(57)【要約】  本発明の改変型免疫細胞は、（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現しているか、（２）Ｔ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。これによって、生体内における免疫を適切に誘導し得る新たなツールを提供する。
2016093350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞。
【請求項２】
不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
【請求項３】
不変型の上記Ｔ細胞受容体α鎖はＶα２４であり、上記Ｔ細胞受容体β鎖はＶβ１１である、請求項１または２に記載の改変型免疫細胞。
【請求項４】
（ｉ）可変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖、または（ｉｉ）Ｔ細胞受容体γ鎖およびＴ細胞受容体δ鎖その細胞表面にさらに発現している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞。
【請求項５】
上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδＴ細胞である、請求項４に記載の改変型免疫細胞。
【請求項６】
ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤。
【請求項８】
ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、請求項７に記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法。
【請求項１０】
２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法。
【請求項１３】
上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫細胞の分類、成熟過程および細胞の機能などを明らかにするこれまでの研究の成果に基づいて、免疫療法には種々の免疫細胞が利用されている。免疫療法は、自然免疫、獲得免疫またはこれらの組合せを人為的に刺激誘導することによって、化学物質に依存しない疾患の治療法である。したがって、生体に本来的に備わっている機能を惹起させるという、患者の肉体的負担を軽減し得る治療法として期待されている。【０００３】
自然免疫は、自然免疫に関与する免疫細胞が体内の異物をパターン認識して即座に反応するため、抗原特異的な免疫細胞治療の対象外となる症例に対しても効果が見込まれる。従って、自然免疫を向上させる治療は、単独治療に限らず、抗原特異的な免疫細胞治療を補完する目的での併用治療にも利用可能という利点を有する。【０００４】
自然免疫に関与する免疫細胞として、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、γδＴ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）が知られている。生体内のリンパ球では、自然免疫に関与するこれらの免疫細胞の割合は一般に低い。そのため、自然免疫を向上させる実際の免疫療法では、治療対象からリンパ球を採取して目的の免疫細胞を培養し、細胞数を増幅させた後に治療対象の体内に戻す方法が採用されている。しかし、従来の方法では、治療対象から採取したリンパ球の状態によっては、目的の免疫細胞が所望の通りに増殖・活性化しないことがあった。【０００５】
このような課題に鑑み、本発明者は、患者由来のＮＫＴ細胞からｉＰＳ細胞などの初期化された細胞を経由することによって当該細胞を増幅させた後に、ＮＫＴ細胞に再分化させた細胞を利用する方法の確立に関わっている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報「ＷＯ２００８／０３８５７９号（２００８年４月３日公開）」
【特許文献２】国際公開公報「ＷＯ２０１０／０２７０９４（２０１０年３月１１日公開）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、生体内の自然免疫を増強させる種々のアプローチを検討した結果、自然免疫に関与する細胞自体を増殖・活性化させるのではなく、自然免疫を容易かつ効果的に活性化させ、細胞増殖能も向上させ得るという優れた機能性を付与した、新規の免疫細胞を作製する必要があるとの結論に達した。【０００８】
以上の検討に鑑みて、本発明の目的は、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールとして、自然免疫を活性化させ得る機能的な免疫細胞および当該免疫細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、特定のＴ細胞の表面に、ＮＫＴ細胞の不変型のＴ細胞受容体を発現させることによって、ＣＤ１ｄリガンドによる刺激を受けて活性化されてＴｈ１サイトカイン（特にインターフェロンγ）の産生能が向上した改変型免疫細胞を作製できることを見出した。さらに、当該改変型免疫細胞は、ＣＤ１ｄリガンドの刺激によってＴｈ１サイトカインの産生能を向上させただけでなく、細胞増殖能の向上を示した。特定の上記免疫細胞を、適切な上記免疫誘導をもたらす状態にするには、いかなる条件を満たすべきかについて、これまで一切の報告がなされていない。本発明者は、これらの知見に基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。【００１０】
（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞、
（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｔ細胞株を用いて改変型免疫細胞を作製できたことを示す図である。
【図２】ＰＢＭＣ由来の活性化Ｔ細胞を用いて作製した改変型免疫細胞およびそのサイトカイン産生能を確認した図である。
【図３】図２の改変型免疫細胞が樹状細胞を成熟させ得ることを示す図である。
【図４】健常者の末梢血におけるＮＫＴ細胞およびγδＴ細胞を、各リガンドによる活性化の前後を確認した図である。
【図５】ＰＢＭＣ由来のγδＴ細胞を用いて作製した改変型免疫細胞を確認した図である。
【図６】図５の改変型免疫細胞の増殖活性化能およびサイトカイン産生能を確認した図である。
【図７】腫瘍細胞の接種から１２〜２４日後に測定したモデル動物における腫瘍サイズに基づいて、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価した結果を示す図である。
【図８】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養から所定の日数の経過後において、フローサイトメトリーによって、細胞の増殖および細胞集団について確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔本発明の改変型免疫細胞〕
本発明の第１の一局面は、改変型免疫細胞を提供する。当該改変型免疫細胞は、（１）外因性の不変型の（インバリアントな）Ｔ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現しているか、または（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。
【００１４】
上記改変型免疫細胞は、不変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している間、ＣＤ１ｄリガンドの刺激によってＴｈ１型のサイトカインを、効果的に（より詳細にはインターフェロンγの産生を誘導して高い産生量を示すように）産生する。本発明によれば、実施例に証明されている通り、細胞株すら材料になり得るので、自然免疫を向上させる機能的な免疫細胞を所望の数だけ利用できることと、実質的に同じ利点を享受できる。実施例に証明されている通り、上記改変型免疫細胞は、インターフェロンγを産生し、かつ樹状細胞（ＤＣ）と共培養したときに、ＤＣによる免疫抑制性のＩＬ−１０の産生をほとんど誘導せずにＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ７０）の産生を強く誘導する。したがって、上記改変型免疫細胞は、直接的および間接的なサイトカインの産生誘導に基づいて、自然免疫を向上させる免疫療法への利用に適している。
【００１５】
本明細書に使用されるとき、用語“Ｔ細胞”は、ＮＫＴ細胞のＴＣＲ（以下、ＮＫＴ−ＴＣＲと記載する）を本来的に表面発現していないＴ細胞を意味する。つまり、改変型免疫細胞におけるＮＫＴ−ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、内因性ではなく、外因性である。したがって、本明細書に使用されるとき、“Ｔ細胞”は“ＮＫＴ細胞以外のＴ細胞”と読み換えられ得る。以上のことから、本明細書においてＮＫＴ細胞に言及する場合、“ＮＫ”または“ナチュラルキラー”を、“Ｔ細胞”の前に必ず付してこれを説明する。
【００１６】
本明細書に使用されるとき“ＮＫＴ細胞”は、ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞である。すなわち、ＮＫＴ細胞のより詳細な定義は、ＴＣＲのリガンドに対する多様性が限られている細胞であり、このようなＮＫＴ細胞は不変ＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）とも称される。
【００１７】
改変型免疫細胞の表面に発現している外因性のＴ細胞受容体（以下、ＴＣＲと記載する）α鎖は、ｉＮＫＴ細胞に特有のα鎖（例えば、ヒトのＶα２４およびマウスのＶα１４）である。改変型免疫細胞の表面に発現している外因性のＴＣＲβ鎖は、上述の通りＴＣＲα鎖と二量体を形成するｉＮＫＴ細胞に特有のβ鎖（例えば、ヒトのＶβ１１、ならびにマウスのＶβ８．２、Ｖβ７およびＶβ２）である。なお、上記改変型免疫細胞において、ヒト由来のＴ細胞を用いる場合はＴＣＲα鎖はＶα２４であること、ＴＣＲβ鎖はＶβ１１であることが好ましい。
【００１８】
本発明に使用されるＴ細胞受容体の一実施形態において、例えば、ヒトのＶα２４は、GenBank Accession No.DQ341448に登録されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドにコードされており、ヒトのＶβ１１は、GenBank Accession No.DQ341459に登録されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドにコードされている。また、本発明に使用される不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報は、実施例１に示される通り、例えば健常なボランティアから確立されているＮＫＴ細胞株をサブクローニングすることによって、決定され得る。同様に、マウス由来のＮＫＴ細胞株から、Ｖα１４、Ｖβ８．２、Ｖβ７、Ｖβ２等の塩基配列情報を決定することができる。当該塩基配列情報に基づいて、本発明のＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖のポリヌクレオチドを作製することができる。
【００１９】
好適には、本発明に用いるＴＣＲα鎖をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１と高い相同性を示すものが好ましく、ＴＣＲβ鎖をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２と高い相同性を示すものが好ましい。ここで、「高い相同性」とは９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９８％以上の相同性をいう。
【００２０】
上記改変型免疫細胞の作製材料になり得る細胞は、Ｔ細胞であり、好ましくはＣＤ３陽性Ｔ細胞（γδＴ細胞、可変型ＴＣＲを発現するαβＴ細胞および粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞など）である（本明細書において、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を意図してＣｄ３陽性細胞とも称する）。ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、特に限定されないが、樹立されているＴ細胞株または個体から採取されたＴ細胞などであり得る。ＣＤ３陽性Ｔ細胞の具体例は、活性化Ｔ細胞、γδＴ細胞および／またはＭＡＩＴ細胞などであり得る。上記活性化Ｔ細胞、γδＴ細胞および／またはＭＡＩＴ細胞は、（１）未活性の状態において採取した後に活性化させるか、または（２）細胞を採取した時点において活性化されていてもよい。ここで、（１）の場合、例えば、樹立されている未活性のＴ細胞株または個体から採取された未活性のＴ細胞は、試験管内において刺激を与えることによって活性化され得る。（２）の場合、例えば、上記細胞は、個体から採取した末梢血に由来しており、かつ採取時に活性化されている。後述する実施例３において確認されている通り、作製材料として個体から採取した細胞を改変型免疫細胞として当該個体に戻す免疫療法または免疫誘導において、当該個体の末梢血由来のＣＤ３陽性Ｔ細胞が最も好ましい。
【００２１】
一実施形態において、上記改変型免疫細胞は、作製した状態のまま保存（好ましくは凍結保存）または使用される。他の実施形態において、上記改変型免疫細胞は、作製後に活性化してから保存（好ましくは凍結保存）または使用される。この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、ＣＤ１ｄリガンドまたはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化されている。上記改変型免疫細胞は、活性化によって、インターフェロンγの効果的な産生とともに細胞増殖能の向上を示し（実施例１〜３）、樹状細胞（ＤＣ）に機能的な成熟（実施例２）を示させる。
【００２２】
ＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄと結合した状態においてＮＫＴ−ＴＣＲによって認識される糖脂質を意味する。当該糖脂質の例としては、α−ＧａｌＣｅｒ（α−ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ（α−Ｃ−ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ３）、ＧＳＬ−１（α−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびＧＳＬ−１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。これらのうちα−ＧａｌＣｅｒまたはα−Ｃ−ＧａｌＣｅｒが好ましい。
【００２３】
γδＴ細胞の増殖活性化剤は、γδＴ細胞を増殖活性化する公知の薬剤である。当該薬剤としては、アミノビスホスホネート、ゾレドロン酸、パミドロン酸二ナトリウム、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸、およびヒートショックプロテインなどが挙げられる。
【００２４】
一実施形態において、本発明の改変型免疫細胞の活性化は、ＣＤ１ｄリガンドをパルス（ロード）した状態のＣＤ１ｄ発現細胞と、上記改変型免疫細胞とをインビトロの反応系において接触させることによって実施され得る。別の実施形態において、上記活性化は、上記改変型免疫細胞およびＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞を投与対象に投与することでもよい。投与対象に投与することによって、対象の体内において上記改変型免疫細胞とＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞とが接触し、当該改変型免疫細胞はインビトロの反応系と同様に活性化され得る。この場合において、上記ＣＤ１ｄ発現細胞および改変型免疫細胞は、投与対象に対して、同時または逐次に投与される。ここで、上記ＣＤ１ｄ発現細胞および改変型免疫細胞が投与対象に対して逐次に投与される場合、当該２つの細胞を投与対象に投与する順序は特に限定されない。
【００２５】
ＣＤ１ｄリガンドをパルス（ロード）した状態のＣＤ１ｄ発現細胞は、任意のＣＤ１ｄ発現細胞とＣＤ１ｄリガンドとを共培養して、細胞表面上のＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドを結合させることによって得られる。ＣＤ１ｄ発現細胞は、腫瘍細胞、健常者に通常に存在する樹状細胞、または人為的に導入されたＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドからＣＤ１ｄを発現している任意の細胞（樹立された細胞株を包含している）であり得る（例えば国際公開ＷＯ２００７／０９７３７０号、ＷＯ２０１０／０６１９３０、ＷＯ２０１３／０１８７７８などを参照のこと）。
【００２６】
一実施形態において、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、上記改変型免疫細胞に導入されたベクターを介して発現される。この実施形態において、ベクターがｍＲＮＡ自身からなる場合、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ｍＲＮＡから直接的に翻訳される。この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、ｍＲＮＡの導入から少なくとも約４８時間にわたって上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の発現を維持する。したがって、この実施形態における上記改変型免疫細胞は、上述のＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された後に、作製から少なくとも約４８時間以内に使用されることが好ましい（但し、上記改変型免疫細胞が保存（好ましくは凍結保存）された場合にはこの限りではない。）。この実施形態における上記改変型免疫細胞は、ｍＲＮＡの分解にともなって生体内の本来の状態に戻り、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現しなくなるからである。すなわち、この実施形態における上記改変型免疫細胞を用いた免疫療法および生体における免疫誘導は、遺伝子治療に該当しない。
【００２７】
一実施形態において、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、上記改変型免疫細胞に維持されているＤＮＡから発現されている。この実施形態における上記改変型免疫細胞は、使用前の適切な時点に活性化される。したがって、この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、培養によって安定的かつ容易に必要な細胞数にまで増殖させられ得る。
【００２８】
本発明の一局面における改変型免疫細胞は、免疫療法用の細胞、後述の免疫誘導剤、および種々の他の用途に適している。
【００２９】
上述の通り、本発明の一局面における改変型免疫細胞は、免疫療法用の細胞として適している。当該改変型免疫細胞によって治療可能な疾患としては、がん、感染症およびアレルギー疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。また、この改変型免疫細胞は、他の免疫療法用の細胞と組み合わせて使用され得る。特に、上述したインターフェロンγの産生、ＤＣの機能的な成熟等の結果として、機能的になる細胞および活性化される細胞などとともに、上記改変型免疫細胞は使用され得る。ここでは、治療を例に挙げて説明したが、本発明の一局面における改変型免疫細胞は、個体における免疫を誘導することによって、上述の疾患の予防に有効である。
【００３０】
〔本発明の免疫誘導剤〕
本発明の第２の局面は、上記改変型免疫細胞を含んでいる免疫誘導剤を提供する。この改変型免疫細胞は、インターフェロンγの産生、ＤＣの成熟等にしたがって、個体における免疫反応を誘導し得る。上記改変型免疫細胞は、活性化によって免疫誘導能を示し得るが、当該改変型免疫細胞の活性化は、生体の内外において実現され得る。
【００３１】
したがって、一実施形態において、上記免疫誘導剤は、上記改変型免疫細胞の活性化剤をさらに含んでいる。当該活性化剤は、上述のＣＤ１ｄリガンドおよびγδＴ細胞の増殖活性化剤として具体的に説明されている。他の実施形態において、上記免疫誘導剤は、上記活性化剤と組み合わせてキット化されている。
【００３２】
また、別の態様において上記免疫誘導剤は、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞と組み合わせてキット化されている。この実施形態において、上記免疫誘導剤の投与と同時または投与の前後に、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞が投与され得る。
【００３３】
〔本発明の改変型免疫細胞の製造方法〕
本発明の第３の局面は、上述の改変型免疫細胞の製造方法を提供する。当該方法は、不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している。
【００３４】
一実施形態において、２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている。すなわち、当該ポリヌクレオチドの好適な例はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡを細胞に導入することの主な利点は、上述の通り、作製された改変型免疫細胞を投与する方法が遺伝子治療に該当しないことである。
【００３５】
他の実施形態において、２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、持続的に細胞を形質転換し得るＤＮＡによって形成され得る。したがって、上記ポリヌクレオチドの例としては、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、公知のベクターなどが挙げられる。
【００３６】
一実施形態において、上記ＣＤ３陽性細胞は末梢血に由来する。当該末梢血は、上記改変型免疫細胞を投与する予定の対象から得られることが好ましい。上記ＣＤ３陽性細胞がγδＴ細胞である実施形態において、上記ＣＤ３陽性細胞は、２つのポリヌクレオチドの導入前に、上記γδＴ細胞の増殖活性化剤によって増殖させられ得る。後述の実施例に記載の通り、γδＴ細胞は、増殖活性化剤を用いた処理によって増殖する。したがって、γδＴ細胞は、末梢血における初期の存在数が少なくとも、十分な数を確保され得る。
【００３７】
〔本発明の改変型免疫細胞の活性化方法〕
本発明の第４の局面は、改変型免疫細胞の活性化方法を提供する。当該方法は、改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドまたはγδＴ細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している。当該改変型免疫細胞、ＣＤ１ｄリガンドおよびγδＴ細胞の増殖活性化剤の詳細はいずれも、これまでの項目に述べられている通りである。
【００３８】
好ましい実施形態において、上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している。いくつかの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、樹状細胞の表面に発現しているＣＤ１ｄと結合している。特定の実施形態において、上記樹状細胞は、疾患特異的な抗原をコードしているポリヌクレオチドを導入したヒトの樹状細胞である。上記抗原ペプチドが対象の体内における獲得免疫をさらに誘導可能だからである。他の実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、固相化されているＣＤ１ｄと結合している。この場合、活性化された改変型免疫細胞の単離を要することなく、当該改変型免疫細胞を対象への投与に使用し得る。
【００３９】
（まとめ）
以上をまとめると、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
【００４０】
（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞、
（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞、
（３）不変型の上記Ｔ細胞受容体α鎖はＶα２４であり、上記Ｔ細胞受容体β鎖はＶβ１１である、（１）または（２）に記載の改変型免疫細胞、
（４）（ｉ）可変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖、または（ｉｉ）Ｔ細胞受容体γ鎖およびＴ細胞受容体δ鎖をその細胞表面にさらに発現している、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞、
（５）上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδＴ細胞である、（４）に記載の改変型免疫細胞、
（６）ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞、
（７）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤、
（８）ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、（７）に記載の免疫誘導剤、
（９）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法、
（１０）２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている、（９）に記載の方法、
（１１）上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、（１０）に記載の方法、
（１２）（９）〜（１１）のいずれか１つに記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤と共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法、
（１３）上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している、（１２）に記載の方法、
（１４）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞または（７）もしくは（８）に記載の免疫誘導剤を、対象に投与することを包含している、対象の免疫を誘導する方法。
【実施例】
【００４１】
〔材料および方法〕
後述する各実施例において用いた材料および方法は、以下の通りである。【００４２】
（試薬）
ヒトおよびイヌの組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を、R&D systems（Minneapolis, MN）から購入した。ＩＬ−２を、Shionogi & Co., LTD（Osaka, Japan）から購入した。α−ＧａｌＣｅｒは、石井保之博士によって理研において合成された。α−ＧａｌＣｅｒおよびビヒクル（０．４％のＤＭＳＯ）をＰＢＳによって希釈した。ゾレドロン酸（ＺＯＬ）を、Novartis Pharmaceuticals Ltdから購入した。以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、それぞれ購入した。BD（San Diego, CA）からの抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、抗ヒトＣＤ４０、抗ヒトＣＤ８６（２３１１）およびヒトのインバリアントＮＫＴ細胞のα鎖およびβ鎖の会合受容体（６Ｂ１１）、Beckman Coulterからの抗ヒトＶα２４（Ｃ１５）、Ｖβ１１（Ｃ２１）およびγ９、e-Bioscienceからの抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、MBLからの抗ヒトＣＤ１ｄテトラマー。FACSCalibur（商標）装置、およびCELLQuest（商標）ソフトウェア（BD Biosciences）もしくはFlowJo（Tree Star, San Carlos, CA）ソフトウェアを、分析のために使用した。【００４３】
（細胞株）
ジャーカット細胞株を理研のＢＲＣから得た。American Type Culture Collection（Rockville, MD）から、ＨＥＫ２９３細胞株を購入した。ヒトＣＤ１ｄをＨＥＫ２９３細胞に導入するために、pCMV6-XLA4/hCD1d（OriGene Technologies Inc., Rockville, MD）およびpCAG-ピューロマイシン耐性遺伝子（理研のＲＣＡＩにおける西田圭吾博士より提供）を、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションし、ピューロマイシンによって選択した。１週間後に、MX-hCD1dをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、続いて、FACSAria SorterによってｈＣＤ１ｄの発現に基づいて選別した。【００４４】
（ヒトＰＢＭＣの単離）
健常な血液提供者由来のバフィーコートからヒトＰＢＭＣを得、Ficoll-Hypaque（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）の密度勾配遠心分離によって分離した。ＰＢＭＣ、およびいくつかの場合に磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）分離によって精製したＣＤ１４＋単球を、ＰＢＳを用いて３回にわたって洗浄し、無血清の凍結保存培地Cellbanker2（JUJI Field Inc., Tokyo, Japan）を用いて、使用まで液体窒素に保存した。すべての試験は、理研の施設内審査委員会によって承認された。【００４５】
（ヒト樹状細胞（ＤＣ）の生成）
磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）を用いて単離したＣＤ１４＋細胞を、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）の生成のために使用した。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下において３日にわたって単球を培養して、ｉｍＤＣを生成した。【００４６】
（ｉＮＫＴ細胞株およびＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞株のインビトロ生成）
ＮＫＴ細胞株を調製するために、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下においてα−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて、ＰＢＭＣをパルスした。１０〜１４日後に、ＦＩＴＣ標識の抗ＶαｍＡｂを用いて、ヒトｉＮＫＴ細胞を、染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）を用いて選択した。ヒトｉＮＫＴ細胞を、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５の存在下に維持した。【００４７】
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞株を調製するために、ＺＯＬ（１００μｍｏｌ／Ｌ）および３００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣを培養した。１０〜１４日後に、ＦＩＴＣ標識の抗γ９ｍＡｂを用いて、γδＴ細胞を、染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（MiltenyiBiotec Inc.）を用いて選択した。ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下に維持した。【００４８】
（ＲＮＡのインビトロ転写（ＩＶＴ））
pSP64 Poly（A）ベクターにおけるＥＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて切り出し、pGEM-4Zベクター（Promega, Madison, WI）にふたたびクローニングした。この試験に使用したＯＶＡプラスミドはこれまでに述べられている。ＭＡＲＴ−１用の発現プラスミド（pcDNA3 （＋）-MART-1）を単離した。ＩＶＴのために、これらのプラスミドを、制限酵素消化（ＥＧＦＰおよびＯＶＡのためのＢａｍＨＩ、ならびにＭＡＲＴ−１のためのＮｏｔＩ）によって直鎖化し、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）によって精製し、鋳型として使用した。mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion, Austin, TX）を用いることによって、ベクター上にあるＴ７プロモータ配列の制御下において、ＲＮＡを生成した。キットに基づくＤＮａｓｅＩを用いて鋳型ＤＮＡを消化した。ＩＶＴ  ＲＮＡを、それからRNeasyMini/Midi Kits（QIAGEN, Valencia, CA）よって精製し、水に溶離させた。ＲＮＡの完全性を、変性条件下におけるアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を、分光光度計によって決定した。【００４９】
（ＴＣＲを導入したＰＢＬの調製）
Ｔ細胞のＲＮＡエレクトロポレーションを、これまでに報告されている通りに実施した。簡単に説明すると、１０％のＦＣＳを含有しているＲＰＭＩにおける５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂ  ＯＫＴ３（Janssen pharmaceutical, Inc., Tokyo, Japan）および３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いて、１０６細胞／ｍＬのＰＢＬをインビトロにおいて刺激した。２または３日後に、Ｔ細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭを用いて１回洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭにおいて５×１０６／１００μＬの濃度に懸濁させた。１０μｇの各ＲＮＡを４ｍｍのキュベットに移し、１００μＬの細胞懸濁液を加え、ＢＴＸにおいてパルスした。パルス条件は、５００Ｖ、５ｍ秒の方形波パルスであった。エレクトロポレーション後ただちに、細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を有している新しいＣＭに移し、３７℃においてインキュベートした。【００５０】
（サイトカイン産生アッセイ）
ＮＫＴ−ＴＣＲ  ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞およびＶα２４−Ｖβ１１−細胞を、FACS Ariaによって選別し、応答細胞として使用した。刺激細胞について、ＣＤ１ｄ  ２９３を、５００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒありまたはなしで、２４時間にわたってパルスした。いくつかの実験において、ＣＤ１ｄ  ２９３を、１０μｍｏｌ／ＬのＺＯＬを用いて２４時間にわたって処理し、刺激細胞として使用した。１×１０５の応答細胞を、１×１０４の刺激細胞とともに２４時間にわたって共培養した。培養上清を回収し、インターフェロンγ産生を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ（BD）によって測定した。【００５１】
（ＤＣ成熟）
ＮＫＴ−ＴＣＲ  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたＴ細胞を、選別し、それから１００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒの存在下または非存在下において、２４時間にわたって自家の未成熟ＤＣとともに共培養した（１：１）。ポジティブコントロールとして１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを使用した。２４時間後に、ＤＣを、フローサイトメトリーによってＣＤ４０およびＣＤ８６について分析し、培養上清におけるＩＬ１０およびＩＬ１２ｐ７０の産生を、ＥＬＩＳＡ（BD）によって測定した。【００５２】
（細胞傷害性アッセイ）
γδＴ細胞、またはＮＫＴ−ＴＣＲをエレクトロポレーションしたγδＴ細胞の細胞傷害活性を、製造者の指示にしたがってＬＤＨアッセイキット（Takara Bio Company）を用いて、分析した。標的細胞として、ＣＤ１ｄ  ２９３を、５００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒまたは１０μｍｏｌ／ＬのＺＯＬのありまたはなしで、２４時間にわたって処理した。１×１０４の標的細胞を、１０×１０５のエフェクタ細胞とともに、１％ＦＣＳ／ＲＰＭＩにおいて１２時間にわたって共培養した。培養上清を、テトラゾリウム塩を含んでいる新たに調製したReaction Mixtureとともにインキュベートし、吸光度を４９０ｎｍにおいて測定した。データは、独立した３回の実験に基づく３つ１組のウェルの平均±標準偏差である。バックグラウンドコントロールの値を引いた後に、細胞傷害性の値（％）を以下の通りに算出した。
細胞傷害性（％）＝｛（エフェクタ：標的細胞混合物−エフェクタ細胞コントロール）−自然発生的な標的細胞コントロール｝／（最大の標的細胞コントロール−自然発生的な標的細胞コントロール）×１００。【００５３】
（統計分析）
インビトロデータにおける差異を、マンホイットニーＵ検定を用いて分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。【００５４】
〔実施例１：ジャーカット細胞株を用いた改変型免疫細胞の作製〕
健常なボランティアから確立されているＮＫＴ細胞株由来のＮＫＴ細胞ＴＣＲのＶα鎖およびＶβ鎖を最初にサブクローニングした。インビトロ転写手法によって、ＤＮＡにおけるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のコード領域（ＴＣＲα鎖：配列番号１、ＴＣＲβ鎖：配列番号２）からそれぞれのｍＲＮＡを生成した。エレクトロポレーションによってジャーカットＴ細胞に両方のＴＣＲ鎖をトランスフェクトした後に、抗Ｖα２４と抗Ｖβ１１Ａｂとの組合せ、またはＣＤ３と抗６Ｂ１１もしくは抗ＣＤ１ｄ／Ｇａｌ−テトラマーとの組合せを用いたサイトメトリーによってＮＫＴ−ＴＣＲの発現を決定した（図１Ａ）。【００５５】
これまでに報告されている通り、Ｖα２４およびＶβ１１の両方の発現は、抗６Ｂ１１ｍＡｂによって評価された。ＮＫＴ−ＴＣＲの発現レベルは、６〜１２時間に上方制御され、４８時間以降に低下した（図１Ｂ）。特に、９０％を超えるジャーカット細胞上におけるＶα２４およびＶβ１１の発現を６時間以降に検出した。それから、細胞を、α−ＧａｌＣｅｒ結合ＣＤ１ｄ抗体の固相とともに培養した後に、ＴＣＲシグナルの下流を評価した。ＭＡＰＫは刺激後の１０分間にリン酸化されており（図１Ｃ）、ＴＣＲシグナル伝達は、Ｖα２４およびＶβ１１のＴＣＲのｍＲＮＡをトランスフェクトしたジャーカット細胞において明らかに増強されたことを示している。【００５６】
以上のように、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のｍＲＮＡを導入することによって、ジャーカット細胞上に機能的なＮＫＴ−ＴＣＲを一過性に発現している改変型免疫細胞を、作製できた。【００５７】
〔実施例２：健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の活性化Ｔ細胞を用いた改変型免疫細胞の作製〕
抗ＣＤ３ＡｂおよびＩＬ−２によって３日間かけて生成された初代の活性化Ｔ細胞に、Ｖα２４およびＶβ１１のＴＣＲ鎖のｍＲＮＡをトランスフェクトした。ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞上におけるＴＣＲのα鎖（Ｖα２４）およびβ鎖（Ｖβ１１）の発現を、抗６Ｂ１１ｍＡｂによって評価した。６Ｂ１１＋細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞由来の６０〜７０％であり、両方の鎖がそれらの細胞表面に明らかに発現されていることを示している（図２Ａおよび２Ｂ）。【００５８】
α−ＧａｌＣｅｒ結合ＣＤ１ｄ抗体の固相を用いた刺激後に、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋トランスフェクトした（以下、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋と記載する）細胞およびＶα２４−Ｖβ１１−非トランスフェクトの（以下、ＮＫＴ−ＴＣＲ−と記載する）細胞におけるＴＣＲシグナル伝達を分析した。ＮＫＴ−ＴＣＲ−細胞ではなく、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞は、ＭＡＰキナーゼシグナルの活性化を示した（図２Ｃの右欄）。【００５９】
さらに、α−ＧａｌＣｅｒをロードした細胞（ＣＤ１ｄ−ＨＥＫ２９３細胞／Ｇａｌ）とともに、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞を共培養することによって、サイトカイン産生を分析した。ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞は、ＩＬ−４ではなく、インターフェロンγを、α−ＧａｌＣｅｒ依存的により多く産生した。しかし、ＮＫＴ−ＴＣＲ−細胞およびトランスフェクションなしの活性化Ｔ細胞の両方は、インターフェロンγを産生しなかった（図２Ｄ）。したがって、Ｖα２４ＴＣＲおよびＶβ１１ＴＣＲのｍＲＮＡをトランスフェクトした活性化Ｔ細胞（ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞）は、インターフェロンγ産生について機能的であり、Ｔｈ１型に傾いたこれらの６Ｂ１１＋細胞が、Ｔｈ１型のＮＫＴ細胞を４８時間にわたって模倣し得ることを示している。【００６０】
続いて、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞のアジュバント効果を確認した。ＮＫＴ細胞は、インビボおよびインビトロにおいて表現型および機能の両方においてＤＣの成熟を誘導するとこれまでに報告されている。ＮＫＴ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞がＤＣを成熟させ得るか否かを評価した。成熟マーカーおよびサイトカイン産生を、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞および自家の単球由来の成熟ＤＣを培養した後に、評価した。【００６１】
ＮＫＴ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＤＣ上の共刺激分子の上方制御は、ＬＰＳ刺激による上方制御と同様に認められた（図３Ａ）。また、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞によって成熟されたＤＣにおいて、ＩＬ−１２ｐ７０の産生は、抗原特異的に顕著に認められ、ＩＬ−１０の産生は、ほとんど認められなかった（図３Ｂ）。Ｌ−１２ｐ７０は、免疫を刺激する方向に作用し、ＩＬ−１０は、逆に免疫を抑制する方向に作用する。したがって、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＤＣの成熟は、免疫誘導にとってＬＰＳ刺激よりはるかに好ましい。【００６２】
〔実施例３：健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のγδＴ細胞を用いた改変型免疫細胞の作製〕
γδＴ細胞は、自然リンパ球（innate lymphocytes）の１つとしてよく知られている。γδＴ細胞のなかでもγ９型のγδＴ細胞は、いくつかの内因性のγδＴ細胞リガンドがＡＰＣ上において上方制御されている、ゾレドロン酸（ＺＡ）をのせた細胞によって増殖され得る。図４に示すように、末梢血において非常に低頻度にしかＮＫＴ細胞が認められない人でさえ、適切な数のγδＴ細胞を有している。さらに、γδＴ細胞は、ＮＫＴ細胞よりはるかに多く増殖する可能性を有している（図４Ａおよび４Ｂ）。【００６３】
明らかに、γδＴ細胞は、ＮＫＴ−ＴＣＲを通常には発現していないが、エレクトロポレーションによるトランスフェクション後に、γ９δＴＣＲとともにＮＫＴ−ＴＣＲを発現し得る（図５）。これらのＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞を、ＺＡをのせたＣＤ１ｄ−ＨＥＫ２９３細胞と共培養すると、γδＴ細胞はインターフェロンγを産生し、これらがγδＴ細胞であることを確認した。【００６４】
γδＴ細胞にＮＫＴ−ＴＣＲを発現させたことによる機能の違いを調べるため、（１）ＺＡで刺激を与えて培養したγδＴ細胞と、（２）ＣＤ１ｄ−ＨＥＫ２９３細胞／Ｇａｌと共培養した上記ＮＫＴ−ＴＣＲ＋γδＴ細胞とを比較した。その結果を図６に示す。刺激または共培養から７２時間後における細胞数を計測したところ、細胞増殖に顕著な違いがあった（図６の左パネル）。同様に、刺激または共培養から４８時間後にインターフェロンγの産生量をＥＬＩＳＡによって測定したところ、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋γδＴ細胞において産生量の顕著な増加が認められた（図６の右パネル）。【００６５】
以上より、ＮＫＴ−ＴＣＲを発現させ、かつα−ＧａｌＣｅｒの刺激を与えることによって、γδＴ細胞の細胞増殖能およびインターフェロンγの産生量を向上させることが示された。【００６６】
以上のことから、末梢血に相対的に多く存在し、かつ臨床用途に十分な量に増殖させ得るγδＴ細胞を改変することによって、γδＴ細胞の利用能を大きく向上させ得ることが分かった。また、個体差に基づいて、γδＴ細胞は、ＺＡ単独では活性化されないか、または刺激が不十分な場合を生じるが、この改変型γδＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒを利用する選択肢を新たにもたらす。よって、この改変型γδＴ細胞は、γδＴ細胞を利用できないか、またはγδＴ細胞の利用有効性の低い個体を実質的に減少させ、より多くの個体に治療の機会を与え得る。【００６７】
さらに、以上の各実施例に共通して、各細胞に導入されているのは、ＮＫＴ細胞ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のｍＲＮＡである。実施例１および２において非常によく証明されている通り、細胞表面におけるα鎖およびβ鎖が時間の経過にしたがって減少している。しかし、細胞数が減少している訳ではない。つまり、ＮＫＴ−ＴＣＲ＋細胞は、導入されたｍＲＮＡの分解によって、ＮＫＴ細胞ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の発現量が徐々に低下し、最終的にｍＲＮＡの導入前の状態に戻っているに過ぎない。このため、これらの実施例で得られた細胞を免疫療法に適用することは、遺伝子治療に該当しない。導入される外来因子が残留しないこれらの実施例の細胞は、従来の遺伝子治療と比較にならないほど、極めて低い副作用しか示さないことが明らかである。自家細胞を使用する免疫細胞療法に、これらの実施例の細胞を適用する場合、実質的に副作用はないとみなし得る。【００６８】
また、遺伝子治療を実施するための規制を受けないため、これらの実施例の細胞を扱う場所にほとんど制限がない。時間の経過によって細胞の性質が生体内の状態に戻るので、細胞の作製に使用した器具および生体由来の材料を、医療施設において通常に使用される器具などと同等の処理方法によって処分し得る。【００６９】
〔実施例４：改変型免疫細胞のインビボ抗腫瘍効果の確認〕
ＮＫＴ−ＴＣＲを新たに発現させた免疫細胞によるインビボ抗腫瘍効果を検討するため、ＮＫＴ−ＴＣＲを発現させたγδＴ細胞（実施例３のＮＫＴ−ＴＣＲ＋γδＴ細胞；以下、改変型免疫細胞と称する）を用いて検証を行った。【００７０】
２ｘ１０６個のＫ５６２細胞を皮下接種された免疫不全マウスを、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価するモデル動物として準備した。改変型免疫細胞を実施例３と同じ手順にしたがって作製した。以下の２種類の処理物を、上記モデル動物における腫瘍接種部位に対して接種の７日後に投与した（それぞれｎ＝２）。
（１）２ｘ１０６個の改変型免疫細胞を懸濁させた、１００μｌの培地（図７における「γδ＋ＮＫＴ  ＴＣＲ」；濃い線）
（２）１００μｌの培地のみ（図７における「non-treated」；薄い線）。【００７１】
上記接種の１２〜２４日後に測定したモデル動物における腫瘍サイズに基づいて、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価した結果を図７に示す。図７に示す通り、改変型免疫細胞の投与を受けたモデル動物はいずれも、接種の１２〜２４日後において、腫瘍サイズの増大を示さなかった。一方、改変型免疫細胞の投与を受けなかったモデル動物ではいずれも、時間の経過とともに（特に接種の１７日以降に）腫瘍サイズの増大が認められた。このことから、上記改変型免疫細胞（ＮＫＴ−ＴＣＲ＋γδＴ細胞）は、非常に優れた抗腫瘍活性をインビボにおいて示すことが明らかになった。【００７２】
〔比較例：ＮＫＴ−ＴＣＲを導入したＮＫ細胞の有効性〕
ＮＫＴ−ＴＣＲをＮＫ細胞に導入した場合にも、実施例３の改変型免疫細胞と同様の効果を示すか検討するため、上述の通りに採取した健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を含む培地で培養した。細胞の増殖を確認した後に、ＮＫＴ−ＴＣＲを発現させるためのｍＲＮＡを細胞に導入し、ＮＫＴ−ＴＣＲを表面発現している細胞集団を確認した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養から所定の日数の経過後において、フローサイトメトリーによって、細胞の増殖および細胞集団について確認した結果を図８に示す。【００７３】
図８における矢印の左側に示す通り、培養開始の３日後および７日後のそれぞれの時点におけるフローサイトメトリーによって、細胞の増殖を確認した。また、７日後の時点では、他の蛍光標識抗体を用いてさらに分析して、ＣＤ３＋ＣＤ５６−細胞群（11.0％）、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞群（72.1％）、ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞群（76.4％）、ＣＤ１６−ＣＤ５６＋細胞群（17.4％）が存在することを確認した。培養開始の８日後の時点でＮＫＴ−ＴＣＲ  ｍＲＮＡ（Ｖα２４ｍ  ＲＮＡおよびＶβ１１  ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションし、その６時間後にＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のフローサイトメトリーで確認した。図８の矢印の右側に示す通り、ＣＤ３＋細胞では抗６Ｂ１１ｍＡｂに反応する細胞が41.0％、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞が71.5％の割合であったのに対し、ＮＫ細胞が含まれるＣＤ５６＋細胞では抗６Ｂ１１ｍＡｂに反応する細胞が2.31％、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞が8.5％であった。【００７４】
以上の通り、ＣＤ３＋細胞と比べて、ＮＫ細胞ではＮＫＴ−ＴＣＲの発現自体が抑えられてしまった。したがって、実施例３において作製したようなＣＤ３＋細胞に基づく改変型免疫細胞と同様の効果を発揮する細胞は、ＮＫ細胞を材料にした場合には極めて非効率にしか得らないことが明らかになった。以上の実験は、ＮＫＴ−ＴＣＲのｍＲＮＡをＮＫ細胞に導入すれば、ＮＫＴ細胞様の機能を示す細胞が得られるのではないかという、当業者にとって通常の予想を裏切る、極めて予想外の結果を示した。したがって、実施例３に示した通り、免疫療法用の改変型免疫細胞の作製には、ＣＤ３＋細胞が非常に適していることが、明らかになった。【００７５】
本発明は上述した各実施形態および各実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態および各実施例にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、免疫細胞療法に利用することができる。特に、本発明は、直接に細胞傷害性免疫を発揮するエフェクター細胞および他の免疫細胞を活性化させる免疫誘導剤として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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