(57)【要約】  実施形態に従う標的核酸検出法は、（Ａ）標的核酸を含み得る試料、核酸プローブ、これに結合している被覆核酸鎖、標識物質及びプライマーセットを含む反応場を等温増幅反応条件下に置くこと、（Ｂ）等温増幅反応条件下、核酸プローブからの信号をモニタリングすること、（Ｃ）（Ｂ）で得た信号に基づき標的核酸を検出することを含む。核酸プローブは、基体の少なくとも１面に固定されている。核酸プローブ及び被覆核酸鎖の塩基配列は、等温増幅反応条件下、増幅産物と核酸プローブとの競合、核酸プローブからの被覆核酸鎖の脱離、及び被覆核酸鎖と増幅産物との結合が得られる配列であるか、等温増幅反応条件下、核酸プローブと被覆核酸鎖とが結合した状態で、被覆核酸鎖と増幅産物との結合、及び被覆核酸鎖の伸長が得られる配列である。信号の検出は、核酸プローブに結合している核酸の存在又は量の増加により阻害される。
2016136033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸検出法であって、
当該標的核酸は、第１の配列および／またはその相補配列を含み、
当該方法が、
（Ａ）前記標的核酸を含み得る試料と、
前記第１の配列とは異なる第２の配列を含む核酸鎖を含み、これによって、反応場を支持するための基体の少なくとも１面に固定された核酸プローブと、
前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域と前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域とを含み、前記第２の配列結合領域が前記第２の配列にハイブリダイズによって当該核酸プローブに結合している被覆核酸鎖と、
検出可能な信号を生ずる標識物質と、
前記第１の配列を含む増幅産物を形成するためのプライマーセットと
を含む反応液により形成されている反応場を等温増幅反応条件下に置くこと、および
（Ｂ）前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブからの当該信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出すること、
（Ｃ）前記（Ｂ）で得られた前記試料についての当該信号に基づいて、前記標的核酸についての検出結果を得ること
を含み、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、
（ａ）前記等温増幅反応条件下で、前記被覆核酸鎖に対する前記増幅産物と前記核酸プローブとの競合、それによる前記核酸プローブからの前記被覆核酸鎖の脱離、および前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合が得られる配列であるか、または
（ｂ）前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が維持された状態で、前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合、および前記増幅産物を鋳型とした前記被覆核酸鎖の伸長が得られる配列であり、
前記標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、前記核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されている
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ａ）の配列であり、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場に前記標的核酸が存在しない場合には維持され、当該反応場に前記標的核酸が存在する場合には、当該標的核酸と前記核酸プローブとが前記被覆核酸鎖に対して競合することにより解消するような範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ｂ）の配列であり、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場において前記標的核酸が存在する場合および不在の場合共に維持されるような範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記等温増幅反応条件が、２５℃〜７０℃の反応場の温度条件を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記等温増幅反応条件が、１０ｍＭ〜１２０ｍＭの反応場の塩濃度条件を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記被覆核酸鎖の塩基長が、前記核酸プローブの塩基長よりも長いことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の配列結合領域と第２の配列結合領域とが、前記被覆核酸鎖上に独立して配置されている、または前記被覆核酸鎖上に互いに部分的若しくは全体に亘り重なり合って配置されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識物質が、電気化学的に活性な物質または光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標識物質が、前記核酸プローブの当該核酸鎖に結合しており、アントラキノン、フェロセンおよびメチレンブルーからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であるか、またはＡｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）からなる群より選択される光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識物質は、前記反応液中に分散しており、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、およびコバルト錯イオンからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーセットが、前記反応場の形成の以前に前記核酸プローブが固定されている当該基体の当該面に遊離可能に固定されており、前記反応場への前記プライマーセットの持ち込みが、前記反応液への前記基体からの遊離によって達成されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料についての前記（Ａ）および前記（Ｂ）を行うことと並行して、
（Ｄ）コントロールプローブと、
検出可能な信号を生ずる標識物質と、
が存在している反応場を前記（Ａ）に記載の等温増幅反応条件と同様な条件下に置くこと、および
（Ｅ）前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブからの当該信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出すること、
を行い、更に
（Ｆ）前記（Ｂ）で得られた前記試料についての当該信号と、前記（Ｅ）で得られた当該コントロールプローブからの当該信号とを比較することにより、前記標的核酸についての検出結果を得ること
を特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸の検出が、定量的な検出であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸を検出するためのアッセイキットであって、
前記アッセイキットは、
当該標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、
そこにおいて等温増幅反応を行い、それにより生じた増幅産物を検出するためのプローブ固定基体と、
検出可能な電気化学的信号を生ずる標識物質と、
任意に反応試薬と
を含み、
前記標的核酸は、第１の配列および／またはその相補配列を含み、
前記プライマーセットは、前記第１の配列および／またはその相補配列を増幅するためのプライマーを含み、
前記プローブ固定基体は、
前記等温増幅反応を行うための反応場を支持する基体；
前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプローブ固定領域；
前記プローブ固定領域に固定された第２の配列を含む核酸鎖を含む核酸プローブ；および
前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域と、前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域とを含み、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列とのハイブリダイズによって前記核酸プローブに結合している被覆核酸鎖；
を備え、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、
（ａ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記被覆核酸鎖に対する前記増幅産物と前記核酸プローブとの競合、それによる前記核酸プローブからの前記被覆核酸鎖の脱離、および前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合が得られる配列であるか、または
（ｂ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が維持された状態で、前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合、および前記増幅産物を鋳型とした前記被覆核酸鎖の伸長が得られる配列であり、
前記標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、前記核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されおり、
前記標識物質は、前記プローブ固定基体と別体であるか、または前記少なくとも１つの面における前記核酸プローブに対応する位置に、間接的若しくは遊離可能に直接に、固定されている
ことを特徴とするアッセイキット。
【請求項１５】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ａ）の配列であり、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場に前記標的核酸が存在しない場合には維持され、当該反応場に前記標的核酸が存在する場合には、当該標的核酸と前記核酸プローブとが前記被覆核酸鎖に対して競合することにより解消するような範囲にあることを特徴とする請求項１４に記載のアッセイキット。
【請求項１６】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ｂ）の配列であり、
前記標識物質は、前記反応液中に分散しており、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場において前記標的核酸が存在する場合および不在の場合共に維持されるような範囲にあることを特徴とする請求項１４に記載のアッセイキット。
【請求項１７】
前記標識物質が、電気化学的に活性な物質または光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項１８】
前記標識物質が、前記核酸プローブの当該核酸鎖に結合しており、アントラキノン、フェロセンおよびメチレンブルーからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であるか、またはＡｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）からなる群より選択される光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１４〜１６の何れか１項に記載のアッセイキット。
【請求項１９】
前記標識物質は、前記反応液中に分散しており、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、およびコバルト錯イオンからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であることを特徴とする請求項１４〜１６の何れか１項に記載のアッセイキット。
【請求項２０】
当該プライマーセットが、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプライマー固定領域に遊離可能に固定されていることを特徴とする請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項２１】
更に、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に独立して配置された少なくとも１つのコントロールプローブ固定領域、および前記コントロールプローブ固定領域に固定されたポジティブコントロールプローブおよび／またはネガティブコントロールプローブを含むことを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項２２】
請求項１４〜２１の何れか１項に記載のアッセイキットであって、
前記標的核酸は、第１〜第ｎの標的核酸であり、前記第１〜第ｎの標的核酸は、第１１〜第１ｎの配列および／またはその相補配列である第１〜第ｎの相補配列をそれぞれ含み、
前記プライマーセットは、前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ増幅するためのプライマーをそれぞれ含む複数のプライマー群を含み、
前記プローブ固定基体において、
前記基体は、第１〜第ｎのプライマーセットを用いる等温増幅反応が、当該第１〜第ｎの標的核酸をそれぞれ鋳型として、互いに異なる配列の前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの増幅産物を生成する反応場を支持するものであり、
前記プローブ固定領域として、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に独立して配置された第１〜第ｎのプローブ固定領域を含み、
前記核酸プローブとして、前記第１〜第ｎのプローブ固定領域のそれぞれにそれぞれ固定された第２１〜第２ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの核酸鎖をそれぞれ含む核酸プローブ群を含み、
前記被覆核酸鎖として、前記第１１〜第１ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第１１〜第１ｎの配列結合領域と、前記第２１〜第２ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第２１〜第２ｎの配列結合領域とをそれぞれ含み、前記第２１〜２ｎの配列結合領域それぞれでの前記第２１〜２ｎの配列それぞれとのハイブリダイズによって前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれに対して結合している第１〜第ｎの被覆核酸鎖を含み、
前記第１〜第ｎの核酸プローブおよび前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、
（ａ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれに対応する前記第１〜第ｎの増幅産物と前記１〜第ｎの核酸プローブ配列とのそれぞれの競合、それらによる前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれからの前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の脱離、および前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の前記第１１〜１ｎの配列結合領域と前記第１〜第ｎの増幅産物の前記第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合が得られる配列であるか、または
（ｂ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれの前記第１１〜１ｎの配列結合領域と前記第１〜第ｎの増幅産物の前記第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合、および前記第１〜第ｎの増幅産物のそれぞれを鋳型とした前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの伸長が得られる配列である
ことを特徴とするアッセイキット。
【請求項２３】
標的核酸を検出するためのプローブ固定基体であって、
前記標的核酸は、第１の配列および／またはその相補配列を含み、
前記プローブ固定基体は、
プライマーセットを用いて、前記第１の配列および／またはその相補配列を増幅し、増幅産物を得るための等温増幅反応を行う反応場を支持する基体；
前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプローブ固定領域；
前記プローブ固定領域に固定された第２の配列を含む核酸鎖を含む核酸プローブ；
前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域と、前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域とを有し、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列とのハイブリダイズによって前記核酸プローブに結合している被覆核酸鎖；および
前記少なくとも１つの面における前記核酸プローブに対応する位置に、間接的または遊離可能に直接に、固定されている検出可能な信号を生ずる標識物質；
を備え、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、
（ａ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記被覆核酸鎖に対する前記増幅産物と前記核酸プローブとの競合、それによる前記核酸プローブからの前記被覆核酸鎖の脱離、および前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合が得られる配列であるか、または
（ｂ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が維持された状態で、前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と前記増幅産物の前記第１の配列とのハイブリダイズを介した結合、および前記増幅産物を鋳型とした前記被覆核酸鎖の伸長が得られる配列であり、
前記標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、前記核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されている
ことを特徴とするプローブ固定基体。
【請求項２４】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ａ）の配列であり、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
形成された前記反応場における前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場に前記標的核酸が存在しない場合には維持され、当該反応場に前記標的核酸が存在する場合には、当該標的核酸と前記核酸プローブとが前記被覆核酸鎖に対して競合することにより解消するような範囲にあることを特徴とする請求項２３に記載のプローブ固定基体。
【請求項２５】
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ｂ）の配列であり、
前記核酸プローブおよび前記被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、
形成された前記反応場における前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記核酸プローブと前記被覆核酸鎖との結合が、当該反応場において前記標的核酸が存在する場合および不在の場合共に維持されるような範囲にあることを特徴とする請求項２３に記載のプローブ固定基体。
【請求項２６】
前記標識物質が、電気化学的に活性な物質または光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のプローブ固定基体。
【請求項２７】
前記標識物質が、前記核酸プローブの当該核酸鎖に結合しており、アントラキノン、フェロセンおよびメチレンブルーからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であるか、またはＡｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）からなる群より選択される光学的に活性な物質であることを特徴とする請求項２３〜２５の何れか１項に記載のプローブ固定基体。
【請求項２８】
前記標識物質は、前記反応液中に分散しており、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、およびコバルト錯イオンからなる群より選択される電気化学的に活性な物質であることを特徴とする請求項２３〜２５の何れか１項に記載のプローブ固定基体。
【請求項２９】
当該プライマーセットが、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプライマー固定領域に遊離可能に固定されていることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のプローブ固定基体。
【請求項３０】
更に、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に独立して配置された少なくとも１つのコントロールプローブ固定領域、および前記コントロールプローブ固定領域に固定されたポジティブコントロールプローブおよび／またはネガティブコントロールプローブを含むことを特徴とする請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプローブ固定基体。
【請求項３１】
請求項２３〜２９の何れか１項に記載のプローブ固定基体であって、
前記標的核酸は、第１〜第ｎの標的核酸であり、前記第１〜第ｎの標的核酸は、第１１〜第１ｎの配列および／またはその相補配列である第１〜第ｎの相補配列をそれぞれ含み、
前記プライマーセットは、前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ増幅するためのプライマーをそれぞれ含む複数のプライマー群を含み、
前記プローブ固定基体において、
前記基体は、第１〜第ｎのプライマーセットを用いる等温増幅反応が、当該第１〜第ｎの標的核酸をそれぞれ鋳型として、互いに異なる配列の前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの増幅産物を生成する反応場を支持するものであり、
前記プローブ固定領域として、前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に独立して配置された第１〜第ｎのプローブ固定領域を含み、
前記核酸プローブとして、前記第１〜第ｎのプローブ固定領域のそれぞれにそれぞれ固定された第２１〜第２ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの核酸鎖をそれぞれ含む核酸プローブ群を含み、
前記被覆核酸鎖として、前記第１１〜第１ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第１１〜第１ｎの配列結合領域と、前記第２１〜第２ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第２１〜第２ｎの配列結合領域とをそれぞれ含み、前記第２１〜２ｎの配列結合領域それぞれでの前記第２１〜２ｎの配列それぞれとのハイブリダイズによって前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれに対して結合している第１〜第ｎの被覆核酸鎖を含み、
前記第１〜第ｎの核酸プローブおよび前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、
（ａ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれに対応する前記第１〜第ｎの増幅産物と前記１〜第ｎの核酸プローブ配列とのそれぞれの競合、それらによる前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれからの前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の脱離、および前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の前記第１１〜１ｎの配列結合領域と前記第１〜第ｎの増幅産物の前記第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合が得られる配列であるか、または
（ｂ）形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれの前記第１１〜１ｎの配列結合領域と前記第１〜第ｎの増幅産物の前記第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合、および前記第１〜第ｎの増幅産物のそれぞれを鋳型とした前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの伸長が得られる配列である
ことを特徴とするプローブ固定基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、標的核酸検出法、アッセイキットおよびプローブ固定基体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査などの様々な場面で核酸検査が実施されている。その後の検査を効率的に行うためや遺伝子の発現量を分析するために核酸を定量することが重要なものとなっている。【０００３】
核酸を定量するための方法として、リアルタイムＰＣＲ法やマイクロアレイ法などが知られている。【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、核酸の増幅を伴うために感度が高く、広い定量範囲に亘り分析を行うことができる。その一方で検出する核酸の種類が多くなると種類ごとに分析を行う必要がある。他方、マイクロアレイ法は、同時に数万種類以上の核酸を分析することができる。しかしながら感度および定量分析の精度はリアルタイムＰＣＲ法に劣る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８５５１６９７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｓ．Ｗ．Ｙｅｕｎｇ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．Ｈ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｉ−Ｍｉｎｇ  Ｈｓｉｎｇ，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．４１，２００６，１３３７４−１３３７５
【非特許文献２】Ａｇｎｅｓ  Ａｎｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｐｐｈｅ  Ｄｅｍａｉｌｌｅ，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．２，２００６，５４２−５５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような状況におい、現在、核酸を簡便かつ高感度に検出する方法の更なる開発が望まれている。【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、核酸を簡便かつ高感度に検出できる標的核酸検出法、アッセイキットおよびプローブ固定基体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態によれば、標的核酸検出法は、（Ａ）標的核酸を含み得る試料と、核酸プローブと、被覆核酸鎖と、標識物質と、プライマーセットとを含む反応場を等温増幅反応条件下に置くこと、（Ｂ）等温増幅反応条件下で、核酸プローブからの信号をモニタリングするまたは２つ以上の時点で検出すること、（Ｃ）（Ｂ）で得られた信号に基づいて標的核酸を検出することを含む。核酸プローブは、反応場を支持するための基体の少なくとも１面に固定されている。被覆核酸鎖は、ハイブリダイズによって核酸プローブに結合している。核酸プローブおよび被覆核酸鎖の塩基配列は、（ａ）等温増幅反応条件下で、被覆核酸鎖に対する増幅産物と核酸プローブとの競合、核酸プローブからの被覆核酸鎖の脱離、被覆核酸鎖と増幅産物とのハイブリダイズを介した結合が得られる配列であるか、（ｂ）等温増幅反応条件下で、核酸プローブと被覆核酸との結合が維持された状態で、被覆核酸鎖と増幅産物とのハイブリダイズを介した結合、増幅産物を鋳型とした被覆核酸鎖の伸長が得られる配列である。標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施形態の標的核酸検出法の１例を示すフローチャートである。
【図２】実施形態の核酸プローブ固定基体の模式図である。
【図３】被覆核酸鎖の第１の配列および第２の配列が、連続している、部分的もしくは完全に重なっている、または１つの配列である実施形態の核酸プローブ固定プローブ固定基体の模式図である。
【図４】電気化学的に活性な物質を標識物質として備える実施形態の核酸プローブ固定基体と、標識物質が光学的に活性な物質であり、被覆核酸鎖が光学的に活性な物質が発する信号を強調するための物質を含んでいる実施形態の核酸プローブ固定基体の模式図である。
【図５】実施形態の核酸プローブ固定基体を示す図である。
【図６】実施形態の核酸プローブ固定基体の使用時の様子を示す図である。
【図７】実施形態のアレイ型核酸プローブ固定基体の平面図である。
【図８】実施形態のアレイ型核酸プローブ固定基体の平面図である。
【図９】実施形態のアレイ型核酸プローブ固定基体の一部分とそれにより得られる検出信号を示す図である。
【図１０】実施形態のアレイ型核酸プローブ固定基体の一部分とそれにより得られる検出信号を示す図である。
【図１１】実施形態のアレイ型核酸プローブ固定基体の一部分とそれにより得られる検出信号を示す図である。
【図１２】実施形態のチップ素材の１例を示す図である。
【図１３】実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。
【図１４】実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具の使用例を示す図である。
【図１５】実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具の使用例を示す図である。
【図１６】実施形態の標的核酸測定方法のフローチャートを示す図である。
【図１７】実施形態における測定した電気信号の波形の一例を示す図である。
【図１８】実施形態の核酸プローブ固定基体の使用時の様子の一例を示す図である。
【図１９】実施形態の核酸プローブ固定基体の使用時の様子の一例を示す図である。
【図２０】実施形態の標的核酸検出装置の一例を示すブロック図である。
【図２１】実施形態の電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体の模式図である。
【図２２】例１の実験結果を示す図である。
【図２３】例１の実験結果を示す図である。
【図２４】実施形態の蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体の模式図である。
【図２５】例２の実験結果を示す図である。
【図２６】例２の実験結果を示す図である。
【図２７】例３の実験結果を示す図である。
【図２８】例３の実験結果を示す図である。
【図２９】例４の実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【００１２】
１．定義
「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製することをいう。実施形態において使用される増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を等温増幅する方法であれはよい。増幅法は、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅およびＩＣＡＮ増幅などを含んでもよい。また、所望に応じて逆転写反応を増幅反応と同時に行ってもよい。
【００１３】
「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅されるべき配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域も含み得る。
【００１４】
「標的核酸」とは、標的配列を含む核酸である。標的核酸は、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。標的核酸は、増幅反応に供されるべき試料に含まれる被検核酸であってもよく、標的配列をそれを増幅するためのプライマーセットを用いて増幅して得られる増幅産物であってもよい。
【００１５】
「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。
【００１６】
「試料」とは、核酸プローブ固定基体の反応場に持ち込まれ、そこにおいて増幅および検出されるべき標的核酸を含む物質である。試料は、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰などであってもよく、またはこれらの何れかまたはその混合物から何れかの手段によって抽出された核酸成分を含む液体であってよい。
【００１７】
２．第１の実施形態
２−１．標的核酸検出法
第１の実施形態に従うと標的核酸検出法が提供される。検出されるべき標的核酸は、第１の配列および／またはその相補配列を含む。標的核酸検出法は、図１（ａ）に示すような以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含み得る。
【００１８】
（Ａ）では、試料、核酸プローブ、被覆核酸鎖、標識物質およびプライマーセットを含む反応液により形成されている反応場を等温増幅反応条件下に置く。試料は、標的核酸を含み得るものである。核酸プローブは、第１の配列とは異なる第２の配列を含む核酸鎖を含み、これによって、反応場を支持するための基体の少なくとも１面に固定されている。被覆核酸鎖は、第２の配列に相補的な第２の配列結合領域と第１の配列に相補的な第１の配列結合領域とを含む。被覆核酸鎖の第２の配列結合領域が、核酸プローブの第２の配列にハイブリダイズすることによって、被覆核酸鎖は、核酸プローブに結合している。検出可能な信号を生ずる標識物質は、標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害される。プライマーセットは、標的核酸の第１の配列を増幅するためのプライマーセットであり、このプライマーセットにより、第１の配列を含む増幅産物を形成する。
【００１９】
（Ｂ）では、等温増幅反応条件下で、核酸プローブからの信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出する。
【００２０】
（Ｃ）では、（Ｂ）で得られた試料についての信号に基づいて、標的核酸についての検出結果を得る。
【００２１】
ここにおいて、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、以下の（ａ）または（ｂ）の特徴を有する。
【００２２】
（ａ）等温増幅反応条件下で、被覆核酸鎖に対する増幅産物と核酸プローブとの競合、それによる核酸プローブからの被覆核酸鎖の脱離、および被覆核酸鎖の第１の配列結合領域と増幅産物の第１の配列とのハイブリダイズを介した結合が得られる配列である。
【００２３】
（ｂ）等温増幅反応条件下で、核酸プローブと被覆核酸との結合が維持された状態で、被覆核酸鎖の第１の配列結合領域と増幅産物の第１の配列とのハイブリダイズを介した結合、および増幅産物を鋳型とした被覆核酸鎖の伸長が得られる配列である。
【００２４】
例えば、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ａ）の配列であるとき、核酸プローブおよび被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、例えば、等温増幅反応条件下で、ハイブリダイズによる核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が、反応場に前記標的核酸が存在しない場合には維持され、反応場に標的核酸が存在する場合には、標的核酸と核酸プローブとが被覆核酸鎖に対して競合することにより解消するような範囲にある。
【００２５】
また例えば、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が上記（ｂ）の配列であるとき、核酸プローブおよび被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値は、例えば、等温増幅反応条件下で、ハイブリダイズによる核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が、反応場において標的核酸が存在する場合および不在の場合に拘わらず、共に維持されるような範囲にある。
【００２６】
また、標的核酸についての検出結果は、コントロールプローブからの信号と比較することにより得てもよい。その場合、図１（ｂ）に示すように上記の（Ａ）および（Ｂ）に加えて、以下の（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）の工程を含む方法が提供され得る。
【００２７】
（Ｄ）では、コントロールプローブおよび標識物質を含む反応液により形成されている反応場を等温増幅反応条件下に置く。
【００２８】
（Ｅ）では、等温増幅反応条件下で、コントロールプローブからの信号をモニタリングまたは２つ以上の時点で検出する。
【００２９】
（Ｆ）では、（Ｂ）で得られた試料についての信号と、（Ｅ）で得られたコントロールプローブからの信号とを比較することにより、標的核酸についての検出結果を得る。
【００３０】
このような方法は、例えば、以下のようなアッセイキットおよびプローブ固定基体を用いて行われ得る。
【００３１】
２−２．アッセイキット
実施形態に従うと、アッセイキットが提供され得る。標的核酸を検出するためのアッセイキットの１例は、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、そこにおいて等温増幅反応を行い、それにより生じた増幅産物を検出するためのプローブ固定基体と、検出可能な電気化学的信号を生ずる標識物質と、任意に反応試薬とを含む。
【００３２】
プローブ固定基体の１例は、等温増幅反応を行うための反応場を支持する基体、反応場が形成された際に反応場に接する基体の少なくとも１つの面に配置されたプローブ固定領域、プローブ固定領域に固定された第２の配列を含む核酸鎖を含む核酸プローブ、および第１の配列に相補的な第１の配列結合領域と、第２の配列に相補的な第２の配列結合領域とを含み、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列とのハイブリダイズによって核酸プローブに結合している被覆核酸鎖を含む。
【００３３】
標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害され得る。標識物質は、プローブ固定基体と別体でアッセイキットに含まれてもよく、或いは、核酸プローブが固定されている基体の少なくとも１面の核酸プローブに対応する位置に、間接的若しくは遊離可能に直接に、固定されている。
【００３４】
更なる例としてのプローブ固定基体は、プライマーセットを用いて、第１の配列番号および／またはその相補配列を増幅し、増幅産物を得るための等温増幅反応を行う反応場を支持する基体、反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプローブ固定領域、プローブ固定領域に固定された第２の配列を含む核酸鎖を含む核酸プローブ、第１の配列に相補的な第１の配列結合領域と第２の配列に相補的な第２の配列結合領域とを含み、第２の配列結合領域での第２の配列とのハイブリダイズによって核酸プローブに結合している被覆核酸鎖、基体の面の核酸プローブに対応する位置に、間接的または遊離可能に直接に、固定されている検出可能な信号を生ずる標識物質を備える。
【００３５】
２−３．プローブ固定基体
実施形態に従うと、例えば、次のようなプローブ固定基体が提供される。
【００３６】
基体は、第１〜第ｎのプライマーセットを用いる等温増幅反応が、第１〜第ｎの標的核酸をそれぞれ鋳型として、互いに異なる配列の第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの増幅産物を生成する反応場を支持するものであり得る。
【００３７】
プローブ固定領域として、反応場が形成された際に反応場に接する基体の少なくとも１つの面に独立して配置された第１〜第ｎのプローブ固定領域を含み得る。
【００３８】
核酸プローブとして、第１〜第ｎのプローブ固定領域のそれぞれにそれぞれ固定された第２１〜第２ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの核酸鎖をそれぞれ含む核酸プローブ群を含み得る。
【００３９】
被覆核酸として、第１１〜第１ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第１１〜第１ｎの配列結合領域と、第２１〜第２ｎの配列のそれぞれにそれぞれ相補的な第２１〜第２ｎの配列結合領域とをそれぞれ含み、第２１〜２ｎの配列結合領域それぞれでの第２１〜２ｎの配列それぞれとのハイブリダイズによって第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれに対して結合している第１〜第ｎの被覆核酸鎖を含み得る。
【００４０】
第１〜第ｎの核酸プローブおよび第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、次の（ａ）または（ｂ）の条件を満たす。
【００４１】
（ａ）形成された反応場での等温増幅反応条件下で、第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれに対応する第１〜第ｎの増幅産物と１〜第ｎの核酸プローブ配列とのそれぞれの競合、それらによる第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれからの第１〜第ｎの被覆核酸鎖の脱離、および第１〜第ｎの被覆核酸鎖の第１１〜１ｎの配列結合領域と第１〜第ｎの増幅産物の第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合が得られる配列である。
【００４２】
（ｂ）形成された反応場での等温増幅反応条件下で、第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれの第１１〜１ｎの配列結合領域と第１〜第ｎの増幅産物の第１１〜第１ｎの配列とのそれぞれのハイブリダイズを介したそれぞれの結合、および第１〜第ｎの増幅産物のそれぞれを鋳型とした第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの伸長が得られる配列である。
【００４３】
以上のような第１の実施形態に従うと、核酸を簡便かつ高感度に検出できる。
【００４４】
３．第２の実施形態
核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が、上記（ａ）の配列である場合の標的核酸検出法の１例を第２の実施形態として以下において更に詳しく説明する。
【００４５】
第２の実施形態の標的核酸検出法は、第１の配列および／またはその相補配列を含む標的核酸を検出する方法である。第１の配列は、任意の配列であればよい。当該方法は、等温増幅反応と、核酸プローブからの信号を指標とする増幅産物の検出を同じ反応場で同じ反応条件下で並行して行う。
【００４６】
等温増幅に使用するプライマーセットは、標的核酸に含まれる第１の配列を増幅するためのプライマーセットであればよい。また、プライマーセットは、反応場において得られる増幅産物の１本鎖部分に第１の配列を含むように設計されることが好ましい。例えば、ＬＡＰＭ法を利用する場合、ＬＡＭＰ増幅産物は、１本鎖領域であるループ部分と、２本鎖領域であるステム部分とを有するステムループ構造を有する。この場合、ループ部分に第１の配列が含まれるように設計され得る。
【００４７】
核酸プローブは、固相に固定されている核酸鎖と、それに結合している検出可能な信号を生ずる標識物質とを含む。核酸鎖は、第１の配列とは異なる第２の配列を含む。このような核酸プローブは、検出方法を行う以前の初期状態において、被覆核酸鎖とハイブリダイズしている。
【００４８】
被覆核酸鎖は、２つの配列領域を含む核酸である。１つめの領域は、第２の配列結合領域である。この領域は、核酸プローブに含まれる第２の配列に相補的な配列を有する。この領域と核酸プローブの第２の配列とのハイブリダイズによって、被覆核酸鎖は、核酸プローブに結合している。被覆核酸鎖が核酸プローブに結合していることにより、核酸プローブ中の標識物質の信号の検出が阻害されている。本実施形態において、標識物質の信号の検出の阻害とは、標識物質が本来的に生ずる信号を検出できない状態、または被覆核酸鎖が核酸プローブに結合していないときに検出されるべき信号が検出できない状態に修飾するなど、検出が阻害される、または検出可能性が阻害されることをいう。例えば、標識物質を有する核酸プローブが独立して１本鎖で存在するときには検出される信号が、核酸プローブへの被覆核酸鎖の結合によって、減弱若しくは消失または検出不可能な信号に変更若しくは変調するなどをいう。このような標識物質の信号の検出の阻害は可逆的である。核酸プローブへの被覆核酸の結合の解消、即ち、被覆核酸が核酸プローブから脱離すると、本来的に標識物質の生じる信号が検出できる状態になる。
【００４９】
被覆核酸鎖が含む２つめの領域は、第１の配列結合領域である。この領域は、増幅産物に含まれる第１の配列に相補的な配列を有する。この第１の配列結合領域には、増幅産物中の第１の配列がハイブリダイズする。
【００５０】
被覆核酸鎖が、上記のような２つの領域、即ち、核酸プローブが結合するための領域と増幅産物が結合するための領域とを有することにより、被覆核酸鎖についての核酸プローブと増幅産物との間での競合反応を得ることが可能となる。競合反応を利用することによって、増幅産物の存在量に応じて、被覆核酸鎖は核酸プローブから脱離する。そして被覆核酸鎖の第１の配列結合領域の配列が、増幅産物中の第１の配列とハイブリダイズする。それにより被覆核酸鎖は増幅産物と結合する。
【００５１】
標的核酸検出法では、このような被覆核酸鎖の結合によって信号の検出または検出可能性がマスクされている核酸プローブが存在している反応場において、等温増幅反応を行う。それと同時に等温増幅反応により生じた増幅産物と核酸プローブとの競合反応を行わせる。同時に核酸プローブからの被覆核酸鎖の脱離により生じた標識物質からの信号を検出する。信号の検出は、連続してモニタリングしてもよく、或いは断続的に複数の時点で検出を行ってもよい。
【００５２】
核酸プローブおよび被覆核酸鎖は、前記等温増幅反応条件下で次の２つの条件を満たす；
（ｉ）ハイブリダイズを介する核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が、反応場に第１の配列を含む核酸が存在しない場合には維持される；
（ｉｉ）反応場に前記第１の配列を含む核酸が存在する場合、この核酸と核酸プローブとが被覆核酸鎖に対して競合し、核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が解消する。
【００５３】
このような条件は、Ｔｍ値を考慮し、核酸プローブおよび被覆核酸鎖の塩基配列および塩基長を設計することにより満たすことができる。プライマーセットの反応場への持ち込みは、核酸プローブが固定されている固相に対するプライマーセットの添加であってもよく、それによる増幅産物が核酸プローブと遭遇できるように固相に対して遊離可能に固定されていてもよい。
【００５４】
このような標的核酸検出法は、より簡便かつ高感度に核酸を検出することが可能である。また、当該方法により、定量的に標的核酸を検出することが可能である。当該方法は、核酸プローブ固定基体を用いて行われ得る。
【００５５】
３−１．核酸プローブ固定基体
核酸プローブ固定基体の例を、図２を参照しながら説明する。この核酸プローブ固定基体は、試料中の標的核酸を等温で増幅し、且つ当該増幅により得られた増幅産物を検出することによって試料中の標的核酸を検出する反応具の例である。
【００５６】
図２（ａ）は、核酸プローブ固定基体の１例の初期状態を示す。図２（ｂ）は、増幅産物の１例を模式的に示す。図２（ｃ）は、更なる核酸プローブ固定基体の初期状態を示す。図２（ｄ）および（ｅ）は、図２（ｃ）の核酸プローブ固定基体の使用時の状態を示す模式図である。
【００５７】
図２（ａ）に示すように、核酸プローブ固定基体１は、基体２と核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とを備える。核酸プローブ３は、基体２に固定されている核酸鎖３ａと、核酸鎖３ａに結合している標識物質とを備える。このような核酸プローブ固定基体１により検出されるべき標的核酸からの増幅産物の１例を図２（ｂ）に示す。増幅産物６は、１本鎖領域に第１の配列８を有する。一方、核酸プローブ３の核酸鎖３ａは、第２の配列７を有する。図２（ａ）に示す被覆核酸鎖５は、核酸鎖３ａの配列、即ち、第２の配列７の相補配列であると共に、第１の配列８の相補配列である。言い換えれば、この被覆核酸鎖５では、第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’とが完全に重なって配置されており、第１の配列結合領域８’の配列と第２の配列結合領域７’の配列は等しい。
【００５８】
図２（ｃ）には、核酸プローブ固定基体１の更なる例を示す。この例は、核酸プローブ３および被覆核酸鎖５の配列の構成を除いて図２（ａ）の核酸プローブ固定基体１と同じ構成である。この例では、被覆核酸鎖５は、１本の核酸鎖上で更なる核酸１０を介して隣り合っている第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’とを有する。このような核酸プローブ固定基体１において増幅産物６が、被覆核酸鎖５で覆われた核酸プローブ３に接近する（図２（ｄ））と、被覆核酸鎖５を結合対象として、即ち、被覆核酸鎖５に対して、核酸プローブ３と増幅産物６とが競合する。ここで、図２（ｂ）には、１本鎖領域であるループ部分と、２本鎖領域を含むステム部分とを有するステムループ構造を有する増幅産物の１例を増幅産物６として示す。それによって被覆核酸鎖５と核酸プローブ３との間の結合は不安定になり、被覆核酸鎖５に増幅産物６が結合する。この結合は、被覆核酸鎖５の第１の配列結合領域への第１の配列のハイブリダイズによる。被覆核酸鎖５が脱離した結果、核酸プローブ３が含む標識物質４の信号が検出可能となる。この標識物質からの検出可能な信号を指標にして、試料中の標的核酸を測定することが可能となる。
【００５９】
核酸プローブ３への標識物質４の結合は、核酸プローブ３における何れの位置でもよい。また、核酸プローブ３の基体２への固定は、核酸鎖３ａの３’末端または５’末端の何れであってもよい。標識物質４の結合は、核酸鎖３ａの基体２への結合部付近であってもよく、核酸鎖３ａの非結合末端またはその付近であってもよく、核酸鎖３ａの中央部またはその付近であってもよい。標識物質４の核酸鎖３ａへの結合方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよく、核酸と標識物質とを結合するための何れの方法が選択されてもよい。
【００６０】
ここで、基体２は液相の反応場を支持するように構成されている。核酸プローブ３は、液相により反応場が形成された際に反応場に接する基体２の少なくとも１つの面に、一方の末端で固定されている。なお、図中、ここでは図２（ａ）〜（ｅ）では、相補的な配列同士を同様の斜線で示している。図２（ａ）の被覆核酸鎖５は、第１の配列８と第２の配列７の双方に相補的であることをクロスで示している。
【００６１】
ここにおいて、「反応場」とは、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域をいう。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域内のみで進行する場合には、反応領域が反応場と解される。
【００６２】
基体２は、容器形状、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよい。基体２の大きさおよび形状は実施者が任意に選択すればよい。また、基体２として、流路を有する基板を用いてもよい。
【００６３】
核酸プローブ３は、そこに含まれる核酸鎖３ａを形成した後に、そこに標識物質４を結合させた後に、基体２へ固定されてもよく、基体上に核酸プローブ３を形成し、そこに標識物質４を結合させてもよい。核酸プローブ３への被覆核酸鎖５の結合は、核酸プローブ３の基体２への固定の前に行ってもよく、固定の後に行ってもよい。
【００６４】
核酸プローブ３の基体２への固定は、これらに限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基およびビオチンなど末端修飾基を介して行ってよい。これらの官能基の選択および核酸プローブ３の固定は、それ自身公知の手段により達成することが可能である。
【００６５】
核酸プローブ３の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００６６】
被覆核酸鎖５は、第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’とを含む。第１の配列結合領域８’は、増幅産物６の少なくとも一部分の配列に相補的な配列を含んでよい。第２の配列結合領域７’は、核酸プローブ３の少なくとも一部分の配列に相補的な配列を含んでよい。
【００６７】
図２（ｃ）に示すように、核酸プローブ３は、第２の配列７に加えて更なる配列を含んでもよい。また、被覆核酸鎖５は、第１の配列結合領域８’（増幅産物６の第１の配列８の相補配列）および第２の配列結合領域７’（核酸プローブ３の第２の配列７の相補配列）に加えて更なる配列、例えば、スペーサ配列などを含んでいてもよい。
【００６８】
被覆核酸鎖５は、第２の配列７を介して核酸プローブ３とハイブリダイズすることにより、標識物質４が発する信号に影響を与えている。被覆核酸鎖５と核酸プローブ３との間のハイブリダイズは、被覆核酸鎖５に対して増幅産物６と核酸プローブ３とが競合し、被覆核酸鎖５が核酸プローブ３から脱離し、被覆核酸鎖５が増幅産物６と結合することによって解消する（図２（ｅ））。ここで、核酸プローブ３からの被覆核酸鎖５の解離と、被覆核酸鎖５および増幅産物６の結合とは、どちらかが先に生じ得る、或いは当該解離と当該結合とが同時に生じ得る。
【００６９】
図２（ａ）〜（ｄ）および（ａ’）〜（ｄ’）に更なる例を示した。これらの例は、被覆核酸鎖５の第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’の配置を除いて図２（ｃ）の核酸プローブ固定基体１と同じ構成である。
【００７０】
被覆核酸鎖５は、第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’との間に更なる塩基を含んでいてもよく、含んでいなくともよい。図３（ａ）および（ａ’）は、被覆核酸鎖５が第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’との間に更なる塩基を含まずに、これらが隣り合って配置されている例を示す。また第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’は、部分的に互いに重なり合って配置されてもよい（例えば、図３（ｂ）および（ｂ’））。また第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’は、一方の領域の一部分または全体が、他方の領域に含まれていてもよい（例えば、図３（ｂ）、（ｂ’）、（ｃ）および（ｃ’））。一方の領域の全体が他方の領域に含まれる場合の例を図３（ｃ）および（ｃ’）に示す。或いは、第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’が、完全に重なり合い、１つの配列を共有していてもよい（例えば、図２（ａ）、図３（ｄ）および（ｄ’））。また被覆核酸鎖５は、第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’のみを含んでいてもよく（例えば、図２（ａ））、それらの３’端側および５’端側に更なる塩基または塩基配列を含んでもよい（例えば、図２（ｄ）、図３（ａ）〜（ｄ）および（ａ’）〜（ｄ’））。
【００７１】
被覆核酸鎖５は、図２（ｃ）および図３（ａ）に示すように、第１の配列結合領域８’と第２の配列結合領域７’とが互いに重ならずに独立して配置されていることがより好ましい。この場合、第１の配列結合領域８’は増幅産物６とのハイブリダイズのために使用され、第２の配列結合領域７’は核酸プローブ３とのハイブリダイズのために使用される。これにより、核酸プローブ３の配列７（即ち、第２の配列）またはその相補鎖である被覆核酸鎖５の第２の配列結合領域７’の配列と、増幅産物６の配列（即ち、第１の配列）とを同じ配列にする必要がなくなる。その結果、核酸プローブ３および被覆核酸鎖５の設計の自由度が大きくなり、設計が簡便になる。例えば、後述するように複数の核酸プローブを１つの核酸プローブ固定基体において用いるときにはより有利である。
【００７２】
被覆核酸鎖５の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００７３】
第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’の塩基長は同じであっても異なっていてもよい。しかしながら、第１の配列結合領域８’と増幅産物６中の第１の配列との間の親和性（第１の親和性）と、第２の配列結合領域７’と核酸プローブ３との間の親和性（第２の親和性）は、第１の親和性の方が、第２の親和性よりも強く、結合の後により安定して存在することが好ましい。
【００７４】
第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’の塩基長は、それぞれ独立して例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。また、第１の配列結合領域８’および第２の配列結合領域７’の塩基長は、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００７５】
標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。また、標的核酸の長さは、使用するプライマーセットにより規定され得る。
【００７６】
増幅産物中の第１の配列の長さは、例えば、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００７７】
反応場への等温増幅に使用するプライマーセットの持ち込みは、反応液などの液体中に混合し、その液体を基体の核酸プローブが固定されている面に添加することにより行ってもよい。或いは、反応液などの液体中にプライマーセットを混合し、得られた混合液中に核酸プライマー固定基体を浸漬してもよい。また、詳しくは後述するが、プライマーセットは、核酸プライマーの固定されている基体表面に接する反応場に接する基体表面に遊離可能に固定されていてもよい。
【００７８】
反応液は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤が反応液に含まれてもよい。
【００７９】
反応液は、例えば、プライマーセット、更なる増幅試薬、例えば、増幅酵素、ｄＮＴＰ、緩衝剤などを水中に含む液体であってもよい。検査されるべき試料は、反応液に含まれて反応場に持ち込まれてもよく、反応液を反応場に持ち込んだ後に、その反応場に持ち込まれてもよい。
【００８０】
等温増幅反応条件、例えば、反応場の温度および塩濃度などは、そこにおいて使用される増幅酵素の種類の選択によって定まる。また、核酸プローブ固定基体１において使用される核酸プローブ３および被覆核酸鎖５の長さおよび塩基配列は、選択された増幅酵素の種類、等温増幅反応条件、例えば、温度および塩濃度などに応じて設計すればよい。核酸プローブおよび被覆核酸鎖は、等温増幅反応条件下で、次の２つの条件を満たす；
（ｉ）ハイブリダイズを介する核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が、反応場に第１の配列を含む核酸が存在しない場合には維持される；
（ｉｉ）反応場に第１の配列を含む核酸が存在する場合、この核酸と核酸プローブとが被覆核酸鎖に対して競合し、核酸プローブと被覆核酸鎖との結合が解消する。
【００８１】
例えば、核酸プローブ３および被覆核酸鎖５は、反応場の塩濃度および増幅反応時の温度においてもハイブリダイズを維持するように、Ｔｍ値および配列の長さが設計される。
【００８２】
核酸プローブ３および被覆核酸鎖５を設計する、並びに等温増幅反応条件を決定する際の基準は、核酸プローブ、被覆核酸鎖および増幅反応物の塩基配列長さ、並びに等温増幅反応条件、例えば、温度および塩濃度の何れかを最初に設定し、上記の２つの条件を満たすように他の条件を設定すればよい。
【００８３】
反応場の塩濃度は、増幅反応が可能である範囲であればよく、例えば、１０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲であってもよく、１０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲がより好ましい。増幅反応時の反応場の温度は、増幅反応が可能な範囲であればよく、例えば、２５℃〜７０℃の範囲であってもよく、例えば、５５℃〜６５℃の範囲であってもよい。
【００８４】
例えば、等温増幅反応条件として、反応場の温度条件が２５℃〜６０℃であり、ハイブリダイズによる核酸プローブと被覆核酸鎖とを含む２本鎖核酸のＴｍ値が６０℃以上となるように、核酸プローブおよび被覆核酸鎖の塩基長および塩基配列が調整されていることも好ましい。
【００８５】
例えば、第１の配列結合領域８’、第２の配列結合領域７’、第１の配列および第２の配列の塩基長は、全てが互いに同じ塩基長であってもよく、全てが互いに異なる塩基長であってもよい。また、第１の配列と第１の配列結合領域との塩基長が等しくてもよく異なってもよい。および/または第２の配列と第２の配列結合領域との塩基長が等しくても異なっていてもよい。更に、第１の配列と第２の配列とが同じ塩基長であってもよく、異なった塩基長であってもよい。第１の配列結合領域８’、第２の配列結合領域７’、第１の配列および第２の配列の塩基長は、それぞれ等温増幅反応条件下でのＴｍ値に応じて選択されればよい。
【００８６】
核酸プローブ３および被覆核酸鎖５の塩基長は、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、図２（ｃ）、図３（ａ）〜（ｄ）に示すように、核酸プローブ３および被覆核酸鎖５の一方が他方よりも長くてもよい。この場合では、核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とがハイブリダイズして２本鎖を形成すると、一方の５’側または３’側が、他方の３’側または５’側に一本鎖として延出している。
【００８７】
反応液中に検出されるべき第１の配列を有する核酸、即ち、標的核酸が存在した場合には、反応場に存在するプライマーセットは、等温増幅条件下で標的核酸を増幅する。これにより増幅産物６が産生される。
【００８８】
当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限および上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３塩基〜４０塩基、約１０塩基〜３０塩基などであってもよい。
【００８９】
標的核酸中の第１の配列は、プライマーセットに含まれる各プライマーの配列と同じであってもよく、一部が同じであってもよく、一部または全長に亘って異なっていてもよい。好ましいプライマーセットにおいて、そこに含まれる全てのプライマーが第１の配列とは異なる配列を有する。
【００９０】
図４（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に、標識物質２４として電気化学的活性な物質を備える核酸プローブ固定基体の１例の模式図を示す。この例は、標識物質２４が電気化学的活性な物質であり、それが生ずる信号を検出するためのセンサを備えること以外は、図２（ｃ）と同じ構成である。
【００９１】
この例では、図４（ａ）に示すように、核酸プローブ固定基体１は、電気化学的に活性な物質である標識物質２４が発する信号を検出するために基体２に配置されたセンサ、例えば、電極および配線などを含むセンサを備える（図示せず）。そして核酸プローブ３は電極に固定されている。核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とを含む２本鎖は、核酸プローブ３と競合する増幅産物６の存在に応じて（図４（ｂ））、被覆核酸鎖５が脱離した結果、核酸プローブ３からなる１本鎖となる（図４（ｃ））。この１本鎖は、基体２に固定された核酸プローブ３である。電気化学的に活性な物質からの信号、例えば、電流値（Ｉ）は、対応する増幅産物が存在せず、核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とが結合して２本鎖を形成しているときの電流値（Ｉ０）よりも、増幅産物の存在によって１本鎖になったときの電流値（Ｉｔ）の方が大きい。等温増幅反応の開始から所望の時間に亘りモニタリングする、または所望の時間間隔で複数の時点で測定すると、増幅産物が存在する場合には、増幅産物が存在しない場合に比べて大きな電流値が得られ得る。或いは、より早い時点で電流値の増加の立ち上がりが観察され得る。即ち、核酸プローブ３が１本鎖のときの信号の大きさと２本鎖のときの信号の大きさとの間には、増幅産物の有無および量を判定するために必要な差がある。このような信号特性の違いから、当該核酸プローブ固定基体１は、試料中の標的核酸を簡便かつ高感度に検出できる。当該核酸プローブ固定基体１は、反応場に存在する増幅産物を定量的に検出することが可能である。従って、当該核酸プローブ固定基体１は、試料中の増幅産物の量を決定することが可能である。
【００９２】
電気化学的に活性な物質からの信号は、例えば、電流値、電位値、電気容量値、インピーダンス値などの何れかの電気的な指標であればよい。核酸プローブからの被覆核酸鎖５の脱離に伴う当該信号の量的変化および／または予め定めた電気的特性の変化を測定することによって、標的核酸の有無または存在量を決定することが可能となる。信号の量的変化または電気的特性の変化は、例えば、信号の大きさの変化、例えば、信号の減少または消失であってもよく、これらの大きさの変化が生じるまでの時間の長さ、大きさの変化の開始時点のシフトなどであってよく、特定時間内での積算値の変化などであってもよい。
【００９３】
核酸プローブからの電気信号は、核酸プローブが固定される基板から獲得され得る。その場合、例えば、少なくとも一部の基板表面に電極が配置されればよい。その場合、核酸プローブは、電極上に固定され得る。
【００９４】
電気化学的に活性な物質としては、これらに限定するものではないが、例えば、電気的化学的に活性な金属錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体、ルビジウム錯体、アントラキノン（Anthraquinone）、メチレンブルー（Methylene Blue）などを用いることができる。例えば、フェロセンを含む化合物を用いることは好ましい。電気化学的に活性な物質を標識物質４として使用する場合、標識物質４はセンサのより近くに配置される方が、センサから遠くにあるよりも、より好ましい。標識物質４のセンサからの距離は、例えば、５０塩基程度のときであっても、電気化学的な信号を好ましく検出可能である。標識物質４のセンサからの距離は、これらに限定するものではないが、例えば、６０塩基以下、５５塩基以下、５０塩基以下、４０塩基以下、３０塩基以下、２０塩基以下、１０塩基以下であってもよい。標識物質４は、核酸プローブに含まれる核酸鎖中に配置されてもよく、核酸鎖の基板から近い末端若しくは遠い末端に付与されてもよく、核酸プローブの核酸鎖と基体とを結合するための末端修飾基と当該核酸鎖との間に配置されてもよい。更に、標識物質４は１つの核酸プローブ中に複数で含まれてもよく、単数で含まれてもよい。複数で含まれる場合、それらは同じ種類であっても、異なる種類であってもよい。
【００９５】
また、標識物質として光学的に活性な物質を用いてもよい。図４（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）に、標識物質として光学的に活性な物質を備える核酸プローブ固定基体の１例の模式図を示す。この例は、標識物質として光学的に活性な物質を用い、更に被覆核酸鎖５が、クエンチャー９を備えること以外は、図２（ｃ）および図４（ａ）〜（ｃ）と同じ構成である。クエンチャー９は、光学的に活性な物質からの光学的信号をより効果的に検出に利用するために用いられる。
【００９６】
図４（ａ）に示すように、使用前または増幅産物が存在しないときの核酸プローブ固定基体１は、基体２と、それに結合している核酸プローブ３と、核酸プローブ３にハイブリダイズしている被覆核酸鎖５とを備える。核酸プローブ３は、基体２に対してその一端で固定されている核酸鎖３ａと、その他方の末端に光学的に活性な物質である標識物質３４とを備える。被覆核酸鎖５は、核酸鎖３ａの一部分の配列７（第２の配列７）に相補的な配列（第２の配列結合領域７’の配列）と増幅産物６の一部分の配列８（第１の配列８）に相補的な配列（第１の配列結合領域８’の配列）と、第２の配列結合領域７’と第１の配列結合領域８’との間に配置されたクエンチャー９とを含む。
【００９７】
核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とを含む２本鎖は、核酸プローブ３と競合する増幅産物６の存在下では（図４（ｅ））、被覆核酸鎖５が脱離し、その結果、核酸プローブ３からなる１本鎖となる（図４（ｆ））。核酸プローブ３に含まれる光学的に活性な物質からの信号は、被覆核酸鎖５の結合によって検出が阻害される。この例では、この阻害を増強するために被覆核酸鎖５が更にクエンチャー９を含んでいる。
【００９８】
光学的に活性な物質からの信号、例えば、蛍光値（Ｆ）は、対応する増幅産物が存在せず、核酸プローブ３に被覆核酸鎖５が結合して２本鎖を形成しているときの蛍光値（Ｆ０）よりも、増幅産物の存在によって１本鎖になったときの蛍光値（Ｆｔ）の方が大きい。等温増幅反応の開始から所望の時間に亘りモニタリングする、または所望の時間間隔で複数の時点で測定すると、増幅産物が存在する場合には、増幅産物が存在しない場合に比べて大きな蛍光値が得られる。それと共に、早い時点で蛍光値の増加の立ち上がりが観察される。即ち、核酸プローブ３が１本鎖のときの信号特性と２本鎖のときの信号特性との間には、増幅産物の有無および量を判定するために必要な差がある。このような信号特性の違いにより、当該核酸プローブ固定基体１は、試料中の標的核酸を簡便かつ高感度に検出できる。当該核酸プローブ固定基体１は、反応場に存在する増幅産物を定量的に検出することが可能である。従って、当該核酸プローブ固定基体１は、試料中の増幅産物の量を決定することが可能である。
【００９９】
光学的に活性な物質からの信号は、何れかの光学的な指標であればよく、例えば、特定の波長を有する光、例えば、蛍光、発光などであってよい。核酸プローブ３からの被覆核酸鎖５の脱離に伴う当該信号の量的および／または予め定めた光学的特性の変化を測定することによって、標的核酸の有無または存在量を決定することが可能となる。信号の量的または光学的特性の変化は、例えば、光強度の変化、光強度の増加、減弱若しくは消失、波長の変化などであってもよく、光強度の大きさまたは波長の変化が生じるまでの時間の長さ、当該変化の開始時点のシフトなどであってよく、また特定時間内での積算値の変化であってもよい。
【０１００】
標識物質として使用される蛍光物質の例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）などを含む。
【０１０１】
例えば、被覆核酸鎖５に含まれるクエンチャーの例は、例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＤａｂｃｙｌなどを含む。また、例えば、標識物質４としてＣｙ３またはＣｙ５が選択される場合には、クエンチャーとして例えば、ＥｕキレートまたはＵｌｉｇｈｔを用い得る。
【０１０２】
上述の例では、被覆核酸鎖５がクエンチャー９を含んでいる例を示した。クエンチャー９が被覆核酸鎖５に含まれることにより、核酸プローブ３に被覆核酸鎖５のみが結合している場合に比べて、光学的に活性な物質からの信号の発生は更に抑制される。即ち、核酸プローブ３と被覆核酸鎖５とが結合して２本鎖を形成している状態の信号値と、２本鎖から被覆核酸鎖５が脱離した状態の信号値との差が大きくなる。言い換えれば、増幅産物６が存在するときの信号値と、増幅産物６が存在しないときの信号値の差が大きくなる。これにより、更により高精度に標的核酸の検出を行うことが可能となる。
【０１０３】
当該核酸プローブ固定基体は、上述したクエンチャーのように、被覆核酸鎖５による信号検出の阻害効果を増強または補助する修飾物質が被覆核酸鎖５に含まれてもよい。そのような修飾物質は、被覆核酸鎖５の核酸プローブへの結合によって阻害される標識物質の本来的な信号の検出の阻害を促進または補助する物質であればよい。例えば、そのような修飾物質は、被覆核酸鎖５の結合による標識物質４からの信号のマスキング、減少若しくは消失を増強する物質および／または標識物質４の信号特性を検出不可能な方向に変更若しくは修飾する物質などであればよい。例えば、電気化学的に活性な物質を標識物質として用いる場合には、被覆核酸鎖５による電気信号の減少または消失を増強または補助する物質であってもよい。例えば、光学的に活性な物質を標識物質として用いる場合には、被覆核酸鎖５による本来的に生じる光学信号を減少および／または光学的信号の波長を変更する物質などであってもよい。言い換えれば、被覆核酸鎖５は、それ単独で用いられる場合よりも、修飾物質と共に用いられる方が、増幅産物の存在量若しくは不在に応じた、標識物質の信号特性の変化量を大きくできる。従って、修飾物質の使用によって、より高い精度で増幅産物６の存在状態を示すことが可能となる。
【０１０４】
上述したように、プライマーセットが基体に遊離可能に固定され、液体が持ち込まれて反応場が形成されたときに、反応場に遊離してもよい。この反応場への遊離により、プライマーセットが反応場に持ち込まれる。
【０１０５】
このような固定されたプライマーセットを備える核酸プローブ固定基体は、反応場が形成された際に当該反応場に接する基体の少なくとも１つの面に配置されたプライマー固定領域と、このプライマー固定領域に遊離可能に固定されているプライマーセットとを更に備え得る。プライマー固定領域は、対応する核酸プローブが存在する反応場に接する基体の少なくとも１つの面に配置されてもよい。
【０１０６】
また、核酸プローブ固定基体は、１つの基体に固定された複数種類の核酸プローブを備えてもよい。１つの核酸プローブ固定基体において、核酸プローブ３および／または被覆核酸鎖５を複数種類用いる場合には、反応場が形成された際に、当該反応場に接する基体２の少なくとも１つの面に、互いに独立して配置された複数のプローブ固定領域１３を配置することが好ましい。
【０１０７】
図５（ａ）および（ｃ）は、更なる実施形態の核酸プローブ固定基体の例の斜視図である。
【０１０８】
図５（ａ）に記載の核酸プローブ固定基体１は、容器形状の基体２を有する。基体２の内側の底部１４、例えば、底面には、互いに独立した複数のプローブ固定領域１３を備える。プローブ固定領域１３には、標識物質４と核酸鎖とを備え、且つ被覆核酸鎖５が結合している２本鎖の核酸プローブ３が複数固定されている。図５（ｂ）は、図５（ａ）の核酸プローブ固定基体１のプローブ固定領域１３の様子を示す。
【０１０９】
容器形状の基体２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また基体２の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の基体２は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。
【０１１０】
１つの基体２に配置される複数のプローブ固定領域１３に固定される核酸プローブ３は、全ての領域に亘り互いに同じ種類の核酸プローブ３であってもよく、任意の複数の領域が互いに同じ種類の核酸プローブ３であってもよく、全ての領域が互いに異なった種類の核酸プローブ３であってもよい。また、核酸プローブ３に結合している被覆核酸鎖５は、全ての領域の核酸プローブ３に亘り同じであってもよく、任意の複数の領域が互いに同じであってもよく、核酸プローブ３の種類毎に異なっていてもよく、全ての領域が互いに異なる被覆核酸鎖５を割り振られてもよい。また、１つの核酸プローブ固定基体１に含まれる被覆核酸鎖５を有する核酸プローブ３は、１種類の増幅産物を検出するための核酸プローブであってもよく、異なる種類の複数の増幅産物を検出するための核酸プローブであってもよい。互いに同じ種類の核酸プローブは、同じ塩基長を有し、且つ同じ塩基配列を有する。互いに異なる種類の２つの核酸プローブは、互いに同じ塩基長で異なる配列を有してもよく、互いに異なる塩基長で一部分同じ配列を有してもよく、互いに異なる塩基長で異なる配列を有してもよい。
【０１１１】
例えば、被覆核酸鎖５の第１の配列結合領域８’の配列は、増幅産物６に含まれる第１の配列８の種類毎に異なっていてもよい。或いはそれは、１つの核酸プローブ固定基体において検出されるべき互いに異なる複数種類の増幅産物のために、共通する第１の配列結合領域８’が選択されてもよい。またそれは、検出されるべき複数種類の増幅産物のうちの幾つかのために、共通する第１の配列結合領域８’が選択されてもよい。また更に、用いられる複数種類の被覆核酸鎖５の配列が正規直交化配列であってもよい。被覆核酸鎖５の第２の配列結合領域７’の配列についても、核酸プローブとの関係および配列が同様に選択されてもよい。
【０１１２】
正規直交化配列とは特定の関係性を有する配列群を指す。それらの配列は、Ｔｍ値が均一、即ちＴｍ値が一定範囲内に揃うように設計された互いに異なる配列である。それらは、核酸分子自身が分子内で構造化しないので、相補的な配列とのハイブリダイズを阻害することがない。またそれらは相補的な塩基配列以外の配列とは安定したハイブリダイズを形成しない配列である。このような正規直交化配列の使用も好ましい。
【０１１３】
例えば、隣り合うプローブ固定領域１３の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもあってもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってもよい。
【０１１４】
１つの核酸プローブ固定基体１において、複数種類のプライマーセットを用いてもよい。例えば、複数種類のプライマーセットは、反応場を形成するための液体、少なくとも緩衝剤を含む水溶液、或いは更なる反応試薬および／または試料を含む反応液に含ませて反応場または所望の基体表面に持ち込んでもよい。或いは、複数種類のプライマーセットを基体２に遊離可能に固定して反応場に持ち込んでもよい。例えば、複数種類の標的核酸を検出する場合などにおいては、プライマーセット、核酸プローブ３および／または被覆核酸鎖５を複数種類用い得る。
【０１１５】
プライマーセットが固定されている核酸プローブ固定基体は、基体と、基体の少なくとも１つの表面に独立して遊離可能に固定されているプライマーセットと、プライマーセットに対応して独立して固定され、検出可能な信号を生ずる標識物質を含む核酸プローブと、核酸プローブ３に結合しており、それによって核酸プローブからの信号の検出を阻害している被覆核酸鎖とを含み得る。
【０１１６】
プライマーセットを複数種類用いる場合、反応場が形成された際に、当該反応場に接する基体２の少なくとも１つの面に、互いに独立して配置された複数のプライマー固定領域を配置することも好ましい。
【０１１７】
図５（ｃ）は、核酸プローブとプライマーセットとを共に固定して備える核酸プローブ固定基体の１例の斜視図である。この例では、それぞれのプローブ固定領域１３に近接してプライマー固定領域１１が配置されている。図５（ｄ）は、図５（ｃ）の核酸プローブ固定基体１のプローブ固定領域１３の様子を示す。プローブ固定領域１３には、標識物質４によって標識され、被覆核酸鎖５が結合している核酸プローブ３が複数本で固定されている。図５（ｅ）は、プライマー固定領域１１の様子を示す拡大図である。プライマー固定領域１１には、複数本のプライマーとしての核酸鎖が固定されている。
【０１１８】
図５（ｃ）の核酸プローブ固定基体は、核酸プローブ３と共にプライマーセット１２が固定されていることを除いて図５（ａ）に示す核酸プローブ固定基体１と同じ構成を有する。即ち、基体２の内側底部１４、例えば、底面には、互いに独立した複数のプローブ固定領域１３のそれぞれに対応して、互いに独立した複数のプライマー固定領域１１が配置されている。各プライマー固定領域１１には、プライマーセット１２がそれぞれ固定されている。
【０１１９】
プライマーセット１２の基体２への固定は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。例えば、プライマーセット１２の基体２への固定は、プライマーセット１２を含む溶液を基体２に滴下し、その後乾燥させることにより達成される。プライマーセット１２を含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセット１２を含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってもよい。複数のプライマー固定領域１１に、それぞれ所望の種類のプライマーセット１２を含む溶液を滴下し、乾燥する。それにより基体２の１つの面に独立して配置されている複数または全てのプライマー固定領域１１にプライマーセット１２が遊離可能に固定される。
【０１２０】
プライマーセット１２の基体２への固定は、核酸プローブ３の固定の前に行われてもよく、核酸プローブ３の固定の後に行われてもよい。
【０１２１】
１つのプライマー固定領域１１には１つの種類のプライマーセット１２が、複数セットで固定され得る。複数のプライマー固定領域１１のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット１２がそれぞれ固定され得る。
【０１２２】
プライマーセット１２は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類で用意され得る。例えば、１つのプライマー固定領域１１には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット１２が複数セットで固定され得る。例えば、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定領域１１に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、およびＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれ得る。
【０１２３】
ここで、固定領域について「独立して配置される」とは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う固定領域は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出反応具において固定されるプローブと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。
【０１２４】
例えば、隣り合うプライマー固定領域１１の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもあってもよく、好ましくは１００μｍ〜１０ｍｍであってもよい。
【０１２５】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーセット１２が遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【０１２６】
例えば、プローブ固定領域１３とプライマー固定領域１１の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもあってもよく、好ましくは１００μｍ〜１０ｍｍであってもよい。
【０１２７】
例えば、プローブ固定領域１３とプライマー固定領域１１との間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定領域１３とプライマー固定領域１１は、基体２の表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定領域１３がプライマー固定領域１１に含まれてもよく、プライマー固定領域１１がプローブ固定領域１３に含まれてもよい。
【０１２８】
１つのプライマー固定領域１１に固定されるプライマーセット１２の種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類、例えば、２種類以上であってもよい。従って、１つのプライマー固定領域１１に固定される複数のプライマーセット１２は、所望に応じて互いに異なってもよく、一部が互いに異なる配列または一部が互いに同じ配列であってもよい。また、１つの基体２に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーが互いに異なっていてもよく、一部のプライマーが互いに同じ長さであってもよく、一部のプライマーが互いに異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎またはプライマーセットに含まれるプライマーの種類毎に長さが異なっていてもよい。
【０１２９】
１つの核酸プローブ固定基体１に配置されるプライマー固定領域１１とプローブ固定領域１３の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定領域１１に対応するように同数のプローブ固定領域１３が配置されてもよく、プライマー固定領域１１の数がプローブ固定領域１３の数よりも多くてもよく、プライマー固定領域１１の数がプローブ固定領域１３の数よりも少なくてもよい。
【０１３０】
核酸プローブ固定基体１は、更に陽性信号および／または陰性信号を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。ポジティグコントロールおよびネガティブコントロールは、コントロール固定領域に固定され得る。また、このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセット１２および／または核酸プローブ３について設けてもよい。
【０１３１】
ポジティブコントロールは、例えば、標識された１本鎖状態のプローブを用い得る。ネガティブコントロールは、例えば、増幅産物と相補的な配列を持たない２本鎖状態のプローブを用い得る。
【０１３２】
図５（ａ）および（ｃ）では、プローブ固定領域１３およびプライマー固定領域１１が基体２の内側底部１４に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、基体２の内側側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、内側底部１４および内側側面、例えば、基体２に取り付けられた被覆部により形成される天井面などのいずれか、または全てに配置されてもよい。
【０１３３】
図５（ｃ）の核酸プローブ固定基体１の使用時の様子を図６を参照しながら説明する。図６は、容器形状の核酸プローブ固定基体１において行われる核酸反応の様子を経時的に示す模式図である。
【０１３４】
図６（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前の核酸プローブ固定基体１を示す。基体２の内側の底部１４、例えば、底面に配置された複数のプライマー固定領域１１に複数のプライマーセット１２がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定領域１１に対応して、それぞれのプライマー固定領域１１の近傍にプローブ固定領域１３が配置されている。プローブ固定領域１３には、複数の核酸プローブ３が所望の種類毎に固定され、当該複数の核酸プローブ３には被覆核酸鎖がハイブリダイズしている。
【０１３５】
核酸プローブ固定基体１に反応液ＲＳを添加し、それを収容した状態を図６（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。
【０１３６】
基体２の内部への試料の添加は、核酸プローブ固定基体１に反応液ＲＳを添加する以前に反応液に予め添加することにより行われてもよい。または、それは反応液ＲＳを核酸プローブ固定基体１に添加した後に反応液ＲＳに添加することにより行われてもよい。または、それは、核酸プローブ固定基体１に反応液ＲＳを添加する以前に、試料を核酸プローブ固定基体１に添加することにより行われてもよい。
【０１３７】
図６（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように、反応液ＲＳが添加された後の核酸プローブ固定基体１では、底部１４に固定されたプライマーセット１２が遊離して、徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域で示す。遊離し、拡散していくプライマーセット１２は、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセット１２は、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセット１２を用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立して同時に達成される。
【０１３８】
図６（ａ−３）および（ｂ−３）は、遊離および拡散した領域に、増幅の対象となる鋳型核酸が存在し、増幅反応が生じ、それが進行している状態を模式的に示す。
【０１３９】
図６（ａ−３）には、全てのプライマー固定領域１１に固定されたプライマーセット１２により増幅反応が生じ、それが進行している領域を反応領域として模式的に示す。図６（ｂ−３）には、内側の底部１４に固定された全てのプライマー固定領域１１のうちの一部分、即ち、図６（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じ、それが進行している領域を反応領域として模式的に示す。
【０１４０】
図７はチップ型の核酸プローブ固定基体、即ち、アレイ型の核酸プローブ固定基体１である。図７に記載のアレイ型の核酸プローブ固定基体１は、基板を基体２として用いる例である。基体２の１つの面１６には、複数のプライマー固定領域１１が互いに独立して配置されている。プライマー固定領域１１には、図５（ｃ）と同様に、１つのプライマー固定領域１１に対して１つの種類のプライマーセット１２が固定されている。複数のプライマー固定領域１１のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット１２がそれぞれ固定されている。１つプライマー固定領域１１に含まれるプライマーセット１２は、例えば、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要な異なる種類のプライマーを含み得る。
【０１４１】
それぞれのプライマー固定領域１１に対応して、その近傍にプローブ固定領域１３が配置される。プローブ固定領域１３には、種類毎に複数の核酸プローブ３が固定され、それぞれの核酸プローブ３には被覆核酸鎖５がハイブリダイズしている。
【０１４２】
このアレイ型核酸プローブ固定基体１を用いて核酸の増幅および検出を行う際には、少なくとも基体２のプライマーセット１２および核酸プローブ３が固定された領域または面に対して、反応液を載せることにより反応場を形成することにより行い得る。
【０１４３】
或いは、核酸の増幅および検出を行う際には、このアレイ型核酸プローブ固定基体１が容器内に配置され得る。その容器内に反応液を添加することにより反応場が形成され得る。この場合、基体２の両面にプライマーセット１２と核酸プローブ３とが固定され得る。これにより、アレイ型核酸プローブ固定基体１の基体２に、より多くの種類のプライマーセット１２および核酸プローブ３を固定し得る。その結果、より多くの標的配列が増幅および検出され得る。
【０１４４】
更に、アレイ型核酸プローブ固定基体１におけるプライマーセット１２および／または核酸プローブ３の位置を識別するためのラベルが基体２に付与され得る。ラベルの付与は、それ自身公知の手段により行い得る。
【０１４５】
核酸プローブ固定基体の更なる例を、図８を参照しながら説明する。
【０１４６】
図８は、アレイ型核酸プローブ固定基体の平面図である。図８に記載のアレイ型核酸プローブ固定基体１は、流路を有する基板を基体２として用いる例である。基体２の１つの面１６には、直線上に伸び、互いに平行に並ぶ複数の溝により構成された複数の流路１５が形成されている。それぞれの流路１５の底部１４には、複数のプライマー固定領域１１が、流路１５の長手方向に沿って互いに独立して配置される。プライマー固定領域１１には、１つのプライマー固定領域１１に対して１つの種類のプライマーセット１２が固定されている。複数のプライマー固定領域１１のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット１２がそれぞれ固定されている。１つプライマー固定領域１１に含まれるプライマーセット１２は、例えば、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要な異なる種類のプライマーを含んでよい。
【０１４７】
それぞれのプライマー固定領域１１に対応するように、プライマー固定領域１１の近傍にプローブ固定領域１３が配置されている。１つの流路１５において、プライマー固定領域１１とプローブ固定領域１３は、流路１５の長手方向に沿って交互に配置されている。１つのプローブ固定領域１３には、標識物質４を含み、被覆核酸鎖５と結合している核酸プローブが固定されている。複数配置されたプローブ固定領域１３のそれぞれには、互いに異なる標的核酸を検出するための核酸プローブが固定され得る。
【０１４８】
この実施形態を用いての核酸の増幅および検出は、図７の実施形態と同様に行われ得る。或いは、流路１５に対して流体を流すことによって、反応場を形成し、核酸の増幅および検出を行ってもよい。更に、流路１５を形成している溝を所望の蓋体（図示せず）によって覆ってもよい。
【０１４９】
上述のアレイ型核酸プローブ固定基体１は、基体２の表面に流路を形成し、形成された流路内の少なくとも１つの壁面に対してプライマーセット１２および核酸プローブ３を固定することと、核酸プローブ３に被覆核酸鎖５をハイブリダイズさせることとにより製造されてよい。
【０１５０】
流路１５の形成は、基体２の１つの面１６に凹部若しくは凸部、または凹部と凸部を形成することにより行われてよい。それにより、流路１５の形状は、凹部若しくは凸部、または凹部と凸部により規定され得る。例えば、流路１５の形成は、基体２の表面に対して、エッチングなど、基板に溝を形成するためのそれ自身公知の何れかの手段を施すことにより行われ得る。基体２に含まれる流路１５の数は、１または複数であってもよく、好ましくは複数である。
【０１５１】
プライマー固定領域１１およびプローブ固定領域１３の配置、並びにプライマーセット１２および核酸プローブ３の固定は上述の実施形態と同様に行われ得る。
【０１５２】
流路１５に対して配置されるプライマー固定領域１１およびプローブ固定領域１３の位置は、流路底面または底部のみに限られるものではなく、流路内の何れかの面であればよい。例えば、そのような面は、流路１５の底面、側面および/または任意の天井面であり得る。流路１５の天井面は、例えば、全ての流路１５を覆う、または各流路１５を独立して覆うように構成された被覆体または蓋体を基体２に取り付けて提供される流路１５の天井面であり得る。
【０１５３】
流路１５内にプライマー固定領域１１およびプローブ固定領域１３を配置したアレイ型核酸プローブ固定基体１における増幅反応の様子および検出結果を図９〜１１を用いて説明する。
【０１５４】
図９は、図８に示すアレイ型核酸プローブ固定基体１に形成された流路１５のうちの１つの流路１５ａについて示す図である。
【０１５５】
図１０は、プライマー固定領域１１およびプローブ固定領域１３の位置が流路１５ｂの側面であることを除いて、図９に示すアレイ型核酸プローブ固定基体１と同様な核酸プローブ固定基体の１つの流路を示す。
【０１５６】
図１１は、プライマー固定領域１１とプローブ固定領域１３とが実質的に同じ位置に配置されたことを除いて、図９に示すアレイ型核酸プローブ固定基体１と同じ構成の核酸プローブ固定基体の１つの流路１５ｃについて示す。
【０１５７】
図９（ａ）、１０（ａ）および１１（ａ）は、プライマーセット１２と核酸プローブセットが流路１５に固定されている状態を示す。図９（ａ）、１０（ａ）および１１（ａ）の何れにおいても、流路１５の長手方向に沿った流路１５内面に領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧが配置されている。領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのそれぞれには、プライマーセット１２が遊離可能に固定され、それに対応して配置されるべき核酸プローブ３が固定されている。領域Ａ〜Ｇにそれぞれ固定されたプライマーセット１２は、互いに異なる標的配列を増幅するために互いに異なるように設計されている。核酸プローブ３とハイブリダイズしている被覆核酸鎖５は、領域毎に異なる第１の配列を検出するために互いに異なる配列を有する。即ち、領域Ａ〜領域Ｇにそれぞれ配置されたプライマー固定領域１１とプローブ固定領域１３には、領域毎に異なる種類の配列を標的配列および第１の配列とするプライマーセット１２と核酸プローブ３が固定され、被覆核酸鎖５が核酸プローブ３にハイブリダイズしている。
【０１５８】
具体的には、各流路内の領域Ａ〜Ｇにおいて、プライマーセット１２と核酸プローブ３が固定される位置は次の通りである。図９（ａ）では、各領域の位置に対応する流路１５ａの底部１４に、プライマーセット１２とそれに対応する核酸プローブ３とが隣り合って、流路１５の長手方向に沿って配置されている。図１０（ａ）では、流路１５ｂの各領域の位置に対応する一方の側面に対して、プライマーセット１２が遊離可能に固定されている。核酸プローブ３は、プライマーセット１２が固定された側面に対向する、流路１５ｂのもう一方の側面に固定されている。図１１（ａ）では、流路１５ｃの各領域の位置に対応する底部１４の同じ位置に対して、プライマーセット１２が遊離可能に固定され、核酸プローブ３が固定されている。これらの核酸プローブ３には、被覆核酸鎖５が結合している。
【０１５９】
図９（ａ）、１０（ａ）および１１（ａ）のそれぞれの流路１５に反応液を加えた後の状態を図９（ｂ）、１０（ｂ）および１１（ｂ）に示す。各流路１５に反応液が添加されると、プライマーセット１２が反応液中に遊離し、拡散する。反応液中に標的となる鋳型核酸が存在した場合、増幅反応が生じ、増幅産物６が産生される。図９（ｂ）、１０（ｂ）および１１（ｂ）では、増幅反応が生じ、進行している領域を増幅領域１７として模式的に示す。増幅領域１７において産生された増幅産物６に検出されるべき第１の配列が含まれる場合、対応する被覆核酸鎖５について、核酸プローブ３と増幅産物６とが競合反応をする。そして、核酸プローブ３と被覆核酸鎖５との間のハイブリダイズが解消し、検出信号が生じる。
【０１６０】
図９（ｃ）、１０（ｃ）および１１（ｃ）では、それぞれ流路１５ａ，ｂ，ｃの領域Ａ〜Ｇで検出される検出信号の大きさを表すグラフが示される。このグラフは、添加された反応液に含まれる試料が、各流路１５ａ，ｂ，ｃの領域Ａ、ＣおよびＦに固定されたプライマーセット１２により増幅される標的配列を含み、且つそれらのプライマーセット１２により得られた増幅産物６には、領域Ａ、ＣおよびＦに固定された核酸プローブ３とハイブリダイズしている被覆核酸鎖５の第１の配列結合領域８’の配列に相補的な第１の配列が含まれることを示す。即ち、図９（ｃ）、１０（ｃ）および１１（ｃ）のグラフにおいて、領域Ａ、ＣおよびＦについて得られる信号（図中「検出信号」と記載する）は、バックグラウンドレベルよりも大きい検出信号である。このような結果から、試料中に目的とする第１の配列を有する増幅産物が存在することが示される。それに対して、領域Ｂ、Ｄ、ＥおよびＧについて得られる信号は、バックグラウンドレベル以下である。これらの結果に基づいて、「試料中に検出されるべき標的核酸が存在する」と判定される。
【０１６１】
上記の例では、増幅のための試薬としてプライマーセット１２のみが基体２に固定された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセット１２が種類毎に各固定領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などがプライマーセット１２と共に基体２に固定され得る。その場合、固定しようとする物質をプライマーセット１２と一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのような核酸プローブ固定基体１において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【０１６２】
１つの実施形態において、核酸プローブ固定基体は、第１〜第ｎの標的核酸を検出するための核酸プローブ固定基体であってもよい（ここにおいて、ｎは、２以上の整数である）。前記第１〜第ｎの標的核酸は、それぞれ第１１〜第１ｎの配列および／またはその相補配列である第１〜第ｎの相補配列を含む。核酸プローブ固定基体は；
（ｉ）そこにおいて第１〜第ｎのプライマーセットを用いる等温増幅反応が、当該第１〜第ｎの標的核酸をそれぞれ鋳型として、互いに異なる配列の前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む第１〜第ｎの増幅産物を生成する反応場を支持するように構成されている基体；
（ii）前記反応場が形成された際に当該反応場に接する前記基体の少なくとも１つの面に独立して配置された第１〜第ｎのプローブ固定領域；
（iii）前記第１〜第ｎのプローブ固定領域にそれぞれ固定された第２１〜第２ｎの配列を含む第１〜第ｎの核酸鎖と、当該第１〜第ｎの核酸鎖にそれぞれ結合している検出可能な信号をそれぞれ生ずる第１〜第ｎの標識物質とを含む第１〜第ｎの核酸プローブ；および
（iv）前記第１１〜第１ｎの配列にそれぞれ相補的な第１１〜第１ｎの配列結合領域と、前記第２１〜第２ｎの配列にそれぞれ相補的な第２１〜第２ｎの配列結合領域とを有し、前記第２１〜２ｎの配列結合領域それぞれでの前記第２１〜２ｎの配列それぞれとのハイブリダイズによって前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれに結合しており、それらによって前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれからの当該信号の検出をそれぞれ阻害している第１〜第ｎの被覆核酸鎖；
を備え得る。ここにおいて、第１〜第ｎの核酸プローブおよび前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列は、形成された前記反応場での前記等温増幅反応条件下で、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖それぞれに対する対応する前記第１〜第ｎの増幅産物と前記１〜第ｎの核酸プローブ配列との競合、それらによる前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれからの前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の脱離、および前記第１１〜１ｎの配列結合領域それぞれでの前記第１１〜第１ｎの配列それぞれとのハイブリダイズを介した前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖と前記第１〜第ｎの増幅産物とのそれぞれの結合が得られるようにそれぞれ設計されている。
【０１６３】
このような実施形態において、形成された前記反応場における前記等温増幅反応条件下で、当該ハイブリダイズによる前記第１〜第ｎの核酸プローブそれぞれと対応する前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖との結合は次の通りである。即ち、対応する前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む核酸が当該反応場に存在しない場合には維持される。これに対して、対応する前記第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ含む核酸が当該反応場に存在し、これらの核酸と対応する前記核酸プローブとが対応する前記被覆核酸鎖に対してそれぞれ競合する場合には、当該結合は解消する。このような条件は、例えば、前記第１〜第ｎの核酸プローブおよび前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖の塩基配列の長さおよびＴｍ値を調整することにより達成され得る。
【０１６４】
また、このような核酸プローブ固定基体は、更に、前記第１〜第ｎのプローブ固定領域のそれぞれと同じ位置またはそれぞれの近傍に独立してそれぞれ配置されている第１〜第ｎのプライマー固定領域、および前記第１〜第ｎのプライマー固定領域のそれぞれに遊離可能にそれぞれ固定されている当該第１〜第ｎのプライマーセットを備え得る。
【０１６５】
また、そこおいて、前記第２１〜第２ｎの配列が互いに同じ配列を有し、前記第１１〜第１ｎの配列結合領域が互いに異なる配列を有することも好ましい。
【０１６６】
従来の技術においては、被覆核酸鎖５を用いずに、直接に核酸プローブに対して検出されるべき核酸鎖をハイブリダイズさせて検出していた。このような技術では、一つの反応場で、増幅と検出とを同時に行うことは困難である。例えば、増幅反応に適する塩濃度は、核酸のハイブリダイズに適する塩濃度よりも低い。そのため、増幅反応を行った反応場では安定したハイブリダイズが得られず、増幅反応と核酸のハイブリダイズの測定とを１つの反応場で行うことは困難であった。
【０１６７】
本実施形態に拠る核酸プローブ固定基体では、増幅産物の存在に応じて生ずる核酸プローブと被覆核酸鎖との間のハイブリダイズの解消を利用して検出を行う。そのため、増幅反応条件下で、増幅反応と同時に増幅産物をより高感度かつ高精度で測定することが可能となった。これにより、試料中の標的核酸を定量することも可能である。また、複数の標的核酸を同時に増幅し、同時に検出することが可能であるために、従来よりも短時間で標的核酸に関する検査を行うことが可能となる。また、試料の取り違いが生じる可能性も低くなる。
【０１６８】
また、流路を備える反応具の場合には、流路内で反応を行うことが可能である。従って、より操作性に優れたアレイ型核酸プローブ固定基体が提供される。
【０１６９】
また、流路を設けることによって、反応液をより簡便且つ短時間に全てのプライマーセットおよび核酸プローブに行き渡らせることが可能である。複数の流路を設けることによって、複数の試料についてそれぞれに標的核酸の検出を行うことも可能である。
【０１７０】
更なる実施形態として、複数の標的核酸を検出するためのマルチ核酸増幅検出反応具の例を図１２〜図１５を参照しながら説明する。
【０１７１】
（１）チップ素材
まず、電気化学的検出により核酸プローブからの信号を検出するマルチ核酸増幅検出反応具のチップ素材の構成および製造方法の１例について図１２（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図１２（ａ）は、チップ素材１１１の平面図であり、図１２（ｂ）は、図１１（ａ）のチップ素材１１１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１７２】
チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。絶縁膜１１９は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１２０は、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。矩形窓１２１は、小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１２０から露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２２ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１２０から露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２２ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１２０から露出する大矩形部１１６は対極１２３として機能する。電極１１３ｄの円形窓１２０から露出する大矩形部１１６は参照極１２４として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。
【０１７３】
このようなチップ素材１１１は、次のような方法により作製することができる。
【０１７４】
まず、基板１１２上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した、例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを基板１１２の長手方向に沿って形成する。これらの電極１１３ａ〜１１３ｄは、大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。
【０１７５】
次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、絶縁膜１１９を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に円形窓１２０を、および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に矩形窓１２１を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。
【０１７６】
基板１１２は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。
【０１７７】
第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板１１２に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。
【０１７８】
第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１７９】
絶縁膜１１９は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。
【０１８０】
絶縁膜１１９をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１８１】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットと核酸プローブを固定したマルチ核酸増幅検出反応具の構成および製造方法の１例を図１３（ａ）および図１３（ｂ）を参照しながら説明する。図１３（ａ）はマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１３（ｂ）は図１３（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。このマルチ核酸増幅検出反応具は、互いに異なる２つの配列をそれぞれに含む２種類の増幅産物の存在をそれぞれ検出するための装置である。検出されるべき２種類の標的核酸は、それぞれ第１１の配列と第１２の配列とを含む。第１１の配列を検出するための第１の核酸プローブ２０２ａは、第１１の配列を含む第１の核酸鎖とこれに結合した第１の標識物質とを含む。これは初期状態において、第１の核酸鎖の配列に相補的な配列を有する第１の被覆核酸鎖を結合して含む第１の２本鎖核酸を形成している。第１２の配列を検出するための第２の核酸プローブ２０２ｂは、第１２の配列を含む第２の核酸鎖とこれに結合した第２の標識物質とを含む。これは初期状態において、第２の核酸鎖に相補的な配列を有する第２の被覆核酸鎖を含む第２の２本鎖核酸を形成している。
【０１８２】
チップ素材１１１に形成された電極１１３ａの第１の作用極１２２ａを第１のプローブ固定領域２０１ａとし、この第１のプローブ固定領域２０１ａに第１の２本鎖核酸を固定する。第１の核酸プローブ２０２ａを含む第１の２本鎖核酸は、複数本で１つの固定領域に固定され、１つの核酸プローブ群として機能する。
【０１８３】
同様に、電極１１３ｂの第２の作用極１２２ｂを第２のプローブ固定領域とし、この第２のプローブ固定領域に第２の核酸プローブ２０２ｂを含む第２の２本鎖核酸を複数本で固定する。第２の核酸プローブ２０２ｂを含む第２の２本鎖核酸は、複数本で１つの固定領域に固定され、１つの核酸プローブ群として機能する。
【０１８４】
第１および第２の核酸プローブ２０２ａ，２０２ｂを第１および第２のプローブ固定領域２０１ａ，２０１ｂに固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材１１１の場合にはチオール基を第１および第２の核酸プローブ２０２ａ，２０２ｂの３’末端に導入する方法などが含まれる。
【０１８５】
次いで、第１の作用極１２２ａの近傍に第１のプライマー固定領域２０３ａを、第２の作用極１２２ｂの近傍に第２のプライマー固定領域２０３ｂを配置する。この第１のプライマー固定領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａと増粘剤２０５を遊離可能に固定し、第２のプライマー固定領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂと増粘剤２０５を遊離可能に固定する。それによりマルチ核酸増幅検出反応具を作製する。
【０１８６】
第１のプライマーセット２０４ａは第１１の配列を増幅するように設計された複数のプライマーを含み、第２のプライマーセット２０４ｂは第１１の配列とは異なる配列からなる第１２の配列を増幅するように設計された複数のプライマーを含む。
【０１８７】
第１および第２のプライマーセット２０４ａ，２０４ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定領域２０３ａ，２０３ｂに固定することは、例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセットを含ませて滴下して、その後例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。
【０１８８】
増粘剤の使用は任意であり、使用する場合には、それは固定されて用いられてもよく、反応液に含ませて用いられてもよい。増粘剤の固定は、所望の増粘剤を液体に溶解し、プライマーセットの固定と前後して所望の位置に滴下乾燥することにより行う。増粘剤を溶解するための液体は、プライマーセットの固定のために準備された液体であってもよく、或いは他の液体であればよい。固定の位置は、プライマー固定領域であってもよく、プライマー固定領域および／またはプローブ固定領域の近傍であってもよい。
【０１８９】
（３）使用時のマルチ核酸増幅検出反応具
上記（２）において作製されたマルチ核酸増幅検出反応具の使用例について図１４および図１５を参照しながら説明する。
【０１９０】
図１４（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１４（ｂ）は、図１４（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１９１】
本実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具９１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２２ａ、第２の作用極１２２ｂ、対極１２３および参照極１２４、並びに第１のプライマー固定領域２０３ａおよび第２のプライマー固定領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂など、或いは何れかの樹脂を例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または接着剤による接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法により成形された被覆体３０１が、マルチ核酸増幅検出反応具９１の使用前にマルチ核酸増幅検出反応具９１上に装着される。被覆体３０１が装着された後に、鋳型核酸３０３を含む反応液３０２がマルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体３０１とにより形成された空間に添加される。
【０１９２】
被覆体３０１が装着されたマルチ核酸増幅検出反応具９１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７は露出している。
【０１９３】
被覆体３０１をマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着する例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。
【０１９４】
次いで、反応液３０２は被覆体３０１がマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着された後に添加される。
【０１９５】
マルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体３０１とにより形成される空間に液体を添加する方法は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加してもよく、また先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用いて被覆体３０１の一部に差し込んで添加してもよい。
【０１９６】
反応液３０２は、例えば、試料と、増粘剤と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤などを含み得る。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定領域に固定されたプライマーセットによって増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在している場合、そのプライマー固定領域とそれに対応するプローブ固定領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図１５に示す。
【０１９７】
図１５（ａ）は、反応場４０１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図１５（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１５（ｂ）は、図１５（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図１４において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図１５（ａ）および図１５（ｂ）に示すように、反応場４０１に第２のプライマーセットが遊離および拡散し、鋳型核酸と出会った後に増幅反応が行われる。それにより増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、第１２の配列を含む場合、第２の核酸プローブ２０２ｂに結合している被覆核酸と増幅産物とが競合し、被覆核酸が核酸プローブ２０２ｂから脱離し、増幅産物とハイブリダイズする。これにより核酸プローブ２０２ｂは、１本鎖核酸となる。１本鎖核酸となったことにより第２の核酸プローブに含まれる標識物質からの信号が検出可能となる。
【０１９８】
核酸プローブからの信号は、例えば、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７にプローバーを接触させ、標識物質の電流応答を測定することにより行われ得る。
【０１９９】
電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる検出されるべき核酸の検出を簡便かつより正確に行うことが可能である。また、複数の標的核酸を定量的に検出することも可能である。
【０２００】
（４）核酸の検出方法
例として上述したようなマルチ核酸増幅検出反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅して、標識物質からの信号を指標として増幅産物を検出する方法も更なる実施形態として提供される。
【０２０１】
また、特定の容器、チューブ、ディッシュまたは流路を形成した基板などの支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程および／または１種類以上の核酸プローブをプローブ固定領域に固定する工程を含む標的核酸の検出方法も更なる実施形態として提供される。
【０２０２】
そのような標的核酸の検出方法は、例えば、所望の基体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数のプライマーが固定されている位置またはその近傍の位置にそれぞれのプライマーセットに対応する核酸プローブを固定することと、反応液をプライマーセットおよび核酸プローブに対して添加することと、反応液に試料を添加することと、反応液により反応場を形成することと、反応場の反応環境を増幅反応に適した環境に維持することと、核酸増幅反応を行うことと、核酸プローブからの検出可能な信号を検出および／または測定することとを備えてよい。
【０２０３】
反応液は、増幅反応に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素などの酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含み得る。また反応試薬として増粘剤が更に含まれ得る。
【０２０４】
反応液への試料の添加は、反応液をプライマーセットおよび核酸プローブに添加する以前に行っても、後に行ってもよい。
【０２０５】
反応環境の形成および維持は、温度および／または塩濃度を増幅反応に適切な範囲に調整することにより行い得る。反応環境において行われる核酸増幅反応は、複数種類のプライマーセットによる対応する標的核酸の増幅反応であり、これらの複数のプライマーセットが順次または同時に行ってよい。実施形態に従う方法によれば、１つの反応具の連続する空間において複数のプライマーセットによる増幅反応を行うが、このような増幅反応は一般的にマルチ核酸増幅反応と称される反応であり得る。
【０２０６】
実施形態に従う方法によれば、標的核酸を簡便かつ高感度に検出することができる。また、異なる配列による干渉を受けずに複数種類の標的配列についての増幅を独立して同時に行うことができる。増幅反応と同時に、等温増幅反応条件下で増幅反応により生じた特定の配列を含む増幅産物についての有無および／または量を検出することができる。更に、増粘剤を適用すれば、複数種類の標的配列について並行して行われる増幅反応をより効率よく行うことができる。
【０２０７】
増粘剤は、反応液への添加に代えて、上述した通りに基体に固定されてもよい。また増粘剤は、反応液中に含ませて反応場に提供されてもよく、および／または支持体表面に固定されて提供されてもよい。
【０２０８】
マルチ核酸増幅検出反応具を使用して増幅反応を行うと、プライマーセットが固定された領域の付近でのみ増幅反応が進行し、それと並行して増幅産物の検出を行うため、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、複数の増幅反応は、互いに干渉せず、各種の標的核酸について独立して進行され得る。また、実施形態によれば、増幅産物を高感度に行うことが可能であり、また定量的に検出することが可能である。それにより標的核酸を高感度、また定量的に検出することが可能である。
【０２０９】
３−２．標的核酸測定方法
１つの実施形態として、標的核酸を測定する方法が提供され得る。標的核酸を測定する方法は、核酸プローブ固定基体を準備することと、反応場に標的核酸を含む試料を持ち込むことと、標的核酸を増幅することと、増幅産物と核酸プローブ固定基体を反応させ、核酸プローブと被覆核酸との間のハイブリダイズを解消させることと、前記ハイブリダイズの解消により、標識物質から発せられる検出可能な信号の変化を検出することと、を含み得る。
【０２１０】
例えば、標的核酸検出法は、第１の配列および／またはその相補配列を含む標的核酸を検出し得る。そのような方法は、次の工程を含んでもよい；
（ａ）検出可能な信号を生ずる標識物質を含み、前記第１の配列とは異なる第２の配列を含む核酸鎖により固相に固定されている核酸プローブであり、前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域と前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域とを有する被覆核酸鎖が、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列へのハイブリダイズにより当該核酸プローブに結合していることによって、前記信号の検出が阻害されている核酸プローブの存在下で、前記標的核酸を鋳型として前記第１の配列を含む増幅産物を形成するためのプライマーセットを用いて等温増幅を行うことと；
（ｂ）前記等温増幅反応において形成された前記増幅産物と、前記核酸プローブとを競合させ、それにより前記被覆核酸を前記核酸プローブから脱離させ、前記第１の配列結合領域での前記第１の配列のハイブリダイズを介して前記被覆核酸に前記増幅産物を結合させることと；
（ｃ）前記等温増幅反応条件下で、前記核酸プローブからの当該信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出することと。
【０２１１】
また、標的核酸検出法は、図１６に示すように核酸プローブ固定基体を用いて行われてもよい。当該方法は、（ａ）核酸プローブ固定基体を準備すること、（ｂ）増幅反応液を添加して反応場を形成すること、（ｄ）反応場に標的核酸を含む試料を持ち込むこと、（ｄ）標的核酸を等温増幅すること、（ｅ）増幅産物と核酸プローブとを競合させることにより、核酸プローブと被覆核酸との間のハイブリダイズを解消すること、および（ｆ）標識物質からの信号を検出することを含み得る。
【０２１２】
そのような核酸プローブ固定基体の準備は、反応場を支持するように構成された基体の反応場が形成された際に反応場に接する少なくとも１つの面に核酸プローブ固定することと、核酸プローブと被覆核酸鎖とをハイブリダイズさせることと、検出可能な信号を発生する標識物質を核酸プローブと結合させることとを含み得る。
【０２１３】
また上述した通り、当該核酸プローブ固定基体は、プライマー固定領域に遊離可能にプライマーセットを固定して含んでもよい。
【０２１４】
基体の内部への試料の添加は、例えば、核酸プローブ固定基体に反応液を添加する以前に反応液に予め添加することにより行われてもよい。或いはそれは、反応液を核酸プローブ固定基体に添加した後に反応液に添加することにより行われてもよい。或いは核酸プローブ固定基体に反応液を添加する以前に、試料を核酸プローブ固定基体に添加することにより行われてもよい。
【０２１５】
反応液は、固定されたプライマーセットが遊離された後に、プライマーセットと標的核酸との間の増幅反応が可能な液相であればよい。この反応液は、反応場（最初は空気で満たされている）に対し、増幅反応開始前に機械的に若しくは人為的に、何らかの手法で注入されればよい。
【０２１６】
標的核酸の定量は、あらかじめ閾値を設定し、検出信号が当該閾値を超えるまでに要する時間を立ち上がり時間として計測し、得られた結果に基づいて行い得る。或いは、標的核酸の定量は、核酸の存在量が既知である異なる複数の標準試料核酸を用意すること、標準試料核酸を用いて測定し、各核酸の存在量に対して得られた測定結果から検量線を作成すること、および標的核酸の測定結果と作成された検量線とを比較することによって、試料中の標的核酸の存在量を算出することによって行われてもよい。
【０２１７】
実施形態の方法によれば、標的核酸を簡便に定量することが可能となる。また、従来よりも短時間で多くの標的核酸の検査を行うことが可能となる。また、試料の取り違いが生じる可能性が低くなる。
【０２１８】
４．第３の実施形態
上述した第１の実施形態において、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が、上記（ａ）の配列である場合の標的核酸検出法の更なる例を第３の実施形態として図１７を参照しながら説明する。
【０２１９】
第２の実施形態では、標識物質が、核酸プローブに結合した標的核酸検出法の１例について記載した。しかしながら、信号を発する標識物質は、前記核酸鎖に結合しておらず、反応溶液中に含まれていてもよい。第３の実施形態は、そのような方法の１例である。
【０２２０】
第３の実施形態のために用いられるプローブ固定基体の１例を図１７に示す。この例は、標識物質が反応液中に存在し、核酸プローブに結合していないこと以外は、図４（ａ）、（ｂ）および（ｃ）と同じ構成である。このプローブ固定基体１０１の基体２は、反応場を形成する基体２の少なくとも一部分の面に電極２ａを含む。核酸プローブ３は、この電極２ａ上に固定されている（図１７（ａ））。核酸プローブ３には、被覆核酸鎖５が結合している。これらが含まれる反応液中には、標識物質４４が存在している。標識物質４４は、電気化学的信号を生ずる物質であって、増幅産物を鋳型とした被覆核酸の伸長によって信号の検出が阻害されるような物質であり、更に反応液中、即ち、反応場において負の電荷を有する電気化学的に活性な物質であり得る。標識物質４４からの検出可能な信号は、電気信号であり、核酸プローブが固定されている電極により検出される。そして、標識物質４４が生ずる検出可能な信号の検出は、前記核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されている。即ち、図１７（ａ）に示すように、電極２ａの上方には、核酸プローブ３とこれに結合している被覆核酸鎖５が存在しているために、それ以外の領域と比べて、核酸に由来して負の電荷が多く存在する。これによって、標識物質４４からの電気信号の検出が阻害されている。反応場を等温増幅条件下に維持すると、標的核酸を鋳型とする増幅反応が進み、時間の経過と共に増幅産物６が形成され（図１７（ｂ））、存在量が増加していく。増幅産物６は、核酸プローブ３と競合し、被覆核酸鎖５が脱離する。その結果、被覆核酸鎖５は、核酸プローブ３から脱離し、電極に結合している核酸は、２本鎖から１本鎖になる（図１７（ｃ））。核酸プローブ３が１本鎖になると、２本鎖で存在していたときよりも負の電荷が少なくなる。その結果、２本鎖で存在するときよりも大きな電気信号が生じる。このような電気信号の差を検出することにより、標的核酸の存在を検出またはその存在量、例えば、濃度を測定することが可能となる。
【０２２１】
第３の実施形態において使用される標識物質は、増幅産物を鋳型とした被覆核酸の伸長によって信号の検出が阻害されるような物質のうちの反応場において負または正の電荷を有する電気化学的に活性な物質であり得る。そのような物質の例は、その酸化還元電位が検出可能な電気的化学的信号となり得る酸化剤などであり得る。標識物質の例は、例えば、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、コバルト錯イオンなどを含む。これらの標識物質は、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、鉄錯体、ルテニウム錯体、コバルト錯体を反応液に溶解することにより得られる。それらの反応液中の濃度は、例えば、１０μＭ〜１００ｍＭであってもよく、また例えば約１ｍＭであってもよい。
【０２２２】
例えば、標識物質としてフェリシアン化物イオン（Ｆｅ（ＣＮ）６４−）を用いた場合には、Ｆｅ（ＣＮ）６４−がＦｅ（ＣＮ）６３−になる酸化反応により電子が放出される。この電子は、Ｆｅ（ＣＮ）６４−が電極に近づいた際に電極に流れ込む。この電子の流れが、検出されるべき電気化学的信号を生ずる。
【０２２３】
これらの標識物質は、他の標識物質と組み合わせて用いてもよい。反応場において負または正の電荷を有する電気化学的に活性な物質と、例えば、フェロセンで標識した核酸プローブとを組み合わせて用いると、フェロセンがメディエーターとして働き、電気化学的な信号を増幅するので、感度がよりよくなり得る。
【０２２４】
このような反応場において負の電荷を有する電気化学的に活性な物質を標識物質として使用した場合、比較的長い核酸鎖や比較的短い核酸が複数存在する反応液中の部位からは遠ざけられる。これは、核酸鎖が同様に負の電荷を有しているためであり、核酸の電荷が標識物質と反発するためである。このような性質により、被覆核酸鎖が結合している核酸プローブを介する標識物質からの信号、例えば、酸化還元電位の検出が阻害される。
【０２２５】
一方で、反応場に増幅産物６などの第１の配列８を含む核酸が増幅し、１本鎖の核酸プローブ（図１７（ｂ））が増加するに従って、核酸プローブ３に結合している核酸の量が減少する。その結果、標識物質４の酸化還元電位が検出されやすくなる。
【０２２６】
標識物質の反応場への持ち込みは、核酸プローブ固定基体の反応場に接する基体の少なくとも１つの面に遊離可能に固定されていてもよく、反応液にあらかじめ溶解されていてもよい。また、反応場が、流路の内部に形成される場合には、流路の内壁の少なくとも一部分に遊離可能に固定されていてもよい。流路内部に複数の核酸プローブが固定される場合には、各核酸プローブに均等に対応できるように固定されることが好ましい。例えば、各核酸プローブに対応する位置となる流路の内部、即ち、そこにおいて各増幅反応が行われるべき各反応場内またはその周辺などに等量ずつ固定されることが好ましい。
【０２２７】
即ち、標的核酸の検出または定量は、標識物質からの信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で信号を検出することにより行われてもよい。
【０２２８】
第３の実施形態における標的核酸に関する信号は、例えば、標識物質からの信号を電位の関数における電流値として測定され得る。測定には、例えばサイクリックボルタンメトリー法が用いられ得る。与えられる電位は、使用する標識物質に依存して選択され、この電位が、三角波として掃引され得る。この時、与えられる電位および電流から標識物質の存在を反映する電気信号を得ることができる。
【０２２９】
被覆核酸鎖が結合した核酸プローブ、検出されるべき標的核酸およびそれを増幅するためのプローブセットを反応場に存在させ、反応場を等温増幅反応条件下に維持したときに得られる電気信号の経時的変化をイメージ図として図１８に示す。図１８に示すように、は、連続して電極からの信号をモニタリングすると、反応液により反応場を形成した時点では、検出される電位は相対的に低く、図１８の波形のａ領域のように示される。このとき、図１７（ａ）のように核酸プローブに対して被覆核酸鎖が結合している。それにより標識物質は、被覆核酸により増加された負電荷に反発して電極から遠ざけられている。一定時間が経過した後に、電気信号は急速に高くなる（図１８、ｂ領域）。これは、等温増幅反応条件下におかれた反応場で、標的核酸の増幅が進み、ある時点で急速に被覆核酸が核酸プローブから脱離したことを示している。その後、電気信号は緩慢に大きくなるものの特定のレベルで安定する（図１８、ｃ領域）。
【０２３０】
標的核酸を検出および定量は、このような標識物質に由来する電気信号の経時的検出または複数時点での検出によって得られる波形に基づいて行われ得る。例えば、等温増幅反応の開始から所望の時間に亘りモニタリングするか、または等温増幅反応の開始から所望の時間の２つ以上の時点で標識物質からの電気信号を測定すればよい。得られた結果に基づいて、例えば、波形の変化に基づいて、または予め決定された閾値と比較することによって、或いは予めまたは並行して得られたコントロールプローブからのデータ、例えば、波形または数値と比較することによって、標的核酸の検出および定量が行われ得る。
【０２３１】
例えば、得られたピーク電位が、予め定めた閾値よりも低い値になるまでの時間、またはある時点のピーク電位の値の違いによって標的核酸を検出または定量し得る。または、予め検量線を作成しておいてもよい。
【０２３２】
例えば、コントロールと比較して標的核酸を定量する場合には、当該方法は、次のような工程を含み得る。コントロールとして、例えば、被覆核酸鎖とハイブリダイゼ−ションしていない一本鎖の核酸プローブ（以下「コントロールプローブ」と称する）を準備する。これを固定試料用の反応場とは独立した反応場に接する基体の少なくとも１つの面に固定する。このコントロールプローブは、試料について試験を行う反応場と同じ容器、例えば、流路内に存在してもよく、異なる容器に存在してもよい。コントロールプローブからの信号の測定は、コントロール用の反応場に試料が存在しないこと以外は、標的核酸の検出するための核酸プローブ（即ち、検出用プローブ）からの信号を測定するための手順と同様に行い得る。コントロールプローブおよび検出用プローブのそれぞれについて等温増幅反応を行い、標識物質からの電気信号を電位の関数における電流値として測定する。
【０２３３】
電流値の測定には、例えばサイクリックボルタンメトリー法が用いられ得る。ここで、与えられる電位は、使用する標識物質に依存して選択され得、三角波として掃引され得る。与えられた電位と電流との酸化方向のグラフは図１８のような波形を示し得る。このグラフから、ピーク電流およびピーク電位を求める。続いて、コントロールプローブと検出用プローブとからそれぞれ得られたピーク電位の差をΔピーク電位として求める。例えば、電気信号、例えば、ピーク電流、ピーク電位およびΔピーク電位は、コンピュータにより管理されて測定され、任意に算出され得る。Δピーク電位の測定または算出は、得られた電気信号から公知の何れかの方法により行われ得る。得られたΔピーク電位が、あらかじめ定めた閾値よりも低い値になるまでの時間、またはある時点のΔピーク電位の値の違いによって核酸の濃度を同定すればよい。
【０２３４】
第３の実施形態に従う標的核酸検出法は、以下の工程を含んでもよい；
前記第１の配列とは異なる第２の配列を含む核酸鎖により固相に固定されている核酸プローブであって、前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域と前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域とを有する被覆核酸鎖が、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列へのハイブリダイズにより結合している核酸プローブの存在下で、前記標的核酸を鋳型として前記第１の配列を含む増幅産物を形成するためのプライマーセットを用いて等温増幅を行うことと；
前記等温増幅反応において形成された前記増幅産物と、前記核酸プローブとを競合させ、それにより前記被覆核酸を前記核酸プローブから脱離させ、前記第１の配列結合領域での前記第１の配列のハイブリダイズを介して前記被覆核酸に前記増幅産物を結合させることと；
前記等温増幅反応条件下で、核酸プローブと被覆核酸鎖が結合していることによって信号の検出可能性が阻害されるような標識物質からの当該信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出することと。
【０２３５】
第３の実施形態の核酸検出法によって検出できる核酸の濃度は１ａＭ〜１ｎＭであり得る。
【０２３６】
実施形態の方法によれば、標的核酸を簡便に定量することが可能となる。また、従来よりも短時間で多くの標的核酸の検査を行うことが可能となる。また、試料の取り違いが生じる可能性が低くなる。また、第３の実施形態によれば、第２の実施形態よりも、標的核酸の濃度をさらに精度よく簡便に定量でき得る。第３の実施形態の標的核酸検出法およびそこにおいて用いられるプローブ固定基体構成は、標識物質が反応液中に存在し、核酸プローブに結合していないこと以外は、上述した第２の実施形態と同様であり得る。従って、上述した第２の実施形態のために記載された何れの構成およびその組み合わせなどを第３の実施形態に組み込んでまたは上述の第３の実施形態の一部を変更して用いることが可能である。
【０２３７】
４．第４の実施形態
上述した第１の実施形態において、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が、上記（ｂ）の配列である場合の標的核酸検出法の例を第４の実施形態として以下に説明する。この実施形態では、第３の実施形態と同様に、標識物質として反応場において負の電荷を有する電気化学的に活性な物質を用いる。第４の実施形態は、核酸プローブおよび被覆核酸鎖のそれぞれの塩基配列が、上記（ｂ）の配列であることを除いて第３の実施形態と同様の核酸プローブ固定基体を用いて同様に行われ得る。
【０２３８】
図１９を参照しながら、第４の実施形態のために用いられるプローブ固定基体の１例について説明する。プローブ固定基体の基本的な構造は、図１７（ａ）に示される構成と同じである。このプローブ固定基体１０２の基体２が備える電極２ａ上に、核酸プローブ３が固定されている。核酸プローブ３には、被覆核酸鎖５が結合している（図１９（ａ））。これらが存在する反応場には、標識物質４４が存在している。反応場を等温増幅条件下に維持すると、標的核酸を鋳型とする増幅反応が進み、時間の経過と共に増幅産物６が形成される（図１９（ｂ））。形成された増幅産物６は、被覆核酸鎖５に結合し、この状態を維持したままで増幅産物６を鋳型とした被覆核酸鎖５の伸長が開始される。その結果、核酸プローブ３に結合している核酸に由来する負の電荷は、当初の被覆核酸鎖５よりも大きくなっていく（図１９（ｃ））。その結果、電極２ａで得られる電気信号は、経時的に小さくなる。これは、標識物質４４の負の電荷と核酸プローブ３に結合した核酸の負の電荷の反発が大きくなるためである。
【０２３９】
このようなプローブ固定基体１０２を用いて連続してモニタリングした際に、電極から得られる電気信号の経時的変化をイメージ図として図１９（ｄ）に示す。そこに示されるように、得られる電気信号は、増幅反応開始当初から増幅産物の形成および増加に伴い小さくなる。即ち、前記標識物質が生ずる検出可能な信号の検出は、前記核酸プローブに結合している核酸の存在または存在量の増加により阻害されている。
【０２４０】
このような現象を利用し、標識物質から検出される電気信号に基づいて、標的核酸の存在を検出すること、またはその存在量を測定することが可能となる。
【０２４１】
第４の実施形態に従う標的核酸検出法は、以下の工程を含んでもよい；
前記第１の配列とは異なる第２の配列を含む核酸鎖により固相に固定されている核酸プローブであって、前記第２の配列に相補的な第２の配列結合領域と前記第１の配列に相補的な第１の配列結合領域とを有する被覆核酸鎖が、前記第２の配列結合領域での前記第２の配列へのハイブリダイズにより結合している核酸プローブの存在下で、前記標的核酸を鋳型として前記第１の配列を含む増幅産物を形成するためのプライマーセットを用いて等温増幅を行うことと；
前記被覆核酸鎖の前記第１の配列結合領域と、前記等温増幅反応において形成された前記増幅産物の前記第１の配列とをハイブリダイズを介して結合させ、前記増幅産物を鋳型として前記被覆核酸鎖を伸長させることと；
前記等温増幅反応条件下で、増幅産物を鋳型とした被覆核酸の伸長によって信号の検出可能性が阻害されるような標識物質からの当該信号をモニタリングする、または２つ以上の時点で検出することと。
【０２４２】
第４の実施形態の核酸検出法によって検出できる核酸の濃度は１ａＭ〜１ｎＭであり得る。
【０２４３】
実施形態の方法によれば、標的核酸を簡便に定量することが可能となる。また、従来よりも短時間で多くの標的核酸の検査を行うことが可能となる。また、試料の取り違いが生じる可能性が低くなる。
【０２４４】
第４の実施形態において使用される標識物質は、第３の実施形態において使用される標識物質と同様に、増幅産物を鋳型とした被覆核酸の伸長によって信号の検出が阻害されるような物質のうちの反応場において負の電荷を有する電気化学的に活性な物質であり得る。その具体的な物質の例は、上述の通りである。例えば、核酸プローブおよび被覆核酸鎖は、反応場の塩濃度および増幅反応時の温度においてもハイブリダイズを維持するように、更にまた、標的核酸からの増幅産物が存在する環境中でもハイブリダイズを維持するように、Ｔｍ値および配列の長さが設計される。
【０２４５】
核酸プローブ３および被覆核酸鎖５を設計する、並びに等温増幅反応条件を決定する際の基準は、核酸プローブ、被覆核酸鎖および増幅反応物の塩基配列長さ、並びに等温増幅反応条件、例えば、温度および塩濃度の何れかを最初に設定し、上記の２つの条件を満たすように他の条件を設定すればよい。
【０２４６】
第４の実施形態の標的核酸検出法およびそこにおいて用いられるプローブ固定基体構成は、被覆核酸鎖との結合が、増幅産物の存在に拘わらず維持されること以外は、上述した第３の実施形態と同様であり、また、それに加えて、標識物質が反応液中に存在し、核酸プローブに結合していないことを除けば、上述の第２の実施形態と同様であり得る。上述した第２および第３の実施形態のために記載された何れの構成およびその組み合わせなどを第４の実施形態に組み込んでまたは上述の第３の実施形態の一部を変更して用いることが可能である。言い換えれば、ここに記載される何れの実施形態についても、他の実施形態に記載された何れの構成およびその組み合わせ、並びにそれらの一部分などを互いに組み込み合う、または何れかの一部分を変更して他の実施形態の一部分と入れ替え得る。
【０２４７】
５．標的核酸検出キット
本実施形態は、上述の標的核酸検出を行うためのアッセイキットとして提供されてもよい。標的核酸検出キットは、核酸プローブ固定基体とプライマーセットとを備え得る。或いは、標的核酸測定キットは、プライマーセットと、核酸プローブ固定基体と、検出可能な信号を生ずる標識物質とを備え得る。
【０２４８】
これらの核酸プローブ固定基体、プライマーセット、標識物質の詳細は、上述した通りである。標的核酸検出キットに含まれる構成成分は、何れも独立した形態でアッセイキットに含まれてもよく、使用時に反応液の存在により形成される対応する反応場に持ち込まれ得るように、核酸プローブ固定基体以外の全ての成分または一部分の成分が核酸プローブ固定基体の少なくとも１つの面に固定された状態でアッセイキットに含まれてもよい。
【０２４９】
プライマーセットは、核酸プローブ固定基体に遊離可能に固定されていてもよく、核酸プローブ固定基体に固定されずにキットに含まれてもよい。
【０２５０】
またアッセイキットは、核酸プローブ固定基体およびプライマーセットに加えて、標的核酸を増幅するための更なる反応試薬を含んでもよい。更なる反応試薬は、例えば、酵素、ｄＮＴＡおよび／または緩衝剤であり得る。
【０２５１】
実施形態に従うアッセイキットは、より高い精度で簡便に標的核酸を検出することが可能であり、更に定量的に検出することも可能である。従来よりも短時間で標的核酸に関する検査を行うことが可能である。また、試料の取り違いが生じる可能性が低くなる。
【０２５２】
上述のようなアッセイキット、プローブ固定化基体を用いた核酸検出方法は、例えば、以下のような標的核酸検出装置を用いて行われ得る。
【０２５３】
６．標的核酸検出装置
実施形態に従うと、標的核酸検出装置が提供され得る。図２０は標的核酸検出装置の実施形態の１例を示すブロック図である。標的核酸を検出するための標的核酸検出装置５０１は、測定ユニット５１０と、測定ユニット５１０を制御する制御機構５１５と、制御機構５１５を制御するコンピュータ５１６とを備える。測定ユニット５１０は、これに対して着脱可能に配置され、そこにおいて反応を行うチップカートリッジ５１１と、チップカートリッジ５１１からの信号を得る測定系５１２と、チップカートリッジへの液体の送りおよび／または出しをする送液系５１３と、チップカートリッジ５１１の温度を制御する温度制御機構５１４とを含む。
【０２５４】
標的核酸検出装置５０１は、使用される標識物質およびチップカートリッジの構成などに応じて、以下のような構成を取り得る。
【０２５５】
（１）チップカートリッジの外部から反応液を供給し、かつ電気的な信号を発する標識物質を用いる場合
標的核酸検出装置５０１は、チップカートリッジ５１１、このチップカートリッジ５１１と電気的に接続される測定系５１２、チップカートリッジ５１１内に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続し、チップカートリッジ５１１の外に配置された容器に貯蔵された試薬をチップカートリッジ５１１に送る送液系５１３およびチップカートリッジ５１１の温度制御を行う温度制御機構５１４を備える。
【０２５６】
（２）チップカートリッジ内部に反応液が備えられ、かつ電気的な信号を発する標識物質を用いる場合
標的核酸検出装置５０１は、チップカートリッジ５１１、このチップカートリッジ５１１と電気的に接続される測定系５１２、チップカートリッジ５１１に設けられたバルブをインタフェース部を介して物理的に開閉することでチップカートリッジ５１１内部に貯蔵される試薬を所定の位置に移動させる送液系５１３およびチップカートリッジ５１１の温度制御を行う温度制御機構５１４を備える。
【０２５７】
（３）チップカートリッジの外部から反応液を供給し、かつ光学的な信号を発する標識物質を用いる場合
標的核酸検出装置５０１は、チップカートリッジ５１１、このチップカートリッジ５１１からの光学的な信号を測定するための測定系５１２、チップカートリッジ５１１内部に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続し、チップカートリッジ５１１外部に配置された容器に貯蔵された試薬をチップカートリッジ５１１に送る送液系５１３およびチップカートリッジ５１１の温度制御を行う温度制御機構５１４を備える。
【０２５８】
（４）チップカートリッジ内部に反応液が備えられ、かつ光学的な信号を発する標識物質を用いる場合
標的核酸検出装置５０１は、チップカートリッジ５１１、このチップカートリッジ５１１からの光学的な信号を測定するための測定系５１２、チップカートリッジ５１１に設けられたバルブをインタフェース部を介して物理的に開閉することでチップカートリッジ５１１内部に貯蔵される試薬を所定の位置に移動させる送液系５１３およびチップカートリッジ５１１の温度制御を行う温度制御機構５１４を備える。
【０２５９】
例えば、上記（１）に示した標的核酸検出装置の１例について以下に説明する。
【０２６０】
チップカートリッジ５１１は、例えば、図１４に示されるマルチ核酸増幅検出反応具９１と、この反応具９１上に固定された被覆体３０１とを備える。反応具９１と被覆体３０１とにより形成された空間は、向かって左手側を上流とし、右手側を下流とする流路を形成している。この流路内が反応部に相当し、そこに反応場が形成されて所望の増幅および検出反応が行われる。上流側の被覆体３０１の上面には、液体を送入するための送入口が設けられている（図示せず）。下流側の被覆体３０１の上面には、液体を送出するための排出口が設けられている（図示せず）。
【０２６１】
測定系５１２は、チップカートリッジ５１１の電極に電圧を印加すると共に、チップカートリッジ５１１から発せられる電気的な信号を受け取り、制御機構５１５に送る。
【０２６２】
送液系５１３は、反応液などの液体が収容されるべき容器、およびチップカートリッジ５１１とのインタフェースを備え得る。制御機構５１５による制御により、送液系５１３は、容器内の液体を、必要に応じて、インタフェースを介してチップカートリッジ５１１内に送る。
【０２６３】
温度制御機構５１４は、増幅および検出反応のための温度条件を満たすように、チップカートリッジ５１１内の少なくとも反応部の温度を制御する。そのために温度制御機構５１４は、例えば、ヒーターおよび／またはペルティエ素子などを備え得る。温度制御機構５１４は、制御機構５１５により制御され、チップカートリッジ５１１内の反応部の温度を制御する。
【０２６４】
制御機構５１５は、測定系５１２、送液系５１３、温度制御機構５１４、およびコンピュータ５１６に電気的に接続されている。制御機構５１５は、コンピュータ５１６に備えられたプログラムに従って、測定系５１２と、送液系５１３と、温度制御機構５１４とを制御し、測定系５１２から得た信号を検出し、当該信号を測定データとして格納する機構を有する。
【０２６５】
コンピュータ５１６は、制御機構５１５に制御条件パラメータを与えて制御機構５１５を制御するとともに、制御機構５１５に格納された測定データに基づいて解析処理を実行し、核酸を検出および／または定量する。
【０２６６】
このような核酸検出装置による核酸検出は、例えば、以下のように行われ得る。まず、実施者は、チップカートリッジ５１１の反応部に試料を注入し、そのチップカートリッジ５１１を測定ユニット５１０に挿入し、標的核酸検出装置５０１による検出を開始する。送液系５１３の容器には、予め標識物質を含む反応液が充填されている。コンピュータに予め格納されたプログラムに従い、コンピュータが送液系２１３を作動させ、反応液がチップカートリッジ５１１の反応部に送られる。コンピュータおよび制御機構の制御の下で、温度制御機構５１４が、反応場の温度を調節して等温増幅反応を開始させる。コンピュータおよび制御機構の制御の下で測定系５１２が反応部からの電気信号を獲得する。測定系５１２により得られた電気信号は、制御機構に送られて、データとして格納される。格納されたデータは、プログラムに従って、コンピュータにより呼び出され、処理および解析され、試料中に含まれる検出されるべき核酸についての情報、即ち、検出結果および／または定量結果が得られる。コンピュータにより得られた結果は、所望に応じてコンピュータが備えるディスプレイまたはプリンタなどに出力されてもよく、或いはコンピュータに記憶されてもよい。
【０２６７】
上述の実施形態の例では、電気信号を検出する装置の例を示したが、光信号を生ずる標識物質を使用する場合についても、同様に標的核酸検出装置を使用することが可能である。その場合、標的核酸検出装置は、測定系５１２が光信号を検出するように構成されること以外は、上述と同様の構成を有し得る。例えば、標識物質として蛍光物質を使用する場合の測定系５１２は、反応部に励起光を照射する光照射ユニット、標識物質からの蛍光を光信号として得るセンシングユニット、光信号を電気信号に変換する光電変換ユニットなどを備え得る。
【０２６８】
実施形態に従う標的核酸検出装置は、従来よりも高い精度で簡便に標的核酸を検出または定量することが可能である。また、当該標的核酸検出装置によれば、従来よりも短時間で標的核酸に関する検査を行うことが可能である。
【０２６９】
［例］
＜例１＞
図１４に示された反応具と同様の構成を有する電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体１を作製し、使用した例を記載する。何れの電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体も、プライマー固定領域に固定されたプライマーセットと、プライマー固定領域の近傍のプローブ固定領域に固定された核酸プローブとしてのプローブＤＮＡとを含む。プローブ固定領域を電極上に配置し、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するためのセンサとして使用した。
【０２７０】
図２１（ａ）および（ｂ）は、アレイ型核酸プローブ固定基体のプローブ固定領域の一部分を拡大した模式図である。電極上に配置されたプローブ固定領域１３には、核酸プローブ３としてのプローブＤＮＡが固定されている。核酸プローブ３は、核酸鎖３ａとその一端に付与された標識物質４と他端に結合された末端修飾基１８とを含む。核酸鎖３ａには、被覆核酸鎖５が結合されている。核酸鎖３ａと被覆核酸鎖５とは、その配列が互いに相補的である。被覆核酸鎖５の核酸プローブ３からの離脱により検出可能となる標識物質からの検出信号は、核酸プローブ３が固定されている電極を含むセンサによって検出される。
【０２７１】
図２１（ｂ）は、被覆核酸鎖を結合していない核酸プローブ３を固定したときのアレイ型核酸プローブ固定基体のプローブ固定領域の一部分を拡大した模式図である。被覆核酸鎖５を結合していないこと以外は図２１（ａ）と同じである。
【０２７２】
（１）チップ素材の作製
パイレックス（登録商標）ガラス表面にチタンおよび金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。
【０２７３】
（２）アレイ型核酸プローブ固定基体の作製
まず、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ａ）を用意した。この配列（Ａ）の３’末端をチオールで標識し、５’末端をフェロセンで標識した。配列（Ｂ）からなる核酸鎖を被覆核酸鎖として用意し、配列（Ａ）を含む核酸プローブにハイブリダイズさせて、２本鎖核酸プローブ（Ａ）を準備した。同様に、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ａ）を用意した。この配列（Ａ）の３’末端をチオールで標識し、５’末端をフェロセンで標識した。被覆核酸鎖を結合させずに１本鎖核酸プローブ（Ｂ）とした。２本鎖核酸プローブは、１本鎖核酸プローブを固定した基板上に、被覆核酸鎖を添加することで作成することも可能である。
【０２７４】
これらの２本鎖核酸プローブ（Ａ）および１本鎖核酸プローブ（Ｂ）を２つの作用極上に種類毎にそれぞれ固定した。使用した核酸鎖の塩基配列を表１に示す。
【表１】
2016136033.tif 000003
【０２７５】
固定は次の通りに行った。２本鎖核酸プローブ（Ａ）および１本鎖核酸プローブ（Ｂ）をそれぞれ３μＭずつ含むプローブ溶液（Ａ）および（Ｂ）を調製した。これらの溶液１００ｎＬをそれぞれ作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の２つの作用極に核酸プローブを固定した。
【０２７６】
図２１（ａ）は、電極上に配置されたにプローブ固定領域１３に、固定された２本鎖核酸プローブ（Ａ）を模式的に示す。図２１（ｂ）は、電極上に配置されたプローブ固定領域１３に固定された１本鎖核酸プローブ（Ｂ）を模式的に示す。
【０２７７】
（３）電気化学的信号の検出
核酸プローブ（Ａ）および核酸プローブ（Ｂ）からの電気化学的な応答を電気化学アナライザーＡＬＳ６６０ａを用いて測定した。測定方法にはサイクリックボルタンメトリーを使い、電位掃引速度は１００Ｖ／ｓで行った。
【０２７８】
測定した結果を図２２（ａ）および（ｂ）に示す。これらのグラフの横軸は電位（Ｖ）であり、縦軸は電流（ｎＡ）を示す。図２２（ａ）は、核酸プローブ（Ａ）を固定した電極から検出された結果であり、図２２（ｂ）は、核酸プローブ（Ｂ）を固定した電極から検出された結果である。核酸プローブと被覆核酸鎖とがハイブリダイズして核酸プローブが２本鎖であることによって、被覆核酸鎖を結合していない核酸プローブで得られる電流値の約半分の電流値であった。この結果から、被覆核酸鎖の核酸プローブへのハイブリダイズにより核酸プローブ中の標識物質からの信号をマスクできることが明らかとなった。
【０２７９】
（４）プライマーセットの準備
次に、プライマーセット１２として使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセット１２である。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表２に示す。
【表２】
2016136033.tif 000004
【０２８０】
ＬＡＭＰ増幅反応に使用するプライマーの濃度については、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは３．２μＭ、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを０．４μＭ、ＬＰＦプライマーを１．６μＭで行った。
【０２８１】
（５）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を以下の表３に示す。
【表３−１】
2016136033.tif 000005
【０２８２】
通常のＬＡＭＰ反応では０．８Ｍのベタインを添加するが、電気化学的な測定ではベタインが反応を阻害するために用いなかった。鋳型としては１０５ｃｏｐｙ／μＬのプラスミド（長さ：約４ｋｂｐ）を使用し、ＬＡＭＰ増幅反応は６３℃で行った。使用されたプラスミドは、ｐＭＡベクターに表３−２に示す配列番号９により示される配列（Ｐａｒｖｏ  ｖｉｒｕｓのＶＰ遺伝子、長さ１０００ｂｐ）が挿入されたものである。そこにおいて、配列番号９は、その一部分に配列番号２のポリヌクレオチドを含む。表３−２の配列番号２の配列に対応する部分に下線を付す。
【表３−２】
2016136033.tif 000006
【０２８３】
（５）電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を用いたＬＡＭＰ増幅および核酸プローブによる標的核酸の検出
核酸プローブを固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行いながら、フェロセンの酸化電流の測定を行った。結果を図２３に示す。鋳型を添加したチップと添加していないチップとの電流値の比（Ｓ／Ｎ）をプロットした結果、３０分の時点からＳ／Ｎが変化し始め、４５分時点でＳ／Ｎが２まで変化した。このことから、フェロセンの電流をモニタリングし、Ｓ／Ｎの変化する時間をモニタリングする電気化学的な方法で標的核酸を定量的に検出できることが明らかとなった。
【０２８４】
＜例２＞
以下に、蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を作製して使用した例を記載する。
【０２８５】
何れのアレイ型核酸プローブ固定基体も、標識物質として蛍光物質を用い、更に、被覆核酸鎖により蛍光物質からの信号の検出の阻害を補助するための修飾物質を用いたこと以外は、例１と同様に蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体１を準備した。光学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体は、プライマー固定領域に固定されたプライマーセットと、プライマー固定領域の近傍のプローブ固定領域に固定された核酸プローブとしてのプローブＤＮＡとを含む。プローブ固定領域は、電極上に配置したが、検出信号の検出は、標識物質からの蛍光強度を光学的に測定することにより行った。
【０２８６】
図２４（ａ）および（ｂ）は、アレイ型核酸プローブ固定基体のプローブ固定領域の一部分を拡大した模式図である。図２４（ａ）の核酸プローブ３は、核酸鎖３ａとその一端に付与された標識物質４と、他端に結合された末端修飾基とを含む。被覆核酸鎖５と核酸鎖３ａとは、互いに相補配列を有する。被覆核酸鎖５と核酸鎖３ａとがハイブリダイズしたときに、核酸鎖３ａの標識物質４が結合している末端と対向している、被覆核酸鎖５の一端には修飾物質が付与されている。図２４（ｂ）の核酸プローブ３は、被覆核酸鎖５を結合していない。
【０２８７】
（１）チップ素材の作製
パイレックス（登録商標）ガラス表面にチタンおよび金の薄膜をスパッタリングにより形成した。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。
【０２８８】
（２）アレイ型核酸プローブ固定基体の作製
まず、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ａ）を用意した。この配列（Ａ）の３’末端をチオールで標識し、５’末端をＦＡＭで標識した。これを核酸プローブ（Ｃ）とした。配列（Ｂ）からなる核酸鎖を被覆核酸鎖として用意し、配列（Ａ）を含む核酸プローブ（Ｃ）にハイブリダイズさせて、２本鎖核酸プローブ（Ｃ）を準備した。同様に、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ａ）を用意した。この配列（Ａ）の３’末端をチオールで標識し、５’末端をＦＡＭで標識した。被覆核酸鎖を結合させずに１本鎖核酸プローブ（Ｄ）とした。
【０２８９】
これらの２本鎖核酸プローブ（Ｃ）および１本鎖核酸プローブ（Ｄ）を２つの作用極上に種類毎にそれぞれ固定した。使用した核酸鎖の塩基配列を表４に示す。
【表４】
2016136033.tif 000007
【０２９０】
固定は次の通りに行った。２本鎖核酸プローブ（Ｃ）および１本鎖核酸プローブ（Ｄ）をそれぞれ３μＭずつ含むプローブ溶液（Ｃ）および（Ｄ）を調製した。これらの溶液１００ｎＬをそれぞれ作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の２つの作用極に核酸プローブを固定した。図２４（ａ）は、電極上に配置されたプローブ固定領域１３に固定された２本鎖核酸プローブ（Ｃ）を模式的に示す。図２４（ｂ）は、電極上に固定されたプローブ固定領域１３に固定された１本鎖核酸プローブ（Ｄ）を模式的に示す。
【０２９１】
（３）光学的信号の検出
これらの核酸プローブからの蛍光強度を測定した。その結果、２本鎖核酸プローブ（Ｃ）からは、１本鎖核酸プローブ（Ｄ）で測定された蛍光強度の約２倍の蛍光強度が測定された。
【０２９２】
（４）プライマーセットの準備
次に、プライマーセット１２として使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、ＬＡＭＰ法による増幅のためのプライマーセットである。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表５に示す。
【表５】
2016136033.tif 000008
【０２９３】
ＬＡＭＰ増幅反応に使用するプライマーの濃度については、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは３．２μＭ、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを０．４μＭ、ＬＰＦプライマーを１．６μＭで行った。
【０２９４】
（５）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を以下の表６に示す。
【表６】
2016136033.tif 000009
【０２９５】
蛍光測定では通常のＬＡＭＰ反応と同様に、０．８Ｍのベタインを添加した。鋳型としては１０５ｃｏｐｙ／μＬのプラスミド（長さ：約４ｋｂｐ）を使用し、ＬＡＭＰ増幅反応は６３℃で行った。プラスミドは、例１と同じプラスミドを使用した。
【０２９６】
（６）蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を用いたＬＡＭＰ増幅および核酸プローブによる標的核酸の検出
上述と同様な方法により、２本鎖核酸プローブ（Ｃ）を固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行い、６０分後に蛍光測定を行った。コントロールとして、鋳型を含まないＬＡＭＰ反応液で実験を行った。結果を図２５に示す。鋳型を含まない条件で得られた蛍光強度比は０．７程度であった（図中「対象遺伝子無」と記す）。これに対して、鋳型を含む条件で得られた蛍光強度比は、その１．８倍程度にまで増大した（図中「対象遺伝子有」と記す）。これらのことから、ＦＡＭの蛍光強度を測定することによって、光学的に標的核酸の有無を決定できることが明らかとなった。
【０２９７】
（７）蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を用いたＬＡＭＰ増幅および核酸プローブによる標的核酸の検出
鋳型濃度がそれぞれ１０５ｃｏｐｙ／μＬと１０３ｃｏｐｙ／μＬの試料を準備した。他方、上記（６）と同様の蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を準備した。蛍光検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体上で増幅反応の開始時から蛍光強度を経時的に測定した。結果を図２６に示す。グラフの横軸は、反応開始時からの時間（分）を示す。
【０２９８】
図２６から明らかであるように、反応後６０分で鋳型核酸の濃度依存的な蛍光強度の増大が観察された。また、特に、１０５ｃｏｐｙ／μＬと鋳型濃度の高い試料において顕著に強い蛍光強度値が得られた。このことから、ＦＡＭなどの蛍光物質からの蛍光信号をモニタリングすることにより、光学的に標的核酸を定量することが可能であることが証明された。
【０２９９】
以上のことから、本実施形態によれば、核酸を簡便かつ高感度に測定できる基体、キットおよび方法を提供することができることが証明された。
【０３００】
＜例３＞
以下に、第３の実施形態に従う核酸検出方法により標的核酸を定量する例を記載する。これは、標識物質が反応溶液中に含まれる。標的核酸が反応場に存在したとき、被覆核酸鎖は、核酸プローブから脱離し、それにより標識物質が対応する電極によって検出可能となる例である。
【０３０１】
何れのアレイ型核酸プローブ固定基体も、プライマー固定領域に固定されたプライマーセットと、プライマー固定領域の近傍のプローブ固定領域に固定された核酸プローブとしてのプローブＤＮＡとを含む。プローブ固定領域を電極上に配置し、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するためのセンサとして使用した。使用した核酸プローブには、被覆核酸鎖が結合されていて２本鎖を形成している。また、標識物質は、反応液中に存在させた。
【０３０２】
（１）チップ素材の作製
例１と同様の方法でチップを作製した。
【０３０３】
（２）アレイ型核酸プローブ固定基体の作製
まず、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ｅ）を用意した。この配列の３’末端をチオールで標識した。配列（Ｇ）からなる核酸鎖を被覆核酸鎖として用意し、配列（Ｅ）を含む核酸プローブにハイブリダイズさせて、２本鎖核酸プローブ（ＥＧ）を準備した。同様に、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ｆ）を用意した。この配列（Ｆ）の３’末端をチオールで標識した。被覆核酸鎖を結合させずに１本鎖核酸プローブ（Ｆ）とした。２本鎖核酸プローブは、１本鎖核酸プローブを固定した基板上に、被覆核酸鎖を添加することで作成することも可能である。
【０３０４】
これらの２本鎖核酸プローブおよび１本鎖核酸プローブを２つの作用極上に種類毎にそれぞれ固定した。使用した核酸鎖の塩基配列を表７に示す。
【表７】
2016136033.tif 000010
【０３０５】
これらの核酸プローブの固定は、例１の固定と同じ方法によって、チップ素材の２つの作用極に固定することにより行った。
【０３０６】
（３）電気化学的信号の検出
２本鎖核酸プローブおよび１本鎖核酸プローブによる１ｍＭフェリシアン化物イオンからの電気化学的な応答を電気化学アナライザーＡＬＳ６６０ａを用いて測定した。測定方法にはサイクリックボルタンメトリーを使い、電位掃引速度は０．２５Ｖ／ｓで行った。
【０３０７】
測定した結果を図２７（ａ）および（ｂ）に示す。これらのグラフの横軸は電位（Ｖ）であり、縦軸は電流（ｎＡ）を示す。
【０３０８】
図２７（ａ）は、２本鎖核酸プローブと１本鎖核酸プローブを固定した電極から検出された結果である。核酸プローブと被覆核酸鎖とがハイブリダイズして核酸プローブが２本鎖である場合よりも、被覆核酸鎖とハイブリダイズせず核酸プローブが一本鎖である場合では、フェリシアン化物イオンから得られる酸化還元電位がプラスにシフトすることが分かった。
【０３０９】
（４）プライマーセットの準備
次に、プライマーセットとして使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、ＬＡＭＰ法による増幅のためのプライマーセットである。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表８に示す。
【表８】
2016136033.tif 000011
【０３１０】
ＬＡＭＰ増幅反応に使用するプライマーの濃度については、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを０．４μＭ、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは３．２μＭ、ＬＰＦプライマーを１．６μＭで行った。
【０３１１】
（５）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を以下の表９に示す。
【表９】
2016136033.tif 000012
【０３１２】
通常のＬＡＭＰ反応では０．８Ｍのベタインを添加するが、電気化学的な測定ではベタインが反応を阻害するために用いなかった。鋳型となる標的核酸は、１０５ｃｏｐｙ／μＬのプラスミド（長さ：約４ｋｂｐ）を使用した。ＬＡＭＰ増幅反応は６３℃で行った。このプラスミドは、ｐＭＡベクターに表１０に示す配列番号９により示されるパルボウイルス由来のＶＰ遺伝子（Ｐａｒｖｏ  ｖｉｒｕｓのＶＰ遺伝子、長さ１０００ｂｐ）が挿入されたものである。
【表１０】
2016136033.tif 000013
【０３１３】
前記ＬＡＭＰ反応液に、フェリシアン化カリウムを１ｍＭの濃度になるように加えた。
【０３１４】
（６）電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を用いたＬＡＭＰ増幅および核酸プローブによる標的核酸の検出
核酸プローブを固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行いながら、フェリシアン化物イオンの酸化還元電位の測定を行った。結果を図２７（Ｂ）に示す。増幅前には、一本鎖の核酸プローブ（Ｆ）と２本鎖の核酸プローブ（ＥＧ）の場合では、フェリシアン化物イオンの酸化還元電位が異なっていたが、増幅後には同じ波形になることが明らかとなった。
【０３１５】
次に、核酸プローブを固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行いながら、標的核酸を０ｃｏｐｙ／μＬまたは１０−５ｃｏｐｙ／μＬで反応場に存在させて、それぞれ電気信号をモニタリングすることにより、電流信号の経時変化を測定した。結果を図２８に示す。図２８のグラフには、上記２段階の濃度について、１本鎖の鋳核酸プローブ（Ｆ）について得たコントロール実験区と、２本鎖の核酸プローブ（ＥＧ）について得た実験区との電位の差であるΔピーク電位をプロットした。その結果、標的核酸の濃度が０ｃｏｐｙ／μＬの場合も、１０５ｃｏｐｙ／μＬの何れの場合にも、時間と共にΔ電位の値が小さくなった。しかしながら、Δ電位の減少率を示すグラフの傾きの大きさは、１０５ｃｏｐｙ／μＬの方が大きかった。従って、この結果から、反応液中に存在する標的核酸の濃度が低い程、Δ電位の値の減少速度が遅く、標的核酸の濃度が高い程、Δ電位の減少速度が速いことが明らかになった。このことから、例えば、特定のΔ電位の値になるまでの時間を測定することにより、標的核酸の濃度を明らかにすることができる。或いは、例えば、特定の時間でのΔ電位の大きさを測定することにより、標的核酸の濃度を明らかにすることができる。即ち、これらの特定のΔ電位の値および特定の時間を閾値とすることができ得る。以上のことから、フェリシアン化物イオンの電位をモニタリングし、Δピーク電位の変化する時間をモニタリングする電気化学的な方法により、標的核酸を定量的に検出できることが明らかとなった。
【０３１６】
以上のことから、本実施形態によれば、核酸を簡便かつ高感度に測定できる基体、キットおよび方法を提供することができることが証明された。
【０３１７】
＜例４＞
以下に、第４の実施形態に従う核酸検出方法により標的核酸を定量する例を記載する。これは次のような例である。標識物質が反応溶液中に含まれ状態で標的核酸の等温増幅反応が行われる。反応により増幅産物が形成されると、核酸プローブに被覆核酸鎖が結合した状態のまま、増幅産物が被覆核酸鎖に結合する。その後、被覆核酸鎖は、そこに結合した増幅産物を鋳型として伸長する。それにより標識物質は、反応当初よりも更に電極から遠ざけられる。
【０３１８】
標識物質から、被覆核酸鎖の伸長による信号を検出する標的核酸検出法の例を記載する。
【０３１９】
何れのアレイ型核酸プローブ固定基体も使用した
例３と同様のセンサを使用した。
【０３２０】
（１）チップ素材の作製
例１と同様の方法でチップを作製した。
【０３２１】
（２）アレイ型核酸プローブ固定基体の作製
まず、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ｅ）を用意した。この配列（Ｅ）の３’末端をチオールで標識した。配列（Ｈ）からなる核酸鎖を被覆核酸鎖として用意し、配列（Ｅ）を含む核酸プローブにハイブリダイズさせて、２本鎖核酸プローブ（ＥＨ）を準備した。同様に、核酸プローブに含まれる核酸鎖として配列（Ｆ）を用意した。この配列（Ｆ）の３’末端をチオールで標識した。被覆核酸鎖を結合させずに１本鎖核酸プローブ（Ｆ）とした。２本鎖核酸プローブは、１本鎖核酸プローブを固定した基板上に、被覆核酸鎖を添加することで作成することも可能である。
【０３２２】
これらの２本鎖核酸プローブ（Ｅ）および１本鎖核酸プローブ（Ｆ）を２つの作用極上に種類毎にそれぞれ固定した。使用した核酸鎖の塩基配列は前出の表７に示す。
【０３２３】
これらの核酸プローブの固定は、例１の固定と同じ方法によって、チップ素材の２つの作用極に固定することにより行った。
【０３２４】
（３）電気化学的信号の検出
例３と同様の方法により電気化学的信号を検出した。
【０３２５】
（４）プライマーセットの準備
例３と同様のプライマーセットを準備し、例３と同様の濃度で使用した。
【０３２６】
（５）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を以下の表１１に示す。酵素としてＧｓｐＳＳＤを使用し、ＫＣｌ濃度を６０ｍＭに調整した。標的核酸および標識物質は、例３と同じものを使用した。
【表１１】
2016136033.tif 000014
【０３２７】
（６）電気化学的検出用のアレイ型核酸プローブ固定基体を用いたＬＡＭＰ増幅および核酸プローブによる標的核酸の検出
核酸プローブを固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行いながら、標的核酸を０１、１０３、１０４、１０５および１０６ｃｏｐｙ／μＬで反応場に存在させて、それぞれの電気信号をモニタリングすることによって電流信号の経時変化を測定した。それによりフェリシアン化物イオンの酸化還元電位を行った。結果を図２９に示す。図２９のグラフには、上記５段階の濃度について、１本鎖の鋳核酸プローブ（Ｆ）について得たコントロール実験区と、２本鎖の核酸プローブ（ＥＨ）について得た実験区との電位の差であるΔピーク電位をプロットした。その結果、標的核酸の何れの濃度の場合にも時間と共にΔ電位の値が小さくなった。そのようなΔ電位の減少の速度は、標的核酸の濃度が高くなるにしたがって小さくなった。即ち、この結果から、反応液中に存在する標的核酸の濃度が低い程、Δ電位の値の減少速度が速く、標的核酸の濃度が高い程、Δ電位の減少速度が遅いことが明らかになった。このことから、例えば、特定のΔ電位の値になるまでの時間を測定することにより、標的核酸の濃度を明らかにすることができる。或いは、例えば、特定の時間でのΔ電位の大きさを測定することにより、標的核酸の濃度を明らかにすることができる。即ち、これらの特定のΔ電位の値および特定の時間を閾値とすることができ得る。以上のことから、フェリシアン化物イオンの電位をモニタリングし、Δピーク電位の変化する時間をモニタリングする電気化学的な方法により、標的核酸を定量的に検出できることが明らかとなった。
【０３２８】
以上のことから、本実施形態によれば、核酸を簡便かつ高感度に測定できる基体、キットおよび方法を提供することができることが証明された。鋳型の濃度に応じて酸化還元電位が異なり、本実施形態によれば、核酸を簡便かつ高感度に測定できる基体、キットおよび方法を提供することができることが証明された。
【０３２９】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【０３３０】
１…核酸プローブ固定基体、２…基体、２ａ…電極、３…核酸プローブ、３ａ…核酸鎖、４…標識物質、５…被覆核酸鎖、６…増幅産物、７…第２の配列、７’…第２の配列結合領域、８…第１の配列、８’…第１の配列結合領域、９…クエンチャー、１１…プライマー固定領域、１２…プライマーセット、１３…プローブ固定領域、１４…底部、１５，１５ａ，１５ｂ，１５ｃ…流路、１６…面、１７…増幅領域、４４…標識物質、９１…マルチ核酸増幅検出反応具、１０１…プローブ固定基体、１０２…プローブ固定基体、１１１…チップ素材、１１２…基板、１１３，１１３ａ，１１３ｂ，１１３ｃ，１１３ｄ…電極、１１４…金属薄膜パターン、１１５…金属薄膜パターン、１１６…大矩形部、１１７…小矩形部、１１８…細線、１１９…絶縁膜、１２０，１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ…円形窓、１２１…矩形窓、１２２，１２２ａ，１２２ｂ…作用極、１２３…対極、１２４…参照極、２０１ａ，２０１ｂ…プローブ固定領域、２０２ａ，２０２ｂ…核酸プローブ、２０３ａ，２０３ｂ…プライマー固定領域、２０４ａ，２０４ｂ…プライマーセット、２０５…増粘剤、３０１…被覆体、３０２…反応液、３０３…鋳型核酸、５０１…標的核酸検出装置、５１０…測定ユニット、５１１…チップカートリッジ、５１２…測定系、５１３…送液系、５１４…温度制御機構、５１５…制御機構、５１６…コンピュータ。
【図１】
2016136033.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2016136033.tif 000026
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2016136033.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2016136033.tif 000038
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016136033.tif 000045
2016136033.tif 000046
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