(57)【要約】  ピーナッツの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供する。  本発明のピーナッツ結合核酸は、ピーナッツアレルゲンに対する解離定数が、１０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とし、例えば、配列番号１−１５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。また、本発明のピーナッツ結合核酸は、例えば、ダイズタンパク質と比較して、前記ピーナッツアレルゲンに対して有意に特異的に結合することが好ましい。
2015083391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピーナッツアレルゲンに対する解離定数が、１０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とするピーナッツ結合核酸分子。
【請求項２】
前記ピーナッツアレルゲンが、コンアラキン（conarachin）またはそのサブユニットである、請求項１記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項３】
前記サブユニットが、Ａｒａ  ｈ１である、請求項２記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項４】
前記ピーナッツアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が、ダイズタンパク質と比較して、前記ピーナッツアレルゲンに対して有意に特異的に結合する核酸分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項６】
ダイズタンパク質に対する解離定数が、１０ｎＭを超える、請求項１から５のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項７】
前記ダイズタンパク質が、β−コングリシニン（β-conglycinin）である、請求項１から６のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項８】
前記ピーナッツアレルゲンの検出濃度が、１０ｐｐｍ以上である、請求項１から７のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
（ａ）配列番号１−１５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【請求項１０】
下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
（ｅ）ピリミジンリッチな塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項９または１０記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、修飾塩基を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子を含むことを特徴とする、ピーナッツ検出用センサ。
【請求項１４】
さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む、請求項１３記載のピーナッツ検出用センサ。
【請求項１５】
前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである、請求項１４記載のピーナッツ検出用センサ。
【請求項１６】
さらに、ポルフェリンを含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のピーナッツ検出用センサ。
【請求項１７】
試料と請求項１から１２のいずれか一項に記載のピーナッツ結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のピーナッツアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする、ピーナッツの検出方法。
【請求項１８】
前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１７記載のピーナッツの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピーナッツに結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラッカセイ（Arachis hypogaea）、鶏卵および牛乳は、それぞれ、米国における３大アレルギンとして有名である。中でも、ラッカセイ（特に、種子であるピーナッツ）は、アレルギーの症状が重篤であり、アナフィラキシーショックによって死に至る場合がある。また、ラッカセイには、微量であっても、アレルギー反応を誘発し、加熱処理によって、アレルゲン性が高まってしまうという問題もある。このため、加工食品やその製造ライン等においては、原料としてラッカセイが混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。【０００３】
アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。そして、ラッカセイに関しても、例えば、種子であるピーナッツの主要なアレルゲンであるＡｒａ  ｈ１タンパク質に対する抗体を用いて、ピーナッツアレルゲンを検出する方法が報告されている（特許文献１）。【０００４】
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。しかしながら、これまでにラッカセイのアレルゲンに対する核酸分子は報告されていない。また、前述のように、ラッカセイは、微量であっても危険性が高いため、分析の特異性や精度の向上も望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２７１０９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、ピーナッツの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のピーナッツ結合核酸分子は、ピーナッツアレルゲンに対する解離定数が、１０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。【０００８】
本発明のピーナッツ検出用センサは、前記本発明のピーナッツ結合核酸分子を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のピーナッツの検出方法は、試料と前記本発明のピーナッツ結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のピーナッツアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のピーナッツ結合核酸分子は、ピーナッツアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のピーナッツ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のピーナッツアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、ピーナッツアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のピーナッツ結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるピーナッツアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３において、アプタマーとピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１との結合能を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例４において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例５において、アプタマーとピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１との結合能を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例５において、アプタマーとピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１との結合能を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例６において、アプタマーとピーナッツアレルゲンである未変性コンアラキンとの結合能を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例６において、アプタマーとピーナッツアレルゲンである未変性コンアラキンとの結合能を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例６において、アプタマーとピーナッツアレルゲンである加熱変性コンアラキンとの結合能を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例６において、アプタマーとピーナッツアレルゲンである加熱変性コンアラキンとの結合能を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例７において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例７において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例７において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例７において、アプタマーとピーナッツタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例８において、アプタマーとダイズアレルゲンβ−コングリシニンとの結合能を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例８において、アプタマーとダイズタンパク質との結合能を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例９において、アプタマーとピーナッツアレルゲンおよびダイズアレルゲンとの結合能を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の実施例９において、アプタマーとピーナッツアレルゲンおよびダイズアレルゲンとの結合能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ピーナッツアレルゲンが、コンアラキン（conarachin）またはそのサブユニットである。
【００１３】
本発明の核酸分子は、例えば、前記サブユニットが、Ａｒａ  ｈ１である。
【００１４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ピーナッツアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである。
【００１５】
本発明の核酸分子は、例えば、前記核酸分子が、ダイズタンパク質と比較して、前記ピーナッツアレルゲンに対して有意に特異的に結合する。
【００１６】
本発明の核酸分子は、例えば、ダイズタンパク質に対する解離定数が、１０ｎＭを超える。
【００１７】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ダイズタンパク質が、β−コングリシニン（β-conglycinin）である。
【００１８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ピーナッツアレルゲンの検出濃度が、１０ｐｐｍ以上である。
【００１９】
本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１−１５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【００２０】
本発明の核酸分子は、例えば、下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｅ）ピリミジンリッチな塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００２１】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。
【００２２】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、修飾塩基を含む。
【００２３】
本発明の検出用センサは、例えば、さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む。
【００２４】
本発明の検出用センサは、例えば、前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである。
【００２５】
本発明の検出用センサは、例えば、さらに、ポルフェリンを含む。
【００２６】
本発明の検出方法は、例えば、前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである。
【００２７】
（１）ピーナッツ結合核酸分子
本発明のピーナッツ結合核酸分子は、前述のように、ピーナッツアレルゲンに対する解離定数が、１０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。
【００２８】
ラッカセイは、マメ科ラッカセイ属であり、学術名が、Arachis hypogaeaである。本発明においてピーナッツアレルゲンとは、例えば、ラッカセイの植物個体全体または植物個体の部分に含まれる。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織または細胞等があげられ、前記器官は、例えば、種子（ピーナッツ）、果実、花弁、花冠、花、葉、果実、茎（地下茎）、根、むかご等があげられる。本発明において、ピーナッツアレルゲンとは、特に、ラッカセイの中でも前記ピーナッツ（種子）に含まれるアレルゲンであることが好ましい。
【００２９】
本発明の核酸分子は、例えば、ピーナッツの主要アレルゲンである、コンアラキン（conarachin）またはそのサブユニットに結合する。コンアラキンは、例えば、コンアラキンＩおよびコンアラキンII（α−コンアラキン）である。前記コンアラキンのサブユニットは、例えば、Ａｒａ  ｈ１があげられる。コンアラキンは、皮を除去したピーナツ（種子）において、ピーナッツタンパク質総量の約１７％に該当するといわれている。Ａｒａ  ｈ１は、コンアラキンのβサブユニットであり、トリマー構造の糖ペプチドである。
【００３０】
前記ピーナッツアレルゲンは、例えば、加熱による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、いずれのアレルゲンに対しても結合可能である。前述のように、ピーナッツは、加熱によってアレルゲン性が高くなる。食品の製造等において、加熱処理を伴う場合が多いため、変性アレルゲンに結合する本発明の核酸分子は、特に好ましい。
【００３１】
本発明の核酸分子は、前記ピーナッツアレルゲンに対する解離定数が、１０ｎＭ以下であり、好ましくは１ｎＭ以下であり、より好ましくは０．１ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記ピーナッツアレルゲンの検出限界濃度が、例えば、５ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭである。
【００３２】
本発明の核酸分子と前記ピーナッツアレルゲンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface  Plasmon  resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名  BioRad社）が使用できる。
【００３３】
本発明の核酸分子は、例えば、ダイズタンパク質と比較し、前記ピーナッツアレルゲンに対して有意に特異的に結合する核酸分子である。つまり、ピーナッツアレルゲンに対する結合性が、ダイズタンパク質に対する結合性よりも有意であるともいえる。ピーナッツの主要なアレルゲン（例えば、コンアラキン（Conarachin））は、ダイズタンパク質（中でも、例えば、β−コングリシニン（β-conglycinin））と約４５％の遺伝子配列相同性があり、類似している。このため、前記ピーナッツアレルゲンに対する結合物質を使用して前記ピーナッツアレルゲンを検出するにあたって、前記結合物質が前記ダイズタンパク質に結合することによって、偽陽性が生じる場合がある。しかしながら、本発明の核酸分子は、前記ダイズタンパク質と比較して、前記ピーナッツアレルゲンに対して有意に特異的に結合するため、偽陽性の影響を低減できる。
【００３４】
本発明の核酸分子は、Ａｒａ  ｈ１に対する解離定数が、例えば、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下であり、その範囲として、例えば、０．２〜０．１５ｎＭが例示できる。また、本発明の核酸分子は、Ａｒａ  ｈ１の検出限界濃度が、例えば、５ｎＭ、６ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭである。
【００３５】
本発明の核酸分子は、コンアラキンの検出限界濃度が、例えば、５ｎＭ、６ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭであり、具体例として、加熱変性コンアラキンの検出限界濃度は、例えば、５ｎＭ、６ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭである。
【００３６】
本発明の核酸分子は、ピーナッツタンパク質の検出限界濃度が、例えば、３ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、５０ｐｐｍであり、具体例として、加熱変性ピーナッツタンパク質の検出限界濃度は、例えば、３ｐｐｍ、１０ｐｐｍである。
【００３７】
本発明の核酸分子は、前記ダイズタンパク質に対する検出限界濃度が、例えば、１０ｎＭを超える、もしくは１００ｎＭ、１０００ｎＭ、または検出不可（前記ダイズタンパク質に未結合）であり、具体例として、β−コングリシニンに対する検出限界濃度が、例えば、１００ｎＭを超える、もしくは３００ｎＭ、１０００ｎＭ、または検出不可（β−コングリシニンに未結合）である。
【００３８】
本発明の核酸分子は、例えば、タンパク質総量における前記ピーナッツアレルゲンの含量（タンパク質量）が１０ｐｐｍ以上の試料について、前記ピーナッツアレルゲンを検出でき、好ましくは３ｐｐｍ以上であり、より好ましくは１ｐｐｍ以上である。具体例として、本発明の核酸分子は、タンパク質総量における前記コンアラキンの含量が、例えば、１０ｐｐｍ以上、３ｐｐｍ以上、１ｐｐｍ以上の試料について、前記コンアラキンを検出できる。
【００３９】
本発明のピーナッツ結合核酸分子について、具体例を以下に示す。本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
（ａ）配列番号１−１５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【００４０】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のピーナッツ結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
【００４１】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
【００４２】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１−１５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４３】
P_NES01（NAH1128R7Am2s19G）  配列番号１
CCCGCCTGTATTCCTGTCC
P_NES02（CONA161R8m1s31）  配列番号２
GAATCCGCGGGGTAGCGGTGGCGAGCGATTC
P_NES03（CONA161R2R8m1s32）  配列番号３
GTTCGTGGTGTGTTGTGTGTGATTCCAGGGAC
P_NES04（CONA171NNHR2R8m2s24）  配列番号４
GTTTTCTAGGCCAATCTGATCAAC
PolydT20  配列番号５
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CT25_C3（Pyrimidine  rich）  配列番号６
CTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTC
P_NES_M01（CONA170TEDAR2R8m1）  配列番号７
GGATTCCGTGCCGTGCTAAAGGCCTCCCCGTTTATAGGCAGGTATCCGGCAGACTACTGGGCTTGCGACAAATG
NAH1121NNH200R7m1s26  配列番号８
TCTCTACCCCCCACCGCCCACGACTC
CT25_C11  配列番号９
CTCTCTCTCCCCCCCCCCCTCTCTC
CT25_C7  配列番号１０
CTCTCTCTCTCCCCCCCTCTCTCTC
CT25_C0  配列番号１１
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
CA25_C11  配列番号１２
CACACACACCCCCCCCCCCACACACA
CA25_C7  配列番号１３
CACACACACACCCCCCCACACACACA
CA25_C3  配列番号１４
CACACACACACACCCACACACACACA
CA25_C0  配列番号１５
CACACACACACACACACACACACACA
【００４４】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、ピーナッツアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００４５】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、ピーナッツアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００４６】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００４７】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００４８】
本発明の核酸分子は、例えば、下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含んでもよい。
（ｅ）ピリミジンリッチな塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００４９】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、ピリミジン塩基のヌクレオチドをリッチに含むものであり、前記ポリヌクレオチドの全塩基のうちピリミジン塩基の割合が、例えば、５０％以上、６０％以上、８０％以上、１００％である。前記（ｅ）のポリヌクレオチドの長さは、例えば、１９〜７４塩基長、１９〜５０塩基長、１９〜４０塩基長である。前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、ピリミジン塩基の種類は、特に制限されず、例えば、シトシン、チミンおよびウラシルがあげられ、好ましくはシトシンおよびチミンである。前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、ピリミジン塩基として、いずれか一種類のみを有してもよいし、いずれか二種類を有してもよいし、３種類を有してもよい。具体例として、前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、塩基として、チミンのみを有するポリヌクレオチド、シトシンのみを有するポリヌクレオチドがあげられる。前者は、例えば、前記配列番号５のポリヌクレオチド、または、配列番号６においてシトシンが全てチミンに置換されたポリヌクレオチドがあげられ、後者は、例えば、配列番号５または６においてチミンが全てシトシンに置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、塩基としてチミンとシトシンを有するポリヌクレオチドがあげられ、具体例として、配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００５０】
また、前記（ｅ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、前述した配列番号９−１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００５１】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、具体的には、例えば、２〜２０、２〜１０、２または３である。
【００５２】
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００５３】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００５４】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００５５】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００５６】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。
【００５７】
前記ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含んでもよい。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００５８】
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【００５９】
【化１】
2015083391.tif 000003
【化２】
2015083391.tif 000004
【００６０】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
【００６１】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられる。
【００６２】
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられる。
【００６３】
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
【００６４】
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
【００６５】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００６６】
前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜８０個、さらに好ましくは１〜７０個、特に好ましくは１〜６０個、４０個、２７個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。
【００６７】
前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を含む場合、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
【００６８】
前記配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、前記修飾塩基を含むことが好ましく、中でもチミンが前記修飾チミンであることが好ましい。前記配列番号７のポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、特に制限されず、下限は、例えば、１個、３個、５個であり、上限は、例えば、１７個、１５個、１３個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
【００６９】
前記配列番号７のポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
【００７０】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００７１】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００７２】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００７３】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個であり、具体的には、例えば、前述の範囲と同様である。
【００７４】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００７５】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００７６】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００７７】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００７８】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、ピーナッツアレルゲンであるコンアラキンまたはＡｒａ  ｈ１が好ましく、より好ましくは加熱処理したコンアラキンまたはＡｒａ  ｈ１である。また、カウンターとして、例えば、未変性または加熱変性のダイズタンパク質を使用することが好ましい。
【００７９】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記ピーナッツアレルゲンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記ピーナッツアレルゲンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記ピーナッツアレルゲンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００８０】
（２）ピーナッツ検出用センサ
本発明のピーナッツ検出用センサは、前述のように、本発明のピーナッツ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のセンサは、前記本発明のピーナッツ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【００８１】
本発明のセンサは、例えば、前記ピーナッツ結合核酸分子に前記ピーナッツアレルゲンが結合した状態で、活性型となり、前記ピーナッツ結合核酸分子に前記ピーナッツアレルゲンが未結合の状態で、不活性型となる、前記結合を検出する結合検出用核酸分子を、さらに含んでもよい。本発明のセンサは、前記結合検出用核酸分子を含む場合、前記結合検出用核酸分子が活性型であるか不活性型であるかによって、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合の有無を確認でき、それによって、前記ピーナッツアレルゲンの有無を分析することができる。
【００８２】
前記結合検出用核酸分子としては、例えば、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子があげられる。前記Ｇカルテッド構造を形成する核酸分子は、例えば、Ｇカルテッド構造を形成した状態が、活性型であり、Ｇカルテッド構造を非形成の状態が、不活性型である。
【００８３】
前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子は、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅ等があげられ、好ましくはＤＮＡｚｙｍｅである。
【００８４】
Ｇカルテッド構造を形成した活性型ＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、酸化還元反応を触媒するペルオキシダーゼ様の活性を示す。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を検出することによって、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
【００８５】
この場合、本発明のセンサは、例えば、ポルフィリンを共存させることが好ましい。前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
【００８６】
また、Ｇカルテッド構造を形成した活性型のＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することで、蛍光を生じる。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ポルフィリンを共存させ、前記ＤＮＡｚｙｍｅと前記ポルフィリンとの複合体形成による蛍光を検出することによって、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
【００８７】
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）、Ｚｎ−ＤＩＧＰ、ＺｎＰＰ９およびＴＭＰｙＰ等が好ましい。
【００８８】
本発明のセンサは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
【００８９】
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
【００９０】
（３）検出方法
本発明の検出方法は、前述のように、ピーナッツの検出方法であって、試料と前記本発明のピーナッツ結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のピーナッツアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のピーナッツ検出用センサを使用してもよい。
【００９１】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ピーナッツアレルゲンに特異的に結合することから、例えば、ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のピーナッツアレルゲンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のピーナッツアレルゲンの有無またはピーナッツアレルゲンの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
【００９２】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
【００９３】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００９４】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のピーナッツアレルゲンの有無または量を分析する工程を含む。
【００９５】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００９６】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。
【００９７】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００９８】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のピーナッツアレルゲンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のピーナッツアレルゲンの量を分析（定量）できる。
【００９９】
そして、前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にピーナッツアレルゲンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にピーナッツアレルゲンが存在すると判断できる。
【０１００】
前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
【０１０１】
前記蛍光偏光法による前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【０１０２】
前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記ピーナッツアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、ピーナッツアレルゲンと未結合の状態とピーナッツと結合した状態を比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、ピーナッツアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、ピーナッツアレルゲンと未結合の前記標識化核酸分子およびピーナッツアレルゲンと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、ピーナッツアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
【０１０３】
前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
【０１０４】
前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
【０１０５】
前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０〜１０塩基長、０〜７塩基長、０〜５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
【０１０６】
前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
【０１０７】
前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。
【０１０８】
前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
【０１０９】
前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
【０１１０】
前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の検出方法は、例えば、前記試料と前記標識化核酸分子とを接触させ、前記試料中のピーナッツアレルゲンと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、ピーナッツアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
【０１１１】
前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０〜６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０〜８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ〜５ナノ秒があげられる。
【０１１２】
前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、ピーナッツアレルゲン未結合の基準、ピーナッツアレルゲン結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、ピーナッツアレルゲンが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、ピーナッツアレルゲンが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
【０１１３】
前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、ピーナッツアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのピーナッツアレルゲンが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、ピーナッツアレルゲンが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
【０１１４】
また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、ピーナッツアレルゲンが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、ピーナッツアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのピーナッツアレルゲンが存在すると判断できる。
【０１１５】
また、前記基準は、ピーナッツアレルゲンの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のピーナッツアレルゲンと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のピーナッツアレルゲンに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるピーナッツアレルゲンの量を判断することができる。
【０１１６】
また、本発明の核酸分子として、前記本発明のピーナッツ検出用センサを使用する場合、例えば、酸化還元反応の検出または蛍光発生の検出によって、前記ピーナッツアレルゲンの検出を行うことができる。
【０１１７】
前述のように、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテッド構造を形成し、ペルオキシダーゼ様の酸化還元反応の触媒活性を示す活性型となる。このため、前記酸化還元反応を検出することによって、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合を検出できる。この場合、例えば、前記酸化還元反応の基質を併用することが好ましい。
【０１１８】
また、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ピーナッツ結合核酸分子への前記ピーナッツアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発生する。このため、前記蛍光を検出することによって、前記ピーナッツ結合核酸分子へのピーナッツアレルゲンの検出を検出できる。
【０１１９】
（４）検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のピーナッツ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ピーナッツアレルゲンの検出等を行うことができる。
【０１２０】
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記ポルフィリン、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【実施例】
【０１２１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１２２】
［実施例１］
各アプタマーについて、ピーナッツアレルゲンに対する結合能を確認した。【０１２３】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
P_NES01（NAH1128R7Am2s19G）  配列番号１
CCCGCCTGTATTCCTGTCC
P_NES02（CONA161R8m1s31）  配列番号２
GAATCCGCGGGGTAGCGGTGGCGAGCGATTC
P_NES03（CONA161R2R8m1s32）  配列番号３
GTTCGTGGTGTGTTGTGTGTGATTCCAGGGAC
P_NES04（CONA171NNHR2R8m2s24）  配列番号４
GTTTTCTAGGCCAATCTGATCAAC
PolydT20  配列番号５
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CT25_C3（Pyrimidine  rich）  配列番号６
CTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTC
P_NES_M01（CONA170TEDAR2R8m1）  配列番号７
GGATTCCGTGCCGTGCTAAAGGCCTCCCCGTTTATAGGCAGGTATCCGGCAGACTACTGGGCTTGCGACAAATG【０１２４】
前記P_NES_M01（配列番号７）の合成において、全てのＴについて、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基を使用した。【０１２５】
前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。【０１２６】
（２）試料
市販のピーナッツ（種子）について、皮の除去、粉砕、ヘキサンを用いた脱脂を行った後、下記抽出液で、２時間、タンパク質の抽出を行った。そして、タンパク質を含む上清画分を回収し、これを０．２２μｍフィルターで濾過し、得られた濾液を、未変性ピーナッツ試料として使用した。さらに、前記未変性ピーナッツ試料を１０分間煮沸した後、上清画分を回収し、これを加熱変性ピーナッツ試料として使用した。また、認証標準物質のダイズ（種子）粉末（ground  soybean、NMIJ  CRM  7511-a  No.11）について、前記ピーナッツと同様にして、脱脂、抽出および濾過を行った濾液を、未変性ダイズ試料として使用し、さらに、前記未変性ダイズ試料を１０分間煮沸した後、上清画分を回収し、これを加熱変性ダイズ試料として使用した。前記抽出液は、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）、５００ｍｍｏｌ／Ｌの組成とした。前記緩衝液は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０の組成とした（以下、同様）。【０１２７】
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。【０１２８】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。この結果を、前記アプタマーとタンパクの結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。【０１２９】
前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。【０１３０】
これらの結果を図１に示す。図１は、前記加熱変性ピーナッツ試料または前記加熱変性ダイズ試料のタンパク質に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０〜１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である（以下、同様）。【０１３１】
図１に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記加熱変性ピーナッツ試料のタンパク質に対して、結合性を示したのに対して、前記加熱変性ダイズ試料のタンパク質に対しては、ほとんど結合性を示さなかった。【０１３２】
また、前述のＳＰＲ解析結果から、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記加熱変性ピーナッツ試料のタンパク質または前記加熱変性ダイズ試料のタンパク質の結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値（Ａ）に対するタンパク質結合測定値（Ｂ）の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。これらの結果を図２に示す。図２において、縦軸は、前記結合相対値を示す。図２に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記加熱変性ピーナッツ試料のタンパク質に対して、結合性を示したのに対して、前記加熱変性ダイズ試料のタンパク質に対しては、ほとんど結合性を示さなかった。【０１３３】
これらの結果から、実施例のアプタマーは、いずれも、ダイズタンパク質と比較して、ピーナッツタンパク質に対して優れた特異性で結合することがわかった。このため、本発明のアプタマーによれば、ダイズタンパク質への結合による偽陰性を抑制し、優れた精度で、ピーナッツアレルゲンを検出できるといえる。【０１３４】
［実施例２］
前記実施例１の各アプタマーについて、ピーナッツアレルゲンであるＡｒａ  ｈ１およびコンアラキンに対する動態パラメータを確認した。【０１３５】
（１）Ａｒａ  ｈ１
試料は、市販のピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１（INDOOR  biotechnologies社、＃NA-AH1-1、Blanched  peanut,  crushed  (Runner  cultivar)）を、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌに調整したものを使用した。前記Ａｒａ  ｈ１は、湯通しされたピーナッツから精製されているため、加熱変性タンパク質である。そして、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行い、その解析結果から、動態パラメータを算出した。これらの結果を下記表１に示す。下記表１に示すように、Ａｒａ  ｈ１に対する解離定数（ＫＤ）は、１０ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。【０１３６】
【表１】
2015083391.tif 000005
【０１３７】
試料は、市販のピーナッツアレルゲン  コンアラキン（COSMO  BIO、CSB-CSB-NP003601PL、Arachis  hypogaea  seed,  Native）を、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、３．１２５ｎｍｏｌ／Ｌに調整したものを使用した。前記コンアラキンは、未変性タンパク質であり、前記コンアラキンは、一般的に、ピーナツにおけるピーナッツタンパク質総量の約１７％。そして、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行い、その解析結果から、動態パラメータを算出した。これらの結果を下記表２に示す。下記表２に示すように、コンアラキンに対する解離定数（ＫＤ）は、１０ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。【０１３８】
【表２】
2015083391.tif 000006
【０１３９】
［実施例３］
前記実施例１のアプタマーについて、ダイズタンパク質共存下におけるピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１への結合力を確認した。【０１４０】
前記実施例２のＡｒａ  ｈ１を、２５ｎｍｏｌ／Ｌに調整し、ダイズタンパク質未添加の試料１（−）とした。また、前記Ａｒａ  ｈ１と、前記実施例１の加熱変性ダイズ試料とを混合し、Ａｒａ  ｈ１が２５ｎｍｏｌ／Ｌであり、前記加熱変性ダイズ試料が１０ｐｐｍである、ダイズタンパク質添加の試料２（＋）とした。なお、２５ｎｍｏｌ／Ｌ  Ａｒａ  ｈ１は、ピーナッツタンパク質１ｐｐｍ相当量である。そして、これらの試料を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行った。そして、前述のＳＰＲ解析結果から、ダイズ共存下における、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記ピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１の結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値に対するタンパク質結合測定値の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。【０１４１】
これらの結果を、図３に示す。図３は、前記結合相対値を示すグラフである。図３に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、ダイズタンパク質を添加した試料２（＋）は、ダイズタンパク質未添加の試料１（−）と同程度の結合性を示した（＋５％未満の誤差）。この結果から、本発明のアプタマーは、ダイズタンパク質の共存下においても、ダイズタンパク質ではなく、ピーナッツアレルゲンに特異的に結合し、ピーナッツアレルゲンを精度良く分析できることがわかった。【０１４２】
［実施例４］
前記実施例１のアプタマーについて、ピーナッツタンパク質およびダイズタンパク質に対する結合力を確認した。【０１４３】
前記実施例１と同様にして、加熱処理により熱変性させたピーナッツ試料およびダイズ試料を調製した。各試料のタンパク質濃度は、所定濃度（３ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ）とした。そして、下記配列の５’末端に、蛍光物質ＦＩＴＣを付加して、標識化アプタマーを調製した。
NAH1121NNH200R7m1s26（配列番号１６）
5’-FITC-TCTCTACCCCCCACCGCCCACGACTC-3’【０１４４】
前記標識化アプタマーを緩衝液で１ｎｍｏｌ／Ｌに調製し、前記試料１０μＬを添加し、室温で１５分間反応させた。これにより、前記標識化アプタマーと前記試料のタンパク質との複合体を形成させた。前記緩衝液は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の組成とした。前記反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。偏光励起光の波長は、６３５ｎｍとし、偏光度の検出波長は、６６５ｎｍとした。【０１４５】
偏光度の測定結果を図４に示す。図４は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図４において、横軸は、前記試料のタンパク質濃度を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。前記標識化アプタマーは、タンパク質が結合すると、分子量の増大により、蛍光偏光度が増加する。図４に示すように、前記ダイズ試料に関しては、タンパク質濃度が増加しても蛍光偏光度は変化しなかった。これに対して、前記ピーナッツ試料に関しては、タンパク質濃度の増加に伴い、相関的に増加した。これらの結果から、本発明のアプタマーによれば、ダイズタンパク質が共存する場合であっても、ピーナッツアレルゲンに特異的に結合することが分かった。また、ピーナッツタンパク質の検出濃度は、３ｐｐｍであっても十分に検出できることもわかった。【０１４６】
［実施例５］
前記実施例１のアプタマーについて、ピーナッツアレルゲンであるＡｒａ  ｈ１への結合力を確認した。【０１４７】
前記実施例２のＡｒａ  ｈ１を所定濃度（６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｍｏｌ／Ｌ）に調製し、これらを試料とした以外は、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行った。そして、前述のＳＰＲ解析結果から、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記Ａｒａ  ｈ１の結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値に対するタンパク質結合測定値の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。【０１４８】
これらの結果を、図５および６に示す。図５は、前記Ａｒａ  ｈ１に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、図６は、前記結合相対値を示すグラフである。図５の各グラフにおいて、プロットは、上から、前記Ａｒａ  ｈ１濃度が、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌである。図５および図６に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記Ａｒａ  ｈ１に結合能を示し、中でも、P_NES03、P_NES04およびpolydTは、図５に示すように、洗浄によってもほとんど解離が見られず、優れた結合能であることがわかった。【０１４９】
［実施例６］
前記実施例１のアプタマーについて、ピーナッツアレルゲンである未変性コンアラキンおよび加熱変性コンアラキンへの結合力を確認した。【０１５０】
未変性コンアラキンは、前記実施例２の未変性コンアラキンを使用した。加熱変性コンアラキンは、前記未変性コンアラキンを、１０分間煮沸処理して調製した。【０１５１】
前記未変性コンアラキンを所定濃度（１０、３０、１００、３００、１０００ｎｍｏｌ／Ｌ）および前記加熱変性コンアラキンを所定濃度（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｎｍｏｌ／Ｌ）に調製し、これらを試料とした以外は、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行った。そして、前述のＳＰＲ解析結果から、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記コンアラキンの結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値に対するタンパク質結合測定値の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。【０１５２】
これらの結果を、図７−１０に示す。図７および８は、前記未変性コンアラキンの結果であり、図９および１０は、前記加熱変性コンアラキンの結果であり、図７および９は、それぞれ、前記コンアラキンに対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、図８および１０は、前記結合相対値を示すグラフである。図７の各グラフにおいて、プロットは、上から、前記未変性コンアラキン濃度が、１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、３０ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌである。図９の各グラフにおいて、プロットは、上から、前記加熱変性コンアラキン濃度が、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、３．１２５ｎｍｏｌ／Ｌである。図７−１０に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記未変性コンアラキンおよび前記加熱変性コンアラキンに結合能を示し、特に、前記加熱変性コンアラキンに対して、より優れた結合能を示した。【０１５３】
［実施例７］
前記実施例１のアプタマーについて、ピーナッツアレルゲンであるピーナッツタンパク質への結合力を確認した。【０１５４】
前記実施例１の前記未変性ピーナッツ試料および前記加熱変性ピーナッツ試料を使用した。前記ピーナッツ試料を所定のタンパク質濃度（１、３、１０、３０、１００ｐｐｍ）に調製し、これらを試料とした以外は、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行った。そして、前述のＳＰＲ解析結果から、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記ピーナッツ試料のタンパク質の結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値に対するタンパク質結合測定値の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。【０１５５】
これらの結果を、図１１−１４に示す。図１１および１２は、前記未変性ピーナッツ試料の結果であり、図１３および１４は、前記加熱変性ピーナッツ試料の結果であり、図１１および１３は、それぞれ、前記ピーナッツ試料のタンパク質に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、図１２および１４は、前記結合相対値を示すグラフである。図１１および図１３の各グラフにおいて、プロットは、上から、前記ピーナッツ試料のタンパク質濃度が、１００ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、３ｐｐｍ、１ｐｐｍである。図１１−１４に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記未変性ピーナッツ試料および前記加熱変性ピーナッツ試料のタンパク質に結合能を示し、特に、前記加熱変性ピーナッツ試料のタンパク質に対して、より優れた結合能を示した。【０１５６】
［実施例８］
前記実施例１のアプタマーについて、ダイズアレルゲンへの結合力を確認した。【０１５７】
ダイズアレルゲンの試料として、未変性β−コングリシニン、加熱変性β−コングリシニン、未変性ダイズタンパク質および加熱変性ダイズタンパク質を準備した。前記未変性β−コングリシニンは、市販品（Sigma社、商品名β−conglycinin  from  Glycine  max(soybean)、C5868-5GM）を使用し、前記加熱変性β−コングリシニンは、前記未変性β−コングリシニンを、１０分間煮沸した後、上清画分を回収して使用した。前記未変性ダイズタンパク質および前記加熱変性ダイズタンパク質は、それぞれ、前記実施例１で調製した前記未変性ダイズ試料および前記加熱変性ダイズ試料を使用した。【０１５８】
前記β−コングリシニンの濃度は、１８．７５、３７．５、７５、１５０および３００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記ダイズ試料は、タンパク質濃度を１、３、１０、３０および１００ｐｐｍとし、これらを試料とした以外は、前記実施例１と同様にして、ＳＰＲ解析を行った。そして、前述のＳＰＲ解析結果から、前記チップに固定化されたアプタマーに結合した前記ピーナッツ試料のタンパク質の結合相対値を求めた。前記結合相対値は、アプタマー固層化測定値に対するタンパク質結合測定値の割合（タンパク質結合測定値／アプタマー固層化測定値）として算出した。【０１５９】
これらの結果を、図１５および１６に示す。図１５は、前記β−コングリシニンの前記結合相対値を示すグラフであり、（Ａ）が、前記未変性β−コングリシニン、（Ｂ）が、前記加熱変性β−コングリシニンの結果である。図１６は、前記ダイズ試料のタンパク質の前記結合相対値を示すグラフであり、（Ａ）が、前記未変性ダイズ試料、（Ｂ）が、前記加熱変性ダイズ試料の結果である。なお、図１６（Ｂ）には、前記加熱変性ピーナッツ試料（１０ｐｐｍ）の結果を併記した。図１５および図１６に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記ダイズアレルゲンにほとんど結合能を示さなかった。また、前記加熱変性ピーナッツ試料の結果と比較した場合、いずれのアプタマーも、前記ピーナッツアレルゲンに対する結合能は、前記ダイズアレルゲンに対する結合能よりも有意に優れていることも明らかである。【０１６０】
［実施例９］
ピリミジンリッチのアプタマーについて、ピーナツアレルゲンおよびダイズアレルゲンへの結合力を確認した。【０１６１】
ピリミジンリッチのアプタマーとして、下記８種類のアプタマーを使用した以外は、前述の実施例と同様にして、Ａｒａ  ｈ１、加熱変性ピーナッツタンパク質、未変性β−コングリシニンおよび加熱変性ダイズタンパク質に対する結合力を、ＳＰＲにより確認した。【０１６２】
CT25_C11  配列番号９
CTCTCTCTCCCCCCCCCCCTCTCTC
CT25_C7  配列番号１０
CTCTCTCTCTCCCCCCCTCTCTCTC
CT25_C3（Pyrimidine  rich）  配列番号６
CTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTC
CT25_C0  配列番号１１
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
CA25_C11  配列番号１２
CACACACACCCCCCCCCCCACACACA
CA25_C7  配列番号１３
CACACACACACCCCCCCACACACACA
CA25_C3  配列番号１４
CACACACACACACCCACACACACACA
CA25_C0  配列番号１５
CACACACACACACACACACACACACA【０１６３】
これらの結果を、図１７および１８に示す。図１７は、前記タンパク質に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、図１８は、前記結合相対値を示すグラフである。図１７および１８に示すように、本実施例のアプタマーは、いずれも、ダイズタンパク質である未変性β−コングリシニンにはほとんど結合せず。加熱変性ダイズタンパク質には、全く結合が見られなかった。これに対して、本実施例のアプタマーは、Ａｒａ  ｈ１および加熱変性ピーナッツタンパク質には、極めて高い結合能を示した。【０１６４】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０１６５】
この出願は、２０１３年１２月４日に出願された日本出願特願２０１３−２５１４７７を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のピーナッツ結合核酸分子は、ピーナッツアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のピーナッツ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のピーナッツアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、ピーナッツアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のピーナッツ結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるピーナッツアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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