(57)【要約】  本発明は、ヘマトクリット値が変動しても、様々な血液成分、とくに血中グルコース濃度を精度よく測定可能なバイオセンサを提供する。  電気絶縁性の基板１０２と、前記電気絶縁性の基板１０２上に形成された作用極１０４２および対極１０４４を有する電極系１０４と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層２０４とを有し、前記電極系１０４は金により形成され、前記電極系１０４上には親水性高分子層２０２が設けられ、前記親水性高分子層２０２に前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが前記試料と接触した後に移行するように、前記親水性高分子層２０２外に前記試薬層２０４が設けられているバイオセンサ１０によって上記課題を解決した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の血液成分を酸化還元酵素により酸化し、その反応生成物の酸化電流を電極で検出し、前記血液成分を測定するバイオセンサであって、
前記バイオセンサは、電気絶縁性の基板と、前記電気絶縁性の基板上に形成された作用極および対極を有する電極系と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層とを有し、
前記電極系は金により形成され、
前記電極系上には親水性高分子層が設けられ、
前記親水性高分子層と前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層が分離して配置されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記親水性高分子層が、光架橋性ポリマーにより形成されてなることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記光架橋性ポリマーがポリビニルアルコールを骨格とするポリマーであることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記親水性高分子層上に前記試薬層が設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設け、これとは別に、カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設け、前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせてなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記血液成分が、グルコースであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設ける第１工程と、
カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設ける第２工程と、
前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせる第３工程とを有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサおよびその製造方法に関し、とくにグルコースのような血液成分を精度よく測定可能なバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、微生物、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生物材料の分子認識能を利用し、サンプル中の基質含有量を定量するセンサである。各種バイオセンサの中でも酵素を利用したセンサの実用化は進んでおり、例えば、基質中のグルコース、乳酸、コレステロール、アミノ酸等を測定することができる。【０００３】
例えば下記特許文献１には、電気絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された作用極および対極を有する電極系と、前記電極系上に設けられた試薬層とから構成され、前記試薬層は第１および第２の層を順次積層したものを主体とし、前記第１の層は親水性高分子と酵素と電子受容体を含有するものであり、前記第２の層は非水溶性高分子と水溶性高分子を含有するものであることを特徴とするバイオセンサが開示されている。【０００４】
また、下記特許文献２には、血糖値測定用のバイオセンサとして、主に電気化学的な反応を利用して、例えばフェリシアン化カリウム等の試薬をメディエーターとし、血液中のグルコースとセンサ中に担持されたグルコースオキシダーゼ等の酵素とを反応させ、得られる電流値を計測することにより血糖値を求める手法が開示されている。【０００５】
一方、血液の粘性の指標としてヘマトクリット値が知られている。ヘマトクリット値は血液中に占める赤血球の容積の割合（％）であり、一般的に、健康な成人ではヘマトクリット値は４０〜５０％である。一方、貧血患者はヘマトクリット値が下がり、１５％を下回る状態になる場合もある。このようなヘマトクリット値の変動は、バイオセンサを用いた血液成分、とくにグルコース濃度の定量に悪影響を及ぼすことが知られている。しかしながら、従来技術ではいずれも、ヘマトクリット値の変動に対処できず、血中グルコース濃度の測定精度に問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特開平６−２１３８５８号公報
【特許文献２】日本国特表２００５−５１２０２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明の目的は、ヘマトクリット値が変動しても、様々な血液成分、とくに血中グルコース濃度を精度よく測定可能なバイオセンサおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、電気化学的な反応を利用したバイオセンサにおいて、電気絶縁性の基板上に形成された作用極および対極を有する電極系上に親水性高分子層を設け、前記親水性高分子層外に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設けることにより、上記のような従来の課題を解決できることを見出し、本発明を完成することができた。【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．試料中の血液成分を酸化還元酵素により酸化し、その反応生成物の酸化電流を電極で検出し、前記血液成分を測定するバイオセンサであって、
前記バイオセンサは、電気絶縁性の基板と、前記電気絶縁性の基板上に形成された作用極および対極を有する電極系と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層とを有し、
前記電極系は金により形成され、
前記電極系上には親水性高分子層が設けられ、
前記親水性高分子層と前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層が分離して配置されていることを特徴とするバイオセンサ。
２．前記親水性高分子層が、光架橋性ポリマーにより形成されてなることを特徴とする前記１に記載のバイオセンサ。
３．前記光架橋性ポリマーがポリビニルアルコールを骨格とするポリマーであることを特徴とする前記２に記載のバイオセンサ。
４．前記親水性高分子層上に前記試薬層が設けられている前記１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
５．電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設け、これとは別に、カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設け、前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせてなることを特徴とする前記１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
６．前記血液成分が、グルコースであることを特徴とする前記１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
７．電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設ける第１工程と、
カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設ける第２工程と、
前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせる第３工程とを有することを特徴とする前記１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサを製造する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、電気化学的反応を利用して試料中の血液成分を測定するバイオセンサにおいて、電気絶縁性の基板上に金からなる作用極および対極を有する電極系と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層とを有し、前記電極系上に設けられた親水性高分子層に前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが前記試料と接触した後に移行するように、前記親水性高分子層外に前記試薬層が設けられていることを特徴としている。【００１１】
このように、電気化学的反応の迅速な検出が可能な金を電極として使用し、かつ、親水性高分子層外に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが配置されていることから、血液成分を含む試料が酸化還元酵素およびレドックスメディエーターの一部又は全部と共に親水性高分子層外で混合され親水性高分子層へ到達し、親水性高分子層が分子篩クロマトグラフィー様に機能し、赤血球や酸化還元酵素などの生体高分子成分が電極に到達する前に、グルコースのような血液成分を測定することができる。これにより、血液中のヘマトクリット値が変動しても、様々な血液成分を精度よく測定可能なバイオセンサおよびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のバイオセンサの一例を示す分解斜視図である。
【図２】図２は、本発明のバイオセンサの一例を示す図１におけるＢ−Ｂ断面図である。
【図３】図３は、本発明に用いられる電極を説明するための平面図である。
【図４】図４（ａ）〜（ｄ）は、スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用する方法により、電極を製造する工程を示す図である。
【図５】図５（ａ）〜（ｇ）は、フォトリソグラフィーにより形成したマスクを使用する方法により、電極を製造する工程を示す図である。
【図６】図６（ａ）〜（ｃ）は、実験例１の結果を示す図である。
【図７】図７（ａ）〜（ｄ）は、実験例２の結果を示す図である。
【図８】図８（ａ）〜（ｄ）は、実験例２の結果を示す図である。
【図９】図９（ａ）〜（ｄ）は、実験例２の結果を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）〜（ｃ）は、実験例３の結果を示す図である。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｃ）は、実験例３の結果を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｃ）は、実験例３の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実験例４の結果を示す図である。
【図１４】図１４（ａ）〜（ｃ）は、実験例４の結果を示す図である。
【図１５】図１５（ａ）〜（ｅ）は、メタルマスクを使用する方法により、くし型電極を製造する工程を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｄ）は、リフトオフ法により、くし型電極を製造する工程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
図１は、本発明のバイオセンサの一例を示す分解斜視図である（ただし、電極系上の親水性高分子層および試薬層は省略している）。図１において、バイオセンサ１０は、血液成分を酸化還元酵素により酸化し、その反応による酸化電流を電極で検出し、血液成分を測定するものであって、具体的には、電気絶縁性の基板１０２上に作用極１０４２および対極１０４４からなる電極系１０４が形成されている。
【００１５】
さらにバイオセンサ１０は、電気絶縁性の基板１０２上にスペーサー１０８およびカバーフィルム１０９が設けられ、これら部材は一体的に設けられている。また、スペーサー１０８は、切欠きが設けられ、キャビティＣを形成している。
【００１６】
血液成分の測定時は、１μｌ未満、例えば０．１〜０．２５μｌの血液試料は吸引口Ａから毛細管現象によりキャビティＣ内に導入され、電極系１０４と下記で説明する試薬層のある位置まで導かれる。そして、電極系１０４上での血液と試薬層内の試薬との反応により生じる電流値は、図示しないリード１１２、１１４を通じて、外部の測定装置によって読みとられる。
【００１７】
本発明では、電極系１０４が金により形成されるとともに、電極上に形成された親水性高分子層と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層とを有し、かつ、親水性高分子層に前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが前記試料と接触した後に移行するように、前記親水性高分子層外に（分離して）前記試薬層が設けられていることを特徴としている。
【００１８】
図２は、本発明のバイオセンサの一例を示す図１におけるＢ−Ｂ断面図である。
【００１９】
前記のように本発明のバイオセンサ１０は、電気絶縁性の基板１０２と、その上に形成された作用極１０４２および対極１０４４を有する電極系１０４とを有し、電極系１０４上には親水性高分子層２０２が設けられている。また、親水性高分子層２０２上には、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層２０４が設けられ、親水性高分子層２０２に試薬層２０４中の酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが血液などの試料と接触する前に移行しないようになっている。なお、符号Ｖは空気孔である。
【００２０】
親水性高分子層２０２を形成するポリマーとしては、本発明の効果の観点、また製造の容易性の観点から、光架橋性ポリマーから形成されるのが好ましく、とくに下記の感光性樹脂組成物から形成されるのがさらに好ましい。
【００２１】
すなわち、上記形態で使用する感光性樹脂組成物は、水溶性高分子を主成分として含有しかつ感光性基を有する組成物であるが、感光性基を有する水溶性高分子を含有する組成物でもよく、水溶性光架橋剤、すなわち感光性基を有する化合物と、感光性基を有さない水溶性高分子とを含有する組成物でもよい。また、感光性基を有する水溶性高分子と感光性基を有さない水溶性高分子と水溶性光架橋剤とを含有する組成物でもよい。
【００２２】
なお、水溶性高分子の含有率は、感光性樹脂組成物の固形分中７０ｗｔ％以上であることが好ましく、８５ｗｔ％以上であることが特に好ましい。
【００２３】
親水性高分子層２０２を形成するための感光性樹脂組成物が有する感光性基は特に限定されず、感光性の基として公知のものでよいが、特にアジド基を有する感光性基が好ましい。
【００２４】
アジド基を有する感光性基は、下記（１）式または（２）式のいずれかの構造を有していることが特に好ましい。
【００２５】
【化１】
2014112570.tif 000003
【００２６】
なお、（１）式は１価の基を、（２）式は２価の基を示しており、式中Ｒ１及びＲ２はそれぞれ水素原子、スルホン酸基またはスルホン酸塩基を示す。スルホン酸塩基は−ＳＯ３Ｍで表されるが、Ｍとしては例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等が挙げられる。また、感光性基は水溶性光架橋剤または水溶性高分子と直接結合していてもよく、アルキレンなどのスペーサーやアミド結合を介して結合していてもよい。
【００２７】
水溶性高分子としては、感光性樹脂組成物の成分として公知のものを使用することができ、例えば、ポリ酢酸ビニルけん化物（ポリビニルアルコール）、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリルアミド−ダイアセトン（メタ）アクリルアミド共重合体、ポリＮ−ビニルホルムアミド、ポリＮ−ビニルアセトアミドなどが挙げられる。これらのうち、ポリ酢酸ビニルけん化物を好適に使用することができる。ポリ酢酸ビニルけん化物の重合度とけん化度は特に限定されないが、平均重合度２００〜５０００、けん化度６０〜１００％のものが好適に使用することができる。平均重合度が２００より小さい場合には、十分な感度が得られ難く、また、平均重合度が５０００より大きい場合には、感光性樹脂組成物の粘度が高くなり、塗布性が悪くなるという不具合が発生し易く、さらに、粘度を下げるために濃度を低くすると、所望の塗布膜厚を得るのが困難となる。また、けん化度が６０％より小さいと十分な水溶性および水現像性が得られ難い。
【００２８】
感光性基を有する水溶性高分子を得るには、例えば感光性基を持つ化合物（感光基ユニット）を水溶性高分子と反応させればよい。水溶性高分子に感光性基を導入するための感光性基を持つ化合物としては、例えば、３−（４−アジドフェニル）−Ｎ−（４，４′−ジメトキシブチル）−２−フェニルカルボニルアミノ−プロパ−２−エンアミド）、２−（３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−エノイルアミノ）−Ｎ−（４，４−ジメトキシブチル）−３−（３−ピリジル）プロプ−２−エンアミド）、３−（４−アジドフェニル）−Ｎ−（４，４′−ジメトキシブチル）−２−［（３−ピリジル）カルボニルアミノ］−プロパ−２−エンアミドなどの特開２００３−２９２４７７号公報などに記載される感光基ユニットや、３−（２−ジメトキシブチル）−（４−アジドベンジリデン−２−スルホン酸ナトリウム）ロダニン、３−（２−ジメトキシエチル）−（４−アジドベンジリデン−２−スルホン酸ナトリウム）ロダニンなどの特許第３１６３０３６号明細書などに記載される感光基ユニットなどが挙げられる。
【００２９】
水溶性光架橋剤としては、感光性基をもつものであれば特に限定されないが、上述のように、アジド基を感光性基として有することが好ましい。例えば、４，４′−ジアジドスチルベン−２，２′−ジスルホン酸、４，４′−ジアジドベンザルアセトフェノン−２−スルホン酸、４，４′−ジアジドスチルベン−α−カルボン酸およびこれらのアルカリ金属塩、アンモニウム塩、有機アミン塩などが挙げられる。
【００３０】
また、感光性樹脂組成物は溶液状態とすることが好ましい。感光性樹脂組成物の溶媒としては、組成物に含有される成分を溶解可能であれば特に限定されないが、水または水と相溶性のある有機溶媒との混合溶液を使用することができる。水と相溶性のある有機溶媒の、非限定的な例として、アセトンなどのケトン類、メタノールなどの低級アルコール類、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどが挙げられる。なお、固形分濃度は１０ｗｔ％以下であることが好ましい。
【００３１】
さらに、感光性樹脂組成物にその光硬化性を損なわない範囲で添加物を混合することもできる。
【００３２】
塗布された感光性樹脂組成物の厚みは塗布可能であれば特に限定されないが、好適な膜厚は５０μｍ〜３００μｍである。膜厚が５０μｍ未満では、ヘマトクリットの影響の抑制が不十分となる場合があり、３００μｍを超えると、信号強度が低下してしまう場合がある。
【００３３】
塗布された感光性樹脂組成物は、必要に応じて加熱処理を行ってもよい。加熱処理は任意であり特に条件はないが、通常は３０〜１５０℃で１分〜１０時間程度、好ましくは３５℃〜１２０℃で３分〜１時間程度である。
【００３４】
露光する際の光源は、使用する感光性基を感光可能な光源であれば特に限定されない。例えば、光源としてＸ線、電子線、エキシマレーザー（Ｆ２、ＡｒＦ、ＫｒＦレーザーなど）および高圧水銀灯を使用することができる。これらの光源のうち、感光効率のよい波長を適宜選択できる。露光エネルギーは感光性基の構造、使用する光源のエネルギーに応じて適宜設定できる。通常０．１ｍＪ／ｃｍ２〜１０Ｊ／ｃｍ２であり、１ｍＪ／ｃｍ２〜１Ｊ／ｃｍ２程度が好ましい。
【００３５】
露光後は、必要に応じて加熱後、水による洗浄を行ってもよい。加熱処理は任意であり特に条件はないが、通常は３０〜１５０℃で１分〜１０時間程度、好ましくは３５〜１２０℃で３分〜１時間程度である。
【００３６】
試薬層２０４は、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む。酸化還元酵素およびレドックスメディエーターは、測定すべき血液成分の種類により適宜選択すればよいが、例えば酸化還元酵素としては、グルコースオキシターゼ、ラクテートオキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、コレステロールエステラーゼ、ウリカーゼ、アスコルビン酸オキシターゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。レドックスメディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンまたはその誘導体、フェナジンメトルサルフェート、メチレンブルー、フェロセンまたはその誘導体等が挙げられる。
【００３７】
本発明のバイオセンサは、血液中のグルコース濃度を測定するのにとくに好ましい。
【００３８】
試薬層２０４を、親水性高分子層２０２に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが血液などの試料と接触する前に移行しないように設けるには、例えば次のような方法がある。
【００３９】
まず、電気絶縁性の基板１０２上に、作用極１０４２および対極１０４４を有する電極系１０４を設ける。電極系１０４の形成方法は公知の手段の中から適宜選択することができる。さらに電極系１０４上に前記のようにして親水性高分子層２０２を形成する。なお、親水性高分子層２０２は形成後に乾燥することが好ましい。
【００４０】
これとは別に、カバーフィルム１０９上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層２０４を、公知の塗布または印刷手段により設ける。なお、試薬層２０４は形成後に乾燥することが好ましい。
【００４１】
続いて、電極系１０４と試薬層２０４とが向き合わうようにして絶縁性の基板１０２、電極系１０４およびカバーフィルム１０９とを一体的に貼り合わせる。
【００４２】
このような工程を経てバイオセンサ１０を製造することにより、親水性高分子層２０２外に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターが配置されていることから、血液成分を含む試料が酸化還元酵素およびレドックスメディエーターの一部又は全部と共に親水性高分子層外で混合され親水性高分子層へ到達し、親水性高分子層が分子篩クロマトグラフィー様に機能し、赤血球や酸化還元酵素などの生体高分子成分が電極に到達する前に、グルコースのような血液成分を測定することができる。これにより、血液中のヘマトクリットが変動しても、様々な血液成分を精度よく測定可能となる。
【００４３】
また、本発明の電極系１０４は、一つの作用極１０４２と一つの対極１０４４で構成されているが、複数の作用極と複数の対極からなる電極から構成されてもよい。
【００４４】
図３は、本発明に用いられる電極を説明するための平面図である。図３において、電極１０４’は、作用極１０４２および対極１０４４がそれぞれ平板型形状として形成され、これら作用極１０４２および対極１０４４が隣接して配置された形状を有する。
【００４５】
本発明に用いられる電極１０４’は、例えば次の方法により形成することができる。
【００４６】
（１）スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用する方法
図４は、スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用する方法により、電極１０４’を製造する工程を示す図である。
【００４７】
まず、絶縁性基板を準備し［図４（ａ）］、電極を構成する貴金属をスパッタリング、真空蒸着、めっき等の手段により、絶縁性基板上に貴金属の膜を形成する［図４（ｂ）］。
次に、前記電極膜上にスクリーン印刷法を適用してレジストを平板型形状に印刷し［図４（ｃ）］、エッチングを行なう［図４（ｄ）］。
最後に、レジストを剥離液等により除去することにより、電極が完成する［図４（ｅ）］。
【００４８】
（２）フォトリソグラフィーにより形成したマスクを使用する方法
図５は、フォトリソグラフィーにより形成したマスクを使用する方法により、くし型電極１０４’を製造する工程を示す図である。
まず、電気絶縁性の基板を準備し［図５（ａ）］、電極を構成する貴金属をスパッタリング、真空蒸着、めっき等の手段により、電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成する［図５（ｂ）］。
次に、前記貴金属の膜上にスピンコート、スプレー塗布、スクリーン印刷、ドライフィルム貼付等の手段を適用してレジストを塗布または貼付し［図５（ｃ）］、フォトマスクを介して露光を行なう［図５（ｄ）］。
続いて、電極を形成する部分以外のレジストおよび貴金属の膜をエッチングする［図５（ｅ）および（ｆ）］。
最後に、電極を形成する部分のレジストを剥離液等により除去することにより、電極が完成する［５（ｇ）］。
【００４９】
（３）メタルマスクを使用する方法
図１５は、メタルマスクを使用する方法により、くし型電極１０４’を製造する工程を示す図である。
まず、電気絶縁性の基板を準備し［図１５（ａ）］、基板の上に作製したい電極パターンを抜いたテンプレート（メタルマスクと呼ぶ）［図１５（ｂ）］を重ね［図１５（ｃ）］、電極を構成する貴金属をスパッタリング、真空蒸着、めっき等の手段により処理して電極を形成し［図１５（ｄ）］、電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成する。
続いて、メタルマスクを除去することにより、電極が完成する［図１５（ｄ）］。
【００５０】
（４）リフトオフ法
図１６は、リフトオフ法により、くし型電極１０４’を製造する工程を示す図である。
まず、絶縁性基板を準備し［図１６（ａ）］、スクリーン印刷法を適用して、電極を形成しない部分にレジストを平板型形状に印刷［図１６（ｂ）］、乾燥させる。
次に、レジストを印刷した基板に、電極を構成する貴金属をスパッタリング、真空蒸着、めっきなどの手段により、貴金属の膜を形成する［図１６（ｃ）］。
最後に、レジストを剥離液等で除去することにより、レジストとレジスト上に形成された貴金属の膜が除去され、電極が完成する［図１６（ｄ）］。
【００５１】
複数の作用極と複数の対極の電極系の場合は、所望の形状を精度よく形成できるという観点から、前記（２）のフォトリソグラフィーにより形成したマスクを使用する方法を採用するのが好ましい。
【００５２】
なお、絶縁性基板１０２、スペーサー１０８およびカバーフィルム１０９を形成するための材料としては、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリエーテル、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ−ρ−フェニレンスルフィド、ポリエーテルエステル、ポリ塩化ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。中でも、ポリエステル、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン２，６−ナフタレート、ポリブチレンテレフタレート等からなるフィルムが好ましい。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例および比較例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。【００５４】
実験例１．ＡＷＰ濃度の検討
［方法］
スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、
（１）アジド系感光基をポリビニルアルコールにペンダントした化合物とポリ酢酸ビニルけん化物を含む水溶性感光性樹脂組成物（東洋合成株式会社製、製品名：ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ−ＡＷＰ、以下ＡＷＰという）０．５％水溶液、１ｍｌ  
（２）ＡＷＰ１％水溶液、１ｍｌ  
（３）ＡＷＰ２％水溶液、１ｍｌ  を塗布し、３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行い、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。フェリシアン化カリウム１００ｍＭ、グルコース脱水素酵素（以下ＧＤＨ）  ２ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（以下ＰＰＢという）（ｐＨ７．５）、洗浄した各種ヘマトクリット値（以下Ｈｔという）の馬赤血球（Ｈｔ０、Ｈｔ２０、Ｈｔ４０）、１００ｍｇ／ｄＬのグルコースの溶液を混合し、（１）〜（３）の金電極、または何も載せていない金電極に添加し５秒間閉回路０ｍＶ印加後、各サンプリングタイムで閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００５５】
［結果］
図６（ａ）〜（ｃ）にＨｔ４０を１００％の電流値としたときの各ヘマトクリット値におけるサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値をプロットしたものを示す。ＡＷＰの場合は電流値が大幅に低下する（１ｓｅｃの値で１／１０前後）。ヘマトクリットの影響においてはかなりの効果があり、ＡＷＰによってヘマトクリットの影響をかなり排除できていることが分かった。ＡＷＰ濃度は０．５％〜２％の範囲ではあまり違いがなかったが０．５％はややばらつきが大きいことと、塗りやすさを考え１％がよいと分かった。【００５６】
実験例２
［方法］
スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、ＡＷＰ１％水溶液、１ｍｌを塗布し３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行い、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。これに、フェリシアン化カリウム１００ｍＭ、ＧＤＨ  １ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．５）、洗浄した馬赤血球Ｈｔ０，２０，４０，５５＋グルコース２０、１００、４００、８００ｍｇ／ｄＬを添加し、５秒間閉回路０ｍＶ印加後、各サンプリングタイムで閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００５７】
［結果］
図７（ａ）〜（ｄ）、図８（ａ）〜（ｄ）および図９（ａ）〜（ｄ）にＨｔ４０を１００％としたときの各ヘマトクリット値におけるサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値をプロットしたものを示す。グルコースのどの濃度においてもＡＷＰの効果はあり、ＡＷＰがないものと比較するとヘマトクリットの影響は少なくなっていた。【００５８】
実験例３
［方法］
１．スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、（４）ＡＷＰ０．５％水溶液＋グルコース脱水素酵素（以下ＧＤＨ）を０．８ｍｌ復水時に２ｕｎｉｔ／ｍｌとなる量、１ｍｌ（５）ＡＷＰ１％水溶液＋ＧＤＨを０．８ｍｌ復水時に２ｕｎｉｔ／ｍｌとなる量、１ｍｌ（６）ＡＷＰ２％水溶液＋ＧＤＨを０．８ｍｌ復水時に２ｕｎｉｔ／ｍｌとなる量、１ｍｌを塗布し、３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行い、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。フェリシアン化カリウム１００ｍＭ、ＧＤＨ  ２ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．５）、洗浄した馬赤血球Ｈｔ０、Ｈｔ２０、Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬのグルコースの溶液（ＧＤＨについては、すでに電極上に載せてあるセンサーに対しては除いた溶液）を混合し、（４）〜（６）の金電極、何も載せていない金電極に添加し５秒間閉回路０ｍＶ印加、３０秒間閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００５９】
２．スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、ＡＷＰ１％水溶液、１ｍｌを塗布し３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行った後、フェリシアン化カリウム２００ｍＭ、ＧＤＨ  ２ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．５）、ルーセンタイトＳＷＮ０．３％、５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを０．８ｍｌで復水した時にそれぞれの濃度になるように調製したものを１ｍｌ、ＡＷＰを塗布した電極またはコントロールとして塗布していない電極上に塗布し、３７℃で１０分、５０℃で５分乾燥させたものを、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。これに、洗浄した馬赤血球Ｈｔ０、２０、４０、６０＋グルコース１００ｍｇ／ｄＬを添加し、５秒間閉回路０ｍＶ印加後、各サンプリングタイムで閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００６０】
３．スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、ＡＷＰ１％水溶液、１ｍｌを塗布し３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行った後、フェリシアン化カリウム２００ｍＭ、ＧＤＨ  ２ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．５）、ルーセンタイトＳＷＮ０．３％、５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを０．８ｍｌで復水した時にそれぞれの濃度になるように調製したものを１ｍｌ、キャピラリーシール上に塗布し、３７℃で１０分、５０℃で５分乾燥させたものを、ＡＷＰ塗布金電極または塗布していない金電極の電極面にキャピラリーシールへの試薬塗布面が対向するように貼り、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。これに、洗浄した馬赤血球Ｈｔ０、２０、４０、６０＋グルコース１００ｍｇ／ｄＬを添加し、５秒間閉回路０ｍＶ印加後、各サンプリングタイムで閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００６１】
［結果］
１．図１０（ａ）〜（ｃ）にＡＷＰにＧＤＨを混合し塗布した場合のＨｔ４０を１００％の電流値としたときの各ヘマトクリット値におけるサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値を示す。実施例１の結果と比較し全体を通して、ヘマトクリットの影響は、ＡＷＰのみ塗布した場合、ほとんどヘマトクリットの影響が見られなかったが、ＧＤＨを混合塗布した場合はヘマトクリットの影響が見られていたため、ＧＤＨ１．６ｕｎｉｔ／ｍｌとＡＷＰの固定可能量を超えた、かなり過剰量が入っているため、赤血球がアクセスする隙間を作ってしまっている可能性がある。【００６２】
２．図１１（ａ）〜（ｃ）にＨｔ４０を１００％の電流値としたときの各ヘマトクリット値におけるサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値をプロットしたものを示す。ＡＷＰ膜上に試薬を塗布乾燥すると、膜の状態が悪くなるようで、ＡＷＰなしよりかなり影響が大きく見えてしまった。【００６３】
３．図１２（ａ）〜（ｃ）にＨｔ４０を１００％の電流値としたときの各ヘマトクリット値におけるサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値をプロットしたものを示す。先の２．のＡＷＰ膜上に試薬を塗布した場合はヘマトクリットの影響をより受けるようになってしまっていたが、キャピラリーシールに塗布する方法であれば、測定が可能であり、ヘマトクリットの影響を受けにくくする効果がみられることが分かった。【００６４】
実験例４
［方法］
スクリーン印刷により形成した印刷マスクを使用し作成した金電極１０４に、ＡＷＰ１％水溶液、１ｍｌを塗布し３７℃で４５分乾燥させ、６０ｍＪ／ｃｍ３のＵＶ（３５２ｎｍ）照射（ＣＨＩＢＩ  ＬＩＧＨＴ  ｍｏｄｅｌ−１で３０ｓｅｃ）を行った後、フェリシアン化カリウム２００ｍＭ、ＧＤＨ  ２ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．５）、ルーセンタイトＳＷＮ０．３％、５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを０．８ｍｌで復水した時にそれぞれの濃度になるように調製したものを１ｍｌ、キャピラリーシール上に塗布し、３７℃で１０分、５０℃で５分乾燥させたものを、ＡＷＰ塗布金電極の電極面にキャピラリーシールへの試薬塗布面が対向するように貼り、シリカゲル入りの箱に入れ室温で保存した。これに、種々の濃度のグルコース溶液を添加し、５秒間閉回路０ｍＶ印加後、各サンプリングタイムで閉回路＋２００ｍＶ印加し、電流値を測定した。【００６５】
［結果］
図１３に電流値のタイムコース、図１４（ａ）〜（ｃ）にサンプリングタイム１，５，２０秒の電流値の結果を示す。グルコース高濃度でばらつきが少し大きいが、８００ｍｇ／ｄＬまで直線性があった。ＡＷＰを電極側に塗布し、酵素、メディエーター等の試薬をキャピラリー側に塗布することで測定が可能だった。【００６６】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１３年１月１７日付で出願された日本特許出願（特願２０１３−００６５６０）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【符号の説明】
【００６７】
１０  バイオセンサ
１０２  絶縁性基板
１０４  電極系
１０４２  作用極
１０４４  対極
１０８  スペーサー
１０９  カバーフィルム
２０２  親水性高分子層
２０４  試薬層
Ａ  吸引口
Ｃ  キャビティ
Ｖ  空気孔
【図１】
2014112570.tif 000004
【図２】
2014112570.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月17日(2014.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の血液成分を酸化還元酵素により酸化し、その反応生成物の酸化電流を電極で検出し、前記血液成分を測定するバイオセンサであって、
前記バイオセンサは、電気絶縁性の基板と、前記電気絶縁性の基板上に形成された作用極および対極を有する電極系と、酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層とを有し、
前記電極系は金により形成され、
前記電極系上には親水性高分子層が設けられ、
前記親水性高分子層と前記酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層が分離して配置され、
前記親水性高分子層が、光架橋性ポリマーにより形成され、
前記光架橋性ポリマーがポリビニルアルコールを骨格とするポリマーであることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記親水性高分子層上に前記試薬層が設けられている請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設け、これとは別に、カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設け、前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせてなることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記血液成分が、グルコースであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
電気絶縁性の基板上に、作用極および対極を有する電極系と親水性高分子層とをこの順で設ける第１工程と、
カバーフィルム上に酸化還元酵素およびレドックスメディエーターを含む試薬層を設ける第２工程と、
前記親水性高分子層と前記試薬層とを向き合わせるようにして前記電気絶縁性の基板、前記電極系および前記カバーフィルムとを一体的に貼り合わせる第３工程とを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサを製造する方法。
【国際調査報告】
2014112570.tif 000020
2014112570.tif 000021