、
吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
検査用ストリップ、第１のポット、および第２のポットを内包し、標識保持パッドを臨む試料液滴下用開孔を有するハウジングケースとを備えたイムノクロマトグラフキットである。【００１５】
なお、ここで、第２の増幅液は第１の増幅液とは異なる溶液であり、第１の増幅液と共に標識物質に作用して標識からのシグナルを増幅する効果を奏するものである。【００１６】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットは、ハウジングケースを、開口を有する上部ケースと、検査用ストリップが配置される収容部を有する下部ケースと、上部ケースおよび下部ケースの間に配置される中間部材とからなるものとし、中間部材が、第２のポットを受容し、第２の増幅液を流下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有することが好ましい。【００１７】
上記において、第１のポットおよび第２のポットが、それぞれシート部材を備えた一面を有していることが望ましい。ここで、シート部材とは外的な押圧作用により破断可能なシートからなるものとする。【００１８】
このとき、中間部材のポット収容部内に、第２のポットのシート部材を破断する突起部を、第２のポットのシート部材に面して備え、
突起部によりシート部材が破断される位置まで、第２のポットを突起部に対して相対的に移動させる可動部材を備えていることが好ましい。
ここで、「相対的に移動させる」とは、第２のポットを突起部に向けて移動させるものであってもよいし、突起部を第２のポットに向けて移動させるものであってもよいし、さらには第２のポットおよび突起部の双方を互いに向けて移動させるものであってもよいことを意味する。【００１９】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットは、第１のポットのシート部材を備えた一面が送液用パッドに面して配置されており、
送液用パッドを介して第１のポットのシート部材と対向する位置に配置され、外部からの押圧力により送液用パッドを押圧して変位させて、第１のポットのシート部材を破断させて第１のポットの内部に送液用パッドを押し込む可動部材を備えていることが好ましい。【００２０】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットは、標識保持パッドの少なくとも２辺がフィルム状固定部材により覆われて不溶性担体に固定されており、標識保持パッドの、ハウジングケースの試料液滴下用開孔に臨む領域は、フィルム状固定部材に覆われていないことが望ましい。【００２１】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、第１の増幅液を銀イオンのための還元剤液とし、第２の増幅液を銀イオンを含む溶液とすることが好ましい。
ここで、第１の増幅液が、２価の鉄イオンを含む溶液であることが特に好ましい。【００２２】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、増幅指標領域に含まれる、第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質であることが好ましい。【００２３】
また、標識保持パッドに含まれる、不溶性担体上に固定された被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としては、金属コロイドが好ましい。【００２４】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットは、試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
試料液を展開させる不溶性担体、不溶性担体上に固定された被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を不溶性担体に送液する送液用パッド、および不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、不溶性担体上の標識保持パッドと吸収パッドとの間に、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域を有する検査用ストリップと、
送液用パッドの下方に配置された、第１の増幅液を封入した第１のポットと、
吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
検査用ストリップ、第１のポット、および第２のポットを内包するハウジングケースとを備え、
ハウジングケースが、検査用ストリップが配置される収容部を備えた下部ケースと、下部ケースと嵌合する上部ケースと、上部ケースおよび下部ケースの間に配置される流路形成部材とを備え、
流路形成部材は、不溶性担体の表面との間に、不溶性担体上に滴下される第２の増幅液を検査領域上に導く間隙を形成する一面を有するものであり、
吸収パッドの吸水力が４５μL/分以上９０μL/分以下であり、
検査用ストリップにおいて送液用パッド側を上流、吸収パッド側を下流としたとき、不溶性担体の一端と吸収パッドの上流側の端との距離が４４ｍｍ以上６４ｍｍ以下であり、
流路形成部材の上記一面の上流側の端と、標識保持パッドの下流側の端との距離が１ｍｍ以上１９ｍｍ以下である。【００２５】
なお、ここで、第２の増幅液は第１の増幅液とは異なる溶液であり、第１の増幅液と共に標識物質に作用して標識からのシグナルを増幅する効果を奏するものである。【００２６】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、第２の増幅液を検査領域上に導く上記間隙が、０．０１ｍｍ以上１．００ｍｍ以下であることが好ましい。【００２７】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、標識保持パッドの上流側の端と送液用パッドの下流側の端との距離が１２ｍｍ以上３０ｍｍ以下であることが好ましい。【００２８】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、不溶性担体の一端と吸収パッドの上流側の端との距離が４９ｍｍ以上５９ｍｍ以下であることが好ましい。【００２９】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、吸収パッドの吸水力が６５μL/分以上７５μL/分以下であることが好ましい。【００３０】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、不溶性担体上の検査領域と吸収パッドとの間に、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を検査領域側から順に有することが好ましい。【００３１】
上記増幅指標領域に含まれる、第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質であることが好ましい。【００３２】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、上部ケースと下部ケースとの間に配置される中間部材を備え、中間部材が、第２のポットを受容し、第２の増幅液を不溶性担体上に滴下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有することが好ましい。【００３３】
なお、中間部材は、流路形成部材と一体的に形成されていることが好ましい。【００３４】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、第２の増幅液を、不溶性担体の検査領域よりも下流側に滴下されるように構成することが好ましい。【００３５】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、第１の増幅液を銀イオンのための還元剤液とし、第２の増幅液を銀イオンを含む溶液とすることが好ましい。【００３６】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、第１の増幅液を２価の鉄イオンを含む溶液とすることが好ましい。【００３７】
また、標識保持パッドに含まれる、不溶性担体上に固定された被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としては、金属コロイドが好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
第１の本発明のイムノクロマトグラフキットは、シグナル増幅のための第１の増幅液が封入された第１のポットおよび第２の増幅液が封入された第２のポットを検査ストリップと共にハウジングケース内に備えているので、第１および第２の増幅液を外部から注入するために別途用意する必要がなく１本のイムノクロマトグラフキットのみでシグナル増幅による高感度な検出を行うことができる。また、不溶性担体に第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を備えており、第２の増幅液の供給タイミングを視覚的に認識することができるため、専用の分析装置がなくても、増幅反応を正常に行うことができる。したがって本発明のイムノクロマトグラフキットは専用の分析装置を備えていない、あるいは分析装置が使用できない非常時、災害時等において特に有用である。【００３９】
また、第１の増幅液のポットを送液用パッドの下方に備えた構成であるため、第１の増幅液の送液は、送液用パッドを第１の増幅液中に浸すことにより、送液用パッド中を毛細管現象により浸透して、標識保持パッド側へと展開させることができるので、送液用パッドの内部から第１の増幅液を展開させることができる。送液用パッドの上方から増幅液を滴下させる場合に比して、不溶性担体の内部に確実に第１の増幅液を浸透させることができ、より高い増幅効果を得ることができる。【００４０】
第２の本発明のイムノクロマトグラフキットは、シグナル増幅のための第１の増幅液が封入された第１のポットおよび第２の増幅液が封入された第２のポットを検査用ストリップと共にハウジングケース内に備えているので、第１および第２の増幅液を外部から注入するために別途用意する必要がなく１本のイムノクロマトグラフキットのみでシグナル増幅による高感度な検出を行うことができる。本発明のイムノクロマトグラフキットは専用の分析装置を備えていない、あるいは分析装置が使用できない非常時、災害時等において特に有用である。【００４１】
また、第１の増幅液のポットを送液用パッドの下方に備えた構成であるため、第１の増幅液の送液は、送液用パッドを第１の増幅液中に浸すことにより、送液用パッド中を毛細管現象により浸透させて標識保持パッド側へと展開させることができるので、送液用パッドの内部から第１の増幅液を展開させることができる。送液用パッドの上方から増幅液を滴下させる場合に比して、不溶性担体の内部に確実に第１の増幅液を浸透させることができ、より高い増幅効果を得ることができる。【００４２】
ハウジングケースが、検査用ストリップが配置される収容部を備えた下部ケースと、下部ケースと嵌合する上部ケースと、上部ケースおよび下部ケースの間に配置される流路形成部材とを備え、流路形成部材は、不溶性担体の表面との間に、不溶性担体上に滴下される第２の増幅液を検査領域上に導く間隙を形成する一面を有するものであり、吸収パッドの吸水力が４５μL/分以上９０μL/分以下であり、検査用ストリップにおいて送液用パッド側を上流、吸収パッド側を下流としたとき、不溶性担体の一端と吸収パッドの上流側の端との距離が４４ｍｍ以上６４ｍｍ以下であり、流路形成部材の上記一面の上流側の端と、標識保持パッドの下流側の端との距離が１ｍｍ以上１９ｍｍ以下であるので、検査時間が長くなりすぎることなく、ＰＯＣＴに適した検査時間を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のイムノクロマトグラフキットの一実施形態の態様を示す分解概略斜視図である。
【図２】検査用ストリップおよび流路形成部材と一体的に形成された中間部材の位置関係を示す概略側面図である。
【図３Ａ】イムノクロマトグラフキットのハウジングケースの試料液滴下用開孔の部分を示す概略平面図である。
【図３Ｂ】イムノクロマトグラフキットのハウジングケースの試料液滴下用開孔の部分を示す概略平面図である。
【図４】図１に示すイムノクロマトグラフキットの可動部材の押圧前の概略断面図である。
【図５】図１に示すイムノクロマトグラフキットの可動部材の押圧後の概略断面図である。
【図６】図１に示すイムノクロマトグラフキットの中間部材の上部ケース側の構成を示す概略斜視図である。
【図７】図１に示すイムノクロマトグラフキットの中間部材の下部ケース側の構成を示す概略斜視図である。
【図８】図１に示すイムノクロマトグラフキットの中間部材の下部ケース側の面を示す概略底面図である。
【図９】イムノクロマトグラフキットの第１の可動部材の一態様を示す概略断面図である。
【図１０】イムノクロマトグラフキットの第１の可動部材の他の態様を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。なお、視認しやすくするため、図面中の各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜変化させてある。なお、以下に説明する本実施形態は、第１の本発明の実施形態であり、また、第２の本発明の実施形態でもある。
【００４５】
図１は、本発明の実施形態にかかるイムノクロマトグラフキット１００の分解概略斜視図である。
図１に示すように、本実施形態のイムノクロマトグラフキット１００は、試料液を展開させるための不溶性担体２を含む検査用ストリップ１と、シグナル増幅のための第１の増幅液を封入した第１のポット４０と、第２の増幅液を封入した第２のポット５０とが、ハウジングケース９に内包されてなる。ハウジングケース９は、不溶性担体２が載置される不溶性担体収容部１１を備えた下部ケース１０と、下部ケース１０と嵌合する上部ケース２０と、上部ケース２０と下部ケース１０との間に配置される流路形成部材６５とを備えている。なお、本実施形態においては、上部ケース２０は、検査用ストリップ１上の所定位置に試料液滴下用開孔２１を有するものである。
【００４６】
図２は検査用ストリップ１および流路形成部材６５の配置を示す概略側断面図である。
流路形成部材６５は、不溶性担体２の表面２Ｓとの間に、不溶性担体２上に滴下される第２の増幅液を後述の検査領域上に導く間隙６０を形成する一面６２を有するものであり、本実施形態においては、第２のポット５０を受容し、第２の増幅液５１を不溶性担体２上に滴下させるための増幅液充填孔３４を底面に備えたポット収容部３２を有している中間部材３０と一体的に形成されている。なお、ポット収容部３２を有する中間部材３０と、流路形成部材６５とは、別体として構成されていてもよいが、一体的に構成されていることにより、部品数を抑制することができ好ましい。以下、本実施形態においては、中間部材３０は流路形成部材６５を含むものとして、すなわち、流路形成部材６５は中間部材３０の一部を構成するものとして説明する。すなわち、本実施形態においては、ハウジングケース９は、検査用ストリップ１が載置されるストリップ収容部１１を有する下部ケース１０と、検査用ストリップ１上の所定位置に試料液滴下用開孔２１を有する上部ケース２０と、下部ケース１０と上部ケース２０との間に配置される中間部材３０とにより構成される。
【００４７】
図１においては、内部を理解しやすくするためにハウジングケース９が上部ケース２０、中間部材３０および下部ケース１０の部品に分けて示されているが、実際に使用する際は、これらの部品を嵌合させて一体として使用する。
【００４８】
検査用ストリップ１は、図２に示すように、試料液を展開させる不溶性担体２と、不溶性担体２上に固定された被検物質に結合可能な第１の物質で修飾された標識物質を含む標識保持パッド３と、不溶性担体２の一端２ａに接触して配置された第１の増幅液４１を不溶性担体２に送液する送液用パッド４と、不溶性担体２の他端に接触して配置された吸収パッド５とを備えている。不溶性担体２はバック粘着シート７上に固定されて支持されている。そして、不溶性担体２は、標識保持パッド３と吸収パッド５との間に、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域Ｌ１、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域Ｌ２、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域Ｌ３を標識保持パッド３側から順に有する。
【００４９】
なお、本明細書において検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３が形成されてなる不溶性担体２をクロマトグラフ担体と称する場合がある。また、本明細書においては、図１、２記載のように送液用パッド４側を上流、吸収パッド５側を下流として定義している。また、図１の紙面における上下方向により上部、下部を定義する。
【００５０】
本実施形態においては、不溶性担体２の上記一端２ａである上流側の端（以下において、上流端２ａ）と吸収パッド５の上流側の端（上流端）５ａとの距離Ａは４４ｍｍ以上６４ｍｍ以下である。この距離Ａが４４ｍｍ以上であれば、増幅後の感度が良好であり、６４ｍｍ以下であれば、検査時間を１５分以下とすることが可能となるため、好ましい。より好ましい範囲は４９ｍｍ以上５９ｍｍ以下である。
【００５１】
本実施形態においては、吸収パッド５の吸水力は、４５μL/分以上９０μL/分以下である。吸収パッド５としては、不溶性担体２に供給された試料液と、第１の増幅液４１、および第２の増幅液５１を吸収し、短時間で検査を完了させるために吸収速度の速い（吸水力の大きい）パッドを使用する必要がある。４５μL/分以上であれば、検査時間を１５分以下とすることが可能となり、９０μL/分以下であれば、吸収パッドとしての厚みが嵩みすぎることなくコンパクトなキットを構成できるため好ましい。より好ましい範囲は６５μL/分以上７５μL/分以下である。なお、吸水力の定義および測定方法については後記する。
【００５２】
流路形成部材６５の、不溶性担体２の表面２Ｓとの間に間隙６０を形成する一面６２の上流側の端（上流端）６４と、標識保持パッド３の下流側の端（下流端）３ｂとの距離Ｂが、１ｍｍ以上１９ｍｍ以下である。この距離Ｂが１ｍｍ以上であれば、標識保持パッド３上に滴下される試料液が間隙６０に入り込むのを抑制することができ、増幅異常の発生を回避できるので好ましく、１９ｍｍ以下であれば、検査時間を１５分以内とすることが可能となるので好ましい。なおここで、一面６２の上流端６４は不溶性担体２の表面２Ｓと流路形成部材６５の一面６２より形成される間隙６０の上流端と一致する。
【００５３】
流路形成部材６５の一面６２と不溶性担体２の表面２Ｓとの間隙６０の距離Ｄは、第２の増幅を濃度ムラがなく均一にしかも迅速に実施することを可能とするために、この間隙６０内を第２の増幅液により均一に濡らし、間隙６０内を第２の増幅液により迅速に満たす必要がある。これを実現するためには、この間隙６０の距離Ｄを、０．０１ｍｍ以上１．００ｍｍ以下とすることが好ましい。
【００５４】
標識保持パッド３の上流側の端（上流端）３ａと送液用パッド４の下流側の端（下流端）４ｂとの距離Ｃは、１２ｍｍ以上３０ｍｍ以下であることが好ましい。この距離Ｃが１２ｍｍ以上であると、試料液と第１の増幅液４１が混合することによる増幅のムラの発生がなく好ましく、３０ｍｍ以下であれば、検査時間を短縮化することができるので、好ましい。
【００５５】
不溶性担体２としては、例えば、ニトロセルロースメンブレンなどを使用することができる。また、不溶性担体２が固定されるバック粘着シート７とは、不溶性担体２が貼り付けられる面が粘着面であるシート状基材である。
不溶性担体中の試料液の移動速度は、毛細管流動速度（キャピラリーフローレート）として、水が４ｃｍの不溶性担体２中を流れるのに要する時間を測定して求めた１ｃｍ移動するのに要する時間で定義される。本実施形態においては、キャピラリーフローレートが１２０〜１８０秒／ｃｍの不溶性担体を用いることが好ましい。１２０秒／ｃｍ以上であれば、検査領域上の第２の物質と被検物質とを十分に反応させること、および、標識物質を修飾した第１の物質に結合可能な物質と第１の物質とを十分に反応させることが可能となり好ましい。一方、キャピラリーフローレートが１８０秒／ｃｍ以下であれば、試料液の不溶性担体中の移動を迅速に行うことが可能であり、検査時間が１５分以内に完了する迅速処理が可能となり、好ましい。
不溶性担体２は、長手方向に５０ｍｍ以上７０ｍｍ以下程度の長さを有することが好ましい。
【００５６】
標識保持パッド３は、不溶性担体２の長手方向中央部に固定されている。標識物質は、例えば、直径５０ｎｍの金コロイド（ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社製）を用いることが可能である。標識物質の表面は、被検物質と結合する物質で修飾することにより、被検物質との結合体を形成することが可能である。
標識物質は上記に限るものではなく、通常のクロマトグラフ法に用いることができる金属硫化物、免疫凝集反応に用いられる着色粒子などを使用することができ、特には、金属コロイドが好ましい。金属コロイドとしては、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、特に、適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点でこのましく、その中でも金コロイドが最も好ましい。
【００５７】
図２に示すように、標識保持パッド３は、その上流側と下流側の２辺が、封止フィルム等からなるフィルム状固定部材６で不溶性担体２に固定されていることが好ましい。フィルム状固定部材６で覆われていない部分が、被検物質溶液（試料液）を点着する領域に相当する。なお、標識保持パッド３が固定される２辺は図２に示す上流側と下流側に限るものではなく、不溶性担体の長さ方向に平行な２辺であってもよい。また、標識保持パッド３のフィルム状固定部材６に覆われて不溶性担体に固定されている辺は２辺のみに限らず、３辺あるいは４辺全てであってもよい。
【００５８】
標識保持パッド３を、少なくとも２辺で不溶性担体に固定化することで、検査用ストリップ１を作製する段階での取り扱い性が向上すると共に、輸送時、使用時など、不慮の衝撃を受けた場合にずれて、測定精度が悪化することがない。また、少なくとも２辺をフィルム状固定部材６により覆って不溶性担体２に固定化することにより、標識保持パッド３に滴下される試料液（被検物質溶液）が、標識保持パッド３からこぼれてしまうことがなく、すべての試料液を、標識保持パッド３を経由させて不溶性担体２に移行させることができるので試料液を有効に測定に供することが可能になる。
【００５９】
なお、検査用ストリップ１の上部ケース２０の試料液滴下用開孔２１に臨む領域は全域が標識保持パッド３となるように上部ケース２０および検査用ストリップ１の位置を規定することが好ましい。また、標識保持パッド３を不溶性担体２上に固定するフィルム状固定部材６は、図３Ａに示すように、上部ケース２０の試料液滴下用開孔２１から視認される標識保持パッド３の領域がフィルム状固定部材６で覆われることがないように、フィルム状固定部材６の貼付位置を定めることが特に望ましい。図３Ｂに示すように、上部ケース２０の試料液滴下用開孔２１から視認される標識保持パッド３が一部フィルム状固定部材６で覆われている場合と比べて開孔２１から滴下した試料液を全て標識保持パッド３上に滴下することが可能となり、試料液中の全ての被検物質を無駄にすることなく標識化することが可能になる。
【００６０】
なお、フィルム状固定部材６が流路形成部材６５側に延びて配置されていても、フィルム状固定化部材は不溶性物質であるため、フィルム状固定化部材を通して試料液が流路形成部材６５と不溶性担体２との間隙６０に入ることはない。
【００６１】
検査領域Ｌ１は、被検物質に結合する第２の物質を含み、被検物質と結合した標識物質が被検物質を介して補足される標識物質補足領域である。例えば、インフルエンザＡ型ウィルスあるいはそのバイオマーカーを被検物質として検出したい場合には、例えば、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ＳＰＴＮ−５  ７３０７、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）が物理吸着によりライン状に固定化されている抗体固定化ラインにより検査領域Ｌ１を構成する態様が好ましい。
この検査領域Ｌ１に被検物質と第１の物質を介して標識物質が結合した複合体が到達すると第２の物質と被検物質が特異的に結合し、被検物質と第１の物質を介して標識物質が補足されることとなる。一方、被検物質との複合体を構成していない標識物質は、検査領域Ｌ１に補足されることなく通過する。
【００６２】
確認領域Ｌ２は、第１の物質に結合可能な物質を含み、標識保持パッド３から試料液と共に不溶性担体２中を展開され、検査領域Ｌ１を通過した標識物質が第１の物質を介して補足され、試料液の展開の完了を確認するための領域である。例えば、インフルエンザＡ型ウィルスあるいはそのバイオマーカーを被検物質として検出したい場合には、例えば、抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギＦ（ａｂ'）２、品番５６６−７０６２１、和光純薬工業(株)社製）が物理吸着によりライン状に固定化されている態様が好ましい。
【００６３】
増幅指標領域Ｌ３は、第１の増幅液４１と反応する物質を含み、第１の増幅液４１と反応して発色もしくは色が変化することにより、第１の増幅液４１がその領域まで展開されたことを示し、第２の増幅液５１の滴下のタイミングの指標となる領域である。例えば、第１の増幅液４１として、硝酸鉄水溶液とクエン酸（和光純薬工業（株）社製、０３８−０６９２５）の混合水溶液を使用する場合には、ブロモクレゾールグリーン(和光純薬工業（株）社製)がライン状に固定化された発色試薬固定化ラインにより増幅指標領域Ｌ３を構成する態様が好ましい。このとき第１の増幅液４１が増幅指標領域Ｌ３に到達すると、領域Ｌ３は緑色からオレンジ色へと変化する。この変色は、検査領域Ｌ１および確認領域Ｌ２が第１の増幅液４１により十分に満たされたことの指標として捕えることができる。
【００６４】
第１の増幅液４１と反応する物質とは、第１の増幅液４１を検出するための発色試薬であり、例えば、イオンに反応して発色する化合物を使用することが好ましい。第１の増幅液４１の詳細については後記するが、例えば、第１の増幅液４１が、２価の鉄イオン（Fe2+）を含む場合には、その発色試薬としては、Fe2+イオンと反応して発色する化合物を使用することができる。Fe2+イオンと反応して発色する化合物としては、Fe2+イオンと錯形成することで発色できる化合物を使用することができる。Fe2+イオンと反応して発色する化合物の具体例としては、フェナントロリン骨格を有する化合物［例えば、1,10-フェナントロリン、5-メチルフェナントロリン、5-ニトロフェナントロリン、バソフェナントロリン（4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン）、またはバソフェナントロリンジスルホン酸など］、あるいはビピリジン骨格を有する化合物［例えば、2,2'-ビピリジンなど］を使用することができ、好ましくはフェナントロリン骨格を有する化合物を使用することができる。また、被検物質を含む水溶液と第１の増幅液４１のｐＨが異なる場合には、第１の増幅液４１を検出するために、プロトンにより構造変化が生じて色味が変化する試薬を使用することが好ましい。特に第１の増幅液４１が酸性(ｐＨ７より小さい、プロトン濃度が高い)である場合には、酸性領域用のｐＨ指示薬として公知の発色試薬であるH+イオンと反応して発色する化合物(例えば、メチルオレンジ、メチルレッド、コンゴーレッドおよびメチルイエローなどのジアゾ系の発色試薬、並びに、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープルおよびブロモチモールブルーなどのサルトン系の発色試薬)等を、増幅試薬を含む水溶液のｐＨに合わせて適宜選択して使用することが好ましい。上記の中でも、1,10-フェナントロリン、バソフェナントロリンまたはブロモクレゾールグリーンを使用することがより好ましい。
【００６５】
さらに、イムノクロマトグラフキット１００を構成する各部品の構成および部品が一体化された構成並びにその使用形態について説明する。
図４および図５は、イムノクロマトグラフキット１００のシグナル増幅前および増幅後の態様を示す概略断面図であり、図６は中間部材３０の上面（上部ケース側）を臨む斜視図、図７および図８は中間部材３０の下面（下部ケース側）を臨む概略斜視図および概略底面図である。
【００６６】
第１の増幅液４１が封入された第１のポット４０は、例えば樹脂材料から構成された一面に開口を有する容器４２に増幅液４１が充填され、その容器４２の開口を破断可能なシート部材４３により覆って封止してなるものである。
【００６７】
第２の増幅液５１が封入された第２のポット５０も同様に、例えば樹脂材料から構成された一面に開口を有する容器５２に第２の増幅液５１が充填され、その容器５２の開口を破断可能なシート部材５３により覆って封止してなるものである。
第１のポット４０および第２のポット５０におけるシート部材４３、５３としては、アルミ箔やアルミラミシートなどが好適に使用される。
【００６８】
金属コロイドなどの金属系標識物質のシグナルを増幅させる方法としては、標識物質に銀イオンおよび銀イオンのための還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させ、その銀粒子が標識物質を核として標識物質上に沈着することにより標識物質によるシグナルを増幅させる方法（以下において、銀増幅）を用いることが好ましい。
銀増幅を実現させるために、第１の増幅液４１としては、銀イオンのための還元剤を含む還元剤液を、第２の増幅液５１としては銀イオンを含む溶液を用いればよい。
【００６９】
第１の増幅液４１として好ましい態様である銀イオンのための還元剤としては、銀イオンを銀に還元することができれば、無機、有機のいかなる材料または混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Ｆｅ２＋、Ｖ２＋、Ｔｉ３＋などの金属イオンで原子価の変化しうる還元性金属塩、還元性金属錯塩を挙げることができる。無機還元剤を用いる場合には、酸化されたイオンを錯形成するか還元することにより、除去するか還元性への影響を排除する必要がある。例えば、Ｆｅ２＋を還元剤として用いる場合には、クエン酸やＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid:エチレンジアミン四酢酸）を用いて亜酸化物であるＦｅ３＋の錯体を形成し、還元性への影響を排除することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、Ｆｅ２＋の金属塩が特に好ましい。
還元剤の他の例については、特開２０１４−６６６７４号公報等の記載を参照できる。
【００７０】
第２の増幅液５１として好ましい銀イオンを含む溶液としては、溶媒中に銀イオン含有化合物が溶解されているものである。銀イオン含有化合物としては有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、無機銀塩もしくは銀錯体である。無機銀塩としては、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物を使用することが可能であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀などが挙げられる。
【００７１】
図１および図４に示すように、下部ケース１０と中間部材３０とは、中間部材３０に形成された係合突起部３６が、下部ケース１０に形成された係合口であって係合突起部３６に対応する係合口１６に挿入されることにより係合される。そして、下部ケース１０と上部ケース２０とは、下部ケース１０と中間部材３０とが係合された状態で、上部ケース２０の４隅に形成された嵌合突起部２９が、下部ケース１０に形成された嵌合口であってそれらの嵌合突起部２９にそれぞれ対応する嵌合口１９に挿入されて嵌合される。
【００７２】
下部ケース１０には、検査用ストリップ１が配置される収容部として、不溶性担体２が載置される不溶性担体収容部１１およびその下流側に吸収パッド５が載置される吸収パッド収容部１３が設けられている。また、不溶性担体収容部１１の上流側には第１のポット４０が収容される第１のポット収容部１２が設けられている。
検査用ストリップ１は下部ケース１０内の収容部に載置され、第１のポット収容部１２には、第１のポット４０が、そのシート部材４３を有する面が上面となるように配置されており、そのシート部材４３の表面に検査用ストリップ１の送液用パッド４が配置される。
【００７３】
図１〜図８に示すように、中間部材３０は、第２のポット５０を受容し、第２の増幅液５１を不溶性担体２上に滴下させるための増幅液充填孔３４を底面に備えたポット収容部３２を有している。また、ポット収容部３２内の第２のポット５０のシート部材５３に面する位置にシート部材５３を破断する突起部３３が設けられている。本例においては、ポット収容部３２の上方に第２のポット５０が、そのシート部材５３を有する面が下面となるように配置されており、そのシート部材５３に対向するポット収容部３２の底面に突起部３３が設けられている。中間部材３０を下部ケース１０に装着する際に、第２のポット５０のシート部材５３が突起部３３により破られないように、第２のポット５０と中間部材３０のポット収容部３２の底面との間に、例えばバネ部材を挿入して、第２のポット５０が上部ケース２０側に付勢されるように構成されていてもよい。
【００７４】
また中間部材３０の増幅液充填孔３４に隣接する部分には増幅液充填孔のリブ３５が設けられており、ポット収容部３２の裏面側には、下部ケース１０と係合する際に、吸収パッド５の押さえとなる吸収パッド押さえ突起３７が備えられている。そして、このリブ３５に連続して中間部材３０の一部として流路形成部材６５の一面６２が形成されている。なお、中間部材３０は、この一面６２が検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３の上方に位置するように配置されるものであり、この一面６２は、検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３を上方から視認可能とするために、透明な材料で形成されており、観察窓６１の一面を兼ねている。
【００７５】
上部ケース２０の上面の中間部には、既述の通り試料液滴下用開孔２１が設けられており、この開孔２１から検査用ストリップ１の標識保持パッド３上に試料液を滴下する。開孔２１と標識保持パッド３との位置が一致するように、標識保持パッド３の位置を調整することで、標識保持パッド３上に確実に試料液を点着することが可能となる。
上部ケース２０の、中間部材３０の観察窓６１に対応する位置は開口２８とされており、観察窓６１からの視認性を妨げないように構成されている。
【００７６】
また、上部ケース２０の、下部ケース１０のポット収容部１２に対応する位置には、細い矩形の開口からなる差込口２３が設けられており、その差込口２３に挿入可能とされた柱状部２２ａを有する第１の可動部材２２が、その柱状部２２ａの先端が差込口２３に挿入された状態で保持されている。第１の可動部材２２は、力を加えることによって下部に押し込むことができるように構成されており、可動部材２２を押し込むことによって、送液用パッド４を押圧して変位させて、第１の増幅液が封入された第１のポット４０のシート部材を破断させて第１のポット内部に送液用パッドを押し込み、送液用パッドを第１の増幅液に浸らせることができる。この状態で、送液用パッドを通じて、第１の増幅液を不溶性担体上に展開することが可能となる。
【００７７】
可動部材２２の柱状部２２ａの先端が差込口２３に挿入された状態で、かつ外力を加えて押下するまでは、ポットのシート部材を突き破ることなく保持された状態を維持する機構としては、例えば、柱状部２２ａの先端に上部ケース２０から容易に抜けない引き抜き防止機構が設けられており、かつ、例えば、上部ケース２０の上面と可動部材２２の頭部２２ｈとの間にバネ部材を備えた構成を有していればよい。
【００７８】
なお、第１の可動部材２２に力を加えるタイミングは、不溶性担体２上の標識保持パッド３上に、試料液を滴下した直後から３０秒以内が好ましく、直後がさらに好ましい。このようなタイミングで第１の増幅液４１を不溶性担体２に提供することによって、吸収パッド５の毛細管現象による吸引力を利用して、試料液を、検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２、増幅指標領域Ｌ３の方向に展開することができ、同様に第１の増幅液４１を検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２、増幅指標領域Ｌ３の方向に展開することが可能となる。
上記のように、第１のポット４０を送液用パッド４の下方に配置する構造をとることで、イムノクロマトグラフキットに第１の増幅液４１の内蔵を可能とすると共に、十分な量の増幅液４１の供給が可能となり、増幅条件の安定が可能となる。
【００７９】
上部ケース２０の、中間部材３０のポット収容部３２と対応する位置には、クロス状開口からなる差込口２５が設けられており、差込口２５とほぼ同形状の断面を有する柱状部２４ａを有する第２の可動部材２４の柱状部２４ａの先端が差込口２５に挿入された状態で保持されている。第２の可動部材２４は、力を加えることによって、下部に押し込むことができるように構成されており、可動部材２４を押し込むことによって、中間部材３０のポット収容部３２内の突起部３３により第２のポット５０のシート部材５３が破断される位置まで、第２のポット５０を突起部３３に向けて移動させる。これにより、突起部３３が第２のポット５０のシート部材５３を突き破り、第２の増幅液５１を外部に供給することが可能となる。中間部材３０のポット収容部３２の底面に設けられている増幅液充填孔３４から不溶性担体２の上部に増幅液が滴下されて不溶性担体上の検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３に第２の増幅液５１を供給することが可能となる。なお、この際、増幅液充填孔３４から不溶性担体２の上部に滴下された第２の増幅液５１は、中間部材３０と不溶性担体２との隙間に充填されていき、隙間を通って検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３の上方に供給されて、徐々に不溶性担体２に浸透する。
【００８０】
第２の可動部材２４の柱状部２４ａの先端が差込口２５に挿入された状態で、かつ外力を加えて押下するまでは、第２のポット５０を押し下げないように保持された状態を維持する機構としては、第１の可動部材２２の場合と同様に、例えば、柱状部２４ａの先端に上部ケース２０から容易に抜けない引き抜き防止機構が設けられており、かつ、例えば、上部ケース２０の上面と可動部材２４の頭部の間にバネ部材を備えた構成を有していればよい。
【００８１】
なお、本実施形態において、第２の可動部材２４は、第２のポット５０を中間部材３０に設けられている突起部３３に向けて移動させるものとしたが、第２の可動部材は、第２のポットを突起部に対して相対的に移動させることができればよく、第２のポットを移動させることなく、突起部を移動させることにより、突起部により第２のポットのシート部材を破断させる構成、あるいは、第２のポットおよび突起部の両者を移動させて突起部によりシート部材を破断させる構成であってもよい。例えば、中間部材の収容部に配置された突起部が第２の可動部材に接続されており、第２の可動部材を外部から押すことにより突起部をシート部材に向けて移動させる構成などが考えられる。
【００８２】
第２のポットのシート部材は、必ずしも検査用ストリップに面して位置されていなくてよく、破断されてポットから流出する第２の増幅液を収容部３２底面の増幅液充填孔３４から不溶性担体２上に滴下させることができる構成であれば、第２のポットおよび第２のポットを収容する収容部の構成も本実施形態の構成に限らない。
【００８３】
図４に示すように、ハウジングケース９の各部材が一体化された状態において、下部ケース１０の略中央部に標識保持パッド３が位置するように不溶性担体２が位置されており、その上流側の一端に送液用パッド４、下流側に吸収パッド５がそれぞれ一部不溶性担体２と重なりを持って配置されており、上部ケース２０の試料液注入用の開孔２１が標識保持パッド３を臨む位置となるように検査用ストリップ１の配置が調整されている。送液用パッド４は、一端が不溶性担体２と重なり、他端は不溶性担体２と重ならずに伸びており、この伸びた部分がポット収容部１２に備えられた第１のポット４０の上面に位置するように配置されている。
【００８４】
吸収パッド５の不溶性担体と重なる領域および検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２、増幅指標領域Ｌ３の上部に中間部材３０は配置されている。中間部材３０の吸収パッド押さえ突起３７が不溶性担体２と重なる領域で吸収パッド５を抑えるように位置されており、既述の通り、領域Ｌ１〜Ｌ３は中間部材３０の観察窓６１の下方に位置され、その一面６２が不溶性担体２との間に間隙６０を構成している。上部ケース２０の開口２８が観察窓６１の上方に位置する。また、第１の可動部材２２および第１の可動部材２２が挿入される差込口２３は送液用パッド４の上方に位置し、第２の可動部材２４および第２の可動部材２４が挿入されるクロス状差込口２５は第２のポット５０の上方に位置している。
【００８５】
中間部材３０のポット収容部３２の形状は、第２の増幅液５１を封入した第２のポット５０と嵌合する構造であることが好ましい。このような構造とすることで、第２の増幅液５１を不溶性担体２に供給する時の供給量と供給速度の繰り返し再現性を高めることが可能となる。また、増幅液充填孔３４から不溶性担体２上に第２の増幅液５１を供給する構造をとることで、第２の増幅液５１が、外部にこぼれるのを防止できる。
【００８６】
また、第２の増幅液５１を不溶性担体２の下流側上方から供給する構成、すなわち、試料液の展開方向、第１の増幅液４１の展開方向および第２の増幅液５１の展開方向が同一の直線上であるため、１つの吸収パッド５で、被検物質を含む試料液、第１の増幅液４１、第２の増幅液５１の３つの溶液の吸収を行うことが可能となり、コンパクトなキットの設計が可能となる。
【００８７】
＜イムノクロマトグラフ検査方法＞
上記イムノクロマトグラフキット１００を用いたイムノクロマトグラフ検査方法について簡単に説明する。
試料液滴下用開孔２１から試料液を標識保持パッド３上に滴下する。試料液中に被検物質が含まれている場合には、標識保持パッド３において、被検物質と第１の物質が結合することにより、第１の物質を介する被検物質と標識物質との複合体が形成され、この複合体が試料液と共に吸収パッド５の吸引力により毛細管現象で吸収パッド５側に向かって展開される。この試料液を滴下すると同時もしくはその後、第１の可動部材２２を押下し、送液用パッド４を変位させて第１のポット４０のシート部材４３を破断させ、送液用パッド４を第１の増幅液４１に浸して第１の増幅液４１を送液する。なお、第１の可動部材２２を押下するタイミングは試料液の滴下時から３０秒以内とすることが好ましく試料液の滴下の直後が特に好ましい。
【００８８】
検査領域Ｌ１に到達した複合体は、検査領域Ｌ１の第２の物質と結合し捕捉される。また、被検物質と結合していない第１の物質は検査領域Ｌ１を通過して確認領域Ｌ２に到達し、確認領域Ｌ２の第１の物質と結合する物質と結合し捕捉される。
【００８９】
第１の増幅液４１は検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２を経て増幅指標領域Ｌ３へ到達する。このとき、増幅指標領域Ｌ３が変色することにより、第１の増幅液４１の増幅指標領域Ｌ３への到達を視覚的に認識することができる。増幅指標領域Ｌ３の変色を確認後、第２の可動部材２４を押下して第２の増幅液５１を不溶性担体２上に供給する。本実施形態においては、増幅液充填孔３４から不溶性担体２上の領域Ｌ１〜Ｌ３よりも下流側に滴下された第２の増幅液５１は、流路形成部材６５の一面６２と不溶性担体２の表面２Ｓとの間隙６０に浸透してこの間隙６０により検査領域Ｌ１に導かれる。
【００９０】
第２の増幅液５１を不溶性担体２に供給してから反応終了を待ち、観察窓６１から、検査領域Ｌ１および確認領域Ｌ２の発色を確認する。検査領域Ｌ１の発色により被検物質の有無およびその濃度の高低を確認することが可能であり、確認領域Ｌ２の発色により被検物質を測定する検査が成功したかどうかを確認することができる。検査領域Ｌ１および確認領域Ｌ２における発色は標識のシグナルを増幅して得られたものであり、高感度な検査を実現することができる。
【００９１】
以上のように、本イムノクロマトグラフキット１００を用いれば、専用の分析装置などを用いることなく、このキット単体で精度よく検査を行うことができる。
【００９２】
以下に、可動部材２２の柱状部２２ａの先端が差込口２３に挿入された状態で容易に抜けることなく、かつ外力を加えて押下するまでは、ポットのシート部材を突き破ることなく保持された状態を維持する機構の好ましい具体的な態様について図９および図１０を参照して説明する。
【００９３】
まず、図９を参照して第１の態様について説明する。図９は、イムノクロマトグラフキット１００の可動部材２２の周辺を示す概略断面図であり、Ａは第１の可動部材２２の押下前、Ｂは第１の可動部材２２の押下後を示す。
【００９４】
可動部材２２の柱状部２２ａの先端に上部ケース２０から容易に抜けない引き抜き防止突起２２ｂが設けられている。また、柱状部２２ａの頭部側に所定深さまでハウジングケース内に挿入されたときに可動部材２２の上方への移動を制限する移動防止突起２２ｃが設けられている。
柱状部２２ａに設けられているこれらの突起２２ｂおよび２２ｃは先端側に向けて細くなる突起部であり、細くなっている側から差込口２３に挿入される際は、弾性により若干縮まり容易に挿入することができるが、ハウジングケース内に一旦挿入された後は、突起部の末広がり側が上部ケース２０に引っかかり差込口２３から引き抜けなくなる。
可動部材２２の押下前に柱状部２２ａの先端２２ｄのみが差込口２３に挿入されて下方に下がらないようにするための機構は、図９のＡ、Ｂに示すようなバネ部材２２ｅの弾性力を利用することにより実現することができる。
【００９５】
図１０は図９に説明した態様の一部設計変更例である。図１０において、Ａは可動部材２２の押下前の状態を示す概略平面図であり、Ｂは概略平面図Ａ中のＢ−Ｂ線における概略断面図であり、Ｃは可動部材２２の押下後の状態を示す概略断面図である。
可動部材２２の柱状部２２ａに備えられている引き抜き防止突起２２ｂおよび移動防止突起２２ｃについては図９のものと同様である。
【００９６】
本設計変更例においては、可動部材２２の押下前に柱状部２２ａの先端２２ｄのみが差込口２３に挿入されて下方に下がらないようにするための機構が異なる。ここでは、取り外し可能な押下防止のためのクリップ部材２２ｆを備えている。押下前においては、クリップ部材２２ｆが、可動部材２２の頭部２２ｈと上部ケース２０の上面との間に、柱状部２２ｂを挟むようにして差し込まれており可動部材２２を押下する際に、クリップ部材２２ｆを引き抜いた状態で可動部材２２を押下する。バネ部材よりも構成が簡易であり、クリップ部材２２ｆを備えた状態で可動部２２に力が加わっても可動部２２は移動しないため、運搬時などに多少の衝撃を受けても可動部材２２による第１のポットのシート部材の破断を生じることなく好ましい。
【００９７】
なお、第２の可動部材２４の柱状部２４ａの先端が差込口２５に挿入された状態で容易に抜けることなく、かつ外力を加えて押下するまでは第２のポットを移動させることなく保持された状態を維持する機構としても上記の構成を同様に用いることが可能である。
【００９８】
なお、本発明のイムノクロマトグラフキットには、検体の抽出を補助する補助薬品などを含む検体抽出液を内包するポットや検体希釈液を内包するポット、キットの保存を助ける乾燥剤や脱酸素剤、取扱い説明書などの添付文書、および、綿棒などの検体採取器具などの検査に必要な器材一式もしくはその一部を含んでも良い。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明のイムノクロマトグラフキットの実施例および比較例について説明する。実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットは、被検物質としてインフルエンザウィルス抗原を検出するためのインフルエンザウィルス抗原検出用イムノクロマトグラフキットである。【０１００】
(１）イムノクロマトグラフキットの作製
（１−１）被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としての抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイドの作製
直径５０ｎｍ金コロイド溶液（品番：ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社製）９ｍＬに５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．５）を１ｍＬ加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、１６０μｇ／ｍＬの抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ＳＰＴＮ−５  ７３０７、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）溶液１ｍＬを加えて攪拌した。１０分間静置した後、１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ(polyethylene glycol)；重量平均分子量（Ｍｗ．）：２００００、品番：１６８−１１２８５、和光純薬工業（株）社製）水溶液を５５０μＬ加えて攪拌し、続いて１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ（Bovine serum albumin）；ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番：Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ社製）の水溶液を１．１ｍＬ加えて攪拌した。この溶液を遠心加速度８０００×ｇ、４℃で３０分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立（株）社製）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス塩酸）バッファー（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ）に分散し、再び８０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。【０１０１】
（１−２）標識保持パッドとしての抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイド保持パッドの作製
（１−１）で作製したインフルエンザＡ型抗体修飾金コロイドを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）の濃度が０．０５質量％、スクロースの濃度が５質量％、そして光路長１０ｍｍとしたときの金コロイドの５２０ｎｍの光学濃度が０．１となるように水で希釈し、金コロイド塗布液とした。この塗布液を、１２ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社製）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、２４時間減圧乾燥することでインフルエンザＡ型抗体修飾金コロイド保持パッドを得た。【０１０２】
(１−３）クロマトグラフ担体の作製
不溶性担体２として６０ｍｍ×３００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）を用い、このメンブレン上に以下のような方法により、検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３を形成してクロマトグラフ担体を作製した。【０１０３】
６０ｍｍ×３００ｍｍの矩形のニトロセルロースメンブレンの３００ｍｍの２つの長辺のうちの一辺から他辺側に１５ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ＳＰＴＮ−５  ７３０７、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）溶液をライン状に塗布し検査領域Ｌ１とした。さらに同じ一辺から他辺側に１１ｍｍの位置に、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギＦ（ａｂ'）２、品番５６６−７０６２１、和光純薬工業（株）社製）溶液をライン状に塗布し確認領域Ｌ２とした。さらに同じ一辺から他辺側に９ｍｍの位置に、３０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したブロモクレゾールグリーン(和光純薬工業（株）社製)をライン状に塗布し増幅指標領域Ｌ３とした。それぞれの塗布の後にニトロセルロースメンブレンを、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬工業（株）社製）を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、メンブレンを浸漬させてそのまま３０分間静置した。その後、別のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔris−ＨＣl（ｐＨ７．５）バッファー５００ｍＬにニトロセルロースメンブレンを移して浸し、そのまま３０分間静置した。その後、ニトロセルロースメンブレンを液から取り出し、２５℃の環境で２４時間乾燥させた。【０１０４】
本実施例においては、抗インフルエンザＡ型抗体が被検物質に結合する第２の物質に相当し、抗マウスＩｇＧ抗体が第１の物質に結合可能な物質に相当し、プロモクレゾールグリーンが第１の増幅液と反応する物質に相当する。【０１０５】
(１−４) 検査用ストリップの作製
バック粘着シート（６０ｍｍ×３００ｍｍ（ニップンテクノクラスタ社製）)に、（１−３）で作製したクロマトグラフ担体(検査領域Ｌ１、確認領域Ｌ２および増幅指標領域Ｌ３が形成された不溶性担体２)を貼り付けた。次に不溶性担体２の中央近傍の所定箇所に（１−２）で作製した標識保持パッド３としての金コロイド抗体保持パッドを配置し、幅４ｍｍの封止フィルムで金コロイド保持パッドの両端を１．５ｍｍがフィルムと金コロイド保持パッドに重なるように貼り付けて、不溶性担体２に固定した。送液用パッド４（２５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社製））を不溶性担体２の上流側に、送液用パッド４と不溶性担体２が７ｍｍ重なるように貼り付けた。こうして作製した部材を、３００ｍｍの長辺と垂直な方向に対して平行に、幅が５ｍｍとなるようにギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社製）で切断し、６０本の検査用ストリップ（但し、吸収パッドを含まない。）を作製した。【０１０６】
（１−５）増幅液の作製
(１−５−１）第１の増幅液（還元剤溶液）の作製
水２９０ｇに、硝酸鉄(III)九水和物（和光純薬工業（株）社製、０９５−００９９５）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、クエン酸（和光純薬工業（株）社製、０３８−０６９２５）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０重量％）を３６ｍＬ加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬工業（株）社製、０９１−００８５５）を６０．８ｇ加えてこれを第１の増幅液４１である還元剤溶液とした。【０１０７】
（１−５−２）第２の増幅液（銀イオン溶液）の作製
水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０重量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（和光純薬工業（株）社製、１２３−００２４６）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ12Ｈ25-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  ０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを第２の増幅液５１である銀イオン溶液とした。【０１０８】
（１−６）吸収パッドの作製
１２ｍｍ×１０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ガラス濾紙、アドバンテック社製）を６０枚準備し、各検査用ストリップの吸収パッド５とした。【０１０９】
（１−７）イムノクロマトグラフキットの部品の作製
図１に示したハウジングケース９を構成する下部ケース１０、上部ケース２０、中間部材３０、およびハウジングケース９に備えられる第１の可動部材２２、第２の可動部材２４、第１の増幅液４１を収容する第１のポット４０、第２の増幅液５１を収容する第２のポット５０を、ポリプロピレンを材料として射出成形によりそれぞれ作製した。【０１１０】
以下、まず第１の発明の実施例および比較例（実施例１、２および比較例１、２とする）について説明する。【０１１１】
（１−８−１）実施例１のイムノクロマトグラフキットの作製
下部ケース１０、（１−４）で作製した検査用ストリップと（１−６）で作製した吸収パッドを、図４に示すように固定した。次に、第１のポット４０、第２のポット５０に、それぞれ、（１−５−１）、（１−５−２）で作製した第１の増幅液、第２の増幅液を充填し、シート部材としてのアルミ箔で封止し、図４に示すように、それぞれ下部ケース１０、中間部材３０に装着した。第１の可動部材２２、第２の可動部材２４を上部ケース２０にそれぞれ差込口２３、２５に装着し、下部ケース１０、中間部材３０、上部ケース２０を図４のように組み立ててイムノクロマトグラフキットを作製した。なお、この際、金コロイド抗体保持パッドを固定する封止フィルムが試料液滴下用開孔から見えない配置とした（図３Ａ参照）。すなわち、実施例１のイムノクロマトグラフキットは、試料液滴下用開孔に臨む領域は標識保持パッドの封止フィルムで覆われてない領域となるように構成した。【０１１２】
（１−８−２）実施例２のイムノクロマトグラフキットの作製
実施例１のイムノクロマトグラフキットの作製において、金コロイド抗体保持パッドを固定するフィルム状固定部材が被検物質滴下用開孔部から見えるように設置した（図３Ｂ参照）以外は同様にして実施例２のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１１３】
（１−８−３）比較例１のイムノクロマトグラフキットの作製
（１−３）のクロマトグラフ担体の作製において、金コロイド抗体保持パッドを不溶性担体に封止フィルムで固定しない、すなわち金コロイド抗体保持パッドが不溶性担体に固定されていない点以外は（１−３）の記載と同様にしてクロマトグラフ担体を作製し、他は実施例１と同様にして比較例１のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１１４】
（１−８−４）比較例２のイムノクロマトグラフキットの作製
（１−３）のクロマトグラフ担体の作製において、増幅指標領域（発色試薬固定化ライン）を設けない以外は（１−３）の記載と同様にしてクロマトグラフ担体を作製し、他は実施例１と同様にして比較例２のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１１５】
（２）評価
（２−１）点着
模擬陽性検体（ＢＤ  ＦｌｕエグザマンコントロールＡ＋Ｂ−(ベクトン・ディッキンソン社製))を抽出液(１質量％ＢＩＧＣＨＡＰ含有１％ＢＳＡ−ＰＢＳ)を用いて２５６０倍に希釈した液を作製し、４０μＬを抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイド保持パッドに点着した。【０１１６】
（２−２）第１の増幅液（還元剤溶液）の展開
（２−１）の試料液の点着直後に、第１の可動部材を押下して送液用パッドを変位させて第１のポットに送液用パッドを押し込むことにより、第１の増幅液を封止しているアルミ箔を破り、第１のポットの中に送液用パッドを浸すことにより、毛細管現象を利用して第１の増幅液をクロマトグラフ担体に供給した。【０１１７】
（２−３）銀増幅
増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色した後、第２の可動部材２４を押下して第２のポットを中間部材３０のポット収容部の突起部に向けて移動させることにより、第２のポットの第２の増幅液を封止しているアルミ箔を突起部により押し破り、銀イオン溶液を中間部材３０の銀イオン溶液充填孔からクロマトグラフ担体に供給して、銀増幅反応を行った。
なお、比較例２については、第１の増幅液の送液開始から５〜１０分後に第２の可動部材２４を押下して第２のポットを中間部材３０のポット収容部の突起部に向けて移動させることにより、第２のポットの第２の増幅液を封止しているアルミ箔を突起部により押し破り、銀イオン溶液を中間部材３０の銀イオン溶液充填孔からクロマトグラフ担体に供給して、銀増幅反応を行った。【０１１８】
（２−４）増幅成功率の算出
各実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットを用意し、上記の（２−１）、（２−２）及び（２−３）に記載した処理を１０回試行し、増幅成功率を算出した。検査領域Ｌ１および確認領域Ｌ２に黒色ラインが認められたら増幅成功とした。【０１１９】
（２−５）検査領域の濃度値の算出
繰り返し再現性を確認するために、増幅処理済みの各実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットから、クロマトグラフ担体を取り出し、検査領域Ｌ１の濃度をＬＡＳ４０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ（株）社製）で撮影し、濃度差（Δ＝（検査領域Ｌ１の濃度）−（バックグラウンド部の濃度））を算出した。そして各実施例および比較例につき１０回分（Ｎ＝１０）の濃度差のばらつきを求めた。【０１２０】
各実施例および比較例の差異および評価結果を表１に纏めて示す。
【表１】
2016114122.tif 000003
【０１２１】
標識保持パッドを不溶性担体に固定し、増幅指標領域を不溶性担体に設けることで、銀増幅反応の成功率が増すと共に、１０回同様の検査を繰り返したときの濃度のばらつき（ＣＶ：coefficient of variation）が良好であり、測定精度が高いことがわかった。しかも、試料液滴下用開孔から金コロイド抗体保持パッドを固定する封止フィルムが見えない配置とし、試料液滴下用開孔からは標識保持パッドの封止フィルムに覆われていない領域のみが見えるようにすることで、さらに濃度ばらつき（ＣＶ）が低下し再現性を向上させることが可能となることが明らかになった。【０１２２】
金コロイド保持パットを不溶性担体に固定化しない場合には、パットがずれて、不溶性担体の幅方向で展開する金コロイドの濃度ムラが生じる場合があり、測定濃度がばらつき、ＣＶの低下が観察された。増幅指標領域（発色試薬固定化ライン）を設けない場合には、銀イオン溶液を供給するタイミングが不安定になり、意図する増幅がおこなわれない確率が高くなり、検出精度が低くなった。これらの結果から、本発明の効果が確認された。【０１２３】
次に第２の発明の実施例および比較例（実施例１１〜２０および比較例１〜４とする。）について説明する。
（２１）イムノクロマトグラフキットの作製方法
上記（１）イムノクロマトグラフキットの作製方法とほぼ同様であり、（１）の作製方法と異なる点のみ説明する。
（１−３）クロマトグラフ担体の作製において、ニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）に代えてニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF135（キャピラリーフローレート＝１３５秒／ｃｍ）、ミリポア社製）を用いた。
（１−４）検査用ストリップの作製において、不溶性担体２上の標識保持パッド３の位置は標識保持パッド３の上流端３ａと送液用パッド４の下流端４ｂとの距離Ｂが１２ｍｍとなるようにした。【０１２４】
（２１−８−１）実施例１１のイムノクロマトグラフキットの作製
下部ケース１０、（１−４）で作製した検査用ストリップと（１−６）で作製した吸収パッド５を、図４に示すように固定した。次に、第１のポット４０、第２のポット５０に、それぞれ、（１−５−１）、（１−５−２）で作製した第１の増幅液４１、第２の増幅液５１を充填し、シート部材としてのアルミ箔で封止し、図４に示すように、それぞれ下部ケース１０、中間部材３０に装着した。第１の可動部材２２、第２の可動部材２４を上部ケース２０にそれぞれ差込口２３、２５に装着し、下部ケース１０、中間部材３０、上部ケース２０を図４のように組み立ててイムノクロマトグラフキットを作製した。
本実施例１１は、不溶性担体２の上流端２ａと吸収パッド５の上流端５ａとの距離Ａを５４ｍｍ、標識保持パッド３の下流端３ｂと流路形成部材６５の一面６２の上流端６４との距離Ｂを３ｍｍとした。【０１２５】
（２１−８−２）実施例１２〜１４および比較例１１〜１３のイムノクロマトグラフキットの作製
上記実施例１１のイムノクロマトグラフキットにおいて、下記の表１に示すように、不溶性担体２の上流端２ａと吸収パッド５の上流端５ａとの距離Ａを変更し、吸水力の異なる吸収パッド５に変更し、他は実施例１１と同様の構成および手順で実施例１２〜１４および比較例１１〜１３のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１２６】
（２１−８−３）実施例１５、１６および比較例１４のイムノクロマトグラフキットの作製
上記実施例１１のイムノクロマトグラフキットの作製方法の工程（１−４）において、不溶性担体２上の標識保持パッド３を固定する位置を調整し、下記の表１に示すように、標識保持パッド３の下流端３ｂと流路形成部材６５の一面６２の上流端６４との距離Ｂを変更し、他は実施例１１と同様の構成および手順で実施例１５、１６および比較例１４のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１２７】
（２１−８−４）実施例１７のイムノクロマトグラフキットの作製
上記実施例１４のイムノクロマトグラフキットの作製方法の工程（１−４）において、不溶性担体２上の標識保持パッド３を固定する位置を調整し、下記の表１に示すように、標識保持パッド３の下流端３ｂと流路形成部材６５の一面６２の上流端６４との距離Ｂを変更し、他は実施例１４と同様の構成および手順で実施例１７のイムノクロマトグラフキットを作製した。【０１２８】
（２１−８−５）実施例１８〜２０のイムノクロマトグラフキットの作製
上記実施例１１のイムノクロマトグラフキットの作製方法の工程（１−４）において、送液用パッド４を貼る位置を調整し、標識保持パッド３の上流端３ａと送液用パッド４の下流端４ｂとの距離Ｃを変更し、他は実施例１と同様の構成および手順で実施例１８〜１９のイムノクロマトグラフキットを作製した。距離Ｃについて、それぞれ実施例１８は１０ｍｍ、実施例１９は１８ｍｍ、実施例２０は３０ｍｍとした。【０１２９】
（２２）評価
（２２−１）点着
模擬陽性検体（ＢＤ  ＦｌｕエグザマンコントロールＡ＋Ｂ−(ベクトン・ディッキンソン社製))を抽出液(１質量％ＢＩＧＣＨＡＰ含有１％ＢＳＡ−ＰＢＳ)を用いて２５６０倍に希釈した液を作製し、４０μＬを抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイド保持パッドに点着した。【０１３０】
（２２−２）第１の増幅液（還元剤溶液）の展開
（２２−１）の試料液の点着直後に、第１の可動部材２２を押下して送液用パッド４を変位させて第１のポット４０に送液用パッド４を押し込むことにより、第１の増幅液４１を封止しているアルミ箔を破り、第１のポット４０の中に送液用パッド４を浸すことにより、毛細管現象を利用して第１の増幅液４１をクロマトグラフ担体に供給した。【０１３１】
（２２−３）発色時間の測定
（２２−２）で第１の増幅液４１をクロマトグラフ担体に供給した直後から、増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色するまでの時間を発色時間として、計測した。【０１３２】
（２２−４）増幅方法
増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色した後、第２の可動部材２４を押下して第２のポット５０を中間部材３０のポット収容部３２の突起部３３に向けて移動させることにより、第２のポット５０の第２の増幅液５１を封止しているアルミ箔を突起部３３により押し破り、第２の増幅液５１である銀イオン溶液を中間部材３０の増幅液充填孔３４からクロマトグラフ担体に供給して、銀増幅反応を行った。増幅液充填孔３４から滴下された第２の増幅液５１は、流路形成部材６５の一面６２と不溶性担体２との間隙６０に充填され毛細管現象により検査領域Ｌ１に導かれ、銀増幅反応は数十秒で完了する。【０１３３】
（２２−５）検査領域の濃度値の算出
増幅処理済みの各実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットから、クロマトグラフ担体を取り出し、検査領域Ｌ１の濃度をＬＡＳ４０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ（株）社製）で撮影し、濃度差（ΔＯＤ＝（検査領域Ｌ１の濃度）−（バックグラウンド部の濃度））を算出した。発色時間の規格は、ＰＯＣＴに適する検査時間を鑑みて１５分以下を好ましい範囲とした。【０１３４】
（２２−６）吸収パッドの吸水力の測定方法
本明細書において、吸収パッドの吸水力は１分間当たりの吸水量で定義されるものであり、具体的には、以下のようにして求めたものとする。
ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１３５(キャピラリーフローレート１３５秒／ｃｍ、ミリポア社製)のメンブレンを２０ｍｍ×２０ｍｍの大きさに切り出して、水を飽和量吸収させた。このメンブレン上に、縦１５ｍｍ×横１０ｍｍ×高さ２ｍｍの大きさの吸収パッドを載せ、その上に２０ｍｍ×２０ｍｍの底面積をもつ６３０ｇの重りを乗せた状態で、１０秒間押し付けた。１０秒後に吸収パッドを回収して重量を測定した。吸収パッドをメンブレン上に載せる前後における重量の増加分である水の吸収量を計算し、吸収パッドの吸水量として１分当たりの吸水量を求めた。【０１３５】
（２２−７）  濃度ムラの評価
濃度ムラについて官能評価を行った。評価の基準は以下の通りとした。
Ａ  濃度ムラが発生しない。
Ｂ  濃度ムラがわずかに発生するが気にならない。
Ｃ  濃度ムラが発生し、実用的に許容されない。【０１３６】
実施例１１〜１７および比較例１１〜１４のイムノクロマトグラフキットについて、構成上の差異および上記測定結果についてまとめ下記表２に示す。なお、いずれの実施例および比較例についても流路形成部材６５の一面６２と不溶性担体２の表面２Ｓとにより形成される間隙６０の距離Ｄは、０．３ｍｍとした。
【表２】
2016114122.tif 000004
【０１３７】
表２の結果より、吸収パッド５の吸水力が４５μL/分以上であり、不溶性担体２の上流端２ａと吸収パッド５の上流端５ａの距離Ａが４４ｍｍ〜６４ｍｍであるとき、発色時間は１５分以下に抑えられ、濃度ムラなく良好な検査を行うことができることが明らかである。比較例１１、１２のように吸水力が４５μL/分より小さいとき、発色時間が２０分超えとなり、ＰＯＣＴに適さない結果となった。比較例１３のように、距離Ａが大き過ぎると、第１の増幅液の拡散が途中で止まってしまい、発色自体生じなかった。また、比較例４のように、流路形成部材６５の一面６２の上流端６４と、標識保持パッド３の下流端３ｂとの距離Ｂが１．０ｍｍ未満の場合、試料液を標識保持パッド３に点着した際に、流路形成部材６５と不溶性担体２の間隙６０に試料液が毛管力で入り込み、濃度ムラが発生した。すなわち、標識保持パッド３の下流端３ｂと流路形成部材６５の一面６２の上流端６４との距離Ｂは１．０ｍｍ以上とする必要性があることが明らかになった。【０１３８】
さらに、表３に、実施例１１、実施例１８〜２０について構成上の差異、および上記測定結果についてまとめて示す。
【表３】
2016114122.tif 000005
【０１３９】
表３の結果より、標識保持パッド３の上流端３ａと送液用パッド４の下流端４ｂとの距離Ｃは１２ｍｍ以上であることが望ましいことがわかった。実施例１８のように、距離Ｃが１２ｍｍ未満の場合、試料液と第１の増幅液が液状で混合する割合が増加して、増幅のムラ（濃度ムラ）が生じる場合があった。
【符号の説明】
【０１４０】
１  検査用ストリップ
２  不溶性担体
２ａ  不溶性担体の一端（上流端）
３  標識保持パッド
３ａ  標識保持パッドの上流端
３ｂ  標識保持パッドの下流端
４  送液用パッド
４ｂ  送液用パッドの下流端
５  吸収パッド
５ａ  吸収パッドの上流端
６  封止フィルム（フィルム状固定部材）
７  バック粘着シート
９  ハウジングケース
１０  下部ケース
１１、１３  収容部
１２  第１のポットの収容部
２０  上部ケース
２１  試料液滴下用開孔
２２  第１の可動部材
２３  第１の可動部材の差込口
２４  第２の可動部材
２５  第２の可動部材の差込口
３０  中間部材
３２  第２のポットの収容部
３３  突起部
３４  増幅液充填孔
４０  第１の増幅液用の第１のポット
４１  第１の増幅液
５０  第２の増幅液用の第２のポット
５１  第２の増幅液
６０  間隙
６１  観察窓
６２  流路形成部材の一面
６４  流路形成部材の上流端
６５  流路形成部材
１００  イムノクロマトグラフキット
Ｌ１  検査領域
Ｌ２  確認領域
Ｌ３  増幅指標領域
【図１】
2016114122.tif 000006
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月10日(2016.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
前記試料液を展開させる不溶性担体、該不溶性担体上に固定された前記被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、前記不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を前記不溶性担体に送液する送液用パッド、および前記不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、前記不溶性担体の前記標識保持パッドと前記吸収パッドとの間に、前記被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、前記第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、前記第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を前記標識保持パッド側から順に有する検査用ストリップと、
前記送液用パッドの下方に配置された、前記第１の増幅液を封入した第１のポットと、
前記吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
前記検査用ストリップ、前記第１のポット、および前記第２のポットを内包し、前記標識保持パッドを臨む試料液滴下用開孔を有するハウジングケースとを備え、
前記第１のポットが、シート部材を備えた一面を有し、
前記第１のポットの前記シート部材を備えた一面が前記送液用パッドに面して配置されており、
前記送液用パッドを介して前記第１のポットの前記シート部材と対向する位置に配置され、外部からの押圧力により、前記送液用パッドを押圧して変位させて、前記第１のポットの前記シート部材を破断させて前記第１のポットの内部に前記送液用パッドを押し込む可動部材を備え、
前記送液用パッドを押し込んだ後の前記可動部材の元の位置側への移動を防止する移動防止構造を有するイムノクロマトグラフキット。
【請求項２】
前記ハウジングケースが、前記試料液滴下用開孔を有する上部ケースと、前記検査用ストリップが配置される収容部を有する下部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される中間部材とを備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を流下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有する請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項３】
前記第２のポットが、シート部材を備えた一面を有している請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項４】
前記ハウジングケースが、前記試料液滴下用開孔を有する上部ケースと、前記検査用ストリップが配置される収容部を有する下部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される中間部材とを備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を流下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有し、
前記第１のポットおよび前記第２のポットが、それぞれシート部材を備えた一面を有しており、
前記中間部材の前記ポット収容部内に、前記第２のポットの前記シート部材を破断する突起部を、前記第２のポットの前記シート部材に面して備え、
前記突起部により前記シート部材が破断される位置まで、前記第２のポットを前記突起部に対して相対的に移動させる可動部材を備えた請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記標識保持パッドの少なくとも２辺がフィルム状固定部材により覆われて前記不溶性担体に固定されており、
前記標識保持パッドの、前記ハウジングケースの前記試料液滴下用開孔に臨む領域は、前記フィルム状固定部材に覆われていない請求項１から４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項７】
前記第１の増幅液が、銀イオンのための還元剤液であり、
前記第２の増幅液が、銀イオンを含む溶液である請求項１から４および６のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項８】
前記第１の増幅液が、２価の鉄イオンを含む溶液である請求項１から４および６から７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項９】
前記第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質である請求項１から４および６から８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１０】
前記標識物質が金属コロイドである請求項１から４および６から９のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１１】
試料液中の被検物質を検出するイムノクロマトグラフキットであって、
前記試料液を展開させる不溶性担体、該不溶性担体上に固定された前記被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質を含む標識保持パッド、前記不溶性担体の一端に接触して配置された第１の増幅液を前記不溶性担体に送液する送液用パッド、および前記不溶性担体の他端に接触して配置された吸収パッドを備え、前記不溶性担体上の前記標識保持パッドと前記吸収パッドとの間に、前記被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域を有する検査用ストリップと、
前記送液用パッドの下方に配置された、前記第１の増幅液を封入した第１のポットと、
前記吸収パッドの上方に配置された、第２の増幅液を封入した第２のポットと、
前記検査用ストリップ、前記第１のポット、および前記第２のポットを内包するハウジングケースとを備え、
前記ハウジングケースが、前記検査用ストリップが配置される収容部を備えた下部ケースと、該下部ケースと嵌合する上部ケースと、前記上部ケースおよび前記下部ケースの間に配置される流路形成部材とを備え、
前記流路形成部材は、前記不溶性担体の表面との間に、該不溶性担体上に滴下される前記第２の増幅液を前記検査領域上に導く間隙を形成する一面を有するものであり、
前記吸収パッドの吸水力が４５μｌ／分以上９０μｌ／分以下であり、
前記検査用ストリップにおいて前記送液用パッド側を上流、前記吸収パッド側を下流としたとき、前記不溶性担体の前記一端と前記吸収パッドの上流側の端との距離が４４ｍｍ以上６４ｍｍ以下であり、
前記流路形成部材の前記一面の上流側の端と、前記標識保持パッドの下流側の端との距離が１ｍｍ以上１９ｍｍ以下であり、
前記第１のポットが、シート部材を備えた一面を有し、
前記第１のポットの前記シート部材を備えた一面が前記送液用パッドに面して配置されており、
前記送液用パッドを介して前記第１のポットの前記シート部材と対向する位置に配置され、外部からの押圧力により、前記送液用パッドを押圧して変位させて、前記第１のポットの前記シート部材を破断させて前記第１のポットの内部に前記送液用パッドを押し込む可動部材を備え、
前記送液用パッドを押し込んだ後の前記可動部材の元の位置側への移動を防止する移動防止構造を有するイムノクロマトグラフキット。
【請求項１２】
前記間隙が、０．０１ｍｍ以上１．００ｍｍ以下である請求項１１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１３】
前記標識保持パッドの上流側の端と前記送液用パッドの下流側の端との距離が１２ｍｍ以上３０ｍｍ以下である請求項１１または１２に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１４】
前記不溶性担体の前記一端と前記吸収パッドの上流側の端との距離が４９ｍｍ以上５９ｍｍ以下である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１５】
前記吸収パッドの吸水力が６５μｌ／分以上７５μｌ／分以下である請求項１１から１４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１６】
前記不溶性担体上の前記検査領域と前記吸収パッドとの間に、前記第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、前記第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域を前記検査領域側から順に有する請求項１１から１５のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１７】
前記第１の増幅液と反応する物質が、プロトンを介して反応する物質である請求項１６に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１８】
前記上部ケースと前記下部ケースとの間に配置される中間部材を備え、
該中間部材が、前記第２のポットを受容し、前記第２の増幅液を前記不溶性担体上に滴下させるための孔を底面に備えたポット収容部を有する請求項１１から１７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項１９】
前記中間部材が、前記流路形成部材と一体的に形成されている請求項１８記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２０】
前記第２の増幅液が、前記不溶性担体の前記検査領域よりも下流側に滴下される請求項１１から１９いずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２１】
前記第１の増幅液が、銀イオンのための還元剤液であり、
前記第２の増幅液が、銀イオンを含む溶液である請求項１１から２０のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２２】
前記第１の増幅液が、２価の鉄イオンを含む溶液である請求項１１から２１のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項２３】
前記標識物質が金属コロイドである請求項１１から２２のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【国際調査報告】
2016114122.tif 000017
2016114122.tif 000018
2016114122.tif 000019
2016114122.tif 000020