(57)【要約】  多能性幹細胞の細胞培養性能、特に優れた細胞増殖能を誘導可能なポリペプチド組成物と、これを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供する。  ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン由来の所定の第１の領域のアミノ酸配列を含む所定のポリペプチドを含み、かつ、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物と；このポリペプチド組成物の存在下で、多能性幹細胞を培養することを含む多能性幹細胞の培養方法と；細胞培養表面を有する支持体と、支持体の細胞培養表面上に配置されたポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドと、を有する培養器。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および
（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列
で表される第１の領域を含むポリペプチドであり、かつ、
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
【請求項２】
４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（ｄ）を含み、ポリペプチド（ｄ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および
（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列
で表される第１の領域と、以下の（２−ｉ）〜（２−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、および
（２−iii）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、
で表される第２の領域と、を含むポリペプチドであり、かつ、
ポリペプチド（ｄ）であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
【請求項３】
ポリペプチドにおけるいずれかの位置のシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、請求項１又は請求項２記載のポリペプチド組成物。
【請求項４】
組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）が、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基との間で分子内架橋されている少なくとも１種のポリペプチドを含む請求項１〜請求項３のいずれか一項記載のポリペプチド組成物。
【請求項５】
組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）が、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、
５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；
１９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と２１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；
２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；並びに、
３２番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；
の間でそれぞれ分子内架橋されているポリペプチドを含む請求項１〜請求項３のいずれか一項記載のポリペプチド組成物。
【請求項６】
組成物に含まれるポリペプチドとプラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１（Plasminogen activator inhibitor-1）との結合定数が、０．０６よりも大きい請求項１〜請求項３のいずれか一項記載のポリペプチド組成物。
【請求項７】
組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）として、下記（３ａ−ｉ）〜（３ａ−iii）のうちいずれか１のアミノ酸配列からなる第３の領域をさらに含む少なくとも１種のポリペプチドを含む請求項１〜請求項６のうちいずれか一項記載のポリペプチド組成物：
（３ａ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（３ａ−ii）（３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（３ａ−iii）（３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項８】
組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）として、下記（４ａ−ｉ）〜（４ａ−iii）のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなる第４の領域をさらに含む少なくとも１種のポリペプチドを含む請求項１〜請求項７のうちいずれか一項記載のポリペプチド組成物：
（４ａ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（４ａ−ii）（４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（４ａ−iii）（４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項９】
以下のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド中に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか一項記載のポリペプチド組成物の存在下で、多能性幹細胞を培養することを含む多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
細胞培養表面を有する支持体と、支持体の細胞培養表面上に配置された請求項１〜請求項９のいずれか一項記載のポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドと、を有する培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド組成物およびこれを用いた多能性幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷した組織の機能回復等を目的として種々の再生医療が開発されている。なかでも組織そのものの再生などを最終的な目的とする霊長類、特にヒトの全能性または多能性幹細胞に関する技術が多く報告されている。特に、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚性幹細胞とは異なり体細胞から誘導されるため、倫理面の問題が少ないという利点を有する。
これらの霊長類の全能性または多能性幹細胞（これらの両者を総称して、本発明では単に「多能性幹細胞」と称する。）を培養する場合には、多能性幹細胞を未分化状態で長期間にわたって維持することが要求される。未分化状態の多能性幹細胞を長期間培養するためには、一般に、マウス繊維芽細胞等のフィーダー細胞が用いられる。【０００３】
しかしながら、マウス繊維芽細胞のような異種動物由来のフィーダー細胞を使用することで、異種動物由来の抗原性物質などの異物が培養液中に混入する可能性が指摘されている。全能性または多能性幹細胞を、医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用する場合には、これらの細胞をフィーダー細胞非存在下にて培養することが求められている。【０００４】
このような事情に鑑み、フィーダー細胞の機能を代替する細胞接着性素材の開発が行われている。例えばNature Biotechnology, 2001, Vol19, pp.971-974では、フィーダー細胞の代替物としてマウス肉腫抽出成分であるマトリゲルを使用し、未分化状態を維持したヒト胚性幹細胞を首尾よく培養したことが開示されている。【０００５】
特開２００１−１７１８３号公報には、フィーダー細胞を含まず、かつ増殖する霊長類始原細胞を含む細胞性組成物が開示されており、好ましい態様として、細胞外マトリクスをさらに含む細胞性組成物が開示されている。また特開２０１０−２９１８６号公報には、所定濃度の細胞外マトリックスタンパク質と水性溶媒とを含むコーティング溶液で、プラズマ重合された細胞培養表面をコーティングした細胞培養基質が開示されており、この細胞培養基質が、胚性幹細胞の分化を回避するのに役立つ良好な接着性を有すると記載されている。【０００６】
Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288およびNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、胚性幹細胞の長期培養に寄与しうるビトロネクチン部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチド、具体的には、天然ビトロネクチンのアミノ酸配列における１番目から５２番目までのアミノ酸配列であるポリペプチド（Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288参照）、およびＲＧＤ配列を含む４１番目から５２番目までのアミノ酸配列（Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610参照）であるポリペプチドがそれぞれ開示されている。これらのポリペプチドは非生体試料であるが故に抗原性物質等の混入可能性を回避でき、かつ工業的に生産できる点で優れている、と知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多能性幹細胞を再生医療等の医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用することを考慮すると、マウス等に由来する繊維芽細胞等の異種のフィーダー細胞またはマウス由来のマトリゲルをはじめとする異種動物由来成分の使用をできる限り排除すべきである。また、同種動物由来の細胞または成分であっても、抗原性物質の混入などの可能性を完全に排除できるものではない。さらに、同種および異種のいずれであっても生体に由来する材料は、抽出量がごく微量であったり、ドナーによって性能がばらつくなど、工業的観点からも好ましくない。近年、医療用途への応用を目指して、異種動物由来成分または抗原性物質が混入しない化学的に同定された条件下での幹細胞の培養の検討が盛んに行われている。しかしながら、実用に足る細胞培養性能を示しフィーダー細胞を代替できる材料は見出されていない。【０００８】
例えば、生体に由来する材料そのものの使用を回避する手段として、Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288およびNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610にはヒトビトロネクチンの部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチドを使用して胚性幹細胞の長期培養を実施した例が開示されている。
しかしながら、これらの組換えペプチドでも、多能性幹細胞の細胞培養性能としては充分とはいえない。【０００９】
本発明は、多能性幹細胞の細胞培養性能、特に優れた細胞増殖能を誘導可能なポリペプチド組成物と、これを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］  以下のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）：（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列で表される第１の領域を含むポリペプチドであり、かつ、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
［２］  ４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（ｄ）を含み、ポリペプチド（ｄ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列で表される第１の領域と、以下の（２−ｉ）〜（２−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、および（２−iii）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、で表される第２の領域と、を含むポリペプチドであり、かつ、ポリペプチド（ｄ）であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
［３］  ポリペプチドにおけるいずれかの位置のシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である［１］または［２］に記載のポリペプチド組成物。
［４］  組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）が、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基との間で分子内架橋されている少なくとも１種のポリペプチドを含む［１］〜［３］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物。
［５］  組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）が、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；１９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と２１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；並びに、３２番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；の間でそれぞれ分子内架橋されているポリペプチドを含む［１］〜［３］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物。
［６］  組成物に含まれるポリペプチドとプラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１（Plasminogen activator inhibitor-1）との結合定数が、０．０６よりも大きい［１］〜［３］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物。
［７］  組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）として、下記（３ａ−ｉ）〜（３ａ−iii）のうちいずれか１のアミノ酸配列からなる第３の領域をさらに含む少なくとも１種のポリペプチドを含む［１］〜［６］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物：（３ａ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、（３ａ−ii）（３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、（３ａ−iii）（３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
［８］  組成物中のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）として、下記（４ａ−ｉ）〜（４ａ−iii）のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなる第４の領域をさらに含む少なくとも１種のポリペプチドを含む［１］〜［７］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物：（４ａ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、（４ａ−ii）（４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、（４ａ−iii）（４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
［９］  以下のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）：（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド中に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物。
［１０］  ［１］〜［９］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物の存在下で、多能性幹細胞を培養することを含む多能性幹細胞の培養方法。
［１１］  細胞培養表面を有する支持体と、支持体の細胞培養表面上に配置された［１］〜［９］のいずれか１に記載のポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドと、を有する培養器。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多能性幹細胞の細胞培養性能、特に優れた細胞増殖能を誘導可能なポリペプチド組成物と、これを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の参考例における各ポリペプチドの培養プレート表面の吸着試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の参考例における各ポリペプチドを用いたｉＰＳ細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図３】本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）および拡大像（右欄）である。
【図４】本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）およびＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図５】本発明の実施例にかかるポリペプチド組成物Ｉ−１（レーン（Ｂ））とＩ−２（レーン（Ａ））のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル画像である。
【図６】本発明の実施例にかかるポリペプチド組成物中のポリペプチドとＰＡＩ−１との結合の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のポリペプチド組成物は、以下のポリペプチド（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および
（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列
で表される第１の領域を含むポリペプチドであり、かつ、
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。
【００１４】
また、本発明の他のポリペプチド組成物は、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（ｄ）を含み、ポリペプチド（ｄ）が、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および
（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列
で表される第１の領域と、以下の（２−ｉ）〜（２−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列：
（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、および
（２−iii）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、
で表される第２の領域と、を含むポリペプチドであり、かつ、
ポリペプチド（ｄ）であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。
【００１５】
本発明者らは、多能性幹細胞を増殖可能にする組換えタンパク質を開発するべく鋭意研究を重ね、所定のヒトビトロネクチンＮ末端側の部分配列を含み、多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを、ヒトビトロネクチンＮ末端側のシステイン残基を介して分子間架橋した二量体以上の多量体の形態でなく、分子間架橋されていない単量体の形態で多く含むポリペプチド組成物の存在下で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の増殖能が高まることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１６】
本発明のポリペプチド組成物は、上述したポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下の組成物である。本ポリペプチド組成物は、多能性幹細胞の増殖能を高めることができる。
また、本発明の他のポリペプチド組成物は、上述したポリペプチド（ｄ）を含み、かつ、ポリペプチド（ｄ）であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下の組成物である。本ポリペプチド組成物は、多能性幹細胞の増殖能を、未分化状態を維持しつつ高めることができる。
【００１７】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１８】
本明細書において、「同種」とは、ヒトを意味し、「異種」とは、ヒト以外の動物を意味する。
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）または三文字表記（例えば、グリシン残基を「Gly」）で表記する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（またはイミノ酸）残基の個数を基準とする。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知のやり方で、挿入、欠失、および置換を考慮に入れたうえで、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させたときに、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、4ｔｈＥｄ  −  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号１に対して同一性８０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が８０以上であることを示す。
本明細書において、アミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」との表現は、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸の欠失、置換および付加の２つ以上の組み合わせを排除するものではない。
【００２０】
＜ポリペプチド＞
本発明に係るポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は以下のとおりである：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド。
配列番号１：
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
【００２１】
ここで、ポリペプチドにおいて「多能性幹細胞の培養性能を有する」とは、多能性幹細胞の増殖活性を有することを意味する。増殖活性を有するか否かについては、例えばポリペプチドを吸着させた細胞培養表面上に多能性幹細胞を２５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種し、８日間培養した後に非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除いた時に、接着細胞が２５００ｃｅｌｌｓ／ウェル（播種細胞数の１０倍）以上存在するか否かにより評価することができる。
ここで接着細胞数は、多能性幹細胞が発現するアルカリフォスファターゼの活性を定量する方法、またはＭＴＴ試験などによって定量することができる。
【００２２】
配列番号１で示される全長４５９アミノ酸残基で構成されたポリペプチドは、ビトロネクチンである。本発明において、ビトロネクチンとは、ヒトビトロネクチンを意味する。なお、天然のビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることも確認されている。
【００２３】
ポリペプチド（ｂ）は、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するものであり、より好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するものである。
ポリペプチド（ｃ）は、好ましくは、配列番号１において１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチドである。
【００２４】
本発明にかかるポリペプチドは、好ましくは、（ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、または、（ｃ１）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチドである。
ここで、（ｂ１）のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するものであり、より好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するものである。
また、（ｃ１）のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１において１若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するものである。
【００２５】
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、以下の（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列で示される第１の領域を含む。
（１−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（１−ii）アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列、および
（１−iii）アミノ酸配列（１−ｉ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列。
【００２６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド部位は、ヒトビトロネクチンのソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメインとして既知のドメインである。ＳＭＢドメインは、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）と相互作用することが知られている。また、ＳＭＢドメインには、ビトロネクチンのアミノ酸配列における２５番目〜３１番目の７アミノ酸残基に相当するＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列と、ビトロネクチンのアミノ酸配列における４５番目〜４７番目の３アミノ酸残基に相当する細胞接着性モチーフであるＲＧＤ配列との双方が含まれている。ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）における第１の領域は、配列番号２で示されるアミノ酸配列およびＲＧＤ配列からなる群より選択されるいずれか一方を有していればよく、細胞接着性および細胞増殖性の観点から、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）における第１の領域は、これらの配列の双方を含むことが好ましい。
【００２７】
即ち、（１−ｉ）〜（１−iii）の第１の領域は、天然ビトロネクチンの比較的Ｎ末端側に位置する配列であり、未分化多能性幹細胞との接着性を発揮し、その結果、多能性幹細胞を増殖可能にしていると推測される。このため、第１の領域を含むポリペプチドは、第１の領域を含まないポリペプチドと比較し、細胞接着性に優れ、より細胞増殖能に優れる。
【００２８】
本発明におけるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）において所定のアミノ酸配列を含む第１の領域は、優れた細胞接着性を有する。このため本発明におけるポリペプチドは、細胞、特に多能性幹細胞を良好に増殖させることができる。このようなアミノ酸配列を有する本発明にかかる（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドは、多能性幹細胞を、長期にわたって増殖させることができる。
【００２９】
ポリペプチドが「多能性幹細胞への細胞接着能」を有するとは、多能性幹細胞がポリペプチドに対して付着性を示すことを意味する。多能性幹細胞がポリペプチドに対して付着性を示すか否かは、既知の評価方法で評価することができる。例えば、ポリペプチドで被覆した培養表面に多能性幹細胞を播種して２４時間後に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等で軽くすすぎ、すすいだ後の培養表面上に残っている多能性幹細胞の量に基づいて評価することができる。
【００３０】
（１−ii）で示されるアミノ酸配列は、好ましくは、アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは、アミノ酸配列（１−ｉ）からなるアミノ酸配列との同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列である。
【００３１】
（１−iii）で示されるアミノ酸配列は、好ましくは、アミノ酸配列（１−ｉ）において、１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目〜４４番目のアミノ酸残基には、５番目のアミノ酸残基、９番目のアミノ酸残基、１９番目のアミノ酸残基、２１番目のアミノ酸残基、２５番目のアミノ酸残基、３１番目のアミノ酸残基、３２番目のアミノ酸残基および３９番目のアミノ酸残基としてシステイン残基が含まれる。ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、これらの８個のシステイン残基に相当するシステイン残基を含まなくてもよく、または、少なくとも１つ含み得る。システイン残基は、他のシステイン残基と生理条件下で架橋しやすい傾向があるため、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）がシステイン残基を含む場合、ポリペプチドにおける他の部位のシステイン残基同士では分子内架橋を生じてもよい。
【００３３】
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、多能性幹細胞の増殖促進向上の観点から、配列番号１に示されるアミノ酸配列における上述した８個のシステイン残基のうち、２つ以上を含むことがより好ましく、第１の領域に含まれる２つ以上のシステイン残基が、互いに分子内架橋していることが特に好ましい。
【００３４】
分子内架橋を形成可能なシステイン残基の組み合わせは、多能性幹細胞の増殖促進向上の観点から、５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；１９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と２１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；並びに、３２番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基の組み合わせであることが好ましい。ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、分子内架橋を形成可能なシステイン残基の４つの好ましい組み合わせのいずれか１つを含むことが好ましく、これら４つすべてを含むことがより好ましい。なお、本明細書では、特定のシステイン残基を、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置を示す数字との組み合わせで表示する場合があり、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基の場合には、「Ｃｙｓ２５」と表示することがある。
【００３５】
第１の領域のアミノ酸残基数は、多能性幹細胞の細胞接着性および増殖性の観点から、３〜６０アミノ酸残基数とすることができ、１０〜５５アミノ酸残基数であることが好ましい。
【００３６】
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）に含まれるアミノ酸残基数（アミノ酸長）は、４００〜５５０の範囲であれば特に制限はなく、ヒトビトロネクチンに対する高い相同性を有する点で、４５０〜５２０であることが好ましく、４５０〜４５９であることがより好ましい。
【００３７】
本発明に係るポリペプチド（ｄ）は、以下のとおりである。
上記（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列で表される第１の領域と、以下の（２−ｉ）〜（２−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列で表される第２の領域と、を含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド：
（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、および
（２−iii）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列。
【００３８】
ポリペプチド（ｄ）は、多能性幹細胞の培養性能を有するために、「多能性幹細胞への細胞接着性」および「支持体の細胞培養表面への吸着能」を備えており、好ましい。ここで、支持体とは、本発明の培養方法を用いて、細胞培養を行う際に、本発明にかかるポリペプチドを付与する面を有する、培養器の部位である。
即ち、上記（１−ｉ）〜（１−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列で表される第１の領域は、優れた細胞接着性を有することから、細胞、特に多能性幹細胞を良好に増殖させることができる。このようなアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｄ）は、多能性幹細胞を、未分化状態に維持しながら長期にわたって増殖させることができる。
また、上記（２−ｉ）〜（２−iii）のいずれか１つのアミノ酸配列で表される第２の領域は、支持体の細胞培養表面への吸着性に寄与する。このようなアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｄ）は、支持体の細胞培養表面への良好な接着性を示す。ポリペプチド（ｄ）は、第１の領域と第２の領域とを共に含むことによって、培養期間中に支持体の細胞培養表面から剥がれることなく、多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら長期にわたって増殖させることができる。また、ポリペプチド（ｄ）は、培養中の未分化状態の多能性幹細胞を、支持体の細胞培養表面からの剥がれを抑制しつつ増殖させることができ、培養操作における取扱い性を向上させることができる。
この結果、ポリペプチド（ｄ）は、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を促進すると共に、化学結合による支持体の細胞培養表面への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドとして得ることができる。
【００３９】
また、ポリペプチド（ｄ）は、天然ヒトビトロネクチンと比べて抗原性物質及び感染症源の混入リスクを排除すると同時に、天然ビトロネクチンと同等の性能、即ち多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖性、及び未分化維持性を保持することができる。
【００４０】
ここで、ポリペプチドについて「多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能である」とは、多能性幹細胞が培養期間において分化能を維持していることを意味する。多能性幹細胞が未分化状態であるか否かは、既知の評価方法で評価することができる。例えば、分子マーカーの発現（ＳＳＥＡ−４、および／またはＯｃｔ−４等のフローサイトメトリーによる発現測定、Ｏｃｔ−４および／またはＮＡＮＯＧ等の免疫染色など）、インビトロ実験における多能性分化の確認、および免疫不全マウス等への移植によるテラトーマ形成の確認などの当業者既知の方法によりなされる。増殖しているか否かは、常法により、各種顕微鏡を用いた目視による観察若しくは、ＡＬＰ活性等の反応試験、フローサイトメトリーなどを利用した方法、またはその他の方法により評価すればよい。また、本発明における多能性幹細胞が分化能を維持する培養期間としては、培養条件および多能性幹細胞の細胞状態によって異なるが、例えば、１ヶ月の培養期間とすることができる。
【００４１】
ポリペプチド（ｄ）における第１の領域は、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）における第１の領域と同様である。ポリペプチド（ｄ）における第１の領域に関する事項については、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）について記載した事項をそのまま適用する。
【００４２】
第２の領域は、配列番号３で示される３２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド（ｄ）の精製容易性の観点から好ましくは、ポリペプチド（ｄ）における第２の領域は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、天然ビトロネクチンのＣ末端側に位置するヘモペキシン様ドメインIIの一部に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基で構成されたヘパリン結合ドメインに相当する。以下、配列番号３で示されるアミノ酸配列をヘパリン結合ドメインと称する場合がある。
【００４３】
ポリペプチド（ｄ）は、ヘパリン結合ドメインを有することにより、支持体の細胞培養表面への吸着能を有すると推測される。この結果、ポリペプチド（ｄ）を用いることにより、未分化多能性幹細胞を、未分化状態を維持して長期にわたり培養することができる。
また、ポリペプチド（ｄ）は、ヘパリン結合ドメインを含むことにより、ポリペプチド（ｄ）の親水性を担保し、ポリペプチドの疎水凝集を抑制する傾向がある。この結果、ポリペプチド（ｄ）は精製しやすく、製造効率が高い。
【００４４】
ここで、「支持体の細胞培養表面への吸着能を有する」とは、アミノ酸配列が、対象となる培養器の細胞培養表面（以下、単に「培養表面」ということがある）に対して化学的な反応をすることなく物理的に吸着することを意味する。支持体の細胞培養表面への吸着能を有するか否かについては、例えば、プラズマ処理したポリスチレン製培養器に２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるように当該ポリペプチドを含有する溶液を添加して３７℃で２時間放置した後、リン酸緩衝液にて２回洗浄したときに、培養皿表面に残存する当該ポリペプチドが１０ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上存在するか否かにより評価することができる。
ここで培養皿表面に残存するポリペプチドの量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を定量するＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法または、吸着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸をＨＰＬＣなどによって定量することにより測定できる。
【００４５】
またヘパリン結合ドメインは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有すると共に、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００４６】
またさらにヘパリン結合ドメインは、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して、１個若しくは数個、好ましくは、１個〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００４７】
ポリペプチド（ｄ）は、第１の領域と、第２の領域とを有していればよく、その相対位置には特に制限はない。ポリペプチド（ｄ）では、第１の領域が、第２の領域のＮ末端側に位置していることが好ましい。
【００４８】
第１の領域および第２の領域を有する、ポリペプチド（ｄ）は、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなる。４０アミノ酸残基以上とすることにより、細胞接着性若しくは細胞増殖性または支持体の細胞培養表面への吸着能に優れ、一方、４５０アミノ酸残基以下とすることにより、細胞接着性または細胞増殖性および支持体の細胞培養表面への吸着能がより発揮され、さらに、タンパク質同士の会合、架橋または凝集の形成を抑制できる。ポリペプチド（ｄ）は、凝集の形成等を起こりにくくするという観点から、８０個以上であることが好ましく、９０個以上であることがより好ましく、１００個以上であることがさらに好ましく、一方、４００個以下であることが好ましく、２５０個以下であることがより好ましく、１７０個以下であることがさらに好ましく、１５０以下であることがさらにより好ましい。これらの上限値または下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、４０個〜４００個のアミノ酸残基からなることが好ましく、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなることがより好ましく、８０個〜１５０個のアミノ酸残基からなることがさらに好ましく、１００個〜１５０個のアミノ酸残基からなることがさらにより好ましい。
【００４９】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、−２．０〜−０．９５のＧＲＡＶＹ値を有することが、疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132） は、ポリペプチドの疎水度の総平均を表す。ＧＲＡＶＹの値が大きいほど、疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が−０．９５以下であれば、疎水凝集の発生を容易に抑制できる傾向がある。一方、−２．０以上であれば、支持体の細胞培養表面への吸着および未分化細胞の増殖をしやすくなり、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて吸着性および細胞増殖性が向上する傾向がある。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値としては、凝集形成の抑制と吸着性または細胞増殖性を両立する点で、−１．７０〜−０．９７５がより好ましく、−１．６０〜−１．１０がさらに好ましい。アミノ酸残基数が少ないほど凝集する傾向があるため、アミノ酸残基数が８０〜１７０個のポリペプチドである場合に、凝集形成の抑制と吸着性または細胞増殖性を両立する点で、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であることが好ましく、−１．６０〜−１．１０であることがさらに好ましい。
【００５０】
ＧＲＡＶＹ値は、配列中の、例えば疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔ）の割合の増減、またはアミノ酸残基数の増減等により調整することができる。
【００５１】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、上述したアミノ酸配列以外の他のアミノ酸配列をさらに有することが好ましい。細胞接着性および支持体の細胞培養表面への吸着能を適切に発揮する観点から、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、即ち、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の部分配列を含むことが好ましい。これにより、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、ヒトビトロネクチンに近い性質、例えば、多能性幹細胞に対する優れた接着性および増殖性を獲得することができる。
【００５２】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）に含まれ得るヒトビトロネクチンの部分アミノ酸配列としては、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の細胞接着性および細胞増殖性、または支持体の細胞培養表面への吸着能、または凝集形成抑制の観点から、以下の第３の領域および第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが好ましい：
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列およびその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第３の領域、および、
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列およびその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第４の領域。
【００５３】
第３の領域としては、ポリペプチドの作製時、疎水凝集を抑制する傾向があるという観点から、（３ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を選択することができ、（３ｂ）２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を選択することができ、（３ｃ）２７４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を選択することができ、または（３ｄ）２９４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列とすることができる。（３ａ）〜（３ｄ）のアミノ酸配列では、アミノ酸残基数を減らすことによって疎水凝集を軽減できる傾向がある。中でも、（３ｄ）のアミノ酸配列を選択することが、疎水凝集をより確実に抑制できる傾向があるため好ましい。
【００５４】
ここでポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、下記（３ａ−ｉ）〜（３ａ−iii）のうちいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域をさらに含むものが好ましい。
（３ａ−ｉ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（３ａ−ii）  （３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（３ａ−iii）  （３ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００５５】
また、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、下記（３ｂ−ｉ）〜（３ｂ−iii）のうちいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域をさらに含むものも好ましい。
（３ｂ−ｉ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（３ｂ−ii）  （３ｂ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（３ｂ−iii）  （３ｂ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、１若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００５６】
第４の領域は、培養皿への吸着性の観点から、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目〜４０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列とすることができ、または３７４番目〜３７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列とすることができる。
中でも、培養皿への吸着性に加えて、ポリペプチド作製時に疎水凝集を抑制しやすいという点で、３７４番目〜３７９番目が好ましく、選択するアミノ酸数を減らすことによって疎水凝集が軽減される傾向がある。
【００５７】
ここで、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）が、下記（４ａ−ｉ）〜（４ａ−iii）のうちいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域をさらに含むものが好ましい。
（４ａ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（４ａ−ii）  （４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（４ａ−iii）  （４ａ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、1若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
また、下記（４ｂ−ｉ）〜（４ｂ−iii）のうちいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域をさらに含むものも好ましい。
（４ｂ−ｉ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（４ｂ−ii）  （４ｂ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（４ｂ−iii）  （４ｂ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、1若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００５８】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、さらに、下記（４ｃ−ｉ）〜（４ｃ−iii）のうちいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域をさらに含むものも好ましい。
（４ｃ−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜３７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列、
（４ｃ−ii）前記（４ｃ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、
（４ｃ−iii）（４ｃ−ｉ）のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列に対して、1若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００５９】
第３の領域および第４の領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、所定範囲のアミノ酸残基のうち、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。これらの部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数は、上述したポリペプチド（ｄ）の総アミノ酸残基数を超えない範囲で選択すればよい。
【００６０】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、第３の領域を含むことにより、培養皿との吸着性を高める利点を有する傾向がある。第４の領域を含むことにより、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、培養皿との吸着性をさらに高める利点を有する傾向がある。ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、第３および第４の領域のいずれか一方のみを有してもよく、両方を有してもよい。
また、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のＧＲＡＶＹ値は、調整容易性の観点から、第３および第４の領域を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数の増減、アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加等により調整されることが好ましく、特に、第３の領域を構成するアミノ酸配列の長さを調整することがより好ましい。
【００６１】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜１３１番目に含まれるアミノ酸残基を含まなくてもよく、５６番目〜２６８番目に含まれるアミノ酸残基を含まなくてもよく、２６９番目〜２７３番目に含まれるアミノ酸残基を含まなくてもよく、あるいは、５０番目〜２９３番目に含まれるアミノ酸残基を含まなくてもよい。これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の多能性細胞培養への性能に寄与しないものであると推測され、培養皿との吸着の観点で適した配列が選択される。
【００６２】
第３の領域が、配列番号１で示される配列のシステイン残基に対応するアミノ酸残基を含む場合、当該システイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内または分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、特に制限はなく、セリン残基、アラニン残基またはグリシン残基を好適に挙げることができる。なかでも、システインと類似の構造を有する点で、セリン残基またはアラニン残基が好ましい。
【００６３】
またポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、細胞接着性および支持体の細胞培養表面への吸着性が損なわれない範囲で、上記以外の他の付加的な任意のアミノ酸残基を有していてもよい。このような他の任意のアミノ酸残基からなる配列としては、例えば、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を組換え技術によって容易に作製するために付加される付加配列を挙げることができる。このような付加配列としては、Ｎ末端側のメチオニン残基、Ｎ末端側のＧＰＬＧ配列、タグ配列（例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間に付加可能なリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＧＳ等）などを挙げることができる。
【００６４】
ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、当業者に既知のアミノ酸合成技術または遺伝子組み換え技術によって製造することができる。
遺伝子組み換え技術によりポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を得る場合、具体的にはまず、対象となるアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から目的とするポリペプチドを常法により回収することにより、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を得ることができる。
【００６５】
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）は、細胞増殖性および未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号３、ヘパリン結合ドメイン）からなる第２の領域と、以下の第３の領域および第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域；および
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、
を含む８０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ａ）であることが好ましい。
【００６６】
また、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）は、細胞増殖性および未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列とＲＧＤ配列を含む）からなる第１の領域と、
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域および第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つ：
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域；および
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域と、
を含む１００個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ｂ）であることが好ましい。
【００６７】
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、細胞増殖性および未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（配列番号３、ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域および第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域；および
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む４００個〜５５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ａ）であることが好ましい。
【００６８】
また、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、細胞増殖性および未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（配列番号３、ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域および第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つ：
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域；および
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域と、
を含む４００個〜５５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ｂ）であることが好ましい。
【００６９】
また、上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であるポリペプチドであることが好ましい。
また、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）は、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個であることが好ましい。
さらに、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
またさらに、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個であることが好ましい。
さらに、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
またさらに、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
またさらに、ポリペプチド（ｄ）としての上記ポリペプチド（Ａ）または（Ｂ）は、さらにＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜１７０個のポリペプチドであることが好ましい。
ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）の一例を以下に挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
本発明にかかるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）の好適例として、
（ｄ１）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ２）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、または、
（ｄ３）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、
を挙げることができ、より好ましい例として、
（ｄ４）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ５）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチド、または、
（ｄ６）配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８および配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチドを挙げることができる。
なお、本明細書においては、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、ポリペプチド（ｃ）、及びポリペプチド（ｄ）を総称して「特定ポリペプチド」ということがある。つまり、「特定ポリペプチド」とはポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のうちの任意の一つ又は二つ以上を指す。
【００７２】
＜ポリペプチド組成物＞
ポリペプチド組成物は、上述したポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、ポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。また、ポリペプチド組成物が、上述したポリペプチド（ｄ）を含む組成物である場合には、ポリペプチド（ｄ）であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、ポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。ポリペプチド組成物は、それぞれのポリペプチド組成物において、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種と、ポリペプチド（ｄ）との双方を含んでもよく、この場合には、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種であって、第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、ポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。
【００７３】
即ち、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）に含まれる第１の領域にシステイン残基が１つ以上存在する場合、第１の領域のシステイン残基が、他のポリペプチドに存在する第１の領域のシステイン残基との間で分子間架橋を形成することにより、ポリペプチドの二量体以上の多量体が形成され得る。第１の領域に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されているポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の多量体が、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０％を超える含有率でポリペプチド組成物中に存在すると、多能性幹細胞の増殖能が損なわれる。なお、本明細書におけるポリペプチドの全質量に対する多量体の含有率とは、組成物中に複数種類のポリペプチドが存在する場合には、これらのポリペプチドを組み合わせた全体の総質量に対する多量体の含有量（率）とする。
【００７４】
ポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の多量体の含有率は、多能性幹細胞の増殖能促進の観点から、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の１５質量％以下であることが好ましく、１０質量％以下であることがより好ましく、５質量％以下であることが特に好ましい。
【００７５】
ポリペプチド組成物は、さらに、多能性幹細胞の培養性能の観点から、第１領域のシステイン残基を介した分子間架橋による多量体以外の、ポリペプチドにおけるいずれかの位置のシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下であることが好ましく、１５質量％以下であることがより好ましく、１０質量％以下であることがより好ましく、５質量％以下であることがさらに好ましい。
【００７６】
ポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の多量体の含有率は、例えば、常法により実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）の結果を、「ＩｍａｇｅＪ」（アメリカ国立衛生研究所（NIH：National Institutes of Health)提供）等の画像解析ソフトを用いて解析することにより算出することができる。
【００７７】
ポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、多能性幹細胞の増殖促進向上の観点から、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基との間で分子内架橋されているポリペプチドを含むことがより好ましく、第１の領域に含まれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；１９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と２１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；２５番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３１番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基；並びに、３２番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基と３９番目のアミノ酸残基に相当するシステイン残基、の間でそれぞれ分子内架橋されている少なくとも１種のポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を含むことがさらに好ましい。
【００７８】
本発明のポリペプチド組成物は、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）以外のポリペプチドを含んでもよい。ポリペプチド組成物が、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含むポリペプチド組成物の場合、本発明の効果をより効率よく得る観点から、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の総含有率が、組成物の８５質量％以上であることが好ましく、９０質量％以上であることがより好ましく、９５質量％以上であることがさらに好ましく、９９質量％以上であることが特に好ましい。また、ポリペプチド組成物がポリペプチド（ｄ）を含むポリペプチド組成物の場合、本発明の効果をより効率よく得る観点から、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）の総含有率が、組成物の８５質量％以上であることが好ましく、９０質量％以上であることがより好ましく、９５質量％以上であることがさらに好ましく、９９質量％以上であることが特に好ましい。
【００７９】
ポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドと、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１（Plasminogen activator inhibitor-1：ＰＡＩ−１）との結合定数は、多能性幹細胞の培養性能の観点から、０．０６よりも大きいことが好ましい。２５番目のシステイン残基と３１番目のシステイン残基によって形成される分子内架橋を有するポリペプチドは、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１（Plasminogen activator inhibitor-1：ＰＡＩ−１）に対する結合性を示すことが知られている。このため、ＰＡＩ−１に対する結合定数が低いほど、２５番目のシステイン残基と３１番目のシステイン残基によって形成される分子内架橋を有するポリペプチドが少ないことを意味する。多能性幹細胞の増殖促進の観点から、組成物中のポリペプチドとＰＡＩ−１との結合定数は、０．１以上であることがより好ましく、０．２２以上であることがさらに好ましい。なお、組成物中のポリペプチドとＰＡＩ−１との結合定数の上限値は特に制限はないが、すべてのポリペプチドにＰＡＩ−１が１分子ずつ結合したことに相当する点で１．０以下が好ましい。
【００８０】
ポリペプチドにおけるシステイン残基は、同一ポリペプチドにおける他のシステイン残基との間で、または、他のポリペプチドにおけるシステイン残基との間で架橋する傾向がある。他のポリペプチドにおけるシステイン残基との間で形成される分子間架橋の形成は、酸化還元条件を調整することにより制御可能であることは公知であり、例えば、Sinha N. K. et al., J Biol Chem. 250 pp.8624-8629, 1975に開示された方法が挙げられる。
【００８１】
具体的には、目的とするポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を、尿素、グアニジン塩酸塩などの変性剤と組み合わせて変性剤濃度が４Ｍ〜８Ｍとなる反応溶液を調製する工程と、得られた反応溶液中に、還元型グルタチオン、システインなどの還元剤と、酸化型グルタチオン、シスチンなどの酸化剤とを所定の割合、例えば、還元剤と酸化剤の割合（還元剤：酸化剤（モル比））を１０：１〜２：１で共存させる工程と、還元剤及び酸化剤を含む反応溶液中の変性剤の濃度を０Ｍ〜０．５Ｍまで下げていく工程とを含む製造方法により得ることができる。
【００８２】
本発明のポリペプチド組成物は、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種を含み、ポリペプチド中に含まれるシステイン残基を介して分子間架橋されている二量体以上の多量体ポリペプチドが、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である、ポリペプチド組成物であってもよい。本形態のポリペプチド組成物では、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）中のいずれかの位置のシステイン残基を介して分子間架橋されている多量体の含有率が、組成物に含まれるポリペプチドの全質量の２０質量％以下である。このため、本形態のポリペプチド組成物もまた、前述したポリペプチド組成物と同様に、多能性幹細胞の増殖性能を高め得る。
【００８３】
本形態のポリペプチド組成物中に含まれ得るポリペプチド（ａ）に関し、他の形態のポリペプチド組成物に関して前述した事項のすべてについては、本形態のポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ａ）に適用可能である限り、前述した事項がそのまま流用され、好ましい範囲もそのまま流用される。
【００８４】
本形態のポリペプチド組成物中に含まれ得るポリペプチド（ｂ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチドであれば、如何なる配列を有するものであってもよく、上述した（１−ｉ）〜（１−iii）のアミノ酸配列を有しなくてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性に関する事項、ポリペプチド（ｂ）が含んでもよいアミノ酸配列、ＧＲＡＶＹ値等の他の形態のポリペプチド組成物に関して前述した事項のすべてについては、本形態のポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ｂ）に適用可能である限り、前述した事項がそのまま流用され、好ましい範囲もそのまま流用される。
【００８５】
本形態のポリペプチド中に含まれ得るポリペプチド（ｃ）は、配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多能性幹細胞の培養性能を有するポリペプチドであれば如何なる配列を有するものであってもよく、上述した（１−ｉ）〜（１−iii）のアミノ酸配列を有しなくてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列における欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数及び種類、ポリペプチド（ｂ）が含んでもよいアミノ酸配列、ＧＲＡＶＹ値等の他の形態のポリペプチド組成物に関して前述した事項のすべてについては、本形態のポリペプチド組成物におけるポリペプチド（ｃ）に適用可能である限り、前述した事項がそのまま流用され、好ましい範囲もそのまま流用される。
【００８６】
＜多能性幹細胞の培養方法＞
本発明の多能性幹細胞の培養方法は、上述したポリペプチド組成物の存在下で、多能性幹細胞を培養することを含む。本培養方法によれば、多能性幹細胞をより効率よく増殖させることができる。
【００８７】
多能性幹細胞の培養方法は、多能性幹細胞の増殖促進向上の観点および取り扱い性の観点から、支持体の細胞培養表面に本発明にかかるポリペプチド組成物を付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること（以下、培養表面調製工程という）、および、ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して、培養すること（以下、培養工程という）、を含むものである。
【００８８】
本発明にかかる多能性幹細胞として、好ましくは、霊長類動物の多能性幹細胞であり、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞および初期胚細胞等が包含され、これらの細胞を１種、または必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。ｉＰＳ細胞には、Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317；Cell, 2006, August 25; Vol.126(4), pp.663-676に記載されている細胞、またはこれに類する細胞が包含される。
なかでも、本発明において好ましく適用される多能性幹細胞の例には、ｉＰＳ細胞を挙げることができる。
なお、霊長類動物としては、ヒト、サル、ゴリラなどが挙げられ、使用されるポリペプチド（ａ）〜（ｄ）と同属となるヒトであることが特に好ましい。本発明に適用される成分または物質が、霊長類動物に由来する成分または物質であれば、同種動物由来の成分または物質として本発明に好ましく適用可能である。
【００８９】
培養に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを挙げることができ、好ましくは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８である。
【００９０】
また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％（v/v）とすることができる。
【００９１】
なかでも、その他の成分として、水、塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の塩化物、水酸化物、炭酸化物などの無機塩、およびピルビン酸ナトリウム等の有機塩）、アミノ酸（必須アミノ酸および非必須アミノ酸）、ビタミン（リボフラビン、ビオチン、シアノコバラミン、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体等）、微量元素（セレン、鉄、亜鉛、銅等）、炭素源（Ｄ−グルコース等）、ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子 ＦＧＦ−２等）、ＴＧＦ−β、インスリンならびにトレンスフェリンを含む培地であることが好ましい。
【００９２】
本発明の培養方法では、多能性幹細胞を、異種動物由来成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、異種動物由来の異物混入の可能性を高い精度で排除することができる。異種細胞由来成分の非存在下での培養としては、異種動物由来成分を含有しない培養液を使用する培養、異種動物由来のフィーダー細胞等を使用しない培養などが挙げられる。
さらに、本発明の培養方法では、多能性幹細胞を異種動物由来成分および血清成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、よりいっそう、異種動物由来成分の混入を排除することができる。
【００９３】
異種動物由来成分を含有しない培地としては、非必須アミノ酸、グルタミン酸、β―メルカプトエタノール、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、インスリン、トランスフェリンなどの培地成分の少なくとも１種を含有する低浸透圧培地からなる混合培地を使用することができる。具体的にはＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）などの培地を使用することができるが、これに限定されない。
【００９４】
なお、細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％（v/v）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【００９５】
多能性幹細胞の培養および継代方法には、多能性幹細胞を維持するために用いられている通常の培地を使用することができる。具体的には、例えば、ｍＴｅＳＲ、ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。培地への多能性幹細胞の播種は常法により行う。なお、一連の継代において用いる培地は必ずしも同一でなくてもよく、多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる培地であってもよい。
【００９６】
培養表面調製工程では、ポリペプチド被覆培養表面は、支持体の培養表面に対して特定ポリペプチドを所定量含有するコーティング溶液を付与することを含む。これにより、特定ポリペプチドにより培養表面を被覆することができる。
コーティング溶液における特定ポリペプチドの総含有量は、コーティング対象となる培養表面の種類または大きさによって異なるが、培養表面に対する吸着能の観点から、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることがより好ましい。コーティング溶液を調製するために用いられる水性媒体としては特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、超純水等を挙げることができる。
コーティングは、コーティング溶液を付与した後、所定時間、例えば３０分〜２４時間程度保持すればよく、これにより特別な処理を要せずに、培養表面に特定ポリペプチドを被覆することができる。
【００９７】
培養工程は、ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養することを含む。
多能性幹細胞の播種密度および培養については、特に制限はなく、一般に行われる条件をそのまま適用すればよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度として、上述した培養および継代条件にて培養すればよい。また１０μｍ〜１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２〜５個／ｃｍ２程度の播種密度として上述した培養および継代条件にて培養してもよい。
【００９８】
これにより、特定ポリペプチドで被覆した培養表面上で、多能性幹細胞を取り扱いよく、また、ポリペプチド（ｄ）を用いた場合には未分化状態を維持して良好に、増殖させることができる。
さらに、特定ポリペプチドの存在下（好ましくは、さらに異種動物由来成分等の非存在下）で培養した多能性幹細胞は、試料等に由来する抗原性物質等の異物の混入可能性を、ほとんど完全に、または大幅に排除することが可能であり、当該培養方法にて培養した多能性幹細胞は医療用途、もしくはそれに準じた用途への使用に対し、充分に安全性を担保することができる。
さらにまた、特定ポリペプチドを用いた培養方法によれば、多能性幹細胞をより低コスト、かつ簡便な操作にて培養することができ、医療用途のみならず研究分野での需要に対しても広く貢献することができる。
【００９９】
＜培養器＞
本発明において培養器とは、細胞培養に用いられる表面を有する支持体を有するものである。このような支持体としては、当業界で細胞培養用支持体として周知のものをそのまま用いることができる。支持体の素材の例には、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂）、ガラス、微孔質のフィルター材料（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルそしてポリカーボネート）、バッチ式または連続式で細胞培養において、あるいは遺伝子工学（例えばバイオリアクター等）において用いられるバイオリアクター用材料（中空繊維チューブまたはマイクロキャリアビーズを含めてもよい。）、および、ポリエチレンテレフタレート、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、セラミックおよびその関連ポリマー材料等を含めてもよい。
また、支持体は、プラズマ重合薄膜により培養表面が被覆された支持体であってもよい。
【０１００】
培養器の形態としては特に制限はなく、多能性幹細胞の培養に適用可能な如何なる形態であってもよい。このような形態の容器の例としては、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル）、培養皿（例えば、ペトリディッシュ等）、チューブ、培養フラスコ、ローラーボトル、振盪培養フラスコ等を挙げることができる。
【０１０１】
本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持体と、支持体の細胞培養表面上に配置されたポリペプチド組成物に含まれるポリペプチドと、を有するものである。
本培養器は、前述した本発明にかかるポリペプチド組成物中のポリペプチド、即ち、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種を備えた培養表面を有している。そのため、培養表面に対して特定ポリペプチドが良好に吸着しており、特定ポリペプチド上に多能性幹細胞を播種した場合には、取扱い性よく、また、ポリペプチド（ｄ）を用いた場合には未分化状態を維持させた状態で、多能性幹細胞を増殖させることができる。
ここで、培養器における培養表面とは、細胞を播種し成育する際に、細胞が付着し得る表面を意味する。
【０１０２】
本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持体を備えたものを準備すること（以下、「準備工程」）、細胞培養表面に、ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも一種を付与して、吸着処理を行うこと（以下、「吸着処理工程」）を含む製造方法により製造することができる。これにより、簡便に本発明にかかる培養器を得ることができる。
【０１０３】
準備工程では、培養表面を有する支持体を備えた培養器が準備される。支持体が、プラズマ重合薄膜を培養表面に有する場合には、プラズマ重合薄膜を支持体上に形成する工程を含めてもよい。プラズマ重合薄膜を形成する方法については、常法をそのまま適用すればよい。
【０１０４】
吸着処理工程では、特定ポリペプチドを培養表面に付与して保持することを含む。吸着処理工程では、特定ポリペプチドを所定量で含有する吸着液を調製し、培養表面に付与し、所定時間保持することにより、特定ポリペプチドを培養表面に吸着させればよい。
吸着処理工程については、培養方法においてポリペプチド被覆培養表面調製工程で説明した事項をそのまま適用することができる。
【実施例】
【０１０５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【０１０６】
［参考例１］
＜ポリペプチドの調製＞
ＰＣＲを利用した常法にて、表２および表３に示すアミノ酸配列を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１７の各ポリペプチドをコードする遺伝子配列を増幅した。なお、ＲＣＰ−１１は天然ヒトビトロネクチンの配列に相当する。なお、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における位置を、表２および表３中、「ＮＯＴＥ」欄に示す。ただし、各ポリペプチドのアミノ酸配列には、表中に記載された対応する範囲の天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に対して付加、削除、または置換されたアミノ酸配列が含まれる場合がある。なお、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７は、上述した配列番号４〜１３および配列番号３８で示されるアミノ酸配列のそれぞれに対して、Ｎ末端にメチオニンを有する以外は、同一のアミノ酸配列からなる。【０１０７】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７については、あらかじめＮｃｏＩ（タカラバイオ株式会社）にて切断処理したｐＥＴ−２８ｂ（＋）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、Clontech Laboratories, Inc）を用いて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。ＲＣＰ−１１〜ＲＣＰ−１６については、あらかじめＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社）にて切断処理したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）に、上記と同様の手法にて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。発現用ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。【０１０８】
【表２】
2015064661.tif 000003
【０１０９】
【表３】
2015064661.tif 000004
【０１１０】
作製したＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７の発現ベクターを用い、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を常法によりトランスフォームし、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業株式会社）を添加したカナマイシン含有ＬＢ中で、３７℃、５時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【０１１１】
菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）にて再懸濁した。ソニケーションにて菌体を破砕した後、１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、不溶性画分を回収した。０．５質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）に再懸濁し、ソニケーション処理を行った。遠心処理にて不溶性画分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、ソニケーション処理にて不溶性画分を可溶化した。【０１１２】
上記の方法により得られた目的ペプチドを含む溶液を、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）およびＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  ５ｍｌ（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製した。前述した高濃度尿素バッファを結合用バッファとし、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして段階的溶出を行い、目的のポリペプチドを精製した。【０１１３】
上記で作製されたＲＣＰ−１１〜ＲＣＰ−１６の発現ベクターを用いて、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を常法によりトランスフォームし、アンピシリン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１００μＭのＩＰＴＧを添加したアンピシリン含有ＬＢ中で、２０℃、２４時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【０１１４】
菌体を回収し、Ｂ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（商品名、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて再懸濁したのち、ソニケーションにて菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心して不溶性画分を除去し、上清をＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、およびＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製した。溶出画分をＨｉｐｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて脱塩し、さらに、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を、溶液量の１／２０００で添加して４℃で２４時間インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。再度ＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２にて精製し、切断したＧＳＴタグをカラムに吸着させ除去した。カラム通過画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（商品名、３．５Ｋ ＭＷＣＯ．：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、以下、同じ）を用いて透析し、ＰＢＳに置換した。【０１１５】
上記のようにして得られたＲＣＰ−１のポリペプチドを、レディーゲル（１２．５％，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で泳動し、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した。その結果、アミノ酸配列から予想される分子量２８．３ｋＤａに相当する箇所に単一のバンドが確認できた。その他のポリペプチドに対しても同様の結果が得られた。【０１１６】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７について、精製後の各ポリペプチド溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（商品名、３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物はＮａｎｏＤｒｏｐ（商品名、Ｔｈｒｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。透析後の凝集の有無を表４に示す。【０１１７】
またＧＲＡＶＹ値は、アミノ酸ごとに決められている疎水性の指標を総和し、アミノ酸数で割った値として計算した（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132参照）。ＧＲＡＶＹ値は各ポリペプチドに含まれるアミノ酸の疎水度から計算されるポリペプチドの親疎水性の指標であり、値が大きいほど疎水的、小さいほど親水的であることを示す。結果を表４に示す。
また凝集有無については、以下のＧ、ＡおよびＢで評価した。結果を表４に併せて示す。
Ｇ：凝集物形成が見られない。
Ａ：粒径１００ｎｍ程度の粒子形成が認められる。
Ｂ：粒径１ｍｍ以上の可視凝集の形成が認められる。【０１１８】
【表４】
2015064661.tif 000005
【０１１９】
表４に示されるように、ＲＣＰ−２〜ＲＣＰ−５、ＲＣＰ−７〜ＲＣＰ−８、およびＲＣＰ−１７は、アミノ酸残基数が約８０個〜約１７０個のポリペプチドであり、凝集が生じやすいが、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５の範囲にあるため、凝集形成が抑制されていることがわかる。【０１２０】
［参考例２］
＜培養皿への吸着性評価＞
上記の方法により得られた各ポリペプチドを、所定のバッファにて、０〜２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の所定の最終濃度でウェルへ添加できるように希釈し、プラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ―Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｆａｌｃｏｎ社）に６４μＬずつ添加した。３７℃、２時間インキュベートして各ポリペプチドをプレートに吸着させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１６の各ポリペプチド被覆表面を得た。【０１２１】
上記のようにして得られた各ポリペプチド被覆表面のうち、ＲＣＰ−１およびＲＣＰ−１１〜１６を被覆した表面に対し、ホウ酸バッファと１ＮのＮａＯＨをそれぞれ６４μＬ付与し、８０℃、湿度１００％で２４時間インキュベートした。空冷後、各ウェルにホウ酸バッファを７５μＬ添加し、さらにＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド：和光純薬工業株式会社）／メタノール溶液（１６０ｍｇ／ｍｌ）と、ＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン：和光純薬工業株式会社）／ホウ酸バッファ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を１：１００（質量比）に混合した反応液を５０μＬ添加した。４０℃で３０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ マルチラベルカウンター（商品名、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度を測定した（励起３５５ｎｍ／蛍光４８６ｎｍ）。別途各ポリペプチド溶液より検量線を作成し、吸着量を算出した。結果を図１に示す。図１において黒菱形はＲＣＰ−１、黒四角はＲＣＰ−１１、黒三角はＲＣＰ−１２、黒丸はＲＣＰ−１３、白菱形はＲＣＰ−１４、白四角はＲＣＰ−１５、白三角はＲＣＰ−１６をそれぞれ示す。【０１２２】
図１に示されるように、試験に使用したポリペプチドのうち、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号３［配列番号１における３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列］）を含むＲＣＰ−１、１５、１６のポリペプチドを用いた場合に、ヒトビトロネクチンの配列を有するＲＣＰ−１１と同等の良好なプレートへの吸着性を有することがわかる。一方でＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮを含まないＲＣＰ−１３、１４の吸着量は該配列を含むポリペプチドに対して約１／４と低いことがわかる。【０１２３】
［参考例３］
＜細胞接着性評価１＞
上記ポリペプチドへのヒトｉＰＳ細胞（「Ｔｉｃ」：細胞番号Ｎｏ．ＪＣＲＢ１３３１：独立行政法人  医薬基盤研究所［５６７−００８５  大阪府茨木市彩都あさぎ７丁目６番８号］より分譲）の細胞接着性評価は、以下のとおりに行った。
ヒトｉＰＳ細胞を維持するためのフィーダー細胞として、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）（初代マウス胚性線維芽細胞：ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済み, Ｃ５７／ＢＬ６由来、継代３代目）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ (v/v) ウシ胎児血清培地を使用して２４時間培養し、Ｔ２５フラスコ（商品名、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上に接着させた。ヒトｉＰＳ細胞用培地は、表５の組成のものに、ＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したものを使用した。【０１２４】
【表５】
2015064661.tif 000006
【０１２５】
ｉＰＳ細胞は、上記培地を用いて、３７℃、５％（v/v、以下同じ）ＣＯ２インキュベーター内で維持培養した。培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。継代操作は ディスパーゼ（登録商標）II（ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＧｒａｄｅII、Ｒｏｃｈｅ社）で細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。【０１２６】
上述の様にして培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ遠心して細胞を回収し、終濃度１０μＭ  Ｙ−２７３６２（（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業株式会社）を含むＴｅＳＲ２（商品名、異種動物由来成分および血清成分不含培地、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁した。【０１２７】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７と、ＲＣＰ−１１、ＲＣＰ−１５およびＲＣＰ−１６と、比較対照として、ヒトビトロネクチン（ヒト血漿より抽出、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、リコンビナントラミニン（ｒＬａｍｉｎｉｎ−５：オリエンタル酵母社、および、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１：Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）とを、それぞれ表６に示す添加濃度となるように、所定のバッファ（ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７は、上記のＧＲＡＶＹ値および凝集特性の評価で用いた透析用バッファ、ＲＣＰ−１１、１５、１６、天然ビトロネクチンおよびリコンビナントラミニンはＰＢＳ）に懸濁して、試料１〜１７を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させた。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、ｉＰＳ細胞を、３００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。２４時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表６に示す。表６中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを用いた試料１５による細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
表６に示されるように、配列番号１に記載された配列の１番目〜４４番目を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０、ＲＣＰ−１７およびＲＣＰ−１１と天然ヒトビトロネクチンは、ｉＰＳ細胞の細胞接着率が良好であった。特に、配列番号１に記載された配列の第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てを含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０、ＲＣＰ−１７は、天然ヒトビトロネクチンおよび、天然ヒトビトロネクチンと同一アミノ酸配列を有するＲＣＰ−１１よりも細胞接着率が良好であった。これより、配列番号１に記載された配列の１番目〜４４番目に細胞接着に重要な配列が存在することがわかる。【０１３０】
［参考例４］
＜細胞接着性評価２＞
表７に示すポリペプチドをＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた表面を作製した後、１００μＭの上記合成ペプチドを添加した細胞懸濁液を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種した。播種２４ｈ後の接着細胞数を、＜細胞接着性評価１＞と同様の手法にて算出した。結果を表７に示す。表７中、細胞接着率については、合成ペプチドを含まない培養液での細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。【０１３１】
【表７】
2015064661.tif 000008
【０１３２】
表７に示されるように、ＣＳＹＹＱＳＣまたはＲＧＤを含むＰｅｐｔｉｄｅ−４、５および６を添加することで天然ビトロネクチンへの細胞の接着が有意に阻害されたのに対し、ＣＳＹＹＱＳＣおよびＲＧＤを含まないＰｅｐｔｉｄｅ−１、２、３およびＰｅｐｔｉｄｅ−５、６のＲＧＤ配列をＲＧＥに置換したＰｅｐｔｉｄｅ−７、８を添加した場合は接着阻害が無いことがわかる。従って、ポリペプチドがＣＳＹＹＱＳＣおよびＲＧＤの少なくとも一方を含むことにより、細胞接着能が発揮されることがわかる。【０１３３】
［参考例５］
＜増殖評価＞
上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＲＣＰ−１、１１および天然ヒトビトロネクチンを吸着させた９６ウェルプレートに対し、２５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で８日間培養した。各経時後の接着細胞数を、上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測し、増殖曲線を得た。増殖曲線を図２に示す。なお図２において黒菱形はＲＣＰ−１を用いた例、黒四角はＲＣＰ−１１を用いた例を示す。
同様にＲＣＰ−１〜１０およびＲＣＰ−１７と、比較対照として、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１をそれぞれ表８に示す添加濃度となるように、試料１〜１２を調製し、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして各ポリペプチドを吸着させた９６ウェルプレートに対して５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。３日後の細胞数を上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測した。結果を表８に示す。【０１３４】
【表８】
2015064661.tif 000009
【０１３５】
図２より、ＲＣＰ−１は、天然ビトロネクチンのアミノ酸配列を有するＲＣＰ−１１よりも高い細胞増殖性を示した。ＲＣＰ−１１の細胞数は、培養８日目で、ＲＣＰ−１の細胞数の約２／３程度であった。得られた細胞数の増減から倍加時間を算出したところ、ＲＣＰ−１を用いた場合には４６．４±２．１時間、ＲＣＰ−１１を用いた場合には６７．７±２．１時間であった。
また表８より、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７はいずれも、ビトロネクチンと同じ細胞外マトリクスであるラミニンよりも細胞増殖率が高いことがわかる。このような高い細胞増殖率は、配列番号１における２７４番目のシステイン残基をセリン残基に置換しても同様に得られることがわかる。【０１３６】
図２および表８の結果から、驚くべきことに、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列からなり、天然ヒトビトロネクチンの第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てに相当する配列を含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７は、ヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−１１、および比較例であるＬａｍｉｎｉｎ−５１１よりも高い増殖能を有していることがわかる。
さらに、表８より、ＣＳＹＹＱＳＣの配列およびＲＧＤ配列と、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列の双方を含むＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７はいずれも高い細胞増殖性を示すことがわかった。【０１３７】
［参考例６］
＜細胞接着性評価３＞
ＲＣＰ−１を、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度にＰＢＳで調整して使用した以外は、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして細胞接着性を評価した。結果を表９に示す。表９中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた培養器に対する細胞接着率を１００とした場合の相対値とした。ｎ＝３。【０１３８】
【表９】
2015064661.tif 000010
【０１３９】
表９に示されるように、ＲＣＰ−１に対するｉＰＳ細胞の接着性は、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上添加することで天然ビトロネクチンと同等の細胞接着率を示した。【０１４０】
［参考例７］
＜未分化維持評価＞
上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＴｅＳＲ２中に懸濁した。上記＜細胞接着性評価１＞で用いた試料１、試料２、試料５、試料６および試料７をそれぞれ、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして吸着させた６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ，  Ｆａｌｃｏｎ社）にｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。６日毎に前述と同様の方法にて継代を行った。それぞれの試料上で培養したｉＰＳ細胞の形態を図３に示す。【０１４１】
また本条件で１ヶ月間培養した後、細胞を４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳにて膜透過性を亢進させた。Ｉｍａｇｅ  ＩＴ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてブロッキング処理を行った後、抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＤＡＰＩ（同仁化学社）を添加して標識し、蛍光顕微鏡にて撮像した。これらの蛍光顕微鏡像を図４に示す。【０１４２】
図３および図４のそれぞれにおいて、（Ａ）はＲＣＰ−１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｂ）はＲＣＰ−１１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｃ）は天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｄ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｅ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５１１上で培養したｉＰＳ細胞を、それぞれ示す。スケールバー：１００μｍ。図３において左欄はコロニー全体像、右欄は拡大像であり、図４において左欄はＤＡＰＩ染色像、右欄は抗ＮＡＮＯＧ抗体による染色像を示す。図３および図４中のスケールバー：２００μｍ。【０１４３】
図３に示されるように、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列を含むＲＣＰ−１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は均質なコロニー、かつ高い核占有率を有する未分化細胞に特徴的な形態を示していた。また図４に示されるように、細胞増殖ドメインおよび吸着ドメインを有するＲＣＰ−１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は、ＮＡＮＯＧをコロニー全体に強く発現しており、未分化状態が良好に維持されていることがわかった。【０１４４】
上記参考例１〜７の評価結果から、ＣＳＹＹＱＳＣおよびＲＧＤ配列のいずれか一方とＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列を含む４０〜４５０アミノ酸残基からなるポリペプチドは、支持体の細胞培養表面への吸着性に優れていた。また、このようなポリペプチドは、ｉＰＳ細胞との共培養条件下では、ｉＰＳ細胞の細胞接着性、および未分化状態の維持において、天然ビトロネクチンおよびヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−１１と同等であり、かつｉＰＳ細胞の増殖性においてはＲＣＰ−１１よりも優れる結果であった。ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７はいずれもｉＰＳ細胞の細胞接着性および未分化状態の維持の点で良好であることがわかる。このような各能力の全てにおいて良好の結果は、その他のポリペプチドまたは比較例であるリコンビナントラミニンでは得られなかった。【０１４５】
従って、本発明にかかる（ｄ）のポリペプチドによれば、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、細胞培養表面への吸着性に優れたポリペプチドと、該ポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法および培養器を提供することができる。【０１４６】
［実施例１］
＜ポリペプチド組成物の調製＞
上記で得られたＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７のうち、ＲＣＰ−１７を以下の実施例に用いた。
参考例１において得られた精製後のポリペプチドＲＣＰ−１７の溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（商品名、３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、尿素濃度が２Ｍになるまで段階透析し、尿素を除去した。
透析後、ポリペプチド溶液を希釈用バッファ（２Ｍ  尿素、ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で１／１０倍（ｖ／ｖ）に希釈し、次にポリペプチドの酸化を進行させるために、酸化バッファ（２Ｍ  尿素、２ｍＭ  酸化型グルタチオン［和光純薬工業株式会社］、２０ｍＭ  還元型  グルタチオン［和光純薬工業株式会社］、ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を透析外液として５日間透析した。続いて透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に透析をして尿素を除去した。最終透析産物はアミコンウルトラ  ３Ｋ（商品名、ミリポア社）を使って、ポリペプチド濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。
最終透析産物を４℃で２４ｈ静置し、酸化を十分に進行させ、最終産物としてポリペプチド組成物Ｉ−１を得た。最終産物の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商品名、Ｔｈｒｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より算出した。【０１４７】
一方、参考例１において得られた精製後のポリペプチドＲＣＰ−１７の溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（商品名、３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を使用し、透析外液を、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、尿素濃度が０Ｍとなるまで段階透析することによって、尿素を除去して、最終産物としての比較用のポリペプチド組成物Ｉ−２を得た。【０１４８】
＜ポリペプチド組成物の性状＞
上記のようにして得られたＲＣＰ−１７のポリペプチドを含有するポリペプチド組成物Ｉ−１およびＩ−２と、比較例としてＶＴＮ−Ｎ（商品名、リコンビナントヒトビトロネクチン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むポリペプチド組成物Ｉ−３をそれぞれ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５質量％，ＡＴＴＯ社）を用いて分離し、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色した。結果を図５に示す。  また、得られた染色像をＩｍａｇｅＪにて解析することによりＢａｎｄ強度を定量し、単量体および多量体の存在比を算出した。結果を表１０に示す。【０１４９】
【表１０】
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【０１５０】
図５では、尿素を段階透析で除去したのみのポリペプチド組成物Ｉ−２およびＶＴＮ−Ｎを含有するポリペプチド組成物Ｉ−３における、分子間架橋した多量体の形成が確認されるのに対し、ポリペプチドの酸化処理を経て得られたポリペプチド組成物Ｉ−１では、ＲＣＰ−１７の多量体は確認されなかった。
また、表１０に示されるように、実施例に係るポリペプチド組成物Ｉ−１では、多量体が約５質量％以下であった。【０１５１】
［実施例２］
＜細胞増殖性評価２＞
実施例１で得られたポリペプチド組成物Ｉ−１〜ポリペプチド組成物Ｉ−３を用いて、以下の細胞増殖性評価を行った。【０１５２】
各ポリペプチド組成物Ｉ−１〜Ｉ−３を、組成物中のポリペプチドの濃度が表１１に示す最終濃度となるように、所定のバッファ（ＲＣＰ−１７を含むポリペプチド組成物Ｉ−１、Ｉ−２に対しては、参考例のＧＲＡＶＹ値および凝集特性の評価で用いた透析用バッファ、ＶＴＮ−Ｎを含むポリペプチド組成物Ｉ−３に対してはＰＢＳ）に懸濁して、ポリペプチド液を調製し、プラズマ処理細胞培養表面を有するプラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させ、ポリペプチド被覆表面を有するペプチド処理９６ウェルプレートを得た。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、ＴｅＳＲ２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ.）とＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ.）を１：１（体積比）に混合した培地に懸濁したｉＰＳ細胞を、１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。７２時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４質量％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表１１に示す。表１１中、細胞増殖率は、リコンビナントラミニンを用いて培養した際の７２時間後の細胞数を１００％とする割合で示す。ｎ＝３。【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
表１１に示されるように、本発明の実施例にかかるポリペプチド組成物Ｉ−１は、ポリペプチド組成物Ｉ−２よりも細胞増殖性に優れることがわかる。このことはポリペプチドの多量体形成によって細胞増殖活性が損なわれることを示している。【０１５５】
［実施例３］
＜ポリペプチド組成物の調製＞
上記で得られたＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０およびＲＣＰ−１７のうち、ＲＣＰ−５に対して、以下の方法で還元処理を施した。
ＲＣＰ−５を含むポリペプチド溶液に、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業株式会社）を終濃度１００ｍＭとなるように添加し、４℃で２４ｈ静置し、試料Ａを調製した。
比較として、ＲＣＰ−５を含むポリペプチド溶液を、未処理のまま−８０℃で凍結させて、試料Ｂを調製した。
それぞれの試料を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（商品名、３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去し、それぞれポリペプチド組成物ＩＩ−１（試料Ａ）およびＩＩ−２（試料Ｂ）を得た。【０１５６】
＜ポリペプチドの構造分析＞
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ法を用いてジスルフィド結合の解析を行った。詳細を以下に示す。【０１５７】
１）タンパク質の酵素消化
５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）９００μＬをエッペンドルフチューブに入れ、ポリペプチド組成物ＩＩ−１およびＩＩ−２をそれぞれ１００μＬ加えた。さらに、１０μＬの１００μｇ／ｍｌトリプシン（和光純薬工業株式会社）または５００ｎｇ／ｍｌのＧｌｕ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、３７℃で一晩静置した。消化された断片化ペプチドを遠心エバポレーター（Ｂｕｃｈｉ）にて１００μＬまで濃縮した。【０１５８】
２）脱塩
上記消化物１０μＬをｚｉｐｔｉｐ Ｃ１５チップ（商品名、ミリポア）を用いて脱塩し、測定試料とした。【０１５９】
３）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定
ＵｌｔｒａｆｌｅｘＴＯＦ／ＴＯＦ（商品名、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用い、レーザー波長３３７ｎｍにより試料を測定した。リフレクターモードにて測定を行い、同じくＰｅｐｔｉｄｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  II（商品名、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、製品番号２２２５７０）を用いて、ｍ／ｚ ７００〜４０００の範囲を質量校正した。非還元測定では、ペプチド消化物１μＬとＣＨＣＡマトリクス(α−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸）の０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ−ＭｅＣＮ（２：１）の飽和溶液４μＬを混合し、ターゲットプレートへ載せた。還元測定では、ペプチド消化物０．５μＬと４０ｍＭ ＤＴＴ溶液（ｐＨ９．０）０．５μＬをターゲットプレート上で混合し、２０分静置した後にＣＨＣＡマトリクス飽和溶液０．５μＬを載せ、乾燥させた。試料をターゲットプレートに載せてからのオンターゲット洗浄（脱塩）は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社より入手した手順書に従い実施した。【０１６０】
４）測定値の評価
得られた質量分析値は、Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅｒｖｅｒ（商品名、マトリックスサイエンス株式会社）にて検索を行い、それぞれの酵素による断片化ペプチドの配列を同定した。同様に、還元処理による断片化ペプチドの質量変化を調べることで断片化ペプチド内に含まれるシステインが関わるジスルフィド結合の架橋位置を同定した。【０１６１】
解析の結果、ポリペプチド組成物ＩＩ−１に含まれるＲＣＰ−５のＮ末端側４残基（Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ９、Ｃｙｓ１９、Ｃｙｓ２１）については、Ｃｙｓ５とＣｙｓ９、Ｃｙｓ１９とＣｙｓ２１をペアとして分子内架橋しているものが主成分として検出された。またポリペプチド組成物ＩＩ−２に含まれるＲＣＰ−５でのみ、Ｃｙｓ３９同士が分子間架橋した成分が観測された。【０１６２】
＜ＰＡＩ−１結合性評価＞
Ｃｙｓ２５とＣｙｃ３１が架橋した構造を持つポリペプチドと結合することが知られているＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｉｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（ＰＡＩ−１）を用い、Ｃｙｓ２５とＣｙｃ３１の架橋構造の検出を試みた。【０１６３】
上記ポリペプチド組成物ＩＩ−１およびＩＩ−２（１００μｇ／ｍｌ）を、ポリスチレン製、平面底、黒色96ウェルプレート（ｈａｌｆ−Ａｒｅａ）へ６４μＬ／ウェルとなるよう添加した。シーリングフィルム（フナコシ株式会社）でプレート全体を覆い、４℃にて静置することで各ポリペプチド組成物中のＲＣＰ−５を固相化した。１２時間後、ウェル内の液を廃棄し、５％ Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ（株式会社ニッポンジーン）を１５０μＬ／ウェルとなるよう添加した。３７℃で１時間静置後、ウェル内の液を廃棄し、さらにＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、同様に３７℃で静置することでブロッキングを施した。１時間後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）を１５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、連続的にウェル内から液を廃棄した。この操作を計４回実施し、ウェル内を洗浄した。【０１６４】
続いて、ＴＢＳにて１７０ｎＭから２．６ｎＭまで順次等倍希釈を行った組換え体ＰＡＩ−１（カタログ番号１７８６−ＰＩ, Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）溶液を、それぞれウェル内へ５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、３７℃で静置した。１時間後、ウェル内からＰＡＩ−１溶液を廃棄し、前述と同様の方法でＴＢＳＴにて計４回洗浄することで、未結合ＰＡＩ−１を除去した。次に、未標識ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（カタログ番号Ａ１０５３７，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）原液をＴＢＳにて７００倍希釈し、１５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、３７℃で静置することでさらにブロッキングを行った。１時間後、ウェル内から抗体溶液を廃棄し、前述と同様の方法でＴＢＳＴにて計４回洗浄した。その後、抗ＰＡＩ−１抗体（カタログ番号ＡＦ１７８６, Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）原液をＴＢＳにて１００倍希釈し、１００μＬ／ウェルとなるよう添加した。３７℃で１時間静置の後、ウェル内から抗体溶液を廃棄し、前述と同様の方法でＴＢＳＴにて計4回洗浄することで未結合抗ＰＡＩ−１抗体を除去した。【０１６５】
さらに、ＨＲＰ標識抗ｇｏａｔ  ＩｇＧ抗体（カタログ番号８１−１６２０、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）原液をＴＢＳにて７５００倍希釈し、１００μＬ／ウェルとなるよう添加した。３７℃で１時間静置の後、ウェル内から抗体溶液を廃棄し、前述と同様の方法でＴＢＳＴにて計４回洗浄することで未結合標識抗体を除去した。続いて、ＱｕａｎｔａＢｌｕ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、ＨＲＰ基質を説明書に記載の通りに調整し、５０μＬ／ウェルとなるよう添加した。３７℃で２０分間暗所に静置した後、同ｋｉｔに付属する停止液を５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、反応を停止させた。励起、蛍光波長をそれぞれ３３０ｎｍ、４１０ｎｍとし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）にてＲＣＰ−５とＰＡＩ−１との結合を相対蛍光単位として測定した。【０１６６】
得られた測定値をＸ軸に、測定値をＰＡＩ−１添加濃度（ｎＭ）で割った値をＹ軸にプロットした結果を図６に示す。得られた直線は、以下のＳｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔの式に相当するため、傾きから結合定数（ＫＡ）を算出できる。【０１６７】
（式）
ＰＡＩ−１結合量／ＰＡＩ−１添加量  ＝  −ＫＡ×ＰＡＩ−１結合量【０１６８】
算出した結果を表１２に示す。ポリペプチド組成物ＩＩ−１中のＲＣＰ−５は、ポリペプチド組成物ＩＩ−２中のＲＣＰ−５と比較してＰＡＩ−１の結合定数が大きい、すなわちＣｙｓ２５とＣｙｓ３１と分子内架橋体が多く存在することをわかった。【０１６９】
【表１２】
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【０１７０】
＜細胞増殖性評価＞
実施例３の＜細胞増殖性評価２＞に記載の方法と同様にして、ポリペプチド組成物ＩＩ−１およびＩＩ−２の細胞増殖性を評価した。結果を表１３に示す。ポリペプチド組成物ＩＩ−１はポリペプチド組成物ＩＩ−２と比較して細胞増殖活性に優れる、つまりＣｙｓ２５とＣｙｓ３１と分子内架橋体が結合しているポリペプチドは細胞増殖活性に優れることがわかった。【０１７１】
【表１３】
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【０１７２】
このように本発明のポリペプチド組成物は、所定のヒトビトロネクチンＮ末端側の部分配列を含み、多能性幹細胞に対する細胞接着能を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを、ヒトビトロネクチンＮ末端側のシステイン残基を介して分子間架橋した二量体以上の多量体の形態でなく、分子間架橋されていない単量体の形態で多く含むペプチド組成物である。このようなポリペプチド組成物の存在下で多能性幹細胞が効率よく増殖することがわかった。【０１７３】
したがって、本発明によれば、多能性幹細胞の細胞培養性能、特に優れた細胞増殖能を誘導可能なポリペプチド組成物およびこれを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。【０１７４】
２０１３年１０月３１日に出願された日本国特許出願第２０１３−２２７５８３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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