(57)【要約】  耐酸耐塩性酵母由来の酸や塩に耐性を示す遺伝子およびタンパク質を発酵生産の優れた酵母に導入する、またはそれらの発現量を向上させることにより耐酸耐塩性を付与することで強酸（低pH）や高塩濃度の環境下で様々な生育阻害耐性および発酵阻害耐性を示す酵母を作製し、それを用いてエタノールなどの有用物質を生産する方法の提供。  Issatchenkia orientalis由来のLGS1遺伝子あるいは他酵母由来のGH72ファミリーに属するLGS1相同遺伝子（GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子など）を恒常的に発現する遺伝子組換え酵母およびそれを用いた低pHや高塩濃度の環境下で耐性を獲得する方法およびグルコースやグルコースを含む糖化液からエタノールなどの有用物質を高効率に生産する方法。
2015141705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LGS1遺伝子あるいはGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子を発現するプラスミドを含む、グルコースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
【請求項２】
LGS1遺伝子あるいはGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が染色体組込みにより導入されている、グルコースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
【請求項３】
GH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子がGAS1、GAS2、GAS3、GAS4、GAS5、Gel1、Gel2、Gel3、Gel4、Gel5、Gel6、Gel7、Glt1、PHR1、PHR2、PHR3、EPD1、EPD2、およびGCW2からなる群より選択されるものである、請求項１または２に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項４】
LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が酵母または細菌由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項５】
LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Issatchenkia orientalisに由来する、請求項４に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項６】
LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、請求項４に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項７】
LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Kluyveromyces marxianusに由来する、請求項４に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項８】
LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Scheffersomyces (Pichia) stipitisに由来する、請求項４に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項９】
さらに、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が導入されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１０】
キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子がScheffersomyces (Pichia) stipitisに由来し、かつキシルロキナーゼ遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、請求項９に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１１】
遺伝子組換え酵母がSaccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、請求項１〜１０のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【請求項１２】
遺伝子組換え酵母がKluyveromyces marxianusを宿主として作製される、請求項１〜１０のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【請求項１３】
遺伝子組換え酵母がScheffersomyces (Pichia) stipitisを宿主として作製される、請求項１〜１０のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【請求項１４】
遺伝子組換え酵母がIssatchenkia orientalisを宿主として作製される、請求項１〜１０のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、グルコースからエタノールを生産する方法。
【請求項１６】
請求項９〜１４のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。
【請求項１７】
請求項９〜１４のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、グルコースとキシロースの混合糖からエタノールを生産する方法。
【請求項１８】
請求項９〜１４のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、セルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐酸耐塩性酵母由来の酸や塩に耐性を示す遺伝子およびタンパク質を発酵生産の優れた酵母に導入する、またはそれらの発現量を向上させることにより耐酸耐塩性を付与することで強酸（低pH）や高塩濃度の環境下で様々な生育阻害耐性および発酵阻害耐性を示す酵母を作製し、それを用いてエタノールなどの有用物質を生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油の枯渇や地球温暖化問題を解決するための代替エネルギーとしてバイオエタノール（植物由来原料であるバイオマスから生産されるエタノール）が注目されている。バイオマスからのエタノール生産方法は多種多様であるが、破砕や分解（糖化）等の処理によりバイオマスから糖液を調製した後、酵母等の微生物による反応（発酵）を利用して糖液からエタノールを生産することが基本の流れである。エタノール発酵微生物として、酵母（Saccharomyces cerevisiae）以外に、ザイモモナス菌（Zymomonas mobilis）やコリネ型細菌（Corynebacterium glutamicum）等も知られているが、細菌類はエタノール耐性が低い、酵母はpH4.5付近で用いることで他の微生物種の混入を極力抑えた連続生産ができる等の理由から、現在稼働している産業プラントの発酵工程では、酵母を利用している場合がほとんどである。【０００３】
酵母の増殖や発酵の能力は様々な環境因子によって影響される。大多数の酵母は、常温・常圧という通常の環境条件下では増殖や発酵が可能であるが、高温、酸性、アルカリ性あるいは高塩濃度という特殊な環境では生育や発酵することができない。しかし、最近このような特殊環境下に生育できる酵母（Issatchenkia orientalis）の存在が明らかにされている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照）。耐熱性、耐酸性、耐塩性に優れたIssatchenkia orientalisは、特殊環境への適応または耐性機構の解明に適した材料であるだけでなく、新たな遺伝子資源および酵素資源として活用して産業利用へ応用するという観点からも重要である。【０００４】
先に、本発明者らは次世代シークエンサーによりIssatchenkia orientalis NBRC1279株のゲノム配列を解析し、得られたゲノム情報から、耐酸性や耐塩性などストレス耐性や発酵阻害耐性に関係するIssatchenkia orientalis特有の遺伝子が存在することを予想している。しかしながらIssatchenkia orientalisから、耐酸性や耐塩性などストレス耐性や発酵阻害耐性に関連する有用な遺伝子を同定し、さらなる耐性能を引き出すことに加えて、通常の環境条件下でしか増殖や発酵が可能な酵母に耐性能を付与する検討は行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２７８８２５公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kitagawa Tら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.87, pp.1841-1853 (2010)
【非特許文献２】Isono Nら、Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.113, pp.76-78 (2012)
【非特許文献３】Kwon YJら、Bioresource Technology, Vol.102, pp.8099-8104 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来法では、酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いたアルコール発酵や有用物質生産の際に、pH 2.0等の低pHストレス条件下や硫酸ナトリウム等の塩濃度が高い条件下では、酵母の増殖阻害や発酵阻害が生じ、効率良く目的の生産物を製造することができなかった。特にリグノセルロース系バイオマスは、硫酸などの酸で処理することで発酵の原料となる単糖（グルコースやキシロース）に加水分解することが多いため、Saccharomyces cerevisiaeで発酵するには発酵液を中和する工程が必要となり、コストアップに繋がってしまう。そのために、酵母への耐酸耐塩性付与に関する技術開発を進める必要がある。【０００８】
そこで、本発明では、強酸や高塩濃度の環境下でも生育可能で、グルコースやグルコースを含む混合糖、バイオマス糖化液からエタノール等の有用物質を高収率生産でき、かつ糖の消費速度が改善された遺伝子組換え酵母の作製およびそれを用いたエタノール等の有用物質の効果的な生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Issatchenkia orientalis NBRC1279株のゲノムライブラリーをSaccharomyces cerevisiae BY4742株に導入し、NBRC1279株では生育可能でBY4742株では生育不可能なpH 2.0の低pHの条件下において生育可能な耐酸性株を取得した。また、この株はpH 2.5、7.5% Na2SO4の強酸・高塩濃度の条件下でも耐性を示した。この耐酸性酵母株から耐酸耐塩性に寄与するLGS1遺伝子を同定・単離した（図１を参照）。LGS1遺伝子の耐酸耐塩性に寄与するという機能はこれまでに報告例がなく、これは驚くべき知見である。【００１０】
本発明では、耐酸性を付与した酵母を用いてグルコースやグルコースを含む混合糖、バイオマス糖化液から高効率でエタノールなどの有用物質を生産するために、Issatchenkia orientalis由来のLGS1遺伝子に注目し、Saccharomyces cerevisiae にLGS1遺伝子を導入して恒常的発現させた。強酸や強酸・高塩濃度の条件下で、LGS1遺伝子を発現する形質転換体は、好気的増殖能や嫌気的エタノール発酵能が顕著に向上した。したがって、Saccharomyces cerevisiaeにおいてIssatchenkia orientalis由来のLGS1遺伝子を発現させることが、耐酸耐塩性付与する上で重要であり、これにより耐酸耐塩性を付与した酵母は、従来公知の酵母株よりも低pHや高塩濃度の環境下で耐性を獲得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[１]  LGS1遺伝子あるいはGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子を発現するプラスミドを含む、グルコースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。   
[２]  LGS1遺伝子あるいはGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が染色体組込みにより導入されている、グルコースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。      【００１２】
[３]  GH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子がGAS1、GAS2、GAS3、GAS4、GAS5、Gel1、Gel2、Gel3、Gel4、Gel5、Gel6、Gel7、Glt1、PHR1、PHR2、PHR3、EPD1、EPD2、およびGCW2からなる群より選択されるものである、[１]または[２]に記載の遺伝子組換え酵母。【００１３】
[４]  LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が酵母または細菌由来である、[１]〜[３]のいずれかに記載の遺伝子組換え酵母。   
[５]  LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Issatchenkia orientalisに由来する、[４]に記載の遺伝子組換え酵母。   
[６]  LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、[４]に記載の遺伝子組換え酵母。   
[７]  LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Kluyveromyces marxianusに由来する、[４]に記載の遺伝子組換え酵母。   
[８]  LGS1遺伝子およびGH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子が、Scheffersomyces (Pichia) stipitisに由来する、[４]に記載の遺伝子組換え酵母。   
[９]  さらに、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が導入されている、[１]〜[８]のいずれかに記載の遺伝子組換え酵母。   
[１０]  キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子がScheffersomyces (Pichia) stipitisに由来し、かつキシルロキナーゼ遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、[９]に記載の遺伝子組換え酵母。   
[１１]  遺伝子組換え酵母がSaccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、[１]〜[１０]のいずれかの遺伝子組換え酵母。   
[１２]  遺伝子組換え酵母がKluyveromyces marxianusを宿主として作製される、[１]〜[１０]のいずれかの遺伝子組換え酵母。   
[１３]  遺伝子組換え酵母がScheffersomyces (Pichia) stipitisを宿主として作製される、[１]〜[１０]のいずれかの遺伝子組換え酵母。   
[１４]  遺伝子組換え酵母がIssatchenkia orientalisを宿主として作製される、[１]〜[１０]のいずれかの遺伝子組換え酵母。   【００１４】
[１５]  [１]〜[１４]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、グルコースからエタノールを生産する方法。   
[１６]  [９]〜[１４]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。   
[１７]  [９]〜[１４]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、グルコースとキシロースの混合糖からエタノールを生産する方法。   
[１８]  [９]〜[１４]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、セルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。   
[１９]  培養液のpHが2.0〜5.0である、[１５]〜[１８]のいずれかの方法。
[２０]  培養液が5％以上のNa2SO4を含む、[１５]〜[１９]のいずれかの方法。   【００１５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-056001号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、発酵生産の優れた従来公知の野性型酵母や遺伝子組換え酵母よりも、強酸や高塩環境下における増殖阻害耐性・発酵阻害耐性が向上し、グルコース、キシロース、キシロースとグルコースを含む混合糖、リグノセルロース系バイオマス糖化液に含まれる混合糖からエタノールや他の有用物質を高効率に生産できる遺伝子組換え酵母を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明における耐酸耐塩性酵母Issatchenkia orientalis由来の耐酸耐塩性遺伝子を同定するまでの流れを示す説明図である。まず、Issatchenkia orientalis NBRC1279株から抽出したゲノムDNAを制限酵素で切断し、ゲノム断片をプラスミド（pPGK）に挿入し、ゲノムDNA(ショットガン)ライブラリーを作製する。このライブラリーをSaccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換し、NBRC1279株では生育可能でBY4742株では生育不可能な強酸（pH 2.0）の条件下で培養する。その結果、生育可能な耐酸性酵母株として1クローン取得し、この株はpH 2.5および7.5% Na2SO4の強酸・高塩濃度の条件下でも耐性を示すことを確認した。この耐酸耐塩性酵母株からプラスミドを単離し（約3.8 kbpの遺伝子断片が挿入）、シークエンス解析により挿入されたDNAの塩基配列を決定した結果、2種類のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていることを確認した。他酵母とのホモロジー検索の結果を基に、 2種類の遺伝子の機能を類推し、各々の遺伝子をクローニングし、再度BY4742株に形質転換した。これら形質転換酵母株を強酸（pH 2.0）および強酸・高塩濃度（pH 2.5、7.5% Na2SO4）の条件下で培養し、いずれの条件下でも生育可能な株が観察された。この耐酸耐塩性酵母株の保持するLGS1遺伝子が耐酸耐塩性に寄与していることを明らかにし、耐酸耐塩性に関わる遺伝子を同定した。この遺伝子を構成的に高発現することによって、本発明における遺伝子組換え酵母は強酸や高塩濃度の環境下でも耐性を獲得し、良好な増殖能を示すと共に、グルコースやキシロースなどの糖からエタノール等の有用物質を高効率的に生産することが可能である。
【図２】図２は、スクリーニングにより取得した耐酸性酵母株において、プラスミド上のゲノムDNAの模式的な構造（Ａ）および様々な低pH（＋高塩濃度）に調整したSCD寒天培地における4種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株、B42-Clone1株、B42-LPR1、およびB42-LGS1株）の生育能（Ｂ）を示す特性図である。
【図３】図３は、酵母由来の4種類の遺伝子（Issatchenkia orientalisのLGS1、Saccharomyces cerevisiaeのGAS1、Candida albicansのPHR1およびPHR2）から推定されるアミノ酸配列のアライメントを示す特性図である。Io Lgs1pはIssatchenkia orientalis由来のLGS1遺伝子産物、Sc Gas1pはSaccharomyces cerevisiae由来のGAS1遺伝子産物、Ca Phr1pはCandida albicans由来のPHR1遺伝子産物、およびCa Phr2pはCandida albicans由来のPHR2遺伝子産物を示す。白抜きの丸（○）は４配列中３配列についてアミノ酸が同一である位置を、黒塗りの丸（●）は4配列中４配列についてアミノ酸が同一である位置を示す。
【図４】図４は、様々なpH（＋高塩濃度）に調整したSCD寒天培地における4種類の遺伝子組換え酵母（DG1-Con株、DG1-LGS1株、B42-Con株、およびB42-LGS1株）の生育能（Ａ）およびpH 4.0に調整したSCD培地で培養した2種類の遺伝子組換え酵母（DG1-Con株およびDG1-LGS1株）の細胞形態（Ｂ）を示す特性図である。
【図５】図５は、2種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株およびB42-LGS1株）の、SCD培地における好気的増殖を示す特性図である。
【図６】図６は、pHを5.0（Ａ）、4.0（Ｂ）、3.0（Ｃ）、および2.0（Ｄ）に調整したSCD-2培地における、2種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株およびB42-LGS1株）の嫌気的エタノール発酵能（グルコース消費量およびエタノール生産量）を示す特性図である。
【図７】図７は、pHを3.0（Ａ）、2.5（Ｂ）、2.2（Ｃ）、および2.0（Ｄ）に調整したSCD-3培地における、2種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株およびB42-LGS1株）の嫌気的エタノール発酵能（グルコース消費量およびエタノール生産量）を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
LGS1タンパク質は、Saccharomyces cerevisiaeのGAS1やCandida albicansのPHR1およびPHR2等と高い同一性を持つタンパク質であり、GH72ファミリー（Carotti Cら、European Journal of Biochemistry, Vol.271, pp.3635-3645 (2004)）に属している。GH72ファミリーのメンバーはZhangら, Applied and Environmental Microbiology, 2011, vol. 77, No.8, pp. 2676-2684、Ragniら, Yeast 2007, 24, pp. 297-308等にも記載されており、また公知のデータベース（CAZY等）から取得することもできる。Saccharomyces cerevisiaeのGAS1遺伝子はGPIアンカーを持つグルカノシルトランスフェラーゼをコードしており、その欠損は細胞壁の合成に障害を与える（Nuoffer Cら、Molecular and Cellular Biology, Vol.11, pp.27-37 (1991)およびPopolo Lら、Journal of Bacteriology, Vol.175, pp.1879-1885 (1993)）。またCandida albicansのPHR1およびPHR2は機能的に関連しており、それらの発現は生育環境のpHによって制御されている（Saporito-Irwin SMら、Molecular and Cellular Biology, Vol.15, pp.601-613 (1995)およびMuehlschlegel FAら、Molecular and Cellular Biology, Vol.17, pp.5960-5967 (1997)）。本明細書においてLGS1の相同遺伝子とは、酵母の耐酸耐塩性に関しLGS1遺伝子と同等の機能を有する遺伝子をいい、例としては、限定するものではないが、GH72ファミリーに属するLGS1の相同遺伝子、例えばGAS1、GAS2、GAS3、GAS4、GAS5、Gel1、Gel2、Gel3、Gel4、Gel5、Gel6、Gel7、Glt1、PHR1、PHR2、PHR3、EPD1、EPD2、GCW2等が挙げられる。LGS1遺伝子およびLGS1の相同遺伝子（GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などGH72ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子）は、かかるタンパク質をコードする遺伝子であれば由来は特に限定されないが、例えばAspergillus fumigatus、Aspergillus nidulans、Aspergillus oryzae、Candida albicans、Candida dubliniensis、Candida glabrata、Candida maltosa、Coccidioides posadasii、Cryptococcus neoformans、Debaryomyces hansenii、Eromothecium gossypii、Fusarium oxysporum、Issatchenkia orientalis 、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Magnaporthe grisea、Neurospora crassa、Paracoccidioides brasiliensis、Pneumocystis carinii、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Scheffersomyces (Pichia) stipitis、およびYarrowia lipolytica由来のものが挙げられる。ある実施形態において、LGS1相同遺伝子はSaccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus、Scheffersomyces (Pichia) stipitis、およびIssatchenkia orientalisなどの酵母に由来する。好ましくは、LGS1遺伝子は、Issatchenkia orientalisに由来するものである。Issatchenkia orientalisのLGS1遺伝子（配列番号１）は、Issatchenkia orientalis と同義であるPichia kudriavzeviiのドラフトゲノム情報（DDBJ/EMBL/GeneBankにALNQ01000000として登録）から利用することができる（Chan GFら、Eukaryotic Cell, Vol.11, pp.1300-1301 (2012)）。
【００１９】
LGS1の相同遺伝子としては、例えば、Issatchenkia orientalis由来のLGS1タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上、例えば９６％以上、９７%以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつLGS1活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；Issatchenkia orientalis由来のLGS1のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつLGS1活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；Issatchenkia orientalis由来のLGS1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつLGS1活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ある実施形態においてLGS1活性は酵母に耐酸耐塩性を付与する活性を含む。アミノ酸配列または塩基配列の同一性や相同性は、BLAST、ClustalXやGenetyxといった公知のソフトウェアを使用して決定することができる。
【００２０】
上記のアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸における「数個」の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下程度、例えば５個以下、４個以下または３個以下を意味する。
【００２１】
また、上記の「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高いＤＮＡと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましく６５℃での条件をいう。
【００２２】
上記のとおりGAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などはGH72ファミリーに属する。本発明者らはLGS1遺伝子がGAS1遺伝子の機能を相補し酵母に耐酸耐塩性を付与することを見出した。またGAS1遺伝子もLGS1遺伝子と同様に、耐酸耐塩性に寄与すると考えられる。したがってこれらの知見から、PHR1、PHR2等のGH72ファミリーに属する他のメンバーについても、同様に酵母の耐酸耐塩性に寄与すると考えられる。
【００２３】
LPR1は、Saccharomyces cerevisiaeのPXR1と高い同一性を持つタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeのPXR1遺伝子はリボソームRNAおよび核小体低分子 RNAの熟成に必須なタンパク質をコードしている（Guglielmi Bら、Journal of Biological Chemistry, Vol.277, pp.35712-35719 (2002)）。LPR1遺伝子およびLPR1の相同遺伝子（PXR1遺伝子など）は、かかるタンパク質をコードする遺伝子であれば、特に限定されないが、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus、Scheffersomyces (Pichia) stipitis、およびIssatchenkia orientalisなどの酵母に由来する。好ましくは、LPR1遺伝子は、Issatchenkia orientalisに由来するものである。Issatchenkia orientalisのLPR1遺伝子（配列番号２）は、Issatchenkia orientalis と同義であるPichia kudriavzeviiのドラフトゲノム情報（DDBJ/EMBL/GeneBankにALNQ01000000として登録）から利用することができる（Chan GFら、Eukaryotic Cell, Vol.11, pp.1300-1301 (2012)）。
【００２４】
上記の遺伝子は、それぞれの遺伝子配列に基づいて、当業者に周知である一般的な方法、例えば、ハイブリダイゼーション法、PCR法等によって得ることができる。さらにLGS1遺伝子およびLGS1の相同遺伝子（GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などGH72ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子）の破壊（欠失）または不活性化させる方法は、当業者に周知である一般的な分子生物学的手法を用いて行うことができ、特に限定されないが例えば、SOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）によって調製される欠失用DNA断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた相同組換えにより、宿主細胞より当該遺伝子を欠失または不活性化させることができる。また、PCRを利用した遺伝子破壊やランダム変異および部位特異的変異によっても得ることができる。一般的に、PCRを利用した遺伝子破壊では、プライマーで抗生物質耐性遺伝子カセットをPCRで増幅してターゲット遺伝子と置き換える。ランダム変異法では、遺伝子シャッフリングやエラープローンPCRを用いて変異体プールを構築し、その中から目的の性質に改変された変異体をスクリーニングする。部位特異的変異法では、既知のLGS1遺伝子配列およびLGS1の相同遺伝子配列を基に設計した、所定の位置に変異を導入したLGS1クローニング用プライマーを用いてPCRを行うことによって、クローニングされたLGS1遺伝子の所定の位置に変異を導入することができる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、これら目的の酵素遺伝子を宿主細胞内にて発現させる。その方法は、当業者に公知である一般的な分子生物学的手法を用いて行うことができる（Sambrook J.ら、“Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL /second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。すなわち、当該酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換することにより行うことができる。
【００２６】
ベクターとしては、遺伝子の導入および発現のために当業者に公知である一般的な酵母発現ベクターを用いることができる。酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれも用いることが可能である。
【００２７】
ベクターには、上記タンパク質をコードする遺伝子を一または複数を含めることができる。また、ベクターには、目的のタンパク質をコードする遺伝子の他に、宿主細胞における複製を可能とする複製起点、および形質転換体を同定する選択マーカー、さらに、好ましくは、酵母由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により酵素の遺伝子配列に連結されて含まれ得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。用いることができる転写プロモーターは、宿主細胞内にて遺伝子発現を駆動できる限り、特に限定されず、例えばGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH１プロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができるが、遺伝子を構成的に発現可能であるPGKプロモーターを用いるのが好ましい。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やHIS3、TRP1などの栄養要求性遺伝子などが例示される。
【００２８】
宿主細胞として用いることができるものとしては、特に限定するものではないがSaccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus、Scheffersomyces (Pichia) stipitis、およびIssatchenkia orientalisなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
【００２９】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３０】
好ましくは、LGS1遺伝子あるいはLGS1の相同遺伝子（GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などGH72ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子）は、宿主細胞において構成的に発現させる。例えば、LGS1遺伝子あるいはLGS1の相同遺伝子をマルチコピープラスミド上で発現させても良いし、染色体組込み型ベクター等に導入した後、酵母染色体上に組込み、シングルまたは数コピーで発現させても良い。好ましくは、LGS1遺伝子あるいはLGS1の相同遺伝子をマルチコピープラスミド上で発現させる。また、本発明においては、特開2009-195220号公報に記載のキシロース還元酵素XR、キシリトール脱水素酵素XDH、およびキシルロキナーゼXK遺伝子が染色体DNAに組込まれた遺伝子組換え酵母を利用することができる。XR遺伝子は、Scheffersomyces stipitisに由来するものであり得るGeneBank登録番号XM_001385144、配列番号１２）。XDH遺伝子は、Scheffersomyces stipitisに由来するものであり得る（GeneBank登録番号AF127801またはX55392、配列番号１３）。XK遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するものであり得る（GeneBank登録番号NC_001139.7、配列番号１４）。
【００３１】
上記LGS1遺伝子あるいはLGS1の相同遺伝子（GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などGH72ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子）を構成的に過剰発現させることによって耐酸耐塩性を付与・強化することができ、これにより作製される耐酸耐塩性酵母を用いて、従来公知である発酵生産の優れた酵母を用いた場合よりも、増殖阻害や発酵阻害を回避して有用物質を効率良く生産できる遺伝子組換え酵母を得ることができる。
【００３２】
本明細書において耐酸性とは、酸性条件下でも微生物（酵母等）が生存または増殖できることをいい、具体的にはpH2.0〜5.0、2.0〜4.0、2.0〜3.0、2.0〜2.5、2.0〜2.4、2.0〜2.3、2.0〜2.2または2.0〜2.1、好ましくは2.0でも生存または増殖できることをいう。本明細書において耐塩性とは、塩濃度の高い条件下でも微生物が生存または増殖できることをいい、具体的には1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、または7.5％以上のNa2SO4存在下でも生存または増殖できることをいう。また本明細書では耐酸性及び耐塩性の両方をまとめて耐酸耐塩性ということがある。本発明の遺伝子組み換え酵母は好ましくは耐酸耐塩性を有する。例えばある実施形態において耐酸耐塩性を有する本発明の遺伝子組み換え酵母はpH2.0〜5.0、2.0〜4.0、2.0〜3.0、2.0〜2.5、2.0〜2.4、2.0〜2.3、2.0〜2.2または2.0〜2.1かつ1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、または7.5％以上のNa2SO4存在下、例えばpH2.0〜5.0かつ5％Na2SO4存在下、pH2.0〜4.0かつ6％Na2SO4存在下、pH2.0〜3.0かつ7％Na2SO4存在下、またはpH2.0〜2.5かつ7.5％Na2SO4存在下で増殖可能である。本明細書において濃度、例えば塩濃度等を％として記載するとき、特に断らない限り、これは終濃度を重量％にて表記したものを意味する。  本明細書において酵母に耐酸耐塩性を付与する、とは、酸性かつ高塩濃度条件下で生存または増殖できなかった酵母にある遺伝子（例えばLGS1遺伝子あるいはLGS1の相同遺伝子）を導入し、その結果得られる遺伝子組換え酵母が酸性かつ高塩濃度条件下で生存または増殖できるようになることをいう。例えばGAS1欠失酵母は酸性かつ高塩濃度条件下では生存または増殖できないが、これにLGS1遺伝子を導入することにより増殖可能となり耐酸耐塩性が付与される（図４Ａ）。
【００３３】
宿主細胞および当該宿主細胞を欠失または不活性化させた遺伝子を用いて形質転換する方法は、上に定義するとおりである。
【００３４】
本発明に係る遺伝子組換え酵母は、固相に固定化されていても良い。固相としては例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物などが挙げられる（特にこれらに限定されない）。本発明に係る遺伝子組換え酵母を固相に固定することによって、連続反復使用が可能となる点において有利である。
【００３５】
本発明に係る遺伝子組換え酵母は、好気および嫌気条件下でグルコースなどの六炭糖や五炭糖のキシロースからエタノールなどの有用物質を生産することが可能である。その際、培地に含まれる糖の濃度は、0.1〜20 ％、好ましくは0.5 ％〜10 ％、さらに好ましくは、2 ％〜4 ％である。
【００３６】
また、本発明に係る遺伝子組換え酵母は、発酵反応によりリグノセルロース系バイオマスから調整した糖化液からエタノールなどの有用物質を生産することが可能である。糖化液は、特に限定するものではないが、木質（広葉樹および針葉樹）や農産廃棄物等の草本などのリグノセルロース系バイオマスを由来するものから調製することが可能である。糖化液を調製するための糖化技術は、当該分野において一般的な手法を用いることができ、酸分解法でも良いし酵素糖化法でも良いが、好ましくは、高効率と低環境負荷が期待できる非硫酸前処理・酵素糖化法である。実際、酵母を用いて発酵させる際には、解毒処理していない糖化液を直接用いても良いし、解毒処理した糖化液を用いても良い。糖化液のpHは未処理の酸性糖化液を用いても良いし、中性付近に調整してから用いても良いが、好ましくは未処理の酸性糖化液を用いる。
【００３７】
上記培養によるエタノール生産反応は、当業者に公知である一般的な方法によって行うことが可能である。培養温度は25 ℃〜38 ℃、好ましくは27 ℃〜33 ℃、さらに好ましくは30 ℃に制御する。培地のpHは、1.5〜6.0、好ましくは、2.0〜5.0、2.0〜4.0、2.0〜3.0、2.0〜2.5、2.0〜2.4、2.0〜2.3、2.0〜2.2または2.0〜2.1、さらに好ましくは2.0に制御する。発酵は嫌気条件で進行するので、酸素が存在しない状態が必要であり、そのため、発酵させる前に系内の酸素および培地中の溶存酸素を除去する操作、すなわち、窒素ガスを培地中に吹き込む操作を行うことが好ましい。反応は、連続式で行っても、バッチ式で行っても良い。さらに培地の塩濃度は高くてもよく、これにより混入微生物の増殖が抑制されうる。例えば培地は1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、または7.5％のNa2SO4を含み得る。塩はエタノール生産に影響を及ぼさない限りNaCl、KCl等の他の塩であり得る。
【００３８】
培養開始から0〜192時間、好ましくは0〜96時間、さらに好ましくは、72時間後の培地を回収してエタノールを分離する。培地よりエタノールを分離する方法は、蒸留、浸透気化膜等の公知の方法が用いられるが、蒸留による方法が好ましい。次いで、分離したエタノールをさらに精製（エタノール精製法としては、公知の方法、例えば蒸留等を用いることができる）することによって、エタノールを得ることができる。
【００３９】
本発明者らは酵母のGAS1遺伝子欠失株を作製し、GAS1機能をLGS1遺伝子が相補することを確認した。GAS1遺伝子もLGS1遺伝子と同様に、耐酸耐塩性に寄与する機能を有すると考えられる。これらの知見から、PHR1、PHR2等のGH72ファミリーに属する他のメンバーについても、同様に酵母の耐酸耐塩性に寄与すると考えられる。当業者であれば、慣用の手法を用いて、GH72ファミリーに属する他の遺伝子が酵母に耐酸耐塩性を付与する活性を有するか容易に確認することができる。これには例えば本発明のGAS1遺伝子欠失酵母株を用いることができる。このGAS1欠失株を、GH72ファミリーに属する遺伝子を有する組換えベクターで形質転換し、遺伝子組換え酵母の耐酸耐塩性を確認すればよい。
【実施例】
【００４０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：耐酸耐塩性酵母株の探索
Issatchenkia orientalis NBRC1279株のゲノム解析の結果により得られたゲノム情報から、耐酸性や耐塩性などストレス耐性や発酵阻害耐性に関係するIssatchenkia orientalis特有の遺伝子が存在することが予想された。そこで、これら有用な遺伝子を同定することを試みた。本発明における耐酸耐塩性酵母Issatchenkia orientalis由来の耐酸・耐塩性遺伝子を同定するまでの流れを図１に示した。まずIssatchenkia orientalis NBRC1279株から抽出したゲノムDNAを制限酵素でランダムに切断後、3〜5 kp以上のDNA断片を分画し、分画したDNA末端を平滑化してプラスミド（pPGK）に挿入し、ゲノムDNA(ショットガン)ライブラリーを作製した。ゲノムカバー率が10倍以上になるように、作製したゲノムDNAライブラリーをSaccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換し、pH 2.0に調整した栄養要求性寒天培地（6.7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、 20 g/l グルコース、2 g/l 検定したいアミノ酸を除いたdrop out mix、17 g/l agar : SCD寒天培地）において30℃で培養した。尚、この寒天培地上ではNBRC1279株は生育できるが、BY4742株は生育できないことを確認している。その結果、生育可能な耐酸性酵母株として1コロニー（1クローン）取得し、B42-Clone1株と命名した。B42-Clone1株はpH 2.5および7.5% Na2SO4の強酸・高塩濃度の条件下でも耐性を示した。これらの結果から、取得した耐酸耐塩性酵母株においてIssatchenkia orientalis NBRC1279株由来の耐酸耐塩性遺伝子が効果的に機能していることが予測された。
実施例２：耐酸耐塩性遺伝子の同定
取得した耐酸耐塩性性酵母株（B42-Clone1株）からプラスミド（pPGK-Clone1と命名）を単離し、制限酵素により切断した結果、pPGK上に3819 bpの遺伝子断片（Clone1と命名）（配列番号３）が挿入されていることが確認された。シークエンス解析により挿入されたゲノムDNAの塩基配列を決定した結果、2種類のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていることを確認した（図２のAを参照）。これらの遺伝子の推定アミノ酸配列を基に他酵母とのホモロジー検索を実施したところ、Saccharomyces cerevisiaeのPXR1およびGAS1とそれぞれ高い同一性を持つことが分かり、LPR1（Like PXR1）およびLGS1（Like GAS1）と命名した。また、Issatchenkia orientalis のLGS1は、Candida albicansやCandida glabrataなど病原カンジダ菌種のPHR1およびPHR2等と同一性を持ち、GH72ファミリーに属することも分かった（図３を参照）。LGS1の推定アミノ酸配列のアライメントから、Saccharomyces cerevisiaeのGAS1と60%一致し、Candida albicansのPHR1およびPHR2とそれぞれ61%および58%一致し、それぞれ高い同一性を示した。Saccharomyces cerevisiaeのPXR1遺伝子はリボソームRNAおよび核小体低分子 RNAの熟成に必須なタンパク質をコードしている一方、GAS1遺伝子はGPIアンカーを持つグルカノシルトランスフェラーゼをコードしており、細胞壁の合成に必要であることから、今回取得した耐酸耐塩性酵母株において耐酸耐塩性の機能に寄与する遺伝子は、GAS1の相同遺伝子であるLGS1と予想された。そこで、pPGK-Clone1上に含まれる2種類の遺伝子（LPR1およびLGS1遺伝子）のうち、LGS1遺伝子が耐酸耐塩性に寄与するかどうか検討するために、LGS1遺伝子に加えてLPR1遺伝子のクローニングを行った。
実施例３：pPGK-LPR1の作製      
野生型LPR1遺伝子を作製するため、Issatchenkia orientalis 由来Clone1の シークエンス解析の結果得られた塩基配列の情報を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、LPR1遺伝子の5’末端にEcoR I切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-ATgaattcATGGGTCTCGCAGGAACAAG-3’(配列番号４)
5’-GAggatccTCATTTGATCATGAAGATTTC-3’ (配列番号５)
PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。20 pmolの各プライマーと100 ngのIssatchenkia orientalisゲノムDNAを用い、変性反応を98℃で10秒間、アニーリング反応を55℃で5秒間、伸長反応を72℃で5秒間の条件でLPR1遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR IおよびBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-LPR1と名付けた。
実施例４：pPGK-LGS1の作製      
野生型LGS1遺伝子を作製するため、Issatchenkia orientalis 由来Clone1の シークエンス解析の結果得られた塩基配列の情報を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、LGS1遺伝子の5’末端にEcoR I切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-ATgaattcATGAAGTTCTCAAAGTCTCTCGC-3’(配列番号６)
5’-GAggatccTCAGATCAAAATCATAGAGATGGAGC-3’ (配列番号７)
PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。20 pmolの各プライマーと100 ngのIssatchenkia orientalisゲノムDNAを用い、変性反応を98℃で10秒間、アニーリング反応を55℃で5秒間、伸長反応を72℃で5秒間の条件でLGS1遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR IおよびBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-LGS1と名付けた。
実施例５：遺伝子組換え酵母株の作製（１）
上記プラスミドpPGK-LPR1およびpPGK-LGS1をYEASTMAKER yeast transformation system 2（クロンテック社）を用いてリチウム酢酸法によりSaccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換した。BY4742株をpPGK-LPR1を用いて形質転換して、遺伝子組換え酵母B42-LPR1株を作製した。また、pPGK-LGS1をBY4742株に形質転換して、遺伝子組換え酵母B42-LGS1株を作製した。一方、いずれの遺伝子も含まないpPGKを用いてBY4742株に形質転換してB42-Con株を作製し、コントロール株として用いた。
実施例６：遺伝子組換え酵母の培養（１）
耐酸耐塩性能を調べるために、まずスクリーニングにより取得したB42-Clone1株に加えてB42-LPR1株およびB42-LGS1株とそれらのコントロール酵母（B42-Con）株を、通常の栄養要求性寒天培地（SCD寒天培地）において30℃で生育させ、その後様々な低pH（pH 2.5、2.3、2.2、2.1、および2.0）に調整したSCD寒天培地および低pH・高塩濃度（pH 2.5、7.5% Na2SO4）のSCD寒天培地に植え継いで30℃で培養した。【００４１】
図２のBは、4種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株、B42-Clone1株、B42-LPR1株、およびB42-LGS1株）を用いて、上記SCD寒天培地において培養した結果（pH 2.1および2.0のSCD培地では13日目、それ以外のSCD培地では6日目）、これら遺伝子組換え酵母株の生育能示した図である。まずpH 2.5では、4種類いずれの遺伝子組換え酵母も良好に生育した。しかしpH 2.3では、B42-Clone1株およびB42-LGS1株は良好に生育したものの、コントロール株のB42-Con株およびB42-LPR1株の生育能は悪くなった。pH 2.2以下では（pH 2.2、2.1、2.0）、B42-Clone1株およびB42-LGS1株は生育したが、B42-Con株およびB42-LPR1株はほとんど生育しなかった。また、pH 2.5および7.5% Na2SO4の条件下でも、B42-Clone1株およびB42-LGS1株は生育できたが、B42-Con株およびB42-LPR1株は生育できなかった。pH 2.2以下、pH 2.5および7.5% Na2SO4の条件下では、B42-Clone1株と比べてB42-LGS1株の生育能の方が良かった。これらの結果から、耐酸耐塩性に寄与する遺伝子はLGS1であることが明らかとなった。
実施例７：遺伝子組換え酵母株の作製（２）
Issatchenkia orientalis 由来LGS1遺伝子がSaccharomyces cerevisiae 由来GAS1遺伝子の機能を相補するか否かを検討するために、GAS1遺伝子を欠損したノックアウト酵母にLGS1遺伝子を導入して形質転換酵母を作製し、この遺伝子組換え酵母株の耐酸耐塩性能を調べた。【００４２】
そのために、ノックアウト酵母のコレクションの中からGAS1遺伝子を欠損した酵母ΔGAS1株をオープンバイオシステムズ社から取得し（親株はBY4742株）、上記プラスミドpPGK-LGS1をYEASTMAKER yeast transformation system 2（クロンテック社）を用いてリチウム酢酸法により形質転換して、遺伝子組換え酵母DG1-LGS1株を作製した。また、LGS1遺伝子を含まないpPGKを用いてΔGAS1株に形質転換してDG1-Con株を作製し、コントロール株として用いた。
実施例８：遺伝子組換え酵母の培養（２）
耐酸耐塩性能を調べるために、DG1-Con株およびDG1-LGS1株に加えて先に作製したB42-Con株およびB42-LGS1株を、通常の栄養要求性寒天培地（SCD寒天培地）において30℃で生育させた後、低pH（pH 2.5および2.2）に調整したSCD寒天培地および低pH・高塩濃度（pH2.5、7.5% Na2SO4）のSCD寒天培地に植え継いで30℃で培養した。【００４３】
図４のAは、4種類の遺伝子組換え酵母（DG1-Con株、DG1-LGS1株、B42-Con株、およびB42-LGS1株）を用いて、上記SCD寒天培地において培養した結果（pH 2.5のSCD寒天培地では3日目、pH 2.2のSCD寒天培地では6日目、pH2.5および7.5% Na2SO4のSCD寒天培地では9日目）、これら遺伝子組換え酵母株の生育能を示した図である。まずpH 2.5のSCD寒天培地では、DG1-Con株のみ生育することができなかったが、残り3種類の遺伝子組換え酵母株はいずれも良好に生育した。DG1-Con株は、pH 2.5のSCD寒天培地で16日以上培養しても生育しなかったが、pH 2.8のSCD寒天培地では3日目に生育してきた。pH 2.2のSCD寒天培地では、DG1-Con株に加えてB42-Con株も生育できなかったが、DG1-LGS1株およびB42-LGS1株は良好に生育可能であった。また、pH 2.5および7.5% Na2SO4の条件下でも、DG1-LGS1株およびB42-LGS1株は生育できたが、DG1-Con株およびB42-Con株は生育できなかった。これらの結果から、GAS1遺伝子を欠損すると耐酸耐塩性能が低下するが、LGS1遺伝子を発現することで耐酸耐塩性能が野性株よりも増加することが分かった。さらに、GAS1遺伝子もLGS1遺伝子と同様に、耐酸耐塩性に寄与する機能を有することが示唆された。【００４４】
次に、ΔGAS1株においてLGS1遺伝子を発現するDG1-LGS1株とそのコントロール酵母DG1-Con株を、pH 4.0に調整した栄養要求性培地（6.7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、 20 g/l グルコース、2 g/l 検定したいアミノ酸を除いたdrop out mix : SCD培地）において30℃で12時間好気的に培養し、顕微鏡でそれぞれの酵母細胞の形態を観察した（図４のBを参照）。DG1-Con株は、細胞のサイズが大きく、液胞の占める割合が多く、出芽する娘細胞が1個以上の細胞が多く見られ、これまでに報告されているGAS1遺伝子の欠損株の形態と一致した（Popolo Lら、Journal of Bacteriology, Vol.175, pp.1879-1885 (1993)）。一方、DG1-LGS1株では、DG1-Con株で観察された特徴的な形態は見られず、野生株と同様の形態を示した。このように、LGS1遺伝子はGAS1遺伝子の機能を相補することが可能であった。【００４５】
GAS1、PHR1、およびPHR2遺伝子などはGH72ファミリーに属する。上記のようにLGS1遺伝子はGAS1遺伝子の機能を相補する。またGAS1遺伝子もLGS1遺伝子と同様に、耐酸耐塩性に寄与する機能を有すると考えられる。したがってこれらのことから、PHR1、PHR2等のGH72ファミリーに属する他のLGS1の相同遺伝子についても、同様に酵母の耐酸耐塩性に寄与すると考えられる。
実施例９：遺伝子組換え酵母の培養（３）
好気的増殖実験のために、BY4742株においてLGS1遺伝子を発現するB42-LGS1株とそのコントロール酵母B42-Con株を、20 g/lグルコースを含む栄養要求性培地（6.7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、 20 g/l グルコース、2 g/l 検定したいアミノ酸を除いたdrop out mix : SCD培地）において30℃で12時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、pH 2.2に調整したSCD培地300 μlに適量を接種した（菌体量を統一）。培養液はマイクロプレートリーダーHiTS（Scinics社）において、緩やかに振盪しながら30℃で216時間、好気的に培養した。その結果、B42-Con株はほとんど増殖しなかったのに対し、B42-LGS1株は良好に増殖した。同様に、強酸・高塩濃度（pH2.2、5% Na2SO4）のSCD培地においても、B42-Con株は増殖しなかったが、B42-LGS1株は良好に増殖することができた。図５を参照されたい。
実施例１０：遺伝子組換え酵母の培養（４）
エタノール発酵実験のために、BY4742株においてLGS1遺伝子を発現するB42-LGS1株とそのコントロール酵母B42-Con株を、20 g/lグルコースを含む栄養要求性培地（6.7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、 20 g/l グルコース、2 g/l 検定したいアミノ酸を除いたdrop out mix : SCD培地）において30℃で24時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、40 g/lグルコースを含む4種類の発酵培地（SCD-2培地）20 mlに適量を接種した（菌体量を統一）。発酵培地（SCD-2培地）のpHは5.0、4.0、3.0、2.0にそれぞれ調整し、各発酵液は攪拌棒を入れた50 mlの密封型のバイアルにおいて、緩やかに攪拌しながら30℃で72時間、嫌気的に培養した。
実施例１１：エタノール濃度の測定（１）
エタノール、グルコース、グリセロール、酢酸の濃度は高速液体クロマトグラフィー（HPLC; 日本分光株式会社）を用いて測定した。分離カラムはHPX-87Hカラム（Bio-Rad社）を用い、HPLC装置は5 mM H2SO4で0.6 ml/minの流速で流し、65℃で運転した。酵母の増殖は分光光度計Biowave II（WPA社）を用いて600 nmでの波長を測定した。解析の結果、pHを5.0、4.0、および3.0に調整したSCD-2培地では、B42-Con株とB42-LGS1株の間で増殖速度にそれほど違いがみられなかったが、pHを2.0に調整したSCD-2培地では、これら遺伝子組換え酵母株間で増殖速度に顕著な違いがみられた。すなわち、B42-Con株はほとんど増殖しなかったのに対し、B42-LGS1株は良好に増殖した。【００４６】
図６は、2種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株およびB42-LGS1株）を用いて、40 g/Lのグルコースを含む発酵培地（SCD-2培地）を用いた嫌気培養における、これら遺伝子組換え酵母株のグルコース消費量およびエタノール生産量を経時的に示した図である。それぞれpHを5.0、4.0、3.0、および2.0に調整したSCD-2培地での発酵実験の結果を図６のA、B、C、およびDに示している。【００４７】
まずpHを5.0および4.0に調整したSCD-2培地では、72時間後、コントロール株のB42-Con株と比べてLGS1遺伝子を発現するB42-LGS1株の方がややエタノール生産量が多くなったものの、グルコース消費量およびエタノール生産量は共に、2株の間でほとんど変化しなかった（図６のAおよびBを参照）。いずれの条件下でも、72時間後に75〜78%のグルコースを消費し、13.8〜14.8 g/Lのエタノールを生産した。【００４８】
pHを3.0に調整したSCD-2培地では、グルコース消費量およびエタノール生産量について、酵母株間で差が生じた（図６のCを参照）。すなわち、コントロール株のB42-Con株は72時間後に72%のグルコースを消費したのに対し、B42-LGS1株は72時間後に80%のグルコースを消費し、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が速くなった。B42-Con株は72時間後に13.0 g/Lのエタノールを生産したのに対し、B42-LGS1株は72時間後に15.0 g/Lのエタノールを生産し、グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ86%および94%であった。このように、最終的なエタノール生産量およびエタノール収率はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が高かった。両酵母株とも、pH 3.0〜5.0に調整したSCD-2培地では、副産物であるグリセロールおよび酢酸は少量生産された（それぞれ0.9 g/lおよび0.6 g/l以下）。【００４９】
さらにpHを2.0に調整したSCD-2培地では、グルコース消費量およびエタノール生産量について、酵母株間でさらに差が生じた（図６のDを参照）。すなわち、コントロール株のB42-Con株は72時間後に42%しかグルコースを消費できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に77%のグルコースを消費し、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度もB42-Con株と比べてB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。B42-Con株は72時間後に6.7 g/Lしかエタノールを生産できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に13.3 g/Lのエタノールを生産することができ、グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ81%および87%であった。このように、pH 3.0の条件下のみならずpH 2.0の低pH条件下でも、最終的なエタノール生産量およびエタノール収率はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が高くなった。両株とも、pH 2.0に調整したSCD-2培地では、少量のグルセロールと酢酸を生産したが（それぞれ1.3 g/lおよび0.8 g/l以下）、pH 3.0〜5.0の条件下におけるこれら副産物量よりもやや増加した。このように、コントロール株のB42-Con株はpH 2.0の発酵培地で顕著にグルコースからのエタノール生産性が低下したが、LGS1遺伝子を発現するB42-LGS1株はpHが2.0の発酵培地でも、pHが5.0、4.0、および3.0の発酵培地にいける結果とほぼ同様で、エタノール発酵性がほとんど損なわれなかった。これらの結果から、LGS1遺伝子を発現する酵母株では低pH条件下でもエタノール発酵能が阻害をほとんど受けないことが明らかになり、LGS1遺伝子が耐酸性の獲得において重要な働きをしていることが示唆された。
実施例１２：遺伝子組換え酵母の培養（５）
さらなるエタノール発酵実験のために、B42-LGS1株とB42-Con株をSCD培地において30℃で24時間、好気的に培養した後、遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、40 g/lグルコースおよび7.5%のNa2SO4を含む4種類の発酵培地（SCD-3培地）20 mlに適量を接種した（菌体量を統一）。発酵培地（SCD-3培地）のpHは3.0、2.5、2.2、2.0にそれぞれ調整し、実施例１０と同様に、各発酵液は攪拌棒を入れた50 mlの密封型のバイアルにおいて、緩やかに攪拌しながら30℃で72時間、嫌気的に培養した。
実施例１３：エタノール濃度の測定（２）
実施例１１と同様に、エタノール、グルコース、グリセロール、酢酸の濃度は高速液体クロマトグラフィー（HPLC; 日本分光株式会社）を用いて測定し、分離カラムはHPX-87Hカラム（Bio-Rad社）を用い、HPLC装置は5 mM H2SO4で0.6 ml/minの流速で流し、65℃で運転した。酵母の増殖は分光光度計Biowave II（WPA社）を用いて600 nmでの波長を測定した。解析の結果、pHを3.0に調整したSCD-3培地では、B42-Con株とB42-LGS1株の間で増殖速度にそれほど違いがみられなかったが、pHを2.5、2.2、および2.0に調整したSCD-3培地では、これら遺伝子組換え酵母株間で増殖速度に顕著な違いがみられた。すなわち、B42-Con株と比べてB42-LGS1株はより良好に増殖した。【００５０】
図７は、2種類の遺伝子組換え酵母（B42-Con株およびB42-LGS1株）を用いて、40 g/Lのグルコースおよび7.5%のNa2SO4を含む発酵培地（SCD-3培地）を用いた嫌気培養における、これら遺伝子組換え酵母株のグルコース消費量およびエタノール生産量を経時的に示した図である。それぞれpHを3.0、2.5、2.2、および2.0に調整したSCD-3培地での発酵実験の結果を図７のA、B、C、およびDに示している。【００５１】
まず、pHを3.0に調整したSCD-3培地では、グルコース消費量およびエタノール生産量について、酵母株間で差が生じた（図７のAを参照）。すなわち、コントロール株のB42-Con株は72時間後に全てのグルコースを消費したのに対し、B42-LGS1株は55時間後に全てのグルコースを消費し、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方がやや速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方がやや速くなった。B42-Con株は72時間後に18.2 g/Lのエタノールを生産したのに対し、B42-LGS1株は72時間後に19.4 g/Lのエタノールを生産し、グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ86%および92%であった。このように、最終的なエタノール生産量およびエタノール収率はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方がやや高かった。両酵母株とも、pH 3.0に調整したSCD-3培地では、副産物であるグリセロールおよび酢酸は少量生産された（それぞれ2.2 g/lおよび0.8 g/l以下）。【００５２】
pHを2.5および2.2に調整したSCD-3培地では、グルコース消費量およびエタノール生産量について、酵母株間でさらに差が生じた（図７のBおよびCを参照）。すなわち、pH2.5のSCD-3培地では、コントロール株のB42-Con株は72時間後に57%しかグルコースを消費できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に全てのグルコースを消費し、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度もB42-Con株と比べてB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。B42-Con株は72時間後に9.8 g/Lしかエタノールを生産できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に19.6 g/Lのエタノールを生産することができ、グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ80%および95%であった。また、pH2.2のSCD-3培地では、コントロール株のB42-Con株は72時間後に36%しかグルコースを消費できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に86%のグルコースを消費し、pH2.5の場合と同様に、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度もB42-Con株と比べてB42-LGS1株の方が顕著に速くなった。B42-Con株は72時間後に6.2 g/Lしかエタノールを生産できなかったのに対し、B42-LGS1株は72時間後に16.0 g/Lのエタノールを生産することができた。このように、pH 2.5の条件下のみならずpH 2.2の低pH・高塩濃度条件下でも、最終的なエタノール生産量はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が高くなった。グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ82%および83%であった。両酵母株とも、pH 2.5および2.2に調整したSCD-3培地では、副産物であるグリセロール（それぞれ2.2 g/lおよび3.0 g/l以下）および酢酸（それぞれ0.6 g/lおよび0.5 g/l以下）を少量生産した。【００５３】
さらにpHを2.0に調整したSCD-3培地でも、グルコース消費量およびエタノール生産量について、酵母株間で差が生じたが（図７のDを参照）、pH3.0〜2.2のSCD-3培地における場合と比べて、B42-LGS1株の発酵能がやや弱くなった。すなわち、コントロール株のB42-Con株は72時間後に31%のグルコースを消費し、B42-LGS1株は72時間後に46%のグルコースを消費した。この場合でも、グルコース消費速度はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が速くなった。また、グルコース消費速度と比例して、エタノール生産速度もB42-Con株と比べてB42-LGS1株の方が速くなった。B42-Con株は72時間後に4.0 g/Lのエタノールを生産したのに対し、B42-LGS1株は72時間後に7.7 g/Lのエタノールを生産し、グルコース消費量からのエタノール収率は、B42-Con株およびB42-LGS1株で（理論収率の100%に対して）それぞれ59%および77%であった。このように、pH 2.0の低pH・高塩濃度条件下でも、最終的なエタノール生産量およびエタノール収率はB42-Con株よりもB42-LGS1株の方が高くなった。両株とも、pH 2.0に調整したSCD-3培地では、少量のグルセロールを生産したが（1.9 g/l以下）、酢酸は生産しなかった。このように、LGS1遺伝子を発現するB42-LGS1株は、コントロール株のB42-Con株と比べて、pH 2.0および7.5%のNa2SO4の低pH・高塩濃度の発酵培地でもグルコースからのエタノール生産性が高かった。これらの結果から、LGS1遺伝子を発現する酵母株では低pH・高塩濃度の条件下でもエタノール発酵能が阻害を受けにくくなっていることが明らかになり、LGS1遺伝子が耐酸耐塩性の獲得において重要な働きをしていることが示唆された。【００５４】
これらの実施例から、耐酸耐塩性に関わるLGS1遺伝子を構成的に高発現することによって作製した本発明の遺伝子組換え酵母（B42-LGS1株）は、低pHや高塩環境下における増殖阻害・発酵阻害を回避し、グルコースなどの糖を炭素源として良好に増殖し、エタノールなどの有用物質を高効率に生産できることが明らかとなった。【００５５】
LGS1がGAS1を相補できたことから（実施例８、図４）、GH72ファミリーに属する他のLGS1の相同遺伝子についてもLGS1やGAS1と同様に酵母に耐酸耐塩性を付与すると考えられる。こうした耐酸耐塩性を付与した酵母も同様にエタノール生産に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明において、耐酸耐塩性付与方法およびこれにより作製される耐酸耐塩性酵母を用いて、従来公知である発酵生産の優れた酵母を用いた場合よりも、増殖阻害や発酵阻害を回避してエタノール等の有用物質を効率良く生産できる。これにより、強酸や高塩環境下などの環境ストレス条件下でも、バイオマス由来の糖を次世代の液体エネルギーとして期待されているエタノールや他の有用物質への高効率変換を実現可能にするので、バイオマス資源の実用化および発酵工程の経済性向上に大きく貢献することができる。【００５７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列の簡単な説明
配列番号１  LGS1遺伝子の塩基配列
配列番号２  LPR1遺伝子の塩基配列
配列番号３  Clone 1遺伝子の塩基配列
配列番号４−７  プライマー
配列番号８  LGS1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号９  GAS1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０  PHR1の推定アミノ酸配列
配列番号１１  PHR2の推定アミノ酸配列
配列番号１２  XR遺伝子
配列番号１３  XDH遺伝子
配列番号１４  XK遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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