(57)【要約】  容器本体と、前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、を備え、前記容器本体は、液体が流入される流入口と、前記流入口から流入した液体が通過する通路と、前記通路を通過した液体が流出される流出口と、を有し、前記通路の底面には、当該通路を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域が、当該通路に沿って並んで設けられていることを特徴とする細胞培養容器である。
2015125742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体と、
前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、
を備え、
前記容器本体は、
液体が流入される流入口と、
前記流入口から流入した液体が通過する通路と、
前記通路を通過した液体が流出される流出口と、
を有し、
前記通路の底面には、当該通路を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域が、当該通路に沿って並んで設けられている
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記細胞播種領域は、前記通路に沿って等間隔で設けられている
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記通路は、蛇行する部分を有する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記通路は、複数の通路構成要素に分岐する部分と、当該複数の通路構成要素が合流する部分と、を有する
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記通路の底面には、前記細胞播種領域と同心状に窪みが凹設されている
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記窪みは、角錐状または円錐状を有する
ことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記窪みは、平坦な底部を有する
ことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記平板のうち前記窪みと向かい合う部分には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されている
ことを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記窪みの内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記窪みの外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項７に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記通路の底面は、平坦であり、
前記細胞播種領域の内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記細胞播種領域の外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記細胞播種領域の外側の表面粗さは、前記細胞播種領域の内側の表面粗さより大きいことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記通路の底面及び前記平板は、光透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記平板は、ガス透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養により目的とする組織や臓器を人工的に作成する再生医療の研究開発が進められている。細胞の培養操作等を行うには所定の基準、例えばＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）を充足した細胞培養施設が用いられる。【０００３】
従来、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞という）や胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という）等の培養では、ディッシュやフラスコ等の開放系の培養容器が用いられ、人の手を介して行われるピペッティングにより当該容器内に細胞懸濁液や培地等の液体が導入され、または当該容器内から液体や細胞が回収されている。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の培養においては、所定の大きさのコロニーを形成して培養を行う必要があり、培養により大きくなったコロニーはピペッティングにより細胞塊を適当な大きさに砕いて継代している。しかしながら、このような開放系の培養容器では、開蓋時に容器内の空間が外気と通じるため、細菌・ウィルス等の外界からのコンタミネーションのリスクがある。【０００４】
このような開放系の培養容器の欠点を補うものとして、閉鎖系の培養容器が知られている（例えば、米国特許第６４７９２５２号明細書、特開２０１０−１１７４７号公報参照）。閉鎖系の培養容器には、例えば容器内部の空間に外部からアクセスするためのアクセスポートが設けられており、液体の注入または排出時に各アクセスポートにシリンジが挿し込まれることで、外界からのコンタミネーションのリスクが軽減されるようになっている。
【発明の概要】
【０００５】
しかしながら、これらの閉鎖系の細胞培養容器では、密閉された容器内部の一面に形成された連続する培養面上に細胞が付着し培養が行われており、なおかつ、ピペッティング等によって細胞に直接アクセスすることができない。そのため、培養する細胞塊のサイズを均一にできず、また細胞の培養位置をコントロールすることができない。
【０００６】
本発明は、以上のような問題点に着目し、これを有効に解決すべく創案されたものである。本発明の目的は、複数の細胞塊を同時に培養するための閉鎖系の細胞培養容器であって、培養する細胞塊のサイズを均一にできると共に細胞の培養位置をコントロールできる細胞培養容器を提供することにある。
【０００７】
本発明は、容器本体と、前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、を備え、前記容器本体は、液体が流入される流入口と、前記流入口から流入した液体が通過する通路と、前記通路を通過した液体が流出される流出口と、を有し、前記通路の底面には、当該通路を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域が、当該通路に沿って並んで設けられていることを特徴とする細胞培養容器である。
【０００８】
好ましくは、前記細胞播種領域は、前記通路に沿って等間隔で設けられている。
【０００９】
また、好ましくは、前記通路は、蛇行する部分を有する。
【００１０】
また、好ましくは、前記通路は、複数の通路構成要素に分岐する部分と、当該複数の通路構成要素が合流する部分と、を有する。
【００１１】
また、好ましくは、前記通路の底面には、前記細胞播種領域と同心状に窪みが凹設されている。
【００１２】
この場合、更に好ましくは、前記窪みは、角錐状または円錐状を有する。
【００１３】
あるいは、前記窪みは、平坦な底部を有してもよい。
【００１４】
また、前記通路の底面に前記窪みが凹設されている場合、好ましくは、前記平板のうち前記窪みと向かい合う部分には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されている。
【００１５】
あるいは、前記窪みが平坦な底部を有する場合、前記窪みの内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、前記窪みの外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていなくてもよい。
【００１６】
あるいは、前記通路の底面は、平坦であり、前記細胞播種領域の内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、前記細胞播種領域の外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていなくてもよい。
【００１７】
また、好ましくは、前記細胞播種領域の外側の表面粗さは、前記細胞播種領域の内側の表面粗さより大きい。
【００１８】
また、好ましくは、前記通路の底面及び前記平板は、光透過性を有する。
【００１９】
また、好ましくは、前記平板は、ガス透過性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器を示す概略平面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示す細胞培養容器のＡ−Ａ線に沿った断面図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａに示す細胞培養容器のＢ−Ｂ線に沿った断面図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明の第１の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器を示す概略平面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示す細胞培養容器のＣ−Ｃ線に沿った断面図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａに示す細胞培養容器のＤ−Ｄ線に沿った断面図である。
【図４】図４は、図３Ｃに示す細胞培養容器の符号Ｅが付された一点鎖線で囲まれた部分を拡大して示す概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の別例を説明するための概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の別例を説明するための概略図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の別例を説明するための概略図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の第３の実施の形態による細胞培養容器を示す概略平面図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａに示す細胞培養容器のＦ−Ｆ線に沿った断面図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ａに示す細胞培養容器のＧ−Ｇ線に沿った断面図である。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の第３の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の第３の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本発明の第３の実施の形態による細胞培養容器の使用方法の一例を説明するための概略図である。
【図９】図９は、本発明の第４の実施の形態による細胞培養容器を示す概略平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、添付の図面を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、本明細書に添付する図面においては、図示の理解のしやすさの便宜上、適宜縮尺および縦横の寸法比等を、実物のそれらから変更し誇張してある。
【００２２】
（第１の実施の形態）
図１Ａは、本発明の第１実施の形態による細胞培養容器を示す概略平面図である。図１Ｂは、図１Ａに示す細胞培養容器のＡ−Ａ線に沿った断面図である。図１Ｃは、図１Ａに示す細胞培養容器のＢ−Ｂ線に沿った断面図である。
【００２３】
本実施の形態の細胞培養容器１０ａは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、骨髄間質細胞（ＭＳＣ）等の軟骨細胞、樹状細胞等の様々な接着性（付着性）細胞を培養する用途に用いることができる。本実施の形態では、以下、ｉＰＳ細胞を培養する用途を主に想定して説明するが、これはあくまでも一例である。
【００２４】
図１Ａ〜図１Ｃに示すように、本実施の形態による細胞培養容器１０ａは、容器本体３１ａと、容器本体３１ａの一面に貼り付けられた平板３２と、を備えている。容器本体３１ａ及び平板３２の材質としては、光透過性を有する樹脂が用いられ、例えばポリスチレンが用いられる。容器本体３１ａ及び平板３２が光透過性を有することにより、培養中の細胞を外部から光学的に観察することが容易である。
【００２５】
本実施の形態では、図１Ａに示すように、容器本体３１ａは、平面視略長方形状を有している。容器本体３１ａの寸法は、具体的には、例えば縦１３０ｍｍ、横８５ｍｍ、高さ１０ｍｍである。
【００２６】
図１Ａに示すように、容器本体３１ａは、液体（細胞が分散された液体、培養液、剥離剤、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）が流入される流入口１１と、流入口１１から流入した液体が通過する通路１２と、通路１２を通過した液体が流出される流出口１３と、を有している。流入口１１と通路１２と流出口１３とは、例えば射出成形により一体に形成されている。
【００２７】
図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、容器本体３１ａの通路１２は、容器本体３１ａの平板３２が貼り付けられた一面側に溝状に形成されている。通路１２の口径（すなわち溝の深さ及び幅）は、２ｍｍ以上であることが好ましい。ｉＰＳ細胞のコロニーの成長限界サイズが２ｍｍ〜３ｍｍであり、通路１２の口径が２ｍｍより小さい場合、ｉＰＳ細胞のコロニーの成長が通路１２によって制限されてしまう。また、通路１２の口径は、４ｍｍ以下であることが好ましい。通路１２の口径が４ｍｍより大きい場合、液体の流れの向きが通路１２によって制限される効果が弱まり、乱流が発生しやすくなる。通路１２の口径は、２ｍｍ〜４ｍｍであることがより好ましい。
【００２８】
また、図１Ａに示すように、容器本体３１ａの通路１２は、平面視において蛇行する部分、すなわち直線部と折り返し部とが交互に接続された部分を有している。これにより、容器本体３１ａを大型化させることなく、通路１２の全長を延伸することができる。通路１２の幅と高さと通路長さとの比（アスペクト比）は、例えば幅：高さ：通路長さ＝３：４：６０〜１８００である。
【００２９】
図１Ａに示すように、通路１２の底面には、通路１２を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域２０ａが、当該通路１２に沿って並んで設けられている。前述したようにｉＰＳ細胞のコロニーの成長限界サイズは２ｍｍ〜３ｍｍであることから、細胞播種領域２０ａのピッチ（中心間隔）は、コロニー端が重なり合わない範囲で成長限界サイズに応じて２ｍｍ〜３ｍｍの範囲に設定するのが好ましい。これにより、隣り合うコロニー端が結合することなく、かつ、広い播種面積を確保することができる。また、隣り合う２つの細胞播種領域２０ａ間には最低限の境界があれば良く、隣り合う２つの細胞播種領域２０ａの縁の間隔は、例えば２ｍｍ以下である。
【００３０】
図示されていないが、細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さは、細胞播種領域２０ａの内側の表面粗さより大きいことが好ましい。例えば、細胞播種領域２０ａの内側の表面粗さは、Ｒａ０．２以下であり、細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さは、Ｒａ０．８以下である。ここで、「Ｒａ」は、算術平均粗さであることを示し、ＪＩＳ  Ｂ０６０１の規定による。このような表面粗さの違いは、例えば容器本体３１ａの射出成形時に使用される金型の表面粗さを調整することにより実現され得る。細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さが大きいほど、細胞播種領域２０ａの外側に細胞が付着しにくい。
【００３１】
本実施の形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、通路１２の底面には、前記細胞播種領域２０ａと同心状に窪み２１が凹設されている。図示された例では、窪み２１は、四角錐状を有しているが、これに限定されず、ｎ角錐状（ｎは３または５以上の自然数）または円錐状を有していてもよい。
【００３２】
窪み２１の頂角は、９０°以下であることが好ましい。窪み２１の頂角が９０°より大きい場合、窪み２１の斜面を細胞が滑り落ちにくい。また、窪み２１の頂角は、３０°以上であることが好ましい。窪み２１の頂角が３０°より小さい場合、後述するように容器が反転される際に、窪み２１の内側から細胞が落下しにくい。窪み２１の頂角は、３０°〜９０°であることがより好ましい。
【００３３】
容器本体３１ａの流入口１１及び流出口１３は、容器本体３１ａの同一側面に設けられている。流入口１１は通路１２の一端に連通され、流出口１３は通路１２の他端に連通されている。図示されていないが、流入口１１及び流出口１３には、シリンジの先端を挿入可能なスリット付のゴム栓、注射針を刺すことが可能な弾性膜、またはルアーロック等の医療用に使用されている開閉弁を具備する構造が設けられている。これにより、液体の注入時及び回収時において、外界からのコンタミネーションのリスクが軽減され得る。
【００３４】
本実施の形態の平板３２は、適度なガス透過性を有するように薄く形成されている。平板３２の厚みは、例えば５０μｍ〜２００μｍである。これにより、培養中の細胞に酸素ガス等のガスを供給することが容易である。なお、嫌気性の細胞を培養する場合には、平板３２は、ガス不透過性を有することが好ましく、この場合、平板３２の厚みは、例えば２０００μｍ〜３０００μｍである。
【００３５】
平板３２は、容器本体３１ａの通路１２が形成された一面上に、通路１２の天井全体を覆うように対向して配置され、通路１２の外側の部分（すなわち通路１２を規定する壁部の先端部分）に貼り付けられて固定支持されている。本実施の形態では、平板３２は通路１２の外側の部分に接着剤により接着されているが、固定方法は接着剤に限定されず、例えば熱融着または超音波融着であってもよい。平板３２が通路１２の外側の部分によって固定支持されていることで、平板３２の湾曲が抑制され得る。
【００３６】
次に、図２Ａ〜図２Ｅを参照し、本実施の形態による細胞培養容器１０ａの使用方法の一例について説明する。
【００３７】
まず、図２Ａに示すように、平板３２が貼り付けられる前の容器本体３１ａの通路１２が形成された面が、Ｏ２プラズマ処理される。具体的には、例えば、４０ｍＬ／ｍｉｎの流量のＯ２ガスが２７ｋＷの電力によってプラズマ化され、当該Ｏ２プラズマに容器本体３１ａの通路１２が形成された面が５分間曝される。
【００３８】
次に、容器本体３１ａの通路１２に細胞非接着コーティング液が塗布される。具体的には、例えば、通路１２内に１０ｍＬの細胞非接着コーティング液が流入され、３７℃で２時間静置される。その後、通路１２から細胞非接着コーティング液が流出され、通路１２が滅菌水により洗浄される。
【００３９】
次に、図２Ｂに示すように、容器本体３１ａの通路１２が形成された一面に、平板３２が貼り付けられる。具体的には、例えば、通路１２の外側の部分に接着剤（不図示）が塗布された後、平板３２が容器本体３１ａの一面上に、通路１２の天井全体を覆うように対向して載置され、接着剤により接着される。次いで、接着剤が４０℃の乾燥機により１６時間固化される。
【００４０】
次に、流入口１１から通路１２にＰＢＳが流入され、通路１２がＰＢＳにより満たされる。これにより、通路１２から気泡が除かれる。その後、細胞培養容器１０ａは、容器本体３１ａが平板３２より下方に位置する姿勢のまま静置される。
【００４１】
次に、図２Ｃに示すように、平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分に細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ、以下ＥＣＭという）４１が塗布される。具体的には、例えば、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、流入口１１から通路１２に２５ｍＬのＥＣＭ（例えば、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦ）が流入される。通路１２内のＰＢＳは、ＥＣＭにより押し流されて流出口１３から流出される。この状態で、１時間静置される。これにより、通路１２の細胞非接着コーティング液が塗布されていない部分、すなわち平板３２のうち通路１２の天井面に対応する領域全体に、ＥＣＭ４１が付着される。
【００４２】
次に、細胞播種工程として、図２Ｄに示すように、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、細胞４０が分散された２５ｍＬの細胞懸濁液（例えば、ｉＰＳ細胞が分散された細胞懸濁液）が流入口１１から通路１２に、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。細胞懸濁液中の細胞４０は、単細胞の形態で分散されていてもよいし、細胞塊（クランプ）の形態で分散されていてもよい。平板３２に付着しなかったＥＣＭは、細胞懸濁液により押し流されて流出口１３から流出される。
【００４３】
本実施の形態では、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の移動方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。これにより、細胞懸濁液中の細胞密度にムラが生じることが抑制され、細胞４０は通路１２の底面に実用上均一な密度で落下（沈殿）するように制御される。
【００４４】
また、本実施の形態では、細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さが相対的に大きいため、細胞播種領域２０ａの外側に細胞が付着することが抑制される。
【００４５】
次に、細胞培養容器１０ａ全体に振動（例えば、周波数１８０Ｈｚ）が３０分間加えられる。これにより、通路１２の底面のうち窪み２１の外側に落下した細胞４０が窪み２１の内側に誘導され、すなわち、細胞播種領域２０ａの内側に効果的に細胞４０が凝集される。更に、本実施の形態の窪み２１は、角錐状または円錐状を有しているため、窪み２１の内側に落下した細胞４０は、角錐状または円錐状の窪み２１の斜面に沿って滑り落ちる。これにより、細胞４０は、窪み２１の頂部を中心として高密度に凝集され得る。具体的には、例えば、各窪み２１の内側に約１００個〜１０００個ずつ細胞４０が凝集される。
【００４６】
次に、静置された後で、図２Ｅに示すように、細胞培養容器１０ａが上下反転される。これにより、窪み２１の内側に凝集された細胞４０が、平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分に落下する。
【００４７】
平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分にはＥＣＭ４１が塗布されているため、平板３２上に落下した細胞４０は、ＥＣＭ４１を足場としてその場で培養され得る。
【００４８】
次に、４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【００４９】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、新しい培地と古い培地とが混ざりにくく、古い培地が新しい培地によって押し出されることで、新しい培地を流し続けなくても古い培地を容易に有効に交換できる。
【００５０】
次に、更に４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【００５１】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。
【００５２】
その後、更に４８時間静置される。このようにして、細胞４０は、１コロニーあたり３０００個〜２００００個になるまで培養される。
【００５３】
次に、細胞回収工程として、流入口１１から通路１２に剥離剤（例えば、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、剥離剤により押し流されて流出口１３から流出される。平板３２上で培養された細胞４０のコロニーは、剥離剤によりＥＣＭ４１から剥離される。
【００５４】
その後、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。ＥＣＭ４１から剥離された培養細胞４０のコロニーは、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出（回収）される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、通路１２の底面にずり応力が均一にかかる。これにより、培養細胞４０の取りこぼしが低減する。
【００５５】
以上のような本実施の形態によれば、通路１２を通過する液体中の細胞４０が、通路１２に沿って並んで設けられた複数の細胞播種領域２０ａの内側に播種されるため、培養する細胞塊のサイズを均一にできると共に、各細胞播種領域２０ａに対応する所定の位置に培養位置をコントロールすることができる。
【００５６】
また、本実施の形態によれば、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の進行方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。これにより、細胞播種時に液体中の細胞密度にムラが生じることが抑制され、播種する細胞塊のサイズが均一になる。また、培地交換時に新しい培地と古い培地とが混ざりにくく、古い培地が新しい培地によって押し出されることで、新しい培地を流し続けなくても古い培地を容易に出し切ることができ、培地を有効に交換できる（すなわち、液交換時のロスがない）。また、細胞回収時に通路１２の底面にずり応力が均一にかかるため、培養細胞４０の取りこぼしが低減する。
【００５７】
また、本実施の形態によれば、細胞播種領域２０ａが通路１２に沿って等間隔で設けられているため、細胞４０の培養位置を通路１２に沿って等間隔になるようにコントロールすることができる。これにより、培養中の細胞密度が通路１２に沿って均等となり、培養細胞４０の品質管理が容易となる。
【００５８】
また、本実施の形態によれば、通路１２が蛇行する部分を有するため、容器本体３１ａを大型化させることなく、通路１２の全長を延伸することができる。これにより、流路１２の幅を広げることなく培養位置の数を増やすことができ、結果的に、より多くの細胞塊を同時に１つの容器１０ａで培養することが可能である。
【００５９】
また、本実施の形態によれば、通路１２の底面には、細胞播種領域２０ａと同心状に窪み２１が凹設されているため、容器１０ａが振動されることで、窪み２１の外側に落下した細胞４０が窪み２１の内側に誘導され、すなわち、細胞播種領域２０ａの内側に効果的に細胞４０が播種され得る。
【００６０】
また、本実施の形態によれば、細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さが細胞播種領域２０ａの内側の表面粗さより大きいことにより、細胞播種領域２０ａの外側に細胞が付着することが抑制される。これにより、液体中の細胞は、細胞播種領域２０ａの内側に一層効率的に播種され得る。
【００６１】
また、本実施の形態によれば、窪み２１が角錐状または円錐状を有するため、角錐状または円錐状の窪み２１の斜面に沿って細胞４０が滑り落ちる。これにより、窪み２１の頂部を中心として細胞４０が高密度に凝集され得る。
【００６２】
また、本実施の形態によれば、平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分にＥＣＭ４１が塗布されている。容器１０ａが上下反転されることで、各窪み２１の内側に凝集された細胞４０が、ＥＣＭ４１が塗布された部分に落下される。これにより、その場で細胞４０の培養を行うことができる。
【００６３】
（第２の実施の形態）
次に、図３Ａ〜図３Ｃを参照して、本発明の第２の実施の形態について説明する。
図３Ａは、本発明の第２の実施の形態による細胞培養容器１０ｂを示す概略平面図である。図３Ｂは、図３Ａに示す細胞培養容器のＣ−Ｃ線に沿った断面図である。図３Ｃは、図３Ａに示す細胞培養容器のＤ−Ｄ線に沿った断面図である。
【００６４】
図３Ａ〜図３Ｃに示すように、第２の実施の形態による細胞培養容器１０ｂでは、通路１２の底面には、細胞播種領域２０ｂと同心状に窪み２２が凹設されており、当該窪み２２は、平坦な底部を有している。
【００６５】
図示された例では、窪み２２は平面視円形状を有しているが、これに限定されず、例えば平面視楕円形状や平面視多角形形状であってもよい。窪み２２の深さは、例えば、０．１ｍｍ〜１．０ｍｍである。
【００６６】
窪み２２の底部の厚みは、０．０５ｍｍ〜０．３ｍｍであることが好ましい。本件発明者が硬度Ａ３０のシリコーンゴム膜を使用して実際に検証した結果、窪み２２の底部が０．０５ｍｍより薄い場合、強度不足のために破れ易く、液漏れが生じるおそれがある。
【００６７】
図４は、図３Ｃに示す細胞培養容器１０ｂの符号Ｅが付された一点鎖線で囲まれた部分を拡大して示す概略図である。
【００６８】
図４に示すように、本実施の形態では、細胞播種領域２０ｂ（窪み２２）の外側の表面粗さは、細胞播種領域２０ｂ（窪み２２）の内側の表面粗さより大きい。例えば、細胞播種領域２０ｂの内側の表面粗さは、Ｒａ０．２以下であり、細胞播種領域２０ｂの外側の表面粗さは、Ｒａ０．８以下である。このような表面粗さの違いは、例えば容器本体３１ｂの射出成形時に使用される金型の表面粗さを調整することで実現されている。細胞播種領域２０ｂ（窪み２２）の外側の表面粗さが大きいほど、細胞播種領域２０ｂ（窪み２２）の外側に細胞が付着しにくい。
【００６９】
その他の構成は図１Ａ〜図１Ｃに示す第１の実施の形態と略同様である。図３Ａ〜図３Ｃ、及び、図４において、図１Ａ〜図１Ｃに示す第１の実施の形態と同一の部分には同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００７０】
次に、図５Ａ〜図５Ｅを参照し、第２の実施の形態による細胞培養容器１０ｂの使用方法の一例について説明する。
【００７１】
まず、図５Ａに示すように、平板３２が貼り付けられる前の容器本体３１ｂの通路１２が形成された面が、Ｏ２プラズマ処理される。具体的には、例えば、４０ｍＬ／ｍｉｎの流量のＯ２ガスが２７ｋＷの電力によってプラズマ化され、当該Ｏ２プラズマに容器本体３１ｂの通路１２が形成された面が５分間曝される。
【００７２】
次に、容器本体３１ｂの通路１２に細胞非接着コーティング液が塗布される。具体的には、例えば、通路１２内に１０ｍＬの細胞非接着コーティング液が流入され、３７℃で２時間静置される。その後、通路１２から細胞非接着コーティング液が流出され、通路１２が滅菌水により洗浄される。
【００７３】
次に、図５Ｂに示すように、容器本体３１ｂの通路１２が形成された一面に、平板３２が貼り付けられる。具体的には、例えば、通路１２の外側の部分に接着剤（不図示）が塗布された後、平板３２が容器本体３１ｂの一面上に、通路１２の天井全体を覆うように対向して載置され、接着剤により接着される。次いで、接着剤が４０℃の乾燥機により１６時間固化される。
【００７４】
次に、流入口１１から通路１２にＰＢＳが流入され、通路１２がＰＢＳにより満たされる。これにより、通路１２から気泡が除かれる。その後、細胞培養容器１０ｂは、容器本体３１ｂが平板３２より下方に位置する姿勢のまま静置される。
【００７５】
次に、図５Ｃに示すように、平板３２のうち窪み２２と向かい合う部分にＥＣＭ４１が塗布される。具体的には、例えば、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、流入口１１から通路１２に２５ｍＬのＥＣＭ（例えば、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦ）が流入される。通路１２内のＰＢＳは、ＥＣＭにより押し流されて流出口１３から流出される。この状態で、１時間静置される。これにより、通路１２の細胞非接着コーティング液が塗布されていない部分、すなわち平板３２のうち通路１２の天井面に対応する領域全体に、ＥＣＭ４１が付着される。
【００７６】
次に、細胞播種工程として、図５Ｄに示すように、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、細胞４０が分散された２５ｍＬの細胞懸濁液（例えば、ｉＰＳ細胞が分散された細胞懸濁液）が流入口１１から通路１２に、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。細胞懸濁液中の細胞４０は、単細胞の形態で分散されていてもよいし、細胞塊（クランプ）の形態で分散されていてもよい。平板３２に付着しなかったＥＣＭは、細胞懸濁液により押し流されて流出口１３から流出される。
【００７７】
本実施の形態では、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の進行方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。これにより、細胞懸濁液中の細胞密度にムラが生じることが抑制され、細胞４０は通路１２の底面に実用上均一な密度で落下するように制御される。
【００７８】
また、本実施の形態では、細胞播種領域２０ｂの外側の表面粗さが相対的に大きいため、細胞播種領域２０ｂの外側に細胞が付着することが抑制される。
【００７９】
次に、細胞培養容器１０ｂ全体に振動（例えば、周波数１８０Ｈｚ）が３０分間加えられる。これにより、通路１２の底面のうち窪み２２の外側に落下した細胞４０が窪み２２の内側に誘導され、すなわち、細胞播種領域２０ｂの内側に効果的に細胞４０が播種される。具体的には、例えば、各窪み２２の内側に約５００個〜５０００個ずつ細胞４０が播種される。
【００８０】
ここで、細胞培養容器１０ｂ全体に振動が加えられる代わりに、または、細胞培養容器１０ｂ全体に振動が加えられることに加えて、細胞培養容器１０ｂの一方側（例えば、図３Ａにおける右側）が他方側（図３Ａにおける左側）より低くなるように、細胞培養容器１０ｂ全体が傾斜されてもよい。この場合、通路１２の底面に落下した細胞４０は、傾斜に沿って前記一方側に滑り落ちることで、窪み２２の内側のうち前記一方側（右側）の縁に高密度に凝集され得る。
【００８１】
次に、静置された後で、図５Ｅに示すように、細胞培養容器１０ｂが上下反転される。これにより、窪み２２の内側に凝集された細胞４０が、平板３２のうち窪み２２と向かい合う部分に落下する。
【００８２】
平板３２のうち窪み２２と向かい合う部分にはＥＣＭ４１が塗布されているため、平板３２上に落下した細胞４０は、ＥＣＭ４１を足場としてその場で培養され得る。
【００８３】
次に、４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【００８４】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、新しい培地と古い培地とが混ざりにくく、古い培地が新しい培地によって押し出されることで、新しい培地を流し続けなくても古い培地を容易に有効に交換できる。
【００８５】
次に、更に４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【００８６】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。
【００８７】
その後、更に４８時間静置される。このようにして、細胞４０は、１コロニーあたり３０００個〜２００００個になるまで培養される。
【００８８】
次に、細胞回収工程として、流入口１１から通路１２に剥離剤（例えば、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、剥離剤により押し流されて流出口１３から流出される。平板３２上で培養された細胞４０のコロニーは、剥離剤によりＥＣＭ４１から剥離される。
【００８９】
その後、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。ＥＣＭ４１から剥離された培養細胞４０のコロニーは、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出（回収）される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、通路１２の底面にずり応力が均一にかかる。これにより、培養細胞４０の取りこぼしが低減する。
【００９０】
次に、図６Ａ〜図６Ｃを参照し、第２の実施の形態による細胞培養容器１０ｂの使用方法の別例について説明する。
【００９１】
まず、図６Ａに示すように、平板３２が貼り付けられる前の容器本体３１ｂのうち、窪み２２の内側にはＥＣＭ４１が塗布されるが、窪み２２の外側にはＥＣＭ４１が塗布されない。具体的には、例えば、ＥＣＭとしてＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦが、液滴滴下装置等を用いて容器本体３１ａの窪み２２の内側にのみ滴下される。その後、滴下されたＥＣＭ４１が乾燥される。これにより、ＥＣＭ４１の消費量が顕著に低減される（例えば、消費量は１ｍＬ以下で済む）。
【００９２】
次に、図６Ｂに示すように、容器本体３１ｂの通路１２が形成された一面に、平板３２が貼り付けられる。具体的には、例えば、通路１２の外側の部分に接着剤（不図示）が塗布された後、平板３２が容器本体３１ｂの一面上に、通路１２の天井全体を覆うように対向して載置され、接着剤により接着される。次いで、接着剤が４０℃の乾燥機により１６時間固化される。
【００９３】
次に、流入口１１から通路１２にＰＢＳが流入され、通路１２がＰＢＳにより満たされる。これにより、通路１２から気泡が除かれる。その後、細胞培養容器１０ｂは、容器本体３１ｂが平板３２より下方に位置する姿勢のまま静置される。
【００９４】
次に、細胞播種工程として、図６Ｃに示すように、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、細胞４０が分散された２５ｍＬの細胞懸濁液（例えば、ｉＰＳ細胞が分散された細胞懸濁液）が流入口１１から通路１２に、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。細胞懸濁液中の細胞４０は、単細胞の形態で分散されていてもよいし、細胞塊（クランプ）の形態で分散されていてもよい。通路１２内のＰＢＳは、細胞懸濁液により押し流されて流出口１３から流出される。
【００９５】
本実施の形態では、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の進行方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。これにより、細胞懸濁液中の細胞密度にムラが生じることが抑制され、細胞４０は通路１２の底面に実用上均一な密度で落下するように制御される。
【００９６】
また、本実施の形態では、細胞播種領域２０ｂの外側の表面粗さが相対的に大きいため、細胞播種領域２０ｂの外側に細胞が付着することが抑制される。
【００９７】
次に、細胞培養容器１０ｂ全体に振動（例えば、周波数１８０Ｈｚ）が３０分間加えられる。これにより、通路１２の底面のうち窪み２１の外側に落下した細胞４０が窪み２１の内側に誘導され、すなわち、細胞播種領域２０ｂの内側に効果的に細胞４０が播種される。具体的には、例えば、各窪み２２の内側に約５００個〜１０００個ずつ細胞４０が播種される。
【００９８】
ここで、細胞培養容器１０ｂ全体に振動が加えられる代わりに、または、細胞培養容器１０ｂ全体に振動が加えられることに加えて、細胞培養容器１０ｂの一方側（例えば、図３Ａにおける右側）が他方側（図３Ａにおける左側）より低くなるように、細胞培養容器１０ｂ全体が傾斜されてもよい。この場合、通路１２の底面に落下した細胞４０は、傾斜に沿って前記一方側に滑り落ちることで、窪み２２の内側のうち前記一方側（右側）の縁に高密度に凝集され得る。
【００９９】
図６Ｃに示すように、窪み２２の内側にはＥＣＭ４１が塗布されているため、窪み２２の内側に播種された細胞４０は、ＥＣＭ４１を足場としてその場で培養され得る。
【０１００】
次に、４８時間静置された後で、培養細胞が光学的に観察される。
【０１０１】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、新しい培地と古い培地とが混ざりにくく、古い培地が新しい培地によって押し出されることで、新しい培地を流し続けなくても古い培地を容易に出し切ることができ、培地を有効に交換できる。
【０１０２】
次に、更に４８時間静置された後で、培養細胞が光学的に観察される。
【０１０３】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。
【０１０４】
その後、更に４８時間静置される。細胞４０は、１コロニーあたり１００００個〜２００００個になるまで培養される。
【０１０５】
次に、細胞回収工程として、流入口１１から通路１２に剥離剤（例えば、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、剥離剤により押し流されて流出口１３から流出される。各窪み２２において培養された細胞４０のコロニーは、剥離剤によりＥＣＭ４１から剥離される。
【０１０６】
その後、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。ＥＣＭ４１から剥離された細胞４０のコロニーは、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出（回収）される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、通路１２の底面にずり応力が均一にかかる。これにより、培養細胞４０の取りこぼしが低減する。
【０１０７】
以上のような第２の実施の形態によれば、図６Ａ〜図６Ｃに示すように、窪み２２の内側にはＥＣＭ４１が塗布されているが、窪み２２の外側にはＥＣＭ４１が塗布されていない場合、窪み２２の内側に細胞が播種された後、容器を上下反転させることなく、その場で培養を行うことができる。また、窪み２２の外側にはＥＣＭ４１が塗布されていないため、ＥＣＭの消費量が顕著に低減されると共に、細胞４０の培養位置が窪み２２の内側に効果的にコントロールされ得る。
【０１０８】
（第３の実施の形態）
次に、図７Ａ〜図７Ｃを参照して、本発明の第３の実施の形態について説明する。
図７Ａは、本発明の第３の実施の形態による細胞培養容器１０ｃを示す概略平面図である。図７Ｂは、図７Ａに示す細胞培養容器のＦ−Ｆ線に沿った断面図である。図７Ｃは、図７Ａに示す細胞培養容器のＧ−Ｇ線に沿った断面図である。
【０１０９】
図７Ａ〜図７Ｃに示すように、第３の実施の形態による細胞培養容器１０ｃでは、通路１２の底面は、平坦であり、通路１２に沿って並んで設けられた細胞播種領域２０ｃの内側には、ＥＣＭ４１が塗布されており、細胞播種領域２０ｃの外側には、ＥＣＭ４１が塗布されていない。ＥＣＭ４１の塗布方法について説明すると、例えば、ＥＣＭとしてＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦが、液滴滴下装置等を用いて通路１２の底面の細胞播種領域２０ｃの内側にのみ滴下される。その後、滴下されたＥＣＭ４１が乾燥される。これにより、ＥＣＭの消費量が顕著に低減されると共に、細胞の培養位置が細胞播種領域２０ｃの内側に効果的にコントロールされ得る。
【０１１０】
図示されていないが、細胞播種領域２０ｃの外側の表面粗さは、細胞播種領域２０ｃの内側の表面粗さより大きいことが好ましい。例えば、細胞播種領域２０ｃの内側の表面粗さは、Ｒａ０．２以下であり、細胞播種領域２０ｃの外側の表面粗さは、Ｒａ０．８以下である。このような表面粗さの違いは、例えば容器本体３１ｃの射出成形時に使用される金型の表面粗さを調整することにより実現され得る。細胞播種領域２０ｃの外側の表面粗さが大きいほど、細胞播種領域２０ｃの外側に細胞が付着しにくい。
【０１１１】
その他の構成は図３Ａ〜図３Ｃに示す第２の実施の形態と略同様である。図７Ａ〜図７Ｃにおいて、図３Ａ〜図３Ｃに示す第２の実施の形態と同一の部分には同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【０１１２】
次に、図８Ａ〜図８Ｃを参照し、第３の実施の形態による細胞培養容器１０ｃの使用方法の一例について説明する。
【０１１３】
図８Ａに示すように、平板３２が貼り付けられる前の容器本体３１ｃのうち、通路１２に沿って並んで設けられた細胞播種領域２０ｃには、ＥＣＭ４１が予め塗布されており、細胞播種領域２０ｃの外側には、ＥＣＭ４１が塗布されていない。
【０１１４】
まず、図８Ｂに示すように、容器本体３１ｃの通路１２が形成された一面に、平板３２が貼り付けられる。具体的には、例えば、通路１２の外側の部分に接着剤（不図示）が塗布された後、平板３２が容器本体３１ｃの一面上に、通路１２の天井全体を覆うように対向して載置され、接着剤により接着される。次いで、接着剤が４０℃の乾燥機により１６時間固化される。
【０１１５】
次に、流入口１１から通路１２にＰＢＳが流入され、通路１２がＰＢＳにより満たされる。これにより、通路１２から気泡が除かれる。その後、細胞培養容器１０ｃは、容器本体３１ｃが平板３２より下方に位置する姿勢のまま静置される。
【０１１６】
次に、細胞播種工程として、図８Ｃに示すように、流入口１１に１ｍＬのエアプラグが挿入された状態で、細胞４０が分散された２５ｍＬの細胞懸濁液（例えば、ｉＰＳ細胞が分散された細胞懸濁液）が流入口１１から通路１２に、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。細胞懸濁液中の細胞４０は、単細胞の形態で分散されていてもよいし、細胞塊（クランプ）の形態で分散されていてもよい。通路１２内のＰＢＳは、細胞懸濁液により押し流されて流出口１３から流出される。
【０１１７】
本実施の形態では、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の進行方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。これにより、細胞懸濁液中の細胞密度にムラが生じることが抑制され、細胞４０は通路１２の底面に実用上均一な密度で落下するように制御される。
【０１１８】
本実施の形態では、細胞播種領域２０ｃの内側にはＥＣＭ４１が塗布されているが、細胞播種領域２０ｃの外側にはＥＣＭ４１が塗布されていないため、細胞播種領域２０ｃの外側に細胞が付着することが抑制される。これにより、細胞４０は細胞播種領域２０ｃの内側に効果的に播種される。具体的には、例えば、各細胞播種領域２０ｃの内側に約５００個〜５０００個ずつ細胞４０が播種される。
【０１１９】
細胞播種領域２０ｃの内側にはＥＣＭ４１が塗布されているため、細胞播種領域２０ｃの内側に凝集された細胞４０は、ＥＣＭ４１を足場としてその場で培養され得る。
【０１２０】
次に、４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【０１２１】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、新しい培地と古い培地とが混ざりにくく、古い培地が新しい培地によって押し出されることで、新しい培地を流し続けなくても古い培地を容易に出し切ることができ、培地を有効に交換できる。
【０１２２】
次に、更に４８時間静置された後で、培養細胞４０が外部から光学的に観察される。
【０１２３】
次に、培地交換工程として、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出される。
【０１２４】
その後、更に４８時間静置される。このようにして、細胞４０は、１コロニーあたり１００００個〜２００００個になるまで培養される。
【０１２５】
次に、細胞回収工程として、流入口１１から通路１２に剥離剤（例えば、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。通路１２内の古い培地は、剥離剤により押し流されて流出口１３から流出される。通路１２の底面において培養された細胞４０のコロニーは、剥離剤によりＥＣＭ４１から剥離される。
【０１２６】
その後、流入口１１から通路１２に培地（例えば、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製ＲｅｐｒｏＦＦ２）が、例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの流量で流入される。ＥＣＭ４１から剥離された細胞４０のコロニーは、新しい培地により押し流されて流出口１３から流出（回収）される。本実施の形態では、通路１２内において通路１２に沿った流れが形成されるため、通路１２の底面にずり応力が均一にかかる。これにより、培養細胞４０の取りこぼしが低減する。
【０１２７】
以上のような第３の実施の形態によれば、細胞播種領域２０ｃの外側にはＥＣＭ４１が塗布されていないため、ＥＣＭの消費量が顕著に低減されると共に、細胞４０の培養位置が細胞播種領域２０ｃの内側に効果的にコントロールされ得る。
【０１２８】
また、本実施の形態によれば、通路１２の底面が平坦であるため、培養中の細胞４０の視認性がよい。
【０１２９】
（第４の実施の形態）
次に、図９を参照して、本発明の第４の実施の形態について説明する。
図９は、本発明の第４の実施の形態による細胞培養容器１０ｄを示す概略平面図である。
【０１３０】
図９に示すように、第４の実施の形態による細胞培養容器１０ｄでは、通路１２’は、複数（図示された例では８つ）の通路構成要素１２１〜１２８に分岐する部分１２９ａと、当該複数の通路構成要素１２１〜１２８が合流する部分１２９ｂと、を有している。各通路構成要素１２１〜１２８のコンダクタンスを均等に揃える観点から、分岐する部分１２９ａ及び合流する部分１２９ｂは、それぞれ、図示されたような樹形状、すなわち２分岐をｎ回繰り返すことで２ｎ個の通路構成要素に均等に分岐する形状を有することが、好ましい。
【０１３１】
本実施の形態の細胞播種領域２０ｄは、各通路構成要素１２１〜１２８の底面に、当該通路構成要素１２１〜１２８に沿って並んで設けられている。
【０１３２】
流入口１１から流入される液体は、通路１２’を通過する際に、分岐する部分１２９ａにおいて各通路構成要素１２１〜１２８に分岐され、各通路構成要素１２１〜１２８を通過する液体は、合流する部分１２９ｂにおいて合流されて、流出口１３へと導かれる。このように、流入口１１から流出口１３までの液体の流れの向きが通路１２’の各構成要素によって制限されるため、通路１２内において液体を構成する各液体分子の進行方向が通路１２と平行な向きに揃えられ、すなわち流入口１１と流出口１３との間における乱流の発生が抑制される。
【０１３３】
その他の構成は図１Ａ〜図１Ｃに示す第１の実施の形態と略同様である。図９において、図１Ａ〜図１Ｃに示す第１の実施の形態と同一の部分には同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【０１３４】
また、第４の実施の形態による細胞培養容器１０ｄの使用方法は、第１の実施の形態による細胞培養容器１０ａの使用方法と略同様であり、詳細な説明は省略する。
【０１３５】
以上のような第４の実施の形態によっても、容器本体３１ｄを大型化させることなく、通路１２’の全長を延伸することができる。これにより、流路１２’の幅を広げることなく培養位置の数を増やすことができ、結果的に、より多くの細胞塊を同時に１つの容器で培養することが可能である。
【０１３６】
なお、本実施の形態では、図９に示すように、通路１２’の底面には、細胞播種領域２０ｄと同心状に窪み２１ａが凹設されており、当該窪み２１ａは、角錐状または円錐状（図示された例では、四角錐状）を有しているが、これに限定されない。例えば、第２の実施の形態と同様に、通路１２’の底面には、細胞播種領域２０ｄと同心状に窪みが凹設されており、当該窪みは、平坦な底部を有していてもよい。あるいは、第３の実施の形態と同様に、通路１２’の底面は、平坦であり、細胞播種領域２０ｄの内側にはＥＣＭが塗布されているが、細胞播種領域２０ｄの外側にはＥＣＭが塗布されていなくてもよい。
【０１３７】
最後になったが、上述した個々の実施の形態により開示する発明が限定されるものではない。各実施の形態は、処理内容を矛盾させない範囲で適宜組み合わせることが可能である。
【符号の説明】
【０１３８】
１０ａ    細胞培養容器
１０ｂ    細胞培養容器
１０ｃ    細胞培養容器
１０ｄ    細胞培養容器
１１      流入口
１２      通路
１２’    通路
１２１    通路構成要素
１２２    通路構成要素
１２３    通路構成要素
１２４    通路構成要素
１２５    通路構成要素
１２６    通路構成要素
１２７    通路構成要素
１２８    通路構成要素
１２９ａ  分岐する部分
１２９ｂ  合流する部分
１３      流出口
２０ａ    細胞播種領域
２０ｂ    細胞播種領域
２０ｃ    細胞播種領域
２０ｄ    細胞播種領域
２１      窪み
２２      窪み
３１ａ    容器本体
３１ｂ    容器本体
３１ｃ    容器本体
３１ｄ    容器本体
３２      平板
４０      細胞
４１      細胞外マトリックス（ＥＣＭ）
【図１Ａ】
2015125742.tif 000003
【図１Ｂ】
2015125742.tif 000004
【図１Ｃ】
2015125742.tif 000005
【図２Ａ】
2015125742.tif 000006
【図２Ｂ】
2015125742.tif 000007
【図２Ｃ】
2015125742.tif 000008
【図２Ｄ】
2015125742.tif 000009
【図２Ｅ】
2015125742.tif 000010
【図３Ａ】
2015125742.tif 000011
【図３Ｂ】
2015125742.tif 000012
【図３Ｃ】
2015125742.tif 000013
【図４】
2015125742.tif 000014
【図５Ａ】
2015125742.tif 000015
【図５Ｂ】
2015125742.tif 000016
【図５Ｃ】
2015125742.tif 000017
【図５Ｄ】
2015125742.tif 000018
【図５Ｅ】
2015125742.tif 000019
【図６Ａ】
2015125742.tif 000020
【図６Ｂ】
2015125742.tif 000021
【図６Ｃ】
2015125742.tif 000022
【図７Ａ】
2015125742.tif 000023
【図７Ｂ】
2015125742.tif 000024
【図７Ｃ】
2015125742.tif 000025
【図８Ａ】
2015125742.tif 000026
【図８Ｂ】
2015125742.tif 000027
【図８Ｃ】
2015125742.tif 000028
【図９】
2015125742.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月5日(2016.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体と、
前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、
を備え、
前記容器本体は、
液体が流入される流入口と、
前記流入口から流入した液体が通過する通路と、
前記通路を通過した液体が流出される流出口と、
を有し、
前記通路の底面には、当該通路を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域が、当該通路に沿って並んで設けられ、前記通路の口径は通路全長に渡り２ｍｍ〜４ｍｍである
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
容器本体と、
前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、
を備え、
前記容器本体は、
液体が流入される流入口と、
前記流入口から流入した液体が通過する通路と、
前記通路を通過した液体が流出される流出口と、
を有し、
前記通路の底面または前記平板の通路面のいずれか一方に、前記通路を通過する細胞が播種される細胞外マトリクス（ECM）が塗布され、前記通路の口径は通路全長に渡り２ｍｍ〜４ｍｍである
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
前記通路の幅と通路長さの比が、幅：通路長さ＝３：６０〜１８００である請求項１にまたは記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記平板は前記通路を規定する壁部の先端部分に固定支持されている請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記細胞播種領域は、前記通路に沿って等間隔で設けられている
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記通路は、蛇行する部分を有する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記通路は、複数の通路構成要素に分岐する部分と、当該複数の通路構成要素が合流する部分と、を有する
ことを特徴とする請求項１、５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記通路の底面には、前記細胞播種領域と同心状に窪みが凹設されている
ことを特徴とする請求項１、５，７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記窪みは、角錐状または円錐状を有する
ことを特徴とする請求項８に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記窪みは、平坦な底部を有する
ことを特徴とする請求項８に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記平板のうち前記窪みと向かい合う部分には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されている
ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記窪みの内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記窪みの外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記通路の底面は、平坦であり、
前記細胞播種領域の内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記細胞播種領域の外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項１，５，７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
前記細胞播種領域の外側の表面粗さは、前記細胞播種領域の内側の表面粗さより大きいことを特徴とする請求項１、５，７乃至１３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
前記通路の底面及び前記平板は、光透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１６】
前記平板は、ガス透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月16日(2017.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体と、
前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、
を備え、
前記容器本体は、
液体が流入される流入口と、
前記流入口から流入した液体が通過する通路と、
前記通路を通過した液体が流出される流出口と、
を有し、
前記通路の底面には、当該通路を通過する細胞が播種される複数の細胞播種領域が、当該通路に沿って一列に並んで設けられ、前記通路を通過する細胞が播種される各細胞播種領域の口径は２ｍｍ〜４ｍｍであることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
容器本体と、
前記容器本体の一面に貼り付けられた平板と、
を備え、
前記容器本体は、
液体が流入される流入口と、
前記流入口から流入した液体が通過する通路と、
前記通路を通過した液体が流出される流出口と、
を有し、
前記通路の底面または前記平板の通路面のいずれか一方に、前記通路を通過する細胞が播種される細胞外マトリクス（ECM）が塗布され、前記通路の口径は通路全長に渡り２ｍｍ〜４ｍｍである
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
前記通路の幅と通路長さの比が、幅：通路長さ＝３：６０〜１８００である請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記平板は前記通路を規定する壁部の先端部分に固定支持されている請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記細胞播種領域は、前記通路に沿って等間隔で設けられている
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記通路は、蛇行する部分を有する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記通路は、複数の通路構成要素に分岐する部分と、当該複数の通路構成要素が合流する部分と、を有する
ことを特徴とする請求項１、５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記通路の底面には、前記細胞播種領域と同心状に窪みが凹設されている
ことを特徴とする請求項１、５，７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記窪みは、角錐状または円錐状を有する
ことを特徴とする請求項８に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記窪みは、平坦な底部を有する
ことを特徴とする請求項８に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記平板のうち前記窪みと向かい合う部分には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されている
ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記窪みの内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記窪みの外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記通路の底面は、平坦であり、
前記細胞播種領域の内側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されており、
前記細胞播種領域の外側には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が塗布されていない
ことを特徴とする請求項１，５，７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
前記細胞播種領域の外側の表面粗さは、前記細胞播種領域の内側の表面粗さより大きいことを特徴とする請求項１、５，７乃至１３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
前記通路の底面及び前記平板は、光透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１６】
前記平板は、ガス透過性を有する
ことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【国際調査報告】
2015125742.tif 000030
2015125742.tif 000031
2015125742.tif 000032
2015125742.tif 000033