(57)【要約】  空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料を空間変調する第１空間変調部と、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料を空間変調する第２空間変調部と、前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光による前記蛍光試料の画像を、変調画像として取得する撮像部とを備える。
2015162921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料を空間変調する第１空間変調部と、
空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料を空間変調する第２空間変調部と、
前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光による前記蛍光試料の画像を、変調画像として取得する撮像部と、
を備えることを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項２】
請求項１に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記変調画像は、
誘導放出光に起因して自然放出光に生じた減少分による前記蛍光試料の画像である
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項３】
請求項２に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記撮像部は、
前記励起光と前記誘導光との双方に応じて発生した自然放出光による前記蛍光試料の画像と、前記励起光のみに応じて発生した自然放出光による前記蛍光試料の画像との差分をとることにより、前記変調画像を取得する
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項４】
請求項２に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記撮像部は、
前記励起光と、時間方向にかけて強度の変調された前記誘導光とに応じて発生した自然放出光を、前記変調に同期して検出することにより、前記変調画像を取得する
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記変調画像に含まれる変調成分のうち、少なくとも、空間周波数Ｋで変調された変調成分と、空間周波数２Ｋで変調された変調成分と、空間周波数−Ｋで変調された変調成分と、空間周波数−２Ｋで変調された変調成分と、空間周波数ゼロで変調された変調成分とを、互いに分離して抽出する演算部を更に備える
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項６】
空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料を空間変調し、
空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料を空間変調し、
前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光による前記蛍光試料の画像を、変調画像として取得する
ことを特徴とする構造化照明観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造化照明顕微鏡装置及び構造化照明観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオサイエンス、特に分子生物学の分野において、主要な顕微技術として利用されているのは蛍光顕微鏡である。特に近年では１００ｎｍ以下の空間分解能を実現する超解像顕微鏡が登場し、バイオサイエンス分野にさらなる貢献を遂げている。【０００３】
広く利用されている超解像顕微鏡としてＳＩＭ（Structured Illumination Microscopy）がある（特許文献１等を参照。）。ＳＩＭは、格子パターンからなる励起光で試料を空間変調することにより分解能を最大で２倍に向上させる顕微鏡である。【０００４】
しかし、現状のＳＩＭが達成できる分解能は１００ｎｍ程度であるのに対して、観察対象である細胞小器官のサイズは５０ｎｍ以下であるため、分解能の更なる向上が求められる。【０００５】
因みに、ＮＳＩＭ（ＮＳＩＭ：Nonlinear Structured Illumination Microscopy）は、励起光の照度増大により励起を飽和させて蛍光試料からの蛍光放出量を飽和させ、照明パターンに対して見た目上の高い空間周波数成分を重畳させることにより高い分解能を達成している。しかしながら、励起光の強度を高めると生体試料へのダメージが増大するという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国再発行特許発明第３８３０７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、励起光の照度を著しく高めることなく高い分解能（例えばＳＩＭより高い分解能）を達成することのできる構造化照明顕微鏡装置及び構造化照明観察方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明を例示する構造化照明顕微鏡装置の一態様は、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料を空間変調する第１空間変調部と、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料を空間変調する第２空間変調部と、前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光による前記蛍光試料の画像を、変調画像として取得する撮像部とを備える。【０００９】
本発明を例示する構造化照明観察方法の一態様は、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料を空間変調し、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料を空間変調し、前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光による前記蛍光試料の画像を、変調画像として取得する。【００１０】
本発明によれば、励起光の照度を著しく高めることなく高い分解能を達成することのできる構造化照明顕微鏡装置及び構造化照明観察方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１実施形態のＳＴ−ＳＩＭの構成図である。
【図２】ＳＴ−ＳＩＭにおいて標本５に入射する光と標本５から射出する光とを説明する図である。
【図３】第１実施形態のＳＴ−ＳＩＭのタイミングチャートである。
【図４】励起光による干渉縞と、誘導光による干渉縞と、合成干渉縞との関係を説明する図である。
【図５】合成干渉縞のフーリエスペクトルと、変調画像に含まれる各種の変調成分とを説明する図である。
【図６】位相数Ｎｍａｘ＝５、方向数Ｍｍａｘ＝１である場合の復調演算を説明する図である。
【図７】方向数Ｍｍａｘ＝４とした場合の解像範囲の例である。
【図８】励起光の干渉縞の光軸方向の強度分布と、合成干渉縞の光軸方向の強度分布と、差分干渉縞の光軸方向の強度分布とを説明する図である。
【図９】第２実施形態のＳＴ−ＳＩＭのタイミングチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として誘導放出構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ：Stimulated Emission - Structured Illumination Microscopy）を説明する。ここでは、構造化照明を２光束干渉で実現したＳＩＭ、すなわち２Ｄ−ＳＩＭ（Two-Dimensional Structured Illumination Microscopy）に誘導放出過程を適用した場合を想定する。
【００１３】
先ず、図１を参照してＳＴ−ＳＩＭの構成を説明する。図１に示すとおりＳＴ−ＳＩＭ１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、第２対物レンズ３２と、撮像素子３５と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０とが備えられる。
【００１４】
レーザユニット１００には、パルスレーザ光源１０１、レンズ１０２、ビームスプリッタＢＳ、光パラメトリック発振器１０３、１０４、ミラーＭ１、Ｍ２、ダイクロイックミラーＤＭ、レンズ１０５などが配置される。照明光学系１０には、コレクタレンズ１２、位相型の回折格子１３、機構１３Ａ、集光レンズ１６、０次光カットマスク１８、レンズ２５、視野絞り２６、フィールドレンズ２７、ダイクロイックミラー７、対物レンズ６、標本５が配置される。
【００１５】
レーザユニット１００の光源は、パルスレーザ光源１０１である。パルスレーザ光源１０１によるパルス発振の繰り返し周波数ｆｒは、例えば８０ＭＨｚである。なお、レーザユニット１００の光源は、パルスレーザ光源ではなくＣＷレーザ光源（ＣＷ：Continuous wave）であってもよいが、ここではパルスレーザ光源を想定する。
【００１６】
パルスレーザ光源１０１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１０２により径の太い平行光束となり、ビームスプリッタＢＳへ入射する。ビームスプリッタＢＳへ入射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタＢＳを透過するパルスレーザ光と、ビームスプリッタＢＳを反射するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタＢＳを透過したパルスレーザ光は光パラメトリック発振器１０３へ入射する。ビームスプリッタＢＳを反射したパルスレーザ光は、ミラーＭ１へ入射すると、ミラーＭ１を反射し、光パラメトリック発振器１０４へ入射する。
【００１７】
光パラメトリック発振器１０３は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω１に変換し、光パラメトリック発振器１０４は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２に変換する。ここでは、光周波数ω１、ω２の関係をω２＜ω１とする。
【００１８】
光パラメトリック発振器１０３から射出した光周波数ω１のパルスレーザ光は、ミラーＭ２で反射した後、ダイクロイックミラーＤＭを反射する。光パラメトリック発振器１０４から射出した光周波数ω２のパルスレーザ光は、ダイクロイックミラーＤＭを透過し、光周波数ω１のパルスレーザ光と光路が統合される。
【００１９】
互いの光路を統合させた光周波数ω１、ω２のパルスレーザ光は、レンズ１０５を介して光ファイバ１１の入射端に入射すると、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出した光周波数ω１、ω２のパルスレーザ光は、コレクタレンズ１２によって径の太い平行光束に変換され、回折格子１３へ入射すると、各次数の回折光束に分岐する。各次数の回折光束は、集光レンズ１６に入射すると、集光レンズ１６の集光作用を受けて瞳共役面６Ａ’の各位置に集光する。
【００２０】
各次数の回折光束のうち、２次以上の高次回折光束と０次回折光束とは、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された０次光カットマスク１８で遮光され、±１次回折光束は、０次光カットマスク１８を通過する。
【００２１】
０次光カットマスク１８を通過した±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で回折格子１３と共役な面を形成した後、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、ダイクロイックミラー７で反射した後、対物レンズ６の瞳面６Ａ上の互いに異なる位置に集光する。なお、＋１次回折光束の集光位置と、−１次回折光束の集光位置とは、対物レンズ６の光軸ＡＺに関して対称である。
【００２２】
瞳面６Ａ上に集光した±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から平行光束となって射出すると、標本５の表面で互いに干渉して周期的な照度分布を有した干渉縞、具体的には、正弦波状の照度分布を有した干渉縞を形成する。この干渉縞（構造化照明）によって標本５が空間変調される。
【００２３】
標本５は、蛍光染色された生体などの蛍光試料である。この標本５が干渉縞で空間変調されると、干渉縞の周期構造と、標本５に発現している蛍光領域の周期構造との差に相当するモアレ縞が現れる。このモアレ縞においては、蛍光領域における高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す蛍光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かう。よって、標本５を空間変調すると、蛍光領域の高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達される。
【００２４】
空間変調された標本５で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光束に変換された後、ダイクロイックミラー７を透過し、第２対物レンズ３２を介して撮像素子３５の撮像面に蛍光領域の変調像を形成する。
【００２５】
撮像素子３５の撮像面に形成された変調像は、撮像素子３５によって電気信号である変調画像へと変換される。画像記憶・演算装置４０は、この変調画像に対して復調演算を施すことにより復調画像を生成する。この復調画像が蛍光領域の超解像画像である。この超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、不図示の画像表示装置へと送出される。
【００２６】
ここで、ＳＴ−ＳＩＭにおいても２Ｄ−ＳＩＭと同様、復調演算を行うために干渉縞の位相の異なる複数枚の変調画像が必要である。ここでは干渉縞の位相をシフトさせるために、機構１３Ａが回折格子１３を周期構造の方向へシフトさせると仮定する。なお、ここでは、ＳＴ−ＳＩＭにおいて干渉縞の位相の異なる変調画像の必要枚数（位相数）は、誘導光（後述）の強度によって異なるが、少なくとも「５以上」となる。そこで、ここでは必要な位相数を「５」として説明する。なお、機構１３Ａによる干渉縞の位相シフトのタイミングは、制御装置３９によって制御される。
【００２７】
また、ＳＴ−ＳＩＭにおいても２Ｄ−ＳＩＭと同様、標本５の複数方向に亘る超解像効果を得るためには干渉縞の方向の異なる複数枚の変調画像が必要である。ここでは干渉縞の方向を切り換えるために、機構１３Ａが回折格子１３を光軸ＡＺの周りに回転させると仮定する。ＳＴ−ＳＩＭにおいて干渉縞の方向の異なる変調画像の必要枚数（方向数）は、必要に応じて決定される。因みに、方向数が４である場合、回折格子１３の回転位置は４５°ずつ異なる４位置の間で切り換えられる。なお、機構１３Ａによる干渉縞の方向切り換えのタイミングは、制御装置３９によって制御される。
【００２８】
次に、光周波数ω１のパルスレーザ光と、光周波数ω２のパルスレーザ光とを説明する。
【００２９】
上述したとおりＳＴ−ＳＩＭでは、標本５を空間変調するパルスレーザ光として、光周波数ω１のパルスレーザ光と、光周波数ω２のパルスレーザ光とが使用される。
【００３０】
これらの光周波数ω１のパルスレーザ光と光周波数ω２のパルスレーザ光との間では、回折格子１３における回折角度が異なるので、瞳面６Ａにおける集光位置が若干ずれる。
【００３１】
しかし、光周波数ω１のパルスレーザ光と光周波数ω２のパルスレーザ光との間では、標本５に形成する干渉縞の照度分布（分布形状及び空間周波数）は共通である。なぜなら、回折格子１３と標本５とは共役であって、結像倍率は光周波数（波長）に依存しないからである。よって以下では、光周波数ω１の干渉縞の空間周波数、光周波数ω２の干渉縞の空間周波数を「Ｋ」とおく。
【００３２】
また、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、光周波数ω１のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２のパルスレーザ光の光路長との差は、予めゼロに設定されている。
【００３３】
よって、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭにおいて、光周波数ω１のパルスレーザ光が標本５に照射されるタイミングと、光周波数ω２のパルスレーザ光が標本５に照射されるタイミングとは一致する。
【００３４】
先ず、光周波数ω１のパルスレーザ光が標本５に照射されると、標本５に存在する幾つかの蛍光物質の電子のエネルギー準位が励起準位に移行（励起）する。つまり、光周波数ω１のパルスレーザ光には、電子を励起する働きがある。
【００３５】
但し、光周波数ω１のパルスレーザ光と同時に光周波数ω２のパルスレーザ光が標本５に照射されると、励起中の電子の幾つかのエネルギー準位が基底準位へ移行（誘導放出）し、光周波数ω２の誘導放出光が発生する。つまり、光周波数ω２のパルスレーザ光には、励起中の電子を誘導放出させる働きがある。
【００３６】
よって以下では、標本５に照射される光周波数ω１のパルスレーザ光を「励起光」と称し、標本に照射される光周波数ω２のパルスレーザ光を「誘導光」と称す。なお、励起光の光周波数ω１及び誘導光の光周波数ω２の各々は、波長換算にしておよそ紫外域〜近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。これらの波長は、標本５に使用された蛍光色素に応じて選択されることが望ましい。
【００３７】
また、標本５において励起光と誘導光との双方が照射されてもなお励起準位にある電子には自然放出が起こり、光周波数ω１より低い光周波数ωｆの自然放出光（蛍光）が発生する。また、標本５に照射された励起光の大部分は標本５を通過し、標本５に照射された誘導光の大部分は標本５を通過する。
【００３８】
したがって、図２（ａ）に示すとおり、ＳＴ−ＳＩＭにおいて励起光及び誘導光に応じて標本５から射出する光は、以下の４種類である。
【００３９】
（１）光周波数ω１の励起光
（２）光周波数ω２の誘導光
（３）光周波数ω２の誘導放出光
（４）光周波数ωｆの蛍光
ＳＴ−ＳＩＭでは、このうち光周波数ωｆの蛍光のみを検出対象とする。
【００４０】
但し、図２（ｂ）に示すとおり蛍光の光周波数範囲はブロードであって、誘導光の光周波数ω２は蛍光の光周波数と部分的に重複していることになる。
【００４１】
そこで、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、光周波数範囲がブロードな蛍光のみを高精度に検出するために、制御装置３９は、レーザユニット１００と撮像素子３９とを同期制御することにより、撮像素子３５による変調画像の撮像タイミング（＝撮像素子３５の電荷蓄積タイミング）が標本５に対する誘導光の照射タイミングから外れるような構成を採用する。但し、励起光のパルス幅、誘導光のパルス幅の各々は、蛍光寿命より短いことが望ましい。
【００４２】
したがって、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、誘導光及び誘導放出光に起因したノイズ成分が変調画像に重畳することを防止できる。
【００４３】
なお、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、標本５に対する励起光の照射タイミングが、標本５に対する誘導光の照射タイミングに一致するので、撮像素子３５による変調画像の撮像タイミングは、標本５に対する励起光の照射タイミングから自動的に外れることになる。
【００４４】
したがって、本実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、励起光に起因したノイズ成分が変調画像に重畳することを防止できる。
【００４５】
図３は、標本５に対する励起光の照射タイミングと、標本５に対する誘導光の照射タイミングと、撮像素子３５の電荷蓄積タイミングと、干渉縞の位相シフトタイミングとの関係を示すタイミングチャートである。
【００４６】
本実施形態の制御装置３９は、図３（ａ）、（ｂ）に示すとおり、励起光及び誘導光を標本５へ同時に照射すると共に、この照射を周期Ｔｒ＝１／ｆｒで繰り返す。この周期Ｔｒは、標本５を染色した蛍光物質の蛍光寿命より長いことが望ましい。よって、標本５からの蛍光の発光及び減衰は、周期Ｔｒで繰り返される。
【００４７】
また、本実施形態の制御装置３９は、図３（ｃ）に示すとおり、１周期Ｔｒ内のうち励起光及び誘導光の照射後かつ蛍光発光中のタイミングで撮像素子３５の電荷蓄積を行う。このタイミングでは、励起光、誘導光、誘導放出光は撮像素子３５に入射せず、蛍光のみが撮像素子３５へ入射する。よって、この電荷蓄積により生成された変調画像には、励起光に起因したノイズ成分、誘導光に起因したノイズ成分、誘導放出光に起因したノイズ成分は、何れも重畳しない。
【００４８】
また、本実施形態の制御装置３９は、図３（ｄ）に示すとおり、１周期Ｔｒ内のうち撮像素子３５の電荷蓄積後のタイミングで干渉縞の位相シフトを行う。
【００４９】
さらに、本実施形態の制御装置３９は、以上の処理を１ラウンドとして５ラウンド分だけ繰り返し（ラウンドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５）、５位相分の変調画像を取得する。
【００５０】
また、本実施形態の制御装置３９は、５位相分の変調画像の取得（ラウンドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５）を、干渉縞の方向を切り換えながら繰り返し、例えば５位相×４方向の変調画像＝２０枚の変調画像を取得する。
【００５１】
なお、本実施形態の制御装置３９は、励起光及び誘導光の照射、撮像素子３５の電荷蓄積、干渉縞の位相シフトからなる一連の処理の繰り返し周期Ｔｒを、蛍光寿命より長く設定するので、時間的に連続する２枚の変調画像の間のクロストークを防ぐこともできる。ここでいう「クロストーク」とは、先行フレームの変調画像に反映させるべき蛍光が後続フレームの変調画像に反映されてしまう現象のことである。
【００５２】
次に、ＳＴ−ＳＩＭにおける干渉縞を詳しく説明する。図４は、ＳＴ−ＳＩＭにおける干渉縞を説明する図であり、図４中の符号「ｘ」は、図４（ａ）に示すとおり干渉縞による標本５の変調方向を表している。
【００５３】
先ず、励起光の単体による干渉縞Ｉｅｘ（ｘ）は、図４（ｂ）に示すとおり、Ｉｅｘ（ｘ）＝Ｉｅ（１＋ｃｏｓＫｘ）で表される。この干渉縞Ｉｅｘ（ｘ）は、正弦波状の強度分布を有しており、空間周波数ゼロの成分と空間周波数Ｋの成分とからなる。
【００５４】
次に、誘導光の単体による干渉縞Ｉｓｔ（ｘ）は、図４（ｃ）に示すとおり、Ｉｓｔ（ｘ）＝Ｉｓ（１＋ｃｏｓＫｘ + φＳ）で表される。この干渉縞Ｉｓｔ（ｘ）も、正弦波状の強度分布を有しており、空間周波数ゼロの成分と空間周波数Ｋの成分とからなる。ここでφＳは励起光に対する誘導光の位相差である。なお、図４（ｃ）にはφＳ＝０の場合を示した。
【００５５】
そして、ＳＴ−ＳＩＭの標本５は、図４（ｄ）に示すとおり、以上の２種類の干渉縞Ｉｅｘ（ｘ）、Ｉｓｔ（ｘ）が相互に形成する合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）によって照明されるとみなせる。この合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）は、以下の式（１）で表される。
【００５６】
【数１】
2015162921.tif 000003
【００５７】
但し、式（１）の「Ａ」は蛍光に寄与する係数であり、「Ｂ」は誘導放出に寄与する係数である。また、式（１）は近似式である。
【００５８】
この合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）は、正弦波状の強度分布とは若干異なり、高周波数成分を有している。具体的には、合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）には、空間周波数ゼロの成分と、空間周波数Ｋの成分と、空間周波数ｍＫの周波数成分とが含まれる（但し、ｍは２以上の変調次数であって、ｍ＝２、３、４、…である。）。
【００５９】
このように、標本５を変調する照明パターン（合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ））に空間周波数ゼロの成分と、空間周波数Ｋの成分と、空間周波数２Ｋ以上の成分とが含まれるＳＴ−ＳＩＭは、標本５を変調する照明パターン（２光束干渉縞）に空間周波数ゼロの成分と、空間周波数Ｋの成分としか含まれない２Ｄ−ＳＩＭと比較して、超解像範囲を広くすることができる（図５）。
【００６０】
また、ＳＴ−ＳＩＭにおいて、超解像範囲の上限値を決めるのは、変調次数ｍの最大値であって、変調次数ｍの値は、誘導光の強度に依存する。このため、誘導光の強度が大きいときほど変調次数ｍの最大値は大きくなり、超解像範囲が拡大される（解像力が向上する）。但し、変調次数ｍの最大値が大きいときほど、干渉縞の位相の異なる変調画像の必要枚数（位相数）が増加するので、超解像画像のフレームレートは低下する傾向にある。この傾向はＮＳＩＭにおいても同様であり、超解像範囲の拡大（解像力の向上）とフレームレートの向上とは、トレードオフの関係にある。
【００６１】
しかし、ＳＴ−ＳＩＭにおける空間周波数ｍＫの成分の振幅｜αｍ｜は、ＮＳＩＭにおける空間周波数ｍＫの成分の振幅より大きくすることが可能なため、ＳＴ−ＳＩＭとＮＳＩＭとの間で変調次数ｍの最大値が共通であるならば、ＳＴ−ＳＩＭのＯＴＦの方が、ＮＳＩＭのＯＴＦよりも高コントラストになる。したがって、ＳＴ−ＳＩＭの解像力は、ＮＳＩＭの解像力より高くなる。
【００６２】
また、ＳＴ−ＳＩＭにおいて、励起光の位相を基準とした誘導光の位相φＳをφＳ＝π［ｒａｄ］に設定すると、空間周波数２Ｋ以上の成分の振幅｜αｍ｜を増大させつつ、空間周波数Ｋの成分の振幅｜α１｜も増大させることができる。このようなメリットはＮＳＩＭでは得られない。つまり、ＮＳＩＭでは、空間周波数２Ｋ以上の成分の振幅｜αｍ｜を増大させると空間周波数Ｋの成分の振幅｜α１｜が減少してしまうため、ある空間周波数にとってはコントラストが低下してしまうことになり、これは解像力の低下を引き起こす。
【００６３】
ここで、励起光の位相を基準とした誘導光の位相φＳをπ［ｒａｄ］に設定するためには、波長の異なる誘導光と励起光とが図１の瞳面６Ａ又は瞳共役面６Ａ’の近傍で空間的に分離されることを利用すればよい。
【００６４】
例えば、瞳面６Ａ又は瞳共役面６Ａ’の近傍面のうち、誘導光の＋１次回折光又は−１次回折光の光路にのみガラスブロックを挿入し、ガラスブロックの位相遅延量を（２ｎ＋１）πに設定すればよい。ここでｎは整数である。
【００６５】
或いは、瞳面６Ａ又は瞳共役面６Ａ’の近傍に空間光変調器を配置し、空間光変調器のうち、誘導光の＋１次回折光又は−１次回折光の入射領域の位相遅延量を（２ｎ＋１）πに設定し、他の領域の位相遅延量をゼロに設定すればよい。ここでｎは整数である。
【００６６】
なお、位相φＳは励起光の位相を基準とした誘導光の位相なので、誘導光を位相遅延させる代わりに、励起光を位相遅延させてもよいし、誘導光と励起光との双方を位相遅延させてもよい。但し、誘導光と励起光との双方を位相遅延させる場合は、双方の位相遅延量との間に適当な差異が設けられる。
【００６７】
或いは、回折格子１３として励起光用の回折格子と誘導光用の回折格子とを用意し、格子線と垂直な方向における２つの回折格子の位置を予めずらしておくことにより、励起光の位相を基準とした誘導光の位相φＳをπ［ｒａｄ］にしてもよい。
【００６８】
また、画像処理によるアーティファクト（誤差）を低減するためには、使用する次数をｍとした場合、その次数ｍより高い次数（ｍ＋１）の振幅ができる限り小さく抑えられることが望ましい。また、ＳＴ−ＳＩＭとＮＳＩＭとの間で振幅｜α２｜を共通にした場合、振幅｜α３｜はＳＴ−ＳＩＭの方が小さくなる。このため、アーティファクト低減の観点からも、ＳＴ−ＳＩＭは優れていると言える。
【００６９】
すなわち、ＳＴ−ＳＩＭでは、誘導光の強度と位相とを適切に制御することで、照明パターン（合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ））に含まれる周波数成分のうち、空間周波数３Ｋ以上の高周波数成分を、無視できるレベル（ノイズレベル）にまで低減することができる。
【００７０】
加えて、ＳＴ−ＳＩＭにおいて超解像のために行っていることは、２Ｄ−ＳＩＭと同様の励起光照射（励起光による自然放出）に加えて誘導光照射（誘導光による誘導放出）を行うことに過ぎないので、ＮＳＩＭのように励起光照射の強度を著しく高めて飽和を生じさせる必要もない。このため、生体試料などを含む標本５のダメージを低減することができる。
【００７１】
以下、合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）に含まれる高周波数成分（空間周波数３Ｋ以上）を無視できると仮定して議論を展開する。 
【００７２】
ＳＴ−ＳＩＭの合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）のフーリエスペクトルは、図５（ａ）に示すとおりである。このフーリエスペクトルのうち、０次フーリエスペクトルの大きさ（＝空間周波数ゼロの成分の振幅）は｜α０｜であり、±１次フーリエスペクトルの大きさ（＝空間周波数Ｋの成分の振幅）は｜α１｜であり、±２次フーリエスペクトルの大きさ（＝空間周波数２Ｋの成分の振幅）は｜α２｜であり、３次以上の高次フーリエスペクトルの大きさ（＝空間周波数３Ｋ以上の成分の振幅）はゼロ（ノイズレベル）である。
【００７３】
そして、このフーリエスペクトルからなる合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）で標本５を空間変調すると、変調画像には、図５（ｂ）に示すとおり０次変調成分と、＋１次変調成分と−１次変調成分と２次変調成分と−２次変調成分との５つの変調成分が重畳し、３次以上の高次変調成分は重畳しない。本実施形態における位相数を５としたのは、これら５つの変調成分を復調演算で分離するためである。
【００７４】
なお、０次変調成分は、一様照明で解像可能な空間周波数範囲（＝通常解像範囲）の情報であり、＋１次変調成分は、通常解像範囲から＋Ｋだけずれた空間周波数範囲の情報であり、＋２次変調成分は、通常解像範囲から＋２Ｋだけずれた空間周波数範囲の情報であり、−１次変調成分は、通常解像範囲から−Ｋだけずれた空間周波数範囲の情報であり、−２次変調成分は、通常解像範囲から−２Ｋだけずれた空間周波数範囲の情報である。
【００７５】
つまり、ＳＴ−ＳＩＭの合成干渉縞Ｉｓｐ（ｘ）で解像可能な空間周波数範囲は、２Ｄ−ＳＩＭの干渉縞で解像可能な空間周波数範囲（＝通常解像範囲の最大２倍）の最大１．５倍であり、通常解像範囲の最大３倍である。
【００７６】
次に、図６を参照して画像記憶・演算装置４０による復調演算を説明する。
【００７７】
ここでは簡単のため、合成干渉縞の位相数Ｎｍａｘを５、方向数Ｍｍａｘを１と仮定する。図６において符号Ｉｒ（１，１）、Ｉｒ（２，１）、…、Ｉｒ（５，１）は、合成干渉縞の位相の互いに異なる変調画像であって、変調画像Ｉｒ（Ｎ、Ｍ）の「Ｎ」は、その変調画像に寄与した合成干渉縞の位相番号（ここでは１〜５）であり、変調画像Ｉｒ（Ｎ、Ｍ）の「Ｍ」は、その変調画像に寄与した合成干渉縞の方向番号（ここでは１）である。
【００７８】
画像記憶・演算装置４０による復調演算は、以下の手順（Ａ）〜（Ｅ）からなる。
【００７９】
（Ａ）画像記憶・演算装置４０は、図６（ａ）に示すとおりＮｍａｘ×Ｍｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）の変調画像を個別にフーリエ変換する。
【００８０】
（Ｂ）画像記憶・演算装置４０は、図６（ｂ）に示すとおり合成干渉縞の方向が共通であるＮｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）の変調画像同士で変調成分の分離を行う。
【００８１】
（Ｃ）画像記憶・演算装置４０は、図６（ｃ）に示すとおり互いに分離された５つの変調成分の各々を再配置する。
【００８２】
（Ｄ）画像記憶・演算装置４０は、図６（ｄ）に示すとおり再配置された５つの変調成分を同一の波数空間上で重み付け合成することにより、空間周波数範囲の拡張された復調画像Ｏｋを生成する。
【００８３】
（Ｅ）画像記憶・演算装置４０は、図６（ｅ）に示すとおり復調画像Ｏｋを逆フーリエ変換することにより、標本５の超解像画像Ｏｒを生成する。
【００８４】
次に、手順（Ｂ）〜（Ｅ）の原理を説明する。
【００８５】
先ず、変調方向の標本座標をｘとおき、結像光学系（対物レンズ６、第２対物レンズ３２）の点像強度分布をＰｒ（ｘ）とおき、標本５における蛍光領域の構造をＯｒ（ｘ）とおき、合成干渉縞による標本５の変調次数ｌを−２、−１、０、１、２とおき、合成干渉縞による標本５の１次変調の空間周波数をＫとおき、合成干渉縞の位相をφとおき、合成干渉縞の振幅をｍｌとおくと、変調画像は以下の式（２）で表される。
【００８６】
【数２】
2015162921.tif 000004
【００８７】
但し、式（２）中の記号「＊」は、畳み込み積分を表す。ここでは、実空間における量と波数空間における量とを区別するために、実空間における量には添え字「ｒ」を付与し、波数空間における量には添え字「ｋ」を付与する。
【００８８】
よって、変調画像Ｉｒ（ｘ）をフーリエ変換したもの（＝Ｉｋ（ｋ））は、以下の式（３）のとおり表される。
【００８９】
【数３】
2015162921.tif 000005
【００９０】
なお、結像光学系の点像強度分布Ｐｒ（ｘ）をフーリエ変換したもの（＝Ｐｋ（ｋ））は、結像光学系の伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）に相当する。
【００９１】
ここで、式（３）におけるＯｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝−２、−１、０、１、＋２）は、変調画像Ｉｋ（ｋ）に重畳された各次数の変調成分である。１次変調成分Ｏｋ（ｋ＋Ｋ）、−１次変調成分（ｋ−Ｋ）においては、標本５の実際の空間周波数成分がＫだけ（低周波数側へ）シフトしている。また、２次変調成分Ｏｋ（ｋ＋２Ｋ）、−２次変調成分（ｋ−２Ｋ）においては、標本５の実際の空間周波数成分が２Ｋだけ（低周波数側へ）シフトしている。このシフトの量が大きいほど、超解像効果は大きくなる。このため、合成干渉縞による１次変調の空間周波数「Ｋ」の値は、結像光学系が結像できる範囲内でなるべく高い値に設定されることが望ましい。
【００９２】
さて、Ｎｍａｘ×Ｍｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）の変調画像のうち、合成干渉縞の方向が共通であって位相の異なるＮｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）の変調画像の間では、φのみが異なり、ｍｌ及びＫは共通である。よって、それらＮｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）のうち第ｊフレームの変調画像に反映されている合成干渉縞の位相をφjとおくと、第ｊフレームの変調画像Ｉｋｊ（ｋ）は、以下の式（４）で表される。
【００９３】
【数４】
2015162921.tif 000006
【００９４】
よって、手順（Ｂ）では、Ｎｍａｘフレーム（ここでは５フレーム）の変調画像Ｉｋｊ（ｋ）によって得られる５つの方程式を連立させて解くことで、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝−２，−１，０，１，＋２）の各々を既知とする（互いに分離する）ことができる。因みに、この式（４）におけるＰｋ（ｋ）は、結像光学系に固有なので、予め測定しておくことが可能である。
【００９５】
なお、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝−２，−１，０，１，＋２）を互いに分離する際には、 Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）Ｐｋ（ｋ）（ｌ＝−２，−１，０，１，＋２）の各々を既知としてから、それらをＰｋ（ｋ）の値で除算してもよいが、単なる除算を行う代わりに、ウィナーフィルタなどノイズの影響を受けにくい公知の手法を利用してもよい。
【００９６】
そして、手順（Ｃ）では、±１次変調成分Ｏｋ（ｋ＋Ｋ）、Ｏｋ（ｋ−Ｋ）を、変調周波数Ｋの分だけｋｘ方向にかけてシフト（再配置）すると共に、±２次変調成分Ｏｋ（ｋ＋２Ｋ）、Ｏｋ（ｋ−２Ｋ）を、変調周波数２Ｋの分だけｋｘ方向にかけてシフト（再配置）すればよい。
【００９７】
また、手順（Ｄ）では、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝−２，−１，０，１，＋２）を波数空間上で重み付け合成することで、周波数範囲の広い復調画像Ｏｋ（ｋｘ）を生成すればよい。
【００９８】
よって、手順（Ｅ）では、この復調画像Ｏｋ（ｋｘ）を逆フーリエ変換すれば、標本５の超解像画像Ｏｒ（ｘ）が得られる。この超解像画像Ｏｒ（ｘ）は、合成干渉縞の変調方向（ｘ方向）にかけて高い超解度を有している。
【００９９】
なお、ここでは位相数Ｎｍａｘを５と仮定したので、連立方程式を解くことによって変調成分の分離を行ったが、位相数Ｎｍａｘが５より大きい場合は、国際公開第２００６／１０９４４８号パンフレットに開示された方法で分離を行ってもよい。
【０１００】
また、ここでは手順（Ｃ）、（Ｄ）を順次に行ったが、手順（Ｃ）、（Ｄ）を一括の演算式で行うことも可能である。その演算式としては、以下の非特許文献１のOnline Methodsにおける数式（１）などが適用可能である。
【０１０１】
非特許文献１："Super-Resolution Video Microscopy of Live Cells by Structured Illumination", Peter Kner, Bryant B. Chhun, Eric R. Griffis, Lukman Winoto, and Mats G. L. Gustafsson, NATURE METHODS Vol.6 NO.5, pp.339-342, (2009)
また、ここでは方向数Ｍｍａｘ＝１とした場合の復調演算を説明したが、方向数Ｍｍａｘを２以上としてよいことは言うまでもない。
【０１０２】
例えば、４５°ずつ異なる４方向の合成干渉縞の各々で５位相の変調画像を取得し（合計２０枚の変調画像を取得し）、合成干渉縞の方向ごとに手順（Ｂ）〜（Ｄ）を行えば、図７に示すとおり４方向の各々に亘って解像範囲を拡張することができる。
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態（ＳＴ―ＳＩＭ）の変形例を説明する。ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。
【０１０３】
本実施形態の制御装置３９は、励起光と誘導光とのうち双方をオンした状態で標本５の蛍光画像である変調画像ＩＡを取得すると共に、励起光と誘導光とのうち前者のみをオンした状態で標本５の蛍光画像である変調画像ＩＢを取得し、変調画像ＩＡ、ＩＢを１セットとして画像記憶・演算装置４０へ送出する。
【０１０４】
変調画像ＩＡに寄与した干渉縞は、第１実施形態で説明した合成干渉縞であり、変調画像ＩＢに寄与した干渉縞は、励起光の単体による干渉縞である。また、互いにセットを成す変調画像ＩＡ、ＩＢの間で干渉縞の位相及び方向は共通である。
【０１０５】
本実施形態の画像記憶・演算装置４０は、互いにセットを成す変調画像ＩＢと変調画像ＩＡとの差分画像ＩＤ＝ＩＢ−ＩＡを生成し、差分画像ＩＤに対して第１実施形態の変調画像と同様の復調演算を施すことにより、超解像画像を生成する。
【０１０６】
図８は、変調画像ＩＢの感度と、変調画像ＩＡの感度と、差分画像ＩＤの感度とを比較する図である。なお、ここでいう「画像の感度」とは、標本５から画像へと反映可能な蛍光強度分布のことであって、標本５の光軸方向にかけて一様な密度で蛍光物質が存在していた場合における画像の輝度分布に相当する。
【０１０７】
図８（ａ）は、変調画像ＩＢの光軸方向（ｚ方向）における感度分布を模式的に示し、図８（ｂ）は、変調画像ＩＡの光軸方向（ｚ方向）における感度分布を模式的に示し、図８（ｃ）は、差分画像ＩＤの光軸方向（ｚ方向）における感度分布を模式的に示している。図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）において点線で示すのは、標本５の内部における観察対象面であって、対物レンズ６の焦点面に相当する。
【０１０８】
先ず、図８（ａ）に示すとおり、変調画像ＩＢの感度分布カーブによると、観察対象面から外れた面からの蛍光までもが変調画像ＩＢに影響するので、変調画像ＩＢには背景成分（ノイズの一種）が重畳する。なお、図８（ａ）には示さなかったが、変調画像ＩＢの感度分布カーブは、前述したｘ方向にかけて空間周波数ゼロの成分と空間周波数Ｋの成分とを含んでいる。
【０１０９】
次に、図８（ｂ）に示すとおり、変調画像ＩＡの感度分布カーブによると、観察対象面から外れた面からの蛍光までもが変調画像ＩＡに影響するので、変調画像ＩAには背景成分（ノイズの一種）が重畳する。但し、変調画像ＩＡに寄与した干渉縞（＝合成干渉縞）は、観察対象面にて多くの誘導放出光を発生させるので、観察対象面から発生する蛍光はその分だけ減少する。このため、図８（ｂ）の感度分布カーブのピークは、図８（ａ）の感度分布カーブのピークよりも低くなる。これは、誘導放出光の強度が励起光の強度と誘導光の強度との積に比例することに起因する。なお、図８（ｂ）には示さなかったが、変調画像ＩＡの感度分布カーブは、前述したｘ方向にかけて、空間周波数ゼロの成分及び空間周波数Ｋの成分に加えて、空間周波数２Ｋ以上の成分をも含んでいる。これは式（１）に示したとおりである。
【０１１０】
次に、図８（ｃ）に示すとおり、差分画像ＩＤの感度分布カーブによると、観察対象面から外れた面からの蛍光は差分画像ＩＤに影響しない。この差分画像ＩＤは、誘導放出光に起因して蛍光に生じた減少分ΔＩＦＬを表している。この減少分ΔＩＦＬは、式（５）のとおり表される。つまり、この差分画像ＩＤは、誘導放出光による標本５の画像を、間接的に表わしている。なお、図８（ｃ）には示さなかったが、差分画像ＩＤの感度分布カーブは、前述したｘ方向にかけて、空間周波数ゼロの成分及び空間周波数Ｋの成分に加えて、空間周波数２Ｋ以上の成分をも含んでいる。
【０１１１】
【数５】
2015162921.tif 000007
【０１１２】
但し、式（５）は近似式である。
【０１１３】
このように、本実施形態のＳＴ―ＳＩＭでは、焦点面以外で発生する余分な蛍光を除去することができる。この余分な蛍光は、構造化照明のコントラストを低下させるので問題となっており、深部観察の性能を制限している一因であった。
【０１１４】
したがって、余分な蛍光の影響を除去する本実施形態のＳＴ―ＳＩＭは、第１実施形態のＳＴ―ＳＩＭと同じ効果に加えて、標本５の深部観察効果をも達成することができる。
【０１１５】
図９は、本実施形態のタイミングチャートである。ここでは、図３に示したタイミングチャートとの相違点のみを説明する。
【０１１６】
図９に示すとおり、本実施形態の制御装置３９も第１実施形態の制御装置３９と同様、ラウンドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５を順次に実行する。これらのラウンドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５によると、合成干渉縞で変調された５枚の変調画像ＩＡ（５枚の間で位相のみが異なる）が取得される。
【０１１７】
但し、本実施形態の制御装置３９は、ラウンドＡ（ｉ−１）とラウンドＡｉとの間にラウンドＢｉを実行する。ラウンドＢｉは、ラウンドＡｉにおいて誘導光の照射及び位相シフトを休止したものであり、図９において点線で示した波形は、休止を意味している。このようなラウンドＢｉ（ｉ＝１〜５）によると、励起光の単体による干渉縞で変調された５枚の変調画像ＩＢ（５枚の間で位相のみが異なる）が取得される。
【０１１８】
したがって、本実施形態の制御装置３９は、互いにセットを成す変調画像ＩＢ、ＩＡを連続して取得することができる。
【０１１９】
なお、本実施形態では、制御装置３９が２種類の変調画像ＩＡ、ＩＢを取得すると共に、画像記憶・演算装置４０が変調画像ＩＡ、ＩＢの差分をとることにより、復調演算の対象となる変調画像（＝差分画像ＩＤ）を構築したが、差分画像ＩＤの構築方法は、これに限定されることはない。
【０１２０】
例えば、本実施形態の制御装置３９は、誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、標本５で発生した自然放出光（蛍光）をロックインカメラにより検出周波数ｆ１でロックイン検出することにより、差分画像ＩＤを構築してもよい。
【０１２１】
或いは、本実施形態の制御装置３９は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、標本５で発生した誘導放出光をロックインカメラにより検出周波数ｆ１でロックイン検出することにより、差分画像ＩＤを構築してもよい。
［実施形態の補足］
なお、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、合成干渉縞に含まれる空間周波数成分のうち、無視できるレベル（ノイズレベル）にまで抑制される空間周波数範囲を、「３Ｋ以上」としたので、必要な位相数Ｎｍａｘが「５」であった。
【０１２２】
しかし、第１実施形態又は第２実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、抑制される空間周波数範囲を「４Ｋ以上」、「５Ｋ以上」、「６Ｋ以上」、…、などとしてもよい。
【０１２３】
例えば、抑制される空間周波数範囲が「４Ｋ以上」である場合、必要な位相数Ｎｍａｘは「７」となり、抑制される空間周波数範囲が「５Ｋ以上」である場合、必要な位相数Ｎｍａｘは「９」となる。
【０１２４】
また、第１実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、位相シフト周期をＴｒに設定したが、位相シフト周期をｎ・Ｔｒに設定し（但し、ｎは２以上の整数）、干渉縞の方向及び位相の共通するｎ枚の変調画像を平均化することにより、ＳＮ比の高い変調画像を生成してもよい。
【０１２５】
また、第２実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、位相シフト周期を２Ｔｒに設定したが、位相シフト周期を２ｎ・Ｔｒに設定し（但し、ｎは２以上の整数）、干渉縞の方向及び位相の共通するｎ枚の変調画像ＩＡ及びｎ枚の変調画像ＩＢをそれぞれ平均化することにより、ＳＮ比の高い変調画像ＩＡ、ＩＢを生成してもよい。
【０１２６】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、標本５から射出した蛍光を検出対象とするために、標本５に励起光及び誘導光の照射されるタイミングと、撮像素子３５の電荷蓄積タイミングとをずらしたが、両者のタイミングを一致させてもよい。
【０１２７】
但し、その場合は、標本５と撮像素子３５との間に波長選択フィルタを配置し、その波長選択フィルタに対して、励起光と同じ光周波数（ω１）の光をカットし、誘導光及び誘導放出光と同じ光周波数（ω２）の光をカットし、蛍光と同じ光周波数（ωｆ）の光を通過させる波長選択特性を付与すればよい。
【０１２８】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、標本５に励起光の照射されるタイミングと誘導光の照射されるタイミングとを一致させたが、励起光を照射した後に誘導光を照射してもよい。但し、励起光と誘導光との間の照射タイミングのずれは、蛍光寿命に比べて十分小さいことが望ましい。
【０１２９】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、標本５に対する誘導光の照射直後に撮像素子３５の電荷蓄積を開始したが、この電荷蓄積の開始タイミングをΔＴだけ遅延させてもよい。ΔＴの遅延により、誘導光の照射強度を高めるのと同様の効果が得られる。なぜなら、標本５では誘導光の照射強度が強い場所ほど蛍光寿命が短くなり、蛍光寿命の短い場所で発生した蛍光はΔＴの遅延により撮像素子３５の検出対象から外れ、その結果、蛍光の消光効率が向上するからである。したがって、消光効率を同等にすることを想定したならば、ΔＴを導入した場合の方が、導入しない場合よりも、誘導光の照射強度を小さくすることができる。但し、ΔＴは、蛍光寿命よりも短いことが望ましい。
【０１３０】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭでは、励起光と誘導光との双方をパルス光としたが、励起光と誘導光との少なくとも一方をＣＷ光としてもよい。
【０１３１】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭにおいて、励起光と誘導光との双方をＣＷ光とする場合は、撮像タイミング及び位相シフトタイミングを任意に設定することが可能である。
【０１３２】
但し、ＣＷ光（ＣＷレーザ）を利用する場合は、蛍光のみを検出するためにフィルタを導入することが望ましい。
【０１３３】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭは、透過型の顕微鏡に本発明を適用したものであるが、反射型の顕微鏡にも本発明は適用可能である。
【０１３４】
また、上述した何れかの実施形態のＳＴ−ＳＩＭの復調演算は、ハードウエアで実行されてもソフトウエアで実行されてもよい。
【０１３５】
また、上述した何れかの実施形態では、本発明の適用された２Ｄ−ＳＩＭを説明したが、本発明は３Ｄ−ＳＩＭに適用することも可能である。これにより、分解能向上の効果を光軸方向にかけても達成することができる。
【０１３６】
因みに、３Ｄ−ＳＩＭは、標本５を空間変調するための干渉縞を、２光束干渉縞ではなく３光束干渉縞としたものである。このため、３Ｄ−ＳＩＭでは、例えば０次光カットマスク１８の代わりに高次光カットマスクを使用し、＋１次回折光及び−１次回折光に加えて０次回折光を標本５へ導入すればよい。但し、本発明の適用された３Ｄ−ＳＩＭは、本発明の適用された２Ｄ−ＳＩＭと比較して、干渉縞の位相の異なる変調画像の必要枚数（位相数）が多くなる。因みに、本発明の適用された３Ｄ−ＳＩＭのＯＴＦを、本発明の適用された２Ｄ−ＳＩＭにおいて２Ｋ成分まで利用する場合のＯＴＦと同等に拡大するためには、必要な位相数は「９」となる。
【０１３７】
また、上述した何れかの実施形態では、励起光と誘導光との双方を構造化照明（＝空間周波数Ｋの構造化照明）としたが、励起光と誘導光とのうち励起光の方を一様照明（＝空間周波数ゼロの構造化照明）としてもよい。ただし、その場合は、励起光と誘導光との双方を構造化照明とした場合と比較して、誘導光の強度を高める必要がある。
また、上述した何れかの実施形態では、標本５の複数方向に亘る超解像効果を得るために、干渉縞の方向の異なる複数枚の変調画像を取得する方法について述べたが、方向がおよそ９０°ずれた互いにインコヒーレントな２つの干渉縞による構造化照明で変調画像を取得すれば、他の方向の構造化照明で変調画像を取得せずとも面内方向でほぼ等方的な分解能を得ることができる。この場合、方向がおよそ９０°ずれたインコヒーレントな２つの励起光干渉縞による構造化照明と、方向がおよそ９０°ずれたインコヒーレントな２つの誘導光干渉縞による構造化照明とを用いると共に、励起光干渉縞の方向と誘導光干渉縞の方向とを一致させればよい。
【０１３８】
また、誘導放出の過程と同時に他の光学過程が発生することも考えられるが、その光学過程による非線形性を誘導放出による非線形性に加えて利用しても良い。例えば、誘導光が吸収を持つ場合は基底状態枯渇（ＧＳＤ：Ground State Depletion）の過程が誘導放出の過程と同時に発生し、また、励起状態とさらに高次の励起状態とのエネルギー差に相当する波長を誘導光が有している場合は、励起状態吸収の過程が誘導放出の過程と同時に発生する。このように誘導放出以外の光学過程が発生した場合にも上述した実施形態は実現が可能である。
［実施形態の作用効果］
上述した何れかの実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）は、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ蛍光物質を励起準位へ移行させるための光周波数ω１を有した励起光で蛍光試料（標本５）を空間変調する第１空間変調部（パルスレーザ光源１０１、光パラメトリック発振器１０３、回折格子１３、対物レンズ６など）と、空間周波数Ｋの正弦波状照度分布を有し、かつ励起中の前記蛍光物質を基底準位へ移行させるための光周波数ω２を有した誘導光で前記蛍光試料（標本５）を空間変調する第２空間変調部（パルスレーザ光源１０１、光パラメトリック発振器１０４、回折格子１３、対物レンズ６など）と、前記励起光と前記誘導光とに応じて前記蛍光試料で発生する自然放出光（蛍光）による前記蛍光試料（標本５）の画像（変調画像ＩＡ、差分画像ＩＤ）を、変調画像として取得する撮像部（対物レンズ６、第２対物レンズ３２、撮像素子３５、制御装置３９、画像記憶・演算装置４０）とを備える。
【０１３９】
したがって、上述した何れかの実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）は、誘導光を使用しない２Ｄ−ＳＩＭと比較して、超解像範囲（解像可能な空間周波数の範囲）を拡張できる。
【０１４０】
しかも、上述した何れかの実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）では、励起光照射（励起光による自然放出）に加えて誘導光照射（誘導光による誘導放出）を行い、誘導放出過程の非線形性により高調波成分を発生させるので、少なくとも励起光の強度についてはＮＳＩＭのように極端に高める必要はない。
【０１４１】
しかも、上述した何れかの実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）において、誘導光の強度及び位相が適切に設定されていれば、前記変調画像（変調画像ＩＡ、差分画像ＩＤ）に含まれる空間周波数成分のうち、空間周波数３Ｋ以上の高周波数成分がノイズレベルにまで抑えられるので、前記変調画像（変調画像ＩＡ、差分画像ＩＤ）の復調演算が複雑になることはない。
【０１４２】
また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）において、前記変調画像（差分画像ＩＤ）は、誘導放出光に起因して自然放出光に生じた減少分による前記蛍光試料の画像である。
【０１４３】
また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）において、前記撮像部は、前記励起光と前記誘導光との双方に応じて発生した自然放出光による前記蛍光試料の画像と、前記励起光のみに応じて発生した自然放出光による前記蛍光試料の画像との差分をとることにより、前記変調画像（差分画像ＩＤ）を取得する。
【０１４４】
或いは、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）において、前記撮像部は、前記励起光と、時間方向にかけて強度の変調された前記誘導光とに応じて発生した自然放出光を、前記変調に同期して検出することにより、前記変調画像（差分画像ＩＤ）を取得する。
【０１４５】
また、上述した何れかの実施形態の構造化照明顕微鏡装置（ＳＴ−ＳＩＭ）は、前記変調画像に含まれる変調成分のうち、少なくとも、空間周波数Ｋで変調された変調成分と、空間周波数２Ｋで変調された変調成分と、空間周波数−Ｋで変調された変調成分と、空間周波数−２Ｋで変調された変調成分と、空間周波数ゼロで変調された変調成分とを、互いに分離して抽出する演算部（画像記憶・画像記憶・演算装置４０）を更に備える。
［その他］
また、上述した何れかの実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１４６】
１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、６…第２対物レンズ３５…撮像素子、３９…制御装置、４０…画像記憶・演算装置、１０１…パルスレーザ光源、１０２…レンズ、ＢＳ…ビームスプリッタ、１０３、１０４…光パラメトリック発振器、Ｍ１、Ｍ２…ミラー、ＤＭ…ダイクロイックミラー、１０５…レンズ、１２…コレクタレンズ、１３…位相型の回折格子、１３Ａ…機構、１６…集光レンズ、１８…０次光カットマスク、２５…レンズ、２６…視野絞り、２７…フィールドレンズ、７…ダイクロイックミラー、６…対物レンズ、５…標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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