(57)【要約】  抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体や、かかる抗体を含有するイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤や、かかる抗体を用いるイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法や、かかる抗体をコードする遺伝子を提供することを課題とする。  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する抗イヌＰＤ−１抗体や、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を作製する。また、かかる抗体を含有するイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤を作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する、以下の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
【請求項２】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体。
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体。
（ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
【請求項４】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体。
（ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか記載の抗体をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体や、かかる抗体を含有するイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤や、かかる抗体を用いるイヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法や、かかる抗体をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいては、近年、免疫抑制性分子である免疫チェックポイント分子を標的とした抗体医薬が注目されており、多くの臨床試験が実施されている。特にＰＤ−１（Programmed cell death 1）及びＰＤ−Ｌ１（programmed cll death 1 ligand-1）を標的としたヒトのがんを対象とした臨床試験では優れた成績をおさめており、次世代のがん治療として着目されている（非特許文献１、２参照）。【０００３】
ＰＤ−１はＴ細胞の表面に存在する受容体である。Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を有しており、自己に対する免疫反応を抑制するなどの機能が明らかにされている。かかる免疫反応の抑制は、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合することによって行われる。一方、がん細胞はＰＤ−Ｌ１を発現し、発現したＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合することによってＴ細胞の活性化を抑制し、免疫反応から逃れる能力を獲得している。したがって、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することが、がんの治療に有効であると考えられる。【０００４】
これまでに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を有効成分として含み、インビボにおいてがん細胞の増殖を抑制する作用を有するがん治療剤（特許文献１参照）や、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアレルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん剤（特許文献２参照）が提案されている。また、メラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞がんの治療剤として抗ＰＤ−１抗体の開発が進められている（非特許文献３参照）。【０００５】
一方、ペットの長寿化に伴い、近年、件数が急増しているのがペットのがんである。人間同様、ペットのがん治療も進歩を遂げ、外科療法、放射線治療、化学療法（抗がん剤）の三大療法が積極的に行われている。【０００６】
ペットの中ではイヌの飼育率が高く、日本国内において約１３００万頭が飼われている。そのため、イヌのがんの発生件数が増加している。イヌのがんの治療においては、従来から用いられている上記３大療法では限界があり、それに代わる、又は同時に用いることができる新たな治療法として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイント分子を標的とした治療が期待されるが、ヒトのＰＤ−１やＰＤ−Ｌ１に対する抗体医薬はイヌに対しては作用しないという問題があった。そこで、イヌＰＤ−１やイヌＰＤ−Ｌ１に対する抗体の開発が求められていた。しかしながら、イヌにおいては、ＰＤ−１やＰＤ−Ｌ１についての研究が進んでおらず、イヌにおけるＰＤ−１やＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡの発現も確認されていない状況であり、イヌのＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１を認識する抗体の作製は困難であるのが現状であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−６５７４８号公報
【特許文献２】特開２０１０−８３８６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】横山勇生“ＰＤ−１に関連した抗体製剤などの開発が活発化”  ２０１３年３月６日  日経メディカルオンライン、インターネットＵＲＬ: http://medical.nikkeibp.co.jp/leaf/all/search/cancer/news/201303/529345.html（２０１４年６月２３日検索）
【非特許文献２】野中希“ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂと抗ＰＤ−１抗体薬ｎｉｖｏｌｕｍａｂの併用により進行悪性黒色腫の半数に顕著で持続的な腫瘍縮小効果”  ２０１３年５月１７日  日経メディカルオンライン、インターネットＵＲＬ: http://medical.nikkeibp.co.jp/leaf/all/search/cancer/news/201305/530569.html（２０１４年６月２３日検索）
【非特許文献３】Suzanne L. et al., The New England Journal of Medicine Vol.366, No. 26:2443-2454, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体や、かかる抗体を含有するイヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤や、かかる抗体を用いるイヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法や、かかる抗体をコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、まずイヌＰＤ−１及びイヌＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡのクローニングに成功し、塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。次に、イヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡを用いてイヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１発現細胞株を作製し、かかる細胞株を用いてイヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１に対するラットモノクローナル抗体の作製に成功した。さらに、得られたラットモノクローナル抗体はイヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する能力を有することを見いだし、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する、以下の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体。
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体。
（ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体。
（ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤。
（６）上記（１）〜（４）のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法。
（７）上記（１）〜（４）のいずれか記載の抗体をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗体は、イヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤として用いることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】イヌＰＤ−１（ｃａｎｉｎｅＰＤ−１、以後「ｃＰＤ１」ともいう）の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図２】イヌＰＤ−Ｌ１（ｃａｎｉｎｅＰＤ−Ｌ１、以後「ｃＰＤＬ１」ともいう）の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図３】（Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体とＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体とＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果を示す図である。
【図４】（Ａ）はヒトのＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤＬ１）−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果を示す図である。
【図５】（Ａ）ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合阻害を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果を示す図である。
【図６】ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果を示す図である。
【図７】末梢血単核細胞にＰＤ−１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＤ−１：４Ｆ１２−Ｅ６又はｃＰＤ−Ｌ１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１：Ｇ１１−６）を加えて、さらにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を加えて刺激培養し、得られた培養上清中のイヌＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図８】イヌＰＢＭＣをＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ又はＣｏｎＡ存在下で培養し、ＰＢＭＣを回収後、ＣＤ３陽性分画（Ｔ細胞)におけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２−Ｅ６）又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１−６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図９】イヌＰＢＭＣより磁気ビーズにより分離したＣＤ１４陽性単球をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を誘導し、かかる未成熟樹状細胞（ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ抗体陽性）におけるＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２−Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１−６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の抗イヌＰＤ−１抗体としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合し、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体であれば特に制限されないが、
（ａ’）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；（ｂ’）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
の（ａ’）又は（ｂ’）記載の抗イヌＰＤ−１抗体であることが好ましく、かかる抗イヌＰＤ−１抗体はイヌＰＤ−１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ−１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することが可能となる。
【００１５】
また、本発明の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体であれば特に制限されないが、
（ｃ’）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；（ｄ’）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
の（ｃ’）又は（ｄ’）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体であることが好ましく、かかる抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体はイヌＰＤ−Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ−Ｌ１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することが可能となる。
【００１６】
本発明の抗イヌＰＤ−１抗体の他の態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合し、
（ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
（ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−１抗体；
の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ−１抗体を挙げることができる。
【００１７】
本発明の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体の他の態様としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、
（ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体；
の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を挙げることができる。
【００１８】
上記抗イヌＰＤ−１抗体や抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体（以後、これらを総称して「本件抗イヌ抗体」ともいう）の種類としては特に制限されないが、モノクローナル抗体を挙げることができ、モノクローナル抗体の配列から組換えタンパクとして作製されるキメラ抗体、イヌ化抗体や、抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２、抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを、アミノ酸架橋によって連結させたＳｃＦｖ、ＳｃＦｖが二量体化したｄｉａｂｏｄｙなどの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。
【００１９】
本発明において、「９０％以上の同一性」とは、同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を意味する。
【００２０】
本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子としては、例えば、上記抗イヌＰＤ−１抗体をコードする遺伝子として、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３５に示される塩基配列と、配列番号３６に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号１１〜１３に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号１４〜１６に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。
【００２１】
また、上記抗イヌＰＤ−１抗体をコードする遺伝子の他の態様としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３７に示される塩基配列と、配列番号３８に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号１７〜１９に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号２０〜２２に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。
【００２２】
上記抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をコードする遺伝子としては、配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３９に示される塩基配列と、配列番号４０に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号２３〜２５に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号２６〜２８に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
上記抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をコードする遺伝子の他の態様としては、配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号４１に示される塩基配列と、配列番号４２に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号２９〜３１に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号３２〜３４に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。
【００２４】
上記抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をコードする遺伝子をベクターに組み込むことによって、上記抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をコードする遺伝子の発現ベクターを作製することができる。かかる発現ベクターに用いるベクターとしては、上記抗イヌＰＤ−１抗体又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をコードする遺伝子を発現できるものであればよく、プラスミドベクターでも、ファージベクターでもよい。
【００２５】
上記モノクローナル抗体は、慣用のプロトコールに従って作製することが可能である。たとえば、遺伝子組換え技術により、上記本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、組換え抗体として作製することが可能である。組換え抗体を作製する方法としては、例えば本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる（Peter J. Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, WILEY, 1997参照）。発現ベクターに組み込む本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子の塩基配列は、発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。
【００２６】
また、トランスジェニック動物作製技術を用いて本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタなどのトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから大量に産生することも可能である。
【００２７】
さらに、上記モノクローナル抗体は、配列番号１又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現する細胞を抗原としてマウス、ラットなどのヒト以外の動物へ投与し、本件抗イヌ抗体を産生する細胞クローンを細胞融合技術（ハイブリドーマ法（Kohler G, et al., Nature 256:495-497, 1975参照）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Danuta Kozbor, et al., Immunology Today 4, 72-79, 1983参照）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY:77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）参照）によりスクリーニングすることにより作製することが可能である。
【００２８】
上記イヌ化抗体は、たとえば重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体の定常領域をイヌ抗体の定常領域に置換することにより作製することが可能である。イヌ抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。
【００２９】
作製した本件抗イヌ抗体は、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。
【００３０】
本件抗イヌ抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤としては、本件抗イヌ抗体を含有していれば特に制限されず、抗イヌＰＤ−１抗体及び／又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を複数種類含んでいてもよい。かかる結合阻害剤は、イヌＰＤ−１とイヌＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することから、ＰＤ−Ｌ１を発現しているイヌのがんの治療剤として用いることもできる。なお、本発明における結合阻害には、in vivoにおける結合阻害もin vitroにおける結合阻害も含まれる。
【００３１】
上記結合阻害剤は、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。また、上記結合阻害剤をイヌに投与する場合の投与方法としては、経口投与のほか、注射や点滴、塗布、坐剤、鼻腔内スプレーなどによる非経口投与とすることもでき、適宜任意の形態に製剤することができる。
【００３２】
上記結合阻害剤中に含まれる本件抗体の量は、０．０００１〜５０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％を挙げることができる。
【００３３】
本件抗イヌ抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害方法としては、本件抗イヌ抗体を用いるかぎり特に制限されず、抗イヌＰＤ−１抗体及び／又は抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を複数種類用いてもよい。
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３５】
なお、以下の実施例におけるＰＣＲに用いるプライマーを表１に示す。
【００３６】
【表１】
2016006241.tif 000002
【００３７】
また、以下の実施例で用いたラット腎臓細胞株であるＮＲＫ細胞、及びヒト腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μＭの２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地で維持した。これらの細胞株は加湿インキュベーターにより、５％ＣＯ2ガス濃度下、３７℃で培養したものを用いた。
【実施例１】
【００３８】
［ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体の作製］
１．ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１のｃＤＮＡクローニング
（プライマーの設計）
ｃＰＤ１のｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー（YTM1142：配列番号４３）とリバースプライマー（YTM1143：配列番号４４）は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿５４３３３８の配列に基づいて設計し、ｃＰＤＬ１のｃＤＮＡｓを増幅するためのフォワードプライマー（YTM1144：配列番号４５）とリバースプライマー（YTM1145：配列番号４６）は、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿００５６１５９３６．１の配列に基づいて設計した。なお、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿５４３３３８及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿００５６１５９３６．１の配列は、イヌにおいて発現が確認されていない遺伝子である。【００３９】
（ＰＣＲ反応）
上記プライマー対を用い、正常なイヌの胸腺のｃＤＮＡをテンプレートとし、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）を用い、その添付のプロトコールに従ってｃＰＤ１遺伝子とｃＰＤＬ１遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、プレ変性を９４℃で２分行い、その後９８℃で１０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリング、６８℃で６０秒の伸長を３５サイクル行い、さらに最終伸長を６８℃で１０分行った。【００４０】
（ベクターへの挿入及び塩基配列の決定）
上記で調製したＰＣＲ産物をゲル精製し、pBluescript SK(-)ベクターのＳｍａＩ部位に挿入し、インサートとしてｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１遺伝子を含むコンストラクトベクター(pBS-cPD1、pBS-cPDL1)を作製した。かかるコンストラクトベクターはフォワードプライマー（M13(-20)：配列番号４７）とリバースプライマー（M13 reverse：配列番号４８）を用い、BigDye（登録商標）Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer社製)及びABI Prism（登録商標）３７７自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems社製)によって塩基配列を決定した。得られたｃＰＤ１の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を図１に、ｃＰＤＬ１の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を図２に示すと共に、ｃＰＤ１の塩基配列を配列番号４９、アミノ酸配列を配列番号１に、ｃＰＤＬ１の塩基配列を配列番号５０、アミノ酸配列を配列番号６に示す。【００４１】
２．ラットモノクローナル抗体の作製
（ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１発現ベクターの構築）
ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１タンパク質を過剰発現するレトロウイルスベクターを構築した。まず、ｃＰＤ１の配列とｃＰＤＬ１の配列のＣ末端に２つのＦＬＡＧタグ配列を加えるため、ｃＰＤ１の増幅には、pBS-cPD1をテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1142：配列番号４３）と、ｃＰＤ１配列のＣ末端にＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM1167：配列番号５１）とを用い、ｃＰＤＬ１の増幅には、pBS-cPDL1をテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1144：配列番号４５）と、ｃＰＤＬ１配列のＣ末端にＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM1168：配列番号５２）を用いて一次ＰＣＲを行った。【００４２】
次に、各一次ＰＣＲ産物をテンプレートとし、一次ＰＣＲと同様のフォワードプライマーと、１ｓｔＦＬＡＧタグ配列にアニールするダブルＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM838：配列番号５３）を用いて、二次ＰＣＲを行った。得られた各ＰＣＲ産物をpMxs-IPベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に挿入し、pMx-IP-cPD1-FL、pMx-IP-cPDL1-FL#9を作製した。【００４３】
（形質導入細胞の作製）
一般的なトランスフェクション方法によって、pMx-IP-cPD1-FL、pMx-IP-cPDL1-FL#9をＮＲＫ細胞にトランスフェクトし、ｃＰＤ１を安定発現するＮＲＫ細胞、ｃＰＤＬ１を安定発現するＮＲＫ細胞を作製した。まず、トランスフェクションを行う１日前にＮＲＫ細胞（３．５×１０5個）を６ウェルディッシュに播種した。細胞のトランスフェクションは、Lipofectamine 2000(Invitrogen社製)を用い、添付のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後の細胞を４８時間インキュベートし、その後、安定な形質導入細胞を得るために７．５μｇ／ｍｌのプロマイシン（Sigma-Aldrich社製）の存在下で培養し、ｃＰＤ１を安定発現するＮＲＫ細胞（ＮＲＫ／ｃＰＤ１）、ｃＰＤＬ１を安定発現するＮＲＫ細胞（ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１）を作製した。【００４４】
上記ＮＲＫ／ｃＰＤ１及びＮＲＫ／ｃＰＤＬ１において、ｃＰＤ１及びｃＰＤＬ１が安定発現していることは、一次抗体として、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（1:1000希釈、Sigma-Aldrich社製）、二次抗体としてＩｇＧ−Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８−標識抗マウス(Biolegend社製)を用いた免疫蛍光法によって確認した。【００４５】
（ラットモノクローナル抗体の作製）
ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体を作製するために、上述で作製したＮＲＫ／ｃＰＤ１又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（５００μｌの上記ＤＭＥＭ培地中、１×１０7個）を等量のTiter Max（登録商標）Gold(CytRx社製)で乳化し、７週齢のSprague−Dawleyラット（九動社製）の後足蹠に皮肉投与した。投与から２週間後に、膝窩のリンパ節細胞を単離し、Ｐ３Ｕ１細胞と融合させた。すなわち、リンパ節単球細胞（１×１０8個）とＰ３Ｕ１細胞（２×１０7個）と混合し、無血清のＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。上澄みを除去後、細胞を３７℃で２分インキュベートし、３７℃の０．５ｍｌポリエチレングリコール１５００（Roche Diagnostics社製）を加え、さらに３７℃の９ｍｌ無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、９００ｒｐｍで５分、室温にて遠心した。上澄みを除去後、１０％ＦＢＳとhypoxanthine-aminopterin-thymidine（HAT：Life Technologies社製）を含む３６ｍｌのＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）で懸濁し、加湿インキュベーターにより、５％ＣＯ2ガス濃度下、３７℃で１時間培養した。４ｍｌのBM-Condimed H1培地（Roche Diagnostics社製）を加え、細胞を４つの９６ウェル組織培養プレートに播種（１００μｌ／ウェル）して培養した。コロニーが得られた後、ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法やフローサイトメトリーで同定し、かかるハイブリドーマを限定希釈によりクローニングし、ｃＰＤ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマとしてハイブリドーマ３Ｂ７−Ｄ９、ハイブリドーマ４Ｆ１２−Ｅ６、ｃＰＤＬ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマとしてハイブリドーマＨ７−９、ハイブリドーマＧ１１−６を得た。以後、ハイブリドーマ３Ｂ７−Ｄ９によって産生された抗体を「３Ｂ７−Ｄ９」、ハイブリドーマ４Ｆ１２−Ｅ６によって産生された抗体を「４Ｆ１２−Ｅ６」、ハイブリドーマＨ７−９によって産生された抗体を「Ｈ７−９」、ハイブリドーマＧ１１−６によって産生された抗体を「Ｇ１１−６」ともいう。なお、ハイブリドーマ３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６、Ｈ７−９、Ｇ１１−６は国立大学法人山口大学共同獣医学部に保管されており、一定の条件下で分譲可能である。
【実施例２】
【００４６】
［抗ｃＰＤ１抗体又は抗ｃＰＤＬ１抗体であることの確認］
（抗体濃度及び細胞数）
ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６と、上記で作製したＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合や、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７−９、Ｇ１１−６と、上記で作製したＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を、以下に示すフローサイトメトリー解析により調べた。各ラットモノクローナル抗体の濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０μｇ／ｍｌであり、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。【００４７】
（フローサイトメトリー解析）
フローサイトメトリー解析に用いる細胞株の染色は次の文献（Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71(12):1561-1568, 2009）に記載の方法に従って行った。一次抗体としては、精製したｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対する各ラットモノクローナル抗体を用いた。二次抗体としては抗ラットＩｇＧ−ＰＥ（Southern biotech社製)を用いた。サンプルはBD AccuriC6 (BD Bioscience社製)を用いて解析し、得られた結果をFlowJo software (Treestar社製)によって解析した。【００４８】
（結果）
結果を図３に示す。図３（Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（anti-cPD1 mAb）とＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果であり、図３（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（anti-cPD-L1 mAb）とＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果である。横軸は作製した抗体に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸は各ラットモノクローナル抗体の濃度を示す。図３に示すように、いずれのラットモノクローナル抗体を用いた場合でも蛍光強度が増加しており、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６はＮＲＫ／ｃＰＤ１と結合し、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７−９、Ｇ１１−６は、ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に結合することが確認された。すなわち、３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６は抗ｃＰＤ１抗体であり、Ｈ７−９、Ｇ１１−６は、抗ｃＰＤＬ１抗体であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００４９】
［ラットモノクローナル抗体によるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合阻害試験］
１.ｃＰＤ１とヒトＩｇＦｃ領域との融合タンパク質、ヒトのＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤＬ１）とヒトＩｇＦｃ領域との融合タンパク質の作製
（ｈＰＤＬ１発現プラスミドの構築）
ｈＰＤＬ１発現プラスミドを構築するため、ヒトのバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）由来のｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1150：配列番号５４）とリバースプライマー（YTM1151：配列番号５５）を用いてｈＰＤＬ１を増幅した。ＰＣＲによる増幅は上記実施例１と同様に行った。増幅したＰＣＲ産物をpBluescript SK(-)ベクターのＳｍａＩ部位に導入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断し、得られた断片をpMxs-IPベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に連結し、ｈＰＤＬ１発現プラスミドであるpMx-IP-hPDL1#21を作製した。【００５０】
（融合タンパク質発現ベクターの作製）
ｃＰＤ１又はｈＰＤＬ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクターを構築した。かかる発現ベクターを作製するために、実施例１で作製したpMx-IP-cPD1-FLをテンプレートとしてフォワードプライマー（YTM1153：配列番号５６）とリバースプライマー（YTM1154：配列番号５７）を用いてＰＣＲを行うことでｃＰＤ１の細胞外領域を増幅し、上述で作製したpMx-IP-hPDL1#21をテンプレートとしてフォワードプライマー（YTM1157：配列番号５８）とリバースプライマー（YTM1158：配列番号５９）を用いてＰＣＲを行うことでｈＰＤＬ１の細胞外領域を増幅した。それぞれのＰＣＲ産物は、ｃＰＤ１についてはＢａｍＨＩ、ｈＰＤＬ１についてはＢｇｌＩＩで切断し、pFUSE-hIgG2-Fc2ベクター(Invivogen社製)のＥｃｏＲＶとＢｇＩＩＩ部位にクローニングし、ｃＰＤ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクター（pFUSE-cPD1-hIg#2）、ｈＰＤＬ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクター（pFUSE-hPDL1-hIg#9）を作製した。【００５１】
（融合タンパク質の作製及び精製）
上述で作製したベクターpFUSE-cPD1-hIg#2、pFUSE-hPDL1-hIg#9、又は空ベクターのpFUSE-hIgG2-Fc2をＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にトランスフェクトした。まず、トランスフェクションを行う１日前に、２×１０6個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４つの１０ｃｍディッシュに播種した。次に、７．５μｇの各ベクターと３０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  PEI Maxを含む３７５μｌのOPTI-MEMを混合して室温で１５分インキュベートし、細胞に加えた。トランスフェクションから２４時間後に、培地をＧＩＴ無血清培地（和光純薬工業社製）に置換し、さらに細胞を４８時間培養した。４日目と８日目の各トランスフェクト細胞から上澄みを集め、rProtein A agarose（GE healthcare社製）によって精製した。続いて、可溶性タンパク質を透析によって脱塩し、ｃＰＤ１の細胞外領域とｈＩｇＧ２  Ｆｃ領域との融合タンパク質（ｃＰＤ１−ｈＩｇ）、及び、ｈＰＤＬ１の細胞外領域とｈＩｇＧ２  Ｆｃ領域との融合タンパク質（ｈＰＤＬ１−ｈＩｇ）を作製した。上記融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって確認した。【００５２】
２．ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合試験
後述するラットモノクローナル抗体によるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との阻害試験の予備試験として、ｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合、又はｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を、上記フローサイトメトリー解析と同様の方法で調べた。ｈＰＤＬ１−ｈＩｇ、ｃＰＤ１−ｈＩｇの濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０、４０μｇ／ｍｌとし、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。結果を図４に示す。図４（Ａ）はｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果であり、図４（Ｂ）はｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果である。横軸は作製した融合タンパク質に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸はｈＰＤＬ１−ｈＩｇ又はｃＰＤ１−ｈＩｇの濃度を示す。図４に示すように、ｈＰＤＬ１−ｈＩｇはＮＲＫ／ｃＰＤ１に結合し、ｃＰＤ１−ｈＩｇはＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に結合することが明らかとなった。【００５３】
３．ラットモノクローナル抗体によるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合阻害試験
（フローサイトメトリー解析）
（１）ＮＲＫ／ｃＰＤ１に、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６）を反応させ、その後ｈＰＤＬ１−ｈＩｇを反応させることで、ｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、（２）ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｈ７−９、Ｇ１１−６）を反応させ、その後ｃＰＤ１−ｈＩｇを反応させることで、ｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、又は（３）ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６）とｃＰＤ１−ｈＩｇを反応させ、その後その混合反応物をＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に反応させることで、ｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、の３点をそれぞれ調べた。各抗体によるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合阻害は上記フローサイトメトリー解析と同様に調べた。各ラットモノクローナル抗体の濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０μｇ／ｍｌとし、ｈＰＤＬ１−ｈＩｇ、ｃＰＤ１−ｈＩｇの濃度は４０μｇ／ｍｌとし、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。【００５４】
（結果）
結果を図５、６に示す。図５（Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合阻害を調べた結果であり、図５（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果であり、図６はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果である。横軸は作製した抗体に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸左は各ラットモノクローナル抗体の濃度、縦軸右はｈＰＤＬ１−ｈＩｇ又はｃＰＤ１−ｈＩｇの有り（＋）／無し（−）を示す。図５（Ａ）、（Ｂ）、図６に示すように、ｈＰＤＬ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合や、ｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７−Ｄ９、４Ｆ１２−Ｅ６が阻害し、ｃＰＤ１−ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７−９、Ｇ１１−６が阻害することが明らかとなった。
【実施例４】
【００５５】
［ラットモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の塩基配列の決定］
トータルＲＮＡを実施例１で得られた各ハイブリドーマ細胞株から単離し、全ての可変領域と定常領域の５’領域を含む、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ２ａ）の塩基配列とκ軽鎖の塩基配列を５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法によって得た。【００５６】
まず、単離したＲＮＡを逆転写酵素Superscript（登録商標）IIIを用いて逆転写した。プライマーとしては、軽鎖の増幅にはYTM171（配列番号６０)、重鎖の増幅にはYTM172（配列番号６１）を用いた。逆転写反応後、ＴｄＴ酵素反応によりｐｏｌｙＣを付加し、その後、軽鎖の増幅にはフォワードプライマー（YTM166：配列番号６２）とリバースプライマー（YTM171：配列番号６０）、重鎖の増幅にはフォワードプライマー（YTM166：配列番号６２）とリバースプライマー（YTM172：配列番号６１）を用いて一次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、軽鎖又は重鎖の全ての可変領域を増幅するために、フォワードプライマー（YTM170：配列番号６３）とリバースプライマー（YTM173：配列番号６４）、又はフォワードプライマー（YTM170：配列番号６３）とリバースプライマー（YTM174：配列番号６５）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ハイブリドーマ３Ｂ７−Ｄ９及びハイブリドーマＧ１１−６においては、５’ＲＡＣＥや一次ＰＣＲにおけるプライマーとしてYTM171の代わりにYTM1224（配列番号４２）、を用いた。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物をpBluescript SK(-)ベクターにクローニングし、その塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定した。【００５７】
３Ｂ７−Ｄ９の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号２に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３６に、アミノ酸配列を配列番号３に、４Ｆ１２−Ｅ６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号４に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３８に、アミノ酸配列を配列番号５に、Ｈ７−９の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３９に、アミノ酸配列を配列番号７に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４０に、アミノ酸配列を配列番号８に、Ｇ１１−６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号４１に、アミノ酸配列を配列番号９に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４２に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。【００５８】
さらに、それぞれの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。３Ｂ７−Ｄ９の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１〜１３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４〜１６に、４Ｆ１２−Ｅ６の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７〜１９、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２０〜２２に、Ｈ７−９の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２３〜２５、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６〜２８に、Ｇ１１−６の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２９〜３１、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３２〜３４に示す。
【実施例５】
【００５９】
［ＩＦＮ−γの産生増強］
３頭のイヌ（Ａ，Ｂ，Ｃ）より末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収し、ＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート中にウェル当たり２×１０５個、ｉｓｏｔｙｐｅ（ラットＩｇＧ２ａ：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＤ−１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＤ−１：４Ｆ１２−Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１：Ｇ１１−６）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるように加えて、さらにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌとなるように加えて３日間刺激培養し、得られた培養上清中のイヌＩＦＮ−γをcanine IFN-gamma DuoSet ELISA（R&D社製)により測定した。結果を図７に示す。【００６０】
図７から明らかなように、ＣｏｎＡ刺激により産生されるＩＦＮγは、ａｎｔｉ−ＰＤ−１である４Ｆ１２−Ｅ６やａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１であるＧ１１−６の存在下で産生増強される傾向がみられた。このことから、ＣｏｎＡ刺激によりイヌのＴ細胞ではＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の発現が増強し、それらがそのＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合することで過剰なＴ細胞の活性化を防いでいる可能性が示唆され、得られたＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１抗体は、イヌの細胞上に発現するＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１両分子の相互作用を阻害できることが示唆された。
【実施例６】
【００６１】
［ＰＭＡ（Phorbol-12-myristate-13-acetate）／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ｉｏｎｏ）又はＣｏｎＡ存在下でのＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現誘導］
イヌＰＢＭＣをＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ又はＣｏｎＡ存在下で３日間培養し、ＰＢＭＣを回収後、ＣＤ３陽性分画(Ｔ細胞)におけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２−Ｅ６）又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１−６）を用いてフローサイトメトリー解析した。結果を図８に示す。【００６２】
図８から明らかなように、活性化イヌＴ細胞には、ＰＤ−１もＰＤ−Ｌ１も発現が誘導されていることが明らかとなった。このように、本発明の抗体を用いることで、Ｔ細胞におけるＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現を調べることが可能であること、換言すれば、イヌの細胞における細胞表面に発現するＰＤ−１やＰＤ−Ｌ１の発現を調べることが可能であることが明らかとなった。
【実施例７】
【００６３】
［ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦ存在下でのＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現誘導］
イヌＰＢＭＣより磁気ビーズにより分離したＣＤ１４陽性単球をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を誘導した。未成熟樹状細胞であることは、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ抗体（eBioscience社製）を同時に染色することで確認した。得られた未成熟樹状細胞におけるＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２−Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１−６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を図９に示す。【００６４】
図９に示すとおり、ＰＤ−１は発現しておらず、ＰＤＬ−１が発現していることが確認できた。このように、本発明の抗体を用いることで、未成熟樹状細胞におけるＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現を調べることが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明で得られたラットモノクローナル抗体は、イヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ−１又はイヌＰＤ−Ｌ１の発現解析や機能解析に用いることができるほか、イヌＰＤ−1とイヌＰＤ−Ｌ１との結合阻害剤として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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