(57)【要約】  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかと、を併用する併用抗抗酸菌薬、抗抗酸菌薬のスクリーニング方法、及びＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかと、を併用することを特徴とする併用抗抗酸菌薬。
【請求項２】
ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、下記構造式（１）で表される化合物を含み、
ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、下記構造式（２）で表される化合物を含む請求項１に記載の併用抗抗酸菌薬。
【化１】
2014196512.tif 000014
【化２】
2014196512.tif 000015
構造式（２）中、「Ｍｅ」は、メチル基を表す。
【請求項３】
ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、ツニカマイシンを含み、
ＲＮＡ合成阻害剤が、リファンピシンを含む請求項１に記載の併用抗抗酸菌薬。
【請求項４】
ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性を測定する工程を含むことを特徴とする抗抗酸菌薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
下記構造式（１）で表される化合物を含むことを特徴とするＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤。
【化３】
2014196512.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌を含む抗酸菌に対して有効な併用抗抗酸菌薬、抗抗酸菌薬のスクリーニング方法、及びＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フクシン、クリスタルバイオレットなどで固定染色した場合、塩酸酸性アルコールによる脱色に抵抗性を示すような細菌は、抗酸菌、又は抗酸性細菌などと呼ばれる。
前記抗酸菌には、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などのマイコバクテリウム属に属する細菌が含まれる。
結核は、結核菌により引き起こされる感染症であり、世界中の感染症の中で単独の感染症として死亡者数の最も多い疾患である。近年、前記結核菌の中に、多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）や、超多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）が検出され、大きな問題となっている。【０００３】
これまでに、抗酸性菌に対して優れた抗菌活性を有する化合物であるカプラザマイシン類及びその誘導体（例えば、特許文献１〜４参照）などが見出されている。
例えば、前記提案の中でもカプラザマイシンの誘導体であるＣＰＺＥＮ−４５は、前記多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）や、超多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）に対し優れた抗菌活性を有することが見出されている。【０００４】
このような状況下、抗酸菌に含まれる結核菌により引き起こされる結核に対する治療薬の開発へ向けた研究が活発に行われており、より優れた治療薬となり得るものの速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／０１２６４３号
【特許文献２】国際公開第２００４／０６７５４４号
【特許文献３】国際公開第２００８／０２０５６０号
【特許文献４】特開２０１０−８３８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、抗酸菌に対して優れた薬効を有する併用抗抗酸菌薬、抗抗酸菌薬のスクリーニング方法、及びＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する優れた阻害活性を有するＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかと、を併用することを特徴とする併用抗抗酸菌薬である。
＜２＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性を測定する工程を含むことを特徴とする抗抗酸菌薬のスクリーニング方法である。
＜３＞  下記構造式（１）で表される化合物を含むことを特徴とするＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤である。
【化１】
2014196512.tif 000002
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前記目的を達成することができ、抗酸菌に対して優れた薬効を有する併用抗抗酸菌薬、抗抗酸菌薬のスクリーニング方法、及びＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する優れた阻害活性を有するＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、構造式（２）で表される化合物の紫外線吸収スペクトルを示した図である。
【図２】図２は、構造式（２）で表される化合物のＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルを示した図である。
【図３】図３は、構造式（２）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示した図である。
【図４】図４は、構造式（２）で表される化合物の炭素１３核磁気共鳴スペクトルを示した図である。
【図５】図５は、構造式（１）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示した図である。
【図６】図６は、構造式（１）で表される化合物の炭素１３核磁気共鳴スペクトルを示した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、試験例２において、薬剤としてＣＰＺＥＮ−４５を用いた場合の結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、試験例２において、薬剤としてカプラザマイシンＢを用いた場合の結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、試験例２において、薬剤としてツニカマイシンを用いた場合の結果を示すグラフである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、試験例２において、薬剤としてバンコマイシンを用いた場合の結果を示すグラフである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、試験例２において、薬剤としてレボフロキサシンを用いた場合の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐＨＹｃａｔの概要を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、試験例４のＴａｇＯの酵素活性を評価した結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、試験例４のＭｒａＹの酵素活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、試験例５の結果を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、試験例６のＣＰＺＥＮ−４５と、カプラザマイシンＢとの組合せの結果を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、試験例６のツニカマイシンと、リファンピシンとの組合せの結果を示す図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、試験例６のカプラザマイシンＢと、リファンピシンとの組合せの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（併用抗抗酸菌薬）
本発明の併用抗抗酸菌薬は、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかと、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００１１】
＜ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤＞
前記併用抗抗酸菌薬における前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００１２】
前記ＷｅｃＡとは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が有する酵素（塩基配列は、配列番号１参照）である。前記ＷｅｃＡは、細胞壁の構成成分であるミコリルアラビノガラクタンの合成に関与する酵素である。
前記オルソログとは、共通の祖先遺伝子を有すると考えられる遺伝子群のことをいう。前記ＷｅｃＡのオルソログとしては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓが有する酵素であるＷｅｃＡ（細胞壁の構成成分であるミコリルアラビノガラクタンの合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号２参照）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓが有する酵素であるＷｅｃＡ（細胞壁の構成成分であるミコリルアラビノガラクタンの合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号３参照）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが有する酵素であるＴａｇＯ（細胞壁の構成成分であるテイコ酸の合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号４参照）、などが挙げられる。
【００１３】
−ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物−
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記構造式（１）で表される化合物（以下、「ＣＰＺＥＮ−４５」と称することがある）、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ＣＰＺＥＮ−４５が好ましい。
【化２】
2014196512.tif 000003
【００１４】
前記ＣＰＺＥＮ−４５、及びツニカマイシンは、抗菌性を有する化合物として公知の化合物である。
【００１５】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物は、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００１６】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物は、化学合成により得られたものであってもよいし、前記化合物を生産する微生物から得られたものであってもよい。
前記ＣＰＺＥＮ−４５の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２００４／０６７５４４号、特開２０１０−８３８４７号公報に記載の方法、などが挙げられる。
前記ツニカマイシンの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ツニカマイシンを生産する微生物から製造する方法が挙げられる。
【００１７】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物からなるものであってもよい。
【００１８】
−その他の成分−
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２０】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００２１】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００２２】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２３】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２４】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００２５】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００２６】
前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２７】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００２８】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
＜ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれか＞
前記併用抗抗酸菌薬における前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤は、どちらか一方を用いてもよいし、両方を用いてもよい。
【００３０】
−ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤−
前記併用抗抗酸菌薬における前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記ＭｕｒＸとは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が有する酵素（塩基配列は、配列番号５参照）である。前記ＭｕｒＸは、細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンの合成に関与する酵素である。
前記ＭｕｒＸのオルソログとしては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓが有する酵素であるＭｒａＹ（細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンの合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号６参照）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓが有する酵素であるＭｒａＹ（細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンの合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号７参照）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが有する酵素であるＭｒａＹ（細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンの合成に関与する酵素、塩基配列は、配列番号８参照）、などが挙げられる。
【００３１】
−−ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物−−
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カプラザマイシン（Ｃａｐｒａｚａｍｙｃｉｎ）類、リポシドマイシン（Ｌｉｐｏｓｉｄｏｍｙｃｉｎ）類、ムレイドマイシン（Ｍｕｒｅｉｄｏｍｙｃｉｎ）類、パシダマイシン（Ｐａｃｉｄａｍｙｃｉｎ）類、ナプサマイシン（Ｎａｐｓａｍｙｃｉｎ）類、ムレイマイシン（Ｍｕｒａｙｍｙｃｉｎ）類、ＦＲ−９００４９３、カプラマイシン（Ｃａｐｕｒａｍｙｃｉｎ）類、Ａ−５０３０８３、バクテリオファージφＸ１７４溶菌タンパク質Ｅ（Ｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  φＸ１７４）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、カプラザマイシンＢ、リポシドマイシンＢ、ムレイドマイシンＡ、ムレイマイシンＡ１、カプラマイシン、バクテリオファージφＸ１７４溶菌タンパク質Ｅが好ましく、カプラザマイシンＢがより好ましい。
【００３２】
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物は、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００３３】
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物は、化学合成により得られたものであってもよいし、前記化合物を生産する微生物から得られたものであってもよい。
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物は公知の化合物であり、その製造方法は、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記カプラザマイシンＢの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第０１／０１２６４３号に記載されている受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８で寄託されているストレプトミセス・エスピーＭＫ７３０−６２Ｆ２株を用いて製造する方法が挙げられる。
前記ストレプトミセス・エスピーＭＫ７３０−６２Ｆ２株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託申請し、１９９８年１１月２７日に国内寄託（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０６７）され、その後、２０００年７月１２日にブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求が受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８として国際寄託された。
【００３４】
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物からなるものであってもよい。
【００３５】
−−その他の成分−−
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
−ＲＮＡ合成阻害剤−
前記併用抗抗酸菌薬における前記ＲＮＡ合成阻害剤は、ＲＮＡの合成を阻害する化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００３７】
−−ＲＮＡの合成を阻害する化合物−−
前記ＲＮＡの合成を阻害する化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、リファマイシンＳＶ（Ｒｉｆａｍｙｃｉｎ  ＳＶ）、リファブチン（Ｒｉｆａｂｕｔｉｎ）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、リファンピシンが好ましい。
【００３８】
前記ＲＮＡの合成を阻害する化合物は、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００３９】
前記ＲＮＡの合成を阻害する化合物は、化学合成により得られたものであってもよいし、前記化合物を生産する微生物から得られたものであってもよい。
前記ＲＮＡの合成を阻害する化合物は公知の化合物であり、その製造方法は、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４０】
前記ＲＮＡ合成阻害剤中のＲＮＡの合成を阻害する化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＲＮＡ合成阻害剤は、ＲＮＡの合成を阻害する化合物からなるものであってもよい。
【００４１】
−−その他の成分−−
前記ＲＮＡ合成阻害剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記ＲＮＡ合成阻害剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
＜その他の成分＞
前記併用抗抗酸菌薬中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記併用抗抗酸菌薬中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
＜抗酸菌＞
前記抗酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、結核菌が好ましい。前記結核菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
＜使用＞
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとの組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＣＰＺＥＮ−４５と、カプラザマイシンＢとの組合せ、ツニカマイシンと、リファンピシンとの組合せが好ましく、ＣＰＺＥＮ−４５と、カプラザマイシンＢとの組合せがより好ましい。
前記併用抗抗酸菌薬は、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかのみを併せて使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。
【００４５】
前記併用抗抗酸菌薬は、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとをそれぞれ単剤として併用してもよいし、両者を１つの剤（合剤）として併用してもよい。
【００４６】
＜剤形＞
前記併用抗抗酸菌薬、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及び前記ＲＮＡ合成阻害剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の前記併用抗抗酸菌薬、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及び前記ＲＮＡ合成阻害剤は、常法に従い製造することができる。
前記併用抗抗酸菌薬が、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとをそれぞれ単剤として併用する場合における剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、両者が、同一の剤形であってもよいし、異なる剤形であってもよい。
【００４７】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００４８】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００４９】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００５０】
＜投与＞
前記併用抗抗酸菌薬、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及び前記ＲＮＡ合成阻害剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記併用抗抗酸菌薬が、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとをそれぞれ単剤として併用する場合における投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、両者が、同一の投与方法であってもよいし、異なる投与方法であってもよい。
【００５２】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記併用抗抗酸菌薬における前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとの投与量の比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記併用抗抗酸菌薬は、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、前記ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとを同時期に投与してもよいし、異なる時期に投与してもよい。
【００５４】
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いることができる。
【００５５】
（治療方法）
前記併用抗抗酸菌薬は、抗酸菌に感染した個体に投与することにより、抗酸菌に感染した個体を治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記併用抗抗酸菌薬を投与することを特徴とする、抗酸菌に感染した個体を治療する方法にも関する。前記治療方法は、前記抗酸菌の中でも結核菌に好適に用いることができる。
【００５６】
（抗抗酸菌薬のスクリーニング方法）
本発明の抗抗酸菌薬のスクリーニング方法は、活性測定工程を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００５７】
＜活性測定工程＞
前記活性測定工程は、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性を測定する工程である。
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性とは、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性を阻害する活性であってもよいし、ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現を抑制する活性であってもよい。
【００５８】
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微生物が生産する化合物、該化合物の誘導体、植物抽出物、タンパク質、などが挙げられる。
【００５９】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性を測定する方法、ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量を測定する方法などが挙げられる。
【００６０】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログを発現する菌株の菌体破砕液を用いて測定する方法が挙げられる。
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログを発現する菌株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの遺伝子を導入した枯草菌などが挙げられる。前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの遺伝子を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの遺伝子を挿入したプラスミドを枯草菌に導入する方法が挙げられる。
前記菌体破砕液の調製方法としては、菌体を破砕することができれば特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記菌体破砕液を用いたＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの基質を放射ラベルし、該放射ラベルした基質を前記菌体破砕液に含ませ、反応させた後、薄層クロマトグラフィー、及びオートラジオグラフィーにより反応物を検出することにより測定することができる。前記基質としては、例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられる。
【００６１】
前記ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子を有する抗酸菌に被験物質を作用させ、該抗酸菌におけるｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。
前記被験物質を作用させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗酸菌の培地に前記被験物質を含ませる方法などが挙げられる。
前記ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量としては、ｍＲＮＡの発現量であってもよいし、タンパク質の発現量であってもよい。
前記ｍＲＮＡの発現量、及びタンパク質の発現量の測定方法は、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、前記ｍＲＮＡの発現量は、リアルタイムＰＣＲ法により測定することができ、前記タンパク質の発現量は、ウェスタンブロッティングにより測定することができる。
【００６２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、評価工程などが挙げられる。
前記評価工程とは、前記活性測定工程で得られた結果から、前記被験物質により前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性が阻害されたか否かを評価する工程である。
前記評価工程において、前記被験物質が、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害したか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記活性測定工程において、前記被験物質を作用させなかった場合（対照）と比較して、前記被験物質を作用させた場合に、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性が低下していたり、前記ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量が低下していたりした場合には、前記被験物質は、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害したと評価することができ、前記被験物質は、抗抗酸菌薬として用いることが可能と考えられる。
また、前記活性測定工程において、対照として、前記ＣＰＺＥＮ−４５及び前記ツニカマイシンの少なくともいずれかを作用させた場合と比較して、前記被験物質を作用させた場合に、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの酵素活性が低下していたり、前記ｗｅｃＡ遺伝子乃至そのオルソログ遺伝子の発現量が低下していたりした場合には、前記被験物質は、前記ＣＰＺＥＮ−４５及び前記ツニカマイシンの少なくともいずれかよりも前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害したと評価することができ、前記被験物質は、抗抗酸菌薬としてより有用となり得ると考えられる。
【００６３】
前記抗抗酸菌薬のスクリーニング方法は、結核菌に対する薬剤のスクリーニング方法として好適に用いることができる。
【００６４】
（ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤）
本発明のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤としては、下記構造式（１）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含むものが好適に挙げられる。
【化３】
2014196512.tif 000004
【００６５】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログとは、前記併用抗抗酸菌薬のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤における記載と同様である。
前記構造式（１）で表される化合物は、前記ＣＰＺＥＮ−４５であり、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００６６】
前記ＣＰＺＥＮ−４５は、化学合成により得られたものであってもよいし、前記化合物を生産する微生物から得られたものであってもよい。
前記ＣＰＺＥＮ−４５の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記併用抗抗酸菌薬のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤における記載と同様の方法が挙げられる。
【００６７】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のＣＰＺＥＮ−４５の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、前記ＣＰＺＥＮ−４５からなるものであってもよい。
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、前記ＣＰＺＥＮ−４５以外のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物を含有していてもよい。前記ＣＰＺＥＮ−４５以外のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性を阻害する化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、などが挙げられる。
【００６８】
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記併用抗抗酸菌薬のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤における記載と同様のものが挙げられる。
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
＜用途＞
前記ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、優れたＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害作用を有するので、例えば、上述した本発明の併用抗抗酸菌薬の有効成分として好適に用いることができる。また、例えば、上述した本発明の抗抗酸菌薬のスクリーニング方法の指標とする試薬などとしても好適に用いることができる。
【実施例】
【００７０】
以下に製造例、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例、試験例に何ら限定されるものではない。【００７１】
（製造例１）
＜構造式（２）で表される化合物の製造＞
前記構造式（２）で表される化合物（カプラザマイシンＢ）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８の受託番号で寄託されているストレプトミセス・エスピーＭＫ７３０−６２Ｆ２株を用い、国際公開第０１／０１２６４３号の実施例１と同様にして製造した。【００７２】
−カプラザマイシンＢの物理化学的性質−
前記カプラザマイシンＢの物理化学的性質は、以下のとおりであり、前記カプラザマイシンＢが、下記構造式（２）で表される構造を有することが確認された。
（１）  外観  ：  無色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ５３Ｈ８７Ｎ５Ｏ２２
（３）  高分解能質量分析（ＨＲＦＡＢＭＳ：陰イオンモード）  ：
実験値：１１４４．５７５０（Ｍ−Ｈ）−
計算値：１１４４．５７６４
（４）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２３  −２．６°（ｃ  ０．９１、ＤＭＳＯ）
（５）  紫外線吸収スペクトル（メタノール中）  ：
メタノール溶液で測定した紫外線吸収のピークは、以下の通りであった。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）  ：２６１（８，０００）
図１に紫外線吸収スペクトルを示した。
（６）  赤外線吸収スペクトル  ：
図２にＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルを示した。
（７）  プロトン核磁気共鳴スペクトル  ：
６００ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシド：重水（＝１０：１）の混合溶媒中で室温にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルを図３に示した。
（８）  炭素１３核磁気共鳴スペクトル  ：
１５０ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシド：重水（＝１０：１）の混合溶媒中で室温にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルを図４に示した。
（９）  溶解性  ：
メタノール、ＤＭＳＯ、水に可溶でありアセトン、酢酸エチルに不溶であった。
（１０）  ＴＬＣ  ：
シリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）の薄層クロマトグラフィー上でブタノール：メタノール：水（４：１：２）の溶媒で展開したときのＲｆ値は、０．４４であった。【００７３】
【化４】
2014196512.tif 000005
構造式（２）中、「Ｍｅ」は、メチル基を表す。【００７４】
（製造例２）
＜構造式（１）で表される化合物の製造＞
前記構造式（１）で表される化合物（ＣＰＺＥＮ−４５）は、特開２０１０−８３８４７号公報の実施例１と同様にして、ＣＰＺＥＮ−４５のトリフルオロ酢酸塩の無色結晶を製造した。【００７５】
−ＣＰＺＥＮ−４５の物理化学的性質−
前記ＣＰＺＥＮ−４５のトリフルオロ酢酸塩の物理化学的性質は、以下のとおりであり、前記ＣＰＺＥＮ−４５が、下記構造式（１）で表される構造を有することが確認された。
（１）  融点  ：  １７５℃−１７７℃（分解）
（２）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２２  ＋７９°（ｃ１，ＭｅＯＨ）
（３）  マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）  ：
ｍ／ｚ  ８０１  ［Ｍ＋ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ］−
（４）  １９Ｆ−ＮＭＲスペクトル（３７６．５ＭＨｚ，  重ＤＭＳＯ中、フレオン１１内部標準）  ：  δ−７３．８６  （ｓ，  ＣＦ３）
（５）  プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ、重水中、ＴＭＳ内部標準）：
プロトン核磁気共鳴スペクトルを図５に示した。
（６）  炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５．８ＭＨｚ、重水中、ＴＭＳ内部標準）：
炭素１３核磁気共鳴スペクトルを図６に示した【００７６】
【化５】
2014196512.tif 000006
【００７７】
（試験例１：ＣＰＺＥＮ−４５とカプラザマイシンＢの抗菌活性比較）
カプラザマイシンＢ、及びＣＰＺＥＮ−４５の各種の菌に対する抗菌作用について、ＭＩＣを測定することにより試験した。結果を表１に示した。
＜ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の測定＞
−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ−
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに対するＭＩＣは、寒天希釈法（Ａｇａｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。具体的には、２倍希釈系列で調製した薬剤を含む培地（グリセロール及びＯＡＤＣ含有の７Ｈ１０寒天培地）に菌を接種し、３７℃で、２日間〜１４日間培養し、測定した。
−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ以外の微生物−
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ以外の微生物に対するＭＩＣは、寒天希釈法（Ａｇａｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。具体的には、２倍希釈系列で調製した薬剤を含む培地（ミューラー・ヒントン寒天培地）に菌を接種し、３７℃で、１８時間培養し、測定した。【００７８】
【表１】
2014196512.tif 000007
【００７９】
表１から、カプラザマイシンＢと、ＣＰＺＥＮ−４５とでは、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する抗菌活性において、違いが観られた。そのため、両者は、抗菌の作用機序が異なることが推測された。
また、ＣＰＺＥＮ−４５は、ＷｅｃＡのオルソログが生育に必須ではないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ  ＦＤＡ２０９株、及びＳｔａｐｈ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  Ｎｏ．５株、並びに、ＷｅｃＡのオルソログを有さないＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｓ−２２３株、及びＳｔｒ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＲ−２株に対して抗菌活性を示さなかった。【００８０】
（試験例２：Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株における高分子合成）
ＣＰＺＥＮ−４５、及びカプラザマイシンＢに対して、結核菌と類似した感受性を示す枯草菌のＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株（ＡＴＣＣより入手）を用い、以下の各薬剤を含有する薬剤溶液を投与した際の高分子の合成を以下のようにして試験した。
＜薬剤＞
・  ＣＰＺＥＮ−４５（製造例２で製造したもの）
・  カプラザマイシンＢ（製造例１で製造したもの）
・  ツニカマイシン
・  バンコマイシン
・  レボフロキサシン【００８１】
＜試験方法＞
枯草菌  Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（ＮＢ培地）を用い、温度  ３７℃、振とう速度  １４０ｓｐｍにて対数期（ＯＤ６００＝０．２）まで培養し、菌液を調製した。
９６穴プレートに、２倍希釈系列で調製した前記薬剤溶液  ０．０１ｍＬと、菌液  ０．０９ｍＬとを加えて混和し、３７℃で５分間静置培養した。
前記培養後、下記濃度に調製した放射ラベルした化合物（以下、「放射ラベル化合物」と称することがある）０．０１ｍＬを加え、３７℃で更に１０分間静置培養した。
その後、１０％  トリクロロ酢酸水溶液を０．１ｍＬ加え、菌体の高分子成分を不溶化し、次いで、フィルター付きの９６穴プレートに移し、液体成分を濾過した後、５％  トリクロロ酢酸水溶液  ０．２ｍLにて、フィルターを３回洗浄した。
乾燥後、フィルター上に残存する放射活性を、液体シンチレーションカウンター（トライカーブ２８００ＴＲ  パーキンエルマー社）で測定し、菌体の高分子合成量を評価した。結果を図７Ａから図７Ｅに示した。
−放射ラベル化合物−
・  ０．１μＣｉ／μＬ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−［１−１４Ｃ］ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ペプチドグリカン合成の評価に使用、以下、「Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」と称することがある。）
・  ０．０１μＣｉ／μＬ  ［１４Ｃ（Ｕ）］ｇｌｙｃｅｒｏｌ（テイコ酸合成の評価に使用、以下、「Ｇｌｙｃｅｒｏｌ」と称することがある。）
・  １μＣｉ／μＬ  ［１−１４Ｃ］ａｃｅｔａｔｅ（細胞膜脂肪酸合成の評価に使用、以下、「Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ」と称することがある。）
・  １μＣｉ／μＬ  ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  （ＤＮＡ合成の評価に使用、以下、「Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ」と称することがある。）
・  １μＣｉ／μＬ  ［５，６−３Ｈ］ｕｒｉｄｉｎｅ  （ＲＮＡ合成の評価に使用、以下、「Ｕｒｉｄｉｎｅ」と称することがある。）
・  ５μＣｉ／μＬ  Ｌ−［４，５−３Ｈ］ｌｅｕｃｉｎｅ  （タンパク質合成の評価に使用、以下、「Ｌｅｕｃｉｎｅ」と称することがある。）【００８２】
図７Ａは、薬剤としてＣＰＺＥＮ−４５を用いた場合、図７Ｂは、薬剤としてカプラザマイシンＢを用いた場合、図７Ｃは、薬剤としてツニカマイシンを用いた場合、図７Ｄは、薬剤としてバンコマイシンを用いた場合、図７Ｅは、薬剤としてレボフロキサシンを用いた場合の結果を示す。なお、図７Ａ〜図７Ｅ中、「■」は、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取込量、「◆」は、［５，６−３Ｈ］ｕｒｉｄｉｎｅの取込量、「▲」は、Ｌ−［４，５−３Ｈ］ｌｅｕｃｉｎｅの取込量、「×」は、［１−１４Ｃ］ａｃｅｔａｔｅの取込量、「●」は、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−［１−１４Ｃ］ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅの取込量、「＋」は、［１４Ｃ（Ｕ）］ｇｌｙｃｅｒｏｌの取込量を示す。
図７Ａから、ＣＰＺＥＮ−４５の存在下では、細胞壁の主要構成成分の１つであるテイコ酸の構成成分であるグリセロールの菌体への取込みが阻害されていることが確認された。これは、図７Ｃに示すように、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＴａｇＯ（ＷｅｃＡのオルソログ）を阻害することが知られているツニカマイシンと同様の結果であった。
また、図７Ｂから、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＭｒａＹ（ＭｕｒＸのオルソログ）を阻害するカプラザマイシンＢの存在下では、ペプチドグリカンの構成成分であるＮ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅの菌体への取込みが阻害されていることが確認された。これは、図７Ｄに示すように、同様の阻害活性を有するバンコマイシンと同様の結果であった。
なお、図７Ｅに示すように、ＤＮＡ合成を阻害するレボフロキサシンは、ＣＰＺＥＮ−４５、カプラザマイシンＢ、ツニカマイシン、バンコマイシンとは異なる結果であった。【００８３】
（試験例３−１：薬剤耐性菌の作製、及び遺伝子型の同定）
親株として、枯草菌のＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株（ＡＴＣＣより入手）を用い、カプラザマイシンＢ、又はＣＰＺＥＮ−４５に対する耐性を有する耐性菌を以下のようにして作製し、その遺伝子型を確認した。
＜耐性菌の作製＞
親株として枯草菌  Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を用いた。
前記Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を、ＭＩＣの１／８倍濃度〜４倍濃度の薬剤（カプラザマイシンＢ、又はＣＰＺＥＮ−４５）を含有するＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（ＮＢ培地）に、終濃度  １％になるように植菌し、３７℃、１４１ｓｐｍにて２４時間静置培養した。
ＭＩＣの１／４倍濃度の薬剤存在下で生育した菌の培養液を植菌源に用い、再度同条件にて培養を行った。
これを、ＭＩＣが親株の１２８倍を超えるまで続け、耐性菌を作製した。【００８４】
−ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の測定−
前記ＭＩＣは、マイクロブロス希釈法（ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。具体的には、培地としてＬＢ  ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）を用い、９６穴プレートで、薬剤を２倍希釈系列で調製した溶液０．１ｍＬに菌液を０．１ｍＬ加え混和し、３７℃で１６時間培養し、測定した。
なお、薬剤として、ツニカマイシン、及びバンコマイシンについても測定した。結果を表２に示した。【００８５】
−遺伝子型の同定−
前記親株、及び耐性菌のｍｒａＹ遺伝子、及びｔａｇＯ遺伝子の遺伝子型を以下のようにして同定した。結果を表２に示した。
前記親株、及び耐性菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法によりｍｒａＹ遺伝子、及びｔａｇＯ遺伝子断片を増幅し、アガロースゲル電気泳動により両遺伝子の遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片の配列は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７３０  アプライドバイオシステム）にて同定した。
ｍｒａＹ遺伝子の増幅に用いたプライマーの配列は、以下のとおりである。
５’末端側：５’−ＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）
３’末端側：５’−ＴＣＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１０）
ｔａｇＯ遺伝子の増幅に用いたプライマーの配列は、以下のとおりである。
５’末端側：５’−ＣＣＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号１１）
３’末端側：５’―ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１２）【００８６】
【表２】
2014196512.tif 000008
【００８７】
表２中、「１６８」は親株を示し、「ＣＰＺＢ」はカプラザマイシンＢを示し、「ＴＵＮ」はツニカマイシンを示し、「ＶＣＭ」はバンコマイシンを示し、「ＷＴ」は、野生型を示す。
表２から、ＣＰＺＥＮ−４５耐性株では、ＴａｇＯをコードする遺伝子であるｔａｇＯに変異を有する株が存在することが確認された。そのため、ＣＰＺＥＮ−４５は、ＴａｇＯを標的とすることが考えられた。【００８８】
（試験例３−２：標的遺伝子の検討）
ｍｒａＹ遺伝子、又はｔａｇＯ遺伝子を高発現する株を以下のようにして作製し、該株のＭＩＣを測定した。
＜ｍｒａＹ遺伝子、又はｔａｇＯ遺伝子を高発現する株の作製＞
市販品のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）、ｐＨＴ０１（独ＭｏＢｉＴｅｃ社製）を用い、枯草菌で複製可能なプラスミド「ｐＨＹｃａｔ」を作製した。前記ｐＨＹｃａｔの概要を図８に示した。
前記プラスミド「ｐＨＹｃａｔ」は、前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ、及び前記ｐＨＴ０１の両者を制限酵素ＢａｎＩ、及びＰｖｕＩＩで処理し、その結果得られたｐＨＹ３００ＰＬＫの２，８４８ｂｐのＤＮＡ断片、及びｐＨＴ０１の２，１４９ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションすることによって得た。
前記「ｐＨＹｃａｔ」を制限酵素ＮｈｅＩで処理後、緑豆ヌクレアーゼにて末端を平滑化したフラグメントに、枯草菌  Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記遺伝子型の同定の際と同一の条件にてＰＣＲで増幅したｍｒａＹ遺伝子、又はｔａｇＯ遺伝子を挿入し、「ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ」、及び「ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ」のプラスミドを作製した。
前記「ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ」、又は「ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ」を枯草菌  Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株に導入し、ｍｒａＹ高発現株（以下、「１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ株」と称することがある）、及びｔａｇＯ高発現株（以下、「１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ株」と称することがある）を作製した。また、対照株として、ｐＨＹｃａｔを枯草菌  Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株に導入した株を作製した。【００８９】
−ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の測定−
前記作製した３株を用い、試験例３−１と同様にしてＭＩＣを測定した。結果を表３に示した。【００９０】
【表３】
2014196512.tif 000009
【００９１】
表３中、「１６８／ｐＨＹｃａｔＡ」は「ｐＨＹｃａｔ」を導入した株を示し、「１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ」は「ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ」を導入した株を示し、「１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ」は「ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ」を導入した株を示し、「ＣＰＺＢ」はカプラザマイシンＢを示し、「ＴＵＮ」はツニカマイシンを示し、「ＶＣＭ」はバンコマイシンを示す。
表３から、ｍｒａＹ遺伝子高発現株では、カプラザマイシンＢに対する耐性を有しているが、ＣＰＺＥＮ−４５に対しては耐性を有していないことが確認された。また、ｔａｇＯ遺伝子高発現株では、カプラザマイシンＢに対する耐性を有していないが、ＣＰＺＥＮ−４５に対する耐性を有していることが確認された。また、ｔａｇＯ遺伝子高発現株は、ＴａｇＯの酵素活性を阻害することが知られているツニカマイシンに対しても耐性を有していることが確認された。そのため、試験例３−２の結果からも、ＣＰＺＥＮ−４５は、ＴａｇＯを標的とすることが考えられた。
また、上記結果は、試験例１において、ＣＰＺＥＮ−４５が、ＷｅｃＡのオルソログが生育に必須ではないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ  ＦＤＡ２０９株、及びＳｔａｐｈ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  Ｎｏ．５株、並びに、ＷｅｃＡのオルソログを有さないＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｓ−２２３株、及びＳｔｒ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＲ−２株に対して抗菌活性を示さなかったこととも整合していると考えられる。【００９２】
（試験例４：酵素活性評価）
ＭｒａＹ、及びＴａｇＯの両酵素の活性について、これらを高発現する、前記試験例３−２で製造した１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｍｒａＹ株、及び１６８／ｐＨＹｃａｔ−ｔａｇＯ株の菌体破砕液を用い、以下のようにして測定した。
また、対照として、ツニカマイシン、バンコマイシン、及びレボフロキサシンについても同様に試験した。
＜酵素液の調製＞
ＬＢ培地で対数期（ＯＤ６００＝０．４）まで培養した菌を遠心分離により集菌（５，０００ｒｐｍ、１０分間）し、ＴＭＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、６２５ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にて２回洗浄した。
次いで、１／４０容量のＴＭＳバッファーに再懸濁し、プローブソニケーションにより菌体を破砕し（氷上にて、３０秒間破砕、３０秒間静置を１０回繰り返す）、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）にて未破砕の菌を除去し、上清を酵素液とした。【００９３】
−ＴａｇＯの活性測定−
ＴａｇＯの活性測定は、下記反応液  ０．０２ｍＬを温度３０℃で１時間反応させることにより行った。
反応後、０．２ｍＬのクロロホルム−メタノール（２：１）溶液を加えることによって反応を停止させ、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、３分間）した。
次いで、反応物が含まれる下層を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、展開溶媒は、クロロホルム：メタノール：水：濃アンモニア水＝６５：３５：４：４を用いた）、及びオートラジオグラフィーにて分析し、コントロールに対する比率から、ＴａｇＯの酵素活性を算出した。結果を図９Ａに示した。
−−反応液−−
・  酵素液  ２５０ｎｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／μＬ
・  １２５μＭ  ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
・  ２０μＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
・  ０．０５μＣｉ／μＬ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、［ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−３Ｈ］−
・  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
・  ２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
・  １％  ＣＨＡＰＳ【００９４】
−ＭｒａＹの活性測定−
ＭｒａＹの活性測定は、下記反応液  ０．０２ｍＬを温度３０℃で２０分間反応させることにより行った。
反応後、０．０２ｍＬの反応停止液（ブタノール：氷酢酸中にピリジン（終濃度６Ｍ）を溶解させたもの＝２：１（容量比））を加えることによって反応を停止させ、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、３分間）した。
次いで、反応物が含まれる下層を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、展開溶媒は、クロロホルム：メタノール：水：濃アンモニア水＝８８：４８：４：１を用いた）、及びオートラジオグラフィーにて分析し、コントロールに対する比率から、ＭｒａＹの酵素活性を算出した。結果を図９Ｂに示した。
−−反応液−−
・  酵素液  ２０ｎｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／μＬ
・  ５０μＭ  ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
・  ０．０２μＣｉ／μＬ  ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、［１−３Ｈ］−
・  ５０μＭ  ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ
・  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
・  ２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
・  １０ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００【００９５】
図９Ａ及び９Ｂ中、「◆」は、ＣＰＺＥＮ−４５の結果を示し、「■」は、カプラザマイシンＢの結果を示し、「▲」は、ツニカマイシンの結果を示し、「×」は、バンコマイシンの結果を示し、「＊」は、レボフロキサシンの結果を示す。
図９Ａ及び９Ｂの結果から、ＴａｇＯの酵素活性は、ＣＰＺＥＮ−４５により最も阻害されており、ＭｒａＹの酵素活性は、カプラザマイシンＢにより最も阻害されていた。そのため、試験例４の結果からも、ＣＰＺＥＮ−４５は、ＴａｇＯを標的とすることが考えられた。【００９６】
（試験例５：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡに対するＣＰＺＥＮ−４５の阻害活性）
結核菌と近縁であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡに対するＣＰＺＥＮ−４５の阻害活性を以下のようにして、試験した。
＜酵素液の調製＞
Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｍｃ２１５５株（ＡＴＣＣより入手）をグリセロール−アラニン培地で対数期まで培養し、その菌体  １０ｇを３０ｍＬのＡバッファーに懸濁し、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０；  ＭＳＥ  Ｌｔｄ．，  Ｃｒａｗｌｅｙ，  Ｓｕｓｓｅｘ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；  １ｃｍ  ｐｒｏｂｅ）を用いて氷上にて６０秒間破砕、９０秒間静置の操作を１０回繰り返した。この菌体破砕液を４℃、２７，０００ｇで１２分間遠心後、上清を更に４℃、１００，０００ｇで６０分間遠心することにより、ＷｅｃＡを含む細胞膜画分を得た。前記細胞膜画分を適量のＡバッファーに再懸濁し、これを酵素液とした。
−グリセロール−アラニン培地−
グリセロール  ２０ｍＬ、バクトカジトン（Ｄｉｆｃｏ社製）  ０．３ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム  ０．０５ｇ、リン酸水素二カリウム  ４．０ｇ、クエン酸  ２．０ｇ、Ｌ−アラニン  １．０ｇ、塩化マグネシウム六水和物  １．２ｇ、硫酸カリウム  ０．６ｇ、塩化アンモニウム  ２．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．２ｇ、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）  ０．０５ｇを、１Ｌの脱イオン水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを６．６に調整した。
−Ａバッファー−
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）、５ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。【００９７】
＜ＷｅｃＡの酵素活性の測定＞
下記酵素反応液（液量０．１ｍＬ）に前記ＣＰＺＥＮ−４５を所定量添加し、３７℃で１時間静置することにより、酵素反応を行った。次いで、１ｍＬのクロロホルム−メタノール（２：１）溶液を加えて反応を停止させ、激しく攪拌することにより、反応生成物を有機層に抽出した。前記反応生成物の適量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、オートラジオグラフィーにて検出した。結果を図１０に示した。
−酵素反応液−
前記酵素液（１ｍｇタンパク質相当分）、ＡＴＰ  ６０μＭ、及び［１４Ｃ］−ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ０．０１μＣｉ／μＬを０．１ｍＬの前記Ａバッファーに含む液。【００９８】
図１０中、「１」から「１０」は、順に、ＣＰＺＥＮ−４５の添加量を、０μｇ／ｍＬ、０．０００１９１２５μｇ／ｍＬ、０．０００３８２５μｇ／ｍＬ、０．０００７６５μｇ／ｍＬ、０．００１５３μｇ／ｍＬ、０．００３０６μｇ／ｍＬ、０．００６１１μｇ／ｍＬ、０．０１２２１μｇ／ｍＬ、０．０２４４１μｇ／ｍＬ、０．０４８８２８μｇ／ｍＬとした場合の結果を示し、「ＳＦ」は、展開溶媒の上端を示し、「Ｏｒｉｇ．」は、原点を示す。
オートラジオグラフを定量化した結果、ＩＣ５０は、０．００４４μｇ／ｍＬと算出され、ＣＰＺＥＮ−４５は、結核菌と近縁であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡを阻害することが確認された。
Ｂ． ｓｕｂｉｌｉｓのＴａｇＯと、Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡと、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＷｅｃＡとのアミノ酸配列の相同性を表４に示す。Ｂ． ｓｕｂｉｌｉｓのＴａｇＯと、Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡとは、同一の反応を触媒する酵素である。また、下記表４に記載されているように、Ｂ． ｓｕｂｉｌｉｓのＴａｇＯ及びＭ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＷｅｃＡと、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＷｅｃＡとは、それぞれ、３５．７％、８６．０％の相同性を有している。更に、これらの酵素では、酵素反応に必須の領域のアミノ酸配列が極めて良く保存されている。即ち、これらの酵素は、互いにオルソログである。
そのため、ＣＰＺＥＮ−４５による抗菌作用は、結核菌のＷｅｃＡ乃至そのオルソログを標的とすることにより発揮されていると考えられた。【００９９】
【表４】
2014196512.tif 000010
【０１００】
（試験例６：ＷｅｃＡ乃至そのオルソログ阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとの相乗効果）
菌株として、Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ６０７株（ＡＴＣＣより入手）を用い、下記薬剤の併用により、相乗効果が得られるか否かについて、以下のようにしてＭＩＣを測定し、ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘを算出することにより、試験した。結果を図１１Ａ〜図１１Ｃに示した。
＜ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の測定＞
前記ＭＩＣは、マイクロブロス希釈法（ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。具体的には、培地としてＯＡＤＣ含有  ７Ｈ９ｂｒｏｔｈ培地を用い、９６穴プレートで、１種又は２種の薬剤を２倍希釈系列で調製した溶液０．１ｍＬに菌液を０．１ｍＬ加え混和し、３７℃で３日間培養し、測定した。
＜薬剤の組合せ（薬剤Ａ及び薬剤Ｂ＞
（１）  薬剤Ａ：ＣＰＺＥＮ−４５（ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤）、薬剤Ｂ：カプラザマイシンＢ（ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤）
（２）  薬剤Ａ：ツニカマイシン（ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤）、薬剤Ｂ：リファンピシン（ＲＮＡ合成阻害剤）
（３）  薬剤Ａ：カプラザマイシンＢ（ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤）、薬剤Ｂ：リファンピシン（ＲＮＡ合成阻害剤）【０１０１】
＜ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）＞
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘは、下記式（１）から算出した。
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＝（薬剤ＡのＦＩＣ＋薬剤ＢのＦＩＣ）の最小値  ・・・  式（１）
薬剤ＡのＦＩＣ＝薬剤Ａと薬剤Ｂとの組合せにおけるＭＩＣ／薬剤Ａ単独におけるＭＩＣ
薬剤ＢのＦＩＣ＝薬剤Ｂと薬剤Ａとの組合せにおけるＭＩＣ／薬剤Ｂ単独におけるＭＩＣ
前記ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘの数値から、薬剤の併用による効果を判断することができる。
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ≦０．５  ・・・  相乗効果である（ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃ）。
０．５＜ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ≦１  ・・・  相加効果である（ａｄｄｉｔｉｖｅ）。
１＜ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ≦２  ・・・  不関である（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）。
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＞２  ・・・  拮抗作用である（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）。【０１０２】
図１１Ａは、ＣＰＺＥＮ−４５と、カプラザマイシンＢとの組合せの結果を示し（縦軸：ＣＰＺＥＮ−４５、横軸：カプラザマイシンＢ）、図１１Ｂは、ツニカマイシンと、リファンピシンとの組合せ（縦軸：ツニカマイシン、横軸：リファンピシン）の結果を示し、図１１Ｃは、カプラザマイシンＢと、リファンピシンとの組合せ（縦軸：カプラザマイシンＢ、横軸：リファンピシン）の結果を示す。また、図１１Ａ〜図１１Ｃ中、着色部は「生育可能（ｖｉａｂｌｅ）」を示し、非着色部は「生育不可（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）」を示す。
図１１Ａ〜図１１Ｃの結果から、ＣＰＺＥＮ−４５（ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤）と、カプラザマイシンＢ（ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤）との組合せ（ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＝０．０９５〜０．３７５）、ツニカマイシン（ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤）と、リファンピシン（ＲＮＡ合成阻害剤）との組合せ（ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＝０．２８１）では、併用による相乗効果が認められた。
一方、カプラザマイシンＢ（ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤）と、リファンピシン（ＲＮＡ合成阻害剤）との組合せ（ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＝１〜２）では、相乗効果は認められなかった。
以上から、ＷｅｃＡ乃至そのオルソログ阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかとを併用することにより、非常に優れた抗抗酸菌作用が得られることがわかった。
【受託番号】
【０１０３】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８【０１０４】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤と、ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤、及びＲＮＡ合成阻害剤の少なくともいずれかと、を併用することを特徴とする併用抗抗酸菌薬である。
＜２＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、下記構造式（１）で表される化合物を含み、
ＭｕｒＸ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、下記構造式（２）で表される化合物を含む前記＜１＞に記載の併用抗抗酸菌薬である。
【化６】
2014196512.tif 000011
【化７】
2014196512.tif 000012
構造式（２）中、「Ｍｅ」は、メチル基を表す。
＜３＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤が、ツニカマイシンを含み、
ＲＮＡ合成阻害剤が、リファンピシンを含む前記＜１＞に記載の併用抗抗酸菌薬である。
＜４＞  抗酸菌が、結核菌である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の併用抗抗酸菌薬である。
＜５＞  ＷｅｃＡ乃至そのオルソログに対する被験物質の活性を測定する工程を含むことを特徴とする抗抗酸菌薬のスクリーニング方法である。
＜６＞  抗酸菌が、結核菌である前記＜５＞に記載の抗抗酸菌薬のスクリーニング方法である。
＜７＞  下記構造式（１）で表される化合物を含むことを特徴とするＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤である。
【化８】
2014196512.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の併用抗抗酸菌薬は、抗酸菌に対して優れた薬効を有しており、現在非常に大きな問題となっている結核菌に感染した患者の治療に好適に用いることができる。
本発明のスクリーニング方法によれば、優れた抗抗酸菌作用を有する抗抗酸菌薬を得ることができる。
本発明のＷｅｃＡ乃至そのオルソログの活性阻害剤は、前記抗抗酸菌薬の有効成分や、本発明のスクリーニング方法における試薬としても好適に利用可能である。
【図１】
2014196512.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014196512.tif 000022
【図７Ａ】
2014196512.tif 000023
【図７Ｂ】
2014196512.tif 000024
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2014196512.tif 000026
【図７Ｅ】
2014196512.tif 000027
【図８】
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【図９Ａ】
2014196512.tif 000029
【図９Ｂ】
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【図１０】
2014196512.tif 000031
【図１１Ａ】
2014196512.tif 000032
【図１１Ｂ】
2014196512.tif 000033
【図１１Ｃ】
2014196512.tif 000034
【配列表】
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【国際調査報告】
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