(57)【要約】  本発明は、甲殻類の感染症の中でも有効な対応手段が無く、養殖場においていったん発生すると全滅を引き起こしかねない感染症を抑制する方法を提供することを目的とする。本発明に係る甲殻類の感染症の抑制方法は、甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させる工程を含むことを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させる工程を含むことを特徴とする甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項２】
パラクロレラ属藻類を４週間以上にわたり摂取させる請求項１に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項３】
パラクロレラ属藻類を１日当たり５．０ｇ／ｋｇ体重以下摂取させる請求項１または２に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項４】
パラクロレラ属藻類としてパラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）種藻類を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項５】
パラクロレラ・ケスレリ種藻類としてＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を用いる請求項４に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項６】
パラクロレラ属藻類として、下記（１）〜（３）の何れかの塩基配列を有する１８Ｓ  ｒＲＮＡを有するものを用いる請求項１〜５の何れかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
（１）  配列番号１の塩基配列
（２）  上記（１）に規定される塩基配列において、１以上、３１以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列
（３）  上記（１）に規定される塩基配列に対して９８．５％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項７】
パラクロレラ属藻類としてパラクロレラ・バイエリンク（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）種藻類を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項８】
ウィルスを原因とする感染症を抑制するためのものである請求項１〜７のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項９】
従属栄養培養したパラクロレラ属藻類を用いる請求項１〜８のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。
【請求項１０】
甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させることを特徴とする、甲殻類の感染症を抑制するためのパラクロレラ属藻類の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲殻類自身の免疫力を効果的に高めることにより、甲殻類の感染症を抑制する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食用の甲殻類は、天然から採取される場合もあるが、安定供給や効率化のために養殖されることも多い。また、最近では、幼生段階まで甲殻類を育て、放流した後に十分に生育したものを採取する「育てる漁業」も盛んになっている。【０００３】
しかし甲殻類の養殖では、高密度状態で飼育されるため、いったん感染症が生じると全滅したり或いは全滅に近い状態となり得る。よって、甲殻類の養殖では抗生物質が使われることがあるが、抗生物質は甲殻類への残留の問題の他、環境に与える悪影響や、耐性菌の出現といった問題がある。また、一般的な抗生物質は耐性菌でない限り主に細菌に対して有効であるが、ウィルスや真菌には効果が無いという欠点があり、ウィルスや真菌には特別な抗生物質を用いる必要がある。特にウィルスに対して有効な薬剤は極めて少ない。【０００４】
そこで、甲殻類自身の免疫力を高め、感染症に対する抵抗性や自然治癒力を付けさせることが好ましい。【０００５】
甲殻類の免疫力を高めるための飼料としては、例えば、ペプチドグリカン（特許文献１，２）、酵母由来のタンパク質成分（特許文献３，４）、リポポリサッカライド（特許文献５）、菌体自体（特許文献６）、リン脂質含有タンパク質等（特許文献７）などがある。【０００６】
また、マウスにおける腫瘍増殖抑制効果を有する免疫賦活化作用成分として、海産クロレラに含有される多糖類が知られている（特許文献８）。特許文献９には、カロテノイドの一種であるルテインを含むクロレラが添加されている養鶏飼料が開示されており、クロレラに含まれる成分が生体防御を高める作用や細菌感染抵抗性を高める作用などを有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−２２７０５号公報
【特許文献２】特開平１０−２２９８３１号公報
【特許文献３】特開平８−１１３５３９号公報
【特許文献４】特開平８−２８３１７５号公報
【特許文献５】国際公開第００／５７７１９号パンフレット
【特許文献６】特開２００１−３４２１４０号公報
【特許文献７】特開２００４−９７００６号公報
【特許文献８】特開昭６１−７８７２９号公報
【特許文献９】特開２００４−２９８０６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、甲殻類のみならず、他の生物の免疫力を高めるための様々な方法が知られている。【０００９】
しかし、甲殻類の免疫力を改善するための従来技術では、免疫力を高めるといってもそれを証明するための試験が非常に簡便なものであったりするなど、実際の感染症に効果があるか不明であるところがあった。また、免疫機構は脊椎動物のみならず植物にも類似の機構が見出され、甲殻類の免疫機構でも脊椎動物と同様に体液性免疫と細胞性免疫が見出されているが、生物種により異なる点が多々ある。よって、脊椎動物の中でも特にヒトに対しては、免疫力を高めるいわゆる健康食品が幅広く開発されているが、脊椎動物に有効な免疫賦活物質が甲殻類にも有効であるとは限らない。【００１０】
上記の状況下、本発明は、甲殻類の感染症の中でも有効な対応手段が無く、養殖場においていったん発生すると全滅を引き起こしかねない感染症を抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、クロレラ属藻類に近縁なものではあるがクロレラ属藻類とは異なるパラクロレラ属藻類自体が、甲殻類の免疫力を高め、その感染症を顕著に抑制できることを見出して本発明を完成した。【００１２】
以下、本発明を示す。【００１３】
［１］  甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させる工程を含むことを特徴とする甲殻類の感染症の抑制方法。【００１４】
［２］  パラクロレラ属藻類を４週間以上にわたり摂取させる上記［１］に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。パラクロレラ属藻類を甲殻類に４週間以上にわたって摂取させれば、感染症をより確実に抑制できる。【００１５】
［３］  パラクロレラ属藻類を１日当たり５．０ｇ／ｋｇ体重以下摂取させる上記［１］または［２］に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。一般的な免疫賦活剤と同様に、パラクロレラ属藻類も摂取量が多過ぎると免疫力が用量依存的に向上せず、向上効果がかえって低下し始めることがある。しかし１日当たりの摂取量が０．００１ｇ／ｋｇ体重以上、５．０ｇ／ｋｇ体重以下であれば、甲殻類に対する免疫力向上効果は十分に高い。【００１６】
［４］  パラクロレラ属藻類としてパラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）種藻類を用いる上記［１］〜［３］のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。【００１７】
［５］  パラクロレラ・ケスレリ種藻類としてＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を用いる上記［４］に記載の甲殻類の感染症の抑制方法。【００１８】
［６］  パラクロレラ属藻類として、下記（１）〜（３）の何れかの塩基配列を有する１８Ｓ  ｒＲＮＡを有するものを用いる上記［１］〜［５］の何れかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。  
（１）  配列番号１の塩基配列
（２）  上記（１）に規定される塩基配列において、１以上、３１以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列
（３）  上記（１）に規定される塩基配列に対して９８．５％以上の配列同一性を有する塩基配列【００１９】
［７］  パラクロレラ属藻類としてパラクロレラ・バイエリンク（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）種藻類を用いる上記［１］〜［３］のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。【００２０】
［８］  ウィルスを原因とする感染症を抑制するためのものである上記［１］〜［７］のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。【００２１】
［９］  従属栄養培養したパラクロレラ属藻類を用いる上記［１］〜［８］のいずれかに記載の甲殻類の感染症の抑制方法。【００２２】
［１０］  甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させることを特徴とする、甲殻類の感染症を抑制するためのパラクロレラ属藻類の使用。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、養殖など高密度での飼育状態下においても、甲殻類の免疫力を向上させ、その感染症を効果的に抑制することができる。また、本発明方法で用いるパラクロレラ属藻類については、その生細胞を用いてもよいが、その乾燥体であっても同様に効果を発揮することができるので、安定的な供給が可能である。よって本発明に係る甲殻類の感染症の抑制方法は、これまで有効な対応策のなかった甲殻類の感染症を有効に抑制でき、例えば甲殻類の効率的で安定的な養殖を可能にするものとして、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料または含まない通常飼料を与えた場合におけるウィルス感染クルマエビの生存率の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料または含まない通常飼料を与えた場合におけるウィルス感染クルマエビの生存率の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料または含まない通常飼料を与えた場合におけるウィルス感染クルマエビの生存率の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料または含まない通常飼料を与えた場合におけるウィルス感染クルマエビの血リンパに含まれる細胞数を比較するためのグラフである。
【図５】図５は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料を与えた場合と、陰性対照として通常飼料のみ、または陽性対照として市販の抗生物質代替品を含む飼料を与えた場合におけるウィルス感染バナメイエビの生存率の変化を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明に係るパラクロレラ属藻類を含む飼料を与えた場合と、陰性対照として通常飼料のみ、または陽性対照として市販の抗生物質代替品を含む飼料を与えた場合におけるビブリオ菌感染バナメイエビの生存率の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る甲殻類の感染症の抑制方法は、甲殻類に対して、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させる工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
パラクロレラ属は、トレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）と緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）とにまたがるクロレラ属のうち、トレボキシア藻綱に属するものであるが、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析によれば他のクロレラ属とは別のグループを形成するものである。
【００２７】
パラクロレラ属藻類にはクロレラ属藻類のような強固な細胞壁構造が認められず、代わりに多糖類を主体とした厚い膜で覆われている。このことが、クロレラ属藻類に比べてパラクロレラ属藻類が甲殻類に消化吸収され易く、感染症に対する抵抗力を効率的に向上させることができる理由であると考えられる。
【００２８】
一般的に、パラクロレラ属藻類は、野外で採取した淡水サンプルから、一般的な培地を使った継代培養によりコロニーを分離し、最終的に分子系統学的解析により属種を特定することにより得ることができる。また、市販のものなどがあれば、入手して使用すればよい。
【００２９】
パラクロレラ属藻類は、淡水培地やＬＢ培地などの一般的な培地中、好気条件、嫌気条件のいずれでも生育可能であるが、室温〜３０℃、明条件、好気条件で特によく増殖する。
【００３０】
パラクロレラ属藻類としては、例えば、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｉｃｔｙｏｓｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｕｃｉｄｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｉｃｌｏｓｔｅｒ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋが挙げられる。これらの中でも特にＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉとｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉが好適である。
【００３１】
パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）種藻類のうち、特に好適なＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８−１  １２０号室
（ｉｉ）  受託日：  ２０１３年９月３日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６
本発明に係るＫＮＫ−Ａ００１株の形態的特徴などは、以下のとおりである。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
また、ＫＮＫ−Ａ００１株の１８Ｓ  ｒＲＮＡの部分塩基配列を配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示す。
【００３４】
また、その１８Ｓ  ｒＲＮＡが、配列番号１に相当する（１）の塩基配列に対して、下記（２）または（３）の塩基配列を有する場合には、ＫＮＫ−Ａ００１株と同じくパラクロレラ属藻類に属し、且つＫＮＫ−Ａ００１株と同様に甲殻類の感染症を効果的に抑制できると考えられる。
【００３５】
（２）  上記（１）に規定される塩基配列において、１以上、３１以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列
（３）  上記（１）に規定される塩基配列に対して９８．５％以上の配列同一性を有する塩基配列
なお、欠失などの変異の導入により１８Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列の塩基数が変化する場合においても、変異数が上記のとおり１以上、３１以下の範囲内にあるか、配列同一性のパーセンテージが上記のとおり９８．５％以上の範囲内にあれば、変異導入後の配列において、変異導入前の特定位置に相当する位置を特定することは当業者にとり容易である。具体的には、塩基配列の多重アラインメント用プログラムで比較すべき配列をアライメントし、位置を決定することが可能である。また、塩基配列の同一性も、多重アラインメント用プログラムで容易に求めることができる。
【００３６】
上記塩基配列（２）において、欠失などの変異の数としては、３０以下、２０以下または１０以下がより好ましく、９以下、８以下、６以下または５以下がさらに好ましく、４以下、３以下、２以下または１個がさらに好ましい。
【００３７】
また、上記塩基配列（３）において、塩基配列の同一性のパーセンテージとしては、９９．０％以上、９９．２％以上または９９．４％以上がより好ましく、９９．５％以上、９９．６％以上または９９．７％以上がさらに好ましく、９９．８％以上または９９．９％以上がさらに好ましい。
【００３８】
本発明で用いるパラクロレラ属藻類としては、少なくとも最終の培養段階で従属栄養培養したものが好ましい。パラクロレラ属藻類は、独立栄養培養した場合と従属栄養培養した場合とでは細胞の構成や細胞に含まれる成分に相違が生じる場合があり得るが、少なくとも従属栄養培養したパラクロレラ属藻類による甲殻類の感染症の抑制効果は確認されている。
【００３９】
本発明に係るパラクロレラ属藻類には、その変異体であって、その乾燥体が甲殻類の感染症に対して優れた抑制効果を示すものも含むものとする。ここで「変異体」とは、人為的な選択、交雑、突然変異、遺伝子組み換えなどにより改良したパラクロレラ属藻類をいうものとする。
【００４０】
本発明に係るパラクロレラ属藻類は、その生細胞を用いてもよいが、乾燥体を用いてもよい。後記の実施例のとおり、パラクロレラ属藻類の乾燥体を用いても甲殻類の感染症を効果的に抑制することができるし、また、乾燥体であれば生細胞に比べて簡易な条件で保存することが可能であり、安定的に供給することができる。
【００４１】
パラクロレラ属藻類自体の乾燥体は、パラクロレラ属藻類の生細胞や、当該生細胞を含む培養液を乾燥することにより得ることができる。即ち、パラクロレラ属藻類の培養液から濾過や遠心分離などにより生細胞を分離して乾燥したり、或いは培養液をそのまま乾燥すればよい。なお、パラクロレラ属藻類は、培養液中に分泌物を放出し、この分泌物が水生生物の成長に有効な成分の一つである可能性がある。培養液をそのまま乾燥した場合には、乾燥体にはかかる分泌物が含まれることになる。
【００４２】
パラクロレラ属藻類の生細胞や当該生細胞を含む培養液の乾燥は、常法に従って行うことができる。例えば、当該生細胞または培養液を５０℃以上、２００℃以下で１０秒間以上、１０時間以下程度乾燥すればよい。乾燥時には減圧してもよい。なお、培養液を薄膜状に流下させつつ乾燥すれば、乾燥時間を短縮することができる。また、凍結乾燥してもよい。具体的な乾燥条件は、乾燥すべきパラクロレラ属藻類や培養液の量、使用する機器などに応じて適宜調整することができる。また、得られた乾燥体は、一般的には凝集しているので、さらに粉砕してもよい。粉砕程度は、給餌すべき甲殻類が摂取し易い程度に調整すればよい。
【００４３】
なお、本発明における「乾燥体」は特に制限されず、パラクロレラ属藻類が生細胞ではなく、また、明らかな湿潤状態になければその水分含量は問わないものとする。例えば、乾燥体の水分含量としては３０質量％以下とすることができる。当該水分含量としては、その値が低いほど飼料の保存安定性が高く、また、運搬が容易であるので、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下がさらに好ましく、８質量％以下がよりさらに好ましい。一方、過剰に乾燥させる必要はないので、当該水分含量としては１質量％以上が好ましく、２質量％以上がより好ましく、５質量％以上がさらに好ましい。なお、上記の乾燥は細胞を殺すためや保存安定性を向上させるために行うものであるので、実際の給餌時や飼料製品とする場合の飼料における水分含量は問題にならない。例えば、パラクロレラ属藻類の乾燥体を養殖水などに分散した上で給餌してもよい。また、乾燥体中の水分含量は、カールフィッシャー法により容易に測定することができる。
【００４４】
本発明方法では、甲殻類に対して、パラクロレラ属藻類自体を１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重以上摂取させる。本発明方法では、上述したとおりパラクロレラ属藻類の生細胞或いは乾燥体の何れを給餌してもよいが、かかる上記摂取量は、パラクロレラ属藻類の乾燥状態での質量を基準にする。
【００４５】
パラクロレラ属藻類の摂取量は、甲殻類の成長度合いなどに応じて適宜調整すればよい。例えば、上記の１日当たりの摂取量としては、０．００２ｇ／ｋｇ体重以上、０．００３ｇ／ｋｇ体重以上または０．００５ｇ／ｋｇ体重以上が好ましく、０．０１ｇ／ｋｇ体重以上、０．０２ｇ／ｋｇ体重以上または０．０５ｇ／ｋｇ体重以上がより好ましい。一方、当該摂取量が多過ぎると、パラクロレラ属藻類に含まれない栄養成分や含有量の少ない栄養成分などが不足するおそれがあり得るので、当該摂取量としては２０ｇ／ｋｇ体重以下が好ましく、１０ｇ／ｋｇ体重以下がより好ましい。さらに、甲殻類に対する免疫力向上効果をより確実に発揮せしめるためには、当該摂取量としては５．０ｇ／ｋｇ体重以下が特に好ましい。さらに、刺激が強過ぎると、免疫抑制効果が低減することもあり得る。かかる観点からは、上記の１日当たりの摂取量としては、場合によっては、１．０ｇ／ｋｇ体重以下が好ましく、０．５ｇ／ｋｇ体重以下がより好ましく、０．４ｇ／ｋｇ体重以下がさらに好ましい。
【００４６】
パラクロレラ属藻類は、それのみを給餌してもよいが、その場合には甲殻類が摂取しないおそれや、パラクロレラ属藻類に含まれない栄養成分などが不足するおそれがあり得る。そのような場合には、パラクロレラ藻類を一般的な甲殻類飼料に混合することが好ましい。かかる場合における飼料全体におけるパラクロレラ属藻類の割合としては、０．００１質量％以上、１０質量％以下が好ましい。当該割合としては、０．００２質量％以上がより好ましく、０．００５質量％以上がさらに好ましく、０．０１質量％以上が特に好ましく、また、８質量％以下がより好ましく、６質量％以下がさらに好ましく、５質量％以下が特に好ましい。
【００４７】
本発明では、ウィルスなどによる感染症に対する甲殻類の抵抗性を改善することを目的としている。しかし、免疫機能はすぐに向上するものではないので、本発明に係るパラクロレラ属藻類は甲殻類に継続的に、例えば少なくとも１週間にわたり摂取させることが好ましい。当該摂取期間としては、２週間以上がより好ましく、４週間以上がさらに好ましく、５週間以上が特に好ましい。上限は特に制限されず、甲殻類の飼育開始から十分に成長するまで、例えば製品として出荷するまでとすればよい。
【００４８】
パラクロレラ属藻類の摂取回数は適宜調整すればよいが、例えば、他の飼料と共に一日当たり１回以上、３回以下とすることができる。
【００４９】
パラクロレラ属藻類を飼料に混合して甲殻類に摂取させる場合、その形態は特に制限されず、給餌すべき甲殻類の種類や成長度合いなどに応じて適宜決定すればよい。例えば、一般的には飼料全体を粉末状態にし、幼生に対しては５０μｍ以上、１００μｍ以下程度とし、十分に成長した段階では５００μｍ以上、８００μｍ以下程度とすることができ、その中間段階では粒子径を段階的に調整すればよい。
【００５０】
本発明方法の対象となる甲殻類としては、例えば、クルマエビ、ウシエビ、大正エビ、ホワイトシュリンプ、ブルーシュリンプ、ブラウンシュリンプ、テンジクエビ、イセエビ、テナガエビ、ヒラテナガエビ、ミナミテナガエビ、アメリカザリガニなどのエビ類；ガザミ、タラバガニ、マツバガニ、ケガニ、シャコなどのカニ類などを挙げることができるが、養殖や種苗生産の対象となる甲殻類であれば特に制限無く本発明方法を適用することができる。
【００５１】
本発明方法によれば、甲殻類の感染症を有効に抑制することが可能になる。なお、本発明における「抑制」には、感染症の発症の抑制、即ち「予防」と、発症した感染症の軽減、即ち「治療」の両方の概念が含まれる。従って、本発明方法は、甲殻類の感染症の発症前に予防的に実施してもよいし、症状が比較的軽度なうちに治療するか或いは症状の進行を阻害するために使用してもよいし、重度な症状を軽減するために使用してもよい。
【００５２】
本願は、２０１３年１１月２８日に出願された日本国特許出願第２０１３−２４５９８６号、および２０１３年１２月９日に出願された日本国特許出願第２０１３−２５４１９２号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年１１月２８日に出願された日本国特許出願第２０１３−２４５９８６号、および２０１３年１２月９日に出願された日本国特許出願第２０１３−２５４１９２号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００５４】
実施例１：クルマエビの養殖実験
（１）  飼料の調製
殺菌した液体培地にパラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）ＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を接種し、アルミホイルで遮光した後、３０℃で７２時間前培養した。次に、より大容量の殺菌液体培地に前培養培地を加え、アルミホイルで遮光した後、内温３０℃、通気量２Ｌ／分、撹拌数４５０ｒｐｍ、ｐＨ６〜７で１４３時間培養した。【００５５】
次いで、ダブルドラム型乾燥機により培養液を乾燥し、得られた乾燥凝集体をフェザーミルで粉砕することによりＫＮＫ−Ａ００１株の細胞乾燥物を得た。【００５６】
また、パラクロレラ属藻類として、パラクロレラ・バイエリンク（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）種藻類（製品名「バイエリンク」，三井物産株式会社より購入）を同様の実験に供した。【００５７】
市販のエビ用飼料（ヒガシマル社製，製品名「エビスター」）に、上記ＫＮＫ−Ａ００１株を０．１質量％（１，０００ｐｐｍ）もしくは１質量％（１０，０００ｐｐｍ）、または上記バイエリンク種藻類を０．１質量％（１，０００ｐｐｍ）添加してよく混合することにより、飼料を調製した。また、比較のために、対照として上記エビ用飼料のみを用いた。【００５８】
（２）  養殖実験
２００Ｌ容の水槽を４槽用意し、それぞれに同一量の砂を入れ、約２４℃に加温した海水を同一水量で常時注水し流水させた。各水槽に体重３〜５ｇのクルマエビを１５尾ずつ収容し、上記飼料を１日１回、日没後に飽食給餌した。翌朝に各水槽の残餌状況を観察し、給餌量を調整した。１日当たりの給餌量は、エビの体重当たりおおよそ３００〜６００ｇ／ｋｇ／ｄａｙであった。【００５９】
別途、クルマエビのホワイトスポット病の原因ウィルスであるホワイトスポットシンドロームウィルスに感染することにより斃死したクルマエビの筋肉をホモジナイズし、遠心分離して得られた上澄液をリン酸緩衝液で希釈することによりウィルス液を調製した。飼育開始から４週間後に、当該ウィルス液０．１ｍＬを各群の水槽中のエビの第３腹節の筋肉中に打注することによりウィルス感染させた。ウィルス感染から毎日、生存エビ数から生存率を算出した。結果を図１に示す。【００６０】
図１に示す結果のとおり、市販飼料のみを給餌していた対照群では、ウィルス感染から生存率は急激に低下し、ウィルス感染から８日目には生存率は７％まで低下した。一方、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した他の３群では、ウィルス感染後も対照群に比べて生存率は明らかに維持されている。かかる結果から、パラクロレラ属藻類により、甲殻類の免疫力が向上してウィルス感染に対する抵抗力が向上し、感染症を抑制できることが明らかとなった。なお、ウィルス感染から数日間は、パラクロレラ・ケスレリＫＮＫ−Ａ００１株０．１％摂取群とバイエリンク株０．１％摂取群の生存率が、対照群の生存率よりも低くなっている。これら群でウィルス感染から３日目に死んだクルマエビ２尾のウィルス量をＰＣＲにて測定したところ、死因はウィルス感染ではないことが明らかとなった。死因としては、打注処理によるショックが考えられる。よって、これら群でウィルス感染以外による死亡が無ければ、１４日経過後の生存率はより高い値を示した可能性がある。【００６１】
実施例２：クルマエビの養殖実験
実施例１（１）と同様にして、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）ＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を０．０２質量％（２００ｐｐｍ）または０．０５質量％（５００ｐｐｍ）含む飼料を調製した。また、比較のために、対照として上記エビ用飼料のみを用いた。【００６２】
また、実施例１（２）と同様に養殖実験を行った。結果を図２に示す。図２中、「＊」はウィルス感染から１４日目におけるクルマエビの生存率に関してｔ−テストでｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【００６３】
図２の結果のとおり、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した群においては、普通飼料を給餌した群に対して生存率が有意に改善されており、ウィルス感染症が有効に抑制されていることが実証された。【００６４】
実施例３：クルマエビの養殖実験
実施例１において、より小さなクルマエビを用いて同様の実験を行った。即ち、実施例１（１）と同様にして、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）ＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を０．０１質量％（１００ｐｐｍ）、０．０２質量％（２００ｐｐｍ）または０．０５質量％（５００ｐｐｍ）含む飼料を調製した。また、比較のために、対照として上記エビ用飼料のみを用いた。また、実施例１（２）において、体重が約１．５ｇのクルマエビを用い、各水槽におけるクルマエビ数を２５尾とした以外は同様にして、養殖実験を行った。結果を図３に示す。【００６５】
図３に示す結果のとおり、体重に対する接種ウィルス液量がより多い場合であっても、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した３群の生存率は、市販飼料のみを給餌した対照群に比べて明らかに高かった。なお、２００ｐｐｍおよび５００ｐｐｍのパラクロレラ属藻類配合群で死んだクルマエビそれぞれ１尾ずつについて、実施例１と同様にＰＣＲによりウィルス量を測定したが、死因はウィルス感染ではないことが明らかにされた。【００６６】
また、ホワイトスポットシンドロームウィルス感染から１４日後、生き残ったクルマエビから血リンパを採取し、採取した血リンパに含まれる細胞数を計測した。【００６７】
具体的には、十分に氷冷したＫ−１９９培地０．５ｍＬを１ｍＬシリンジにとり、当該シリンジに２６Ｇの注射針を取り付け、クルマエビから血リンパを０．５ｍＬ採取した。別途、１５ｍＬチューブにＫ−１９９培地２ｍＬを加え、上記血リンパ液を加えて穏やかに攪拌した。次いで、当該血リンパ液を血球計算板上に流し込んで、細胞数を計数した。結果を図４に示す。【００６８】
図４に示す結果のとおり、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した３群のクルマエビの血リンパ細胞数は、市販資料のみを給餌した対照群に比べて明らかに多かった。血リンパに含まれる細胞は免疫に関与するので、この結果より、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌すれば、甲殻類の免疫力が高まり、感染症に対して強くなることが証明された。【００６９】
実施例４：バナメイエビの養殖実験
実施例１（１）と同様にして、市販のエビ用飼料（ＹｕｅＨａｉ社製）に、上記ＫＮＫ−Ａ００１株を０．００５質量％（５０ｐｐｍ）、０．０１質量％（１００ｐｐｍ）または０．０２質量％（２００ｐｐｍ）含む飼料を調製した。また、比較のために、陰性対照として上記エビ用飼料のみを用い、また、陽性対照として、表２に示す組成を有する飼料を用いた。なお、陽性対照試料には、細菌の胞子混合物であって、抗生物質代替品であるＨＡＮＳＥＮ社製の「ＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）」が含まれている。【００７０】
【表２】
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【００７１】
２００Ｌ容の水槽を各群につき４槽用意し、それぞれに同一量の砂を入れ、約２４℃に加温した海水を同一水量で常時注水し流水させた。各水槽に体重１〜２ｇのバナメイエビを１５尾ずつ収容し、上記飼料を１日１回、日没後に飽食給餌した。翌朝に各水槽の残餌状況を観察し、給餌量を調整した。１日当たりの給餌量は、エビの体重当たりおおよそ３０〜６０ｇ／ｋｇ／ｄａｙであった。【００７２】
別途、上記実施例１（２）と同様にしてホワイトスポットシンドロームウィルス液を調製し、飼育開始から４０日後に、当該ウィルス液０．１ｍＬを各群の水槽中のエビの第３腹節の筋肉中に打注することによりウィルス感染させた。ウィルス感染から１３日目まで毎日、生存エビ数から生存率を算出した。結果を図５に示す。【００７３】
図５に示す結果のとおり、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した３群の生存率は、市販飼料のみを給餌した対照群に比べて明らかに高かった。このようにパラクロレラ属藻類は、甲殻類の免疫力を高めることが明らかとなった。【００７４】
実施例５：バナメイエビの養殖実験
実施例１（１）と同様にして、市販のエビ用飼料（ＹｕｅＨａｉ社製）に、上記ＫＮＫ−Ａ００１株を０．００５質量％（５０ｐｐｍ）、０．０１質量％（１００ｐｐｍ）、０．０２質量％（２００ｐｐｍ）または０．０５質量％（５００ｐｐｍ）含む飼料を調製した。また、実施例４と同様にして、陰性対照飼料と陽性対照飼料を用いた。【００７５】
別途、南海水産研究所保有のビブリオ・アルジノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）を１．５×１０6ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、飼育開始から４０日後に各群の水槽中のエビの第３腹節の筋肉中に打注することにより感染させた。感染から１２日目まで毎日、生存エビ数から生存率を算出した。なお、ビブリオ・アルジノリチカスは海水に常在する菌であり、海水との接触によって、ヒトにも中耳炎、皮膚潰瘍や創傷感染、菌血症を引き起こす。結果を図６に示す。【００７６】
図６に示す結果のとおり、ビブリオ菌感染症に対しても、パラクロレラ属藻類が配合された飼料を給餌した３群の生存率は、市販飼料のみを給餌した対照群に比べて明らかに高かった。このようにパラクロレラ属藻類は、甲殻類の免疫力を高め、甲殻類の細菌感染症にも効果を示すことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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