(57)【要約】  リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素を有効成分として含有する、飲食物の不快臭を低減するための風味改善用酵素組成物が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素を有効成分として含有する、飲食物の不快臭を低減するための風味改善用酵素組成物。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素が、微生物により生産されたものである、請求項１に記載の風味改善用酵素組成物。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素が、放線菌由来酵素である、請求項１または２に記載の風味改善用酵素組成物。
【請求項４】
リン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料の不快臭の発生を抑制する方法であって
請求項１から３のいずれかに記載の風味改善用酵素組成物でリン脂質を含む飲食物または飲食物の原材料を処理する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
前記原材料が卵黄または全卵である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記飲食物が、菓子、パン、ケーキ類、マヨネーズ、またはドレッシングである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
不快臭の発生が抑制され、リン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料の製造方法であって、
請求項１から３のいずれかに記載の風味改善用酵素組成物でリン脂質を含む飲食物または飲食物の原材料を処理する工程、を含む、製造方法。
【請求項８】
前記原材料が卵黄または全卵である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記飲食物が、菓子、パン、ケーキ類、マヨネーズ、またはドレッシングである、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の製造方法により製造されたリン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食物の不快臭の発生を抑制させる酵素組成物、不快臭発生抑制方法、不快臭発生抑制食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼA2（EC 3.1.1.4、以下「ＰＬＡ２」ともいう。）は、大豆、卵黄、菜種、ひまわりなどに含まれるグリセロリン脂質に作用する酵素であり、２位のエステル結合を加水分解する。ＰＬＡ２は、微生物から動物、植物にまで幅広く存在し、産業用酵素としては、ブタ膵臓、放線菌由来のＰＬＡ２やブタ膵臓由来のＰＬＡ２酵素を遺伝子組換え技術によりカビで発現させたもの等が使用されている（例えば特許文献１）。【０００３】
ＰＬＡ２で処理した卵黄または全卵を用いることにより、パン等の型枠からのはがれがなめらかになり、老化を抑制し、ふっくら感や口溶けの良い食感を与えることが知られている（特許文献２）。【０００４】
ところが、ＰＬＡ２を有効成分として含む酵素製剤を作用させた卵黄または全卵やリン脂質を含む油脂等をパンやケーキなどの食品に使用した場合、不快な臭いを発生させる場合がある。【０００５】
そこで、かかる不快臭の発生を防止し、食品の風味を向上させる方法および酵素組成物が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１７２５８３号公報
【特許文献２】特開２００３−３２５１４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、飲食物の不快臭の発生を抑制することができる酵素組成物、飲食物の不快臭の発生を抑制する方法、および不快臭の発生が抑制された飲食物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＬＡ２を有効成分として含む酵素製剤中にリパーゼが共存し得ることを見出し、この酵素製剤で卵黄または全卵を処理した改質（リゾ化）卵黄または改質（リゾ化）全卵を使用して、パン等を製造した際に生じる不快臭の主な原因が、このリパーゼの働きによって被改質物中の脂肪等から生じる遊離脂肪酸およびその酸化物にあると考え、本発明を完成した。【０００９】
本発明は、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素を有効成分として含有する、飲食物の不快臭を低減するための風味改善用酵素組成物を提供する。【００１０】
１つの実施形態では、上記ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、微生物により生産されたものである。【００１１】
１つの実施形態では、上記ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、放線菌由来酵素である。【００１２】
１つの実施形態では、上記ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、１または複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加していてもよい配列番号１もしくは３の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる酵素、または、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加していてもよい配列番号２もしくは４のアミノ酸配列からなる酵素である。【００１３】
本発明はさらに、リン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料の不快臭の発生を抑制する方法を提供し、この方法は、
上記酵素組成物でリン脂質を含む飲食物または飲食物の原材料を処理する工程、
を含む。【００１４】
１つの実施形態では、上記原材料は卵黄または全卵である。【００１５】
１つの実施形態では、上記原材料がリン脂質を含む油脂である。【００１６】
１つの実施形態では、上記飲食物は、菓子、パン、ケーキ類、マヨネーズ、またはドレッシングである。【００１７】
本発明はまた、不快臭の発生が抑制され、リン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料の製造方法を提供し、この方法は、
該飲食物の原材料を上記風味改善用酵素組成物でリン脂質を含む飲食物または飲食物の原材料を処理する工程、を含む。【００１８】
１つの実施形態では、上記原材料は卵黄または全卵である。【００１９】
１つの実施形態では、上記原材料がリン脂質を含む油脂である。【００２０】
１つの実施形態では、上記飲食物は、菓子、パン、ケーキ類、マヨネーズ、またはドレッシングである。【００２１】
本発明はまた、上記製造方法で製造されたリン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素製剤の中にリパーゼ活性が共存することを見出し、リパーゼ活性のないまたは極めて少ないホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素組成物を使用することによって、飲食物における不快臭の発生を抑制することができる。また本発明によれば、かかる用途に好適に使用し得る酵素組成物が提供される。このような酵素組成物を、飲食物またはその原材料と共に用いることにより、飲食物において不快臭の発生を抑制する方法および不快臭の発生を抑制した飲食物の製造方法を提供することができる。さらに、そのような不快臭の発生が抑制された飲食物もまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ホスホリパーゼＡ２は、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）の２位のエステル結合を加水分解し、１−アシル−２−リゾリン脂質（以下、単に「１−アシルリゾリン脂質」ともいい、例えば、１−アシル−２−リゾホスファチジルコリン）と脂肪酸とを生成する触媒作用を有する酵素である。
【００２４】
本発明の酵素組成物においては、その有効成分は、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素であることを特徴とする。より好ましくは、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率が、０．００１以下、さらに好ましくは０．０００１以下である。最も好ましくは、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率が０、すなわち、リパーゼ活性を含まない。
【００２５】
ホスホリパーゼＡ２活性、およびリパーゼ活性は、本明細書中では以下の方法により測定される。リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率は以下の方法により決定されたユニット数の比率を意味する。
【００２６】
ホスホリパーゼＡ２活性は、基質としての大豆レシチンに酵素をｐＨ８．０、３７℃で反応させた際に、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を遊離する活性を１ユニットとする。酵素反応により生成した遊離脂肪酸はＮＥＦＡ−Ｃ  テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。
【００２７】
リパーゼ活性は、リパーゼキットＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を使用して、以下の手順で測定する。5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）を含む発色液１mL、検体50μＬを混和後、フェニルメチルスルホニルフルオリドを含むエステラーゼ阻害液20μLを添加する。混和後、恒温槽で３０℃にて５分間予熱する。予熱終了後、三酪酸ジメルカプロール、ドデシル硫酸ナトリウムを含む基質液100μLを加え、混和後３０℃にて３０分間インキュベーションする。反応停止液２mLを加え、反応を停止させる。吸光度412nmを測定する。ブランクは基質溶液を反応停止後に添加する。検体とブランクの吸光度差が0.001を示した場合を1ユニットとする。
【００２８】
ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、上で説明したリパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率を満たす限り、酵素の由来および調製方法は問わない。
【００２９】
ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素の由来は、動物、植物、微生物等特に制限されない。該酵素は、酵素が由来する微生物、動物あるいは植物等から単離および精製されたものであってもよく、微生物または動植物等から酵素遺伝子をクローニングし、遺伝子組換えにより、微生物や動植物細胞に導入して形質転換体を作り、それらにより生産し、抽出、精製したものであってもよい。また、該酵素は、プロテイン・エンジニアリングの手法等により上記酵素を人工的に改変した酵素であってもよい。該酵素は好ましくは微生物由来酵素であり、より好ましくは放線菌由来酵素である。
【００３０】
１つの実施形態では、ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、微生物により生産されたものである。微生物により生産された酵素の起源は、微生物由来の酵素に加えて、微生物由来の酵素以外の酵素であってもよく、動物由来、植物由来等の酵素であって、微生物により生産されたものも含まれる。動物由来の酵素としては、ブタ由来酵素が好ましく用いられるが、これに限られない。酵素生産に用いられる微生物としては、細菌、放線菌、酵母、糸状菌（カビ）、ラン藻、菌類、単細胞藻類、原虫等が含まれる。
【００３１】
微生物としては、例えば、自然界に存在する野生型微生物、野生型微生物の自然および／または人工突然変異株あるいはこれらの形質転換体等が好適に使用できるが、これらに限られない。酵素は、一般的には、微生物菌体またはその培養液から単離または抽出された精製酵素または粗精製酵素として用いられる。精製した酵素を溶液中、あるいはカラムやビーズ等に固定化して用いてもよく、あるいは微生物菌体自体をそのまま用いて反応させてもよい。
【００３２】
放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクチノマヂューラ属（Actinomadura）、またはフランキア属（Frankia）に属する放線菌等が挙げられる。
【００３３】
微生物由来酵素としては放線菌由来酵素が好ましく、ストレプトマイセス属に属する放線菌由来酵素がさらに好ましく、このような酵素としては、例えば、ストレプトマイセス・ビオラセルバー（Streptomyces violaceoruber）ＮＢＲＣ１５１４６株由来ホスホリパーゼＡ２（商品名「ＰＬＡ２  ＮＡＧＡＳＥ  １０Ｐ／Ｒ」、ナガセケムテックス株式会社製）、ストレプトマイセス・エバミチルス（Streptomyces avermitilis）ＮＢＲＣ１４８９３株由来ホスホリパーゼＡ２などが好適に用いられる。
【００３４】
ストレプトマイセス・ビオラセルバーＮＢＲＣ１５１４６株由来ホスホリパーゼＡ２は、上で説明した比率を満たし、好ましくは下記の理化学的性質を有する：
（ａ）作用および基質特異性：１，２−ジアシルリン脂質の２位のアシル基がグリセロール骨格と結合する部位を加水分解し、２−アシル基を遊離する。
（ｂ）至適ｐＨ：７〜９
（ｃ）安定ｐＨ：４〜１０
（ｄ）至適温度：５０℃
（ｅ）安定温度：３０−６０℃
（ｆ）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で１４ｋＤａである。
【００３５】
ストレプトマイセス・ビオラセルバーＮＢＲＣ１５１４６株由来ホスホリパーゼＡ２は、天然型としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、その配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。該塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列であってもよい。より好ましくは９０個以下、さらに好ましくは４５個以下、さらに好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１６個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは１〜数個、最も好ましくは１〜３個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列である。
【００３６】
ストレプトマイセス・エバミチルスＮＢＲＣ１４８９３株由来ホスホリパーゼＡ２は、上で説明した比率を満たし、例えば、以下に示すようにして調製され得る。
【００３７】
ストレプトマイセス・エバミチルスＮＢＲＣ１４８９３株からゲノムＤＮＡを調製し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、遺伝子断片を得る。ｐＴＯＮＡ５（特開２００９−６５８３７号公報）を制限酵素NdeＩおよびHindIIIで処理し、上記遺伝子断片をNdeＩおよびHindIIIで処理し、得られた２つの断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入する。カナマイシンを選択マーカーにして、遺伝子断片含有ｐＴＯＮＡ５プラスミドを得る。得られた遺伝子断片含有プラスミドを接合性大腸菌Ｓ１７−１に導入し、その形質転換された大腸菌から接合形質転換によりストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株を形質転換する。この形質転換株を培養して酵素を生産させ、培養液から酵素溶液を取得し、必要に応じて分離精製する。
【００３８】
ストレプトマイセス・エバミチルスＮＢＲＣ１４８９３株由来ホスホリパーゼＡ２は、天然型としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。該塩基配列は、配列番号３に記載の塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列からなる遺伝子であってもよい。より好ましくは９０個以下、さらに好ましくは４５個以下、さらに好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１６個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは１〜数個、最も好ましくは１〜３個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列である。
【００３９】
ストレプトマイセス・ビオラセルバーＮＢＲＣ１５１４６株由来ホスホリパーゼＡ２およびストレプトマイセス・エバミチルスＮＢＲＣ１４８９３株由来ホスホリパーゼＡ２のような酵素は、上で説明した比率を満たす限り、天然型酵素のアミノ酸配列（配列番号２または４に記載のアミノ酸配列）に対して１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。
【００４０】
当業者であれば、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入法などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。この場合、相同アミノ酸、活性中心等の技術常識を考慮して活性に悪影響を与えない変異を導入することが好ましい。
【００４１】
本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基の位置、種類および個数は、上で説明した比率を満たす限り限定されない。上記個数は、例えば、３０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは７個以下、よりさらに好ましくは５個以下、特に好ましくは１〜数個、最も好ましくは１〜３個である。上記位置および種類は、例えば、上で説明した比率を満たす限り限定されない。
【００４２】
また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあるので、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も、上で説明した比率を満たす限り、本発明において用いられ得る。
【００４３】
上記天然型酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列）に対して一定程度の同一性（類似アミノ酸による置換を含まない）または相同性（類似アミノ酸による置換を含む）を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、上で説明した比率を満たす限り、本発明において用いられ得る。
【００４４】
好ましくは、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【００４５】
タンパク質の同一性または相同性検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはDDBJ、EMBL、あるいはGenBankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした推定アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTA、ClustalW, Phylipなどの相同性検索プログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて、あるいはローカルホストを用いて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記手順を利用して行い得る。
【００４６】
ホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素は、例えば、配列番号１または３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは遺伝子によってコードされ得る。配列番号１および３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは遺伝子はそれぞれ、配列番号２および４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、すなわち、ストレプトマイセス・ビオラセルバーＮＢＲＣ１５１４６株由来ホスホリパーゼＡ２およびストレプトマイセス・エバミチルスＮＢＲＣ１４８９３株由来ホスホリパーゼＡ２をコードする。
【００４７】
本発明で用いられ得る酵素はまた、例えば、配列番号１または３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ上で説明した比率を満たす酵素であり得る。
【００４８】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１または３に記載の塩基配列中のホスホリパーゼＡ２タンパク質をコードする領域の全長またはコード領域中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０個、６０個または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system（Amersham Biosciences社製）を用いて、マニュアルに記載の条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００４９】
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％ SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC、0.1％ SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％ SDSの条件であるが、これらの条件に特に限定されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、温度、塩濃度、ホルムアミド濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５０】
本発明は、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素を有効成分として含有する、飲食物の不快臭を低減するための風味改善用酵素組成物を提供する。ここで、「不快臭」とは、典型的にはリパーゼにより分解された脂肪酸及びその酸化物に由来する不快臭をいうが、これらに限られない。また、本発明の飲食物の不快臭を低減するための風味改善用酵素組成物においては、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性は０であってもよい。
【００５１】
風味改善用酵素組成物は、リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性が０．００５以下であるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素のみからなるものであってもよく、または酵素活性を実質的に損なわない限り、賦形剤、添加剤等の食品分野で許容される他の成分を含むものであってもよい。本発明の酵素組成物中におけるホスホリパーゼＡ２活性を有する酵素の量は、酵素処理が達成される限り特に制限されないが、例えば、０．０５〜１００重量％、好ましくは、０．０５〜５０重量％、より好ましくは０．０５〜３０重量％である。酵素組成物は、任意の剤型が可能であり、酵素処理が達成される限り特に制限されないが、例えば水などの溶媒に溶解または分散させた液状であっても、または固形（例えば、粉末状）であってもよい。
【００５２】
本発明の酵素組成物はリン脂質の改質が求められる飲食物または飲食物の原材料に添加され、酵素処理に供される。これにより、リン脂質を改質できるとともに、他のホスホリパーゼＡ２製剤による処理で発生する不快臭が抑制される。また、本発明の酵素組成物は、飲食物の原材料のうちリン脂質を含まないものと混合された後に、リン脂質を含む他の原材料に加えられ、酵素処理に供されることもできる。ここで、リン脂質を含まない原材料としてはリン脂質を含まない油脂（例えば精製油）などが挙げられ、特に精製油は、リパーゼ活性により不快臭が発生し得るため、他のホスホリパーゼＡ２製剤と予め混合することは難しいが、本発明の酵素組成物ではそれが可能となる。また、原材料がリン脂質を含む油脂の場合、本発明の酵素組成物で酵素処理することにより、不快臭の発生が抑制されつつ、リン脂質がリゾ化された油脂が得られる。本発明の不快臭の発生を抑制する方法、本発明の製造方法、および該製造方法により製造された飲食物または飲食物の原材料についても同様である。
【００５３】
本発明はまた、リン脂質がリゾ化された飲食物または飲食物の原材料の不快臭の発生を抑制する方法（以下、「本発明の方法」と称することがある。）を提供し、本方法は、酵素組成物で飲食物または飲食物の原材料を処理する工程を含む。処理に用いる「酵素組成物」の剤型は液体であっても固体であってもよく、処理する飲食物または飲食物の原材料に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
本発明の風味改善用酵素組成物により酵素処理される対象は、飲食物または飲食物の原材料であり、卵黄、全卵、リン脂質を含む油脂などが挙げられる。１つの実施形態では、卵黄、全卵またはリン脂質を含む油脂である。本発明の酵素組成物で処理する卵黄は、生、凍結、粉末、加塩、加糖等任意の形態の卵黄が用いられる。また、該酵素組成物で処理する飲食物の原材料としては卵白を含んだ全卵の形態であってもよい。また、パンやケーキなどの原料として使用する油脂を該酵素組成物により改質してもよい。また、リン脂質を含む油脂は、例えば、マーガリン、クリーム、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、ショートニング、ファストスプレッドである。
【００５５】
１つの実施形態としては、本発明の風味改善用酵素組成物により改質した卵黄、全卵または油脂を使用した飲食物である。このような飲食物としては、例えば、菓子、パン、ケーキ類、マヨネーズ、ドレッシングなどが挙げられる。
「飲食物」または「飲食物の原料」には食用油脂も含まれる。１つの実施形態では、「飲食物」または「飲食物の原料」は、油脂を前記風味改善用酵素組成物により処理した不快臭を低減した改質油脂である。
【００５６】
本明細書において、「菓子」とは、小麦粉やその他の穀類を使用する菓子であれば、特に限定されるものではないが、まんじゅう、蒸しようかん、カステラ、どら焼き、今川焼き、たい焼き、きんつば、ワッフル、栗まんじゅう、月餅、ボーロ、八つ橋、せんべい、かりんとう、クッキー、ドーナツ等をいう。
【００５７】
本明細書において、「ケーキ類」とは、スポンジケーキ、バターケーキ、シフォンケーキ、ロールケーキ、スイスロール、ブッセ、バウムクーヘン、パウンドケーキ、チーズケーキ、スナックケーキ、蒸しケーキ、ホットケーキ、パンケーキ等をいう。
【００５８】
本明細書において、「油脂」としては、食用油脂を意味し、例えば、以下のように常温で液体のもの（脂肪油）および常温で固体のもの（脂肪）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。脂肪油（常温で液体）としては、サラダ油、白絞油、コーン油、大豆油、ごま油、菜種油（キャノーラ油）、こめ油、糠油、椿油、サフラワー油 （ベニバナ油）、ヤシ油（パーム核油）、綿実油、ひまわり油、エゴマ油（荏油）、アマニ油、オリーブオイル、ピーナッツオイル、アーモンドオイル、アボカドオイル、ヘーゼルナッツオイル、ウォルナッツオイル、グレープシードオイル、マスタードオイル、レタス油、鯨油、鮫油、肝油等が挙げられる。脂肪（常温で固体）としては、カカオバター、ピーナッツバター、パーム油、ラード（豚脂）、ヘット（牛脂）、鶏油、兎脂、羊脂、馬脂、シュマルツ、乳脂（バター、ギーなど）、硬化油（マーガリン、ショートニングなど）等が挙げられる。
【００５９】
また、本発明の酵素組成物により処理された卵黄、全卵またはリン脂質を含む油脂等の飲食物の原材料は、マヨネーズ、タルタルソース、乳化型ドレッシング等の酸性水中油型乳化物にも好適に使用され得る。
【００６０】
飲食物または飲食物の原材料を水および酵素組成物で処理する工程については、飲食物または飲食物の原材料に対して添加された酵素組成物が飲食物または飲食物の原材料中のリン脂質に作用できる限り、酵素の添加の順序または様式は問わない。飲食物または飲食物の原材料を酵素で処理する工程は、通常の飲食物の製造における原料の前処理工程で行うことが一般的である。飲食物または飲食物の原材料を酵素組成物で処理する工程としては、例えば、酵素を水または適当な水溶液に分散または溶解して添加することができる。
【００６１】
本発明において、酵素処理とは、飲食物または飲食物の原材料を本発明の酵素組成物（他の飲食物の原材料と混合されたものであってもよい）と接触させ、酵素組成物中のホスホリパーゼＡ２を基質に作用させることをいう。
【００６２】
酵素処理は、好ましくはｐＨ２〜１０、より好ましくはｐＨ３〜９、さらにより好ましくはｐＨ４〜９の範囲内で行う。上記ｐＨになるように、酵素を添加する前、同時、もしくは後に、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）が添加され得る。
【００６３】
酵素処理は、当該酵素の至適温度にもよるが、通常２５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の条件下で、通常１５分〜８時間、好ましくは１５分〜５時間、行われ得る。
【００６４】
酵素処理に供される酵素組成物の量は、処理対象物の改質（リゾ化）が達成できる限り特に制限されないが、飲食物または飲食物の原材料１ｋｇ当たりホスホリパーゼＡ２活性が好ましくは１００〜５０００ユニット、より好ましくは３００〜３０００ユニットとなる量である。また、酵素処理に供される酵素組成物の量は、酵素処理当たり好ましくは１〜１０００ｐｐｍ、より好ましくは１０〜５００ｐｐｍであってもよい。酵素処理は、バッチ式、多段バッチ式、あるいは連続式で行い得る。酵素処理後、酵素を失活させるために加熱処理することが望ましい。
【００６５】
本発明はまた、不快臭の発生を抑制した飲食物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある。）を提供し、本製造方法は、該飲食物の原材料を上記酵素組成物で処理する工程、および該酵素組成物処理後の該原材料を用いて該飲食物を製造する工程を含む。酵素組成物での飲食物の原材料の処理については、上記に記載のとおりである。処理後の原材料を用いる飲食物の製造については、当該分野で用いる通常の手順が用いられ得る。
【００６６】
本発明はまた、上記製造方法で製造された飲食物を提供する。このような飲食物は、他のホスホリパーゼＡ２酵素製剤処理にて生じ得る不快臭の発生が抑制された飲食物であり得る。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００６８】
（実施例１：リパーゼ活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比率）
ナガセケムテックス株式会社が製造する、放線菌由来のＰＬＡ２（PLA2 NAGASE 10P/R）とブタ膵臓由来のＰＬＡ２（Biocatalysts社  製品名：Lipomod 699L）、ブタ膵臓由来のＰＬＡ２をカビで発現させたＰＬＡ２（DSM社  製品名：MaxapalA2）のホスホリパーゼＡ２活性とリパーゼ活性を測定した。【００６９】
（ＰＬＡ２活性測定法）
ホスホリパーゼＡ２活性は、基質としての大豆レシチンに酵素をｐＨ８．０、３７℃で反応させた際に、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を遊離する活性を１ユニットとした。酵素反応により生成した遊離脂肪酸はＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。【００７０】
（リパーゼ活性測定方法）
リパーゼキットS(DSファーマバイオメディカル株式会社)を使用して、以下の手順で測定した。5’5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を含む発色液1mL、検体50μLを混和後、フェニルメチルスルホニルフルオリドを含むエステラーゼ阻害液20μLを添加した。混和後、恒温槽で30℃にて5分間予熱した。予熱終了後、三酪酸ジメルカプロール、ドデシル硫酸ナトリウムを含む基質液100μLを加え、混和後、30℃にて30分間インキュベーションした。反応停止液2mLを加え、反応を停止させた。吸光度412nmを測定した。ブランクは基質溶液を反応停止後に添加した。検体とブランクの吸光度差が0.001を示した場合を1ユニットとした。【００７１】
（ホスホリパーゼＡ２活性とリパーゼ活性の比較）
表１に示す通り、放線菌由来のＰＬＡ２またはブタ膵臓由来のＰＬＡ２では、ホスホリパーゼＡ２活性中のリパーゼ活性の比率が、ブタ膵臓由来のＰＬＡ２をカビで発現させたＰＬＡ２より、著しく低い事がわかった。【００７２】
【表１】
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【００７３】
（実施例２：製パン評価）
表２に記載のバター以外の材料をミキサー(愛工舎製作所)に投入し、２６℃で、低速で３分間、低中速で３分間、低中速で５分間捏ね上げた。その後無塩バターを投入し、低速で２分、中低速で５分、高速で１分、中低速で２分間捏ね上げ、一次発酵を行った(３０℃、湿度７５％、９０分)。一次発酵終了後、生地を２３７．５ｇずつに分割し、モルダー(愛工舎製作所製)でガス抜きをした後、成形をした。その後、二次発酵(３２℃、湿度７５％、７０分)を行い、オーブンで２３０℃、４０分間、焼成した。対照区として酵素を添加しない区を設けた。各酵素の使用量については、活性のユニット数（Ｕ）が同等視することができる量を添加した。【００７４】
【表２】
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【００７５】
不快臭がするかどうかを、評価者３名を対象に行った。評価は焼成1日後、焼成3日後で評価した。評価は3点で評価した。不快臭がしないものを1点、不快臭がするものを2点、特に不快臭が強いものを3点として評価した。その結果を表３に示す。【００７６】
【表３】
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【００７７】
表３に示す通り、ブタ膵臓由来のＰＬＡ２をカビで発現させたＰＬＡ２は、同等活性の放線菌由来のＰＬＡ２またはブタ膵臓由来のＰＬＡ２に比べて、焼成後のパンで不快な臭いの発生を確認した。【００７８】
（実施例３：酵素処理したパン中の遊離脂肪酸量測定）
表4に記載のバター以外の材料をミキサー(愛工舎製作所)に投入し、26℃で低速で3分間、低中速で2分間捏ね上げた。その後、バターを投入し、低中速で2分間、中低速で7分間捏ね上げ、一次発酵を行った(30℃、湿度90%、30分)。一次発酵終了後、生地を220gずつ分割し、モルダー(愛工舎製作所)でガス抜きをした後、成形をした。その後、二次発酵を行い、オーブンで210℃、40分間焼成した。対照区として、酵素を添加しない区を設けた。【００７９】
【表４】
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【００８０】
酵素処理したパン中の遊離脂肪酸量はGC−ヘッドスペース法にて測定した。GCは（島津製作所製GC2010）を使用して分析した。ヘッドスペース用のサンプル瓶(GLサイエンス社製)に焼成した翌日のクラムを約2.1g〜約2.3g採取し、分析サンプルとした。【００８１】
＜GC＞
カラム        ：InertCap
FFAP (0.25mmID×30m, df=0.25μm)(GLサイエンス社製)
カラム温度    ：60℃-10℃/分-240℃ (5分)
検出器        ：FID, 240℃
キャリアガス：He
カラム流量    ：1.2mL/min
＜ヘッドスペース＞
保温時間          ：30分
オーブン温度      ：90℃
トランスファー温度：210℃
ニードル温度      ：200℃
キャリアガス圧    ：140kPa【００８２】
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(Ci4)、吉草酸(C5)、イソ吉草酸(Ci5)、カプロン酸(C6)、エナント酸(C7)、カプリル酸(C8)、カプリン酸(C10)のピーク面積をそれぞれ算出し、各ピーク面積の合計を、分析に供したパン重量で除し、酵素無添加を100として各酵素製剤により生成した脂肪酸量とした。【００８３】
表5に示すとおり、ブタ膵臓由来のPLA2をカビで発現させたPLA2（MaxapalA2）は他のPLA2より著しく、脂肪酸を産生することが分かった。これは実施例１のリパーゼ含有量のデータと一致することから、MaxapalA2中のリパーゼが関与している可能性がある。【００８４】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、不快臭を低減し、風味のよい飲食物を製造することができることから、食品産業および食品添加物産業において利用できる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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