(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染阻害活性を有する、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片を提供する。本発明はまた、特定の可変領域を有する、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染阻害活性を有し、エスケープ変異株出現抑制性を示す抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染阻害活性を有する、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項２】
エスケープ変異株出現抑制性を示す、請求項１に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項３】
前記抗体又は抗原結合性抗体断片が、以下の（ａ）又は（ｂ）の重鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
【請求項４】
前記抗体又は抗原結合性抗体断片が、以下の（ｃ）〜（ｆ）のいずれかの軽鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
（ｄ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（ｆ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
【請求項５】
請求項４記載の抗体又は抗原結合性抗体断片と同じ立体構造エピトープを認識する、抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項６】
前記抗体又は前記抗原結合性抗体断片がＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体、ｄｓＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、又はシングルドメイン抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項７】
前記抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項８】
前記抗体又は抗原結合性抗体断片が化学修飾されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片を有効成分として含有する、医薬。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤である、請求項１１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに対する感染阻害活性を有する抗体及びその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ：以下、ＨＣＶと記載する場合もある）は、フラビウイルス科ヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属に分類されるＲＮＡウイルスであり、非Ａ非Ｂ肝炎の主要な原因ウイルスとして同定された（非特許文献１）。【０００３】
ＨＣＶは、主として輸血によって感染するが、今日では高感度なＨＣＶの検出方法が確立されたため、輸血による新たなＨＣＶ感染患者は激減している。一方、現在でも肝炎が顕在化していないウイルスキャリアを含めたＨＣＶ保有者は、日本では２００万人以上、世界では１億７０００万人以上に上ると推定されている。これはＨＣＶ感染による肝炎の慢性化率が７０〜８０％と高いことや薬剤治療が十分な効果を示さないことが大きな原因となっている。ＨＣＶ感染により引き起こされる慢性肝炎、すなわち、Ｃ型慢性肝炎は、その後二十数年の経過の中で肝硬変に至り、最終的には肝癌に悪化する可能性がある。肝硬変まで病状が進行したＣ型慢性肝炎患者は生体肝移植により治療され得るが、生体肝移植後に約半数が肝炎を再発することが知られており、肝炎再発を防ぐ手立てが無いのが現状である（非特許文献２）。【０００４】
生体肝移植後の肝炎再発を防ぐために、ウイルスの感染阻害や排除を目的とした抗体医薬の開発が望まれている。ＨＣＶ感染の最初の過程であるＨＣＶの細胞表面への結合は、ＨＣＶのエンベロープタンパク質が担っていると考えられていることから、ＨＣＶエンベロープタンパク質に対する抗体を作製する研究がなされてきた。しかし、Ｃ型肝炎患者の１０％程度において血清中に抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体が認められているが、抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体の出現によりＣ型肝炎が自然に治癒するのは、そのうちの約１０％であることから（非特許文献３）、抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体により治癒すると考えられる患者は、Ｃ型肝炎患者全体のわずか１％程度に過ぎない。これは、ＨＣＶエンベロープタンパク質に対する抗体産生が阻害又は抑制される機構が存在するためと推測されている（非特許文献４）。また、複数の抗ＨＣＶ抗体陽性Ｃ型慢性肝炎患者の血漿から得られた免疫グロブリンを混合した製剤の検討もなされている。しかし、患者由来の抗ＨＣＶ抗体混合製剤は、生体肝移植時から投与した場合においても、血漿中ＨＣＶ量を抑制しないことが明らかにされている（非特許文献５）。【０００５】
一方、非特許文献４では、哺乳動物で発現させた、ＨＣＶのエンベロープタンパク質の一つであるＥ２タンパク質が、ヒト細胞表面に存在するＣＤ８１に特異的に結合することが開示されている。この実験結果に基づいてＣ型肝炎患者からＥ２タンパク質とＣＤ８１との結合を阻害するＮＯＢ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を示す抗体を単離する試みがなされている。その代表的な例として、ファージディスプレイ法を用いて、遺伝子型１ａのＨＣＶに感染したＣ型慢性肝炎患者の骨髄リンパ球から作製した抗体遺伝子ライブラリーからＮＯＢ活性を示す抗体が単離されている（特許文献１）。さらに、遺伝子型１ｂのＨＣＶに感染したＣ型肝炎患者の末梢Ｂ細胞から作製したハイブリドーマから、ＮＯＢ活性を示す抗体が単離されている（非特許文献６、特許文献２）。しかし、ＮＯＢ活性を示す抗体が必ずしも感染を阻害するものではないことも報告されている（非特許文献７）。【０００６】
また、抗ＨＣＶ抗体を抗体医薬として用いる際には、ウイルスゲノムが変異することによりＨＣＶ感染阻害抗体の阻害活性に対して耐性を獲得したウイルス変異株、すなわち、エスケープ変異株の出現が危惧される。抗ＨＣＶ抗体の投与によるＨＣＶのエスケープ変異株の出現はチンパンジーを用いた実験において実証されている（非特許文献８）。【０００７】
非特許文献９には、遺伝子型２ａのＨＣＶに対して感染阻害活性を有する抗ＨＣＶ抗体が、エスケープ変異株の出現を抑制すると示唆されているが、実際にはエスケープ変異株の出現を示唆するデータも開示されている（特許文献３）。また、特許文献３には、これら抗体の遺伝子型１ｂのＨＣＶに対する感染阻害活性は示されておらず、また、開示されている遺伝子型１ｂのＨＣＶに対する結合活性が弱いことから、これら抗体には遺伝子型１ｂのＨＣＶに対する十分な感染阻害活性はないと考えられる。さらに、特許文献３では、これら抗体が遺伝子型２ａ以外の遺伝子型のＨＣＶに対してもエスケープ変異株の出現を抑制するか否かについても明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６４４７３号
【特許文献２】国際公開第２００４／００５３１６号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０３３３１９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２
【非特許文献２】Ｇａｎｅら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３年、第９巻、ｐｓ２８−ｓ３４
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第６６巻、ｐ．１４２５−１４３１
【非特許文献４】Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第１１７巻、ｐ．９３３−９４１
【非特許文献５】Ｄａｖｉｓら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００５年、第１１巻、ｐ．９４１−９４９
【非特許文献６】Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２０００年、第７４巻、ｐ．１０４０７−１０４１６
【非特許文献７】Ｂｕｒｉｏｎｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００２年、第７６巻、ｐ．１１７７５−１１７７９
【非特許文献８】Ｍｏｒｉｎら、Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１２年、第８巻、ｅ１００２８９５
【非特許文献９】Ｋｅｃｋら、Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１２年、第８巻、ｅ１００２６５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特定の遺伝子型のＨＣＶに限定されない複数の遺伝子型のＨＣＶに対して感染阻害活性を有する抗ＨＣＶ抗体は、複数の遺伝子型のＨＣＶが感染している患者に対する効果を有するのみならず、対象となる患者のスペクトルが広いため、医薬として特に有用である。したがって、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して高い感染阻害活性を有する抗ＨＣＶ抗体が望まれる。さらに 、インターフェロンとリバビリン治療に難治性の遺伝子型１ｂのＨＣＶの感染を強力に阻害する抗体が望まれている。【００１１】
また、エスケープ変異株の出現は、抗ＨＣＶ抗体を医薬として開発する際の大きな障害となっている。したがって、エスケープ変異株の出現を誘導しにくい、エスケープ変異株出現抑制性を示す抗ＨＣＶ抗体が望まれる。【００１２】
そこで、本発明の目的は、複数の遺伝子型のＨＣＶの感染を阻害する、抗ＨＣＶ抗体を提供することにある。さらには、本発明の別の目的は、ＨＣＶのエスケープ変異株出現抑制性を示す抗ＨＣＶ抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して高い感染阻害活性を有する抗ＨＣＶ抗体を見出し、さらには、エスケープ変異株出現抑制性を示す抗ＨＣＶ抗体を見出すに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染阻害活性を有する、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片。
（２）エスケープ変異株出現抑制性を示す、上記（１）に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（３）前記抗体又は抗原結合性抗体断片が、以下の（ａ）又は（ｂ）の重鎖可変領域を含む、上記（１）又は（２）に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
（４）さらに軽鎖可変領域を含む、上記（３）記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（５）前記抗体又は抗原結合性抗体断片が、以下の（ｃ）〜（ｆ）のいずれかの軽鎖可変領域を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
（ｄ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（ｆ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（６）上記（５）記載の抗体又は抗原結合性抗体断片と同じ立体構造エピトープを認識する、抗体又は抗原結合性抗体断片。
（７）以下の（ｇ）又は（ｈ）に記載の重鎖可変領域と以下の（ｉ）又は（ｊ）に記載の軽鎖可変領域とを含む、（１）に記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（ｇ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
（ｈ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
（ｉ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２０で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
（ｊ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（８）前記抗体又は抗原結合性抗体断片がＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体、ｄｓＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、又はシングルドメイン抗体である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（９）前記抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（１０）前記抗体又は抗原結合性抗体断片が化学修飾されている、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片。
（１１）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸。
（１２）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコードする核酸。
（１３）上記（１１）又は（１２）に記載の核酸を含むベクター。
（１４）上記（１３）に記載のベクターが導入された宿主細胞。
（１５）上記（１４）に記載の宿主細胞を培養する工程、及び発現された抗体又は抗原結合性抗体断片を回収する工程を含む、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片の製造方法。
（１６）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片を有効成分として含有する、医薬。
（１７）Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤である、上記（１６）に記載の医薬。
（１８）肝臓移植において使用するためのＣ型肝炎の予防剤である、上記（１７）に記載の医薬。
（１９）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス検出用試薬。
（２０）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体又は抗原結合性抗体断片を対象者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防法。【００１５】
本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願2014-058936号の開示全体を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、複数の遺伝子型のＨＣＶに対してＨＣＶ感染阻害活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗体ファージｅ２ｄ０６６及び抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＨ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのＶＨ領域のアミノ酸配列（下段）を示す図である。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４はフレームワーク領域である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；  ＣＤＲ）である。
【図２】抗体ファージｅ２ｄ０６６が提示するＶＬ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのＶＬ領域のアミノ酸配列（下段）を示す。
【図３】抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示するＶＨ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのＶＨ領域のアミノ酸配列（下段）を示す。
【図４】抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示するＶＬ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのＶＬ領域のアミノ酸配列（下段）を示す。
【図５】抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＬ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのＶＬ領域のアミノ酸配列（下段）を示す。
【図６】遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のＩｇＧ抗体のＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図７】遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のｓｃＦｖのＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図８】遺伝子型３ａのＨＣＶｃｃ（Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のＩｇＧ抗体のＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図９】遺伝子型３ａのＨＣＶｃｃ（Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のｓｃＦｖのＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図１０】遺伝子型１ｂのＨＣＶｃｃ（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のＩｇＧ抗体のＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図１１】遺伝子型１ｂのＨＣＶｃｃ（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のｓｃＦｖのＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図１２】遺伝子型１ａのＨＣＶｃｃ（Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のＩｇＧ抗体のＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図１３】遺伝子型１ａのＨＣＶｃｃ（Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対する本発明のｓｃＦｖのＨＣＶ感染阻害活性を示す。
【図１４】未変性Ｅ２タンパク質（図１４Ａ）及び変性Ｅ２タンパク質（図１４Ｂ）に対する本発明のＩｇＧ抗体の結合性を示す（エピトープ解析）。Ｅ２タンパク質としては、ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質を用いた。
【図１５】直鎖状ペプチド（Ｅ２タンパク質アミノ酸配列内の１２アミノ酸残基からなる）に対する本発明のＩｇＧ抗体の結合性を示す（エピトープ解析）。図１５Ａ：ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、図１５Ｂ：ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ、図１５Ｃ：ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ、図１５Ｄ：ＭＢＬ−ＨＣＶ１（ＩｇＧ）。
【図１６】ビオチン化ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＥ２タンパク質（ＴＨ  Ｅ２Ｆｃタンパク質）への結合に対する、他の抗体の競合阻害作用を示す（エピトープ解析）。
【図１７】ビオチン化ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＥ２タンパク質（ＴＨ  Ｅ２Ｆｃタンパク質）への結合に対する、他の抗体の競合阻害作用を示す（エピトープ解析）。
【図１８】遺伝子型２ａのＪ６ＣＦ株（図１８Ａ）のＥ２タンパク質、又は遺伝子型１ｂのＴＨ株（図１８Ｂ）のＥ２タンパク質に対する本発明の抗体及び他の抗体の結合性を示す。
【図１９】遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）感染後のｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ処置による、感染拡大抑制作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、複数の遺伝子型のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する感染阻害活性を有する、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片に関する。
【００１９】
本発明はまた、複数の遺伝子型のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する感染阻害活性と、エスケープ変異株出現抑制性を示す、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片に関する。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片は、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して、エスケープ変異株出現抑制性を示すことが好ましい。
【００２０】
通常、ウイルスの増殖は、中和抗体の存在下で一旦押さえられるが、再び増殖してくることがある。このようにして増殖してくるウイルスを、その抗体に対して中和抵抗性（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）があると言い、そのウイルスをエスケープ変異株と呼ぶ。この再増殖は、中和抗体の存在下でウイルスのエンベロープタンパク質に変異が起こり、中和抗体がエンベロープタンパク質に結合できなくなる結果である。中和抗体存在下でも、その抗体が結合するウイルスのエンベロープタンパク質中のエピトープに変異が起こらず、エスケープ変異株の出現を誘導しにくい抗体も知られている。本願明細書では、このような抗体を「エスケープ変異株出現抑制性」を示す抗体と定義する。本発明の抗体又は抗原結合性断片は、従来の抗体よりもウイルスのエンベロープタンパク質中のエピトープに変異を生じさせにくく、エスケープ変異株の出現を誘導しにくい。
【００２１】
本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片は、立体構造エピトープに結合し、エスケープ変異株出現抑制性を示すことが好ましい。
【００２２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、１０種類のウイルスタンパク質（ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）がこの順番で連結した１つの前駆体タンパク質（ポリプロテイン）として翻訳され、その後、細胞内及びウイルスのプロテアーゼにより、前駆体タンパク質から１０種類の成熟したウイルスタンパク質（ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）がそれぞれ生成される。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、その実体は、ウイルス粒子として存在する。ＨＣＶのウイルス粒子（ＨＣＶ粒子）は、ＨＣＶの構造タンパク質（ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質）から構成されるウイルスの殻の内部にＨＣＶゲノムを含有している。本願明細書では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）とＨＣＶ粒子とは同じ意味で用いている。
【００２３】
本願明細書では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルスタンパク質中のアミノ酸残基の位置（アミノ酸残基番号又はアミノ酸番号ともいう）は、ＨＣＶの前駆体タンパク質を基準として、前駆体タンパク質のＮ末端のアミノ酸（開始メチオニン）を１番目としたときの番号で示す。例えば、遺伝子型１ｂのＴＨ株のＥ２タンパク質は、３８４番目のアミノ酸残基で始まり、７１７番目のアミノ酸残基で終わる。
【００２４】
立体構造エピトープ（構造エピトープともいう）とは、一次構造上において連続したアミノ酸残基からなる直鎖状エピトープとは異なり、一次構造上では離れている不連続性のアミノ酸残基からなるタンパク質の高次構造に依存したエピトープである。立体構造エピトープを構成する不連続性のアミノ酸残基は、部分的に連続することもある。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片が立体構造エピトープを認識することは、還元剤及び熱処理等によって変性させたＥ２タンパク質との結合性の消失又は結合性の低下により確認できる。
【００２５】
Ｅ２タンパク質は、宿主細胞表面に存在する受容体（ＨＣＶ受容体）との結合に関与するエンベロープタンパク質であり、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、このＨＣＶ受容体を介して宿主細胞に感染する。ＣＤ８１は、このＨＣＶ受容体の一つとして同定されており、ＨＣＶの感染に必須の因子の一つであることが報告されている（Ａｋａｚａｗａら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.、２００７年、第８１巻、ｐ．５０３６−５０４５）。
【００２６】
抗体（完全抗体）は、一般的には、免疫グロブリン（Ｉｇ）とも呼ばれるタンパク質で、その構造は、２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）を含むヘテロ四量体を最小単位として、それが１つ又は２つ以上が集まってできたタンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプにおいて重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（以下、ＶＨ領域）を有し、それに定常領域（ＩｇＧの場合、ＣＨ領域：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）が続く。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（以下、ＶＬ領域）を有し、それに１つの定常領域（以下、ＣＬ領域）を有する。ＣＬ領域は重鎖の最初の定常領域であるＣＨ１と整列しており、かつＶＬ領域はＶＨ領域と整列している。抗体の可変領域（Ｆｖ）は相補性決定領域（以下、ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する領域を有している。可変領域は、ＣＤＲに加えて、フレームワーク領域（以下、ＦＲ）と呼ばれる相対的に保存されている部分も有している。完全な重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）により連結された４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を含み、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。完全抗体は例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡであり得る。
【００２７】
本発明に係る抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体（完全抗体）は、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する特異的結合性をもたらす重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに定常領域（ＣＬ、ＣＨ１及びＦｃ）を有する。
【００２８】
本発明に係る抗原結合性抗体断片とは、完全抗体の一部の成分を含み、当該抗体のＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する抗原結合性を保持するタンパク質をいう。本発明に係る抗原結合性抗体断片は、ＨＣＶに対して感染阻害活性を保持する。一般に、抗原結合性抗体断片は完全抗体（免疫グロブリン分子）と比べて分子量が小さいために細胞浸透性に優れており、また微生物を用いて生産可能であるため比較的安価に製造できるという利点を持つ。
【００２９】
抗原結合性抗体断片の例としては、Ｆａｂ（ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ及びＣＨ１からなる抗体断片；ＩｇＧ抗体をパパインにて処理することにより得られる）、Ｆ（ａｂ）’２（ヒンジ領域においてジスルフィド結合で架橋された２つのＦａｂフラグメントからなる抗体断片；ＩｇＧ抗体をペプシンにて処理することにより得られる）、Ｆａｂ’、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）、ｄｓＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体にはｓｃＦｖが包含され、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）とは、典型的には、可変領域（Ｆｖ）であるＶＨ領域とＶＬ領域とがリンカーで一本鎖に連結された抗体である。ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ）とは、安定化のためにフレームワーク領域に導入された鎖内ジスルフィド結合を介してＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域とが連結された抗体である。
【００３０】
本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片は、例えば、化学的に合成したもの（合成抗体）、遺伝子組換え技術によって作製したもの（組換え抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、重鎖及び軽鎖可変領域をリンカーや導入したジスルフィド結合等を介して連結したもの（単鎖抗体やダイアボディなど）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、キメラ抗体等であってよい。組換え抗体は、典型的には、宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体又は抗原結合性抗体断片である。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３１】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の一実施形態は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む。好ましくはこのＶＨ領域は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、ＶＨ領域を含み、かつＶＬ領域を含まないシングルドメイン抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔともいう）であってもよい。これは例えば、ＶＨ領域のみからなる抗体断片である。例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含み、かつＶＬ領域を含まないシングルドメイン抗体、例えば、当該ＶＨ領域のみからなる抗体断片が挙げられる。
【００３３】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片はまた、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含み、かつＶＬ領域を含む抗体であってもよい。ＶＬ領域（軽鎖可変領域）は、ＨＣＶに対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されず、任意の抗体由来（好ましくはヒト抗体由来）の配列であってよい。
【００３４】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片が有するＶＬ領域の好ましい例としては、例えば、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ領域が挙げられる。このＶＬ領域として、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００３５】
上記のＶＬ領域の別の好ましい例として、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域も挙げられる。このＶＬ領域として、例えば、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００３６】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の具体例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含むものが挙げられる。本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の具体例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含むものが挙げられる。
【００３７】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片はまた、上記の抗体又は抗原結合性抗体断片と同じ立体構造エピトープを認識する抗体又は抗原結合性抗体断片であってもよい。例えば、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ領域（好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域）を含み、かつ、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ領域（好ましくは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域）、又は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域（好ましくは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域）を含む、抗体又は抗原結合性抗体断片と同じ立体構造エピトープを認識するものも包含する。
【００３８】
以上のような本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、複数の遺伝子型（好ましくは遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、及び３ａを含む）のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する感染阻害活性を有し、エスケープ変異株出現抑制性を示す。好ましい実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、２以上の遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ及び遺伝子型３ａのＨＣＶに対する高い感染阻害活性を有する。
【００３９】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の別の実施形態は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ領域と、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ領域とを含んでもよい。このＶＨ領域は配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。このＶＬ領域は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。これら抗体は、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して高い感染阻害活性を有する。このような本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の具体例として、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含むものが挙げられる。このような本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、複数の遺伝子型（遺伝子型１ｂ及び２ａを含む）のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する感染阻害活性を有する。
【００４０】
ＣＤＲは抗体の特異性を決定する領域である。本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片が有するＣＤＲ以外の領域（例えば、完全抗体の場合は、重鎖及び軽鎖の各ＦＲ及び各定常領域）のアミノ酸配列は、ＨＣＶに対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されず、他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片は、ＣＤＲ以外の領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列を含むことが好ましい。本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片のＣＤＲはヒト抗体由来であるため、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を構成するその他の領域がヒト抗体由来であれば、ヒト抗体由来のアミノ酸配列のみで構成される抗体又は抗原結合性抗体断片となるため、より好ましい。本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片の軽鎖は、配列番号３８〜４０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むＣＬ領域（定常領域）を有してもよい。
【００４１】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など、いずれのクラスに属するものであってもよいが、好ましくはＩｇＧである。本発明の抗体の軽鎖は、λ鎖、又はκ鎖のいずれであってもよい。
【００４２】
本発明の抗体は、上記のような重鎖可変領域（ＶＨ領域）を含む重鎖及び上記のような軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む軽鎖とともに定常領域を有する完全抗体であり得る。完全抗体である本発明の抗体の好ましい例としては、配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体（実施例に記載のｅ２ｄ０６６  ＩｇＧに対応）、配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体（実施例に記載のｅ２ｄ０８１  ＩｇＧに対応）、及び配列番号２８で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体（実施例に記載のｅ２ｄ０７３  ＩｇＧに対応）が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片はまた、配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体（実施例に記載のｅ２ｄ０６６  ＩｇＧに対応）、又は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体（実施例に記載のｅ２ｄ０８１  ＩｇＧに対応）と同じ立体構造エピトープを認識するものも包含する。
【００４４】
本発明の抗原結合性抗体断片は、上記のような重鎖可変領域（ＶＨ領域）と上記のような軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を有する単鎖抗体、例えばｓｃＦｖであることも好ましい。単鎖抗体とは、一本鎖抗体とも呼ばれ、少なくともＶＨ領域及びＶＬ領域を含み（ＣＬ領域をさらに含んでもよい）、それらが一本鎖に連結された抗体断片を意味する。ｓｃＦｖは、典型的には、Ｆｖを構成するＶＨ領域１個とＶＬ領域１個とがリンカーで連結された抗体である。但し本明細書では、ＶＨ領域とＶＬ領域のほかに、さらにＣＬ領域を含むものもｓｃＦｖと呼ぶ。本発明に係るｓｃＦｖの具体例として、ＶＨ領域、リンカー、並びにＶＬ領域及びＣＬ領域（ＶＬＣＬ領域）を含む、配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなる抗体断片（実施例に記載のｅ２ｄ０６６  ｓｃＦｖに対応）、配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなる抗体断片（実施例に記載のｅ２ｄ０８１  ｓｃＦｖに対応）、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなる抗体断片（実施例に記載のｅ２ｄ０７３  ｓｃＦｖに対応）が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片は、ヒト体内において免疫原性を有しない限り、ヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列に由来しない配列（例えば、人為的に変異を加えた配列）を含んでもよい。本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片は、例えば、上記に記載の完全抗体を構成するアミノ酸配列に対して、ＦＲや定常領域中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。そのようなアミノ酸の置換は、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸の置換である。そのようなアミノ酸置換を有する抗体は、未置換抗体と機能的に同等であることが好ましい。そのため、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。フレームワーク領域内のアミノ酸残基のシステインへのアミノ酸置換によってジスルフィド結合を導入することにより安定化した抗体及び抗原結合性抗体断片（ｄｓＦｖなど）を作製することもでき、そのような抗体及び抗原結合性抗体断片も本発明の範囲に含まれる。ここで「機能的に同等」とは、アミノ酸置換を有する抗体が、置換前の抗体と同様の生物学的又は生化学的活性を有する、特にＨＣＶ感染阻害活性を有することを意味する。
【００４６】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、例えば以下のような方法で作製できる。
【００４７】
抗体又は抗体断片をコードする核酸（遺伝子）を、１つ又は複数の適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させることができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．、ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．、１９９７年、ＷＩＬＥＹ；  Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、２０００年、ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ；  Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．、１９９３年、ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。なお、抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡは、例えば、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）又はＤＮＡ合成機を用いて作製することができる。
【００４８】
具体的には、例えば、完全抗体を作製する場合には、抗体の可変領域をコードするＤＮＡとヒトＩｇＧの定常領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターへ組み込めばよい。又は、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体の定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。それらのＤＮＡは、発現ベクター中の発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御下に組み込むことが好ましい。次に、得られた発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、それを培養することにより、抗体を産生させることができる。これらの発現ベクターは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
得られたＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し発現させることにより完全抗体を得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第１９９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲとしては、相補性決定領域が下記実施例に記載のｅ２ｄ０６６又はｅ２ｄ０８１の完全抗体と同様の構造の抗原結合部位を形成することを妨げないものを選択して用いることができる。また、様々なヒト抗体由来のＦＲに置換してもよい（国際公開第１９９９／５１７４３号参照）。
【００５０】
本発明の抗原結合性抗体断片も、公知の方法、例えば完全抗体の酵素消化又は遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。本発明の抗原結合性抗体断片は、抗原との結合活性を維持する限り他のタンパク質と融合してもよい。例えば、ＶＨを含むＨ鎖断片と、ＶＬを含むＬ鎖断片を適当なリンカーを介して連結し、それを宿主細胞で発現させることにより、又は培養細胞中で別々のベクターから発現させたＨ鎖タンパク質とＬ鎖タンパク質を会合させることにより、ｓｃＦｖやＦａｂ等の抗原結合性抗体断片を作製できる。
【００５１】
例えば、ファージディスプレイ法においてＶＨとＶＬを挿入したファージミドを大腸菌に形質転換することにより本発明の抗原結合性抗体断片を作製することもできる。具体的には、ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させ、ファージミドベクターにＶＬを挿入して大腸菌に形質転換し、ＶＬ陽性のファージミドの精製を行い、次に、ＶＨをＶＬ陽性のファージミドに挿入し、大腸菌で発現させる２段階クローニング法によって本発明の抗原結合性抗体断片を作製することができる。また、ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させた後に連結し、その連結物をファージミドに組み込み、それにより大腸菌を形質転換することによるＶＬ−ＶＨアッセンブリー法によっても本発明の抗原結合性抗体断片を作製できる。
【００５２】
ｓｃＦｖの調製は、例えば、次のようにして行うことができる。遺伝子組換え技術により、単離したＶＨ及びＶＬをコードするそれぞれのｃＤＮＡの間に（又は、ＶＨ及びＶＬＣＬをコードするそれぞれのｃＤＮＡの間に）リンカーをコードするＤＮＡを挿入し、得られた一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを宿主細胞に導入し発現させることによりｓｃＦｖを作製できる。
【００５３】
本発明のｓｃＦｖにおいてＶＨ領域とＶＬ領域とを結ぶリンカーは、その両端に連結されたＶＨ及びＶＬの発現や、ＶＨとＶＬとの結合を阻害するものでなければ特に制限されない。リンカーペプチドの長さは、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば１５アミノ酸）である。本発明においては、（ＧＧＧＧＳ）３という１５アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号３５）（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２００７年、２０（９）巻、ｐ．４２５−４３２）をリンカーとして好適に用いることができる（なお、ＧはグリシンをＳはセリンを表す）。可変領域をコードするＤＮＡの調製のため、例えば、ＣＤＲとヒト抗体のＦＲを連結するように設計した塩基配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成することができる。
【００５４】
ＦＲの選択には、例えば、二つの方法が採用できる。１つめの方法は、ＮＥＷＭ、ＲＥＩなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、ｐ．３２３−３２７；Ｔｅｍｐｓｔ，ＰＲら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９４年、第７巻、ｐ．１５０１−１５０７；  Ｅｌｌｉｓ  ＪＨ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第１５５巻、ｐ．９２５−９３７）。２つめの方法は、ヒト抗体のＦＲで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Ｓａｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、３１巻、ｐ．３７１−３８１；  Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９３年、６巻、ｐ．９７１−９８０；  Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９１年、第４巻、ｐ．７７３−７８３）。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。
【００５５】
また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法として、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ、１９９５年、第１５２巻、ｐ．２７１−２７５；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８３年、第１００巻、ｐ．４６８−５００；  Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８４年、第１２巻、ｐ．９４４１−９４５６；  Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７年、第１５４巻、ｐ．３５０−３６７；  Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８５年、第８２巻、ｐ．４８８−４９２；  Ｋｕｎｋｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８８年、第８５巻、ｐ．２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片をコードする所定の核酸に適宜変異を導入することにより、該抗体及び抗原結合性抗体断片と機能的に同等な抗体及び抗原結合性抗体断片を調製することができる。部位特異的変異誘発を実施するためのキットも市販されており、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片の作製に利用することができる。
【００５６】
本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片は、化学的に修飾（化学修飾）されたものであってもよい。すなわち、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片は、化学修飾された抗体及び抗原結合性抗体断片を包含する。この化学修飾は、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片が、ＨＣＶに対する特異的結合性を有することができる限り、任意のものであってよく、例えば機能上の修飾又は標識であってよい。そのような化学修飾として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、及びＰＥＧ化（ポリエチレングリコール）などが挙げられる。また化学修飾は、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる修飾であってもよい。これら修飾は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
【００５７】
本発明は、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸も提供する。例えば、本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸は、配列番号１で示されるＶＨ領域をコードする塩基配列と配列番号３で示されるＶＬ領域をコードする塩基配列とを含むものであってもよく、さらに配列番号３８で示されるアミノ酸配列からなるＣＬ領域をコードする塩基配列を含んでもよい。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸はまた、配列番号１１で示されるＶＨ領域をコードする塩基配列と配列番号１３で示されるＶＬ領域をコードする塩基配列とを含むものであってもよく、さらに配列番号３９で示されるアミノ酸配列からなるＣＬ領域をコードする塩基配列を含んでもよい。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸はまた、配列番号１で示されるＶＨ領域をコードする塩基配列と配列番号２１で示されるＶＬ領域をコードする塩基配列とを含むものであってもよく、さらに配列番号４０で示されるアミノ酸配列からなるＣＬ領域をコードする塩基配列を含んでもよい。本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコードする核酸も提供する。本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸を含むベクター、及び該ベクターが導入された宿主細胞も提供する。
【００５８】
宿主細胞とは、ベクターが導入される対象細胞を指し、例えば、細菌細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞など）、真菌細胞（酵母細胞など）、昆虫細胞などであってよい。ベクターが導入された宿主細胞は、突然変異又は環境の影響などにより、ベクターが導入された当初の細胞と全く同一ではない形質（表現型）を示す細胞となりうるが、このような細胞の子孫もその「宿主細胞」に包含する。
【００５９】
本発明は、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片をコードする核酸を含むベクターが導入された宿主細胞を培養する工程、及びその培養において発現された抗体又は抗原結合性抗体断片抗体を回収する工程を含む、抗Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質抗体又は抗原結合性抗体断片抗体の製造方法も提供する。より具体的には、当該ベクターから本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の発現が誘導される条件下で宿主細胞を培養し、その培養物から目的とする抗体又は抗原結合性抗体断片を回収すればよい。回収した抗体又は抗原結合性抗体断片は公知の方法により精製することができる。
【００６０】
以下に、本発明の抗体の製造方法のより具体的な例として、ヒト化ＩｇＧ抗体の製造方法について記すが、他の抗体を当該方法と同様にして取得することもできる。
【００６１】
ヒト化ＩｇＧ抗体の製造に用いる発現用ベクター（ヒト化抗体発現用ベクター）は、ヒト抗体の重鎖定常領域及びヒト抗体の軽鎖定常領域をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターである。そのベクターは、発現ベクターにヒト抗体の重鎖定常領域及びヒト抗体の軽鎖定常領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【００６２】
ヒト抗体の定常領域は、任意のヒト抗体の重鎖及び軽鎖定常領域であってよく、例えば、ヒト抗体の重鎖のＩｇＧ１サブクラスの定常領域及びヒト抗体の軽鎖のκクラスの定常領域等が挙げられる。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖定常領域をコードする遺伝子はエキソンとイントロンを含む染色体ＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよい。
【００６３】
ヒト化抗体発現用ベクターを作製するために用いる動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の定常領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０年））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７年））、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４年））、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８，１５２７（１９８１年））、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１７３（１９９０年））等が挙げられる。動物細胞用発現ベクター中で用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７年））、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７年））、免疫グロブリン重鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５年））とエンハンサー（Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３年））等が挙げられる。
【００６４】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体重鎖及び軽鎖が別々のベクター上に存在するタイプ又は同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらであってもよいが、ヒト化抗体発現用ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体重鎖及び軽鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４年））。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７、１０３５（２０００年））、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８年））などが挙げられる。
【００６５】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【００６６】
ヒト化抗体の安定的生産は、ヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称する）を安定に生産する形質転換株を得ることで実現できる。動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（特開平２−２５７８９１；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３，１３３（１９９０年））等が挙げられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などが挙げられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等が挙げられる。
【００６７】
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）やピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０培地（日水製薬）、ＧＩＴ培地（日本製薬）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＭＤＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ（ニチレイバイオサイエンス：１４３６５Ｃ）、又はこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４、１９９８年、又はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、１９９６年）等により測定できる。また、形質転換株については、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【００６８】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ ８、１９８８年、又はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６年）。また、ヒト化抗体の精製には、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体の重鎖、軽鎖又は抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８０（１９７０年））やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ １２、１９８８年、又はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６年）等で測定することができる。
【００６９】
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を例示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞、又は非ヒト動物個体若しくは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体を製造することができる。
【００７０】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して高い感染阻害活性を有する。本発明に係る抗体又は抗原結合性抗体断片は、好ましくは、２以上の遺伝子型のＨＣＶ、例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、及び６ａからなる群から選択される２以上の遺伝子型のＨＣＶ、特に、遺伝子型１ｂ及び２ａを含む２以上の遺伝子型のＨＣＶに対する感染阻害活性を有する。なお遺伝子型１ａのＨＣＶとしてはＨ７７株、ＨＣＶ−１株、ＨＣＶ−Ｈ株、Ｊ１株など、遺伝子型１ｂのＨＣＶとしてはＴＨ株、ｃｏｎ１株、ＨＣＶ−Ｊ株、ＪＴ株、ＢＫ株など、遺伝子型２ａのＨＣＶとしてはＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株、ＪＦＨ−２株、ＪＣＨ−１株など、遺伝子型３ａのＨＣＶとしてはＳ３１０株、Ｅ−ｂ１株、遺伝子型４ａのＨＣＶとしてはＥＤ４３、遺伝子型５ａのＨＣＶとしてはＥＵＨ１４８０、遺伝子型６ａのＨＣＶとしてはＥＵＫ２などがある。
【００７１】
本発明において「ＨＣＶ感染」とは、ＨＣＶ粒子が宿主細胞の細胞表面に結合するときに始まり、宿主細胞内で増殖された後、細胞外に放出されるまでの過程をいう。したがって、本発明において「ＨＣＶ感染阻害活性」とは、ＨＣＶ感染の前記一連の過程のうち少なくとも一つを阻害又は抑制することにより体内又は細胞集団中でのＨＣＶ感染の進行を阻止する活性である。本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片のＨＣＶ感染阻害活性は、ＨＣＶが宿主細胞の細胞表面のウイルス受容体に結合する経路及び／又は宿主細胞内にＨＣＶゲノムが侵入する経路を阻害することによるものであることが好ましい。なお、「ＨＣＶ粒子」とは、ＨＣＶエンベロープタンパク質とそれにパッケージングされたＨＣＶゲノムから構成される、ＨＣＶそのもの又はＨＣＶ様構造物をいう。
【００７２】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の、ＨＣＶ感染阻害活性は、例えば、培養細胞への感染性を有するキメラＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ−７細胞）に感染させた際の阻害活性を測定することで評価できる。培養細胞への感染性を有するキメラＨＣＶ粒子の作製は、例えば、ある遺伝子型のＨＣＶゲノムの構造遺伝子であるＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質のコード配列を、培養細胞内で高効率に自律複製する遺伝子型２ａのＨＣＶ株ＪＦＨ−１の構造遺伝子と組換え、培養細胞に導入し、それを培養してＨＣＶ粒子を産生させることにより作製することができる。このキメラＨＣＶ粒子を用いることにより、様々な遺伝子型ＨＣＶに対する感染阻害活性を評価できる。この基本技術は、例えば、Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６；  Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６；  Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００７年、第１０３巻、ｐ．７４０８−７４１３に記載されている。
【００７３】
ＨＣＶ感染阻害活性の評価は、具体的には、例えば、ＨＣＶ感染阻害活性を評価すべき抗体の存在下及び非存在下で、ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ−７細胞）との混合物を培養するか、又はＨＣＶ粒子を感染させたＨＣＶ感染細胞を培養し、得られる培養物中に放出されたＨＣＶゲノムＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出する方法により行うことができる。ここで、検出は、一般的には、培養物中のＨＣＶゲノムＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量を測定（例えば定量）することにより行うことができる。この場合、培養物中にＨＣＶゲノムＲＮＡ及びＨＣＶ粒子が存在しないか、あるいは抗体非存在下に比べ少ない場合に、その抗体はＨＣＶに対する感染阻害活性を有すると評価することができる。
【００７４】
ＨＣＶ感染阻害活性の評価法として、より具体的には、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、抗体を含む試料とＨＣＶ粒子とを混合し、３７℃にて１時間反応させる（混合サンプル）。次に、前日に９６ウェルプレートに５×１０３個／ウェルで培養したＨｕｈ−７細胞に混合サンプル５０μＬを添加し、３７℃にて２．５時間培養する。培養液を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、再び新鮮培地を加えて培養を続ける。４８時間後、培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を１００μＬ加えて、細胞からＲＮＡを調製する。ＲＮＡを定量後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶゲノムＲＮＡ量を測定する。ＨＣＶゲノムＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉらの方法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第１１６巻、ｐ．６３６−６４２）に従いＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することにより行えばよい。測定によって得られたＨＣＶゲノムＲＮＡ量から、ＨＣＶ感染阻害活性を算出することができる。
【００７５】
ＨＣＶ感染阻害活性の評価法として、以下の方法も挙げられる。抗体を含む試料とＨＣＶ粒子とを混合し、室温にて３０分間反応させる（混合サンプル）。次に、前日に４８ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで培養したＨｕｈ−７細胞に混合サンプル１００μＬを添加し、３７℃にて３時間培養する。培養液を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、再び新鮮培地を加えて培養を続ける。７２時間培養後、培養液を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）  １００μＬ／ウェルを添加して細胞溶解液を作製する。回収した細胞溶解液に含まれるＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質を、ルミパルスＧ１２００（富士レビオ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス）を用いて定量する。測定によって得られたＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質のモル濃度から、ＨＣＶ感染阻害活性を算出することができる。
【００７６】
一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、ＨＣＶのエスケープ変異株出現抑制性を示す。エスケープ変異株とは、ＨＣＶのウイルスゲノムが変異することにより感染阻害抗体の阻害活性に対して耐性を獲得したウイルス変異株のことをいい、エスケープ変異株出現抑制性とは、エスケープ変異株の出現の誘導率を低下させる、又はエスケープ変異株の出現を誘導させない性質をいう。
【００７７】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片が、エスケープ変異株出現抑制性を示すことは、Ｍｅｉｔａｌらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００８年、第１０５巻、ｐ．１９４５０−１９４５５）に従い、評価対象の抗体の存在下においてＨＣＶ粒子を細胞に感染させて培養した後、回収した培養上清と抗体とを再度混合して非感染細胞に感染させる作業を繰り返し、最終的に培養上清中に含まれるＨＣＶの感染力価を測定することで、評価できる（反復継代感染による評価）。具体的には、例えば、各遺伝子型のＨＣＶとＪＦＨ−１とのキメラＨＣＶ粒子とヒト抗ＨＣＶ抗体とを混合して３７℃にて１時間反応させる（混合サンプル）。次に、１２ウェルプレートに播種した非感染Ｈｕｈ−７細胞に混合サンプルを添加し、感染させる。感染３日後に６ウェルプレートに継代し、継代後３日目及び６日目に培養上清を回収する。回収した培養上清中にキメラＨＣＶ粒子が含まれていることを、ＨＣＶの感染力価測定により確認し、感染力価を確認後の回収した培養上清（３日目又は６日目に回収した培養上清）と抗体とを再度混合し、非感染細胞に新たに感染させ、これを８回繰り返す（継代感染の反復回数：トータル８回）。最後に得られた培養上清中に含まれるＨＣＶの感染力価を測定し、感染阻害濃度ＩＣ５０を算出すればよい。８回に渡る反復継代感染によっても、感染阻害濃度ＩＣ５０の顕著な増加が生じず、感染阻害活性の大幅な低下が生じない場合（例えば、感染阻害濃度ＩＣ５０  １μｇ／ｍＬ以下）には、エスケープ変異株出現抑制性を示すと判断することができる。
【００７８】
また、Ｍｅｉｔａｌらの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００８年、第１０５巻、ｐ．１９４５０−１９４５５）には、ＡＰ３３抗体を上記の反復継代感染で評価した結果、継代感染を３回繰り返した場合エスケープ変異株は出現しないが、５回繰り返した場合はエスケープ変異株が出現することが示されている。この結果からＡＰ３３抗体はエスケープ変異株出現抑制性を示す抗体ではないと考えられている。また、Ｋｅｃｋらの文献（Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１２年、第８巻、ｅ１００２６５３）は、上記の反復継代感染で評価した結果、ＣＢＨ−２抗体では継代感染を３回繰り返すとエスケープ変異株が出現するのに対し、ＨＣ−８４．１抗体及びＨＣ−８４．２５抗体では継代感染をそれぞれ４回及び５回繰り返した場合にエスケープ変異体の出現が抑制されることを示しており、その結果からＨＣ−８４．１抗体及びＨＣ−８４．２５抗体はエスケープ変異株出現抑制性を示す抗体であると記載している。ただし、これら抗体については、国際公開第２０１３／０３３３１９号において、上記の反復継代感染による評価とは異なる評価方法、具体的には、Ｍｅｉｔａｌらの方法とはウイルス量と抗体処置濃度とが異なり、反復感染の条件を感染阻害活性ＩＣ５０値の濃度から開始する方法で評価した場合に、反復感染の過程でウイルス量を一定の濃度に維持するために必要な抗体量が増加（すなわちＩＣ５０値が上昇）したこと、すなわちエスケープ変異株の出現を示唆するデータが報告されている（国際公開第２０１３／０３３３１９号）。したがって、公知情報に基づき、好ましくは、上記の反復継代感染で評価した結果、継代感染を４〜５回繰り返してもエスケープ変異株の出現を抑制する場合に、エスケープ変異株出現抑制性を示すと判断することができる。さらに好ましくは、上記の反復継代感染で評価した結果、継代感染を８回繰り返してもエスケープ変異体が出現しない場合、エスケープ変異株出現抑制性を示すと判断することができる。
【００７９】
エスケープ変異株出現抑制性のない（又は低い）公知の抗ＨＣＶ抗体では、上記の継代感染を４〜５回繰り返す過程でエスケープ変異株が生じるため、感染阻害活性の大幅な低下が認められる。また、エスケープ変異株の出現は、上記の反復感染培養の期間中又は最後に得られた培養上清中に含まれるＨＣＶの塩基配列を解析し、変異したアミノ酸残基を特定することにより確認できる。
【００８０】
一例として、立体構造エピトープに結合する、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、好ましくはエスケープ変異株出現抑制性を示す。
【００８１】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、ＨＣＶのＥ２タンパク質に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、特に、ＨＣＶのＥ２タンパク質の構造エピトープ（立体構造エピトープ）を特異的に認識（結合）する。
【００８２】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、複数の遺伝子型のＨＣＶに対して高い感染阻害活性を有するため、医薬、特に、Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤として用いることができる。本発明は、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を有効成分として含有する医薬、特にＣ型肝炎の治療剤又は予防剤も提供する。
【００８３】
本発明の医薬は、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物であってもよい。「医薬的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用し得る溶媒及び／又は添加剤をいう。
【００８４】
医薬的に許容可能な溶媒には、例えば、水、医薬的に許容される有機剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類）が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８５】
また、医薬的に許容可能な添加剤には、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００８６】
医薬的に許容可能な添加剤は、この他、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉）、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含んでもよい。
【００８７】
溶媒及び添加剤は、剤形に応じて単独で又は適宜組み合わせて使用することができる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を、溶剤（例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液）に溶解し、これに吸着防止剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン）を添加したものを使用することができる。または、使用前に溶解し再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。例えば、凍結乾燥のために賦形剤（例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類）を使用することができる。
【００８８】
本発明の医薬は、常法に従って製剤化することができる。製剤化については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．を参照されたい。
【００８９】
本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬は、経口投与、組織内投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）、局所投与（例えば、経皮投与）又は経直腸的投与で投与することができる。剤形は、投与方法に適する形態であることが好ましい。例えば、組織内投与の場合、血流を介した注射が好ましく、その場合の剤形は典型的には液体である。
【００９０】
注射の場合、注入部位は特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。血流を介して本発明の医薬を直ちに全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性が比較的低く、患者などの対象者に与える負担が小さいからである。または、肝臓内又は肝門脈に注射してもよい。これは、本発明の医薬をＨＣＶが局在する部位に直接的に作用させることができるからである。
【００９１】
本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬を対象者（患者等）に投与する場合、一投与単位に、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を、ＨＣＶ感染阻害活性が発揮され得る有効量が含有されることが好ましい。「有効量」とは、有効成分がその機能を発揮する上で必要な量、すなわち、本発明では、ＨＣＶ感染を阻害する上で必要な量であって、かつ投与する対象者に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、対象者（患者等）の情報、剤型及び投与経路等の様々な条件によって変化し得る。「対象者（患者等）の情報」とは、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用医薬の有無及び治療に対する耐性等を含む。本発明の医薬の最終的な投与量及び有効量は、個々の対象者の情報等に応じて、医師の判断によって決定される。ＨＣＶ感染阻害効果を得る上で、本発明の医薬の大量投与が必要な場合、対象者に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【００９２】
本発明の医薬を対象者に投与する場合、有効成分である本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で選ばれる。または、対象者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができるが、これらの投与量に制限されるものではない。また、上記投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
【００９３】
具体的な投与量の一例として、例えば、Ｃ型肝炎発症初期であって、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの上記医薬の有効量は、通常１〜２０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１〜５００ｍｇの範囲である。対象者の情報又は投与経路等に応じて、前記範囲未満又は前記範囲を超える用量を投与することもできる。
【００９４】
本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬の投与対象となる対象者は、限定するものではないが、好ましくはヒト等の霊長類、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等の哺乳動物であり、ヒト等の霊長類が特に好ましい。対象者は、Ｃ型肝炎に罹患していてもよいし、罹患していないが罹患のリスクがある者であってもよい。対象者は、肝臓移植を受ける慢性Ｃ型肝炎患者であってもよいし、輸血が必要な手術を受ける患者であってもよい。
【００９５】
本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬は、任意のＣ型肝炎に対して有効であり得るが、好ましくは、慢性Ｃ型肝炎又は劇症Ｃ型肝炎に対して有効であり、また、各種遺伝子型のＨＣＶ（例えば１ａ、１ｂ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、又は６ａ）、例えば遺伝子型１ａ、２ａ、３ａ又は１ｂのＨＣＶによって引き起こされるＣ型肝炎に対して特に有効である。本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬は、ＨＣＶがいったん感染した生体内での細胞レベルの感染拡大（他の細胞へのＨＣＶ伝播）も抑制することができる。したがって本発明は、本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬を対象者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防法にも関する。
【００９６】
本発明の抗体若しくは抗原結合性抗体断片又は医薬は、肝臓移植において使用するためのＣ型肝炎の予防剤として好適に用いることができる。例えば、慢性Ｃ型肝炎患者の生体肝移植時のＣ型肝炎再発予防のために、肝臓移植前、肝臓移植中又は肝臓移植後に投与することが好ましい。
【００９７】
本発明の医薬は、その治療若しくは予防効果の補完又は増強、或いは投与量の低減のために、他の薬剤と適量配合又は併用して使用しても構わない。併用する薬剤としては、既存の抗ウイルス剤、例えば、インターフェロン、リバビリンなどが挙げられる。
【００９８】
また、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、試料中のＨＣＶの検出に使用する、ＨＣＶ検出用試薬として用いることもできる。本発明は、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いた、試料中のＨＣＶの検出方法にも関する。
【００９９】
試料とは、ＨＣＶ（ＨＣＶ粒子又はそのエンベロープタンパク質）を含み得る様々な試料をいう。例えば、培養細胞、培養細胞破砕液、培養液上清、又は対象者由来の試料、例えばヒト試料である。ヒト試料とは、ヒトから採取した組織（例えば、術後採取組織）や、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、精液等の体液等のあらゆるヒト由来の生体試料であり、好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。また、液体試料のみならず固体試料であってもよい。例えば、臓器移植によるドナー臓器、又は組織切片標本等でもよい。
【０１００】
ＨＣＶの検出は、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法等の標識抗体を用いた公知の免疫学的検出方法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）又は水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）により実施することができるが、標識抗体を用いた免疫学的検出方法により実施することが好ましい。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ法は、酵素免疫吸着分析法とも呼ばれ、試料中に含まれる微量の標的抗原を、酵素標識した抗体又は抗原を用いて、当該酵素の作用を利用して抗原抗体反応を発色濃度や蛍光強度として検出し、標的抗原を定量する方法である。例えば、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を、固相担体に固定して、当該抗体等と試料中のＨＣＶとの免疫学的反応を酵素的に検出する方法である。ＥＬＩＳＡ法の測定方法については、公知の方法（石川榮治ら編「酵素免疫測定法」、１９８７年、第３版、医学書院など）を参照されたい。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片の固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより達成できる。
【０１０２】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を、標識する標識物質としては、例えばＥＬＩＳＡ法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ４８０又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）又はヨウ素１３１（１３１Ｉ）等を用いることができるが、この限りでない。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。標識抗原と抗体との結合法は、ＥＬＩＳＡ法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
【０１０３】
また、上記の免疫学的測定方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施することもできる。その場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【０１０４】
ＨＣＶ検出方法の具体例として、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法に適用する場合について、以下に例を挙げて、簡単に説明をする。まず、本発明の抗体を不溶性の担体に固相化する。なお、固相化する抗体は、ＨＣＶを特異的に認識するものであれば、１種類であっても数種類であってもよい。次に、固相化抗体の表面に、ＨＣＶを含み得る試料を作用させ、固相化抗体とＨＣＶの複合体を担体の表面に形成させる。その後、洗浄液を用いて十分に洗浄することで、試料中に存在していたＨＣＶ以外の未結合の物質が除去される。さらに、ＨＣＶを特異的に認識する他の抗ＨＣＶ標識体を作製し、この標識抗体を、固相化抗体とＨＣＶの複合体が結合した担体に作用させ、洗浄液を用いて十分に洗浄した後、標識を利用して検出することで試料中に存在するＨＣＶを検出することができる。
【０１０５】
また、先に標識抗体とＨＣＶを含む試料を混合して抗原抗体複合体を形成した後、固相化抗体に作用させることもできる。固相化する抗体をビオチン標識すれば、ビオチン化固相化抗体、ＨＣＶを含む試料、ビオチン以外の標識を施した抗体を全て混合して抗原抗体複合体を形成した後、アビジンを固相化した担体に作用させることで、ビオチン化以外の標識を利用して抗原抗体複合体を検出することができる。
【０１０６】
さらに、上記の免疫学的測定方法は、免疫クロマトグラフィー用テストストリップを用いることもできる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部などから構成される。市販の妊娠診断薬等がこれと同様の形態を有する。本測定方法の原理は、以下の通りである。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は、試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において試料中のＨＣＶと抗体が抗原抗体反応し、反応複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部では、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が生じ、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると、呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、侵襲性がきわめて低く、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また、このようなテストストリップは安価に大量生産できる点でも便利である。
【実施例】
【０１０７】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。【０１０８】
（実施例１）抗体ファージライブラリーのスクリーニング
以下のヒト抗ＨＣＶ抗体のスクリーニングには、Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、１９９６年、第７７巻、ｐ．２５３１−２５３９、Ｂｕｇｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、２００１年、第７５巻、ｐ．９９８６−９９９０、及び、Ｊｏｓｔｏｃｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年、第２８９巻、ｐ．６５−８０に記載されている、一般的なファージディスプレイ法を用いた。【０１０９】
１．抗体ファージライブラリーの作製
以下に記載する抗体ファージライブラリーの作製は、Ｇｅｊｉｍａら、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（２００２）、第１１巻、ｐ．１２１−１２９に十分に記載されている方法に準じて行った。【０１１０】
ヒト慢性Ｃ型肝炎患者より抗体遺伝子をコードするｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡよりＰＣＲ法でＶＨ領域遺伝子とＶＬＣＬ領域遺伝子（ＶＬ領域遺伝子及びＣＬ領域遺伝子）をそれぞれ別個に増幅した。増幅したＶＨ領域遺伝子とＶＬＣＬ領域遺伝子とを、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３５）などのリンカーペプチド配列をコードしたリンカーＤＮＡを含むファージミドベクターであるｐＴＺ１９Ｒに組み込み、ＶＨ領域遺伝子、リンカー、ＶＬ領域遺伝子、ＣＬ領域遺伝子の順序で、ｓｃＦｖ遺伝子を調製した。調製したｓｃＦｖ遺伝子を、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを利用してファージミドベクターであるｐＴＺ１９Ｒに組み込み、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを構築した。このｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーをＴＧ−１（ＳｕｐＦ）などの大腸菌に形質転換後、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を重感染させ、ｓｃＦｖファージライブラリーを調製した。作製した抗体ファージは、ヒト抗体のＶＨ領域とＶＬＣＬ領域とがリンカーで結合しているペプチドを提示するファージである。【０１１１】
２．スクリーニングに用いたＨＣＶのＥ２タンパク質の作製
スクリーニングに用いたＨＣＶのＥ２タンパク質の調製は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。その方法はＫｒｅｙら、ＰＬＯＳ  ＰＡＴＨＯＧＥＮＳ、第６巻、ｅ１０００７６２に十分に記載されている。【０１１２】
ＨＣＶのＴＨ株（遺伝子型１ｂ、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２６９巻、ｐ．１４２０５−１４２１０、国際公開第２００６／０２２４２２号）のＥ２タンパク質（アミノ酸番号３８４−７１１；膜貫通領域を含まない）をコードするＤＮＡ、又は、ＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ、国際公開第２００４／１０４１９８号）のＥ２タンパク質（アミノ酸番号３８４−７１４；膜貫通領域を含まない）をコードするＤＮＡを、それぞれ、Ｓ２細胞発現ベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉs（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素サイトＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩを用いて挿入した。【０１１３】
トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法により行った。トランスフェクション用溶液を以下のように作製した。ＨＣＶのＥ２タンパク質コード遺伝子で挿入断片を組み換えたｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓを１９μｇ、セレクション用プラスミドベクターｐＣｏＨｙｇｒｏを１μｇ、２Ｍ  ＣａＣｌ２を３６μＬ混合し、精製水で３００μＬにメスアップした。この混合溶液をＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＨＢＳ；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１）にゆっくり滴下し、穏やかにボルテックスしながらよく混合し、トランスフェクション用溶液を作製した。【０１１４】
６ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬのＳ２細胞を２ｍＬ播種し、２８℃で１２時間程度培養し、２〜４×１０６細胞／ｍＬにした。上記のトランスフェクション用溶液を室温で３０分間静置後、Ｓ２細胞を播種した６ウェルプレートにまんべんなく均等に滴下し、その後２８℃で２４時間培養した。２４時間後、培地交換し（Ｓｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｍｅｄｉｕｍ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、３００μｇ／ｍＬ  ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ）、３〜４日毎に培地交換しながら継代培養した。約３週間選択培養して安定細胞株とした。【０１１５】
Ｅ２タンパク質の発現誘導は、２×１０６個のＳ２細胞（２２５ｃｍ２フラスコ１個あたり４０ｍＬ）にＣｕＳＯ４（最終濃度０．５  ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えて５日培養した。培養液を回収し、遠心（２０００ｒｐｍ、５分）により細胞を除去して培養上清を得た。培養上清を、Ｈｉｓタグタンパク質精製用クロマトグラフィー担体（Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ）を用いて精製し、ＨＣＶのＴＨ株（遺伝子型１ｂ）Ｅ２タンパク質又はＨＣＶのＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のＥ２タンパク質を得た。【０１１６】
３．ＨＣＶのＥ２タンパク質に結合する抗体ファージのスクリーニング
以下に記載する抗体ファージのスクリーニングは、Ｇｅｊｉｍａら、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（２００２）、第１１巻、ｐ．１２１−１２９に十分に記載されている方法に基づいて行った。【０１１７】
上記２．項にて作製したＨＣＶのＥ２タンパク質（ＴＨ株（遺伝子型１ｂ）Ｅ２タンパク質又はＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のＥ２タンパク質）を、イムノチューブなどのプラスチック表面又は磁気ビーズ表面に結合させ、上記１．項で作製したｓｃＦｖファージライブラリーを添加して反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄し非特異的なファージを取り除いた。特異的に結合したファージは０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出し、大腸菌に感染させて増幅した。この操作を３回繰り返すことでＨＣＶ  Ｅ２タンパク質（ＴＨ株（遺伝子型１ｂ）Ｅ２タンパク質又はＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のＥ２タンパク質）に特異的なファージを濃縮し、取得した。【０１１８】
４．選抜した抗体ファージの可変領域
上記３．項で選抜した３種類の抗体ファージ（ｅ２ｄ０６６、ｅ２ｄ０７３、及びｅ２ｄ０８１）が提示するペプチド中のＶＨ領域及びＶＬ領域の塩基配列を、常法により解析した。また、ＣＬ領域の塩基配列についても、常法により解析した。【０１１９】
（１）抗体ファージｅ２ｄ０６６
抗体ファージｅ２ｄ０６６が提示する、ＶＨ領域をコードする塩基配列を配列番号１に、そのアミノ酸配列を配列番号２に示し（図１）、ＶＬ領域をコードする塩基配列を配列番号３に、そのアミノ酸配列を配列番号４に示す（図２）。また、抗体ファージｅ２ｄ０６６が提示する、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７に示し、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号８、配列番号９、配列番号１０に示す。また、ＣＬ領域のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。【０１２０】
（２）抗体ファージｅ２ｄ０７３
抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示する、ＶＨ領域をコードする塩基配列を配列番号１１に、そのアミノ酸配列を配列番号１２に示し（図３）、ＶＬ領域をコードする塩基配列を配列番号１３に、そのアミノ酸配列を配列番号１４に示す（図４）。また、抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示する、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示し、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示す。また、ＣＬ領域のアミノ酸配列を配列番号３９に示す。【０１２１】
（３）抗体ファージｅ２ｄ０８１
抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＨ領域をコードする塩基配列は、抗体ファージｅ２ｄ０６６が提示するＶＨ領域をコードする塩基配列と同一であった。すなわち、抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＨ領域をコードする塩基配列を配列番号１に、そのアミノ酸配列を配列番号２に示し（図１）、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７に示す。また、抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＬ領域をコードする塩基配列を配列番号２１に、そのアミノ酸配列を配列番号２２に示し（図５）、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をそれぞれ、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５に示す。また、ＣＬ領域のアミノ酸配列を配列番号４０に示す。【０１２２】
図１〜５には、ＶＨ領域又はＶＬ領域をコードする塩基配列（上段）及びそのアミノ酸配列（下段）と、ＶＨ領域又はＶＬ領域のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４との対応を示す。なお、図１は抗体ファージｅ２ｄ０６６及び抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＨ領域、図２は抗体ファージｅ２ｄ０６６が提示するＶＬ領域、図３は抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示するＶＨ領域、図４は抗体ファージｅ２ｄ０７３が提示するＶＬ領域、図５は抗体ファージｅ２ｄ０８１が提示するＶＬ領域を示す。【０１２３】
また、表１には、抗体ファージ（ｅ２ｄ０６６、ｅ２ｄ０７３、ｅ２ｄ０８１）が提示するＣＤＲを示す。
【表１】
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【０１２４】
（実施例２）ｓｃＦｖの作製
選抜した３種類の抗体ファージ（ｅ２ｄ０６６、ｅ２ｄ０７３、及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域、並びにＶＬ領域及びＣＬ領域（ＶＬＣＬ領域）の塩基配列とアミノ酸配列に基づいて、それぞれのＶＨ領域とＶＬＣＬ領域とをリンカーで結合したｓｃＦｖを常法により作製した。リンカーとしては（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３５）を用い、常法によりＶＨ領域のＣ末端とＶＬ領域のＮ末端にリンカーを連結した。ｅ２ｄ０６６のＶＨ領域（配列番号２）、ＶＬ領域（配列番号４）及びＣＬ領域（配列番号３８）（ＶＬＣＬ領域）並びにリンカー（配列番号３５）を含むｓｃＦｖ（ｅ２ｄ０６６  ｓｃＦｖと呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号３２に示す。ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域（配列番号１２）、ＶＬ領域（配列番号１４）及びＣＬ（配列番号３９）（ＶＬＣＬ領域）並びにリンカー（配列番号３５）を含むｓｃＦｖ（ｅ２ｄ０７３  ｓｃＦｖと呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。ｅ２ｄ０８１のＶＨ領域（配列番号２）、ＶＬ領域（配列番号２２）及びＣＬ領域（配列番号４０）（ＶＬＣＬ領域）並びにリンカー（配列番号３５）を含むｓｃＦｖ（ｅ２ｄ０８１  ｓｃＦｖと呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号３４に示す。【０１２５】
具体的には、これらのファージミドＤＮＡ（選抜した抗体ファージ）を制限酵素ＳａｌＩにて消化後、自己再結合させてプロテインＡ融合型抗体（ｓｃＦｖ−ＰＰ型抗体）に変換し、それを用いて大腸菌ＤＨ１２ＳＴＭを形質転換した。形質転換後、２５ｍＬの２×ＹＴＧＡにて３０℃通夜培養した。その培養液１０ｍＬを１Ｌの２×ＹＴＡに混ぜて３時間培養した後、１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ  ＩＰＴＧを加え３０℃で２０時間培養した。培養液を４℃、８０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理に供し、上清を回収した。回収した上清に３１３ｇの硫酸アンモニウムをゆっくり加えて室温にて３０分かき混ぜた後、４℃、８５００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理に供した。沈渣を２０ｍＬのＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）入りＰＢＳに懸濁した。続いてＰＢＳに対して４℃で通夜透析後、４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理に供した。上清を回収し、それを２ｍＬのＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア）を充填したカラムに添加し、室温にてカラム内を自然滴下で通過させた。３００ｍＬのＰＢＳでカラムを洗浄した後、８ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液を２ｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓにてｐＨを７．０に調整した後、透析濃縮用チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、４℃、４５００ｒｐｍ回転）に入れ、ＰＢＳに対して透析し、濃縮した。その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質濃度を算出した。【０１２６】
（実施例３）ＩｇＧ抗体の作製
選抜した３種類の抗体ファージ（ｅ２ｄ０６６、ｅ２ｄ０７３、及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域及びＶＬ領域の塩基配列とアミノ酸配列に基づいて、ＶＨ領域とＶＬ領域とを含むＩｇＧ抗体を常法により作製した。【０１２７】
具体的には、ｓｃＦｖ抗体のＶＨ及びＶＬＣＬ遺伝子を鋳型とし、Ｈ鎖とＬ鎖増幅用プライマーを用い、ＰＣＲを行った。ＶＨの増幅産物はあらかじめヒトＩｇＧ１定常領域を含んだコンストラクションベクターへ、ＶＬＣＬはＬ鎖用コンストラクションベクターへそれぞれライゲーションし、これを連結してＩｇＧ型抗体遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを得た。【０１２８】
このプラスミドＤＮＡを制限酵素にて消化し、リニアライズし、リニアライズしたプラスミド４０μｇを２５０Ｖ・８００μＦの条件にてエレクトロポレーションで、細胞数１×１０７のＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。導入後直ちに１０％ＦＢＳを含むＨａｍ−Ｆ１２培地（和光純薬工業：０８７−０８３３５＋ＭＢＬ２６８−１）に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。【０１２９】
２４時間後に、最終濃度１０μｇ/ｍＬとなるようにピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）を添加し、選択を開始した。約１０日から１４日後に選択されたコロニーを確認し、細胞をＰＢＳ ２０ｍＬで洗浄し、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（和光純薬工業:２６４−１６９３５）１ｍＬにて処理後、Ｈａｍ−Ｆ１２を５ｍＬ加え、プレートより剥離、回収し細胞数を測定した。その結果を元に限界希釈を０．２細胞／２００μＬ／ウェル（９６ウェルプレート５枚）の条件で行った。１４日間培養後、各ウェルの培養上清を用いたＥＬＩＳＡにてＩｇＧ型抗体を高発現する細胞を選択した。選択された細胞を無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ（ニチレイバイオサイエンス：１４３６５Ｃ）に馴化し、初期細胞数２×１０５にて１０日間培養し、上清を回収した。【０１３０】
ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  ヘルスケア：１７−１２７９−０２)１ｍＬをカラムに充填し、培養上清を添加し、流速１滴/２秒で送液し、発現タンパク(ＩｇＧ)をカラムに結合させた。１０ｍＬのＰＢＳを流速１滴／２秒で送液し、非吸着成分を洗浄後、１０ｍＬの溶出バッファー（０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン、ｐＨ３）を流速1滴／秒で送液、溶出液を回収した。アミコンウルトラ−１５遠心式フィルターユニット１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＵＦＣ９０１０９６）にて１ｍＬまで遠心による限外ろ過濃縮と同時に溶液置換（ＰＢＳ）を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体タンパクの濃度を算出した。【０１３１】
得られた、ｅ２ｄ０６６のＶＨ領域（配列番号２）とＶＬ領域（配列番号４）とを含むＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧと呼ぶ）の、重鎖全長のアミノ酸配列を配列番号２６に、軽鎖全長のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。得られた、ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域（配列番号１２）とＶＬ領域（配列番号１４）とを含むＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧと呼ぶ）の、重鎖全長のアミノ酸配列を配列番号２８に、軽鎖全長のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。得られた、ｅ２ｄ０８１のＶＨ領域（配列番号２）とＶＬ領域（配列番号２２）とを含むＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧと呼ぶ）の、重鎖全長のアミノ酸配列を配列番号３０に、軽鎖全長のアミノ酸配列を配列番号３１に示す。【０１３２】
（実施例４）ｓｃＦｖ及びＩｇＧ抗体の感染阻害活性
１．各遺伝子型キメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）の作製
（１）Ｊ６／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶ粒子（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）の産生
Ｊ６／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶ粒子（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）は、国際公開第２０１１／０５２７３５号に記載の方法に準じ、以下の通り作製した。【０１３３】
ＨＣＶ  ＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のゲノムＲＮＡ全領域を逆転写して得たｃＤＮＡ（ゲノムｃＤＮＡ）をｐＵＣ１９プラスミドのＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流にクローニングしたプラスミドＤＮＡ（ｐＪＦＨ−１）を、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６及び国際公開第２００４／１０４１９８号に記載の方法に準じて作製した。このｐＪＦＨ−１を、ＥｃｏＲＩで消化後、さらにＢｃｌＩで部分消化し、ＥｃｏＲＩ部位から最初のＢｃｌＩ部位までの断片（約２８４０ｂｐ）を切除したプラスミドＤＮＡ断片を調製し、それを精製した。【０１３４】
一方、ＨＣＶ  Ｊ６ＣＦ株（遺伝子型２ａ）のゲノムｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６；  Ｙａｎａｇｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第２６２巻、ｐ．２５０−２６３）をｐＵＣ１９プラスミドのＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流にクローニングしたプラスミドＤＮＡ（ｐＪ６ＣＦ）を、国際公開第２００６／０２２４２２号に記載の方法に準じて作製した。このｐＪ６ＣＦをＥｃｏＲＩ及びＢｃｌＩで部分消化し、得られた約２８４０ｂｐの断片を精製し、それを上記のＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩを切除したｐＪＦＨ−１断片に連結して、組換えプラスミドＤＮＡ（ｐＪ６／ＪＦＨ−１）を得た。このｐＪ６／ＪＦＨ−１中にクローン化されたＤＮＡは、Ｊ６ＣＦ株ゲノムｃＤＮＡの５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質の各タンパク質をコードする配列、ＮＳ２タンパク質のＮ末端から１６位のアミノ酸残基までの領域をコードする配列、並びに、ＪＦＨ−１株ゲノムｃＤＮＡのＮＳ２タンパク質の１７位のアミノ酸残基からＣ末端までの領域をコードする配列、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質の各タンパク質をコードする配列及び３’非翻訳領域を、この順で連結させたＨＣＶキメラゲノムｃＤＮＡである。【０１３５】
作製したｐＪ６／ＪＦＨ−１を、ＸｂａＩで切断した後、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０Ｕ（トータル反応液量  ５０μＬ）を加えて３０℃で３０分間インキュベーションすることにより、ＸｂａＩ切断末端を平滑化した後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを合成した（国際公開第２００６／０２２４２２号参照）。こうして合成した、Ｊ６／ＪＦＨ−１キメラゲノムＲＮＡを以下の細胞導入に用いた。３×１０６個のＨｕｈ−７細胞と５μｇのＪ６／ＪＦＨ−１キメラゲノムＲＮＡをＣｙｔｏｍｉｘ溶液（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、  １０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルタチオン；４００μＬ）に懸濁し、４ｍｍキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて２６０Ｖ、９５０μＦで、Ｈｕｈ−７細胞へのＪ６／ＪＦＨ−１キメラゲノムＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。その後、ゲノムＲＮＡを導入したＨｕｈ−７細胞を直径１０ｃｍのディッシュに播種し、継代培養を行った。継代時には、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス）を用いて培養上清中に含まれるＨＣＶのｃｏｒｅタンパク質を定量し、ＨＣＶ粒子産生の確認を行った。ｃｏｒｅタンパク質の量が多い、すなわち、ＨＣＶ粒子産生の活性が高い培養上清を選択し、Ｊ６／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶ粒子のウイルスストック（Ｊ６／ＪＦＨ−１ウイルスストック）として保存した。【０１３６】
１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む）で培養した直径１０ｃｍのディッシュ中のＨｕｈ−７細胞に、上記で得たＪ６／ＪＦＨ−１ウイルスストック（４×１０４ｆｆｕ／ｍＬ（ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ））を１００μＬ程度加え、Ｈｕｈ−７細胞にＨＣＶ粒子を感染させた。細胞がコンフルエントにならないように適宜継代し、２２５ｃｍ２フラスコの１個から、４個へ、１２個へと拡大培養を行った。次いで、そのうちの２２５ｃｍ２フラスコ８個より細胞を剥離し、セルスタック（商標）５段２個（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、培地は６５０ｍＬ／個となるように添加した。残り４個のフラスコから得た細胞を１２個のフラスコに播種することにより、効率よくウイルス粒子産生が続けられた。【０１３７】
継代翌日に培養上清を捨て、２％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む）を６５０ｍＬ加えた。培地交換３日後に培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターを通した後、ディープフリーザーで保存した。また、培養上清回収後のセルスタックに２％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む）を６５０ｍＬ加え、さらに培養を続けた。この２日後に同様の作業を行い、培養上清を回収した。さらに、同様の作業をもう１回繰り返した。ここで回収した培養上清から、次に記載の方法でキメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）を精製した。【０１３８】
（２）Ｊ６／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶ粒子（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）の精製
産生させたウイルス粒子は、以下３段階の工程を用いて精製した。【０１３９】
（Ａ）濃縮及び透析濾過
中空糸カートリッジＨｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＧＥ  ヘルスケア：５００ｋＤａカットオフ、モデル番号ＵＦＰ−５００−Ｃ−８Ａ、以下「Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ」とする）を利用して、上記（１）で得たＨＣＶ粒子を含む培養上清を６０倍に濃縮した。【０１４０】
（Ｂ）密度勾配超遠心
Ｕｌｔｒａ−ｃｌｅａｒ  ２５×８９ｍｍ遠心管（ベックマンコールター：カタログ番号３４４０５８）に、冷却した６０％ショ糖を含むＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を３ｍＬ加え、２０％ショ糖を含むＴＮＥ緩衝液を７ｍＬ重層した。さらに、２０％ショ糖を含むＴＮＥ緩衝液の上に、サンプルを２５ｍＬ重層した。ＳＷ−２８（ベックマンコールター）を用いて、２８，０００回転で４時間、４℃で超遠心を行った。【０１４１】
チューブの底面に２５Ｇ注射針（テルモ）を用いて穿孔を開け、そこから１ｍＬの画分を１２本得た。各画分の溶液について比重を測定し、ショ糖の密度勾配が形成されていることを確認した。比重の大きい方から、３番目、４番目、５番目の各画分を回収して、濃縮及び緩衝液置換に用いた。【０１４２】
（Ｃ）濃縮及び緩衝液置換
溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（排除分子量：１００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＴＮＥ緩衝液を用いてバッファ置換を行うとともに濃縮を行った。こうして得た濃縮液を、感染性ＨＣＶ粒子を含むウイルス液（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）として、以下の実施例に使用した。【０１４３】
（３）その他遺伝子型のキメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）の作製
他の遺伝子型のキメラＨＣＶ粒子の作製に関しては、Ｈ７７株（遺伝子型１ａ）とＪＦＨ−１株とのキメラＨＣＶ粒子（Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）は、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、ＳＣＩＥＮＣＥ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６、ＴＨ株（遺伝子型１ｂ）とＪＦＨ−１株とのキメラＨＣＶ粒子（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）は国際公開第２００９／０１４２１６号及び国際公開第２００９／１３１２０３号、Ｓ３１０−Ａ株（遺伝子型３ａ）とＪＦＨ−１株とのキメラＨＣＶ粒子（Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）は国際公開第２０１３／０３１９５６号を参照し、作製した。これらのキメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）は、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ 、２００６年、第１０３巻、ｐ.７４０８−７４１３の文献にも詳しく記載されており、基本的にこの文献に従って作製し、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの作製（産生及び精製）と同様の方法で精製した。【０１４４】
Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの作製に用いたキメラゲノムＲＮＡは、ＪＦＨ−１株の５’非翻訳領域、Ｈ７７株のｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質及びＮＳ２タンパク質の各タンパク質をコードする配列、並びに、ＪＦＨ−１株のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質の各タンパク質をコードする配列及び３’非翻訳領域を、この順で連結させたＨＣＶキメラゲノムＲＮＡである。【０１４５】
ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの作製に用いたキメラゲノムＲＮＡは、ＪＦＨ−１株の５’非翻訳領域、ＴＨ株のｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質の各タンパク質をコードする配列、ＮＳ２タンパク質のＮ末端から３３位のアミノ酸残基までの領域をコードする配列、並びに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質の３４位のアミノ酸残基からＣ末端までの領域をコードする配列、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質の各タンパク質をコードする配列及び３’非翻訳領域を、この順で連結させたＨＣＶキメラゲノムＲＮＡである。ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４１に示す。【０１４６】
Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの作製に用いたキメラゲノムＲＮＡは、ＪＦＨ−１株の５’非翻訳領域、Ｓ３１０株のｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質及びＮＳ２タンパク質の各タンパク質をコードする配列（アミノ酸番号１−１０３２に相当）、並びに、ＪＦＨ−１株のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質の各タンパク質をコードする配列（アミノ酸番号１０３１−３０３４に相当）及び３’非翻訳領域を、この順で連結させたＨＣＶキメラゲノムＲＮＡである。【０１４７】
このように、ここで作製した各遺伝子型キメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）は、構造遺伝子部分がＪＦＨ−１株以外のＨＣＶ株のゲノムＲＮＡ由来である。各遺伝子型キメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）の細胞感染時の表現型は、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃでは遺伝子型２ａ、Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃでは遺伝子型１ａ、Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃでは遺伝子型３ａ、ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃでは遺伝子型１ｂである。【０１４８】
２．感染阻害活性の測定
ＰＢＳで希釈した、既知ヒト抗Ｅ２タンパク質抗体ＭＢＬ−ＨＣＶ１（Ｂｒｏｅｒｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、２００９年、第８３巻、ｐ．１２４７３−１２４８２）、本発明のｓｃＦｖ又はＩｇＧ抗体に、各遺伝子型キメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型２ａ）、Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型１ａ）、Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型３ａ）、ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型１ｂ））を含むＰＢＳ希釈液を感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｍｏｉ）＝０．１となるように添加して、室温にて３０分間反応させ、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を作製した。【０１４９】
その後、Ｈｕｈ−７細胞（２×１０４細胞／ウェル；１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む））を播種し培養した４８ウェルプレートの培養上清を除去し、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を１００μＬ／ウェルで添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３時間インキュベートした。３時間後に培養上清を除去し、Ｄ−ＭＥＭ  ５００μＬに置換して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにてさらに７２時間培養した。培養後はＤ−ＭＥＭを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μＬ／ウェルで添加して細胞溶解液を作製し、スクリューキャップチューブに回収した。回収した細胞溶解液に含まれるＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質はルミパルスＧ１２００（富士レビオ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス）を用いて定量した。測定によって得られたＨＣＶのｃｏｒｅタンパク質のモル濃度（ｃｏｒｅタンパク質量）から、各抗体（ｓｃＦｖ又はＩｇＧ抗体）のＨＣＶｃｃ感染阻害活性を算出した。具体的には、抗体を加えずにキメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）を感染させた細胞におけるＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質量（対照値：図中の横軸「０μｇ／ｍＬ」）を１００％としたときの、各抗体の存在下でＨＣＶｃｃを添加した細胞におけるＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質量の比率（％）を、その抗体の感染阻害活性の評価値とした。すなわち、細胞中のｃｏｒｅタンパク質量（対照に対する％）が少ないほど、各抗体の感染阻害活性が高いことを示す。【０１５０】
遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対するＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖの感染阻害活性をそれぞれ図６及び図７に、遺伝子型３ａのＨＣＶｃｃ（Ｓ３１０／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対するＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖの感染阻害活性をそれぞれ図８及び図９に、遺伝子型１ｂのＨＣＶｃｃ（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対するＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖの感染阻害活性をそれぞれ図１０及び図１１に、遺伝子型１ａのＨＣＶｃｃ（Ｈ７７／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対するＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖの感染阻害活性をそれぞれ図１２及び図１３に示す。縦軸は、感染阻害活性を表す。横軸は、作用させた各抗体及びその濃度（細胞へ添加後の最終濃度）を示す。【０１５１】
また、各遺伝子型のＨＣＶｃｃに対するＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体、本発明のＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖの感染阻害活性ＩＣ５０値を表２に示す。
【表２】
2015141826.tif 000003
【０１５２】
この結果より、上記のとおり作製した本発明のｓｃＦｖ（ｅ２ｄ０６６  ｓｃＦｖ、ｅ２ｄ０７３  ｓｃＦｖ、及びｅ２ｄ０８１  ｓｃＦｖ）及びＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ）は共に、複数の遺伝子型キメラＨＣＶ粒子（ＨＣＶｃｃ）に対して強い感染阻害活性を有することが示された。特に、ｅ２ｄ０６６のＶＨ領域（配列番号２）とＶＬ領域（配列番号４）とを含むｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖ、並びに、ｅ２ｄ０８１のＶＨ領域（配列番号２）とＶＬ領域（配列番号２２）とを含むｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ抗体及びｓｃＦｖは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び３ａのＨＣＶに対する感染阻害活性を示し、また遺伝子型２ａ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）及び遺伝子型１ｂ（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）に対し、感染阻害活性が知られている、細胞受容体に対する抗体である抗ＣＤ８１抗体（Ｅｍｍａｎｕｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００４年、第１０１巻、ｐ．７２７０−７２７４）及びＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体よりも高い感染阻害活性を示した。これは、本発明の抗体及び抗原結合性抗体断片が、ＨＣＶの感染そのものを阻害する効果を有することから、肝臓移植患者におけるＨＣＶの再感染（Ｃ型肝炎再発）等の予防効果を有することを示しており、肝臓移植において使用するためのＣ型肝炎の予防剤、特に、慢性Ｃ型肝炎患者の生体肝移植時のＣ型肝炎再発予防に適用できることを示すものである。【０１５３】
（実施例５）ＩｇＧ抗体のエスケープ変異株出現抑制性の評価
各ＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ又はｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ）について、エスケープ変異株出現抑制性を評価した。【０１５４】
エスケープ変異株出現抑制性の評価方法は、Ｍｅｉｔａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００８年、第１０５巻、ｐ．１９４５０−１９４５５に十分に記載された方法に準じて行った。【０１５５】
ＰＢＳで希釈したＩｇＧ抗体と、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃとを混合して、３７℃にて１時間反応させ、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を作製した。【０１５６】
その後、１２ウェルプレートに播種したＨｕｈ−７細胞（培地：１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む））に、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を添加し、ＨＣＶｃｃを細胞に感染させた。感染３日後に６ウェルプレートに継代し、継代後３日目及び６日目に培養上清を回収した。回収した培養上清中にＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃが含まれていることを、感染力価測定（以下の記載の、「最後に回収した培養上清中に含まれるＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃの感染力価」の測定方法と同様の方法）により確認した。感染力価を確認後の培養上清（３日目又は６日目に回収した培養上清）を次の感染に使用した。【０１５７】
感染力価を確認後の回収した培養上清（感染培養により産生したＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃを含む）を、再びＩｇＧ抗体と混合し、その混合液を非感染のＨｕｈ−７細胞に添加し、ＨＣＶｃｃを細胞に感染させた。これを８回繰り返した（ＨＣＶｃｃの継代感染の反復回数：トータル８回）。【０１５８】
最後に回収した培養上清中に含まれるＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（以下、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗと呼ぶ）の感染力価を、以下のようにして測定した。感染力価測定の前日に、Ｈｕｈ−７細胞を１×１０４細胞／ウェルとなるようにポリ−Ｄ−リジンコート（ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏａｔｅｄ）９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗを各ウェルに添加して、３７℃で７２時間培養した。培養後、培養上清を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄後、細胞をメタノールで−２０℃、２０分間処置し固定した。固定した細胞をブロックエース溶液（ＤＳファーマバイオメディカル）で１時間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄後、抗ｃｏｒｅ抗体（２Ｈ９；Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６）を１０μｇ／ｍＬとなるように添加して１時間室温にてインキュベートした。上清を除去して細胞を洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加して１時間室温にてインキュベートした。細胞を洗浄後にＰＢＳを各ウェルに５０μＬ添加して蛍光顕微鏡にて細胞を観察した。感染力価は蛍光を発する細胞数を数え、ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（ｆｆｕ／ｍＬ）として示した。【０１５９】
Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗ、又は比較対照として、親株であるＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃに対する、ＩｇＧ抗体の感染阻害活性測定を行い、エスケープ変異株の検出を行った。まず、６０μＬのＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗ又はＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ（それぞれ１００ｆｆｕ）に、希釈したＩｇＧ抗体を同容量添加し、３７℃にて１時間インキュベートし、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を作製した。８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにあらかじめ播種したＨｕｈ−７細胞の培養上清を除去し、抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を１００μＬ添加して、３７℃にて２４時間培養した。その後、培養上清を除去し、各ウェルに１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む）を２００μＬ添加して、さらに４８時間培養した。培養後、上記の感染力価測定と同様の手法で、各ウェルの細胞に蛍光標識抗体を作用させ、蛍光を発する細胞数を数えて感染力価を測定した。抗体を加えずにＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗ又はＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃを感染させた細胞における感染力価を１００％として、各抗体−ＨＣＶｃｃ混合液を添加した細胞における感染力価％を算出した後、５０％感染阻害濃度をＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）で示した。ＩＣ５０の値が低いほど、各抗体による感染阻害活性が高いことを示す。【０１６０】
結果を表３に示す。表中の「Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ」は、親株であるＪ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃに対する各抗体の感染阻害濃度ＩＣ５０を示し、「Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗ」は、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗに対する各抗体の感染阻害濃度ＩＣ５０を示す。【０１６１】
【表３】
2015141826.tif 000004
【０１６２】
表３に示すとおり、既知ヒト抗Ｅ２タンパク質抗体ＭＢＬ−ＨＣＶ１（Ｂｒｏｅｒｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、２００９年、第８３巻、ｐ．１２４７３−１２４８２）は、上記と同様の方法で評価した結果、１００μｇ／ｍＬの濃度でも、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗに対する感染阻害活性は認められず、エスケープ変異株が出現することが示された。【０１６３】
それに対し、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧの、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ−８Ｗに対する感染阻害活性は、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃに対する感染阻害活性と比較して、同等程度であるかわずかに減少するのみであった。すなわち、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧについては、８回に渡る反復継代感染によってもエスケープ変異株の出現が抑制され、それらの抗体がエスケープ変異株出現抑制性を示すことが示された。特に、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧは、エスケープ変異株の出現が認められなかったことから、非常に強いエスケープ変異株出現抑制性を示すことが示された。【０１６４】
ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧとｅ２ｄ０８１  ＩｇＧのＶＨ領域のアミノ酸配列は同一である（配列番号２）。したがって、このＶＨ領域（配列番号２）（特に、配列番号５で示されるＣＤＲ１、配列番号６で示されるＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるＣＤＲ３を含むＶＨ領域）が、エスケープ変異株出現抑制性に寄与している可能性が示された。【０１６５】
（実施例６）エピトープ解析
各ＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ）が立体構造エピトープを認識するかどうかを判定するため、変性Ｅ２タンパク質を認識するか否かを試験した。変性Ｅ２タンパク質に結合できる抗体はＥ２タンパク質の直鎖状エピトープを認識する抗体であり、変性Ｅ２タンパク質に結合できない抗体はＥ２タンパク質の立体構造エピトープを認識する抗体といえる。【０１６６】
なお、コントロール抗体として、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の直鎖状エピトープを認識するＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体、立体構造エピトープを認識するＡＲ３Ａ抗体（国際公開第２０１０／０４７８３０号）についても、同様に解析した。【０１６７】
１．ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質（ＴＨ株のＥ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質）の作製
国際公開第２０１０／０３８７８９号に記載の方法で作製した。【０１６８】
ＴＨ株（遺伝子型１ｂ）のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２６９巻、ｐ．１４２０５−１４２１０、国際公開第２００６／０２２４２２号）を鋳型として、ＴＨ株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目〜第７１７番目に相当する領域からなるタンパク質（Ｅ２タンパク質に該当）をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅した。増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ−ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にクローニングした。Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うよう挿入した。このベクターをＣＭＶ−１３−ＴＨＥ２と名付けた。ＣＭＶ−１３−ＴＨＥ２をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列とＥ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製した。その後、マウスＩＬ−７受容体−ヒト免疫グロブリンＦｃドメインからなるキメラタンパク質を発現するベクターＣＤＭ−ｍＩＬ７Ｒ−Ｉｇ（Ｓｕｄｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．９１２５〜９１２９）のＳａｃＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列とＥ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うよう挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、ＴＨ  Ｅ２Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＣＤＭ−ＴＨＥ２Ｆｃを得た。【０１６９】
ベクターＣＤＭ−ＴＨＥ２Ｆｃを、ＤＥＡＥデキストラン法によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクトして、ＴＨ  Ｅ２Ｆｃタンパク質を発現させた。ＣＤＭ−ＴＨＥ２Ｆｃを導入した細胞の培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａを結合させた担体であるＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＴＨ  Ｅ２Ｆｃタンパク質を精製した。【０１７０】
２．各抗体のビオチン化
各抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ、ＡＲ３Ａ抗体、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体）をビオチン化した。ビオチン化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、添付書に従って行った。ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したＩｇＧ抗体１００μＬに、２０ｍｍｏｌ／ＬのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを２．４μＬ加え、混合して氷中に２時間静置した。次に、Ｚｅｂａ（商標）  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて脱塩し、未反応のビオチンを除去し、ビオチン化抗体を調製した。【０１７１】
３．エピトープ解析
ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質を、２％ＳＤＳ、５％２ＭＥを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で９５℃、３分加熱処理することにより、変性させた。【０１７２】
未変性のＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質、及び、変性したＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質を、それぞれ、０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈してイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬずつ添加し、４℃にて一晩静置することによって各タンパク質をプレートに固相化した。タンパク質溶液を除去し、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、ブロッキングした。【０１７３】
次に、ビオチン化抗体をＰＢＳで３倍段階に希釈して、上記の固相化したプレートの各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３０００倍希釈したアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  ヘルスケア）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄し、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（ナカライテスク）にて発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。【０１７４】
その結果を図１４に示す。図１４Ａは、未変性のＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質に対する各ＩｇＧ抗体の結合性を示し、図１４Ｂは、変性したＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質に対する各ＩｇＧ抗体の結合性を示す。図の縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）を示し、横軸はビオチン化抗体の希釈倍率を示す。【０１７５】
ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ、並びに、ＡＲ３Ａ抗体は、変性したＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質には結合しなかったが、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体は、変性及び未変性のＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質のいずれにも反応した（図１４）。【０１７６】
したがって、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧは、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体とは異なり、立体構造エピトープを認識することが示唆された。【０１７７】
（実施例７）直鎖状ペプチドによるエピトープ解析
実施例６により、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧは、立体構造エピトープを認識することが示唆された。そこで、１２アミノ酸残基からなる直鎖状ペプチド群を用いて、これらの抗体が立体構造エピトープを認識することを確認した。【０１７８】
ＴＨ株のＥ２タンパク質に相当するアミノ酸配列（配列番号３６）（ＴＨ株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合に第３８４番目〜第７１７番目までに相当するアミノ酸配列）について、１２個の連続するアミノ酸をＮ末端から３アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなるペプチド群（ペプチド番号１〜８２）を合成した。各ペプチドのＮ末端はビオチン化し、Ｃ末端はグリシンアミドとした。【０１７９】
各ペプチドを、ＤＭＳＯに溶解後、ＰＢＳに０．０１ｎｍｏｌ／μＬとなるように溶解した。このペプチド溶液をストレプトアビジンコーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬ加え、室温で２時間反応させた。ペプチド溶液を除去し、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することによってブロッキングした。【０１８０】
ブロッキング溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した各抗体を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、抗体溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄し、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＧＥヘルスケア）を５０μＬ／ウェル加え、室温にて１時間反応させた。反応後、抗体溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  含有ＰＢＳで５回洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キットで発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによってペプチドに結合した抗体を検出した。【０１８１】
その結果、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体はペプチドＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮ（配列番号３７）に結合したが（図１５Ｄ）、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧはいずれのペプチドにも結合しなかった（図１５Ａ、Ｂ及びＣ）。以上より、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体は直鎖状エピトープを、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧは立体構造エピトープを認識することが示された。【０１８２】
（実施例８）競合ＥＬＩＳＡによるエピトープの比較
立体構造エピトープを認識するｅ２ｄ０６６  ＩｇＧが、立体構造エピトープを認識するｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ及びＡＲ３Ａ抗体と同一のエピトープを認識するか否かについて、競合ＥＬＩＳＡにより検討した。【０１８３】
コントロール抗体として、立体構造エピトープを認識する中和抗体ＡＲ３Ａ、直鎖状エピトープＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮ（配列番号３７）（ＴＨ株のＥ２タンパク質の第４１２番目のＱから第４２３番目のＮまで）を認識する中和抗体ＭＢＬ−ＨＣＶ１、及び直鎖状エピトープ（第５２２番目のＤ〜第５３４番目のＮまで）を認識する非中和抗体８Ｄ１０−３（国際公開第２０１０／０３８７８９号）を使用した。【０１８４】
各抗体（２０μｇ／ｍＬから３倍段階希釈）に、ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ（実施例６の２．項に記載）を等量加え撹拌後、ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質（上記の実施例６に記載）を固相化（０．５μｇ／ウェル）したＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えた。１時間後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、３０００倍希釈したアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  ヘルスケア）を加え反応させた。１時間後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（ナカライテスク）にて発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。【０１８５】
結果を図１６に示す。図の縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）を示し、横軸は各抗体の濃度を示す。【０１８６】
ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質への結合は、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧにより抗体の濃度依存的に阻害された。したがって、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧは、同一エピトープを認識することが示された。【０１８７】
一方、ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ、ＡＲ３Ａ抗体、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体及び８Ｄ１０−３抗体は、ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質への結合を阻害しなかったことから、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧとはエピトープが異なることが示された。【０１８８】
ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧとｅ２ｄ０８１  ＩｇＧのＶＨ領域のアミノ酸配列は同一であった（配列番号２）。したがって、このＶＨ領域（アミノ酸配列（配列番号２））、特に、配列番号５で示されるＣＤＲ１、配列番号６で示されるＣＤＲ２、及び、配列番号７で示されるＣＤＲ３を含むＶＨ領域が、同一のエピトープ認識に寄与している可能性が示された。【０１８９】
次にエスケープ変異株出現抑制性を示すことが示唆されているＨＣ−８４．１抗体（国際公開第２０１３／０３３３１９号）をＫｒｅｙらの文献（ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｅ１００３３６４，２０１３）に基づいて作製し、ｅ２ｄ０６６とのエピトープの異同について、上記と同様な方法で検討した。ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ、ＨＣ−８４．１抗体、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体及びＡＲ３Ａ抗体を２０μｇ／ｍＬから３倍段階希釈したサンプル中に、ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ（実施例６の２．項に記載）を等量加え撹拌後、ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質（上記の実施例６に記載）を固相化（０．５μｇ／ウェル）したＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えた。１時間後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、３０００倍希釈したアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  ヘルスケア）を加え反応させた。１時間後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（ナカライテスク）にて発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。【０１９０】
結果を図１７に示す。図の縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）を示し、横軸は各抗体の濃度を示す。ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質への結合は、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ及びｅ２ｄ０８１  ＩｇＧにより抗体の濃度依存的に阻害された。【０１９１】
一方、ＨＣ−８４．１抗体、ＡＲ３Ａ抗体及びＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体は、ビオチン化したｅ２ｄ０６６  ＩｇＧのＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質への結合を阻害しなかったことから、ＨＣ−８４．１抗体のエピトープもｅ２ｄ０６６  ＩｇＧとは異なることが示された。【０１９２】
（実施例９）各種モノクローナル抗体のＥ２タンパク質への結合性比較
ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ、ＨＣ−８４．１抗体、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体及びＡＲ３Ａ抗体のＪ６ＣＦ  Ｅ２−Ｆｃ、ＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質への結合性を比較した。Ｊ６ＣＦ  Ｅ２−Ｆｃ又はＴＨ  Ｅ２−Ｆｃタンパク質（上記の実施例６に記載）を固相化（０．５μｇ／ウェル）したＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に各種モノクローナル抗体を３０μｇ／ｍＬから１０倍段階希釈したサンプルを加えた。１時間後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、５０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  −ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え反応させた。１時間後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにて洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（ナカライテスク）にて発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。【０１９３】
その結果を図１８に示す。ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧは遺伝子型２ａのJ６ＣＦ株、遺伝子型１ｂのＴＨ株のＥ２タンパク質に対し、ＨＣ−８４．１抗体、ＭＢＬ−ＨＣＶ１抗体及びＡＲ３Ａ抗体よりも結合性が高いことが示された。
（実施例１０）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染拡大に対するＩｇＧ抗体の阻害効果
遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）が感染した細胞に、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧの処置を行うことにより、ＨＣＶ感染拡大に対するｅ２ｄ０６６  ＩｇＧの作用を評価した。比較として、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼ活性に対する阻害剤テラプレビル（ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）（ＶＸ−９５０）及びインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）についても評価した。【０１９４】
評価の前日に１２ウェルプレートにＨｕｈ−７細胞（４×１０４細胞／ウェル；１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを含む））を播種し培養した。上記実施例４の１．項にて作製した遺伝子型２ａのＨＣＶｃｃ（Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）をＰＢＳにてｍｏｉ＝０．０３となるように調製した後、Ｈｕｈ−７細胞に添加後、Ｈｕｈ−７細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４時間培養した。
４時間後に培養上清を除去し、ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、テラプレビル（ＶＸ−９５０）及びＩＦＮ−αをそれぞれ含むＤ−ＭＥＭに置換して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにてさらに９６時間培養した。また、抗体・薬剤を含まないＤ−ＭＥＭに置換して同様に培養した細胞を対照として設けた（図１９中の横軸「処置なし」）。培養後、細胞培養上清を回収した。回収した細胞培養上清液中に含まれるＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質をルミパルスＧ１２００（富士レビオ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス）を用いて定量した。【０１９５】
結果を図１９に示す。縦軸は、細胞培養上清中のＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質濃度（ｐｍｏｌ／Ｌ）を表し、その値が低いほど感染阻害活性が高いことを示す。横軸は、左から「処置なし」、作用させた抗体ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ、薬剤テラプレビル、ＩＦＮ−α並びにそれらの濃度（細胞へ添加後の最終濃度）を示す。
ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧの処置により、対照（「処置なし」）と比較して、細胞培養上清中のＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質濃度は著しく低値を示し、その効果はテラプレビル（ＶＸ−９５０）及びＩＦＮ−αによる効果と同等以上であった。すなわちｅ２ｄ０６６  ＩｇＧは、ＨＣＶ感染後の細胞におけるＨＣＶ産生を抑制する効果又はＨＣＶ感染細胞から周辺のＨＣＶ未感染細胞への感染を抑制する効果を有していた。【０１９６】
したがって、本発明の抗体及び抗原結合性抗体は、ＨＣＶの細胞への感染そのものを阻害できると共に、ＨＣＶの感染成立後においてもＨＣＶの感染拡大を抑制できることが示された。本発明の抗体及び抗原結合性抗体は、ＨＣＶの感染そのものを阻害する効果を有することから、肝臓移植患者におけるＨＣＶの再感染（Ｃ型肝炎再発）等の予防効果を有することが示され、また、ＨＣＶの感染成立後のＨＣＶ感染拡大抑制効果を有することから、ＨＣＶ持続感染者における治療効果、すなわち、Ｃ型肝炎の治療効果を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片は、高いＨＣＶ感染阻害活性及びＨＣＶ感染拡大抑制効果を有するため、Ｃ型肝炎の治療薬又は予防薬、特に、慢性Ｃ型肝炎患者の生体肝移植時の肝炎再発予防への適用が期待できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１９８】
配列番号１：ｅ２ｄ０６６（及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域をコードする塩基配列
配列番号２：ｅ２ｄ０６６（及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域のアミノ酸配列
配列番号３：ｅ２ｄ０６６のＶＬ領域をコードする塩基配列
配列番号４：ｅ２ｄ０６６のＶＬ領域のアミノ酸配列
配列番号５：ｅ２ｄ０６６（及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６：ｅ２ｄ０６６（及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７：ｅ２ｄ０６６（及びｅ２ｄ０８１）のＶＨ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８：ｅ２ｄ０６６のＶＬ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９：ｅ２ｄ０６６のＶＬ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０：ｅ２ｄ０６６のＶＬ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域をコードする塩基配列
配列番号１２：ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域のアミノ酸配列
配列番号１３：ｅ２ｄ０７３のＶＬ領域をコードする塩基配列
配列番号１４：ｅ２ｄ０７３のＶＬ領域のアミノ酸配列
配列番号１５：ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６：ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１７：ｅ２ｄ０７３のＶＨ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１８：ｅ２ｄ０７３のＶＬ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１９：ｅ２ｄ０７３のＶＬ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２０：ｅ２ｄ０７３のＶＬ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１：ｅ２ｄ０８１のＶＬ領域をコードする塩基配列
配列番号２２：ｅ２ｄ０８１のＶＬ領域のアミノ酸配列
配列番号２３：ｅ２ｄ０８１のＶＬ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ｅ２ｄ０８１のＶＬ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５：ｅ２ｄ０８１のＶＬ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６：ｅ２ｄ０６６のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ）重鎖全長のアミノ酸配列
配列番号２７：ｅ２ｄ０６６のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０６６  ＩｇＧ）軽鎖全長のアミノ酸配列
配列番号２８：ｅ２ｄ０７３のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ）重鎖全長のアミノ酸配列
配列番号２９：ｅ２ｄ０７３のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０７３  ＩｇＧ）軽鎖全長のアミノ酸配列
配列番号３０：ｅ２ｄ０８１のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ）重鎖全長のアミノ酸配列
配列番号３１：ｅ２ｄ０８１のＩｇＧ抗体（ｅ２ｄ０８１  ＩｇＧ）軽鎖全長のアミノ酸配列
配列番号３２：ｅ２ｄ０６６  ｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号３３：ｅ２ｄ０７３  ｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号３４：ｅ２ｄ０８１  ｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号３５：リンカーのアミノ酸配列
配列番号３６：ＴＨ株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：ＴＨ  Ｅ２タンパク質由来ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３８：ｅ２ｄ０６６のＣＬ領域のアミノ酸配列
配列番号３９：ｅ２ｄ０７３のＣＬ領域のアミノ酸配列
配列番号４０：ｅ２ｄ０８１のＣＬ領域のアミノ酸配列
配列番号４１：ＴＨ株とＪＦＨ−１株とのキメラＨＣＶ粒子（ＴＨ／ＪＦＨ−１  ＨＣＶｃｃ）の前駆体タンパク質のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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