(57)【要約】  二次元電気泳動の実施者の操作の簡素化と、且つ、再現性の高い二次元電気泳動の実施を実現する。本発明の一形態では、等電点電気泳動ゲル（１）の一端部に、予め分子量マーカーが導入されたマーカー導入領域（２）を有しており、等電点電気泳動の際には当該マーカー導入領域（２）に電場がかからない構成となっている一方、二次元目電気泳動の際にはマーカー導入領域（２）の分子量マーカーが等電点電気泳動されたサンプルとともにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（４２４）に移動する構成となっている。
2015064736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次元電気泳動の一次元目電気泳動に用いる一次元目電気泳動媒体であって、
電気泳動試料を含有しておらず、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質を含有していることを特徴とする一次元目電気泳動媒体。
【請求項２】
上記標準物質は、分子量標準であることを特徴とする請求項１に記載の一次元目電気泳動媒体。
【請求項３】
乾燥状態であることを特徴とする請求項１または２に記載の一次元目電気泳動媒体。
【請求項４】
上記標準物質は、等電点標準であり、
上記一次元目電気泳動媒体は、乾燥状態であることを特徴とする請求項１または２に記載の一次元目電気泳動媒体。
【請求項５】
等電点電気泳動媒体であることを特徴とする請求項１から４までの何れか１項に記載の一次元目電気泳動媒体。
【請求項６】
上記一次元目電気泳動の際に電場がかかる領域と電場がかからない領域とを有し、
上記電場がかからない領域に上記分子量標準を含有していることを特徴とする請求項２に記載の一次元目電気泳動媒体。
【請求項７】
帯状を有した媒体保持面を有し、当該媒体保持面に沿って請求項１から６までの何れか１項に記載の一次元目電気泳動媒体を保持していることを特徴とする、媒体付き保持体。
【請求項８】
上記一次元目電気泳動媒体は、上記媒体保持面の長尺を挟んで位置する両端部のうちの少なくとも一方の端部に、上記標準物質を含有した領域を有しており、
上記一次元目電気泳動媒体は、上記一次元目電気泳動の際に電場がかかる領域を、上記標準物質を含有した領域とは異なる箇所に有していることを特徴とする請求項７に記載の、媒体付き保持体。
【請求項９】
一次元目電気泳動用の一対の電極と、二次元目電気泳動用の陰極および陽極とを備えた、二次元電気泳動装置であって、
電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を一部の領域に含有し、他の領域に電気泳動試料を含有している媒体を一次元目電気泳動媒体として用い、
上記一次元目電気泳動用の一対の電極は、上記一次元目電気泳動媒体における上記分子量標準を含有していない領域に電場をかける構成となっており、
上記二次元目電気泳動用の陰極および陽極は、上記一次元目電気泳動媒体の全領域に電場をかける構成となっていることを特徴とする二次元電気泳動装置。
【請求項１０】
上記一次元目電気泳動媒体は帯状を有しており、
上記一次元目電気泳動用の一対の電極の電極間の距離は、上記帯状の一次元目電気泳動媒体の長尺よりも短く、且つ、上記二次元目電気泳動用の上記陰極側の端部の長さよりも短いことを特徴とする請求項９に記載の二次元電気泳動装置。
【請求項１１】
請求項１から６までの何れか１項に記載の一次元目電気泳動媒体に電気泳動試料を導入する準備工程と、
上記準備工程に続いて一次元目電気泳動媒体に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、
上記一次元目電気泳動工程後の一次元目電気泳動媒体を、二次元目電気泳動媒体の端部に接触させた状態で、二次元目電気泳動媒体に電場をかけて二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴とする二次元電気泳動方法。
【請求項１２】
上記準備工程では、請求項６に記載の一次元目電気泳動媒体の上記電場がかかる領域に、上記電気泳動試料を導入し、
上記一次元目電気泳動工程は、上記電場がかかる領域に電場をかけることを特徴とする請求項１１に記載の二次元電気泳動方法。
【請求項１３】
請求項１から６までの何れか１項に記載の一次元目電気泳動媒体を作製するための治具であり、
標準物質を含有する標準物質導入用物質を保持する標準物質導入用物質保持部と、
標準物質が導入される前の一次元目電気泳動媒体を、当該標準物質導入用物質保持部に隣接した位置に保持する媒体保持部とが設けられていることを特徴とする治具。
【請求項１４】
上記電気泳動試料を含有する電気泳動試料導入用物質を保持する電気泳動試料導入用物質保持部が更に設けられており、
上記媒体保持部は、上記一次元目電気泳動媒体を、電気泳動試料導入用物質保持部に隣接した位置に保持することを特徴とする請求項１３に記載の治具。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の治具を用いて、一次元目電気泳動媒体の一部の領域に、電気泳動試料を導入し、当該一次元目電気泳動媒体の他の領域に、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を導入する準備工程と、
上記準備工程後に、上記一部の領域に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、
上記一次元目電気泳動工程後に、上記一次元目電気泳動媒体を二次元目電気泳動媒体における陰極側の端部に接触させた状態で、一次元目電気泳動媒体の全領域に電場がかかるようにして二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴とする二次元電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二次元電気泳動に用いられる一次元目電気泳動媒体に関し、より詳細には、分析精度が高く且つ高再現性を実現することできる一次元目電気泳動ゲル、当該媒体を保持した媒体付き保持体、当該媒体を用いた二次元電気泳動装置、および当該媒体を用いた二次元電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中のタンパク質を網羅的に解析する技術はプロテオーム解析と呼ばれる。プロテオーム解析において、二次元電気泳動はタンパク質の差を画像で検出できるために良く利用されている。二次元電気泳動法はタンパク質を等電点と分子量の物理的性質に基づいて分離する方法として知られている。全てのタンパク質は、各々が固有の電荷および分子量を有しているために、生体中に存在するタンパク質混合液を分子量または電荷で分離することで各種タンパク質に分離することが可能である。特に、電荷で分離することは、タンパク質は同じ種類のタンパク質でも、翻訳後修飾によって電荷が異なるタンパク質種が存在し、それらタンパク質の分子量はほとんど同じであるために重要である。【０００３】
上述の二次元電気泳動法の手法は、試料であるサンプルを固定化ｐＨグラジェント（ＩＰＧ）ゲルに浸みこませた後、ＩＰＧゲルの両端に電圧を印加して等電点電気泳動である一次元目電気泳動を行い、一次元目電気泳動後に当該ＩＰＧゲルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液に浸漬した後、サンプルを分子量に基づいて分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法）を二次元目電気泳動として行なう。この手法において、サンプルの比較対象となる標準物質（マーカーと呼ばれることもある）を、サンプルとともに泳動してサンプルの同定を行うことが知られている。例えば、上述した等電点電気泳動であれば等電点マーカーをサンプルとともに泳動し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであれば分子量マーカーをサンプルとともに泳動することが知られている。【０００４】
一般に、これらの標準物質は、電気泳動開始時にサンプルとともにゲルにアプライする。すなわち、一次元目電気泳動の開始時に一次元目電気泳動ゲルに等電点マーカーをアプライし、二次元目電気泳動の開始時に二次元目電気泳動ゲルに分子量マーカーをアプライする。また、等電点マーカーはサンプルに混合してＩＰＧゲルに浸みこませる手法が一般的である一方、分子量マーカーはＳＤＳに浸漬した後にＩＰＧゲルが存在しない部分に手作業でアプライすることが一般的である。具体的には、二次元目電気泳動ゲルの端面にウェルが形成されていて当該ウェルにアプライする場合と、ろ紙等の多孔質に分子量マーカーを浸みこませたプラグを二次元目電気泳動ゲルの端面に乗せてアプライする方法などがある（特許文献１および２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公表特許公報「特表２００９−５４４９７４号公報（２００９年１２月１７日公表）」
【特許文献２】日本国公表特許公報「特表２００３−５２６７９９号公報（２００３年９月９日公表）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のような標準物質（マーカー）のアプライ法は、電気泳動を実施する実施者の技量等によって誤差が出やすく、そのため、泳動結果の分析に関して再現性がとり難いという問題がある。【０００７】
例えば、二次元目電気泳動時の分子量マーカーのアプライに関して、アプライ位置がずれたり、アプライ量が過多であったりすると、サンプルの泳動レーンに当該マーカーが混入するなどして、正確な泳動結果が得られない虞がある。【０００８】
また、上述のように、実施者自らが各電気泳動開始時に標準物質（マーカー）をアプライする必要があるため、実施者にとって作業が煩雑である。【０００９】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、電気泳動実施者の作業を簡素化し、且つ再現性の高い二次元電気泳動を実施するための一次元目電気泳動媒体を提供するとともに、当該媒体を保持した媒体付き保持体、当該媒体を用いた二次元電気泳動装置、当該媒体を用いた二次元電気泳動方法、および、当該媒体を作製するための治具を提供することにある。【００１０】
なお、本明細書において、二次元電気泳動のうちの一次元目の電気泳動については一次元目電気泳動と称し、二次元目の電気泳動については二次元目電気泳動と称する。すなわち、一次元目電気泳動と、これに続く二次元目電気泳動とによって、二次元電気泳動が構成される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る、二次元電気泳動の一次元目電気泳動用媒体は、二次元電気泳動の一次元目電気泳動に用いる一次元目電気泳動媒体であって、電気泳動試料を含有しておらず、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質を含有していることを特徴としている。【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る二次元電気泳動装置は、一次元目電気泳動用の一対の電極と、二次元目電気泳動用の陰極および陽極とを備えた、二次元電気泳動装置であって、電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を一部の領域に含有し、他の領域に電気泳動試料を含有している媒体を一次元目電気泳動媒体として用い、上記一次元目電気泳動用の一対の電極は、上記一次元目電気泳動媒体における上記分子量標準を含有していない領域に電場をかける構成となっており、上記二次元目電気泳動用の陰極および陽極は、上記一次元目電気泳動媒体の全領域に電場をかける構成となっていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、二次元電気泳動を実施する実施者の操作を簡素化することができ、且つ、再現性の高い二次元電気泳動の実施に寄与することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態の概念を示す図である。
【図２】本発明に係る、二次元電気泳動の一次元目電気泳動媒体の一実施形態である等電点電気泳動ゲルの斜視図である。
【図３】図２に示す等電点電気泳動ゲルを備えたゲル付き保持体の図であり、（ａ）が側面図であり、（ｂ）が等電点電気泳動ゲル側の側面図である。
【図４】図２に示す等電点電気泳動ゲルを作製する途中の過程を図示した図である。
【図５】図２に示す等電点電気泳動ゲルを作製する途中の過程を図示した図である。
【図６】図２に示す等電点電気泳動ゲルの上面図である。
【図７】図２に示す等電点電気泳動ゲルのサンプル導入工程を示す図である。
【図８】図２に示す等電点電気泳動ゲルを用いて行う等電点電気泳動器具を示し、（ａ）は等電点電気泳動器具の上面図であり、（ｂ）は等電点電気泳動器具に等電点電気泳動ゲルをセットした状態を示した断面図である。
【図９】本発明に係る二次元電気泳動装置の一実施形態を示す図である。
【図１０】図９に示す二次元電気泳動装置の断面図である。
【図１１】本発明に係る、二次元電気泳動の一次元目電気泳動媒体の他の実施形態である等電点電気泳動ゲルの斜視図である。
【図１２】図１１に示す等電点電気泳動ゲルにサンプルと分子量マーカーとを同時に導入するための同時導入治具を示し、（ａ）が上面図であり、（ｂ）が（ａ）に示す切断線Ａ−Ａ´における断面図である。
【図１３】図１２に示す同時導入治具を用いて、図１１に示す等電点電気泳動ゲルにサンプルと分子量マーカーとを同時に導入する様子を示す図である。
【図１４】サンプルと分子量マーカーとが導入された図１１に示す等電点電気泳動ゲルを用いて等電点電気泳動を行うための等電点電気泳動器具の断面図である。
【図１５】本発明に係る二次元電気泳動装置の他の実施形態を示す図である。
【図１６】実施例の泳動結果を示す図である。
【図１７】実施例の泳動結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
〔実施形態１〕
以下、本発明の一実施形態について、図１から図１０を用いて詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、二次元電気泳動の一次元目電気泳動媒体、当該媒体を保持した媒体付き保持体、当該媒体を用いた二次元電気泳動装置、および当該媒体を用いた二次元電気泳動方法に関する。そこで、本実施形態１では、一次元目電気泳動として等電点電気泳動を行い、二次元目電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う二次元電気泳動を挙げる。
【００１７】
ここで、先述したように、一般的な二次元電気泳動では、等電点電気泳動の開始時に等電点電気泳動ゲルに等電点マーカーをアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの開始時にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに分子量マーカーをアプライする。そのため、必然的にＳＤＳ−ＰＡＧＥの実施者自らが分子量マーカーのアプライ操作を行うことになり、操作が煩雑であるだけでなく、実施者の技量によっては分子量マーカーを良好にアプライすることができずに分析精度が低下したり再現性がとれないという事態を招く虞がある。この問題を解決するべく、本実施形態１では、一次元目電気泳動の前に、二次元目の電気泳動において用いる標準物質（分子量マーカー）を一次元目電気泳動ゲル（等電点電気泳動ゲル）に予め導入することを特徴的構成の一つとして具備する。なお、分子量マーカーは、分子量の基準となるタンパク質の混合液で良い。
【００１８】
本実施形態１の詳細を説明する前に、本実施形態１の概念を図１を用いて説明する。図１には、等電点電気泳動ゲル１（等電点電気泳動媒体）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４の陰極側の端部に接触した状態を示しており、この状態は、二次元目電気泳動であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を開始する時点を示している。特徴的なのは、等電点電気泳動ゲル１の一端部に、一次元目電気泳動の際に電場がかからず、二次元目電気泳動の際に電場がかかる領域であるマーカー導入領域２が形成されており、一次元目電気泳動の前に、このマーカー導入領域２に二次元目の電気泳動において用いる分子量マーカー（分子量標準）が導入される点にある。この分子量マーカーは、二次元目電気泳動までは移動せずマーカー導入領域２内に留まる一方、二次元目電気泳動が開始すると、図１に矢印で示すように一次元目電気泳動によって分離された電気泳動試料（図１中の白丸）とともに等電点電気泳動ゲル１からＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４へと移動し（分子量マーカーは図１中の黒丸）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４内を泳動する構成となっている。
【００１９】
なお、分子量マーカーを等電点電気泳動ゲルに導入するタイミングは、電気泳動試料であるサンプル（以下、単にサンプルと称することがある）を等電点電気泳動ゲルに導入する前に導入する態様と、サンプルと同時に等電点電気泳動ゲルに導入する態様とがある。そこで、本実施形態１では前者の態様を説明し、後者の態様は後述する実施形態２において説明する。
【００２０】
（１−１）本実施形態１の等電点電気泳動ゲル
図２は、本実施形態１の等電点電気泳動ゲルの斜視図である。本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１は、帯状をなしており、その一端領域に、分子量マーカーが導入されたマーカー導入領域２が形成されている。また、帯状の等電点電気泳動ゲル１の長尺方向に沿ったマーカー導入領域２の隣りに、サンプルが導入される等電点電気泳動領域３が形成されている。
【００２１】
ここで、本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１は、等電点電気泳動のサンプルが等電点電気泳動ゲル１に導入される前の段階で、マーカー導入領域２に既に分子量マーカーが導入された等電点電気泳動ゲルを提供するものである。すなわち、本実施形態１は、等電点電気泳動領域３がサンプルを含まず泳動ゲルのみで構成され、マーカー導入領域２のみに分子量マーカーが導入された等電点電気泳動ゲル１を提供するものである。二次元電気泳動の実施者は、本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１を入手し、等電点電気泳動領域３にサンプルを導入するだけでよく、二次元目電気泳動開始時に分子量マーカーを実施者自らが導入しなくとも良いというメリットがある。
【００２２】
本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１は、例えば、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲルが好適である。ＩＰＧゲルは、例えば、ゲル骨格を形成するアクリルアミド／ビスアクリルアミド混合溶液（例えば、混合比：３７．５／１）と、ゲル骨格内のｐＨを規定する数種類のアクリルアミドバッファーと、重合開始剤である過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）と、重合促進剤であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）と、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）とを用いて製造することができる。
【００２３】
本実施形態１の帯状の等電点電気泳動ゲル１は、その長尺の長さが、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの陰極側の端辺の長さと同じかそれより短い。これにより、図１に示す接触構成を実現することができる。
【００２４】
なお、本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１は、乾燥状態であっても、膨潤状態であってもよいが、標準物質やサンプルは、膨潤状態のゲル内に存在しているよりも、乾燥状態のゲル内に存在しているほうが、安定しているため、流通、保管などを行う場合には、乾燥状態であることが好ましい。
【００２５】
（１−２）本実施形態１のゲル付き保持体
また、本発明は帯状の一次元目電気泳動用ゲルを保持部の保持面に接着させたゲル付き保持体も含む。そこで、本実施形態１のゲル付き保持体４０を図３に示す。図３では、図２に示した帯状の等電点電気泳動ゲル１を保持部４の保持面に接着させたゲル付き保持体４０を提供する。図３中の（ａ）は、ゲル付き保持体４０の側面図であり、図３中の（ｂ）はゲル付き保持体４０の等電点電気泳動ゲル１側の側面図である。
【００２６】
保持部４は、例えばチップ様の形状を有した絶縁材から構成してもよく、あるいはフィルム状であってもよい。
【００２７】
なお、保持部４の保持面に接着させた帯状の等電点電気泳動ゲル１は、膨潤状態であってもよいし、乾燥状態であってもよい。
【００２８】
次に、等電点電気泳動ゲル１の一例として、ＩＰＧゲルに分子量マーカーを導入する方法を説明する。
【００２９】
（１−３）等電点電気泳動ゲルへの分子量マーカーの導入
分子量マーカーを導入した等電点電気泳動ゲル１は、次の各工程に経て作製することができる。すなわち、本実施形態１におけるマーカーの導入方法は、分子量マーカー導入前の等電点電気泳動ゲルシートを作製するゲル準備工程と、ゲル準備工程によって作成された等電点電気泳動ゲルシートの一部に分子量マーカーを導入するマーカー導入工程と、マーカー導入工程後の等電点電気泳動ゲルシートから帯状の等電点電気泳動ゲル１を切り出す切断工程とを含む。以下、各工程について詳述する。
【００３０】
（ゲル準備工程）
分子量マーカー導入前の等電点電気泳動ゲルシートを作製するゲル準備工程では、まず、アクリルアミド／ビスアクリルアミド混合溶液（混合比：３７．５／１）、アクリルアミド誘導体４種（酸解離定数：３．６、６．２、７．０、８．５）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ；Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、グリセロールおよび純水を用いて、所望の混合比で調整した酸性側モノマー溶液および塩基性側モノマー溶液を調製する（例えば、Ｐ．Ｇ．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９０を参照のこと）。
【００３１】
そして、調製した酸性側モノマー溶液および塩基性側モノマー溶液をミキサーを用いて混合し、得られた混合溶液を、ＩＰＧゲル作製器具に充填し、ゲル化する。
【００３２】
ここで、本実施形態１では、図３に示すゲル付き保持体４０を提供するために、上記混合溶液を充填する前に、ＩＰＧゲル作製器具に予めシート状のゲル接着層（例えば、ゲルボンドフィルム）を配置しておき、そこに上記混合溶液を充填する。なお、得られるＩＰＧゲルの長さは、例えば、５０ｍｍ〜２４０ｍｍまで任意に設計することができる。
【００３３】
その後、洗浄、乾燥を行い、ＩＰＧゲルにおけるゲル接着層とは反対側の面に、保護フィルムを貼り付ける。なお、保護フィルムの貼り付けは、気泡、ダスト等の混入を防ぐように、ローラー等を用いて、注意深く行うことが好ましい。
【００３４】
次に、ゲル接着層上にチップ接着層を設ける。例えば、ゲル接着層上に接着剤を塗布してもよいし、両面テープを貼付してもよい。両面テープを貼付する場合、ローラー等の器具を用いて、気泡、ダストが混入しないように注意深く行うことが好ましい。以上により、片面に保護フィルムが設けられたシート状の等電点電気泳動ゲルが形成される。
【００３５】
本実施形態１では、概して正方形のシート状の等電点電気泳動ゲルを形成する。この正方形のシート状の等電点電気泳動ゲルは、最終的に作製する帯状の等電点電気泳動ゲルが複数本並んで構成される形状を有している。このように複数本分の帯状の等電点電気泳動ゲルをシート状に一度に作製することにより、後述のマーカー導入工程において行う処理を効率的に行うことができるほか、ハンドリングも容易であるため好ましい。なお、シート状の等電点電気泳動ゲルの形状はこれに限定されるものではない。
【００３６】
（マーカー導入工程）
続いて、ゲル準備工程において作成したシート状の等電点電気泳動ゲルの一部に分子量マーカーを導入する工程を行う。本実施形態１では、このマーカー導入工程において、分子量マーカーを含有するマーカー含有液に正方形のシート状の等電点電気泳動ゲルの一辺およびその近傍を浸漬することによって、浸漬した領域に分子量マーカーを導入する手法をとる。また、分子量マーカー液に浸漬するシート状の等電点電気泳動ゲルの一辺とは、ゲル準備工程において作成したＩＰＧゲルのｐＨ勾配方向に直交する方向に沿った一辺である。
【００３７】
ここで、図４は、マーカー導入工程において用いるマーカー導入治具１００（治具）の斜視図である。図４に示すマーカー導入治具１００は、並列に設けられた三列の溝部を有しており、そのうちの中央の列に位置する溝部が分子量マーカー液を貯留するマーカー液貯留部１０２（標準物質導入用物質保持部、媒体保持部）である。また、このマーカー液貯留部１０２を挟んで前後に位置する残り二つの溝部は、マーカー液貯留部１０２から溢れたマーカー液を受けるマーカー液逃げ部１０１である。マーカー導入工程では、図４に示すようにシート状の等電点電気泳動ゲルの一辺およびその近傍をマーカー液貯留部１０２の分子量マーカー液に浸漬する。
【００３８】
例えば、図示していない支持部材によってシート状の等電点電気泳動ゲルを支持して、図４に示すようにシート状の等電点電気泳動ゲルの下端領域を分子量マーカー液に浸すようにすれば、下端領域のみに分子量マーカー液を浸透させることができ、容易且つ確実にシート状の等電点電気泳動ゲルの一部にマーカー導入領域を形成したシート状の等電点電気泳動ゲルを作製することができる（図５）。
【００３９】
なお、マーカー導入工程において分子量マーカー液に浸漬するシート状の等電点電気泳動ゲルは、膨潤状態であってもよいし、乾燥状態であってもよい。
【００４０】
また、マーカー導入工程の後であって、続く切断工程までの間に、乾燥工程を設ける。この乾燥工程により、分子量マーカーがシート状の等電点電気泳動ゲルの下端領域において安定して保持され、且つ続く切断工程の際に切断を容易にすることができる。
【００４１】
（切断工程）
続いて、マーカー導入工程において一辺およびその近傍に分子量マーカーが導入されたシート状の等電点電気泳動ゲルから帯状の等電点電気泳動ゲルを切り出す。
【００４２】
先述したように分子量マーカーが導入されたシート状の等電点電気泳動ゲルの一辺とは、ゲル準備工程において作成したＩＰＧゲルのｐＨ勾配方向に直交する方向に沿った一辺である。そこで、当該一辺を複数に分割するように、ｐＨ勾配方向に沿って切断することによって、帯状の等電点電気泳動ゲルの一端領域に分子量マーカーが導入された帯状の等電点電気泳動ゲルを作製することができる（図６）。
【００４３】
以上の各工程を経て、図２に示す分子量マーカーが導入された等電点電気泳動ゲルが完成する。ここで、図６に示すように、帯状の等電点電気泳動ゲル１の一端領域に実現されたマーカー導入領域２は、等電点電気泳動時に帯状の等電点電気泳動ゲル１に電場をかける一対の電極３０１の電極間から外れた位置にある。そのため、一対の電極３０１に電圧が印加されている間、すなわち、サンプルが等電点電気泳動されている間に、マーカー導入領域２に導入された分子量マーカーが、等電点電気泳動ゲル１内を移動することはない。
【００４４】
（１−４）ゲル付き保持体の作製
図３に示すゲル付き保持体４０は、上述した切断工程によって帯状に切断した等電点電気泳動ゲルを、保持部４に接着させることによって作製することができる。好ましくは、上述した切断工程の際に、保持部４の保持面を分子量マーカーが導入されたシート状の等電点電気泳動ゲルの上面に接着し、切断と同時に、図３に示すゲル付き保持体４０が完成するようにしたほう良い。なぜなら、帯状の等電点電気泳動ゲルをそれ単独で扱うと折れ曲がったり千切れたりする虞が高いためである。保持部４に限らず、帯状の等電点電気泳動ゲルは何らかの部材に接着させた状態で扱うことが好ましい。
【００４５】
（１−５）本実施形態１の等電点電気泳動ゲルへのサンプル導入方法
本実施形態１では、図７に示すサンプル導入治具２００を用いて、図２に示す帯状の等電点電気泳動ゲル１の等電点電気泳動領域３にサンプルを導入する。なお、本実施形態１では、図３に示すゲル付き保持体４０の状態にある帯状の等電点電気泳動ゲル１にサンプルを導入する方法を例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
サンプル導入治具２００は、図７に示すように、底部にサンプル液２０１を保持するための溝２０２が設けられ、上方に向かって開口した筐体２０３を備えている。ゲル付き保持体４０が、図７に示すように、筐体２０３の開口側から底部に向けて挿入され、帯状の等電点電気泳動ゲル１の等電点電気泳動領域３が溝２０２に保持されたサンプル液２０１と接触すると、サンプル液２０１が吸収されて、等電点電気泳動領域３にサンプルが導入される。
【００４７】
サンプルの導入に際して、等電点電気泳動ゲル１はサンプル液２０１を吸収できる程度に乾燥していることが好ましい。
【００４８】
しかしながら、サンプル導入治具２００が、後述する等電点電気泳動器具を兼ねている場合には、等電点電気泳動ゲル１が膨潤状態であっても、サンプル液２０１と等電点電気泳動領域３とが接触してさえいれば、等電点電気泳動領域３に電場がかけられると同時にサンプルが等電点電気泳動領域３内に移動するため、サンプル液２０１との接触時に等電点電気泳動ゲル１が乾燥状態である必要はない。
【００４９】
あるいは、サンプル導入治具２００が後述する等電点電気泳動器具を兼ねていない場合であっても、サンプル液２０１中のサンプルを等電点電気泳動領域３内に移動させることを目的としてサンプル導入治具２００に設けた一対の電極によって、等電点電気泳動領域３に電場をかけてサンプルの導入を行ってもよく、この場合も、サンプル液２０１との接触時に等電点電気泳動ゲル１が乾燥状態である必要はない。
【００５０】
なお、サンプル導入方法は、この方法に限らない。例えば等電点電気泳動ゲル１が乾燥状態である場合には、等電点電気泳動領域３表面にピペッター等を用いてサンプル液を載せてサンプルを等電点電気泳動領域３内に導入してもよい。
【００５１】
なお、サンプル導入治具２００は、後述する等電点電気泳動器具として構成することも可能である。すなわち、サンプル導入と等電点電気泳動とを一つの治具（器具）で兼ねることができる。このようにサンプルの導入とサンプルの等電点電気泳動とをサンプル導入治具２００内で行うと、迅速なサンプル分析が可能となる。
【００５２】
（１−６）等電点電気泳動器具
図８は、本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１を用いて等電点電気泳動（一次元目電気泳動工程）を行う等電点電気泳動器具を示す図であり、図８中の（ａ）が等電点電気泳動器具の上面図であり、図８中の（ｂ）が（ａ）に示す切断線Ａ−Ａ´における等電点電気泳動器具の断面図である。なお、説明の便宜上、図８中の（ａ）には等電点電気泳動ゲル１を図示しておらず、図８中の（ｂ）は等電点電気泳動ゲル１を図示している。
【００５３】
本実施形態１の等電点電気泳動器具３００は、槽本体３０２に設けられた凹部の底面に一対の電極３０１が配されている。槽本体３０２の凹部は底面に沿って帯状に細長い形状を有している。そして、一対の電極３０１はそれぞれ、図８中の（ａ）に示すように線状の導電体が凹部の短尺方向に沿って配設されてなる。一対の電極３０１は、例えば白金から構成することができる。
【００５４】
電極３０１同士は、槽本体３０２の凹部の長尺方向に所定の長さ離間している。その所定の長さ、つまり離間距離は、帯状の等電点電気泳動ゲル１の等電点電気泳動領域３の長尺方向（つまりｐＨ勾配方向）に沿った長さと等しいか当該長さよりも僅かに短く構成されている。
【００５５】
換言すれば、帯状の等電点電気泳動ゲル１は、等電点電気泳動領域３の長尺方向（つまりｐＨ勾配方向）の長さが一対の電極３０１の離間距離と等しいか一対の電極３０１の離間距離より僅かに長くなるように構成されている。
【００５６】
また、槽本体３０２の凹部に挿入される帯状の等電点電気泳動ゲル１が、乾燥状態にあるときには、槽本体３０２の凹部の底面と帯状の等電点電気泳動ゲル１との間の間隙に等電点電気泳動用の緩衝液３０３が充填されている。そして、乾燥状態の帯状の等電点電気泳動ゲル１が、この緩衝液３０３を吸収して膨潤する。なお、槽本体３０２の凹部に挿入される帯状の等電点電気泳動ゲル１が、既に膨潤状態である場合には、槽本体３０２の凹部の底面に緩衝液３０３を充填しない。
【００５７】
図８中の（ｂ）に示す状態において一対の電極３０１に電圧を印加して、帯状の等電点電気泳動ゲル１に電場をかけると、一方の電極３０１と他方の電極３０１との間で等電点電気泳動領域３に電場がかかる一方、マーカー導入領域２には電場がかからない。これにより、マーカー導入領域２に導入された分子量マーカーは泳動されず、等電点電気泳動領域３内のサンプルのみが等電点の違いによって分離される。
【００５８】
なお、図８の等電点電気泳動器具３００は、マーカー導入領域２にも緩衝液３０３が接触している。これは、等電点電気泳動器具３００に設置される帯状の等電点電気泳動ゲル１が乾燥状態である場合に、等電点電気泳動領域３のみに緩衝液３０３を接触させて緩衝液３０３のみが膨潤すると等電点電気泳動ゲル１の表面が凹凸になって良好な等電点電気泳動を行うことができない場合が想定されるためである。マーカー導入領域２にも緩衝液３０３を接触させて等電点電気泳動領域３とともに膨潤させることによって、良好な等電点電気泳動を行うことができる。
【００５９】
一方、膨潤状態である帯状の等電点電気泳動ゲル１を等電点電気泳動器具３００にセットする場合には、マーカー導入領域２を緩衝液３０３に接触させても接触させなくてもよい。
【００６０】
また、本実施形態１では、図８中の（ｂ）に示すように、図３に示すゲル付き保持体４０に具備された状態の等電点電気泳動ゲル１を、等電点電気泳動器具３００にセットしているが、この手法に限定されるものではない。
【００６１】
なお、先述したように、上記サンプル導入治具２００に一対の電極が設けられている場合には、サンプル導入治具２００が等電点電気泳動器具３００の機能を兼ね備えることも可能である。
【００６２】
なお、本実施形態１では、等電点電気泳動器具３００を、二次元電気泳動のうちの一次元目電気泳動用の器具として説明しているが、等電点電気泳動専用の泳動装置として提供されてもよい。すなわち、本実施形態１の等電点電気泳動ゲル１を用いた等電点電気泳動専用の電気泳動装置も、本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
（１−７）二次元電気泳動装置
次に、本発明に係る二次元電気泳動装置の一実施形態として、自動化二次元電気泳動装置４００を例に挙げて説明する。
【００６４】
図９は、本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す。
【００６５】
図９中の（ａ）は自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す斜視図である。図９中の（ｂ）は、上述した等電点電気泳動ゲル１が保持部４を介して支持アーム４３１に結合される構成を示す。図９中の（ｃ）は、自動化二次元電気泳動装置４００において用いられる二次元目電気泳動部４２０の構成を示す断面図である。
【００６６】
本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００は、台座としての固定手段４０１の上に、上述した等電点電気泳動器具３００を含む一次元電気泳動部４１０と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（二次元目電気泳動工程）を行うための二次元目電気泳動部４２０と、上記支持アーム４３１と、固定手段４０１および／または支持アーム４３１を移動して双方の相対位置を変更させる駆動手段４０４とを有している。
【００６７】
自動化二次元電気泳動装置４００では、サンプルが、まず、一次元電気泳動部４１０の等電点電気泳動器具３００にて第１方向（図９中Ｙ方向）に分離され、サンプルの平衡化を経た後に、二次元目電気泳動部４２０にて第２方向（図９中Ｘ方向）に分離される。これは、駆動手段４０４が支持アーム４３１をＸ軸方向およびＺ軸方向へ移動可能に保持していることにより実現される。
【００６８】
（一次元目電気泳動部）
一次元電気泳動部４１０には、複数の槽が設けられており、そのうちの一つが、上述した一対の電極３０１を備えた等電点電気泳動器具３００として構成されている。一次元電気泳動部４１０について、図１０を用いて更に説明する。
【００６９】
図１０は、自動化二次元電気泳動装置４００の断面図である。一次元電気泳動部４１０は、単一の絶縁体に複数の槽４１１・４１２が設けられた構成を有している。
【００７０】
そのうちの第一試薬槽４１１は、一次元目分離を行うまでの工程に必要な試薬を格納するためのものであり、第２試薬槽４１２は、一次元目分離後で２次元目分離前に必要な試薬を格納するためのものである。具体的には、第一試薬槽４１１は、ゲル配置槽４１１ａ、サンプル槽４１１ｂ、膨潤槽４１１ｃ、第一分離槽４１１ｄからなる。第一分離槽４１１ｄは、等電点電気泳動器具３００として構成され、一対の電極３０１を介して第１電圧印加手段４０５によって等電点電気泳動ゲル１に電圧が印加される。また、サンプル槽４１１ｂは、サンプル導入部を有しており、サンプル導入治具２００（図７）として構成される。
【００７１】
また、第２試薬槽４１２は、第１平衡化槽４１２ａ、染色槽４１２ｂ、洗浄槽４１２ｃ、第２平衡化槽４１２ｄからなる。第１平衡化槽４１２ａは、第１方向分離に用いた緩衝液を置換させて、第１方向分離後に行う染色の効率を上げるための緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。洗浄槽４１２ｃは、蛍光色素を格納した染色槽４１２ｂにて付着した過剰な蛍光色素を洗浄する緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。第２平衡化槽４１２ｄは、第２方向分離を行うために好ましい試薬が格納されており、例えば、等電点電気泳動ゲル１のタンパク質を還元する試薬、該タンパク質をＳＤＳ化する試薬が格納されている。また、第２方向分離の方法に応じて、緩衝液、界面活性剤、酵素、相互作用物質などが格納されてもよい。
【００７２】
ここで、駆動手段４０４による支持アーム４３１の移動について説明する。駆動手段４０４は、まず、支持アーム４３１をゲル配置槽４１１ａの所望のＸ位置まで駆動し、次いで支持アーム４３１を所望のＺ位置まで下降させる。続いて、ゲル配置槽４１１ａに配置したゲル付き保持体４０を、制御手段により支持アーム４３１への吸着を制御する。支持アーム４３１への吸着の制御は、例えば電磁弁を用いれば自動制御され得る。駆動手段４０４は、支持アーム４３１に吸着させたゲル付き保持体４０を図１０中の矢印４０２の方向へ移動し、これにより、等電点電気泳動ゲル１は、一次元電気泳動部４１０に設けられた各槽において所望の処理が施され、引き続き二次元目電気泳動部４２０へ搬送される。
【００７３】
すなわち、一次元電気泳動部４１０では、サンプルを等電点電気泳動ゲル１の等電点電気泳動領域３に導入する工程、等電点電気泳動ゲル１を膨潤させる工程と、等電点電気泳動ゲル１に電圧を印加してサンプルを等電点電気泳動領域３内において第１方向に分離する工程と、等電点電気泳動ゲル１中（等電点電気泳動領域３中）の分離サンプルを染色する工程と、二次元目電気泳動部４２０での環境に平衡化する工程とが行われる。このように一次元電気泳動部４１０では、等電点電気泳動ゲル１へのサンプルの添加と等電点電気泳動ゲル１の膨潤とを別々に行うことにより、サンプル導入と膨潤速度の合計時間が従来に比して短縮することができる。
【００７４】
（二次元目電気泳動部）
二次元目電気泳動部４２０には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４が具備されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４において、一次元電気泳動部４１０から搬送された等電点電気泳動ゲル１に含まれた分離サンプルが、第１方向と異なる第２方向にさらに分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）される。
【００７５】
二次元目電気泳動部４２０は、下部絶縁板４２１と上部絶縁板４２２とを重ね合わせた絶縁部４２０ａに、上部絶縁板４２２を貫いて下部絶縁部に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂを有している。また、下部絶縁板４２１には、上部絶縁板４２２との間にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４を覆いかつ収納するためのゲル収納部４２４´が設けられている。ゲル収納部４２４´に収納されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４は下部絶縁板４２１および上部絶縁板４２２からなる絶縁部４２０ａに覆われ、第１開口部４２５および第２開口部４２６において絶縁部４２０ａの外部と接触可能である。
【００７６】
第１開口部４２５および第２開口部４２６は、二次元目電気泳動部４２０に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂにそれぞれ面している。第２方向へのサンプル分離を実行するために、第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには、ゲル収納部４２４´に収納されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４と第１開口部４２５および第２開口部４２６を介して接する第１緩衝液および第２緩衝液がそれぞれ充填される。第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂが設けられており、第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂを介して第２電圧印加手段４０６によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４に電圧が印加されると、第１開口部４２５から第２開口部４２６に向かって電流が流れるとともに、等電点電気泳動ゲル１の等電点電気泳動領域３中の分離サンプルと、等電点電気泳動ゲル１のマーカー導入領域２中の分子量マーカーとが第２開口部４２６から第１開口部４２５に向かって展開／分離される。なお、ここから、一次元目電気泳動用の一対の電極３０１の電極間の距離は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４の陰極側の端部の長さよりも短いといえる。
【００７７】
ここで、図９中の（ｃ）に示すように、第２開口部４２６の形状に関して、第２緩衝液槽４２８ｂにおいて上部絶縁板４２２を貫く開口の幅は、対応する下部絶縁板４２１の溝幅より広い。この差分によって、図１０に示すように、第２開口部４２６から挿入したゲル付き保持体４０の等電点電気泳動ゲル１と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４とを密着させ得、その結果、一次元目電気泳動を終えた等電点電気泳動ゲル１中のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を首尾よく行い得る。
【００７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４に等電点電気泳動ゲル１を接着させるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４を覆う絶縁部４２０ａは等電点電気泳動ゲル１とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４とを密着させる部位を有していなければならない。このような部位は第２開口部４２６であっても、第１開口部４２５と第２開口部４２６との間にさらなる開口部４２６´が設けられてもよい。
【００７９】
また、等電点電気泳動ゲル１とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４とを密着させるために、第２開口部４２６からＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４が突出していることが好ましく、密着度を増すためには突出したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４に凹凸がないことがより好ましい。なお、第２開口部４２６からＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４が突出していない場合は、第２開口部４２６に等電点電気泳動ゲル１とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４とを密着させるための接着部材（図示せず）が設けられていればよい。好ましい接着部材としては、アガロース、低粘度（１〜３％程度）のアクリルアミドなどのゲル、グリセリン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロースなどの高粘調液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
なお、一次元電気泳動部４１０、二次元目電気泳動部４２０およびゲル付き保持体４０を、サンプルごとに交換して用いる場合があることを想定して、これらの固定手段４０１への固定は着脱可能であることが好ましい。そのための機構としては、真空吸着機構以外に、挟固定機構、磁力固定機構および静電吸着機構が挙げられるが、これらに限定されない。また、真空吸着機構を採用する場合は、真空吸着プレートを介して固定することが好ましい。
【００８１】
また、固定手段４０１の直下には、図１０に示す冷却手段４０９（例えば、放熱手段）が設けられてもよい。冷却手段４０９を採用することにより、電気泳動時の一次元電気泳動部４１０および二次元目電気泳動部４２０の温度を一定に保つことができる。
【００８２】
（１−８）サンプル
上述したサンプルとしては、電気泳動及び転写によって分離または分析する対象の物質であればよく、例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物又は組織断片等の生物材料から採取した調製物を好適に用いることができる。特に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがより好適である。
【００８３】
（１−９）二次元電気泳動
先述した図９に示す二次元電気泳動装置に関して、第１方向（図中Ｙ方向）への分離と第２方向（図中Ｘ方向）への分離を規定するパラメータは同じであってもよいが、分離性能を向上させるためにはそれぞれ異なることが好ましい。これら２方向への分離を規定するパラメータとしては、タンパク質の等電点、分子量、単位サイズあたりの表面電荷（ゾーン電気泳動）、ミセルへの分配係数（ミセル動電クロマトグラフィー）、固定相−移動相への分配係数（電気クロマトグラフィー）、相互作用物質との親和定数（親和結合電気泳動）などが挙げられるが、通常の２次元電気泳動では、第１方向への分離が等電点に基づいて、第２方向への分離が分子量に基づいて行われる。
【００８４】
（１−１０）マーカー
本実施形態１において等電点電気泳動ゲルに導入する分子量マーカーは、従来周知のものを用いることができ、サンプルに応じ、マーカーの分子量範囲や検出バンド数等が適したマーカーを選択すればよい。分子量マーカーを複数種用いることも可能である。
【００８５】
また、一般的に分子量マーカーと称されるものに限らず、既知の物質をマーカー（蛍光標識されていてもよい）として、上述したように等電点電気泳動ゲルに導入してもよい。なお、分子量マーカーは、分子量の基準となるタンパク質の混合液で良い。これは、二次元電気泳動を用いたウェスタンブロッティングを行なうときに、当該等電点電気泳動ゲルの分子量マーカーを入れる位置に二次元電気泳動ウェスタンブロッティングに供するサンプルと同じサンプルを添加しておくことを想定したものである。その結果、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥのみで分離した時のパターンと二次元電気泳動で添加した時のパターンと比較することができる。
【００８６】
更に、本実施形態１では、一次元目電気泳動用ゲルに、二次元目電気泳動の際のマーカーを導入した形態を説明した。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではなく、一次元目電気泳動用ゲルに予め一次元目電気泳動の際のマーカー（例えば、等電点マーカー）を導入しておき、必要に応じてゲルを乾燥させて保管し、サンプルの一次元目電気泳動が必要になった時点で、等電点マーカーが既に導入されたゲルにサンプルを導入して一次元目電気泳動を行うことも可能である。要するに、本発明の目的は、電気泳動の実施者がゲルにマーカーを導入する手間を省き、且つマーカーを実施者が導入した場合に懸念される問題を解決することにある。そのため、一次元目電気泳動用ゲルに一次元目電気泳動で用いるマーカーを予め導入したゲルも、この目的を実現するための手段の一つである。なお、一次元目電気泳動用ゲルに一次元目電気泳動で用いるマーカーを予め導入した態様の場合には、当該マーカーは、一次元目電気泳動でゲル内を移動する必要があるので、当該マーカーの導入位置は、上述した一対の電極の電極間内である必要がある。
【００８７】
（１−１１）マーカーを導入する対象ゲル
本実施形態１では、等電点電気泳動ゲルに分子量マーカーを導入したが、マーカーを導入する対象ゲルは、等電点電気泳動ゲルに限らず、二次元電気泳動の一次元目電気泳動に用いる一次元目電気泳動媒体であればよい。
【００８８】
〔実施形態２〕
本発明の他の実施形態について、図１１から図１５に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、上記実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００８９】
（２−１）本実施形態２の等電点電気泳動ゲル
図１１は、本実施形態２の等電点電気泳動ゲルの斜視図である。上記実施形態１の等電点電気泳動ゲル１（図２）との相違点は、本実施形態２の帯状の等電点電気泳動ゲル１´は、長尺の両端部に分子量マーカーが導入されたマーカー導入領域２が形成されている点にある。これらマーカー導入領域２に挟まれた領域が等電点電気泳動領域３である。なお、本実施形態２の等電点電気泳動ゲル１´も、実施形態１と同様に図３のゲル付き保持体４０の形態で扱うことができる。
【００９０】
（２−２）等電点電気泳動ゲルへの分子量マーカーの導入
また本実施形態２では、実施形態１と異なり、分子量マーカーとサンプルとを同時に等電点電気泳動ゲルに導入する。図１２および図１３を用いてこれを説明する。
【００９１】
図１２は、本実施形態２において用いる、分子量マーカーとサンプルとを導入する同時導入治具５００（治具）を示す図であり、図１２中の（ａ）が同時導入治具５００の上面図であり、図１２中の（ｂ）が（ａ）の切断線Ａ−Ａ´における同時導入治具５００の断面図である。図１３は、同時導入治具５００を用いた、等電点電気泳動ゲルへの分子量マーカーおよびサンプルの導入方法を説明する図であり、図１２中の（ｂ）に対応する。
【００９２】
同時導入治具５００は、細長い溝が形成された筐体５０１として構成されており、細長い溝（媒体保持部）は、帯状の等電点電気泳動ゲルの長尺に沿って、その長さがほぼ等しく形成されている。溝の底部には、複数の窪みが形成されており、細長い溝の両端部に分子量マーカー液を貯留するマーカー液用窪み５０２（標準物質導入用物質保持部）と、マーカー液用窪み５０２とマーカー液用窪み５０２とに挟まれた細長い溝の凡そ中央部分にサンプル液を貯留するサンプル液用窪み５０３（電気泳動試料導入用物質保持部）とが形成されている。
【００９３】
これらの窪みにそれぞれ液を貯留させた状態を、図１３中の（ａ）に示す。図１３中の（ａ）に示すように、サンプル液用窪み５０３にサンプル液５３３が貯留され、マーカー液用窪み５０２に分子量マーカー液５５２が貯留され、マーカー液用窪み５０２とサンプル液用窪み５０３との境界に設けられた窪みに緩衝液５５４が貯留される。そして、図１３中の（ａ）に示すように、筐体５０１の底部に等電点電気泳動ゲルを対向させて筐体５０１の開口側からゲル付き保持体４０を筐体５０１の溝に挿入する。等電点電気泳動ゲルの表面がこれら液に接触することによって、図１３中の（ｂ）に示すように、両端部に分子量マーカーが導入されてマーカー導入領域２が形成され、これと同時に、中央部にサンプルが導入されて等電点電気泳動領域３が形成された帯状の等電点電気泳動ゲル１´を作製することができる。
【００９４】
なお、本実施形態２では、分子量マーカーとサンプルとを同時に導入する態様であるため、導入時には等電点電気泳動ゲルは帯状を有しているサンプル等の導入を行う前の帯状の等電点電気泳動ゲルは、上記実施形態１の項目（１−３）において説明したゲル準備工程と切断工程とを含む方法によって作製することができる。
【００９５】
（２−３）等電点電気泳動器具
等電点電気泳動ゲル１´を用いて等電点電気泳動を行う等電点電気泳動器具は、先述した実施形態１の等電点電気泳動器具３００のように、一対の電極を備え、これら電極同士の離間距離が等電点電気泳動領域３の長尺方向（つまりｐＨ勾配方向）に沿った長さと等しいか当該長さよりも僅かに短く構成されており、且つ、これら電極それぞれが等電点電気泳動ゲル１´の等電点電気泳動領域３に接触する位置にある等電点電気泳動器具であればよい。
【００９６】
例えば、図１４に示すように、図１２に示した同時導入治具５００の底部に上述の一対の電極３０１を設けることによって、分子量マーカーおよびサンプルの同時導入機能を兼ねた等電点電気泳動器具６００として実現することも可能である。なお、同時導入治具５００と、等電点電気泳動器具とは別体であってもよい。
【００９７】
（２−４）二次元電気泳動装置
本実施形態２では、一つの器具を用いて二次元電気泳動を行う態様を説明する。
【００９８】
図１５は、本実施形態２の二次元電気泳動装置の斜視図であり、図１５中の（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とはこの順で二次元電気泳動の過程を示している。
【００９９】
図１５に示す二次元電気泳動装置７００は、比較的大型の凹部７０１が設けられた筐体７０２から構成されており、凹部７０１の中央部よりも紙面左側に寄った位置に、第１方向（図１５中Ｙ方向）に互いに離間した（一次元目電気泳動用の）一対の電極３０１が設けられている。また、凹部７０１の中央部を挟んで凹部７０１の側面の紙面左側と紙面右側とに、第２方向（図１５中Ｘ方向）にサンプルを分離するための二次元目電気泳動用の第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂが設けられている。また、図１５中の（ａ）に示すように、凹部７０１の底部には、一対の電極３０１が配列している領域に第１方向（図１５中Ｙ方向）に沿って凹溝７０３が形成されている。
【０１００】
図１５中の（ｂ）は、一次元目電気泳動（等電点電気泳動）時の構成を示しており、マーカー導入領域２と等電点電気泳動領域３とを有する等電点電気泳動ゲル１´を保持したゲル付き保持体４０が、凹部７０１内にセットされた状態を示している。このとき、等電点電気泳動ゲル１´は、凹部７０１の凹溝７０３（図１５中の（ａ））を塞いでおり、等電点電気泳動ゲル１´の表面（下面）と、凹溝７０３内に設けられた一対の電極３０１とが接触している状態となっている。この状態で、一対の電極３０１に図示しない電源から電圧を印加すると、等電点電気泳動領域３内のサンプルが第１方向（図１５中Ｙ方向）に分離される。ここまでが一次元目電気泳動（等電点電気泳動）の工程である。
【０１０１】
一次元目電気泳動（等電点電気泳動）を終えると、続いて図１５中の（ｃ）に示すように、二次元目電気泳動用ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４を等電点電気泳動ゲル１´に隣接するように設ける。そして、電気泳動のための緩衝液を凹部７０１に導入した後、第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂに電圧を印加することによって、等電点電気泳動領域３内のサンプルがＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４に移動した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル４２４内で第２方向（図１５中Ｘ方向）に分離する。ここまでが二次元目電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動）の工程である。
【０１０２】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）は、二次元電気泳動の一次元目電気泳動（等電点電気泳動）に用いる一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）であって、電気泳動試料（サンプル）を含有せず、当該電気泳動試料（サンプル）の比較対象となる標準物質（分子量マーカー）を含有していることを特徴としている。
【０１０３】
上記の構成によれば、一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）は、既に標準物質（分子量マーカー）を含有している。そのため、従前の二次元電気泳動を実施する実施者であれば、一次元目電気泳動の開始と二次元目電気泳動の開始とに際して、標準物質を電気泳動媒体に導入する操作を行う必要がある。しかしながら、上記一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）によれば、その少なくともいずれかの導入操作を省略することができ、操作が簡素化される。
【０１０４】
具体的には、一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）に含有している標準物質が、一次元目電気泳動の際に用いる標準物質（等電点マーカー）であるならば、二次元電気泳動の実施者は、この一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）を入手すると、電気泳動試料のみを一次元目電気泳動媒体に導入する操作を行えばよく、一次元目電気泳動の際に用いる標準物質（分子量マーカー）を導入する操作は不要であり、実施者の操作を簡素化することができる。また、一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）に含有している標準物質が、二次元目電気泳動の際に用いる標準物質（分子量マーカー）であるならば、二次元電気泳動の実施者は、二次元目電気泳動の開始に際して標準物質を導入する操作を省くことができ、操作が簡素化される。また、一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）に含有している標準物質が、二次元目電気泳動の際に用いる標準物質（分子量マーカー）であるならば、一次元目電気泳動と二次元目電気泳動とを連続して行うことができる。
【０１０５】
また、実施者による標準物質の導入操作が不要であることから、実施者の技量によっては標準物質を良好にアプライすることができずに分析精度が低下したり再現性がとれないという事態を招く虞がなく、再現性の高い分析の実現に寄与することができる。
【０１０６】
また本発明の態様２に係る一次元目電気泳動媒体（等電点電気泳動ゲル１、１´）は、上記態様１において、上記標準物質は分子量標準（分子量マーカー）である。
【０１０７】
また本発明の態様３に係る一次元目電気泳動媒体は、上記態様１または２において、乾燥状態である。
【０１０８】
上記の構成によれば、上記の効果に加えて、一次元目電気泳動媒体が乾燥していることから、標準物質（分子量マーカー）を安定して保持することが可能である。
【０１０９】
また本発明の態様４に係る一次元目電気泳動媒体は、上記態様１または２において、上記標準物質は、等電点標準であり、上記一次元目電気泳動媒体は、乾燥状態である。
【０１１０】
また本発明の態様５に係る一次元目電気泳動媒体は、上記態様１から４において、等電点電気泳動媒体である。
【０１１１】
また本発明の態様６に係る一次元目電気泳動媒体は、上記態様２において、上記一次元目電気泳動の際に電場がかかる領域と電場がかからない領域とを有し、上記電場がかからない領域に上記分子量標準を含有している。
【０１１２】
上記の構成によれば、含有されている分子量標準は、一次元目電気泳動の際には一次元目電気泳動媒体内を移動しない。すなわち、一次元目電気泳動が終わっても分子量標準の位置は変わらない。そのため、一次元目電気泳動媒体の上記電場がかからない領域を、二次元目電気泳動媒体において分子量標準を泳動したいレーンの端部に隣接する位置に設け、そこに分子量標準を含有させておくことにより、二次元目電気泳動を行う際に、一次元目電気泳動媒体で分離された電気泳動試料と混和することなく、二次元目電気泳動媒体に分子量標準を二次元目電気泳動によって移動させることができる。
【０１１３】
また本発明の態様７に係る媒体付き保持体は、帯状を有した媒体保持面を有し、当該媒体保持面に沿って上記態様１から６の一次元目電気泳動媒体を保持していることを特徴としている。
【０１１４】
上記の構成によれば、一次元目電気泳動媒体が薄層であったり細長かったりする場合であってそれ単独で取り扱うと折れ曲ったり千切れる虞があり取り扱いが容易でない場合であっても、一次元目電気泳動媒体が保持体の媒体保持面に保持されていることにより、取扱いが容易となる。
【０１１５】
また本発明の態様８に係る媒体付き保持体は、上記態様７において、上記一次元目電気泳動媒体は、上記媒体保持面の長尺を挟んで位置する両端部のうちの少なくとも一方の端部に、上記標準物質を含有した領域を有しており、上記一次元目電気泳動媒体は、上記一次元目電気泳動の際に電場がかかる領域を、上記標準物質を含有した領域とは異なる箇所に有している。
【０１１６】
また本発明の態様９に係る二次元電気泳動装置は、一次元目電気泳動用の一対の電極と、二次元目電気泳動用の陰極および陽極とを備えた、二次元電気泳動装置であって、電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を一部の領域に含有し、他の領域に電気泳動試料を含有している媒体を一次元目電気泳動媒体として用い、上記一次元目電気泳動用の一対の電極は、上記一次元目電気泳動媒体における上記分子量標準を含有していない領域に電場をかける構成となっており、上記二次元目電気泳動用の陰極および陽極は、上記一次元目電気泳動媒体の全領域に電場をかける構成となっていることを特徴としている。
【０１１７】
上記の構成によれば、二次元目電気泳動に際して二次元電気泳動の実施者が分子量標準を導入する操作が不要であることから、実施者の操作を簡素化することができる。また、分子量標準を一次元目電気泳動媒体に含有させて、二次元目電気泳動の際に一次元目電気泳動媒体から二次元目電気泳動媒体に移動させることから、一次元目電気泳動媒体から二次元目電気泳動媒体に移動する電気泳動試料と泳動条件を等しくすることができ、正確な分析を実現することができる。
【０１１８】
また本発明の態様１０に係る二次元電気泳動装置は、上記態様９において、上記一次元目電気泳動媒体は帯状を有しており、上記一次元目電気泳動用の一対の電極の電極間の距離は、上記帯状の一次元目電気泳動媒体の長尺よりも短く、且つ、上記二次元目電気泳動用の上記陰極側の端部の長さよりも短い。
【０１１９】
また本発明の態様１１に係る二次元電気泳動方法は、上記態様１から６の一次元目電気泳動媒体に電気泳動試料を含浸させる準備工程と、上記準備工程に続いて一次元目電気泳動媒体に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、上記一次元目電気泳動工程後の一次元目電気泳動媒体を、二次元目電気泳動媒体の端部に接触させた状態で、二次元目電気泳動媒体に電場をかけて二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴としている。
【０１２０】
上記の構成によれば、態様１の効果を享受することができる。
【０１２１】
また本発明の態様１２に係る二次元電気泳動方法は、上記態様１１において、上記準備工程では、請求項６に記載の一次元目電気泳動媒体の上記電場がかかる領域に、上記電気泳動試料を導入し、上記一次元目電気泳動工程は、上記電場がかかる領域に電場をかける。
【０１２２】
また本発明の態様１３に係る治具は、上記一次元目電気泳動媒体を作製するための治具であり、標準物質を含有する導入用物質を保持する導入用物質保持部と、標準物質が導入される前の一次元目電気泳動媒体を、当該標準物質導入用物質保持部に隣接した位置に保持する媒体保持部とが設けられていることを特徴としている。
【０１２３】
また本発明の態様１４に係る治具は、上記態様１３において、上記電気泳動試料を含有する電気泳動試料導入用物質を保持する電気泳動試料導入用物質保持部が更に設けられており、上記媒体保持部は、上記一次元目電気泳動媒体を、電気泳動試料導入用物質保持部に隣接した位置に保持する。
【０１２４】
上記の構成によれば、標準物質と電気泳動試料とを一つの治具によって一次元目電気泳動媒体に導入することができる。
【０１２５】
また本発明の態様１５に係る二次元電気泳動方法は、態様１３または１４の治具を用いて、一次元目電気泳動媒体の一部の領域に、電気泳動試料を導入し、当該一次元目電気泳動媒体の他の領域に、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を導入する準備工程と、上記準備工程後に、上記一部の領域に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、上記一次元目電気泳動工程後に、上記一次元目電気泳動媒体を二次元目電気泳動媒体における陰極側の端部に接触させた状態で、一次元目電気泳動媒体の全領域に電場がかかるようにして二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴としている。
【０１２６】
上記の構成によれば、二次元目電気泳動に際して二次元電気泳動の実施者が分子量標準を導入する操作が不要であることから、実施者の操作を簡素化することができる。また、分子量標準を一次元目電気泳動媒体に含有させて、二次元目電気泳動の際に一次元目電気泳動媒体から二次元目電気泳動媒体に移動させることから、一次元目電気泳動媒体から二次元目電気泳動媒体に移動する電気泳動試料と泳動条件を等しくすることができ、正確な分析を実現することができる。
【０１２７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【０１２８】
以上のように、本発明の一態様に係る、二次元電気泳動の一次元目電気泳動用媒体は、二次元電気泳動の一次元目電気泳動に用いる一次元目電気泳動媒体であって、電気泳動試料を含有しておらず、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質を含有していることを特徴としている。
【０１２９】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る媒体付き保持体は、帯状を有した媒体保持面を有し、当該媒体保持面に沿って上記一次元目電気泳動媒体を保持していることを特徴としている。
【０１３０】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る二次元電気泳動装置は、一次元目電気泳動用の一対の電極と、二次元目電気泳動用の陰極および陽極とを備えた、二次元電気泳動装置であって、電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を一部の領域に含有し、他の領域に電気泳動試料を含有している媒体を一次元目電気泳動媒体として用い、上記一次元目電気泳動用の一対の電極は、上記一次元目電気泳動媒体における上記分子量標準を含有していない領域に電場をかける構成となっており、上記二次元目電気泳動用の陰極および陽極は、上記一次元目電気泳動媒体の全領域に電場をかける構成となっていることを特徴としている。
【０１３１】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る二次元電気泳動方法は、上記一次元目電気泳動媒体に電気泳動試料を導入する準備工程と、上記準備工程に続いて一次元目電気泳動媒体に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、上記一次元目電気泳動工程後の一次元目電気泳動媒体を、二次元目電気泳動媒体の端部に接触させた状態で、二次元目電気泳動媒体に電場をかけて二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴としている。
【０１３２】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る治具は、
上記一次元目電気泳動媒体を作製するための治具であり、
標準物質を含有する導入用物質を保持する導入用物質保持部と、
標準物質が導入される前の一次元目電気泳動媒体を、当該導入用物質保持部に隣接した位置に保持する媒体保持部とが設けられていることを特徴としている。
【０１３３】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る他の二次元電気泳動方法は、上記治具を用いて、一次元目電気泳動媒体の一部の領域に、電気泳動試料を導入し、当該一次元目電気泳動媒体の他の領域に、当該電気泳動試料の比較対象となる標準物質としての分子量標準を導入する準備工程と、上記準備工程後に、上記一部の領域に電場をかけて一次元目電気泳動を行う一次元目電気泳動工程と、上記一次元目電気泳動工程後に、上記一次元目電気泳動媒体を二次元目電気泳動媒体における陰極側の端部に接触させた状態で、一次元目電気泳動媒体の全領域に電場がかかるようにして二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動工程とを含むことを特徴としている。
【実施例】
【０１３４】
〔実施例１：ゲル付き保持体の作製（分子量マーカーの導入）〕
実施形態１において説明したゲル付き保持体４０として、チップ端面に乾燥した帯状のＩＰＧゲル（５２ｍｍ長）が形成されている、自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチャリングシステム株式会社）で供給されているＩＥＦチップを用いた。【０１３５】
ここで、上記自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄは、一次元目電気泳動の陰極と陽極との間が４８ｍｍ離間しており、ＩＥＦチップのＩＰＧゲルをセットすると、ＩＰＧゲルの両端に２ｍｍづつ電極間外の領域が存在することになる。そこで、当該領域にピペッターを用いて０．５μｌの分子量マーカー液（BenchMark Fluorescent Protein Standard、ライフテクノロジーズ社）を滴下した。滴下後、真空デシケーターに約１時間放置して、滴下領域を乾燥させた。この滴下領域が、マーカー導入領域２である。【０１３６】
以上により、図１１に示す、分子量マーカーを両端部に導入したＩＰＧゲルを完成させた。【０１３７】
〔実施例２：分子量マーカーを含むＩＰＧゲルの作製〕
ｐＨに勾配を有する分離媒体として、ｐＨ４−１０のＩＰＧゲルを保持シート（ゲルボンドフィルム：Ｌｏｎｚａ社製）上に作製し、真空デシケーターに一晩放置することで乾燥させて、シート状のＩＰＧゲルを作製した。【０１３８】
次に、図４に示したマーカー導入治具１００のマーカー液貯留部１０２を、分子量マーカー（BenchMark Fluorescent Protein Standard：Invitrogen）で満たし、当該シート状のＩＰＧゲルを、ｐＨ勾配方向と垂直方向に、酸性側ゲル端面から浸漬し、約１時間放置した。【０１３９】
浸漬後、当該シート状のＩＰＧゲルをマーカー導入治具１００より取り出し、真空デシケーターに約１時間放置することで、浸漬領域を乾燥させた。【０１４０】
乾燥後、シート状のＩＰＧゲルを、ｐＨ勾配方向に短冊状に切断した。これにより、図２に示す、長尺のＩＰＧゲルの一端部に分子量マーカーを導入したＩＰＧゲルを作製した。【０１４１】
〔実施例３：分子量マーカーを含有したＩＰＧゲルを用いた二次元電気泳動〕
実施例１で作製したＩＰＧゲルを、自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチャリングシステム株式会社）を用いてメーカー標準方法に基づいて評価した。【０１４２】
予め蛍光標識（ＩＣ５−ＯＳｕ：同仁化学）されたマウス肝臓サンプルをゲル膨潤液（尿素、チオ尿素、3-（3-cholamidepropyl）dimethylammonio-1-propanesulphonate（ＣＨＡＰＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、両性電解質（Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）を含む）に混合してサンプル液とした。【０１４３】
実施例１で作製したＩＰＧゲルの等電点電気泳動領域３（図２および図３）に、サンプル液を３０分間接触させて、ＩＰＧゲルにサンプル導入させた後、このＩＰＧゲルをゲル膨潤液に５分間浸漬してゲル膨潤を行った。その後、自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄにセットして、等電点電気泳動を行なった。泳動開始前に、ＩＰＧゲルのマーカー導入領域は等電点電極間の外側に位置していることを確認した。【０１４４】
等電点電気泳動は、２００Ｖで５分間定電圧をかけた後、５分間で１０００Ｖまでリニアー勾配で上昇させ、その後、１０００Ｖを５分間維持した後、１０分間で６０００Ｖまでリニアー勾配で上昇させた後、６０００Ｖで５分間維持するという条件で行った。【０１４５】
その後、５分間のＳＤＳ平衡化処理を行った後、二次元目電気泳動を行なった。二次元目電気泳動は、２０ｍＡ一定で、３５分間行った。【０１４６】
二次元目電気泳動の終了後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、蛍光イメージスキャナー（Ｔｙｈｏｏｎ：ＧＥ  ヘスルケア社）で撮像し、スポットを可視化した。その結果を、図１６に示す。【０１４７】
図１６において、破線で囲んだ部分に分子量マーカーのバンドを確認することができた。また、それ以外の部分にマウス肝臓サンプルのスポットを確認することができた。また、等電点電極間にアプライされたマウス肝臓サンプル中には分子量マーカーの混入によるスポットは極微量であり、電極間外にアプライされた分子量マーカーが電極間に混入してこないことを確認することができた。【０１４８】
以上の結果から、本発明の有用性が確かめられた。【０１４９】
〔実施例４：分子量マーカーとサンプルとを同時導入したＩＰＧゲルを用いた二次元電気泳動〕
自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチャリングシステム株式会社）で供給されている溶液チップを図１２の同時導入治具５００として、溶液チップのサンプル導入溝（図１２のサンプル液用窪み５０３に相当）の電極間外の両端に０．５μｌの溶液のチャンバー（図１２のマーカー液用窪み５０２に相当）を作製した。【０１５０】
次に、作製した上記チャンバー（マーカー液用窪み５０２に相当）に分子量マーカー液を０．５μｌアプライした。そして、自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄで供給されているＩＥＦチップを用いて、メーカー標準方法に基づいて二次元電気泳動を行なった。【０１５１】
ここで、上記チャンバー内の分子量マーカー液の分子量マーカーは、サンプル導入溝（図１２のサンプル液用窪み５０３に相当）に貯留されたサンプル液のサンプルが導入されると同時にＩＰＧゲルに吸着され、当該分子量マーカーは電極間外にあるために二次元目電気泳動までは移動せずにＩＰＧゲル内に保持される。なお、サンプルは、予め蛍光標識（ＩＣ５−ＯＳｕ：同仁化学）されたマウス肝臓サンプルをゲル膨潤液に混合して調整した。分子量マーカーは蛍光標識されているBenchMark Fluorescent Protein Standard（ライフテクノロジーズ社）を用いた。【０１５２】
サンプルおよび分子量マーカーを上記治具で３０分間ＩＰＧゲルに導入させた後、このＩＰＧゲルを、５分間ゲル膨潤液に浸漬してゲル膨潤を行った後、等電点電気泳動を行なった。【０１５３】
等電点電気泳動は、２００Ｖで５分間定電圧をかけた後、５分間で１０００Ｖまでリニアー勾配で上昇させ、その後、１０００Ｖを５分間維持した後、１０分間で６０００Ｖまでリニアー勾配で上昇させた後、６０００Ｖで５分間維持するという条件で行った。【０１５４】
その後、５分間のＳＤＳ平衡化処理を行った後、二次元目電気泳動を行なった。二次元目電気泳動は、２０ｍＡ一定で、３５分間行った。【０１５５】
二次元目電気泳動の終了後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、蛍光イメージスキャナー（Ｔｙｈｏｏｎ：ＧＥ  ヘスルケア社）で撮像し、スポットを可視化した。その結果を、図１７に示す。【０１５６】
図１７において、破線で囲んだ部分に分子量マーカーのバンドを確認することができた。また、それ以外の部分にマウス肝臓サンプルのスポットを確認することができた。【０１５７】
以上の結果から、本発明の有用性が確かめられた。【０１５８】
〔実施例５：ゲル付き保持体の作製（蛍光標識ペプチドの導入）〕
上記実施例１と同様に、自動２次元電気泳動装置Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチャリングシステム株式会社）で供給されているＩＥＦチップのチップ端面に形成されている乾燥した帯状のＩＰＧゲルの等電点電気泳動領域３（図１）に、ピペッターを用いて１〜２μｌの蛍光標識ペプチド溶液を滴下した。この蛍光標識ペプチドは、等電点マーカーとして機能する。【０１５９】
滴下後、滴下領域を乾燥させることにより、帯状のＩＰＧゲルに予め蛍光標識ペプチドを導入したゲル付き保持体を作製した。このゲル付き保持体を、等電点電気泳動を行う段階で等電点電気泳動領域３にサンプルを吸着させて、等電点電気泳動を行うことができる。【０１６０】
以上により、蛍光標識ペプチドを両端部に導入したＩＰＧゲルを保持したゲル付き保持体を完成させた。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、二次元電気泳動装置に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１６２】
１、１´  等電点電気泳動ゲル（等電点電気泳動媒体）
２  マーカー導入領域
３  等電点電気泳動領域
４  保持部
４０  ゲル付き保持体
１００  マーカー導入治具（治具）
１０２  マーカー液貯留部（標準物質導入用物質保持部、媒体保持部）
２００  サンプル導入治具
２０１  サンプル液
２０３  筐体
３００  等電点電気泳動器具
３０１  電極
３０２  槽本体
３０３  緩衝液
４００  自動化二次元電気泳動装置
４０１  固定手段
４０２  矢印
４０４  駆動手段
４０５  第１電圧印加手段
４０６  第２電圧印加手段
４０９  冷却手段
４１０  一次元電気泳動部
４１１  第一試薬槽
４１１ａ  ゲル配置槽
４１１ｂ  サンプル槽
４１１ｃ  膨潤槽
４１１ｄ  第一分離槽
４１２  第２試薬槽
４１２ａ  第１平衡化槽
４１２ｂ  染色槽
４１２ｃ  洗浄槽
４１２ｄ  第２平衡化槽
４２０  二次元目電気泳動部
４２０ａ  絶縁部
４２１  下部絶縁板
４２２  上部絶縁板
４２４  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル
４２４´  ゲル収納部
４２５  第１開口部
４２６  第２開口部
４２６´  開口部
４２８ａ  第１緩衝液槽
４２８ｂ  第２緩衝液槽
４２９ａ  第１電極
４２９ｂ  第２電極
４３１  支持アーム
５００  同時導入治具（治具）
５０１  筐体
５０２  マーカー液用窪み（標準物質導入用物質保持部）
５０３  サンプル液用窪み（電気泳動試料導入用物質保持部）
５３３  サンプル液
５５２  分子量マーカー液
５５４  緩衝液
６００  等電点電気泳動器具
７００  二次元電気泳動装置
７０１  凹部
７０２  筐体
７０３  凹溝
【図１】
2015064736.tif 000003
【図２】
2015064736.tif 000004
【図３】
2015064736.tif 000005
【図４】
2015064736.tif 000006
【図５】
2015064736.tif 000007
【図６】
2015064736.tif 000008
【図７】
2015064736.tif 000009
【図８】
2015064736.tif 000010
【図９】
2015064736.tif 000011
【図１０】
2015064736.tif 000012
【図１１】
2015064736.tif 000013
【図１２】
2015064736.tif 000014
【図１３】
2015064736.tif 000015
【図１４】
2015064736.tif 000016
【図１５】
2015064736.tif 000017
【図１６】
2015064736.tif 000018
【図１７】
2015064736.tif 000019
【国際調査報告】
2015064736.tif 000020
2015064736.tif 000021
2015064736.tif 000022
2015064736.tif 000023