(57)【要約】【課題】β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法、並びに当該方法に用いる遺伝子、タンパク質及び形質転換体を提供する。【解決手段】宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法、並びに当該方法に用いる遺伝子、タンパク質及び形質転換体。（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
前記中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質が、中鎖脂肪酸エステルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
前記宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９７％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９７％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９７％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項９】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項１２】
請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
宿主に、請求項１２記載の遺伝子を導入して得られる形質転換体。
【請求項１４】
前記宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して得られる、請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１３又は１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項１５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びこれを用いた中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。【０００３】
植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−ＡＣＰ（アシルキャリアプロテイン、acyl-carrier-protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応を繰り返して、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein  synthase：以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS  I、KAS  II、KAS  III、KAS  IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS  IIIは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素数２のアセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を炭素数４のβ−ケトアシル−ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、KAS  I、KAS  II、及びKAS  IVが関与する。KAS  Iは主に炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、KAS  IIは主に炭素数１８のステアロイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、KAS  IVは炭素数６〜１４の中鎖アシル−ＡＣＰの伸長反応に関与するといわれている。
現在のところ、植物のKAS  IVについての知見はほとんど得られておらず、わずかに双子葉植物のクフェアで報告例があるのみである（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９８／４６７７６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dehesh  K，et  al.，The  Plant  Journal.，1998，vol．15(3)，p．383-390
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【０００７】
また、本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）（以下、「本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ」ともいう。）、及び当該タンパク質をコードする遺伝子（以下、「本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子」ともいう。）に関する。
また、本発明は、宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、植物由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法の提供に関する。また、本発明は、植物由来の新たなβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの提供に関する。
【０００９】
本発明者らは、植物のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼについて研究を行い、ココヤシ（Cocos nucifera）から、新たなβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを同定した。そして、これらを用いて宿主を形質転換したところ、形質転換体では中鎖脂肪酸又はそのエステルの生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能に優れる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質を生産することができる。また、本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びこれをコードする遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰの合成に用いることができる。
本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
【００１１】
本明細書において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
以下、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、これを用いた形質転換体、及び脂質の製造方法について順に説明する。
【００１２】
１．β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ
本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。具体的に、本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼには、以下のタンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が包含される。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、単子葉植物のココヤシ由来の新規β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応を繰り返し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）の作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）とマロニルＡＣＰとの縮合反応で、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
【００１４】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有する。本発明において、タンパク質が「β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性」とは、アセチル−ＡＣＰやアシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性をいう。
タンパク質がβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献１（Dehesh  et  al.，The  Plant  Journal.，1998，vol．15(3)，p．383-390）に記載の方法によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認することができる。
【００１５】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（以下、単に「KAS」ともいう）は、アシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒し、その基質特異性によってKAS  I、KAS  II、KAS  III、KAS  IVに分類される。KAS  IIIは、炭素数２のアセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を基質とし、炭素数２から４の伸長反応を触媒する。KAS  Iは、主に炭素数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰを合成する。KAS  IIは、主に炭素数１６から１８の伸長反応を触媒し、炭素数１８のステアロイルＡＣＰを合成する。KAS  IVは炭素数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。
【００１６】
前記タンパク質（Ａ）として規定するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、後述の実施例で示されているように、中鎖アシル−ＡＣＰを選択的に合成し、KAS  IVであると考えられる。
本明細書において「中鎖アシル−ＡＣＰ特異的」β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼとは、主に炭素数４〜１２のアシルＡＣＰを基質とし、炭素数６から１４までのアシルＡＣＰの伸長反応を選択的に触媒するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。以下、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを、中鎖特異的β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼともいう。
また、本明細書において、「中鎖」とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの中鎖アシル−ＡＣＰ特異性については、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析し、中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、上記の系に後述する中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを共発現することで、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ単独発現時と比較して中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献１（Dehesh  et  al.，The  Plant  Journal.，1998，vol．15(3)，p．383-390）に記載の方法によって中鎖アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応が起こること、により確認することができる。
【００１７】
前記タンパク質（Ｂ）において、中鎖特異性の観点から、配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。
本明細書においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列として、配列番号１のアミノ酸配列に変異を導入したアミノ酸配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、中鎖特異性の観点から、配列番号１のアミノ酸配列において、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列が特に好ましい。
アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
【００１９】
上述したタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ココヤシから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子を用いることができる。
【００２０】
２．β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子
本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子である。
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ココヤシ由来の野生型β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
【００２１】
タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ａ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２２】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、中鎖特異性の観点から、配列番号２の塩基配列との同一性は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。
【００２３】
また、前記ＤＮＡ（ｂ）の塩基配列として、配列番号２の塩基配列に変異を導入した塩基配列、すなわち、配列番号２の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。前記ＤＮＡ（ｂ）の塩基配列は、中鎖特異性の観点から、配列番号２の塩基配列において、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列であることが特に好ましい。
【００２４】
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２５】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ココヤシからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００２６】
３．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明の形質転換体は、上述のタンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、宿主に導入してなるものであることが好ましい。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
そのため、宿主にβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入することで、形質転換体の脂質生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００２７】
本発明で用いることができるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００２８】
また、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られている。よってアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼと同様、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、中鎖アシル−ＡＣＰに特異的なチオエステラーゼ（以下、「中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」ともいう）であることが好ましい。本明細書において「中鎖アシル−ＡＣＰ特異的」なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとは、炭素数６〜１４のアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を選択的に加水分解する活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。
中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。特に、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを元来有していない宿主を用いる場合、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入が効果的である。
【００２９】
本発明では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして、公知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質を用いることができる。用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Umbellularia californica由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1）；Cuphea calophylla  subsp.  mesostemon由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABB71581）；Cocos nucifera由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB3：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照、配列番号５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６）；Cinnamomum camphora由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragrans由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71729）；Myristica fragrans由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71730）；Cuphea lanceolata由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookeriana由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）；Ulumus americana由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71731）；Sorghum bicolor由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER87824）；Sorghum bicolor由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER88593）；Cocos nucifera由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nucifera由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB2：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB1：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB2：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB3：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Elaeis guineensis由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAD42220）；Desulfovibrio vulgaris由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ACL08376）；Bacteriodes fragilis由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAH09236）；Parabacteriodes distasonis由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicron由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAO77182）；Clostridium asparagiforme由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEG55387）；Bryanthella formatexigens由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EET61113）；Geobacillus  sp. 由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EDV77528）；Streptococcus dysgalactiae由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  BAH81730）；Lactobacillus brevis由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABJ63754）；Lactobacillus plantarum由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAD63310）；Anaerococcus tetradius由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorus由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAE80300）；Clostridium thermocellum由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABN54268）；Nannochloropsis oculata由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Nannochloropsis gaditana由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Nannochloropsis granulata由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）；Symbiodinium microadriaticum由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号���４）、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３０】
上述したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの中でも、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが好ましく、Cocos nucifera由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６）、Umbellularia californica由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1）、Cuphea lanceolata由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）、Cuphea hookeriana由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）、Ulumus americana由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71731）、又はこれらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
【００３１】
タンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性又は中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L，Voelker  TA，Hawkins  DJ.，“Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995  Nov  7;92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００３２】
４．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、好ましくは前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、宿主に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が宿主に比べ改変される。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３３】
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、好ましくは前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主にさらに導入したものであることが好ましい。具体的には、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、好ましくは前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００３４】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、好ましくは中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子をさらに導入した形質転換体も、同様にして作製することができる。
【００３５】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、植物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、中鎖脂肪酸生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、スナモモ、ダイズ、トウモロコシ、イネ、ヒマワリ、クスノキ、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３６】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  （PtTE）  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００３７】
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００３８】
上記ベクターに前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主が植物の場合、アグロバクテリウムを用いた方法(C.  R.  Acad.  Sci.  Paris.  Life  Science  316,  1194(1993)等)、パーティクルガン法(BioRad社PDS-1000/He等)等を用いることができる。
【００３９】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４０】
５．中鎖脂肪酸の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質を生産する。
本発明の製造方法は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体、好ましくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子及び前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体、から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する工程を含む。当該工程は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体、好ましくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子及び前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体、を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、「培養物」には、培養液の他に、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
【００４１】
培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
また、中鎖脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００４２】
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００４３】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００４４】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００４５】
本発明の製造方法を用いることで、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質を効率的に生産することができる。
中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質として好ましくは中鎖脂肪酸のエステルである。具体的には、中鎖アシル基を有するトリアシルグリセロール、又は中鎖アシル基を有するリン脂質が好ましく、中鎖アシル基を有するトリアシルグリセロールがより好ましい。
中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質は、Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸又はそのエステルが好ましく、Ｃ１２脂肪酸又はそのエステルがよりさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルが特に好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
【００４６】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００４７】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。
【００４８】
＜１＞  宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
＜２＞  前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、＜１＞項記載の製造方法。
【００４９】
＜３＞  宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜４＞  宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【００５０】
＜５＞  前記（Ｂ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞  前記（Ｂ）のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である、＜１＞〜＜５＞項記載の方法。
＜７＞  前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜８＞  前記ＤＮＡ（ｂ）において、配列番号２で表される塩基配列との同一性が９８％以上、より好ましくは９９％以上である、＜７＞項記載の方法。
＜９＞  前記（ｂ）の塩基配列が、配列番号２の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列である、＜７＞又は＜８＞項記載の方法。
＜１０＞  前記中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質が、中鎖脂肪酸エステルである、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞  前記宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入する、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
【００５１】
＜１２＞  宿主に下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、得られた形質転換体から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を採取する、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性、を有するタンパク質
＜１３＞  宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜１４＞  宿主に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ１）をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【００５２】
＜１５＞  前記宿主が微生物又は植物である、＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞  前記植物がシロイヌナズナである、＜１５＞項記載の方法。
＜１７＞  前記脂質が、炭素数が１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
【００５３】
＜１８＞  前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
＜１９＞  前記（Ｂ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、である、＜１８＞項記載のタンパク質。
＜２０＞  前記（Ｂ）のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である、＜１８＞又は＜１９＞項記載のタンパク質。
【００５４】
＜２１＞  ＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜２２＞  前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子。
＜２３＞  前記ＤＮＡ（ｂ）において、配列番号２で表される塩基配列との同一性が９８％以上、より好ましくは９９％以上である、＜２２＞項記載の遺伝子。
＜２４＞  前記ＤＮＡ（ｂ）の塩基配列が、配列番号２の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列である、＜２２＞又は＜２３＞項記載の遺伝子。
【００５５】
＜２５＞  宿主に、＜２１＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜２６＞  前記宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子をさらに導入して得られる、＜２５＞項記載の形質転換体。
＜２７＞  前記宿主が微生物又は植物である、＜２５＞又は＜２６＞項記載の形質転換体。
＜２８＞  前記植物がシロイヌナズナである、＜２７＞項記載の形質転換体。
【００５６】
＜２９＞  脂質を製造するための、＜２５＞〜＜２８＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜３０＞  前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜２９＞項に記載の形質転換体の使用。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例で用いたプライマーを表１に示す。【００５８】
【表１】
2016021481.tif 000002
【００５９】
１．ココヤシのRNA抽出
ココヤシ固形胚乳を液体窒素で凍結した後、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて破砕した。破砕した固形胚乳に対してフェノール／クロロホルム、50mM  Tris-HCl  （pH9）を添加しよく混ぜ、7500rpmで10分間遠心操作を行い、上清を回収した。回収した上清に再度同様のフェノール／クロロホルム処理を行った。上層を回収し、これに対してエタノール沈殿操作を行い、そこに含まれる核酸成分を精製した。RNA成分の精製のために、RNeasy  Plant  Mini  Kit  （Qiagen,  Valencia,  California製）を用いた。エタノール沈殿後の核酸ペレットに、1M  DTTを1/100容量添加したRLT  Bufferを加えてボルテックスしたものを、QIA  shredder  spin  columnにアプライした。以降はキット添付のマニュアルに従って操作を行い、最終的に脱イオン水（dH2O）でココヤシ由来のtotal  RNAを溶出した。得られたRNA溶液に対し、DNaseI（サーモサイエンティフィック製）をバッファーとともに添加し、1時間37℃にて処理を行った。その後、フェノール／クロロホルム処理・エタノール沈殿処理を行い、ココヤシ胚乳由来RNA溶液とした。
続いて、PrimeScript  II  1st  strand  cDNA  Synthesis  Kit（タカラバイオ製）を用いて、得られたRNAからcDNAを調製した。【００６０】
２．ココヤシ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
茨城県潮来市で採取した野生のアブラナ様植物から、Brassica rapa由来の  Napin遺伝子プロモーターを、栃木県益子町で採取した野生のアブラナ様植物から、Napin遺伝子ターミネーターをそれぞれ取得した。PowerPlant  DNA  Isolation  Kit（MO  BIO  Laboratories製,  USA）を用いて、野生のアブラナ様植物のゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（タカラバイオ製）を用いたPCR反応により、上記プロモーターとターミネーター領域を増幅した。具体的には、プライマーNo.1とNo.2を用いてBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターを、プライマーNo.3とNo.4を用いてBrassica rapa由来のNapin遺伝子ターミネーターをそれぞれ増幅した。増幅が見られたPCR産物をテンプレートとし、Napin遺伝子プロモーターはプライマーNo.5とNo.6、Napin遺伝子ターミネーターはプライマーNo.3とNo.7を用いて、再度PCR反応を行った。Napin遺伝子プロモーター配列を配列番号１５、Napin遺伝子ターミネーター配列を配列番号１６に示す。これらの増幅断片をMighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）で処理した後、pMD20-Tベクター（タカラバイオ製）にライゲーション反応により挿入することで、Napin遺伝子プロモーターを含むプラスミドpPNapin1、およびNapin遺伝子ターミネーターを含むプラスミドpTNapin1をそれぞれ構築した。【００６１】
植物導入用ベクターとして、pRI909ベクター（タカラバイオ製）を用いた。pRI909ベクターに、下記の手順でBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターとNapin遺伝子ターミネーターを導入した。プラスミドpPNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.8とNo.9を用いたPCR反応により、両末端に制限酵素認識配列を付加したプロモーター配列を増幅した。また、プラスミドpTNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.10とNo.11を用いたPCR反応によりターミネーター配列を増幅した。増幅産物は、Mighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）を用いて処理した後、pMD20-Tベクターにライゲーション反応により挿入し、プラスミドpPNapin2及びプラスミドpTNapin2をそれぞれ構築した。プラスミドpPNapin2を制限酵素Sal  IとNot  Iで、プラスミドpTNapin2を制限酵素Sma  IとNot  Iでそれぞれ処理し、Sal  IとSma  Iで処理したpRI909ベクターにライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapinを構築した。【００６２】
次に、カリフォルニア・ベイ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、BTEとも略記する）遺伝子の葉緑体移行シグナルペプチドをコードする遺伝子（配列番号１７）を、Invitrogen社（Carlsbad,  California）の提供する受託合成サービスを利用して取得した。取得した遺伝子配列を含むプラスミドをテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.12とNo.13を用いたPCR反応により、シグナルペプチドをコードする遺伝子断片を増幅した。Mighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）を用いて、増幅した遺伝子断片の両末端にデオキシアデニン（dA）を付加した後、pMD20-Tベクター（タカラバイオ製）にライゲーション反応により挿入し、プラスミドpSignalを構築した。
プラスミドpSignalを制限酵素Not  Iで処理し、プラスミドp909PTnapinのNot  Iサイトにライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapin-Sを得た。【００６３】
前記で調製したココヤシ胚乳由来のcDNAをテンプレートとし、制限酵素PrimeSTAR  MAX（タカラバイオ製）、プライマーNo.14とNo.15を用いたPCR反応により、ココヤシ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、CTEとも略記する）をコードする遺伝子配列（配列番号６）を増幅した。また、p909PTnapin-Sをテンプレートとし、プライマーNo.16とNo.17を用いて、p909PTnapin-Sの直鎖状断片を増幅した。CTE遺伝子断片とp909PTnapin-S断片とを、In-Fusion  Advantage  PCR  Cloning  Kit（クロンテック製）を用いたIn-fusion反応により連結し、植物導入用プラスミドp909CTEを構築した。当該プラスミドは、CTE遺伝子がBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターにより発現制御され、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドによって葉緑体へと移行するよう設計された。【００６４】
３．ココヤシ由来β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子
下記の手順により、植物導入用ベクターpRI909が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子を、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子（Bar遺伝子）に置換した。Bar遺伝子は、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードする。Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子は、NCBIのGene  Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310（ACCESSION  NO.  DQ469641）の配列を参考に、Gene  Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した（配列番号１８）。人工合成遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.18とNo.19を用いたPCR反応により、Bar遺伝子を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.20とNo.21を用いたPCR反応により、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。両増幅断片をNde  IとSpe  Iで処理し、ライゲーション反応で連結して、プラスミドpRI909  Barを構築した。【００６５】
西洋アブラナ（Brassica napus）の種子で発現するBrassica napus  Napinプロモーターの配列を、NCBIのGene  Bankに開示されたBrassica napus  napin  Promoter（ACCESSION  NO.  EU416279）の配列を参考に、Gene  Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した（配列番号１９）。人工合成したプロモーター配列をテンプレートとし、プライマーNo.22とNo.23を用いて、Brassica napus  Napinプロモーター配列を増幅した。また、プラスミドpRI909  Barをテンプレートとし、プライマーNo.24とNo.25のプライマーを用いて、pRI909  Barの直鎖状断片を増幅した。さらに、プラスミドp909CTEをテンプレートとし、プライマーNo.26とNo.27を用いて、CTE-Tnapin配列を増幅した。これらの増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinを構築した。【００６６】
プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinをテンプレートとし、プライマーNo.28とNo.29を用いて、CTE遺伝子領域を含まないp909Pnapus-Tnapinの直鎖状断片を増幅した。さらに、ココヤシ胚乳由来cDNAをテンプレートとし、プライマーNo.30とNo.31を用いて、配列番号３に示すCnKAS624遺伝子を増幅した。得られた増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Pnapus-CnKAS624-Tnapinを構築した。
同様の方法で、ココヤシ胚乳由来cDNAをテンプレートとし、プライマーNo.32とNo.33を用いて、配列番号２に示すCnKAS34遺伝子を増幅し、プラスミドp909Pnapus-CnKAS34-Tnapinを構築した。
また、同様に、ココヤシ胚乳由来cDNAをテンプレートとし、プライマーNo.34とNo.35を用いて、配列番号４に示すCnKAS1567遺伝子を増幅し、プラスミドp909Pnapus-CnKAS1567-Tnapinを構築した。
なお、配列番号３に示すCnKAS624遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示すCnKAS34遺伝子の塩基配列と５７％の同一性を示す。また、配列番号３の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と５２％の同一性を示す。
また、配列番号４に示すCnKAS1567遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示すCnKAS34遺伝子の塩基配列と５８％の同一性を示す。また、配列番号４の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と５６％の同一性を示す。【００６７】
４．シロイヌナズナの形質転換
前記で構築したプラスミドp909CTEを、インプランタイノベーションズ（株）によるシロイヌナズナ形質転換受託サービスに供し、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana，  Colombia株）の形質転換体を得た。シロイヌナズナは、野生型及び形質転換体を、室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間（約4000ルクス）の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。【００６８】
次に、p909CTEを導入したシロイヌナズナ形質転換体を親株として、以下の形質転換体を作成した。
プラスミドp909Pnapus-CnKAS624-Tnapin、p909Pnapus-CnKAS1567-Tnapin、p909Pnapus-CnKAS34-TnapinをAgrobacterium tumefaciens  GV3101株にそれぞれ導入し、これを用いてp909CTEを導入したシロイヌナズナを形質転換した。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除し、さらに6〜7日間育成したものに、各プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。得られた種子を、MS寒天培地（100μg/mlクラフォラン、7μg/mlビアラフォスを含む）に播種し、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体を室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。【００６９】
５．脂質の抽出とメチルエステル化
シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて粉砕し、そこに20μlの7-ペンタデカノン（0.5mg/ml  メタノール）（内部標準）と20μlの酢酸を添加したクロロホルム0.25ml、メタノール0.5mlを加え、十分に攪拌した後、15分間静置した。さらに、1.5％KCl  0.25mlとクロロホルム0.25mlを添加し、十分に攪拌した後、15分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに、0.5Ｎ水酸化カリウム−メタノール溶液を100μl加え、70℃で30分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3ml添加して乾燥物を溶解し、80℃で10分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mlとヘキサン0.3mlを添加し、十分に攪拌した後、30分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層（上層部分）を採取し、ガスクロマトグラフィ（GC）分析に供した。【００７０】
６．GC分析
GCによりメチルエステル化した試料の分析を行った。使用したGCは、カラム：DB1-MS  （J&W  Scientific,  Folsom,  California）、分析装置：6890  （Agilent  technology,  Santa  Clara,  California）を用いて、[カラムオーブン温度：150℃保持0.5分→150〜320℃（20℃/分昇温）→320℃保持2分、注入口検出器温度：300℃、注入法：スプリットモード（スプリット比=75:1）、サンプル注入量5μl、カラム流速：0.3ml/min  コンスタント、検出器：FID、キャリアガス：水素、メイクアップガス：ヘリウム]の条件で行った。
GC解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、種子中の各脂質に対応するGCのピークは、各脂肪酸の標準品のメチルエステルの保持時間（Retention  Time,  RT）により同定した。また、各ピーク面積を内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、解析に供した全種子中に含まれる脂肪酸量を算出した。
各シロイヌナズナ種子の総脂肪酸中に含まれる各脂肪酸の割合を表２に示す。なお、表２において、野生型およびp909Pnapus-CnKAS1567-Tnapin導入株については１ラインの値を、親株（p909CTE導入株）、p909Pnapus-CnKAS34-Tnapin導入株、p909Pnapus-CnKAS624-Tnapin導入株については独立した３ラインの平均値を示した。また、Ｃ１８：ｎは、Ｃ１８不飽和脂肪酸(Ｃ１８：１〜Ｃ１８：３)の総計を表す。【００７１】
【表２】
2016021481.tif 000003
【００７２】
表２に示すように、野生型の種子に比べ、CTE遺伝子のみを導入した形質転換体の種子ではＣ１２：０脂肪酸が約３％、Ｃ１４：０脂肪酸が約１３％、Ｃ１６：０脂肪酸が約１５％増加した。
CTE遺伝子とCnKAS624遺伝子を共導入した形質転換体の種子、及びCTE遺伝子とCnKAS1567遺伝子を共導入した形質転換体の種子では、CTE遺伝子のみを発現する形質転換体の種子に比べ、Ｃ１６：０脂肪酸が大幅に増加した。一方、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸はいずれも減少した。CnKAS624遺伝子及びCnKAS1567遺伝子はいずれも、BLASTプログラム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によるホモロジーサーチを用いるとKAS  Iとしてアノテーションされた。KAS  Iは、アシル−ＡＣＰをＣ１６まで伸長させる。これらの結果から、CnKAS624遺伝子及びCnKAS1567遺伝子は、KAS  Iをコードすると考えられる。【００７３】
CTE遺伝子とCnKAS34遺伝子を共導入した形質転換体の種子では、CTE遺伝子のみを発現する形質転換体の種子に比べ、Ｃ１２：０脂肪酸が大きく増加し、Ｃ１４：０脂肪酸は同程度であった。一方、Ｃ１６：０脂肪酸は減少した。これらの結果から、CnKAS34遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰに特異性を持つKAS  IV遺伝子をコードすると考えられる。なお、CnKAS34遺伝子は、BLASTプログラムによるホモロジーサーチを用いるとKAS  IIとしてアノテーションされた。しかし、KAS  IIはＣ１６アシル−ＡＣＰをＣ１８アシル−ＡＣＰへ変換する反応を触媒する酵素であり、上記で得られたCnKAS34遺伝子の導入効果とは一致しない。KAS  IIとアノテーションされたのは、植物において、KAS  IV遺伝子がほとんど同定されていないためと考えられる。【００７４】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【００７５】
本願は、2014年8月4日に日本国で特許出願された特願2014-159011に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【配列表】
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【国際調査報告】
2016021481.tif 000004
2016021481.tif 000005
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