(57)【要約】  本発明は、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離する方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法を提供する：（Ａ）培養調製物を、５〜５００μｍの孔径の細孔を有するフィルターに通過させること、（Ｂ）培養調製物に、キレート剤を添加すること、及び（Ｃ）培養調製物を、生理的な水溶液で希釈すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離する方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法：
（Ａ）培養調製物を、５〜５００μｍの径の細孔を有するフィルターに通過させること、
（Ｂ）培養調製物に、キレート剤を添加すること、及び
（Ｃ）培養調製物を、生理的な水溶液で希釈すること。
【請求項２】
少なくとも工程（Ａ）を含み、且つフィルターの細孔が２０〜１００μｍの径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも工程（Ａ）を含み、且つ培養調製物を、複数回、フィルターに通過させる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも工程（Ｂ）を含み、且つキレート剤がクエン酸又はその塩である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
少なくとも工程（Ｂ）を含み、且つキレート剤を添加後、混合物を１０分以上撹拌する、請求項１又は４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも工程（Ｃ）を含み、且つ生理的な水溶液がカルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない、請求項１記載の方法。
【請求項７】
生理的な水溶液が、リン酸緩衝生理食塩水である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の全てを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順で、工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を行う、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
培地組成物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
以下の（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）からなる群から選択される少なくとも１つの構成因子を含む、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離するための試薬：
（Ａ’）５〜５００μｍの径の細孔を有するフィルター、
（Ｂ’）キレート剤、及び
（Ｃ’）生理的な水溶液。
【請求項１２】
（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）の全てを含む、請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
更に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む、請求項１１又は１２記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元或いは浮遊状態にて培養できる培地組成物から、動植物細胞及び／又は組織を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。【０００３】
動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及びスフェア培養等が知られている。【０００４】
脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物を含む構造体を液体培地中に混合することにより、該液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養し得ること、この前記構造体を含む培地組成物を用いて培養することにより細胞の増殖活性が亢進することが報告されている（特許文献１）。当該培地組成物においては、脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物が、金属イオン（例、カルシウムイオン等の二価金属イオン）を介して連結することにより不定形な構造体を形成し、これが培地中で三次元ネットワークを形成することにより、細胞等を浮遊させるための担体となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０１７５１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物を含む構造体を液体培地中に混合することにより、該液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養し得ること、この培地組成物を用いて培養することにより細胞の増殖活性が亢進することが報告されている。本発明者らは、この培地組成物を用いて、動植物細胞及び／又は組織を培養した後、動植物細胞及び／又は組織をより効率的に取り出さなければならないという、新たな課題を見出した。【０００７】
本発明は、該培地組成物を用いて、動植物細胞及び／又は組織を培養した後、動植物細胞及び／又は組織をより効率的に取り出す（回収する）方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、動植物細胞及び／又は組織を培養後の培地組成物を、細胞及び／又は組織が通過可能で且つ５〜５００μｍの大きさの細孔を有するフィルターに通過させるという前処理を行うことで、細胞及び／又は組織の回収率が向上することを見出した。また、ＰＢＳ等の生理的な水溶液による希釈、又はキレート処理によっても、細胞及び／又は組織の回収率を向上させることができた。更に、フィルター通過、希釈及びキレート処理を適宜組み合わせることにより、細胞及び／又は組織の回収率が更に上昇した。これらの知見に基づき、更に検討を加えることにより、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は下記のとおりである：
［１］細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離する方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法：
（Ａ）培養調製物を、細胞又は組織が通過可能で且つ５〜５００μｍの孔径の細孔を有するフィルターに通過させること、
（Ｂ）培養調製物に、キレート剤を添加すること、及び
（Ｃ）培養調製物を、生理的な水溶液で希釈すること。
［２］少なくとも工程（Ａ）を含み、且つフィルターの細孔が２０〜１００μｍの孔径を有する、［１］の方法。
［３］少なくとも工程（Ａ）を含み、且つ培養調製物を、複数回、フィルターに通過させる、［１］又は［２］の方法。
［４］少なくとも工程（Ｂ）を含み、且つキレート剤がクエン酸又はその塩である、［１］の方法。
［５］少なくとも工程（Ｂ）を含み、且つキレート剤を添加後、混合物を１０分以上撹拌する、［１］又は［４］の方法。
［６］少なくとも工程（Ｃ）を含み、且つ生理的な水溶液がカルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない、［１］の方法。
［７］生理的な水溶液が、リン酸緩衝生理食塩水である、［６］の方法。
［８］工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の全てを含む、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順で、工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を行う、［８］の方法。
［１０］培地組成物が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有する、［１］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］以下の（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）からなる群から選択される少なくとも１つの構成因子を含む、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離するための試薬：
（Ａ’）５〜５００μｍの孔径の細孔を有するフィルター、
（Ｂ’）キレート剤、及び
（Ｃ’）生理的な水溶液。
［１２］（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）の全てを含む、［１１］の試薬。
［１３］更に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む、［１１］又は［１２］の試薬。【００１０】
（１’）細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物から細胞または組織を回収するための前処理方法であって、細胞または組織を含む培地組成物を、細胞又は組織が通過可能で且つ５〜５００μｍの大きさの細孔を有するフィルターに通過させる工程を含むことを特徴とする方法。
（２’）液体培地を添加する工程を含む（１’）の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物を用いて、動植物細胞及び／又は組織を培養した後、得られた培養調製物から、動植物細胞及び／又は組織をより効率的に回収できる。
また、本発明では、血球系細胞（単細胞）の回収が容易になり、フローサイトメトリー法による解析が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
【００１３】
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
【００１４】
本発明に用いられる培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物である。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、培養対象の細胞やこれを含む組織を培養することを可能にする。当該培地組成物は、ＷＯ２０１４／０１７５１３Ａ１及びＵＳ２０１４／０１０６３４８Ａ１の記載に従い、調製することが可能である。
【００１５】
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
【００１６】
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
【００１７】
本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。
【００１８】
細胞及び／又は組織を培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、または形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
【００１９】
本発明における細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、５分以上（例、少なくとも５〜６０分）、１時間以上（例、１時間〜２４時間）、２４時間以上（例、１日〜２１日）、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【００２０】
本発明に用いる培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０〜４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは２５〜３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。
【００２１】
浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、１５ｍｌコニカルチューブ中に１０ｍｌ注入し、少なくとも５分以上（例、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上）、３７℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの７０％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）に代替して評価してもよい。
【００２２】
本発明における培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）構造体と培地を含有する組成物である。
【００２３】
当該培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である組成物である。
【００２４】
「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開２００４−１２９５９６号公報）、本発明における構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
【００２５】
また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。
【００２６】
当該構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が０．２μｍ乃至２００μｍのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、１μｍを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは５μｍを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、１００μｍ以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは７０μｍ以下のものである。
【００２７】
「特定化合物」とは、液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明における培地組成物の粘度）は、３７℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
【００２８】
構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ−２２型粘度計、機種：ＴＶＥ−２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ  １°３４’×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。
【００２９】
「特定化合物」の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
【００３０】
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
【００３１】
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より１種又は２種以上から構成されるものを使用できる。
【００３２】
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸又はリン酸を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のし易さを考慮すると、最も好ましくは、ＤＡＧである。
【００３３】
ここでいう塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩；等が挙げられる。
【００３４】
これらの高分子化合物または多糖類の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
【００３５】
更に、ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【００３６】
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ−カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「特定化合物」の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム、並びにそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。
【００３８】
本発明における脱アシル化ジェランガムとは、１−３結合したグルコース、１−４結合したグルクロン酸、１−４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
【００３９】
前記構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属カチオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属カチオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される培地組成物の粘度は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。
【００４０】
【化１】
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【００４１】
「特定化合物」は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１−３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液−液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
【００４２】
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ−ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。
【００４３】
培地中での特定化合物の濃度は、０．０００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．３％（Ｗ／Ｖ）（或いは、０．００５％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ））、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（Ｗ／Ｖ）（或いは、０．０１％乃至０．０２％（Ｗ／Ｖ））培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(Ｗ／Ｖ)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(Ｗ／Ｖ)培地中に添加すれば良い。
【００４４】
上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．０００１〜０．４（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００５〜０．４％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
【００４５】
ＤＡＧ又はその塩：０．００５〜０．０２％（好ましくは０．０１〜０．０２％）（Ｗ／Ｖ）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）
アルギン酸ナトリウム：０．０００１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）（好ましくは、０．１〜０．４％（Ｗ／Ｖ））
ネイティブジェランガム：０．０００１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）
ローカストビーンガム：０．１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）
メチルセルロース：０．１〜０．４％（Ｗ／Ｖ）（好ましくは０．２〜０．４％（Ｗ／Ｖ））
カラギーナン：０．０５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）
ダイユータンガム：０．０５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
【００４６】
濃度［％（Ｗ／Ｖ）］＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
【００４７】
前記化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１及び／又はＲ２に当たる水酸基を、Ｃ１−３アルコキシ基、Ｃ１−３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
【００４８】
本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００４９】
本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在してもよい。本発明に使用される化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
【００５０】
本発明における培地組成物には、金属カチオン、例えば２価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、２種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、金属カチオン（例、カルシウムイオン）が含まれることにより、高分子化合物（例、多糖類）が当該金属カチオンを介して集合し；高分子化合物（例、多糖類）が三次元ネットワークを形成し；或いは、高分子化合物（例、多糖類）が当該金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することにより、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体が形成されるからである。金属イオン濃度は０．１ｍＭ及至３００ｍＭで、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。
【００５１】
本発明に使用される培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
【００５２】
本発明には、上記培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法、得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法、当該培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法も含まれる。
【００５３】
本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び／又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び／又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び／又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。
【００５４】
本発明により培養されたヒト由来の細胞及び／又は組織は、疾患や障害を有する患者に対し治療目的にて移植することができる。この際、治療の対象とする疾患や障害の種類、前処置方法並びに細胞移植方法は、当事者により適宜選択される。移植された細胞のレシピエントへの生着と疾患や障害からの回復や、移植に伴う副作用の有無、治療の効果は、移植治療における一般的な方法により適宜検査され、判断することができる。
【００５５】
さらに、細胞及び／又は組織が効率よく増殖されるため、本発明における培地組成物は細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞や組織の分化や増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明に使用される培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅できるだけでなく、効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、本発明に使用される化合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
【００５６】
本発明に使用される培養方法を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理等）を施してもよい。更に、これらの培養器材に対しては、予め細胞外マトリックスや細胞接着分子などをコーティングしてもよい。このようなコーティング材料としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリン、ヒアルロン酸、スーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。これらのコーティング材料は、遺伝子組換え技術によりアミノ酸配列を人為的に改変させたものも使用することできる。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、シリコン、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００５７】
細胞及び／又は組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明における培養方法に用いることができる。
【００５８】
本発明における特定化合物を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と特定化合物とを混合して培地組成物を調製することができる。
【００５９】
培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
【００６０】
細胞及び／又は組織が植物由来である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。
【００６１】
上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００６２】
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００６３】
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００６４】
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
【００６５】
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
【００６６】
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノカルディシン、ｍ−カルボキシフェノール、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
【００６７】
好ましい態様において培地は、金属カチオン（例えば２価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオン）を含有する。カルシウムイオンは０．１〜１０ｍＭ好ましくは０．５〜３．０ｍＭ含有される。金属カチオンが含まれることにより、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介して集合し；アニオン性官能基を有する高分子化合物が三次元ネットワークを形成し；或いは、アニオン性官能基を有する高分子化合物が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することにより、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体が形成されるからである。
【００６８】
本発明における特定化合物を上記の培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて当該特定化合物を用時溶解または分散させる（これを、培地添加剤とする。）。その後、培地中での特定化合物濃度として、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば０．０００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるように、当該培地添加剤を培地中に添加すれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．３％（Ｗ／Ｖ）（或いは、０．００５％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ））、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）（或いは、０．０１％乃至０．０３％（Ｗ／Ｖ））培地中に添加すれば良い。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムの場合、０．０００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００１％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００３％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．０３％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとダイユータンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．０１％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとメチルセルロースの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．２％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ−カラギーナンの混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好まし��は、０．０１％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
【００６９】
濃度［％（Ｗ／Ｖ）］＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
【００７０】
ここで、培地添加剤に用いる適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられるが、これらに限られるわけではない。この際、特定化合物濃度は０．００１％乃至５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．１％乃至０．６％（Ｗ／Ｖ）とすることが望ましい。その際、当該特定化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該特定化合物を培養の際に担体表面上に固定化或いは、担体内部に担持して使用することもできる。当該特定化合物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該特定化合物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ乃至１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ乃至１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ乃至０．５μｍである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
【００７１】
上記調製により特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより、液体培地中に上記構造体が形成され、培地組成物を得ることができる。培地には通常、高分子化合物がイオンを介して集合、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオンが含まれるので、特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、培地組成物を得ることができる。あるいは、培地添加剤（特定化合物の溶液又は分散液）に培地を添加してもよい。さらに、培地組成物は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒（例えばイオン交換水や超純水等を含む水）中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、（１）液体培地と培地添加剤（溶液）とを混合する、（２）液体培地に上記高分子化合物（粉末等の固体）を混合する、（３）培地添加剤（溶液）に粉末培地を混合する、（４）粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。培地組成物における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、（１）若しくは（４）又は（１）若しくは（３）の態様が好ましい。
【００７２】
特定化合物を溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば８０℃〜１３０℃、好ましくは加熱滅菌されるような１００℃〜１２５℃（例、１２１℃）が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の２価金属イオン）を添加することにより（例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより）、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の２価金属イオン）を含む溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する際に、加熱（例えば８０℃〜１３０℃、好ましくは１００℃〜１２５℃（例、１２１℃））し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。
【００７３】
本発明に使用される培地組成物の製造方法を例示するが、これによって限定されるものではない。特定化合物をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度（例えば、５〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは１０〜３０℃）で撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。
【００７４】
溶解後、必要に応じて撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌、フィルター濾過）を行う。静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
【００７５】
あるいは、粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合し、上記温度で加熱することで本発明に用いる培地組成物を調製する。
【００７６】
例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．２％乃至０．５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．３％乃至０．４％（Ｗ／Ｖ）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．２％乃至０．８％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．３％乃至０．６％（Ｗ／Ｖ）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
【００７７】
そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上（例、８０〜１３０℃）に加熱しながら撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が０．０１５％の場合は０．３％水溶液：培地の比率は１：１９）、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
【００７８】
さらに、本発明の培地組成物は調製後、遠心処理により構造体を沈降させることができる。
【００７９】
本発明に用いる培地組成物及びその製造方法の好適な態様を以下に記載する。
本発明に用いる培地組成物は、好適には、細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物であって、前記培地組成物の粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下（３７℃条件下）であり、且つ脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有することを特徴とする、培地組成物である。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度が、０．００５〜０．３％（Ｗ／Ｖ）（好ましくは、０．０１〜０．０５％（Ｗ／Ｖ））である。一態様において、当該培地組成物は、更に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有する。一態様において、当該培地組成物には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の２価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、０．１ｍＭ及至３００ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭである。
【００８０】
当該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムまたはその塩と培地とを混合することにより製造することが出来る。一態様において、当該培地は液体培地である。一態様において、当該液体培地には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の２価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、０．１ｍＭ乃至３００ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ乃至１００ｍＭである。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩と、培地とを混合する。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩は、滅菌された状態である。一態様において、滅菌はオートクレーブ滅菌により行われる。別の態様において、滅菌はろ過滅菌により行われる。一態様において、ろ過滅菌は０．１〜０．５μｍのフィルターに通過させることにより実施する。
【００８１】
本発明において培養する細胞及び／又は組織の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、細胞及び／又は組織が単独で培地組成物中に分散した状態、細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態等が、より好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋された状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が、さらに好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が挙げられる。これらの状態の内、細胞塊（スフェア）を形成した状態は、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、本発明における方法で培養する最も好ましい状態として挙げることができる。
【００８２】
細胞及び／又は組織を表面上に担持させる担体としては、種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ、セラミックスビーズ等が挙げられる。当該高分子の例としては、ビニル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、アニリン樹脂、アイオノマー樹脂、ポリカーボネート、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、セルロース、アルギン酸塩及びこれらの混合物等が使用できる。当該担体は、細胞の接着を高める、或いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、２種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び／又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数１０μｍから数１００μｍ、より好ましくは１００μｍから２００μｍであり、その比重は、１に近いことが好ましく、より好ましくは０．９〜１．２、特に好ましくは約１．０である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ２（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２（登録商標）、（以上、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（登録商標）（ＮＵＮＣ）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｇ（登録商標）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓ（登録商標）（以上、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＨＩＬＬＥＸＣＴ（登録商標）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ−ＣＯＡＴＥＤ（登録商標）、及びＨＩＬＬＥＸＩＩ（登録商標）（Ｓｏｌｏ  Ｈｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）等が挙げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び／又は組織を表面上に担持させた担体は、特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。
【００８３】
細胞及び／又は組織を担体内部に包埋する際、種々の高分子から構成された材料を当該担体として選択することができる。この様な高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、ポリウレタンフォーム等のスポンジ、ＤｓｅＡ―３Ｄ（登録商標）、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させることも可能である。また更に、細胞及び／又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を１種以上混合することができる。
【００８４】
これらの担体に細胞及び／又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、２５Ｇ〜１９Ｇ程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数１０μｍから数１０００μｍ、より好ましくは１００μｍから２０００μｍである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約２０００μｍのビーズ状担体の場合、５００万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び／又は組織を包埋させた担体は、特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。
【００８５】
細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ−（２−ハイドロキシ−エチルメタクリレート）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
【００８６】
また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ  ２０１０，３６１−３６６、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９−７００、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２−５７９、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７−１１１、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８−２５９等に記載された方法を用いることもできる。
【００８７】
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ジブチルリルｃＡＭＰなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ―メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン−５’−ホスホセレン酸、Ｓｅ―アデノシルセレノメチオニン、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６等のＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
【００８８】
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
【００８９】
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
【００９０】
さらに、特定化合物の構造体を含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該特定化合物の濃度は、０．０００５％乃至１．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００１％乃至０．３％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．０１％乃至０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。スフェアは、当該特定化合物の構造体を含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、３日間乃至１０日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。
【００９１】
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍの直径を有する。
【００９２】
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００９３】
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。
【００９４】
スフェアの静置培養に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
【００９５】
特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養されたスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。
【００９６】
植物由来の細胞及び／又は組織を静置培養する際の方法として、分化していない植物細胞塊であるカルスを培養することができる。カルスの誘導は、使用する植物種についてそれぞれ公知の方法により行うことができる。例えば、分化した植物体の一部の組織（例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等）表面を、必要に応じて７０％アルコールや１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、メス等を用いて適当な大きさの組織片（例えば、約１〜約５ｍｍ角の根切片）を切り出し、クリーンベンチ等を用いた無菌操作により、当該組織片を予め滅菌したカルス誘導培地に播種して適当な条件下で無菌培養する。ここで誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に付されてもよいし、あるいは継代用培地で継代培養することにより種株として維持することもできる。継代培養は、液体培地及び固形培地のいずれを用いて行ってもよい。
【００９７】
培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式（回分培養、流加培養、連続培養等）、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、培地組成物に対する細胞塊の湿重量が４〜８（重量／容積（Ｗ／Ｖ））％、好ましくは５〜７（Ｗ／Ｖ）％となるように培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は３ｍｍ乃至４０ｍｍ、好ましくは３ｍｍ乃至２０ｍｍ、より好ましくは５ｍｍ乃至１５ｍｍである。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。
【００９８】
細胞及び／又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６体積％が好ましい。培養期間は通常３乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０乃至３０℃であり、光が必要であれば照度２０００〜８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。培養期間は通常３乃至７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
【００９９】
細胞及び／又は組織を培養する際には、培養組成物に対して別途調製した細胞及び／又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織と培地組成物を分離した後、新しい培地組成物を細胞及び／又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び／又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
【０１００】
細胞または組織の単離方法
本発明は、動植物細胞及び／又は組織を含有する前記培地組成物（即ち、前記培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物）から、動植物細胞及び／又は組織を効率的に単離するための処理方法を提供する。本発明の方法は、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む：
（Ａ）細胞及び／又は組織を含む培地組成物（即ち、細胞又は組織の培養調製物）を、５〜５００μｍの大きさ（孔径）の細孔を有するフィルターに通過させること、
（Ｂ）細胞及び／又は組織の培養調製物に、キレート剤を添加すること、及び
（Ｃ）細胞及び／又は組織の培養調製物を、生理的な水溶液で希釈すること。
以下各工程について説明する。
【０１０１】
工程（Ａ）  フィルター通過
工程（Ａ）によれば、前記培地組成物をフィルター通過させることで、培地組成物中に含まれる「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」が部分的に破壊され、細胞又は組織の回収率が向上するものと考えられる。使用できる動植物細胞及び組織としては、上述のものすべて（スフェアを含む）が挙げられる。
【０１０２】
フィルターの細孔の大きさ（孔径）は、５〜５００μｍであり、好ましくは、１０〜２００μｍであり、より好ましくは、２０〜１００μｍであり、更に好ましくは３０〜４０μｍである。
【０１０３】
フィルターの孔径は、培養調製物中の細胞又は組織が通過可能な大きさであることが好ましい。ここで、「細胞又は組織が通過可能な大きさ」とは、生存を維持したまま、細胞又は組織を通過させることが出来る大きさを意味する。例えば、フィルターの孔径が、培養対象の細胞又は組織の直径よりも大きい場合のみならず、培養調製物中の、細胞塊、スフェア又は組織が、その直径よりも小さい孔径のフィルターを通過することにより、生存を維持したまま、複数の細胞、細胞塊、スフェア又は組織に分割される態様も、「細胞又は組織が通過可能な大きさ」に包含される。細胞の大きさは、細胞の種類に依存するために一概に規定することはできないが、直径７．５〜２０μｍ程度の一般的な細胞であれば、単一細胞の状態で、２０〜１００μｍ、好ましくは３０〜４０μｍの孔径のフィルターを良好な生存性を維持したまま容易に通過することができ、更に培地組成物中に含まれる「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」が効率的に破壊されるため、良好な回収率が期待できる。
【０１０４】
フィルターの素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、アクリル、ポリ乳酸、セルロース混合エステル、ポリカーボン、ポリエステル、ガラス等が挙げられるが、特に限定されない。素材により、極性、帯電性、親水性等の性能が異なるが、これらの性能と回収率との相関性は弱く、いずれの素材を用いた場合においても良好な回収率が期待できる。ポリアミド（ナイロン）、ポリエチレン、ポリエステル、ガラス等が入手容易性等の観点から好ましい。
【０１０５】
これらのフィルターは市販品を用いてもよく、その具体例としては、Ｐａｒｔｅｃ社製ＣｅｌｌＴｒｉｃｓフィルター（商標）：孔径５μｍ（型番０６−０４−００４−２３２３）、１０μｍ（型番０６−０４−００４−２３２４）、２０μｍ（型番０６−０４−００４−２３２５）、３０μｍ（型番０６−０４−００４−２３２６）、５０μｍ（型番０６−０４−００４−２３２７）、１００μｍ（型番０６−０４−００４−２３２８）及び１５０μｍ（型番０６−０４−００４−２３２９）、ベクトンディッキンソン社製Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）：孔径４０μｍ（型番３５２３４０）、７０μｍ（型番３５２３５０）及び１００μｍ（型番３５２３６０）、アズワン社製フィルコンＳ（商標）：孔径２０μｍ（型番２−７２１１−０１）、３０μｍ（型番２−７２１１−０２）、５０μｍ（型番２−７２１１−０３）、７０μｍ（型番２−７２１１−０４）、１００μｍ（型番２−７２１１−０５）及び２００μｍ（型番２−７２１１−０６）等が挙げられる。
【０１０６】
フィルターに通過させる回数は、１回でもよいが、複数回のフィルター通過により、細胞又は組織の回収率を向上させることが出来る。フィルターに通過させる回数は、通常１〜１０回であり、好ましくは３〜８回、より好ましくは３〜５回である。
【０１０７】
フィルターに複数回通過させる場合、細胞又は組織の培養調製物を１枚のフィルターに通過させて、通過した懸濁液を回収する操作を複数回行ってもよいし、複数の枚数（例えば、３〜５枚）を重ねたフィルターメンブレンを含む多重フィルターに、細胞又は組織の培養調製物を通過させてもよい。多重フィルターを用いる方が、操作効率の観点からは有利である。フィルターに複数回通過させる場合、同一の孔径の複数のフィルターを用いてもよいし、異なる孔径の複数のフィルターを組み合わせて用いてもよい。好ましくは、同一の孔径（例えば３０〜４０μｍ）のフィルターを複数（例えば、３〜５枚）用いる。
【０１０８】
工程（Ｂ）  キレート剤添加
工程（Ｂ）によれば、前記培地組成物にキレート剤を添加することで、培地組成物中に含まれる「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」から金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の２価金属イオン）が除去されて、当該構造体中の金属カチオンを介した特定化合物（例、脱アシル化ジェランガム）同士の結合がルーズになり、「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」が部分的に破壊され、細胞又は組織の回収率が向上するものと考えられる。
【０１０９】
キレート剤としては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の２価金属イオン（好ましくは、カルシウムイオン）と錯体を形成することが可能な化合物であれば、特に限定されないが、例えば、クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）；ＥＤＴＡ又はその塩（例、ＥＤＴＡ２Ｎａ、ＥＤＴＡ３Ｎａ、ＥＤＴＡ４Ｎａ等のエデト酸ナトリウム塩）；ＨＥＤＴＡ３Ｎａ等のヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸塩；ＥＧＴＡ又はその塩；ペンテト酸塩（ジエチレントリアミン五酢酸塩）；フィチン酸；エチドロン酸等のホスホン酸及びそのナトリウム塩等の塩類；シュウ酸ナトリウム；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等のポリアミノ酸類；ポリリン酸ナトリウム；メタリン酸ナトリウム；リン酸；アラニン；ジヒドロキシエチルグリシン；グルコン酸；アスコルビン酸；コハク酸；酒石酸等を挙げることができる。細胞又は組織の回収率を向上する観点から、クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）或いはＥＤＴＡ又はその塩（例、ＥＤＴＡ２Ｎａ、ＥＤＴＡ３Ｎａ、ＥＤＴＡ４Ｎａ等のエデト酸ナトリウム塩）が好ましく、クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）が最も好ましい。
【０１１０】
キレート剤の添加量は、前記培地組成物に含まれる「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」中の金属カチオンを介した特定化合物（例、脱アシル化ジェランガム）同士の結合をルーズにすることができる量である。例えば、クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）の場合、通常、添加直後の終濃度として、２．４ｍＭ以上、好ましくは、１０ｍＭ以上である。理論的には、上限値は、クエン酸又はその塩の飽和濃度であるが、濃度が高すぎると細胞又は組織の生存性への影響が懸念されるため、通常、３０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下である。従って、クエン酸又はその塩の好ましい添加量の範囲は、添加直後の終濃度として、２．４〜３０ｍＭ、より好ましくは１０〜１５ｍＭである。抗凝固剤として市販もされている３．１２〜３．８（Ｗ／Ｖ）％クエン酸３ナトリウム水溶液を、培養調製物１に対して１／１０体積量添加することにより、好適な濃度を達成することが出来る。
【０１１１】
前記培養調製物に対して、キレート剤を添加した後、キレート剤が均一となるように、転倒混和、ボルテックス等により得られた混合物をよく撹拌することが好ましい。撹拌時間は、通常、３０秒〜１分である。
【０１１２】
キレート剤が均一となった混合物を、更に撹拌し続けることにより、細胞又は組織の回収率を上昇させることが出来る。撹拌方法としては、転倒混和、撹拌子、ボルテックス等を挙げることができ、特に限定されないが、細胞や組織の生存性への悪影響を避ける観点から、転倒混和、撹拌子等の比較的穏やかな方法が好ましい。撹拌時間は、細胞回収率を上昇させることが出来る限り特に限定されないが、通常１０分以上である。撹拌時間が長い程、回収率が上昇することから、回収率を上昇させる観点からは、長ければ長い方がよいが、細胞や組織の生存性への悪影響を避ける観点からは、撹拌時間は、好ましくは６０分以下、より好ましくは３０分以下である。このような長時間の撹拌は、特にフィルター濾過を併用しない場合における回収率の向上に有効である。
【０１１３】
尚、キレート剤が均一となった混合物を、撹拌せずに静置すると、細胞又は組織の回収率が逆に低下する恐れがあるため、静置は避ける方が好ましい。
【０１１４】
工程（Ｃ）  希釈
工程（Ｃ）によれば、前記培地組成物を、生理的な水溶液で希釈することで、培地組成物中に含まれる「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」の濃度が低下し、細胞または組織を浮遊させる能力が低下する結果、細胞又は組織の回収率が向上するものと考えられる。
【０１１５】
希釈に用いる生理的な水溶液は、培養調製物中の細胞又は組織と等張であることが好ましい。そのような生理的な水溶液としては、液体培地、平衡塩類溶液、生理食塩水等を挙げることが出来る。液体培地としては、上述の細胞又は組織を浮遊させて培養することができる培地組成物の調整に使用することができるものを挙げることが出来る。一態様において、希釈工程では、細胞または組織を含む培地組成物に使用されている培地と同一の液体培地を、添加する。平衡塩類溶液としては、（ダルベッコ）ＰＢＳ（(Dulbecco's) Phosphate Buffered Saline）、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）、ＥＢＳＳ（Earle's Balanced Salt Solution）、ＧＢＳＳ（Gey's Balanced Salt Solution）、ＨＢＳＳ（Hank's Buffered Salt Solution）、ＲＢＳＳ（Ringer's Balanced Salt Solution）、ＳＢＳＳ（Simm's Balanced Salt Solution）、ＴＢＳＳ（Tyrode's Balanced Salt Solution）、アルセルバー液（Alsever's Solution）、Ｐｕｃｋ’ｓ平衡塩類溶液（Puck's Balanced Salt Solution）等を挙げることが出来る。
【０１１６】
希釈に用いる生理的な水溶液は、好ましくは、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない。カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない生理的な水溶液を用いることにより、培地組成物中のカルシウムイオン濃度及びマグネシウムイオン濃度が低下し、「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」から金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の２価金属イオン）が除去されて、当該構造体中の金属カチオンを介した特定化合物（例、脱アシル化ジェランガム）同士の結合がルーズになり、「細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体」が部分的に破壊され、細胞又は組織の回収率が向上すると考えられるからである。「カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない」とは、カルシウムイオン濃度及びマグネシウムイオン濃度が、それぞれ、０．００１ｍＭ以下であることを意味する。希釈に用いる生理的な水溶液中の、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン濃度は、それぞれ、好ましくは０．０００１ｍＭ以下、より好ましくは０．００００１ｍＭ以下、最も好ましくは０ｍＭである。
【０１１７】
希釈に用いる生理的な水溶液は、好ましくは、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む２価金属イオンを実質的に含有しない。２価金属イオンとしては、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの他、亜鉛イオン、バリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオン等が挙げられる。「２価金属イオンを実質的に含有しない」とは、２価金属イオンの合計濃度が、０．００１ｍＭ以下であることを意味する。希釈に用いる生理的な水溶液中の、２価金属イオンの合計濃度は、好ましくは０．０００１ｍＭ以下、より好ましくは０．００００１ｍＭ以下、最も好ましくは０ｍＭである。
【０１１８】
希釈に用いる生理的な水溶液には、細胞又は組織の生存率を上昇させるため、血清（FBS等）、アルブミン等を添加してもよい。
【０１１９】
細胞または組織を含む培地組成物（即ち、細胞又は組織の培養調製物）の体積と同じ体積の生理的な水溶液を添加する場合の希釈率を２倍としたとき、希釈工程における希釈率は、好ましくは２倍以上である。希釈率が高い程、回収率が向上するので、回収率向上の観点からは希釈率は高ければ高い方が好ましいが、希釈率が高すぎると、全体の体積が大きすぎてハンドリングに支障が生じる懸念がある。従って、希釈率は、通常、２〜１０倍であり、好ましくは２〜５倍である。
【０１２０】
工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の、それぞれの好適な態様は、以下の通りである。
（ＡＡ）細胞又は組織の培養調製物を、５〜５００μｍ（好ましくは１０〜２００μｍ、より好ましくは２０〜１００μｍ、更に好ましくは３０〜４０μｍ）の孔径の細孔を有するフィルターを、複数回（好ましくは、３〜８回、より好ましくは３〜５回）通過させる。好ましくは、フィルター濾過は、複数枚（好ましくは３〜８枚、より好ましくは３〜５枚）重ねたフィルターメンブレンに、細胞又は組織の培養調製物を通過させることにより行う。
（ＢＢ）細胞又は組織の培養調製物に、クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）を添加する。好ましくは、得られた混合物を、１０分以上（例えば、１０〜６０分、好ましくは１０〜３０分）撹拌する。
（ＣＣ）細胞又は組織の培養調製物を、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない（好ましくは、２価金属イオンを実質的に含有しない）生理的な平衡塩類溶液（例、（ダルベッコ）PBS）で、２〜１０倍（好ましくは２〜５倍）の希釈率で、希釈する。
【０１２１】
一態様において、本発明の方法に供される細胞または組織を含む培地組成物（即ち、細胞又は組織の培養調製物）は、０．１（ｗ／ｖ）％以上の濃度のタンパク質（例えば、血清アルブミン）を含有する。本発明の方法が、工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）を含む場合には、本発明の方法に供される細胞または組織を含む培地組成物（即ち、細胞又は組織の培養調製物）は、好ましくは、０．１（ｗ／ｖ）％以上の濃度のタンパク質（例えば、血清アルブミン）を含有する。当該濃度のタンパク質を含有することにより、タンパク質を含有しない場合と比較して、細胞又は組織の回収率の上昇が期待できる。細胞または組織を含む培地組成物中のタンパク質濃度は、０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．２（ｗ／ｖ）％以上である。タンパク質濃度が高い程、より高い細胞又は組織の回収率が期待できる。タンパク質濃度の上限値は、理論的には、タンパク質の溶解度であるが、コスト等の観点から、５（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは２（ｗ／ｖ）％以下程度とすることが好ましい。尚、血清（例、ＦＢＳ）中のタンパク質濃度は、一般的には５（ｗ／ｖ）％程度なので、血清濃度２（ｖ／ｖ）％が、タンパク質濃度０．１（ｗ／ｖ）％に相当する。従って、細胞または組織を含む培地組成物中の血清濃度が、２（ｖ／ｖ）％以上、好ましくは４（ｖ／ｖ）％以上（例えば、１０（ｖ／ｖ）％以上）であれば、細胞又は組織の回収率を上昇させる濃度のタンパク質を含有しているものと見積もることができる。従って、例えば、タンパク質濃度が０．１（ｗ／ｖ）％を下回る上述の培地組成物（例えば、無血清の培地組成物）中で、細胞又は組織を培養し、得られた培養物を本発明の方法に供する場合には、培地組成物中のタンパク質濃度が、０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．２（ｗ／ｖ）％以上となるように、培養物中にタンパク質（例えば、血清アルブミン、血清等）を添加してもよい。
【０１２２】
工程（Ａ）〜（Ｃ）の組み合わせ
上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選択される２又は３（即ち全て）の工程を組み合わせることにより、いずれか１つの工程を単独で行う場合よりも、細胞又は組織の回収率が向上することが期待される。２つの工程の組み合わせとしては、（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、（Ｂ）と（Ｃ）の組み合わせ、（Ａ）と（Ｃ）の組み合わせ（例えば、（ＡＡ）と（ＢＢ）の組み合わせ、（ＢＢ）と（ＣＣ）の組み合わせ、（ＡＡ）と（ＣＣ）の組み合わせ）が挙げられる。
【０１２３】
２又は３の工程を組み合わせる場合の、工程の順序は、特に限定されない。工程（Ａ）と（Ｂ）を組み合わせる場合、（Ａ）→（Ｂ）及び（Ｂ）→（Ａ）（例えば、（ＡＡ）→（ＢＢ）及び（ＢＢ）→（ＡＡ））のいずれの順で行ってもよい。工程（Ｂ）と（Ｃ）を組み合わせる場合、（Ｂ）→（Ｃ）及び（Ｃ）→（Ｂ）（例えば、（ＢＢ）→（ＣＣ）及び（ＣＣ）→（ＢＢ））のいずれの順で行ってもよい。工程（Ａ）と（Ｃ）を組み合わせる場合、（Ａ）→（Ｃ）及び（Ｃ）→（Ａ）（例えば、（ＡＡ）→（ＣＣ）及び（ＣＣ）→（ＡＡ））のいずれの順で行ってもよい。工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を全て組み合わせる場合、（Ａ）→（Ｂ）→（Ｃ）、（Ａ）→（Ｃ）→（Ｂ）、（Ｂ）→（Ａ）→（Ｃ）、（Ｂ）→（Ｃ）→（Ａ）、（Ｃ）→（Ａ）→（Ｂ）及び（Ｃ）→（Ｂ）→（Ａ）（例えば、（ＡＡ）→（ＢＢ）→（ＣＣ）、（ＡＡ）→（ＣＣ）→（ＢＢ）、（ＢＢ）→（ＡＡ）→（ＣＣ）、（ＢＢ）→（ＣＣ）→（ＡＡ）、（ＣＣ）→（ＡＡ）→（ＢＢ）及び（ＣＣ）→（ＢＢ）→（ＡＡ））のいずれの順で行ってもよい。
【０１２４】
尚、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を含む態様においては、工程（Ｂ）における１０分以上の撹拌を行わなくても、高い回収率を達成することが可能である。
【０１２５】
回収率を向上させる観点から、工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を全て組み合わせて行うことが好ましい。
【０１２６】
また、工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を全て組み合わせて行う場合、回収率を向上させる観点から、（Ａ）→（Ｂ）→（Ｃ）（例えば、（ＡＡ）→（ＢＢ）→（ＣＣ））の順で行うことが好ましい。
【０１２７】
前記前処理工程の後、得られた細胞又は組織を含む混合物を、遠心分離やろ過処理に付し、細胞又は組織以外の画分を除去することにより、最終的に細胞又は組織の培養調製物から、細胞及び／又は組織を単離することができる。遠心分離により細胞や組織を沈殿させる技術は、当業者に周知であり、細胞や組織の種類に応じて、当業者であれば適切な条件を設定することができる。一般的には、３００〜５００Ｇ程度の遠心力で遠心分離を行うことにより、細胞や組織を沈殿させて、上清と分離させることができる。
【０１２８】
細胞または組織を単離するための試薬
また、本発明は、以下の（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）からなる群から選択される少なくとも１つの構成因子を含む、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離するための試薬をも提供する：
（Ａ’）５〜５００μｍの孔径の細孔を有するフィルター、
（Ｂ’）キレート剤、及び
（Ｃ’）生理的な水溶液。
【０１２９】
本発明の試薬を用いて、上記本発明の方法を行うことにより、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物中の、細胞または組織の培養調製物から、細胞または組織を単離することができる。構成因子（Ａ’）は、工程（Ａ）を含む態様に、構成因子（Ｂ’）は、工程（Ｂ）を含む態様に、構成因子（Ｃ’）は、工程（Ｃ）を含む態様に、それぞれ対応する。各用語の定義は、上述の「細胞または組織の単離方法」の項で記載した通りである。
【０１３０】
構成因子（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）の、それぞれの好適な態様は、以下の通りである。
（ＡＡ’）５〜５００μｍ（好ましくは、１０〜２００μｍ、より好ましくは、２０〜１００μｍ）の孔径の細孔を有するフィルター。複数回（好ましくは、３〜８回、より好ましくは３〜５回）のフィルター濾過を可能とするため、複数個（好ましくは３〜８個、より好ましくは３〜５個）のフィルター（シングルメンブレン）の組み合わせであってもよいし、複数枚（好ましくは３〜８枚、より好ましくは３〜５枚）重ねたフィルターメンブレンを含む多重フィルターであってもよい。
（ＢＢ’）クエン酸又はその塩（例、クエン酸３ナトリウム）。
（ＣＣ’）カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを実質的に含有しない（好ましくは、２価金属イオンを実質的に含有しない）生理的な平衡塩類溶液（例、（ダルベッコ）PBS）で、２〜１０倍（好ましくは２〜５倍）の希釈率で、希釈する。
【０１３１】
本発明の試薬は、上記（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）からなる群から選択される２又は３（即ち全て）の構成因子を組み合わせて含んでいてもよい。各構成因子を、各々独立した容器内に入れた上で、全ての構成因子を１つのパッケージに収容することにより、キットとしてもよい。２つの構成因子の組み合わせとしては、（Ａ’）と（Ｂ’）の組み合わせ、（Ｂ’）と（Ｃ’）の組み合わせ、（Ａ’）と（Ｃ’）の組み合わせ（例えば、（ＡＡ’）と（ＢＢ’）の組み合わせ、（ＢＢ’）と（ＣＣ’）の組み合わせ、（ＡＡ’）と（ＣＣ’）の組み合わせ）が挙げられる。２又は３の前記構成因子を組み合わせて含む本発明の試薬を用いることにより、対応する２又は３の工程の組み合わせを含む本発明の方法を実施することが出来る。
【０１３２】
好ましい態様において、本発明の試薬は、構成因子（Ａ’）、（Ｂ’）及び（Ｃ’）（例えば、（ＡＡ’）、（ＢＢ’）及び（ＣＣ’））を含む。
【０１３３】
本発明の試薬は、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物を調製するための、上記特定化合物（例、脱アシル化ジェランガムまたはその塩）を更に含んでいてもよい。このような態様の本発明の試薬を用いることにより、使用者は、当該特定化合物（例、脱アシル化ジェランガムまたはその塩）を用いて、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物を調製し、当該培地組成物中で所望の細胞または組織を浮遊培養し、得られた細胞または組織の培養調製物から、上記本発明の方法により細胞または組織を単離することができる。
【０１３４】
当該特定化合物（例、脱アシル化ジェランガムまたはその塩）は、単離された化合物や、水溶液として、本発明の試薬に含まれていてもよいし、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の態様で、本発明の試薬に含まれていてもよい。該培地組成物は、０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．２（ｗ／ｖ）％以上の濃度のタンパク質（例、血清アルブミン、血清）を含有していてもよい。或いは、本発明の試薬は、培養後の培養物中のタンパク質濃度を、０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．２（ｗ／ｖ）％以上に調整するためのタンパク質（例、血清アルブミン、血清）を含んでいてもよい。
【０１３５】
以下に本発明の培地組成物の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【０１３６】
［実施例１］フィルターを併用した希釈による細胞回収試験
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を特許文献１の方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した後、ナイロン製のフィルターＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させて細胞懸濁液を得た。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブ３本に５ｍＬずつ分注した。さらに脱アシル化ジェランガム不含ＤＭＥＭ培地を、１本目の細胞懸濁液に対して２０ｍＬ、２本目の細胞懸濁液に対して５ｍＬ、３本目の細胞懸濁液に対して０ｍＬ（添加なし）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
孔径１００μｍのフィルターを用いた場合も上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
さらに、フィルターに通過させない場合についても上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１に示す。２倍希釈または５倍希釈時の細胞回収率は、フィルターを通過させた後に上昇しており、脱アシル化ジェランガム含有培地からの細胞回収率の向上に本発明の方法が有用であることが示された。【０１３７】
【表１】
2016039391.tif 000003
【０１３８】
［実施例２］：細胞回収におけるフィルターろ過の効果
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉeｔｉｎ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ株式会社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製）の組成物を特許文献１の方法に従い調製した。上記培地にＴＰＯ依存性ヒト巨核芽球性白血病細胞株（ＵＴ−７／ＴＰＯ；非特許文献：Ｋｏｍａｔｓｕら，Ｂｌｏｏｄ. １９９６，８７：４５５２−４５６０.）を２００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した後、６ウェルプレートに分注し３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３日間培養した。
培養後、上記の細胞懸濁液を１５ｍＬチューブ３本に９．５ｍＬずつ分注した。1本目の細胞懸濁液については、市販のフィルターであるＣｅｌｌＴｒｉｃｓ（商標）（ＰＡＲＴＥＣ社製、孔径３０μｍ、ナイロン）を３回通過させた。２本目の細胞懸濁液については、市販のフィルターであるフィルコンＳ（商標）（アズワン社製、孔径２０μｍ、ポリエチレン）を３回通過させた。３本目の細胞懸濁液については、市販のフィルターであるＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（ベクトンディッキンソン社製、孔径４０μｍ、ナイロン）を３回通過させた。
各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＩＭＤＭ培地０．５ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。孔径３０μｍのフィルターを１回通過させた場合も上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
さらに、フィルターを通過させない場合についても上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
その結果、細胞回収率はフィルターを通過させた後に上昇しており、脱アシル化ジェランガム含有培地からの細胞回収率の向上に本発明の方法が有用であることが示された。細胞懸濁液に含まれる細胞数を１００としたときの回収率を表２に示す。【０１３９】
【表２】
2016039391.tif 000004
【０１４０】
［実施例３］：細胞回収におけるフィルターろ過の効果
０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）を用いて、実施例２と同様の方法を行い、回収率を測定した。
孔径３０μｍのフィルターを１回通過させた場合と５回通過させた場合も上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
さらに、フィルターを通過させない場合についても上述と同様の方法を行い、回収率を測定した。
その結果、細胞回収率はフィルターを通過させた後に上昇しており、脱アシル化ジェランガム含有培地からの細胞回収率の向上に本発明の方法が有用であることが示された。細胞懸濁液に含まれる細胞数を１００としたときの回収率を表３に示す。【０１４１】
【表３】
2016039391.tif 000005
【０１４２】
［実施例４］希釈液組成の細胞回収率への効果
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。さらに脱アシル化ジェランガム不含ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬工業株式会社製）、またはＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を、１本の細胞懸濁液に対して２０ｍＬまたは０ｍＬ（添加なし）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。尚、ＤＭＥＭ培地は、カルシウム塩及びマグネシウム塩として、ＣａＣｌ２（ａｎｈｙｄ．）を２００ｍｇ／ｍｌ、ＭｇＳＯ４（ａｎｈｙｄ．）を９７．６７ｍｇ／ｍｌ含有する。一方、ＲＰＭＩ−１６４０培地は、カルシウム塩及びマグネシウム塩として、ＣａＣｌ２（ａｎｈｙｄ．）を１００ｍｇ／ｍｌ、ＭｇＳＯ４（ａｎｈｙｄ．）を４８．８４ｍｇ／ｍｌ含有する。Ｄ−ＰＢＳ（−）には、カルシウム塩及びマグネシウム塩は含まれない。従って、Ｄ−ＰＢＳ（−）＜ＲＰＭＩ−１６４０培地＜ＤＭＥＭ培地の順で、二価金属イオン（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン）濃度が低い。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１４３】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表４に示す。細胞回収率は希釈液中のＣａ及びＭｇ濃度の低い順に高くなり、Ｄ−ＰＢＳ（−）で最も細胞回収率が高く、本発明の方法が有用であることが示された。【０１４４】
【表４】
2016039391.tif 000006
【０１４５】
［実施例５］キレート剤を用いた細胞回収試験
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。クエン酸添加群には３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ）クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ））、２０秒間ボルテックスで撹拌した（Ｎ−２０Ｍ、株式会社日伸理化製）。さらにＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を、１本の細胞懸濁液に対して２０ｍＬまたは０ｍＬ（添加なし）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。その後、フィルター濾過群についてはナイロン製のフィルターＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させて細胞懸濁液を得た。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１４６】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表５に示す。クエン酸３ナトリウムを添加することにより、細胞回収率は８割以上に達した。Ｄ−ＰＢＳ（−）希釈のみ行った場合と比べ、２倍以上の細胞が得られ、キレート剤を用いた細胞回収方法が有用であることが示された。【０１４７】
【表５】
2016039391.tif 000007
【０１４８】
［実施例６］キレート剤の種類及び撹拌時間の検討
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。キレート剤として、クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液（３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ））又はＥＤＴＡ水溶液（１１ｍＭ）を、０．５ｍＬ添加し、２０回転倒混和した。この時点での各キレート剤の終濃度は、０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ）（クエン酸３ナトリウム）、１ｍＭ（ＥＤＴＡ）である。その後、細胞懸濁液を、振とう機（タイテック社製、Ｂｉｏ  Ｓｈａｋｅｒ、ＢＲ−３０）で、１２０ｒｐｍにて、０、１０又は３０分間撹拌した。更に、さらにＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を、１本の細胞懸濁液に対して２０ｍＬまたは０ｍＬ（添加なし）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１４９】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表６に示す。いずれのキレート剤を用いた場合でも、細胞回収率は上昇したが、ＥＤＴＡよりもクエン酸３ナトリウムの方が、細胞回収率を上昇させる効果が強かった。また、キレート剤を添加した後、撹拌を続けることにより、細胞回収率が更に上昇した。【０１５０】
【表６】
2016039391.tif 000008
【０１５１】
［実施例７］キレート剤添加条件の検討
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。キレート剤として、クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液（３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ））を０．５ｍＬ添加し、２０秒間ボルテックスで撹拌した（Ｎ−２０Ｍ、株式会社日伸理化製）。この時点でのクエン酸３ナトリウムの終濃度は、０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ）である。その後、細胞懸濁液を、室温にて、０又は３０分間静置した。更に、さらにＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を、１本の細胞懸濁液に対して２０ｍＬまたは０ｍＬ（添加なし）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。その後、フィルター濾過群についてはナイロン製のフィルターＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させて細胞懸濁液を得た。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１５２】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表７に示す。クエン酸３ナトリウムを添加後に細胞懸濁液を静置すると、細胞回収率が低下したが、フィルター濾過により、細胞回収率は回復した。【０１５３】
【表７】
2016039391.tif 000009
【０１５４】
［実施例８］キレート剤添加条件の検討
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。以下の工程Ｂ及びＣを、Ｂ→Ｃ、又はＣ→Ｂの順序で行った。
Ｂ：クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０．５ｍＬ添加し、２０秒間ボルテックスで撹拌（Ｎ−２０Ｍ、株式会社日伸理化製）。
Ｃ：Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を、１本の細胞懸濁液に対して２０ｍＬ添加し、２０回転倒混和。
その後、フィルター濾過群については、ナイロン製のフィルターＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させて細胞懸濁液を得た。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１５５】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表８に示す。ＰＢＳ希釈より前にクエン酸処理する方が、ＰＢＳ希釈後にクエン酸処理するよりも、細胞回収率が高かったが、フィルター濾過により、Ｂ及びＣの工程の順序に関わらず、高い細胞回収率が達成された。【０１５６】
【表８】
2016039391.tif 000010
【０１５７】
［実施例９］キレート剤添加条件の検討
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。以下の工程Ａ、Ｂ及びＣを、下記の表に記載した順序で行った。
Ａ：Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させる。
Ｂ：クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を終濃度が０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ）となるように添加し、２０秒間ボルテックスで撹拌するか、手で３０秒間緩やかに混和する。
Ｃ：Ｄ−ＰＢＳ（−）で５倍希釈。
得られた細胞懸濁液を、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。
陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。続いて５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１５８】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表９に示す。クエン酸処理、ＰＢＳ希釈及びフィルター濾過を組み合わせることにより、高い細胞回収率が達成された。フィルター濾過後にクエン酸処理を行った群では、遠心分離により細胞のペレットはできたが、ペレットが浮遊してしまい、細胞回収率を計測することができなかった。【０１５９】
【表９】
2016039391.tif 000011
【０１６０】
［実施例１０］フィルター及びキレート剤を用いた細胞回収試験
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従い、ホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。
上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。遠心回収の前処理の有無で細胞回収率を評価した。前処理ありの群ではナイロン製のフィルターＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）（孔径４０μｍ、ベクトンディッキンソン株式会社製）を３回通過させた。次に、３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ）クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ））、手動で泡立たない程度に３０秒間撹拌した。さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して５ｍＬ（２倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。
各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１６１】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１０に示す。前述の前処理を行った群では９割の回収率を示し、処理を行わなかった群の１０倍以上の細胞を得た。このことから、フィルター濾過、キレート処理及び希釈を組み合わせた細胞回収方法の有用性が示された。【０１６２】
【表１０】
2016039391.tif 000012
【０１６３】
［実施例１１］キレート剤を用いた細胞回収法における培地中タンパク質の効果
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を特許文献１の方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地に０％（添加なし）または１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、または０．１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した。調製した各培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加し、本細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した。次に、３．８％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム水溶液を０ｍＬまたは０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ））、２０秒間ボルテックスで撹拌した。さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して２０ｍＬ（５倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。
各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１６４】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１１に示す。本結果より、培地中にＦＢＳやＢＳＡなどのタンパク質が含まれることにより、キレート剤添加や希釈による細胞回収率増多効果が増幅することが明らかとなった。尚、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、または０．２０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加した場合にも、クエン酸処理及び／又は希釈処理により、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、または０．１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加したときと同様の高い細胞回収率が達成された。【０１６５】
【表１１】
2016039391.tif 000013
【０１６６】
［実施例１２］細胞回収におけるフィルター濾過の効果
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注した後、下記各種フィルターのいずれかにて３回濾過を行った。
フィルターＮｏ．１：（スペクトラム・ラボラトリーズ社製ＳｐｅｃｔｒａＭｅｓｈ（商標）、ポリエステル製、３７μｍ、
フィルターＮｏ．２：アズワン社製フィルコンＳ（商標）：ポリエチレン製、２０μｍ、
フィルターＮｏ．３：アズワン社製フィルコンＳ（商標）：ポリエチレン製、３０μｍ、
フィルターＮｏ．４：アズワン社製フィルコンＳ（商標）：ポリエチレン製、１００μｍ、
フィルターＮｏ．５：ベクトンディッキンソン社製Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）：ナイロン製、孔径４０μｍ、
フィルターＮｏ．６：ベクトンディッキンソン社製Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（商標）：ナイロン製、孔径１００μｍ、
フィルターＮｏ．７：富士理化工業社製ガラスフィルター板、ガラス製、孔径４０−５０μｍ。
さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して２０ｍＬ（５倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。
各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１６７】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１２に示す。本結果より、３０〜４０μｍ径のいずれの素材のフィルターも、８割前後の細胞回収率を示した。【０１６８】
【表１２】
2016039391.tif 000014
【０１６９】
［実施例１３］フィルター（複層）及びキレート剤を用いた細胞回収試験
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注後、フィルコンＳ（商標）（孔径３０μｍ、アズワン社製）を３回通過、または同フィルター中のフィルターメンブレンを３枚重ねてフィルターホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、型番：ＸＸ３００１２４０）にセットし１回通過させた。次に、３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ）クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０ｍＬ（添加なし）または０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ））、ボルテックスで２０秒間撹拌した。さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して０ｍＬ（添加なし）または２０ｍＬ（５倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。
各々、５００Ｇ、１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１７０】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１３に示す。本結果より、フィルターを３枚重ねた場合にも、単層で３回濾過した場合と同程度の細胞回収率が得られた。【０１７１】
【表１３】
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【０１７２】
［実施例１４］キレート剤による希釈率及び遠心力低減の検討
０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注後、フィルコンＳ（商標）（孔径３０μｍ、アズワン社製）中のフィルターメンブレンを３枚重ねてフィルターホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、型番：ＸＸ３００１２４０）にセットし１回通過させた。次に、３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ）クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０ｍＬ（添加なし）または０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ））、ボルテックスで２０秒間撹拌した。さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して０ｍＬ（添加なし）、５ｍＬ（２倍希釈）、または２０ｍＬ（５倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でヒト巨核芽球性白血病ＭＥＧ０１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を懸濁させた。
３００Ｇまたは５００Ｇにて１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１７３】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１４に示す。希釈倍率が低くなると細胞回収率が低下するが、クエン酸を添加すると改善し、遠心力を３００Ｇに落とした場合にも７割以上の回収率を得られた。【０１７４】
【表１４】
2016039391.tif 000016
【０１７５】
［実施例１５］フィルター、キレート剤を用いたリンパ球系細胞の回収
０．０１５または０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製）またはＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業株式会社製）の組成物を、特許文献１に記載された方法に従いホモミキサーにて調製した。上記培地にヒトＴ細胞性白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製、Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１）を１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。上記の細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに５ｍＬずつ分注後、フィルコンＳ（商標）（孔径３０μｍ、アズワン社製）を３枚重ねてフィルターホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、型番：ＸＸ３００１２４０）にセットし１回通過させた。次に、３．８％（ｗ／ｖ）（１２９．２ｍＭ）クエン酸３ナトリウム二水和物水溶液を０ｍＬ（添加なし）または０．５ｍＬ添加し（終濃度０．３５％（ｗ／ｖ）（１２ｍＭ））、ボルテックスで２０秒間撹拌した。さらに、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＬの細胞懸濁液に対して０ｍＬ（添加なし）または２０ｍＬ（５倍希釈）添加して希釈を行い、２０回転倒混和した。また、陽性対照として、脱アシル化ジェランガム不含のＤＭＥＭ培地に上記と同濃度でＪｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製、Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１）を懸濁させた。
５００Ｇにて１０分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。各々、ＤＭＥＭ培地１ｍＬで再懸濁し、１０μＬ分取し等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて回収された生細胞数を測定し、回収率を測定した。【０１７６】
陽性対照の回収率を１００とした時の各条件での細胞回収率を表１５に示す。フィルター濾過とキレート剤の併用により、脱アシル化ジェランガム含有培地からリンパ球系細胞を９５％以上回収できた。【０１７７】
【表１５】
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【０１７８】
［実施例１６］フィルター及びキレート剤を用いて回収後の細胞増殖評価
［実施例１５］と同様にフィルターとクエン酸３Ｎａを用いて０．０２０％脱アシル化ジェランガム含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業株式会社製）から回収したヒトＴ細胞性白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製、Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業株式会社製）に１０００００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した。また、陽性対照として、細胞回収処理（フィルター濾過、キレート剤添加、遠心処理）を行っていない細胞を同培地に同濃度にて懸濁した。
上記細胞懸濁液を２５平方センチメートル細胞培養フラスコ（コーニング社製）に１０ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて６日間まで培養した。
培養後、細胞懸濁液から１０μＬ分取し、等量のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  ０．４％（インビトロジェン株式会社製）と混合した後、全自動セルカウンター（ＴＣ２０、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）にて生細胞数を測定した。【０１７９】
細胞増殖評価結果を表１６に示す。細胞増殖速度は回収処理の有無に関わらず同程度であり、回収処理を経たことによる細胞障害性は認められなかった。【０１８０】
【表１６】
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【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明によれば、細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物を用いて、動植物細胞及び／又は組織を培養した後、得られた培養調製物から、動植物細胞及び／又は組織をより効率的に回収できる。【０１８２】
ここで述べられた特許、特許出願明細書、科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１８３】
本出願は、日本で出願された特願2014-183687（出願日：2014年9月9日）及び特願2015-110331（出願日：2015年5月29日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【国際調査報告】
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