(57)【要約】  疎水化冷水魚由来ゼラチンを含む第１剤と、水溶性架橋用分子を含む第２剤とからなる外科用シーラントであって、前記水溶性架橋用分子は、２個以上の活性エステル基を有する多塩基酸、酸無水物及び２個以上のアルデヒド基を有するアルデヒド化合物からなる群より選ばれる少なくとも一種であり、前記疎水化冷水魚由来ゼラチンは冷水魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の少なくとも一部が疎水性基で置換されたゼラチンであり、前記疎水性基が、置換率（疎水性基のモル数／（疎水性基とゼラチン中の反応性アミノ基との合計モル数）×１００）が３〜２０モル％の、炭素数８〜１８の直鎖脂肪族基である、ことを特徴とする外科用シーラント。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水化冷水魚由来ゼラチンを含む第１剤と、水溶性架橋用分子を含む第２剤とからなる外科用シーラントであって、
前記水溶性架橋用分子は、２個以上の活性エステル基を有する多塩基酸、酸無水物及び２個以上のアルデヒド基を有するアルデヒド化合物からなる群より選ばれる少なくとも一種であり、
前記疎水化冷水魚由来ゼラチンは冷水魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の少なくとも一部が疎水性基で置換されたゼラチンであり、
前記疎水性基が、置換率（疎水性基のモル数／（疎水性基とゼラチン中の反応性アミノ基との合計モル数）×１００）が３〜２０モル％の、炭素数８〜１８の直鎖脂肪族基である、ことを特徴とする外科用シーラント。
【請求項２】
前記疎水化冷水魚由来ゼラチンの分子量が１００００以上１５００００以下であることを特徴とする請求項１に記載の外科用シーラント。
【請求項３】
前記冷水魚由来ゼラチンが、タイ、ティラピア、タラ、サケあるいはこれらの遺伝子組換え冷水魚由来ゼラチンの１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外科用シーラント。
【請求項４】
前記冷水魚由来ゼラチンが、構成アミノ酸１０００個当たりイミノ酸が１９０個以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の外科用シーラント。
【請求項５】
疎水性基が、前記構成アミノ酸の一つであるＬｙｓのアミノ基の一部に結合されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の外科用シーラント。
【請求項６】
前記水溶性架橋用分子が、ポリエチレングリコール  ジスクシンイミジル  スクシネート、ペンタエリスリトール−ポリ（エチレングリコール）エーテル  テトラスクシンイミジル  グルタレート、及びポリ−Ｌ−グルタミン酸スクシンイミドからなる群より選ばれる１種または２種以上の組合せであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の外科用シーラント。
【請求項７】
第１剤がｐＨ８〜１１の水溶液の形態で使用され、第２剤がｐＨ３〜８の水溶液の形態で使用され、それらの混合液のｐＨが８〜９となるように混合されて使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の外科用シーラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外科用シーラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
外科用シーラント（以下、「シーラント」という）は、血管、皮膚等の生体組織（以下、「組織」という）における患部を縫合した後に適用されて膜を形成し、血液や体液の漏出、ウージング、気体のリーク等を防止する材料である。外科適用範囲は、呼吸器外科、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科等である。外科用シーラントには、（１）塗布性に優れること、（２）形成されるゲル膜の強度が高いこと、（３）ゲル化時間が短いことが要求される。また、（４）組織に対してゲル膜の界面接着強度が高く、（５）ゲル膜の含水率変化が少なく、柔軟性に優れていることが好ましい。【０００３】
現在、シーラントとして、主に使用されているものは、フィブリン系外科用シーラントであり、製品としてはボルヒール（商品名、Ｂｏｌｈｅａｌ，化学及血清療法研究所製）がある。この外科用シーラントは、生体由来成分で構成されているため、生体親和性は高いが、接着強度が低いという課題がある。【０００４】
近年、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：以下、ＨＳＡ）と架橋剤とからなる外科用シーラントの接着強度が高いことが分かってきた（非特許文献１）。ＨＳＡは、血液製剤から作られる血清タンパク質であり、分子量６９０００、直径約１０ｎｍの球状であり、マイナスチャージを持った酸性タンパク質である。また、架橋剤としては、酒石酸（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｔａｒｔａｒａｔｅ：以下、ＤＳＴ）が用いられている。しかし、血液製剤を使うと医薬品の分類となるため、承認認可の面で多大な労力を必要とする。また、医薬品となる場合には、認可後も、使用履歴を２０年間継続して残さねばならず、多大な労力を必要とするという課題がある。【０００５】
そのため、ＨＳＡに代わり、非血液製剤であるゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）の使用が検討されている。例えば、特許文献１では、ゼラチンをスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸により架橋して調製する医用材料が開示されている。また、特許文献２は、組織接着フィルムに関するものであり、ゼラチン又はコラーゲンから作成される組織接着フィルムが開示されている。しかし、これらの材料は、膜強度と界面接着強度の双方が要求される封止力が十分でないという課題がある。また、特許文献３は、組織接着構成物に関するものであり、粒子形態の合成および／または架橋性の材料と、粒子状材料とが混合された組織接着構成物が開示されている。しかし、この組織接着構成物も、封止力が十分でないという課題がある。【０００６】
上記課題を解決すべく、本発明者はゼラチンの誘導化法（非特許文献１）を用いて、側鎖に疎水性基を備えたゼラチンを合成し、該ゼラチンと架橋剤からなる組織接着剤を提案した（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９―１０３４７９号公報
【特許文献２】特開２００８−２８４２５６号公報
【特許文献３】特表２００６−５２３１１３号公報
【特許文献４】ＷＯ  ２０１４／１１２２０８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．，２４，５４６−５５９（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記組織接着剤は、優れた組織への接着力を示す。しかし、上述のとおり、シーラントには接着力だけでなく、血液や体液の圧力に耐えるための膜自体の強度（以下「膜強度」という）も要求される。そこで、本発明は、上記接着剤を膜強度の点でさらに改良し、優れたシーラントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
種々検討したところ、疎水性基が所定の炭素数の脂肪族基である場合に、優れた膜強度、引いては封止力を達成できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）疎水化冷水魚由来ゼラチンを含む第１剤と、水溶性架橋用分子を含む第２剤とからなる外科用シーラントであって、
前記水溶性架橋用分子は、２個以上の活性エステル基を有する多塩基酸、酸無水物及び２個以上のアルデヒド基を有するアルデヒド化合物からなる群より選ばれる少なくとも一種であり、
前記疎水化冷水魚由来ゼラチンは冷水魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の少なくとも一部が疎水性基で置換されたゼラチンであり、
前記疎水性基が、置換率（疎水性基のモル数／（疎水性基とゼラチン中の反応性アミノ基との合計モル数）×１００）が３〜２０モル％の、炭素数８〜１８の直鎖脂肪族基である、
ことを特徴とする外科用シーラント。【００１１】
（２）  前記疎水化冷水魚由来ゼラチンの分子量が１００００以上１５００００以下であることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。【００１２】
（３）  前記冷水魚由来ゼラチンがタイ、ティラピア、タラ、サケあるいはこれらの遺伝子組換え冷水魚由来ゼラチンの１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。【００１３】
（４）  前記冷水魚由来ゼラチンが構成アミノ酸１０００個当たりのイミノ酸が１９０個以下とされていることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。【００１４】
（５）  疎水性基が、前記構成アミノ酸の一つであるＬｙｓのアミノ基の一部に結合されていることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。【００１５】
（６）  前記水溶性架橋用分子が、ポリエチレングリコール  ジスクシンイミジル  スクシネート、ペンタエリスリトール−ポリ（エチレングリコール）エーテル  テトラスクシンイミジル  グルタレート、及びポリ−Ｌ−グルタミン酸スクシンイミドからなる群より選ばれる１種または２種以上の組合せであることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。【００１６】
（７）  第１剤がｐＨ８１１の水溶液の形態で使用され、第２剤がｐＨ３〜８の水溶液の形態で使用され、それらの混合液のｐＨが８〜９となるように混合されて使用されることを特徴とする（１）に記載の外科用シーラント。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の外科用シーラントの疎水化冷水魚由来ゼラチン（以下、「疎水化ゼラチン」という場合がある）は、炭素数８〜１８の直鎖脂肪族基を備え、これにより高い膜強度を示す。特許文献４記載のシーラントでは、ゼラチンがこれらの基を有する場合、炭素数がより少ない基及び脂環式基を有する場合に比べて接着強度が弱く、置換率をかなり高くしなければ同等の接着力を示すことができない。ところが驚くことに、圧縮強度で評価することができる膜強度の点では、これらの基の方が、置換率が低くても接着力の低さを補って余りある顕著に高い膜強度を有し、その結果、高い封止力を示すことが見出された。該外科用シーラントは、血液等の漏れの防止が鍵となる外科手術、例えば血管吻合手術等に大変有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の外科用シーラントの第２剤における水溶性架橋用分子の一例を示す図である。
【図２】本発明の外科用シーラントの第１剤における疎水化冷水魚由来ゼラチンの一例を示す説明図である。
【図３】本発明の外科用シーラントを用いたゲル膜形成の工程図の一例を示す図である。
【図４】１．９Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例２）、８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例１）、１２．２Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例３）のディスクゲルの貯蔵弾性係数の角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）である。
【図５】３．２Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎ（参考例４）、６．４Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎ（参考例５）、１３．７Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎ（参考例６）のディスクゲルの貯蔵弾性係数の角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）である。
【図６】２．１Ｈｘ−ｃＧｌｔｎ（参考例７）、８．５Ｈｘ−ｃＧｌｔｎ（参考例８）、１８．３Ｈｘ−ｃＧｌｔｎ（参考例９）の貯蔵弾性係数の角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）である。
【図７】３．８Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎ（実施例２）、９．０Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎ（実施例３）、１９．０Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎ（実施例４）の貯蔵弾性係数の角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）である。
【図８】４．０Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例５）、９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例１）、１８．７Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例６）の貯蔵弾性係数の角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）である。
【図９】各疎水性基の置換率に対する圧縮弾性係数をプロットしたグラフである。
【図１０】各ディスクゲルの含水率（算出値）の経時変化を示すグラフであって、（ａ）はＯｒｇ−ｃＧｌｔｎ（比較例１）であり、（ｂ）は８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例１）であり、（ｃ）は９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例１）である。
【図１１】各ディスクゲルの膨潤度の経時変化を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜水溶性架橋用分子＞
図１は、本発明の外科用シーラントの第２剤における水溶性架橋用分子の一例である、ペンタエリスリトール−ポリ（エチレングリコール）エーテル  テトラスクシンイミジル  グルタレート（略称：４Ｓ−ＰＥＧ）の構造を示す図である。同図において、ｎは分子量（Mｎ)が８０００〜１２，０００程度となる数である。４Ｓ−ＰＥＧは、ＰＥＧ残基を含む分岐鎖の末端に、疎水化ゼラチンと反応する活性エステル基を有する。４Ｓ−ＰＥＧは生体安全性が高く、容易に水に溶解する。
【００２０】
水溶性架橋用分子は、２個以上の活性エステル基を有する多塩基酸、酸無水物及び２個以上のアルデヒド基を有するアルデヒド化合物からなる群より選ばれる少なくとも一種である。これらの基は、疎水化ゼラチン中の活性エステルと反応性のアミノ基と反応して架橋構造を形成する。
【００２１】
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基で活性化されたエステル基の１種または２種以上の組み合わせであることが好ましい。スクシンイミドは、生体内の代謝経路に存在するコハク酸の誘導体であり、アメリカ食品医薬品局で認可された外科用シーラントに使用されている実績がある。
【００２２】
多塩基酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、cis−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が例示され、例えばジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）、ポリ−Ｌ−グルタミン酸スクシンイミジル等を使用することができる。
【００２３】
２個以上の活性エステル基を有する多塩基酸の好ましい例としては、上記４Ｓ−ＰＥＧの他、下記式で表されるポリエチレングリコール  ジスクシンイミジル  スクシネート（ＰＥＧ−（ＳＳ）２）、
【化１】
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ポリ−Ｌ−グルタミン酸スクシンイミドの群から選ばれる１種または２種以上の組合せを用いることができる。
【００２４】
アルデヒド化合物としては、１分子中に２つ以上のアルデヒド基が導入された、アルデヒド基導入多糖類、例えばアルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストラン、及びアルデヒド基導入ヒアルロン酸が、酸無水物としては、無水グルタル酸、無水マレイン酸、及び無水コハク酸が、ジイソチオシアンネートとしてはヘキサメチレンジイソチオシアネート等が例示される。
【００２５】
該架橋剤は、疎水化ゼラチンの反応性アミノ基１当量に対して、該架橋剤中の活性基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基で活性化されたエステル基が０．２〜３当量、好ましくは０．３〜２当量、より好ましくは０．４〜１．５当量、最も好ましくは０．５〜１．２当量となる量で使用される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計当量が上記範囲となる量とする。
【００２６】
第２剤は、ｐＨ３〜８の水溶液の形態で使用されることが好ましく、より好ましくはｐＨが４〜６である。該ｐＨとするための水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、各種緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）、又はこれらの混合物を用いることができる。
【００２７】
＜疎水化冷水魚由来ゼラチン＞
図２は、本発明の外科用シーラントの第１剤に含まれる疎水化冷水魚由来ゼラチンの一例を示す説明図である。該疎水化ゼラチンは、冷水魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を疎水性基で置換したゼラチンである。冷水魚由来ゼラチンを構成するアミノ酸の一つであるＬｙｓのアミノ基の一部が疎水性基で置換されている。Ｌｙｓは、タンパク質を構成するα−アミノ酸の一つであり、側鎖にε−アミノ基を持つ。
【００２８】
疎水化冷水魚由来ゼラチンの分子量（Ｍｗ）は、１０，０００〜１５０，０００であることが好ましく、１０，０００〜１２０，０００であることがより好ましく、最も好ましくは１０，０００〜１００，０００である。分子量が前記範囲のゼラチンと架橋剤から得られる膜は、強度が高く、取扱い性も良い。疎水化冷水魚由来ゼラチンは、水性溶媒への溶解性が高く、ゲル化せず、液体状で保持できる。
【００２９】
冷水魚由来ゼラチンは、タラゼラチンに限られるわけではなく、タイゼラチン、ティラピアゼラチン、サケゼラチン等でもよく、これらの遺伝子組換えゼラチンであってもよい。好ましくは、天然由来のタラゼラチンである。
【００３０】
冷水魚由来ゼラチンは、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であり、構成アミノ酸１０００個当たり、１９０個以下のイミノ酸、すなわち、８０個以下のヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）と、１１０個以下のプロリンを有している。冷水魚由来ゼラチンの常温流動性は、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が８０個以下であること又はプロリンの数が１１０個以下であることに起因すると考えられる。いずれかの条件を満たせば、変性温度がほぼ室温以下となり、常温流動性が生じると考えられる。
【００３１】
タイゼラチンのヒドロキシプロリン数は７３、プロリン数は１０８で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３０２．５Ｋである。ティラピアゼラチンのヒドロキシプロリン数は８２、プロリン数は１１０で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３０９Ｋである。これらに対して、ブタゼラチンのヒドロキシプロリン数は９５、プロリン数は１２１で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３１６Ｋである。
【００３２】
なお、冷水魚由来ゼラチンは、動物由来のゼラチンのアミノ酸配列と類似しており、酵素により容易に分解され、また生体親和性も高い。
【００３３】
第１剤はｐＨ８〜１１の溶液の形態で使用されることが好ましく、９〜１０であることがより好ましい。該ｐＨとするための水性溶媒としては、ホウ酸緩衝液を用いることができる。第１剤水溶液中の疎水化冷水魚ゼラチンの濃度は、１０〜４０ｗ／ｖ％の範囲であり、１５〜３０ｗ／ｖ％が好ましい。
【００３４】
＜疎水性基＞
疎水性基は、置換率（モル％）、即ち（疎水性基のモル数／（疎水性基とゼラチン中の反応性アミノ基との合計モル数）×１００、が３〜２０モル％であり、好ましくは３〜１２モル％、より好ましくは５〜１０モル％である。置換率が前記下限値未満では、圧縮弾性係数が低くなる傾向があり、前記上限値を超えると第１剤水溶液が白濁したり、高粘度となったりする場合がある。
【００３５】
疎水性基は炭素数８〜１８、好ましくは８〜１４の直鎖脂肪族基である。該置換基は、例えばアミド基を介してゼラチンに結合される。直鎖脂肪族基としては、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、テトラデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘキサデセノイル基、オクタデカノイル基、オクタデセノイル基等が挙げられる。
【００３６】
＜添加剤＞
上記第１剤水溶液及び／又は第２剤水溶液は、外科用シーラントに慣用の各種添加剤を、本発明の目的を阻害しない量でさらに含んでよい。該添加剤としては、着色料、ｐＨ調整剤、粘度調整剤等が挙げられる。好ましくは、第１剤あるいは２剤中に着色料を添加し、より好ましくはブリリアントブルーを、第１剤中に、該第１剤の重量の０．００１〜０．１ｗｔ％添加することにより、施術箇所を分かり易くする。
【００３７】
＜外科用シーラントの製造方法＞
本発明の外科用シーラントは、第１剤と第２剤を個別に調製し、適用時もしくは直前に両者を混合して使用する。
【００３８】
［第１剤の調製法］
（１）出発ゼラチン溶液の調製
出発材料のゼラチンを５〜５０ｗｔ／ｖ％となる量で、有機溶媒、例えばジメチルスルホキサイド等に溶解する。
（２）疎水化
工程（１）で得られたゼラチン溶液に、疎水性基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、上記の疎水性基を有する有機酸もしくは酸クロライドを使用することができる。ゼラチンの有機溶媒溶液中に目的とする置換率となる量の有機酸もしくは酸クロライドを添加し、不活性ガス雰囲気下、６０〜１００℃で加熱し、一昼夜攪拌する。
（３）精製
工程（２）で得られた反応溶液に、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールを加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール、酢酸エチル等で洗浄して、最終生成物を得る。
（４）第１剤水溶液の調製
工程（３）で得られたゼラチン誘導体を、１０〜４０ｗ／ｖ％、好ましくは１５〜３０ｗ／ｖでホウ酸緩衝液等に溶解し、ｐＨ８〜１１、好ましくは９〜１０とする。所望により、誘導体化されていないゼラチン、その他添加剤を添加する。
【００３９】
［第２剤の調製法］
第２剤は、市販されている架橋剤を使用してよく、使用に際して、該架橋剤を超純水、ＰＢＳ又はこれらの混合物等の水性溶媒に上述の範囲となる量で溶解して、ｐＨを３〜８、好ましくは４〜６とする。
【００４０】
好ましくは、第１剤水溶液と第２剤水溶液の混合液のｐＨが８〜９となるように、各溶液のｐＨを調製する。例えば、第１剤水溶液をｐＨ９、イオン強度０．０５〜０．１のホウ酸緩衝溶液とし、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１〜０．０３のリン酸緩衝溶液とすることで、同体積で混合した際に８〜９のｐＨとすることができる。又は、第１剤水溶液をｐＨ１０、イオン強度０．０５〜０．１のホウ酸緩衝溶液として、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１〜０．０７のリン酸緩衝溶液としてもよい。
【００４１】
＜組織への適用方法＞
本発明の外科用シーラントは、皮膚、血管、腱、神経、及びリンパ管等の管状組織、肝臓、膵臓、及び心臓などの臓器の断裂部分に適用することができる。なかでも、湿潤組織、例えば、血管、肺等に好適に適用される。適用方法としては、第１剤と第２剤を組織に施与する直前に混合して組織へと施与し、又は、種々の二成分型ディスペンサを用いて同時に施与してよい。
【００４２】
図３は、二成分型ディスペンサを用いて、外科用シーラントを適用する方法の一例を示す概略図である。図５（ａ）に示すように、患部３１ｃを有する組織３１に、図５（ｂ）に示すように、第１剤水溶液５１と第２剤水溶液５２を貯蔵したダブルシリンジ注射器５０から、両溶液５１、５２を同時に押し出して、ダブルシリンジ注射器５０内で混合してから、筒部５０ａから混合溶液５３を、組織３１に施与する。図５（ｃ）に示すように、両溶液を押し出した後、１０分程度放置することにより、所望の厚さのゲル膜４１を形成することができる。ディスペンサに代えて、ダブルシリンジを備えるエアーアシストのスプレーで噴霧しても良い。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜ゼラチン調製及び外科用シーラント調製＞
（参考例１）
非特許文献１に記載された、ジメチルスルホキシド中におけるアミノ基のコレステリルクロロホルミエートへの求核置換反応を用いた方法により、タラ由来ゼラチン（Ｍｗ＝１０万）の側鎖のアミノ基のうちの８．３ｍｏｌ％を疎水性基（コレステリル基：Ｃｈｏｌと略記する。）で置換した疎水化冷水魚由来ゼラチンである８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎを合成した。【００４４】
次に、ｐＨ８．０のＰＢＳに４０ｗｔ％で８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎを溶解して、第１剤水溶液を調製した。別途、ｐＨ８．０のＰＢＳに水溶性架橋剤４Ｓ−ＰＥＧを溶解して、第２剤水溶液を調製した。４Ｓ−ＰＥＧの濃度は、第１剤水溶液と第２剤水溶液を等体積で混合した時に８．３Ｃｈｏｌ−Ｇｌｔｎの反応性アミノ基と４Ｓ−ＰＥＧ中活性エステル基の当量比が１：１となるようにした。これは、以下においても同様である。【００４５】
（実施例１）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の９．６ｍｏｌ％を疎水性基（ステアロイル基：Ｓｔｅと略記する。）で置換して９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００４６】
（参考例２）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１．９ｍｏｌ％を疎水性基（Ｃｈｏｌ）で置換して１．９Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００４７】
（参考例３）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１２．２ｍｏｌ％を疎水性基（Ｃｈｏｌ）で置換して１２．２Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００４８】
（参考例４）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の３．２ｍｏｌ％を疎水性基（プロパノイル基：Ｐｒｏと略記する。）で置換して３．２Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００４９】
（参考例５）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の６．４ｍｏｌ％を疎水性基（Ｐｒｏ）で置換して６．４Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５０】
（参考例６）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１３．７ｍｏｌ％を疎水性基（Ｐｒｏ）で置換して１３．７Ｐｒｏ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５１】
（参考例７）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の２．１ｍｏｌ％を疎水性基（ヘキサノイル基：Ｈｘと略記する。）で置換して２．１Ｈｘ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５２】
（参考例８）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の８．５ｍｏｌ％を疎水性基（Ｈｘ）で置換して８．５Ｈｘ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５３】
（参考例９）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１８．３ｍｏｌ％を疎水性基（Ｈｘ）で置換して１８．３Ｈｘ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５４】
（実施例２）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の３．８ｍｏｌ％を疎水性基（ラウロイル基：Ｌａｕと略記する。ドデカノイル基ともいう。）で置換して３．８Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５５】
（実施例３）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の９．０ｍｏｌ％を疎水性基（Ｌａｕ）で置換して９．０Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５６】
（実施例４）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１９．０ｍｏｌ％を疎水性基（Ｌａｕ）で置換して１９．０Ｌａｕ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５７】
（実施例５）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の４．０ｍｏｌ％を疎水性基（Ｓｔｅ）で置換して４．０Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５８】
（実施例６）
タラ由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の１８．７ｍｏｌ％を疎水性基（Ｓｔｅ）で置換して１８．７Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎを合成したことを除き、参考例１と同様にして外科用シーラントを調製した。【００５９】
（比較例１）
疎水化ゼラチンに代えて、原料タラゼラチン（Ｏｒｇ−ｃＧｌｔｎと略記する。）を用いたことを除き、参考例１と同様にして比較用の外科用シーラントを調製した。【００６０】
（比較例２）
フィブリンシーラントとしてボルヒール（商品名）を用いた。【００６１】
表１に、以上の外科用シーラントの内容を示す。
【表１】
2016117569.tif 000004
【００６２】
＜ゲル調製＞
（参考例１−Ｇ〜比較例２−Ｇ）
参考例１の８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ水溶液１５０μｌと第２剤水溶液１５０μｌを混合して、型に入れ、３７℃条件下で５分間静置した。これにより、直径４．０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎと４Ｓ−ＰＥＧからなるディスクゲル（「参考例１−Ｇ」と表す。以下、同様。）を調製した。なお、混合の際、透明な混合溶液に所定量のブリリアントブルー色素を混入して、着色して、ゲルの大きさを明確に認識できるようにした。以下、同様にして表２に示す各ディスクゲルを調製した。【００６３】
＜周波数依存動的粘弾性測定：貯蔵弾性係数および膜強度測定＞
次に、ＭＣＲ３０１  粘弾性計を用いて、０．１〜１００（１／ｓ）の角周波数領域でひずみ５％の測定条件で、各ディスクゲルの貯蔵弾性係数（Ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）を測定した。また、角周波数１．０（１／ｓ）の貯蔵弾性係数を圧縮弾性係数（Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）とし、表２に示した。図４〜８に各ディスクゲルの角周波数依存性を示すグラフ（ａ）および圧縮弾性係数を示す棒グラフ（ｂ）示した。いずれのグラフにおいても、比較のために、原料ゼラチン（比較例１−Ｇ）及びフィブリンシーラント（比較例２−Ｇ）のデータも示した。【００６４】
【表２】
2016117569.tif 000005
【００６５】
図４（ａ）〜８（ａ）に示すように、測定周波数領域では、いずれの材料も安定した貯蔵弾性係数挙動を示した。また、いずれの参考例、実施例のディスクゲルもフィブリンシーラント（比較例２‐Ｇ）と比べて貯蔵弾性係数が高かった。中でも、実施例２〜４（図７（ａ））、実施例１、５、６（図８（ａ））は、比較例１−Ｇに比べても貯蔵弾性係数が高かった。【００６６】
図４（ｂ）〜８（ｂ）に示すように、いずれの参考例、実施例のディスクゲルもフィブリンシーラント（比較例２‐Ｇ）と比べて圧縮弾性係数が高く、とりわけ実施例１〜６（図７（ｂ）及び図８（ｂ））は、原料ゼラチンよりも圧縮弾性係数が高いことが分かった。図９は、置換基ごとに置換率と圧縮弾性係数の関係を示す図である。同図から分かるように、炭素数１２（Ｌａｕ）及び炭素数１８（Ｓｔｅ）の疎水性基は、置換率４〜１９モル％程度までの広い範囲で、圧縮弾性係数が高く、これらの置換基を有するゼラチンの接着力も合わせて考慮すると、優れた封止力が達成できることが分かった。【００６７】
＜ゲル化時間測定＞   
（参考例１−Ｔ）
参考例１の８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ水溶液である第１剤水溶液１５０μｌと第２剤水溶液１５０μｌを混合して、直径１６ｍｍのガラスチューブ内に入れた。次に、ガラスチューブ内にマグネットを入れ、マグネットスターラ―を用いて、３７℃、２８０ｒｐｍ条件で撹拌したところ、徐々にゲル化が進み、マグネットの回転がゆっくりとなり、最終的にマグネットが停止するまでの時間をゲル化時間とした。同様の測定を参考例５、参考例８、実施例３、実施例５、比較例１について行った。結果を表３に示す。【００６８】
【表３】
2016117569.tif 000006
【００６９】
表３に示すように、疎水性基で置換したゼラチンはすべて、疎水性基の無いゼラチン（Ｏｒｇ）に比べて、ゲル化時間が速かった。【００７０】
＜耐圧強度測定用サンプル作製＞
（実施例１‐Ｒ）
ラット摘出肺のエアーリークモデルの作製は、非特許文献５に記載の方法を参考に行った。ラット肺は膨らんだ状態と萎んだ状態に大きな差があるため、まず、ラット摘出肺の気管部に空気導入管を接続し、紐により閉塞してから、ラット摘出肺の内部に空気を導入して、ラット摘出肺を膨らませた。【００７１】
肺を膨らませた状態で、ラット摘出肺の表面に対して２０ゲージの注射針（２０Ｇ針）を深さ約２ｍｍ刺して、欠損部を形成し、欠損モデルを作製した。そして、ラット摘出肺の内部の空気圧と外気圧を平衡状態として５分間安定させた。次いで、リング中心部に前記欠損部が位置するように、ラット摘出肺の表面に厚さ０．５ｍｍ、内径７．０ｍｍ、外径２０．０ｍｍのシリコーンリングを配置した。【００７２】
次に、実施例１の外科用シーラント（９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎの水溶液と４Ｓ−ＰＥＧ水溶液からなる）をシリコーンリング内の肺表面に円形状に塗布し、５分間硬化させて、欠損部を封止した後、シリコーンリングをはずして、耐圧強度測定用サンプル（実施例１−Ｒ）とした。【００７３】
＜耐圧強度測定＞
得られた耐圧強度測定用サンプルを、３７℃生理食塩水中に浸漬し、１ｍＬ／ｓｅｃで肺へ空気を送入した。シーラントに亀裂が発生し、水中で泡の発生が見られたときの空気圧力（Ａｉｒ  ｌｅａｋ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を耐圧強度とした。同様にして、参考例１（８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ）、比較例１及び２について耐圧強度を測定した。結果を表４に示す。【００７４】
【表４】
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【００７５】
上表から分かるように、実施例１（９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ）は、参考例１（８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ）、比較例１（Ｏｒｇ）、比較例２（フィブリン）のいずれに比べても耐圧強度が高く、優れた封止力があることが分かった。【００７６】
＜浸漬したディスクゲルの含水率算出＞
参考例１−Ｇ（８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ）、実施例１−Ｇ（９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ）、比較例１−Ｇ（Ｏｒｇ−ｃＧｌｔｎ）の各ディスクゲルを、上述の方法で作製し、直ちに３７℃の生理食塩水に浸漬した。浸漬開示時から１、３、５、１０、１５、３０、６０、１２０、２４０分間経過時で、ディスクゲルの質量（所定時間浸漬後質量：Ｗｔ）を測定した。測定後、ゲル内部のナトリウムイオンを取り除くため、ディスクゲルを３７℃の２ｍｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ水中に２４時間浸漬してから、４８時間凍結乾燥して、ディスクゲルの質量（乾燥後質量：Ｗｄ）を測定した。【００７７】
得られたＷｔ、Ｗｄの値から（１）式より、ゲル中に含まれる含水率％（Ｗａｔｅｒ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を算出した。結果を表５に示す。
Ｗａｔｅｒ  ｃｏｎｔｅｎｔ＝（Ｗｔ−Ｗｄ）×１００…（１）【００７８】
【表５】
2016117569.tif 000008
【００７９】
図１０は、各ディスクゲルの含水率（算出値）の経時変化を示すグラフであって、（ａ）はＯｒｇ−ｃＧｌｔｎ（比較例１−Ｇ）であり、（ｂ）は８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例１−Ｇ）であり、（ｃ）は９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例１−Ｇ）である。
図１０より、いずれのディスクゲルにおいても、約８０％であった初期含水率は、３０分後には約９０％に変化し、ほぼ平衡状態に達した。ここから、作製直後のディスクゲルを浸漬したときに含水率の変化が生じるものの、大きな変化はないことが確認された。【００８０】
＜浸漬したディスクゲルの膨潤変化＞
上記実験において、浸漬開始時から０、１０、３０、６０、１２０、２４０分間経過時で、各ディスクゲルの膨潤変化を写真撮影した。図１１は、各ディスクゲルの膨潤変化を示す写真である。図１１に示すように、Ｏｒｇ−ｃＧｌｔｎ（比較例１‐Ｇ）のディスクゲルの大きさは、浸漬後１０分の時点で、直径が僅かに増加した。その後、大きな変化がなかった。また、８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例１−Ｇ）、９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例１−Ｇ）のディスクゲルでは、３０分後に直径が僅かに増加した。その後、大きな変化がなかった。これは疎水性基の効果によるものと考えられる。【００８１】
なお、ゲルは膨潤すると、一般にゲル内部の高分子密度が減少し、膜強度が低下しゲル破壊および組織からの剥離を引き起こす可能性がある。外科用シーラントは湿潤環境で用いられるので、同環境で用いられても、膨潤しにくいことが求められる。８．３Ｃｈｏｌ−ｃＧｌｔｎ（参考例１‐Ｇ）、９．６Ｓｔｅ−ｃＧｌｔｎ（実施例１‐Ｇ）のディスクゲルでは、浸漬後３０分以降は膨潤の変化は少なかった。これらの結果から、本発明の外科用シーラントは、体内の湿潤環境でも十分な封止力を、長期間備えることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の外科用シーラントは高い封止力を示し、血管吻合手術等に大変有用である。
【符号の説明】
【００８３】
３１…組織、３１ａ…一面、３１ｃ…穴、４１…ゲル膜、５０…ダブルシリンジ注射器、５０ａ…筒部、５１…第１剤水溶液、５２…第２剤水溶液、５３…混合溶液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016117569.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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