(57)【要約】式（１）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＰＡＲγ活性化剤。    【化１】2016006548.tif 000013［式（１）中、Ｒ１は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
2016006548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＰＡＲγ活性化剤。
【化１】
2016006548.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項２】
前記Ｒ１が水素原子、リン酸基又は置換基を有していてもよい糖残基であり、前記Ｒ２がフェニル基、４−メチルフェニル基、ベンジル基又は４−メチルベンジル基であることを特徴とする請求項１に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項３】
糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは治療のための医薬であって、請求項１又は２に記載のＰＰＡＲγ活性化剤を含む医薬。
【請求項４】
糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、請求項１又は２に記載のＰＰＡＲγ活性化剤を含むサプリメント。
【請求項５】
式（２）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の治療、予防、抑制又は改善用組成物。
【化２】
2016006548.tif 000012
［式（２）中、Ｒ１は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項６】
前記ＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患が、糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される１種以上の病態、症状又は疾患であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質代謝活性化剤、抗糖尿病剤又は肥満症や生活習慣病などの予防・改善等に用いることのできるＰＰＡＲγ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
香醋（香酢）は、主に糯米を発酵させ、長期間熟成させて製造される発酵食品であり、中国では古くから酢調味料として用いられている。香醋は、日本で一般的に用いられる酢である米酢よりもアミノ酸等の有機化合物の含有率が高く、近年は日本でも健康の保持増進に役立つ健康食品として人気が高まっている。【０００３】
例えば、本発明者らは特許文献１において、香醋の低級アルカノール抽出物を有効成分として含有するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α活性化剤及びγ活性化剤を開示している。これによれば、香醋の低級アルカノール抽出物に、脂肪酸酸化の刺激及び血清脂質の仲介作用に関与し糖代謝を改善するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）αの活性化作用、並びに脂肪細胞の分化に関与し血糖値及び血中脂質の低下等をもたらすＰＰＡＲγの活性化作用が認められることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２４９３２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１で開示されたＰＰＡＲ活性化剤は、香醋を低級アルカノールで抽出することにより得られた抽出物であるところ、この抽出物のＰＰＡＲγ活性化作用に関する効果確認は、一般に生体内に比べて反応条件が整えられた実験系で行われており、香醋の低級アルカノール抽出物を１．０％（すなわち、１００００ｐｐｍ）という高い割合で細胞培養液に添加した場合において、ＰＰＡＲγ活性化作用がみられることが確認されている。よって、この香醋の低級アルカノール抽出物をＰＰＡＲγ活性化剤として使用するにあたっては、これを多量に添加又は摂取する必要がある。【０００６】
また、特許文献１で開示された香醋の低級アルカノール抽出物は、複数の成分が含まれる混合物であり、ＰＰＡＲ活性化剤としての有効成分が具体的に何であるのかは示されていない。【０００７】
従って、本発明の目的は、香醋中に含まれる優れたＰＰＡＲ活性化作用を有する有効成分を特定し、その有効成分を含むＰＰＡＲ活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは、香醋に種々の分画処理を施し、得られた分画物を検討した結果、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有するブテノライド化合物を発見した。すなわち、本発明のＰＰＡＲγ活性化剤は、式（１）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する。【０００９】
【化１】
2016006548.tif 000003
【００１０】
［式（１）中、Ｒ１は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］【００１１】
このブテノライド化合物は、ＰＰＡＲγリガンド活性を有し、ＰＰＡＲγを活性化させる作用を有している。また、このブテノライド化合物は白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞化し、脂質代謝を活性化させる作用を特に有している。さらに、このブテノライド化合物は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧、動脈硬化、内臓脂肪型肥満、皮下脂肪蓄積、体重増加、レプチン抵抗性、脂肪肝又は生活習慣病などのＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の予防、改善又は治療等に有効である。【００１２】
また、本発明のＰＰＡＲγ活性化剤は、前述した式（１）において、Ｒ１が水素原子、リン酸基又は置換基を有していてもよい糖残基であり、Ｒ２がフェニル基、４−メチルフェニル基、ベンジル基又は４−メチルベンジル基であることが好ましい。これにより、水溶性の性質を有し、ＰＰＡＲγ活性化剤として好適なブテノライド化合物が選択される。【００１３】
また、本発明の医薬は、糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは治療のための医薬であって、上述のＰＰＡＲγ活性化剤を含有する。これにより、上述したブテノライド化合物からなるＰＰＡＲγ活性化剤の好適な用途が選択される。【００１４】
また、本発明のサプリメントは、糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、上述のＰＰＡＲγ活性化剤を含んでいる。これにより、上述したブテノライド化合物からなるＰＰＡＲγ活性化剤の好適な用途が選択される。【００１５】
また、本発明のＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の治療、予防、抑制又は改善用組成物は、式（２）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。【００１６】
【化２】
2016006548.tif 000004
【００１７】
［式（２）中、Ｒ１は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］【００１８】
ＰＰＡＲγは、主に糖・脂質代謝に関与する因子であり、メタボリックシンドローム、代謝性疾患、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧、動脈硬化、高脂血症、炎症性疾患及び悪性腫瘍などの増殖性疾患に関与している。上述したブテノライド化合物は、ＰＰＡＲγリガンド活性を有し、ＰＰＡＲγを活性化させる作用を有しているため、ＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の予防、改善、抑制又は治療に有効に用いられる。【００１９】
また、ＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患としては、糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される１種以上の病態、症状又は疾患であることが好ましい。これにより、上述したブテノライド化合物の特に好適な用途が選択される。このブテノライド化合物は、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞化させ、脂質を利用した熱産生を促進し、脂質代謝を活性化させる作用を有するほか、体重増加抑制作用、内臓脂肪蓄積抑制作用、皮下脂肪蓄積抑制作用、アディポネクチン増強作用、インスリン分泌抑制作用及びレプチン分泌抑制作用等を有している。それゆえ、これらのＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患を治療、予防、抑制又は改善することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、高いＰＰＡＲγ活性化作用を有するブテノライド化合物が得られる。このブテノライド化合物は、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞化させて脂質代謝を活性化する作用を有するほか、体重増加抑制作用、内臓脂肪蓄積抑制作用、アディポネクチン増強作用、インスリン分泌抑制作用及びレプチン分泌抑制作用等を有している。それゆえ、インスリン抵抗性、糖尿病、体重増加、肥満症、高脂血症、高血圧、動脈硬化、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、脂肪肝又はメタボリックシンドロームなどのＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患を治療、予防、抑制又は改善するために使用することができる。このように、上述のような病態等の予防又は改善に役立ち、食品やサプリメント、薬剤等に広く応用可能なブテノライド化合物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のＰＰＡＲγ活性化剤の有効成分であるブテノライド化合物を香醋から製造する方法を概略的に説明するフローチャートである。
【図２】実施例１における、香醋から順相カラム分画物を調整する方法を概略的に説明するフローチャートである。
【図３】実施例１における、順相カラム分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図４】実施例２における、逆相カラム分画物を調整する方法を概略的に説明するフローチャートである。
【図５】実施例２で得られた逆相カラム分画物（ｆｒ．１〜５）と実施例１で得られた順相カラム分画物（分画前ｆｒ．１）のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラムである。横軸は保持時間（分）を示す。
【図６】実施例２における、逆相カラム分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図７】実施例３における、ピーク分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図８】実施例３で得られたピーク分画物のうち、ピーク５のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラムである。縦軸は検出強度を、横軸は保持時間（分）を示す。
【図９】実施例３における、ピーク５の分画物及び実施例２で得た逆相カラム分画物のフラクション５のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図１０】実施例４における、ピーク５の分画物のＬＣ／ＭＳの結果を示すチャートである。縦軸は検出強度を、横軸はｍ／ｚ値を示す。
【図１１】実施例５における、ＵＣＰ−１遺伝子の発現量の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例７における、５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライド合成品のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図１３】実施例８におけるブテノライド化合物のＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図１４】実施例９における、５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライド投与によるマウスの体重増加抑制効果を示すグラフである。
【図１５】実施例１０における、マウス血液中に含まれるアディポネクチンの量を示すグラフである。
【図１６】実施例１１における、マウス血液中に含まれるインスリンの量を示すグラフである。
【図１７】実施例１２における、マウス血液中に含まれるレプチンの量を示すグラフである。
【図１８】実施例１３における、５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライド投与によるマウスの皮下脂肪及び内臓脂肪の蓄積抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のＰＰＡＲγ活性化剤には有効成分として上述の式（１）で表されるブテノライド化合物が含まれる。この式（１）中、Ｒ１で示される原子としては水素原子が好ましく、分子としては、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基が挙げられる。脂肪酸基としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸又はステアリン酸等が挙げられる。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、各種プロピル基又は各種ブチル基が挙げられる。また、リン酸基、糖残基による配糖体は、体外での安定性及び体内での吸収性の観点から好ましく、糖としては、特に限定されないが、各種グルコース、各種ガラクトース又は各種マンノース等が用いられ、特にグルコースが好適な配糖体を形成する糖として用いられる。
【００２３】
また、Ｒ２はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基が好ましく、特に、作用効果の観点から、フェニル基、４−メチルフェニル基、ベンジル基又は４−メチルベンジル基が好適に用いられる。
【００２４】
この式（１）で表わされる化合物のうち、特に薬理活性の点から好ましい化合物としては、以下式（３）に示す５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライドや以下式（４）に示す５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライドのほか、５−ヒドロキシ−４−（４−メチルベンジル）ブテノライドや５−ヒドロキシ−４−ベンジルブテノライドを挙げることができ、後述するように、ＰＰＡＲγ活性化剤として香醋中から発見された５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライド又は５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライドが特に好ましい。
【００２５】
【化３】
2016006548.tif 000005
【００２６】
【化４】
2016006548.tif 000006
【００２７】
式（３）に示すブテノライド化合物、すなわち、５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライドは、発酵食品である香醋から抽出して得ることができる。香醋からこのブテノライド化合物を得る方法としては、特に限定されないが、一例として、図１のフローチャートに示すように、香醋（を準備する工程）Ｓ０と、香醋に含まれている脂質成分を除去する脱脂処理工程Ｓ１と、溶媒を用いて目的の成分を抽出する溶媒抽出処理工程Ｓ２と、順相クロマトグラフィーによる分画工程Ｓ３と、逆相クロマトグラフィーによる分画工程Ｓ４とから概略構成される。
【００２８】
この香醋Ｓ０とは、糯米に麹を添加してアルコール発酵させ、籾殻を添加して酢酸発酵させ、水を添加して抽出し、その抽出液を一定期間熟成させたものである。
【００２９】
図１に示す脱脂処理Ｓ１は、香醋Ｓ０に含まれている余分な脂質成分を除去する目的で行われる。香醋Ｓ０の脱脂処理を行うことにより、香醋に含まれている余分な脂質成分が除去されるため、後に行われる溶媒抽出処理Ｓ２や分画工程Ｓ３及びＳ４において、式（３）で表わされるブテノライド化合物を有効に抽出することが可能となる。具体的には、特に限定されないが、香醋Ｓ０に有機溶媒を加えてよく撹拌し、有機溶媒相に余分な脂質成分を移動させた後、遠心分離機などを用いて水相と有機溶媒相とに分離し、水相を回収することにより行うことができる。この操作は複数回行われることが好ましい。有機溶媒としては、脱脂効果を有するものであればよく、たとえば、石油系有機溶媒やアルコール類などが好適に用いられ、特にｎ−ヘキサンが好適に用いられる。用いる有機溶媒の量としては、香醋の１０重量％から１０００重量％程度が好ましく、香醋の量の半分から２倍程度が最も好ましい。
【００３０】
次に図１に示す溶媒抽出処理Ｓ２では、脱脂処理した香醋に溶媒を加え、加えた溶媒に目的となるブテノライド化合物を移動させることが行われる。用いられる溶媒としては、有機溶媒が好適に用いられ、特に限定されないが、ｎ−ブタノール又はエタノールなどのアルカノール、酢酸エチル、ブチレングリコール及びクロロホルム等を用いることができる。これらの溶媒抽出処理Ｓ２は、単一の処理に限られず、同じ溶媒での抽出処理を複数回行うことや、複数種類の溶媒抽出処理を組み合わせて行うことも可能である。
【００３１】
上述した溶媒抽出処理Ｓ２の一例として、有機溶媒としてクロロホルムを用いた際の抽出処理について説明する。このクロロホルム抽出処理では、脱脂した香醋にクロロホルムを加え、クロロホルム相に目的成分であるブテノライド化合物を効率よく移動させることが行われる。具体的には、たとえば香醋とクロロホルムとを分液漏斗を用いて分配し、クロロホルム相を回収することにより行われる。この場合、分配は複数回行われることが好ましい。クロロホルムの添加量としては、水相（香醋）の１０重量％から１０００重量％程度が好ましく、水相の量の半分から２倍程度が最も好ましい。回収されたクロロホルム相は、減圧濃縮処理等により溶媒を簡単に除去することができ、固形又は濃縮された香醋のクロロホルム抽出物を得ることができる。
【００３２】
次に、図１に示す順相クロマトグラフィーによる分画工程Ｓ３について説明する。この分画工程Ｓ３では、工程Ｓ２で得られた溶媒抽出物に含まれている目的成分のブテノライド化合物を精製分離することを目的としている。一例として、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画処理について説明する。具体的には、特に限定されないが、シリカゲルが充填されたクロマト管の上に溶媒抽出物を吸着させたシリカゲルをのせ、その上から所定の移動相を流して溶出させることにより行われる。移動相としては、特に限定されないが、ベンゼン−アセトンが好適に用いられ、例えば、ベンゼン：アセトンの比を４０：１から０：１までの勾配とした移動相で溶出することにより、好適に分離することが可能である。得られた分画物のうち、どの分画物に目的物質が含まれているかを確認するにあたっては、後述するＰＰＡＲγ活性化試験や、ＰＰＡＲγが関与する遺伝子（ＵＣＰ−１遺伝子等）の発現量を測定する試験等を行うことができる。
【００３３】
次に、図１に示す逆相クロマトグラフィーによる分画工程Ｓ４について説明する。この分画工程Ｓ４では、工程Ｓ３で得られた順相カラム分画物に含まれている目的成分のブテノライド化合物をさらに精製分離し、略単離することを目的としている。一例として、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画処理について説明する。具体的には、特に限定されないが、オクタデシルシリル基（Ｃ１８）で修飾されたシリカゲルをカラムに充填し、工程Ｓ３で得られた分画物をカラムに添加した後、所定の移動相を流して溶出させることにより行われる。移動相としては、特に限定されないが、メタノール−水が好適に用いられ、例えば、メタノール：水の比を１：９から１：０までの勾配とした移動相で溶出することにより、好適に単離することが可能である。得られた分画物のうち、どの分画物に目的物質のブテノライド化合物が含まれているかを確認するにあたっては、後述するＰＰＡＲγ活性化試験や、ＰＰＡＲγが関与する遺伝子（ＵＣＰ−１遺伝子等）の発現量の測定試験等を行うことができる。また、得られた分画物についてＨＰＬＣ分析を行い、クロマトグラムを確認して、単一ピークが得られているかを確認することによりブテノライド化合物を単離できたか否かの確認を行うことができる。
【００３４】
なお、上述した分画処理Ｓ３、Ｓ４は、単一の処理に限られず、同じ充填材又は異なる充填材による分画処理を複数回行うことや、同じ移動相又は異なる移動相による分画処理を組み合わせて行うことも可能である。
【００３５】
また、式（３）で表されるブテノライド化合物は、香醋から抽出分離して得る方法の他に、公知の合成方法で製造することも可能である。例えば、フェニルアセトアルデヒドとグリオキシル酸エステルとをアルドール縮合させ、３−フェニル−４−オキソ−２−ヒドロキシ−ブタン酸エステルを得たのち、水の存在下で酸を作用させること（特開平６−２１１８２５号公報）、フェニルアセトアルデヒドとグリオキシル酸エステルとをモルホリン塩酸塩存在下で反応させること（特開平１１−１５２２８０号公報）等により本発明のブテノライド化合物を製造することができる。同様に、式（４）及び式（１）で表わされるその他のブテノライド化合物についても、公知の合成方法（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、１９８１年、第４６巻、ｐｐ．４８８９−４８９４及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１３年、第５４巻、ｐｐ．５３２２−５３２４等参照）にて製造することが可能である。
【００３６】
上述したブテノライド化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、このブテノライド化合物又はその塩は、水和物やアルコール等の有機溶媒和物などであってもよく、無水物であってもよい。また、各種異性体やラセミ体、又はこれらの混合物なども含まれる。さらに、このブテノライド化合物又はその塩は、分子構造中に含まれる官能基が修飾される等した、生体の代謝作用により効果を示すようになるプロドラッグであってもよい。
【００３７】
式（１）で表されるブテノライド化合物はＰＰＡＲγを活性化させる作用を有する。なお、本発明において、ＰＰＡＲγ活性化剤とは、ＰＰＡＲγに結合する等してＰＰＡＲγを活性化させ、標的遺伝子の発現を調整できる物質のことをいう。ＰＰＡＲγの標的遺伝子としては、例えば、アディポネクチン、ＵＣＰ−１、脂肪酸結合タンパク質又はａＰ２等が挙げられる。また、本明細書において、ＰＰＡＲγリガンド活性とＰＰＡＲγアゴニスト活性とは同義である。
【００３８】
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤はＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の治療、予防、抑制又は改善に用いることができる。ここでの治療や病態の改善には、これらの疾患や病態に対する予防や予後の処置も含まれる。ＰＰＡＲγが関与する疾病には、脂肪細胞の分化や代謝に関与するものが広く含まれ、特にインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、脂肪肝、体重増加、肥満、レプチン抵抗性、動脈硬化、炎症性疾患、悪性腫瘍若しくはメタボリックシンドローム又はこれらに関連する疾患が含まれる。本発明のＰＰＡＲγ活性化剤は、これらの疾患の一つ又は複数に対する治療や改善、症状や病態の抑制や予防等に用いられる。
【００３９】
また、本発明のブテノライド化合物は、脂肪を蓄積させる白色脂肪細胞を、脂肪を燃焼させる褐色脂肪細胞に変換させる作用を有していることから、脂質代謝活性化剤として用いることができる。なお、脂質代謝活性化剤としての作用機序は上述した白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞化させることのみに限定されず、本発明の化合物がＰＰＡＲγ活性化作用を有し、ＰＰＡＲγの標的遺伝子の転写が亢進することも関係する。
【００４０】
さらに、式（１）で表されるブテノライド化合物は、ＰＰＡＲγ活性化作用を有することから、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性治療剤、抗肥満症剤、体重増加抑制剤、内臓脂肪蓄積抑制剤、皮下脂肪蓄積抑制剤、レプチン抵抗性治療剤、脂質代謝異常治療剤、抗高脂血症剤、動脈硬化治療剤及びメタボリックシンドローム抑制剤として用いることができる。
【００４１】
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤等は、上述した式（１）で表されるブテノライド化合物を有効成分として含むものであり、ヒト又は動物のための医薬品、医薬部外品及び食品として用いることができる。食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含まれる。
【００４２】
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤等を医薬品又は医薬部外品として用いる場合には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の薬理学的に許容される担体や賦形剤、滑沢剤、分散剤、崩壊剤、緩衝剤、溶剤、増量剤、保存剤、香料又は安定化剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。さらに、このブテノライド化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、リポソーム製剤、微粉末化又はシクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【００４３】
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤等を経口投与製剤として用いる場合には、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等の形態で用いることができるが、消化管からの吸収に適した形態で用いることが好ましい。また、流通性、保存性などの理由により所望される形態での製剤を提供する場合にも従来の製剤技術を用いることができる。また、外用剤等の非経口投与剤として用いる場合には、注射剤、坐剤およびテープ剤、パップ剤などの経皮吸収剤等の形態とすることができる。また、流通性や保存性などの理由から固形製剤を使用時に適当な溶剤で溶解してから用いることもでき、液剤および半固形剤の形態で提供することも従来の製剤技術により可能である。
【００４４】
また、本発明のＰＰＡＲγ活性化剤等を食品として用いる場合には、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、スープ、粥、飲料、麺類、ゼリー、シリアル、パン、乳製品、調味料、食用油、菓子等の形態が挙げられる。また、動物用食品（飼料、ペットフード；ドライタイプ、ウェットタイプ、動物用サプリメント、動物用飲料等）として用いることも可能である。食品として用いる際には、香醋に由来するエキス等の成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々添加することも可能である。
【００４５】
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤等の投与量又は有効摂取量は、目標とする治療効果、投与方法、投与対象及び剤形によって変化するため、特に限定されないが、一日の経口投与量としては、有効成分として約０．０１μｇ／６０ｋｇ体重〜約３００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、好ましくは、０．０５μｇ／６０ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、これを１〜３回に分割して投与することが好ましい。また、一日の非経口的な投与量としては、有効成分として約０．０１μｇ／６０ｋｇ体重〜１００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、好ましくは約０．０３μｇ／６０ｋｇ体重〜５０ｍｇ／６０ｋｇ体重が好ましい。
【００４６】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例におけるＰＰＡＲ活性化試験の測定方法は、下記の通りである。
（１）ＰＰＡＲγ活性化試験
（１−１）準備
ヒト由来のＰＰＡＲγリガンド結合ドメインと酵母由来のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインからなるキメラタンパク質を発現するプラスミドのｐＭ−ＰＰＡＲγと、このキメラタンパク質によって発現が制御されるようにデザインされた、ＧＡＬ４応答配列の下流にウミホタル由来のルシフェラーゼ構造遺伝子を連結したプラスミドのｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃを準備した。また、トランスフェクション効率補正用プラスミドとして、細胞内で恒常的に発現するウイルス性発現プロモーターを持ったウミシイタケ由来のルシフェラーゼ発現プラスミドのｐＲＬ−ＣＭＶを準備した。他方、ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓由来）の培地として、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用い、１００ｍｍシャーレにＣＶ−１細胞を４．５×１０５ｃｅｌｌｓとなるように播き、３７℃、５％ＣＯ２環境下でインキュベーターにて培養を行った。【００４８】
（１−２）ＣＶ−１細胞の形質転換
２４時間培養後のＣＶ−１細胞に、２．０μｇのｐＭ−ＰＰＡＲγ、４．０μｇのｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃ、及び０．０４μｇのｐＲＬ−ＣＭＶをコトランスフェクトし、ＣＶ−１細胞の形質転換を行った。形質転換はリポソーム法で行い、LipofectAMINE（登録商標）Reagent（インビトロジェン社製品）を使用した。形質転換操作後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で３．５時間培養を行った。【００４９】
（１−３）被検試料の添加
インキュベート後、トリプシン処理によりＣＶ−１細胞を回収し、９６ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＬ播種した。被検試料を４％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで希釈して最終濃度の２倍の濃度となるように調整し、上述した９６ｗｅｌｌプレートに５０ｍＬ添加した。なお、コントロール物質としては、ＤＭＳＯを用いた。被検試料及びコントロール物質（ＤＭＳＯ）を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間インキュベートを行った。【００５０】
（１−４）ルシフェラーゼ活性の測定
ルシフェラーゼ活性の測定は、Dual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System（プロメガ社製品）を用いて行った。９６ｗｅｌｌプレートから培養液を除き、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ペーパータオルで水分を除去した。細胞溶解液（Passive Lysis Buffer）を３０ｍＬ加え、９６ｗｅｌｌプレートを１５分振とうした。細胞抽出液を１０ｍＬずつ９６ｗｅｌｌルミノプレートに移した。発光基質液７０ｍＬを添加し、測定時間１０秒の設定でルシフェラーゼによる発光強度をルミノメーター（Micro Lumat Plus、ベルトールドジャパン社製品）を用いて測定した。【００５１】
被検試料のＰＰＡＲγ活性化作用は、コントロールに対する割合（％）で評価した。トランスフェクション効率を補正するために、測定したウミホタル・ルシフェラーゼ活性値（Ａ）を測定したウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性値（Ｂ）で除した値（Ａ／Ｂ）を求めた。コントロール群のＡ／Ｂ値の平均値を算出し、この平均値を１００とした。被検試料のＡ／Ｂ値を算出し、コントロールの平均値に対する割合（％）を被検試料のＰＰＡＲγ活性化能とした。【００５２】
［実施例１  順相カラム分画物の調整及び活性測定］
図２に示す分画フローにより、香醋より７つの順相カラム分画物を調整した。以下、分画フローの各処理について詳述する。【００５３】
（１）ヘキサン脱脂処理
香醋（製品名；８年熟成恒順香醋、日本恒順株式会社製品）１Ｌに対して、等量のｎ−ヘキサンを加えてよく撹拌したのち、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、水層を回収した。この分配操作を３回行い、香醋に含まれる余分な脂質成分を除去した。【００５４】
（２）クロロホルム抽出処理
次に、回収した水層に等量のクロロホルムを加え、分液ロートを用いて３回分配操作を行い、クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層の減圧下濃縮を行って溶媒を除去し、３９７０ｍｇのクロロホルム抽出物を得た。【００５５】
（３）順相シリカゲルカラム処理
クロロホルム抽出により得た抽出物３９７０ｍｇを少量のアセトンに溶かし、１３０ｇのシリカゲル（シリカゲル６０、０．０４０−０．０６３ｍｍ  カラムクロマトグラフィー用；メルクミリポア社製品）に吸着させた。次に、ガラスクロマト管（クロマト管の長さ６０ｃｍ、直径２．７ｃｍ、容量３４３ｍＬ）にシリカゲルを１３０ｇ充填し、その上に香醋のクロロホルム抽出物を吸着させたシリカゲルをのせた。ベンゼン：アセトン＝２０：１、１０：１、５：１、３：１、２：１、１：１及びアセトン１００％の溶媒の順に５５０ｍＬずつ各溶媒を流し、溶媒毎に溶出した分画物を分け、順相カラム分画物（フラクション１〜７）として回収した。回収した分画物をそれぞれ減圧下濃縮して溶媒を除去し、得られた分画物の固形重量を測定した。ＰＰＡＲγリガンド活性測定における最終濃度の１０００倍以上の濃度となるように、得られた分画物の一部を適量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ナカライテスク株式会社製品）に溶解させた。【００５６】
（４）順相カラム分画物の活性測定
実施例１で得た７つの順相カラム分画物を被検試料として、ＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を評価した。各分画物の最終濃度は１００μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬとした。各分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を図３に示す。これらの図の縦軸はコントロール物質（ＤＭＳＯ）の活性に対する分画物の活性の割合である。図３に示すように、フラクション１の分画物（溶出溶媒がベンゼン：アセトン＝２０：１）について、濃度依存的なＰＰＡＲγリガンド活性が認められた。【００５７】
［実施例２  逆相カラム分画物の調整及び活性測定］
（１）逆相ＯＤＳカラム処理
図４の分画フローに示すように、実施例１で得たＰＰＡＲγ活性化作用が認められるフラクション１の順相カラム分画物について、さらに逆相クロマトグラフィーを行い、５つの逆相カラム分画物を調整した。逆相クロマトグラフィーは以下のように行った。ガラスクロマト管（クロマト管の長さ４０ｃｍ、直径２．２ｃｍ、容量１５２ｍＬ）に充填材として、ＯＤＳシリカゲル（ＹＭＣ＊ＧＥＬ  ＯＤＳ−Ａ  ６ｎｍ  Ｓ−１５０μｍ；ワイエムシィ社製品）５０ｇをメタノールで懸濁させて充填した。脱気したメタノール１００％を、気泡を作らないようにこの充填材に１００ｍＬ注いで流した。次に、充填材の１０倍量（７６０ｍＬ）の脱気したメタノール１０％水溶液で充填材を平衡化した。実施例１で得たフラクション１の分画物１１７ｍｇをメタノールに溶かし、その溶液を充填材の上から添加した。そして、メタノール濃度が１０％、２０％、３０％、４０％及び１００％の脱気したメタノール水溶液を、この濃度の順に充填材の上から１８０ｍＬずつ流し、溶媒毎に溶出した分画物を分け、逆相カラム分画物（フラクション１〜５）として回収した。得られた逆相カラム分画物は減圧下濃縮して溶媒を除去し、得られた分画物の一部を適量のジメチルスルホキシドに溶解させた。回収した分画物について、高速液体クロマトグラフィー（使用カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ.  Ｓ−５μｍ  ３０ｎｍ、移動相：メタノール２０％水溶液−メタノール７０％水溶液、流速：１ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出条件ＵＶ：２８０ｎｍ）を用いて分離状況の確認を行った。各分画物のＨＰＬＣの結果を図５に示す。図５の横軸は保持時間（分）を示す。【００５８】
（２）逆相カラム分画物の活性測定
実施例２で得た逆相カラム分画物（フラクション１〜５）及び実施例１で得た順相カラム分画物のフラクション１を被検試料として、ＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を評価した。各分画物の最終濃度は１００μｇ／ｍＬとした。また、ＰＰＡＲγアゴニストであるトログリタゾン（Ｔｒｏ）についてもＰＰＡＲγ活性化試験を行った。トログリタゾンの最終濃度は１μＭとした。ＰＰＡＲγリガンド活性を図６に示す。これらの図の縦軸はコントロール物質（ＤＭＳＯ）の活性に対する分画物の活性の割合である。図６に示すように、逆相カラム分画物のフラクション４（溶出溶媒が水：メタノール＝６０：４０）及びフラクション５（溶出溶媒がメタノール１００％）について、ＰＰＡＲγリガンド活性が認められた。【００５９】
［実施例３  ピーク分画物の調整及び活性測定］
（１）高速液体クロマトグラフィーによる分画
図５に示す逆相カラム分画物のＨＰＬＣクロマトグラムをみると、ＰＰＡＲγ活性化作用が認められるフラクション４及び５には、複数の特異的なピークが認められる。そこで、フラクション４及び５について特異的なピークを示す物質の分画を行い、活性物質を精製することを試みた。分画は、逆相高速液体クロマトグラフィー（使用カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ.  Ｓ−５μｍ  ３０ｎｍ、移動相：メタノール２０％水溶液−メタノール７０％水溶液、流速：１ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出条件ＵＶ：２８０ｎｍ）を用いて行った。【００６０】
（２）ピーク分画物の活性測定
実施例３で得たピーク分画物及びトログリタゾン（Ｔｒｏ）を被検試料として、ＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を評価した。各分画物の最終濃度は１００μｇ／ｍＬ、トログリタゾンの最終濃度は１μＭとした。結果を図７に示す。図７に示すように、フラクション４のピーク５の分画物に明確なＰＰＡＲγリガンド活性が認められた。なお、このピーク５の分画物をＨＰＬＣ分析したところ、シングルピークとして検出され（図８参照）、単一成分として単離できたことがわかった。【００６１】
さらに、実施例３で得たピーク５の分画物、実施例２で得た逆相カラム分画物のフラクション５及びトログリタゾンについて、ＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各分画物のＰＰＡＲγリガンド活性を評価した。ピーク５の分画物の最終濃度は低濃度；５０μｇ／ｍＬ、及び高濃度；１００μｇ／ｍＬとし、逆相カラム分画物のフラクション５の最終濃度は２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬ、トログリタゾンの最終濃度は１０μＭとした。結果を図９に示す。図９に示すように、ピーク５の分画物のＰＰＡＲγリガンド活性は、濃度依存的に上昇することが認められた。【００６２】
［実施例４  ピーク分画物の構造決定］
実施例３で得たピーク５の分画物について構造解析を行った。構造解析は、ＬＣ／ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＢＣ及びＨＳＱＣを行った。ＬＣ／ＭＳの結果を図１０に示す。図１０の横軸はｍ／ｚ値を、縦軸は検出強度を示す。図１０よりピーク５の分画物は分子量１７６．１６８７、示性式はＣ１０Ｈ８Ｏ３であることが示唆された。また、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＢＣ及びＨＳＱＣの結果より、ピーク５に含まれている成分は、５−ヒドロキシ−４−フェニルブテノライド（以下、「５Ｈ４ＰＢ」という）であることが明らかとなった。【００６３】
［実施例５  ＵＣＰ−１遺伝子発現量の測定］
ミトコンドリア脱共役型タンパク質（Uncoupling Protein；ＵＣＰ）はミトコンドリア内膜での酸化的リン酸化反応を脱共役させ、エネルギーを熱として消費する機能を有している。そのうち、ＵＣＰ−１は脂肪燃焼による熱産生を行う褐色脂肪細胞に特異的に発現している。近年、特定のＰＰＡＲγ合成アゴニストが脂肪を貯蔵する白色脂肪細胞を脂肪燃焼させる褐色脂肪細胞のように変化させることが報告されている（H. Ohno et al、Cell metabolism、2012年、Vol.15、pp.395-404）。そこで、ＰＰＡＲγリガンド活性が認められたピーク５の分画物、すなわち、５Ｈ４ＰＢが白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞化させる作用を有するか確認するため、ＵＣＰ−１遺伝子の発現量を測定する試験を行った。【００６４】
試験は次のように行った。間葉系細胞株１０Ｔ１／２を１２ｗｅｌｌプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種した。細胞がコンフルエントになるまで培養した後、ピーク５の分画物（５Ｈ４ＰＢ）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、コントール物質としてはＤＭＳＯを用いた。サンプル添加から２４時間後、細胞からｍＲＮＡを回収し、ｍＲＮＡ量を定量した。ｍＲＮＡ定量は、ライトサイクラー（登録商標、ロシュ・アプライド・サイエンス社）を用いて行った。結果を図１１に示す。図の縦軸はコントロール物質（ＤＭＳＯ）のＵＣＰ−１発現量に対するピーク５の分画物のＵＣＰ−１発現量の比である。図１１に示すように、ピーク５の分画物はＵＣＰ−１の発現レベルを上昇させる作用を有することがわかった。ＵＣＰ−１の発現量の増加は脂質からの熱産生の亢進を表わす。この結果より、ピーク５の分画物、すなわち、５Ｈ４ＰＢはＵＣＰ−１の活性化を介して脂質代謝の改善、促進に寄与することがわかった。【００６５】
［実施例６  ５Ｈ４ＰＢの合成］
化学合成により得た５Ｈ４ＰＢが香醋から抽出して得た５Ｈ４ＰＢと同様のＰＰＡＲγ活性化作用を有するか確認するため、５Ｈ４ＰＢを合成した。合成は次のようにして行った。グリオキシル酸一水和物１００ｍｇとモルホリン１５０ｍｇを１，４−ジオキサン４５０μＬに分散させて、水５５μＬを一滴ずつ加えた。フェニルアセトアルデヒド１４０ｍｇを加え、室温で１時間静置した後、２４時間加熱還流した。生成物を減圧濃縮し、ジエチルエーテル２．５ｍＬで抽出した。抽出したジエチルエーテル層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥させた後、再び減圧濃縮した。濃縮物をアセトン／クロロホルム混合溶液に溶かし、再結晶により５Ｈ４ＰＢを１４０ｍｇ得た。得られた合成５Ｈ４ＰＢについて、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行い、香醋から抽出して得た５Ｈ４ＰＢ（実施例３で得たピーク５の分画物）と同一であることを確認した。【００６６】
［実施例７  合成品の活性測定］
実施例６で得た５Ｈ４ＰＢ合成品を被検試料として、ＰＰＡＲγ活性化試験を行った。合成５Ｈ４ＰＢの最終濃度は３．５μＭとした。結果を図１２に示す。これらの図の縦軸はコントロール物質（ＤＭＳＯ）の活性に対する合成品の活性の割合である。図１２に示すように、化学合成により得られた５Ｈ４ＰＢについても、香醋由来物と同様に高いＰＰＡＲγリガンド活性が認められた。【００６７】
［実施例８  各種ブテノライド化合物の合成及び各合成品の活性測定］
５Ｈ４ＰＢをはじめとする各種ブテノライド化合物を化学合成し、種々濃度におけるＰＰＡＲγリガンド活性を測定した。本実施例において、５Ｈ４ＰＢ及び各種ブテノライドの合成は以下のようにして行った。まず、上記式（３）で表わされる５Ｈ４ＰＢについては、１Ｌ容量の４口フラスコにモルホリン５３ｍＬ（０．６ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン１２０ｍＬを順次加え、氷浴しながら５０％グリオキシル酸水溶液を６２ｍＬ（０．６ｍｏｌ、１．５当量）及び濃塩酸５０ｍＬを順次滴下して加えた。この混合物を内温８７℃まで加熱し、フェニルアセトアルデヒド（４８％フタル酸ジエチル溶液、０．４ｍｏｌ）を１，４−ジオキサンで３倍希釈したものをゆっくり滴下し、この混合液を終夜還流させた。薄層クロマトグラフィーを用いて還流後の反応液中にアルデヒドが含まれないことを確認し、反応液を室温まで放冷した。反応液を濃縮して２００ｍＬの酢酸エチルを加えた。飽和重曹水で洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮して一部オイル状の黄色固体１０１ｇを得た。この黄色固体に２００ｍＬの酢酸エチルを加えて溶解させ、アルミナ（塩基性）を加えて撹拌しバッチ処理した。アルミナをろ過して除いた後、ろ液を濃縮して黄色固体（一部オイル）９６ｇを得た。これを０．５倍量の酢酸エチルに溶解させ、１倍量のヘキサンを加えて撹拌し、析出した固体をろ取して乳白色固体の５Ｈ４ＰＢを３０．２ｇ（収率４０％、ＧＣ純度９８．６％）を得た。【００６８】
また、上記式（４）で表わされる５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライド（式（１）におけるＲ２：メチルフェニル基）の化学合成については、フェニルアセトアルデヒドの代わりに４−メチルフェニルアセトアルデヒド（４８％フタル酸ジエチル溶液、０．４ｍｏｌ）を用い、このアルデヒドの滴下温度を混合物の内温６０℃とし、滴下終了後に内温８７℃にまで加熱したほかは、本実施例の５Ｈ４ＰＢの合成方法（各試薬のモル比、反応時間等）と同様に行った。得られた化合物の収率は３０％、ＧＣ純度は９７．６％であった。【００６９】
また、以下式（５）に示す５−ヒドロキシ−４−（４−メチルベンジル）ブテノライド（式（１）におけるＲ２：メチルベンジル基）の化学合成については、フェニルアセトアルデヒドの代わりに３−（４−メチルフェニル）プロピオンアルデヒド（４８％フタル酸ジエチル溶液、０．４ｍｏｌ）を用いたほかは、上述の５Ｈ４ＰＢの合成方法と同様にして混合液を終夜還流させて反応させた。薄層クロマトグラフィーを用いて還流後の反応液中にアルデヒドが含まれないことを確認し、反応液を室温まで放冷した。反応液を濃縮して２倍量の酢酸エチルを加えた。この溶液を希塩酸と飽和重曹水で洗浄し、カラムで分けにくい成分を除去した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮して粗製固体を得た。この固体を１０倍量のヘキサン／酢酸エチル＝１の混合溶媒に溶解させ、シリカゲル（ＰＱＳ１００Ｂ）３倍量でバッチ処理した。得られた濃縮液にヘキサンを加え、析出した固体をろ取して無色固体の５−ヒドロキシ−４−（４−メチルベンジル）ブテノライドを収率２４％、ＧＣ純度９９．２％で得た。【００７０】
【化５】
2016006548.tif 000007
【００７１】
さらに、以下式（６）に示す５−ヒドロキシ−４−ベンジルブテノライド（式（１）におけるＲ２：ベンジル基）の化学合成については、フェニルアセトアルデヒドの代わりに３−フェニルプロピオンアルデヒド（４８％フタル酸ジエチル溶液、０．４ｍｏｌ）を用いたほかは、上述の５Ｈ４ＰＢの合成方法と同様にして混合液を終夜還流させて反応させた。薄層クロマトグラフィーを用いて還流後の反応液中にアルデヒドが含まれないことを確認し、反応液を室温まで放冷した。反応液を濃縮して２倍量の酢酸エチルを加えた。飽和重曹水で洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮して粗製固体を得た。この粗製固体をシリカゲル（ＰＱＳ１００Ｂ、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝４→２．３）で精製した。得られた濃縮液にヘキサンを加え、析出した固体をろ取して無色固体の５−ヒドロキシ−４−ベンジルブテノライドを収率６０％、ＧＣ純度９９．６％で得た。【００７２】
【化６】
2016006548.tif 000008
【００７３】
上述のようにして合成した４種のブテノライド化合物、すなわち、５Ｈ４ＰＢ（式（１）におけるＲ２：フェニル基）、５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライド（式（１）におけるＲ２：メチルフェニル基）、５−ヒドロキシ−４−ベンジルブテノライド（式（１）におけるＲ２：ベンジル基）及び５−ヒドロキシ−４−（４−メチルベンジル）ブテノライド（式（１）におけるＲ２：メチルベンジル基）について、以下表１に示す被検試料濃度における試験を行った。ＰＰＡＲγリガンド活性の測定は、被検試料添加後のインキュベート時間を４８時間とした以外は、実施例７と同様にして行った。結果を以下表１及び図１３に示す。以下表に示す値及び図の縦軸はコントロール物質（ＤＭＳＯ）の活性に対する各合成品の活性の割合（％）である。表１及び図１３では被検試料である各種ブテノライド化合物を式（１）におけるＲ２の官能基で表わしている。【００７４】
【表１】
2016006548.tif 000009
【００７５】
表１及び図１３に示すように、４種の被検試料いずれもＰＰＡＲγリガンド活性を有することがわかった。このうち、表１において＊が付された数値の試験区はコントロールに比べて２倍以上の活性を示し、ｐ＜０．０５（有意差有り）であった。この結果より、５Ｈ４ＰＢ（Ｒ２：フェニル基）及び５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライド（Ｒ２：メチルフェニル基）は０．８〜１０μｇ／ｍＬの範囲で高い活性を示し、５−ヒドロキシ−４−ベンジルブテノライド（Ｒ２：ベンジル基）は２〜４μｇ／ｍＬの範囲で高い活性を示し、５−ヒドロキシ−４−（４−メチルベンジル）ブテノライド（Ｒ２：メチルベンジル基）は４〜２０μｇ／ｍＬの範囲で高い活性を示すことが分かった。このうち、５Ｈ４ＰＢ及び５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライドは低濃度範囲において高い活性を有し、特に５−ヒドロキシ−４−（４−メチルフェニル）ブテノライドは最も高い活性を有することが明らかとなった。【００７６】
［実施例９  食餌性肥満モデルマウスに対する抗肥満作用の検証］
実施例６で得た５Ｈ４ＰＢを、高脂肪食を給餌したマウスに投与し、その抗肥満作用を検証した。５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（供給源：日本チャールス・リバー株式会社）を温度が２０〜２６℃、湿度が３５〜７５％、照明が１２時間（７：００〜１９：００）の環境条件下にて、１ケージあたり１匹ずつ単飼した。１週間程度馴化させた後、以下表２に示すように、６〜８匹ずつ６群に分けた。試験群のうち、ノーマル群には、試験期間中、通常固形飼料ＣＲＦ１（オリエンタル酵母株式会社製品、３．５７ｋｃａｌ／ｇ）を給餌し、コントロール群及び薬剤投与群には、試験期間中、高カロリー固形飼料Ｄ１２４９２（リサーチダイエット社製品、５．２４ｋｃａｌ／ｇ）を給餌した。飼料は自由摂取とし、飲水も給水瓶からの自由飲水とした。【００７７】
【表２】
2016006548.tif 000010
【００７８】
各薬剤投与群のマウスに対し、被検物質である５Ｈ４ＰＢ（実施例６にて製造）又は陽性対照物質であるロシグリタゾン（和光純薬工業株式会社製品）を、表２に示す所定の投与量で１日１回１２週間に亘り投与した。なお、ロシグリタゾンは選択的ＰＰＡＲγリガンドであり、ＰＰＡＲγと結合してグルコース、脂肪酸、インスリンの血中濃度を低下させる作用を有する物質である。投与にあたっては、週に１回体重測定を行い、各個体への投与量を算出した。５Ｈ４ＰＢ及びロシグリタゾンはそれぞれ０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース水溶液に懸濁させ、同水溶液にて希釈して、投与容量が１０ｍＬ／ｋｇとなるように調整したのち、注射筒及びフレキシブル胃ゾンデを用いて胃内に強制投与した。なお、ノーマル群及びコントロール群のマウスに対しては、０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース水溶液のみを１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で１日１回１２週間に亘り投与した。【００７９】
試験（投与）開始から週１回の頻度で各個体の体重を測定し、試験群ごとの平均値を求めた。結果を図１４に示す。図の縦軸はマウスの体重（ｇ）であり、横軸は試験開始からの日数（日）を示している。図１４に示すように、コントロール群は、試験開始２１日以降、ノーマル群と比較して体重の有意な増加が認められた。また、５Ｈ４ＰＢを投与した群では、コントロール群と比べて、高カロリー食による体重増加が抑制されることが示された。具体的には、試験終了時点（８４日目）における高カロリー食によるコントロール群の体重増加量（コントロール群の体重からノーマル群の体重を減じた値）に対し、５Ｈ４ＰＢを０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与した試験群は体重増加が２５．８％抑制され、５Ｈ４ＰＢを０．０１ｍｇ／ｋｇ／日投与した試験群は体重増加が２７．８％抑制された。このように、５Ｈ４ＰＢは高い抗肥満効果があることが認められた。一方、ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロシグリタゾンの投与結果によれば、ロシグリタゾンを０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与した低用量の試験群ではコントロール群よりも体重が増加し、抗肥満効果は観察されなかった。また、ロシグリタゾンを１０ｍｇ／ｋｇ／日投与した高用量の試験群については５Ｈ４ＰＢを０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与した試験群と比較しても体重増加抑制率は低かった。これらより、５Ｈ４ＰＢは低用量の投与であっても抗肥満効果が得られることがわかった。【００８０】
［実施例１０  食餌性肥満モデルマウスにおける血中アディポネクチンの測定］
アディポネクチンは、インスリン抵抗性や糖尿病、動脈硬化等の代謝異常症候群と関係する分泌蛋白である。アディポネクチン欠損マウスは、野生型マウスと比べてインスリン抵抗性を発症しやすく、動脈硬化に罹患しやすい性質を有しており、ヒトにおいてもアディポネクチン濃度の低下と糖尿病及び動脈硬化等の代謝異常症候群とが関連することが知られている。そこで、実施例９における食餌性肥満モデルマウスについて、血中アディポネクチン量を測定する試験を行った。【００８１】
実施例９の試験開始から８５日経過した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの各個体について、２％イソフルラン麻酔下にてヘパリン添加した注射筒を用いて腹部大静脈より採血を行った。採血量は約０．８ｍＬとした。採取した血液は遠心分離するまで氷冷下で保存し、遠心分離（条件：４℃、約１８００×ｇ、１０分間）した後、上層を回収して血漿を得た。血漿はサンプリングチューブに分注し、測定を行うまで冷凍保存した。各個体から得たマウス血漿中に含まれるマウスアディポネクチン濃度を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、試験群ごとの平均値を求めた。結果を図１５に示す。【００８２】
図の縦軸はマウス血漿中のアディポネクチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、棒グラフの各バーは、左側からノーマル群、コントロール群、５Ｈ４ＰＢ０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与群、５Ｈ４ＰＢ ０．０１ｍｇ／ｋｇ／日投与群、ロシグリタゾン０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与群及びロシグリタゾン１０ｍｇ／ｋｇ／日投与群を示している。この結果によれば、コントロール群と比べて、５Ｈ４ＰＢを投与した群では、アディポネクチン濃度が上昇することが認められた。また、ｔ検定の結果、特に０．０１ｍｇ／ｋｇ／日の投与群において、有意なアディポネクチン濃度の上昇が確認された。これらのことから、５Ｈ４ＰＢの投与により、アディポネクチンが作用するインスリン抵抗性や糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の予防・改善効果が得られることがわかった。【００８３】
［実施例１１  食餌性肥満モデルマウスにおける血中インスリンの測定］
実施例１０において、各個体から得たマウス血漿中に含まれるマウスインスリン量を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、試験群ごとの平均値を求めた。結果を図１６に示す。図の縦軸はマウス血漿中のインスリン濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、棒グラフの各バーが示す試験群は上述した図１５と同様である。この結果によれば、肥満による高インスリン血症が認められるコントロール群と比べて、５Ｈ４ＰＢを投与した群では、特に低用量の群において、インスリン濃度の上昇が抑制されていることが確認された。これらのことから、５Ｈ４ＰＢの投与により、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善効果が得られることがわかった。【００８４】
［実施例１２  食餌性肥満モデルマウスにおける血中レプチンの測定］
レプチンは、食欲と代謝の調節を行うタンパク質ホルモンであるが、肥満により血中レプチン濃度が上昇し、レプチン抵抗性が生じることが知られている。実施例１０において、各個体から得たマウス血漿中に含まれるマウスレプチン量を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、試験群ごとの平均値を求めた。結果を図１７に示す。図の縦軸はマウス血漿中のレプチン濃度（ｐｇ／ｍＬ）であり、棒グラフの各バーが示す試験群は上述した図１５及び図１６と同様である。この結果によれば、肥満による高レプチン血症が認められるコントロール群と比べて、５Ｈ４ＰＢを投与した群では、用量依存的にレプチン濃度の上昇が抑制されていることが確認された。これらのことから、５Ｈ４ＰＢの投与により、レプチン抵抗性や肥満の予防・改善効果が得られることがわかった。【００８５】
［実施例１３  食餌性肥満モデルマウスにおける皮下脂肪量及び内臓脂肪量の測定］
実施例９の試験開始から８５日経過した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの各個体について、２％イソフルラン麻酔下にて採血後、安楽死させた。各個体から鼠径部皮下脂肪、精巣周囲脂肪、腎臓周囲脂肪及び腸間膜脂肪を採取して各脂肪の重量を測定し、試験群ごとの平均値を求めた。【００８６】
結果を図１８（Ａ）〜（Ｄ）に示す。各図の縦軸は測定した各脂肪組織の重量（ｇ）であり、棒グラフの各バーは、左側からノーマル群、コントロール群、５Ｈ４ＰＢ０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与群、５Ｈ４ＰＢ ０．０１ｍｇ／ｋｇ／日投与群、ロシグリタゾン０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与群及びロシグリタゾン１０ｍｇ／ｋｇ／日投与群を示している。図１８に示すように、この結果によれば、コントロール群と比べて、５Ｈ４ＰＢを投与した群では、高カロリー食による皮下脂肪及び内臓脂肪の蓄積が抑制されることが示された。具体的には、高カロリー食によるコントロール群の各脂肪組織の増加量（コントロール群の脂肪組織重量からノーマル群の脂肪組織重量を減じた値）に対して、５Ｈ４ＰＢを０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与した試験群では、鼠径部皮下脂肪は約３５％、精巣周囲脂肪は約１８％、腎臓周囲脂肪は約１３％及び腸間膜脂肪は約１６％、それぞれ脂肪組織の増加が抑制され、５Ｈ４ＰＢを０．０１ｍｇ／ｋｇ／日投与した試験群では、鼠径部皮下脂肪は約３４％、精巣周囲脂肪は約１５％、腎臓周囲脂肪は約１３％及び腸間膜脂肪量は約４０％、それぞれ脂肪組織の増加が抑制された。このように、５Ｈ４ＰＢは低用量の投与において皮下脂肪及び内臓脂肪の蓄積抑制効果があることが認められた。また、ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロシグリタゾンの投与結果によれば、ロシグリタゾンを低用量（０．０３７μｇ／ｋｇ／日）で投与した試験群ではコントロール群よりも内臓脂肪量が増加し、内臓脂肪の蓄積抑制効果は観察されなかった。これらより、５Ｈ４ＰＢは低用量の投与であっても皮下脂肪及び内臓脂肪の蓄積抑制効果が得られることがわかった。【００８７】
［実施例１４  ５Ｈ４ＰＢの投与による肝臓組織への影響の検討］
実施例１３において、各個体から脂肪組織を採取する際に、肝臓を採取して病理組織検査を行った。病理組織検査所見は以下の通りであった。【００８８】
ノーマル群の個体については、肝細胞内に脂肪滴の沈着は認められず、ごく軽度の炎症性細胞の浸潤のみが認められた。他方、コントロール群の個体については、８個体のうち７個体に肝細胞内に小型〜大型脂肪滴の沈着がごく軽度〜軽度に認められ、ノーマル群と同様に炎症性細胞の浸潤がごく軽度に認められた。５Ｈ４ＰＢを０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与した試験群及び０．０１ｍｇ／ｋｇ／日投与した試験群については、肝細胞内の脂肪滴の沈着が全く無いかあるいは弱い沈着に留まった。ロシグリタゾン０．０３７μｇ／ｋｇ／日投与群では、肝細胞内に微細・小型・大型脂肪滴が混在してごく軽度〜軽度の沈着が認められ、ロシグリタゾン１０ｍｇ／ｋｇ／日投与群では、これら脂肪滴は増加し、中程度の沈着が認められると共に肝細胞は軽度の肥大を呈していた。【００８９】
これらの病理組織検査所見によれば、ロシグリタゾン投与群やコントロール群と比較して、５Ｈ４ＰＢによる肝障害は認められなかった。これにより、５Ｈ４ＰＢが安全性の高い成分であることが確認された。【００９０】
以上述べた実施例は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明はＰＰＡＲγが関与する生活習慣病やその他病態を予防又は改善するＰＰＡＲγ活性化剤を提供するため、医療や食品分野（サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含む）の産業において幅広く役立つものである。
【図１】
2016006548.tif 000014
【図２】
2016006548.tif 000015
【図３】
2016006548.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016006548.tif 000020
【図８】
2016006548.tif 000021
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2016006548.tif 000026
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2016006548.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月19日(2016.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＰＡＲγ活性化剤。
【化１】
2016006548.tif 000032
［式（１）中、Ｒ1は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ2はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項２】
前記Ｒ1が水素原子、リン酸基又は置換基を有していてもよい糖残基であり、前記Ｒ2がフェニル基、４−メチルフェニル基、ベンジル基又は４−メチルベンジル基であることを特徴とする請求項１に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項３】
糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは治療のための医薬であって、請求項１又は２に記載のＰＰＡＲγ活性化剤を含む医薬。
【請求項４】
糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、請求項１又は２に記載のＰＰＡＲγ活性化剤を含むサプリメント。
【請求項５】
式（２）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患の治療、予防、抑制又は改善用組成物。
【化２】
2016006548.tif 000033
［式（２）中、Ｒ1は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ2はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項６】
前記ＰＰＡＲγが関与する病態、症状又は疾患が、糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、体重増加、内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、レプチン抵抗性、脂質代謝異常、高脂血症、動脈硬化及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される１種以上の病態、症状又は疾患であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
式（３）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする抗肥満剤。
【化３】
2016006548.tif 000034
［式（３）中、Ｒ1は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ2はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項８】
式（４）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【化４】
2016006548.tif 000035
［式（４）中、Ｒ1は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ2はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【請求項９】
式（５）で表わされるブテノライド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする抗糖尿病剤。
【化５】
2016006548.tif 000036
［式（５）中、Ｒ1は水素原子、リン酸基、脂肪酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有していてもよい糖残基を示し、Ｒ2はフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、エチルベンジル基、フェネチル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基又はエチルフェネチル基を示す。］
【国際調査報告】
2016006548.tif 000037
2016006548.tif 000038
2016006548.tif 000039
2016006548.tif 000040