(57)【要約】  密閉された容器内で血小板活性化試薬と血液を反応させる工程、該容器の第一の端に接続されたポンプによって血液と混ざらない液体を該容器に注入することにより、血小板活性化試薬と血液の混合液を該容器から押し出して、該容器の第二の端に接続されたフィルターデバイスのフィルターを通過させる工程、およびポンプにかかる圧力を測定する工程を含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性や持続性を総合的かつ定量的に解析する方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
密閉された容器内で血小板活性化試薬と血液を反応させる工程、該容器の第一の端に接続されたポンプによって血液と混ざらない液体を該容器に注入することにより、血小板活性化試薬と血液の混合液を該容器の第二の端から押し出して、該容器の第二の端に接続されたフィルターデバイスのフィルターを通過させる工程、およびポンプにかかる圧力を測定する工程を含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析する方法。
【請求項２】
血液と混ざらない液体がミネラルオイルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血小板活性化試薬が終濃度１〜１０μＭのＡＤＰ、終濃度０．５〜１０μｇ／ｍｌのコラーゲン、または終濃度０．２〜２０ｍＭのアラキドン酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液と混ざらない液体の注入速度が５〜２００μl／分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記フィルターは、メッシュのピッチサイズまたは径が１０μｍ〜５０μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記血小板活性化試薬と血液の混合液が、血小板活性化試薬と血液を混合してから２０秒以上２分以内に前記フィルターへ到達するように、前記血液と混ざらない液体を前記容器に注入する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血液を収容するための容器と、該容器の第一の端に気密に接続されたポンプと、該ポンプにかかる圧力を測定するセンサーと、該容器の第二の端に気密に接続されたフィルターデバイスとを含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析する為の装置。
【請求項８】
血液を収容するための容器は、血液収容部とそれを密閉するキャップからなる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
血液を収容するための容器は、前記キャップを介してフィルターデバイスと接続される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
該フィルターデバイスは、フィルター部と廃液貯留部を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記廃液貯留部が空気穴を有する、請求項１０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板凝集能を調べるための方法および検査装置に関し、より詳しくは血小板活性化試薬と混合された血液を容器からポンプで押出してフィルターを通過させ、その際の圧力変化の積分値より血小板凝集能および形成された凝集塊の安定性および持続性の評価を総合的に行うための方法およびそれに使用する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（血小板凝集検査の従来技術の問題点）
動脈における血栓形成（白色血栓）又は一次止血において血小板の活性化及び凝集は中心的機能を果たす。
血小板は血管が障害を受けた場合に、血管内皮細胞下に存在するコラーゲンに対し、直接的、非直接的に結合する。血流の緩やかな環境下（低ずり応力下）ではGPVIなどコラーゲン受容体により直接的な結合が主となり、血流の早い環境下（高ずり応力下）ではコラーゲンにvWFが結合し、vWFに対し血小板のGPIbα受容体が結合することで間接的にコラーゲンに結合する。コラーゲンとの直接的、間接的相互作用は血小板を活性化し、この刺激により濃染顆粒及びα顆粒からアデノシン二リン酸（ADP）,セロトニンなど様々な血小板活性化物質が放出される。
これら放出された血小板活性化因子は自己の血小板及び周囲の血小板を活性化させる。活性化を受けた血小板はフィブリノゲン受容体であるGPIIbIIIaが活性化型に構造変化を受け、フィブリノゲンに対し高親和性型となる。２量体であるフィブリノゲンを介して活性化血小板が次々架橋を受け血小板凝集塊を形成する。【０００３】
従来、血小板凝集能の測定としては光透過法が主に行われている。この方法では、血液から分離された多血小板血漿（以下、ＰＲＰと称する）に血小板活性化試薬を混合し、血小板凝集による濁度の経時的変化（低下）に対する凝集率曲線が作成される（例えば、特許文献１）。【０００４】
また、血液からＰＲＰ調製が手間である為、より簡便に血小板凝集を測定する為に全血で測定可能な血小板凝集測定装置も考案されている。主なものとしては、全血と血小板活性化物質を混合後、血液中に浸した電極への血小板の粘着・凝集による電気抵抗の変化を測定したものがある（例えば、非特許文献１，２）。【０００５】
また、複数の濃度の血小板活性化試薬と混合した血液を数分間静置して反応させた後に吸引することによりメッシュを通過させ、吸引圧より、血小板活性化試薬の閾値を決定し、血小板凝集能の正常と異常を決定する方法も報告されている（特許文献２、特許文献３）。この方法は、凝集曲線と凝集閾値とから全血中の血小板凝集閾値係数を算出し、血小板凝集閾値係数が何れの領域に含まれるかにより全血中の血小板凝集能が正常であるか否かを判定する全血血小板凝集能測定方法である。【０００６】
また、特許文献４には、微弱な血小板活性化試薬を混合した抗凝固処理された血液を、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板の機能を検査することを特徴とする、血小板機能検査方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平８−１０２２６号公報
【特許文献２】特開２００５−２９１８４９号公報
【特許文献３】特開２００６−３００８５９号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／０１８８３３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morphologic alterations of blood cells in the impedance aggregometer.  Blood Cells. 1985;11(2):325-36, 337-9.
【非特許文献２】A method of testing platelet aggregation in native whole blood.  Thromb Res. 1985 Apr 1;38(1):91-100.
【発明の概要】
【０００９】
従来の血小板凝集能測定では、血小板活性化試薬添加による凝集塊形成及びそれが発生する閾値を測定することは可能であったが、その安定性や持続性を定量的に測定することは困難であった。すなわち、異なる濃度の血小板活性化試薬と数分間反応させた後、吸引によってフィルターを通過させ、目詰まりによる陰圧で血小板凝集を引き起こす濃度を測定する方法では、目詰まりを起こす血小板活性化試薬の閾値濃度を決定することは可能であるが、通過する血液の流速はメッシュの目詰まり程度に依存して変化するので正確且つ定量的に評価できなかった。
また、吸引の場合には血液と吸引用シリンジの間に存在する空気の存在により特に低流速域（100μｍ/分以下）において流速を一定に保つことが出来ず、また、一定流速下におけるフィルター通過による正確な圧力変化を経時的に測定することはできない。さらに、種々の濃度の血小板活性化試薬を調整し、吸引する必要があるので、手間がかかるという問題もあった。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、血小板凝集開始の速度や凝集塊の安定性や持続性を定量的に評価することのできる方法及び装置を提供することを課題とする。
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明は、密閉された容器内で血小板活性化試薬と血液を反応させる工程、該容器の第一の端に接続されたポンプによって血液と混ざらない液体を該容器に注入することにより、血小板活性化試薬と血液の混合液を該容器の第二の端から押し出して、該容器の第二の端に接続されたフィルターデバイスのフィルターを通過させる工程、およびポンプにかかる圧力を測定する工程を含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析する方法、を提供する。
前記血液と混ざらない液体はミネラルオイルであることが好ましい。
前記血小板活性化試薬は終濃度１〜１０μMのＡＤＰ、終濃度０．５〜１０μｇ／ｍｌのコラーゲン、または終濃度０．２〜２０ｍＭのアラキドン酸であることが好ましい。
前記血液と混ざらない液体の注入速度は５〜２００μl/分であることが好ましい。5分の反応とすると25μｌ〜１ｍｌの血液で足りるので、適量の血液サンプルで測定が可能である。
前記フィルターは、メッシュのピッチサイズまたは径が１０μｍ〜５０μｍであることが好ましい。
また、前記血液と混ざらない液体を前記容器に注入する際には、前記血小板活性化試薬と血液の混合液が、血小板活性化試薬と血液を混合してから２０秒以上２分以内に前記フィルターへ到達するようにすることが好ましい。
本発明はまた、密閉容器と、該容器の第一の端に接続されたポンプと、該ポンプにかかる圧力を測定するセンサーと、該容器の第二の端に気密に接続されたフィルターデバイスとを含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析するための装置を提供する。密閉容器は血液収容部とそれを密閉するキャップからなることが好ましく、密閉容器は該キャップを介してフィルターデバイスと接続されることが好ましく、ここで、フィルターデバイスはフィルター部と廃液貯留部を含むことが好ましく、この廃液貯留部は空気穴を有することが好ましい。
【００１２】
本発明の方法および装置によれば、血小板凝集の安定性や持続性を定量的に評価することができる。
前記血液と混ざらない液体はミネラルオイルであると、血液を効率よく容器から押し出してフィルターデバイスに到達させることができるため好ましい。
前記血小板活性化試薬は終濃度が１〜１０μＭのＡＤＰ，終濃度が０．５〜１０μｇ／ｍｌのコラーゲン，または終濃度が０．２〜２０ｍＭのアラキドン酸であると、血小板凝集塊が形成されやすく、圧力上昇波形が効率よく得られるため、好ましい。
前記血液と混ざらない液体の注入速度は５〜２００μｌ／分であると、正確な送液が可能で、且つ少量の血液で一定時間測定可能であるため、好ましい。
前記フィルターのメッシュのピッチサイズまたは径が１０μｍ〜５０μｍであると、血小板凝集塊による圧力上昇波形が再現性良く得られるため、好ましい。
【００１３】
また、前記血液と混ざらない液体を前記容器に注入する際に、前記血小板活性化試薬と血液の混合液が、血小板活性化試薬と血液を混合してから２０秒以上２分以内に前記フィルターへ到達するようにすると、血小板が活性化されながらフィルターを通過することで、凝集塊の形成速度が、圧力波形の立ち上がり時間に反映されやすくなる。
血小板凝集能反応が開始されたのち、終了する前に迅速にフィルターを通過させることで、圧力波形の積分値には、血小板凝集塊の形成速度、安定性、持続性が総合的に反映される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の血小板凝集能測定装置の第１の形態例を示す図。
【図２】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例１）。
【図３】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例２）。
【図４】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例３）。
【図５】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例４）。
【図６】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例５）。
【図７】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例６）。
【図８】本発明の血小板凝集能測定装置の第２の形態例を示す図。
【図９】本発明の血小板凝集能測定装置におけるフィルターの一例を示す図。
【図１０】本発明の血小板凝集能測定装置（血液収容容器とフィルターデバイス）の第３の形態例を示す図。
【図１１】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例７）。
【図１２】本発明の血小板凝集能測定装置を用いた圧力測定結果のグラフ（実施例８）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ミネラルオイルなどの血液と混ざらない液体を送液するポンプと気密に接続した容器内で血小板活性化試薬と血液を混合した後、該液体を容器に一定の流速で注入することで、血小板活性化試薬と血液の混合液を、容器の他の端に接続されたフィルターデバイスのフィルターに一定の流速で流入させ、その際の圧力の変化波形を経時的に測定することで、血小板凝集能、血小板凝集塊安定性、及びそれらの総合評価を行うものである。
【００１６】
まず、図面を参照して本発明の血小板凝集能測定方法および装置を説明する。なお、本発明において、「血液」とは、全血及び多血小板血漿を含む。図１は、本発明の血小板凝集能測定装置の形態例を示す概念図である。ただし、本発明の装置はこの態様に限定はされない。
以下、図１に基づいて説明する。
【００１７】
本発明の第一の態様に係る装置１０は、血液収容容器１（以下、単に容器１と呼ぶことがある）と、該容器１の第一の端に気密に接続された送液ポンプ２と、該ポンプ２にかかる圧力を測定する圧力センサー３と、該容器１の第二の端に接続されたフィルターデバイス４と、を有する。
【００１８】
フィルターデバイス４は、フィルター部５と廃液貯留部６を含む。
フィルターデバイス４は、測定時に容器１の第二の端の開孔を有する突起部を、フィルター部に連通する開口部（貫通孔）に連結して使用することができる。
フィルターデバイス４は、例えば、円筒形の容器の内部に、円の中央にフィルターを有するフィルター部５を、フィルターの外周が密着するようにはめ込むことで作製することが可能である。これにより、フィルターを通過した血液試料を廃液として廃液貯留部６にため込むことができる。廃液貯留部６には空気穴７が開いており、これによって通気され、正確な圧力測定が可能となる。
【００１９】
容器１の材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等が挙げられるが、透明な材質が好ましい。また、意図しない部位での血液凝固を抑制するために、内部がＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）によって処理されていてもよい。
【００２０】
本発明の方法においては、まず、容器１内で血液と血小板活性化試薬とを反応させる。
容器１内に収容される血液は抗凝固処理されたものであることが好ましい。
ここで、抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤のうち、一般的な３．２％クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液９容に対してこの抗凝固処理剤１容とするのが好ましい。
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、トロンビン阻害剤、コーン由来トリプシンインヒビター（１９７７．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５２．８１０５）等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。
抗凝固処理された血液を得る方法としては、シリンジまたは真空採血管に予め上記の抗凝固処理剤を入れて採血を行うか、または、採血直後の血液に抗凝固処理剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。
【００２１】
抗凝固処理された血液と混合する血小板活性化試薬としては、ＡＤＰ、コラーゲン、アラキドン酸およびリストセチン等が挙げられる。血小板活性化試薬は、健常人において血小板活性化が惹起されるような濃度で使用する。血小板活性化が起こるような濃度とは、例えば、ＡＤＰの場合、終濃度１〜１０μＭであり、コラーゲンの場合、終濃度０．５〜１０μｇ／ｍｌであり、アラキドン酸の場合、終濃度０．２〜２０ｍＭである。
【００２２】
予め血液と血小板活性化試薬とを混合し、その混合液を容器１内に入れてもよいが、容器１内に血小板活性化試薬を乾燥又は液体状態で入れておき、そこに血液を加えて反応させることが好ましい。
例えば、容器１のフィルターデバイス接続側の端をゴムなどの素材でできた、針で貫通可能なキャップにしておき、シリンジで採血した血液を注入することで、予め容器１内に収容された血小板活性化試薬と反応させることができる。
【００２３】
容器１の第一の端にチューブを介して気密に接続された送液ポンプ２によって該ポンプ２内の血液と混ざらない液体を容器１に注入することで、該容器１内の血小板活性化試薬と血液の混合液が、該容器１の第二の端に接続されたフィルターデバイス４に押し出される。
【００２４】
なお、血液と混ざらない液体を容器１に注入して血小板活性化試薬と血液の混合液をフィルター部へ押し出すタイミングとしては、血小板活性化試薬と血液の混合液が、血液と血小板活性化試薬を混合してから２０秒以上２分以内（好ましくは20秒以上1分以内）にフィルターへ到達するようなタイミングで注入を開始することが好ましい。
【００２５】
例えば、特許文献２では、０．５，１，２，４μＭのＡＤＰと血液を混合し5分反応させた後に、フィルターを吸引通過させ、目詰まりによる吸引圧より凝集曲線を引き、血小板凝集の起こる血小板活性化物質の閾値濃度を決定している。
しかし、この方法では異なる濃度の血小板活性化試薬の調整の必要が有り手間となる他、凝集を引き起こす濃度閾値の決定は可能であるが、形成された血小板凝集塊の安定性や持続性等は結果に反映されない。
一方、本発明では、健常人において血小板活性化が起こる濃度域の血小板活性化試薬と血液を混合後20秒以上〜2分以内（好ましくは20秒以上1分以内）以内の血液をフィルターを通過させる。圧力の上昇開始に、血小板凝集塊の形成度合（速度）が反映され、最大圧力は凝集塊の安定性が反映される。さらに、圧力の積分値には、凝集形成と形成された凝集塊の安定性の両者が反映される。
【００２６】
送液ポンプの液体は、容器１に注入した時に、血液と混ざらず、血液と血小板活性化試薬の混合液を容器１から押し出すことのできる液体であればよいが、例えば、ミネラルオイルが挙げられる。なお、送液ポンプの流速を段階的に高めることで、ずり応力を段階的に上昇させることも可能である。
【００２７】
容器１から押し出された血小板活性化試薬と血液の混合液は、フィルターデバイス４に到達し、血小板凝集によるフィルターの目詰まりを起こしながら、フィルターを通過する。
そして、フィルターを通過した血液は、廃液貯留部６に収容される。
【００２８】
フィルターはメッシュ状であり、メッシュのピッチサイズまたは径が１０μｍ〜５０μｍであることが好ましく、２０μｍ〜５０μｍであることがより好ましい。また、フィルターの面積は１〜１００ｍｍ２とすることが好ましい。フィルターの厚みは、１０〜１００μｍが好ましい。
【００２９】
血小板の安定性を測定する為には、流速は５〜２００μｌ／分の一定の流速であることが好ましく、１０〜１００μｌ／分の一定の流速であることがより好ましい。
また、２分〜１０分間かけて、試料をフィルターに通過させることが望ましい。
本発明の方法によれば、低流速、例えば５０μｌ／分で、１０分フィルターを経時的に通過させた場合にも、５００μｌと比較的少量の全血サンプルの使用で十分である。
なお、血液容器及びフィルターはヒーターによって約３７℃に加温されることが望ましい。
【００３０】
一定の流速でフィルターを通過させることで血液凝集によってフィルター目詰まりは発生し、それによって生じる微妙な圧力変化を感度良く測定し、２〜１０分間の圧力波形の積分値を算出することで、血小板凝集能を評価することができる。
【００３１】
圧力上昇開始時間（測定開始から圧力が上昇し始めるまでの時間）は、主に血小板凝集能や凝集速度に関連するのに対し、最大圧力は形成された血小板凝集塊の安定性や強度を反映し、時間に対してプロットした圧力波形の積分値・下部面積（ＡＵＣ）は、その総合指標となる。
密閉した容器内の血小板が活性化された血液をマイクロポンプでフィルターに流入させることで、一定流速でフィルターを通過した際の、圧力変化を０．１ｋＰａ単位で正確に測定することが可能である。
また、フィルターが血小板凝集塊による目詰まりして圧力が上昇開始した後に、さらに一定時間（2〜10分程度）、血液をフィルターに一定流速で通過させ続け、その後の圧力変化を引き続き測定することで、血小板凝集塊の安定性・強度を同時に測定することが可能となる。
【００３２】
本発明の方法によれば、用いる血小板活性化試薬の種類や濃度に依存した血小板凝集塊形成による閉塞開始、凝集塊の安定性及び持続性が測定可能である。
例えばＡＤＰを５μＭの濃度で用いた場合は、コラーゲンを１．５μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合に比較し圧力上昇開始（凝集塊形成）が早いが２〜３分後には圧力が一定に達する。その一方で、コラーゲンを１μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合は、上昇開始は遅いが、５〜６分後まで持続的な圧力上昇が観察される。
このように用いる血小板活性化試薬や、それを抑制する抗血小板薬によって、圧力上昇開始、最大圧力等が異なる影響を受ける。
【００３３】
本発明の第二の態様にかかる血小板凝集能測定装置を図８に示す。
図８Ｂに示すように、血液収容容器１は、送液ポンプと連結するための管を挿入するための連結部となる貫通孔を有する第一の端９と、血液を収容するための血液収容部１３と、キャップ８と、キャップ８に接続されてフィルターデバイス４と連結するための突起部を有する第二の端１１からなる。血液収容部内部で血小板活性化試薬と血液とを混合したのち、キャップ８をつけて密閉し、血液収容容器１とフィルターデバイス４を接続する。
なお、血液収容部内部に血小板活性化試薬と血液との混合液を充満させたのちに、血液収容容器１とフィルターデバイス４を接続して、混合液をフィルターデバイスに流すことが測定誤差をなくすためには好ましい。そのために、まず、血液収容容器１の第二の端に気密に密閉容器を接続し、血液収容容器１から該密閉容器に混合液を少し排出させて、血液収容容器１に混合液が充満した状態にさせたのち、この密閉容器を外し、血液収容容器１をフィルターデバイス４に接続してもよい。
【００３４】
なお、図８Ｃに示すように、フィルターデバイス４は、血液収容容器１の第二の端の突起部を挿入するための貫通孔１２を有する部分と、フィルター５と、廃液貯留部６を有する。廃液貯留部６には空気穴７が設けられている。
フィルター５は、廃液貯留部６の、血液収容容器１に接続される側の面の、貫通孔１２に該当する部分を覆うように設置されており、これにより、血液収容容器１から貫通孔１２を通って流れてきた血液と血小板活性化試薬の混合液がフィルター５を通過する。
【００３５】
図８Ａに示すように、使用時には、送液ポンプ２と連結するための管が、血液収容容器１の第一の端９に挿入され、血液収容容器１のキャップ８の外側に設けられた、第二の端１１の突起部が、フィルターデバイス４の貫通孔１２に挿入され、血液収容容器１内で血小板活性化試薬と混合された血液が、送液ポンプ２によって、フィルターデバイス４へ押し出され、フィルター５を通過し、廃液貯留部６に貯留される。
一定の流速でフィルターを通過させることで血液凝集によってフィルター目詰まりは発生し、それによって生じる微妙な圧力変化を感度良く測定し、２〜１０分間の圧力波形の積分値を算出することで、血小板凝集能を評価することができる。
【００３６】
図９にフィルター５の構造の例を示す。図９Ａの全体図に示すように、容器１から押し出された血小板活性化試薬と血液の混合液が通過する部分をカバーするように、中央部にフィルターが配置されている。フィルター部分の拡大図を図９Ｂに、開孔部分の拡大図を図９Ｃに示す。
【００３７】
本発明の第三の態様にかかる血小板凝集能測定装置を図１０に示す。
図１０Ａが血液収容容器１を、図１０Ｂがフィルターデバイス４を示す。血液収容容器１は、図８Ｂの第二の態様の血液収容容器とは異なり、第二の端側にキャップを有しない。一方、フィルターデバイスは、血液収容容器１の第二の端に気密に接続されるような端を有する。すなわち、血液収容部１３で血小板活性化試薬と血液が混合されたのち、血液収容容器１の第二の端は、フィルターデバイス４の端に直接、気密に接続される。そして、混合液はフィルターデバイス４の貫通孔１２を通ってフィルターを通過し、廃液貯留部６に貯留される。
【実施例】
【００３８】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３９】
以下の実験では図１の装置を作製して用いた。
容器１（血液リザーバー）はアクリル製の内容量４５０μｌの円柱状(内径６ｍｍ、深さ１６ｍｍ)のものを用いた。
フィルターはニッケル製マイクロメッシュフィルター  30μm×30μm角型開口（ピッチサイズ４５μｍ）で直径１mm、の円形のフィルターをフィルター部の中央に配置して用いた。【００４０】
実施例１
血液リザーバーに200ｍＭのADP 試薬（Dynabite社;ドイツ）13μl（終濃度5.6μM）を添加した後、テルモ採血管（ベノジェクト 3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加えて血液リザーバー内で混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とＡＤＰ試薬を混合した1分後に、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、AR-C66096（血小板P2Y12受容体阻害剤；Tocris Bioscience社；イギリス）を終濃度25,50,100,250nM添加した血液を用い同様の測定を行った。【００４１】
それぞれの圧力波形を図２に示す。
AR-C66096は圧力上昇開始を遅延すると共に、濃度依存的に圧力上昇を抑制した。特に、50nM, 100nMのAR-C66096存在下においては、山なりの圧力曲線を描いた。これらの結果より、AR-C66096の存在により血小板凝集塊の安定性と持続性が抑制されたことが示される。また、表１に示すように圧力下部面積がAR-C66096の濃度依存的に抑制された。これらの結果から、本発明の方法は圧力上昇開始の遅延、圧力の安定性の双方を反映しており、定量的な血小板凝集の評価ができることが分かる。【００４２】
【表１】
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【００４３】
対照として、同様にAR-C66096を終濃度25, 50, 100, 250nMを添加した血液を用いMultiplate(インピーダンス式血小板凝集能解析装置；Dynabite社)を用いて全血血小板凝集を測定した。血小板活性化試薬としてはＡＤＰ（終濃度6.5μM）を使用した。ＡＵＣ値を表２に示す。その結果、濃度依存性は見られず、特に高濃度のAR-C66096 存在下のＡＵＣ値は高濃度のAR-C66096の効果を反映しにくかった。また、全てのインピーダンス曲線は右肩上がりであった。即ち、血流等の物理的負荷がかからない為、一度電極に粘着・凝集した血小板凝集塊は壊れることなく保持され、電気抵抗を高めていると考えられた。【００４４】
【表２】
2014098242.tif 000004
【００４５】
実施例２
血液リザーバーに25μg/ml（終濃度0.7μg/ml）のコラーゲン試薬（Dynabite社製）13μlを添加した後、テルモ採血管（ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μM、またはアスピリン50μMとAR-C66096  250μＭの両方を添加した血液を用い同様の測定を行った。【００４６】
それぞれの圧力波形を図３に示す。
アスピリンは圧力上昇開始を遅延すると共に、圧力上昇を抑制した。また、アスピリンとＡＲ−Ｃ６６０９６の併用で相乗的に圧力上昇を抑制した。【００４７】
対照として、同様にアスピリンを終濃度100μM、またはアスピリン50μMとAR-C66096  250μＭの両方を添加した血液を用いMultiplate(インピーダンス式血小板凝集能解析装置；Dynabite社)を用いて全血血小板凝集を測定した。血小板活性化試薬としてはコラーゲン（終濃度3.2μg/ml）を使用した。電気抵抗のＡＵＣ値を表３に示す。その結果、アスピリンの効果は見られたが、アスピリンとAR-C66096の相乗効果は見られなかった。【００４８】
【表３】
2014098242.tif 000005
【００４９】
実施例３
血液リザーバーに50μg/ml（終濃度1.4μg/ml）のコラーゲン試薬（Dynabite社製）13μlを添加した後、テルモ採血管（ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加え混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。繰り返し５回測定を行った。
それぞれの圧力波形を図４に示す。５回の測定による下部圧力面積は15.11±0.8（平均±ＳＤ）でＣＶ値は5.3%と良好な再現性を示した。【００５０】
実施例４
血液リザーバーに100mMのアラキドン酸試薬（Dynabite社製）30または50μl(それぞれ終濃度6.25mMおよび10mM)  終濃度、を添加した後、テルモ採血管（ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液をアラキドン酸試薬50μlと混合し同様の測定を行った。
圧力波形結果を図５に示す。その結果、アラキドン酸によって血小板が活性化されて圧力が上昇したが、アスピリンによって圧力上昇は抑制された。【００５１】
実施例５
血液リザーバーに1mMのPAR1活性化試薬（ペプチド配列SLFFRN；Dynabite社製）20μlを添加した後、テルモ採血管（ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液を用い同様の測定を行った。
圧力波形結果を図６に示す。ADP凝集に比較的近い、圧力波形となった。また。PAR1活性化ペプチドによる凝集波形はアスピリンの阻害を受けなかった。【００５２】
実施例６
血液リザーバーに20mMのPAR4活性化試薬（ペプチド配列AYPGKF；Dynabite社製）20μlを添加した後、テルモ採血管（ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液を用い同様の測定を行った。
圧力波形結果を図７に示す。圧力上昇は１分以内におき、２〜３分の間に上昇し、その後ほぼ一定圧を持続した。ADP凝集に比較的近い、圧力波形となった。また。PAR4活性化ペプチドによる凝集波形はアスピリンの阻害を受けなかった。【００５３】
以下の実験では図８の装置を作製して用いた。【００５４】
実施例７
容器１（血液リザーバー）はアクリル製の内容量250μｌの(内径６ｍｍ、深さ１６ｍｍ)のものを用いた。
フィルターはニッケル製マイクロメッシュフィルター  25μm×25μm角型開口（ピッチサイズ４５μｍ）で直径１mmの円形のフィルターをフィルター部の中央に配置して用いた。【００５５】
血液リザーバーにADP 試薬(エムシーメディカル社製)を終濃度3μMになるように添加した後、37℃に加温したテルモ採血管（ベノジェクト 3.13%クエン酸ナトリウム含有）に採血した血液240μlを加えて血液リザーバー内で混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とＡＤＰ試薬を混合した30秒、60秒、90秒後に、ミネラルオイルを流速25μl/分で血液リザーバーに注入し、フィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。
それぞれの圧力波形を図１１に示す。
圧力パターンの結果より、ADP試薬混合後90秒後にフィルターを通過させた検体では、30秒、1分後にフィルターを通過させた場合に比べ圧力上昇が低下することが分かる。【００５６】
実施例８
血液リザーバー内でコラーゲン試薬（モリヤ産業）（終濃度4μg/ml）とクエン酸ナトリウムによって抗凝固処理した血液（240μｌ）を加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した30，60，90秒後、ミネラルオイルを流速25μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。
圧力波形結果を図１２に示す。
コラーゲンによって活性化した血液は、ADP試薬と比べて混合後の時間に大きな影響を受けず、堅調な圧力上昇を示した。血小板活性化試薬によって、混合後フィルターを通過させるまでの時間の影響が異なることが分かる。
【符号の説明】
【００５７】
１０…血小板凝集能測定装置、１…血液収容容器、２…ポンプ、３…圧力センサー、４…フィルターデバイス、５…フィルター、６…廃液貯留部、７…空気穴、８…キャップ、９…血液収容容器の第一の端、１１…血液収容容器の第二の端、１２…貫通孔、１３…血液収容部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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