(57)【要約】  ＴＤＨ３プロモーターやＧＡＬ１０プロモーターよりも高発現のプロモーターを提供することを課題とする。  酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターであって、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えており、前記酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列が、（ａ）配列番号１〜４に示す塩基配列；（ｂ）配列番号１〜４に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された配列；（ｃ）配列番号１〜４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列；の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列であるプロモーターを作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターであって、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えており、前記酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列が、以下に示す（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列であることを特徴とするプロモーター。
（ａ）配列番号１〜４に示す塩基配列；
（ｂ）配列番号１〜４に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加、若しくは挿入された配列；
（ｃ）配列番号１〜４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列；
【請求項２】
酵母が、サッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターが導入された酵母の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターに関し、より詳しくは、酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターであって、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えたプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は酵素や医薬品用タンパク質の生産宿主として利用されており、これらタンパク質の生産性を高めるには高発現プロモーターの利用は不可欠である。これまでに酵母においてタンパク質を高発現させるために、様々な高発現プロモーターが利用されている。かかるプロモーターとしては、恒常的高発現のＴＤＨ３遺伝子のプロモーター（以下、「ＴＤＨ３プロモーター」ともいう）、ＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、ＡＤＨ１遺伝子のプロモーター、誘導的高発現のＧＡＬ１遺伝子のプロモーター、ＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター（以下、「ＧＡＬ１０プロモーター」ともいう）、ＣＵＰ１遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５遺伝子のプロモーターなどがあり、中でも恒常的に発現量の強さが期待できるものとして、ＴＤＨ３遺伝子のプロモーターやＰＧＫ遺伝子のプロモーターなど、解糖系遺伝子のプロモーターが好んで利用されている。【０００３】
また、さらなるタンパク質の生産性向上を求めて、例えば、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるＰＩＲ１遺伝子の上流に位置し、当該ＰＩＲ１遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーターを利用する方法（特許文献１参照）や、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンの５’側上流１５０塩基対よりさらに５’側上流の非翻訳領域と外来の異種遺伝子とから成るＤＮＡ断片を利用する方法（特許文献２参照）や、酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ）のプロモーターの制御下に目的遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする遺伝子発現方法（特許文献３参照）や、人工的なイントロン様配列によって高発現させる方法（非特許文献１参照）が提案されている。【０００４】
しかしながら、上記プロモーターを用いても、絶対的な発現量は古くから用いられているＴＤＨ３プロモーターやＧＡＬ１０プロモーターなどからほとんど改善されていないのが現状であり、より高い発現能力を有するプロモーターの開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−１７９８９９号公報
【特許文献２】特開平０８−１６８３８０号公報
【特許文献３】特開２００３−１６４２９５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】L. Li et al., Letters in Applied Microbiology 40:347-352 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＴＤＨ３プロモーターやＧＡＬ１０プロモーターよりも高発現のプロモーターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酵母遺伝子破壊株を用いたゲノムワイド解析から、イントロンに発現能力を高める作用があることに着目するに至った。また、開始コドン上流にイントロンがあれば、構造遺伝子を操作することなく過剰発現可能であると考えた。そこで、開始コドンより上流、又は開始コドン領域近くにイントロンを含むプロモーター配列をゲノム上から探した。その結果、いくつかのリボソーマルタンパク質（以下、「ＲＰＳ」ともいう）をコードする遺伝子であるリボソーマルタンパク質遺伝子のプロモーター配列が高い活性を持つことを明らかにした。【０００９】
さらに、これらのプロモーター配列のエンハンサー領域を、一般的高発現プロモーターであるＴＤＨ３プロモーター及び誘導型高発現プロモーターであるＧＡＬ１０プロモーターのエンハンサー領域に置換することでより発現能力が高まると考えた。そこで、分泌性ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として、リボソーマルタンパク質遺伝子のプロモーターのイントロン配列の上流の様々な位置にＴＤＨ３プロモーター配列を配置して発現を調べたところ、イントロン配列のすぐ上流にＴＤＨ３プロモーター配列を配置した時に最もルシフェラーゼ活性が高いことが明らかとなった。さらにガラクトース誘導性の高発現プロモーターであるＧＡＬ１０プロモーター配列をリボソーマルタンパク質遺伝子プロモーターのイントロン配列の上流に配置したプロモーターではガラクトース誘導的にルシフェラーゼ活性が高いことを見いだし、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターであって、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えており、前記酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列が、以下に示す（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列であることを特徴とするプロモーター。
（ａ）配列番号１〜４に示す塩基配列；
（ｂ）配列番号１〜４に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加、若しくは挿入された配列；
（ｃ）配列番号１〜４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列；
（２）酵母が、サッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする上記（１）記載のプロモーター。
（３）上記（１）又は（２）記載のプロモーターを含む組換えベクター。
（４）上記（３）記載の組換えベクターが導入された酵母の形質転換体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプロモーターは、ＴＤＨ３プロモーターの１５倍以上、ＧＡＬ１０プロモーターの１０倍以上もの高発現能力を有する。かかるプロモーターを用いることで、酵母における酵素や医薬品用タンパク質などの有用物質を効率よく生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＤＨ３プロモーター配列−ＲＰＳイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株を培養し、培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μｌ・ＯＤ））を調べた結果を示す図である。
【図２】ＧＡＬ１０プロモーター配列−ＲＰＳ２５Ａのイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株、及びＴＤＨ３プロモーター配列−ＲＰＳ２５Ａのイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株を培養し、培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μｌ・ＯＤ））を調べた結果を示す図である。
【図３】ＴＤＨ３プロモーター配列−長さの異なるＲＰＳ２５Ａプロモーター配列−ｙＣＬｕｃ株を培養し、培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μｌ・ＯＤ））を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のプロモーターとしては、酵母において目的遺伝子を高発現させるためのプロモーターであって、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えており、前記酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列が以下に示す（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列であることを特徴とするプロモーターであれば特に制限されず、プロモーターとは、目的遺伝子配列の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された遺伝子の発現を制御することができる領域の塩基配列を意味し、エンハンサー領域も含まれる。なお、本発明のプロモーターが備える配列は、上述のように酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを組み合わせた配列であることから、自然産物ではない。
（ａ）配列番号１〜４に示す塩基配列；
（ｂ）配列番号１〜４に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された配列；
（ｃ）配列番号１〜４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列；
【００１４】
なお、配列番号１に示す塩基配列は、リボソーマルタンパク質遺伝子２４Ａ（ＲＰＳ２４Ａ）のイントロン配列、配列番号２に示す塩基配列は、リボソーマルタンパク質遺伝子２５Ａ（ＲＰＳ２５Ａ）のイントロン配列、配列番号３に示す塩基配列は、リボソーマルタンパク質遺伝子２６Ａ（ＲＰＳ２６Ａ）のイントロン配列、配列番号４に示す塩基配列は、リボソーマルタンパク質遺伝子２６Ｂ（ＲＰＳ２６Ｂ）のイントロン配列である。
【００１５】
上記（ｂ）における１又は数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された配列としては、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された配列を挙げることができる。
【００１６】
上記（ｃ）における配列番号１〜４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列としては、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する配列を挙げることができる。
【００１７】
酵母としては特に制限されず、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、キャンディダ属（Candida）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）ピキア属（Pichia）、及びシゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）に属する酵母を挙げることができ、サッカロマイセス属に属する酵母を好適に挙げることができ、サッカロマイセス・セレビシエをより好適に挙げることができる。
【００１８】
上記目的遺伝子としては、用途に合わせて全長の遺伝子でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製された人工的な遺伝子でもよい。
【００１９】
本発明において、目的遺伝子を高発現させるとは、例えば、ＴＤＨ３プロモーター配列を用いた場合と比較して、プロモーター配列の下流に配置した目的遺伝子を１５倍以上、好ましくは３５倍以上、より好ましくは４０倍以上発現させることや、ＧＡＬ１０プロモーター配列を用いた場合と比較して、プロモーター配列の下流に配置した目的遺伝子を８倍以上、好ましくは１０倍以上発現させることを挙げることができる。
【００２０】
目的遺伝子の発現は、たとえば、プロモーター配列の下流に、分泌型のルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）にて２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養したときの培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μｌ・ＯＤ））を測定することによって求めることができる。
【００２１】
本発明における酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列としては、その全長の配列だけでなく、全長の配列に対して１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、最も好ましくは１〜２個、中でも１個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された配列や、全長の配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する配列も含まれる。なお、酵母のＴＤＨ３プロモーター配列又はＧＡＬ１０プロモーター配列は、酵母の染色体や、酵母のＴＤＨ３プロモーター配列又はＧＡＬ１０配列を含有する市販のベクターをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅することや、これらの染色体やベクターを制限酵素処理することによって得ることができる。
【００２２】
酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター配列と、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列とを順次備えているとは、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列の下流に、酵母のリボソーマルタンパク質遺伝子のイントロン配列（以下、単に「ＲＰＳイントロン配列」ともいう）が作動可能に組み込んでいれば特に制限されず、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列と、酵母のＲＰＳイントロン配列との間には任意の塩基配列を含んでいてもよいが、かかる任意の塩基配列の長さとしては、２００塩基対以下、好ましくは１００塩基対以下、より好ましくは５０塩基対以下を挙げることができ、０塩基対、即ち、任意の塩基配列を含まず、酵母のＴＤＨ３又はＧＡＬ１０プロモーター配列と、酵母のＲＰＳイントロン配列とが直接つながっていることが最も好ましい。
【００２３】
本発明の組換えベクターに用いるベクターとしては、本発明のプロモーターを含み、該プロモーターの下流に作動可能に組み込んだ目的遺伝子を発現できるものであれば特に制限されず、直鎖状でも環状でもよく、自立複製可能であるものや、あるいは染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ターミネーターなどの制御配列や選択マーカーを含有しているものを用いてもよい。
【００２４】
本発明の組換えベクターが導入された酵母の形質転換体としては、本発明の組換えベクターが導入された酵母の形質転換体であって、酵母としては、サッカロマイセス属の酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがより好ましい。
【００２５】
本発明の組換えベクターの酵母への導入方法としては、特に制限されず、酢酸リチウム法、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法などの化学的方法；ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法などの生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法などの物理的方法；などの公知の方法を例示することができる。
【００２６】
本発明の組換えベクターを含む酵母の形質転換体を培養することで、目的遺伝子産物を効率よく生産することができる。培養方法としては酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、本発明の組換えベクターが導入された酵母がサッカロマイセス・セレビシエの場合は、３０℃前後、ｐＨ６前後、及び、振とう培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下で培養することができる。目的遺伝子産物は培養液又は破砕した酵母から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティなどのクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
【実施例１】
【００２７】
サッカロマイセス・セレビシエのゲノム配列から、コーディング配列上流、あるいは開始コドンＡＴＧ直後に配置されたイントロン配列を探索したところ、ＲＰＳ２４Ａ、ＲＰＳ２５Ａ、ＲＰＳ２６Ａ、ＲＰＳ２６Ｂのイントロン配列が見つかった。そこで、ＴＤＨ３プロモーター配列の下流にＲＰＳ２４Ａ、ＲＰＳ２５Ａ、ＲＰＳ２６Ａ、ＲＰＳ２６Ｂのイントロン配列を配置した人工プロモーターを構築し、ＴＤＨ３プロモーター配列の発現能力と比較した。【００２８】
［ＲＰＳイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株の構築］
（RPS24Ap(-730〜+469)-yCLuc株の構築）
RAK4333株（Fukunaga T et al. Yeast 30: 243-253 (2013)）の染色体ＤＮＡからURA3-290（配列番号５）とURA-290c（配列番号６）をプライマーに用いてＰＣＲによりURA3-5’-TDH3p-yCLuc-URA3を増幅し、Δsnt309株（Giaever G et al., Nature 418: 387-391 (2002)）に導入しRAK6164株を得た。【００２９】
作製したRAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、プライマーにScURA3-5’40-ScRPS24A-730（配列番号７）とyCLuc+30cNoATG-ScRPS24A+469c（配列番号８）を用いて、ＰＣＲによりＲＰＳ２４Ａの−７３０から＋４６９まで（開始コドンＡＴＧのＡの位置を＋１とする）のＤＮＡ断片（ScURA3-5’40-RPS24Ap-yCLuc+30）を増幅した。同じくRAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、yCLuc+1（配列番号９）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーとしてyCLuc-URA3を増幅した。ScURA3-5’40-RPS24Ap-yCLuc+30とyCLuc-URA3の２種のＤＮＡ断片を融合させるために、これらのＤＮＡ断片をテンプレートとし、ScURA3-5’40-ScRPS24A-730（配列番号７）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ScURA3-5’40-RPS24Ap-yCLuc-URA3を増幅した。これをS. cerevisiae BY4743株（Brachmann CB et al., Yeast 14:115-132 (1998)）のura3Δ0の位置に次の方法で導入した。【００３０】
試験管にＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）を２ｍｌ入れ、酵母を植菌し、２８℃で一晩振とう培養した。１５ｍｌチューブに９ｍｌのＹＰＤ液体培地を入れ、そこに１晩培養した培養液１ｍｌを加え、２８℃で５時間静置培養した。次に８、０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心し、上澄みを捨て、５ｍｌの滅菌水を加えて、再び同じ条件で遠心し上澄みを捨て、残った液で細胞を懸濁した。形質転換液（５４％ポリエチレングリコール３３５０、１２０ｍＭ酢酸リチウム、７５０μg／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ）１３５μｌに、細胞懸濁液６１μｌ、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ溶液４μｌを加え十分混合した。これを４２℃の温浴中に４０分間置いた後、１００μｌの滅菌水を加えＳＤ−Ｕｒａ寒天培地（０．１７％Yeast Nitrogen Base、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、０．００２４％adenine sulfate、０．０１％L-Histidine HCl、０．０２％L-Leucine、０．０１％L-Lysine HCl、０．０１％L-Methionene、０．０１％L-Tryptphan、２％寒天末）に広げ、２８℃で３日間静置培養し、形質転換体のコロニーを得た。【００３１】
ScURA3-5’40-RPS24Ap-yCLuc-URA3をS. cerevisiae BY4743株に導入した上記形質転換体（RAK8422）はura3Δ0::RPS24Ap-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ。【００３２】
（RPS25Ap(-1598〜-1)-yCLuc株の構築）
RAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、プライマーにScURA3-5’40-ScRPS25A-1598（配列番号１１）とyCLuc+30c-ScRPS25A-1c（配列番号１２）を用いて、ＰＣＲによりＲＰＳ２５Ａの−１５９８から−１までのＤＮＡ断片（ScURA3-5’40-RPS25Ap-yCLuc+30）を増幅した。同じくRAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、yCLuc+1（配列番号９）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーとしてyCLuc-URA3を増幅した。ScURA3-5’40-RPS25Ap-yCLuc+30とyCLuc-URA3の２種のＤＮＡ断片を融合させるために、これらのＤＮＡ断片をテンプレートとし、ScURA3-5’40-ScRPS25A-1598（配列番号１１）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ScURA3-5’40-RPS25Ap-yCLuc-URA3を増幅した。このＤＮＡ断片をS. cerevisiae BY4743株に上記の方法で導入した。【００３３】
ScURA3-5’40-RPS25Ap-yCLuc-URA3をS. cerevisiae BY4743株に導入した形質転換体（RAK8424）はura3Δ0::RPS25Ap-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ。【００３４】
（RPS26Ap(-1115〜-1)-yCLuc株の構築）
RAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、プライマーにScURA3-5’40-ScRPS26A-1115（配列番号１３）とyCLuc+30c-ScRPS26A-1c（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲによりＲＰＳ２６Ａの−１１１５から−１までのＤＮＡ断片（ScURA3-5’40-RPS26Ap-yCLuc+30）を増幅した。同じくRAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、yCLuc+1（配列番号９）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーとしてyCLuc-URA3を増幅した。ScURA3-5’40-RPS26Ap-yCLuc+30とyCLuc-URA3の２種のＤＮＡ断片を融合させるために、これらのＤＮＡ断片をテンプレートとし、ScURA3-5’40-ScRPS26A-1115（配列番号１３）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ScURA3-5’40-RPS26Ap-yCLuc-URA3を増幅した。これをS. cerevisiae BY4743株に上記の方法で導入した。【００３５】
ScURA3-5’40-RPS26Ap-yCLuc-URA3をS. cerevisiae BY4743株に導入した形質転換体（RAK8426）はura3Δ0::RPS26Ap-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ。【００３６】
（RPS26Bp(-1505〜-1)-yCLuc株の構築）
RAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、プライマーにScURA3-5’40-ScRPS26B-1505（配列番号１５）とyCLuc+30c-ScRPS26B-1c（配列番号１６）を用いて、ＰＣＲによりＲＰＳ２６Ｂの−１５０５から−１までのＤＮＡ断片（ScURA3-5’40-RPS26Bp-yCLuc+30）を増幅した。同じくRAK6164の染色体ＤＮＡをテンプレートに、yCLuc+1（配列番号９）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーとしてyCLuc-URA3を増幅した。ScURA3-5’40-RPS26Bp-yCLuc+30とyCLuc-URA3の２種のＤＮＡ断片を融合させるために、これらのＤＮＡ断片をテンプレートとし、ScURA3-5’40-ScRPS26B-1505（配列番号１５）とURA3-310c（配列番号１０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ScURA3-5’40-RPS26Bp-yCLuc-URA3を増幅した。これをS. cerevisiae BY4743株に上記の方法で導入した。【００３７】
ScURA3-5’40-RPS26Bp-yCLuc-URA3をS. cerevisiae BY4743株に導入した形質転換体（RAK8428）はura3Δ0::RPS26Bp-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ。【００３８】
［ＴＤＨ３プロモーター配列−ＲＰＳイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株の構築］
上記のとおり構築したura3Δ0::RPS24Ap-yCLuc-URA3、ura3Δ0::RPS25Ap-yCLuc-URA3、ura3Δ0::RPS26Ap-yCLuc-URA3、ura3Δ0:: RPS26Bp-yCLuc-URA3のそれぞれの遺伝子型を持つ酵母株から染色体を調製した。これらの染色体をテンプレートとし、下記の表１に示すプライマーの組合せでＰＣＲを行い、高発現プロモーターとして知られているＴＤＨ３コーディング配列上流配列４０塩基（ＴＤＨ３プロモーター配列の一部）と、ＲＰＳイントロン配列とを順次上流に持つyCLuc-URA3のＤＮＡ断片を増幅した。【００３９】
【表１】
2016021149.tif 000002
【００４０】
増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ、RAK5125株（MATa ade2Δ0AΔhis3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0::ScTDH3p-yGLuc-LEU2）に上記の方法で導入して形質転換体を得た。得られた形質転換体はそれぞれ下記の遺伝子型を持つ。
ura3Δ0::TDH3p-RPS24A(+1_+469)-yCLuc-URA3
ura3Δ0::TDH3p-RPS25A(-327_-1)-yCLuc-URA3
ura3Δ0::TDH3p-RPS26A(-378_-1)-yCLuc-URA3
ura3Δ0::TDH3p-RPS26B(-361_-1)-yCLuc-URA3【００４１】
これらの遺伝子型におけるＴＤＨ３ｐはＴＤＨ３コーディング配列上流６９８塩基の配列である。また、RPS24A(+1_+469)、RPS25A(-327_-1)、RPS26A(-378_-1)及びRPS26B(-361_-1)は、それぞれのＰＲＳ遺伝子のイントロン配列である。【００４２】
また、コントロールとして、TDH3p-yCLuc-URA3遺伝子をRAK5125株に導入した形質転換体も作製した。かかる形質転換体はura3Δ0::TDH3p-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ。【００４３】
［ルシフェラーゼ活性の測定］
２４−ｗｅｌｌマルチウェルプレートの各ウェルにＹＰＤ液体培地を１ｍｌ入れ、上記で作製した形質転換体を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液１０μｌを、ＹＰＤ液体培地１ｍｌを入れた２４−ｗｅｌｌマルチウェルプレートの各ウェルに植菌した。これを２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００）を分光光度計で測定した。ルシフェラーゼ測定キット（アトー社製）とルミノメータ(Glo Max20/20n Luminometer：Promega社製)を用いて培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μｌ・ＯＤ））をルシフェラーゼ活性として算出することでプロモーターの発現能力を評価した。【００４４】
結果を図１に示す。図１に示すように、ＴＤＨ３プロモーター配列のみを用いた場合と比較して、ＴＤＨ３プロモーター配列とＰＲＳ２４Ａのイントロン配列を用いた場合には４０倍、ＴＤＨ３プロモーター配列とＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いた場合には４９倍、ＴＤＨ３プロモーター配列とＰＲＳ２６Ａのイントロン配列を用いた場合には３９倍、ＴＤＨ３プロモーター配列とＰＲＳ２６Ｂのイントロン配列を用いた場合には１７倍も高い発現能力を有することが明らかとなった。
【実施例２】
【００４５】
［ＧＡＬ１０プロモーター配列−ＲＰＳイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株の構築］
（ＧＡＬ１０プロモーター配列−ＲＰＳ２５Ａのイントロン配列−ｙＣＬｕｃ株の構築）
細胞に悪影響を与えるタンパク質の生産では誘導型発現の仕組みは欠かせない。現在、最も発現能力の高い誘導型プロモーターはＧＡＬ１０プロモーターである。そこで、ＧＡＬ１０プロモーター配列の下流にＰＲＳのイントロン配列をつなげることで、ＧＡＬ１０プロモーターよりも発現能力の高い誘導型プロモーターの作製を試みた。具体的には、ＧＡＬ１０コーディング配列上流５１１ｂｐをガラクトースプロモーターとして用い、その下流にＲＰＳ２５Ａのイントロン配列（−３２７〜−１）をつなげたプロモーターをサッカロマイセス・セレビシエ染色体上に構築した。以下にその構築方法を示す。【００４６】
ura3Δ0::RPS25Ap-yCLuc-URA3を持つ酵母株（RAK8424)の染色体をテンプレートに、ScURA3-5'40-ScRPS25A-600（配列番号２２）とURA3-280c（配列番号２１）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ScURA3-5'40-ScRPS25A-600-yCLuc-URA3を増幅した。このＤＮＡ断片をRAK3600（Fukunaga T et al. Yeast 30: 243-253 (2013)）へ上記の方法で導入し、形質転換体（RAK10635）を得た。【００４７】
RAK4296（Fukunaga T et al. Yeast 30: 243-253 (2013)）の染色体ＤＮＡをテンプレートにTDH3p40yCLuc+1（配列番号２３）と15G-yCLuc+1662c（配列番号２４）をプライマーに用いて、ＰＣＲによりTDH3p40-yCLuc-15Cを増幅した。また、RAK3625の染色体DNAをテンプレートに15C-LEU2-1（配列番号２５）とURA3-300c（配列番号２６）をプライマーに用いて、ＰＣＲにより15G-LEU2-URA3-3’を増幅した。これら２つのＤＮＡ断片を１５Ｃ（連続するシトシン１５塩基）配列を介してＰＣＲで融合させた。得られた融合ＤＮＡ断片TDH3p40-yCLuc-LEU2-URA3-3’をRAK4314株に導入しＳＤ−Ｌｅｕ寒天培地で選択し、形質転換体を得た。この形質転換体（RAK4920）はura3Δ0::TDH3p-yCLuc-LEU2の遺伝子型を持つ。【００４８】
ura3Δ0::TDH3p-yCLuc-LEU2の遺伝子型を持つ酵母RAK4920の染色体をテンプレートに、yCLuc+21（配列番号２７）とURA3-280c（配列番号２１）をプライマーとしてＰＣＲし、yCLucの大部分を上流に持つＬＥＵ２マーカーを増幅した。RAK10635のＵＲＡ３マーカーをこのＬＥＵ２マーカーを用いて置換し、ura3Δ0:: ScRPS25A-600-yCLuc-LEU2を構築した（RAK12003）。この酵母株から染色体を調製し、これをテンプレートとして、ScGAL10p-40(40)-RPS25A-327（配列番号２８）とURA3-280c（配列番号２１）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、GAL10p-40(40)-RPS25A(-327_-1)-yCLuc-LEU2-URA3-3’を増幅した。このＤＮＡ断片をRAK4315株（ura3Δ0::GAL10p-URA3）に上記の方法で導入しＳＤ−Ｌｅｕ寒天培地（０．１７％Yeast Nitrogen Base、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、０．００３％adenine sulfate、０．０１％Uracil、０．０１％L-Histidine HCl、０．０１％L-Lysine HCl、０．０１％L-Methionene、０．０１％L-Tryptphan、２％寒天末）で増殖した株を選択して形質転換体を得た。得られた形質転換体はura3Δ0::GAL10p-RPS25A(-327_-1)-yCLuc-LEU2の遺伝子型を持つ。【００４９】
（ＧＡＬ１０プロモーター配列−ｙＣＬｕｃ株の構築）
コントロールとして、GAL10p-yCLuc-LEU2をURA3Δ0に挿入した株を次のように構築した。RAK12003株の染色体をテンプレートにGAL10p40-yCLuc+1（配列番号２９）とURA3-280c（配列番号２１）をプライマーに用いてＰＣＲし、ScGAL10-40(40)-yCLuc -LEU2-URA3-3’を増幅した。これをRAK4315（ura3Δ0::GAL10p-URA3）に導入してSD-Leu寒天培地を用いて形質転換体を得た。得られた形質転換体はura3Δ0::GAL10p-yCLuc-LEU2の遺伝子型を持つ。【００５０】
（ルシフェラーゼ活性の測定方法）
２４−ｗｅｌｌマルチウェルプレートの各ウェルにＹＰＤ液体培地を１ｍｌ入れ、上記で作製したura3Δ0::GAL10p-RPS25A(-327_-1)-yCLuc-LEU2、ura3Δ0::GAL10p-yCLuc-LEU2の遺伝子型を持つ形質転換体、及び実施例１で作製したura3Δ0::TDH3p-RPS25A(-327_-1)-yCLuc-URA3、ura3Δ0::TDH3p-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ形質転換体を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液１０μｌを、非誘導条件のＹＰＤ培地又は誘導条件（ガラクトース条件）のＹＰＧａｌ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ガラクトース）１ｍｌを入れた２４−ｗｅｌｌマルチウェルプレートの各ウェルに植菌した。これを２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ600）を分光光度計で測定し、上記と同様の方法でプロモーターの発現能力を評価した。【００５１】
結果を図２に示す。図２に示すように、ガラクトース条件において、ＧＡＬ１０プロモーター配列のみを用いた場合と比較して、ＧＡＬ１０プロモーター配列とＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いた場合には１１倍も高い発現能力を有することが明らかとなった。さらに、ＧＡＬ１０プロモーターとＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いた場合でも、グルコース培地では発現が抑制され、ガラクトース培地で発現が１２５５倍向上していた。ＧＡＬ１０プロモーター配列のみを用いた場合の誘導倍率が１５０倍程度であることを考えると、ＧＡＬ１０プロモーター配列とＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いた場合には非常にガラクトース誘導性が高いことが明らかとなった。【００５２】
さらに、極めて高い発現能力を有するＴＤＨ３プロモーター配列とＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いた場合と比較しても７０％近くもの発現能力を有しており、ＧＡＬ１０プロモーター配列とＰＲＳ２５Ａのイントロン配列を用いると、誘導性及び発現能力が高いプロモーターとなることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５３】
［ＴＤＨ３プロモーター配列−長さの異なるＲＰＳ２５Ａプロモーター−ｙＣＬｕｃ株の構築］
RAK10635の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、ScTDH3(-40〜-1)-RPS25Ap-500（配列番号３０）とURA3-280c（配列番号２１）、ScTDH3p-40(40)-RPS25Ap-450（配列番号３１）とURA3-280c（配列番号２１）、又は、ScTDH3p-40(40)-RPS25Ap-400（配列番号３２）とURA3-280c（配列番号２１）の組合せでＰＣＲを行い、それぞれ、ScTDH3p(40)-ScRPS25A(-500〜-1)-yCLuc-URA3、ScTDH3p(40)-ScRPS25A(-450〜-1)-yCLuc-URA3、ScTDH3p(40)-ScRPS25A(-400〜-1)-yCLuc-URA3のＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片をRAK5125に上記記載の方法で導入し、それぞれ、ura3Δ0::ScTDH3p-ScRPS25A(-500〜-1)-yCLuc-URA3、ura3Δ0::ScTDH3p-ScRPS25A(-450〜-1)-yCLuc-URA3、ura3Δ0::ScTDH3p-ScRPS25A(-400〜-1)-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ形質転換体を得た。【００５４】
得られた形質転換体は、ＴＤＨ３プロモーター下流に、イントロンを含み長さの異なるＲＰＳ２５Ａプロモーター配列（ＲＰＳ２５Ａの−５００から−３２８（配列番号３３）とＲＰＳ２５Ａのイントロン配列である−３２７から−１（配列番号２）、ＲＰＳ２５Ａの−４５０から−３２８（配列番号３４）とＲＰＳ２５Ａの−３２７から−１（配列番号２）、又は、ＲＰＳ２５Ａの−４００から−３２８（配列番号３５）とＲＰＳ２５Ａの−３２７から−１（配列番号２））を持つ。これらの形質転換体、及び実施例１で作製したura3Δ0::TDH3p-yCLuc-URA3の遺伝子型を持つ形質転換体を上記と同様の方法で培養し、ルシフェラーゼ活性測定、及び培養液の濁度測定を行い、発現能力を評価した。【００５５】
結果を図３に示す。図３に示すように、ＴＤＨ３プロモーター配列と、ＲＰＳ２５Ａイントロン配列の間にＲＰＳ２５Ａイントロン配列の上流の配列を１７３塩基対、１２３塩基対、７３塩基対含む場合においても、ＴＤＨ３プロモーター配列のみを用いた場合と比較して、３７倍、２４倍、２７倍高い発現能力を示すことが明らかとなった。また、ＴＤＨ３プロモーター配列と、ＲＰＳ２５Ａイントロン配列とが直接つながっていれば、ＴＤＨ３プロモーター配列のみを用いた場合と比較して、１０３倍も高い発現能力を示すことが明らかとなった。すなわち、ＴＤＨ３プロモーターとＲＰＳ２５Ａイントロン配列の間にＲＰＳ２５Ａイントロン配列の上流の配列の一部を含んでいても高い発現能力を示すが、ＴＤＨ３プロモーター配列と、ＲＰＳ２５Ａイントロン配列とが直接つながっているほうが、より高い発現能力を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のプロモーターは高発現能力を有することから、酵素や、ワクチン、抗体などのタンパク質生産分野において利用可能である。また、キシロースやセルロースからのエタノール生産の分野にも応用することが可能である。さらに、酵母自身の配列を使用しており、セルフクローニングであることから、安全性が高く、食品分野でも利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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