(57)【要約】  生体成分が溶解した溶液中から核酸を高効率で抽出することができ、使用後にリサイクルすることが可能な固体状の組成物を提供する。  グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド並びにセルロースを含む粒子が上記課題を解決できる。
2016084945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド、並びにセルロースを含む粒子。
【請求項２】
前記粒子における、セルロースに対するグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドの比が、４７％〜６４％である請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
磁性体及び／又は粒子中でプラスに帯電する物質を更に含む請求項１又は２に記載の粒子。
【請求項４】
グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド、並びにセルロースを含む固体状の核酸抽出用組成物。
【請求項５】
前記核酸抽出用組成物における、セルロースに対するグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドの比が、４７％〜６４％である請求項４に記載の核酸抽出用組成物。
【請求項６】
磁性体及び／又は組成物中でプラスに帯電する物質を更に含む請求項４又は５に記載の核酸抽出用組成物。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか一項に記載の粒子、請求項４〜６の何れか一項に記載の核酸抽出用組成物の何れかに、核酸を含む溶液を混合して核酸を前記粒子又は核酸抽出用組成物に吸着する工程、
前記核酸が吸着した前記粒子又は核酸抽出用組成物に核酸溶出液を混合することで、前記粒子又は核酸抽出用組成物に吸着した核酸を分離する核酸抽出工程、
を含む核酸抽出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸抽出工程後の前記粒子又は核酸抽出用組成物を、核酸クリーニング液で処理して前記粒子又は核酸抽出用組成物の表面に残留している核酸を除去する表面回復工程、
を含む前記粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド並びにセルロースを含む粒子、核酸抽出用組成物、核酸抽出方法、及び粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法に関する。特に、核酸を含む多様なサンプルからの核酸の抽出操作が容易であり、また、高純度且つ効率的に核酸を抽出することができる粒子及び核酸抽出用組成物に関する。更に、前記粒子及び核酸抽出用組成物を用いた核酸抽出方法、並びに核酸抽出後の粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中に含まれる微量の核酸の分析は、生物化学、医療、食品、犯罪捜査等の多くの分野で行われている。サンプル中の核酸の抽出方法としては、古くは、Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ  Ｍｉｓｃｈｅｒ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄが用いられ、次いで、１９６７年にフェノール・クロロホルム法が開発されている。前記の核酸抽出方法は、タンパク質等の除去したい成分を変性し、次いで、遠心分離等により生体成分が溶解している溶液から除去することで核酸抽出を行っている。したがって、抽出したい核酸は液体に溶解した状態であることから、酵素等の影響により核酸が分解されやすいという問題がある。また、抽出操作は液体の混合を繰り返すことから、操作中にこぼれ易い等の問題がある。【０００３】
上記問題点を解決するため、１９７９年には、従来の液体を用いた核酸の抽出方法に代え、固体のシリカ粒子を用いた核酸の抽出方法が開発された。とろこで、大学等の研究室では、予算の都合上、核酸等の抽出に用いる器具・材料等をリサイクルする場合がある。シリカ粒子をリサイクルする方法としては、核酸抽出後のシリカ粒子をＨＣｌで処理することが知られている（非特許文献１参照）。また、サンプル中の核酸を抽出する方法としては、磁性粒子を用いた方法も知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｇａｄｅｎａｈａｌｌｉ  Ｂ．  Ｓｉｄｄａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｒｒｙｏｖｅｒ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ”，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２，２００７．ｐ１８６−１９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に記載されている方法は、ＨＣｌでシリカ粒子を表面処理すると表面が変化しリサイクル能が低下することと、リサイクルには２〜３日程度要するという問題がある。また、磁性粒子を用いた核酸の抽出方法は、大型の装置等が必要であり、又抽出時間もかかり、核酸抽出が煩雑であるという問題がある。
現状では、サンプル中の核酸を抽出することができ且つリサイクル可能な固体状の組成物は知られていない。【０００６】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされた発明で、鋭意研究を行ったところ、
（１）グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドとセルロースを混合した粒子又は核酸抽出用組成物は、生体成分が溶解した溶液中から核酸を抽出できること、
（２）セルロースに対するグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドの比を調整することで、サンプル中の核酸を、従来のシリカ粒子より高効率で抽出できること、
（３）従来のシリカ粒子を用いた核酸の抽出方法では、一度使用したシリカ粒子はリサイクルできなかったが、本発明の使用済みの粒子又は核酸抽出用組成物は、核酸クリーニング液で処理することで粒子又は核酸抽出用組成物表面の核酸を除去することができ、リサイクルが可能であること、
（４）粒子又は核酸抽出用組成物に磁性体を加えると、磁石により核酸が吸着した粒子又は核酸抽出組成物を回収できるので作業効率を更に向上できること、
（５）粒子又は核酸抽出用組成物にプラスに帯電する物質を加えると、カオトロピック塩やＮａ+を含むバインディングバッファーを用いなくても核酸を抽出できること、
を新たに見出した。【０００７】
すなわち、本発明の目的は、グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド並びにセルロースを含む粒子、核酸抽出用組成物、核酸抽出方法、及び粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下に示す、グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド並びにセルロースを含む粒子、核酸抽出用組成物、核酸抽出方法、及び粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法に関する。【０００９】
（１）グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド、並びにセルロースを含む粒子。
（２）前記粒子における、セルロースに対するグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドの比が、４７％〜６４％である上記（１）に記載の粒子。
（３）磁性体及び／又は粒子中でプラスに帯電する物質を更に含む上記（１）又は（２）に記載の粒子。
（４）グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド、並びにセルロースを含む固体状の核酸抽出用組成物。
（５）前記核酸抽出用組成物における、セルロースに対するグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイドの比が、４７％〜６４％である上記（４）に記載の核酸抽出用組成物。
（６）磁性体及び／又は組成物中でプラスに帯電する物質を更に含む上記（４）又は（５）に記載の核酸抽出用組成物。
（７）上記（１）〜（３）の何れか一に記載の粒子、上記（４）〜（６）の何れか一に記載の核酸抽出用組成物の何れかに、核酸を含む溶液を混合して核酸を前記粒子又は核酸抽出用組成物に吸着する工程、
前記核酸が吸着した前記粒子又は核酸抽出用組成物に核酸溶出液を混合することで、前記粒子又は核酸抽出用組成物に吸着した核酸を分離する核酸抽出工程、
を含む核酸抽出方法。
（８）上記（７）に記載の核酸抽出工程後の前記粒子又は核酸抽出用組成物を、核酸クリーニング液で処理して前記粒子又は核酸抽出用組成物の表面に残留している核酸を除去する表面回復工程、
を含む前記粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法。
【発明の効果】
【００１０】
（１）本発明のグラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド（以下、「ＧＯ」と記載することがある。）並びにセルロースを含む粒子、及び核酸抽出用組成物は、生体成分が溶解した溶液中から核酸を選択的に抽出できる。
（２）セルロースに対するグラフェンオキサイドの比を調整することで、多様なサンプル中の核酸を、従来のシリカ粒子より高効率で抽出できる。したがって、唾液等に含まれる極微量の核酸であっても抽出することができる。
（３）従来のシリカ粒子を用いた核酸の抽出方法では、一度使用したシリカ粒子はリサイクルすることができなかったが、本発明の粒子又は核酸抽出用組成物は、核酸クリーニング液で処理することで粒子又は核酸抽出用組成物表面の核酸を除去することができ、リサイクルが可能である。したがって、繰り返し核酸の抽出に用いることができるので、研究室等の経費を節減することができる。
（４）粒子又は核酸抽出用組成物に磁性体を加えた場合、磁石により核酸が吸着した粒子又は核酸抽出組成物を回収できるので作業効率が向上する。
（５）粒子又は核酸抽出用組成物にプラスに帯電する物質を加えると、カオトロピック塩やＮａ+を含むバインディングバッファーを用いなくても核酸を抽出できるので、核酸抽出後にＰＣＲで増幅する場合に必要であった、Ｎａ+やカオトロピック塩を除去する工程が不要となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、図面代用写真で、図１（Ａ）は実施例１で作製した粒子の写真、図１（Ｂ）は比較例１で作製した粒子の写真である。
【図２−１】図２−１は、図面代用写真で、ＧＯの比を種々変えた粒子のＳＥＭ写真である。
【図２−２】図２−２は、図面代用写真で、ＧＯの比を種々変えた粒子のＳＥＭ写真である。
【図３】図３は、図面代用写真で、ＧＯの比が、夫々５３％、５６％、６０％、６４％の粒子をピペットの先端で押した写真を示している。
【図４】図４（Ａ）は、表２の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ値をグラフ化したもので、図４（Ｂ）は、表２の２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値をグラフ化したものである。
【図５】図５（Ａ）は、表２の核酸溶出液１μｌに含まれる核酸量（ｎｇ）値をグラフ化したもので、図５（Ｂ）は、表２のＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄをグラフ化したものである。
【図６】図６は、実施例４及び比較例２の結果を表すグラフで、多様なサンプルからのＤＮＡ抽出のＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄ値を示すグラフである。
【図７】図７（Ａ）は、図面代用写真で、左側は実施例５で作製したＣＧＭ０、右側は実施例５で作製したＣＧＭ４５の写真である。図７（Ｂ）及び（Ｃ）は、図面代用写真で、図７（Ｂ）はＣＧＭ０を純水に分散した容器に磁石を近付けた写真、図７（Ｃ）はＣＧＭ４５を純水に分散した容器に磁石を近付けた写真である。
【図８】図８（Ａ）は、図面代用写真で、実施例５のＣＧＭ４５のＳＥＭ写真である。図８（Ｂ）〜（Ｄ）は、図面代用写真で、ＣＧＭ４５粒子表面をエネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＸ）で解析したマッピングで、図８（Ｂ）は炭素元素、図８（Ｃ）は酸素元素、図８（Ｄ）はＦｅ元素の分散を表している。
【図９】図９は、実施例５の各サンプルの核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄのグラフである。
【図１０】図１０は、実施例６の各サンプルの核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明のＧＯ及びセルロースを含む粒子、核酸抽出用組成物、核酸抽出方法、及び粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法ついて詳しく説明する。
【００１３】
本発明のＧＯ及びセルロースを含む粒子は、ＧＯを含む水に、セルロース及びセルロース分子間の水素結合を壊すための物質を添加・混合（以下、「混合溶液」と記載することがある。）し、混合溶液を凝固用溶液に滴下し、混合溶液を凝固することで製造することができる。
【００１４】
本発明に用いるＧＯは、グラフェンオキサイド（Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅ；炭素原子シートが単層）、グラファイトオキサイド（Ｇｒａｐｈｉｔｅ  Ｏｘｉｄｅ；炭素原子シートが多層）を夫々用いてもよいし、両者を混合して用いてもよい。ＧＯはＭａｒｃａｎｏ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ等の公知の法で製造してもよいし、市販されているものを用いてもよい。セルロースも一般的に市販されているものを用いればよい。
【００１５】
凝固用溶液としては、混合溶液を凝固できれば特に制限は無く、例えば、ＨＮＯ3、Ｈ2ＳＯ4、アセトン、エタノール、食塩水、その他、酸性溶液等が挙げられる。前記凝固用溶液の中では、安定性や凝固能力等の面から、ＨＮＯ3、Ｈ2ＳＯ4が好ましい。また、凝固用溶液は、必要に応じて５℃〜５０℃に調整する必要があるが、ＨＮＯ3は室温で使用可能であることから、操作性の観点から好ましい。粒子の大きさは、混合溶液を滴下する際の器具（スポイト等）の口径を調整し、凝固用溶液中に滴下する混合溶液の量を調整すればよい。なお、本発明の「粒子」とは、上記のとおり、凝固用溶液中に混合溶液を滴下して形成された粒子を意味し、混合溶液の粘度により異なるものの、球形、楕円形、涙形等が挙げられる
【００１６】
セルロース分子間の水素結合を壊すための物質としては、セルロース分子間の水素結合が壊れれば特に制限は無い。例えば、ＮａＯＨ、尿素等が挙げられ、単独でも組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
セルロースに対するＧＯの比は、サンプル中の核酸を吸着し、核酸溶出液により吸着した核酸を離脱することでサンプル中の核酸を抽出できれば特に制限はない。なお、本発明において、「セルロースに対するＧＯの比」とは、（ＧＯ／（セルロース＋ＧＯ））×１００（％）を意味する。混合溶液を凝固用溶液中に滴下すると混合溶液が固化し、セルロースとＧＯは凝固用溶液に溶解しないので、混合溶液中のセルロースに対するＧＯの比と粒子中のセルロースに対するＧＯの比は同じと推測される。
【００１８】
セルロースに対するＧＯの比（以下、単に「ＧＯの比」と記載することがある。）としては、５％以上が好ましく、３１％以上がより好ましい。更に、従来のシリカ粒子と遜色ない高効率で核酸を抽出する場合は、ＧＯの比を４７％以上とすることが特に好ましい。
【００１９】
一方、ＧＯの比の上限は、製造した粒子又は組成物が固体状態を維持できる比であれば特に制限はない。例えば、ＧＯの比が６４％でも固体状態を維持することができるので、６４％以下とすればよく、取り扱いの利便性等を考慮し、６０％以下、５６％以下、５３％以下等、適宜調整すればよい。
【００２０】
なお、酵素によるＤＮＡの分解を抑えるためにグラフェンオキサイドを使用することは知られている（Ｈａｏｚｈｉ  Ｌｅｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  “Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ”，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，３，ｐ３８８８−３８９２、参照）。また、グラフェンオキサイドとセルロースを含む組成物をフィルム状にしてバイオセンサーに用いることも知られている（Ｑｉａｎｇ  Ｙａｎｇ  ｅｔ．  Ａｌ．，  “Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ  ｂｙ  Ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇｎｉｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”，Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃ，２０１０，Ｖｏｌ．１１４，Ｎｏ．９，ｐ３８１１−３８１６、参照。）しかしながら、ＧＯ及びセルロースを粒子状にすることは本発明で新たに見出した形状である。更に、ＧＯ及びセルロースを含む組成物を用いて核酸を抽出し且つリサイクルできることも、本発明で新たに見出したことである。
【００２１】
したがって、組成物を用いて核酸を抽出する場合、組成物の形状としては特に制限はないが、比表面積が大きくなり、また、核酸抽出に一般的に用いられているエッペンドルフチューブ等に効率的に充填できることから、粒子状が好ましい。なお、本発明の粒子はサンプル中の核酸を選択的に吸着することができるので、例えば、サンプル中に本発明の粒子を添加・混合した後、粒子をサンプルから除去することで、サンプルから核酸を除去しタンパク質等の濃縮用の用途にも使用することができる。したがって、本発明の粒子の用途としては、核酸抽出用に限定されない。
【００２２】
また、上記のとおり、ＧＯ及びセルロースを含む組成物をフィルム状に形成することは知られているが、ＧＯ及びセルロースを含む組成物を、核酸抽出に用いることは知られていない。したがって、本発明のＧＯ及びセルロースを含む組成物は、核酸抽出用として新たな用途を提供することができる。上記のとおり、エッペンドルフチューブを用いて核酸を抽出する場合、組成物の形状は粒子状が好ましいが、粒子に限定されるものではない。例えば、混合溶液を凝固用溶液中に中空となるように押し出すことで、組成物をチューブ状に形成し、核酸を含むサンプルをチューブに流し、次いで、核酸溶出液を流すことで、連続処理ができるようにしても良い。また、ガラス板等にキャストした後に凝固用溶液中に浸漬する、又は、凝固用溶液中に薄膜状に押し出すことでフィルム状としても良い。何れの形態であっても、核酸を含むサンプル液と接触させることで、核酸を吸着させることができる。
【００２３】
本発明の核酸抽出方法は、先ず、核酸を含むサンプル溶液及びバインディングバッファー、並びに粒子又は核酸抽出用組成物を混合することで粒子又は核酸抽出用組成物に核酸を吸着させ、次いで、エタノールで洗浄後、核酸が吸着した粒子又は核酸抽出用組成物と核酸溶出液を混合することで前記粒子又は核酸抽出用組成物に吸着した核酸を離脱させ、サンプル中の核酸を核酸溶出液中に回収することができる。なお、本発明の核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。また、ＤＮＡは一本鎖であっても２本鎖であっても良い。
【００２４】
バインディングバッファーとしては、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ  ｓａｌｔｓ（ＧＩＴＣ）、ＮａＣｌ、ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ等を用いればよい。
【００２５】
核酸溶出液としては、粒子又は核酸抽出用組成物の表面と核酸のイオン結合を壊し、核酸が溶出できれば特に制限はない。例えば、ＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０、キアゲン社製）等が挙げられる。
【００２６】
粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法は、粒子又は核酸抽出用組成物の表面に残留している核酸にダメージを与え、表面から除去できる核酸クリーニング液で表面処理を行えばよい。核酸クリーニング液は、上記のとおり核酸にダメージを与え、粒子又は核酸抽出用組成物の表面から核酸を除去できるものであれば特に制限は無く、例えば、ＨＣｌ等の酸性溶液、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液、又はＵｒｅａ等が挙げられる。核酸クリーニング液で、粒子又は核酸抽出用組成物の表面に残留している核酸を除去して表面回復することで、粒子又は核酸抽出用組成物をリサイクルすることができる。したがって、予算が限られている研究室等で有用である。
【００２７】
また、本発明の粒子又は核酸抽出用組成物は、磁性体を含んでいてもよい。磁性体を含んだ粒子又は核酸抽出用組成物は、磁石で回収することができるので作業効率が向上する。磁性体としては、磁石により引き寄せられるものであれば特に制限はないが、例えば、（１）マグネタイト、マグヘマイト、フェライト等の磁性酸化鉄、及び他の金属酸化物を含む酸化鉄、（２）鉄、コバルト、ニッケル等の金属、又は、これらの金属とアルミニウム、コバルト、銅、鉛、マグネシウム、錫、亜鉛、アンチモン、ベリリウム、ビスマス、カドミウム、カルシウム、マンガン、セレン、チタン、タングステン、バナジウム等の金属との合金、（３）及びこれらの混合物、などが挙げられる。
【００２８】
また、粒子又は核酸抽出用組成物にプラスに帯電する物質を加えると、核酸の抽出効率が向上し、更に、カオトロピック塩やＮａ+を含むバインディングバッファーを用いなくても核酸を抽出できる。プラスに帯電する物質としては、マイナスの電荷を持つ核酸を引き寄せることができれば特に制限はなく、マグネタイト、マグヘマイト、フェライト等の酸化鉄、酸化アルミ、酸化マグネシウム等が挙げられる。
【００２９】
上記磁性体、プラスに帯電する物質は、粒子又は核酸抽出用組成物に別々に加えてもよいし、両者を組み合わせて加えてもよい。また、酸化鉄（例えば、マグネタイト、マグヘマイト、フェライト）等の磁性及びプラスに帯電の両方の性質を有する物質の場合は、単独で２つの異なる効果を奏するので好ましい。
【００３０】
粒子又は核酸抽出用組成物中に含む酸化鉄の量は、微量でも添加すれば効果が得られるので下限値は特にない。一方、酸化鉄の含有量が多く成りすぎると固体形の粒子又は核酸抽出用組成物を形成できなくなることから、固体形状を保つ範囲を上限とすればよい。
【００３１】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３２】
〔種々のＧＯの比の粒子の作製〕
＜実施例１＞
以下の（１）〜（５）に示す工程により、本発明の粒子を作製した。
（１）先ず、以下に示すＭａｒｃａｎｏ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄにより、ＧＯを作製した。
（ａ）３６０ｍｌのＨ2ＳＯ4と４０ｍｌのＨ3ＰＯ4の混合液を、３．０ｇの片状黒鉛（ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｆｌａｋｅｓ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び１８．０ｇのＫＭｎＯ4（和光純薬工業株式会社製）に添加して得られた混合物を３０−４０℃に発熱させた。
（ｂ）次いで、上記（ａ）で得られた混合物を５０℃に加熱し、１２時間撹拌した。撹拌後は、室温まで冷却し、３０％Ｈ2Ｏ2を含む氷に投入した。次いで、混合溶液のｐＨが７．０になるまで、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（登録商標）透析管  ＭＷＣＯ  ６０００を用いて透析を行った。
（ｃ）精製後、Ｏｍｎｉｐｏｒｅ（登録商標）  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒｓ（０．１μｍ）を用いて混合溶液をろ過し、グラファイトオキサイドパウダーを得るために室温で乾燥した。
（ｄ）３０−４０ｍｇのグラファイトオキサイドパウダーを、吸引条件化でガラスアンプル中に密封し、炎源を用いて急速加熱した。当該熱剥離プロセス（ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）により、グラファイトオキサイドパウダーとグラフェンオキサイドパウダーの混合パウダーであるＧＯを得た。
（ｅ）混合パウダーを蒸留水で希釈し、６０分間超音波処理を行った。次いで、４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行って沈殿物を除去した。そして、得られた溶液を乾燥させることでＧＯを得た。（ｅ）で得られたＧＯは、（ｄ）で得られた混合パウダーより、グラフェンオキサイドの含有比が高い。
（２）２５０ｍｌビーカーに、水を９０ｍｌ及び上記（１）で合成したＧＯを４．５ｇ入れて攪拌した。
（３）ビーカーを氷中に入れ、冷却した上記（２）の溶液中に、ＮａＯＨ（和光純薬工業株式会社製）を６ｇ及びＵｒｅａ（和光純薬工業株式会社製）を４ｇ添加して攪拌した。約１０分程度の静置後、セルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を４ｇ添加して攪拌後、約１０分程度静置した。
（４）次いで、上記（３）の溶液を−２０℃の冷凍庫で２時間冷却し、常温に戻した後、５％ＨＮＯ3の中にピペットを用いて滴下し、約１日静置した。
（５）５％ＨＮＯ3を取り除き、純水で洗浄することで、実施例１のＧＯとセルロースを含む粒子を作製した。実施例１で作製した粒子のＧＯの比は、５３％であった。【００３３】
図１（Ａ）は、実施例１で作製した粒子の写真で、ＧＯとセルロースが混合した黒色の長径が約３ｍｍの楕円であった。【００３４】
また、実施例１と同様の手順で、ＧＯの比を変えた種々の粒子を作製した。表１は、実施例１も含め、上記工程（２）におけるＧＯの添加量（ｇ）、当該添加量を添加した際のＧＯの比を示す。【００３５】
【表１】
2016084945.tif 000003
【００３６】
＜比較例１＞
ＧＯを添加しなかった以外は、実施例１と同様の手順で粒子を作製した。図１（Ｂ）は、比較例１で作製した粒子の写真で、ＧＯが含まれていないので白色の長径が約３ｍｍの楕円の粒子が得られた。【００３７】
図２−１及び図２−２は、表１に示す種々のＧＯの比の粒子及び比較例１の粒子のＳＥＭ写真である。ＳＥＭ写真から明らかなように、ＧＯの比を増加すると粒子表面は微細な凹凸が増加したが、６０％を超えるとやや平滑化が観察された。【００３８】
図３は、ＧＯの比が、夫々５３％、５６％、６０％、６４％の粒子をピペットの先端で押した写真を示している。何れのＧＯの比でも粒子が形成されることを確認したが、ＧＯの比が６４％の場合、粒子が柔らかく慎重に取り扱いをする必要があった。【００３９】
〔ＤＮＡの抽出実験〕
＜実施例２＞
下記表２に示すＧＯの比が異なる１３種類の粒子を作製し、各々５個の粒子を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。次に、エッペンドルフチューブに、ＤＮＡサンプル（Ｓｉｇｍａ  Ｄ７２９０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を２０μｌ、バインディングバッファーとしてＧｕＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ４５０５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１８０μｌ添加して攪拌した。次に、７０％エタノールで２回洗浄した後、核酸溶出液（ＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）を５００μｌ添加し、７０℃に加熱して５分間攪拌することで、実施例１で作製した粒子に吸着したＤＮＡを溶出した。次に、ＤＮＡを含む核酸溶出液の純度を調べる為、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００ｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用いて、核酸溶出液（１μｌ）の２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をマニュアルに従って測定し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値を計算した。
また、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００ｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）に表示される前記１μｌの核酸溶出液に含まれる核酸量（ｎｇ／μｌ）を５００倍することで、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。
また、比較のため、市販の核酸精製用キットであるＱｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（株式会社キアゲン社製）を用い、添付マニュアルにしたがって上記ＤＮＡサンプルの抽出を行い、上記と同様の手順により吸光度を測定し、２６０／２８０ｎｍ及び２６０／２３０ｎｍ値を計算した。
なお、Ｑｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔの標準的な核酸溶出液量は２００μｌであることから、核酸量（ｎｇ／μｌ）の値を２００倍することで、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄ値を比較することで、核酸の抽出効率を対比することができる。【００４０】
表２は、ＧＯの比を０％〜５３％まで変化した粒子、及びＱｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてＤＮＡ抽出を行った時の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値、並びに、核酸溶出液１μｌに含まれる核酸量（ｎｇ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄをまとめたものである。図４（Ａ）は、表２の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ値をグラフ化したもので、図４（Ｂ）は、表２の２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値をグラフ化したものである。また、図５（Ａ）は、表２の核酸溶出液１μｌに含まれる核酸量（ｎｇ）値をグラフ化したもので、図５（Ｂ）は、表２のＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄをグラフ化したものである。【００４１】
【表２】
2016084945.tif 000004
【００４２】
一般的に、２６０／２８０ｎｍの値が１．８〜２．０の範囲内にある場合は、タンパク質の混入が少なくＤＮＡの純度が高いとされている。したがって、ＧＯの比が５％以上であると、ＤＮＡを純度よく抽出できることが明らかとなった。【００４３】
また、一般的に、２６０／２３０ｎｍの値が２．０〜２．２の範囲内にある場合は、緩衝塩類等の共雑物が少ない奇麗なＤＮＡとされている。ＧＯの比が３１％以上であると、市販の核酸精製用キットであるＱｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用した場合より良い結果が得られ、更に、ＧＯの比が４７％以上になると、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍの何れの値も、望ましいとされている範囲内になることが分かった。実施例２では、ＧＯの比が５３％までしか２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値、並びに、核酸溶出液１μｌに含まれる核酸量（ｎｇ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄの測定を行っていないが、図３に示すとおり、ＧＯの比が６４％の時にも粒子が形成できることは確認しているので、同様の効果が期待できる。【００４４】
以上の結果より、ＧＯの比を変えることで、抽出後のＤＮＡ純度が変わることが明らかとなり、ＧＯの比が５％〜６４％が好ましく、３１％〜６４％がより好ましいことが明らかとなった。【００４５】
また、表２及び図５（Ａ）及び（Ｂ）から明らかなように、ＧＯの比が２０％までは、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄの増加は見られなかったが、それ以降は、ＧＯの比の増加とともに、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄが増加した。また、ＧＯの比が４７％で、市販のＱｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔのＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄに近い値となり、更にＧＯの比を大きくすることで、Ｑｉａａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔのＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄ値より大きな値が得られた。【００４６】
以上の結果より、セルロースに対するＧＯの比を変えることで、サンプル中のＤＮＡ抽出後のＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄが変わることが明らかとなり、ＧＯの比は２０％〜６４％が好ましく、４７％〜６４％がより好ましい。【００４７】
〔多様なサンプルからのＤＮＡの抽出〕
＜実施例３＞
実施例２のサンプルＤＮＡに代え、サンプルとして、喫煙済みタバコのフィルター部分の紙を１ｃｍ×１ｃｍ、噛んだ後のチューイングガムを１５ｍｇ、ドライイーストを２０ｍｇ、鳥の胸肉１５ｍｇを用いた以外は、実施例２と同様の手順でＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。【００４８】
＜比較例２＞
主に犯罪捜査用に用いられ、サンプル中に含まれるＤＮＡを高感度で検出できるＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｋｉｔ−ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ（キアゲン社製）を用い、マニュアルに従って実施例３と同様のサンプルのＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。【００４９】
図６は、実施例３及び比較例２の結果を表すグラフである。図６に示すように、本発明の粒子（ＧＯの比は５３％）を用いると、犯罪捜査に用いられる高感度のＤＮＡ検出キットであるＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｋｉｔ−ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｃｏｌｕｍｎｓより、多様なサンプル中のＤＮＡを高感度で抽出することができた。また、実施例２で用いたサンプルＤＮＡは一本鎖であるが、実施例３のＤＮＡは２本鎖である。したがって、本発明の粒子は、一本鎖及び２本鎖の何れの核酸も抽出できることが確認できた。【００５０】
〔粒子のリサイクル能の確認〕
＜実施例４＞
次に、実施例２でＤＮＡ抽出実験を行った粒子（ＧＯの比は５３％）のリサイクル能の確認を行った。
粒子のリサイクル能は、実施例２と同様の条件でＤＮＡ抽出実験を行った粒子を多数準備し、５００μｌのＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで1回洗浄、ＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄、２Ｍ  ＨＣｌで１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間処理した粒子を得た。次いで、各粒子にＡＥ  ｂｕｆｆｅｒを５００μｌ添加し、７０℃に加熱して５分間攪拌することで、粒子表面に残留していたＤＮＡを溶出し、溶出液に含まれるＤＮＡ量をＱｕｂｉｃ２．０（ライフテクノロジー社製）で検出した。表３は、Ｑｕｂｉｃ２．０の検出値（ｎｇ／ｍｌ）を示している。【００５１】
【表３】
2016084945.tif 000005
【００５２】
表３から明らかなように、粒子表面に吸着したＤＮＡをＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した後に、再度粒子をＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄しても、粒子表面からＤＮＡが検出された。一方、ＨＣｌで１時間以上処理すると、粒子表面の残留ＤＮＡの量がＱｕｂｉｃ２．０の検出限界値より低いことを表す「＜０．１」となった。【００５３】
次に、ＨＣｌ処理した粒子の核酸抽出能について、以下の手順で確認を行った。
（１）混合溶液中のＧＯの比が５３％の粒子を準備し、上記実施例２と同様の手順でＤＮＡサンプルからＤＮＡの抽出を行い、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値を計算した。また、１μｌの核酸溶出液に含まれる核酸量（ｎｇ／μｌ）を５００倍することで、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。
（２）２Ｍ  ＨＣｌで２時間処理した後の粒子表面に残留しているＤＮＡの量を上記と同様の手順で測定した。
（３）上記（２）でＨＣｌ処理した粒子を用いた以外は、上記（１）と同様の手順で２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値を計算した。また、１μｌの核酸溶出液に含まれる核酸量（ｎｇ／μｌ）を５００倍することで、Ｔｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。
上記（３）の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ／２３０ｎｍ値、並びにＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄの値は、何れも（１）の値の約９９％であった。以上の結果より、本発明の粒子は、リサイクルが可能であることが明らかとなった。【００５４】
〔Ｆｅ3Ｏ4を含んだ粒子の作製〕
＜実施例５＞
上記実施例１の（３）の工程の際に、Ｆｅ3Ｏ4を０．３ｇ〜４．５ｇを加えた以外は、実施例１と同様の手順でＦｅ3Ｏ4を含む粒子を作製した。実施例５で作製した粒子の配合比を表４に示す。【００５５】
【表４】
2016084945.tif 000006
【００５６】
図７（Ａ）の左側はＣＧＭ０、右側はＣＧＭ４５の写真で、直径約２．６ｍｍの略球形であった。また、図７（Ｂ）はＣＧＭ０を純水に分散した容器に磁石を近付けた写真、図７（Ｃ）はＣＧＭ４５を純水に分散した容器に磁石を近付けた写真である。図７（Ｂ）及び（Ｃ）から明らかなように、Ｆｅ3Ｏ4を含む粒子（ＣＧＭ４５）は磁石を近付けると磁石に引き寄せられた。したがって、粒子がＦｅ3Ｏ4を含む場合、磁石を用いて核酸を吸着した粒子を回収できるので、操作の利便性が向上する。【００５７】
図８（Ａ）はＣＧＭ４５のＳＥＭ写真、図８（Ｂ）〜（Ｄ）はＣＧＭ４５粒子表面をエネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＸ）で解析したマッピングで、図８（Ｂ）は炭素元素、図８（Ｃ）は酸素元素、図８（Ｄ）はＦｅ元素の分散を表している。図８（Ｂ）〜（Ｄ）の写真から明らかなように、実施例５で作製した粒子の中では、ＧＯ、Ｆｅ3Ｏ4が均一に分散していることを確認した。【００５８】
次に、実施例５で作製した粒子を用い、実施例２のバインディングバッファー（ＧｕＨＣｌ）に代え純水を用いた以外は、実施例２と同様の手順でＤＮＡの抽出実験を行い、核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。図９は、各サンプルの核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄのグラフである。図９から明らかなように、ＧＯとセルロースの粒子にＦｅ3Ｏ4を添加すると、添加量の増加に伴い核酸抽出効率が向上した。これは、Ｆｅ3Ｏ4が粒子内でプラスに帯電するため、マイナスに帯電している核酸を引き寄せ、そして、ＧＯの芳香環と核酸の芳香環とがπ−πスタキングにより相互作用したためと考えられる。【００５９】
なお、実施例５では、バインディングバッファー（ＧｕＨＣｌ）に代え純水を用いたため、表２に示す核酸抽出効率より低い値となっている。ところで、一般的に用いられるバインディングバッファーは、グアニジニウムイオン、尿素、ヨウ化物イオン等のカオトロピック塩を含み、更に、核酸の抽出効率を上げるためにＮａ+を添加する場合がある。しかしながら、抽出した核酸溶液にＮａ+やカオトロピック塩を含まれていると、ＰＣＲで核酸を増幅する際の阻害要因となる。したがって、抽出した核酸をＰＣＲにより増幅する場合、実施例５に示すＧＯ＋セルロースにＦｅ3Ｏ4を添加した粒子を用いると、Ｎａ+やカオトロピック塩を除去する工程が不要であることから、核酸抽出用の粒子として非常に有用である。【００６０】
〔Ｆｅ2Ｏ3を含んだ粒子の作製〕
＜実施例６＞
Ｆｅ3Ｏ4に代えＦｅ2Ｏ3を用い、表５に示す配合比にした以外は、実施例５と同様の手順で粒子を作製し、核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄを求めた。【００６１】
【表５】
2016084945.tif 000007
【００６２】
図１０は、各サンプルの核酸量（ｎｇ／μｌ）及びＴｏｔａｌ  Ｙｉｅｌｄのグラフである。図１０から明らかなように、Ｆｅ3Ｏ4よりはやや劣るものの、Ｆｅ2Ｏ3を粒子中に添加することで、核酸の抽出効率は向上した。上記実施例５及び６の結果から、ＧＯ＋セルロース粒子に酸化鉄を加えることで核酸の抽出効率が向上し、また、バインディングバッファーを用いなくても核酸を抽出できることが明らかとなった。なお、粒子中に分散した酸化鉄がプラスに帯電することでマイナスに帯電する核酸を引き寄せると考えられることから、酸化鉄に限らず、粒子又は核酸抽出用組成物中でプラスに帯電する物質であれば同等の効果を奏すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の粒子又は核酸抽出用組成物を用いることで、従来の核酸抽出用キットを用いた場合と比較して、多様なサンプルから核酸を高効率で抽出することができる。また、本発明の粒子又は核酸抽出用組成物は、リサイクルが可能である。
したがって、大学、企業、研究機関等において、多様なサンプルから核酸の抽出に有用である。
【図１】
2016084945.tif 000008
【図２−１】
2016084945.tif 000009
【図２−２】
2016084945.tif 000010
【図３】
2016084945.tif 000011
【図４】
2016084945.tif 000012
【図５】
2016084945.tif 000013
【図６】
2016084945.tif 000014
【図７】
2016084945.tif 000015
【図８】
2016084945.tif 000016
【図９】
2016084945.tif 000017
【図１０】
2016084945.tif 000018
【国際調査報告】
2016084945.tif 000019
2016084945.tif 000020
2016084945.tif 000021
2016084945.tif 000022