(57)【要約】  本発明は、骨形成促進作用と軟骨細胞増殖促進作用を併せ持つ新規なペプチドを提供するために、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が１００以下であり、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドもしくはその誘導体またはその塩を提供する。（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸の保存的置換または欠失を有するアミノ酸配列（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が１００以下であり、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸の保存的置換または欠失を有するアミノ酸配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
【請求項２】
少なくとも１つのリン酸化セリンを有する請求項１に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
【請求項３】
リポビテリン１のフラグメントである請求項１または２に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
【請求項４】
さらに、軟骨細胞増殖促進活性および／またはヒアルロン酸産生促進活性を有する請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
【請求項５】
以下の（ｉ）〜（ｖｉ）から選択されるアミノ酸配列からなる請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
（ｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号２）
（ｉｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号３）
（ｉｖ）Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号４）
（ｖ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号５）
（ｖｉ）Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号６）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項１０】
骨芽細胞増殖促進作用を有する請求項９に記載の骨形成促進剤。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする骨吸収抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする軟骨前駆細胞分化誘導剤。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする間葉系幹細胞増殖促進剤。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする間葉系幹細胞分化誘導剤。
【請求項１７】
経口投与用である請求項９〜１６のいずれかに記載の剤。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする医薬。
【請求項１９】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項２１】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である請求項２０に記載の飲食品。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とするサプリメント。
【請求項２３】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である請求項２２に記載のサプリメント。
【請求項２４】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする食品添加物。
【請求項２５】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である請求項２４に記載の食品添加物。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする化粧品。
【請求項２７】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である請求項２６に記載の化粧品。
【請求項２８】
哺乳動物に対して請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
【請求項２９】
哺乳動物に対して請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする軟骨障害または関節疾患の予防または改善方法。
【請求項３０】
骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善において使用する請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩。
【請求項３１】
骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善のための、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
【請求項３２】
骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用の医薬を製造するための、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチド、当該ペプチドを含有する骨形成促進剤、骨吸収抑制剤、軟骨細胞増殖促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、軟骨前駆細胞分化誘導剤、間葉系幹細胞増殖促進剤、間葉系幹細胞分化誘導剤、並びにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量または骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折のリスクが高まった全身性疾患である。日本では骨粗鬆症の患者は約１，１００万人と言われており、その８割は女性である。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の高齢化に伴い今後患者数が増加すると推測される。また、近年、小中学生の骨折率が増加しており、骨粗鬆症を予防するという見地からも若年期にしっかりと骨塩量を高めて、より高い最大骨量を得ることは非常に重要である。このように、今や骨の健康を保つことは性別や年齢に関係なく全社会的な関心事である。【０００３】
従来、骨の疾患を予防あるいは治療する方法として、食餌療法によるカルシウム補給、軽い運動、日光浴、薬物治療等が行われている。食餌療法によるカルシウム補給としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や、牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、溶解性や吸収性、呈味性の点で必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。適度な運動は骨量を増やし、骨を強化するので、散歩やウオーキングは骨の健康によいとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものである。まして寝たきりの老人ではほとんど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３の補給と言う点ではよいとされているが、これだけでは不十分である。【０００４】
一方、各種軟骨疾患の予防および治療の過程においては、軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要である。すなわち、軟骨細胞の増殖、成熟化が骨の正常な成長や骨折した場合の修復をもたらすものと考えられている。軟骨細胞の増殖を誘導する因子としては、ＴＧＦ−β１（Transforming Growth Factor：形質転換増殖因子）、ＩＧＦ−１（Insulin-like Growth Factor：インスリン様成長因子）、ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor：塩基性繊維芽細胞成長因子）、ＰＴＨｒＰ（PTH-related peptide：副甲状腺ホルモン関連タンパク）、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor：肝細胞増殖因子）、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）等が報告されている。しかし、安全性、安定性、有効性に優れた軟骨細胞増殖促進薬の臨床的応用は確立されていない。【０００５】
軟骨疾患の中でも、最も患者数の多い疾患は変形性関節症である。原因の一つとして加齢が考えられ、これからの高齢化社会においては本症例の増加が予想される。関節疾患など軟骨の変性を主病変とする軟骨障害の予防と治療には、従来、エストロゲン、カルシトニンなどの骨吸収抑制物質、アスピリンや非ステロイド性消炎剤（ＮＳＡＩＤ）が主に使用されてきたが、十分な効果が得られていないばかりか、消化管障害などの有害作用はよく知られている。それゆえ、軟骨損傷や軟骨障害の治療において安全に用いられる予防または改善剤が強く求められている。【０００６】
本発明者らは、少なくともＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列を含む卵黄由来のペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有すること（特許文献１参照）、卵黄タンパク質加水分解物が軟骨細胞増殖促進活性を有すること（特許文献２参照）を見出し、特許出願している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−２１１９７９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／００７３１８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、骨形成促進作用と軟骨細胞増殖促進作用を併せ持つ新規なペプチドを提供すると共に、当該ペプチドを利用する優れた用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が１００以下であり、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸の保存的置換または欠失を有するアミノ酸配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
［２］少なくとも１つのリン酸化セリンを有する前記［１］に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
［３］リポビテリン１のフラグメントである前記［１］または［２］に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
［４］さらに、軟骨細胞増殖促進活性および／またはヒアルロン酸産生促進活性を有する前記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
［５］以下の（ｉ）〜（ｖｉ）から選択されるアミノ酸配列からなる請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
（ｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号２）
（ｉｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号３）
（ｉｖ）Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号４）
（ｖ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号５）
（ｖｉ）Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号６）
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［７］前記［６］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［８］前記［７］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
［９］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする骨形成促進剤。
［１０］骨芽細胞増殖促進作用を有する前記［９］に記載の骨形成促進剤。
［１１］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする骨吸収抑制剤。
［１２］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤。
［１３］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
［１４］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする軟骨前駆細胞分化誘導剤。
［１５］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする間葉系幹細胞増殖促進剤。
［１６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする間葉系幹細胞分化誘導剤。
［１７］経口投与用である前記［９］〜［１６］のいずれかに記載の剤。
［１８］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする医薬。
［１９］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である前記［１８］に記載の医薬。
［２０］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする飲食品。
［２１］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である前記［２０］に記載の飲食品。
［２２］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とするサプリメント。
［２３］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である前記［２２］に記載のサプリメント。
［２４］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする食品添加物。
［２５］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である前記［２４］に記載の食品添加物。
［２６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を含有することを特徴とする化粧品。
［２７］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用である前記［２６］に記載の化粧品。
［２８］哺乳動物に対して前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
［２９］哺乳動物に対して前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする軟骨障害または関節疾患の予防または改善方法。
［３０］骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善において使用する前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩。
［３１］骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善のための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
［３２］骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用の医薬を製造するための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、骨形成促進作用と軟骨細胞増殖促進作用を併せ持つ新規なペプチドを提供することができる。当該ペプチドは、経口摂取により骨形成を促進できるので、骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節痛の予防・改善用の医薬、飲食品、サプリメント、食品添加物、化粧品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】卵黄タンパク加水分解物を分画分子量１ｋＤａのＵＦ膜で分画し、それぞれの画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図２】卵黄タンパク加水分解物の分子量１ｋＤａ以上の画分を陰イオン交換カラムに供し、非吸着画分（素通り）、各塩化ナトリウム濃度（７５０ｍＭ、１Ｍ）で溶出して得られた画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図３】強い骨芽細胞増殖活性が認められた７５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分について逆相ＨＰＬＣを行って分取した画分を示す図である。
【図４】図３に示された、Ｇ１〜Ｇ９それぞれの骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図５】Ｇ３およびＧ４中のフラクション１１〜２０の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図６】フラクション１２についてさらに異なる条件でＨＰＬＣを行い、検出されたピークを示す図である。
【図７】図６に示された２つのピークをそれぞれ含む画分を分取し、骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図８】解析の結果明らかとなったペプチドの構造を示す図である。
【図９】合成ペプチド（Ｎｏ．１）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１０】合成ペプチド（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１１】合成ペプチド（Ｎｏ．４およびＮｏ．５）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１２】合成ペプチド（Ｎｏ．６）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１３】合成ペプチド（Ｎｏ．１）を経口投与したラットの脛骨成長板の伸長幅を測定した結果を示す図である。
【図１４】合成ペプチド（Ｎｏ．１およびＮｏ．６）について軟骨細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１５】合成ペプチド（Ｎｏ．１およびＮｏ．６）についてヒアルロン酸産生促進活性を測定した結果を示す図である。
【図１６】実施例１４の実験プロトコールを示す図である。
【図１７】合成ペプチド投与群について一日あたりの成長軟骨伸長速度（長軸方向）を計測した結果を示す図である。
【図１８】合成ペプチド投与群について一次海綿骨の形成を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す図である。
【図１９】合成ペプチド投与群について血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度増加を確認した結果を示す図である。
【図２０】実施例１５の実験プロトコールを示す図である。
【図２１】合成ペプチド投与群について一日あたりのラット脛骨成長幅を算出した結果を示す図である。
【図２２】合成ペプチド投与群についてラット骨組織あたりの二次海綿骨の骨量を測定した結果を示す図である。
【図２３】合成ペプチド投与群について骨芽細胞の局在する骨面の総骨面に対する割合を測定した結果を示す図である。
【図２４】合成ペプチド投与群について破骨細胞の局在する骨面の総骨面に対する割合を測定した結果を示す図である。
【図２５】実施例１６の実験プロトコールを示す図である。
【図２６】合成ペプチド投与群について一日あたりのラット二次海綿骨石灰化速度を算出した結果を示す図である。
【図２７】合成ペプチド投与群について骨芽細胞が局在する骨面の総骨面に対する割合を測定した結果を示す図である。
【図２８】合成ペプチド投与群についてラット骨組織あたりの骨芽細胞数を測定した結果を示す図である。
【図２９】合成ペプチド投与群について骨形成速度を算出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔ペプチド〕
本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドを提供する。
本発明者らは、卵黄タンパク質を加水分解したペプチド混合物から、強い骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドの同定を試み、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の各アミノ酸配列からなるペプチドを単離した。（ｉｉ）〜（ｖｉ）の各アミノ酸配列は、（ｉ）のアミノ酸配列に含まれる部分配列であった。
（ｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号２）
（ｉｉｉ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号３）
（ｉｖ）Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号４）
（ｖ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号５）
（ｖｉ）Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号６）
【００１３】
本発明のペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドである。
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸の保存的置換または欠失を有するアミノ酸配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
【００１４】
本発明のペプチドは、上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列のみからなるペプチドでもよく、上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列およびそれ以外のアミノ酸配列からなるペプチドでもよい。（ａ）、（ｂ）または（ｃ）以外のアミノ酸配列を含む場合、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）以外のアミノ酸配列はペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有する限り特に限定されない。例えば、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）以外のアミノ酸配列として、タグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなど）を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明のペプチドのアミノ酸残基数は特に限定されないが、１０００以下が好ましく、５００以下がより好ましく、２００以下がさらに好ましく、１００以下がさらに好ましく、８０以下がさらに好ましく、７０以下がさらに好ましく、６０以下がさらに好ましく、５０以下がさらに好ましく、４０以下がさらに好ましく、３０以下がさらに好ましく、２０以下がさらに好ましく、１５以下が特に好ましい。骨芽細胞増殖促進活性を有する限り、下限は特に限定されないが、３以上が好ましく、４以上がより好ましく、５以上がさらに好ましい。
【００１６】
ホモロジー検索の結果、配列番号１のアミノ酸配列は、卵黄に含まれる前駆タンパク質の一種であるビテロジェニン２のアミノ酸配列（配列番号７）の第１０６０位−第１０７４位であることが明らかとなった。したがって、本発明のペプチドは、ビテロジェニン２の第１０６０位−第１０７４位の中の少なくとも４つの連続するアミノ酸を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するビテロジェニン２のフラグメントであることが好ましい。
【００１７】
ここで、ビテロジェニン２は卵黄に含まれる前駆タンパク質であり、リポビテリン１（Lipovitellin-1）、ホスビチン（Phosvitin）、リポビテリン２（Lipovitellin-2）およびＹＧＰ４０（yolk glycoprotein of 40 kDa）の４つの卵黄タンパク質に切断されることが知られている（DATABASE UniProt: P02845 (VIT2_CHICK)参照）。ビテロジェニン２の第１０６０位−第１０７４位はリポビテリン１のアミノ酸配列（配列番号８）の第１０４５位−第１０５９位該当する。したがって、本発明のペプチドは、リポビテリン１の第１０４５位−第１０５９位の中の少なくとも４つの連続するアミノ酸を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するリポビテリン２のフラグメントであることが好ましい。
【００１８】
本発明のペプチドとしては、上記（ｉ）〜（ｖｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
【００１９】
本明細書において「アミノ酸の保存的置換」とは、以下の表１の各群内におけるアミノ酸間の置換をいう。この中で、好ましいアミノ酸の保存的置換としては、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、グリシンとアラニンとの間での置換等が挙げられる。
【００２０】
【表１】
2015129726.tif 000002
【００２１】
本発明のペプチドの誘導体は、特定のアミノ酸配列で示されるペプチドのＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ１−６アルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ１−６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドの誘導体に含まれる。
【００２２】
本発明のペプチドの誘導体には、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
【００２３】
本発明のペプチドの誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されていてもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基などが挙げられる。また、側鎖の置換基は、保護基で保護されていてもよい。さらに、糖鎖が結合した糖ペプチドも本発明のペプチドの誘導体に含まれる。
【００２４】
本発明のペプチドまたはその誘導体は塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、Ｄ−アミノ酸を含んでもよく、非天然アミノ酸を含んでもよい。また、本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに他の物質を連結してもよい。ペプチドに連結可能な他の物質としては、例えば、他のペプチド、脂質、糖または糖鎖、アセチル基、天然または合成のポリマー等が挙げられる。また、本発明のペプチドは、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに、糖鎖付加、側鎖酸化、リン酸化等の修飾を行ってもよい。
【００２６】
本発明のペプチドその誘導体またはその塩は、少なくとも１つのリン酸化セリンを有していることが好ましい。リン酸化セリンの位置は特に限定されないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第５位、第１１位および第１２位のセリン残基の少なくとも１つがリン酸化されていることが好ましく、第５位および第１１位の少なくとも１つがリン酸化されていることがより好ましく、第５位および第１１位の両方がリン酸化されていることがさらに好ましい。セリンがリン酸化されることにより、骨化細胞の増殖促進作用が増強されることが確認されている。
【００２７】
本発明のペプチド誘導体としては、配列番号９〜１４に示されたアミノ酸配列からなるリン酸化セリンを有するペプチドが好ましい（図１０参照）。
【００２８】
本発明のペプチドその誘導体またはその塩（以下、これらを単に「本発明のペプチド」と記す。）は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、本発明のペプチドを一部に含むペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼで切断することによって製造することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により製造することができる。
【００２９】
また、本発明のペプチドは、鶏の卵黄タンパク質の加水分解物から精製して取得することができる。卵黄タンパク質の加水分解物の調製方法、ペプチドの精製方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、脱脂卵黄粉末を調製し、プロテアーゼ等の酵素を用いて加水分解物を調製し、限外濾過、ＨＰＬＣ等の各種クロマトグラフィーを用いて目的のペプチドを精製する方法などが挙げられる。
【００３０】
得られたペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有することは、細胞増殖を測定する公知の方法から適宜選択した試験系において骨芽細胞を使用し、ペプチドを添加した場合とペプチドを添加していない場合とを比較して、ペプチドを添加した場合の方が骨芽細胞の増殖レベルが高いことを確認すればよい。例えば、骨芽細胞由来の細胞株を用いる細胞培養系において、ＭＴＴアッセイやセルカウント法を用いる方法が挙げられる。
【００３１】
得られたペプチドが軟骨細胞増殖促進活性を有することは、細胞増殖を測定する公知の方法から適宜選択した試験系において軟骨細胞または軟骨前駆細胞を使用し、ペプチドを添加した場合とペプチドを添加していない場合とを比較して、ペプチドを添加した場合の方が骨芽細胞の増殖レベルが高いことを確認すればよい。例えば、骨芽細胞由来の細胞株を用いる細胞培養系において、ＭＴＴアッセイやセルカウント法を用いる方法が挙げられる。
【００３２】
得られたペプチドがヒアルロン酸産生促進活性を有することは、ヒアルロン酸産生能を有する培養細胞を用いて、培地にペプチドを添加した場合とペプチドを添加していない場合の培養上清中のヒアルロン酸量を公知の方法で測定、比較し、ペプチドを添加した場合の方が培養上清中のヒアルロン酸量が高いことを確認すればよい。ヒアルロン酸量の測定方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００３３】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡと ＲＮＡとのハイブリッドのいずれであってもよい。一本鎖の場合は、コード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３４】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して組み合わせることにより任意にデザインすることができる。また、配列番号１のアミノ酸配列は、上述のように卵黄に含まれる前駆タンパク質の一種であるビテロジェニン２のアミノ酸配列（配列番号７）の一部であるので、ビテロジェニン２をコードする遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法やＰＣＲ法等によって取得することができる。具体的には、例えば、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して塩基配列をデザインし、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すればよい。また、ビテロジェニン２をコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｘ１３６０７）中の本発明のペプチドをコードする領域を増幅するためのプライマーを設計し、これらプライマーを用いてニワトリゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことにより、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００３６】
〔発現ベクター〕
本発明は、上記本発明のペプチドを製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のペプチドを回収、精製することができる。
【００３７】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明のペプチドを融合ペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明のペプチドをＧＦＰ融合ペプチドとして発現させてもよい。
【００３８】
宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００３９】
〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。
【００４０】
〔骨形成殖促進剤、骨吸収抑制剤、軟骨細胞増殖促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、軟骨前駆細胞分化誘導剤、間葉系幹細胞増殖促進剤、間葉系幹細胞分化誘導剤〕
本発明は、本発明のペプチドを含有する骨形成促進剤を提供する。本発明のペプチドは骨形成促進活性を有するため、骨形成促進剤の有効成分として好適に用いることができる。本発明のペプチドが骨形成促進活性を有することは、例えば、被験動物に本発明のペプチドを一定期間（例えば、７、１４、２１日間等）投与し（例えば、経口投与等）、その後、脛骨成長板の伸長幅の増加、成長軟骨の伸長速度の増大、一次海綿骨の形成促進、血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度の増加、骨組織あたりの二次海綿骨の骨量の増大、骨芽細胞の増加、破骨細胞の減少、二次海綿骨石灰化速度の増大等を指標にして確認することができる。ここで、成長軟骨とは、例えば骨端にある骨の伸長部位のことをいう。一次海綿骨とは、例えば成長軟骨の直下にある未熟な海綿骨をいう。二次海綿骨とは、例えば成熟した海綿骨をいう。すなわち、本発明において「骨形成促進」は、「脛骨成長板の伸長幅の増加」、「成長軟骨の伸長速度の増大」、「一次海綿骨の形成促進」、「血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度の増加」、「骨組織あたりの二次海綿骨の骨量の増大」、「骨芽細胞の増加」、「破骨細胞の減少」、「二次海綿骨石灰化速度の増大」等を言い換えることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する骨芽細胞増殖促進剤を提供する。本発明のペプチドは骨芽細胞増殖促進活性を有するため、骨芽細胞増殖促進剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する骨吸収抑制剤を提供する。本発明のペプチドは骨吸収抑制活性を有するため、骨吸収抑制剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する軟骨細胞増殖促進剤を提供する。本発明のペプチドは軟骨細胞増殖促進活性を有するため、軟骨細胞増殖促進剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有するヒアルロン酸産生促進剤を提供する。本発明のペプチドはヒアルロン酸産生促進活性を有するため、ヒアルロン酸産生促進剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する軟骨前駆細胞分化誘導剤を提供する。本発明のペプチドは軟骨前駆細胞分化誘導活性を有するため、軟骨前駆細胞分化誘導剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する間葉系幹細胞増殖促進剤を提供する。本発明のペプチドは間葉系幹細胞増殖促進活性を有するため、間葉系幹細胞増殖促進剤の有効成分として好適に用いることができる。また、本発明は、本発明のペプチドを含有する間葉系幹細胞分化誘導剤を提供する。本発明のペプチドは間葉系幹細胞分化誘導活性を有するため、間葉系幹細胞分化誘導剤の有効成分として好適に用いることができる。
【００４１】
上記各剤の有効成分として、本発明のペプチド以外に、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩も好適に用いることができる。本明細書においてリポビテリン１は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなり、リポビテリン１と実質的に同質の活性を有するタンパク質を意味する。配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。また、実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４２】
リポビテリン１の誘導体としては、上述の本発明のペプチドの誘導体の説明において例示した各種誘導体が好ましい。また、リポビテリン１またはその誘導体の塩としては、上述の本発明のペプチドまたはその誘導体の塩の説明において例示した各種塩が好ましい。
リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩は、公知の遺伝子組み換え技術を用いて組換えタンパク質として製造することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により製造することができる。また、鶏の卵黄タンパク質から精製することができる。
以下、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩も含めて「本発明のペプチド等」と記す。
【００４３】
本発明のペプチド等は、哺乳動物への経口投与により目的の効果を奏することが確認されているので、これらの剤は、経口投与用の剤として好適に実施することができる。また、本発明のペプチド等は、卵黄タンパク質であるリポビテリン１またはそのフラグメントであるため、安全性が高く、作用がマイルドであり長期間の摂取または使用が可能である。
【００４４】
〔医薬〕
本発明は、本発明のペプチド等を含有する医薬を提供する。本発明のペプチド等は、骨芽細胞増殖促進活性を有するため、骨形成促進用の医薬として使用することができる。本発明の骨形成促進用医薬は、例えば骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、グルココルチコイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、骨折、腰痛等の予防または治療用医薬として好適に使用することができる。
また、本発明のペプチド等は、軟骨細胞増殖促進活性および／またはヒアルロン酸産生促進活性を有するため、軟骨障害または関節疾患の予防または改善用の医薬として使用することができる。軟骨障害としては、例えば変形性関節症、軟骨の欠損、軟骨損傷、半月板損傷などが挙げられる。関節疾患としては、関節痛、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、化膿性関節炎、痛風性関節炎、外傷性関節炎、骨関節炎などが挙げられる。
【００４５】
本発明の医薬は、本発明のペプチド等を有効成分とし、医薬製剤の製造法として公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例、速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤）、エアゾール剤、フィルム剤（例、口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム）、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例、肛門坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の経口剤または非経口剤が挙げられる。担体または添加剤の配合割合については、医薬分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００４６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００４７】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明の医薬は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、本発明のペプチド等を製剤全量に対して通常０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１〜９５％（ｗ／ｗ）の割合で添加することにより、常法に従って製造することができる。
投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜５００ｍｇである。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００４８】
本発明の医薬は、他の骨疾患治療用医薬、他の軟骨または関節疾患治療用医薬と組み合わせて使用することにより、相加的または相乗的な効果の向上が期待できる。他の骨形成促進用医薬としては、例えば活性型ビタミンＤ３製剤、ビタミンＫ２製剤、副甲状腺ホルモン製剤（テリパラチド）、女性ホルモン製剤（エストロゲン）、ビスフォスフォネート製剤、ＳＥＲＭ（塩酸ラロキシフェン）、カルシトニン製剤などが挙げられる。他の軟骨または関節疾患治療用医薬としては、例えばグルコサミン、コンドロイチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、Ｎ−アセチルグルコサミン等が挙げられる。
【００４９】
〔飲食品〕 
本発明は、本発明のペプチド等を含有する飲食品を提供する。本発明の飲食品は、骨形成促進用飲食品として、また、軟骨障害または関節疾患の予防・改善用飲食品として好適である。
飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品が含まれる。飲食品の形態は特に限定されない。例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。
【００５０】
本発明は、本発明のペプチド等を含有するサプリメントを提供する。本発明のサプリメントは、骨形成促進用サプリメントとして、また、軟骨障害または関節疾患の予防・改善用サプリメントとして好適である。サプリメントは、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等の形態で提供することができる。
【００５１】
本発明は、本発明のペプチド等を含有する食品添加物を提供する。本発明の食品添加物は、骨形成促進用食品添加物として、また、軟骨障害または関節疾患の予防・改善用食品添加物として好適である。本発明の食品添加物の形態は特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等が挙げられる。本発明の食品添加物は、一般的な食品添加物の製造方法に準じて製造することができる。
さらに、本発明のペプチド等を含有する飼料または飼料添加物としても実施することができる。
【００５２】
本発明は、本発明のペプチド等を含有する化粧品を提供する。本発明の化粧品は、骨形成促進用化粧品として、また、軟骨障害または関節疾患の予防・改善用化粧品として好適である。化粧品には、いわゆる薬用化粧品（医薬部外品）が含まれる。化粧品としては、例えば、洗浄剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーローション、アフターシェーブローション、ボディーローション、化粧ローション、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、エモリエントクリーム、エアゾール製品、消臭剤、芳香剤、脱臭剤または入浴剤などを挙げることができる。本発明の化粧品は、本発明のペプチド以外に化粧品として一般に使用されている成分、例えば、界面活性剤、保湿剤、動植物由来油脂、シリコーン類、高級アルコール、低級アルコール、動植物由来抽出エキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、着色剤、各種香料などを目的に応じて適宜配合することができる。
【００５３】
本発明には、さらに以下の発明が含まれる。
（ａ）骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用の医薬を製造するための、上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
（ｂ）骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善のための、上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩。
（ｃ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
（ｄ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする軟骨障害または関節疾患の予防または改善方法。
（ｅ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を経口的に摂取させることを特徴とする非治療的な骨形成促進方法。
（ｆ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩を、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩を経口的に摂取させることを特徴とする非治療的な軟骨障害または関節疾患の予防または改善方法。
（ｇ）骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善において使用する上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩。
（ｈ）骨形成促進、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善のための、上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
（ｉ）骨形成促進用、または、軟骨障害もしくは関節疾患の予防もしくは改善用の医薬を製造するための、上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩、または、リポビテリン１もしくはその誘導体またはその塩の使用。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５５】
〔実施例１：卵黄タンパク加水分解物中の骨芽細胞増殖促進活性成分の同定〕
（１）卵黄タンパク加水分解物の調製
脱脂卵黄粉末（キューピー株式会社製）１００質量部に、水５００質量部を加えて均一に撹拌した後、商品名「アルカラーゼ」（Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼ、ノボザイムズ・ジャパン株式会社製）５質量部を加え、ｐＨ７で５５〜６０℃にて３時間反応させた。反応終了後、９０℃で１０分間の熱処理により酵素を失活させてから、濾過を行い、濾液を回収した。濾液をスプレー乾燥して、卵黄タンパク加水分解物を得た。
なお、脱脂卵黄粉末は、市販の卵黄粉末（例えば、キユーピー株式会社製）から調製してもよい。具体的には、市販の卵黄粉末１質量部に、エタノール（またはｎ−ヘキサン）５〜１０質量部を加え、ブレンダーで３０分間程度撹拌した後、濾過して固形物を回収する。この操作を３回ほど繰り返して卵黄から脱脂を行う。脱脂した卵黄を風乾することにより脱脂乾燥粉末を調製することができる。【００５６】
（２）骨芽細胞増殖活性の測定方法
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ Ｓｕｂｃｌｏｎｅ−４（ATCC No.CRL-2593）を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を、上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（1×104個/mL）を調製した。この細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で前培養した。翌日、Ｃａ濃度が５００μｇ／ｍＬになるようにＣａＣｌ２を添加したα−ＭＥＭ培養液９５０μＬにサンプルまたはＰＢＳ（−）を５０μＬ加えてよく混和した培養液に交換し、更に７２時間培養した。骨芽細胞の増殖活性は、セルカウント法にて測定した。サンプルの骨芽細胞増殖促進活性は、ＰＢＳ（−）の増殖値を１００としたときの相対値で表した。【００５７】
（３）ＵＦ膜による分画
卵黄タンパク加水分解物６０ｇを水６００mＬに溶解し、ＵＦ膜（分画分子量：１ｋＤａ、日本ミリポア株式会社製）を用いて分画し、分子量１ｋＤａ以下の画分と分子量１ｋＤａ以上の画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。分子量１ｋＤａ以下の画分と分子量１ｋＤａ以上の画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物０．２ｍｇ相当量）を添加した。
結果を図１に示した。図１から明らかなように、分子量１ｋＤａ以上の画分に骨芽細胞増殖活性が認められた。【００５８】
（４）陰イオン交換カラムによる分画
上記（３）で骨芽細胞増殖活性が認められた分子量１ｋＤａ以上の画分を陰イオン交換カラム（樹脂：Dowex、カラムサイズ：φ１０ｍｍ×６３ｍｍ）に供し、素通り画分および各ＮａＣｌ濃度（７５０ｍＭまたは１Ｍ）の水溶液で溶出、分画して得られた各画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。各画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物１０ｍｇ相当量）を添加した。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、７５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。【００５９】
（５）ＨＰＬＣによる分画（１回目）
上記（４）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた７５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分をＣ１８−逆相カラム（カラムサイズ：φ５０ｍｍ×２５０ｍｍ）で分画し、溶出時間０〜４５分まで１分ごとにフラクションを分取した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
カラム：「Ｃ１８−逆相カラム、サイズ：φ５０ｍｍ×２５０ｍｍ）」（株式会社ハイペップ研究所製）
移動相：（A）10％Acetonitrile/0.1% TFA
（B）60％Acetonitrile/0.1% TFA
B 5%→95％（40min）Gradient
検出：UV215nm
サンプル量：601mg【００６０】
得られた４５画分を５画分ずつ混合してＧ１〜Ｇ９とし（図３参照）、これらについて骨芽細胞増殖活性を測定した。各画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物６６ｍｇ相当量）を添加した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
結果を図４に示した。図４から明らかなようにＧ３において強い骨芽細胞増殖活性が認められた。【００６１】
次に、Ｇ３の５画分（フラクション１１〜１５）およびＧ４の５画分（フラクション１６〜２０）について骨芽細胞増殖活性を測定した。各画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物６６ｍｇ相当量）を添加した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
結果を図５に示した。図５から明らかなようにフラクション１１〜２０のいずれの画分にもコントロールより強い骨芽細胞増殖活性が認められた。【００６２】
（６）ＨＰＬＣによる分画（２回目）
フラクション１１〜２０について、さらに下記条件でＨＰＬＣを行った。
カラム：商品名「ODS-A（10×4.6mmI.D.）」（YMC社製）
移動相：4％Acetonitrile/0.1% TFA  (isocratic)
温度：40℃
検出：UV215nm
サンプル量：50μg
フラクション１１〜２０のうち、フラクション１２において２つの明瞭なピークが検出されたため（図６参照）、当該フラクション１２について解析を進めた。すなわち、フラクション１２を上記条件のＨＰＬＣに供し、ピーク１およびピーク２を含む画分を分取した（図６参照）。ピーク１含む画分（ｐｅａｋ１）、ピーク２を含む画分（ｐｅａｋ２）並びにピーク１およびピーク２以外の画分（ｏｔｈｅｒｓ）について骨芽細胞増殖活性を測定した。各画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物１３３ｍｇ相当量）を添加した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
結果を図７に示した。図７から明らかなように、ピーク２を含む画分に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。【００６３】
（７）ペプチドの同定
ピーク２を含む画分に含まれるペプチドのアミノ酸配列を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（質量分析計）を用いて解析した。これらの解析結果から、ピーク２を含む画分中に、少なくとも図８に示す６種類のペプチドが存在することが明らかとなった。これらのペプチドは、卵黄に含まれるリポビテリン１のフラグメントであり、それぞれリポビテリン１のアミノ酸配列（配列番号８）において、Ｎｏ．１は第１０４５位−第１０５２位、Ｎｏ．２は第１０４５位−第１０５１位、Ｎｏ．３は第１０４７位−第１０５１位、Ｎｏ．４は第１０５３位−第１０５９位、Ｎｏ．５は第１０５２位−第１０５９位、Ｎｏ．６は第１０４５位−第１０５９位にそれぞれ該当するものであった。【００６４】
〔実施例２：合成ペプチドを用いた骨芽細胞増殖促進活性の検討〕
実施例１で同定された骨芽細胞増殖促進活性を有する６種類のペプチドを化学合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。ペプチドの合成には、ペプチド自動合成装置Ｓｙｒｏ ＩＩ（バイオタージ・ジャパン株式会社製）を使用した。【００６５】
実施例１と同じ方法で各合成ペプチドの骨芽細胞増殖活性を測定した。各合成ペプチドを濃度が２．５、５、１０μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加した。コントロールには、ＰＢＳ（−）を添加した。骨芽細胞の増殖促進活性は、ＰＢＳ（−）の増殖値を１００とした時の相対値で表した。
Ｎｏ．１の結果を図９に、Ｎｏ．２およびＮｏ．３の結果を図１０に、Ｎｏ．４およびＮｏ．５の結果を図１１に、Ｎｏ．６の結果を図１２にそれぞれ示した。図９〜１２から明らかなように、いずれの合成ペプチドも、濃度依存的に骨芽細胞の増殖を促進した。【００６６】
〔実施例３：合成ペプチドによる成長期ラットの骨伸長促進作用の検討〕
３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）または生理食塩液（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回４日間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；human growth hormone、ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を２０μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回４日間皮下投与した。４日目の投与後にカルセインを皮下投与し、さらに１日間飼育した。ラットを麻酔下に放血して安楽死させ、脛骨を採取し、脛骨成長板の組織標本を作製して脛骨成長板に形成されるカルセインの沈着面（蛍光領域）を、蛍光顕微鏡で測定することで骨の伸長幅を観察した。
結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、合成ペプチドの投与量に依存して脛骨成長板の伸長幅が増加することが確かめられた。最大投与量における作用は、ヒト成長ホルモンを皮下投与した場合に見られる伸長幅の増加量とほぼ同等であった。この結果から、本発明のペプチドは、経口投与により骨形成を促進できることが明らかになった。【００６７】
〔実施例４：合成ペプチドを用いた軟骨細胞増殖促進活性の検討〕
軟骨細胞への分化能を有するマウス由来細胞株ＡＴＤＣ５（RIKEN BANK、RBC0565）を用いた。対数増殖期にあるＡＴＤＣ５を５％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有イーグルＭＥＭ培地に懸濁して細胞懸濁液（3×104個/mL）を調製し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種して５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ、３７℃条件下で前培養を行った。翌日、培地全量を除去し、合成ペプチド（Ｎｏ．１またはＮｏ．６）を１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含む培地を添加して７２時間培養した。コントロールには合成ペプチドを含まない培地を添加した。各ウェルにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）の反応溶液（10μg/well）を加えて、３時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。合成ペプチドの軟骨細胞増殖促進活性は、コントロールの吸光度（増殖値）を１００％としたときの相対値で表した。
結果を図１４に示した。図１４から明らかなように、合成ペプチドＮｏ．６およびそのフラグメントである合成ペプチドＮｏ．１の両方に、軟骨細胞の増殖促進作用が認められた。【００６８】
〔実施例５：合成ペプチドを用いたヒアルロン酸産生促進活性の検討〕
実施例４と同じマウス由来細胞株ＡＴＤＣ５細胞を用いた。対数増殖期にあるＡＴＤＣ５を２４ウェルプレートに２×１０４個／ｍＬ／ウェルで播種し、５％ＦＣＳ（牛胎児血清）、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、３×１０−８Ｍ亜セレン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地を用いて、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ、３７℃条件下で前培養を行った。翌日、培地全量を除去し、合成ペプチド（Ｎｏ．１またはＮｏ．６）を１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含む培地を添加して７２時間培養した。コントロールには合成ペプチドを含まない培地を添加した。４８時間培養後の培養上清を回収し、ＱｎＥ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ（Biotech Trading Partners）を用いてヒアルロン酸濃度を測定した。合成ペプチド添加群における培養上清中のヒアルロン酸濃度は、バックグラウンドに相当する吸光度を差し引いた値を、標準物質であらかじめ作成した検量線に適用して算出した。
結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、合成ペプチドＮｏ．６およびそのフラグメントである合成ペプチドＮｏ．１の両方に、ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。【００６９】
〔実施例６：合成ペプチドによる骨密度回復試験〕
３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラットに、低カルシウム食（炭酸カルシウムとして０．０５％）を与えて１週間予備飼育を行った後、通常食（炭酸カルシウムとして１．２％）に切り替え、合成ペプチド（Ｎｏ．１）または生理食塩液（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。７日目の経口投与後にラットを麻酔下に放血して安楽死させ、大腿骨および脛骨を摘出し、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＸＡ）法および末梢骨定量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ）法により脛および大腿骨の骨量および骨形態計測を行った。その結果、対照群に比べて合成ペプチド投与群では脛骨の長さ、重量および骨密度に増加傾向が認められ、カルシウム欠乏によって低下した骨密度の回復を促進することが示された。【００７０】
〔実施例７：卵巣摘出ラットを用いた閉経後骨粗鬆症モデルでの検討〕
卵巣摘出手術（ＯＶＸ）を施した雌性ラット（８か月齢、各１０例／群)に、手術の翌日から合成ペプチドＮｏ．１を胃ゾンデを用いて１日１回６か月間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。その結果、ＯＶＸ−合成ペプチド投与群では、合成ペプチド投与量の増加に伴い大腿骨骨幹端遠位部の骨密度が増加し、ＯＶＸ対照群（合成ペプチド非投与群）と比較して有意な増加が認められた。また、中用量投与群（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）および高用量投与群（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）では、卵巣を摘出しなかった偽手術群と同程度以上であった。また、骨形態計測パラメータについて、ＯＶＸ−合成ペプチド投与群では投与量の増加に伴い脛骨骨幹端近位部の海綿骨骨量が増加し、ＯＶＸ対照群と比較して有意な増加が認められ、中用量投与群および高用量投与群では卵巣を摘出しなかった偽手術群と同程度以上であった。また、ＯＶＸによる骨梁数および骨梁幅の減少並びに骨梁間隔の増大が、ＯＶＸ−合成ペプチド投与群では抑制される傾向がみられた。【００７１】
〔実施例８：成熟ラットおよび老齢ラットにおける骨形成促進作用〕
成熟雌性ラット（８か月齢、各１０例／群）に、合成ペプチドＮｏ．１を胃ゾンデを用いて１日１回２０週間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてアレンドロン酸ナトリウム水和物（以下、「アレンドロン酸」）（３００μｇ／ｋｇ）を１日１回２０週間連日皮下投与した。その結果、大腿骨の骨密度および脛骨骨幹端近位部の海綿骨骨量は、投与終了時において合成ペプチド投与群およびアレンドロン酸投与群で、対照群と比較して有意に増加し、合成ペプチド投与群とアレンドロン酸投与群における増加の程度は同程度であった。
老齢雌性ラット（１３〜１４か月齢、各１０例／群）に、合成ペプチドＮｏ．１を胃ゾンデを用いて１日１回２０週間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてアレンドロン酸（３００μｇ/ｋｇ）を１日１回２０週間連日皮下投与した。その結果、大腿骨の骨密度および脛骨骨幹端近位部の海綿骨骨量は、合成ペプチド投与群で用量依存的に増加した。【００７２】
〔実施例９：破骨細胞培養系における骨吸収抑制作用〕
ウサギの長管骨および肩甲骨から調製した破骨細胞粗画分を象牙切片上で合成ペプチド（０．０００１〜１０００μｍｏｌ／Ｌ）存在下において４８時間培養した結果、濃度依存的な吸収窩の総面積の減少が認められた。また、破骨細胞粗画分をコラーゲン処理して調製した単離破骨細胞を合成ペプチド（０．０００１〜１０００μｍｏｌ／Ｌ）で１５分間前処置した後、象牙切片上で２４時間培養した結果、濃度依存的な吸収窩の総面積の減少が認められた。【００７３】
〔実施例１０：合成ペプチドを用いた間葉系幹細胞増殖促進活性の検討〕
マウス間葉系幹細胞１０Ｔ１／２（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ９０８０）またはＳＴ２（理研ＢＲＣ ＩＤ：ＲＣＢ０２２４）を、１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地を入れた９６ウェルプレートにウェル当たり５０００個播種し、合成ペプチドをそれぞれ０．１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌ添加して７２時間培養した。培養液１００μＬ当たり１０μＬのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートした。その後、４５０ｎｍでの吸光度についてマイクロプレートリーダーを用いて測定した。その結果、合成ペプチドの添加によって１０Ｔ１／２およびＳＴ２の増殖活性が有意に上昇した。【００７４】
〔実施例１１：合成ペプチドを用いた間葉系幹細胞分化誘導作用の検討〕
マウス間葉系幹細胞１０Ｔ１／２またはＳＴ２を、１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地を入れた９６ウェルプレートにウェル当たり５０００個播種し、合成ペプチドをそれぞれ０．１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌ添加して４日間培養したのち、βグリセロリン酸Ｉ（１０ｍＭ）およびアスコルビン酸（50μｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ培地に交換した。この際、前記の合成ペプチドを含ませた培地と含まない培地についてそれぞれ検討した。この培地でさらに３日培養を行い（合わせて７日後）、細胞を固定した。固定後、Alkaline Phosphatase Substrate Kit I <VECTOR Red>（Vector Laboratories）を用いてアルカリフォスファターゼの活性染色を行った。その結果、合成ペプチドを添加した細胞で、強いアルカリフォスファターゼの活性が認められた。一方、非添加の細胞においてはこのような活性は認められなかった。すなわち、合成ペプチドを添加することで、４日という比較的短間に、未分化な間葉系幹細胞から骨芽細胞様の細胞（前骨芽細胞）への分化を効率的に誘導することが可能であった。【００７５】
〔実施例１２：合成ペプチドを用いた軟骨前駆細胞の分化誘導作用の検討〕
軟骨細胞への分化能を有するマウスＥＣ（胚性がん腫）由来のクローン化細胞株ＡＴＤＣ５（理研ＢＲＣ ＩＤ：ＲＣＢ０５６５）を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。ＡＴＤＣ細胞を、２×１０４個／ウェルずつ４８ウェルプレートに播種した。２４時間後に培養上清を除去し、１０ｎｇ／ｍＬインスリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加した。同時に０．１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度で合成ペプチドを添加した。陽性対照として１および５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ）を添加した。３〜４日毎に培地を交換した。
さらに合成ペプチドとＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４の相乗効果を確認するため、０．１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの合成ペプチドと１ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４を共添加した。培地交換を繰り返しながら、１４日間培養を行った後、１０％ホルマリン中性緩衝液にて細胞の固定を行った。固定後、アルシアンブルー液にて４時間染色を行い、色素を洗浄後にプレートを乾燥させ、写真を撮影した。
マウス軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５細胞において、合成ペプチドの添加により、アルシアンブルー陽性ノジュール形成が確認され、濃度依存的にその数は増加した。これは合成ペプチドによりＡＴＤＣ５細胞が軟骨細胞に分化したことを示す。さらに、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４との相乗効果が示された。【００７６】
〔実施例１３：骨芽様細胞を用いた骨形成因子の解析〕
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ Ｓｕｂｃｌｏｎｅ−４（ＡＴＣＣ Ｎｏ.ＣＲＬ−２５９３）を、合成ペプチド濃度が２．５、５、１０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加した１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で７２時間培養した。培養終了後、骨芽様細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性をｐ−ニトロフェニルリン酸基質法により測定した。さらに培養上清中のオステオカルシン（ＯＣＮ）量をオステオカルシン測定用キット（タカラバイオ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、合成ペプチドの添加濃度に依存してＡＬＰ活性およびＯＣＮ量が増加傾向を示した。ＡＬＰやＯＣＮは骨形成機能を反映する因子と考えられており、各合成ペプチドがその様な関連因子を介して骨芽様細胞の骨形成機能を促進することが示唆された。【００７７】
〔実施例１４：合成ペプチドによる成長軟骨および一次海綿骨における骨形成促進作用の検討〕
４週齢のCrlj:W1雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝３）。合成ペプチド（Ｎｏ．１）の用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ;ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として、４日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、６日目の投与後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。７日目に検体を投与した後は絶食条件でラット飼育した。２４時間後に採血後、ラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図１６を参照）。その後、脛骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS社製BX-53)で画像を取得し、形態計測システム(Histometry RT digitizer, System Supply Co., Ltd.)および解析ソフト(CSS-840 cancellous bone morphometry version, System Supply Co., Ltd.)を用いて骨形態計測を行った。成長軟骨における長軸方向の成長率(Lo.G.R; Longitudinal Growth Rate)の計測において、成長率は、テトラサイクリンおよびカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔（２日間）から一日あたりの成長幅を算出した。
その結果、ｈＧＨ投与群およびＮｏ．１投与群はコントロール群に対して有意な骨成長促進作用を示し、Ｎｏ．1投与群はｈＧＨ投与群に対しても有意な骨成長促進作用を示した(図１７)。さらに、Ｎｏ．１投与群はコントロール群およびｈＧＨ投与群に対して一次海綿骨に取り込まれた蛍光標識が高頻度に検出され、成長期における海綿骨の形成を早期に誘導することが示唆された(図１８；白色部位)。
また、血清中のインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度をＥＬＩＳＡ（R&D社製 Mouse/Rat IGF-I Quantikine ELISA Kit; MG100)で測定した結果、ｈＧＨ投与群およびＮｏ．１投与群はコントロール群に対してＩＧＦ−１濃度が高値であった(図１９)。成長期において骨や筋肉の発育に関与するＩＧＦ−１の増加は、上述した骨成長促進作用を来す一因である可能性を示唆している。
これらの結果から、本発明のペプチドは、経口投与により長軸方向の骨成長や内部構造である海綿骨の形成を促進することが明らかになった。【００７８】
〔実施例１５：合成ペプチドによる成長軟骨および二次海綿骨における骨形成促進作用の検討〕
４週齢のCrlj:W1雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）または注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回２１日間強制経口投与した（各群：ｎ＝３）。合成ペプチドの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ;ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回２１日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として、１８日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、２０日目の投与後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。２１日目に検体を投与した後は絶食条件でラット飼育した。２４時間後ラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図２０を参照）。その後、頸骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS社製BX-53)で画像を取得し、形態計測システム(Histometry RT digitizer, System Supply Co., Ltd.)および解析ソフト(CSS-840 cancellous bone morphometry version, System Supply Co., Ltd.)を用いて骨形態計測を行った。骨端軟骨における長軸方向の成長率(Lo.G.R; Longitudinal Growth Rate)を計測において、成長率は、テトラサイクリンおよびカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔（２日間）から一日あたりの成長幅を算出した。
その結果、ｈＧＨ投与群およびＮｏ．１投与群はコントロール群に対して有意に骨成長促進作用を示し、Ｎｏ．１投与群はｈＧＨ投与群に対しても有意な骨成長促進作用を示した（図２１）。このことから、本発明のペプチドがより長期の経口投与条件においても長軸方向の骨成長を促進することが示された。
さらに、上述した解析システムにより二次海綿骨の骨量(BV;Bone volume/TV;Tissue volume)を解析した結果、Ｎｏ．１投与群は、コントロール群およびｈＧＨ投与群に対して二次海綿骨の骨量が高値となった(図２２)。また、Ｎｏ．１投与群において、総骨面に対して骨芽細胞が局在する骨面の割合(Ob.S;Osteoblast surface /BS;Bone surface )が高値となり（図２３）、破骨細胞の局在する骨面の割合(Oc.S;Osteoclast surface/BS;Bone surface)は低値となった（図２４）。
これらの結果から、本発明のペプチドを経口投与することにより、骨芽細胞の増加や破骨細胞への分化抑制を介した形成優位の骨代謝が誘導される可能性が示された。【００７９】
〔実施例１６：合成ペプチドによる二次海綿骨における骨石灰化速度の増加作用の検討〕
４週齢のCrlj:W1雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）または注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝１０）。合成ペプチドの用量は、１、１０および１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ;ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として、４日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、６日目の投与後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。７日目に検体を投与した後は絶食条件でラット飼育した。２４時間後にラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した。その後、頸骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS社製BX-53)で画像を取得し、形態計測システム(Histometry RT digitizer, System Supply Co., Ltd.)および解析ソフト(CSS-840 cancellous bone morphometry version, System Supply Co., Ltd.)を用いて骨形態計測を行った。二次海綿骨における骨石灰化速度(MAR:Mineral Apposition Rate)については、二次海綿骨におけるテトラサイクリンおよびカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔（２日間）から一日あたりの骨石灰化速度を算出した。その結果、ｈＧＨ投与群およびＮｏ．１投与群はコントロール群と比べて有意に骨石灰化速度が増加した。さらに、Ｎｏ．１投与群において１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上では、ｈＧＨ投与群に対しても有意な骨石灰化速度の増加が示された（図２６）。Ｎｏ．１投与群では、総骨面に対して骨芽細胞が局在する骨面の割合(Ob.S;Osteoblast surface/BS;Bone surface)が高値となり（図２７）、骨組織あたりの骨芽細胞数(N.Ob;Number of osteoblast/TV:Tissue volume)も高値となった（図２８）。Ｎｏ．１投与群に見られた二次海綿骨の骨石灰化速度の増加は、そのような骨芽細胞の増加に起因する可能性が考えられた。また、骨面を基準とし、１年間に形成される骨量を骨形成速度(BFR;Bone formation rate/BS;Bone surface)として算出した結果、Ｎｏ．１投与群で高値となった（図２９）。Ｎｏ．１投与群において１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上では、コントロール群に対して有意な骨形成速度の増加が示された。
これらの結果から、本発明のペプチドを経口投与することによって二次海綿骨の骨石灰化が促進され、骨形成速度が増加することが示された。【００８０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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