(57)【要約】  自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル。
【請求項２】
自己組織化ペプチドが、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ又はＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣである、請求項１に記載のナノゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性タンパク質を医薬品として用いたＤＤＳ治療が注目され、有効な薬理活性を発現するための機能性キャリアが広く研究されている。しかし、キャリアへのタンパク質の担持操作における変性や担持効率の低さは依然として大きな課題であり、タンパク質の立体構造を損なうことなく、担持効率を高めるキャリアの設計が求められている。一方、特定のアミノ酸配列を有する自己組織化ペプチドは、β−シート構造形成に基づく自己組織ネットワークを構築する。生体適合性に優れたペプチドの自己組織ネットワークを担持マトリックスとしたナノキャリアを創製することができれば、タンパク質の構造安定性を維持可能な新規ＤＤＳキャリアとなることが期待できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、タンパク質の構造安定性を維持可能な新規ＤＤＳキャリアを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下のとおりである。
［１］自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル、
［２］自己組織化ペプチドが、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ又はＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣである、請求項１に記載のナノゲル。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のナノゲルは、タンパク質の機能を損なうことなく担持することができ、優れた徐放性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＲＡＤＡプレコート当量を変化させた際の会合体への担持量測定結果である。
【図２】添加ＦＩＴＣ−ＢＳＡに対する会合体への担持量測定結果である。
【図３】ＦＩＴＣ−ＢＳＡ放出挙動評価である。上段が放出割合表記であり、下段が放出量標記である。
【図４】担持・放出物質収支である。
【図５】ＲＡＤＡ修飾アルブミンの構造安定性評価の結果である。
【図６】ＲＡＤＡ修飾アルブミンの構造安定性評価の結果である。
【図７】ＦＩＴＣ−ライソザイムのＣＤスペクトルの測定結果である。
【図８】ＲＡＤＡプレコート当量を変化させた際のＦＩＴＣ−ライソザイムへの担持量測定結果である。
【図９】添加ＦＩＴＣ−ライソザイムに対する会合体への担持効率測定結果である。
【図１０】ＦＩＴＣ−ライソザイムの放出挙動評価である。
【図１１】ＦＩＴＣ−ライソザイムの担持・放出物質収支である。
【図１２】ＲＡＤＡプレコートライソザイムの溶菌活性である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明において用いられる自己組織化ペプチドは、たとえば、以下の４つの一般式で表すことができる。
（（ＸＹ）l−（ＺＹ）m）n      （Ｉ）
（（ＹＸ）l−（ＹＺ）m）n      （II）
（（ＺＹ）l−（ＸＹ）m）n      （III）
（（ＹＺ）l−（ＹＸ）m）n      （IV）
（式（Ｉ）〜（IV）中、Ｘは酸性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは塩基性アミノ酸を表し、ｌ、ｍおよびｎは共に整数（ｎ×（ｌ＋ｍ）＜２００）である。）
また、そのＮ末端はアセチル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。
ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。
これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができる。より具体的には、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標））又はその末端改変型であるＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣ（ＲＡＤＡＧＧＧＣ）である。
【０００８】
キトサンとは、キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）の脱アセチル化物であり、β−１，４−ポリグルコサミン構造を主とする多糖類である。本発明のキトサンには、従来公知の誘導体、たとえば、カルボキシメチルキトサンを含む。
キトサンは、当該分野で公知の任意の方法により調製され得る。たとえば、キトサンは、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類の甲皮や、カブトムシ、バッタなどの昆虫類の甲皮などの原材料を脱カルシウム処理し、除タンパク処理をして得られるキチンを、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ処理）で脱アセチル化することなどによって得ることができる。また、キトサンの原材料としては、上述の甲皮等に代えて、キノコ類、微生物、イカの中骨等を用いてもよい。
キトサンとしては、種々の分子量のものが知られている。本発明の水性組成物において、キトサンの分子量は特に限定されるものではないが、重量平均分子量が１０００〜１００００００の範囲にあることが好ましく、１００００〜３０００００の範囲にあることがより好ましい。重量平均分子量は、「重量平均絶対分子量」と言い換えてもよい。
キトサンの重量平均分子量は、当該分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱分析法（ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法）、蒸気圧式絶対分子量測定、メンブレン式絶対分子量測定などの方法によって測定可能である。キトサンの重量平均分子量は、少なくとも、いずれかの測定方法及び測定条件において前記数値範囲内に含まれればよく、全ての測定方法及び測定条件下で前記数値範囲内に含まれる必要はない。
本発明の水性組成物に含まれるキトサンにおいて、キチンからの脱アセチル化の程度は、好ましくは５０％程度である。
【０００９】
本発明のポリエチレングリコールは、従来公知の誘導体、たとえばマルチアームポリエチレングリコール、末端にアルデヒド，ヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有する誘導体を含む。ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、１０００〜２００００、より好ましくは、１０００〜５０００である。
【００１０】
用語「ポリマー」又は「重合体」は、互換的に使用することができ、分子量の小さいモノマーから得ることができる、モノマー単位の繰り返しで構成された構造を有する分子をいう。用語「高分子」は、ポリマーのほか、例えばタンパク質、核酸等のような多数の原子が共有結合してなる巨大分子をいう。
【００１１】
ポリマーにおいて用語「平均重合度」は、１個のポリマー分子中に含まれるモノマー単位の平均数をいう。すなわち、ポリマー組成物中には、異なる長さのポリマー分子がある程度の範囲で分散して存在している。
【００１２】
ポリマーの重合度に関して「数平均分子量」とは、ポリマー組成物中の分子１個あたりの分子量の平均をいい、「重量平均分子量」とは、重量に重みをつけて計算した分子量をいう。また、数平均分子量と重量平均分子量の比を分散度といい、ポリマー組成物の分子量分布の尺度となる。分散度が１に近いほど、ポリマー組成物中の平均重合度が近くなり、同じ程度の長さのポリマー鎖を多く含むことになる。
【００１３】
本発明のナノゲルには、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、必要に応じて、例えば、ラジカル捕捉剤、過酸化物分解剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、熱安定剤、可塑剤、難燃剤、帯電防止剤等の添加剤を添加して使用することができる。また、本発明のポリマー以外のポリマーと混合させて使用することができる。このような、本発明の生分解性ナノゲルを含む組成物もまた、本発明の目的である。
【００１４】
本発明の生分解性ナノゲルは、適宜の有機溶媒に溶解させて単独で使用することもできるし、使用の目的に応じて他の高分子化合物と混合して使用する等、各種の組成物として使用することができる。また、本発明の医療用機器は、生体内組織や血液と接して使用される表面の少なくとも一部分に本発明の生分解性ナノゲルを有していればよい。つまり、医療用機器を成す基材の表面に対して、本発明の生分解性ナノゲルを含む組成物を表面処理剤として用いることができる。また、医療用機器の少なくとも一部の部材を本発明の生分解性ナノゲル、又は、その組成物で構成しても良い。
【００１５】
本発明の一つの態様は、生体内組織や血液に接して使用されたときに、分解されるまでの間、血液や組織に対して異物反応を抑制するための、本発明の生分解性ナノゲルである。
【００１６】
本発明の生分解性ナノゲルは、医療用途に好ましく使用されることができる。本発明の生分解性ナノゲルを他の高分子化合物等と混合して組成物として使用する場合には、その使用の用途に応じて適宜の混合割合で使用することができる。特に、本発明の生分解性ナノゲルの割合を９０重量％以上とすることで、本発明の特徴を強く有する組成物とすることができる。その他、使用の用途によっては、本発明の生分解性ナノゲルの割合を５０〜７０重量％とすることで、本発明の特徴を活かしつつ、各種の特性を併せ持つ組成物とすることができる。
【００１７】
本発明の一つの態様は、本発明の生分解性ナノゲルを含む、医療用機器である。ここで、「医療用機器」とは、人工器官等の体内埋め込み型デバイス及びカテーテル等の一時的に生体組織と接触することがあるデバイスを含み、生体内で取り扱われるものに限定されない。また、本発明の医療用機器は、本発明のポリマー組成物を少なくとも表面の一部に有する医療用途に使用される機器である。本発明でいう医療用機器の表面とは、例えば、医療用機器が使用される際に血液等が接触する医療用機器を構成する材料の表面並びに材料内の孔の表面部分等をいう。
【００１８】
本発明において、医療用機器を構成する基材の材質や形状は特に制限されることなく、例えば、多孔質体、繊維、不織布、粒子、フィルム、シート、チューブ、中空糸や粉末等いずれでも良い。その材質としては木錦、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ブタジエン−アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミクス及びそれらの複合材料等が例示でき、複数の基材より構成されていても構わず、その血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部に本発明に係る生分解性ナノゲルが設けられることが望ましい。
【００１９】
本発明の生分解性ナノゲルは、生体内組織や血液と接して使用される医療用機器の全体をなす材料、又はその表面部をなす材料として用いることができ、体内埋め込み型の人工器官や治療器具、体外循環型の人工臓器類、手術縫合糸、さらにカテーテル類（血管造影用カテーテル、ガイドワイヤー、ＰＴＣＡ用カテーテル等の循環器用カテーテル、胃管カテーテル、胃腸カテーテル、食道チューブ等の消化器用カテーテル、チューブ、尿道カテーテル、尿菅カテーテル等の泌尿器科用カテーテル）等の医療用機器の血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部が本発明に係る生分解性ナノゲルで構成されることが望ましい。また、本発明に係る生分解性ナノゲルが有する生分解性を利用して、治療の際に体内に留置される医療用機器に特に好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明の生分解性ナノゲルは、止血剤、生体組織の粘着材、組織再生用の補修材、薬物徐放システムの担体、人工すい臓や人工肝臓等のハイブリッド人工臓器、人工血管、塞栓材、細胞工学用の足場のためのマトリックス材料等に用いても良い。
【００２１】
これらの医療用機器においては、血管や組織への挿入を容易にして組織を損傷しないため、さらに表面潤滑性を付与してもよい。表面潤滑性を付与する方法としては水溶性高分子を不溶化して材料表面に吸水性のゲル層を形成させる方法が優れている。この方法によれば、生体親和性と表面潤滑性を併せ持つ材料表面を提供できる。
【００２２】
本発明の生分解性ナノゲルはそれ自体が生体親和性に優れた材料であるが、様々な生理活性物質をさらに担持させることもできるため、血液フィルターのみならず、血液保存容器、血液回路、留置針、カテーテル、ガイドワイヤー、ステント、人工肺装置、透析装置、内視鏡等の様々な医療用機器に用いることができる。
【００２３】
具体的には、本発明の生分解性ナノゲルを、血液フィルターを構成する基材表面の少なくとも一部にコーティングしてもよい。また、血液バッグと前記血液バッグに連通するチューブの血液と接する表面の少なくとも一部に本発明の高分子化合物をコーティングしてもよい。また、チューブ、動脈フィルター、遠心ポンプ、ヘモコンセントレーター、カーディオプレギア等からなる器械側血液回路部、チューブ、カテーテル、サッカー等からなる術野側血液回路部から構成される体外循環血液回路の血液と接する表面の少なくとも一部を本発明の生分解性ナノゲルでコーティングしてもよい。
【００２４】
また、先端に鋭利な針先を有する内針と、前記内針の基端側に設置された内針ハブと、前記内針が挿入可能な中空の外針と、前記外針の基端側に設置された外針ハブと、前記内針に装着され、かつ前記内針の軸方向に移動可能なプロテクタと、前記外針ハブと前記プロテクタとを連結する連結手段とを備えた留置針組立体の、血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。また、長尺チューブとその基端（手元側）に接続させたアダプターから構成されるカテーテルの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
【００２５】
また、ガイドワイヤーの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。また、金属材料や高分子材料よりなる中空管状体の側面に細孔を設けたものや金属材料のワイヤや高分子材料の繊維を編み上げて円筒形に成形したもの等、様々な形状のステントの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
【００２６】
また、多数のガス交換用多孔質中空糸膜をハウジングに収納し、中空糸膜の外面側に血液が流れ、中空糸膜の内部に酸素含有ガスが流れるタイプの中空糸膜外部血液灌流型人工肺の、中空糸膜の外面もしくは外面層に、本発明の生分解性ナノゲルが被覆されている人工肺としてもよい。
【００２７】
また、透析液が充填された少なくとも一つの透析液容器と、透析液を回収する少なくとも一つの排液容器とを含む透析液回路と、前記透析液容器を起点とし、又は、前記排液容器を終点として、透析液を送液する送液手段とを有する透析装置であって、その血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
【実施例１】
【００２８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の例で用いた薬品は、とくに断りの無い場合は市販品をそのまま用いた。以下の例において、各実施例で得られた重合体の分子量分布の測定は以下のようにして行った。【００２９】
数平均分子量（［Ｍｎ］、単位：ｇ/mol）
ピーク分子量が既知の標準ポリスチレンを用い、該標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー社製「TOSO HLC-8320GPC」、カラム構成：TSKguardcolumn SuperMP(HZ)-M, TSKgel SuperMultiporeHZ-M ４本直列）を使用して、重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。（溶媒：THF、温度：４０℃、流量：0.35 mL/min）。【００３０】
分子量分布（［Ｍｗ／Ｍｎ］）
上記の方法で求めた重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の値を用い、その比（Ｍｗ／Ｍｎ）として求めた。【００３１】
ＮＭＲ測定
ポリマーの構造解析については、ＮＭＲ測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ製、４００ＭＨｚ）を用い、１Ｈ−ＮＭＲ測定及び１３Ｃ−ＮＭＲ測定を行った。なお、ケミカルシフトはＣＤＣｌ３（１Ｈ：７．２６ppm、１３Ｃ：７７．１ppm）を基準とした。【００３２】
片末端アルデヒドポリ（エチレングリコール）（ＣＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ）の合成
α−アセタール−ω−ヒドロキシロイル−ＰＥＧ（Ｍｎ＝５，３００，５４５ｍｇ）をＴＨＦ  ２．５ｍＬに溶解させ、１Ｎ  ＨＣｌ  ２．５ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した。その後、水洗しておいたクロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水後、ジエチルエーテルで再沈した。ベンゼンを用いたフリーズドライにより白色の固体（ＣＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ）を得た（収量：４２２ｍｇ（回収率：７７％）１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ−ｄ，基準ピーク：下線部）δ：９．７８−９．８３（２），３．５４−３．８０（１））。【００３３】
ＰＥＧグラフトキトサン（ＰＥＧ−ｇ−ＣＳ）の合成
キトサン（ＣＳ、（甲陽ケミカル、ＤＡＣ５０、Ｌｏｔ：９８１０２８、Ｍｗ＝２３４，０００、Ｍｎ＝９３，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５、脱アセチル化度＝５４％），８０ｍｇ，アミノ基２．３８×１０−４ｍｏｌ［脱アセチル化度より質量当たりのアミノ基量を算出］）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水８ｍＬに溶解させ、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（約３５０μＬ）を添加してｐＨを６．５に調整した。そこへ粉末のＣＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（４１０ｍｇ，アルデヒド基４．７６×１０−５ｍｏｌ［アルデヒド化率６０％より算出］，０．２ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のアミノ基）を加え、常温で１時間撹拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２９ｍｇ，１０ｅｑ．ｖｓ．アルデヒド基）を添加し２４時間常温で撹拌した。得られた溶液を水に対して１日間透析（分画分子量：１２０００〜１４０００）し、凍結乾燥により白色の固体（ＰＥＧ−ｇ−ＣＳ）を得た。（収量：４３５ｍｇ（回収率：８９％）１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ  ＯＸＩＤＥ，基準ピーク：下線部）δ：２．８３−３．００（１），２．６７−２．８２（２））。
なお、キトサン（甲陽ケミカル、ＤＡＣ５０ＨＣｌ、Ｌｏｔ：１０７３１１、Ｍｗ＝１，０４６，０００、Ｍｎ＝１５７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝６．７、脱アセチル化度＝４７％）を用いたときは、ナノゲルの形成は困難であった。【００３４】
ＰＥＧ及びＲＡＤＡグラフトキトサン（ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ）の合成
ＰＥＧ−ｇ−ＣＳ  ５０ｍｇ（残存するアミノ基１．８７×１０−５ｍｏｌ）を１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させた。そこへ０．１Ｎ  ＮａＯＨ（約３５μＬ）を加え、溶液のｐＨを７．４３に調整した。別途用意した６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＨＬ；Ｈｅｔｅｒｏ  Ｌｉｎｋｅｒ）のｄｒｙ  ＤＭＳＯ溶液（１２．０ｍｇ，３．７４×１０−５ｍｏｌ，２．０ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のアミノ基）を添加し、室温で３時間撹拌した（ＰＥＧ／ＨＬ−ｇ−ＣＳ）。撹拌後、透析膜（分画分子量１２０００〜１４０００）を用いてＭｉｌｌｉ−Ｑ中で４時間透析精製を行った。構造解析のため、サンプルの一部を凍結乾燥により粉体回収した。１Ｈ−ＮＭＲよりマレイミド修飾率を測定した（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ  ＯＸＩＤＥ，基準ピーク：下線部）δ：６．９４−７．０４（３），２．８６−３．０２（１），２．７５−２．８６（２））。【００３５】
【表１】
2016075977.tif 000002
ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳの構造である。「Grafted degree」は、キトサンのアミノ基に対してＰＥＧ及びＲＡＤＡがどの程度修飾されたかの割合を示す。このとき、キトサン中のアミノ基の量は、脱アセチル化度を元に定義している。すなわち、脱アセチル化を考慮したアミノ基が全て修飾されると、５４％になる。
ＰＥＧは、１Ｈ−ＮＭＲ解析から算出した。ＨＬ（Ｈｅｔｅｒｏ  Ｌｉｎｋｅｒ）は、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの略称であり、キトサン骨格にマレイミド基を修飾するための低分子である。マレイミド基の修飾率も、１Ｈ−ＮＭＲ解析から算出した。次に、ＲＡＤＡＧＧＧＣのシステインをターゲットに、マレイミド基と反応させることで、キトサンをＲＡＤＡＧＧＧＣで修飾した。ＲＡＤＡ修飾後の定量解析には、マイクロＢＣＡアッセイを用いた。【００３６】
サンプル溶液を１００ｍＬにメスアップ（最終溶媒濃度：１５ｍＭ  ＰＢＳ）し、ＲＡＤＡＧＧＧＣ水溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬを１００ｍＬ添加：２４ｍｇ，１．２ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のマレイミド基）を添加し、室温で１６時間撹拌した（撹拌時のｐＨ６．７５）。撹拌後、透析膜（分画分子量１２０００〜１４０００）を用いてＭｉｌｌｉ−Ｑ中で２日間透析精製を行った。透析後、凍結乾燥により白色の固体を得た（ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ）。なお、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳの乾燥サンプルは、ＩＲ解析に必要な量のみを採取した。ＲＡＤＡの修飾率は、マイクロＢＣＡアッセイを用いたサンプル単位重量あたりのペプチド量の定量から見積もった。以後の実験は、目的濃度まで濃縮したＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ水溶液を用いた。【００３７】
ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳの会合挙動評価を表２に示した。
【表２】
2016075977.tif 000003
【００３８】
ＣＤスペクトル測定によって、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳにおけるＲＡＤＡのβシート構造由来の負のコットン効果が確認された（表３）。また、蛍光測定からも、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳにおけるＲＡＤＡのβシート構造の形成が確認された（表３）。
【表３】
2016075977.tif 000004
【００３９】
ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ会合体によるＦＩＴＣ−ＢＳＡの担持・徐放評価
ＦＩＴＣ−ＢＳＡは、６６ｋＤａであり、その構造内に３５のＣｙｓ残基を有し、その中の３４のＣｙｓ残基は、−Ｓ＝Ｓ−を形成している。【００４０】
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（２×ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ，２．０ｍＬ）に対してＲＡＤＡＧＧＧＣ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水溶液（０．５ｍＬ、１、５、１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を添加し、暗所室温で１６時間撹拌した。この時、溶液中でＦＩＴＣ−ＢＳＡの濃度は０．４ｍｇ／ｍＬとなっているため、未反応のＲＡＤＡＧＧＧＣを除く精製操作は行わずにＲＡＤＡＧＧＧＣプレコートＦＩＴＣ−ＢＳＡサンプルとして使用した。また、比較として、末端改変されていないＲＡＤＡ１６も同様の重量比率及び操作を用いてＦＩＴＣ−ＢＳＡと混合・撹拌した（表４）。
【表４】
2016075977.tif 000005
【００４１】
上記操作によってＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ−ＢＳＡを調製した。ＲＡＤＡ１６を用いることでＦＩＴＣ−ＢＳＡを物理的に被覆したサンプルを、ＲＡＤＡＧＧＧＣを用いることでＦＩＴＣ−ＢＳＡに存在するＣｙｓ残基中のチオールとのジスルフィド結合（ＦＩＴＣ−ＢＳＡに対して化学修飾）を狙ったサンプルの２種類を調製した。ＦＩＴＣ−ＢＳＡは分子内に３５個のＣｙｓ残基を有し、そのうちの１つは分子内ジスルフィド結合に関与しないフリーのＣｙｓであるため、そのＣｙｓとのジスルフィド結合形成を狙ってＲＡＤＡＧＧＧＣを添加した。このＲＡＤＡプレコート手法によって、ＦＩＴＣ−ＢＳＡに対して実際にＲＡＤＡＧＧＧＣが化学修飾出来ているかについて確認は行えていないが、以降の担持・徐放検討及び、構造安定性試験によって、ＲＡＤＡプレコートの効果を評価した（表５、表６、図１〜４）。
【表５】
2016075977.tif 000006
【表６】
2016075977.tif 000007
【００４２】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＲＡＤＡ修飾による分子認識機能を評価した。コントロールとして未処理のアルブミンを用いたＥＬＩＳＡ定量結果である。ＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣいずれのアルブミン処理においても、ＥＬＩＳＡ定量結果はコントロールと同程度であったことからタンパク質の構造変異を伴わないＲＡＤＡプレコートを達成し、本手法によるナノゲル内包においても、タンパク質の構造変異のない内包が達成できる（図５、６）。【００４３】
ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ会合体によるＦＩＴＣ−ライソザイムの担持・徐放評価
ＦＩＴＣ−ライソザイムの合成（Robeson, J, L. et al. Langmuir. 1996, 12, 6104-6113、Takano, M. et al. Eur. J. Pharmacol. 2004, 502, 149-155）
ライソザイム５０ｍｇ（３．５７×１０−６ｍｏｌ）をｐＨ９．２の１００ｍＭホウ酸緩衝液（ホウ酸溶液に１Ｍ  ＮａＯＨを添加することでｐＨを調整した（ホウ酸終濃度１００ｍＭ））３０ｍＬに溶解させ、そこへ１．０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ水溶液を５５０μＬ（１．４１×１０−６ｍｏｌ，０．５５ｍｇ，モル等量で０．４ｅｑ．ｖｓ．ライソザイム）添加し、室温で１時間撹拌した。その後、ＰＢＳ中で２日間透析を行った後、溶媒交換を一晩行わず（透析通算３日間）透析膜外液にＦＩＴＣ由来の吸収が見られないことをＵＶスペクトル測定により確認した。透析終了後、透析膜内液の不溶化物を取り除くために孔径１．０μｍのシリンジフィルターを用いてろ過を行った。ろ過後、ＦＩＴＣ、ライソザイムそれぞれの濃度を定量し（詳細は下記参照）、回収溶液を使用濃度である０．５  ｍｇ／ｍＬまでＰＢＳを用いて希釈した。【００４４】
ＦＩＴＣ−ライソザイム中における各化合物の濃度決定
ＦＩＴＣの定量については、時間経過や溶媒種によって蛍光強度は変動が大きく定量性を欠くため、吸光度測定を利用した。
（Ａ）ＦＩＴＣ−ライソザイム中のＦＩＴＣ定量〜ＵＶスペクトル測定〜
１．ＦＩＴＣの定量を行うため、ＦＩＴＣのＰＢＳ溶液［０／５／１０／２５／５０（×１０−６Ｍ）］のＵＶスペクトル測定を行い、４９５ｎｍにおける吸光度から検量線を作成した。
２．サンプル溶液の吸光度が測定可能領域に入るよう、ＰＢＳで１０倍希釈したサンプルのＵＶスペクトルを測定した。
３．サンプル溶液の４９５ｎｍにおける吸光度から、１．で作成した検量線を使用して、サンプル溶液中のＦＩＴＣ濃度を算出した。
（Ｂ）ＦＩＴＣ−ライソザイム中のライソザイム定量〜ＢＣＡアッセイ〜
１．検量線としてライソザイムのＰＢＳ溶液を調製した  ［０／０．２５／０．５０／０．７５／１．０／１．５／２．０（ｍｇ／ｍＬ）］。
２．ＦＩＴＣがＢＣＡアッセイの妨害物質にならないかを確認するため、ＦＩＴＣのＰＢＳ溶液を調製した［０／１０／２５／５０／１００（μｇ／ｍＬ）］。
３．上記の１．．２．で調製した検量線及び、サンプル溶液のＢＣＡアッセイをキットの手順に則り行った。
（Ｃ）ＦＩＴＣ，ライソザイムそれぞれの濃度決定
１．ＦＩＴＣについては（Ａ）の実験により得られたサンプル溶液の４９５ｎｍにおける吸光度から、検量線を使用してｓａｍｐｌｅ溶液中のＦＩＴＣ濃度を算出した。
２．ライソザイムについては、（Ｂ）よりＦＩＴＣがＢＣＡアッセイに反応することが分かったため、（Ｂ）のＦＩＴＣの検量線において、（Ａ）で算出されたＦＩＴＣ濃度に相当する吸光度をバックグラウンドとして差し引いたうえでライソザイムの検量線から濃度を決定した。【００４５】
ＦＩＴＣ−ライソザイムの構造安定性評価
上記の操作によってライソザイム濃度を算出されたサンプル溶液と同濃度のＦＩＴＣ未修飾ライソザイム溶液についてＣＤスペクトル測定を行った（本測定ではライソザイム濃度を０．０５ｍｇ／ｍＬに調整）。
ＣＤスペクトル測定条件
開始波長：３００  ｎｍ
終了波長：２０５  ｎｍ
積算回数：３回
データ間隔：０．５  ｎｍ
レスポンス：１  ｓｅｃ
バンド幅：１．０  ｎｍ
光路長：１  ｃｍ
感度：５０  ｍｄｅｇ
操作感度：２００  ｎｍ／ｍｉｎ【００４６】
サンプル溶液中の各化合物定量結果を表７及び図６に示した。【００４７】
【表７】
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【００４８】
合成したＦＩＴＣ−ライソザイムとｎａｔｉｖｅライソザイムのライソザイム濃度を合わせてＣＤスペクトル測定を行ったところ、スペクトルの波形・強度の一致が確認された。したがって、今回合成したＦＩＴＣ−ライソザイムはＦＩＴＣ修飾による変性はないものと考えられる．
ＦＩＴＣの吸光度から検量線を使い、合成したＦＩＴＣ−ライソザイムを会合体への担持・徐放評価を行った。【００４９】
ＦＩＴＣ−ライソザイムへのＲＡＤＡプレコート
ＦＩＴＣ−ライソザイムは、１４ｋＤａであり、その構造内に８つのＣｙｓ残基を有し、その全てが−Ｓ＝Ｓ−を形成している。【００５０】
ＦＩＴＣ−ライソザイム（２×ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ，２．０ｍＬ）に対してＲＡＤＡＧＧＧＣ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水溶液０．５ｍＬ、１、５、１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ−ライソザイム）を添加し、暗所室温で１６時間撹拌した。この時、溶液中でＦＩＴＣ−ライソザイムの濃度は０．４ｍｇ／ｍＬとなっているため、未反応のＲＡＤＡＧＧＧＣを除く精製操作は行わずにＲＡＤＡＧＧＧＣプレコートＦＩＴＣ−ライソザイムサンプルとして使用した。また、比較として、末端改変されていないＲＡＤＡ１６も同様の重量比率及び操作を用いてＦＩＴＣ−ライソザイムと混合・撹拌した。【００５１】
プレコートに用いるＲＡＤＡ水溶液濃度・条件を示す。【００５２】
【表８】
2016075977.tif 000009
【００５３】
＊添加当量は、１ｍｏｌのライソザイムに対するＲＡＤＡの添加モル量を意味する。【００５４】
上記操作によってＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ−ライソザイムを調製した。ＲＡＤＡ１６を用いることでＦＩＴＣ−ライソザイムを物理的に被覆したサンプルを、ＲＡＤＡＧＧＧＣを用いることでＦＩＴＣ−ライソザイムに存在するＣｙｓ残基中のチオールとのジスルフィド結合（ＦＩＴＣ−ライソザイムに対して化学修飾）を狙ったサンプルの２種類を調製した。ＦＩＴＣ−ライソザイムは分子内に８個のＣｙｓ残基を有し、その全てが分子内ジスルフィド結合に関与しているため、ｆｒｅｅのＣｙｓは存在しないが、ジスルフィド結合を形成しているＣｙｓ残基中のチオールを介し、ＲＡＤＡＧＧＧＣが交換反応によってライソザイムと結合することを狙いプレコートを行った。ＦＩＴＣ−ＢＳＡと同様に、このＲＡＤＡプレコート手法によって、ライソザイムに対して実際にＲＡＤＡＧＧＧＣが化学修飾出来ているか確認は行えていないが、以降の担持・徐放検討及び、溶菌活性試験を行うことで、ＲＡＤＡプレコートの意義とそのライソザイムについて評価を行った。【００５５】
１．ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳのＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液の濃度を２．０ｍｇ／ｍＬに調整した。
２．予めＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣでプレコートを行ったＦＩＴＣ−ＢＳＡ（ＲＡＤＡのプレコート添加当量：１，５，１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ−ライソザイム）及びプレコートを行っていないＦＩＴＣ−ライソザイムを、ＦＩＴＣ−ライソザイム濃度が０．４ｍｇ／ｍＬになるよう調整した（溶媒終濃度：１．６×ＰＢＳ）。
３．上記１，２それぞれの溶液をマイクロチューブ中に７５０μＬずつ等量添加・混合し、３０分間バスソニケーターを用いて超音波を当てた。（内包時濃度…ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ：１．０ｍｇ／ｍＬ，ＦＩＴＣ−ライソザイム：２００μｇ／ｍＬ）
４．超音波終了後、うち１ｍＬを１００，０００ｒｐｍ，３０分間遠心し、上澄みの溶液を取れる限り全量分取した。
５．上澄みのサンプルをそれぞれ９６ウェルプレートに１００μＬ添加し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定した。［観測波長：４９４ｎｍ］
６．ＲＡＤＡ未プレコートＦＩＴＣ−ライソザイム、及び、ＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣを１０等量プレコートしたＦＩＴＣ−ライソザイムの３サンプルについては、徐放挙動を測定するため、それぞれの遠心管に新たなＰＢＳ、または会合体の崩壊を加速させることが既知である１Ｍ  ＮａＯＨを３００μＬ添加した。
７．一定時間ごとに、溶媒に放出されるＦＩＴＣ−ライソザイムの吸光度を測定した（９６ウェルプレートに１００μＬ添加、４９４ｎｍにおける吸光度を測定し、測定後使用した１００μＬのサンプルは遠心管に全量戻した。）。【００５６】
結果を図８〜１１に示した。
まず担持量について考察する。ＲＡＤＡをプレコートしていないフリーＦＩＴＣ−ライソザイムと比較した際、ＲＡＤＡをプレコートしたサンプルにおいて担持量の向上が観測された。また、この担持量向上のライソザイムは、ＲＡＤＡの添加当量を上げることでさらに向上可能であるということが分かった。さらに２種のＲＡＤＡにおいて比較すると、ＦＩＴＣ−ライソザイムへの物理的被覆であるＲＡＤＡ１６より、ＦＩＴＣ−ライソザイムへのジスルフィド結合という化学修飾が示唆されるＲＡＤＡＧＧＧＣにおいてより担持量が向上するという結果が得られた。この結果は、ＦＩＴＣ−ライソザイムをＲＡＤＡでプレコートするという手法によって、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳ会合体のＲＡＤＡコアへと分子間βシート構造形成を介し、効率的に担持されたためであると考えられる。以上の結果は、先に行ったＦＩＴＣ−ＢＳＡと同様の傾向を示すものであり、これによりＲＡＤＡプレコート手法が種々のタンパク質の担持量向上において適用可能であることが示唆された。【００５７】
次に放出挙動について考察する。本実験では、会合体からのＦＩＴＣ−ライソザイムの徐放挙動を測定するにあたり、溶媒としてＰＢＳと会合体の崩壊を加速させることが既知である１Ｍ  ＮａＯＨとの２種類を使用した。上段には、内包量に対する放出量の割合を、放出率として示したグラフを、下段には放出されたＦＩＴＣ−ライソザイムの重量を縦軸にしたグラフを示した。２種の溶媒について比較すると、会合体の崩壊が観測されないＰＢＳ中では、ＦＩＴＣ−ライソザイムの放出はほぼ観測されず、会合体の崩壊が示唆される塩基性条件では、会合体の崩壊に伴い、担持量の６０％程度の放出が観測された。また、１Ｍ  ＮａＯＨ中での各サンプルのリリースを比較すると、ＲＡＤＡ未修飾のＢＳＡと比較した際、ＲＡＤＡをプレコートしたＦＩＴＣ−ＢＳＡにおいてスローリリースが達成され、またこのライソザイムはＲＡＤＡ１６よりＲＡＤＡＧＧＧＣにおいて顕著であるという結果が得られた。これは、ＲＡＤＡの自己組織化特性により、ＢＳＡがβシート構造形成を介して会合体コアへと効率的に担持されているとする内包量の結果と相関のとれた結果であると考えられる。【００５８】
また、担持量と放出量の物質収支について考察すると、１Ｍ  ＮａＯＨを使用した系において、６時間までの間に担持量の８０％程度を放出したという結果が得られた。ＦＩＴＣ−ＢＳＡを用いた系では６時間までの間に担持量のほぼ全量を放出するという結果が得られたため、これについてはＰＥＧ／ＲＡＤＡ−ｇ−ＣＳとライソザイムとの何か特異的な結合が関与していると考えられる。一般にＲＡＤＡを用いたバルクゲルでは、タンパク質の放出挙動は、タンパク質の分子量に大きく依存し、電荷についてはあまり影響を受けないということが知られている（Koutsopoulos, S. et al. PNAS. 2009, 106, 4623-4628、Hosseinkhani, H. et al. Chem. rev. 2013, 113, 4837-4861）。そのため、ＦＩＴＣ−ＢＳＡと比較して分子量の小さいＦＩＴＣ−ライソザイムではＦＩＴＣ−ＢＳＡよりも早い放出挙動が得られると考えていたが、今回得られた結果では、ＲＡＤＡをプレコートしていないＦＩＴＣ−ライソザイムにおいてもＰＢＳ中での放出が大きく抑制されており、ＲＡＤＡのマクロゲルが示す特性とは異なる結果が得られた。本会合体はＲＡＤＡのほか、構成成分としてＰＥＧとＣＳを含むため、このいずれかとライソザイムの特異的な結合により、このような結果が得られたと考えているが詳細については考察・検討中である。【００５９】
ＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ−ライソザイムの機能評価
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ溶液の調製
１×ＰＢＳ＊を用いてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４６９８）１５０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、光路長１ｃｍのセルを用いて溶液のＵＶスペクトルを測定し、４５０ｎｍにおける吸光度が０．６−０．７になっていることを確認した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓを用いたライソザイムの溶菌活性では、終濃度が１００μｇ／ｍＬを採用することとした。
＊１×ＰＢＳ…１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，８．０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４【００６０】
Ｌｙｓｏｚｙｍｅの溶菌活性評価（Davies, R. C. et al. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 1968, 178, 294-503）
１．光路長１ｃｍのブラックセルに６６６μＬのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）と１ｘＰＢＳ  ２３４μＬを添加した。
２．そこへ別途調製した１００μＬのライソザイムサンプル溶液を添加した。なお、ペプチドプレコートライソザイムサンプルは、ライソザイムとペプチド溶液を混合後、暗所で１６時間反応させることで調製した後、引き続く溶菌活性評価に用いた。
３．ライソザイムサンプルを添加後、素早く１０回ピペッティングした後、直ちに測定を開始し、４５０ｎｍにおける吸光度をモニターした。
４．開始直後から６０秒後までの４５０ｎｍの吸光度の減少速度を直線近似の傾きから算出し、ライソザイムの溶菌活性とした。
５．ペプチドを添加しないライソザイムの活性を１とした場合のペプチドプレコートサンプル（プレコート条件は，ライソザイム：ＲＡＤＡ又はＧＧＧＣ−ＲＡＤＡ＝１：１，１：１０，１：１００の３種）の溶菌活性を比較することで、ペプチドコートによるライソザイムの溶菌活性残存率を算出した。ここで、サンプルの総体積は１０００μＬとし、終濃度はそれぞれＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ；１００μｇ／ｍＬ，ライソザイム；６μｇ／ｍＬに統一した。【００６１】
図１２には、ライソザイムの溶菌活性を１とした際のペプチドコートライソザイムの溶菌活性を示す。ＲＡＤＡ１６，ＲＡＤＡＧＧＧＣともにプレコートによるライソザイムの失活は安定に保持されていることが確認された。この結果、タンパク質に対するペプチドコートは、タンパクの活性を保持したまま、安定かつ高効率にナノゲル中に担持させることが可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のナノゲルは、プロテインデリバリーのために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016075977.tif 000023
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