(57)【要約】本発明は小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。詳細には、本発明は、ＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。好ましいＴＧＦβシグナル阻害剤としては、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドが含まれる。
2015064768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
【請求項２】
前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全に関連するものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項３】
前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全によるアポトーシスに関連するものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項４】
前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関するものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項５】
前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項６】
前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも１つを抑制することを含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項７】
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアプタマー、ＴＧＦ−βレセプターのアプタマー、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノロリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項８】
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項９】
さらにＥＲストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤を含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項１０】
前記ＥＲストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤は、ＢｉＰｉｎｄｕｃｅｒＸ（ＢＩＸ）、４−フェニル酪酸（４−ｐｈｅｎｙｌ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＢＡ））、トリメチルアミンＮ−オキシド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｎ−ｏｘｉｄｅ（ＴＭＡＯ））、タウロウルソデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＵＤＣＡ））およびテプレノンからなる群より選択される、請求項９に記載の処置または予防薬。
【請求項１１】
前記角膜内皮は霊長類のものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項１２】
前記角膜内皮はヒトのものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項１３】
さらなる医薬成分を含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項１４】
点眼薬である、請求項１に記載の処置または予防薬。
【請求項１５】
小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する障害の処置または予防のためのＴＧＦ−βシグナル阻害物質。
【請求項１６】
被験体における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のＴＧＦ−βシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体（ＥＲ）関連ストレスおよび細胞死に関連する疾患、障害または状態の処置または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。【０００４】
角膜内皮細胞については、その疾患の状態に関する研究が進んでいる。非特許文献１は、ヒト角膜内皮細胞と酸化ストレスとの関係に関する基礎研究に関する文献である。非特許文献２は、ヒト角膜内皮細胞と小胞体ストレスとの関係に関する基礎研究に関する文献である。非特許文献３はヒト角膜内皮細胞と酸化ストレスとの関係に関する基礎研究に関する文献である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｎｏｕｃｈｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，基礎老化研究（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｒｏｎｔｏｌｏｇｙ）：Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２，５１（２０１０）
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｌ．Ｃｏｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１，４６−５５（２０１１）
【非特許文献３】Ｕｌａ  Ｖ．Ｊｕｒｋｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ：Ｖｏｌ．１７７，Ｎｏ．５，２２７８−２２８９（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
角膜内皮の状態を良好に保つためには、種々の考慮が必要であるところ、本発明者らは、そのうちの小胞体（ＥＲ）ストレスと角膜内皮細胞との関係に注目し、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）経路を阻害することにより、そのストレス状態が改善することができることを見出し、ＥＲストレス関連の障害を処置または予防しうる技術を見出し、本発明を完成した。したがって、本発明は以下のような発明を提供する。
（１）ＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
（２）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である、項目（１）に記載の処置または予防薬。
（３）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、項目（１）または（２）に記載の処置または予防薬。
（４）前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目（１）〜（３）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（５）前記ＴＧＦβシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアプタマー、ＴＧＦ−βレセプターのアプタマー、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノロリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目（１）〜（４）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（６）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目（１）〜（５）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（７）前記角膜内皮は霊長類のものである、項目（１）〜（６）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（８）前記角膜内皮はヒトのものである、項目（１）〜（７）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（９）さらなる医薬成分を含む、項目（１）〜（８）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（１０）点眼薬である、項目（１）〜（９）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（１１）角膜内皮の小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する障害の処置または予防のためのＴＧＦβシグナル阻害物質。
（１１Ａ）前記ＴＧＦβシグナル阻害物質は、項目（１）〜（１０）のいずれか１項の阻害剤の特徴を有する、項目（１１）に記載のＴＧＦβシグナル阻害物質。
（１２）被験体における角膜内皮の小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のＴＧＦβシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
（１２Ａ）項目（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目（１２）に記載の方法。【０００７】
本発明は別の局面では、本発明は以下のような発明を提供する。
（Ａ１）ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
（Ａ２）前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全に関連するものである、項目（Ａ１）に記載の処置または予防薬。
（Ａ３）前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全によるアポトーシスに関連するものである、項目（Ａ１）または（Ａ２）に記載の処置または予防薬。
（Ａ４）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関するものである、項目（Ａ１）〜（Ａ３）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ５）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、項目（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ６）前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも１つを抑制することを含む、項目（Ａ１）〜（Ａ５）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ７）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド
、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｈＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアプタマー、ＴＧＦ−βレセプターのアプタマー、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノロリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ８）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目（Ａ１）〜（Ａ７）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ９）さらにＥＲストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤を含む、項目（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ１０）前記ＥＲストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤は、ＢｉＰ  ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｘ（ＢＩＸ）、４−フェニル酪酸（４−ｐｈｅｎｙｌ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＢＡ））、トリメチルアミンＮ−オキシド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅＮ−ｏｘｉｄｅ（ＴＭＡＯ））、タウロウルソデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＵＤＣＡ））およびテプレノン（セルベックス（ｓｅｌｂｅｘ）としても販売されている）からなる群より選択される、項目（Ａ９）に記載の処置または予防薬。
（Ａ１１）前記角膜内皮は霊長類のものである、項目（Ａ１）〜（Ａ１０）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ１２）前記角膜内皮はヒトのものである、項目（Ａ１）〜（Ａ１１）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ１３）さらなる医薬成分を含む、項目（Ａ１）〜（Ａ１２）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ１４）点眼薬である、項目（Ａ１）〜（Ａ１３）のいずれか１項に記載の処置または予防薬。
（Ａ１４Ａ）前記疾患、障害または状態は、アグリソームの発現増加を伴うものである、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ１４Ｂ）前記疾患、障害または状態は、アグリソームに関連する疾患、障害または状態である、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ１４Ｃ）前記疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を伴うものである上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ１４Ｄ）前記疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を原因とするものである、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ１５）小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する障害の処置または予防のためのＴＧＦ−βシグナル阻害物質。
（Ａ１５Ａ）前記ＴＧＦβシグナル阻害物質は、項目（Ａ１）〜（Ａ１４）、および（Ａ１４Ａ）〜（Ａ１４Ｄ）のいずれか１項の阻害剤の特徴を有する、項目（Ａ１５）に記載のＴＧＦβシグナル阻害物質。
（Ａ１６）被験体における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のＴＧＦ−βシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
（Ａ１６Ａ）項目（Ａ１）〜（Ａ１４）、および（Ａ１４Ａ）〜（Ａ１４Ｄ）のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目（Ａ１６）に記載の方法。【０００８】
小胞体ストレスは、正常な高次構造に折り畳まれなかったタンパク質の小胞体への蓄積による細胞へのストレスであり、通常の細胞外マトリックスにより生じるものではない。その点で本発明のフックス角膜内皮ジストロフィなどにおいて小胞体ストレスによる細胞障害をＴＧＦβシグナルの抑制により救済できることは細胞外マトリクスに関する情報等のこれまでの知見からは予想できなかったものであるといえる。【０００９】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、従来角膜移植しか治療方法がなかった小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患を処置または予防しうる医薬であって点眼薬等でも実現可能な技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明に基づく、小胞体ストレスとアポトーシスとの関係に注目した小胞体ストレス関連の疾患（例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ）の病態仮説のスキームを示す。
【図２】図２は、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて小胞体およびミトコンドリアの形態異常を示す。左側は不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）であり、右側は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞（ｉＦＥＣＤ）を示す。上段および下段はともに透過型電子顕微鏡像を示す。★はミトコンドリアを示し、★★は小胞体を示し、★★★は細胞外マトリックスを示す。
【図３】図３は、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて角膜内皮細胞の小胞体ストレスが亢進することを示す免疫染色の結果である。ＧＲＰ７８やＧＡＤＤ１５３などの小胞体ストレス関連タンパク質の発現がｉＦＥＣＤで著明であることを示す。上段ではＧＲＰ７８の緑色蛍光が左パネルのｉＨＣＥＣにおいてまばらに観察され、右パネルのｉＦＥＣＤでは著明に観察される。他方、下段では、ＧＡＤＤ１５３の緑色蛍光は左パネルにおいてほとんど観察されず、右パネルでは著明に観察された。
【図４】図４は、ＴＧＦ−βは角膜内皮細胞のＥＲストレスを促進することを示す図である。上パネルはｉＨＣＥＣを示し、下パネルはｉＦＥＣＤを示す。各パネルのうち左側からコントロール（未刺激）、ＴＧＦ−β、ＴＧでの刺激を示す。各パネルのうち上側からＧＲＰ７８、ＩＲＥ１およびＧＡＰＤＨを示す。シャペロンであるＧＲＰ７８やストレスセンサーであるＩＲＥ１の発現レベルがＴＧＦβにより誘導され、また特にｉＦＥＣＤにおいてその発現レベルが高くなることを示す。ＴＧはタプシガルジンのことであり、ＥＲストレスのポジティブコントロールとして用いた。
【図５】図５は、フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞はＴＧＦベータにより小胞体ストレスがコントールと比べて高く生じること（フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞は小胞体ストレス高感受性）を示す結果である。左側はｉＨＣＥＣを示し、右側はｉＦＥＣＤを示す。各々、左上はコントロール、右上はコントロールにＳＢ４３１５４２添加の結果を示し、左中はＴＧＦ−β２刺激、右中はＴＧＦ−β２刺激にＳＢ４３１５４２添加の結果を示し、左下はＴＧ刺激、右下はＴＧ刺激にＳＢ４３１５４２添加の結果を示す。
【図６】図６はフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞はＴＧＦβにより小胞体ストレスがコントロールと比べて高く生じること（フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞は小胞体ストレス高感受性）を示す結果である。図５の細胞におけるアポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した結果の代表例である。左側はｉＨＣＥＣを示し、右側はｉＦＥＣＤを示す。各々、左上はコントロール、右上はコントロールにＳＢ４３１５４２添加の結果を示し、左下はＴＧＦ−β２刺激、右下はＴＧＦ−β２刺激にＳＢ４３１５４２添加の結果を示す。
【図７】図７はＳＢ４３１５４２はフックス角膜内皮ジストロフィのアポトーシスを抑制することを示すグラフである。ｙ軸はアネキシンＶ陽性細胞の割合を示し、ｘ軸は左からコントロール、ＳＢ４３１５４２、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ＋ＳＢ４３１５４２を示す。白はｉＨＣＥＣを示し、黒はｉＦＥＣＤを示す。＊は統計学的有意を示す（ｐ＜０．０１）。バーは標準偏差を示す。
【図８】図８は、Ａ−８３−０１およびＡＬＫ５阻害剤で図７と同様の実験を行った結果を示す。ｙ軸はアネキシンＶ陽性細胞の割合を示し、ｘ軸は左からコントロール、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ２＋ＳＢ４３５１４２、ＴＧＦβ２＋Ａ−８３−１およびＴＧＦβ２＋ＡＬＫ５阻害剤を示す。白はｉＨＣＥＣを示し、黒はｉＦＥＣＤを示す。＊は統計学的有意を示す（ｐ＜０．０１）。バーは標準偏差を示す。
【図９】図９はＴＧＦ−βが角膜内皮細胞のＥＲストレスを促進することを示す図である。ｉＦＥＣＤにおいてＥＲストレスはＴＧＦ−βにより誘導されることが示される。左から、２列ずつ（２列の組のうちでは、それぞれ、左列はｉＨＣＥＣを示し、右列はｉＦＥＣＤを示す。）、ＴＧＦ−β２処理後の時間別のウェスタンブロットの結果を示し、それぞれ０時間、３時間後、６時間後を示す。上の行からそれぞれ、ＰＥＲＫ、リン酸化ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、ＧＡＰＤＨを示す。ＰＥＲＫおよびＡＴＦ６はＥＲストレスセンサーを示し、ＧＲＰ７８はＥＲ統合性を担う分子シャペロンを示し、ＣＨＯＰはＥＲストレス媒介アポトーシスの誘導因子を示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。ＴＧＦ−βがＥＲストレスセンサーであるＰＥＲＫのリン酸化を促進し、ＡＴＦ６の発現を促進することを示す。また、シャペロンであるＧＲＰ７８の発現が上昇する。さらにＣＨＯＰの発現が上昇し、ＥＲストレスによりアポトーシスが生じることが示される。
【図１０】図１０は蛍光色素ＪＣ−１（５，５’，６，６’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−１，１’，３，３’−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）による染色像である。ｉＦＥＣＤにおいてミトコンドリア脱極が示される。左列はｉＨＣＥＣを示し、右列はｉＦＥＣＤを示す。上行はＪＣ１染色を示し（緑で染色される）、下行はＪＣ１染色を示す（赤で染色される）。緑はミトコンドリアを示し、赤はミトコンドリア膜電位を示す。青はＤＡＰＩ（核を染色する）を示す。ｉＦＥＣＤにおいてはｉＨＣＥＣと比べてミトコンドリア膜電位の低下を認める。ミトコンドリアを示す緑色染色について（上欄）、左パネル、右パネルともにミトコンドリアを示す緑色蛍光が観察される。ミトコンドリア膜電位を示す赤色染色について（下欄）、左パネルでは赤色蛍光が著明に観察されるが、右パネルはほとんど観察されなかった。
【図１１】図１１はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）によりミトコンドリア膜電位をフローサイトメトリーを用いて測定したものを示す。ｉＦＥＣＤにおいてミトコンドリア脱極が示される。左パネルは、ミトコンドリア膜の蛍光強度を示す。右パネルのうち左グラフはｉＨＣＥＣを示し、右グラフはｉＦＥＣＤを示す。左パネルは脱極した細胞の割合を示し、左カラムはｉＨＣＥＣを示し右から無はｉＦＥＣＤを示す。ミトコンドリア膜電位がｉＦＥＣＤにおいてはｉＨＣＥＣと比べて有意に低下している。＊＊は統計学的有意（ｐ＜０．０５）を示す。左パネルの色（緑と赤）について、緑は膜電位が低下して脱局した細胞、赤は低下せず脱局していない細胞を示す。
【図１２】図１２では、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロムＣの漏出が示される。ここでは、シトクロムＣのミトコンドリアからの漏出をウエスタンブロッティング法にて測定したものであるが、ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣより多くのシトクロムＣの漏出を認める。コントロールとしてスタウロスポリンを用いた。左２列はｉＨＣＥＣを示し（左側はスタウロスポリンなし、右側はスタウロスポリンありを示す）、右２列はｉＦＥＣＤを示す（左側はスタウロスポリンなし、右側はスタウロスポリンありを示す）。上の行からそれぞれシトクロムｃ、ＧＡＰＤＨおよびＶＤＡＣの染色を示す。ＧＡＰＤＨは細胞質ゾルのマーカーであり、ＶＤＡＣはミトコンドリアのマーカーである。
【図１３】図１３はアポトーシスにおけるミトコンドリア機能不全の関与を示す。この図では、ミトコンドリアの障害がアポトーシスを誘導するかどうかについて、スタウロスポリンによりミトコンドリア障害を誘導して、アポトーシス関連のタンパク質をウエスタンブロッティング法にて測定したものである。左列からコントロール、スタウロスポリン刺激後１５分後、３０分後、１時間後、３時間後、４時間後を示す。上の行から、それぞれカスパーゼ９、カスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＤＰＨ（コントロール）の結果を示す。ミトコンドリア障害により活性化することが知られているカスパーゼ９の活性化を認め、さらにカスパーゼ３、ＰＡＲＰの活性化を認めることからミトコンドリア障害によりアポトーシスが誘導されることが示される。
【図１４】図１４は、フックス角膜内皮ジストロフィでは変性タンパク質が多く、ＴＧＦ−β刺激で増加することを示す図である。左パネルは、コントロール（ＴＧＦβ刺激なし；上段）およびＴＧＦβ刺激あり（１０ｎｇ／ｍｌ；下段）の細胞写真を示す（４０倍）。右上のグラフは、それぞれ、フローサイトメーターの結果を示す。左からｉＨＣＥＣ（黒）とｉＦＥＣＤ（赤）の比較、ｉＨＣＥＣ（黒）とｉＨＣＥＣ＋ＴＧＦβ（赤）の比較、およびｉＦＥＣＤ（黒）とｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦβ（赤）の比較を示す。ｙ軸は細胞計数であり、ｘ軸はアグリソームの蛍光強度を示す。左のグラフでは、ｉＨＣＥＣ（黒）がｉＦＣＥＤ（赤）よりも全体に左にずれて観察される。中央のグラフでは、ｉＨＣＥＣ（黒）とｉＨＣＥＣ＋ＴＧＦβ（赤）とはほぼ重なって観察される。右のグラフでは、ｉＦＥＣＤ（黒）はｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦβ（赤）よりも左上にずれて観察される。右下欄は、アグリソームの蛍光強度をコントロールと、ＴＧＦβで刺激したｉＨＣＥＣおよびｉＦＣＥＤと比較したものである。白棒はｉＨＣＥＣであり、黒棒はｉＦＥＣＤである。＊はｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
（定義）
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｕｃｈｓ’  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
【００１４】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞
の略称である。
【００１５】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの３つのアイソフォームが存在する。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。
【００１６】
理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ  ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。
【００１７】
トランスフォーミング（形質転換）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、アポトーシス、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびアポトーシス等の強力な調節剤である。
【００１８】
ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして
機能することが十分裏付けられている。
【００１９】
ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ―Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
【００２０】
Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ―Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ―Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ―Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ―Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ―Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ―Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
１つの実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、アグリソームの発現増加を伴うものである。あるいは、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、アグリソームに関連する疾患、障害または状態である。
別の実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を伴うものである。あるいは、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を原因とするものである。
哺乳動物細胞において，フォールディングしなかったり（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）、ミスフォールディングやタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質（折りたたみ不全タンパク質、変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ともいう。）はユビキチン化され，微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し、アグリソームという封入体を形成することが知られる。一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染，酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは，パーキンソン病の神経細胞に見られるＬｅｗｙ小体や，アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるＭａｌｌｏｒｙ小体，筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など，細胞内の封入体が関与する疾患がいくつか知られている。
【００２１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ’ｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：７５３−９１；Ｖｉｌａｒ  ＪＭＧ，Ｊａｎｓｅｎ  Ｒ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ  （２００６）  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２（１）：ｅ３；Ｌｅａｓｋ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１８，８１６−８２７  （２００４）；Ｃｏｅｒｔ  Ｍａｒｇａｄａｎｔ  ＆  Ａｒｎｏｕｄ  Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  （２０１０）１１，９７−１０５；Ｊｏｅｌ  Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０；１５２：１５９−１６６等を参照のこと。
【００２２】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βシグナル阻害剤」とは、ＴＧＦシグナル伝達を阻害する任意の因子をいう。ＴＧＦ−βについて拮抗する場合はアンタゴニストという場合もあるが、本発明についていう場合ＴＧＦ−βアンタゴニストはＴＧＦ−βシグナル阻害剤に包含される。この阻害剤は、通常物質であるので、「ＴＧＦ−βシグナル阻害物質」は、「ＴＧＦβシグナル阻害剤」と交換可能に使用されうる。なお、「ＴＧＦ−β」は本明細書において「ＴＧＦβ」とも記載されることがあるが、両者は同じ意味で用いられる。
【００２３】
したがって、代表的には、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤、リガンドトラップ（リガンドに対する抗体、デコイレセプター）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＧＦ−β受容体キナーゼ阻害剤、ペプチドアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを挙げることができるがこれらに限定されない（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２０１２；８（７）：９６４−９７８  Ｆｉｇ３等を参照）。
【００２４】
本発明で用いられうる例示的なＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭ  ＴＬＫ  インヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ  ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物等を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明のＴＧＦ−βシグナル阻害剤、組成物、医薬、治療剤、予防剤は、中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。本明細書において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、Ｊ．Ｈｏｎｉｇｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｐ６５０  （１９５３）を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、ＰＥＧもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。薬学的に受容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成される���の、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００２５】
このほかのＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＴＧＦ−βの１つまたは複数のアイソフォームに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（米国特許第５，５７１，７１４号；国際公開第９７／１３８４４号および国際公開第００／６６６３１号もまた参照）、ＴＧＦ−βレセプター、そのようなレセプターの可溶性形態（例えば、可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター）、またはＴＧＦ−βレセプターに対して向けられる抗体（米国特許第５，６９３，６０７号、米国特許第６，００１，９６９号、米国特許第６，０１０，８７２号、米国特許第６，０８６，８６７号、米国特許第６，２０１，１０８号；国際公開第９８／４８０２４号；国際公開第９５／１０６１０号；国際公開第９３／０９２２８号；国際公開第９２／００３３０号）、潜在性関連ペプチド（国際公開第９１／０８２９１号）、大きな潜在型ＴＧＦ−β（国際公開第９４／０９８１２号）、フェチュイン（米国特許第５，８２１，２２７号）、デコリンならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンなどの他のプロテオグリカン（国際公開第９１／１０７２７号；米国特許第５，６５４，２７０号、米国特許第５，７０５，６０９号、米国特許第５，７２６，１４９号；米国特許第５，８２４，６５５号；国際公開第９１／０４７４８号；米国特許第５，８３０，８４７号、米国特許第６，０１５，６９３号；国際公開第９１／１０７２７号；国際公開第９３／０９８００号；および国際公開第９４／１０１８７号）、ソマトスタチン（国際公開第９８／０８５２９号）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（国際公開第９７／４０８４８号）、インスリン様成長因子ＩＩ（国際公開第９８／１７３０４号）、ＩＰ−１０（国際公開第９７／００６９１号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド（Ｐｆｅｆｆｅｒ、米国特許第５，９５８，４１１号；国際公開第９３／１０８０８号）、植物、菌類、および細菌の抽出物（ＥＰ−Ａ−８１３８７５；特開平８−１１９９８４号；およびＭａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６９３，６１０号）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（米国特許第５，６８３，９８８号；米国特許第５，７７２，９９５号；米国特許第５，８２１，２３４号、米国特許第５，８６９，４６２号；および国際公開第９４／２５５８８号）、ＳｍａｄおよびＭＡＤを含む、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＥＰ−Ａ−８７４０４６；国際公開第９７／３１０２０号；国際公開第９７／３８７２９号；国際公開第９８／０３６６３号；国際公開第９８／０７７３５号；国際公開第９８／０７８４９号；国際公開第９８／４５４６７号；国際公開第９８／５３０６８号；国際公開第９８／５５５１２号；国際公開第９８／５６９１３号；国際公開第９８／５３８３０号；国際公開第９９／５０２９６号；米国特許第５，８３４，２４８号；米国特許第５，８０７，７０８号；および米国特許第５，９４８，６３９号）、ＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｖｏｇｅｌ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：６６５；およびＳｔｒｏｓｃｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：７７１−７７��）、その同起源のレセプターへのＴＧＦ−βの結合を阻害するまたはそれに干渉するのに適している、１つまたは複数の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマーまたはそれをコードする発現プラスミド、ならびにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する、上記に同定される分子の任意の変異体、断片、または誘導体を含むが、これらに限定されない。ＴＧＦ−β阻害剤は、ＴＧＦ−βアンタゴニストであり得、そのレセプターへのＴＧＦ−β結合を遮断するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体（またはＦ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する抗体の他の形態もしくは断片などのその断片）であり得る。ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ある実施形態において、ＴＧＦ−β機能の好ましい阻害剤は、可溶性ＴＧＦ−βレセプター、とりわけ、例えば、ＴＧＦＢＩＩＲまたはＴＧＦＢＩＩＩＲの細胞外ドメイン、好ましくは組換え可溶性ＴＧＦ−βレセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲまたはｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）を含む、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター（ＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター（ＴＧＦＢＩＩＩＲもしくはベータグリカン）である。ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−βレセプターおよびそれらをコードする核酸は、当技術分野において十分に知られている。ＴＧＦ−β１型レセプターをコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１５４３６および米国特許第５，５３８，８９２号（Ｄｏｎａｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．）において開示される。ＴＧＦ−β２型レセプターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＷ２３６００１、ＡＩ３５７９０、ＡＩ２７９８７２、ＡＩ０７４７０６、およびＡＡ８０８２５５の下で公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型レセプターの核酸配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３２４３、ＡＩ８８７８５２、ＡＩ８１７２９５、およびＡＩ６８１５９９の下で公的に入手可能である。
【００２６】
またさらなる他のＴＧＦ−βシグナル阻害剤またはアンタゴニストおよびそれらの製造方法は、現在開発中のより多くのものと共に、当該分野で十分知られている。有効なＴＧＦ−βアンタゴニストはいずれも、本発明の方法において有用であり得ることから、使用する特異的ＴＧＦ−βシグナル阻害剤またはアンタゴニストは、限定的な特徴のものではない。そのようなアンタゴニストの例には、１つまたはそれより多いアイソタイプのＴＧＦ−βに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（米国特許第５，５７１，７１４号および国際公開９７／１３８４４）、ＴＧＦ−βレセプター、そのフラグメント、その誘導体、およびＴＧＦ−βレセプターに対する抗体（米国特許第５，６９３，６０７号、同第６，００８，０１１号、同第６，００１，９６９号および同第６，０１０，８７２号、ならびに国際公開９２／００３３０、国際公開９３／０９２２８、国際公開９５／１０６１０および国際公開９８／４８０２４）；潜伏関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ；国際公開９１／０８２９１）、ｌａｒｇｅ  ｌａｃｅｎｔ  ＴＧＦ−β（国際公開９４／０９８１２）、フェチュイン（米国特許第５，８２１，２２７号）、デコリン、ならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカンおよびエンドグリンといったような他のプロテオグリカン（米国特許第５，５８３，１０３号、同第５，６５４，２７０号、同第５，７０５，６０９号、同第５，７２６，１４９号、同第５，８２４，６５５号、同第５，８３０，８４７号、同第６，０１５，６９３号、ならびに国際公開９１／０４７４８、国際公開９１／１０７２７、国際公開９３／０９８００および国際公開９４／１０１８７）が含まれる。
【００２７】
そのようなアンタゴニストのさらなる例には、ソマトスタチン（国際公開９８／０８５２９）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（国際公開９７／４０８４８）、インスリン様増殖因子ＩＩ（国際公開９８／１７３０４）、ＩＰ−１０（国際公開９７／００６９１）、アルギニン（ａｒｇ）−グリシン（ｇｌｙ）−アスパラギン酸（ａｓｐ）含有ペプチド（米国特許第５，９５８，４１１号および国際公開９３／１０８０８）、植物、真菌類および細菌類の抽出物（欧州特許出願第８１３８７５号、特開平８−１１９９８４号および米国特許第５，６９３，６１０号）、アンチセンスオレゴヌクレオチド（米国特許第５，６８３，９８８号、同第５，７７２，９９５号、同第５，８２１，２３４号および同第５，８６９，４６２号、ならびに国際公開９４／２５５８８）、ならびにＳｍａｄおよびＭＡＤ（欧州特許出願ＥＰ８７４０４６、国際公開９７／３１０２０、国際公開９７／３８７２９、国際公開９８／０３６６３、国際公開９８／０７７３５、国際公開９８／０７８４９、国際公開９８／４５４６７、国際公開９８／５３０６８、国際公開９８／５５５１２、国際公開９８／５６９１３、国際公開９８／５３８３０および国際公開９９／５０２９６、ならびに米国特許第５，８３４，２４８号、同第５，８０７，７０８号および同第５，９４８，６３９号）、ならびにＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｇ．Ｖｏｇｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：６６５（１９９９）およびＳｔｒｏｓｃｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：７７１−７４（１９９９））、ならびにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する上記分子のいずれかのフラグメントおよび誘導体を含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する他のタンパク質の宿主が含まれる。
【００２８】
本発明における使用のために適したＴＧＦ−βアンタゴニストはまた、ＴＧＦ−βの量または活性を阻害するそれらの能力が保持される限り、前述のＴＧＦ−βアンタゴニストの機能的変異体、変異体、誘導体、および類似体をも含む。本明細書において使用される「変異体」、「誘導体」、および「類似体」は、親化合物に対して同様の形または構造を有し、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用する能力を保持する分子を指す。例えば、本明細書において開示されるＴＧＦ−βアンタゴニストのいずれも、結晶化されてもよく、有用な類似体は、（１つまたは複数の）活性部位の形のための担う座標に基づいて合理的に設計され得る。その代わりに、当業者は、不必要な実験を伴うことなく、知られているアンタゴニストの官能基を改変し得、あるいは活性、半減期、生物学的利用能、または他の望ましい特徴の増加についてそのような改変分子をスクリーニングし得る。ＴＧＦ−βアンタゴニストがポリペプチドである場合、ポリペプチドの断片および改変体は、送達の容易さ、活性、半減期などを増加させるために産生され得る（例えば、上記に議論されるようなヒト化抗体または機能的抗体断片）。合成および組換えポリペプチドの産生の当技術分野における技術のレベルを考慮すれば、そのような改変体は、不必要な実験を伴うことなく、達成される可能性がある。当業者らはまた、本明細書において記載されるＴＧＦ−β阻害剤の結晶構造および／または活性部位についての知識に基づいて新規な阻害剤を設計してもよい。可溶性ＴＧＦ−βレセプターなどのポリペプチド阻害剤はまた、遺伝子移入を介して有効に導入され得る。したがって、本発明の方法のある実施形態は、ＴＧＦ−βレセプターまたは結合パートナー、好ましくは可溶性レセプターまたは可溶性結合パートナーの発現のための適したベクターの使用を含む。ある好ましい実施形態において、可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストの投与は、可溶性アンタゴニストをコードするｃＤＮＡ、あるいは、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含むベクターを使用する遺伝子移入によって達成することができ、このベクターは、ベクターを用いて形質移入される細胞中で可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を引き起こし、ＴＧＦ−βの活性を阻害し、ＴＧＦ−β媒介性の線維形成を抑制する、任意の適したベクターを使用することができる。好ましいベクターは、遺伝子移入の目的で開発されたアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。遺伝子移入の他の非ベクター方法、例えば脂質／ＤＮＡ複合体、タンパク質／ＤＮＡ抱合体、裸のＤＮＡの移入方法などもまた使用することができる。アデノウイルス遺伝子移入を介しての送達のために開発されたさらなる適したＴＧＦ−βアンタゴニストは、Ｉｇ  Ｆｃドメインに融合された、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプターの細胞外ドメインをコードするキメラｃＤＮＡ（Ｉｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５５：ｐｐ．４���５〜４７５）、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプターのドミナントネガティブ変異体のアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、７２：ｐｐ．８９〜１００）、およびＴＧＦ−β結合プロテオグリカンであるデコリンのアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７７：ｐｐ．Ｌ４１２−Ｌ４２２）を含むが、これらに限定されない。アデノウイルス媒介性の遺伝子移入は、他の遺伝子送達様式と比較して、効率が非常に高い。
【００２９】
ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合フラグメント、可溶性フラグメント等は、本発明において有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−βレセプターおよびそれらをコードする核酸は、当該分野で十分知られている。ＴＧＦ−β１型レセプターをコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｌ１５４３６およびＤｏｎａｈｏｅらの米国特許第５，５３８，８９２号に開示されている。ＴＧＦ−β２型レセプターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＷ２３６００１；ＡＩ３５７９０；ＡＩ２７９８７２；ＡＩ０７４７０６；およびＡＡ８０８２５５の下、公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型レセプターの核酸配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ００３２４３；ＡＩ８８７８５２；ＡＩ８１７２９５；およびＡＩ６８１５９９の下、公的に入手可能である。１つの例示的な実施形態において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、そのレセプター、またはＦ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する他の「抗体」型といったようなそのフラグメントへのＴＧＦ−β結合を遮断する抗体である。その抗体は、キメラ化またはヒト化され得る。本明細書中、キメラ化抗体は、ヒト抗体の定常領域、およびマウス抗体といったような非ヒト抗体の可変領域を含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常領域およびフレームワーク可変領域（すなわち、超可変領域以外の可変領域）、ならびにマウス抗体といったような非ヒト抗体の超可変領域を含む。勿論、その抗体は、ファージ提示システムから選択されるもしくは選抜されるか、またはゼノマウスから産生されるヒト抗体といったような、いずれかの他の種類の抗体誘導体であり得る。
【００３０】
Ｓｍａｄ関連の知見も増大している。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、この分子がタイプＩ（ＴｂＲＩ）およびタイプＩＩ（ＴｂＲＩＩ）のセリン／スレオニンキナーゼ受容体からなるヘテロ二量体細胞表面複合体に結合し、そしてこのヘテロ二量体細胞表面複合体を誘起するときに開始される。ついでこのヘテロ二量体受容体は、前記のシグナルを下流の標的Ｓｍａｄプロテインのリン酸化を通じて前記のシグナルを伝播する。上述のように、Ｓｍａｄタンパク質には三つの機能クラスがあり、それらは、例えばＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のような、レセプターにより制御されるＳｍａｄ（Ｒ―Ｓｍａｄ）、Ｓｍａｄ４とも呼ばれるコメディエーター（Ｃｏ―Ｓｍａｄ）および阻害Ｓｍａｄ（Ｉ―Ｓｍａｄ）である。このヘテロ二量体受容体複合体によるリン酸化に続いて、このＲ―ＳｍａｄがこのＣｏ―Ｓｍａｄと複合体を形成し、そして前記の核に移り、他の各タンパク質と連携して、それらは標的遺伝子の転写を調節する（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：７３７−７４０）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｔｔｏｎ，Ｄ．（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：１７４５）。ヒトＳｍａｄ３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ：４２４７６２０２に開示されている。ネズミＳｍａｄ３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ：３１５４３２２１に開示されている。上述のように、ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（「ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｍａｄ」または「ｃｏ―Ｓｍａｄ」とも称する）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。したがって、ＴＧＦ−βシグナル阻害は、Ｓｍａｄ２、３またはｃｏ―Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ４）の阻害によっても達成されうる。Ｒ―Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ―Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。したがって、Ｒ―Ｓｍａｄを直接または間接に阻害することによってもＴＧＦ−βシグナル阻害が達成されうる。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（Ｉ―Ｓｍａｄ）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ―Ｓｍａｄの受容体媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する。それらは、Ｒ―Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型受容体と関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。したがって、Ｓｍａｄ６および７は、本発明においてＴＧＦ−βシグナル阻害剤として機能しうる。
【００３１】
本発明において使用されうるＳｍａｄ３の阻害剤としては、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、抗体等のほか、低分子化合物として、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから販売される６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、「（ＴＧＦ−β等の）発現を抑制する物質（例えば、核酸）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、またはｍＲＮＡからの蛋白質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはこれらの発現ベクター等の核酸などが例示される。その中でも、ｓｉＲＮＡおよびその発現ベクターが好ましく、特にｓｉＲＮＡが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、本発明において標的遺伝子は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に関与する任意の遺伝子である。
【００３３】
本発明において標的とされるＴＧＦ−β等の特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．）。
【００３４】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＴＧＦ−βのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のＴＧＦ−β等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のＴＧＦ−β等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するＴＧＦ−β等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、ＴＧＦ−β等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
【００３５】
ＴＧＦ−β等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
【００３６】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７０５９．）。
【００３７】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてＴＧＦ−β等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３８】
ＴＧＦ−β等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
【００３９】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＴＧＦ−β等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。ＴＧＦ−β等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００４０】
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
【００４１】
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００４２】
さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
【００４３】
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
【００４４】
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
【００４５】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
【００４６】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
【００４７】
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、ＴＧＦ−β等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００４８】
本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
【００４９】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００５０】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、ＴＧＦ−βまたは他のＴＧＦ−βシグナルのメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
【００５１】
また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体（ベシクル）に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、ＯＣＨＩＹＡ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸または医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、ＴａｋｅｓｈｉｔａＦ．ＰＮＡＳ．（２００３）１０２（３４）１２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ  Ｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ（２００４）３２（１３）ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
【００５２】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５３】
本明細書において、「角膜内皮」の「小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患、障害または状態」とは、角膜内皮の疾患、障害または状態のうち、小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものをいう。
【００５４】
本明細書において角膜内皮に関して「小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する疾患、障害または状態」は、ＥＲ関連ストレスに関連する任意の疾患、障害または状態を挙げることができ、例えば、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫等を挙げることができるがこれらに限定されない。ＥＲストレスとミトコンドリア障害とは、通常同時に存在するものであり、ミトコンドリア障害によっても通常全ての症状は出るとされている。したがって、これらの関連は、ミトコンドリア機能不全を確認することによっても検出または診断することができる。また、これらの疾患、障害または状態は、多くが、ミトコンドリア機能不全によるアポトーシスに関連するものであるため、アポトーシスを確認することによっても検出または診断することができる。
【００５５】
本明細書において「（ＥＲストレスにより生じる）ミトコンドリア機能不全の治療剤」とは、ＥＲストレス治療薬と実質的に同様の治療剤を指し、例えば、ＢｉＰ  ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｘ（ＢＩＸ）、４−フェニル酪酸（４−ｐｈｅｎｙｌ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＢＡ））、トリメチルアミンＮ−オキシド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅＮ−ｏｘｉｄｅ（ＴＭＡＯ））、タウロウルソデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＵＤＣＡ））、テプレノン（セルベックス（ｓｅｌｂｅｘ）としても販売されている）等を挙げることができるがそれらに限定されない（例えば、精神経誌（２０１２）１１４巻２号１１５頁を参照のこと）。
【００５６】
本明細書において「フックス角膜内皮ジストロフィに関する疾患、障害または状態」とは、フックス角膜内皮ジストロフィに関する任意の疾患、障害または状態をいい、そのうち、小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものが本発明の特に目的とするものであるが、それに限定されない。そのような小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する、フックス角膜内皮ジストロフィに関する疾患、障害または状態としては、たとえば、角膜内皮細胞の障害に関連するものが想定され、あるいは、フックス角膜内皮ジストロフィに関する疾患、障害または状態の別の形態としては、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫等を挙げることができるがこれらに限定されない。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Ｃｏｒｎｅａｌｇｕｔｔａｅ）およびデスメ膜の肥厚を
生じる。グッテー（Ｃｏｒｎｅａｌ  ｇｕｔｔａｅ）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のＱＯＬを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【００５７】
フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養（Ｚａｎｉｏｌｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．；９４（１）：２２−３１．２０１２およびＫｅｌｌｉｈｅｒ  Ｃ．ｅｔ
ａｌ．ＥｘｐＥｙｅ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ．９３（６），８８０−８８８，２０１１）や不死化の報告（Ａｚｉｚｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．
Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２；５２（１３）：９２９１−９２９７．２０１１）があるが、細胞外マト
リックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。
【００５８】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈ��ｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ  Ｊｏｙｃｅらの報告｛Ｊｏｙｃｅ，２００４＃１６１｝｛Ｊｏｙｃｅ，２００３＃７｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５９】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００６０】
（ＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防）
１つの局面において、本発明はＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。本発明では、角膜内皮においてＥＲストレスが関連する疾患、障害または状態を、ＴＧＦβシグナル阻害剤を投与することによって、予想外にＥＲストレスを低減または消失、あるいは正常レベルに維持または戻すことができたことを見出した。したがって、このようなＴＧＦβシグナル阻害剤の角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防のための用途は従来の知見からは予想できなかった用途であるといえる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である。フックス角膜内皮ジストロフィは現在のところ、根本的な治療方法や技術が存在せず、フックス角膜内皮ジストロフィの治療は角膜移植に頼らざるを得なかった。本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィの中でもひとつの重要な異常または障害の原因となるＥＲストレスを処置しうることから、フックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防に有用であることが理解される。特に、ＥＲストレスはアポトーシスと密接に関連することが見出されたことから、本発明はフックス角膜内皮ジストロフィの根本的治療としても期待される。本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害や、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫などを処置しまたは予防しうることができる。
【００６２】
フックス角膜内皮ジストロフィに関しては、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−β誘導小胞体（ＥＲ）ストレスについて以下のことも確認されている。すなわち、本発明者らが樹立した、フックス角膜内皮ジストロフィ（ＦＥＣＤ）のヒト患者角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の不死化細胞モデル（ｉＦＥＣＤ）および正常ドナー角膜ＨＣＥＣ（ｉＨＣＥＣ）を用いてＴＧＦβシグナル伝達の、ＦＥＣＤにおけるＥＲストレスの関与を調べたところ、関与していることが示されており、ＦＥＣＤにおける細胞喪失に関与し得ることも示されている。したがって、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害は、ＦＥＣＤの有効な治療になり得ることが示されたといえる。
【００６３】
フックス角膜内皮ジストロフィについては、本発明において、形態学的なＥＲ変化を明らかにするために，ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で評価したところ、細胞の膨張がｉＦＥＣＤで見られたが、ｉＨＣＥＣでは見られなかった。ＥＲストレスセンサー（ＰＥＲＫおよびＡＴＦ６）の発現を、ＴＧＦβの有無の違いで刺激してウェスタンブロットで分析し、細胞外マトリクスタンパク質の産生およびＥＲ共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）をコラーゲンＩ型、ＩＶ型、フィブロネクチンおよびＥＲマーカータンパク質であるＰＤＩの免疫染色で試験したところ、コラーゲンＩ型およびＩＶ型、ならびにフィブロネクチンはｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣよりも高い発現が見られたが、ＥＲとともに共局在化していることが分かった。また、ＴＧＦβにより、ｉＦＥＣＤにおけるＰＥＲＫリン酸化およびＡＴＦ６切断はｉＨＣＥＣよりも増加していたことも本発明者の知見としてわかっている。ＴＧＦβシグナル伝達のアポトーシスにおける関与を調べるために、細胞をＴＧＦβで処理し、アネキシンＶ陽性のアポトーシス細胞をフローサイトメトリーで評価した。ｉＨＣＥＣのアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の割合はＴＧＦβ刺激の前と比較して増加していなかった（例示のデータとして、刺激前が１１．１±０．６％、刺激後が１２．３±０．５％）。他方、ＴＧＦβは、ｉＦＥＣＤにおいてＴＧＦβ刺激前に比べて刺激後は、アネキシンＶ陽性細胞を増加させることがわかっている（例示のデータとして、刺激前が１９．４±１．４％、刺激後が２９．９±１．５％、ｐ＜０．０１）。また、これらに加え、シャペロンであるＧＲＰ７８の発現が上昇することが示されており、ＣＨＯＰの発現が上昇し、ＥＲストレスによりアポトーシスが生じることが示された。これらのリン酸化の促進および発現の促進はｉＨＣＥＣに比べてｉＦＥＣＤにおいてより顕著に見られており、３時間後でこの増大は見られ、６時間後にその増大効果は増強されることが示されていることから、経時的に増加するものであることが示されている。
【００６４】
また、本発明において、１つの具体的実施形態では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞の機能のレベルについて、ミトコンドリア機能不全が関与することが示された。実施例において実証されるように、ＦＥＣＤ患者のヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の不死化細胞モデル（ｉＦＥＣＤ）および正常ドナー角膜ＨＣＥＣ（ｉＨＣＥＣ）という細胞モデルを用いて、ＦＥＣＤのミトコンドリア機能不全の関与が実証されている。
【００６５】
ＦＥＣＤでは、ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で評価されるように、ｉＦＥＣＤではミトコンドリア膨張が確認されたが、ｉＨＣＥＣにおけるミトコンドリアの形態は正常であることから、フックス角膜内皮ジストロフィではミトコンドリアの形態が異常となることが示された。加えて、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は、ＪＣ−１色素およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）等によって示されるように、ｉＨＣＥＣよりもｉＦＥＣＤで低いことも示されている。シトクロムＣのミトコンドリアから細胞質への漏出もまた、ウェスタンブロットによって評価されるように、ｉＨＣＥＣよりもｉＦＥＣＤにおいてミトコンドリア画分でのシトクロムＣのレベルがより高いことが示されている。ウェスタンブロットで示されるように、カスパーゼ９、カスパーゼ３およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が、ミトコンドリアストレス刺激剤（例えば、スタウロスポリン）により切断されていることが観察されることからミトコンドリア機能不全がアポトーシスに関与していることが示されている。ＥＲストレスはミトコンドリア障害を引き起こすことが多くの細胞で知られており、ＥＲストレスを制御することで、ミトコンドリア障害を軽減できることは容易に推定される。このように、本発明の結果から、当業者は、ミトコンドリア機能不全は、ＦＥＣＤの病態に関与しており、強力な治療剤の標的として利用し得ると評価することができる。
【００６６】
本発明の医薬または方法の投与（移植）対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
【００６７】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＡＬＫ４、５または７を経由するＳｍａｄ２／３系と、ＡＬＫ１、２、３または６を経由するＳｍａｄ１／５／８系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている（Ｊ．  Ｍａｓｓａｇｕ’ｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：７５３−９１；Ｖｉｌａｒ  ＪＭＧ，Ｊａｎｓｅｎ  Ｒ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ（２００６）  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２（１）：ｅ３；Ｌｅａｓｋ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１８，８１６−８２７（２００４）；Ｃｏｅｒｔ  Ｍａｒｇａｄａｎｔ  ＆  Ａｒｎｏｕｄ  Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１０）  １１，９７−１０５；Ｊｏｅｌ  Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０；１５２：１５９−１６６．）。ＢＭＰ−７はＴＧＦ−βシグナルを抑制し線維化を抑制することができることも知られている（上記文献の他、Ｒａｌｆ  Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４，４９９２−５０１２，Ｊｕｎｅ  １，２００９；Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ  Ｍ  Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，９５２−９６１（２００７）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，９６４−９６８（２００３））。しかしながら、これらの文献では、非常に特殊な疾患である梅毒性角膜実質炎または人工的に作製した重度の障害により実際にコラーゲンなどの細胞外基質からなる膜状組織を伴うような状態についてＴＧＦ−βとの関与が記載されているが、これから治療効果を予測することは困難である。また、角膜の重度な障害時の線維化がＩＬ−１βにより、途中ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化によるということも示されているが、他方ウサギでの過剰な冷凍外傷により生体において重度の炎症が生じた時にみられる線維化がｐ３８  ＭＡＰＫの活性化を伴い、阻害剤で一部線維化が抑制できることをウサギを用いて示されている。これらの知見は極めて強い炎症が生体に生じ細胞外基質からなる膜状組織を伴うような状況においてｐ３８ＭＡＰＫの活性化を伴うことを示したものであり、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤が角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態（たとえば、フックス角膜内皮ジストロフィ等の障害）を処置または予防に有効であるということを述べたものではなく、正常状態の維持についてなんら示唆を与えるものではない。このように、角膜内皮細胞については、従前は正常機能を保ちつつ培養することは困難であると考えられており、これまでに報告されたものは、結局のところフックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態を処置または予防できなかった。ましてや、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を抑制することにより、角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態（たとえば、フックス角膜内皮ジストロフィ等の障害）を処置または予防することができるとは考えられていなかった。
【００６８】
本発明で用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのシグナル経路を阻害することができる限り、どのような薬剤（ａｇｅｎｔ）を用いてもよい。また、阻害されるべきＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、周知のように、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βレセプターが直接関連するもののほか、ＢＭＰ−７のように最終的にＴＧＦ−βのシグナル伝達経路と同様（阻害剤・アンタゴニスト等であれば正反対）の効果を発揮するものであれば、どのようなシグナルに関連する因子であってもよい。
【００６９】
本発明においては、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
【００７０】
１つの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、およびＳｍａｄ３の阻害剤は本明細書において他の箇所で説明された任意のものを利用することができる。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明において用いられうるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭＴＬＫ  インヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ  ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。なお、言及した抗体は中和抗体であってもよいがこれに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、これらのいずれの経路のＴＧＦ−βシグナル阻害剤であっても、本発明の効果を達成することができると理解される。ＡＬＫ−４、５、７阻害剤であるＡ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノロリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、もまた、実施例において効果が示されているため、ＡＬＫ−４，５，７阻害剤もまた本発明の具体的な実施例で使用されうることが理解される。そして、ＡＬＫ−５阻害剤である２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンもまた、実施例において、効果が示されているため、ＡＬＫ−５阻害剤もまた本発明の具体的な実施例で使用されうることが理解される。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）を含む。角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態（たとえば、フックス角膜内皮ジストロフィ等に関する障害）が改善されることが示されたからである。好ましい実施形態では、ＳＢ４３１５４２は、使用時に約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、好ましくは、使用時に約１μＭ〜約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、さらに好ましくは使用時に約１μＭの濃度で存在するように含まれる。
【００７３】
本発明で使用されるＴＧＦβシグナル阻害剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７４】
好ましい実施形態では、使用されるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＢＭＰ−７を含む。線維化が抑制された上に、正常機能を担うタンパク質が保持されていることが示され、また霊長類への移植にも耐え得るからである。好ましい実施形態では、ＢＭＰ−７は、使用時に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれ、より好ましくは、使用時に約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれる。ＢＭＰ−７は、使用時に約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれていても、約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれていてもよい。
【００７６】
１つの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ミトコンドリア機能不全を処置することができる。このミトコンドリア機能不全の処置は、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものであってよいが、これに限定されない。
【００７７】
あるいは、ミトコンドリア機能不全の処置を行う薬剤を、単独でまたは他の薬剤例えばＴＧＦ−βシグナル阻害剤等とともに用いて眼科の治療、特に角膜内皮の治療を行うことができる。ミトコンドリア機能不全に関与する疾患、障害または状態の処置のための薬剤としては、ミトコンドリア呼吸鎖の特定のエレメントにより使用されるビタミン（例えば、ビタミンＥまたはその誘導体）、補因子、補酵素Ｑ（ユビキチン）、ニコチンアミド、リボフラビン、カルニチン、ビオチン、およびリポ酸等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７８】
ミトコンドリア機能不全によって起こる疾患には、例えばミトコンドリアの潜在的機能障害によるミトコンドリア膨化、酸化的ストレス（例えば、活性酸素種やフリーラジカルの作用によるもの）による機能障害、遺伝的因子による機能障害およびミトコンドリアのエネルギー生成のための酸化的リン酸化機構の機能不全による疾患が含まれうる。上記の病理学的要因によって進行する疾患の具体的な例には、多数あるが、眼科領域が関連するものとしては、視神経萎縮、視神経症、網膜色素変性症、白内障を挙げることができるがこれらに限定されない。また、上述したフックス角膜内皮ジストロフィに関する疾患、障害または状態の別の形態としては、角膜内皮密度低下、ｇｕｔｔａｅの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫なども、ミトコンドリア機能不全によって起こる角膜内皮に関連する疾患、障害または状態として列挙することができる。
【００７９】
本発明の処置または予防薬は、さらなる医薬成分を含んでいてもよい。そのような医薬製品の代表例としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ステロイドを挙げることができる。理論に束縛されることを望まないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含めることにより、角膜内皮細胞の接着を亢進することによって細胞の脱落を防止し、良好な細胞形態および高い細胞密度を持った角膜内皮細胞層の形成を可能とするため、ＴＧＦβシグナル阻害剤の効果を強化することができるからである。本発明においては、１種類のＲｈｏキナーゼ阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
【００８０】
本発明において使用されうるＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができ、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などを挙げることができる。
【００８１】
本発明中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の濃度は、通常約１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約５〜２０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１０μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８２】
本発明は、点眼剤として投与することができる。
【００８３】
投与量、投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態により異なるが、通常成人に対し、例えば点眼剤として使用する場合には、有効成分を約０．０００１〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００３〜０．０３ｗ／ｖ％含有する製剤を、１日あたり１〜１０回、好ましくは１〜６回、より好ましくは１〜３回、１回当たり約０．０１〜０．１ｍＬ投与することができる。本発明の医薬を前房内に注入する場合には、上記濃度の１０分の１〜１０００分のｌの濃度のものが使用され得る。当業者は疾患の状態によって、ＴＧＦβシグナル阻害剤、Ｒｈｏ  キナーゼ阻害剤等の種類および濃度を適宜選択することができる。
【００８４】
別の局面において、本発明は、角膜内皮のＥＲストレスに関連する障害の処置または予防のためのＴＧＦβシグナル阻害物質を提供する。ＴＧＦβシグナル阻害物質は、ＴＧＦβシグナル阻害剤と交換可能に使用されうる。この用途において、角膜内皮のＥＲストレスおよびＴＧＦβシグナル阻害剤については、本明細書において説明した任意の実施形態を使用することができる。
【００８５】
別の局面において、本発明は、被験体における角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のＴＧＦβシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法を提供する。この方法において、角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態およびＴＧＦβシグナル阻害剤については、本明細書において説明した任意の実施形態を使用することができる。
【００８６】
本発明の医薬または方法の投与（移植）対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００８７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８９】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。【００９０】
フックス角膜内皮ジストロフィでは角膜内皮細胞が細胞死に至り、残存する角膜内皮細胞が、ポンプ機能、バリア機能を代償できなくなると角膜の透明性を維持できなくなり角膜混濁による失明に至る。また、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞は、細胞外マトリックスを過剰に産生しｇｕｔｔａｅの形成およびデスメ膜の肥厚を生じることが知られている。ｇｕｔｔａｅの形成およびデスメ膜の肥厚は光の散乱などを生じるために視力低下、羞明、霧視の原因とない患者のＱＯＬを著しく傷害する。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）をモデルとして、健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）と比較して細胞外マトリックスの産生に関わる原因を明らかにして、治療ターゲットの同定を行った。【００９１】
（調製例１：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）モデルの作製）
本例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。【００９２】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。【００９３】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて２９３Ｔ  細胞  （ＲＣＢ２２０２；Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。ＳＢ４３１５４２は、ＴＯＣＲＩＳ社から得た（カタログ番号：１６１４）。ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭから得た（カタログ番号：５５９３８９）。【００９４】
（調製例２：不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認）
本実施例では、不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認を行った。【００９５】
（Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色）
まず、不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認のために、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色を行った。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。【００９６】
（染色等の細胞観察方法（組織学的試験））
細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養した細胞をＬａｂ−ＴｅｋＴＭ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ  Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れ、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。具体的には、Ｌａｂ−ＴｅｋＴＭＣｈａｍｂｅｒ  ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ  Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上の培養細胞を室温で１０分間４％ホルムアルデヒド中で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。細胞の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを使用した。ＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの染色は、それぞれ、ＺＯ−１ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）の１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。【００９７】
結果を見たところ、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤともに全ての細胞でＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１を発現しており、作製した不死化細胞株が正常な機能を維持していることが示された。【００９８】
また、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの透過型電子顕微鏡による形態観察像を確認した（データ示さず）。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＤＭＥＭにより無血清でＴｒａｎｓｗｅｌｌ上に培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定して透過型電子顕微鏡により形態を観察したところ、形態的に明らかな異常を認めない一層の細胞であることが示された。【００９９】
また、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞は細胞外マトリックスを過剰に産生しｇｕｔｔａｅの形成およびデスメ膜の肥厚を生じることが知られている。そこで、細胞外マトリックスを構成するタンパク質であるＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現について、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤを培養皿で培養し免疫染色を行った。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較してＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が増加していることが示された。また、培養したｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲ法により検討したところＩ型コラーゲン、フィブロネクチンは有意に発現レベルの亢進を認め、ＩＶ型コラーゲンにおいては発現亢進の傾向を認めた。フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮同様にｉＦＥＣＤが細胞外マトリックスを過剰に産生するかどうかについて検討した。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＴｒａｎｓｗｅｌｌ上にＤＭＥＭにより無血清で培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定してＨＥ染色を行った。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較して有意に肥厚した細胞外マトリックスの産生を認めた。以上よりフックス角膜内皮ジストロフィ患者における過剰な細胞外マトリックスの産生という特徴を有する疾患モデル細胞を作製した。疾患モデル細胞を用いた解析による不明点の多いフックス角膜内皮ジストロフィの病態解明に寄与することが期待されるため、この細胞を用いて、以下小胞体ストレスに関連する疾患の代表例としてのフックス角膜内皮ジストロフィの治療薬の開発を試行した。【０１００】
（実施例１：フックス角膜内皮ジストロフィにおける小胞体およびミトコンドリアの形態観察）
本実施例では、小胞体ストレスについて調べるために、その代表例として、上記調製例で調製したフックス角膜内皮ジストロフィをモデルとして、その細胞において小胞体およびミトコンドリアの形態異常が見られるかどうか観察した。【０１０１】
（電子顕微鏡による細胞内小器官の観察）
次に、電子顕微鏡を用いた細胞の観察によりＥＲストレスおよびＥＣＭの産生が亢進されていることを確認した。前固定として、細胞が播かれたトランスウェルを、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで希釈したｐＨ７．２の２．５％グルタルアルデヒドで３時間室温で固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで３回洗浄後、後固定として、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで希釈した１％オスミウム酸で１時間室温で固定し、蒸留水で３回洗浄した。細胞内小器官の局在と形態変化を調べるために、０．５％酢酸ウラニルに１時間室温で浸した。脱水処理のため、７０％エタノール、９０％エタノールに細胞をそれぞれ１０分浸し、１００％エタノールに２０分浸した。その後、酸化プロピレンに３０分浸し、酸化プロピレンとアラルダイト樹脂混合物を１：１の割合で混合したものに１時間室温で浸した。アラルダイト樹脂混合物の中にトランスウェルを浸し、２時間室温で浸潤させた。２時間ごとにアラルダイド樹脂混合物を３回交換し、１２時間後に再度２時間ごとアラルダイド樹脂を３回交換した。続いて、アラルダイド樹脂混合物で包埋し、６０℃で２４時間インキュベートすることで硬化させた。ミクロトーム（ＬｅｉｃａＥＭＵＣ７、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３００ｎｍの切片を作製し、グリッド上に回収した。グリッド染色後、電子顕微鏡で観察した。【０１０２】
（結果）
結果を図２に示す。フックス角膜内皮ジストロフィにおいて小胞体およびミトコンドリアの形態が異常になっていることが判明した。より詳細にはｉＨＣＥＣでは正常形態の小胞体およびミトコンドリアを認め、細胞外マトリックスは認められなかった。他方、ｉＦＥＣＤでは小胞体およびミトコンドリアが拡張し、形態異常を呈していた。また、細胞外マトリックスが細胞間に認められた。【０１０３】
これらの結果から、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、小胞体およびミトコンドリアの形態が異常となることが把握された。【０１０４】
（実施例２：フックス角膜内皮ジストロフィにおいて角膜内皮細胞の小胞体ストレスが亢進する）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、小胞体ストレスが亢進するかどうかを確認するために、小胞体ストレスに応答して発現する分子シャペロンであるＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３の発現を観察した。ＧＡＤＤ１５３は、種々のストレス、特に小胞体に対するストレスに応じて発現・誘導され、細胞周期を停止させ、アポトーシスに関与しているタンパク質として知られている（参考文献として、Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１３  Ｍａｙ  ２８；３３２（２）：２４９−６４を参照）。【０１０５】
（材料および方法）
（免疫染色による発現観察）
免疫染色によりＥＲストレスに関連するＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３の発現が亢進されていることを確認した。免疫染色の手法は、上記調製例２に準じ、抗体については、ＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３に対する抗体に変更して実験を行った。
・ＧＲＰ７８に対する抗体：（ｓｃ−３７６７６８、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
・ＧＡＤＤ１５３に対する抗体：（ｓｃ−５７５、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
手短には以下のとおりに行った。【０１０６】
組織染色検査のために、培養した細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。ＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３に対する抗体をそれぞれ１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
・ウェスタンブロット法：ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製（カタログ番号：ＥＨ−２２２２））に転写した。５％無脂肪乾燥乳（５％ＮＯＮ  ＦＡＴ  ＤＲＹ  ＭＩＬＫ、ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社  カタログ番号：９９９９）を補った０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）を含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）（ＴＢＳ−Ｔ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、抗ＧＲＰ７８抗体を５％無脂肪乾燥乳を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社（カタログ番号：７０７４Ｐ２））とインキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社（カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ））で発光させたバンドを検出した。【０１０７】
本手法では、以下の一次抗体を使用した。
・抗ＧＲＰ７８抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、ＳＣ−３７６７６８）
・抗ＩＲＥ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４Ｃ１０）
・抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＥＤＩＣＡＬ  ＆  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｍ１７１−３）
二次抗体は以下のとおりであった。
・ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：５０００希釈）
一次抗体および二次抗体とともにインキュベーションを行った。メンブレンを、ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって感光させ、次いで、ＬＡＳ４０００Ｓ画像化システム（富士フィルム株式会社、東京都）を用いて調べた。【０１０８】
（細胞刺激）
１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）にて細胞を２４時間刺激した。またＥＲストレスのポジティブコントロールとして１０μＭ  タプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ；ＴＧ；Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）により２４時間刺激したものを用いた。【０１０９】
（結果）
結果を図３に示す。フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、正常角膜由来の角膜内皮細胞と比べて小胞体ストレスの亢進を示すＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３の発現増加が見られた。【０１１０】
（実施例３：ＴＧＦ−βは角膜内皮細胞のＥＲストレスを促進する）
本実施例では、ＴＧＦ−βは角膜内皮細胞のＥＲストレスを促進することを確認するために、実施例２と同様のウェスタンブロットを行い、ＧＲＰ７８のほか、小胞体膜上のストレスシグナル伝達に関与する膜タンパク質であるＩＲＥ１の動向も観察した。１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）にて細胞を刺激した。またＥＲストレスのポジティブコントロールとしてタプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ；ＴＧ；Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）により刺激したものを用いた。【０１１１】
（材料および方法）
ウェスタンブロットは、実施例２の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例２のものに加え以下を用いた。
・抗ＩＲＥ１に対する抗体：（１４Ｃ１０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・ＴＧＦ−β２：（３０２−Ｂ２−００２、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）【０１１２】
（結果）
結果を図４に示す。正常細胞においても、フックス角膜内皮ジストロフィモデルの細胞において、ＴＧＦβによりシャペロンであるＧＲＰ７８やストレスセンサーであるＩＲＥ１の発現レベルが誘導された。特にフックス角膜内皮ジストロフィモデルの細胞においてその発現レベルが高くなった。ＴＧはタプシガルジンのことであり、ＥＲストレスのポジティブコントロールとして用いた。【０１１３】
（実施例４：フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞は小胞体ストレス高感受性）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞は小胞体ストレス高感受性であることを示すために、ＴＧＦβシグナルの阻害剤であるＳＢ４３１５４２を投与し、ＥＲストレスの亢進がキャンセルされるかどうかを確認した。【０１１４】
（材料および方法）
ＳＢ４３１５４２は、ＴＯＣＲＩＳ社から得た（カタログ番号：１６１４）。【０１１５】
（手法）
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約３日間培養した。さらに、ＴＧＦβ２、ＳＢ４３１５４２、ＴＧを添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。【０１１６】
（結果）
結果を図５に示す。ｉＦＥＣＤにおいてのみＴＧＦβ２により細胞が障害されｉＨＣＥＣと比べて多量の浮遊細胞が認められた。浮遊細胞はＳＢ４３１５４２によってキャンセルされた。一方、ＴＧにより特に、ｉＦＥＣＤにおいて多量の浮遊細胞が認められたが、ＳＢ４３１５４２ではキャンセルされなかった。このことはＳＢ４３１５４２は非特異的な細胞障害抑制薬としてではなく、ＴＧＦβシグナルにより誘導される細胞障害に特異的であることを示す。図６では図５の細胞におけるアポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した結果の代表例を、図７ではグラフによりアネキシンＶ陽性のアポトーシス細胞を縦軸にプロットしたものを示す。【０１１７】
（材料および方法）
・フローサイトメトリー：
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約３日間培養した。さらに、ＴＧＦβ２、ＳＢ４３１５４２を添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間インキュベートした。ＡＣＣＵＭＡＸで細胞を剥離し、ＭＥＢＣＹＴＯ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ｋｉｔ）１００ｔｅｓｔ（４７００、ＭＥＤＩＣＡＬ  ＆  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）により、ＡｎｎｅｘｉｎＶとＰＩを使用してフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ
ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））でアネキシンＶ又はＰＩ陽性細胞を測定した。【０１１８】
（結果）
結果を図７に示す。示されるように、フックス角膜内皮ジストロフィの細胞は、ＴＧＦβ２によりアポトーシス細胞が増大し、その増大は、ＳＢ４３１５４２によりキャンセルされた。フックス角膜内皮ジストロフィにおいて自然発生するアポトーシスについても、ＴＧＦβシグナル阻害を行うことで小胞体（ＥＲ）関連ストレスを抑制することで、治療または進行予防が可能であることが示唆される。【０１１９】
（実施例７：ＴＧＦβシグナル阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィのアポトーシスを抑制する）
本実施例では、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβのシグナル阻害剤（Ａ−８３−０１、ＡＬＫ５阻害剤）でもフックス角膜内皮ジストロフィのアポトーシスを抑制することができるかを確認した。本実施例では、アポトーシスの指標として用いられるアネキシンＶの陽性細胞を計数することによって、観察した。【０１２０】
（手法）
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約３日間培養した。さらに、ＴＧＦβ２、ＳＢ４３１５４２及びＴＧＦβシグナル阻害剤であるＡ−８３−０１（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ；ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：０１８−２２５２１）、ＡＬＫ５阻害剤（Ｗａｋｏ  ｃａｔａｌｏｇＮｏ：０１２−２３０２１；ＣＡＳ  Ｎｏ．４４６８５９−３３−２；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）を添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間インキュベートした。ＡＣＣＵＭＡＸで細胞を剥離し、アネキシンＶとプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）を使用してフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））でアネキシンＶ又はＰＩ陽性細胞を測定した。【０１２１】
（結果）
結果を図８に示す。実施例６と同様にフックス角膜内皮ジストロフィの細胞は、ＴＧＦβ２によりアポトーシス陽性細胞が増大し、その増大は、ＳＢ４３１５４２によりキャンセルされた。さらに、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル阻害剤であるＡ−８３−０１、ＡＬＫ５阻害剤においてもアポトーシス細胞が抑制されることがわかった。【０１２２】
以上から、ＳＢ４３１５４２に限らず、ＴＧＦβシグナル阻害剤を用いることにより、角膜内皮の小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連する疾患、障害または状態、特にアポトーシスに関連する処置または予防を行うことができることが実証された。【０１２３】
（実施例９：抗ＩＧＦ−β２抗体およびＳｍａｄ阻害剤での実験）
実施例８と同様の実験を抗ＴＧＦ−β２抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ；ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：ＡＢ−１１２−ＮＡ）およびＳｍａｄ阻害剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ；ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：５５６４０５）を用いて実施することができる。【０１２４】
（実施例１０：フックス角膜内皮ジストロフィにおけるＴＧＦ−βによるＥＲストレス促進）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて、ＴＧＦ−βによりより強いＥＲストレス誘導が生じることを確認するために、実施例２と同様のウェスタンブロットを行い、分子シャペロンであるＧＲＰ７８、ＥＲストレス応答によるアポトーシスに関与するＣＨＯＰの発現を調べた。また、小胞体膜上のストレスシグナル伝達に関与するリン酸化ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６の発現も合わせて調べた。刺激は１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）にて行った。また、経時変化も合わせて調べた。【０１２５】
（材料および方法）
ウェスタンブロットは、実施例２の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例２のものに加え以下を用いた。
・ＰＥＲＫに対する抗体：（Ｄ１１Ａ８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・リン酸化ＰＥＲＫに対する抗体：（ｓｃ−３２５７７，ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
・ＡＴＦ６に対する抗体：（７３−５０５，Ｂｉｏ  Ａｃａｄｅｍｉａ）
・ＧＲＰ７８に対する抗体：（ＳＣ−３７６７６８，ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
・ＣＨＯＰに対する抗体：（Ｌ６３Ｆ７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・ＴＧＦ−β２：（３０２−Ｂ２−００２、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）【０１２６】
（結果）
結果を図９に示す。ＴＧＦ−βがＥＲストレスセンサーであるＰＥＲＫのリン酸化を促進し、ＡＴＦ６の発現を促進することが示された。また、シャペロンであるＧＲＰ７８の発現が上昇することが示された。これらのリン酸化の促進および発現の促進はｉＨＣＥＣに比べてｉＦＥＣＤにおいてより顕著に見られた。このように、ＴＧＦ−βはまた、ＥＲストレスマーカーを増大させたことが示された。さらにＣＨＯＰの発現が上昇し、ＥＲストレスによりアポトーシスが生じることが示された。また、３時間後でこの増大は見られ、６時間後にその増大効果は増強されることが示された。【０１２７】
（実施例１１：フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞におけるミトコンドリア機能不全の関与）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞においてミトコンドリア機能不全が関与していることを確認する実験を行った。【０１２８】
（方法）
本発明者らは、上述の調製例に記載されているように、ＦＥＣＤ患者のヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の不死化細胞モデル（ｉＦＥＣＤ）および正常ドナー角膜ＨＣＥＣ（ｉＨＣＥＣ）を樹立しており、これを本実施例で用いた。この実施例の目的は、細胞モデルを用いて、ＦＥＣＤのミトコンドリア機能不全の関与を調査することにある。【０１２９】
ミトコンドリアの形態変化を調べるために、ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣのミトコンドリア膜電位を、ＪＣ−１色素（ＢＤ  Ｎｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５１３０２）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍ−７５１２）によって評価した。
シトクロムＣのミトコンドリアから細胞質への放出は、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、８９８７４）でミトコンドリアの分画を行い、ウェスタンブロットによって評価した（Ａｎｔｉ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂｃａｍ、ａｂ１３５７５）。【０１３０】
ミトコンドリア機能不全のアポトーシスへの関与を評価するために、カスパーゼ９、カスパーゼ３およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ミトコンドリアストレス刺激剤のスタウロスポリン（ａｂｃａｍ、ａｂ１２００５６）で刺激したｉＨＣＥＣにおいてウェスタンブロットにより評価した。【０１３１】
（結果および考察）
図１０では、ミトコンドリア膜電位を蛍光プローブＪＣ−１色素を用いて評価した。緑色蛍光はミトコンドリアを示し、赤色蛍光はミトコンドリア膜電位を示すものであるが、赤色蛍光の欠如はミトコンドリア膜電位が脱極していることを示すものである。ｉＦＥＣＤの赤色蛍光はｉＨＣＥＣよりも弱かった。図１１では、フローサイトメトリーを用いてミトコンドリア膜電位を評価した。ＪＣ−１およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）での評価により、ミトコンドリア膜電位がｉＨＣＥＣよりもｉＦＥＣＤで低いことが判明した（それぞれ図１０および１１）。【０１３２】
ウェスタンブロットにより、ｉＨＣＥＣよりもｉＦＥＣＤにおいてミトコンドリア画分でのシトクロムＣのレベルがより高いことが観察された（図１２）。図１２では、ミトコンドリアからシトクロムＣの細胞質への漏出が認められることからフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞において、ミトコンドリア障害が生じていることが示される。【０１３３】
（実施例１２：ミトコンドリア障害とアポトーシスの関係）
本実施例では、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア障害が細胞障害を生じるかどうかについて、実施例２と同様のウェスタンブロットを行いアポトーシスに関連するタンパク質であるカスパーゼ９、カスパーゼ３およびＰＡＲＰの発現を調べた。ミトコンドリアの障害を誘導するためにスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）により刺激して経時的に変化を確認した。【０１３４】
（材料および方法）
ウェスタンブロットは、実施例２の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例２のものに加え以下を用いた。
・カスパーゼ９に対する抗体：（９５０８Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・カスパーゼ３に対する抗体：（９６６２Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・ＰＡＲＰに対する抗体：（９５４２Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・スタウロスポリン：（ａｂ１２００５６、ａｂｃａｍ）【０１３５】
（結果）
結果を図１３に示す。図１３では、ミトコンドリアストレス因子のスタウロスポリンにより刺激されたｉＨＣＥＣにおけるウェスタンブロットによりシグナルの下流を評価した結果を示す。スタウロスポリンでミトコンドリア障害を誘導することによりカスパーゼ９、カスパーゼ３およびＰＡＲＰが活性化された。電子顕微鏡による観察においてｉＨＣＥＣのミトコンドリアの形態は正常であったが、ｉＦＥＣＤでは拡張を認めた。ミトコンドリア膜電位が低下した細胞は、ｉＨＣＥＣで１１．７±１．７％であったのに対して、ｉＦＥＣＤでは４１．９±１０．２％と有意に増加した（ｐ＜０．０５）。また、シトクロムｃの細胞質への漏出は、ｉＨＣＥＣと比較してｉＦＥＣＤにおいて強く認められた。これらの結果から、ミトコンドリアストレスにより、シトクロムｃの漏出が引き起こされ、ミトコンドリア障害により活性化することが知られているカスパーゼ９の活性化を認め、さらにカスパーゼ３およびＰＡＲＰの活性化を認めることからミトコンドリア障害によりアポトーシスが誘導されることが理解される。以上から、ＦＥＣＤの病態にミトコンドリア障害が関与していると理解される。【０１３６】
以上から、本実施例により、ミトコンドリア機能不全は、ＦＥＣＤの病態に関与しており、強力な治療剤の標的として利用し得ると評価することができる。さらに多くの細胞種においてＥＲストレスがミトコンドリア障害を生じることが知られているために、ＥＲストレスの薬物による軽減はミトコンドリア障害を抑制し、フックス角膜内皮ジストロフィの治療に応用できることが理解される。【０１３７】
（実施例１３：フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質が亢進する）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質が亢進することを示す。【０１３８】
フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、折りたたみ不全タンパク質ともいう）が蓄積することを調べるために、変性タンパク質に応答して発現するアグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）の発現を測定することができる。変性タンパク質（あるいはミスフォールディングタンパク質）やタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質はユビキチン化され，微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し，アグリソームと呼ばれる封入体を形成することが知られている。【０１３９】
一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染，酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは，パーキンソン病の神経細胞に見られるＬｅｗｙ小体や，アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるＭａｌｌｏｒｙ小体，筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など，細胞内の封入体が関与する疾患等の関連が報告されている。【０１４０】
（材料および方法）
フローサイトメトリーによりフックス角膜内皮ジストロフィにアグリソームが蓄積していることを確認した。
（使用機器）
・  ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ａｇｇｒｅｓｏｍｅ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ：（ＥＺＮ−５１０３５−Ｋ１００，Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））
手短には以下のとおりに行った。
ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへ１×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約２間培養した。さらに、ＴＧＦβ２（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間インキュベートした。その後、ＡＣＣＵＭＡＸＴＭ（フナコシ）で細胞を剥離し、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ａｇｇｒｅｓｏｍｅ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ：（ＥＺＮ−５１０３５−Ｋ１００，Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））を使用してフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））でアグリソームを測定した。【０１４１】
（結果）
結果を図１４に示す。フックス角膜内皮ジストロフィの細胞（ｉＦＥＣＤ）はヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）に比べてアグリソームの蛍光強度が１．２２倍と有意に高かった。さらに、ＴＧＦ−β２刺激によりフックス角膜内皮ジストロフィではアグリソームが１．１１倍に増加し、著明な細胞死を認めた。
以上から、フックス角膜内皮ジストロフィでは変性タンパク質を細胞内に多く有し、ＴＧＦ−βシグナルによりその量が増加することが示された。変性タンパク質による小胞体ストレスがフックス角膜内皮ジストロフィ（ＦＥＣＤ）の病態に関わっている可能性があると理解される。【０１４２】
（実施例１３：フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が蓄積する）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が蓄積することを示す。【０１４３】
フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、変性タンパク質が蓄積することを調べるために、変性タンパク質に応答して発現するアグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）の発現を測定することができる。変性タンパク質（あるいはミスフォールディングタンパク質）やタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質はユビキチン化され，微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し，アグリソームと呼ばれる封入体を形成することが知られている。【０１４４】
一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染，酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは，パーキンソン病の神経細胞に見られるＬｅｗｙ小体や，アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるＭａｌｌｏｒｙ小体，筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など，細胞内の封入体が関与する疾患等の関連が報告されている。【０１４５】
（材料および方法）
培養したヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞（ｉＦＥＣＤ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約３日間培養する。ＡＣＣＵＭＡＸＴＭ（フナコシ）で細胞を剥離し、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ａｇｇｒｅｓｏｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＺＮ−５１０３５−Ｋ１００，Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））を使用してアグリソームを染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）により測定する。【０１４６】
（結果）
ｉＨＣＥＣと比較してｉＦＥＣＤにおいてアグリソームの発現量が高くなる。このことはフックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、変性タンパク質が蓄積していることを示すものと解釈できる。
アグリソームおよび変性タンパク質の結果から、ＴＧＦ−βシグナルについて、アグリソームおよび変性タンパク質による小胞体ストレスがフックス角膜内皮ジストロフィへの関与が示される。【０１４７】
（実施例１５：アグリソームを指標とした診断）
本実施例では、アグリソームを指標とした診断が可能であることを実証する。アグリソームの測定は、実施例１３−１４等の記載をもとに実施することができる。
前房内にアグリソームを染色できる色素を注入するなどの方法により、角膜内皮細胞のアグリソームの沈着を評価することで診断に用いることが可能である。【０１４８】
（実施例１６：点眼剤の調製例）
点眼剤の調製例
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。【０１４９】
ＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社等から入手可能）  ０．１から３０ｍＭ、望ましくは１から１０ｍＭ
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。【０１５０】
点眼剤は、基剤で希釈することも出来る。【０１５１】
基材の組成は以下のとおり。【０１５２】
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。【０１５３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許出願２０１３−２２７０４８および２０１４−１８４１７２に対して優先権主張をするものであり、本明細書においてその内容は全体が参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
ＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮のＥＲストレスに関連する疾患、障害または状態、特に、フックス角膜内皮ジストロフィのＥＲストレス、アポトーシスに関連する疾患、障害または状態の治療または予防薬に関する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図７】
2015064768.tif 000003
【図８】
2015064768.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015064768.tif 000009
【図６】
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【図９】
2015064768.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2015064768.tif 000014
【図１３】
2015064768.tif 000015
【図１４】
2015064768.tif 000016
【国際調査報告】
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2015064768.tif 000018
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