(57)【要約】 本発明の医療器具は、一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、上記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有するものであり、かつ、該基材は、上記一面に凹凸構造を備え、上記凹凸構造から構成される凸凸間の幅（Ｌ１）と、上記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜３００であり、上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具である。【化１】2016158039.tif 000015（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
2016158039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、
前記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有するものであり、かつ、該基材は、前記一面に凹凸構造を備え、
前記凹凸構造から構成される凸凸間の幅（Ｌ１）と、前記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜３００であり、前記細胞が前記凹凸構造を備えた前記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具。
【化１】
2016158039.tif 000012
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
【請求項２】
前記Ｌ１／Ｌ２が１〜１００である請求項１に記載の医療器具。
【請求項３】
前記凹凸構造の凸凸間の幅が１０μｍ〜１０００μｍである請求項１または２に記載の医療器具。
【請求項４】
前記一面の水接触角が７０°〜１６０°である請求項１ないし３のいずれか一項に記載の医療器具。
【請求項５】
前記一面は、前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される請求項１ないし４のいずれか一項に記載の医療器具。
【請求項６】
前記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと前記光硬化性化合物の質量比（フッ素含有環状オレフィンポリマー／光硬化性化合物）が、９９．９／０．１〜５０／５０である請求項５に記載の医療器具。
【請求項７】
前記一面に接触させて細胞を培養するために用いられる請求項１ないし６のいずれか一項に記載の医療器具。
【請求項８】
前記細胞からの培養細胞が細胞シート、スフェロイドまたはコロニーから選択される成長細胞の群体を形成しながら浮遊増殖する請求項７に記載の医療器具。
【請求項９】
成長細胞の群体を緩衝液により遊離して前記一面から離脱させる請求項７または８に記載の医療器具。
【請求項１０】
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の前記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
【化２】
2016158039.tif 000013
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
【請求項１１】
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の前記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
【化３】
2016158039.tif 000014
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の医療器具の一面上に接触させるように細胞を播種する工程と、
前記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
該一面上に緩衝液を添加して、該一面から培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療器具、フッ素含有環状オレフィンポリマー、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物、および細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物の細胞は、従来から多くのものが培養されており、培養技術も様々な形態のものが検討されている。細胞培養技術は、特に、生命科学の分野において、医薬品の開発や病態メカニズムの解明などに欠くことのできない技術となっている。また、研究目的としての細胞培養技術のみならず、生物学、医学、薬学、免疫学などの分野での利用を目的とした工業生産的培養方法も種々検討されている。さらに、近年では医療などの分野において、組織細胞を培養し、これを人工臓器、人工歯骨、人工皮膚などの代替組織として利用する研究も盛んに行われている。【０００３】
このような細胞培養は、通常、一定の容器の中で培養液とともに行われる。ここで、動物細胞の多くは、物質に付着して育成される接着依存性を有しており、このような接着依存性を有する細胞の培養には、細胞が付着するための基材（器具）が必要とされる。細胞培養用の基材としては、ポリスチレンを原料として成形されたものが一般的に用いられる。また、基材の表面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理などを施し、親水性を付与したものがシャーレ、フラスコ、マルチプレートなどの培養器具として市販されている。【０００４】
しかしながら、付着性細胞種に関し、培養器具を用いて細胞培養をした場合には、培養容器の培養面を細胞が覆いつくしてしまい、細胞増殖が停止してしまう接触阻害を起こしうることが知られている。また、播種される細胞濃度が低すぎると、栄養分や酸素等が細胞に十分供給されている環境であっても細胞の接着や増殖に影響が生じるという密度効果も知られている。また、組織培養に応用される細胞増殖が群体を形成した状態の細胞シートやスフェロイド、コロニーを作製する際に、播種を繰り返して培養する操作（以下、継代操作と略す）が用いられている。この操作過程においては、細胞が培養容器の培養面に付着しながら平面的に増殖する挙動を示すことに起因し、操作が煩雑となり、細胞を損傷なく再現良く培養することが困難となる場合がある。【０００５】
このような問題を解決するために、ゲルやスポンジ状に架橋したコラーゲンを培養基材の上に配置して線維芽細胞や角化細胞などを播種、培養することで培養粘膜・皮膚を製造する方法が開示されているが（特許文献１参照）、利用されるコラーゲン種の多くは、ウシあるいはブタの結合組織から可溶化し、抽出されたコラーゲンであり、近年ＢＳＥ（牛海綿状脳症）や口蹄疫などの問題により、医療応用などを考慮する場合にその使用が困難になってきている。【０００６】
継代操作について従来の技術では、分裂を繰り返す付着性細胞を培養するために培養容器で細胞を適当な時間培養して目的の細胞濃度まで増殖する度に、細胞を培養面から剥離し、その一部を新たな培養容器に移し替える操作を継続的に行なう方法が一般的であった（例えば、特許文献２、３参照）。特許文献２では、面積が異なる複数の培養面を有する培養容器を用い、最小面積を有する培養面から細胞培養を開始し、増殖が進行するにつれて細胞をスクレーパーで剥離して徐々に面積の大きな培養面へと細胞を移動しながら培養を閉鎖系で行なう方法が開示されている。また、特許文献３には、ガス透過性の樹脂で作製された細胞バッグ同士を接続し、バッグ内の培養液を混合させることで、細胞濃度を調整する継代操作が開示されている。しかしながら、何れの方法であっても、この継代操作は、液交換などの非常に煩雑な作業を伴うものであり、また、基材に付着した細胞を剥がして新たな培養容器に移し替える操作を行うため、細胞を損傷させ、増殖した形態を崩壊させてしまうなどの問題が潜在している。【０００７】
細胞を培養する基材表面の性状と増殖性については、Ｌ細胞（胃腸内分泌細胞）を培養した例で、細胞の増殖形態と基材の水接触角との関係を評価した結果が開示されている（非特許文献１参照）。この文献においては、種々の基材を用いて、水に対する接触角と細胞の接着との相関についての検討がなされている。また、この検討の中では、水に対して６０〜８０°の接触角を有する基材がＬ細胞の接着性に優れることが示されている。【０００８】
また、最近では細胞が接触する基材の表面に、凹凸構造を形成した基材を用いた培養技術が提案されている（例えば、特許文献４、５参照）。このような凹凸構造を付形した基材を用いる培養は、多くの場合、スフェロイド培養であり細胞は塊状の形態で増殖する態様を示す。しかしながら、凹凸構造を付形する基材の材料は、シクロオレフィンポリマー（特許文献４参照）、ポリジメチルシロキサン（特許文献５参照）などの従来から知られた細胞接着性の材料であり、基材の凹凸構造によるスフェロイド培養において、細胞が基材と接触する面積が小さくなっていても本質的に接着性の態様は変わらず細胞は足場を形成する。これにより、培養した細胞を基材から離脱させる際に、細胞を損傷させ、増殖した形態を崩壊させてしまうなど潜在的な問題がある。ここで、凹凸構造を付形した基材を用いる細胞培養では、細胞が足場を形成する上での効果的な凹凸構造の形状やサイズについて報告されているものの、基材表面の水接触角と接着性或いは、増殖性の関係についての記載は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１４７５８５号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９５５８号公報
【特許文献３】特開平７−０４７１０５号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／０９７１２１号パンフレット
【特許文献５】特開２０１０−８８３４７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙ．Ｔａｍａｄａ，Ｙ．Ｉｋａｄａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５５，３３４−３３９（１９９３）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、基材の一面に接触または保持させた細胞を、損傷させること無く基材から離脱させることができる医療器具を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下に示される。
（１）
一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、
上記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有するものであり、かつ、該基材は、上記一面に凹凸構造を備え、
上記凹凸構造から構成される凸凸間の幅（Ｌ１）と、上記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜３００であり、上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具。
【化１】
2016158039.tif 000003
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
（２）
上記Ｌ１／Ｌ２が１〜１００である（１）に記載の医療器具。
（３）
上記凹凸構造の凸凸間の幅が１０μｍ〜１０００μｍである（１）または（２）に記載の医療器具。
（４）
上記一面の水接触角が７０°〜１６０°である（１）ないし（３）のいずれか一つに記載の医療器具。
（５）
上記一面は、上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される（１）ないし（４）のいずれか一つに記載の医療器具。
（６）
上記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと上記光硬化性化合物の質量比（フッ素含有環状オレフィンポリマー／光硬化性化合物）が、９９．９／０．１〜５０／５０である（５）に記載の医療器具。
（７）
上記一面に接触させて細胞を培養するために用いられる（１）ないし（６）のいずれか一つに記載の医療器具。
（８）
上記細胞からの培養細胞が細胞シート、スフェロイドまたはコロニーから選択される成長細胞の群体を形成しながら浮遊増殖する（７）に記載の医療器具。
（９）
成長細胞の群体を緩衝液により遊離して上記一面から離脱させる（７）または（８）に記載の医療器具。
（１０）
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
【化２】
2016158039.tif 000004
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
（１１）
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
【化３】
2016158039.tif 000005
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
（１２）
（１）ないし（９）のいずれか一つに記載の医療器具の一面上に接触させるように細胞を播種する工程と、
上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
該一面上に緩衝液を添加して、該一面から培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、基材の一面に接触または保持させた細胞を、損傷させること無く基材から離脱させることができる医療器具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１５】
【図１】実施例１に記載のリン酸緩衝生理食塩水によりシート状に浮遊したマウス胚繊維芽細胞の明暗視顕微鏡写真を示す図である。
【図２】実施例８に記載の１４日間培養したヒト皮膚繊維芽細胞の細胞骨格タンパクの蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図３】比較例４に記載の７日間培養したヒト皮膚繊維芽細胞の細胞骨格タンパクの蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施の形態に基づいて説明する。なお、本明細書中において「〜」は特に断りがなければ以上から以下を表す。
【００１７】
（医療器具）
本発明における医療器具は以下に示される。
一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、上記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有し、かつ、該基材は、上記一面に凹凸構造を備え、上記凹凸構造から構成される凸凸間の幅（Ｌ１）と、上記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜３００であり、上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具である。
ここで、「上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず」とは、培養細胞が保持された一面上に培養液または緩衝液を添加したときに、該一面から培養細胞が浮遊し、剥離する状態をいう。
また、本実施形態において、基材の一面に接触させる細胞は幹細胞を含んでもよい。
【００１８】
【化４】
2016158039.tif 000006
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。好ましくは、式（１）中のＲ１〜Ｒ４は、それぞれが、フッ素またはフッ素原子を含む置換基である。）
【００１９】
本発明者らは、医療器具を構成する基材の細胞を接触または保持させる一面に、一般式（１）により表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー、または該フッ素含有環状オレフィンポリマーを含む組成物から構成される凹凸構造が形成された基材を用い、播種した細胞を少なくとも上記凹凸構造の凹部底面に接触または保持させることで細胞の密度を適切に、かつ基材全面に渡って均一に保つことができることを発明した。
また、培養後の形態で均一な細胞密度の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーなどの群体を形成し、該一面に保持した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液によって容易に浮遊させることができることを見出した。これにより、成長細胞を損傷させること無く基材から離脱させることが可能となる。
【００２０】
以下、本発明における医療器具について詳細に説明する。
本発明における医療器具は、凹凸構造を形成した基材を備え、基材の一面のうち少なくとも凹部底面に細胞と培養液が接触または保持される形態で使用される医療器具である。このような医療器具は、例えば凹凸構造を形成した基材の一面の少なくとも凹部底面に接触または保持させた細胞を培養し増殖させ、成長細胞を利用することを目的としてもよく、または、凹凸構造を形成した基材の一面の少なくとも凹部底面に接触または保持させた成長細胞を利用した検査を行うために利用してもよい。
一方、細胞を培養するための医療器具においては、凹凸構造を形成した一面の少なくとも凹部底面を、細胞を培養するための培養面とすることもできる。
【００２１】
本発明における医療器具において、基材の細胞を接触または保持させる一面は、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成される。これにより、医療用または細胞培養の基材の一面に接触または保持させた細胞や、一面上において培養した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を用いることによって成長細胞の群体を基材から浮遊させることができる医療器具を得てもよい。これにより、基材の凹凸構造を形成した一面に接触または保持させた成長細胞を損傷させること無く基材から離脱させることが可能となる。
【００２２】
さらに、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより基材の一面を構成することによって、一面に接触または保持させた細胞が当該一面に接着および付着しない基材を実現することができる。これにより、細胞培養において、細胞を厚み方向へ群体を形成させながら増殖させた細胞シートや、個別に分離しながら群体を増殖させたスフェロイドや、ランダムに分散した群体を形成させたコロニーを作り分けることができる。
【００２３】
通常の細胞を培養するために用いられる医療器具においては、増殖した細胞が培養面に接着または付着しながら増殖するため、厚み方向に対して均一な平面状態、個別に分離した球状状態、またはランダムに分散したコロニー状態で細胞が増殖する。この場合、細胞が培養面を覆いつくしてしまうと細胞が接着または付着する足場が無くなるため、接触阻害等の影響により細胞成長が妨げられる。一方で、効率的な細胞培養を行うために播種を繰り返して培養する継代操作を用いることが考えられるが、細胞を剥がして新たな培養容器に移し替える作業により細胞を損傷させるおそれがある。また、継代操作は頻繁な液交換などの非常に煩雑な作業を伴うものである。
【００２４】
これに対し、本発明によれば、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーによって細胞を接触または保持させる基材の凹凸構造を形成した一面を構成することによって、増殖した細胞が基材の一面に接着および付着することを抑制することができる。このため、継代操作によらずとも、厚み方向に対して群体を形成するように細胞を増殖させることができる。したがって、細胞の損傷の誘発や操作の煩雑化を抑えつつ、より効率的な細胞培養を行うことができる。
【００２５】
また、本発明の医療器具においては、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーによって形成される凹凸構造の凸凸間の幅（Ｌ１）と当該基材と接触または保持させる細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）は１〜３００の範囲であり、好ましくは２〜２００、さらに好ましくは３〜１００である。なお、この細胞の最大径（Ｌ２）は、凸凸間の幅（各凹部）に播種した細胞ひとつあたりの最大径を示す。ここで、Ｌ２は、凸凸間の幅に播種した複数の細胞の最大径をそれぞれ測定し、それらの値を平均した値である。これにより、細胞を凹部の底面に確実に接触または保持させることができ、細胞が個々の仕切内で増殖するため基材一面上での細胞の密度を適切に、かつ均一に保つことで細胞の増殖性を高く、また、培養形態で均一な細胞密度の群体状の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーなどを作製することができる。そして、培養した群体形状の細胞塊や細胞シートを、例えば、リン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液によって容易に浮遊させ基材から離脱させることができる。
【００２６】
ここで、細胞の最大径とは、培養液中に浮遊した状態の細胞を顕微鏡観察して計測した計測値であり、種類により大きさも様々である。一般に、マウス、ラット、ヒトなどの動物細胞の多くは１０μｍ〜１００μｍであり、特にヒト細胞の場合で１０μｍ〜６０μｍ、種類によっては精子細胞の２．５μｍや卵細胞の２００μｍ程度のものまで存在する。顕微鏡観察によるひとつあたりの細胞の計測から得られた細胞の最大径をＬ２とする。
これに合わせ、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーによって形成される凹凸構造の凸凸間の幅は、好ましくは１０μｍ〜１０００μｍである。より好ましくは１５μｍ〜１０００μｍ、さらに好ましくは２０μｍ〜１０００μｍである。ここでの凸凸間の幅は、パターンを上方から観察したときの計測値であり、例えば、正方形や長方形などのパターンでは対角、円形のパターンでは直径、不定形のパターンでは最大幅を示し、形状は特に限定されない。この範囲とすることで、細胞を効果的に凹凸構造の凹部底面に接触または保持させることが可能になり、上記したように培養した形態で均一な密度の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーを作製することができる。
【００２７】
さらに、上記した凹凸構造の凸凸間の幅（Ｌ１）と当該基材と接触または保持させる細胞の最大径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜３００である基材を用いて細胞を培養する際の、細胞を播種した後のひとつあたりの凹部底面に接触または保持される細胞数は好ましくは１〜１００個であり、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個である。これにより、播種した後の基材一面上での細胞の密度を適切に、かつ均一に保つことで細胞の増殖性を高く、また、培養後の形態で均一な細胞密度の群体状の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーを作製することができる。なお、ここでの細胞数は、播種した後の細胞が凹部底面に沈降するまでの時間を考慮して明暗視顕微鏡などにより、細胞を観察してカウントした細胞数であり、通常、複数の凹部に接触または保持された細胞をカウントした細胞数を凹部の数で除した平均値として取り扱う。
【００２８】
本発明の医療器具を用いて作製した培養細胞は、好ましくは、薬物代謝系酵素活性を維持した培養細胞である。すなわち、生体内での細胞増殖とほぼ同じ機能を維持したまま成長させた培養細胞であり、細胞の種類を限定的に選ばない。もしくは、遺伝子変異を起こす確率の高いウイルスまたは細菌などごく限られた細胞の種類を除いて正常に生細胞を培養することができる。その細胞の薬物代謝系酵素活性は、低温下で保存する、または特別な培養保存操作（例えば、酸素過多で保存するなど）をすることなく維持された培養細胞である。
一方、細胞の形状は、特に限定する必要は無いが、例示するならば、例えば、シート状細胞、スフェロイド状細胞、コロニー状細胞、神経系形態細胞などである。特に、再生医療の分野では、本発明のように生体細胞と同様な薬物代謝系酵素活性を維持していることが望まれており、本発明の培養細胞は好適に生産できることが、重要な訴求点になる。また、本発明の培養細胞は、創薬やバイオ薬品、美容においても同様の機能を長期間維持することができ、本発明は世界的な潮流となりうる発明である。
【００２９】
また、上記フッ素含有環状オレフィンポリマーにより基材を構成することによって、基材の成形性を向上させることができ、工業的に価値のあるあらたな医療器具が実現される。
【００３０】
本発明において、培養細胞を接触または保持させる一面が上記フッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成されるとは、例えばプラスチックや金属などの他の材料により形成される支持体の一面上に上記フッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成される凹凸構造を形成したフィルムが貼り付けられて基材が構成される場合や、溶融成型で基材全体が上記フッ素含有環状オレフィンポリマーで構成され、細胞を接触または保持させる部分に凹凸構造が形成される場合を含んでもよい。
【００３１】
また、本発明の医療器具上で作製された培養細胞を綿、布、不織布などで覆い積層された積層体も提供してもよい。または、この積層体は、グリセリンなどの保湿剤を含侵させてもよい。すなわち、本発明の医療器具で作製された培養細胞は、積層体の覆いを外し、直接、再生医療として患部に貼り合わせ、フィルムを離脱させる医療行為を行ってもよい。
【００３２】
本発明において培養細胞と接触または保持する凹凸構造を形成した一面における水接触角は、例えば７０°〜１６０°であり、好ましくは７５°〜１５５°、より好ましくは８０°〜１５０°とすることができる。これにより、一面に接着および付着せずに増殖した細胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を用いてより容易に浮遊させることができる。このため、細胞を基材から離脱させる際に、細胞に損傷が発生することをより確実に抑えることが可能となる。
【００３３】
基材の一面における水接触角は、基材の一面を構成する材料や、基材の作製方法における種々の条件を適切に選択することにより制御することができる。本発明においては、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーから構成され、凹凸構造を形成した基材で上記基材の一面を形成することが、水接触角を所望の範囲とするために重要な要素の一つである。
【００３４】
水接触角の測定は、日本工業規格ＪＩＳ−Ｒ３２５７（基板ガラス表面のぬれ性試験方法）に準じて、２５±５℃、５０±１０％の恒温恒湿条件下で水滴の形状を球形とみなせる４μｌ以下の容量の水滴を基材表面に滴下し、静滴法により、基材表面に水滴が接触した直後から１分以内の基材と水滴の接触界面の角度を計測する方法で行うことができる。本発明においては、例えば種々のプラスチック材料の物性値に利用される数値と同様に、上記方法により水滴が接触した直後から１分以内の数値を物性値として取り扱うことができる。
【００３５】
本発明における医療器具で取扱うことができる細胞の種類としては、動物細胞の場合で浮遊系細胞、接着系細胞に関わらず、例えば、線維芽細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、神経細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上細胞、網膜色素上細胞、歯根膜幹細胞、筋繊維芽細胞、心筋細胞、肝細胞、脾内分泌細胞、皮膚角化細胞、皮膚繊維芽細胞、皮下脂肪由来前駆細胞、腎臓細胞、底部毛根鞘細胞、鼻粘膜上皮細胞、血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、不死化細胞、がん細胞、角化細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが例示され、より具体的にはＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｈｓ−６８細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＣ−１２細胞、Ｋ５６２細胞、Ｌ細胞、２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨＴ−２９細胞、Ａ５４９細胞、Ｂ１６細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｖ７９細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＮＳＣＬＣ細胞、Ａ４３１細胞、Ｓｆ９細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｊ７７４細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＨａＣａＴ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、ＨｕＨ−７細胞、Ｒａｔ１細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、ＴＩＧ細胞、ＣＨＬ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＭＩＮ６細胞、ＫＡＴＯ細胞、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞、ＤＴ４０細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＦＭ３Ａ細胞、などが例示される。初代細胞あるいは継代された細胞のいずれであってもよい。
【００３６】
これらの細胞の由来としては各種生物、例えば、ヒト、イヌ、ラット、マウス、トリ、ブタ、ウシ、昆虫等の細胞、または、これらが集合して形成された組織、器官、微生物、ウイルスなどが挙げられ、より具体的には、ヒト子宮頚部癌由来、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ卵巣由来、ＣＶ−１細胞由来、ヒト骨髄性白血病由来、ヒト乳癌由来、ヒトＴ細胞白血病由来、Ａｆｒｉｃａ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ腎由来、ヒト副腎髄褐色細胞種由来、ヒト骨髄性白血病由来、Ｃ３Ｈマウス皮下組織由来、ヒト胎児腎由来、ヒト肝癌由来、ヒト組織球性白血病由来、ヒト大腸癌由来、ヒト肺癌由来、マウスメラノーマ由来、イヌ腎臓由来、Ｂａｌｂ／ｃマウス胎仔由来、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ肺由来、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３由来、ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胎仔由来、ヒトバーキットリンパ腫由来、ヒト肺非小細胞癌由来、ヒト皮膚Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｉｄ由来、蛾の幼虫卵巣由来、Ｓｙｒｉａｎ  ｇｏｌｄｅｎ  ｈａｍｓｔｅｒ腎由来、マウスマクロファージ由来、マウス筋組織由来、雑系Ｓｗｉｓｓマウス胎仔由来、ヒト急性Ｔ細胞白血病由来、マウスＥＣ細胞ＯＴＴ６０５０由来、マウスｃａｌｖａｒｉａ由来、ヒト表皮角化細胞由来、ＤＢＡ／２マウス胸腺腫瘍由来、ヒト幹細胞癌由来、ラット結合組織由来、ヒト骨肉腫由来、ヒト胎児肺由来、ヒト神経芽細胞腫由来、マウスインスリノーマ由来、ヒト胃癌由来、Ｃ３Ｈマウス胎仔由来、ニワトリＢ細胞白血病由来、マウス自然発生乳癌由来、などが例示される。
【００３７】
（医療器具に利用するフッ素含有環状オレフィンポリマー）
本発明における基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーは、下記一般式（１）で表される構造単位を含有する。
【００３８】
【化５】
2016158039.tif 000007
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
【００３９】
一般式（１）においてＲ１〜Ｒ４は、フッ素；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ヘキサフルオロイソプロピル基、ヘプタフルオロイソプロピル基、ヘキサフルオロ−２−メチルイソプロピル基、ペルフルオロ−２−メチルイソプロピル基、ｎ−ペルフルオロブチル基、ｎ−ペルフルオロペンチル基、ペルフルオロシクロペンチル基等のアルキル基の水素の一部または全てがフッ素で置換されたアルキル等のフッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基；フルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、トリフルオロエトキシ基、ペンタフルオロエトキシ基、ヘプタフルオロプロポキシ基、ヘキサフルオロイソプロポキシ基、ヘプタフルオロイソプロポキシ基、ヘキサフルオロ−２−メチルイソプロポキシ基、ペルフルオロ−２−メチルイソプロポキシ基、ｎ−ペルフルオロブトキシ基、ｎ−ペルフルオロペントキシ基、ペルフルオロシクロペントキシ基等のアルコキシ基の水素の一部または全てがフッ素で置換されたアルコキシ基等のフッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基；またはフルオロメトキシメチル基、ジフルオロメトキシメチル基、トリフルオロメトキシメチル基、トリフルオロエトキシメチル基、ペンタフルオロエトキシメチル基、ヘプタフルオロプロポキシメチル基、ヘキサフルオロイソプロポキシメチル基、ヘプタフルオロイソプロポキシメチル基、ヘキサフルオロ−２−メチルイソプロポキシメチル基、ペルフルオロ−２−メチルイソプロポキシメチル基、ｎ−ペルフルオロブトキシメチル基、ｎ−ペルフルオロペントキシメチル基、ペルフルオロシクロペントキシメチル基等のアルコキシアルキル基の水素の一部または全てがフッ素で置換されたアルコキシアルキル基等のフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基が例示される。
【００４０】
また、Ｒ１〜Ｒ４が互いに結合して環構造を形成していてもよく、ペルフルオロシクロアルキル、酸素を介したペルフルオロシクロエーテル等の環を形成してもよい。
さらに、フッ素を含有しないその他のＲ１〜Ｒ４は、水素；メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、２−メチルイソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペントキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基；またはメトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ペントキシメチル基等の炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基が例示できる。好ましくは、式（１）中のＲ１〜Ｒ４は、それぞれが、フッ素またはフッ素原子を含む置換基である。
【００４１】
フッ素含有環状オレフィンポリマーは、一般式（１）で表される構造単位のみを有するものであってもよく、一般式（１）で表される構造単位とともに他の構造単位を有するものであってもよい。また、フッ素含有環状オレフィンポリマーは、一般式（１）で表される構造単位であって、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが互いに異なる二種類以上の構造単位を含んでいてもよい。
【００４２】
本発明における一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーの具体的な例として、ポリ（１−フルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−１−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−１−フルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１−ジフルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロエチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１−ビス（トリフルオロメチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロエチル−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−ペルフルオロ−ｉｓｏ−プロピル−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（トリフルオロメチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロプロピル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロプロピル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロプロピル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｉｓｏ−プロピル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−プロピル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１，２−ビス（トリフルオロメチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２，２，３，３，３ａ,６ａ−オクタフルオロシクロペンチル−４，６−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２，２，３，３，４，４，３ａ,７ａ−デカフルオロシクロヘキシル−５，７−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメチル−２−ペルフルオロエチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−(１−トリフルオロメチル−２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−シクロペンチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン)、ポリ（（１，１，２−トリフルオロ−２−ペルフルオロブチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメチル−２−ペルフルオロブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−１−ペルフルオロエチル−２，２−ビス（トリフルオロメチル））−３，５−シ��ロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−ペルフルオロプロピル−２−トリフルオロメチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ヘキシル−２−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−オクチル−２−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロヘプチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロオクチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロデカニル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−ペルフルオロペンチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメチル−２−ペルフルオロブチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−ペルフルオロヘキシル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメチル−２−ペルフルオロペンチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（ペルフルオロブチル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（ペルフルオロヘキシル）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メトキシ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ｔｅｒｔ−ブトキシメチル−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，３，３，３ａ,６ａ−ヘキサフルオロフラニル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−１−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−１−フルオロ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１−ジフルオロ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロエトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１−ビス（トリフルオロメトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（トリフルオロメトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロプロポキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロプロポキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロプロポキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｉｓｏ−プロポキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−プロポキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ���１，２−ジフルオロ−１，２−ビス（トリフルオロメトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−ペルフルオロエトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−ペルフルオロブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−ペルフルオロブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−１−ペルフルオロエトキシ−２，２−ビス（トリフルオロメトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−ペルフルオロプロポキシ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ヘキシル−２−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−オクチル−２−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロヘプトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロオクトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ペルフルオロデシロキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−ペルフルオロペントキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−ペルフルオロブトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−ペルフルオロヘプトキシ３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−ペルフルオロペンチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（ペルフルオロブトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（ペルフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メトキシ−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ｔｅｒｔ−ブトキシメチル−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（２',２',２'−トリフルオロエトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−(２',２',３',３',３'−ペンタフルオロプロポキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−(２',２',３',３',３'−ペンタフルオロプロポキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−(２',２',３',３',���'−ペンタフルオロプロポキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−プロポキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−（１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−プロポキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−(２',２',３',３',４'，４'，４'−ヘプタフルオロブトキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−(１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−(１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−(１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−(１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−ブトキシ)−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−（２',２',２'−トリフルオロエトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−（２',２',３', ３',４'，４'，４'−ヘプタフルオロブトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−（２',２',３', ３',４'，４'，４'−ヘプタフルオロブトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−フルオロ−１−（２',２',２'−トリフルオロエトキシ）−２，２−ビス（トリフルオロメトキシ））−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−(２',２',３',３',３'-ペンタフルオロプロポキシ)−２−トリフルオロメトキシ−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−メチル−２−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ブチル−２−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−ヘキシル−２−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−オクチル−
２−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，７'，７'，７'−トリデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，７'，７'，８'，８'，８'−ペンタデカフルオロオクトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，７'，７'，８'，８'，９'，９'，９'−ヘプタデカフルオロデシロキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−（１',１',１'−トリフルオロ−ｉｓｏ−プロポキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ジフルオロ−１−トリフルオロメトキシ−２−（２',２',３',３',４'，４'，４'−ヘプタフルオロブトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（２',２',３',３',４'，４'，４'−ヘプタフルオロブトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）、ポリ（１，２−ビス（２',２',３',３',４'，４'，５'，５'，６'，６'，６'−ウンデカフルオロヘプトキシ）−３，５−シクロペンチレンエチレン）等が挙げられる。
【００４３】
本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマーの分子量は、例えば試料濃度３．０〜９．０ｍｇ／ｍｌでゲルパーミュエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定したポリスチレン換算の重量平均分子量（Ｍｗ）において、５,０００〜１,０００,０００であることが好ましく、１０,０００〜３００,０００であることがより好ましい。この重量平均分子量（Ｍｗ）を上記下限値以上とすることにより、溶液キャスト法により成形した成形物、あるいは基材にコートした成形物において曲げなどの外部応力に起因したヒビなどの発生しない、良好な状態の成形物をより確実に得ることができる。また、重量平均分子量（Ｍｗ）を上記上限値以下とすることにより、溶融成形が容易な流動性を持つことができる。
【００４４】
また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比である分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．３〜５．０とすることが好ましく、１．５〜４．５とすることがより好ましく、１．７〜４．０とすることがとくに好ましい。この分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を上記下限値以上とすることにより、溶液キャスト法や溶融成形法などの各種成形法で作製したフィルムまたは成形物の靱性を向上させ、外部応力に起因したクラックや割れの発生をより効果的に抑制することができる。一方で、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を上記上限値以下とすることにより、オリゴマーなどの特に低分子量成分が溶出することを抑え、凹凸構造を形成した基材表面の水接触角が変化して細胞増殖の形態が妨げられることをより確実に抑制することが可能となる。重量平均分子量（Ｍｗ）、および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を上記した範囲とすることにより、医療用または細胞培養および細胞を利用した検査に用いられるものとしてとくに好適な医療器具を得ることができる。
【００４５】
示差走査熱量分析によるフッ素含有環状オレフィンポリマーのガラス転移温度は、５０〜３００℃とすることが好ましく、８０〜２８０℃とすることがより好ましく、１００〜２５０℃とすることがさらに好ましい。ガラス転移温度が上記範囲であると、加熱滅菌処理が行え、また使用環境下で形状を維持することができ、さらに溶融成形において加熱温度に対して優れた流動性を有し製造安定性良く、色相にも優れた医療用または細胞培養および細胞を利用した検査のための基材としての医療器具を好適に得ることができる。
【００４６】
本発明における一般式（１）で表される構造単位を含有する部分化フッ素化ポリマーは、全フッ素化ポリマーとは異なり、主鎖が炭化水素で側鎖にフッ素原子を有する部分的なフッ素化ポリマーである構造であり、これに起因して極性が大きくなる。これにより、ポリマー合成時の溶剤である通常市販されているエーテルやケトンなどの極性溶剤に対して良く溶解し、光硬化性化合物などの極性化合物にも優れた溶解性を示しながら、本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマーの成形物は、培養基材として市販されているガラス製、ポリスチレン製、またはオレフィンポリマー製の表面性状に対して水接触角が７０°以上の比較的疎水な表面性状を有する。これにより、培養した群体形状のスフェロイドやコロニーなどの細胞塊や細胞シートを、例えば、リン酸緩衝液により浮遊させ容易に基材から離脱させることができる。
【００４７】
本発明における上述の樹脂の利用形態においては、例えば、医療用または細胞培養バッグ、プレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、チューブなどが例示できる。ここでは、例えば、細胞は、生体臓器や血液などを含む細胞であってもよい。
【００４８】
（フッ素含有環状オレフィンポリマーの製造方法）
次に、フッ素含有環状オレフィンポリマーの製造方法について説明する。
以下に記載の製造方法によって得られるフッ素含有環状オレフィンポリマーからなる凹凸構造を形成した成形物を、本発明の医療器具における基材として用いることにより、細胞の接着、または付着が抑制されることを特徴とする医療器具を好適に得ることができる。
【００４９】
具体的には、下記一般式（２）で表される環状オレフィンモノマーを開環メタセシス重合触媒によって連鎖移動重合し、得られる重合体の主鎖のオレフィン部を水素添加することによって、フッ素含有環状オレフィンポリマーを合成することができる。
【００５０】
【化６】
2016158039.tif 000008
（式（２）中、Ｒ１〜Ｒ４は、一般式（１）のＲ１〜Ｒ４と同義である。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。好ましくは、式（２）中のＲ１〜Ｒ４は、それぞれが、フッ素またはフッ素原子を含む置換基である。）
【００５１】
なお、本発明の効果を損なわない範囲であれば、一般式（２）で表される環状オレフィンモノマー以外のモノマーを含んでいてもよい。
【００５２】
ここで、本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマーを合成するに際し、一般式（２）で表されるモノマーは、重合に寄与する化合物全体のうち、９０〜１００量％用いることが好ましく、９５〜１００質量％用いることがより好ましく、９８〜１００質量％用いることが更に好ましい。
【００５３】
本発明の一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーは、一般式（２）で表されるモノマーを開環メタセシス重合した後に、主鎖の二重結合を水素添加（水添）したフッ素含有ポリマーである。開環メタセシス重合は、Ｓｃｈｒｏｃｋ触媒が好ましく用いられ、Ｇｒｕｂｂｓ触媒を用いてもよく、これにより極性モノマーに対する重合触媒活性を高め、工業的に優れた製造方法を実現することが可能となる。なお、これらの開環メタセシス重合触媒は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、古典的な有機遷移金属錯体、遷移金属ハロゲン化物または遷移金属酸化物と、助触媒としてのルイス酸との組み合せからなる開環メタセシス重合触媒を用いることもできる。
【００５４】
また、開環メタセシス重合を行う時は分子量、およびその分布を制御するために、連鎖移動剤としてオレフィンまたはジエンを使用することができる。オレフィンとしては、例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンまたはこれらのフッ素含有オレフィンを用いることができる。さらには、ビニルトリメチルシラン、アリルトリメチルシラン、アリルトリエチルシラン、アリルトリイソプロピルシラン等のケイ素含有オレフィンまたはこれらのフッ素およびケイ素含有オレフィン等も連鎖移動剤として用いることもできる。また、ジエンとしては、１，４−ペンタジエン、１，５−ヘキサジエン、１，６−ヘプタジエン等の非共役系ジエンまたはこれらのフッ素含有非共役系ジエンがあげられる。これらオレフィン、フッ素含有オレフィンまたはジエンはそれぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００５５】
また、モノマーの開環メタセシス重合は、無溶剤で行っても溶剤を使用してもよい。溶剤を使用する場合の溶剤としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジメトキシエタンもしくはジオキサン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸プロピルもしくは酢酸ブチル等のエステル類；ベンゼン、トルエン、キシレンもしくはエチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサンもしくはヘプタン等の脂肪族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ジメチルシクロヘキサンもしくはデカリン等の脂肪族環状炭化水素類；メチレンジクロライド、ジクロロエタン、ジクロロエチレン、テトラクロロエタン、クロロベンゼンもしくはトリクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；フルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、メタキシレンヘキサフルオライド等のフッ素含有芳香族炭化水素類；ペルフルオロヘキサン等のフッ素含有脂肪族炭化水素類；ペルフルオロシクロデカリン等のフッ素含有脂肪族環状炭化水素類；またはペルフルオロ−２−ブチルテトラヒドロフラン等のフッ素含有エーテル類を用いることができる。これらは、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５６】
モノマーの開環メタセシス重合では、該モノマーの反応性および重合溶剤ヘの溶解性によっても異なるが、モノマー溶液に対するモノマーの濃度は５〜１００質量％であることが好ましく、１０〜６０質量％であることがより好ましい。また、反応温度は、−３０〜１５０℃であることが好ましく、３０〜１００℃であることがより好ましい。また、反応時間は、１０分〜１２０時間であることが好ましく、３０分〜４８時間であることがより好ましい。さらに、ブチルアルデヒド等のアルデヒド類、アセトン等のケトン類、メタノール等のアルコール類、水等の失活剤で反応を停止し、重合体の溶液を得ることができる。
【００５７】
開環メタセシス重合で得られたポリマーの主鎖の二重結合部を水素添加するための触媒は、水素添加できる触媒であれば、均一系金属錯体触媒でも不均一系の金属担持触媒のいずれであってもよい。均一系金属錯体触媒として、例えば、クロロトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム、ジクロロトリス（トリフェニルホスフィン）オスミウム、ジクロロヒドリドビス（トリフェニルホスフィン）イリジウム、ジクロロトリス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム、ジクロロテトラキス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム、クロロヒドリドカルボニルトリス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム、ジクロロトリス（トリメチルホスフィン）ルテニウム等が挙げられ、また、不均一系金属担持触媒として、例えば、活性炭担持パラジウム、アルミナ担持パラジウム、活性炭担持ロジウム、アルミナ担持ロジウム、活性炭担持ルテニウム、アルミナ担持ルテニウム等が挙げられる。本発明においてはこれらの水添触媒は、好ましくは、容易に分離できる不均一系金属担持触媒が好適であり、また、単独で用いてもよく、または二種類以上を組合せて使用することもできる。
【００５８】
水素添加に用いられる溶剤としては、ポリマーを溶解し、かつ、溶剤自身が水素添加されないものであれば特に制限はなく、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジメトキシエタンなどのエーテル類；酢酸エチル、酢酸プロピルまたは酢酸ブチル等のエステル類；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ジメチルシクロヘキサン、デカリンなどの脂肪族環状炭化水素類；メチレンジクロリド、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロエチレン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン、トリクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類；フルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、メタキシレンヘキサフルオライド等のフッ素含有芳香族炭化水素類；ペルフルオロヘキサン等のフッ素含有脂肪族炭化水素類；ペルフルオロシクロデカリン等のフッ素含有脂肪族環状炭化水素類；ペルフルオロ−２−ブチルテトラヒドロフラン等のフッ素含有エーテル類等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組合せて使用してもよい。
【００５９】
上記の主鎖のオレフィン部の水素添加反応は、水素圧力が常圧〜１０ＭＰａであることが好ましく、０．５〜８ＭＰａであることがより好ましく、２〜５ＭＰａであることがとくに好ましい。また、反応温度は、０〜２００℃の温度であることが好ましく、室温〜１５０℃であることがより好ましく、５０〜１００℃であることがとくに好ましい。水素添加反応の実施様式は、特に制限はないが、例えば、触媒を溶剤中に分散または溶解して行う方法、触媒をカラムなどに充填し、固定相としてポリマー溶液を流通させて行う方法などが挙げられる。
【００６０】
さらに、主鎖のオレフィン部の水素添加処理は、水素添加処理前のポリマーの重合溶液を貧溶剤に析出させポリマーを単離した後に、再度溶剤に溶解して水素添加処理を行なっても、重合溶液からポリマーを単離することなく、上記の水添触媒で水素添加処理を行なってもよく、特に制限はない。
【００６１】
また、ポリマーのオレフィン部の水素添加率は８０％以上であることが好ましく、９０〜１００％であることが好ましく、９５〜１００％であることが更に好ましい。水素添加率を上記下限値以上とすることは、オレフィン部において、光吸収に起因した劣化や成形時の加熱に起因した酸化が生じることを抑制し、基材との接着性を良好なものとすることができる。さらに、２重結合の残留によって蛍光顕微鏡での成長細胞の観察を妨げることがある。
【００６２】
水素添加後、特に、活性炭担持パラジウム、アルミナ担持パラジウムなどの固体触媒を好ましく用いる場合のポリマー溶液からポリマーを取得する方法は、特に制限はないが、例えば、ろ過、遠心分離、デカンテーション等の方法でポリマーを取得し、撹拌下の貧溶剤に反応溶液を排出する方法、反応溶液中にスチームを吹き込むスチームストリッピング等の方法によってポリマーを析出させる方法、または、反応溶液から溶剤を加熱等によって蒸発除去する方法等が挙げられる。
【００６３】
また、不均一系金属担持触媒を利用して水素添加反応を実施した場合は、合成液をろ過して金属担持触媒をろ別した後に、上記した方法でポリマーを取得することもできる。なお、粒径の大きな触媒成分を予めデカンテーション、遠心分離などの方法でポリマー溶液中に沈降させ、上澄みを採取し、触媒成分を粗取りした溶液をろ過し、上記した方法でポリマーを取得してもよい。特に、触媒成分を精密ろ過することが、好適であり、ろ過フィルターの目開きは、好ましくは、１０μｍ〜０．０５μｍ、特に好ましくは、１０μｍ〜０．１０μｍ、さらに好ましくは、５μｍ〜０．１０μｍである。
【００６４】
（フッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を利用した医療器具の作製方法）
本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を利用した医療器具は、医療用または細胞培養、または細胞の検査のため等に用いることができる。ここで医療器具を作製する方法について記載する。本発明における医療器具は、例えば、凹凸構造を形成したフィルムやシート状の単層膜からなる基材や、他の材料の上に凹凸構造を形成したフィルムやシート状の単層膜を接着剤または粘着剤などで本発明の樹脂または他樹脂または他材料に貼り付けて形成してしてもよい。さらに、押出しフィルム成型や射出成型のような方法でロールまたは金型に凹凸構造をつけて凹凸構造を形成してもよい。
【００６５】
さらに、具体的には、ワニス状のフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を、溶液キャスト法でパターンモールドに塗工し、溶剤蒸発または溶剤蒸発後にＵＶ照射するインプリント法や、予めフィルム成型し、熱加圧またはＵＶ硬化でモールドのパターンを転写するインプリント方法、または押出しフィルム成型や射出成型のような方法でロールまたは金型の表面に凹凸構造のパターンをつけて凹凸構造を形成する溶融成型、または、ロールｔｏロールでのＵＶ硬化でモールドのパターンを付形する方法を挙げることができる。
【００６６】
本発明におけるこれらの凹凸構造の凹部は凸凸間の幅（Ｌ１）であり、好ましくは１０μｍ〜１０００μｍのパターンを賦型したものであり、より好ましくは２０μｍ〜１０００μｍ、さらに好ましくは５０μｍ〜１０００μｍのパターンをインプリント賦型したものであり、凹部底面に安定的に細胞を接触させることができる。また、凹凸構造の凸部の幅は、好ましくは１μｍ〜３００μｍのパターンを賦型したものであり、より好ましくは３μｍ〜３００μｍ、さらに好ましくは５μｍ〜３００μｍであり、凸部の高さは、好ましくは１０μｍ〜１０００μｍのパターンを賦型したものであり、より好ましくは２０μｍ〜１０００μｍ、さらに好ましくは５０μｍ〜１０００μｍである。これにより、播種した細胞を適切な密度で基材全面に均一に接触または保持させることができ、培養した後の形状で、群体形状のスフェロイド、コロニーなどの細胞塊や細胞シートをリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液によって浮遊させ容易に基材から離脱させることができる。
【００６７】
凹凸構造の形状は、特に限定されないが、これらの凹凸構造は、スクリーン印刷、エンボス加工、サブミクロンインプリント、ナノインプリントなど様々な方法で形成した円形、正方形、長方形、正三角形、正六角形など様々な形状であってもよく、凸凸間の幅（Ｌ１）は、その最大長さである。
【００６８】
本発明の医療器具を製造する上で、一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は、次の有機溶剤を使用して作製してもよい。例えば、メタキシレンヘキサフロライド、ベンゾトリフロライド、フルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン等のフッ素含有芳香族炭化水素類；ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクタン等のフッ素含有脂肪族炭化水素類；ペルフルオロシクロデカリン等のフッ素含有脂肪族環状炭化水素類；ペルフルオロ−２−ブチルテトラヒドロフラン等のフッ素含有エーテル類；クロロホルム、クロルベンゼン、トリクロルベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類；テトラヒドロフラン、ジブチルエーテル、１,２−ジメトキシエタン、ジオキサン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル類；または、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類等を挙げることができる。これらのうちから、溶解性や製膜性を考慮して選択することができる。また、これらは単独で用いてもよく、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。特に、製膜性の観点からは、大気圧下で７０℃以上の沸点をもつ溶剤が好ましい。これにより、蒸発速度が速くなりすぎることを確実に抑えることができ、膜表面におけるムラの発生を抑制でき、また、製膜時における膜厚精度の向上にも資することができる。
【００６９】
一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を溶解させる濃度は、１．０〜９９．０質量％であることが好ましく、５．０〜９０．０質量％であることがより好ましく、１０．０〜８０．０質量％であることがとくに好ましい。濃度は、ポリマーの溶解性やろ過プロセスへの適応性、パターン成形性、製膜性、フィルムの膜厚を考慮して選択してもよい。
【００７０】
さらに、本発明においてフィルム特性を損なわない範囲であれば、必要に応じて他の公知の成分を加えてよい。他の成分としては、老化防止剤、レベリング剤、濡れ性改良剤、界面活性剤、可塑剤等の改質剤、紫外線吸収剤、防腐剤、抗菌剤などの安定剤、光増感剤、シランカップリング剤等が挙げられる。
【００７１】
次いで、上記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物のワニスは、フィルターを通過させてろ過することができる。これによって、ワニスのポリマー不溶分やゲル、異物等の含有量を大きく低減させることができ、細胞を培養する培養器具や、細胞を利用した検査を行う検査器具としての基材表面のパターンを安定的に形成することができる。加えて、疎水性を示す表面性状を全面にわたって均一に形成することができる。
【００７２】
ろ過フィルターの目開きは、好ましくは１０μｍ〜０．０５μｍ、より好ましくは１０μｍ〜０．１μｍ、さらに好ましくは５μｍ〜０．１μｍである。ろ過のプロセスは、孔径の大きなフィルターから小さなフィルターへポリマー溶液を送る多段プロセスでも、直接、孔径の小さなフィルターへワニスを送る単一プロセスでもよい。フィルターの材質は、テフロン（登録商標）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースなどの有機材料からなるものでも、ガラス繊維、金属などの無機材料からなるものでもよく、細胞培養に悪影響を与えなければワニス特性、プロセス適応性から選ぶことができる。
【００７３】
また、ワニスをフィルターへ送る方法としては、圧力差を利用する方法でも、スクリューなどを介して機械的な駆動によってワニスをフィルターへ送液する方法でもよい。さらに、ろ過の温度は、フィルター性能や、溶液粘度、ポリマーの溶解性を考慮した範囲で選ばれ、−１０〜２００℃であることが好ましく、０℃〜１５０℃であることがより好ましく、室温〜１００℃であることがとくに好ましい。
【００７４】
次に、上記の一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを有機溶剤に溶解したワニスからフィルムの一面に凹凸構造を形成した基材の作製方法の例を示す。本発明においては、種々のインプリント法により凹凸構造が形成された基材が作製される。
【００７５】
本発明の基材の作製に用いられるモールドは、表面に微細パターンが形成されたものである。このモールドの基材材質としては、ニッケル、鉄、ステンレス鋼、ゲルマニウム、チタン、シリコン等の金属材料、ガラス、石英、アルミナ等の無機材料、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等の樹脂材料、ダイヤモンド、黒鉛等の炭素材料等が挙げられる。
【００７６】
凹凸構造が形成された基材は、上記ワニスとモールドのパターン面を接触させ、溶剤を蒸発させることによってモールドのパターンを転写すること、または、フィルムを作製後にモールドパターンを加熱転写すること、または、モールドパターンに塗工した本発明の組成物をＵＶ硬化し転写することにより得ることができる。
【００７７】
本発明の一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを有機溶剤に溶解したワニスと、モールドとを接触させる方法としては特に制限はないが、例えば、テーブルコート、スピンコート、ダイコート、スプレーコート、バーコート、ロールコートなどの方法でモールドの微細なパターン面の上にポリマー溶液（ワニス）を塗布する方法、または、ステンレス鋼、シリコン等の金属材料、ガラス、石英等の無機材料、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等の樹脂材料等の基材の上にテーブルコート、スピンコート、ダイコート、スプレーコート、バーコート、ロールコートなどの方法でポリマー溶液を塗布し、モールドの微細なパターン面をそれに被せて接触させる方法のいずれであってもよい。
【００７８】
具体的には、（Ａ）微細パターンを有するモールド表面に、フッ素含有環状オレフィンポリマーと有機溶剤からなる溶液(ワニス)を塗布する工程と、上記溶液から溶剤を蒸発させる工程と、を含む方法、（Ｂ）支持体（基材）にフッ素含有環状オレフィンポリマーと有機溶剤からなる溶液（ワニス）を塗布する工程と、塗布層の上面を微細パターンが形成されたモールド表面で押圧する工程と、上記塗布層から溶剤を蒸発させる工程と、を含む方法、等を挙げることができる。尚、（Ｂ）の方法においては、塗布層から溶剤を蒸発させた後、モールドで押圧することもできる。
【００７９】
転写体から溶剤を蒸発させ、乾燥する温度は通常１０〜３００℃であり、好ましくは５０〜２００℃の範囲であり、圧力は通常１３３Ｐａから大気圧の範囲であり、さらに、乾燥時間は通常１０分〜１２０時間であり、好ましくは３０分〜４８時間の範囲で実施することができる。また、乾燥温度、圧力および時間はそれぞれの設定で段階的に変化させてもよい。
【００８０】
本発明においては、溶剤を蒸発させてモールド上に転写体を形成させた後、この転写体を剥離することで、基材が得られる。転写体の剥離は、ガラス転移温度以下の温度で行なうことが好ましく、さらに、（ガラス転移温度−２０℃）以下の温度で剥離することがより好ましい。これによって転写体に形成されたパターン形状を精度よく保持し、容易に剥離することができる。剥離の方法は、モールドから剥離によって離型しても、または、モールドと転写体を例えば水などの媒体と浸漬やスプレーなどの方法で接触させた後に表面張力を利用して剥離することができる。また、転写体背面に樹脂材、或いは、ガラス等の無機材を貼り付け該基板を支持体に剥離してもよい。
【００８１】
また、本発明の凹凸構造が形成された基材は、一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物からなるフィルムを、モールドのパターン面と接触させて押圧することによってモールドのパターンを加熱またはＵＶ硬化転写させることにより得ることもできる。
【００８２】
例えば、フィルムにガラス転移温度以上に加熱したモールドを圧着する方法、または、フィルムをガラス転移温度以上に加熱しモールドを圧着させる方法、または、フィルム及びモールドをガラス転移温度以上に加熱し、モールドを圧着する方法が好ましく、加熱温度は、ガラス転移温度〜（ガラス転移温度＋１００℃）の範囲であり、好ましくは、（ガラス転移温度＋５℃）〜（ガラス転移温度＋５０℃）であり、また、圧着圧力は、通常１ＭＰａ〜１００ＭＰａであり、好ましくは、１ＭＰａ〜６０ＭＰａの範囲である。これにより、転写体に形成されたパターン形状を精度よく形成することができる。
【００８３】
圧着によってモールド上に形成させた転写体の剥離は、ガラス転移温度以下の温度で行なうことが好ましく、さらに、（ガラス転移温度−２０℃）以下の温度で剥離することがより好ましい。これによって転写体に形成されたパターン形状を精度よく保持し、容易に離脱することができる。剥離の方法は、モールドから剥離によって剥離しても、または、モールドと転写体を例えば水などの媒体と浸漬やスプレーなどの方法で接触させた後に表面張力を利用して剥離することができる。また、転写体背面に樹脂材、或いは、ガラス等の無機材を貼り付け該基板を支持体に剥離してもよい。
【００８４】
さらに、溶融成形法により凹凸構造を形成した基材となるフィルムを作製する方法が挙げられる。溶融成形法でフィルム製造する方法としては、上記に例示したフッ素含有環状オレフィンポリマーを溶融混練機を用いてＴダイを経てフィルム化する方法が挙げられる。Ｔダイによる溶融押出しフィルム製造においては、例えば、必要に応じて添加剤を配合した環状オレフィンポリマーを押出機に投入し、ガラス転移温度よりも好ましくは５０℃〜２００℃高い温度、より好ましくは８０℃〜１５０℃高い温度で溶融混練し、Ｔダイから押出し、冷却ロールで送りながらポリマーのガラス転移温度以上に加熱した表面に微細なパターンを有するロール形状のモールドをフィルムに押し当てることで凹凸構造を形成したフィルムに加工する。この際の、表面に微細なパターンを有するロールの加熱温度は、上述のフィルムとモールドを加熱圧着することにより凹凸構造を形成する際の加熱温度と同じ範囲で用いられる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、紫外線吸収剤、酸化防止剤、難燃剤、帯電防止剤、着色剤等の添加剤を添加してもよい。
【００８５】
本発明において、例えば、フッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を用いて作製されるフィルム基材の膜厚は、１〜１００００μｍであることが好ましく、５〜５０００μｍであることがより好ましく、１０〜２０００μｍであることがとくに好ましい。これらは、例えば、培養バッグ、培養プレート、培養シャーレなどの細胞培養に用いられる医療器具を作製する観点から好適な範囲となる。なお、ここでいう基材の膜厚は、基材を構成するフィルムの膜厚であり、この膜厚は、各器具を作製するプロセスや器具の用途に合わせて適宜設定することができる。射出成型基材については、特に、制限はない。
【００８６】
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を用いた、溶液キャスト法、加熱圧着法もしくは溶融成形法で製造した凹凸構造を形成したフィルムやシート、射出成型物は、ヒートシール法や、接着剤を利用したシール法、溶融押出しもしくは溶融成型などにより、例えば、袋、チューブ、成型物などの形態の医療器具を製造できる。また、ポリスチレン、ポリエチレン、金属などの他の材料で作製された、例えばシャーレ、マルチウェルプレート、フラスコなどに、本方法で得られたフィルム、シート、または溶融成型物を組み合わせた形態の医療器具を製造できる。
【００８７】
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は、上記において例示した一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含む。本発明によれば、このようなフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を用いて、医療器具における、基材の凹凸構造を有する一面を形成することができる。
これにより、モールドの形状やサイズを精度良く転写しながら、各種部材との強固な密着性を発現しつつ、細胞培養バッグ、またはプレートなどの各種培養器具の特性等を改質することができ、細胞の接着、または付着を抑制しつつ増殖させることが可能な医療器具を提供することができる。
さらに、本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は、例えばフッ素含有環状オレフィンポリマーを任意の濃度で光硬化性化合物と、光硬化開始剤と混合することで得られる。
【００８８】
フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を調製する際に用いる有機溶剤は、特に制限はないが、例えばメタキシレンヘキサフロライド、ベンゾトリフロライド、フルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン等のフッ素含有芳香族炭化水素類；ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクタン等のフッ素含有脂肪族炭化水素類；ペルフルオロシクロデカリン等のフッ素含有脂肪族環状炭化水素類；ペルフルオロ−２−ブチルテトラヒドロフラン等のフッ素含有エーテル類、クロロホルム、クロルベンゼン、トリクロルベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類；テトラヒドロフラン、ジブチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル類；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−メトキシエタノール、３−メトキシプロパノール等のアルコール類などが挙げられる。特に、光硬化性化合物そのものを調製溶剤として用いることができる。
これらのうちから、特に、製膜性の観点からは、大気圧下で７０℃以上の沸点をもつ溶剤が好ましい。これにより、蒸発速度が速くなりすぎることを確実に抑えることができる。このため、塗布する際に部分的に溶剤が乾き始めてしまう等に起因して膜厚精度の悪化や膜表面におけるムラが生じてしまうことを、確実に抑制することができる。
【００８９】
なお、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物には、必要に応じて、フッ素含有環状オレフィンポリマー、光硬化性化合物、および光硬化開始剤以外の他の公知の成分を添加することもできる。このような成分としては、例えば、老化防止剤、レベリング剤、濡れ性改良剤、界面活性剤、可塑剤等の改質剤、紫外線吸収剤、防腐剤、抗菌剤などの安定剤、光増感剤、シランカップリング剤等が挙げられる。
【００９０】
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物における光硬化性化合物は、フッ素含有環状オレフィンポリマーと光硬化性化合物の質量比（フッ素含有環状オレフィンポリマー／光硬化性化合物）は、９９.９／０.１〜５０／５０であることが好ましく、９９.９／０.１〜５５／４５であることがより好ましく、９９.９／０.１〜６０／４０であることがさらに好ましい。光硬化性化合物としては、カチオン重合可能な開環重合性化合物、反応性二重結合基を有する化合物等が挙げられる。好ましくは、コートして用いる際の硬化後の体積収縮にともなう基材の変形の抑制や、フッ素含有環状オレフィンポリマーとの相溶性の観点からカチオン重合可能な開環重合性化合物が選ばれる。
【００９１】
カチオン重合可能な開環重合性化合物および反応性二重結合基を有する化合物は、1分子中に反応性基を1個有していてもよく、複数個有していてもよい。また、光硬化性化合物中には、異なる反応性基数の化合物を任意の割合で混合して用いてもよい。さらに、光硬化性化合物として、反応性二重結合基を有する化合物とカチオン重合可能な開環重合性化合物を任意の割合で混合したものを用いてもよい。これらにより、本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物でモールドのパターンを寸法精度良く転写しながら、他の材料からなる部材と寸法精度良く、かつ強固に密着させることが可能になる。また、本発明の効果を発現可能な細胞培養、もしくは細胞を検査するための基材としての医療器具を好適に得ることができる。
【００９２】
光硬化性化合物のうち、カチオン重合可能な開環重合性化合物としては、例えば、シクロヘキセンエポキシド、ジシクロペンタジエンオキサイド、リモネンジオキサイド、４−ビニルシクロヘキセンジオキサイド、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル−３'，４'−エポキシシクロヘキサンカルボキシレート、ジ（３，４−エポキシシクロヘキシル）アジペート、（３，４−エポキシシクロヘキシル）メチルアルコール、（３，４−エポキシ−６−メチルシクロヘキシル）メチル−３，４−エポキシ−６−メチルシクロヘキサンカルボキシレート、エチレン−１，２−ジ（３，４−エポキシシクロヘキサンカルボン酸）エステル、（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、フェニルグリシジルエーテル、ジシクロヘキシル−３，３´−ジエポキシド、１，７−オクタジエンジエポキシド、ビスフェノールＡ型エポキシ樹脂、ハロゲン化ビスフェノールＡ型エポキシ樹脂、ビスフェノールＦ型エポキシ樹脂、ｏ−、ｍ−、ｐ−クレゾールノボラック型エポキシ樹脂、フェノールノボラック型エポキシ樹脂、多価アルコールのポリグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキセニルメチル−３'，４'−エポキシシクロヘキセンカルボキシレートといった脂環式エポキシ樹脂あるいは水添ビスフェノールＡのグリシジルエーテル等のエポキシ化合物等の、エポキシ化合物類が挙げられる。
【００９３】
さらに、３−メチル−３−（ブトキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（ペンチロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（ヘキシロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（２−エチルヘキシロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（オクチロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（デカニロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（ドデカニロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（フェノキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（ブトキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（ペンチロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（ヘキシロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（２−エチルヘキシロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（オクチロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（デカニロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（ドデカニロキシメチル）オキセタン、３−（シクロヘキシロキシメチル）オキセタン、３−メチル−３−（シクロヘキシロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（シクロヘキシロキシメチル）オキセタン、３−エチル−３−（フェノキシメチル）オキセタン、３，３−ジメチルオキセタン、３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−メチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−エチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−エチル−３−フェノキシメチルオキセタン、３−ｎ−プロピル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−イソプロピル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−ｎ−ブチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−イソブチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−ｓｅｃ−ブチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ヒドロキシメチルオキセタン、３−エチル−３−（２−エチルヘキシル）オキセタン等、
その他、オキセタニル基を２個以上有する化合物としてビス（３−エチル−３−オキセタニルメチル）エーテル（３−エチル−３{[(３−エチルオキセタン−３−イル)メトキシ]メチル}オキセタン）、１，２−ビス［（３−エチル−３−オキセタニルメトキシ）］エタン、１，３−ビス［（３−エチル−３−オキセタニルメトキシ）］プロパン、１，３−ビス［（３−エチル−３−オキセタニルメトキシ）］−２，２−ジメチル−プロパン、１，４−ビス（３−エチル−３−オキセタニルメトキシ）ブタン、１，６−ビス（３−エチル−３−オキセタニルメトキシ）ヘキサン、１，４−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］ベンゼン、１，３−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］ベンゼン、１，４−ビス｛［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ベンゼン、１，４−ビス｛［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝シクロヘキサン、４，４´−ビス｛［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ビフェニル、４，４´−ビス｛［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ビシクロヘキサン、２，３−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，６−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、１，４−ビス［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］ベンゼン、１，３−ビス［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］ベンゼン、１，４−ビス｛［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ベンゼン、１，４−ビス｛［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝シクロヘキサン、４，４´−ビス｛［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ビフェニル、４，４'−ビス｛［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］メチル｝ビシクロヘキサン、２，３−ビス［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５−ビス［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，６−ビス［（３−エチル−３−オキセタニル）メトキシ］ビシクロ［２．２．１］ヘプタン等のオキセタン化合物類が挙げられる。これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせで用いてもよい。
【００９４】
また、光硬化性化合物のうち、反応性二重結合基を有する化合物としては、例えば、フルオロジエン（ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦ２ＣＦ＝ＣＦ２、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ＝ＣＦ２、ＣＦ２＝ＣＦＣＦ２Ｃ（ＯＨ）（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＦ２＝ＣＦＣＦ２Ｃ（ＯＨ）（ＣＦ３）ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＦ２＝ＣＦＣＦ２Ｃ（ＣＦ３）（ＯＣＨ２ＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＦ２＝ＣＦＣＨ２Ｃ（Ｃ（ＣＦ３）２ＯＨ）（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２等）などのオレフィン類；ノルボルネン、ノルボルナジエンなどの環状オレフィン類；シクロヘキシルメチルビニルエーテル、イソブチルビニルエーテル、シクロヘキシルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのアルキルビニルエーテル類；酢酸ビニルなどのビニルエステル類；（メタ）アクリル酸、フェノキシエチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ステアリルアクリレート、ラウリルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、アリルアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、エトキシエチルアクリレート、メトキシエチルアクリレート、グリシジルアクリレート、テトラヒドロフルフリールアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ポリオキシエチレングリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルビニルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ジメチルアミノエチルメタクリレートなどの（メタ）アクリル酸及びその誘導体またはそれらのフッ素含有アクリレート類などが挙げられる。これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせで用いてもよい。
【００９５】
本発明の上記モノマーを硬化させる為の光硬化開始剤としては、光の照射によってカチオンを生成する光カチオン開始剤、光の照射によってラジカルを生成する光ラジカル開始剤、などが挙げられる。光硬化開始剤の使用量は、光硬化性化合物１００質量部に対して０.０５質量部以上であることが好ましく、０.１〜１０質量部であることがより好ましい。
【００９６】
光硬化開始剤のうち、光の照射によってカチオンを生成する光カチオン開始剤としては、光照射により、上記カチオン重合可能な開環重合性化合物類のカチオン重合を開始させる化合物であれば特に限定はないが、例えば、オニウム陽イオンと対を成す陰イオンとのオニウム塩のように光反応しルイス酸を放出する化合物が好ましい。
【００９７】
オニウム陽イオンの具体例としては、ジフェニルヨードニウム、４−メトキシジフェニルヨードニウム、ビス（４−メチルフェニル）ヨードニウム、ビス（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ヨードニウム、ビス（ドデシルフェニル）ヨードニウム、トリフェニルスルホニウム、ジフェニル−４−チオフェノキシフェニルスルホニウム、ビス〔４−（ジフェニルスルフォニオ）−フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（ジ（４−（２−ヒドロキシエチル）フェニル）スルホニオ）−フェニル〕スルフィド、η５−２，４−（シクロペンタジェニル）〔１，２，３，４，５，６−η−（メチルエチル）ベンゼン〕−鉄（１＋）等が挙げられる。また、オニウム陽イオン以外に、過塩素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、トリニトロトルエンスルホン酸イオン等が挙げられる。また、これらの光カチオン開始剤は、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００９８】
一方、陰イオンの具体例としては、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、ヘキサフルオロアンチモネート、ヘキサフルオロアルセネート、ヘキサクロロアンチモネート、テトラ（フルオロフェニル）ボレート、テトラ（ジフルオロフェニル）ボレート、テトラ（トリフルオロフェニル）ボレート、テトラ（テトラフルオロフェニル）ボレート、テトラ（ペンタフルオロフェニル）ボレート、テトラ（ペルフルオロフェニル）ボレート、テトラ（トリフルオロメチルフェニル）ボレート、テトラ［ジ（トリフルオロメチル）フェニル）］ボレート等が挙げられる。また、これらの光カチオン開始剤は、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００９９】
さらに好ましく用いられる光カチオン開始剤の具体例としては、例えば、イルガキュアー２５０（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー２９０（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー７８４（ＢＡＳＦ社製）、エサキュアー１０６４（ランベルティー社製）、ＷＰＩ−１２４（和光純薬工業社製）、ＣＹＲＡＵＲＥ ＵＶＩ６９９０（ユニオンカーバイト日本社製）、ＣＰＩ−１００Ｐ（サンアプロ社製）、ＰＨＯＴＯ  ＩＮＩＴＩＡＴＯＲ  ２０７４（ソルベイジャパン社製）、アデカオプトマーＳＰ−１７２（ＡＤＥＫＡ社製）、アデカオプトマーＳＰ−１７０（ＡＤＥＫＡ社製）、アデカオプトマーＳＰ−１５２（ＡＤＥＫＡ社製）、アデカオプトマーＳＰ−１５０（ＡＤＥＫＡ社製）等が挙げられる。また、これらの光カチオン開始剤は、単独で用いても、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
【０１００】
また、光硬化開始剤のうち、光の照射によってラジカルを生成する光ラジカル開始剤としては、例えば、アセトフェノン、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノン、クロロアセトフェノン、２，２−ジエトキシアセトフェノン、ヒドロキシアセトフェノン、２，２−ジメトキシ−２'−フェニルアセトフェノン、２−アミノアセトフェノン、ジアルキルアミノアセトフェノンなどのアセトフェノン類；ベンゾイン、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソプロピルエーテル、ベンゾインイソブチルエーテル、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−２−メチルプロパン−１−オン、１−（４−イソプロピルフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−オンなどのベンゾイン類；ベンゾフェノン、ベンゾイル安息香酸、ベンゾイル安息香酸メチル、メチル−ｏ−ベンゾイルベンゾエート、４−フェニルベンゾフェノン、ヒドロキシベンゾフェノン、ヒドロキシプロピルベンゾフェノン、アクリルベンゾフェノン、４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類；チオキサントン、２−クロロチオキサントン、２−メチルチオキサントン、ジエチルチオキサントン、ジメチルチオキサントンなどのチオキサントン類；ペルフルオロ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）、ペルフルオロベンゾイルペルオキシドなどのフッ素系ペルオキド類；その他、α−アシルオキシムエステル、ベンジル−（ｏ−エトキシカルボニル）−α−モノオキシム、アシルホスフィンオキサイド、グリオキシエステル、３−ケトクマリン、２−エチルアンスラキノン、カンファーキノン、テトラメチルチウラムスルフィド、アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルペルオキシド、ジアルキルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシピバレート等が挙げられる。
【０１０１】
さらに好ましく用いられる光ラジカル開始剤の具体例としては、例えば、イルガキュアー６５１（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー１８４（ＢＡＳＦ社製）、ダロキュアー１１７３（ＢＡＳＦ社製）、ベンゾフェノン、４−フェニルベンゾフェノン、イルガキュアー５００（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー２９５９（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー１２７（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー９０７（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー３６９（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー１３００（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー８１９（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー１８００（ＢＡＳＦ社製）、ダロキュアーＴＰＯ（ＢＡＳＦ社製）、ダロキュアー４２６５（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアーＯＸＥ０１（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアーＯＸＥ０２（ＢＡＳＦ社製））、エサキュアーＫＴ５５（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＩＰ１５０（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＩＰ１００Ｆ（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＴ３７（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＴＯ４６（ランベルティー社製）、エサキュアー１００１Ｍ（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＩＰ／ＥＭ（ランベルティー社製）、エサキュアーＤＰ２５０（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＢ１（ランベルティー社製）、２，４−ジエチルチオキサントンが挙げられる。これらの中で、さらに好ましく用いられる光ラジカル重合開始剤としては、イルガキュアー１８４（ＢＡＳＦ社製）、ダロキュアー１１７３（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー５００（ＢＡＳＦ社製）、イルガキュアー８１９（ＢＡＳＦ社製）、ダロキュアーＴＰＯ（ＢＡＳＦ社製）、エサキュアーＫＩＰ１００Ｆ（ランベルティー社製）、エサキュアーＫＴ３７（ランベルティー社製）およびエサキュアーＫＴＯ４６（ランベルティー社製）が挙げられる。また、これらの光ラジカル開始剤は、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【０１０２】
さらに、必要に応じて第３成分として他の公知の成分、例えば、老化防止剤、レベリング剤、濡れ性改良剤、界面活性剤、可塑剤等の改質剤、紫外線吸収剤、防腐剤、抗菌剤などの安定剤、光増感剤、シランカップリング剤等を加えてもよい。
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は硬化後の形態で、光硬化性化合物が３次元の網目構造を形成することができ表面硬度を硬く改質することができる。このため、医療器具等に実装した場合の傷付き性を改善でき、細胞培養や細胞の検査のための基材として用いる際に、利便性良く使用することができる。
【０１０３】
本発明の光硬化性組成物は、上述した本発明の一般式（１）で表されるフッ素含有環状オレフィンポリマーワニスと同様にろ過精製することができる。
次に、上記の一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤とを含む光硬化性組成物からなるワニスを用い、基材の凹凸構造を形成する方法は、上述したフッ素含有環状オレフィンポリマーワニスと同様な塗布工程を経た後に、ＵＶ照射硬化することによってモールドのパターンを転写することにより得ることができる。
【０１０４】
ＵＶ照射硬化のＵＶ照射工程は、滅菌を兼ねてもよいが、照射光としては、光硬化開始剤に光を照射することによってラジカル反応またはイオン反応を引起すエネルギーを与えることができれば特に限定されるものではない。この光源としては、波長４００ｎｍ以下の光線、例えば、低圧水銀灯、中圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、ケミカルランプ、ブラックライトランプ、マイクロウェーブ励起水銀灯およびメタルハライドランプ、ｉ線、Ｇ線、ＫｒＦエキシマレーザ光、ＡｒＦエキシマレーザ光を用いることができる。
【０１０５】
フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物からなる上記フィルムへの照射強度は、目的とする製品毎に制御されるものであって特に限定されるものではない。例えば、光硬化開始剤の活性化に有効な光波長領域（光硬化開始剤によって異なるが、例えば３００〜４２０ｎｍの光が用いられる）の光照射強度が０．１〜１００ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましい。照射強度を０．１ｍＷ／ｃｍ２以上とすることにより、反応時間が長くなり過ぎることを確実に抑制できる。一方で、照射強度を１００ｍＷ／ｃｍ２以下とすることにより、ランプから輻射される熱および組成物の重合時の発熱に起因して得られる硬化物の凝集力の低下や黄変あるいは支持体の劣化が生じることを、より確実に抑制することが可能となる。
【０１０６】
この光の照射時間は、目的とする製品毎に制御されるものであって特に限定されるものではないが、光波長領域での光照射強度と光照射時間の積として表される積算光量を、例えば３〜１０００ｍＪ／ｃｍ２に設定することができる。更に好ましくは５〜５００ｍＪ／ｃｍ２であり、特に好ましくは１０〜３００ｍＪ／ｃｍ２である。積算光量を上記下限値以上とすることにより、光重合開始剤からの活性種の発生を十分なものとし、得られる硬化物の特性の向上を図ることができる。一方で、積算光量を上記上限値以下とすることにより、生産性向上に寄与することができる。また、重合反応を促進するために加熱を併用することも場合によっては好ましい。また、光を照射して硬化性樹脂を硬化させる場合の温度は、通常０〜１５０℃が好ましく、０〜６０℃がより好ましい。
【０１０７】
フィルムやシート状の単層膜からなる基材を得る場合には、例えばモールドからフィルムを剥離させることにより基材を製造することができる。支持体からのフィルムの剥離は、例えば、フィルムの端部に市販のテープを貼り付け、これに応力を加えて剥離することにより行ってもよく、水や溶剤などの液体をフィルムと支持体の接触界面に接触させて支持体表面とフィルムの接触面の表面張力の差を利用してフィルムを剥離することにより行ってもよい。
【０１０８】
プラスチックや金属などの支持体の上に凹凸構造を形成したコート膜を形成した基材を得る場合には、例えば上記工程のうち塗布膜の乾燥工程までを実施して、支持体の上にフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物をコートする。次いで、モールドのパターン面とフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物のコート面を接触させ、必要に応じ圧着し、ＵＶ照射、剥離することによって支持体の上に本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物からなる凹凸構造を形成したコート膜を形成した基材を製造することができる。この場合、支持体は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、アクリル樹脂などの有機材料、もしくはガラス、シリコン、アルミなどの無機材料から選択されることがとくに好ましい。
【０１０９】
モールドのパターン面とフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物のコート面を接触させる際の圧力は、０．０１〜５ＭＰａ、好ましくは０．０５〜４ＭＰａ、より好ましくは０．１〜３ＭＰａの範囲で用いられ、圧着しながらＵＶ照射しても、ラミネーターなどの圧着装置を利用して圧着した後にＵＶ照射してもよい。これにより、パターンの形状、サイズに依存せず、モールドのパターンを高い精度で転写した基材を作製することができる。
【０１１０】
本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物をプラスチックまたは金属からなる支持体に製膜し、加熱して、必要に応じ圧着した後に、光を照射して硬化させて得られる硬化膜フィルムの膜厚は、特に制限はないが、好ましくは１μｍ〜１００００μｍであり、より好ましくは５μｍ〜５０００μｍであり、さらに好ましくは１０μｍ〜２０００μｍである。これらの範囲であると、自立した単層フィルムや、支持体上のコート膜を得ることができる。また、本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は、光硬化の際の体積収縮が小さく、精度良くパターンを転写しながら基材の変形を確実に抑制することもできる。また、例えば、培養バッグ、培養プレート、培養シャーレなどの細胞培養に用いられる医療器具を作製する観点から好適な範囲となる。さらに、フィルムの膜厚は、それら器具を作製するプロセスに合わせて適宜設定することができる。
【０１１１】
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー、またはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物から上記の方法で作製した凹凸構造を持つ基材において、モールドから剥離後の基材を加熱し溶融流動させることで、例えば、凸部の頂点から凹部底面に向かって傾斜構造をもつ形状に凹凸構造を変化させてもよい。これにより、播種した細胞を効果的に凹部底面に集合させた状態で細胞培養することができ、培養後の形状として細胞からの培養細胞が均一な厚みの細胞シート、スフェロイドまたはコロニー等の成長細胞の群体を作製することができる。
【０１１２】
（細胞培養方法）
本発明における細胞培養方法は、本発明における医療器具を構成する基材の凹凸構造を形成した一面に、接触または保持させるよう細胞を播種する工程と、上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、上記一面上にリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を添加して、上記一面から上記培養細胞を浮遊させる工程とを備える。これにより、培養細胞を損傷なく基材から離脱させることができ、かつ効率的な増殖で細胞培養することができる。
【０１１３】
本発明においては、細胞培養の形態として、医療器具内に細胞を播種した後、静置した状態で浮遊細胞を培養することができる。より具体的には、本発明の細胞培養としては、細胞として群体を形成させながら浮遊増殖させることができる。
これは、基材の細胞を接触または保持する一面が本発明における水接触角が７０°以上の疎水な表面性状を有するフッ素含有環状オレフィンポリマー、またはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成されていることにより実現される。また、培養環境を一定に保つために、播種した後にタッピングにより気泡を抜いてもよく、細胞の形態や増殖性を考慮して振動を与えて培養してもよく、培養液を流動させながら培養してもよく、撹拌しながら培養してもよく、特に制限はない。これらの中から、細胞の特性、装置の形態、生産性を考慮して好適に選ばれる。何れの形態であっても、本発明における医療器具で細胞を培養することにより、細胞を培養器具に付着、または密着を抑制しつつ、細胞シート、スフェロイド、コロニーなどの群体を形成させながら増殖させることができる。
【０１１４】
培養方法は、本発明における基材を各種培養方法に応じた容器に加工した医療器具を用いて行われる。例えば、静置培養、回転培養、マイクロキャリア培養、旋回培養、スフェロイド培養、ゲル内培養、三次元担体培養、加圧循環培養などの方法で細胞培養を実施することができる。これらのうち、細胞の特性、培養形態、または生産性を考慮して好適に選ばれ、単独で用いても２種類以上を併用してもよい。
【０１１５】
これらの各種培養方法における温度は、３５〜４０℃であることが好ましく、３６〜３８℃であることがより好ましく、３６．５〜３７．５℃であることがとくに好ましい。また、圧力は、０．０２〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５〜０．３ＭＰａであることがより好ましく、０．０８〜０．２ＭＰａであることがとくに好ましい。さらに、水素イオン指数（ｐＨ）は、８〜６であることが好ましく、７．５〜６．５であることがより好ましい。
【０１１６】
本発明における医療器具を培養器具として用いる際の滅菌方法としては、例えば、アルコールなどに浸漬する湿式滅菌、エチレンオキシドによるガス滅菌、紫外線滅菌、放射線滅菌、高温、高圧の水蒸気によるオートクレーブ滅菌、直接蒸気に触れてはいけないものに用いる乾熱滅菌、熱に不安定な成分を含む基材に適したろ過滅菌などを挙げることができる。これらの中から、本発明の効果を損なわない範囲でプロセス適合性を考慮して、好適に選ばれ、２種類以上の滅菌方法を組み合わせて用いてもよい。
【０１１７】
また、培養に用いる培地の種類としては、液状、ゲル状、固形（粉末）などの形態に依らず、細胞の特性、培養形態に応じて選択できる。この例として、例えば、ＢＭＥ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、１９９培地、ＲＰＭＩ培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ１０４、１０７、１３１、１５１、１７０、２０２培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＭＣＤＢ１５３培地などが挙げられる。これらは、単独で用いても２種類以上を混合して用いてもよく、さらにはヒト、イヌ、ラット、マウス、トリ、ブタ、ウシなどの生物由来の血清と混合して用いてもよい。
【０１１８】
また、細胞培養の目的に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、例えば、ラミニン−５、ラミニン−５１１、ラミニン−５２１などのコラーゲン、本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー、またはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物などを、本発明の上記基材の内壁や、細胞を接触または保持する一面の一部、もしくは全面に塗工して用いてもよい。これらは単独、あるいは２種類以上を混合して用いてもよい。また、本発明において、細胞の種類、培養細胞の応用に応じて、細胞の培養液や緩衝液を選択することができ、蛍光色素や細胞の固定化試薬も自由に選択して用いてもよい。
【０１１９】
さらに、培養、もしくは培養した細胞を浮遊させて基材から離脱させる際に用いるリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液は、細胞が増殖する過程において、系内の水素イオン指数(ｐＨ)を変化させないものであればよく、通常は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液、濃縮ＳＳＣ緩衝液、濃縮ＳＳＰＥ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸緩衝液、ＣＡＢＳ緩衝液、ピペリジン緩衝液、グリシン緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ギ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液、ピペラジン緩衝液、ピリジン緩衝液、カコジル酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、エタノールアミン緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、炭酸緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、ビス−トリスプロパン緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＭＯＢＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＴＥＡ緩衝液、ピロリン酸緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、トリシン緩衝液、ヒドラジン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ビシン緩衝液、ＨＥＰＢＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＡＭＰＤ緩衝液、ＴＡＢＳ緩衝液、ＡＭＰＳＯ緩衝液、タウリン緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、水酸化アンモニウム緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、メチルアミン緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液などを単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、ＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼ、またはＮＡＤＨデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよく、好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液、濃縮ＳＳＣ緩衝液、濃縮ＳＳＰＥ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸緩衝液などを単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、ＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼまたはＮＡＤＨデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよい。
さらに好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液、濃縮ＳＳＣ緩衝液、濃縮ＳＳＰＥ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液などを単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、ＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼまたはＮＡＤＨデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよい。
【０１２０】
本発明の医療器具を用いて、例えばヒト細胞を含む動物の細胞を培養し、細胞を分離し採取する過程において、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を添加すると、細胞が自然に浮遊した状態で基材から容易に離脱する方法を発明した。
【０１２１】
本発明によれば、細胞の浮遊離脱は、例えば、培養した細胞と基材の界面状態を観察することで、浮遊、または接着の現象を理解できる。通常のスフェロイド培養に利用される基材の表面に見られる細胞の足場となる微細な凹凸構造を設けた本発明の一般式（１）からなる基材の上で、細胞を7日間培養し、培養細胞と基材との界面を走査型電子顕微鏡で観察すると、足場形成に必要な十分に小さな径の凹凸構造を設けた基材の上で増殖した細胞であっても、その界面に細胞から伸びた足は観察されず、また、本培養容器で培養した細胞に、例えば、リン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液を添加すると細胞は浮遊しながら基材から離脱させることができる。
【０１２２】
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー、またはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物からなる医療器具を用いて細胞培養することにより、細胞は浮遊して細胞シート、スフェロイド、コロニーなどの群体を形成しながら効率よく増殖し、増殖した成長細胞は浮遊させて細胞を損傷させること無く基材から離脱できるという優れた細胞培養方法を実現することができるようになった。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例において、本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。なお、実施例におけるポリマー分析値測定方法、基材（フィルム）の作製条件および分析方法、細胞の取り扱い方法、培養器具の滅菌方法および培養評価方法は以下に記載された通りである。【０１２４】
［重量平均分子量（Ｍｗ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）］
下記の条件下でゲルパーミュエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）または、トリフルオロトルエン（ＴＦＴ）に溶解したポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）を、ポリスチレンスタンダードによって分子量を較正して測定した。
検出器：日本分光社製ＲＩ−２０３１および８７５−ＵＶまたはＶｉｓｃｏｔｅｃ社製Ｍｏｄｅｌ２７０、直列連結カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０６Ｍ、８０４、８０３、８０２．５、カラム温度：４０℃、流量：１.０ｍｌ／分、試料濃度：３.０〜９.０  ｍｇ／ｍｌ【０１２５】
［ガラス転移温度］
島津製作所社製ＤＳＣ−５０を用い、測定試料を窒素雰囲下で１０℃／分の昇温速度で加熱し測定した。【０１２６】
［水接触角測定］
協和界面科学社製固体表面エナジー解析装置ＣＡ−ＸＥ型を使用してＪＩＳ  Ｒ３２５７（基板ガラス表面のぬれ性試験方法）に準拠し、２μｌの水滴を基材表面に滴下し、静滴法により、基材表面に水滴が接触してから１分以内に接触角を測定した。【０１２７】
［ＵＶ硬化］
塗布膜の硬化には光源として、ＳＣＩＶＡＸ社製ＵＶインプリント装置（Ｘ−１００Ｕ）を用いて、培養フィルムとモールドを無圧着もしくは圧着した状態で、波長３６５ｎｍのＬＥＤ光を照射して硬化した。【０１２８】
［培養フィルムの凸凸間の幅（Ｌ１）計測］
日本分光社製  走査型電子顕微鏡 ＪＳＭ−６７０１Ｆ（以下、ＳＥＭとも表記する。）を使用し、ＳＥＭの写真から任意の９点の凸凸間の幅を計測し平均値により算出した。【０１２９】
［細胞種および培養液について］
マウス胚繊維芽細胞（以下、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞と略す）を用い、１０％仔ウシ血清（Ｃａｌｆ  Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＣＢＳ）と、高グルコースと、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｌ-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有）と、を含む溶液（以下、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液と記載する。）中で、すべての継代培養および細胞増殖性試験を行った。また、ヒト皮膚繊維芽細胞（以下、Ｈｓ−６８細胞と略す）のすべての継代培養および細胞増殖性試験についても同様に行った。【０１３０】
［細胞の解凍］
凍結したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、またはＨｓ−６８細胞の細胞懸濁液を３７℃ウォーターバスに浸けて解凍し、解凍した細胞懸濁液に氷上冷却した１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地を添加して遠心分離した。遠心後、上澄み液を除去して細胞塊をタッピングによりほぐした後、３７℃ウォーターバスで保温した１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地を添加した。血球計算盤で細胞数を計数し、ウォーターバスで保温した１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて細胞懸濁液を調製し培養フラスコに細胞を播種した後、加湿インキュベーターで培養した。【０１３１】
［細胞の継代］
加湿インキュベーターから培養フラスコを取り出して培地をアスピレーターで除去し、３７℃ウォーターバス中で保温したダルベッコＰＢＳ（−）を加え、上澄みをアスピレーターで除去した。再度、同様な操作行った後、３７℃ウォーターバス中で保温した０．０２５ｗ／ｖ％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えて加湿インキュベーター内で静置した後、１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて剥がれた細胞を回収して遠沈管に移し遠心分離して上澄み液を除去し、タッピングにより細胞塊をほぐした後、１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地を加えた。血球計算盤で細胞数を計数した後、１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地で細胞懸濁液を調製し、培養フラスコに細胞を播種して、加湿インキュベーターで培養した。【０１３２】
［細胞培養器具の滅菌方法］
直径１５ｍｍに切り出した円形の培養フィルムをＴＣＰＳマルチウェルプレート（コーニング社製）穴部に置き、７０％エタノール水溶液を加えて４０分〜1時間浸漬した後、７０％エタノール水溶液を除去してダルベッコＰＢＳ（−）に１５分〜４０分間浸漬した。次に、ＰＢＳ（−）を除去して、培養器具をひっくり返し、同様な操作を行い、培養器具の表裏面を滅菌処理した。滅菌処理終了後、クリーンベンチ内で一晩乾燥させた。【０１３３】
［細胞懸濁液の調製と細胞径の計測］
２５ｃｍ２培養フラスコで約６０％コンフルエント状態になったＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を、上記、細胞の継代操作と同様な方法で０．０２５ｗ／ｖ％トリプシン−ＥＤＴＡで処理して剥がした。血球計算盤で細胞数を計数して、１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地で７３００〜７６００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、またはＨｓ−６８細胞の細胞懸濁液を調製した。また、実施例１０ではＨｓ−６８細胞を１５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した細胞懸濁液を使用した。
顕微鏡観察によるひとつあたりの細胞の平均計測から、細胞の最大径（Ｌ２）は２５μｍであった。または、同様な方法で調整したＨｓ−６８細胞の顕微鏡観察によるひとつあたりの細胞の平均計測から、細胞の最大径（Ｌ２）は２０μｍであった。【０１３４】
［凹部底面に沈降した細胞の数の確認］
ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、またはＨｓ−６８細胞を凹凸構造の細胞を培養する面に播種し、加湿インキュベーターに入れた直後から４時間後のサンプルを加湿インキュベーターから取り出し、顕微鏡観察して、基材一面の任意の凹部３０ヵ所に沈降している細胞の数をカウントし、ひとつあたりの凹部底面に沈降した細胞の数を平均値（＝細胞数／３０）として示した。【０１３５】
［細胞増殖性の評価］
培養開始後１、３、７、および１４日経過後の培養容器を加湿インキュベーターから取り出して培地を除去し、１０％ＷＳＴ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８）／１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地の混合溶液を添加して、加湿インキュベーターで３時間インキュベートした。その後、培地２００μｌを９６ウェルプレートに移し、プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ｍａｘ  ＰＬＵＳ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。各培養容器の細胞増殖性は、吸光度の経時変化により確認した。【０１３６】
［有意差検定］
各種培養容器について、細胞を播種したサンプルを９検体準備して培養し、吸光度の測定結果をＰｒｉｓｍ  ６  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ６．０１（エムデーエフ社製）により数値解析して、結果の平均値を吸光度として算出し、標準偏差に±の符号を付しバラツキの範囲とした。【０１３７】
［蛍光顕微鏡観察］
所定期間細胞を培養した容器から培地を除去して、４％グルタルアルデヒド／リン酸緩衝液を添加し１時間静置した後、４％グルタルアルデヒド／リン酸緩衝液を除去した。その後、滅菌水で洗浄し、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ライフサイエンス製）を使用し細胞核、および細胞骨格タンパクを染色して蛍光顕微鏡観察に用いる試料を調製した。蛍光顕微鏡観察は、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス製）を使用した。【０１３８】
［製造例１］ポリマー１
５，５，６−トリフルオロ−６−（トリフルオロメチル）ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン（１００ｇ）と１−ヘキセン（０．２６８ｇ）のテトラヒドロフラン溶液に、Ｍｏ（Ｎ−２，６−Ｐｒｉ２Ｃ６Ｈ３）（ＣＨＣＭｅ２Ｐｈ）（ＯＢｕt）２（５０ｍｇ）のテトラヒドロフラン溶液を添加し、７０℃で開環メタセシス重合を行った。得られたポリマーのオレフィン部を、パラジウムアルミナ（５ｇ）存在下１６０℃で水素添加反応を行い、ポリ（１，１，２−トリフルオロ−２−トリフルオロメチル−３，５−シクロペンチレンエチレン）のテトラヒドロフラン溶液を得た。その溶液を孔径５μｍのフィルターで加圧ろ過しパラジウムアルミナを除去した溶液をメタノールに加え、白色のポリマーをろ別、乾燥し９９ｇのポリマー１を得た。得られたポリマー１は、上記一般式（１）により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は１００％、重量平均分子量（Ｍｗ）は８３０００、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１.７３、ガラス転移温度は１０９℃であった。【０１３９】
［製造例２］培養フィルム１
製造例１で合成したポリマー１をメチルイソブチルケトンに３０質量％濃度で溶解し、その溶液を孔径１μｍのフィルターで加圧ろ過し、次いで０．１μｍのフィルターでろ過してポリマー１のメチルイソブチルケトン溶液を調製した。次いで、凸部の幅１００μｍ、パターンピッチ１３０μｍ、パターン深さ４０μｍの格子形状を有する石英モールドにポリマー１のメチルイソブチルケトン溶液を塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、１４０℃で６０分乾燥して剥離することで、厚み８０μｍの格子形状の培養フィルム１を作製した。
培養フィルム１の凸凸間の幅（Ｌ１）は１００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は４であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２６．０°であった。【０１４０】
［製造例３］培養フィルム２
製造例２で使用したポリマー１のメチルイソブチルケトン溶液を、凸部の幅５００μｍ、パターンピッチ５７０μｍ、パターン深さ７０μｍの格子形状を有するニッケルモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、１４０℃で６０分乾燥して剥離することで、厚み１１０μｍの格子形状の培養フィルム２を作製した。
培養フィルム２の凸凸間の幅（Ｌ１）は５００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は２０であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１３４．１°であった。【０１４１】
［製造例４］培養フィルム３
製造例１で合成したフッ素含有環状オレフィンポリマー１（Ａ）を３０質量％濃度で溶解したメチルイソブチルケトン溶液１００ｇに、光硬化性化合物（Ｂ）として３−エチル−３{[(３−エチルオキセタン−３−イル)メトキシ]メチル}オキセタンと１，７−オクタジエンジエポキシドの質量比９／１の混合物を２０ｇ、および光硬化開始剤としてアデカオプトマーＳＰ−１７２（ＡＤＥＫＡ社製）を０．８ｇ加えた溶液を調製し、孔径１μｍのフィルターで加圧ろ過し、次いで０．１μｍのフィルターでろ過して光硬化性組成物１を調製した（成分（Ａ）と成分（Ｂ）の比：［（Ａ）／（Ｂ）＝６０／４０］）。次いで、凸部の幅３００μｍ、パターンピッチ３５０μｍ、パターン深さ５０μｍの格子形状を有する石英モールドに、光硬化性組成物１をアプリケーターを用いて均一にコートした後、１４０℃で３０分乾燥し、コート面の背面から波長３６５ｎｍのＵＶ光を２００ｍＪ／ｃｍ２の積算光量で照射し、その後モールドから剥離することで、厚み９０μｍの格子形状の培養フィルム３を作製した。
培養フィルム３の凸凸間の幅（Ｌ１）は３００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は１２であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２８．１°であった。【０１４２】
［製造例５］培養フィルム４
製造例１で合成したフッ素含有環状オレフィンポリマー１（Ａ）を３０質量％濃度で溶解したシクロヘキサノン溶液１００ｇに、光硬化性化合物（Ｂ）として３−エチル−３{[(３−エチルオキセタン−３−イル)メトキシ]メチル}オキセタンと１，７−オクタジエンジエポキシドの質量比９／１の混合物を３ｇ、および光硬化開始剤としてＣＰＩ−１００Ｐ（サンアプロ社製）を０．１ｇ加えた溶液を調製し、孔径１μｍのフィルターで加圧ろ過し、次いで０．１μｍのフィルターでろ過して光硬化性組成物２を調製した（成分（Ａ）と成分（Ｂ）の比：［（Ａ）／（Ｂ）＝９０／１０］）。次いで、製造例３で使用したニッケルモールドに光硬化性組成物２をアプリケーターを用いて均一にコートした後、１４０℃で５０分乾燥し、コート面の背面から波長３６５ｎｍのＵＶ光を２００ｍＪ／ｃｍ２の積算光量で照射し、その後モールドから剥離することで、厚み１０５μｍの格子形状の培養フィルム４を作製した。
培養フィルム４の凸凸間の幅（Ｌ１）は５００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は２０であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２９．４°であった。【０１４３】
［実施例１］
製造例２で作製した培養フィルム１を滅菌し、パターン面を上方に２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートの穴部底面に置き、滅菌グリース（東レ・ダウコーニング社製）でＳＵＳ製Ｏ−リング（内径１１ｍｍ）と密着させて固定した後、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を培養フィルム１のパターン面に播種した。同操作を９回実施して、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をして加湿インキュベーターに移動し、庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム１の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に１．３個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．３１±０．０２であり、３日経過後で０．９５±０．０５であり、７日経過後で２．３７±０．０８であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した（図１参照）。【０１４４】
［実施例２］
製造例３で作製した培養フィルム２を滅菌し、実施例１と同様な方法で２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を培養フィルム２のパターン面に播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム２の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に２６個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２４±０．０２であり、３日経過後で０．７３±０．０５であり、７日経過後で１．８９±０．０９であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１４５】
［実施例３］
製造例４で作製した培養フィルム３を滅菌し、実施例１と同様な方法で２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を培養フィルム３のパターン面に播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム３の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に９．７個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２８±０．０１であり、３日経過後で０．８９±０．０２であり、７日経過後で２．２６±０．０７であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１４６】
［実施例４］
製造例５で作製した培養フィルム４を滅菌し、実施例１と同様な方法で２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を培養フィルム４のパターン面に播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム４の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に２６個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２４±０．０３であり、３日経過後で０．７０±０．０４であり、７日経過後で１．７５±０．０６であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１４７】
［実施例５］
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を５，６−ジフルオロ−５−ペンタフルオロエチル−６−トリフルオロメチルビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エンに変更したこと以外は、製造例１と同様な方法により９７ｇのポリマー２を得た。得られたポリマー２は、一般式（１）により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は１００％、重量平均分子量（Ｍｗ）は９１０００、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１.９３、ガラス転移温度は１０４℃であった。
次に、製造例２と同様な方法により厚み８５μｍの格子形状の培養フィルム５を作製した。培養フィルム５の凸凸間の幅（Ｌ１）は１００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は４であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２８．１°であった。
培養フィルム５による実施例１と同様な方法で実施したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養では、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム５の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．３個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．３０±０．０３であり、３日経過後で０．９９±０．０３であり、７日経過後で２．２８±０．１１であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１４８】
［実施例６］
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を５，６−ジフルオロ−５−へプタフルオロ−ｉｓｏ−プロピル−６−トリフルオロメチルビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エンに変更したこと以外は、製造例１と同様な方法により９８ｇのポリマー３を得た。得られたポリマー３は、一般式（１）により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は１００％、重量平均分子量（Ｍｗ）は１４２０００、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１.４０、ガラス転移温度は１３７℃であった。
次に、モールドを製造例３で使用した格子形状のニッケルモールドに変更したこと以外は、製造例２と同様な方法により厚み１０３μｍの格子形状の培養フィルム６を作製した。培養フィルム６の凸凸間の幅（Ｌ１）は５００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は２０であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１３６．３°であった。
培養フィルム６による実施例１と同様な方法で実施したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養では、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム６の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に２６個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２１±０．０３であり、３日経過後で０．６８±０．０３であり、７日経過後で１．５６±０．１５であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１４９】
［実施例７］
製造例４で調製した光硬化性組成物１［（Ａ）／（Ｂ）＝６０／４０］をＰＥＴフィルムにスピンコートして、１００℃で１分間加熱した後に、製造例２で使用した格子形状の石英モールドのパターン面と光硬化性組成物１のコート面が接触するようにＰＥＴフィルムを被せ、０．３ＭＰａの圧力で圧着しながら波長３６５ｎｍのＵＶ光を２００ｍＪ／ｃｍ２の積算光量で照射した。次いで、石英モールドからＰＥＴフィルムを剥離して、ＰＥＴフィルムの表面に格子形状を形成した培養フィルム７を作製した。培養フィルム７の凸凸間の幅（Ｌ１）は１００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は４であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２７．３°であった。
培養フィルム７による実施例１と同様な方法で実施したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養では、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム７の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．３個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が０．２７±０．０１であり、３日経過後で０．８５±０．０２であり、７日経過後で２．１４±０．０９であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。【０１５０】
［実施例８］
細胞種をＨｓ−６８細胞に変更した以外は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞と同様な方法により細胞の解凍、継代、懸濁液を調製し、１０％仔ウシ血清Ｄ−ＭＥＭ培地で７５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
培養フィルムの作製は、モールドを製造例４で使用した石英モールド（凸部の幅３００μｍ、パターンピッチ３５０μｍ、パターン深さ５０μｍ）に変更した以外は、製造例２と同様な方法で培養フィルム９を作製した。培養フィルム９の凸凸間の幅（Ｌ１）は３００μｍであり、Ｈｓ−６８細胞の最大径（Ｌ２＝２０μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は１５であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２４．２°であった。
次いで、滅菌済みの培養フィルム９を用いて実施例１と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム９の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に９．７個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２７±０．０５であり、３日経過後で０．８２±０．０９であり、７日経過後で１．６９±０．１１であり、１４日経過後で３．２１±０．１３であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、１４日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、１４日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニー状に群体を形成した状態（図２参照）で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に１００％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５１】
［実施例９］
滅菌済みの培養フィルム１（Ｌ１／Ｌ２＝５）を用いて実施例８と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム１の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．３個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２８±０．０４であり、３日経過後で１．８３±０．０５であり、７日経過後で１．７９±０．１０であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に９９．８％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５２】
［実施例１０］
滅菌済みの培養フィルム９（Ｌ１／Ｌ２＝１５）を用いて、細胞数を１５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに変更した以外は実施例８と同様な方法で調整した解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム９の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．９個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．０６±０．０１であり、３日経過後で０．１７±０．０９であり、７日経過後で０．３６±０．１２であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニーを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に１００％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５３】
［実施例１１］
滅菌済みの培養フィルム３（Ｌ１／Ｌ２＝１５）を用いて実施例８と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム３の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に９．６個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２１±０．０４であり、３日経過後で０．７４±０．０９であり、７日経過後で１．６０±０．１１であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に９９．９％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５４】
［実施例１２］
実施例６で作製した滅菌済みの培養フィルム６（Ｌ１／Ｌ２＝２５）を用いて実施例８と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム６の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に２６個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２３±０．０５であり、３日経過後で０．６５±０．０８であり、７日経過後で１．５５±０．１１であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイド状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に１００％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５５】
［実施例１３］
製造例２で使用したポリマー１のメチルイソブチルケトン溶液から溶液キャスト法にて、厚み１２０μｍのポリマー１のフィルムを作製した。次いで、加熱板の上でポリマー１のフィルムと製造例４で使用した石英モールド（凸部の幅３００μｍ、パターンピッチ３５０μｍ、パターン深さ５０μｍ）のパターン面を接触させ、加熱板に置き１５０℃に加熱して、１０ＭＰａで熱圧着しそのまま５秒間保持した。７０℃に冷却後、モールドを離脱して培養フィルム１０を作製した。培養フィルム１０の凸凸間の幅（Ｌ１）は３００μｍであり、Ｈｓ−６８細胞の最大径（Ｌ２＝２０μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は１５であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１２４．９°であった。
次いで、滅菌済みの培養フィルム１０を用いて実施例１と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム１０の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に９．８個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２６±０．０４であり、３日経過後で０．８７±０．０３であり、７日経過後で１．７０±０．１０であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニーを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に１００％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５６】
［実施例１４］
６穴ＴＣＰＳマルチウェルプレート（コーニング製）の凹部底面を切り抜き、製造例２で作製した凸凸間の幅（Ｌ１）が１００μｍでありヒト胚繊維芽細胞の最大径（Ｌ２＝２０μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）が５であるフィルム１を６穴全ての凹部底面に容器の裏面から貼り付け細胞培養容器を作製し、エタノールにより滅菌処理した。
次いで、細胞液の量を１０ｍＬに変更したこと以外は、実施例８と同様な方法により、解凍済みのＨｓ−６８細胞液を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム１の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．３個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２９±０．０１であり、３日経過後で０．８３±０．０１であり、７日経過後で１．７９±０．０５であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ１００％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察しても、殆ど蛍光が観察されないことから、同様に１００％の培養細胞が生細胞であることを確認した。【０１５７】
［参考例１］
製造例２で使用したポリマー１のメチルイソブチルケトン溶液を、直径１５０ｎｍ、ピッチ２５０ｎｍのピラー形状を有するニッケルモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、１４０℃で６０分乾燥して剥離することで、厚み５０μｍのホール形状の培養フィルム１１を作製した。培養フィルム１１の水接触角（１５秒経過時）は１２４．３°であった。
次いで、滅菌済み培養フィルム１１を用いて、実施例１と同様な方法で２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を培養フィルム１１のパターン面に播種した。同操作を９回繰り返し、検体数で９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．１０±０．０２であり、３日経過後で０．３４±０．０３であり、７日経過後で０．７０±０．０９であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、７日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
さらに、7日間培養したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養液を除去して、脱水処理、乾燥してＳＥＭ観察用の試料を調整し、細胞と培養フィルム１１の界面の状態を観察すると、培養フィルム１１のパターン面の最大径１５０ｎｍのホール（凹部）に絡みつくように細胞から伸びた糸状の足場形成は見られなかった。【０１５８】
［比較例１］
γ線滅菌済み２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレート（コーニング製、水接触角は１５秒後で４６．１°）の穴部底面に解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察しマルチウェルプレートの底部を観察すると、まばらに点在したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞が観察され、中には凝集塊の状態で沈降したものもあり全体的に培養面に対して不均一な状態で沈降していた。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．２７±０．０３であり、３日経過後で１．０８±０．１１であり、７日経過後で１．５１±０．２３であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。【０１５９】
［比較例２］
エタノール滅菌済みアペルＴＭフィルム（三井化学社製）を使用して、実施例１と同様な方法でＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養を開始した。４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察すると、まばらに点在したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞が観察され、中には凝集塊の状態で沈降したものもあり全体的に培養面に対して不均一な状態で沈降していた。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．１１±０．０１であり、３日経過後で１．２２±０．１０であり、７日経過後で１．７１±０．１９であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。【０１６０】
［比較例３］
製造例１に記載のモノマーを５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エンに、溶剤をシクロヘキサンに変更した以外は製造例１と同様な方法により４９ｇのポリマー４を得た。また、水素添加率は１００％、重量平均分子量（Ｍｗ）は１２９０００、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は２.２６、ガラス転移温度は６７℃であった。
次に、ポリマー４を３０質量％で溶解したシクロヘキサノン溶液をガラス基板に塗工して、１５０℃で３時間乾燥し厚み７５μｍのフィルムを作製した。その後、製造例２で使用した格子形状の石英モールドを用いて加熱溶融圧着ナノインプリント法により、厚み７３μｍの格子形状の培養フィルム８を作製した。培養フィルム８の凸凸間の幅（Ｌ１）は１００μｍであり、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の最大径（Ｌ２＝２５μｍ）との比（Ｌ１／Ｌ２）は４であった。また、水接触角（１５秒経過時）は１０１．２°であった。
培養フィルム８による実施例１と同様な方法で実施したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養では、４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム４の凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に１．４個の細胞が存在することが確認された。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が０．０７±０．０１であり、３日経過後で０．１５±０．０２であり、７日経過後で０．１８±０．１１であった。経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、７日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。【０１６１】
［比較例４］
細胞懸濁液をＨｓ−６８細胞液（１０ｍＬ）に変更したこと以外は、比較例１と同様にインキュベーターの庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、１日経過後の吸光度が０．３３±０．０６であり、３日経過後で１．４９±０．１１であり、７日経過後で３．１０±０．１３であった。経過日数に対して吸光度は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、シート状に細胞は増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった（図３参照）。
さらに、７日間培養した細胞を蛍光発光試薬で染色して細胞核、および細胞骨格タンパクの形態を蛍光顕微鏡観察すると、青色蛍光発光した細胞核、および緑色蛍光発光した細胞骨格タンパクは、二次元的に広がったシート形状の蛍光発光分布で観察され細胞が厚み方向に重なった細胞シートの群体形成は確認できなかった。
この培養細胞のＮＡＤＰＨデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ０％が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光観察は、γ線滅菌済み２４穴ＴＣＰＳマルチウェルプレートの蛍光吸収で測定することができなかった。【０１６２】
［比較例５］
パターンピッチ４μｍの六方最密充填配列を付形した滅菌済み２４穴ナノカルチャープレート（ＳＣＩＶＡＸ社製、水接触角（１５秒経過時）は１２５°、Ｌ１／Ｌ２＝０．１６）の穴部底面のパターン面に解凍済みのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞液（１ｍＬ）を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。
４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面を観察するとひとつの凹部にも沈降したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞は入っていなかった。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．０７±０．０３であり、３日経過後で０．０９±０．０２であり、７日経過後で０．１０±０．０９であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対してスフェロイドの群体を形成して増殖しサイズ、形状は不揃いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
さらに、7日間培養したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の培養液を除去して、脱水処理、乾燥してＳＥＭ観察用の試料を調整し、細胞とナノカルチャープレート界面の状態を観察すると、ナノカルチャープレートのパターン面の凹部に絡みつくように細胞の足場が形成されている様子が観察された。【０１６３】
［比較例６］
口径５００μｍのホール形状を付形した滅菌済み６穴スフェロイド形成培養用容器（ＩＷＡＫＩ社製、Ｌ１／Ｌ２＝２５）の穴部底面のパターン面に実施例８と同様にＨｓ−６８細胞の細胞懸濁液を播種した。同操作を９回繰り返し、検体数９個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度３７℃、炭酸ガス濃度５％の滅菌空気下で培養を開始した。
４時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し、凹凸構造の任意の３０ヵ所の凹部底面に沈降したＨｓ−６８細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に２５個の細胞が存在することを確認した。
ＷＳＴ−８法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が０．０８±０．０１であり、３日経過後で０．１１±０．０４であり、７日経過後で０．１５±０．０６であった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対してスフェロイドの群体を形成して増殖したがサイズ、形状は不揃いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。【０１６４】
この出願は、２０１５年３月３１日に出願された日本出願特願２０１５−０７０８６８号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。【０１６５】
本発明は、以下の態様を含む。
＜１＞
基材を備える医療器具であって、
上記基材は細胞を接触させる一面を有するものであり、
上記基材の上記細胞と接触する上記一面が、下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成された凹凸構造を備え、
当該凹凸構造から構成される凸凸間の幅（Ｌ１）と、ひとつあたりの上記細胞の直径（Ｌ２）の比（Ｌ１／Ｌ２）が１〜１００であり、上記細胞が凹凸構造を備えた上記一面に接着しないことを特徴とする医療器具。
【化７】
2016158039.tif 000009
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
＜２＞
上記細胞を接触させる上記一面が備える凹凸構造の凸凸間の幅が１０μｍ〜１０００μｍである＜１＞に記載の医療器具。
＜３＞
上記細胞を接触させる上記一面の水接触角が７０°〜１６０°である＜１＞または＜２＞に記載の医療器具。
＜４＞
上記基材の備える上記一面は、上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される＜１＞ないし＜３＞のいずれか一つに記載の医療器具。
＜５＞
上記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと上記光硬化性化合物の質量比（フッ素含有環状オレフィンポリマー／光硬化性化合物）が、９９．９／０．１〜５０／５０である＜４＞に記載の医療器具。
＜６＞
上記一面に接触させた上記細胞を培養するために用いられる＜１＞ないし＜５＞のいずれか一つに記載の医療器具。
＜７＞
細胞培養において、上記細胞が群体を形成しながら浮遊増殖する＜６＞に記載の医療器具。
＜８＞
培養した上記細胞をリン酸緩衝生理食塩水により浮遊して上記一面から離脱させる＜６＞または＜７＞に記載の医療器具。
＜９＞
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の、上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
【化８】
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（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
＜１０＞
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の、上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式（１）で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
【化９】
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（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４のうち、少なくとも１つは、フッ素、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルキル基、フッ素を含有する炭素数１〜１０のアルコキシ基、またはフッ素を含有する炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基である。Ｒ１〜Ｒ４がフッ素を含有しない基である場合、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、または炭素数２〜１０のアルコキシアルキル基から選ばれる。Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ１〜Ｒ４は互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
＜１１＞
＜１＞ないし＜８＞のいずれか一つに記載の医療器具の上記一面上に、上記一面に接触させるように上記細胞を播種する工程と、
上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
上記一面上にリン酸緩衝生理食塩水を添加して、上記一面から上記培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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