(57)【要約】  本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を抽出する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞の溶解物を得る溶解物取得工程と、上記溶解物取得工程で得られた上記宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加し、得られた希釈液から不溶物を分離して、上記親水性組換えタンパク質を含む上清を回収する工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であり、上記希釈用溶媒は水系溶媒である親水性組換えタンパク質の抽出方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を抽出する方法であって、
前記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞の溶解物を得る溶解物取得工程と、
前記溶解物取得工程で得られた前記宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加し、得られた希釈液から不溶物を分離して、前記親水性組換えタンパク質を含む上清を回収する工程を含み、
前記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、前記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であり、前記希釈用溶媒は水系溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項２】
前記溶解用溶媒は、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒である請求項１に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項３】
前記溶解用溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上である請求項１又は２に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項４】
前記溶解用溶媒は、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒である請求項１〜３のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項５】
前記溶解用溶媒は、前記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項６】
前記希釈用溶媒は、（１）水、（２）水とエタノールの混合液、及び（３）水溶性緩衝液からなる群から選ばれる一種の水系溶媒である請求項１〜５のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項７】
前記溶解用溶媒は、前記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加する請求項１〜６のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項８】
前記希釈用溶媒は、前記宿主細胞の溶解物に対して、体積比として、０．５倍以上添加する請求項１〜７のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【請求項９】
前記親水性タンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる一つのタンパク質である請求項１〜８のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性組換えタンパク質の抽出方法に関し、詳細には、ハイドロパシ―インデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質等の親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝的組換え技術により、目的の外来遺伝子を大腸菌等の宿主の細胞中に導入して目的タンパク質を発現させることが可能になり、この技術を利用して、様々な有用な組換えタンパク質の生産が行われている。クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、このような特性から、クモ糸は新規な素材として注目され、クモ糸の原料となるクモ糸タンパク質を遺伝的組換え技術により大腸菌等の宿主細胞に発現させ、回収することが行われている。一般に、大腸菌等の宿主を用いて組換えタンパク質の生産を行う際、菌体を破壊して目的のタンパク質を回収する。例えば、特許文献１には、宿主細胞から組換えクモ糸タンパク質を回収する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００４−５０３２０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１では、ギ酸やプロピオン酸等の有機酸を使用して、宿主細胞を溶解させて組換えクモ糸タンパク質を回収しているが、ギ酸やプロピオン酸等の有機酸を用いると酸に対して耐性がないタンパク質は分解されやすいという問題がある。【０００５】
本発明は、上記従来の問題を解決するため、有機酸を用いず、親水性組換えクモ糸タンパク質等の親水性組換えタンパク質を発現している宿主から、親水性組換えタンパク質を抽出することができる親水性組換えタンパク質の抽出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を抽出する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞の溶解物を得る溶解物取得工程と、上記溶解物取得工程で得られた上記宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加し、得られた希釈液から不溶物を分離して、上記親水性組換えタンパク質を含む上清を回収する工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であり、上記希釈用溶媒は水系溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の抽出方法に関する。【０００７】
本発明の親水性組換えタンパク質の抽出方法において、上記溶解用溶媒は、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であることが好ましく、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましい。上記溶解用溶媒は、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒であることがより好ましい。上記溶解用溶媒は、上記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものであることが好ましい。上記希釈用溶媒は、（１）水、（２）水とエタノールの混合液、及び（３）水溶性緩衝液からなる群から選ばれる一種の水系溶媒であることが好ましい。上記溶解用溶媒は、上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加することが好ましく、上記希釈用溶媒は、上記宿主細胞の溶解物に対して、体積比として、０．５倍以上添加することが好ましい。上記親水性組換えタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる一つのタンパク質であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒を用い、希釈用溶媒として水系溶媒を用い、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主を溶解用溶媒で溶解させ、得られた宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加して希釈し、不溶物を分離し、上清を回収することにより、有機酸を使用せず、簡便且つ効率的に宿主からハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を抽出することができる。【０００９】
また、本発明によると、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用いることにより、ハイドロパシーインデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の親水性組換えタンパク質をより高い純度で得ることができる。また、本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものを用いることにより、より純度が高いハイドロパシーインデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の親水性組換えタンパク質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２〜５で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】図３は、実施例６〜８で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例９〜１３で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例１６で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】図６は、実施例１７〜２１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】図７は、実施例２２で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】図８は、実施例２３〜２６で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】図９は、実施例２８で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、比較例１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】図１１Ａは、実施例３２で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真であり、図１１Ｂは、実施例３３で得られたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、タンパク質のハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ）は、以下のように算出したものである。まず、タンパク質中に存在するアミノ酸のハイドロパシーインデックスの総和を求める。次にその総和をタンパク質中のアミノ酸残基数で割ることにより平均値を求め、算出された平均値をタンパク質のハイドロパシーインデックスとする。なお、アミノ酸のハイドロパシーインデックスについては、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105-132.）を使用する。具体的には、各アミノ酸のハイドロパシーインデックス（以下において、ＨＩとも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
本発明者らは、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主に非プロトン性極性溶媒を添加して宿主細胞を溶解させて得られた宿主細胞の溶解物に水等の水系溶媒を添加して希釈することで、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が上清にて回収されることを見出し、本発明に至った。すなわち、宿主細胞を非プロトン性極性溶媒で溶解させることにより、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が非プロトン性極性溶媒に溶解された溶解物が得られ、該溶解物に水等の水系溶媒を添加すると、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質は凝集しないが、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質以外のタンパク質の大半が凝集することを見出し、本発明に至った。以下において、特に指摘がない場合、親水性タンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性タンパク質を意味する。また、以下において、特に指摘がない場合、組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質を意味する。
【００１４】
上記非プロトン性極性溶媒は、特に限定されないが、夾雑物を低減するという観点から、純度が９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。上記非プロトン性極性溶媒は、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用いると、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の親水性組換えタンパク質をより高い純度で抽出できる。環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）等が挙げられる。
【００１５】
また、上記非プロトン性極性溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましい。双極子モーメントは、分子の極性の強さを表す指標として用いられ、双極子モーメントが大きいほど、極性の強さも大きくなる。一般的に双極子モーメントが３．０Ｄ以上の分子は極性が強いとされ、タンパク質等の極性を持った化合物を溶解する場合には極性の大きな溶媒が有効である。下記表２に、講談社サイエンティフィック社が出版している溶剤ハンドブック（２００７年）に基づいた各種有機化合物（有機溶剤）の双極子モーメントを記載する。双極子モーメントが３．０Ｄ以上の非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１,３−ジメチル−２−イミダゾリドン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル等が挙げられる。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
組換えタンパク質の抽出純度が高い観点から、上記非プロトン性極性溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であり、且つ、環状構造を有しないことがより好ましく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）からなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒であることがさらに好ましい。
【００１８】
上記溶解用溶媒は、非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものであることが好ましい。非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加すると、より純度が高い組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の親水性組換えタンパク質を得ることができるため好ましい。上記無機塩は、特に限定されないが、組換えタンパク質の純度を高める観点から、好ましくは、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも一つである。上記アルカリ金属ハロゲン化物としては、例えばＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ等を用いることが好ましい。上記アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、例えばＣａＣｌ2等を用いることが好ましい。上記アルカリ土類金属硝酸塩としては、例えばＣａ（ＮＯ3）2等を用いることが好ましい。上記チオシアン酸塩としては、例えばＮａＳＣＮ等を用いることが好ましい。
【００１９】
上記溶解用溶媒が非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである場合、特に限定されないが、組換えタンパク質の純度を高める観点から、無機塩の濃度は、０．１Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．２５Ｍ以上であり、さらに好ましくは０．５Ｍ以上である。また、上記溶解用溶媒において、無機塩の濃度の上限は特に限定されないが、飽和状態以下であることが好ましく、例えば２．５Ｍ以下にすればよい。
【００２０】
上記溶解用溶媒の添加量は、上記宿主を溶解できる量であればよく、特に限定されないが、溶解性を高める観点から、上記宿主（細胞）の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは０．７５倍以上であり、さらに好ましくは１倍以上である。また、操作の簡便性から、上記溶解用溶媒の添加量は上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは６倍以下であり、さらに好ましくは４倍以下である。上記宿主（細胞）は、乾燥した状態でもよく、湿った状態でもよい。
【００２１】
上記溶解用溶媒を宿主に添加し、宿主細胞の溶解物を得る溶解物取得工程は、特に限定されないが、組換えタンパク質の溶解性の観点から、２０℃以上で行うことが好ましく、４５℃以上で行うことがより好ましく、５０℃以上で行うことがさらに好ましい。また、組換えタンパク質の分解を抑制するという観点から、上記溶解物取得工程は、１００℃以下で行うことが好ましく、９５℃以下で行うことがより好ましい。また、上記溶解物取得工程は、特に限定されないが、例えば、１０〜３００分間行うことが好ましく、より好ましくは３０〜１８０分間行うことが好ましい。溶解物取得工程で得られた宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加する前に、不溶物を分離してもよい。不溶物の分離は、沈降物（凝集物）を分離できればよく、特に限定されない。取扱いの簡便性から、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜等を用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、室温（２０±５℃）、８０００×ｇ〜１５０００×ｇで５〜２０分間行うことができる。上記不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
【００２２】
上記希釈用溶媒は、水系溶媒である。本発明において、水系溶媒とは、水を含む溶媒をいい、例えば、水、水と水混和性有機溶媒との混合液、水溶性緩衝液、酸性水溶液、塩基性水溶液等が挙げられる。酸性水溶液としては、ギ酸、酢酸、希塩酸等の酸性水溶液が挙げられ、塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの塩基性水溶液が挙げられる。水混和性有機溶媒としては、水と混合できる有機溶媒であればよく、公知のものを用いることができる。具体的には、メタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００２３】
上記希釈用溶媒は、純度が高い組換えタンパク質が得られるとともに、簡便という観点から、水であることが好ましい。上記水としては、特に限定されないが、夾雑物を低減するという観点から、純水、蒸留水、超純水等を用いることが好ましい。組換えクモ糸タンパク質等の組換えタンパク質の純度をより高める観点から、上記希釈用溶媒は、水とエタノールの混合液であることが好ましい。組換えクモ糸タンパク質等の組換えタンパク質を含む上清における組換えタンパク質の純度が高いという観点から、エタノールの添加量は、希釈液全体質量（宿主細胞の溶解物と希釈用溶媒の合計質量）に対して５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることがさらに好ましく、２５質量％以上であることが特に好ましい。また、組換えタンパク質を凝集させない観点から、５０質量％以下であることが好ましく、４５質量％以下であることがより好ましく、４０質量％以下であることがさらに好ましい。
【００２４】
上記希釈用溶媒は、水溶性緩衝液であってもよい。上記水溶性緩衝液としては、例えば、ｐＨ３〜９のリン酸系緩衝液、ｐＨ３〜９のトリス系緩衝液等を用いることができる。上記リン酸系緩衝液の濃度は、例えば１０〜２００ｍＭである。上記トリス系緩衝液の濃度は、例えば１０〜１００ｍＭである。例えば、上記トリス系緩衝液としては、ｐＨ３〜９の５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を用いることができる。また、例えば、上記リン酸系緩衝液としては、ｐＨ３〜９の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いることができる。
【００２５】
上記宿主細胞の溶解物に希釈用溶媒を添加して希釈することで、組換えクモ糸タンパク質等の組換えタンパク質以外の夾雑タンパク質の大部分を凝集させ、凝集した不溶物を分離除去し、組換えタンパク質を含むタンパク質溶液（上清）を回収する。
【００２６】
上記希釈用溶媒の添加量は、組換えタンパク質以外のタンパク質（以下において、他のタンパク質とも記す。）を凝集させることができればよく、特に限定されない。均一に希釈するという観点から、宿主細胞の溶解物に対して、体積比で、０．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは０．７５倍以上であり、さらに好ましくは１倍以上である。また、組換えタンパク質を凝集させない観点から、１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは６倍以下であり、さらに好ましくは４倍以下である。
【００２７】
上記において、不溶物の分離は、沈降物（凝集物）を分離できればよく、特に限定されない。取扱いの簡便性から、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜等を用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、室温（２０±５℃）、８０００×ｇ〜１５０００×ｇで５〜２０分間行うことができる。上記不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
【００２８】
上記組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックス（ＨＩ）が０以下の親水性の組換えタンパク質であればよく、特に限定されない。抽出効率が高いという観点から、上記組換えタンパク質は、ＨＩが−０．１以下であることが好ましく、−０．３以下であることがより好ましい。
【００２９】
上記組換えタンパク質としては、特に限定されないがい、例えば、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン及び組換えコラーゲンなどからなる群から選ばれる一つのタンパク質であることが好ましい。
【００３０】
上記組換えクモ糸タンパク質は、天然型クモ糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であればよく、特に限定されない。例えば天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等を含む。上記組換えクモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４等が挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの小瓶状線で産生される小吐糸管しおり糸に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状線スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ）等が挙げられる。
【００３１】
上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含むポリペプチドが挙げられる。なお、上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質において、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３２】
上記式１において、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味している。上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１４残基以下であり、特に好ましくは１２残基以下である。上記式１において、ＲＥＰ２は１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、上記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
【００３３】
大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
【００３４】
上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列である。配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質のＨＩは、−０．９４８である。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００３５】
本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。
【００３６】
また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から５４２残基目までのアミノ酸配列である。配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質のＨＩは、−０．９２である。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００３７】
また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号６に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基から３１８残基目までのアミノ酸配列である。配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質のＨＩは、−０．３５７である。また、上記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００３８】
上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式２：（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｚ）ｍ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）ｌ（Ａｌａ）ｏで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００３９】
上記式２において、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｍは１〜４の範囲の整数であることが好ましく、ｌは０〜４の範囲の整数であることが好ましく、ｏは１〜６の範囲の整数であることが好ましい。
【００４０】
クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが、伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためだと考えられている。
【００４１】
上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘで示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００４２】
上記式３において、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｎは４以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数、より好ましくは２０以上の整数である。
【００４３】
上記式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号８に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当する１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に開始コドンと、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列である。配列番号８に示されているアミノ酸配列を有するＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ のタンパク質のＨＩは、−０．４８２である。また、上記式３：（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００４４】
クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸等においては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
【００４５】
上記組換えクモ糸タンパク質は、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。ＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質は、強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として挙げられる。
【００４６】
組換えレシリンとしては、例えば天然のレシリンに由来する組換えレシリンを用いることができる。天然のレシリンに由来する組換えレシリンとしては、式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個、好ましくは４個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上含むポリペプチドが挙げられる。ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００４７】
上記式４において、ＲＥＰ３は（Ｓｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏ）から構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｊは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、Ｕは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。
【００４８】
上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリン等が挙げられる。配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのウェブデータベースより取得したレシリンの部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＮＰ＿６１１１５７、ＧＩ：２４６５４２４３）において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに、９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換し、置換した配列の１９残基目から３２１残基目までを切り取り、切り取った配列のＮ末端に開始コドンと、Ｈｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列（配列番号１０）である。配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリンのＨＩは、−１．２２９である。また、上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、公知文献「Synthesis and properties of crosslinked recombinant pro-resilin」［Christopher M. Elvin, Andrew G. Carr, Mickey G. Huson, Jane M. Maxwell, Roger D. Pearson, Tony Vuocolo, Nancy E. Liyou, Darren C. C. Wong, David J. Merritt & Nicholas E. Dixon, Nature 437, 999-1002(13 October 2005)］に記載されているrec1-resilinのアミノ酸配列と同様である。
【００４９】
また、上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリンが挙げられる。配列番号１３に示されているアミノ酸配列は、キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列である。配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリンのＨＩは、−１．２２９である。また、上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
【００５０】
レシリンは、昆虫のクチクラの特定の領域に存在するゴム様タンパク質であり、優れた弾性材料である。該物質の弾性能は９７％であるとされ、貯蔵エネルギーのわずか３％しか熱として損失しない。この弾性能はレシリン中のチロシン同士が架橋することによってもたらされていると考えられている。ジチロシン架橋されたレシリンはクチクラに優れた弾性を与え、昆虫の飛行システムや跳躍システムに大きな役割を果たしている。
【００５１】
組換えコラーゲンとしては、例えば天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンを用いることができる。天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンとしては、式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を５以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上連続して含むポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
上記式５において、ＲＥＰ４はＧｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意の一つのアミノ酸を意味する。上記式５において、ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列は同一であってもよく異なっていてもよい。
【００５３】
上記式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有する組換えコラーゲンが挙げられる。配列番号１６に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列である。また、上記式５：ＲＥＰ５で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いてもよい。
【００５４】
コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつであり、多細胞動物の細胞外マトリクスの主成分である。ヒトのコラーゲンは３０種類以上あることが報告されているが、いずれのコラーゲンにおいてもコラーゲン様配列と呼ばれるＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の繰り返し配列を有することがその配列的特徴として挙げられる。
【００５５】
上記組換えタンパク質は、組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、組換えタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、組換えタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）等で自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記の対象タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にＨｉｓタグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００５６】
上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルス等を用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクター等を用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主（細胞）としては、例えば、タンパク質発現系に用いられる動物細胞、植物細胞、微生物等を用いることができ、生産コストの観点から微生物を用いることが好ましく、安全性及び操作性という観点から大腸菌を用いることがより好ましい。
【００５７】
上記組換えタンパク質は、大腸菌等の微生物を宿主とした組換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【００５８】
上記組換えタンパク質を含む上清において、組換えタンパク質のタンパク質全体に対する純度（精製度）は、４０質量％以上であることが好ましく、４５質量％以上であることがより好ましく、５０質量％以上であることがさらに好ましく、６０質量％以上であることがさらにより好ましく、６５質量％以上であることが特に好ましい。本発明において、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）又はＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、染色後の電気泳動画像を解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて画像解析することで求めることができる。
【００５９】
上記組換えタンパク質を含む上清は、透析等によりさらに精製してもよい。また、上記組換えタンパク質を含む上清にエタノールを最終濃度が５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上になるように添加し、組換えタンパク質を凝集させてもよい。また、上記組換えタンパク質を含む上清は、粉末化してもよい。粉末化する方法は、特に限定されない。エタノールで凝集させた組換えタンパク質を凍結乾燥することで、粉末化することができる。或いは、上記組換えタンパク質を含む上清を噴霧乾燥することで直接粉末化してもよい。得られた組換えクモ糸タンパク質の粉末は、湿式紡糸、キャストフィルムの作製等に用いることができる。得られた組換えレシリン及び組換えコラーゲンの粉末は、ゲル、キャストフィルム、多孔質体の作製等に用いることができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００６１】
（大腸菌での組換えタンパク質の発現）
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースより、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）を取得し、同配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加し、該配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号４に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６２】
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースより、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）を取得し、同配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加し、該配列の１残基目から５４２残基目までのアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号５に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６３】
（３）ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースより、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）を取得し、同配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加し、該配列の１残基目から３１８残基目までのアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号７に示す塩基配列からなるＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６４】
（４）Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵの遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースから、アメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）を入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号９に示す塩基配列からなるＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６５】
（５）Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子の合成
ＮＣＢＩのウェブデータベースより、レシリンの部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＮＰ＿６１１１５７、ＧＩ：２４６５４２４３）を取得し、該配列の８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに、９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換し、置換した配列の１９残基目から３２１残基目までを切り取り、切り取った配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列（配列番号１０）からなるポリペプチド（Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）をコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１１に示す塩基配列からなるＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６６】
（６）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子の合成
キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列（配列番号１３）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１４に示す塩基配列からなるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６７】
（７）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子の合成
ヒトのコラーゲンタイプ４の部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１６）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１７に示す塩基配列からなるＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００６８】
＜タンパク質の発現＞
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターＡ、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター及びＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを、それぞれ、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたそれぞれのシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬとともに加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の菌体から調製したタンパク質溶液を用い、一般的なプロトコールに従い、ＩＰＴＧ添加に依存して目的とするタンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍは約１２．５ｋＤａ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮは約４７．５ｋＤａ、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗは約２６．４ｋＤａ、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵは約３６．９ｋＤａ、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉは約２８．５ｋＤａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉは約２８．５ｋＤａ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉは約２４．５ｋＤａ）が発現していることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌と、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を発現している大腸菌、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を発現している大腸菌、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（−２０℃）で保存した。【００６９】
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ及びＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質のハイドロパシ―インデックス（ＨＩ）を下記表３に示した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ、ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ、Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ及びＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質は、いずれも、ＨＩが０以下の親水性のタンパク質であった。【００７０】
【表３】
2014103846.tif 000005
【００７１】
（実施例１）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置し、大腸菌（細胞）の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を回収した。【００７２】
（実施例２）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍＬ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置し、大腸菌の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７３】
（実施例３）
超純水に替えて濃度が１０質量％のエタノール水溶液（以下において、１０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７４】
（実施例４）
超純水に替えて濃度が３０質量％のエタノール水溶液（以下において、３０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７５】
（実施例５）
超純水に替えて濃度が５０質量％のエタノール水溶液（以下において、５０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７６】
（実施例６）
超純水に替えて濃度が７０質量％のエタノール水溶液（以下において、７０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７７】
（実施例７）
超純水に替えて濃度が８０質量％のエタノール水溶液（以下において、８０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７８】
（実施例８）
超純水に替えて濃度が９０質量％のむエタノール水溶液（以下において、９０％エタノールと記す。）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００７９】
（実施例９）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍＬ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置し、大腸菌の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８０】
（実施例１０）
超純水に替えて５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ３）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例９と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８１】
（実施例１１）
超純水に替えて５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例９と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８２】
（実施例１２）
超純水に替えて５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例９と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８３】
（実施例１３）
超純水に替えて５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）で大腸菌の溶解物を等倍希釈した以外は、実施例９と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８４】
（実施例１４）
０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯに替えて、０．２５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに１ｍＬ添加した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８５】
（実施例１５）
０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯに替えて、ＤＭＳＯを、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに１ｍＬ添加した以外は、実施例２と同様にして、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００８６】
実施例１で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清、及び実施例２〜１５で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。具体的には、各実施例で得られた上清３０μＬに、２ｘＳＤＳ緩衝液（４ｗ／ｖ％  ＳＤＳ、２０ｗ／ｖ％  グリセロール、１０ｗ／ｖ％  ２−メルカプトエタノール、０．００４ｗ／ｖ％  ブロモフェノールブルー、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）３０μＬを加え、９５℃で１０分間熱処理し、室温で冷却した熱変性したタンパク質溶液を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりバンドを確認した。電気泳動後、実施例１は、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その他の実施例はゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図１〜図４に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（組換えクモ糸タンパク質）の純度を求めた。その結果を下記表４に示した。対照として、図２及び図４には、それぞれ、実施例２における大腸菌の溶解物を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も併せて示した。なお、Ｏｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインの場合はタンパク質を１．５μｇ、ＣＢＢの場合はタンパク質を７μｇ用いて電気泳動した。【００８７】
【表４】
2014103846.tif 000006
【００８８】
図１には、実施例１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図１において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１は、実施例１で得られた上清に含まれるタンパク質を示している。図１において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図１及び表４から、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を超純水で希釈することで、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）を含む上清が得られることが確認できた。上清に含まれているタンパク質において、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ）の純度は６０％以上であり、精製率が高かった。【００８９】
図２には、実施例２〜５で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図２において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１は、実施例２の大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２、３、４、５は、それぞれ、実施例２、３、４、５で得られた上清に含まれるタンパク質を示している。図３には、実施例６〜８で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図３において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、それぞれ、実施例６、７、８で得られた上清に含まれるタンパク質を示している。図２及び図３において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ（分子量約４７．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図２、図３及び表４から、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を各種水系溶媒で希釈することで、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）を含む上清が得られることが確認できた。また、希釈用溶媒として水とエタノールの混合液を用い、希釈液（大腸菌の溶解物と希釈用溶媒の混合液）におけるエタノールの濃度が３５質量％以下である場合、希釈用溶媒として純水のみを用いた場合と比較して、得られた上清に含まれているタンパク質において、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）の純度が高いことが分かった。特に、希釈液におけるエタノールの濃度が１０〜３０質量％であると、得られた上清に含まれているタンパク質において、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）の純度がより高かった。一方、希釈液において、エタノールの濃度が４５質量％以上になると、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）の純度が希釈用溶媒として純水のみを用いた場合と比較して低くなることが分かった。これは、希釈液におけるエタノールの濃度が高過ぎると、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）の凝集が起きるためであると推測される。【００９０】
図４には、実施例９〜１３で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図４において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーンａは、実施例９の大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーンｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、それぞれ、実施例９、１０、１１、１２、１３で得られた上清に含まれるタンパク質を示している。図４において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ（分子量約４７．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図４及び表４から、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を各種水系溶媒で希釈することで、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）を含む上清が得られることが確認できた。また、希釈用溶媒がｐＨ３〜９の５０ｍＭのトリス緩衝液である場合も、純水を用いた場合と同様に目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）を抽出し得ることが分かった。【００９１】
また、表４の実施例１、２、１４及び１５の結果から、溶解用溶媒として、無機塩（ＬｉＣｌ）を含むＤＭＳＯを用いた方が、無機塩を含まないＤＭＳＯのみを用いる場合より、純度が高い組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）を抽出し得ることが分かった。【００９２】
（実施例１６）
ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇを用いた以外は、実施例２と同様にしてＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を含む上清を回収した。【００９３】
実施例１６で得られたＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図５に示した。なお、図５には、実施例１６における大腸菌の溶解物、及びＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も併せて示した。ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱については、２ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを添加し、６０℃で３０分間静置することで溶解させた溶液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【００９４】
図５において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２は上清に含まれるタンパク質を示し、レーン３は沈澱に含まれるタンパク質を示している。図５において、矢印で示しているのがＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ（分子量約２６．４ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図５から、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を純水で希釈することで、目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ４Ｋａｉ−Ｗ）を含む上清が得られることが確認できた。【００９５】
（実施例１７）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍＬ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置し、大腸菌の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００９６】
（実施例１８〜２１）
大腸菌の溶解物を下記表５に示すリン酸緩衝液で等倍希釈した以外は、実施例１７と同様にしてＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を回収した。【００９７】
実施例１７〜２１で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図６に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）の純度を求めた。その結果を下記表５に示した。なお、図６には、実施例１７における大腸菌の溶解物を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も併せて示した。【００９８】
【表５】
2014103846.tif 000007
【００９９】
図６には、実施例１７〜２１で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図６において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１は、実施例１７の大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２、３、４、５、６は、それぞれ、実施例１７、１８、１９、２０、２１で得られた上清に含まれるタンパク質を示している。図６において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ（分子量約４７．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図６及び表５から、希釈用溶媒がｐＨ３〜９の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液である場合も、純水を用いた場合と同様に目的とする組換えクモ糸タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＮ）を抽出し得ることが分かった。【０１００】
（実施例２２）
Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇを用いた以外は、実施例２と同様にしてＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を含む上清を回収した。【０１０１】
実施例２２で得られたＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図７に示した。なお、図７には、実施例２２における大腸菌の溶解物、及びＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も併せて示した。Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱については、２ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを添加し、６０℃で３０分間静置することで溶解させた溶液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【０１０２】
図７において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２は上清に含まれるタンパク質を示し、レーン３は沈澱に含まれるタンパク質を示している。図７において、矢印で示しているのがＦｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ（分子量約３６．９ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図７から、０．５ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を純水で希釈することで、目的とする組換えクモ糸タンパク質（Ｆｌａｇ９２−ｓｈｏｒｔ２−ＵＵ）を含む上清が得られることが確認できた。【０１０３】
（実施例２３）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で４０分間溶解させ、大腸菌の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を回収した。【０１０４】
（実施例２４）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＦを用いた以外は、実施例２３と同様にしてＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を回収した。【０１０５】
（実施例２５）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＡを用いた以外は、実施例２３と同様にしてＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を回収した。【０１０６】
（実施例２６）
１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＮＭＰを用いた以外は、実施例２３と同様にしてＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を回収した。【０１０７】
実施例２３〜２６で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図８に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、上清におけるＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍタンパク質の純度を求めた。その結果を下記表６に示した。【０１０８】
図８において、下の部分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍのタンパク質を含む上清を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、上の部分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、対応する大腸菌の溶解物を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図８において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１、２、３、４は、それぞれ、実施例２３、２４、２５、２６に対応する。図８において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ−ｓｍａｌｌ−Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。【０１０９】
【表６】
2014103846.tif 000008
【０１１０】
図８及び表６から分かるように、溶解用溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡを用いた場合は、目的とする親水性組換えタンパク質の純度が高かった。一方、溶解用溶媒として、ＮＭＰを用いた場合は、目的とする親水性タンパク質（組換えタンパク質）の純度が低かった。溶解用溶媒として環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用いると、ＨＩが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主細胞からより高い純度で組換えタンパク質（ＨＩが０以下）を抽出できた。【０１１１】
（実施例２７）
（１）Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、ＤＭＳＯを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で４０分間溶解させ、大腸菌（細胞）の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１１２】
（実施例２８）
ＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを用いた以外は、実施例２７と同様にしてＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１１３】
（実施例２９）
ＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＦを用いた以外は、実施例２７と同様にしてＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１１４】
（実施例３０）
ＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＮＭＰを用いた以外は、実施例２７と同様にしてＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１１５】
（実施例３１）
ＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＩを用いた以外は、実施例２７と同様にしてＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１１６】
実施例２７〜３１で得られたＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、上清におけるＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの純度を求め、その結果を下記表７に示した。【０１１７】
また、実施例２８で得られたＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を用いて行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９に示した。なお、図９には、実施例２８における大腸菌の溶解物、及びＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も併せて示した。Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した後の沈澱については、２ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを添加し、６０℃で３０分間溶解させた溶液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【０１１８】
図９において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２は上清に含まれるタンパク質を示し、レーン３は沈澱に含まれるタンパク質を示している。図９において、矢印で示しているのがＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ（分子量約２８．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図９から、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を純水で希釈することで、目的とする組換えレシリン（Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）を含む上清が得られることが確認できた。【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
上記表７の結果から分かるように、溶解用溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦを用いた場合は、目的とする親水性組換えタンパク質の純度が高かった。特に、無機塩を添加したＤＭＳＯを溶解用溶媒として用いた場合、純度がより高かった。一方、溶解用溶媒として、ＮＭＰ又はＤＭＩを用いた場合は、目的とする親水性組換えタンパク質）の純度が低かった。溶解用溶媒として環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用いると、ＨＩが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主細胞からより高い純度で組換えタンパク質（ＨＩが０以下）を抽出し得ることが確認できた。【０１２１】
（比較例１）
（１）Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むイソプロパノールを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で４０分間溶解させ、大腸菌（細胞）の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を回収した。【０１２２】
比較例１で得られた大腸菌の溶解物及び上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図１０に示した。図１０において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌の溶解物に含まれるタンパク質を示し、レーン２は上清に含まれるタンパク質を示している。図１０において、矢印は、Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ（分子量約２８．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドの位置を示している。【０１２３】
また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、比較例１で得られた大腸菌の溶解物及び上清におけるＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質の純度を求めた。その結果、大腸菌の溶解物におけるＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質の純度は５．５％であり、上清におけるＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質の純度は０％であった。【０１２４】
イソプロパノールを用いた場合、大腸菌からＲｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を抽出することができなかった。すなわち、プロトン性極性溶媒を用いた場合、ＨＩが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主細胞から組換えタンパク質（ＨＩが０以下）を抽出することができなかった。【０１２５】
（実施例３２）
（１）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置して溶解させ、大腸菌（細胞）の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離した。得られた大腸菌の溶解物の上清を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１２６】
実施例３２で得られたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、染色後のタンパク質の電気泳動写真を図１１Ａに示した。図１１Ａにおいて、矢印で示しているのがＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ（分子量約２８．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図１１Ａから、１．０ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を純水で希釈することで、目的とする組換えレシリンタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）を含む上清が得られることが確認できた。解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析したところ、上清におけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉの純度は６９．７％であった。【０１２７】
（実施例３３）
（１）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加して菌体を分散させ、６０℃で３０分間静置して溶解させ、大腸菌（細胞）の溶解物を得た。
（２）得られた大腸菌の溶解物を遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離した。得られた大腸菌の溶解物の上清を超純水で等倍希釈し、得られた希釈液を、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ−３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を回収した。【０１２８】
実施例３３で得られたＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのタンパク質を含む上清を用いて、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図１１Ｂに示した。図１１Ｂにおいて、矢印で示しているのがＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ（分子量約２４．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図１１Ｂから、１．０ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解し、大腸菌の溶解物を純水で希釈することで、目的とする組換えコラーゲンタンパク質（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ）を含む上清が得られることが確認できた。解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析したところ、上清におけるＣｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉの純度は４３．７％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明によると、組換えタンパク質としてハイドロパシーインデックスが０以下の親水性タンパク質を発現している宿主から親水性タンパク質を抽出することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
配列番号１、２、３、６、８、１０、１２、１３、１５、１６    アミノ酸配列
配列番号４、５、７、９、１１、１４、１７    塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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