(57)【要約】  本発明は、デリバリーデバイスの有無に関わらず、生体内で広範囲の種類の悪性腫瘍に対して効果を発揮しうる人工核酸アンチセンス抗悪性腫瘍剤として、13〜17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、YB-1の発現を調節するオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号2の配列からなり、糖部分架橋型のヌクレオシド構造を有し、かつヌクレオチド間結合がホスホロチオエート型である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
13〜17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、YB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
14〜16塩基長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
15塩基長である、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号1または配列番号2の配列からなる、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも1つの架橋型ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
架橋型ヌクレオチドが、下記からなる群より選択されるいずれか一のヌクレオシド構造を有する、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド
【化１】
2016006697.tif 000017
【化２】
2016006697.tif 000018
(式IおよびII中、
Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。)。
【請求項７】
少なくとも1つのホスホロチオエート型ヌクレオチドを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、細胞または組織と接触させる工程を含む、細胞または組織におけるYB-1の発現の調節方法。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、対象に投与する工程を含む、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置方法。
【請求項１０】
YB-1の発現に関連した疾患または状態が、癌である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
癌が、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
癌が、抗癌剤耐性の癌である、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
抗癌剤耐性の癌が、ゲムシタビン耐性の膵癌である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
YB-1の発現に関連した疾患または状態を処置するための、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
癌を処置するための、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌を処置するための、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗癌剤耐性の癌を処置するための、請求項15または16に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ゲムシタビン耐性の膵癌を処置するための、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
皮下投与用または経口投与用である、請求項14〜19のいずれか1項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス抗悪性腫瘍剤に関する。本発明は、医薬、医療、ライフサイエンス等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
転写因子Y-box binding protein-1 (YB-1) は腫瘍細胞や腫瘍血管に特異的に高発現し、増殖や治療抵抗性に寄与する。特許文献1は、YB-1が腫瘍新生血管の血管内皮細胞特異的なバイオマーカーであること、そしてYB-1の発現を抑制することにより、腫瘍血管新生を抑制し、結果的に腫瘍の増殖を阻害し得るとの知見に基づき、YB-1の発現を測定することを含む、腫瘍新生血管血管内皮細胞の検出方法を提供する。また、特許文献2は、オリゴヌクレオチド、特にヒトYB-1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを開示している。【０００３】
一方、特許文献3は、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス用の新規な分子、人工ヌクレオシドを開示する。このヌクレオシドは、2',4'-架橋型核酸(BNA/LNA)の架橋構造にアミド結合が導入されている。従来の2',4'-BNA/LNAに匹敵する一本鎖RNAに対する結合親和性と、LNAを上回るヌクレアーゼ耐性とを有し、特に、一本鎖RNAに対しては非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待されている。【０００４】
他方、特許文献4は、YB-1をコードする遺伝子の所定の部分配列を標的配列とするsiRNAが、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導し、血管内皮細胞による管腔形成を阻害することを開示する。引用文献4はまた、このsiRNAは、腫瘍部位等における異常な血管の新生を抑制し、また過度に形成された新生血管を破壊するため、難治性腫瘍や増殖性血管疾患に対して有効である旨を述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2011-88876号公報
【特許文献２】米国特許公報6140126号
【特許文献３】国際公開公報WO2011/052436
【特許文献４】特開2013-216627号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
標的遺伝子の発現を阻害する方法として、siRNAやmiRNAを用いることにより、アンチセンス核酸を用いる場合に比較してより高い抑制効果が得られうることが知られている。siRNAやmiRNAは、体内ではヌクレアーゼ分解酵素により急速に分解され、安定性が低く、また二本鎖核酸であることから単体では細胞内に取込まれないという問題があり、デリバリーデバイスが必要とされる。しかし、有効な核酸用デリバリーデバイスは開発されていない。【０００７】
一方、糖鎖を適切に架橋した人工核酸LNAによるアンチセンスは、ヌクレアーゼ耐性を有し、生体内で安定であるが、肝臓/腎臓への毒性の懸念が報告されている。また、上記LNAに比較してヌクレアーゼ耐性と相補性核酸結合能がより増した新世代の人工核酸が最近開発され、肝臓の高脂血症因子の発現抑制と症状改善が報告されている。【０００８】
しかしながら、抗腫瘍効果と安全性を生体内で確保した人工核酸アンチセンス構造体は未だ存在しない。【０００９】
癌細胞と腫瘍新生血管に高発現する悪性化因子Y-box binding protein-1 (YB-1)を生体内で抑制し、腫瘍の増大・転移を阻害できれば、汎用性の高い癌治療法が可能となるが、デリバリーデバイスなしでも生体内で機能するsiRNAやアンチセンス等の標的遺伝子発現抑制核酸構造体は見出されていない。また、核酸用デリバリーデバイスも未だ有用なものが報告されていない。【００１０】
本発明は、デリバリーデバイスの有無に関わらず、生体内で広範囲の種類の悪性腫瘍に対して効果を発揮しうる人工核酸アンチセンス抗悪性腫瘍剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下を提供する。
[1]  13〜17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、ヒトYB-1をコードするポリヌクレオチドを標的とする、すなわちYB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチド。
[2]  14〜16塩基長である、1に記載のオリゴヌクレオチド。
[3]  15塩基長である、2に記載のオリゴヌクレオチド。
[4]  配列番号1または配列番号2の配列からなる、オリゴヌクレオチド。
[5]  少なくとも1つの架橋型核酸を含む、1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
[6]  架橋型核酸が、下記からなる群より選択されるいずれか一のヌクレオシド構造を有する、5に記載のオリゴヌクレオチド【００１２】
【化１】
2016006697.tif 000002
【００１３】
【化２】
2016006697.tif 000003
【００１４】
(式IおよびII中、
Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,  2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。)。
[7]  少なくとも1つのホスホロチオエート型ヌクレオチドを含む、1〜6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
[8]  1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、細胞または組織と接触させる工程を含む、細胞または組織におけるYB-1の発現の抑制方法。
[9]  1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、対象に投与する工程を含む、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置方法。
[10]  YB-1の発現に関連した疾患または状態が、癌である、9に記載の方法。
[11]  癌が、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌である、10に記載の方法。
[12]  癌が、抗癌剤耐性の癌である、10または11に記載の方法。
[13]  抗癌剤耐性の癌が、ゲムシタビン耐性の膵癌である、12に記載の方法。
[14]  1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
[15]  YB-1の発現に関連した疾患または状態を処置するための、14に記載の医薬組成物。
[16]  癌を処置するための、15に記載の医薬組成物。
[17]  胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌を処置するための、16に記載の医薬組成物。
[18]  抗癌剤耐性の癌を処置するための、16または17に記載の医薬組成物。
[19]  ゲムシタビン耐性の膵癌を処置するための、18に記載の医薬組成物。
[20]  皮下投与用または経口投与用である、請求項14〜19のいずれか1項記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、YB-1の発現を効率的に調節可能なオリゴヌクレオチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】YB-1は膵・胆道癌の癌細胞・新生血管で高発現する
【図２】YB-1アンチセンスオリゴBNAの増殖抑制効果
【図３】YB-1アンチセンスオリゴBNAの細胞周期抑制とアポトーシス誘導
【図４】YB-1アンチセンスオリゴBNAの局所投与による抗腫瘍効果
【図５】YB-1アンチセンスオリゴBNAの血中投与による抗腫瘍効果
【図６】YB-1アンチセンスオリゴBNAの血中投与は腫瘍/肝臓/腎臓のYB-1発現を抑制する
【図７】YB-1アンチセンス オリゴBNAの 血中投与の安全性評価(人工核酸(BNA)の血中反復投与は肝機能障害を誘発する)
【図８】架橋構造の改変による人工核酸の進化
【図９】人工核酸構造改変による安全性の改善  -  LNA/BNA vs BNAamide (AmNA)  -
【図１０】人工核酸YB-1アンチセンスオリゴAmNAの血中投与による抗腫瘍効果
【図１１】人工核酸YB-1アンチセンスオリゴAmNAの血中投与による抗腫瘍効果(Gemcitabine耐性膵癌に対して抗腫瘍効果を発揮)
【図１２】様々なアンチセンスオリゴ核酸のYB-1発現抑制効果の比較。A：MiaPaCa2(膵癌細胞)、B：GBd-15細胞、C：TGBC2細胞
【図１３Ａ】HCT116(大腸癌)皮下腫瘍モデルにASO_#1_AmNまたはASO_#10_AmNAを2回投与した場合のYB-1発現抑制効果。Saline; n=2、Ctrl; n=2、#1 AmNA; n=3、#10 AmNA; n=3
【図１３Ｂ】SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO_#1_AmNまたはASO_#10_AmNAを2回投与した場合のYB-1発現抑制効果。Saline; n=2、Ctrl; n=2、#1 AmNA; n=3、#10 AmNA; n=3
【図１３Ｃ】SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO_#10_AmNAを4回投与した場合の、YB-1発現抑制効果。
【図１４】反復血中投与による膵癌・大腸癌に対する抗腫瘍効果。(A) 皮下腫瘍の増殖抑制。 (B)癌細胞へのアポトーシス誘導。(C)腫瘍組織の微小血管密度の抑制。
【図１５】肺癌に対する抗腫瘍効果。(A)治療21日目の皮下腫瘍の写真。(B) Growth inhibition of LLC s.c. tumor(＊P<0.05, **P<0.01; n＝5)
【図１６】悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果。 (A)YB-1 KD efficiency. *P<0.001. (B)悪性中皮腫細胞株：H226の写真(C)パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真。パネル右、治療21目の腫瘍重量(n=3, P<0.05)。
【図１７】卵巣癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果。(A) #10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制。(B) 細胞増殖抑制。*P<0.001. (C)パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較。パネル右、Tumor growth inhibition(n=4, P<0.05)。
【図１８】胃癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果。(A) #10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制。(B)濃度依存性の増殖抑制。*P<0.001. (C)パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較。パネル右Kaplan-Meier生存曲線(n=5, P<0.05)。
【図１９】人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる抗癌剤増感作用。(A)膵癌細胞株MIA PaCa-2。(B)卵巣癌細胞株SKOV-3。
【図２０】人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる放射線増感作用。
【図２１】天然核酸、LNA/BNA、AmNA核酸から作成されたアンチセンスによるYB-1ノックダウン効率の比較。血管内皮細胞株(HUVEC, HPAEC)、膵癌細胞株(MiaPaCa2-)。*P < 0.01 vs BNA, P<0.0001 vs NA
【図２２】siRNAとAmNA-AONによるYB-1ノックダウン効率の比較。(A)mRNAレベル。 (B)蛋白レベル。*P < 0.05
【図２３】15mer~18merによるYB-1ノックダウン効率の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
数値範囲を「X〜Y」で表す際は、その範囲は両端の値を含む。処置は、予防および治療を含み、好ましくは治療を指す。処置の対象は、ヒトである場合と非ヒト動物(例えば、マウス)である場合とを含む。「Aおよび/またはB」は、A、Bのうち、少なくとも一方であることを指し、Aのみである場合、Bのみである場合以外に、AおよびBである場合を含む。
【００１８】
〔標的〕
本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の核酸分子を標的とし、その発現を調節する。一般に、標的核酸は、例えば、その発現が特定の疾患または疾患状態に関連する細胞遺伝子(または遺伝子から転写されたmRNA)、または感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明において、標的核酸は、癌細胞と腫瘍新生血管に高発現する悪性化因子Y-box binding protein-1 (YB-1)をコードする。標的核酸は、一本鎖DNA、RNA、二本鎖DNAであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域、セグメントまたは部位にハイブリダイズし、YB-1の発現を調節する。調節は、発現を上方に制御することと、下方に制御すること(阻害)を含むが、好ましくは発現を下方に制御することを指す。発現の調節は、mRNAレベル、または 蛋白レベルで、確認することができる。
【００１９】
〔オリゴヌクレオチド〕
本発明は、YB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドというとき、同一または異なるヌクレオシドが、リン酸ジエステル結合またはそれ以外のヌクレオシド間結合で2〜50個結合した、オリゴマーまたはポリマーであるヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドと、天然型オリゴヌクレオチドの誘導体(非天然型、人工型、修飾された、ということもある。)とを含む。そのような誘導体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられる。オリゴヌクレオチドというとき、特に記載した場合を除き、一本鎖のDNAまたはRNA、二本鎖のDNAまたはRNAを含む。本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、天然型または非天然型の、一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはまた、特に記載した場合を除き、医薬として許容される塩の形態であるものを含む。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば13〜18塩基長であり、好ましくは13〜17塩基長である。好ましい態様の一つにおいては、14〜16塩基長であり、より好ましくは15塩基長である。YB-1の発現を抑制するとは、適切な対照(例えばコントロールとなるオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが存在しない)を用いた場合に対して、発現が75％以下であること、好ましくは70％以下であること、より好ましくは50％かであること、さらに好ましくは30％以下であることをいう。抑制率を評価するための詳細な実験方法は、本願明細書の実施例2等に述べられている。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の、少なくとも8塩基長部分を含む。好ましい態様の一つにおいては、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の、少なくとも10塩基長部分、より好ましくは12塩基長部分、さらに好ましくは14塩基長部分を含む。特に好ましい態様の一つにおいては、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の全部を含む。配列番号2に記載の配列の全部を含む15mer、または配列番号2に記載の配列の全部を含み、さらに他の配列を含む17merは、本発明の特に好ましい態様の例である。配列表の配列番号2には、実施例の項に記載した実験で使用し、YB-1発現の抑制効果の高いオリゴヌクレオチドの配列が示されている。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。すなわち、天然型オリゴヌクレオチドの誘導体(非天然型、人工型ということもある。)であってもよい。当該分野で公知であるように、ヌクレオチドは、ヌクレオシド部分を含み、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、時々「核酸塩基」または単に「塩基」と呼ばれるヘテロ環塩基である。ヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むものである。ペントフラノース糖を含むかかるヌクレオシドは、リン酸基が、該糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させ、線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものと一般に称されている。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3'から5'へのリン酸ジエステル結合である。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの修飾は、糖部分であってもよく、および/またはヌクレオシド間結合(主鎖)においてされていてもよい。
【００２４】
糖部分が修飾されたオリゴヌクレオチドの例として、糖部分架橋型人工核酸BNA(Bridged Nucleic Acid)として知られているものが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらを含んでいてもよい。本発明に適用可能な、糖部分が修飾されたヌクレオチドに含まれる構造(ヌクレオシド部分)を以下に示す。
【００２５】
【化３】
2016006697.tif 000004
【００２６】
このようなオリゴヌクレオシドの調製法は、当業者にはよく知られている。これらのうち、特に好ましい例は、以下のヌクレオシド構造を含むものである。
【００２７】
【化４】
2016006697.tif 000005
【化５】
2016006697.tif 000006
【００２８】
上述の、本発明に適用可能な、糖部分が修飾されたヌクレオチドに含まれる構造(ヌクレオシド部分)、ならびに式IおよびII中、Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,  2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなる。
【００２９】
Baseは、6-アミノプリン-9-イル基、2,6-ジアミノプリン-9-イル基、2-アミノ-6-クロロプリン-9-イル基、2-アミノ-6-フルオロプリン-9-イル基、2-アミノ-6-ブロモプリン-9-イル基、2-アミノ-6-ヒドロキシプリン-9-イル基、6-アミノ-2-メトキシプリン-9-イル基、6-アミノ-2-クロロプリン-9-イル基、6-アミノ-2-フルオロプリン-9-イル基、2,6-ジメトキシプリン-9-イル基、2,6-ジクロロプリン-9-イル基、6-メルカプトプリン-9-イル基、2-オキソ-4-アミノ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、4-アミノ-2-オキソ-5-フルオロ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、4-アミノ-2-オキソ-5-クロロ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-メトキシ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-メルカプト-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-ヒドロキシ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-ヒドロキシ-5-メチル-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、または4-アミノ-5-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基(5-メチルシトシン-1-イル、またはmCと表すこともある。)であってもよい。
【００３０】
Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。
【００３１】
より好適には、Rは、水素原子、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Rは、水素原子またはメチル基である。
【００３２】
架橋型ヌクレオチドは、より好ましくは下記のヌクレオシド構造を有する。
【化６】
2016006697.tif 000007
【００３３】
式中、BaseおよびRは、上で定義したとおりである。
【００３４】
糖部分の架橋は、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドのうち、少なくとも1つ、好ましくは数個(例えば、3つ以上、好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5または6つ)においてされていてもよい。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００３６】
リン原子をその中に含む、好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、通常の3'-5'結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合された類似体、ならびにその中の一つ以上のヌクレオチド間結合が3'から3'、5'から5'、または2'から2'への結合である、逆の極性を有するものが挙げられる。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、3'末端ヌクレオチド間結合において、単一の、3'から3'への結合、すなわち、無塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基(核酸塩基が、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する)を含む。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形もまた、含まれる。このようなリン含有結合の調製法は、当業者にはよく知られている。
【００３７】
リン原子をその中に含有しない、好ましい、修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または一つ以上の、短鎖ヘテロ原子の、もしくはヘテロ環式の、ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらとしては、(一部はヌクレオシドの糖部分から形成された)モルホリノ結合を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル(riboacetyl)主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびに混合されたN、O、S、およびCH2成分部分を有する他のものが挙げられる。このようなオリゴヌクレオシドの調製法は、当業者にはよく知られている。
【００３８】
修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの特に好ましい実施態様の一つは、ホスホロチオエート型(S化)のオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したものを指す。ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドは、核酸分解酵素に対して耐性を示す点で好ましい。ホスホロチオエート型(S化)は、オリゴヌクレオチドに含まれる一部または全部のヌクレオシド間結合においてすることができる。 
【００３９】
オリゴヌクレオチドは、糖および主鎖の双方において修飾されていてもよい。このようなオリゴヌクレオチドの特に好ましい例は、下記のものである。このようなオリゴヌクレオチドの調製は、当業者であれば適宜行うことができ、また合成受託サービスを行う会社が複数存在しており、他社へ委託して製造することもできる。
【００４０】
【化７】
2016006697.tif 000008
【００４１】
【化８】
2016006697.tif 000009
【００４２】
【化９】
2016006697.tif 000010
【００４３】
なお、配列番号Xに記載の配列というとき、そのヌクレオチド配列(塩基配列ということもある。)は、天然型のヌクレオチドのみからなる配列であってもよく、天然型ヌクレオチドの誘導体(修飾された、非天然型、人工型ということもある。)を含む配列であってもよい。すなわち、配列に関し、本明細書、請求の範囲、図面および配列表において記号Cまたはcは、そのヌクレオチドの塩基部分はシトシンまたはその誘導体（例えばシトシンの修飾体、具体的には5-メチルシトシン、2'-O-メチルシトシン等)であり；塩基以外の部分は、特に限定されず、天然型であってもよく、糖部分は架橋型であってもよく；主鎖またはヌクレオシド間結合は、例えばリン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート型(S化ということもある。)であってもよい。「A」または「a」、「G」または「g」、「T」または「t」、「U」または「u」においても同様である。またヌクレオチドまたは塩基配列に関し、「5」は、特に記載した場合を除き、5-メチルシトシンを指す。さらにヌクレオチドまたは塩基配列に関し、「N」または「n」は、特に記載した場合を除き、塩基部分が、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン/ウラシル、不明または他の塩基であるヌクレオチド（DNAまたはRNAであり、DNAであることが好ましい。）または塩基自体を指す。ヌクレオチドまたは塩基配列が大文字で記載された際は、特に記載した場合を除き、糖部分架橋型である塩基またはヌクレオチドを指す。
【００４４】
〔製剤〕
本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の医薬として許容される、塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与すると、その生物学的に活性のある代謝産物もしくは残留物を(直接もしくは間接的に)提供し得る任意の他の化合物であり得る。
【００４５】
医薬として許容される塩は、本発明の化合物の生理学的におよび医薬として許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的効果をそれに付与しない塩のことを言う。オリゴヌクレオチドについての、医薬として許容される塩およびその使用の好ましい例は、当業者にはよく知られている。
【００４６】
オリゴヌクレオチドに関して、医薬として許容される塩の好ましい具体例としては、限定されないが、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン、などの陽イオンで形成された塩、(b)無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成された酸付加塩、(c)例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アルコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸で形成された塩、ならびに(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素の陰イオンから形成された塩が挙げられる。
【００４７】
本発明の実施形態に係る医薬組成物は、種々の剤形とし、種々の投与経路を採ることができる。すなわち、本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるかどうか、および治療される部分により、適切な経路で投与できる。投与は、局所的または全身的、経口または非経口であり得る。非経口投与の例としては、眼、膣、直腸等の粘膜を介しての投与；吸入または通気(例えばドライパウダーまたはエアロゾルとして噴霧することを含む。)による、胸腔、肺、気管内、または鼻腔内への投与；塗布または貼付による表皮への投与；注射または埋め込みによる皮下投与；注射または点滴による静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内または頭蓋内(髄腔内または脳室内を含む。)が挙げられる。
【００４８】
医薬組成物により処置される対象は、動物を含む。動物は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの哺乳動物であり得る。ヒト以外の霊長類としては、サル、およびチンパンジーが挙げられる。他の例は、マウス、ラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの実験動物であり得る。好ましい態様では、処置の対象はヒトであり得る。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置のために用い得る。YB-1の発現に関連した疾患または状態の具体的な例は、癌である。癌には、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌が含まれる。
【００５０】
本発明の医薬組成物へは、細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込み促進のために、促進剤が添加されてもよい。例えば、LIPOFECTINTM試薬(Junichiら,米国特許第5,705,188号)等のカチオン脂質、カチオングリセロール誘導体、およびポリリシン(Lolloら,国際特許公開WO 97/30731号)等のポリカチオン分子が使用できる。
【００５１】
特に好ましいと考えられる実施態様の一つは、凍結乾燥した有効成分を、投与直前に生理食塩水等で溶解し、静脈内、腹腔内または局所へ、注射または点滴により投与することである。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、化学療法薬剤を含む他の医薬組成物とともに用いることができ、また化学療法で耐性となった対象に対して用い得る。かかる化学療法薬剤の例には、ヌクレオチドアナログが含まれる。より具体的には、プリンアナログ、例えばチオグアニン、リン酸フルダラビン(F-Ara-A、フルダラ)、クラドリビン(2-CdA、ロイスタチン)が含まれる。また、ピリミジンアナログ、例えば、シタラビン(Ara-C、キロサイド)やゲムシタビン(GEM、ジェムザール)が含まれる。ゲムシタビンは膵癌の治療で用いられる。他の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトザントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)等である。
【００５３】
医薬組成物は、有効成分であるオリゴヌクレオチドに加えて、医薬として許容される担体を含むようにしてもよい。医薬組成物は、抗癌剤と併用してもよい。医薬組成物と異なる作用機序を有する抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果の向上が期待できる。
【００５４】
別の態様において、本発明の組成物は、第1の核酸を標的にする1つ以上のオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的にする1つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドを含み得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的にした2つ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドの多数の例が当該分野において公知である。2つ以上の結合した化合物が、一緒にまたは連続して使用できる。
【００５５】
投与は、数日〜数ヶ月続く治療の過程内で、または治癒が達成されるか、または疾患状態の減少が達成されるまで、治療すべき疾患状態の重篤度および反応性に基づき、設計することができる。最適な投与スケジュールは、患者の身体内での薬物の蓄積を測定することにより計算できる。当業者であれば、最適な投薬量、投与方法および頻度を容易に決定できる。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効能に依存して変動し、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが見出されているEC50に基づいて評価できる。一般的に、有効成分の投薬量は、体重1kg当たり0.01μg〜100 g、体重1kg当たり0.1μg〜10 g、体重1kg当たり1.0μg〜1 g、体重1kg当たり10.0μg〜100 mg、体重1kg当たり100μg〜10 mg、または体重1kg当たり1 mg〜5 mgであり、1日毎に、1週間毎に、1ヶ月毎にもしくは1年毎に1回以上、または2〜20年毎に、単回または複数回、投与できる。当業者は、投与の頻度を、体液または組織中での測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて容易に評価し得る。首尾良い治療の後、患者に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けさせることが望ましくあり得るが、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kg当たり0.01μg〜100 gの範囲内で、1日毎に1回以上〜20年毎に1回、維持投薬量で投与する。
【００５６】
治療用組成物での治療の効果は、該治療を受けている患者または対象から組織または体液を回収した後に評価できる。生検試料は、患者または対象に有害な効果をもたらすことなく特定の組織から回収され得ることが当該分野で公知である。ある態様において、組織およびその構成細胞には、血液(例えば、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34＋細胞、CD4＋細胞等の造血細胞)、リンパ球および他の血液系細胞、骨髄、乳房、子宮頚部、結腸、食道、リンパ節、筋肉、末梢血、口腔粘膜および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、体液およびその構成細胞には、血液、尿、精液、滑液、リンパ液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。患者から採取した組織または体液は、標的mRNAまたはタンパク質の発現レベルから評価できる。さらに、特定の疾患状態、状態または表現型と関連することが知られているかまたは疑われている他の遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを評価し得る。mRNAレベルは、リアルタイムPCR、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションまたはDNAアレイ分析により測定され得るか、または評価できる。タンパク質レベルは、ELISA、免疫ブロット、定量タンパク質分析、タンパク質活性分析(例えば、カスパーゼ活性分析)、免疫組織化学または免疫細胞化学を用いて測定され得るか、または評価できる。さらに、治療の効果は、当該分野で公知の手順の臨床的方法により、治療を受ける患者または対象から回収した前述の組織および体液における疾患または状態に関連するバイオマーカーを測定することにより評価できる。これらのバイオマーカーには、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸ならびにグルコースおよび脂質代謝の他のマーカー；リポタンパク質(a)またはLp(a)またはアポリポタンパク質B；肝臓トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチンならびに腎機能および肝機能の他のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、C反応性タンパク質および炎症の他のマーカー；テストステロン、エストロゲンおよび他のホルモン；腫瘍マーカー;ビタミン、ミネラルおよび電解質が挙げられるが、これらに限定されない。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例中、BNAとは、特に記載した場合を除き、LNA/2'4'-BNAを指す。
〔実施例1：膵癌および胆道癌におけるYB-1発現確認〕
抗癌剤や放射線抵抗性に関与するYB-1は多くの癌種や腫瘍血管に高発現することが知られているが、抗癌剤や放射線耐性の膵・胆道癌での発現は未だ明らかではない。我々は臨床検体(ホルマリン固定標本から作製したパラフィン包埋切片)を用いて膵癌および胆道癌におけるYB-1発現を免疫染色で検討した。膵癌40例中37例の膵管癌細胞に高発現を認め、腫瘍血管にも癌細胞ほどの高頻度ではないが、YB-1高発現を認めた(40例中24例)。一方、胆道癌組織においては、癌細胞におけるYB-1発現は中程度で37例中26例に認め、膵・胆道癌でのYB-1高発現を確認した(図1)。【００５８】
〔実施例2：アンチセンスオリゴ核酸のスクリーニングおよび評価〕
候補アンチセンスオリゴ核酸を種々合成し、種々の癌細胞に対して遺伝子導入試薬Lipofectamine RNAiMaxを用いて導入して、YB-1発現抑制能を指標にスクリーニングを行い、5-20nM濃度で70％以上のノックダウン効率を示すASO#1およびASO#10を見出した(データ示さず)。ASO#10の構造を以下に示す。【００５９】
【化１０】
2016006697.tif 000011
【００６０】
次に膵癌・血管内皮細胞に対するASO#10(「YB-1 ASO」と表すこともある。TCTcctgcaccCTGg、SEQ ID NO.:2)による増殖抑制効果を検討した。細胞を96穴プレートに60％コンフルエントで撒き、翌日、遺伝子導入試薬Lipofectamine RNAiMaxを用いて、ASO#10を膵癌細胞には最終濃度50nMで、血管内皮細胞には5nMで導入し、経時的にMTTアッセイ法にて増殖能を測定した。我々が合成したASO#10はコントロールアンチセンスオリゴ核酸(CATttcgaagtACTc、SEQ ID NO.:3)に比較して、有意に膵癌・血管内皮細胞の増殖抑制効果を認めた(図2)。なお、ASO#10により、胃癌および乳癌もノックダウンされることを確認済みである。【００６１】
〔実施例3：YB-1 ASO BNAによる、細胞周期解析、アポトーシスの誘導確認〕
実施例2で認めた癌・血管内皮細胞の増殖抑制効果の機序を明らかにするために、血管内皮細胞(1x105/well)に上記と同じ条件でYB-1 ASO BNA(TCTcctgcaccCTGg、SEQ ID NO.:2  配列中、大文字の箇所がBNAに相当する。以下の実施例において同じ。)5nMの濃度で導入した。導入72時間後に、細胞をPI (1μg/ml,) 30min, 37℃インキュベーションし、その後Flow cytometer (FACS CantoII) にて細胞周期解析を行った。YB-1 ASOはコントロールアンチセンスオリゴBNA(CATttcgaagtACTc、SEQ ID NO.:3  配列中、大文字の箇所がBNAに相当する。以下の実施例において同じ。)に比較して、G2/M分画が有意に減少し(22.1 vs 14.5% for HUVEC; 28.5 vs 14.0% for HPAEC細胞)、G2/M arrestが誘導された。更に、subG1分画が有意に増加し(17.7 vs 2.0% for HUVEC; 18.7 vs 1.3% for HPAEC)、アポトーシスの増加も認められた。【００６２】
アポトーシスの誘導の確認のため、血管内皮HUVEC細胞に蛍光FITC標識したAnnexin Vを投与し、その蛍光を観察したところ、YB-1 ASO BNAにより、アポトーシスのマーカーである細胞膜外フォスファチジルセリンと結合したAnnexin V陽性細胞の増加が認められたが、コントロールアンチセンスオリゴBNAで処理した細胞にはほとんどAnnexin Vを認めなかった。【００６３】
マイクロアレイを行ったところ、HUVEC、HPAEC細胞とも細胞周期・細胞分裂に関連する広範な遺伝子の発現抑制が認められた。蛋白質を抽出し、G2/M移行に関与するCDK1, Cyclin  B1の発現レベルを比較したところ、YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスオリゴに比較して、明らかに発現を抑制していると認められた(図3)。【００６４】
〔実施例4：YB-1 ASO BNAの局所投与による効果〕
ルシフェラーゼを安定発現するMiaPaCa-luc膵癌細胞をヌードマウス大腿皮下に移植して約6-7mm大の皮下腫瘍を作成した。YB-1 ASO BNA(最終濃度 10 μM)をアテロコラーゲンインプラントと容量比1：1で混合し腫瘍内に局所投与し(毎週1回、計2回)、経時的に腫瘍容量(ルシフェラーゼ活性)をIVISイメージングにて評価した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスオリゴBNAに比較して、有意に腫瘍量の抑制が認められ、Day 17日目の肉眼的所見でも、YB-1 ASO BNA群では腫瘍は白色調に退縮を認めた。一方、コントロールアンチセンスBNA群では発赤を伴う腫瘍の増大を認めた(図4)。【００６５】
〔実施例5：YB-1 ASO BNAの血中投与による効果〕
SUIT2膵癌およびHCT116大腸癌細胞をヌードマウス大腿皮下に移植して約6-7mm大の皮下腫瘍を作成した。YB-1 ASO BNA(200 μg/200 μL)を尾静脈から血中投与し(毎週1回、計3回)、経時的に腫瘍径を計測し腫瘍量を測定した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して、1/4〜1/5と腫瘍増大を抑制した(図5)。【００６６】
〔実施例6：YB-1 ASO BNAの血中投与によるYB-1発現抑制の確認〕
上記HCT116大腸癌皮下腫瘍を作成したヌードマウスに、YB-1 ASO BNA(図6中では「ASO#10」と表記されている。200 μg/200 μL)を尾静脈から血中投与し(毎週1回、計2回)、最終投与48時間後に皮下腫瘍、肝臓、腎臓を採取してRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を解析した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して有意に腫瘍、肝臓、腎臓のYB-1発現が約1/3に抑制されていた。更に、腫瘍の凍結切片を用いてYB-1の免疫染色を行ったところ、YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して腫瘍組織内のYB-1発現と新生血管マーカーのCD31の発現が低下しており、生体内でのYB-1発現抑制が確認できた(図6)。【００６７】
〔実施例7：YB-1 ASO BNAの血中投与による安全性の確認〕
抗腫瘍効果を認めたYB-1 ASO BNAの血中投与による安全性を血液検査で検討した。ヌードマウスにYB-1 ASO BNA(図7中では、「ASO-YBX1」と表記されている。)100μg/200 μL, 200 μg/200 μLの濃度で尾静脈から血中単回投与した後48時間後に採血し、肝・腎機能を評価するためにALT,  T.Bil, BUN, Creatininの項目に関して、血液生化学検査を行ったところ、YB-1 ASO BNA、コントロールアンチセンスBNAとも機能異常を認めなかった。しかし、3回反復投与した場合、YB-1 ASO BNAのみ肝機能マーカーAST, T.Bilの上昇を認めたが、コントロールアンチセンスBNAと生食コントロールでは機能異常は認めなかった(図7)【００６８】
〔実施例8：架橋型人工核酸AmNA〕
共同発明人：小比賀、山本らは(大阪大学)架橋型人工核酸の開発並びにその架橋構造の最適化を進めてきた(図8左下)。AmNAと呼ばれる架橋型人工核酸は従来の2',4'-BNA/LNAと同等の標的RNA結合能を維持しつつ、DNAに対しては結合力を低下させることに成功しており、RNA選択性に優れた架橋型人工核酸である(図8右上)。さらに、In vitroでのヌクレアーゼ(3'-エキソヌクレアーゼ)に対する分解耐性に関する比較実験で、これまでに開発されてきた関連の架橋型人工核酸2',4'-BNAに比べ高い耐性能力を示している(前掲特許文献3)。【００６９】
〔実施例9：YB-1 ASO AmNAの血中投与による肝機能への影響〕
実施例7と同様に、担癌ヌードマウスの尾静脈からYB-1 ASO BNA(図9中では、「ASO #10」と表記されている。)およびYB-1 ASO AmNA(図9中では、「ASO #10 AmNA」と表記されている。)を 200 μgのオリゴヌクレオチドを、各々200 μLの生理食塩水に溶解し、尾静脈から血中投与して(毎週1回、計3回)、最終投与の48時間後に血液を採取し、血液生化学検査を行った。YB-1 ASO AmNAの構造を以下に示す。【００７０】
【化１１】
2016006697.tif 000012
【００７１】
2',4'-BNA/LNA で作成したYB-1 ASOは、肝機能障害のマーカーのAST, ALTがControl ASOに比較して有意に上昇するのに対して、AmNAで合成したYB-1 ASOは肝機能障害を誘発しなかった(図9)。YB-1 ASO AmNAの高い安全性を示している。【００７２】
〔実施例10：YB-1 ASO AmNAの血中投与による抗腫瘍効果〕
実施例9で従来のBNAで構成されるASOに比較して高い安全性が認められたAmNAタイプのYB-1 ASOの血中投与による抗腫瘍効果を検討した。ヌードマウス大腿皮下部にヒト大腸癌細胞HCT116を移植し、直径が6-7mmの皮下腫瘍が形成されてから(平均腫瘍容量 78 vs 72 mm3)、尾静脈からYB-1 ASO AmNAを 200 μg/200 μL血中投与した(隔週1回、計2回)。継時的に腫瘍径を計測し、(長径)x(短径)2/2の計算式で算出した腫瘍容量をコントロールアンチセンス群と比較した。2回目の投与後1週間目(day 28)に皮下腫瘍を採取し、重量を比較した。YB-1 ASO AmNA群はコントロールアンチセンス群に比較して、腫瘍径でも腫瘍重量でも約1/5に抑制された(図10)。＊P<0.05【００７３】
〔実施例11：YB-1 ASO AmNAの抗癌剤耐性癌細胞に対する抗腫瘍効果〕
抗癌剤ゲムシタビン耐性の膵癌を長期間低濃度のゲムシタビン含有培地で培養することでヒト膵癌SUIT2細胞株を作成した(IC50値：耐性株100 nM vs 親株5 nM)。皮下腫瘍を実施例10と同様に作成し、同じプロトコールでYB-1 ASO AmNAおよびコントロールアンチセンスを200 μg/200 μL血中投与した(隔週1回、計2回)。YB-1 ASO AmNA群はコントロールアンチセンス群に比較して、腫瘍径でも腫瘍重量でも約1/3に抑制され、抗癌剤耐性癌細胞に対しても抗腫瘍効果を発揮することがあきらかとなった(図11)。＊P<0.05【００７４】
〔実施例12：種々のアンチセンスのYB-1発現抑制効果の比較〕
所定の濃度の各アンチセンスを、実施例2の方法で種々の癌細胞に用いて導入し、48時間後にRNA sampleを採取して、qRT-PCRで解析した。結果を図12に示す。【００７５】
本研究で用いたアンチセンス核酸の配列を下表にまとめた。HsYBX1-839-BNA18=ASO#16, HsYBX1-840-BNA18=ASO#17およびHsYBX1-841-BNA18=ASO#18は、18merで1つずつターゲットサイトをずらしたものである。なお、大文字で記載されたヌクレオチドはBNAであり、例えばCCTは5(L)5(L)T(L)を意味し、5(L)=LNA_mCである。【００７６】
【表１】
2016006697.tif 000013
【００７７】
〔実施例13：YB-1 ASO AmNAによるYB-1発現抑制の確認〕
実施例6と同様の方法で、AmNAタイプのYB-1 ASOのYB-1発現抑制効果を確認した。本研究で用いたアンチセンス核酸の配列を下表にまとめた。【００７８】
【表２】
2016006697.tif 000014
【００７９】
図13Aに、HCT116(大腸癌)皮下腫瘍モデルにASO #1 AmNAおよび#10 AmNAを2回投与(1回目の投与1週間後に、2回目を投与)した場合の結果を示す。図13Bに、SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO#1AmNA, #10AmNAを2回投与(1回目の投与1週間後に、2回目を投与)した場合の結果を示す。図13Cに、ASO #10 AmNAを週1回、計4回投与した場合の結果を示す。
〔実施例14：反復血中投与による膵癌・大腸癌に対する抗腫瘍効果〕
ゲムシタビン耐性膵癌SUIT2-GRおよび大腸癌HCT116をヌードマウス大腿皮下に移植することにより皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、3週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与した。継時的に腫瘍径を測定した。毎週投与のプロトコールでも表3のごとく、安全性に問題なく、day14, 21には皮下腫瘍の有意な抑制効果が認められた(図14(A))。【００８０】
表3に、治療実験における血液サンプルを測定した結果を示す。血液一般、生化学検査に異常を認めなかった。【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例3の方法に準じて、in vitro膵癌細胞株SUIT2に、#10AmNA YB-1アンチセンスを20nMで導入した。Flow cytometer(FACS)解析、およびアポトーシスマーカー：PARPp85、Caspase-3のWestern blot解析で、膵癌細胞においてアポトーシス誘導が認められた(図14(B))。【００８３】
腫瘍組織の微小血管密度の抑制。治療実験(A)のSUIT2-GR皮下腫瘍における新生血管マーカーCD31の免疫染色を行った。その結果、#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与により微小血管密度が減少し、新生血管阻害が誘導されたことが認められた(図14(C))。【００８４】
〔実施例15：肺癌に対する抗腫瘍効果〕
肺癌Lewis lung cancerの皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、3週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与した。継時的に腫瘍径を測定した。その結果、治療21日目の皮下腫瘍の写真で、コントロール群に比較して#10AmNA YB-1アンチセンス投与群の小さな皮下腫瘍を認めた(図15(A))。治療14日目、21日目には#10AmNA YB-1アンチセンス投与群において、有意にコントロールアンチセンス群より腫瘍の増大が抑制された(図15(B))。(＊P<0.05, **P<0.01; n＝5)【００８５】
〔実施例15：悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果〕
悪性中皮腫細胞株H226に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、増殖抑制 (B)が認められた。*P<0.001.【００８６】
悪性中皮腫細胞株H226の皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、2週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図15(C)に示す。パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍重量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、腫瘍の増大が抑制された(n=3, P<0.05)。【００８７】
〔実施例16：悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果〕
悪性中皮腫細胞株H226に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、増殖抑制 (B)が認められた。*P<0.001.【００８８】
悪性中皮腫細胞株H226の皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、2週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図16(C)に示す。パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍重量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、腫瘍の増大が抑制された(n=3, P<0.05)。【００８９】
〔実施例17：卵巣癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果〕
卵巣癌細胞株SKOV3に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(図17(A))、増殖抑制(図17 (B))が認められた。*P<0.001. 【００９０】
Luciferase安定発現卵巣癌細胞株SKOV3の腹膜播種モデルを作成し、癌移植1週間後から毎週1回、2週間#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW腹腔内に投与し、継時的にluciferase活性で腫瘍量を評価した。結果を図17(C)に示す。パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、抑制された(n=4, P<0.05)。【００９１】
〔実施例18：胃癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果〕
胃癌細胞株AS44に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、濃度依存性の増殖抑制(B)が認められた。*P<0.001. 【００９２】
Luciferase安定発現胃癌細胞株AS44-lucの腹膜播種モデルを作成し、癌移植1週間後から毎週1回、2週間#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW腹腔内に投与した。継時的にluciferase活性で腫瘍量を評価した。結果を図18(C)に示す。パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較を示す。パネル右Kaplan-Meier生存曲線で示されるように、生存率は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群は、コントロール群に比較して有意に延長した(n=5, P<0.05)。【００９３】
〔実施例19：人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる抗癌剤増感作用〕
膵癌細胞株MIA PaCa-2(図19(A))、卵巣癌細胞株SKOV-3(図19(B))に対して#10AmNA YB-1アンチセンス(5 nM)を試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 抗癌剤による殺細胞効果をアンチセンスの有無で比較した。低濃度#10AmNA YB-1アンチセンス導入による殺細胞効果の増強が認められた。同等の殺細胞効果を認めた抗癌剤濃度を青(5-FU)、赤色(Gemcitabine)で示す。【００９４】
〔実施例20：人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる放射線増感作用〕
膵癌細胞株SUIT-2に対して#10AmNA YB-1アンチセンス(10 nM)を試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 X線照射による殺細胞効果をアンチセンスの有無で比較した。結果を図20に示す。低濃度YB-1アンチセンス導入による殺細胞効果の増強が認められた。【００９５】
〔実施例21：天然核酸、LNA/BNA、AmNA核酸から作成されたアンチセンスによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
血管内皮細胞株(HUVEC, HPAEC)、膵癌細胞株(MiaPaCa2-)に YB-1天然型核酸アンチセンス(NA)、LNA/BNA型核酸アンチセンス(BNA), AmNA型核酸アンチセンス(AmNA)を各濃度で導入した。24時間後にRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を評価した。結果を図21に示す。AmNA型核酸アンチセンスによるYB-1のノックダウン効率は有意に天然型核酸アンチセンス、LNA型核酸アンチセンスよりも高かった。The graph shows mean ± SD (n=3). *P < 0.01 vs BNA, P<0.0001 vs NA【００９６】
〔実施例22：siRNAとAmNA-AONによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
膵癌細胞株(AsPC-1, MIA PaCa-2, Suit-2)に YB-1 siRNA または  YB-1 #10AmNAを導入(最終濃度20nM)。48時間後にRNAと蛋白質を抽出し、real-time RT-PCR、Western blotにてYB-1発現をmRNA(A) 、蛋白レベル(B)で評価した。結果を図22に示す。siRNA, #10AmNA-AONによるmRNAレベルのノックダウン効率はともに高く、明らかな差を認めなかった。一方、蛋白レベルでのノックダウン効率はAmNA-AONが明らかにsiRNAよりも著明であった。The graph shows mean ± SD (n=3). *P< 0.05【００９７】
〔実施例23：15~18merによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
膵癌細胞株(MIA PaCa-2)、大腸癌細胞株(HCT-116)および卵巣癌細胞株(SKOV3)に15~18merのオリゴヌクレオチドを各濃度で導入した。24時間後にRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を評価した。15mer以外の用いたオリゴヌクレオチドの構造を以下に示す。【００９８】
【化１２】
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【００９９】
結果を図23に示す。細胞によっては、16merまたは17merのアンチセンスによるYB-1のノックダウン効率が優れていた。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、医薬品製造、医療、およびライフサイエンス等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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