(57)【要約】  本発明は、治療用角膜内皮代替細胞を効率的に製造する方法の提供、特に眼内（前房内）への移植に適した状態で多量に安定して製造できる方法の提供を課題とする。さらに本発明は、眼内、特に前房内への投与に好適な移植用組成物の提供を目的とする。幹細胞をＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤を含む分化誘導培地で浮遊培養することで治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造することができる。該スフェアあるいは単一細胞化した培養角膜内皮細胞を眼内（前房内）に移植する際、粘弾性物質を添加することにより、移植後の接着細胞数を増加させることが可能となる。
2016093359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を分化誘導培地で浮遊培養して治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造する方法であって、該分化誘導培地がＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
該分化誘導培地がさらにＮ２サプリメント、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＧＳＫ３阻害剤が、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法により得られた治療用角膜内皮代替細胞スフェア。
【請求項１０】
移植用である、請求項９記載のスフェア。
【請求項１１】
前房内への移植用である、請求項１０記載のスフェア。
【請求項１２】
治療用角膜内皮代替細胞スフェア、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物。
【請求項１３】
培養角膜内皮細胞、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物。
【請求項１４】
前房内への移植用である、請求項１２又は１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
治療用角膜内皮代替細胞スフェアが請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法により得られたものである、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
培養角膜内皮細胞が単一細胞化されたものである、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
粘弾性物質がヒアルロン酸及び／又はコンドロイチン硫酸である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ヒアルロン酸濃度が５〜４０ｍｇ/ｍｌである請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
コンドロイチン硫酸濃度が請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
インスリン、ＥＧＦおよびｂＦＧＦをさらに含む、請求項２０記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から治療用角膜内皮代替細胞を製造する、特に、幹細胞から浮遊培養による細胞凝集体（スフェア）を経て治療用角膜内皮代替細胞へと誘導する方法に関する。さらに、本発明は治療用角膜内皮代替細胞のスフェアを含有する移植用の医薬組成物、及び培養角膜内皮細胞を含有する移植用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に達することで認識される。つまり、角膜は、生体が視覚情報を得る際に光が通る通路の前面に位置する。したがって、損傷等により角膜に濁りが生じることは、視覚機能に重大な影響を及ぼす。【０００３】
角膜は、組織学的には、外表面側から、角膜上皮、角膜実質、及び角膜内皮の３層からなる構造を有する。角膜の透明性は、角膜内皮のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅによるＮａ＋能動輸送（ポンプ機能）とバリア機能（ＺＯ−１等のタイトジャンクションタンパク質）により、含水率が一定に保たれることにより保持されている。【０００４】
角膜内皮細胞の減少などの角膜内皮の損傷により、上記の角膜内皮細胞の機能が損なわれ、角膜実質部に浮腫が生じる。これは角膜の透明性の低下を招き、視力を低下させる。このような状態は、水疱性角膜症と呼ばれている。一方で、ヒトの角膜内皮細胞は、一度障害を受けると再生する能力をほとんど持たないことが知られている。従って、なんらかの傷害により角膜内皮細胞が減少した場合、その治療は角膜移植が有効な、場合によって唯一の手段となる。実際、角膜移植適応例の約半数は角膜内皮機能不全による水疱性角膜症が占める。【０００５】
現在、角膜内皮損傷患者は、角膜の上皮、実質及び内皮の３層構造の全てを移植する全層角膜移植により処置されている。全層角膜移植は、確立された技術ではあるが、日本での角膜提供は不足しているのが現状であり、また、拒絶反応が問題となる。かかる問題点を解消するために、損傷を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」が普及しつつある。角膜内皮を温存して、ドナーの上皮と実質のみを移植する深層層状角膜移植（Deep Lamellar Keratoplasty：ＤＬＫＰ）（非特許文献１および２）や内皮を含む一部の角膜だけを移植する角膜内皮移植（特許文献１および２、非特許文献３）等が知られている。しかしながら、例えば角膜内皮移植の場合、その移植材料の供給源となるのは依然として角膜内皮そのものであり、角膜の提供者が限られていることを鑑みれば、全層角膜移植同様、ドナー不足の問題点を克服することができない。さらに角膜内皮細胞は培養が難しく、移植に十分な数の培養細胞を調製することには時間的及び費用的な負担が大きい。【０００６】
本発明者らは、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell：人工多能性幹細胞）等の幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法（特許文献３）及びｉＰＳ細胞等の幹細胞から角膜内皮細胞の単層細胞シートを製造する方法を報告している（特許文献４）。
一方、虹彩実質組織から細胞凝集体を形成し角膜内皮細胞へと分化させる方法（特許文献５）やヒト培養角膜内皮細胞を細胞凝集体の状態で培養する試みが報告されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２４８５２号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８６９号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１３／０５１７２２
【特許文献４】特願２０１３−１５０９９３
【特許文献５】特開２００９−２６８４３３号公報
【特許文献６】特開２００６−１８７２８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Aggarwal RK. Br J Ophthalmol1997;81:178-179.
【非特許文献２】Shimmura S. et al., Cornea 2005; 24(2):178-81.
【非特許文献３】Price FW Jr, Price MO. J Refract Surg. 2005;21(4):339-45.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、眼内（前房内）への移植に適した状態で、角膜内皮機能不全を治療可能な、角膜内皮細胞の代替細胞である治療用角膜内皮代替細胞を多量に安定して製造することである。さらに本発明は、本発明の方法により得られた治療用角膜内皮代替細胞を含む移植用の組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、幹細胞を特定の分化誘導条件下で浮遊培養することによって細胞凝集体（スフェア）を形成させ、当該スフェアを移植に用いることによって、移植後速やかに角膜内皮細胞層の代替となる組織構築を達成することが可能となり、優れた角膜内皮機能が得られることを見出して本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］幹細胞を分化誘導培地で浮遊培養して治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造する方法であって、該分化誘導培地がＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤を含むことを特徴とする、方法。
［２］該分化誘導培地がさらにＮ２サプリメント、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、上記［１］記載の方法。
［３］ＧＳＫ３阻害剤が、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、上記［１］に記載の方法。
［４］ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、上記［１］に記載の方法。
［５］レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、上記［１］に記載の方法。
［６］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞である、上記［６］記載の方法。
［８］幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［９］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法により得られた治療用角膜内皮代替細胞スフェア。
［１０］移植用である、上記［９］記載のスフェア。【００１２】
［１１］前房内への移植用である、上記［１０］記載のスフェア。
［１２］治療用角膜内皮代替細胞スフェア、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物。
［１３］培養角膜内皮細胞、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物。
［１４］前房内への移植用である、上記［１２］又は［１３］記載の医薬組成物。
［１５］治療用角膜内皮代替細胞スフェアが上記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法により得られたものである、上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１６］培養角膜内皮細胞が単一細胞化されたものである、上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１７］粘弾性物質がヒアルロン酸及び／又はコンドロイチン硫酸である、上記［１２］〜［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］ヒアルロン酸濃度が５〜４０ｍｇ/ｍｌである上記［１７］記載の医薬組成物。
［１９］コンドロイチン硫酸濃度が５〜５０ｍｇ／ｍｌである上記［１７］又は［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、上記［１２］〜［１９］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２１］インスリン、ＥＧＦおよびｂＦＧＦをさらに含む、上記［２０］記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、より効率的に幹細胞から治療用角膜内皮代替細胞を製造することができる。本発明によって製造された治療用角膜内皮代替細胞スフェアは、細胞間タイトジャンクションを保っている為、当該スフェアをそのまま前房内に注入し移植することで、移植後すみやかに角膜内皮組織構築を達成することができ、上皮−間葉移行（ＥＭＴ）を防止することが可能となる。
また、治療用角膜内皮代替細胞スフェアを本発明の医薬組成物として投与することで、治療用角膜内皮代替細胞を移植部位に効率的に滞留・接着させることが可能となる。
本発明によれば、治療用角膜内皮代替細胞スフェアあるいは培養角膜内皮細胞をヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等の粘弾性物質とともに前房内に投与し移植することで、それらの細胞を移植部位に効率的に滞留・接着させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞から浮遊培養により製造した治療用角膜内皮代替細胞スフェアの顕微鏡写真を示す図である。
【図２】本発明のスフェアにおいて、細胞境界にタイトジャンクションが形成されていることを示した図である。細胞境界にＺＯ−１及びＣＬＤＮ７を発現していることがわかる。
【図３】本発明のスフェアを、通常の接着培養用ディッシュで培養（接着培養）すると該スフェアから細胞が周囲に広がっていくことを示した図である。各図は順次倍率を高くしたものである。
【図４】本発明のスフェア由来の治療用角膜内皮代替細胞において、細胞境界にタイトジャンクション及び接着結合が形成されることを示した図である。細胞境界にＺＯ−１及びＮ−カドヘリンの発現が見られた。さらに細胞膜上にＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅの発現も確認された。
【図５】本発明のスフェア由来の治療用角膜内皮代替細胞において、十分なポンプ機能が得られることを示したグラフである。Ｕｓｓｉｎｇチャンバーを用いた電圧測定によりポンプ機能を調べた。対象として角膜内皮細胞の株化細胞であるＢ４Ｇ１２を用いた。
【図６】本発明のスフェア由来の治療用角膜内皮代替細胞においてＥＭＴが生じているか否かを検証した図である。左図は免疫蛍光染色によりα−ＳＭＡの発現を調べた図であり、右図はアクチンのファロイジン染色によりストレスファイバーが形成されているか否かを調べた図である。
【図７】治療用角膜内皮代替細胞スフェア及び粘弾性物質を含有する本発明の移植用医薬組成物を用いて（あるいは用いずに）治療用角膜内皮代替細胞スフェアをウサギの前房内に注入（移植）した後、２日目の移植眼の角膜後面を示した図である。本発明の移植用医薬組成物を用いて注入した場合にはフィブリンの沈着は認められず（Ａ、Ｂ）、抗ヒト核抗体で核が染色されるｉＰＳ由来治療用角膜内皮代替細胞が広がって角膜後面を覆っていることが示された。さらにタイトジャンクションの形成が維持されていた（Ｃ）。
【図８】本発明のスフェアをカニクイザル眼に移植し、角膜浮腫について調べた結果を示す図である。対照には、スフェアを注入せずに角膜内皮細胞を剥離した（Ａ）。移植眼では角膜内皮を剥離した上でスフェアを注入した（Ｂ）。移植眼では角膜浮腫が抑制され、角膜厚を維持できていることがわかった（Ｃ）。
【図９】培養角膜内皮細胞及び粘弾性物質を含有する本発明の移植用医薬組成物を用いて（あるいは用いずに）培養角膜内皮細胞をウサギの前房内に注入（移植）した後、２日目の移植眼の角膜後面における、接着した細胞の密度を評価したグラフである。粘弾性物質を添加することにより、移植後の接着細胞の増加が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
本発明において「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化し得る細胞をいうが、中でも角膜内皮細胞に分化し得る細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞）、体細胞由来人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられ、角膜内皮細胞への分化誘導が可能なものが挙げられる。より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞及び角膜実質由来の神経堤幹細胞である。神経堤幹細胞とは、自己複製能と多分化能を持つ多能性の幹細胞であり、脊椎動物の発生過程では、神経管の背側から体中に移動し、様々な組織の形成に寄与することが知られている。角膜内皮は角膜実質と同じく神経堤由来とされている。
【００１６】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
【００１７】
ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Nature. 2008 Jul 31;454(7204):646-50）、低分子化合物を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 Jan 9;4(1):16-9、Cell Stem Cell. 2009 Nov 6;5(5):491-503）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4）など、ｉＰＳ細胞の作成法については技術的な改良が鋭意行なわれているが、作製されたｉＰＳ細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明の方法に用い得る。
本発明では、より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を用いる。神経堤幹細胞を用いることで治療用角膜内皮代替細胞への分化誘導が容易になる。ｉＰＳ細胞からの神経堤幹細胞の誘導は当分野で知られている手法に従って、あるいはそれに準じた方法で実施することができる。例えばNature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701あるいは、Nature, 2010 vol.463, 958-964に記載された方法に準じて実施することができる。
【００１８】
体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、角膜内皮細胞へと分化し得る細胞であり、例えば角膜実質に由来する神経堤幹細胞（Corneal-derived progenitors：ＣＯＰｓ）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells）、皮膚由来多能性前駆細胞（skin-derived precursors：ＳＫＰｓ）等が挙げられる。好ましくはＣＯＰｓ及びＳＫＰsである。ＣＯＰｓは、例えば、Stem Cells. 2006;24(12):2714-2722に記載の方法によって調製することができる。具体的には、マウス角膜から上皮、内皮を取り除いた後の角膜実質をコラゲナーゼ処置し、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）、Ｂ２７サプリメント、ＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で分離した細胞を培養することによって調製する。ＳＫＰｓは、例えばNat Cell Biol., 2001 vol. 3, 778-784に記載された方法に準じて調製することができる。
【００１９】
１．治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造方法
本発明の製造方法は、幹細胞から治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造する方法であり、特定の組成からなる分化誘導培地で幹細胞を浮遊培養する工程を含む。
本発明において、「治療用角膜内皮代替細胞」とは、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から誘導される、角膜内皮機能不全を治療可能な、角膜内皮細胞の代替となり得る細胞である。即ち、治療用角膜内皮代替細胞は角膜内皮細胞と同等の生理機能を有する。
本発明の製造方法によって製造される治療用角膜内皮代替細胞スフェア（以下、本発明のスフェアとも称する）は、数十個乃至数百個の細胞が凝集した細胞の塊であって、一般的に球状を呈する。ここで「球状」とは、完全に球形である場合に加え、卵形やラグビーボール状といった略球形の形状であることを含む。
該スフェアは、例えば、直径が２０〜２０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは３０〜１５００μｍの範囲であり、特に好ましくは４０〜１０００μｍの範囲である。
【００２０】
本発明の製造方法において用いる分化誘導培地（以下、本発明の分化誘導培地とも称する）は、ＧＳＫ３（Glycogen synthase kinase 3）阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ（Rock kinase）阻害剤を含む。
【００２１】
本工程で用いる幹細胞は上述の通りであるが、好ましくは角膜内皮細胞への分化が運命付けられた細胞であり、具体的には、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞及び角膜実質由来神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）である。皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）を用いることもまた好ましい。例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等のより未分化な幹細胞を用いる場合には上記工程の前に、神経堤幹細胞へと誘導する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。かかる工程は、例えば、Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載の方法、及びそれに準じた方法によって実施することができる。
【００２２】
セリン／スレオニンプロテインキナーゼであるＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３には異なる遺伝子にコードされアミノ酸レベルで高い相同性を有するＧＳＫ３αとＧＳＫ３βのアイソフォームが存在する。また、ＧＳＫ３βがＷｎｔシグナルにも関与し、ＧＳＫ３βを阻害することによりＷｎｔシグナルが活性化されることが知られている。ＧＳＫ３阻害剤として、ＧＳＫ３α阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤として、具体的にはＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ケンパウロン（Kenpaullone）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime）、ＴＷＳ−１１９、ＳＢ４１５２８６、およびＲｏ３３０３５４４等が例示される。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本工程では、好ましくは、ＢＩＯが用いられる。ＧＳＫ３阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＢＩＯの場合、通常１０〜１０００ｎＭ、好ましくは５０〜１０００ｎＭ、より好ましくは５００ｎＭ程度である。１種又は２種以上のＧＳＫ３阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２３】
本工程で用いるレチノイン酸としては、全トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シス−レチノイン酸、１１−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸などが例示される。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本工程では、好ましくは、全トランス−レチノイン酸である。レチノイン酸の培地中の濃度は、用いるレチノイン酸の種類によって適宜設定されるが、全トランス−レチノイン酸の培地中の濃度は、通常１〜１０００ｎＭ、好ましくは１０〜１０００ｎＭ、より好ましくは１００ｎＭ程度である。本発明の医薬組成物においては、レチノイン酸は脂肪酸でエステル化されていてもよく、医療用レチノールパルミチン酸エステルの場合、通常２〜２００単位／ｍｌ、好ましくは４０〜１５０単位／ｍｌ、より好ましくは１００〜１２０単位／ｍｌ程度で用いる。
【００２４】
ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質をいう。Ｒｈｏキナーゼとは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種で、アミノ末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する。
本工程で用いるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−９）、Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）が挙げられる。
これらはいずれも商業的に入手可能であり、なかでも特にＹ−２７６３２が好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、Ｙ−２７６３２の場合、通常５〜２０μＭ、好ましくは１０μＭ程度である。１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２５】
本発明の分化誘導培地には、上記したＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤に加え、さらに、Ｎ２サプリメント、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ（Basic Fibroblast Growth Factor）が含まれていてもよく、また含まれていることが好ましい。
【００２６】
Ｎ２サプリメントは、神経系細胞の培養に汎用される血清代替品であり、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む試薬であり、商業的に入手可能である。細胞の培養に用いられる通常の濃度で使用することができ、例えば市販のＮ２サプリメントをそのマニュアルに従って添加する。
【００２７】
ＥＧＦ（上皮成長因子）は、５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合からなるタンパク質である。細胞表面に存在するＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割を果たす。本発明で用いるＥＧＦの由来は、本発明のスフェアの製造に有効である限り、特に限定されないが、将来的に眼内への適用を考慮した場合、ヒト由来であることが好ましい。ＥＧＦは商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。例えば、既知の塩基配列、アミノ酸配列に基づいて合成することができる。ＥＧＦの培地中の濃度は、通常１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ程度である。
【００２８】
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）は、もともと生体内に存在するタンパク質の一種であり、細胞の増殖や分化の調節を行い、様々な組織及び臓器において、血管新生、平滑筋細胞成長、創傷治癒、組織修復、造血、神経細胞分化等の機能を有することが知られている。本発明で用いるｂＦＧＦの由来は、本発明のスフェアの製造に有効である限り、特に限定されないが、将来的に眼内への適用を考慮した場合、ヒト由来であることが好ましい。ｂＦＧＦは商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。例えば、既知の塩基配列、アミノ酸配列に基づいて合成することができる。ｂＦＧＦの培地中の濃度は、通常１〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ程度である。
【００２９】
本工程において、分化誘導培地中の各成分（以下、本発明の添加因子とも称する）は、培地中に同時に添加されてもよく、また、幹細胞から治療用角膜内皮代替細胞スフェアを誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。各添加因子は培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。また、形成されたスフェアを接着培養することにより、当該スフェアから治療用角膜内皮代替細胞の単層細胞層が伸展していく。かかる接着培養時の分化誘導には、ＧＳＫ３阻害剤を含有しない培地への培地交換が好ましい。
【００３０】
本工程で用いる培地は、上記した各添加因子を含有している限り特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）に各添加因子を添加してなるものである。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地、ハム培地、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute medium）１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｆ１２培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、商業的に入手可能である。さらに本工程で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合には、ウシ血清（Bovine Serum）、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）などの哺乳動物の血清が使用でき、該血清の培地中の濃度は０．１〜２０％、好ましくは１〜１０％である。好ましくは無血清培地であり、その場合、血清代替品が添加される。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地の混合培地である。
【００３１】
本工程で用いられる培地は必要に応じてビタミン、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）等を含有できる。
【００３２】
本工程は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で、治療用角膜内皮代替細胞スフェアへと誘導するに十分な期間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて浮遊培養することによって実施される。幹細胞としてｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞またはＣＯＰｓ、あるいはＳＫＰｓを用いる場合には、好ましくは７日〜２週間培養する。培養期間が短すぎるとスフェア形成が十分でない可能性があり、長すぎるとスフェアが治療用としては大きくなりすぎる可能性がある。必要に応じて適宜培地交換を行う（例、３日に１回）。上述のように必要に応じて、各添加因子の種類（組合せ）を変えることができ、また好ましい。浮遊培養開始後２日目程度からスフェアが形成され始める。
【００３３】
ここで、「浮遊培養」とは、細胞を培養基材へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によりコーティング処理）されていない培養基材、あるいは人工的に細胞との接着を抑制する処理（例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）によりコーティング処理）した培養基材を使用して行うことができる。培養基材としては、例えばディッシュ、シャーレやプレート（６ウェル、２４ウェル等のマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等）、フラスコ、チューブ、ローラーボトル、スピンナーフラスコ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよい。
【００３４】
本工程において、幹細胞から治療用角膜内皮代替細胞スフェアが製造されたことの確認は、顕微鏡を用いて目視により行うことができる。さらに本発明のスフェアは細胞境界にタイトジャンクションが形成されていることから、細胞境界におけるタイトジャンクションに特異的な分子のタンパク質レベルあるいは遺伝子レベルでの発現を確認することにより確認することができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、ＺＯ−１、ＣＬＤＮ７等が挙げられる。
【００３５】
形成された治療用角膜内皮代替細胞スフェアをそのまま接着培養することにより、治療用角膜内皮代替細胞層を製造することができる。接着培養されたスフェアから治療用角膜内皮代替細胞層が培養基材上に広がる。このスフェアから広がった細胞層もタイトジャンクションを保ち、角膜内皮細胞に特徴的なＮ−カドヘリンによる接着結合が形成される。当該細胞はまた、Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を有する。Ｎ−カドヘリンによる接着結合の確認はタンパク質レベル（例、抗原抗体反応を利用した方法）あるいは遺伝子レベル（例、ＲＴ−ＰＣＲを利用した方法）での発現を確認することにより行うことができる。細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能は、例えばUssing chamberを用いてInvestigative Ophthalmology & Visual Science, 2010 vol. 51, No. 8, 3935-3942やCurrent Eye Research, 2009 vol. 34, 347-354に記載の方法に従って測定することができる。
【００３６】
簡便には、細胞形態を評価することによっても治療用角膜内皮代替細胞層への分化誘導を確認することができる。内皮細胞へと分化した細胞はモザイク状の増殖形態を示す。
【００３７】
本発明により、ｉＰＳ細胞、皮膚幹細胞、その他各種の体性幹細胞から浮遊培養により治療用角膜内皮代替細胞層の前駆状態である治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造することができる。このスフェアは細胞間タイトジャンクションを保っている為、スフェアをそのまま前房内に注入し移植することができ、また好適である。
【００３８】
２．医薬組成物
本発明は、治療用角膜内皮代替細胞スフェア及び粘弾性物質を含有する医薬組成物、特に移植用医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、培養角膜内皮細胞及び粘弾性物質を含有する医薬組成物、特に移植用医薬組成物を提供する。本明細書中、これらを総称して本発明の医薬組成物と略記する場合がある。当該医薬組成物は、治療用角膜内皮代替細胞あるいは培養角膜内皮細胞を眼内に移植、特に前房内に移植するのに好適に用いられる。粘弾性物質を含めることによってスフェアや細胞を拡散させることなく移植を必要とする部位に効率的に接着させることが可能となる。
治療用角膜内皮代替細胞スフェアとしては上記「１．治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造方法」により製造されたものが挙げられる。
培養角膜内皮細胞としては、初代培養細胞であっても株化細胞であってもよいが、角膜内皮細胞は初代培養が難しいことから、株化細胞を用いることが好ましい。培養角膜内皮細胞は、単一細胞化されていることが好ましいが、角膜への接着が可能な範囲で、必要に応じて２〜数個の細胞、１０〜数十個の細胞等の細胞塊の状態で用いることもできる。
「粘弾性物質」としては、スフェアあるいは細胞を含有する移植用の溶液（以下、移植用溶液と略記する場合がある）に適度な粘性を付与することができる物質であれば特に限定されないが、好ましくはヒアルロン酸及び／又はコンドロイチン硫酸であり、より好ましくはヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸である。これらの成分は通常眼科領域で利用されている物質であり、副作用の懸念なく使用することができる。
ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸は塩やエステルの形態で用いることもできる。例えばヒアルロン酸はヒアルロン酸ナトリウムとして、コンドロイチン硫酸はコンドロイチン硫酸エステルナトリウムとして市販されている（例、ビスコート（登録商標）０．５；ヒアルロン酸ナトリウムを３０ｍｇ／ｍｌの濃度で、コンドロイチン硫酸エステルナトリウムを４０ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ含む）ので、それらを用いることができ、また、簡便である。
ヒアルロン酸濃度は、通常、５〜４０ｍｇ/ｍｌであり、好ましくは１０〜３０ｍｇ/ｍｌであり、より好ましくは１５〜２５ｍｇ/ｍｌである。
コンドロイチン硫酸濃度は、通常、５〜５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１５〜４０ｍｇ/ｍｌであり、より好ましくは２０〜３５ｍｇ/ｍｌである。
【００３９】
粘弾性物質としてビスコート（登録商標）０．５を用いる場合にはスフェアあるいは細胞を含有する移植用溶液と１：１〜５、好ましくは１：１〜３の割合で移植用溶液と混合する。移植用溶液が多すぎると十分な粘性が得られず、投与したスフェアあるいは細胞の移植部位への十分な滞留が妨げられ、注入直後に創部からスフェアあるいは細胞が漏れ出す可能性がある。粘弾性物質が多すぎると眼圧の上昇が懸念される。
【００４０】
移植用溶液としては、眼内投与、特に前房内投与に適した溶液であれば特に限定されないが、非刺激性の等張化された培養液や生理食塩水、緩衝液等が用いられる。好ましくは治療用角膜内皮代替細胞スフェアあるいは培養角膜内皮細胞を培養していたのと同様の培養液を使用する。当該医薬組成物には必要に応じて各種の成分を含めることができる。該成分は、前房内に投与された（移植された）治療用角膜内皮代替細胞スフェアあるいは培養角膜内皮細胞が脱落することなく各内皮細胞層へ分化するのに有用なものであれば特に限定されないが、レチノイン酸及びＲＯＣＫ阻害剤を添加することが好ましい。またインスリン、ＥＧＦ及びｂＦＧＦも添加するのに好ましい成分である。
【００４１】
「レチノイン酸」、「ＲＯＣＫ阻害剤」及び「ｂＦＧＦ」としては、上記「１．治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造方法」で例示したものと同様のものが用いられる。レチノイン酸の医薬組成物中の濃度は、用いるレチノイン酸の種類によって適宜設定されるが、全トランス−レチノイン酸の場合、通常１０〜１０００ｎＭ、好ましくは２００〜８００ｎＭ、より好ましくは５００ｎＭ程度である。本発明の医薬組成物においては、レチノイン酸は脂肪酸でエステル化されていてもよく、医療用レチノールパルミチン酸エステルの場合、通常２〜２００単位/ｍｌ、好ましくは４０〜１５０単位/ｍｌ、より好ましくは１００〜１２０単位/ｍｌ程度で用いる。ＲＯＣＫ阻害剤の医薬組成物中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、Ｙ−２７６３２の場合、通常１〜１０μＭ、好ましくは５μＭ程度である。ＥＧＦの医薬組成物中の濃度は、通常１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７５ｎｇ／ｍｌ程度である。ｂＦＧＦの医薬組成物中の濃度は、通常０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１．５ｎｇ／ｍｌ程度である。５ｎｇ／ｍｌ程度での使用もまた好ましい。
インスリンとは、ペプチドの一種であり、動物、例えば、ウシ、ブタの膵臓から生産されたインスリンや遺伝子組換え技術により生産されたインスリンのいずれもが使用できるが、将来的に眼内への適用を考慮した場合、ヒト由来であることが好ましい。インスリンは商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。例えば、既知の塩基配列、アミノ酸配列に基づいて合成することができる。インスリンの医薬組成物中の濃度は、通常１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは７．５μｇ／ｍｌ程度である。５μｇ／ｍｌ程度での使用もまた好ましい。
【００４２】
医薬組成物中の治療用角膜内皮代替細胞スフェア懸濁液の細胞密度は、移植後、剥離範囲を被覆することができ、脱落することなく生着し治療用角膜内皮代替細胞層へ分化するのに十分な量であれば特に限定されないが、通常、１〜５×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で用いる。スフェア懸濁液における細胞密度の決定は、スフェア懸濁液の一部をサンプリングし、当該サンプル中のスフェアを酵素処理して細胞を１個ずつばらばらにして細胞数を計測し、その結果を用いて行う。
【００４３】
医薬組成物中の培養角膜内皮細胞懸濁液の細胞密度は、移植後、剥離範囲を被覆することができ、脱落することなく生着するのに十分な量であれば特に限定されないが、通常、１〜５×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で用いる。懸濁液における細胞密度の決定は、懸濁液の一部をサンプリングし、当該サンプル中の細胞数を計測し、その結果を用いて行う。
【００４４】
本発明の移植用医薬組成物の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物が挙げられるが、好ましくはヒトである。
本発明の移植用医薬組成物の投与量としては、投与対象の体重や年齢、症状などにより一概に規定されるものではないが、例えばヒトであれば一眼あたり５０〜２００μｌが前房内に投与される。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。【００４６】
実施例１：治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造と機能評価
１．ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞の調製
既報（Nature, 2010 vol.463, 958-964）に基づいてヒトｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞を得た。本実施例では、ｉＰＳ細胞を培養する際にマトリゲルを用いず浮遊培養した点が上記既報とは異なっている。浮遊培養することによってより効率的に神経堤幹細胞（ｉＰＳ−ＮＣＣ）へと分化誘導することができた。ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７（山中伸弥教授（京都大学）、岡野栄之教授（慶應義塾大学）から供与された）を用いた。
２．治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造
上記１．で得られたｉＰＳ−ＮＣＣをアキュターゼによる酵素処理にて単一細胞とした。これを低接着性プレート（又はディッシュ）（Ｎｕｎｃ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社等）内で１×１０４〜１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養した。
培地の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２サプリメント（１×）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＴＲＡ（１００ｎＭ）、ＢＩＯ（５００ｎＭ）及びＹ２７６３２（１０μＭ）を含む。
培養開始後２日目でスフェアの形成が確認された（図１）。
３．治療用角膜内皮代替細胞スフェアのタイトジャンクション
上記２．で得られたスフェアにおいて、細胞境界にタイトジャンクションが形成されているか否かを、ＺＯ−１及びＣＬＤＮ７の発現の有無を免疫蛍光染色法により調べることで確認した。
（１）ＺＯ−１染色
１次抗体：×２００希釈；ヤギ抗ＺＯ−１抗体（ＬＳ−ＢＩＯ、＃ＬＳ−Ｂ９７７４）
２次抗体：×２００希釈；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ抗ヤギ抗体（ライフテクノロジー、＃Ａ１１０５５）
（２）ＣＬＤＮ７染色
１次抗体：×２００希釈；ウサギ抗ＣＬＤＮ７抗体（アブカム、＃ａｂ２７４８７）
２次抗体：×２００希釈；Ｃｙ−３標識ロバ抗ウサギ抗体（ジャクソンラボ、＃７１１−１６５−１５２）
（３）ＤＡＰＩ染色（同仁化学研究所、＃Ｄ２１２）
結果を図２に示す。細胞境界にＺＯ−１及びＣＬＤＮ７の発現が観察された。この結果より、スフェアの段階で既に細胞間タイトジャンクションが形成されていることがわかった。
４．治療用角膜内皮代替細胞スフェアから製造された治療用角膜内皮代替細胞層の機能評価−１
上記２．で得られたスフェアを、さらに１週間以上浮遊培養した後、通常の接着培養用ディッシュ（イワキ、＃３０００−０３５）にて接着培養するとスフェアはディッシュに接着し、細胞が該スフェアから広がっていった（図３参照）。このスフェアから広がっていった細胞について種々のタンパク質の発現や機能を調べた。具体的には角膜内皮細胞に特徴的なＮ−カドヘリンの発現、細胞間タイトジャンクションに特徴的なＺＯ−１の発現、角膜内皮細胞の機能として重要なＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  α１の発現について調べた。
（１）ＺＯ−１染色
１次抗体：×１００希釈；ウサギ抗ＺＯ−１抗体（インビトロゲン、＃４０−２２００）２次抗体：×２００希釈；Ｃｙ−３標識ロバ抗ウサギ抗体（ジャクソンラボ、＃７１１−１６５−１５２）
（２）Ｎ−カドヘリン染色
１次抗体：×１００希釈；マウス抗Ｎ−カドヘリン抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック、＃ＭＡ１−２００２）
２次抗体：×２００希釈；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ抗マウス抗体（ライフテクノロジー、＃Ａ２１２０２）
（３）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  α１染色
１次抗体：×２００希釈；マウス抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  α１抗体（ノバス  バイオロジカルス、＃ＮＢ３００−１４６）
２次抗体：×２００希釈；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ抗マウス抗体（ライフテクノロジー、＃Ａ２１２０２）
結果を図４に示す。細胞境界にＺＯ−１の発現が観察されタイトジャンクション構造を保っていることが確認された（図４、左図）。また、角膜内皮細胞に特徴的なＮ−カドヘリンの発現が見られたことから接着結合も形成していることが確認された（図４、中図）。さらに、角膜内皮細胞の機能として重要であるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅも細胞膜上に沿って発現していた（図４、右図）。
さらに、上記２．で得られたスフェアをいったんスナップウェル（Corning、＃3801）に撒きなおし、６日間培養してコンフルエントにした後、Ussing chamber（Physiological Instrument; EM-CSYS-2）に挿入してウェルの表裏のshort circuit current （ＳＣＣ）を測定し、１０μＭのウワバイン添加前後のＳＣＣの差よりＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を定量した。対照として、ヒト角膜内皮細胞株であるＢ４Ｇ１２細胞（DSMZ、＃ACC-647）のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を定量した。結果を図５に示す。本発明のスフェアはヒト角膜内皮細胞株であるＢ４Ｇ１２細胞のポンプ機能と同等以上のポンプ機能を有していることがわかった。
５．治療用角膜内皮代替細胞スフェアから製造された治療用角膜内皮代替細胞層の機能評価−２
単層細胞シートの状態にある角膜内皮細胞を移植に使用する際、通常、細胞シートを酵素処理により単一細胞にして、細胞懸濁液として前房内に注入し角膜後面に接着させる。しかしながらこのような酵素処理は細胞にとってストレスであり、結果として間葉系の細胞形態に変化してしまう、即ち上皮−間葉移行（ＥＭＴ）を生じてしまうといった問題点があった。
本発明のようにスフェアを経由した場合でもＥＭＴが生じるのかを調べた。具体的には、ＥＭＴを獲得した細胞では上皮系から間葉系への発現マーカーの変化やアクチンストレスファイバーの再構築が誘導されることから、間葉系細胞のマーカー（例、α−ＳＭＡ、ＦＳＰ−１）の発現の有無、及びストレスファイバー形成の有無を調べた。
（１）α−ＳＭＡ染色
１次抗体：×２００希釈；ウサギ抗α−ＳＭＡ抗体（Ｂｉｏｓｓ、＃ｂｓ−０１８９Ｒ）２次抗体：×２００希釈；Ｃｙ−３標識ロバ抗ウサギ抗体（ジャクソンラボ、＃７１１−１６５−１５２）
（２）アクチン染色
×４０希釈；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（インビトロゲン、＃Ａ１２３７９）
結果を図６に示す。スフェアから得られた治療用角膜内皮代替細胞層ではα−ＳＭＡ陽性細胞を認めず、又ストレスファイバーも形成されていなかった。これらの結果からスフェアを経由する本発明の方法を用いて得られた治療用角膜内皮代替細胞ではＥＭＴが生じないことがわかった。【００４７】
実施例２：スフェア移植実験
１．治療用角膜内皮代替細胞スフェアを含有する移植用医薬組成物
上記２．で得られたスフェアを用いて、以下の手順で表１に記載の組成の移植用医薬組成物を調製した。
（１）ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＡＴＲＡ、Ｙ２７６３２、インスリン及びｂＦＧＦを添加した培地を調製する。
（２）（１）で得られた培地に細胞密度が１×１０７細胞／ｍｌとなるようにスフェアを混合し細胞懸濁液（×２）を調製した。
（３）（２）で得られた細胞懸濁液２００μｌにビスコート（登録商標）０．５  ２００μｌを添加して混合する。
ビスコート（登録商標）０．５には、日局精製ヒアルロン酸ナトリウム３０ｍｇ／ｍｌ、及びコンドロイチン硫酸エステルナトリウム４０ｍｇ／ｍｌが含まれている。【００４８】
【表１】
2016093359.tif 000003
【００４９】
２．スフェアの移植
（手順）
上記１．で調製した移植用医薬組成物を用いて、治療用角膜内皮代替細胞スフェアを以下の手順で眼前房内に移植した。
（１）ウサギの前房を生理食塩水還流させながら、内皮面をこすり、細胞を脱落させた。
（２）細胞が脱落した前房を生理食塩水で洗浄した。
（３）洗浄後、上記１．で調製した移植用医薬組成物を２６ゲージのシリンジを用いて前房内に注入した。
比較の為に、培地のみ注入した眼（Control；スフェアなし、ビスコートなし）、移植用医薬組成物を用いずにスフェアのみを注入した眼（スフェアあり、ビスコートなし眼）を準備した。
（４）２時間、ウサギをうつ伏せで安置した。
（５）２日間観察後、眼球を回収して肉眼的および顕微鏡的に観察した。
同様にカニクイザルについてもスフェアを前房内に注入した移植眼を作製した。
移植眼に対し、治療用角膜内皮代替細胞層の形成、角膜厚及び眼圧を測定した。
角膜厚は角膜厚測定装置（トーメーコーポレーション；SP-100）を、眼圧は眼圧測定装置（ホワイトメディカル；AccuPen（ACCUTOME社製））を、それぞれ用いて測定した。
（結果）
ウサギへの移植実験におけるControlと、「スフェアあり、ビスコートなし眼」では、術後２日後に回収した眼球の角膜後面には肉眼的および顕微鏡的にフィブリンの沈着が認められた（図７Ａ左、中）。「スフェアあり、ビスコートなし眼」を顕微鏡的に観察すると、フィブリンによりスフェアがからみとられていて角膜に接着できていない状態が観察された（図７Ｂ）
一方、上記手順で移植用医薬組成物を使用してスフェアを移植した場合、角膜後面へのフィブリンの沈着は認めなかった（図７Ａ右）。この眼球角膜を顕微鏡的に観察したところ、角膜後面に接着し広がって、移植後２日でタイトジャンクションを保った治療用角膜内皮代替細胞層を形成することができた（図７Ｃ）。ＺＯ−１及び核の染色は、実施例１に準じて行った。
さらに、本発明のスフェアを、角膜内皮細胞を剥離したカニクイザル前房内に移植し、移植直後、移植後１日及び２日の時点での移植眼における角膜厚を測定した。結果を図８に示す。移植眼では角膜浮腫が抑制され、角膜厚を維持できていることがわかる。また、眼圧の上昇も認められなかった。【００５０】
実施例３：培養角膜内皮細胞移植実験
１．培養角膜内皮細胞を含有する移植用医薬組成物
培養角膜内皮細胞株化細胞（Ｂ４Ｇ１２細胞）を酵素処理にて単一細胞とした。
ヒアルロン酸ナトリウム１５ｍｇ／ｍｌ及びコンドロイチン硫酸エステルナトリウム２０ｍｇ／ｍｌを添加した単一細胞化細胞懸濁液（懸濁液１）およびこれらを添加せず代わりにＰＢＳを添加した単一細胞化細胞懸濁液（懸濁液２）を調製した。ヒアルロン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸エステルナトリウム以外の添加物は、実施例２、表１に記載されているものと同様のものを同様の濃度で使用した。懸濁液１及び２とも、最終の細胞密度は１．０×１０５細胞／１００μｌとなるように調整した。
２．培養角膜内皮細胞の移植
（手順）
上記１．で調製した移植用医薬組成物を用いて、培養角膜内皮細胞を以下の手順で眼前房内に移植した。
（１）ウサギ（４羽）の前房を生理食塩水還流させながら、内皮面をこすり、角膜内皮細胞を直径８ｍｍの範囲で剥離させた。
（２）細胞が脱落した前房を生理食塩水で洗浄した。
（３）洗浄後、上記１．で調製した移植用医薬組成物を２６ゲージのシリンジを用いて前房内に１羽あたり２００μｌ（＝２．０×１０５細胞）ずつ注入した。単一細胞化懸濁液１を用いて調製した医薬組成物を注入した群（粘弾性物質添加群）、単一細胞化懸濁液２を用いて調製した医薬組成物を注入した群（ＰＢＳ添加群）、それぞれ２羽ずつ作成した。
（４）３時間、ウサギの体位を制限して細胞を角膜後面へ沈着させ接着させた。
（５）２日間観察後、眼球を回収して角膜後面の接着細胞の範囲および密度を評価した。
（結果）
粘弾性物質添加群のウサギでは、角膜内皮細胞が剥離した直径８ｍｍの範囲全体に亘って細胞の接着が確認された。一方、ＰＢＳ添加群のウサギでは、接着範囲は５ｍｍ×６ｍｍ程度と粘弾性物質添加群に比べて狭かった。
各ウサギにおいて、角膜内皮細胞を剥離した領域内で任意に４個所選択し、各箇所における接着細胞の数を顕微鏡下で測定しその密度を算出した。結果を下記表２及び図９に示す。
これらの結果より、培養角膜内皮細胞単一細胞化懸濁液の前房内注入法においても、粘弾性物質を添加することにより角膜後面への細胞の接着密度が有意に高くなることがわかった。【００５１】
【表２】
2016093359.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ｉＰＳ細胞、皮膚幹細胞、その他各種体性幹細胞から浮遊培養により治療用角膜内皮代替細胞層の前駆状態である細胞スフェアを製造することができる。このスフェアは細胞間タイトジャンクションを保っているため、スフェアをそのまま前房内に注入し移植すると、接着しそこから広がり、すみやかにタイトジャンクションを保った治療用角膜内皮代替細胞層の組織構築を達成することができ、かつ、細胞の単一細胞化等の刺激によって生じるＥＭＴも防止することが可能である。
従って、本発明は、誘導した治療用角膜内皮代替細胞を角膜後面に効率よく移植する方法を提供する。当該方法によってｉＰＳ細胞、皮膚幹細胞、その他の各種体性幹細胞から誘導した治療用角膜内皮代替細胞の臨床応用が可能となる。【００５３】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−２５１２３６（出願日２０１４年１２月１１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年5月26日(2016.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を分化誘導培地で浮遊培養して治療用角膜内皮代替細胞スフェアを製造する方法であって、該分化誘導培地がＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
該分化誘導培地がさらにＮ２サプリメント、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＧＳＫ３阻害剤が、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
治療用角膜内皮代替細胞スフェア、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物であって、該粘弾性物質が、５〜４０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸及び／又は５〜５０ｍｇ／ｍｌコンドロイチン硫酸である医薬組成物。
【請求項１３】
培養角膜内皮細胞、及び粘弾性物質を含有する移植用医薬組成物であって、該粘弾性物質が、５〜４０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸及び／又は５〜５０ｍｇ／ｍｌコンドロイチン硫酸である医薬組成物。
【請求項１４】
前房内への移植用である、請求項１２又は１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
治療用角膜内皮代替細胞スフェアが請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法により得られたものである、請求項１２又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
培養角膜内皮細胞が単一細胞化されたものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
インスリン、ＥＧＦおよびｂＦＧＦをさらに含む、請求項２０記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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