(57)【要約】本発明は、PRRSワクチンの高性能化のために、GP5抗原を最適化及び高蓄積化することを課題とし、豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウィルスのGlycoprotein 5 (GP5)のウィルス外領域(ectGP5)とアジュバントタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
2016021276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウィルスのGlycoprotein 5 (GP5)のウィルス外領域(ectGP5)とアジュバントタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ウィルス外領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３０位のアスパラギンから５３位のスレオニンからなるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記GP5が欧州型または北米型である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記GP5が欧州型I、II型および北米型II、III、IV型のいずれかの型である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ウィルス外領域は、配列番号３、６、２１〜３４で示されるアミノ酸配列または配列番号６との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記アジュバントタンパク質が大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB)および／または2型志賀毒素サブクラスｅ（Ｓｔｘ２ｅ）のＢサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ウィルス外領域及び前記アジュバントタンパク質がペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸個数が５〜２５個である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーがPG12（配列番号５５）、PG17（配列番号５７）、もしくはPG22（配列番号５９）、または配列番号５５、５７、もしくは５９との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列で示される、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号６１のアミノ酸配列または配列番号６１との同一性が８０％以上のアミノ酸配列で示される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
【請求項１２】
請求項１１に記載のDNAを含むDNA構築物。
【請求項１３】
豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウィルスのGlycoprotein 5 (GP5) コードするDNA及びMatrix protein (M)をコードするDNAを含み、各DNAはそれぞれプロモーター及びターミネーターと連結された、DNA構築物。
【請求項１４】
前記GP5をコードするDNAは、配列番号１、７〜２０で示されるアミノ酸配列または配列番号１との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列をコードするDNAであり、前記GP5はPRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、請求項１３に記載のDNA構築物。
【請求項１５】
前記GP5をコードするDNAは、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３２位のセリンがアラニンに置換され、かつ、３３位のアスパラギン酸がセリンに置換されているアミノ酸配列をコードするDNAを含む、請求項１３または１４に記載のDNA構築物。
【請求項１６】
前記Mが欧州型または北米型である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のDNA構築物。
【請求項１７】
前記Mが欧州型I、II型および北米型II、III、IV型のいずれかの型である、請求項１６に記載のDNA構築物。
【請求項１８】
前記Mは、配列番号３５、３７〜５０で示されるアミノ酸配列または配列番号３５との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のDNA構築物。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項２１】
前記形質転換体が植物である、請求項２０に記載の形質転換体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の形質転換体またはそれから得られたタンパク質を含むPRRS防除剤。
【請求項２３】
請求項２２に記載の防除剤をブタに投与することを特徴とするPRRSの治療または予防方法。
【請求項２４】
小胞輸送経路を備えた真核生物を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換することを特徴とする、真核生物の同一細胞内でGP5とMを発現させる方法。
【請求項２５】
小胞輸送経路を備えた真核生物を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換して、該真核生物の同一細胞内でGP5とMを発現させることを含む、PPRS防除剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）に対して防除、すなわち、予防および治療効果を有する融合タンパク質、これをコードするDNAを含むDNA構築物、PRRSウィルス抗原をコードするDNAを含むDNA構築物、これらを含むベクター及び形質転換体に関する。本発明はまた、PRRSウィルス抗原を発現する方法、及びPRRSウィルス抗原を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は養豚業界で最も問題となっている疾病であり、日本国内での推定損失額は年間280億円にも上ると試算されている。PRRSは仔豚では繁殖障害、母豚では流産を引き起こす。PRRSの原因となるPRRSウィルス（PRRSV）は免疫系細胞のマクロファージに感染する性質を持つため、豚の基礎的な免疫力の低下を引き起こす。そのため、他の病原細菌やウィルスの感染を誘発するため被害が甚大なものとなる。近年は中国をはじめとした海外において、高病原性PRRSVの出現が報告されており、このウィルスは単独感染でも重篤な被害を引き起こす。
現在、海外メーカーからワクチンが市販されているが、効果が低いのが現状である。理由としてPRRSVの多様性が挙げられる。PRRSVは大きくType1(欧州型)とType2(北米型)に分けられ、各タイプはさらにサブタイプに分類される。日本国内では北米型ウィルスを基に作製された弱毒ワクチンが市販されているが、多型に対する有効性は疑問視されている。また、海外においても欧州型ウィルスをもとにしたワクチンが市販されているが、多型への効果は低い。また弱毒化されているとはいえ、ウィルスそのものを用いた場合には病原性の復帰を否定できないという問題もある。【０００３】
非特許文献１では、遺伝子組換え植物（バナナ）を用いてPRRSV抗原の全長Glycoprotein 5 (GP5)を生産し、ブタへの経口投与によりPRRSV予防効果を確認している。しかしながら、GP5の蓄積量は〜250 ng/g湿重量（葉）程度と低く、ワクチン効果発揮のためには50 g湿重量もの葉を三回投与する必要があった。
非特許文献２では、Mタンパク質を発現するトウモロコシが作製され、当該トウモロコシのマウス経口投与によって中和抗体を誘導可能であることが示されている。しかしながら、非特許文献２では、実際の対象動物であるブタでの効果確認試験は行われていないし、GP5とMタンパク質を別々に発現させることも記載されていない。
特許文献１では、GP5とMタンパク質を含む非感染性のウィルス様粒子が開示されている。特許文献１では、GP5とMタンパク質以外のエンベロープタンパク質もウィルス様粒子に含まれている。また、特許文献１では、タンパク質の発現様式は、GP5とMが別の転写単位として転写されるのではなく、一本の転写産物から複数種類のPRRSVタンパク質が翻訳されている。さらに、特許文献１では、哺乳類の培養細胞を宿主としてウィルス様粒子が生産されるため、ワクチンとして商業化するためにはコストと生産性の面において問題があった。
非特許文献３では、GP5のエピトープ領域のみを抗原として用いて、PRRSワクチン効果があることが確認されている。しかしながら、GP5の蓄積量は低く、ワクチン効果を発揮させるには大量生産が必要であるという課題があった。
非特許文献４では、大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB)と全長GP5を融合したワクチン抗原がタバコで発現されている。しかしながら、全長GP5のみを発現するタバコと比較して性能が有意に優れていることはなく、ワクチンの高性能化のためにはLTBと融合するGP5の最適化等の改良が必要であった。
このように、PRRSワクチンの高性能化のために、GP5抗原の最適化、高蓄積化が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許公開第1156111号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chan et al., Plant Biotechnology J. 11 (2013) 315-324
【非特許文献２】Hu et al., Vaccine (2012) 68-74
【非特許文献３】Ostrowski et al., J. Virology 2002, 4241-4250
【非特許文献４】Min-Yuan Chia et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 2011, 140, 215-225
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、PRRSワクチンの高性能化のために、GP5抗原を最適化及び高蓄積化することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、LTBとGP5ウィルス外領域(ectGP5)を融合することで、植物体においてGP5抗原を効果的に蓄積できることを見出した。
また、本発明者らは、GP5ウィルス外領域を含む全長GP5タンパク質とMタンパク質を別々の転写単位として共発現させることにより、単独発現の場合よりもGP5抗原の蓄積量が顕著に改善されることを見出した。
本発明者らは、このようにして本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウィルスのGlycoprotein 5 (GP5)のウィルス外領域(ectGP5)とアジュバントタンパク質を含む融合タンパク質。
（２）前記ウィルス外領域は、配列番号１のアミノ酸配列における３０位のアスパラギンから５３位のスレオニンからなるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、（１）に記載の融合タンパク質。
（３）前記GP5が欧州型または北米型である、（１）または（２）に記載の融合タンパク質。
（４）前記GP5が欧州型I、III型および北米型II、III、IV型のいずれかの型である、（３）に記載の融合タンパク質。
（５）前記ウィルス外領域は、配列番号３、６、２１〜３４で示されるアミノ酸配列または配列番号６との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、（１）に記載の融合タンパク質。
（６）前記アジュバントタンパク質が大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB) および／または2型志賀毒素サブクラスｅ（Ｓｔｘ２ｅ）のＢサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（７）前記ウィルス外領域及び前記アジュバントタンパク質がペプチドリンカーを介して連結されている、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（８）前記ペプチドリンカーのアミノ酸個数が５〜２５個である、（７）に記載の融合タンパク質。
（９）前記リンカーがPG12（配列番号５５）、PG17（配列番号５７）、もしくはPG22（配列番号５９）、または配列番号５５、５７、もしくは５９との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列で示される、（７）または（８）に記載の融合タンパク質。
（１０）配列番号６１のアミノ酸配列または配列番号６１との同一性が８０％以上のアミノ酸配列で示される、（９）に記載の融合タンパク質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
（１２）（１１）に記載のDNAを含むDNA構築物。
（１３）豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウィルスのGlycoprotein 5 (GP5) コードするDNA及びMatrix protein (M)をコードするDNAを含み、各DNAはそれぞれプロモーター及びターミネーターと連結された、DNA構築物。
（１４）前記GP5をコードするDNAは、配列番号１、７〜２０で示されるアミノ酸配列または配列番号１との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列をコードするDNAであり、前記GP5はPRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、（１３）に記載のDNA構築物。
（１５）前記GP5をコードするDNAは、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３２位のセリンがアラニンに置換され、かつ、３３位のアスパラギン酸がセリンに置換されているアミノ酸配列をコードするDNAを含む、（１３）または（１４）に記載のDNA構築物。
（１６）前記Mが欧州型または北米型である、（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のDNA構築物。
（１７）前記Mが欧州型I、II型および北米型II、III、IV型のいずれかの型である、（１６）に記載のDNA構築物。
（１８）前記Mは、配列番号３５、３７〜５０で示されるアミノ酸配列または配列番号３５との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる、（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のDNA構築物。
（１９）（１２）〜（１８）のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクター。
（２０）（１９）に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
（２１）前記形質転換体が植物である、（２０）に記載の形質転換体。
（２２）（２１）に記載の形質転換体またはそれから得られたタンパク質を含むPRRS防除剤。
（２３）（２２）に記載の防除剤をブタに投与することを特徴とするPRRSの治療または予防方法。
（２４）小胞輸送経路を備えた真核生物を、（１３）〜（１８）のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換することを特徴とする、真核生物の同一細胞内でGP5とMを発現させる方法。
（２５）小胞輸送経路を備えた真核生物を、（１３）〜（１８）のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換して、該真核生物の同一細胞内でGP5とMを発現させることを含む、PPRS防除剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の融合タンパク質をコードするDNAを含むベクターまたは本発明のDNA構築物を含むベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより、先行技術文献に記載されるワクチンと比べて、植物細胞内での抗原蓄積・防除（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）性能が顕著に改善される。
本発明の融合タンパク質またはこれをコードするDNA構築物により、PRRSを予防または治療することができる。健康な状態のブタに本発明の融合タンパク質をコードするDNAを含むベクターまたは本発明のDNA構築物を含むベクターで形質転換した形質転換植物を与えると、ワクチン効果や免疫賦活剤としての効果が期待できる。
本発明では、可食植物にタンパク抗原を高レベルで蓄積させ経口投与するため、既存のワクチンよりも、省コスト化、省力化、ブタのストレス軽減による生産性の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】LTB融合ectGP5をコードするDNAを含むベクターの概略図である。ERは小胞体、Apoはアポプラスト、Vacは液胞に輸送されるようにシグナル配列が付加されていることを示す。
【図２】PRRSウィルスの全長エンベロープタンパク質（GP5及びM）をコードするDNAを含むベクターの概略図である。
【図３】本発明のLTB融合ectGP5のタバコ培養細胞またはレタス細胞における一過性発現を示す（電気泳動写真）。
【図４】本発明のLTB融合ectGP5のタバコ培養細胞の安定形質転換体における発現を示す（電気泳動写真）。
【図５】本発明のDNA構築物によってコードされる全長エンベロープタンパク質（GP5、GP4、及びM）のタバコ培養細胞の安定形質転換体における発現を示す（電気泳動写真）。
【図６】レタスにおけるLTB融合ectGP5および全長エンベロープタンパク質（GP5及びM）の蓄積を示す（電気泳動写真）。
【図７】形質転換レタスのブタへの経口投与によるPRRV予防効果を示す。陰性対照には空ベクターレタスを投与した。攻撃初日から剖検時（攻撃後３週間目）までの体重増加率（％）を示す。
【図８】PRRSウィルスのサブタイプ、株の名称、発見場所、年、全長GP5及びectGP5並びにMのEMBLタンパク質の番号及び配列番号の一覧を示す。
【図９】各種全長GP5のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１０】各種ectGP5のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１１】各種全長Mのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１２】LTB融合ectGP5（NAは北アメリカ型、EUは欧州型）をコードするDNAを含むベクターの概略図である。２，４以外は糖鎖が付加されている。また、８，９はStx2eBも付加されている。
【図１３】酵母におけるLTB融合ectGP5の蓄積を示す（電気泳動写真）。○は糖鎖が付加されない組み換えタンパク質のバンドを、星印は糖鎖が付加された組み換えタンパク質のバンドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜GP5ウィルス外領域とアジュバントタンパク質を含む融合タンパク質とそれをコードするDNA構築物（第１のDNA構築物）＞
本発明の融合タンパク質は、PRRSウィルスのGlycoprotein 5 (GP5)のウィルス外領域(ectGP5)とアジュバントタンパク質が融合されている。
本発明のectGP5とアジュバントタンパク質との融合タンパク質は、好ましくは、遺伝子組換え技術によって作られたタンパク質で、２種類以上のタンパク質遺伝子（コード領域）が読み枠を合わせて連結され、連続的に転写・翻訳されることにより、１つのタンパク質を形成したものである。本発明に用いる融合タンパク質は、タンパク質同士が直接融合していても良いし、ペプチドリンカーを介して結合していてもよい。
【００１２】
本発明で用いるPRRSVは、Type1(欧州型)とType2(北米型)どちらでもよい。北米型についてはさらにI〜VI型に分けられる。日本国内ではType2(北米型)ウィルスを使用するのが好ましい。特にType1(欧州型)のＩ、III型を使用することが好ましい。またType2(北米型)のII、III、IV型ウイルスを使用するのが好ましい。
GP5はPRRSウィルスのエンベロープタンパク質の１つであり、GP5にはウィルス外領域(ectGP5)が含まれる。ectGP5は、例えば、Ostrowski et al., Journal of virology (2002)76:4241-4250に記載されている。本発明において、ectGP5は、好ましくは、PRRSウィルスに対する中和抗体を誘導し得るエピトープ領域である。本発明において、ectGP5は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３０位のアスパラギンから５３位のスレオニンを含む領域がより好ましい。
ectGP5のアミノ酸配列は、例えば、EDRD-I株由来の配列番号３によって示されるアミノ酸配列であり、その塩基配列は、配列番号４によって示される。配列番号３の１５位と２２位のアスパラギンには、N-結合型糖鎖が付加される。しかし、本発明において、糖鎖付加部位のアミノ酸は糖鎖が付加されないように置換されてもよい。
ectGP5のアミノ酸配列は、EDRD-I株以外の株に由来する配列番号２１〜３４によって示される配列であってもよい。これらの配列が由来する株の名称等は、図８に記載されている。また、各種ectGP5のアミノ酸配列のアライメントを図１０に示す。配列番号６と配列番号２１〜３４との同一性％はそれぞれ、79、83、79、83、79、92、86、86、75、71、86、79、86、92％である。
【００１３】
ectGP5はPRRSウィルスに対する予防効果を誘導することができる限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３０位のアスパラギンから５３位のスレオニンを含む領域または配列番号３で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。ectGP5の説明において、前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。またectPG5とは、上記配列との同一性が７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であり、PRRSウイルスの予防効果を誘導する機能を保持するものを含む。
本発明において、配列番号３の３位のセリンがアラニンに置換され、かつ、４位のアスパラギン酸がセリンに置換されている、配列番号６のアミノ酸が好ましい。また、ectGP5は、配列番号６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ上記機能を保持するものであってもよい。
【００１４】
本発明において使用されるアジュバントタンパク質としては、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導し得る機能を補助または増強するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌性下痢の原因となる毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性毒素の大腸菌易熱性毒素（LT）が挙げられる。LTは、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット（LTA）は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット(LTB)は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与し、粘膜アジュバント作用を有することが知られている。
LTBは、粘膜アジュバント作用を有する限り、それぞれ、配列番号５３で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、LTBにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。配列番号５３で表されるアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAL55672として登録されている。
また、LTBは、それぞれ、配列番号５３で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつアジュバント作用を有するものであってもよい。
【００１５】
大腸菌易熱性毒素のBサブユニットの９０位（すなわち、配列番号５３の９０位）はアスパラギンであり、真核生物の小胞輸送経路を用いて発現した場合には糖鎖が付加される。本発明においては、９０位のアスパラギンがセリンに置換されており、糖鎖が付加されていないものを用いた。９０位がセリン残基であるLTBサブユニットタンパク質の説明において、「数個」とは、配列番号５３で表されるアミノ酸配列の第９０位のセリン残基以外の位置で、好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。
また、９０位がセリン残基であるLTBサブユニットタンパク質は、配列番号５３で表されるアミノ酸配列の９０位に対応する位置がセリンである以外は、配列番号５３で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００１６】
上記のように、本発明の融合タンパク質は、ectGP5及びアジュバントタンパク質の融合タンパク質であり、本発明のDNA構築物は、ectGP5及びアジュバントタンパク質の融合タンパク質をコードするDNAを含むため、GP5ウィルス外領域の免疫原性を上昇させることができる。
【００１７】
本発明で用いるワクチンにおける、PRRSウィルスに対する予防効果の誘導とは、ワクチンを投与していない動物に対して、ワクチン投与した動物のPRRSに対する臨床スコアが改善され、例えば、体重が１．２倍以上増加していることを言う。本発明において、LTBと融合したectGP5抗原は、全長GP5とLTBを融合させた場合と比較して、例えば、10倍、100倍、400倍以上、蓄積量が増加している。
【００１８】
なお、アジュバントタンパク質はＷＯ２００９／００４８４２に記載されたような志賀毒素のサブユニットタンパク質でもよい。志賀毒素（Ｓｔｘ）は、腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、１型（Ｓｔｘ１）及び２型（Ｓｔｘ２）に分けられる。Ｓｔｘ１は、ａ〜ｄのサブクラスに、Ｓｔｘ２はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。このうち、Ｓｔｘ２ｅのＢサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）がアジュバントタンパク質としては特に好ましく、Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）としては配列番号１８７のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、Ｓｔｘ２ｅＢは、Ａｓｎ７３（すなわち、配列番号１８７のアミノ酸配列の５５位のＡｓｎ残基）がＳｅｒに置換されている変異体や、特開2012-019719に開示されたような変異体でもよい。さらに、Ｓｔｘ２ｅＢは、配列番号１８７で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつアジュバント作用を有するものであってもよい。
アジュバントはＬＴＢとＳｔｘ２ｅＢの組み合わせでもよい。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、GP5ウィルス外領域及びアジュバントタンパク質がリンカーを介して連結されている。
本発明の融合タンパク質において、GP5ウィルス外領域とアジュバントタンパク質とが融合される順序は、いずれが先であってもよい。
【００２０】
本発明で用いるペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、好ましくは５〜２５個、さらに好ましくは１０〜２２個、より好ましくは１２〜２２である。また、本発明で用いるペプチドリンカーにおいて、好ましくは、プロリンの含有率が２０〜２７％、より好ましくは、２０〜２５％である。
ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開ＷＯ2009/133882号パンフレットに記載されている。
本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG12)または配列番号５５（PG12）と同一性が８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するペプチド、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG17) または配列番号５７（PG17）と同一性が８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するペプチド、及び配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG22) または配列番号５９（PG22）と同一性が８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するペプチドである。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、GP5ウィルス外領域とアジュバントタンパク質が、PG12（配列番号５５）を介して連結されていることがより好ましい。本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、配列番号６１で表される。
本発明の融合タンパク質は、大腸菌易熱性毒素（LT）Aサブユニットを含んでいてもよいが、Aサブユニットを含む場合には、Aサブユニットは無毒化されていることが好ましい。
前記PG12、PG17及びPG22などのペプチドを、前記融合タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該融合タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
【００２２】
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、そのアミノ末端に、植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されている。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した融合タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、バラ科（Rosaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、オランダイチゴ属（Fragaria）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、オランダイチゴ（Fragaria×ananassa）、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ−ＤグルカンエキソヒドロラーゼをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号６４で表される。
また、酵母で発現させる場合は、インベルターゼ分泌シグナルなど、酵母で機能する分泌シグナルを使用してもよい。
【００２３】
さらに、本発明の融合タンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された融合タンパク質を、小胞体型（ER）の融合タンパク質ともいい、該小胞体型の融合タンパク質をコードするDNA構築物を、小胞体型のDNA構築物ともいう。小胞体型の融合タンパク質は、真核生物で効率良く蓄積する報告例が多数ある。
本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、カルボキシル末端には小胞体残留シグナルペプチドまたは液胞移行シグナルペプチドのいずれも付加されていない融合タンパク質を、アポプラスト型（Apo）の融合タンパク質ともいい、該アポプラスト型の融合タンパク質をコードするDNA構築物を、アポプラスト型のDNA構築物ともいう。
本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に液胞移行シグナルペプチドが付加された融合タンパク質を、液胞型（Vac）の融合タンパク質ともいい、該液胞型の融合タンパク質をコードするDNA構築物を、液胞型のDNA構築物ともいう。
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチドまたは液胞移行シグナルペプチドが付加されている。好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列（配列番号６５）を利用することができる。好ましい液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、VSD配列（配列番号６６）を利用することができる。
【００２４】
本発明の融合タンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。遺伝子工学的に生産する方法については、後述する。
【００２５】
本発明の第１のDNA構築物は、本発明の融合タンパク質をコードするDNAを含むことを特徴とする。
すなわち、本発明で用いる第１のDNA構築物は、PRRSウィルスのGP5ウィルス外領域をコードするDNA、及びアジュバントタンパク質をコードするDNA、好ましくは、大腸菌易熱性毒素のBサブユニットをコードするDNAを含む。前記ペプチドリンカーをコードするDNAは、例えば配列番号５６(PG12)、配列番号５８(PG17)、配列番号６０(PG22)で表される。大腸菌易熱性毒素をコードするDNAとして、例えばBサブユニット(Asn90)をコードするDNA（配列番号５４）が挙げられる。前記GP5ウィルス外領域をコードするDNA、及び大腸菌易熱性毒素などのアジュバントタンパク質をコードするDNAは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
【００２６】
GP5ウィルス外領域をコードするDNA及び大腸菌易熱性毒素をコードするDNAは、例えば、配列番号３４、５４の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各タンパク質を生産するウィルス及び細菌より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより合成することもできる。
本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号６２で表される。
【００２７】
本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、配列番号６２の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのDNAどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのDNAがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのDNAがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば2×SSC（300mM NaCl、30mM クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは0.1×SSC（15mM NaCl、1.5mM クエン酸）、６０℃が挙げられる。
【００２９】
＜GP5及びMをコードするDNAを含むDNA構築物（第２のDNA構築物）＞
本発明のDNA構築物の第２の態様は、PRRVウィルスのGlycoprotein 5 (GP5)及びMatrix protein (M)をコードするDNAを含み、GP5及びMは各々プロモーター及びターミネーターのセットと連結され、別々の転写単位として発現される。
本発明のGP5及びMをコードするDNA構築物は、各々プロモーター及びターミネーターのセットと連結されているため、GP5及びMのタンパク質遺伝子（コード領域）が連結されておらず、別々に翻訳されることにより、別々のタンパク質を形成する。
本発明のGP5及びMをコードするDNA構築物は、GP5をコードするDNA並びにそのプロモーター及びターミネーターのセットと、MをコードするDNA並びにそのプロモーター及びターミネーターのセットが連結されて１つのDNA構築物となっていてもよい。あるいは、本発明のGP5及びMをコードするDNA構築物は、GP5をコードするDNA並びにそのプロモーター及びターミネーターのセットと、MをコードするDNA並びにそのプロモーター及びターミネーターのセットが連結されていない、別々のDNA構築物であってもよい。
【００３０】
GP5はPRRSウィルスのエンベロープタンパク質の１つであり、GP5にはウィルス外領域(ectGP5)が含まれる。本発明において、GP5は全長タンパク質であることが好ましいが、全長タンパク質でなくてもよく、部分配列であってもよい。
GP5のアミノ酸配列は、例えば、EDRD-I株に由来する配列番号１によって示され、その塩基配列は、配列番号２によって示される。配列番号１の３０位、４４位、５１位のアスバラギンには、N-結合型糖鎖が付加される可能性がある。しかし、本発明において、糖鎖付加部位のアミノ酸は糖鎖が付加されないように置換されてもよい。
GP5のアミノ酸配列は、EDRD-I株以外の株に由来する配列番号７〜２０によって示される配列であってもよい。これらの配列が由来する株の名称等は、図８に記載されている。また、GP5のアミノ酸配列のアライメントを図９に示す。配列番号５と配列番号７〜２０との同一性％はそれぞれ、89、89、89、89、88、91、57、56、63、55、57、60、60、57％である。
【００３１】
GP5はウィルス外領域(ectGP5)を含む限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。GP5の説明において、前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、GP5は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ上記機能を保持するものであってもよい。
さらに、GP5は、配列番号１において３３位のアスパラギン酸がセリンに置換された配列、または、配列番号１において３２位のセリンがアラニンに置換され、かつ、３３位のアスパラギン酸がセリンに置換された配列（配列番号５）と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ上記機能を保持するものであってもよい。
【００３２】
Matrix protein (M)はPRRSウィルスのエンベロープタンパク質の１つであり、MにもPRRSウィルスに対する予防効果を誘導し得る領域が含まれる。MはGP5とジスルフィド結合を形成する。本発明において、Mは全長タンパク質であることが好ましいが、全長タンパク質でなくてもよく、部分配列であってもよい。
Mのアミノ酸配列は、例えば、配列番号３５によって示され、その塩基配列は、配列番号３６によって示される。
Mのアミノ酸配列は、EDRD-I株以外の株に由来する配列番号３７〜５０によって示される配列であってもよい。これらの配列が由来する株の名称等は、図８に記載されている。また、Mのアミノ酸配列のアライメントを図１１に示す。配列番号３５と配列番号３７〜５０との同一性％はそれぞれ、96、96、96、96、97、95、81、81、81、78、82、82、82、81％である。
MはPRRSウィルスに対する予防効果を誘導できる限り、好ましくは、PRRSウィルスに対する予防効果を誘導でき、かつ、GP5とジスルフィド結合できる限り、配列番号３５で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Mにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Mは、配列番号３５で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ上記機能を保持するものであってもよい。
【００３３】
上記のように、本発明の第２のDNA構築物は、GP5及びMを別々の転写単位としてコードするDNAを含むため、GP5ウィルス外領域を含むGP5及びMを効率的に産生することができる。また、本発明の第２のDNA構築物は、特許文献１のウィルス粒子とは異なり、ウィルス粒子を使用していないため、病原性を回復するおそれはない。また、MとGP5以外の抗体を誘導する可能性が高いウイルス粒子とは異なり、選択的にMとGP5を発現させることができる。よって、マクロファージに取り込まれた後に複製してダメージを与える可能性が高いウィルス粒子とは異なり、ワクチンとしての効果が高い。
【００３４】
本発明で用いる第１及び第２のDNA構築物において、好ましくは、前記融合タンパク質をコードするDNAまたは前記GP5及びMをコードするDNAが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明で用いるDNA構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記融合タンパク質またはGP5及びMが生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのDNAが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
【００３５】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ATG、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、バラ科（Rosaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、オランダイチゴ属（Fragaria）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、オランダイチゴ（Fragaria×ananassa）、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）（配列番号６７）を用いることができ、翻訳開始点上流３塩基を改変したNtADH5'UTR領域（NtADHmod 5'UTR）（配列番号６８）を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開2012-19719号公報および国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００３６】
また、配列番号６８の塩基配列で表されるような前記NtADHmod 5'UTRは、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記NtADHmod 5'UTRと好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているDNAを使用してもよい。
【００３７】
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてGUS（β−グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
【００３８】
本発明で用いる融合タンパク質をコードする第１のDNA構築物は、例えば、配列番号６９〜７１で表される塩基配列を有する（図１）。
配列番号６９(ER LTB-ectGP5)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、LTBタンパク質（変異型Asn90Ser）およびectGP5タンパク質をPG12を介して連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端にHAタグ及び小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７０(Apo LTB-ectGP5)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、LTBタンパク質（変異型Asn90Ser）およびectGP5タンパク質をPG12を介して連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端にHAタグを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７１(Vac LTB-ectGP5)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、LTBタンパク質（変異型Asn90Ser）およびectGP5タンパク質をPG12を介して連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端にHAタグ及び液胞移行シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７２(ER LTB)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、LTBタンパク質（変異型Asn90Ser）およびPG12を連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端にHAタグ及び小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
【００３９】
本発明で用いる全長エンベロープタンパク質をコードするDNAを含む第２のDNA構築物は、例えば、配列番号７３〜７８で表される塩基配列を有する（図２）。
配列番号７３(GP5-HA)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、カルボキシル末端にHAタグを付加したGP5タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７４(GP5-Flag)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、カルボキシル末端にFlagタグを付加したGP5タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７５(M-YFP-HA)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号６８）に、カルボキシル末端にYFPタグ及びHAタグを付加したMタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号７６(GP5-HA/M-YFP-HA)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、上記GP5-HA及びM-YFP-HAの各々について、下記のカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター及びHSPT878ターミネーターを転写単位として使用し、互いに連結した組み換えベクターである。
配列番号７７(GP5-Flag/M-YFP-HA)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、上記GP5-Flag及びM-YFP-HAの各々について、下記のカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター及びHSPT878ターミネーターを転写単位として使用し、互いに連結した組み換えベクターである。
配列番号７８(GP5-Flag/GP4-YFP-HA)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、上記GP5-Flag及びGP4-YFP-HAの各々について、下記のカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター及びHSPT878ターミネーターを転写単位として使用し、互いに連結した組み換えベクターである。
【００４０】
本発明で用いる第１及び第２のDNA構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするDNA、及び融合タンパク質をコードするDNA、小胞体残留シグナルペプチドまたは液胞移行シグナルペプチドをコードするDNAなどの各DNAを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
【００４１】
本発明で用いる組換えベクターは、前記第１または第２のDNA構築物を含むことを特徴とする。本発明で用いる組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするDNAまたはGP5及びMをコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウィルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドDNAは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばpRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm等を用いることもできる。ウィルスDNAとしては、例えばpTB2等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
【００４２】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）、レタスのユビキチンプロモーター（Hirai et al. 2011 Plant Cell Rep. 30:2255-65）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター(HSPT)等が好ましく用いられる。本発明で使用される好ましいターミネーターは、例えば、Matsui et al., 2014に記載されるような、配列番号７９で表されるHSPT878である。
【００４３】
本発明の組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、前記第１または第２のDNA構築物を適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
【００４４】
本発明で用いる形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよいが、小胞輸送経路を有する真核細胞が好ましい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、バラ科（Rosaceae）、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞や、オランダイチゴ属（Fragaria）に属する植物の細胞、中でもオランダイチゴ（Fragaria×ananassa）が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーターやレタスのユビキチンプロモーター（Hirai et al. 2011 Plant Cell Rep. 30:2255-65）等を用いることができる。また酵母（Saccharomyces cerevisiae）、麹（Aspergillus）等の微生物を用いることもできる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus）、枯草菌（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、アグロバクテリウム（Agrobacteriumtumefaciens）等が用いられる。
【００４５】
本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
【００４６】
本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって前記形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記融合タンパク質またはGP5及びMを生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記GP5タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
【００４７】
レタスの場合は、例えば0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
また、本発明で用いる種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明で用いる種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記GP5タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、前記形質転換体に含まれる。
【００４８】
アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)は植物の傷口で感染させるもので、腫瘍誘発性のTi(tumor-inducing)プラスミドと呼ばれる大きな染色体外因子を運搬する。多くの研究所において、数年に亘る鋭意研究の後、アグロバクテリウム系の開発により、様々な植物組織を型通りに形質転換することが可能となった。この技術により転換された代表的な植物として、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、ナタネ、ジャガイモ、ポプラ、及びダイズ、イチゴ、イネなどがある。
様々な種の植物について、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換された組織から植物を再生することが実証されている。この植物として、ヒマワリ、トマト、シロツメクサ、アブラナ、コットン、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、イチゴ、イネ、その他多数の野菜作物を挙げることができる。
本発明においては、アグロバクテリウムTiベクターにより上記レタスをはじめとした可食植物を形質転換することが好ましい。
【００４９】
本願明細書中において、GP5ウィルス外領域とアジュバントタンパク質の融合タンパク質、GP5ウィルス外領域とアジュバントタンパク質がペプチドリンカーを介して連結された融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするDNAを含む第１のDNA構築物、PRRSウィルスのGP5及びMをコードするDNAを含む第２のDNA構築物、及び該第１または第２のDNA構築物を含むベクターで形質転換された植物等を総称して、PRRS防除剤ということがある。なお、本発明のPRRS防除剤は、上記融合タンパク質を含む限り、または、PRRSウィルスのGP5及びMをコードするDNAを別々に含む限り、ワクチンまたは免疫賦活剤などの医薬及び飼料のいずれの形態であってもよい。本発明において、防除とは、予防及び治療のいずれも含むものである。
本発明のPRRS防除剤は、PRRSの防除（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）効果を有する。本発明でいうPRRSの症状には、子豚においては免疫力の低下、体重減少、呼吸器の疾患が含まれ、母豚においては繁殖障害（流産）が含まれる。PRRSはマクロファージに感染して免疫力を低下させるため、他の疾患（マイコプラズマ、サーコウィルス等）による二次感染のリスクを高めるが、広義には他の疾患による症状もPRRSウィルスによる症状ととらえることができる。また近年中国を中心に流行している高病原性PRRSは、単独感染でも死にいたる場合がある。
【００５０】
本発明のPRRS防除剤は、前記形質転換体を含んでいてもよい。本発明のPRRS防除剤は、前記融合タンパク質またはGP5及びMを含む形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。また、本発明のPRRS防除剤には、融合タンパク質またはGP5及びMの免疫原性を高める他のアジュバントを配合することもできる。一般的には、水酸化アルミニウム、コレラ毒素(CTB)、細菌の鞭毛、例えばサルモネラのフラジェリンなどがアジュバントとして用いられる。
【００５１】
本発明のPRRSの防除方法は、前記DNA構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を動物に投与することを特徴とする。本発明のPRRS防除剤の防除対象としては、ブタが挙げられる。
本発明のPRRS防除剤をブタに投与する方法としては、ブタの飼料に、前記DNA構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。この場合の投与量は、融合タンパク質またはGP5及びMの質量として、１日当たり好ましくは0.2 ｍｇ以上、さらに好ましくは0.5 ｍｇ以上である。本発明のPRRS防除剤は、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１．植物発現用ワクチン遺伝子の構築
PRRSウィルスの中和エピトープであることが知られているGP5のウィルス外領域(ectGP5)(Ostrowski et al., 2002)をワクチン抗原として用い、粘膜アジュバント活性を有することが知られているLTBに融合した。植物細胞内での蓄積部位として、小胞体、アポプラスト、液胞に輸送されるようにデザインした。また、PRRSウィルスの全長エンベロープタンパク質の発現のために、GP5、M、GP4の各タンパク質遺伝子を構築した。検出用タグとしてYFP、HA、Flagタグを融合した。詳細は以下の通りである。【００５３】
本発明の融合タンパク質をコードするDNA構築物を含むベクターの作製
LTB（Asn90Ser変異体）断片（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除くAla22からAsn124までの領域）を以下の要領で作製した。以下の二本のオリゴヌクレオチドを、3’相補末端を介してアニールした後、T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan)を用いて伸長反応を行った。一段階目はLTB-AとLTB-B、LTB-CとLTB-D、LTB-EとLTB-F、LTB-GとLTB-H、LTB-IN90SとLTB-Jを用い、それぞれA+B、C+D、E+F、G+H、IN90S+J断片を作製した。二段階目の反応には、A+BとC+D、E+FとG+Hを用いA+B+C+DとE+F+G+H断片を作製した。最後にA+B+C+DとE+F+G+HとIN90S+Jを用い、全長のA+B+C+D+E+F+G+H+IN90S+J断片を作製した。【００５４】
LTB-A: 5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3'（配列番号８０）
LTB-B: 5'-cgttgatggtgtagatttgggtgttgcggtactcgctgc-3'（配列番号８１）
LTB-C: 5'-ccatcaacgacaagatcctcagctacaccgagagcatgg-3'（配列番号８２）
LTB-D: 5'-cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc-3'（配列番号８３）
LTB-E: 5'-atcaccttcaagagcggcgagaccttccaggtcgaggtc-3'（配列番号８４）
LTB-F: 5'-cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa-3'（配列番号８５）
LTB-G: 5'-gacagccagaagaaggccatcgagaggatgaaggacaccctcaggatc-3'（配列番号８６）
LTB-H: 5'-gcagagcttgtcgatcttggtctcggtgaggtaggtgatcctga-3'（配列番号８７）
LTB-IN90S: 5'-aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc-3'（配列番号８８）
LTB-J: 5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3'（配列番号８９）【００５５】
得られたLTB（Asn90Ser）断片をBamHIとBglIIで切断した後、Plasmid14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)の脱リン酸化したBamHI-BglIIギャップへ挿入した。得られたプラスミドをBglIIで処理した後、脱リン酸化し、リン酸化したPG12断片を挿入した。なおPG12断片は、PG12-Fプライマー（5'-gatcccctggttctggtcctggttctccta-3'）（配列番号９０）とPG12-Rプライマー（5'-gatctaggagaaccaggaccagaaccaggg-3'）（配列番号９１）をアニーリングした後T4 polynucleotide kinase (PNK) (New England Biolabs, Hitchin, UK)でリン酸化し作製した。
得られたプラスミドをBglIIで処理した後、脱リン酸化し、リン酸化したHA断片を挿入した（LTBN90S-PG12-HA）。なおHA断片は、HA-Fプライマー（5'-gatcttatccttatgattatcctgattatgctg-3'）（配列番号９２）とHA-Rプライマー（5'-gatccagcataatcaggataatcataaggataa-3'）（配列番号９３）をアニーリングした後T4 polynucleotide kinase (PNK)でリン酸化し作製した。
PRRSVのectGP5断片は、EDRD-1株(Yoshii et al., Arch Virol, 2005, 150:2313-24)のアミノ酸配列を元に、Ser32をAlaに、Asp33をSerに置換した人工遺伝子を合成した。ectGP5-2(5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3')（配列番号９５）とectGP5-3(5'-tt agatct ggt gcc gtt cag ctc gca gag ggt caa gtt gta-3')（配列番号９６）を、3’相補末端を介してアニールした後、T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan)を用いて伸長反応を行った。得られたectGP5-2＋3断片を熱変性した後にectGP5-1(5'-aa gcatgc ggatcc aac gcc gcc tcc tcg tcc tcc tcg cac-3')（配列番号９４）とアニールした後、T4 DNA polymeraseを用いて伸長反応を行った。得られたectGP5-1＋2＋3断片をBamHIとBglIIで処理した後、上記LTBN90S-PG12-HAプラスミドをBglIIで処理して脱リン酸化したベクターに挿入した。
得られたプラスミドからBamHIとSacIを用いてLTBN90S-PG12-ectGP5-HA-HDEL断片を切り出し、2BHプラスミド（Matsui et al., Transgenic Res., 2011,20;735-48）のBamHI-SacIギャップへ挿入した。得られたプラスミドからSacIとEcoRIを用いてシロイヌナズナ熱ショックタンパク質遺伝子転写ターミネーター(HSPT)を取り除き、長鎖バージョンのHSPT(HSPT878, Matsui et al., 2014)のSacI-EcoRI断片を挿入した。これにより、pRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5（配列番号６９）プラスミドを構築した（図１）。
また、pRI909 Apo LTBN90S-PG12-ectGP5（配列番号７０）とpRI909 Vac LTBN90S-PG12-ectGP5（配列番号７１）については、ER LTB-ectGP5の構築で用いたPlasmid14のかわりにPlasmid 13と15(Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)をそれぞれ用いることで同様に作製した（図１）。【００５６】
全長のGP5、M、GP4をコードするDNA構築物を含むベクターの作製
全長のGP5、M、GP4タンパク質はEDRD-1株(Yoshii et al., Arch Virol, 2005, 150:2313-24)のアミノ酸配列を元に以下の要領で作製した。GP5はectGP5と同様にSer32をAlaに、Asp33をSerに置換した。Glycoprotein 4 (GP4)はPRRSウィルスのエンベロープタンパク質の１つである。GP4のアミノ酸配列は、例えば、配列番号５１によって示され、その塩基配列は、配列番号５２によって示される。
以下の二本のオリゴヌクレオチドを、3’相補末端を介してアニールした後、T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan)を用いて伸長反応を行い、LTBの構築と同様に各全長の遺伝子を合成した。【００５７】
GP5-1: 5'-aatgcatgttgggca agtgcttgac cgccggctgc-3'（配列番号９７）
GP5-2: 5'-gcaccacaagaaggggagcctggagcagcagccgg-3'（配列番号９８）
GP5-3: 5'-tctt gtggtgcatc gtgcccttct gcttggccgc c-3'（配列番号９９）
GP5-4: 5'-ggaggacgaggaggcggcgttcaccaaggcggcca-3'（配列番号１００）
GP5-5: 5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3'（配列番号１０１）
GP5-6: 5'-accagtcggtgccgttcagctcgcagagggtcaag-3'（配列番号１０２）
GP5-7: 5'-ccg actggttggc cgacaagttc gactgggccg tg-3'（配列番号１０３）
GP5-8: 5'-tcaacacggggaagatcacgaagctctccacggcc-3'（配列番号１０４）
GP5-9: 5'-ccgtgttga cccacatcgt gagctactgc gccttg-3'（配列番号１０５）
GP5-10: 5'-cacggtgtccaagaagtggctggtggtcaaggcgc-3'（配列番号１０６）
GP5-11: 5'-gacacc gtgggcttgg tggccgtgag caccgccgg-3'（配列番号１０７）
GP5-12: 5'-gctcaacacgtatctgccgtggtagaagccggcgg-3'（配列番号１０８）
GP5-13: 5'-cgt  gttgagcagc  atctacgccg  tgtgcgcctt gg-3'（配列番号１０９）
GP5-14: 5'-gcctgatcacgaagcacaccaaggcggccaaggcg-3'（配列番号１１０）
GP5-15: 5'-tgatcaggct caccaagaac tgcatgagct ggaga-3'（配列番号１１１）
GP5-16: 5'-agttggtgtatctggtgcagctgtatctccagctc-3'（配列番号１１２）
GP5-17: 5'-ga tacaccaact tcttgttgga caccaagggc agg-3'（配列番号１１３）
GP5-18: 5'-tgatcacggggctcctccatctgtagagcctgccc-3'（配列番号１１４）
GP5-19: 5'-cccgtgatc  atcgagaagg  gcggcaaagt ggaagt-3'（配列番号１１５）
GP5-20: 5'-tcaagtcgatcaagtggccctccacttccactttg-3'（配列番号１１６）
GP5-21: 5'-tcgacttgaa gagggtggtg ttggacggca gcgcc-3'（配列番号１１７）
GP5-22: 5'-ggtgatgggggtggcggcgctg-3'（配列番号１１８）
GP5-23: 5'-ccccatcacc aaagtgagcg ccga-3'（配列番号１１９）
GP5-24: 5'-ttagatctggggtggccccactgctcggcgctc-3'（配列番号１２０）【００５８】
M-1: 5'-aatgcatg ggcagca gcttggacga cttctgccac-3'（配列番号１２１）
M-2: 5'-acactttctggggggcggtgctgtcgtggcagaag-3'（配列番号１２２）
M-3: 5'-ccagaa agtgttgttg gccttcagca tcacctaca-3'（配列番号１２３）
M-4: 5'-caaggcgtagatcatgatgggggtgtaggtgatgc-3'（配列番号１２４）
M-5: 5'-ctacgcct tgaaagtgag caggggcagg ctcttgg-3'（配列番号１２５）
M-6: 5'-caagaagatcaacaagtgcaacaagcccaagagcc-3'（配列番号１２６）
M-7: 5'-gttgatcttc ttgaactgcg ccttcacctt cggct-3'（配列番号１２７）
M-8: 5'-gctctggaagtgcacgaaggtcatgtagccgaagg-3'（配列番号１２８）
M-9: 5'-cttccagag caccaacaaa gtggccttga ccatgg-3'（配列番号１２９）
M-10: 5'-cccacaacaaggccaccacggcgcccatggtcaag-3'（配列番号１３０）
M-11: 5'-gttgtggg gcgtgtacag cgccatcgag acctgga-3'（配列番号１３１）
M-12: 5'-agcctgcatctgctggtgatgaatctccaggtctc-3'（配列番号１３２）
M-13: 5'-gatgcagg ctctgcttgt tgggcaggaa gtacatc-3'（配列番号１３３）
M-14: 5'-ctccacgtggtgggcgggggccaagatgtacttcc-3'（配列番号１３４）
M-15: 5'-cacgtgga gagcgccgcc ggcttccacc ccatcgc-3'（配列番号１３５）
M-16: 5'-accacgaaggcgtggttgtcgctggcggcgatggg-3'（配列番号１３６）
M-17: 5'-ccttcg tggtgaggag gcccggcagc accaccgtg-3'（配列番号１３７）
M-18: 5'-gccgggcaccaaggtgccgttcacggtggt-3'（配列番号１３８）
M-19: 5'-tgcccggc ttgaagagct tggtg-3'（配列番号１３９）
M-20: 5'-tcttcacggccttcctgccgcccaacaccaagctc-3'（配列番号１４０）
M-21: 5'-gccgtgaaga ggggcgtggt gaacttg-3'（配列番号１４１）
M-22: 5'-ttagatctcttggcgtacttcaccaagttcaccac-3'（配列番号１４２）【００５９】
GP4-1: 5'-aatgcatg gccgcca gcttgttgtt cttgttggtg-3'（配列番号１４３）
GP4-2: 5'-ggctcaccaagaagcactcgaagcccaccaacaag-3'（配列番号１４４）
GP4-3: 5'-ggt gagccaggcc ttcgcctgca agccctgctt c-3'（配列番号１４５）
GP4-4: 5'-gtcttgatgtcgctcaagctgctgctgaagcaggg-3'（配列番号１４６）
GP4-5: 5'-gaca tcaagaccaa caccaccgcc gccgccagct t-3'（配列番号１４７）
GP4-6: 5'-agcagctgatgtcctgcaacacggcgaagctggcg-3'（配列番号１４８）
GP4-7: 5'-catc agctgcttga ggcacggcga cagcagcccc c-3'（配列番号１４９）
GP4-8: 5'-ctgcactgcctgctcttcctgatggtctgggggct-3'（配列番号１５０）
GP4-9: 5'-gcagtgcagg accgccatcg gcacccccgt gtaca-3'（配列番号１５１）
GP4-10: 5'-tcggtcacgttggcggtgatggtgatgtacacggg-3'（配列番号１５２）
GP4-11: 5'-cgtgaccga cgagaactac ttgcacagca gcgact-3'（配列番号１５３）
GP4-12: 5'-gaacaagcagctgctcaacatcaacaagtcgctgc-3'（配列番号１５４）
GP4-13: 5'-gctgcttgt tctacgccag cgagatgagc gagaag-3'（配列番号１５５）
GP4-14: 5'-cgttgccgaacaccactttgaagcccttctcgctc-3'（配列番号１５６）
GP4-15: 5'-cggcaac gtgagcggca tcgtggccgt gtgcgtga-3'（配列番号１５７）
GP4-16: 5'-acgtgctgcacgtagctggtgaagttcacgcacac-3'（配列番号１５８）
GP4-17: 5'-gcagca cgtgagggag ttcacccaga ggagcttgg-3'（配列番号１５９）
GP4-18: 5'-gtgcaagagcctcacgtggtccaccaccaagctcc-3'（配列番号１６０）
GP4-19: 5'-gctct tgcacttcat gacccccgag accatgag-3'（配列番号１６１）
GP4-20: 5'-acggtggcccatctcatggtctc-3'（配列番号１６２）
GP4-21: 5'-gccaccgt gttggcctgc ttgttcgcca-3'（配列番号１６３）
GP4-22: 5'-ttagatctgatggccaacaagatggcgaacaagc-3'（配列番号１６４）【００６０】
開始コドン近傍配列改変型タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’非翻訳領域（NtADHmod 5'-UTR）を、ADH-221(Sato et. al., 2004) を鋳型として、ADH XbaI-F プライマー（5'-aatctagagtctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-3'）（配列番号１６５）及びADHmod NsiI-R プライマー（5'-aaatgcatcttttttcttgatttccttcac-3'） （配列番号１６６）を用いたPCR により増幅した。得られたDNA断片をXbaIとNsiIで処理し、GP5断片をNsiIとBglIIで処理した断片と共に、Plasmid 14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)のXbaI-BglIIギャップに挿入した。得られたプラスミドをNsiIで切断した後セルフライゲーションして、NtADHmod 5'-UTR の開始コドン(atg)とGP5の開始コドンが一致するように融合した。得られたプラスミドをBglIIで切断し、HA断片を挿入した。得られたプラスミドを鋳型として用い、ADH KpnI-F プライマー（5'-aaggtacctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-3'）（配列番号１６７）とNOST-Rプライマー（5'- tgccaaatgtttgaacgatc-3'）（配列番号１６８）を用いてPCRを行いNtADHmod 5'-UTR-GP5-HA断片を増幅し、得られた断片をpRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5のKpnI-Sacギャップに挿入した(GP5-HA) （配列番号７３）（図２）。GP5-Flagについては、前述のHA断片のかわりにFlag断片を挿入して作製した。なおFlag断片はFlag-F （5'-gatctgattataaggatgacgatgacaagg-3'） （配列番号１７１）とFlag-R （5'-gatcccttgtcatcgtcatccttataatca-3'） （配列番号１７２）をアニーリングして作製した。
前述のNtADHmod 5'-UTR をXbaIとNsiIで処理し、MもしくはGP4断片をNsiIとBglIIで処理した断片と共に、Plasmid 14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)のXbaI-BglIIギャップに挿入した。得られたプラスミドをそれぞれNsiIで切断した後、セルフライゲーションして、NtADHmod 5'-UTR の開始コドン(atg)とMもしくはGP4の開始コドンが一致するように融合した。YFP遺伝子断片（pEYFP、Clontech)をYFP-F(5'-tttggatcc agcaagggcgaggagctgttca-3') （配列番号１６９）とYFP-R(5'-tttagatct cttgtacagctcgtccatgccgag-3') （配列番号１７０）を用いて増幅した後BamHIとBglIIで切断し、BglIIで切断後に脱リン酸化処理した前述のGP4もしくはMプラスミドに挿入した。得られたプラスミドをBglIIで切断し、HA断片を挿入した。得られた断片を鋳型として用い、ADH KpnI-F プライマー（配列番号１６７）とNOST-Rプライマー（配列番号１６８）を用いてPCRを行いNtADHmod 5'-UTR-M/GP4-YFP-HA断片を増幅し、得られた断片をpRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5のKpnI-Sacギャップに挿入した(M-YFP-HA（配列番号７５）、GP4-YFP-HA)（図２）。
GP5とMもしくはGP4を共発現するカセットは以下の要領で構築した。GP5-HAをSpeIとEcoRIで処理してHSPT878の下流を切断し、35Spro-NtADHmod 5'-UTR-M/GP4-HA-HSPT878のXbaI-EoRI断片を挿入した(GP5-HA/M-YFP-HA)（配列番号７６）。同様にGP5-Flagを用いてGP5-Flag/M-YFP-HA（配列番号７７）とGP5-Flag/GP4-YFP-HA（配列番号７８）を作製した。【００６１】
実施例２．プロトプラストを用いた一過性発現実験
プロトプラストを用いた一過性発現は、Matsui et al., 2011, Transgenic Res. 20(4):735-48に従い実施した。
3種類のLTB融合ectGP5について、タバコ培養細胞(Nicotiana tabacumL. cv. BY2)（理研バイオリソースセンター）およびレタスプロトプラスト (Lactucasativa L. cv. greenwave)（タキイ種苗）で一過性発現を行った。その結果、BY2とレタスの両宿主において、小胞体、アポプラスト、液胞のいずれの区画型でも蓄積を確認した（図３）。【００６２】
実施例３．タバコ培養細胞への遺伝子導入
タバコ培養細胞の形質転換は、Nakayama et al., 2000, Plant Physiol. 122:1239-47に従い実施した。
各ワクチンをタバコ培養細胞の安定形質転換体で発現した。LTB融合ectGP5は小胞体、アポプラスト、液胞のいずれの型でも蓄積を確認した（図４）。
全長のエンベロープタンパク質の発現では、GP5-HA、M-YFP-HA、GP4-HAのいずれも蓄積を確認した。また単独発現よりもMと共発現した方がGP5の蓄積が上昇することを見出した。この蓄積量上昇効果は、GP4との共発現では見られなかった（図５）。【００６３】
実施例４．アグロバクテリウムによるレタスへの遺伝子導入
以下の通り、ER LTB-ectGP5、GP5-HA、GP5-HA/M-YFP-HAの３種類について、遺伝子組換えレタスを作製した。
レタス(Lactuca sativa L.)品種グリーンウェーブ(タキイ種苗)をMS培地 [1/2×ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（MS塩、和光純薬工業）、1×Murashige and Skoog vitamin solution（MSビタミン、Sigma-Aldrich）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に無菌播種後、10-16日目の本葉を5 mm角程度に切断し、本切片をベクターコンストラクトを有するバイナリープラスミド（pRI909）を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA105）懸濁液に10分間浸漬後、共存培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l 6-ベンジルアミノプリン（BA）、0.1 mg/l 1-ナフチル酢酸（NAA）、0.1 M アセトシリンゴン、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、暗所で2日間培養した。切片を滅菌水で洗浄後、選抜培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l BA、0.1 mg/l NAA、0.5 g/l ポリビニルピロリドン（PVP）、50 mg/lカナマイシン（Km）、250 mg セフォタキシム（Cef）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、蛍光灯下（2000-3000 lux）で培養を行った。以降、不定芽が得られるまで3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい選抜培地への移植を行った。不定芽から形成された再分化個体は発根培地[1/2× MS塩、1× MSビタミン、0.5 g/l PVP、250 mg Cef、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に移植し、同条件で培養を行った。以降、3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい発根培地への移植を行った。発根した再分化個体は鉢植えにし、同条件で栽培を行った。【００６４】
実施例５．植物からのタンパク質抽出
タンパク質抽出はTCA-acetone法（Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23:405）に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入レタス本葉を用いて行った。100-200 mgのサンプルをTissueLyzer II（QIAGEN）を用い破砕後、サンプルの5倍量の TCA-acetone（10% トリクロロ酢酸、90% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、-20℃で1時間静置後、16,000×g、4℃、30分間遠心操作を行い、上清を除去し、タンパク質を含む沈殿を得た。さらに夾雑物を除去するために、サンプルの5倍量の acetone/BME（100% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を除去した。本夾雑物除去操作はさらに2回行った。沈殿は減圧乾燥後、サンプルの2倍量の 抽出Iバッファー [0.5 M 塩化ナトリウム、5 mM イミダゾール、6 M 尿素、20 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）-HCl、pH7.9] に懸濁し、16,000×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収、タンパク質溶液を得た。タンパク質濃度の測定は、Protein Assay Kit II（Bio-Rad）を用い行った。【００６５】
実施例６．ウエスタン解析
得られたタンパク質溶液をマイクロチューブに適量入れ、同量のサンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え混合し、沸騰水中で5分間加温し、サンプルのSDS化を行った。タンパク質定量時の標準物質には精製LTB（LTB（Asn90））を用いた。これを抽出Iバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これら希釈系列をスタンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（ミニプロティアンTetraセル）およびミニプロティアンTGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動バッファー（EZ Run、ATTO製）を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを5 μlアプライし、200 V定電圧で40分間行った。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液（TBS系, pH7.2、ナカライテスク）に浸し、室温で1時間振とうまたは4℃で16時間静置後、TBS-T（137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。
組換えタンパク質の検出には、一次抗体TBS-Tで10,000倍希釈して使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。二次抗体はTBS-Tで10,000倍希釈し、本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。
抗HAタグ：
一次抗体  抗HA抗体(Roche, Cat No. 11-867-423-001)
二次抗体  Anti-Rat IgG, AP-conjugate (Promega, Cat No. S3831)
抗FLAGタグ：
一次抗体  抗FLAG抗体(SIGMA, Cat No. F1804)
二次抗体  Anti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat No. 7054S
アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液（0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5）中にメンブレンを浸し、室温で7分間振とうすることにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、抗原タンパク質の定量を行った。抗原として、全長GP5-LTBを使用した場合（非特許文献４に対応）、全長GP5を使用した場合（比較例に対応）、全長GP5/Mを使用した場合（本発明２に対応）、LTB-ectGP5を使用した場合（本発明１に対応）の抗原蓄積量の比較を以下の表１に示す。全長GP5のみ発現させた場合よりも、全長GP5とMを同時に発現させた方が2.5倍以上抗原の蓄積量が多いことが分かった。また非特許文献４（全長GP5-LTB）よりも、LTB-ectGP5の方が400倍以上抗原（ectGP5）の蓄積量が多いことが分かった。【００６６】
【表１】
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【００６７】
その結果、どのコンストラクトを用いた場合も組換え抗原の蓄積を確認した。またタバコ培養細胞と同様、単独発現よりも、GP5とMを発現した方がGP5の蓄積が上昇した（図６）。【００６８】
実施例７．PRRSウィルス感染防御試験
ER LTB-ectGP5（ワクチン１）およびGP5-HA/M-YFP-HA（ワクチン２）の二種類について、ワクチンレタスの経口投与によるPRRSウィルス予防効果確認試験を行った。陰性対照として空ベクター(pRI909)組換えレタスを用いた。分娩後9、16、29、30、31、36、37、38、43、44、45、51、52日目に凍結乾燥したワクチンレタスもしくは空ベクターレタスの凍結乾燥粉末（0.5 g / 回）を水に懸濁し、チューブを接続したシリンジで強制投与した。
感染ウィルスをDMEM(10%非働化済み牛胎児血清、100U/ml penicillin、100U/ml streptomycin添加)でコンフルエントまで増殖させたMA-104株(アフリカミドリザル腎細胞)（ATCC受託番号CRL-2378）に感染させ、CO2インキュベーター内で37℃、6日間培養した。培養後、遠心分離(3,000 rpm、15分間)を行い、上清をウィルス懸濁液とした。65日齢のブタの両鼻腔内にキャニオンスプレーを用いてウィルス希釈液を投与した。投与ウィルス量は、一頭当たり8.89×108 copiesであった。
攻撃後、体重、飼料摂取量、体温を測定した。また定期的に採血し、ELISAによりPRRSV特異的抗体価を測定した。STECによる攻撃21日目に安楽死後、剖検を行い、各臓器及び組織の異常を肉眼的に観察した。主要臓器の病理標本を作製し、病理組織学的所見を観察した。
その結果、呼吸症状や体温については群間で差は認められなかった。増体重については、ワクチネーション期間では群間では差は無かったが、攻撃後三週間で、ワクチン投与群で増体重が良い傾向が認められた（図７）。【００６９】
実施例８．組換えタンパク質の酵母での発現
図１２に示すような酵母での組換えタンパク質発現用の遺伝子コンストラクトを用意した。まず、酵母の小胞輸送経路に組換えタンパク質を輸送するために、酵母インベルターゼの分泌シグナルペプチドを利用した(SUCSP, Hashimoto et al., Protein Engineering, 1998 2;75-77)。SUCSPのDNA断片は以下のように調製した。HindIII-SUCSP-Fプライマー(5'-aaagcttaagatgcttttgcaagccttccttttcctcttggctggtttcgccgccaag-3'（配列番号１７３）, 下線はHindIIIサイト)とBamHI-SUC2SP-Rプライマー(5'-aaggatccggcagaaatcttggcggcgaaaccagccaagag-3'（配列番号１７４）, 下線はBamHIサイト) をアニーリングした後、T4 DNAポリメラーゼで処理した。続いてHindIIIとBamHIで切断した。 LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)に相当するDNA断片（NAはNorth Americanを意味し、+は N-結合型糖鎖付加部位があることを示す）をBamHIと SacIでER LTB-ectGP5 (配列番号６９)から切り出した。SUCSP およびLTB-PG12-ectGP5(NA)(+)をBamHIサイトを介してライゲーションし、pYES2 (Invitrogen)のHindIII-SacIギャップに挿入してpYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)を作製した。得られたプラスミドの塩基配列はT7プロモータープライマー（T7 pro F）(5'-taatacgactcactataggg-3'（配列番号１７５）)およびpYES2-Rプライマー (5'-gtaagcgtgacataactaattacatga-3'（配列番号１７６）)を用いて確認した。【００７０】
欧州型ウィルス株のectGP5(ectGP5(EU)(+); DGSGSSSTYQYIYNLTICELNGT（配列番号１７７）, N-結合型糖鎖付加部位を下線で示す)は、EURO type-Fプライマー(5'-aaggatccgacggctccgggtcctcctcgacctaccagtacatctacaacttgaccatctgc-3'（配列番号１７８）, 下線はBamHIサイト)、HDEL-SacI-Rプライマー (5'-aagagctcacaattcatcatgttcaga-3'（配列番号１７９）, 下線はSacIサイト)および鋳型としてLTB-PG12-ectGP5(NA)(+)を用いてPCRを行って作製した。 得られたectGP5(EU)(+)の断片をBamHI とSacIで切断し、LTB-PG12もしくはLTB-PG12-ectGP5(NA)(+)のC末端に融合してLTB-PG12-ectGP5(EU)(+)もしくはLTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-ectGP5(EU)(+)を作製した。【００７１】
LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-PG12-ectGP5(EU)(+)の構築は、LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-ectGP5(EU)(+)を鋳型としたインバースPCRによりectGP5(NA)(+)とectGP5(EU)(+)の間にPG12 を挿入して行った。【００７２】
N-結合型糖鎖が付加されるアスパラギンをセリンに置換したLTB-PG12-ectGP5(NA)(-)は以下の要領で作製した。LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)を鋳型とし、LTB 1Fプライマー(5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3'（配列番号１８０）, 下線はBamHIサイト)とectGP5(NA) deglycosylation-R プライマー (5'-tttagatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3'（配列番号１８１）, 下線はBglIIサイト) を用いてPCRを行った。増幅したDNA断片はBamHIとBglIで切断し、pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)の脱リン酸化したBamHI-BglII ギャップに挿入してLTB-PG12-ectGP5(NA)(-)を作製した。【００７３】
ectGP5(NA)がLTBのN末端に付加された融合抗原の構築は以下の通り実施した。PG12のN末端側配列を付加したectGP5(NA)を、HindIII-SUCSP-FプライマーとPGGP5-Rプライマー (5'-gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccgttcagctcgcagagggtcaagtt-3'（配列番号１８２）, 下線で示したのはPG12のN末端側配列であり、それ以降は ectGP5の配列を示す)および鋳型としてpYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)を用いてPCRを行って増幅した。また、PG12のC-末端側配列を付加したLTBを、PGLTB-Fプライマー(5'-cctggttctggtcctggttctcctagatccgccccccagaccatcaccga-3'（配列番号１８３）, 下線で示したのはPG12のC末端側配列であり、それ以降はLTB領域の配列を示す。)とLTB-BglII-Rプライマー (5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3'（配列番号１８４）, 下線はBglIIサイト) および鋳型としてpYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)を用いてPCRを行って増幅した。両PCR産物を混合してPG12領域でアニーリングし、NA ectGP5-Fプライマー(5'-aagcatgcggatccaacgccgcctcctcgtcctcctcgcac-3'（配列番号１８５）, 下線はBamHIサイト)とLTB-BglII-Rプライマーを用いて2nd PCR を行った。 得られたDNA断片をBamHIとBglIIで切断し、pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)の脱リン酸化したBamHI-BglIIギャップに挿入してectGP5(NA)(+)-PG12-LTBを作製した。【００７４】
N-結合型糖鎖付加部位に変異を導入したectGP5(NA)(-)-PG12-LTBも基本的に同様の方法で構築した。ただし、PGGP5-Rプライマーの代わりにPGGP5minusGly-Rプライマー (5'-gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3'（配列番号１８６）, 下線で示したのはPG12のN末端側配列であり、それ以降はectGP5領域の配列を示す) を使用した。【００７５】
LTBとStx2eBの融合タンパク質にさらにectGP5を融合したStx2eB-PG12-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+) とLTB-PG12-Stx2eB-PG12-ectGP5(NA)(+)は以下のように構築した。Stx2eB-PG12-LTB-PG12とLTB-PG12-Stx2eB-PG12のDNA断片は特願2013-243932に記載の方法で作製した。各断片をectGP5(NA)(+)に融合してpYES2に挿入した。【００７６】
各遺伝子コンストラクトを酵母に導入し発現させた。
酵母 (Saccharomyces cerevisiaeINVSc1, Invitrogen) の形質転換は S. c. EasyCompTM Transformation Kit (Invitrogen)に添付の方法に従い実施した。LTB融合タンパク質はガラクトース処理を12時間行って発現誘導した。ガラクトース誘導後、酵母培養液200μl と2×SDS-PAGE sample buffer (EZ Apply, ATTO) 200μlを混合し、95°Cで5分間熱処理を行った。得られたサンプル4μlを SDS-PAGEに供した。 ウエスタン解析は、抗HA 抗体 (No. 11 867 423 001, Roche) もしくは抗LT毒素抗体を用いて実施した。各コンストラクトについて、独立した２クローンを解析した。その結果、図13に示すように、各組み換えタンパク質の発現が確認でき、糖鎖付加産物に対応するバンドも確認できたが、糖鎖付加部位に変異を導入したものは糖鎖付加産物は見られなかった。ectGP5(NA)(+)とectGP5(EU)(+)の融合においては間にPG12を付加することで蓄積量が上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の融合タンパク質は、畜産の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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