(57)【要約】  本発明は、（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び（ｂ）細胞に加熱処理した動物由来の試料を接触させる工程を含む、動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法、それに用いる組成物およびキット、ならびにＧタンパク質共役型受容体を発現する細胞を用いた、動物由来の試料中に存在するＧタンパク質共役型受容体のアゴニスト活性の測定系におけるバックグラウンドを低減する方法であって、動物由来の試料を加熱処理する工程を含む方法を提供する。
2016035677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法であって、
（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び
（ｂ）加熱処理した動物由来の試料を細胞と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
動物由来の試料を精製しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱処理が、４５℃で３０分以上６０分以下、５０℃で５分以上６０分以下、５５℃で３０秒以上６０分以下、６０℃で１５秒以上６０分以下、６５℃で５秒以上１５分以下、７０℃で５秒以上５分以下、７５℃で５秒以上１分以下、８０℃で５秒以上３０秒以下及び８５℃で５秒以上１５秒以下からなる群から選択される加熱処理である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
加熱処理が、５０℃以上６０℃以下で５分以上１５分以下、５５℃以上６５℃以下で１分以上１５分以下、または５５℃以上６０後以下で１分以上１０分以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
動物由来の試料が接触することにより細胞内及び／または細胞外で産生されたサイクリックヌクレオチド量を測定する、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）で使用する細胞が、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞である、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
動物由来の試料が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）で使用する細胞が、更にＧタンパク質共役型受容体を発現する、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
測定したサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量から動物由来の試料中のＧタンパク質共役型受容体に結合する物質の量を決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質共役型受容体が、甲状腺刺激ホルモン受容体である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
甲状腺疾患の診断のために行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞を含む、甲状腺疾患の診断用キットであって、加熱処理した正常人ヒト血清を含む、キット。
【請求項１３】
Ｇタンパク質共役型受容体を発現する細胞を用いた、動物由来の試料中に存在するＧタンパク質共役型受容体のアゴニスト活性の測定系におけるバックグラウンドを低減する方法であって、動物由来の試料を加熱処理する工程を含む方法。
【請求項１４】
動物由来の試料を精製しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
加熱処理が、４５℃で３０分以上６０分以下、５０℃で５分以上６０分以下、５５℃で３０秒以上６０分以下、６０℃で１５秒以上６０分以下、６５℃で５秒以上１５分以下、７０℃で５秒以上５分以下、７５℃で５秒以上１分以下、８０℃で５秒以上３０秒以下及び８５℃で５秒以上１５秒以下からなる群から選択される加熱処理である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
加熱処理が、５０℃以上６０℃以下で５分以上１５分以下、５５℃以上６５℃以下で１分以上１５分以下、または５５℃以上６０後以下で１分以上１０分以下である、請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、更にサイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する、請求項１３−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｇタンパク質共役型受容体が、甲状腺刺激ホルモン受容体である、請求項１３−１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitroサイクリックヌクレオチド測定系に用いる測定対象サンプルの前処理方法、それに適したキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ等のサイクリックヌクレオチドは、細胞内伝達物質として、種々の生理機能に関与しており、疾患の診断にその測定系が利用されている。例えば、バセドウ病の診断では、甲状腺刺激ホルモン受容体に結合する抗体をブタ甲状腺細胞等に作用させ、甲状腺細胞におけるｃＡＭＰの濃度の上昇を、ラジオアイソトープ標識ｃＡＭＰを用いて測定することによりＴＳＨＲ刺激型抗体（以下、ＴＳＡｂとも称す）の量を測定するバイオアッセイ法(TSAb法)（非特許文献１および非特許文献２）が臨床で使用されている。【０００３】
しかしながら、このような従来の測定系では、測定対象となる患者血清をプロテインＧやポリエチレングリコール、チャーコールデキストランで処理し（特許文献１）、血清中のIgG分画を粗精製し、または低分子の不純物を吸着除去することで、血清中の不純物を取り除いた後に、細胞に添加して培養する必要があり、簡便で迅速に測定結果を得ることが重要である臨床検査において、精製をしないで簡便に患者血清を測定することができる方法の開発が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−７７６８８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Methods in Enzymology, 74, 405〜420(1981)
【非特許文献２】J Clin Endocrinol Metab. 1986 May;62(5):855-62
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ポリエチレングリコール等による生理活性物質の精製を必要としない簡便な検体前処理工程を含む、in vitroサイクリックヌクレオチド測定方法およびそれに用いる組成物及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、測定対象サンプルに加熱処理等を行うことにより、ポリエチレングリコール等を用いた生理活性物質の精製を行わずに、in vitro細胞アッセイにおいて動物由来のサンプル中の生理活性物質により得られたサイクリックヌクレオチドの量を定量できることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
本発明は、一つの側面において、動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法であって、（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び（ｂ）加熱処理した動物由来の試料を細胞と接触させる工程を含む、方法を提供する。【０００９】
本発明は、一つの側面において、Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞を含む、Ｇタンパク質共役型受容体が関連する疾患の診断用組成物またはキットを提供する。【００１０】
かくして、本発明が提供するものとして以下のものが例示される：
（１）動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法であって、
（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び
（ｂ）加熱処理した動物由来の試料を細胞と接触させる工程
を含む、方法；
（２）動物由来の試料を精製しない、（１）に記載の方法；
（３）精製が、ポリエチレングリコールまたはチャーコールデキストランでの処理である、（２）に記載の方法；
（４）加熱処理が、４５℃で３０分以上６０分以下、５０℃で５分以上６０分以下、５５℃で３０秒以上６０分以下、６０℃で１５秒以上６０分以下、６５℃で５秒以上１５分以下、７０℃で５秒以上５分以下、７５℃で５秒以上１分以下、８０℃で５秒以上３０秒以下及び８５℃で５秒以上１５秒以下からなる群から選択される加熱処理である、（１）−（３）のいずれかに記載の方法；
（５）加熱処理が、５０℃以上６０℃以下で５分以上１５分以下、５５℃以上６５℃以下で１分以上１５分以下、または５５℃以上６０後以下で１分以上１０分以下である、（１）−（３）のいずれかに記載の方法；
（６）動物由来の試料が接触することにより細胞内及び／または細胞外で産生されたサイクリックヌクレオチド量を測定する、（１）−（５）のいずれかに記載の方法；
（７）動物由来の試料が、ヒト由来の血清または血漿である、（１）−（６）のいずれかに記載の方法；
（８）（ｂ）で使用する細胞が、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞である、（１）−（７）のいずれかに記載の方法；
（９）動物由来の試料が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する、（８）に記載の方法；
（１０）サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルが、ＣＮＧカルシウムチャンネルである、（８）または（９）に記載の方法；
（１１）カルシウム依存性発光タンパク質が、イクオリンである、（８）−（１０）のいずれかに記載の方法；
（１２）（ｂ）で使用する細胞が、更にＧタンパク質共役型受容体を発現する、（１）−（１１）のいずれかに記載の方法；
（１３）測定したサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量から動物由来の試料中のＧタンパク質共役型受容体に結合する物質の量を決定する、（１２）に記載の方法；
（１４）Ｇタンパク質共役型受容体が、甲状腺刺激ホルモン受容体である、（１２）または（１３）に記載の方法；
（１５）甲状腺刺激ホルモン受容体刺激型抗体を測定する方法である、（１４）に記載の方法；
（１６）甲状腺疾患の診断のために行う、（１４）または（１５）に記載の方法；
（１７）加熱処理した正常動物由来の血清または血漿を用いて、既知濃度のＧタンパク質共役型受容体に結合する物質を含む標準液を作成する工程；作成した標準液を細胞に接触させる工程；サイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程をさらに含む、（１２）−（１６）のいずれかに記載の方法；
（１８）Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞を含む、甲状腺疾患の診断用キットであって、加熱処理した正常人ヒト血清を含む、キット；
（１９）Ｇタンパク質共役型受容体を発現する細胞を用いた、動物由来の試料中に存在するＧタンパク質共役型受容体のアゴニスト活性の測定系におけるバックグラウンドを低減する方法であって、動物由来の試料を加熱処理する工程を含む方法；
（２０）動物由来の試料を精製しない、（１９）に記載の方法；
（２１）精製が、ポリエチレングリコールまたはチャーコールデキストランでの処理である、（２０）に記載の方法；
（２２）加熱処理が、４５℃で３０分以上６０分以下、５０℃で５分以上６０分以下、５５℃で３０秒以上６０分以下、６０℃で１５秒以上６０分以下、６５℃で５秒以上１５分以下、７０℃で５秒以上５分以下、７５℃で５秒以上１分以下、８０℃で５秒以上３０秒以下及び８５℃で５秒以上１５秒以下からなる群から選択される加熱処理である、（１９）−（２１）のいずれかに記載の方法；
（２３）加熱処理が、５０℃以上６０℃以下で５分以上１５分以下、５５℃以上６５℃以下で１分以上１５分以下、または５５℃以上６０後以下で１分以上１０分以下である、（１９）−（２１）のいずれかに記載の方法；
（２４）細胞が、更にサイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する、（１９）−（２３）のいずれかに記載の方法；ならびに
（２５）Ｇタンパク質共役型受容体が、甲状腺刺激ホルモン受容体である、（１９）−（２４）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法の前処理方法が提供される。該前処理方法は、動物由来の試料を加熱処理することを特徴とする。加熱処理によって測定系のバックグラウンドが低減され、動物由来の試料から目的物質を精製または抽出する必要がなくなる。これにより、測定工程が簡略化され、測定時間が大幅に短縮される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プラスミドpmCNGα2を示した図である。
【図２】プラスミドpcDNA mt s AEQを示した図である。
【図３】未処理の血清を用いた自己抗体を含む標準液の反応曲線の図である。
【図４】熱処理をおこなった血清を用いた自己抗体を含む標準液の反応曲線の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、一つの側面において、動物由来の試料が惹起するサイクリックヌクレオチドの産生量を測定する方法であって、（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び（ｂ）加熱処理した動物由来の試料を細胞と接触させる工程を含む、方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、前記(b)工程において、動物由来の試料が細胞と接触することにより細胞内及び／または細胞外で産生されたサイクリックヌクレオチド量を測定する方法を提供する。方法は、in vitroで実施される。
【００１５】
動物由来の試料は、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ）の血液由来の試料であり得、例えば、ヒト血清またはヒト血漿である。
【００１６】
加熱処理は、温度を制御できるいずれかの方法で実施することができ、例えば、温浴またはヒートブロック等を利用して実施することができる。動物由来の試料がヒト由来の血清または血漿の場合、ヒト由来の血清または血漿を、４０℃から８５℃の間で血清または血漿の成分が熱変成しないような適切な時間で加熱処理を実施することができる。例えば、４５℃で３０分以上６０分以下、５０℃で５分以上６０分以下、５５℃で３０秒以上６０分以下、６０℃で１５秒以上６０分以下、６５℃で５秒以上１５分以下、７０℃で５秒以上５分以下、７５℃で５秒以上１分以下、８０℃で５秒以上３０秒以下、８５℃で５秒以上１５秒以下、５０℃以上６０℃以下で５分以上１５分以下、５５℃以上６５℃以下で１分以上１５分以下または５５℃以上６０℃以下で１分以上１０分以下でヒト由来の血清または血漿を加熱処理することができる。
【００１７】
加熱処理後の試料は、遠心分離（例えば、1000rpm、20分）してその上清を細胞に接触させるために用いてもよく、遠心分離を行わず、加熱処理後の試料を細胞に接触させるために用いてもよい。
【００１８】
加熱処理を行うことにより、試料を精製する必要がなくなる。試料の精製には、例えば、ProteinGと結合させた樹脂やマグネットビーズを用いたIgG等の精製方法、ポリエチレングリコール等の高分子親水性物質やチャーコールデキストラン等の多孔性性の低分子吸着物質等が用いられているが、これらを使用する必要がなくなる。さらに、試料の加熱処理を行うことによって、遠心分離工程を省略することもできる。したがって、加熱処理を行うことによって、工程数が減り、目的物質の測定に要する時間が大幅に短縮される。
【００１９】
また、４℃以上３０℃以下で７日間、２５℃以上３０℃以下で２４時間以上７日間以下（例えば、４℃で７日間、２５℃以上３０℃以下で２４時間）ヒト由来の血清または血漿を処理することにより、上記加熱処理に変わる処理としてもよい。
【００２０】
加熱処理した動物由来の試料を細胞に接触させる工程は、in vitroで実施される。細胞は、細胞培養用のディッシュやプレートで培養することができ、加熱処理した動物由来の試料を添加した培養液で細胞を培養することにより加熱処理した動物由来の試料を細胞に接触させることができる。培養液は、細胞に適した培地を使用すればよく、例えば、１０％ＦＢＳを含んだ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０等を使用してもよい。加熱処理した動物由来の試料中の生理活性物質が細胞に作用し、細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチドの量を変化させる。このような生理活性物質の例には、生理活性アミン類、神経伝達物質となるアミノ酸類、生理活性ペプチド類（例えば、甲状腺刺激ホルモン（以下、ＴＳＨとも称す）、バソプレッシン、インクレチン等）、脂質メディエーター類、ケモカイン類等が挙げられる。
【００２１】
本明細書において、サイクリックヌクレオチドは、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰなど環状のリン酸エステル結合を持つヌクレオチドであり、好ましくはｃＡＭＰである。
【００２２】
細胞は、初代培養細胞であっても、細胞株であってもよく、動物由来の試料に存在する生理活性物質によって、細胞内及び／細胞外のサイクリックヌクレオチドの量が変化する細胞であり得る。変化は、増加であっても減少であってもよい。例えば、増加は細胞がサイクリックヌクレオチドを産生することによりもたらされてもよい。本発明が提供する方法は、動物由来の試料に存在する生理活性物質により細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチドの量が変化すれば、その変化のメカニズムによらず、使用することができる。例えば、動物由来の試料に存在する生理活性物質が細胞内のアデニル酸シクラーゼまたはグアニル酸シクラーゼに結合しこれら酵素を活性化する場合、動物由来の試料に存在する生理活性物質が細胞の受容体に結合し、その結果サイクリックヌクレオチドが産生する場合等に、本発明が提供する方法が使用できる。
【００２３】
動物由来の試料に存在する生理活性物質によって変化したサイクリックヌクレオチドの量を測定する方法は、いずれの方法を用いてもよく、例えば、標識サイクリックヌクレオチド（例えば、ＲＩ標識ｃＡＭＰ）を用いてサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量を測定するラジオイムノアッセイ法、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）が調節するルシフェラーゼの転写活性を指標にサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量を測定するレポータージーンアッセイ、またはサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量の変化によりサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル（cyclic nucleotide gated ion channel））が介する細胞内へのカルシウムイオンの流入量が変化し、その結果生じるカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン（aequorin））の発光量の変化を指標に測定する方法であってもよい。
【００２４】
一つの実施態様では、本発明が提供する方法に、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞を使用してもよい。このような細胞は、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を共にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、３Ｔ３細胞等の細胞株に強制発現させて調製してもよく、どちらかが発現している細胞を用いるのであれば、もう一方を強制発現させて調製してもよい。
【００２５】
例えば、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞等の細胞株に、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルとしてＣＮＧカルシウムチャンネルを、カルシウム依存性発光タンパク質としてイクオリンを発現する発現ベクターを導入し、これらを安定的に強制発現させることにより、本発明に使用する細胞を調製してもよく、ＣＮＧカルシウムチャンネルを内在的に発現する嗅組織由来の細胞にイクオリンを発現する発現ベクターを導入し、これを安定的に強制発現させることにより、本発明に使用する細胞を調製してもよい。
【００２６】
本発明が提供する方法にサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞を使用する場合、細胞内及び／または細胞外で変化したサイクリックヌクレオチドの量は、動物由来の試料が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量の変化に反映される。
【００２７】
よって、一つの実施態様として、本発明は、（ａ'）動物由来の試料を加熱処理する工程；及び（ｂ'）サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞に加熱処理した動物由来の試料を接触させる工程を含む、動物由来の試料が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する方法を提供する。
【００２８】
例えば、加熱処理した動物由来の試料を、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル及びカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞に接触させることにより、細胞内でサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）が産生され、細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量が増加し、その増加により、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルを介した細胞内へのカルシウムの流入量が増加し、その結果、細胞内のカルシウム依存性発光タンパク質の発光量が増加する。このような現象を利用して、動物由来の試料が惹起したカルシウム依存性発光タンパク質の発光量の増加により、動物由来の試料が惹起した細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の増加の量（例えば、細胞内のサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の増加の量）を測定することができる。
【００２９】
本明細書において、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルは、サイクリックヌクレオチドの濃度変化に応答してカルシウムイオンの細胞への流入量を変化させるチャンネルであり、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルを含む。
【００３０】
ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルは、ｃＡＭＰの濃度変化に応答してカルシウムイオンの細胞への流入量を変化させるチャンネルであり、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるチャンネルを含む。ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルの例としては、ＣＮＧ（cyclic nucleotide gated ion channel）カルシウムチャンネルがある。場合によりそのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されていてもよく、例えば、ｃＧＭＰに比較しｃＡＭＰにより感受性を示すように改変（置換、付加、欠失を含む）されてもよい。ＣＮＧカルシウムチャンネルは、天然のＣＮＧカルシウムチャンネルに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるタンパク質あり得る。改変の例としては、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける４６０番目のシステインのトリプトファンへの置換、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５８３番目のグルタミン酸のメチオニンへの置換、ウシＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５３７番目のトレオニンのセリン、メチオニン、バリンまたはアラニンへの置換、およびそれらの組合せ等が挙げられる。上記に挙げた置換は、その由来とする動物種に限定されず、他の動物種の対応する部位でのアミノ酸の置換にも適用される。例えば、ウシＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５３７番目のトレオニンに対応するマウスＣＮＧカルシウムチャンネルのトレオニンを、セリン、メチオニン、バリンまたはアラニンへ置換することができる。置換は、１以上の位置で行うことができ、例えば、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける４６０番目のシステインのトリプトファンへの置換を行うと共に、５８３番目のグルタミン酸のメチオニンへの置換を行うこともできる。
【００３１】
ＣＮＧカルシウムチャンネルは、α−サブユニットおよび／またはβ−サブユニットからなることができる。その構成は任意であり、例えば、α２サブユニット、α３サブユニット、α４サブユニットおよびβ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットからなる構成をとることができる。そして、サブユニットは、それぞれ上記のように改変され得る。
【００３２】
ＣＮＧカルシウムチャンネルの由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ブタであり得る。ＣＮＧカルシウムチャンネルは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、ＣＮＧカルシウムチャンネルは、配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるタンパク質であり得る。
【００３３】
本明細書において、カルシウム依存性発光タンパク質は、カルシウムに応答して構造が変化するタンパク質を含み、カルシウムを感受して発光するタンパク質、所謂カルシウムセンサーとして機能するタンパク質を含む。
【００３４】
カルシウム依存性発光タンパク質の例としては、イクオリン（aequorin）、cameleon（インビトロジェン）、Case12（Evrogne社）、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボイン、カルシウムに感受性のあるカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列と二つの色の異なるＧＦＰを結合したタンパク質、ＧＦＰのアミノ酸配列の１４４番と１４６番の間にカルモジュリンを結合したカルシウム依存性発光タンパク質、および特開２００２−１５３２７９に記載されているプローブナンバーＧ３−８５、Ａ１−２のタンパク質、または、存在する場合には、これらのアポタンパク質（例えば、アポイクオリン）が挙げられる。
【００３５】
カルシウム依存性発光タンパク質は、適宜目的に応じそのアミノ酸配列が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、発光量を増加させる為および／またはＳＮ比を良くする為に改変されてもよい。改変には、アミノ酸配列における、１個または数個のアミノ酸の付加、置換、欠失が含まれる。カルシウム依存性発光タンパク質には、天然のカルシウム依存性発光タンパク質のアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であってカルシウムを感受して発光するタンパク質が含まれる。例えば、カルシウム依存性発光タンパク質は、その遺伝子をヒト型のコドン頻度に最適化し、ミトコンドリア移行シグナルを有するように改変され得る。
【００３６】
カルシウム依存性発光タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、カルシウム依存性発光タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルシウムを感受して発光するタンパク質であり得る。
【００３７】
カルシウム依存性発光タンパク質としてイクオリン（aequorin）を用いる場合は、発光基質を細胞に添加してカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定することができる。発光基質としては、セレンテラジンまたはセレンテラジンの誘導体を使用することができる。セレンテラジンの誘導体には、ViviRen（登録商標、プロメガ社）が含まれる。例えば、カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する時のViviRenの最終濃度は、０．２４〜１２μＭとすることができる。
【００３８】
一つの実施態様では、本発明が提供する方法に、ＧＰＣＲ（例えば、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ）を発現する細胞を使用してもよい。この場合、動物由来の試料に存在する生理活性物質がＧＰＣＲに結合することで、細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量が変化する。よって、細胞内及び／または細胞外のサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量の変化を測定することにより、動物由来の試料中のＧＰＣＲに結合する物質の量を測定することができる。ＧＰＣＲに結合する物質は、ＧＰＣＲの内因性リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。細胞は、ＧＰＣＲを強制発現させて調製してもよく、ＧＰＣＲが構成的に発現している細胞を使用してもよい。
【００３９】
ＧｓがカップルするＧＰＣＲの例としては、ＴＳＨＲ、バソプレッシンＶ２受容体及びＧＬＰ−１受容体が挙げられ、ＴＳＨＲに結合する物質の例としては、ＴＳＨ、ＴＳＨＲ刺激型抗体（ＴＳＡｂ）、ＴＳＨＲ結合阻害型抗体（以下、ＴＳＢＡｂとも称す）が挙げられ、バソプレッシンＶ２受容体に結合する物質の例としてはＡＶＰが、ＧＬＰ−１受容体に結合する物質の例としてはＧＬＰ−１が挙げられる。
【００４０】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）が結合する受容体であればよく、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる受容体を含む。ＴＳＨＲの由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ブタであり得る。また、ＴＳＨＲは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、または、ＴＳＨＲは、天然のＴＳＨＲに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＴＳＨが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００４１】
ＴＳＨＲは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、ＴＳＨＲは、配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＴＳＨが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であり得る。
【００４２】
あるいは、ＴＳＨＲは、ＴＳＨＲに類縁する受容体、例えば、黄体ホルモン受容体、卵胞刺激ホルモン受容体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン受容体等とＴＳＨＲとのキメラタンパク質であり得る。これらキメラタンパク質は、ＴＳＨＲのアミノ酸残基８−８９または８−１６５以外の部分を、黄体ホルモン受容体、卵胞刺激ホルモン受容体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン受容体の適切な部分と置換することにより作成してもよい。例えば、ＴＳＨＲ−黄体ホルモン受容体キメラタンパク質を作成するために、ＴＳＨＲのアミノ酸残基９０−１６５をＬＨ−ＣＧ受容体のsegment Mc2と置換し、さらに、ＴＳＨＲのアミノ酸残基２６１−３７０をＬＨ−ＣＧ受容体のsegment Mc4と置換してもよい。
【００４３】
また、本発明において、ＴＳＨは哺乳類由来であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ブタ由来であり得る。ＴＳＨは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、天然のＴＳＨに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＴＳＨＲに結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００４４】
バソプレッシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ）は、アルギニンバソプレッシン（以下、ＡＶＰとも称す）が結合する受容体の一種であり、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる受容体である。Ｖ２Ｒの由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラットであり得る。また、Ｖ２Ｒは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、または、Ｖ２Ｒは、天然のＶ２Ｒに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡＶＰが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００４５】
Ｖ２Ｒは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、Ｖ２Ｒは、配列番号４に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡＶＰが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であり得る。
【００４６】
また、本明細書において、ＡＶＰは哺乳類由来であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット由来であり得る。ＡＶＰは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、天然のＡＶＰに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｖ２Ｒに結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００４７】
ＧＬＰ−１受容体は、ＧＬＰ−１ペプチドが結合する受容体の一種であり、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる受容体である。ＧＬＰ−１受容体の由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラットであり得る。また、ＧＬＰ−１受容体は、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、または、ＧＬＰ−１受容体は、天然のＧＬＰ−１受容体に対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１が結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００４８】
ＧＬＰ−１受容体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、ＧＬＰ−１受容体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１が結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であり得る。
【００４９】
また、ＧＬＰ−１は、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、さらに当該ペプチド中アミノ酸に脂肪酸などの修飾基を導入したものでもよく、天然ＧＬＰ−１に対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００５０】
一つの実施態様では、本発明が提供する方法に、ＧＰＣＲ（例えば、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ（例えば、ＴＳＨＲ、バソプレッシンＶ２受容体及びＧＬＰ−１受容体））に加え、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞を使用してもよい。この場合、動物由来の試料中に存在するＧＰＣＲに結合する物質が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量の変化は、サイクリックヌクレオチドの変化量および動物由来の試料中に存在するＧＰＣＲに結合する物質の量を反映するので、動物由来の試料中に存在するＧＰＣＲに結合する物質が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量から動物由来の試料中に存在するＧＰＣＲに結合する物質の量を測定することができる。ＧＰＣＲに結合する物質は、内因性リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００５１】
一つの実施態様では、本発明は、（ａ）動物由来の試料を加熱処理する工程；   （ｂ）ＧＰＣＲ（例えば、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ（例えば、ＴＳＨＲ、バソプレッシンＶ２受容体及びＧＬＰ−１受容体））に加え、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞に加熱処理した動物由来の試料を接触させる工程；及び（ｃ）カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程を含む、動物由来の試料中に存在するＧＰＣＲに結合する物質の量を測定する方法を提供する。
【００５２】
本発明が提供する方法において、in vitroサイクリックヌクレオチド測定系におけるバックグラウンドの低減は、動物由来の試料を加熱処理する工程で達成されてもよい。加熱処理により、動物由来の試料を精製することは必要でなくなる。例えば、動物由来の試料をポリエチレングリコールやチャーコールデキストランで処理して精製しなくてもよい。さらに、動物由来の試料を加熱した後、遠心分離する工程も行わなくてもよい。このことは、本発明が提供する方法の実施するための時間を大幅に短縮する。
【００５３】
一つの実施態様では、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を発現する細胞を用いた、動物由来の試料中に存在するＧタンパク質共役型受容体に結合
する物質の活性の測定系におけるバックグラウンドを低減する方法であって、動物由来の試料を加熱処理する工程を含む方法を提供する。Ｇタンパク質共役型受容体は、上記の通り、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ（例えば、ＴＳＨＲ、バソプレッシンＶ２受容体及びＧＬＰ−１受容体）であってもよい。ＧＰＣＲに結合する物質はＧＰＣＲの内因性リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。細胞は、ＧＰＣＲに加えて、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞を使用してもよい。
【００５４】
Ｇタンパク質共役型受容体に結合する物質の活性の測定系とは、物質がＧＰＣＲに結合することにより変化するＧＰＣＲの下流で作動する細胞内情報伝達系を評価する試験系であり得る。バックグラウンドは、Ｇタンパク質共役型受容体に結合する物質の活性の測定系において、ＧＰＣＲに結合する物質を細胞に接触させない時に得られる測定値であってもよい。
【００５５】
ＧＰＣＲが細胞内のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等のサイクリックヌクレオチドの量を変化させるＧＰＣＲであれば、Ｇタンパク質共役型受容体に結合する物質の活性の測定系として、上記で説明したin vitroでサイクリックヌクレオチドを測定する試験系を利用することができる。このような試験系の例には、標識サイクリックヌクレオチド（例えば、ＲＩ標識ｃＡＭＰ）を用いてサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量を測定するラジオイムノアッセイ法、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）が調節するルシフェラーゼの転写活性を指標にサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量を測定するレポータージーンアッセイ、及びサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）の量の変化によりサイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル（cyclic nucleotide gated ion channel））が介する細胞内へのカルシウムイオンの流入量が変化し、その結果生じるカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン（aequorin））の発光量の変化を指標に測定する方法が挙げられる。
【００５６】
例えば、ＧＰＣＲとして、ＴＳＨＲを考える場合、ＴＳＨＲ、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現させるベクターを細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトし、これらを発現させた細胞を調製し；得られた細胞に、加熱処理した動物由来の試料（例えば、血清）を接触させ；動物由来の試料中に存在するＴＳＨＲに結合する物質（例えば、ＴＳＡｂ）が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定してもよい。このような工程を実施することにより、ＴＳＨＲに結合する物質（例えば、ＴＳＡｂ）が存在しない動物由来の試料（例えば、血清）を細胞に接触させた結果として生じるカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を低減できるので、バックグラウンドの低減が達成される。なお、カルシウム依存性発光タンパク質として、イクオリンを使用する場合は、発光基質としてセレンテラジンまたはその誘導体（例えば、ViviRen（登録商標、プロメガ社））を採用し、細胞培地中に添加してもよい。
【００５７】
本発明が提供する方法において、ＴＳＨＲを発現する細胞を使用し、動物由来の試料がヒト由来の血清である場合、甲状腺疾患の診断に利用できる。甲状腺疾患には、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症が含まれ、甲状腺機能亢進症にはバセドウ病が含まれ、甲状腺機能低下症には橋本病が含まれる。本明細書において、橋本病は、血中においてＴＳＢＡｂが陽性である甲状腺機能低下症、甲状腺腫のない萎縮性甲状腺炎、ＴＳＢＡｂにより惹起される萎縮性甲状腺炎、粘液水腫を含む。好ましい実施態様では、本発明が提供する方法は、バセドウ病と無痛性甲状腺炎、亜急性甲状腺炎との鑑別診断に利用できる。
【００５８】
例えば、バセドウ病が疑われるヒトの血液由来の試料（例えば、血清、血漿）を熱処理し、ＴＳＨＲ、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞に接触させて、カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定することにより、当該ヒトの血液中の甲状腺刺激ホルモン受容体刺激型抗体（ＴＳＡｂ）を測定することができる。ヒト血液由来の試料にポリエチレングリコールを添加する前処理や、活性炭等の多孔性物質に接触させる前処理をしなくても、バックグラウンドの低減が達成されるので、バセドウ病診断の迅速な診断にこの方法が利用できる。また、本発明が提供する方法を利用することにより、ヒト血液由来の試料にポリエチレングリコールを添加する前処理を実施したときと同等の有病正診率を示すバセドウ病の診断方法が達成される。
【００５９】
また、例えば、橋本病が疑われるヒトの血液由来の試料（例えば、血清、血漿）を熱処理し、ＴＳＨＲ、サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウムチャンネル）及びカルシウム依存性発光タンパク質（例えば、イクオリン）を発現する細胞にＴＳＨと共に接触させて、カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定することにより、当該ヒトの血液中の甲状腺刺激ホルモン受容体結合阻害型抗体（ＴＳＢＡｂ）を測定することができる。ヒト血液由来の試料にポリエチレングリコールを添加する前処理や、活性炭等の多孔性物質に接触させる前処理をしなくても、バックグラウンドの低減が達成されるので、橋本病診断の迅速な診断にこの方法が利用できる。また、本発明が提供する方法を利用することにより、ヒト血液由来の試料にポリエチレングリコールを添加する前処理を実施したときと同等の有病正診率を示す橋本病の診断方法が達成される。
【００６０】
被験者がバセドウ病か否かの判断、橋本病が否かの判断は、例えば、被験者の血清（または血漿）試料と同量の正常人の血清（または血漿）試料を用いた場合に発せられるカルシウム依存性発光タンパク質の発光量と比較することにより行うことができる。具体的には、バセドウ病か否かの判断は、例えば、被験者由来の血清（または血漿）と健常人由来の血清（または血漿）を本発明が提供する方法に供し、被験者由来の血清（または血漿）が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量が健常人由来の血清（または血漿）が惹起するカルシウム依存性発光タンパク質の発光量よりも大きいときは、バセドウ病である、またはバセドウ病の疑いがあると診断してもよい。本発明が提供する方法による試験結果に診断補助とし、臨床症状を鑑みて医師により診断されてもよい。また、橋本病か否かの判断は、例えば、被験者由来の血清（または血漿）と健常人由来の血清（または血漿）を本発明が提供する方法に供し、被験者由来の血清（または血漿）がＴＳＨによるカルシウム依存性発光タンパク質の発光を阻害する程度が健常人由来の血清（または血漿）がＴＳＨによるカルシウム依存性発光タンパク質の発光を阻害する程度よりも大きいときは、橋本病である、または橋本病の疑いがあると診断してもよい。また、本発明が提供する方法による試験結果に診断補助とし、臨床症状を鑑みて医師により診断されてもよい。
【００６１】
一つの実施態様において、動物由来の試料中の生理活性物質の量を定量するために、既知濃度の生理活性物質を含んだ熱処理した試料を測定対象の検体と同時に本発明が提供する方法を実施してもよい。
【００６２】
例えば、ＧＰＣＲに関連する疾患（例えば、バセドウ病、橋本病）を診断する為に本発明が提供する方法を使用する場合、本発明が提供する方法は、さらに、加熱処理した正常動物由来の血清または血漿を用いて、既知濃度のＧＰＣＲに結合する物質を含む標準液を作成する工程；作成した標準液を細胞に接触させる工程；サイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程を含んでもよい。ＧＰＣＲに関連する疾患がバセドウ病であれば、本発明が提供する方法は、バセドウ病を疑われる被験者の血清または血漿由来の試料を加熱処理する工程、細胞に加熱処理した被験者の血清または血漿由来の試料を接触させる工程、及び加熱処理した被験者の血清または血漿由来の試料が細胞に接触することにより変化するサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程に加えて、正常人の血清または血漿由来の試料を加熱処理する工程、細胞に加熱処理した正常人の血清または血漿由来の試料を接触させる工程、及び加熱処理した正常人の血清または血漿が細胞に接触することにより変化するサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程を含んでもよい。また、ＧＰＣＲに関連する疾患が橋本病であれば、本発明が提供する方法は、橋本病を疑われる被験者の血清または血漿由来の試料を加熱処理する工程、細胞に加熱処理した被験者の血清または血漿由来の試料をＴＳＨと共に接触させる工程、及び加熱処理した被験者の血清または血漿由来の試料とＴＳＨが細胞に接触することにより変化するサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程に加えて、正常人の血清または血漿由来の試料を加熱処理する工程、細胞に加熱処理した正常人の血清または血漿由来の試料をＴＳＨと共に接触させる工程、及び加熱処理した正常人の血清または血漿とＴＳＨが細胞に接触することにより変化するサイクリックヌクレオチド量またはカルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する工程を含んでもよい。
【００６３】
本発明は、一つの側面にいて、Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞を含む、Ｇタンパク質共役型受容体が関連する疾患の診断用組成物またはキットを提供する。
【００６４】
Ｇタンパク質共役型受容体が関連する疾患は、ＧＰＣＲが活性化または抑制されていることに起因する疾患を含む概念であり、Ｇタンパク質共役型受容体が関連する疾患の例としては、バセドウ病、橋本病、抗利尿ホルモン不適合分泌症候群、尿崩症が挙げられる。
【００６５】
一つの実施態様として、本発明は、甲状腺刺激ホルモンレセプター、ＣＮＧカルシウムチャンネルおよびイクオリンを発現する細胞を含む、甲状腺疾患（例えば、バセドウ病、橋本病）の診断用組成物またはキットを提供する。キットには、さらに、細胞培養液、カルシウム依存性発光タンパク質の発光基質またはその水溶液、細胞培養用プレートまたは試験管、ＴＳＨまたはその水溶液及び抗ＴＳＨ抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。
【００６６】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞は、適宜調製され得、例えば、３Ｘ１０４cells/ml〜３Ｘ１０６cells/mlの濃度として調製される。細胞培養用プレートとして９６穴プレートを用いる場合、細胞は、９６穴プレートの１wellあたり、例えば、３Ｘ１０３cells〜３Ｘ１０５cellsで播種されることができる。
【００６７】
細胞培養液は、本発明に係る細胞を維持できるものであれば限定されず、Ca2+不含またはCa2+、Mg2+不含であり得る。
【００６８】
カルシウム依存性発光タンパク質の発光基質は、イクオリンの発光基質であるセレンテラジンまたはセレンテラジンの誘導体を含み、セレンテラジンの誘導体には、ViviRen（登録商標、プロメガ社）が含まれる。ViviRenの濃度は適宜設定されることができ、例えば、０．６〜３０ｍＭである。例えば、カルシウム依存性発光タンパク質の発光基質の水溶液は、４ｍＭ ViviRen（Promega）水溶液である。カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する時のViviRenの最終濃度は、０．２４〜１２μＭとすることができる。
【００６９】
細胞培養用プレートの例としては、ルミノメーターで発光量を測定できるものであり、細胞培養ができる９６穴プレートが挙げられる。試験管は、特に限定されず、当業者が適宜選択できる。例えば、カルシウム依存性発光タンパク質から発せられる発光を測定する装置に適した試験管を用いることができる。
【００７０】
ＴＳＨは、ＴＳＨＲのアゴニストとして使用できるものであればよく、ポジティブコントロールとして使用され得る。ＴＳＨは、限定はされないが、ウシ由来のＴＳＨであり得る。ＴＳＨは当業者が適宜調製でき、0.01〜100mU/mlで調整され得る。例えば、ウシ由来ＴＳＨは、１mU/mlの水溶液として調製される。カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する時のウシ由来ＴＳＨの最終濃度は、0.6μU/ml〜6mU/mlとすることができる。例えば、カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する時のウシ由来ＴＳＨの最終濃度は、100μU/mlである。また、ＴＳＨの代わりに、またはＴＳＨに加えて、ＴＳＡｂを使用してもよい。ＴＳＡｂはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
【００７１】
抗ＴＳＨ抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗ＴＳＨ抗体は適切な哺乳動物由来の抗体であり得、マウス抗ＴＳＨ抗体、ラット抗ＴＳＨ抗体、ウサギ抗ＴＳＨ抗体、ヤギ抗ＴＳＨ抗体が含まれる。抗ＴＳＨ抗体は、当業者により適宜改変され得る。また、抗原となるＴＳＨも適宜選択され、抗原となるＴＳＨには、ヒトＴＳＨ、マウスＴＳＨ、ラットＴＳＨ、ウサギＴＳＨ、ネコＴＳＨ、イヌＴＳＨが含まれる。本発明が提供するキットに用いられる抗ＴＳＨ抗体の例としては、ヤギ抗ヒトＴＳＨポリクローナル抗体が挙げられる。抗ＴＳＨ抗体の濃度は、当業者が適宜設定できる。例えば、キットに梱包される抗ＴＳＨ抗体溶液の濃度を、0.01μg/ml〜100μg/mlとしてもよい。カルシウム依存性発光タンパク質の発光量を測定する時の抗ＴＳＨモノクローナル抗体の最終濃度は、例えば、0.05〜5.48μg/mlであり得る。
【００７２】
甲状腺機能低下症（例えば、橋本病）の患者の中には血中のＴＳＨ量が高値である患者が存在する。この場合、ＴＳＨにより細胞においてカルシウム依存性発光タンパク質が発光するので、甲状腺機能低下症の患者であるにもかかわらず、バセドウ病と診断され得る。しかしながら、当該ＴＳＨ量が高値である甲状腺機能低下症の患者由来の血液試料を抗ＴＳＨ抗体と共に本発明に係る細胞に添加することで、患者由来のＴＳＨが中和されるので、当該患者をバセドウ病と誤って診断することを回避できる。  また、抗ＴＳＨ抗体を患者由来の血液試料と共に細胞に添加した場合と、抗ＴＳＨ抗体を添加せずに患者由来の血液試料を細胞に添加した場合のカルシウム依存性発光タンパク質から発せられる発光量を比較することにより、患者の血中におけるＴＳＨ量に関する情報を得ることができる。当該情報と患者の臨床症状を併せることにより、医師は甲状腺疾患をより正確に診断できる。
【００７３】
また、本発明が提供するキットは、Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞の他、正常人由来の血清または血漿を含んでもよい。正常人由来の血清は、加熱処理されていてもよい。既知濃度のＴＳＡｂまたはＴＳＢＡｂを熱処理された正常人由来の血清または血漿で希釈して作成された標準液を、さらに含んでもよい。
【００７４】
また、本発明が提供するキットは、Ｇタンパク質共役型受容体、サイクリックヌクレオチド依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム依存性発光タンパク質を発現する細胞の他、測定対象の試料の熱処理に用い、熱処理の際に蓋が開くのを防止するフックが蓋についたテストチューブを含んでもよい。
【００７５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
１．凍結細胞の構築方法の詳細
ヒト甲状腺由来のcDNA ライブラリーからPCR法によりヒト甲状腺刺激ホルモンレセプターのcDNA配列（Genbank No.NM_000369）（配列番号６）を増幅し、pUC18にクローニングした。pUC18にクローン化したhTSHR cDNAをBamH1で切り出し、pZeoSV2ベクター（Invitrogen）にリクローニングし、pZeoSV2 hTSHRを作成した。【００７７】
マウス臭上皮細胞由来のcDNAライブラリーからサイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネル（Genbank No. BC048775）（配列番号７）をPCR法で増幅し（1994bp）発現ベクター（pCMVSPORT, Invitrogen）にクローニングしてpmCNGα2（図１）を作成した。更に、cAMPに対する選択性と感度を上昇させるために、460番目のシステイン(C)をトリプトファン(W)に、583番目のグルタミン酸(E)をメチオニン（M）にアミノ酸置換を導入した改変サイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネル（配列番号８）を発現するコンストラクトpmCNGα2MWを点変異PCR法により作成した。また、オリゴDNA伸長法によってヒト型のコドン頻度に最適化し、ミトコンドリア移行シグナルを有する合成アポイクオリンcDNA配列（676bp）（配列番号９）を、KpnI, NheIで制限酵素処理し、KpnI, NheIで処理したpcDNA3.1(Invitrogen)にクローニングし、アポイクオリン発現ベクターpcDNA
mt sAEQ（図２）を作成した。【００７８】
CHO細胞株を10cm2シャーレに細胞濃度1.0x105 cells/mlで播種した。翌日、シャーレあたり1μgのpZeoSV2 hTSHR、2μgのpmCNGα2MW, 2μgのpcDNA mt sAEQをX-treame（ロッシュ社）を用いて遺伝子導入した。翌日、シャーレに400μLのベルセン溶液(EDTA)を添加し、細胞をシャーレより剥がし、10 mLの5% cFCS を含むDMEM/F12 培地に懸濁した。得られた懸濁液を1000回転で5分間遠心分離後、ペレットを2-5×106 cells/mLの濃度で1mLのセルバンカー1（日本全薬工業（株））に溶解させ-80℃で保存した。【００７９】
２．検体の熱処理条件の検討 
ヒト由来のプール血清を25μLチューブ（コーニング社、1.2mLポリプロピレンチューブ,Cat# 4412）に移してキャップをして、温浴槽（岩城硝子、CTR320）に血清が水中につかるように浮かべて35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃で、5秒、15秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分、60分、24時間熱処理を行った。熱処理後、緩衝液１（カルシウム不含CO2インディペンデント培地）100μLを添加し測定前まで-80℃で保存した。対照として、100μL の15% PEG6000溶液を試料に加えて攪拌後、5分間4℃で放置した後、1000rpm 20分間遠心分離し、上清を除去した。沈澱に100μLの緩衝液１を添加し、PEG処理済み試料とし、熱処理試料と共に25μLを96ウェルプレートに添加した。１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの緩衝液 (カルシウム不含CO2インディペンデント培地)に懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に10mLの緩衝液２（カルシウム不含CO2インディペンデント培地, 5% PEG6000）を加えて25μL 1mM ViviRen (Promega社)を添加し、100μL/wellで96穴プレートに播種した。標準液は、65℃で30分加熱処理したヒト血清に緩衝液１を添加した調整液を0 mIU/Lとして、甲状腺ホルモン受容体刺激抗体（NIBSC 08/204)を添加して、0、35〜750 mIU/L（検体希釈率を予め乗じた表示値）の濃度となるよう作成した。25℃で4時間培養後、100mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーター（PerkinElmer社、ARVO-Sx、以下、実施例において同機種を使用した）で発光量を測定した。標準曲線の発光量から、各試料の発光量を4パラメーターロジステック曲線で換算し、値を定量した（表１、２）。【００８０】
表１、２に処理温度と時間における処理検体の定量値（mIU/L)を示した。バセドウ病と正常人のカットオフが35mIU/Lであることから、35以上の値を非特異反応があると判定して、斜線で示した。熱変性してタンパク質が凝固したサンプルはグレーで示した。25〜30℃で24時間以上、40℃で15〜60分以上、45℃で5〜30分以上、50℃で1〜5分以上、55℃で30秒以上、60℃で15秒以上、65〜85℃で5秒以上熱処理すると正常人血清の非特異反応がおさえられることがわかった。細胞の製造ロットによって、非特異反応の強さが異なり、導入効率が高い細胞は、非特異反応が強い（ロット１及び２）傾向が見られた。このように未処理の血清を希釈した試料は細胞の遺伝子導入効率によるロット差による影響を受けやすく、検査値の差が生じる原因となる。血清を熱処理することによって、未精製の血清でも細胞のロット差による影響を少なくすることができる。【００８１】
【表１】
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【表２】
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【００８２】
３．刺激抗体を含む標準液の作成方法の検討
ヒト正常人プール血清を緩衝液１で希釈し、0、63〜1350 mIU/L（最終濃度）の濃度となるように甲状腺刺激抗体を添加し、標準液系列1〜6を作成した。調整した血清25μLに緩衝液1を200μL添加して希釈し、25μL/wellでプレートに添加した（熱処理なし、図３）。また、60℃、5分間温浴で処理後に、25μL/wellでプレートに添加した（熱処理あり、図４）。１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの緩衝液 (カルシウム不含CO2インディペンデント培地)に懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に10mLの緩衝液２（カルシウム不含CO2インディペンデント培地, 5% PEG6000）を加えて25μL 1mM ViviRen (Promega社)を添加し、100μL/wellで96穴プレートに播種した。25℃で4時間培養後、100mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
熱処理を行わない標準液は、0濃度のバックグラウンドが高く、SN比が低くなる（1350mIU/Lの発光値を０の発光値で割った値：SN=2）のに対して、熱処理を行った血清では、バックグラウンドが下がり、SN比が高く（SN=10）できることがわかった。【００８３】
４．熱処理により調整した標準液を用いた患者血清の測定の比較
バセドウ病、亜急性、無痛性甲状腺炎の各患者血清を25μL分取し、緩衝液1を200μL添加して希釈し、温浴で60℃、5分処理し、25μL/wellでプレートに添加した。3で調整した標準液を用いて各患者血清を測定した。対照として、25μLの血清に100μL の15%PEG6000を加えて、４℃、5分間静置した後に、3000rpm, 20分間遠心分離した後に、緩衝液1を200μL添加してPEG処理済み試料とした。１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの緩衝液 (カルシウム不含CO2インディペンデント培地)に懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に10mLの緩衝液２（カルシウム不含CO2インディペンデント培地, 5% PEG6000）を加えて25μL 1mM ViviRen (Promega社)を添加し、100μL/wellで96穴プレートに播種した。25℃で4時間培養後、100mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。【００８４】
その結果、未処理の血清を用いた標準液、患者検体では、SNが悪くウィンドーが狭まるために、バセドウ病の一部、無痛性甲状腺炎が分離して診断できなかったのに対して、熱処理を行った血清、標準液を用いたキットでは、PEG処理済み血清と同様にバセドウ病と無痛性甲状腺炎、亜急性甲状腺炎の診断ができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、検査薬、診断薬、研究試薬、医療機器等の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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