(57)【要約】【課題】従来公知のプロサイモシンα又はそのペプチドよりも製造・加工が容易であり，それらと同等又はそれ以上の活性を有するペプチド提供すること。【解決手段】本発明は，配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するペプチドを有効成分として含有してなる，血液臓器関門障害改善剤，血液臓器関門障害を伴う疾患又は虚血性疾患の治療剤，神経細胞死抑制剤を提供する。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
前記「配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列」中の２個のアミノ酸が結合してなるペプチドまたはその塩。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
前記「配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチド」が，
配列番号２または配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなる，ペプチドまたはその塩。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。
【請求項６】
請求項５に記載の血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤であって，
前記血液脳関門障害を伴う疾患が，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である，
血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む虚血性疾患の治療剤。 
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む脳梗塞の治療剤。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む，
血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む神経細胞死抑制剤。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，
脳虚血性疾患用治療剤。 
【請求項１２】
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，前記血栓溶解剤が，プラスミノーゲンアクチベータである，治療剤。
【請求項１３】
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって， 脳虚血性疾患が脳梗塞である，治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，プロサイモシンα由来のペプチド，及びそのペプチドを有効成分として含む血液臓器関門障害改善剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は日本人の死亡率第４位，寝たきりの病因で第１位の重要疾患であり，脳虚血が原因で生じる疾患である。脳卒中をはじめとする脳虚血性の疾患に対しては，予後を改善する意味で，急性期治療が重要であるといわれている。現在注目されている主な治療方法はプラスミノーゲンアクチベータ（以下，「ｔＰＡ」と記載する）をはじめとした血栓溶解剤であるが，その使用は４．５時間以内に限られ，その恩恵をうけることができる患者は十数パーセント程度にすぎない（非特許文献１参照）。この一因として，脳虚血後の時間経過と共に血液脳関門が脆弱になること，ｔＰＡなどの血栓溶解剤の使用により出血性脳卒中の危険性が増すことが挙げられる。【０００３】
発明者は近年，プロサイモシンαが神経細胞死保護作用を有する物質であり，この神経細胞死抑制効果によって脳卒中障害を軽減することができることを初めて見出した（特許文献１参照）。また発明者らはプロサイモシンαがマウス，ラットにおいて脳卒中および虚血性緑内障を抑制する効果を有することも見出した（非特許文献２〜４参照）。さらに発明者は，プロサイモシンαが，血液脳関門の脆弱化から血液脳関門を保護する作用を有することを見出すとともに，ラットプロサイモシンα中の３０アミノ酸からなる活性本体と，活性発現に重要な当該配列中の９アミノ酸とを明らかにした（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００４／０６４８６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】最新医療：医療：医療と介護：読売新聞オンライン ２００５年１０月２５日付記事，「脳梗塞に新薬 ｔＰＡ」，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｍｉｕｒｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｒｙｏｕ／ｍｅｄｉ／ｓａｉｓｉｎ／２００５１０２５ｉｋ１４．ｈｔｍ
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），１７６，８５３−８６２
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７），１４，１８３９−１８４２
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００９），１６，３４９−３５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し，血液臓器関門を保護することができる物質であって，薬剤等への適用を見据えて，現在公知のペプチドよりも取扱いの容易な物質が望まれている。特に，製造の容易さ及び市場での採算性を考慮すると，長さを１０アミノ酸以下にすることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，プロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチドを改変したペプチド（Ｐ８改変ペプチド：配列番号２など）及びこのペプチドを環状したペプチド（環状Ｐ８改変ペプチド：配列番号３）が，血液脳関門障害改善活性などの特性を有することを見出した。本発明者はさらに鋭意検討し，本発明を完成するに至った。【０００８】
上記の発明は，基本的には以下の知見に基づく。本発明者は，国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット（特許文献２）に開示されたＰｒｏＴα９と表記されるラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいてアミノ酸配列からＮ末端及びＣ末端の残基を１〜数個移動させて得られる部分ペプチド（配列番号１，４又は６で示されるペプチド）及びこれらのペプチドの１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる改変ペプチド又はその塩ペプチド（配列番号２，３又は５で示される改変ペプチド）の網膜虚血障害保護作用を検討し，改変ペプチドがより高い作用を示すことを見出した。【０００９】
P+2N／−4C      : DNEVDEE（配列番号４）
P+2N／−4C改変  : DNEVDQE（配列番号５）
P+2N／−3C      : DNEVDEEE（配列番号１）
P+2N／−3C改変  : DNEVDQEE（配列番号２）
P+2N／−3C改変  : *DNEVDQEE*（配列番号３）  ＊のアミノ酸を結合して環状化
P+2N／−2C      : DNEVDEEEE（配列番号６）
P+2N／−2C改変  : DNEVDQEEE（配列番号７）【００１０】
また，本発明者は，先に説明した環状Ｐ８改変ペプチドが上記ペプチドの中でも最も高い網膜虚血障害保護作用を有することを見出した。【００１１】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血作用抑制作用が認められた。【００１２】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の血管脆弱化に対する保護作用が認められた。【００１３】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡ併用時の運動障害改善作用が認められた。【００１４】
本発明者は，環状Ｐ８改変ペプチドが，ＰＩＴモデルにおける運動障害改善において高活性を示すことを見出した。【００１５】
本発明の第１の側面は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩に関する。この塩は薬学的に許容される塩である。この側面は，配列（配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列）に含まれる２つのアミノ酸残基が結合したものが好ましい。【００１６】
この側面のペプチドまたはその塩の好ましいものは，配列番号２又は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。そして，この側面のペプチド又はその塩の特に好ましいものは，配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。配列番号３は，末端のＮ（アスパラギン酸部分）とＥ（グルタミン酸）との間で結合が形成されたペプチドである。【００１７】
本発明の第２の側面は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤に関する。このように，本発明のペプチドまたはその塩を有効成分として含む治療剤を，本発明の治療剤ともよぶ。この治療剤は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩をその機能を発揮できる程度の有効量含むものである。具体的に説明すると，この治療剤は，血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤といえる。さらに具体的に説明すると，この治療剤は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患の治療剤である。また，本発明の治療剤の好ましい態様は，虚血性疾患の治療剤である。さらに，本発明の治療剤の好ましい態様は，脳梗塞の治療剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，神経細胞死抑制剤である。【００１８】
本発明の第３の側面は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩を血栓溶解剤投与の１時間前に前投与することにより，脳梗塞後６時間における血栓溶解剤による治療効果を高めることが期待される。また，同時投与することにより脳梗塞４時間後に投与した血栓溶解剤による出血作用を抑制するなどの重要な副作用を軽減できるという特性も期待できる。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の血液臓器関門障害改善剤は，虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し，血液臓器関門障害を改善することができる。特に脳虚血（脳卒中など）により生じうる血液脳関門の脆弱化の抑制や，網膜虚血により生じうる血液網膜関門障害の改善に有用である。よって本発明の剤は血液臓器関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。 
あるいは，各臓器の虚血により血液臓器関門が脆弱化した場合であって，血栓溶解剤の適用対象外と判断されるような場合であっても，従来公知の血栓溶解剤と本発明の剤とを併用することによって，血栓溶解剤による血液臓器関門からの出血といった副作用を心配することなく虚血性疾患を治療することができる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤の有効成分は，プロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチド（本明細書中，「ＰｒｏＴα８」や「Ｐ８」と記載する場合がある；配列番号１）を改変したペプチド（配列番号２及び３）等である。この有効成分は，従来知られているプロサイモシンα全長やプロサイモシンα由来のペプチドに比べて，製造・加工が容易であって，かつ同等以上の虚血改善効果を有している。したがって当該ペプチドは，血液臓器関門障害の改善剤や，血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤，また虚血性疾患の治療剤等の有効成分として，より有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは，網膜虚血モデルにおいてペプチドを投与した場合のERGにおけるａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは，網膜虚血モデルにおいてペプチドを投与した場合のERGにおけるｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。
【図２】図２は，ペプチドの網膜虚血障害保護効果を示すための染色された網膜を示す図面に替わる写真である。
【図３】図３は，ＰＩＴモデルにおいてペプチドを静脈内投与した場合のアクセレイテッドロータロッドテスト（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｒｏｔａ  ｒｏｄ  ｔｅｓｔ）の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程及び臨床スコアの基準を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは，ペプチドを静脈内投与した場合のｔＭＣＡＯモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。
【図５Ａ】図５Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。
【図５Ｃ】図５Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血領域を定量的解析したグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における血液脳関門破綻に誘導されるエバンスブルー漏出を示す写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における血液脳関門破綻に誘導されるエバンスブルー漏出領域を定量的解析したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下，本発明を詳細に説明する。
プロサイモシンα（以下，「ＰｒｏＴα」と記載する場合がある）とは，神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能を有し，また「脳虚血性の血液脳関門脆弱化を顕著に抑制し，血液脳関門障害を改善する機能」をも有することが知られている公知のタンパク質である。
【００２２】
上記の発明は，基本的には以下の知見に基づく。国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット（特許文献２）に開示されたＰｒｏＴα９と表記されるラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいてＮ末端及びＣ末端の残基を１〜数個移動させて得られる部分ペプチド（配列番号１，４又は６で示されるペプチド）及びこれらのペプチドの１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる改変ペプチド又はその塩ペプチド（配列番号２，３，５又は７で示される改変ペプチド）の網膜虚血障害保護作用を検討し，改変ペプチドがより高い作用を示すことを見出した。
【００２３】
P+2N／−4C      : DNEVDEE（配列番号４）
P+2N／−4C改変  : DNEVDQE（配列番号５）
P+2N／−3C      : DNEVDEEE（配列番号１）
P+2N／−3C改変  : DNEVDQEE（配列番号２）
P+2N／−3C改変  : *DNEVDQEE*（配列番号３）  ＊のアミノ酸を結合して環状化
P+2N／−2C      : DNEVDEEEE（配列番号６）
P+2N／−2C改変  : DNEVDQEEE（配列番号７）
【００２４】
また，先に説明した環状Ｐ８改変ペプチドが上記ペプチドの中でも最も高い網膜虚血障害保護作用を有することを見出した。
【００２５】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチド（配列番号３で示されるペプチド）は，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血作用抑制作用が認められた。
【００２６】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血領域の縮小作用が認められた。
【００２７】
Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡ併用時の運動障害改善作用が認められた。
【００２８】
環状Ｐ８改変ペプチドは，ＰＩＴモデルにおける運動障害改善において高活性を示すことを見出した。
【００２９】
本発明のペプチドまたはその塩（単に本発明のペプチドとよぶ場合がある）は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列の一部を置換したアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩であり，配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと同様又はそれ以上の活性を有するものである。配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドの活性は，後述する実施例で評価された活性のうちいずれか１つであればよい。また，このように本発明のペプチドまたはその塩は，単離されたペプチドであるか，又は単離及び精製されたペプチドである。
【００３０】
本発明のペプチドは，ヒトや哺乳動物（例えば，モルモット，ラット，マウス，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ又はサル）の細胞に由来するペプチドであってもよい。また，本発明のペプチドは，プロサイモシンα又はそれに由来するペプチドの部分ペプチドであってもよい。さらに，本発明のペプチドは，合成ペプチドであってもよい。
【００３１】
本発明のペプチドの例は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。本発明のペプチドは，たとえば，ペプチド内のアミノ酸同士が結合し，環状構造を有していてもよく，また環状構造を有していることが好ましい。
【００３２】
なお，本発明のペプチドには，たとえばアミノ酸残基や，末端が修飾されているものも含まれる。そのような置換の例は，アミノ酸残基又はペプチド末端が，アセチル化又はアミド化されているものである。
【００３３】
本発明のペプチドの好ましい例は，配列番号２又は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。これらの中でも，本発明のペプチドの好ましい例は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。
【００３４】
本明細書におけるペプチドは，ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）であり，右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のペプチドは，Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボキシレート（−ＣＯＯ−），アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲの例は，Ｃ１−６アルキル基，Ｃ３−８シクロアルキル基，Ｃ６−１２アリール基，Ｃ７−１４アラルキル基，及びピバロイルオキシメチル基である。Ｃ１−６アルキル基の例は，メチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓ−ブチル基及びｔ−ブチル基である。Ｃ３−８シクロアルキル基の例は，シクロペンチル基及びシクロヘキシル基である。Ｃ６−１２アリール基の例は，フェニル基及びα−ナフチル基である。のＣ７−１４アラルキル基の例は,ベンジル基及びフェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；及びα−ナフチルメチル基などのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基である。
【００３５】
本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合，カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルの例は，上記したＣ末端のエステルである。
【００３６】
本発明のペプチドには，上記したペプチドにおいて，Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの，Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの，分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの，あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖タンパク質などの複合ペプチド・複合タンパク質なども含まれる。Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基の保護基の例は，Ｃ１−６アシル基であり，Ｃ１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の例は，−ＯＨ，−ＳＨ，アミノ基，イミダゾール基，インドール基，及びグアニジノ基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の保護基の例は，Ｃ１−６アシル基であり，Ｃ１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基である。
【００３７】
本発明のペプチドの塩は，生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩の例は，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，及び硫酸）との塩及び有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，及びベンゼンスルホン酸）との塩である。
【００３８】
本発明のペプチドの塩は，実質的に本発明のペプチドと同様の作用を有する。このため，本明細書の実施例においてもペプチドの塩が用いられている場合や，ペプチドの塩が含まれている場合が存在する。そのような場合であっても，簡便のためペプチドのみを用いたように表記する。
【００３９】
本発明のペプチドは，特許文献１又は２に開示されたプロサイモシンα又はプロサイモシンα由来のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断すること，又は公知の合成方法によって製造することができる。また，ペプチドの環状化は，例えば高度希釈法など従来公知の方法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させる方法等により行うことができる（特表２０１０−５１４７２８号公報，特表２００２−５３３２９９号公報，再表２００８／１１７８３３号公報参照）。
【００４０】
本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療剤
本発明の血液脳関門障害改善剤は，本発明のペプチドを有効成分として含有する。このため本発明の血液脳関門障害改善剤は，脳虚血により生じる血液脳関門の脆弱性を保護し，血液脳関門障害を改善することができる。従って本発明の血液脳関門障害改善剤は，それが有する神経保護作用によって血液脳関門を保護すると共に，脳血管障害により脆弱化した血液脳関門をも改善することができるので，脳虚血性の疾患全般，特に血液脳関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。 
【００４１】
本発明における「血液脳関門障害を伴う疾患」とは，血液脳関門に異常を生ずることが知られている疾患全般（例えば血液脳関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になる疾患，血液脳関門における物質輸送が異常を来す疾患など）や，血液脳関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患は，多くが脳虚血を伴う疾患であり，具体的には，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患などのほか，脳卒中，外傷性脳障害，緑内障，糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。なお，ここでいう「治療」には，疾患を完治させる場合のみならず，病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
【００４２】
本発明の「血液脳関門障害改善剤」および「血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤」は，本発明のペプチドを，公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず公知の担体又は希釈剤を適用することが可能であるが，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。
【００４３】
本明細書中「血液臓器関門」とは，血管内の血液と臓器の組織液との間の物質交換を制御する機構のことをいう。血液臓器関門による物質交換の制御機構は，アミノ酸やグルコースをはじめとする神経活動のエネルギー源となる必須内因性物質を臓器内に取り込むメカニズムと，臓器内の毒物や不要な異物などを血中に排出するメカニズムに支えられている。これらのメカニズムは，各臓器の毛細血管内皮細胞に発現している多くのトランスポーター輸送系によってコントロールされ得る。
代表的な血液臓器関門である血液脳関門を解剖学的に見ると，血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成し，細胞間隙への物質透過性を制限していることが理解できる。つまり血液脳関門の存在により，脳組織をはじめとする中枢神経系へ血管内の成分が流れ込まなくなるため，中枢神経系の生化学的恒常性が高度に維持されている。血液脳関門に異常を生じた場合，脳血管内と脳内の選択的な物質透過性に異常が生じ，これらの異常が結果的に中枢神経系に影響を及ぼすこととなる。
【００４４】
血液臓器関門として具体的には，血液脳関門，血液網膜関門，血液脳脊髄液関門，血液胆汁関門，血液胸腺関門，血液精巣関門などが挙げられる。好ましくは，血液脳関門，血液網膜関門などの脳神経系の臓器における血液臓器関門である。
【００４５】
血管梗塞時には，梗塞部位だけでなく血液臓器関門にも虚血症状が生じる。虚血症状が生じた部分の血管は急激に弱くなるので，血流が再開された場合，血液臓器関門から出血する可能性が高い。特に脳梗塞などの脳虚血の場合は，血液脳関門の血管壁が急激に弱くなり，血流再開に伴い出血するリスクが非常に高い。
したがって血管梗塞治療に適用するか否か検討されるべきｔＰＡなどの血栓溶解剤は，例えば脳梗塞の場合，梗塞後４．５時間（好ましくは３時間）以内にその病態が確認できた場合でしか使用できないために，ほとんどが適用外となってしまう。
それに対しＰｒｏＴαは，脳梗塞のような血栓の排除に急を要する一方で必ず出血を避けなければならないような疾患に対する治療に用いることができる。すなわち，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善することが可能であるだけでなく，後述するように，ｔＰＡなどの血栓溶解剤を併用することができるよう，血液脳関門などの血液臓器関門の脆弱性を改善する目的でも用いることが可能なものである。
【００４６】
本発明における「血液臓器関門障害」とは，血液臓器関門に何らかの異常を生ずることをいう。このような異常としては，血液臓器関門における物質の選択的透過性の異常，毛細血管内皮細胞のタイトジャンクションの崩壊（細胞間隙の広がり），毛細血管内皮細胞の減少が挙げられ，さらに血液臓器関門の機能低下に起因する障害，例えば浮腫や黄疸などが挙げられる。
【００４７】
本発明における「血液臓器関門障害」として具体的には，上記した血液臓器関門障害で一般的に生じる症状だけでなく，例えば血液脳関門障害に伴って生ずる，脳毛細血管内皮細胞の減少およびそれに伴う発熱，脳浮腫などの脳炎症状，記憶・学習，食欲，睡眠障害や情動性疼痛などのありとあらゆる高次脳機能障害，血圧，呼吸，消化器症状を伴う自律神経疾患，頭蓋内圧亢進症状に伴う頭痛，嘔吐，脳ヘルニアなども含まれる。また臓器が網膜の場合は，例えば中心性漿液性網脈絡膜症が挙げられる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤は，このような血液臓器関門障害を改善し，血液臓器関門を保護するものである。
【００４８】
血液臓器関門の異常は，血液臓器関門周辺の毛細血管の数量や長さを確認することで発見することが可能である。
例えば血液脳関門の異常を確認する場合，大脳皮質知覚領域における毛細血管の数量や長さを通常の状態と比較する。すなわち大脳皮質知覚領域における毛細血管が少なければ，脳梗塞に伴い血液脳関門の異常が発生していると判断することができるし，大脳皮質知覚領域における毛細血管が適量であれば，血液脳関門の異常は無いものと判断することができる。毛細血管の長さや量は自体公知の方法によって判別することができるが，そのような方法としては，「生体の科学；５５（３）巻，２６６−２７２頁（森川俊一，江崎太一著），２００４年」に記載のレクチン（例，トマトレクチン）による血管内皮細胞の染色が挙げられる。
【００４９】
例えば，配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＤＮＥＶＤＱＥＥ）からなるペプチド及びこのペプチドのアミノ酸配列中の２個のアミノ酸が結合してなるペプチド（配列番号３）は，本発明の血液臓器関門障害改善剤，血液臓器関門障害を伴う疾患又は虚血性疾患の治療剤，神経細胞死抑制剤などの有効成分として利用することができる。配列番号３のペプチドは，１番目のＤと８番目のＥとの間に結合が形成されたものである。なお，配列番号５の１番目のＤと７番目のＥとの間に結合が形成されたものも本発明の好ましいペプチドである。
【００５０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは，ラットプロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチド（ＰｒｏＴα８と呼ぶ）である。当該ペプチドは，ラット由来のプロサイモシンαだけでなく，ヒト由来のプロサイモシンαにおける対応するペプチド，マウス由来のプロサイモシンαにおける対応するペプチドなど，いずれの動物種のものも同じ配列である。
【００５１】
配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは，プロサイモシンαが有する機能，例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有するペプチドである。そして当該ペプチドは，創薬シーズへの適応をより容易にする目的で，その機能を維持しつつ，従来公知のプロサイモシンα由来のペプチドよりもさらに短小化されたペプチドである。
【００５２】
先に説明したとおり，本発明では，配列番号１で表されるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩であって，配列番号２または３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと「実質的に同等の機能を有するペプチド」を使用することもできる。ここで「実質的に同等の機能を有するペプチド」とは，上記「配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」と同様の機能（ここでいう「同等の機能」とは，機能が質的に同等であることをいい，その活性／作用の強弱について述べているわけではない），例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有し，かつ「配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列における１個のアミノ酸が置換されたペプチドが挙げられる。どのようなアミノ酸を置換させることができるかについては，当業者であれば所望の機能や後述するペプチド修飾との兼ね合いにより適宜決定することが可能である。 
【００５３】
ただし，本発明者は，ラットプロサイモシンαの５０番目〜５６番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチド及び５１番目〜５７番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチドも，配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと同等の活性を有するが，５１番目〜５５番目のアミノ酸からなる５アミノ酸のペプチド及び４９番目〜５６番目のアミノ酸からなる８アミノ酸のペプチドでは，活性が低下することを見出している（データ示さず）。
【００５４】
これらのペプチドは，天然由来のペプチドでなくてもよく，自体公知のペプチド合成法によって製造することが可能である。またアミノ酸の欠失，付加，置換若しくは転位についても，自体公知の方法により行うことが可能である。
【００５５】
本発明のペプチドは，プロサイモシンαが有する機能，例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，ネクローシス抑制機能，アポトーシス促進機能，間接的アポトーシス抑制機能など）などを有する限りにおいて，ペプチド修飾されていてもよい。
【００５６】
ペプチドの修飾としては，蛍光標識（例，ＦＩＴＣ化，Ｄｎｓ化，Ｎｍａ化など），その他の標識（例，ビオチン標識など），脂肪酸による修飾（例，ＤＨＡ修飾など），リン酸化，スルホン化，水酸化，メチル化，アセチル化，プレニル化，パルミトイル化，カルボキシル化，アミノ基の修飾（例，アセチル化，ホルミル化，ピログルタミン酸化，アミド化，スクシニル化，ビオチニル化，Ｚ化，Ｄｎｐ化，Ｄｎｓ化，ミリストイル化など），チオール基の修飾（例，ファルネシル化，ゲラニル化など），糖による修飾（例，Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）含有ペプチドなど），グリコシルホスファチジルイノシトール付加，ユビキチン化，ペプチド結合の修飾（例，還元型，スタチン型など）などが挙げられる。所望の機能を調整すべく，当業者であればこのましい修飾態様を適宜選択することが可能である。
【００５７】
本発明のペプチドが修飾される場合，ペプチドにおける修飾位置は特に限定されないが，ペプチド末端で修飾されることが好ましい。
ペプチド末端の修飾方法としては，上述した本発明のペプチドが有する機能を阻害しないものであれば特に限定されないが，当該機能を向上させる，あるいは本発明のペプチドの体内での分解を抑制するといった観点から，アセチル化またはアミド化であることが望ましい。本発明のペプチドをペプチド末端でアセチル化またはアミド化することによって，本発明のペプチドの機能を向上させ，あるいは体内での分解を抑制することができる。 
ペプチド末端におけるアセチル化またはアミド化は，当業者であれば適切な手法を適宜選択して行うことが可能である。例えば，本発明のペプチドは，Ｎ末端がアセチル化され，かつ／又はＣ末端がアミド化されたペプチドである。
【００５８】
本発明の「血液脳関門障害改善剤」は，本発明のペプチドを有効成分として含有してなるので，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善するだけでなく，さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し，血液臓器関門を保護することができる。
すなわち本発明の血液臓器関門障害改善剤は，本発明のペプチドが有する細胞保護作用によって，血液臓器関門周囲の神経組織を保護すると共に，血管障害により脆弱化した血液臓器関門をも改善し，血液臓器関門を保護することができる。したがって虚血性の疾患全般，血液臓器関門障害を伴う疾患，特に脳神経系組織における虚血性疾患，脳神経系臓器における血液臓器関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。
【００５９】
本発明における「血液臓器関門障害を伴う疾患」とは，血液臓器関門に異常を生ずることが知られている疾患全般や，血液臓器関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患としては，血液臓器関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になることに起因する疾患や，血液臓器関門における物質輸送が異常を来すことに起因する疾患などが挙げられる。
臓器としては，脳神経系の臓器であることが好ましい。本発明の「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」に含まれる「本発明のペプチド」は，特に脳神経系の血液臓器関門の障害に対し有効に機能するので，当該剤は，脳神経系の血液臓器関門障害を伴う疾患の治療に有用である。
【００６０】
血液臓器関門障害が，血液脳関門障害である場合，血液脳関門障害を伴う疾患の多くは脳虚血を伴う疾患であって，このような疾患として具体的には，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，黄疸または出血性疾患などのほか，脳卒中，外傷性脳障害などが挙げられる。
また血液臓器関門障害が，血液網膜関門障害である場合，血液網膜関門障害を伴う疾患として具体的には，緑内障，糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。
なおここでいう疾患の「治療」には，疾患を完治させる場合のみならず，病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
【００６１】
本発明における「虚血性疾患」とは，虚血によって生じる様々な疾患のことをいう。虚血は血栓による動脈の梗塞や，動脈自体の狭窄など様々な原因によって生ずる。 
虚血性疾患としては，脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患（脳卒中，脳梗塞，脳血栓，一過性脳虚血発作など），心臓組織の虚血により生じる虚血性疾患（虚血性心疾患；例えば心筋梗塞，狭心症など），腸組織の虚血により生じる虚血性腸疾患（虚血性腸疾患；例えば急性腸間膜動脈閉塞症，虚血性大腸炎，腹部アンギナなど）が挙げられるが，好ましくは，脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患である。
【００６２】
一方，本発明の「虚血性疾患の治療剤」は，血栓溶解剤と併用することで，血栓溶解剤の適用範囲を広げることができる。特に本発明の「虚血性疾患の治療剤」を血栓溶解剤と併用することで，血管梗塞に起因する虚血性疾患をより効果的に治療することが可能である。
【００６３】
一般に血栓溶解剤は，血管梗塞急性期であって，従来の血管構造が保たれている期間内（例えば脳梗塞の場合は，発症後４．５時間以内）の患者にしか使用することができず，そのため，ＣＴやＭＲＩなどで出血がない事を確認した上で用いることが求められている。これは，血液臓器関門が虚血により脆弱化するので，発症初期の血液臓器関門の構造が比較的維持されている状態でないと血栓溶解剤の効果により出血などの副作用が生じる危険性が高まるためである。したがって特に脳梗塞を始めとする脳血管障害の場合は，頭蓋内から出血がない，あるいは出血する危険性が無い状態で使用することが望まれるため，多くの脳血管障害に直面した医師は，出血の危険性を恐れて，本来使用したい血栓溶解剤を使用しない場合が多い。
しかしながら，本発明の「虚血性疾患の治療剤」に含まれる本発明のペプチドは，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善するだけでなく，さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し，血液臓器関門を保護することができる。本発明のペプチドは出血を引き起こさないので，虚血性疾患等の治療において，出血の有無を確認することなく早期に投与することが可能である。したがって，本発明のペプチド，あるいは本発明の「虚血性疾患の治療剤」を用いることにより，血液臓器関門の構造が維持され，血栓溶解剤の副作用として考えられる脆弱血管から出血するリスクが極めて低くなる。
【００６４】
したがって，血栓溶解剤の使用に際し本発明の「虚血性疾患の治療剤」を併用することにより，血管梗塞の発症時期に左右されること無く血栓溶解剤を用いることができる。これにより効果的に種々の虚血性疾患を治療できるようになる。特に脳虚血性疾患（例えば，脳梗塞，脳卒中など）では発症後４．５時間しか血栓溶解剤を用いることができなかったが，本発明の虚血性疾患治療剤との併用により，４．５時間が経過したとしても血栓溶解剤を使用することが可能になり，急性期における脳虚血性疾患の治療ルートの選択範囲が飛躍的に拡大する。
【００６５】
従って，本発明は本発明のペプチドを有効成分として含有する，虚血性疾患治療剤を提供すると共に，該虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせも提供する。なお，当該血栓溶解成分は，本発明の虚血性疾患治療剤の中に含まれていてもよいし，虚血性疾患治療剤とは別の血栓溶解剤として用いてもよい。
【００６６】
本発明の虚血性疾患治療剤と併用され得る血栓溶解剤（血栓溶解成分）としては，具体的にはｔＰＡ，ウロキナーゼ，ストレプトキナーゼ，ナットウキナーゼ，プロウロキナーゼ，スタフィロキナーゼ，デスモテプラーゼ，ＡＰＳＡＣなど，あるいはこれらの血栓溶解成分に由来するペプチドが挙げられるが，これらに限定されない。好ましくはｔＰＡである。ここで「これらの血栓溶解成分に由来するペプチド」とは，上記血栓溶解成分が有する活性をそれぞれ有し，かつ各血栓由来成分（蛋白質）全長のアミノ酸配列の一部または全部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
ｔＰＡは，市販されているものを用いてもよいし，また公知の方法で合成したものを用いてもよい。
【００６７】
さらに本発明の虚血性疾患治療剤は，他の公知の血管障害治療剤（血管障害治療成分）と併用して用いることができる。他の公知の血管障害治療剤としては特に限定されないが，上記血栓溶解剤の他に，例えばラジカルスカベンジャー（エダラボン）が挙げられる。
【００６８】
本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解剤（血栓溶解成分）との組み合わせは，（１）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを一緒に製剤化し，単剤（配合剤）として投与する方法，（２）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し，同時に投与する方法，（３）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し，時間差で投与する方法（例，本発明の虚血性疾患治療剤を先に投与し，次いで血栓溶解成分を投与する），などが挙げられるがこれらに限定されない投与方法によって，投与することができる。 
併用される他の公知の血管障害治療剤の投与量は，用途や投与対象の年齢，体重，性別，疾患の程度等の要件によって適宜変更可能であるが，例えば，ｔＰＡの場合，虚血性疾患の治療に一般に使用される量を用いることができ，通常げっ歯類では約１０ｍｇ／ｋｇ，ヒトでは約０．６ｍｇ／ｋｇである。
【００６９】
本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせでは，血栓溶解成分を使用できる期間を延長することが可能となる。かかる効果を奏するには，ヒトの場合，ｔＰＡ約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約０．９ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇに対し，本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。マウスでは，ｔＰＡ約１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇに対し，本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。
【００７０】
前述のとおり本発明のペプチドは，神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）を有するペプチドであるため，本発明のペプチドを含む剤は，神経細胞死抑制剤として用いることが可能である。
よって本発明は，本発明のペプチドを有効成分として含有する，神経細胞死抑制剤を提供する。
【００７１】
本発明の「血液臓器関門障害改善剤」，「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」，「虚血性疾患の治療剤」および「神経細胞死抑制剤」（以下，これらをまとめて「本発明の剤」と記載する場合がある）は，本発明のペプチドを公知の方法に従って薬学的に許容される担体あるいは希釈剤，さらに必要に応じて上記併用成分と混合することにより，製剤化される。
適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず，自体公知の担体あるいは希釈剤を適用することが可能であるが，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。
【００７２】
本発明の剤の剤型は特に限定されることなく，自体公知の投与剤型を適用可能である。しかしながら公知の臓器血管障害の治療用医薬と同様に，血管投与用の注射剤として調製されることが好ましく，特に血液脳関門障害に対する剤の場合は，脳室内投与用の注射剤として調製されることが好ましい。
より具体的には，本発明のペプチドを，水，生理食塩水，等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際，ポリエチレングリコール，グルコース，各種アミノ酸，コラーゲン，アルブミン等を保護剤として添加して調製することが可能である。また，リボソーム等の封入体にペプチドを包埋させて投与することも可能である。
【００７３】
本発明のペプチドを上述した疾患の治療に用いるとき，有効成分としての本発明のペプチドの用量は特に限定されず，対象の年齢，体重，病状，および投与経路，その他の要素により異なるが，投薬する医師などが容易に適宜決定することができる。
【００７４】
本発明のペプチド，あるいは本発明の剤の投与方法は特に限定されず，現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として，大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は，脳実質を傷つけないという点で有利である。また非経口投与（例えば，血管内投与（例，静脈内投与），脳室内投与など），経口投与などにより投与してもよい。
【００７５】
本発明のペプチドを全身投与，例えば静脈内投与する場合，１日の投与量は，例えば，約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇである。また，本発明のペプチドを局所投与，例えば硝子体内投与する場合，１回の投与量が約０．１ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌ，好ましくは約１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌとなるように投与する。
【００７６】
本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。実施例により実証されたとおり，本発明のペプチド又はその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。このため，たとえば，本発明のペプチドまたはその塩と，血栓溶解剤とを併用することで，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。
【００７７】
本発明の治療剤の好ましい態様は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩が対象に投与された後，３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に血栓溶解剤が投与されるものであってもよい。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。
【００７８】
本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチドを，血液脳関門障害を伴う疾患を治療するために有効な量投与する工程を含む，血液脳関門障害を伴う疾患の治療方法をも提供する。
【００７９】
血液脳関門障害を伴う疾患の例は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，及び脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である。
【００８０】
本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチドを脳梗塞の治療に有効な量投与する工程を含む，脳梗塞の治療方法をも提供する。
【００８１】
本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチド及び血栓溶解剤を脳虚血性疾患の治療に有効な量投与する工程を含む，脳虚血性疾患の治療方法をも提供する。血栓溶解剤の例は，プラスミノーゲンアクチベータである。この方法は，特に脳梗塞の治療に有効である。すなわち，血栓溶解剤と本発明のペプチドを併用することで，血栓溶解剤の治療可能時間を延長することができ，さらに血栓溶解剤による運動機能低下を防止できる。本発明のペプチド及び血栓溶解剤は，対象に同時に投与されてもよい。一方，たとえば，脳卒中の疑いがある場合に，本発明のペプチドを取り急ぎ投与し，その後３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に，検査結果に基づいて血栓溶解剤を対象に投与してもよい。
【実施例】
【００８２】
以下，実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００８３】
［試験方法］
試薬等
ｔＰＡは，協和発酵キリン株式会社（東京，日本）より購入した。【００８４】
実験動物
本実験で使用したＣ５７／ＢＬ６Ｊ系雄性マウス６〜９週齢（１９〜２８ｇ）は，恒温（２２±２℃）の部屋で１２時間毎の昼夜自然管理下において飼育し，水道水及び一般動物用固形飼料（ＭＦ，オリエンタル酵母，東京，日本）を自由に摂取させた。以下に示す全ての実験は，長崎大学動物実験指針で定める方法に準じて行った。 【００８５】
網膜虚血モデル
ペントバルビタール７５ｍｇ／ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。37℃の恒温台の上にマウスを置き，体温を維持する。硝子体を１％の硫酸アトロピンで散瞳させ，無菌眼内潅流溶液（ＢＳＳ ＰＬＵＳ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ; Ａｌｃｏｎ, Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ, ＴＸ, ＵＳＡ）の容器を予め水面がマウスの眼より１３５．５ ｃｍ（１００ ｍｍＨｇ）の高さになるようにつり上げておき，灌流溶液を小児用輸液セットに接続した３３Ｇの注射針を針先から少し垂らしながら前眼房に刺入し固定した。前房に針を刺入した後，灌流系を解放することにより前眼房内に圧力（１００ ｍｍＨｇ）を４５分間負荷した（マウス正常眼圧は１５ ｍｍＨｇ程度）。これらの操作は実体顕微鏡下で行い，眼圧の上昇により網膜虚血が惹起されていることを網膜内血流の遮断を指標に目視にて確認した。虚血負荷終了後に注射針を抜き，眼圧を低下させることにより網膜を再灌流させた。モデルは虚血−再灌流法を用いた一般的緑内障モデルであり，既存の緑内障治療薬であるアンジオテンシン変換酵素阻害薬の全身投与により神経保護効果を示すこと等が知られている。【００８６】
ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色による組織障害評価
標本作製：ペントバルビタール５０ ｍｇ/ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。心臓から Ｋ+ ｆｒｅｅ ＰＢＳ ４０ ｍｌを灌流して脱血し，４％ ＰＦＡ ３０ ｍｌを灌流して固定した。マウスから眼球を取り出し，室温で３時間，４％ ＰＦＡで浸漬固定した。２５%スクロースに置換し，８時間以上組織が沈むまで４℃でインキュベーションした。その後，組織表面の水分を拭き取った後，ＯＣＴコンパウンドで包埋した。凍結ミクロトーム ＣＭ１９００で１０μｍ厚切り切片を作成し，シランコーティングしたスライドガラスに張り付けた。ヒーターの中で一晩乾燥させた。【００８７】
ＨＥ染色：検体の細胞核をギルヘマトキシリン液にて染色し，洗浄後０．２％ 塩酸・７０％エタノールにて分別を行う。分別液を洗浄し，９５％エタノールにて検体を親和させる。組織をエオジン・フロキシン液にて対比染色する。エタノールにて分別・脱水を行った後，キシレンにて透徹した。検体は封入した後，ＢＩＯＺＥＲＯ顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ，大阪，日本）にて観察を行った。【００８８】
網膜電位図（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ: ＥＲＧ）による網膜機能の評価
マウスを暗室にて3時間暗順応させた後，ペントバルビタール５０ ｍｇ/ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。１％ アトロピン点眼にて瞳孔を開かせた後，コンタクト電極（ＫＥ-Ｓ; Ｋｙｏｔｏ ｃｏｎｔａｃｔ ｌｅｎｓｅｓ，京都，日本）を角膜先端に設置し，鉄電極を眼近傍に設置した。皮下プラチナ針電極は，腹部に設置した。ＥＲＧはＳＬＳ−３１００（日本光電，東京，日本）にて２０ Ｊの閃光にて誘発させ，ＭＥＢ-９１０４（日本光電）にて２分ごとに３０分間計測した。バックグラウンド補正は，通常時の明時における反応を２分ごとに２０分間計測したものを使用した。計測されるａ波，ｂ波の増幅は，Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ（日本光電）にて定量した。【００８９】
一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）モデル
マウスを３％ イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｒ ＭＫ-Ａ１００，室町機械株式会社，東京，日本）。摂氏３７度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で咽頭部位の皮膚を鋏で ２ ｃｍほど縦に切る。硬質絹糸（硬質8号，夏目製作所）で皮を右側に引っ張り，視野を確保した。実体顕微鏡を使い，結合組織，神経などを剥離しながら気管左に位置する左総頸動脈を硬質絹糸で確保する。総頸動脈を上方へ辿ると内頸動脈と外頸動脈に分かれるので，左手前側の外頸動脈を二か所，軟質絹糸で硬く結び，間を切る。内頸動脈から上部に伸びる細い血管を軟質絹糸で確保する。軟質絹糸と硬質絹糸を強く引っ張り血流を止めて，内頸動脈に鋏で切りこみを入れる。そこから塞栓子を１から１．５ ｃｍ挿入し，中大脳動脈を閉塞する。内頸動脈を塞栓子ごと軟質絹糸で結び，塞栓子を固定した。引っ張っている硬質絹糸の下に軟質絹糸を通し，硬質絹糸の手前で総頸動脈を結んでから硬質絹糸を外す。軟質絹糸で胸を２か所縫合する。本課題の一過性中大脳動脈閉塞モデル（ｔＭＣＡＯ）の場合，１時間，または４時間後に再び摂氏３７度の恒温台の上でマウスに３％イソフルランで麻酔をかけ，胸を縫合した軟質絹糸をほどき，胸を開ける。内頸動脈を結んでいた軟質絹糸を緩め，塞栓子を抜去し，すぐに再び内頸動脈を結んだ。【００９０】
血栓性脳梗塞（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ: ＰＩＴ）モデル
マウスを３％イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｒ ＭＫ-Ａ１００，室町機械株式会社，東京，日本）。術中は，２．５％イソフルランで麻酔効果の維持を行った。摂氏３７度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で左耳と左眼の間の皮膚を５〜６ｍｍ切開した。側頭筋縁に沿って眼科用ハサミを入れ，頭蓋骨と側頭筋の付着部を切開し，側頭筋下の中大脳動脈領域の頭蓋骨を露出した。軟質絹糸で四方向に皮膚および側頭筋を引っ張ることで視野を確保した後，実体顕微鏡下にて中大脳動脈領域の頭蓋骨にドリルで約１．５ｍｍ径の小孔を開けた。ローズベンガル（Ｗａｋｏ）３０ ｍｇ/ｋｇを尾静脈内投与し，直後にＵＶスポット光源（Ｌ-４８８７-１３；浜松ホトニクス，静岡，日本）に接続したライトガイド（Ａ４８８８；浜松ホトニクス，静岡，日本）の先端部を，硬膜下に確認される遠位中大脳動脈に垂直に充て緑色光を１０分間照射した。その後，中大脳動脈が変化（細くなる又は血赤色が薄くなる）していることを確認した後，側頭筋を戻し，皮膚を軟質絹糸にて縫合した。【００９１】
神経学的スコアリング
脳虚血に伴う運動機能障害の程度を評価するため，以下の定義による神経学的スコア（Clinical Scores）を用いた。また，1〜4の各数値は 2段階評価とした（スコア1と2を示すなら，1.5とした）。
1：右前肢の運動機能障害，2：一方向性の行動をとる，3：体勢を保てず傾く，4：自発運動の消失，5：死亡【００９２】
統計処理
独立した2群間については，Ｆ-ｔｅｓｔによる分散分析後にＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。多群間解析については，Ｏｎｅ-ｆａｃｔｏｒ ＡＮＯＶＡ，ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡによる分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。【００９３】
［実施例１］
網膜虚血誘発網膜機能障害に対するプロサイモシンα由来ペプチド及びそれらの改変ペプチドの抑制効果
特許文献２で既に特定したペプチド９（＝ＰｒｏＴα９）の誘導化を目指し，アミノ酸配列を前後させる，あるいはＮ末端およびＣ末端を欠損するなどした，下記表１に示す７種類のペプチドの効果を網膜虚血モデルで評価した。なお，網膜虚血モデルにおける硝子体内投与処置における評価は，眼内という閉鎖系であることから網膜の厚みを測定する組織化学的解析，網膜電位図 (ERG)による機能解析は，高い再現性と高感度性を有する。【００９４】
【表１】
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【００９５】
表１は，本発明と関連するペプチドを示す表である。Ｐｅｐ−３５は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５６番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号４）である。Ｐｅｐ−３６は，Ｐｅｐ−３５において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号５）である。Ｐｅｐ−３７は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５７番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号１）である。Ｐｅｐ−３８は，Ｐｅｐ−３７において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号２）である。Ｐｅｐ−３９は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５８番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号６）である。Ｐｅｐ−４０は，Ｐｅｐ−３９において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号７）である。Ｐｅｐ−４１は，Ｐｅｐ−３８において，Ｎ末端のアスパラギン酸とＣ末端のグルタミン酸とを結合させたペプチド（配列番号３）である。【００９６】
ＥＲＧでは，光照射から視神経（神経節細胞）に至る活動を評価することができる。角膜の後極に対する電位差は＋２〜１７ｍＶであるが（網膜の静止電位），光刺激後，１５ｍｓｅｃの潜時で内向きの電圧変化ａ−ｗａｖｅ（ａ波）が生じ，その後外向きの電圧変化ｂ−ｗａｖｅ（ｂ波）が生じる。ａ波は外顆粒層（視細胞）の働きを反映し，ｂ波は内顆粒層から神経節細胞層までの機能を反映している。ａ波及びｂ波は，虚血処理の１週間後の時点ではほぼ完全に消失し，電位は平坦なものになる。ａ波及びｂ波の消失は，網膜虚血障害により網膜機能が低下したことを示す。神経保護タンパク質であるプロサイモシンα １ｐｍｏｌ（ＰＢＳ溶液中）を虚血の２４時間後に硝子体内に注入すると，その内向き，外向きの電流がほぼ完全に回復することが知られている（非特許文献４参照）。
虚血処理は，マウス前眼房に１３０ｍｍＨｇの水圧を４５分間適用することにより行った。網膜電位の測定は，虚血処理の１週間後に行った。虚血処理の１週間後，マウスを３時間暗順応させた。その後光を短時間照射し，角膜に装置した電極を用いて静止電位の変化を測定した。
本実施例では，前記ペプチド０．１ ｐｍｏｌを，虚血の24時間後に硝子体内に投与した。【００９７】
結果を図１Ａ及びＢに示す。図１Ａ及びＢは，上記ペプチドを用いた場合の網膜電位の値を示すグラフである。図１Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。なお，図中の縦軸は電圧の変化分を示す。また，図１Ａ及びＢから求めた網膜電位の値の回復率を，表２に示す。【００９８】
【表２】
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【００９９】
図１Ａ及びＢ，並びに表２から明らかなように，改変ペプチドであるＰｅｐ−３６，３８，４０及び４１は，それぞれ，改変していないＰｅｐ−３５，３７，及び３９に比べて高い網膜虚血障害保護作用を有していた。
また，上記改変ペプチドの中でも，環状ペプチドであるＰｅｐ−４１はａ−ｗａｖｅ回復率６６．０％，ｂ−ｗａｖｅ回復率７７．３％と最も高い活性を示した。
なお，０．１ ｐｍｏｌという投与量での保護効果としてはプロサイモシンαに比べて相当高いと考えられる。【０１００】
［実施例２］
網膜虚血に対するプロサイモシンα由来ペプチド及びそれらの改変ペプチドの形態学的改善効果
実施例１において各ペプチドによる網膜虚血の組織障害抑制効果を調べるため，網膜組織のＨＥ染色を行った。図２は，染色された網膜を示す図面に替わる写真である。また，図２の組織障害抑制効果の評価を表３に示す。【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
図２及び表３から，例えば，Ｐｅｐ−３６，３９，４０及び４１は網膜虚血モデルにおいて組織障害を抑制し，特にＰｅｐ−４０及び４１には高い組織保護作用があることがわかった。【０１０３】
［実施例３］
ＰＩＴモデルにおけるＰ８改変ペプチドの運動障害回復効果
アクセレイテッドロータロッドテスト（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｒｏｔａ ｒｏｄ ｔｅｓｔ）は，運動協調性（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）および運動学習機能の解析に特化した手法である。運動協調性は，主に線条体領域に存在する神経細胞の機能障害によって低下することが知られている。また，運動学習は主に小脳で制御されており，小脳神経細胞の機能障害によって運動学習機能は低下する。【０１０４】
脳梗塞動物モデルであるＰＩＴモデルは，尾静脈投与により光感受性色素であるローズベンガルを投与することで，緑色光を照射した場所特異的に活性酸素種を発生させることが可能な方法である。産生された活性酸素種は，血管内皮細胞を傷害し，血栓を形成させることで血管閉塞を引き起こす。中大脳動脈における緑色光の照射により，その血流支配下にある大脳皮質，線条体で虚血傷害を引き起こすことが可能である。そのため，ＰＩＴモデルで見られる運動機能障害は，運動協調性を制御する線条体が主な病態責任領域であると考えられる。【０１０５】
神経保護ペプチドとして見出された本発明のペプチドが，PITモデルにおける運動機能回復に寄与することができるか，運動協調性の観点から検討することを目的とし，アクセレイテッドロータロッドテストを実施した。【０１０６】
アクセレイテッドロータロッドテストはＲＯＴＡ-ＲＯＤ ＴＲＥＡＤＭＩＬＬ ＦＯＲ ＲＡＴＳ ＆ ＭＩＣＥ（ＭＫ-６１０Ａ，室町機械）を用いて行った。この実験では，ロッドの回転は5分間で４．５ ｒｐｍから４５ ｒｐｍまで加速する条件とした。体重20〜25ｇの雄性マウス（C57BL／J6）をロッドに乗せ，ロッド上からマウスが落下するまでの時間（落下潜時）を測定することにより行った。本試行は1日4試行，1試行につき1時間の間隔をあけて3日連続で実施し「Training」（トレイニング）とした。【０１０７】
その後PIT手術を行い，1週間後に運動機能障害を4試行／日することで評価し，「Test」値とした。ただし，回転するRota rodからマウスが落下せず，ロッドにしがみついたまま一緒に回転する場合は，連続して2回回転した時点で歩行不可と判定し，測定を終了，落下時間として判定した。【０１０８】
改変ペプチドによる効果の判定試験では，PIT虚血終了５時間後に各ペプチドを３ｍｇ／ｋｇ尾静脈投与(ｉ.ｖ.)し，投与した。効果検定は１週間後に行った。なお，ローズベンガルをｉ.ｖ.投与し緑色光を照射しない群をｓｈａｍ群とし，ローズベンガルのｉ.ｖ.投与および緑色光照射を行い，5時間後に溶媒ＰＢＳ（１００μＬ／１０グラム, ｉ.ｖ.）処置したものをＰＩＴ処置群とした。また，5時間後にＰｅｐ−３５，３８又は４１（それぞれ３ ｍｇ／ｋｇ, ｉ.ｖ.）で処置したものを，それぞれＰＩＴ+Ｐｅｐ−３５処置群，ＰＩＴ+Ｐｅｐ−３８処置群及びＰＩＴ+Ｐｅｐ−４１処置群とした。 【０１０９】
参考文献：Ｊｕｎｇ-Ｋｉｌ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ。 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６７ (２００７) ６２０〜６２５【０１１０】
図３は，７日後におけるアクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）の結果を示す，走行不可能となるまでの時間の平均値を示す棒グラフである。【０１１１】
図３から，PIT処置を行った場合には運動能力の低下が見られるが，PIT処置後に改変ペプチドを３ｍｇ／ｋｇ投与した系では，運動能力が回復する傾向にあることがわかった。特にＰｅｐ−４１には高い回復効果があることがわかった。【０１１２】
［実施例４］
ｔＭＣＡＯ（一過性中大脳動脈閉塞）虚血モデルにおけるP8改変ペプチドの評価
ｔＭＣＡＯモデル（60分間虚血）において超急性期に相当する虚血1時間後静脈内投与で運動障害に対し保護効果を有するかを評価した。
C57BL／J6マウスの左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを１時間維持し，次いで再灌流した。再灌流の１時間後にPep−35（3mg／kg），Pep−38（3mg／kg）又はPep−41（3mg／kg又は10mg／kg）を尾静脈内投与し，その後24時間毎にマウスの経過を観察して運動機能及び生存を評価した。【０１１３】
図４Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程及び運動障害を表す臨床スコアを示す。
図４Ｂは，60分間のｔＭＣＡＯを行った後１〜７日間の運動障害を評価したスコアの変遷を示す。なお，図４Ｂ中，黒丸で示したデータは，60分間のｔＭＣＡＯの１時間後に，ＰＢＳ中0.1%のDMSO（Vehicle）を尾静脈に3mg／kg投与した時の値を示し，マウスを７日間毎日評価したところ，７日後にほぼ最大の臨床スコアの悪化を示し，ほぼ全てのマウスが死亡した（ｎ＝９）。【０１１４】
図４Ｂから明らかなように，Pep−35（3mg／kg）投与では，有意な改善効果が観察され，臨床スコアは平均１程度に低下した。また，Pep−38及びPep−41は，3mg／kgでは臨床スコアの低下傾向が見られ，10mg／kgでは臨床スコアが平均２程度に低下し，有意な改善効果を有することがわかった。【０１１５】
［実施例５］
ｔＰＡ誘発性出血に対するP8改変ペプチドの抑制効果（その１）
次に，P8改変ペプチドの血管系に対する効果について着目した。脳梗塞治療薬として使用される血栓溶解剤ｔＰＡは，急性期における処置では梗塞自体を消失させることから有用である。しかし，副作用として脳出血を惹起することから，ｔＰＡを投与する際に画像診断が必要であり，更に虚血後4.5時間以内に投与する必要がある。そこで，P8改変ペプチドのｔＰＡ誘発性の副作用抑制効果の有無について解析を行った。ｔＰＡによる脳出血を有意に誘発させることを目的として，ｔＭＣＡＯモデルで虚血4時間処置後に10 mg／kg ｔＰＡを処置し，再還流を行う系を用いた。【０１１６】
4時間のｔＭＣＡＯを行い，１日後にPBSを用いた還流により血液を序去し，灌流により除去できなかった脳組織内の血液を脳血管の破綻による出血とし，脳出血評価を実施した（図５）。ｔＰＡ 10mg／kg＋PBS，ｔＰＡ 10mg／kg＋ペプチド3mg／kgは再灌流直前に尾静脈投与した。齧歯類に対する４時間のｔＭＣＡＯは広域に渡り脳内出血を引き起こすことから，ヒトでｔＰＡ誘発性脳出血のリスクが高まる4.5時間以降に相当する。【０１１７】
図５Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
図５Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図５Ｂには，対照（PBS）又はPep−35〜41を3mg／kg投与した際の写真が示されている。
図５Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を出血面積により定量的に解析したものである。【０１１８】
図５Ｂ及びＣから，Pep−38及び41は，Pep−36，37及び40と比べて有意な出血抑制効果が見られた。したがって，P8改変ペプチドをｔＰＡと併用することにより，ｔＰＡの副作用である脳出血を抑制することが分かった。【０１１９】
［実施例６］
ｔＰＡ誘発性出血に対するP8改変ペプチドの抑制効果（その２）
実施例５におけるP8改変ペプチドの効果を詳細に検証するため，ｔＭＣＡＯを行った１日後にエバンスブルー染色をした以外は実施例５と同様にして脳出血の評価を行った。血管が脆弱化している部分ではエバンスブルーが漏出するため染色される。【０１２０】
図６Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
図６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図６Ｂには，対照（Vehicle），Pep−35，38，又は41を3mg／kg投与した際の写真が示されている。
図６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血領域を定量的解析したものである。【０１２１】
図６Ｂ及びＣから，P8改変ペプチドであるPep−38及び41は，ｔＰＡ誘発性の副作用である血管脆弱化及び出血を有意に抑制することが分かった。【０１２２】
本明細書中で述べられた全ての刊行物に記載された内容は，ここに引用されたことによって，その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の血液脳関門障害改善剤は，脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することができる。従って，本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療薬となり得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１：ＰｒｏＴα８（Ｐ８，P+2N／−3C，Ｐｅｐ−３７）
配列番号２：Ｐ８改変ペプチド（P+2N／−3C改変，Ｐｅｐ−３８）
配列番号３：環状Ｐ８改変ペプチド（環状P+2N／−3C改変，Ｐｅｐ−４１）
配列番号４：P+2N／−4C（Ｐｅｐ−３５）
配列番号５：P+2N／−4C改変（Ｐｅｐ−３６）
配列番号６：P+2N／−2C（Ｐｅｐ−３９）
配列番号７：P+2N／−2C改変（Ｐｅｐ−４０）
【図１Ａ】
2015022953.tif 000006
【図１Ｂ】
2015022953.tif 000007
【図２】
2015022953.tif 000008
【図３】
2015022953.tif 000009
【図４Ａ】
2015022953.tif 000010
【図４Ｂ】
2015022953.tif 000011
【図５Ａ】
2015022953.tif 000012
【図５Ｂ】
2015022953.tif 000013
【図５Ｃ】
2015022953.tif 000014
【図６Ａ】
2015022953.tif 000015
【図６Ｂ】
2015022953.tif 000016
【図６Ｃ】
2015022953.tif 000017
【配列表】
2015022953000001.app
【国際調査報告】
2015022953.tif 000018
2015022953.tif 000019
2015022953.tif 000020
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