(57)【要約】弾性を有する三次元組織体及びそれを製造可能な方法を提供する。平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体に関する。また、平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む、三次元組織体の製造方法であって、前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である製造方法に関する。
2015053367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体。
【請求項２】
前記三次元組織体は、少なくとも１．２倍の長さに伸ばすことが可能である、請求項１記載の三次元組織体。
【請求項３】
平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む、三次元組織体の製造方法であって、
前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である、製造方法。
【請求項４】
平滑筋細胞を高密度で培養することによって、前記平滑筋細胞を調製することを含む、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記平滑筋細胞は、胎児期又は幼年期の平滑筋細胞である、請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
前記積層は、前記平滑筋細胞の細胞層の形成と前記細胞外マトリックス成分を含む層の形成とを交互に行うこと、又は、前記細胞外マトリックス成分で被覆された平滑筋細胞を積層することを含む、請求項３から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項３から６のいずれかに記載の製造方法により製造された、弾性を有する三次元組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、三次元組織体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管平滑筋細胞を三次元化した血管モデルが、外傷や動脈硬化症等といった血管疾患の外科的治療の点、及び近年見直しが求められている動物実験に代わる新たな代替手段の提供の点から広く求められている。このため血管平滑筋細胞を人工的に三次元化して血管モデルを構築するための研究が行われている（例えば、非特許文献１及び２等）。非特許文献１には、コラーゲンを高発現させた培地にて平滑筋細胞を数週間培養後、解離後にロール化して血管形状にした後にさらに数週間培養することで人工血管モデルが開示されている。また、非特許文献２には、特許文献１に開示されたフィブロネクチン及びゼラチンのナノ薄膜を形成することによる細胞の積層化の技術を用い、ラット新生児血管平滑筋細胞やヒト臍帯静脈血管平滑筋細胞を積層化して、血管壁に類似の平滑筋細胞の積層体を形成することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４９１９４６４号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌ’Ｈｅｕｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １２，  ４７  （１９９８）
【非特許文献２】Ｍ．  Ｍａｔｓｕｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３  （２０１２）  ６３−７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
移植のために様々な人工血管が提案されている。しかしながら、血管の中膜層、特に動脈の中膜層は伸縮性及び弾性を有するにも関わらず、弾性を有する人工血管はまだ提案されていない。例えば、非特許文献１には得られた人工血管が剛性を有することは示されているが、弾性を有することは示されていない。また、非特許文献２の方法は、得られる積層体における弾性線維の発現が低く、積層体を基材から解離した後の自立性が低いという問題がある。さらに、非特許文献１の方法は、移植可能な血管モデルの作製のためには数ヶ月の時間を要するという問題がある。【０００６】
そこで、本開示は、弾性を有する三次元組織体及びそれを製造可能な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体に関する。【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む三次元組織体の製造方法であって、前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、弾性線維を有する三次元組織体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは実施例１の三次元組織体の画像、図１Ｂはラット新生児の血管の画像、図１Ｃは成体ラットの血管の画像、図１Ｄは比較例１の三次元組織体の画像を示す。
【図２】図２は、実施例１の三次元組織体及びラット新生児の血管の蛍光免疫組織切片写真の一例を示す。
【図３】図３は、実施例１の三次元組織体の弾性評価実験の画像の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を、細胞外マトリックス成分を介して積層して三次元組織化することによって、弾性を有する三次元組織体を製造できる、との知見に基く。
【００１２】
未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を、細胞外マトリックス成分を介して積層することによって、弾性を有する三次元組織体を製造できるメカニズムは明らかではないが、以下のように推察される。すなわち、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞は、細胞回収のためのトリプシン等の細胞解離剤による処理後も平滑筋細胞の形質が保たれる。また、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を積層して培養することによって、積層された該平滑筋細胞が三次元組織体において細胞外マトリックス成分を分泌し、この分泌された細胞外マトリックス成分が弾性線維の発現に寄与し、弾性を有する三次元組織体が得られるものと考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１３】
本開示において「未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞」とは、一又は複数の実施形態において、分化した形質を示す平滑筋細胞、及び分化した形質と未分化な形質との双方を併せ持つ平滑筋細胞（いわゆる、未分化型から分化型に分化する過程の平滑筋細胞）を含む。分化型（収縮型）平滑筋細胞は、一又は複数の実施形態において、未分化型（合成型）平滑筋細胞と比較して、収縮タンパク質に富み、収縮に特化し、及び又は分裂能（増殖能）が低い平滑筋細胞をいう。「未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞」であるか否かは、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を１、２、３、４又は５日間培養して増殖能の程度を確認することによって判別することができる。また、ＳＭ２２，ＳＭ１，ＳＭ２，ＳＭｅｍｂ等のマーカーを用いて判別することもできる。分化型に方向づけられた細胞では、未分化型の細胞に比べて、ＳＭ２２，ＳＭ１，ＳＭ２が多く発現し、ＳＭｅｍｂの発現は減少している。
【００１４】
未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を分化させること又は平滑筋細胞を形質変換させることによって得ることができ、好ましくは平滑筋前駆細胞又は未分化型若しくは脱分化型の平滑筋細胞を分化型（収縮型）の平滑筋細胞に形質変換させることによって得ることができる。形質変換は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を高密度で培養することによって行うことができる。本開示において「平滑筋細胞を高密度で培養する」とは、実質的に１００％コンフルエントの状態で平滑筋細胞を培養することをいう。実質的に１００％コンフルエントとしては、一又は複数の実施形態において、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％コンフルエントを含む。なお、通常の培養条件で継代培養した平滑筋細胞は、通常、増殖能を有する未分化型の平滑筋細胞である。通常の培養条件としては、例えば、８０％以下、７０％以下、又は５０％以下コンフルエントでの培養が挙げられる。
【００１５】
本開示において「平滑筋細胞」とは、平滑筋を構成する又は構成しうる細胞をいう。平滑筋細胞としては、一又は複数の実施形態において、血管平滑筋細胞、及び気管平滑筋細胞等が挙げられる。平滑筋細胞の由来は特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、ヒト及びヒト以外の動物等が挙げられる。ヒト以外の動物としては、特に限定されず、例えば、霊長類（アカゲザル等）、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、及びブタ等が挙げられる。ヒトの生体組織とより同等の性質・機能を発揮させる観点からは、ヒトが好ましい。また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を分化誘導した平滑筋細胞であってもよい。
【００１６】
本開示において「弾性を有する」とは、三次元組織体に力を加えると三次元組織体が伸長し、除荷すれば略元の寸法に戻ることができる性質を有することをいう。三次元組織体に加える力としては、一又は複数の実施形態において、引っ張り力等が挙げられる。本開示において「弾性を有する」としては、一又は複数の実施形態において、少なくとも１．２倍の長さに伸ばすことが可能であることをいい、好ましくは少なくとも１．３倍、１．４倍、１．５倍又は２倍の長さに伸ばすことが可能であることをいい、より好ましくは三次元組織体を伸ばした後元の長さに戻ることが可能であることをいう。本開示において「少なくとも１．２倍の長さに伸ばすことが可能」とは、伸長方向における伸長前の三次元組織体の長さを１とした場合、伸長後の伸長方向における三次元組織体の長さが１．２又はそれ以上になることをいう。また、本開示において「弾性を有する」としては、一又は複数の実施形態において、三次元組織体における弾性線維の発現が高いことをいう。弾性線維の発現は、一又は複数の実施形態において、Ｅｌａｓｔｉｃａ  ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色や、放射性同位元素（［3Ｈ］ｖａｌｉｎｅ）で評価できる。
【００１７】
本開示において「平滑筋細胞が細胞外マトリックス成分を介して積層され」とは、平滑筋細胞が細胞外マトリックス成分を介して三次元的に積み重ねられることをいい、好ましくは平滑筋細胞を含む細胞層が複数層積層されていることをいう。「細胞層が複数層積層されている」とは、一又は複数の実施形態において、細胞層が単層の細胞培養体ではないことをいう。
【００１８】
本開示において「細胞外マトリックス成分」とは、生体内で細胞の外の空間を充填して骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たす物質をいう。また、細胞外マトリックス成分は、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでもよく、また人工的に合成された物質やその一部を含んでもよい。細胞外マトリックス成分としては、後述の例又は特許４９１９４６４号及び特開２０１２−１１５２５４号に開示のものが使用できる。
【００１９】
本開示において「三次元組織体」とは、細胞外マトリックス成分と、細胞外マトリックス成分を介して積層された平滑筋細胞とを含み、かつ、弾性を有するものをいう。三次元組織体に含まれる細胞が平滑筋細胞であることは、一又は複数の実施形態において、ａｌｐｈａ  ＳＭＡ（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）陽性を検出することで確認できる。本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞以外の細胞を含んでいてもよい。平滑筋細胞以外の細胞としては、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞、線維芽細胞、及び血球由来細胞等が挙げられる。本開示の三次元組織体に含まれる細胞の由来は特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、ヒト及びヒト以外の動物等が挙げられる。ヒト以外の動物は、上記の通りである。
【００２０】
［三次元組織体］
本開示は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体（以下、「本開示の三次元組織体」ともいう）に関する。本開示の三次元組織体は、弾性を有し、一又は複数の実施形態において、高いレベルで弾性線維が発現しているため、優れた自立性を示す、すなわち支持体なしで三次元構造が維持され組織片として利用できるという効果を奏する。このため、本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、管状等への成形が可能となりうる。本開示の三次元組織体は、後述する本開示の製造方法によって製造できる。
【００２１】
本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分と積層された平滑筋細胞とを含む中膜層と、中膜層上に形成された内皮細胞を含む内膜層とを有する。本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、外膜層、外膜層上に形成された中膜層、及び中膜層上に形成された内膜層を含み、外膜層は線維芽細胞を含み、中膜層は細胞外マトリックス成分と積層された平滑筋細胞とを含み、内膜層は内皮細胞を含む。
【００２２】
本開示の三次元組織体は、自立性に優れることから、一又は複数の実施形態において、移植用血管として利用でき、また人工血管としての形成が可能となるという効果を奏する。本開示の三次元組織体は、弾性を有することから、一又は複数の実施形態において、冠動脈等の屈折部を有していたり、管径の細い血管のための人工血管としても利用できる。また、本開示の三次元組織体は、生体内の血管と同様に弾性を有することから、一又は複数の実施形態において、血管疾患の病態解明や薬理効果評価のための血管モデルとしても使用できる。
【００２３】
［三次元組織体の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む、三次元組織体の製造方法であって、前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である製造方法（以下、「本開示の製造方法」ともいう）に関する。本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞の積層開始から１週間〜数週間といった短い期間で、弾性線維の発現が高く自立性に優れる三次元組織体を製造できる。
【００２４】
細胞外マトリックス成分を介した平滑筋細胞の積層は、一又は複数の実施形態において、未分化型から分化型に方向付けられた細胞を含む細胞液を用いて平滑筋細胞を積層することを含む。
【００２５】
本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、細胞液を調製することを含んでもよい。細胞液は、一又は複数の実施形態において、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を培地等に分散させることによって調製することができる。細胞液の調製は、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞を分化型に分化させる点から、高密度で平滑筋細胞を培養することを含む。高密度での培養期間は、平滑筋細胞の由来に応じて適宜決定できる。平滑筋細胞がラット又はマウス由来の場合、高密度での培養期間は、一又は複数の実施形態において、６日以上、７日以上、若しくは８日以上であり、又は２０日以下若しくは１５日以下である。また、平滑筋細胞がヒト由来の場合、高密度での培養期間は、一又は複数の実施形態において、２日以上であり、又１０日以下、８日以下又は５日以下である。培養温度は特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。培地は、一又は複数の実施形態において、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。
【００２６】
高密度で培養する平滑筋細胞は、三次元組織体における弾性線維の産生量を向上させ、三次元組織体の弾性を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、平滑筋前駆細胞、及び合成型の平滑筋細胞が挙げられ、また、胎児期の平滑筋細胞又は幼年期までの平滑筋細胞等が挙げられる。幼年期までの平滑筋細胞は、一又は複数の実施形態において、増殖能が高く、細胞外基質や増殖因子などを盛んに産生し、合成型であることが知られている。平滑筋細胞は、一又は複数の実施形態において、動脈等から採取できる。動脈としては、大動脈、冠状動脈、肺動脈、及び臍帯動脈等が挙げられる。幼年期までの平滑筋細胞は、一又は複数の実施形態において、臍帯動脈等から採取できる。
【００２７】
細胞液の調製は、一又は複数の実施形態において、高密度で培養した細胞を解離処理することを含む。解離処理に用いる細胞解離剤としては、一又は複数の実施形態において、トリプシン等が挙げられる。解離処理条件は特に制限されるものではない。解離処理温度は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。解離処理時間は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、１０〜１２０分、１５〜６０分、又は１５〜４５分である。細胞液の調製は、一又は複数の実施形態において、解離処理した細胞を培地に分散させることを含む。培地は上述の通りである。
【００２８】
細胞外マトリックス成分を介した平滑筋細胞の積層は、一又は複数の実施形態において、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を含む細胞層（以下、単に「細胞層」ともいう）の形成と細胞外マトリックス成分を含む層（以下、「細胞外マトリックス成分層」ともいう）の形成とを交互に行うこと（第１の積層方法）、又は、細胞外マトリックス成分で被覆された未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を積層すること（第２の積層方法）によって行うことができる。
【００２９】
［第１の積層方法］
第１の積層方法は、細胞層の形成と細胞外マトリックス成分層の形成とを交互に行うことによって、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を含む細胞層を複数層積層することを含む。細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を含む細胞液を基材又は細胞外マトリックス成分層上に配置し、培養することによって行うことができる。細胞液における未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、１×１０2〜１×１０7個／ｍＬ、１×１０3〜１×１０6個／ｍＬ、又は１×１０3〜１×１０5個／ｍＬである。配置する未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０2〜１×１０9個／ｃｍ2、１×１０4〜１×１０8個／ｃｍ2、１×１０5〜１×１０7個／ｃｍ2又は１×１０5〜１×１０6個／ｃｍ2である。インキュベーション温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。細胞層１層形成あたりのインキュベーション時間は、一又は複数の実施形態において、１〜２４時間、３〜１２時間、又は３〜６時間である。基材としては、特に限定されるものではなく、従来公知及び今後開発されるものが使用できる。
【００３０】
細胞外マトリックス成分層の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に、細胞外マトリックス成分を含む液を配置することによって形成できる。細胞外マトリックス成分層の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に、物質Ａを含む液（溶液Ａ）と、物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む液（溶液Ｂ）とを交互に配置することによって形成できる。細胞外マトリックス成分層の形成は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａと溶液Ｂとを交互に配置することを１セットとして、これを２セット、又は３セット以上繰返し行うことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質又は高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質又は高分子と相互作用するタンパク質又は高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質又は高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質又は高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。溶液Ａ（溶液Ｂ）は、一又は複数の実施形態において、物質Ａ（物質Ｂ）と溶媒又は分散媒体（以下、単に「溶媒」ともいう）とを含む。溶液Ａ（溶液Ｂ）における物質Ａ（物質Ｂ）の含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１〜１質量％、０．０１〜０．５質量％、又は０．０２〜０．１質量％である。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３〜１１、６〜８、又は７．２〜７．４である。
【００３１】
本開示の製造方法は、細胞層の形成と細胞外マトリックス成分層の形成とを交互に行うことによって前記細胞層を複数層積層することを含む。積層する細胞層の数は、特に制限されないが、ヒト等の生体組織とより同等の性質・機能を発揮させる観点から、５層以上、６層以上、又は７層以上が好ましく、また１５層以下、１４層以下、１３層以下、１２層以下、１１層以下、又は１０層以下が好ましい。なお、第１の積層方法は、一又は複数の実施形態において、特許４９１９４６４号に開示された方法を参酌して行うことができる。
【００３２】
［第２の積層方法］
第２の積層方法は、細胞外マトリックス成分で被覆された平滑筋細胞を積層することによって、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞を三次元的に積み重ねることを含む。
【００３３】
細胞外マトリックス成分で被覆された平滑筋細胞（以下、「被覆細胞」ともいう）は、一又は複数の実施形態において、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞と、平滑筋細胞を覆う細胞外マトリックス成分を含む膜（以下、「細胞外マトリックス成分膜」ともいう）とを含む。細胞外マトリックス成分膜は、物質Ａを含む膜と、前記物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含むことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、上述の通りである。
【００３４】
細胞外マトリックス成分膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１〜１×１０3ｎｍ、又は２〜１×１０2ｎｍであり、被覆細胞がより密に積層された三次元組織体が得られるという理由から、３〜１×１０2ｎｍが好ましい。細胞外マトリックス成分膜の厚みは、例えば、被膜を構成する膜の数によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分膜は、特に制限されず、１層であってもよいし、一又は複数の実施形態において、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。
【００３５】
被覆細胞の積層は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞が三次元的に積み重ねられた状態となるように被覆細胞を播種し、培地で培養することを含む。播種時の被覆細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、目的とする三次元組織体の大きさ及び厚み、培養する容器の大きさならびに積層される細胞の数等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2〜１×１０9個／ｃｍ3、１×１０4〜１×１０8個／ｃｍ3、又は１×１０5〜１×１０7個／ｃｍ3である。培地及び培養条件は上述の通りである。
【００３６】
被覆細胞は、一又は複数の実施形態において、物質Ａを含む溶液（溶液Ａ）と、物質Ｂを含む溶液（溶液Ｂ）とを、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞に交互に接触させることにより調製することができる。溶液Ａ及び溶液Ｂは上述の通りである。なお、第２の積層方法は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法を参酌して行うことができる。
【００３７】
本開示の製造方法は、三次元組織体における弾性線維の発現を向上させ、三次元組織体の自立性を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、細胞を積層して得られた積層体を１日間以上培養することを含んでいてもよい。細胞を培養する期間は、一又は複数の実施形態において、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、１０日以上、又は１５日以上であり、また３０日以下、２５日以下、又は２１日以下である。
【００３８】
本開示の製造方法は、ヒト等の生体組織とより同等の性質及び又は機能を発揮させる観点から、一又は複数の実施形態において、平滑筋細胞が積層された細胞層上に、血管内皮細胞を含む細胞液を配置し培養することが好ましい。一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞の細胞層が１層となるように細胞液を配置することが好ましい。培養条件は上述の通りである。
【００３９】
本開示の製造方法は、ヒト等の生体組織とより同等の性質及び又は機能を発揮させる観点から、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞が細胞外マトリックス成分を介して積層された線維芽細胞層上に、上述の平滑筋細胞を含む細胞液を配置し、平滑筋細胞が積層された細胞層を形成することが好ましい。
【００４０】
［人工血管］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の三次元組織体を成形することによって得られた人工血管に関する。本開示の人工血管は、本開示の三次元組織体を成形したものであるため、一又は複数の実施形態において、自立性に優れる。本開示の人工血管の形状は、一又は複数の実施形態において、管状であることが好ましい。
【００４１】
［評価方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の三次元組織体を用いた被検物質の血管に対する影響を評価する方法に関する。本開示の評価方法によれば、一又は複数の実施形態において、実際の血管に近い環境で被検物質の評価を行うことができる。本開示の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価において極めて有用なツールとなりうる。
【００４２】
本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、被検物質を本開示の三次元組織体に接触させること、被検物質の三次元組織体への影響を観察すること、及び観察結果に基づいて被検物質を評価することを含む。
【００４３】
［評価キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、被検物質の評価キットに関する。本開示のキットは、本開示の三次元組織体を含む。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、所定の検査に用いる試薬、材料、用具、及び装置、並びに、その評価についての説明書（取扱説明書）の少なくとも１つを含む製品をさらに含んでもよい。
【００４４】
以下に、細胞外マトリックス成分として記載したＲＧＤ配列を有する物質、相互作用を有する物質、正の電荷を有する物質、及び負の電荷を有する物質について、例を挙げて説明する。
【００４５】
（ＲＧＤ配列を有する物質）
ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００４６】
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
【００４７】
ＲＧＤ配列を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００４８】
ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
【００４９】
（相互作用する物質）
相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００５０】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、上述のＲＧＤ配列を有する合成高分子として例示したものが挙げられる。
【００５１】
相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
【００５２】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子又はタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００５３】
（正の電荷を有する物質）
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００５４】
（負の電荷を有する物質）
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００５５】
正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、一又は複数の実施形態において、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００５６】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕  平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体。
〔２〕  前記三次元組織体は、少なくとも１．２倍の長さに伸ばすことが可能である、〔１〕記載の三次元組織体。
〔３〕  平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む、三次元組織体の製造方法であって、
前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である、製造方法。
〔４〕  平滑筋細胞を高密度で培養することによって、前記平滑筋細胞を調製することを含む、〔３〕記載の製造方法。
〔５〕  前記平滑筋細胞は、胎児期又は幼年期の平滑筋細胞である、〔３〕又は〔４〕記載の製造方法。
〔６〕  前記積層は、前記平滑筋細胞の細胞層の形成と前記細胞外マトリックス成分を含む層の形成とを交互に行うこと、又は、前記細胞外マトリックス成分で被覆された平滑筋細胞を積層することを含む、〔３〕から〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕  〔３〕から〔６〕のいずれかに記載の製造方法により製造された、弾性を有する三次元組織体。
【００５７】
以下に、実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
［平滑筋細胞（ＳＭＣ）液の調製］
ラット新生児より回収した大動脈平滑筋細胞を４継代培養したものを１１日間培養した。なお、１１日間の培養のうち、７日間の培養を９５％以上コンフルエントの密度で行った。トリプシン処理（０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（３７℃、５−７分間）して回収した細胞を、５０％コンフルエントの密度で播種し５日間培養した。なお、この５日間の培養では細胞の増殖能は極めて低かった。このため、この細胞は、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞であることが確認できた。５日間培養した細胞を上記と同様の条件でトリプシン処理して回収し、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地に分散させてＳＭＣ液を調製した。なお、培地は１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用い、培地交換は４８時間ごとに行った。【００５９】
［フィブロネクチン溶液（ＢＦＮ溶液）の調製］
ウシ血漿由来フィブロネクチン（製品番号Ｆ１１４１、ＳＩＧＭＡ製、溶液、１ｍｇ／ｍＬ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈してＢＦＮ溶液を調製した。【００６０】
［Ｇｅｌａｔｉｎ溶液の調製］
ゼラチン（製品番号０７７−０３１５５、Ｗａｋｏ製）を０．２ｍｇ／ｍｌ  となるように、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で３７℃で３−４時間かけて溶解してＧｅｌａｔｉｎ溶液を調製した。【００６１】
［三次元組織体の作製］
セルディスク（品名セルディスクＬＦ、住友ベークライト製）をＢＦＮ溶液２ｍＬに浸漬（３７℃、各１分）しセルディスク表面にＢＦＮ層を形成した後、ＢＦＮ層上にＳＭＣ液を配置した。ＳＭＣ液の配置は、ＳＭＣが１１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2播種されるように行った。細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）で半日培養することで細胞を接着させてＳＭＣ層（第１層）を形成した。つぎに、ＳＭＣ層を、ＢＦＮ溶液２ｍＬとＧｅｌａｔｉｎ溶液２ｍＬとに交互に計９回浸漬（３７℃、各１分）してＳＭＣ層表面にフィブロネクチン−ゼラチン（ＦＮ−Ｇ）ナノ薄膜を形成した。ＦＮ−Ｇナノ薄膜上に速やかにＳＭＣ液を配置し（ＳＭＣ：１１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）で６−１２時間培養することで細胞を接着させてＳＭＣ層（第２層）を形成した。このＳＭＣ層の形成とＦＮ−Ｇナノ薄膜との形成とを交互に繰返し行うことによって、４日間で７層のＳＭＣ層を積層した後、３日間培養することによって７層のＳＭＣ層を含む三次元組織体を形成した。なお、培地は、７層のＳＭＣ層を積層する間は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用い、その後３日間は１−２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。培地交換は１日ごとに行った。【００６２】
（比較例１）
［細胞液の調製］
ラット新生児より回収した大動脈平滑筋細胞を５−７継代培養したものを、８０％コンフルエントの密度の状態でトリプシン処理（０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（３７℃、５−７分間）して細胞を回収した。回収した細胞を、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に分散させて細胞液を調製した。なお、培地交換は４８時間ごとに行った。
［三次元組織体の作製］
ＳＭＣ液に代えて上記の細胞液を使用した以外は、実施例１と同様の手順で、４日間で７層のＳＭＣ層を積層した。その後、１−２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３７℃で４８時間培養することによって７層のＳＭＣ層を含む三次元組織体を形成した。【００６３】
［組織染色による評価］
得られた三次元組織体及びラットの血管の弾性線維の発現をＥｌａｓｔｉｃａ  ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色にて評価した。その画像を図１Ａ〜Ｄに示す。図１Ａは実施例１の三次元組織体の画像、図１Ｂはラット新生児の血管の画像、図１Ｃは成体ラットの血管の画像、図１Ｄは比較例１の三次元組織体の画像である。
また、弾性線維の発現に重要なｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−１，−２の発現を免疫染色で評価した。その画像を図２に示す。図２は、得られた三次元組織体の蛍光免疫組織切片写真の一例であって、上側の画像が実施例１の三次元組織体の画像であり、下側の画像がラット新生児の血管の画像である。【００６４】
図１Ａ及びＤに示すように、実施例１の三次元組織体は、比較例１の三次元組織体と比較して弾性線維の発現が極めて高かった。図１Ａ〜Ｃ及び図２に示すように、実施例１の三次元組織体は、ラット新生児及び成体ラットに匹敵する高いレベルで弾性線維が発現していることが確認できた。また、実施例１の三次元組織体における弾性線維は、ラット新生児及び成体ラットの弾性線維と同様に厚い層状となっている。これらのことから、実施例１の三次元組織体は、高い弾性を示すことが示唆された。【００６５】
［目視による弾性評価］
実施例１で作製した三次元組織体の弾性を目視により評価した。その評価実験の画像を図３に示す。すなわち、図３において、左から順に、実施例１で作製した三次元組織体をセルディスクから解離した画像、解離した三次元組織体を毛細管に巻きつけた画像、それを長手方向に引っ張った様子の画像をそれぞれ示す。図３に示すように、実施例１の三次元組織体は、管状に成形可能な程度の自立性を示し、かつ長手方向（伸長方向）に対して２倍程度の伸びを示した。よって、実施例１の三次元組織体は、十分な自立性を示すと共に、優れた弾性を示すことが確認できた。なお、比較例１の三次元組織体は、引っ張ることができなかった。【００６６】
したがって、実施例１の方法によれば、優れた弾性を示す三次元組織体を短期間で製造することができた。【００６７】
（比較例２）
細胞液の調製において、４継代の培養期間を１１日間に代えて９日間（９５％以上コンフルエント培養：５日間）とした以外は実施例１と同様にして三次元組織体を作製した。積層に用いた平滑筋細胞は、細胞増殖能が高く、未分化型から分化型に分化されておらず、平滑筋細胞を積層できたものの、得られた三次元組織体は弾性を有さなかった。【００６８】
（実施例２）
［三次元組織体の作製］
ＳＭＣ層を１日に１層、つまり７日間で７層のＳＭＣ層の積層を行った（ＳＭＣ液配置後の培養時間を１２−２４時間とした）以外には、実施例１と同様にしてＳＭＣ層の形成とＦＮ−Ｇナノ薄膜との形成とを交互に繰返し行い、その後、３日間培養することによって７層のＳＭＣ層を含む三次元組織体を形成した。
得られた三次元組織体について弾性を目視により評価した。作製した三次元組織体をセルディスクから解離し、それを長手方向に引っ張ったところ、伸長方向に対して２倍程度の伸びを示した。
【図１】
2015053367.tif 000003
【図２】
2015053367.tif 000004
【図３】
2015053367.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月10日(2015.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平滑筋細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記平滑筋細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層された弾性を有する三次元組織体。
【請求項２】
前記三次元組織体は、少なくとも１．２倍の長さに伸ばすことが可能である、請求項１記載の三次元組織体。
【請求項３】
平滑筋細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することを含む、三次元組織体の製造方法であって、
前記平滑筋細胞が、未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞である、製造方法。
【請求項４】
平滑筋細胞を高密度で培養することによって、前記平滑筋細胞を調製することを含む、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記平滑筋細胞は、胎児期又は幼年期の平滑筋細胞である、請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
前記積層は、前記平滑筋細胞の細胞層の形成と前記細胞外マトリックス成分を含む層の形成とを交互に行うこと、又は、前記細胞外マトリックス成分で被覆された平滑筋細胞を積層することを含む、請求項３から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項３から６のいずれかに記載の製造方法により製造された、弾性を有する三次元組織体。
【請求項８】
実質的に１００％コンフルエントの状態で平滑筋細胞を培養すること、
前記培養した細胞を解離処理して回収すること、及び
前記回収した細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層して培養することを含む、三次元組織体の製造方法。
【請求項９】
前記平滑筋細胞の培養は、平滑筋前駆細胞、未分化型の平滑筋細胞及び脱分化型の平滑筋細胞からなる群から選択される平滑筋細胞を実質的に１００％コンフルエントになるまで培養し、さらに実質的に１００％コンフルエントの状態で培養することを含む、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記実質的に１００％コンフルエントの状態で平滑筋細胞を培養することによって、平滑筋細胞を未分化型から分化型に方向付けられた平滑筋細胞とする、請求項８又は９に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2015053367.tif 000006
2015053367.tif 000007