(57)【要約】第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料の製造方法は、第８リン酸カルシウムとゼラチンを共沈させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を生成すること、前記共沈物を洗浄液で洗浄してゼラチンを除去し、第８リン酸カルシウムのスラリーを生成すること、前記第８リン酸カルシウムのスラリー又は該スラリーから形成した乾燥顆粒をゼラチン水溶液に分散させること、及びゼラチン水溶液に分散した第８リン酸カルシウムの分散体を乾燥させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を得ることからなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料の製造方法であって、
第８リン酸カルシウムとゼラチンを共沈させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を生成すること、
前記共沈物を洗浄液で洗浄してゼラチンを除去し、第８リン酸カルシウムのスラリーを生成すること、
前記第８リン酸カルシウムのスラリー又は該スラリーから形成した乾燥顆粒をゼラチン水溶液に分散させること、及び
前記ゼラチン水溶液に分散した第８リン酸カルシウムの分散体を乾燥させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を得ること
からなる方法。
【請求項２】
前記第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体における第８リン酸カルシウムの含有量は、前記複合体の質量に対して４０質量％を超え９０質量％以下であり、ゼラチンの含有量は、前記複合体の質量に対して１０質量％以上６０質量％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体における第８リン酸カルシウムの含有量は、前記複合体の質量に対して１０質量％〜９０質量％である、請求項１に記載の方法により製造された骨再生材料。
【請求項４】
第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料の製造方法であって、
粒径１０〜１０００μｍの第８リン酸カルシウム顆粒をゼラチン水溶液に分散させること、及び
前記ゼラチン水溶液に分散した第８リン酸カルシウム顆粒の分散体を乾燥させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体であって、前記複合体における第８リン酸カルシウムの含有量が前記複合体の質量に対して１０質量％〜９０質量％であり、かつ、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対して第８リン酸カルシウム０．１〜９質量部である複合体を得ること
からなる方法。
【請求項５】
前記ゼラチン水溶液に分散させる第８リン酸カルシウム顆粒の粒径が３００〜５００μｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体の弾性率が０．４ＭＰａ以上である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料であって、前記複合体における第８リン酸カルシウムの粒径が３００〜５００μｍであり、第８リン酸カルシウムの含有量が前記複合体の質量に対して２０質量％〜９０質量％であり、
かつゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対して第８リン酸カルシウム０．１〜９質量部である骨再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連分野の相互参照）
本願は、2013年12月2日に出願した特願2013-249675号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
（技術分野）
本発明は、骨再生材料の製造方法及び該方法により製造された骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアパタイトの前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ：以下、「ＯＣＰ」と記載する場合がある）が人工骨材として用いられるようになってきている。ＯＣＰは通常、その成形性を改善するために、アルギン酸、ゼラチン（以下、「Ｇｅｌ」と記載する場合がある）、及びコラーゲン等の高分子材料との複合体の形で用いられており、例えばそのような複合体の骨再生材料として、ＯＣＰとゼラチンとの共沈物の熱脱水架橋体を含む骨再生材料（特許文献１）や、ＯＣＰ微粉末とゼラチンとの複合体を含む骨再生材料（特許文献２）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2011-234799
【特許文献２】特開2013-106644
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を含む骨再生材料は、最終的な複合体中のＯＣＰ濃度がゼラチン溶液の濃度により制限されてしまう、又は操作性が不良である等の問題があった。【０００５】
本発明の目的は、良好な操作性を呈する程度の弾性率及び／又は高濃度のＯＣＰの含有を可能にし、高い骨再生能を示す骨再生材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、共沈法及び湿式法でのＯＣＰとゼラチンとからなる複合体を含む骨再生材料の製造方法を更に詳しく検討し、特定の条件下で製造されたＯＣＰとゼラチンとからなる複合体が予期しない高い骨再生能を示し、特には良質な再生骨を生じさせることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の第１の態様によれば、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料の製造方法であって、
第８リン酸カルシウムとゼラチンを共沈させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を生成すること、
前記共沈物を洗浄液で洗浄してゼラチンを除去し、第８リン酸カルシウムのスラリーを生成すること、前記共沈物を洗浄液で洗浄してゼラチンを除去し、第８リン酸カルシウムのスラリーを生成すること、前記第８リン酸カルシウムのスラリー、又は該スラリーから形成した乾燥顆粒をゼラチン水溶液に分散させること、及び  前記ゼラチン水溶液に分散した第８リン酸カルシウムの分散体を乾燥させ、その第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を得ることからなる方法が提供される。【０００７】
本発明の一実施形態において、前記第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体における第８リン酸カルシウムの含有量は、前記複合体の質量に対して４０質量％を超え９０質量％以下であり、ゼラチンの含有量は、前記複合体の質量に対して１０質量％以上６０質量％未満である。【０００８】
本発明の別の実施形態において、前記第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体における第８リン酸カルシウムの含有量が、前記複合体の質量に対して１０質量％〜９０質量％である、上記方法より製造された骨再生材料が提供される。【０００９】
本発明の第２の態様によれば、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料の製造方法であって、
粒径１０〜１０００μｍの第８リン酸カルシウム顆粒をゼラチン水溶液に分散させること、及び
前記ゼラチン水溶液に分散した第８リン酸カルシウム顆粒の分散体を乾燥させ、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体であって、前記複合体における第８リン酸カルシウムの含有量が前記複合体の質量に対して１０質量％〜９０質量％であり、かつ、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対して第８リン酸カルシウム０．１〜９質量部である複合体を得ることからなる方法が提供される。【００１０】
本発明の一実施形態において、前記ゼラチン水溶液に分散させる第８リン酸カルシウム顆粒の粒径が３００〜５００μｍである。【００１１】
本発明の別の実施形態において、前記複合体の弾性率が０．４ＭＰａ以上である。【００１２】
本発明の第３の態様によれば、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体からなる骨再生材料であって、前記複合体における第８リン酸カルシウムの粒径が３００〜５００μｍであり、第８リン酸カルシウムの含有量が前記複合体の質量に対して２０質量％〜９０質量％であり、かつゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対して第８リン酸カルシウム０．１〜９質量部である骨再生材料が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高濃度のＯＣＰの含有し、及び／又は良好な操作性を呈する、優れた骨再生能を示す骨再生材料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】共沈法を用いて製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスクをラットの頭蓋骨の骨欠損部に埋入して8週目の再生した頭蓋骨の断面を示すへマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の写真（Ａ，Ｄ，Ｇ）（黒三角は欠損作製部位を示す）、シリウス赤染色の明視野の写真（Ｂ，Ｅ，Ｈ）、及び偏光像の写真（Ｃ，Ｆ，Ｉ）。Ａ−Ｃ：ＯＣＰ／Ｇｅｌ(１７／８３)ディスク、Ｄ−Ｆ：ＯＣＰ／Ｇｅｌ（２９／７１）ディスク、Ｇ−Ｉ：ＯＣＰ／Ｇｅｌ（４４／５６）ディスク。
【図２】湿式法を用いて製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスクをラットの頭蓋骨の骨欠損部に埋入して8週目の再生した頭蓋骨の断面を示すへマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の写真（Ａ，Ｄ）（黒三角は欠損作製部位を示す）、シリウス赤染色の明視野の写真（Ｂ，Ｅ）、及び偏光像の写真（Ｃ，Ｆ）。Ａ−Ｃ：ＯＣＰ／Ｇｅｌ(２９／７１)ディスク、Ｄ−Ｆ：ＯＣＰ／Ｇｅｌ（４４／５６）ディスク。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、単数形（a, an, the）は、本明細書で別途明示がある場合または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。
【００１６】
本発明は、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体（以下、「ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体」とも称する）を含む骨再生材料の製造方法を提供する。
【００１７】
１．共沈法(co-precipitation)によるＯＣＰの調製
本発明の方法の一態様では、共沈法で第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）を調製する。まずＯＣＰとゼラチンを共沈させて、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を形成するが、例えば、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は、ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液にカルシウム水溶液を滴下または注加する方法、ゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液にリン酸水溶液を滴下または注加する方法によって得られる。
【００１８】
ＯＣＰとゼラチンの共沈法についてはHanda T et al, Acta Biomater 2012; 8: 1190-1200又は特開2011-234799を参照されたい。
【００１９】
ゼラチンとしては、特に限定されない。通常、コラーゲンを熱処理して得られる。市販のゼラチンであってもよい。コラーゲンとしては、特に限定されない。例えば、豚、牛の皮膚、骨、腱に由来するコラーゲンが挙げられる。市販のコラーゲンであってもよい。
【００２０】
リン酸としては、水溶液中でＰＯ43-を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸アンモニウムおよび正リン酸が挙げられる。
【００２１】
カルシウムとしては、水溶液中でＣａ2+を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、酢酸カルシウム、塩化カルシウムおよび硝酸カルシウムが挙げられる。
【００２２】
リン酸とカルシウムとの割合は、特に限定されないが、好ましくは、モル比で、カルシウム１に対してリン酸が０．７１〜１．１０、より好ましくは０．７３〜１．００である。
【００２３】
ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液、ならびにゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液は、好ましくはｐＨが４．５〜７．５である。カルシウム水溶液またはリン酸水溶液を混合することによってｐＨを変動させないために、緩衝成分を含んでもよい。
【００２４】
ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液へのカルシウム水溶液の滴下または注加、あるいはゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液へのリン酸水溶液の滴下または注加は、好ましくは５０℃〜８０℃、より好ましくは約６０℃〜７５℃で行われる。５０℃未満または８０℃を超えると、ＯＣＰが生成しにくい。
【００２５】
ここで、「滴下」とは、一方の溶液の液滴を他方の溶液に加えることをいい、「注加」とは、チューブなどの中空管を用いて、一方の溶液を他方の溶液に加えることをいう。
【００２６】
次に共沈法で得たＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体から、本発明では洗浄液で洗浄してゼラチンを除去し、ＯＣＰのスラリーを生成する。洗浄液は、純水でもよいし、緩衝成分、リン酸イオン、カルシウムイオン等を含んでもよいが、好ましくは純水である。洗浄は１〜数回行なわれる。ゼラチンを一旦除去することで、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰ及びゼラチンの濃度の調節が可能となる。このＯＣＰのスラリーを、後述するようにゼラチン水溶液に添加して、本発明のＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を調製し得る。
【００２７】
さらに、上記のＯＣＰのスラリーは、加熱処理、及び整粒し、乾燥顆粒又は乾燥粉体としてゼラチン水溶液に添加してもよい。また、ＯＣＰスラリーを遠心沈降で濃縮した後、回収し、乾燥顆粒あるいは乾燥粉体としてゼラチン水溶液に添加しても良い。
【００２８】
この加熱処理は、５０℃〜２００℃、好ましくは１００℃〜１５０℃の温度で、３時間〜２４０時間、好ましくは２４時間〜１００時間行われる。これにてゼラチンとの混合用のＯＣＰ（以下、Ｃ−ＯＣＰとも称する）が調製される。この条件での加熱はＯＣＰ粒子の結晶構造や表面の物質性状（粒径を含む）に影響しないことが明らかとなっている（Suzuki O, et al., Bone Miner 1993; 20: 151-166）。
【００２９】
乾燥後のＯＣＰは、任意選択で篩い等の選別手段を用いて、適度な粒径の顆粒に整粒して、後述するようにゼラチン水溶液に分散してＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を作製してもよい。整粒後のＯＣＰ粒子径の下限は特に限定されないが、例えば、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、５３μｍ、１００μｍ、２００μｍ、２９５μｍ、３００μｍ、４００μｍ等から適宜設定できる。整粒後の粒子径の上限は特に限定されないが、例えば、９００μｍ、８００μｍ、７００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２９５μｍ等から適宜設定できる。整粒後の粒子径の範囲としては特に限定されないが、例えば、１０〜５００μｍ、５０〜３００μｍ、５３〜３００μｍ、３００〜５００μｍ等の範囲で適宜設定できる。ゼラチン水溶液のゼラチン濃度は特に限定されないが、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５〜４％（ｗ／ｖ）である。比較的高濃度、例えば１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜４％（ｗ／ｖ）のゼラチン水溶液と混合できれば、操作性がプラスされた良い材料となることが期待できる。
【００３０】
２．湿式法(wet method)によるＯＣＰの調製
本発明の方法の別の態様では、湿式法でＯＣＰを調整する。ＯＣＰは市販のものを用いてもよいし、例えば公知の湿式法（Suzuki O et al., Tohoku J Exp Med 1991; 164: 37-50）で合成してもよいし、あるいは公知の湿式法で得たＯＣＰを一部加水分解して得た非化学量論的ＯＣＰ（低結晶性ＯＣＰ：特願2008-284109）でもよい。
【００３１】
得られたＯＣＰは場合により５０℃〜２００℃、好ましくは１００℃〜１５０℃の温度で、３時間〜２４０時間、好ましくは２４時間〜１００時間乾燥させる。ＯＣＰは、通常、個々の結晶が凝集した沈殿物であり、粒径は通常１０〜１０００μｍ程度の顆粒に整粒して用いる。
【００３２】
次に、任意選択でＯＣＰを篩い等の選別手段を用いてさらに粒子径を整粒してもよい。
整粒後の粒子径の下限は特に限定されないが、例えば、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、５３μｍ、１００μｍ、２００μｍ、２９５μｍ、３００μｍ、４００μｍ等から適宜設定できる。整粒後の粒子径の上限は特に限定されないが、例えば、９００μｍ、８００μｍ、７００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２９５μｍ等から適宜設定できる。整粒後の粒子径の範囲としては特に限定されないが、例えば、１０〜５００μｍ、５０〜３００μｍ、５３〜３００μｍ、３００〜５００μｍ等の範囲で適宜設定できる。これにてゼラチンとの混合用のＯＣＰ（Ｗ−ＯＣＰとも称する）が調製される。これにてゼラチンとの混合用のＯＣＰ（Ｗ−ＯＣＰとも称する）が調製される。整粒したＷ−ＯＣＰはそのままあるいは少量の水を加えた後、ゼラチンと混合してＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体作製に供する。
【００３３】
ゼラチン水溶液に分散し凍結乾燥して複合体にしたときとＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中とでは、ＯＣＰの寸法がほぼ変化しないと考えてもよいが、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの粒子径はＳＥＭ等で確認することができる。
【００３４】
なお、本願発明の効果が得られる限りにおいて、上記の粒径から外れた粒径のＯＣＰがごくわずか含まれている場合でも、当然本願発明の範囲に含まれる。
３．調製されたＯＣＰからのＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の作製
次に、上記の「１．共沈法によるＯＣＰの調製」で得られたＣ−ＯＣＰ又は「２．湿式法によるＯＣＰの調製」で得られたＷ−ＯＣＰを、ゼラチン水溶液に分散させる。ゼラチン水溶液のゼラチン濃度は特に限定されないが、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５〜４％（ｗ／ｖ）である。ゼラチン水溶液のｐＨとしては、特に限定されないが、好ましくは５〜８である。ゼラチン水溶液は緩衝成分、リン酸イオン、カルシウムイオンを含んでいてもよい。ゼラチン水溶液に分散させるＯＣＰと、ゼラチンとの割合は特に限定されないが、通常ゼラチン１質量部に対してＯＣＰが０．１〜９質量部、好ましくはゼラチン１質量部に対してＯＣＰが０．６〜９質量部である。
【００３５】
通常、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は、複合体の質量に対して１０質量％〜９０質量％のＯＣＰと、１０質量％〜９０質量％ゼラチンとを含み、好ましくは複合体の質量に対して２０質量％〜９０質量のＯＣＰと、１０質量％〜８０質量％のゼラチンとを含み、より好ましくは複合体の質量に対して高濃度の４０質量％〜９０質量％のＯＣＰと、１０〜６０質量％のゼラチンとを含む。複合体には後述するように第３の成分が含まれてもよい。
【００３６】
本発明の骨再生材料であるＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰとゼラチンの合計量は、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の質量に対し、つまりＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の質量を１００質量％として６０質量％以上、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５％質量以上、より好ましくは９８％質量以上、最も好ましくは９９％質量以上である。好ましい一つの実施形態では、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体はＯＣＰとＧｅｌのみからなり、他の成分を実質的に含まない。
【００３７】
一実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は１０質量％〜９０質量％のＯＣＰを含み、、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は１０質量％〜９０質量％のＯＣＰと、１０〜９０質量％のゼラチンとを含む。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は２０質量％〜９０質量％のＯＣＰを含み、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は２０質量％〜９０質量％のＯＣＰを含み、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は２０質量％〜９０質量％のＯＣＰと、１０〜８０質量％のゼラチンとを含む。ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％〜９０質量％のＯＣＰを含み、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％〜９０質量％ＯＣＰと、１０質量％〜６０質量％のゼラチンとを含む。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％よりも大きく９０質量％以下のＯＣＰを含み、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％よりも大きく９０質量％以下のＯＣＰと、１０質量％以上６０％未満のゼラチンとを含むる。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％よりも大きく９０質量％以下のＯＣＰを含み、ゼラチンと第８リン酸カルシウムとの配合割合がゼラチン１質量部に対してＯＣＰ０．６〜９質量部である。別の実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は４０質量％よりも大きく９０質量％以下のＯＣＰと、１０質量％以上６０質量％未満のゼラチンとを含む。これらの実施形態の湿式法におけるＯＣＰの粒径は１０〜１０００μｍ、例えば３００〜５００μｍである。
【００３８】
上記の実施形態のＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体によると、骨質が良い状態での骨の再生が可能である。
【００３９】
ＯＣＰを共沈法で調製する場合、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体からゼラチンを一旦除去して再度ＯＣＰをゼラチン水溶液と混合することから、ＯＣＰとゼラチンとの割合の調製が容易となり、これまで困難であった４０質量％を超える濃度のＯＣＰを含むＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の調製が可能となる。一方、ＯＣＰを湿式法で調製する場合、ゼラチン水溶液の濃度が高くても複合体の調製ができる上、ゼラチン水溶液のゼラチン濃度が高くてもＯＣＰ／ゼラチン複合体を製造でき、操作性が良好である。また、湿式法において得られたＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は、ＯＣＰ濃度が低くても比較的高い弾性率を有する。弾性率は例えば０．４ＭＰａ以上である。一実施形態において、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体のＯＣＰが５０質量％未満の場合に弾性率が０．３ＭＰａを超え、ＯＣＰが５０質量％以上の場合にＯＣＰで弾性率が０．４ＭＰａを超える。
【００４０】
次に、前記ゼラチン水溶液に分散したＯＣＰの分散体を乾燥させ、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を得る。乾燥は、通常凍結乾燥であり、乾燥条件は特に限定されない。予備凍結温度としては、例えば、−１０〜−１９６℃が挙げられ、凍結温度としては、例えば、−４０〜−９０℃が挙げられ、圧力としては、例えば、５０Ｐａ以下が挙げられる。通常１０〜７２時間で凍結乾燥物が得られる。この凍結乾燥物はＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の一態様である。
【００４１】
凍結乾燥物は、さらに熱架橋処理に供してもよい。熱架橋処理により、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の安定性を高めることができる。熱架橋条件としては、特に限定されない。熱架橋処理温度としては、例えば、１００〜２００℃が挙げられ、処理時間としては、通常６〜４８時間が挙げられる。
【００４２】
本発明のＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を含む骨再生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。
【００４３】
本発明の骨再生材料は、通常１０〜５００μｍ、好ましくは１００〜３００μｍの細孔径を有する。細孔径が１０μｍ以上であると、細孔内への細胞の浸入が円滑であり、５００μｍ以下であると、骨再生材料の強度が維持される。また、通常０．１〜１．０ＭＰａ、好ましくは０．２〜０．６ＭＰａの弾性率を有する。弾性率が０．１ＭＰａ以上であると、骨再生材料の硬さが維持されるため、骨再生材料からなる成形体の操作性が良好であり、１．０ＭＰａ以下であると、骨再生材料からなる成形体を骨欠損部の形状への加工性が良い。
【００４４】
本発明の骨再生材料は、適宜成形して使用する。成形手段としては、特に限定されない。例えば、骨再生材料を適当な型に入れて固める方法、固める際に圧力を加える方法が挙げられる。成形体の形状としては、特に限定されない。例えば、ディスク、ブロック、シートが挙げられる。ディスクの大きさとしては、特に限定されない。例えば、直径は、通常３〜２０ｍｍ、好ましくは５〜１０ｍｍである。例えば、厚みは、通常０．５〜５ｍｍ、好ましく１〜２ｍｍである。ブロックの大きさとしては、特に限定されない。例えば、長さ５〜１５ｍｍ、幅５〜５０ｍｍ、高さ５〜１００ｍｍ、好ましくは、長さ８〜１２ｍｍ、幅１０〜３０ｍｍ、高さ１０〜５０ｍｍである。
【００４５】
成形体は、骨欠損部の形状に応じて適宜整形され、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。
【００４６】
本明細書中に引用されているすべての特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００４７】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００４８】
実施例１
（共沈法によるＯＣＰ（Ｃ−ＯＣＰ）の調製）
最終濃度0.5%(w/v)のゼラチン（ブタ皮膚由来のゼラチン乾燥粉末(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)を用いて純水で調製、最終濃度0.5%(w/v)）共存下でカルシウム（酢酸カルシウム一水和物、最終モル濃度  0.040 mol/L）およびリン酸（リン酸二水素ナトリウム二水和物、最終モル濃度  0.040 mol/L）の溶液から、共沈法でＯＣＰ／Ｇｅｌスラリーを合成する（Handa T et all, Acta Biomater 2012; 8: 1190-1200）。得られたスラリーを純水で５回洗浄してゼラチンを除去し、ＯＣＰスラリーとした。ＯＣＰスラリーを一定量採取し，105℃で24時間乾燥後、質量を計測してスラリー1mLあたりのＯＣＰ含有量を算出した。【００４９】
（湿式法によるＯＣＰ(Ｗ-ＯＣＰ) の調製）
通法に従い湿式法（Suzuki O et al., Tohoku J Exp Med 1991; 164: 37-50)にて顆粒ＯＣＰを合成し，105℃で24時間乾燥を行った。乾燥後、ふるいを用いて粒子径300〜500μmに整粒した。整粒したＷ−ＯＣＰを、最終的なＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰ添加時の濃度が17，29，44質量％となるように計量し、少量の純水に加え、Ｗ-ＯＣＰ懸濁液とした。【００５０】
（ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの作製）
（１）ゼラチン溶液の調製
ブタ皮膚由来のゼラチン乾燥粉末(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO) を0.5及び3.0％(w/v)となるように純水に加え、室温で30分間攪拌し、膨潤させた。この時、最終ＯＣＰ／Ｇｅｌ溶液量から、後で加えるＣ-ＯＣＰスラリー若しくはＷ-ＯＣＰ懸濁液の容量を差し引いた分量となるように純水を計量する。膨潤・溶解後、攪拌しながら加熱して溶液温度40〜50℃でゼラチンを完全に溶解させた。【００５１】
（２）ＯＣＰの添加及びディスクの成形
上記（１）で得られたゼラチン溶液に、最終的なＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が17，29，44％となるようにＣ−ＯＣＰスラリーもしくはＷ−ＯＣＰ懸濁液を添加、混和した。Ｃ−ＯＣＰスラリーは0.5％(w/v) のゼラチン水溶液と混和し、Ｗ−ＯＣＰ懸濁液は3.0％(w/v) のゼラチン水溶液と混和した。かかるＣ−ＯＣＰスラリー又はＷ−ＯＣＰ懸濁液とゼラチン水溶液との混合物を内径9ｍｍの樹脂性チューブに充填し、-20℃にて24時間予備凍結させ、3日間凍結乾燥させてシリンダー状のＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を得た。シリンダー状ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を切断、ディスク状（直径９ｍｍ、厚さ１ｍｍ）に成形後、真空乾燥機(Vacuum Drying Oven DP32，ヤマト科学株式会社) で熱架橋処理(150℃，24時間) および滅菌処理を行った。得られたＯＣＰ／Ｇｅｌディスク中のＯＣＰとゼラチンの割合は、ＯＣＰの比率が17，29，44質量％の場合、ゼラチンの質量比率はそれぞれ83，71，56質量％である。【００５２】
実施例２
（評価）
（１）骨形成の検証
セボフルランおよび塩酸メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールを用いて、ラット（Ｗｉｓｔａｒ、12週齢、雄性）に全身麻酔を施した。次いで、ラットの頭蓋部皮膚を剃毛し、露出した皮膚およびその下の骨膜をメスで切開した。頭蓋骨正中部に直径９ｍｍの骨欠損部を形成した。次いで、実施例１のＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを、骨欠損部に埋入して骨膜および皮膚を縫合した。【００５３】
埋入から8週間後、ラットから摘出した頭蓋骨の脱灰標本を用いて、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及びシリウス赤染色により組織学的分析を行った。また、シリウス赤染色では、顕微鏡での標本の明視野観察及び偏光観察を行なった。共沈法を用いて製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを用いた場合の結果を図１に、湿式法を用いて製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを用いた場合の結果を図２に示す。【００５４】
図１によると、共沈法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）で、17質量％−44質量％のＯＣＰ濃度の材料を検討し、ゼラチンは調整の初期濃度０．５％(w/v)のゼラチンを用いたが、埋入から8週間後のラット頭蓋冠骨欠損での検討で、良好な骨形成能、良好な材料の吸収性、及びよく組織化された再生骨の再生が確認された。具体的には、へマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の写真（図１Ａ，Ｄ，Ｇ）によると、欠損作製部位（黒三角）がＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を埋入しない対照（図示せず）と比較して、17質量％、29質量％、44質量％のいずれのＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの場合にも欠損作製部位が修復されていることが確認された。また、シリウス赤染色の明視野の写真（図１Ｂ，Ｅ，Ｈ）、によると、再生骨基質（コラーゲン）が母床骨（写真下側）に近づいており、よく組織化された再生骨（ordered bone）の再生が確認された。シリウス赤染色の偏光の写真（図１Ｃ，Ｆ，Ｉ）によると、明視野の写真のコラーゲン線維の走行のコントラストが顕著に示され、ＯＣＰの濃度が高いほど骨質が良い状態で骨が再生することが確認された。【００５５】
図２によると、湿式法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｗ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）で、29質量％及び44質量％のＯＣＰ濃度の材料を検討し、図１の共沈法で製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを用いた場合の結果と同様、良好な骨形成能、良好な材料の吸収性、及びよく組織化された再生骨の再生が確認された。具体的には、へマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の写真（図２Ａ，Ｄ）によると、欠損作製部位（黒三角）がＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を埋入しない対照（図示せず）と比較して、29質量％、44質量％のＯＣＰ／Ｇｅｌディスクいずれの場合にも欠損作製部位が修復されていることが確認された。また、シリウス赤染色の写真（図２Ｂ，Ｅ）によると、再生骨基質（コラーゲン）が母床骨（写真下側）に近づいており、よく組織化された再生骨（ordered bone）の再生が確認された。【００５６】
偏光像の写真（図２Ｃ，Ｆ）によると、シリウス赤染色の写真のコラーゲン線維の走行のコントラストが顕著に示され、ＯＣＰの濃度が高いほど骨質が良い状態で骨が再生することが確認された。【００５７】
（２）染色による骨形成率の測定
ＨＥ染色の結果から、組織形態計測により、共沈法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）で骨形成量および残存ＯＣＰ量を定量し、新生骨形成率＝骨形成量／骨欠損面積×１００を算出した。【００５８】
表１に示されるように、共沈法で製造したＣ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを埋入したラットでは、8週間及び12週間の骨形成率は対照と比べて有意に高く（p<0.01）、17質量％、29質量％、44質量％のいずれのＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの場合も５０％を超える高い形成率を示し、ＯＣＰ濃度が高くなると骨形成率が高くなる傾向も示された（平均値±標準偏差、各群n=5,但し8週の対照及び17%C-OCP/Gelはn=4、8週目：対照14.05±9.09%、17%C-OCP/Gel  65.79±6.16%、29%C-OCP/Gel 59.16±15.00%、44%C-OCP/Gel 74.76±9.68%、12週目：対照30.17±4.90、17%C-OCP/Gel  62.71±9.97%、29%C-OCP/Gel 79.73±4.28%、44%C-OCP/Gel 80.56±8.03%）。【００５９】
【表１】
2015083668.tif 000002
【００６０】
さらにシリウス赤染色の結果から、新生骨中の高配向性骨形成率を計算した。まず、明視野像で新生骨面積を計測し、次に同一標本の偏光像で高配向性新生骨面積（偏光下で緑〜青色に観察されるコラーゲン線維の配向性が高い面積）を計測し、高配向性骨形成率＝高配向性新生骨面積／新生骨面積×１００を算出した（各群のn数はＨＥ染色と同じ）。【００６１】
表２に示されるように、8週間及び12週間の新生骨中の高配向性骨形成率は、共沈法で製造したＣ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを埋入したラットでは17質量％、29質量％、44質量％のいずれのＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの場合も対照と比べて有意に高く（p<0.05）、ＯＣＰ濃度が高くなると高配向性骨形成率が高くなる傾向も示された（平均値±標準偏差、各群n=5,但し8週の対照及び17%C-OCP/Gelはn=4、8週目：対照0.63±0.48%、17%C-OCP/Gel  33.25±6.34%、29%C-OCP/Gel 41.78±9.83%、44%C-OCP/Gel 50.00±4.69%、12週目：対照0.93±1.41、17%C-OCP/Gel  47.58±12.13%、29%C-OCP/Gel 66.25±9.91%、44%C-OCP/Gel 68.00±8.08%）。【００６２】
【表２】
2015083668.tif 000003
【００６３】
（４）弾性率
実施例１で得られた各ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの弾性率を万能試験機（株式会社島津製作所製、ＥＺ−Ｌ−５００Ｎ）により測定した。内径９ｍｍ×厚み１ｍｍのディスクを圧縮試験用治具に設置し、一定のクロスヘッドスピードで荷重−変位曲線を測定して、連続性のある曲線部分にて、荷重−変位の値から応力−ひずみの値（応力／ひずみ：弾性率）を計算した。結果を表３に示す。【００６４】
表３から明らかなように、湿式法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｗ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）では、ＯＣＰの割合が増えるに従い弾性率が上昇し、埋入の際に操作性の良い弾性率であった（各群のn=4,29%W-OCP/Gel 0.38±0.04MPa、44%W-OCP/Gel 0.49±0.03MPa）。これは共沈法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）の弾性率（各群のn=4,17%C-OCP/Gel 0.014±0.001MPa、29%C-OCP/Gel 0.012±0MPa、77%C-OCP/Gel 0.018±0.004MPa）よりも高かった。【００６５】
【表３】
2015083668.tif 000004
【００６６】
さらに、C-OCPの乾燥顆粒（粒径300-500μm）を3%(w/v)Gelに分散させて作製したＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が77%であるＣ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体と、W-OCP（粒径300-500μm）を3%(w/v)Gelに分散させて作製したＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が77%であるＷ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を、実施例１の手順に従って作製したところ、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が17，29，44質量％のＣ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体及びＷ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体よりも弾性率がそれぞれ顕著に増大していた（データ非図示）。
【図１】
2015083668.tif 000005
【図２】
2015083668.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月3日(2015.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
［表２］
2015083668.tif 000007
［００６３］
（４）弾性率
実施例１で得られた各ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの弾性率を万能試験機（株式会社島津製作所製、ＥＺ−Ｌ−５００Ｎ）により測定した。内径９ｍｍ×厚み１ｍｍのディスクを圧縮試験用治具に設置し、一定のクロスヘッドスピードで荷重−変位曲線を測定して、連続性のある曲線部分にて、荷重−変位の値から応力−ひずみの値（応力／ひずみ：弾性率）を計算した。結果を表３に示す。
［００６４］
表３から明らかなように、湿式法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｗ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）では、ＯＣＰの割合が増えるに従い弾性率が上昇し、埋入の際に操作性の良い弾性率であった（各群のｎ＝４，２９％Ｗ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ  ０．３８±０．０４ＭＰａ、４４％Ｗ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ  ０．４９±０．０３ＭＰａ）。これは共沈法で調製したＯＣＰより製造したＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）の弾性率（各群のｎ＝４，１７％Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ  ０．０１４±０．００１ＭＰａ、２９％Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ  ０．０１２±０ＭＰａ、４４％Ｃ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ  ０．０１８＋０．００４ＭＰａ）よりも高かった。
［００６５］
［表３］
2015083668.tif 000008
［００６６］
さらに、Ｃ−ＯＣＰの乾燥顆粒（粒径３００−５００μｍ）を３％（ｗ／ｖ）Ｇｅｌに分散させて作製したＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が７７％であるＣ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体と、Ｗ−ＯＣＰ（粒径３００−５００μｍ）を３％（ｗ／ｖ）Ｇｅｌに分散させて作製したＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体中のＯＣＰの質量比率が７７％であるＷ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を、実施例１の手順に従って作製したところ、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合
【国際調査報告】
2015083668.tif 000009
2015083668.tif 000010
2015083668.tif 000011
2015083668.tif 000012