(57)【要約】  アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患を治療又は予防できる新規な手段が開示されている。本願発明者らは、鋭意研究の結果、抗菌ペプチドLL-37に神経反発因子Sema3Aの発現を促進する作用があること等を見出した。LL-37は、ヒトカテリシジンhCAP18のＣ末端３７残基からなるペプチドである。該抗菌ペプチドを利用することで、アトピー性皮膚炎や乾皮症等の掻痒性皮膚疾患の病変部における神経反発因子等の軸索ガイダンス分子の発現を正常化し、掻痒の軽減と皮膚病変の改善が可能になる。
2016035804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a)又は(b)のポリペプチドを有効成分として含有する、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記(b)のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記(b)のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する、請求項２記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチドを有効成分として含有する、請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
掻痒性皮膚疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
下記の(a)又は(b')のポリペプチドを有効成分として含有する、セマフォリン3Aの発現促進剤。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b')  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、セマフォリン3Aの発現を促進する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤である請求項６記載の剤。
【請求項８】
それを必要とする対象に対し、下記の(a)又は(b)のポリペプチドの有効量を投与することを含む、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防方法。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
それを必要とする対象に対し、下記の(a)又は(b')のポリペプチドの有効量を投与することを含む、セマフォリン3Aの発現を促進する方法。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b')  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、セマフォリン3Aの発現を促進する活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な表皮バリアは、外界からの種々の刺激から身体を防御し、適度な水分を体内に保持させる役割を持つ。表皮は物理的なバリアであると同時に、表皮自身が独自の病原体の認識・排除機構を持ち、リンパ球の関与しない自然免疫のバリアを形成している。【０００３】
病原体の排除機構として、表皮角化細胞は抗菌ペプチドであるヒトβディフェンシン（human β-defencin :hBD）およびカテリシジンを産生する（非特許文献１、２）。強い陽性荷電を持つこれらのペプチドは、陰性に荷電した細菌の細胞膜に挿入され、小孔を形成し、殺菌作用を発揮する（非特許文献３）。ヒトカテリシジンとしてLL-37が良く知られている。LL-37は18 kDaの不活性型タンパク質hCAP18がセリンプロテアーゼのカリクレインによる分解を受けることにより遊離される、C末端３７アミノ酸残基の抗菌活性を持つペプチドである。ヒト正常表皮において、比較的抗菌活性の弱いhBD-1は恒常的に発現しているが、他の抗菌ペプチドは細菌の接触、分化、サイトカイン刺激などで細菌感染や炎症などの非常時に誘導される（非特許文献４）。抗菌ペプチドの用途としては、例えば乳癌細胞などの癌細胞の増殖や転移を阻害する技術が開発されている（特許文献１）。【０００４】
皮膚の表皮角化細胞が産生する抗菌ペプチドは乾癬病変部で増加しており、そのことが乾癬で皮膚感染症の少ない一つの要因とされている。アトピー性皮膚炎病変部では健常者には見られない黄色ブドウ球菌の細菌叢形成が見られ、表皮に炎症があるにもかかわらず乾癬病変部と比較して抗菌ペプチドの発現が誘導されないことが報告されている（非特許文献５）。このアトピー性皮膚炎患者の表皮における抗菌ペプチドの発現異常が、黄色ブドウ球菌の増殖や重症感染の頻度が極めて高い原因の１つと考えられている。また、黄色ブドウ球菌が産生する毒素やプロテアーゼはアトピー性皮膚炎の慢性化と重症化の一因とされている（非特許文献６）。【０００５】
本願発明者らのグループによる先行研究では、皮膚バリアの機能が破綻しているアトピー性皮膚炎患者や乾皮症患者、またはそれらのモデルマウスの皮膚において、神経伸長因子（nerve growth factor [NGF], amphiregulin）の発現増加ならびに、神経線維を退縮させる神経反発因子（セマフォリン3A(Sema3A)、anosmin-1）の発現減少を見出し、それにより通常は表皮−真皮境界部に収束している知覚神経線維が表皮内に多数侵入し、増生することを報告した（非特許文献７）。また、組換えSema3Aを配合した軟膏はアトピー性皮膚炎モデル動物の掻破行動を抑制すると共に皮膚炎も改善した（非特許文献８）。以上の結果は、神経反発因子が表皮内神経侵入を伴う難治性痒みの治療標的になることを強く示唆する成果であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５４１２８７号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２１３００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Scott et al, Crit Rev Immunol, 2000: 20: 407-431
【非特許文献２】Weinberg et al, Crit Rev Oral Biol Med, 1998: 9: 399-414
【非特許文献３】Ganz et al, Nat Rev Immunol, 2003: 3, 710-720
【非特許文献４】Midorikawa et al., Infect Immun. 2003, 71(7):3730-3739
【非特許文献５】Harder et al, J Invest Dermatol, 2010: 130, 1355-1364
【非特許文献６】Cork et al, J Invest Dermatol, 2009: 129, 1892-1908
【非特許文献７】Tominaga et al., Exp Rev Dermatol, 2010, 5, 197-212
【非特許文献８】Negi et al., J Dermatol Sci, 2012, 66: 37-43
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１及び２並びに非特許文献１〜８には、アトピー性皮膚炎病変部のSema3A発現と抗菌ペプチドの関連性については全く報告されていない。特許文献２には、LL-37等の抗菌ペプチドを隔離する化合物を皮膚疾患及び皮膚障害の処置に用いる技術が開示されているが、LL-37を隔離する物質を有効成分として用いる技術であり、LL-37等の抗菌ペプチド自体を皮膚疾患の治療剤として用いるものではない。【０００９】
本発明の目的は、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患を治療又は予防できる新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、抗菌ペプチドLL-37にSema3A等の神経反発因子の発現を促進する作用などがあることを見出し、該抗菌ペプチドを利用することで、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の病変部における神経反発因子等の軸索ガイダンス分子の発現を正常化し、掻痒の軽減と皮膚病変の改善が可能になることを見出し、本願発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、下記の(a)又は(b)のポリペプチドを有効成分として含有する、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤を提供する。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチド。【００１２】
また、本発明は、下記(a)又は(b')のポリペプチドを有効成分として含有する、Sema3Aの発現促進剤を提供する。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b')  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、Sema3Aの発現を促進する活性を有するポリペプチド。【００１３】
さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、上記(a)又は(b)のポリペプチドの有効量を投与することを含む、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、上記(a)又は(b')のポリペプチドの有効量を投与することを含む、Sema3Aの発現を促進する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、軸索ガイダンス分子を標的とした新規な掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤が提供された。上記ポリペプチドをアトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の病変部に局部投与することで、軸索ガイダンス分子の発現を正常化し、掻痒の軽減と皮膚病変の改善が可能となる。掻痒性皮膚疾患に対して使用されている従来の標準的治療薬はステロイド剤や抗ヒスタミン薬であるが、これらはアレルギー反応の結果遊離される各種の起痒・炎症物質を抑えることで症状を改善する薬剤であり、対症療法である。このような薬剤では、表皮内まで多数の知覚神経線維が侵入して痒みに対し過敏となった状態を根本的に改善することはできない。一方、軸索ガイダンス分子を標的とする本発明の剤は、痒みの根本的治療を可能にし得るものである。従来の標準的治療薬とは作用機序が異なるので、本発明の剤は、ステロイド剤や抗ヒスタミン薬が無効となってしまった難治性のアトピー性皮膚炎に対しても治療効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）をLL-37で刺激し、48時間後に軸索ガイダンス分子であるSema3AおよびNGFのmRNA発現を解析した結果である。神経反発因子Sema3Aの発現が促進され、神経伸長因子NGFの発現が抑制されることが確認された。コントロール（LL-37非添加）に対し、*はP<0.05で、**はP<0.01で、***はP<0.001で有意差あり。
【図２】NHEKをLL-37で刺激し、48時間後に軸索ガイダンス分子であるKAL1およびArteminのmRNA発現を解析した結果である。神経反発因子KAL1の発現が促進され、神経伸長因子Arteminの発現が抑制されることが確認された。コントロール（LL-37非添加）に対し、**はP<0.01で、***はP<0.001で有意差あり。
【図３】NHEKをLL-37で刺激し、48時間後に抗菌ペプチドであるhBD-1およびhBD-2のmRNA発現を解析した結果である。両mRNAの発現促進が確認された。コントロール（LL-37非添加）に対し、*はP<0.05で、***はP<0.001で有意差あり。
【図４】NHEKをLL-37で刺激し、48時間後にTSLPのmRNA発現を解析した結果である。TSLPの発現抑制が確認された。さらにNHEKにSLIGRLを添加し、TSLPの発現誘導を行った場合においても、LL-37の添加によりTSLPのmRNA発現が抑制されることが確認された。コントロール（LL-37及びSLIGRL非添加）に対し、***はP<0.001で有意差あり。
【図５】NHEKをLL-37で刺激し、48時間後に軸索ガイダンス分子であるSema3Aタンパク質の発現を解析した結果である。神経反発因子Sema3Aの発現量が増加することが確認された。コントロール（LL-37非添加）に対し、***はP<0.001で有意差あり。
【図６】アトピー性皮膚炎を発症したDfb-NC/Ngaマウスに１日２回４日間、１匹当たりmCRAMP軟膏100mg又はワセリンの塗布を行い、塗布前と塗布後の掻破行動回数の変化率を比較した結果である。mCRAMP軟膏塗布群（n=3）では、無処置群（n=2）および対照群（n=2）と比較してアトピー性皮膚炎モデルマウスの掻破行動回数が明らかに低下した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の剤は、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤であり、以下のポリペプチドを有効成分として含有する。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチド。
【００１７】
配列番号１は、ヒトのカテリシジンであるLL-37のアミノ酸配列である。LL-37は、表皮角化細胞において、神経伸長因子の発現を抑制し、かつ、神経反発因子の発現を促進する作用を有することが本願発明者らにより明らかとなった。さらに、LL-37は、表皮角化細胞におけるサイトカインTSLPの発現を抑制することができることも明らかとなった。アトピー性皮膚炎や乾皮症等の掻痒性皮膚疾患病変部では、軸索ガイダンス分子のうち、NGFやamphiregulin等の神経伸長因子の発現が増加し、Sema3Aやanosmin-1等の神経反発因子の発現が減少していることが知られている（非特許文献７）。またアトピー性皮膚炎病変部ではサイトカインTSLPが高発現しており（Soumelis et al, Nat Immunol, 2002: 3, 673-680）、最近ではTSLPが炎症のみならず掻痒を誘発することも報告されている（Wilson et al, Cell, 2013: 155, 285-295）。さらに、組換えSema3Aを病変部に塗布することで、掻痒が軽減し皮膚炎が改善することも知られている（非特許文献８）。LL-37を皮膚疾患病変部に適用することで、軸索ガイダンス分子及びTSLPの発現が正常化され、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の病態を効果的に改善することができる。
【００１８】
また、一般に、タンパク質において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ機能を有している場合があることは、当業者において広く知られている。従って、上記(b)に定義した、配列番号１において１又は数個（例えば、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドも、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、上記(a)のポリペプチド（LL-37と配列が同一のポリペプチド）と同様に掻痒性皮膚疾患の治療又は予防に使用することができる。(b)のポリペプチドは、例えば、配列番号１との配列同一性が８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であり得る。
【００１９】
ここで、「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらのグループ内での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループ内で置換することにより、有効成分として用いるポリペプチドの掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を維持できる可能性が高くなる。
【００２０】
掻痒性皮膚疾患の治療には、掻痒の改善、炎症性皮膚病変の改善など、皮膚病変部の種々の症状の改善が包含される。また、掻痒性皮膚疾患の予防には、例えば、掻痒の改善による皮膚病変の発生の防止が包含される。繰り返し掻痒が生じている部位に対し、掻痒の発生前に予防的に本発明の剤を用いることもできる。
【００２１】
「掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性」とは、掻痒性皮膚疾患の皮膚病変部の症状を改善又は該症状の増悪を防止する活性を意味する。カテリシジンなどの抗菌ペプチドに皮膚掻痒を抑制する効果があることは下記実施例において具体的に示される通りであるが、この効果は、カテリシジンなどの抗菌ペプチドが病変部における軸索ガイダンス分子及びサイトカインTSLPのいずれか一つ又は複数の発現を正常化する作用、すなわち、Sema3AやKAL1などの神経反発因子の発現促進、NGFやArteminなどの神経伸長因子の発現抑制、TSLPの発現抑制のいずれか一つ又は複数の作用によってもたらされている。従って、配列番号１と少数のアミノ酸が異なる任意のポリペプチドが掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するかどうかは、ヒト表皮角化細胞等の表皮由来培養細胞（好ましくはヒト表皮由来培養細胞）において、当該任意のポリペプチドが上記した神経反発因子の発現又は産生の促進、神経伸長因子の発現又は産生の抑制、TSLPの発現抑制等の作用のうちのいずれか一つ又は複数を示すかどうかなどを調べることによって評価することができる。簡便には、表皮由来細胞においてSema3Aの発現又は産生を促進する作用があるかどうかによって上記の治療又は予防活性を評価することができる。
【００２２】
また、掻痒性皮膚疾患の症状を呈するモデル動物が公知であり、任意のポリペプチドが掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するか否かは、そのようなモデル動物への投与実験を行なって調べることもできる。
【００２３】
例えば、掻痒性皮膚疾患の１種であるアトピー性皮膚炎を発症するモデル動物として、NC/Ngaマウスが知られている。NC/Ngaマウスは、アトピー性皮膚炎の動物モデルとして、当該分野において広く用いられているモデルであり、通常飼育条件下で飼育すると、約７週齢ごろから顔、耳、上背部などにアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎を発症する。
【００２４】
上記の活性の評価に使用可能なモデル動物の他の具体例として、ドライスキンモデルマウスが挙げられる。アトピー性皮膚炎、乾皮症、腎不全、胆汁うっ滞性肝疾患などの疾患では、ドライスキンを呈することが知られている。ドライスキンモデルマウスは、例えば、ICRマウスの背中の毛を剃り、その後、アセトン溶液をしみ込ませたコットンを皮膚に5分間塗布することで作製することができる。あるいは、Hos:HR-1ヘアレスマウス（無毛マウス）の皮膚にアセトン溶液をしみ込ませたコットンを5分間塗布することで作製することもできる。ドライスキンモデルマウスではアセトン処理24時間後から神経線維の表皮内侵入が観察され、アトピー性皮膚炎モデルマウスと同様に軸索ガイダンス分子の発現異常（神経伸長因子NGF、amphiregulinの発現上昇、及び神経反発因子Sema3Aの発現低下）が認められる（Kamo et al, J Dermatol Sci 62 91-97, 2011)。
【００２５】
アトピー性皮膚炎を発症するモデル動物を用いた掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性の評価は、例えば、モデル動物の皮膚病変部にポリペプチドを塗布等により投与し、病変部の症状の改善の有無を評価することにより行なうことができる。皮膚病辺部の症状の改善の有無は、例えば、クリニカルスキンスコア（Leung、Clin Exp Immunol 107 (Suppl. 1), 25-30, 1997; Suto et al., Int Arch Allergy Immunol 120 (Suppl. 1), 70-75, 1999）等の公知の指標を用いて評価することができる。例えば、無処置の疾患発症個体群のスコア平均値と比較して、一定期間ポリペプチドを投与した発症個体群のスコア平均値が有意に低下した場合、又は、例えば、ポリペプチド投与群のスコア平均値が無処置個体群のスコア平均値の約３分の２以下、好ましくは約２分の１以下となった場合には、該ポリペプチドは掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有すると判断できる。
【００２６】
また、アトピー性皮膚炎モデル動物及びドライスキンモデル動物を用いた掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性の評価は、次のようにして実施することができる。例えば、表皮内に侵入している神経線維の数（上記疾患モデルでは表皮内侵入する神経線維の数が増加している）、軸索ガイダンス分子の発現異常（神経伸長因子NGF、amphiregulinの発現上昇、及び神経反発因子Sema3Aの発現低下）が、無処置の疾患発症個体群と比較して正常化していた場合、該ポリペプチドは掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有すると判断できる。
【００２７】
「掻痒性皮膚疾患」の具体例としては、特に限定されないが、アトピー性皮膚炎、乾皮症、結節性痒疹、慢性腎不全、胆汁うっ滞性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、透析掻痒症、内臓悪性腫瘍等を挙げることができる。本発明の剤は、アトピー性皮膚炎に特に好ましく用いることができる。感染症に伴う皮膚掻痒に対しては、ポリペプチドの抗菌活性が病原体に対しても好ましく効果を奏すると期待されるため、感染症に伴う皮膚掻痒の治療又は予防にも本発明の剤を使用することができるが、本発明で対象とする掻痒性皮膚疾患は感染症に伴う皮膚掻痒以外の疾患であり得る。本発明で対象とする掻痒性皮膚疾患はまた、乾癬以外の疾患であり得る。
【００２８】
なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数（２以上）のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多い高分子量の分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、タンパク質も包含される。
【００２９】
また、一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。本発明のポリペプチドは、掻痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。
【００３０】
ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
【００３１】
ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7."等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
【００３２】
ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、一部のみをＤ体にするよりは、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。
【００３３】
本発明で有効成分として用いられる上記ポリペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。
【００３４】
本発明の剤は、上記ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した薬理学的に許容される賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
【００３５】
本発明の剤は、治療すべき皮膚病変部又は予防すべき皮膚部に局部投与して用いられる。局部投与方法としては、注射剤・点滴剤等による皮内投与、軟膏剤・クリーム剤・ローション剤・貼付剤等による局部投与等が挙げられる。投与量は、症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、通常、対象動物に対し有効成分量として１日0.01μg〜1 g程度、例えば1μg〜10 mg程度であり、１回ないし数回に分けて投与される。症状の改善の程度に応じ、数日ないし数ヶ月間にわたり、毎日１回若しくは数回、ないしは数日おきに１日若しくは数回、定期的に投与することができる。
【００３６】
本発明の剤の投与対象は哺乳動物であり、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられる。本発明の剤はヒトに対して特に好ましく用いることができる。
【００３７】
本発明の剤は、単独で用いてもよいし、他の掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤等と併せて用いることもできる。掻痒性皮膚疾患に従来用いられている標準的治療薬はステロイド剤や抗ヒスタミン薬であるが、本発明の剤はこれらの標準的治療薬とは作用機序が異なるので、本発明の剤とステロイド剤等とを組み合わせて用いることも可能である。
【００３８】
LL-37ペプチドの作用のうち、Sema3Aの発現・産生を促進する作用に特に着目した場合、本発明の治療又は予防剤は、Sema3Aの発現促進剤ないしは産生促進剤としてとらえることができる。すなわち、本発明は、下記の(a)又は(b')のポリペプチドを有効成分として含有する、Sema3Aの発現促進剤を提供する。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチド。
(b')  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、かつ、Sema3Aの発現を促進する活性を有するポリペプチド。
【００３９】
(b')のポリペプチドがSema3Aの発現を促進する活性があるかどうかは、例えば、表皮由来の培養細胞（正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）など）にポリペプチドを添加し、細胞内でのSema3Aの発現量を測定し、ポリペプチド非添加の細胞内でのSema3A発現量と比較することにより調べることができる。その他、(b')のポリペプチドについての好ましい条件等は、上記した(b)のポリペプチドと同様である。
【００４０】
上述の通り、組換えSema3Aを配合した軟膏をアトピー性皮膚炎病変部に適用することで、掻痒を軽減し皮膚炎を改善することができることが知られている（非特許文献８）。上記(a)又は(b')のポリペプチドを有効成分とするSema3A発現促進剤によれば、表皮角化細胞のSema3A発現を促進し、Sema3A産生量を増大させることで、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の治療又は予防が可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００４２】
１．ヒトカテリシジンLL-37の処理がヒト表皮角化細胞における神経反発因子等の発現に及ぼす効果
[材料及び方法]
（１）LL-37の合成
LL-37ペプチド（LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES、配列番号１）は、ペプチド自動合成機（島津製作所製モデルＰＳＳＭ−８）を用い、同機の取扱説明書のプロトコールに従って合成した。【００４３】
（２）NHEKの培養
正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）はLonza社のプロトコールに従い、培養した。NHEKを12ウェル組織培養プレート内で培養し、増殖期（80%コンフルエント）にLL-37(20μg/ml)を単独で、又はLL-37(20μg/ml)及びペプチドSLIGRL(配列番号２、100μM)を添加した。なお、ペプチドSLIGRLは、PAR2アゴニストとしてよく使用されているペプチドであり、PAR2の活性化により角化細胞においてTSLP発現促進が誘導されることが知られている（Wilson et al, Cell, 2013: 155, 285-295）。LL-37の添加から48時間後に全RNAを抽出し、リアルタイムPCRによりmRNA発現解析を行った。また、培養上清を回収し、ELISAによりタンパク質発現量の解析を行った。【００４４】
（３）各遺伝子のmRNA発現解析
各遺伝子の転写レベルを、定量リアルタイムPCRによって分析した。全RNAを、製造業者の取扱説明書に従って、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて培養細胞から抽出し、PrimeScript RT reagent kit（Takara）を用いて、cDNAに逆転写した。定量リアルタイムPCRは製造業者の取扱説明書に従って、SYBR Premix Ex Taq（Takara）を使用して、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR system （Applied Biosystems）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表１に示す。リボソームタンパク質S18（RPS18）を基準遺伝子として使用した。各mRNAの量を、RPS18のmRNA量に対して標準化し、そして最終的に未処理対照のmRNAに対する比として示した。【００４５】
【表１】
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【００４６】
（４）タンパク質発現解析
各タンパク質の発現レベルを、ELISAによって分析した。培養上清中のSema3A量を製造業者の取扱説明書に従って、Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit（USCN Life Science）を使用して測定した。【００４７】
[結果]
LL-37の添加により、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）におけるSema3A、KAL1、hBD-1、hBD-2のmRNA発現増加ならびにNGF、Artemin、TSLPのmRNA発現減少が認められた（図１、図２、図３、図４）。さらに、NHEKにSLIGRLを添加し、TSLPの発現誘導を行った場合においても、LL-37の添加によりTSLPのmRNA発現減少が認められた（図４）。【００４８】
また、LL-37の添加により正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）の培養上清中のSema3Aタンパク質量の増加が認められた（図５）。この結果から、LL-37の添加により正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）においてSema3AのmRNA発現が増加し、Sema3Aタンパク質が産生され、培養上清中に分泌されていることが示唆された。【００４９】
Sema3A、KAL1は神経軸索の伸長方向を決定する分子である神経反発因子として知られ、神経反発因子が存在すると神経軸索の伸長が阻害される。【００５０】
NGF、Arteminは神経軸索の伸長方向を決定する分子である神経伸長因子として知られ、神経伸長因子が存在すると神経軸索の伸長が促進される。【００５１】
TSLPはIL-2ファミリーに属するサイトカインであり、アトピー性皮膚炎患者表皮病変部で高発現していることが報告されている（Soumelis et al, Nat Immunol, 2002: 3, 673-680）。【００５２】
これらの結果から、LL-37がアトピー性皮膚炎病変部における神経反発因子及び神経伸長因子の発現を正常化する可能性が示唆された。また、抗菌ペプチドhBD-1、hBD-2の発現を誘導し、サイトカインTSLPの発現を抑制する可能性が示唆された。アトピー性皮膚炎病変部にLL-37配合軟膏を外用することで、LL-37自身及びLL-37により誘導されるhBDによる黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性の補充と共に、軸索ガイダンス分子及びTSLPの発現の正常化が可能となり、より効果的にアトピー性皮膚炎病態を改善する可能性が期待される。【００５３】
２．アトピー性皮膚炎モデルマウスにおけるマウスカテリシジン mCRAMPによる掻破行動の抑制
[材料及び方法]
（１）アトピー性皮膚炎モデルマウスの作製
ビオスタ社のプロトコールに従い、NC/Ngaマウス（オリエンタル酵母工業株式会社）の背部にコナヒョウヒダニ虫体（Dermatophagoides farinae body, Dfb）成分を含む軟膏試薬であるビオスタAD（株式会社ビオスタ）を週2回、３週間反復塗布することでアトピー性皮膚炎を誘発した。抗菌ペプチドであるmCRAMP軟膏の塗布を開始する前日にクリニカルスキンスコアを判定し（Suto et al., Int Arch Allergy Immunol 120 (Suppl. 1), 70-75, 1999）、スコア５以上の個体を実験に用いた。【００５４】
（２）アトピー性皮膚炎モデルマウスへのmCRAMP軟膏の塗布
アトピー性皮膚炎を発症したDfb-NC/Ngaマウスに１日２回４日間、mCRAMP軟膏を１匹当たり100mgで塗布した。mCRAMP軟膏は親水ワセリン（丸石製薬）100mgに20μlのmCRAMP溶液（10μg/ml； ANASPEC社）を混合することで作製した。対照群（ワセリン塗布）のマウスには親水ワセリン100mgに20μlの蒸留水を混合したものを塗布した。なお、mCRAMP（GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ、配列番号１９）は、マウスカテリシジン関連抗菌ペプチド（cathelicidin-related antimicrobial peptide）であり、ヒトのLL-37に相当する。【００５５】
（３）掻破行動解析
SCLABA（登録商標）-Real（株式会社ノベルテック）を用いて掻破行動の測定及び解析を行った。アトピー性皮膚炎発症後mCRAMP軟膏塗布前（Day 0）とmCRAMP軟膏塗布後（Day 4）に各マウス12時間の掻破行動の測定を行った。【００５６】
[結果]
アトピー性皮膚炎発症後軟膏塗布前（Day 0）と軟膏塗布後（Day 4）の各群のマウスの掻破行動の変化率を比較し、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するmCRAMP軟膏塗布による治療効果を検討した。その結果、mCRAMP軟膏の塗布によりアトピー性皮膚炎モデルマウスの掻破行動が明らかに抑制された（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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