(57)【要約】  本発明に係るいくつかの態様は、パターン形成の自由度を向上させ、細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離等を抑制する細胞配列培養用基材の製造方法を提供することを課題とする。  本発明に係る典型的な細胞培養用基材の製造方法は、第１の物質領域と第２の物質領域とを形成する第１の工程を含み、前記第１の工程において、前記第１の物質領域に含まれる第１の物質と前記第２の物質領域に含まれる第２の物質との結合の形成がなされることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質でベース基材を被覆して前記ベース基材上に細胞非接着性物質層を形成する工程と、細胞接着性物質を含む微小液滴を前記細胞非接着性物質層上の所望の領域に配置して前記細胞非接着性物質層上の一部に前記細胞接着性物質層を形成する工程と、この工程の後、光を照射して細胞接着性領域及び細胞非接着性領域を有する細胞配列培養用基材を製造する工程とを具備することを特徴とする細胞配列培養用基材の製造方法。
【請求項２】
第１の物質領域と、
第２の物質領域と、を含み、
前記第２の物質領域はパターンを形成しており、
前記第１の物質領域の細胞に対する接着性と前記第２の物質領域の前記細胞に対する接着性とは異なること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養用基材において、
前記第２の物質領域の前記細胞に対する接着性は、前記第１の物質領域の前記細胞に対する接着性より低いこと、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞培養用基材において、
前記第２の物質領域は、前記第１の物質領域の上に配置されていること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項５】
請求項２乃至４のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
前記第２の物質領域は、細胞接着性蛋白質を含むこと、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項６】
請求項２乃至５のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
前記第１の物質領域に含まれる第１の物質と前記第２の物質領域に含まれる第２の物質との間に結合が形成されていること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項７】
請求項２乃至６のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
前記第２の物質領域は、荷電を有する高分子を有すること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項８】
請求項２乃５のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
さらにベース基材を含み、
前記第１の物質領域に含まれる第１の物質は、前記ベース基材と結合していること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項９】
第１の物質領域と第２の物質領域とを形成する第１の工程を含み、
前記第１の工程において、前記第１の物質領域に含まれる第１の物質と前記第２の物質領域に含まれる第２の物質との結合の形成がなされること、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養用基材の製造方法において、
前記第２の物質領域の細胞に対する接着性は、前記第１の物質領域の前記細胞に対する接着性より高いこと、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞培養用基材の製造方法において、
さらに、
第１の物質層と第２の物質層とを形成する第２の工程と、
前記第１の物質層及び前記第２の物質層に光を照射し、前記第１の物質層及び前記第２の物質層をそれぞれ前記第１の物質領域及び前記第２の物質領域とする第３の工程と、を含むこと、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法において、
前記第２の物質領域はパターンを形成していること、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の細胞培養用基材の製造方法において、
前記第２の物質層は、微小液滴を所望のパターンに応じて配置すること、
を特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１又は１３に記載の細胞培養用基材の製造方法において、
前記第２の工程の後、前記第１の物質層の粘性を増加させる第４の工程を含むこと、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１５】
請求項２乃至８のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
前記第２の物質領域は、ベース基材に形成された複数のウェルの各々に形成されていること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項１６】
請求項２乃至８のいずれかに記載の細胞培養用基材において、
前記第１の物質領域は、ベース基材に形成された複数のウェルの各々に形成されていること、
を特徴とする細胞培養用基材。
【請求項１７】
請求項１３に記載の細胞培養用基材の製造方法において、
前記微小液滴の配置は、マイクロピペット、キャピラリー、マイクロディスペンサーやインクジットプリンター及びエレクトロスピニングからなる群から選ばれたいずれかの手段により行われること、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の細胞培養基材の製造方法において、
前記第１の物質層は、不安定中間体を光照射により生成する物質を含んでいること、
を特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１９】
請求項２乃至８のいずれかに記載の細胞培養用基材を用いること、
を特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のいくつかの態様は、創薬や環境分析分野で幅広い応用が期待され、細胞を微小パターンとしてアレイ化できる細胞配列培養用基材の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境分析分野や薬物スクリーニング分野において、細胞が規則正しく配列された細胞アレイを利用する試みが、動物実験代替技術として注目されている。細胞アレイの細胞の配列を制御するために、細胞接着性領域及び細胞非接着性領域を有する細胞アレイ用基材等の細胞配列培養用基材を作成する試みは多数なされている。【０００３】
このうちフォトリソグラフィー技術を使用する方法として、例えば、撥水性のシリコンに半導体デバイス作成技術を使用して親水性の酸化シリコン領域を形成し、この親水性領域に細胞を配列させる方法（特許文献１）、感光性を有する細胞非接着性親水性高分子或いは感光性を有する細胞接着性親水性高分子膜にフォトマスクを設置して露光した後、現像することにより得る方法（特許文献２）、プラスチック基板にフォトレジストのパターンを形成し、アンモニアプラズマ処理し、グルタルアルデヒド反応後、細胞接着性蛋白質をコートし、最後にフォトレジストを除去する方法（特許文献３）、石英基板にフォトレジストを塗布し、これにフォトマスクを通して露光・現像し、グルタルアルデヒト等の架橋剤を含むコラーゲン等の細胞接着性蛋白質を塗布し、架橋反応後、フォトレジストを剥離する方法（特許文献４）、基板上に、例えばＩＴＯのような金属酸化物層をスパッタリングにより形成し、集積回路形成手法により、フォトレジストのパターンを形成後、露出した金属酸化膜層を酸で除き、更に、フォトレジストを除いて、金属酸化膜パターンを得、これにポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）を塗布し、最後に酸で金属酸化膜領域をそのコート層と共に除去する方法（特許文献５）、基板上にフォトレジストを塗布し、フォトマスクを介して露光・現像し、フォトレジストのパターンを得、その後露出した基板部分をシラン化合物の蒸気で処理し、更に、フォトレジストを除去する方法（特許文献６）、基板上にＮ−イソプロピルアクリルアミドを塗布し、金属製マスクを介して電子線を照射し、水で洗浄することにより、感温性高分子であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のパターンを得、これを例えばフィブロネクチンのような細胞接着性蛋白質溶液に浸漬することにより、ポリマーで被覆されていない部分に細胞接着性蛋白質を吸着させる方法（特許文献７）、細胞接着性表面を有する基板にアルカリ可溶性重合成分、光重合開始剤及びラジカル重合性架橋性単量体を含む感光性樹脂組成物を塗布し、これにパターンマスクを介して紫外線を露光し、アルカリ現像液で現像する方法（特許文献８）等が知られている。【０００４】
一方、フォトリソグラフィー技術を使用しない方法としては、例えば、基板上に塗布された細胞非接着性のポリエチレングリコールセグメントをベースとするポリマーをマスクパターンを介してプラズマ処理する方法（特許文献９）や、細胞非接着性基板にインクジェットプリンターを用いて細胞接着性蛋白質を塗布してパターンを形成する方法（特許文献１０）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−１７３５７５号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開平４−４０８９０号公報
【特許文献４】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献５】特開平７−７５５４７号公報
【特許文献６】特開平１１−１５１０８６号公報
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０１／０６８７９９号公報
【特許文献８】特開２００４−３２１０４０号公報
【特許文献９】国際公開第ＷＯ２００３／０１０３０２号公報
【特許文献１０】米国特許第５，１０８，９２６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明のいくつかの態様はこのような事情に鑑み、パターン形成の自由度を向上させ、なおかつ、細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離等を抑制する細胞配列培養用基材の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る細胞配列培養用基材の製造方法は、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質でベース基材を被覆し、この上に細胞接着性物質を含む微小液滴を配置した後、光を照射する工程を含むが、細胞非接着物質から生成した反応性を有する不安定中間体が、基材、細胞接着性物質、及び細胞非接着物質自身と結合するため、細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離を抑制する細胞配列培養用基材が得られる。【０００８】
本発明に係る細胞培養用基材は、第１の物質領域と、第２の物質領域と、を含み、前記第２の物質領域はパターンを形成しており、前記第１の物質領域の細胞に対する接着性と前記第２の物質領域の前記細胞に対する接着性とは異なることを特徴とする。【０００９】
上記の細胞培養用基材において、前記第２の物質領域の前記細胞に対する接着性は、前記第１の物質領域の前記細胞に対する接着性より低いことが好ましい。【００１０】
上記の細胞培養用基材において、前記第２の物質領域は、前記第１の物質領域の上に配置されていることが好ましい。【００１１】
上記の細胞培養用基材において、前記第２の物質領域は、細胞接着性蛋白質を含んでいることが好ましい。【００１２】
上記の細胞培養用基材において、前記第１の物質領域に含まれる第１の物質と前記第２の物質領域に含まれる第２の物質との間に結合が形成されていることが好ましい。【００１３】
上記の細胞培養用基材において、前記第２の物質領域は、荷電を有する高分子を有していてもよい。【００１４】
上記の細胞培養用基材において、さらにベース基材を含み、
前記第１の物質領域に含まれる第１の物質は、前記ベース基材と結合していることが好ましい。【００１５】
本発明に係る細胞培養基材の製造方法は、第１の物質領域と第２の物質領域とを形成する第１の工程を含み、前記第１の工程において、前記第１の物質領域に含まれる第１の物質と前記第２の物質領域に含まれる第２の物質との結合の形成がなされることを特徴とする。【００１６】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、前記第２の物質領域の細胞に対する接着性は、前記第１の物質領域の前記細胞に対する接着性より高いことが好ましい。【００１７】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、さらに、第１の物質層と第２の物質層とを形成する第２の工程と、前記第１の物質層及び前記第２の物質層に光を照射し、前記第１の物質層及び前記第２の物質層をそれぞれ前記第１の物質領域及び前記第２の物質領域とする第３の工程と、を含むことを特徴とする。【００１８】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、前記第２の物質領域はパターンを形成していることが好ましい。【００１９】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、前記第２の物質層を、微小液滴を所望のパターンに応じて配置することが好ましい。【００２０】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、前記第２の工程の後、前記第１の物質層の粘性を増加させる第４の工程を含むことが好ましい。【００２１】
上記の細胞培養用基材において、前記第２の物質領域は、ベース基材に形成された複数のウェルの各々に形成されていてもよい。【００２２】
上記の細胞培養用基材において、前記第１の物質領域は、ベース基材に形成された複数のウェルの各々に形成されていてもよい。【００２３】
上記の細胞培養用基材の製造方法において、前記微小液滴の配置は、マイクロピペット、キャピラリー、マイクロディスペンサーやインクジェットプリンター及びエレクトロスピニングからなる群から選ばれたいずれかの手段により行われること好ましい。【００２４】
上記の細胞培養基材の製造方法において、前記第１の物質層は、不安定中間体を光照射により生成する物質を含んでいることが好ましい。【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記の細胞培養用基材を用いることを特徴とする。【００２６】
かかる本発明は、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質でベース基材を被覆して前記ベース基材上に細胞非接着性物質層を形成する工程と、細胞接着性物質を含む微小液滴を前記細胞非接着性物質層上の所望の領域に配置して前記細胞非接着性物質層上の一部に前記細胞接着性物質層を形成する工程と、この工程の後、光を照射して細胞接着性領域及び細胞非接着性領域を有する細胞配列培養用基材とを製造する工程を具備することを特徴とする細胞配列培養用基材の製造方法にある。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のいくつかの態様によれば、特にフォトリソグラフィー技術を使用せず工業的に製造容易に、なおかつ、細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離等を抑制する細胞配列培養用基材を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の製造方法例を示す断面図及び平面図である。
【図２】ベース基材の平面図及び断面図である。
【図３】マルチウェルプレート基材を用いた細胞配列培養用基材の平面図及び断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の細胞配列培養用基材板の製造方法は、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質でベース基材を被覆してベース基材上に細胞非接着性物質層を形成する工程と、細胞接着性物質を含む微小液滴を細胞非接着性物質層上の所望の領域に配置して細胞非接着性物質層上の一部に細胞接着性物質層を形成する工程と、この工程の後、光を照射して細胞接着性領域及び細胞非接着性領域を有する細胞配列培養用基材を製造する工程を具備する。
【００３０】
ベース基材の材質に特に制限は無く、例えば、シリコン、ガラス等の無機物や、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、ポリエーテルスルホン等のプラスチック等を挙げることができる。また、ベース基材の形状にも特に制限はなく、例えば、平面状の基材でも、細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えたマルチウェルプレート基材でもよく、シャーレ状基材でもよい。なお、細胞を顕微鏡下で観察する場合は、ベース基材は透明又は半透明なものが好ましい。また、ベース基材上を被覆する細胞非接着性物質の被覆性や、この細胞非接着性物質に光照射することにより発生する不安定中間体との反応性を高めるための処理を行ってもよい。このような処理としては、例えば、スルホン化親水化処理、コロナ放電処理、プラズマ酸化処理、オゾン処理、シランカップリング剤処理等を挙げることができる。
【００３１】
このベース基材を、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質で被覆する。反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質としては、光照射により反応性を有する不安定中間体を生成する構造を、細胞非接着性高分子に導入したものが挙げられる。反応性を有する不安定中間体の具体例としては、例えばラジカル、ナイトレン等が挙げられ、光照射によりラジカルやナイトレンを生成する構造としては、ジアゾ基を有するジアゾニウム塩構造、アジド基を有するアジド構造、トリハロメチル基を有するトリハロメチル構造等を挙げることができ、アジド基を有する構造が好ましい。アジド基を有する構造として、例えば下記式（１）で表される構造を有するものが特に好ましい。そして、このような光照射によりラジカルやナイトレン等の反応性を有する不安定中間体を生成する構造を、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、２−メタクロイルオキシエチルホスホリスコリンを含むメタクリル系ポリマー等の水溶性高分子に、ペンダント状に付加したり共重合したり、又はポリマーの末端に導入することにより、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質を得ることができる。中でも、細胞非接着性物質は、アジド基を有する水溶性高分子、例えば、下記式（１）で表される構造を有する水溶性高分子であることが好ましく、より好ましくは、アジド基を有するポリビニルアルコールやアジド基を有するポリエチレングリコールである。また、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する光架橋剤と細胞非接着性高分子との混合物を、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質としてもよい。
【００３２】
【化１】
2014112633.tif 000002
（Ｒ１は、水素原子、スルホン酸基又はスルホン酸塩基を表す。）
【００３３】
光照射によりナイトレンを生成する細胞非接着性物質の具体例としては、例えば、永松元太郎、乾英夫著“感光性高分子”講談社（１９９７）の１９５ページから２０４ページに示されているアジド基ペンダントポリビニルアルコール系物質、特開平７−２３４５０４号公報に記載のアジド基ペンダントポリビニルアルコール系物質、特開平１０−３１０７６９号公報に記載のアジド基ペンダントポリビニルアルコール系物質、特開２００３−２９２４７７号公報に記載のアジド基ペンダントポリビニルアルコール系物質、特開２００６−３０７１８４号公報に記載のアジド基ペンダントポリエチレングリコール系物質を挙げることができる。
【００３４】
上述した反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質を水、水と相溶性のある有機溶媒、又はそれらの混合物に溶解もしくは分散させた溶液で、ベース基材を被覆することにより、ベース基材上に細胞非接着性物質層を形成する。その際の被覆方法としては、例えばディップ法、スピンコート法、スプレー塗布法等を使用することができる。水と相溶性のある有機溶媒としては、例えば、アセトン等のケトン類、メタノール等のアルコール類、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等が挙げられる。この細胞非接着性物質の溶液には、他の溶剤や、界面活性剤のような添加剤を加えることができるが、細胞に影響を与える物質の添加は基本的に避けるほうが無難である。
【００３５】
なお、ベース基材を細胞非接着性物質で被覆して細胞非接着性物質層を形成した後、必要に応じて加熱処理を行ってもよい。加熱処理条件は、基材や細胞非接着性物質に顕著に悪影響を及ぼさない条件である限り特に限定されないが、通常は４〜７０℃で１分間〜２４時間程度、好ましくは２０〜６０℃で５分間〜１時間程度である。
【００３６】
また、細胞非接着性物質層の形成後、細胞接着性物質層を形成する前に、細胞非接着性物質層をプレ露光してもよい。プレ露光すると細胞非接着物質層の粘性が増加するので、細胞非接着物質層上に形成する細胞接着性物質層の形状や配置の制御が容易になる。このプレ露光後、細胞非接着性物質層に、細胞接着性物質等を反応により結合させる必要があるため、プレ露光において反応する反応性を有する不安定中間体の量は、プレ露光により生成した反応性を有する不安定中間体に対して、０％以上１００％未満、好ましくは２０％以上８０％未満である。なお、プレ露光により生成する不安定中間体の量は、照射時間、照射エネルギー、照射光の波長により制御可能であり、反応した反応性を有する不安定中間体の量は、細胞非接着性物質の紫外スペクトルを測定することにより測定できる。
【００３７】
次に、細胞非接着性物質層上の所望の領域に、細胞接着性物質を含む微小液滴を配置して、細胞非接着性物質層上の一部に細胞接着性物質層を形成する。細胞接着性物質としては、特に制限は無いが、例えば、細胞接着性蛋白質として知られているコラーゲン、エラスチン、プロテオグルカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ゼラチンや、特開２００３−３３１７７号公報に記載されている温度応答性ポリマー、荷電を有する高分子等を挙げることができる。温度応答性ポリマーとしては、Ｎ−イソプロピルアミドを含む共重合体、及びポリ（Ｎ−イソプルピルアクリルアミド）等を挙げることができる。特に細胞接着性蛋白質や、荷電を有する高分子が好適である。細胞と基材とが強固に接着可能であり、また、細胞と荷電を有する高分子との相互作用により、細胞の挙動を制御することが可能になるためである。
【００３８】
また、細胞接着性物質として、細胞培養温度（通常３７℃程度の温度）において細胞接着性を示す温度応答性ポリマーであり、かつその温度応答性ポリマーの下部臨界溶解温度が細胞培養温度より低いポリマーを使用した場合には、雰囲気の温度条件を選択することにより細胞を脱着することが可能となる。なお、このようなポリマーは、下部臨界溶解温度より低い温度では相転移してポリマーが疎水性を示す。
【００３９】
このような細胞接着性物質を適当な溶媒に溶解又は分散させた溶液を、微小液滴吐出手段を使用して、細胞非接着性物質層上の所望の領域に含む微小液滴として配置することにより、細胞非接着性物質層上の一部に細胞接着性物質層を形成する。細胞接着性物質を溶解又は分散させる溶媒としては、細胞に顕著な悪影響を与えないため水が好ましい。また、必要に応じて水溶性有機溶媒を使用することができる。水溶性有機溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、エチレンクリコール、ジエチレンクリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセリン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル等を挙げることができる。更に、この細胞接着性物質の溶液には、必要に応じ、界面活性剤、消泡剤、防腐剤、無機塩類、有機塩類等を添加することができる。微小液滴吐出手段としては、例えばマイクロピペット、キャピラリー、マイクロディスペンサーやインクジェットプリンター、エレクトロスピニング等を挙げることができる。
【００４０】
この微小液滴の体積は５×１０−１３ｎＬ〜１μＬが好ましく、特に５×１０−１３ｎＬ〜１００ｎＬが好ましく、また、細胞接着物質層の平面視の直径は１０μｍ〜１０ｍｍ程度が好ましい。また、微小液滴の形状には特に制限は無い。例えば、国際公開第ＷＯ２００３／０１０３０２号公報に開示されているような、相互に異なる動物細胞のスフェロイドを形成するような細胞アレイの場合には、同公報に開示されているように、細胞接着性物質層（細胞接着領域）が直径５０〜５００μｍの実質的に円形で、他の細胞接着領域との最短の間隔が約１００μｍである配置としてもよい。
【００４１】
細胞非接着性物質層上に細胞接着性物質層を形成した後、光を照射する。これにより、細胞接着性物質層からなる細胞接着性領域と、露出した細胞非接着物質層からなる細胞非接着性領域とを有する細胞配列培養用基材を製造することができる。細胞非接着物質層及び細胞接着性物質層に光を照射することにより、細胞非接着性物質層から、反応性を有する不安定中間体が生成する。そして生成した反応性を有する不安定中間体が、基材や、細胞接着性物質と反応して結合を形成し、また、細胞非接着性物質同士も結合して、細胞非接着性物質のゲルが生成する。例えば、光照射により反応性を有する不安定中間体を生成する細胞非接着性物質として、アジド構造を有する水溶性高分子を使用した場合、光照射により細胞非接着性物質は窒素を放出し反応性を有する不安定中間体であるナイトレンを生成し、このナイトレンは基材、上層の細胞接着性物質、及び細胞非接着性物質と反応し、基材及び細胞接着性物質との結合を形成すると共に、ナイトレン同士の結合等により細胞非接着性物質のゲル化をもたらす。このように、光照射により生成した反応性を有する不安定中間体が反応することにより、基材と細胞非接着性物質層、細胞接着性物質層と細胞非接着性物質層、細胞非接着性物質層を構成する細胞非接着性物質同士が強固に結合するため、細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離等を抑制する細胞配列培養用基材を製造することができる。
【００４２】
照射光の好適な波長は細胞非接着性物質の構造により異なるが、例えば、２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である。また、照射に使用する光源は、細胞非接着性物質から反応性を有する不安定中間体を発生させることが可能な光源であれば特に限定されない。例えば、光源としてＸ線、電子線、エキシマレーザー（Ｆ２、ＡｒＦ、ＫｒＦレーザーなど）、及び固体紫外線レーザーをそれぞれ発生させる光源、メタルハライドランプ、キセノンランプ、又は高圧水銀灯を使用することができる。照射エネルギーは、細胞非接着物質の構造、使用する光源のエネルギーに応じて適宜設定すればよく、通常０．１ｍＪ／ｃｍ２〜５０００ｍＪ／ｃｍ２であり、特に１ｍＪ／ｃｍ２〜１０００ｍＪ／ｃｍ２程度が好ましい。
【００４３】
また、光を照射した後に、細胞非接着性物質と結合しなかった細胞接着性物質を洗浄する目的で、洗浄液に浸漬してもよい。洗浄液は、細胞非接着性物質及び細胞接着性物質を顕著に変性させないものであれば特に限定されず、例えば、水や必要に応じて水溶性有機溶媒を使用することができる。さらに、細胞や、細胞非接着性物質及び細胞接着性物質に顕著に悪影響を及ぼさない範囲で、種々の添加剤を添加してもよい。これら水溶性有機溶媒や添加剤は、細胞接着性物質を吐出する際に使用したものと同様のものを使用すればよい。
【００４４】
このようにして製造した細胞配列培養用基材に細胞を含有する溶液を播種する等して細胞配列培養用基材を用いて細胞を培養すると、細胞非接着性物質層に対して細胞は細胞接着性物質層に優先的に接着するため、細胞をパターン状に配列することができる。なお、血管内皮細胞、線維芽細胞等、種々な細胞の培養に適用することができる。
【００４５】
以下に本発明の細胞配列培養用基材１０の製造方法例を、図面を使用して説明する。なお、図１（ａ）及び図１（ｂ）は本発明の製造方法例を示す断面図、図１（ｃ）は細胞配列培養用基材１０の平面図であり、図１（ｃ）のＡ−Ａ´断面図が図１（ｂ）に相当する。
【００４６】
まず、図１（ａ）に示すように、ベース基材１１を、反応性を有する不安定中間体を光照射により生成する細胞非接着性物質で被覆して、ベース基材１１上に細胞非接着性物質層１２を形成する。その後、図１（ｂ）及び図１（ｃ）に示すように細胞接着性物質を含む微小液滴を細胞非接着性物質層１２上の所望の領域に配置して、細胞非接着性物質層１２上の一部に細胞接着性物質層１３を形成した後、細胞接着性物質層１３側から全面に光を照射する。これにより、細胞接着性物質層１３からなる細胞接着性領域と、露出した細胞非接着性物質層１２からなる細胞非接着性領域とを表面に有する細胞配列培養用基材１０を製造することができる。なお、図１では、スライドガラス等の平面状のベース基材１１を用いたが、ベース基材として、図２のベース基材２１の平面図（図２（ａ））及びＢ−Ｂ´断面図（図２（ｂ））に示すように、細胞を培養する領域となるウェル２２を複数個備えたマルチウェルプレート基材を使用してもよい。ベース基材２１としてマルチウェルプレート基材を使用した場合、図３の細胞配列培養用基材２０の平面図（図３（ａ））及びＣ−Ｃ´断面図（図３（ｂ））に示すように、各ウェル２２の底面に細胞非接着性物質層２３を設け、細胞非接着性物質層２３上に細胞接着性物質層２４を設ければよい。なお、細胞接着性物質層が規則正しく配列されている細胞アレイ用基材について説明したが、細胞接着性物質層の配列は規則正しくなくてもよく、ランダムに配列するようにしてもよい。また、ベース基材が透明の場合には、細胞非接着性物質層や細胞接着性物質層が設けられている側とは反対側から露光を行うようにしてもよい。
【００４７】
以上説明した非常に簡単な方法で製造される細胞アレイ用基材等の細胞配列培養用基材は、基材、細胞非接着性物質層、細胞接着性物質層が強固に結合しているため細胞培養中に細胞接着性物質のパターン脱離等が生じず、例えば薬物の細胞に対する作用の評価や薬物動態試験等に有用で、創薬や環境分析分野での応用が期待できる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００４９】
＜ベース基材Ｂ−１＞
ソーダライム製２２ｍｍφカバーガラス（松浪ガラス(株)製）【００５０】
＜ベース基材Ｂ−２＞
ポリスチレン製９６穴マルチウェルプレート平底タイプ（住友ベークライト(株)製：商標「スミロンマルチウェルプレート９６Ｆ」、０．３２ｃｍ２／ウェル）【００５１】
＜細胞非接着性物質溶液Ｉ＞  アジド基を有するポリビニルアルコール水溶液：
ニコチノイルグリシン１８．０ｇ、アジドベンズアルデヒド１５ｇ、無水酢酸３０ｇ、酢酸ソーダ１．０ｇ、及びシクロヘキサン３０ｇを混合して、７０℃で６時間加熱後放冷し、１６時間後にイソプロピルアルコール３０ｇを加え、室温でろ過した。その後、ろ過床上で冷メタノール３０ｇで洗浄し、減圧乾燥して、アジド基を有するアズラクトン化合物４−（（４−アジドフェニル）メチレン−２−（３−ピリジル）−１，３−オキザゾリン−５−オン）１０ｇを得た。このアズラクトン化合物は、赤外吸収スペクトルにおいて３９０ｎｍに吸収極大をもっていた。このアズラクトン化合物をイソプロピルアルコール５５ｇに分散し、アミノブチルアルデヒドジメチルアセタール４．６ｇを５〜１０℃でゆっくりと加えた。２時間後、反応液の吸収から３９０ｎｍの吸収は消失し、あらたに３１０ｎｍに吸収をもつようになった。その後水５００ｇを加え、アンモニア水でｐＨ＝８．０に調整し、さらに２時間、５℃で攪拌をし、析出物をろ別した。これにより、３−（４−アジドフェニル）−Ｎ−（４，４’−ジメトキシブチル）−２−［（３−ピリジル）カルボニルアミノ］−プロパ−２−エンアミド６ｇを得た。【００５２】
そして、ポリビニルアルコール（ＥＧ−３０、日本合成工業(株)製）１００ｇを水９００ｇに溶解し、これに、３−（４−アジドフェニル）−Ｎ−（４，４’−ジメトキシブチル）−２−［（３−ピリジル）カルボニルアミノ］−プロパ−２−エンアミド１０ｇ、及びリン酸３ｇを加え、６０℃で２４時間反応した。アセタール化率は９７％であった。リン酸をイオン交換処理により除去し、感光基がＰＶＡ（ポリビニルアルコール）に対し０．８ｍｏｌ％導入された感光液を調整した。この感光液を純水で希釈し、固形分総重量が５％になるようにした。【００５３】
得られた水溶液を０．４５μｍセルロースアセテートメンブレンフィルター（以下「０．４５μｍフィルター」という）でろ過したものを、細胞非接着性物質溶液Ｉとする。【００５４】
＜細胞非接着性物質溶液II＞  アジド基を有するポリエチレングリコール水溶液：
ポリエチレングリコールジアミン（日本油脂（株）製、数平均分子量２０００）１５．８ｇ、２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オンを６．０ｇ（ポリエチレングリコールジアミンのアミノ基に対して１．２倍モル当量）、及びテトラヒドロフラン７０ｇを混合して、２５℃で１８時間反応させた。反応終了後、テトラヒドロフランを減圧下で除去し、その後水５０ｇ、及び酢酸エチル５０ｇを添加して分液抽出操作を行った。分液抽出操作で水相を有機相で２回洗浄した後、水相を凍結乾燥することにより、下記式（ａ）で表されｎ＝４５の感光性樹脂を１９．８ｇ得た。得られた感光性樹脂を１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オンに由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オンの導入率は８３％であった。【００５５】
【化２】
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【００５６】
得られた感光性樹脂（細胞非接着性物質）と純水とを固形分総重量が５％になるように混合した水溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものを、細胞非接着性物質溶液IIとする。【００５７】
＜細胞非接着性物質溶液III＞アジド基を有する架橋剤とポリビニルピロリドンとの混合液：
光架橋剤（４，４‘−ジアジドスチルベン−２，２’−ジスルホン酸）とポリビニルピロリドンとを９：１（重量比）の割合で含有する水溶液と、純水とを固形分総重量が５％になるように混合した。得られた水溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものを細胞非接着性物質溶液IIIとする。【００５８】
＜被覆工程Ｃ−１＞
細胞非接着性物質溶液をベース基材上に滴下して、速やかに基材を１０００ｒｐｍ×３０秒間でスピンさせることにより、ベース基材上部を細胞非接着性物質溶液で全面被覆して細胞非接着性物質層を形成する工程。【００５９】
＜被覆工程Ｃ−２＞
細胞非接着性物質溶液をベース基材上に滴下し、その滴下した液滴が基材上に広がることにより、ベース基材上部を細胞非接着性物質溶液で全面被覆して細胞非接着性物質層を形成する工程。【００６０】
＜プレベイク工程Ｐ−１＞
６０℃に設定した恒温乾燥機を使用して、細胞非接着性物質層を形成したベース基材をベイク（加熱）する工程。【００６１】
＜プレ露光工程ＰＬ−１＞
高圧水銀灯を使用し、細胞非接着性物質層を露光量１０００ｍＪ／ｃｍ２で露光する工程。【００６２】
＜細胞接着性物質溶液ａ＞
細胞接着性物質コラーゲンタイプＩを含む水溶液と純水とを、固形分総重量が０．２５％になるように混合したものを細胞接着性物質溶液ａとする。【００６３】
＜細胞接着性物質溶液ｂ＞
エタノールと純水の混合溶媒（混合比１：１（重量比））と、細胞接着性物質コラーゲンタイプＩを含む水溶液とを、固形分総重量が０．２５％になるように混合したものを細胞接着性物質溶液ｂとする。【００６４】
＜細胞接着性物質溶液ｃ＞
ラミニンと純水とを、固形分総重量が０．２５％になるように混合し、得られた水溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものを細胞接着性物質溶液ｃとする。【００６５】
＜細胞接着性物質溶液ｄ＞
フィブロネクチンと純水とを、固形分総重量が０．２５％になるように混合し、得られた水溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものを、細胞接着性物質溶液ｄとする。【００６６】
＜微小液滴吐出工程Ｄ−１＞
隣り合う細胞接着性物質層同士が、２ｍｍ以上離れ且つ２１ｍｍ以内の範囲となるように、ソーダライムガラス製キャピラリー（内径８０μｍφ）を使用して、細胞非接着性物質層上に、細胞接着性物質溶液を吐出する工程。【００６７】
＜微小液滴吐出工程Ｄ−２＞
隣り合う細胞接着性物質層同士が、２ｍｍ以上離れ且つ２１ｍｍ以内の範囲となるように、０．５μＬ容量のマイクロピペッター（エッペンドルフ(株)製電動マイクロピペッター）を使用して、細胞非接着性物質層上に、細胞接着性物質溶液を吐出する工程。【００６８】
＜微小液滴吐出工程Ｄ−３＞
隣り合う細胞接着性物質層同士が２０μｍ以上離れかつ２１ｍｍ以内の範囲となるように、エレクトロスピニング方法（(株)ワイエムシィ製エレクトロスピニング装置）を使用し、１２０μｍφ径の穴が空いたガラス製マスクを介して、細胞非接着性物質層上に、細胞接着性物質溶液を吐出する工程。【００６９】
＜露光工程Ｌ−１＞
高圧水銀灯を使用し、露光量１０００ｍＪ／ｃｍ２で細胞非接着性物質層及び細胞接着性物質層を露光する工程。【００７０】
＜洗浄工程Ｗ−１＞
露光後の細胞非接着性物質層及び細胞接着性物質層を純水に１分間浸漬して洗浄する工程。【００７１】
＜ポストベイク工程ＰＢ−１＞
６０℃に設定した恒温乾燥機を使用して、洗浄工程後のベース基材をベイク（加熱）する工程。【００７２】
（実施例１）
表１に示すように、被膜工程Ｃ−１において細胞非接着性物質溶液Ｉでベース基材Ｂ−１上面を被覆して細胞非接着性物質層を形成した。次いで、プレベイク工程Ｐ−１を行った後、細胞非接着性物質層上に、微小液滴吐出工程Ｄ−１において細胞接着性物質溶液ａを、隣り合う細胞接着性物質同士が２ｍｍ以上離れ且つ２１ｍｍ以内の範囲にあるように、多数配置した。その後、露光工程Ｌ−１においてベース基材上の細胞非接着性物質層及び細胞接着性物質層に光を照射し、洗浄工程Ｗ−１、ポストベイク工程ＰＢ−１を経て、細胞配列培養用基材を製造した。【００７３】
（実施例２〜１４）
表１に記載する条件で、各細胞配列培養用基材を製造した。【００７４】
【表１】
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【００７５】
（試験例１）細胞配列培養用基材の評価
実施例１〜１４で得られた細胞配列培養用基材について、ウシ血管内皮細胞を使用した評価を行った。評価は、細胞を培地に懸濁させた溶液を、実施例１〜１４で得られた細胞配列培養用基材に播種し、播種２日後に倒立顕微鏡を使用して観察を行った。その結果、実施例１〜１４全ての細胞配列培養用基材において、血管内皮細胞が細胞非接着性物質層上には接着せず、所望の領域に配置された細胞接着性物質層上にのみ接着しており、血管内皮細胞が、得られた細胞配列培養用基材上でパターン状に接着していることを確認した。【００７６】
また、実施例１〜２で得られた細胞接着領域の直径はおおよそ２ｍｍであり、実施例３〜４及び７で得られた細胞接着領域の直径はおおよそ３ｍｍであり、実施例５〜６及び８〜１４で得られた細胞接着領域の直径はおおよそ１２０μｍであった。また、培養開始から７日経過後も、全ての基材において細胞が細胞接着性物質層から剥がれることが無く、細胞非接着性物質層への細胞の接着も発生していなかった。
【符号の説明】
【００７７】
１０，２０  細胞配列培養用基材
１１，２１  ベース基材
１２，２３  細胞非接着性物質層
１３，２４  細胞接着性物質層
２２        ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2014112633.tif 000009
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