(57)【要約】  本発明は、代謝性骨疾患の症状を改善することができる代謝性骨疾患用光治療器を提供することを課題とする。本発明は、近赤外光を主たる波長帯域とする治療光を出力する光源（７）、（８）を備えるとともに、前記光源（７）、（８）から出力された治療光を患部（５）に照射する光源部を少なくとも有する、代謝性骨疾患用光治療器（１）に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外光を主たる波長帯域とする治療光を出力する光源を備えるとともに、前記光源から出力された治療光を患部に照射する光源部を少なくとも有する、代謝性骨疾患用光治療器。
【請求項２】
前記光源部が、複数の光源を備え、前記複数の光源それぞれから出力された治療光を前記患部に面照射する、請求項１に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
【請求項３】
前記光源部が、青色光を含む治療光を前記患部に対して照射する、請求項１または２に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
【請求項４】
前記近赤外光は、７００〜９００ｎｍの光である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
【請求項５】
前記代謝性骨疾患が、骨粗鬆症、骨ページェット病、関節リウマチおよび変形性関節症から選ばれるいずれか１に伴う関節骨または軟骨変性の関節疾患である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝性骨疾患用光治療器に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝性骨疾患は、骨組織において骨を形成する骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）および骨を破壊する破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨代謝のバランスが崩壊する疾患である。この代謝性骨疾患には、例えば、骨粗鬆症、骨軟化症、大理石病等がある。また、関節リウマチを発症した患者は、骨粗鬆症等の代謝性骨疾患を合併している場合が多い。【０００３】
従来、例えば、関節リウマチを対象とした光治療装置が提案されている（例えば、特許文献１）。この光治療装置は、生体への浸透性の高い近赤外光を主たる波長帯域とした治療光を関節リウマチ患者の手指関節等の患部に照射することで、血管を拡張し、末梢神経の機能を改善することで、疼痛の緩解、消炎効果を実現するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特開２００９−２０７６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した従来の技術は、患部への治療光照射により一時的に一定期間、疼痛の緩解、消炎効果を実現するものであって、疾患自体の症状を改善するものではないため、疾患自体の症状を改善する技術が望まれていた。【０００６】
したがって本発明の目的は、代謝性骨疾患の症状を改善することができる代謝性骨疾患用光治療器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の通りである。
１．近赤外光を主たる波長帯域とする治療光を出力する光源を備えるとともに、前記光源から出力された治療光を患部に照射する光源部を少なくとも有する、代謝性骨疾患用光治療器。
２．前記光源部が、複数の光源を備え、前記複数の光源それぞれから出力された治療光を前記患部に面照射する、前記１に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
３．前記光源部が、青色光を含む治療光を前記患部に対して照射する、前記１または２に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
４．前記近赤外光は、７００〜９００ｎｍの光である、前記１〜３のいずれか１に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
５．前記代謝性骨疾患が、骨粗鬆症、骨ページェット病、関節リウマチおよび変形性関節症から選ばれるいずれか１に伴う関節骨または軟骨変性の関節疾患である、前記１〜４のいずれか１に記載の代謝性骨疾患用光治療器。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の代謝性骨疾患用光治療器によれば、代謝性骨疾患自体の症状を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施の形態１において、培養細胞を用いた光照射実験の操作の流れを説明する補助図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態１の実験１−１において、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量の測定結果を示す図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態１の実験１−２において、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３の産生量の測定結果を示す図である。
【図４】図４は、実施の形態１の実験１−２において、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−１３の産生量の測定結果を示す図である。
【図５】図５（ａ）および（ｂ）は、実施の形態１の実験２−１において、正常骨芽細胞のＡＬＰ活性の測定結果を示す図である。
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、実施の形態１の実験２−２において、正常骨芽細胞のオステオカルシンの産生量の測定結果を示す図である。
【図７】図７（ａ）および（ｂ）は、実施の形態１の実験３−１−１において、破骨細胞数の計測結果を示す図である。
【図８】図８（ａ）および（ｂ）は、実施の形態１の実験３−１−２において、破骨細胞による象牙質切片の溶解度合いの測定結果を示す図である。
【図９】図９（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態１の実験３−１−２において、破骨細胞により溶解された象牙質切片の画像の一例を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）および（ｂ）は、実施の形態１の実験３−２−１において、破骨細胞数の計測結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施の形態１の実験３−２−２において、破骨細胞による象牙質切片の溶解度合いの測定結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施の形態１の実験３−３において、変形性膝関節症患者由来の軟骨細胞の軟骨基質プロテオグリカンの産生量の測定結果を示す図である。
【図１３】図１３（ａ）および（ｂ）は、実施の形態２において、健常ラットとＣＩＡモデルの左後肢を示す画像である。
【図１４】図１４は、実施の形態２の実験５−１−１において、ＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みの計測結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施の形態２の実験５−１−２において、ＣＩＡモデルの行動量の計測結果を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態２の実験５−１−２において、ラットの行動の軌跡の計測結果の一例を示す図である。
【図１７】図１７（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態２の実験５−２によるＣＩＡモデルの右後肢膝関節の長軸断面のＨＥ染色の病理標本の画像である。
【図１８】図１８（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態２の実験６−１において、ＣＩＡモデルの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像の画像である。
【図１９】図１９は、実施の形態２の実験６−１において、ＣＩＡモデルの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像の輝度値の計測結果を示す図である。
【図２０】図２０（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態２の実験６−２において、ＣＩＡモデルの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の画像である。
【図２１】図２１（ａ）〜（ｃ）は、実施の形態２の実験６−３において、ＣＩＡモデルの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の画像である。
【図２２】図２２は、実施の形態３の実験７において用いられた代謝性骨疾患用光治療器の斜視図である。
【図２３】図２３は、実施の形態３の実験７において用いられた代謝性骨疾患用光治療器の断面図である。
【図２４】図２４は、実施の形態３の実験７において用いられた代謝性骨疾患用光治療器の使用状態を示す図である。
【図２５】図２５は、実施の形態３の実験７において、第１の患者の手指部分のＭＲＩ画像である。
【図２６】図２６は、実施の形態３の実験７において、第２の患者の手指部分のＭＲＩ画像である。
【図２７】図２７は、実施の形態３の実験７において、第３の患者の手指部分のＭＲＩ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の代謝性骨疾患用光治療器は、近赤外光を主たる波長帯域とする治療光を出力する光源を備えるとともに、前記光源から出力された治療光を患部に照射する光源部を少なくとも有する。
【００１１】
なお、本発明でいう「代謝性骨疾患の治療」とは、代謝性骨疾患自体の状態を改善することをいう。すなわち、代謝性骨疾患自体の状態を改善することとは、代謝性骨疾患による骨密度の減少の進行を抑制すること、骨密度の減少の進行を停止すること又は骨密度が増加することをいう。
【００１２】
代謝性骨疾患としては、例えば、骨粗鬆症、骨ページェット病、関節リウマチ若しくは変形性関節症に伴う関節骨または軟骨変性の関節疾患が挙げられる。
【００１３】
本発明の代謝性骨疾患用光治療器が骨粗鬆症および骨ページェット病に有効である理由を以下に述べる。
【００１４】
ビスフォスフォネート系薬剤（例えば、エチドロン酸二ナトリウムまたはリセドロン酸ナトリウム水和物など）は骨粗鬆症または骨ページェット病の治療薬として使用されており、次のような作用機序で破骨細胞に作用し骨吸収を抑制していると考えられている。
【００１５】
まずビスフォスフォネート系薬剤がハイドロキシアパタイトと強く結合し骨表面に沈着する。破骨細胞は液胞型プロトンＡＴＰａｓｅを介してプロトン（Ｈ＋）を骨表面に放出し骨吸収窩を形成するが、骨吸収窩は酸性環境であるためビスフォスフォネート系薬剤は骨から遊離し、破骨細胞に取り込まれる。取り込まれたビスフォスフォネート系薬剤は破骨細胞のファルネシルピロリン酸合成酵素を阻害することでアポトーシスを誘導し、骨吸収を抑制すると考えられている。
【００１６】
後述する実施例では、破骨細胞を用いた実験により光を照射することで成熟破骨細胞への分化を抑制し、また破骨細胞の活性化も抑制することが確認された。また動物実験により光を照射することでラットの骨密度減少を抑制する結果が示された。
【００１７】
これらの結果はビスフォスフォネート系薬剤と同様に光は破骨細胞に作用し骨吸収を抑制する効果を有することを示している。したがって、本発明の代謝性骨疾患用光治療器は骨粗鬆症および骨ページェット病の治療に有効であると考えられる。
【００１８】
また、本発明の代謝性骨疾患用光治療器が関節リウマチおよび変形性関節症に伴う関節骨・軟骨変性の関節疾患に有効である理由を以下に述べる。
【００１９】
関節リウマチは滑膜を炎症の主座とする慢性炎症性疾患であり、関節軟骨だけでなく骨にまで破壊が進むのに対し、加齢または関節への過負荷に伴う変形性関節症は組織の変性・破壊が軟骨にほぼ限定されるが、両疾患とも関節炎を伴った関節破壊という病変が特徴である。
【００２０】
炎症により変性した滑膜細胞または軟骨細胞からＭＭＰ−３またはＭＭＰ−１３などの軟骨基質を分解するマトリックスメタロプロテアーゼが産生され関節軟骨を分解し骨破壊が進行することが分かっている。
【００２１】
後述する実施例では、滑膜細胞を用いた実験より光を照射することでＭＭＰ−３またはＭＭＰ−１３の産生が抑制されることが確認され、また動物実験の病理標本観察からも軟骨破壊抑制が示されている。さらに、後述する実施例では、軟骨細胞を用いた実験より青色光（４７０ｎｍ）の照射により、軟骨細胞からの軟骨基質プロテオグリカンの産生を促進することが示されている。したがって、本発明の代謝性骨疾患用光治療器は、関節リウマチおよび変形性関節症に伴う関節骨・軟骨変性の関節疾患の治療に有効であると考えられる。
【００２２】
本発明において治療光として、主たる波長領域として近赤外光が用いられる理由は、後述の実施の形態１〜３の実験結果で示す通り、近赤外光は骨代謝のバランス改善に有用であり、また、水や血液中のヘモグロビンに吸収され難いため、患部の深部組織まで治療光を供給することができるからである。
【００２３】
以下、代謝性疾患の治療に使用する近赤外光を主たる波長帯域とする治療光の条件について説明する。なお、下記条件は、患者の性別、年齢、身長、体重または疾病の症状等を考慮して、その範囲内から適宜選択することができる。
【００２４】
本発明において、近赤外光とは、概ね７００〜９００ｎｍの波長を指す。本発明において、近赤外光を主たる波長帯域とする治療光の照射は、経皮的照射であることが好ましい。本発明において、近赤外光を主たる波長帯域とする治療光は、連続照射またはパルス照射であることができる。
【００２５】
本発明の代謝性骨疾患用光治療器の光源部は、前記光源から近赤外光を主たる波長帯域とする治療光を複数の光源から出力し、これを患部に面照射するのが治療効果の観点から好ましい。本発明で言う面照射とは、治療光が照射される領域が点ではなく面であることを意味する。治療光は、患部の全体にわたって実質的に一様に照射され、局部的な照射が認められないことが好ましい。
【００２６】
なお、本発明の治療光は近赤外光に限定されず、たとえば、概ね３００〜１０００ｎｍの波長帯域とする治療光が挙げられる。上記波長帯域の治療光のうち、例えば、青色光としては、概ね４３０〜５００ｎｍの波長を指し、赤色光としては、概ね６００〜７５０ｎｍの波長を指す。
【００２７】
また、本発明の代謝性骨疾患用光治療器における光源は、前記の各条件を満たす公知の光源であることができ、該光源は、公知の照射装置に組み込むことができる。このような公知の照射装置としては、例えば、ＩＮＮＯＶＡＴＩＶＥ  ＭＥＤ  ＭＵＬＴＩ  ＷＡＶＥ  ＬＩＧＨＴ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＳＹＳＴＥＭ（ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ＭＥＤ  ＩＮＣ．製）等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明の実施の形態の一態様に係る代謝性骨疾患用光治療器について、図面とともに説明する。
また、以下の実施の形態では、代謝性骨疾患を合併した関節リウマチ及び変形性関節症を例に説明しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、代謝性骨疾患全般に用いることができる。【００２９】
（実施の形態１）
実施の形態１では、培養細胞を用いた実験により近赤外光を主たる波長帯域とする治療光が代謝性骨疾患自体の症状の改善に有用であることを示すものである。【００３０】
≪実験１≫
該実験１では、インターロイキン−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β、以下、「ＩＬ−１β」と略する。）を添加することにより擬似的に炎症が誘導された滑膜線維芽細胞（Ｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）における光の影響を評価した。【００３１】
具体的には、実験１は、ＩＬ−１βにより炎症が誘導された滑膜線維芽細胞に光を照射した場合と照射しなかった場合における滑膜線維芽細胞のインターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６、以下、「ＩＬ−６」と略する。）、マトリックスメタプロテイナーゼ−３（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎｇａｓｅ−３、以下、「ＭＭＰ−３」と略する。）およびマトリックスメタプロテイナーゼ−１３（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎｇａｓｅ−１３、以下、「ＭＭＰ−１３」と略する。）の産生量を測定し、光の影響が評価した。なお、ＩＬ−６、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３は、代謝性骨疾患の評価マーカではなく、関節リウマチ自体の症状の評価マーカである。【００３２】
実験１の評価マーカとしてＩＬ−６を用いた理由は、次の理由からである。ＩＬ−６は、ＩＬ−１βにより滑膜線維芽細胞で炎症が生じることに伴い産生される炎症マーカの一つであって、関節リウマチにおいて炎症の臨床的評価に一般的に用いられている。【００３３】
したがって、光が関節リウマチの炎症抑制効果を有するか否かは、光を照射した場合と照射しなかった場合とにおける滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量を比較することで評価することができる。それゆえ、ＩＬ−６を、実験１における評価マーカとして用いた。本実験は、光の炎症抑制効果を確認するために行われたものである。以下、この実験を「実験１−１」とする。【００３４】
また、実験１の評価マーカとしてＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３を用いた理由は、次の理由からである。ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３は、滑膜線維芽細胞の炎症に伴い産生される酵素であって、軟骨基質を溶解する機能を有する。【００３５】
関節リウマチの初期症状又は中期症状における滑膜線維芽細胞は、このＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の産生量が増大することが知られている。すなわち、滑膜線維芽細胞からＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の産生量が増大しているということは、軟骨の溶解の進行していることを示し、結果的に骨への損傷が起こり得る状況であることが分かる。【００３６】
したがって、光が骨への損傷初期である軟骨の溶解抑制効果を有するか否かは、光を照射した場合としなかった場合とにおける滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３およびＭＭ−１３の産生量の比較を行うことで評価できる。それゆえ、ＭＭＰ−３およびＭＭ−１３を、実験１における評価マーカとして用いた。以下、この実験を「実験１−２」とする。【００３７】
実験１で用いた滑膜線維芽細胞は、変形性膝関節症患者（８１歳、女性、ステージ４（ＳｔｅｉｎｂｒｏｃｋｅｒによるＸ線学的にみた骨破壊病変をもとにした病期分類：ステージ１〜４）、クラス３［Ｓｔｅｉｎｂｒｏｃｋｅｒによる生活動作をもとにした機能障害分類：クラス１〜４）］から採取したものである。【００３８】
また、実験１の滑膜線維芽細胞に照射する光の波長（ｎｍ）、滑膜線維芽細胞に照射した光のパワー密度（ｍＷ／ｃｍ２）、滑膜線維芽細胞に照射する光の照射時間（秒）は、以下の［表１］に示す１２通りの条件で行った。【００３９】
【表１】
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【００４０】
また、上記１２通りの条件で行った実験結果は、ＩＬ−１βによって炎症が誘導された滑膜線維芽細胞であって、光の照射を行わなかった場合をネガティブ（以下、「ネガティブコントロール」とする。）、ＩＬ−１βによって炎症が誘導されていない滑膜線維芽細胞であって、光の照射を行わなかった場合をポジティブ（以下、「ポジティブコントロール」とする。）、としたコントロールに基づき評価を行った。【００４１】
＜実験１の手順＞
実験１（実験１−１および実験１−２）を以下の手順により行った。【００４２】
（１）Ｓｉｇｍａ製の基本培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ，ｗｉｔｈ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ）に、終濃度が１０％となるようにＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ，ＩＮＣ製のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、以下、「ＦＢＳ」と略する。）および終濃度を１％となるようにＧＩＢＣＯ製のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｉｎｅ（５０００Ｕ／ｍｌ）を添加し、第１の調製培地を準備した。【００４３】
（２）患者から採取した滑膜線維芽細胞は、ＣＯ２インキュベータ内において第１の調製培地中で３７℃にて３回継代を行った。【００４４】
（３）第１の調製培地に終濃度が０．０１ｎｇ／ｍｌとなるようにＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製ＩＬ−１βを添加した第２の調製培地を準備し、滑膜線維芽細胞が培養されている第１の調製培地を第２の調製培地に交換した。【００４５】
（４）図１に示すように、第２の調製培地に交換した透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【００４６】
（５）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【００４７】
（６）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後および４８時間後の各ウェルの培養液の上清を回収した。【００４８】
（７）回収した培養液の上清に含まれるＩＬ−６、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の濃度の測定は、それぞれＥＬＩＳＡ法により行った。なお、ＩＬ−６濃度のＥＬＩＳＡは、Ｒ＆Ｄ製のキット（ＩＬ−６、Ｈｕｍａｎ、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、型番Ｓ６０５０）が用いられ、ＭＭＰ−３濃度のＥＬＩＳＡは、Ｒ＆Ｄ製のキット（ＭＭＰ−３、Ｔｏｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、ＳＭＰ３００）が用いられ、ＭＭＰ−１３濃度のＥＬＩＳＡは、Ｒ＆Ｄ製のキット（ＭＭＰ−１３、Ｐｒｏ−ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、ＳＭＰ１３００）が用いられた。【００４９】
＜実験１の評価結果＞
１．実験１の評価結果について
図２（ａ）〜（ｃ）は、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞によるＩＬ−６の産生量の測定結果を示している。図２（ａ）は近赤外光（８４０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量の経時変化を示している。図２（ｂ）は赤色光（６６０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量の経時変化を示している。図２（ｃ）は青色光（４７０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量の経時変化を示している。【００５０】
図２（ａ）〜（ｃ）の結果から、滑膜線維芽細胞に光を照射した後２４時間経過以降において、滑膜線維芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の光を５０秒間照射した場合［図２（ａ）〜（ｃ）中の黒三角］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の光を５００秒間照射した場合［図２（ａ）〜（ｃ）中の△］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の光を５０秒間照射した場合［図２（ａ）〜（ｃ）中の黒四角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の光を５００秒間照射した場合［図２（ａ）〜（ｃ）中の□］におけるＩＬ−６の産生量は、近赤外光（８４０ｎｍ）、赤色光（６６０ｎｍ）および青色光（４７０ｎｍ）のいずれの場合においても、僅かではあるがネガティブコントロールの場合［図２（ａ）〜（ｃ）中の○］と比較して、滑膜線維芽細胞のＩＬ−６の産生量よりも少なくなってきていることが理解できる。【００５１】
すなわち、図２（ａ）〜（ｃ）の結果は、近赤外光、青色光、赤色光を問わず、僅かではあるが光の照射により滑膜線維芽細胞からのＩＬ−６の産生を抑制していることを示唆するものだといえる。したがって、実験１−１の結果より、滑膜線維芽細胞への光の照射が炎症抑制効果を有していることを確認できた。【００５２】
２．実験１−２の評価結果について
図３（ａ）〜（ｃ）は、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞によるＭＭＰ−３の産生量の測定結果を示している。図３（ａ）は近赤外光（８４０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３の産生量の経時変化を示している。図３（ｂ）は赤色光（６６０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３の産生量の経時変化を示している。図３（ｃ）は青色光（４７０ｎｍ）を照射した滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３の産生量の経時変化を示している。【００５３】
図３（ａ）〜（ｃ）の結果から、滑膜線維芽細胞に光を照射した後１２時間経過以降において、滑膜線維芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の光を５０秒間照射した場合［図３（ａ）〜（ｃ）中の黒三角］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の光を５００秒間照射した場合［図３（ａ）〜（ｃ）中の△］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の光を５０秒間照射した場合［図３（ａ）〜（ｃ）中の黒四角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の光を５００秒間照射した場合［図３（ａ）〜（ｃ）中の□］におけるＭＭＰ−３の産生量は、近赤外光（８４０ｎｍ）、赤色光（６６０ｎｍ）および青色光（４７０ｎｍ）のいずれの場合においても、ネガティブコントロールの場合［図３（ａ）〜（ｃ）中の○］と比較して、滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−３の産生量よりも少なくなってきていることが理解できる。【００５４】
すなわち、図３（ａ）〜（ｃ）の結果は、近赤外光、青色光、赤色光を問わず、光の照射により滑膜線維芽細胞からのＭＭＰ−３の産生を抑制していることを示唆するものだといえる。【００５５】
一方、図４は、変形性膝関節症患者由来の滑膜線維芽細胞に光を照射した後４８時間経過時のＭＭＰ−１３の産生量の測定結果を示している。【００５６】
図４に示すＩＬ−１β（−）とは、滑膜線維芽細胞がＩＬ−１βによって炎症が誘導されていない場合を示し、ＩＬ−１β（＋）は滑膜線維芽細胞がＩＬ−１βによって炎症が誘導されている場合を示している。また、図４に示すＬＥＤ（−）とは、滑膜線維芽細胞に光が照射されていない場合を示している。したがって、図４におけるＩＬ−１β（−）およびＬＥＤ（―）はポジティブコントロールの結果を示し、ＩＬ−１β（＋）およびＬＥＤ（―）はネガティブコントロールの結果を示している。【００５７】
図４の結果から、滑膜線維芽細胞のＭＭＰ−１３の産生量は、近赤外光（８４０ｎｍ）、赤色光（６６０ｎｍ）および青色光（４７０ｎｍ）のいずれの光を照射しても、ネガティブコントロールよりも少ないことが理解できる。【００５８】
すなわち、図４の結果は、近赤外光、青色光、赤色光を問わず、光の照射により滑膜線維芽細胞からのＭＭＰ−１３の産生を抑制していることを示唆するものだといえる。【００５９】
実験１−２から、光の照射によって滑膜線維芽細胞からＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の産生が抑制されている結果を得ることができ、光が軟骨基質融解の抑制効果を有している可能性を新たに見出すことができた。【００６０】
≪実験２≫
実験１では、滑膜線維芽細胞への光の照射が炎症抑制効果を有することを確認した。また、滑膜線維芽細胞への光の照射がＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の産生抑制効果を有する（すなわち、光の照射が軟骨基質融解の抑制効果を有すること。）可能性が新たに見出された。【００６１】
次に骨代謝における光の影響の検討を行った。実験２は、骨代謝のうち、骨形成に係る骨芽細胞における光の影響を評価したものである。具体的には、実験２では、正常骨芽細胞に光を照射した場合としなかった場合において、正常骨芽細胞から産生されるアルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、以下、「ＡＬＰ」と略する。）の活性およびオステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の産生量の比較を行い、骨芽細胞における光の影響を評価した。【００６２】
なお、ＡＬＰおよびオステオカルシンは、骨芽細胞の活性度合いを示すマーカであって、特にオステオカルシンは骨形成を直接的に示すマーカであることが知られている。それゆえ、実験２において、ＡＬＰおよびオステオカルシンを評価マーカとして用いた。【００６３】
また、実験２の骨芽細胞への光の照射条件は、実験１の［表１］と同様とした。また、実験２で行われた１２通りの実験結果は、正常骨芽細胞に光を照射しなかった場合をコントロールとして評価を行った。【００６４】
以下、正常骨芽細胞のＡＬＰ活性の評価を「実験２−１」、オステオカルシンの産生量の評価を「実験２−２」として説明する。【００６５】
＜実験２の手順＞
実験２を以下の手順により行った。【００６６】
１．実験２−１の実験手順について
（１）ＬＯＮＺＡ製骨芽細胞基本培地ＯＢＭに、終濃度が０．１％となるようにＬＯＮＺＡ製アスコルビン酸、終濃度が１０％となるようにＬＯＮＺＡ製ＦＢＳおよび終濃度が０．１％となるようにＬＯＮＺＡ製ＧＡ−１０００を添加した第３の調製培地を準備した。【００６７】
（２）Ｌｏｎｚａ製ヒト由来骨芽細胞（Ｃａｔ＃：ＣＬＣＣ−２５３８）は、ＣＯ２インキュベータ内において第３の調製培地中で３７℃にて２回継代を行った。【００６８】
（３）第３の調製培地に終濃度が２００ｎＭとなるようにＬＯＮＺＡ製ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、終濃度が１０ｍＭとなるようにＬＯＮＺＡ製β―グリセロリン酸を添加した第４の調製培地を準備し、ヒト由来骨芽細胞が培養されている第３の調製培地を第４の調製培地に交換した。【００６９】
（４）第４の調製培地に交換した透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備し各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【００７０】
（５）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【００７１】
（６）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後０日後、９日後、１２日後および１８日後の各ウェルの培養液の上清を回収した。【００７２】
（７）回収した培養上清に含まれるＡＬＰ活性の評価は、プライマリーセル製のＡＬＰ染色キット（Ｃａｔ＃  ＡＫ２０）を用いて骨芽細胞を染色することにより行った。また、回収した培養上清に含まれるオステオカルシンの濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ法により行った。なお、オステオカルシン濃度は、タカラバイオ株式会社製のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｇｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ、Ｃａｔ＃：ＭＫ１２８）を用いて測定した。【００７３】
＜実験２の評価結果＞
１．実験２−１の評価結果について
図５（ａ）および（ｂ）は、正常骨芽細胞から産生されたＡＬＰ活性の測定結果を示している。図５（ａ）は正常骨芽細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５０秒間照射した後の正常骨芽細胞のＡＬＰ活性の経時変化を示している。図５（ｂ）は正常骨芽細胞に各波長の光を１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５００秒間照射した後の正常骨芽細胞のＡＬＰ活性の経時変化を示している。【００７４】
なお図５（ａ）および（ｂ）における縦軸の「Ａｒｅａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ」とは、一定視野範囲内におけるＡＬＰ活性を示す骨芽細胞が占める面積の割合のことをいう。骨芽細胞が成長と同時に産生するＡＬＰを染色することで、染色された細胞が骨形成を示す骨芽細胞と評価できるので、染色された骨芽細胞が一定視野範囲内を占める割合（Ａｒｅａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を画像的に解析することで一定視野範囲内におけるＡＬＰ活性を示す骨芽細胞が占める面積の割合を数値的に算出することができる。【００７５】
図５（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の黒四角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の□］のいずれに場合においても、正常骨芽細胞から産生されたＡＬＰ活性は、コントロールの場合［図５（ａ）および（ｂ）中の×］と比較してほとんど差異がないことが理解できる。すなわち、この結果は、正常骨芽細胞への近赤外光（８４０ｎｍ）の照射がＡＬＰ活性に影響がないことを示唆するものと考えられる。【００７６】
一方、図５（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の●］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の○］のいずれの場合においても、正常骨芽細胞への青色光の照射後１２日経過以降、コントロールの場合［図５（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して、正常骨芽細胞から産生されたＡＬＰ活性と比較して大きく活性が低下したことが理解できる。【００７７】
また、図５（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の黒三角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０間秒又は５００秒間照射した場合［図５（ａ）および（ｂ）中の△］、青色光の結果同様、いずれの場合においても、正常骨芽細胞への赤色光の照射後１２日経過以降、コントロールの場合［図５（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して、ＡＬＰ活性と比較して大きく活性が低下したことが理解できる。【００７８】
すなわち、この結果は、正常骨芽細胞への青色光（４７０ｎｍ）および赤色光（６６０ｎｍ）の照射が、ＡＬＰ活性を抑制することを示唆するものと考えられる。【００７９】
図５の結果から骨芽細胞への近赤外光の照射は、骨芽細胞のＡＬＰ活性に影響があることは見出すことができなかった。一方、骨芽細胞への青色光および赤色光の照射は、骨芽細胞のＡＬＰ活性を低下させる結果を得た。すなわち、係る実験結果は、少なくとも青色光および赤色光は、骨芽細胞の活性（すなわち、骨形成）に好ましくない影響を与える可能性があることが推測される。【００８０】
２．実験２−２の評価結果について
図６（ａ）および（ｂ）は、正常骨芽細胞から産生されたオステオカルシンの産生量の測定結果を示している。図６（ａ）は正常骨芽細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５０秒間照射した後の正常骨芽細胞のオステオカルシンの産生量の経時変化を示している。図６（ｂ）は正常骨芽細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５００秒間照射した後の正常骨芽細胞のオステオカルシンの産生量の経時変化を示している。【００８１】
図６（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の黒四角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の□］のいずれの場合においても、コントロールの場合［図６（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して、オステオカルシンの産生量が上回ったことが理解できる。すなわち、この結果は、骨芽細胞への近赤外光（８４０ｎｍ）の照射は、骨芽細胞を活性させ、骨形成が促進される可能性があることを示唆している。【００８２】
一方、図６（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の●］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の○］のいずれの場合においても、正常骨芽細胞への青色光の照射後８日経過以降、コントロールの場合［図６（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して、正常骨芽細胞からのオステオカルシンの産生量が大きく低下したことが理解できる。【００８３】
また、図６（ａ）および（ｂ）の結果から、正常骨芽細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の黒三角］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の光を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図６（ａ）および（ｂ）中の△］、青色光の結果同様、いずれの場合においても、正常骨芽細胞への赤色光の照射後８日経過以降、コントロールの場合［図６（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して、正常骨芽細胞からのオステオカルシンの産生量が大きく低下したことが理解できる。【００８４】
すなわち、この結果は、正常骨芽細胞への青色光（４７０ｎｍ）および赤色光（６６０ｎｍ）の照射は、骨芽細胞の活性を低下させ、骨形成が抑制される可能性があることを示唆している。【００８５】
図６（ａ）および（ｂ）の結果から骨芽細胞への近赤外光の照射は、骨芽細胞の活性を向上させ、骨形成を促進させる可能性があることを見出した。一方、骨芽細胞への青色光および赤色光の照射は、骨芽細胞の活性を低下させ、骨形成を抑制させる可能性があることを見出した。【００８６】
≪実験３≫
実験３は、骨代謝のうち、骨融解に係る破骨細胞における光の影響について評価したものである。実験３の説明の前に、関節リウマチにおける骨破壊の作用機序について説明する。【００８７】
まず、滑膜線維芽細胞は、関節リウマチにより炎症を引き起こされると、破骨細胞の形成等に係る蛋白質であるＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｕｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ−Ｂ  Ｌｉｇａｎｄ）を細胞表層に提示する。次に、破骨前駆細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌ）は、滑膜線維芽細胞表層に提示されたＲＡＮＫＬと結合して分化を開始し、成熟破骨細胞（Ｍａｔｕｒｅ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）となる。【００８８】
通常時（関節リウマチが発症していない場合）では、この成熟破骨細胞が主に骨吸収を行い、一方で骨芽細胞が骨形成を行うことで一定のバランスを保持して骨代謝が行われる。しかし、関節リウマチの場合では、過度に生じた炎症により産生されるＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）が成熟破骨細胞に作用することとなる。【００８９】
成熟破骨細胞は、このＴＮＦ−αの作用により骨吸収を加速する活性型へ移行する。関節リウマチ患者は、健常者と比較して活性型の成熟破壊細胞が増加し、骨吸収が促進されている。その結果、関節リウマチ患者における骨は、骨形成と骨吸収のバランスが崩壊することで骨が損傷されている。【００９０】
実験３において、光が破骨前駆細胞の分化を抑制するか否かの評価（以下、「実験３−１」とする。）と、光が破骨細胞の活性型への変化を抑制しているか否かの評価（以下、「実験３−２」とする。）と、の２つの評価を行うことで破骨細胞における光の影響を評価した。【００９１】
＜実験３−１について＞
実験３−１の実験として第１の実験（以下、「実験３−１−１」とする。）と第２の実験（以下、「実験３−１−２」とする。）を行った。【００９２】
１．実験３−１−１について
実験３−１−１の実験として、破骨細胞から生成された酒石酸耐性酸ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、以下、「ＴＲＡＰ」と略する。）の量を測定し、破骨細胞における光の影響を評価した。【００９３】
ＴＲＡＰを評価に用いた理由は、破骨前駆細胞の分化により分化した破骨細胞はＴＲＡＰを生成し、このＴＲＡＰの生成により破骨細胞の有無が判断できるため、光が破骨前駆細胞の分化を抑制するか否かを評価することができるからである。【００９４】
具体的には、ＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞に光を照射し、その光の照射後に分化した成熟破骨細胞をＴＲＡＰ染色し、赤色に染色された破骨細胞数を計測した。【００９５】
なお、実験３−１−１の破骨前駆細胞への光の照射条件は、実験１の［表１］と同様とした。また、実験３−１−１で行われた１２通りの実験結果は、破骨前駆細胞に光を照射しなかった場合をコントロールとして破骨細胞における光の影響を評価した。【００９６】
２．実験３−１−２について
実験３−１−１の実験結果を確認するために、実験３−１−２を行った。実験３−１−２は、実験３−１−１で分化された破骨細胞が骨吸収を行っているかを評価したものである。【００９７】
具体的には、ＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞を象牙質切片上で培養させ、この破骨前駆細胞に光を照射することで、分化された破骨細胞の象牙質切片の溶解度合いを評価した。なお、破骨細胞が象牙質切片を溶解すると、象牙質切片表面が他の部分と比較して黒くなるため、各時間で象牙質切片表面の画像を取得し、その画像の輝度値から象牙質切片の溶解部分の面積を算出した。【００９８】
なお、実験３−１−２の破骨前駆細胞への光の照射条件は、実験１の［表１］と同様である。また、実験３−１−２で行われた１２通りの実験結果は、破骨前駆細胞に光を照射しなかった場合をコントロールとして評価した。【００９９】
＜実験３−１の手順＞
実験３−１を以下の手順により行った。【０１００】
１．実験３−１−１の手順について
（１）ＬＯＮＺＡ製ヒト破骨前駆細胞基本培地ＯＢＰＭに、終濃度が２ｍＭとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎａｔｅ、終濃度が１０％となるようにＬＯＮＺＡ製ＦＢＳおよび終濃度が１％となるようにＬＯＮＺＡ製ＧＡ−１０００を添加した第５の調製培地を準備した。【０１０１】
（２）Ｌｏｎｚａ製ヒト由来破骨前駆細胞（２Ｔ−１１０）は、ＣＯ２インキュベータ内において第５の調製培地中で３７℃で培養を行った。【０１０２】
（３）第５の調製培地に終濃度が３０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製ＲＡＮＫＬ、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｍ−ＣＳＦを添加した第６の調製培地を準備し、ヒト由来破骨前駆細胞が培養されている第５の調製培地を第６の調製培地に交換した。【０１０３】
（４）第６の調製培地に交換した透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【０１０４】
（５）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【０１０５】
（６）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後２日後、４日後、６日後、８日後、１０日後、１２日後および１４日後の各ウェルで培養した破骨細胞をプライマリーセル製のＴＲＡＰ染色キット（ＡＫ０４Ｆ）により染色し、染色した破骨細胞数をカウントした。【０１０６】
２．実験３−１−２の手順について【０１０７】
（１）ＬＯＮＺＡ製ヒト破骨前駆細胞基本培地ＯＢＰＭに、終濃度が２ｍＭとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎａｔｅ、終濃度が１０％となるようにＬＯＮＺＡ製ＦＢＳおよび終濃度が１％となるようにＬＯＮＺＡ製ＧＡ−１０００を添加した第５の調製培地を準備した。【０１０８】
（２）Ｌｏｎｚａ製ヒト由来破骨前駆細胞（２Ｔ−１１０）は、ＣＯ２インキュベータ内において第５の調製培地中３７℃にて培養を行った。【０１０９】
（３）第５の調製培地に終濃度が３０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製ＲＡＮＫＬ、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｍ−ＣＳＦを添加した第６の調製培地を準備し、象牙質切片を備えたマルチウェルプレートに培養したヒト由来破骨前駆細胞を播種し、第６の調製培地に交換した。【０１１０】
（４）第６の調製培地に交換した透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【０１１１】
（５）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【０１１２】
（６）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後２日後、４日後、６日後、８日後、１０日後、１２日後および１４日後の各ウェルの象牙質切片を回収し、顕微鏡を用いて破骨細胞による象牙質切片の溶解度合いを観察した。【０１１３】
＜実験３−１の評価結果＞
１．実験３−１−１の評価結果について
図７は、ＴＲＡＰ染色により赤色に染色された破骨細胞数の計測結果を示している。図７（ａ）は、ＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞に各波長の光がパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５０秒間照射した後のＴＲＡＰ染色した破骨細胞数の経時変化を示している。図７（ｂ）はＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞に各波長の光がパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５００秒間照射した後のＴＲＡＰ染色した破骨細胞数の経時変化を示している。【０１１４】
図７（ａ）および（ｂ）の結果では、ＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の黒四角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の□］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の黒三角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の△］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の●］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図７（ａ）および（ｂ）中の○］のいずれの場合においても、コントロールの場合［図７（ａ）および（ｂ）中の×］と比較してＴＲＡＰ染色された破骨細胞数が少ない結果となった。【０１１５】
すなわち、図７の結果は、破骨前駆細胞に近赤外光（８４０ｎｍ）、赤色光（６６０ｎｍ）および青色光（４７０ｎｍ）を照射することで、破骨前駆細胞の成熟破骨細胞への分化を抑制していることを示唆するものである。【０１１６】
２．実験３−１−２の評価結果について
図８（ａ）および（ｂ）は、破骨細胞による象牙質切片の溶解面積の算出結果を示している。図８（ａ）は、破骨前駆細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５０秒間照射した後の破骨細胞による象牙異質切片の溶解面積の経時変化を示している。図８（ｂ）は破骨前駆細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５００秒間照射した後の破骨細胞による象牙異質切片の溶解面積の経時変化を示している。【０１１７】
図８（ａ）および（ｂ）の結果では、ＲＡＮＫＬを結合させた破骨前駆細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の黒四角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の□］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の黒三角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の△］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の●］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図８（ａ）および（ｂ）中の○］のいずれの場合においても、コントロールの場合［図８（ａ）および（ｂ）中の×］と比較して象牙異質切片の溶解面積が少ない結果となった。【０１１８】
実験３−１−１の光の照射により破骨前駆細胞の分化が抑制されていることを、光の照射により破骨細胞による骨融解も抑制された図８（ａ）および（ｂ）の結果においても確認することができた。【０１１９】
なお、一例として、図９（ａ）〜（ｃ）に実験３−１−２で取得した象牙質切片の画像を示す。図９（ａ）は、コントロールの場合における破骨前駆細胞の象牙質切片上での培養開始１０日目の画像である。図９（ｂ）は、コントロールの場合における破骨前駆細胞の象牙質切片上での培養開始１４日目の画像である。図９（ｃ）は、破骨前駆細胞にパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間照射後の破骨前駆細胞の象牙質切片上での培養開始１４日目の画像である。【０１２０】
同じサンプルである図９（ａ）と（ｂ）とを比較すると、培養開始１０日目に比べて１４日目のほうが、象牙質切片が溶解されていることが理解できる。また、同じ培養日数のサンプルである図９（ｂ）と（ｃ）とを比較すると、図９（ｂ）の方が、象牙質切片が溶解されていることが理解できる。【０１２１】
＜実験３−２について＞
実験３−２の実験として第１の実験（以下、「実験３−２−１」とする。）と第２の実験（以下、「実験３−２−２」とする。）を行った。【０１２２】
１．実験３−２−１について
実験３−２−１の実験として、ＴＮＦ−αを導入した成熟破骨細胞に光を照射し、光の照射後の成熟破骨細胞に対して実験３−１−１と同様ＴＲＡＰ染色を行い、染色された破骨細胞数を計測した。染色された破骨細胞数が多いほど活性型への移行が多いことを示すため、光を照射することで、光の照射が成熟破骨細胞の活性型への移行を抑制しているか否かを評価した。【０１２３】
２．実験３−２−２について
実験３−２−１の実験結果を確認するために、実験３−２−２を行った。実験３−２−２は、実験３−１−２と同様の実験である。【０１２４】
＜実験３−２の手順＞
実験３−２を以下の手順により行った。【０１２５】
１．実験３−２−１の手順について【０１２６】
（１）ＬＯＮＺＡ製ヒト破骨前駆細胞基本培地ＯＢＰＭに、終濃度が２ｍＭとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎａｔｅ、終濃度が１０％となるようにＬＯＮＺＡ製ＦＢＳおよび終濃度が１％となるようにＬＯＮＺＡ製ＧＡ−１０００を添加した第５の調製培地を準備した。【０１２７】
（２）ＬＯＮＺＡ製ヒト由来破骨前駆細胞（２Ｔ−１１０）は、ＣＯ２インキュベータ内において第５の調製培地中で３７℃にて培養を行った。【０１２８】
（３）第５の調製培地に終濃度が３０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製ＲＡＮＫＬ、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｍ−ＣＳＦを添加した第６の調製培地を準備し、ヒト由来破骨前駆細胞が培養されている第５の調製培地を第６の調製培地に交換した後、ＣＯ２インキュベータ内において第６の調製培地中で３７℃にて２週間培養した。【０１２９】
（４）第６の調製培地に終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製ＴＮＦ−αを添加した第７の調製培地を準備し、ヒト由来破骨前駆細胞が培養されている第６の調製培地を第７の調製培地に交換した。【０１３０】
（５）第７の調製培地に交換された透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【０１３１】
（６）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【０１３２】
（７）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後２日後、４日後、６日後、８日後、１０日後、１２日後および１４日後の各ウェルで培養した破骨細胞を、プライマリーセル製のＴＲＡＰ染色キット（ＡＫ０４Ｆ）により染色した。【０１３３】
２．実験３−２−２の手順について【０１３４】
（１）ＬＯＮＺＡ製ヒト破骨前駆細胞基本培地ＯＢＰＭに、終濃度が２ｍＭとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎａｔｅ、終濃度が１０％となるようにＬＯＮＺＡ製ＦＢＳおよび終濃度が１％となるようにＬＯＮＺＡ製ＧＡ−１０００を添加した第５の調製培地を準備した。【０１３５】
（２）ＬＯＮＺＡ製ヒト由来破骨前駆細胞（２Ｔ−１１０）は、ＣＯ２インキュベータ内において第５の調製培地中３７℃で培養を行った。【０１３６】
（３）第５の調製培地に終濃度が３０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製ＲＡＮＫＬ、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＯＮＺＡ製Ｍ−ＣＳＦを添加した第６の調製培地を準備し、象牙質切片を備えたマルチウェルプレートに培養したヒト由来破骨前駆細胞を播種し、第６の調製培地に交換した後、ＣＯ２インキュベータ内において第６の調製培地中で３７℃で２週間培養した。【０１３７】
（４）第６の調製培地に終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製ＴＮＦ−αを添加した第７の調製培地を準備し、ヒト由来破骨前駆細胞が培養されている第６の調製培地を第７の調製培地に交換した。【０１３８】
（５）第７の調製培地に交換された透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【０１３９】
（６）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【０１４０】
（７）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後４日後の各ウェルの象牙質切片を回収し、顕微鏡を用いて破骨細胞による象牙質切片の溶解度合いを観察した。【０１４１】
＜実験３−２の評価結果＞
１．実験３−２−１の評価結果について
図１０（ａ）および（ｂ）は、ＴＲＡＰ染色により赤色に染色された破骨細胞数の計測結果を示している。図１０（ａ）は、ＴＮＦ−αを導入することで活性型への移行が誘導された成熟破骨細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５０秒間照射した後にＴＲＡＰ染色した破骨細胞数の経時変化を示している。図１０（ｂ）はＴＮＦ−αを導入することで活性型への移行が誘導された成熟破骨細胞に各波長の光をパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２で５００秒間照射した後にＴＲＡＰ染色した破骨細胞数の経時変化を示している。【０１４２】
図１０（ａ）および（ｂ）の結果では、ＴＮＦ−αを導入することで活性型への移行が誘導された成熟破骨細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射し場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の黒四角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の□］、パワー密１ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の黒三角］、パワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の△］、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の●］およびパワー密度１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５０秒間又は５００秒間照射した場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の○］のいずれの場合においても、コントロールの場合［図１０（ａ）および（ｂ）中の×］と比較してＴＲＡＰ染色された破骨細胞数が少ない結果となった。【０１４３】
すなわち、図１０（ａ）および（ｂ）で示した結果は、成熟破骨細胞に近赤外光（８４０ｎｍ）、赤色光（６６０ｎｍ）および青色光（４７０ｎｍ）を照射することで、成熟破骨細胞からさらにＴＲＡＰを産生する活性型破骨細胞への移行を抑制していることを示唆している。【０１４４】
２．実験３−２−２の評価結果について
図１１は、破骨細胞による象牙質切片の溶解面積の算出結果を示している。図１１は、破骨細胞の象牙質切片での培養開始４日目の結果である。【０１４５】
図１１の結果から、ＴＮＦ−αを導入することで活性型への移行が誘導された成熟破骨細胞にパワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２の近赤外光（８４０ｎｍ）を５００秒間照射した場合、パワー密度１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２の赤色光（６６０ｎｍ）を５００秒間照射した場合、パワー密度（１ｍＷ／ｃｍ２乃至１０ｍＷ／ｃｍ２の青色光（４７０ｎｍ）を５００秒間照射した場合においても、コントロールの場合と比較して、象牙異質切片の溶解面積が少ない結果となった。【０１４６】
実験３−２−１の光の照射により成熟破骨細胞の活性型への移行が抑制されていることを、光の照射により破骨細胞による骨融解も抑制された図１１の結果においても確認することができた。【０１４７】
≪実験３−３≫
実験３−３は、ＩＬ−１βにより、軟骨基質プロテオグリカンの産生量が抑制された軟骨細胞に、光を照射した場合と照射しなかった場合における、軟骨細胞の軟骨基質プロテオグリカンの産生量を測定し、光の影響を評価した。【０１４８】
実験３−３で用いた軟骨細胞は、変形性膝関節症患者（７８歳、女性）から採取したものである。また、実験３−３の軟骨細胞への光の照射条件は、実験１の［表１］と同様とした。【０１４９】
また、上記１２通りの条件で行った実験結果は、ＩＬ−１βによって軟骨基質プロテオグリカンの産生量が抑制された軟骨細胞であって、光の照射を行わなかった場合をネガティブ（以下、「ネガティブコントロール」とする。）、ＩＬ−１βによって軟骨基質プロテオグリカンの産生量が抑制されない軟骨細胞であって、光の照射を行わなかった場合をポジティブ（以下、「ポジティブコントロール」とする。）、としたコントロールに基づき評価を行った。【０１５０】
＜実験３−３の手順＞
実験３−３を以下の手順により行った。【０１５１】
（１）Ｓｉｇｍａ製の基本培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｓｉｇｍａ）に、終濃度が１０％となるようにＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ，ＩＮＣ製のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、以下、「ＦＢＳ」と略する。）および終濃度を１％となるようにＧＩＢＣＯ製のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｉｎｅ（５０００Ｕ／ｍｌ）を添加し、第１の調製培地を準備した。【０１５２】
（２）患者から採取した軟骨細胞は、ＣＯ２インキュベータ内において第１の調製培地中で３７℃にて２回継代を行った。【０１５３】
（３）第１の調製培地に終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製ＩＬ−１βを添加した第２の調製培地を準備し、軟骨細胞が培養されている第１の調製培地を第２の調製培地に交換した。【０１５４】
（４）図１に示すように、第２の調製培地に交換した透明マルチウェルプレートを、ＣＯ２インキュベータ内において、ＬＥＤ照射装置上に設置した。そして、準備した各透明マルチウェルプレートに対し、各光照射条件で光を照射した。【０１５５】
（５）各マルチウェルプレートを、光照射後直ぐに保存用ＣＯ２インキュベータに保存した。【０１５６】
（６）ＣＯ２インキュベータにて保存した各マルチウェルプレートにおいて、光の照射後２４時間後の各ウェルの培養液の上清を回収した。【０１５７】
（７）回収した培養液の上清に含まれるプロテオグリカンの濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ法により行った。なお、プロテオグリカン濃度のＥＬＩＳＡは、ＤＩＡ  ｓｏｕｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙｓ社製のキット（ＤＩＡ  ｓｏｕｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙｓ  Ｓ．Ａ．，  Ｎｉｖｅｌｌｅｓ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）が用いられた。【０１５８】
＜実験３−３の評価結果＞
１．実験３−３の評価結果について
図１２は、変形性膝関節症患者由来の軟骨細胞に光を照射した後２４時間経過時の軟骨基質プロテオグリカンの産生量の測定結果を示している。【０１５９】
図１２に示すＩＬ−１β（−）とは、軟骨細胞がＩＬ−１βによって軟骨基質プロテオグリカンの産生量が抑制されていない場合を示し、ＩＬ−１β（＋）は軟骨細胞がＩＬ−１βによって軟骨基質プロテオグリカンの産生量が抑制されている場合を示している。また、図１２に示すＬＥＤ（−）とは、軟骨細胞に光が照射されていない場合を示している。したがって、図１２におけるＩＬ−１β（−）およびＬＥＤ（―）はポジティブコントロールの結果を示し、ＩＬ−１β（＋）およびＬＥＤ（―）はネガティブコントロールの結果を示している。【０１６０】
図１２の結果から、軟骨細胞の軟骨基質プロテオグリカンの産生量は、青色光（４７０ｎｍ）を照射した場合に、ネガティブコントロールの場合と比較して多くなっていることがわかる。【０１６１】
すなわち、図１２の結果は、青色光（４７０ｎｍ）の照射により、軟骨細胞からの軟骨基質プロテオグリカンの産生を促進することを示唆するものだといえる。【０１６２】
実験３−３の結果から、青色光（４７０ｎｍ）が軟骨細胞における軟骨基質プロテオグリカンの産生促進効果を有している可能性を新たに見出すことができた。【０１６３】
≪実施の形態１のまとめ≫
以上の実験結果より、近赤外光は骨形成を促進し、一方では骨融解を抑制することが分かった。すなわち、近赤外光は、関節リウマチのような代謝性骨疾患によって異常に進行される骨吸収を抑制することで、骨代謝のバランス改善に寄与している可能性があることが分かった。【０１６４】
一方、青色光や赤色光は、骨溶解を抑制する結果となったものの、骨形成も抑制する結果となった。【０１６５】
一方、青色光は軟骨細胞における軟骨基質プロテオグリカンの産生促進効果を有していることがわかった。すなわち、青色光は、変形性関節症等でみられる軟骨の変性や破壊を抑制することができる可能性があるということが分かった。【０１６６】
（実施の形態２）
実施の形態１の実験結果により、近赤外光は代謝性骨疾患により崩壊した骨代謝のバランスを改善させる効果がある可能性が見出された。実施の形態２において、関節リウマチを擬似的に誘導したラットをモデルとして用い、近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用であることを示す。【０１６７】
≪実験４≫
実験４は、関節リウマチを擬似的に誘導したラットのモデルの作成方法について示す。実験４で作成されたモデルは、コラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下、「ＣＩＡ」と略する。）を発症したモデル（以下、「ＣＩＡモデル」と略する。）であって、このモデルはヒトの関節リウマチ特有の異常な滑膜増殖の症状と同様の症状を有する。なお、実施の形態２における各実験は、実験４により作成されたＣＩＡモデルが用いられた。【０１６８】
実施の形態２で用いられたＣＩＡモデルは、Ｌｅｗｉｓラット（ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社製）を用いて作製されたものであって、健常Ｌｅｗｉｓラット［図１３（ａ）］と比較して特に後肢踵部分が大きく腫れあがった症状を有する［図１３（ｂ）］。【０１６９】
＜実験４の手順＞
実験４を以下の手順により行い、ＣＩＡモデルを得た。【０１７０】
（１）１ｍｌのＣｈｏｎｄｒｅｘ製Ｉｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｄを１ｍｌ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製２ｍｇ／ｍｌ  免疫用ウシＩＩ型コラーゲン溶液（０．０５Ｍ酢酸）を０．８ｍｌおよび１６ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｈｙｄｒａｔｅを０．２ｍｌ、を混合した混合溶液を調整し、係る混合溶液を氷冷した。【０１７１】
（２）氷冷した混合溶液は、メカニカルホモジナイザーにより約３０，０００回転で９０秒間攪拌した後、更に５分間氷冷した。この（２）の手順を４回行い、これによりエマルジョン化した関節炎誘導薬剤を調製した。【０１７２】
（３）７週齢の雌のＬｅｗｉｓラットに麻酔を施し、尻尾の皮内に関節炎誘導薬剤を０．２５ｍｌ注射した。【０１７３】
（４）更に、１回目の関節炎誘導薬剤の注射から１週間後に、Ｌｅｗｉｓラットの尻尾の皮内に関節炎誘導薬剤を０．１３ｍｌ注射した。【０１７４】
（５）以上の操作により、１回目の関節炎誘導薬剤の注射から約３週間後に後肢踵が重度に腫れあがったＣＩＡモデルが得られた。【０１７５】
≪実験５≫
実験５において、ＣＩＡモデルの後肢への近赤外光を照射が、炎症抑制効果を有することを確認する実験を行った。実験５では、第１の実験（以下、「実験５−１」とする。）および第２の実験（以下、「実験５−２」とする。）を行った。【０１７６】
＜実験５−１について＞
実験５−１は、近赤外光の照射がＣＩＡモデルの後肢の炎症を抑制していることをＣＩＡモデルの表現型により評価したものである。ここでは、実験５−１−１と実験５−１−２の２つの実験を行った。【０１７７】
実験５−１−１は、ＣＩＡモデルの後肢膝部分を中心とした近赤外の照射が、ＣＩＡモデルの後肢の踵部分の腫れを抑制できているか否かを、ＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みを計測することで評価する実験である。実験５−１−１により、光の照射によりＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みが小さくなれば、ＣＩＡモデルの後肢の炎症を抑制できていることを確認できる。【０１７８】
具体的には、ＣＩＡモデルに対して表２で示す条件で実験を行い、近赤外光を照射する群および照射しない群として、それぞれ５匹のＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みの平均値を取得した。そして、各群ラットの関節炎が発症する前の後肢踵の厚みを基準として、発症後の後肢踵部分の厚みの平均値の腫れ度合い（（発症後肢踵部分の厚みの平均値−発症前後肢踵部分の厚みの平均値）×１００／発症前後肢踵部分の厚みの平均値）を求めることで、近赤外光の影響を評価した。また、実験５−１−１において、上記腫れ度合いが９０％を超えた日を０日目として、ＣＩＡモデルの後肢への近赤光の照射を開始した。【０１７９】
【表２】
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【０１８０】
実験５−１−２は、実験５−１−１と同じＣＩＡモデルを用い、実験５−１−１とは異なる観点からＣＩＡモデルの後肢膝部分を中心とした近赤外の照射が、炎症を抑制し運動機能を改善していることを評価する実験である。具体的に実験５−１−２では、ＣＩＡモデルの後肢膝部分を中心に近赤外を照射した場合としなかった場合とにおけるＣＩＡモデルの行動量を解析した。ＣＩＡモデルの行動量の解析は、実験５−１−１の０日目以降の各計測日における５分間のＣＩＡモデルの総移動距離を算出したものである。この総移動距離は、ＣＩＡモデルの行動を画像で撮像し、画像解析によりラットの動きを追跡することで算出した。【０１８１】
＜実験５−１の評価結果＞
１．実験５−１−１の評価結果について
図１４は、実験５−１−１の評価結果を示している。図１４から理解できるように、近赤外光を照射した場合（図１４中の○）および近赤外光を照射しなかった場合（図１４中の●）のいずれの場合も、０日目を基準として２、３日目経過頃がＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みの腫れのピークであることが理解できる。そして、図１４から理解できるように、近赤外光を照射した場合は、近赤外光を照射しなかった場合と比較して、腫れのピークが抑制されていることが理解できる。しかし、腫れのピークに到達後、一定期間経過すると、近赤外光を照射した場合としなかった場合とでは、特段、顕著な差異は見られなかった。【０１８２】
すなわち、この結果は、後肢への近赤外光の照射は、関節リウマチによる炎症のピークを抑制していることを示唆しているものと思われる。【０１８３】
２．実験５−１−２の評価結果について
図１５は、実験５−１−２の評価結果を示している。図１５から分かるように、近赤外光を照射したＣＩＡモデルの行動量は、コントロールである健常ラットの行動量には及ばないものの、照射しなかったＣＩＡモデルと比較して、近赤外光照射開始から１１日目頃から行動量が顕著に回復してきているのが理解できる。【０１８４】
また、図１６（ａ）〜（ｃ）は、図１５における近赤外光照射２５日目のラットの５分間の行動の軌跡計測結果の一例を示している。図１６（ａ）はコントロールである健常マウス、図１６（ｂ）は近赤外光を照射したＣＩＡモデル、図１６（ｃ）は近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの移動軌跡を示している。【０１８５】
図１６（ａ）〜（ｃ）からも分かるように、赤外光を照射したＣＩＡモデルは、照射しなかったＣＩＡモデルと比較して、明らかに行動量が多いことが理解できる。【０１８６】
すなわち、図１５および図１６（ａ）〜（ｃ）の結果は、ＣＩＡモデルの表現型の観点から近赤外光の照射が関節リウマチの炎症を抑え、ＣＩＡモデルの後肢の運動機能を回復していることを示唆するものであるといえる。【０１８７】
＜実験５−２について＞
実験５−１において、近赤外光照射に炎症抑制効果があることをＣＩＡモデルの表現型から確認した。実験５−２は、近赤外光の照射が炎症を抑制していることを病理染色により確認したものである。【０１８８】
具体的に実験５−２では、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）染色（以下、「Ｈ．Ｅ．染色」とする。）した近赤外光照射３２日目のラットの右後肢膝関節の長軸断面の病理標本により、滑膜細胞の増殖度合いと、滑膜細胞による関節の軟骨および骨の侵食度合いを評価した。【０１８９】
＜実験５−２の評価結果＞
図１７（ａ）〜（ｃ）は、代表的なラットの右後肢膝関節の長軸断面のＨ．Ｅ．染色の病理標本を示している。図１７（ａ）は健常ラット、図１７（ｂ）は近赤外光を照射したＣＩＡモデル、図１７（ｃ）は近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの右後肢膝関節の長軸断面のＨ．Ｅ．染色の病理標本である。また、図１７の病理標本における関節、滑膜、軟骨、大腿骨、脛骨の位置については、図１７（ａ）中に示されている。【０１９０】
まず、健常ラット［図１７（ａ）］と近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデル［図１７（ｃ）］の大腿骨の病理染色の結果を比較すると、図１７（ｃ）の複数の黒三角の位置で示されているように、明らかに滑膜細胞が異常増殖し、軟骨に侵食していることを理解できる。【０１９１】
一方、近赤外光を照射したＣＩＡモデル［図１７（ｂ）］の大腿骨の病理染色の結果は、黒三角の位置で示されているように、一部、滑膜細胞が異常増殖し、軟骨に侵食している部分があるものの、近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの大腿骨の病理染色の結果と比較して、明らかに近赤外光の照射により、滑膜の異常増殖を抑制していることが理解できる。【０１９２】
以上の結果により、近赤外光により炎症が抑制され、その結果、その炎症に誘導された滑膜細胞による軟骨の溶解をも抑制するという、実施の形態１における実験１で示したＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の評価結果を反映する結果を、ラットをモデルとした場合においても確認することができた。【０１９３】
≪実験６≫
実験６において、ＣＩＡモデルへの近赤外光の照射により骨代謝のバランスが改善し、骨の機能が回復していることを示す。実験６として、ＣＩＡモデルの後肢へ近赤外光を照射した場合としなかった場合において、実験６−１、実験６−２および実験６−３の３通りの実験を行った。【０１９４】
実験６−１では、ＣＩＡモデルの後肢へ近赤外光を照射した場合としなかった場合におけるＣＩＡモデルの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像を取得し、そのＸ線画像における短軸断面の輝度値の比較を行った。Ｘ線画像により骨密度の直接的な状態が把握できるため、実験６−１においてＸ線画像の評価を行った。【０１９５】
実験６−１も、実験５と同様にＣＩＡモデルに対して［表２］で示す条件で実験を行い、近赤外光を照射した場合と照射しなかった場合のそれぞれについて、５匹のＣＩＡモデルのＸ線画像を取得した。また、実験５と同様、ＣＩＡモデルの後肢踵部分の厚みの腫れ度合いが９０％を超えた日を０日目とし、ＣＩＡモデルの後肢への近赤光の照射を開始し、照射開始３２日目のＣＩＡラットの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像を取得した。また、コントロールとして、３匹の健常ラットの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像を取得した。【０１９６】
実験６−２では、近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用で有ることを、骨代謝のうち骨形成に係る骨芽細胞の観点から評価した。【０１９７】
実験６−２において、近赤外光を照射した場合と照射しなかった場合におけるラットの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色を行った。実験６−２は、病理染色として、抗オステオカルシン抗体を使ったオステオカルシンの免疫染色を行った。オステオカルシンの染色を行った理由は、前述の通り、オステオカルシンは骨形成マーカであって、病理標本において、多々オステオカルシンの染色が確認されるということは、骨芽細胞からオステオカルシンを多々生成していることを示すので、骨形成の活性度が評価できるからである。すなわち、近赤外光を照射した場合の病理標本が、照射しなかった場合の病理標本と比較して、オステオカルシンの染色が多々確認されれば、近赤外光の照射が、骨芽細胞の活性化に寄与していることが示される。【０１９８】
実験６−３では、近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用で有ることを、骨代謝のうち骨融解に係る破骨細胞の観点から評価した。【０１９９】
実験６−３において、実験６−２と同様、ラットの右後肢の大腿骨の骨端部位を用い、ＴＲＡＰ染色を用いた病理染色を行った。ＴＲＡＰ染色を用いた理由は、前述の通り、破骨細胞が分化を開始すると破骨細胞がＴＲＡＰを生成するため、近赤外光が破骨前駆細胞の分化を抑制するか否かを評価することができるからである。【０２００】
＜実験６の評価結果＞
１．実験６−１の評価結果について
図１８（ａ）〜（ｃ）は、ラットの左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像を示している。図１８（ａ）はコントロールとして設定された健常ラット（３例）、図１８（ｂ）は近赤外光を照射したＣＩＡモデル（４例）および図１８（ｃ）は近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデル（５例）、の左肢大腿骨の短軸断面のＸ線画像である。【０２０１】
コントロールである健常ラットのＸ線画像は、図１８（ａ）に示すように大腿骨内部にまで白く表示されていることから、骨密度が高い状態であることが理解できる。一方、ＣＩＡモデルは、図１８（ｂ）および（ｃ）に示すように、コントロールと比較して大腿骨内部において黒く表示されている部分が多いことから、骨密度が低い状態であることが理解できる。【０２０２】
近赤外光を照射したＣＩＡモデルと照射しなかったＣＩＡモデルとのＸ線画像を比較すると、図１８（ｂ）の近赤外光を照射したＣＩＡモデルの大腿骨内部のほうが、黒く表示されている部分が少なく、骨密度が高い状態であることが理解できる。【０２０３】
これらＸ線画像の大腿骨内部の輝度値の平均をとった結果、図１９に示すように、明らかに近赤外光を照射したＣＩＡモデルの骨密度が高い状態であることが分かった。すなわち、実験６−１の実験結果は、近赤外光が実施の形態１で示すように骨代謝のバランスを改善し、粗になった骨の回復を促進していることを骨の状態から示唆したものであるといえる。【０２０４】
２．実験６−２の評価結果について
図２０（ａ）〜（ｃ）は、代表的なラットの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の結果を示している。図２０（ａ）はコントロールとして設定した健常ラット、図２０（ｂ）は近赤外光を照射したＣＩＡモデルおよび図２０（ｃ）は近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の結果である。図２０（ａ）〜（ｃ）の病理染色における海綿骨、骨端軟骨の位置については、図２０（ａ）中に示してある。【０２０５】
まず、図２０（ａ）〜（ｃ）中の複数の黒三角で示した位置が抗オステオカルシン抗体により染色されたオステオカルシンである。健常ラット［図２０（ａ）］と近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデル［図２０（ｃ）］の右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の結果を比較すると、健常ラットの病理標本には複数のオステオカルシンの染色が確認されたが、近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの病理染色標本にはオステオカルシンの染色が確認されなかった。この結果から、関節リウマチによって骨形成が抑制されていることを改めて確認することができた。【０２０６】
一方、近赤外光を照射したＣＩＡモデルの病理染色標本［図２０（ｂ）］は、健常ラットと同等のオステオカルシンの染色が確認された。すなわち、実施の形態１の実験２で示した結果と同様、近赤外光によって骨芽細胞の活性を向上させ、骨形成を促進させる結果が得られた。【０２０７】
３．実験６−３の評価結果について
図２１（ａ）〜（ｃ）は、代表的なラットの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の結果を示している。図２１（ａ）はコントロールとして設定した健常ラット、図２１（ｂ）は近赤外光を照射したＣＩＡモデルおよび図２１（ｃ）は近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色の結果である。【０２０８】
まず、図２１（ａ）〜（ｃ）中の複数の矢印で示した位置が、ＴＲＡＰ染色により染色された破骨細胞である。図２１より、健常ラット、近赤外光を照射したＣＩＡモデル、近赤外光を照射しなかったＣＩＡモデルの右後肢の大腿骨の骨端部位の病理染色において、いずれもＴＲＡＰ染色された破骨細胞が確認される。すなわち、実験６−３において、近赤外光はＣＩＡモデルにおける破骨細胞の分化を抑制していない結果となり、実施の形態１の実験３の結果を反映する結果とはならなかった。【０２０９】
≪実施の形態２のまとめ≫
以上、近赤外光が骨吸収を抑制するか否かは実施の形態１および２の実験結果では判断できないが、少なくとも近赤外光は骨形成を促進させる効果を有し、骨代謝のバランスを改善させている可能性があることが分かった。【０２１０】
（実施の形態３）
実施の形態１および２は、近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用であることを示している。実施の形態３では、関節リウマチ患者を被験者として、近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用であることを示す。【０２１１】
≪代謝性骨疾患用光治療器について≫
関節リウマチ患者を被験者として近赤外光が骨代謝のバランス改善に有用であることを示すための実験に、図２２および図２３に示した代謝性骨疾患用光治療器を用いた。以下に実験７で使用した代謝性骨疾患用光治療器の具体的な構成について説明する。【０２１２】
図２２は、代謝性骨疾患用光治療器１の斜視図であり、その内部が透視された図である。図２３は、図２２の代謝性骨疾患用光治療器１のＸＹ方向における断面図である。図２４は、図２２の代謝性骨疾患用光治療器１の使用状態を示す図である。【０２１３】
代謝性骨疾患用光治療器１は、図２２および図２３に示すように、その内部に設けた患部挿入室２に患部である手が挿入できるように患部挿入口３が設けられている。また、図２３に示すように平板状の面状部材４が固定されている。【０２１４】
面状部材４は、患部挿入口３の周縁下部から患部挿入室２の奥側にわたって設置されている。そして、代謝性骨疾患用光治療器１は、患部挿入口３から患部挿入室２に挿入された手５が、図２４に示すように面状部材４上に配置できるように構成されている。以後、この面状部材４の手５を配置する側の面を第１の面６と称する。面状部材４は、治療光を透過する材質で構成されおり、例えば、透明アクリル樹脂や透明ガラスのような硬質な材質である。【０２１５】
図２３に示すように代謝性骨疾患用光治療器１には、複数の光源（例えば、ＬＥＤ）を備えた第１の光源部７が、面状部材４の第１の面６に対向し、第１の面６と一定距離をおいた位置に設けられている。そして、第１の光源部７は、複数の光源それぞれから治療光を出力することにより面光源を構成し、手に対して面照射することができる構成となっている。【０２１６】
また、代謝性骨疾患用光治療器１には、複数の光源を備えた第２の光源部８が、面状部材４の第１の面６の反対面である第２の面９に対向し、第２の面９と一定距離をおいた位置に設けられている。そして、第２の光源部８は、複数の光源それぞれから治療光を出力することにより面光源を構成し、手に対して面照射することができる構成となっている。【０２１７】
第１の光源部７および第２の光源部８それぞれの複数の光源は、骨代謝のバランスを改善する効果を有する近赤外光を主たる波長帯域とした治療光を出力するものである。なお、実施の形態１および実施の形態２で説明したとおり、青色光や赤色光は骨形成を抑制する可能性があるので、代謝性骨疾患用光治療器１から最終的に患部へ照射される治療光には、青色光や赤色光の成分を含まないことが好ましい。【０２１８】
≪実験７≫
上記構成からなる代謝性骨疾患用光治療器１を用いて実験７を行った。実験７では、関節リウマチを発症した被験者の手に近赤外光を照射することで、近赤外光が骨代謝のバランスが改善されることをＭＲＩ画像診断解析により確認した。【０２１９】
＜実験条件＞
１．被験者について
実験７では、被験者として、抗リウマチ薬治療開始６月以上経過し、病状が安定した４０歳以上の女性（３例）を対象とした。【０２２０】
２．近赤外光の照射条件について
実験７で行われた上述の代謝性骨疾患用光治療器１の設定は、治療光として患部に照射される近赤外光の照射パワー密度を、０．１１５Ｗ／ｃｍ２とし、中心波長を８５０ｎｍとして設定した。【０２２１】
３．近赤外光の手の治療時間および期間について
被験者は、実験７において、上述の代謝性骨疾患用光治療器１の患部挿入口３を介して患部挿入室２内に挿入し、５分間、近赤外光を照射することで治療を行った。また、１回の治療において、右手、左手について近赤外光の照射をそれぞれ５分ずつ行い、これを週に１回、８週間（合計９回の治療）行った。【０２２２】
＜実験７の評価結果＞
図２５は、第１の患者における近赤外光照射前および９回目（８週目）の治療後の手指部分のＭＲＩ診断画像である。近赤外光照射前の手指部分のＭＲＩ診断画像では、特に図２５中の破線丸印で囲まれた部分で示されるように手指骨の骨びらん、骨髄内浮腫部分が黒く不鮮明な部分が多い画像が得られた。これは、関節リウマチにより、骨が損傷していることを示している。【０２２３】
一方、９回目（８週目）の治療後の手指部分のＭＲＩ診断画像では、特に図２５中の破線丸印で囲まれた部分で示されるように手指骨の骨びらん、骨髄内浮腫部分が白く、明瞭な画像が得られた。すなわち、近赤外光を照射することによって、手指骨の骨びらん、骨髄内浮腫部分の状態が軽度に改善している傾向を確認した。【０２２４】
また、図２６および図２７は、それぞれ第２の患者および第３の患者における近赤外光照射前および９回目（８週目）の治療後の手指部分のＭＲＩ診断画像である。この結果も、第１の患者と同様、近赤外光を照射することによって、手指骨の骨びらん、骨髄内浮腫部分の状態が軽度に改善している傾向が見られた。【０２２５】
≪実施の形態３のまとめ≫
実施の形態１および２の実験結果により、近赤外光は骨代謝のバランス改善に有用であることを示したが、実施の形態３において、実際の被験者で行った実験についても手指の骨状態が改善していることから、近赤外光は骨代謝のバランス改善に有用であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２２６】
本発明の代謝性骨疾患用光治療器によれば、代謝性骨疾患自体の症状を改善することができる。【０２２７】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１４年１月１４日付で出願された日本特許出願（特願２０１４−００４２３８）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【符号の説明】
【０２２８】
１  代謝性骨疾患用光治療器
２  患部挿入室
３  患部挿入口
４  面状部材
５  手
６  第１の面
７  第１の光源部
８  第２の光源部
９  第２の面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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