(57)【要約】ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制できる新たな医薬組成物を提供すること。エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を含有する、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を含有する、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
抗血小板作用を有する薬剤をさらに含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗血小板作用を有する薬剤が、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物を製造するための、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物の使用。
【請求項５】
抗血小板作用を有する薬剤をさらに使用する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗血小板作用を有する薬剤が、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を哺乳動物に投与することを含む、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法。
【請求項８】
エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と同時に、または、別々に抗血小板作用を有する薬剤を哺乳動物に投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と、抗血小板作用を有する薬剤とを組み合わせてなるステント留置後の血栓・塞栓形成抑制剤。
【請求項１１】
抗血小板作用を有する薬剤が、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１０に記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を含有するステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を用いてステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するためのエドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と抗血小板作用を有する薬剤との併用もしくは配合剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エドキサバントシル酸塩水和物は、ヒトなどの哺乳動物の活性化血液凝固第X因子（以下、「FXa」という）を競合的かつ選択的に阻害する。【０００３】
エドキサバントシル酸塩水和物を含有する医薬組成物は、非弁膜症性心房細動患者における脳卒中及び全身性塞栓症のリスク低減、深部静脈血栓症及び肺塞栓症の治療などの効能・効果を有する（非特許文献１、非特許文献２などを参照）。【０００４】
ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するために、アスピリン、クロピドグレルなどの抗血小板薬が使用されている（非特許文献３などを参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2012 120: Abstract 4697
【非特許文献２】SAVAYSA Label
【非特許文献３】Clinical Therapeutics, Vol.32, No. 14, 2010, p.2265-2281
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、エドキサバンなどのFXa阻害剤を用いて、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を含有する、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物；
（２）抗血小板作用を有する薬剤をさらに含有する、前記（１）に記載の医薬組成物；
（３）抗血小板作用を有する薬剤が、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（２）に記載の医薬組成物；
（４）ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するための医薬組成物を製造するための、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物の使用；
（５）抗血小板作用を有する薬剤をさらに使用する、前記（４）に記載の使用；
（６）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（５）に記載の使用；
（７）エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を哺乳動物に投与することを含む、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法；
（８）エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と同時に、または、別々に抗血小板作用を有する薬剤を哺乳動物に投与することを含む、前記（７）に記載の方法；
（９）哺乳動物がヒトである前記（７）または（８）に記載の方法；
（１０）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（８）または（９）に記載の方法；
（１１）エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と、抗血小板作用を有する薬剤とを組み合わせてなるステント留置後の血栓・塞栓形成抑制剤；
（１２）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（１１）に記載の抑制剤；
（１３）抗血小板作用を有する薬剤を投与されている哺乳動物に、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を投与することを含む、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法；
（１４）哺乳動物がヒトである前記（１３）に記載の方法；
（１５）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（１３）または（１４）に記載の方法；
（１６）エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を投与されている哺乳動物に、抗血小板作用を有する薬剤を投与することを含む、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法；
（１７）哺乳動物がヒトである前記（１６）に記載の方法；
（１８）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（１６）または（１７）に記載の方法；
（１９）エドキサバンもしくはその薬学的に許容され得る塩またはそれらの水和物と抗血小板作用を有する薬剤の両方を含有する製剤を哺乳動物に投与することを含む、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制する方法；
（２０）哺乳動物がヒトである前記（１９）に記載の方法；ならびに
（２１）抗血小板作用を有する薬剤がアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、エリノグレル、チカグレロル、カングレロール、シロスタゾール、アブシキマブ、エピフィダチド、チロフィバン、ボラパクサールおよびジピリダモールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩である、前記（１９）または（２０）に記載の方法；
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制できる新たな医薬組成物を提供することができるという効果を奏する。さらに、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するために従来から用いられている抗血小板薬の投与用量を減少させたとしても、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物をさらに投与することにより、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を十分に抑制できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、ステント血栓のラットモデルにおけるエドキサバントシル酸塩水和物の抗血栓効果および抗FXa効果を示した図である。Aは血栓タンパク質量を示し、BはFXa活性を示す。図中、バーは平均±標準誤差（n=8）を示す。括弧中の値は阻害率（%）を示す。コントロール群と比較したP値（Dunnettテスト）を*の数で示す。*はP<0.05であり、**はP<0.01であり、***はP<0.001である。
【図２】図2は、ステント血栓のラットモデルにおけるアスピリンの抗血栓効果を示した図である。図中、バーは平均±標準誤差（n=4〜8）を示す。括弧中の値は阻害率（%）を示す。コントロール群と比較したP値（Dunnettテスト）を*の数で示す。**はP<0.01であり、***はP<0.001である。
【図３】図3は、ステント血栓のラットモデルにおけるクロピドグレル硫酸塩の抗血栓効果を示した図である。図中、バーは平均±標準誤差（n=4〜8）を示す。括弧中の値は阻害率（%）を示す。コントロール群と比較したP値（Dunnettテスト）を*の数で示す。*はP<0.05であり、***はP<0.001である。
【図４】図4は、ステント血栓のラットモデルにおけるチカグレロル硫酸塩の抗血栓効果を示した図である。図中、バーは平均±標準誤差（n=8）を示す。括弧中の値は阻害率（%）を示す。コントロール群と比較したP値（Dunnettテスト）を*の数で示す。*はP<0.05であり、**はP<0.01であり、***はP<0.001である。
【図５】図5は、ステント血栓のラットモデルにおいてアスピリンとエドキサバントシル酸塩水和物とを併用した場合の抗血栓効果および抗FXa効果を示した図である。Aは血栓タンパク質量を示し、BはFXa活性を示す。図中、バーは平均±標準誤差（n=11または12）を示す。Edoはエドキサバントシル酸塩水和物を意味し、ASAはアスピリンを意味する。括弧中の値は阻害率（%）を示す。Aにおける**は、コントロール群と比較したP値（Welchテスト）が0.01未満であることを示し、#はアスピリン単独群と比較したP値（Student tテスト）が0.05未満であることを示す。Bにおける***は、コントロール群と比較したP値（Welchテスト）が0.001未満であることを示し、###は、アスピリン単独群と比較したP値（Welchテスト）が0.001未満であることを示す。
【図６】図６は、ステント血栓のラットモデルにおいてクロピドグレル硫酸塩とエドキサバントシル酸塩水和物とを併用した場合の抗血栓効果および抗FXa効果を示した図である。Aは血栓タンパク質量を示し、BはFXa活性を示す。図中、バーは平均±標準誤差（n=10）を示す。Edoはエドキサバントシル酸塩水和物を意味し、Clopidoはクロピドグレル硫酸塩を意味する。括弧中の値は阻害率（%）を示す。Aにおける***は、コントロール群と比較したP値（Student t テスト）が0.001未満であることを示し、###は、クロピドグレル硫酸塩単独群と比較したP値（Student t テスト）が0.001未満であることを示す。Bにおける***は、コントロール群と比較したP値（Welchテスト）が0.001未満であることを示し、###は、クロピドグレル硫酸塩単独群と比較したP値（Welchテスト）が0.001未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「ステント」としては、金属製ステント、樹脂製ステント、薬剤溶出性ステント、生体吸収性ステントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
ステントが留置される場所としては、血管内であれば、特に限定されないが、好ましくは、頸動脈、末梢動脈、頭蓋内動脈または冠動脈である。
【００１２】
本明細書において、「エドキサバン」とは、特に記載が無い限り、下記式：
【００１３】
【化１】
2016035780.tif 000002
【００１４】
で表されるN-(5-chloropyridin-2-yl)-N'-[(1S,2R,4S)-4-(dimethylcarbamoyl)-2-(5-methyl-4,5,6,7-tetrahydro[1,3]thiazolo[5,4-c]pyridine-2-carboxamido)cyclohexyl]oxamideを意味する。
【００１５】
エドキサバンの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、トシル酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。エドキサバンの塩は、好ましくは、塩酸塩、酒石酸塩またはトシル酸塩であり、より好ましくは、トシル酸塩である。
【００１６】
エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物は、好ましくは、下記式：
【００１７】
【化２】
2016035780.tif 000003
【００１８】
で表されるエドキサバントシル酸塩水和物である。エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物は市販されているものを使用すればよい。
【００１９】
本発明で使用される抗血小板作用を有する薬剤としては、アスピリン（Aspirin）、チクロピジン（Ticlopidine）、クロピドグレル（Clopidogrel）、プラスグレル（Prasugrel）、エリノグレル（Elinogrel）、チカグレロル（Ticagrelor）、カングレロール（Cangrelor）、シロスタゾール（Cilostazo）、アブシキマブ（Abciximab）、エピフィダチド（Epifibatide）、チロフィバン（Tirofiban）、ボラパクサール（vorapaxar）、ジピリダモール（Dipyridamole）、または、それらの塩などが挙げられる。抗血小板作用を有する薬剤は市販されているものを使用すればよい。
【００２０】
本明細書において、「エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と、抗血小板作用を有する薬剤とを組み合わせてなる」とは、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を含有する製剤と抗血小板作用を有する薬剤を含有する製剤を同時に、または、別々に投与される態様、あるいは、エドキサバンもしくはその薬学的に許容され得る塩またはそれらの水和物と抗血小板作用を有する薬剤の両方を含有する製剤（以下、「配合剤」という）を投与する態様をいう。
【００２１】
本明細書において、「同時に」投与する、とは、ほぼ同じ時間に投与することをいう。
【００２２】
本明細書において、「別々に」投与する、とは、異なった時間に別々に投与することをいう。例えば、最初に、抗血小板作用を有する薬剤を投与し、次いで、決められた時間後に、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物を投与したり、またその逆もしかりである。
【００２３】
本発明の医薬組成物または配合剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタなど、好ましくはヒト）に投与される場合には、全身的または局所的に、経口または非経口で投与され得る。また、薬剤としてエドキサバンもしくはその薬学的に許容され得る塩またはそれらの水和物を使用した薬剤溶出ステントまたはバルーンも、本発明の医薬組成物に含まれる。
【００２４】
本発明の医薬組成物または配合剤は、投与方法に応じて適切な形態を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法によって調製できる。
【００２５】
経口用の医薬組成物または配合剤の形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物は、添加剤として通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、膨潤剤、膨潤補助剤、コーティング剤、可塑剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤、湿潤剤などを必要に応じて選択し、常法に従って製造され得る。
【００２６】
非経口用の医薬組成物または配合剤の形態としては、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、座剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物は、添加剤として通常用いられる安定化剤、防腐剤、溶解補助剤、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、着香剤、ゲル化剤、中和剤、緩衝剤、等張剤、界面活性剤、着色剤、緩衝化剤、増粘剤、湿潤剤、充填剤、吸収促進剤、懸濁化剤、結合剤などを必要に応じて選択し、常法に従って製造され得る。
【００２７】
本発明の医薬組成物が薬剤溶出ステントまたはバルーンである場合は、常法に従って、ステントまたはバルーンに薬剤を担持させることで本発明の医薬組成物が製造され得る。
【００２８】
本発明の医薬組成物に含有されるエドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物の投与量は、症状、年齢、体重などにより異なるが、経口投与の場合には、1日1〜数回、成人一人一回当たり、エドキサバンとして1〜200mg、好ましくは5〜100mgである。より好ましくは1日1回15〜60mgである。抗血小板作用を有する薬剤と併用される場合には、出血リスクを勘案して適宜投与量を減量することも考慮する。
【００２９】
抗血小板作用を有する薬剤の投与量は、各薬剤の添付文書などに従って設定され、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物と併用する場合には、出血リスクを勘案して適宜減量することも考慮する。例えば、抗血小板作用を有する薬剤としてアスピリン、クロピドグレルまたはプラスグレルを使用する場合、それぞれ、75〜325mg/日、50〜75mg/日または3.75〜10mg/日の用量で各薬剤を投与すればよい。
【００３０】
上記で得られる医薬組成物または配合剤は、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するために用いることができる。さらに、上記で得られる医薬組成物または配合剤は、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するために従来から用いられている抗血小板作用を有する薬剤の投与用量を減少させたとしても、エドキサバンまたはその薬学的に許容され得る塩あるいはそれらの水和物をさらに投与することにより、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を十分に抑制できるので、副作用を低減しつつ、ステント留置後の血栓・塞栓の形成を抑制するために用いることができる。
【００３１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
（試薬）
実施例で使用した試薬は次の通りである。
0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（以下、「0.5%MC溶液」という）（和光純薬株式会社）
チオペンタールナトリウム（田辺三菱製薬株式会社）
プロテインアッセイCBB溶液、NaOH、10×Tris Buffered Saline (10×TBS、pH7.4)（ナカライテスク株式会社）
ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma Aldrich Co. LLC.）
Sodium citrate tribasic dihydrate（Sigma Aldrich Co. LLC.）
Albumin Standard（Bovine albumin、Thermo Fisher Scientific Inc.）
ヒトFXa（Enzyme Research Laboratories Ltd.）
S-2222（FXaの基質）（Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A.）
生理食塩液、蒸留水（株式会社大塚製薬工場）
Na2CO3（キシダ化学株式会社）【００３３】
（材料）
実施例で使用したステントは次の通りである。
ステント（材質：ステンレス316L、外径：2.0mm、長さ：16mm）（川澄化学工業株式会社）【００３４】
（被検物質）
被検物質として、エドキサバントシル酸塩水和物（以下、「エドキサバン」と省略する）、アスピリン、クロピドグレル硫酸塩（以下、「クロピドグレル」と省略する）およびチカグレロル硫酸塩（以下、「チカグレロル」と省略する）を使用した。【００３５】
（薬液の調製）
被検物質を0.5%MC溶液に溶解または懸濁して、投与用の溶液または懸濁液を調製した。【００３６】
（試薬溶液の調製）
0.2%BSA含有2×TBS：使用時に10×TBSを蒸留水で希釈し、BSA（終濃度0.2%）を添加した。
FXa：0.2%BSA含有2×TBSで40IU/mLに調製し、-80℃で保存した。用時融解し、同溶媒で0.032IU/mLに希釈した。
S-2222：蒸留水で3mMに調製し、-20℃で保存した。用時融解し、蒸留水で0.75mMに希釈した。【００３７】
（動物）
実施例で使用した動物は次の通りである。
種：ラット
系統・性別：Slc:SD、雄
入手先：日本エスエルシー株式会社
使用時の週齢：10週齢
馴化期間：1週間以上【００３８】
（飼育環境）
馴化は次の環境で行った。
設定温度：23℃
湿度：55±10%
照明：12時間/日（7:00〜19:00）
飼育匹数：1ケージ当たり3匹
餌および水：固形飼料FR-2（株式会社フナバシファーム）および水道水を自由摂取させた。【００３９】
（モデルの作製）
ラットをチオペンタールナトリウム（100 mg/mL/kg、i.p.）で麻酔し、保温マットにのせた。麻酔18分後にステント4個が入ったポリエチレンチューブ（約34cm）を左右の頸動脈および頸静脈に挿入して動静脈シャント（以下、「AVシャント」という）を作製し、シャント内に血流を開通させた。開通30分後に血栓が付着したステントを取出し、血栓タンパク質の量を測定した。【００４０】
（実施例１）エドキサバン、アスピリン、クロピドグレルおよびチカグレロルの抗血栓効果
一晩絶食したラットにエドキサバン（0.3、1または3mg/10mL/kg）をAVシャント開通の30分前に、またはアスピリン（1、3、5、10、25、50または100mg/15mL/kg）、クロピドグレル（1、3、10または30mg/10mL/kg）もしくはチカグレロル（0.3、1または3mg/10mL/kg）をAVシャント開通の2時間前に経口投与した。コントロール群には0.5%MC溶液（10mL/kgまたは15mL/kg）を経口投与した。エドキサバン投与の12分後に、またはアスピリン、クロピドグレル、チカグレロル投与の1時間42分後に、ラットをチオペンタールナトリウムで麻酔し、上記の「モデルの作製」に記載の方法で血栓モデルを作製した。採取した血栓付ステントはタンパク質定量まで-20℃で保存した。なお、エドキサバンの評価では、血栓付ステントの採取直前に頸静脈から1/10容（0.04mL）の3.13%sodium citrate tribasic dihydrate水溶液を充填したシリンジを用いて0.36mL採血した。採取した血液を4℃で1,500×g、10分間遠心し（ユニバーサル冷却遠心機5930、久保田商事株式会社）、血漿を分離後、血漿中抗FXa活性を測定した。【００４１】
（実施例２）エドキサバンとアスピリンまたはクロピドグレルとの併用時の抗血栓効果
一晩絶食したラットにアスピリン（5mg/15ml/kg）またはクロピドルレル（3mg/10ml/kg）を経口投与し、その1.5時間後にエドキサバン（0.5mg/10mL/kg）を経口投与した。コントロール群には0.5%MC溶液（10mL/kgまたは15mL/kg）を経口投与した。エドキサバン投与の12分後にラットをチオペンタールナトリウムで麻酔し、上記の「モデルの作製」に記載の方法で血栓モデルを作製し、実施例１と同様に抗血栓効果を評価した。【００４２】
（パラメータの測定）
血栓タンパク質の量：血栓付きステントを0.9mLの2%Na2CO3含有0.1N NaOH溶液の中に入れて約30分間煮沸し、タンパク質を可溶化した。この血栓可溶化液中のタンパク質の量をBradford法（Anal Biochem. 1976;72:248-254）によって定量した。【００４３】
血漿中抗FXa活性：ヒトFXaによるS-2222分解反応に対する血漿サンプルの阻害率を算出した。96ウェルプレートに血漿5μL、精製水5μLを分注し、続いて0.2%BSA含有2×TBSで希釈した0.032IU/mL FXaを50μL添加した。0.75mM S-2222を40μL加えて反応を開始し、吸光度計SPECTRAmax 190（Molecular Devices）を用いて405nmにおける吸光度を室温で10分間測定した。算出された反応速度（FXa活性、ΔO.D./min）を用いて、血漿中抗FXa活性（阻害率）を以下の計算式から算出した。
血漿中抗FXa活性（%）=(1-被検物質投与ラット各個体の血漿のΔO.D./min/コントロール群ラットの血漿の平均ΔO.D./min)×100【００４４】
（統計学的処理）
成績は平均値±標準誤差で表した。SAS System Release 8.2およびMicrosoft Excel 2010を使用して解析を実施した。解析は全て両側検定で行い、有意水準5%未満とした。【００４５】
実施例１（被検物質の抗血栓効果）：血栓タンパク質の量および血漿中FXa活性について、コントロール群と各被検物質の各用量群の比較をDunnett検定で実施し、Spearman相関係数の検定によって用量反応性を評価した。【００４６】
実施例２（エドキサバンと抗血小板薬との併用時の抗血栓効果）：血栓タンパク質の量および血漿中FXa活性について、各群間の等分散性をF検定で確認後、Student t検定あるいはWelch検定で各群間の比較を実施した。【００４７】
（結果）
（実施例１）
ラットステント血栓モデルの実験を5回実施し、この時のコントロール群の平均血栓タンパク質の量は1025〜2953μgであった。【００４８】
エドキサバンは0.3、1および3mg/kgで血栓形成をそれぞれ37%（Ρ=0.407）、70%（Ρ=0.042）、および86%（Ρ=0.011）抑制した（図１のA）。エドキサバンの抗血栓効果には用量依存性が認められた（P<0.001）。エドキサバンの経口投与後の血漿中には用量依存的（Ρ<0.001）かつ有意な抗FXa活性が認められた（図１のB）。【００４９】
アスピリンは、5および10mg/kgでそれぞれ40%および47%の血栓形成抑制率を示したが、有意な作用ではなかった（図２のA）。10、25、50および100mg/kgでは、血栓形成をそれぞれ63%（Ρ=0.001）、64%（P<0.001）、70%（P<0.001）、および83%（P<0.001）抑制した（図２のB）。アスピリンの抗血栓効果には用量依存性が認められた（P<0.001）。【００５０】
クロピドグレルは、1、3、10および30mg/kgで血栓形成をそれぞれ40%（P=0.075）、47%（P=0.024）、84%（P<0.001）、および94%（P<0.001）抑制した（図３）。クロピドグレルの抗血栓効果には用量依存性が認められた（P<0.001）。【００５１】
チカグレロルは、0.3、1、および3 mg/kgで血栓形成をそれぞれ67%（P=0.014）、74%（P=0.006）および89%（P<0.001）抑制した（図４）。チカグレロルの抗血栓効果には用量依存性が認められた（P<0.001）。【００５２】
（実施例２）
ラットステント血栓モデルにおけるエドキサバン（0.5mg/kg）とアスピリン（5mg/kg）との併用効果を評価した。コントロール群の血栓タンパク質の量は1692±304μgであった（図５のA）。エドキサバンおよびアスピリンは共に単独で42%の血栓形成抑制率を示した（それぞれのP値：0.060および0.056）。エドキサバンとアスピリンとの併用群は65%（P=0.004 vs. control）の有意な抑制作用を示し、アスピリン単独群と比較して有意に血栓量が減少した（P=0.049 vs. アスピリン）。本併用はエドキサバン単独群に対しては有意ではなかった（Ρ=0.054 vs. エドキサバン）。エドキサバン単独群およびエドキサバンとアスピリンとの併用群の血漿中抗FXa活性は同等であった（図５のB）。【００５３】
次に、エドキサバン（0.5mg/kg）とクロピドグレル（3mg/kg）との併用効果を評価した。コントロール群の血栓タンパク質の量は1209±151μgであった（図６のA）。エドキサバンおよびクロピドグレルの単独での血栓形成抑制率は、それぞれ25%（Ρ=0.340）および21%（Ρ=0.149）であった。エドキサバンとクロピドグレルとの併用群は61%（Ρ<0.001 vs. control）の有意な抑制作用を示し、クロピドグレル単独群に比べ有意に血栓量が減少した（Ρ<0.001 vs. クロピドグレル）。本併用はエドキサバン単独群に対しては有意ではなかった（Ρ=0.166 vs. エドキサバン）。エドキサバン単独群およびエドキサバンとクロピドグレルとの併用群の血漿中抗FXa活性は同等であった（図６のB）。【００５４】
以上の結果から、ラットステント血栓モデルにおいて、FXa阻害薬であるエドキサバンは、抗血小板薬であるアスピリン、クロピドグレルおよびチカグレロルと同様に、用量依存的かつ有意な抗血栓作用を示した。さらに、本モデルにおいて、低用量の抗血小板薬（アスピリンまたはクロピドグレル）に低用量のエドキサバンを上乗せすることによって、抗血小板薬単独に比べ有意に血栓量が減少することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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