(57)【要約】  抗原ポリペプチドをコードする遺伝子がヒトパラインフルエンザ２型ウイルス遺伝子に組み込まれているウイルスベクターであって、抗原ポリペプチドはウイルスの構造蛋白質との融合蛋白質として発現するウイルスベクター、ならびにその製造方法が開示される。本発明のウイルスベクターには、ウイルス粒子上に抗原ペプチドが定量的に大量に含まれており、抗原ポリペプチドを標的細胞に効率的に運ぶことができる。
2014103310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原ポリペプチドをコードする遺伝子がパラミクソウイルス科のウイルス遺伝子に組み込まれているウイルスベクターであって、前記抗原ポリペプチドはウイルスの構造蛋白質あるいはその一部との融合蛋白質として発現するウイルスベクター。
【請求項２】
融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＭ蛋白質から選ばれるいずれか１または２以上あるいはその一部との融合蛋白質である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
抗原ポリペプチドをコードする遺伝子が、
１）ＨＮ遺伝子の３’末端側に配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの外部に発現される、
２）Ｆ遺伝子の３’末端側に配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの内部に発現される、または
３）ＨＮ遺伝子の３’末端側およびＦ遺伝子の３’末端側にそれぞれ配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの外部と内部の両方に発現される、
ことを特徴とする請求項１または２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
抗原ポリペプチドとウイルスパッケージングシグナルであるＦまたはＨＮ膜蛋白質の膜・細胞内ドメインとを融合させ、ベクターエンベロープ上に抗原ポリペプチドが保持されることを特徴とする請求項１または２に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
ウイルスがＦ蛋白質欠損型パラミクソウイルス科のウイルスである、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項６】
ウイルスが核酸不活化処理されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項７】
核酸不活化処理がウイルスエンベロープの構造を実質的に変化させないものである、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
抗原ポリペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２ｅ蛋白質、またはその断片である、請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項９】
抗原ポリペプチドが、強毒型インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ＲＳウイルス、ヘンドラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびパピローマウイルスから選ばれるウイルスの抗原ペプチド、A群β（ベータ）型溶連菌、Mycobacterium  tuberculosis、コレラ菌、およびマイコプラズマから選ばれる細菌の抗原ペプチド、または癌抗原ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、およびＰＳＡからなる群から選ばれるいずれか１または２以上、あるいはこれらの断片である、請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
抗原ポリペプチドをウイルスの構造蛋白質あるいはその一部との融合蛋白質として発現するパラミクソウイルス科のウイルスベクターの製造方法であって、融合蛋白質をコードする遺伝子がウイルス遺伝子に組み込まれているパラミクソウイルス科のウイルスベクターをＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、
の各工程を含む方法。
【請求項１１】
融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＭ蛋白質から選ばれる１または２以上あるいはその一部との融合蛋白質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質またはＦ蛋白質の細胞内領域から選ばれる融合蛋白質である請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原ポリペプチドが、
１）ＨＮ蛋白質のＣ末端側に融合され、ベクターエンベロープの外部に発現される、
２）Ｆ蛋白質のＣまたはＮ末端側に融合され、ベクターエンベロープの内部に発現される、または
３）ＨＮ蛋白質のＣ末端側およびＦ蛋白質のＣあるいはＮ末端側またはＨＮ蛋白質のＮ末端側にそれぞれ融合され、ベクターエンベロープの外部と内部の両方に発現される、
ことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
抗原ポリペプチドが、ウイルスのＨＮ蛋白質またはＦ蛋白質の膜・細胞内領域と融合し、ベクターエンベロープ上に抗原ポリペプチドが包含されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
Ｆ遺伝子を欠損したパラミクソウイルス科のウイルスを、パラミクソウイルス科のウイルスのＦ遺伝子または抗原と融合したＦ遺伝子を発現するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして
培養上清からウイルス粒子を単離することを含む、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスを核酸不活化処理する工程をさらに含む、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
核酸不活化処理がウイルスエンベロープの構造を実質的に変化させないものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗原ポリペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２ｅ蛋白質、またはその断片である、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
抗原ポリペプチドが、強毒型インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ＲＳウイルス、ヘンドラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびパピローマウイルスから選ばれるウイルスの抗原ペプチド、A群β（ベータ）型溶連菌、Mycobacterium  tuberculosis、コレラ菌、およびマイコプラズマから選ばれる細菌の抗原ペプチド、または癌抗原ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、およびＰＳＡからなる群から選ばれる抗原ペプチドのいずれか１または２以上、あるいはこれらの断片である、請求項１０〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
抗原遺伝子と融合されたパラミクソウイルス科のウイルスのＦ遺伝子を含み、前記抗原とＦ蛋白質との融合蛋白質を発現するＶｅｒｏ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防または治療用のワクチンとして有用なＲＮＡウイルスベクターおよび不活化ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
パラミクソウイルス科のウイルスはマイナス一本鎖ＲＮＡをゲノムとしてもち、リバースジェネティクス法による外来遺伝子高発現可能なベクターが作製されており、遺伝子治療用ベクター或いは遺伝子組換えワクチン用ベクターとしての優れた特性を有していると考えられている。ウイルスの生活環にＤＮＡフェーズが含まれず、しかも転写・複製がすべて核の外の細胞質で起こるため、染色体ＤＮＡと相同性組換えを起こす確率が極めて小さく、染色体への遺伝子組換えによる発癌リスクが小さい。【０００３】
本発明者らは、これまでに、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであるパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科ルブラウイルス属に属するヒトパラインフエンザ２型ウイルス(以後ｈＰＩＶ２と記載)のベクター化を図り、ワクチンおよび遺伝子治療用ベクターとしての利用を検討してきた。【０００４】
当該過程で、ウイルスの構造蛋白質であるＦ遺伝子を完全に欠失させた、ｈＰＩＶ２のＦ遺伝子欠損型ベクターを構築した。当該ベクターは非伝播性（non-transmissible）または１回感染性（single-round-infectious）の特性をもつ。また、Ｆ遺伝子欠損型ベクター産生用に、ハイタイターのベクター産生能をもったＦ遺伝子安定発現パッケージ細胞の取得にも成功している。Ｆ遺伝子を欠損した当該ベクターは、Ｆ遺伝子を発現させたパッケージ細胞でのみ、Ｆ蛋白質をウイルスエンべロープに保持する感染性ベクターを産生することができる。一方、Ｆ遺伝子を発現していない細胞・組織では、いわゆる自己複製（self-replication）は起こすが感染性のベクターを産生できないため、レシピエントでの無尽蔵なベクターの増殖が起こらず、安全性が高いといえる（特許文献１）。【０００５】
遺伝子組換えＲＮＡ生ウイルスベクターまたは弱毒化ＲＮＡ組換えウイルスを用いたワクチンあるいは遺伝子治療における、非臨床試験、臨床研究、治験等で多くの有効性を示す結果が報告されている（非特許文献１〜９）。しかし、現在のところアメリカ食品医薬品局および欧州医薬品庁より医薬品として承認を受けた遺伝子組換え生（ライブ）ＲＮＡウイルスベクター製剤は報告されていない。その理由は、遺伝子組換え生ＲＮＡウイルスをベクターとして用いる場合、弱毒化ウイルスを利用し病原性の低減を図る、あるいは非伝播型のベクターを利用する等の安全面での対策が取られているが、依然として感染細胞内では、ウイルスおよび外来遺伝子産物が大量に産生されるため、ホメオスタシスへの影響あるいは外来遺伝子の変異等の懸念を払拭できない等によるものと推察される。【０００６】
したがって、ウイルスが転写・複製しないようにゲノムを不活化あるいはコンポーネントに分解したワクチンは安全性が高いといえる。不活化ワクチンの作製にはホルマリンによる処理法が多く用いられている。【０００７】
しかし、安全性が高いと考えられる不活化ワクチンにも安全性上の問題が存在する。１９６０年代にパラミクソウイルス科に属するＲＳＶに対するホルマリンによる不活化ＲＳＶワクチンが開発され、当該ワクチン接種後に、ＲＳＶの自然感染により乳幼児で重症患者および２人の死亡者がでた。その後精力的に原因の解明がなされた。ホルマリンによるウイルスの不活化処理によりＦ膜蛋白質の立体構造が変化することが判明した。当該ワクチン接種により変性したＦ膜蛋白質に対する中和活性をもたない抗体が産生され、ホルマリン処理により正常構造のＦ膜蛋白質が存在しないため、当該蛋白質に対する中和活性のある抗体が産生されないことが分かった。そして、当該ワクチン後にＲＳＶウイルスの自然感染により、生体反応はウイルスの増殖を抑えようと、中和活性のない抗体を過度に産生する。その結果、肺組織に通常のＲＳＶ感染ではみられないような多数の好酸球が浸潤し、それに伴いIL-4、IL-５等のサイトカインが上昇し、局所ＩｇＡ抗体や細胞性免疫も誘導されず、重症化が引き起こされたものと考えられている。【０００８】
またホルマリン不活化ＲＳＶは、抗原提示細胞である樹状細胞を成熟させる能力が、ライブＲＳＶに比べて劣ることが知られており、ホルマリンを使用しないＵＶ処理や熱処理等による不活化が検討されているが、いずれも樹状細胞を活性化する能力が低いこと、さらに炎症反応が誘導されることから、実用化には至っていない。同様に、パラミクソウイルス科に属する麻疹ウイルスのホルマリン不活化ワクチンも好酸球の浸潤と異型麻疹が報告されている。【０００９】
一方、動物試験においてＴｈ１型の免疫を誘導できるよう工夫された不活化ＲＳＶワクチンは、ウイルス感染を予防できる効果があることが報告されており、Ｔｈ１を誘導できる不活化ワクチンはこれらの問題を解決できる可能性があると考えられる。【００１０】
ウイルスベクターによるインビボでの導入遺伝子発現は高いと考えられるが、ウイルス感染細胞・組織での導入遺伝子発現に定量性がなくあるいは発現量が低く、遺伝子治療用ベクターとして実効性が高くない例が報告されている。また、導入ウイルスベクターに対するpre-existingな抗体による発現の抑制あるいは複数回のウイルスベクター投与に伴う当該ベクターに対する抗体による発現の抑制も報告されている。これら報告例は、一過的にせよある一定量以上の遺伝子発現が求められる遺伝子治療に、抗体誘導能の高いウイルスベクターを用いることの難しさを感じさせる。【００１１】
ウイルスベクターに外来遺伝子を導入し発現させる場合、外来遺伝子産物はパッケージングシグナルをもたないため、通常外来遺伝子産物はベクターに含有されることはなく、ウイルスベクターがインビボ投与後レシピエント細胞に感染し、そこで転写・複製が起こり、初めて外来遺伝子産物が産生される。したがって、中和抗体等によりウイルスベクターの感染、転写・複製等が阻害される場合、外来遺伝子の発現は抑制あるいは低下することとなる。【００１２】
また、インビボでは、細胞・組織へのウイルス感染効率が低く、あるいはウイルスが感染しても転写複製が起こらないもしくは効率が非常に悪く、外来遺伝子がほとんど発現しないことも多い。インビボの感染細胞ではウイルス感染により誘導されるインターフェロン等によりウイルスの転写複製が低く抑えられること、細胞外マトリクス等によりウイルスベクターがターゲット細胞に到達ができないことなどが理由として考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１０８１９５
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｖｉｔｏｌｏｇｙ．３７７（２），２２５（２００８）
【非特許文献２】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３６２（１），１３９（２００７）
【非特許文献３】Ｖｉｔｏｌｏｇｙ．１６（１１），２１８８３（２００８）
【非特許文献４】Ｖａｃｃｉｎｅ．２８，２７７１，（２０１０）
【非特許文献５】Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６５２１，（２０１１）
【非特許文献６】Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１０８９，（２００２）
【非特許文献７】Ｖａｃｃｉｎｅ．２９，８５５７，（２０１１）
【非特許文献８】Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５８４，（２００９）
【非特許文献９】Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１４６（１），９２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、疾患の予防または治療用のワクチンとして有用なパラミクソウイルス科のウイルスベクターであって、標的細胞に抗原ポリペプチド（蛋白質およびペプチドを含む）を効率的に導入することができるウイルスベクターおよび不活化ベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ウイルスベクターの構造遺伝子と抗原蛋白質またはペプチドの遺伝子とを融合させて発現させることにより、抗原蛋白質またはペプチドを標的細胞に効率的かつ定量的に運ぶことが可能となることを見いだした。【００１７】
また、発明者らは、以下の４タイプのベクター：１）膜蛋白質ＨＮ遺伝子の３’末端側(以降コード鎖)に抗原遺伝子を配置させることにより抗原をベクターエンベロープの外部に抗原ペプチド発現させるタイプ、2)Ｆパッケージング細胞のＦ遺伝子の３'末端側に抗原遺伝子を配置させることによりベクターエンベロープの内部に抗原ペプチドを発現させるタイプ、３）上記１）と２）を組み合わせることにより、ベクターエンベロープの内部および外部の両位置に抗原ペプチドを発現させるタイプ、さらに４）抗原とウイルスへのパッケージングシグナルとして機能する膜蛋白質の膜・細胞内ドメインとを融合することによりベクター上に抗原を取り込むタイプ、を構築することに成功した。これにより、複数抗原のベクターへの様々な導入が可能となる。【００１８】
すなわち、本発明は、抗原ポリペプチドを標的細胞に効率的にデリバリーしうるウイルスベクターに関するものであり、具体的には以下に示す発明が提供される：
［１］  抗原ポリペプチドをコードする遺伝子がパラミクソウイルス科のウイルス遺伝子に組み込まれているウイルスベクターであって、該抗原ポリペプチドはウイルスの構造蛋白質あるいはその一部との融合蛋白質として発現するウイルスベクター：
［２］  融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＭ蛋白質から選ばれる１または２以上あるいはその一部との融合蛋白質である、［１］に記載のウイルスベクター：
［３］  抗原ポリペプチドをコードする遺伝子が、
１）ＨＮ遺伝子の３’末端側に配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの外部に発現される、
２）Ｆ遺伝子の３’末端側に配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの内部に発現される、または
３）ＨＮ遺伝子の３’末端側およびＦ遺伝子の３’末端側にそれぞれ配置され、抗原ポリペプチドがベクターエンベロープの外部と内部の両方に発現される、
ことを特徴とする［１］または［２］に記載のウイルスベクター。
［４］抗原ポリペプチドとウイルスパッケージングシグナルであるＦまたはＨＮ膜蛋白質の膜・細胞内ドメインとを融合させ、ベクターエンベロープ上に抗原ポリペプチドが保持されることを特徴とする［１］または［２］に記載のウイルスベクター：
［５］  ウイルスがＦ蛋白質欠損型パラミクソウイルス科のウイルスである、［１］〜［４］のいずれかに記載のウイルスベクター：
［６］  ウイルスが核酸不活化処理されたものである、［１］〜［５］のいずれかに記載のウイルスベクター：
［７］  核酸不活化処理がウイルスエンベロープの構造を極力変化させない（実質的に変化させない）ものである、［６］に記載のウイルスベクター：
［８］  抗原ポリペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２ｅ蛋白質、またはその断片である、［１］〜［７］のいずれかに記載のウイルスベクター：
［９］  抗原ポリペプチドが、強毒型インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ＲＳウイルス、ヘンドラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびパピローマウイルスから選ばれるウイルスの抗原ペプチド、A群β（ベータ）型溶連菌、Mycobacterium  tuberculosis、コレラ菌、およびマイコプラズマから選ばれる細菌の抗原ペプチド、またはＲＳＶのＦ蛋白質、癌抗原ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、およびＰＳＡからなる群から選ばれるいずれか１または２以上、あるいはこれらの断片である、［１］〜［７］のいずれかに記載のウイルスベクター：
［１０］  抗原ポリペプチドをウイルスの構造蛋白質あるいはその一部との融合蛋白質として発現するパラミクソウイルス科のウイルスベクターの製造方法であって、融合蛋白質をコードする遺伝子がウイルス遺伝子に組み込まれているパラミクソウイルス科のウイルスをＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、
の各工程を含む方法：
［１１］  融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＭ蛋白質から選ばれる１または２以上あるいはその一部との融合蛋白質である、［１０］に記載の方法：
［１２］  融合蛋白質がウイルスのＨＮ蛋白質またはＦ蛋白質の細胞内領域から選ばれる融合蛋白質である［１０］または［１１］に記載の方法：
［１３］  抗原ポリペプチドが、
１）ＨＮ蛋白質のＣ末端側に融合され、ベクターエンベロープの外部に発現される、
２）Ｆ蛋白質のＮあるいはＣ末端側またはＨＮ蛋白質のＮ末端側に融合され、ベクターエンベロープの内部に発現される、または
３）ＨＮ蛋白質のＣ末端側およびＦ蛋白質のＮあるいはＣ末端側またはＨＮ蛋白質のＮ末端側にそれぞれ融合され、ベクターエンベロープの外部と内部の両方に発現される、
ことを特徴とする、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法：
［１４］  抗原ポリペプチドが、ウイルスのＨＮ蛋白質またはＦ蛋白質の膜・細胞内領域と融合し、ベクターエンベロープ上に抗原ポリペプチドが包含されることを特徴とする、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法：
［１５］  Ｆ遺伝子を欠損したパラミクソウイルス科のウイルスを、パラミクソウイルス科のウイルスのＦ遺伝子または抗原と融合したＦ遺伝子を発現するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離することを含む、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の方法：
［１６］  ウイルスを核酸不活化処理する工程をさらに含む、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の方法：
［１７］  核酸不活化処理がウイルスエンベロープの構造を極力変化させない（実質的に変化させない）ものである、［１６］に記載の方法：
［１８］  抗原ポリペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２ｅ蛋白質、またはその断片である、［１０］〜［１７］のいずれかに記載の方法：
［１９］  抗原ポリペプチドが、強毒型インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ＲＳウイルス、ヘンドラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびパピローマウイルスから選ばれるウイルスの抗原ペプチド、A群β（ベータ）型溶連菌、Mycobacterium  tuberculosis、コレラ菌、およびマイコプラズマから選ばれる細菌の抗原ペプチド、またはＲＳＶのＦ蛋白質、癌抗原ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、およびＰＳＡからなる群から選ばれるいずれか１または２以上、あるいはこれらの断片である、［１０］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］  抗原遺伝子と融合されたパラミクソウイルス科のウイルスのＦ遺伝子を含み、前記抗原とＦ蛋白質との融合蛋白質を発現するＶｅｒｏ細胞。
【発明の効果】
【００１９】
１）従来のプラットホーム型不活化ウイルスベクターでは、ベクターあたりの抗原導入量が低く、それゆえ抗体産生効率が低いという問題があった。これに対し、本発明のウイルスベクターでは、ウイルス粒子上に抗原ペプチドが定量的に大量に含むことができる。
２）本発明では、融合させたウイルスベクターの構造蛋白質、特に膜蛋白質自体が免疫原性をもつため、当該蛋白質に融合された免疫原性の低い抗原ポリペプチドに対する高い免疫を誘導できる。すなわち、ベクター自身がアジュバント活性を有し、投与の際にアジュバントの添加が不要または通常より少量である。
３）本発明のウイルスベクターでは、抗原とアジュバントが同一の細胞に導入されるため、ペプチドとアジュバントを混合投与したときにそれぞれが異なる細胞に取り込まれることによる非効率的な免疫誘導を低減させることが可能となる。
４）本発明で用いられるヒトパラインフルエンザウイルスは、マイナス一本鎖ウイルスで、末端が３リン酸で修飾されている（５’−ＰＰＰ）。この末端の３リン酸とこれに続く数ベースのシングル鎖ＲＮＡ部分は、ＩＦＩＴという細胞内シグナルの基質となり、抗ウイルス活性を有する１型インターフェロン等を誘導し、ＤＣ細胞成熟等に寄与する（Abbas  YT.,  Nature,  Vol.  494,  Issue  7435,  pp60-64  （2013)；Saito  T.  et al.,  J.  Exp.  Med.  Vol.205,  No.7,  pp1523-1527  (2008)）。
５）本発明では、低濃度のβプロピオラクトン等を用いて核酸不活化が行われるため、ウイルスエンベロープ蛋白質の立体構造が維持され、これら蛋白質の機能を維持した状態でウイルスゲノムのみが不活化される。それゆえ、ベクターは生ウイルスに近い細胞吸着性を有し、上述した構造による免疫誘導能・ＤＣ細胞成熟化能を発揮できる。
６）上記した利点から、本発明のウイルスベクターは、従来ヒトにおいて十分な効果が期待できなかったウイルスベクターとは異なり、ヒトにおいても高い効果を期待できる。
７）抗原導入を遺伝子レベルで行うことにより、不活化後に抗原導入を行う必要がなく、不活化後の抗原導入に伴う問題（低い抗原導入効率、エンベロープ構造の破壊等）を回避できる。
８）本発明のウイルスベクターは、ベクターエンベロープの外部、内部、又はその両方に抗原を配置できるように構成することが可能であり、これにより複数抗原のベクターへの様々な導入が可能となる。
以上のとおり、本発明によれば、効率的なウイルス不活化処理により、樹状細胞等に対しライブウイルスベクターと遜色のない免疫誘導が可能な不活化ベクターを取得でき、パラミクソウイルス科ウイルスを利用した不活化ベクターのワクチン化に途を開くことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１はヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのマウス細胞（NIH-3T3細胞）およびサル細胞（Vero細胞）での遺伝子発現効率を示す。マウス細胞では１０４希釈までＧＦＰ発現を確認でき、サル細胞では１０７希釈までＧＦＰ発現を確認できた。
【図２】図２はヒトおよびマウス樹状細胞中でのｈＰＩＶ２／ΔＦのコピー数を示す。
【図３】図３はマウス樹状細胞へのｈＰＩＶ２／ΔＦの感染効率を示す。
【図４】図４はライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ感染後のヒト樹状細胞の成熟マーカー発現を示す。
【図５】図５はライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ感染後のヒト樹状細胞でのＭＨＣおよびサイトカイン発現を示す。
【図６】図６はβプロピオラクトンによるウイルス不活化処理の結果を示す。(A)Day 5およびDay 10におけるベクターのＧＦＰ蛍光、(B) 赤血球凝集反応（ＨＡ ｔｉｔｅｒ）。(C)-(E) 生ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ、βプロピオラクトン処理ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰおよびホルマリン処理ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ投与後の肺胞洗浄液中での抗体値（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＡ）を示す。
【図７】図７はライブおよびβプロピオラクトン（ＢＰＬ）不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦによるマウス樹状細胞の成熟化およびＭＨＣ発現とサイトカインの誘導を示す。
【図８】図８はｈＰＩＶ２のＨＮと抗原との融合蛋白質を製造するためのベクターの構築を示す。(A)抗原をＨＮと融合させたｈＰＩＶ２(ΔＦ)ゲノム図（融合抗原例：Ｍ２ｅペプチド、ｇｐ−１００ペプチド、ＷＴ−１ペプチド）。(B)抗原をＨＮと融合させた不活化ｈＰＩＶ２(ΔＦ)の概念図。(C)ウエスタンブロットによるＨＮへの抗原導入ウイルスの抗原の確認結果（ＨＮ−Ｍ２ｅは抗原導入ウイルス、ＨＮは抗原導入のないウイルスであり、ＨＮ−Ｍ２ｅでのみ抗Ｍ２抗体陽性反応が見られた）。
【図９】図９(A)はｈＰＩＶ２とパッケージ細胞中のＦ蛋白質と抗原との融合蛋白質を製造するためのパッケージ細胞樹立用プラスミドベクター図（融合抗原例：Ｍ２ｅペプチド、ｇｐ−１００ペプチド、ＷＴ−１ペプチド）を示す。図９(B)はウエスタンブロットによる回収ベクターの抗原の導入結果を示す。ウエスタンブロットは、左から、ｈＰＩＶ２ｗｔ：抗原導入のないウイルス、ＨＮ−Ｍ２ｅｈＰＩＶ２ΔＦ：ＨＮへの抗原導入ウイルス、Ｆ−Ｍ２ｅ ｔａｎｄｅｍ ｈＰＩＶ２ΔＦ：Ｆへの抗原導入ウイルス。
【図１０】図１０は、(A)ｈＰＩＶ２への抗原導入様式(ベクターと抗原の配置図)、および(B)ＨＮ及びＦに抗原を同時導入したベクターでの抗原導入結果(ウエスタンブロット)を示す。ウエスタンブロットは、左から、ｈＰＩＶ２ｗｔ：抗原導入のないウイルス、ＨＮ−Ｍ２ｅｈＰＩＶ２ΔＦ：ＨＮへの抗原導入ウイルス、Ｆ Ｍ２ｅ ｔａｎｄｅｍ ｈＰＩＶ２ΔＦ：Ｆへの抗原導入ウイルス、４ＦＭ２ｅ ｔａｎｄｅｍ＋ＨＮ Ｍ２ｅ ｈＰＩＶ２ΔＦ：ＦおよびＨＮへの両方に抗原導入したウイルス。
【図１１】図１１はｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅのインフルエンザウイルスに対するワクチン効果を示す。
【図１２】図１２はｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００のメラノーマ細胞に対するワクチン効果を示す。
【図１３】図１３はメラノーマ細胞を移植したマウスにおけるｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００／ＷＴ−１の治療効果を示す。
【図１４】図１４(A)は、ｈＰＩＶ２／ΔＦプラスミドのＮｏｔＩ領域に、Ｍ２ｅ抗原またはＲＳＶのＦ（改変を含む）の細胞外領域とウイルスへのパッケージングシグナルとして機能するＦ膜蛋白質の膜・細胞内ドメインとを融合させた遺伝子を導入する図を示す。図１４(B)は回収したベクターの感染細胞でのＭ２ｅの発現確認を示す。
【００２１】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１２−２８３４２１号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１つの観点においては、本発明は、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子がパラミクソウイルス科のウイルス構造遺伝子に組込まれているウイルスベクターであって、該抗原ポリペプチドはウイルスの構造蛋白質との融合蛋白質として発現することを特徴とするウイルスベクターおよび当該ベクターであって生（ライブ）ウイルスと同様な免疫誘導が可能な不活化ベクターを提供する。
【００２３】
下記の実施例に具体的に示されるように、本発明においては、Ｆ遺伝子欠損型ｈＰＩＶ２ベクターのＨＮ遺伝子および／またはＦ遺伝子に万能型インフルエンザウイルスのＭ２ｅペプチド遺伝子、メラノーマ抗原のｇｐ１００ペプチド遺伝子、またはＷＴ−１がん抗原遺伝子を融合型に発現させたＦ遺伝子欠損型ｈＰＩＶ２ベクターをそれぞれ構築した。また、Ｆ遺伝子欠損型ｈＰＩＶ２ベクターの外来遺伝子導入部分にＭ２ｅ抗原とパッケージングシグナルを含むＦ膜蛋白質の膜・細胞内ドメインとを融合させたＦ遺伝子欠損型ｈＰＩＶ２ベクターを構築した。
【００２４】
さらに、β・プロピオラクトン処理により当該ベクターの赤血球凝集活性および樹状細胞を成熟化させる能力を保持した状態でゲノムの不活化処理をした。このようにして得られた不活化またはライブベクターにより、インフルエンザウイルス対する極めて高いワクチン効果およびメラノーマの増殖抑制効果が認められた。
【００２５】
本発明において用いられるパラミクソウイルス科のウイルスとして特に好ましいものはヒトパラインフルエンザ２型ウイルスであり、そのゲノムは約15,000塩基のモノシストロニックな一本鎖マイナスＲＮＡである。ウイルス構造遺伝子産物として、ＮＰ蛋白質、Ｐ（ホスホ）蛋白質、Ｍ（マトリクス）蛋白質、Ｆ（フュージョン）蛋白質、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）蛋白質およびＬ（ラージ）蛋白質が当該順にゲノム上にコードされている。また、ＲＮＡ編集によりＶ（ブイ）蛋白質が産生される。ＲＮＡゲノムにヌクレオカプシド蛋白質（ＮＰ）が結合し、らせん対称リボヌクレオシドプロテイン複合体（ヌクレオカプシド、ＲＮＰ）を形成している。ウイルスゲノムがコードする蛋白質のうち、ＮＰ蛋白質、Ｐ（ホスホ）蛋白質およびＬ（ラージ）蛋白質がＲＮＰの形成に必要である。ウイルス・エンベロープ上には、Ｆ（フュージョン）蛋白質、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）蛋白質が存在し、レセプターへの吸着と融合を担っている。Ｍ（マトリクス）蛋白質はＦおよびＨＮ蛋白質の細胞質内ドメイン、エンベロープ脂質二重膜およびＲＮＰと相互作用し、ウイルス粒子の出芽に重要である。
【００２６】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、細胞質で増殖するＲＮＡウイルスであるため、宿主細胞の染色体中に遺伝子が組込まれることはない。また、このウイルスは、ヒト気道粘膜に感染し、ＩｇＡを中心とする粘膜免疫、ＩｇＧによる液性免疫および細胞性疫免疫を誘導することが知られている。さらにこれまでにヒト（成人）に感染にしたときの重篤報告例がないことから、治療用ウイルスベクターとしてきわめて有用であると考えられる。
【００２７】
「ウイルスベクター」とは、感染した細胞中で発現させるべき遺伝子がウイルスゲノム遺伝子とともにパッケージングされているウイルス粒子、ならびに感染能をもつウイルスを産生できるウイルスゲノムを含まないベクターを意味する。本明細書では特に後者を「不活化ベクター」と称し、薬剤等の処理によって核酸を不活化することにより得ることができる。
【００２８】
「抗原ポリペプチド」とは本発明のウイルスベクターを投与した被験者において免疫反応を誘起することができるポリペプチドであり、例としては、癌抗原またはその一部、細菌やウイルス由来の蛋白質またはその一部が挙げられる。例えば、インフルエンザ用ワクチンとして用いるのに有用な抗原ポリペプチドとしては、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質、ＮＡ蛋白質、Ｍ２蛋白質またはＭ２ｅ蛋白質、またはこれらの断片がある。
【００２９】
さらに、感染症関連導入抗原ポリペプチドとして、インフルエンザウイルス(強毒型インフルエンザウイルスを含む)、パラインフルエンザ３型ウイルス、ＲＳウイルス、ヘンドラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス等のウイルスの抗原ペプチド、A群β（ベータ）型溶連菌、Mycobacterium  tuberculosis、コレラ菌、マイコプラズマ等の細菌の抗原ペプチドが挙げられる。
【００３０】
また、癌治療用ワクチンとして用いるのに有用な抗原ポリペプチドとしては、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、ＰＳＡなどが挙げられる。断片とは、抗原となるべき蛋白質の部分配列を持つポリペプチドであって、被験者に投与したときに免疫反応を誘起できるものをいう。なお、免疫反応には、液性免疫と細胞性免疫の両方が含まれる。
【００３１】
本発明においては、抗原ポリペプチドはウイルスの構造蛋白質あるいは構造蛋白質の一部との融合蛋白質として発現する。このことにより、ウイルス中で発現した抗原ポリペプチドがウイルス粒子中にとりこまれて、ウイルスが感染した細胞にデリバリーされる。すなわち、本発明においては、ウイルス遺伝子上に組込まれた抗原ポリペプチドの遺伝子が感染細胞において転写・翻訳されるだけではなく、ウイルス粒子自体が抗原ポリペプチドを有しており、このことにより、大量の抗原ポリペプチドを確実にレシピエント細胞にデリバリーすることができる。
【００３２】
抗原ポリペプチドを融合蛋白質として発現させるためには、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスの構造蛋白質あるいは構造蛋白質の一部をコードする遺伝子と連結させるようにウイルス遺伝子中に組み込む。ウイルスの構造蛋白質をコードする遺伝子としては、ｈＰＩＶ２のＨＮ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子およびＬ遺伝子が挙げられる。抗原遺伝子は１種類でもよいが、２種類以上の抗原遺伝子を連結してもよい。このことにより、２種類以上の抗原に対する免疫反応を誘起することができる。また、ＨＮ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子のうちの複数の遺伝子に抗原を同時に複数個導入することも可能である。このようなベクターの構築は、慣用の組換えＤＮＡ技術を用いて定法により行うことができる。
【００３３】
特に好ましくは、抗原ポリペプチドは、ＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＭ蛋白質から選ばれる１または２以上との融合蛋白質として発現される。抗原ポリペプチドがＨＮ蛋白質のＣ末端側に融合した形になるように組込むと、抗原ポリペプチドをウイルスのエンベロープ上で発現させることができる。また、ＨＮ蛋白質のＮ末端側に融合、Ｆ蛋白質のＮもしくはＣ末端側に融合またはＭ蛋白質と融合した形で組込むと、抗原ポリペプチドをウイルス粒子内部で発現させることができる。Ｆ蛋白質のＣ末端側に抗原ペプチドを融合させたＦ蛋白質を構築し、これを当該タンパク質をトランスに供給するパッケージング細胞に組み合わせれば、Ｆ欠損型ｈＰＩＶ２のエンベロープ内部に大量の抗原を発現させることができる。さらに、抗原ペプチドをウイルスのＨＮ蛋白質またはＦ蛋白質の膜・細胞内領域と融合し、ベクターエンベロープ上に抗原を包含されることができる。また、ＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質はそれ自体が抗原性をもち、免疫原性の低い抗原ポリペプチドに対しても、ＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質と融合させることにより、より高い免疫原性を付与することが可能となる。
【００３４】
本発明の１つの好ましい態様では、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスとしてＦ遺伝子欠損（ΔＦと称する）ウイルスを用いる。ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ蛋白質は、ウイルスの複製・転写工程において、ウイルスエンベロープと細胞膜を融合させウイルスヌクレオカプシドを宿主内に導入する際に必要とされる蛋白質である。Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、パッケージング細胞中ではＦ遺伝子を保持した感染性のｈＰＩＶ２を産生するが、Ｆ蛋白質を発現していない細胞では感染性のウイルスを産生しない。したがって、被験者の細胞に感染した後に自立増殖能をもつウイルス粒子を構成することができず、他の細胞に感染することがないため、ワクチン用ウイルスとして安全性が高い。
【００３５】
Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを調製するには、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白を発現する細胞でＦ遺伝子欠損ウイルスを培養することにより、当該細胞からトランスに供給されるＦ蛋白の存在下で、ウイルスエンベロープ上にＦ蛋白を保持させることにより、感染能を有するウイルス粒子を製造することができる。
【００３６】
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｆ遺伝子欠損ウイルスに感染しウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞として、Ｖｅｒｏ細胞を用いる。Ｖｅｒｏ細胞は、ヒトパラインフエンザ2型ウイルスＦ蛋白に対する許容性がとりわけ高く、またインターフェロンの発現がなく、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を常時発現させた場合でも安定して増殖することができ、かつウイルス粒子を効率よく産生することができる。
【００３７】
また、Ｆ遺伝子を発現させるＶｅｒｏパッケージング細胞に代わり、抗原ポリペプチドを融合させたＦ遺伝子を保持するＶｅｒｏ細胞をパッケージング細胞とすることでＦ遺伝子をトランスに供給する感染能を有する欠損ウイルス粒子を製造することができる。
【００３８】
別の観点においては、本発明は、抗原ポリペプチドをウイルスの構造蛋白質との融合蛋白質として発現するヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法を提供する。この方法は、融合蛋白質をコードする遺伝子がウイルス遺伝子に組み込まれているヒトパラインフルエンザ２型ウイルスをＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、の各工程を含む。
【００３９】
１つの好ましい態様においては、本発明のウイルスベクターは核酸不活化処理が施されたものである。核酸不活化処理とは、Ｆ蛋白質、ＨＮ蛋白質等のエンベロープ蛋白質の立体構造を保ち、これらの蛋白質の機能を有した状態でウイルスゲノムのみを不活化することをいう。核酸不活化処理は、例えば、核酸アルキル化剤処理、過酸化水素処理、ＵＶ照射、放射線照射、または熱処理により行うことができる。特に好ましくは、核酸アルキル化剤であるβプロピオラクトンでウイルスベクターを処理する。ウイルス培養液にβプロピオラクトンを加え、４℃で２４時間程度インキュベーションすればよい。βプロピオラクトンの好ましい濃度は、終濃度で０．００４％〜０．０５％、より好ましくは０．００４％〜０．０１％である。
【００４０】
Ｆ遺伝子欠損ウイルスを用いることにより、薬剤処理により万が一、生ウイルスが残存しても、当該ウイルスは増殖能を欠き、レシピエント内で増殖の恐れはなく、不活化ワクチンの高い安全性を保つことが可能となる。
【００４１】
本発明のウイルスベクターをβプロピオラクトンで処理すると、ウイルスベクターの赤血球凝集活性および樹状細胞を成熟化させる能力を保持したまま、ゲノムを不活化することができる。この方法によれば、ウイルス粒子自体がアジュバント活性を持つため、抗原に対する免疫を惹起するアジュバントと併用する必要がない、またはアジュバント濃度を低減できるという利点がある。
【００４２】
本発明のウイルスベクターは、シアル酸レセプターを介して細胞に感染する。シアル酸は多くの細胞・組織に表在しているため、ベクターの投与経路としては、経鼻噴霧、経肺、経口、舌下、皮内、皮下、静脈への直接投与の他に、樹状細胞等の免疫惹起細胞へのエクスビボ投与などが考えられる。
【００４３】
本発明のウイルスベクターは、典型的には、噴霧剤としてヒトを含む哺乳動物細胞に投与することができる。噴霧剤は定法により調製することができる。例えば、ウイルスベクターを含む培養上清を、必要により濃縮し、適当な担体または賦形剤とともに、ＰＢＳ等の緩衝液、ウイルスベクター安定溶液または生理食塩水に懸濁した後、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。噴霧剤には、必要に応じて安定化剤、保存剤などを加えてもよい。こうして得られた発現ベクターを被験者に吸入投与することができる。
【００４４】
さらに、典型的には、注射剤として皮下、皮内、筋肉注射剤としてヒトを含む哺乳動物細胞に投与することができる。当該注剤は定法により調製することができる。例えば、ウイルスベクターを含む培養上清を、必要により濃縮し、適当な担体または賦形剤とともに、ＰＢＳ等の緩衝液または生理食塩水に懸濁した後、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤には、必要に応じて安定化剤、保存剤などを加えてもよい。こうして得られた発現ベクターを被験者に注射剤として投与することができる。
【００４５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１  ｈＰＩＶ２／ΔＦによるアフリカミドリザル細胞（Ｖｅｒｏ細胞）およびマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）での導入遺伝子の発現の確認
９６ウエルプレートにＶｅｒｏ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞がベクター感染時に単層になるように培養した。ＧＦＰ遺伝子を導入したｈＰＩＶ２／ΔＦを原液から１０８まで希釈した。当該ベクターは、感染性ベクターを生じないので１次感染した細胞でしかＧＦＰの蛍光を呈しない。当該希釈ウイルスを細胞培養液の１０分の１量を添加し、３日間培養した。【００４７】
その結果、Ｖｅｒｏ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞では、それぞれ１０の１から７乗のベクター希釈液および１０の１から４乗のベクター希釈液を添加したときに、ＧＦＰの蛍光を認めることができた（図１）。【００４８】
実施例２  ｈＰＩＶ２／ΔＦによるヒトおよびマウス樹状細胞での増殖ベクターコピー数の確認
（ヒト樹状細胞の回収）倫理規定に基づき健常人の抹消血よりＣＤ１４陽性細胞を回収し、細胞培養１日目、４日目、７日目に培養液にＧＭ−ＣＳＦが５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４が２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、細胞の培養を行った。培養８日の細胞にＧＦＰ遺伝子を導入したｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５、５０、１００になるように感染し、感染３日後の細胞中のｈＰＩＶ２のＮ遺伝子領域部分について定量的ＰＣＲを行い、ゲノムのコピー数を測定した。【００４９】
（マウス樹状細胞の回収）倫理規定に基づきＢ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨より骨髄を回収し、残渣を除去し培養（ＲＰＭ−１６４０培地、１０％ＦＢＳ）した。培養２日おきに培養液に培地を交換し、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）となるように添加した。培養８日の細胞にＧＦＰ遺伝子を導入したｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５、５０、１００になるように感染し、感染３日後の細胞中のｈＰＩＶ２のＮ遺伝子領域部分について定量的ＰＣＲを行い、ゲノムのコピー数を測定した。Ｎ領域部分を用いた定量的ＰＣＲの結果、Ｎ領域部分の細胞あたりのコピー数は、ヒト樹状細胞でマウスの樹状細胞に比べて最大約５倍多いことが分かった（図２）。【００５０】
実施例１および２により、ｈＰＩＶ２はマウス細胞に感染し、導入遺伝子を増殖させることが可能であることが確認できた。ただし、ヒト・サルの細胞に比べ、マウス細胞では導入発現量が少なく、増殖したウイルス数も少なかった（図１および図２）。【００５１】
実施例３  ｈＰＩＶ２／ΔＦによる樹状細胞での感染効率の確認
倫理規定に基づき健常人の抹消血よりＣＤ１４陽性細胞を回収し、細胞培養１日目、４日目、７日目に培養液にＧＭ−ＣＳＦの終濃度が５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４の終濃度が２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、細胞の培養を行った。培養８日の細胞にＧＦＰ遺伝子を導入したｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５、５０、１００になるように感染させた。【００５２】
倫理規定に基づきＢ５７ＢＬ／６の大腿骨より骨髄を回収し、残渣を除去し培養（ＲＰＭ−１６４０培地、１０％ＦＢＳ）した。培養２日おきに培養液に培地を交換し、ＧＭ−ＣＳＦの終濃度が２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４の終濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。培養８日の細胞にＧＦＰ遺伝子を導入したｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５、５０、１００になるように感染させた。【００５３】
感染２日後にＧＦＰの蛍光を指標にフローサイトメトリーを用いて樹状細胞への感染効率を調べた。ＣＤ１１ｃ陽性細胞を樹状細胞とした。【００５４】
マウスの結果を図３に示した。ＭＯＩ＝２５で２７．５％、ＭＯＩ＝５０で５１．０％、ＭＯＩ＝１００で６８．０％のマウス樹状細胞でＧＦＰ蛍光陽性であった（図３）。ヒトでは、ＭＯＩ＝２５で５９．９％、ＭＯＩ＝５０で７３．１％、ＭＯＩ＝１００で７７．８％の樹状細胞でＧＦＰ蛍光陽性であった。【００５５】
以上の結果から、ｈＰＩＶ２／ΔＦは、ヒトの樹状細胞およびマウス樹状細胞に感染し遺伝子を発現させることができることができ、マウスの樹状細胞にくらべヒトの樹状細胞のほうがより感染効率が高いことがわかった。【００５６】
実施例４  ｈＰＩＶ２／ΔＦによるヒト樹状細胞の成熟化
実施例３においてｈＰＩＶ２／ΔＦは効率よくヒト樹状細胞に遺伝子導入できることが確認された。樹状細胞が免疫提示細胞として有効に機能し、効率的な免疫を誘導するためには、当該細胞が成熟化しリンパ器官へのホーミングすることが極めて重要である。そこで、ＭＯＩ＝２５でｈＰＩＶ２／ΔＦをヒト樹状細胞に２日間感染させ、樹状細胞の成熟化能を、抗原提示細胞の補助刺激因子であるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現について調べた。二次リンパ器官へのホーミング能についてはＣＣＲ７の発現上昇を指標にして評価した。陽性コントロールとして、ＴＲＬ４を活性化し成熟化およびリンパ器官へのホーミングを非常に効率よく引き起こすことが知られているＬＰＳ（リポ多糖）を培地中に１μｇ／ｍＬとなるように添加した。評価は指標抗体によりフローサイトメトリーにより行った。【００５７】
その結果、ｈＰＩＶ２／ΔＦの感染により樹状細胞は、ＬＰＳと匹敵する程度で補助刺激因子の発現を誘導でき、ＣＣＲ７の発現が上昇した（図４）。【００５８】
実施例５  ｈＰＩＶ２／ΔＦによるヒト樹状細胞での主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ、ヒトではＨＬＡ）発現とサイトカインの誘導
抗原特異的な免疫誘導にはＭＨＣ上への抗原の提示が重要である。そのためには、ＭＨＣクラスＩ分子またはＩＩ分子に抗原が提示される必要がある。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上の抗原を認識し細胞障害性Ｔ細胞等を誘導する。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の抗原を認識し、活性化する。【００５９】
樹状細胞はＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子で抗原を提示することが可能である。ｈＰＩＶ２／ΔＦはヒト樹状細胞のＭＨＣクラスＩ分子（ヒトではＨＬＡ−Ａ分子）およびＭＨＣクラスＩＩ分子（ヒトではＨＬＡ−ＤＲ分子）の発現上昇について、実施例３および４と同じ条件で、ＭＨＣクラスＩ分子についてはヒトＨＬＡ−Ａ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子についてはヒトＨＬＡ−ＤＲ分子を指標として発現上昇を調べた。その結果、ＨＬＡ−Ａ分子およびＨＬＡ−ＤＲ分子も陽性コントロールのＬＰＳと同程度に発現を上昇させた（図５）。【００６０】
さらに、培養上清中のＩＬ−６およびＩＬ−１２サイトカインの誘導を調べた。ｈＰＩＶ２／ΔＦはヒト樹状細胞に対し、ＩＬ−６ではＬＰＳと同程度の発現の上昇を、ＩＬ−１２ではＬＰＳより低いが、発現の上昇が認められた（図５）。【００６１】
実施例６  ｈＰＩＶ２／ΔＦの不活化と赤血球凝集活性および不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦによる免疫誘導
ｈＰＩＶ２／ΔＦの蛋白質の構造と機能を保持したまま、ゲノムのみを不活化すべく、アルキル化剤のβ―プロピオラクトン（ＢＰＬ）による不活化を検討した。無血清培地で培養したＧＦＰ遺伝子保持ｈＰＩＶ２／ΔＦの培養液に、０．００４％、０．００５％、０．００７５％、０．００９％、０．０１％、０．０１２％、０．０２５％、０．０５％となるようにＢＰＬを添加し、４℃で２４時間処理した。その後３７℃で３０分間処理しＢＰＬを不活性化した。超遠心にてｈＰＩＶ２／ΔＦを回収した。コントロールとして、同容量のｈＰＩＶ２／ΔＦも超遠心にて濃縮し、最終容量を同量のＰＢＳ溶液に懸濁した。不活化ベクターとコントロールベクターをｈＰＩＶ２のＦ発現細胞に感染させ、１０日間培養した。さらに、上清液を新たなｈＰＩＶ２のＦ発現細胞に感染させ、１０日間培養した。さらに、同操作を行った。合計、３回のベクターをＦ発現細胞で培養させた。ＴＣＩＤ５０によるウイルスの測定でも同様の結果を得た。【００６２】
その結果、コントロールベクターは強い蛍光と細胞変性を示したが、０．００４％、０．００５％、０．００７５％、０．００９％、０．０１％、０．０１％、０．０１２％、０．０２５％、０．０５％で不活化したベクターは、いずれもＧＦＰの蛍光を示さず、細胞変性も認められなかった。すなわち、ＢＰＬ処理によりゲノムは完全に不活化されていることが確認された（図６Ａ）。【００６３】
次に、不活化したベクターとコントロールベクターの赤血球凝集反応を調べた。モルモット１％赤血球溶液ベクター希釈用液を同量加えて赤血球凝集反応を調べた。【００６４】
その結果、不活化ベクターは不活化処理をしていないライブｈＰＩＶ２／ΔＦコントロールベクターと同じ５１２ＨＡ値を示した（図６Ｂ）。これは、不活化したベクターのＨＮ蛋白質が全く赤血球凝集能力を失っていないこと、つまり立体構造が保たれ、機能を失っていないことを示している。従って、不活化処理によりベクターはゲノムのみが不活化されているものと推察された。【００６５】
不活化の効果を調べるために、当該ベクターの不活化を０．０１２％のＢＰＬおよび常法によるホルマリン処理を行い、生ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ、ＢＰＬ不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰおよびホルマリン処理ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰの２ｘ１０７個の各ベクターパーティクルをＢ６マウス経鼻より2回(1週間おきに)投与し、投与後1週間後に肺胞洗浄液を回収し、ベクターに対する抗体価（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２およびＩｇＡ）を調べた。９６ウエルプレートに４μｇ/ｍＬの不活化ｈＰＩＶ２をコーティングしておき、抗体価を測定した。その結果、、肺胞洗浄液中で、ＢＰＬ不活化処理ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰはライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰには劣るがＩｇＧ１，ＩｇＧ２およびＩｇＡの抗体が誘導された。ホルマリン処理ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰに対する抗体の上昇は肺胞洗浄液中ではほとんどみられなかった(図６Ｃ，ＤおよびＥ)。これは、ホルマリン処理により、肺胞洗浄液中に、通常の立体構造をもつｈＰＩＶ２蛋白質に対する抗体の誘導が低いことを示している。一方、脾臓細胞を用い長期に抗原で刺激した場合には、ホルマリン処理ｈＰＩＶ２／ΔＦも抗体の上昇は認められた。この結果、低濃度のＢＰＬ処理はホルマリン処理に対して、ベクターに対して生ウイルスに近い抗体を誘導できることが確認できた。これの結果から、低濃度のＢＰＬによる不活化処理はホルマリン処理に比べてより生ウイルスの近い膜蛋白質構造を維持できると推察された。  【００６６】
実施例７  ｈＰＩＶ２／ΔＦによるマウス樹状細胞の成熟化および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ、ヒトではＨＬＡ）発現とサイトカインの誘導
Ｂ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨より骨髄を回収し、細胞培養１日目、４日目、７日目に培養液にＧＭ−ＣＳＦが２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、細胞の培養を行った。培養８日の細胞にＧＦＰ遺伝子を保持し、０．０５％のＢＰＬで処理した不活化ベクターのｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５になるように感染し、感染２日後の細胞中のＣＤ４０およびＣＤ８０の発現上昇による樹状細胞の成熟化、Ｈ−２ＫbおよびＩ−Ａ／Ｉ−ＥによるＭＨＣクラスＩまたはＩＩの上昇、培養液中でのＩＬ−６およびＩＬ−１２の発現を調べた。コントロールは、不活化をしていない（ライブ）ｈＰＩＶ２／ΔＦを用いた。【００６７】
その結果、ｈＰＩＶ２／ΔＦのマウス樹状細胞への感染により、ＣＤ４０およびＣＤ８６の成熟マーカーの発現量はライブｈＰＩＶ２／ΔＦに比べては劣るが、発現上昇が認められた（図７）。さらに、０．０１２％のＢＰＬで処理した不活化ベクターｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５になるように感染させた場合には、その効果は（ライブ）ｈＰＩＶ２／ΔＦと同等であった。【００６８】
ＭＨＣクラスＩ分子に相当するマウスＨ−２Ｋb分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子に相当するＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ分子についても、同様に上昇していた。サイトカインの分泌もライブｈＰＩＶ２／ΔＦに比べて劣るがそれぞれ上昇していた（図７）。さらに、０．０１２％のＢＰＬで処理した不活化ベクターｈＰＩＶ２／ΔＦを多重感染度（ＭＯＩ）が２５になるように感染させた場合には、その効果は（ライブ）ｈＰＩＶ２／ΔＦと同等であった。【００６９】
以上の結果から、ｈＰＩＶ２／ΔＦはライブおよび不活化ベクターともに、ベクター評価に使用できると判断できたので、以下の試験を行った。【００７０】
実施例８  ｈＰＩＶ２のＨＮ遺伝子と抗原遺伝子を融合させたｈＰＩＶ２／ΔＦの構築
ｈＰＩＶ２のＨＮ蛋白質のＣ末端テール部分に万能型インフルエンザウイルスのＭ２ｅ抗原ペプチド（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤＤ−Ｃ末端（配列番号１））または皮膚がん悪性腫瘍のｇｐ−１００抗原ペプチド（Ｎ末端−ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ−Ｃ末端（配列番号２））を挿入したベクターのプラスミドコンストラクトを構築した。当該構築はｈＰＩＶ２にコンストラクト上重要とされる、ゲノムの総数が６の倍数になるように、ルールオブ６ルールに基づいて構築した。リーバースジェネティクス法により、ウイルスの回収を図った。【００７１】
その結果、万能型インフルエンザウイルスのＭ２ｅ抗原ペプチドまたは皮膚がん悪性腫瘍のｇｐ−１００抗原ペプチドをＨＮ遺伝子に融合したｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅおよびｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００を回収することができた（図８）。Ｍ２ｅ抗原ペプチド（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＥＣＲＣＳＤＳＳＤＤ−Ｃ末端（配列番号７））、（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＬＴＲＮＧＷＧＣＲＣＳＤＳＳＤＤ−Ｃ末端（配列番号８））、ＷＴ-１のＮ末端−ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ−Ｃ末端（配列番号３）、Ｎ末端−ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ−Ｃ末端（配列番号４）、Ｎ末端−ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ−Ｃ末端（配列番号５）、Ｎ末端−ＲＭＰＮＡＰＹＬ−Ｃ末端（配列番号６）をコードする遺伝子の導入も行っている。しかし、Ｎ末端−ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ−Ｃ末端（配列番号４）のように疎水性の高いぺプチドを導入したベクターの回収は、通常の欠損型ｈＰＩＶ２／ΔＦの回収と比べると難しいこともわかった。パラミクソウイルス科の欠損型ウイルスベクターの融合型の抗原発現例の報告はない。【００７２】
実施例９  Ｆ遺伝子と抗原遺伝子の融合産物を発現するパッケージ細胞の構築とｈＰＩＶ２／ΔＦの構築
パッケージング細胞を作製するために構築したＦ発現用プラスミド上のｈＰＩＶ２Ｆ遺伝子の３’末端側に万能型インフルエンザウイルスのＭ２ｅ抗原ペプチド（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤＤ−Ｃ末端：配列番号１）、ＷＴ-１抗原ペプチド（Ｎ末端−ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ−Ｃ末端（配列番号３））、ＷＴ-１抗原ペプチド（Ｎ末端−ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ−Ｃ末端（配列番号４））またはＷＴ-１抗原ペプチド（Ｎ末端−ＲＭＰＮＡＰＹＬ−Ｃ末端（配列番号６））をコードする遺伝子を導入し、パッケージング細胞を構築した。抗原は、一個あるいは複数個導入した。当該細胞を用いて、常法のリバースジェネテクス法によりＦ欠損型ｈＰＩＶ２の回収を行った。【００７３】
その結果、図９に示すように、ベクター内部に抗原を保持するベクターを回収することができた。複数個の抗原を発現するベクターも回収できた。また、ベクターエンベロープの外部より内部に抗原を発現させる系のほうがベクターの回収が容易であることも分かった。Ｍ２ｅ抗原ペプチド（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＥＣＲＣＳＤＳＳＤＤ−Ｃ末端（配列番号７））、（Ｎ末端−ＳＬＬＴＥＶＥＴＬＴＲＮＧＷＧＣＲＣＳＤＳＳＤＤ−Ｃ末端（配列番号８））または、ＷＴ-１ペプチド（Ｎ末端−ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ−Ｃ末端（配列番号５））をコードする遺伝子の導入も行っている。【００７４】
実施例１０  Ｆ欠損型ｈＰＩＶ２エンベロープの内と外の両方に抗原を発現させることができるベクターの構築
実施例８および９において、ベクターエンベロープの内と外に抗原を発現させることができるベクターの回収を示した。本実施例では、ベクターの内と外の両部位に抗原を保持するＦ欠損型ｈＰＩＶ２の回収について検討を行った。Ｍ２ｅ抗原（配列番号１）を保持する実施例８で回収したベクターを、実施例９に示したＦ遺伝子にＭ２ｅ遺伝子を２個融合させたＦパッケージング細胞に感染させ、ベクターが回収できるかを調べた。【００７５】
その結果、図１０に示すように、ウイルス感染培養上清３ｍＬから回収したベクターのウエスタンブロットで抗Ｍ２抗体に反応する２種類の蛋白質が検出された。これらの分子量は、Ｆ蛋白質（開裂したＦ蛋白質）およびＨＮ蛋白質にＭ２ｅ抗体を加えた分子量に相当しており、エンベロープの外部と内部に抗原を保持するベクターが回収できたことが確認された。また、図１０から、ＨＮ蛋白質よりＦ蛋白質に融合したＭ２ｅのバントの方が濃く、ベクター上にはパッケージ細胞からトランスに供給されたＦ蛋白質および抗原がより多く存在することも分かった。【００７６】
実施例１１  ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅのインフルエンザウイルスに対するワクチン効果
インフルエンザＭ２ｅ抗原（配列番号１）をＨＮ蛋白質に融合型で発現させたｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅのインフルエンザＲＰ８株に対する予防効果を調べた。ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅは、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅおよび０．０５％ＢＰＬ処理した不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅを用いた。さらに、単独でＭ２の全体を発現するライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２も比較の対象として用いた。ＨＮと融合したＭ２ｅは、ＨＮがＮ末端領域のウイルスエンベロープの膜内に存在し、Ｃ末端領域は膜外に存在している。【００７７】
この実験では、ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅ型においてＨＮと融合型に構築したＭ２ｅが、抗原として認識されるかという点と不活化したｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅがワクチンとして有効であるかどうかを調べた。【００７８】
倫理規定に沿い５週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃを用いて試験を行った。麻酔下で、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅ、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅ、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰを経鼻投与により２ｘ１０８個のベクター（ＴＣＩＤ５０換算）２０μｌを投与した。当該投与を２週間後に再度行った。さらに投与２週間後にインフルンザウイルスＰＲ８株１６、０００個（ＬＤ５０は１，０００個以下）をベクター投与群とコントロール群の麻酔下のマウスに経鼻より２０μｌ投与した。投与日より連日体重測定および外観観察を行った。マウスについては、死亡または体重がインフルエンザウイルス接種時と比較した３０％減少したマウスは死亡したものとみなした。【００７９】
図１１にインフルエンザウイルス接種から１０日間の体重変化（百分率）と死亡例の結果を示す。極めて驚いたのは、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅ群（４例）は、全例においてインフルエンザウイルス投与後も全く体重も減少もなく、立毛も全くみられず、動き、摂餌がほとんどウイルス投与前と変わらなかった。【００８０】
一方、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２では、３例中１匹は、回復したが他は死亡した。特に、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２では、インフルエンザウイルス投与時の平均体重が他マウスより最大２ｇ近く減少していた。これは、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦと不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦを比較した場合、マウスの肺胞洗浄液中に分泌される蛋白質総量がライブｈＰＩＶ２／ΔＦで１０倍以上高いこと、インビトロのｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２感染細胞は、ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅ感染細胞に比べて、細胞変性効果が高く細胞に対する毒性が高いことが影響している可能性もある。Ｍ２は９７アミノ酸残基から成る膜蛋白質であって、４量体を形成しプロトンチャンネルとして働くため、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／Ｍ２によりＭ２蛋白質の全長を導入した場合に、当該機能が働き体重インフルエンザを感染前にマウスの体重を減少させた可能性がある。一方、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅではＨＮ膜蛋白質にＭ２ｅを融合して発現する形式をとっており、免疫原性の高いＨＮ膜蛋白質と誘導することにより、Ｍ２ｅに対する抗原性が高まり、より高いワクチン効果が得られたと考えられる。実際、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＯＭＰＣ）に融合させたＭ２ｅに抗原性が亢進した例が報告されている。不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅを経鼻投与ではＭ２ｅに対しＩｇＡ抗体が、筋肉内投与ではＩｇＧ２が優先的に誘導されていた。【００８１】
また、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅも、インフルエンザウイルスに対するワクチン効果は認められなかった。【００８２】
不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−Ｍ２ｅが極めて高いワクチン効果を示したことは、当該不活化ベクターシステムがインフルエンザウイルスに対するワクチン用システムとして極めて有効に機能することを証明している。赤血球凝集活性を保持する不活化ｈＰＩＶ２は、アジュバントを添加せずにワクチン効果を誘導することができること、ウイルスの構造蛋白質と融合させたＭ２ｅがワクチン用抗原として十分に機能すること、Ｍ２ｅをｈＰＩＶ２膜蛋白質と融合させることによりＭ２ｅに高い免疫効果を付与できること、ウイルス構成蛋白質の転写・複製を伴わないためにレシピエントに対する毒性が少ないこと等の可能性をもつことが確認された。【００８３】
実施例１２  ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００のＢ−１６メラノーマ細胞に対するワクチン効果
ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００のＢ−１６メラノーマ細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏによる予防的な腫瘍抑制効果について調べた。【００８４】
マウス大腿骨よりＤＣ細胞を回収し、インビトロで培養し、ベクターを添加し、マウスに戻すｅｘ  ｖｉｖｏによる腫瘍抑制効果をしらべた。実施例２で示したようにＢ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨より骨髄を回収し、残渣を除去し培養（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＢＳ）した。培養２日おきに培養液に培地を交換し、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）となるように添加した。培養８日後にＤＣへの分化を確認した。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＢＳで培養し、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰおよび０．０５％のＢＰＬで処理したｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰをＭＯＩ＝５０相当で培養液に添加した。２日間培養した。当該細胞を回収し、６週齢のＢ５７ＢＬ／６に鼠蹊部近傍の皮下（Subcutaneous：ＳＣ）に３ｘ１０６個の細胞を１週間間隔で３回投与した。最後の投与から１週間後に、マウス背中皮内（Intradermal：ＩＤ）に５ｘ１０５個／１００μｌのマウスメラノーマ細胞（投与前に３回ＰＢＳで洗浄）を投与し、投与後の腫瘍径を測定し、腫瘍容量を算定した。腫瘍容量は、腫瘍の、短径ｘ短径ｘ長径ｘ０．５の式により計算した。【００８５】
その結果を図１２に示す。コントロール群が最も腫瘍容量が大きくなった。最も効果が高かったのは、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００処理群であり、計測期間中にはいずれも腫瘍増殖が認められなかった。ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ群でも一部マウスでも腫瘍の生育が認められなかった。これは、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰの感染により、ＤＣの免疫機能全般が高められた効果によるものと予想された。【００８６】
これら試験の結果、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００は、ライブｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰに比べて、高い腫瘍増殖抑制効果を示した。【００８７】
一方、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００と不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰおよびコントロールとを比較すると、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰおよびコントロールと比べて、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００は明らかな腫瘍の増殖抑制効果を示した。ライブに比べると不活化ｈＰＩＶ２の腫瘍抑制効果は小さかったが、これは上皮系の細胞に比べてＤＣへのｈＰＩＶ２の遺伝子導入効率が低いこと、またマウス細胞はヒト細胞に比べて感染・遺伝子導入効率が悪いことが要因であると考えられ、ベクターの添加量を増やせばその効果は高くなることが予想される。【００８８】
ライブおよび不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００は、ライブおよび不活化のｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰに比べて、優位に腫瘍増殖を抑制したことから、ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００より抗原となるｇｐ−１００ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ等の腫瘍抑制免疫を誘導したものと考えられる。しかも、アジュバントを添加せずに腫瘍抑制効果を発揮できることが分かった。【００８９】
実施例１３  ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００およびＷＴ−１のＢ−１６メラノーマ細胞に対するワクチン効果
次に、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００と不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＷＴ−１（ＷＴ−１の導入配列：Ｎ末端−ＲＭＰＮＡＰＹＬ−Ｃ末端（配列番号６））の治療効果について調べた。Ｂ５７ＢＬ／６マウスの背中を剃毛し、２ｘ１０６個細胞のＢ−１６メラノーマ細胞をマウス皮内に移植した。４日後に移植Ｂ−１６メラノーマの径が３ｍｍ程度になったところで、腫瘍内に７０μＬに調整した各７．０ｘ１０６個の不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００および不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＷＴ−１を、細胞移植後４日、７日、１０日、１３日目に合計４回投与した。腫瘍径をそれぞれ測定した。コントロールとして、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰを投与した。投与初期には、７０μLの容量は腫瘍容量を超えた容量であった。【００９０】
その結果、腫瘍容量は、ＰＢＳを投与群に比べて、不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ投与および不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００と不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＷＴ−１では、腫瘍の抑制効果が認められた（図１３）。不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＧＦＰ投与群と不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＨＮ−ｇｐ−１００と不活化ｈＰＩＶ２／ΔＦ／ＷＴ−１投与群の両者間では、大きな差は認められなかった。腫瘍にベクターを直接投与する場合、免疫惹起による腫瘍抑制効果よりもベクター投与自身による腫瘍細胞の溶解等による腫瘍の抑制が高いことが考えられる。腫瘍抗原を保持しないウイルスベクターおよび不活化ウイルスベクターの腫瘍内投与で、ウイルスコンポーネントが抗腫瘍効果をしめすことが報告されており、今回の腫瘍へ不活化ベクター投与による腫瘍抑制効果がみられたと考えられる。【００９１】
実施例１４  ｈＰＩＶ２／ΔＦの各部位への外来遺伝子の挿入
Ｍ２ｅ遺伝子（配列番号１）を２個連結し、そのＣ末端側にｈＰＩＶ２のＦ膜アンカー領域と膜・細胞内領域の蛋白質をコードする遺伝子を連結、つまりベクターへのパッケージングシグナルとの連結産物を構築し、ｈＰＩＶ２／ΔＦに挿入し、外来遺伝子産物がベクターに取り込まれるかどうかを検討した。【００９２】
上記遺伝子構築物の３’側に、常法によりｈＰＩＶ２のＲ１、介在配列およびＲ２を付加し、その両端にＮｏｔ Ｉ配列を配置した。ｈＰＩＶ２／ΔＦのＮｏｔ Ｉ部位に挿入することにより、Ｍ２ｅを２個連結し、Ｆ膜アンカー領域と膜内領域の蛋白質との融合蛋白質を組込んだベクタープラスミドを構築した（図１４Ａ）。ｈＰＩＶ２／ΔＦは、ＮＰ遺伝子上流域にＮｏｔＩ制限サイトが導入されており、当該領域に外来遺伝子を挿入し、単独に外来遺伝子を発現させることができる。【００９３】
常法によりＦ発現細胞で当該ベクターの回収を行った。培養上清より回収した試料をＦ発現Ｖｅｒｏ細胞(１ｘ１０６個細胞)に感染させた。感染８日後に細胞を回収し、抗Ｍ２抗体を用いてウエスタンブロットを行った。【００９４】
その結果、図１４Ｂに示すように感染細胞において抗Ｍ２抗体に対する陽性反応が見いだされた。これは、目的遺伝子を保持するベクターが回収されたことを意味する。前述の作製ベクターと当該ベクターを組み合わせることにより、さらに多くの抗原を導入できる不活化ベクターの作製が可能となる。同様の方法でＲＳＶウイルスのＦ膜蛋白質の膜外領域ペプチドあるいは改変Ｆ膜蛋白質の膜外領域ペプチドを導入したｈＰＩＶ２／ΔＦの構築を行っている。【００９５】
上記と同様の方法で、外来遺伝子挿入部位を、Ｎ遺伝子前部以外にＮＰ−Ｐ間、Ｐ−Ｍ間、Ｍ−ＨＮ間、ＨＮ−Ｌ間としたベクタープラスミドを構築する。さらに、導入遺伝子として、ＲＳＶのＦ蛋白質、ＲＳＶの改変Ｆ蛋白質遺伝子を使用したベクタープラスミドを構築する。【００９６】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、疾患の予防または治療用のワクチンとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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