(57)【要約】  マルチナノポア基板への励起光照射を、測定を中断することなく、簡単な構成で高精度に制御する。観察容器１０３中に設置された基板上の少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象に対し、励起光の照射を同時に行い、検出器１０９で検出される基準対象から発生する信号に基づき、測定試料に励起光が照射される位置を演算し、演算結果に基づき測定試料に対する励起光照射の位置を駆動制御部１１５で制御しながら、測定対象の測定を行うことにより、測定と定位置制御を同時に行うことで、測定試料の解析を短時間で行うことが可能となる。
2016059703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、
前記励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、
少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象が設置される基板と、
前記ナノポアに位置する測定試料と、前記基準対象に前記励起光を同時に照射し、前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料に前記励起光が照射される位置を演算し、当該演算結果に基づき前記測定試料に対する励起光照射の位置を制御する位置制御部と、を備え、
前記励起光照射の位置制御を行いながら、前記測定試料に対する測定を行う、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項２】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記励起光照射によって発する信号が、ラマン散乱光或いは蛍光である、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項３】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記励起光照射によって発する前記基準対象のスペクトルを用いて、前記検出器の位置または前記検出器の画像素子の情報を補正する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項４】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記基準対象の径は前記測定試料より小さい、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項５】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記測定試料に照射する前記励起光のスポット径より小さいスポット径の励起光を前記基準対象に照射する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項６】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記励起光のスポット径が前記測定試料及び前記基準対象より小さい時、
前記基準対象への前記励起光のスポット径を、前記測定試料への前記励起光スポット径より大きくする、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項７】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記測定試料は生体分子であり、
前記基準対象はシリコン単結晶、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトを用いて構成される、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項８】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射される位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項９】
請求項８に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
所定の温度変化の検出により、前記励起光のスポット位置のスキャンを開始して、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
事前に取得した前記基準対象の位置と信号強度の情報と、前記基準対象から得られる前記信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１１】
基板上の少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象に対し、励起光の照射を同時に行い、
検出器で検出される前記基準対象から発生する信号に基づき、前記測定試料に前記励起光が照射される位置を演算し、
当該演算結果に基づき前記測定試料に対する励起光照射の位置を制御しながら、前記測定対象の測定を行う、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記励起光照射によって発する信号が、ラマン散乱光或いは蛍光である、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射される位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の定位置制御方法であって、
所定の温度変化の検出により、前記励起光のスポット位置のスキャンを開始して、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
事前に取得した前記基準対象の位置と信号強度の情報と、前記基準対象から得られる前記信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン顕微鏡を用いた生体分子検出における定位置制御技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
本技術分野の背景技術として、ナノポアラマンＤＮＡシーケンスに関する特許文献１があり、この公報には、内径約10nmのナノポアに生体ポリマーを進入させ、ナノポアに照射する励起光と、ナノポア近傍に存在する導電性薄膜によってナノポアを通過する生体ポリマーのラマン散乱光が増大した後に、検出することによって生体ポリマーを測定する技術が開示されている。そのため、励起光の照射スポット径にもよるが、観察対象である箇所を数十から数百ナノメータの精度で定位置に保持し続けることが必要である。【０００３】
このような定位置制御に関する技術として、特許文献２がある。また、温度変化による位置ずれを検知補正する技術として、特許文献３がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２／０４３０２８Ａ１
【特許文献２】特開昭６２−４３０５０号公報
【特許文献３】特開２００３−１７２６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１記載の技術においては、励起光の照射スポット径は大きければ大きいほど、励起光自体のドリフトや測定個所であるナノポア自体のドリフトの影響が軽微になる。しかし、照射スポット径が大きいといくつかのデメリットを有する。第一に、測定箇所以外の箇所にも照射されるためノイズ及びバックグランドの信号が大きくなる。第二に、照射スポットが大きいが故に導電性薄膜に多くの熱が供給され、導電性薄膜の寿命を短くし、長時間測定を不可能にするのに対し、照射スポットが小さいと、外部へ熱が拡散しやすい。第三に、複数のナノポアに照射する場合、照射スポットが大きければ大きいほど励起光源に高い出力を必要とし、大型で高額な設備が必要となる。つまり、照射スポットは生体ポリマーが進入するナノポアのサイズもしくは生体ポリマーを検出するサイズに近いほど好ましいとなる。そのためには、高精度に定位置に励起光やナノポアを制御する必要がある。ドリフトの主な要因は、装置設置環境温度の変化と考えられる。装置の構成や、温度変化によるが数μメータもしくは数ナノメータのドリフトは通常の生活環境の範囲内でドリフトすることは、装置を構成する材質の線膨張係数から容易に想像できる。したがって、これらのドリフトを回避する機能が望まれる。【０００６】
特許文献２記載の技術では、特定のパターンを含む一定領域のパターン検出と測定を繰返すことにより、ドリフトが起きても補正機能により再度最適な位置での測定が可能になるが、一定領域のパターン検出を行っている間は測定が行われないため、パターン検出時間中の試料測定データが失われる。例えば、ナノポアラマンＤＮＡシーケンスにおいて、パターン検出を行っている間にＤＮＡが通過してしまうとその分のデータが失われてしまう。その結果、単位時間当たりに得られるＤＮＡシーケンスデータ量が減るため、その分測定時間を延ばす必要がある。さらに、ＤＮＡが通過中にドリフトが発生し、補正の為にパターン検出を行う場合は、通過中のＤＮＡのデータが部分的にしか解析できず、単分子を解析できるナノポアラマンＤＮＡシーケンスの特徴を失ってしまう。例えば10,000塩基のＤＮＡ配列測定中の時、5,000塩基まで測定したところに補正動作を行えば、その補正中に残りの5,000塩基がナノポアを通過し測定が出来ない。補正前にドリフトを感知しＤＮＡの移動を止めたとしても、慣性動作により急には止まらず測定できない領域が生まれてしまう。【０００７】
近年、１細胞レベルで、ゲノム配列決定、RNA解析、エピゲノム解析などの研究が活発化し、各細胞による差異や同一細胞での時間変化に伴う各種変化を解析する。各個人のゲノム配列は、細胞ごとに異なる場合があることが知られている。特に、ガン組織を摘出してゲノム配列を解析すると、通常正常細胞とガン細胞の混合物のデータが得られる。ガン細胞自身も時間と共に変化していくので、場合によっては複数種の混合配列データが得られることになる。ガン組織のゲノム配列を１細胞ごとに決定できれば、ガンの発生と増殖についてより正確な理解が得られるだろう考えられ日々研究が行われている。これらの目的から、１細胞内の単分子のＤＮＡを解析することにラマンナノポアＤＮＡシーケンサは価値を持っている。【０００８】
また、特許文献３記載の技術は、変位検出手段、振動手段、加熱冷却手段など本来の測定の目的とは異なる各種の手段を必要とする為、装置が複雑になり高度な制御や高額な装置となってしまう。ドリフトの主要因である熱による影響を少なくするため装置全体を、線膨張係数の小さなインバーやダイヤモンドの使用も選択肢と存在するが価格や加工性から現実的ではない。また、熱容量を大きくし環境温度の影響を受けにくくする方法も選択肢として存在するが、大きくなり重量が増すことは、装置を架設するのに広い敷地を必要となるか、装置を架設する屈強な机等を用意する必要が生まれ、利便性を欠くことになる。【０００９】
本願発明の目的は、上記の課題を解決し、定位置制御を試料の観察と同時に実行可能とする定位置制御装置、及びその方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、本発明においては、少なくとも一つ以上の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、少なくとも一つのナノポアと基準対象が設置される基板と、ナノポアに位置する測定試料と基準対象に励起光を同時に照射し、基準対象から得られる検出信号により、測定試料に励起光が照射される位置を演算し、演算結果に基づき、測定試料に対する励起光照射を定位置に制御する位置制御部とを備え、励起光照射の位置制御を行いながら、測定試料に対する測定を行う構成の定位置制御装置を提供する。【００１１】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、基板上の少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象に対し、励起光の照射を同時に行い、基準対象から発生する信号に基づき、測定試料に励起光が照射される位置を演算し、当該演算結果に基づき測定試料に対する励起光照射の位置を制御しながら、測定対象の測定を行う定位置制御方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、測定と定位置制御を同時に行うことで、解析を短時間で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に係る、ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置の構成例を示す図である。
【図２】実施例１に係る、ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置の検出部と観察容器の断面構成の一例を示す図である。
【図３】ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置のマルチナノポア基板の一例を示す図である。
【図４Ａ】実施例１に係る、マルチナノポア基板の一例を示す図である。
【図４Ｂ】実施例１に係る、マルチナノポア基板に励起光照射する構成例を示す模式図である。
【図５】実施例１に係る、定位置制御のため励起光をスキャンした結果を示すグラフ図である。
【図６】実施例１に係る、定位置制御の補正を繰返し得られた信号強度を示すグラフ図である。
【図７】実施例２に係る、マルチナノポア基板の他の例を示す図である。
【図８】実施例２に係る、基準対象であるシリコン単結晶をＸ軸方向にスキャンした結果を示すグラフ図である。
【図９】実施例３に係る、マルチナノポア基板の他の例を示す図である。
【図１０】実施例３に係る、マルチナノポア基板に高さが異なる基準対象を配置した例を示す図である。
【図１１】実施例４に係る、マルチナノポア基板の他の例を示す図である。
【図１２】実施例５に係る、定位置制御フローチャートの一例を示す図である。
【図１３】実施例５に係る、定位置制御事前設定ための画面表示例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の種々の実施例を図面に従い、順次説明する。
【実施例１】
【００１５】
実施例１として、少なくとも一つ以上の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、少なくとも一つのナノポアと基準対象が設置される基板と、ナノポアに位置する測定試料と基準対象に励起光を同時に照射し、基準対象から得られる検出信号により、測定試料に励起光が照射される位置を演算し、演算結果に基づき、測定試料に対する励起光照射を定位置に制御する位置制御部とを備える構成の定位置制御装置、及びその方法の実施例を説明する。【００１６】
本実施例では、ナノポアに測定試料としての生体ポリマーを進入させ、ラマンスペクトルを検出するナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置の定位置制御装置を例示して以下の説明を行う。すなわち、内径約10nmのナノポアに生体ポリマーを進入させ、ナノポアに照射する励起光と、ナノポア近傍に存在する導電性薄膜によってナノポアを通過する生体ポリマーのラマン散乱光が増大した後、ラマンスペクトルを検出する装置１００の実施例である。【００１７】
図１は、本実施例のナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置の構成例を示す。ここでは、正立型顕微鏡を基本構成として、ラマン光の観察に適用した場合を一例として、装置の構成と動作を説明する。なお、この装置構成は正立型顕微鏡の基本構成に限定されるものではなく、例えば倒立型顕微鏡を基本構成とする場合等、照射光による試料の信号検出を可能とする構成で有れば良い。【００１８】
同図において、光源１０１は、蛍光もしくはラマン散乱光を発生させることができる波長の外部光を励起光として照射する。当技術分野で公知の光源１０１、例えば、半導体レーザ、クリプトン（Kr）イオンレーザ、ネオジム（Nd）レーザ、アルゴン（Ar）イオンレーザ、YAGレーザ、窒素レーザ、サファイアレーザなどを使用することができる。この光源１０１からの外部光を励起光として複数のナノポアに照射する場合、多重照射機構１１３を用いる。この多重照射機構１１３としては、限定されるものではないがマイクロレンズアレイ、回折格子型ビームスプリッターまたはLCOS(Liquid crystal on silicon)を用いることができる。本実施例の装置にあっては、後で説明するように、これらの構成を用いて、複数の外部光を励起光としてナノポア、及び基準対象に照射する。また、光源から外部光を顕微鏡観察容器に照射し収束させるために、光源と組み合わせて、共焦点レンズ及び対物レンズ１０２を使用することが好ましい。以上の光源１０１から対物レンズ１０２までの光学系を照射光学系と総称する。【００１９】
顕微鏡観察容器１０３は、ＸＹステージ１０４上に架設し、位置決め手段であるＸＹステージ１０４によって水平面上の位置を調整することができる。垂直方向位置に関してはＺ軸調整機構１０５により対物レンズ１０２で集光した領域に測定対象の試料が位置するように調整する。Ｚ軸調整機構１０５は、ＸＹステージ１０４に持たせてもよい。位置決め手段としてこれらのステージ以外に、θ軸ステージ、ゴニオステージを利用し精密に調整してもよい。これらの位置決め手段は、駆動制御部１１５によって制御され、駆動制御部１１５はコンピュータ１１６を使って使用者が操作可能である。【００２０】
また、同図に示すように、装置構成として測定波長領域などの測定目的に応じたノッチフィルタ、ショートパスフィルター、ロングパスフィルター等のフィルタ１０６、ビームスプリッター１０７、回折格子１０８、などを組みあわせてもよい。その他、光学部品配置の必要に応じてミラー１１２やピンホール、レンズ１１４、ＮＩＲ（近赤外）ミラー１１７を使用してもよい。このような蛍光もしくはラマン散乱光の検出のため、適宜好ましい構成要素を選択することができる。【００２１】
一方、励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器は、蛍光もしくはラマン散乱光を検出することができる検出器であれば任意の分光検出器を使用することができる。また、検出器１０９は、検出の高速化に伴う感度低下を防ぐために、光電子増倍機構、例えばイメージインテンシファイアを有することが好ましい。更に、検出器１０９は、ラマン散乱光等の画像情報を直接記録することができる大容量メモリを備えることが好ましく、それによりケーブル、ボード、コンピュータなどを介することなく、装置１００内の解析装置１１８は、高速に解析を行うことができる。なお、解析装置１１８は、検出器１０９などからの計測値を記録するフレームバッファメモリを更に備えてもよい。また、解析装置１１８は、検出器１０９等からの計測値をデジタル化や演算処理、出力するためのコンピュータ１１６と接続する構成としても良い。【００２２】
更に、本実施例のナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置１００に、明視野観察が可能な機能を持たせてもよい。そのためには図１に示すように、明視野の照射光源としてＬＥＤ１１０、明視野撮像素子として２次元検出器１１１を使用する。使用する顕微鏡観察容器における試料の数及び配置に応じて、１又は複数の１次元又は２次元検出器１１１を使用することができる。そのような分光検出器としては、ＣＣＤ（電荷結合素子）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサ、他の高感度素子（アバランシェフォトダイオードなど）のイメージセンサなどが挙げられる。【００２３】
＜観察容器の説明＞
本実施例の装置１００に用いる顕微鏡観察容器１０３は、図２に一例の断面構成を示すように、その内部に少なくとも一つのナノポア２０３と後で説明する基準対象が設置された基板２０３が配置されている観察容器２０１からなる。観察容器２０１は、ナノポア２０２を有する基板２０３を隔てて２つの閉じられた空間、すなわち試料導入区画２０４と試料流出区画２０５で構成されている。但し、試料導入区画２０４と試料流出区画２０５はナノポア２０２で連通している。試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５は、両区画にそれぞれ連結された流入路２０６、２０７を介して導入される液体２１０、２１１で満たされる。液体２１０、２１１は、試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５にそれぞれ連結された流出路２０８、２０９から流出する。流入路２０６と流入路２０７は基板２０３を挟んで対向する位置に設けられてもよいが、これに限定されない。流出路２０８と流出路２０９は基板２０３を挟んで対向する位置に設けられてもよいが、これに限定されない。【００２４】
基板２０３は、基材と、基材に面して形成された導電性薄膜２１６と、導電性薄膜２１６に設けられた、試料導入区画２０４と試料流出区画２０５とを連通するナノポア２０２を有し、観察容器２０１の試料導入区画２０４と試料流出区画２０５の間に配置される。本図においては、基板２０３には本実施例に係る基準対象の図示は省略されている。【００２５】
図２中の２１３は観察される試料、２１４、２１５は第１、第２の電極を示している。図示を省略した電圧印加手段により、試料導入区画２０４に設けた第１の電極２１４、試料流出区画２０５に設けた第２の電極１１５の間に電圧が印加される。また、これら電極間には電流計が配置されていてもよい。第１の電極２１４と第２の電極２１５の間の電流は、試料のナノポア通過速度を決定する点で適宜定めればよく、例えば、試料を含まないイオン液体を用いた場合、DNAであれば100mV〜300mV程度が好ましいが、これに限定されない。これらの電極は、金属、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケルなど；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）、タングステン、タンタルなどから作製することができる。【００２６】
電極間に電圧印加によってナノポア２０２を通過する測定試料として生体分子ポリマーは、励起光によってラマン光を発するが、ナノポア２０２近傍に導電性薄膜２１６を用意し近接場を発生させ、ラマン光を増強することができる。ナノポア近傍に設置する導電性薄膜２１６は、薄膜の定義から明らかな通り、平面状に形成する。導電性薄膜２１６の厚さは、採用する材料に応じて、0.1nm〜10nm、好ましくは0.1nm〜7nmとする。導電性薄膜の厚さが小さいほど、発生する近接場を限定することができ、高分解能かつ高感度での解析が可能となる。また導電性薄膜の大きさは特に限定されるものではなく、使用する基板及びナノポアの大きさ、使用する励起光の波長などに応じて適宜選択することができる。【００２７】
本実施例の装置において、基板２０３は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料を含む）で形成することができる。基板を構成する電気的絶縁体材料の例としては、シリコン（ケイ素）、ケイ素化合物、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。ケイ素化合物としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、炭化ケイ素等、酸窒化ケイ素が挙げられる。特に基板の支持部を構成するベース（基材）は、これらの任意の材料から作製することができるが、例えばケイ素又はケイ素化合物であってよい。【００２８】
基板２０３のサイズ及び厚さは、ナノポア２０２を設けることができるものであれば特に限定されるものではない。基板は、当技術分野で公知の方法により作製することが可能で、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、基板は、フォトリソグラフィ又は電子線リソグラフィ、及びエッチング、レーザーアブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、化学蒸着（CVD）、誘電破壊、電子線若しくは収束イオンビームなどの技術を用いて作製することができる。基板は、表面への目的外の分子の吸着を避けるために、コーティングしてもよい。【００２９】
＜ナノポアの説明＞
本実施例において「ナノポア」及び「ポア」とは、ナノメートル（nm）サイズ（すなわち、1nm以上、1μm未満の直径）の孔（開口部）であり、基板を貫通して試料導入区画と試料流出区画とを連通する孔を意味する。ナノポア又はポアの孔とは、ナノポア又はポアが試料溶液と接する部分のナノポア又はポアの開口円を指す。生体高分子の分析の際には、試料溶液中の生体高分子やイオンなどは一方の開口部からナノポアに進入し、同じ又は反対側の開口部からナノポア外に出る。本実施例の装置で使用する基板２０３は、通常、少なくとも1つのナノポア２０２を有する。ナノポアは、具体的には導電性薄膜２１６に設けられるが、場合により、基材である絶縁体に同時に設けてもよい。【００３０】
ナノサイズの孔を形成するのに適した材料及び厚さの導電性薄膜２１６を基板２０３上に形成することによって、ナノポア２０２を簡便かつ効率的に基板に設けることができる。ナノポア形成の面から、導電性薄膜２１６の材料は、例えば酸化ケイ素（SiO2）、窒化ケイ素（SiN）、酸窒化ケイ素（SiON）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが好ましい。また導電性薄膜、及び場合によっては基板全体は、実質的に透明であってもよい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ50％以上、好ましくは80％以上透過できることを意味する。また導電性薄膜２１６は、単層であっても複層であってもよい。導電性薄膜２１６の厚みは、1nm〜200nm、好ましくは1nm〜50nm、より好ましくは1nm〜20nmである。導電性薄膜２１６は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（LPCVD）により、基板２０３上に形成することができる。【００３１】
更に、導電性薄膜２１６上には、絶縁層を設けることも好ましい。絶縁層の厚みは好ましくは5nm〜50nmである。絶縁層には任意の絶縁体材料を使用できるが、例えばケイ素又はケイ素化合物（窒化ケイ素、酸化ケイ素など）を使用することが好ましい。【００３２】
上述したように、ナノポアの孔サイズは、分析対象の生体高分子の種類によって適切なサイズを選択することができる。ナノポアは、均一な直径を有していてもよいが、部位により異なる直径を有してもよい。ナノポアは、1μm以上の直径を有するポアと連結していてもよい。基板の導電性薄膜２１６に設けるナノポアは、最小直径部、すなわち当該ナノポアの有する最も小さい直径が、直径100nm以下、例えば1nm〜100nm、好ましくは1nm〜50nm、例えば1nm〜10nmであり、具体的には1nm以上5nm以下、3nm以上5nm以下などであることが好ましい。【００３３】
測定試料２１３の一例としてのssDNA（1本鎖DNA）の直径は約1.5nmであり、ssDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は1.5nm〜10nm程度、好ましくは1.5nm〜2.5nm程度である。他の例であるdsDNA（2本鎖DNA）の直径は約2.6nmであり、dsDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は3nm〜10nm程度、好ましくは3nm〜5nm程度である。他の生体高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、糖鎖などを試料として分析対象とする場合も同様に、生体高分子の外径寸法に応じたナノポア直径を選択することができる。【００３４】
ナノポアの深さ（長さ）は、基板２０３又は導電性薄膜２１６の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポアの深さは、分析対象試料の生体高分子を構成するモノマー単位とすることが好ましい。例えば生体高分子として核酸を選択する場合には、ナノポアの深さは、塩基3個以上の大きさ、例えば約1nm以上とすることが好ましい。ナノポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。【００３５】
ナノポアは、基板に少なくとも1つ設けることができ、複数のナノポアを設ける場合に、規則的に配列してもよい。ナノポアは、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）の電子ビームを照射することにより、ナノリソグラフィー技術又はイオンビームリソグラフィ技術などを使用することにより形成することができる。【００３６】
＜導電性薄膜の説明＞
導電性薄膜２１６が平面状でなく、屈曲などが存在すると、その屈曲部において近接場が誘起され光エネルギーが漏出し、目的外の場所においてラマン散乱光を発生させる。すなわち背景光が増大し、S/Nが低下する。そのため、導電性薄膜２１６は平面状であることが好ましく、換言すると断面形状は屈曲のない直線状であることが好ましい。導電性薄膜を平面状に形成することは、背景光の低減、S/N比の増大に効果があるだけではなく、薄膜の均一性や作製における再現性などの観点からも好ましい。【００３７】
導電性薄膜の形状は、外部光を照射することにより近接場を発生し、増強することができる形状であれば、任意の形状とすることができる。このような近接場を発生するプローブは当技術分野で公知であり、例えば、ティップ増強ラマン散乱（TERS）により近接場を発生及び増強して増強場とすることができる鋭角の端部を有する形状、金属ボウタイ構造などが知られている。導電性薄膜の好ましい平面形状の一例として鋭角の端部を有する形状が挙げられ、この端部をナノポアに面して設けることが特に好ましい。この場合、その端部の角度は10〜80度、好ましくは20〜60度、より好ましくは20〜40度とする。このような近接場光を形成するための導電性薄膜（光散乱体）の好ましい形状については、例えば特開2009-150899号公報を参照されたい。なお、導電性薄膜の端部の頂点部分は、厳密な意味での点でなくともよく、一定以下、好ましくは10nm以下の曲率半径を有する丸みを帯びた形状等であってもよい。鋭角の端部以外の導電性薄膜の形状としては、端部の頂点の角度より鈍角な角を採用することができる。ただし角の部分には近接場が誘起され光エネルギーが漏出することから、ナノポアに面する鋭角の端部以外については、複雑な形状は極力回避し、角のない円形や、直線状などを採用することが好ましい。また導電性薄膜の全体の形状は、鋭角の端部を有する限り、任意の形状とすることができ、三角形、四角形及び五角形などの多角形、扇形、円形と三角形の合成形などとすることが可能である。【００３８】
一方、導電性薄膜の形状として金属ボウタイ（bow-tie）構造を採用することも可能である。即ち、円形、楕円形又は多角形の2つの導電性薄膜を、その形状の凸部が互いに対向するように配置する。このような金属ボウタイ構造については、例えば米国特許第6,649,894号を参照されたい。金属ボウタイ構造は、近接場が形成される領域にギャップ（開口）を挿入した構造とみなすことも可能である。ギャップの挿入によって異方性が導入され、検出感度が改善される。このような技術についての説明は、例えば米国特許第6,768,556号及び米国特許第6,949,732号を参照されたい。【００３９】
導電性薄膜は、その少なくとも一部、特に好ましくは近接場を発生する端部などの構造が、ナノポアに面して設けられる。導電性薄膜は、その少なくとも一部、特に好ましくはその端部がナノポアに面して設けられている限り、固体基板の表面上に配置されてもよいし、あるいは固体基板の間に配置されてもよい。例えば、固体基板の表面上に、ナノポアの開口部に面して配置することができる。あるいは、固体基板上のナノポアの中心軸方向におけるほぼ中間の位置（深さ）に導電性薄膜を配置することができる。この場合、導電性薄膜は、固体基板の薄膜部分によって挟まれた構造となることが好ましい。これにより、近接場はナノポアの中心軸方向（深さ方向）の中間付近に形成されるため、生体ポリマーの形状と移動速度を制御しながらナノポア内で生体ポリマーのラマン散乱光を発生させることができ、高精度及び高感度に解析を行うことが可能である。なお、導電性薄膜を固体基板に配置する場合には、照射される外部光の偏光方向を考慮して配置することが好ましい。【００４０】
また、導電性薄膜は、各ナノポアに対して少なくとも1つ配置されていればよく、奇数であっても偶数であってもよい。例えば、導電性薄膜は、各ナノポアに対して１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上を配置することが可能である。後述する実施例に記載のように、導電性薄膜が複数存在すると、強い光の場が形成されるため、各ナノポアに対して2つ以上の導電性薄膜を配置することが好ましい。あるいは、導電性薄膜は、上述した形状を1単位として、複数の単位を有する１つの薄膜とすることも可能である。【００４１】
導電性薄膜は、導電性又は光散乱特性を有する材料で形成することができる。そのような材料としては、金属、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケルなど；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）などが挙げられる。【００４２】
ここで複数の導電性薄膜を、特に連結して配置する場合の注意点について述べる。複数の導電性薄膜を連結して配置する場合、連結した結果できる導電性薄膜の全体としての形状において、その少なくとも一部、特に好ましくはそのナノポアに面する部分の形状が鋭角の端部を有する必要がある。複数の導電性薄膜をナノポア付近で連結すると、この鋭角の端部が消失するおそれがあるが、端部は近接場の効率的な形成に必要であるため、その消失は回避しなければならない。関連して、導電性薄膜を1つ用いる場合、それをナノポアの全周を囲むように配置すると、同様の不具合が生じるおそれがある。つまり励起光により導電性薄膜に誘起された電荷が、ナノポアの全周を取り囲む導電性薄膜を通して回り込んでしまい、ナノポア部分に双極子が形成されないという不具合のおそれがある。そのため、生体ポリマーの特性解析チップにおける少なくとも1つの導電性薄膜が、ナノポアの全周でなく、固体基板のナノポアを形成する一部のみに配置されることが好適である。【００４３】
導電性薄膜２１６は、その端部がナノポアの開口部に面して配置されていることが好ましい。より具体的には、導電性薄膜を、ナノポア中心軸に対して直交する面内に、かつ薄膜の端部をナノポアの開口部に面して配置する。また少なくとも２つの導電性薄膜を配置する場合には、これらの導電性薄膜が、ナノポアの開口部をはさんで互いに対向して配置されることが好ましい。このような場合、外部光を導電性薄膜に照射することにより、導電性薄膜がナノポアに面する端部において近接場を発生させて、ナノポアを進入する生体ポリマーのラマン散乱光を発生させる。【００４４】
導電性薄膜は、当技術分野で公知の方法により作製し、固体基板に配置することができる。例えば、導電性薄膜を銀で形成する場合には、所望の厚さの銀薄膜をスパッタリングにより基板に形成した後、所望の形状を電子ビームにより形成することができる。また導電性薄膜を単層のグラフェンで形成する場合には、グラファイトから作製したグラフェンを支持基板にのせ、電子ビームを照射して所望の形状のグラフェンを形成することができる。【００４５】
本実施例の装置における解析チップに外部光を照射することにより、ナノポアに進入した生体ポリマーが励起されてラマン散乱光を発生し、そのラマン散乱光のスペクトルに基づいて生体ポリマーの特性を解析することができる。形成される近接場の厚さは基本的に導電性薄膜の厚さと同等である、すなわち導電性薄膜はナノポアの中心軸に直交するため、形成される近接場の中心軸方向の厚さは導電性薄膜の厚さと同程度である。そのため、本実施例の解析チップを用いることにより、高空間分解能かつ高感度で生体ポリマーを解析することができる。【００４６】
＜測定動作の説明＞
図２に示した液体２１０は分析対象となる試料２１３を含む試料溶液である。液体２１０は、試料２１３以外には、電荷の担い手となるイオンを好ましくは大量に含むイオン液体のみを含むことが好ましい。イオン液体としては、電離度の高い電解質を溶解した水溶液が好ましく、塩類溶液、例えば塩化カリウム水溶液などを好適に使用できる。試料２１３は、イオン液体中で電荷を有するものであることが好ましい。試料２１３は、典型的には生体高分子である。【００４７】
電極２１４、２１５に対する電圧印加により、電荷をもつ試料２１３が試料導入区画２０４からナノポア２０２を通過し、試料流出区画２０５へと移る。試料２１３が励起光によって照射されたナノポア２０２を通過するとき、導電性薄膜２１６によって増強されたラマン散乱スペクトルを液浸媒体２１７よって効果的にラマン光を集光し、図１の対物レンズ１０２に対応する対物レンズ２１８を通して検出器１０９に達し解析される。【００４８】
図３に、一般的に使用されているマルチナノポア基板の一構成例を示す。同図に示すように、基板３０１上にナノポア３０２と導電性薄膜３０３が複数設けられている。これらは、図２のナノポア２０２、導電性薄膜２１６に対応している。ナノポア３０２及び導電性薄膜３０２が格子状に２０個設けているが、これに限定されない。マルチナノポア基板３０１にも多重照射機構１１３によって励起光がナノポア３０２を照射し、図２で説明した検知器１０９で検出される。【００４９】
＜基準対象を用いた測定の説明＞
さて、一般的な装置設置環境の温度変化やステージ駆動を成すモータの熱による温度変化などにより、上述した励起光のドリフトや観察容器のドリフトが起き、照射光がナノポアに正しく照射されず、所望の信号が得られないことがある。そこで、本実施例のナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置においては、図４Ａに示す基準対象を備えた基板を用いる。図４Ａのマルチナノポア基板４０１は、複数のナノポア４０２と導電性薄膜４０３に加え、基準対象としての基準物質４０４，４０５，４０６を備えており、このマルチナノポア基板４０１を用いることにより、観察時の環境変化に影響されることなく所望の信号が得ることが可能となる。ナノポア４０２、導電性薄膜４０３は、それぞれ図２のナノポア２０２、導電性薄膜２１６に対応している。ここでマルチナノポア基板上の基準対象とは、上述の温度変化等によるドリフトの影響を排除するための基準となる対象を意味する。【００５０】
本実施例の装置において、初めにマルチナノポア基板４０１を含む観察容器２０１を装置１００に架設する。図４Ｂに模式的に示すように、架設後に多重照射機構１１３、対物レンズ２１８等の照射光学系を利用して、複数の励起光がマルチナノポア基板４０１に照射される位置と、ナノポア４０２の位置を合わせる。この初期段階における位置を合わせる手段の一つとして、励起光を照射しながらＸＹステージ１０４等の各種ステージを駆動し、基準対象として例示した基準物質４０５、４０６や、ナノポア４０２から発せられるラマン散乱光を検出する。そのため、マルチナノポア基板４０１上のナノポア４０２、基準物質４０４−４０６の配置と、複数の励起光の照射配置が合うように、設計または位置調整を事前に行っておく必要がある。検出はラマン散乱光に限定されるものではなく、蛍光物質を基準物質４０４−４０６とし蛍光を検出してもよい。望ましくは検出するのに十分な信号が得られるものが好ましい。例えば市販品として入手することも可能である、蛍光を発するビーズをマルチナノポア基板４０１に固定して行うことも可能である。【００５１】
なお、初期段階で位置合わせに用いる信号検出は、基準対象である基準物質４０４−４０６ではなく、マルチナノポア及び導電性薄膜から得られる信号を検出してもよい。この初期段階においては、観察対象である試料が溶液中に混合されておらず、観察容器２０１を満たした溶液もまたラマン散乱光を持ち、試料同様に導電性薄膜によって増強された信号を得ることが出来るため、この信号を利用し高精度な初期段階での位置合わせを行うことも可能である。【００５２】
また、フォトリソグラフィ技術ならびに微細加工技術を用いて、基板上に基準対象としてのシリコン単結晶の構造体を形成し、このシリコン単結晶のラマン散乱光を検出してもよい。平坦な単結晶薄膜が貼り付けられた基板も一般に市販されており、厚み（すなわち、構造体の高さ）を規定したものも製造できる。また、シリコンに限らず、単結晶のような結晶方位面が規定された材料や、単結晶に限らずラマン散乱強度の絶対値が再現性良く得られる平坦で均質な材料を成膜あるいは貼り付けたのち、その上から、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングし、これらの材料を微細加工技術により基準対象としての構造体に加工すれば、位置調整だけでなく、ラマン散乱光の強度基準として用いることも可能である。このような位置とラマン散乱強度の規定された構造体を基準対象として配するためのレイアウトパターンは、ナノポアを形成する際に用いるものと同じ相対位置決め手段、例えば、構造体形成用のあわせマークなど、あるいは、複数のレイアウトのあわせが不要な一括形成法を用いて形成可能であるため、高精度にナノポアと基準対象をマルチナノポア基板上に配置することが可能である。【００５３】
さらに、ナノポア４０２の形成位置と基準対象である基準物質４０４−４０６の材料が異なる場合でも、あらかじめ、マルチナノポア基板４０１上に異なる材料の面領域を設け、この上にリソグラフィ技術により微細加工用のマスクを形成しこれを加工すれば、ナノポアの機能に関わる構造体と、位置ならびにラマン散乱強度を規定する別の材料の構造体である基準対象を、高精度に配置したものを製造することも可能である。ここでは、シリコン単結晶を例として取り上げたがこれに限定されない。検出したい波数レンジ内にピークをもつスペクトルを与えられる材料で有ればよい。例えば酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトなど基板上に成膜及び加工が可能な材質などを選んでもよい。【００５４】
以上、フォトリソグラフィ技術ならびに微細加工技術を用いて基準対象を用意する手段を記載したが、これに限定されない。材料によっては加工が難しい場合も想定される。例えば、基板上一面に基準物質の材料を成膜し、その後、基準物質を加工しやすい材料で覆い、信号を得たい大きさ、範囲のみを覆った箇所をエッジング等で露出させ、露出した箇所から蛍光やラマン光を検出してもよい。【００５５】
図５に本実施例の構成において、位置合わせの基準対象の一例としてシリコン単結晶を用い、位置制御部の一部として機能する駆動制御部１１５を用いて基準対象をＸＹ軸方向スキャンした結果を示す。このときスキャンする軸はＸＹステージ１０４を利用したＸＹ方向に限定されるわけではなく、Ｚ軸調整機構１０５を利用したＺ軸方向や、更にはθ軸方向やゴニオステージを利用し傾斜方向のスキャンを実施してもよい。ＸＹ軸を一面スキャンするだけでなく、スキャンの方法も限定されるものではない。各軸の移動と照射により信号を検出する動作の結果から、最も強く信号が得られる座標位置に移動することで、最も信号が強く得られる座標軸から測定を開始することが可能である。【００５６】
望ましくは、スキャン後の位置で測定を開始し、測定完了まで同じ座標軸で望ましい信号を得たいが、前述したように、装置を構成するＸＹステージ１０４等のステージモーターや検出器の排熱、環境の温度変化によりマイクロメータもしくはナノメータの範囲ではドリフトが発生する。そこで、本実施例の装置においては、試料の混合が開始された液体２１０の測定開始と共にナノポア４０２からの信号を検出しながら、同時に位置制御部の一部として機能する駆動制御部１１５により、基準対象である基準物質４０４−４０６のスキャン動作も行い、検出器１０９の検出信号を使って、位置制御部の一部として機能するコンピュータ１１６、あるいは解析装置１１８によって、スキャン後に最も信号が強い座標軸を演算する。その最大信号強度を放つ座標軸を中心に、位置制御部の一部として機能する駆動制御部１１５の制御の下、再度スキャンを行う。このとき、スキャンを行う範囲は初期の位置決め時に得た図５に示す座標軸と信号の結果から、最低限必要な信号が得られる範囲の中でスキャンを行うよう制御する。この操作により、常に最低限必要な検出信号を得られ続けるように定位置制御を行うことができる。【００５７】
言い換えるなら、駆動制御部１１５、コンピュータ１１６等を含む位置制御部は、測定試料及び基準対象の位置に対して、励起光のスポット位置をスキャンし、基準対象から得られる信号により、測定試料が励起光を強く照射する位置を演算し、演算結果から測定試料に対するスポット位置を所望の位置に制御する。【００５８】
なお、試料が混入された液体を使った試料測定中の位置制御のための信号として、ナノポアからの信号を利用すると仮定すると、その信号として溶媒である液体自体の信号と、時々ナノポアを通過する観察対象である試料、すなわち生体ポリマーの信号が合わさったものを検出してしまい、誤差の原因となるので、本実施例の装置にあっては、試料の測定の実行中は、基準対象である基準物質からの検出信号のみを用いて、位置制御部による定位置制御のスキャンを実施する。【００５９】
試料測定中の定位置制御用のスキャン範囲は、製品出荷前などの事前に試験した基準物質またはナノポアをスキャンした座標軸と信号の結果を用いて決定してもよい。好ましくは、測定開始直前の初期段階でその基板の位置合わせを行った時に使用した基準物質から得られた情報を利用するが、より好ましくは初期段階での位置合わせ時にナノポア位置から得られた情報を利用して、最低限必要な信号が得られる範囲を決めるのが望ましい。【００６０】
位置制御部を使って試料の測定中のスキャンを行う時間間隔として、常にスキャンを繰り返しても良いが、一定間隔で実施してもよい。図６に本実施例の装置を用いて、2分間隔で直径700nm、高さ220nmの基準対象としての円柱型シリコン単結晶をスキャンと同時に、ラマン光測定を行い、スキャン結果を元に補正を繰返し得られた試料の信号強度の一例を示す。これは、装置起動直後のモータ等に熱が発生し温度ドリフトが起きやすい条件下で測定を行った。同時に装置内の温度も測定したが、図に示す温度変化が起きても測定開始時の信号を100％とした時に対し、常に80％以上の信号を保つことを確認した。一方、本実施例の定位置制御の補正動作を行わずに、装置起動直後のラマン光の測定を行ったところ、図６に示すように、約５分後に80％以下の信号強度となり、以降時間経過とともに信号の減少が観測された。【００６１】
また、駆動制御部１１５等の位置制御部による定位置制御用のスキャンの間隔は、一定の時間間隔で行うことに制限されない。例えば、装置１００内や装置外または排熱箇所等に温度センサを設け、温度センサがある一定範囲外の温度を示した時や時間当たりの温度変化が発生した時に、上述の位置制御部による定位置制御用のスキャン動作を行ってもよい。すなわち、位置制御部は、所定の温度変化の検出により、定位置制御用の励起光のスポット位置のスキャンを開始して、前記スポット位置を所望の位置に制御する。【００６２】
また上記の位置制御部によるスキャンを行うステージ駆動の方法として、ＸＹ軸を満遍なく一面スキャンしても良いが、測定開始点のＸ軸のみを上記の必要範囲内でスキャンを行い、最大信号強度が得られるＸ座標軸に移動し、続いてＹ軸のみを上記の必要範囲内でスキャンを行う操作を繰り返すことによりスキャン時間を短縮してもかまわない。このとき、位置合わせ同様にスキャンするステージ駆動軸はＸＹに限定されるわけではなく、Ｚ軸方向やθ軸方向やゴニオステージを利用し傾斜方向のスキャンを実施してもよい。【００６３】
上述した本実施例の定位置制御の動作により、複数の励起光が基板に照射する位置と、マルチナノポアの位置が制御され、常に最低限必要な信号をマルチナノポアから得ることが可能になる。【００６４】
なお、ここで得られる信号は、ラマン光や蛍光であるため物質固有のスペクトルを持つ。例えば、シリコン単結晶であれば520cm-1にピークを持つスペクトルが得られる。そこで、この物質固有のスペクトルを用いて検出器自身のドリフト（位置ずれ）を補正してもよい。すなわち、基準対象である基準物質のスペクトルを用いて、検出器の位置または検出器の画像素子の情報を補正することができる。例えば検出器１０９がドリフトした場合、基準対象としてのシリコン単結晶のラマン光が520cm-1を示す位置、例えば、２次元の検出面上の所定の画像素子ではなく、ドリフトした位置、例えば、540cm-1を示す位置の画像素子で検出してしまう。つまり、試料が本来得られる波数位置でピークを得られず、異なる波数位置でピークを検出するか弱いピークとして検知してしまう。【００６５】
しかし、基準物質としてシリコン単結晶を用いているのが自明であるため、検出器の各画像素子の検出信号を用いて、ドリフトして得られた基準物質のピークを元に上記のドリフトを補正することが可能である。測定開始時に検出器が基準物質の信号を得た位置を所定の画像素子の情報として記憶しておき、ドリフトした位置の画像素子から得られた基準物質の信号を得た位置からドリフト量を計算し、図示を省略した検出器１０９自身が備えた駆動機構を使用しドリフトした距離だけ補正してもよい。補正手段は駆動機構に限定されず、他の手段を用いてもよい。【００６６】
図４に示したように、本実施例の装置おいては、複数の基準物質４０４−４０６を、アレイ化されたナノポア４０２の端に用意する。その結果、検出器１０９に各基準物質のピークが複数の点として得られることを利用し、ピークを捉えた各画像素子の位置の情報と波数情報を再度計算し補正する。したがって複数のピークが得られる物質を用いるとより高精度に補正が可能となるため、そのような物質を基準物質として用いてもよい。ここではシリコン単結晶のラマン光を用いた例を示したが、これに限定されるわけではなく、ラマン光を発する他の材料や蛍光物質の蛍光を用いてもよい。【００６７】
以上に示した本実施例の構成により、高精度に環境温度や装置内の温度をコントロールする機構を新たに用意することなく、励起光の照射位置を定位置に制御することが可能である。また、位置の変位を検出する機構も新たに用意することなく定位置に制御することが可能である。更に、少なくとも一つ以上の基準物質を用いることにより検出器に新たな駆動機構を用意することなく、検出器自身を定位置に制御することが可能である。つまり、本実施例によれば、ナノポアが形成された基板に、基準対象である基準物質を配備することで、ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置の励起光の照射位置を定位置に制御し、高精度の信号検出を行うことが可能になる。
【実施例２】
【００６８】
実施例２は、信号の減衰をより押さえて定位置制御のスキャンを実行可能な装置の実施例である。図７は、本実施例において信号の減衰をより押さえる基準物質７０４，７０５，７０６を備えたマルチナノポア基板７０１を示す構成図の例である。本実施例のマルチナノポア基板７０１も、実施例１同様に図１に示すナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置を用いて、試料である生体ポリマーをナノポアに通過させ、生体ポリマーを検出する。このとき、本実施例においては、図４Ｂに示した照射光学系を用いてナノポア７０２及び導電性薄膜７０３に照射する励起光のスポット径と基準対象に同時に照射するスポット径が等しい時、ナノポア位置での試料の径に対し、小さい径の基準物質７０４−７０６を配置する。これにより、効果的に信号の減衰を押さえて定位置制御用の励起光のスキャンを実行することが可能となる。また、励起光のスポット径が試料及び基準物質の径より小さい時、基準物質への励起光スポット径が、測定試料への励起光スポット径より大きくする。【００６９】
図８に一例として、直径700nmと150nmかつ高さ220nmの二種の円柱型シリコン単結晶の中心位置を含めたＸ軸方向にスキャンした信号の検出結果を示す。同図が示すように、直径の小さい円柱型シリコン単結晶の方が、中心位置から外れた時の信号の減衰が大きく顕著である。例えば、ナノポア位置で励起光が照射された試料の径、すなわち増強場の径が直径700nmとするとき、基準物質として直径150nmのシリコン単結晶を使用すると、基準物質側からの信号の減衰が顕著であるため、試料の信号の減衰を押さえてスキャンすることが出来る。スキャンのレンジを広く取り過ぎると試料の信号を大きく失ってしまうのに対し、径の小さい基準物質側からの信号の減衰が顕著であるため、励起光のスキャンのレンジが狭くても所望の位置を検出可能であることを利用し、試料の信号を失わずに基準物質の信号の減衰を検出して、正確に所望の位置を検出することが可能となる。一例としてシリコン単結晶を挙げたがこれに限定されず、検出したい波数レンジ内にピークをもつスペクトルを与えられる材料で有ればよい。例えば酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトなど基板上に成膜及び加工が可能な材質などを選んでもよい。または蛍光物質を用いても同様である。【００７０】
測定試料に対して基準物質の径が小さいことによって信号の減衰が抑えられることを説明したが、これに限定されない。励起光が照射するスポット径も試料に照射するものより、基準物質に照射するスポット径が小さい方が好ましい。すなわち、測定試料に照射する励起光のスポット径より小さいスポット径の励起光を基準物質に照射することも可能である。一般にレンズ等を用いて励起光の照射スポットを絞り小さくするが、原理的に波長以下の大きさに照射スポットを絞れない為、図４Ｂにその一例を示した照射光学系を一部変更し、試料に照射する波長より短い波長の励起光を基準物質に照射することにより照射スポットを小さくし、ドリフトした時の基準物質からの信号の増減を顕著にして高感度にドリフトを検出する構成とすることができる。すなわち、測定試料に対するものより短い波長の励起光を用いて、試料より小さい励起光スポット径を基準物質に照射することができる。【００７１】
また、一般に、光軸上に設けるピンホール、またはアパーチャが大きくなる被写界深度は深くなる。この現象を利用し、試料の光軸上に設けるピンホールに対し、基準物質の光軸上に設けるピンホールを小さくすると、基準物質の光軸に対し垂直な方向（図１、図４におけるＺ軸方向）におけるドリフトに対し、信号の増減が顕著になるため高感度にドリフト検出することが可能となる。【００７２】
以上説明した本実施例の基準対象の径をナノポア位置での試料の径より小さくすること等の構成により、より高感度にドリフトを検出し、高精度に定位置制御を行うことが可能となる。
【実施例３】
【００７３】
実施例３では、信号の減衰をより押さえて、高精度に定位置制御を行うことが可能な装置の実施例である。実施例１及び２では、例えば装置内の温度変化などによりドリフトしても定位置制御用の励起光スキャンによってドリフトの方向を検知し、ドリフト方向に補正することによって信号の減衰を押さえる構成を示した。本実施例では、スキャンによってドリフトの方向を検知するのではなく、複数の励起光の照射位置と、ナノポア及び基準対象の位置がずれた時の信号変化からドリフト方向とドリフト量を演算し補正する。【００７４】
図９は本実施例における基準対象である基準物質９０２、９０５を備えたマルチナノポア基板９００の一例を示す平面図である。複数配備されたナノポア９０４は、実施例１および２同様に、図１に示すナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置１００を用いて、ナノポア９０４に試料である生体ポリマーを通過させ、生体ポリマーを検出する。本実施例も実施例１同様に、初めにマルチナノポア基板９００を含む観察容器２０１を装置に架設する。架設後に図４Ｂにその一例を示した照射光学系等を用いて、複数の励起光が同時にマルチナノ基板９００に照射する位置９０１と、マルチナノポア９０４の位置を合わせる。位置を合わせる手段の一つとして、励起光をマルチナノポア基板９００に照射しながら各軸各種ステージ１０４等を駆動し、基準物質９０２から発せられるラマン散乱光を検出し、ラマン散乱光の信号強度とステージ位置情報をコンピュータ１１６或いは解析装置１１８の記憶媒体などに記憶する。そのためには、本実施例においても、マルチナノポア基板９００上のナノポアの配置と複数の励起光の照射配置が合うように、設計または位置調整を事前に行っておく必要がある。検出はラマン散乱光に限定されるものではなく、蛍光物質を基準物質とし蛍光を検出してもよい。【００７５】
本実施例においては、マルチナノポア基板９００において、照射スポット９０１が各ナノポア９０４から得られる信号が最大になる位置に合わせ、最大信号を発する位置からずらした位置に基準物質９０２を配置する。基準物質９０２は事前に照射スポットからずらした位置に配置してもよい。または、基準物質９０２への照射スポットの位置をずらしてもよい。同図に示された４つの基準物質中、基準物質９０２であればＹ軸方向にずらした位置に配置をし、Ｙ軸方向にずれた場合に信号が増加することと、検出した検出器１０９の画像素子の位置情報からドリフトした方向を認識する。さらに、初期の位置合わせの時に実施したスキャン動作の結果のステージ位置情報と信号強度の関係と、基準物質９０２がドリフト時に発生した信号強度の増加からドリフト量が算出される。算出されたドリフト方向とドリフト量を元にステージ駆動によってナノポアから最も強い信号が得られる位置への補正動作が可能となる。このとき基準物質９０２と異なる位置（ベクトル）に他の３つの基準物質を配置することにより、各方位のドリフトを高精度に補正することが可能となる。【００７６】
図９の配置構成で、基準物質の位置をずらす幅は、検出したいドリフト量によって決められる。高感度に検出したい場合、例えば図８に示したスキャン結果を参考にすると基準物質としてシリコンの単結晶を用い、中心位置から例えば200nmずらした位置に直径150nmのシリコンの単結晶を配置すると、信号の増減によって、ドリフト量を見積もることが可能である。【００７７】
図１０は、本実施例の装置において、Ｚ軸方向のドリフトを検出すべくマルチナノポア基板１０００に基準対象である基準物質１００１、１００２を配置した一例の図である。この基準物質１００１、１００２は図９の平面図に示した２個の基準物質９０５に対応する。例えば、基準物質１００１の高さをマルチナノポア９０４が最も信号が強くなる位置と同じ高さに用意した時、基準物質１００２を基準物質１００１より高い位置、すなわち高さを高くして配置する。この結果、Ｚ軸方向において検出される試料が上がる方向にドリフトした場合、基準物質１００１の信号が下がり、基準物質１００２の信号は上昇する。一方、試料が下がる方向にドリフトした場合、基準物質１００１、１００２の双方の信号下がる。ここで、基準物質１００１，１００２はＸＹ軸方向にドリフトが発生しても信号強度に影響を受けない程度に広いサイズの径にしておくことが好ましい。これにより、各基準物質の信号の増減でＺ軸のドリフト方向を認識し補正することが可能となる。【００７８】
基準物質を配置する位置は、上記の様に配置されることに限定されない。例えば、基準物質１００２を基準物質１００１より低い位置に配置にしてもよい。または、双方の基準物質ともにマルチナノポア９０４が最も信号が強くなる位置と同じ高さに用意せず、一方の基準物質はマルチナノポア９０４が最も信号が強くなる位置より低くし、一方はマルチナノポア９０４が最も信号が強くなる位置より高い位置に配置してもよい。つまり、各軸方向にずらして配置する基準物質１００１、１００２は、少なくとも検出したいＺ軸のドリフト量を検出可能な位置に配置する。【００７９】
一例として基準対象として、シリコン単結晶を挙げたがこれに限定されず、検出したい波数レンジ内にピークをもつスペクトルを与えられる材料で有ればよい。例えば酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトなど基板上に成膜及び加工が可能な材質などを選んでもよい。または蛍光物質を用いても同様である。
【実施例４】
【００８０】
実施例４は、励起光の照射位置とナノポアの位置がずれた時の信号変化からドリフト方向とドリフト量を演算し補正する他の構成の実施例である。ドリフト方向とドリフト量を演算し補正する他の構成として、本実施例では、図９に示したマルチナノポア基板９００の構成とは異なり、図１１に示す様に、照射スポット位置に対して、基準物質が検出したいドリフト方向のずれた位置に配備されドリフトに応じ信号が変化する構成を備える。【００８１】
本実施例においては、図１１に示すマルチナノポア基板１１００の構成を用いる。複数配備された複数のナノポア１１０２、は実施例１−３と同様に、図１に示したナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置を用いて、ナノポア１１０２に試料である生体ポリマーを通過させ、生体ポリマーを検出する。本実施例においても、初めにマルチナノポア基板１１００を含む観察容器２０１を装置１００に架設する。架設後に複数の励起光が基板１１００に照射する位置１１０１と、マルチナノポア１１０２の位置を合わせる。位置を合わせる手段の一つとして、励起光をマルチナノポア基板１１００に照射しながら各軸各種ステージを駆動し、基準物質から発せられるラマン散乱光を検出し、ラマン散乱光の信号強度とステージ位置情報をコンピュータ１１６、解析装置１１８などで記憶する。そのためには、マルチナノポア基板１１００上のナノポア１１０２の配置と複数の励起光の照射配置が合うように、設計または位置調整を事前に行っておく必要がある。検出はラマン散乱光に限定されるものではなく、蛍光物質を基準物質とし蛍光を検出してもよい。【００８２】
図１１のマルチナノポア基板１１００において、照射スポット１１０１が各ナノポア１１０２から得られる信号が最大になる位置に合わせる。直方体基準物質１１０４、１１０５は、最大信号を発する位置、例えば、照射スポットの中心からずらした位置に配置する。例えば、直方体基準物質１１０４の中心が照射スポットの中心に対しＸ軸方向にずれており、Ｙ軸方向に長辺をもつ。直方体基準物質１１０５は、中心が照射スポットに対しＹ軸方向にずれており、Ｘ軸方向に長辺をもつ直方体である。基準物質１１０４であればＹ軸方向にずらした位置に配置をし、Ｘ軸方向にずれた場合に信号が増減することと、基準物質１１０５であればＸ軸方向にずらした位置に配置をし、Ｙ軸方向にずれた場合に信号が増減することと、信号を検出した検出器１０９の画像素子の位置情報からドリフトした方向を認識する。さらに、ＹおよびＸ軸方向に長辺を持つ直方体基準物質１１０４、１１０５それぞれを少なくとも２つ以上架設することが望ましい。より好ましくは、検出箇所となるナノポア１１０３より外側に配置すると回転方向のドリフトが発生した時、内側のナノポアより外側の基準物質の方が大きくドリフトするため、外側の基準物質１１０４、１１０５の補正を行うことによって内側に位置するナノポア１１０２への照射をより正確に補正することが可能となる。【００８３】
基準物質１１０６の高さまたは厚みは、Ｚ軸方向に異なる高さに設計された実施例３で示した基準物質９０５と同様に配備する。これらの基準物質は事前に鉛直方向における照射スポットからずらした位置に配置し、信号の増減を持ってＺ軸方向のドリフトを検出する。これらの基準物質１１０６を複数用いて、測定する基板１１００の傾きを検出してもよい。例えば図１１に示すように四隅に基準物質１１０６を配置し、四つの信号の増減を持って傾きの向きを検出し、傾き調整用のステージもしくは駆動機構を持って平面を保つ為に補正してもよい。【００８４】
本実施例によれば、このようなＸＹＺ軸方向のドリフトのみならず、回転方向を検出することも可能である。例えば、図１１に示すように、基板の両端に直方体基準物質１１０５を配置する。直方体基準物質１１０５の中心が照射スポットの中心に対しＹ軸方向にずれ、Ｘ軸方向に長辺を持たせて配置することにより、回転方向のドリフトを検出することが可能になる。時計回りに基板がドリフトした場合、二つの直方体基準物質１１０５から得られる信号が同時に減衰する。この現象から、基板が時計回りにドリフトしたことを検知し、反時計回りにステージを回転させ補正する。一方、反時計回りに基板がドリフトした場合、二つの直方体基準物質１１０５から得られる信号が同時に増加する。この現象から、基板が反時計回りにドリフトしたことを検知し、時計回りにステージを回転させ補正する。【００８５】
本実施例により、実施例３の構成と同様、ドリフト方向とドリフト量を演算し補正することができるのみならず、回転方向のドリフトを検出する補正することも可能なる。
【実施例５】
【００８６】
以上説明した実施例１−４において、各軸におけるドリフトに対する補正動作を説明してきたが、補正に用いるθステージの回転軸とドリフトが発生した時の回転軸の回転中心が異なり、且つ回転方向のドリフトとＸＹＺ軸方向のドリフトが複合された場合は、コンピュータ１１６あるいは解析装置１１８で実行する、基準物質から得られる信号の情報に基づく各種のドリフト補正は順序だって行う必要がある。そこで、実施例５として、このような場合においける好適なドリフト補正を行うことが可能な装置の実施例を示す。【００８７】
図１２に、本実施例におけるドリフト補正の一例のフローチャートを示す。まず初めに、例えば図１１に示した基板１１００を持つ観察容器２０１を装置１００に架設する。架設後に励起光を観察容器２０１に照射し、各ナノポア１１０２からの信号強度が最も強くなる位置を探すスキャン動作を行い測定位置を決める（１２００）。同時に、各基準物質１１０４、１１０５、１１０６からの信号強度と位置情報も取得しコンピュータ１１６や解析装置１１８等の記憶媒体に保存する（１２０１）。【００８８】
スキャン終了後にナノポアが最も信号強度が強く発する位置に移動し、ナノポアを通過する生体分子の信号の検出と同時に、基準物質からの信号測定を開始する。測定開始時の基準物質からの信号は順次記憶され、その後のドリフト補正時に用いる。【００８９】
測定開始後に温度変化等によりドリフト発生した場合、基準値の信号に変化が見られるため基準値の変化を持ってドリフトを検知する。検知及び演算は常時行ってもよいが、演算処理を軽減するために、先に説明したように、例えば１０分間隔でデータを取得する等、定期的に基準値の信号を取得しドリフトを検出してもよい。なお、ドリフトを検知する信号強度を事前に設定してもよい。【００９０】
図１３に、本実施例の装置における、ドリフト検知及び補正の条件設定の一構成例を示す。表示画面１３００は、例えばコンピュータ１１６や解析装置１１８のディスプレイ等に表示される画面である。表示画面１３００中のドリフト補正ウィンドウ１３０１で「Drift detection point」と示した項目は、スタート時の基準物質からの信号値から例えば90％を下回った時にドリフトと認識する値を設定する項目である。ドリフトを検知した時、まず初めにＺ軸のドリフトを検知する基準物質１１０６の信号を検出し、事前スキャン情報を元に、スタート時を同じ信号強度になる高さや傾きになるように補正する（１２０２）。これは、単純にＺ軸がドリフトしフォーカスがずれたことにより他の基準値からの信号値が変化してドリフトと認識していないかを確認する工程である。そのため、Ｚ軸基準物質からの信号強度に対するドリフトと認識する値を、図１３に示す様に「Z Drift detection point」として他の項目より厳しく例えば95％と設定してもよい。なお、表示画面１３００中の「Save」等の各種のボタン１３０２は、操作者が各種の操作に用いる。【００９１】
Ｚ軸を監視する基準物質１１０６の信号がスタートに戻った時、基準物質１１０４、１１０５の信号値が「Drift detection point」の値の範囲を超えていた場合にさらなる補正動作を行う。このとき、基準物質１１０４，１１０５全ての信号強度が増加もしくは減衰していた場合（１２０３）、順次、最も少ない移動量で少なくとも一つの対角対をなす基準物質がスタート時の信号強度になる位置を測定前にスキャンした情報からθを動かす。しかし、スタート時の信号強度になる位置が見当たらない場合は、θを動かし最も少ない移動量で少なくとも一つの対角対をなす基準物質が等しくなる位置に動かす。このとき、一回の補正動作で動ける移動量を図１３の「θ axis correction range」として設定してもよい。これは、１軸のみを大きく動かし過ぎることによって他の軸の補正が難しくなることを軽減するためである。【００９２】
θ軸の補正動作が完了したら、対角対を成す基準物質の信号が最もスタート時の信号強度から乖離している対の信号を用いてＸ軸もしくはＹ軸方向のドリフト補正を実施例４の手順に従い行う。ＸＹ軸もθ軸同様に一回の補正動作で動ける移動量を設定してもよい。ドリフト量が少ない場合、この時点で全ての基準物質からの信号強度がスタート時の強度に戻り、その結果ナノポアを通過する生体試料からの信号が常に制限された範囲で強い信号を得ることが可能になる。このとき、基準物質から得られるラマンスペクトルのピークがスタート時と同じ検出器の素子に無い場合は、検出器を同じ素子に照射されるように動かし波数校正する。もしくは、スタート時の基準物質から得られるラマンスペクトルのピークの検出器内の素子情報と補正後の位置情報から演算して波数校正してもよい。波数校正の為のスペクトル情報は、測定前の設定条件として基準物質の材質を選ぶように設定してもよい。材質の例としては、シリコン単結晶や酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトなどがある。【００９３】
ドリフト量が大きく、全ての基準物質からの信号強度がスタート時の強度に戻らなかった場合はもう一度θ軸の補正とＸＹ軸の補正を繰り返す。この時、繰り返す回数を指定してもよい。指定した回数以内にスタート時の信号強度もしくはドリフト検知と認識する信号強度を満たさない場合は警告を出し、再測定を促してもよい。もしくは単純に基準物質からの信号がある一定の値を下回った場合に警告を出し、再測定を促してもよい。これらの警告は、装置等へ想定外の衝突があった際の影響を受け大きくずれた場合の検出に効果的である。【００９４】
一方、装置架設後のスキャンが終え、測定を開始し、Ｚ軸補正を行い基準物質１１０６の信号がスタートに戻った時、基準物質１１０４、１１０５の信号値が「Drift detection point」の値の範囲を超えていた場合にさらなる補正動作を行う（１２０２）。このとき、基準物質１１０４，１１０５の信号強度が対角対を成す基準物質１１０４の二つもしくは基準物質の１１０５の二つが互いに増減が異なる場合（１２０４）、ＸＹ軸方向のドリフト量を測定前のスキャン結果を基にスタート時の信号強度になるように見積もり移動する。見積もった結果が、対角対に対をなす基準物質同士でドリフト量が異なる場合はθ軸方向のドリフトが想定されるため、対角対をなす基準物質同士の信号量が等しくなる位置にＸＹ軸補正する。ＸＹ軸補正後に、最も少ない移動量で少なくとも一つの対角対同士の基準物質がスタート時の信号強度になる位置にθを動かす。 
ドリフト量が少ない場合、この時点で全ての基準物質からの信号強度がスタート時の強度に戻り（１２０５）、その結果ナノポアを通過する生体試料からの信号が常に制限された範囲で強い信号を得る、スタート時に戻ることが可能になる。このとき、基準物質から得られるラマンスペクトルのピークがスタート時と同じ検出器の素子に無い場合は、検出器を同じ素子に照射されるように動かし波数校正する。もしくは、スタート時の基準物質から得られるラマンスペクトルのピークの検出器内の素子情報と補正後の位置情報から演算して波数校正してもよい（１２０６）。そして、ドリフト補正を完了する（１２０７）。【００９５】
ドリフト量が大きく、全ての基準物質からの信号強度がスタート時の強度に戻らなかった場合はもう一度θ軸の補正とＸＹ軸の補正を繰り返す。この時、繰り返す回数を指定してもよい。指定した回数以内にスタート時の信号強度もしくはドリフト検知と認識する信号強度を満たさない場合はアラームを出し（１２０８、１２０９）、再スキャンや再測定を促してもよい。もしくは単純に基準物質からの信号がある一定の値を下回った場合に警告を出し、再測定を促してもよい。これらの警告は、装置等へ想定外の衝突があった際の影響を受け大きくずれた場合の検出に効果的である。【００９６】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。【００９７】
更に、上述した各構成、機能、解析装置等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成することによりソフトウェアで実現する場合を例に説明してきたが、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良い。【００９８】
以上、本明細書において、種々の実施例に基づき、本発明の実施の態様を説明してきたが、以上の説明にあっては、特許請求の範囲に記載した発明のみならず、多くの発明が開示されている。それらの一部を例示すると以下の通りである。【００９９】
[例示１]
少なくとも一つ以上の励起光照射が可能な光学系と、
少なくとも一つ以上の励起光照射によって発する信号検出が可能な手段と、
測定試料の検出と共に基準物質の検出も同時に行い、基準物質から得られる信号により、測定試料が励起光を強く照射される位置を演算する位置演算手段とを備え、演算結果から測定試料の位置、もしくは光学系位置を所望の位置に補正する位置制御方法及び装置。【０１００】
[例示２]
例示１において、励起光照射によって発する信号がラマン散乱光あるいは蛍光である位置制御方法及び装置。【０１０１】
[例示３]
例示１において、少なくとも一つ以上の基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０２】
[例示４]
例示１において、励起光照射によって発する少なくとも一つ以上の基準物質のスペクトルを用いて検出器の位置または画像素子情報を補正する位置制御方法及び装置。【０１０３】
[例示５]
例示１において、試料より小さい基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０４】
[例示６]
例示１において、試料より小さい励起光スポット径を基準物質に照射し、基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０５】
[例示７]
例示１において、試料より短い波長の励起光を用いて、試料より小さい励起光スポット径を基準物質に照射し、基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０６】
[例示８]
例示１において、励起光スポット径が試料及び基準物質より小さい時、基準物質への励起光スポット径が試料への励起光スポット径より大きく、基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０７】
[例示９]
例示１において、シリコン単結晶、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトである基準物質からの信号を検出する位置制御方法及び装置。【０１０８】
[例示１０]
例示１において、試料として生体分子を解析する位置制御方法及び装置。【０１０９】
[例示１１]
例示１において、試料及び基準物質の位置と励起スポット位置を駆動手段を備え、
駆動手段を用いてスキャンを行い、位置演算手段の演算結果から測定試料の位置、もしくは光学系位置を所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１０】
[例示１２]
例示１１において、温度変化を検出と同時に、試料及び基準物質の位置と励起スポット位置を駆動手段によりスキャンを行い、温度変化の検出を持って試料の位置、もしくは光学系位置を所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１１】
[例示１３]
例示１において、基準物質の信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、測定試料の位置、もしくは光学系位置を所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１２】
[例示１４]
例示１３において、事前に取得した基準物質の位置と信号強度の情報と基準物質の信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、測定試料の位置、もしくは光学系位置を所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１３】
[例示１５]
例示１において、試料と位置が合わさった励起スポット位置とずれた位置に配置される基準物質を用いて、所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１４】
[例示１６]
例示１において、試料と焦点位置が異なる基準物質を用いた、所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１５】
[例示１７]
例示１において、基準物質測定光軸上に設けるピンホールを試料測定光軸上に設けるピンホールより小さい装置。【０１１６】
[例示１８]
例示１において、基準物質が直方体である所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１７】
[例示１９]
例示１において、少なくとも２つ直方体基準物質の長辺が直交する直線状に存在し、所望の位置に補正する制御方法及び装置。【０１１８】
[例示２０]
例示１において、基準物質がプラズモン共鳴である方法及び装置。
【符号の説明】
【０１１９】
１００  ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置
１０１  光源
１０２、２１８  対物レンズ
１０３  顕微鏡観察容器
１０４  ＸＹステージ
１０５  Ｚ軸調整機構
１０６  フィルタ
１０７  ビームスプリッター
１０８  回折格子
１０９  検出器
１１０  ＬＥＤ
１１１  ２次元検出器
１１２  ミラー
１１３  多重照射機構
１１４  レンズ
１１５  駆動制御部
１１６  コンピュータ
１１７  ＮＩＲ（近赤外）ミラー
１１８  解析装置
２０１  観察容器
２０２、３０２、４０２、７０２、９０４、１１０２  ナノポア
２０３、３０１  基板
２０４  試料導入区画
２０５  試料流入区画
２０６、２０７  流入路
２０８、２０９  流出路
２１０、２１１  液体
２１３  試料
２１４、２１５  電極
２１６  導電性薄膜
２１７  液浸媒体
３０２  ナノポア
３０３、４０３、７０３、９０３、１１０３  導電性薄膜
４０１、７０１、９０１、１０００、１１００  マルチナノポア基板
４０４、４０５、４０６、７０４、７０５、７０６、９０２、９０３、１００１、
１００２、１００４−１００６  基準物質
９０１  励起光が基板に照射する位置
１００３、１１０１  励起光が基板に照射する位置
１３００  表示画面
１３００  ドリフト補正ウィンドウ
【図１】
2016059703.tif 000003
【図２】
2016059703.tif 000004
【図３】
2016059703.tif 000005
【図４Ａ】
2016059703.tif 000006
【図４Ｂ】
2016059703.tif 000007
【図５】
2016059703.tif 000008
【図６】
2016059703.tif 000009
【図７】
2016059703.tif 000010
【図８】
2016059703.tif 000011
【図９】
2016059703.tif 000012
【図１０】
2016059703.tif 000013
【図１１】
2016059703.tif 000014
【図１２】
2016059703.tif 000015
【図１３】
2016059703.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月25日(2015.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、
前記励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、
少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象が設置される基板と、
前記ナノポアに位置する測定試料と、前記基準対象に前記励起光を同時に照射し、前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料に前記励起光が照射される位置を演算し、当該演算結果に基づき前記測定試料に対する励起光照射の位置を制御する位置制御部と、を備え、
前記励起光照射の位置制御を行いながら、前記測定試料に対する測定を行い、
前記測定試料に対する測定を行いながら、
前記励起光照射によって発する前記基準対象のスペクトルを用いて、前記検出器の位置または前記検出器の画像素子の情報を補正する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項２】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記励起光照射によって発する信号が、ラマン散乱光或いは蛍光である、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記基準対象の径は前記測定試料より小さい、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項５】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記測定試料に照射する前記励起光のスポット径より小さいスポット径の励起光を前記基準対象に照射する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項６】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記励起光のスポット径が前記測定試料及び前記基準対象の径より小さい時、
前記基準対象への前記励起光のスポット径を、前記測定試料への前記励起光のスポット径より大きくする、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項７】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記測定試料は生体分子であり、
前記基準対象はシリコン単結晶、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化チタン、シリコンカーバイトを用いて構成される、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項８】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射される位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項９】
請求項８に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
所定の温度変化の検出により、前記励起光のスポット位置のスキャンを開始して、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、
事前に取得した前記基準対象の位置と信号強度の情報と、前記基準対象から得られる前記信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、前記励起光のスポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１１】
基板上の少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象に対し、励起光の照射を同時に行い、
検出器で検出される前記基準対象から発生する信号に基づき、前記ナノポアに位置する測定試料に前記励起光が照射される位置を演算し、当該演算結果に基づき前記測定試料に対する励起光照射の位置を制御しながら、前記測定対象の測定を行い、
前記測定試料に対する測定を行いながら、
事前に取得した前記基準対象の位置と信号強度の情報と、前記基準対象から得られる前記信号の増減からドリフト量及びドリフト方向を演算し、前記励起光のスポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記励起光照射によって発する信号が、ラマン散乱光或いは蛍光である、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射される位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の定位置制御方法であって、
所定の温度変化の検出により、前記励起光のスポット位置のスキャンを開始して、前記スポット位置を所望の位置に制御する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
複数の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、
前記励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、
少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象が設置される基板と、
前記ナノポアに位置する測定試料と、前記基準対象に前記励起光を同時に照射し、前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料に前記励起光が照射される位置を演算し、当該演算結果に基づき前記測定試料に対する励起光照射の位置を制御する位置制御部と、を備え、
前記励起光照射の位置制御を行いながら、前記測定試料に照射する前記励起光のスポット径より小さいスポット径の励起光を前記基準対象に照射し、
前記測定試料に対する測定を行う、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１７】
複数の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、
前記励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、
少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象が設置される基板と、
前記ナノポアに位置する測定試料と、前記基準対象に前記励起光を同時に照射し、
前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射する位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する位置制御部と、を備え、
前記励起光照射の位置制御を行いながら、前記測定試料に対する測定を行う、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１８】
複数の励起光の照射が同時に可能な照射光学系と、
前記励起光照射によって照射位置から発生する信号の検出を行う検出器と、
少なくとも一つのナノポアと少なくとも一つ基準対象が設置される基板と、
前記ナノポアに位置する測定試料と、前記基準対象に前記励起光を同時に照射し、
所定の温度変化の検出により、前記測定試料及び前記基準対象の位置に対して、前記励起光のスポット位置をスキャンし、
前記基準対象から得られる前記信号により、前記測定試料が励起光を強く照射される位置を演算し、演算結果から前記測定試料に対する前記スポット位置を所望の位置に制御する位置制御部と、を備え、
前記励起光照射の位置制御を行いながら、前記測定試料に対する測定を行う、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項１９】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、前記測定試料と位置が合わさった前記励起光のスポット位置とずれた位置に配置される前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
こと特徴とする定位置制御装置。
【請求項２０】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記位置制御部は、前記測定試料と焦点位置が異なる前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項２１】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記基準対象の測定光軸上に設けるピンホールを、前記測定試料の測定光軸上に設けるピンホールより小さくする、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項２２】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記基準対象が直方体である、
ことを特徴とする定位置制御装置。
【請求項２３】
請求項１に記載の定位置制御装置であって、
前記基準対象が直方体であり、
前記位置制御部は、前記測定試料と位置が合わさった前記励起光のスポット位置とずれた位置に中心が配置される直方体の前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
ことを特緒とする定位置制御装置。
【請求項２４】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって
前記基準対象の径は前記測定試料より小さい、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項２５】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記測定試料と位置が合わさった前記励起光のスポット位置とずれた位置に配置される前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
こと特徴とする定位置制御方法。
【請求項２６】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記測定試料と焦点位置が異なる前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項２７】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記基準対象の測定光軸上に設けるピンホールを、前記測定試料の測定光軸上に設けるピンホールより小さくする、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項２８】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記基準対象が直方体である、
ことを特徴とする定位置制御方法。
【請求項２９】
請求項１１に記載の定位置制御方法であって、
前記基準対象が直方体であり、
前記位置制御部は、前記測定試料と位置が合わさった前記励起光のスポット位置とずれた位置に中心が配置される直方体の前記基準対象を用いて、前記励起光のスポット位置を補正する、
ことを特緒とする定位置制御方法。
【国際調査報告】
2016059703.tif 000017
2016059703.tif 000018
2016059703.tif 000019
2016059703.tif 000020