(57)【要約】  多価アミンに由来する基を介した架橋構造を有するコンドロイチン硫酸誘導体を提供する。また、同コンドロイチン硫酸誘導体を含有する組成物を提供する。また、角膜上皮障害及び／又はドライアイに対して治療効果を有する眼疾患処置剤及び処置方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋基を介した架橋構造をコンドロイチン硫酸の構成二糖単位間に有するコンドロイチン硫酸誘導体を有効成分として含有する眼疾患処置剤。
【請求項２】
前記架橋基が、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンからなる群より選択される少なくとも１種に由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項３】
前記架橋基が、多価アミンに由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項４】
前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、請求項３に記載の眼疾患処置剤。
【請求項５】
前記多価アミンが、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン、１，１２−ジアミノドデカン、スペルミジン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３又は４に記載の眼疾患処置剤。
【請求項６】
前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はコンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項７】
前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜２０の炭化水素基である、請求項６に記載の眼疾患処置剤。
【請求項８】
点眼剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項９】
前記眼疾患が角膜上皮障害である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項１０】
前記眼疾患がドライアイである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項１１】
多価アミンに由来する基を介した架橋構造をコンドロイチン硫酸の構成二糖単位間に有するコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１２】
前記多価アミンが、主鎖上に生分解点及びジスルフィド結合を有しない多価アミンである、請求項１１に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１３】
前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、請求項１１に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１４】
前記多価アミンが、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン、１，１２−ジアミノドデカン、スペルミジン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１５】
前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１６】
前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜２０の脂肪族炭化水素基である、請求項１５に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸誘導体、及び薬学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項１８】
水溶液である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸誘導体を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸架橋体、並びにこれを含有する組成物、及び眼疾患処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ドライアイ」は、国際的な組織であるDry Eye WorkShop(DEWS)により、「涙液と眼表面の多因子的な疾患であり、その結果として眼表面の潜在的な障害とともに、不快感、視覚障害、涙液層の不安定性などの症状を生じる。それは涙液層の浸透圧の上昇と眼表面の炎症を伴う」と定義されている（The Ocular Surface Vol.5, No.2:75-92, 2007）。【０００３】
日本において、コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」ともいう。）を含有する点眼剤（コンドロン（登録商標））が知られており、その効能・効果は「角膜表層の保護」である。角膜上皮に対するＣＳの作用に関する研究報告（Tsutomu Fujiharaら、Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, Vol.11, No.4:503-508, 1995）では、角膜上皮障害の予防を検討している。Teruo Nishidaら、 Experimental Eye Research, 53:753-758, 1991では、ＣＳが角膜上皮細胞に与える作用の有無について検証されている。また、最近の文献であるGary D. Novack, The Ocular Surface, Vol.12, No.3:227-230, 2014では、日本や米国のドライアイ治療薬が種々挙げられている。【０００４】
一方、架橋基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体（以下、「ＣＳ架橋体」ともいう。）（国際公開第９１／１６８８１号パンフレット、特開平６−７３１０２号公報、Amnon Sintovら、Biomaterials, 16:473-478, 1995）のうち、１,１２−ジアミノドデカンを架橋剤として用いてＣＳ誘導体の製造を試みたRubinsteinらの報告がある（国際公開第９１／１６８８１号パンフレット、Amnon Sintovら、Biomaterials, 16:473-478, 1995）。ＣＳ分野では、ＣＳの水に溶けやすい性質を水に溶けにくいものに変化させ、膜や錠剤などの形態とするために架橋が用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９１／１６８８１号パンフレット
【特許文献２】特開平６−７３１０２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】The Ocular Surface Vol.5, No.2:75-92, 2007
【非特許文献２】Tsutomu Fujiharaら、Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, Vol.11, No.4:503-508, 1995
【非特許文献３】Teruo Nishidaら、 Experimental Eye Research, 53:753-758, 1991
【非特許文献４】Gary D. Novack, The Ocular Surface, Vol.12, No.3:227-230, 2014
【非特許文献５】Amnon Sintovら、Biomaterials, 16:473-478, 1995
【非特許文献６】C. Bourieら、Journal of Biomaterials Applications, Vol.12:201-221, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, Vol.11, No.4:503-508, 1995では、既に発症した角膜上皮障害に対する処置は開示されていない。Experimental Eye Research, 53:753-758, 1991には、ＣＳが角膜上皮細胞の伸展作用を有しないことが示されている。また、The Ocular Surface, Vol.12, No.3:227-230, 2014では、ＣＳを有効成分とする治療薬の記載は一切ない。
また、国際公開第９１／１６８８１号パンフレット又はBiomaterials, 16:473-478, 1995記載の製造方法を再現し種々の分析法を用いても、結局ＣＳの架橋は確認されず（C. Bourieら、Journal of Biomaterials Applications, Vol.12:201-221, 1998）、実際はＣＳ架橋体が得られないことが明らかとなった。
そこで本発明は、多価アミンに由来する基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体を提供することを課題とする。また、同ＣＳ誘導体を含有する組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、角膜上皮障害及び／又はドライアイに対して治療効果を有する眼疾患処置剤及び処置方法を提供することを課題とする。本発明は、少なくともこれらの一つ以上の課題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、多価アミンに由来する基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体を初めて製造し、本発明を完成した。また、ＣＳの架橋はＣＳを難溶性にするために用いられるというこれまでの知見に反して、ＣＳ架橋体を含有する組成物が、意外にも溶液状で用いることができ、また、角膜上皮障害及び／又はドライアイに対して優れた治療効果を発揮することを見出し、本発明を完成した。【０００９】
本発明は以下の態様を包含する。
［Ａ１］架橋基を介した架橋構造をコンドロイチン硫酸の構成二糖単位間に有する、コンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ２］前記架橋基が、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンからなる群より選択される少なくとも１種に由来する基である、［Ａ１］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ３］前記架橋基が多価アミンに由来する基である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ４］前記多価アミンが、主鎖上に生分解点を有しない多価アミンである、［Ａ３］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ５］前記多価アミンが、主鎖上にジスルフィド結合を有しない多価アミンである、［Ａ３］又は［Ａ４］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ６］前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の炭素数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、［Ａ３］〜［Ａ５］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ７］前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、［Ａ３］〜［Ａ５］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ８］前記多価アミンが脂肪族多価アミンである、［Ａ３］〜［Ａ７］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ９］前記多価アミンがジアミンである、［Ａ３］〜［Ａ８］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１０］前記多価アミンが、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン、１，１２−ジアミノドデカン、スペルミジン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である、［Ａ３］〜［Ａ７］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１１］前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はコンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される、［Ａ１］〜［Ａ１０］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１２］一般式（Ｉ）において、
Ｒが、主鎖上に生分解点を有しない、［Ａ１１］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１３］一般式（Ｉ）において、
Ｒが、主鎖上にジスルフィド結合を有しない、［Ａ１１］又は［Ａ１２］に記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１４］一般式（Ｉ）において、
Ｒが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
ヘテロ原子を有する場合のヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択される１〜３個の原子であり、
置換の場合の置換基は、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアミノアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、炭素数１〜３のアルキルエステル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、アミノ基、ホルミル基、ヒドロキシ基、及びカルボキシ基からなる群から選択される少なくとも１種である、［Ａ１１］〜［Ａ１３］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１５］前記炭化水素基が、主鎖の炭素数が１〜２０の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１６］前記炭化水素基が、主鎖の炭素数が１〜１０の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１７］前記炭化水素基が、主鎖の炭素数が１〜８の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１８］前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜２０の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ１９］前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜１１の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ２０］前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜８の炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ１４］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ２１］前記炭化水素基が、脂肪族炭化水素基である、［Ａ１１］〜［Ａ２０］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ２２］水溶性である、［Ａ１］〜［Ａ２１］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体。
［Ａ２３］［Ａ１］〜［Ａ２２］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体、及び薬学的に許容される担体を含有する組成物。
［Ａ２４］水溶液である、［Ａ２３］に記載の組成物。
［Ａ２５］２５℃の条件下、多孔質フィルター（孔径５．０μｍ、直径２５ｍｍ）を通過させたときのフィルター通過率が８０％以上である［Ａ２３］又は［Ａ２４］に記載の組成物。
［Ａ２６］粘度が、５〜１１，０００ｍＰａ・ｓである［Ａ２３］〜［Ａ２５］のいずれかに記載の組成物。
［Ａ２７］前記コンドロイチン硫酸誘導体の濃度が、組成物の総量に対し、０．１〜１５重量％である、［Ａ２３］〜［Ａ２６］のいずれかに記載の組成物。
［Ａ２８］［Ａ１］〜［Ａ２２］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体を含有する医薬。
［Ａ２９］眼疾患処置剤である、［Ａ２３］〜［Ａ２７］のいずれかに記載の組成物。
［Ａ３０］角膜上皮障害処置剤である、［Ａ２３］〜［Ａ２７］のいずれかに記載の組成物。
［Ａ３１］ドライアイ処置剤である、［Ａ２３］〜［Ａ２７］のいずれかに記載の組成物。
［Ｂ１］［Ａ１］〜［Ａ２２］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸誘導体を有効成分として含有する、眼疾患処置剤。
［Ｂ２］点眼剤である、［Ｂ１］に記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ３］水性点眼剤である、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ４］水溶液である、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ５］２５℃の条件下、多孔質フィルター（孔径５．０μｍ、直径２５ｍｍ）を通過させたときのフィルター通過率が８０％以上である［Ｂ１］〜［Ｂ４］のいずれかに記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ６］前記眼疾患が角膜上皮障害である、［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれかに記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ７］前記眼疾患がドライアイである、［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれかに記載の眼疾患処置剤。
［Ｂ８］前記処置が治療である、［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれかに記載の眼疾患処置剤。
［Ｃ１］［Ａ２３］〜［Ａ２７］のいずれかに記載の組成物を眼に投与することを含む、眼疾患処置方法。
［Ｃ２］眼への投与方法が点眼である、［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］前記組成物が水性点眼剤である、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］前記組成物が水溶液である、［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ５］前記組成物が、２５℃の条件下、多孔質フィルター（孔径５．０μｍ、直径２５ｍｍ）を通過させたときのフィルター通過率が８０％以上である、［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ６］前記眼疾患が角膜上皮障害である、［Ｃ１］〜［Ｃ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ７］前記眼疾患がドライアイである、［Ｃ１］〜［Ｃ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ８］前記処置が治療である、［Ｃ１］〜［Ｃ７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一態様によれば、多価アミンに由来する基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体を提供できる。また、本発明の別の態様によれば、前記ＣＳ架橋体を含有する組成物を提供できる。また、本発明の別の態様によれば、角膜上皮障害及び／又はドライアイに対して治療効果を有する眼疾患処置剤を提供できる。本発明の別の態様によれば、眼疾患処置方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化液のHPLCチャートを示す。
【図２】多段階質量分析の結果の一例を示す。
【図３】多段階質量分析の結果の一例を示す。
【図４】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図５】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図６】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図７】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図８】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図９】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【図１０】モデル動物に１日２回点眼した場合のフルオレセイン染色の程度の平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
初めに、本明細書において使用する用語を以下のように定義する。「コンドロイチン硫酸」（「ＣＳ」ともいう。）とは、コンドロイチン硫酸又はその塩のことを意味する。「コンドロイチン硫酸架橋体」（「ＣＳ架橋体」ともいう。）とは、架橋基を介した架橋構造をＣＳの構成二糖単位間に有するＣＳ誘導体又はその塩のことを意味する。同架橋構造は、同一のＣＳ分子内、及び／又は異なるＣＳ分子間に存在してよい。
【００１３】
本明細書において、「置換」とは、化合物中の１又は２以上の水素原子が、他の原子又は原子団で置き換わることを意味する。この際に、水素原子の代わりに導入された原子又は原子団を「置換基」という。「ヘテロ原子」とは、化合物中に含まれる炭素及び水素以外の原子を意味し、例えば、窒素、酸素、硫黄等が挙げられる。「ヘテロ原子を有する」とは、別に記載のない限り、１又は２種以上のヘテロ原子を、それぞれ１又は２個以上有することを意味する。「鎖上にヘテロ原子を有する」とは、鎖を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられていることを意味する。「炭素鎖」とは、場合により分岐を有してよく、また、鎖上にヘテロ原子を有してよい、主に炭素で構成される原子鎖を意味する。「反応性官能基」とは、コンドロイチン硫酸が有する官能基と反応する性能を有する官能基を意味する。「主鎖」とは、別に記載のない限り、２個の反応性官能基の間を結ぶ直鎖の炭素鎖を意味する。反応性官能基が３個以上ある場合は、反応性官能基の間を結ぶ炭素鎖のうち、最長の炭素鎖を主鎖とする。炭素鎖が分岐を有する場合は、別に記載のない限り、分岐を構成する炭素鎖は主鎖に含まない。主鎖は、反応性官能基に直接結合している位置を除き１又は２個以上のヘテロ原子を有してもよい。反応性官能基の間を結ぶ炭素鎖中に環状構造が存する場合は、当該環状構造を、少なくとも１つの分岐を有し、かつ分岐した炭素鎖の少なくとも２つが終点となる原子を共有する構造とみなして、各分岐鎖のうち最長のものを主鎖とする。本明細書において「主鎖の原子数」は、主鎖を構成する原子の数を意味し、主鎖上にヘテロ原子を有する場合は、同ヘテロ原子を含めた原子の数を指すものとする。本明細書において、多価アミン、又は多価アミンに由来する基における「主鎖」とは、反応性官能基である２個の一級アミノ基の間を結ぶ直鎖の炭素鎖を意味する。
【００１４】
本明細書において、「炭化水素」とは、炭素及び水素を有する基や化合物等をいい、別に記載のない限り、ヘテロ原子、及び／又は置換基を有してもよい。また、「炭化水素」は、直鎖であっても、分岐を有してもよい。「脂肪族」とは、芳香族性を持たない基や化合物等を意味する。「環式」とは、分子内に環状構造を有する基や化合物等を意味する。「非環式」とは、分子内に環状構造を有しない基や化合物等を意味する。「アルキル基」とは、１価の直鎖又は分岐の飽和脂肪族炭化水素基をいい、「アルキレン基」とは、２価の直鎖又は分岐の飽和脂肪族炭化水素基をいう。「アルケニレン基」とは、少なくとも１つの二重結合を有する、２価の直鎖又は分岐の不飽和脂肪族炭化水素基をいう。「アルキニレン基」とは、少なくとも１つの三重結合を有する、２価の直鎖又は分岐の不飽和脂肪族炭化水素基をいう。「アリール基」とは、１価の単環式又は多環式の芳香族炭化水素基をいう。「アリーレン基」とは、２価の単環式又は多環式の芳香族炭化水素基をいう。「アリールアルキレン基」とは、アリール基の水素原子１個がアルキレン基で置換された２価の基、又は芳香環の水素原子２個がアルキレン基で置換された２価の基をいう。「シクロアルキル基」とは、１価の環式脂肪族炭化水素基をいう。「シクロアルキレン基」とは、２価の環式脂肪族炭化水素基をいう。「シクロアルキルアルキレン基」とは、シクロアルキル基の水素原子１個がアルキレン基で置換された２価の基、又はシクロアルカンの水素原子２個がアルキレン基で置換された２価の基をいう。「アミノアルキル基」とは、アルキル基にアミノ基が置換した基をいう。「ヒドロキシアルキル基」とは、アルキル基にヒドロキシ基が置換した基をいう。
本明細書において「多価アミン」とは一級アミノ基（−ＮＨ２）を２個以上有するアミンを意味する。また、本明細書において、「ジアミン」は一級アミノ基を２個、「トリアミン」は一級アミノ基を３個有するアミンを意味する。
本明細書において「脂肪族多価アミン」とは、脂肪族炭化水素の２以上の水素原子が一級アミノ基で置換された多価アミンを意味する。「芳香族多価アミン」とは、芳香族炭化水素の２以上の水素原子が一級アミノ基又はアミノアルキル基で置換された多価アミンを意味する。
【００１５】
本明細書において、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１６】
以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。本発明は、これらの実施形態によって限定されるものではない。
＜ＣＳ架橋体＞
本発明における「ＣＳ架橋体」は、ＣＳの構成二糖単位間に、架橋基を介した架橋構造を有しており、前記架橋構造は、同一のＣＳ分子内、及び／又は異なるＣＳ分子間で形成されていてよい。前記ＣＳ架橋体の原料に用いられるＣＳは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの二糖構造の繰り返しを基本骨格とし、主に構成糖のヒドロキシ基の一部が硫酸化されたグリコサミノグリカンである限りにおいて特に限定されない。また、このＣＳ架橋体、及びその原料に用いるＣＳは、塩を形成しない遊離状態であっても、薬学的に許容される塩を形成していてもよい。
【００１７】
前記の薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩等が挙げられる。本発明におけるＣＳ架橋体は、生体への適用性及び親和性の観点から、薬学的に許容されるアルカリ金属イオンとの塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
本発明におけるＣＳ架橋体、及びその原料に用いられるＣＳは、水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００１８】
ＣＳ架橋体の原料に用いられるＣＳの種類は特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸Ｃ（以下、「ＣＳＣ」ともいう。）が挙げられる。ＣＳ架橋体の原料に用いられるＣＳの由来等は特に限定されず、天然物由来、化学的に合成したもの等のいずれをも用いることができる。例えば天然物からＣＳを取得する場合には、所望のＣＳの種類等に応じて、原料とすべき天然物を適宜選択することができる。また、天然物由来物質を化学合成手法により適宜修飾して、目的とするＣＳを得てもよい。
【００１９】
ＣＳ架橋体の原料に用いられるＣＳの重量平均分子量は特に限定されないが、１０，０００〜１００，０００であることが好ましく、１０，０００〜８０，０００であることがより好ましく、１０，０００〜６０，０００であることが更に好ましく、１５，０００〜４５，０００であることが特に好ましい。ＣＳの重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー、又は光散乱法を用いた常法により測定できる。
このようなＣＳに架橋剤を共有結合させることにより、ＣＳ架橋体を製造することができる。
【００２０】
＜架橋基＞
本発明において、「架橋基」とは、ＣＳが有する基と共有結合しうる基を２個以上有する化合物に由来する基をいう。このような化合物としては、アミノ基、エポキシ基、ビニル基、及びハロアルキル基からなる群より選択される少なくとも１種の基を２個以上有するものであることが好ましい。本発明におけるＣＳ架橋体は、これらの基により架橋が形成されていることが好ましい。また、ＣＳが有する基と共有結合しうる基を２個以上有する化合物としては、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることがより好ましい。
【００２１】
本発明における架橋基が有する炭素の数、並びに、本発明の多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンの炭素数は、特に限定されないが、１〜２０、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、４〜１２、４〜１０、４〜８が例示される。
【００２２】
アミノ基はＣＳのカルボキシ基とアミド結合を形成しうる。エポキシ基、ビニル基、及びハロアルキル基は、ＣＳのヒドロキシ基とエーテル結合を形成しうる。ＣＳは構成二糖単位中にただ１つのみのカルボキシ基を有するので、ＣＳ架橋体の構造の多様性を低減させるためには、架橋基はアミノ基に由来する基を有することが好ましく、多価アミンに由来する基であることが特に好ましい。多価アミンとしては、一級アミノ基（−ＮＨ２）を２個以上有していれば特に限定されないが、例えば、トリアミン、ジアミン等が挙げられ、ＣＳ架橋体の構造の多様性低減の点から、ジアミンが好ましい。
【００２３】
本発明における多価アミンは、生体中で分解可能な結合、すなわち生分解点を有しない多価アミンであってよい。本発明における多価アミンは、分子内の主鎖上に生分解点を有しない多価アミンであってよい。本明細書では、「生分解点」とは、以下の一般式（ＩＩ）；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｄ−   （ＩＩ）
（Ｄは、酸素原子、又は硫黄原子を表す）
で示される構造を意味する。すなわち、生分解点としては、エステル結合又はチオエステル結合が挙げられる。よって、本発明における多価アミンは、分子内の主鎖上にエステル結合及びチオエステル結合を有しない多価アミンであってよい。
【００２４】
本発明における多価アミンは、ジスルフィド結合を有しない多価アミンであってよい。また、同多価アミンは、その主鎖上にジスルフィド結合を有しない多価アミンであってよい。
【００２５】
本発明における多価アミンとしては、例えば、脂肪族多価アミン、及び芳香族多価アミンが挙げられ、このうち脂肪族多価アミンが好ましい。脂肪族多価アミンは、非環式脂肪族多価アミン、又は環式脂肪族多価アミンのいずれであってもよいが、非環式脂肪族多価アミンが好ましい。脂肪族多価アミンは、飽和脂肪族多価アミン、又は不飽和脂肪族多価アミンのいずれであってもよい。すなわち、脂肪族多価アミンは、非環式飽和脂肪族多価アミン、非環式不飽和脂肪族多価アミン、環式飽和脂肪族多価アミン、又は環式不飽和脂肪族多価アミンのいずれであってもよいが、このうち、非環式飽和脂肪族多価アミンが好ましい。また、生体成分と同一物質又はその誘導体を多価アミンとしてよく、例えば、多価アミンは塩基性アミノ酸又はその誘導体であってもよい。
【００２６】
本発明における多価アミンとしては、例えば、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の、脂肪族多価アミン、芳香族多価アミン等が挙げられる。
本発明における置換基としては、例えば、アルキル基、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエステル基、アルコキシ基、アミノ基、ホルミル基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルボニル基等が挙げられるが、アミノアルキル基等の反応性官能基を含む基が置換基となるときは、当該置換基が主鎖を構成しないように置換しているものとする。このうち、アルキル基、アミノアルキル基、アルキルエステル基、又はヒドロキシ基が好ましい。アルキル基、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエステル基、及びアルコキシ基の炭素数はそれぞれ独立して１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。アルキル基としては、炭素数１〜３のアルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、又はプロピル基が好ましい。アミノアルキル基としては、アミノメチル基、アミノエチル基、又はアミノプロピル基が好ましい。アルキルエステル基としては、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、ブチルエステル基が例示され、このうち、メチルエステル基、又はエチルエステル基が好ましい。置換基を有する場合、置換基の数は特に限定されないが、置換可能な位置に１〜５個有していてよく、１〜３個が好ましい。置換基が２個以上の場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
本発明におけるヘテロ原子としては、例えば、窒素、酸素、硫黄等が挙げられる。主鎖上にヘテロ原子を有する場合、同ヘテロ原子の数は特に限定されないが、１〜５個、又は１〜３個が例示される。ヘテロ原子を２個以上有する場合、各ヘテロ原子は同一でも異なっていてもよい。主鎖上にヘテロ原子を２個以上有する場合、これらヘテロ原子同士が直接結合しないように位置してもよい。主鎖上にヘテロ原子を有する場合、反応性官能基、特に一級アミノ基と直接結合している位置以外にヘテロ原子を有してよい。
【００２７】
本発明における多価アミンの主鎖の炭素数は、１以上、又は２以上が例示され、２０以下、１２以下、１０以下、８以下、６以下、又は４以下が例示される。前記炭素数は例えば、１〜２０、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、２〜２０、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２が挙げられる。架橋反応効率の点からは、多価アミンの主鎖の炭素数は、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が特に好ましい。また、薬効の点からは、多価アミンの主鎖の炭素数は、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６がより好ましく、２〜５がより好ましく、２〜４がより好ましい。
【００２８】
本発明における多価アミンの主鎖の原子数は、１以上、又は２以上が例示され、２０以下、１２以下、１１以下、１０以下、８以下、６以下、又は４以下が例示される。前記原子数は例えば、１〜２０、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、２〜２０、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２が挙げられる。架橋反応効率の点からは、多価アミンの主鎖の原子数は、１〜１１が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が特に好ましい。また、薬効の点からは、多価アミンの主鎖の原子数は、１〜１１が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６がより好ましく、２〜５がより好ましく、２〜４がより好ましい。
【００２９】
本発明における多価アミンは、トリアミン、又はジアミンであることが好ましく、ジアミンであることがより好ましい。
本発明における多価アミンは、脂肪族ジアミン又は芳香族ジアミンが好ましく、脂肪族ジアミンがより好ましい。脂肪族ジアミンとしては、非環式脂肪族ジアミン又は環式脂肪族ジアミンが例示され、なかでも非環式脂肪族ジアミンが好ましい。環式脂肪族ジアミンとしては、シクロアルキレンジアミン、及びビス（アミノアルキル）シクロアルカンなどが例示され、非環式脂肪族ジアミンとしては、アルキレンジアミン、アルケニレンジアミン、及びアルキニレンジアミンが例示される。このうち、アルキレンジアミン又はアルケニレンジアミンが好ましく、アルキレンジアミンが特に好ましい。芳香族ジアミンとしては、例えば、アリーレンジアミン、及びビス（アミノアルキル）ベンゼンなどが挙げられる。
【００３０】
本発明における多価アミンの具体例としては、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン（プトレシン）、１，５−ジアミノペンタン（カダベリン）、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，２−エタンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン（スペルミジン）、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン（スペルミン）等のアルキレンジアミン、プロパン−１，２，３−トリアミン、ペンタン−１，３，５−トリアミン、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン等のトリアミン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、及びこれらの塩が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を併せて使用できる。
【００３１】
本発明における多価エポキシ化合物は、エポキシ基を２個以上有していれば、特に限定されない。ジエポキシ化合物としては、例えば、ジグリシジル化合物が挙げられる。
本発明における多価ビニル化合物としては、ビニル基を２個以上有していれば、特に限定されない。ジビニル化合物としては、例えば、ジビニルスルホンが挙げられる。
本発明におけるエピハロヒドリンとしては、例えば、エピクロロヒドリンが挙げられる。
【００３２】
＜架橋構造＞
本発明において、「架橋構造」とは、同一の又は異なるＣＳ分子を、架橋基を介して、共有結合により結びつけている構造のことを意味する。
本発明において、架橋基が多価アミンに由来する基である場合、本発明のＣＳ架橋体は、以下の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ  （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はコンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される架橋構造を有してよい。
【００３３】
また、本発明において、架橋基が多価アミンに由来する基である場合、本発明のＣＳ架橋体は、以下の一般式（ＩＩＩ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２   （ＩＩＩ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−、Ｒ、−ＣＯ−ＮＨ−は、先に式（Ｉ）で定義されたとおりである）
で示される構造、すなわち、多価アミンのアミノ基のうち１つがＣＳと共有結合した構造を有してよい。
【００３４】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）において、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−、及び−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２は、多価アミンに由来する基であるため、前記の＜架橋基＞の項目の本発明における多価アミンに関する説明における記述、例示、及び好ましい範囲がそのまま適用できる。
【００３５】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基であってよい。ここでいう炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、又は芳香族炭化水素基であってよいが、脂肪族炭化水素基が好ましい。脂肪族炭化水素基は、非環式脂肪族炭化水素基、又は環式脂肪族炭化水素基のいずれであってもよいが、非環式脂肪族炭化水素基が好ましい。脂肪族炭化水素基は、飽和脂肪族炭化水素基、又は不飽和脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。すなわち、脂肪族炭化水素基は、非環式飽和脂肪族炭化水素基、非環式不飽和脂肪族炭化水素基、環式飽和脂肪族炭化水素基、又は環式不飽和脂肪族炭化水素基のいずれであってもよいが、なかでも非環式飽和脂肪族炭化水素基が好ましい。非環式脂肪族炭化水素基としては、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基が例示され、なかでもアルキレン基、又はアルケニレン基が好ましく、アルキレン基がより好ましい。環式脂肪族炭化水素基としては、シクロアルキレン基、及びシクロアルキルアルキレン基が例示される。芳香族炭化水素基としては、アリーレン基、及びアリールアルキレン基が例示される。一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲは、主鎖上にヘテロ原子を有しない無置換の炭化水素基以外の炭化水素基であってもよい。
本発明における置換基、ヘテロ原子としては、前記の＜架橋基＞の項目の本発明における多価アミンに関する説明における記述、例示、及び好ましい範囲がそのまま適用できる。
【００３６】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲは、生分解点を有しない炭化水素基であってよい。同Ｒは、主鎖上に生分解点を有しない炭化水素基であってよい。生分解点としては、例えば、エステル結合又はチオエステル結合が挙げられる。すなわち、Ｒは、主鎖上にエステル結合及びチオエステル結合を有しない炭化水素基であってよい。
【００３７】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲは、ジスルフィド結合を有しない炭化水素基であってよい。同Ｒは、その主鎖上にジスルフィド結合を有しない炭化水素基であってよい。同Ｒは、その主鎖上にヘテロ原子を２個以上有する場合、これらヘテロ原子同士が直接結合しないように位置してもよい。一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲは、その両端の原子、すなわち窒素原子と結合している原子が炭素原子であってよい。
【００３８】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲの主鎖の炭素数及び原子数は、前記の＜架橋基＞の項目の本発明における多価アミンの主鎖の炭素数及び原子数に関する記述、例示、及び好ましい範囲がそのまま適用できる。
【００３９】
本発明のＣＳ架橋体の一つの実施形態では、一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲが、−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｒ１−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である。ここでＲ１は酸素原子、硫黄原子、又は−ＮＨのいずれかを表し、ｎが２以上のときは、各Ｒ１は同じであっても異なっていてもよい。また、ｎは１〜５、又は１〜３の整数を表す。
【００４０】
本発明のＣＳ架橋体の一つの実施形態では、一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲが、−（ＣＨ２）ｌ−（ＣＲ２Ｒ３）−（ＣＨ２）ｍ−である。ここでＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、炭素数１〜３のアルキル基、アルキルエステル基、又はアミノアルキル基であり、ｌは１〜５の整数であり、ｍは０〜５の整数である。さらなる実施形態では、Ｒは前記式−（ＣＨ２）ｌ−（ＣＲ２Ｒ３）−（ＣＨ２）ｍ−で表され、ここでＲ２、Ｒ３、ｌ及びｍは先に定義したとおりであり、Ｒ２が水素原子の場合には、Ｒ３は水素原子でない。別のさらなる実施形態では、Ｒは前記式−（ＣＨ２）ｌ−（ＣＲ２Ｒ３）−（ＣＨ２）ｍ−で表され、ここでＲ２、Ｒ３及びｌは先に定義したとおりであり、ｍは１〜５の整数であり、Ｒ２が水素原子の場合には、Ｒ３は水素原子でない。
【００４１】
本発明のＣＳ架橋体の一つの実施形態では、一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲが、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｑ−である。ここでｐ及びｑはそれぞれ独立して、０〜３、又は１〜２の整数である。
【００４２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）におけるＲの具体例としては、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）4−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）９−、−（ＣＨ２）１０−、−（ＣＨ２）１１−、−（ＣＨ２）１２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｐｈ−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＮＨ２）（ＣＨ３）ＣＨ２−、−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）−、及び−（ＣＨ２）３−ＣＨ（ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）−が挙げられる（ここで、Ｘは１，４−シクロヘキシレン基を、Ｐｈは１，４−フェニレン基を表す）。
【００４３】
また、架橋基として多価アミンに由来する基を選択する場合、ＣＳにおけるカルボキシ基のすべてが、架橋基とアミド結合している必要はなく、その一部がアミド結合していてもよい。
【００４４】
本発明のＣＳ架橋体の一実施形態として、以下が挙げられる。
多価アミンに由来する基を介した架橋構造をＣＳの構成二糖単位間に有するＣＳ誘導体であって、前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、ＣＳ分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるＣＳ分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜１１の、置換又は無置換の脂肪族炭化水素基を表し、ヘテロ原子を有する場合のヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択される１〜３個の原子であり、置換の場合の置換基は、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアミノアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、炭素数１〜３のアルキルエステル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、アミノ基、ホルミル基、ヒドロキシ基、及びカルボキシ基からなる群から選択される少なくとも１種であり、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はＣＳの構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示されるものである、ＣＳ誘導体。ここで、この実施形態におけるＣＳ架橋体は、一般式（Ｉ）中のＲが、主鎖上に生分解点及び／又はジスルフィド結合を有しない炭化水素基であってよい。
【００４５】
＜ＣＳ架橋体の製造方法＞
本発明におけるＣＳ架橋体は、ＣＳが有する２つの官能基と架橋剤が有する２つの反応性官能基を、通常用いられる方法によって共有結合させることにより製造することができる。ＣＳが有する２つの官能基は、同一のＣＳ分子の基でも、異なるＣＳ分子の基でもよい。架橋剤としては、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、エピハロヒドリン等の多官能性架橋剤を使用することができ、前記＜架橋基＞の項目におけるそれぞれの例示や好ましい範囲がそのまま適用できる。
【００４６】
ＣＳと架橋剤を反応させる際の溶媒中のＣＳの濃度は、２〜２０重量％（以下、「ｗｔ％」ともいう。）が好ましく、２〜１５重量％がより好ましく、３〜１５重量％が特に好ましい。
【００４７】
架橋反応時の溶媒としては、ＣＳ及び架橋剤が溶解する溶媒であれば特に限定されないが、水、及び水混和性有機溶媒の混合溶媒が好ましい。水混和性有機溶媒は、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、第三級ブタノールなどの低級アルコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類、アセトン、１，４−ジオキサン、テドラヒドロフラン、アセトニトリルが挙げられる。これらの中でも、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンが好ましい。これらの水混和性有機溶媒は、水に対して単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４８】
架橋反応時間は、特に限定されるものではないが、１〜４８時間、１〜２４時間、２〜２０時間、終夜等が例示される。本明細書において、「終夜」とは１０〜２４時間を意味する。なお、１０％炭酸ナトリウム水溶液を添加すること等により、架橋反応の途中で反応を停止してもよい。架橋反応時の温度は、特に限定されず、使用する溶媒により適宜選択されるが、５〜６０℃が好ましく、１５〜３０℃がより好ましい。
【００４９】
架橋反応の後に、適宜、アルカリによる処理工程を加えることができる。架橋反応後の反応液をアルカリ性にするアルカリ処理は、該反応液がアルカリ性となる処理である限り特に限定されない。具体的には、アルカリ処理には無機塩基を使用することが好ましく、なかでも、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、又は炭酸ナトリウムを使用することが好ましい。アルカリ処理のｐＨ条件としては、７．２〜１１、好ましくは７．５〜１０が例示される。アルカリによる処理時間は、特に限定されるものではないが、２〜１２時間、好ましくは２〜６時間が例示される。アルカリ処理の際の温度は、５〜６０℃が好ましく、１５〜３０℃がより好ましい。
【００５０】
架橋反応後、又は上記のアルカリによる処理工程後のＣＳ架橋体を含む反応液を、１）撹拌工程、２）沈殿工程、３）洗浄工程、４）乾燥工程を経由させることで、最終的に乾燥粉末状態のＣＳ架橋体が得られる。
撹拌工程、沈殿工程、洗浄工程、及び乾燥工程は、当業者にとって一般的に行われる方法で行うことができ、特に限定されない。
【００５１】
＜多価アミンを架橋剤として用いた、ＣＳの架橋方法＞
架橋剤として多価アミンを使用する場合、ＣＳのカルボキシ基と架橋剤のアミノ基を、通常用いられるアミド化方法によって共有結合させることにより架橋することができる。
【００５２】
この場合のアミド化方法としては、例えば、溶媒中、水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドＮ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などを挙げることができる。アミド化方法の反応条件は、使用するＣＳと架橋剤に応じて適宜選択される。
【００５３】
ＣＳのカルボキシ基と多価アミン架橋剤を反応させる場合、溶媒中のＣＳの濃度は、２〜２０重量％が好ましく、２〜１５重量％がより好ましく、３〜１５重量％が特に好ましい。
ＣＳに対する多価アミン架橋剤のモル当量としては、ＣＳの二糖単位１．００モル当量（ｅｑ）に対して、０．００５〜０．５００ｅｑが好ましく、０．００５〜０．３００ｅｑがより好ましく、０．００５〜０．２５０ｅｑがより好ましく、０．００５〜０．２００ｅｑがより好ましく、０．００５〜０．１００ｅｑが特に好ましい。
【００５４】
多価アミン架橋剤に対する縮合剤のモル当量としては、多価アミン架橋剤の１．００モル当量（ｅｑ）に対して、（０．５０〜５．００）×価数ｅｑが好ましく、（１．００〜４．００）×価数ｅｑがより好ましく、（１．００〜３．００）×価数ｅｑが特に好ましい。ここで「価数」とは、多価アミンの価数を意味する。
【００５５】
架橋反応時の溶媒、架橋反応時間、及び架橋反応時の温度については、前記の例示及び好ましい範囲がそのまま適用される。架橋反応時のアミド化法、ＣＳの濃度、多価アミン架橋剤の構造、架橋剤の添加量、縮合剤の添加量、及び溶媒は、ＣＳ架橋体に求められる性質によって、適宜選択される。
【００５６】
ＣＳのヒドロキシ基を利用した架橋の場合、利用されるヒドロキシ基の位置の違いにより、多様な構造のＣＳ架橋体が生じうる。このため、ＣＳ架橋体の構造の多様性を低減させるためには、ＣＳのカルボキシ基を利用した架橋を選択することが好ましい。すなわち、ＣＳのカルボキシ基とアミド結合を形成する点で、架橋剤としては、多価アミンが好ましい。また、ＣＳ架橋体の構造の多様性を低減させるためには、ジアミンが特に好ましい。
【００５７】
ＣＳ架橋体の架橋構造は、例えば、実施例１２Ａに記載の方法により確認することができる。
【００５８】
＜架橋率＞
本発明におけるＣＳ架橋体の架橋率は、ＣＳの繰り返し二糖単位当たりの、２以上の官能基がＣＳと結合した架橋基の数を百分率で表した値を意味する。例えば、ジアミンに由来する基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体の架橋率は、以下の式（Ａ）により算出される。
【数１】
2016114397.tif 000002
（上記式中、Ｒは、−ＯＨ、−ＯＭ（Ｍは、周期表１族又は２族の金属元素を表す）、又は、ジアミンに由来する基を表す。）
【００５９】
本発明のＣＳ架橋体の架橋率は特に限定されないが、０．０１％以上、０．０５％以上、０．１％以上、０．５％以上、３０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下が例示され、０．０１〜３０％が好ましく、０．０５〜１０％がより好ましく、０．１〜５％がより好ましく、０．２５〜４％がより好ましく、０．５〜３％が特に好ましい。
【００６０】
＜架橋率測定＞
ジアミンに由来する基を介した架橋構造を有するＣＳ誘導体の架橋率は、例えば、以下の方法により測定できる。被験物質に希硫酸を加え60℃、6時間加熱を行った後、得られた溶液を塩基性にし、プロピレンオキサイドを添加し60℃で一晩加熱を行う。強酸性にした溶液を110℃で一晩加熱を行い、得られた溶液を塩基性にし、イソチオシアン酸フェニルを用いて架橋基のアミノ基のラベル化を行い、ラベル化された架橋基をLC/MSにより定量する。そして、ＣＳ二糖単位のモル数に対する架橋基のモル数を百分率で算出する。
【００６１】
＜薬学的に許容される担体＞
本明細書における「薬学的に許容される担体」としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、精製水、注射用水等が挙げられる。また、適宜、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤等の通常用いられる添加剤を使用してよい。添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素一カリウム、エデト酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。
【００６２】
＜ＣＳ架橋体を含有する組成物＞
本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物（「本発明の組成物」ともいう。）の調製方法は特に限定されないが、例えば、本発明のＣＳ架橋体を、薬学的に許容される担体と混合し、４〜２４時間、又はそれ以上の時間、振盪機で振盪することにより、調製することができる。
【００６３】
本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物は、液状であることが好ましく、溶質が充分に微粒状態で溶媒中に均質に分散していると考えられる点で、水溶液であることがより好ましい。本明細書における「水溶液」とは、水を媒質とする組成物であって、その性状（以下、「溶状」ともいう。）が澄明のものをいう。溶状は、後述する「溶状確認試験」により判定することができる。特に、本発明の組成物を点眼剤等の医薬として使用する場合、不溶物が存在すると、これが異物感につながる可能性があるため、本発明の組成物は水溶液であることが好ましい。水を媒質とする組成物としては、具体的には、本発明のＣＳ架橋体を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、精製水、又は注射用水と混合した組成物が例示される。
本発明のＣＳ架橋体は、水溶性であることが好ましい。ＣＳ架橋体が水溶性か否かは、後述する「水溶性確認試験」により判定することができる。
本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物は、ＣＳ架橋体のフィルター通過率が５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが特に好ましい。
本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物の粘度は、５〜１１，０００、１０〜５，０００、２０〜１，０００、３０〜３００、又は３０〜２５０ｍＰａ・ｓであってよい。本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物中のＣＳ架橋体の濃度は、組成物の総量に対し、０．１〜１５重量％、０．３〜１３重量％、又は１〜１０重量％であってよい。
【００６４】
＜溶状確認試験＞
調製した組成物の６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、（株）島津製作所社製）を使用して測定する。吸光度値が０．１以下の場合にその組成物の溶状を「澄明」と、０．１を超える場合に「白濁」と判定する。
【００６５】
＜水溶性確認試験＞
ＣＳ架橋体を濃度が２．０％（ｗ／ｗ）になるように水又はＰＢＳに溶解し、その組成物の６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、（株）島津製作所社製）を使用して測定する。吸光度値が０．１以下となる場合にそのＣＳ架橋体を「水溶性」と判定する。
【００６６】
＜粘度測定＞
Ｅ型回転粘度計(ＴＶ−Ｌ／Ｈ、東機産業社)、標準コーン（CORD-1, 1°34’xR24）を使用して、２５℃での５ｒｐｍ値を測定し、本明細書における「粘度」(mPa・s)とした。５ｒｐｍ値が検出範囲外の場合は、その他回転数から外挿値を算出し、本明細書における「粘度」(mPa・s)とした。
【００６７】
＜フィルター通過性試験＞
２５℃条件下で多孔質フィルター（孔径が５．０μm、直径２５ｍｍ）に試料を通過させ、通過前後の試料中のＣＳの二糖単位換算濃度（以下、「ＣＳ濃度」ともいう。）を後記カルバゾール硫酸法で測定し、以下の式（Ｂ）により、本明細書における「フィルター通過率」が算出される。なお、フィルター通過時の圧力は5.3kgf/cm2以下とする。
【数２】
2016114397.tif 000003
例えば、フィルター通過前の試料中のＣＳ濃度が１．００％で、フィルター通過後の試料中のＣＳ濃度が０．９０％の場合、フィルター通過率は９０％になる。
【００６８】
＜カルバゾール硫酸法によるＣＳ濃度の算出＞
Ｄ−グルクロノラクトン(分子量：１７６．１２)の２０．０μｇ／mＬ水溶液を標準品として使用したカルバゾール硫酸法から以下の式（Ｃ）によりＣＳ濃度(mol/L)が算出される。
【数３】
2016114397.tif 000004
（ここで、ＯＤ530とは、波長530nmにおける光学濃度を表す）
【００６９】
本発明のＣＳ架橋体、及び本発明の組成物は、医薬、眼疾患処置剤等として使用することができる。すなわち、本発明のＣＳ架橋体は、医薬、眼疾患処置剤の有効成分として使用することができる。
【００７０】
＜眼疾患処置剤＞
本発明の眼疾患処置剤は、本発明のＣＳ架橋体を有効成分として含有する、眼疾患処置剤である。ＣＳ架橋体としては、本明細書にて先に説明したＣＳ架橋体、特に、先に［Ａ１］〜［Ａ２２］のいずれかとして挙げた態様のＣＳ誘導体が挙げられる。本明細書における「眼疾患」とは、前眼部における何らかの異常であれば特に限定されない。前眼部のなかでも、眼表面が好ましく、角膜がより好ましく、角膜上皮が特に好ましい。本明細書における「前眼部」には、涙液が含まれる。本明細書における「眼疾患」としては、角膜上皮障害、涙液層の異常、又はドライアイが好ましく、なかでも、角膜上皮障害、又はドライアイが特に好ましい。本明細書において「ドライアイ」とは、ドライアイ疾患又はドライアイ症候群の両方、又はいずれであってもよい。「涙液層の異常」とは、涙液層が破綻した状態や、涙液層が破綻しやすい状態にあることをいい、ＤＥＷＳによるドライアイの定義（The Ocular Surface Vol.5, No.2:75-92, 2007）で言及されている「涙液層の不安定」な状態を包含する意味である。涙液層の異常の原因としては、涙液の蒸発の亢進、涙液の減少等が挙げられる。涙液層の異常は、シルマー法、涙液層破壊時間（ＢＵＴ）、角膜球面不正指数（ＳＲＩ）等を用いて評価することもできる。
【００７１】
「角膜上皮障害」とは、角膜上皮に生じる障害であれば、特に限定されない。例えば、角膜上皮欠損、角膜上皮びらん、角膜潰瘍、角膜穿孔等が挙げられ、点状表層角膜症や角膜炎等による角膜上皮障害も包含する。また、例えば、ドライアイ、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群等の内因性疾患に伴う角膜上皮障害、又は、コンタクトレンズ装用、外傷、手術、感染性、薬剤性等の外因性疾患に伴う角膜上皮障害も包含する。なかでも、ドライアイに伴う角膜上皮障害であることが好ましい。
【００７２】
本明細書における「処置」には、治療が含まれる。「治療」とは、改善、治癒、治癒促進することを包含する。すなわち、「処置剤」には、治療剤が含まれ、「治療剤」には、改善剤、治癒促進剤が包含される。本明細書において、涙液層の異常を治療することを、「涙液層安定化」ともいう。
【００７３】
本明細書における「眼疾患処置剤」は、前眼部における異常、なかでも、眼表面、又は涙液における異常に対する処置剤であることが好ましい。具体的には、角膜上皮障害処置剤、涙液層安定化剤、及びドライアイ処置剤が例示される。
【００７４】
＜剤形及び製剤＞
本発明のＣＳ架橋体を有効成分として含有する眼疾患処置剤（以下、「本発明の剤」ともいう。）の剤形は、特に限定されるものではないが、例えば、点眼剤、眼軟膏剤、クリーム剤、ローション剤等が挙げられ、なかでも点眼剤が好ましく、水性点眼剤が特に好ましい。「水性点眼剤」とは、水を５０重量％以上含有する点眼剤を意味する。本発明の水性点眼剤としては、水を８０重量％以上含有する点眼剤が好ましく、９０重量％以上含有する点眼剤がより好ましい。本発明の水性点眼剤に含有される水は、製薬上又は生理学的に許容されるものであればよい。例えば、蒸留水、精製水、滅菌精製水、注射用水、注射用蒸留水等を使用できる。これらの定義は第十六改正日本薬局方に基づく。生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等を使用してもよく、また、適宜、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤等の通常用いられる添加剤を使用してよい。添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素一カリウム、エデト酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。点眼剤のｐＨ、及び浸透圧比は、眼科製剤に許容される範囲であれば特に限定されない。なお、本発明の剤には、ヒアルロン酸を含まなくてよい。
【００７５】
本発明の剤は、液状であることが好ましく、溶質が充分に微粒状態で溶媒中に均質に分散していると考えられる点で、水溶液であることがより好ましい。特に、本発明の剤を点眼剤として使用する場合、不溶物が存在すると、これが異物感につながる可能性があるため、本発明の剤は水溶液であることが好ましい。また、本発明の剤は、ＣＳ架橋体のフィルター通過率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上が特に好ましい。
【００７６】
本発明の剤に含まれるＣＳ架橋体の濃度は、特に限定されないが、所望の薬効を示す有効濃度であってよく、０．０１〜２０重量％、０．１〜１５重量％、０．３〜１０重量％が例示される。
【００７７】
＜適用対象＞
本発明の剤の適用対象は、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、特に限定されないが、ヒト、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウスなどが例示される。本発明の剤は、ヒト又は動物用の医薬にすることができ、ヒト用の医薬とすることが好ましい。
【００７８】
＜用法及び用量＞
本発明の剤の投与量は、患者の症状の軽重、年令、体重、医師の判断などに応じて適宜変えることができる。
本発明の剤の１日当たりの投与回数、及び投与期間は、特に限定されない。１日当たりの投与回数としては、例えば、１〜８回、１〜６回、１〜４回、１〜３回、１又は２回等が挙げられ、「適宜増減可能」としてもよい。投与期間としては、特に限定されないが、例えば、１週間〜数ヵ月が挙げられる。また、連日投与が好ましい。また、点眼剤としては、１回１〜２滴、又は１回１〜３滴の点眼が例示される。したがって、１回１〜３滴の１日１〜８回点眼、１回１〜３滴の１日１〜６回点眼、１回１〜３滴の１日１〜４回点眼、１回１〜３滴の１日１〜３回点眼、１回１〜３滴の１日１又は２回点眼が例示され、これらの連日点眼が例示される。
【００７９】
＜本発明の剤の使用方法＞
本発明の剤は、これをヒト又は動物の眼に投与することにより使用することができる。本発明の剤のヒト又は動物の眼への投与は、医学的に許容される態様で行われ、かつ本発明の効果を発揮できるものである限りにおいて特に限定されない。
投与の具体的方法も特に限定されず、剤形や製剤形態に応じて適宜投与すればよいが、点眼を好ましく例示することができる。
【００８０】
＜眼疾患の処置方法＞
本発明の処置方法は、本発明の剤、又は本発明のＣＳ架橋体を含有する組成物をヒト又は動物の眼に投与することを含む、眼疾患処置方法である。本発明の処置方法は、前記＜適用対象＞、＜用法及び用量＞、＜本発明の剤の使用方法＞等の説明に従って、同様に実施することができる。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例及び試験例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が制限されるべきものではない。なお、特に断りのない限り「％」は質量基準である。また、特に断りのない限り、多価アミン架橋剤、及び縮合剤のモル当量はＣＳの構成二糖単位に対するモル当量を表し「ｅｑ」で示した。【００８２】
実施例１
CS-NC2N架橋体の製造
(A)代表例
CS(CSC、局外規コンドロイチン硫酸ナトリウム、重量平均分子量４０，０００、生化学工業株式会社) 2.00g (二糖単位3.91mmol ［二糖単位の平均分子量を５１１として算出］, 1.00eq)を濃度10%となるよう注射用水(WFI)に溶解させ、エタノール (EtOH) 20.0mLを混和した。架橋剤としてエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩（NC2N・2HCl、和光純薬工業株式会社）10.4mg(0.0783mmol, 0.0200eq)の50% エタノール溶液 4.00mLと、縮合剤としてDMT-MM（TRIAZIMOCH、株式会社トクヤマ）86.6mg (0.313mmol, 0.0800eq)の50% エタノール溶液4.00mLを順次滴下し、室温にて終夜撹拌した（架橋反応）。10% 炭酸ナトリウム水溶液（Na2CO3/WFI） 20mLを加え、２〜４時間激しく撹拌した。50wt% 酢酸水溶液(AcOH/WFI) 4.0mLで中和した後、塩化ナトリウム (NaCl) 2.0gを加え、EtOHを用いて沈殿させた。得られた沈殿をろ取し、90% EtOH 200mLで3回、EtOH 200mLで2回順次洗浄した。得られた沈殿を、42℃で終夜減圧乾燥することで、ＣＳ架橋体（CS-NC2N架橋体、化合物１）を白色粉体として1.81g得た。【００８３】
(B)代表例とは架橋剤の当量が異なる製造例
NC2N・2HClのモル当量を(0.0050, 0.0100, 0.0150, 0.0175, 0.0225, 0.0250, 0.0275eq)、DMT-MMのモル当量を(0.0200, 0.0400, 0.0600, 0.0700, 0.0900, 0.100, 0.110eq)とした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC2N架橋体、化合物２〜８）を白色粉体として得た(各約1.75g)。【００８４】
実施例２
CS-NC2N架橋体の製造
(A)10g スケール
CS量を10g、NC2N・2HClのモル当量を0.020eq、DMT-MMのモル当量を0.080eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC2N架橋体、化合物９）を白色粉末として8.94g得た。
(B)20g スケール
CS量を20g、NC2N・2HClのモル当量を0.02375eq、DMT-MMのモル当量を0.0950eq、架橋反応時間を3時間46分とした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC2N架橋体、化合物１０）を白色粉末として19.1g得た。【００８５】
実施例３
CS-NC3N架橋体の製造
CS量を1g、架橋剤を１，３−ジアミノプロパン・２塩酸塩（NC3N・2HCl、東京化成工業株式会社）(モル当量は、0.0150, 0.0200, 0.0300, 0.0400eq)、DMT-MMのモル当量を0.0600, 0.0800, 0.120, 0.160eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC3N架橋体、化合物１１〜１４）を白色粉末として得た(各約0.84g)。【００８６】
実施例４
CS-NC4N架橋体の製造
CS量を4g、架橋剤を１，４−ジアミノブタン・２塩酸塩（NC4N・2HCl、和光純薬工業株式会社）(モル当量は、0.0300, 0.0425, 0.0450, 0.0475eq)、DMT-MMのモル当量を0.120, 0.170, 0.180, 0.190eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC4N架橋体、化合物１５〜１８）を白色粉末として得た(各約3.85g)。【００８７】
実施例５
CS-NC5N架橋体の製造
CS量を1g、架橋剤を１，５−ジアミノペンタン・２塩酸塩（NC5N・2HCl、東京化成工業株式会社）（モル当量は、0.0250, 0.0350, 0.0450, 0.0550eq)、DMT-MMのモル当量を0.100, 0.140, 0.180, 0.220eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC5N架橋体、化合物１９〜２２）を白色粉末として得た(各約0.85g)。【００８８】
実施例６
CS-NC6N架橋体の製造
CS量を4g、架橋剤を１，６−ジアミノヘキサン・２塩酸塩（NC6N・2HCl、和光純薬工業株式会社）(モル当量は、0.0400, 0.0525, 0.0550, 0.0575eq)、DMT-MMのモル当量を0.160, 0.210, 0.220, 0.230eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC6N架橋体、化合物２３〜２６）を白色粉末として得た(各約3.83g)。【００８９】
実施例７
CS-NC8N架橋体の製造
CS量を4g、架橋剤を１，８−ジアミノオクタン・２塩酸塩（NC8N・2HCl、１，８−ジアミノオクタン[和光純薬工業株式会社]に、１Ｎ塩酸を２．００eq分添加して調製した）(モル当量は、0.0500, 0.0650, 0.0700, 0.0725eq)、DMT-MMのモル当量を0.200, 0.260, 0.280, 0.290eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC8N架橋体、化合物２７〜３０）を白色粉末として得た(各約3.88g)。【００９０】
実施例８
CS-NC12N架橋体の製造
CS量を1g、架橋剤を１，１２−ジアミノドデカン・２塩酸塩（NC12N・2HCl、１，１２−ジアミノドデカン[Sigma-Aldrich社] に、１Ｎ塩酸を２．００eq分添加して調製した））(モル当量は、0.0550, 0.0700eq)、DMT-MMのモル当量を0.220, 0.280eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC12N架橋体、化合物３１及び３２）を白色粉末として得た(各約0.82g)。【００９１】
実施例９
CS-LysEt架橋体の製造
CS量を1g、架橋剤をＬ-リシンエチルエステル・２塩酸塩（LysEt・2HCl、Sigma-Aldrich社）(モル当量は0.0450eq)、DMT-MMのモル当量を0.180eqで固定し、架橋反応時間を2時間、3時間、3時間40分、4時間20分、5時間、5時間50分とした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-LysEt架橋体、化合物３３〜３８）を白色粉末として得た(各約1.04g)。【００９２】
実施例１０
CS-OrnEt架橋体の製造
CS量を2g、架橋剤をオルニチンエチルエステル・２塩酸塩（OrnEt・2HCl、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社） (モル当量は、0.0200, 0.0300, 0.0325, 0.0350eq)、DMT-MMのモル当量を0.0800, 0.120, 0.130, 0.140eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-OrnEt架橋体、化合物３９〜４２）を白色粉末として得た(各約1.99g)。【００９３】
実施例１１
CS-Spermidine架橋体の製造
CS量を1又は2g、架橋剤をスペルミジン・３塩酸塩(Spermidine・3HCl、Sigma-Aldrich社)(モル当量は、0.0100, 0.0200，0.0220eq)、DMT-MMのモル当量を0.0400, 0.0800，0.0880eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-Spermidine架橋体、化合物４３、４４及び６７）を白色粉末として得た(それぞれ約0.77、0.77、及び1.75g)。【００９４】
実施例Ａ１
CS-triAmine架橋体の製造
CS量を2g、架橋剤を２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン・３塩酸塩（triAmine・3HCl、Aldrich社）（モル当量は、0.0091, 0.0092, 0.0097eq）、DMT-MMのモル当量を0.0364, 0.0368, 0.0388eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-triAmine架橋体、化合物４８〜５０）を白色粉末として得た(各約1.74g)。【００９５】
実施例Ａ２
CS-NC3(OH)N架橋体の製造
CS量を2g、架橋剤を１，３−ジアミノ−２−プロパノール・２塩酸塩（NC3(OH)N・2HCl、１，３−ジアミノ−２−プロパノール[Aldrich社]に、1N塩酸を2.00eq分添加して調製した）（モル当量は、0.0220, 0.0240, 0.0260eq）、DMT-MMのモル当量を0.0880, 0.0960, 0.1040eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC3(OH)N架橋体、化合物５１〜５３）を白色粉末として得た(各約1.75g)。【００９６】
実施例Ａ３
CS-NC4(=)N架橋体の製造 
CS量を2g、架橋剤を（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン・２塩酸塩（NC4(=)N・2HCl、Small Molecules, Inc.社）（モル当量は、0.0270, 0.0275eq）、DMT-MMのモル当量を0.1080, 0.1100eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC4(=)N架橋体、化合物５４及び５５）を白色粉末として得た(各約1.80g)。【００９７】
実施例Ａ４
CS-Xylylene架橋体の製造 
CS量を2g、架橋剤を１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン・２塩酸塩（Xylylene・2HCl、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン[Aldrich社]に、1N塩酸を2.00eq分添加して調製した）（モル当量は、0.0135, 0.0145, 0.0150eq）、DMT-MMのモル当量を0.0540, 0.0580, 0.0600eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-Xylylene架橋体、化合物５６〜５８）を白色粉末として得た(各約1.77g)。【００９８】
実施例Ａ５
CS-Cyclohex架橋体の製造 
CS量を2g、架橋剤を１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン・２塩酸塩（Cyclohex・2HCl、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン[関東化学社]に、1N塩酸を2.00eq分添加して調製した）（モル当量は、0.0410, 0.0425eq）、DMT-MMのモル当量を0.1640, 0.1700eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-Cyclohex架橋体、化合物５９及び６０）を白色粉末として得た(各約1.80g)。【００９９】
実施例Ａ６
CS-NC5(S)N架橋体の製造 
CS量を2g、架橋剤を２，２’−チオジエタンアミン・２塩酸塩（NC5(S)N・2HCl、２，２’−チオジエタンアミン[東京化成社]に、1N塩酸を2.00eq分添加して調製した）（モル当量は、0.0170, 0.0180eq）、DMT-MMのモル当量を0.0680, 0.0720eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-NC5(S)N架橋体、化合物６１及び６２）を白色粉末として得た(各約1.77g)。【０１００】
実施例Ａ７
CS-Glycol(C5)架橋体の製造
CS量を２g、架橋剤を２，２’−オキシジエタンアミン・２塩酸塩（Glycol(C5)・2HCl、和光純薬社）（モル当量は、0.0290, 0.0310eq）、DMT-MMのモル当量を0.1160, 0.1240eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-Glycol(C5)架橋体、化合物６３及び６４）を白色粉末として得た(各約1.76g)。【０１０１】
実施例Ａ８
CS-Glycol(C11)架橋体の製造
CS量を２g、架橋剤を１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン・２塩酸塩（Glycol(C11)・2HCl、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン[東京化成社]に、1N塩酸を2.00eq分添加して調製した）（モル当量は、0.0380, 0.0410eq）、DMT-MMのモル当量を0.1520, 0.1640eqとした以外は、実施例１(A)と同様の方法で、ＣＳ架橋体（CS-Glycol(C11)架橋体、化合物６５及び６６）を白色粉末として得た(各約1.87g)。【０１０２】
比較例１
ＣＳ−ＮＣ１２Ｎ誘導体（比較例）の製造
１，１２−ジアミノドデカンにより修飾されたＣＳ誘導体の粉末を以下の手順で製造した。なお、本製造方法の引用元である文献によれば、同修飾はＣＳの親水性を低下させることを目的とする。
国際公開第９１／１６８８１号の実施例５、「A．コンドロイチンの修飾」、及びBiomaterials, 16:473-478, 1995に記載の方法に従い、コンドロイチン硫酸Ａ（CSA、Sigma-Aldrich社）1.00g (二糖単位2.18mmol［二糖単位の平均分子量を458として算出]、1.00eq)、１，１２−ジアミノドデカン・２塩酸塩（Sigma-Aldrich社）（モル当量０．３０、０．６０、０．９０eq）、及び縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（モル当量０．６６、１．３２、１．９８eq）を使用し、ＣＳ誘導体（「ＣＳ−ＮＣ１２Ｎ誘導体（比較例）」、化合物４５〜４７）を白色粉末として得た（各約０．４６g）。【０１０３】
上記実施例及び比較例で製造した化合物の一覧を表１〜４に示す。【０１０４】
【表１】
2016114397.tif 000005
【０１０５】
【表２】
2016114397.tif 000006
１）化合物３３〜３８は、架橋剤当量及びDMT-MM当量を固定し、架橋反応時間をそれぞれ2時間、3時間、3時間40分、4時間20分、5時間、5時間50分として製造した。【０１０６】
【表３】
2016114397.tif 000007
【０１０７】
【表４】
2016114397.tif 000008
【０１０８】
実施例１２Ａ
分析（架橋構造の確認）
国際公開第９１／１６８８１号に記載されている方法により製造されたCS-NC12N誘導体を分析したところ、種々の分析法を用いてもＣＳの架橋は確認されなかった（C. Bourie, et al., J.Biomater.Appl., 12, (1998), 201-221）。そこで、本発明のＣＳ架橋体の架橋を実証するために、本発明のＣＳ架橋体の酵素消化物を液体クロマトグラフィー(HPLC)/多段階質量分析にて解析した。
＜試験物質＞
ＣＳ（CSC、局外規コンドロイチン硫酸ナトリウム、重量平均分子量４０，０００、生化学工業株式会社）、CS-NC2N架橋体(化合物９)を用いた。
＜方法＞
（１）CS、及びCS-NC2N架橋体の酵素消化
ＣＳ、及びCS-NC2N架橋体の1% w/v水溶液各２０μLに、50 mMトリス塩酸緩衝液 (pH 7.5)-0.1% BSA溶液にて希釈したコンドロイチナーゼＡＢＣ(Ｃ−ＡＢＣ)(生化学工業株式会社)(50 U/mL) を10μL添加した。反応溶液を３７℃、３時間加温後、３０秒間の煮沸により反応を停止した。
（２）酵素消化物のHPLC分析
Ｃ−ＡＢＣ消化液の組成が、水：アセトニトリル＝１：１(ｖ/ｖ)となるよう希釈した(全量200μL)溶液を、HPLC (Prominence、島津製作所製）にESI-MS (LCMS-IT-TOF、島津製作所製)を接続したLC-MS装置を用いて分析した。カラムは、TSKgel Amide-80 HR 4.6mmI.D×250mmを用いた。溶離液は、20mM ギ酸アンモニウム水溶液(Solvent A)及びアセトニトリル(Solvent B)により、C-ABC消化液を分析した(Detect: 232nm及びMS)。ESI-MSは、-3.5 kVのインターフェース電圧、200 ℃のCDL温度及びヒートブロック温度にそれぞれセットして操作した。スキャン分子量範囲は、MSでは m/z = 300 〜 1500、MSnではm/z = 50 〜 2000に設定した。
（３）新規出現ピークの多段階質量分析
LC-MS分析結果により、CS-NC2N架橋体のチャートにのみ検出されたピークに関して、以下の条件で質量分析を実施した。ESI-MSにはnanoESI イオン源(NES-100; New Objective製)を接続したLCMS-IT-TOF (島津製作所製)を使用した。上述のHPLC条件により分画したCS-NC2N架橋構造を含む溶液を、減圧化で溶媒留去後、0.5% NH3含有50% MeOH溶液に溶解した。この溶液を、シリンジポンプを用いて直接注入した。10μL/hの流速、−1.5kVのインターフェース電圧、200℃のCDL温度及びヒートブロック温度にそれぞれセットして操作した。スキャン分子量範囲は、MSでは m/z = 1300 〜 1500、MSnではm/z = 50 〜 2000に設定した。【０１０９】
＜試験結果＞
Ｃ−ＡＢＣ消化は、ＣＳ、ＣＳ−ＮＣ２Ｎ架橋体同様に進行したことを、消化液のHPLCチャートから確認した(図１)。図１中、ピークＡ、及びＢは、未架橋のＣＳでは検出されない代表的なピークであり、LC-MSでの解析から、ジアミンに由来する基を有する構造体に由来するピークであることが示唆された。その他、質量電荷比よりジアミンに由来する基を有すると推定された構造について、一覧を表５にまとめた。
次に、ジアミンに由来する基による架橋構造を確認するため、ピークＢに関して、多段階質量分析を実施した。結果の一例を図２、図３に示した。図２、図３に示されている通り、ＣＳの２つのグルクロン酸とエタン−１，２−ジアミンが、共有結合していると示唆されるピークが検出された。【０１１０】
【表５】
2016114397.tif 000009
【０１１１】
＜結論＞
CS-NC2N架橋体の酵素消化液の液体クロマトグラフィー／多段階質量分析により、ジアミンが、確かに２つのグルクロン酸のカルボキシ基と共有結合を形成していることが示された。このことから、本発明のＣＳ架橋体が、架橋構造を有することが実証された。【０１１２】
実施例１２Ｂ
架橋率の測定
実施例１及び２で調製した試料の一部を10mg秤量し、20mM硫酸を1mL添加し、脱気溶解を行った。得られた溶液を60℃で6時間加熱を行った後塩基性にし、エタノール及びプロピレンオキサイドを添加し、60℃で一晩加熱を行った。冷却した溶液を酸性にした後、溶液を減圧乾固させた。そこに内部標準物質としてジアミノブタンを加え、更に6M塩酸を加え、得られた溶液を110℃で一晩加熱した。溶液を減圧乾固し、そこにジメチルスルホキシド：水＝3：1の溶液を加え、30分間振とうした。得られた液を別容器に分取し、そこにトリエチルアミン、及びイソチオシアン酸フェニル：アセトニトリル＝1 : 9の溶液を加え、良く撹拌した後20分間30℃で加熱した。0.22μmのフィルターを通した後、LC-ESI-MSを用いてポジティブモードで分析した。カラムは、Gemini-NX 3um C18 2x50mmを用いた。溶離液は、H2O(SolventA)、MeCN(SolventB)、100mM NH4HCO3(pH 10.0 by NH4OH)(SolventC)により分析した。結果を表６に示した。【０１１３】
【表６】
2016114397.tif 000010
【０１１４】
実施例１３
ＣＳ架橋体を含有する組成物の調製
次の組成のリン酸緩衝生理食塩水（本明細書において、「ＰＢＳ」ともいう。）を調製した。
０．０６５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素ナトリウム２水和物、
０．０３％（ｗ／ｖ）リン酸水素２ナトリウム１２水和物
０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム
実施例１、２、４、６〜１１、及びＡ１〜Ａ８で製造されたＣＳ架橋体の各種を表７、８及び９に示す濃度になるように前記ＰＢＳと混合し、終夜振盪機で振盪することにより、各試料を調製した（試料１〜４３、試料５５〜７１、及び試料７５〜７７）。その後、一部の試料について、６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、（株）島津製作所社製）を用いて測定した。結果を表７、８及び９に示した。【０１１５】
比較例２
ＣＳを含有する組成物の調製
ＣＳ（CSC[生化学工業株式会社]、及びCSA[Sigma-Aldrich社]）を用いて、実施例１３の方法に準じて、表１０に示す濃度になるように各試料を調製した（試料４７〜５４）。その後、試料５３について、６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、（株）島津製作所社製）を用いて測定した。結果を表１０に示した。【０１１６】
比較例３
ＣＳ−ＮＣ１２Ｎ誘導体（比較例）を含有する組成物の調製
比較例１で製造されたＣＳ−ＮＣ１２Ｎ誘導体（比較例）を用いて、実施例１３の方法に準じて、表８に示す濃度になるように各試料を調製した（試料４４〜４６、７２〜７４）。その後、各試料について、６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、（株）島津製作所社製）を用いて測定した。結果を表８に示した。【０１１７】
実施例１４
各試料の粘度測定
実施例１３、及び比較例２で調製した試料について、Ｅ型回転粘度計(ＴＶ−Ｌ／Ｈ、東機産業社)、標準コーン（CORD-1, 1°34’xR24）を使用して、２５℃での５ｒｐｍ値を測定し粘度(mPa・s)とした。５ｒｐｍ値が検出範囲外の場合は、その他回転数から外挿値を算出し、粘度(mPa・s)とした。結果を、表７〜１０に示した。【０１１８】
【表７】
2016114397.tif 000011
【０１１９】
【表８】
2016114397.tif 000012
【０１２０】
【表９】
2016114397.tif 000013
【０１２１】
【表１０】
2016114397.tif 000014
【０１２２】
＜結論＞
上記試料７、１３、１６、１９、２２、２６、３１、３５〜４０、４２、５３、５５〜７１、及び７５〜７７の溶状は澄明であり、これらは水溶液であることが確認された。また、高濃度組成物の溶状が澄明であれば、これより低濃度の組成物の溶状も澄明であると考えられる。なお、試料１〜４３、４７〜７１、及び７５〜７７は、目視によっても澄明（ここでいう「澄明」とは、組成物が澄みきっていることを意味する）であることが確認された。一方、ＣＳ−ＮＣ１２Ｎ誘導体（比較例）（化合物４５〜４７）を含有する組成物の溶状は白濁であり、同組成物は水溶液ではなかった。【０１２３】
実施例１５
フィルター通過性試験
実施例１３で調製された試料のうち、一部の試料を、多孔質フィルター（孔径５．０μｍ、直径２５ｍｍ、Millex（登録商標）‐SV 5.00μm（Millipore Ireland社））を装着した1mL シリンジ（SS-01T、テルモ社）に充填した。２５℃の条件下、前記試料を5.3kgf/cm2以下の圧力でピストンにより押出し、フィルターを通過させた。フィルター通過前の試料と、０．５ｍＬ以上通過させた後のフィルター通過試料について、Ｄ−グルクロノラクトンの２０．０μg／ｍＬ水溶液を標準品として、カルバゾール硫酸法によりＣＳ濃度を測定した。この数値から通過前のＣＳ濃度に対する通過後のＣＳ濃度の割合を計算し、フィルター通過率を算出した。結果を表１１に示した。【０１２４】
【表１１】
2016114397.tif 000015
【０１２５】
＜結論＞
以上の結果から、今回調製された試料のフィルター通過率は８０％以上になることが分かった。【０１２６】
実施例１６
ＣＳ架橋体の角膜上皮障害治癒促進作用の検証（１）
ＳＤラット（日本チャールス・リバー株式会社）を用い、Ｆｕｊｉｈａｒａらの方法（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２（１）：９６−１００（２００１））に準じ、ドライアイモデルを作製した。モデル作製後、試験物質を点眼し、角膜上皮障害治癒促進作用を検証した。
＜試験物質＞
ＣＳ（CSC、局外規コンドロイチン硫酸ナトリウム、重量平均分子量４０，０００、生化学工業株式会社）、化合物１０、化合物１８、又は化合物４２を、ＣＳ架橋体の濃度が２％になるようにＰＢＳと混合し、終夜振盪機で振盪することにより、試験物質を調製した。試験物質として、２％ＣＳ、２％ＣＳ−ＮＣ２Ｎ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ４Ｎ架橋体、及び２％ＣＳ−ＯｒｎＥｔ架橋体を使用し、対照としてＰＢＳを使用した。
＜方法＞
（１）ドライアイモデルの作製
ＳＤラットを用いて、イソフルランによる吸入麻酔下で両眼の眼窩外涙腺を摘出し、ドライアイモデルを作製した。
（２）試験物質の点眼
モデル作製から約８週後に、角膜上皮の障害部分をフルオレセインにて染色した。角膜上皮の上部、中間部、及び下部のそれぞれについて、フルオレセインによる染色の程度を下記の基準に従ってスコア判定し、上記各部のスコアの合計値を算出した。両眼の平均スコアが５以上の個体に対して、試験物質を各眼５μＬずつ１日２回３週間点眼した。コントロールとしてＰＢＳを用い、上記と同じ操作を行った。
＜判定基準＞
０：  点染色がない
１：  疎（点状のフルオレセイン染色が離れている）
２：  中間（１と３の中間)
３：  密（点状のフルオレセイン染色が隣接）
（３）角膜上皮障害治癒作用の評価
点眼開始１、２、３週間後に、（２）に記載した方法で角膜上皮障害のスコアを評価した。
（４）統計解析方法
点眼開始１、２、３週間後のスコアの平均値を用いて、ＰＢＳと各試験物質との平均値の差をｔ検定で解析し、有意水準は両側５％とした。【０１２７】
＜試験結果＞
点眼開始１、２、３週後のスコアの推移及び平均値を表１２及び図４に示した。２％ＣＳ−ＮＣ２Ｎ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ４Ｎ架橋体、及び２％ＣＳ−ＯｒｎＥｔ架橋体は、ＰＢＳに対して有意な角膜上皮障害治癒促進作用を示した。また、２％ＣＳ−ＮＣ２Ｎ架橋体、及び２％ＣＳ−ＮＣ４Ｎ架橋体は、２％ＣＳに対して有意な角膜上皮障害治癒促進作用を示した。【０１２８】
【表１２】
2016114397.tif 000016
【０１２９】
実施例１７
ＣＳ架橋体の角膜上皮障害治癒促進作用の検証（２）
実施例１６の方法に準じ、角膜上皮障害治癒促進作用を検証した。
＜試験物質＞
化合物４９、又は化合物５２を、ＣＳ架橋体の濃度が２％になるようにＰＢＳと混合し、終夜振盪機で振盪することにより、試験物質を調製した。試験物質として、２％ＣＳ−ｔｒｉＡｍｉｎｅ架橋体、及び２％ＣＳ−ＮＣ３（ＯＨ）Ｎ架橋体を使用し、対照としてＰＢＳを使用した（実施例１７Ａ）。
また、化合物５５、又は化合物６０についても同様にＰＢＳと混合し、試験物質を調製した。試験物質として、２％ＣＳ−ＮＣ４（＝）Ｎ架橋体、及び２％ＣＳ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘ架橋体を使用し、対照としてＰＢＳを使用した（実施例１７Ｂ）。【０１３０】
＜試験結果＞
点眼開始１、２、３週後のスコアの推移及び平均値を表１３及び図５（実施例１７Ａ）、並びに表１４及び図６（実施例１７Ｂ）に示した。２％ＣＳ−ｔｒｉＡｍｉｎｅ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ３（ＯＨ）Ｎ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ４（＝）Ｎ架橋体、及び２％ＣＳ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘ架橋体は、ＰＢＳに対して有意な角膜上皮障害治癒促進作用を示した。【０１３１】
【表１３】
2016114397.tif 000017
【０１３２】
【表１４】
2016114397.tif 000018
【０１３３】
実施例１８
ＣＳ架橋体の角膜上皮障害治癒促進作用の検証（３）
実施例１６の方法に準じ、角膜上皮障害治癒促進作用を検証した。
＜試験物質＞
化合物２６、化合物６２、化合物６４、化合物６６、又は化合物６７を、ＣＳ架橋体の濃度が２％になるようにＰＢＳと混合し、終夜振盪機で振盪することにより、試験物質を調製した。試験物質として２％ＣＳ−ＮＣ６Ｎ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ５（Ｓ）Ｎ架橋体、２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ５）架橋体、２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１１）架橋体、及び２％ＣＳ−Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ架橋体を使用し、対照としてＰＢＳを使用した（実施例１８Ａ〜Ｄ）。【０１３４】
＜試験結果＞
点眼開始１、２、３週後のスコアの推移及び平均値を表１５及び図７（実施例１８Ａ）、表１６及び図８（実施例１８Ｂ）、表１７及び図９（実施例１８Ｃ）、並びに表１８及び図１０（実施例１８Ｄ）に示した。２％ＣＳ−ＮＣ６Ｎ架橋体、２％ＣＳ−ＮＣ５（Ｓ）Ｎ架橋体、２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ５）架橋体、２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１１）架橋体、及び２％ＣＳ−Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ架橋体は、ＰＢＳに対して有意な角膜上皮障害治癒促進作用を示した。２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１１）架橋体の点眼開始１、２、３週後のスコア平均値は、２％ＣＳ−Ｇｌｙｃｏｌ（Ｃ５）架橋体に比べ低い値を示し、主鎖の酸素原子の数が多いほど、強い角膜上皮障害治癒促進作用を有することが示された。【０１３５】
【表１５】
2016114397.tif 000019
【０１３６】
【表１６】
2016114397.tif 000020
【０１３７】
【表１７】
2016114397.tif 000021
【０１３８】
【表１８】
2016114397.tif 000022
【０１３９】
＜結論＞
以上より、本発明のＣＳ架橋体が、眼疾患処置剤、特に、角膜上皮障害治療剤、及び／又はドライアイ治療剤として使用できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明のＣＳ架橋体、及びこれを含有する組成物は眼疾患処置剤として、また、本発明の方法は眼疾患の処置方法として、産業上利用することができる。
【図１】
2016114397.tif 000023
【図２】
2016114397.tif 000024
【図３】
2016114397.tif 000025
【図４】
2016114397.tif 000026
【図５】
2016114397.tif 000027
【図６】
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【図７】
2016114397.tif 000029
【図８】
2016114397.tif 000030
【図９】
2016114397.tif 000031
【図１０】
2016114397.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月20日(2016.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋基を介した架橋構造をコンドロイチン硫酸の構成二糖単位間に有するコンドロイチン硫酸誘導体を有効成分として含有する眼疾患処置剤。
【請求項２】
前記架橋基が、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンからなる群より選択される少なくとも１種に由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項３】
前記架橋基が、多価アミンに由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項４】
前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、請求項３に記載の眼疾患処置剤。
【請求項５】
前記多価アミンが、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン、１，１２−ジアミノドデカン、スペルミジン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３又は４に記載の眼疾患処置剤。
【請求項６】
前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はコンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項７】
前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜２０の炭化水素基である、請求項６に記載の眼疾患処置剤。
【請求項８】
点眼剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項９】
前記眼疾患が角膜上皮障害である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項１０】
前記眼疾患がドライアイである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月6日(2016.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋基を介した架橋構造をコンドロイチン硫酸の構成二糖単位間に有するコンドロイチン硫酸誘導体を有効成分として含有する、ドライアイ又は角膜上皮障害の処置用の、眼疾患処置剤。
【請求項２】
前記架橋基が、多価アミン、多価エポキシ化合物、多価ビニル化合物、及びエピハロヒドリンからなる群より選択される少なくとも１種に由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項３】
前記架橋基が、多価アミンに由来する基である、請求項１に記載の眼疾患処置剤。
【請求項４】
前記多価アミンが、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、主鎖の原子数が１〜２０の、置換又は無置換の多価アミンである、請求項３に記載の眼疾患処置剤。
【請求項５】
前記多価アミンが、エタン−１，２−ジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン、１，１２−ジアミノドデカン、スペルミジン、Ｌ−リシンエチルエステル、Ｌ−オルニチンエチルエステル、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−（アミノメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジアミン、（Ｅ）−２−ブテン−１，４−ジアミン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、２，２’−チオジエタンアミン、２，２’−オキシジエタンアミン、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３又は４に記載の眼疾患処置剤。
【請求項６】
前記架橋構造が、次の一般式（Ｉ）；
Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ   （Ｉ）
（式中、Ｙ−ＣＯ−は、コンドロイチン硫酸分子内の構成二糖単位に由来する部分を表し、
−ＣＯ−Ｚは前記と同一の又は異なるコンドロイチン硫酸分子の構成二糖単位に由来する部分を表し、
Ｒは、主鎖上にヘテロ原子を有するか又は有しない、置換又は無置換の炭化水素基を表し、
−ＣＯ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−はコンドロイチン硫酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシ基と多価アミンが有するアミノ基とのアミド結合を表す）
で示される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【請求項７】
前記炭化水素基が、主鎖の原子数が１〜２０の炭化水素基である、請求項６に記載の眼疾患処置剤。
【請求項８】
点眼剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の眼疾患処置剤。
【国際調査報告】
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