(57)【要約】  多様な組織型を持つ良性または悪性卵巣腫瘍において、悪性度の極めて高い卵巣明細胞腺癌を高い感度と特異度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。本発明は、卵巣明細胞腺癌の新たな検出マーカーとして、新規組織因子経路阻害因子２プロセシングポリペプチドであるＮＴ−ＴＦＰＩ２を提供する。ＮＴ−ＴＦＰＩ２の量、又はＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２との合計量を測定することにより、卵巣明細胞腺癌を検出する。また、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を特異的に認識する抗体を卵巣明細胞腺癌の検出試薬に含める。
2016084912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有する、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）プロセシングポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｉｉ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１６，０００に分画される。
（ｉｉｉ）アスパラギン結合型糖鎖切断処理後のペプチド断片が、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１２，０００に分画される。
【請求項２】
検体において、請求項１に記載のＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量を測定することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
【請求項３】
前記検体において、さらにインタクトＴＦＰＩ２量を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量と前記インタクトＴＦＰＩ２量との合計が、対照から算出した基準値を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いる抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
質量分析法を用いて前記測定を行う、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣腫瘍において極めて悪性度の高い卵巣明細胞腺癌の検出に用いられる組織因子経路阻害因子２（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２；ＴＦＰＩ２）タンパク質の新規プロセシングポリペプチド（以下「ＮＴ−ＴＦＰＩ２」と称する）、並びにＮＴ−ＴＦＰＩ２を測定対象とする卵巣明細胞腺癌検出方法に関する。より詳しくは、ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２との合計量を算出する測定法を利用した、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、及び卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は婦人科悪性腫瘍の中で最も死亡率の高い腫瘍であり、日本における年間罹患数は約７，０００から８，０００人、年間死亡者数は約４，０００人であるが、その数は年々増加すると予測されている。卵巣癌は卵巣表層上皮性の悪性腫瘍が約８５％を占め、さらに組織型により漿液性、類内膜型、粘液性、明細胞、未分化型に分類されている。その中で、明細胞腺癌は欧米人の罹患率が５％程度であるのに対し、日本人の罹患率は２０％から３０％と高い傾向が報告されている。卵巣明細胞腺癌は、Ｓｔａｇｅ  Ｉ期症例が約半数を占め、またシスプラチンやパクリタキセルなどを用いた化学療法に対する抵抗性を有しており、悪性度が極めて高いのが特徴である。【０００３】
従来、卵巣癌を検出する方法として、経膣超音波法、ＣＴ、ＭＲＩなどが用いられている。
また、全血、血球、血清、血漿などの血液成分から卵巣癌を検出する方法としては、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １２５、ＣＡ１２５）を検出対象とする方法が一般に知られている。ＣＡ１２５は、１９８１年にＢａｓｔらがヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡ４３３）を免疫原として樹立したモノクローナル抗体（ＯＣ１２５）によって認識される抗原であり、血液成分中にＣＡ１２５を検出すると高い陽性率で卵巣表層上皮性卵巣癌を示す。そのため、卵巣癌のスクリーニング、卵巣癌の治療効果の評価、治療後の経過観察などに有効な検査として広く利用されている（非特許文献１及び２）。【０００４】
しかしながら、卵巣癌全般におけるＣＡ１２５の陽性率は約８０％程度であり、偽陰性となる場合があることから約２０％程度の卵巣癌はＣＡ１２５では判別不可能となっている。悪性卵巣癌における各組織型間で比較すると、漿液性癌におけるＣＡ１２５陽性率は９０％以上を示すのに対し、明細胞腺癌におけるＣＡ１２５陽性率は約６５％と極めて低い結果となっている（非特許文献３）。ＣＡ１２５は良性腫瘍である子宮内膜症の補助マーカーとしても活用されるが、良性卵巣腫瘍と悪性卵巣腫瘍の明瞭な区分及び悪性腫瘍の組織型を同定することは困難である。【０００５】
多様な組織型を持つ卵巣腫瘍において、悪性度の極めて高い卵巣明細胞腺癌のみを血液検査で同定することが可能となれば、卵巣癌スクリーニング及び経過観察時の診断精度向上への貢献に加え、将来的には術前化学療法を含む明細胞腺癌特徴的な術前治療法開発への貢献が期待される。さらに、卵巣明細胞腺癌は卵巣子宮内膜症を発生母地とする癌化説が提唱されており、卵巣子宮内膜症の経過観察用途とその癌発生機序を解明するためにも、卵巣明細胞腺癌特徴的なマーカー分子の同定ならびに当該分子の検出方法が切望されている。【０００６】
ところで、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５；ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、３つのクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含む胎盤由来セリンプロテアーゼインヒビターである（非特許文献４）。ＴＦＰＩ２は各クニッツドメイン（ＫＤ）に３箇所のジスルフィド結合を有し、クニッツドメイン２及び３に付加されるアスパラギン結合型糖鎖構造の差異により、分子量３０，０００Ｄａ〜３５，０００Ｄａ付近に複数種分画されることが報告されている（非特許文献５）。【０００７】
ＴＦＰＩ２は、婦人科疾患との関連においては子癇前症では子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）及び正常妊婦に比べ血中ＴＦＰＩ２量が増加することや（非特許文献６）、子宮内膜症患者で血中ＴＦＰＩ２量が向上すること（特許文献１）等の知見が得られている。癌との関連においては、遺伝子レベルでの研究が盛んに行われており、子宮体癌及び卵巣癌において明細胞腺癌にて一定以上遺伝子発現が向上する群に含まれること（非特許文献７）、胃癌において遺伝子発現が向上すること（特許文献２）、癌においてＴＦＰＩ２のスプライシングバリアントであるａｓＴＦＰＩ２の遺伝子発現が向上すること（非特許文献８）等が報告されている。さらに近年、様々な癌においてＴＦＰＩ２プロモーター部ＣｐＧアイランドに過剰メチル化が生じることから、エピジェネティックマーカーの研究が盛んに行われている（特許文献３、非特許文献９、１０、１１、１２及び１３）。
一方、本発明者の荒川らはＴＦＰＩ２が卵巣癌では明細胞腺癌細胞株から特異的に産生されること、卵巣癌患者組織における遺伝子発現は明細胞腺癌患者のみで特異的に向上することを明らかとし（特許文献４）、血中ＴＦＰＩ２は健常人及び子宮内膜症例と比較して明細胞腺癌で有意に向上していることを見出した（特許文献５、非特許文献１４）。【０００８】
しかし今日まで、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチドの存在は知られていなかったし、及び当該ポリペプチドを測定対象として卵巣明細胞腺癌を検出することもその効果も当然に不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５０６９６５号
【特許文献２】特開２００８−１１８９１５号
【特許文献３】ＷＯ２００８／０８４２１９号
【特許文献４】特許公開２０１３−７９９７９号
【特許文献５】特許公開２０１３−６１３２１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６８， １３３１ （１９８１）
【非特許文献２】Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ４， １ （１９８９）
【非特許文献３】日本分子腫瘍マーカー研究会誌，２０， ９８ （２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６， ９３９（１９９４）
【非特許文献５】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．  Ｍａｙ  ２９；７６（５）：７４９−５６（１９９８）
【非特許文献６】Ｐｌａｃｅｎｔａ，２８，２２４（２００７）
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．， １１， ６４２２ （２００５）
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ. Ｍａｒ １２；６：２０.（２００７）
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．， １９７，１６（２０１０）
【非特許文献１０】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３０，１２０５（２０１０）
【非特許文献１１】Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１３０（ｉ）：１３２−９（２０１３）
【非特許文献１２】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３３（５）：１２７８−８５（２０１３）
【非特許文献１３】Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，５８（４）：１０１０−５（２０１３）
【非特許文献１４】Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ２０１３，  １２  （１０），  ｐｐ.４３４０−４３５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、多様な組織型を持つ良性または悪性卵巣腫瘍において、悪性度の極めて高い卵巣明細胞腺癌を高い感度と特異度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは鋭意検討し、哺乳細胞由来組み換えＴＦＰＩ２タンパク質及び癌細胞由来ＴＦＰＩ２タンパクに高親和性を示す抗体群を樹立し、各抗体の性状解析を行ったところ、明細胞腺癌細胞培養上清中にはインタクトＴＦＰＩ２と新規ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド（ＮＴ−ＴＦＰＩ２）が存在することを見出した。さらに、本発明者らは、卵巣腫瘍及び子宮腫瘍において、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体を用いてインタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２を測定した場合、インタクトＴＦＰＩ２単独を測定した場合に比べて卵巣明細胞腺癌の検出特異度が向上することから、ＮＴ−ＴＦＰＩ２が卵巣明細胞腺癌の検出マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
（１）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有する、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）プロセシングポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｉｉ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１６，０００に分画される。
（ｉｉｉ）アスパラギン結合型糖鎖切断処理後のペプチド断片が、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１２，０００に分画される。
（２）検体において、（１）に記載のＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量を測定することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
（３）前記検体において、さらにインタクトＴＦＰＩ２量を測定することを含む、（２）に記載の方法。
（４）前記ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量と前記インタクトＴＦＰＩ２量との合計が、対照から算出した基準値を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定する、（３）に記載の方法。
（５）配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いる抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、（５）に記載の方法。
（７）質量分析法を用いて前記測定を行う、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（８）配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、卵巣明細胞腺癌の新規検出マーカーが提供され、また多様な組織型を持つ良性卵巣腫瘍及び悪性卵巣腫瘍において極めて悪性度の高い卵巣明細胞腺癌を高い感度と特異度で陽性と検出し、良性卵巣腫瘍及び明細胞腺癌以外のその他悪性卵巣腫瘍は陰性と検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを導入した細胞の（ａ）抗ＦＬＡＧ抗体または（ｂ）陰性対照である抗ＢＮＣ抗体によるＦＡＣＳ解析結果を示した図。
【図２】分泌型ＴＦＰＩ２のＥＬＩＳＡ解析結果を示した図。縦軸は吸光度を、横軸はウェルあたりの各溶液の添加量を示す。
【図３】分泌型ＴＦＰＩ２のウエスタンブロット解析結果を示した図（写真）。
【図４】ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を用いたＣＥＬＩＳＡ解析による各マウス血清抗体価測定結果を示した図。縦軸は吸光度を示す。
【図５】分泌型ＴＦＰＩ２を用いたＥＬＩＳＡ解析による各マウス血清抗体価測定結果を示した図。縦軸は吸光度を示す。
【図６】ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を用いたＣＥＬＩＳＡ解析による各モノクローナル抗体解析結果を示した図。縦軸は吸光度を、横軸は抗体添加濃度を示す。
【図７】３種の卵巣癌細胞培養上清を用いた免疫沈降−ウエスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）解析による各モノクローナル抗体解析結果を示した図（写真）。グラフ縦軸は単位面積あたりのシグナル強度を示す。
【図８−１】２種の卵巣癌細胞培養上清を用いた３種のモノクローナル抗体のＩＰ−ＷＢ解析結果を示した図（ＷＢ像）（写真）。
【図８−２】２種の卵巣癌細胞培養上清を用いた３種のモノクローナル抗体のＩＰ−ＷＢ解析結果を示した図（Ｒｕｂｙ染色像）（写真）。
【図８−３】２種の卵巣癌細胞培養上清を用いた３種のモノクローナル抗体のＩＰ産物のアミノ酸配列解析結果を示す図。
【図９】２種のＡＩＡ測定試薬による各種卵巣癌培養上清解析結果を示した図。縦軸のＲａｔｅは単位時間当たりの４−メチルウンベリフェロンの生成量［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ）］を示す。
【図１０−１】Ｎ型糖鎖消化処理あり／なし３種の卵巣癌培養上清のＡＩＡ解析結果を示した図。
【図１０−２】Ｎ型糖鎖消化処理あり／なし３種の卵巣癌培養上清の免疫沈降回収率を示した図。
【図１０−３】Ｎ型糖鎖消化処理あり／なし３種の卵巣癌培養上清のＷＢ像を示した図。
【図１１−１】２種の卵巣癌培養上清におけるＴＦＰＩ２の経時変化のＡＩＡ解析結果を示した図。
【図１１−２】２種の卵巣癌培養上清におけるＴＦＰＩ２の経時変化のＩＰ−ＷＢ解析結果を示した図（写真）。
【図１２−１】５種の卵巣癌細胞内ＴＦＰＩ２のＡＩＡ解析結果を示した図。
【図１２−２】５種の卵巣癌細胞内ＴＦＰＩ２のＩＰ−ＷＢ解析結果を示した図（写真）。
【図１３】妊娠周期に伴うＴＦＰＩ２経時変化のＡＩＡ解析結果を示した図。
【図１４】各種婦人科腫瘍パネルのＴＦＰＩ２及びＣＡ１２５のＡＩＡ解析結果を示した図。横棒は各疾患群の中央値を示す。
【図１５】各種婦人科腫瘍パネルのＴＦＰＩ２及びＣＡ１２５測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ  Ｐｌｏｔ）を示した図。
【図１６】ＴＦＰＩ２及びＣＡ１２５のＣＣＡ及び非ＣＣＡ卵巣腫瘍検体のＲＯＣ曲線を示した図。
【図１７−１】ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列解析結果を示した図。Ａ：抗体カラム結合画分のＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色像（写真）、Ｂ：バンド＃１〜＃３から同定された配列情報の、ＴＦＰＩ２アミノ酸配列上へのマッピング結果。
【図１７−２】ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列解析結果を示した図。Ｃ：バンド＃３から検出された代表的なＴＦＰＩ２由来ペプチドの前駆イオンの質量スペクトルチャート。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜１＞本発明の組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）プロセシングポリペプチド
本発明のポリペプチドは、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）プロセシングポリペプチドである。
後述する実施例が示すように、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は癌細胞の細胞内画分には存在せず、細胞培養上清のみに存在していたことから、インタクトＴＦＰＩ２が癌細胞外に分泌された後に細胞外マトリクスに局在し、何らかの特徴的なプロセシングを経て出現するＴＦＰＩ２の断片ポリペプチドであると推測される。
【００１７】
ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、インタクトＴＦＰＩ２のＮ末端側に位置するクニッツドメイン１を含む断片である。より具体的には、配列番号１はヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列であり、その開始メチオニンから２２残基目のグリシンはシグナルペプチドである。ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、それに続く２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンもしくは１３０残基目のシステインまでの配列を少なくとも含むもの、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、本発明のポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個をいう。
ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、配列番号１に示すＴＦＰＩ２アミノ酸配列２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンまたは１３０残基目のシステインよりもＣ末端側のアミノ酸配列も含んでいてもよく、例えば１３１残基目のアミノ酸としてヒスチジンまたは１３２残基目のアミノ酸としてアルギニンを有するものも好ましい。また、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３部分を含まないことが好ましい。
また、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を認識する抗体の抗原決定基を有しないことが好ましい。
なお、インタクトＴＦＰＩ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドである。
【００１８】
また、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１６，０００に分画される。より具体的には、例えば１０〜２０質量％のグラジエントのポリアクリルアミドゲルを用いて常法に従い還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した場合に、分子量マーカー、好ましくはＦｕｌｌ Ｒａｎｇｅ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）の分子量１７，０００に相当するバンド位置より僅かに低分子側に検出される。
【００１９】
さらに、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、アスパラギン結合型糖鎖切断処理後のペプチド断片が、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１２，０００に分画される。アスパラギン結合型糖鎖切断処理は、Ｎ−グリカナーゼ等によって行うことができ、これによりアスパラギン結合型糖鎖を遊離させたポリペプチドに対して、例えば１０〜２０質量％のグラジエントのポリアクリルアミドゲルを用いて常法に従い還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した場合に、分子量マーカー、好ましくはＦｕｌｌ Ｒａｎｇｅ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）の分子量１２，０００に相当するバンド位置に検出される。
なお、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列のＮ末端から１１６残基目のアスパラギンにアスパラギン結合型糖鎖が付加している。
【００２０】
＜２＞本発明の卵巣明細胞腺癌を検出する方法
本発明の卵巣明細胞腺癌を検出する方法は、検体において、ＮＴ−ＴＦＰＩ２量を測定することを含む。これは、他の組織型と比べて卵巣明細胞腺癌細胞において特徴的に、細胞外にＮＴ−ＴＦＰＩ２が存在することに基づく方法である。この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカー（ＣＡ１２５）やインタクトＴＦＰＩ２単独を測定した場合に比べて、卵巣明細胞腺癌を特異的に高い感度と特異度で検出することができる。
本発明の検出方法では、検体において、ＮＴ−ＴＦＰＩ２量に加えさらにインタクトＴＦＰＩ２量を測定してもよい。これは、検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２との合計量に基づいて卵巣明細胞腺癌の検出の判定を行っても十分な感度と特異度が得られるからでもある。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ−ＴＦＰＩ２量を測定することによっても、卵巣明細胞腺癌の検出を行えるからでもある。
【００２１】
本発明の検出方法において、ＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
【００２２】
ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
【００２３】
抗原抗体反応を利用してＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジンまたは１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１に抗原認識部位を有する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。
（Ｂ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３に抗原認識部位を有する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。
（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１に認識部位を有する抗体を検出抗体とする。
【００２４】
本発明の卵巣明細胞腺癌を検出する方法においては、前述した（Ｃ）や（Ｄ）の方法で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を判定の基準に用いてもよいが、（Ａ）の方法で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を判定の基準に用いても十分な感度と特異度が得られるうえ、抗体の取得しやすさや測定が一段階で簡便なことから、後者がより好ましい。
【００２５】
ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
なお、免疫原として、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、またはＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けない導入した通りのＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２に対し、高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。
ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２６】
ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【００２７】
本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で用いる、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体、例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
【００２８】
本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で用いる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
【００２９】
本発明の検出方法において、質量分析法を利用してＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）等により行うことができる。
【００３０】
本発明の検出方法では、測定により得たＮＴ−ＴＦＰＩ２量が、対照から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定することが好ましい。又は、測定により得たＮＴ−ＴＦＰＩ２量とインタクトＴＦＰＩ２量との合計が、対照から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定することが好ましい。
判定に用いるＮＴ−ＴＦＰＩ２量及びインタクトＴＦＰＩ２量は、測定値もしくは換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。
基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、明細胞腺癌以外の卵巣腫瘍、子宮腫瘍、又は健常人などの卵巣明細胞腺癌ではない検体と、卵巣明細胞腺癌検体とをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。例えば、具体的には、血清を検体として用いた際のＮＴ−ＴＦＰＩ２量とインタクトＴＦＰＩ２量との合計の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって算出される測定値（ｒａｔｅ：ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））である１．９に設定してもよい。
【００３１】
＜３＞本発明の卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬
本発明の卵巣明細胞腺癌検出用の試薬は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアミノ酸から１３１残基目又は１３０残基目のアミノ酸までの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む。前記抗体は好ましくは、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である。これらの抗体はＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識することができる。
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む、卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。卵巣癌の腫瘍マーカーとしては、例えばＣＡ１２５等が挙げられる。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
【００３２】
本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。
このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
【００３３】
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）〜（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
【００３４】
次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２濃度を定量する。
【００３５】
上記のＴＦＰＩ２の検出試薬に関する説明は、卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬にも準用できる。卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬は、上記の本発明の試薬と同様に作製されたものであってもよく、従来市販されているものであってもよい。
【００３６】
検出試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、検出の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として２．５倍希釈した血清や血漿を５０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＮＴ−ＴＦＰＩ２量及びインタクトＴＦＰＩ２量の測定を行う場合、当該検体５０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
【００３７】
本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、用手法での検出にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた検出にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた検出は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく検出が可能で、かつ短時間に検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２並びに卵巣癌の腫瘍マーカーの濃度が定量可能であるため、好ましい。
【００３８】
本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法及び本発明の検出試薬の対象となる検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液などが挙げられる。また、卵巣組織生検を検査対象としてもよいが、その場合は生検試料の培養上清を検体とする。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、卵巣明細胞腺癌を簡便かつ非侵襲的に検出できるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよく、例えば、血清や血漿の場合は、２．５倍希釈した検体を５０μＬ用いればよい。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。【００４０】
＜実施例１＞  ＤＮＡ免疫用ベクターの構築
ＤＮＡ免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、対象抗原タンパク質を膜結合型タンパク質として細胞表面上に局在させるのが好ましい。ＴＦＰＩ２は本来分泌タンパク質であるため、ＴＦＰＩ２を細胞表面上に局在させるべく、ＴＦＰＩ２のＣ末端側にＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーを付加したタンパク質（以下、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２）を発現可能なプラスミドベクターを構築した。【００４１】
（１）下記（ａ）のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８）の７３から７０５塩基からなるポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ａ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号２、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３から８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号３、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）【００４２】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカーのコード領域とＦＬＡＧタグのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）で得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２の発現プラスミドを構築した。【００４３】
（３）（２）で構築した発現プラスミドに挿入されているポリヌクレオチドにより発現されるＴＦＰＩ２が、想定通り細胞表面に局在していることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３−２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ2インキュベータにて、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＴＦＰＩ２を一過性発現させた。
（３−３）（３−２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、または、陰性対照としてＦＬＡＧタグとは結合しないマウス抗ＢＮＣ抗体を添加し、３０分静置した。なお、ＢＮＣとは、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるペプチドである（特開２００９−２４０３００号）。
（３−４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行なった。【００４４】
ＦＡＣＳ解析の結果を図１に示す。解析の結果、陰性対照である抗ＢＮＣ抗体を添加した場合（図１（ｂ））は蛍光標識された細胞によるシグナルの増加、いわゆるシフトが認められなかった。一方、抗ＦＬＡＧ抗体を添加した場合（図１（ａ））は蛍光標識された細胞によるシフトが認められた。本結果より、発現したＦＬＡＧタグペプチドを付加したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２が細胞表面上に局在していることが示された。【００４５】
＜実施例２＞  免疫及び採血
マウスへの免疫は、実施例１（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを、ＤＮＡ量として４０μｇ含むよう調製したＰＢＳ溶液１００μＬを、４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに投与した。初回の免疫から７日後、１４日後、２１日後、２８日後、及び３５日後に追加投与し、初回の免疫開始後４２日目に採血して抗血清を採取し、それぞれ抗血清Ａ−１からＡ―４とした。【００４６】
＜実施例３＞  ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２恒常発現細胞の作製
抗血清評価用として、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を恒常的に発現可能なチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を以下の方法で作製した。
（１）実施例１（２）で構築したＴＦＰＩ２発現プラスミドを、常法に従いＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ遺伝子導入後、５％ＣＯ2インキュベータにて、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養した。
（２）培養後、抗生物質Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２５０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに３週間培養した。
（３）抗ＦＬＡＧ抗体を用いてセルソーターによりＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を獲得した。【００４７】
＜実施例４＞  分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドの構築
実施例１（２）で構築したＴＦＰＩ２発現プラスミドにおいて、挿入したＴＦＰＩ２遺伝子と、その３’末端側に存在するＧＰＩアンカーのコード領域との間に、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特許文献５）をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入することにより、Ｎ末端側にＦＬＡＧペプチド、Ｃ末端側にＢＮＣペプチドがそれぞれ付加され、且つＧＰＩアンカーを有さない分泌型ＴＦＰＩ２を発現可能なプラスミドを調製した。具体的調製方法を以下に示す。【００４８】
（１）下記（ｂ）のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２  ｃＤＮＡの開始コドン及び終止コドンを除いたインタクト（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の１４８番目から７８０番目の領域）の３’末端側にＢＮＣペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ｂ）分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号４、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３から８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ａｇｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｃａｔｔａｇｔｇｇｃｇａｃｇｃａｇａａｃｔｔｔｇｃａａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号５、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）【００４９】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。【００５０】
（３）プラスミドｐＦＬＡＧ１に挿入したポリヌクレオチドにより発現される分泌型ＴＦＰＩ２において、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグが付加されていることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）実施例１記載と同様に、（２）で構築した分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを２９３Ｔ細胞株へ導入して分泌型ＴＦＰＩ２を一過性発現させ、培養７２時間後の培養液を遠心分離し、上清を分泌型ＴＦＰＩ２溶液として回収した。
（３−２）分泌型ＴＦＰＩ２溶液を試料として用いて、（Ａ）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、及び（Ｂ）ウエスタンブロット（ＷＢ）法を行った。【００５１】
（Ａ）ＥＬＩＳＡ法
（Ａ−１）ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を１００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）に固相化した。
（Ａ−２）４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（Ａ−３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、分泌型ＴＦＰＩ２溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−４）０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）により３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ）で１μｇ／ｍＬになるよう希釈したマウス抗ＢＮＣモノクローナル抗体溶液を、５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−５）ＴＢＳ−Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−６）ＴＢＳ−Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。【００５２】
（Ｂ）ウエスタンブロット法
（Ｂ−１）（３−１）で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社製）に転写した。
（Ｂ−２）５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（ブロッキング溶液）を室温で２時間反応することでブロッキング後、ブロッキング溶液にアルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＣ抗体を１μｇ／シートにて添加し、４℃で一晩反応させた。
（Ｂ−３）ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（パーキンエルマー社製）を用い、得られた化学発光を感光フィルムにより検出した。
ＥＬＩＳＡ法での解析結果を図２に示す。分泌型ＴＦＰＩ２溶液（分泌型ＴＦＰＩ２培養上清）では、陰性対照（２９３Ｔ培養上清）と比較して明瞭な添加量依存的なシグナルが認められ、分泌型ＴＦＰＩ２が培養上清中に産生されていることが示された。
ウエスタンブロット法での解析結果を図３に示す。分泌型ＴＦＰＩ２溶液（分泌型ＴＦＰＩ２培養上清）では、分子量約３５ｋＤａ付近に明瞭なバンドが検出され、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＢＮＣタグを有する分泌型ＴＦＰＩ２が培養上清中に産生されていることが示された。【００５３】
＜実施例５＞  マウス抗血清の評価
実施例２で採取したマウス抗血清を、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）、及び実施例４で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液を用いたＥＬＩＳＡにより解析した。なお、特異性の検討の為、ＴＦＰＩ２とは異なるタンパク質をＧＰＩアンカー型（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーを有する）及び分泌型（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグを有する）でそれぞれ発現する発現プラスミドを、公知の遺伝子配列に基づいて上述したＴＦＰＩ２発現プラスミドと同様に構築し、２９３Ｔ細胞株やＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入して利用した。以下、当該ＴＦＰＩ２とは異なるタンパク質を、対照タンパク質ともいう。【００５４】
（１）ＣＥＬＩＳＡ解析
（１−１）９６ウェルプレートに、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び陰性対照細胞として前記対照タンパク質をＧＰＩアンカー型で発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１ウェルあたり５×１０4細胞で添加し、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、５％ＣＯ2インキュベータにて、２４時間・３７℃で培養した。
（１−２）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現細胞及び陰性対照細胞に対して２０００倍希釈した抗血清（Ａ１からＡ４）またはマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を、それぞれ１次抗体として添加し、室温にて１時間反応させた。
（１−３）反応後プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を２次抗体として添加し、室温にて１時間反応させた。
（１−４）反応後プレートを洗浄し、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。【００５５】
（２）ＥＬＩＳＡ解析
陰性対照として前記対照タンパク質を分泌型で発現する２９３Ｔ細胞株の培養上清（以下、分泌型対照タンパク質溶液ともいう）を用いた他は、実施例４（Ａ）と同様な方法で各マウス抗血清を評価した。
ＣＥＬＩＳＡ解析の結果を図４に示す。陰性対照細胞ではいずれの抗血清でもシグナルがほとんど認められなかったが、ＴＦＰＩ２発現細胞では明瞭なシグナルが認められた。本結果より実施例２で実施したＤＮＡ免疫により特異性の高い抗ＴＦＰＩ２抗血清が得られたことが示された。
ＥＬＩＳＡ解析の結果を図５に示す。ＣＥＬＩＳＡの結果同様、抗血清（Ａ１からＡ４）を用いた場合は、ＴＦＰＩ２に対してのみ明瞭なシグナルが認められ、本法でも実施例２で実施したＤＮＡ免疫により特異性の高い抗血清が得られたことが示された。
図４及び図５の結果をまとめると、実施例２で得られたマウス抗血清は、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２及び分泌型ＴＦＰＩ２のいずれに対しても特異性の高い抗血清であることがわかる。【００５６】
＜実施例６＞  ハイブリドーマの樹立
ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生可能なハイブリドーマを以下の方法により樹立した。
（１）実施例２でＤＮＡ免疫により抗体価の上昇が認められたマウスから脾臓細胞を採取し、脾細胞を回収した。
（２）回収した脾細胞とマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０とで、ポリエチレングリコール存在下で常法に従い細胞融合を実施した。
（３）ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／ＧＩＴ培地（和光純薬社製）で約１０日間培養することで抗体産生細胞ハイブリドーマを選択した。
（４）選択した抗体産生細胞ハイブリドーマの培養上清を、実施例５（１）に記載のＣＥＬＩＳＡ及び実施例４（Ａ）に記載のＥＬＩＳＡに供し、ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生可能なハイブリドーマのスクリーニングを行った。
（５）スクリーニングにより選択されたウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ない、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／ＧＩＴ培地からＧＩＴ培地に馴化培養し、最終的に１０種類のハイブリドーマ（ＴＳ−ＴＦ０１〜ＴＳ−ＴＦ１０）を樹立した。【００５７】
＜実施例７＞ 抗原認識部位の同定
各抗体の抗原認識部位を、ＴＦＰＩ２の各クニッツドメインであるＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３のバリアント発現細胞により同定した。各バリアント発現用プラスミドの具体的調製方法を以下に示す。
（１）下記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）記載のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２のＫＤ１領域、ＫＤ２領域及びＫＤ３からＣ末端領域に相当するポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。【００５８】
（ｃ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ１用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号６、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３から８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔａｔｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号７、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２５９から２７３番目の塩基配列に相当）【００５９】
（ｄ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ２用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｔｔｃｃｃａａａｇｔｔｔｇｃ−３’（配列番号８、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２７４から２８８番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｇｇｔｇｃｇｃａ−３’（配列番号９、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４４５から４５９番目の塩基配列に相当）【００６０】
（ｅ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ３用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔａｔｔｃｃａｔｃａｔｔｔｔｇｃ−３’（配列番号１０、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４６０から４７４番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号１１、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）【００６１】
（２）実施例1（２）記載の方法で３種のＧＰＩ型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。
（３）実施例３記載の方法で上記３種の一過性発現細胞を調製し、実施例６記載１０種のモノクローナル抗体の抗原認識部位を同定した。【００６２】
ＦＡＣＳ解析の結果から判明した各抗体の抗原認識部位を表１に示す。【００６３】
【表１】
2016084912.tif 000003
【００６４】
＜実施例８＞  モノクローナル抗体調製と精製抗体によるＣＥＬＩＳＡ解析
実施例６で樹立した１０種類のハイブリドーマから、以下の方法によりＴＦＰＩ２に対するモノクローナル抗体（抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体）を調製し、ＣＥＬＩＳＡ解析を実施した。【００６５】
（１）実施例６で樹立したハイブリドーマ培養上清３００ｍＬを５０％硫安で分画し、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））により透析後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、以下の方法によりモノクローナル抗体の精製を行なった。
（１−１）前記カラムをあらかじめＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ  リン酸＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））にて緩衝液置換した後、ハイブリドーマ培養上清を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで通過させた。
（１−２）カラム容量の５倍以上のＰＢＳにより十分カラムを洗浄することで、未結合タンパク質の除去を行なった。この際、カラムを通過した緩衝液のＯＤ２８０による吸光度が０．０１以下になったことを確認することで、未結合タンパク質が残存していないと判断した。
（１−３）カラム洗浄後、溶出液（１００ｍＭ  グリシン（ｐＨ２．５））により結合抗体を溶出させた。なお、溶出抗体は速やかに１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加し、中性にするとともに、ＴＢＳによる速やかな透析を行ない、各精製抗体のタンパク濃度を吸光度計により定量した。【００６６】
（２）陽性対照としてマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）、比較対照として抗ＴＦＰＩ２  Ｐ―２抗体（サンタクルズ社製）及び前記１０種の抗ＴＦＰＩ２抗体を抗体添加量が２００ｎｇ／ｗｅｌｌから２．５ｎｇ／ｗｅｌｌになるよう１％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を用いて抗体希釈溶液を調製した。
（２−１）前記抗体希釈溶液を実施例５（１）記載の方法でＣＥＬＩＳＡ解析を実施した。なお、各抗体２００ｎｇ／ｗｅｌｌのみＴＦＰＩ２発現細胞と対照細胞で解析し、６６．６ｎｇ／ｗｅｌｌ以下の抗体希釈溶液はＴＦＰＩ２発現細胞のみとした。ＣＥＬＩＳＡ解析結果を図６に示す。陽性対照である抗ＦＬＡＧ抗体はＴＦＰＩ２発現細胞及び陰性対照細胞双方で明瞭なシグナルが認められた。比較対照である抗ＴＦＰＩ２  Ｐ−２抗体はＴＦＰＩ２発現細胞対して全くシグナルが認められなかったが、当該抗体はＷＢ用途いわゆる変性タンパク検出用であり、天然型の高次構造を有するＴＦＰＩ２を用いた本解析系では反応性が認められないことは至極当然である。一方、前記１０種の抗ＴＦＰＩ２抗体は抗体間差が認められるものの総じてＴＦＰＩ２発現細胞に対して特異的かつ濃度依存的なシグナルが認められた。【００６７】
＜実施例９＞  各種モノクローナル抗体固定化磁気ビーズによる免疫沈降性能評価
実施例８で調製した１０種類の抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体の抗体固定化磁性微粒子を調製し、各抗体と特異的に結合する卵巣明細胞腺癌細胞培養上清中のタンパク質を以下の方法により同定した。なお、卵巣明細胞腺癌細胞としてはＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ及びＯＶＳＡＹＯの３種類を用いた。【００６８】
（１）実施例８で得られた精製モノクローナル抗体の一部を、常法に従いＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ磁性微粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし抗体固定化磁性微粒子を調製した。【００６９】
（２）免疫沈降−ウエスタンブロット法（ＩＰ−ＷＢ法）
（２−１）前記３種の癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬社製）にて１００％コンフルエント状態で３日間培養した。
（２−２）培養上清を遠心後、上清０．１ｍＬに対し、実施例８に記載の方法で調製した１０種の抗体固定化磁性微粒子を各々添加し、室温で１時間撹拌して反応させた。
（２−３）ＰＢＳＴ−ＮＰ４０（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％  ＮＰ４０）で２回洗浄後、界面活性剤を含まないＰＢＳで３回洗浄した。
（２−４）各抗体固定化磁性微粒子に結合したタンパク質を実施例４（Ｂ）記載のウエスタンブロットにより解析した。なお、分子量マーカーはＦｕｌｌ−Ｒａｎｇｅ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒｓ（ＧＥ社製）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルは１０−２０％グラジェントゲル（マリソル社製）用いた。ウエスタンブロットの検出用抗体は横浜市立大婦人科にて樹立されたインタクトＴＦＰＩ２のＮ末端を認識する抗ＴＦＰＩ２ペプチド抗体（非特許文献６参照）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて標識し、実施例４記載の方法で検出した。ＷＢデータの解析はＣｈｅｍｉ−Ｓｔａｇｅ付属Ｌａｂｏ１Ｄソフトウェア（クラボウ社製）で行い、各抗体の強いシグナルが認められたＡまたはＢにおける単位面積あたりのシグナル強度を数値化した。なお本検討は３回実施しており、面積Ｌａｂｏ１Ｄソフトウェア解析結果は３回の実験結果におけるシグナル平均値及び標準誤差を算出した。【００７０】
ＩＰ−ＷＢ法の解析像及びＷＢシグナルのＬａｂｏ１Ｄソフトウェア解析結果を図７に示す。培養上清中から分子量約２８，０００付近と分子量約１６，０００付近に明瞭なシグナルが検出された。本ＷＢ解析にはＴＦＰＩ２のＮ末端認識抗体を用いていることから、分子量約２８，０００付近のシグナル（Ａ）はインタクトＴＦＰＩ２に相当、分子量約１６，０００付近のシグナル（Ｂ）は何らかの理由により低分子化したＴＦＰＩ２断片ポリペプチドと推定された。また、その単位面積あたりのシグナルは抗体間で差異が認められ、クニッツドメイン１に抗原認識部位を有するＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体ではそのシグナルが高い傾向が認められた。クニッツドメイン１を含むこのＴＦＰＩ２断片ポリペプチドをＮＴ−ＴＦＰＩ２とした。【００７１】
＜実施例１０＞  質量分析法によるモノクローナル抗体結合タンパク質の同定
実施例９でＮＴ−ＴＦＰＩ２に親和性の高いことが確認されたＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体、並びに対照としてＴＳ−ＴＦ０５抗体の計３種類の抗体固定化磁性微粒子を用いたＩＰ−ＷＢの再検証を行った。また、ＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体に結合するＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドを質量分析法により解析した。卵巣癌細胞培養上清としては実施例９で調製したＯＶＩＳＥ及びＯＶＭＡＮＡの２種類を用い、実施例９記載の方法で調製したサンプルを用いてＩＰ−ＷＢを実施した。ＯＶＭＡＮＡサンプルのみ質量分析用に以下の通りサンプルを調製した。【００７２】
（１）ＯＶＭＡＮＡサンプル溶液をエバポレーターで濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、分離したタンパク質をＲｕｂｙ染色（インビトロジェン社製）により染色した。
（２）染色が認められた分子量約１６，０００付近の３種類及び染色が認められない周辺の１種類計４種類の断片（ＴＳ−ＴＦ０１：図８Ｒｕｂｙ染色のＡ及びＢに記載の断片、ＴＳ−ＴＦ０４：図８Ｒｕｂｙ染色のＣ及びＤに記載の断片）を切り出し、ジチオスレイトール及びヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化後、トリプシンによるゲル内消化を実施した。
（３）トリプシン消化により生成したペプチド断片を、Ｃ１８逆相カラムを用いた１ＤナノＬＣシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により分離し、ＬＴＱオービトラップ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりＭＳ／ＭＳ測定を行なった。得られたデータはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．３ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて解析し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。【００７３】
ＷＢ像及びＲｕｂｙ染色像及びＯＶＭＡＮＡの分子量約１６，０００付近のＩＰ産物から同定されたタンパク質を図８に示す。ＷＢ像ではＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体双方で分子量約１６，０００付近にＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドと推定される明瞭なシグナルがＯＶＩＳＥ及びＯＶＭＡＮＡ双方で認められた。Ｒｕｂｙ染色像では低分子化したＴＦＰＩ２断片ポリペプチドと推定される明瞭なバンドの分子量が若干上昇しているように認められるが、サンプル濃縮による塩濃度上昇の影響で泳動が乱れたと推察している。ＯＶＭＡＮＡ  ＩＰ産物の質量分析データより、明瞭な染色が認められたＡ、Ｂ及びＣ計３種の分子量約１６，０００付近のタンパクはＮＴ−ＴＦＰＩ２であることが証明された。また、そのＣ末端側の同定ペプチド情報（ＦＦＳＧＧＣＨ；配列番号１２）及びＮ末端認識抗体の結果から、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドは配列番号１で表されるＴＦＰＩ２タンパク質のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン残基までを少なくとも含むポリペプチドであることが明らかとなった。【００７４】
なお、本実施例ではアルギニンもしくはリジン残基を特徴的に消化するトリプシンによりゲル内消化を実施したことから、本ポリペプチドは１３１残基目のヒスチジンより後ろのＴＦＰＩ２タンパク質のＣ末端側の配列も含み得ると充分に考えられる。すなわち、本実施例はＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端の配列を限定するものではない。【００７５】
＜実施例１１＞  ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
実施例９及び実施例１０で明細胞腺癌培養上清中にはインタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２双方の存在が認められたため、固相側をクニッツドメイン１に抗原認識部位を有するＴＳ−ＴＦ０４抗体、検出側にクニッツドメイン１に抗原認識部位を有するＴＳ−ＴＦ０１抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２を包括的に測定対象とする「ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。また、固相側にクニッツドメイン１に抗原認識部位を有するＴＳ−ＴＦ０４抗体、検出側にクニッツドメイン３に抗原認識部位を有するＴＳ−ＴＦ０５抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２のみを測定対象とする「Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。【００７６】
（１）水不溶性フェライト担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０１またはＴＳ−ＴＦ０５）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、２種類の抗ＴＦＰＩ２標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製した標識抗体を０．５μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、測定試薬Ａ（ＴＳ−ＴＦ０４抗体／ＴＳ−ＴＦ０１抗体を用いたＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬）及び測定試薬Ｂ（ＴＳ−ＴＦ０４抗体／ＴＳ−ＴＦ０５抗体を用いたＩ−ＴＦＰＩ２測定試薬）の２種類のＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。【００７７】
＜実施例１２＞  ＴＦＰＩ２測定試薬の性能評価
ＴＦＰＩ２を含むサンプルとして実施例４で作製した組換えＴＦＰＩ２上清、実施例９で調製したＯＶＩＳＥ及びＯＶＭＡＮＡをＦＢＳで１０倍希釈し、ＴＦＰＩ２を含まないサンプルとしてＦＢＳのみの計４種の擬似検体サンプルをそれぞれ調製し、実施例１１で作製した２種のＴＦＰＩ２測定試薬を用いて５点測定することで前記試薬を評価した。【００７８】
評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００による測定は、
（１）希釈サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。【００７９】
各種擬似検体サンプルの測定値を表２に示す。ＦＢＳを除くいずれの擬似検体サンプルも５点測定の変動係数が３％以下を示しており、実施例１１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬にて得られる結果が信頼し得る結果であることが証明された。【００８０】
【表２】
2016084912.tif 000004
【００８１】
＜実施例１３＞ 各種卵巣癌細胞培養上清パネルによるＴＦＰＩ２測定試薬の検証
本発明者の荒川らは、明細胞性、漿液性及び粘液性の各種卵巣癌培養細胞パネルにおいて、培養上清を質量分析法により、細胞中の遺伝子発現をＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲにより解析し、明細胞性のみで特徴的に産生される分子としてＴＦＰＩ２を同定した（特許文献４）。従って、実施例１１記載のＴＦＰＩ２測定試薬でも同様に明細胞腺癌培養上清のみでＴＦＰＩ２測定値が高値を示せば、本試薬の測定対象はＴＦＰＩ２と判断できる。荒川らが使用した各種卵巣癌細胞培養上清パネルをＴＦＰＩ２測定試薬により解析した。【００８２】
１）１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬社製）にて以下の細胞群を１００％コンフルエント状態で３日間培養した。
明細胞性：ＯＶＩＳＥ、ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＳＡＹＯ
漿液性  ：ＯＶＫＡＴＥ、ＯＶＳＡＨＯ
粘液性  ：ＲＭＵＧ−Ｓ、ＭＣＡＳ
２）実施例１２記載の方法で、計８種類の培養上清を２種のＴＦＰＩ２測定試薬により解析した。【００８３】
解析結果を図９に示す。明細胞性においてＯＶＴＯＫＯを除く３種全てにおいて高いシグナルを示す一方、漿液性及び粘液性ではシグナルがほとんど認められなかった。また、測定試薬間の相関性は非常に高いことが示された。本結果より、ＴＦＰＩ２測定試薬はＴＦＰＩ２を測定対象としていることが示された。【００８４】
＜実施例１４＞  Ｎ−グリカナーゼ処理によるＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドの分子量検証
ＴＦＰＩ２はＵｎｉＰｒｏｔ等の一般的なデータベース及び文献等のこれまでの公知情報から、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１１６残基目及び１７０残基目の２か所のアスパラギンにアスパラギン結合型糖鎖が付加していることが知られている。従って、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドは実施例１０の結果から１１６残基目のアスパラギン結合型（Ｎ型）糖鎖を含む糖タンパクと予測されるため、Ｎ−グリカナーゼを用いた糖鎖消化処理によるＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドの分子量変化を、実施例１０記載の３種の抗体と、Ｎ−グリカナーゼ処理区または未処理区の実施例９記載のＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ及びＯＶＳＡＹＯ上清とを用いてＩＰ−ＷＢを行い検証した。同時に、上清中ＴＦＰＩ２のＩＰ効率を、実施例１１で作製した測定試薬を用いて算出するＩＰ−ＡＩＡにより検証した。【００８５】
（１）４００μＬのＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ及びＯＶＳＡＹＯ上清を２試験区設け、片方の試験区にはＮ−グリカナーゼ処理区として１０００ＵのＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ社製）を添加し、残るもう一方は未処理区とした。双方の試験区とも３７℃で１６時間反応させた。
（２）１抗体区あたり１００μＬの（１）で処理した上清を用い、対照として磁性微粒子のみの添加区を、３種の抗体固定化磁性微粒子添加区の計４試験区を設け、実施例９記載の方法でＩＰを実施した。反応後の溶液をマグネットにより上清及び磁性微粒子画分に分離した。
（３）上清画分は実施例１０記載の２種類の測定試薬で測定し、Ｎ−グリカナーゼ処理によるＴＦＰＩ２測定値への影響及び３種の抗体のＩＰ効率を算出した。ＩＰ効率（回収率（％））は、１００−（（２）記載上清の測定値/抗体未固定の磁性微粒子反応溶液測定値）から算出した。
（４）磁性微粒子画分には実施例９記載の方法でＷＢを実施し、その発光シグナルを検出した。【００８６】
Ｎ-グリカナーゼ処理によるＴＦＰＩ２測定値への影響及びＩＰ回収率、ならびにＷＢ像を図１０に示す。
ＴＦＰＩ２の測定値及びＩＰ効率はいずれもＮ−グリカナーゼ処理の有無で変動がなく、Ｎ−グリカナーゼ処理による反応系の阻害は認められなかった。ＩＰ効率においては、ＴＳ−ＴＦ０４及びＴＳ−ＴＦ０１ＩＰ区は、３種の上清と２種の測定系いずれの結果においても回収率が９７％以上と高く、ほぼ完全にＴＦＰＩ２分子を回収していることが示された。一方、ＴＳ−ＴＦ０５ＩＰでは、Ａ）ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬による回収率は４点平均７４．３％なのに対し、Ｂ）Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬による回収率は４点平均９１．３％と有意な差異が認められた。ＴＳ−ＴＦ０５は、ＴＳ−ＴＦ０４及びＴＳ−ＴＦ０１とは異なるＴＦＰＩ２の領域を認識することが示唆された。【００８７】
ＷＢ結果より、Ｎ−グリカナーゼ未処理ではＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体双方で、分子量約１６，０００付近にＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドと推定される明瞭なシグナルが、３種の培養上清全てにおいて認められた。一方、Ｎ−グリカナーゼ処理区では、分子量約１２，０００付近にＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドと推定される明瞭なシグナルが、３種の培養上清全てにおいて認められた。ＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体の親和性が高いＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドと推定されるシグナルが、糖鎖消化により分子量が明瞭に減少したことから、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドはＮ型糖鎖修飾を受けていることが明らかとなった。【００８８】
＜実施例１５＞  ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドの経時的変化の検証
ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドの産生機構解明を目標として、培養上清中におけるＴＦＰＩ２の経時的な動態を、実施例９記載のＩＰ−ＷＢまたは実施例１４記載のＩＰ−ＡＩＡ法により検証した。
（１）ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ及びＯＶＳＡＹＯ細胞を１５ｃｍディッシュにてコンフルエントな状態になるまで前培養した。
（２）各ディッシュに新たな培地２０ｍＬを加え、培養２４、４８、７２、及び１４４時間後の培養上清をそれぞれ経時的に回収した。
（３）（２）で回収した上記４点の上清を、実施例９記載の方法で抗体あたり１００μＬの上清を用いてＩＰを実施し、３種の抗体固定化磁性微粒子を含む溶液をマグネットにより上清及び磁性微粒子画分に分離した。
（４）上清画分は実施例１１記載の２種類の測定試薬で測定し、培養上清中ＴＦＰＩ２量の経時変化を測定した。
（５）培養期間によりＴＦＰＩ２が経時的に向上することから、ＷＢを実施する際に回収時間の異なる計４点のＴＦＰＩ２量を平均化する必要がある。そこで（４）の２４時間後の培養上清中のＴＦＰＩ２測定値を基に、以降３点の磁性微粒子画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加量を適宜希釈して各レーンのＴＦＰＩ２添加量を調整し、実施例９記載のＷＢを実施した。経時的に回収した培養上清のＴＦＰＩ２測定値及びＷＢ像を図１１に示す。【００８９】
培養上清中のＴＦＰＩ２は、ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系及びＩ−ＴＦＰＩ２測定系の双方で経時的な増加傾向が認められた。ＷＢ結果より、培養１４４時間後に回収した上清中ではＴＳ−ＴＦ０１抗体及びＴＳ−ＴＦ０４抗体双方で分子量約１６，０００付近にＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドと推定される明瞭なシグナルがＯＶＩＳＥ及びＯＶＭＡＮＡ培養上清において認められた。本シグナルはＯＶＩＳＥ及びＯＶＭＡＮＡ双方で経時的に増加すること、ＯＶＭＡＮＡでは２４時間後から存在することが明らかとなった。【００９０】
＜実施例１６＞  癌細胞内ＴＦＰＩ２分子の検証
実施例１３及び１４により、培養上清中にインタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドが産生することが示されたが、当該分子が細胞内にも局在することも考えられる。従って、細胞内のＴＦＰＩ２分子をＩＰ−ＷＢ法により検証した。
１）明細胞性としてＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ及びＯＶＳＡＹＯを、漿液性としてＯＶＫＡＴＥ及びＯＶＳＡＨＯを実施例１３記載の方法で培養した。
２）細胞可溶化剤として２Ｍチオウレア、７Ｍウレア、３％ＣＨＡＰＳ、1％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００溶液を調製し、細胞培養プレートから培地を除去しＰＢＳで３回洗浄後、細胞可溶化剤を培養プレートに添加した。
３）セルスクレーパーにより細胞を剥がし、１５，０００ｒｐｍで２０分遠心分離後、その上清画分を細胞抽出液とした。
４）上記細胞抽出液を用いて、実施例１１記載の２種類のＴＦＰＩ２測定試薬による測定、及び実施例９記載の３種の抗体によるＩＰ−ＷＢを実施した。【００９１】
ＴＦＰＩ２測定試薬による解析結果及びＷＢ像を図１２に示す。ＴＦＰＩ２の発現特異性は細胞内でも培養上清と同様に明細胞性特異的であることが示された。また、細胞内には分子量２４，０００から３１，０００の間に２本の明瞭なシグナルが認められた。当該シグナルは分子量より糖鎖の付加したインタクトＴＦＰＩ２及び糖鎖が付加していないインタクトＴＦＰＩ２と推定される。一方、ＮＴ−ＴＦＰＩ２に相当する分子量１６０００付近のシグナルは検出下限以下であった。本結果より、細胞内にはインタクトＴＦＰＩ２分子は多量に存在するものの、ＮＴ−ＴＦＰＩ２はごく微量もしくは存在しない可能性が示唆された。【００９２】
実施例１４、１５、１６より、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドは明細胞腺癌にて産生されるＮ型糖鎖を有する分子量約１６０００付近に分画される糖タンパクポリペプチドであること、培養上清に産生され継時的に蓄積すること、癌細胞内ではインタクトＴＦＰＩ２と比較してごく微量もしくは発現していないことが示された。ＮＴ−ＴＦＰＩ２の産生機序としては細胞外へ分泌後に何らかの要因でプロセシングを受けていることが考えられる。【００９３】
＜実施例１７＞  妊婦血清検体のＴＦＰＩ２測定
本実施例で使用した６２例の妊婦血清検体（ＰＲＯＭＥＤＤＸ社購入検体）は第１三半期から第３三半期を含む妊娠５週齢から４０週齢の検体であり、いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米人血清検体である。
全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製）を評価用装置とし、実施例１１で作製したＡ）ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬及びＢ）Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬の２種類を用いて測定した。【００９４】
ＴＦＰＩ２測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ  Ｐｌｏｔ）を図１３に、各測定試薬の第１、２及び３三半期における最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における濃度範囲を表３に示す。ＴＦＰＩ２測定値は妊娠週齢と血中濃度に高い相関性が示されたことから、実施例１１で作製した２種の測定試薬は、何れも検体中のＴＦＰＩ２を測定対象としていることが示された。【００９５】
【表３】
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【００９６】
＜実施例１８＞  卵巣癌検体のＴＦＰＩ２測定
本実施例で使用した検体パネル（１２３例）を表４に示す。本検体は横浜市立大婦人科にて同一プロトコルにて収集された血清検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けている。【００９７】
【表４】
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【００９８】
全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製）を評価用装置とし、実施例１１で作製した２種のＴＦＰＩ２測定試薬及びＣＡ１２５測定試薬（東ソー社製、承認番号２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系及びＩ−ＴＦＰＩ２測定系のＴＦＰＩ２測定値及びＣＡ１２５測定値を図１４に示す。ＣＡ１２５は卵巣癌悪性全般で高値傾向を示すが、ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系及びＩ−ＴＦＰＩ２測定系の測定値は明細胞腺癌で高値傾向を示した。
本パネル解析結果を良性卵巣腫瘍、子宮内膜症、境界悪性腫瘍、明細胞腺癌、その他悪性卵巣腫瘍の５群に分類した結果を図１５に、２種のＴＦＰＩ２測定値及びＣＡ１２５測定値の各群における最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における濃度範囲を表５に示す。ＣＡ１２５は良性卵巣腫瘍に比べ子宮内膜症で高値、さらに悪性腫瘍全般で明瞭な高値傾向を示した。ＣＡ１２５は子宮内膜症の補助マーカーであることから良性腫瘍において子宮内膜症で高値を示すことは妥当である。明細胞腺癌とその他悪性卵巣腫瘍間では中央値がほぼ等しいことから、ＣＡ１２５では明細胞腺癌を見分けることは不可能であるといえる。一方、ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系及びＩ−ＴＦＰＩ２測定系の測定値は明細胞腺癌のみで高値傾向が認められたが、ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系の測定値の方がより高値傾向にあることが示された。【００９９】
【表５−１】
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【０１００】
【表５−２】
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【０１０１】
卵巣明細胞腺癌群及びその他卵巣腫瘍群間におけるＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系、Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系及びＣＡ１２５測定データの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図１６に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）及び有意差検定におけるＰ値を表６に示す。卵巣明細胞腺癌群及びその他卵巣腫瘍群間における２種のＴＦＰＩ２測定値の有意差は、いずれもｐ＜０．０００２を示し、統計的有意差が認められたことから、２種のＴＦＰＩ２測定試薬はＣＡ１２５に比べ卵巣明細胞腺癌の検出に有用であることが示された。また、インタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２を包括的に測定するＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系はインタクトＴＦＰＩ２のみを測定するＩ−ＴＦＰＩ２測定系と比較してＰ値ならびにＡＵＣも上回ることが示された。【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
次に、ＴＦＰＩ２基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を上記ＲＯＣ解析から得られた値とし、及びＣＡ１２５の基準値は一般的な基準値付近である３６Ｕ／ｍＬとした場合の卵巣明細胞腺癌群及びその他卵巣腫瘍群間における感度及び特異度を表７に示す。ＣＡ１２５にとっては不利な条件であるが、少なくとも明細胞腺癌を特異的に診断する目的ではＴＦＰＩ２の有用性が明らかとなった。また、Ａ）ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬はＢ）Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬と比較して特異度が高いことが示された。【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
ＴＦＰＩ２を上記基準値、ＣＡ１２５を一般的な基準値である３５Ｕ／ｍＬとした場合の実施例１７記載の全臨床検体の陽性率を表８に示す。Ａ）ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定試薬は、本パネルにおいて擬陽性が極端に低くかつ明細胞腺癌を高い確率で陽性と判別可能となり、明細胞腺癌診断マーカーとしての性能を有していることが示された。【０１０６】
【表８】
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【０１０７】
＜実施例１９＞  質量分析法によるＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列解析
ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列を、重酸素水法を用いた質量分析法により解析した。
卵巣癌細胞培養上清としては実施例９で調製したＯＶＭＡＮＡを用い、ＴＳ−ＴＦ０１抗体カラムを用いて質量分析用に以下の通りサンプルを調製した。
（１）ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳカラム（ＧＥヘルスケア社製）とＴＳ−ＴＦ０１抗体を用いて常法に従いＴＳ−ＴＦ０１抗体結合カラムを作製した。
（２）ＯＶＭＡＮＡ培養上清１０ｍＬをシリンジにて抗体カラムに３回通液し、ＴＢＳで３回洗浄を行った。
（３）０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）溶液１ｍＬを抗体カラムに３回通液し、抗体カラム結合画分溶液として回収した。
（４）抗体カラム結合画分溶液をトリクロロ酢酸で濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色（インビトロジェン社製）により染色した。
（５）染色が認められた計３種類（図１７Ａ：ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色の＃１〜＃３に記載の断片）のゲル断片を切り出し、アセトニトリルにて脱水後、Ｖ８プロテアーゼ（シグマ社製）を用いてゲル内消化を行った。その際、得られるＣ末端配列がゲル内消化によって生じたものなのか、あるいは細胞のプロセシング作用によって生じたものなのかを質量情報から区別するために、ゲル内消化反応は通常の超純水（Ｈ2Ｏ16）と重酸素水（Ｈ2Ｏ18）を１：１の割合で混合した１０ ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中で行った。
（６）ペプチド消化物をＣ１８逆相ナノＬＣシステムに連結したトリプルＴＯＦ５６００質量分析装置（ＡＢＳｃｉｅｘ社製）にて分析した。測定データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔソフトウェア(ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製)を用いてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてアミノ酸配列を同定した。【０１０８】
抗体カラム結合画分のＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色像を図１７Ａに、バンド＃１〜＃３から同定された配列情報をＴＦＰＩ２アミノ酸配列上にマッピングした結果を図１７Ｂに、バンド＃３から検出された代表的なＴＦＰＩ２由来ペプチドの前駆イオンの質量スペクトルを図１７Ｃに、対応するイオンの同定情報を表９に示す。抗体カラム結合画分のＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色像で強いシグナルを示す２８ ｋＤａ（＃１）、２４ ｋＤａ（＃２）、及び１７．５ ｋＤａ（＃３）のバンドは、全てＴＦＰＩ２ペプチドであることが示された。コンフィデンス値９９以上、かつＮ末端の直前がグルタミン酸（Ｅ）あるいはアスパラギン酸（Ｄ）残基を有するペプチド（分泌シグナル配列の直下の23ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥ34（配列番号１３）は除く）の中で、124ＫＦＦＳＧＧＣＨ131（配列番号１５）、及び124ＫＦＦＳＧＧＣ130（配列番号１６）は、＃３からのみ検出された。【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
Ｃ末端配列同定を目的とする本実施例において、Ｖ８プロテアーゼによるゲル内消化の実験系には超純水（Ｈ2Ｏ16）と重酸素水（Ｈ2Ｏ18）を１：１で混合した水溶液を用いた。ゲル内でプロテアーゼ消化されたペプチドはＣ末端がＯ16とＯ18で同程度にラベルされるが、細胞培養時にプロセシング作用で生じたＣ末端はＯ18ラベルされない。
本実施例で検出されたペプチドの前駆イオンの質量スペクトルの代表例（図１７Ｃ）、及び対応するイオンの同定情報（表９）から内部ペプチドと想定される23ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥ34（配列番号１３）や81ＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥ90（配列番号１４）は、Ｃ末端がＯ18でラベルされて生じたペプチドと、通常のＯ16から生じたペプチドとが同時に検出・同定された。例えば図１７Ｃに示すように、23ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥ34（配列番号１３）は、Ｏ16及びＯ18でラベルされたｍ／ｚ ６０８．７６及びｍ／ｚ ６０９．７６となる２価イオンのモノアイソトープイオンがそれぞれ検出され、それらに付随するアイソトポマーが混在した形で前駆イオンが検出された。81ＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥ90（配列番号１４）の場合も同様であり、本データはこれらのペプチドがＣ末端ではないことを示しており、Ｃ末端配列同定を主旨とする本解析系の妥当性を実証するものである。
一方、124ＫＦＦＳＧＧＣＨ131（配列番号１５）、124ＫＦＦＳＧＧＣ130（配列番号１６）、及び203ＤＣＫＲＡＣＡＫＡＬＫ212（配列番号１７）は、Ｏ16でラベルされて生じたペプチドは、検出・同定されたものの、Ｏ18でラベルされて生じたペプチドは検出されなかった。従って、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列はＨｉｓ１３１又はＣｙｓ１３０であることが強く示唆される。【０１１１】
本明細書の実施例から総合的に勘案すると、ウエスタンブロットで検出される全長ＴＦＰＩ２はバンド＃１とバンド＃２に相当し、Ｎ末端はＡｓｐ２３、Ｃ末端はＬｙｓ２１２となり、Ｌｙｓ２１２以降の配列は何らかの理由で切断を受けることが推測される。バンド＃１とバンド＃２とでＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度が異なるのは、ＴＦＰＩ２の糖鎖構造の違いに起因する可能性がある。一方、ＷＢで検出される１７．５ ｋＤａのＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドはバンド＃３に相当し、Ｎ末端は全長ＴＦＰＩ２と同じくＡｓｐ２３であるが、Ｃ末端はＨｉｓ１３１又はＣｙｓ１３０であることが明らかとなった。
また、バンド＃３から全長ＴＦＰＩ２のＣ末端側に位置する203ＤＣＫＲＡＣＡＫＡＬＫ212（配列番号１７）も検出されたことから、バンド＃３にはＮＴ−ＴＦＰＩ２とＡｒｇ１３２よりＣ末端の配列を有するポリペプチド、いわゆるＣＴ−ＴＦＰＩ２が混在していることを示唆される。しかしながら、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチドのＣ末端配列は、重酸素水法による質量情報から定義されたものであり、その妥当性を否定するものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、卵巣明細胞腺癌の新規検出マーカーが提供され、また多様な組織型を持つ良性卵巣腫瘍及び悪性卵巣腫瘍において卵巣明細胞腺癌のみを高い感度と特異度で検出する方法が提供される。これらは、卵巣明細胞腺癌のスクリーニング及び術後経過観察、あるいは子宮内膜症の経過観察等の用途に好適に供せるため、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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