(57)【要約】  セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、コロイダルシリカとを分散状態で含有し、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、コロイダルシリカとを分散状態で含有し、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項２】
請求項１記載の糖化反応液において、前記コロイダルシリカの平均一次粒子径が、１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、且つ動的光散乱法による測定粒子径が５ｎｍ以上、５００ｎｍ未満であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項３】
請求項１又は２記載の糖化反応液において、前記糖化酵素の濃度が、０．００５質量％以上、３．０質量％以下であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項記載の糖化反応液において、前記コロイダルシリカの濃度が、０．００５質量％以上、４０質量％以下であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項記載の糖化反応液において、前記糖化酵素と前記コロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）が、０．００２以上、３００以下であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項記載の糖化反応液において、ｐＨが３以上、１１以下であることを特徴とする糖化反応液。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項記載の糖化反応液において、前記糖化酵素が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のもの及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来のものの少なくとも一方を含むことを特徴とする糖化反応液。
【請求項８】
セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化組成物であって、糖化酵素と、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、且つ動的光散乱法による測定粒子径が５ｎｍ以上、５００ｎｍ未満であるコロイダルシリカとを分散状態で含有し、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下であることを特徴とする糖化酵素組成物。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか一項記載の糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化酵素組成物、糖化反応液及び糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスを原料に、エタノールを製造するセルロース系バイオエタノールが知られている。【０００３】
セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスからグルコースといった糖を生成する方法（糖化技術）としては、セルロース系バイオマスに硫酸を加えて加水分解する方法が知られているが、反応器の腐食や廃液処理の問題がある。また、例えば、カーボンやゼオライト等にスルホ基を担持させた固体酸触媒を用いてセルロース系バイオマスを糖化する方法も提案されているが、固体同士の反応であるが故に、反応速度が極めて遅い上、未反応残渣と固体酸触媒との分離が困難という問題がある。更に、上述のどの方法も加水分解の制御が難しく、反応が進行し過ぎた結果、糖自体が分解し、糖の収率が低下してしまう問題もある。【０００４】
一方、酵素を用いて糖化を行う方法も知られている（特許文献１参照）。かかる方法は、原料を加圧熱水で処理する熱水処理工程、その熱水処理物を機械的粉砕処理する機械的粉砕処理工程及びその機械的粉砕物を酵素で糖化処理する糖化処理工程を含む。しかしながら、かかる方法では、酵素で糖化する際の反応速度が遅く、得られる糖化液の濃度が十分とはいえないという問題があった。【０００５】
そこで、酵素をシリカ系メソ多孔体に担持させて用いることにより、酵素を溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることができ、酵素反応をより効率的に進めるという方法が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、かかる方法では、酵素を担体に吸着固定化する工程が必要であるという問題があり、また、固定化された酵素は、固定化されていないものと比較して、反応効率が４０〜５０％程度に低下する虞があるという問題がある。更に、固体同士の反応であるが故に、未反応残渣と酵素が固定された担体との分離が困難という問題もある。【０００６】
また、シリカゾルと酵素を混合し、シリカゲルとした後、粉末化した固定化酵素も知られている（特許文献３、４参照）。このような固定化酵素でも酵素の回収はできるものの、反応効率自体は低いものであった。他にも、０．５μｍ〜１００μｍのシリカ粉末と酵素を混合してセルロースを含む植物繊維を加水分解する方法も知られているが、シリカ粉末を混合した効果が明確ではなく、未反応残渣と懸濁したシリカ粉末との分離が困難という問題がある（特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１３６２６３号公報
【特許文献２】特開２００９−１２５００６号公報
【特許文献３】特公昭６３−２５９５号公報
【特許文献４】特公昭６３−２１４７５号公報
【特許文献５】特開平１０−６６５９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な工程で酵素による糖化反応の速度を向上させる糖化酵素組成物、糖化反応液及び糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成する本発明の第１の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、コロイダルシリカとを分散状態で含有し、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下であることを特徴とする糖化反応液にある。【００１０】
ここで、前記コロイダルシリカの平均一次粒子径が、１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、且つ動的光散乱法による測定粒子径が５ｎｍ以上、５００ｎｍ未満であることが好ましい。【００１１】
また、前記糖化酵素の濃度が、０．００５質量％以上、３．０質量％以下であることが好ましい。【００１２】
また、前記コロイダルシリカの濃度が、０．００５質量％以上、４０質量％以下であることが好ましい。【００１３】
また、前記糖化酵素と前記コロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）が、０．００２以上、３００以下であることが好ましい。【００１４】
また、ｐＨが３以上、１１以下であることが好ましい。【００１５】
また、前記糖化酵素が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のもの及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来のものの少なくとも一方を含むことが好ましい。【００１６】
また、本発明の第２の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化組成物であって、糖化酵素と、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、且つ動的光散乱法による測定粒子径が５ｎｍ以上、５００ｎｍ未満であるコロイダルシリカとを分散状態で含有し、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下であることを特徴とする糖化酵素組成物にある。【００１７】
また、本発明の第３の態様は、前記糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法にある。【００１８】
また、糖化反応の反応温度を、５℃以上、１００℃以下とすることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】糖化組成物中の全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合のｐＨ依存性を示す。
【図２】糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率のｐＨ依存性を示す。
【図３】糖化反応液の酵素反応７日後の糖化組成物中の全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合の依存性を示す。
【図４】糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率のシリカ濃度依存性を示す。
【図５】糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率の糖化酵素／コロイダルシリカ比０．１〜３００の範囲での依存性を示す。
【図６】糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率の糖化酵素／コロイダルシリカ比０．００３〜０．１の範囲での依存性を示す。
【図７】糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率の平均一次粒子径依存性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明においては、原料としてセルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方が用いられる。
【００２１】
かかるセルロース又はヘミセルロースは、例えば、広葉樹、針葉樹等の農林水産物資源、又は当該農林水産物資源の廃棄物といったセルロース系バイオマスに含有されている。より具体的には、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、木材繊維、木材チップ、単板くず、木粉、パルプ類、古紙類、綿、ホヤ、酢酸菌等が挙げられる。また、これらの原料は、セルロース系バイオマス由来のものであれば特に限定されず、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２２】
これらの中でも、ユーカリ木粉（広葉樹）、スギ木粉（針葉樹）、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、綿に含有されるセルロース又はヘミセルロースであることが好ましい。これらの場合、理由は定かではないが、解繊しやすく、比較的高収率で糖を得ることができる。
【００２３】
ここで、セルロースとは、グルコースがβ−１，４グルコシド結合により重合した重合体をいう。ヘミセルロースは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース等がグルコシド結合により重合した重合体で、セルロース以外の水不溶性の多糖類をいう。
【００２４】
また、セルロースは、その部分分解物であるセロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよく、結晶性であっても非結晶性であってもよい。また、カルボキシメチル化、アルデヒド化又はエステル化した誘導体であってもよい。なお、セルロース又はヘミセルロースは、上述したとおり、バイオマス由来のものであれば特に限定されず、植物由来、真菌由来、細菌由来であってもよい。
【００２５】
本発明の糖化酵素としては、セルラーゼを主体としたものが用いられる。かかるセルラーゼは、セルロース又はヘミセルロースをグルコース等の糖にまで分解する酵素を意味している。
【００２６】
かかる糖化酵素を生産する微生物としては、特に限定されないが、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)菌、アスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)菌、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）菌、フザリウム属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)菌、フミコーラ属(Ｈｕｍｉｃｏｌａ)菌、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）菌、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）菌、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)菌、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）菌、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌、トレメテス属(Ｔｒａｍｅｔｅｓ)菌、トリコデルマ属(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)菌、等が挙げられ、これらの他にも、クロストリジウム属(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ)菌、シュードモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)菌、セルロモナス属(Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ)菌、ルミノコッカス属(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ)菌、バチルス属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)菌等の細菌、スルフォロバス属(Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ)菌、ストレプトマイセス属(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)菌、サーモアクチノマイセス属(Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ)菌、サーモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）菌等の放線菌が挙げられる。なお、これらの酵素は人工的に改変されていてもよい。また、これらの酵素は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２７】
これらの中でも、特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のもの及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来のものが好ましい。結晶性セルロースに対して活性が高いからである。
【００２８】
また、セルラーゼは、一連の酵素群であってもよい。かかる酵素群としては、エンドグルカナーゼ(ＥＣ ３．２．１．７４)、セロビオヒドロラーゼ(ＥＣ ３．２．１．９１)、β−グルコシダーゼ(ＥＣ ２３．２．４．１，ＥＣ ３．２．１．２１) 等が挙げられる。なお、異なった微生物由来のセルラーゼを混合して用いることが好ましい。この場合、それらの相乗効果により、セルロース又はヘミセルロースの糖化をより促進させることができる。
【００２９】
上述のセルラーゼは、多くはｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが一般的であるが、ｐＨ６〜１０の範囲で至適な酵素活性を有するアルカリセルラーゼと呼ばれるものであってもよい。また、上述のセルラーゼは、多くは反応温度２５℃以上、５０℃以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが多いが、７０℃以上１００℃以下の範囲で至適な酵素活性を有する耐熱性セルラーゼと呼ばれるものであってもよい。
【００３０】
本発明でコロイダルシリカは、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、好ましくは、５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以下であり、糖化反応液中に分散させて用いられる。平均一次粒子径は、窒素吸着法（ＢＥＴ法）により測定される比表面積Ｓ（ｍ2／ｇ）から換算式Ｄ（ｎｍ）＝２７２０／Ｓにより算出されたものである。かかるコロイダルシリカは、その一部又は全部が糖化酵素の担体となり、コロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素と共に分散状態で用いられるものである。コロイダルシリカは、分散された液中における粒子径として、動的光散乱法による測定粒子径で表示することができる。本発明では、動的光散乱法による測定粒子径は、５ｎｍ以上、５００ｎｍ未満、好ましくは、１０ｎｍ以上、４５０ｎｍ以下が望ましい。また、シリカは多孔質ではなく、中実のシリカである。なお、コロイダルシリカは、水、メタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコールなどの分散媒に分散させた分散液として用いられ、分散液は、コロイド液又はゾルなどと呼ばれる。酵素の活性を阻害しない範囲で、分散媒を選択してよいが、好ましくは、水、エタノールである。
【００３１】
一方、沈降法シリカと呼ばれるシリカ粉末は、平均一次粒子径が４００ｎｍ以下、動的光散乱法による測定粒子径が５００ｎｍ以上の多孔質の粉末であり、分散媒に懸濁させてもコロイド液の性質を示さず、且つ本発明のコロイダルシリカのような高い分散性を有していない。
【００３２】
コロイダルシリカの製造方法として、水ガラスを原料とする水ガラス法、金属アルコキシドを原料とするアルコキシド法、塩化珪素化合物を原料とする気相法などがある。どの製造法で得られたコロイダルシリカを用いても良いが、好ましくは水ガラス法が望ましい。
【００３３】
本発明の糖化反応液は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を原料に、糖化酵素とコロイダルシリカとを分散させたものであり、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下のものである。より好ましくは、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が５０％以上、１００％以下である。全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％より低いと反応効率が悪化するため好ましくない。
【００３４】
ここで、糖化反応液において、糖化酵素の濃度は、０．００５質量％以上、３．０質量％以下、好ましくは、０．０１質量％以上、１．０質量％以下である。糖化酵素の濃度が０．００５質量％より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、３．０質量％より高いと糖化酵素が溶液に溶解しにくくなるだけでなく、経済的に不適である。
【００３５】
また、糖化反応液において、コロイダルシリカの濃度は、０．００５質量％以上、４０質量％以下、好ましくは、０．０１質量％以上、１０質量％以下である。コロイダルシリカの濃度が０．００５質量％より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、４０質量％より高いと分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。
【００３６】
また、糖化反応液において、糖化酵素と前記コロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）は、０．００２以上、３００以下、好ましくは、０．１以上、１０以下である。両者の質量比率がこの範囲を外れると反応効率の向上が顕著ではなくなる。
【００３７】
また、糖化反応液のｐＨは、３以上、１１以下、好ましくは、３以上、９以下、より好ましくは、４以上、７以下である。ｐＨが３より低いと、コロイダルシリカの凝集が生じて糖化酵素の反応効率が低下し、一方、１１より高いと、コロイダルシリカが溶解しやすくなるため、好ましくない。
【００３８】
糖化反応液のｐＨ調整剤として、硫酸、塩酸、硝酸といった鉱酸、酢酸、シュウ酸といったカルボン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸といったヒドロキシ酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムといった水酸化物塩、アンモニア、尿素等が挙げられる。本発明の効果を阻害しない範囲であれば使用に特にその種類や濃度に制限はない。また、これらのｐＨ調整剤は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。更に緩衝作用を有する緩衝液の状態で使用してもよい。
【００３９】
また、本発明の糖化反応液は、反応温度を、５℃以上、１００℃以下、好ましくは、２０℃以上、５５℃以下とするのが好ましい。反応温度が５℃より低いと糖化反応の効率が著しく低下し、１００℃より高いと糖化酵素が失活する虞があり、好ましくない。
【００４０】
なお、セルロース又はヘミセルロースを含有するセルロース系バイオマスの前処理は、公知の範囲により行えばよい。一般には、カッターミル等による物理的な粉砕、及び酸又はアルカリ処理によってリグニンとセルロース及びヘミセルロースとの構造を化学的に破壊することにより、糖化反応用原料とすればよい。
【００４１】
糖化反応液を作製する際に、糖化酵素が分散している反応液にコロイダルシリカを添加してもよく、コロイダルシリカが分散している反応液に糖化酵素を添加してもよい。本発明の効果を阻害しない範囲であれば、ｐＨ調整剤等のその他の添加剤は任意の順序で添加できる。
【００４２】
糖化反応を行う際、適切な分画分子量の逆浸透（ＲＯ）膜や限外ろ過（ＵＦ）膜を用い、糖化酵素及びコロイダルシリカと、グルコース等の糖を分離することも可能である。好ましくは分画分子量１，０００以上、１００，０００以下である。分画分子量がこの範囲より小さいと、糖の分離は可能だが目詰まりしやすく、膜透過速度が著しく低下し、また、この範囲より大きいと、糖化酵素やコロイダルシリカが糖とともに流出してしまう虞があり、好ましくない。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づいてさらに詳述するが、本発明はこの実施例により何ら限定されるものではない。【００４４】
コロイダルシリカの平均一次粒子径と動的光散乱法による測定粒子径は、それぞれ以下の測定装置を用いて測定した。
窒素吸着法測定装置（平均一次粒子径の測定）：Ｍｏｎｏｓｏｒｂ  ＭＳ−１６（カンタクローム・インスツルメンツ・ジャパン合同会社製）
動的光散乱法粒子径測定装置：ゼータサイザーナノＳ（マルバーンインスツルメンツ製）【００４５】
（実施例１〜７、比較例１の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で、糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼ（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を用いた。【００４６】
まず、脱イオン水８５ｇ中にセルラーゼ粉末１５ｇを添加し、室温下、マグネティックスターラーで２時間撹拌しながら溶解して１５質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）２００ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し、酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）２００ｇを得た。得られた酸性シリカゾル１５ｇ中に、上述のセルラーゼ水溶液４．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸、酢酸ナトリウム（以下、酢酸Ｎａ）、酢酸−酢酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ３．５〜５．０）、０．５Ｍ相当のＮａＯＨ、ＨＣ１のうち１種類を１．０ｇ添加し、シリカ濃度３０質量％、セルラーゼ濃度３質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ５５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００４７】
（実施例８の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）１５ｇ中に、上述のセルラーゼ水溶液４．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸Ｎａ０．５ｇ及び１Ｍ相当ＮａＯＨ０．５ｇを添加し、シリカ濃度３０質量％、セルラーゼ濃度３質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ５５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。表１に、実施例１〜８の糖化酵素組成物を示す。【００４８】
（全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合の測定）
本発明の糖化酵素組成物において、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合は、遠心分離法により得られた上澄み中の糖化酵素の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＣＢＢ法）により定量して算出した。【００４９】
具体的な手順は以下の通りである。【００５０】
糖化酵素組成物１．０ｍＬを５０ｍＬ遠沈管に採取し、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ−２０１（トミー精工社製）で２５，０００Ｇ、３０分、４℃の条件で遠心分離し、上澄み液を得た。次にセル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク製）を脱イオン交換水で５倍に希釈したものを２．５ｍＬ添加し、次いで、上記の上澄み液を０．０５ｍＬ添加し、密栓した。この混合溶液を、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、３０分間静定し、分光光度計ＵＶ−３１５０（島津製作所製）を用い、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。既知の糖化酵素濃度の試料を作製し、同様に吸光度を測定して検量線を作成した。得られた検量線から上澄み液の糖化酵素濃度を算出した。【００５１】
上記の方法で得られた上澄み液の糖化酵素濃度を、添加した糖化酵素濃度で除して１００倍した値を全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合とした。実施例１〜８の糖化酵素組成物の全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合とｐＨとの関係を図１に示す。全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合は、糖化酵素組成物のｐＨに依存していることが判る。【００５２】
（比較例２〜１０の糖化酵素組成物）
コロイダルシリカを添加しない代わりに脱イオン水で糖化酵素の濃度調整をした以外は、実施例１〜８と同様に行って、コロイダルシリカを含まない糖化酵素組成物を得た。該糖化酵素組成物を表１に示す。【００５３】
（比較例１１の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル１５ｇ中に、脱イオン水５ｇ添加し、シリカ濃度３０質量％の糖化酵素組成物を得た。糖化酵素組成物を併せて表１に示す。【００５４】
（実施例１〜８の糖化反応液）
実施例１〜８の糖化酵素組成物に、微結晶セルロース粉末を２．５質量％添加し、分散させて糖化反応液とした。【００５５】
具体的な手順は以下の通りである。【００５６】
２０ｍＬのガラス瓶に各糖化酵素組成物を１０ｍＬ入れ、４ｍｍφで１０ｍｍの攪拌子で攪拌した状態で、微結晶セルロース粉末（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を０．２５ｇ（２５ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後、密栓した。【００５７】
（実施例１〜８の糖の製造方法）
実施例１〜８の糖化反応液を、２４℃の恒温室中で、攪拌下で１４日間酵素反応させた。【００５８】
糖化反応液の酵素反応の反応温度、３日後、及び１４日後において、以下の通り、糖化率を測定した結果を、表２に示す。実施例１〜８の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率とｐＨとの関係を図２に示す。【００５９】
（比較例１〜１１）
糖化反応液の作製及び糖の製造方法は、実施例１〜８と同様に行った。結果を表２に示す。また、比較例１〜８の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率とｐＨとの関係を図２に示す。図１、図２より各ｐＨ領域において、糖化酵素単独に比べて、コロイダルシリカが配合され、且つ全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が４２％以上、１００％以下の糖化反応液の方が糖化率が高いことが判る。【００６０】
（糖化率の測定）
酵素法（Ｇ６ＰＤＨ−ＨＫ法）を用いて、糖化反応液の酵素反応時のグルコース生成濃度を定量し、糖化率を算出した。【００６１】
２ｍＬマイクロチップに、糖化反応液の試料を０．５ｍＬ採取し、１１０℃，３０分間加熱して酵素を失活させた。次に、未反応のセルロースおよびコロイダルシリカを除去するため、５０ｍＬ遠沈管に試料を移し、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ−２０１（トミー精工社製）で２５，０００Ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心分離した。遠心分離後直ちにその上澄み液を回収した。酵素法には、Ｆ−キット  グルコース（Ｊ．Ｋ．インターナショナル製）を使用した。分光光度計ＵＶ−３１５０（島津製作所製）を用いて波長３４０ｎｍの吸光度（セル長１０ｍｍ）を測定した。【００６２】
具体的な手順は以下の通りである。【００６３】
セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルにＦ−キット溶液Ｉを１．０ｍＬ添加し、次いで、上記の上澄み液を０．１ｍＬと脱イオン水１．９ｍＬを添加し、密栓した。次にこの混合溶液を上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、３分間静定し、生成した上澄み部分の波長３４０ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定し、Ｅ1とした。次に、Ｆ−キット溶液ＩＩを０．０２ｍＬ添加し、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、１５分間静定し、生成した上澄み部分の波長３４０ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定し、Ｅ2とした。ブランクの吸光度は、上澄み液の代わりに脱イオン水を用いて測定した値を使用した。【００６４】
Ｄ−グルコースの濃度は以下の式から求めた。【００６５】
【数１】
2016021447.tif 000002
【００６６】
上記の方法で測定された糖化反応液の酵素反応時のグルコース生成濃度を添加した微結晶セルロース粉末濃度（２５ｍｇ／ｍＬ相当）で除して１００倍した値を糖化率とした。【００６７】
【表１】
2016021447.tif 000003
ｐＨ調整剤
Ａ：酢酸
Ｂ：酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ＝３．５）
Ｃ：酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ＝４．０）
Ｄ：酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ＝４．５）
Ｅ：酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ＝５．０）
Ｆ：酢酸ナトリウム
Ｇ：ＮａＯＨ
Ｈ：ＨＣｌ【００６８】
【表２】
2016021447.tif 000004
【００６９】
（実施例９〜２６の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼ（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を用いた。【００７０】
まず、脱イオン水９０ｇ中にセルラーゼ粉末１０ｇを添加し、室温下、マグネティックスターラーで２時間撹拌しながら溶解して１０質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）２００ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）２００ｇを得た。得られた酸性シリカゾル中に、脱イオン水、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液を撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）を０．０５Ｍ相当添加し、シリカ濃度０．０１〜３８質量％、セルラーゼ濃度０．１〜３質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ５５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００７１】
表３に、実施例９〜２６の糖化酵素組成物を示す。【００７２】
（比較例１２〜１４の糖化酵素組成物）
コロイダルシリカを添加しない代わりに脱イオン水で糖化酵素の濃度調整をした以外は、実施例９〜２６と同様に行った。糖化酵素組成物を表３に示す。【００７３】
糖化反応液の作製、糖の製造方法、糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表４に示す。また、実施例３、９〜１３、比較例４の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率とシリカ濃度との関係を図４に示す。全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、シリカ濃度が０．０１〜３０質量％の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。実施例２２では、シリカ濃度が３８質量％でも高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００７４】
更に、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、糖化酵素濃度が０．１〜３．０質量％の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００７５】
また、実施例３、９〜１３、比較例４の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率と、糖化酵素とコロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）との関係を図５に示す。【００７６】
実施例２２〜２６、比較例１４の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率と、糖化酵素とコロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）との関係を図６に示す。【００７７】
図５、６より全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、糖化酵素とコロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）が０．００３〜３００の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００７８】
さらに、実施例２０、２７〜３１、比較例１３の糖化反応液の酵素反応１４日後の糖化率と一次粒子径との関係を図７に示す。全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、コロイダルシリカの平均一次粒子径が５ｎｍ〜３１０ｎｍにおいて高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００７９】
【表３】
2016021447.tif 000005
【００８０】
【表４】
2016021447.tif 000006
【００８１】
（実施例２７の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼ（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を用いた。【００８２】
次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：１５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．８、シリカ濃度１０質量％）１０ｇ中に、脱イオン水８．０ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ１５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００８３】
（実施例２８の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：１２ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：２０ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．６、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１３．０ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ２０ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００８４】
（実施例２９の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：８０ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：１２０ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．５、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．０、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル２．５ｇ中に、脱イオン水１５．５ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ１２０ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００８５】
（実施例３０の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：１６０ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：２００ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．３、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．３、シリカ（ＳｉＯ2）濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル２．５ｇ中に、脱イオン水１５．５ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ２００ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００８６】
（実施例３１の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３１０ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：４５０ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ８．５、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ３．３、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル２．５ｇ中に、脱イオン水１５．５ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ４５０ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００８７】
表５に、実施例２７〜３１の糖化酵素組成物を示す。【００８８】
糖化反応液の作製、糖の製造方法、糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表６に示す。【００８９】
【表５】
2016021447.tif 000007
【００９０】
【表６】
2016021447.tif 000008
【００９１】
（実施例３２〜３７の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いた。【００９２】
まず、脱イオン水９ｇ中にセルラーゼ粉末１ｇを添加し、２時間、室温でマグネティックスターラーで撹拌しながら溶解して１０質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル中に、脱イオン水、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液を撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）を０．０５Ｍ相当添加し、シリカ濃度０．０１〜１０質量％、セルラーゼ濃度０．０１〜１質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ５５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【００９３】
表７に、実施例３２〜３７の糖化酵素組成物を示す。【００９４】
（比較例１５〜２０の糖化酵素組成物）
コロイダルシリカを添加しない代わりに脱イオン水で糖化酵素の濃度調整をした以外は、実施例３２〜３７と同様に行った。糖化酵素組成物を表７に示す。【００９５】
糖化反応液の作製、糖の製造方法、糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表８に示す。【００９６】
全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ属由来のセルラーゼでも、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼと同様に高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００９７】
また、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、シリカ濃度が０．０１〜１０質量％の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００９８】
更に、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、糖化酵素濃度が０．０１〜１．０質量％の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【００９９】
【表７】
2016021447.tif 000009
【０１００】
【表８】
2016021447.tif 000010
【０１０１】
（実施例３８〜４３の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いた。【０１０２】
まず、脱イオン水９．５ｇ中にセルラーゼ粉末０．５ｇを添加し、２時間、室温でマグネティックスターラーで撹拌しながら溶解して５質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：５５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．０、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを、強酸性水素型陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ製）で処理してアルカリ金属イオンを除去し酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）２０ｇを得た。得られた酸性シリカゾル中に、脱イオン水、上述の５質量％セルラーゼ水溶液を撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）のうち１種類を０．０５Ｍ相当添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．０１〜０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。得られた糖化酵素組成物について動的光散乱法による測定粒子径を確認したところ５５ｎｍであり、コロイダルシリカの分散体における粒子径は変化していなかった。【０１０３】
表９に、実施例３８〜４３の糖化酵素組成物を示す。【０１０４】
（比較例２１〜２６の糖化酵素組成物）
コロイダルシリカを添加しない代わりに脱イオン水で糖化酵素の濃度調整をした以外は、実施例３８〜４３と同様に行った。糖化酵素組成物を表９に示す。【０１０５】
糖化反応液の作製については、微結晶セルロース粉末を５．０質量％添加に変更した以外は、実施例１〜８と同様に行った。糖の製造方法については、酵素反応期間を７日間、反応温度を４０℃又は５０℃に変更した以外は実施例１〜８と同様に行った。糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表１０に示す。【０１０６】
全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２５％以上、１００％以下の糖化反応液において、糖化酵素とコロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）が０．００２〜０．１の範囲で高い糖化率を示し、コロイダルシリカを含有しない場合よりも糖化率が高いことが判る。【０１０７】
【表９】
2016021447.tif 000011
Ｉ：酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ＝６．０）【０１０８】
【表１０】
2016021447.tif 000012
【０１０９】
（実施例４４の糖化酵素組成物）
まず、以下の手順で糖化酵素水溶液として、セルラーゼ水溶液を作製した。なお、セルラーゼとしては、ｐＨ３以上、６以下の範囲で至適な酵素活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼ（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を用いた。【０１１０】
まず、脱イオン水３８ｇ中にセルラーゼ粉末２．０ｇを添加し、２時間、室温でマグネティックスターラーで撹拌しながら溶解して５質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１１】
（実施例４５の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）７ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１２】
（実施例４６の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）１０ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１３】
（実施例４７の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）１４ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１４】
（実施例４８の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）１５ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１５】
（実施例４９の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）１６ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１６】
（比較例２７の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）２０ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１７】
（比較例２８の糖化酵素組成物）
水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：４５ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：７５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．９、シリカ濃度２０質量％）５．０ｇ中に、脱イオン水１２．０ｇ、アルファイン８３（ポリ塩化アルミニウム、大明化学工業製）２７ｐｐｍ、上述の５質量％セルラーゼ水溶液２．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１１８】
（比較例２９の糖化酵素組成物）
コロイダルシリカを添加しない代わりに脱イオン水で糖化酵素の濃度調整をした以外は、実施例４４〜４９と同様に行って、コロイダルシリカを含まない糖化酵素組成物を得た。該糖化酵素組成物を表１１に示す。【０１１９】
表１１に、実施例４４〜４９の糖化酵素組成物を示す。【０１２０】
糖化反応液の作製、糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖の製造方法については、酵素反応期間を７日間に変更した以外は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表１２に示す。また、実施例４４〜４９の糖化反応液の酵素反応７日後の糖化組成物中の全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合の依存性を図３に示す。糖化酵素とコロイダルシリカとの質量比率（糖化酵素／コロイダルシリカ）及びｐＨが一定の場合に糖化率は全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合に依存し、全糖化酵素に対してコロイダルシリカに固定化されていない糖化酵素の割合が２７％以上、７７％以下において高い糖化率を示すことが判る。【０１２１】
【表１１】
2016021447.tif 000013
【０１２２】
【表１２】
2016021447.tif 000014
【０１２３】
（比較例３０の糖化酵素組成物）
まず、脱イオン水９ｇ中にセルラーゼ粉末１ｇを添加し、２時間、室温でマグネティックスターラーで撹拌しながら溶解して１０質量％のセルラーゼ水溶液を得た。次に、沈降法シリカ粉末（商品名：カープレックス  ＃８０、ＤＳＬ．ジャパン製、平均一次粒子径：７ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：１７５０ｎｍ）０．１ｇに、脱イオン水１７．９ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１２４】
（比較例３１の糖化酵素組成物）
沈降法シリカ粉末（商品名：トクシール ＧＵ−Ｎ、トクヤマ製、平均一次粒子径：１１ｎｍ、動的光散乱法による測定粒子径：４７４０ｎｍ）０．１ｇに、脱イオン水１７．９ｇ、上述の１０質量％セルラーゼ水溶液１．０ｇを撹拌しながら添加し、更にｐＨ調整として、１Ｍ相当の酢酸−酢酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．０）１．０ｇ添加し、シリカ濃度５質量％、セルラーゼ濃度０．５質量％の糖化酵素組成物を得た。【０１２５】
表１３に、比較例３０、３１の糖化酵素組成物を示す。【０１２６】
糖化反応液の作製、糖の製造方法、糖化反応効率の測定は実施例１〜８と同様に行った。糖化率を測定した結果を、表１４に示す。コロイダルシリカと異なり、沈降法で得られたシリカ粉末では、糖化率が向上しないことが判る。【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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