(57)【要約】  光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である）に置換することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間の、光架橋形成を抑制することによって、光応答性核酸プローブの不活性化を防ぐ手段を提供する。
2015064718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である）に置換することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間の、光架橋形成を抑制する方法。
【請求項２】
光架橋形成が、
光応答性核酸の塩基配列中にある、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、
該光応答性核酸の塩基配列中の光応答性塩基を含む４塩基長以上の部分塩基配列（光応答性部分塩基配列）に対して相補的な部分塩基配列（相補的部分塩基配列）を有する核酸（部分相補性核酸）の当該相補的部分塩基配列中にある、光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間に、光架橋が形成される反応であり、
部分相補性核酸として、相補的部分塩基配列中の光架橋可能なＴ又はＵのヌクレオチドの少なくとも１個以上に代えて、次の式（Ｉ）：
【化１】
2015064718.tif 000034
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、
ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基であり、
Ｘは、式ＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる、部分相補性核酸を使用することによって、
光応答性核酸と部分相補性核酸との間の光架橋形成を抑制する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光応答性核酸が、光応答性部分塩基配列と相補的部分塩基配列とを、同一分子中に異なった配列領域として含み、光応答性核酸の分子と部分相補性核酸の分子とが同一の分子であり、
光応答性核酸と部分相補性核酸との間の光架橋形成を抑制する方法が、光応答性塩基及び光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の間の光架橋によって、光応答性核酸の自己架橋体形成を抑制する方法である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）中のＲが、−ＣＮである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）：
【化２】
2015064718.tif 000035
（ただし、式ＩＩ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｘは、式ＩＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）；
【化３】
2015064718.tif 000036
（ただし、式ＩＩＩ中、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、ホスホノ基、スルホ基、又は水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の芳香族化合物の１価基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の複素環系芳香族化合物の１価基、又は、次の式：
【化４】
2015064718.tif 000037
（ただし、上記式中、Ｒａ、Ｒ２及びＲ３は、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とは独立に、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３として挙げられた基から選択された基を表す）
で表される１価基を表し、
Ｒ６は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＩＩＩでＱ1に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｑ2は、水素原子を表す）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
部分相補性核酸の塩基配列中の全てのＴ又はＵのヌクレオチドが、式（Ｉ）で表される修飾ヌクレオチドによって置換されている、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、
光架橋可能なＴ又はＵのヌクレオチドの少なくとも１個以上に代えて、次の式（Ｉ）：
【化５】
2015064718.tif 000038
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、
ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基であり、
Ｘは、式ＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドとを、
含む、自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【請求項９】
式（Ｉ）中のＲが、−ＣＮである、請求項８に記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【請求項１０】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基である、請求項８〜９のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【請求項１１】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）：
【化６】
2015064718.tif 000039
（ただし、式ＩＩ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｘは、式ＩＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）；
【化７】
2015064718.tif 000040
（ただし、式ＩＩＩ中、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、ホスホノ基、スルホ基、又は水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の芳香族化合物の１価基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の複素環系芳香族化合物の１価基、又は、次の式：
【化８】
2015064718.tif 000041
（ただし、上記式中、Ｒａ、Ｒ２及びＲ３は、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とは独立に、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３として挙げられた基から選択された基を表す）
で表される１価基を表し、
Ｒ６は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＩＩＩでＱ1に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｑ2は、水素原子を表す）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【請求項１２】
自己架橋体形成抑制型光応答性核酸が、光応答性塩基を含む４塩基長以上の部分塩基配列（光応答性部分塩基配列）に対して相補的な部分塩基配列（相補的部分塩基配列）を有し、
光架橋可能なＴ又はＵが、当該相補的部分塩基配列に位置するＴ又はＵである、請求項８〜１１のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【請求項１３】
自己架橋体形成抑制型光応答性核酸の塩基配列中の全てのＴ又はＵのヌクレオチドが、式（Ｉ）で表される修飾ヌクレオチドによって置換されている、請求項８〜１２のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間の、光架橋形成を抑制する方法、及び自己架橋体形成抑制型光応答性核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の二重鎖形成と検出があり、これは基礎研究だけではなく、医療分野、工業分野、農業分野などで、すでに広く使用されている。核酸二重鎖形成と検出に特に有用な技術として、光応答性核酸を使用した光架橋技術がある。この光架橋技術は、すでに多くの応用があり、例えば、アンチセンスなどの核酸医薬、SNPsのセンシングなどの医療分野から、核酸を用いたDNAナノテクノロジー分野までに至る。この光応答性核酸を使用した光架橋技術は、本発明者の研究グループによって開拓されてきた分野であり、複数の光応答性人工ヌクレオチドが開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。【０００３】
この光架橋技術の特に優れた応用として、高感度な選択的核酸増幅方法（光クランプ法）がある（特許文献２）。この方法は、ＰＣＲによる核酸増幅に先立って、光応答性核酸をクランププローブとして使用して、被検体中に量的に多数ある野生型（あるいは正常型）の塩基配列の核酸と光連結して、解離できない二重鎖を形成することによって、多数ある野生型（あるいは正常型）の塩基配列の核酸を、ＰＣＲで増幅されないように抑制し、結果として、被検体中に量的に少量である目的の変異型の塩基配列の核酸を、高感度で選択的に増幅するというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６６４４７号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３３１９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者の研究グループは、上記の光クランプ法において、本来、クランププローブとして機能するはずの光応答性核酸の一部が機能せずに、いわば不活性化し、クランプ形成効率が悪化することがある、という問題を見いだした。これは、光応答性核酸の高い光反応効率からすれば、本来、あり得ないことであった。このような光応答性核酸プローブの不活性化は、光クランプ法における効率低下という問題にとどまらず、光応答性核酸プローブのあらゆるアプリケーションにおいて、問題となる可能性がある。【０００６】
そこで、本発明の目的は、光応答性核酸プローブの不活性化を防ぐ手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者が鋭意研究してきたところ、上記の光クランプ法における光応答性核酸プローブの不活性化は、光応答性核酸プローブが自己の塩基配列内で部分的に二重鎖を形成するような塩基配列を備えていた場合に、自己の塩基配列内で二重鎖形成した状態で光架橋されてしまい、すなわち、光応答性核酸プローブが自己架橋体を形成してしまって、本来意図していた相補鎖と二重鎖を形成して光架橋する能力を失ってしまうことによるものであることがわかった。【０００８】
この知見に基づいた不活性化抑制の手段としては、例えば、自己の塩基配列内で二重鎖形成するような塩基配列の採用をあらかじめ回避する、というものがある。しかし、このような手段は、光応答性核酸プローブの応用の範囲を限定するものとなってしまい、十分に長い塩基配列を使用したい場合には、特に厳しい制約となる。【０００９】
そこで、本発明者は、このような光応答性核酸プローブの塩基配列の制約を回避すべく、さらに研究を進めたところ、光応答性核酸プローブの光応答性核酸の光連結対象の塩基であるチミン（Ｔ）は、相補鎖との二重鎖形成が可能な範囲で種々の修飾を受けても光応答性核酸との光架橋形成能が維持されるというものであったが、チミンの５位を電子吸引性のシアノ基に置換した５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＴ）としたところ、相補鎖との二重鎖形成には影響を与えることなく、光応答性核酸との光架橋形成の速度が、極めて小さくなることを見いだして、本発明に到達した。すなわち、チミンの５位を電子吸引性のシアノ基に置換した５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＴ）を導入すれば、光応答性核酸プローブの不活性化を抑制することができる。【００１０】
また、この知見によれば、光応答性核酸プローブの自己架橋体形成による不活性化を抑制することにとどまらず、光応答性塩基近傍の塩基配列に対して相補的な塩基配列をその近傍に有しているチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基が、意図しない光架橋を形成してしまって、その結果として意図する光架橋が形成されない、あるいは光応答性核酸が浪費されて、目的の反応の効率や収率が低下してしまう、という事態を防ぐために、広く利用することができる。【００１１】
したがって、本発明は、次の（１）〜にある。
（１）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である）に置換することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間の、光架橋形成を抑制する方法。
（２）
光架橋形成が、
光応答性核酸の塩基配列中にある、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、
該光応答性核酸の塩基配列中の光応答性塩基を含む４塩基長以上の部分塩基配列（光応答性部分塩基配列）に対して相補的な部分塩基配列（相補的部分塩基配列）を有する核酸（部分相補性核酸）の当該相補的部分塩基配列中にある、光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間に、光架橋が形成される反応であり、
部分相補性核酸として、相補的部分塩基配列中の光架橋可能なＴ又はＵのヌクレオチドの少なくとも１個以上に代えて、次の式（Ｉ）：
【化１】
2015064718.tif 000003
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、
ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基であり、
Ｘは、式ＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる、部分相補性核酸を使用することによって、
光応答性核酸と部分相補性核酸との間の光架橋形成を抑制する方法である、（１）に記載の方法。
（３）
光応答性核酸が、光応答性部分塩基配列と相補的部分塩基配列とを、同一分子中に異なった配列領域として含み、光応答性核酸の分子と部分相補性核酸の分子とが同一の分子であり、
光応答性核酸と部分相補性核酸との間の光架橋形成を抑制する方法が、光応答性塩基及び光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の間の光架橋によって、光応答性核酸の自己架橋体形成を抑制する方法である、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
式（Ｉ）中のＲが、−ＣＮである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩ）：
【化２】
2015064718.tif 000004
（ただし、式ＩＩ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｘは、式ＩＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩＩ）：
2015064718.tif 000005
（ただし、式ＩＩＩ中、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、ホスホノ基、スルホ基、又は水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の芳香族化合物の１価基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の複素環系芳香族化合物の１価基、又は、次の式：
【化３】
2015064718.tif 000006
（ただし、上記式中、Ｒａ、Ｒ２及びＲ３は、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とは独立に、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３として挙げられた基から選択された基を表す）
で表される１価基を表し、
Ｒ６は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＩＩＩでＱ1に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｑ2は、水素原子を表す）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８）
式ＩＩＩ中において、次の式（ＩＩＩａ）：
【化４】
2015064718.tif 000007
で表される骨格構造が、
次の式：
【化５】
2015064718.tif 000008
で表されるＤ−トレオニノール構造、
次の式：
【化６】
2015064718.tif 000009
で表されるＬ−トレオニノール構造、
又は、次の式：
【化７】
2015064718.tif 000010
で表されるセリノール構造である、（７）に記載の方法。
（９）
部分相補性核酸の塩基配列中の全てのＴ又はＵのヌクレオチドが、式（Ｉ）で表される修飾ヌクレオチドによって置換されている、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。【００１２】
さらに、本発明は、次の（１１）〜にもある。
（１１）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、
光架橋可能なＴ又はＵのヌクレオチドの少なくとも１個以上に代えて、次の式（Ｉ）：
【化８】
2015064718.tif 000011
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、
ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基であり、
Ｘは、式ＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドとを、
含む、自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１２）
式（Ｉ）中のＲが、−ＣＮである、（１１）に記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１３）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基である、（１１）〜（１２）のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１４）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩ）：
【化９】
2015064718.tif 000012
（ただし、式ＩＩ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｘは、式ＩＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１５）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩＩ）：
【化１０】
2015064718.tif 000013
（ただし、式ＩＩＩ中、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、ホスホノ基、スルホ基、又は水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の芳香族化合物の１価基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の複素環系芳香族化合物の１価基、又は、次の式：
【化１１】
2015064718.tif 000014
（ただし、上記式中、Ｒａ、Ｒ２及びＲ３は、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とは独立に、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３として挙げられた基から選択された基を表す）
で表される１価基を表し、
Ｒ６は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＩＩＩでＱ1に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｑ2は、水素原子を表す）
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分として、上記修飾ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合によって光応答性部分塩基配列中に導入されている、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１６）
式ＩＩＩ中において、次の式（ＩＩＩａ）：
【化１２】
2015064718.tif 000015
で表される骨格構造が、
次の式：
【化１３】
2015064718.tif 000016
で表されるＤ−トレオニノール構造、
次の式：
【化１４】
2015064718.tif 000017
で表されるＬ−トレオニノール構造、
又は、次の式：
【化１５】
2015064718.tif 000018
で表されるセリノール構造である、（１５）に記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１７）
自己架橋体形成抑制型光応答性核酸が、光応答性塩基を含む４塩基長以上の部分塩基配列（光応答性部分塩基配列）に対して相補的な部分塩基配列（相補的部分塩基配列）を有し、
光架橋可能なＴ又はＵが、当該相補的部分塩基配列に位置するＴ又はＵである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
（１８）
自己架橋体形成抑制型光応答性核酸の塩基配列中の全てのＴ又はＵのヌクレオチドが、式（Ｉ）で表される修飾ヌクレオチドによって置換されている、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の自己架橋体形成抑制型光応答性核酸。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、光クランプ法などで使用される光応答性核酸プローブの自己架橋体形成を抑制して、プローブの不活性化を防ぐことができる。これによって、光応答性核酸プローブは、選びうる塩基配列や塩基配列長に、特段に制約を受けることなく、反応効率（収率）を向上させることができる。さらに、本発明によれば、光応答性塩基近傍の塩基配列に対して相補的な塩基配列をその近傍に有しているチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基が、意図しない光架橋を形成してしまって、その結果として意図する光架橋が形成されない、あるいは光応答性核酸が浪費されて、目的の反応の効率や収率が低下してしまう、という事態を防ぐことができ、光応答性核酸の応用の範囲をさらに広げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＴとCNＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を表す図である。
【図２】図２は、光照射時間を延ばしたサンプルの変性ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。
【図３】図３は、CNＴとＴの光反応性の相違を示すＨＰＬＣチャート及びグラフである。
【図４】図４は、CNVＫ含有プローブの光架橋実験の光反応スキームとその結果を示す図である。
【図５】図５は、CNＴによるCNVＫ含有プローブの不活性化の抑制の実験の結果を示す図である。
【図６】図６は、CNVＤ含有プローブの光架橋実験の光反応スキームを示す図である。
【図７】図７は、CNVＤ含有プローブの光架橋実験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１６】
［光架橋形成］
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基は、ピリミジン塩基に属するチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）、及びシトシンと、高い選択性を持って光架橋を形成する（特許文献１）。この光架橋形成反応は、光反応であるために、極めて迅速であり、効率が高く、また溶媒条件や温度条件は、生理的な条件を含めて、所望の条件を幅広く選択することができる。特に、３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基は、［２＋２］光環化反応によって、ピリミジン塩基と効率よく光反応して、光架橋を形成する。
【００１７】
ところが、このような光架橋の形成は、ピリミジン塩基に修飾を行った場合にも、短時間で効率よく進行するために、ピリミジン塩基に修飾を行って、塩基対を形成するために必要な相補性を維持したままで、光架橋の形成を抑制することは、これまでは実現できていなかった。例えば、ピリミジン塩基が、メチルシトシン、シュードウリジンとなった場合でも、この光架橋の形成は進行するものであった。
【００１８】
［光架橋形成の抑制］
ところが、本発明によれば、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基を、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である）に置換することによって、置換後の修飾塩基は塩基対を形成するために必要な相補性が損なわれることなく維持されたまま、光架橋形成を抑制することができる。この光架橋形成の抑制は、チミン（Ｔ）による光架橋形成反応が９０％を超える効率で達成される条件（光照射時間）においても、光架橋形成反応が１％程度に抑制されているという、極めて顕著なものであった（実施例参照）。
【００１９】
［光架橋形成のための二重鎖形成］
光応答性塩基とチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基との間の光架橋は、光照射に先立って、光応答性塩基を含む塩基配列と、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基を含む塩基配列とが、その相補性によって二重鎖を形成して、光架橋反応が進行可能に配置されて、その状態で光照射を受けることによって、光反応が好適に進行して、形成される。そこで、好適な実施の態様において、光応答性塩基を含む光応答性核酸の塩基配列中の光応答性塩基を含む部分塩基配列（光応答性部分塩基配列）に対して、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基を含む部分塩基配列は、相補的な塩基配列（相補的部分塩基配列）である。好適な実施の態様において、光応答性部分塩基配列と、相補的部分塩基配列とは、二重鎖の領域を形成できる程度に安定化されたものであり、例えば、４塩基長、好ましくは５塩基長、さらに好ましくは６塩基長、さらに好ましくは７塩基長、さらに好ましくは８塩基長の長さを少なくとも有するものである。
【００２０】
［光架橋形成抑制性修飾塩基及び修飾ヌクレオチド］
光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基に代えて導入することによって、光架橋の形成を抑制する修飾塩基（光架橋形成抑制性修飾塩基）は、ピリミジン環の５位が、Ｒ基（ただし、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、ただし、Ｒ1は、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である）に置換されたものであり、この修飾塩基を塩基部分として備えた修飾ヌクレオチド（光架橋形成抑制性修飾ヌクレオチド）は、次の式（Ｉ）：
【化１６】
2015064718.tif 000019
で表される修飾ヌクレオチドである。
【００２１】
式Ｉにおいて、Ｒは、−ＣＮ、又は−ＣＯ−Ｒ1であり、好ましくは−ＣＮ（シアノ基）である。Ｒ1は、Ｒが電子吸引性の基となるＲ1であれば、使用することができ、例えば、飽和又は不飽和の、鎖状又は分枝の、環式又は非環式の、Ｃ１〜Ｃ１２の炭化水素基である。このような基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基、トリル基、ナフチル基を挙げることができる。
【００２２】
式Ｉにおいて、Ｘは、式ＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、Ｙは、水酸基を表し、Ｚは、水素又は水酸基を表す。
【００２３】
［光架橋形成抑制性修飾塩基及び修飾ヌクレオチドの合成］
上記の光架橋形成抑制性修飾塩基及び修飾ヌクレオチドは、公知の手段によって合成することができ、そのアミダイト体を合成した後にＤＮＡシンセサイザー等を使用する等の公知の手段によって、これらが光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基に代えて導入された核酸（修飾核酸）を製造することができる。また、所望により、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基、あるいはその他の修飾塩基を含む核酸（修飾核酸）をいったん製造した後に、これに対して修飾反応を行って、光架橋形成抑制性修飾塩基へ変化させることによって、光架橋形成抑制性修飾塩基が光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基に代えて導入された核酸（修飾核酸）を製造することができる。
【００２４】
［光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基］
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基は、好ましくは３−ビニルカルバゾール構造を有する光応答性塩基であり、さらに好ましくは、次の式（ＩＩ）：
【化１７】
2015064718.tif 000020
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分である。
【００２５】
式ＩＩにおいて、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｘは、式ＩＩでＸに結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｙは、水酸基を表し、
Ｚは、水素又は水酸基である。
【００２６】
好適な実施の態様において、式ＩＩのＲａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２７】
好適な実施の態様において、式ＩＩのＲ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２８】
本発明の好適な実施の態様において、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基は、次の式（ＩＩＩ）：
【化１８】
2015064718.tif 000021
で表される修飾ヌクレオチドの塩基部分である。
【００２９】
式ＩＩＩにおいて、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、ホスホノ基、スルホ基、又は水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の芳香族化合物の１価基、Ｃ６〜Ｃ１２の単環式又は二環式の複素環系芳香族化合物の１価基、又は、次の式：
【化１９】
2015064718.tif 000022
（ただし、上記式中、Ｒａ、Ｒ２及びＲ３は、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とは独立に、式ＩＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３として挙げられた基から選択された基を表す）
で表される１価基を表し、
Ｒ６は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＩＩＩでＱ1に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｑ2は、水素原子を表す。
式ＩＩＩにおけるＲａ、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、式ＩＩについて上述したＲａ、Ｒ２及びＲ３とすることができる。
【００３０】
例えば、式ＩＩＩのＲ４として、次に挙げる基を使用することができる。（ただし、波線は遊離原子価の位置を示している。）
【００３１】
【化２０】
2015064718.tif 000023
【００３２】
好適な実施の態様において、式ＩＩＩ中において、次の式（ＩＩＩａ）：
【化２１】
2015064718.tif 000024
で表される骨格構造が、
次の式：
【化２２】
2015064718.tif 000025
で表されるＤ−トレオニノール構造、
次の式：
【化２３】
2015064718.tif 000026
で表されるＬ−トレオニノール構造、
又は、次の式：
【化２４】
2015064718.tif 000027
で表されるセリノール構造である。
【００３３】
上記式ＩＩＩで表される修飾ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドや式ＩＩの修飾ヌクレオチドであればリボース（又はデオキシリボース）構造の糖骨格である部分が、上記式ＩＩＩａで表される骨格構造で代替されたものとなっている。そこで、式ＩＩＩで表される修飾ヌクレオチドは、光応答性人工ヌクレオチドアナログということもできる。驚くべきことに、式ＩＩＩの修飾ヌクレオチドは、このような骨格構造の相違にも関わらず、核酸への組み込みと光応答性に関しては、光応答性塩基として振る舞う。本発明者はこの発見に基づいて、すでに日本国特許出願（特願２０１３−７０３８１）を行った。
【００３４】
［自己架橋体形成の抑制］
本発明による光架橋形成の抑制は、光応答性塩基と、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基が、異なる核酸分子に含まれていて、異なる核酸分子間の光架橋を形成する場合においても、当然に有用であるが、光応答性塩基と、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基が、同じ核酸分子に含まれていて、核酸分子内の自己架橋を形成する場合において、特に有用である。例えば、光クランプ法で使用される光応答性核酸プローブが、その核酸分子内の塩基配列によっては、核酸分子内で部分的に二重鎖を形成してしまうと考えられるが、その部分的に形成された二重鎖の領域のなかに、光応答性塩基とチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基が、光架橋可能に位置している場合には、光応答性核酸プローブは、自己の分子内部において、自己架橋を形成してしまい、本来、意図していた光架橋反応に参加することができず、結果としてプローブの利用効率（収率）が非常に悪化する。このような場合に、光応答性核酸プローブの自己架橋体形成を抑制すれば、プローブの損失を防いで、利用効率（収率）は良好なものとなる。すなわち、好適な実施の態様において、光応答性部分塩基配列と、相補的部分塩基配列とが、同一の核酸分子中に含まれており、これによって自己架橋体の形成が抑制される。
【００３５】
［全てのチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の置換］
本発明によれば、核酸分子中の光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基のうち、少なくとも１個以上を光架橋形成抑制性修飾塩基に置き換えることで、そのチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基に関して、光架橋抑制を実現することができる。したがって、少なくとも１個を置換すれば、本発明の範囲内にあたる。
【００３６】
一方で、本発明の光架橋形成抑制性修飾塩基によって置換された核酸は、置換前のチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の核酸と比較して、Ｔｍ値に変化がなく、二重鎖の形成能がそのまま維持されているという点で、優れたものである。つまり、本発明の光架橋形成抑制性修飾塩基による置換は、二重鎖の形成能に影響を与えないことから、置換数を最小にすることなく、対象とする核酸分子のチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の全てを、光架橋形成抑制性修飾塩基によって置換することができる。全てのチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基を置換する場合には、相補鎖構造の検討を何ら行う必要がなく、一律な置換によって、あらゆる望まれない光架橋形成を、一律に抑制することができるという点で、有利である。例えば、多種類の塩基配列の光応答性核酸プローブを製造する場合において、特に有利である。
【００３７】
［光架橋形成抑制の反応条件］
本発明によれば、従来から知られている光架橋形成の条件において、光架橋形成を抑制することができる。例えば、光架橋のために照射される光は、一般に３５０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光であるが、これらの光照射条件において、光架橋形成を抑制することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。【００３９】
［CNVＫ含有ＯＤＮの合成］
次の式：【００４０】
【化２５】
2015064718.tif 000028
【００４１】
で表されるヌクレオチド（CNVＫ）のアミダイト体の合成を、次のＳｃｈｅｍｅ  １（スキーム１）にしたがって行った。合成は、特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００９／０６６４４７号）に開示された手順にしたがって行った。【００４２】
【化２６】
2015064718.tif 000029
【００４３】
また、同様にして、次の式：【００４４】
【化２７】
2015064718.tif 000030
【００４５】
で表されるヌクレオチド（CNＴ）のアミダイト体を合成した。【００４６】
合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＴ）のアミダイト体をアセトニトリルで１００ｍＭに調整し、ＡＢＩ３４００にてＯＤＮを合成した。合成したＯＤＮ配列は下記Ｔａｂｌｅ１に示す。合成後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。【００４７】
【表１】
2015064718.tif 000031
【００４８】
［CNVＫとCNＴの光反応性の解析］
２０μＭ ＯＤＮ１と２０μＭ ＯＤＮ２もしくは２０μＭ ＯＤＮ３をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で９０℃で５分間加熱した後、ゆっくり４℃までアニーリングを行った。その後、ＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を４℃で行い、光照射による光架橋体の確認を変性ＰＡＧＥにより解析した。この結果を、図１に示す。【００４９】
図１は、ＴとCNＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を表す図である。図１において、各レーンは、Ｍ：１０ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｋｅｒ、Ｌａｎｅ１〜５：Ｔａｒｇｅｔ塩基がＴの場合、Ｌａｎｅ６〜１０ Ｔａｒｇｅｔ塩基がCNＴの場合、をそれぞれ表す。光照射時間はそれぞれ０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓである。ＯＤＮ１とＯＤＮ２は、ハイブリダイズして二重鎖を形成し、光応答性塩基であるCNVＫの５’側に隣接する位置にある塩基と相補的な位置にあたる塩基（ターゲット塩基）であるＴと、CNVＫとが、光照射に応じて光架橋を形成して、電気泳動においてクロスリンク体が検出されている。ＯＤＮ１とＯＤＮ３もまた、ハイブリダイズして二重鎖を形成する配列となっており、CNVＫの５’側に隣接する位置にある塩基と相補的な位置にあたる塩基（ターゲット塩基）として、CNＴが位置している。【００５０】
ＯＤＮ１とＯＤＮ２の組み合わせの場合、すなわち、ターゲット塩基がＴの場合には、２秒の光照射で原料となる９ｍｅｒのバンドがほぼ消失している。一方、ＯＤＮ１とＯＤＮ３の組み合わせの場合、すなわち、ターゲットがCNＴの場合には２秒の光照射でもクロスリンク体のバンドが確認されなかった。この結果よりCNVＫの架橋塩基がＴとCNＴの場合で反応性に大きな差があることがわかった。CNＴが架橋塩基の場合には、そもそも架橋反応が進行しないのか、ゆっくり反応するのかを調べるために、さらに光照射時間を延ばしたサンプルでの変性ＰＡＧＥ解析を行った。この結果を図２に示す。【００５１】
図２は、光照射時間を延ばしたサンプルの変性ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。各レーンは、Ｍは１０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｋｅｒ、及び光照射時間０秒、１秒、５秒、１０秒、３０秒、６０秒、１２０秒、３００秒をそれぞれ示している。【００５２】
図２に示されるように、ＯＤＮ１とＯＤＮ３の組み合わせの場合も、光照射時間を極端に延ばすことによって、うっすらと光架橋体らしきバンドが確認できた。よって、チミンの５位をシアノ基に置換したCNＴは、チミン（Ｔ）と比較して、CNVＫとの架橋速度が圧倒的に遅いことがわかった。【００５３】
より定量的な議論をするためにＨＰＬＣ解析を行い、ＯＤＮ３の減少量から光架橋率を算出した。この結果を図３に示す。【００５４】
図３は、図３の（Ａ）において、ＯＤＮ１とＯＤＮ３のクロスリンク反応のＨＰＬＣ解析を示しており、光照射時間０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓ、５ｓについて、それぞれ横軸をリテンションタイム（分）としたチャートを示している。図３は、図３の（Ｂ）において、ＯＤＮ２（Ｔ）とＯＤＮ３（CNＴ）の光反応性の比較のグラフを示しており、横軸は光照射時間（秒）、縦軸は光架橋率（％）を示している。図３の（Ｂ）の上側の近似曲線はＯＤＮ２（Ｔ）、下側の近似曲線はＯＤＮ３（CNＴ）を示す。【００５５】
ＨＰＬＣの結果からも、秒単位の光照射ではCNＴとCNVＫの光架橋反応はほとんど進行していないことがわかった。ＯＤＮ３の光照射による減少量から光架橋率を算出したところ、ターゲットがＴの場合は光照射時間１秒で９０％以上なのに対して、ターゲットがCNＴの場合は光照射１秒で１％前後となった。カーブフィティングにより近似曲線を求めたところ、ターゲットがCNＴの場合は、ターゲットがチミンの場合の約１／８０の速度で光架橋反応がゆっくり進行することがわかった。【００５６】
［CNVＫ含有プローブの不活性化の抑制］
CNVＫはその光応答能の高さのために、最安定な構造ではなく一時的に形成した二本鎖状態を架橋することも考えられる。特に自己架橋構造の形成はCNVＫ含有プローブを不活性化させる要因の一つになると考えられる。上記で得られたCNＴがCNVＫとの光応答性が低いという知見から出発して、CNVＫ含有プローブの不活性化の抑制の実験を行った。【００５７】
一連の実験に先立って、まず、塩基配列に関しては、自己架橋を形成するような配列をスクリーニングして選択し、ＯＤＮ４の配列を使用することに決定して実験を行った。
２０μＭ Ｐｒｏｂｅ ＯＤＮ（ＯＤＮ４もしくはＯＤＮ５）と２０μＭ ＯＤＮ６をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム）中で９０℃で５分間加熱した後、ゆっくり２５℃までアニーリングを行った。Ｌａｎｅ５、６はサンプル作成後、９０℃で５分間加熱し、すぐに２５℃に移し急冷を行った。Ｌａｎｅ７、８は２０μＭ Ｐｒｏｂｅ ＯＤＮと４μＭ ＯＤＮ６とし、プローブをターゲットの５倍量とした。これらサンプルをＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を２５℃で１０秒間行った。そして、変性ＰＡＧＥによる解析を行った。これらの操作の流れ及び結果を、図４に示す。【００５８】
図４は、CNVＫ含有プローブの光架橋実験の光反応スキームとその結果を示す図である。図４の（Ａ）は、光架橋によるCNVＫ含有プローブの光反応スキームを示す説明図である。図４の（Ｂ）は、この実験の変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。図４の（Ｂ）において、各レーンは、レーンＭは１０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｋｅｒ、レーン１と２はＰｒｏｂｅのみ、レーン３と４はＰｒｏｂｅとＴａｒｇｅｔ、レーン５と６はＰｒｏｂｅとＴａｒｇｅｔを急冷したもの、レーン７と８はＴａｒｇｅｔに対してＰｒｏｂｅが５倍量（５当量）入ったものである。レーン２、４、６、８には、光照射を行い、レーン１、３、５、７には、光照射を行っていない。【００５９】
今回使用しているCNVＫ含有プローブでは、光照射後に原料バンドよりも少し低分子量側に新たなバンドが現れている。これは、光照射しない場合には現れないこと、CNVＫ含有プローブ（ＯＤＮ４）のみを加えた場合でも現れること、変性条件下の電気泳動でもＯＤＮ４のバンドと区別されて現れること、などにより、CNVＫ含有プローブ（ＯＤＮ４）が自己分子内で光架橋して生成した自己架橋体のバンドだと考えられる。【００６０】
さらに、ＯＤＮ４に含まれるＴをすべてCNＴに置換したプローブを用いて同様の実験を行った。この結果を、図５に示す。【００６１】
図５は、CNＴによるCNVＫ含有プローブの不活性化の抑制の実験の結果を示す図である。図５の（Ａ）は、通常のプローブを使用し、図５の（Ｂ）は、CNＴ置換プローブを使用している。各レーンは、レーンＭは１０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｋｅｒレーン１と２はＰｒｏｂｅのみ、レーン３と４はＰｒｏｂｅとＴａｒｇｅｔレーン５と６はＰｒｏｂｅとＴａｒｇｅｔを急冷したものレーン７と８はＴａｒｇｅｔに対してＰｒｏｂｅが５倍量（５当量）入ったものである。レーン２、４、６、８には、光照射を行い、レーン１、３、５、７には、光照射を行っていない。【００６２】
上記の結果から示されるように、CNVＫ含有プローブ（ＯＤＮ４）に含まれるＴをCNＴに置換することによって、自己架橋体のバンドは確認されなくなった。また、クロスリンク体のバンドも明瞭に確認できるようになった。このように、CNVＫ含有プローブに含まれるＴをCNＴに置換することによって、CNVＫ含有プローブのターゲットであるＯＤＮ６との二重鎖形成と光架橋反応は阻害されることなく、CNVＫ含有プローブ（ＯＤＮ５）内での自己架橋のみを抑制し、プローブの不活性化を抑制することが可能となった。【００６３】
CNVＫ含有プローブが自己架橋するような塩基配列は、ごく一部の配列に限られる。しかし、生体内に存在する様々な配列をターゲットにする場合や、長鎖のプローブを用いる場合などには、望まれない自己架橋は起こり得る現象だと考えられる。上記のように、CNVＫ含有プローブに含まれるＴをCNＴに置換することによって、このような望まれない自己架橋の形成を抑制することができる。ＴをCNＴに置換することによってはプローブの二重鎖形成能と光架橋反応性は損なわれないので、全てのＴをCNＴに置換することができる。また、例えば、シミュレーションによってある程度の自己架橋を形成するような構造を予測することによって、自己架橋の形成に関与すると予測される箇所のＴのみをCNＴに置換することも可能である。上記の知見を用いることによって、より幅広いアプリケーションにCNVＫ含有プローブを用いることができ、より幅広い配列への応用が可能となる。【００６４】
［Ｔｍ値］
ＯＤＮ１とＯＤＮ２のＴｍ値と、ＯＤＮ１とＯＤＮ３のＴｍ値は、測定可能な差が見られなかった。すなわち、ＴをCNＴに置換した場合にも、二重鎖形成能は維持されていた。【００６５】
［CNVＤ含有ＯＤＮの合成］
次の式で表されるヌクレオチドアナログ（CNVＤ）を、Ｓｃｈｅｍｅ２（スキーム２）に従って行った。さらに、ヌクレオチドアナログ（CNVＤ）のアミダイト体を合成し、これを用いて、上記CNVＫ同様にＯＤＮを合成して、CNＴとの光反応性の解析に使用した。【００６６】
【化２８】
2015064718.tif 000032
【００６７】
【化２９】
2015064718.tif 000033
【００６８】
［CNVＤとCNＴの光反応性の解析］
CNVＫに代えてCNVＤを含有するＯＤＮを使用して、CNVＫによる上記実験と同様に、CNＴとの光反応性を、Ｔと対比して、解析した。図６は、CNVＤ含有プローブの光架橋実験の光反応スキームを示す図である。図７は、CNVＤ含有プローブの光架橋実験の結果を示すグラフである。図７の結果から示されるように、CNVＤの光架橋反応をＴターゲットの場合と比較して、CNＴを用いることによって約１５％にまで抑制することができた（光照射時間は１秒の時点での比較）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、光クランプ法などで使用される光応答性核酸プローブの自己架橋体形成を抑制して、プローブの不活性化を防ぐことができる。本発明は、産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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