(57)【要約】  本発明の塩基変異の検出方法は、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。
2016093333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、
前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、
前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する塩基変異の検出方法。
【請求項２】
前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、
前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定する請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、
前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと、
前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む、キット。
【請求項８】
前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法であって、
前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用意し、
前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う、対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法。
【請求項１２】
前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法に関する。
本願は、２０１４年１２月１１日に日本に出願された特願２０１４−２５０９０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の塩基配列は個体間で様々である。これらの塩基配列の違いのうち、頻度が１％以上のものは「遺伝子多型」と呼ばれる。多型の種類は様々であり、塩基の置換、塩基の挿入又は欠損、特定の塩基配列の繰り返し回数の違い等が挙げられる。これらの多型を塩基変異という。【０００３】
塩基変異の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の融解曲線を解析する方法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法、ＰＣＲ産物の塩基配列をシーケンスする方法、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法等により行われている。【０００４】
融解曲線を解析する方法では、まず、ＰＣＲ法により、検出対象となる対象塩基配列の近傍を増幅する。ＰＣＲ法とは、耐熱性ポリメラーゼと、標的核酸と相補性を有する２つのプライマーとを用いて、（１）鋳型となる２本鎖標的核酸の変性、（２）変性した標的核酸へのプライマーのアニーリング、（３）プライマーからの伸長反応、という３つのステップを、温度制御を行うことにより繰り返し、指数関数的に標的核酸を増幅する方法である。【０００５】
続いて、インターカレーター試薬を使用してＰＣＲ産物の融解曲線を作成する。インターカレーター試薬は、溶液中に存在する際には、２分子以上の集合体として存在するため、エキシトン効果により蛍光発光を示さないが、標的核酸にインターカレートすることで、集合状態から単離され、蛍光発光する。インターカレーター試薬としては、例えばエチジウムブロマイドやサイバーグリーンが挙げられる。【０００６】
より具体的には、ＰＣＲ産物の温度を上昇させて、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離（融解）させると、インターカレーター試薬からの蛍光が消失する。これを利用して、融解曲線を作成する。続いて融解曲線を解析し、ＰＣＲ産物の塩基配列の相違によって融解曲線がわずかに相違することに基づいて塩基変異を検出する。【０００７】
また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法では、蛍光物質及び消光物質を付加したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの存在下でＰＣＲ反応を行うと、上記のＰＣＲ法のステップ（２）においてＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが標的核酸にアニーリングされる。さらにステップ（３）の伸長反応に伴い、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが分解される。その結果、消光物質から遊離した蛍光物質が蛍光を発するようになる。【０００８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）法により塩基変異を検出する場合、例えば、塩基変異を有する配列（変異型配列）に相補的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、及び、上記ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとは蛍光物質が異なっており、野生型配列に相補的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、２種類のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの存在下でＰＣＲ反応を行う。その後、分解した各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに由来する２色の蛍光の蛍光強度を比較することにより、塩基変異が検出される。【０００９】
また、シーケンス法では、ＰＣＲ産物の塩基配列を直接解読することにより、塩基変異が検出される。【００１０】
また、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法では、ＤＮＡの三重鎖構造を特異的に認識して切断するクリベースを利用して、塩基変異が検出される。【００１１】
これらの塩基配列の検出方法のうち、シーケンス法やＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）法は、融解曲線による検出方法やＴａｑＭａｎ（登録商標）法よりも、１塩基変異の検出能力に優れている。【００１２】
ところで、塩基変異の中には、癌等の疾患により後天的に塩基配列が変異する体細胞変異が存在する。体細胞変異の有無を検出することは、疾患の治療方法の選択を行うにあたり、非常に有用である。【００１３】
体細胞変異には、未知の変異配列が多く存在する。そのため、シーケンス法やＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）法によってこれらの塩基変異を検出するためには、新たな塩基変異が発見される度に、使用するプライマーやプローブの配列を見直さなければならないという問題がある。【００１４】
また、体細胞変異の場合、核酸サンプル中の大部分は野生型配列を有しており、変異型配列を有する核酸は、ごくわずかなコピー数しか存在しない場合がある。このような場合、検出感度が低い融解曲線による検出方法やＴａｑＭａｎ（登録商標）法では体細胞変異を検出することが困難な場合がある。【００１５】
したがって、体細胞変異の検出に適した塩基変異の検出方法が求められている。体細胞変異の検出においては、体細胞変異の塩基配列を詳細に解明する必要はなく、塩基変異の有無のみを検出できればよい場合がある。【００１６】
例えば、特許文献１及び非特許文献１では、人工核酸ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）により野生型配列のＰＣＲ増幅をブロックして、変異型配列を特異的にＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ産物の融解曲線を作成し、野生型と変異型との融解曲線の相違に基づいて、塩基変異の有無を検出する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】日本国特表２０１４−５０１５３３号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Bjornar Gilje, et al., Journal of Molecular Diagnostics, 10, 325-331, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、特許文献１や非特許文献１では、融解曲線により塩基変異の有無を検出しているため、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合には、塩基変異を検出することが困難な場合がある。また、検出対象の塩基変異以外に、一塩基多型（ＳＮＰ）や、塩基の挿入、塩基の欠失等を含む場合には、塩基変異を誤検出してしまう場合がある。また、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失である場合は、野生型と変異型とで融解曲線に大きな違いが生じず、識別が困難になる場合がある。【００２０】
そこで、本発明は、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。また本発明は、核酸サンプル中に、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。さらに本発明は、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異の検出が可能な塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。本発明はまた、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は以下の通りである。
本発明の第一態様に係る塩基変異の検出方法は、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。
上記第一態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
上記第一態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
上記第一態様において、前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列であってもよい。
上記第一態様において、前記ＰＣＲ反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定してもよい。
上記第一態様において、前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。
本発明の第二態様に係るキットは、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む。
上記第二態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
上記第二態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
上記第二態様において、前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。
本発明の第三態様に係る、対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法は、前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用意し、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う。
上記第三態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
上記第三態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様によれば、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の第１実施形態に係る塩基変異の検出方法を説明する模式図である。
【図２】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
【図３】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
【図４】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
【図５】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
【図６】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［塩基変異の検出方法］
本発明の第１実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法は、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを用いて、核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行う。さらに、プローブ由来の蛍光を検出することにより、ＰＣＲ反応における鋳型の増幅量を測定する。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
【００２５】
まず、本実施形態の塩基変異の検出方法の概要を説明する。図１は、本実施形態に係る塩基変異の検出方法を説明する模式図である。図１に示すように、ここでは、対象塩基配列１０中の塩基変異２０’（図１ではアデニン残基）を検出する場合を説明する。塩基変異２０’に対応する野生型配列の残基は、残基２０（図１ではグアニン残基）である。なお、本明細書においては、核酸サンプル中の対象塩基配列を有する領域（対象塩基配列を有する部位）を、対象塩基配列と呼ぶ。また、本明細書において、「塩基」とは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン等のプリン塩基又はピリミジン塩基を意味する。
また、「残基」とは、ＤＮＡの場合のヌクレオチドに相当する単位を意味する。すなわち、本明細書において、「塩基」とは、ＤＮＡの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる残基のうちの塩基部分又はこれに相当する部分を意味する。また、「残基」とは、ＤＮＡの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる単位又はこれに相当する単位を意味する。
【００２６】
まず、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒと、ブロッカー核酸断片５０と、プローブ６０と、の存在下でＰＣＲ反応を行う。プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒは、核酸サンプルｗ（野生型）及び核酸サンプルｍ（変異型）を鋳型として、対象塩基配列１０を含む増幅対象領域３０をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットである。ブロッカー核酸断片５０は、対象塩基配列１０に相補的な塩基配列を有する。プローブ６０は、増幅対象領域３０のうち、対象塩基配列１０と同一鎖上で、対象塩基配列１０よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
【００２７】
ブロッカー核酸断片５０を構成する残基のうち、少なくとも１残基は人工核酸である。
また、プローブ６０は、鋳型に相補的な塩基配列を有しており、プローブ６０の一方の末端には蛍光物質Ｆが結合しており、他方の末端には消光物質Ｑが結合している。
【００２８】
また、ブロッカー核酸断片５０の融解温度及びプローブ６０の融解温度は、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒの融解温度よりも高いことが好ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも先にブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０を鋳型に結合させることができ、塩基変異の検出精度を向上させることができる。
【００２９】
ＰＣＲ反応では、まず反応溶液を９０〜９９℃程度に加熱して、核酸を変性させる。次に、反応溶液の温度を５０〜６０℃程度に下げ、アニーリングさせる。ここで、ブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０の融解温度がプライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒの融解温度より高い場合、ブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０が、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも先に鋳型に結合する。このとき、ブロッカー核酸断片５０は、野生型の塩基配列を有しているため、野生型の鋳型ｗに結合する。しかしながら、塩基変異２０’を有する変異型の鋳型ｍには結合しない。その後、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒが鋳型に結合する。
【００３０】
次に、反応溶液の温度を６０〜７５℃程度に調整し、Ｔａｑポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を行う。ここで、野生型の鋳型ｗにはブロッカー核酸断片５０が結合しているため、プライマーの伸長反応が妨害される。一方、変異型の鋳型ｍにはブロッカー核酸断片５０が結合していないため、プライマーの伸長反応が行われる。
【００３１】
やがて、プライマーの伸長はプローブ６０の結合部位に到達する。ここで、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、蛍光を発するようになる。
【００３２】
変性、アニーリング、及び伸長のサイクルを繰り返してＰＣＲ反応を進めると、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅は抑制され、変異型の鋳型ｍのＰＣＲ増幅が優先的に行われる。また、蛍光物質Ｆの存在量は、鋳型ｍのＰＣＲ増幅量に比例して増大する。
【００３３】
したがって、蛍光物質Ｆの蛍光の量を測定することにより、鋳型ｍのＰＣＲ増幅量を測定することができる。これにより、核酸サンプルの対象塩基配列１０中の塩基変異２０’の存在を検出することができる。上記のＰＣＲ増幅の抑制は、ブロッカー核酸断片５０が少なくとも１残基の人工核酸を含むことにより効率的に行われる。具体的な人工核酸については後述する。人工核酸の位置は、ブロッカー核酸断片５０を構成する残基のいずれであってもよい。
【００３４】
本実施形態の方法によれば、ブロッカー核酸断片５０によって、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅を抑制することにより、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。
【００３５】
また、増幅対象領域３０のうち、対象塩基配列１０以外の領域に塩基変異が存在する場合であっても、対象塩基配列１０中の塩基変異を正確に検出することができる。また、対象塩基配列１０中の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、対象塩基配列１０の範囲内であれば、新規の塩基変異が存在する場合であっても、プライマー４０Ｆ、プライマー４０Ｒ、ブロッカー核酸断片５０、及びプローブ６０の設計を変更することなく、塩基変異を検出することができる。
【００３６】
また、ブロッカー核酸断片５０（対象塩基配列１０）を変更することにより、新規の塩基配列の探索を容易に行うことも可能である。
【００３７】
このように、本実施形態に係る方法によれば、低コピー数の体細胞変異遺伝子の遺伝子型が判定可能であるのみならず、今後新たに発見される変異形態にも対応することが可能である。したがって、本実施形態に係る方法は、癌遺伝子の早期発見等のオーダーメイド医療にも有用である。
【００３８】
続いて、本実施形態に係る塩基変異の検出方法について、より詳細に説明する。
【００３９】
（塩基変異）
本明細書において、塩基変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味する。本実施形態に係る検出方法によれば、ＳＮＰやマイクロサテライト多型等の先天的な塩基変異だけでなく、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されることにより生じた、体細胞変異等の後天的な塩基変異も検出することができる。
【００４０】
（核酸サンプル）
本実施形態において、核酸サンプルは、被験対象由来のゲノムＤＮＡを含有する試料であってもよい。あるいは、ゲノムＤＮＡを鋳型として、目的の塩基変異部位を含む領域を予めＰＣＲ等で増幅して得られた増幅産物を含有する試料であってもよい。
【００４１】
本実施形態において、対象塩基配列１０は１個であってもよく、複数であってもよい。
対象塩基配列１０が複数存在する場合、核酸サンプルを鋳型として、各対象塩基配列１０を含む複数の増幅対象領域３０を複数対のプライマーセットを用いて同時にＰＣＲ増幅し（「多重ＰＣＲ」又は「ｍＰＣＲ」とも呼ばれる。）、このＰＣＲ増幅産物を核酸サンプルに用いて各対象塩基配列中の塩基変異を検出してもよい。これにより、例えば核酸サンプルが希少な場合であっても、サンプルを増やして塩基変異を検出することができる。
【００４２】
（対象塩基配列）
対象塩基配列１０は、野生型の塩基配列であってもよい。ブロッカー核酸断片５０は、対象塩基配列１０に相補的な塩基配列を有する。そのため、この場合、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅を抑制し、変異型の鋳型ｍのＰＣＲ増幅を優先的に行うことができる。これにより、核酸サンプル中の変異型の鋳型ｍの存在量が少ない場合であっても、塩基変異を検出することが容易になる。
【００４３】
対象塩基配列は特に限定されないが、例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。これらの遺伝子における変異は、癌、特に大腸癌と関連することが報告されている。
【００４４】
また、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は癌の治療薬の一種であるが、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３に変異がある大腸癌の場合、抗ＥＧＦＲ抗体の効果が得られないことが知られている。また、例えば大腸癌では、ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２が野生型であるものの１０％程度にＢＲＡＦ遺伝子の変異がある患者が存在し、予後が不良であることが報告されている。このように、上記の遺伝子における体細胞変異の有無を検出することは、疾患の治療方法の選択を行うにあたり、非常に有用である。
【００４５】
（融解温度）
融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）とは、ＤＮＡ分子の５０％が変性して一本鎖となる温度である。融解温度は、核酸の吸光度の変化に基づいて求めることができる。核酸を構成する塩基は、波長２６０ｎｍ付近に強い吸収を持っているが、二本鎖核酸では、スタッキング相互作用により、核酸全体の吸光度が個々の塩基の吸光度の総和より小さい。ところが、二本鎖核酸溶液が加熱され、水素結合が切断されると、個々の塩基が自由になって光を吸収するため、二本鎖核酸よりも吸光度が大きくなる。したがって、核酸の温度を変化させながら吸光度を測定し、横軸に温度、縦軸に吸光度をプロットするとシグモイド曲線が得られる。融解温度は、この曲線の変極点の温度に相当し、吸光度の全上昇分の５０％における温度として定義することができる。
【００４６】
（ブロッカー核酸断片）
ブロッカー核酸断片５０は、人工核酸を少なくとも１残基有する。
【００４７】
現在、人工核酸として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸）、鏡像体ヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシヌクレオシドに代わるβ−Ｌ−デオキシヌクレオシド）等のヌクレオシド修飾された核酸等が知られている。
【００４８】
本実施形態において、人工核酸は、これらの中でもＢＮＡであることが好ましい。
例えば、ＰＮＡオリゴヌクレオチドはその構造の特異性から鎖長の長い構造の合成が困難なことや、塩基配列によっては水に対して著しく溶解性が低下するなどの問題がある。一方で、ＢＮＡオリゴヌクレオチドではそのような問題がなく、本実施形態に係るブロッカー核酸断片に使用するのに、より適した物質である。
また、ＢＮＡは他の人工核酸に比べてＴｍ値が高いため、ブロッカーとして用いるのにより適した物質である。Ｔｍ値が高い場合、例えば、反応溶液を９０〜９９℃程度に加熱して核酸を変性させる工程のように、核酸増幅反応（ＰＣＲ）による高温度域での反応のときでも、ブロッカー核酸断片が鋳型ｗの結合部から外れにくいため、鋳型ｗのＰＣＲ増幅の抑制をより効果的に行うことができる。
発明者らは、ＢＮＡを少なくとも１残基有するブロッカー核酸断片５０が、格段に向上したＰＣＲ増幅の抑制効率を示すことを見出した。全ての残基がＢＮＡである核酸断片をブロッカー核酸断片５０として使用した場合、変異型の配列や配列が似ている他の領域などの完全にはマッチしない領域をブロックしてしまうおそれがある。
【００４９】
ＢＮＡとは、架橋化核酸の総称である。ＢＮＡとしては、リボースの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子とがメチレンを介して結合した２つの環状構造を持つヌクレオチドである２’，４’−ＢＮＡ、３’，４’−ＢＮＡ、２’−デオキシ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ；フラノース環の２位のＯと４位のＣとを−ＮＲＣＨ２−（Ｒはメチル基）で架橋した構造を有する２’，４’−ＢＮＡＮＣ；フラノース環の２位のＯと４位のＣとを−ＣＨ２ＯＣＨ２−で架橋した構造を有する２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ等が知られている。
【００５０】
ブロッカー核酸断片５０に含ませるＢＮＡとしては、上記のいずれのＢＮＡであってもよいが、２’，４’−ＢＮＡであることが好ましい。また、ブロッカー核酸断片５０の長さは、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも融解温度が高ければ特に制限されない。
【００５１】
（プローブ）
本実施形態で用いるプローブは、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するオリゴヌクレオチドである。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
【００５２】
本実施形態では、ＰＣＲ反応のアニーリング工程において、プライマー４０Ｆ、ブロッカー核酸断片５０、及びプローブ６０が、鋳型ｗの同一鎖上に、当該鎖の３’側から５’側に向かってこの順で結合する必要がある。これにより、鋳型ｗにおいては、鋳型ｗのＰＣＲ増幅が抑制されるとともにプローブ６０の分解が抑制される。また、鋳型ｍにおいては、ブロッカー核酸断片５０が結合しないため、プライマー４０Ｆの伸長により、プローブ６０が分解され、蛍光物質Ｆが定量的に遊離される。
【００５３】
（鋳型の増幅量を測定する工程）
本実施形態では、プローブ６０の分解によって遊離した蛍光物質Ｆの蛍光の量を測定することにより、鋳型のＰＣＲ増幅量を測定することができる。蛍光の測定はＰＣＲ反応と同時にリアルタイムに測定することが好ましい。このような蛍光をリアルタイムに測定する場合は、リアルタイム定量ＰＣＲで使用される各種装置を用いて実施することができる。
【００５４】
塩基変異を検出するにあたっては、対照の核酸サンプルをもうけることが好ましい。これにより、塩基変異をより正確に検出することができる。対照としては、例えば、野生型の塩基配列を有する核酸サンプル（標準核酸）を用いることができる。この場合、核酸サンプルを鋳型に用いた場合の鋳型のＰＣＲ増幅量が、標準核酸を鋳型に用いた場合の鋳型のＰＣＲ増幅量と比較して多かった場合に、核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定することができる。
【００５５】
すなわち、本発明の第１実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法において、前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列であり、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブと、を用いて、前記核酸サンプル及び野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行う。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。さらに、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。さらに、前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定する。
【００５６】
［塩基変異を検出するためのキット］
本発明の第２実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットは、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを含む。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
【００５７】
本実施形態に係るキットは、上述した塩基変異の検出方法に好適に用いることができる。ブロッカー核酸断片及びプローブの具体的な態様は、上述した態様と同様である。
【００５８】
本実施形態に係るキットによれば、ブロッカー核酸断片によって、検出対象でない鋳型（例えば、野生型の塩基配列を有する核酸）のＰＣＲ増幅を抑制することにより、核酸サンプル中に、検出対象の鋳型（例えば、塩基変異を有する核酸）がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。
【００５９】
また、増幅対象領域のうち、対象塩基配列以外の領域に塩基変異が存在する場合であっても、対象塩基配列中の塩基変異を正確に検出することができる。また、対象塩基配列中の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、対象塩基配列の範囲内であれば、新規の塩基変異が存在する場合であっても塩基変異を検出することができる。
【００６０】
本実施形態に係るキットにおいて、上記の人工核酸は、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率が高まる観点から、ＢＮＡであることが好ましい。好適なＢＮＡは、上述した構成と同様である。また、ブロッカー核酸断片の融解温度及びプローブの融解温度は、プライマーセットの融解温度よりも高いことが好ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマーよりも先にブロッカー核酸断片及びプローブを鋳型に結合させることができ、塩基変異の検出精度を向上させることができる。
【００６１】
本実施形態に係るキットは、対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。このようなキットは、大腸癌等の癌の診断や治療方法の選択に有用である。
【００６２】
［核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法］
本発明の第３実施形態に係る前記対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法は、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用いる。プライマーセットは、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。さらに、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片の存在下で行う。
【００６３】
本実施形態に係る方法によれば、特定の塩基配列を有する鋳型のＰＣＲ増幅を特異的に抑制することができる。ブロッカー核酸断片の具体的な態様は、上述した態様と同様である。
【００６４】
本実施形態に係る方法において、上記の人工核酸は、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率が高まる観点から、ＢＮＡであることが好ましい。好適なＢＮＡは、上述した構成と同様である。また、ブロッカー核酸断片の融解温度は、プライマーセットの融解温度よりも高いことが望ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマーよりも先にブロッカー核酸断片を鋳型に結合させることができ、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率を更に向上させることができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されない。【００６６】
［実験例１］
癌遺伝子であるＫＲＡＳのコドン１２〜１３、コドン６１及びコドン１４６の塩基変異を検出した。【００６７】
表１に記載の試薬を用いて、表２の組成となるようにＰＣＲ反応の反応液を調製した。
また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液とを調製した。
ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。ブロッカー核酸断片の人工核酸にはＢＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）を用いた。【００６８】
また、ブロッカー核酸断片の全残基をＢＮＡで作製すると、その高い結合力から、野生型の鋳型だけでなく、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅を抑制してしまう可能性がある。そのため、ブロッカー核酸断片にはランダムに通常のヌクレオチド残基を含有させた。表１に示すブロッカー核酸断片の塩基配列のうち、太文字にし、下線を付した残基はＢＮＡを示し、通常の文字は通常のヌクレオチド残基であることを示す。【００６９】
また、プローブには、蛍光物質としてＦＡＭ、消光物質としてＴＡＭＲＡを使用した。
また、核酸サンプルには、ヒトゲノムＤＮＡを用いた。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。【００７０】
【表１】
2016093333.tif 000003
【００７１】
【表２】
2016093333.tif 000004
【００７２】
続いて、調製したＰＣＲ反応の各反応液を、リアルタイムＰＣＲ解析システム（商品名「ＣＦＸ９６」、バイオラッド社）にセットし、５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ジーンエクスプレッションマスターミックス内の酵素を活性化させた。その後、９５℃で１５秒間保持して変性させた後、６０℃で３０秒間保持して、アニーリング及び伸長させた。この９５℃１５秒、６０℃３０秒の繰り返し反応を４０サイクル実施した。【００７３】
図２は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。横軸はＰＣＲのサイクル数を示し、縦軸は、プローブに由来する蛍光の強度を示す。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。【００７４】
ブロッカー核酸断片の存在下（図２で（＋）と表記）及び非存在下（図２で（−）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３には塩基変異が存在しないことを示す。【００７５】
図３は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を上記と同様にして検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。【００７６】
ブロッカー核酸断片の存在下（図３で（＋）と表記）及び非存在下（図３で（−）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１には塩基変異が存在しないことを示す。【００７７】
図４は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基変異を上記と同様にして検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。【００７８】
ブロッカー核酸断片の存在下（図４で（＋）と表記）及び非存在下（図４で（−）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６には塩基変異が存在しないことを示す。【００７９】
［実験例２］
核酸サンプルを変更した以外は実験例１と同様にして、ＰＣＲ反応の反応液を調製した。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液を調製した。ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。【００８０】
図５は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡ（図５中、「野生型」と示す。）、又は、上記野生型配列を有するヒトゲノムＤＮＡ９０％と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３にＧ１３Ｄ変異（ＧＧＣ→ＧＡＣ）を有するヒトゲノムＤＮＡ（図５中、「変異型」と示す。）１０％と、の混合物を使用した。【００８１】
ブロッカー核酸断片の存在下（図５で（＋）と表記）及び非存在下（図５で（−）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、野生型の鋳型のＰＣＲ増幅が抑制され、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅が選択的に行われたことが示された。【００８２】
また、ブロッカー核酸断片の存在下では、変異型の鋳型を含む核酸サンプルの増幅量が、野生型の鋳型の増幅量と比較して多かった。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２〜１３に塩基変異が存在することを示す。また、この結果は、変異型の鋳型が核酸サンプル中に１０％存在すれば、塩基変異を明確に検出可能であることを示す。【００８３】
図６は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡ（図６中、「野生型」と示す。）、又は、上記野生型配列を有するヒトゲノムＤＮＡ９０％と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１にＱ６１Ｈ変異（ＣＡＡ→ＣＡＣ）を有するヒトゲノムＤＮＡ（図６中、「変異型」と示す。）１０％と、の混合物を使用した。【００８４】
ブロッカー核酸断片の存在下（図６で（＋）と表記）及び非存在下（図６で（−）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、野生型の鋳型のＰＣＲ増幅が抑制され、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅が選択的に行われたことが示された。【００８５】
また、ブロッカー核酸断片の存在下では、変異型の鋳型を含む核酸サンプルの増幅量が、野生型の鋳型の増幅量と比較して多かった。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１に塩基変異が存在することを示す。また、この結果は、変異型の鋳型が核酸サンプル中に１０％存在すれば、塩基変異を明確に検出可能であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。また、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる。また、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明により、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００８７】
１０…対象塩基配列、２０…残基、２０’…塩基変異、３０…増幅対象領域、４０Ｆ，４０Ｒ…プライマー、５０…ブロッカー核酸断片、６０…プローブ、ｗ…野生型核酸サンプル（野生型の鋳型）、ｍ…変異型核酸サンプル（変異型の鋳型）、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。
【図１】
2016093333.tif 000005
【図２】
2016093333.tif 000006
【図３】
2016093333.tif 000007
【図４】
2016093333.tif 000008
【図５】
2016093333.tif 000009
【図６】
2016093333.tif 000010
【配列表】
2016093333000001.app
【国際調査報告】
2016093333.tif 000011
2016093333.tif 000012
2016093333.tif 000013