(57)【要約】【課題】  ジペプチジルペプチダーゼＩＶペプチダーゼに対する新規な蛍光プローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法及び検出キットを提供する。【解決手段】  以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用蛍光プローブ：【化１】2016006678.tif 000014（式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立に同一又は異なるアミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結し、ＢはＡとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す）。
2016006678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用蛍光プローブ：
【化１】
2016006678.tif 000012
（式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立に同一又は異なるアミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結し、ＢはＡとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す）。
【請求項２】
Ａが、プロリン又はアラニンから選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
Ｂが、グリシン、グルタミン酸、リシン、チロシン、ロイシン、又はプロリンから選択されるアミノ酸残基である、請求項２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ａがプロリン残基であり、Ｂがグリシン残基である、請求項３に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が水素原子であり、Ｘがメチレン基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
以下の群から選択される化合物又はその塩を含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用蛍光プローブ：
2016006678.tif 000013
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを生体外において試料と接触させる工程、及び、当該試料中に含まれるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）と前記蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの検出方法。
【請求項８】
蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを更なる特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを用いて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が発現している標的細胞を検出する方法。
【請求項１０】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌細胞が、食道癌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用キット。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを含む薬液を測定対象の試料と接触させるための装置であって、前記蛍光プローブを含む薬液を収容する薬液収容部と、前記薬液を前記試料に噴霧可能に構成された薬液噴霧部を備える、該装置。
【請求項１４】
前記試料中に含まれるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）と前記蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段をさらに備える、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記装置が内視鏡である、請求項１３又は１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ検出用の蛍光プローブに関する。より詳細には、癌細胞において発現するジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出するための蛍光プローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法、及び当該プローブを含む検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は、世界中で多くの患者が罹患しており、特に、男性の罹患率は年々増加の一途を辿っている。一般に、食道癌の予後は、胃癌・大腸癌を含む消化管系の癌の中では極めて不良であることが知られている。食道癌の治療は、病期によって、内視鏡治療、手術、放射線治療 、化学療法の中から、単独あるいは複数の治療法を組み合わせて行われるが、このうち最も一般的な治療法である手術は、侵襲が大きく、呼吸器合併症、反回神経麻痺、縫合不全などの合併症のリスクも高い。近年、手術成績は改善してきているが、それでも他の消化管系の癌と比較すると再発率及び死亡率が高いといわれている。【０００３】
食道癌の早期発見は、侵襲の大きな手術を回避し、比較的侵襲の小さい内視鏡治療や化学放射線治療での根治的治療を可能とするだけでなく、その後の長期予後の改善も期待できる。また、内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）施行時や手術時に癌組織を検出することができれば、切除断端の評価も可能とり、遺残のない治療を行うことができるようになる。このような背景から、食道癌を迅速かつ的確に検出する手法の開発が強く望まれている。【０００４】
しかしながら、通常の内視鏡観察だけでは早期の食道癌を発見することは難しいため、従来はヨード剤が併用されてきたが、胸やけや気分不快といった刺激症状が強く、またヨードアレルギーのある患者には使用できないなどの点が問題となっていた。【０００５】
一方、タンパク質やポリペプチドのＮ−末端からジペプチドを特異的に除去する酵素であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、多くの疾患状態と関連していることが知られていたが、近年、かかるジペプチジルペプチダーゼＩＶが、食道癌組織において、正常細胞と比較して高レベルで発現していることが明らかとなった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｏｓｃｉｎｓｋｉら、ＡＰＭＩＳ、１１６、８２３−３１、２００８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明では、迅速かつ高感度な食道癌の検出手段の開発を目的として、食道癌組織中において高レベルで発現しているジペプチジルペプチダーゼＩＶに着目し、かかるペプチダーゼに対する新規な蛍光プローブを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ジペプチド部位を有するキサンテン骨格の化合物を蛍光プローブとして用いることにより、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを特異的にかつｏｎ／ｏｆｆ蛍光応答で検出することができ、それによって、迅速かつ高感度に食道癌の検出が可能となることを見出した。これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用蛍光プローブを提供するものである。
【化１】
2016006678.tif 000003
【００１０】
式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立に同一又は異なるアミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結し、ＢはＡとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す。【００１１】
上記式（Ｉ）において、好ましくは、Ａが、プロリン又はアラニンから選択されるアミノ酸残基である。好ましくは、Ｂが、グリシン、グルタミン酸、リシン、チロシン、ロイシン、又はプロリンから選択されるアミノ酸残基である。より好ましくは、Ａがプロリン残基であり、Ｂがグリシン残基である。【００１２】
また、上記式（Ｉ）において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が水素原子であり、Ｘがメチレン基である。【００１３】
本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、以下の群から選択される化合物又はその塩である。
【化２】
2016006678.tif 000004
【００１４】
別の態様において、本発明は、上記の蛍光プローブを生体外において試料と接触させる工程、及び、当該試料中に含まれるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）と蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの検出方法を提供するものである。好ましくは、当該方法は、蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを更なる特徴とする。【００１５】
更なる態様において、本発明は、上記の蛍光プローブを用いて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が発現している標的細胞を検出する方法を提供するものである。好ましくは、前記標的細胞は癌細胞であり、より好ましくは、前記癌細胞は食道癌細胞である。【００１６】
更なる態様において、本発明は、上記の蛍光プローブを含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用キットを提供するものである。【００１７】
更なる別の態様において、本発明は、上記の蛍光プローブを含む薬液を測定対象の試料と接触させるための装置であって、前記蛍光プローブを含む薬液を収容する薬液収容部と、前記薬液を前記試料に噴霧可能に構成された薬液噴霧部を備える、該装置を提供するものである。好ましくは、当該装置は、前記試料中に含まれるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）と前記蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段をさらに備えることができる。好ましい態様において、前記装置は内視鏡であることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、アミノ酸残基を有するキサンテン骨格の化合物を蛍光プローブとして用いることにより、食道癌組織中において高レベルで発現しているジペプチジルペプチダーゼＩＶを蛍光応答で検出することができ、それによって、食道癌の存在を正確、迅速、高感度に特定及びイメージングすることできるという優れた効果を奏するものである。【００１９】
本発明の蛍光プローブを、例えば内視鏡検査時に適用することで、食道癌の早期発見が可能となり、侵襲の大きな外科治療ではなく、侵襲の小さい内視鏡的治療や化学放射線治療での根治的治療が可能となる。また、ＥＳＤ施行時や手術時に適応することで切除断端の評価も可能とり、遺残のない治療を行うことができることが期待できる。そして、従来のヨード剤を用いる場合のように、患者の胸やけや気分不快といった刺激症状等が生じたり、ヨードアレルギーのある患者には使用できないといった問題も解決される。従って、本発明の医療上、産業上の利用価値、経済価値は極めて大きいものといえる。【００２０】
また、本発明の蛍光プローブを用いた検出方法は、その検出手順が簡便であることに加えて、生体にとって安全な可視光により検出を行うことができ、また、必要とされる蛍光プローブの使用量も微量である。本発明の蛍光プローブを用いた検出方法は、これらの点においても極めて実用性に優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の蛍光プローブであるＧＰ−ＨＲＭＧへのＤＰＰ−ＩＶ添加による吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化を示した図である。
【図２】図２は、本発明の蛍光プローブであるＧＰ−ＨＲＭＧへのＤＰＰ−ＩＶ添加に伴うＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図３】図３は、ＤＰＰ−ＩＶ添加後６分間における本発明の蛍光プローブの蛍光強度上昇速度を示したグラフである。
【図４】図４は、ＤＰＰ−ＩＶ添加に伴う本発明の蛍光プローブの蛍光強度の時間依存性をプロットしたグラフである。
【図５】図５は、本発明の蛍光プローブを用いた食道癌培養細胞でのライブセルイメージング画像である。
【図６】図６は、本発明の蛍光プローブを用いたヒト食道癌生検検体のイメージング画像である。
【図７】図７は、図６のイメージングにおける蛍光強度の時間依存性をプロットしたグラフである。
【図８】図８は、本発明の蛍光プローブを用いたヒト食道癌手術検体のイメージング画像（図８ａ）、及びヨード染色画像との比較を示した画像（図８ｂ）である。
【図９】図９は、本発明の蛍光プローブを用いたヒト食道癌ＥＳＤ検体のイメージング画像（図９ａ）、及びヨード染色画像との比較を示した画像（図９ｂ）である。
【図１０】図１０は、阻害剤を添加した場合のヒト食道癌手術検体のイメージング画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２３】
１．定義
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００２４】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数３〜１５個（Ｃ３〜１５）、炭素数５〜１０個（Ｃ５〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００２５】
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２７】
本明細書中において、「アリールオキシ基」とは、前記アリール基が酸素原子を介して結合する基である。アリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、２−チエニルオキシ基、３−チエニルオキシ基、２−ピリジルオキシ基、３−ピリジルオキシ基、４−ピリジルオキシ基、２−フリルオキシ基、３−フリルオキシ基、２−チアゾリルオキシ基、４−チアゾリルオキシ基、５−チアゾリルオキシ基、２−オキサゾリルオキシ基、４−オキサゾリルオキシ基、５−オキサゾリルオキシ基、１−ピラゾリルオキシ基、３−ピラゾリルオキシ基、４−ピラゾリルオキシ基、２−ピラジニルオキシ基、２−ピリミジニルオキシ基、４−ピリミジニルオキシ基、５−ピリミジニルオキシ基、１−ピロリルオキシ基、２−ピロリルオキシ基、３−ピロリルオキシ基、１−イミダゾリルオキシ基、２−イミダゾリルオキシ基、４−イミダゾリルオキシ基、３−ピリダジニルオキシ基、４−ピリダジニルオキシ基、３−イソチアゾリルオキシ基、３−イソオキサゾリルオキシ基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イルオキシ基、又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イルオキシ基等が例示される。
【００２８】
本明細書中において、「アルキルアミノ」及び「アリールアミノ」は、−ＮＨ２基の水素原子が上記アルキル又はアリールの１又は２で置換されたアミノ基を意味する。例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ等が挙げられる。同様に、「アルキルチオ」及び「アリールチオ」は、−ＳＨ基の水素原子が上記アルキル又はアリールで置換された基を意味する。例えば、メチルチオ、エチルチオ、ベンジルチオ等が挙げられる。
【００２９】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルアミノカルボニル−）およびＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００３０】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、およびピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造およびそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
【００３１】
２．蛍光プローブ分子
本発明の蛍光プローブは、キサンテン骨格に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの基質となるジペプチド部位を導入した構造を有することを特徴とするものであって、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
【化３】
2016006678.tif 000005
【００３２】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を表す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ１としては水素原子が好ましい。
【００３３】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表す。Ｒ２及びＲ７が水素原子であることが好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６が水素原子であることも好ましい。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７がいずれも水素原子であることがさらに好ましい。
【００３４】
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表す。Ｒ８及びＲ９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合、及びＲ８がアルキル基であり、かつＲ９が水素原子である場合が好ましく、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合がさらに好ましい。
【００３５】
ＸはＣ１−Ｃ３アルキレン基を表す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）のほか、分枝鎖状アルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。
【００３６】
Ａ及びＢは、それぞれ独立に同一又は異なるアミノ酸残基を表す。ここで、Ａは、隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結しており、すなわち、アミノ酸残基Ａのカルボニル部分と式（Ｉ）のＮＨとがアミド結合を形成することでキサンテン骨格と連結している。さらに、Ａは、通常のペプチド鎖と同様にＢと連結することができ、その結果、ＢはＡとアミド結合を形成して連結する。本明細書において、「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。従って、Ｂは、いわゆるＮ−末端残基と同様の構造を有し、中間のアミノ酸残基であるＡは通常のペプチド鎖と同様にＢと連結することができる。
【００３７】
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはＤ−又はＬ−アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
【００３８】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出するという本発明の目的の観点からは、上記Ａ及びＢは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）の基質ペプチドであって選択的に加水分解されやすいアミノ酸残基の組み合わせであることが好ましい。より具体的には、Ａはプロリン又はアラニンから選択されるアミノ酸残基であり、Ｂはグリシン、グルタミン酸、リシン、チロシン、ロイシン、又はプロリンから選択されるアミノ酸残基であることが好ましい。より好ましくは、Ａがプロリン残基であり、Ｂがグリシン残基である。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物の具体例としては、以下の式１〜６の化合物が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
【化４】
2016006678.tif 000006
【００４０】
これらの化学構造から明らかなように、式１〜６の化合物は、ＡとＢの組み合わせ（Ａ−Ｂ）が、順に、プロリン−グリシン；プロリン−グルタミン酸；プロリン−リシン；プロリン−チロシン；プロリン−ロイシン；及びプロリン−プロリンとなっている例である。
【００４１】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は塩として存在する場合がある。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【００４２】
式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００４３】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００４４】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、３位及び６位にアミノ基を有し、９位に２−カルボキシフェニル基又は２−アルコキシカルボニルフェニル基を有するキサンテン化合物などを原料として用い、９位の２−カルボキシフェニル基又は２−アルコキシカルボニルフェニル基をヒドロキシアルキル基に変換した後に３位のアミノ基をアシル化することにより容易に製造することができる。原料として使用可能な３，６−ジアミノキサンテン化合物としては、例えば、いずれも市販されているローダミン１１０やローダミン１２３などを例示することができるが、これらに限定されることはなく目的化合物の構造に応じて適宜のキサンテン化合物を選択することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物におけるキサンテン骨格部分の酸素原子を、特定の置換基を有するＣ原子やＳｉ原子、或いは、Ｇｅ原子、Ｐｂ原子に置換した態様の骨格を有する化合物を用いて、本発明における一般式（Ｉ）と同様の機能を有する蛍光プローブを製造することもできる。
【００４５】
また、本明細書の実施例には、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００４６】
上記の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
【００４７】
３．蛍光プローブ分子の発光機構
上記式（Ｉ）で示される化合物は、その高い水溶性、高い蛍光量子収率等から、バイオイメージングに広く利用されているキサンテン系蛍光色素の骨格であるが、キサンテン骨格上部が閉環状態では、中性領域（例えばｐＨ５ないし９の範囲）において当該蛍光プローブ自体は実質的に無吸収・無蛍光（蛍光応答がＯｆｆの状態）である。これに対し、Ｂ−Ａ−ＮＨにおけるジペプチド部位がジペプチジルペプチダーゼＩＶにより加水分解され、キサンテン骨格から切断されると速やかに開環した互変異性体となって強蛍光性の下記化合物が生じる。
【化５】
2016006678.tif 000007
【００４８】
すなわち、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む本発明の蛍光プローブは、食道癌組織で発現したジペプチジルペプチダーゼＩＶによって加水分解され、強い蛍光を発する上記開環化合物を与える性質を有する。従って、本発明の蛍光プローブを用いることによって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを蛍光強度の変化により観測し、それにより、当該ジペプチジルペプチダーゼＩＶを発現する食道癌の存在を検出することが可能となる。
【００４９】
より詳細には、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、中性領域において例えば４４０〜５１０ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記開環化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えばｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２４ｎｍ）を発する性質を有している。従って、本発明の蛍光プローブを用いて検出を行う場合には、通常は４４０〜５１０ｎｍ程度の可視光を照射すればよい。観測すべき蛍光波長は通常は５１０〜８００ｎｍ程度であり、例えば５１６〜５５６ｎｍ程度の蛍光を観測することが好ましい。
【００５０】
本発明の蛍光プローブとしては、上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
【００５１】
なお、本発明の蛍光プローブは、例えば手術中、検査中、手術後において用いることができる。本明細書において「手術」の用語は、内視鏡又は腹腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、任意の手術を包含する。また、「検査」の用語は、内視鏡を用いた検査及び検査に伴う組織の切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。これらの用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００５２】
４．蛍光プローブを用いた検出方法。
かかる発光機構に従い、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの検出方法は、上記の蛍光プローブを生体外において試料と接触させる工程、及び、当該試料中に含まれるジペプチジルペプチダーゼＩＶと蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする。かかる方法によってジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出することにより、ジペプチジルペプチダーゼＩＶが発現している標的細胞を検出することも可能となる。好ましくは、上記標的細胞は癌細胞であり、より好ましくは、食道癌細胞である。本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。
【００５３】
上記の蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを発現する標的細胞に瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記ジペプチジルペプチダーゼＩＶと蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
【００５４】
測定対象である試料と蛍光プローブを接触させる手段としては、代表的には、蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、上記試料の形態や測定環境等に応じて適宜選択することが可能である。蛍光プローブを含む溶液を試料に噴霧等を行う場合、例えば、蛍光プローブを含む薬液を収容する薬液収容部と、当該薬液を測定対象である試料に噴霧可能に構成された薬液噴霧部を備える、装置を用いることができる。かかる装置は、内視鏡であってもよい。そのような機能を有する内視鏡としては、例えば、特開２０１０−２４０１８８号公報や特開２０１５−２３９０４号公報に開示されている構造を有するものを挙げることができる。また、当該装置は、蛍光プローブによる蛍光応答を観測するため、上述のような蛍光イメージングの手段をさらに備えることもできる。
【００５５】
本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜１０μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。
【００５６】
本発明の方法によるジペプチジルペプチダーゼＩＶの検出は、一般的には中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲、より好ましくはｐＨ６．８〜７．６の範囲で行うことができる。ｐＨを調整する手段としては、例えば、リン酸バッファー等の当該技術分野において周知の任意のｐＨ調節剤や緩衝液を用いることができる。
【００５７】
５．キット
本発明の検出方法においては、上記蛍光プローブを含むジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）検出用キットを用いることが好ましい。特に、上記プロテアーゼがキモトリプシンである場合、上記蛍光プローブとトリプシンを含み、測定が行われるまでの期間において蛍光プローブとトリプシンが混合することなく格納されていることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【００５８】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいても良い。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
１．蛍光プローブの合成
以下のスキームに従って、種々のジペプチド部位を有するヒドロキシメチルローダミングリーン（ＨＲＭＧ）を合成した。なお、化合物Ａ７の合成の際に用いるFmoc-アミノ酸を種々変えることによって、異なるジペプチド部位を有する化合物１〜６を得た。
【化６】
2016006678.tif 000008
【００６１】
化合物Ａ１の合成
Rhodamine 110 Chloride 1127 mg (3.12 mmol, 1eq) をメタノール 180 mLに溶解し、硫酸 9 mLを加えた後にアルゴン雰囲気下で80 ℃で一晩撹拌した。室温まで冷却した後、反応溶媒を減圧除去し、残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和後、濾過した。濾過して得られた個体をメタノールに溶解させ回収し、メタノールを減圧除去した。残渣をテトラヒドロフラン 200 mLに溶解させ、氷浴下で撹拌させながら水素化リチウムアルミニウム 1545 mg (40.7 mmol, 13 eq) を加えアルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して一晩室温で撹拌した。反応溶液を氷浴下で撹拌しながらメタノール30 mLを加えた後、反応溶媒を減圧除去した。残渣に飽和ロッシェル塩水溶液 200 mLと酢酸エチル100 mLを加えてアルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して一晩撹拌した。反応溶液から分液操作で酢酸エチル層を抽出した後に酢酸エチルを減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して (ジクロロメタン/メタノール=90/10) 目的化合物 (557 mg, 56%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 4.63 (s, 2H), 5.38 (s, 1H), 6.30 (dd, 2H, J = 2.1, 9.0 Hz), 6.41 (d, 2H, J = 2.1 Hz), 6.64 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.04-7.08 (m, 1H), 7.14-7.16 (m, 2H), 7.39-7.42 (m, 1H)
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 40.2, 63.0, 103.4, 112.2, 115.4, 127.3, 128.7, 128.9, 131.2, 131.9, 145.7, 148.5, 152.8
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 319.14018 ; found, 319.14465 (-4.48 mmu)【００６２】
化合物Ａ２の合成
化合物A1 557 mg (1.75 mmol, 1eq)、t-ブチルジメチルシリルクロライド 402 mg (2.66 mmol, 1.5eq)、イミダゾール 242 mg (3.55 mmol, 2eq)をN.N’-ジメチルホルムアミド 25 mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して４時間撹拌した。水を100 mL加えた後、酢酸エチルを加え分液操作で酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチルを減圧除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(酢酸エチル/ヘキサン=2/3)目的化合物  (713 mg, 94%)を得た。
1H NMR (400 MHz, aceton-d6 ): δ 0.11 (s, 6H), 0.98 (s,9H), 4.72 (s, 4H), 4.79 (s, 2H), 5.44 (s, 1H), 6.35 (dd, 2H, J = 2.9, 10.7 Hz), 6.46 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 6.71 (d, 2H, J = 10.7 Hz), 7.22-7.29 (m, 3H), 7.53-7.57 (m, 1H)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -5.47, 18.3, 25.9, 39.1, 62.9, 102.0, 110.6, 114.1, 126.4, 127.2, 127.4, 130.4, 130.7, 138.5, 143.9, 146.0, 151.3
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 433.23113 ; found, 433.23114 (0.01 mmu)【００６３】
化合物Ａ３の合成
化合物A2 311 mg (0.720 mmol, 2eq)、Fmoc-プロリン 124 mg (0.368 mmol, 1eq)、HATU 137 mg (0.360 mmol, 1eq)をN,N’-ジメチルホルムアミド 5 mLに溶解させた後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン 128 μL (0.722 mmol, 2eq)を加えてアルゴン雰囲気下にて50 ℃で90分間撹拌した。反応溶媒を減圧除去した後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和食塩水を加えて分液操作を行った。酢酸エチル層を抽出し、減圧除去によって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/1)で精製し、目的化合物(167 mg, 62%)を得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 752.35197 ; found, 752.35316 (1.19 mmu)【００６４】
化合物Ａ４の合成
化合物A3 167 mg (0.222 mmol, 1.5eq)をジクロロメタン1.6 mL、N,N’-ジメチルホルムアミド 0.4 mLに溶解させた後、2-クロロトリチルクロライドレジン 102 mg (0.145 mmol, 1eq)、N,N-ジエチルイソプロピルアミン 200 μL (1.13 mmol, 7.8eq)を加え、アルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して24時間撹拌した。濾過により反応溶媒を取り除いた後、レジンをジクロロメタン/メタノール/N,N-ジイソプロピルエチルアミン=17/2/1混合液およびジクロロメタンで洗浄した。得られたレジンを６等分した。【００６５】
以下、ペプチド固相合成法に則り、化合物Ａ５〜Ａ７、及び化合物１〜６を合成した。【００６６】
化合物Ａ５の合成
得られたA4を6等分し、各々に、N,N’-ジメチルホルムアミド 1.1 mLを加え、1時間振とう後濾過により溶液を除き、テトラクロロ-p-ベンゾキノン120 mM N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 1.6 mLを加え30分振とうした。溶液を濾過によって除き、N,N’-ジメチルホルムアミド 1.1 mLを加え1分間振とうし、溶液を濾過によって除いた。【００６７】
化合物Ａ６の合成
20％ピペリジン/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液(v/v) 800 μLを加えて3分間振とうし、溶液を濾過によって除き、再び20％ピペリジン/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液(v/v) 800 μLを加えて12分間振とうし、溶液を濾過によって除いた。N,N’-ジメチルホルムアミド 900 μLを加え1分間振とうし、溶液を除く作業を6度行った。【００６８】
化合物Ａ７の合成
440 mM HATU/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 440 μL、2M  N,N-ジエチルイソプロピルアミン/ N-メチルピロリドン溶液 200 μL、480 mM Fmoc-アミノ酸(1 ; Fmoc-グリシン、2 ; Fmoc-t-ブチル-グルタミン酸、3 ; Fmoc-Boc-リシン、4 ; Fmoc-t-ブチル-チロシン、5 ; Fmoc-ロイシン、6 ; Fmoc-プロリン)/ N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 400 μL 2時間振とうした。濾過により溶液を除き、N,N’-ジメチルホルムアミド 900 μLを加え1分間振とうし、溶液を除いた。再び440 mM HATU/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 440 μL、2M  N,N-ジエチルイソプロピルアミン/ N-メチルピロリドン溶液 200 μL、480 mM Fmoc-アミノ酸(化合物１〜６に応じて、それぞれ以下を用いた。1 ; Fmoc-グリシン、2 ; Fmoc-t-ブチル-グルタミン酸、3 ; Fmoc-Boc-リシン、4 ; Fmoc-t-ブチル-チロシン、5 ; Fmoc-ロイシン、6 ; Fmoc-プロリン)/ N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 400 μL 2時間振とうした。濾過により溶液を除き、N,N’-ジメチルホルムアミド 900 μLを加え1分間振とうし、溶液を除いた。三たび440 mM HATU/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 440 μL、2M  N,N-ジエチルイソプロピルアミン/ N-メチルピロリドン溶液 200 μL、480 mM Fmoc-アミノ酸(1 ; Fmoc-グリシン、2 ; Fmoc-t-ブチル-グルタミン酸、3 ; Fmoc-Boc-リシン、4 ; Fmoc-t-ブチル-チロシン、5 ; Fmoc-ロイシン、6 ; Fmoc-プロリン)/ N,N’-ジメチルホルムアミド溶液 400 μL 1時間振とうした。濾過により溶液を除き、N,N’-ジメチルホルムアミド 900 μLを加え1分間振とうし、溶液を除いた。20％ピペリジン/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液(v/v) 800 μLを加えて3分間振とうし、溶液を濾過によって除き、再び20％ピペリジン/N,N’-ジメチルホルムアミド溶液(v/v) 800 μLを加えて12分間振とうし、溶液を濾過によって除いた。N,N’-ジメチルホルムアミド 900 μLを加え1分間振とうし、溶液を除く作業を6度行った。【００６９】
化合物Ａ７の合成
得られたレジンを30 mLバイアル瓶に移し、トリフルオロ酢酸 2 mL、水 200 μL、トリエチルシラン200 μLを加え２時間撹拌した。濾過によってレジンを除き、アセトニトリルで洗いこんだ後、濾液を減圧蒸留し残渣をジエチルエーテル 40 mLに加えて3,000 rpmで10分間遠心した。ジエチルエーテルを除き、再びジエチルエーテル 40 mLを加えて3,000 rpmで10分間遠心し、ジエチルエーテルを除いた。残渣を一晩風乾させた後、HPLCを用いて精製を行った。化合物1-4,6はHPLC(eluent A (H2O 0.1% TFA) and eluent B (CH3CN 80%, H2O 20%, 0.1% TFA) (A/B = 80/20 to 25/75 45 min))で精製し目的化合物を得た。 化合物5はHPLC(eluent A (H2O 0.1% TFA) and eluent B (CH3CN 80%, H2O 20%, 0.1% TFA) (A/B = 80/20 to 25/75 45 min))で精製し、さらにHPLC(eluent A (H2O 0.1% TEAA) and eluent B (CH3CN 80%, H2O 20%, 0.1% TEAA) (A/B = 80/20 to 25/75 45 min))で精製し、最後にHPLC(eluent A (H2O 0.1% TFA) and eluent B (CH3CN 80%, H2O 20%, 0.1% TFA) (A/B = 80/20 to 25/75 45 min))で精製し目的化合物を得た。
［収量及び収率］化合物1 ; 4.7 mg, 42%、化合物2 ; 3.2 mg, 25%、化合物3 ; 5.1 mg, 39%、化合物4 ; 3.2 mg, 23%、化合物5 ; 4.3 mg, 34%、化合物6 ; 6.7 mg, 55%)
【実施例２】
【００７０】
２．蛍光プローブによるＤＰＰ−ＩＶアッセイ
実施例１で合成したグリシン−プロリンのジペプチド部位を有する化合物１（ＧＰ−ＨＲＭＧ）及びジペプチド部位を有しないヒドロキシメチルローダミングリーン（ＨＲＭＧ）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。結果を表１に示す。
【表１】
2016006678.tif 000009
【００７１】
表１の結果から、本発明の蛍光プローブである化合物１は、中性条件では主に無色無蛍光の閉環構造で存在することが示された。【００７２】
次に、化合物１にＤＰＰ−ＩＶを作用させ、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの変化を測定した。その結果を図１に示す（化合物１の濃度は３．５μＭ）。図１より、ＤＰＰ−ＩＶの添加に伴い、化合物１の吸光度及び蛍光強度の増加が観測された。【００７３】
同様に、化合物１にＤＰＰ−ＩＶを作用させ、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる解析を行った。得られた結果を図２に示す。図２は、ＤＰＰ−ＩＶとの反応によって、化合物１のピーク位置がＨＲＭＧと同一となったことから、ＤＰＰ−ＩＶによって化合物１のジペプチド部位が加水分解され、切断されたことを示すものである。【００７４】
化合物１に加え、同じく実施例１で合成した化合物２〜６について蛍光アッセイを行った。溶液条件は、蛍光プローブの濃度１．１μＭ、２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）を含む溶液１８μＬ、及びＤＰＰ−ＩＶ、２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液を含む溶液２μＬ含む溶液を用いた。各蛍光プローブを含む溶液にＤＰＰ−ＩＶを添加し、蛍光強度の増加を測定した結果を図３及び図４に示す（励起波長５０１ｎｍ、蛍光波長５２４ｎｍ）。図３はＤＰＰ−ＩＶ添加後６分間における蛍光強度上昇速度を示したグラフであり、図４は蛍光強度の時間依存性をプロットしたグラフである。これらの結果から、いずれの化合物もＤＰＰ−ＩＶに対する蛍光プローブとして機能すること、及び蛍光強度上昇速度がジペプチド部位の種類に依存することが明らかとなった。
【実施例３】
【００７５】
３．食道癌培養細胞でのライブセルイメージング
ヒト食道扁平上皮癌細胞６種類に、ＧＰ−ＨＭＲＧ（化合物１）を滴下した後、経時的にイメージングを行った。【００７６】
ヒト食道扁平上皮癌細胞として、高分化型２種（ＫＹＳＥ３０，ＫＹＳＥ２７０）、中分化型２種（ＫＹＳＥ１４０，ＫＹＳＥ５２０）、低分化型２種（ＫＹＳＥ１５０，ＫＹＳＥ１１７０）を、μ-Slide 8wellを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で2日間培養した。これに、ＧＰ−ＨＭＲＧ（化合物１）のＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ) のうち０．２μＬを２００μＬのRPMI1640 (phenolred-free)に溶かしたもの (最終プローブ濃度１０μＭ)を滴下した後、ＴＣＳ  ＳＰ５を用いて６０分間観察した。また、阻害剤実験としてＧＰ−ＨＭＲＧ（化合物１）５μＭと、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤１００μＭを、２００μＬのRPMI1640 (phenolred-free)に溶かしたもの を滴下した後、同様にＴＣＳ  ＳＰ５を用いて６０分間観察した。【００７７】
その結果、すべての細胞において、経時的な蛍光強度の上昇がみられた。また、阻害剤を添加したプローブでは、阻害剤を添加していないプローブと比較して、蛍光強度が下がっていた（図５）。
【実施例４】
【００７８】
４．ヒト食道癌生検検体のイメージング
術前に上部内視鏡検査を施行した症例に対して、腫瘍部と非腫瘍部から各々1個ずつ生体サンプルを採取し、各種蛍光プローブ（化合物１〜６）を滴下した後、経時的にイメージング及び蛍光強度を測定した。【００７９】
各種蛍光プローブのＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ) のうち０．５μＬを１００μＬのRPMI1640 (phenolred-free)に溶かし (最終プローブ濃度５０μＭ)、各々の検体に５０μＬずつ滴下した後、Maestro In Vivo Imaging System Exを用いて蛍光強度を経時的に３０分間測定した。その結果、非腫瘍部と比較して腫瘍部で蛍光強度の上昇を認めた(図６及び図７)。なお、免疫染色によって、腫瘍部の組織ではＤＰＰ−ＩＶが高発現していることを確認した。【００８０】
また、ＧＰ−ＨＭＲＧ（化合物１）、ＥＰ−ＨＭＲＧ（化合物２）、ＰＰ−ＨＭＲＧ（化合物６）に関しては、１０例以上の症例を集積することができたので、このデータからＲＯＣ曲線を用いてcutoff値を算出し、感度、特異度、正診率、陽性的中率、陰性的中率を求めたところ、従来法であるＮＢＩ（Ｎａｒｒｏｗ Ｂａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ）やヨード染色法に劣らない結果であった(表２（ａ）〜（ｃ）)。
【表２】
2016006678.tif 000010
2016006678.tif 000011
【実施例５】
【００８１】
５．ヒト食道癌手術検体ならびにＥＳＤ検体のイメージング
食道癌の手術ならびに内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）を施行した症例に対して、それぞれの施術において摘出した直後の食道検体（それぞれ手術検体、ＥＳＤ検体という）をイメージング室に持ち込み、検体に直接各種蛍光プローブ（化合物１〜６）を噴霧した後、経時的にイメージングを行った。手術検体には、各種蛍光プローブのＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ) のうち１０μＬを２ｍＬ のRPMI1640  (phenolred-free)に溶かし (最終プローブ濃度５０μＭ)、内視鏡用の散布チューブを用いて検体に蛍光プローブを噴霧した後、Maestro In Vivo Imaging System Exを用いてイメージングを行った。ＥＳＤ検体には、各種蛍光プローブのＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ)のうち３μＬを６００μＬ のRPMI1640  (phenolred-free)に溶かし (最終プローブ濃度５０μＭ)、検体に蛍光プローブを滴下した後、Maestro In Vivo Imaging System Exを用いてイメージングを行った。【００８２】
その結果、プローブを噴霧してから数分で、腫瘍部の可視化に成功した（図８及び９）。蛍光プローブによるイメージングを行った検体に関して、免疫染色によってＤＰＰ−ＩＶ発現を確認し、上記蛍光イメージングの結果と対応するものであることを確認した。【００８３】
また、本蛍光プローブがＤＰＰ−ＩＶに反応していることを確かめるために、手術検体を用いて阻害剤実験を行った。具体的には、ＥＰ−ＨＭＲＧ（化合物２）のＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ) のうち5μＬを1ｍＬ のRPMI1640  (phenolred-free)に溶かし (最終プローブ濃度５０μＭ)、ガーゼにしみこませたものと、ＥＰ−ＨＭＲＧ（化合物２）のＤＭＳＯ溶液 (１０ｍＭ) のうち5μＬとＤＰＰ−ＩＶ阻害剤(１０ｍＭ)のうち5μＬを1ｍＬ のRPMI1640  (phenolred-free)に溶かして (最終プローブ濃度５０μＭ)、ガーゼに染み込ませたものを用意し、それぞれが検体の半分を覆うように5分間貼付し、その後イメージングを行った。その結果、阻害剤を含むプローブを散布した部位では、腫瘍部での蛍光強度の上昇がみられなかった(図１０)。【００８４】
以上の結果は、本発明の蛍光プローブを用いることによって、ヒト食道癌の存在を高感度に検出できることを実証するものである。
【図１】
2016006678.tif 000015
【図２】
2016006678.tif 000016
【図３】
2016006678.tif 000017
【図４】
2016006678.tif 000018
【図５】
2016006678.tif 000019
【図６】
2016006678.tif 000020
【図７】
2016006678.tif 000021
【図８】
2016006678.tif 000022
【図９】
2016006678.tif 000023
【図１０】
2016006678.tif 000024
【国際調査報告】
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