(57)【要約】  本発明の目的は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、脱髄疾患を効果的に予防又は治療できる医薬を提供することである。  ＦＧＦ２１にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があり、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞の投与が脱髄疾患の予防又は治療に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記有効成分がＦＧＦ２１である、請求項１に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記脱髄疾患が中枢神経系の脱髄疾患である、請求項１又は２に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
中枢神経系の脱髄疾患の後遺症の改善に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤。
【請求項６】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤。
【請求項７】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、脱髄疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
【請求項８】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤の製造のための使用。
【請求項９】
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分の髄鞘の修復剤の製造のための使用。
【請求項１０】
脱髄疾患の予防又は治療が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、その予防又は治療に有効な量を投与する工程を含む、脱髄疾患の予防又は治療方法。
【請求項１１】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に有効な量を投与する工程を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進方法。
【請求項１２】
髄鞘の修復が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、髄鞘の修復に有効な量を投与する工程を含む、髄鞘の修復方法。
【請求項１３】
脱髄疾患の予防又は治療の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
【請求項１４】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
【請求項１５】
髄鞘の修復の処理に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱髄疾患の予防又は治療剤に関する。より詳細には、本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、髄鞘を効果的に修復できる、脱髄疾患の予防又は治療剤に関する。更に、本発明は、脱髄疾患の予防又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は神経突起を伸ばして他の神経細胞と接触しており、この接触によって神経活動の伝播することで神経機能が担われている。脳と脊髄からなる中枢神経系では、大部分の神経突起の周りが髄鞘に覆われている。髄鞘は、神経活動の跳躍的な伝導を促すことで神経活動の伝播を加速させ、また、髄鞘内部の軸索の恒常性の維持にも寄与している。【０００３】
髄鞘の脱落により神経活動の伝達が破綻すると、多彩な神経症状が現れ、脱髄疾患と呼ばれる神経疾患が生じることが知られている。脱髄疾患は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の中枢神経系と、ギラン・バレー症候群や慢性炎症性脱髄性多発根神経炎等の末梢神経系の２つに大別される。中枢神経系の脱髄疾患の１つである多発性硬化症では、自己免疫系の異常な活性化によって時間的、空間的に脱髄病巣が生じ、視力障害、感覚障害、運動機能障害、自律神経障害等の症状があらわれる。多発性硬化症は、日本の有病率は１０万人あたり８〜９人とされ、国内で約１２０００〜１６０００人の罹患者が存在しており、多発性硬化症を初めとする脱髄疾患の根本的な治療方法の確立が緊急性のある課題となっている。【０００４】
髄鞘は、オリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖、遊走、分化を遂げて形成されることが知られている。そのため、脱髄疾患の治療には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することにより、脱落した髄鞘を修復させることが有効であると考えられている。しかしながら、従来、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できる薬剤は開発されておらず、脱髄疾患の治療は、ステロイドや免疫抑制剤投与やリハビリテーション等の対症療法が中心になっており、根本的な治療法は依然として確立できていない。【０００５】
一方、繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ；ＦＧＦｓ）は、血管新生、創傷治癒、細胞増殖に関与する成長因子として知られている。ＦＧＦには、２３個のサブタイプがあり、その中の１つであるＦＧＦ２１は、肝臓及び膵臓で高度に発現しており、栄養摂取、脂肪分解、糖代謝、体内時計制御等の多彩な活性を有することが明らかにされている。また、近年では、ＦＧＦ２１は、肥満、糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム等に対する治療薬として利用することも試みられている（例えば、特許文献１）。しかしながら、従来、ＦＧＦ２１が、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に及ぼす影響については明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／６６０７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、脱髄疾患を効果的に予防又は治療できる医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ＦＧＦ２１にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があり、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞の投与が脱髄疾患の予防又は治療に有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤。
項２．  前記有効成分がＦＧＦ２１である、項１に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項３．  前記脱髄疾患が中枢神経系の脱髄疾患である、項１又は２に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項４．  中枢神経系の脱髄疾患の後遺症の改善に使用される、項１〜３のいずれかに記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項５．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤。
項６．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤。
項７．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、脱髄疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
項８．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤の製造のための使用。
項９．  ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分の髄鞘の修復剤の製造のための使用。
項１０．  脱髄疾患の予防又は治療が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、その予防又は治療に有効な量を投与する工程を含む、脱髄疾患の予防又は治療方法。
項１１．  オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に有効な量を投与する工程を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進方法。
項１２．  髄鞘の修復が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、髄鞘の修復に有効な量を投与する工程を含む、髄鞘の修復方法。
項１３．  脱髄疾患の予防又は治療の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
項１４．  オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
項１５．  髄鞘の修復の処理に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体内のＦＧＦ２１量を増大させることにより、髄鞘の修復を担うオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することができ、脱髄疾患を効果的に予防又は治療することができる。また、本発明によれば、髄鞘の修復によって、中枢神経系の脱髄疾患の後遺症を改善することもできる。このように、本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させる手法を確立できており、脱髄疾患の根本療法として、脱髄疾患を罹患している患者に福音をもたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。
【図２】試験例２において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。
【図３】試験例３において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。
【図４】試験例４において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。
【図５】試験例５において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。
【図６】試験例５において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＭＢＰ陽性領域を計測した結果を示す。
【図７】試験例５において、脱髄モデルマウスの後肢の運動機能を解析した結果を示す。
【図８】試験例６において、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。
【図９】試験例５において、脳挫傷モデルマウスの脳組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．脱髄疾患の予防又は治療剤
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。
【００１３】
有効成分
本発明では、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として使用する。
【００１４】
（ＦＧＦ２１）
ＦＧＦ２１は、それ自体、投与された生体内でオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
【００１５】
本発明で使用されるＦＧＦ２１としては、具体的には、ヒトＦＧＦ２１、そのオルソログ、及びそれらの変異体が挙げられる。
【００１６】
ヒトＦＧＦ２１は、２８個のアミノ酸のシグナル配列を含む分泌タンパク質（配列番号１に示すアミノ酸配列）である。本発明では、ヒトＦＧＦ２１として、シグナル配列（配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜２８番目のアミノ酸残基）を含むものを使用してもよいが、シグナル配列が除去されたものを使用してもよい。
【００１７】
ＦＧＦ２１のオルソログとしては、特に制限されないが、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等に由来するものが挙げられる。ＦＧＦ２１は、投与対象となる生物種に応じて、その由来を適宜設定すればよい。
【００１８】
ＦＧＦ２１の変異体としては、ＦＧＦ２１が本来有する生物活性を保持していることを限度として特に制限されず、例えば、突然変異したＦＧＦ２１、遺伝子工学的手法によって改変したＦＧＦ２１等が挙げられる。また、ＦＧＦ２１の変異体については、特表２０１１−５２３５６１号公報、特表２０１２−５０４９６５号公報、特表２０１２−５２５８４４号公報、特表２０１２−５２５８４７号公報等において報告されており、本発明では、これらの公知のＦＧＦ２１の変異体を使用することもできる。
【００１９】
ＦＧＦ２１は、天然タンパク質であってもよいが、遺伝子工学的手法により製造された組換え体であってもよい。
【００２０】
（ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ）
ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、投与された生体内でＦＧＦ２１を発現し、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
【００２１】
ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡにおける塩基配列は公知であり、例えば、ヒトＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、配列番号２に示す塩基配列として知られている。ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、その塩基配列に基づいて、遺伝子工学的手法によって得ることができる。
【００２２】
また、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、生体内でＦＧＦ２１を発現できるように、発現ベクターに組み込んで使用することが好ましい。
【００２３】
当該発現ベクターとしては、具体的には、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。これらの中でも、ヒト等の哺乳動物を投与対象とする場合には、ウイルスベクターが好適である。
【００２４】
当該発現ベクターでは、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡが、投与対象となる生体内の細胞でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていればよい。発現ベクターに使用されるプロモーターは、投与対象である生体で機能可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ＳＶ４０由来プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００２５】
当該発現ベクターは、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡの下流に転写終結シグナルを含んでいることが好ましい。更に、当該発現ベクターには、更に形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子含んでいてもよい。
【００２６】
（ＦＧＦ２１発現促進物質）
ＦＧＦ２１発現促進物質とは、生体内でＦＧＦ２１の発現を促進させる物質である。ＦＧＦ２１産生促進物質は、投与された生体において、生体が本来有しているＦＧＦ２１発現能を向上させ、発現されたＦＧＦ２１がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
【００２７】
ＦＧＦ２１発現促進物質は、生体内でＦＧＦ２１の発現を促進させることを限度として、ＦＧＦ２１の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化、及びフォールディング等のいかなる段階で作用するものであってもよい。
【００２８】
ＦＧＦ２１発現促進物質として、具体的には、フェノフィブラート、ロシグリタゾン、ＧＷ７６４７等のＰＰＡＲαアゴニスト；ＣＲＥＢＨ、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＰＡＲβ、甲状腺ホルモン受容体β、ＲＯＰα等の転写因子が挙げられる。転写因子の場合には、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡの場合と同様に発現ベクターに組み込んだ状態で使用すればよい。
【００２９】
（ＦＧＦ２１産生細胞）
ＦＧＦ２１産生細胞とは、ＦＧＦ２１産生能を備えている細胞である。ＦＧＦ２１産生細胞は、投与された生体内でＦＧＦ２１を産生し、産生されたＦＧＦ２１がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
【００３０】
ＦＧＦ２１産生細胞は、ＦＧＦ２１産生能を有し、且つ生体への投与が許容されることを限度として特に制限されないが、具体的には膵島、心筋細胞、肝細胞等の生体内細胞；ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡを組み込んだ形質転換細胞；ｉＰＳ細胞等の幹細胞から誘導した分化させたＦＧＦ２１産生細胞等が挙げられる。
【００３１】
本発明で使用されるＦＧＦ２１産生細胞は、投与対象となる生体から得られた自家細胞、又は当該自家細胞から形質転換若しくは誘導した細胞であることが好ましいが、投与対象となる生体以外から得られた他家細胞、又は当該他家細胞から形質転換若しくは誘導した細胞であってもよい。
【００３２】
（好適な有効成分）
本発明では、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞の中から１種を選択して使用してもよく、またこれらの中から２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの有効成分の中でも、より一層効果的にオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させるという観点から、好ましくはＦＧＦ２１が挙げられる。
【００３３】
他の成分
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、脱髄疾患の予防又は治療に有効な他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００３４】
また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、具体的には、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の懸濁化剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール等の溶解補助剤；ヒト血清アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等の安定化剤；ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等の吸着防止剤；ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；水、生理食塩水等の希釈剤；脂質；緩衝剤；乳化剤；着色料；着香料；甘味料等が挙げられる。
【００３５】
また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤において、有効成分としてＦＧＦ２１をコードしている遺伝子、ＣＲＥＢＨ等の転写因子等を使用する場合であれば、遺伝子治療剤において使用されるトランスフェクション試薬が含まれていてもよい。
【００３６】
剤型
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の剤型については、特に制限されず、使用する有効成分の種類や投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００３７】
投与対象
本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することにより髄鞘を修復できるので脱髄疾患の予防又は治療目的で使用される。脱髄疾患とは、有髄神経の髄鞘が障害されることによって生じる神経疾患の１つである。
【００３８】
本発明において予防又は治療対象となる脱髄疾患は、中枢神経系及び末梢神経系のいずれの脱髄疾患であってもよい。本発明において予防又は治療対象となる中枢神経系の脱髄疾患としては、具体的には、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、同心円硬化症等の炎症性脱髄疾患；亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症等のウイルス性脱髄疾患；ＣＯ中毒、低酸素脳症等の中毒性脱髄疾患；異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー等の代謝性脱髄疾患；橋中心髄鞘破壊症、ビタミンＢ１２欠乏症等が挙げられる。また、本発明において予防又は治療対象となる末梢神経系の脱髄疾患としては、具体的には、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎等が挙げられる。これらの脱髄疾患の中でも、本発明における予防又は治療対象として、好ましくは中枢神経系の脱髄疾患、更に好ましくは中枢神経系の炎症性脱髄疾患、より好ましくは多発性硬化症が挙げられる。
【００３９】
また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、中枢神経系の脱髄疾患の後遺症がある患者に投与すると、髄鞘を修復することによって当該後遺症を改善することもできる。
【００４０】
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤において、投与対象となる生物は、脱髄疾患に罹患している生物であればよく、ヒトの他、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等が挙げられる。本発明で使用される有効成分の由来は、投与対象となる生物の種類に応じて設定すればよい。例えば、ヒトの脱髄疾患の予防又は治療する場合であれば、有効成分は、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ヒトＦＧＦ２１の産生促進物質、ヒトＦＧＦ２１を産生するヒト由来細胞等の中から選択して使用すればよい。
【００４１】
投与方法
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の投与形態としては、例えば、経口投与、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等が挙げられ、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。これらの投与形態の中でも、本発明の脱髄疾患の予防または治療として、好ましくは局所投与が挙げられる。
【００４２】
本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて、脱髄疾患の予防又は治療に有効な量を適宜設定すればよいが、例えば、ＦＧＦ２１を有効成分として使用する場合であれば、１日当たり、０．１〜１０μｇ程度、好ましくは１〜５μｇ程度となる量を１又は数回に別けて投与すればよい。また、有効成分としてＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞を使用する場合であれば、生体内でのＦＧＦ２１の産生量が、前記範囲内になるように適宜設定すればよい。
【００４３】
２．オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤・髄鞘の修復剤
前記有効成分は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させるので、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤として使用することもできる。また、前記有効成分は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させることにより、脱落した髄鞘を修復させることができるので、髄鞘の修復剤として使用することもできる。
【００４４】
即ち、本発明は、更に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤を提供する。また、本発明は、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤を提供する。
【００４５】
当該オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤及び髄鞘の修復剤において、有効成分の種類、任意に配合可能な他の成分、剤型、投与対象、投与方法等については、前記「１．脱髄疾患の予防又は治療剤」の場合と同様である。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４７】
実施例１：心筋細胞の培養上清によるオリゴデンドロサイト前駆細胞増殖効果に対するＦＧＦ受容体の関与の検討
様々な増殖因子（growth factor）を産生する心筋細胞の培養上清がオリゴデンドロサイト前駆細胞を増殖させるか検討し、またその増殖効果に対するＦＧＦ受容体拮抗剤の作用について検討した。【００４８】
（１）材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）から摘出した心臓をミンチングした後に１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）に注いで３７℃で２０分振とうした。得られた細胞溶液をピペッティングし、静置後、上清を回収した。上清を回収した残りの心筋細胞に再び１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）に注ぎ、３７℃で２０分振とうした後に上清を回収する操作を３回繰り返した。集めた上清を５％ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で懸濁し、培養用ディッシュに細胞溶液を注いだ。３０分後、浮遊細胞を回収し、更に５％ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭで懸濁した後に遠心分離した（２０００ｒｐｍ、６分）。その後、沈殿物を５％ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭで懸濁後、パーコール法により心筋細胞を分離した。次いで、得られた心筋細胞を培養用ディッシュに播種して、５％ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭにて２日間培養し、培養上清を回収した。得られた心筋細胞の培養上清を、以下の実験に用いた。【００４９】
オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から、以下の手法で採取した。先ず、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスから単離した皮質を、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｍｉｌｌｔｅｎｙ社製）を使用して、単一細胞の状態となるように分散させて細胞溶液を得た。得られた細胞溶液をａｎｔｉ−Ａ２Ｂ５結合ビーズ（Ｍｉｌｌｔｅｎｙ社製）に反応させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ２Ｂ５陽性細胞）のみを採取した。なお、Ａ２Ｂ５はオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーである。【００５０】
採取したオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、更にＦＧＦＲ阻害剤であるＳＵ５４０２（シグマ社製）を０μＭ、１０μＭ、３０μＭ、及び１００μＭ、又はＦＧＦＲ３阻害剤であるＰＤ１７３０７４（シグマ社製）を０μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、及び１μＭとなるように添加して、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しないこと以外は、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。本実験では、各群５〜６例ずつ検討した。【００５１】
（２）結果
各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図１に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、分散分析により統計解析を行った。【００５２】
図１から明らかなように、心筋細胞の培養上清を添加した群では、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込みが増加し、ＳＵ５４０２又はＰＤ１７３０７４を共処置するとＢｒｄＵの取り込み増加が抑制された。また、心筋細胞の培養上清を添加した群と心筋細胞の培養上清をしなかった群（コントロール）の間には有意な差（ｐ＜０．０１）が認められた。【００５３】
即ち、本実験結果から、心筋細胞の培養上清には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させる増殖因子が含まれていることが示唆された。また、心筋細胞の培養上清によるオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖効果は、ＦＧＦ受容体を介した作用であることが示された。【００５４】
実施例２：心筋が産生するオリゴデンドロサイト前駆細胞増殖効果に関わるＦＧＦのサブタイプの同定
心筋細胞の培養上清に含まれるＦＧＦのいずれのサブタイプが、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に関与しているかについて検討した。【００５５】
（１）材料及び方法
心筋細胞の培養上清は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）を用いて、実施例１と同様の方法で調製した。また、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から実施例１と同様の方法で採取した。得られたオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ＦＧＦ１中和抗体添加群、ＦＧＦ２中和抗体添加群、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ導入群、及びＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ導入群の４群に分けて、以下の実験を行った。なお、本実験では、各群４例ずつ検討した。【００５６】
ＦＧＦ１中和抗体添加群では、先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、これと同時にＦＧＦ１中和抗体（ＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ社製）を３μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ１中和抗体の代わりにコントロールＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｉ５２５６）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。【００５７】
ＦＧＦ２中和抗体添加群では、ＦＧＦ１中和抗体の代わりに、ＦＧＦ２中和抗体（ＩｇＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用したこと以外は、前記ＦＧＦ１中和抗体添加群と同条件で実験を行った。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ２中和抗体の代わりにコントロールＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｉ５２５６）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。【００５８】
ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ添加群では、先ず、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＲＮＡｉ/ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅs社製）を用いてＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を心筋細胞に導入した。次いで、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡを心筋細胞へ導入しなかった場合、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡの代わりにコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｅｌｅｃｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。【００５９】
ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ添加群では、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡの代わりに、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用したこと以外は、前記ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ添加群と同条件で実験を行った。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡの代わりにコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｅｌｅｃｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。【００６０】
（２）結果
各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図２に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、分散分析により統計解析を行った。図２から明らかなように、心筋細胞の培養上清を添加することによって、ＢｒｄＵの取り込みが著しく上昇し、ＦＧＦ１中和抗体添加群、ＦＧＦ２中和抗体添加群、及びＦＧＦ１８ｓｉＲＮＡ導入群では、心筋細胞の培養上清を添加することによるＢｒｄＵの取り込みの上昇は抑制されなかった。一方、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ導入群では、心筋細胞の培養上清を添加した条件で、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡを導入しなかった場合、及びコントロールｓｉＲＮＡを使用した場合に比べて、ＢｒｄＵの取り込みの上昇が顕著に抑制できていた（ｐ＜０．０１）。【００６１】
以上の結果から、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１８は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に影響を及ぼさないが、ＦＧＦ２１は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に関与していることが示唆された。【００６２】
実施例３：オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用の検討
オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用を、培養細胞を用いて検証した。【００６３】
（１）材料及び方法
組み換えＦＧＦ１５（Ａｂｃａｍ社製）、ＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）、ＦＧＦ２３（Ｒ＆Ｄ社製）を使用直前に生理食塩水で希釈して、ＦＧＦ２１含有液を準備した。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から実施例１と同様の手法で採取した。【００６４】
先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液中に各種ＦＧＦ含有液を各種ＦＧＦが１０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、ＦＧＦ２１含有液の代わりに同量の生理食塩水を使用して、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。なお、本実験では、各群３例ずつ検討した。【００６５】
（２）結果
各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図３に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、統計解析を行った。図３から明らかなように、ＦＧＦ２１を添加することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞のＢｒｄＵの取り込みが著しく増加しており、ＦＧＦ２１を添加した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められた。ＦＧＦ１５、ＦＧＦ２３を添加した群とコントロールトの間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められなかった。即ち、本結果から、ＦＧＦ２１には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があることが確認された。【００６６】
実施例４：脱髄モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討（１）
ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。【００６７】
（１）材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）の脊髄内に、生理食塩水で１％（w/v）に希釈したリゾフォスファチジルコリンをマウス１匹当たり２μｌ局所投与し、脱髄モデルマウスを作製した。【００６８】
組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で４．１７μｇ／ｍｌとなるように希釈したＦＧＦ２１含有液を浸透圧ポンプ（アルゼット社製）に充填し、ポンプの先端にカニューレを装着し、先端を脱髄モデルマウスのリゾフォスファチジルコリン投与部位に添えて、ＦＧＦ２１の投与を持続的に行った。７日後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。最終的にＦＧＦ２１は３５０ｎｇ投与した。脊髄組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。ＰＤＧＦＲαはオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであり、Ｋｉ６７は細胞増殖マーカーである。また、コントロールとして、生理食塩水を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５匹のマウスを用いて検討した。【００６９】
（２）結果
ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図４に示す。また、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数については、分散分析により統計解析を行った。図４から分かるように、ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスでは、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１を投与した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数において有意な差（ｐ＜０．０５）が認められた。この結果から、ＦＧＦ２１は、生体内で、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。【００７０】
実施例５：脱髄モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討
ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。【００７１】
（１）材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）に、胸椎１１番目と胸椎１２番目が椎弓を切除し、背柱の正中線に深さ２ｍｍで、生理食塩水で１％（w/v）に希釈したリゾフォスファチジルコリン２μｌを局所投与することにより、脱髄モデルマウスを作製した。【００７２】
組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を用いて、ＦＧＦ２１を１日当たり５００ｎｇ／ｋｇ体重の投与量で２週間皮下投与した。２週間後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。採取した脊髄組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５又は６匹のマウスを用いて検討した。【００７３】
（２）結果
ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図５に示す．本試験でも、ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１は、生体内でオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。【００７４】
実施例６：脱髄モデルマウスの髄鞘修復に対する効果の検討
ＦＧＦ２１の髄鞘修復作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。【００７５】
（１）材料及び方法
脱髄モデルマウスは、前記実施例５と同様の手法で作出した。リゾフォスファチジルコリン投与から７日後の脱髄モデルマウスに対して、組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を用いて、ＦＧＦ２１を１日当たり５００ｎｇ／ｋｇ体重の投与量で２週間皮下投与した。２週間後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。前記実施例５と同様の手法で、採取した脊髄組織から切片を作成し、切片を抗ＭＢＰ抗体にて免疫染色を行い、切片内のＭＢＰ陽性領域を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水を使用して、前記と同条件でＭＢＰ陽性領域を測定した。なお、本実験では、各群１匹のマウスを用いて検討した。【００７６】
（２）結果
ＭＢＰ陽性領域を計測した結果について、平均値を図６に示す．ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、ＭＢＰ陽性領域が増加しており、ＦＧＦ２１は、生体内で髄鞘修復を促進できることが明らかとなった。【００７７】
実施例７：脱髄モデルマウスの神経症状に対する効果の検討
ＦＧＦ２１の神経症状への治療効果について、脱髄モデルマウスを用いて検討した。【００７８】
（１）材料及び方法
脱髄モデルマウスの作出と組み換えＦＧＦ２１の投与は、前記実施例５と同様の手法で実施した。マウスの後肢の運動機能はｌａｄｄｅｒ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔを実施した。長さ１メートルの梯子を高さ１５ｃｍの位置に設置した。梯子の幅はランダムに０．６、１．２、１．８ｃｍにして、マウスを梯子の上を歩かせた。肢を踏み外す回数を計測し、全歩数に対する肢を踏み外す回数の割合（％）を算出した。なお、本実験では、各群３匹のマウスを用いて検討した。【００７９】
（２）結果
梯子を踏み外した回数の割合を算出した結果について、平均値±標準誤差を図７に示す．ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、梯子を踏み外す回数が低下しており、ＦＧＦ２１は、神経機能の改善を促すことが明らかとなった。【００８０】
実施例８：ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用の検討
オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用を、ヒト由来の培養細胞を用いて検証した。【００８１】
（１）材料及び方法
組み換えヒトＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を使用直前に生理食塩水で希釈して、ＦＧＦ２１含有液を準備した。また、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社製）を準備した。【００８２】
先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｄｅで被膜したプラスティック組織培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）１（ｖ/ｖ）％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ/ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液中にＦＧＦ２１含有液をＦＧＦ２１が６ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、ＦＧＦ２１含有液の代わりに同量の生理食塩水を使用して、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。なお、本実験では、コントロール群を６例、ＦＧＦ２１群を４例検討した。【００８３】
（２）結果
各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図８に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、統計解析を行った。図６から明らかなように、ＦＧＦ２１を添加することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞のＢｒｄＵの取り込みが著しく増加しており、ＦＧＦ２１を添加した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められた。即ち、本結果から、ＦＧＦ２１には、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があることが確認された。【００８４】
実施例７：脳挫傷モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討
ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脳挫傷モデルマウスを用いて検討した。【００８５】
（１）材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）を麻酔下で、脳定位固定装置（ナリシゲ社製）に固定した。頭皮を正中切開し、筋膜を取り除き、頭蓋を露出した。ブレグマから２ｍｍ側方の地点を中心にして直径４ｍｍの円形で開頭した。脳挫傷はＰｎｅｕｍａｔｉｃ Ｉｍｐａｃｔ Ｄｅｖｉｃｅ（ＡｍＳｃｉｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に直径３ｍｍのチップを接続して、作成した。衝撃を与えるパラメーターは、速度４〜４．５ｍｍ／秒、深さ１ｍｍ、持続時間を１２０ミリ秒とした。【００８６】
組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を浸透圧ポンプ（アルゼット社製）に充填した。また、当該浸透圧ポンプの先端にカニューレを装着し、更にその先端にＢｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔ（アルゼット社製）を繋ぎ、ＦＧＦ２１含有液を脳室内に持続的に投与した。ＦＧＦ２１含有液の投与は、ＦＧＦ２１が１日当たり５０ｎｇ／ｋｇ体重となる投与量で１週間行った。その後、脳挫傷マウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脳組織を採取した。採取した脳組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５又は６匹のマウスを用いて検討した。【００８７】
（２）結果
ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図９に示す。本試験でも、ＦＧＦ２１を投与した脳挫傷モデルマウスにおいて、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１は、脳挫傷後においてもオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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