(57)【要約】  本発明は、ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料および該材料によって形成されるミセルを提供することを目的とする。  チオールとハロゲン化アルキルの反応性を利用して、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標識タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）とを水性溶媒中、又は前記水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で混合して形成された、種々の分子量の化合物や生体高分子を取り込むことができるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料：
【化１】
2016084979.tif 000032
（式（Ｉ）中、Ｅ１は、炭素、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよく、Ｅ２は、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよく、Ｒ１はヘテロ原子を含んでもよい同一または異なった炭化水素基であり、場合によっては、Ｅ１を含んで環を形成してもよく、Ｒ２は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭化水素鎖を示し、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は酸素、窒素あるいはカルボニル基、エーテル基、アミド基を含んでもよい同一または異なった炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基を示し、ｌは０〜２の整数であり、ｍは０〜２の整数であり、ｋは０又は１の数を示し、ｋが０のときは３−ｍは１である。）
【請求項２】
Ｅ１およびＥ２がケイ素であり、ｋが１、ｌが２，ｍが０である請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項３】
Ｒ１が下記式（II）で表されるシロール基であってＥ１を含んで環を形成している請求項１又は２に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化２】
2016084979.tif 000033
（式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。）
【請求項４】
前記式（II）中、XはSiであり、Rnは、４個のフェニル基を表すことを特徴とする、請求項３に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項５】
前記式（Ｉ）中、前記((-R5-E2)(R2)m)kは−(CH2)3−Si−であり、前記((-R3-S-R4-Y)3-mは、(−(CH2)3−Y)3であることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項６】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（III）で表されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
2016084979.tif 000034
【請求項７】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、イオウ原子に置換された１個のＹと、前記イオウ原子を介して結合された、標的配列提示部とをさらに備え、水性溶媒中で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成する、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項８】
前記標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質で構成されていることを特徴とする、請求項７に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項９】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（IV）で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
2016084979.tif 000035
【請求項１０】
前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１１】
前記標的認識部位は、標的組織へ前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が形成したミセルを送達するための機能性ペプチドであることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１２】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１３】
前記機能性ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記機能性ペプチドの結合体が細胞以内へのエンドサイトーシスを促進するものであることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料によって形成され、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ミセル。
【請求項１５】
前記分子量２０万以下のタンパク質は、免疫グロブリンG、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のミセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達システムに使用可能な、カルボシランデンドリマー、そのデンドリマーを用いた薬物送達システム用凝集性担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、様々な疾患治療薬の開発が進んでいるが、なかでも、抗体、ペプチドアプタマー、核酸等の生体高分子は、次世代医薬品として注目を集めている。こうした生体高分子は、製造工程における品質管理、製剤の保存、及び投与方法等、様々な点で従来の低分子化合物を有効成分とする医薬品とは異なる取り扱いをする必要がある。【０００３】
一般に、医薬製剤を投与する場合、治療を要する疾病と薬剤の性質にもよるが、標的部位にどれだけの有効成分を送達できるかが奏効率に影響する。とりわけ、生体高分子を有効成分とする場合には、投与時の剤形によって抗体が生成されて有効性が低下し、それによって治療効果も下がるといった問題も生じることが知られている。【０００４】
このため、こうした医薬薬剤を標的部位に適切に送達するための手段として、様々の薬剤送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）の開発が、盛んに行われている。ＤＤＳに使用する担体としては、例えば、リポソーム、合成樹脂粒子等を挙げることができ、こうした担体を使用した製剤としては、例えば、標的部位に局在する分子と特異的に結合するリガンドをリポソーム等に結合させたもの（特許文献１、及び２参照）、リポソームや合成樹脂粒子等の表面にＮ−アセチルグルコサミンその他の糖を露出させたもの（特許文献３及び４参照）、及びミセルに抗体を結合させたもの（特許文献５参照）などが報告されている。【０００５】
また、ミセル構造となるデンドリマーを利用した担体についても、開発が進められつつある（特許文献６、７及び８参照）。デンドリマーとは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする、規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーは数分子が集合すると球状となり、その内部にナノメートルスケールの空間が形成される。そして、この空間に様々な官能基が現れるように分子を組み込むこともでき、こうした設計の自由度が高い。このため、現在、ナノテクノロジーの分野においては、様々な新規デンドリマーの開発が盛んに行われている。【０００６】
デンドリマーは、ＤＤＳの担体として、また、生体系における外部刺激に応答する分子センサーとして利用できる可能性がある。これまでに、ウイルスや細菌への感染によって生じる疾患を予防及び／又は治療するために、例えば、デンドリマーを利用した担体の開発が行われてきている（特許文献９参照）。【０００７】
一方、ＡＩＥ（aggregation-induced emission；発光性化合物が互いに凝集し合い、特定の波長の光を照射することによって、高効率発光を惹起する現象）効果を有するシロール基を含有するデンドリマー（以下、本明細書においては、「カルボシランデンドリマー」という。）は、通常、ミセルを形成すると蛍光発光することが知られている（非特許文献１参照）。しかし、蛍光タンパク質と結合させた場合に、同様の発光が生じることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０１１６３２
【特許文献２】ＷＯ２００５／０１１６３３
【特許文献３】特開２００７−    １９２３
【特許文献４】特開２００９−  ４６４１３
【特許文献５】特開２０１４−  ７３９７５
【特許文献６】特開２００１−２０６８８５
【特許文献７】特開２００５−１２００６８
【特許文献８】特開２００７−２３８８６０
【特許文献９】特許第５６２９８８８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chem Commun (Camb). 2009 Aug 7;(29):4332-53. doi: 10.1039/b904665h. Epub 2009 May 13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、ＤＤＳ用の担体の研究は精力的に行われてはいるものの、生体高分子の特性を損なうことなく、効率的に輸送することは、非常に難しい。具体的に言えば、生体への投与ルートのうち、経口投与の場合には、胃酸という強酸で担体が分解されないようにしない限り、有効成分である生体高分子は腸には到達し得ず、吸収もされないことになる。【００１１】
また、静脈投与（静脈注射）の場合には、血流中に一時に高濃度の薬剤を投与することはできるが、血中の薬剤濃度は分解、尿中への排出、肝臓への蓄積等で時間と共に急速に低下したり、標的性が無いまま血中に留まる等、標的部位に有効濃度で送達させることは難しい。そして、標的部位に送達する薬剤の量を増やそうとすると、重篤な副作用が発生する場合もある。或は少量を何度も投与するなど患者や医療従事者の負担が多大になる。例えば、前者では、パーキンソン病の治療薬であるレボドパのように、この薬剤の血液脳関門の通過量が非常に少ないために奏効率が上がらないものもある。一方でレボドパの投与量を増やすと、標的部位である脳以外にもレボドパの分解酵素があるため、重篤な副作用が現れて、それ以上治療が続けられなくなるということが実際に起こっている。【００１２】
さらに、こうした担体は、生体高分子という大きな分子量の薬剤をその内部に取り込むことができるという特性に加えて、投与後の生体との相互作用ができる限り小さいものという特性も必要である（生体適合性）。さらに、標的部位に送達されるまでの間は、安定した構造を保つことができ、標的部位に送達されたときに、取りこんだ分子（有効成分）を速やかに放出できるという性質も求められる。
これまで、こうした特性・性質を有する担体は実用化されておらず、こうした特性・性質を有する担体に対する強い社会的要請があった。最近ではexosomeなどの天然のナノ粒子及び細胞（例えば、赤血球）の持つ標的性や生体適合性をＤＤＳに利用する研究が盛んであるが薬剤の内包技術が完成しておらず、実用化には至っていない。【００１３】
ところで、デンドリマーは、有機溶媒と水性溶媒との混合溶媒の条件下において、ミセル（疎水性部分がミセルの内側に存在する構造）、および逆ミセル（親水性部分がミセルの内側に存在する構造）を形成することが知られていた。【００１４】
上述したように、これまで行われた様々な研究においては、上記カルボシランデンドリマーの側鎖の末端に親水基、例えば、糖やアミノ酸、PEG等親水性分子を担持させ、こうした化合物の親水基が外側に向くようにミセルを形成させ、そうしたミセルをドラッグデリバリーシステムで実用的に利用できるか否かが検討されてきた。同一分子内に親水基が存在しない限り、ミセルは形成されないからである。
しかし、これらの親水基を担持させたカルボシランデンドリマーでは、それらが標的組織に送達されたか否かを、生体内で観察することは不可能である。ＡＩＥミセルは発光はするものの、環境依存であり、発光も弱いことによる。【００１５】
一方、こうした分子に担持させることができる親水性分子とタンパク質とでは分子量が大きく相違すること、及びタンパク質は溶媒のpHや塩濃度その他の溶媒の条件によって容易に変性するため、上記のような親水性分子をタンパク質に替えることは非常に困難とされていた。【００１６】
このため、標的組織への送達や薬剤の放出を確認し量を見積もるツールとして、強い蛍光を発しつつ生体標的性や適合性を有する生体高分子、例えば、蛍光タンパク質、をこうしたカルボシランデンドリマーに担持させた分子で蛍光二分子間の相互作用を利用し上記性能を獲得させた複合分子に対する強い社会的要請があった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、チオールとハロゲン化アルキルの反応性を利用して、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標識タンパク質とを（例えば、緑色蛍光タンパク質）を水性溶媒中、又は前記水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で混合したところ、前記デンドリマーとタンパク質との複合体である凝集性分子が形成されること、かつ、この凝集性分子は、タンパク質を外側に向けた状態でミセルを形成することを初めて見出した。ここで、前記水性溶媒は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水その他の溶質を含む。【００１８】
また、本発明の発明者等は、さらに、上記のようなタンパク質をデンドリマーに担持させると、ミセル形成が誘導されることを見出した。さらに、上記タンパク質、上記カルボシランデンドリマー、及びモデル薬剤を混合したところ、上記モデル薬剤を内包したミセルが形成されることも見出した。こうしたモデル薬剤としては、例えば、色素、抗体等が挙げられる。【００１９】
加えて、本発明の発明者らは、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有デンドリマーが生理食塩水中で発光すること、及びその発光現象が、シロールと蛍光タンパク質との間における共鳴エネルギー移動（FRET）によるものであることをも見出した。
さらに、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有カルボシランデンドリマーによって形成されるミセルの内径は、およそ50nm〜500nm程度であること、及びこのような内径を有するミセルには、その内部に種々の薬剤を内包させることが可能であることをも見出した。【００２０】
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、種々の分子量の化合物や生体高分子を取り込むことができるカルボシランデンドリマー、前記デンドリマーを用いたＤＤＳ用薬剤、及びその製造方法を提供することを目的とする。【００２１】
本発明は、以下の態様を含むものである。
本発明の一の実施態様においては、本発明は、下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料である。【００２２】
【化１】
2016084979.tif 000002
【００２３】
ここで、上記式（Ｉ）中、Ｅ１は、炭素、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよい。また、Ｅ２は、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１はヘテロ原子を含んでもよい同一または異なった炭化水素基であり、場合によっては、Ｅ１を含んで環を形成してもよい。Ｒ２は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭化水素鎖を示す。Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は同一または異なった炭化水素鎖であり、酸素、窒素、カルボニル基、エーテル基、及びアミド基のいずれかを含んでもよい。Ｙはハロゲン基を示す。ｌは０〜２の整数であり、ｍは０〜２の整数であり、ｋは０又は１であり、ｋが０のときは３−ｍは１である。【００２４】
また、Ｅ１およびＥ２はケイ素であり、ｋが１、ｌが２，ｍが０であることが好ましい。さらに、Ｒ１は、Ｅ１を含んで環を形成している下記式（II）で表されるシロール基であることが好ましい。ここで、式（II）中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４であることが好ましい。【００２５】
【化２】
2016084979.tif 000003
【００２６】
また、前記式（Ｉ）中、前記((-R5-E2)(R2)m)kは−(CH2)3−Si−であり、前記((-R3-S-R4-Y)3-mは、(−(CH2)3−Y)3であることが好ましい。より好ましくは、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（III）で表されるものである。【００２７】
【化３】
2016084979.tif 000004
【００２８】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子に含まれる、少なくとも１個のＹがイオウ原子に置換され、前記イオウ原子を介して結合された、標的配列提示部（TSPP）をさらに備え、水性溶媒中で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成するものであることが好ましい。【００２９】
ここで、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（IV）〜（IX）で表されるものとなる。【００３０】
【化４】
2016084979.tif 000005
【００３１】
【化５】
2016084979.tif 000006
【００３２】
【化６】
2016084979.tif 000007
【００３３】
【化７】
2016084979.tif 000008
【００３４】
【化８】
2016084979.tif 000009
【００３５】
【化９】
2016084979.tif 000010
【００３６】
ここで、前記標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質で構成されていることが好ましい。そして、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。【００３７】
また、前記標的認識部位は、標的組織へ前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が形成したミセルを送達するための機能性ペプチドであることが好ましい。前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、薬剤等を送達し得る担体の製造に必要なＤＤＳ用凝集性担体材料を作製することができる。そして、上記担体材料（凝集性分子）を用いて、ＤＤＳ用薬剤の担体（ミセル）を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、一般的なカルボシランデンドリマーの基本的な形態を示す模式図である。
【図２】図２は、ジメチルシランからの、ジメチルダンベル（１）６-Brの合成スキームを示した図である。
【図３】図３は、作製したミセルの粒径の分布を示すグラフである。
【図４】図４は、作製したミセルを走査型顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したときの、典型的な電子顕微鏡写真である。
【００４０】
【図５】図５は、ＧＦＰと式（X）に示すシロールデンドリマーとの複合体（以下、「GFP-シロールデンドリマー複合体」という。）、ＧＦＰのみ、または、式（X）に示すシロールデンドリマーのみでインキュベートして得られた産物の発光特性を調べた結果を示す図である。
【００４１】
【図６】図６は、薬剤モデルの存在下で作製したミセルの粒径の分布を調べた結果を示す図である
【図７】図７は、DiIを内包させたGFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセルを360nmで励起したときの発光特性を調べた結果を示す図である。
【００４２】
【図８】図８は、Alexa594で標識したＷＧＡを内包させたGFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセルを360nmで励起したときの発光特性を調べた結果を示す図である。
【図９】図９は、アニーリング温度を変えてインバースＰＣＲを行った後の、ＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図１０】図１０は、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの蛍光スペクトルを測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＭＣＦ−７の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの粒径分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、上述した通りの下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料である。
【００４４】
【化１０】
2016084979.tif 000011
【００４５】
ここで、上記式（Ｉ）で表される化合物は、（ａ）下記式（II）で表されるシロール基と（ここで、Ｒ１は、Ｅ１を含んで環を形成している）；
【００４６】
【化１１】
2016084979.tif 000012
【００４７】
（ｂ）−(CH2)3−Si−である(-R5-E2)(R2)m)kと、(−(CH2)3−Y)3である(-R3-S-R4-Y)3-mとを含むものであることが、水性溶媒中での適度な大きさのミセルを形成することから好ましい。本発明のカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）は、以下の構造を有する化合物であることが、凝集性と後述する標的配列提示部とを備えるようにすることができることから、さらに好ましい。
【００４８】
【化１２】
2016084979.tif 000013
【００４９】
一般的なカルボシランデンドリマーの構造を、図１のＡ〜Ｃに示す。図１のＡに示す化合物はファン(0)3と呼ばれるものであり、この化合物は、円で囲んだベンゼン環をコアとしている。図１のＢに示す化合物は、ダンベル(1)6と呼ばれるものであり、図１のＡに示す２分子のファン(0)3分子が、コアに代えて、２つのメチル基がついたケイ素（Me-Si-Me）で結合されている。図１のＣに示す化合物は、ボール(1)6と呼ばれる化合物であり、ダンベルのMe-Si-Meのメチル基に代えて、ファン(0)3のコアが外れた分子が結合し、球状となっている。
【００５０】
本発明のカルボシランデンドリマーの構造は、従来のカルボシランデンドリマーとは全く相違しており、分子の末端に結合している臭素原子の１つが標的配列提示部との結合に関与する。ここで、標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質であることが、上記デンドリマーで形成されるＤＤＳ用薬剤の特異的な送達を可能にする上で好ましい。
【００５１】
そして、上記標的配列を構成するタンパク質は、チオール基を有するものであり、前記チオール基はフォールディングされたタンパク質の外側に位置していることが好ましい。
【００５２】
チオール基は、上記デンドリマー中に存在するハロゲン原子と反応し、タンパク質とデンドリマーとを結合させる役割を担うため、フォールディングされたタンパク質の内側に位置していても、結合に関与できないからである。ここで、「チオール基を有するタンパク質」には、元々チオール基を有しているタンパク質のほか、遺伝子工学的手法等を用いて新たにチオール基を導入したもの、及びシステインを含むタンパク質のシステインが還元されて、チオール基となったもの等が含まれる。
【００５３】
タンパク質中のチオール基の存在位置は特に限定されないが、タンパク質上の特定の領域にチオール基が存在することが好ましい場合もある。なお、「システインを含むタンパク質」に含まれるシステインは、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、所望の位置への挿入による方法その他の遺伝子工学的手法等により、所望の位置に導入されたものであってもよい。タンパク質の所望のアミノ酸の位置にシステイン残基を導入することは、部位特異的突然変異導入法その他の公知の遺伝子工学的手法を使用することにより、当業者であれば容易に実施することができる。
【００５４】
上記の標的配列提示部を構成するタンパク質は、会合する性質（以下、「会合性」ということがある。）を有するものであればよく、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（以下、下記のような緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を集合的に「ＧＦＰ」ということがある。）及びその変異体を含む蛍光タンパク質を使用することが好ましい。こうした蛍光タンパク質が結合した上記カルボシランデンドリマーは、タンパク質が会合すると強い蛍光を発し、会合状態を容易に検出できるからである。
【００５５】
本発明において使用することができるＧＦＰとしては、例えば、配列表の配列番号１に示すＧＦＰ、配列番号２に示すＧＦＰ、配列表の配列番号３に示すＢＦＰ（青色蛍光タンパク質)、配列表の配列番号４に示すＹＦＰ等のほか、クロンテック社から市販されているＣＦＰやＲＦＰその他のＧＦＰ誘導体を挙げることができる。これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができるが、配列表の配列番号１に示すＧＦＰが、蛍光の強さ及び扱いやすさから好適に使用することができる。
【００５６】
また、こうしたＧＦＰは、公知の方法（例えば、Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460等を参照されたい）を用いて産生してもよく、こうしたタンパク質の産生を受託生産する企業に依頼して作製したものを使用してもよい。
【００５７】
シロールその他のＡＩＥ効果を惹起する官能基を含む分子をデンドリマーの骨格として用い、標的配列提示部を蛍光タンパク質等の会合性タンパク質で構成された本発明の凝集性担体を作製し、これを用いてミセルを形成させると、シロール基が凝集した部分からも蛍光が生じ、蛍光タンパク質−シロール間で蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じて、強い蛍光となる。そして、ミセルが崩壊するとFRETは消失する。
【００５８】
このため、本発明の凝集性担体を用いて作製したミセルを、薬剤送達のための担体として用いると、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、FRETの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうした担体の存在位置および存在状態を追跡することができる。
【００５９】
蛍光タンパク質とシロールデンドリマーとの間でFRETを生じさせるには、蛍光タンパク質のどの位置が、上記シロールデンドリマーに固定されるかが重要になってくる。デンドリマーと結合する蛍光タンパク質上の位置は、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる。蛍光タンパク質としてＧＦＰを用いる場合には、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又はＣ末端領域のいずれかに隣接するループ領域と、デンドリマーとが結合することが望ましく、これらの領域中にチオール基を有するシステインなどのアミノ酸が存在していることが好ましい。
【００６０】
ここで、「Ｎ末端領域」での結合は、Ｎ末端近傍に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。Ｃ末端領域との結合も同様に、Ｃ末端領域に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と、上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。
【００６１】
本発明のシロールデンドリマーに担持されるハロゲン基の位置は、特に限定されないが、上記シロールデンドリマーの側鎖に存在することが好ましい。より好ましくは、上記式（III）に示すように、側鎖の末端（シロール基から最も遠い位置）に存在することがさらに好ましい。
【００６２】
上述したように、本発明の方法に使用されるシロールデンドリマーは、例えば、上記式（Ｉ）で示す化合物である。
【００６３】
そして、式（Ｉ）で表されるシロールデンドリマーの構造は、ｋ、ｌ、ｍの組み合わせに応じて種々の構造を取り得ることができ、代表的な化合物は下記の化学式であらわすことができる。
【００６４】
【化１３】
2016084979.tif 000014
【００６５】
【化１４】
2016084979.tif 000015
【００６６】
【化１５】
2016084979.tif 000016
【００６７】
【化１６】
2016084979.tif 000017
【００６８】
ここで、上記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）及び（Ｉｄ）中、Ｅ１は、炭素、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｅ２は、ケイ素、ゲルマニウムのいずれかであり、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１は、炭化水素基を示す。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、酸素、窒素、カルボニル基、エーテル基、アミド基のいずれかを含んでいてもよい、同一または異なった炭化水素鎖を示す。Ｙはハロゲン基を示す。
【００６９】
式（Ｉ）の化合物として、例えば、以下の式（III）で示される化合物を使用することができる。この化合物は、例えば、スキーム1に示すように、シロールコア2（1,1-ジアリール-2,3,4,5-テトラフェニルシロール）を、公知の中間体18を経て、1,2-ジフェニルアセチレンから合成することができる。
【００７０】
次いで、触媒としてH2PtCl6・6H2Oを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体のO-メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Tetrahedron Lett., 2007 48:4365-4368）。
【００７１】
【化１７】
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【００７２】
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
【００７３】
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、FRETによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。
【００７４】
本発明の凝集性分子は、チオール基を有する上述したタンパク質（標的配列提示部）と、側鎖にハロゲン基を有するデンドリマー化合物（式（III））とを混合し、インキュベートして、タンパク質のチオール基とデンドリマー化合物のハロゲン基とを反応させ、デンドリマー化合物にタンパク質を結合させる。このとき、タンパク質は、DTTなどの還元剤で予め処理をして、-SH基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。この反応で、1分子のＧＦＰが組み込まれた場合の反応を、スキーム１に示す。
【００７５】
【化１８】
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【００７６】
例えば、上記のスキーム１に示す反応は、適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、生理食塩水など水溶性溶媒）中で行うことができる。この場合の反応条件は、使用するタンパク質によって異なるが、反応温度は、使用するタンパク質の変性温度を下回ってさえいればよく、例えば、0〜50℃、好ましくは30℃〜45℃、より好ましくは37℃程度とすることができる。ＧＦＰを用いると、42℃までは、温度依存的に反応性を向上させることができることから、ＧＦＰを使用することがＤＤＳ用凝集性担体材料を作製する上では好適である。
【００７７】
また、反応時間は、反応温度によっても異なるが、例えば、1時間〜24時間、好ましくは、10時間〜19時間、より好ましくは、15時間〜18時間程度とすることが好ましい。この程度の反応時間とすることにより、使用したチオール基を有するタンパク質が上記シロールデンドリマーに結合するとともに、ミセルが形成されるからである。
【００７８】
すなわち、タンパク質−デンドリマー複合体が形成されるにつれて、タンパク質（親水性部分）を外側に、デンドリマーのコアの部分（疎水性部分）を内側にしたミセルが形成される。すなわち、上記のような会合性のタンパク質をデンドリマーの側鎖に結合させることにより、タンパク質の会合が駆動力となってミセルが形成されていくものと考えられる。
【００７９】
ここで、上記シロールデンドリマーには、少なくとも１個以上のタンパク質が、側鎖末端のハロゲン原子と置換されて結合する。このため、上記の反応で得られるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料は、上述した化学式（IV）〜（IX）で表される結合体の混合物として得られることになる。
【００８０】
チオール基を有するタンパク質が蛍光タンパク質である場合には、こうしたタンパク質とデンドリマーとの混合比（モル比）は、タンパク質を１として、デンドリマーが例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは、１：５〜１５、より好ましくは、１：１０程度である。
【００８１】
また、上記の反応を行なう際には、標的配列提示部であるタンパク質に、標的認識部位となるアミノ酸配列を組み込んでおくことが、後述するＤＤＳでの効率のよい送達を実現する上で好ましい。こうした標的認識部位の組み込みは、Inverse PCRによって行うことができる。反応終了後に、未反応の蛍光タンパク質をゲル濾過で除き、本発明のＤＤＳ用凝集性分子を得ることができる。
【００８２】
上記のような標的認識部位を組み込んでおくことにより、前記炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、腫瘍細胞で構成された組織等に、特異的に、本発明のＤＤＳ用凝集性分子で構成されたミセルを送達することができる。ここで、前記炎症を起こしている正常組織としては、自己免疫疾患として顕著な特徴を有する組織等を挙げることができる。また、好ましくない遺伝子発現の見られる組織としては、ＳＮＰ解析により病態と一塩基置換等遺伝子変異との関連が明らかな組織等を挙げることができる。好ましくない遺伝子発現の見られる細胞としては、前述の好ましくない遺伝子発現の見られる組織由来の細胞等を挙げることができる。さらに、腫瘍細胞で構成された組織としては、乳癌組織、肺癌組織、肝癌組織、子宮頸癌組織等を挙げることができる。以上のような標的認識部位としては、配列表の配列番号１〜５に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）ＤＤＳ用凝集性分子及びミセルの作製
本実施例においては、タンパク質として下記の通りのＧＦＰを、また、デンドリマーとしてシロールデンドリマーを用いた。
（１）ＤＤＳ用凝集性分子の作製
本実施例において、ハロゲン基を有するデンドリマーとして、下記の化学式（X）に示す化合物（以下、「ジメチルダンベル（１）６−Br」ということがある。）を使用し、チオール基を有するタンパク質として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）（配列番号１）を用いた。【００８４】
【化１９】
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【００８５】
ここで使用したＧＦＰ（配列表の配列番号１）は、既に発明者らが報告した方法に従って調製を行った（Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460を参照されたい）。配列番号１に示すＧＦＰのアミノ酸配列は、Ｃ末端領域の251番目のアミノ酸をシステインに置換したほか、元々存在していたシステイン（60番目）をセリンに置換したものとした。【００８６】
まず、20μＭ濃度のＧＦＰ溶液（リン酸緩衝生理食塩水、以下、「ＰＢＳ」と略すことがある。）に、最終濃度１ｍＭとなるようにDTTを加え、10分間室温で処理し、ＧＦＰ表面に存在するシステインの還元を行った。システインを還元した、400〜450μL の20μMのＧＦＰ溶液（ＰＢＳ）に、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式(X)に示すシロールデンドリマー溶液（DMSO溶媒）を10μL加えてボルテックスで混合した。【００８７】
混合後、37℃で静置した状態で、終夜インキュベートし、ＧＦＰと上記シロールデンドリマーとを結合させ、引き続き、ミセルを形成させた。このときのインキュベート時間は、約16〜18時間であった。得られたミセルを含む溶液中のミセルの粒子の特性を、動的光散乱法（DLS; Dynamic light scattering）により測定した。結果を表１に示す。【００８８】
【表１】
2016084979.tif 000021
【００８９】
また、上記反応液を、25℃にてZETASIZER NANO-S（マルバーン社製）を用いて、レーザー光の波長を532 nmとして、粒径を測定した。結果を図３に示す。図３のＡはＧＦＰのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３のＢは式（X）のシロールデンドリマーのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。ＣはＧＦＰと式（X）のシロールデンドリマーを混合してインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。横軸は得られた産物の粒径を、縦軸は横軸に示すサイズの産物の全体に占める％を表す。【００９０】
ＧＦＰと上記シロールデンドリマーとをインキュベートした場合（GFP-Silole only）には、得られたミセルの粒径はおよそ150nmであった。これに対し、ＧＦＰのみをインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ４nm、上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ650nmであった。上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径がこのように大きくなったのは、おそらく、シロールデンドリマー同士で凝集し、大きな凝集体が形成されたためと考えられた。【００９１】
次に、得られたミセルの粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ; Scanning Electron Microscope）で観察したところ、粒子径がおよそ100〜500nmの多数の粒子と、粒子径が500nm程度の少数の粒子とが確認された（図４参照）。【００９２】
以上の結果から、本発明のＤＤＳ用凝集性担体を用いて形成されたミセルは、粒子径の分布はおよそ100〜500nmであり、およそ100〜200nm程度の粒子径のものが多いことが明らかになった。また、ＳＥＭを用いた電顕微鏡写真の像から、球状のミセル構造を形成していることも確認された。【００９３】
（２）蛍光共鳴エネルギー移動の確認
本実施例において使用したシロールデンドリマーは、疎水性のシロールのコア部分が凝集すると発光する（ＡＩＥ効果を発揮する）性質を有しているため、ミセル構造をとった場合にも発光することが確認されていた。そこで、シロールデンドリマーにＧＦＰを結合させたGFP-シロールデンドリマーからなるミセルを作製した場合に、シロールとＧＦＰとの間において蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じるがどうかを検討した。【００９４】
発光特性の実験は、上記の反応液から、未反応の蛍光タンパク質及びデンドリマー（遊離している分子）を除去した後に行った（図５参照）。シロールデンドリマーのみでインキュベートした産物は360nmの波長で励起し（□）、ＧＦＰのみでインキュベートした産物は488nmの波長で励起し（△）、ＧＦＰおよびシロールデンドリマーを用いてインキュベートした産物（本発明のミセル）は360nmの波長で励起し（●）、各々の発光波長の特性を調べた。GFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセル（ＧＦＰおよび式（X）のシロールデンドリマーでインキュベートして得られた産物）は、シロールからＧＦＰへのFRETによる発光が、510nm付近に観察された。【００９５】
図５に示すように、シロールデンドリマーの発光のピークは480nm付近で観察された。また、ＧＦＰとシロールデンドリマーとの結合体の発光では、シャープなピークは認められず、510nm付近でもっとも高い値を示した。これに対し、ＧＦＰの発光は、510nm付近にシャープなピークとして観察され、これは上記シロールデンドリマーからＧＦＰへのFRETによるものと考えられた。また、ミセルが崩壊したときに、FRETに起因すると考えられるＧＦＰの発光も消失した。【００９６】
すなわち、ＡＩＥ効果を有するデンドリマーと、蛍光タンパク質等の会合性のタンパク質とを結合させた分子（GFP-シロールデンドリマー複合体）を作製し、こうした分子を用いてミセルを形成させると、ミセルの状態でもデンドリマーと蛍光タンパク質との間でFRETが生じること、ミセルの崩壊によってFRETも消失した。
以上から、本発明のミセルをＤＤＳ用凝集性担体として使用すると、送達された組織・器官を確認できることが示された。また、標的組織・器官に送達されたミセルが崩壊した後であっても、蛍光タンパク質の蛍光を追跡することはでき、これによって、蛍光タンパク質が送達された細胞内の環境等を感知することもできる。【００９７】
（３）GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルへの薬剤等の内包実験
次に、本発明のミセルを用いて、薬剤等を内包するミセルが作製できるか否かを確認した。本実施例では、モデル薬剤として、DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate、Promokine PK-CA707-60010, PromoCell GmbH製）、Oil orange SS（東京化成工業（株）製、T0553）、ヤギ抗マウスIgG（abcam社製、ab6708）-Alexa610（Molecular Probes社製、A30050）およびＷＧＡ（Wheat Germ Agglutinin：小麦胚芽レクチン、Molecular Probes社製）（WGA-Alexa Fluoro (登録商標) 594 conjugate、W11262）を用いた。【００９８】
システインを還元した20μMのＧＦＰに、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式（X）に示すシロールデンドリマー（DMSO溶媒）を10μL加え、さらに、DiI（最終濃度；1μＭ、蛍光色素）、Oil orange SS（最終濃度；20μＭ、蛍光色素）、ヤギ抗マウスIgG-Alexa610（最終濃度；0.1μＭ）及びＷＧＡ（最終濃度；2μＭ）のいずれかを加えてボルテックスで混合し、37℃で静置して終夜インキュベートした（約16〜18時間）。【００９９】
各モデル薬剤を加えた試料中で、各薬剤を内包するミセルが形成されているか否か、及びミセルが形成されている場合には、それらのミセルの粒子径を、上述した動的光散乱法により測定した。結果を表２に示す。ここで、薬剤モデルとしては、DiI、Oil orange SS、及びヤギ抗マウスIgG-Alexa 610を使用した。【０１００】
図６のＡ〜Ｃに、上記のモデル薬剤を用いた場合の粒径の分布を示す。図６のＡはDiIの存在下、図６のＢはOil orange SSの存在下、図６のＣはヤギ抗マウスIgG-Alexa 610の存在下で、各々、ミセルを作製した場合の粒径分布である。横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。DiIを加えた場合のミセルの粒径はおよそ95nm、Oil orange SSを加えた場合もおよそ95nm、IgG-Alexa610を加えた場合はおよそ180nmであった。【０１０１】
【表２】
2016084979.tif 000022
【０１０２】
蛍光色素であるDiIを内包するミセルの発光特性を調べた結果を、図７に示す。図７のＢは、図７のＡの500nm付近のスペクトルを拡大した図である。横軸は波長（nm）を、縦軸は相対的蛍光強度(a.u.)を表す。まず、DiIを内包するミセルを作製し、該ミセルをＰＢＳで３回洗浄した試料、その後、この反応溶液を0.45μmの孔径のフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料、及び0.45μmのフィルターに代えて0.22μmのフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料をそれぞれ調製し、これらの試料の蛍光を測定した。【０１０３】
図７のＡ及びＢに示すように、360nmの波長で励起した場合には、480nm波長付近に肩ピークが確認され、シロールの発光によるものと考えられた。510nm付近のピークはシロールからＧＦＰへのFRETによるものを考えられ、570nm付近のピークはシロールからDiIへのFRETに起因するものと考えられた。以上の結果から、DiIがミセル内に封入されていることが確認された。【０１０４】
次に、Alexa594で標識したＷＧＡを内包させたミセルの発光特性を調べた（図８のＡ及びＢ参照）。図８のＡは、Alexa594標識ＷＧＡを添加したときの反応液をそのまま測定した結果である。また、図８のＢは、限外濾過スピンカラム（Millipore社製）を用いて、反応液から未内反応タンパク質等（Alexa594で標識したＷＧＡ、シロールデンドリマー、ＧＦＰ等その他のミセルに取り込まれなかったもの）を除去した後、測定を行った結果である。図８中、実線はGFP-シロールデンドリマー複合体とＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示し、破線はＧＦＰとＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示す。【０１０５】
図中、実線は、GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルにAlexa594標識ＷＧＡを内包させたもの、また、破線は、ＧＦＰとAlexa594標識ＷＧＡを混合したものを内包させたものを、それぞれ測定した結果を示す（励起波長はいずれも360nm）。【０１０６】
限外濾過スピンカラム処理を行っていない反応液をそのまま測定した結果を示す図８のＡには、シロールデンドリマーからの蛍光が480nm付近に、ＧＦＰからの蛍光が510nm付近に、また、ＷＧＡからの蛍光が610nm付近にそれぞれ検出された。これに対し、図８のＢに示されるように、限外濾過スピンカラム処理を行うとフリーのシロールデンドリマー、ＧＦＰおよびＷＧＡが除去され（点線）るため、これらからの発光はほとんど検出でされなかった。以上より、作製されたミセルにAlexa594標識ＷＧＡが内包されていることが確認できた。【０１０７】
（実施例２）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の調製
本願発明のミセルとＣ末端で結合し、かつ、ガン細胞の表面に発現する受容体と結合する標的ペプチドとＮ末端で結合する、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を以下のように調製した。【０１０８】
（１）インバースＰＣＲ
（１−１）ペプチド配列の選定
選定した標的ペプチドのペプチド配列を下記表３に記載した。ＭＣＦ−７はヒト乳腺癌由来細胞である。【０１０９】
【表３】
2016084979.tif 000023
【０１１０】
（１−２）プライマーの作成
表３に示された上記ペプチド配列についてインバースＰＣＲを行なうためのプライマーを下記表４に記載した。これらプライマーは、上記ペプチド配列のDMとPGTVLPの間から伸長反応が開始するように設計した。【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
（１−３）インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの調製
インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドは、以下の論文に記載の方法で調製した。
「Protease-sensitive signalling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein.   - Miho Suzuki, et al.  Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression
Volume 1679, Issue 3, 17 September 2004, Pages 222-229」【０１１３】
（１−３−１）GFPuv5変異体のプラスミド構築
GFPuv5は、I167T突然変異＋フォワードプライマー 5’CATTGAAGATGGCTCCGTTCAA（配列番号９） 及びリバースプライマー5’TTGTGGCGAGTTTTGAAGTTAG（配列番号１０）を用いたインバースＰＣＲを用いた遺伝子マニピュレーション用の同義の突然変異と、それに引き続くＰＣＲ産物の環化処理とによって、pGFPgcn4から作製された。このようにして得られたコンストラクトをpGFPgcn5と命名した。【０１１４】
その後、GFPuv5のcDNAをpET21a（Novagen社製）にクローニングしてタンパク発現をさせて精製し、このタンパク質をGFPuv5tagと命名した。そのコード領域を、プライマー5’CTCGACCAT[ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT]CGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA（配列番号１１）（GFPuv5シリーズのＮ末端向きのT7遺伝子の10タンパク質用の最初の11アミノ酸のエピトープタグに接着する、接着するタグは［  ］で示した）、及びGFPuv5シリーズのＣ末端にHisタグを提供する、5’TGACGTGAATTCATTA[GTGATGGTGATGGTGATG]TTTGTAGAGCTCATCCATGC（配列番号１２）（Hisタグを[  ]で示す）とを用いて増幅した。【０１１５】
これらをpET21aに挿入し、NdeI及びEcoRIで消化した。このpGFPgcnプラスミドを遺伝子マニュピレーションに使用し、pET21aプラスミドをT7プロモーターの制御下でのタンパク質発現に使用した。GFPuv5の遺伝子及びその突然変異体の遺伝子の塩基配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した(ABI PRISM 3100 Genetic Analyser社製)。実験中に、さらに３つの同義の突然変異が発見された(Ser-30 agtがagcへ、His-78 catがcacへ、Gln-183 caaがcagへ)。【０１１６】
それらの突然変異は蛍光タンパク質にとっては有害ではないため、これらの突然変異を含んだまま実験を継続した。精製されたGFPuv5tagの蛍光強度は、GFPuv4tagの約1.9倍であった。その後、48位又は70位のいずれかのシステイン残基を、pGFPgcn5を用いたインバースＰＣＲによってランダム化されたアミノ酸で置換した。【０１１７】
オリゴヌクレオチド5’CTTAAATTTATTNNKACTGGAAAAC（配列番号１３） 及び5’GGTAAGTTTTCCGTATGTTG（配列番号１４）をシステイン48の突然変異に使用し、5’GTGTTCAANNKTTTTCCCGTTATCCG（配列番号１５）及び5’CATACGTCAGAGTAGTGACAAG（配列番号１６） をシステイン70の突然変異に使用した。大腸菌BL21 (DE3)の培養物を、得られたプラスミドで形質転換し、昼光励起の下で、強い蛍光についてスクリーニングを行ない、寒天培地上で選択した。48では、幾つかの強い蛍光を発する変異体が得られた(Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, and Tyr substituted) 。しかし、70位では、C70V システイン変異体のみが適切な蛍光を与えた。【０１１８】
強い蛍光強度を有する二重システイン突然変異GFPuv5を作製するために、一重突然変異を有するプラスミドをNcoI及びEcoRIで消化し、それぞれの領域に再度ライゲーションした。選択は一重突然変異体で行った。UV5C0 tag (C48S/C70V) が全ての組換体の中で最も高い蛍光強度を示した。
次に、システインを6位及び229位にそれぞれインバースＰＣＲによって導入した。この導入には、C48S突然変異を有するプラスミドと、以下のプライマーのセットをそれぞれの突然変異に使用した。【０１１９】
Glu置換用：5’TGTCTTTTCACTGGAGTTGTCCC（配列番号１７）及び5’TTCTCCTTTACTCATTTTTTC（配列番号１８）
Ile置換用：5’TGCACACATGGCATGGATGAGCTC（配列番号１９） 及び5’CCCAGCAGCAGTTACAAACTC（配列番号２０）
トリプシン標的配列(Gln-Gly-Arg)からなる３つのプロテアーゼタグは、種々のスペーサー配列を有し（スペーサーなし、Thrスペーサー又はGly-Thrスペーサー）、必要なシステインがHis-231とAsp-234との間で置換されている。このコンストラクトを、puvC48Stagと得られたプラスミド（テンプレート）と、以下のプライマーを用いて得た。【０１２０】
5’CAGCGCCGTTGTGAGCTCTACAAATAATGAATT (スペーサーなし用：配列番号２１)）
5’ACATGTGAGCTCTACAAATAA (Thrスペーサー用：配列番号２２) 及び
5’GGAACATGTGAGCTCTACAAA (Gly-Thrスペーサー用：配列番号２３); 
（リバースプライマー）
5’TGTAATCCCAGCAGCAGTTAC (スペーサーなし用：配列番号２４)
5’ACGGCCCTGTGTAATCCC (T及びGTスペーサー用：配列番号２５)
得られたプラスミドをpUV5trypS0tag, pUV5- trypS1tag 及びpUV5trypS2tagとそれぞれ命名した。詳細は、表1 を参照されたい。【０１２１】
（１−３−２）GFPuv5tag突然変異体の精製
全てのプラスミドで大腸菌BL 21(DE3)を形質転換した。アンピシリン(50Ag/ml)及びIPTG (0.5mM)を添加したＬＢ培地(38mL)に、定常期の終夜培養した大腸菌(12ml)を播種し、37℃で８時間インキュベートした。2,500xgで20分間遠心して細胞を集め、10mLのＰＢＳに再懸濁した。細胞のペレットを、50mMトリス及び8M尿素を含む10mLの溶解バッファー（pH8.0）中で、15分間、室温にて溶解させ、ボルテックスした。1,200xgで15分間遠心し、上清をＰＢＳ中に懸濁したNi2+-NTA 樹脂(Qiagen Co. Ltd.製)と混合した。この樹脂を、ＰＢＳ及び20mMのイミダゾールで順番に洗浄した後に、結合したGFPuv5tag突然変異体を250mMのイミダゾール溶液で溶出させた。【０１２２】
バッファー交換のために、溶出物を10倍希釈したＰＢＳで平衡化したPD-10ゲル電気泳動濾過カラム(Amersham Bioscience Co. Ltd.製)にアプライした。溶出されたGFPuv5tag突然変異体タンパク質を集め、それらの濃度をクマジータンパクアッセイ試薬(Pierce社製)で定量した。精製されたGFPuv5tag突然変異体を、15％ SDS-PAGEによって分析した。
インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの塩基配列を配列番号２６に示した。【０１２３】
（１−４）ＰＣＲの条件
下記表５に示す反応液を調製し、下記表６の条件でインバースＰＣＲを行った。【０１２４】
【表５】
2016084979.tif 000025
【０１２５】
【表６】
2016084979.tif 000026
【０１２６】
（１−５）電気泳動による確認
上記ＰＣＲ反応液の一部をとって、0.8％PAGE、電圧100V、印圧時間30分間のゲル電気泳動を行い、各サンプル中で増幅されたペプチドを確認した。泳動結果を図９に示す。【０１２７】
（２）非依存的Ａ配列の除去及びＰＣＲ産物の精製
下記表７の反応液を調製し、120℃で30分間反応させ、上記ＰＣＲによって生じた非依存的Ａ配列を除去した。その後、QIAquick（登録商標） PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用して、キットに添付の説明書に従って上記ＰＣＲ産物を精製した。【０１２８】
【表７】
2016084979.tif 000027
【０１２９】
（３）ライゲーション反応
引き続き、下記表８に示す反応液を調製し、160℃で３時間以上反応させて、後述する大腸菌ＤＨ５αの形質転換用環状プラスミドを作製した。【０１３０】
【表８】
2016084979.tif 000028
【０１３１】
（４）大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μlを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液にライゲーション反応液を1μL加え、氷上で30分間放置した。その後、42℃で30秒間インキュベートした後に、氷上で2分間冷却した。ここに、SOC（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で1時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地（東洋紡（株）製）に播種し、37℃で一晩静置した。
【０１３２】
（５）コロニーＰＣＲ
上記形質転換で得られたコロニーからコロニーＰＣＲを行い、想定されるインサートを確認した。
（５−１）ＰＣＲ用反応液溶液の調製
下記表９のコロニーＰＣＲ用反応液を調製した。【０１３３】
【表９】
2016084979.tif 000029
【０１３４】
上記コロニーＰＣＲ用反応液をＰＣＲ用チューブに入れ、上記アンピシリン含有ＬＢ培地で増殖した大腸菌を採取し、これを加えた。ＰＣＲは下記の表１０に示すプログラムで行った。【０１３５】
【表１０】
2016084979.tif 000030
【０１３６】
（５−２）電気泳動
上記ＰＣＲ反応液の1.2％PAGEで印加電圧100V、時間30分間の電気泳動を行い、増幅が確認できたコロニーを、ＬＢ液体培地（東洋紡（株）製）が入った培養ボトルに移植し、37℃でインキュベートした。【０１３７】
（６）プラスミドの精製
上記ＬＢ液体培地で培養した大腸菌中の上記プラスミドを、Wizard Plus SV Minipreps. DNA Purification System（プロメガ（株）製）を用い、製品に添付された説明書に従って精製した。その後、精製したプラスミドの配列をユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼して解析した。【０１３８】
（７）大腸菌BL21(DE3）の形質転換
大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μLを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液に、上記シーケンスにより目的とする配列が入っていることが確認できたプラスミド液1μlを加え、氷上で30分間放置した。【０１３９】
その後、42℃で30秒間インキュベート後、氷上で２分間冷却した。ここに、ＳＯＣ（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で１時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地に播種し、37℃で一晩静置した。翌日、形質転換されて緑色の蛍光を発しているコロニーを取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地１mlが入った培養ボトルに入れ、37℃で一晩静置して前培養を行った。【０１４０】
（８）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の精製
（８−１）コロニーの培養
50mLチューブにアンピシリン含有ＬＢ液体培地４mLを入れ、ここに上記前培養液290μLを加えたものを試料として４本用意し、28℃で４時間シェーカー上で培養した。その後、100mMのIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を43μL加え、28℃で一晩シェーカー上で培養した。【０１４１】
（８−２）タンパク質の回収
翌日、上記の４本のチューブの培養液を１本のチューブに集約した。内容物を移した３本のチューブを、それぞれ１ｍlのＰＢＳ（-）バッファー（和光純薬工業（株）製）で洗浄し、この洗浄液もまとめたチューブに加えた。以上のように培養物を集約したチューブを、室温にて、5,000rpm（遠心機名：KUBOTA3740、ローター番号KUBOTA AF2018、久保田商事（株）製）で５分間遠心した。【０１４２】
その後、(i)上清を捨て、沈殿したペレットに、ＰＢＳ（-）バッファーを３ml加えて、(ii)よく攪拌した後、5,000rpmで５分間遠心した。上記の(i)と(ii)とを２回繰り返した。沈殿したペレットに、B-PER Lysis Buffer（Reagent社製）を４mL加え、蓋を締めて室温にて一晩シェーカーで攪拌した。【０１４３】
（８−３）His-tagによる精製
Ni-NTA Agarose（QlAGEN社製）を15mLチューブに２mLとり、(i)1,000rpmで１分間遠心し、(ii)上清を捨てて、１×ＰＢＳバッファーを1mL加えてよく攪拌した。上記(i)と(ii)とを３回繰り返し、Ni-NTA樹脂を調製した。【０１４４】
上記B-PER Lysis Buffer溶液が入ったチューブを、12,000rpmで10分間、室温にて遠心した後、上清を15mLのファルコンチューブに移した。ここに、よく撹拌した上記Ni-NTA樹脂400μLを加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。ここに、(iii)１×ＰＢＳバッファーを４mL加えてよく攪拌し、(iv)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(iii)と(iv)とを２回繰り返した。【０１４５】
その後、(v)20ｍMのイミダゾール（和光純薬工業（株）製）を４mL加えてよく攪拌し、(vi)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(v)と(vi)とを２回繰り返した。ここに、250ｍMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間遠心し、緑色蛍光を発している上清を、新しい15mLのファルコンチューブに入れ、次のゲルろ過用タンパク質精製溶液とした。【０１４６】
（８−４）ゲルろ過による精製
上記タンパク質精製溶液中のイミダゾールとＰＢＳバッファーとを置換し、精製して目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を得た。以上の操作では、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のNap5カラムを使用し、製品に添付の説明書に従って精製を行った。【０１４７】
（９）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の選択
上記精製作業で得られた標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質濃度の吸光度（280nm）、及び発色団濃度（形成能）の吸光度（488nm）を常法に従って計測し、A488/A280の値が1.5を超えたものを、目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質として選択した。結果を表１１に示した。【０１４８】
【表１１】
2016084979.tif 000031
【０１４９】
（実施例３）標的ペプチド配列結合ミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）の作製
タンパク質としてＧＦＰに代えて、実施例２で調製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を用いて、実施例１と同様にして、標的ペプチド配列が結合したミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）を作成した。【０１５０】
（１）発光特性
上記作製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの発光特性を、実施例１と同様にして測定した（図１０参照）。図１０の凡例中、反応物は、シロールデンドリマーと標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質が結合した複合体を、未反応物は、それらが結合していない状態のものを示し、各数値は励起光の波長（nm）を示す。標的ペプチド配列結合ミセルでも、実施例１と同様に、510nm付近に発光のピークが観察された。【０１５１】
（２）粒子特性
上記標的ペプチド配列結合ミセルの粒子特性を、実施例１と同様に動的光散乱法により測定した（図１１参照）。図１１中、横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。その結果、実施例１と同様に、およそ100nm〜200nmの粒子径を有する粒子が確認された。
以上から、標的ペプチド配列を有する蛍光タンパク質結合ミセルも、標的配列を有しないそれと同等のミセルを形成することが示された。さらに、実施例１で得られたミセルも、本実施例で得られたミセルのいずれもが、蛍光タンパク質の会合によって形成される、蛍光タンパク質会合駆動型ミセルであると推定された。
【産業上利用分野】
【０１５２】
本願発明は、医薬製剤分野、特に薬剤送達の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号２：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号３：ＢＦＰのアミノ酸配列
配列番号４：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号５：イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：ＭＣＦ−７認識ペプチド配列
配列番号７：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号８：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号９：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１０：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１１：インバースＰＣＲ用プライマー
配列番号１２：インバースＰＣＲ用プライマー
配列番号１３：オリゴヌクレオチド
配列番号１４：オリゴヌクレオチド
配列番号１５：オリゴヌクレオチド
配列番号１６：オリゴヌクレオチド
配列番号１７：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１８：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１９：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２０：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２１：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２２：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２３：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２４：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２５：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２６：インバースＰＣＲ用プラスミドの塩基配列
【図１】
2016084979.tif 000036
【図２】
2016084979.tif 000037
【図３】
2016084979.tif 000038
【図４】
2016084979.tif 000039
【図５】
2016084979.tif 000040
【図６】
2016084979.tif 000041
【図７】
2016084979.tif 000042
【図８】
2016084979.tif 000043
【図９】
2016084979.tif 000044
【図１０】
2016084979.tif 000045
【図１１】
2016084979.tif 000046
【配列表】
2016084979000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月28日(2016.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物と、タンパク質とで構成された標的配列提示部を有する凝集性分子であって、前記標的配列提示部は：
水性溶媒中で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成し；そして、
前記凝集性分子が凝集したときに蛍光を発する；ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化１】
2016084979.tif 000047
（式（Ｉ）中、Ｒ１は下記の式（ＩＩ）で表されるシロール基であり、Ｒ２及びＲ３は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基又はイオウ原子を介して結合された標的配列提示部である。）
【化２】
2016084979.tif 000048
（式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（ＩＩＩ）で表されるものであることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化３】
2016084979.tif 000049
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質で構成されており、前記タンパク質中に存在するチオール基は、フォールディングされたタンパク質の外側に位置している、ことを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項９】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＶ）〜（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化４】
2016084979.tif 000050
【化５】
2016084979.tif 000051
【化６】
2016084979.tif 000052
【化７】
2016084979.tif 000053
【化８】
2016084979.tif 000054
【化９】
2016084979.tif 000055
（上記式中、ＴＳＰＰは標的認識部位を表す。）
【請求項１０】
前記標的認識部位を有するタンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１１】
前記標的認識部位は、標的組織へ前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が形成したミセルを送達するための機能性ペプチドであることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１２】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞、前腫瘍状態の組織及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１３】
前記機能性ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記機能性ペプチドとの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料によって形成され、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、及び疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ミセル。
【請求項１５】
前記分子量２０万以下のタンパク質は、免疫グロブリンＧ、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のミセル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の一の実施態様においては、本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物と、タンパク質とで構成された標的配列提示部を有する凝集性分子であって；前記標的配列提示部は：水性溶媒で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成し；そして、前記凝集性担体材料が凝集したときに蛍光を発する、ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料である。
［００２２］
［化１］
2016084979.tif 000056
［００２３］
ここで、（式（Ｉ）中、Ｒ１は下記の式（ＩＩ）で表されるシロール基であり、Ｒ２及びＲ３は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基又はイオウ原子を介して結合された標的配列提示部である。）
［００２４］
［化２］
2016084979.tif 000057
［００２５］
ここで、式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＩＩ）で表されるものである。
［００２６］
［化３］
2016084979.tif 000058
［００２７］
また、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＶ）〜（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれるいずれかのものである、ことが好ましい。
［００２８］
［化４］
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
2016084979.tif 000059
［００２９］
［化５］
2016084979.tif 000060
［００３０］
［化６］
2016084979.tif 000061
［００３１］
［化７］
2016084979.tif 000062
［００３２］
［化８］
2016084979.tif 000063
［００３３］
［化９］
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
2016084979.tif 000064
［００３４］
上記式中、ＴＳＰＰは標的認識部位を表す。前記標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質で構成されていることが好ましい。そして、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
［００３５］
また、前記標的認識部位は、標的組織へ前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が形成したミセルを送達するための機能性ペプチドであることが好ましい。前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることが好ましい。
［００３６］
前記機能性ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特定的に結合し、前記標的タンパク質と前記機能性ペプチドとの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることが好ましい。
［００３７］
本発明の別の態様は、上述した前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料によって形成され、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、及び疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ミセルである。
ここで、前記分子量２０万以下のタンパク質は、免疫グロブリンＧ、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれるいずれかのタンパク質であ
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
［図１１］図１１は、ＭＣＦ−７の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの粒径分布図である。
発明を実施するための形態
［００４３］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物と、タンパク質とで構成された標的配列提示部を有する凝集性担体材料であって、前記標的配列提示部は：水性溶媒で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成し；そして、前記凝集性担体材料が凝集したときに蛍光を発する；ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料である。
［００４４］
［化１０］
2016084979.tif 000065
［００４５］
ここで、式（Ｉ）中、Ｒ１は下記の式（ＩＩ）で表されるシロール基であり、Ｒ２及びＲ３は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基又はイオウ原子を介して結合された標的配列提示部である。
［００４６］
［化１１］
2016084979.tif 000066
［００４７］
ここで、式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。本発明の前記式（Ｉ）で表されるカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）は、下記式（ＩＩＩ）で表される構造を有する化合物であることが、凝集性と後述する標的配列提示部とを備えるようにすることができることから、さらに好ましい。
［００４８］
［化１２］
2016084979.tif 000067
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
［００４９］
一般的なカルボシランデンドリマーの構造を、図１のＡ〜Ｃに示す。図１のＡに示す化合物はファン（０）３と呼ばれるものであり、この化合物は、円で囲んだベンゼン環をコアとしている。図１のＢに示す化合物は、ダンベル（１）６と呼ばれるものであり、図１のＡに示す２分子のファン（０）３分子が、コアに代えて、２つのメチル基がついたケイ素（Ｍｅ−Ｓｉ−Ｍｅ）で結合されている。図１のＣに示す化合物は、ボール（１）６と呼ばれる化合物であり、ダンベルのＭｅ−Ｓｉ−Ｍｅのメチル基に代えて、ファン（０）３のコアが外れた分子が結合し、球状となっている。
［００５０］
本発明のカルボシランデンドリマーの構造は、従来のカルボシランデンドリマーとは全く相違しており、分子の末端に結合している臭素原子の１つが標的配列提示部との結合に関与する。ここで、標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質であることが、上記デンドリマーで形成されるＤＤＳ用薬剤の特異的な送達を可能にする上で好ましい。
［００５１］
そして、上記標的配列を構成するタンパク質は、チオール基を有するものであり、前記チオール基はフォールディングされたタンパク質の外側に位置していることが好ましい。
［００５２］
チオール基は、上記デンドリマー中に存在するハロゲン原子と反応し、タンパク質とデンドリマーとを結合させる役割を担うため、フォールディングされたタンパク質の内側に位置していても、結合に関与できないからである。ここで、「チオール基を有するタンパク質」には、元々チオール基を有しているタンパク質のほか、遺伝子工学的手法等を用いて新たにチオール基を導入したもの、及びシステインを含むタンパク質のシステインが還元されて、チオール基となったもの等が含まれる。
［００５３］
タンパク質中のチオール基の存在位置は特に限定されないが、タンパク質上の特定の領域にチオール基が存在することが好ましい場合もある。なお、「システインを含むタンパク質」に含まれるシステインは、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、所望の位置への挿入による方法その他の遺伝子工学的手法等により、所望の位置に導入されたものであってもよい。タンパ
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ク質の所望のアミノ酸の位置にシステイン残基を導入することは、部位特異的突然変異導入法その他の公知の遺伝子工学的手法を使用することにより、当業者であれば容易に実施することができる。
［００５４］
上記の標的配列提示部を構成するタンパク質は、会合する性質（以下、「会合性」ということがある。）を有するものであればよく、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（以下、下記のような緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を集合的に「ＧＦＰ」ということがある。）及びその変異体を含む蛍光タンパク質を使用することが好ましい。こうした蛍光タンパク質が結合した上記カルボシランデンドリマーは、タンパク質が会合すると強い蛍光を発し、会合状態を容易に検出できるからである。
［００５５］
本発明において使用することができるＧＦＰとしては、例えば、配列表の配列番号１に示すＧＦＰ、配列番号２に示すＧＦＰ、配列表の配列番号３に示すＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、配列表の配列番号４に示すＹＦＰ等のほか、クロンテック社から市販されているＣＦＰやＲＦＰその他のＧＦＰ誘導体を挙げることができる。これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができるが、配列表の配列番号１に示すＧＦＰが、蛍光の強さ及び扱いやすさから好適に使用することができる。
［００５６］
また、こうしたＧＦＰは、公知の方法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６７９（２００４）２２２−２２９：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０（２００５）４５４−４６０等を参照されたい）を用いて産生してもよく、こうしたタンパク質の産生を受託生産する企業に依頼して作製したものを使用してもよい。
［００５７］
シロールその他のＡＩＥ効果を惹起する官能基を含む分子をデンドリマーの骨格として用い、標的配列提示部を蛍光タンパク質等の会合性タンパク質で構成された本発明の凝集性担体を作製し、これを用いてミセルを形成させると、シロール基が凝集した部分からも蛍光が生じ、蛍光タンパク質−シロール間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じて、強い蛍光となる。そして、ミセルが崩壊するとＦＲＥＴは消
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
失する。
［００５８］
このため、本発明の凝集性担体を用いて作製したミセルを、薬剤送達のための担体として用いると、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、ＦＲＥＴの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうした担体の存在位置および存在状態を追跡することができる。
［００５９］
蛍光タンパク質とシロールデンドリマーとの間でＦＲＥＴを生じさせるには、蛍光タンパク質のどの位置が、上記シロールデンドリマーに固定されるかが重要になってくる。デンドリマーと結合する蛍光タンパク質上の位置は、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる。蛍光タンパク質としてＧＦＰを用いる場合には、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又はＣ末端領域のいずれかに隣接するループ領域と、デンドリマーとが結合することが望ましく、これらの領域中にチオール基を有するシステインなどのアミノ酸が存在していることが好ましい。
［００６０］
ここで、「Ｎ末端領域」での結合は、Ｎ末端近傍に存在する１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。Ｃ末端領域との結合も同様に、Ｃ末端領域に存在する１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と、上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。
［００６１］
本発明のシロールデンドリマーに担持されるハロゲン基の位置は、特に限定されないが、上記シロールデンドリマーの側鎖に存在することが好ましい。より好ましくは、上記式（ＩＩＩ）に示すように、側鎖の末端（シロール基から最も遠い位置）に存在することがさらに好ましい。
［００６２］
上述したように、本発明の方法に使用されるシロールデンドリマーは、例えば、上記式（Ｉ）で示す化合物である。そして、式（Ｉ）で表されるシロールデンドリマーの構造は、下記式（ＩＶ）〜（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。
［００６３］
［化１３］
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
2016084979.tif 000068
［００６４］
［化１４］
2016084979.tif 000069
［００６５］
［化１５］
2016084979.tif 000070
［００６６］
［化１６］
2016084979.tif 000071
［００６７］
［化１７］
2016084979.tif 000072
［００６８］
［化１８］
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
2016084979.tif 000073
［００６９］
式（Ｉ）の化合物として、例えば、以下の式（ＩＩＩ）で示される化合物を使用することができる。この化合物は、例えば、スキーム１に示すように、シロールコア２（１，１−ジアリール−２，３，４，５−テトラフェニルシロール）を、公知の中間体１８を経て、１，２−ジフェニルアセチレンから合成することができる。
［００７０］
次いで、触媒としてＨ２ＰｔＣｌ６・６Ｈ２Ｏを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体のＯ−メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００７  ４８：４３６５−４３６８）。
［００７１］
［化１９］
2016084979.tif 000074
［００７２］
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
［００７３］
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、ＦＲＥＴによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。
［００７４］
本発明の凝集性分子は、チオール基を有する上述したタンパク質（標的配列提示部）と、側鎖にハロゲン基を有するデンドリマー化合物（式（ＩＩＩ））とを混合し、インキュベートして、タンパク質のチオール基とデンドリマー化合物のハロゲン基とを反応させ、デンドリマー化合物にタンパク質を結合させる。このとき、タンパク質は、ＤＴＴなどの還元剤で予め処理をして、−ＳＨ基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。この反応で、１分子のＧＦＰが組み込まれた場合の反応を、スキーム１に示す。
［００７５］
［化２０］
2016084979.tif 000075
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
［化２１］
2016084979.tif 000076
［００８５］
ここで使用したＧＦＰ（配列表の配列番号１）は、既に発明者らが報告した方法に従って調製を行った（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６７９（２００４）２２２−２２９：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０（２００５）４５４−４６０を参照されたい）。配列番号１に示すＧＦＰのアミノ酸配列は、Ｃ末端領域の２５１番目のアミノ酸をシステインに置換したほか、元々存在していたシステイン（６０番目）をセリンに置換したものとした。
［００８６］
まず、２０μＭ濃度のＧＦＰ溶液（リン酸緩衝生理食塩水、以下、「ＰＢＳ」と略すことがある。）に、最終濃度１ｍＭとなるようにＤＴＴを加え、１０分間室温で処理し、ＧＦＰ表面に存在するシステインの還元を行った。システインを還元した、４００〜４５０μＬの２０μＭのＧＦＰ溶液（ＰＢＳ）に、最終濃度１０倍モル等量になるように、２００μＭの上記式（Ｘ）に示すシロールデンドリマー溶液（ＤＭＳＯ溶媒）を１０μＬ加えてボルテックスで混合した。
［００８７］
混合後、３７℃で静置した状態で、終夜インキュベートし、ＧＦＰと上記シロールデンドリマーとを結合させ、引き続き、ミセルを形成させた。このときのインキュベート時間は、約１６〜１８時間であった。得られたミセルを含む溶液中のミセルの粒子の特性を、動的光散乱法（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により測定した。結果を表１に示す。
［００８８］
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月18日(2017.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物と、タンパク質とで構成された標的配列提示部を有する凝集性分子であって、前記標的配列提示部は：
水性溶媒中で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成し；そして、
前記凝集性分子が凝集したときに蛍光を発する；ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化１】
2016084979.tif 000077
（式（Ｉ）中、Ｒ１は下記の式（ＩＩ）で表されるシロール基であり、Ｒ２及びＲ３は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基又はイオウ原子を介して結合された標的配列提示部である。）
【化２】
2016084979.tif 000078
（式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（ＩＩＩ）で表されるものであることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。式中、ｎは１〜３の整数を表し、Ｘは臭素原子又は―Ｓ−ＴＳＰＰを表す。ここで、すべてのＸが同時に臭素原子になることはない。
【化３】
2016084979.tif 000079
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質で構成されており、前記タンパク質中に存在するチオール基は、フォールディングされたタンパク質の外側に位置している、ことを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項９】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＶ）〜（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【化４】
2016084979.tif 000080
【化５】
2016084979.tif 000081
【化６】
2016084979.tif 000082
【化７】
2016084979.tif 000083
【化８】
2016084979.tif 000084
【化９】
2016084979.tif 000085
（上記式中、ＴＳＰＰは標的認識部位を表す。）
【請求項１０】
前記標的認識部位を有するタンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１１】
前記標的認識部位は、標的組織へ前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が形成したミセルを送達するための機能性ペプチドであることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１２】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞、前腫瘍状態の組織及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１３】
前記機能性ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記機能性ペプチドとの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることを特徴とする、請求項１１に記載のドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料によって形成され、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、及び疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ミセル。
【請求項１５】
前記分子量２０万以下のタンパク質は、免疫グロブリンＧ、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のミセル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
［図１１］図１１は、ＭＣＦ−７の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの粒径分布図である。
発明を実施するための形態
［００４３］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物と、タンパク質とで構成された標的配列提示部を有する凝集性担体材料であって、前記標的配列提示部は：水性溶媒で凝集して直径５０〜５００ｎｍのミセルを形成し；そして、前記凝集性担体材料が凝集したときに蛍光を発する；ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料である。
［００４４］
［化１０］
2016084979.tif 000086
［００４５］
ここで、式（Ｉ）中、Ｒ１は下記の式（ＩＩ）で表されるシロール基であり、Ｒ２及びＲ３は、同一または異なった炭化水素基又は環を有してもよい炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｙはハロゲン基又はイオウ原子を介して結合された標的配列提示部である。
［００４６］
［化１１］
2016084979.tif 000087
［００４７］
ここで、式中、Ｘはケイ素、Ｒはフェニル基であり、ｎは４である。本発明の前記式（Ｉ）で表されるカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）は、下記式（ＩＩＩ）で表される構造を有する化合物であることが、凝集性と後述する標的配列提示部とを備えるようにすることができることから、さらに好ましい。式中、ｎは１〜３の整数を表し、Ｘは臭素原子又は―Ｓ−ＴＳＰＰを表す。ここで、すべてのＸが同時に臭素原子になることはない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
［００４８］
［化１２］
2016084979.tif 000088
［００４９］
一般的なカルボシランデンドリマーの構造を、図１のＡ−Ｃに示す。図１のＡに示す化合物はファン（０）３と呼ばれるものであり、この化合物は、円で囲んだベンゼン環をコアとしている。図１のＢに示す化合物は、ダンベル（１）６と呼ばれるものであり、図１のＡに示す２分子のファン（０）３分子が、コアに代えて、２つのメチル基がついたケイ素（Ｍｅ−Ｓｉ−Ｍｅ）で結合されている。図１のＣに示す化合物は、ボール（１）６と呼ばれる化合物であり、ダンベルのＭｅ−Ｓｉ−Ｍｅのメチル基に代えて、ファン（０）３のコアが外れた分子が結合し、球状となっている。
［００５０］
本発明のカルボシランデンドリマーの構造は、従来のカルボシランデンドリマーとは全く相違しており、分子の末端に結合している臭素原子の１つが標的配列提示部との結合に関与する。ここで、標的配列提示部は、標的認識部位を有するタンパク質であることが、上記デンドリマーで形成されるＤＤＳ用薬剤の特異的な送達を可能にする上で好ましい。
［００５１］
そして、上記標的配列を構成するタンパク質は、チオール基を有するものであり、前記チオール基はフォールディングされたタンパク質の外側に位置していることが好ましい。
［００５２］
チオール基は、上記デンドリマー中に存在するハロゲン原子と反応し、タンパク質とデンドリマーとを結合させる役割を担うため、フォールディングされたタンパク質の内側に位置していても、結合に関与できないからである。ここで、「チオール基を有するタンパク質」には、元々チオール基を有しているタンパク質のほか、遺伝子工学的手法等を用いて新たにチオール基を導入したもの、及びシステインを含むタンパク質のシステインが還元されて、チオール基となったもの等が含まれる。
［００５３］
タンパク質中のチオール基の存在位置は特に限定されないが、タンパク質上の特定の領域にチオール基が存在することが好ましい場合もある。なお、「システインを含むタンパク質」に含まれるシステインは、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、所望の位置への挿入による方法その他の遺伝子工学的手法等により、所望の位置に導入されたものであってもよい。タンパ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
2016084979.tif 000089
［００６９］
式（Ｉ）の化合物として、例えば、以下の式（ＩＩＩ）’で示される化合物を使用することができる。この化合物は、例えば、スキーム１に示すように、シロールコア２（１，１−ジアリール−２，３，４，５−テトラフェニルシロール）を、公知の中間体１８を経て、１，２−ジフェニルアセチレンから合成することができる。
［００７０］
次いで、触媒としてＨ２ＰｔＣｌ６・６Ｈ２Ｏを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体の０−メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００７  ４８：４３６５−４３６８）。
［００７１］
［化１９］
2016084979.tif 000090
［００７２］
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
［００７３］
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、ＦＲＥＴによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タ
【国際調査報告】
2016084979.tif 000091
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