(57)【要約】  本発明は、新たなオーロラＢキナーゼの機能阻害剤を提供することを目的とする。本発明はまた、新たな核酸抗癌剤を提供することを目的とする。本発明により、染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングＲＮＡを標的とした、新たなオーロラＢキナーゼの機能阻害剤及び核酸抗癌剤が提供された。該オーロラＢキナーゼの機能阻害剤及び核酸抗癌剤は、染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングＲＮＡの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
2014112144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１で表されるＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、
式１：    ５’−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−３’
ここで、Ａは、少なくとも２以上のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｂは、配列番号１で示されるsatellite I RNA配列又はその亜種の配列の一部と相補的な配列を含む、少なくとも５以上のデオキシリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｃは、少なくとも２以上のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである、
ここで、前記ＡおよびＣは、それぞれ、その一部のリボヌクレオチドが安定化のために修飾されており、かつ、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又はホスホラミデートのいずれかのヌクレオチド間結合で結合したオリゴヌクレオチドである。
【請求項２】
前記式１のＢが、配列番号１の配列の一部である連続する少なくとも６つのオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む、前記（１）に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記式１において、Ｂのヌクレオチド数が１０〜２０である前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記式１において、ＡおよびＣのヌクレオチド数が２〜５である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾されてもよいリボヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル置換された又は２’−フルオロ置換されたリボヌクレオチドである、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合した、前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記Ｂが、配列番号２で示される下記配列
５’−ＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’
を含む、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記式１が、下記配列（配列番号３）
５’−ｍＡ*ｍＵ*ｍＵ*ｍＣ*ｍＣ*Ａ*Ｃ*Ａ*Ａ*Ａ*Ａ*Ａ*Ｇ*Ａ*Ｇ*ｍＵ*ｍＧ*ｍＵ*ｍＵ*ｍＵ*−３’
（ここで、ｍは、２’−Ｏ−メチル置換による修飾を表し、＊は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をしめす）
で示される請求項１に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオーロラＢキナーゼの活性阻害剤。
【請求項１０】
前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むセントロメア局在化阻害剤。
【請求項１１】
前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む抗癌核酸医薬組成物。
【請求項１２】
さらに他の抗癌剤を含む、前記（１１）に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新たな核酸抗癌剤及びそれを用いる方法に関する。より具体的には、本発明は、染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングＲＮＡの一部に相補的な配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、特には抗癌組成物、及び該アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーロラキナーゼは、酵母からヒトに至るまで、生物種を越えて幅広く保存された染色体分配制御に必須なセリン・スレオニンリン酸化酵素である。オーロラキナーゼは、癌細胞の多くで高発現しており、遺伝子不安定性や腫瘍の進行を誘発するなど、発癌に深く関わる分裂期キナーゼとして知られている。動物細胞においては、オーロラＡ、オーロラＢ、及びオーロラＣの3種類が存在する。オーロラＡは、紡錘体形成の制御に、オーロラＢは、染色体キネトコアへの紡錘体結合制御や細胞質分裂に必須なキナーゼとして機能している。また、オーロラキナーゼは、細胞分裂期の各ステップにおいて、キネトコア（動原体）が形成されるセントロメアなど特有な染色体領域に局在し、その特異的局在が活性制御に重要な役割を果たす。また、マウスにおいて、セントロメア領域に存在するマイナーサテライトの転写物が、オーロラＢキナーゼの制御に関与しているとの報告がある（非特許文献１：Federica F. et al. Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 15, 5071-5080）【０００３】
これらオーロラキナーゼの阻害剤（ＡＴＰの拮抗結合阻害低分子化合物）は、近年、新しい将来性ある抗癌剤として大変大きな注目を浴びている。実際、既に新規抗癌剤として臨床試験が開始されているオーロラキナーゼ阻害化合物が存在し、例えば、MLN8237 (alisertib) やVX-680などをあげることができる。これらの阻害化合物は、全てオーロラキナーゼのＡＴＰ結合部位に対して拮抗的に結合する低分子阻害化合物であるが、結合特異性の問題から、オーロラキナーゼ以外のキナーゼも阻害する可能性があり、問題視されている。【０００４】
オーロラキナーゼの機能阻害は、有糸分裂期のみに作用するので、細胞分裂を短時間に繰り返さない正常組織の細胞に対する阻害作用は低く、増殖が旺盛な癌細胞に選択的に強く影響を与えることが予測されるが、一方、ＡＴＰ拮抗型の阻害化合物は、特異性が高い場合でも、細胞内に多種類存在するオーロラキナーゼ以外の細胞内キナーゼ（例えば、スプライシング因子のリン酸化に関わるClkやSRPK1などのキナーゼ）にも作用する可能性があるという問題点がある。【０００５】
そこで、従来のＡＴＰの拮抗結合阻害低分子化合物に比べて、上記問題点、例えば正常細胞への影響が少ない或いは無い、オーロラＢキナーゼを選択的に阻害する又は抗癌性をもつ化合物が望まれていた。【０００６】
また、染色体セントロメア領域にあるサテライトIIから転写される転写産物（ＲＮＡ）が、膵臓癌及び上皮癌において過剰発現していることが報告されている（非特許文献２：David T. Ting, et al, Science 331, 593 (2011)）。【０００７】
なお、本発明の核酸がターゲットしているセントロメア由来のサテライトＩノンコーディングＲＮＡ（本明細書中では、satellite I ncRNA 又 はsatellite I RNAとも記す）は、ヒト染色体セントロメア領域から転写されるnon-coding RNA（mRNAとは異なり、タンパク質情報を持たないRNA）であるが、その生物学的機能についてはほとんど知られていない。【０００８】
また、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドとしては、２本鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖がＤＮＡとＲＮＡのキメラである２本鎖ポリヌクレオチド（特許文献１）や、ＲＮＡの一部のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置換したＲＮＡ（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３８０３３１８号公報
【特許文献２】特開２００８−１２５３７４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Federica F., et al. Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 15, 5071-5080.
【非特許文献２】David T. Ting, et al, Science 331, 593 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングＲＮＡを標的とした、新たな核酸抗癌剤及びそれを用いる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングＲＮＡの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、特には、オーロラＢキナーゼの機能阻害剤及び／又は抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒトのセントロメア由来のサテライトＩノンコーディングＲＮＡ（satellite I ncRNA）に対するアンチセンス配列を有する核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド）が、細胞内でオーロラキナーゼを選択的に阻害できることを初めて見いだし、本発明を完成した。さらに本発明者らは、satellite I ncRNAに対するアンチセンス配列を有する核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド）が、がん細胞の染色体分裂異常を引き起こすことを見いだし、本発明を完成した。【００１３】
本発明は、以下を含むものである。
（１）  以下の式１で表されるＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、
式１：    ５’−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−３’
ここで、Ａは、少なくとも２以上（好ましくは２〜５）のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｂは、配列番号１（satellite I RNA 配列:単一ユニット１７１塩基）の配列（又はその亜種の配列）の一部と相補的な配列を含む、少なくとも５以上（好ましくは１０〜２０）のデオキシリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｃは、少なくとも２以上（好ましくは２〜５）のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである、
ここで、前記ＡおよびＣは、それぞれ、その一部のリボヌクレオチドが安定化のために修飾されており、かつ、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又はホスホラミデートのいずれかのヌクレオチド間結合で結合したオリゴヌクレオチドである。
（２）  前記式１のＢが、配列番号１の配列の一部である連続する少なくとも６つのオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む、前記（１）に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（３）  前記式１において、Ｂのヌクレオチド数が１０〜２０である前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（４）  前記式１において、ＡおよびＣのヌクレオチド数が２〜５である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（５）  前記修飾されてもよいリボヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル置換された又は２’−フルオロ置換されたリボヌクレオチドである、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（６）  前記Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合した、前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（７）  前記Ｂが、配列番号２で示される下記配列
５’−ＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’
を含む、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（８）  前記式１が、下記配列（配列番号３）
５’−ｍＡ*ｍＵ*ｍＵ*ｍＣ*ｍＣ*Ａ*Ｃ*Ａ*Ａ*Ａ*Ａ*Ａ*Ｇ*Ａ*Ｇ*ｍＵ*ｍＧ*ｍＵ*ｍＵ*ｍＵ*−３’
（ここで、ｍは、２’−Ｏ−メチル置換による修飾を表し、＊は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をしめす）
で示される前記（１）に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（９）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオーロラＢキナーゼの活性阻害剤。
（１０）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むセントロメア局在化阻害剤。
（１１）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む抗癌核酸医薬組成物。
（１２）  さらに他の抗癌剤を含む、前記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）  癌又は癌の疑いがある対象に、前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、癌を治療するための方法であって、該オリゴヌクレオチドがオーロラＢキナーゼの活性及び／又はセントロメア局在化を阻害する方法。
（１４）  前記投与が、静脈内投与、皮下投与又は動脈内投与である、前記（１３）に記載の方法。
（１５）  さらに、スプライシング因子であるDHX38/Prp16、DHX8/HRH1、及びSAP155から選ばれる少なくとも一つをターゲットとするsiRNAを投与することを含む、前記（１３）または（１４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、新たな作用機序のオーロラキナーゼ阻害剤として有用である。本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、新たな細胞増殖阻害剤として有用であり、新たな抗癌剤となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】上段は、Satellite I RNA（単一ユニット171塩基）の塩基配列を示したものである。下線は、実施例で標的とした領域を示す。下段は、実施例で用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を示す。下線部分はＤＮＡであり、その他は修飾ＲＮＡを示す。図中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を示し、＊は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。
【図２】抗Aurora B抗体を用いた免疫共沈実験の結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２及び５は、免疫沈降を行わずに細胞より回収した全ＲＮＡ、レーン３及び６は、抗Aurora B抗体で免疫沈降させたＲＮＡ、レーン４及び７は、ノーマルIgGで免疫沈降させたＲＮＡの結果を示す。上段は、Satellite Iのプライマーを、下段は、GAPDHのプライマーを用いてRT-PCRを行った結果である。
【図３】Satellite I ncRNAノックダウンによるHeLa細胞増殖を検討した結果を示している。Ａは、本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド（Sat I ASO）でノックダウンしたHeLa細胞の相対増殖曲線を示しており、Ｂは、顕微鏡写真を示している。
【図４】Satellite I ncRNAノックダウンしたHeLa細胞のDAPIによる核染色の結果を示している。左側は、コントロールオリゴヌクレオチドを用いた結果であり、右側は本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた結果である。上段と下段は、顕微鏡視野内の異なる細胞を示す。
【図５】Satellite I ncRNAノックダウンしたHeLa細胞でのsatellite I ncRNAの発現を、RT-PCR解析した結果を示している。
【図６】Satellite I ncRNAノックダウンしたHeLa細胞内のsatellite I RNAをin situ hybridizationにより可視化した結果を示している。上段が、未処理のHeLa細胞を示しており、下段が、Satellite I ncRNAノックダウンしたHeLa細胞を示している。
【図７】Satellite I ncRNAノックダウンによるオーロラキナーゼのリン酸化活性への影響を検討した結果を示している。
【図８】抗DHX38抗体を用いた免疫共沈実験の結果を示している。レーン１は分子量マーカー、レーン２及び６は、免疫沈降を行わずに細胞より回収した全ＲＮＡ、レーン３及び７は、オーロラＢ抗体で免疫沈降させたＲＮＡ、レーン４及び８は、抗DHX38抗体で免疫沈降させたＲＮＡ、レーン５及び９は、ノーマルIgGで免疫沈降させたＲＮＡの結果を示す。最上段はＭ期停止細胞を用いてSatellite Iのプライマーを、２段目は非同調細胞を用いてSatellite Iのプライマーを、３段目及び最下段はGAPDHのプライマーを用いてRT-PCRを行った結果である。
【図９】DHX38/Prp16、DHX8(DDX8)/HRH1及びSAP155のそれぞれを、siRNAを用いてノックダウンしたHeLa細胞のDAPIによる核染色の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。
本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の式１で表されるオリゴヌクレオチドであり、satellite I RNAの一部と相補的な配列を含むデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と、その５’末端及び３’末端にリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）が連結した配列を有する。
式１：５’−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−３’
このようにＤＮＡの両端にＲＮＡを結合することにより、ＤＮａｓｅに対する耐性が高くなり、血中や細胞内でも安定に存在できる。
【００１７】
ここで、Ａ及びＣは、それぞれ、少なくとも２以上のリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。Ａ及びＣを構成するリボオリゴヌクレオチド数の上限に特に制限はないが、十分な効果が得られかつ合成や使用上の観点より、好ましくは２〜５である。Ａ又はＣを構成するリボヌクレオチドは、少なくともその一部が修飾されており、例えば、２’−Ｏ−メチル置換又は２’−フルオロ置換を挙げることができるが、これに限定されるものではない。Ａ又はＣのリボヌクレオチドが修飾されることにより、ＤＮａｓｅ等の核酸分解酵素に対する耐性が向上し、血中や細胞内でも安定に存在できる。
また、Ａ及びＣは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又はホスホラミデートのいずれかのヌクレオチド間結合、好ましくはホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合したオリゴヌクレオチドであり、それにより、細胞内での核酸分解酵素に対する耐性が向上し安定に存在できる。
本発明においては、ターゲット（satellite I RNA）の一部と相補的な配列であるＤＮＡの両端に、修飾されたリボヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチル基置換されたリボヌクレオチドのみからなる２〜５の塩基数のＲＮＡを有するＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが好適に用いられる。
【００１８】
前記式１において、Ｂは、配列番号１に示されるsatellite I RNAの配列（又はその亜種の配列）の一部と相補的な配列を含み、少なくとも５以上のデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。Ｂを構成するデオキシリボオリゴヌクレオチド数の上限は、特に制限はないが、十分な効果が得られかつ合成や使用上の観点より、好ましくは２０である。Ｂは、好ましくは、その一部に、ヒトのsatellite I RNAの一部である連続する少なくとも５、好ましくは６以上の塩基数からなる配列と相補的な配列を含む。
また、Ｂは、好ましくはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又はホスホラミデートのいずれかのヌクレオチド間結合、特に好ましくはホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合したオリゴヌクレオチドであり、それにより、細胞内での核酸分解酵素に対する耐性が向上し安定に存在できる。
本発明においては、ターゲット（satellite I RNA）の一部と完全に相補する少なくとも６塩基数の配列を含むホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合したＤＮＡの両端に、修飾されたリボヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチル基置換されたリボヌクレオチドのみからなる２〜５の塩基数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合したＲＮＡを、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合したＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが好適に用いられる。
【００１９】
本明細書において、「satellite I RNAの配列（又はその亜種の配列）」および「satellite I RNAの配列又はその亜種の配列」は、互いに置き換え可能で用いられ、その亜種の配列とは、human alphoid repetitive DNA もしくは human alpha satellite DNAとして、GenBank、EMBL-Bank、またはDDBJ 核酸配列データベースに登録されているＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列の全部又は一部であって、配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する配列を含む意味であり、例えば、GeneBankのAccession No. M15484〜M15495、M21702〜M21729、M21746、M22267〜M22297、M28031〜M28040、M28426、X13630〜X13657、X14266〜X14278、AJ130751〜AJ130762、AJ131207〜AJ131208、M27771〜M27780の配列、EMBL-BankのAccession No. AJ001558、Z12004の配列に対応するＲＮＡ配列をあげることができる。
【００２０】
本発明において、Ｂは、特に好ましくは、配列番号２に示される配列（５’−ＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’）を含むＤＮＡであり、更には、前記配列を含むホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合されたＤＮＡが最も好ましい。
【００２１】
本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学合成により製造できる。化学合成は、通常のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成方法とＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。例えば、ＤＮＡ合成機を用いて、ホスホトリエステル法又はホスホロアミダイド法により合成することができる。また、修飾されたＲＮＡや、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合したＲＮＡやＤＮＡも化学合成により製造できる。
【００２２】
別の観点より、本発明はまた、前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、オーロラＢキナーゼの活性阻害剤及び／又はオーロラＢキナーゼのセントロメア局在化阻害剤である。本発明の前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オーロラＢキナーゼと結合するsatellite I ncRNA と結合することにより、オーロラＢキナーゼの活性を阻害するとともに、オーロラＢキナーゼのセントロメアへの局在化を阻害する。
【００２３】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む癌に対する核酸医薬組成物である。本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌で高発現しているオーロラＢキナーゼの機能を、活性及びセントロメアへの局在化の２つの側面から阻害することにより、がん細胞に対して抗癌性を示す。
本発明の抗癌性医薬組成物を用いることができる癌腫は特に限定されないが、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、直腸癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭部及び頸部の癌、脳の癌、卵巣癌、メラノーマ、リンパ腫をあげることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは他の抗癌剤（例えば、化学療法剤）と併用して使用することができ、また、本発明の抗癌核酸医薬組成物はさらに、他の抗癌剤（例えば、化学療法剤）を含むことができる。他の抗癌剤としては、例えば、EGFR阻害剤（例えば、Erlotinib）、Bortezomib、nutlin-3やTaxotereをあげあることができるが、これらには限定されない。他の抗癌剤と併用する場合は、同時投与及び種々の順序での連続投与を含む。
また本発明の医薬組成物は、経口的、局所的、非経口的に投与することができ、好ましくは、非経口的投与、例えば、静脈内投与、皮下投与又は動脈内投与である。投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチド量は、患者の状態及び対象とする癌の種類に応じて、適宜選択される。
【００２４】
本発明者らは、染色体セントロメア機能の解析途上で、核内に局在するsatellite I nc RNAがオーロラＢキナーゼと複合体を形成していることを発見した。そこで、satellite I ncRNAの機能を解明するため、satellite I ncRNA に結合する（ハイブリダイズする）相補的な塩基配列を持つＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、核内に存在するRNase H 活性でsatellite I ncRNAを分解させ、その機能をノックダウンする解析を行った。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合によってsatellite I ncRNAの機能が阻害された細胞では細胞分裂に異常が生じ、培養癌細胞(HeLa細胞)の増殖を強く停止した。また、ノックダウン細胞では、オーロラＢキナーゼの分裂期特有な染色体セントロメアへの局在が異常となることが明らかとなった。これらのことより、オーロラＢキナーゼの酵素活性や細胞内分布制御に必須なＲＮＡ因子であるsatellite I ncRNAを機能阻害することにより、癌細胞の増殖停止や死滅を引き起こすことができることが示された。
【００２５】
このように、本発明のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基対合を介して極めて高い特異性でsatellite I ncRNAのみに作用できるので、従来のオーロラキナーゼの阻害剤（ＡＴＰの拮抗結合阻害低分子化合物）に比べ、細胞内でオーロラキナーゼを選択的に阻害できる利点がある。
さらに、オーロラキナーゼによる染色体分離の制御には、その酵素活性だけでなく、細胞分裂の進行に伴ってオーロラキナーゼがセントロメアに分布（局在化）することも極めて重要である。satellite I ncRNAはオーロラキナーゼの細胞内分布制御にも関わっている。従って、本発明による、satellite I ncRNAを標的とした機能抑制は、従来のオーロラキナーゼ酵素活性抑制型の抗癌剤とは作用機作が全く異なる新しいものであり、オーロラキナーゼの活性阻害のみならず、細胞内でのセントロメア局在化をも阻害する作用を併せ持ち、新たな抗癌剤として有用である。
【００２６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：ＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド（Sat I RNA ASO）の調製
図１上段に、染色体セントロメアのSatellite I ncRNAの繰り返し構造の一単位の配列を示す。下線部分は、今回の実験で標的とした領域を示している。
図１下段に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを、INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES (IDT)に依頼し合成した。ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル基で置換されたアデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルを用いた。また、ＲＮＡ及びＤＮＡは、全ての塩基は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により結合させた。【００２８】
実施例２：免疫共沈実験
以下の方法により、オーロラＢキナーゼとSatellite I ncRNAが結合していることを確認した。
（１）Satellite I RNA のRT-PCR
HeLa細胞からTrizol試薬（Invitrogen）を用いてTotal RNAを回収した。Total RNA 1μgからPrimeScript II 1st strand cDNA synthesis Kit (TaKaRa)を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAの1/10量を用いてPCRを行った。逆転写およびPCR反応に用いたPrimerの配列を以下に示す。コントロールとして、GAPDHを用いた。【００２９】
プライマー配列：
M13 SatI p4n Rev（配列番号４）：
5’- CCGTAAAACGACGGCCAGCTTCTGTCTAGTTTTTATGTGAAGATA -3’
SatI p4n F（配列番号５）:   5’- CATTCTCAGAAACTTCTTTGTGATGTG -3’
M13（配列番号６）:   5'- CCGTAAAACGACGGCCAG -3'
GAPDH-3（配列番号７）:  5'-CTGGGCTACACTGAGCAC -3
GAPDH-4（配列番号８）:  5'-GGTCCACCACCCTGTTGC -3'【００３０】
（２） Satellite I ncRNA の免疫沈降解析
HeLa細胞を二重チミジンブロック法にてG1/S期に同調後、100 ng/ml Nocodazol（SIGMA）を加えてM期ブロック（分裂期で細胞周期を停止）した。M期ブロックしたHeLa細胞1 x107 cellを1 mlのLysis buffer (50 mM Tris-HCl ph7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF 0.5% NP40)に縣濁し、氷上で10分静置した後に、4℃ 15,000 rpm 10分遠心し、上精を回収した。上精にDynabeads-Protein G (Invitrogen)に結合させた抗Aurora B抗体（Santa Cruz : ARK-2(H-75) sc-25426）を加え、4℃にて 3時間反応した。BeadsをLysis bufferで４回洗浄し、Trizol試薬（Invitrogen）を用いて共沈したRNAを回収した。その後、上記（１）の方法と同様にしてRT-PCRを行った後、ゲル電気泳動を行った。コントロールとして、normal IgG抗体を用いた。結果を図２に示す。
図２に示すように、レーン３（IP: Aurora B抗体）を用いたものは、Satellite I ncRNAのバンドが確認でき、オーロラＢキナーゼとsatellite I ncRNAが共沈し、両者が結合していることが確認された。なお、コントロールとして、normal IgGを用いたものは、オーロラＢキナーゼと共沈せず、結合は確認されなかった。
このことから、オーロラＢキナーゼとsatellite I ncRNAが特異的に結合していることが示された。【００３１】
実施例３：Satellite I ncRNAノックダウンによる細胞増殖阻害
（１）Sat I RNA ASO のHeLa細胞への導入（トランスフェクション）
HeLa細胞5 x105 cellに、実施例１で調製したアンチセンスオリゴヌクレオチド（Sat I RNA ASO）500 pmolをLipofectamin2000（Invitrogen）を用いて導入した。48時間培養した後に、再度Sat I RNA ASO 500 pmolを導入し、さらに48時間培養した。コントロールとして、ランダムな配列を持つオリゴヌクレオチドを用いた。
結果を図３に示す。図３（Ａ）は、Satellite I ncRNAノックダウンによるHeLa細胞の相対増殖曲線を示しており、コントロールオリゴヌクレオチドでは増殖に全く影響がないが、Satellite I ncRNAを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理すると、多くの細胞が４８時間で死滅した。
図３（Ｂ）は、オリゴヌクレオチド導入４８時間後の細胞写真である。コントロールオリゴヌクレオチドでは、HeLa細胞が良く増殖しているが、Satellite I ncRNAアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞群では、殆どの細胞が死滅していることが確認された。【００３２】
実施例４：Satellite I ncRNAノックダウンした細胞のDAPIによる核染色
実際例３で得られたHeLa細胞を、DAPIにより核染色を行った。結果を図４に示す。ノックダウンされた細胞では、細胞分裂が正常に起こらず、葡萄房様小核と呼ばれる無数の小さな核を持つ細胞の出現が確認された。【００３３】
実施例５：Satellite I RNA ノックダウンのRT-PCR解析による検証
実施例２（１）と同様にして、実施例１で調製したSat I RNA ASO を導入したHeLa細胞からTrizol試薬（Invitrogen）を用いてTotal RNAを回収し、Satellite I RNA 量のRT-PCR解析を行った。結果を図５に示す。図中の矢印は、ノックダウン検証実験において、RT-PCRによりRNAの検出に用いたプライマー配列部分を示す。３’側プライマーには、M13タグ配列を附加することでPCR反応時の特異性をあげた。
Sat I RNA ASO によるノックダウンを行うと、Satellite I RNA量が減少することが確認された。一方、GAPDH mRNA量に変化は生じなかった。【００３４】
実施例６：Satellite I ncRNAノックダウンのin situ hybridizationによる検証
実施例１で調製したSat I RNA ASO によりノックダウンしたHeLa細胞内のsatellite I RNAを、以下の手順に従い、in situ hybridizationにより可視化した。
（１）Sat I RNA の蛍光in situ hybridization
カバーガラス上に培養したHeLa細胞を、4% パラフォルムアルデヒト/PBS溶液で室温10分間固定し、プレハイブリダイゼーション溶液 (2xSSC, 1xデンハルト溶液, 50% ホルムアミド, 10mM EDTA, 100μg/ml yeast tRNA, 0.01% Tween 20)中にて55℃にて 2時間保温した。RNAプローブは、DIG RNA labeling kit (Roche)を用いて調製した。ハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液+ 5% デキストランサルフェート）にRNAプローブを縣濁し、HeLa細胞に加え55℃にて 一晩保温した。プローブとハイブリダイゼーションさせたHeLa細胞をWash buffer (2xSSC, 50% ホルムアミド, 0.01% Tween 20)で2回洗浄(55℃ 30分)した。過剰量のRNAプローブはNTET buffer (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 500mM NaCl, 0.1% Tween 20) 中にて10μg/ml RNase Aで55℃ 1時間処理して分解した。その後細胞を1次洗浄液（2xSSC, 0.01% Tween 20）および2次洗浄液（0.1xSSC, 0.01% Tween 20）で、それぞれ2回ずつ洗浄(55℃ 30分)した。細胞を1x Roche Blocking Reagent (Roche)/TBST (Tris-buffered saline, 0.01% Tween20)にて、室温で1時間 Blockingした後、Blocking Reagentに希釈した抗DIG- mouse IgG(Roche)と室温で1時間反応させた。細胞をTBSTで3回洗浄(室温15分)した後に、抗mouse Ig抗体- Rhodaminと室温1時間反応させ、TBSTで3回洗浄(室温15分)した後に封入して蛍光を観察した。結果を図６に示す。写真は視野内4箇所の細胞を示す。
上段に示した未処理の HeLa 細胞で観察されるように、通常、サテライト I RNAは核内でドット状に分布している（恐らく染色体セントロメア領域に集積していると思われる）。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドでノックダウンすると、ドット状のシグナルが消失し、サテライト I RNAが分解されていることが示唆された。【００３５】
実施例７：Satellite I ncRNAノックダウンによるオーロラキナーゼのリン酸化活性への影響
染色体分離においてキネトコアとスピンドルの結合を制御するオーロラBキナーゼは、活性化に伴い、自己リン酸化（自分自身のリン酸化）を行う。また、同時に基質タンパク質であるHistone H3 やCENPAタンパク質のリン酸化を行って染色体分離を制御する。
そこで、オーロラA、オーロラB、ヒストンH3のリン酸化を、HeLa細胞を用いて、satellite I RNAをアンチセンスオリゴヌクレオチドによってノックダウンしWestern blot 解析を行うことにより検証した。Western blot 解析は、それぞれのリン酸化タンパク質特異的抗体（αPhospho-Aurora A、αPhospho-Aurora B、αPhospho-Histone H3 S10）とタンパク質の全体量を検出する通常の抗体（αAurora B、αHistone H3、αGAPDH）を用いて行った。結果を図７に示す。
オーロラBキナーゼ及びオーロラAキナーゼの自己リン酸化活性の上昇、基質タンパク質の一つである Histone H3 のリン酸化活性の上昇が検出された（10番目のセリン残基のリン酸化：Histone H3 S10）。この結果は、satellite I RNAがオーロラBキナーゼ（及びオーロラAキナーゼ）のリン酸化活性制御に関わっていることを示唆している。【００３６】
実施例８：スプライシング因子とsatellite 1 ncRNAとの結合の検討
実施例２と同様にして、免疫共沈実験を行った。但し、抗Aurora B抗体の代わりに、スプライシンング因子DHX38の免疫沈降解析では、非同調HeLa細胞（M期ブロックにない細胞）の抽出液を用い、抗DHX38抗体で沈降させ、RNAを回収した。
結果を図８に示す。M期停止HeLa細胞抽出液もしくは非同調HeLa細胞抽出液を用いて、オーロラB抗体もしくはDHX38抗体で免疫沈降させると、それぞれ、サテライト I RNAが一緒に沈降してくることが示された。これらの結果から、オーロラBはM期細胞において、スプライシング因子DHX38/Prp16 は間期細胞においてサテライト I ncRNAと結合していることが示唆された。一方、GAPDH mRNAはサテライト I RNAと結合しなかった。 【００３７】
実施例９：スプライシング因子の細胞分裂への関与に関する検証
HeLa間期細胞において、satellite I ncRNAと結合が見られたスプライシング因子DHX38/Prp16、及びDHX38/Prp16と同様にスプライシング反応に関わる複合体スプライソソームの構成成分であるDHX8/HRH1及びSAP155を、それぞれ、以下に示す配列のsiRNAを用いてノックダウンした。siRNAは、株式会社RNAiに依頼して合成した。
DHX38/Prp16
センス（配列番号９）：5’-CCAAACUGGGAGAUAUAAUdTdT-3’
アンチセンス（配列番号１０）：5’-AUUAUAUCUCCCAGUUUGGdTdT-3’
DHX8/HRH1
センス（配列番号１１）：5’-GCUUUAAUGCCCAGCGCAGdTdT-3’
アンチセンス（配列番号１２）：5’-CUGCGCUGGGCAUUAAAGCdTdT-3’
SAP155
センス（配列番号１３）：5’-GCAUAGGCGGACCAUGAUAdTdT-3’
アンチセンス（配列番号１４）：5’-UAUCAUGGUCCGCCUAUGCdTdT-3’
上記配列中、dTはデオキシチミジンを表す。【００３８】
結果を図９に示す。その結果、satellite I ncRNAをノックダウンした細胞と同様な染色体分離異常に起因する細胞分裂の破綻（葡萄状房核の出現）が観察された。これらの結果は、一部のスプライシング因子がsatellite I ncRNAを介して、染色体分離の制御にも関わっている可能性を示唆している。【００３９】
以上のように、オーロラＢキナーゼに結合するsatellite I ncRNAを、高効率で機能阻害するDNA/RNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは、既存のオーロラキナーゼＡＴＰ拮抗型阻害剤よりも特異性が高く、また高効率で癌細胞の分裂増殖を阻害できる新規な抗癌核酸医薬として有用である。【００４０】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のセントロメア由来のサテライトＩノンコーディングＲＮＡ（satellite I ncRNA）に対するアンチセンス配列を有する核酸は、新たなオーロラＢ阻害剤として、また新たな抗癌核酸医薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月12日(2014.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１：
式１：５’−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−３’
ここで、Ａは、少なくとも２以上のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｂは、配列番号１で示されるｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＩＲＮＡ配列又はその亜種の配列の一部と相補的な配列を含む、５以上２０以下のデオキシリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドであり、Ｃは、少なくとも２以上のリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである、
ここで、前記ＡおよびＣは、それぞれ、その一部のリボヌクレオチドが安定化のために修飾されており、かつ、前記式１のオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又はホスホラミデートのいずれかのヌクレオチド間結合で結合したオリゴヌクレオチドである、
で表されるオリゴヌクレオチドであって、
該オリゴヌクレオチドが細胞内に導入されると、細胞内のｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＩＲＮＡが分解されノックダウンされて、該細胞の染色体分離異常を引き起こし細胞死を誘導することができるＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記式１のＢが、配列番号１の配列の一部である連続する少なくとも６つのオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記式１において、Ｂのヌクレオチド数が１０〜２０である請求項１又は２に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記式１において、ＡおよびＣのヌクレオチド数がそれぞれ２〜５である、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾されてもよいリボヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル置換された又は２’−フルオロ置換されたリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ａ、Ｂ及びＣを構成するヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で結合した、請求項１〜５のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記Ｂが、配列番号２で示される下記配列
５’−ＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’
を含む、請求項１〜６のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記式１が、下記配列（配列番号３）
５’−ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｍＵ＊ｍＧ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊−３’
（ここで、ｍは、２’−Ｏ−メチル置換による修飾を表し、＊は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をしめす）
で示される請求項１に記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記染色体分離異常が、オーロラＢキナーゼのリン酸化活性の活性化を介して引き起こされる請求項１〜８のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオーロラＢキナーゼの活性阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオーロラＢキナーゼ及び／又はｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＩＲＮＡのセントロメア局在化阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一つに記載のＤＮＡ／ＲＮＡキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む抗癌核酸医薬組成物。
【請求項１２】
さらに他の抗癌剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＤＨＸ３８／Ｐｒｐ１６，ＤＨＸ８／ＨＲＨ１，およびＳＡＰ１５５から選ばれるスプライシング因子をコードするｍＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を含むｓｉＲＮＡであって、該ｓｉＲＮＡをヒト細胞内に導入して該因子をノックダウンすることにより細胞の分裂において染色体分離異常を引き起こし細胞死を誘導するために用いられることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【国際調査報告】
2014112144.tif 000012
2014112144.tif 000013
2014112144.tif 000014
2014112144.tif 000015