(57)【要約】  本発明は、神経芽腫、肺癌、乳癌等を含む癌の治療薬及び治療法を提供することを目的とする。また、本発明は癌の診断剤及びイメージング用試薬を提供することを目的とする。  本発明は、抗NLRR1モノクローナル抗体、この抗体を含む医薬組成物、この抗体と他の薬剤との併用療法、本発明の抗体を含む診断剤及びイメージング試薬を提供する。本発明はさらに、NLRR1タンパク質又はその細胞外ドメインを用いた抗NLRR1モノクローナル抗体のスクリーニング方法を提供する。
2014175444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合し、かつ、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドにより形成されるエピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列中の、第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）及び第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）のペプチドにより形成されるエピトープ、又は
配列番号１で示されるアミノ酸配列中の第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）及び第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）のペプチドにより形成されるエピトープ、
に結合する請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
モノクローナルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
以下のいずれか、
(i)  配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列において、１又は数個のアミノ酸が置換されたCDR配列を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、
(ii)  配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるCDR配列を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、又は
(iii)  CDR配列が配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、
である抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
重鎖が配列番号１２に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１４に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号９に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含み、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒト化された、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
キメラ抗体である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
以下のいずれかの核酸、すなわち
(i)  請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、
(ii)  重鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号８に示される塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号１０に示される塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、
(iii)  前記(ii)の核酸と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、又は
(iv)  前記(ii)の核酸の塩基配列において、１又は数個の塩基が、置換、欠失、又は付加された塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１２】
放射性同位体、化学発光団、蛍光分子、常磁性イオン、ビオチン又はアビジンで標識されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
薬剤とコンジュゲートされている、請求項１〜１０及び１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項５〜１０及び１２〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び融合パートナータンパク質又はドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
さらにリンカーを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
融合パートナータンパク質又はドメインが、蛍光タンパク質、GFP、RFP、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びグルコアミラーゼである、請求項１４又は１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマ。
【請求項１８】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のハイブリドーマを用いた抗体の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１０及び１２〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患の治療剤。
【請求項２１】
NLRR1タンパク質に関連する疾患が癌である、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２２】
癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、請求項２１に記載の治療剤。
【請求項２３】
さらに、１以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２４】
１以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤が、EGF受容体阻害剤、HER2阻害剤、HER3阻害剤、HER4阻害剤、IGF−１受容体阻害剤、Trk受容体阻害剤、FGF受容体阻害剤、PDGF受容体阻害剤、VEGF受容体阻害剤、及び細胞増殖シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を標的とする小分子干渉性RNA(siRNA)阻害剤からなる群より選択される、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２５】
EGF受容体阻害剤が、PD-158780（CAS No. 171179-06-9）、AG-1478（CAS 153436-53-4）、CGP-59326、AG490（チルホスチン、CAS No. 133550-30-8）、ARRY-334543（CAS No. 845272-21-1）及びそのジ4-メチルベンゼンスルホン酸塩、BIBW-2992（Tomtovok(商標)、CAS No. 439081-18-2）、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)並びにその塩酸塩及び水和物、OSI-774(Tarceva(商標)、Erlotinib、塩酸塩のCAS No. 183319-69-9)；PD183805(Canertinib, CI-1033、CAS No. 289499-45-2)及びその塩酸塩; ZD1839（Iressa（登録商標）、ゲフィチニブ、CAS No. 184475-35-2);ZM105180 ((6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン); BIBX-1382（CAS No. 196612-93-8）； PKI-166（4-[4-[1(R)-フェニルエチルアミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]フェノール）； CL-387785（CAS No. 194423-06-8）; EKB-569（Pelitinib、CAS No. 257933-82-7））； lapatinib（GW-2016、GW-572016若しくはラパチニブジトシラート, CAS No. 388082-78-8、GSK社）; ZD6474（Vandetanib、Caprelsa(商標)、CAS No. 443913-73-3）; CUDC-101（CAS No. 1012054-59-9）; 及びAEE788（CAS No. 497839-62-0）からなる群より選択され、且つ／又は
IGF-1阻害剤が抗IGF-1中和抗体、IGF-1リガンド抗体、小分子IGF-1アンタゴニスト、OSI-906（Linsitinib、CAS No. 867160-71-2）、GSK1904529A (CAS No. 1089283-49-7)、NVP-ADW742 (CAS No. 475488-23-4)、NVP-AEW541（CAS No. 475489-16-8）、GSK1838705A（CAS No. 1116235-97-2）、AG-1024（CAS No. 65678-07-1）からなる群より選択され、
HER2阻害剤がTAK-165（CAS No. 366017-09-6）、CP-724,714（CAS No. 537705-08-1）、ABX-EGF、lapatinib、CUDC-101、AEE788、Afatinib (BIBW2992、CAS No. 439081-18-2)及びそのマレイン酸塩若しくは塩酸塩、CI-1033 (Canertinib、CAS No. 267243-28-7)及びその二塩酸塩、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)及びその塩酸塩若しくは水和物、Neratinib (HKI-272、CAS No. 698387-09-6)及びそのマレイン酸塩、AZD8931（CAS No. 848942-61-0）、Arry-380（CAS No. 937265-83-3）、TAK-285（CAS No. 871026-44-7）、Tyrphostin AG 879 (AG 879、CAS No. 148741-30-4）、HER2抗体、ペルツズマブ（pertuzumab、CAS No. 380610-27-5）、トラスツズマブ（Trastuzumab、ハーセプチン（Herceptin)(登録商標)CAS No. 180288-69-1)からなる群より選択され、且つ／又は
HER3阻害剤が、抗HER3ヒトモノクローナル抗体、U31287（AMG888）からなる群より選択され、且つ／又は
Trk受容体阻害剤がGW 441756（CAS No. 504433-23-2）、BMS-754807（CAS No. 1001350-96-4）及びそのメタンスルホン酸塩からなる群より選択され、且つ／又は
FGF受容体阻害剤がBIBF1120 (Vargatef(商標)、CAS No. 656247-17-5)並びにそのメタンスルホン酸塩及び塩酸塩、BGJ398 (NVP-BGJ398、CAS No. 872511-34-7)並びにそのメタンスルホン酸塩、塩酸塩及び酢酸塩、AZD4547（CAS No. 1035270-39-3）からなる群より選択され、且つ／又は
PDGF受容体阻害剤が、Axitinib（AG013736、Inlyta(商標)、CAS No. 319460-85-0）、Sunitinib（SU11248、Sutent(商標)、CAS No. 341031-54-7）及びそのマレイン酸塩であるSunitinib Malate(CAS No. 341031-54-7)、Tivozanib (AV-951、CAS No. 475108-18-0)並びにその水和物及び塩酸塩、TSU-68 (SU6668、CAS No. 252916-29-3)、Telatinib (BAY 57-9352、CAS No. 332012-40-5)並びにその4-メチルベンゼンスルホン酸塩及び塩酸塩、MK-2461（CAS No. 917879-39-1）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF阻害剤が、ベバシズマブ（Bevacizumab、CAS No. 216974-75-3、アバスチン(商標)）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF受容体阻害剤が、Axitinib、Sorafenib (Nexavar(商標)、CAS No. 284461-73-0)、Tivozanib並びにその水和物及び塩酸塩、Cediranib (AZD2171、Recentin(商標)、CAS No. 288383-20-0)及びそのマレイン酸塩、並びに抗VEGF受容体2抗体、例えばRamucirumab(CAS No. 947687-13-0)からなる群より選択される阻害剤である、請求項２４に記載の治療剤。
【請求項２６】
請求項１〜１０及び１２〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質が関連する疾患の診断剤。
【請求項２７】
NLRR1タンパク質が関連する疾患が癌である、請求項２６に記載の診断剤。
【請求項２８】
癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、請求項２７に記載の診断剤。
【請求項２９】
請求項１２若しくは１３に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、イメージング用試薬。
【請求項３０】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の診断剤又は請求項２９に記載のイメージング用試薬を用いる工程を含む、サンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を検出するin vitro方法又はサンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を含む部位を特定する免疫染色方法。
【請求項３１】
以下の工程、
ａ）  NLRR1細胞外ドメイン又は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化によりNLRR1細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を取得する工程、
ｂ）  エピトープとの反応性に基づき、又は、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体との競合に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドにより形成されるエピトープに結合することができるモノクローナル抗体を選択する工程、
c)  工程b)により選択されたモノクローナル抗体を、癌細胞と混合し、当該癌細胞の生存性を有意に低下させる又は癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を選択する工程、
を含む、NLRR1のエピトープに結合することができるモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
【請求項３２】
以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、又は
(iii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３３】
以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(iii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１−６１５位のアミノ酸配列を有し、かつNLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、かつNLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３６】
NLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NLRR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及び該抗体等を使用するNLRR1の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法、並びに神経芽腫、肺癌及び乳癌を含む癌の診断試薬、診断方法、治療薬、及び治療方法に関する。【０００２】
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学、医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用である。
【背景技術】
【０００３】
NLRR1（neuronal leucine-rich repeat protein 1）は神経芽腫において高発現される１型膜貫通タンパク質であり、LRRN1（Leucine-rich repeat neuronal protein 1）とも呼ばれる。NLRR1は神経芽腫cDNAライブラリーから、予後良好な神経芽腫と予後不良な神経芽腫とで発現が異なるものとして本発明者らにより同定された（非特許文献１）。NLRR1のアミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。N末端側が細胞外ドメインでありロイシンリッチなリピート配列が見られる（LRR）。次にIgG様ドメインがあり、フィブロネクチンIII型ドメインが続く。次いで細胞内ドメインには酸化の可能性のある複数のチロシン残基がある。また、C末端側にはクラスリンアダプター相互作用ドメイン、そしてPDZ結合モチーフが見られる。【０００４】
NLRR1はMYCNの標的遺伝子であることを本発明者らは以前に報告している（非特許文献２）。また本発明者らは以前に、NLRR1が神経芽腫においてEGF媒介MYCN誘導を促進し、in vivoにおける腫瘍増殖を促進することを報告した（非特許文献３）。また同文献において、NLRR1が、IGF-1により媒介される細胞外シグナル調節キナーゼの活性化を通して細胞増殖を正に調節することを報告した。【０００５】
特許文献１はNLRR1とEGFR（epidermal growth factor receptor）とが相互作用して複合体を形成することを記載している。【０００６】
特許文献２は、NLRR-1アンタゴニストを用いた乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、膵癌及び卵巣癌からなる群から選択される癌の治療方法を記載している（請求項５３および６８）。また、NLRR-1アンタゴニストの例として抗体が記載されている（段落[0006]）。しかしながら特許文献２には、NLRR-1アンタゴニストを実際に用いた肺癌又は乳癌に対する治療効果裏付ける実験結果は記載されていない。また、特許文献２にはNLRR-1アンタゴニストを用いた神経芽腫治療の記載はない。さらに、特許文献２はATCC受託番号PTA-8732を有するハイブリドーマから産生される抗NLRR1モノクローナル抗体3D1.6.9を記載しているが（請求項４、段落[0006]）、実施例では同抗体を癌細胞の増殖抑制に用いた記載はない。【０００７】
神経芽腫は、小児癌の一種であり、日本国の年間発症者数は150人程度と推測されている。神経芽腫の早期例の予後は一般に良好だが、進行例の予後は不良である。予後が不良の神経芽腫を本明細書において難治性神経芽腫と呼ぶことがある。本発明者らは、予後不良の難治性神経芽腫でNLRR1の発現が有意に高いことを以前に報告した（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2009／110383号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2009/046123(特表第2010-540653号明細書）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hamano S, et al., Int J Oncol. 2004 Jun;24(6):pp. 1457-66
【非特許文献２】Hossain et. al., Oncogene (2008) 27, pp. 6075-6082
【非特許文献３】Hossain et. al., Cancer Res. July 19, 2012 (online date), 72(17), pp. 4587-96
【非特許文献４】Hamano et. al., Int. J. Oncol. (2004) 24(6), pp. 1457-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
各種癌の治療薬及び治療法が必要とされている。また神経芽腫の、進行例の予後は未だに不良であり、神経芽腫の治療薬及び治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、難治性神経芽腫において発現量が増大しているNLRR1タンパク質に着目し、鋭意研究を重ねた結果、NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する抗NLRR1モノクローナル抗体が、神経芽腫細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させた。さらに本発明者らは、抗NLRR1モノクローナル抗体が肺癌細胞及び乳癌細胞の増殖を抑制すること、EGF受容体阻害剤との併用により癌細胞の増殖を抑制することも見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の態様を包含する。【００１２】
[１]  NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合し、かつ、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片。【００１３】
[２]  配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合する、[１]に記載の抗体又はその抗原結合断片。【００１４】
[３]  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドにより形成されるエピトープに結合する、[１]又は[２]に記載の抗体又はその抗原結合断片。【００１５】
[４]  配列番号１で示されるアミノ酸配列中の、第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）及び第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）のペプチドにより形成されるエピトープ、又は
配列番号１で示されるアミノ酸配列中の第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）及び第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）のペプチドにより形成されるエピトープ、
に結合する[１]〜[３]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００１６】
[５]  モノクローナルである、[１]〜[４]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００１７】
[６]  以下のいずれか、
(i)  配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列において、１又は数個のアミノ酸が置換されたCDR配列を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、
(ii)  配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるCDR配列を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、又は
(iii)  CDR配列が配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、
である抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。【００１８】
[７]  重鎖が配列番号１２に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１４に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。【００１９】
[８]  配列番号９に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含み、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる、[７]に記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２０】
[９]  ヒト化された、[５]〜[８]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２１】
[１０]  キメラ抗体である、[５]〜[８]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２２】
[１０−２]  NLRR1タンパク質の細胞外ドメインへの結合について、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と競合し、かつ、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる[１]〜[１０]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２３】
[１０−３]  受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。【００２４】
[１１]  以下のいずれかの核酸、すなわち
(i)  [５]〜[１０]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、
(ii)  重鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号８に示される塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号１０に示される塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、
(iii)  前記(ii)の核酸と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、又は
(iv)  前記(ii)の核酸の塩基配列において、１又は数個の塩基が、置換、欠失、又は付加された塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。【００２５】
[１２]  放射性同位体、化学発光団、蛍光分子、常磁性イオン、ビオチン又はアビジンで標識されている、[１]〜[１０]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２６】
[１３]  薬剤とコンジュゲートされている、[１]〜[１０]及び[１２]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。【００２７】
[１４]  [５]〜[１０]及び[１２]〜[１３]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片及び融合パートナータンパク質又はドメインを含む、融合タンパク質。【００２８】
[１５]  さらにリンカーを含む、[１４]に記載の融合タンパク質。【００２９】
[１６]  融合パートナータンパク質又はドメインが、蛍光タンパク質、GFP、RFP、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼである、[１４]又は[１５]に記載の融合タンパク質。【００３０】
[１７]  受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマ。【００３１】
[１８]  [５]〜[１０]のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。【００３２】
[１９]  [１７]又は[１８]に記載のハイブリドーマを用いた抗体の製造方法。【００３３】
[２０]  [１]〜[１０]及び[１２]〜[１３]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患の治療剤。【００３４】
[２１]  NLRR1タンパク質に関連する疾患が癌である、[２０]に記載の治療剤。【００３５】
[２２]  癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、[２１]に記載の治療剤。【００３６】
[２３]  さらに、１以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤を含む、[２０]〜[２２]のいずれかに記載の治療剤。【００３７】
[２４]  １以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤が、EGF受容体阻害剤、HER2阻害剤、HER3阻害剤、HER4阻害剤、IGF−１受容体阻害剤、Trk受容体阻害剤、FGF受容体阻害剤、PDGF受容体阻害剤、VEGF受容体阻害剤、及び細胞増殖シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を標的とする小分子干渉性RNA(siRNA)阻害剤からなる群より選択される、[２３]に記載の治療剤。【００３８】
[２５]  EGF受容体阻害剤が、PD-158780（CAS No. 171179-06-9）、AG-1478（CAS 153436-53-4）、CGP-59326、AG490（チルホスチン、CAS No. 133550-30-8）、ARRY-334543（CAS No. 845272-21-1）及びそのジ4-メチルベンゼンスルホン酸塩、BIBW-2992（Tomtovok(商標)、CAS No. 439081-18-2）、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)並びにその塩酸塩及び水和物、OSI-774(Tarceva(商標)、Erlotinib、塩酸塩のCAS No. 183319-69-9)；PD183805(Canertinib, CI-1033、CAS No. 289499-45-2)及びその塩酸塩; ZD1839（Iressa（登録商標）、ゲフィチニブ、CAS No. 184475-35-2);ZM105180 ((6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン); BIBX-1382（CAS No. 196612-93-8）； PKI-166（4-[4-[1(R)-フェニルエチルアミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]フェノール）； CL-387785（CAS No. 194423-06-8）; EKB-569（Pelitinib、CAS No. 257933-82-7））； lapatinib（GW-2016、GW-572016若しくはラパチニブジトシラート, CAS No. 388082-78-8、GSK社）; ZD6474（Vandetanib、Caprelsa(商標)、CAS No. 443913-73-3）; CUDC-101（CAS No. 1012054-59-9）; 及びAEE788（CAS No. 497839-62-0）からなる群より選択され、且つ／又は
IGF-1阻害剤が抗IGF-1中和抗体、IGF-1リガンド抗体、小分子IGF-1アンタゴニスト、OSI-906（Linsitinib、CAS No. 867160-71-2）、GSK1904529A (CAS No. 1089283-49-7)、NVP-ADW742 (CAS No. 475488-23-4)、NVP-AEW541（CAS No. 475489-16-8）、GSK1838705A（CAS No. 1116235-97-2）、AG-1024（CAS No. 65678-07-1）からなる群より選択され、
HER2阻害剤がTAK-165（CAS No. 366017-09-6）、CP-724,714（CAS No. 537705-08-1）、ABX-EGF、lapatinib、CUDC-101、AEE788、Afatinib (BIBW2992、CAS No. 439081-18-2)及びそのマレイン酸塩若しくは塩酸塩、CI-1033 (Canertinib、CAS No. 267243-28-7)及びその二塩酸塩、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)及びその塩酸塩若しくは水和物、Neratinib (HKI-272、CAS No. 698387-09-6)及びそのマレイン酸塩、AZD8931（CAS No. 848942-61-0）、Arry-380（CAS No. 937265-83-3）、TAK-285（CAS No. 871026-44-7）、Tyrphostin AG 879 (AG 879、CAS No. 148741-30-4）、HER2抗体、ペルツズマブ（pertuzumab、CAS No. 380610-27-5）、トラスツズマブ（Trastuzumab、ハーセプチン（Herceptin)(登録商標)CAS No. 180288-69-1)からなる群より選択され、且つ／又は
HER3阻害剤が、抗HER3ヒトモノクローナル抗体、U31287（AMG888）からなる群より選択され、且つ／又は
Trk受容体阻害剤がGW 441756（CAS No. 504433-23-2）、BMS-754807（CAS No. 1001350-96-4）及びそのメタンスルホン酸塩からなる群より選択され、且つ／又は
FGF受容体阻害剤がBIBF1120 (Vargatef(商標)、CAS No. 656247-17-5)並びにそのメタンスルホン酸塩及び塩酸塩、BGJ398 (NVP-BGJ398、CAS No. 872511-34-7)並びにそのメタンスルホン酸塩、塩酸塩及び酢酸塩、AZD4547（CAS No. 1035270-39-3）からなる群より選択され、且つ／又は
PDGF受容体阻害剤が、Axitinib（AG013736、Inlyta(商標)、CAS No. 319460-85-0）、Sunitinib（SU11248、Sutent(商標)、CAS No. 341031-54-7）及びそのマレイン酸塩であるSunitinib Malate(CAS No. 341031-54-7)、Tivozanib (AV-951、CAS No. 475108-18-0)並びにその水和物及び塩酸塩、TSU-68 (SU6668、CAS No. 252916-29-3)、Telatinib (BAY 57-9352、CAS No. 332012-40-5)並びにその4-メチルベンゼンスルホン酸塩及び塩酸塩、MK-2461（CAS No. 917879-39-1）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF阻害剤が、ベバシズマブ（Bevacizumab、CAS No. 216974-75-3、アバスチン(商標)）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF受容体阻害剤が、Axitinib、Sorafenib (Nexavar(商標)、CAS No. 284461-73-0)、Tivozanib並びにその水和物及び塩酸塩、Cediranib (AZD2171、Recentin(商標)、CAS No. 288383-20-0)及びそのマレイン酸塩、並びに抗VEGF受容体2抗体、例えばRamucirumab(CAS No. 947687-13-0)からなる群より選択される阻害剤である、[２４]に記載の治療剤。【００３９】
[２６]  [１]〜[１０]及び[１２]〜[１３]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質が関連する疾患の診断剤。【００４０】
[２７]  NLRR1タンパク質が関連する疾患が癌である、[２６]に記載の診断剤。【００４１】
[２８]  癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、[２７]に記載の診断剤。【００４２】
[２９]  [１２]若しくは[１３]に記載の抗体又はその抗原結合断片又は［１４］〜［１６］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、イメージング用試薬。【００４３】
[３０]  [２６]〜[２８]のいずれかに記載の診断剤又は[２９]に記載のイメージング用試薬を用いる工程を含む、サンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を検出するin vitro方法又はサンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を含む部位を特定する免疫染色方法。【００４４】
[３１]  以下の工程、
ａ）  NLRR1細胞外ドメイン又は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化によりNLRR1細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を取得する工程、
ｂ）  エピトープとの反応性に基づき、又は、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体との競合に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドにより形成されるエピトープに結合することができるモノクローナル抗体を選択する工程、
c)  工程b)により選択されたモノクローナル抗体を、癌細胞と混合し、当該癌細胞の生存性を有意に低下させる又は癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を選択する工程、
を含む、NLRR1のエピトープに結合することができるモノクローナル抗体のスクリーニング方法。【００４５】
[３２]  以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、又は
(iii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。【００４６】
[３３]  以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(iii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。【００４７】
[３４]  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１−６１５位のアミノ酸配列を有し、かつNLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。【００４８】
[３５]  配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、かつNLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。【００４９】
[３６]  NLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドの使用。【００５０】
[３７]  [１]〜[１３]のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は[２０]〜[２５]のいずれかに記載の治療剤を被験体に投与することを含む、癌の治療方法。【００５１】
[３８]  [２６]〜[２８]のいずれかに記載の診断剤又は[２９]に記載のイメージング用試薬を用いることを含む、癌の診断方法。【００５２】
[３９]  癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、[３７]または[３８]に記載の方法。【００５３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-093955号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００５４】
本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を用いるとNLRR1タンパク質に関連する疾患を治療又は予防することができる。本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いると、NLRR1タンパク質の発現が増大している癌細胞の増殖を抑制することができる。また本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を他の薬剤と併用することにより、他の薬剤の用量を低減しても、低減しなかった場合と比較して同等又はそれ以上の薬理効果を発揮することができる。【００５５】
また、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片は、NLRR1タンパク質に関連する疾患の診断方法に用いることができる。【００５６】
さらに、本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、抗癌剤等の薬剤をコンジュゲートしてNLRR1タンパク質に関連する疾患の治療に用いることができ、また、放射性同位体をコンジュゲートして治療又は画像イメージングに用いることができる。【００５７】
また本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は標識してイメージング試薬として利用することもできる。イメージングにより転移癌の有無を検出したり、外科手術で摘出すべき癌組織部位を容易に特定できるようになる。【００５８】
本発明に係るスクリーニング方法を用いて、NLRR1タンパク質に結合しかつNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することのできる抗NLRR1モノクローナル抗体を取得することができる。また本発明に係るペプチドを、該スクリーニング方法に使用することができる。さらに本発明に係るペプチドを用いて該抗体のエピトープ解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】各種成人癌とその正常組織におけるNLRR1タンパクの発現（免疫組織科学的検索）を示す図である。上段が正常組織、下段が腫瘍組織であり、左から右へと、皮膚組織、肺組織、乳房組織、食道組織、胃組織、小腸組織、及び甲状腺組織である。これらの癌細胞組織では、正常組織に比べ高いNLRR1発現が認められた。
【図２】肺癌組織におけるNLRR1のmRNAの発現（リアルタイム定量PCR)を示す図である。図２Ａが腺癌及び扁平上皮癌の個別の検体の事例であり、図２Ｂは発現の平均である。これらの事例では、NLRR1 mRNAは正常組織と比較して腫瘍組織で高度に発現している(qPCR)。
【図３】癌組織の組織ライセートアレイを用いたNLRR1タンパク質の発現解析を示す図である。左が肺癌、右が前立腺癌である。図中、Nは正常組織、Tは腫瘍組織を示す。ライセートアレイを用いたドットブロットからは、肺癌及び前立腺癌組織においてNLRR1が高発現することが見出された。ライセートアレイは、Dip-N-Spots ヒト腫瘍/正常組織ライセートDipstick Array (Protein Biotechnologies)を用い、抗体はヒツジ抗N末端NLRR1 (R&D systems)を使用した。
【図４】NLRR1の各ドメイン欠損タンパク質発現による細胞増殖及び増殖シグナル因子ERKのリン酸化への影響を示す図である。図４Ａに示すように、FIIIドメインを欠損させたNLRR1（ΔFIII）では有意に細胞増殖が低下した。また図４Ｂに示すように、ΔFIII では、ERKのリン酸化も減弱した（右レーン）。
【図５】抗NLRR1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清に対する固相ELISA法の結果を示す図である。二重丸はOD450が1.0＜であること、丸はOD450が0.5より大きく1.0以下であること、三角はOD450が0.2以上で0.5以下であることを表す。それ以外のクローンはOD450が0.2未満であった。各マスの番号はクローンを識別する番号である。
【図６】抗NLRR1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清に対するフローサイトメトリー法によるスクリーニング結果を示す図である。シグナルの強かったクローンを二重丸、シグナルが見られたクローンを丸、弱いシグナルが見られたクローンを三角印で示す。それ以外のクローンでは有意のFCMシグナルは検出されなかった。各マスの番号はクローンを識別する番号であり、クローンの位置関係は図５と同じである。
【図７】神経芽腫細胞株に対する、未精製抗NLRR1モノクローナル抗体を含む馴化培地による処置の影響を示す図である（WSTアッセイ）。左はCHP134であり、右はSY5Y-N1の結果である。
【図８】神経芽腫細胞株に対する、精製抗NLRR1モノクローナル抗体の処置の影響を示す図である（WSTアッセイ）。図８ＡはSY5Y-ctrlであり、図８ＢはSY5Y-N1の結果である。
【図９】NB及び非NB細胞における抗NLRR1モノクローナル抗体（NLRR1 mAb#281-6）の細胞増殖抑制効果を示す図である。上段は神経芽腫細胞株SK-N-DZ、NLF、SK-N-BEに対する影響である。いずれの細胞株についても細胞増殖抑制効果が見られた。下段は乳癌細胞株MCF7、肺癌細胞株A549、及び骨肉腫細胞株SAOS2に対する影響である。抗NLRR1モノクローナル抗体で処置した場合にいずれの細胞株についても細胞増殖抑制効果が見られた。
【図１０】NLRR1モノクローナル抗体によるEGFR阻害剤誘発増殖抑制の強化を示す図である。抗NLRR1モノクローナル抗体(25 μg/ml)と各種濃度のEGF受容体阻害剤（AG1478）とを併用した。図１０ＡがA549であり図１０ＢがSY5Y-N1の結果である。四角は抗体なし、白抜きの丸はクローン♯240、黒塗りの丸はクローン♯281を表す。
【図１１】抗NLRR1モノクローナル抗体（281-6）の結合ドメイン解析のための、種々のNLRR1変異体のアライメントを示す図である。記号は、WT：野生型；ΔLRR：ロイシンリッチリピート領域欠失変異体；ΔIg：Ig様ドメイン欠失変異体；ΔFIII：フィブロネクチンIII型ドメイン欠失変異体をそれぞれ表す。
【図１２】抗NLRR1モノクローナル抗体の結合ドメイン解析結果を示す図である。種々のNLRR1欠失変異体を用いたときのフローサイトメトリーによる結合解析の結果を示す。
【図１３】抗NLRR1モノクローナル抗体のエピトープ解析結果を示す図である。
【図１４】抗NLRR1モノクローナル抗体（#281-6）の重鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。CDR領域は下線で示した。
【図１５】抗NLRR1モノクローナル抗体（#281-6）の軽鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。CDR領域は下線で示した。
【図１６】ペプチドアレイの解析結果を示す図である。行と列の番号は図１７〜１９のそれに対応する。
【図１７】解析に用いた各ペプチドのアミノ酸配列及びシグナルの有無を示す図である。
【図１８】解析に用いた各ペプチドのアミノ酸配列及びシグナルの有無を示す図である。
【図１９】解析に用いた各ペプチドのアミノ酸配列及びシグナルの有無を示す図である。
【図２０】N1mAb抗体（#281-6）による処置が異種移植片腫瘍の増殖を有意に抑制したことを示す図である。白抜きの丸が生理食塩水、黒塗りの丸が抗体である。＊記号はP < 0.05を表し、＊＊記号はP < 0.01を表し、＊＊＊記号はP < 0.001を表す。これらはいずれも各時間における生理食塩水との比較である。＃＃記号は生理食塩水グループと比較してP < 0.01を表す。
【図２１】N1mAb抗体（#281-6）による処置が異種移植片腫瘍の増殖を有意に抑制したことを示す図である。白抜きの丸が生理食塩水、黒塗りの丸が抗体である。＊記号はP < 0.05を表し、＊＊記号はP < 0.01を表し、＊＊＊記号はP < 0.001を表す。これらはいずれも各時間における生理食塩水との比較である。＃＃記号は生理食塩水グループと比較してP < 0.01を表す。
【図２２】図２２ＡはBrdUを用いた免疫組織染色の結果である。図２２Ｂは陽性細胞数を計測した結果である。＊＊＊記号はP < 0.001を表す。BrdU染色はN1mAbが腫瘍の細胞増殖を有意に低減させたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
１．  発明の概要
本発明は、NLRR1タンパク質、好ましくはヒトNLRR1タンパク質、より好ましくはヒトNLRR1タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することのできる抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明の種々の態様を以下に説明する。
【００６１】
２．  用語の定義
本明細書において「抗体」という用語は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指すよう、最も広い意味で用いられ、例としては、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロ接合抗体；単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ等が挙げられる。本発明の抗体は、特に限定するものではないが、IgG、IgM、IgE、IgA、もしくはIgD分子又はそれらのサブクラスのもの、例えばIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4であり得る。本発明の抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等であり得るが、これに限定されない。本発明の抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書においてモノクローナル抗体のことをmAbと標記することがある。
【００６２】
抗体(Ig)は、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも2つの重(H)鎖(約50〜70 kDa)と2つの軽(L)鎖(約25 kDa)を含む。重鎖は重鎖可変ドメイン（VH）と定常ドメイン（CH1）、ヒンジ領域、そしてさらに２つの定常ドメイン（CH2、CH3）を含む。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLを含む。VH及びVLはさらに、「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれるより保存された領域がその間に介在する「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる超可変領域に細分される。各VH及びVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで整列する、3つのCDR及び4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。それぞれのドメインに対するアミノ酸の割付は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)の定義を用いることができる。
【００６３】
本明細書において「特異的に結合する」という用語は、抗NLRR1抗体について用いる場合、抗NLRR1抗体がNLRR1タンパク質と結合し、他の無関係なタンパク質とは全く結合しないか又はほとんど結合しないことを意味する。ただし、この用語は、抗NLRR1抗体が関連分子（例えばNLRR2やNLRR3）と全く交差反応しないことまでは意図しない。好ましくは本発明の抗NLRR1抗体は、例えばNLRR2やNLRR3タンパク質と結合するよりも少なくとも10、50、100、1000又は10000倍以上の親和性でNLRR1タンパク質と結合し得る。
【００６４】
本明細書において抗体の「抗原結合断片」とは、抗原（例えばNLRR1）に対して特異的に結合する抗体の１つ又は複数の断片を指す。例としては、Fab、F(ab')2、Fv、dAb、scFv等が挙げられる。例えばScience 242:423-426, 1988及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988を参照されたい。本発明の抗体は二重特異性抗体とすることもできる。(例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993；Structure 2:1121-23, 1994を参照のこと)。本発明の抗体又はその抗原結合断片を、本発明の抗体等ということがある。
【００６５】
「中和する」という用語は、本明細書中で用いる場合、in vitro又はin vivoでの、抗NLRR1抗体の非存在下でのNLRR1タンパク質の活性と比較して、本明細書中に記載されるような抗NLRR1抗体の存在下ではNLRR1タンパク質の生物学的活性の１つ又は全てが低減される又は無効化されることを意味する。また本明細書では、NLRR1タンパク質を中和する、との語と、NLRR1タンパク質の機能を阻害する、との語は、相互に交換可能に用いられる。
【００６６】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンに特異的に結合できる抗原の一部のことをいい、抗原決定基と呼ばれる。エピトープは一般的にアミノ酸、炭水化物、又は糖側鎖のような分子の化学活性表面基からる。エピトープは、「直線状」であってもよく、又は「不連続」であってもよい。直線状のエピトープの場合、タンパク質と抗体等との相互作用点は全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に起こる。不連続エピトープでは、相互作用点は互いに分離されるタンパク質上でアミノ酸残基を超えて起こる。抗原上のエピトープが決定されると、そのエピトープに対する抗体を作製することができる。あるモノクローナル抗体が認識するNLRR1タンパク質上のエピトープを解析し、次に同じエピトープに結合する抗体を競合的にスクリーニングすることもできる。例えば国際公開第03/48731号を参照のこと。
【００６７】
３．  抗NLRR1モノクローナル抗体の調製方法
本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体を得る方法としては、抗原を、場合により適当なアジュバントと併用して、動物を免疫し、得られたリンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマを作製する方法が挙げられる。別の方法としては、ファージディスプレイライブラリーを用いることもできる。
【００６８】
３．１  抗原の調製
本発明において、免疫抗原は、公知の方法により作製することができる。例えばヒトNLRR1タンパク質の調製法及び精製法については、C末端にヒスチジンタグやmycタグを付加した融合NLRR1タンパク質に対して、ヒスチジンタグ抗体やmycタグ抗体、または亜鉛-付加固体支持体またはコバルト-付加固体支持体を用いて分離することができる。まず精製したNLRR1タンパク質を用意する。次いでこれを、適当なアジュバントと混合する。アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
【００６９】
本発明において、免疫原であるNLRR1タンパク質又はその一部は、ヒト由来、哺乳動物由来、遺伝子組み換え技術により産生された物又は人工合成されたものでありうる。免疫原は好ましくはNLRR1タンパクの細胞外ドメイン又はその一部である。NLRR1タンパクの細胞外ドメインは配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１−６３２位である。本発明の免疫原はNLRR1タンパクの細胞外ドメインである配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１−６３２位のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよく、さらには配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。これらの場合、免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からみて、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加若しくは修飾を施したアミノ酸配列でありうる。本明細書で核酸又はアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加若しくは修飾に関連して用いる「１又は数個」とは、通常１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。本発明の免疫原は、配列番号１で示されるNLRR1のアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドを含むものであり得る。NLRR1タンパク質又はその一部は、ヒト由来、哺乳動物由来、遺伝子組み換え技術により産生された物又は人工合成されたものでありうる。
【００７０】
免疫する動物は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジなどが挙げられる。抗原の動物1匹あたりの投与量は、動物の体重にもよるが、例えば100〜1000μgである。アジュバント無し又はアジュバントを伴う抗原での免疫は、主として抗原を静脈内、皮下、腹腔内、筋中等に注射することにより行う。免疫は単回でも複数回でもよい。複数回の場合、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜3週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。抗体価は吸光度等により評価することができる。
【００７１】
採取した血液は遠心分離する。得られた血清を段階希釈し、酵素免疫測定法（ELISA）や放射性免疫測定法等で抗体価を測定し、抗原に対する抗体価の高い免疫動物にさらに免疫を施す。上記は例示であり、抗原の免疫と抗体価の測定法はこれに限定されない。
【００７２】
３．２  抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫した動物の脾臓細胞又はリンパ節等から調製し、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離するのが好ましい。
【００７３】
３．３  細胞融合
上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら増殖し得るハイブリドーマ細胞を作製するために細胞を融合させる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用できる。使用する細胞株としては、HAT選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3U1、P3-X63-Ag8(ATCC TIB9)、P3-X63-Ag8-U1(JCRB 9085)、P3-NS1-1-Ag4-1(JCRB 0009)、P3-X63-Ag8・653(JCRB 0028)及びSP2/O-Ag-14(JCRB 0029)等が挙げられる。
【００７４】
細胞融合は、一例として、DMEMやRPMI1640培地などで、1×106〜1×107個/mLの脾臓細胞及びリンパ節細胞と１×105〜１×106個/mLのミエローマ細胞を混合し（脾臓細胞及びリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比は5：1が好ましい）、場合により細胞融合促進剤存在下で融合を行う。細胞融合促進剤としては、例えば平均分子量200〜20000 Daのポリエチレングリコールを使用できる。また、電気刺激を利用したエレクトロポレーションを用いることもできる。融合後、例えば10〜20%FCS含有RPMI1640培地などで作製したHAT培地で希釈後、96ウェル培養プレートの各ウェルに0. 5〜3×103個の細胞を播種し、CO2インキュベーターで培養する。
【００７５】
３．４  ハイブリドーマの樹立
細胞融合後に、目的ハイブリドーマを選別する。細胞融合後に例えばHAT培地で選択された陽性コロニーについて、96ウェル培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、抗原に対する抗体価の有無を確認する。確認は、ELISAやウェスタンブロット等の免疫測定法等により行うことができる。抗体陽性ウェルを確認できたらクローニングのために細胞を移す。その際、アミノプテリンを含まない培地を用いると、非融合細胞を除ける。
【００７６】
選択された陽性ウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングする。クローニングは、例えば細胞懸濁液を適当な培地で希釈後、96ウェルプレートの各ウェルに0.1〜2個入るように細胞を播種する。その後、各ウェルの培養上清を確認し、抗体価を確認する。選択された細胞を適当に増殖させハイブリドーマを樹立する。この操作は複数回反復してもよい。
【００７７】
３．５  交差反応性について
ある実施形態において、本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体は、他のタンパク質、例えば他のNLRRファミリーのタンパク質と交差反応しない又はほどんと交差反応しないものであり得る。交差反応性については、上記のハイブリドーマを選別する工程において、NLRR2、NLRR3との反応性をELISAや放射性免疫測定法等により確認することができる。これによりNLRR1とは結合するが、NLRR2にもNLRR3にも結合しないクローンを選択することができる。NLRR1と他のNLRRファミリーのタンパク質のアミノ酸配列を比較して、NLRR1固有の配列（非相同性領域の配列）に基づく免疫原を使用してモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００７８】
３．６  モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマから以下の方法で抗NLRR1モノクローナル抗体を精製する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を適当に調製し、1〜2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマ細胞を投与し、ハイブリドーマを増殖させ、その後腹水を採取する。
【００７９】
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。抗体の精製方法としては、特に限定するものではないが、プロテインAセファロースカラムクロマトグラフィーを用いる方法、プロテインGアフィニティカラムで精製する方法、NLRR1アフィニティカラムを用いる方法、硫安とゲルろ過を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィーを用いる方法、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００８０】
本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、便宜上、本明細書において抗NLRR1モノクローナル抗体TB0777#281-6産生ハイブリドーマと呼ぶことがある。抗体TB0777#281-6産生ハイブリドーマは、寄託者  中川原章（郵便番号260-8717日本国千葉県千葉市中央区仁戸名町６６６−２  千葉県がんセンター内）により、2013年4月25日付で、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室）に、受託番号NITE BP-01595として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００８１】
３．７  モノクローナル抗体のスクリーニング方法
上記の手順により本発明者らは抗NLRR1モノクローナル抗体を取得した。得られたモノクローナル抗体又はそのCDR配列に関する知見を利用して、好ましい結合特性を有するモノクローナル抗体をさらに取得することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含むモノクローナル抗体のスクリーニング方法を提供する：
ａ）  NLRR1細胞外ドメイン又は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化によりNLRR1細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を取得する工程、
ｂ）  エピトープとの反応性に基づき、又は、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体との競合に基づき、配列番号１で示されるNLRR1のアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）及びそれらの組合せからなる群より選択されるペプチドにより形成されるエピトープに結合することができるモノクローナル抗体を選択する工程
c)  工程b)により選択されたモノクローナル抗体を、癌細胞と混合し、当該癌細胞の生存性を有意に低下させることのできるモノクローナル抗体を選択する工程。
【００８２】
ここで抗体を癌細胞と混合するとは、抗体を癌細胞と物理的に接触させることを言う。混合は溶液中に含まれる又は固相に担持された抗体を、溶液中、ウェル内、又はプレート上の細胞と接触させるといった態様を包含する。本発明のスクリーニング方法に用いることのできるNLRR1細胞外ドメインはヒトNLRR1由来に限られない。競合は表面プラズモン共鳴により評価しうる。競合という用語は、第一抗体も第二抗体も同じ抗原に結合可能であり、第一抗体とエピトープとの結合が、第二抗体の非存在下での結合と比較して第二抗体存在下で有意に減少することをいう。工程a)において非ヒト哺乳動物を免疫する代わりに、ファージディスプレイライブラリーを使用することもできる。
【００８３】
４．  ヒト化
本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。ある実施形態において、本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体は本発明のハイブリドーマ（受託番号NITE BP-01595）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、ヒト化された抗体又は抗体断片である。
【００８４】
マウス抗体は慣用の技術を用いてヒト化することができる。抗体をヒト化すると抗体自身の抗原性が低減され、より治療用途に適したものとなる。ヒト化抗体を得るには、マウス抗体などを産生するハイブリドーマの、抗体可変領域をコードする塩基配列を決定し、次いでこの塩基配列情報を基に遺伝子組み換え技術を用いて鋳型となるヒト抗体中にマウス抗体由来の可変領域アミノ酸配列をグラフトする方法などが挙げられる。抗体をヒト化する公知の方法としては、例えば米国特許出願第10/923,068号を参照されたい。他の公知の方法も使用されうる。マウス抗体の可変領域を使用し、これをヒト抗体の定常領域と連結したものをキメラ抗体と呼ぶことがある。本発明はこのようなキメラ抗体も包含する。
【００８５】
４．１  ハイブリドーマが産生する抗体のアミノ酸配列の解析
以下にマウス抗体などを産生するハイブリドーマから、抗体可変領域をコードするcDNAをクローニングする方法を示す。
【００８６】
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をコードするDNAをプローブとして用い、VH又はVLをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVH又はVLの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりVH又はVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【００８７】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のVH又はVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、PCRによりVH又はVLをコードするcDNAを調製することもできる。
【００８８】
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素等で切断後、適当なプラスミドにクローニングし、塩基配列を解析する。決定した塩基配列からVH及びVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。これを元に、遺伝子組み換え技術によりヒト化抗体を作製することができる。また、マウスを免疫する際にXENOMOUSE(登録商標)を使用し、ヒト抗体を得ることもできる。
【００８９】
ヒト抗体としては任意のヒト抗体の重鎖及び軽鎖を有するものを使用する。遺伝子組み換えには適当な動物細胞用発現ベクターと動物細胞用発現用プロモーター、エンハンサーなどを利用する。
【００９０】
５．  モノクローナル抗体の性質
５．１  結合特性
ある実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、NLRR1に結合する。別の実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、NLRR1の細胞外ドメインに結合する。NLRR1の細胞外ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１〜６３２位である。さらなる実施形態において本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、NLRR1のIg様ドメイン及びフィブロネクチンIII型ドメインを含むペプチド又は配列番号２で表されるペプチドに結合する。さらなる実施形態において本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、NLRR1のエピトープ１〜５（それぞれ配列番号３〜７）又はそれらの組合せを有するペプチドに結合する。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、上記の結合特性を有し、かつNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができるものである。
【００９１】
本発明に係るモノクローナル抗体の親和性定数(KD)はELISA、RIA、フローサイトメトリー、またはBIACORE(商標)のような表面プラズモン共鳴によって測定することができる。これにより他の抗体との競合性を評価することができ、また、抗体と他のタンパク質との交差反応性を分析することもできる。
【００９２】
５．２  機能的同等物
ある態様において、本発明には、上記の抗NLRR1モノクローナル抗体に対して80％より高い、85％より高い、90％より高い、95％より高い、96％より高い、97％より高い、98％より高い、又は99％より高い配列同一性を有する可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体が含まれる。
【００９３】
ある態様において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域を有する抗体と比較して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたものであって、NLRR1、好ましくはNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制しうるものである。別の態様において本発明に係る抗体又はその抗原結合断片のCDR配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列と比較して、１又は数個のアミノ酸が置換されたものであって、NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制しうるものである。これらの態様において、置換は保存的アミノ酸置換でありうる。保存的アミノ酸置換はCDR配列に行ってもよい。本明細書において「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質(たとえば、電荷または疎水性)を有する側鎖基を有する別のアミノ酸残基によって置換されていることをいう。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる：
（i）アラニン（Ａ），グリシン（Ｇ）；
（ii）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）；
（iii）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）；
（iv）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）；
（v）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）；
（vi）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）；
（vii）セリン（Ｓ），トレオニン（Ｔ）；および、
（viii）システイン（Ｃ），メチオニン（Ｍ）。   
例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 第2版(1993)を参照されたい。
【００９４】
ある態様において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列は、配列番号９のアミノ酸配列で特定される重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列で特定される軽鎖可変領域をコードする塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。別の態様において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片のCDR配列をコードする塩基配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。なおかつこれらの塩基配列は、NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら,Molecular Cloning 第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、6〜10×SSC（1.5M NaCl、0.15M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSCとする）、25〜50％フォルムアミドを含む溶液中で25〜45℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50℃にて洗浄する。
【００９５】
ある実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列で特定される重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列で特定される軽鎖可変領域と、８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ該抗体又はその抗原結合断片はNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる。
【００９６】
ある実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片のCDR配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列と９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ該抗体又はその抗原結合断片はNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる。この場合、抗体のCDR配列とは、重鎖及び軽鎖に含まれる６つのCDR（重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3)を合わせたものをいう。したがってある抗体のCDR配列との同一性％を計算する場合、これは６つのCDRを合わせた配列に対して計算を行う。
【００９７】
アミノ酸配列について「％配列同一性」という用語は、最も多くのアミノ酸残基が対応するよう整列（アライメント）させた場合に、配列中の全アミノ酸位置のうち、ある位置におけるアミノ酸残基が同じである位置のパーセンテージを意味する。アミノ酸配列同一性は適当な公知のアルゴリズムやそれを用いたソフトウェア（FASTA、Gap、Bestfit等）により決定できる。
【００９８】
５．３  標識、薬剤コンジュゲート化、融合タンパク質
ある実施形態において、本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、当技術分野で公知の手法により標識することができる。標識の例としては、フルオレセイン及びローダミンのような蛍光分子での蛍光標識、放射性同位体標識、ルシフェリンのような化学発光団での標識、ビオチン、アビジン、並びにクロム（III）、ガドリニウム（III）、鉄（II）等の磁気共鳴イメージング用の常磁性イオン標識が挙げられるがこれに限らない。放射性同位体としては、131I、125I、111In、2llAt、90Y、186Re、188Re、153Sm、2l2Bi、32P等が挙げられ、これらを例えばクロラミンT法等により抗体に結合させることができる。放射性同位体標識したNLRR1抗体は、癌細胞が発現するNLRR1タンパク質に結合することから、当該癌を標的として特異的に放射性核種を送達し、癌細胞又は組織を損傷または死滅させ得る、と当業者であれば理解する。このように標識抗体は、イメージング試薬として使用できるのみならず、細胞毒性試薬又は癌標的化薬剤ともなり得る。
【００９９】
本発明は、本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、及び融合パートナータンパク質又はドメインを含み、場合により両者は適当なリンカーにより連結されていてもよい。当業者であれば、公知の遺伝子工学的手法を用いてこうした融合タンパク質を作製しうる。融合パートナータンパク質又はドメインの例としては、蛍光タンパク質、GFP、RFP、ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げられるがこれらに限られない。
【０１００】
本発明において標識、コンジュゲート薬剤、融合パートナーは、１又は複数であってもよく、複数の場合は同一種類又は異なる種類のものを用いることができる。また、標識、コンジュゲート薬剤、融合パートナーを相互に組合せることもできる。例えば125I標識され、且つGFPと融合された抗体等も本発明に包含される。
【０１０１】
ある態様において、本発明は、NLRR1タンパク質の細胞外ドメインへの結合について、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と競合し、かつ、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０２】
５．４  診断剤、診断法等
本発明は、NLRR1抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患の診断剤を提供する。ある態様において診断剤のことを診断薬又は診断試薬ということがある。また本発明は抗NLRR1抗体又はその抗原結合断片及び製薬上許容される賦形剤を含む診断用組成物を提供する。本発明に係る診断剤又は診断用組成物はNLRR1タンパク質に関連する疾患、例えば癌の診断、検査、検出に用いることができる。このような診断剤又は診断用組成物は、キットの形態で提供されうる。
【０１０３】
さらに、本発明は、NLRR1タンパク質に関連する疾患の診断方法及び診断を補助する方法を提供する。ここで、診断とはある被験体が癌等の疾患に罹患しているか否かを判断することをいう。すなわち、本発明に係る診断方法は、本発明の抗体又は抗原結合断片を被験体と接触させること、及び該被験体が癌等のNLRR1タンパク質に関連する疾患に罹患しているか判断することを含む。また、本明細書において診断を補助する方法は、医師の判断を介さずに、診断に有用な情報を提供することを含む。本発明に係る診断を補助する方法は、該診断剤又は診断用組成物を、NLRR1タンパク質に関連する疾患の疑いのある被験体から取得されたサンプルと接触させる工程、及びサンプル中のNLRR1タンパク質発現の増大を調べることにより、該サンプルがNLRR1タンパク質に関連する疾患を有する被験体由来であるか否かを決定する工程を含む。
【０１０４】
本発明におけるサンプル（試料）としては、ヒトの血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液；便；血管若しくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は便、臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、NLRR1又はその細胞外ドメインが含まれる可能性のある生体サンプルが挙げられる。サンプルは生検法により採取された細胞又は組織とすることができる。NLRR1タンパク質発現の増大が認められれば、当該サンプルは陽性と判断、判定又は決定され得る。これにより該サンプルがNLRR1タンパク質に関連する疾患を有する被験体由来であるか否かを決定することができる。標識された抗体の検出は公知のアッセイ法、例えばELISA、RIA、フローサイトメトリー、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット等のイムノアッセイにより行うことができる。
【０１０５】
５．５  イメージング試薬、イメージング方法
本発明はさらに、NLRR1抗体、その抗原結合断片又はその融合タンパク質を含む、イメージング用試薬を提供する。また本発明は、該イメージング試薬を用いたイメージング方法を提供する。このイメージング方法では、該イメージング試薬と、細胞、組織、これらを含むサンプル又は被験体とを接触させ、NLRR1タンパク質発現が増大している細胞、組織や部位などを識別する。すなわち、本発明は、サンプル又は被験体中のNLRR1タンパク質発現細胞を含む部位を特定する免疫染色方法を提供する。例えばこれにより転移癌を検出したり、外科手術に役立てることができる。ここで接触とは、本発明の抗体またはその抗原結合断片とNLRR1タンパク質又はその細胞外ドメインとを、抗体がNLRR1タンパク質に結合しうるように、又はNLRR1タンパク質の活性に影響しうるように物理的に一緒にすることをいう。接触は、インビトロで、試験管内で、若しくはプレート上で行うことができ、又は、細胞サンプルや組織サンプルについて、若しくは被験体中で行われうる。
【０１０６】
５．６  薬剤コンジュゲート
別の実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を、１以上の薬剤とコンジュゲートすることができる。コンジュゲートされる薬剤としては、低分子化合物、細胞障害物質、抗癌剤、例えば神経芽腫、肺癌、乳癌等に対する抗癌剤や抗生物質などがあげられる。抗体の薬剤コンジュゲート化は当技術分野で慣用されている方法により行うことができる。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、PEG化、又はN-グリコシル化等、適宜修飾されたものである。
【０１０８】
本発明は上記の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を包含する。また本明細書においてヌクレオチド配列に言及した場合、これは特に断らないかぎりその相補配列への言及を含むものとする。
【０１０９】
６．  治療剤、医薬組成物
本発明は、NLRR1抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患の治療剤を提供する。別の実施形態において、本発明は、NLRR1抗体又はその抗原結合断片及び製薬上許容される担体を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患を治療するための医薬組成物を提供する。このような治療剤又は医薬組成物はキットの形態で提供されうる。
【０１１０】
本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を含む治療剤又は医薬組成物は、NLRR1タンパク質の発現増大に関連する疾患の治療又は予防に使用できる。NLRR1タンパク質の発現増大に関連する疾患としては、癌、特にNLRR1タンパク質の発現が増大した癌が挙げられる。癌の例としては、神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せが挙げられるがこれらに限られない。NLRR1タンパク質の発現が増大した癌としては、例えば神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、前立腺癌、及び骨肉腫が挙げられるがこれらに限られない。当業者であれば、ある癌細胞においてNLRR1タンパク質の発現が増大しているか、慣用の技術を用いて決定することができる。当業者であれば、本発明に係る医薬組成物をこれらの癌に使用できる、と理解する。
【０１１１】
また、NLRR1タンパク質の発現が増大した癌が、ある組織から別の組織に転移した場合にも、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片がNLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合しうることに変わりはなく、よって本発明に係る医薬組成物は、転移癌の治療にも使用できる、と当業者であれば理解する。よって本発明の医薬組成物は、上記の種類の原発性癌のみならずこのような転移癌にも使用可能である。
【０１１２】
７．  治療法
本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、そのまま、又はこれを含む医薬組成物の形態で、被験体に投与若しくは処置することができる。これにより、NLRR1タンパク質の発現が増大している癌を治療、予防、又は処置することができる。ここでいう癌の治療、予防、又は処置とは、癌細胞を死滅させることのみならず、癌細胞の増殖を抑制若しくは停止させること、癌細胞数を低減すること、癌組織の拡大を阻止すること、癌組織を縮小させること、癌の転移を阻止若しくは予防すること、転移癌の進行を停止させること、転移癌細胞を死滅させることを包含する。
【０１１３】
７．１  投与経路、剤形
本発明に係る医薬組成物は、種々の投与経路により被験体に送達することができる。投与経路としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられるがこれに限られない。組成物は、任意の好都合な経路、例えば注入又はボーラス投与によって、上皮又は皮膚粘膜の内膜を通じた吸収によって投与されることができる。本発明に係る医薬組成物は、適当な剤形、例えば注射可能な溶液剤、分散剤または懸濁液剤、錠剤、丸剤、粉剤、リポソーム、および坐剤のような液体、半固体、固体投与剤形であってもよい。剤形は、治療用途や投与経路に応じて選択できる。経皮投与の剤形の例としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、及び貼付剤があげられる。投与は全身性又は局所であってよい。当業者であれば、癌が進行しており転移癌の可能性が疑われる場合など、癌の進行の程度に応じて投与範囲を局所とするか全身とするか判断し得る。
【０１１４】
７．２  用量、投与期間
本発明に係る医薬組成物は、治療上効果的な用量で投与され得る。当業者であれば、被験体の年齢、症状、癌の種類、形態、進行の程度に応じて適宜投与方法又はレジメンを設定できる。投与量としては、例えば、1回につき体重1 kg当たり活性成分が0.0001 mg〜100 mgの範囲としうる。ヒトの場合、活性成分の投与量は0.001〜1000 mg/kg体重の範囲としうる。投与回数は、単回でもよく、複数回でもよい。投与期間は１日〜6ヶ月以上でありうる。
【０１１５】
７．３  他の薬剤との併用
本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１以上の他の薬剤、例えば抗癌剤と併用して癌治療に用いることができる。本発明は特定の理論に限定されるものではないが、ある態様において次のことが考えられる。説明すると、NLRR1はEGFRと相互作用して複合体形成することが報告されている（特許文献１）。また、本発明者らはNLRR1がEGFRやIGFRなどの受容体の細胞膜上での分布を調節し、EGF及びIGF-1により媒介される細胞外シグナル調節キナーゼの活性化を通して細胞増殖を正に調節することを報告した（非特許文献３）。したがって、当業者であれば、これらの知見から、抗NLRR1モノクローナル抗体とともにEGFR阻害剤又はIGF-1阻害剤、さらには細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤を併用すれば、特に治療効果の増大を期待することができる、と理解する。同様の理由から、HER2阻害剤、HER3阻害剤、HER4阻害剤、IGF-1レセプター阻害剤、Trkレセプター阻害剤、FGF受容体阻害剤、PDGF受容体阻害剤、VEGF受容体阻害剤も併用することができる。なぜならば、これらのタンパク質は、EGFやIGF-1と同様に、細胞外からのリガンドが細胞膜上に分布する受容体と結合することにより活性化し、細胞増殖を促進するシグナルを細胞内に伝達することにより細胞増殖を促進することから、EGFRと同様にこれら受容体も細胞膜上においてNLRR1による影響を受けると考えられるからである。ここで、本明細書において、細胞増殖シグナルに関連するタンパク質とは、正常および腫瘍細胞の増殖を調節する受容体チロシンキナーゼまたは変異したチロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼまたは異常に活性化したセリン／スレオニンキナーゼと、これらを活性化するリガンドタンパク質、およびこれらキナーゼの基質となり活性化されるタンパク質をいう。細胞増殖シグナルに関連するタンパク質としては、EGF、IGF-1、IGF-２、 TGF-α、アンフィレギュリン(amphiregulin)、HB-EGF、ニューレギュリン(neuregulin)、ベータセルリン（betacellulin)、エピレグリン(epiregulin)、NGF、BDNF、FGF、PDGF及びVEGFからなる群から選択されるタンパク質が挙げられるがこれらに限られない。
【０１１６】
併用は、本発明の抗体と１以上の他の薬剤の同時投与であっても逐次投与であってもよい。また本発明の抗体と１以上の他の薬剤とは同一の医薬組成物に含まれていてもよく、別々の医薬組成物に含まれてもよい。本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を他の薬剤と併用する場合、投与量は抗体と他の薬剤の用量を個別に決定することもできるが、併用効果に応じて適宜、本発明の抗体の用量又は他の薬剤の用量を、単独で用いるよりも少ない用量とすることができる。すなわち、ある実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片との併用により、副作用のある薬剤を、より低用量で使用し、副作用を軽減しつつ、用量を低減しなかった場合と比較して同等又はそれ以上の薬理効果を発揮することができる。別の実施形態では、薬剤耐性を有する細胞に対して、本発明の抗体と当該薬剤を併用することにより、細胞増殖抑制効果を高めることができる。これらを本明細書において相乗効果又は併用効果と呼ぶことがある。すなわち、本発明の抗体は１以上の他の薬剤と併用することにより相乗効果を発揮しうる。本発明の抗体と他の薬剤を併用する場合、これらを同一又は個別の成分として含むキットの形態で提供することができる。
【０１１７】
細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤としては、これらのタンパク質を標的とする阻害性化合物、抗体、これらのタンパク質をコードする核酸に対応するsiRNA, shRNA等が挙げられるがこれに限られない。
【０１１８】
７．３．１  EGFR阻害剤
「EGFR阻害剤」（「EGFRアンタゴニスト、EGFRインヒビター」ともいう）は、EGFR活性化又は機能と干渉する薬剤である。本明細書において阻害剤、アンタゴニスト、インヒビターのことを阻害剤等と呼ぶことがある。EGFR阻害剤の例は、EGFR結合EGFR抗体；EGFRリガンド抗体；小分子EGFRアンタゴニスト；EGFRチロシンキナーゼ・阻害剤；アンチセンス及び抑制RNA（例えばshRNA及びsiRNA）分子を含む（WO2004/87207参照）。好ましくは、EGFR阻害剤は、EGFRに結合する抗体又は小分子である。ある態様では、EGFR阻害剤は約1,000nM以下、100nM以下、又は50nM以下のEGFRへの結合能（解離定数）を有する。ある態様では、EGFR阻害剤は1,000nM以下、500nM以下、又は50nM以下のIC50でEGFRシグナリングを阻害する。
【０１１９】
EGFRに結合する抗体の例は、MAb579(ATCC CRL HB 8506)、MAb455 (ATCC CRL HB8507)、MAb225(ATCC CRL 8508)を含む、MAb528(ATCC CRL 8509)及びその変異体、例えばC225又はCetuximab; ERBITUX (登録商標）、再構築ヒト225(国際特許公報第96/40210号）；IMC-11F8；II型変異EGFR結合抗体（米国特許第5,212,290号）；米国特許第5,891,996号のEGFR結合抗体；EGFR結合抗体（例えばABX-EGF（国際特許公報第98/50433号）；EMD55900；EMD72000(matuzumab)；Panitumumab（Amgen社、CAS No. 339177-26-3）、RH3（York Medical Bioscience Inc.社）、MDX-447（Medarex/ Merck KgaA社、Cancer Immunol Immunother. 2008 Feb;57(2):155-63参照）及びmAb806（Structure. 2006 Mar;14(3):401-14参照）又はヒト化mAb806を含む。
【０１２０】
EGFR阻害剤としては、PD-158780（Pfizer社, CAS No. 171179-06-9、N4-(3-Bromophenyl)-N6-methylpyrido[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine）、AG-1478（University of California, CAS 153436-53-4、N-(3-Chlorophenyl)-6,7-dimethoxy-4--quinazolinanine hydrochloride）、CGP-59326（Novartis社、Int J Cancer. 1998 Mar 30;76(1):154-63参照）、AG490（チルホスチン、CAS No. 133550-30-8、(E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide）、ARRY-334543（Array BioPharma社、CAS No. 845272-21-1、N4-[3-Chloro-4-(2-thiazolylmethoxy)phenyl]-N6-[(4R)-4,5-dihydro-4-methyl-2-oxazolyl]-4,6-quinazolinediamine）及びそのジ4-メチルベンゼンスルホン酸塩、BIBW-2992（Boehringer Ingelheim Corp.社、Tomtovok (商標)、CAS No. 439081-18-2、N-[4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[[(3S)-tetrahydro-3-furanyl]oxy]-6-quinazolinyl]-4-(dimethylamino)-2-butenamide）、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2、、N-[4-[[1-[(3-Fluorophenyl)Methyl]-1H-indazol-5-yl]aMino]-5-Methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]carbaMic Acid (3S)-3-MorpholinylMethyl Ester、Bristol-Myers Squibb社)並びにその塩酸塩及び水和物、OSI-774(Tarceva
(商標)、Erlotinib、CAS No. 183321-74-6、N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine)及びその塩酸塩；PD183805(Canertinib, ファイザー社、CI-1033、CAS No. 267243-28-7、N-{4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[3-(morpholin-4-yl)propoxy]quinazolin-6-yl}prop-2-enamide)及びその塩酸塩; ZD1839（Iressa（登録商標）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、CAS No. 184475-35-2、N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine);ZM105180((6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン, Zeneca社); BIBX-1382（CAS No. 196612-93-8、8-(3-Chloro-4-fluoroanilino)-2-((1-methyl-4-piperidyl)amino)pyrimido(5,4-D)pyrimidine）； PKI-166（Novartis, 4-[4-[1(R)-フェニルエチルアミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]フェノール、Clin Cancer Res October 1, 2005 11; 6908参照）； CL-387785（CAS No. 194423-06-8、N-[4-[(3-Bromophenyl)amino]-6-quinazolinyl]-2-butynamide）; EKB-569（Pelitinib、Wyeth Pharmaceuticals社, CAS No. 257933-82-7、(E)-N-(4-(3-chloro-4-fluorophenylamino)-3-cyano-7-ethoxyquinolin-6-yl)-4-(dimethylamino)but-2-enamide）； lapatinib（GW-2016、GW-572016またはラパチニブジトシラート, CAS 
No. 388082-78-8、GSK社、N-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]phenyl]-6-[5-[(2-methylsulfonylethylamino)methyl]-2-furyl]quinazolin-4-amine）; ZD6474（Vandetanib、Caprelsa(商標)、AstraZeneca Pharmaceuticals社、CAS No. 443913-73-3、欧州商標名ZACTIMA(商標)、N-(4-bromo-2-fluorophenyl)-6-methoxy-7-[(1-methylpiperidin-4-yl)methoxy]quinazolin-4-amine）; CUDC-101（CAS No. 1012054-59-9、7-[[4-(3-Ethynylphenylamino)-7-methoxyquinazolin-6-yl]oxy]-N-hydroxyheptanamide）; 及びAEE788（CAS No. 497839-62-0、6-[4-[(4-Ethyl-1-piperazinyl)methyl]phenyl]-N-[(1R)-1-phenylethyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine）が挙げられるがこれに限られない。また、EGFR阻害剤についてはUS5457105、US5679683、US6084095、US6455534、US6596726、US6713484、US6140332、US6399602、WO9924037、WO0132651も参照されたい。
【０１２１】
７．３．２  IGF-1阻害剤
「IGF-1阻害剤」（「IGF-1アンタゴニスト、IGF-1インヒビター」ともいう）は、IGF-1活性化又は機能と干渉する薬剤である。IGF-1阻害剤の例としては、抗IGF-1中和抗体；IGF-1リガンド抗体；小分子IGF-1アンタゴニスト、OSI-906（Linsitinib、シス-3-[8-アミノ-1-（2-フェニル-キノリン-7-イル）-イミダゾ[1,5-a]ピラジン-3-イ ル]-1-メチル-シクロブタノール、CAS No. 867160-71-2）、GSK1904529A (CAS No. 1089283-49-7、N-(2,6-Difluorophenyl)-5-[3-[2-[[5-ethyl-2-(methyloxy)-4-[4-[4-(methylsulfonyl)-1-piperazinyl]-1-piperidinyl]phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]imidazo[1,2-a]pyridin-2-yl]-2-(methyloxy)benzamide)、NVP-ADW742 (CAS No. 475488-23-4、5-(3-(benzyloxy)phenyl)-7-((1r,3r)-3-(pyrrolidin-1-ylmethyl)cyclobutyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine)、NVP-AEW541（CAS No. 475489-16-8、7-((1s,3s)-3-(azetidin-1-ylmethyl)cyclobutyl)-5-(3-(benzyloxy)phenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine）、GSK1838705A（CAS No. 1116235-97-2、2-(2-(1-(2-(dimethylamino)acetyl)-5-methoxyindolin-6-ylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamino)-6-fluoro-N-methylbenzamide）、AG-1024（CAS No. 65678-07-1、3-Bromo-5-t-butyl-4-hydroxy-benzylidenemalonitrile）等が挙げられるが、これらに限られない。
【０１２２】
７．３．３  HER2阻害剤
HER2阻害剤等は、HER2活性化又は機能と干渉する薬剤である。HER2阻害剤としては、TAK-165（CAS No. 366017-09-6、1-[4-[4-[[2-[(1E)-2-[4-(trifluorome-thyl)phenyl]ethenyl]-4-oxazolyl]methoxy]phenyl]but-yl]-1H-1,2,3-triazole）、CP-724,714（CAS No. 537705-08-1、2-Methoxy-N-[3-[4-[[3-methyl-4-[(6-methyl-3-pyridinyl)oxy]phenyl]amino]-6-quinazolinyl]-2-propen-1-yl]acetamide）、ABX-EGF（前掲）、lapatinib（前掲）、CUDC-101（前掲）、AEE788（前掲）、Afatinib (BIBW2992、CAS No. 439081-18-2、N-[4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[[(3S)-tetrahydro-3-furanyl]oxy]-6-quinazolinyl]-4(dimethylamino)-2-butenamide)及びそのマレイン酸塩若しくは塩酸塩、CI-1033 (Canertinib、CAS No. 267243-28-7、N-{4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[3-(morpholin-4-yl)propoxy]quinazolin-6-yl}prop-2-enamide)及びその二塩酸塩、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2、Bristol-Myers Squibb社、[4-[[1-(3-fluorophenyl)methyl]-1H-indazol-5-ylamino]-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]carbamic Acid, (3S)-3-Morpholinylmethyl Ester)及びその塩酸塩若しくは水和物、Neratinib (HKI-272、CAS No. 698387-09-6、(2E)-N-[4-[[3-chloro-4-[(pyridin-2-yl)methoxy
]phenyl]amino]-3-cyano-7-ethoxyquinolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide)及びそのマレイン酸塩、AZD8931（CAS No. 848942-61-0、2-(4-(4-(3-chloro-2-fluorophenylamino)-7-methoxyquinazolin-6-yloxy)piperidin-1-yl)-N-methylacetamide）、Arry-380（CAS No. 937265-83-3、N-(4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-7-yloxy)-3-methylphenyl)-6-(5-((2-(methylsulfonyl)ethylamino)methyl)furan-2-yl)quinazolin-4-amine）、TAK-285（CAS No. 871026-44-7、N-(2-(4-(3-chloro-4-(3-(trifluoromethyl)phenoxy)phenylamino)-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-5-yl)ethyl)-3-hydroxy-3-methylbutanamide）、Tyrphostin AG 879 (AG 879、CAS No. 148741-30-4、(2E)-3-[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]-2-cyano-2-propenethioamide）、HER2抗体、例えばペルツズマブ（pertuzumab、CAS No. 380610-27-5）、トラスツズマブ（Trastuzumab、ハーセプチン（Herceptin)(登録商標)CAS No. 180288-69-1)が挙げられる。
【０１２３】
７．３．４  HER3阻害剤
HER3阻害剤等は、HER3活性化又は機能と干渉する薬剤である。HER3阻害剤の例としては抗HER3ヒトモノクローナル抗体製剤U31287（AMG888）（Amgen社）が挙げられるが、これに限られない。
【０１２４】
７．３．５  Trk受容体阻害剤
Trk受容体阻害剤等は、Trk受容体活性化又は機能と干渉する薬剤である。Trk受容体阻害剤の例としてはGW 441756（CAS No. 504433-23-2、1,3-Dihydro-3-[(1-methyl-1H-indol-3--yl)methylene]-2H-pyrrolo[3,2-b]pyridin-2-one）、BMS-754807（CAS No. 1001350-96-4、(S)-1-(4-(5-cyclopropyl-1H-pyrazol-3-ylamino)pyrrolo[1,2-f][1,2,4]triazin-2-yl)-N-(6-fluoropyridin-3-yl)-2-methylpyrrolidine-2-carboxamide）及びそのメタンスルホン酸塩が挙げられるが、これに限られない。
【０１２５】
７．３．６  FGF受容体阻害剤
FGF受容体阻害剤等は、FGF受容体活性化又は機能と干渉する薬剤である。FGF受容体阻害剤の例としてはBIBF1120 (Vargatef(商標)、Nintedanib、CAS No. 656247-17-5、methyl (3Z)-3-{[(4-{methyl[(4-methylpiperazin-1-yl)acetyl]amino}phenyl)amino](phenyl)methylidene}-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-6-carboxylate)並びにそのメタンスルホン酸塩及び塩酸塩、BGJ398 (NVP-BGJ398、CAS No. 872511-34-7、3-(2,6-dichloro-3,5-dimethoxyphenyl)-1-(6-((4-(4-ethylpiperazin-1-yl)phenyl)amino)pyrimidin-4-yl)-1-methylurea)並びにそのメタンスルホン酸塩、塩酸塩及び酢酸塩、AZD4547（CAS No. 1035270-39-3、N-(5-(3,5-dimethoxyphenethyl)-1H-pyrazol-3-yl)-4-((3S,5R)-3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzamide）が挙げられるが、これに限られない。
【０１２６】
７．３．７  PDGF受容体阻害剤
PDGF受容体阻害剤等は、PDGF受容体活性化又は機能と干渉する薬剤である。PDGF受容体阻害剤の例としては、Axitinib（AG013736、Inlyta(商標)、CAS No. 319460-85-0、N-Methyl-2-[[3-[(E)-2-pyridin-2-ylethenyl]-1H-indazol-6-yl]sulfanyl]benzamide）、Sunitinib（SU11248、Sutent(商標)、CAS No. 341031-54-7、N-(2-diethylaminoethyl)-5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide）及びそのマレイン酸塩であるSunitinib Malate(CAS No. 341031-54-7)、Tivozanib (AV-951、CAS No. 475108-18-0、1-{2-Chloro-4-[(6,7-dimethoxyquinolin-4-yl)oxy]phenyl}-3-(5-methylisoxazol-3-yl)urea)並びにその水和物及び塩酸塩、TSU-68 (SU6668、CAS No. 252916-29-3、(Z)-3-(2,4-dimethyl-5-((2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)-1H-pyrrol-3-yl)propanoic acid)、Telatinib (BAY 57-9352、CAS No. 332012-40-5、4-((4-(4-chlorophenylamino)furo[2,3-d]pyridazin-7-yloxy)methyl)-N-methylpicolinamide)並びにその4-メチルベンゼンスルホン酸塩及び塩酸塩、MK-2461（CAS No. 917879-39-1、N-((2R)-1,4-Dioxan-2-ylmethyl)-N-methyl-N'-[3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-oxo-5H-benzo[4,5]cyclohepta[1,2-b]pyridin-7-yl]sulfamide）が挙げられるが、これに限られない。
【０１２７】
７．３．８  VEGF阻害剤
VEGF阻害剤等は、VEGF活性化又は機能と干渉する薬剤である。VEGF阻害剤の例としては抗VEGF抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ（Bevacizumab、CAS No. 216974-75-3、アバスチン(商標)）が挙げられるが、これに限られない。
【０１２８】
７．３．９  VEGF受容体阻害剤
VEGF受容体阻害剤等は、VEGF受容体活性化又は機能と干渉する薬剤である。VEGF受容体阻害剤の例としてはAxitinib （前掲）、Sorafenib (Nexavar(商標)、CAS No. 284461-73-0、4-[4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methyl-pyridine-2-carboxamide)、Tivozanib (前掲)並びにその水和物及び塩酸塩、Cediranib (AZD2171、Recentin(商標)、CAS No. 288383-20-0、4-[(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yl)oxy]-6-methoxy-7-[3-(pyrrolidin-1-yl)propoxy]quinazoline)及びそのマレイン酸塩、並びに抗VEGF受容体2抗体、例えばRamucirumab(CAS No. 947687-13-0)が挙げられるが、これに限られない。
【０１２９】
上記の各種阻害剤の記載は、その無水物、水和物、製薬上許容される塩、塩酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、メチルスルホン酸塩、4-メチルベンゼンスルホン酸塩を包含するものとする。
【０１３０】
８．  ペプチド
本発明のペプチドはNLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制できるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するために用いることができる。すなわち本発明は、以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドを提供する：
(i)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(iii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【０１３１】
さらに本発明は、以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドを提供する。すなわち、
(i)  配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(ii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(iii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【０１３２】
本発明に係るペプチドは、好ましくは配列番号１で示されるNLRR1の第１−６１５位のアミノ酸配列を有し、かつNLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドである。別の実施形態において、本発明に係るペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
８．１  ペプチドワクチン
本発明に係る抗NLRR1モノクローナル抗体が認識するエピトープに関する知見に基づいて、いわゆるペプチドワクチンを作製することもできる。ペプチドワクチンは、哺乳動物（ヒトを含む）に投与したときに、当該動物における免疫応答を惹起する。本発明のペプチドワクチンは癌細胞が高発現するNLRR1タンパク質に対する免疫応答を惹起することにより、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制すると考えられ、これにより癌を治療しうる。本発明のペプチドワクチンは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１−６３２位のアミノ酸配列若しくは第１−６１５位のアミノ酸配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、かつNLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドであり得る。
【０１３４】
９．  本発明の有利な効果
以上をまとめると、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はNLRR1タンパク質又はNLRR1タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合することができ、NLRR1の機能を中和することができる。この特性を利用して、NLRR1タンパク質の発現が増大した癌細胞の増殖を抑制することができる。該抗体はそのまま又は適宜ヒト化若しくはキメラ化して、製薬上許容される担体と共に医薬組成物に用いることができる。医薬組成物として用いる場合、本発明に係る抗体は他の薬剤と併用してもよく、この場合、本発明に係る抗体及び／又は他の薬剤の用量を低減しつつも、低減しなかった場合と比較して同等又はそれ以上の薬理効果を発揮することができる。これにより薬剤の副作用の低減も可能となる。
【０１３５】
本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は診断剤又はイメージング試薬として利用することもできる。すなわち、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片を含む診断剤又は診断薬は、NLRR1タンパク質に関連する疾患、例えば癌の診断、検査、又は検出に用いることができる。また、任意に標識した抗体を使用し、対象と接触させ、NLRR1タンパク質の発現の有無を検出又はイメージングすることができる。イメージングにより転移癌の有無を検出したり、外科手術で摘出すべき癌組織部位を容易に特定できるようになる。別の態様において、放射性同位体又は抗癌剤で標識した抗体を使用し、NLRR1タンパク質を発現する癌細胞を標的として癌を治療することもできる。
【０１３６】
本発明に係るスクリーニング方法を用いて、NLRR1タンパク質に結合しかつNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することのできる抗NLRR1モノクローナル抗体を取得することができる。また本発明に係るペプチドを、該スクリーニング方法に使用することができる。さらに本発明に係るペプチドを用いて該抗体のエピトープ解析を行うことができる。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。【０１３８】
材料や試薬は特に断らない限り、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製したものである。【０１３９】
[実施例１]
各種成人癌とその正常組織におけるNLRR1タンパクの発現（免疫組織科学的検索）
ヒト各種成人癌（皮膚、肺、乳房、食道、胃、小腸、甲状腺）とその正常組織におけるNLRR1タンパク質の発現をヒツジNLRR1ポリクローナル抗体（R&D Systems）を用いて免疫染色により検討した。染色切片は、ヒト組織切片アレイNormal organs and cancers（SUPER BIO CHIPS社）を用いた。切片はキシレン・エタノール系列により脱パラフィンを行った。この切片を水に浸漬した後、０．３％過酸化水素−メタノールに３０分浸漬させた。ブロッキング試薬（DAKO社）を組織に載せて１０分反応させた後、１％BSAを含有したPBSで１０μｇ／ｍＬに希釈した抗NLRR1抗体を載せて４℃で１２時間反応させた。０．１％Tween−２０を含むＰＢＳを入れた容器に、切片を５分３回浸漬させた後、ビオチンが標識された抗ヒツジIgG抗体を１％BSAを含有したPBSに２００倍に希釈した二次抗体試薬を載せて、室温で３０分反応させた。アビジン・ビオチン試薬（VECTOR社）及びDABで発色反応を行った後、カバーガラスを載せて封入し、試料を得た。【０１４０】
成人癌組織、具体的には皮膚癌、肺癌、乳房癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌において正常組織に比べて高いNLRR1発現が認められた。結果を図１に示す。【０１４１】
[実施例２]
肺癌組織におけるNLRR1のmRNAの発現（リアルタイムPCR)
肺腺癌患者臨床検体１２検体、肺扁平上皮癌患者臨床検体９検体及びその非癌部正常組織よりtotal RNAをTrizol（Gibco BRL）用いて抽出した。cDNAは得られたtotal RNAからSuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen)を用いて合成した。NLRR1とβ-actinの発現はTaqManプローブ(Assay ID: Hs00979743_m1) 及び β-actinコントロール試薬（Applied Biosystems）を用いて、7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)により検出した。【０１４２】
その結果、癌部検体において非癌部検体と比べてNLRR1の高い発現を示す臨床検体が認められ、その平均値は癌部において有意に高かった。結果を図２に示す。図２Ａが検体とNLRR1発現の関係であり、図２Ｂが発現の平均である。【０１４３】
[実施例３]
市販癌組織ライセートアレイを用いたNLRR1タンパク質の発現
（肺癌及び前立腺癌）
ヒトの肺癌及び前立腺癌とその正常組織におけるNLRR1タンパク質の発現をそれぞれのライセートアレイ（Protein Biotechnologies社）を用いて検討した。NLRR1の発現はヒツジNLRR1ポリクローナル抗体（R&D Systems）を用いて検出を行った。【０１４４】
結果を図３に示す。肺組織、前立腺組織のいずれのアレイにおいても、癌組織由来ライセートにおいてNLRR1の高い発現が認められた。【０１４５】
[実施例４]
NLRR1の各ドメイン欠損タンパク質発現による細胞増殖及び増殖シグナル因子ERKのリン酸化への影響
乳癌由来細胞株MCF７において、空の発現ベクター、野生型NLRR1、ロイシン・リッチ・ドメイン（LRR）欠失型、イムノグロブリン様ドメイン（Ig）欠失型、ファイブロネクチン・タイプ３ドメイン（FNIII）欠失型のタンパク質を発現させ、細胞増殖をWST-8法により測定し（WST-8は高感度水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩である）、さらに細胞抽出液を回収し、ウェスタンブロット法により上皮成長因子（EGF）に応答する増殖シグナル因子の一つであるERKのリン酸化を検出した。【０１４６】
結果を図４に示す。FNIII欠失型NLRR1発現細胞において細胞増殖が有意に減少し（図４Ａ）、EGF添加に対するERKのリン酸化も減弱した（図４Ｂ）ことから、NLRR1が持つ細胞増殖を促進する機能はFNIIIが必要であることが分かった。【０１４７】
[実施例５]
抗ヒトNLRR1モノクローナル抗体の作製法
抗原としては、Myc-His Tag化されたヒトNLRR1細胞外ドメインを用いた。Myc-His Tag化されたヒトNLRR1細胞外ドメインについて、TALON(登録商標)コバルト樹脂カラム（Clontech社製）を使用し、製造業者の説明書に記載の手順に従って精製を行った。NLRR1細胞外ドメイン及び完全フロイントアジュバントの精製タンパク質（1:1）をマウスに注射した。注射した用量は１回当たり25μgであり、回数は３回であった。最終注射から３日後に、免疫したマウスからリンパ節細胞を取得し、これをポリエチレングリコール-400手法により、P3U1ミエローマ細胞と5:1の比で融合させた。ハイブリドーマの培養上清は、フローサイトメトリー解析（FCM）を用いて、抗NLRR1抗体を発現するトランスフェクタントについてスクリーニングした。スクリーニングにより得られた抗NLRR1抗体を発現するハイブリドーマを９６ウェル組織培養プレートを用いてクローニングし、ハイブリドーマクローンを樹立した。その後、同ハイブリドーマを用いてプロテインAセファロースカラムクロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製した。【０１４８】
上記の方法で得られたハイブリドーマのうちコロニーの増殖が見られたウェルの培養上清を、NLRR1細胞外領域の精製タンパク質を用いた固相ELISA法及びNLRR1全長を発現したCos7細胞株（NLRR1/Cos7)とその野生株（Cos7 W.T）を用いたフローサイトメトリー法に供し、抗NLRR1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。【０１４９】
固相ELISA法については吸光度（450nm）を測定し、吸光度が１．０以上のものを陽性ウェルと判定した。結果を図５に示す。縦と横のアルファベットと数字は、ウェルを識別するための番号であり、それぞれのマス内の数字は個別のクローンのOD450を表す。【０１５０】
フローサイトメトリー法については、NLRR1/Cos7細胞株を認識し、かつCos7 W.T細胞株に対して陰性を示したものを陽性と判定した。結果を図６に示す。縦と横のアルファベットと数字は、ウェルを識別するための番号であり、各クローンの位置は図５のそれと対応する。それぞれのマス内の数字はクローン番号を表す。両者のスクリーニングにおいて陽性を示す培養上清を選択した。特に、ELISAとフローサイトメトリーで陽性のクローン番号63、198、240、281、及び290を選択した。そのハイブリドーマを９６ウェル組織培養プレートに０．５個細胞／ウェルで播種することによりハイブリドーマ・クローンを樹立した。クローン化できたハイブリドーマの拡大培養を行い、モノクローナル抗体を含有する培養上清を取得した。【０１５１】
それら得られた培養上清のうち細胞増殖抑制効果を持つ抗体をさらにスクリーニングするために、培養上清が４０％又は９０％になるように１０％ＦＢＳを含む RPMI1640の培養液を調整し、それを用いてCHP134ヒト神経芽腫由来細胞株及びNLRR1安定発現SH-SY5Yヒト神経芽腫由来細胞株を５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。培養開始4日目に、Cell Counting Kit-8（Dojindo社）を用いたWST-8法により生細胞数を測定し、以下の計算式により細胞生存率を算出した。 
細胞生存率＝（Ｃ−Ｂ）ｘ１００／（Ａ−Ｂ）
Ａ：コントロール抗体添加ウェルの吸光度
Ｂ：バックグラウンド（細胞株非培養）ウェルの吸光度
Ｃ：抗NLRR1ヒトモノクローナル抗体を含む培養上清添加ウェルの吸光度。【０１５２】
結果を図７に示す。神経芽腫細胞株に対する増殖抑制効果の弱い抗体と強い抗体が認められた。このうち、低濃度の培養上清においても細胞増殖抑制効果が認められた培養上清（クローン240、281、290）について、プロテインＡ担体によるIgG分画の精製及び精製NLRR1タンパク質によるアフィニティ精製を行い、これを抗ヒトNLRR1モノクローナル抗体標品としてin vitroにおける機能解析に用いた。【０１５３】
[抗ヒトNLRR1モノクローナル抗体のサブクラス]
低濃度の培養上清により細胞増殖抑制効果を示した抗ヒトNLRR1モノクローナル抗体について、そのサブクラスをＥＬＩＳＡにより同定した。その結果、クローン240はIgG1、クローン281はIgG1、クローン290はIgM抗体を産生することが同定された。図７Ｂの右下を参照されたい。【０１５４】
［実施例６］
抗ヒトNLRR1モノクローナル抗体の細胞増殖抑制効果
上記の通り精製した各抗NLRR1モノクローナル抗体のうちIgG抗体を産生するクローン（クローン240及び281）を選択し、in vitroにおける細胞増殖抑制効果を下記の方法により測定した。NLRR1全長を発現したSH-SY5Y細胞株（SY5Y-N1)とその野生株（SY5Y-ctrl）を、１０％ＦＢＳを含むRPMI-1640培地を用い、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。各抗NLRR1モノクローナル抗体を培養液中に添加し、濃度依存的 （100、30、10、3、1、0 μg/mL）な細胞増殖抑制効果を測定した。細胞生存率は上記の通り算出した。結果を図８に示す。細胞増殖抑制効果をもつ抗体を複数取得した。【０１５５】
また、抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）の細胞増殖抑制効果を各種培養細胞株において検討した。抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）を終濃度２５μg/mLで添加した培養液中で、SK-N-DZ、NLF、SK-N-BE神経芽腫由来細胞株、MCF7乳癌由来細胞株、A549肺癌由来細胞株、及びSAOS2骨肉腫由来細胞株を5日間培養し、細胞密度をIncucyte（エッセンバイオサイエンス社）を用いて測定した。以下の計算式により細胞生存率を算出した。
細胞生存率＝Ｂｘ１００／Ａ
Ａ：コントロール抗体添加ウェルの細胞密度
Ｂ：抗NLRR1ヒトモノクローナル抗体添加ウェルの細胞密度【０１５６】
結果を図９に示す。抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）は各種神経芽腫由来細胞株に加え、乳癌、肺癌、及び骨肉腫由来細胞株においても細胞増殖抑制効果を示した。【０１５７】
[実施例７]
EGF受容体阻害剤との併用効果
A549肺癌由来細胞株及びNLRR1全長を発現したSH-SY5Y細胞株（SY5Y-N1)を１０％ＦＢＳを含むDMEM又はRPMI-1640培地を用い、5%炭酸ガス気流中、37℃で培養した。各抗NLRR1モノクローナル抗体（終濃度25μg／mL）とともにEGF受容体阻害剤であるAG1478を濃度依存的(10、1、0.1、0.01、0.001μM)に培養液中に添加し、細胞増殖抑制効果を測定した。その結果、図１０に示すように、抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）はNLRR1を発現する神経芽腫由来細胞（SY5Y-N1）及び比較的EGF受容体阻害剤に抵抗性を示す肺癌由来細胞（A549）において、EGF受容体阻害剤の効果を増強することが示された。【０１５８】
[実施例８]
抗NLRR1モノクローナル抗体の結合ドメイン解析
抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）のエピトープ探索方法の一つとして、NLRR1のＩｇドメイン欠損タンパク質及びフィブロネクチンIII型ドメイン欠損タンパク質に対する反応性を、これらのタンパク質の一過性発現HEK293細胞を用いたフローサイトメトリー法により調べた。【０１５９】
方法として、まずHEK293細胞をmyc-タグ化NLRR1欠失変異体発現ベクターでトランスフェクトした。次いでこれをNLRR1 mAb #281及び抗マウスIgG-Alexa488で免疫染色し、フローサイトメトリーを行った。【０１６０】
その結果、抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）はＩｇドメイン及びフィブロネクチンIII型ドメインを同等に認識することが示唆された。図１１に作製したNLRR1部分欠失変異体のアライメントを示す。これらのNLRR1欠失変異体を発現するベクターを使用し、抗NLRR1モノクローナル抗体が認識するドメインをフローサイトメトリーにより決定した結果を図１２に示す。ΔLRRでは野生型とほとんど差が見られず、LRRドメインは結合にさほど影響していないことが分かる。ΔIg及びΔFIIIではカウントが有意に減少したことから、欠失させたドメインを抗NLRR1モノクローナル抗体が認識していることを示す。【０１６１】
[抗NLRR1モノクローナル抗体のエピトープ解析]
抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）のエピトープをさらに詳細に特定する事を目的として、NLRR1のＩｇドメインからフィブロネクチンIII型ドメインまでの１２アミノ酸ずつ91種類合成したペプチドアレイを作製し（JPT社）、抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）の結合活性を調べた。その結果を図１６−１９に示す。これらの図に示すように、抗NLRR1モノクローナル抗体（TB0777#281-6）は少なくとも以下の複数のアミノ酸配列（配列番号３−７）を有するペプチドを認識することが示された。【０１６２】
便宜上、本明細書においてこれらをエピトープ１〜５とする。【０１６３】
NLRR1のエピトープ１（第４５６−４６５位）：  EIYWVTPIGN（配列番号３）
NLRR1のエピトープ２（第４７４−４８３位）：  DKYKLSSEGT（配列番号４）
NLRR1のエピトープ３（第５５６−５６１位）：  WSSATM（配列番号５）
NLRR1のエピトープ４（第５７８−５８１位）：  VHEY（配列番号６）
NLRR1のエピトープ５（第６０２−６０９位）：  HQQTQKSC（配列番号７）。【０１６４】
また、NLRR1タンパク質の全長配列と、各エピトープの位置を図１３に示す。エピトープ１及び２はIg様ドメイン中に含まれる。また、エピトープ３〜５はフィブロネクチンIII型ドメイン中に含まれる。エピトープ１、２と、エピトープ３〜５との位置が離れていること、及び上記のドメイン欠失変異体を分析した結果から、これらは不連続エピトープの可能性がある。【０１６５】
[実施例９]
[抗NLRR1モノクローナル抗体の異種移植片腫瘍の増殖に対する効果]
本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体の異種移植片腫瘍に対する影響を以下の手順により調べた。まず、SCIDマウスに異種移植片を接種した(5×106 NLRR1-安定SH-SY5Y細胞)。次いで腫瘍を増殖させた(>75 mm3)。次いで抗NLRR1モノクローナル抗体N1mAb 100 μg/マウスにて週２回、３週間にわたりマウスに腹腔内注射した。結果を図２０に示す。【０１６６】
より具体的には、雌SCIDマウスに、NLRR1を安定して発現するSH-SY5Y細胞を皮下接種し、これらのマウスを２つのグループ（１グループ当たり７匹のマウス）に無作為に分けた。これらのマウスに、生理食塩水または抗NLRR1モノクローナル抗体TB0777#281-6（N1mAb）(100μg)を週２回、３週間に渡り注射した（図２０の矢印記号）。結果は平均腫瘍容積±標準偏差(SD)として示す。グループ間での差異は、反復測定の分散分析（ANOVA）とそれに続くボンフェローニの事後検査により評価した。【０１６７】
[抗NLRR1モノクローナル抗体の異種移植片腫瘍の増殖に対する効果]
まず、SCIDマウスに異種移植片を接種する(5×106 CHP134細胞)。次いで腫瘍を増殖させた(>75 mm3)。その後、モノクローナル抗体TB0777#281-6を200 μg/マウスにて、週２回、３週間にわたり腹腔内注射を行った。結果を図２１に示す。【０１６８】
より具体的には、CHP134異種移植片を有するSCIDマウス(１グループ当たり７匹のマウス)に、生理食塩水または抗NLRR1モノクローナル抗体TB0777#281-6(200μg) を週２回、３週間に渡り腹腔内注射した（図２１の矢印記号）。グループ間での差異は、反復測定の分散分析（ANOVA）とそれに続くボンフェローニの事後検査により評価した。【０１６９】
[免疫組織染色]
生理食塩水または抗NLRR1モノクローナル抗体TB0777#281-6で処置したCHP134異種移植片腫瘍のパラフィン切片を作製し、次いでこれらを5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）を用いた免疫組織染色に供した。その後、陽性細胞数をカウントした。【０１７０】
より具体的には、BrdU処置(100 μg/g体重)の２４時間後に、CHP134腫瘍を有するすべてのマウスを犠牲にし、腫瘍組織のパラフィン切片をBrdU免疫組織染色に供して、細胞増殖を定量した。腫瘍組織におけるBrdU陽性細胞数は、高倍率視野(hpf)当たりの数をカウントした。結果を図２２に示す。データは各グループについて７匹のマウスから取得した平均±SDである。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体を用いると、NLRR1タンパク質に関連する疾患、特にNLRR1タンパク質の発現が増大している癌細胞、例えば神経芽腫細胞、肺癌細胞、及び乳癌細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の抗NLRR1モノクローナル抗体は癌治療用の医薬組成物として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列番号１    NLRR1のアミノ酸配列（716アミノ酸）
配列番号２    ペプチドアレイに用いたアミノ酸配列（191アミノ酸）
配列番号３    NLRR1のエピトープ１（第456-465位）EIYWVTPIGN
配列番号４    NLRR1のエピトープ２（第474-483位）DKYKLSSEGT
配列番号５    NLRR1のエピトープ３（第556-561位）WSSATM
配列番号６    NLRR1のエピトープ４（第578-581位）VHEY
配列番号７    NLRR1のエピトープ５（第602-609位）HQQTQKSC
配列番号８    抗NLRR1モノクローナル抗体TB0777#281-6の重鎖可変領域の塩基配列
配列番号９    TB0777#281-6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０  TB0777#281-6の軽鎖可変領域の塩基配列
配列番号１１  TB0777#281-6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２  TB0777#281-6の重鎖可変領域のCDR1：SYGVH
配列番号１３  TB0777#281-6の重鎖可変領域のCDR2：VMWAGGSTNYNSALMS
配列番号１４  TB0777#281-6の重鎖可変領域のCDR3：NWALAWFPY
配列番号１５  TB0777#281-6の軽鎖可変領域のCDR1：RSSQSLVHSNGNTYLH
配列番号１６  TB0777#281-6の軽鎖可変領域のCDR2：KVSNRFS
配列番号１７  TB0777#281-6の軽鎖可変領域のCDR3：SQSTHVPPT
配列番号１８−１０９  ペプチドアレイに用いた各ペプチドのアミノ酸配列。【０１７３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月7日(2016.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合する、NLRR1タンパク質の細胞外ドメインに結合し、かつ、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、及び第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）のペプチドにより形成されるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
モノクローナルである、請求項１または２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
以下のいずれか、
(i)  配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列において、１〜３個のアミノ酸が置換されたCDR配列を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、又は
(iii)  CDR配列が配列番号１２に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列の重鎖CDR2、配列番号１４に示すアミノ酸配列の重鎖CDR3、配列番号１５に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR2、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR3からなるCDR配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片、
である抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖が配列番号１２に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１３に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１４に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列のCDR1、配列番号１６に示すアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列のCDR3を有し、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗NLRR1モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号９に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含み、NLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
ヒト化された、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
キメラ抗体である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
以下のいずれかの核酸、すなわち
(i)  請求項３〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、
(ii)  重鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号８に示される塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列が配列番号１０に示される塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、又は
(iv)  前記(ii)の核酸の塩基配列において、１又は数個の塩基が、置換、欠失、又は付加された塩基配列を含み、かつNLRR1の細胞外ドメインに結合しNLRR1タンパク質の発現が増大した細胞の増殖を抑制することができる抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１０】
放射性同位体、化学発光団、蛍光分子、常磁性イオン、ビオチン又はアビジンで標識されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
薬剤とコンジュゲートされている、請求項１〜８及び１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
(i)請求項３〜８及び１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び、(ii)融合パートナータンパク質又は融合パートナードメインを含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
さらにリンカーを含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
融合パートナータンパク質又はドメインが、蛍光タンパク質、GFP、RFP、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びグルコアミラーゼである、請求項１２又は１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項３に記載の抗体を産生するハイブリドーマ、
ヒト化された、請求項３に記載の抗体を産生するハイブリドーマ、または
キメラ抗体である、請求項３に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のハイブリドーマを用いた抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜８及び１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質に関連する疾患の治療剤。
【請求項１９】
NLRR1タンパク質に関連する疾患が癌である、請求項１８に記載の治療剤。
【請求項２０】
癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、請求項１９に記載の治療剤。
【請求項２１】
さらに、１以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２２】
１以上の細胞増殖シグナルに関連するタンパク質の阻害剤が、EGF受容体阻害剤、HER2阻害剤、HER3阻害剤、HER4阻害剤、IGF−１受容体阻害剤、Trk受容体阻害剤、FGF受容体阻害剤、PDGF受容体阻害剤、VEGF受容体阻害剤、及び細胞増殖シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を標的とする小分子干渉性RNA(siRNA)阻害剤からなる群より選択される、請求項２１に記載の治療剤。
【請求項２３】
EGF受容体阻害剤が、PD-158780（CAS No. 171179-06-9）、AG-1478（CAS 153436-53-4）、CGP-59326、AG490（チルホスチン、CAS No. 133550-30-8）、ARRY-334543（CAS No. 845272-21-1）及びそのジ4-メチルベンゼンスルホン酸塩、BIBW-2992（Tomtovok(商標)、CAS No. 439081-18-2）、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)並びにその塩酸塩及び水和物、OSI-774(Tarceva(商標)、Erlotinib、塩酸塩のCAS No. 183319-69-9)、PD183805(Canertinib, CI-1033、CAS No. 289499-45-2)及びその塩酸塩、ZD1839（Iressa（登録商標）、ゲフィチニブ、CAS No. 184475-35-2)、ZM105180 ((6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン)、BIBX-1382（CAS No. 196612-93-8）、PKI-166（4-[4-[1(R)-フェニルエチルアミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]フェノール）、CL-387785（CAS No. 194423-06-8）、EKB-569（Pelitinib、CAS No. 257933-82-7））、lapatinib（GW-2016、GW-572016若しくはラパチニブジトシラート, CAS No. 388082-78-8、GSK社）、ZD6474（Vandetanib、Caprelsa(商標)、CAS No. 443913-73-3）、 CUDC-101（CAS No. 1012054-59-9）、及びAEE788（CAS No. 497839-62-0）からなる群より選択され、且つ／又は
IGF-1阻害剤が抗IGF-1中和抗体、IGF-1リガンド抗体、小分子IGF-1アンタゴニスト、OSI-906（Linsitinib、CAS No. 867160-71-2）、GSK1904529A (CAS No. 1089283-49-7)、NVP-ADW742 (CAS No. 475488-23-4)、NVP-AEW541（CAS No. 475489-16-8）、GSK1838705A（CAS No. 1116235-97-2）、AG-1024（CAS No. 65678-07-1）からなる群より選択され、
HER2阻害剤がTAK-165（CAS No. 366017-09-6）、CP-724,714（CAS No. 537705-08-1）、ABX-EGF、lapatinib、CUDC-101、AEE788、Afatinib (BIBW2992、CAS No. 439081-18-2)及びそのマレイン酸塩若しくは塩酸塩、CI-1033 (Canertinib、CAS No. 267243-28-7)及びその二塩酸塩、BMS-599626 (AC480、CAS No. 714971-09-2)及びその塩酸塩若しくは水和物、Neratinib (HKI-272、CAS No. 698387-09-6)及びそのマレイン酸塩、AZD8931（CAS No. 848942-61-0）、Arry-380（CAS No. 937265-83-3）、TAK-285（CAS No. 871026-44-7）、Tyrphostin AG 879 (AG 879、CAS No. 148741-30-4）、HER2抗体、ペルツズマブ（pertuzumab、CAS No. 380610-27-5）、トラスツズマブ（Trastuzumab、ハーセプチン（Herceptin)(登録商標)CAS No. 180288-69-1)からなる群より選択され、且つ／又は
HER3阻害剤が、抗HER3ヒトモノクローナル抗体、U31287（AMG888）からなる群より選択され、且つ／又は
Trk受容体阻害剤がGW 441756（CAS No. 504433-23-2）、BMS-754807（CAS No. 1001350-96-4）及びそのメタンスルホン酸塩からなる群より選択され、且つ／又は
FGF受容体阻害剤がBIBF1120 (Vargatef(商標)、CAS No. 656247-17-5)並びにそのメタンスルホン酸塩及び塩酸塩、BGJ398 (NVP-BGJ398、CAS No. 872511-34-7)並びにそのメタンスルホン酸塩、塩酸塩及び酢酸塩、AZD4547（CAS No. 1035270-39-3）からなる群より選択され、且つ／又は
PDGF受容体阻害剤が、Axitinib（AG013736、Inlyta(商標)、CAS No. 319460-85-0）、Sunitinib（SU11248、Sutent(商標)、CAS No. 341031-54-7）及びそのマレイン酸塩であるSunitinib Malate(CAS No. 341031-54-7)、Tivozanib (AV-951、CAS No. 475108-18-0)並びにその水和物及び塩酸塩、TSU-68 (SU6668、CAS No. 252916-29-3)、Telatinib (BAY 57-9352、CAS No. 332012-40-5)並びにその4-メチルベンゼンスルホン酸塩及び塩酸塩、MK-2461（CAS No. 917879-39-1）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF阻害剤が、ベバシズマブ（Bevacizumab、CAS No. 216974-75-3、アバスチン(商標)）からなる群より選択され、且つ／又は
VEGF受容体阻害剤が、Axitinib、Sorafenib (Nexavar(商標)、CAS No. 284461-73-0)、Tivozanib並びにその水和物及び塩酸塩、Cediranib (AZD2171、Recentin(商標)、CAS No. 288383-20-0)及びそのマレイン酸塩、並びに抗VEGF受容体2抗体、例えばRamucirumab(CAS No. 947687-13-0)からなる群より選択される阻害剤である、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
請求項１〜８及び１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、NLRR1タンパク質が関連する疾患の診断剤。
【請求項２５】
NLRR1タンパク質が関連する疾患が癌である、請求項２４に記載の診断剤。
【請求項２６】
癌が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌または頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、転移癌、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、及び骨肉腫並びにこれらの癌の一つ以上の組合せからなる群より選択される癌である、請求項２５に記載の診断剤。
【請求項２７】
請求項１０若しくは１１に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、イメージング用試薬。
【請求項２８】
請求項２４〜２６のいずれかに記載の診断剤又は請求項２７に記載のイメージング用試薬を用いる工程を含む、サンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を検出するin vitro方法又はサンプル中のNLRR1タンパク質発現が増大した細胞を含む部位を特定する免疫染色方法。
【請求項２９】
以下の工程、
ａ）  配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化によりNLRR1細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を取得する工程、
ｂ）  エピトープとの反応性に基づき、又は、受託番号NITE BP-01595で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体との競合に基づき、
配列番号１で示されるアミノ酸配列中の、第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）及び第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）のペプチドにより形成されるエピトープ、
配列番号１で示されるアミノ酸配列中の第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）及び第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）のペプチドにより形成されるエピトープ、又は
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５６−４６５位のEIYWVTPIGN（配列番号３）、第４７４−４８３位のDKYKLSSEGT（配列番号４）、第５５６−５６１位のWSSATM（配列番号５）、第５７８−５８１位のVHEY（配列番号６）、及び第６０２−６０９位のHQQTQKSC（配列番号７）のペプチドにより形成されるエピトープ
に結合することができるモノクローナル抗体を選択する工程、
c)  工程b)により選択されたモノクローナル抗体を、癌細胞と混合し、当該癌細胞の生存性を有意に低下させる又は癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を選択する工程、
を含む、NLRR1のエピトープに結合することができるモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
【請求項３０】
以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、又は
(iii)  配列番号１で示されるNLRR1の第４２４−６１４位のアミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３１】
以下から選択される、NLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド、
(i)  配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起することのできるペプチド、
(iii)  配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつNLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチド。
【請求項３２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４２４−６１４位のアミノ酸配列を有し、かつNLRR1細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項３３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、かつNLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項３４】
NLRR1発現の増大した癌細胞の増殖を抑制することのできるモノクローナル抗体を作製するため又は当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するための、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、NLRR1の細胞外ドメインに対する免疫応答を惹起するペプチドを含む免疫原性組成物の使用。
【国際調査報告】
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