(57)【要約】本発明は、ＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、浸潤能を有する癌の検出用又は診断用試薬。
【請求項２】
前記抗体又はその断片がモノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）の細胞外領域に結合するものである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記細胞外領域が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
癌が、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌、胃癌、膵癌、脳腫瘍、舌癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、賢癌、肝癌、前立腺癌、頸癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からたる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
癌が、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌及び皮膚癌からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の試薬。
【請求項６】
癌が、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選ばれる少なくとも１種類である、請求項１に記載の試薬。
【請求項７】
癌が乳癌又は大腸癌である、請求項１に記載の試薬。
【請求項８】
モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む、癌の検出方法。
【請求項９】
モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１０】
癌が浸潤能を有する癌である請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１２】
モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
【請求項１３】
癌が浸潤能を有する癌である請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＴ５（ＳＬＣ１６Ａ４）を指標として浸潤能の高い癌細胞を検出する方法、及び当該癌細胞の検出用又は診断用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界において、死因の上位を占める疾患は、癌である。特に乳癌は、英国、米国および日本において、最も一般的にみられる女性の癌である。現在国内の乳癌罹患者数は４万人を超えており、その数は未だに増加傾向にある。近年、マンモグラフィーまたは他の画像診断法を用いた医療機器の進歩により、乳癌の早期診断が可能になり、乳癌の治癒率は徐々に上昇していくことが見込まれている。【０００３】
早期診断により、乳癌の初期ステージで外科的摘出や放射線治療を受けたにもかかわらず、再発または転移に至る患者は少なくない。実際、初発乳癌の切除手術後の５年生存率が９０％以上であるにも関わらず、乳癌罹患者の約４０％は死に至ることが報告されている（非特許文献１：Ｗｅｉｇｅｌｔ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５，５，５９１−６０２）。また、生存率が２０年を越え寛解したと判断される患者は、全体で２〜３％に過ぎないことも報告されている。すなわち、乳癌の早期診断とは別に、再発または転移を評価できる新しい診断法の開発が望まれている。【０００４】
乳癌の中には、再発または転移しないケースも存在するが、あらかじめ予測することが難しいため、再発または転移のリスクを抑える目的で、多くの患者に治療薬の投与が行われている。このことは、再発または転移をしない患者にとっては副作用のある不要な治療を受けていることになる。
この一方で、乳癌手術においては、術後の生活の質（クオリティ・オブ・ライフ、ＱＯＬ）を高めることを目的として、温存治療が行われている。２００１年の時点でも、全体の４０％以上の患者で実施されているが、温存療法を実施した患者の中には再発または転移のリスクが高い患者も含まれている。【０００５】
癌の「再発」とは、原発巣を手術で摘出した後に、取りきれなかった目に見えない小さな癌が残されて再び腫瘍を形成する場合や、薬物療法（抗癌剤治療）や放射線治療でいったん縮小した癌が再び大きくなる場合を言い、最初に発生した癌のすぐそばで起きることを「再発」を言う。一方、「転移」は、癌細胞が原発巣とは異なる臓器に達し、同一種類の癌を二次的に生じさせることを言う。例えば、乳癌が乳房で再び腫瘍を形成した場合は「再発」であり、肺に転移した二次癌は悪性の乳癌細胞によって形成された乳癌肺「転移」である。
「再発」または「転移」が起きるメカニズムとしては、浸潤能の高い癌細胞が原発巣と同じ組織内の別の部位へ、又は癌周辺組織へ局所的に浸潤し、手術等によって取り残されることが大きな原因と考えられる。【０００６】
癌部を外科的に除去した後でも、癌細胞が再発または転移する場合には、癌細胞が有する性質が重要である。癌細胞の性質の悪さや進行の程度を表す指標としては、異型度と深達度が用いられている。異型度は癌細胞が正常な細胞と形態的にどの程度異なっているかを表したものである。一方、深達度は、癌の深さを示しており、癌細胞の浸潤能が高い場合は深達度が深まり、より悪性度の高い癌細胞として分類され、悪性腫瘍の病期分類に用いられている。よって、浸潤能の高い癌細胞は悪性度が高く、再発または転移リスクの高い癌と考えられている。【０００７】
すなわち、高い浸潤能を有する癌細胞は、再発や転移のリスクが上昇する。よって、癌細胞の浸潤能の高さを評価出来れば、癌細胞の悪性度を決定することが可能になり、手術後の最適な予後の治療方針を選択でき、癌の再発または転移の症例を減少させることで、死亡率を低下させることが期待できる。【０００８】
癌診断においては、身体検診、尿検査、血液生化学検査、血球算定、胸部Ｘ線、乳房Ｘ線検査（マンモグラフィー）や便潜血検査によって癌が疑われる場合、しこりのある組織の一部を採取した生検サンプルを用いた組織学的検査及び免疫組織化学検査が行われ、染色像について形態的な診断が行われる。一般的には、得られた組織から薄切切片を作製し、固定した後にヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）が行われる。
組織の所見においては、組織を構成する基底細胞の消失等が、癌であると判断するための重要な要素になっているが、基底細胞は良性病変でも変化することがあり、ＨＥ染色のみによる判断は困難なことが多く、異型病変における基底細胞の判定は免疫組織化学染色が主体として行われている。免疫組織化学染色において、乳癌では上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｅｒｂＢ２）、大腸癌では上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を検出することにより、癌を評価する方法が利用されている（特許文献１：２００６−５１９３７６号公報）。【０００９】
しかしながら、免疫組織化学染色による発現頻度は、大腸癌でＥＧＦＲを検出した場合、２５〜７７％であり、報告者によって幅がみられる（非特許文献２：モダンメディア５５巻７号２００９年）。また、乳癌においては、Ｈｅｒ２を検出した場合１５〜２５％であり、陽性を示す患者の割合が限られている（非特許文献３：Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２，９，ｐ．７５−８５）。また、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２ともに、正常な組織でも染色の方法によっては染色される場合があり、陽性判定は厳密に標準化された方法が必要となる。【００１０】
また近年、腫瘍組織を構成する癌細胞は均一な集団ではなく、複数の種類の癌細胞が存在すると指摘され、腫瘍内ヘテロ不均一性（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）と呼ばれている（非特許文献４：Ｃｅｌｌ，２０１２，１４９，ｐ．９９４−１００７）。これら複数種類の癌細胞が存在することが、抗癌剤によって一旦縮小した腫瘍が再び増大し、従来よりも抗癌剤耐性でかつ悪性度の高い（すなわち浸潤能が高く転移と再発を繰り返しやすい）腫瘍を形成する原因であると考えられている。さらに、複数種類の細胞の中には、腫瘍組織内に自己複製能や多分化能を有する正常組織幹細胞に酷似した癌細胞（がん幹細胞：ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓあるいはｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓと呼ばれる）が存在しており、これらの細胞が再発や転移を繰り返す癌細胞の元になっていると考えられている。【００１１】
上記のような細胞の同定は、現在、複数のマーカー分子を用いた実験方法が報告されている。乳癌であれば、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２４陰性、分化系譜マーカー（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ３１、Ｄ６４、ＣＤ１４０ｂ）陰性である細胞集団が腫瘍形成の頻度が高いと報告されている（非特許文献５：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，ｐ．３９８３−８）。大腸癌の場合は、ＥｐＣＡＭ陽性、ＣＤ４４あるいはＣＤ１６６陽性の細胞が、腫瘍形成能が高いと報告されている（非特許文献６：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４，ｐ．１０１５８−６３）。これらのように、従来は複数のマーカーを用いた場合に悪性度の高い癌細胞を検出していたため、簡便に悪性度の腫瘍を同定することが出来ないという問題があった。
このような状況から、癌患者において悪性度の高い癌組織を検出でき、手術後の再発または転移のリスクを予測できるような新たな標的分子の開発と、新たな標的分子を検出するためのモノクローナル抗体の開発が求められている。【００１２】
一般的に、特定の細胞を特異的に検出するには、その細胞に特異的に発現する分子と抗体やアプタマーを用いる手法が取られる。そこで、本発明者らは、癌細胞において発現が亢進している遺伝子を絞り込み、癌細胞を特異的に検出するためのマーカー分子として、Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ５（ＭＣＴ５）あるいはＳｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １６  ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＳＬＣ１６Ａ４）と呼ばれる分子に着目した。【００１３】
ＭＣＴ５は、４８７アミノ酸からなる膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［ＲｅｆＳｅｑ］ＩＤ：ＮＭ＿００４６９６．２、ＮＰ＿００４６８７．１として登録されている（配列番号１：塩基配列、配列番号２：アミノ酸配列）。しかし、ヒトＭＣＴ５の機能はほとんど解明されておらず、ウサギＭＣＴ５が、角膜上で乳酸の輸送に関与している事が報告されているだけである（非特許文献７：ＪＰｈａｒｍＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１３，６５ｐ３２８−３６）。【００１４】
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2016052756.tif 000003
【００１５】
ＭＣＴファミリーに関しては過去に命名法が変更されており、ＭＣＴ４がＳＬＣ１６Ａ４と記載されている場合や、ＭＣＴ５がＭＣＴ４と記載されている場合がある。ＭＣＴ５とＭＣＴ４のｉｄｅｎｔｉｔｙは１５．５％、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙは５５．５％と相同性は低く、機能が異なる分子であると考えられる（図１）。以降では非特許文献８（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９９，３４３ｐ２８１−２９９）に記載された統一された表記を用いる。【００１６】
ＭＣＴファミリーに分類される分子の中で、癌細胞の浸潤に関わる分子として、ＭＣＴ１（ＳＬＣ１６Ａ１）とＭＣＴ４（ＳＬＣ１６Ａ３）が報告されている。ＭＣＴ１とＭＣＴ４は乳酸を輸送する分子であり、特にＭＣＴ４は乳癌においてＣＤ１４７と相互作用し、細胞外分解酵素であるｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅの合成を活性化することが報告されている（非特許文献９：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｙ  １；６７（９）：４１８２−９．）。また、非特許文献１０（Ｉｚｕｍｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２０１１，１０２，１００７−１０１３）には、ヒト肺癌においては、ＭＣＴ１とＭＣＴ４は浸潤性に関与しているが、ＭＣＴ５は関与していないと報告されている。
ＭＣＴ５が癌において発現することは、膵臓癌（非特許文献１１：Ｎａｔｕｒｅ２０１２，４９１ｐ３９９−４０５）あるいは頭部と頸部の扁平上皮癌（非特許文献１２：Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１４  Ｍａｒ；５０（３）：２００−７）で報告されているが、癌とＭＴＣ５との生理機能的な関わり合いは明らかにされておらず、浸潤に関与することは報告されていなかった。よって、ＭＣＴ５を検出する抗体が浸潤のマーカーとして利用できることも明らかにされていなかった。【００１７】
ＭＣＴ５に対する抗体としては、ＨＰＡ０４６９８６（ＡＴＬＡＳ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ）やＬＳ−Ｃ２５６４７（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等が公知である。これらの抗体は、アミノ酸の一次構造から予測される立体構造から、ＭＣＴ５の第４番目の細胞内ドメインに含まれる領域（ＩＣＤ４：配列番号７）に含まれる配列を抗原として作製されたものである。また、ｓｃ−１４９３２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）は、ＭＣＴ５のＮ末端領域を抗原として作製されたものであり、ｓｃ−１４９３４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）はＣ末端領域を抗原として作製された抗体である。いずれの抗体もウサギやヤギに精製ポリペプチドを用いて免疫し、その後アフィニティー精製して取得された抗体であり、モノクローナル抗体は報告されていない。【００１８】
抗体を目的タンパク質の検出や疾患の診断ツールとして利用するには、継続的かつ均質な生産と供給が重要であるため、モノクローナル抗体であることが望まれる。一般的に、ＭＣＴ５のような膜タンパク質、特に複数回膜タンパク質に対する抗体を作製することは困難な場合が多い。これは抗原として膜タンパク質を精製しようとしても可溶化し難いことや、部分タンパク質で免疫しても抗原の立体構造を認識しない抗体しか得られない場合が多いためである。また、免疫した動物の末梢血等からポリクローナル抗体を得られたとしても、抗体産生細胞を単離し、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を樹立できる確率は非常に少ないことが現状である。【００１９】
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【００２０】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】２００６−５１９３７６号公報
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｗｅｉｇｅｌｔ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５，５，５９１−６０２
【非特許文献２】モダンメディア５５巻７号２００９年
【非特許文献３】Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２，９，ｐ．７５−８５
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，２０１２，１４９，ｐ．９９４−１００７
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，ｐ．３９８３−８
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４，ｐ．１０１５８−６３
【非特許文献７】ＪＰｈａｒｍＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１３，６５ｐ３２８−３６
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９９，３４３ｐ２８１−２９９）
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｙ  １；６７（９）：４１８２−９．
【非特許文献１０】Ｉｚｕｍｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２０１１，１０２，１００７−１０１３
【非特許文献１１】Ｎａｔｕｒｅ２０１２，４９１ｐ３９９−４０５
【非特許文献１２】Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１４  Ｍａｒ；５０（３）：２００−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、悪性度の高い癌、特に浸潤能の高い癌で発現が亢進する標的分子の同定、及び当該標的分子を高感度に検出できるモノクローナル抗体の取得、及び当該抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬を提供することにある。【００２４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＭＣＴ５が癌細胞の浸潤増加に関与すること、及びＭＣＴ５の細胞外領域と結合する抗体を用いることにより、浸潤能の高い癌部位を検出出来ることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００２５】
（１）モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、浸潤能を有する癌の検出用又は診断用試薬。
（２）前記抗体又はその断片がモノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）の細胞外領域に結合するものである、（１）に記載の試薬。
（３）前記細胞外領域が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むものである、（１）に記載の試薬。
（４）癌が、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌、胃癌、膵癌、脳腫瘍、舌癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、頸癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも１種である、（１）に記載の試薬。
（５）癌が、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌及び皮膚癌からなる群から選ばれる少なくとも１種である、（１）に記載の試薬。
（６）癌が、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選ばれる少なくとも１種類である、（１）に記載の試薬。
（７）癌が乳癌又は大腸癌である、（１）に記載の試薬。
（８）モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む、癌の検出方法。
（９）モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む、癌の診断方法。
（１０）癌が浸潤能を有する癌である（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片。
（１２）モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
（１３）癌が浸潤能を有する癌である（１２）に記載のキット。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ＭＣＴ５を有意に高く発現する癌細胞を、様々な手段により高い感度で検出することができる。癌の診断において、ＭＣＴ５の発現を指標に、生検試料や手術で切除した試料、又は血液中を循環する細胞を解析することで、癌細胞の浸潤能を評価することが出来る。癌細胞の浸潤能の高さは、癌の転移や再発リスク増加につながるため、浸潤能を評価することが出来るということはすなわち、転移や再発性を評価することが出来る。
特に、乳癌手術においては、転移性の高さが乳房の温存範囲を決定する大きな要因になるため、転移性の高さを評価できれば患者のＱＯＬを大幅に向上させることが出来る。また、転移性の高さを評価できることは術後の治療方針の決定に大きく影響を及ぼす。転移や再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、癌による死亡率を低下させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒトＭＣＴ４とヒトＭＣＴ５の全長アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図２】ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−１４の細胞あたりのＭＣＴ５の発現量を比較した図である。
【図３】ＭＣＦ７細胞にＭＣＴ５遺伝子を一過性に導入し、ｍＲＮＡ量を解析した図である。ＭＣＦ７−Ｍｏｃｋは、ＭＣＴ５を含まないベクターを導入し、２４時間後の細胞におけるＭＣＴ５のｍＲＮＡ量を測定した結果であり、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５はＭＣＴ５を含むベクターを一過性導入させた後、２４，４８，７２，９６時間後のＭＣＴ５のｍＲＮＡ量を測定した結果である。
【図４】ＭＣＦ７にＭＣＴ５遺伝子を一過性に発現させ、マトリゲルを透過性する細胞を解析した結果を示す図である。
【図５】ＭＣＦ７にＭＣＴ５遺伝子を安定に発現させ、ｍＲＮＡ量を解析した図である。
【図６】ＭＣＴ５を安定に発現する細胞のマトリゲル透過性を解析した結果である。
【図７】ＭＣＴ５の全長アミノ酸配列と、抗原に用いたＭＣＴ５−ＩＣＤ４とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を示す図である。
【図８】ＭＣＴ５−ＩＣＤ４を抗原としてモノクローナル抗体を取得した際に得られた２種類のクローンの上清に含まれる抗体の活性を、ＥＬＩＳＡを用いて解析した図である。
【図９】クローン番号ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の濃度を変化させてＭＣＴ５−ＩＣＤ４あるいはＴａｇ配列のみを持つタンパク質（Ｔｒｘ，Ｓ，Ｈｉｓ−Ｔａｇ）と反応させた結果を示す図である。
【図１０】ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２に対しＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫細胞染色を行った結果を示す図である。
【図１１】ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２に対しＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図１２】３症例の正常乳腺組織及び、３症例の乳癌組織に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果を示す図である。
【図１３】１０種類の正常乳腺組織及び、進行ステージの異なる１００症例の乳癌組織に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果の一部を示したものである。
【図１４】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「３＋」、「２＋」、「１＋」、「０」と示した。
【図１５】１００症例の乳癌組織の中で、エストロゲンレセプター陰性、プロゲステロンレセプター陰性、Ｈｅｒ２陰性（トリプルネガティブ）であった組織の中で、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果の一部を示したものである。
【図１６】２症例の大腸癌及び３症例の大腸正常組織に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果を示す図である。
【図１７】３症例の肺癌及び３症例の肺正常組織に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果を示す図である。
【図１８】卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌及び皮膚癌に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いて免疫組織染色を行った結果を示す図である。
【図１９】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ精製し、フローサイトメーターでＨＣＴ１１６細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
【図２０】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体及びａｂ１８０６９９、ＨＰＡ０４６９８６、ｓｃ−１４９３２の４種類の抗体を用い、フローサイトメーターでＨＣＴ１１６細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
【図２１】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体及びａｂ１８０６９９、ＨＰＡ０４６９８６の３種類の抗体を用い、ＨＣＴ１１６細胞との反応性を免疫細胞染色で解析した結果を示す図である。
【図２２】ＭＣＴ５の全長アミノ酸配列（配列番号２）と、抗原に用いたＭＣＴ５−ＩＣＤ４（配列番号７）、ＩＣＤ４＿１９６−２５８（配列番号８）、ＩＣＤ４＿２２７−２９９（配列番号９）とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を示す図である。
【図２３】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体がＩＣＤ４（配列番号７）に結合する反応を、ＩＣＤ４及びＩＣＤ４の部分タンパク質であるＩＣＤ４＿１９６−２５８（配列番号８）、ＩＣＤ４＿２２７−２９９（配列番号９）により競争阻害されるかを、ＥＬＩＳＡを用いて解析した結果を示す図である。
【図２４】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が癌細胞に結合する反応を、ＩＣＤ４及びＩＣＤ４の部分タンパク質であるＩＣＤ４＿１９６−２５８（配列番号８）、ＩＣＤ４＿２２７−２９９（配列番号９）により競争阻害されるかを、フローサイトメーターを用いて解析した結果を示す図である。
【図２５】ＭＣＴ５の全長アミノ酸配列と、抗原に用いたＭＣＴ５−ＩＣＤ４（配列番号７）、ＩＣＤ４＿１９６−２５８（配列番号８）、ＩＣＤ４＿２２７−２９９（配列番号９）、ＩＣＤ４＿２２７−２４２（配列番号１０）、ＩＣＤ４＿２３５−２５０（配列番号１１）、ＩＣＤ４＿２４２−２５８（配列番号１２）とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を示す図である。
【図２６】ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体がＩＣＤ４（配列番号７）に結合する反応を、ＩＣＤ４及びＩＣＤ４の部分ペプチドであるＩＣＤ４＿２２７−２４２（配列番号１０）、ＩＣＤ４＿２３５−２５０（配列番号１１）、ＩＣＤ４＿２４２−２５８（配列番号１２）により競争阻害されるかを、ＥＬＩＳＡを用いて解析した結果を示す図である。
【図２７】市販抗体であるＨＰＡ０４６９８６を作製する際に利用されている抗原ＩＣＤ４−１９５−２５０（配列番号１５）並びにＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を作製する際に利用した抗原ＩＣＤ４（配列番号７）、及びＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体のエピトープを含むアミノ酸配列ＩＣＤ４＿２５１−２５８（配列番号１３）のアミノ酸配列上で一致する位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００２９】
１．概要
本発明は、モノカルボキシレートトランスポーター５（ＭＣＴ５）あるいはＳｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒｆａｍｉｌｙ  １６  ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＳＬＣ１６Ａ４）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、浸潤性の高い癌細胞の検出又は診断用試薬に関する。
本発明者は、膜貫通型タンパク質であるＭＣＴ５に着目し、鋭意検討を行った結果、ＭＣＴ５が癌細胞の浸潤能に関係していることを見出し、ＭＣＴ５を検出することで癌の浸潤性の高さを評価できること、すなわち癌組織の中で転移、再発しやすい癌細胞の存在を検出できることを明らかにした。また、特に乳癌及び大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌において癌組織の一部で発現が亢進していることを見出した。
従って、本発明は、ＭＣＴ５を含む癌のマーカーを提供する。
【００３０】
また、本発明者は、従来知られている抗体と比較して、極めて高感度かつ高精度に癌を検出することができるＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体の作製に成功した。本発明の抗体は、癌の病期の初期段階においても浸潤能の高い癌を高感度に検出でき、またＭＣＴ５の細胞外領域に結合することができるため、生きた癌細胞を検出することができる。これにより、例えば、血液試料中に存在する癌細胞を検出することも可能である。すなわち、本発明の抗体を用いることにより、従来の方法では検出することができなかった浸潤能の高い癌を、簡便、高感度かつ高精度に検出することができるため、本発明の抗体は悪性度の高い癌細胞の検出又は診断に極めて有用である。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
【００３１】
２．ＭＣＴ５に対する抗体（抗ＭＣＴ５抗体）
（１）抗原の調製
本発明におけるＭＣＴ５は、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
本発明において、ヒト、マウス及びラットのＭＣＴ５のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４及び６で示される。また、ヒト、マウス及びラットのＭＣＴ５をコードするＤＮＡの塩基配列（ヌクレオチド配列）は、それぞれ、配列番号１、３、及び５で示される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）により登録されている。
【００３２】
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【００３３】
2016052756.tif 000007
【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
抗原としては、ＭＣＴ５のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができ、好ましくは、ＭＣＴ５の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むペプチドを使用することができる。
ＭＣＴ５の細胞外領域の予測は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて、Ｏ１５３７４（ＭＯＴ５＿ＨＵＭＡＮ）として登録されている。データベース上では、例えばヒトＭＣＴ５の場合、配列番号２で示されるアミノ酸のうちの第１９６番目〜第２９９番目からなる領域（配列番号７）は、細胞内領域として予測されている（図７）。他の動物由来のＭＣＴ５については、これらの領域に相当する領域である。
【００３９】
抗原として用いるペプチドとしては、ＭＣＴ５の少なくとも一部であればよく限定はされないが、ＭＣＴ５の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号２で示されるＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域（配列番号７）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第２２７番目〜第２５８番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１４）の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第２５１番目〜第２５８番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１３）の少なくとも一部である。本発明においては、配列番号２で示されるＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域を「ＩＣＤ４」とも称する。
【００４０】
また、ＭＣＴ５には、同じｍＲＮＡに由来する翻訳開始点の異なる変異体が存在する。例えば、ヒトＭＣＴ５の場合、第７４番目から第１２１番目までのアミノ酸が欠如たペプチド（配列番号４４）や、Ｎ末端から第６２番目までのアミノ酸が欠如し、第６３番目から第７３番目のアミノ酸が野生型（配列番号２）とは異なるペプチド（配列番号４５）、Ｎ末端から第１１０番目までのアミノ酸が欠如し、第１１１番目から第１２０番目のアミノ酸（配列番号４６）、及び第４４６番目からＣ末端のアミノ酸が野生型（配列番号２）とは異なるペプチド（配列番号４７）、第１７９番目から第３４６番目のアミノ酸が欠如し、第１７７番目のアミノ酸が野生型のアラニンからロイシンに置き換わったペプチドなどが存在する。
本発明におけるＭＣＴ５には、これらの変異体も含まれる。
【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
ＭＣＴ５は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のＭＣＴ５でもよいし、遺伝子工学的に生産されたＭＣＴ５でもよい。例えば、ＭＣＴ５が認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりＭＣＴ５を得ることができる。
また、抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
【００４４】
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ＭＣＴ５遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
【００４５】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４６】
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
【００４７】
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
上記のようにして得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
【００４８】
また、本発明において、抗原としては、（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのほか、（ｂ）配列番号１２又は１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、が挙げられる。
本発明において、「配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」には、配列番号１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
【００４９】
また、「配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
（ｉ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１２又は１４で示されるアミノ酸配列中の１〜５個（例えば、１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列に１〜２個（例えば、１〜２個、好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００５０】
また、本発明におけるＭＣＴ５には、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列のほか、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列に対して、約７０％以上、７５％以上、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むもの（配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等の相同性検索を利用できる。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うこともできる。
【００５１】
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００５２】
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、ＭＣＴ５若しくはその部分断片又はこれらの変異型のペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列を含むものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又はその部分配列を含む遺伝子を使用することも可能である。
【００５３】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５４】
また、本発明に用いられるＭＣＴ５をコードする遺伝子には、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列に対して６０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有する遺伝子を挙げることができる。
上記ＭＣＴ５をコードする遺伝子又はその変異体は、例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどに記載された塩基配列に基づいて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））などに記載されている公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることができる。
【００５５】
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したＭＣＴ５又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは１μｇ〜１０ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１〜２週間間隔で、２〜２０回、好ましくは５〜１５回免疫を行う。
【００５６】
免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。３〜４回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、ＭＣＴ５以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、ＭＣＴ５に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
【００５７】
（３）モノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、ＭＣＴ５又は部分ペプチド（例えばＩＣＤ４（配列番号７）又はＩＣＤ４＿２５１−２５８（配列番号１３））をそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から１〜３０日後、好ましくは２〜５日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
【００５８】
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
【００５９】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０８〜５×１０８個の抗体産生細胞と２×１０７〜１０×１０７個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比１０：１〜１：１）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００６０】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば１０〜２０％のウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上０．３個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００６１】
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、９６ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に３７℃で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを３７℃で１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。
【００６２】
上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、ＭＣＴ５に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）としては、例えば、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＭＩ４Ｃ４ａ」（以下「ＩＭＩ４Ｃ４ａ」という）、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」（以下「ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」という）が挙げられる。ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
【００６３】
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内にハイブリドーマを約５×１０６〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００６４】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２６、２７及び２８で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましい。また別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの（配列番号１６に示す塩基配列によりコードされる）、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの（配列番号２４に示す塩基配列によりコードされる）が好ましい。
【００６５】
Ｈ鎖のＶ領域配列
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【００６６】
2016052756.tif 000018
【００６７】
Ｈ鎖のＣＤＲ領域
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【００６８】
Ｈ鎖のＣＤＲ領域
2016052756.tif 000020
【００６９】
Ｌ鎖のＶ領域配列
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2016052756.tif 000022
【００７０】
2016052756.tif 000023
【００７１】
Ｌ鎖のＣＤＲ領域
2016052756.tif 000024
【００７２】
（ｖ）抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ
本発明の抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるＭＣＴ５の少なくとも一部であればよく限定はされないが、ＭＣＴ５の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号２で示されるＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域（配列番号７）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第２２７番目〜第２５８番目のアミノ酸からなる領域の（配列番号１４）少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第２５１番目〜第２５８番目のアミノ酸（配列番号１３）からなる領域の少なくとも一部である。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗ＭＣＴ５抗体は、例えば、生体試料中のＭＣＴ５の検出感度が高く、後述する癌の検出及び診断の用途に極めて有用なものである。
【００７３】
また、上述した通り、ＭＣＴ５には４種類の欠損変異体が存在する。具体的には、ヒトＭＣＴ５の場合、第７４番目から第１２１番目までのアミノ酸が欠如たペプチド（配列番号４４）や、Ｎ末端から第６２番目までのアミノ酸が欠如し、第６３番目から第７３番目のアミノ酸が野生型（配列番号２）とは異なるペプチド（配列番号４５）、Ｎ末端から第１１０番目までのアミノ酸が欠如し、第１１１番目から第１２０番目のアミノ酸（配列番号４６）、及び第４４６番目からＣ末端のアミノ酸が野生型（配列番号２）とは異なるペプチド（配列番号４７、第１７９番目から第３４６番目のアミノ酸が欠如し、第１７７番目のアミノ酸が野生型のアラニンからロイシンに置き換わったペプチドなどが存在する。
【００７４】
これらのペプチドの中で第１７９番目から第３４６番目のアミノ酸が欠如し、第１７７番目のアミノ酸が野生型のアラニンからロイシンに置き換わったペプチドを除いた３種類は、配列番号２で示されるＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域において、野生型ＭＣＴ５と共通する。従って、本発明の抗体はこれらの欠損変異体も検出することができる。
また、本発明の抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ（抗原決定基）には、他の動物由来のＭＣＴ５における上記領域に相当する領域の少なくとも一部が含まれる。
本発明のＭＣＴ５に対する抗体には、当該抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
【００７５】
（４）遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
【００７６】
ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域が、例えば配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
【００７７】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特許第２８２８３４０号公報等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗ＭＣＴ５抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲのアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、例えば、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列が好ましく、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号２６、２７及び２８で示されるアミノ酸配列が好ましい。
【００７８】
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（Ｖ領域）の抗原結合部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
【００７９】
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
【００８０】
（５）抗体断片の作製
本発明で使用されるＭＣＴ５に対する抗体の断片は、ＭＣＴ５に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
【００８１】
ｓｃＦｖの場合は、抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
【００８２】
ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
本発明において、重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１６で示される塩基配列を含むもの又は当該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２４で示される塩基配列を含むもの又は当該塩基配列からなるものが挙げられる。
【００８３】
また、本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号２６、２７及び２８で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。さらに、ＶＨとして配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬとして配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。
【００８４】
ＣＤＲを含む抗体断片（ペプチド）は、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含む抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００８５】
ＶＨのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号２１、２２及び２３で示される塩基配列が好ましく、ＶＬのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号２９、３０及び３１で示される塩基配列が好ましい。
【００８６】
2016052756.tif 000025
【００８７】
2016052756.tif 000026
【００８８】
（６）結合親和性
結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍又は１０００〜１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、ＭＣＴ５の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
【００８９】
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１〜１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。
【００９０】
３．癌の検出用又は診断用試薬（癌の検出剤又は診断剤）
本発明の癌の検出用又は診断用試薬は、上記「２．ＭＣＴ５に対する抗体（抗ＭＣＴ５抗体）」に記載した抗体又はその断片を含有するものである。本発明の抗体は、癌に発現しているＭＣＴ５に対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の試薬は癌の検出又は診断のために使用することができる。
【００９１】
本発明における検出又は診断の対象となる癌としては、例えば乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌、胃癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、舌癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、浸潤能を有する癌である。好ましくは、正常細胞又は組織と比較してＭＣＴ５が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌などが挙げられ、好ましくは乳癌、大腸癌、肺癌である。「浸潤能を有する」とは、腫瘍の中でも活発に増殖し、かつ周辺の組織や臓器に広がるがん細胞の性質を意味する。周辺の組織や臓器に広がるためには、組織や臓器の間隔に存在する細胞外マトリックス（基底膜）を分解して移動する必要があり、このような性質を有する癌細胞の場合は浸潤能を有する癌であるといえる。この性質は、例えば細胞外マトリックスを模倣したマトリゲルを通過する能力として評価することができ、マトリゲルインベージョンチャンバー等を用いた測定方法により容易に解析することが可能である。
【００９２】
本発明の試薬は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
【００９３】
また別の態様において、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬の製造のためのＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。また、本発明は、癌の検出又は診断において使用するためのＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬として使用するためのＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。ＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片の説明については上記「２．ＭＣＴ５に対する抗体（抗ＭＣＴ５抗体）」に記載した通りである。
【００９４】
４．癌の検出又は診断方法
本発明の癌の検出又は診断方法は、上記「２．ＭＣＴ５に対する抗体（抗ＭＣＴ５抗体）」に記載した抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料（以下、単に「生体試料」ともいう）とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む方法である。この場合、ＭＣＴ５の検出結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
【００９５】
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
【００９６】
糞便を試料とする場合、特開２００５−４６０６５号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便から癌細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を１０μｍ以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社）を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法など当業者が通常用いる細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
【００９７】
大腸癌や乳癌をはじめとする様々な癌において、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはいまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだ癌であっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、癌が進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのＭＣＴ５を発現する微量な細胞を検出および／または測定することができる。
「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば大腸癌、胃癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含まれる。
【００９８】
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウェルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
本発明において、ＭＣＴ５の検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法などを利用できる。
【００９９】
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び／又は評価し、その検出、測定又は評価結果と癌の可能性等とを関連づけることができる。
本発明においては、ＭＣＴ５の検出、発現量の測定又は評価結果に基づいて、被験者が癌に罹患している可能性の有無を診断することができる。
【０１００】
本発明の検出又は診断方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収した癌細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウェルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウェルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
【０１０１】
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、癌に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
【０１０２】
本発明において、ＭＣＴ５の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、免疫組織染色における染色度合（ＭＣＴ５の検出結果）を、強陽性（Ｓｔｒｏｎｇ）、陽性（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、弱陽性（Ｗｅａｋ）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）などに分類し、染色度合と癌の可能性とを関連付けることにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
また、ＭＣＴ５の細胞外領域は、血液中に放出される場合が想定されるため、血液試料中のＭＣＴ５の発現量を測定することにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することも可能である。この場合、ＭＣＴ５の発現量の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するためには、生体試料中のＭＣＴ５の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）を定めることが望ましい。
【０１０３】
ＭＣＴ５の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、癌患者由来の生体試料におけるＭＣＴ５の発現量を測定する。このとき対象となる患者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。また、２例以上の健常者由来の生体試料におけるＭＣＴ５の発現量も測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方を含む全体から、ＭＣＴ５の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔｔｉｎｇ法を用いて、標準曲線を作成する。ＭＣＴ５を含まないサンプルのシグナル値を基準として、その数値の２倍をｃｕｔ−ｏｆｆ値と定めること等ができる。統計解析を行うための症例は、癌の種類（例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、白血病等）、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さらに、統計処理は、健常者のＭＣＴ５の発現量の測定値と、癌患者において癌の種類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときのＭＣＴ５の発現量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
【０１０４】
本発明において、血液試料中のＭＣＴ５（細胞外領域）の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）は、血清中濃度で、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌであるが、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０５】
上記条件下でＭＣＴ５の発現量を測定した場合において、測定したＭＣＴ５の発現量が上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であるときに、癌が検出されたと判定でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断することができる。本発明においては、前記判定又は診断のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であって、かつ所定上限値以下（例えば、２００ｎｇ／ｍｌ以下、１９０ｎｇ／ｍｌ以下、１８０ｎｇ／ｍｌ以下、１７０ｎｇ／ｍｌ以下、１６０ｎｇ／ｍｌ以下、１５０ｎｇ／ｍｌ以下、１４５ｎｇ／ｍｌ以下、１４０ｎｇ／ｍｌ以下、１３５ｎｇ／ｍｌ以下、１３０ｎｇ／ｍｌ以下）であるときに、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
【０１０６】
本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ（確率）は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９９％以上である。
さらに、本発明の別の態様において、一人の被験者（患者）のサンプルから測定されたＭＣＴ５の発現量を上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値と比較することで癌との関連性を検出又は診断するほかに、複数の患者由来の生体試料を用いてＭＣＴ５の発現量を測定する場合がある。従って、上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団（１次母集団）においてＭＣＴ５の発現量を測定して統計解析処理し、これらの集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能である。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他の集団（２次母集団）における検出又は診断の対象となる個々の被験者由来の試料におけるＭＣＴ５の発現量とを比較することができる。
【０１０７】
あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んでＭＣＴ５の発現量を再度データ処理し、対象となる患者（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ＭＣＴ５の発現量の臨界値の精度を高め、これにより１人又は複数人の被験者における検出又は診断精度を高めることができる。
本発明においては、（ｉ）被験者の生体試料におけるＭＣＴ５の発現量と、（ｉｉ）健常者の生体試料におけるＭＣＴ５の発現量との比較を行うことも可能である。
そして、前記（ｉ）の場合のＭＣＴ５の発現量が、前記（ｉｉ）の場合のＭＣＴ５の発現量と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料におけるＭＣＴ５の発現量の約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上高い場合に、癌が検出されたと判断でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断できる。
【０１０８】
上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
ＭＣＴ５の発現量は各種癌患者において発現するため、健康診断等においてＭＣＴ５の発現量が検出されてもどの癌であるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する（精密検査を行う）ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてＭＣＴ５が検出されたときは、癌種の主要資料（確定診断等）に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
すなわち、本発明は、ＭＣＴ５に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＭＣＴ５を検出する工程を含む、癌の検出又は診断を補助する方法も提供する。
【０１０９】
５．癌の検出用又は診断用キット
本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、癌の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素及び基質（発色性基質等）、基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
【０１１０】
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。本発明のキットを利用することにより、検診等における癌患者の高精度スクリーニング、癌の早期発見、癌の進行度の特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、癌による死亡率を低下させることができる。
抗ＭＣＴ５抗体、癌の種類、検出方法等については上記と同様である。
【実施例】
【０１１１】
実施例１．
（１）ＭＣＴ５の同定
新たな癌細胞特異的な膜タンパク質を同定し、診断や治療目的の抗体を作製する目的で、新たな膜タンパク質マーカーの同定を行った。転移性を示さないＭＣＦ７細胞から作製された転移性を示すＭＣＦ７−１４（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０，１０，ｐ．４１４）の中で、２種類のクローン（ＣＬ１５とＣＬ６）を選択し、ＤＮＡマイクロアレイにより発現プロファイル解析し、ＭＣＦ７に比べＣＬ１５及びＣＬ６細胞で２倍以上、遺伝子の発現が亢進されている膜タンパク質を１９種類絞り込んだ。この中でＣＬ１５及びＣＬ６の両方で５倍以上発現が亢進している遺伝子で、かつ細胞膜への局在が判明している遺伝子に絞り込んだところ、３種類の候補を得た。この中からＭＣＴ５に着目して解析を行った。
図１には、ＭＣＴ５とＭＣＴ４のアミノ酸配列の相同性を解析したアライメント結果を示した。ＭＣＴ５とＭＣＴ４のＩｄｅｎｔｉｔｙは１５．５％であり、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙは５５．５％と相同性は低く、機能が異なる分子であると考えられた。【０１１２】
（２）細胞
ＭＣＦ７−１４  ＣＬ６及びＣＬ１５は、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４から樹立したものを用いた。ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−１４を１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）で、その他の細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。【０１１３】
（３）ＭＣＴ５遺伝子のクローニング
ＭＣＦ７−１４  ＣＬ６を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇから、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたＣＤＮＡを鋳型とし、以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応を行なった。【０１１４】
プライマー配列
2016052756.tif 000027
【０１１５】
ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５６℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを３５サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ）を用いて、ｐＥＦ６−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。増幅断片をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれていることを確認した。以降では、この作製したベクターをｐＥＦ６−ＭＴＣ５−ｍｙｃ／ＨｉｓＡと呼ぶ。【０１１６】
（４）ＭＣＴ５発現の確認（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）
ＭＣＴ５遺伝子の発現については、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたｍＲＮＡの転写量で確認を行った。上記（２）と同様の方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、以下のｐｒｉｍｅｒとＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅された断片量をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いた方法でリアルタイムに検出を行った。内部標準として、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を同時に増幅し、補正を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃、１０秒間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、５秒間のデナチュレーション、および６０℃、４０秒間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行った。【０１１７】
2016052756.tif 000028
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ＭＣＦ７とＭＣＦ７−１４  ＣＬ６におけるＭＣＴ５遺伝子の発現量比較した結果、明確に発現が亢進していることが示された（図２）。【０１１８】
（５）ＭＣＴ５の一過性発現
上記（１）で作製したプラスミドを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュアプライドサイエンス社製）を用いてＭＣＦ７細胞へ導入した。操作は当該キットに添付された資料に基づいて行った。遺伝子導入後、２４、４８、７２、９６時間後にサンプリングを行い、上記（３）の手法で発現量を解析した。結果を図３に示した。遺伝子導入２４時間後にはＭＣＴ５のｍＲＮＡが検出され、９６時間後でも発現が維持されていることが示された。【０１１９】
（６）マトリゲル浸潤能試験
上記（５）で作製した細胞、ＭＣＦ７細胞、及びＭＣＦ７にｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞（Ｍｏｃｋ）をそれぞれ無血清培地に懸濁後、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤ社）のトランスウエル（フィルター上部：上室）に１×１０５個となるよう入れ、３７℃で３日間培養した。トランスウエルのメンブレン（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅは８μｍ）を移動した細胞（フィルター下部：下室）を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ＭｉｌｌｉＱを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。結果を図４に示す。ＭＣＴ５を導入することにより、マトリゲルを透過する細胞数が明確に増加した。このことから、ＭＣＴ５によりＭＣＦ７細胞の浸潤能が明確に増加することが示された。【０１２０】
実施例２．
（１）ＭＣＴ５安定発現株の作製
実施例１．（１）で作製したｐＥＦ６−ＭＣＴ５−ｍｙｃＨｉｓＡベクターを、制限酵素（ＰｍｅＩ）を用いて切断することで、ＭＣＴ５の終始コドンの下流を切断した。一方で、ｐＭＸｓ−ＩＧベクター（東京大学  北村俊雄教授よりライセンス購入した）を制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ）で切断し、ＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードする遺伝子配列を切り出した。この遺伝子断片をＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて平滑化し、制限酵素処理したｐＥＦ６−ＭＣＴ５−ｍｙｃＨｉｓＡベクターと連結させた。以降ではこのベクターをｐＥＦ６−ＭＣＴ５−ＩＧと呼ぶ。【０１２１】
上記２種類のベクター（ｐＥＦ６−ＭＣＴ５−ＩＧ及びｐＥＦ６−ＩＧ）を実施例１（５）記載の方法でＭＣＦ７細胞へ遺伝子導入を行い、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓが２５μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例１（２）記載の培地で培養し、薬剤に耐性を示す細胞を複数樹立した。この中から、蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰの蛍光が見られる細胞を選択した結果、ｐＥＦ６−ＳＬＣ１６Ａ４−ｍｙｃ−ＩＧベクターを導入した細胞としては、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−７の２株を、ｐＥＦ６−ＩＧベクターを導入した細胞としては、ＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ１及びＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ２、ＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ３の３株を樹立した。【０１２２】
（２）ＭＣＴ５発現の確認（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）
上記実施例１（４）に記載の方法を用いて、ＭＣＴ５の発現を解析した。その結果を図５に示した。ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−７細胞は、ＭＣＦ７やＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ１〜３に比べ、１００倍以上ＭＣＴ５のｍＲＮＡが増加していることが示された。【０１２３】
（３）マトリゲル浸潤能試験
ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−７と、ＭＣＦ７との浸潤能の変化を解析した。その結果を図６に示した。ＭＣＦ７に比べ、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−７の浸潤能が明確に亢進していることが示された。【０１２４】
実施例３．
（１）抗ＭＣＴ５抗体の作製【０１２５】
（１）細胞培養
マウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２４７）、ヒト胎児腎細胞２９３Ｔを、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）で８０％コンフルエントを越えないように３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。【０１２６】
（２）ＭＣＴ５細胞内ドメイン４（ＩＣＤ４）遺伝子のクローニング
実施例１（３）で作製したプラスミドを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＭＣＴ５のアミノ酸第１９６番目から第２９９番目をコードする塩基配列（配列番号４０）を含むＤＮＡを増幅した。ＭＣＴ５及びＩＣＤ４とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を図７に示した。【０１２７】
プライマー配列
2016052756.tif 000030
2016052756.tif 000031
【０１２８】
2016052756.tif 000032
【０１２９】
2016052756.tif 000033
【０１３０】
ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ）で切断し、ｐＥＴ３２ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＭＣＴ５の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。【０１３１】
このベクターでＥ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｓｅｔａ  ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）  トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。１ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ  酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製しＭＣＴ５の細胞内領域部分タンパク質（ＩＣＤ４）を得た。【０１３２】
（３）免疫
上記で作製したＩＣＤ４をフロイント完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１００μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約３週間後、同じくＩＣＤ４をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を７回〜１２回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてＩＣＤ４約４０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。【０１３３】
（４）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞に対し０．２５×１０８個の骨髄腫株となるように細胞を混合し、ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう再懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞を１．６×１０５個／ｍＬとなるようＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル２００μＬとなるよう９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＴ培地を１００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり２〜１２個のコロニーが形成された。【０１３４】
（５）ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、ＩＣＤ４に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。ＩＣＤ４をＰＢＳ（−）で希釈し、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウエル当たり５０ｎｇとなるよう分注して、４℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳ−Ｔと記載する）３５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔを３００μＬずつ各ウエルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をＩＣＤ４結合ＥＬＩＳＡプレートに分注し、１時間、室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍希釈したものを各ウエル１００μＬ分注し、１時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＰＯＤとなるよう調製したＯＰＤ基質を加え、室温、２０分間発色させた。１．５Ｎの硫酸で反応を停止した後、４９０ｎｍの吸収を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。【０１３５】
（６）モノクローナル抗体の取得
上記（５）で形成されたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の中から、上記（５）の方法でＩＣＤ４に反応する抗体を選別した。また、ＩＣＤ４を作製する際に付加したＴｒｘ−、Ｓ−、Ｈｉｓ−Ｔａｇに反応する抗体を除くために、ｐＥＴ３２ｂベクターのみを大腸菌に導入し、上記（２）記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をＴａｇと称する。【０１３６】
ＩＣＤ４に反応し、Ｔａｇに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、１４クローンが取得された。この中から、特に力価の高かった２種類のクローンを選択し後の実験に利用した。以降では、それぞれ「ＩＭＩ４Ｃ４ａ」及び「ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」と称する。また以下では、ハイブリドーマ細胞が産生する抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。ハイブリドーマ細胞「ＩＭＩ４Ｃ４ａ」及び「ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」が生産する抗体に関して、培養上清を用いたＥＬＩＳＡの結果を図８に示した。この２種類の抗体とも、ＩＣＤ４には反応するがＴａｇには反応しないことが示された。【０１３７】
限界希釈により単クローニングを行った後、これらのハイブリドーマ細胞を、それぞれ１０ｃｍディッシュ１０枚に９０％コンフルエントとなるよう培養し、ＨＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＥＸ  ＣＥＬＬ  Ｓｐ２／０（ニチレイバイオサイエンス社製）とを１：１で混合した培地で１０日間培養を行った。培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムを用いて精製した。培養上清１００ｍＬに対し、３．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムに対し、培養液を１〜３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。次に６ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．５））で抗体タンパク質を溶出させ、３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０〜７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳに置換した。
また、ハイブリドーマ細胞ＩＭＩ４Ｃ４ａ及びＩＭＩ４Ｃ１２ａが生産する抗体のアイソタイプを解析した。解析にはＩｓｏ  Ｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロッシュ社）を用いた。その結果、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体はサブクラスＩｇＧ１λであり、ＩＭＩ４Ｃ１２ａ抗体はサブクラスＩｇＧ１κであることが示された。【０１３８】
実施例４．抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体とＭＣＴとの反応性
（１）ＥＬＩＳＡ
実施例３．（６）で得られた２種類のハイブリドーマ細胞の中で「ＩＭＩ４Ｃ４ａ」が生産する抗体に関して、ＥＬＩＳＡによる解析を行った。実施例３（５）記載の方法を用い、抗体濃度を０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬに希釈して解析を行った結果を図９に示した。ＩＭＩ４Ｃ４ａはＴａｇには反応しないが、ＩＣＤ４に反応し、濃度依存的に結合のシグナルが上昇することが示された。【０１３９】
（２）免疫細胞染色
ＩＭＩ４Ｃ４ａと、実施例２．（１）記載の乳癌細胞（ＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ１及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２）との反応性を解析した。ＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ１及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２を８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社）でコートしたカバーガラス上へ播種した。２日間培養後、１０％中性緩衝ホルマリン（ＷＡＫＯ社）を用いて細胞を固定した。０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを含むＴＢＳＴで処理した後、上記、実施例３．（６）で精製した抗体を１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識あるいは抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で室温３０分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄ社）で封入した。図１０には、同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。
ＩＭＩ４Ｃ４ａを用いた場合に、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２にのみ強いシグナルが観察され、細胞膜及び細胞質が染色されていると考えられた。すなわち、ＩＭＩ４Ｃ４ａは細胞表面上及び細胞質内に存在するＭＣＴ５と結合することが確認された。ＭＣＴ５は１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞膜上に存在すると考えられている。このことから、細胞質にみられるシグナルはリボソームで翻訳されたＭＣＴ５がゴルジ体や輸送小胞を介して細胞膜上へ輸送される過程のＭＣＴ５分子を検出していると考えられる。【０１４０】
（３）ウエスタンブロッティング
ハイブリドーマ細胞「ＩＭＩＣ４ａ」が産生する抗体に関して、ウエスタンブロッティングによる解析を行った。実施例２．（１）で作製したＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ１及びＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２細胞を１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。細胞に２×ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加し１分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）で３０秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１４１】
泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。ハイブリドーマ細胞ＩＭＩ４Ｃ４ａが生産する抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。また、ネガティブコントロールとして、抗体を含まない培地を同様に反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＰＲ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。実験結果を図１１に示した。この結果から、ハイブリドーマ細胞ＩＭＩ４Ｃ４ａが生産する抗体は変性させたＭＣＴ５とも反応することが示された。また、ＭＣＦ７に比べ、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５−２細胞では、ＭＣＴ５のタンパク質量が亢進していることが示された。【０１４２】
実施例５．臨床組織サンプルの解析
（１）乳癌組織を用いた免疫組織染色
ＩＭＩ４Ｃ４ａと乳癌組織との反応性を解析することで、ＭＣＴ５の乳癌における発現割合を解析した。今回、ヒト癌組織アレイスライド（ＦＤＡ８０８ｂ；ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社）を用いて解析した。
組織アレイスライドをキシレンに５分間浸す操作を３回繰り返して脱パラフィンを行った後、１００％エタノールに５分浸すことを２回繰り返し、９０％エタノール、８０％エタノールにそれぞれ５分浸した後、流水下で２分間浸すことでサンプルの水和を行った。スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸し、６００Ｗのマイクロウエーブで５分間処理する操作を３回繰り返すことで、抗原の賦活化を行った。メタノールで希釈した３％過酸化水溶液で１０分間処理することで、内在性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。この後の検出に関しては、ヒストファイン（Ｍ）キット（ニチレイ社）を用い、添付のプロトコールに従って、ブロッキング、二次抗体反応、洗浄、検出反応を行った。一次抗体反応は、ＩＭＩ４Ｃ４ａを５μｇ／ｍＬとなるようＴＢＳ−Ｔに希釈して室温で１時間反応させた。発色は、ＩｍｐａｃｔＤＡＢ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、室温で５分間反応させることにより行った。反応後のスライドを流水洗浄後、ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて対比染色した後、封入した。組織染色の結果を図１２に示した。【０１４３】
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いた免疫組織染色では、乳癌組織のＣａｓｅ１及びＣａｓｅ３で染色が見られた。また、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体によって染色される領域は、癌組織の一部分が染色された。例えば、乳癌組織のＣａｓｅ１では、３ヶ所見られる癌部の中で、１ヶ所（矢印部分）のみ染色された。また、Ｃａｓｅ３では、癌部の中で非常に濃く染色される領域と（左下矢印部分）と、染色されない部分が存在した。Ｃａｓｅ２では染色は見られなかった。一方、正常乳房組織では、Ｃａｓｅ１〜３の全てで染色は見られなかった。
組織に添付された臨床情報では、Ｃａｓｅ１（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ４）は、Ｓｔａｇｅ０の乳癌で、初期の浸潤領域であり、Ｃａｓｅ３（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ６）は乳管に浸潤した癌であると記載されている。これらの事から、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を用いた場合には、Ｓｔａｇｅ０の非常に初期の乳癌の浸潤部で発現が亢進する組織があることが示された。【０１４４】
さらに、ヒト乳癌組織アレイスライド（ＢＣ０８１１２０；ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社）を用いてヒト乳癌組織１００症例、正常組織１０症例の免疫組織染色を行い、進行ステージ毎にまとめた結果を図１３に示した。正常組織（ａ〜ｃ）では染色が見られず、Ｓｔａｇｅ  Ｉ〜ＩＶ（ｄ〜ｅ及びｇ〜ｍ）で癌組織の一部分が染色された（矢印部分）。図１３ｆでは、癌部が染色されていることが示された。
免疫組織染色における染色度合を、強陽性（３＋）、陽性（２＋）、弱陽性（１＋）、陰性（０）で分類し、ＩＭＩ４Ｃ４ａの免疫組織染色結果を統計解析した結果を図１４に示した。正常な乳房組織では、測定に用いた１０症例のうち全てが染色されなかった。これに対し、乳癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージＩから見られ、癌の進行ステージに従って陽性率が上昇している傾向が見られた。解析した乳癌組織１００症例中、３６症例が陽性を示した。【０１４５】
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体によって染色される組織は、癌組織の中の一部分である。実施例１．（６）及び実施例２．（３）の実験結果から、ＭＣＴ５の発現亢進は癌細胞の浸潤に関与していると推定されることから、乳癌組織中のＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体で染色される部分は、癌組織の中でも浸潤能の高い細胞が存在する部分を染色している可能性が高い。このような癌組織の中に浸潤性が高い細胞が存在することは、これまでの研究からも想定されている。【０１４６】
癌は正常細胞の増殖プログラムに異常が生じたために発生するが、癌の治療を困難にしている本質は、発生あるいは進展の過程でその姿を変えていくことが指摘されている（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３，５０１，ｐ．３２８−３３７）。腫瘍が発見された時の腫瘍塊は、すでに異なった性質をもった細胞の集合体と化しており、こうした癌組織の不均一性はｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙと呼ばれている。すなわち、同一の癌組織内においても、浸潤能の高い癌とそうでない癌の領域が存在することが知られている。
ＭＣＴ５はヒト乳癌培養細胞であるＭＣＦ７において、過剰発現させると浸潤能を増加させる。すなわち、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体で染色される乳癌組織の領域は、浸潤能の高い乳癌組織であると考えられ、本発明の抗体を用いれば浸潤能の高い癌組織を見分けることができると考えられる。【０１４７】
（２）トリプルネガティブな乳癌組織
次に、上記（１）で用いた症例と同じ患者由来の組織サンプルを用い、乳癌のマーカーとして一般的に用いられるエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター及びＨｅｒ２の発現を解析した。エストロゲンセレプター及びプロゲステロンレセプターは、ＥＲ／ＰｇＲ（ＭＯＮＯ）ユニバーサルキット（ニチレイ）を用いた。また、Ｈｅｒ２に関してはＨｅｒｃｅｐｔｅｓｔＩＩ（ＤＡＫＯ）を用いた。それぞれ、キット付属の実験方法に基づいて実験を行った。【０１４８】
乳癌の中で、エストロゲンレセプター陰性、プロゲステロンレセプター陰性、Ｈｅｒ２陰性に分類されるがん組織は、癌細胞の増殖にレセプターを必要としないためホルモン療法やレセプターを利用した抗がん剤の治療が行えず、化学療法しか治療選択肢がない事が問題となっている。また、若年者に多く、悪性度が高い乳癌であるとも指摘されている。【０１４９】
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体でトリプルネガティブの乳癌症例を解析した結果、４２症例中２４症例（５７％）で組織の一部が染色された。免疫組織染色の結果の一部を図１５に示す。図１５パネルａからｄは、ＩＭＩ４Ｃ４ａで染色した結果であり、矢印で示されるようにがん組織の一部に明確な染色が見られた。一方、図１５パネルｅからｈはエストロゲンレセプター、図１５パネルｉからｌはプロゲステロンレセプター、図１５パネルｍからｐはＨｅｒ２を染色した結果であるが、シグナルが見られずトリプルネガティブな症例であることが確認できる。また、エストロゲンレセプター又はプロゲステロンレセプター、Ｈｅｒ２それぞれが陽性であった組織を図１５パネルｑとｒ又は図１５パネルｓとｔ、図１５パネルｕとｖにそれぞれ示した。
すなわち、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体は、従来検出が出来なかった悪性度の高い乳癌症例においても、利用することが出来る事が示された。【０１５０】
（３）大腸組織を用いた免疫組織染色
ＩＭＩ４Ｃ４ａと大腸癌組織及び肺癌組織との反応性を解析することで、ＭＣＴ５の癌における発現割合を解析した。解析には、ヒト組織アレイスライド（ＦＤＡ８０８ｂ；ＵＳＢｉｏｍａｘ社）を用いた。
免疫染色は上記実施例５．（１）記載の方法と同様に行った。大腸癌及び正常大腸粘膜組織染色の結果を図１６に、肺癌及び正常肺組織染色の結果を図１７に示した。
大腸組織に関しては、大腸癌の中で癌の一部が明確に染色される場合（図１６パネルａ）が見られた。また、正常組織においても癌患者の癌周辺組織（Ｃａｎｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ）で、大腸粘膜のクリプト付近が染色される場合が見られた（図１６パネルｃ）。一方、正常大腸組織（図１５パネルｄ〜ｅ）においては、全く染色が見られなかった。【０１５１】
癌患者の癌周辺組織は、癌部との対比として利用されているが、癌周辺組織もすでに遺伝子変異が生じており、正常とは異なった発現プロファイルを示すことが知られている。例えば、正常大腸組織及び大腸癌周辺部の組織、大腸癌組織のｍＲＮＡ発現プロファイルを、高速シーケンサーを用いて解析した結果が報告されている（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１２，７，ｅ４１００１）。この場合、正常大腸に対し、大腸癌及び癌周辺組織で共通して変動する因子（癌抑制遺伝子ＴＧＦＢＲ２）の存在が指摘されている。また、乳癌と同様に大腸癌においても、同一の癌組織内において遺伝子発現パターンが異なる複数の細胞が混在している（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）事が指摘されている。【０１５２】
（４）肺組織を用いた免疫組織染色
肺組織に関しては、肺癌の中で癌の一部が明確に染色される場合（図１７パネルａ）が見られた。一方、正常組織（図１７パネルｄ〜ｆ）においては、全く染色が見られなかった。【０１５３】
（５）その他の癌組織
卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌の組織に対し、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体で免疫組織染色を行った結果を図１８に示す。それぞれの癌組織において、癌部の一部で染色が見られた。【０１５４】
以上の結果から、ＭＣＴ５は、少なくとも乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌において、癌の一部を染色出来る事が示された。ＭＣＴ５が乳癌培養細胞において浸潤を更新させることから、ＭＣＴ５は、悪性度の高い癌組織の診断に利用することができるマーカーであることが示された。また、本発明の抗体は、少なくとも乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌の検出及び診断に有用であることが示された。【０１５５】
実施例６．抗ＭＣＴ５抗体を用いたフローサイトメーター解析
（１）ヒト大腸癌培養細胞を用いたフローサイトメーター解析
ヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞を９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレートより非酵素的に剥離し、１．５ｍＬチューブに回収した。ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体に関し、最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ−Ｔに希釈して５０μＬ添加し、６０分間、氷上で反応させた。比較対象として、抗Ｔｒｘ−Ｔａｇ抗体（オーダーメードメディカルリサーチ社、クローン番号Ｍｕ２Ｃ３４、サブクラスＩｇＧ２ａ）を用い、同様に反応させた。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１／２００希釈して添加し、３０分間、氷上で反応させた。ＰＢＳ＋２％ＰＢＳで２回洗浄後、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ（ＢＤ社）で解析を行った。結果を図１９に示す。ＩＭＩ４Ｃ４ａで反応させた場合、抗Ｔａｇ抗体（ネガティブコントロール）と比べ、明確なシグナルが観察された。すなわち、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が生きた細胞（生存癌細胞）と反応していることが示された。【０１５６】
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて、Ｏ１５３７４（ＭＯＴ５＿ＨＵＭＡＮ）として登録されているヒトＭＣＴ５の配列番号２で示されるアミノ酸のうちの第１９６番目〜第２９９番目からなる領域（配列番号７）は、細胞内領域として予測されている（図７）。すなわち、この領域を認識するＩＭＩ４Ｃ４ａモノクローナル抗体は、細胞内領域を認識すると予測されるため、抗体は細胞膜を透過できないために、生きた癌細胞と反応することが出来ないと予測された。しかしながら、図１９に示される通り、ＩＭＩ４Ｃ４ａはヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞と明確に反応した。このことから、データベース上で予測されたＭＣＴ５の細胞内領域である第１９６番目〜第２９９番目からなる領域（配列番号７）の少なくとも一部は、細胞外に存在することが明らかとなった。この結果は、これまで明らかにされていない新規な知見である。【０１５７】
（２）既存抗体との対比
ＭＣＴ５に対する３種類の既存抗体（ａｂ１８０６９９、ＨＰＡ０４６９８６及びｓｃ−１４９３２）と、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体とをフローサイトメーターを用いて比較した。実験方法は、上記実施例６．（１）と同様に行った。この際、ａｂ１８０６９９及びＨＰＡ０４９８６はウサギポリクローナル抗体であるため、二次抗体としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１／２００希釈して用い、ｓｃ−１４９３２抗体はヤギポリクローナル抗体であるため、二次抗体としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＤｏｎｋｅｙ−ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１／２００希釈して用いた。その結果を図２０に示す。
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が明確にＨＣＴ１１６細胞と結合するのに対し、ａｂ１８０６９９及びＨＰＡ０４６９８６ではわずかに反応が見られただけであった。また、ｓｃ−１４９３２抗体は全く反応が見られなかった。これらのことから、生きた癌細胞を検出するにはＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体でなければほとんど反応しないことが示された。【０１５８】
（３）免疫細胞染色
ＭＣＴ５に対する２種類の既存抗体（ａｂ１８０６９９、ＨＰＡ０４６９８６）を用い、ホルマリン固定したＨＣＴ１１６細胞の免疫細胞染色を行った。細胞のホルマリン固定は実施例４．（２）と同様の方法で行い、抗体との反応及び検出に関しては実施例５．（１）と同様の方法で行った。なお、ａｂ１８０６９９及びＨＰＡ０４６９８６に関しては、ヒストファイン（Ｒ）キット（ニチレイ社）を用い、添付のプロトコールに従って、ブロッキング、二次抗体反応、洗浄、検出反応を行った。結果を図２１に示す。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌは、一次抗体反応を行う際に、抗体を含まない溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて反応させた。
ホルマリン固定した細胞では、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌと対比した場合に、使用した抗体の全てで細胞膜及び細胞質に染色が、同様に染色された。このことから、ホルマリン固定されたサンプルを検出する際には、既存の抗体も利用できることが示された。【０１５９】
実施例７．ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体のエピトープ解析
（１）ＩＣＤ４部分タンパク質の作製
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が結合する領域を絞り込むために、ＩＣＤ４の組換え体部分タンパク質を作製した。
実施例１（３）で作製したプラスミドを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＭＣＴ５のアミノ酸第１９６番目から第２５８番目をコードする塩基配列（配列番号４１）を含むＤＮＡを増幅した。また、ＭＣＴ５のアミノ酸第２２７番目から第２９９番目をコードする塩基配列（配列番号４２）を含むＤＮＡを増幅した。ＭＣＴ５及びＩＣＤ４、ＩＣＤ４＿１９６−２５８及びＩＣＤ４＿２２７−２９９のアミノ酸配列とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を図２２に示した。【０１６０】
プライマー配列
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
プライマー配列
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ）で切断し、ＩＣＤ４＿１９６−２５８はｐＥＴ３２ｂへ、ＩＣＤ４＿２２７−２９９はｐＥＴ３２ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＭＣＴ５の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。このベクターを用い、実施例３．（２）と同様の方法でＭＣＴ５部分タンパク質を発現及び精製し、部分タンパク質を得た。【０１６７】
（２）ＥＬＩＳＡを用いた競争阻害試験
実施例３．（２）で得た部分タンパク質（ＩＣＤ４）及び上記（１）で得た２種類の部分タンパク質（ＩＣＤ４＿１９６−２５８及びＩＣＤ４＿２２７−２９９）、及びネガティブコントロールとしてＴｒｘ−、Ｓ−、Ｈｉｓ−Ｔａｇを有するタンパク質（Ｔａｇ）の合計４種類を用いて、競合阻害試験を行った。
まず、５０ｎｇ／ｍＬ（３３３ｐＭ）のＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体と３．３３ｎＭ（１０倍）、１６．７ｎＭ（５０倍）、３３．３ｎＭ（１００倍）となるよう調製した４種類のタンパク質とを室温で１時間反応させた。次に、１ウエルあたり、５０ｎｇのＩＣＤ４を添加して固相化させたプレートを準備し、このプレートに上記組み換えタンパク質とＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体とを混合した溶液を添加した。室温で１時間反応させた後、実施例３．（５）記載の方法と同様に抗体と抗原との反応を解析した。結果を図２３に示した。ＩＭＩ４Ｃ４ａのＩＣＤ４に対する結合は、ＩＣＤ４＿１９６−２５８及びＩＣＤ４＿２２７−２９９の両方で阻害されたことから、ＩＭＩ４Ｃ４ａが認識するエピトープはＭＣＴ５の第２２７番目から第２５８番目のペプチド配列（配列番号１４）に結合することが示された。【０１６８】
（３）フローサイトメーターを用いた競争阻害試験
次に、細胞に対するＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の結合が、組み換えタンパク質によって同様に阻害されるのか解析を行った。
１．５μｇ／ｍＬ（２０μＭ）のＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体と１００、５００あるいは１０００μＭとなるよう調製したＩＣＤ４、ＩＣＤ４＿１９６−２５８及びＩＣＤ４＿２２７−２９９とをそれぞれ混合し、室温で１時間反応させた。この反応溶液と、４×１０５ｃｅｌｌｓのＨＣＴ１１６細胞とを氷上で３０分反応させた。その後の洗浄、二次抗体反応、検出は実施例６．（１）と同様の方法で実施した。実験結果を図２４に示す。
抗体のみで染色した場合（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ、ＩＣＤ４（配列番号７）、ＩＣＤ４＿１９６−２５８（配列番号８）及びＩＣＤ４＿２２７−２９９（配列番号９）を添加した場合は、明確にシグナルが消失しており、ＭＣＴ５の部分タンパク質により細胞に対するＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の結合が阻害されることが示された。【０１６９】
（４）エピトープの決定
上記実施例（３）の結果から、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体はＩＣＤ４＿２２７−２５８（配列番号１４）の範囲内に結合することが予測された。そこで、ＩＣＤ４＿２２７−２４２（配列番号１０）、ＩＣＤ４＿２３５−２５０（配列番号１１）、ＩＣＤ４＿２４２−２５８（配列番号１２）の３つのペプチドを化学合成して上記（２）と同様にＥＬＩＳＡを用いた競争阻害試験を実施した。図２５に、ＩＣＤ４と合成したペプチドとがアミノ酸配列上で一致する領域をを示す。
ＩＣＤ４＿２２７−２４２、ＩＣＤ４＿２３５−２５０、ＩＣＤ４＿２４２−２５８それぞれを、５０ｎｇ／ｍｌ（３３３ｐＭ）の抗体に対し、１．６７ｎＭ（５倍）、３．３３ｎＭ（１０倍）、１６．７ｎＭ（５０倍）、３３．３ｎＭ（１００倍）、１６７ｎＭ（５００倍）、３３３ｎＭ（１，０００倍）、１．６６μＭ（５，０００倍）、３．３３ｍＭ（１０，０００倍）となるよう調製し、上記（２）と同様に解析した。実験結果を図２６に示す。【０１７０】
ＩＣＤ４＿２２７−２４２及びＩＣＤ４＿２３５−２５０では、抗体の濃度に対し、１０，０００倍のモル比でペプチドを添加した場合でも、ＩＣＤ４に対するＩＭＩ４Ｃ４ａの結合を阻害することは出来なかったが、ＩＣＤ４＿２４２−２５８の場合は、５０倍のモル比から阻害効果が見られ、５００倍以上のモル比で添加した場合に明確な阻害が観察された。阻害効果を示さなかったＩＣＤ４＿２３５−２５０（配列番号１１）と阻害効果を示したＩＣＤ４＿２４２−２５８（配列番号１２）は、ＭＣＴ５の第２３５番目から２５０番目のアミノ酸が重複していることから、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体はＭＣＴ５の第２５１番目から第２５８番目のアミノ酸配列（配列番号１３）を認識していることが示された。【０１７１】
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が認識するエピトープを含む領域、すなわちＩＣＤ４＿２５１−２５８（配列番号１３）は、既存の抗体であるＨＰＡ０４６９８６を取得する際に利用される抗原（ＩＣＤ４＿１９５−２５０（配列番号１５））に含まれないアミノ酸配列である。図２７に、ＩＣＤ４（配列番号７）とＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が認識するエピトープを含むアミノ酸ＩＣＤ４＿２５１−２５８（配列番号１３）、及び既存の抗体であるＨＰＡ０４６９８６を取得する際に利用される抗原ＩＣＤ４＿１９５−２５０（配列番号１５）とが、アミノ酸配列上で一致する位置の模式図を示した。すなわち、上記に記載したような特性を持つＭＣＴ５抗体は、ＩＣＤ４＿２５１−２５８（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である必要がある。【０１７２】
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【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明により、従来の抗体では検出できなかった浸潤能の高い癌細胞を高感度で検出することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１７４】
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７〜２０：合成ペプチド
配列番号２１〜２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５〜２８：合成ペプチド
配列番号２９〜３９：合成ＤＮＡ
配列番号４３：合成ＤＮＡ
配列番号４８：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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