(57)【要約】心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤として、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤及び医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する医薬組成物。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（４）〜（６）のポリペプチドのいずれか１以上を含有する請求項１記載の医薬組成物。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目〜１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目〜１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
心疾患の治療及び／又は予防のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記心疾患が、虚血性心疾患である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する血圧降下剤。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を処理する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者に投与する手順を含む、心疾患の治療及び／又は予防方法。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者に投与する手順を含む、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防方法。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞増殖誘導剤及びこれを含有する医薬組成物、並びに心筋細胞の製造方法に関する。より詳しくは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを含有する心筋細胞増殖誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞後の心筋細胞の急性損失は、心機能を低下させ、心不全をもたらす。心筋梗塞が生じた場合、心筋細胞はアポトーシスおよびネクローシスにより迅速に減少し、間質の脈管成分および非脈管成分が虚血性損傷によりほぼ破壊され、梗塞領域中の心筋細胞が線維性非筋細胞によって徐々に取って代わられ瘢痕組織になる。心筋梗塞後の心筋細胞の損失量は、心機能不全の重症度を決定する因子である。心筋梗塞後の心不全を軽減するため、梗塞心筋領域を回復することが重要な課題となっている。【０００３】
従来、心筋細胞は、生後、最終分化し、分裂する能力を失うと考えられていた。しかし、心筋細胞は、ある病態下または生理的条件下で分裂することが報告された（例えば、非特許文献１参照）。その後、心筋梗塞直後に常在する心筋細胞、血中を循環する幹細胞、またはこれらの両方の細胞に由来する心筋細胞の分裂または再生を示す研究が、ヒトの心臓において報告された（例えば、非特許文献２参照）。【０００４】
現在、心筋梗塞後、早期に再灌流および化学薬剤を投与することによって心筋細胞死を減少させ、梗塞心筋領域を縮小させる治療が試みられている。しかし、これらの治療では、損傷した心筋細胞を再生できず、心臓の損傷した機能を復帰させることもできない。【０００５】
ここで、本発明に関連して、ムスクリン（Ｍｕｓｃｌｉｎ）について説明する。ムスクリンは、当初、オステオクリン（ｏｓｔｅｏｃｒｉｎ）の名称で、骨格筋由来の分泌タンパクとして報告された（非特許文献３，４参照）。特許文献１には、ムスクリンを用いて骨形成を増加させる方法が開示されている。その後、ムスクリンは、ナトリウム利尿ペプチド（natriuretic peptides: NP）の相同領域を有し、心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide: ANP）と競合的にナトリウム利尿ペプチド受容体３に結合することが報告された（非特許文献５参照）。特許文献２には、ムスクリンとその受容体のアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニング系が記載されている。【０００６】
これらのムスクリンに関する先行技術文献には、ムスクリンと心筋細胞との関連については一切報告がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開第２００７／００４９５２１号
【特許文献２】米国特許公開第２０１１／０１０４７０５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Circ. Res., 1998, 83,1-14
【非特許文献２】N. Eng. J. Med., 2001, 344, 1750-1757
【非特許文献３】J. Bio. Chem., 2004, 279, 19391-19395
【非特許文献４】J. Bio. Chem., 2003, 278, 50563-50571
【非特許文献５】J. Endocrinol., 2009, 201, 287-95
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
心筋梗塞後の損傷した心筋細胞を再生させ、心臓の機能を復帰させるため、心筋細胞の分裂、増殖を誘導するための技術が求められている。そこで、本発明は、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが心筋細胞の増殖を誘導する活性を有することを見い出した。この知見に基づき、本発明は、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤及び医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。【００１１】
本発明に係る医薬組成物は、以下の（４）〜（６）のポリペプチドのいずれか１以上を含有するものであってもよい。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目〜１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目〜１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００１２】
本発明は、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者（ヒト及び動物を含む）に投与する手順を含む、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防方法をも提供する。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。【００１３】
また、本発明は、以下の心筋細胞の製造方法も提供する。【００１４】
分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を処理する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。【００１５】
さらに、本発明者らは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが血圧を降下させる活性を有することを見い出した。この知見に基づき、本発明は、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する血圧降下剤を提供する。従って、本発明に係る上記医薬組成物は、虚血性心疾患の治療及び／又は予防に加えて、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防のためにも好適に用いられ得る。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。【００１６】
本発明は、以下の（１）〜（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者（ヒト及び動物を含む）に投与する手順を含む、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防方法をも提供する。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。【００１７】
本発明において、心疾患には、特に虚血性心疾患が含まれ、虚血性心疾患としては、切迫心筋梗塞、心筋梗塞、虚血性心筋症、狭心症及び心筋梗塞後の心不全が例示される。さらに、本発明における心疾患には、心筋の細胞死を伴う心疾患が広く包含され、例えば、うっ血性心筋症、肥大型閉塞性心筋症、肥大型非閉塞性心筋症、特発性心筋症、心筋炎、慢性心不全、弁膜症、冠動脈疾患、心術後症候群、心筋梗塞後症候群（ドレスラー症候群）などが含まれるものとする。また、高血圧関連疾患には、脳卒中、うっ血性心不全；心臓性高血圧；心臓線維症；高血圧症性心臓疾患（hypertensive heart disease）；梗塞後心筋症；腎症、血管症、神経障害などの糖尿病合併症；冠血管疾患；血管形成術後の再狭窄；眼圧上昇；緑内障；異常血管増殖；高アルドステロン症；不安状態および認知障害が含まれるものとする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒト、ウシ、マウス及びラットのムスクリンのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図２】心筋障害モデルにおけるムスクリンの発現解析結果を示す写真である。
【図３】ムスクリンmRNAをマイクロインジェクションしたゼブラフィッシュ胚における心筋細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図４】ムスクリン発現トランスジェニックゼブラフィッシュにおける心筋細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図５】ムスクリンの培養心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した結果を示すグラフである。
【図６】ムスクリンの血圧降下作用を評価した結果を示すグラフである。
【図７】マウス心筋梗塞モデルにムスクリンを投与し、生存率の変化を評価した結果を示すグラフである。
【図８】ムスクリンを投与したマウス心筋梗塞モデルの心臓の肉眼所見を示す写真である。（Ａ）は偽手術を行った群、Ｂは対照群（蒸留水投与群）、Ｃは試験群（ムスクリン投与群）の結果を示す。
【図９】ムスクリンを投与したマウス心筋梗塞モデルの心臓の組織染色像を示す写真である。（Ａ）は偽手術を行った群、Ｂは対照群（蒸留水投与群）、Ｃは試験群（ムスクリン投与群）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２１】
１．心筋細胞増殖誘導剤
本発明者らは、ムスクリンの遺伝子導入あるいはその部分ペプチドの投与により、心筋細胞の分裂及び増殖が誘導されることを見出し（実施例参照）、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが心筋細胞増殖誘導剤として有用であることを明らかにした。
【００２２】
［ポリペプチド］
本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるヒトムスクリンタンパクであってよい。
【００２３】
また、有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸数は、当該ポリペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り、特に限定されない。
【００２４】
有効成分であるポリペプチドは、より具体的には、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号１記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の欠失、置換、挿入もしくは付加が組み合わされたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２５】
アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が置換する場合は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００２６】
さらに、有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。配列同一性は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り特に限定されないが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であってもよく、特に好ましくは９０％以上、さらに特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であってもよい。
【００２７】
従って、本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるポリペプチドには、配列番号１記載のヒトムスクリンタンパクに加えて、配列番号３記載のマウスムスクリンタンパク、ラットムスクリンタンパク、ウシムスクリンタンパクなどが含まれる。図１に、ヒト、ウシ、マウス及びラットのムスクリンタンパクのアミノ酸配列を示す。この他、有効成分であるポリペプチドは、サル、イヌ、ブタ及びウサギなどの種々の生物におけるムスクリンホモログのタンパクが含まれる。
【００２８】
［部分ペプチド］
本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分は、上記ポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。部分ペプチドのアミノ酸配列は、心筋細胞増殖誘導活性を有する限りにおいて、上記ポリペプチドの任意の部分のアミノ酸配列とすることができる。
【００２９】
部分ペプチドの好ましいアミノ酸配列としては、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目〜１１２番目のアミノ酸配列、及び、配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目〜１３０番目のアミノ酸配列が例示される（実施例参照）。
【００３０】
図１に、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目〜１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２））と、配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目〜１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０））のアミノ酸配列を示す。ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）のＮ末端側に存在する「ＫＫＫＲ」のアミノ酸配列、及びＣ末端側に存在する「ＫＲＲ」のアミノ酸配列は、プロテアーゼによる切断部位である。
【００３１】
ムスクリンは分泌タンパクと推定され、ムスクリンタンパクは上記の切断部位においてプロテアーゼにより切断されて部分ペプチドとなった状態で、心筋細胞増殖誘導活性を示している可能性がある。従って、活性を示し得る部分ペプチドとしては、まず、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｈｕｍａｎＭ（８３‐１３３））及び配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目〜１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０））が挙げられ、さらにこれらのポリペプチドの切断によって生じるｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）及びｈｕｍａｎＭ（１１６‐１３３）並びにｍｏｕｓｅＭ（８０‐１０９）及びｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）のペプチドも挙げられる（図１参照）。
【００３２】
また、有効成分である部分ペプチドは、上記ポリペプチドの部分ペプチドにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸数は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り、特に限定されない。
【００３３】
有効成分である部分ペプチドは、より具体的には、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
（ｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列において、１〜１５個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列の１〜１５個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に１〜１５個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に１〜１５個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の欠失、置換、挿入もしくは付加が組み合わされたアミノ酸配列が挙げられる。
【００３４】
さらに、有効成分であるポリペプチドは、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。配列同一性は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り特に限定されないが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であってもよく、特に好ましくは９０％以上、さらに特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であってもよい。
【００３５】
従って、本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分である部分ペプチドには、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）及びｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）に加えて、サル、イヌ、ウシ、ブタ、ラット及びウサギなどの種々の生物におけるムスクリンホモログの部分ペプチドであって、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６−１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３−１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０−１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）及びｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）に対応するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。
【００３６】
本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるムスクリンタンパク及びその部分ペプチドは、脂肪酸やポリエンチレングリコールで修飾されていてもよい。薬効や安全性の改善が認められる限り、修飾される脂肪酸の長さや不飽和度あるいはポリエチレングリコールの分子量や分岐度は限定されない。好ましくは、炭素数１０〜２０の脂肪酸あるいは分子量４０００〜２００００のポリエチレングリコールが用いられる。
【００３７】
２．血圧降下剤
本発明者らは、ムスクリンタンパクの部分ペプチドの投与により、血圧が降下することを見出し（実施例参照）、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが血圧降下剤として有用であることを明らかにした。
【００３８】
本発明に係る血圧降下剤における有効成分は、上述の心筋細胞増殖誘導剤のポリペプチド及びその部分ペプチドと同一である。
【００３９】
３．医薬組成物
（１）虚血性心疾患治療・予防薬
本発明に係る医薬組成物は、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を有効成分として含有する。この医薬組成物は、心筋細胞の分裂及び増殖を誘導することが可能であるので、心疾患、特に虚血性心疾患により損傷した心筋細胞を再生させ、心臓の機能を復帰させるために有用であり、心筋梗塞等の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
【００４０】
（２）高血圧及び高血圧関連疾患治療・予防薬
また、本発明に係る医薬組成物は、他の一側面において、上述の血圧降下剤（あるいは、血圧降下剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を有効成分として含有する。この医薬組成物は、血圧を降下させることが可能であるので、高血圧及び高血圧関連疾患（脳卒中、心疾患及び腎疾患等）の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物は、心筋細胞増殖誘導剤又は血圧降下剤（あるいは、それらに含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を単独で、又は溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体と混合して、注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、溶液剤、徐放剤等の製剤として用いることができる。溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体などの添加剤は、薬剤学的に許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって適宜決定され得る。例えば注射剤の場合、一般に食塩、グルコ−ス、マンニト−ル等の糖類が望ましい。経口剤の場合、でんぷん、乳糖、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム等が望ましい。
【００４２】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、経口的又は注射剤により非経口的に全身性に投与される。また、カテーテル等により遠隔的に投与してもよく、ステントやグラフトあるいは一体化させたステントグラフトに薬剤を結合させてもよい。さらに、体内に留置することにより徐放性に投与してもよい。特に経口投与が好ましい。
【００４３】
本発明に係る医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（ヒト及び動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものであるが、患者の虚血性心疾患又は高血圧等の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量とされる。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００４４】
本発明に係る医薬組成物は、心筋梗塞治療又は高血圧治療のために既に臨床応用されている薬剤や研究段階にある薬剤を有効成分として含有していてもよい。臨床応用されている心筋梗塞治療薬としては、β遮断薬、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害薬（ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、レニン阻害薬）、抗血小板薬、抗凝固薬、脂質代謝異常改善薬（高脂血症治療薬、コレステロール低下薬、HDL上昇薬）、糖尿病治療薬、硝酸薬、ニコランジル、抗不整脈薬及び強心薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬と中性エンドペプチダーゼ阻害薬の配合剤などが挙げられる。また、高血圧治療薬としては、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害薬（ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、レニン阻害薬）、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、利尿薬などが挙げられる。  
【００４５】
本発明に係る医薬組成物は、他の態様として、上述した既に臨床応用されている薬剤や研究段階にある薬剤と組み合わされてなるものであってもよい。ここで、「組み合わせてなる」とは、２以上の医薬のそれぞれを異なる時間に投与する場合、それぞれの医薬を同時に投与する場合、２以上の医薬を含んで成る１種類の医薬組成物を投与する場合、を意味する。前二者の場合、２以上の医薬のそれぞれを同一の投与経路で投与してもよく、又は別の投与経路で投与してもよい。各医薬は、患者に対して症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００４６】
４．心筋細胞の製造方法
（１）ペプチド処理
ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを含む心筋細胞増殖誘導剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける心筋細胞製造のために用いることが可能である。
【００４７】
本発明に係る心筋細胞製造方法は、一態様として、分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を処理する工程を含む。
【００４８】
当該工程は、生体から分離された細胞を定法によって培養し、培養液中にムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを添加することよって行うことができる。該工程では、ムスクリンタンパク等の心筋細胞分裂誘導作用により細胞が分裂、増殖し、多数の心筋細胞が得られる。
【００４９】
ここで、「心筋細胞の前駆細胞」としては、特に限定されないが、胚性幹細胞（ES細胞）、誘導性幹細胞（iPS細胞）、間葉系幹細胞などの心筋細胞への分化能を有する細胞が含まれる。
【００５０】
得られた心筋細胞は、細胞分散液、細胞隗及び細胞シートなどの形態で、心臓への移植材料として利用できるほか、心筋細胞を用いた薬剤スクリーニングや毒性評価などの種々の試験に供することができる。
【００５１】
（２）遺伝子導入
なお、本発明に係る心筋細胞製造方法は、一態様として、分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）をコードする遺伝子を発現可能に導入する工程を含むものであってもよい。
【００５２】
ヒトムスクリンタンパク及びマウスムスクリンタンパクをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２、４に示す。ムスクリンの遺伝子導入は、通常用いられるベクターや遺伝子導入試薬によって、配列番号２、４記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入することによって行えばよい。また、配列番号２、４記載の塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列を公知の手法により改変することによって、ムスクリンの部分ペプチドを遺伝子導入により発現させることもできる。
【実施例】
【００５３】
＜材料＞
１．ゼブラフィッシュ系統
以下の系統のゼブラフィッシュを実験に用いた。
（１）AB系統（野生型ゼブラフィッシュ）
（２）Tg(Cmlc2: mVenus-zGeminin(1/100))系統及びTg(mCherry-zCdt1(1/190)）系統
Cmlc2 (Cardiac myosin-light chain 2)プロモーターの下流で、心筋細胞特異的にFucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)を発現するトランスジェニック系統。
（３）Tg(Cmlc2 : NLS-mCherry)系統
心筋細胞の核内にNLS (nuclear localization signal)-mCherryを発現するトランスジェニック系統。
（４）Tg(Cmlc2 : Fucci)系統（細胞周期可視化ゼブラフィッシュ）
Tg(Cmlc2 : mVenus zGeminin(1/100))とTg(Cmlc2 : mCherry- zCdt1(1/190))の交配により作出されたトランスジェニック系統。Tg(Cmlc2 : Fucci)系統は、心筋細胞にmVenus-geminin（緑）、mCherry-Cdt1（赤）を発現する。GemininはＧ０／Ｇ１期に分解し、Cdt1はＳ／Ｇ２／Ｍ期で分解するため、Tg(Cmlc2 : Fucci)系統では、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期（分裂期）の心筋細胞が緑色で、Ｇ０／Ｇ１期（静止期）の細胞が赤色で可視化される。【００５４】
上記（２）及び（３）のトランスジェニック系統の樹立には、Tol2トランスポゾンシステムを利用した。Tol2トランスポゾンベクター内にCmlc2プロモーターの下流でmVenus-zGeminin(1/100)、mCherry-zCdt1(1/190)、またはNLS-mCherryを発現する配列を組み込んだ。マニピュレーターを使用して、30 pgのプラスミドDNAと25 pgのTol2転移酵素mRNAをAB系統の1 cell stage 胚の割球中へ注入した。【００５５】
＜試験例１：分裂心筋細胞の分離＞
細胞周期可視化ゼブラフィッシュ（Tg(Cmlc2 : Fucci)系統）の心臓からＳ／Ｇ２／Ｍ期にある分裂心筋細胞を以下の手順により分離した。【００５６】
トリカイン麻酔した84時間胚の細胞周期可視化ゼブラフィッシュからピンセットで心臓を摘出した。心臓はピペットマンを使用して氷上のHBSS中に回収した。PBSで2回洗浄し、酵素溶液 (5mg/ml trypsin, 1mM EDTA / PBS, pH 8.0)を1 ml加えて細胞を分離した。30 minおきにピペッティングをしながら、37℃にて60 minインキュベーションした。その後、反応停止溶液 (30% FBS, 6 mM CaCl2 / PBS)を200 μl加えて酵素反応を停止した。PBSで洗浄し、200 μl の懸濁溶液 (1% FBS, 0.8 mM CaCl2, 50 U/ml penicillin, 0.05 mg/ml streptomycin, DMEM, 50 ml)に懸濁した。死細胞を除去するために、SYTOX Blue dead cell stain (invitrogen)を加え15 min室温にてインキュベートし、死細胞を染色した。【００５７】
分離した心筋細胞は、FACSAria III (BD)を使用して分離した。SYTOX Blue dead cell stain (-)の生細胞集団から、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期の細胞集団（mVenus(+)・mCherry(-)）とＧ０／Ｇ１期の細胞集団（mVenus(-)・mCherry(+)）を分離し、それぞれ懸濁溶液中に回収した。【００５８】
NucleoSpin RNA XS (Takara) を使用してmRNAを抽出するために、回収した細胞はPBSにて2回洗浄後、PBSを良く取り除き、TECPを添加したRA1溶液中に溶解して-20℃で保存した。【００５９】
＜試験例２：分裂心筋細胞に発現する遺伝子の同定＞
試験例１で分離した分裂心筋細胞からmRNAを抽出し、シークエンスを行うことにより、分裂心筋細胞で発現する遺伝子を網羅的に同定した。【００６０】
RNASequence用のサンプルは、すべてキットの方法に従って調製した。5,000細胞以上回収した後、NucleoSpin RNA XS(Takara)を用いてTotal RNAを細胞から抽出した。cDNA Synthesis Kits-SMARTer Ultra Low Input RNA for Illumina Sequencing (Clontech)を用いてRNAからDNAに逆転写した。Advantage 2 PCR Kit (Takara) を用いて、逆転写したDNAを増幅し、cDNA library作製した。Covaris S220 (エムエス機器株式会社)を用いて、cDNAを200bpに断片化した。NEBNext DNA Library Preparation (NEW ENGLAND BioLabs)とNEBNext Multiplex oligos For Illumina (NEW ENGLAND BioLabs)を用いてcDNA LibraryにTagを付け、cDNA library (Tag付き)をMi-seq (Illumina)を用いて解析した。【００６１】
解析の結果、分裂心筋細胞で発現が亢進している遺伝子であって、かつ細胞周期関連因子以外の遺伝子として、ムスクリンを同定した。分裂期細胞におけるムスクリンの発現量は、静止期細胞に対して５．６７倍であった。【００６２】
＜試験例３：心筋障害モデルにおけるムスクリンの発現解析＞
心筋障害モデルの心臓におけるムスクリンの発現を以下の手順により解析した。【００６３】
4〜12カ月のゼブラフィッシュをトリカイン麻酔下で開胸して心臓を押し出し、心尖部に液体窒素で冷却した直径0.5 mmの銅線を押し当てて壊死させた。手術後3日目、7日目、14日目に心臓を摘出し、4%PFA/PBSで固定した。【００６４】
固定した組織を10%スクロース/PBSで4℃, 4 hr、20％スクロース/PBSで4℃, 一晩の条件で処理後、包埋し、液体窒素で凍結した。クライオスタット (CM 1850, Leica) を用いて厚さ14 μmの切片を作製し、スライドグラに貼りつけた。ドライヤー（冷風）で乾燥させ-80℃で保存した。【００６５】
凍結切片スライドをRNase freeの水で洗浄した後にproteinase K (20 μg/ml)による透過処理を行った。4%PFA/PBSを加え、室温、15minで再固定したのちにPBSTでよく洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液で65℃、1 hrプレハイブリダイゼーションしたのち、ハイブリダイゼーション溶液に溶解したDIG (digoxigenin)標識したRNA probeを加え、乾燥を防ぐためにパラフィルムを載せた状態で65℃、一晩ハイブリダイズした。翌日、サンプルを洗浄液I (75% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗浄液II (50% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗
浄液III (25% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗浄液IV (2 x SSC)を用いてそれぞれ65℃, 10 minの条件で1回ずつ洗浄し、洗浄液V (0.2 x SSC)を用いて65℃, 30 minの条件で2回、洗浄液VI (0.1 x SSC)を用いて室温, 10 minの条件で1回洗浄した。【００６６】
切片スライドをマレイン酸溶液(0.1M マレイン酸, pH7.5)を用いて15 min 室温で洗浄し、ブロッキング溶液(0.1M マレイン酸, pH7.5, 5% sheep serum, 2% blocking reagent(Roche))で60 minブロッキングを行い、次にanti-DIG antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche)を加えて4℃、一晩振とうした。翌日、PBSTで5回洗浄し、BM-purple AP substarate (Roche)を用いて染色反応を開始した。染色を終了する際は、PBSTで洗浄し、4%PFA/PBSで固定した。PBSTで洗浄したのちに、グリセロールへと段階的に置換して実体顕微鏡(MVX10, Olympus)にて撮影した。【００６７】
上記のDIG標識RNA probeは、以下のように作成した。目的とする遺伝子配列に対応するプライマーを作製し、pCR4blunt TOPO vector (Invitrogen) にzMusclin cDNA配列全長（配列番号５）を組み込んだものを作製した。遺伝子配列の上流5'末端側にのみ存在する制限酵素サイトを用いて切断し、サンプルをエタノールで沈殿させた。DNA 3 μgに対して、DIG mix (Roche) 1 μl、RNase inhibitor (Roche) 1 μl、3'末端下流に存在するT3またはT7プロモーターのRNA polymerase (Roche) 1 μlを加え、37℃、120 min反応させた。DNaseを1μl 添加し、37℃、15 min反応した。サンプルを塩化リチウムで沈殿させ、RNase free waterを25 μl加えた。アガロースゲルを用いた電気泳動でprobeが出来ていることを確認し、ハイブリダイゼーション溶液を添加して-20℃で保存した。【００６８】
結果を図２に示す。障害を加えた心尖部では、３日目以降ムスクリンの発現が観察され、障害後の分裂心筋細胞において、ムスクリンの発現が増加していることが明らかとなった。なお、対照は、障害を加えていない心尖部の結果を示す。【００６９】
＜実施例１：in vivo遺伝子導入による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
発生期のゼブラフィッシュの胚にゼブラフィッシュムスクリンmRNAをマイクロインジェクションにより遺伝子導入し、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した。【００７０】
マニピュレーターを使用し、Tg(Cmlc2 : NLS-mCherry)系統の1 cell stage 胚の割球中へ200pgのmRNAを注入した。mRNAはmMESSAGE mMACHINE kit (Ambion) を用いて合成した。pCS2+vector (Clontech)に合成する分子の全長をコードするcDNA配列を組み込み、シーケンスを行って配列を確認した。制限酵素NotIで切断した後、Proteinase K (100mg/ml)/0.5%SDS処理を行い、RNaseを失活させたものをエタノールで沈殿し、RNase free-waterに溶解した。SP6 RNA polymerase を用い、切断した鋳型DNAからmRNAを合成した。RNAはNanoPhotometer (IMPLEN)で濃度を測定し、アガロースゲルを用いた電気泳動により分解されていないことを確認した。【００７１】
mRNAをインジェクション後２日で、赤色蛍光を呈する心筋細胞の数が有意に増加していた（図３参照）。これらの結果より、ムスクリンが発生期のゼブラフィッシュにおいて心筋細胞の増殖を促進あるいは誘導する作用を有することが明らかとなった。【００７２】
次に、Cmlc2プロモーター下流でムスクリンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、ムスクリンの遺伝子導入による心筋細胞数の増加効果を検討した。トランスジェニック系統の樹立は上述の方法により行った。【００７３】
結果を図４に示す。ムスクリンを発現するトランスジェニック系統（図中Ｍ）では、野生型系統（同（−））に比して有意な心筋細胞の増加が確認された。【００７４】
＜実施例２：in vitroペプチド処理による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
培養心筋細胞にムスクリンタンパクの部分ペプチドを処理し、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した。【００７５】
マウスの新生仔心筋細胞キット(Primary Cell)を使用した。付属のフィブロネクチン溶液をディッシュに加え、37℃インキュベーター内で一晩静置してコーティングした。ディッシュは使用直前に滅菌水で二回洗浄した。心筋細胞は付属の培養メディウム200 μlを使用して1.3×105cells/dish（1回目）、9×104cells/dish (2日目)となるようにディッシュの中央部に播種し、5%CO2存在下の37℃インキュベーターで培養した。播種後6 hrにディッシュに培養メディウム1mlを追加した。また、播種後16 hrに培養メディウムを交換して付着しなかった細胞を取り除いた。6日間処理サンプルのみ播種後88 hrにも培養メディウムを交換した。【００７６】
播種後24 hrに試験物質の添加を開始し、24 hr毎にさらに試薬を添加した。試験物質には、以下のものを用いた。各試験物質について、2枚ずつディッシュを用意した。
（１）FGF2 (human)：最終濃度25ng/ml
（２）mMusclin(80-130)ペプチド：マウスムスクリンのアミノ酸配列（配列番号３）の８０〜１３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド (Phoenix Pharmaceuticals) 、最終濃度1nM, 10 nM, 100 nM
（３）hMusclin (83-112)ペプチド：ヒトムスクリンアミノ酸配列（配列番号１）の８３〜１１２番目のアミノ酸配列からなるペプチド (Phoenix Pharmaceuticals)、最終濃度1nM, 10 nM, 100 nM【００７７】
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging kit (Invitrogen)を用いてDNAを合成した細胞を検出した。試験物質処置開始後6 hrにEdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) を最終濃度10μMとなるように添加した。6日刺激の場合は刺激開始後78 hr後にEdU を添加した。試験物質処置開始から、72 hrまたは144 hrにPBSで2回洗浄し、4%PFA/PBSを加えて室温20 minで細胞を固定した。【００７８】
固定したサンプルは、Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging kit (Invitrogen)の方法に従ってEdUの染色をした後、免疫蛍光染色を行った。0.5% Triton X-100/PBSを加え室温, 20 minで透過処理を行った。Reaction cocktailを加えて室温30 min で反応させ、EdUにAlexa Fluor 647 asideを付加した。4%BSAを室温 1 hr 処理しブロッキングし、一次抗体として抗MF20抗体 (IOWA hybridoma bank)を200倍希釈、抗Phospho-Histone H3 (Ser10)抗体 (Millipore) を100倍希釈して1hr反応させた。PBSで洗浄したのち、二次抗体としてAlexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG conjugate highly cross-absorbed (Invitrogen)、Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG conjugate highly cross-absorbed (Invitrogen)をそれぞれ300倍希釈して1 hr反応させた。PBSで洗浄後、0.5 ng/ml DAPI中で30 min インキュベートし、倒立共焦点レーザー顕微鏡(fv-1000, Olympus)で観察した。各サンプルについて8視野ずつ撮影し、MF20陽性の心筋細胞数と、心筋細胞中のEdU陽性細胞数を数えて、EdU陽性心筋細胞の割合の平均値を求めた。【００７９】
結果を図５に示す。Ａに、mMusclin(80-130)ペプチドで３日間刺激した時のＥｄＵ陽性心筋細胞の割合を示す。Ｂに、mMusclin(80-130)ペプチド又はhMusclin (83-112)ペプチドで６日間刺激した時のＥｄＵ陽性心筋細胞の割合を示す。縦軸は、分裂心筋細胞（EdU陽性心筋細胞）の割合の平均値を示す。【００８０】
Ａに示すように、Musclin 100 nMの処理によって、FGF処理と同程度に心筋細胞の増殖を誘導できた。また、Ｂに示すように、心筋細胞の増殖誘導作用は、hMusclin (83-112)ペプチドに比してmMusclin(80-130)ペプチドでより高かった。【００８１】
＜実施例３：in vivoペプチド投与による、ムスクリンの血圧降下作用の評価＞
マウスにムスクリンタンパクの部分ペプチドを静脈内投与し、ムスクリンの血圧降下作用を評価した。【００８２】
12週齢のオスC57BL/6Jマウスを使用した。イソフルランにて吸入麻酔後、気管内挿管し、1.5%イソフルランにて持続麻酔を行った。また、マウスをヒートパッド上に置いて直腸温をモニターし、実験中は37℃に保った。左頸静脈を剥離後、ヘパリン化生理食塩水を満たした1.2Frポリウレタンカテーテルを挿入し、薬剤投与ラインとした。次に右頸動脈を剥離後、Millar社製1Fr圧・容積測定用カテーテル（PVR-1045）を挿入し、血圧をモニターした。なお、圧データはPowerLab4/26 (ADI INSTRUMENTS社製)を経由して、ノートパソコンに持続的に波形として表示させた。【００８３】
ANPを30 pmol静脈内投与したところ、収縮期血圧で約20 mmHgの速やかな血圧下降が見られた（図６Ａ参照）。投与後、約30秒で血圧は回復した。次に、mMusclin(80-130)を30pmol静脈内投与したところ、ANPと同程度の速やかな血圧の下降が見られた（図６Ｂ参照）。ANPと同様に、投与後、約30秒後に血圧の回復が認められた。【００８４】
＜実施例４：in vivoペプチド投与による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
マウス心筋梗塞モデルを用いて、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性と心筋梗塞の治療効果を評価した。【００８５】
8週齢のオスC57BL/6Jマウス（20頭）を使用した。心筋梗塞作製前日にムスクリンを充填した浸透圧ポンプ（静脈内投与用カテーテルを装着）を、ペントバルビタール麻酔下にて皮下に埋め込み、カテーテルを左頸静脈から血管内に留置した。試験群（10頭）には、蒸留水に溶解したmMusclin(80-130)を0.05 μg/kg体重/minで、合計約50〜100 μｇ投与した。対照群（10頭）には、蒸留水を投与した。【００８６】
翌日、イソフルランにて吸入麻酔後、気管内挿管し、1.5%イソフルランにて持続麻酔を行った。マウスをヒートパッド上に置いて直腸温をモニターし、実験中は37℃に保った。左胸部肋間を開創して、心臓周囲の脂肪組織を除去後、左心耳直下にて冠動脈を6-0ナイロン糸にて結紮した。心筋組織の白色化、及び四肢誘導（aVL）心電図におけるST上昇を確認した後、創部を縫合した。【００８７】
観察期間を2週間として生存率を求め、生存したマウスは心エコーにて心機能を評価し、さらに実験殺後心臓重量を測定した。組織切片を作製後、マッソントリクローム染色を行い、陽性染色部位を梗塞巣として評価した。【００８８】
結果を図７〜図９に示す。図７は、対照群及び試験群の生存率変化（２週間）を示す。図８及び図９は偽手術（シャムオペ）を行った群（Ａ）、対照群（Ｂ）、試験群（Ｃ）の心臓の肉眼所見と組織染色像を示す。対照群では２週間で８０％のマウスが死亡したのに対して、試験群では半数が生存した（図７参照）。また、対照群では、冠状動脈結紮による心筋梗塞に伴って、心拡大（図８Ｂ参照）と広範な梗塞巣（図９Ｂ実線矢印参照）がみられた。一方、試験群では、心拡大が軽減され（図８Ｃ参照）、梗塞巣も減少した(図９Ｃ破線矢印参照)。これらの結果から、心筋梗塞の治療のためにムスクリンが有用であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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