(57)【要約】  本発明は、側鎖にチオール基を有し、光学活性なＤ−体及び／またはＬ−体アミノ酸を、簡易な方法により、収率よく製造する方法を提供することを課題とした。  本発明は、側鎖にチオール基を有するアミノ酸誘導体の製造方法であって、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体のＤ−体及びＬ−体を含む中間体組成物を製造し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離することを特徴とする、製造方法、及び、その中間体を提供する。
2015064453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含む、製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法であって、
β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体［ここで、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分をいう（ただし、水素原子である場合を除く）。］の製造方法であり、
前記工程（Ｉ）において、前記反応（Ａ）の前に、以下の工程（Ｐ）
（Ｐ）β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程
を含み、
前記反応（Ａ）が、アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させる反応とともに行われる、
製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造方法であって、
置換基Ｒ１が芳香族置換基であり、
前記工程（Ｐ）が、以下の工程（Ｐ−１）
（Ｐ−１）β炭素原子に置換基Ｒ１を有するアミノ酸誘導体に対して、β炭素原子に脱離基Ｌを導入する工程、
を含む、製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の製造方法であって、
前記工程（Ｐ）が、以下の工程（Ｐ−２）
（Ｐ−２）グリシンと、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させる工程
を含む、製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の製造方法であって、
前記工程（Ｂ）が、（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基を、アシルアミノ基に変換する反応であり、
前記工程（ＩＩ）における、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素が、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼである、
製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の製造方法であって、
前記工程（ＩＩ）における、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程が、
加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体に対して脂溶性保護基を導入する工程、
を含み、
脂溶性保護基の有無により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程である、
製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の製造方法であって、
Ｄ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であり、
前記工程（ＩＩ）において、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を用い、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離する、
製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の製造方法であって、
Ｌ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であり、
前記工程（ＩＩ）において、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を用い、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離する、
製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の製造方法であって、
前記工程（Ａ）において導入されるチオール基が、ＰＭＢ(パラメトキシベンジル)基、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）基、ベンジル基、Ｔｒｔ（トリチル）基、ジスルフィド基、t-ブチル基から選択される保護基により保護されたチオール基である、
製造方法。
【請求項１０】
β位に保護または非保護のチオール基を有する、光学分割されたＤ−非天然型アミノ酸誘導体及びＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離する工程、
及び、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）で加水分解されなかったＬ−アミノ酸誘導体を加水分解し、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を取得する工程、
を含む、製造方法。
【請求項１１】
β位に保護または非保護のチオール基を有する、光学分割されたＤ−非天然型アミノ酸誘導体及びＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程、
及び、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）で加水分解されなかったＤ−アミノ酸誘導体を加水分解し、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を取得する工程、
を含む、製造方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の製造方法であって、
前記工程（Ｂ）が、（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基を、アシルアミノ基に変換する反応であり、
工程（ＩＩ）に記載の「（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体」が、以下の式で表される、α炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物であり
【化１】
2015064453.tif 000017
［ここで、Ｒ２は、水素原子またはチオール基の保護基を表し、Ｘは、保護または非保護のカルボキシル基を表し、Ａｃｙｌはアシル基を示し、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子の場合を除く）を示す。］、
前記工程（ＩＩ）における、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素が、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼである、
製造方法。
【請求項１３】
以下の式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物
【化２】
2015064453.tif 000018
［ここで、Ｒ２は、水素原子またはチオール基の保護基を表し、Ｘは、保護または非保護のカルボキシル基を表し、Ａｃｙｌはアシル基を示し、Ｒ１は、天然型アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子の場合を除く）を示す。］。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、
前記置換基Ｒ１が、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及び、Ｔｙｒからなる群から選択されるアミノ酸のβ炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子ではない）であり、
前記置換基Ｒ２が、チオール基の保護基であり、
前記置換基Ｘが、ＣＯＯＨである、
組成物。
【請求項１５】
β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体［ここで、Ｒ１は、芳香族置換基をいう。］の製造方法であって、
以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の工程を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ｐ−１）β炭素原子に置換基Ｒ１を有するアミノ酸誘導体に対して、当該β炭素原子に脱離基Ｌを導入し、β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程、
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させ、かつ、当該β炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する工程、
及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する工程、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含む、製造方法。
【請求項１６】
β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法［ここで、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分をいう（ただし、水素原子である場合を除く）。］であって、
以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の工程を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ｐ−２）グリシンと、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させ、β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程、
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させ、かつ、当該β炭素原子に、保護または非保護のチオール基を導入する工程、
及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する工程、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含む、製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２、１５〜１６のいずれか１項に記載の製造方法であって、
原料として、α炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含むアミノ酸誘導体、または、α炭素原子が不斉炭素原子ではないアミノ酸誘導体を用いる、
製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、側鎖にチオール基を有するＤ−体またはＬ−体アミノ酸誘導体の製造方法に関する。また、本発明は、側鎖にチオール基を有するＤ−体またはＬ−体アミノ酸誘導体の製造方法に用いる中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ医薬の研究開発が進められ、ペプチドやタンパク質を合成して構造や機能の解析を行う例や、ペプチドやタンパク質を医薬として用いる例が増えてきている。ペプチドやタンパク質は、アミノ酸から構成されており、タンパク質を構成するα−アミノ酸は、側鎖置換基が水素原子の場合を除き、α炭素原子が不斉原子であるため、Ｄ−体及びＬ−体と呼ばれる鏡像異性体が存在する。生体内に存在するペプチドやタンパク質は、Ｌ−アミノ酸により構成されているため、生体内に存在するペプチドやタンパク質を合成するためには、原料として、光学活性なＬ−アミノ酸が必要である。また、近年では、タンパク質の構造解析において、タンパク質の結晶化効率を高めることを期待して、ラセミタンパク質を用いてのＸ線結晶構造解析が注目されている。ここで、ラセミタンパク質とは、Ｄ−アミノ酸のみからなるタンパク質と、Ｌ−アミノ酸のみからなるタンパク質の等量混合物としてのタンパク質である。タンパク質の構造を解析することはタンパク質の機能を理解するうえで重要な知見である。このようなラセミタンパク質の結晶化により構造解析を行う為に、Ｄ−タンパク質及びＬ−タンパク質の両方を合成することについての需要が高まってきている。このようなＤ−タンパク質及び／またはＬ−タンパク質を製造し、安定的に供給するためには、それぞれ、原料として、光学活性なＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸を大量に効率よく製造することが必要である。特に、Ｄ−タンパク質は、天然に存在せず、化学合成のみによって合成可能である為、原料となるＤ−アミノ酸の工業的生産が必要不可欠である。【０００３】
また、高分子としてのタンパク質を合成する場合、固相合成等によりペプチドを製造する方法では、製造できるペプチドの長さに制限があるので、製造したペプチドを連結する必要がある。ペプチド連結法としては、ＮＣＬ（Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法が用いられる。ＮＣＬにおいては、側鎖にチオール基を有するアミノ酸をＮ末端に有するペプチドと、他のペプチドのＣ末端とを、チオール基の反応性を利用して連結する。したがって、ＮＣＬにおいては、主に、側鎖にチオール基を有するアミノ酸であるシステインを連結部位としてタンパク質合成がデザインされる。また、チオール基を用いた連結反応後に他のアミノ酸に構造を変化させることにより、アラニンなどを連結部位とする方法等も考案されている。しかし、それでもなお、連結部位とすることができるアミノ酸は、非常に限られており、この点がタンパク質合成における制約となっている。【０００４】
したがって、高分子としてのＤ−またはＬ−タンパク質の製造において、ＮＣＬの連結部位としうるアミノ酸を製造するためには、側鎖にチオール基が導入された、光学活性なＤ−またはＬ−アミノ酸を製造する必要がある。しかしながら、このようなアミノ酸の製造方法としては、Ｄ−またはＬ−アミノ酸を原料とし、異性化が生じないように多数の複雑な工程を経ながら側鎖にチオール基を導入する方法が試みられているものの、このような方法により収量及び収率よく目的のアミノ酸を製造することは大変困難である。なお、光学活性なアミノ酸を製造する方法としては、立体選択性のある酵素を用いる方法等に関する報告も存在する（特許文献１、２参照）。しかし、これらにおいては、側鎖にチオール基等の所望の置換基を有するアミノ酸の製造等については特段記載されていない。また、酵素には基質特異性があることから、β位に保護されたチオール基のような嵩高い置換基を有するアミノ酸誘導体に対してもこのような酵素が有効であるともいえない。そして、高分子としてのＤ−またはＬ−タンパク質の製造において、ＮＣＬの連結部位として用いうるような、光学活性なβ−チオアミノ酸誘導体は、これまで、Ｄ−またはＬ−タンパク質の工業的生産を可能にするような態様において製造されるに至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１２５７８６
【特許文献２】特開平１１−６９９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、側鎖にチオール基を有し、光学活性なＤ−体及び／またはＬ−体アミノ酸を簡易な方法により、収率よく製造する方法を提供することを課題とした。特に、本発明者らは、ＮＣＬによる連結部位となりうるアミノ酸のバリエーションを増やすため、側鎖にチオール基を有する、天然型または非天然型の種々のＤ−またはＬ−アミノ酸を、収率よく製造することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った。光学活性なＤ−またはＬ−アミノ酸を原料とする従来方法によれば、不斉炭素原子についての立体異性の制御が大変困難であった。そこで、本発明者らは、あえて、チオール基を有するアミノ酸誘導体を立体異性体の混在する中間体組成物として製造した後に、酵素を用いてα炭素原子についてのＤ−体とＬ−体とを分離することにより、驚くべきことに、従前よりも工程数の少ない簡易な方法で、高収率に、側鎖にチオール基を有する、光学活性なアミノ酸誘導体を製造できることを見出した。すなわち、本発明者らは、ＮＣＬ法においては、ペプチド連結反応に用いたチオール基を連結反応後に除去する方法を用いることが可能であることに着目した。本発明者らは、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体（β−チオアミノ酸誘導体）を、α及びβ炭素原子についての立体異性に関する制御を行わずに、最終的にα炭素原子についての光学活性体として精製して得たものをＮＣＬの連結部位に用いることができると考えた。すなわち、α及びβ炭素原子が不斉原子であるβ−チオアミノ酸誘導体のＤ−体またはＬ−体は、ＮＣＬ反応後にチオール基を除去することにより、α炭素原子のみが不斉炭素原子であり、α炭素原子について光学活性なＤ−体またはＬ−体となることから、ＮＣＬ連結部位に用いるアミノ酸として好適に用いることができる。【０００８】
さらに、本発明者らは、天然型または非天然型の種々のアミノ酸に対してチオール基が導入された光学活性な誘導体を製造するために、中間体としての立体異性体の混在するアミノ酸誘導体組成物の製造方法について鋭意検討した。その結果、本発明者らは、芳香族アミノ酸またはグリシンを原料として用いることにより、天然型アミノ酸を含む種々のアミノ酸に対して側鎖にチオール基が導入された非天然型アミノ酸を、Ｄ−体またはＬ−体アミノ酸として、簡易かつ高収率で製造することができることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法を提供する。この製造方法は、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造し、得られたアミノ酸誘導体に対してＤ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離することを特徴とする。【００１０】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含むことを特徴とする、製造方法を提供する。【００１１】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体［ここで、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分をいう（ただし、水素原子である場合を除く）。］の製造方法を提供する。【００１２】
また、本発明の一実施態様においては、前記「β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法」であって、
前記工程（Ｉ）において、前記反応（Ａ）の前に、工程（Ｐ）として、β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程を含み、
前記反応（Ａ）が、アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させる反応とともに行われる
ことを特徴とする。【００１３】
また、本発明の一実施態様においては、前記置換基Ｒ１が芳香族置換基であり、前記工程（Ｐ）が、工程（Ｐ−１）として、β炭素原子に置換基Ｒ１を有するアミノ酸誘導体に対して、β炭素原子に脱離基Ｌを導入する工程を含むことを特徴とする。【００１４】
また、本発明の一実施態様においては、前記工程（Ｐ）が、工程（Ｐ−２）として、
グリシンと、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させる工程を含むことを特徴とする。【００１５】
また、本発明の一実施態様においては、前記工程（Ｂ）が、当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基を、アシルアミノ基に変換する反応であり、前記工程（ＩＩ）における、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素が、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼであることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の一実施態様においては、前記工程（ＩＩ）における、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程が、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体に対して脂溶性保護基を導入する工程を含み、脂溶性保護基の有無により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程であることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、前記工程（ＩＩ）において、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を用い、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離する、ことを特徴とする。【００１８】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｌ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、前記工程（ＩＩ）において、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を用い、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離することを特徴とする。【００１９】
また、本発明の一実施態様においては、前記工程（Ａ）において導入されるチオール基が、ＰＭＢ(パラメトキシベンジル)基、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）基、ベンジル基、Ｔｒｔ（トリチル）基、ジスルフィド基、t-ブチル基から選択される保護基により保護されたチオール基であることを特徴とする。【００２０】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、光学分割されたＤ−非天然型アミノ酸誘導体及びＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離する工程、
及び、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）で加水分解されなかったＬ−アミノ酸誘導体を加水分解し、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を取得する工程、
を含む、製造方法を提供する。【００２１】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、光学分割されたＤ−非天然型アミノ酸誘導体及びＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程、
及び、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）で加水分解されなかったＤ−アミノ酸誘導体を加水分解し、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を取得する工程、
を含む、製造方法を提供する。【００２２】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、光学分割されたＤ−非天然型アミノ酸誘導体及びＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、
前記工程（Ｂ）が、当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基を、アシルアミノ基に変換する反応であり、
工程（ＩＩ）に記載の「（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体」が、以下の式で表される、α炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物であり
【化１】
2015064453.tif 000003
［ここで、Ｒ２は、水素原子またはチオール基の保護基を表し、Ｘは、保護または非保護のカルボキシル基を表し、Ａｃｙｌはアシル基を示し、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子の場合を除く）を示す。］、
前記工程（ＩＩ）における、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素が、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼである、
製造方法を提供する。【００２３】
また、本発明は、別の実施態様として、以下の式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物
【化２】
2015064453.tif 000004
［ここで、Ｒ２は、水素原子またはチオール基の保護基を表し、Ｘは、保護または非保護のカルボキシル基を表し、Ａｃｙｌはアシル基を示し、Ｒ１は、天然型アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子の場合を除く）を示す。］を提供する。また、このようなアミノ酸誘導体は、前記式で表される化合物の塩であってもよい。【００２４】
また、本発明の一実施態様においては、前記式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物において、前記置換基Ｒ１が、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及び、Ｔｙｒからなる群から選択されるアミノ酸のβ炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子ではない）であることを特徴とする。【００２５】
また、本発明の一実施態様においては、前記式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物において、前記置換基Ｒ２が、チオール基の保護基であることを特徴とする。【００２６】
また、本発明の一実施態様においては、前記式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物において、前記置換基Ｘが、ＣＯＯＨであることを特徴とする。【００２７】
また、本発明の一実施態様においては、前記式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物において、前記置換基Ｒ１が、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及び、Ｔｙｒからなる群から選択されるアミノ酸のβ炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子ではない）であり、前記置換基Ｒ２が、チオール基の保護基であり、前記置換基Ｘが、ＣＯＯＨであることを特徴とする。【００２８】
また、本発明の一実施態様においては、前記式で表される、アミノ酸誘導体のα炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含む組成物において、前記Ｄ−体及びＬ−体の等量混合物であることを特徴とする。【００２９】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体［ここで、Ｒ１は、芳香族置換基をいう。］の製造方法であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の工程を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ｐ−１）β炭素原子に置換基Ｒ１を有するアミノ酸誘導体に対して、当該β炭素原子に脱離基Ｌを導入し、β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程、
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させ、かつ、当該β炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する工程、
及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する工程、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含む、製造方法を提供する。【００３０】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基及び置換基Ｒ１を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法［ここで、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分をいう（ただし、水素原子である場合を除く）。］であって、以下の工程、
（Ｉ）アミノ酸誘導体に対し、以下の工程を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ｐ−２）グリシンと、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させ、β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程、
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子から前記脱離基Ｌを脱離させ、かつ、当該β炭素原子に、保護または非保護のチオール基を導入する工程、
及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する工程、
及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程
を含む、製造方法を提供する。【００３１】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、原料として、α炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体を含むアミノ酸誘導体、または、α炭素原子が不斉炭素原子ではないアミノ酸誘導体を用いることを特徴とする。【００３２】
また、本発明の一実施態様においては、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法であって、原料として、α炭素原子に関するＤ−体及びＬ−体の等量混合物としてのアミノ酸誘導体、または、α炭素原子が不斉炭素原子ではないアミノ酸誘導体を用いることを特徴とする。【００３３】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の製造方法によれば、側鎖にチオール基を有する非天然型アミノ酸について、Ｄ−体またはＬ−体アミノ酸として、光学活性なアミノ酸を原料とする従来方法よりも、簡易な方法によりかつ高収率で製造することができる。すなわち、従来のＤ−体またはＬ−体のアミノ酸を原料とする製造方法によれば、α不斉炭素原子についての立体異性化が生じないよう、加熱条件や、強塩基性や強酸性条件を用いた反応を用いることができなかった。これに対し、本発明の製造方法によれば、チオール基の導入を含む所望のアミノ酸の製造工程において、これらの過激な条件を用いて、反応効率の優れた、より簡便な製造工程を用いることが可能である。【００３５】
また、本発明の製造方法によれば、天然型アミノ酸を含む種々のアミノ酸に対して側鎖にチオール基が導入された非天然型アミノ酸を、Ｄ−体またはＬ−体アミノ酸として、簡易にかつ高収率で製造することができる。【００３６】
本発明の製造方法により得られるアミノ酸誘導体を用いれば、システイン以外の天然型及び非天然型の種々のアミノ酸をペプチド連結法における連結部位として用いることが可能になる。すなわち、タンパク質合成においてペプチド連結のためにアミノ酸配列を変更する必要がない点、また、アミノ酸配列中における種々のアミノ酸を連結部位としてタンパク質合成をデザインすることを可能にする点で、本発明の製造方法は、タンパク質合成におけるペプチド連結法の利用可能性を広げるものであり、利用価値が高い。【００３７】
また、本発明の製造方法によれば、目的とするアミノ酸のＤ−体及びＬ−体誘導体を異性体として区別せずに同時に合成するため、本発明の一態様として、目的とするアミノ酸誘導体のＤ−体及びＬ−体を分離し、さらに、Ｄ−体及びＬ−体の両方を光学活性体として別々に同時に得ることが可能である。このような方法は、Ｄ−体及びＬ−体の双方のタンパク質を合成するニーズに応えるための原料の提供方法として利用価値が高い。【００３８】
本発明の製造方法によれば、ほとんどのアミノ酸残基に対応するβ−チオアミノ酸を合成可能である。前述のとおり、NCL法を利用するペプチド連結法には、連結部位とできるアミノ酸が非常に限られるという制約があったが、本発明の製造方法によるβ−チオアミノ酸を用いることにより、NCL法によるペプチド連結部位の制限が解消される。これにより、ポリペプチド（またはタンパク質）の化学合成において、貴重なアミノ酸の消費量を著しく節約することができる。【００３９】
例えば、貴重なアミノ酸が糖鎖−アミノ酸である場合においては、従来の糖ペプチド合成では、糖鎖−アミノ酸をペプチド固相合成に利用していたため、過剰量の糖鎖−アミノ酸を原料として消費していた。しかしながら、上述のとおり、本発明の製造方法によれば、ほとんどのアミノ酸残基に対応するβ−チオアミノ酸誘導体を合成可能であるため、糖鎖−アミノ酸を含み、N末端にβ−チオアミノ酸、C末端にチオエステル等の活性化基を有する数残基程度の短鎖ペプチドを合成してNCL法等（液相反応）によるペプチド連結反応に用いることができる。すなわち、貴重な糖鎖−アミノ酸を中心にN末端側、C末端側へと効率よくペプチドを伸長することが可能となる。これにより、従来法である固相合成に比べ、貴重な糖鎖アミノ酸や修飾アミノ酸の消費量を著しく節約することが可能となった。例えば、貴重なアミノ酸が糖鎖を有するアミノ酸であり、短鎖ペプチドがβ−チオアミノ酸と糖鎖−Asnから構成される２アミノ酸ユニットである場合の反応の概略図を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の製造方法の一態様についての概略図を示す。
【図２】図２は、本発明の製造方法の一態様によって製造されるβ−チオアミノ酸の応用例に関する概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
「アミノ酸」とは、一般に、アミノ基とカルボキシル基の両方をもつ有機化合物をいう。このカルボキシル基が結合している炭素原子をα炭素原子といい、α炭素原子から炭素原子が連結している場合に、α炭素原子に隣接する炭素原子から順に、β炭素原子、γ炭素原子、という。α炭素原子は、α位炭素原子ともいい、または、置換基の結合位置を示すために単にα位ともいう。β炭素原子等についても同様である。
【００４２】
本発明において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本発明におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。
【００４３】
本発明の製造方法において目的化合物として製造されるアミノ酸は、α炭素原子が不斉炭素原子である限り特に限定されないが、本発明の一態様においては、α炭素原子にアミノ基が結合しているα−アミノ酸が好ましい。本発明の一態様において、ペプチドまたはタンパク質を合成するためのアミノ酸誘導体を製造するという観点においては、アミノ酸は、天然型または非天然型のタンパク質構成アミノ酸であることが好ましい。本発明の一態様において、生体に存在するタンパク質と実質的にほぼ同じアミノ酸配列を有するアミノ酸を製造するという観点からは、アミノ酸は、天然型のアミノ酸であることが好ましい。
【００４４】
本明細書において、アミノ酸誘導体は、アミノ酸の側鎖置換基がさらに他の置換基によって置換されたもの、アミノ基やカルボキシル基等の官能基に対して、保護基やその他の置換基が結合することにより誘導体化されたものを含む。すなわち、本明細書において、アミノ酸誘導体は、これらの例のように誘導体化されたものを含めたアミノ酸を総称するために用いられるもので、誘導体化されていないアミノ酸を排除する趣旨ではない。
【００４５】
アミノ酸は、アミノ酸のα炭素原子にアミノ基が結合しているαアミノ酸である場合、α炭素原子に結合する他の２つの置換基が同じ置換基（たとえば、水素原子）でない限り、α炭素原子は不斉原子であり、Ｄ−体、Ｌ−体と呼ばれる鏡像異性体が存在する。本明細書において、Ｄ−体のアミノ酸のことを「Ｄ−アミノ酸」、または「Ｄ−体アミノ酸」等といい、Ｌ−体のアミノ酸のことを「Ｌ−アミノ酸」、または「Ｌ−体アミノ酸」等という。
【００４６】
β炭素原子も不斉炭素原子であるアミノ酸誘導体の場合、β炭素原子をキラル中心とする光学異性体も存在することとなる。本明細書において、α炭素原子についてのＤ−体またはＬ−体という場合、β炭素原子についての光学異性体についての存在比は任意であってよい。すなわち、β炭素原子についての光学異性体について、光学分割された状態であってもよいが、β炭素原子についての光学異性体を任意の比率で含むものであってもよい。すなわち、本明細書において光学活性なアミノ酸誘導体という場合、少なくともα炭素原子についての光学異性体が光学的に分割された光学活性体であればよい。
【００４７】
また、本明細書において、α炭素原子についてのＤ−体とＬ−体との等量混合物である場合について、アミノ酸誘導体がラセミ体である、または、ラセミ体アミノ酸誘導体である、ともいう。ラセミ体とは、通常広く解釈されるとおり、Ｄ−体とＬ−体との実質的な意味において等量混合物であればよく、また、ラセミ混合物、ラセミ化合物、ラセミ固溶体と呼ばれるような形状で存在するものであってもよい。
【００４８】
本発明の一態様において、本発明は、β位に保護または非保護のチオール基を有するＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体の製造方法に関する。ここで、β位に置換基Ｒを有する、とは、β炭素原子に置換基Ｒが結合している、と同じ意味である。
【００４９】
本明細書において、「保護または非保護の」置換基Ｒとは、保護基によって保護された置換基Ｒ、または、保護されていない置換基Ｒをいう。たとえば、「保護または非保護のチオール基」は、保護基によって保護されたチオール基または、保護されていないチオール基をいう。チオール基の保護基としては、チオール基の保護基として用いることのできるものであれば何ら限定されない。チオール基の保護基としては、例えば、ＰＭＢ(パラメトキシベンジル)基、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）基、ベンジル基、Ｔｒｔ（トリチル）基、ジスルフィド基、t-ブチル基等が挙げられる。
【００５０】
本明細書において、「β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体」という場合、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸の状態において非天然型アミノ酸であることをいう。すなわち、天然型アミノ酸として知られるシステインは、β位に非保護のチオール基を有するアミノ酸であって、β位にチオール基を有する状態において天然型アミノ酸である。「β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体」はこのような天然型のシステインを含むものではないことを意味する。すなわち、「β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体」は、「天然型アミノ酸のβ位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸」またはその誘導体を排除する趣旨ではない。また、本明細書において、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を、「β−チオアミノ酸誘導体」ともいう。
【００５１】
本発明の一態様において、天然型アミノ酸により構成されるタンパク質を合成するためのＮＣＬ連結部位に用いることが可能なアミノ酸を得るという観点においては、本発明における目的化合物としてのβ−チオアミノ酸誘導体は、天然型アミノ酸のβ炭素原子に結合する水素原子の１つの代わりに、保護または非保護のチオール基が結合しているアミノ酸またはその誘導体であることが好ましい。
【００５２】
このようなβ−チオアミノ酸誘導体の一例は、天然型アミノ酸のそれぞれに呼応して、以下の化学式に記載された化合物として示すことができる。
【化３】
2015064453.tif 000005
【００５３】
この化学式においては、Ｄ−体及びＬ−体を立体異性として区別することなく記載しているが、Ｄ−体及びＬ−体を立体異性体として記載すれば、この化学式に記載の化合物は、例えば、天然型アミノ酸がフェニルアラニンである場合を例とすると、以下のような２つの化学式として表すことができる。以下の２つの化学式において、左側がＬ−体、右側がＤ−体である。上記化学式に記載されたその他の化合物についても同様に、Ｄ−体、Ｌ−体として記載することができる。
【化４】
2015064453.tif 000006
【００５４】
また、上記の、天然型アミノ酸のそれぞれに呼応した、β−チオアミノ酸誘導体の一例としての上記化学式においては、最も単純化して、アミノ基、カルボキシル基、及び、その他の側鎖置換基が保護も置換もされていない例を記載したが、「β位に保護または非保護のチオール基を有する非天然型アミノ酸誘導体」としては、これらのアミノ基、カルボキシル基、及び、その他の側鎖置換基が、保護基またはその他の置換基により置換された化合物をも含む。
【００５５】
本発明の一態様において、本発明における目的化合物としてのβ−チオアミノ酸誘導体は、β位に保護または非保護のチオール基を有し、かつ、β位に置換基Ｒ１をも有するアミノ酸誘導体ということもできる。ここで、Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分であって、水素原子ではないものをいう。上記のフェニルアラニンの例でいえば、フェニルアラニンは、β位に水素原子２つ及びフェニル基が結合したアミノ酸であるから、Ｒ１はフェニル基である。同様にして、天然型のアミノ酸について、それぞれ、置換基Ｒ１を理解することができる。例えば、天然型のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎである場合、置換基Ｒ１は、それぞれ、−ＣＯ−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２である。天然型のアミノ酸がＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓである場合、置換基Ｒ１は、それぞれ、インドール−３−イル基、−パラヒドロキシフェニル基、１Ｈ−イミダゾ−４−イル基である。天然型のアミノ酸がＡｓｐ、Ｇｌｕである場合、置換基Ｒ１は、それぞれ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２−ＣＯＯＨである。天然型のアミノ酸がＡｒｇ、Ｌｙｓである場合、置換基Ｒ１は、それぞれ、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）２、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である。天然型のアミノ酸がＭｅｔ、Ｌｅｕである場合、置換基Ｒ１は、それぞれ、−ＣＨ２−ＳＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２である。これらの置換基Ｒ１に含まれるカルボキシル基やアミノ基等は、遊離の酸または塩基であってもよく、塩であってもよい。また、当業者であれば、天然型のアミノ酸ではない場合にも、同様に、そのアミノ酸の構造式から、β炭素原子に結合する置換基部分であって、水素原子ではない置換基部分として、それぞれ置換基Ｒ１を理解することができる。また、置換基Ｒ１が官能基等の反応性の高い基を含む場合には、これらの基を保護基により保護し、または他の置換基より置換し、または、他の置換基に変換しておくことが好ましい。
【００５６】
本明細書において、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体をβ−チオアミノ酸誘導体と呼ぶことがある。また、天然型アミノ酸の側鎖置換基を有するアミノ酸であって、そのβ炭素原子に結合する水素原子に代えて保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸誘導体を、天然型アミノ酸のβ−チオアミノ酸誘導体と呼ぶことがある。たとえば、フェニルアラニンであれば、上記構造式により表されるアミノ酸誘導体を、フェニルアラニンのβ−チオアミノ酸誘導体と呼ぶことができる。また、Ｄ−体とＬ−体の等量混合物としてのアミノ酸誘導体を、Ｄ，Ｌ−β−チオアミノ酸誘導体と呼ぶことがある。
【００５７】
本発明の一態様として、本発明の製造方法は、β位に保護または非保護のチオール基を有する、Ｄ−またはＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法に関する。この製造方法においては、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体をＤ−体とＬ−体を含む中間体組成物として製造した後、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する。上記中間体組成物は、Ｄ−またはＬ−体選択的加水分解酵素の基質となる部位を有するアミノ酸誘導体として製造することから、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有する、β−チオアミノ酸誘導体のＤ−体及びＬ−体を含む組成物、ということもできる。
【００５８】
Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するβ−チオアミノ酸誘導体は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するアミノ酸誘導体に対して、β位にチオール基を導入することにより製造してもよい。または、β−チオアミノ酸誘導体に対して、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するように置換基を変換することにより製造してもよい。また、β−チオアミノ酸誘導体は、アミノ酸誘導体に対して、β位にチオール基を導入することにより製造してもよく、または、アミノ酸誘導体とチオール基含有化合物とを縮合する方法等により製造してもよい。Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位となるように置換基を変換する方法としては、アミノ酸のα炭素原子に結合するアミノ基またはカルボキシル基をＤ−またはＬ−体選択的加水分解酵素の基質となるように変換することにより行うことができる。この反応において、変換反応を行う前のアミノ基またはカルボキシル基は、保護されていないアミノ基またはカルボキシル基であってもよく、他の保護基によって保護されているアミノ基またはカルボキシル基であってもよい。
【００５９】
上記の中間体としての、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するβ−チオアミノ酸誘導体は、α炭素原子についての立体異性を制御しない製造方法により製造することができる。α炭素原子についての立体異性を制御しないことにより、上記のＤ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するβ−チオアミノ酸誘導体は、Ｄ−体及びＬ−体を含む組成物として得ることができる。
【００６０】
Ｄ−体及びＬ−体を含む、上記のＤ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質部位を有するβ−チオアミノ酸誘導体に対して、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させると、Ｄ−またはＬ−アミノ酸誘導体が選択的に加水分解される。加水分解により生じたアミノ基またはカルボキシル基は、保護されていない状態のまま、または、保護基により保護した状態として、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体と、加水分解されなかった他のアミノ酸誘導体とを、その疎水性等の違いを利用して、分離することができる。
【００６１】
本発明は、その一態様として、以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む製造方法として表すことができる。
（Ｉ）Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程、及び、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程。
【００６２】
本明細書において、「Ｄ−体及びＬ−体を含む」という場合、α炭素原子についての光学異性体としてのＤ−体とＬ−体とを含むことをいい、特定のない場合には、その量の比率を特定するものではない。本発明の好ましい一態様においては、Ｄ−体及びＬ−体の双方を実質的に含むことを意味する。また、本発明の一態様においては、Ｄ−体及びＬ−体の等量混合物とすることができる。
【００６３】
本発明の一態様において、工程（Ｉ）は、アミノ酸誘導体に対し、以下の反応（Ａ）及び（Ｂ）を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応
と表現することができる。
【００６４】
ここで、上記反応（Ａ）及び（Ｂ）の順序は、（Ａ）、（Ｂ）の順に行ってもよく、また、（Ｂ）、（Ａ）の順に行ってもよい。また、（Ａ）と（Ｂ）以外に、アミノ酸誘導体の官能基または置換基に対する保護、脱保護等のその他の反応も適宜行うことができる。また、本明細書において、反応（Ａ）、（Ｂ）等と記載しているが、これらは、工程（Ａ）、（Ｂ）等と呼ぶこともできる。
【００６５】
工程（Ｉ）の「アミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程」は、工程（Ｉ）に含まれる反応を行った後に、Ｄ−体及びＬ−体を含む状態が実現していればよく、原料となるアミノ酸は、実質的にＤ−体またはＬ−体の一方から構成されるアミノ酸またはその誘導体であってもよく、また、グリシンのように、α炭素原子が不斉炭素原子ではないアミノ酸またはその誘導体であってもよい。また、本発明の一態様においては、工程（Ｉ）で得られるアミノ酸誘導体を効率よく再結晶化する観点において、Ｄ−体及びＬ−体を等量含むことが好ましい。Ｄ−体及びＬ−体を等量含むとは、実質的な意味において等量であればよい。言い換えれば、本発明の一態様においては、工程（Ｉ）で得られるアミノ酸誘導体の中間体組成物がラセミ体であることが好ましい。
【００６６】
アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応は、アミノ酸誘導体のβ炭素原子に、保護または非保護のチオール基を導入する反応であれば、特に制限されない。アミノ酸誘導体のβ炭素原子に脱離基を導入してから、脱離基との交換反応として導入してもよい。
【００６７】
例えば、この反応は、アミノ酸誘導体に対し、チオール化合物を反応させることにより、行うことができる。保護されたチオール基を導入する観点からは、硫黄原子に保護基と水素原子とが結合したチオール化合物を用いることが好ましい。チオール化合物としては、フェニル環上の任意の位置に、任意の数のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基、ニトロ基等の置換基を有していてもよいベンジルメルカプタン類やトリチルチオール類、メタンチオール、エタンチオール、ｔ−ブタンチオール等のアルカンチオール類、アセトアミドメチル基、トリチル基、ジスルフィド基に容易に変換可能なアシルチオール類等を挙げることができる。本発明の一態様においては、ベンジルメルカプタン類が好ましく、また、パラメトキシベンジルメルカプタンがより好ましい。
【００６８】
チオール化合物の使用量としては、原料となるアミノ酸誘導体１当量に対して１〜１００当量、好ましくは、２〜２０当量、更に好ましくは３〜１０当量とすればよい。使用する溶媒としては、例えばＴＨＦ、ＤＣＭ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等が挙げられるが、これらの中でもＤＭＦが好ましい。反応条件としては、例えば、１〜１００℃、好ましくは１０〜８０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で、３０分〜２４時間、好ましくは、１〜１２時間、更に好ましくは２〜６時間反応を行うことができる。
【００６９】
この反応の原料化合物は、β位にチオール基を導入することのできるアミノ酸またはアミノ酸誘導体であればよい。すなわち、原料化合物は、アミノ酸でもよく、アミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、側鎖置換基等が保護または置換基により置換されたアミノ酸誘導体であってもよい。本発明の一態様において、効率よく反応を行う観点からは、好ましくは、β位に脱離基を有するアミノ酸誘導体であることが好ましく、より好ましくは、β位にハロゲン原子を有するアミノ酸誘導体であることが好ましい。また、本発明の一態様において、副反応を防いで収率を上げる観点からは、アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基が保護されたアミノ酸誘導体であることが好ましい。
【００７０】
アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応は、反応後に、α炭素原子に、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基が結合したアミノ酸誘導体が得られる反応であれば特に制限されない。反応の出発原料における「アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合したアミノ基またはカルボキシル基」は、保護または非保護のアミノ基またはカルボキシル基であってよい。すなわち、保護されていない遊離のアミノ基またはカルボキシル基であってもよく、また、保護基により保護されたアミノ基またはカルボキシル基であってもよい。本発明の一態様において、アミノ酸誘導体のβ位にチオール基を導入した後に、本反応を行う場合、β位にチオール基が導入されたアミノ酸誘導体を原料とし、また、チオール化のためにアミノ基及びカルボキシル基を保護した場合には、これらが保護されたアミノ酸誘導体を原料として、行うことができる。
【００７１】
アミノ基の保護基としては、一般にアミノ基の保護基として用いることができる基を用いることができ、例えば、後述する脂溶性保護基等を用いることができる。本発明の一態様においては、例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート（Ａｌｌｏｃ）基等のカーボネート含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリール基、ベンジル基等の保護基等を挙げることができる。保護基を導入するには、例えば、Ｂｏｃ基を導入する場合には、反応系にＢｏｃ２ＯのＴＨＦ溶液を加える方法等により行うことができる。アミノ基の保護基の導入は、保護基に応じて、上記の方法の他、公知の方法を用いて行うことができる。また、アミノ基の保護基の脱保護は、酸又は塩基で処理することにより行うことができる。例えば、保護基がＢｏｃ基である場合、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の酸を使用することができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましく、例えばＤＣＭやＴＨＦ、アセトニトリル等を挙げることができる。アミノ基の保護基の脱保護は、上記の方法の他、通常の方法を用いて行うことができる。
【００７２】
カルボキシル基の保護基としては、一般にカルボキシル基の保護基として用いることができる基を用いることができ、例えば、後述する脂溶性保護基等を用いることができる。本発明の一態様においては、例えば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基、ベンジル基等のアリールアルキル基によるエステルとして保護することが挙げられる。カルボキシル基の保護基がメチル基である場合、塩化チオニル及びメタノールを加える方法等によりメチルエステル化することができる。カルボキシル基の保護基の導入は、保護基に応じて、上記の方法の他、公知の方法を用いて行うことができる。また、カルボキシル基の保護基の脱保護は、酸又は塩基で処理することにより行うことができる。例えば、保護基がメチル基である場合、水酸化ナトリウム等の塩基を使用することができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましく、例えばＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル等を挙げることができる。カルボキシル基の保護基の脱保護は、上記の方法の他、通常の方法を用いて行うことができる。
【００７３】
「Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素」としては、Ｄ−体アミノ酸選択的に加水分解を行う酵素、または、Ｌ−体アミノ酸選択的に加水分解を行う酵素であれば特に制限されない。たとえば、加水分解酵素は、アミダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等を挙げることができる。これらの酵素の起源は特に制限されず、細菌等の微生物由来であってもよく、哺乳動物由来であってもよい。これらのＤ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素は、市販のものを用いるほか、公知の方法により調製することもできる。市販のものとしては、例えば、アシラーゼ「アマノ」（Ｌ−アシル体選択的アミノアシラーゼ）（アマノエンザイム社製）、Ｄ−アミノアシラーゼ「アマノ」（Ｄ−アシル体選択的アミノアシラーゼ）（アマノエンザイム社製）等を挙げることができる。
【００７４】
本発明の一態様においては、酵素反応後の分離を容易にし、かつ、収率よくＤ−体またはＬ−体を得るという観点において、「Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素」として、Ｄ−アミノアシラーゼまたはＬ−アミノアシラーゼを用いることが好ましい。本発明の製造方法においては、加水分解酵素により加水分解されたＤ−体とＬ−体との分離方法は、分離が可能である限り特に制限されないが、本発明の一態様においては、加水分解されたアミノ基またはカルボキシル基に対して脂溶性保護基を導入することにより、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体と、加水分解されなかった他のアミノ酸誘導体とを効率よく分離することができる。そのような分離において、アシルアミノ基と、１つまたは２つの脂溶性アミノ保護基によって保護されたアミノ基とは、疎水性の違いの程度を比較的大きいものとし、収率のよい分離を可能にするという点においても、加水分解酵素としてアミノアシラーゼを選択することが好ましい。なお、そのような保護基を用いた分離工程については後述する。
【００７５】
「Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的」とは、Ｄ−体またはＬ−体に対する選択性があるものであればよく、１００％ないしそれに準ずるものに限定されない。本発明において、Ｄ−体またはＬ−体の純度の高い光学活性アミノ酸を製造する観点からは、Ｄ−体またはＬ−体に対する選択性が高いものが好ましく、実質的に、Ｄ−体またはＬ−体のいずれか一方にのみ反応するものがより好ましい。
【００７６】
「Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応」としては、上記酵素の選択に応じて、選択した酵素の基質となるように、α炭素原子に結合している、保護または非保護のアミノ基またはカルボキシル基を変換することができる。すなわち、目的とする置換基の種類や構造に応じ、通常の方法を用いて、保護または非保護のアミノ基またはカルボキシル基を変換することができる。例えば、酵素としてアミノアシラーゼを用いる場合には、保護または非保護のアミノ基をアシル化することにより、酵素の基質としてのアミノアシル基に変換することができる。
【００７７】
例えば、アミノ基をアシル化する方法としては、保護または非保護のアミノ基を有するアミノ酸誘導体を、カルボン酸ハロゲン化物やカルボン酸無水物と反応させる方法等により行うことができる。また、例えば、アミノ基をアセチル化する場合には、保護または非保護のアミノ基を有するアミノ酸誘導体を含む反応系に、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）を加えて反応させる方法等により行うことができる。溶媒としては、アミノアシル化が進行する溶媒であれば特に制限されず、例えば、水やメタノール、エタノール、ＴＨＦ、ＤＣＭ等、またはこれらの混合溶媒等を用いることができる。反応温度は、アミノアシル化が進行する温度であれば特に制限されず、例えば、０〜４０℃等とすることができ、通常の室温において行うことができる。反応時間は、アミノアシル化が進行するのに十分な時間であればよく、例えば、１分〜１０時間、好ましくは５分〜１時間等とすることができる。
【００７８】
酵素としてアミノアシラーゼを用いる場合の他、アミダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等を用いる場合にも、公知の方法により行うことができる。アミダーゼを用いる場合には、保護または非保護のアミノ基をアミド化する反応、保護または非保護のカルボキシル基をアミド化する反応により行うことができる。また、エステラーゼを用いる場合には、保護または非保護のカルボキシル基をエステル化する反応により行うことができる。当業者であれば、本明細書の記載を参照し、これらに準じてその他の加水分解酵素を用いる場合にも同様に行うことができるであろう。
【００７９】
アミノ基またはカルボキシル基を保護基により保護しておく場合、保護基により保護されたアミノ基またはカルボキシ基が、そのまま、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となることも考えられる。その場合には、アミノ基またはカルボキシル基を保護基により保護する工程を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応と呼ぶことができる。本発明の一態様において、本発明の製造方法における工程数を少なくする観点からは、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応を先に行い、アミノ基及びカルボキシル基を保護した後に、β位にチオール基を導入することも好ましい。
【００８０】
本発明の一態様において、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基として、ある程度反応性が高い置換基を用いる場合には、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応を、酵素による加水分解反応の直前に行うことが好ましい。また、その場合には、β位にチオール基を導入する反応の際には、アミノ基及びカルボキシル基は、別途保護基により保護しておくことが好ましい。
【００８１】
この場合、上記工程（Ｉ）は、以下のように表現することもできる。すなわち、工程（Ｉ）は、原料となるアミノ酸に含まれるアミノ基及びカルボキシル基が保護基により保護されたアミノ酸誘導体を準備し、そのアミノ酸誘導体に対し、以下の反応を行い、Ｄ−体及びＬ−体を含む、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造する工程
（Ａ）当該アミノ酸誘導体のβ炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入する反応、及び、
（Ｂ）当該アミノ酸誘導体のα炭素原子に結合した保護されたアミノ基または保護されたカルボキシル基を、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素の基質となる置換基に変換する反応、
として表現することもできる。また、原料となるアミノ酸において、その他の官能基が存在する場合には、原料となるアミノ酸に含まれるアミノ基、カルボキシル基、及びその他の官能基が保護基により保護されたアミノ酸誘導体を準備する工程、とすることもできる。
【００８２】
本発明の一態様において、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素は、立体選択性の高さ、入手容易性、アミノ酸誘導体のアミノ基またはカルボキシル基の基質への変換の容易性等の種々の考慮要素により選択することができる。アミノ酸誘導体のアミノ基またはカルボキシル基を保護する工程と、酵素の基質に変換する工程を別にすることは、酵素の基質となる置換基の反応性が高い場合であってもそのような置換基を基質とする加水分解酵素の選択を可能にする点において好ましい。
【００８３】
本発明の一態様において、上記反応により、β位にチオール基が導入され、かつ、アミノ基またはカルボキシル基が加水分解酵素の基質に変換されたアミノ酸誘導体は、再結晶等の方法により分離精製してから次の工程に用いてもよい。精製する方法としては、再結晶、シリカゲルカラム、有機溶媒による抽出等の通常の方法により行うことができる。
【００８４】
本発明者らは、本発明の製造方法の一態様において、β位にチオール基が導入され、かつ、アミノ基またはカルボキシル基が加水分解酵素の基質に変換されたアミノ酸誘導体が、Ｄ−体及びＬ−体の等量混合物である場合において、特にこの中間体組成物を効率よく再結晶化することができることを見出した。Ｄ−体及びＬ−体の等量混合物である場合とは、α炭素原子についてのラセミ体である場合、あるいは、単にラセミ体である場合、ともいうことができる。
【００８５】
このような中間体組成物を再結晶する場合、その前に、有機溶媒による抽出等を用いて粗精製物を得てもよい。有機溶媒による抽出は、通常の方法により行うことができる。再結晶を行う場合、溶媒として、酢酸エチル、メタノール、エタノール、エーテル等の有機溶媒またはその混合溶媒等を用いることができ、好ましくは、メタノール、エーテル等を用いることができる。
【００８６】
本発明の製造方法において、工程（ＩＩ）として、上記の工程（Ｉ）により得られたアミノ酸誘導体に対し、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程を行う。
【００８７】
上記工程（Ｉ）により得られたＤ−体及びＬ−体を含むアミノ酸誘導体に対して、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素のいずれか一方を反応させることにより、その酵素の立体選択性により、Ｄ−体及びＬ−体を含むアミノ酸誘導体のうちの、いずれか一方が上記加水分解酵素により選択的に加水分解される。例えば、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させれば、Ｄ−体のアミノ酸誘導体が選択的に加水分解される。また、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させれば、Ｌ−アミノ酸が選択的に加水分解される。
【００８８】
Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素については、先に述べたとおりである。加水分解反応は、一般的な酵素反応と同様に行うことができる。Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素は、酵素反応に通常用いられる種々の緩衝液に溶解させることにより、酵素溶液を調製して用いることができる。緩衝液としては、酵素反応を進行させることのできる緩衝液であれば特に限定されず、リン酸緩衝液、トリス塩酸塩等を用いることができる。ｐＨは、６．０〜１０．０において行うことができ、好ましくは７．０〜９．０、より好ましくは８．０にすることができる。また、加水分解反応に用いる酵素の量は、加水分解反応が効率よく進行する量である限り特に限定されず、例えば、基質に対して触媒量もしくは過剰量を用いることができる。加水分解反応を効率よく進行させる観点において、例えば基質１００ｍｇに対して０．１〜１００００単位、好ましくは、１〜１０００単位にすることができる。また、反応温度は、１０℃〜６０℃において行うことができ、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは３０℃〜５０℃にすることができる。反応時間は、１時間〜３０日間、好ましくは１２時間〜２０日間、より好ましくは２〜１４日間にすることができる。
【００８９】
本発明の製造方法において、工程（ＩＩ）は、上記酵素による加水分解反応の後、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程を含む。工程（ＩＩ）において、加水分解反応を行い、「続いて」、分離する工程を行う、という場合、加水分解反応の後に、分離工程を行うものであればよく、この加水分解反応と分離反応とは直接的に連続的に行うことに限定されるものではない。例えば、加水分解により生じた遊離のアミノ基またはカルボキシル基を保護されていない状態のまま、分離工程を行ってもよく、または、遊離のアミノ基またはカルボキシル基を保護基により保護する工程等を行った後に、分離工程を行うものであってもよい。本発明の一態様においては、その後の分離工程を収率よく行うために適当な保護基により保護することが好ましい。
【００９０】
工程（ＩＩ）において、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程は、加水分解された一方の鏡像異性体と加水分解されなかった他方の鏡像異性体とを互いに分離する方法である限り、なんら限定されない。例えば、反応系から一方のみを取り出す方法、反応系から一方を除去する方法、有機相と水相とに一方ずつをそれぞれ局在させる方法、反応系から双方を取り出しクロマトグラフィ等の分離精製手段を用いて一方ないし双方をそれぞれ分取する方法等を用いることができる。
【００９１】
例えば、β位にチオール基を有するＤ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法としては、β位にチオール基を有する、Ｄ−体及びＬ−体を含む中間体組成物に対し、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離することにより、行うことができる。
【００９２】
逆に、β位にチオール基を有するＬ−非天然型アミノ酸誘導体の製造方法としては、β位にチオール基を有する、Ｄ−体及びＬ−体を含む中間体組成物に対し、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離することにより、行うことができる。
【００９３】
ここで、例えば、加水分解されたＤ−体を分離する場合、Ｄ−体を反応系から取り出す方法に限定されず、加水分解されなかった未反応物を反応系から除去することによりＤ−体を分離する方法等であってもよい。これらの方法は、例えば、抽出、結晶化、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）等の公知の方法により行うことができる。
【００９４】
本発明の好ましい一態様においては、一方の鏡像異性体を分離した後、他方の鏡像異性体もまた利用することができるという観点において、一方を先に分取した後に他方をも分取する方法、または、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用いることにより双方をそれぞれ精製し分取する方法が好ましい。また、抽出、結晶化等により粗精製物を得てから、Ｄ−体及びＬ−体を分取してもよい。
【００９５】
本発明の一態様において、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程は、加水分解されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体に対して脂溶性保護基を導入する工程を含み、脂溶性保護基の有無及び／または個数により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程とすることができる。
【００９６】
ここで用いられる脂溶性保護基としては、アミノ基またはカルボキシル基の保護基として用いられるものであって脂溶性のものであれば、特に限定されない。例えば、アミノ基の脂溶性保護基としては、カーバメート系、アシル系、イミド系、アルキル系、スルホンアミド系から選択される脂溶性保護基が挙げられる。カーバメート系保護基としては、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基、Ａｌｌｏｃ基等が挙げられる。アシル系保護基としては、アセチル（Ａｃ）基等が挙げられ、イミド系保護基としては、フタロイル（Ｐｈｔ）基等が挙げられ、アルキル系保護基としては、トリチル（Ｔｒｔ）基、ベンジル基、アリール基等が挙げられ、スルホンアミド系保護基としては、ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ又はＴｏｓ）基、２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）基等が挙げられる。また、カルボキシル基の脂溶性保護基としては、エステル系、アミド系、等から選択される脂溶性保護基が挙げられる。例えば、エステル系保護基としては、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基エステル、ベンジル基等のアリールアルキル基エステル等が挙げられる。
【００９７】
本発明の一態様において、脂溶性保護基により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する観点からは、酵素基質部位に変換されたアミノ基またはカルボキシル基との疎水性の違いが大きくなるように、酵素基質部位としての置換基と、脂溶性保護基とを選択することが好ましい。本発明の一態様として、アミノアシラーゼを加水分解酵素として用いる場合には、加水分解後のアミノ基をカーバメート系の脂溶性保護基により保護することが好ましく、特に、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基、Ａｌｌｏｃ基等が好ましい。
【００９８】
本発明の一態様において、脂溶性保護基を用いる場合、脂溶性の保護基の有無及び／または個数により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離することができる。例えば、脂溶性保護基として、Ｂｏｃ基を用いる場合、１つのアミノ基に対して１つの保護基を導入すると、アミノ基は−ＮＨＢｏｃ基となる。また、１つのアミノ基に対して２つの保護基を導入すると、アミノ基は−Ｎ（Ｂｏｃ）２基となり、−Ｎ，Ｎ−ｄｉＢｏｃ基と呼ぶこともできる。本発明の製造方法における分離する工程としては、これらのいずれの状態において分離してもよい。また、加水分解により生じる基がカルボキシル基である場合にも同様に、遊離のカルボキシル基のまま分離する方法の他、カルボキシル基を構成する１つの酸素原子に対し、１つの保護基を導入して分離することもできる。なお、疎水性の違いを利用して、とは、親水性の違いを利用して、ともいうことができる。また、本発明の一態様において、脂溶性保護基を導入することによる、抽出溶媒等の溶媒に対する溶解度の違いを利用して、または、カラムクロマトグラフィ等を用いる場合には、カラム等の固相に対する親和性の違いを利用して、と言い換えることもできる。さらに、分離方法によっては、保護基の嵩高さを利用して分離することもできる。また、主に保護基の有無によって生じる化合物の電荷の差を利用して分離することもできる。
【００９９】
本発明の一態様において、脂溶性保護基の有無及び／または個数により生じる疎水性の違いを利用して、脂溶性保護基を導入されたＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体を分離する方法としては、例えば、抽出による方法、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる方法等を用いることができる。本発明の一態様においては、本発明のアミノ酸を効率よく分離精製する観点において、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いることが好ましい。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製する場合、カラムとしては、市販のシリカゲルをガラス管に充填したものを調製して用いることができる。カラムに用いるシリカゲルは、本発明のアミノ酸誘導体を脂溶性保護基の有無等により分離できるものである限り特に制限されず、例えば、シリカゲル６０（４０〜６３μｍ）（メルク株式会社製）等を用いることができる。カラムに用いるガラス管は、シリカゲルを充填してアミノ酸誘導体を分離できるものであれば特に制限されず、例えば、クロマトグラフ管（フィルター無・コック付）（アズワン株式会社製）などを用いてもよい。展開溶媒としては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて通常用いられる溶媒であってよく、例えば、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール、アセトニトリル等、またはこれらの混合溶媒等を用いることができる。本発明の一態様においては、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１〜１０の展開溶媒、１％ギ酸含有酢酸エチル等を用いることが好ましい。当業者であれば、本発明の記載に基づき、目的とするアミノ酸誘導体の構造等に応じて、展開溶媒を選択して用いることができる。
【０１００】
本発明の一態様において、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体のＤ−体及びＬ−体の両方を光学活性なアミノ酸誘導体として取得してもよい。特に、ラセミタンパク質の合成等に用いられるＤ−体及びＬ−体のアミノ酸誘導体を得るという観点においては、Ｄ−体及びＬ−体の両方を光学活性なアミノ酸誘導体として取得することが好ましい。この場合においては、それぞれ実質的に同じ量のＤ−体及びＬ−体を得るという観点において、原料化合物としては、ラセミ体アミノ酸またはグリシンを用いることが好ましい。
【０１０１】
この場合には、例えば、Ｄ−体及びＬ−体を含む中間体組成物に対し、例えば、Ｄ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＤ−アミノ酸誘導体を分離する工程を行うとともに、または、その前後に、加水分解されなかったＬ−アミノ酸誘導体を取得する工程を行うことにより得ることができる。
【０１０２】
逆に、Ｄ−体及びＬ−体を含む中間体組成物に対し、例えば、Ｌ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させ、続いて、加水分解されたＬ−アミノ酸誘導体を分離する工程を行うとともに、または、その前後に、加水分解されなかったＤ−アミノ酸誘導体を取得する工程を行うことにより得ることができる。
【０１０３】
ここで、加水分解された一方アミノ酸誘導体を分離する工程を行うとともに他方アミノ酸誘導体を取得する場合としては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、それぞれの画分を取得することにより行うことができる。また、加水分解された一方アミノ酸誘導体を分離する工程の前後に他方アミノ酸誘導体を取得する場合としては、抽出、再結晶等の方法において、一方のアミノ酸誘導体を分離した後、もう一方のアミノ酸誘導体を分離することにより行うことができる。
【０１０４】
本発明の一態様において、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体のＤ−体及びＬ−体の両方を光学活性なアミノ酸誘導体として取得する場合、Ｄ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素により加水分解されなかった方のアミノ酸誘導体についても、目的に応じて加水分解してもよい。この加水分解は、Ｄ−体またはＬ−体を含むアミノ酸誘導体組成物に対してＤ−またはＬ−アミノ酸選択的加水分解酵素を反応させることにより行ってもよい。また、Ｄ−体とＬ−体のアミノ酸誘導体を分離した後で、立体選択性のない加水分解酵素により行ってもよく、また、酵素等を用いずに、通常の化学反応として、加水分解反応を行ってもよい。
【０１０５】
本発明の一態様において、Ｄ−体またはＬ−体選択的酵素として、アミノアシラーゼを用いる場合、工程（Ｉ）により得られる中間体は、以下の構造式により表すことができる。
【化５】
2015064453.tif 000007
【０１０６】
なお、上記の化学式においては、α不斉炭素原子及びβ不斉炭素原子についての立体異性体の存在を区別しないで記載したものである。本発明の一態様においては、これらの不斉炭素原子について立体異性体を区別することなく中間体を製造可能であるという意味において、中間体をこのように表すことができる。実際には、α炭素原子についての光学異性とβ炭素原子についての光学異性が存在することから、これらの組み合わせにより生じる４種のジアステレオマーを任意の割合で含むものであってよい。
【０１０７】
本発明の一態様において、Ｄ−体とＬ−体とを含む、アミノアシラーゼの基質部位を有すβ−チオアミノ酸誘導体中間体組成物としては、以下の２つの化学式により表される、Ｄ−体とＬ−体とを含む組成物、として表すこともできる。以下の化学式において、左側がＬ−体、右側がＤ−体である。
【化６】
2015064453.tif 000008
【０１０８】
ここで、Ｒ２−Ｓは、β炭素原子に導入されたチオール基を示す。チオール基は保護されていないチオール基でもよく、保護基により保護されたチオール基でもよい。チオール基の保護基は、すでに述べたとおりである。チオール基の保護基の有無、及び、用いるべき保護基は、本発明の製造法において、目的とする化合物に応じて、適宜決定することができる。例えば、本発明の製造方法の間にチオール基が反応することを防ぐ観点からは、チオール基が保護されていることが好ましい。また、目的化合物として、保護されたチオール基を有するＤ−またはＬ−選択的アミノ酸誘導体を得る場合にも、チオール基が保護されていることが好ましい。
【０１０９】
ここで、Ｘは、保護または非保護のカルボキシル基を表す。カルボキシル基は、保護されていないカルボキシル基であってもよく、遊離の酸であっても塩を構成していてもよい。カルボキシル基の保護基は、すでに述べたとおりである。カルボキシル基の保護及び脱保護は、有機化学における通常の方法により、目的に応じて適宜行うことができる。例えば、本発明の一態様において、本発明の製造方法の間にカルボキシル基が反応することを防ぐ観点からは、カルボキシル基が保護されていることが好ましい。一方、本発明の一態様において、アミノアシラーゼの基質として迅速な反応を求める観点からは、カルボキシル基に保護基が結合していることにより酵素反応速度が低下することが考えられるため、酵素による加水分解反応の前に、保護されたカルボキシル基を脱保護しておくことも望ましい。
【０１１０】
Ａｃｙｌはアシル基を示す。アシル基は、Ｒ−ＣＯ−で表すこともできる。Ｒは、水素原子、直鎖または分枝のアルキル基等であり、１または複数の置換基によって置換されていてもよい。Ｒとしてのアルキル基は、例えば、炭素数１から３、好ましくは、炭素数１〜２のアルキル基とすることができる。また、Ｒの置換基としては、本発明の製造方法における反応を阻害しない限り、アルキル基の置換基としてありうるどのような置換基であってもよく、例えば、塩素原子やフッ素原子等のハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のフェニル基等であってもよい。Ｒ−ＣＯ−で表されるアシル基としては、例えば、アセチル基、ヒドロキシアセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ホルミル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等が挙げられる。例えば、本発明の一態様において、アミノアシラーゼの基質として迅速な反応を求める観点からは、アセチル基、ベンゾイル基等が好ましい。
【０１１１】
Ｒ１は、アミノ酸を構成する側鎖の置換基のうちの、β炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子の場合を除く）を示す。Ｒ１は、官能基を有していてもよく、官能基が保護されていてもよい。官能基の保護及び脱保護も、本発明の製造方法において、適宜行うことができる。例えば、アミノ基やカルボキシル基の保護及び脱保護とともに、Ｒ１に含まれる官能基も保護・脱保護してもよく、または、他の置換基の保護及び脱保護とは別に、独立して、Ｒ１に含まれる官能基も保護・脱保護する工程を設けてもよい。Ｒ１としては、例えば、直鎖または分枝状のアルキル基、芳香族置換基等であり、これらは置換されていてもよい。置換基としては、アミノ酸の側鎖に存在することの知られている置換基等であっておく、水酸基、−ＣＯ−ＮＨ２基、カルボキシル基、アミノ基、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）２基、チオール基、アルキルチオ基、等であってもよく、これらの置換基は、遊離の酸または塩基、またはこれらの塩であってもよい。また、アルキル基は、例えば、炭素数１から６、好ましくは、炭素数１〜５のアルキル基とすることができ、芳香族置換基は、フェニル基等のアリール基の他、インドリル基、イミダゾイル基等のヘテロアリール基とすることができる。
【０１１２】
本発明の一態様において、天然型のタンパク質を合成するためのＮＣＬによる連結部位に用いることのできるβ−チオアミノ酸誘導体を提供するという観点からは、上記式において、前記置換基Ｒ１が、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及び、Ｔｙｒからなる群から選択されるアミノ酸のβ炭素原子に結合する置換基部分（ただし、水素原子ではない）であることが好ましい。また、同様の観点から、前記置換基Ｒ２が、チオール基の保護基であることが好ましく、例えば、ＰＭＢ(パラメトキシベンジル)基、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）基、ベンジル基、Ｔｒｔ（トリチル）基、ジスルフィド基、t-ブチル基等が挙げられる。また、加水分解酵素による反応の基質としての観点からは、上記式において、Ａｃｙｌは、アセチル基であり、Ｘはカルボキシル基であることが好ましく、カルボキシル基は、遊離の酸であってもよく、塩であってもよい。
【０１１３】
本発明の一態様において、本発明のβ−チオアミノ酸誘導体は、β位に脱離基を有するアミノ酸誘導体を経由して製造する方法により効率よく製造することができる。
【０１１４】
本発明者らは、また、本発明の一態様として、β炭素原子に置換基Ｒ１を有するβ−チオアミノ酸誘導体の製造を可能とするため、鋭意検討した結果、一態様として、β位に置換基Ｒ１として芳香族置換基を有するアミノ酸のβ−チオアミノ酸誘導体であれば、光反応を利用してβ位にハロゲン原子を導入する方法により、β位に脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を効率よく製造することができることを見出した。
【０１１５】
β位に置換基Ｒ１として芳香族置換基を有するアミノ酸としては、天然型でいえば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンが挙げられる。また、β位に置換基Ｒ１として芳香族置換基を有するアミノ酸であれば、非天然型のものであってもよい。芳香族置換基としては、アリール基であってもヘテロアリール基であってもよく、例えば、フェニル基、ナフチル基等のアリール基、イミダゾール、ピロール、チアゾール基等のヘテロアリール基であってもよい。
【０１１６】
この方法の場合、原料としては、β位に置換基Ｒ１として芳香族置換基を有するアミノ酸を原料として行うことができる。例えば、天然型の例でいえば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンを原料として行うことができる。原料としてのこれらの芳香族アミノ酸は、市販されているものを用いてもよく、また、公知の方法により調製してもよい。これらのアミノ酸は、入手の容易性その他の事情に応じ、α炭素原子についてのＤ−体とＬ-体との混合物としてのアミノ酸を用いてもよく、また、α炭素原子についてのＤ−体またはＬ-体のいずれか一方のみから実質的になる光学活性体を用いてもよい。本発明の一態様においては、原料として、α炭素原子についてのＤ−体とＬ-体との等量混合物としてのアミノ酸を用いてもよく、この場合、原料としてラセミ体アミノ酸を用いる、と表現することができる。原料としてこれらのラセミ体アミノ酸を用いた場合は、ラセミ体のまま反応が進行し、中間組成物もラセミ体として得られる為、中間組成物の結晶化効率が高く、精製が容易となる。また、原料として光学活性体を用いた場合には、α不斉炭素原子に関する立体配置の制御を行わずにラセミ化が生じることを気にせず反応を進めることができる。本発明の一態様において、中間組成物の精製を効率よく行うという観点からは、原料化合物は結晶化効率が高いラセミ体アミノ酸を用いることが好ましい。
【０１１７】
光反応によりハロゲン原子を導入する方法は、公知の方法により行うことが可能である。一般的には、光の照射のもと、溶媒中においてハロゲン化試薬を反応させることにより行うことができる。例えば、四塩化炭素中において、Ｎ−ブロモスクシニミド（ＮＢＳ）をブロモ化試薬として用いて２００Ｗランプ照射下一時間反応させることによって行われる。ハロゲン化試薬としては、Ｎ−ブロモスクシニミド等を用いることができ、本発明の一態様においては、Ｎ−ブロモスクシニミドが好ましい。また、反応時間は、ハロゲン化反応が十分に進行する限り特に制限されず、３０分〜２時間、好ましくは、１時間、等とすることができる。また、光反応を効率よく行う観点からは、実験系をアルミ箔等により覆っておいてもよい。
【０１１８】
すなわち、この方法は、本発明の製造方法において、前記工程（Ｉ）において、反応（Ａ）としてのチオール基の導入反応の前に、工程（Ｐ）として、「β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程」を行う場合のうちの一態様ということができる。また、特に、置換基Ｒ１が芳香族置換基である場合には、「β炭素原子に置換基Ｒ１を有するアミノ酸誘導体に対して、β炭素原子に脱離基Ｌを導入する工程」として行うことができ、本明細書において、この工程を便宜上（Ｐ−１）と呼ぶことができる。この場合、導入された脱離基Ｌは、反応（Ａ）としてのチオール基の導入反応の際に、脱離基Ｌの脱離とともに、チオール基の導入が行われる。
【０１１９】
なお、工程（Ｉ）における、（Ｂ）カルボキシル基またはアミノ基を酵素の基質となるように変換する反応は、その基質の反応性の程度等に応じて、上記工程（Ｐ）としての、β位に脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程の前に行ってもよく、また、その工程の後に行ってもよい。酵素反応の基質となる構造が、他の工程においても反応性の高い構造のものである場合は、β位に脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造し、β位にチオール基を導入する反応の間は、保護基により保護しておき、その後に、酵素反応の基質となるように変換する反応を行うことが好ましい。
【０１２０】
本発明者らは、さらに、本発明の一態様として、芳香族置換基に限られない種々の置換基Ｒ１を有するβ−チオアミノ酸誘導体の製造を可能とするため、鋭意検討した結果、一態様として、グリシンを原料として、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させる方法を用いることにより、β位に種々の構造のＲ１基を有し、かつ、β位に脱離基Ｌとして水酸基を有するアミノ酸誘導体を効率よく製造することができることを見出した。この方法によれば、目的化合物の構造に応じたアルデヒドを用いることにより、芳香族アミノ酸に限らず、その他の種々の構造を有する種々のアミノ酸をも製造することができる。
【０１２１】
グリシンとＲ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させることにより、グリシンのα炭素原子と、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物のアルデヒド基を構成する炭素原子との間において共有結合を生じる。このため、この反応により生じる化合物においては、アルデヒド基を構成していた炭素原子がアミノ酸のβ炭素原子に相当することとなり、β炭素原子に、置換基Ｒ１、水酸基、及び、水素原子を有するアミノ酸誘導体が生成される。
【０１２２】
したがって、この方法を用いれば、β炭素原子に２つの水素原子を有する天然型または非天然型のアミノ酸に対して、β炭素原子に結合する水素原子の１つの代わりに、保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造することができる。
【０１２３】
例えば、天然型アミノ酸に対してβ位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸誘導体の製造について言えば、β炭素原子に２つの水素原子を有するアミノ酸として、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及び、Ｔｙｒからなる群から選択されるアミノ酸に対して、β位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸誘導体を製造することができる。
【０１２４】
なお、天然型アミノ酸を例として述べたが、非天然型のアミノ酸であっても、β炭素原子に２つの水素原子を有するアミノ酸であれば、同様に製造することができる。
【０１２５】
このグリシンとアルデヒドとを反応させる方法は、例えば、この方法によりフェニルアラニンを製造する場合には、グリシンとベンズアルデヒドを強塩基条件下において、縮合するという方法により行うことができる。溶媒としては、例えば、強塩基水溶液を用いることができ、好ましくは、５Ｎ  ＮａＯＨ等を用いることができる。温度は、低温から室温程度において行うことができ、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは、１０〜２０℃程度とすることができる。反応時間は、３０分〜３時間、好ましくは１時間とすることができる。この方法については、例えば、Ｎａｋａｇａｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００３，５１，１３６３−１３６７の方法を参照して行うことができる。
【０１２６】
この方法において用いられる、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物は、目的とするアミノ酸誘導体の構造に従い決定することができる。
【０１２７】
グリシンを原料としてβ位に水酸基を有するアミノ酸誘導体を製造する方法によれば、原料としてのグリシンは、α炭素原子に水素原子が２つ結合した構造をしているため不斉炭素原子ではない。このグリシンを原料として、上記反応を行うことにより、β位に水酸基を有するアミノ酸誘導体は、通常ラセミ体として得ることができる。
【０１２８】
すなわち、この方法は、本発明の製造方法において、前記工程（Ｉ）において、反応（Ａ）としてのチオール基の導入反応の前に、工程（Ｐ）として、「β炭素原子に置換基Ｒ１及び脱離基Ｌを有するアミノ酸誘導体を製造する工程」を行う場合のうちの一態様ということができる。また、特に、グリシンと、Ｒ１ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物とを反応させる工程は、本明細書において、便宜上工程（Ｐ−２）と呼ぶことができる。
【０１２９】
この方法により、β位に水酸基を有するアミノ酸誘導体を得ることができる。このβ位に水酸基を有するアミノ酸誘導体は、すでに述べた（Ｐ−１）の方法で得られた化合物と同様に、β位の脱離基を脱離させてβ位にチオール基を導入する反応により、β位に保護または非保護のチオール基を有するアミノ酸誘導体に変換することができる。この場合において、β位の脱離基としては、水酸基をそのまま脱離基としてもよいが、水酸基をより脱離しやすい置換基に変換したのち脱離させてもよい。すなわち、水酸基を脱離基に変換する工程をさらに含めてもよい。例えば、水酸基をメシル化し、ＭｓＯ基とすることにより、より容易に脱離させることが可能である。この場合、ＭｓＯが脱離基となる。このような、水酸基を脱離基に変換する工程は、水酸基に、メシルクロライド、トシルクロライド、トリフルオロメタンスルホン酸無水物等を反応させる方法により行うことができる。これらの反応により、それぞれ、ＭｓＯ、ＴｓＯ、ＴｆＯ基が脱離基となる。
【０１３０】
このようにして、グリシンを原料とする方法によっても、β位に脱離基を有するアミノ酸誘導体を製造することが可能である。
【０１３１】
本発明の製造方法において、ラセミ体としての芳香族アミノ酸またはグリシンを原料として行った場合、このチオール基を導入する工程における原料化合物は、α炭素原子についてのＤ−体及びＬ−体の等量混合物であり、ラセミ体アミノ酸であるということもできる。また、原料として、光学活性な芳香族アミノ酸を用いた場合、β位にチオール基を導入する工程においても、立体異性を制御することなく反応を行うことが可能であり、ラセミ化がある程度進行すると考えられるため、チオール基を導入する工程における原料化合物はＤ体及びＬ−体の混合物である考えられる。
【０１３２】
本発明の製造方法の一態様において、β位に脱離基を有するアミノ酸誘導体を経由して行う場合には、上記の反応の後、β位にチオール基を導入する工程を行うことができる。β位にチオール基を導入する工程については、すでに述べたとおりである。
【０１３３】
さらに、グリシンを原料とする方法の１例として、上記のように、グリシンとアルデヒド化合物とを反応させる方法の他、グリシンとケトン化合物を反応させる方法を用いることができる。この方法は、β炭素原子に、水素原子が１つ結合し、置換または非置換のアルキル基が２つ結合しているアミノ酸に対して、β位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸を製造する方法として有用である。
【０１３４】
例えば、天然型アミノ酸に対してβ位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸誘導体の製造について言えば、β炭素原子に１つの水素原子を有するアミノ酸として、Ｖａｌ、及び、Ｉｌｅからなる群から選択されるアミノ酸に対して、β位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸誘導体を製造することができる。
【０１３５】
なお、天然型アミノ酸を例として述べたが、非天然型のアミノ酸であっても、β炭素原子に１つの水素原子を有するアミノ酸であれば、同様に製造することができる。
【０１３６】
このグリシンとケトンとを反応させる方法は、例えば、すでに述べた、グリシンをアルデヒドとを縮合させる反応に準じて、行うことができる。例えば、グリシンとアセトンを強塩基条件下において、低温で縮合させる、等の方法により行うことができる。
【０１３７】
この方法において用いられる、ケトン化合物は、目的とするアミノ酸誘導体の構造に従い決定することができる。目的とするアミノ酸誘導体が、β炭素原子に、置換基Ｒ１の他に置換基Ｒ３を有する化合物である場合には、Ｒ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３で表されるケトン化合物を用いることにより、行うことができる。ここで、Ｒ１及びＲ３は、置換または非置換のアルキル基を示す。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基等とすることができる。置換基としては、アミノ酸側鎖に存在しうる種々の置換基であってよく、これらは保護されていてもよい。
【０１３８】
グリシンとＲ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３で表されるケトン化合物とを反応させることにより、グリシンのα炭素原子と、Ｒ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３で表されるケトン化合物のケトン基を構成する炭素原子との間において二重結合を生じ、ケトン基を構成していたカルボニル酸素は脱離する。このため、この反応により生じる化合物においては、ケトン基を構成していた炭素原子がアミノ酸のβ炭素原子に相当することとなり、β炭素原子に、置換基Ｒ１、及び、置換基Ｒ３を有するアミノ酸誘導体が生成される。この反応において生じるα炭素原子とβ炭素原子の間の二重結合に対し、β炭素原子に保護または非保護のチオール基を、α炭素原子に水素原子を付加することにより、β炭素原子に保護または非保護のチオール基を導入することができる。
この場合のβ炭素原子にチオール基を付加する反応は、公知の方法により行うことができる。例えば、チオール化合物をＤＭＦ等の有機溶媒中、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）等の塩基を用いて求核反応を行うという方法により行うことができる。
【０１３９】
この方法を、天然型のバリンのβ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体の製造を例として、以下の化学反応式として表すことができる。
【化７】
2015064453.tif 000009
【０１４０】
さらに、側鎖にチオール基を有するアミノ酸として、γ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体も製造することができる。
【０１４１】
グリシンを原料とする方法の１例として、グリシンに対し、α位にチオール基を有するアルデヒドを反応させる方法により、β位に水酸基を有し、γ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造することができる。
【０１４２】
この方法を、天然型のスレオニンのγ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体の製造を例として、以下の化学反応式として表すことができる。
【化８】
2015064453.tif 000010
【０１４３】
グリシンを原料とする方法の１例として、グリシンに対し、α位にチオール基を有するケトンを反応させる方法により、β位にアルキル基を有し、γ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造することができる。
【０１４４】
この方法を、天然型のバリンのγ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体の製造を例として、以下の化学反応式として表すことができる。
【化９】
2015064453.tif 000011
【０１４５】
上記のように、グリシンとアルデヒド化合物とを反応させる方法、グリシンとケトン化合物を反応させる方法を応用し、上記のようにγ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体を製造することができる。
これらの方法は、β炭素原子に水酸基が１つ結合しているアミノ酸に対して、γ位に保護または非保護のチオール基が導入されたアミノ酸を製造する方法として有用である。
【０１４６】
本発明の方法により得られる側鎖にチオール基を有する、光学活性なＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体は、目的に応じて、そのままアミノ酸誘導体として種々の用途に用いることができるほか、Ｄ−タンパク質またはＬ−タンパク質を合成するために用いることができる。特に、これらのタンパク質を製造するためのＮＣＬにおける連結部位として用いることができる。特に、β位にチオール基を有するアミノ酸誘導体を好適に用いることができるが、γ位にチオール基を有するアミノ酸誘導体もまた同様に好適に用いることができる。本発明の方法により得られるアミノ酸誘導体は、その目的・用途に応じて、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、その他の側鎖置換基等について、保護または脱保護して用いてもよい。例えば、カルボキシル基またはアミノ基の一方のみを脱保護して、ペプチドの固相合成等に用いることもできる。また、本発明の方法により得られる、側鎖に保護されたチオール基を有するアミノ酸誘導体は、チオール基が保護基により保護されたままペプチド合成を行い、ＮＣＬ連結反応を行うことができる点において有用である。また、そのＮＣＬ連結反応後に、チオール基部分を除去する方法を用いれば、従来方法によればＮＣＬ連結部位とすることができなかったアミノ酸についても、ＮＣＬ連結部位とすることができ、Ｄ−またはＬ−タンパク質合成において有用である。
【０１４７】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【０１４８】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【０１４９】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１５０】
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１５１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１５２】
芳香族アミノ酸を出発原料とする、β位にチオール基を有する光学活性な芳香族アミノ酸誘導体の合成
以下の反応式に表されるように、芳香族アミノ酸を出発原料として、β位にチオール基を有するＤ，Ｌ−フェニルアラニンの合成反応を行った。合成例における化合物の名称の後に記載されている化合物番号は、下記の反応式に記載の化合物番号を示す。
【化１０】
2015064453.tif 000012
【０１５３】
（合成例１）Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（化合物６）
アルゴン下、Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（１０．０ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）をメタノール（４８．４ｍＬ）に加え、溶液を０℃に冷却したのち、塩化チオニル（４．８ｍｌ、６６．６ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、環流させながら１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮した後、メタノール５ｍｌとジエチルエーテル８０ｍＬとの混合溶媒を用いて再結晶を行い、Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（化合物６）を得た（１１．８ｇ）。【０１５４】
（合成例２）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステル（化合物７）
化合物６（１１．８ｇ）をＴＨＦ（２９２ｍＬ）に懸濁させた後、０℃に冷却し、水（１６４ｍＬ）に溶かしたＮａ２ＣＯ３（７．０ｇ、１．０ｅｑ．）を加えた。その後、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２８．７ｇ、２．０ｅｑ．）を滴下し、常温で２時間攪拌した。反応により生じた化合物を酢酸エチルで抽出後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮することにより、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルの粗生成物を得た。
さらにこの粗生成物をアセトニトリル（２０２ｍＬ）に溶かし、触媒として、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（７．４ｇ、１．０ｅｑ．）を加え、次いで、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３９．６ｇ、３．０ｅｑ．）を加え、室温にて１２時間攪拌した。その後、減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン＝１：３の展開溶媒を用いて、化合物７を精製した（１９．８ｇ）。【０１５５】
（合成例３）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−β−ブロモ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステル（化合物８）
アルゴン下、化合物７（５．０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（２６４ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２．３ｇ、１．０ｅｑ．）を加えた後、環流させながら、２００Ｗの白熱電球による光の照射の下、１時間反応させた。なお、光を強めるため、実験系をアルミニウム箔で覆っておいた。次に、反応後、室温になるまで放冷し、スクシンイミドを濾過によって取り除いた。さらに減圧濃縮することにより、化合物８を得た（５．７ｇ）。
Ｃ２０Ｈ２８ＢｒＮＯ６［Ｍ＋Ｎａ］＋：Ｃａｌ  ４８０．００  Ｆｏｕｎｄ  ４８０．１６
１ＨＮＭＲ（４００  ＭＨｚ）  δ：７．５５−７．２４（ｍ，５Ｈ），５．７６（ｄ，１Ｈ），５．７４（ｄ，１Ｈ），５．６８（ｄ，１Ｈ），５．６１（ｄ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｓ，３Ｈ），１．５８（ｓ，９Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ）【０１５６】
（合成例４）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステル（化合物９）
化合物８（１．２７ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（７．９ｍＬ）溶液に、４−メトキシ−α−トルエンチオール（１．５ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）のＤＢＵ（１．９ｍＬ、９．７ｍｍｏｌ）塩のＤＭＦ溶液（４ｍＬ）をアルゴン下、室温で滴下し、３時間反応させた。その後、反応により生じた化合物を酢酸エチルで抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン＝１：７の展開溶媒を用いて、化合物９を精製した（１．０ｇ）。【０１５７】
（合成例５）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステル（化合物１）
化合物９（２．４ｇ、４．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４６ｍＬ）に溶解させ、等量のＴＦＡを加え、室温で５分間反応した後、減圧濃縮し、トルエンで供沸した。その後、ＤＣＭ（４６ｍＬ）に溶かし、ピリジン（１．１ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（１．２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分反応させた。反応後、少量のメタノールを加え反応を止め、減圧濃縮により、化合物１を得た（１．１ｇ）。
Ｃ１８Ｈ２１ＮＯ３Ｓ  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  ３３２．１２  Ｆｏｕｎｄ  ３３１．１３【０１５８】
（合成例６）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（化合物３）
化合物１（１．０ｇ）をＴＨＦ（５．５ｍＬ）に溶かし、１Ｎ  ＮａＯＨ（５．５ｍＬ）を室温下で加え、３０分反応させた。次いで、反応系を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３の酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。さらに、得られた粗成生物を酢酸エチルによって再結晶化し、化合物３を得た（０．６５ｇ）。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ）  δ：７．４０−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．４０−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），７．０７（ｄ，２Ｈ），６．８２（ｄ，２Ｈ），６．８０（ｄ，２Ｈ），４．９６（ｄ，１Ｈ），４．８５（ｄ，１Ｈ），４．２３（ｄ，１Ｈ），４．１０（ｄ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．５４（ｑ，２Ｈ），３．４７（ｑ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ）【０１５９】
β位にチオール基を有するＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体からの、光学活性なアミノ酸誘導体の製造
以下の反応式に表されるように、β位にチオール基を有するＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体に対して酵素を作用させ、β位にチオール基を有する光学活性なアミノ酸誘導体の合成反応を行った。合成例における化合物の名称の後に記載されている化合物番号は、下記の反応式に記載の化合物番号を示す。
【化１１】
2015064453.tif 000013
【０１６０】
（合成例７−１）Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｌ−フェニルアラニン（化合物５）
化合物３（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１４ｍＬ）に溶かしたのち、Ｌ−アミノアシラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種由来）（１１１ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ；商品名アシラーゼ「アマノ」、アマノエンザイム社製）のリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１４ｍＬ）を加え、３７℃で２日間反応させた。その後、室温下、反応系にＢｏｃ２Ｏ（３．０ｅｑ．）のＴＨＦ（２８ｍＬ）溶液を加え、１時間反応させ、Ｂｏｃ化を行った。次いで、反応系を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３の酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、１％ギ酸含有酢酸エチルの展開溶媒を用いて化合物５を精製し、化合物５を３９％の単離収率で得た。
Ｃ２２Ｈ２７ＮＯ５Ｓ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：  Ｃａｌ  ４４０．１５  Ｆｏｕｎｄ  ４４０．１８【０１６１】
また、合成例７において、Ｌ−アミノアシラーゼで分解されなかったＮ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを、合成例７におけるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製の際に同様に精製し、５０％の収率で得た（５０ｍｇ）。これはＤ−アミノアシラーゼを用いることによる、Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−フェニルアラニン合成の原料となる。【０１６２】
（合成例７−２）Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−フェニルアラニン
また、上記合成例７において、Ｌ−アミノアシラーゼをＤ−アミノアシラーゼに代えたほかは同様の方法により合成を行うことにより、Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−フェニルアラニンも合成した。
Ｃ２２Ｈ２７ＮＯ５Ｓ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：  Ｃａｌ  ４４０．１５  Ｆｏｕｎｄ  ４４０．１８【０１６３】
以上の合成例により、芳香族アミノ酸を原料とし、β位に保護されたチオール基を導入し、Ｌ−体選択的アミノアシラーゼ、及び、Ｄ−選択的アミノアシラーゼをそれぞれ用いることにより、β位に保護されたチオール基を有するＬ−アミノ酸、及び、β位に保護されたチオール基を有するＤ−アミノ酸をそれぞれ簡易にかつ収率よく得ることができた。従来の方法ではＬ−アミノ酸を原料としてα位の立体の異性化を抑制しながら、あるいは異性化したＤ−体は都度分離しており、その為収率の向上が難しいのみならず、工業生産も容易ではなかった。それに対して、本発明によればＤ，Ｌ混合アミノ酸を原料または中間体とすることで前述の注意を払う必要がない。また、Ｄ，Ｌ混合アミノ酸は結晶化効率が高く、精製も簡便である為、工程の大幅な短縮が実現できる。本発明技術はＮＣＬに利用できるβ位にチオール基を有する非天然型アミノ酸の工業生産への実用化を可能とする方法である。【０１６４】
以下の反応式に表されるように、芳香族アミノ酸を出発原料として、β位にチオール基を有するＤ，Ｌ−チロシンの合成反応を行った。合成例における化合物の名称の後に記載されている化合物番号は、下記の反応式に記載の化合物番号を示す。
【化１２】
2015064453.tif 000014
【０１６５】
（合成例８）Ｄ，Ｌ−チロシンメチルエステル塩酸塩（化合物１０）
アルゴン下、Ｄ，Ｌ−チロシン（１０．０ｇ、５５．１ｍｍｏｌ）をメタノール（８８ｍＬ）に加え、溶液を０℃に冷却したのち、塩化チオニル（３．９７ｍｌ、６０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、環流させながら一時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮した後、メタノール５ｍＬとジエチルエーテル８０ｍＬとの混合溶媒を用いて再結晶を行い、化合物１０を得た（１０．８ｇ）。【０１６６】
（合成例９）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−Ｏ−Ｂｏｃ−Ｄ，Ｌ−チロシン−メチルエステル（化合物１１）
化合物１０（１０．８ｇ）をＴＨＦ（１８４ｍＬ）に懸濁させた後、０℃に冷却し、水（９２ｍＬ）に溶かしたＮａ２ＣＯ３（５．９ｇ、１．０ｅｑ）を加えた。その後、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２４ｇ、２．０ｅｑ．）を滴下し、常温で二時間攪拌した。酢酸エチルで抽出後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮することでＮ−Ｂｏｃ−Ｄ，Ｌ−チロシン−メチルエステルの粗生成物を得た。さらにこの生成物をアセトニトリル（１８４ｍＬ）に溶かし、ＤＭＡＰ（６．７ｇ、１．０ｅｑ．）を加え、ついで、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３６．２ｇ、３．０ｅｑ．）を加え、１２時間攪拌した。その後、減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン＝１：３の展開溶媒を用いて、化合物１１を精製した（２２．９ｇ）。
１ＨＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）  δ：  ７．２８−７．０４（ｍ，５Ｈ），５．１５（ｄｄ，１Ｈ），３．４３（ｄｄ，１Ｈ），３．２０（ｄｄ，１Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｓ，１８Ｈ）【０１６７】
（合成例１０）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−β−ブロモ−Ｏ−Ｂｏｃ−Ｄ，Ｌ−チロシン−メチルエステル（化合物１２）
アルゴン下、化合物１１（６．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１２０ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２．１ｇ、１．０ｅｑ．）を加えた後、環流させながら、２００Ｗの白熱電球による光の照射の下、一時間反応させた。なお、光を強めるため、実験系をアルミニウム箔で覆っておいた。反応後、室温になるまで放冷し、スクシンイミドを濾過によって取り除いた。さらに減圧濃縮することにより、化合物１２を得た（６．６ｇ）。【０１６８】
（合成例１１）Ｎ，Ｎ−ＤｉＢｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｏ−Ｂｏｃ−Ｄ，Ｌ−チロシン−メチルエステル（１３）
化合物１２（２．９ｇ、５．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２３ｍＬ）溶液に４−メトキシ−α−トルエンチオール（１．４ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）のＤＢＵ（１．５ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）塩のＤＭＦ溶液（１１．５ｍＬ）をアルゴン下、室温で滴下し三時間反応させた。その後、酢酸エチルで抽出、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン＝１：７の展開溶媒を用いて、化合物１３を精製した（１．２ｇ）。【０１６９】
（合成例１２）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−チロシン−メチルエステル（化合物１４）
化合物１３（１．３ｇ、２．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２１ｍＬ）に溶解させ、等量のＴＦＡを加え、室温で５分間反応した後、減圧濃縮し、トルエンで供沸した。その後、ＤＣＭ（２１ｍＬ）に溶かし、ピリジン（０．８ｍｌ、１０．５ｍｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（０．９ｍｌ、１０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分反応させた。反応後、少量のメタノールを加えて反応を止め、減圧濃縮により、粗成生物としての化合物１４を得た（４４１ｍｇ）。
Ｃ１８Ｈ２２ＮＯ４Ｓ  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  ３４８．１２  Ｆｏｕｎｄ  ３４８．１７【０１７０】
（合成例１３）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−チロシン（化合物１５）
粗成生物１４（４４１ｍｇ）をＴＨＦ（１０．５ｍＬ）に溶かし、１Ｎ  ＮａＯＨ（１０．５ｍＬ）を室温下で加え、３０分反応させた。次いで、反応系を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３の酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、１％ギ酸含有酢酸エチル：ヘキサン＝１：２の展開溶媒を用いて、化合物１５を精製した（３０１ｍｇ）。【０１７１】
（合成例１４−１）Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプタト−Ｌ−チロシン（化合物１７）
化合物１５（７２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、９ｍＬ）に溶かしたのち、Ｌ−アミノアシラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種由来）（１１１ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ；商品名アシラーゼ「アマノ」、アマノエンザイム社製）のリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１０ｍＬ）を加え、３７℃で二日間反応させた。その後、室温下、反応系にＢｏｃ２Ｏ（１２４ｍｇ、３．０ｅｑ．）のＴＨＦ（１９ｍＬ）溶液を加え、一時間反応させＢｏｃ化を行った。次いで、反応系を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３の酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、１％ギ酸含有酢酸エチル：ヘキサン＝４：１の展開溶媒を用いて、化合物１７を２９ｍｇ得た。【０１７２】
（合成例１４−２）Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプタト−Ｄ−チロシン
また、上記合成例１４−１において、Ｌ−アミノアシラーゼをＤ−アミノアシラーゼに代えたほかは同様の方法により合成を行うことにより、Ｎ−Ｂｏｃ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−チロシンも合成した。
Ｃ２２Ｈ２７ＮＯ５Ｓ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：  Ｃａｌ  ４４０．１５  Ｆｏｕｎｄ  ４４０．１８【０１７３】
以上の合成例により、芳香族アミノ酸を原料とし、β位に保護されたチオール基を導入し、Ｌ−体選択的アミノアシラーゼを用いることにより、β位に保護されたチオール基を有するＬ−チロシン誘導体、及び、β位に保護されたチオール基を有するＤ−アミノ酸のそれぞれを、簡易にかつ収率よく得ることができた。【０１７４】
グリシンを出発原料とする、β位にチオール基を有する様々な光学活性なアミノ酸誘導体の製造
以下の反応式に表されるように、グリシンを出発原料として合成反応を行った。合成例における化合物の名称の後に記載されている化合物番号は、下記の反応式に記載の化合物番号を示す。
【化１３】
2015064453.tif 000015
【０１７５】
（合成例１５）β−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（化合物１８）
グリシン（７．０ｇ）を５Ｎ  ＮａＯＨ（６３．７ｍＬ）に溶かし、０℃冷却下、ベンズアルデヒド（９．２４ｍＬ）を１０分ごとに３回に分けて加えた。その後、室温で１時間反応させた。次いで、５Ｎ  ＨＣｌ（９３．２ｍＬ）を用いてｐＨ２〜３の酸性にした後、６０℃で減圧濃縮した。得られた粗生成物に、室温下、メタノール（１２０ｍＬ）を加えた。メタノールに不溶性の塩（塩化ナトリウム）を濾過し、溶液を減圧濃縮した。その後、再度メタノール（１００ｍＬ）に溶かし、トリエチルアミンを用いてｐＨを６〜７にすることで再結晶化させ、化合物１８を得た（７．０ｇ）。
Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  １８２．０７  Ｆｏｕｎｄ  １８２．２０【０１７６】
（合成例１６）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−βヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（化合物１９）
β−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（３．０ｇ）を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）に溶かし、無水酢酸（１．０ｅｑ）及び、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）を１５分ごとに３回に分けて加えた。そして最後に５ＮのＨＣｌでｐＨ２〜３の酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮し、化合物１９を得た（１．０ｇ）。
Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  ２２４．０８  Ｆｏｕｎｄ  ２２４．２０【０１７７】
（合成例１７）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−Ｏ−メシル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（化合物２）
合成例１６の方法により得られた化合物１９（１５．０ｍｇ）をアルゴン下、アセトニトリル（３５０μＬ）に溶かし、トリエチルアミン（１４．６μＬ）及びメシルクロライド（６．５μＬ）を加え、常温で２時間反応させた。反応により生じた化合物を酢酸エチルで抽出後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、減圧濃縮を行い、化合物２を得た。なお、得られた化合物が、β位の水酸基がメシル化された化合物２であることを質量分析により確認した。
Ｃ１２Ｈ１５ＮＯ６Ｓ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：  Ｃａｌ  ３２４．０５  Ｆｏｕｎｄ  ３２４．１【０１７８】
（合成例１８）Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（化合物３）
合成例１１と同様の方法により、化合物２のＤＭＦ溶液に４−メトキシ−α−トルエンチオールのＤＢＵ塩のＤＭＦ溶液をアルゴン下、室温で滴下し、３時間反応させ、同様に抽出、洗浄等を行うことにより、化合物３を得る。【０１７９】
以上の合成例により、グリシンを原料として、β−ヒドロキシ−アミノ酸誘導体を合成し、β位の水酸基に代えて、β位に保護されたチオール基を導入することにより、β位に保護されたチオール基を有するＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体を得ることができる。当業者は、本明細書に記載の方法を参照し、この方法により、芳香族アミノ酸に限らず、β位に保護されたチオール基を有する様々な構造のＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体を合成することができるであろう。そして、得られたＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体に対し、合成例７と同様の方法により、β位に保護されたチオール基を有する様々な構造の光学活性なアミノ酸誘導体を簡易な方法により収率よく得ることができる。【０１８０】
β位にチオール基を有するＤ−アミノ酸誘導体の製造
以下の反応式に表されるように、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてβ位にチオール基を有するＤ−アミノ酸誘導体合成反応を行った。合成例における化合物の名称の後に記載されている化合物番号は、下記の反応式に記載の化合物番号を示す。
【化１４】
2015064453.tif 000016
【０１８１】
（合成例１９）β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−フェニルアラニン（２０）
化合物３（１ｍｇ、２８μｍｏｌ）をリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１４０μＬ）に溶かしたのち、別途調製したＤ−アミノアシラーゼ（大腸菌由来）（１ｍｇ、２５０Ｕ／ｍｇ；商品名Ｄ−アミノアシラーゼ「アマノ」、アマノエンザイム社製）リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１４０μＬ）を加え、３７℃で２週間反応させた。ＨＰＬＣにより分析を行い、α位アミノ基が保護されていない化合物２０が生成していることを確認した。なお、ＨＰＬＣは、Ｃａｄｅｎｚａ  Ｃ−１８（７５×４．６ｍｍ）カラムを用い、溶出条件は０．１％ＴＦＡ水溶液：９０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ含有）＝８０：２０→３０：７０（１５分）、流速１ｍＬ／ｍｉｎとして行った。
Ｃ１７Ｈ１９ＮＯ３Ｓ  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  ３１８．１１  Ｆｏｕｎｄ  ３１８．７３【０１８２】
この合成例１９において、酵素反応終了後に、（合成例７−１）と同様にＮ−Ｂｏｃ化を行った後に精製することも可能である。【０１８３】
（合成例２０）β−メトキシベンジルメルカプト−Ｄ−チロシン（２１）
化合物１５（１ｍｇ、２７μｍｏｌ）をリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１７０μＬ）に溶かしたのち、別途調製したＤ−アミノアシラーゼ（大腸菌由来）（１ｍｇ、２５０Ｕ／ｍｇ；商品名Ｄ−アミノアシラーゼ「アマノ」、アマノエンザイム社製）のリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０、１００μＬ）を加え、３７℃で３日間反応させた。ＨＰＬＣにより分析を行い、α位アミノ基が保護されていない化合物２１が生成していることを確認した。なお、ＨＰＬＣは、Ｃａｄｅｎｚａ  Ｃ−１８（７５×４．６ｍｍ）カラムを用い、溶出条件は０．１％ＴＦＡ水溶液：９０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ含有）＝８０：２０→０：１００（１５分）、流速１ｍＬ／ｍｉｎとして行った。
Ｃ１７Ｈ１９ＮＯ４Ｓ  ［Ｍ＋Ｈ］＋：  Ｃａｌ  ３３４．１０  Ｆｏｕｎｄ  ３３４．６６【０１８４】
この合成例２０において、酵素反応終了後に（合成例７−１）と同様にＮ−Ｂｏｃ化を行った後に精製することも可能である。【０１８５】
以上の合成例により、β位に保護されたチオール基を有するＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体から、Ｄ−体を収率よく簡易な方法により得ることができた。すなわち、従来のＤ−体またはＬ−体のアミノ酸を原料とする製造方法によれば、α不斉炭素原子についての立体異性化が生じないよう、加熱条件や、強塩基性や強酸性条件を用いた反応を用いることができなかったところ、本発明の製造方法によれば、これらの過激な条件を用いた、反応効率の優れた、より簡便な製造工程を用いることが可能となった。当業者は、本明細書に記載の方法を参照し、本発明の製造方法により、Ｌ−アミノ酸のみならず、Ｄ−アミノ酸をも効率よく合成することができる。また、出発化合物として、合成例７で述べたように、Ｌ−体選択的加水分解酵素により加水分解されなかったＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体を回収して同様に出発化合物として、Ｄ−体選択的加水分解酵素を反応させれば、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とをＤ，Ｌ−アミノ酸誘導体として同時に合成した上で、Ｄ−体及びＬ−体の両方を効率的に得ることができる。また、逆に、Ｄ−体選択的加水分解酵素を先に反応させた場合においても同様である。このことは、生体内に存在するＬ−タンパク質の他、近年需要の高まっている、Ｄ−タンパク質やラセミタンパク質の原料を安定的に供給し、これらのタンパク質の工業的生産を可能にする点において有用である。【０１８６】
なお、本実施例ではβチオラセミアミノ酸の原料として芳香族アミノ酸またはグリシンを用いた例を示したが、本発明の製造方法においてその他のアミノ酸誘導体を出発原料とすることを否定する意図ではない。当業者であれば、本願に記載の方法に基づいて、様々なアミノ酸誘導体を出発原料として本発明を実施可能である。
【図１】
2015064453.tif 000019
【図２】
2015064453.tif 000020
【国際調査報告】
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