(57)【要約】LAG3+ Tregにより産生されたTGF-beta3により、B細胞活性化が抑制されることを見出した。またTGF-beta3又はTGF-beta3機能を有する分子を含むB細胞活性化の抑制剤および自己免疫疾患の治療剤を見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-beta3を含むB細胞活性化の抑制剤。
【請求項２】
前記B細胞は自己反応性B細胞である請求項1に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記TGF-beta3はB細胞による抗体産生を抑制する請求項1又は請求項2に記載の抑制剤。
【請求項４】
請求項1乃至3のいずれかに記載の抑制剤を含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項５】
TGF-beta3と抗体又は抗体断片とが連結された分子を含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項６】
前記抗体又は抗体断片はB細胞を認識する可変領域を含む請求項5に記載の治療剤。
【請求項７】
前記可変領域はCD19、CD20、CD40、CD22、IL21R、BAFF-R、BCMA、TACI、CD27、又はCD138に含まれるいずれか1つまたは複数をマーカーとして前記B細胞を認識する請求項6に記載の治療剤。
【請求項８】
TGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体を含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項９】
前記自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス、天疱瘡、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ANCA関連血管炎、関節リウマチ、移植臓器拒絶、シェーグレン症候群、若年性皮膚筋炎、重症筋無力症、又はバセドウ病、橋本病等の自己免疫性甲状腺疾患のいずれかである請求項4〜8のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１０】
請求項4〜9のいずれかの治療剤を含む医療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はB細胞活性化の抑制剤、自己免疫疾患の治療剤、及びこの治療剤を含む医療用キットに関する。より具体的には、本発明はTGF-beta3を含むB細胞活性化の抑制剤、及びこの抑制剤を用いた自己免疫疾患の治療剤に関する。さらに、本発明は、TGF-beta3と抗体又は抗体断片とが連結された分子を含む自己免疫疾患の治療剤に関する。さらに、本発明は上記治療剤を含む医療用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己抗体は、複数の臓器系での重篤な炎症によって特徴付けられる全身性エリテマトーデス（SLE）などの様々な自己免疫疾患を誘導する事が知られている（非特許文献１）。高親和性の自己抗体の主な起源は、胚中心（germinal center : GC）で体細胞超変異を受けた自己反応性B細胞である（非特許文献２）。CXCR5を発現する濾胞性ヘルパーT（follicular helper T cell : TFH）細胞は、B細胞と共にGCの形成およびその後の長寿命のプラズマ細胞への分化を可能にするように機能的に特殊化したヘルパーT細胞である。それゆえ、GCにおけるTFH細胞およびメモリーB細胞集団の質と量の制御の破綻は、自己免疫疾患の病態と密接に関係している。Foxp3を発現するCD4+CD25+ レギュラトリーT細胞（CD25+ Treg）は、自己寛容の維持において重要な役割を果たし、従来型のT細胞および樹状細胞の活性化を抑制する（非特許文献３）。さらに、多くの報告から、CD4+CD25+CXCR5+濾胞性Treg（TFR）（非特許文献２）およびCD4+CD25+CD69- Treg（非特許文献４）を含む、CD25+ Tregの液性免疫の制御における重要な役割が示唆されている。これらの知見は、CD25+ Tregが自己反応性免疫を全身で抑制していることを明確に示している; しかしながら、機能的なCD25+ Tregの欠損によって誘導される疾患の病態は、SLEとは異なっており（非特許文献１、５）、SLEにおけるCD25+ Tregの役割は明らかになっていない（非特許文献６）。一方で、最近のマウスにおけるCD8+ Treg研究の進展により、B細胞寛容維持のためQa-1拘束性CD8+ Tregの重要性が明らかになってきた。CD8+ Tregの機能障害を有するマウスは、TFHの顕著な増加を伴うループス様疾患の病態を示す（非特許文献７）。また全身性自己免疫反応を呈するB6.Yaa変異体マウスではCD8+ Treg活性が顕著に欠損していることが知られている（非特許文献８）。それにもかかわらず、ヒトの自己免疫反応制御におけるCD8+ Tregの実際の関与は未だ明らかになっていない。【０００３】
ジンクフィンガー型転写因子であるearly growth response gene 2（Egr2）は、後脳発達および末梢神経系の髄鞘形成において重要な役割を果たす（非特許文献９）。T細胞において、Egr2は、T細胞活性化を負に制御することによりT細胞アナジーの維持に重要な役割を果たしている（非特許文献１０）。全身の自己免疫反応の制御におけるEgr2の関与は、リンパ球特異的Egr2欠損マウスが、Foxp3を発現するCD25+ Tregに影響を与えずにループス様の疾患を呈するという知見によって初めて見出された（非特許文献１１）。さらに、BおよびT細胞においてEgr2およびEgr3の両方に欠損があるマウスは、致死かつ早発型の全身性自己免疫疾患を呈することから、B細胞寛容の制御におけるEgr2およびEgr3の相乗的な役割が示唆される（非特許文献１２）。本発明者らおよび本発明者らの共同研究者は、EGR2における遺伝子多型がヒトでのSLE感受性に影響を与えることを明らかにした（非特許文献１３）。また、本発明者らは、Egr2によって制御されるCD4+CD25-LAG3+ Treg（LAG3+ Treg）の存在を明らかにした（非特許文献１４）。LAG3は、MHCクラスIIに結合するCD4関連分子であり、この結合がITAMを介した阻害性シグナル伝達を樹状細胞に誘導する（非特許文献１５）。脾臓中およそ2%のCD4+CD25- T細胞集団がLAG3を発現している。これらのLAG3+ Tregは高レベルのインターロイキン（IL）-10を産生し、大腸炎のマウスモデルにおいてIL-10依存的に病態を抑制する。またCD25+ Tregとは異なり、LAG3+ Tregの分化は胸腺において発現する選択ペプチド/MHCリガンドとの高親和性相互作用に依存しない。最近、Gaglianiらは、LAG3およびCD49bの同時発現がIL-10を産生する1型制御性T（Tr1）細胞に特異的であることを報告しており（非特許文献１６）、LAG3が、IL-10を産生するFoxp3非依存的CD4+ Tregのマーカーの1つであることが示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tsokos, G.C. Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 365, 2110-2121 (2011).
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【非特許文献３】Sakaguchi, S. & Powrie, F. Emerging challenges in regulatory T cell function and biology. Science 317, 627-629 (2007).
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【非特許文献５２】Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.Nat Immunol. 2012;13:991-999
【非特許文献５３】Kontermann, RE. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics. Current Oppinion in Biotechnology. 2011;6:868-876
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Egr2と自己抗体を介する全身性の自己免疫反応との関連性から、Egr2を発現するLAG3+ TregのB細胞応答制御への関与が示唆された。しかし、LAG3+ Tregによる液性免疫制御メカニズムは明らかになっておらず、特にLAG3+ TregによるB細胞活性化抑制を介在する因子は特定されていなかった。
本発明は、LAG3+ Tregによる作用メカニズムを解明すると共に、この知見に基づく新規なB細胞活性化の抑制剤および自己免疫疾患の治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、LAG3+ Tregにより産生されたtransforming growth factor-beta3（TGF-beta3）がB細胞応答の制御に関与することを実証した。更に、本発明者らは、TGF-beta3の導入がSLE病態モデルマウスの1つであるMRL/lprマウスの病態を有意に改善することを確認した。更に、本発明者らは、ヒトLAG3+ TregにおいてもマウスLAG3+ Tregと同様の機構を通じて、TGF-beta3を介したB細胞活性化の抑制が起こり得ることを見出した。【０００７】
本発明はこれらの新たな知見に基づくものであり、TGF-beta3を用いた抑制剤および治療剤を提供するものである。【０００８】
より具体的には、本発明は以下に関する。
〔１〕TGF-beta3を含むB細胞活性化の抑制剤。
〔２〕前記B細胞は自己反応性B細胞である〔１〕に記載の抑制剤。
〔３〕前記TGF-beta3はB細胞による抗体産生を抑制する〔１〕又は〔２〕に記載の抑制剤。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抑制剤を含む自己免疫疾患の治療剤。
〔５〕TGF-beta3と抗体又は抗体断片とが連結された分子を含む自己免疫疾患の治療剤。
〔６〕前記抗体又は抗体断片はB細胞を認識する可変領域を含む〔５〕に記載の治療剤。
〔７〕前記可変領域はCD19、CD20、CD40、CD22、IL21R、BAFF-R、BCMA、TACI、CD27、又はCD138に含まれるいずれか1つまたは複数をマーカーとして前記B細胞を認識する〔６〕に記載の治療剤。
〔８〕TGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体を含む自己免疫疾患の治療剤。
〔９〕前記自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス、天疱瘡、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ANCA関連血管炎、関節リウマチ、移植臓器拒絶、シェーグレン症候群、若年性皮膚筋炎、重症筋無力症、又はバセドウ病、橋本病等の自己免疫性甲状腺疾患のいずれかである〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の治療剤。
〔１０〕〔４〕〜〔８〕のいずれかの治療剤を含む医療用キット。
また、本発明は以下にも関する。
〔１１〕TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体を投与する工程を含む、B細胞活性化の抑制方法。
〔１２〕TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体を投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法。
〔１３〕B細胞活性化の抑制において用いるための、TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体。
〔１４〕自己免疫疾患の治療において用いるための、TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体。
〔１５〕B細胞活性化の抑制剤の製造における、TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体の使用。
〔１６〕自己免疫疾患の治療剤の製造における、TGF-beta3；TGF-beta3と抗体若しくは抗体断片とが連結された分子；又はTGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】LAG3+ TregによるEgr2依存的な抗体産生制御を示す図である。（a）WT CD4+CD25-LAG3+制御性T細胞（LAG3+ Treg）の養子移入有りまたは無しでの7日時点の野生型（WT）マウスまたはEgr2CKOマウス由来のCD4+CD25-CXCR5+PD-1+ TFHおよびB220+GL-7+Fas+ GCBのフローサイトメトリープロットおよび定量化（n = 5/群）。（b）図8aに記述されているように、WT LAG3+ Tregの養子移入有りまたは無しでNP-OVA/alumを1回免疫したEgr2CKOマウスおよびWTマウスのNP特異的抗体応答（n = 6/群）。（c,d）LAG3+ TregによるインビトロでのB細胞抑制。抗CD3 mAbで刺激した各T細胞サブセットを、刺激したB細胞と共培養した。（c）B220+ B生細胞を、抗IgMによる刺激から72時間後にアネキシンV/PI染色によって定量化した（n = 3/群）。（d）抗CD40抗体/IL-4で刺激したB細胞の培養上清における総IgGを、7日目にELISAによって測定した（n = 3/群）。（e）インビボでのNP特異的抗体応答。図8bに記述されているように、C57BL/6（B6）B細胞およびOT-II CD4+CD25-LAG3-ヘルパーT（Th）細胞を、B6 LAG3+ TregまたはEgr2CKO LAG3+ Tregと共にまたは伴わずに、NP-OVA/alumを2回免疫したRag1KOマウスへ移入した（n = 6/群）。（f）eと同じマウス由来の脾臓CD4+CD25-CXCR5+PD1+ TFHおよびB220+GL7+IgG1+ GCBのフローサイトメトリープロットおよび定量化。（g）図8dに記述されているように、非リンパ球減少TEaマウスでのLAG3+ TregによるB細胞抑制（n = 6/群）。*P < 0.05（Student独立両側t検定）。データは独立した3回の実験の代表例を示す。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図２】LAG3+ Tregによる、Fasを介したB細胞機能制御を示す図である。（a〜d）MRL/lprマウスへのT細胞サブセットの養子移入。10週齢のMRL/lprマウスに、MRL/+マウス由来のLAG3+ Treg（n = 9）、CD4+CD25-LAG3- T細胞（LAG3- T）（n = 9）、CD4+CD25+ Treg（CD25+ Treg）（n = 9）、またはCD4+CD25-CD45RBhigh T細胞（ナイーブT）（n = 8）（各細胞1×105個）を静脈内（i.v.）注射した。LAG3+ Treg×3群のマウス（n = 8）には、10週齢の時点でLAG3+ Treg（細胞1×105個）を注射し、続いて同量のLAG3+ Tregの週1回の注射を2回行った。対照群にはPBSを投与した（n = 13）。（a）タンパク尿の進行。*P < 0.05 vs 対照群。（b）血清中抗ds DNA抗体の定量結果。（c）腎臓切片のH&E染色（上側のパネル）およびIgG免疫蛍光染色（下側のパネル）。スケールバー：50 μm。（d）糸球体スコア。（e）図8eに記述されている通りの、LAG3+ Tregを介したインビトロでのNP特異的抗体応答抑制（n = 6/群）。（f）図1eに概説されている通りの、WT、B6/lpr、またはB6/gldマウスに由来するLAG3+ Tregと共にまたは伴わずにB6 B細胞およびOT-II Th細胞を注射したRag1KOマウスのNP特異的抗体応答（n = 6/群）。抗FasLブロッキング抗体（200 μg/マウス）を週に1回、静脈内注射した。（g〜i）fと同じマウス由来の脾臓CD4+CD25-CXCR5+PD1+ TFH（h）およびB220+GL-7+Fas+ GCB（i）のフローサイトメトリープロット（g）および定量結果。aおよびdにおける統計的有意性はMann-WhitneyのU検定により分析し、その他のものはStudentの両側t検定により分析した（*P < 0.05）。eおよびfにおける実験は、3回繰り返した。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図３】LAG3+ Tregによる、TGF-beta3を介したB細胞活性化抑制を示す図である。（a）B6 CD25+ TregとB6 LAG3+ Tregのマイクロアレイ解析による遺伝子発現プロファイルの比較。B6 CD4+CD25-CD45RBhighナイーブT細胞で正規化した発現値をカラースケールにしたがって示す。（b）B6マウスの脾臓から分取したT細胞サブセットにおけるTgfb3 mRNA発現（n = 3/群）。（c〜e）ELISAによって測定した、B6マウス由来の各T細胞サブセットの培養上清におけるTGF-beta1、2、および3タンパク質のレベル。細胞は1×105個/ウェルで播種した（n = 4/群）。（f）CFSEで標識したB細胞を、リコンビナント(r)TGF-beta3の存在下または非存在下にて、抗IgM mAb有りまたは無しで刺激した（n = 3/群）。（g）rTGF-beta3（1 ng/ml）の存在下または非存在下にて抗IgMで刺激したB細胞の生存性を、7-AADによって評価した（n = 3/群）。（h）抗CD40抗体/IL-4で刺激したB細胞の培養上清中の総IgG産生に及ぼすTGF-beta3の効果（n = 3/群）（図1dと同様に測定）。（i〜k）rTGF-beta3で刺激したまたは無刺激のB細胞におけるSTAT6（i）、Syk（j）、およびNF-κB p65（k）のリン酸化（n = 3/群）。リン酸化タンパク質レベルと全タンパク質レベルとの比率として計算した。（l）Th0、Th1、Th2、もしくはTh17条件下で培養されたナイーブB6 CD4+ T細胞、または新鮮単離B6 LAG3+ Tregの培養上清中のTGF-beta3タンパク質のレベル（ELISAによって測定）。細胞は、細胞3×105個/ウェルで播種した（n = 3/群）。*P < 0.05（Studentの独立両側t検定）。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図４】TGF-beta3によるループス様病態の改善を示す図である。（a）図1eに概説されている通りの、B細胞およびT細胞を移入しNP-OVAを免疫したRag1KOマウスにおける、抗TGF-beta3ブロッキングmAb（100 μg/マウス）週1回注射によるLAG3+ Treg介在B細胞抑制作用のインビボでの阻害（n = 6/群）。（b）aと同じマウス由来の脾臓CD4+CD25-CXCR5+PD1+ TFHおよびB220+GL-7+Fas+ GCBのフローサイトメトリープロットおよび定量化。（c,d）抗TGF-beta3 mAb（100 μg/マウス）の週1回の注射有りまたは無しでの、MRL/+ LAG3+ Tregを移入したMRL/lprマウスにおけるタンパク尿の進行（c）および血清中の抗dsDNA抗体レベル（d）（マウスn = 8/群）。*P < 0.05 vs LAG3+ Treg群。（e）図3eと同様に、WT、Egr2CKO、またはB6/lprマウスに由来する、抗CD3抗体刺激LAG3+ TregによるTGF-beta3の産生（n = 6/群）。（f）pCAGGS対照（n = 8）またはpCAGGS-Tgfb3プラスミドベクター（n = 7）の静脈内注射後のMRL/lprマウスにおけるタンパク尿の進行。（g）fと同じマウス由来の、腎臓切片H&E染色（上側のパネル）およびIgG免疫蛍光染色（下側のパネル）（代表画像）。スケールバー, 50 μm。cおよびfにおける統計的有意性はMann-Whitney U検定により分析し、その他のものはStudentの両側t検定により分析した（*P < 0.05）。eにおける実験は、3回繰り返した。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図５】LAG3+ Tregの抑制活性における、B細胞上でのPD-1の発現の影響を示す図である。（a）PD-1欠損（PD-1KO）マウスにおけるTGF-beta3によるB細胞抑制に対する耐性。B6、PD-1KO、B6/lpr、またはB6/gldマウス由来のCFSE標識B細胞を、rTGF-beta3（1 ng/ml）の存在下または非存在下、抗IgMおよび抗CD40抗体により72時間インビトロで刺激した。B220+ B細胞のCSFE染色強度（ヒストグラム）。（b）rTGF-beta3（1 ng/ml）の存在下または非存在下でのWTまたはPD-1KOマウス由来の抗IgM刺激B細胞におけるBcl-xLおよびBcl-2a1 mRNAレベル（n = 3/群）。（c）インビトロでのLAG3+ Treg によるNP特異的抗体応答抑制の抗PD-L1ブロッキングmAbによる阻害。実験手順は図8eに概説されている（n = 6/群）。（d）B6マウス由来のLAG3+ Tregと共にまたは伴わずに、B6マウスまたはPD-1KOマウスに由来するB細胞およびOT-II Th細胞を注射したRag1KOマウスのNP特異的抗体応答。抗PD-L1ブロッキング抗体（200 μg/マウス）を3日ごとに静脈内注射した。抗NP-BSA抗体のレベルを図1eと同様に測定した（n = 6/群）。*P < 0.05（Studentの独立両側t検定）。データは独立した3回の実験の代表である。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図６】IL-27による、ナイーブT細胞からのTGF-beta3産生Egr2+制御性T細胞の誘導を示す図である。（a）IL-27によるCD4+ T細胞上でのEgr2およびLAG-3の発現誘導。新鮮単離されたナイーブCD4+ T細胞を、IL-27の存在下または非存在下で抗CD3 mAb /CD28 mAbにより刺激した。5日目にEgr2およびLAG-3の発現について細胞を染色した。（b）aと同様に活性化したナイーブWT CD4+ T細胞におけるTgfb3 mRNA発現の定量的RT-PCR解析（3日目）。（c）aと同様に活性化したナイーブWT、Egr2CKO、STAT1KO、またはStat3fl/fl CD4-Cre+（STAT3CKO）CD4+ T細胞培養上清中のTGF-beta3のELISA（5日目）。（d）IL-27で処理したナイーブWT CD4+ T細胞によるインビトロでのB細胞抑制。抗CD3 mAbで刺激した、IL-27で処理したまたは未処理のナイーブWTまたはEgr2CKO CD4+ T細胞を、抗CD40抗体/IL-4で刺激したB細胞と共培養した。7日目に培養上清中の総IgGをELISAにより決定した（n = 3/群）。*P < 0.05（Studentの独立両側t検定）; n.d., 非検出; n.s., 有意差なし。データは独立した3回の実験の代表である。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図７】ヒトCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞による抗体産生の抑制を示す図である。（a）CD4+CD25-CD127highCCR7+ T細胞（ナイーブT）、CD4+CD25highCD127lowCD45RA- T細胞（CD25+ Treg）、およびCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞（LAG3+ Treg）のFACSゲーティング。健常対照（HC）から新鮮単離されたヒト末梢血単核細胞（PBMC）をCD4、CD25、CD45RA、CD127、CCR7、およびLAG3について染色した際の各四分画中の細胞の割合を示す。（b）HC由来の各CD4+ T細胞サブセットに対する抗CD3 mAb刺激条件下でのEGR2、IL10、IFNG、およびFOXP3 mRNA発現の定量的RT-PCR解析（n = 3/群）。（c）各T細胞サブセットの、7日目の培養上清におけるIL-10タンパク質のレベル（n = 3/群）（ELISAによって測定）。（d）HC由来の各CD4+ T細胞サブセットによるインビトロでのB細胞抑制。各CD4+ T細胞サブセットを、TFHおよびブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）で刺激したB細胞と共培養した。ELISAによって培養上清中の総IgGを測定した（n = 3/群）。（e）HC（n = 3）から採取された選別後のT細胞サブセットにおけるTGFB3 mRNA発現。（f）aと同様に各HC（n = 15）および全身性エリテマトーデス患者（SLE）（n = 15）におけるCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞の割合。*P < 0.05（Studentの独立両側t検定）。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図８】LAG3+ Tregによる胚中心B細胞および濾胞ヘルパーT細胞の制御はEgr2依存的であることを示す図である。（a）WT LAG3+ Tregの養子移入有りまたは無しで100μg NP-OVA/alumを1回免疫したWTマウスおよびEgr2fl/fl CD4-Cre+（Egr2CKO）マウスのNP特異的抗体応答についての実験プロトコールの図示。免疫から7日後に、血清中の抗NP-BSA抗体レベルをELISAにより測定した。（b）NP-OVA/alumを2回免疫したRag1-欠損（Rag1KO）マウスへの細胞移入についての実験プロトコールの図示。NP-OVA/alumによる腹腔内(i.p.)免疫の1日前に、C57BL/6（B6）のB細胞およびOT-IIのCD4+CD25-LAG3- ヘルパーT（Th）細胞を、B6マウス由来のLAG3+ Tregと組み合わせてまたは組み合わせずにRag1KOマウスに静脈内（i.v.）注射し、一次免疫から14日後に追加免疫を行った。追加免疫から7日後に、血清中の抗NP-BSA抗体をELISAにより測定した。（c）Egr2CKOマウス中の脾臓LAG3+ Treg。ドットプロットは、CD4+ T細胞（上側のパネル）およびCD4+CD25- T細胞（下側のパネル）にゲートをかけた。数値は、四角形の領域内に含まれる細胞の割合（％）。データは独立した4回の実験の代表である。（d）TEa TCRトランスジェニックマウスへのLAG3+ Tregの移入についての実験プロトコールの図示。B6マウス由来のLAG3+ TregおよびOT-II Th細胞をTEaマウスに静脈内（i.v.）注射し、続いてNP-OVA/alumを1回免疫した。抗NP-BSA抗体のレベルをELISAにより測定した。（e）インビトロでのNP特異的抗体産生。NP-OVA/alumを予め免疫したB6マウスおよびOT-IIマウスからそれぞれ精製されたB細胞およびTh細胞を、非免疫OT-II マウス由来のLAG3+ Tregと共にまたは伴わずに、抗FasLブロッキング抗体の存在下または非存在下でインキュベートし、上清中の抗NP-BSA抗体をELISAにより測定した。
【図９】Egr2-GFPトランスジェニックマウス由来のCD4+CD25-Egr2-GFP+ T細胞の制御活性を示す図である。（a）Egr2 BACクローン（RP23-884D）を用いたEgr2-GFPトランスジェニックマウス（Egr2-GFPマウス）の作製法略図。Egr2コード領域の一部をEGFP-SV40ポリAカセットで置換した。H1およびH2、ホモロジーアーム；Neo、ネオマイシン耐性遺伝子。（b）Egr2-GFPマウスにおけるGFPの発現。Egr2-GFP マウス由来CD4+細胞からのCD4+GFP+細胞およびCD4+GFP-細胞の分取法および、分取細胞におけるegr2タンパク発現評価。分取した各T細胞を、抗Egr2モノクローナル抗体（mAb）を用いて細胞内染色した。データは独立した3回の実験の代表である。（c）CD4+CD25-Egr2-GFP+ T細胞によるインビトロでのB細胞の抑制能の検討。B6 B細胞およびOT-II Th細胞を、Egr2-GFP マウス由来のCD4+CD25-Egr2-GFP+ T細胞（Egr2-GFP+ Treg）と組み合わせてまたは組み合わせずに注射したRag1KO マウスのNP-特異的抗体応答（n＝6/群）。抗NP 抗体レベルを、図1eと同様に決定した。Studentの独立両側t検定（*P < 0.05）を用いて統計分析を行った。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図１０】全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるLAG3+ Tregによる疾患制御機構および、その治療効果を示す図である。（a）腎臓切片の間質性炎症スコア。治療群の10週齢のMRL/lpr マウスに、MRL/+ マウス由来のCD4+CD25-LAG3+ Treg（LAG3+ Treg）（n＝9）、CD4+CD25-LAG3- T細胞（LAG3- T）（n＝9）、CD4+CD25+ Treg（CD25+ Treg）（n＝9）、またはCD4+CD25-CD45RBhigh T細胞（ナイーブT）（n＝8）を静脈内（i.v.）注射した（それぞれ1×105細胞）。LAG3+ Treg×3群（n＝8）では、マウスにLAG3+ Treg（1×105細胞）をまず10週齢で注射し、その後、週1回の注射を2回行った。対照群のマウスにはPBSを投与した（n＝13）。データの供給源は図2a〜dと同一である。各腎臓切片における間質性炎症は、「方法」の項に記載の標準的な方法により等級分けされた。（b〜d）MRL/lprマウス由来のLAG3+ TregまたはMRL/+ マウス由来のCD25+ Treg（n＝6/群）を投与したMRL/lprマウスについての試験結果。MRL/lprマウス由来のLAG3+ Treg（×1および×3）ならびにMRL/+ マウス由来のCD25+ Treg（×3）を用いた点を除いて、他の全ての条件は図10aと同じであった。1群当たりのマウスはn＝6匹。タンパク尿（b）、抗ds DNA抗体（c）、および糸球体のスコア（d）のレベルを、図2a〜dと同じ方法を用いて試験した。平均±標準偏差（s.d.）を示す。（e、f）顕性タンパク尿の発症後の3回にわたるLAG3+ Tregの注射。MRL/+ マウス由来のLAG3+ Treg（1×105細胞）をMRL/lpr マウスにまず13週齢で注射し、その後、週1回の注射を2回行った（MRL/+ LAG3+ Treg×3）。対照群のマウスにはPBSを投与した。タンパク尿（e）および抗ds DNA抗体（f）のレベルを、図2a,bと同じ方法を用いて測定した（対照、n＝10; LAG3+ Treg×3, n＝8）。a、d、およびeにおける統計学的有意性はMann-WhitneyのU検定により分析し、その他についてはStudentの両側t検定により分析した（*P < 0.05）。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図１１】Egr2CKOマウスにおけるFasの発現を示す図である。WTマウス（Egr2fl/fl CD4-Cre-、左側のパネル）およびEgr2CKOマウス（Egr2fl/fl CD4-Cre+、右側のパネル）から新鮮単離した脾臓CD4+ T細胞を、抗CD3 mAbでコーティングされた96ウェルプレートにて1×105細胞/ウェルで72時間インキュベートした。CD4+ T細胞中LAG3陽性細胞（黒線）またはLAG3陰性細胞（灰色線）におけるFasの発現をヒストグラムで示す。データは独立した3回の実験の代表例である。
【図１２】Prdm1CKOマウスおよびIL-10KOマウスにおけるLAG3+ Tregによる抑制能を示す図である。（a）WT B6マウスまたはPrdm1CKO マウス（Prdm1fl/fl CD4-Cre-）の脾臓から分取した各T細胞サブセットにおけるIl10 mRNAの発現。4種の異なるT細胞サブセットは以下の通りである：（ナイーブT）CD4+CD25-LAG3-CD45RBhigh細胞;（CD25+ Treg）CD4+CD25+LAG3-細胞;（LAG3- T）CD4+CD25-LAG3- T細胞;（LAG3+ Treg）CD4+CD25-LAG3+細胞（n＝3/群）。（b）B6 B細胞およびOT-II Th細胞を、WT B6マウス、Prdm1CKOマウスまたはIL-10KO マウス（n＝5/群）のLAG3+ Tregと組み合わせてまたは組み合わせずに注射したRag1KOマウスのNP特異的抗体応答。図1eと同様に抗NP-BSA 抗体レベルを決定した。Studentの独立両側t検定（*P < 0.05）を用いて統計分析を行った。データは独立した3回の実験の代表である。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図１３】TGF-beta1、2、および3によるB細胞活性化の抑制を示す図である。（a）ナイーブB6マウス由来のCFSE標識脾臓B細胞を、rTGF-beta1（1 ng/ml）、rTGF-beta2（1 ng/ml）、またはrTGF-beta3（1 ng/ml）の存在下または非存在下で抗IgM mAbを用いてインビトロで72時間刺激した。ドットプロットは、B220+ B細胞上のCFSEおよびCD40発現を示す。（b）抗CD40抗体/IL-4で刺激したB細胞の培養上清における総IgG産生に対するrTGF-beta1、2、または3の効果。総IgGレベルは図1dと同様に決定した（n＝3/群）。データは独立した3回の実験の代表である（1群当たりのマウス数n＝3以上）。Studentの独立両側t検定（*P < 0.05）を用いて統計分析を行った。データは独立した3回の実験の代表である。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図１４】LAG3+ TregはPD-L1を発現することを示す図である。（a）B6マウスの脾臓由来のCD4+CD25-Egr2+ T細胞におけるLAG3およびPD-L1の共発現の効果。新鮮単離した脾臓CD4+CD25- T細胞におけるLAG3（左側のパネル）およびPD-L1（右側のパネル）の発現を、それらの細胞内Egr2発現に基づいて分析した。（b）B6マウスから新鮮単離した脾細胞を、抗CD4 mAb、抗CD25 mAb、抗LAG3 mAb、およびPD-L1 mAbまたはPD-L2 mAbを用いて染色した。CD4+CD25-LAG3- T細胞、CD25+ Treg、およびLAG3+ TregにおけるPD-L1（左側のパネル）およびPD-L2（右側のパネル）の平均蛍光強度（MFI）レベル（n＝4/群）。Studentの独立両側t検定（*P < 0.05）を用いて統計分析を行った。データは独立した3回の実験の代表である。平均±標準偏差（s.d.）を示す。
【図１５】SLEモデルマウスにおけるTGF-beta1とTGF-beta3の治療効果の比較を示す図である。pCAGGSプラスミドにクローニングした全長Llatent型TGF-beta1と全長latent型TGF-beta3、およびコントロールとしてpCAGGSプラスミドを各100 μg、尾静脈よりMRL/lprマウスに投与した。各プラスミドの投与は11週齢時、15週齢時の2回行い、その後各種病態パラメータを測定した。脾臓重量（a）及びタンパク尿（b）のレベルを測定した。
【図１６】SLEモデルマウスにおけるTGF-beta1とTGF-beta3の治療効果の比較を示す図である（図15と同一実験）。H&E染色（上側のパネル）およびIgG免疫蛍光染色（下側のパネル）に供された腎臓切片の代表的な画像を示す（a）。また糸球体スコアのレベルを測定した。
【図１７】SLEモデルマウスの腎糸球体におけるTGF-beta1とTGF-beta3の治療効果を組織学的スコアリングを用いて比較した図である（図15と同一実験）。CD4/CXCR5/PD-1陽性CD25陰性の濾胞性ヘルパーT細胞（TFH）の割合を測定した。
【図１８】Latent-TGFbeta3のゲル濾過クロマトグラムを示す図である。
【図１９】Latent-TGFbeta3のゲル濾過画分の電気泳動像を示す図である。
【図２０】TGF-beta3改変抗体分子の発現産物の電気泳動像を示す図である。
【図２１】TGF-beta3改変抗体分子のゲル濾過クロマトグラムを示す図である。
【図２２】TGF-beta3改変抗体分子のゲル濾過画分の電気泳動像を示す図である。
【図２３】HEK-Blue_TGFb細胞を用いてTGF-beta3改変抗体分子の生理活性を確認した結果を示す図である。50000細胞のHEK-Blue_TGFb細胞に各刺激タンパク質および5ng/mLのPlasminプロテアーゼ（PLN）を添加して37℃ CO2インキュベーターにて20時間培養後、細胞上清を回収し、Quanti-Blue基質にて分泌されたアルカリフォスファターゼの定量をVersaMaxスペクトロメーターにて測定を行った（OD655nm）。
【図２４】TGF-beta3改変分子のB細胞結合特異性の検証結果を示す図である。脾細胞に各種細胞表面マーカー検出抗体およびTGF-beta3改変抗体分子を反応後、BD LSRFortessaX-20にてTGFb3改変抗体分子の結合特異性を検証した。TGFb3改変抗体分子にはV5タグが挿入されており、rabbit anti-V5抗体およびBV421標識anti-rabbit IgG抗体にてTGFb3改変抗体分子を検出した。lyDC (lymphoid DC)は CD11chi, CD11b-/lo, B220-, pDC (plasmacytoid DC)はCD11clo, CD11b-, Gr-1+, B220+, myDC (myeloid DC)はCD11hi, CD11bhi, B220-, MQ (macrophage)はCD11bhi, CD11c-, NK (natural killer)細胞はCD11bint, CD11c-, CD49b+である。
【図２５】TGF-beta3改変分子のSmadシグナルの入力効果を示す図である。マウス脾細胞に各刺激タンパク質および/または5ng/mLのPlasminプロテアーゼ（PLN）を添加して30分培養後、細胞を固定し、膜透過処理を行った後にanti-B220抗体、anti-pSmad2/3抗体にて反応を行った（破線は刺激なしの時のヒストグラムを示す）。
【図２６−１】TGF-beta1とTGF-beta3のB細胞増殖抑制効果を示す図である。マウス脾臓よりautoMACSを用いてB細胞を精製し、CFSE標識を行った。各刺激タンパク質を添加して3日間培養後、FACS analyzerを用いて7AADによる死細胞を除去した生細胞におけるCFSEの蛍光強度を評価した。
【図２６−２】TGF-beta3改変分子のB細胞増殖抑制効果を示す図である。マウス脾臓よりautoMACSを用いてB細胞を精製し、CFSE標識を行った。各刺激タンパク質および0.5μg/mLのPlasminプロテアーゼ（PLN）を添加して3日間培養後、FACS analyzerを用いて7AADによる死細胞を除去した生細胞におけるCFSEの蛍光強度を評価した。
【図２７】Latent TGF-beta3 あるいはTGF-beta3 改変抗体分子を1 mg/kg でマウスに静脈内投与したときの血漿中TGF-b3濃度推移を示す図である（例数3、誤差バーは標準偏差を表す）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、TGF-beta3を含むB細胞活性化の抑制剤を提供する。B細胞は好ましくは自己反応性B細胞であり、B細胞活性化の抑制としては、例えばB細胞による抗体産生の抑制があげられる。また抑制剤は自己免疫疾患の治療剤の用途で用いることができる。
【００１１】
TGF-beta3は、配列番号１〜６にあげるアミノ酸配列を有するものを含み、またこれらアミノ酸配列の一部を改変、修飾し同様のB細胞活性化の抑制作用を有するものを含み、更にlatent型、mature型を含む。自己免疫疾患としてはSLE、天疱瘡(Pemphigus)、多発性硬化症(Multiple Sclerosis)、視神経脊髄炎（NMO）、ANCA関連血管炎、関節リウマチ、移植臓器拒絶、シェーグレン症候群(Sjogren's syndrome)、若年性皮膚筋炎(Juvenile dermatomyositis)、重症筋無力症(Myasthenia gravis)、又はバセドウ病、橋本病等の自己免疫性甲状腺疾患(Autoimmune thyroid disease including Graves' disease or Hashimoto's thyroiditis)等が挙げられる。
【００１２】
別の観点においては、本発明は、TGF-beta3と抗体又は抗体断片とが連結された分子を含む自己免疫疾患の治療剤を提供する。抗体断片は可変領域又はFc領域等の抗体の構成要素が分離されたものを意味する。
【００１３】
前記抗体又は抗体断片はB細胞を認識する可変領域を含む構成をとることもできる。B細胞を認識は、例えばCD19、CD20、CD40、CD22、IL21R、BAFF-R、BCMA、TACI、CD27、又はCD138に含まれるいずれか1つまたは複数をマーカーとして行うことができる。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、TGF-beta3を認識する第一の可変領域と、B細胞を認識する第二の可変領域とを含む多重特異性抗体を含む自己免疫疾患の治療剤を提供する。
【００１５】
別の観点においては、本発明は、TGF-beta3とPEG、多糖類、または人工ポリペプチドとが連結された分子、或いはTGF-beta3が糖類修飾された分子を含む自己免疫疾患の治療剤を提供する。
【００１６】
別の観点においては、本発明は、前記治療剤を含む医療用キットを提供する。
【００１７】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本実施例において提示されているマイクロアレイデータのアクセッション番号は、E-MEXP-1343 [ArrayExpressデータベース]における番号である。【００１９】
〔方法〕
マウス
C57BL/6（B6）、C57BL/6-Faslpr/lpr（B6/lpr）、C57BL/6-FasLgld/gld（B6/gld）、MRL-Faslpr/lpr（MRL/lpr）、およびMRL-Fas+/+（MRL/+）マウスは、日本エスエルシー株式会社から購入した。B6リコンビナーゼ活性化遺伝子（Rag）-1欠損（Rag1KO）マウス、floxed-Prdm1（Prdm1fl/fl）マウス、Il10欠損（IL-10KO）マウス、T細胞受容体（TCR）トランスジェニックOT-IIマウス（MHCクラスII I-Abについてはトリ卵白アルブミン（アミノ酸残基323〜339）に特異的）、およびTEaマウス（I-AbについてはMHCクラスII I-Eα分子由来のEαペプチド（アミノ酸残基52〜68）に特異的）は、ジャクソン研究所から購入した。Floxed-Stat3（Stat3fl/fl）マウスは、株式会社オリエンタルバイオサービス（日本）から購入した。Rag1KOマウスは、滅菌濾過空気下のマイクロアイソレーターケージに収容した。B6-Pdcd1欠損（PD-1KO）マウス（非特許文献４７）は、RIKEN BRC（日本）から購入した。Floxed Egr2（Egr2fl/fl）マウスは、Patrick Charnay氏（INSERM、フランス）より供与された（非特許文献４８）。Egr2 コンディショナルノックアウト（CKO）マウス（Egr2fl/fl CD4-Cre+）、Prdm1 CKOマウス（Prdm1fl/fl CD4-Cre+）、およびSTAT3 CKO（Stat3fl/fl CD4-Cre+）は、Egr2fl/flマウス、Prdm1fl/flマウス、またはStat3fl/flマウスをB6バックグラウンドのCD4-Creトランスジェニックマウスとそれぞれ交配することによって作製した。CD4-Creトランスジェニックマウス（4196系）、およびStat1欠損（STAT1KO）マウスは、Taconicから購入した。全ての実験について、7週齢以上の同週齢同性のマウスを使用した。全ての動物実験は、東京大学動物実験倫理委員会によって承認された。【００２０】
試薬、抗体および培地
以下の試薬は、BD Pharmingenから購入した; CD3εに対する精製モノクローナル抗体（mAb）（145-2C11）、FasLブロッキング（MFL3）、抗CD40（3/23）、Fcブロック（抗CD16/CD32）、FITC抗CD45RB（16A）、FITC抗Fas（Jo2）、PE抗CD45RB（16A）、APC-Cy7抗CD45RB（16A）、PE抗LAG3（C9B7W）、APC抗LAG-3（C9B7W）、FITC抗IgG1（A85-1）、APC抗IgG1（A85-1）、FITC抗GL7（Ly-77）、FITC抗CD25（PC61）、PE抗CD25（PC61）、APC抗CD25（PC61）、APC-Cy7抗CD25（PC61）、APC抗CD4（L3T4）、APC-Cy7抗CD4（L3T4）、PE抗CXCR5（2G8）、APC-Cy7抗B220（RA3-6B2）、PE抗PD-1（J43）；CD8a（53-6.7）、CD19（1D3）、CD11c（HL3）、CD45RB（16A）、CD25（7D4）、およびCXCR5（2G8）に対するビオチン化mAb；ストレプトアビジン（SA）-FITC抗体（Ab）、SA-APC、ならびにSA-APC-Cy7。Alexa Fluor 488 抗LAG3 mAb（C9B7W）およびFITC抗PD-L1 mAb（MIH6）は、AbD Serotecから購入した。Qdot605抗CD4 mAb（RM4-5）およびSA-Qdot605は、Invitrogenから購入した。PE抗PD-L1 mAb（MIH5）、PE抗Egr2 mAb（erongr2）、PE抗PD-L1 mAb（10F. 9G2）、およびAPC抗B220 mAb（RA3-6B2）は、eBioscienceから購入した。NP（13）-OVAおよびNP（9）-BSAは、Biosearch Technologiesから購入した。SAコンジュゲートマイクロビーズは、Miltenyi Biotecから購入した。FITC抗マウスIgG Abは、Sigmaから購入した。抗PD-L1ブロッキングmAb（10F.9G2）は、Biolegendから購入した。Alexa 488 Fluor抗GFP mAbは、Medical & Biological Laboratoriesから購入した。組換えTGF-beta1（rTGF-beta1）およびrTGF-beta3はMiltenyi Biotecから購入し、rTGF-beta2、抗TGF-beta3ブロッキングポリクローナルAb（MAB234）、およびrIL-27は、R&D Systemsから購入した。
ヒト由来細胞を用いた試験に関しては、以下の抗ヒトmAbを使用した：V450抗hCD4（RPA-T4）、V500抗hCD4（RPA-T4）（どちらもBD Biosciences製）；PerCP-Cy5.5抗ヒトCD3（UCHT1）、Brilliant Violet 421抗hCD25（BC96）、APC抗hCD19（HIB19）、PerCP-Cy5.5抗hCD4（OKT4）、Alexa Fluor 647抗hCD197（G043H7）、APC-Cy7抗ヒトCD45RA（HI100）（いずれもBioLegend製）； Alexa Fluor 488抗hCD25（BC96）、およびPE-Cy7抗hCD127（eBioRDR5）（いずれもeBioscience製）。PE抗hLAG3 ポリクローナルAbはR&D Systemsから購入した。
T細胞およびB細胞は、10% FBS、100μg/ml L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および50μM 2-メルカプトエタノール（全てSigmaから購入した）を添加したRPMI-1640培地中で培養した。【００２１】
Egr2-GFPマウスの作製
ゲノムEgr2遺伝子座全体を包含する細菌人工染色体（BAC）クローンRP23-88D4は、BACライブラリ（Invitrogen）から入手した。Red/ET組み換え系を用いてEgr2エキソン1の開始コドンにSV40 polyA配列と共に高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子（eGFP）を挿入して、このクローンを改変した。PI-SceIを用いて切断した直鎖状Egr2-eGFPコンストラクトを、B6マウス由来の受精した接合子の前核に注入し、偽妊娠雌に移した。以下を用いた尾部より抽出したDNAのPCRによって、出生仔の遺伝子導入を確認した：
Egr2プロモータープライマー：フォワード5'-AGACCGCATTTACTCTTATCACCAG-3'（配列番号：７）
SV40ポリA特異的プライマー：リバース5'-TGAGTTTGGACAAACCACAACTAGA-3'（配列番号：８）
（PCR産物のサイズ：2.1 kb）。F1ヘテロ接合体トランスジェニック雄性マウスと野生型（WT）雌性マウスを交配させることにより、マウスを作製した。【００２２】
細胞の調製
マウス脾臓は細切し、IV型コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）で処理した。ACK（ammonium chloride with potassium）溶解緩衝液中での低浸透圧ショックにより赤血球を溶解させた後、すぐに等浸透圧に回復させた。FcRブロッキング抗体（抗マウスCD16/CD32 mAb）の存在下、2%FCSを含む氷冷PBS中で表面染色を行った。始めに、高純度のCD4+ T細胞を得るために、抗B220 mAb、抗CD19 mAb、抗CD11c mAb、および抗CD8a mAbを用いたMACS（magnetic-activated cell sorting；Miltenyi Biotec）によるネガティブセレクションによって、単細胞懸濁液を精製した。続いて、高純度のCD4+CD25-CD45RBlowLAG3+ T細胞を得るために、抗CD45RB mAbを用いてCD45RBhigh細胞を除去した。CD4+CD25-CD45RBlowLAG3+ T細胞（LAG3+ Treg）、CD4+CD25+ T細胞（CD25+ Treg）、CD4+CD25-LAG3- ヘルパーT細胞（Th細胞）、またはCD4+CD25-CD62LhiCD44low（ナイーブT）を単離するために、FcRブロッキングした細胞をCD4、CD25、CD45RB、およびLAG3に特異的なmAbで染色した。細胞内抗Egr2染色用の細胞は、製造元のプロトールに従ってFoxp3 Staining Buffer Set（eBioscience）を用いて染色した。MACS選別した細胞およびFACS（FACSVantage SE（Becton-Dickinson）またはMoFlo XDP（Beckman Coulter））選別した細胞の純度は、それぞれ90%超および99%超であった。【００２３】
免疫
NP（13）-OVA（Biosearch Technologies）のPBS溶液とalum（Pierce）を1:1比で30分間4℃で混合することによって、NP-OVAのalum溶液を調製した。NP-OVA/alumによる免疫は、腹腔内注射によって実施した。【００２４】
WTマウスからEgr2CKOマウスへのLAG3+ Tregの養子移入
FACSで精製したB6マウス由来のLAG3+ Treg 2×105個を、細胞移入の1日前に100μg NP-OVA/alumで予備免疫した、またはしていない10週齢Egr2CKOマウスに静脈内注射した。脾臓におけるTFHおよびGCBの分化は、細胞移入の7日後にFACSにより解析した。血清中の抗BSA-NP抗体レベルは、上述のとおり、免疫の7日後にELISAにより測定した。【００２５】
B細胞単離および増殖
製造元のプロトールに従ってB細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いたMACSによるネガティブセレクションによって、脾臓B細胞を精製した。MACS選別したB細胞の純度は、B220染色に関して>95%陽性であった。B細胞増殖アッセイのために、B細胞を5μM 5-（および6-）カルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（CFSE; Dojindo）で10分間、37℃で標識した後、rTGF-beta1、rTGF-beta2、またはrTGF-beta3の存在下または非存在下、10μg/ml 抗IgM F（ab）'2（Jackson ImmunoResearch Laboratories）で72時間刺激した。細胞を、抗B220 mAb、7-アミノ-アクチノマイシンD（7-AAD）（Biolegend）およびPE抗CD40 mAbで染色した。7-AAD陰性のCFSE希釈B220+CD40+ 生存B細胞および7-AAD陽性のB220+ 死細胞のパーセンテージを、FACSにより評価した。【００２６】
B細胞活性化共培養アッセイ
96ウェル平底プレートのウェルを、100μl/ウェルのPBS中の10μg/ml 抗CD3 mAbでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを洗浄した後、コーティングされたウェルに、MACSで精製したB細胞およびFACSで精製した各T細胞サブセット（LAG3+ Treg、CD25+ Treg、またはCD4+CD25-CD44loCD62Lhi ナイーブT細胞）または後述のIL-27処理CD4+ T細胞を1×105個/ウェルの密度で加え、rTGF-beta3（1 ng/ml）添加または非添加の10μg/ml 抗CD40 mAb（3/23）＋10μg/ml rIL-4（Cell Signaling Technology）含有RPMI培地中で培養した。3日目にアポトーシスを受けているB細胞を、また7日目の培養上清における総IgG産生量を、製造元のプロトールに従ってAnnexin V Apoptosis Detection Kit（BD Pharmingen）およびマウスIgG ELISA Quantitation Set（Bethyl Laboratories）をそれぞれ用いて測定した。【００２７】
Rag1KOマウスにおける養子細胞移入試験
MACSで精製したB6マウスまたはPD-1KOマウス由来のB細胞2×105個、および、FACSで精製したOT-IIマウスまたはPD-1KO OT-IIマウス由来のTh細胞2×105個を、FACSで精製したB6、Egr2CKO、B6/lpr、B6/gld、もしくはIL-10KOマウス由来のLAG3+ Treg 1×105個と組み合わせてまたは組み合わせずに、Rag1KOマウスに静脈内注射した。対照マウスにはPBSを投与した。続いて細胞移入の24時間後、マウスを100μg NP-OVA/alumで免疫した。初回免疫の14日後、マウスを50μg NP-OVA/alumで再度免疫した。示されている場合には細胞移入の翌日に、抗FasLブロッキング抗体（200μg/マウス）もしくは抗TGF-beta3ブロッキング抗体（100μg/マウス）を週1回の間隔で、または抗PD-L1ブロッキング抗体（200μg/マウス）を3日毎に、マウスに静脈内注射した。再免疫の7日後に、血清中抗NP抗体レベルをELISAで解析し、脾細胞をFACSにより解析した。【００２８】
NP特異的抗体応答の定量化
抗NP IgG抗体レベルを、インビトロまたはインビボ抗体産生アッセイにおける捕捉抗原としてNP（9）-BSA（Biosearch Technologies）を用いたELISAによって、それぞれ定量した。ELISAプレートは、製造元のプロトールに従ってImmuno-Tek ELISA construction system（Zepto Metrix）を用いて、調製した。試料血清または培地とのインキュベーションの後、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG1およびTMB基質を用いてプレートを発色させた。NP（13）-OVA免疫B6マウス由来の連続希釈したプール血清を、各プレートにおける対照として含めた。抗NP IgG1抗体の濃度は、プール血清から構築された検量線との比較によって推定した。【００２９】
TEaマウスにおける養子細胞移入試験
FACSで精製したOT-IIマウス由来のTh細胞2×105個を、FACSで精製したB6マウス由来のLAG3+ Treg 1×105個と組み合わせてまたは組み合わせずに、TEaマウスに静脈内注射した。対照マウスにはPBSを投与した。続いて細胞移入の24時間後、マウスを100μg NP-OVA/alumで免疫した。血清中の抗BSA-NP抗体レベルは、上述のとおり、免疫の14日後にELISAにより解析した。【００３０】
MRL/lprマウスにおける養子細胞移入試験
8週齢のMRL/lpr マウスを、個別の処理群に無作為に割り当てた。処理群における10週齢のMRL/lprマウスに、MRL/+マウスから得たLAG3+ Treg、LAG3- T細胞、CD25+ Treg、またはナイーブT細胞（それぞれ細胞1×105個）を、静脈内注射した。3回注射群（MRL/+ LAG3+ Treg×3、MRL/+ CD25+ Treg×3、およびMRL/lpr LAG3+ Treg×3）には、1×105個のLAG3+ Tregを週1回の間隔で静脈内養子移入した（それぞれ10、11、および12、または、13、14、および15週齢；マウスは、初回注射の時点で10週齢であった）。各T細胞サブセットをまずMACSによって濃縮し、次に、上述のようなFACS（CD4、CD25、CD45RB、およびLAG3の発現に基づく）によって選別した。対照群のマウスにはPBSを投与した。示されている場合には最初の細胞移入の翌日に、抗TGF-beta3ブロッキング抗体（100μg/マウス）を週1回の間隔でマウスに静脈内注射した。マウスを18週齢で屠殺し、病理学的な変化を調査した。抗dsDNA抗体は、製造元のプロトールに従ってマウス抗ds DNA ELISA Kit（Shibayagi）を用い、13および18週齢で測定した。【００３１】
尿タンパク質分析
尿中タンパクはディップスティック（Albustix, Bayer）を用いて週1回の間隔で半定量的に評価した（0＝なし；1＝30〜100 mg/dl；2＝100〜300 mg/dl；3＝300〜1,000 mg/dl；4 ≧ 1,000 mg/dl）。【００３２】
組織学的分析
MRL/lprマウスを18週齢で屠殺した。腎臓病理を、非特許文献４９に記載のように、糸球体の炎症、増殖、半月体形成、および壊死について標準的な方法でグレード付けした。糸球体評価は、実験条件を知らされていない評価者が切片ごとに少なくとも80の糸球体を検査することによって実施した。間質および尿細管の変化にも留意した。これらの特徴の各々に、0から4までのスコア（0は「損傷なし」を表し、4は「重症」を表す）を割り当てた。【００３３】
インビトロNP特異的抗体反応
B6およびOT-IIマウスを、100μg NP-OVA/alumで免疫した。最初の免疫の3週間後にマウスを100μg NP-OVA/alumで再度免疫した。免疫後のB6マウス由来のMACSで精製した2×105個のB細胞および免疫後のOT-II マウス由来のFACSで精製した1×105個のCD4+CD25-LAG3-ヘルパーT細胞（Th細胞）を、免疫していないOT-IIマウス由来のFACSで精製した1×105個のLAG3+ Tregと組み合わせてまたは組み合わせずに、10μg/ml抗PD-L1ブロッキングmAb（10F.9G2）または10μg/ml抗FasLブロッキングmAb（MFL3）の存在下または非存在下で、再免疫の7日後に96ウェル丸底プレートに播種した。培養上清を3週間目に回収し、上述のように抗NP抗体レベルをELISAで分析した。【００３４】
RNA単離、cDNA合成、および定量的リアルタイムPCR
T細胞の総RNAをRNeasy Micro Kit（Qiagen）を用いて調製した。非特許文献１４に記載のように、RNAをcDNAに逆転写して、定量的リアルタイムPCR分析を行った。対照のマウスbetaアクチンまたはヒトGAPDHの存在量を基準として、相対的なRNA存在量を測定した。【００３５】
DNAマイクロアレイ分析
B6マウス由来のCD4+CD25+、CD4+CD25-CD45RBlowLAG3+、およびCD4+CD25-CD45RBhighLAG3- FACS精製T細胞の総RNAを回収し、次いで非特許文献14に記載の方法でAffymetrixマイクロアレイ分析のための試料を調製した。マイクロアレイデータはBioconductor（バージョン19）および統計処理ソフトウェアRおよびGeneSpring GXバージョン7.3.1（Silicon Genetics）を用いて分析した。すべてのマイクロアレイデータは、ArrayExpressデータベース（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress）にアクセッション番号E-MEXP-1343として保存されており、これは本発明者らの研究室での以前の研究（非特許文献１４）と同一である。【００３６】
TGF-betaファミリーメンバーの定量
各T細胞サブセットを、抗CD3 mAbまたは抗CD3 mb/抗CD28 mAbをコーティングしたウェルに、それぞれTGF-beta1および2の測定用に無血清X-Vivo-20培地（Lonza）に、またはTGF-beta3用に上記のRPMI培地に、3×105細胞／ウェルで撒いた。37℃で72時間インキュベートした後、上清を回収して、-80℃で保存した。上清中のTGF-beta1、2、および3レベルは、それぞれTGF-beta1 Emax ImmunoAssay System（Promega）、TGF-beta2 Quantikine ELISA Kit（R&D Systems）、およびTGF-beta3 ELISA Kit（Mybiosource）によって、製造業者のプロトコールに従い測定した。10％FBSを添加したRPMI培地におけるTGF-beta3レベルは、TGF-beta3 ELISA Kitの検出限界以下であった。【００３７】
ウェスタンブロット分析
MACSで精製したB6マウス由来のB細胞を0.75μM CpG-ODN（ENZO Life Science）で72時間、最後の16時間はrTGF-beta3（20 ng/ml）を添加または非添加で前処理し、次にRPMI培地中、10μg/mlの抗CD40 mAb、10μg/mlのrIL-4、または10μg/mlの抗IgM F（ab）'2により刺激した。刺激の後、細胞をLysis Buffer（50mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1％Triton X-100、1 mM EDTA）で処理し、2×Laemmli Buffer（BioRad）で95℃、5分間変性させた後、Mini-PROTEAN TGXプレキャストゲル（BioRad）で電気泳動により分離した。細胞溶解物の総タンパク質濃度は、BCA Protein Assayキット（Pierce）を用いて決定した。電気泳動後のゲルはポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレン上にブロットし、5％BSAでブロッキングした後、リン酸化または総STAT6、NF-κB p65、またはSyk（いずれもCell Signaling Technologyから購入）に対する抗体を反応させ、さらに抗ウサギIgG-HRP（Invitrogen）に対する二次抗体でプローブした。メンブレンはECL Prime基質（GE Healthcare）で発光させた。【００３８】
インビトロヘルパーT細胞分化およびサイトカイン分析
上記のMACSで選別したCD4+ T細胞を、FACSによりCD4+CD25-CD62L+CD44-ナイーブT細胞として精製し、2μg/ml抗CD3 mAbおよび2μg/ml抗CD28 mAbをコーティングした96ウェルプレートに、上記のRPMI培地100μl中3×105の密度で播種した。各エフェクター細胞分化のためのサイトカインは以下の通りである：Th0、抗IFN-γ（10μg/ml; XMG1.2）、および抗IL-4（10μg/ml; 11B11）；Th0、抗IFN-γ（10μg/ml；XMG1.2（BD Pharmingen））、および抗IL-4（10μg/ml；11B11（BD Pharmingen））；Th1、IL-12（10 ng/ml（R&D Systems））、IL-2（50μg/ml（R&D Systems））、および抗IL-4（10μg/ml；11B11）；Th17、TGF-beta1（1ng/ml）、IL-6（50 ng/ml（BioLegend））、IL-23（50 ng/ml（R&D Systems））、抗IFN-γ（10μg/ml；XMG1.2）、および抗IL-4（10μg/ml；11B11）；誘導性Treg、TGF-beta1（5ng/ml）および抗IL-4（10μg/ml；11B11）。培養上清を5日目に回収し、TGF-beta3レベルを上記のようにELISAで測定した。【００３９】
IL-27によるインビトロCD4+Egr2+LAG3+ Treg分化
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec）を用いて製造業者のプロトコールに従い、MACSで精製したナイーブCD4+ T細胞を、25ng/ml IL-27を加えた上記のRPMI培養培地中、2μg/ml抗CD3 mAbおよび1μg/ml抗CD28 mAbでコ−ティングした24または96ウェルプレートにおいて、インビトロで5日間刺激した。IL-27で処理したナイーブT細胞を次いで、CD4発現についてフローサイトメトリーで選別し、各アッセイに用いた。ELISAによる培養上清中のTGF-beta3レベルの決定のため、IL-27処理したT細胞を、PMA（50 ng/ml; Sigma）およびイオノマイシン（1μg/ml; Sigma）で最後の4時間刺激した。【００４０】
TGF-beta3発現プラスミドベクターの構築
マウスTGF-beta3の全長断片を、Tgfb3 cDNA（NM_009368）を含むOmicsLink（商標）Expression-Ready ORFクローニングベクター（GeneCopoeia）から単離した。Tgfb3 cDNAをEcoRIサイトを用いて、CAG（サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー/ニワトリbetaアクチンハイブリッド）プロモーターを有するpCAGGSベクター（非特許文献５０）にサブクローニングし、pCAGGS-Tgfb3とした。組み換えプラスミドを次いで、大腸菌（Escherichia coli）JM109のコンピテント細胞内に形質転換し、EndFree Plasmid Giga Kit（Qiagen）を用いて製造業者のプロトコールに従い、プラスミド精製カラムにて精製した。精製したプラスミドDNAは、使用の直前に、滅菌したPBS（pH 7.4）で1μg/μlに希釈した。【００４１】
プラスミドDNAの静脈内注射
MRL/lprマウスに、滅菌したPBS（pH 7.4）に溶かした100μgのプラスミドDNA（pCAGGs-Tgfb3または対照pCAGGS）を、4週間の間隔を置いて二回、静脈内注射した。週1回の間隔でタンパク尿を半定量的に測定し、最後の投与の6週間後に腎臓病理を上記のように評価した。【００４２】
ヒトPBMCのフローサイトメトリーによる評価
ヒトの試料はすべて、インフォームドコンセントの元で入手した。ヒトリサーチプロジェクトのためのプロトコールは、東京大学の倫理委員会によって承認されている。健康なヒトおよびSLE患者由来のPBMCを、Ficoll-Paque（Amersham Pharmacia Biotech）グラジエントによって単離した。細胞を洗浄した後、それらを示したmAbで、4℃にて20分間染色した。mAbの非特異的結合を防ぐために、標識したmAbで染色する前にHuman Fc Receptor Binding Inhibitor（eBioscience）を添加した。死細胞は、7-AADによって除いた。蛍光陽性細胞をMoflo XDPセルソーターで分析した。5つの異なる亜集団は以下の通りである：（ナイーブT）CD4+CD25-CD45RA+CCR7+細胞；（CD25+ Treg）CD4+CD25+CD127dimCD45RA-細胞；（LAG3+ Treg）CD4+CD25-CD45RA-LAG3+細胞；（Tfh）CD3+CD19-CD4+CD25-LAG3-CXCR5+CD45RA-細胞；（B細胞）CD3-CD19+細胞。【００４３】
ヒトT細胞サブセットの定量的リアルタイムPCR発現解析
プレートに結合した5μg/mlの抗CD3 mAbで72時間刺激したヒトナイーブTおよびCD25+ TregおよびLAG3+ Tregから単離した総RNAを、上記のようにEGR2、IL10、IFNG、およびFOXP3のmRNA発現について分析した。TGFB3 mRNA発現は、各T細胞サブセット由来の刺激していない細胞を用いて決定した。【００４４】
ヒトIL-10の定量
サイトカイン分析のために、ヒトナイーブT、CD25+ Treg、およびLAG3+ Tregを、5μg/mlの抗CD3 mAb /抗CD28 mAbでコーティングした96ウェル平底プレートに、10% FBS、100μg/ml L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および50μM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中、2×104細胞／ウェルで撒いた。培養上清を3日目に回収し、製造業者のプロトコールに従いOptEIA Human IL-10 ELISA Kit II（BD Biosciences）を用いたELISAにより、培養上清中IL-10レベルを測定した。【００４５】
ヒトLAG3+ Treg抑制アッセイ
上記のRPMI-1640培地を共培養に用いた。FACSで精製した1×105個のヒトB細胞およびFACSで精製した5×104個のヒトTFH細胞を、FACSで精製した1×105個のヒトCD25+ TregまたはLAG3+ Tregと共にまたは伴わずに、2μg/ml組み換えブドウ球菌エンテロトキシンB（Toxin Technology）の存在下で、丸底96ウェルプレートに播種した。培養上清を12日目に回収し、総IgGレベルを、製造業者のプロトコールに従いHuman IgG Quantitation Setキット（Bethyl Laboratories）を用いたELISAにより分析した。【００４６】
統計分析
統計的有意性、正規分布、および群間のF検定を、GraphPad Prismバージョン5.03（GraphPad Software, Inc.）を用いて分析した。定量的組織学およびタンパク尿の進行を、Mann-WhitneyのU検定により分析した。他のすべての統計的差異は、Studentの両側t検定を用いて決定した。分散が同等でない場合、Student のt検定にWelchの補正を適用した。すべての試験について、P＜0.05を統計的に有意な差とみなした。図のすべてのデータは、平均±s.dで表される。試料のサイズは、以前の研究で典型的に用いた数に基づいて推定した。試料サイズをあらかじめ決めるために統計的方法は使用しなかった。分析から除外した試料や動物はなかった。MRL/lprマウスにおける養子細胞移入試験を除いて、動物の無作為化は行わなかった。組織学的分析以外、動物実験は盲検方式で実施しなかった。【００４７】
〔結果〕
LAG3+ TregによるEgr2依存的な液性免疫の抑制
T細胞におけるEgr2の役割を明らかにするために、本発明者らはT細胞特異的なEgr2コンディショナルノックアウト（CKO）マウス（Egr2fl/fl CD4-Cre+）を作出した。Egr2 CKOマウスは、CD4+CD25-CXCR5+PD-1+ TFHおよびB220+GL-7+Fas+ 濾胞B細胞 (GCB)の比率の顕著な増加を示した（図1a）。また、Egr2 CKOマウスでは、4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル（NP）-オボアルブミン（NP-OVA）の単回免疫後のNP特異的抗体の産生が増強されていた（図1bおよび図8a）。野生型（WT）LAG3+ Tregを移入すると、TFHおよびGCBの自発的分化が顕著に抑制され（図1a）、過剰な抗体産生が阻害された（図1b）ことから、LAG3+ TregはインビボでB細胞応答を抑制できることが示唆された。インビトロでのT細胞/B細胞共培養系において、抗CD3抗体で刺激したWT LAG3+ Tregは、抗IgM抗体で刺激したB細胞の生存率、および抗CD40抗体/IL-4で刺激したB細胞による総IgG産生量を、CD25+ Tregよりも効果的に低減した（図1c、d）。インビボでのB細胞応答を評価するために、WTマウス由来のB細胞、およびOVA特異的OT-II T細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウス由来のCD4+CD25-LAG3-ヘルパーT細胞（Th細胞）を、組み換え活性化遺伝子1欠損（Rag1KO）マウスに移入し、その後、NP-OVAを2回免疫した。WT LAG3+ Tregの共移入は、NP特異的抗体応答ならびにTFHおよびGCBの発生を著しく効果的に抑制した（図1e,fおよび図8b）。Egr2CKOマウスにおいて増強されたGCBの発生および抗体産生は、B細胞制御におけるEgr2の極めて重要な役割を示唆しており、Egr2欠損LAG3+ Treg（図8c）は、インビボでのB細胞による抗体産生ならびにTFHおよびGCBの発生を抑制することができなかった（図1e、f）。このように、LAG3+ TregによるB細胞応答の抑制には、LAG3+ TregにおけるEgr2の発現が必要であることが明らかとなった。Egr2プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現したトランスジェニックマウス（Egr2-GFPマウス、図9a）において、CD4+ T細胞におけるGFPの発現は、Egr2タンパク質の発現と相関していた（図9b）。Egr2の重要性は、Egr2-GFPマウス由来のCD4+CD25-Egr2-GFP+細胞も、LAG3+ Tregと同様にインビボでB細胞抑制活性を示したという知見によって確認された（図9c）。本発明者らは次に、LAG3+ Tregを介した抗体産生の抑制が、Rag1KOマウスのようなリンパ球減少状態の下のみならず、より生理学的な非リンパ球減少状態の下でも誘導されるかどうかを検証した。Eαペプチド特異的TCRトランスジェニックTEaマウスに、WT B細胞およびOT-II Th細胞を養子移入し、その後、NP-OVAを1回免疫した。共移入WT LAG3+ Tregは、非リンパ球減少TEaマウスにおいてNP特異的な抗体産生を効果的に抑制した（図1gおよび図8d）。【００４８】
LAG3+ TregによるFas変異MRL/lprマウスにおけるループス様疾患の抑制
本発明者らは、ループス様病態を呈する、Fas変異を有するMRL-Faslpr/lpr（MRL/lpr）マウス（非特許文献１７）における病態の進行を、LAG3+ Tregが阻害できるかどうかを調べた。MRL/lprマウスに、Fas変異を有さないMRL-Fas+/+（MRL/+）マウスに由来する様々なT細胞サブセットを養子移入したところ、LAG3+ Tregはタンパク尿の進行を顕著に遅延させたが、CD25+ Tregは遅延させなかった（図2a）。さらに、LAG3+ Tregを3回移入することにより、タンパク尿の進行がほぼ完全に抑制された。抗ds-DNA抗体力価および糸球体病変スコアの増加も、LAG3+ Tregの単回移入によって阻害された（図2b〜dおよび図10a）。対照的に、既報（非特許文献１８）と一致して、MRL/+マウス由来のCD25+ TregをMRL/lprマウスに3回移入しても疾患の進行は変化しなかった（図10b〜d）。さらに、MRL/lprマウス由来のLAG3+ TregをMRL/lprマウスに養子細胞移入した場合も治療効果を及ぼさなかった（図10b〜d）。また、顕性タンパク尿発症後のMRL/lprマウスにMRL/+ LAG3+ Tregを3回注射すると、当該マウスのループス様病態が改善された（図10e、f）。【００４９】
Fasが変異しているMRL/lprマウスにおける、MRL/+に由来するLAG3+ Tregの治療効果から、FasがLAG3+ Tregの抑制能に寄与することが示唆されたことより、本発明者らはB6バックグラウンドマウスにおいて、LAG3+ Tregによる液性免疫抑制能とFas発現の関連につき検討を行った。抗FasLブロッキング抗体を加えると、インビトロ（図2eおよび図8e）およびインビボ（図2f〜i）の両方でLAG3+ Tregによる抗体抑制が抑止された。これに対し、Fasを欠損しているB6/lprマウスに由来するLAG3+ Tregは抗体産生を抑制できなかったが、FasLを欠損しているB6/gldマウスに由来するLAG3+ Tregは抗体産生を抑制できた（図2f〜i）。それゆえ、LAG3+ Treg上の、FasLではなく、Fasが、B細胞の抑制に必要といえる。WTマウスおよびEgr2CKOマウスに由来する活性化CD4+ T細胞は、LAG3+細胞上と類似したレベルのFasを発現した（図11）ので、CD4+ T細胞上のFas発現はEgr2と無関係であった。【００５０】
LAG3+ Tregにより産生されたTGF-beta3の液性免疫制御への関与
次に、本発明者らは、LAG3+ TregによるB細胞抑制がIL-10またはTGF-betaファミリーメンバーによって媒介されるかどうかを調べた。上記のように、LAG3はTr1細胞の特異的な細胞表面マーカーの1つであると考えられている（非特許文献１６）。本発明者らは、LAG3+ Tregが大量のIL-10を産生し（非特許文献１４）、Egr2がB lymphocyte-induced maturation protein-1（Blimp-1）（Prdm1遺伝子によってコードされる）を通じてCD4+ T細胞におけるIL-27誘導性のIL-10産生を媒介すること（非特許文献１９）をこれまでに報告した。予想通り、T細胞特異的なPrdm1CKOマウス（Prdm1fl/fl CD4-Cre+）由来のLAG3+ TregにおけるIL-10発現レベルは、WTマウス由来の場合と比べて顕著に低減された（図12a）。Prdm1CKOおよびIL-10欠損（IL-10KO）マウスに由来するLAG3+ Tregも、インビボでのNP特異的抗体応答を効果的に抑制したことから（図12b）、IL-10がLAG3+ TregによるB細胞抑制にとって重要ではない可能性があることが示唆された。LAG3+ Tregのマイクロアレイ分析（非特許文献１４）および定量的リアルタイムPCRの結果から、TGF-beta1または2ではなく、TGF-beta3の発現の顕著な増加が明らかにされた（図3a、b）。T細胞受容体(TCR)刺激は、LAG3+ Tregの培養上清において、TGF-beta1または2ではなく、TGF-beta3の大量の産生を誘導した（図3c〜e）。対照的に、CD25+ Tregは、これらの条件下で少量のTGF-beta1を産生しただけであった。TGF-beta3は、抗IgM抗体で刺激したB細胞の増殖およびCD40発現を顕著に抑制し（図3f）、B細胞死を強力に誘導し（図3g）、総IgG産生を抑制した（図3h）。TGF-beta3は、TGF-beta1がB細胞の機能を強力に抑制したという以前の所見（非特許文献２０）に合致して、TGF-beta1および2と類似の効果を生み出した（図13a、b）。シグナル伝達に関して、TGF-beta3の添加は、活性化B細胞においてsignal transducer and activator of transcription（STAT）6、Syk、およびNF-κB p65のリン酸化を顕著に低減させた（図3i〜k）。ヘルパーT細胞によって産生されたIL-4はB細胞の増殖および生存を増強し、同時にSTAT6の活性化を介して免疫グロブリンの分泌およびアイソタイプ・スイッチングを促進する（非特許文献２１）。チロシンキナーゼSykの活性化は、B細胞受容体（BCR）刺激に応じた細胞内シグナル伝達にとって重要である（非特許文献２２）。抗原で刺激されたB細胞による特異的な抗体産生に必要なCD40活性化は、NF-κB p65のリン酸化を誘導する（非特許文献２３）。それゆえ、TGF-beta3はB細胞の機能にとって重要な複数の経路を阻害する。TGF-beta3は、IL-23依存的に分化しているTh17細胞によっても産生される（非特許文献２４）ため、TGF-beta3の産生はLAG3+ Tregによるものに限定されない。本発明者らは、Th17細胞に加えてTh1細胞がTGF-beta3を産生することを見出した（図3l）。しかしながら、LAG3+ TregはTh1細胞およびTh17細胞よりも顕著に多量のTGF-beta3を産生した。【００５１】
WT B細胞およびWT OT-II Th細胞を移入しOVA−NPで2回免疫を行ったRag1KOマウスにおいて、LAG3+ Treg共移入による抗体産生の抑制ならびにTFHおよびGCBの発生が、TGF-beta3ブロッキング抗体投与によって相殺された（図4a、b）。TGF-beta3のブロックはまた、MRL/lprマウスにおけるMRL/+ LAG3+ Tregの治療効果を抑止し（図4c、d）、TGF-beta3の重要な役割を示唆していた。興味深いことに、Egr2欠損マウス由来のLAG3+ TregおよびFasが変異したB6/lprマウス由来のLAG3+ TregによるTGF-beta3の産生は、顕著に低減されていた（図4e）。それゆえ、Egr2およびFasは、LAG3+ TregのB細胞抑制活性およびTGF-beta3産生に必要といえる。MRL/lprマウスにおけるループス病態の制御のためのTGF-beta3の重要性は、TGF-beta3発現プラスミドのネイキッドDNA法による投与がタンパク尿の進行および腎病理を顕著に改善したという知見によって検証された（図4f、g）。【００５２】
LAG3+ Tregを媒介した抑制におけるB細胞上のPD-1発現の必要性
Programmed death-1（PD-1）遺伝子の変異体がSLEの疾患感受性と関連付けられている（非特許文献１）。PD-1は、T細胞およびB細胞の両方に負の共刺激シグナルを付与し（非特許文献２５、２６）、PD-1欠損（PD-1KO）マウスはループス様の疾患を発症する（非特許文献２７）。さらに、PD-1およびLAG3は自己免疫および腫瘍免疫を相乗的に制御する（非特許文献２８、２９）。TGF-beta3とPD-1との間の潜在的な協調について調べるため、本発明者らは、B6マウス、PD-1KOマウス、Fasを欠損したB6/lprマウス、およびFasLを欠損したB6/gldマウスに由来する、抗IgM抗体で刺激したB細胞にrTGF-beta3を加えた。PD-1KOマウス由来のB細胞はTGF-beta3誘導性の細胞分裂阻害に耐性であったが、B6/lprマウスまたはB6/gldマウスに由来するB細胞は耐性を示さなかった（図5a）。リン酸化されたSTAT6がB細胞株において抗アポトーシスBcl-xLの発現を誘導することが知られているという既報（非特許文献３０）に合致して、TGF-beta3は、WTマウス由来の活性化細胞においてBcl-xLおよびBcl-2a1の発現を抑制したが、PD-1KO由来のB細胞においては抑制しなかった（図5b）。TGF-beta3およびPD-1による協調的なB細胞抑制は、LAG3+ Tregを介した抑制における、B細胞上でのPD-1発現の重要性を強く支持している。抗PD-L1ブロッキング抗体の添加によって、インビトロでのLAG3+ Tregを介した抗体産生抑制が阻害された（図5c）。抗NP抗体の産生は、PD-1KO B細胞およびWT OT-II Th細胞を移入しOVA−NPで2回免疫を行ったRag1KOマウスでのWT LAG3+ Tregの共移入によって抑制されなかった。しかしながら、WT B細胞およびPD-1KO OT-II Th細胞を移入したRag1KOマウスは、LAG3+ Tregにより抑制された（図5d）。これらの結果は、LAG3+ TregによるB細胞抑制のためにB細胞上でのPD-1の発現が必要とされることを支持するものである。CD4+CD25-Egr2 + T細胞は、PD-1のリガンドPD-L1、およびLAG3の両方を共発現した（図14a、b）。しかしながら、PD-L1およびPD-L2は、GCBを含むさまざまな細胞種に発現している（非特許文献３１）ので、LAG3+ Treg上のPD-L1は、B細胞上のPD-1に対する唯一のリガンドではない可能性もある。【００５３】
IL-27によるB細胞応答抑制機能を有するTGF-beta3産生Egr2+ T細胞の誘導
IL-27は、抗原提示細胞（APC）によって産生されるサイトカインのIL-12/IL-23ヘテロ二量体ファミリーの一員である。IL-27は、IL-10産生Tr1細胞の分化因子として特定された（非特許文献３２）。本発明者らは、IL-27がCD4+ T細胞におけるEgr2の発現を誘導し、Egr2がBlimp-1媒介性のIL-10の産生に必要とされることを以前に報告した（非特許文献１９）。IL-27処理は、Egr2および、LAG3だけでなく(図6a)、TGF-beta3 mRNAおよび、TGF-beta3タンパク質産生も誘導した（図6b、c）。Egr2欠損CD4+ T細胞は、IL-27誘導性のTGF-beta3産生の大幅な低下を示し（図6c）、これにより、TGF-beta3の誘導に対するEgr2の重要性が明らかになった。CD4+ T細胞における特異的STATタンパク質活性化は、ヘルパーT細胞系統の分化に関連している。IL-27を介したIL-10の誘導にはSTAT1およびSTAT3の両方が必要になる（非特許文献３２）が、本発明者らは、IL-27を介したEgr2誘導がSTAT3に依存することを以前に見出した（非特許文献１９）。IL-27媒介性のTGF-beta3誘導は、STAT1欠損CD4+ T細胞ではなく、STAT3欠損CD4+ T細胞で損なわれ（図6c）、これにより、IL-27によるEgr2とTGF-beta3誘導がSTAT3依存的であることが実証された。さらに、IL-27で処理されたCD4+ T細胞は、B細胞抗体産生を顕著に抑制した（図6d）。対照的に、IL-27で処理されたEgr2欠損CD4+ T細胞は、B細胞による抗体産生を抑制することができなかった。このように、IL-27誘導性のTGF-beta3産生細胞は、Egr2依存的に液性免疫に対する抑制活性を示す。【００５４】
ヒトLAG3+ Tregによる抗体産生抑制機構および、ヒトLAG3+ Tregと全身性エリテマトーデスとの関連
本発明者らは、健常ドナーの末梢血単核細胞（PBMC）に由来するCD4+ T細胞においてCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞を同定した（図7a）。マウスLAG3+ Tregと同様に、ヒトCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞は、TCR刺激に応じてEGR2、IL10、およびIFNGを発現し（図7b）、大量のIL-10を産生した（図7c）。ヒトCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞の制御活性は、それらがB細胞およびTFH細胞と共培養された場合に、CD4+CD25+CD127lowCD45RA-活性化Treg（非特許文献３３）と比べて効果的に抗体産生を抑制したという測定結果によって確認された（図7d）。ヒトCD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞は培養後に高レベルのTGF-beta3を発現し（図7e）、それらがマウスLAG3+ Tregと同一の機構を通じてB細胞を抑制することを示唆していた。それゆえ、本発明者らは、CD4+CD25-CD45RA-LAG3+ T細胞集団を、マウスLAG3+ Tregに対するヒトの対応物と考える。本発明者らは次に、LAG3+ Tregがヒトの全身性自己免疫疾患において減少されうるかどうかを評価した。血中のLAG3+ Tregの割合は、健常ドナーと比べてSLE患者の末梢血において顕著に低かった（図7f）。これらの所見から、SLE患者において抗体抑制能を有するT細胞集団をモニターするためにLAG3発現が使用されうることが示唆される。【００５５】
SLEモデルマウスにおけるTGF-beta3とTGF-beta1の治療効果の比較
TGF-beta3とTGF-beta1は一般的には共通のシグナル伝達分子を介して、少なくともin vitroでは同様の生物活性を示すと理解されている。しかし、in vivoでは主にノックアウトマウスの成績から、表現が異なることが報告されており、この違いは発現の時期や場所によって生じている、或いは、本来致死であるTGF-beta1 KOマウスにTGF-beta3をノックインしたマウスでは、rescueされるものの異なる表現も見られることから、生体においては異なる生物活性を示す可能性も示唆されている（非特許文献５１）。
また免疫系の報告では、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルで、TGF-beta3が病原性のT細胞（Th17細胞）を誘導して、病態を悪化させるという、今回の実験結果とは逆の報告もある（非特許文献５２）。同文献では、TGF-beta1にはこの作用が無いことが示されいる。同様に自己免疫疾患の悪化にTGF-beta3が関与していることがTRIM28 KOマウスでも報告されている（特許文献５２）。このマウスは自然発症の自己免疫疾患で短命であり、EAEも重症化するが、これにTGF-beta3のderepressionが関与しているとされている。【００５６】
このように従来の報告では、生体においてTGF-beta3とTGF-beta1とは異なる活性を有することが示唆されていた。そこで、本発明者らは、今回確認されたTGF-beta3の免疫抑制作用をTGF-beta1の作用と比較検討すべく、SLEの自然発症モデルであるMRL/lprマウスに全長TGF-beta1とTGF-beta3をコードする遺伝子を発現させ、SLE様病態に対する両遺伝子発現の影響を検討した。pCAGGSプラスミドにクローニングした全長TGF-beta1とTGF-beta3、およびコントロールとしてpCAGGSプラスミドを各100 μg、尾静脈よりMRL/lprマウスに投与した。各プラスミドの投与は11週齢時、15週齢時の2回行い、その後各種病態パラメータを測定した。
その結果、TGF-beta3発現プラスミドは脾臓重量（21週齢）、経時的なタンパク尿の増加をコントロールプラスミドに比べて有意に抑制し、その効果はTGF-beta1発現プラスミドより強い傾向を示した（図15a, b）。また、TGF-beta3発現プラスミドは腎臓へのIgGの沈着を抑制し、加えて細胞の浸潤と増殖・半月体形成・細胞死等を指標した糸球体傷害もコントロールプラスミド、TGF-beta1発現プラスミドに比べて有意に軽減していることが明らかになった（図16a, b）。さらにTGF-beta1発現プラスミドはリンパ節、脾臓など二次リンパ組織胚中心に存在する、CD4/CXCR5/PD-1陽性CD25陰性の濾胞性ヘルパーT細胞（TFH）の割合を有意に増加させたのに対し、TGF-beta3発現プラスミドはこれを有意に抑制した（図17a, b）。
以上の結果から、MRL/lprマウスモデルにおけるTGF-beta1とTGF-beta3の治療効果の違いは、抗体産生を伴う免疫反応に重要な濾胞性ヘルパーT細胞の抑制能の有無に依存している可能性が示唆された。すなわち、TGF-beta3は濾胞性ヘルパーT細胞の抑制というTGF-beta1にはない作用により、SLEなどの自己免疫疾患治療に有用である可能性がある。【００５７】
〔考察〕
本研究の結果から、LAG3+ Tregが、ループス様病態を呈するMRL/lprマウスにおけるGCBおよびTFHの発生、抗体産生、ならびに疾患の進行を抑制することが実証された。Egr2依存的かつFas依存的にLAG3+ Tregによって産生されるTGF-beta3は、液性免疫の抑制において決定的な役割を果たす。LAG3+ TregはCD25+ Tregよりもはるかに高いレベルのIL-10を産生する（非特許文献１４）ので、LAG3+ Tregは制御性サイトカインの強力な産生体でもある。TGF-beta3の炎症促進性の役割は、TGF-beta3が病原性Th17細胞を効果的に誘導するという知見によって以前に実証された（非特許文献２４、３４）。本発明者らの結果は、自己免疫の制御におけるTGF-beta3の、これまで認識されていなかった役割を明らかにするものであった。TGF-beta1も炎症促進性および抗炎症性の両方の効果を及ぼす（非特許文献３５〜３７）。特に、TGF-beta1はB細胞アポトーシスを誘導し、活性化したヒト扁桃腺B細胞からの免疫グロブリン産生を低減する（非特許文献３８、３９）。CD25+ TregおよびTh3制御性細胞（非特許文献４０、４１）は強力なTGF-beta1産生源であり、CD25+ TregはTGF-beta1を通じてB細胞の免疫グロブリン合成を抑制することが示されている（非特許文献４２）。しかしながら、CD25+ Tregを含むCD4+ T細胞により産生されるTGF-beta1の量は比較的限られており（図3e）、免疫抑制に関連するTGF-beta1産生源を明確にすることは困難であった。いくつかの系において、TGF-beta1およびTGF-beta3が明らかなアイソフォーム特異的生物活性を示すことが実証されているが、TGF-beta1およびTGF-beta3はB細胞応答については同等な抑制活性を示した（図13a、b）。ヘルパーT細胞の発生に関して、TGF-beta3は、病原性Th17細胞の発生中にTh17細胞によって自発的に産生される（非特許文献２４）。本発明者らの実施においては、Th17細胞だけでなく、Th1細胞も、かなりの量のTGF-beta3を産生したが、LAG3+ TregはTh1およびTh17細胞よりもさらに多くの量のTGF-beta3を産生した（図3l）。よって、LAG3+ Tregにより産生される大量のTGF-beta3は、免疫寛容の発生および維持において重要な役割を果たす。【００５８】
本発明者らは、LAG3+ TregにおけるTGF-beta3の分泌に必要な2つの分子FasおよびEgr2を同定した。T細胞およびB細胞におけるEgr2欠損はループス様症候群を引き起こし、Egr2はCD44high T細胞においてp21cip1の発現を直接活性化し、Th1およびTh17分化の制御に関与している。Th17細胞の分化に必要なAP-1阻害剤BATFの機能がEgr2により阻害されるという事実から、Egr2がエフェクターT細胞の内因性の制御因子であることが示唆されている（非特許文献１２）。本発明者らは、本明細書において、T細胞におけるEgr2がTFHおよびGCBの発生の制御にとって重要であることを明らかにした（図1）。液性免疫を制御するためのEgr2の外因性の機能は、Egr2CKOマウスにおいて、Egr2を発現するLAG3+ Tregの移入によって、抗体産生だけでなくTFHおよびGCBの過剰増殖も抑制されたという本発明者らの研究結果によって確認された（図1）。Fasは、アポトーシスを誘発することによってT細胞およびB細胞の増殖を制御する。MRL/lprマウスにおける自己免疫疾患の病態がTGF-beta3の投与により改善された（図4f、g）ことから、LAG3+ TregによるTGF-beta3産生の障害は当該疾患の一因となりうる。【００５９】
IL-10を産生するTr1細胞に対する分化因子IL-27（非特許文献３２）は、CD4+Egr2+LAG3+ T細胞を誘導する（非特許文献１９）。しかしながら、免疫グロブリン産生の増強において、CD46誘導性のTr1細胞が従来型のT細胞と比べて更に強力である（非特許文献４４）ため、B細胞の制御におけるTr1細胞の役割は明らかではない。LAG3+Tregにおいて、IL-10はB細胞応答の制御に直接寄与しなかった（図12）。それにもかかわらず、IL-27の受容体WSX-1の過剰発現がMRL/lprマウスにおける自己免疫疾患の発症から保護するという知見によって、IL-27と抗体産生の制御との間の関連性が示唆された。特筆すべきは、IL-27によるIL-10の誘導にはSTAT1およびSTAT3が必要であるが、Egr2およびTGF-beta3を促進するIL-27の活性はSTAT3依存的であるということである（図6c）。STAT3を活性化するIL-6はTGF-beta3の産生も誘導する（非特許文献２４）ので、STAT3はCD4+ T細胞におけるTGF-beta3誘導のための重要な役割を果たしうる。【００６０】
〔TGF-beta3機能分子への応用〕
本発明者らは、TGF-beta3によるB細胞活性抑制の知見に基づき、TGF-beta3を用いた新たな機能分子の創製を検討した。機能分子は、例えば TGF-beta3を抗体のFc領域とアミノ酸で連結し、さらに該抗体はB細胞を認識する可変領域を含む構成が考えられる。抗体又は抗体断片との連結はTBP(Latent-TGFbeta-binding protein)-1,3および4の第3番目のTBdomain(TGFbeta binding domain)を用いた連結、酵素を用いた連結、化学的な修飾反応を用いた連結等で実施することも出来る。
その他の手法としては、一の可変領域がTGF-beta3を認識し、他の可変領域がB細胞を認識する多重特異性抗体の構成をとることもできる。また、TGF-beta3と抗体のFc断片とが連結し、さらに該TGF-beta3にB細胞を認識する可変領域断片が連結した融合タンパク質の構成をとることもできる。
B細胞は望ましくは自己反応性B細胞であり、また可変領域によるB細胞の認識は、例えばCD19、CD20、CD40、CD22、IL21R、BAFF-R、BCMA、TACI、CD27、CD138等のB細胞表面マーカーとすることができる。【００６１】
またTGF-beta3などの生理活性タンパク質を治療剤として提供するためには、ヒト血漿中で安定的に作用させることが考えられる。血漿中で安定的に作用させるための態様として、抗体や血清アルブミン等の血漿中の半減期が長いタンパク質と連結することが可能である。また、ポリエチレングリコール（PEG）や多糖類を化学的に連結することや糖鎖修飾の改変が可能である。最近では、長い人工ポリペプチド配列を連結することによりPEGを模倣させる技術も報告されている（非特許文献５３）。【００６２】
これら機能分子により、TGF-beta3が安定的にB細胞へ輸送され、効果的に標的とするB細胞活性を抑制し、また自己免疫疾患の治療剤として適用することができる。自己免疫疾患としては、TGF-beta3による改善効果が確認されたSLE以外にも、IgG産生若しくはTFHの増加を伴う疾患、例えば天疱瘡(Pemphigus)、多発性硬化症(Multiple Sclerosis)、視神経脊髄炎（NMO）、ANCA関連血管炎、関節リウマチ、移植臓器拒絶、シェーグレン症候群(Sjogren's syndrome)、若年性皮膚筋炎(Juvenile dermatomyositis)、多発筋炎/皮膚筋炎(Polymyositis/Dermatomyositis)、強皮症（Systemic Sclerosis）、重症筋無力症(Myasthenia gravis)、又はバセドウ病、橋本病等の自己免疫性甲状腺疾患(Autoimmune thyroid disease including Graves' disease or Hashimoto's thyroiditis)等に対しても同様の改善効果が期待される。【００６３】
Latent TGFbeta3およびTGFbeta3改変抗体分子の作製
遺伝子構築
マウスTGFbeta3遺伝子は、データベースに登録されているアミノ酸配列（Uniprot No. P17125 ）の24番目から410番目を使用し、Latent TGFbeta3として発現するために、N末端側にマウスIg kappa鎖のシグナル配列を付加し、直後に精製を簡便に行う目的でFLAGタグを融合させた。また、Latent TGFbeta3については、発現量を改善する目的で公開論文（Molecular Therapy (2010) 18:12, 2104-2111）の情報に従って、データベースに登録されているアミノ酸配列（Uniprot No. P17125 ）の25番目のCysをSerに置換した。野生型のTGFbeta3遺伝子はOmicsLink（商標）Expression-Ready ORFクローニングベクター（GeneCopoeia）に挿入されている遺伝子配列を使用した。シグナル配列を除いたLatent TGFbeta3のアミノ酸配列を配列番号１１に記載した。
TGFbeta3改変抗体分子は、マウスCD19を認識する抗体を片腕に有する分子形であり、C末端にTGFbeta3を連結するためのTB3ドメイン（TBP(Latent-TGFbeta-binding protein)-1,3および4の第3番目のTBdomain(TGFbeta binding domain)）を連結して調製した。また、比較対象としてTGFbeta3を連結するTB3ドメインを持たない抗体も調製した。これらの改変抗体分子は、抗CD19抗体の1個のFabがFcに連結した構造となる。
マウスCD19を認識する抗体1D3の抗体可変領域遺伝子は、ATCCで販売されているラットハイブリドーマ1D3 (ATCC（登録商標）HB-305TM)から定法に従ってクローニングした。クローニングしたL鎖可変領域は、マウスkappa鎖定常領域と連結した。クローニングしたH鎖可変領域は以下に示す改変定常領域配列と連結した。H鎖定常領域としては、まず、Fc受容体への結合を欠失するようにアミノ酸変異を導入したFc領域mF18（EUナンバリングで表される235位のProがLysに置換されたアミノ酸変異および239位のSerがLysに置換されたアミノ酸変異を有する）に対し、Fc領域のヘテロ化を促進するためにCH3ドメインD399Rを導入した。さらに、C末端側に検出および精製に使用するV5タグおよびlatent TGFbeta3をコンジュゲートするためにマウスLTBP1タンパク質の3番目のTBドメイン（TGFbeta binding domain）の配列(TB3)を連結した（配列番号：９）。Fc領域のみを有するH鎖定常領域にも、上述のFc受容体非結合のための変異と、ヘテロ化促進変異としてK409Eを導入した（配列番号：１０）。Fc受容体非結合変異の詳細は公開特許WO 2012-132067に、ヘテロ化促進変異の詳細は公開特許WO2015-046467に記載されている。
これらの遺伝子は哺乳類細胞一過性発現用ベクターpBEF-OriP（Wako）にクローニングした。得られたプラスミドはプラスミド調製キット（Macherey-Nagel, NucleoBond Xtra Maxi）でトランスフェクショングレードの試料を調製し発現実験に使用した。発現したタンパク質の遺伝子名、タンパク質名の一覧を表１に示した。【００６４】
【表１】
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【００６５】
発現
これらのタンパク質の発現にはExpi293-F細胞（Life technologies, A14527）とそのトランスフェクションキット(ExpiFectamine293 transfection kit)を使用した。Expi293-F細胞の培養はExpi293 medium(Life technologies)を培地に用い、37℃のCO2インキュベーター内で135 rpmで振盪して行った。プラスミドの導入はLife technologies社のプロトコールで実施したが、TGFbeta3および抗体のプラスミドに加えてpBEF-EBNA1を加えて行った。また、キットに付属するEnhancer溶液は使用しなかった。検討の結果、培養期間は５または７日間とした。培養終了後、培養液を遠心し、上清を0.45μmのフィルターでろ過した。得られた培養上清は液体窒素で凍結後、-80℃の冷凍庫内で保存した。【００６６】
Latent TGFbeta3の発現検討
Latent TGFbeta3の発現はssIgK-FLAG-TGFbeta3(C25S)のコンストラクトを使用し、培養液30mlあたり、30 μgのプラスミドと2.4μgのpBEF-EBNA1を共発現した。培養期間は7日で最大となったので以降の実験では7日間培養で実施した。またトランスフェクションキットに付属するEnhancer1および2溶液を添加した場合、Pro体比率が高まったため使用していない。【００６７】
Latent-TGFbeta3の精製
AKTA avant（GE healthcare）を使用し、200mlの培養上清を50mM HEPES/150mM NaCl/1mM EDTA,pH7.8溶液で平衡化した2mlのFLAG-M2レジン(Sigma社Anti-FLAG M2 agarose affinity gel #A2220)をつめたカラムにアプライした。実験は低温室内で行い、流速1ml/min．でアプライした後、平衡化バッファーで洗浄した。溶出は0.1mg/ml FLAG peptide(Sigma社 #F3290)を含む平衡化バッファーで行った。Latent-TGFbeta3を含む画分はまとめて20mM Tris-HCl,pH8.0/1mM EDTA溶液に透析した。透析後の画分はBioRad社ENrich-Qカラム(10x100mm #780-0003)に吸着後、濃度勾配0-300mM/45CV のNaCl溶液で溶出した。Pro体との分離が良くない場合、さらにGE heathcare社RESOURCE-Q1mlカラム(#17-1177-01)でも精製を試みた。イオン交換カラムでの分離の後、サンプルを限外ろ過膜で濃縮し、GE healthcare社Superdex200increase 10/300ゲル濾過カラム（#28-9909-44）で精製した。Latent-TGFbeta3のゲル濾過クロマトグラムを図18に示す。以降の実験ではこのゲル濾過画分を濃縮して使用した。【００６８】
分画された画分の分析はSDS-PAGEで行った。ゲルはDRC社10−20％グラジエントゲルまたは12.5％ゲルを使用し、サンプルバッファーはナカライ社の還元用および非還元用の試薬を使用した。各画分の1/3量のサンプルバッファーを添加した後、95℃ 5分熱処理を行い電気泳動試料とした。また分子量マーカーとしてBioRad社Protein marker (PrecisionPlus protein All blue standards #161-0373)を使用した。ゲル濾過画分の電気泳動像を図１９に示す。【００６９】
TGFbeta3改変抗体分子の発現検討
表１で示した遺伝子を挿入したプラスミドを使用してTGFbeta3改変抗体分子（1D3-mF18-latent TGFbeta3）および改変抗体分子（1D3-mF18）を発現した。両分子ともに、抗体H鎖、L鎖は同じプラスミドを使用し、TGFbeta3改変抗体分子の発現は、TGFbeta3発現プラスミドを共発現させることで抗体C末端側にコンジュゲートさせた。コンジュゲート体の発現を最適化するために、発現条件の検討をおこなった。発現に使用したプラスミド量を表２に示す。TGFbeta3のプラスミド量比を抗体と等量から2倍量、5倍量まで増加させて検討した結果、コンジュゲート体が最大となるのは2倍量で、結合率が最大となるのは5倍量であった（図２０）。今後の検討ではこの2倍量か5倍量のプラスミド比で実験を行った。また、培養期間はLatent体と同様に7日でコンジュゲート体量が最大となったため、7日間培養としている。【００７０】
【表２】
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【００７１】
TGFbeta3改変抗体分子の精製
TGFbeta3と抗体のプラスミド量比2:1または5:1でSingle arm抗体と通常の抗体（2arm）の発現を実施した。得られた培養上清100 ml毎に、PBSで平衡化したantiV5-tagレジン（MBL社V5-tagged protein Purification gel #3316）1 mlを添加し、４℃で１５時間振盪しレジンに抗体を吸着させた。このレジンをCentrifuge column,10ml(PIERCE社)に詰めて、カラム容積の１０倍量のPBSで洗浄した。溶出はカラム容積量の2mg / ml V5 peptide in PBS (MBL社 V5-tag peptide #3315-205)で室温３０分処理し溶出した。これを５回繰り返して溶出液とした。
この溶出液を限外ろ過膜（Amicon Ultra MWCO10K, Millipore社 #UFC901024または#UFC801024）で濃縮し、ゲル濾過カラムに供した。
ゲル濾過精製は精製装置AKTAavant (GE healthcare)で行い、カラムはSuperdex200increase10/300（GE healthcare, #28-9909-44）を使用した。平衡化バッファーはPBSを使用した。Single arm 1D3-mF18-latent TGFbeta3コンジュゲート体のゲル濾過クロマトグラムを図２１に示す。
電気泳動（図２２）の結果、先に溶出されるPeak1が、Latent-TGFbeta3がコンジュゲートされた分子であったので、これを分取して使用した。【００７２】
Latent TGFbeta3およびTGFbeta3改変抗体分子の生理活性確認
調製したLatent TGFbeta3およびTGFbeta3改変抗体分子 (Single arm 1D3-mF18-latent TGFbeta3コンジュゲート体または TGFbeta3がコンジュゲートされていないSingle arm 1D3-mF18) の生理活性を、HEK-Blue_TGFb細胞 (hkb-tgfb, InvivoGen)を用いて確認した。酸処理またはプロテアーゼ処理によって放出されるmature型TGFbeta3の生理活性の評価方法については、Smadシグナルの入力を分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）の活性を評価することで検証した。
Latent TGFbeta3またはTGFbeta3改変抗体分子に5μg/mLのPlasmin (P1867, Sigma)プロテアーゼを添加したサンプル、標準品として4mM HClで溶解したmature型TGFbeta3リコンビナントタンパク質(243-B3-010/CF, R&D systems)をflat-bottom 96-well plateに分注し、HEK-Blue_TGFb細胞懸濁液を各5×104 cells/wellとなるように添加して、37℃のCO2インキュベーターにて一晩（20hrs）培養した。翌日、20μLの細胞培養上清に対して180μLのQUANTI-Blue (rep-qb1, InvivoGen) 発色基質を添加し、37℃, CO2インキュベーターで1時間反応後、VersaMaxスペクトロメーター (Molecular devices) にてOD655nmで分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）活性を測定した。
mature型TGFbeta3リコンビナントタンパク質のEC50が約0.2ng/mLに対して、Plasminプロテアーゼ処理したLatent TGFbeta3 およびTGFbeta3改変抗体分子（1D3-mF18-latent TGFbeta3）のEC50はそれぞれ約10ng/mL前後と生理活性を示した。一方でTGFbeta3がコンジュゲートされていない抗体分子（1D3-mF18）はPlasminプロテアーゼ処理をしても生理活性は全く認められなかった。（図２３）【００７３】
TGFbeta3改変抗体分子のB細胞への結合特異性
TGFbeta3改変抗体分子のB細胞結合特異性をFACS解析により検証した。日本チャールスリバーより購入した10-14週齢・オスのC57BL/6Nマウスから、脾臓を単離した。脾細胞を調製してFACSバッファーに再懸濁し、TGFbeta3改変抗体分子、T細胞・B細胞・NK細胞・単球・樹状細胞等のマーカーに対する蛍光標識抗体を反応させた。細胞表面マーカーは、B細胞への特異性に関してはB220 (BUV395, 563793, BD), CD138 (APC, 132506, Biolegend)、T細胞に関してはCD3e (BUV737, 564618, BD), CD4 (PE-CF594, 562285, BD), CD8 (PE-Cy7, 552877, BD), CD25 (APC, 102012, Biolegend)、lymphoid DC細胞・plasmacytoid DC細胞・myeloid DC細胞・macrophageに関してはCD11b (PE, 553311, BD), CD11c (APC, 550261, BD), Gr-1 (FITC, 553127, BD)、NK細胞に関してはCD11b  (PE, 553311, BD), CD49b (DX5) (BV421, 563063, BD)をそれぞれ指標にそれぞれの抗原を認識する蛍光標識抗体を組み合わせた。その後、TGFbeta3改変抗体分子のV5タグを認識する抗体(rabbit anti-V5 Ab, V8137, Sigma), BV421-conjugated donkey anti-rabbit IgG Ab (406410, Biolegend)をそれぞれ4℃, 30分間反応させ、FACSバッファーで2回洗浄後、FACS analyzer (LSRFortessaX-20, BD)にて各細胞を分画しTGFbeta3改変抗体分子の細胞特異性を確認した。
FACS解析の結果、病態モデルの脾細胞でないことからCD138陽性plasma細胞への染色を評価することができなかったが、B220を発現するB細胞への結合特異性を確認することができた（図２４）。【００７４】
TGFbeta3改変抗体分子のSmadシグナル入力効果
B細胞への結合特異性が確認されたTGFbeta3改変抗体分子がSmadシグナルを実際に入力する生理活性が持つことを、リン酸化Smad2/3の検出によって評価した。日本チャールスリバーより購入した10-14週齢・オスのC57BL/6Nマウスから、脾臓を単離した。脾細胞を調製して0.5%BSA含有PBSに再懸濁し、latent TGFbeta3, TGFbeta3改変抗体分子,  5μg/mLのPlasminプロテアーゼを添加して30分間37℃のCO2インキュベーターで反応した後、BD PhosflowTM Lyse/Fix buffer (558049, BD)にて細胞を固定し、2回洗浄後にBD PhosflowTM Perm buffer III (558050, BD)にて細胞膜の透過処理を行った。さらにB220  (BUV395, 563793, BD), CD4 (PE-CF594, 562285, BD)に対する蛍光標識抗体とともにPE標識抗リン酸化Smad2/3抗体 (562586, BD PhosflowTM Smad2 (pS465/pS467)/Smad3 (pS423/pS425), BD) にて染色した後、FACS analyzerにてB細胞におけるリン酸化Smad2/3を評価することで、TGFbeta3改変抗体分子のSmadシグナルの入力効果を検証した。
その結果、未刺激に対して、mature TGFbeta1, mature TGFbeta3はリン酸化Smad2/3の割合が亢進しており、Plasmin処理したlatent TGFbeta3, TGFbeta3改変分子においても同様にリン酸化Smad2/3の割合が亢進していた。一方でTGFbeta3がコンジュゲートされていない1D3-mF18やPlasminプロテアーゼのみにおいてリン酸化Smad2/3の割合は未刺激時と変化がなかった（図２５）。この結果から、B細胞への結合特異性およびSmadシグナル入力効果というTGFbeta3改変抗体分子のコンセプトが確認された。【００７５】
B細胞増殖の抑制効果
日本チャールスリバーから購入した10-14週齢・オスのC57BL/6Nマウスの脾臓を単離し、Mouse B cell isolation kit (130-090-862, Miltenyi Biotec)によって分画したB細胞 (negative fraction)を精製した。
CellTraceTM CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) Cell Proliferation Kit for Flow Cytometry (C34554, Molecular Probes)を用いて、20分間37℃のWater bathで反応した後、PBSで2回洗浄を行い10,000 cells/wellとなるようにround-bottom 96-well plateに分注した。その後、latent TGFbeta3, TGFbeta3改変抗体分子, 0.5μg/mLのPlasminプロテアーゼを添加した。さらに細胞増殖の刺激には5μg/mL のanti-IgM (715-005-140, Jackson)、5μg/mL のanti-CD40 (HM40-3, BD Pharmingen)、2ng/mL のrecombinant murine IL-4 (214-14, Peprotech)の刺激をそれぞれ加え、3日間37℃のCO2インキュベーターにて培養後、細胞分裂をFACS analyzer (LSRFortessaX-20, BD)を用いてTGFbeta3改変抗体分子のB細胞増殖抑制効果を検証した。標準品として、mature TGFbeta1リコンビナントタンパク (240-B-010/CF, R&D Systems)とmature TGFbeta3リコンビナントタンパク(243-B3-010/CF, R&D Systems)を用いて同じタイミングで刺激を開始した。
mature TGFbeta1のB細胞増殖抑制効果は弱かったのに対して、mature TGFbeta3と同様に、Plasminプロテアーゼ処理したTGFbeta3改変抗体分子またlatent TGFbeta3においてもB細胞増殖抑制効果が確認された（図２６）。一方で、TGFbeta3がコンジュゲートされていない1D3-mF18においてはPlasminプロテアーゼ処理しても活性は全く確認されなかった。この結果は、TGFbeta1よりも TGFbeta3のB細胞増殖抑制効果ははるかに強く、TGFbeta3改変抗体分子という分子系にすることによってもその生理活性は保持されることを示している。【００７６】
Latent TGFbeta3およびTGFbeta3改変抗体分子のマウスにおける薬物動態評価
Mature型およびLatent型のTGFbeta3は分子の性質上、非特異的な結合および非常に速い血中消失速度が予想され、そのままの分子系では治療薬としての開発には多くの課題が想定されている。持続的に活性化B細胞を抑制するために、TGFbeta3改変抗体分子という分子系が血中半減期を伸ばすことができるか検証した。
日本チャールスリバーより購入した6週齢・オスのC57BL/6J マウスに対して、Latent TGF-beta3およびTGF-beta3改変抗体分子を1 mg/kgで尾静脈内投与した。投与後、頸静脈より経時的に採血し、血液を遠心分離することで血漿サンプルを得た。血漿サンプル中のTGF-beta3改変抗体分子およびTGF-beta3濃度をELISA法で定量した。血漿中TGF-beta3およびTGF-beta3改変抗体分子の濃度データを解析し、血漿中濃度下面積（AUCinf）および半減期（T1/2）を算出した。
TGF-beta3改変抗体分子の抗体部分のAUCおよび半減期はそれぞれ8100 ng・day/mLおよび2.09 day であった。一方、TGF-beta3 のAUCinfは、Latent TGFbeta3 として投与したときは146 ng・hour/mLであったのに対し、TGFbeta3改変抗体分子として投与したときは982 ng・hour/mL であった。また、TGF-beta3 のT1/2は、Latent TGFbeta3 として投与したときは0.116 hourであったのに対し、TGF-beta3改変抗体分子として投与したときは2.44 hourであった。本研究により、TGF-beta3を改変抗体分子として投与することで、AUCが上昇しT1/2が延長されることが明らかになった(図２７および表３)。
本結果は、TGFbeta3改変抗体分子という分子形に改変することによって、Latent TGFbeta3と比較してSmadシグナル入力効果の持続時間延長が可能となること、また治療薬としての可能性を示唆している。【００７７】
【表３】
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【００７８】
TGFbeta3改変抗体分子のマウスにおける活性評価
以下の手法によりTGFbeta3改変抗体分子によるＢ細胞への特異的な活性を評価する。
A) Ex vivo: B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/Jマウス(SBE-Luc Tgm, 005999, Jackson Laboratory)から脾臓・リンパ節を単離する。TGFbeta3改変抗体分子、T細胞・B細胞・NK細胞・単球・樹状細胞等のマーカーに対する蛍光標識抗体を反応させてB細胞特異性を確認する。また、分画したB細胞にPlasminプロテアーゼを添加しLuciferase活性を測定する。これにより、TGFbeta3が誘導する細胞内シグナルを評価する。
B) In vivo imaging: SBE-Luc Tgマウスに対しAlexa Fluor 647標識したTGFbeta3改変抗体分子を投与し、IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer)を用いてin vivo imagingを行う。蛍光シグナルによって抗体の分布と発光シグナルによるTGFb3を介したSmadシグナルの分布が生体内で重なることを確認することにより、B細胞へのリクルートおよびSmadシグナル入力効果というTGFbeta3改変抗体分子のコンセプトを確認する。
C) B細胞におけるSmadシグナルの確認: 上記実施例で示した1D3-mF18, 1D3-mF18-latent TGFb3, latent-TGFb3に加え、抗CD19抗体(1D3)以外のB細胞表面に結合しない抗体を有し、latent TGFb3を連結した改変抗体分子の4種のタンパク質を作成する。C57BL/6NマウスまたはSBE-Luc Tgマウスに対しこれらを尾静脈投与し、脾臓・リンパ節を単離してpSmadの割合を比較検証する。また、上記4種類のタンパクを尾静脈投与して脾臓・リンパ節を単離後、T細胞・B細胞・NK細胞・単球・樹状細胞等のマーカーに対する蛍光標識抗体を指標に各細胞を分画してRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて網羅的な発現遺伝子解析を行うことによって、各細胞のTGFbeta3シグナル関連遺伝子の発現変化を評価することでTGFbeta3改変抗体分子のコンセプトを確認する。
以上の評価により、TGFbeta3改変抗体分子が標的とするＢ細胞に特異的に活性を有することが証明される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、TGF-beta3のB細胞活性化の抑制作用が新規に見出され、これを利用した自己免疫疾患の新たな治療戦略が提供された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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