(57)【要約】  幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む骨再生剤は、骨伝導能及び骨誘導能を有し、低コストで製造でき、サイズを制御できる。また、（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有する方法は、上記骨再生剤を簡便に製造できる。
2015064705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含むことを特徴とする骨再生剤。
【請求項２】
少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を不活性化してなる不活化細胞塊を含むことを特徴とする請求項１記載の骨再生剤。
【請求項３】
少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体が、幹細胞を、石灰化物を産生する細胞に分化誘導して得られることを特徴とする請求項２記載の骨再生剤。
【請求項４】
幹細胞が、成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞であることを特徴とする請求項３記載の骨再生剤。
【請求項５】
多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項４記載の骨再生剤。
【請求項６】
細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨再生剤。
【請求項７】
不活化細胞塊が、ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルにおいて、（１０００±２００ｃｍ−１）付近のリン酸塩（phosphate）のピーク、（１５５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドII（amide II）のピーク、及び（１６５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドI（amide I）のピークを有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨再生剤。
【請求項８】
（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載された骨再生剤の製造方法。
【請求項９】
幹細胞が、成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞であることを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
不活性化処理が、凍結乾燥処理であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
（１）工程の振盪培養において、骨芽細胞への分化誘導促進因子を添加することを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
骨芽細胞への分化誘導促進因子が、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
振盪培養を５日以上行うことを特徴とする請求項８〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷した骨の硬組織を外科的に治療する際に用いる骨再生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織が骨折等の損傷を受けると、骨を作る細胞である骨芽細胞が増殖、分化し、骨が再生する。損傷の軽度な症例においては、患部を固定することによって骨芽細胞が機能し、治癒に至る。一方で、複雑骨折や関節内の損傷、骨髄炎の併発等により骨芽細胞が有効に機能し得ない環境においては、自家骨移植や、人工関節、人工骨のインプラント、骨補填材の使用等様々な外科的処置が施されてきた。さらに、近年、高齢化の進行により、骨腫瘍摘出、粉砕骨折、関節リウマチの関節固定に伴う骨欠損、顎堤吸収等により失われた骨の欠損部を補う人工骨・骨補填材料の需要は高まる一方である。【０００３】
現在、臨床に使用されている人工骨・骨補填材料の多くは、生体活性・生体適合性・骨伝導性を有するリン酸カルシウムからなる。このようなリン酸カルシウムを用いた骨補填材料としては、ハイドロキシアパタイト（（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）等の非吸収性材料（特許文献１、２）や、β−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）等の吸収性材料（特許文献３、４、５、６）が知られている。【０００４】
しかしながら、これらの生体材料は、自家骨に比べて骨誘導性等に欠ける上、非吸収性材料は、骨と置換しないため、治癒期間・治癒後の強度面やインプラント／骨結合（オッセオインテグレーション）に問題が生じ、吸収性材料は、骨と置換する際に容量が減少し、治癒後の骨形体に問題が生じるため、外科的処置の予後は必ずしも良好ではない。【０００５】
このため、次世代型として、構造体としての人工骨と、ＢＭＰ（Bone Morphogenetic Protein）等の成長因子タンパク質とを組み合わせたハイブリッド人工骨・骨補填材の開発推進が望まれている。【０００６】
しかしながら、骨組織再生には、体細胞の外側に存在する繊維状や網目状の構造体である「細胞外基質」の重要性が明らかとなってきており（非特許文献１、２）、単にリン酸カルシウム材料に成長因子を混ぜるだけでは、十分な骨再生効果を得ることは困難である。特に歯科では、良好なインプラント治療結果を得るために、歯を失った後に生じる垂直性の骨欠損を再生する技術が必要であるが、従来の骨補填材では、垂直的な骨再生を可能にすることは実現できていなかった。【０００７】
一方、幹細胞を用いた骨再生医療は、細胞自体が細胞外基質及び成長因子を産生するため、従来よりも効果的な骨再生技術と考えらえている（非特許文献３）。特に、日本で発見された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、患者由来の細胞から作製可能な幹細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のように受精卵を破壊して作製する必要がないため、その医療応用が期待されている。ただし、ｉＰＳ細胞を用いた治療の最大の課題は、生きた幹細胞を取り扱うが故に、移植した細胞が腫瘍化する可能性をはらんでいることである。また、細胞を培養する課程で大がかりな設備・施設が必要となることも課題となっている。【０００８】
そのため、安全性を担保しつつ、治療効果の高い、幹細胞を用いた新たな骨再生医療の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平８−２２９１１４号公報
【特許文献２】特表２００４−５１８４６６号公報
【特許文献３】特開２０００−２６２６０９号公報
【特許文献４】特開２０１０−７５２４７９号公報
【特許文献５】特開２０１１−２３９８１５号公報
【特許文献６】特開２０１２−１６５１７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kim SH, Turnbull J, Guimond S., Journal of Endocrinology, 2011 May;209(2):139-151.
【非特許文献２】TISSUE ENGINEERING: Part A. February 2009, 15(2): 355-366.
【非特許文献３】Egusa H, Sonoyama W, Nishimura M, Atsuta I, Akiyama K., Journal of Prosthodontic Research, 2012 Oct;56(4):229-48.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、安全であり、骨伝導能及び骨誘導能を有する骨再生剤を提供することを目的とする。また、本発明は、簡便な前記骨再生剤の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、低コストで製造でき、サイズを制御可能な骨再生剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、幹細胞を用いて分化誘導した細胞を不活性化することによって、安全であり、骨伝導能及び骨誘導能を有する骨再生剤を提供できることを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含むことを特徴とする骨再生剤。
［２］少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を不活性化してなる不活化細胞塊を含むことを特徴とする前記［１］記載の骨再生剤。
［３］少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体が、幹細胞を、石灰化物を産生する細胞に分化誘導して得られることを特徴とする前記［２］記載の骨再生剤。
［４］幹細胞が、成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞であることを特徴とする前記［３］記載の骨再生剤。
［５］多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［４］記載の骨再生剤。
［６］細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の骨再生剤。
［７］不活化細胞塊が、ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルにおいて、（１０００±２００ｃｍ−１）付近のリン酸塩（phosphate）のピーク、（１５５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドII（amide II）のピーク、及び（１６５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドI（amide I）のピークを有するものであることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の骨再生剤。
［８］（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載された骨再生剤の製造方法。
［９］（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有することを特徴とする前記［８］に記載された骨再生剤の製造方法。
［１０］幹細胞が、成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞であることを特徴とする前記［８］又は［９］記載の製造方法。
［１１］多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１０］記載の製造方法。
［１２］不活性化処理が、凍結乾燥処理であることを特徴とする前記［８］〜［１１］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１３］細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする前記［８］〜［１２］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１４］（１）工程の振盪培養において、骨芽細胞への分化誘導促進因子を添加することを特徴とする前記［８］〜［１３］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１５］骨芽細胞への分化誘導促進因子が、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１４］記載の製造方法。
［１６］振盪培養を５日以上行うことを特徴とする前記［８］〜［１５］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１７］（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を含む方法により得られた骨再生剤を、組織再生を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与する工程を有することを特徴とする組織再生方法。
［１８］幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む骨再生剤を、組織再生を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与する工程を有することを特徴とする組織再生方法。
［１９］（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を含む方法により得られた組成物の、骨再生剤の製造のための使用。
［２０］幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む組成物の、骨再生剤の製造のための使用。
［２１］骨再生のために使用される組成物であって、
（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を含む方法により得られた組成物。
［２２］骨再生のために使用される組成物であって、幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の骨再生剤は、腫瘍化の可能性がなく、安全であり、骨伝導能（骨と一体化する能力）及び骨誘導能（骨を形成する能力）を有する。さらに、本発明の骨再生剤は、垂直的にボリュームを保ちながら、適切に生体の骨に置換され、良好なオッセオインテグレーションを可能にすることができる。また、本発明の製造方法を用いることにより、簡便に再生剤を製造することができる。本発明の骨再生剤は、低コストで製造でき、サイズを制御することができ、補填時の取り扱いも容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の振盪培養に用いるバイオリアクターの一態様を示す。
【図２】本発明の骨再生剤の製造方法の一態様を示す。
【図３】実施例１の骨再生剤の写真である。
【図４】実験例１の結果を示す。Ａは培養期間ごとの細胞凝集体の観察結果を示す。Ｂは培養期間ごとの細胞凝集体の表面積（μｍ２）を示す。
【図５】実験例２の細胞凝集体のカルシウム量（ｍｇ／フラスコ）を示す。
【図６】実験例３の細胞凝集体の乾燥重量（ｍｇ／フラスコ）を示す。
【図７】ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルの測定結果を示す。
【図８】試験例１の試験方法を示す。
【図９】試験例１の骨補填手術から３週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。
【図１０】試験例１の骨補填手術から３週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。
【図１１】試験例１の骨補填手術から５週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。
【図１２】試験例１の骨補填手術から８週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。
【図１３】試験例１のマイクロＸ線ＣＴ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の骨再生剤は、幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含むことを特徴とする。本発明において、骨伝導能（骨と一体化する能力）及び骨誘導能（骨を形成する能力）を有する本発明の骨再生剤は、骨補填材とも称する。
【００１７】
本発明の骨再生剤に用いる幹細胞は、特に限定されないが、例えば、成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞等が挙げられる。前記成体幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。前記分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem cell）、ＥＧ細胞（Embryonic Germ cell；胚性生殖細胞）又はＥＳ細胞（embryonic stem cell）等が挙げられ、受精卵を破壊して作製する必要がない点から、ｉＰＳ細胞が好ましい。本発明に用いる幹細胞は、いずれかの成体幹細胞又は分化万能性（pluripotency）をもつ多能性幹細胞が樹立されているか、樹立可能である、任意の哺乳動物において適用することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等、より好ましくはヒト又はマウスである。
【００１８】
前記多能性幹細胞はそれぞれ自体公知の方法により取得することができる。例えばＥＳ細胞作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法（例えば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) を参照）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Wilmut et al., Nature， 385, 810 (1997); Cibelli et al.,Science, 280, 1256 (1998); 入谷明ら, 蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999); Baguisi et al., Nature Biotechnology， 17, 456 (1999); Wakayama et al., Nature, 394, 369 (1998); Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127 (1999); Wakayama et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999); RideoutIII et al., Nature Genetics, 24, 109 (2000)）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
ｉＰＳ細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
【００２０】
ｉＰＳ細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウス又はヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、口腔粘膜細胞（例、歯肉線維芽細胞、頬粘膜線維芽細胞、歯肉上皮細胞、頬粘膜上皮細胞等）、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞等）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞等）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞等）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞等）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞等）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞等）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞等）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞等）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞等）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞等）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球等）、感覚に関する細胞（例、桿細胞等）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン等）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞等）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞等）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞等）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞等）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２１】
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（又はKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
(25) Oct3/4, Klf4, Sox2, GLISファミリーのメンバー（例えば、GLIS1、GLIS2、GLIS3等が挙げられ、好適には、GLIS1（GLIS family zinc finger 1）が挙げられる。 WO2010/098419, WO2011/102531を参照)
(26) Oct3/4, Klf4, Sox2, IRXファミリーのメンバー（例えば、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、IRX6等が挙げられ、好適には、IRX6（iroquois homeobox protein 6）が挙げられる。 WO2010/098419を参照)
(27) Oct3/4, Klf4, Sox2, PTXファミリーのメンバー（例えば、PITX1、PITX2、PITX3等が挙げられ、好適には、PITX2（paired-like homeodomain transcription factor 2）が挙げられ、PITX2には３つのアイソフォーム（isoforms a, b及びc）が知られており、いずれのアイソフォームも用いられ得るが、isoform bが特に好ましい。WO2010/098419を参照)
(28) Oct3/4, Klf4, Sox2, DMRTB1(DMRT-like family B with proline-rich C-terminal 1, WO2010/098419を参照)
上記(1)-(28)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6等を用いることもできる。また、Sox2（又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7等を用いることもできる。さらに、Lin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28b等を用いることもできる。
また、上記(1)-(28)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(28)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２２】
これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
【００２３】
上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666又はWO2010/098419に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。なお、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg及びL-Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記表１記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
【００２４】
【表１】
2015064705.tif 000003
【００２５】
また、GLISファミリーのメンバー、IRXファミリーのメンバー、PTXファミリーのメンバー、DMRTB1のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記表２に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得できる。
【００２６】
【表２】
2015064705.tif 000004
【００２７】
また、上記の各アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つKlf4の代替因子として野生型タンパク質と同等の核初期化能力を有する天然もしくは人工の変異タンパク質及びそれをコードする核酸も、本発明のKlf4を代替する核初期化物質として利用することができる。
【００２８】
核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたｃＤＮＡを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピゾーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００２９】
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。例えば、WO2008/118820、WO2010/098419、WO2011/102531、WO2011/004911等に記載の方法を用いることができる。ｉＰＳ細胞は遺伝子操作なしに作製されたものであってもよい。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）もしくは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systems）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrainPeptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入は、これらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができる。
【００３０】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009))や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
【００３１】
核初期化物質のｃＤＮＡとＰＴＤもしくはＣＰＰ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００３２】
マイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００３３】
ｉＰＳ細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることも好ましい。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖ＤＮＡ、特にｃＤＮＡである。
【００３４】
核初期化物質のｃＤＮＡは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）等が用いられ得る。
【００３５】
用いるベクターの種類は、得られるｉＰＳ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エピゾーマルベクター等が使用され得る。
【００３６】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター等が用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーター等が好ましい。
【００３７】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点等を含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３８】
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。
【００３９】
レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre/loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、ｉＰＳ細胞が誘導された後で、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー−プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、もしくはSV40等のポリアデニル化配列で置換した3’-自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステム及びSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., StemCells, 27: 1042-1049 (2009) に開示されている。
【００４０】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等を用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
【００４１】
プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができる。２種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上（たとえば３回又は４回）繰り返して行うことができる。
【００４２】
別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターが挙げられる。エピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、Science, 324, 797-801(2009)に開示されている。
【００４３】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒト又はマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００４４】
また、前記核初期化物質に加え、ｉＰＳ細胞の樹立効率を改善する物質（以下、樹立効率改善物質）を体細胞に接触させることにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤等］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell,2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤等］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA及びshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００４５】
なお、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。すなわち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質及びｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるため、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はない。
【００４６】
ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
【００４７】
ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのｉＰＳ細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００４８】
哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等が挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質との接触に際し、例えば、カチオニックリポソーム等導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（及びｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばＥＳ細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又は幹細胞因子（ＳＣＦ）を添加することが望ましい。
【００４９】
また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）の共存下で培養されるが、フィーダーフリーの状態で培養することも可能である。ＭＥＦとしては、通常ＳＴＯ細胞等がよく使われるが、ｉＰＳ細胞の誘導には、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば１〜１０日後）から開始してもよい。
【００５０】
ｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4等、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである（例えば、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)を参照）。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。核初期化物質としてOct3/4、Klf4及びSox2の３因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがＥＳ細胞と比較して遜色のない高品質のｉＰＳ細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくｉＰＳ細胞を樹立することが可能である。
【００５１】
選択されたコロニーの細胞がｉＰＳ細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性等）及び目視によるＥＳ細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、各種ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。また、ｉＰＳ細胞が未分化であることを確認する方法は、特に限定されず、従来公知の未分化マーカー（例えば、内在製のアルカリホスファターゼ、Oct3/4、Sox2、Nanog、Eras、Esg1等）等を指標とし、これらのｍＲＮＡを検出する方法が挙げられる。また、これらの指標を免疫化学的手法（例えば、免疫染色法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等）を利用して確認してもよい。また、得られたｉＰＳ細胞の多分化能の確認方法についても特に限定されないが、例えば、免疫不全モデル動物（SCIDマウス等）にｉＰＳ細胞を移植し、奇形腫形成の有無を確認する方法等が挙げられる。奇形腫内に三胚葉に由来した細胞集団（組織）の形成が確認されれば、得られたｉＰＳ細胞が多分化能を有していると判断できる。
【００５２】
本発明に用いるｉＰＳ細胞は、胚様体（embryoid body）又は集合体の形体であってもよい。集合体を形体する方法は、特に限定されないが、例えば、Sasakiら：Tissue Eng Part A, 16(8):2497-2504,2010に記載の方法等を使用できる。
【００５３】
胚盤胞期胚から誘導される従来のヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞と非常に異なる生物学的（形態的、分子的及び機能的）特性を有する。マウス多能性幹細胞は、２つの機能的に区別される状態、即ちＬＩＦ依存的なＥＳ細胞と、ｂＦＧＦ依存的なエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣｓ）とで存在し得る。分子学的解析から、ヒトＥＳ細胞の多能性状態は、マウスＥＳ細胞のそれではなく、むしろマウスＥｐｉＳＣｓのそれに類似していることが示唆されている。最近、ＬＩＦの存在下にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc及びNanogを異所的に誘導するか（Cell Stem Cells, 6: 535-546, 2010参照）、ＬＩＦ並びにGSKβ及びERK1/2経路阻害剤と組み合わせて、Oct3/4、Sox2及びKlf4を異所的に誘導する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, オンライン公開doi/10.1073/pnas. 1004584107参照）ことにより、マウスＥＳ細胞様の多能性状態にあるヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞（ナイーヴヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞とも呼ばれる）が樹立されている。これらのナイーヴヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞は、それらの多能性が従来のヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞に比べてより未熟であるため、本発明のための出発材料として好適であり得る。
【００５４】
本発明の骨再生剤に用いる不活化細胞塊は、ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルにおいて、少なくとも、（１０００±２００ｃｍ−１）付近のリン酸塩（phosphate）のピーク、（１５５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドII（amide II）のピーク、及び（１６５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドI（amide I）のピークを有することが好ましい。さらに、不活化細胞塊は、前記ピークに加えて、（８５０±１００ｃｍ−１）付近の炭酸塩（carbonate）のピークをあわせ持つものが好ましい。前記ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルは、公知の方法で測定できる。
【００５５】
本発明の骨再生剤に用いる不活化細胞塊は、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む。本発明の骨再生剤は、前記不活化細胞塊以外の公知の骨再生もしくは骨補填材料等を含んでいてもよい。前記骨再生もしくは骨補填材料として、例えば、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ（β-tricalcium phosphate）、コラーゲンスポンジ等が挙げられる。
【００５６】
前記不活化細胞塊は、本発明の効果を妨げない限り、石灰化物及び細胞外基質以外の物質を含んでいてもよい。前記不活化細胞塊は、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を不活性化して得ることができる。
【００５７】
前記細胞凝集体は、幹細胞を、石灰化物を産生する細胞に分化誘導することによって得ることができる。
【００５８】
前記石灰化物としては、特に限定されないが、例えば、カルシウム系物質等が挙げられる。カルシウム系物質としては、特に限定されないが、例えば、リン酸カルシウム系物質、炭酸カルシウム系物質、乳酸カルシウム及びグルコン酸カルシウム等が挙げられる。リン酸カルシウム系物質としては、特に限定されないが、例えば、水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト、β−ＴＣＰ、α−ＴＣＰ、メタリン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、それらの塩、又はそれらの溶媒和物から選択される１種又は２種以上の混合物等が挙げられ、β−ＴＣＰ、水酸アパタイトが好ましい。炭酸カルシウム系物質として、炭酸カルシウム及び炭酸水素カルシウムが挙げられ、これらの中では炭酸カルシウムが好ましい。上記のカルシウム系物質は、上記の化合物が主成分であれば、上記以外の化合物等が適宜含まれていてもよい。
【００５９】
前記細胞外基質としては、特に限定されないが、例えば、オステオネクチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フィブリン、オステオポンチン、骨シアロタンパク、オステオカルシン、コラーゲン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、プロテオグリカン（ヒアルロン酸、フィブロモデュリン等）、キチン、増殖因子（BMP、FGF-2（Fibroblast growth factor 2 (basic FGF)）、TGFβ（Transforming growth factor-β）、PDGF（Platelet-derived growth factor）、VEGF（Vascular endothelial growth factor）等）等の天然高分子が挙げられ、コラーゲン、増殖因子が好ましい。これらは、１種単独でもよく、２種以上を含んでいてもよい。例えば、前記細胞外基質としては、前記コラーゲンタンパク質を主成分とするものがより好ましい。「主成分とする」とは、対象の成分を５０％以上含むことを意味する。前記コラーゲンタンパク質を主成分とする細胞外基質におけるコラーゲンの含有量は、５０％以上であれば、特に限定されないが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上である。前記コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン等が好ましい。
【００６０】
本発明の不活化細胞塊は、特に限定されないが、ハイドロキシアパタイトの結晶構造を有するリン酸カルシウム及びＩ型コラーゲンを豊富に含んだ不活化細胞塊が好ましい。
【００６１】
本発明の骨再生剤は、本発明の効果を妨げない範囲で、骨芽細胞への分化誘導促進因子等を含んでいてもよい。前記骨芽細胞への分化誘導促進因子としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、スタチン、イソフラボン誘導体、3-ベンゾチエピン誘導体TAK-778（（２Ｒ，４Ｓ）−(−)−Ｎ−〔４−（ジエトキシホスホリルメチル）フェニル〕−１,２,４,５−テトラヒドロ−４−メチル−７,８−メチレンジオキシ−５−オキソ−３−ベンゾチエピン−２−カルボキサミド((2R,4S)-(-)-N-[4-(diethoxyphosphorylmethyl)phenyl]-1,2,4,5-tetrahydro-4-methyl-7,8-methylenedioxy-5-oxo-3-benzothiepin-2-carboxamide))、特許2992677号の[0023]段落の化合物Ａ），ヘリオキサンチン誘導体TH(4-(4-メトキシフェニル)ピリド[40,30:4,5] チエノ[2,3-b]ピリジン-2-カルボキサミド（4-(4-methoxyphenyl)pyrido[40,30:4,5]thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamide）)、フェナミル（Phenamil；３，５−ジアミノ−６−クロロ−Ｎ−［イミノ（フェニルアミノ）メチル］ピラジン−２−カルボキサミド（3,5-Diamino-6-chloro-N-[imino(phenylamino)methyl]pyrazine-2-carboxamide）），ハルミン（Harmine）及びその類縁体、アセロゲニン及び類縁体（例えば、下記式で示されるアセロゲニンＢ）、
2015064705.tif 000005
レスベラトロール（Resveratrol）等の化合物；骨形成に関与するタンパク質；WO2006/123699号や特開2004-083504号公報等に記載の分化誘導促進剤等が挙げられ、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸からなる群から選ばれる１種以上が好ましい。
【００６２】
骨形成に関与するタンパク質としては、骨細胞及び／又は骨芽細胞の成長、増殖、形成若しくはこれらの促進に関与するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、オステオゲニン、多血小板血漿（PRP）、エナメル基質由来タンパク（商品名：エムドゲイン（Emdogain（登録商標））、血小板由来成長因子（platelet derived growth factor；PDGF），線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；FGF）（好適には、FGF-2）等が挙げられる。ＢＭＰとしては、特に限定されず、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−８Ｂ、ＢＭＰ−９等のアイソフォームが挙げられ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９が好ましい。これらの分化誘導促進因子は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、特定の組み合わせの分化誘導促進因子（例えば、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸からなる群から選ばれる１種以上）を用いる場合に、他の分化誘導促進因子を含めてもよいが、含めなくてもよい。
【００６３】
不活化細胞塊あたりのカルシウム含有量は、細胞種（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等）、種（ヒト、マウス）、細胞のクローン株等によって変化し得るため、特に限定されない。例えば、マウスのｉＰＳ細胞を用いた場合であれば、実施例１の工程で一つの25 cm2培養フラスコから作製された全不活化細胞塊あたりのカルシウム含有量は、骨再生効果が高い点から、１０ｍｇ／フラスコ以上が好ましい。前記カルシウムの含有量の測定方法は、後記する実施例に記載のとおりである。
【００６４】
不活化細胞塊の表面積は、細胞種（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等）、種（ヒト、マウス）、細胞のクローン株等によって変化し得るため、特に限定されない。例えば、マウスのｉＰＳ細胞を用いた場合であれば、不活化細胞塊の位相差顕微鏡下にて撮影した写真上におけるＩｍａｇｅＪ画像解析ソフト（National Institutes of Health,米国）を用いて測定した面積は、骨再生効果や取り扱い性を考慮して、３０００００μｍ２以上が好ましい。
【００６５】
不活化細胞塊の最大径は、細胞種（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等）、種（ヒト、マウス）、細胞のクローン株等によって変化し得るため、特に限定されない。例えば、マウスのｉＰＳ細胞を用いた場合であれば、不活化細胞塊の最大径は、骨再生効果や取り扱い性を考慮して、０．１〜５．０ｍｍが好ましく、０．５〜２．０ｍｍがより好ましい。
【００６６】
本発明の骨再生剤の製造方法について、以下に説明する。
【００６７】
本発明の骨再生剤の製造方法の一態様としては、（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有する製造方法が挙げられる。
【００６８】
前記（１）工程の前に、前培養を行ってもよい。前培養は特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、幹細胞を培養容器で接着培養する方法や、接着培養した幹細胞が培養容器中で７０〜８０％コンフルエントに達した段階で低接着性培養プレートに播種し、３７℃で浮遊培養する方法等が挙げられる。
【００６９】
前記（１）工程では、幹細胞を振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導する。前記（１）工程において、振盪培養は、通常０．０１〜１．００Ｈｚであり、得られる細胞のサイズがより大きくなることから、好ましくは０．０５〜０．８０Ｈｚであり、より好ましくは０．１０〜０．７０Ｈｚであり、特に好ましくは０．１５〜０．４５Ｈｚである。振盪培養が０．０１Ｈｚ未満であると、細胞のサイズが大きくならず、目的の細胞凝集体が得られないため、好ましくない。また、振盪培養が１．００Ｈｚを超えると、細胞のサイズが大きくならず、目的の細胞凝集体が得られないため、好ましくない。
【００７０】
前記（１）工程の分化誘導は、幹細胞を、それぞれの分化細胞への分化に適した培地で培養することにより行うことができる。これらの分化誘導用の培地は公知のものも用いることができる。例えば、無血清の最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。また、前記いずれかの培地に、適当濃度の周知慣用の培地添加物を補充した培地（例えば、エス・クロン（Ｓ−Ｃｌｏｎｅ）培地（例えばＳＦ−Ｏ３；三光純薬））等が挙げられる。前記培地添加物としては、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子；ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン及びカナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース及びスクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル及びケイ素等の微量金属；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びＮ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；並びにアデノシン５‘−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、血清アルブミン、トランスフェリン及びラクトフェリン等が挙げられる。本発明に用いられる分化誘導用の培地は、上記のものに限定されない。また、これらの分化誘導用の培地は、骨芽細胞への分化誘導促進剤等を含んでいてもよい。
【００７１】
分化誘導用の培地の具体例としては、1００ｎＭ  デキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．２５ｍＭ  アスコルビン酸塩(ascorbate)及び１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）をＤＭＥＭ中に含有する培地(Pittenger MF et al., Science 284:143,1999)や、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１μＭ  デキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、５０μＭ  アスコルビン酸−２−リン酸、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン及び２５０ｎｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含有するα−ＭＥＭ(Egusa H, Schweizer FE, Wang CC, Matsuka Y, Nishimura I.  Neuronal differentiation of bone marrow-derived stromal stem cells involves suppression of discordant phenotypes through gene silencing.  J Biol Chem. 2005 Jun 24;280(25):23691-7.)等が挙げられる。
【００７２】
本発明の振盪培養は、特に限定されないが、図１に示されるようなシーソー型バイオリアクターを用いて行うことができる。また、振盪培養の角度は、特に限定されないが、水平方向に対して、２５°以内が好ましく、２０°以内がより好ましく、１５°以内がさらに好ましい。振盪培養の振幅は、特に限定されないが、例えば、０．１０〜２．０ｃｍ程度であってもよい。図１では、傾斜角は１０°であり、r（25 cm2 フラスコ半径）は２．５ｃｍであり、振幅は０．４３ｃｍである。
【００７３】
本（１）工程において、培養開始時の細胞濃度は、特に限定されないが、25 cm2培養フラスコを用いた場合には、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／フラスコ程度が好ましく、１×１０６〜７×１０６ｃｅｌｌｓ／フラスコ程度がより好ましい。
【００７４】
本（１）工程において、特に限定されないが、培養温度は、通常３３〜４０℃であり、３５〜３７℃が好ましい。また、（１）工程は、５％ＣＯ２下で行うのが好ましい。
【００７５】
振盪培養は、特に限定されないが、得られる細胞凝集体がより大きくなり、骨補填材として好適なサイズとなることから、５日以上行うことが好ましく、１０日以上がより好ましく、２０日以上がさらに好ましい。培養日数の上限値は特に限定されないが、十分なサイズが得られることから、１００日程度であってもよい。
【００７６】
前記（１）工程では、特に限定されないが、必要に応じて、培地に骨芽細胞への分化誘導促進因子を添加するのが好ましい。分化誘導促進剤は、上述のとおりである。
【００７７】
振盪培養後、細胞凝集体を、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の溶液に懸濁させて回収する。
【００７８】
（２）工程は、前記（１）工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程である。本工程により、上述の不活化細胞塊が得られる。本工程の不活性化の方法は、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥、加熱処理、高圧処理、酸又はアルカリ溶液処理、高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、ガス滅菌等が挙げられる。凍結乾燥について、条件は特に限定されず、公知の方法を使用できる。また、例えば、凍結乾燥の前に、予備凍結を行ってもよい。予備凍結の温度は、特に限定されないが、例えば、約−１２〜−２０℃が好ましい。凍結乾燥温度は、特に限定されないが、約−１００〜−５℃が好ましい。また、凍結乾燥圧力は、特に限定されず、例えば、６００Ｐａ以下が好ましく、５０Ｐａ以下がより好ましい。具体的な凍結乾燥条件としては、例えば、温度を−１０℃に固定して凍結乾燥開始と同時に気圧を徐々に５〜２０Ｐａまで下げていく方法が挙げられる。
【００７９】
本発明の骨再生剤は、前記工程で得られた不活化細胞塊を含んでいればよい。不活化細胞塊を生理食塩水で濡らして、固める等を行ってもよい。
【００８０】
本発明の骨再生剤の製造方法の他の一態様としては、（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養又は静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有する製造方法が挙げられる。
【００８１】
前記（１’）工程では、遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養又は静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導することにより、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る。
【００８２】
遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させる方法としては、特に限定されず、公知の方法を使用することができ、例えば、図２に示されるような、テトラサイクリンを用いる遺伝子発現制御システムを使用することができる。
【００８３】
骨形成に関与するタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、上述の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む成長因子等が挙げられる。ＢＭＰ以外の成長因子としては、例えば、FGF-2、TGFβ、PDGF、VEGF、I型コラーゲン等が挙げられる。ＢＭＰとしては、BMP2、BMP4が好適である。これらは１種単独でもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８４】
遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させる方法は、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主への遺伝子導入、形質転換体の培養及びテトラサイクリン遺伝子発現制御システムの場合にはドキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）の添加により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985), J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.）等に準じて行うことができる。
【００８５】
上述のように、骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させる方法を用いることによって、振盪培養でなくても、静置培養によって良好な骨再生剤を製造できる。一方で、骨形成タンパク質を過剰発現させる方法においても、振盪培養を用いてもよい。振盪培養は、上述のとおりである。
【００８６】
前記静置培養としては、特に限定されないが、培養温度は、通常３３〜４０℃であり、３５〜３７℃が好ましい。また、（１’）工程は、５％ＣＯ２下で行うのが好ましい。
【００８７】
本発明の他の態様として、上記説明した本発明の骨再生剤、即ち、幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含む骨再生剤を、組織再生を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与する工程を有することを特徴とする組織再生方法が挙げられる。
また、本発明の他の態様として、（１）幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養しながら石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、又は（１’）遺伝子操作によって骨形成タンパク質を過剰発現させた幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を含む方法により得られた骨再生剤を、組織再生を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与する工程を有することを特徴とする組織再生方法が挙げられる。
【００８８】
（１）、（１’）及び（２）工程は、上述のとおりである。投与される骨再生剤は、（２）工程で得られた不活化細胞塊のみを骨再生剤としてもよく、上述のように、本発明の効果を妨げない範囲で、増殖因子、骨形成タンパク質等の補助因子を含んでいてもよい。
【００８９】
骨再生剤の投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ウサギ、ネコ、イヌ等）が挙げられる。
特に、骨のような組織の再生を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳動物、中でも、骨損傷ないしは骨欠損を有するヒト又はヒト以外の哺乳動物を投与対象とすることができ、その骨損傷部ないしは骨欠損部に、骨再生剤を埋植などの方法で投与することができる。骨損傷又は骨欠損としては、例えば、骨折、関節内の損傷、骨腫瘍摘出痕、例えば関節固定手術のような手術による骨欠損、顎堤（歯槽骨）吸収による骨欠損、抜歯後の歯槽骨欠損（抜歯窩）などが挙げられる。
本発明の骨再生剤の投与量は、本発明の効果を損なわず薬剤学的有効量である限り特に限定されない。前記投与量は、投与対象、投与対象の体重、疾患、症状等により異なる。
【００９０】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【００９１】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。【００９２】
［実施例１］
１．マウスｉＰＳ細胞
実験には、成体マウス歯肉線維芽細胞にOct3/4、Sox2及びKlf4遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入して作製したｉＰＳ細胞株〔PLoS ONE, 5 (9): e12743, 2010〕を用いた。ｉＰＳ細胞は、組織培養６ウェルプレート（0.1%ゼラチンコート処理）に播種したSNLP76.7-4フィーダー細胞（マイトマイシンＣ処理：2.1×105 cells/well）上で、ＥＳ培地〔１５％ウシ胎児血清（invitrogen）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（invitrogen）、１×１０−４Ｍ  非必須アミノ酸（invitrogen）、１×１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（invitrogen）、５０Ｕ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（invitrogen）含有ＤＭＥＭ培地（ナカライテスク）〕を用いて維持・培養した。【００９３】
２．ｉＰＳ細胞胚様体の作製
組織培養６ウェルプレート中のｉＰＳ細胞が８０％コンフルエントに達した時点で、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理（５５０μｌ、室温、１〜３分間）によって全細胞を回収した。回収した全細胞を、ＥＳ培地（１０ｍＬ）を含む低接着性培養１０ｃｍディッシュに移し、２日間の浮遊培養を行うことにより、ｉＰＳ細胞の胚様体の形成を誘導した。
その後、遠心操作（３００ｒｐｍ，１分間）にてｉＰＳ細胞胚様体を回収し、１μＭレチノイン酸（all-trans retinoic acid：Sigma）含有ＥＳ培地（１０ｍＬ）を含む低接着性培養ディッシュ上に播種し、更に２日間の浮遊培養を行うことにより、ｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導した（Kawaguchi J：Methods Mol Biol 330: 135-148）。【００９４】
３．ｉＰＳ細胞胚様体の骨芽細胞への分化誘導
合計４日間の浮遊培養を終えた時点で、ｉＰＳ細胞胚様体を遠心操作（３００ｒｐｍ，１分間）にて回収し、骨芽細胞分化誘導培地〔１０％ウシ胎児血清（invitrogen）、０．１μＭデキサメタゾン（Sigma）、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（Sigma）及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸（Sigma）、100 units/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、250ng/ml アンホテリシンＢ（invitrogen）含有α−ＭＥＭ培地（ナカライテスク）〕に懸濁した。細胞懸濁液の細胞濃度を測定するために、懸濁液の一部を０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡで処理（３７℃，１０分間）し、細胞数をセルカウンター（商品名：Z1D Coulter Counter, Beckman Coulter社）にて計測した。残りの細胞懸濁液を用いて、浮遊培養用フラスコ（イワキ社：1103-025：表面処理なし・ベントキャップ付、培養面積２５ｃｍ２）の中で、１０ｍＬの骨芽細胞分化誘導培地に４×１０６個の細胞が含まれるよう播種した。
用意した培養フラスコを、シーソー型振盪機（Wave-SI:Taitec社）に設置し、傾斜角１０°、周期０．３３Ｈｚ（１往復／３秒）、振幅０．４３ｃｍにて揺らしながら、ｉＰＳ細胞胚様体を振盪培養した。培地交換は２〜３日毎に行い、培地交換の度に細胞凝集体を新しい培養フラスコで培養を継続した。【００９５】
４．ｉＰＳ細胞凝集体の不活化
振盪培養開始から３０日後に細胞懸濁液をすべて回収して１５ｍｌの遠沈管に移した。細胞懸濁液のｉＰＳ細胞凝集塊が自然沈殿するのを待って培養上清を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、１０ｍｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（20 mM, pH 6.0，スクロース 100 mg/ml添加）又はＰＢＳに、４℃で一晩浸漬した。翌日、細胞懸濁液からｉＰＳ細胞凝集塊を取り出して６ｃｍ細胞培養ディッシュに移し、−８０℃の冷凍庫内で一晩の予備凍結を行った。その後、ディッシュを凍結乾燥装置（商品名：JFD-320 Freeze Drying Device，JEOL社）に設置し、凝集塊となったｉＰＳ細胞を、温度を−１０℃に固定して気圧を一晩かけて徐々に６〜２０Ｐａまで下げていく方法で凍結乾燥を行うことで不活化し、不活化細胞塊を得て、骨再生剤とした。骨再生剤の入っているディッシュに蓋を被せてシールで密封し、防湿庫（ガラス製デシケーター）内で保管した。得られた骨再生剤の写真を図３に示す。【００９６】
［実施例２〜４］
振盪培養の期間を、１０日、２０日、４０日に変更した以外は、実施例１と同様にして、骨再生剤を得た。【００９７】
［実験例１］
実施例１〜４と同様に分化培養を行い、４０日間５日間隔で、位相差顕微鏡下にて細胞凝集体を写真撮影した。対照群（コントロール）として、振盪培養の代わりに、静置培養とする以外は、実施例１〜４と同様の方法で分化誘導を行い、上記と同様に細胞凝集体を写真撮影した。写真の一部を図４Ａに示す。撮影した画像上でランダムに選択した１０個の細胞凝集体が示す面積を、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフト（National Institutes of Health,米国）を用いて測定し、平均値および標準偏差を計算した。結果を図４Ｂに示す。【００９８】
振盪培養したｉＰＳ細胞凝集体の面積は経時的に増加し、３０日後にプラトーに達した。振盪培養３０日後の面積は培養開始時と比較して約２３倍増加した。一方、静置培養した場合にはｉＰＳ細胞凝集体の面積には４０日間で有意な増加を認めなかった。また、振盪培養を、１．０Ｈｚで行った場合も、静置培養と同様に、ｉＰＳ細胞凝集体の大きさを増加させなかった。【００９９】
以上の結果から、本実験の振盪培養は骨芽細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞凝集体の大きさを増加させることが明らかとなった。なお、振盪培養３０日後に計測した細胞凝集体の面積は、３８２，８７８〜１，２６９，４５６μｍ２（平均６８０，９８６μｍ２）であり、直径に換算すると約０．７〜１．２ｍｍ（平均約０．９ｍｍ）となる。市販の骨補填材の直径が０．５〜２ｍｍであることから、本実験の振盪培養法で得られた細胞凝集体は骨再生剤・骨補填材として適切な大きさを有している。【０１００】
［実験例２］
実施例１〜４と同様に分化培養を行い、分化誘導の培養開始から１０日後、２０日後、３０日後、４０日後のそれぞれにおいて、ｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム量を測定した。対照群（コントロール）として、振盪培養の代わりに、静置培養とする以外は、実施例１〜４と同様の方法で分化誘導を行って得られたｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム量も測定した。フラスコ内全てのｉＰＳ細胞凝集体を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍｌの０．５Ｍ  酢酸に室温下で一晩浸漬した。試料をホモジナイザー（破砕棒）で磨り潰し、遠心操作（２，３００ｇ，１０分）後に、回収した上清溶液のカルシウム濃度を、ＭＸＢ法（カルシウムＥ−テストワコー、和光純薬）を用いて、吸光度（ＯＤ：５９５ｎｍ）にて測定した。各試料群について３回の実験を行い、吸光度を１試料につき５回計測し、平均値及び標準偏差を計算した。結果を図５に示す。【０１０１】
振盪培養および静置培養したｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム量は経時的に有意に増加し、３０日後にプラトーに達した（P<0.01: ANOVA, Tukey-Kramer多重比較検定）。１０〜４０日すべての計測点において、振盪培養を行った場合のｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム量は、静置培養を行った場合と比較して有意に多かった（P<0.001: ANOVA, Tukey-Kramer多重比較検定）。培養４０日後のｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム量は、振盪培養を行った方が静置培養と比較して約３倍多かった。【０１０２】
以上の結果から、振盪培養は骨芽細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞凝集体のカルシウム産生を促進することが明らかとなった。【０１０３】
［実験例３］
実施例１〜４と同様に分化培養を行い、分化誘導の培養開始から１０日後、２０日後、３０日後、４０日後のそれぞれにおいて、培養フラスコ内のｉＰＳ細胞凝集体を全て回収し、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬）を用いて４℃で一晩固定した。細胞試料を固定後、蒸留水（５分間浸漬）で３回洗浄し、３０％〜１００％エタノールによる段階的脱水を行った。次に、細胞試料を乾燥機中に３７℃で１２時間静置した後の質量を測定した。対照群（コントロール）として、振盪培養の代わりに、静置培養とする以外は、実施例１〜４と同様の方法で分化誘導を行った。結果を図６に示す。【０１０４】
振盪培養及び静置培養したｉＰＳ細胞凝集体の質量は経時的に増加した。１０〜４０日すべての計測点において、振盪培養を行った場合のｉＰＳ細胞凝集体の質量は、静置培養を行った場合と比較して著明に大きかった。以上の結果から、振盪培養は骨芽細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞凝集体の質量を増加させることが明らかとなった。【０１０５】
［実験例４］
実施例１〜４と同様に分化培養を行い、分化誘導の培養開始から１０日後、２０日後、３０日後、４０日後のそれぞれにおいて、培養フラスコ内のｉＰＳ細胞凝集体を全て回収し、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬）を用いて４℃で一晩固定した。細胞試料を固定後、蒸留水（５分間浸漬）で３回洗浄し、３０％〜１００％エタノールによる段階的脱水を行った。次に、細胞試料を乾燥機中に３７℃で１２時間静置した。乾燥した細胞試料の濃度が２ｗｔ％になるように臭化カリウム（ＫＢｒ）を加え、ＦＴ−ＩＲ分析を行った。分析にはＦＴＩＲ−８３００（島津製作所）を用い、スキャン範囲：２，０００〜８００ｃｍ−１，分解能：１ｃｍ−１で積算５０回の赤外線吸収スペクトルパターンを解析した。結果を図７に示す。【０１０６】
ＦＴ−ＩＲ分析の結果、ｉＰＳ細胞の培養期間が長いほど、細胞試料にはアミノ酸の豊富な基質（AmI，AmII）の中にハイドロキシアパタイトに関連するリン酸基（P）および炭酸アパタイトに関連する炭酸基（C）の存在を示唆するピークが出現した。特に、３０〜４０日間培養したｉＰＳ細胞凝集体は、骨組織特異的なＦＴ−ＩＲの赤外線吸収スペクトルパターン（参照：Boskey A,ら. Biomaterials. 200; 28(15):2465-78のTable 1, Fig 1及びCambra-Moo OらJ Struct Biol. 2012 ;178(3):338-49のFig 6）を示した。【０１０７】
以上の結果から、骨芽細胞分化誘導培地中で３０日間以上振盪培養したｉＰＳ細胞凝集体は、骨組織に近い成分を有していることが明らかとなった。【０１０８】
［試験例１］
実施例の骨再生剤を用いて、図８に示されるように、骨欠損部に補填する動物実験を行った。
具体的には、10週齡雄Sprague-Dawleyラットの頭蓋骨の左右側に、直径５ｍｍの歯科用トレフィンバー１で頭蓋骨をくり抜くことで直径５ｍｍの骨欠損２を形成した。３０日間振盪培養したｉＰＳ細胞凝集体から作製した実施例１の骨再生剤８ｍｇに生理食塩水を数滴加え、各骨欠損部位に填入し、骨膜で被覆して頭皮を縫合した。比較例として、コラーゲンスポンジ（テルダーミス・コラーゲン単層タイプ：オリンパステルモ社（比較例１））あるいはオスフェリオン（商品名、直径０．５〜１．５ｍｍ：オリンパステルモ社（比較例２））の填入、あるいは無処置（填入なし（比較例３））を用いた。【０１０９】
飼育３、５、８週間後に頭蓋骨を摘出し、マイクロＣＴ装置（実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ  Ｒ＿ｍＣＴ２：Ｒｉｇａｋｕ社）にて撮影後，骨構造解析ソフト（ＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ：ラトックシステムエンジニアリング株式会社）を用いて骨密度を測定した。さらに、頭蓋骨を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で浸漬固定した後に脱灰し、パラフィン包埋した試料から３μｍの厚さの切片を作製した。切片試料にヘマトキシン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を施し、組織学的観察を行った。結果を図９〜図１２に示す。また、マイクロＣＴ解析の結果を図１３に示す。【０１１０】
図９は、骨補填手術から３週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。図１０は、骨補填手術から３週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。図１１は、骨補填手術から５週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。図１２は、骨補填手術から８週間後に摘出された頭蓋骨のＨＥ染色の結果を示す。【０１１１】
図９から、骨補填手術から３週間後には、本発明の骨再生剤では、填入しない場合に比べて、厚みをもった新生骨が形成されており、垂直的な骨再生が可能となったことが確認された。図１０から、骨補填手術から３週間後には、本発明の骨再生剤では、コラーゲンスポンジに比べて、２倍以上の厚みをもった新生骨が形成されたことが確認された。また、術後何れの週においても、骨再生剤の導入による腫瘍化は認められなかった。
図１１から、骨補填手術から５週間後には、本発明の骨再生剤を用いると、コラーゲンスポンジに比べて、填入部は垂直的な厚みを保った状態で適切に生体の骨に置換され、良好な骨組織再生が可能となることが確認された。
図１２から、本発明の骨再生剤を用いると、骨補填手術から８週間後には、填入部は垂直的な厚みを保った状態で完全に新生骨に置換され、成熟した皮質骨を形成したことが確認された。一方、オスフェリンを用いた場合は、移植手術から８週間経っても、骨補填材は新生骨に置換されずに残存しており、骨再生の厚み及び皮質骨の形成は十分ではない。【０１１２】
図１３から、本発明の骨補填材を用いると、補填後の骨欠損部位の骨密度は補填後に経時的に増加することが確認された。これは、骨欠損部位への補填後に本発明の骨補填材が確実に新生骨に置換されていることを示している。【０１１３】
上記のように、本発明の骨再生剤は、腫瘍を形成することなく、垂直的に骨を再生し、厚みをもった骨再生を可能にすることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明の骨再生剤は、人工骨・骨補填材、骨折治療材料、関節治療材等の医学領域や、歯周病における骨補填材・抜歯窩における歯槽骨吸収阻害剤・インプラント治療における歯槽再生剤等の歯学領域において有用である。
【符号の説明】
【０１１５】
１    トレフィンバー
２    骨欠損
３    コラーゲンスポンジ
４    骨再生剤（iPS細胞製剤）
５    オスフェリオン
６    未熟骨
７    新生骨
８    厚みをもった骨再生
９    新生骨に取り囲まれた骨再生剤（iPS細胞製剤）
１０  繊維性組織
１１  新生骨に置換されている骨再生剤（iPS細胞製剤）
１２  新生骨に置換されつつあるオスフェリオン
１３  成熟した皮質骨
１４  填入なし
【図１】
2015064705.tif 000006
【図２】
2015064705.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月7日(2015.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上の幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含むことを特徴とする骨再生剤。
【請求項２】
少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を不活性化してなる不活化細胞塊を含むことを特徴とする請求項１記載の骨再生剤。
【請求項３】
少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体が、幹細胞を、石灰化物を産生する細胞に分化誘導して得られることを特徴とする請求項２記載の骨再生剤。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨再生剤。
【請求項７】
不活化細胞塊が、ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルにおいて、（１０００±２００ｃｍ−１）付近のリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のピーク、（１５５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドＩＩ（ａｍｉｄｅ  ＩＩ）のピーク、及び（１６５０±１００ｃｍ−１）付近のアミドＩ（ａｍｉｄｅ  Ｉ）のピークを有するものであることを特徴とする請求項１〜３、及び６のいずれか１項に記載の骨再生剤。
【請求項８】
（１）ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上の幹細胞を０．０１〜１．００Ｈｚで振盪培養することにより石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有することを特徴とする請求項１〜３及び６〜７のいずれか１項に記載された骨再生剤の製造方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
不活性化処理が、凍結乾燥処理であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項８又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
（１）工程の振盪培養において、骨芽細胞への分化誘導促進因子を添加することを特徴とする請求項８、１１、又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
骨芽細胞への分化誘導促進因子が、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
振盪培養を３０日以上行うことを特徴とする請求項８、及び１１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
（１’）遺伝子操作によって骨形成に関与するタンパク質を過剰発現させた、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる１種以上の幹細胞を、振盪培養あるいは静置培養をして、石灰化物を産生する細胞に分化誘導し、少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含有する細胞凝集体を得る工程、及び（２）前記工程で得られた細胞凝集体を不活性化処理する工程を有することを特徴とする請求項１〜３及び６〜７のいずれか１項に記載された骨再生剤の製造方法。
【請求項１７】
不活性化処理が、凍結乾燥処理であることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
細胞外基質が、コラーゲンタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2015064705.tif 000019
2015064705.tif 000020
2015064705.tif 000021
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