(57)【要約】  本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒である親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関する。上記溶解液は水系溶媒で溶媒置換することが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、
前記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、
前記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、前記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項２】
前記溶解用溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上である請求項１に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項３】
前記溶解用溶媒は、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１,３−ジメチル−２−イミダゾリドン、及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒である請求項１又は２に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項４】
前記溶解用溶媒は、前記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項５】
前記不溶物の分離は、濾過による分離及び／又は遠心分離により行う請求項１〜４のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項６】
前記溶解用溶媒は、前記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加する請求項１〜５のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項７】
前記溶解液を、水系溶媒で溶媒置換する請求項１〜６のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項８】
前記溶媒置換された溶解液を、さらにカラム、濾過、遠心分離からなる群から選ばれる一種以上の手段で処理する請求項７に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【請求項９】
前記親水性組換えタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる１つのタンパク質である請求項１〜８のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関し、詳細には、ハイドロパシ―インデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質などの親水性組換えタンパク質を発現している宿主から該親水性組換えタンパク質を粗精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、高張力鋼、ナイロン（登録商標）６繊維などよりも高い強度とタフネスを有することが知られている。このような特性から、クモ糸は新規な素材として注目され、クモ糸の原料となるクモ糸タンパク質を遺伝的組換え技術により大腸菌などの宿主細胞に発現させ、回収することが行われている。例えば、特許文献１には、組換えＤＮＡ技術により、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）大吐糸管（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ）絹糸（しおり糸）タンパク質、アメリカジョロウグモ小吐糸管（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ）絹糸タンパク質などのクモ絹糸タンパク質を製造することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−９８７７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１では、細胞を溶解させて細胞内に存在する組換えクモ絹糸タンパク質を放出して回収するに際し、細胞残渣は溶解するがクモ絹糸タンパク質は溶解しない溶媒で繰り返し処理することによってクモ絹糸タンパク質を沈澱させている。しかし、組換えクモ絹糸タンパク質が水に不溶性のタンパク質の場合は有効であるが、組換えタンパク質が親水性組換えタンパク質の場合は、有効な手段ではなく、工程の簡便化が望まれている。【０００５】
本発明は、上記従来の問題を解決するため、ハイドロパシ―インデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質などの親水性組換えタンパク質を発現している宿主から、簡便かつ効率的に、親水性組換えタンパク質を粗精製することができる親水性組換えタンパク質の粗精製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関する。【０００７】
本発明の親水性組換えタンパク質の粗精製方法において、上記溶解用溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１,３−ジメチル−２−イミダゾリドン、及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒であることがより好ましい。上記溶解用溶媒は、上記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものであることが好ましい。上記不溶物の分離は、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことができる。上記溶解用溶媒は、上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加することが好ましい。上記溶解液を、水系溶媒で溶媒置換することが好ましい。溶媒置換された溶解液を、さらにカラム、濾過、及び遠心分離からなる群から選ばれる一種以上の手段で処理することがより好ましい。上記親水性組換えタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる１つのタンパク質であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒を用い、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主を溶解用溶媒で溶解させ、不溶物を分離し、溶解液を回収することにより、簡便かつ効率的に宿主からハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製することができる。【０００９】
また、本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものを用いることで、より高い精製率でハイドロパシーインデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲンなどの親水性組換えタンパク質を粗精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１及び比較例１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２〜６で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図３】図３は、比較例２で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例８で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、タンパク質のハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ）は、以下のように算出したものである。まず、タンパク質中に存在するアミノ酸のハイドロパシーインデックスの総和を求める。次にその総和をタンパク質中のアミノ酸残基数で割ることにより平均値を求め、算出された平均値をタンパク質のハイドロパシーインデックスとする。なお、アミノ酸のハイドロパシーインデックスについては、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105-132.）を使用する。具体的には、各アミノ酸のハイドロパシーインデックス（以下において、ＨＩとも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
【００１２】
【表１】
2014103847.tif 000003
【００１３】
本発明者らは、ハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ）が０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主に非プロトン性極性溶媒を添加して宿主細胞を溶解させて不溶物を分離することで、上記ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が上清にて回収され、粗精製されることを見出し、本発明に至った。すなわち、宿主細胞を非プロトン性極性溶媒で溶解させることにより、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が非プロトン性極性溶媒に溶解されることを見出し、本発明に至った。以下において、特に指摘がない場合、親水性タンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性タンパク質を意味する。また、以下において、特に指摘がない場合、組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質を意味する。
【００１４】
上記非プロトン性極性溶媒は、特に限定されないが、夾雑物を低減するという観点から、純度が９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。上記非プロトン性極性溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましい。双極子モーメントは、分子の極性の強さを表す指標として用いられ、双極子モーメントが大きいほど、極性の強さも大きくなる。一般的に双極子モーメントが３．０Ｄ以上の分子は極性が強いとされ、タンパク質等の極性を持った化合物を溶解する場合には極性の大きな溶媒が有効である。下記表２に、講談社サイエンティフィック社が出版している溶剤ハンドブック（２００７年）に基づいた各種有機化合物（有機溶剤）の双極子モーメントを記載する。双極子モーメントが３．０Ｄ以上の非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１,３−ジメチル−２−イミダゾリドン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリルなどが挙げられる。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
上記溶解用溶媒が非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである場合、特に限定されないが、組換えタンパク質の純度（精製度）を高める観点から、無機塩の濃度は、０．１Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．２５Ｍ以上であり、さらに好ましくは０．５Ｍ以上である。また、上記溶解用溶媒において、無機塩の濃度の上限は特に限定されないが、飽和状態以下であることが好ましく、例えば２．５Ｍ以下にすればよい。
【００１７】
上記溶解用溶媒の添加量は、上記宿主を溶解できる量であればよく、特に限定されないが、溶解性を高める観点から、上記宿主（細胞）の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは０．７５倍以上であり、さらに好ましくは１倍以上である。また、操作の簡便性から、上記溶解用溶媒の添加量は上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは６倍以下であり、さらに好ましくは４倍以下である。上記宿主（細胞）は、乾燥した状態でもよく、湿った状態でもよい。
【００１８】
上記溶解用溶媒を宿主に添加し、宿主細胞を溶解する工程は、特に限定されないが、組換えタンパク質の溶解性の観点から、２０℃以上で行うことが好ましく、４５℃以上で行うことがより好ましく、５０℃以上で行うことがさらに好ましい。また、組換えタンパク質の分解を抑制するという観点から、上記溶解液取得工程は、１００℃以下で行うことが好ましく、９５℃以下で行うことがより好ましい。また、上記溶解液取得工程は、特に限定されないが、例えば、１０〜３００分間行うことが好ましく、より好ましくは３０〜１８０分間行うことが好ましい。
【００１９】
本発明において、不溶物の分離は、沈降物を分離できればよく、特に限定されない。取扱いの簡便性から、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、室温（２０±５℃）、８０００×ｇ〜１５０００×ｇで５〜２０分間行うことができる。上記不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
【００２０】
上記組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質であればよく、特に限定されない。抽出効率が高いという観点から、ハイドロパシーインデックスが−０．１以下であることが好ましく、−０．３以下であることがより好ましい。
【００２１】
上記組換えタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンなどからなる群から選ばれる一つのタンパク質であることが好ましい。
【００２２】
上記組換えクモ糸タンパク質は、天然型クモ糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であればよく、特に限定されない。例えば天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。上記組換えクモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの小瓶状線で産生される小吐糸管しおり糸に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状線スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
【００２３】
上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含むポリペプチドが挙げられる。なお、上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質において、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００２４】
上記式１において、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味している。上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１４残基以下であり、特に好ましくは１２残基以下である。上記式１において、ＲＥＰ２は１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、上記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
【００２５】
大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
【００２６】
上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列である。配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号４に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）のＨＩは、−０．９４８である。
【００２７】
本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。
【００２８】
また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から５４２残基目までのアミノ酸配列である。配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号５に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）のＨＩは、−０．９２である。
【００２９】
また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号６に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基から３１８残基目までのアミノ酸配列である。配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ）のＨＩは、−０．３５７である。
【００３０】
上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式２：（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｚ）ｍ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）ｌ（Ａｌａ）ｏで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
上記式２において、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｍは１〜４の範囲の整数であることが好ましく、ｌは０〜４の範囲の整数であることが好ましく、ｏは１〜６の範囲の整数であることが好ましい。
【００３２】
クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが、伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためだと考えられている。
【００３３】
上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘで示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３４】
上記式３において、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｎは４以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数、より好ましくは２０以上の整数である。
【００３５】
上記式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号８に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端の１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンと、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列である。配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号９に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ）のＨＩは、−０．４８２である。
【００３６】
クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
【００３７】
上記組換えクモ糸タンパク質は、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。ＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質は、強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として挙げられる。
【００３８】
組換えレシリンとしては、例えば天然のレシリンに由来する組換えレシリンを用いることができる。天然のレシリンに由来する組換えレシリンとしては、式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個、好ましくは４個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上含むポリペプチドが挙げられる。式４において、ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３９】
上記式４において、ＲＥＰ３は（Ｓｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏ）から構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｊは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、Ｕは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。
【００４０】
上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリン等が挙げられる。配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列である。配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリンのＨＩは、−１．２２９である。また、上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００４１】
レシリンは、昆虫のクチクラの特定の領域に存在するゴム様タンパク質であり、優れた弾性材料である。該物質の弾性能は９７％であるとされ、貯蔵エネルギーのわずか３％しか熱として損失しない。この弾性能はレシリン中のチロシン同士が架橋することによってもたらされていると考えられている。ジチロシン架橋されたレシリンはクチクラに優れた弾性を与え、昆虫の飛行システムや跳躍システムに大きな役割を果たしている。
【００４２】
組換えコラーゲンとしては、例えば天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンを用いることができる。天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンとしては、式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を５以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上連続して含むポリペプチドが挙げられる。上記式５において、ＲＥＰ４はＧｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意の一つのアミノ酸を意味する。式５において、ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００４３】
上記式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えコラーゲンが挙げられる。配列番号１３に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列である。配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えコラーゲンのＨＩは、−０．７９２である。また、上記式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いてもよい。
【００４４】
コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつであり、多細胞動物の細胞外マトリクスの主成分である。ヒトのコラーゲンは３０種類以上あることが報告されているが、いずれのコラーゲンにおいてもコラーゲン様配列と呼ばれるＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の繰り返し配列を有することがその配列的特徴として挙げられる。
【００４５】
上記組換えタンパク質は、組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、組換えタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、組換えタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記の対象タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にＨｉｓタグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００４６】
上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主（細胞）としては、例えば、タンパク質発現系に用いられる動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができ、生産コストの観点から微生物を用いることが好ましく、安全性及び操作性という観点から大腸菌を用いることがより好ましい。
【００４７】
上記組換えタンパク質は、大腸菌などの微生物を宿主とした組換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【００４８】
上記組換えタンパク質を含む溶解液を、溶媒置換することでさらに精製してもよい。溶媒置換は透析により行うことができる。透析用の溶媒（透析液）は、水を含む水系溶媒を用いることができる。水系溶媒としては、例えば、水、水と水混和性有機溶媒との混合液、水溶性緩衝液、酸性水溶液、塩基性水溶液等が挙げられる。水としては、例えば、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。酸性水溶液としては、ギ酸、酢酸、希塩酸等の酸性水溶液が挙げられ、塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの塩基性水溶液が挙げられる。水混和性有機溶媒としては、水と混合できる有機溶媒であればよく、公知のものを用いることができる。具体的には、メタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００４９】
上記組換えタンパク質を含む溶解液を水系溶媒で溶媒置換する場合、上記非プロトン性極性溶媒は、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。溶解用溶媒として環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用い、組換えタンパク質を含む溶解液を水系溶媒で溶媒置換すると、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の組換えタンパク質をより高い純度で抽出できる。環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）等が挙げられる。
【００５０】
また、溶媒置換された溶解液は、さらにカラム、濾過、遠心分離などからなる群から選ばれる一種以上の手段で処理されてもよい。カラムには、ゲル濾過カラムやイオン交換カラムなどを用いることができ、濾過には濾紙や濾過膜などを用いることができる。上記処理により、目的タンパク質（親水性組換えタンパク質）の精製度（純度）がより高くなる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００５２】
（大腸菌での組換えタンパク質の発現）
＜遺伝子の合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースより、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）を取得し、同配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加し、該配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号４に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００５３】
（２）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子の合成
キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列（配列番号１０）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１１に示す塩基配列からなるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００５４】
（３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子の合成
ヒトのコラーゲンタイプ４の部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１３）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１４に示す塩基配列からなるＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００５５】
＜タンパク質の発現＞
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを、それぞれ、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬとともに加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した（湿菌体）。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液中の菌体から調製したタンパク質溶液を用い、一般的なプロトコールに従い、ＩＰＴＧ添加に依存して目的とするタンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍは約１２．５ｋＤａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉは約２８．５ｋＤａ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉは約２４．５ｋＤａ）が発現していることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質のハイドロパシーインデックスは、−０．９４８であり、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは−１．２２９であり、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは−０．７９２であった。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（−２０℃）で保存した。【００５６】
（実施例１）
（タンパク質の精製）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約１５ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを４５ｍｌ添加し、６０℃で３０分間溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。
（２）回収した溶解液を透析することにより、ＤＭＳＯと水の溶媒置換を行った。透析液（水）は６時間置きに交換し、トータル４８時間透析を行った。透析後の溶解液を遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶媒置換後の溶解液）を回収した。
（３）溶媒置換後の溶解液４０ｍｌに５０体積％のＮｉレジン（Ｈｉｓに結合する）のスラリーを２ｍｌ加え、室温で１時間振とうした。次いで、Ｎｉレジンを回収し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍｌにて５回洗浄した後、３００ｍＭのイミダゾールを用いて目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）を溶出させ、溶出液を回収した。【００５７】
（比較例１）
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．２ｇに純水５００μｌを入れ、超音波破砕し、超音波破砕液を得た。【００５８】
実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液及びカラム溶出液、並びに比較例１で得られた超音波破砕液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。具体的には、各々のサンプル３０μＬに、２ｘＳＤＳ緩衝液（４ｗ／ｖ％  ＳＤＳ、２０ｗ／ｖ％  グリセロール、１０ｗ／ｖ％  ２−メルカプトエタノール、０．００４ｗ／ｖ％  ブロモフェノールブルー、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）３０μＬを加え、９５℃で１０分間熱処理し、室温で冷却した熱変性したタンパク質溶液を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりバンドを確認した。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図１に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（組換えタンパク質）の純度を求めた。その結果を下記表３に示した。【００５９】
【表３】
2014103847.tif 000005
【００６０】
図１には、実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液及びカラム溶出液、並びに比較例１で得られた超音波破砕液を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図１において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１は、比較例１で得られた超音波破砕液に含まれるタンパク質を示し、レーン２、３、４は、それぞれ、実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液、カラム溶出液に含まれるタンパク質を示している。図１において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図１及び表３の結果から分かるように、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解した溶解液におけるＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの純度は、大腸菌を超音波破砕して得られた超音波破砕液におけるＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの純度より高く、非プロトン性極性溶媒で大腸菌を溶解し、不溶物を分離することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）が粗精製されることを確認した。また、溶解液を水で溶媒置換することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）の純度が高くなっていた。また、溶媒置換後の溶解液をカラムで処理することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）の純度がさらに高くなっていた。【００６１】
（実施例２）
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約１５ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを４５ｍｌ添加し、６０℃で３０分間溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。【００６２】
（実施例３）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＦを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。【００６３】
（実施例４）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＡを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。【００６４】
（実施例５）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＮＭＰを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。【００６５】
（実施例６）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＩを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。【００６６】
（比較例２）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むイソプロパノール（イソプロパノールの純度：９０％）を用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。【００６７】
実施例２〜６、比較例２で得られた上清（溶解液）を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図２及び図３に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（組換えタンパク質）の精製度を求めた。その結果を下記表４に示した。【００６８】
【表４】
2014103847.tif 000006
【００６９】
図２において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１、２、３、４、５は、それぞれ、実施例２、３、４、５、６に対応する。図２において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図２から、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現する大腸菌を非プロトン性極性溶媒で溶解し、不溶物を分離することで、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製できることが分かった。図３において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は、比較例２に対応する。図３において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。【００７０】
上記表４の結果から分かるように、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒を用いた実施例で粗精製した目的の組換えクモ糸タンパク質の純度は、プロトン性極性溶媒であるイソプロパノールを用いた比較例で粗精製した目的の組換えクモ糸タンパク質の純度の２．２〜３．１倍になっており、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒を用いることで、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製できた。【００７１】
（実施例７）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．３ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加し、６０℃で３０分間静置して溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。【００７２】
（比較例３）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．３ｇに、トリス緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を１ｍｌ添加し、超音波破砕し、超音波破砕液を得た。【００７３】
実施例７で得られた上清（溶解液）及び比較例３で得られた超音波破砕液を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色した。染色後のタンパク質の電気泳動写真を、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて画像解析して、目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）の精製度を求めた。実施例７において目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）の精製度は１４．５％であるのに対し、比較例３では目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）の精製度が８．０％であった。【００７４】
（実施例８）
Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加し、６０℃で３０分間静置して溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。【００７５】
実施例８で得られた上清（溶解液）を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図４に示した。【００７６】
図４において、矢印で示しているのがＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ（分子量約２４．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析したところ、目的タンパク質（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ）の精製度は１１．６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主から、親水性組換えタンパク質を粗精製するのに用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１、２、３、６、８、１０、１２、１３、１５  アミノ酸配列
配列番号４、５、７、９、１１、１４  塩基配列
【図１】
2014103847.tif 000007
【図２】
2014103847.tif 000008
【図３】
2014103847.tif 000009
【図４】
2014103847.tif 000010
【配列表】
2014103847000001.app
【国際調査報告】
2014103847.tif 000011
2014103847.tif 000012