(57)【要約】  本発明は、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度を簡易かつ適切に評価できる検査方法を提供することを課題とする。本発明は、被検者における食物アレルギーの検査方法であって、前記被検者の尿中のtetranor-PGDM量を測定する工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者における食物アレルギーの検査方法であって、
前記被検者の尿中のtetranor-PGDM量を測定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記tetranor-PGDM量が多いほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、前記被検者の尿中のtetranor-PGEM量を測定する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記tetranor-PGDM量が一定期間上昇し、前記tetranor-PGEM量が一過性に上昇する場合に、他の炎症性疾患ではなく食物アレルギーであると判断する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
減感作療法のために用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記tetranor-PGDM量及び／又はtetranor-PGEM量の測定を、質量分析装置又はイムノアッセイで行う、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記被検者の尿中に、重水素化tetranor-PGDM及び／又は重水素化tetranor-PGEMを内部標準として加える前処理工程を含み、前記tetranor-PGDM量及び／又はtetranor-PGEM量の測定を、質量分析装置で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
以下の(i)又は(ii)を含む、食物アレルギーの尿検体検査用キット：
(i)抗tetranor-PGDM抗体；
(ii)抗tetranor-PGDM抗体、及び重水素化tetranor-PGDM。
【請求項１１】
さらに、以下のいずれかを含む、請求項９に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット：
(i)抗tetranor-PGEM抗体；
(ii)抗tetranor-PGEM抗体、及び重水素化tetranor-PGEM。
【請求項１２】
食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
【請求項１３】
抗tetranor-PGDM抗体を含む、食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
【請求項１４】
さらに抗tetranor-PGEM抗体を含む、請求項１３に記載の食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
【請求項１５】
食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の尿検体検査用スティック。
【請求項１６】
食物アレルギーマーカーとしての、尿中tetranor-PGDM又は尿中tetranor-PGEMのin vitroでの使用。
【請求項１７】
食物アレルギーにおける肥満細胞活性化マーカーとしての、尿中tetranor-PGDM又は尿中tetranor-PGEMのin vitroでの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度を簡易かつ適切に評価できる検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは食品中に含まれるアレルゲンを体内に取り込むことで起こる様々なアレルギー反応のことをいう。その症状には下痢や嘔吐、皮膚炎などが挙げられる他、重篤になるとショックを起こして死に至る。国内における成人の罹患率は2.6%と高いが、新生児では5.3%とさらに高く重症例が多いため大きな問題となっている。【０００３】
食物アレルギーの発症機構として次のことが分かっている。i）体内に侵入したアレルゲンにT細胞・B細胞が反応してIgEを産生する。ii）アレルゲンが再度体内に入ると、IgEと結合した肥満細胞がヒスタミンなどの活性物質を放出し（脱顆粒）、強い炎症を引き起こす。【０００４】
よく知られる卵・牛乳・小麦以外にもアレルゲンとなり得る食品は多い。食物アレルギーの予防にはアレルゲンの特定と摂食回避しか方法は無く、安心して食物を口にできない患者のQOLは著しく損なわれる。また、原因食物を除去すると、特に小児の場合、栄養に悪影響を及ぼすこともある。さらに近年の生活環境の変化は食物アレルギー罹患率のさらなる増加や症状悪化を招いており、その病態機構の解明と治療薬の開発、食品のアレルギー原性を評価する実験系の確立が急務となっている。【０００５】
また、食物アレルギーの治療方法の一つとして、減感作療法がある。減感作療法は、医師の管理下で希釈したアレルゲンを患者に投与し、免疫寛容を誘導しようとするものである。多くのアレルギー疾患の治療法が対症療法であるのに対し、減感作療法はアレルギー疾患の作用機序に働きかけて根治を目標とする点で注目されている。減感作療法では、極めて低い投与量から開始し、徐々に投与量を増やすが、その際、閾値を超える量のアレルゲンを投与することで重篤な症状を起こすことのないよう、患者におけるアレルギー症状の重篤度を適切に評価する手法が必要とされる。【０００６】
現在、食物アレルギーの診断方法として、血中IgEを測定する診断方法が用いられている。しかしながら、この方法では、アレルギー反応の有無は推測できても、発症リスクや症状の程度を知ることはできない。つまり、血中のIgE抗体の存在量と食物アレルギー症状の発症リスクや重篤度は一致しない（非特許文献１）。また、この方法は採血が必要とされるところ、採血をするためには医療機関に行かなければならず、採血自体、乳幼児には負担も大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働科学研究班による食物アレルギーの診療の手引き2011（http://www.allergy.go.jp/allergy/guideline/05/05_2011.pdf）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後を簡易かつ適切に評価できる検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず肥満細胞が最も大量に産生する生理活性物質であるプロスタグランジンD2（PGD2）に注目し、これを測定することによって食物アレルギーの発症リスクや重篤度を評価できないか検討した。しかしながら、PGD2は、生体内では50秒という短時間で代謝されるため検出が難しかった。
本発明者らは、さらに検討を重ねた結果、PGD2の代謝産物であるtetranor-PGDMは、尿に排出されて安定的に検出することができ、その尿中の濃度が生体に存在する肥満細胞数と相関性を示し、したがってアレルギーの発症リスクや重篤度とも相関性を示すことを見出した。食物アレルギーの治療薬を投与して症状が改善されると、それに伴って尿中のtetranor-PGDM量も減少することを確認した。さらに、食物アレルギーによるtetranor-PGDM量の上昇は、アレルギー刺激がなくなっても一定期間維持されるため、発症後しばらくしても検査ができることを確認した。
加えて、プロスタグランジンE2（PGE2）の代謝産物であるtetranor-PGEMも尿検体で測定することができ、tetranor-PGDMとtetranor-PGEMの濃度変化のパターンを測定することにより、食物アレルギーを、他の炎症疾患と識別できることも見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、
〔１〕被検者における食物アレルギーの検査方法であって、
前記被検者の尿中のtetranor-PGDM量を測定する工程を含む、方法；
〔２〕前記tetranor-PGDM量が多いほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕さらに、前記被検者の尿中のtetranor-PGEM量を測定する工程を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記tetranor-PGDM量が一定期間上昇し、前記tetranor-PGEM量が一過性に上昇する場合に、他の炎症性疾患ではなく食物アレルギーであると判断する、上記〔３〕に記載の方法；
〔５〕食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕減感作療法のために用いられる、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕前記tetranor-PGDM量及び／又はtetranor-PGEM量の測定を、質量分析装置またはイムノアッセイで行う、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔８〕前記被検者の尿中に、重水素化tetranor-PGDM及び／又は重水素化tetranor-PGEMを内部標準として加える前処理工程を含み、前記tetranor-PGDM量及び／又はtetranor-PGEM量の測定を、質量分析装置で行う、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕以下の(i)又は(ii)を含む、食物アレルギーの尿検体検査用キット：
(i)抗tetranor-PGDM抗体；
(ii)抗tetranor-PGDM抗体、及び重水素化tetranor-PGDM；
〔１１〕さらに、以下のいずれかを含む、上記〔９〕に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット：
(i)抗tetranor-PGEM抗体；
(ii)抗tetranor-PGEM抗体、及び重水素化tetranor-PGEM；
〔１２〕食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット；
〔１３〕抗tetranor-PGDM抗体を含む、食物アレルギーの尿検体検査用スティック；
〔１４〕さらに抗tetranor-PGEM抗体を含む、上記〔１３〕に記載の食物アレルギー又は肥満細胞の活性化の尿検体検査用スティック；
〔１５〕食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価することを特徴とする、上記〔１３〕又は〔１４〕に記載の尿検体検査用スティック；
〔１６〕食物アレルギーマーカーとしての、尿中tetranor-PGDM又は尿中tetranor-PGEMのin vitroでの使用；及び
〔１７〕食物アレルギーにおける肥満細胞活性化マーカーとしての、尿中tetranor-PGDM又は尿中tetranor-PGEMのin vitroでの使用
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る検査方法によれば、尿検体におけるtetranor-PGDM量の測定という簡易な方法で、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや症状の重篤度を適切に評価することができる。かかる方法によれば、症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことも可能である。また、減感作療法に対する反応性を評価して、安全な範囲でなるべく多くアレルゲンを投与することにより効率よく治療を進めることができる。
本発明に係る検査方法は、採血等の医療技術を必要としないので、本発明に係る検査用キットや検査用スティックを用いて家庭でも行うことができる。
さらに、本発明に係る検査方法において、尿検体中のtetranor-PGEM量の測定も行えば、他の炎症性疾患と食物アレルギーとを鑑別することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗原（OVA）刺激により作成した食物アレルギーモデルマウスの下痢発症頻度と腸管肥満細胞数を示す。
【図２】抗原（OVA）刺激により作成した食物アレルギーモデルマウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEM濃度変化の推移を示す。
【図３】抗原（OVA）刺激中止後の尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの濃度変化の推移を示す。
【図４】クロモグリク酸ナトリウムを投与した食物アレルギーモデルマウスの下痢発症頻度と尿中tetranor-PGDMの濃度変化を測定した結果である。
【図５】デキサメタゾンを投与した食物アレルギーモデルマウスの下痢発症頻度と尿中tetranor-PGDMの濃度変化を測定した結果である。
【図６】DSS誘導性大腸炎モデルの体重変化とDisease Activity Indexを測定した結果を示す。
【図７】DSS大腸炎モデルマウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【図８】TNBS誘導性大腸炎モデルの体重変化と結腸の長さを測定した結果を示す。
【図９】TNBS大腸炎モデルマウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【図１０】OVA誘発性アレルギー性気管支炎モデルマウスの肺H＆E染色像
【図１１】アレルギー性気管支炎モデルの尿中のtetranor-PGDMとtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【図１２】DNFB誘発性アレルギー性接触皮膚炎モデルマウスの耳の厚さを測定した結果を示す。
【図１３】アレルギー性接触皮膚炎モデルマウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【図１４】ヒト肥満細胞を移植したNOGマウスにおいて、結腸と肺組織に生着した肥満細胞を示す。
【図１５】肥満細胞ヒト化マウスに抗原・抗体刺激を行った後、尿中に排泄されるtetranor-PGDMとtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【図１６】マウス肥満細胞（BMMC）又はヒト肥満細胞（LAD2）を移植したマウスに抗原・抗体刺激を行った後、尿中に排泄されるtetranor-PGDMとtetranor-PGEMの濃度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［食物アレルギーの検査方法］
本発明に係る食物アレルギーの検査方法は、被検者の尿中のtetranor-PGDM量を測定する工程を含む。tetranor-PGDM（9α-hydroxy-11,15-dioxo-13,14-dihydro-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid）は、PGD2の代謝産物である。実施例に示すとおり、尿中tetranor-PGDM量は、食物アレルギーの症状の重篤度の上昇や組織中の肥満細胞の数及び活性化に伴って上昇し、食物アレルギーの治療薬投与による症状の抑制に伴って低下する。したがって、尿中tetranor-PGDM量を測定すれば、食物アレルギーの有無だけでなく、その重篤度も評価することができる。また、食物アレルギーを有する人の尿中では、抗原刺激を行わなくてもtetranor-PGDM濃度が高い。したがって、食物アレルギーを発症していない人の尿中tetranor PGDM量を測定して、食物アレルギーの発症リスクを評価することもできる。
【００１４】
本明細書において「食物アレルギー」は、食品中に含まれるアレルゲンが体内に取り込まれることで起こる様々なアレルギー反応をいう。食物アレルギーとしては、鶏卵、牛乳、甲殻類、小麦、果物、ナッツ類、魚介類、蕎麦などのアレルギーがよく知られるが、これら以外のアレルゲンによるアレルギーも含まれる。症状は、皮膚、粘膜、消化器、呼吸器などに生じ、下痢、嘔吐、皮膚炎などが代表的である。
【００１５】
本明細書において「被検者」は、食物アレルギーの可能性がある者、食物アレルギーを現に発症した者、食物アレルギーの治療を受けている者、食物アレルギーの治療薬を服用している者、食物アレルギーを有するかどうか不明な者等とすることができる。また、「被検者」は、ヒトに限らず、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマなどの哺乳動物であってもよい。
【００１６】
本発明に係る食物アレルギーの検査方法の一態様では、尿中のtetranor-PGDM量がより多いときに、症状がより重篤である、又は発症リスクがより高いと判断される。尿中のtetranor-PGDM量がより多いか否かは、tetranor-PGDM量は、同一個体から複数回採取した尿中のtetranor-PGDM量を測定して結果を比較して判断してもよい。この場合、同一個体における重篤度や発症リスクの変化を評価することができる。また、尿中のtetranor-PGDM量がより多いか否かは、複数人から採取した尿中のtetranor-PGDM量を測定して結果を比較してもよい。この場合、他の人に比較して、重篤度や発症リスクが高いかどうかを評価することができる。
【００１７】
本発明に係る食物アレルギーの検査方法の一態様では、尿中のtetranor-PGDM量が所定の値より高い場合に、症状が重篤である、又は発症リスクが高いと判断され、所定の値より低い場合に、症状が軽い、又は発症リスクが低いと判断される。所定値（カットオフ値）は、複数の健常者又は非食物アレルギー患者の尿検体におけるtetranor-PGDM量と、複数の食物アレルギーの患者の尿検体におけるtetranor-PGDM量を比較して、常法により決定することができる。
【００１８】
一態様において、本発明に係る食物アレルギーの検査方法は、食物アレルギーの患者に投与する治療薬や、患者に対して行う治療方法の評価に用いられる。例えば、治療開始前から治療開始後の任意の時点で採取した尿検体におけるtetranor-PGDM量を測定し、tetranor-PGDM量が減少する場合にその治療薬又は治療方法は有効であると判断され、tetranor-PGDM量が減少しないか増加する場合にはその治療薬又は治療方法は有効ではないと判断される。このとき、tetranor-PGDM量の減少や増加は、有意な減少又な増加ではなくてもよく、減少又は増加の傾向があると当業者が判断できる程度であってもよい。
【００１９】
一態様において、本発明に係る食物アレルギーの検査方法は、食物アレルギーの治療薬の開発のための動物実験において、その薬の効果を評価するために用いてもよい。
【００２０】
一態様において、本発明に係る食物アレルギーの検査方法は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味する。かかる検査方法は、例えば検査会社等で実施される。
【００２１】
本発明の検査に用いられる尿は、常法に従って採取したものを用いることができる。一回の尿でも、二回以上の蓄尿でもよい。採取した尿は、検査時まで室温で保存してもよく、−40℃以下、例えば−80℃で保存してもよい。凍結した尿は、急速に融解させて測定に用いることができる。
【００２２】
尿中のtetranor-PGDM量の測定は、溶液中の特定の物質を検出、測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができる。本明細書において、「尿中のtetranor-PGDM量の測定」という場合、その量を正確に測定するだけでなく、有無を検出することや、一定量より多いか少ないかだけを判定することも含む。尿中のtetranor-PGDM量は、クレアチニンなどの基準物質の量により補正してもよい。
【００２３】
尿中のtetranor-PGDM量を測定する方法としては、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、各種質量分析法、高速液体クロマトグラフィーによる方法、HPLC-MS/MS法等が挙げられるが、これらに限定されない。この中で抗tetranor-PGDM抗体と、尿検体中のtetranor-PGDMとの抗原抗体反応を利用してtetranor-PGDM量を測定するイムノアッセイは特に簡便で好ましい。
【００２４】
イムノアッセイは、検出可能に標識した抗tetranor-PGDM抗体、又は、検出可能に標識した抗tetranor-PGDM抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（EIA又はELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
ELISA法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、RIA法では、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、FPIA法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、CLIA法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
また、イムノアッセイでは、抗tetranor-PGDM抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
【００２５】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるELISA法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができる。ELISA法には競合法とサンドイッチ法がある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に抗tetranor-PGDM抗体を固定し、尿検体と酵素標識したtetranor-PGDMを添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。尿検体中のtetranor-PGDMが多ければ発色は弱くなり、尿検体中のtetranor-PGDMが少なければ発色が強くなるので、検量線を用いてtetranor-PGDM量を求めることができる。
【００２６】
サンドイッチ法では、固相担体に抗tetranor-PGDM抗体を固定し、尿サンプルを添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別の抗tetranor-PGDM抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、tetranor-PGDM量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と尿検体中のtetranor-PGDMを反応させた後、まず非標識抗tetranor-PGDM抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗tetranor-PGDM体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、3,3'−diaminobenzidine（DAB）、3,3'5,5'−tetramethylbenzidine（TMB）、o−phenylenediamine（OPD）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、p−nitropheny phosphate（NPP）等を用いることができる。
【００２７】
本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質や抗体は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
【００２８】
抗tetranor-PGDM抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、tetranor-PGDMで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、tetranor-PGDMで免疫した動物の血清から得ることができる。
抗tetranor-PGDM抗体は、既存の抗体を用いてもよい。
【００２９】
本発明に係る食物アレルギーの検査方法では、被検者の尿中のtetranor-PGDM量に加えてtetranor-PGEM量を測定してもよい。tetranor-PGEM（9,15-dioxo-11α-hydroxy-13,14-dihydro-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid）は、PGE2の代謝産物である。実施例に示すとおり、食物アレルギーの場合、tetranor-PGEM量は、発症後一過性に上昇した後、すぐに低下することがわかった。
【００３０】
実施例に示すとおり、尿中tetranor-PGDM量は、他の炎症性疾患では、食物アレルギーとは異なる挙動を示す。したがって、尿中tetranor-PGDM量を測定することにより、他の炎症性疾患（例えば、腸炎、ぜんそく、アレルギー性皮膚炎）との類症鑑別を行うことができる。
また、実施例に示すとおり、尿中tetranor-PGEM量も、他の炎症性疾患では、食物アレルギーとは異なる挙動を示す。したがって、尿中tetranor-PGDM量と尿中tetranor-PEGM量を両方測定することにより、より精度の高い類症鑑別を行うことができる。
【００３１】
より具体的には、尿中tetranor-PGDM量は一定期間上昇が維持され、尿中tetranor-PGEM量は一過性に上昇してすぐに低下する場合、食物アレルギーであると判断することができる。ここで、一定期間とは、例えば、食物アレルギーの原因となる物質を摂取してから3日以上、5日以上、7日以上、10日以上、又は20日以上をいう。一過性に上昇してすぐに低下するとは、例えば、上昇してから5日以内、4日以内、又は3日以内に低下することをいう。
一方、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の経口投与により作製したマウスの大腸炎モデルでは、尿中tetranor-PGDM量は一過性に上昇してすぐに低下するが、tetranor-PGEM量は急激に上昇しその後も高い値が維持される。DSS腸炎モデルでは、好中球やマクロファージを介した炎症が生じることが知られている。トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）で誘導したマウスの潰瘍性大腸炎モデルでは、尿中tetranor-PGDM量及び尿中tetranor-PGEM量のいずれも、一過性に上昇してすぐに低下する。アレルギー性気管支炎モデルマウスでは、尿中tetranor-PGDM量は一過性に上昇してすぐに低下し、尿中tetranor-PGEM量はほとんど変化しない。喘息に見られる気道炎や気管支炎は、好酸球を介して生じる炎症であることが知られている。アレルギー性皮膚炎モデルマウスでは、尿中tetranor-PGDM量及び尿中tetranor-PGEM量のいずれも上昇し、比較的長期間維持される。
【００３２】
尿中tetranor-PGEM量は、上述した尿中tetranor-PGDM量と同様の方法で測定することができる。
【００３３】
本発明に係る食物アレルギーの検査方法によれば、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化も評価することができる。
本明細書において「肥満細胞の活性化」とは、肥満細胞の数の増大や、脱顆粒の増加を意味する。後述する実施例に示されるとおり、尿中tetranor-PGDM量は、肥満細胞の増加に伴って上昇し、脱顆粒抑制下では減少する。また、尿中tetranor-PGEM量も、肥満細胞の増加に伴って上昇する。よって、尿中tetranor-PGDM量及び尿中tetranor-PGEM量を指標として、肥満細胞の活性化を評価することができる。
例えば、アレルギー性鼻炎は肥満細胞欠損マウスでは症状が生じる一方、食物アレルギーは肥満細胞欠損マウスではほとんど症状が出ないことが知られているなど、食物アレルギーは、肥満細胞依存性が高く、肥満細胞数の増加がその発症と進行に重要であることが知られている。この食物アレルギーに特有の肥満細胞（特に消化管粘膜型の肥満細胞）の活性化を検出する方法としては、これまでに血中のヒスタミン濃度を測定する方法しかなかったが、血中ヒスタミンは15分で消失するため、事実上肥満細胞の活性化を検出する方法は存在しなかった。
【００３４】
［食物アレルギーの検査用キット］
本発明に係る食物アレルギーの検査用キットは、上述した検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うためのキットであり、抗tetranor-PGDM抗体を含む。
本発明の検査用キットは、抗tetranor-PGDM抗体を利用するイムノアッセイによって、tetranor-PGDM量を測定するために必要な試薬及び装置を含む。
【００３５】
検査用キットの一態様は、サンドイッチ法によってtetranor-PGDM量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗tetranor-PGDM抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗tetranor-PGDM抗体；及び、アルカリホスファターゼ基質（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
捕捉用抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体を固定し、ここに尿サンプルを適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。次に、標識した抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、tetranor-PGDM量を求めることができる。
【００３６】
検査用キットの別の態様は、二次抗体を使用してサンドイッチ法によりtetranor-PGDM量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗tetranor-PGDM抗体；一次抗体としての抗tetranor-PGDM抗体；二次抗体としての、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗tetranor-PGDM抗体に対する抗体；及び、アルカリホスファターゼ（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
捕捉用抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体を固定し、ここに尿サンプルを適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、tetranor-PGDM量を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
検査用キットには、内部標準として使用する重水素化tetranor-PGDMが備えられていてもよい。重水素化tetranor-PGDMは、tetranor-PGDMの重水素標識体であり、これらを内部標準とすることにより、尿中のtetranor-PGDM量を質量分析計で測定する際、分析毎の抽出効率およびイオン化効率を補正することができる。重水素化tetranor-PGDMとしては、例えば、tetranor-PGDM-d6、tetranor-PGDM-d4、tetranor-PGDM-d8が挙げられる。
【００３７】
各検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含んでいてもよい。
【００３８】
標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（25I、131I、35S、3H等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。
【００３９】
本発明の検査用キットは、抗tetranor-PGEM抗体を利用するイムノアッセイによって、tetranor-PGEM量を測定するために必要な試薬及び装置を含んでいてもよい。tetranor-PGEM量を測定するために必要な試薬及び装置は、上述したtetranor-PGDM量を測定するために必要な試薬及び装置と同様のものとすることができる。
その場合、内部標準として使用する重水素化tetranor-PGEMが備えられていてもよい。重水素化tetranor-PGEMは、tetranor-PGEMの重水素標識体であり、これらを内部標準とすることにより、尿中のtetranor-PGEM量を質量分析計で測定する際、分析毎の抽出効率およびイオン化効率を補正することができる。重水素化tetranor-PGDMとしては、例えば、tetranor-PGEM-d6、tetranor-PGEM-d4、tetranor-PGEM-d8が挙げられる。
【００４０】
本発明に係る食物アレルギーの検査用キットは、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の評価に用いることもできる。
【００４１】
［尿検体検査用スティック］
本発明に係る食物アレルギーの検査用スティックは、上述した検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うためのスティック状の検査薬であり、尿検体中のtetranor-PGDM量が色のついたラインなどで可視化されるものをいう。検査用スティックは、公知のものを用いることができるが、例えば、例えばイムノクロマト法を利用することができ、金コロイドなどで標識した第1の抗tetranor-PGDM抗体が格納された抗体格納部と、tetranor-PGDMの別のエピトープを認識する第2の抗tetranor-PGDM抗体をセルロース膜などにライン状に固定した判定部が細い溝でつながれた構成とすることができる。かかるスティックに尿検体を添加すると、抗体格納部で標識抗体とtetranor-PGDMが結合してtetranor-PGDM−標識抗体複合体となり、当該複合体が毛細管現象により溝を通って判定部に移動する。当該複合体が固定された第2の抗tetranor-PGDM抗体に捕捉されると、金コロイドのプラズモン効果により、赤色のラインが判定部に出現する。
【００４２】
検査用スティックの判定部には、標識抗体に対する抗体を固定したコントロールラインを設けてもよい。コントロールラインは、tetranor-PGDMの有無にかかわらず発色するので、試験が正しく行われたかどうか確認することができる。
【００４３】
検査用スティックは、尿検体を吸収するための吸収紙や、乾燥剤等をさらに備えていてもよい。
【００４４】
検査用スティックは、抗体格納部に標識した抗tetranor-PGEM抗体も格納し、判定部にtetranor-PGEMの別のエピトープを認識する抗tetranor-PGEM抗体をライン状に固定しておくことにより、tetranor-PGDMとtetranor-PGEMを同時に測定することができる。
【００４５】
このような検査用スティックによれば、家庭でも簡単に尿中tetranor-PGDM量及びtetranor-PGEM量を測定し、食物アレルギーの発症リスクや程度を評価することができる。
【００４６】
本発明に係る食物アレルギー検査用スティックは、食物アレルギーの肥満細胞の活性化の評価に用いることもできる。
【００４７】
［食物アレルギーマーカー及び食物アレルギーにおける肥満細胞活性化マーカー］
本明細書において、「食物アレルギーマーカー」とは、その量が、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後の指標となる物質をいう。また、「食物アレルギーにおける肥満細胞活性化マーカー」とは、その量が、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の有無や程度の指標となる物質をいう。
食物アレルギーマーカー又は食物アレルギーにおける肥満細胞活性化マーカーとして尿中tetranor-PGDM又は尿中tetranor-PGEMをin vitroで使用するためには、本発明に係る食物アレルギーの検査方法について説明したとおり、尿中tetranor-PGDM量又は尿中tetranor-PGEM量を測定すればよい。尿中tetranor-PGDM量又は尿中tetranor-PGEM量の変化を経時的に測定して、そのパターンから、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後、及び肥満細胞活性化の有無や程度を推測することも有効である。
【００４８】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．材料および方法
（1）オボアルブミン（OVA）誘導性食物アレルギーモデルマウスの作製
モデル作製：野生型のBALB/cマウス（6−8週齢、雌）にOVA（50μg）を2週間隔で2回腹腔内投与することで感作し、その2週間後からOVA（10 mg）を2日おきに計10回経口投与した。コントロールとして、OVAで感作したマウスに生理食塩水を2日おきに計10回経口投与した。
投薬治療：上記の方法によりOVAで感作したマウスに、OVAを経口投与する期間、デキサメタゾン（2 mg/kg）またはクロモグリク酸ナトリウム（300μg/マウス）を毎日腹腔内投与した。
症状評価：OVA投与後1時間の間に下痢を発症したマウスの匹数を百分率で評価した。
肥満細胞数：腸管組織のパラフィン切片を作製し、クロロアセテートエステラーゼ（CAE）染色で赤桃色に染まる肥満細胞数を顕微鏡下で計測した。
尿採取：代謝ケージを用いてOVAまたは生理食塩水経口投与後24時間の尿を採取した。【００５０】
（2）デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎モデルマウスの作製
モデル作製：野生型のC57BL/6 マウス（6−8週齢、雌）に2％ DSSを自由飲水により7日間摂取させることで大腸炎を発症させた。水道水を同じ期間自由引水させたマウスをコントロールとして用いた。
症状評価：試験期間中（10日間）、マウスの体重およびDisease activity index (DAI)を毎日測定した。DAIは以下の通りに定義した。0点：正常便、1点：軟便、2点：重度軟便、3点：水溶性下痢、4点：出血性下痢
尿採取：代謝ケージを用いて24時間尿を2日おきに採取した。【００５１】
（3）2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）誘発性大腸炎モデルマウスの作製
モデル作製：野生型のC57BL/6 マウス（6−8週齢、雌）に2.5% TNBSを直腸内投与し、大腸炎を誘導した。コントロールとして、溶媒（50％エタノール）をマウスに結腸内投与した。
症状評価：TNBS投与後10日間、マウスの体重を毎日測定した。
結腸の長さ：TNBS投与3日後と10日後にマウスを安楽殺し、結腸の長さを測定した。
尿採取：代謝ケージを用いて24時間尿を2日おきに採取した。【００５２】
（4）OVA誘発性アレルギー性気管支炎モデルマウスの作製
モデル作製：野生型のBALB/cマウス（6−8週齢、雌）にOVA（50μg）を2週間隔で2回腹腔内投与することで感作し、その2週間後からOVA（150μg）を2日おきに計10回経鼻投与した。コントロールとして、OVAで感作したマウスに生理食塩水を2日おきに計10回経鼻投与した。
症状評価：10回目のOVA経鼻投与の24時間後にマウスを安楽殺し、肺を摘出した。肺組織のパラフィン切片を作製し、H&E染色後、病理組織学的に評価した。
尿採取：代謝ケージを用いてOVAまたは生理食塩水経鼻投与後24時間の尿を採取した。【００５３】
（5）アレルギー性接触皮膚炎モデルマウスの作製
モデル作製：野生型のBALB/cマウス（6−8週齢、雌）の耳介に抗DNP抗体（1.25μg）を皮内投与することで感作し、その24時間後に0.2% ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）を耳介に塗布して皮膚炎を誘導した。
症状評価：DNFBによる刺激後、30分、1時間、3時間、6時間、1−10日に耳介の厚さを測定し、刺激前との厚みの差を耳の浮腫とした。
尿採取：代謝ケージを用いて24時間尿を2日おきに採取した。【００５４】
（6）肥満細胞特異的ヒト化マウスの作製
ヒト化マウス作製：腸免疫不全マウスであるNOGマウス（6−8週齢、雌）にヒト肥満細胞株であるLAD2細胞（5×104または5×105）を静脈内注射することで肥満細胞特異的ヒト化マウスを作製した。コントロールとして、マウスの骨髄由来肥満細胞（BMMC）を静脈内注射した。肥満細胞生着評価：肥満細胞移植の2週間後にマウスを安楽殺し、CAE染色により結腸および肺の肥満細胞数を移植前のマウスと比較した。
尿採取：代謝ケージを用いて24時間尿を移植後1、3、7、14、21日に採取した。【００５５】
（7）尿の前処理
採取したマウスの尿100μlに、内部標準としてtetranor-PGDMおよびtetranor-PGEMの重水素標識体であるtetranor-PGDM-d6およびtetranor-PGEM-d6を5 ngを混合した。精製水で容量を1 mlとし、塩酸でpHを3に調整した。エタノールおよび精製水で平衡化したSep-Pak Vac C18カートリッジに調整した尿を注入し、10%アセトニトリル溶液6 mlおよびヘキサン6 mlで洗浄後、酢酸エチル3 mlで溶出させ、窒素気流化で乾固した。残渣を10%アセトニトリル溶液100μlに溶解し、測定サンプルとした。【００５６】
（8）尿中tetranor-PGDMおよびtetranor-PGEMの測定
前処理後の尿サンプルを用いて、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置（HPLC-MS/MS）によりtetranor-PGDMおよびtetranor-PGEMを測定した。HPLC装置として、Prominence system（システムコントローラーCBM-20A、送液ユニットLC-20AD2台、カラムオーブンCTO-20A、冷却機能付きオートサンプラーSIL20AC、島津製作所）、分離カラムにはInertsilODS-3、内径2.1 mm×長さ150 mm（GLサイエンス社）を使用し、移動相は0.02%酢酸とアセトニトリルの濃度勾配で流速は0.4 ml/minとした。カラムオーブンは37℃、オートサンプラーは4℃に設定した。MS/MS部はエレクトロスプレーイオン化をイオン源とする3連四重極型質量分析装置（LCMS-8030、島津製作所）を用いた。定量法としてMRM（Multiple Reaction Monitoring）法を用いた。tetranor-PGDM（質量数328）およびtetranor-PGEM（質量数328）の検出は、生成したプリカーサーイオンm/z（質量数÷電荷）327のイオンをさらに衝突誘起解離（CID）によって分解し、生成するプロダクトイオンm/z 309を用いて行った。内部標準tetranor-PGDM-d6（質量数334）およびtetranor-PGEM-d6（質量数334）の検出は、生成したプリカーサーイオンm/z（質量数÷電荷）333のイオンをさらにCIDによって分解し、生成するプロダクトイオンm/z 315を用いて行った。tetranor-PGDMとtetranor-PGEMは、化学構造が非常に類似しているため、プリカーサーイオンおよびプロダクトイオンのm/zが同じである。そこでHPLCによる保持時間の違いにより両者を区別した。データ解析はMS/MSに付属するソフトウェア LabSolutions LCMS Ver. 5.53を用いて行った。作成されたマスクロマトグラムから、tetranor-PGDMまたはtetranor-PGEM由来のピークについて面積計算を行い、標準資料を用いて作製した検量線より各ピークの定量を行った。定量の際には、分析毎の抽出効率およびイオン化効率を補正するために内部標準として導入したtetranor-PGDM-d6またはtetranor-PGEM-d6由来のピークの面積値を用いて補正を行った。尿中tetranor-PGDMおよびtetranor-PGEM量は、尿中クレアチニン濃度で補正し、ng/mg Creatinineで表記した。尿中クレアチニン濃度は測定キット（ラボアッセイ クレアチニン、和光純薬）により定量した。【００５７】
２．結果
（1）アレルギー症状の程度と肥満細胞の相関
図1に、食物アレルギーモデルマウスの下痢発症頻度（左：n=10）と、結腸組織中の肥満細胞数（右：n=4）を示す。抗原刺激に比例して下痢発症頻度が高くなり、結腸組織中の肥満細胞数が増加した。【００５８】
（2）尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEM（1）
図2に、食物アレルギーモデルマウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの推移を示す。tetranor-PGDMは抗原刺激の回数に伴って上昇することがわかった（左：n=10）。一方でtetranor-PGEMは、抗原刺激開始後一過性に上昇したあとすぐに低下することがわかった（右：n=10）。【００５９】
（3）尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEM（2）
図3に、抗原刺激の中止後一定期間の尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMの推移を示す。尿中PGDM濃度は、減少傾向はあるものの刺激中止後3週間は有意に高い値で排泄されていた（上：n=7）。一方でPGEMは刺激終了後すぐに減少することが分かった（下：n=7）。【００６０】
（4）尿中tetranor-PGDMの肥満細胞に対する特異性
図4に、OVA経口投与期間中クロモグリク酸ナトリウム（cromolyn）を1日1回、1匹当たり300μg腹腔内投与したときの、尿中tetranor-PGDMの変動を示す。cromolynは、肥満細胞の細胞膜を安定化させて脱顆粒を抑制する。cromolynの投与は、OVA誘発性の食物アレルギー症状を抑え（左：n=5）、尿中に排泄されるtetranor-PGDMの量を有意に減少させた（右：n=5）。【００６１】
（5）尿中tetranor-PGDMの治療に対する反応性
図5に、アレルギー性疾患の治療に用いられるステロイド系抗炎症薬デキサメタゾン（DEX）を1日1回、体重1kg当たり2mg腹腔内投与したときの、尿中tetranor-PGDMの変動を示す。DEXの投与は、OVA誘発性の食物アレルギー症状を抑え（左：n=5）、同時に、尿中に排泄されるtetranor-PGDMの量を有意に減少させた（右：n=5）。【００６２】
（6）尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEM濃度に基づく類症鑑別（1）
図6に、DSS大腸炎モデルマウスの体重（左：n=5）と重症度の変動（右：n=5)を示す。DSSの投与により、体重減少と大腸炎の悪化がみられた。
図7に、DSS大腸炎モデルの尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMの推移を示す。尿中のtetranor-PGDMの濃度はDSSを投与後一過性に上昇したがすぐに低下した（左：n=5）。一方でtetranor-PGEMの濃度はDSS投与開始から急激に上昇し、その後も高い値のまま維持された（右：n=5）。【００６３】
（7）尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEM濃度に基づく類症鑑別（2）
図8に、TNBS大腸炎モデルマウスの体重変動（左：n=5）と結腸の長さ(右：n=5)を示す。TNBSにより、体重減少と結腸の短縮がみられた。
図9に、TNBS大腸炎モデルの尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMの推移を示す。tetranor-PGDM（左：n=5）、tetranor-PGEM（右：n=5）とも、濃度の一過性の上昇が見られた。【００６４】
（8）尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEM濃度に基づく類症鑑別（3）
図10に、OVA誘発性アレルギー性気管支炎モデルマウスの肺のH&E染色像を示す。OVAの投与により炎症細胞の侵潤と気管支杯細胞の過形成がみられた（右）。
図11に、アレルギー性気管支炎症モデルの尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMの推移を示す。尿中のtetranor-PGDMの濃度は一過性に上昇した（左：n=5）。一方でtetranor-PGEM（右：n=5）の濃度はほとんど変化しなかった。【００６５】
（9）尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEM濃度に基づく類症鑑別（4）
図12に、DNFB誘発性アレルギー性接触皮膚炎モデルで生じる耳の腫脹を示す。DNFBの塗布は即時相（IPR）、遅発相（LPR）、超遅発相（vLPR）の3相性に耳の腫脹を現した（n=5）。
図13に、アレルギー性皮膚炎モデルの尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMの推移を示す。尿中のtetranor-PGDM（右：n=5）、tetranor-PGEM（左：n=5）の軽度上昇が長期にわたって維持された。【００６６】
（10）肥満細胞特異的ヒト化マウスの尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEM
図14に、超免疫不全（NOG）マウスの結腸および肺組織にヒト肥満細胞（LAD2）が生着した様子を示す（図７左：n=3）。
図15に、肥満細胞ヒト化マウスに抗原・抗体刺激を行った後、尿中に排泄されるtetranor-PGDMとtetranor-PGEMの推移を示す。tetranor-PGDMの尿中濃度は刺激後すぐに上昇し、2週間高い値が保たれた（●：n=4）。一方でtetranor-PGEMの濃度は刺激後一過性に上昇し、6時間後にはすぐに低下した（▲：n=4）。
これらの結果から、尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMは、ヒトのアレルギーマーカーとしても有用であることがわかった。【００６７】
（11）ヒト又はマウス肥満細胞による尿中tetranor-PGDM/PGEMの産生
図16に、NOGマウスにマウス肥満細胞（BMMC）とヒト肥満細胞（LAD2）をそれぞれ移植し、抗原・抗体刺激後に排泄される尿中tetranor-PGDM及びtetranor-PGEMを示した。ヒト肥満細胞を移植したマウスでは、マウス肥満細胞を移植したマウスと比較して約10倍のtetranor-PGDMが排泄された（左：n=5）。tetranor-PGEMの排泄濃度は約2.5倍であった（右：n=5）。
この結果からも、尿中tetranor-PGDMとtetranor-PGEMは、ヒトのアレルギーマーカーとしても有用であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2016021704.tif 000019
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