(57)【要約】歯牙腫細胞又は正常細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする当該細胞の培養方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞又は歯牙腫細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする当該細胞の培養方法。
【請求項２】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
正常細胞が、唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び癌関連線維芽細胞からなる群から選ばれるいずれかの細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
正常細胞が、唾液腺細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
唾液腺細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
歯牙腫細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
唾液腺細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする移植用唾液腺細胞の製造方法。
【請求項８】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法によって得られた唾液腺細胞を含む、再生医療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔組織の正常細胞、特に唾液腺細胞の培養方法、及び、歯牙腫細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
唾液は口腔・食道の粘膜免疫に重要な役割を果たすだけでなく、摂食・嚥下などの機能にも大きく関与している。このため、加齢、自己免疫疾患、放射線治療等による唾液腺萎縮が引き起こす唾液分泌量の低下は様々な障害の原因となり、唾液分泌量は患者のＱＯＬを左右する重要な因子の一つとされている。
現在、唾液腺再生医療の研究が盛んに行われているものの、実用化には程遠いのが現状である。理由としては唾液腺細胞の初代培養が非常に困難である事が挙げられる。さらに、世界中の研究室で使用されている唾液腺細胞株（ＨＳＧ）がＨｅＬａ細胞（子宮頸部癌細胞）の汚染株であったという点も研究のスピードを落としている要因である。【０００３】
また、良性腫瘍細胞である歯牙腫細胞についても、初期培養及び長期培養が困難なため、長期的実験ができず、発生過程の解明に至ることができていない。
すなわち、正常細胞や良性腫瘍細胞の初代培養及び長期培養の困難性が、長期的実験を妨げ、研究のスピードを落としている。【０００４】
ところで、Ｒｏｃｋ阻害薬を用いてテロメア長を維持することにより、皮膚の初代培養細胞の長期培養を可能とする技術が知られている（非特許文献１：Ｃｈａｐｍａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
しかし、上記文献では、皮膚の初代培養細胞のみ成功しており、口腔組織の細胞については言及していない。その理由として、口腔内には細菌が多く、初代培養が困難であることが考えられる。【０００５】
また、悪性腫瘍細胞において、Ｒｏｃｋ阻害薬を用いて、条件的再プログラム化細胞の樹立に成功したことが知られている（非特許文献２：Ｓｅｅｍａ  Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ａｐｒｉｌ  １５，２０１３，７３，１５６９）。
しかし、非特許文献２は、自律増殖性の高い悪性腫瘍細胞に関するものであり、正常細胞を初代培養して長期に培養するための手段については言及されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈａｐｍａｎ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２０（７）：２６１９−２６，２０１０．
【非特許文献２】Ｓｅｅｍａ  Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ａｐｒｉｌ  １５，２０１３，７３，１５６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、口腔組織の正常細胞及び歯牙腫細胞の長期培養を可能とし、疾患の発生機序の解明につながる実験系を組むことを可能とするための細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｒｏｃｋ阻害薬を用いて正常細胞及び歯牙腫細胞を培養すると、これらの細胞の性質を維持しつつ培養し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【０００９】
（１）正常細胞又は歯牙腫細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする当該細胞の培養方法。
（２）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である（１）に記載の方法。
（３）正常細胞が、唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び癌関連線維芽細胞からなる群から選ばれるいずれかの細胞である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）正常細胞が、唾液腺細胞である（１）又は（２）に記載の方法。
（５）唾液腺細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである（３）又は（４）に記載の方法。
（６）歯牙腫細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである（１）又は（２）に記載の方法。
（７）唾液腺細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする移植用唾液腺細胞の製造方法。
（８）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である（７）に記載の方法。
（９）前記（７）又は（８）に記載の方法によって得られた唾液腺細胞を含む、再生医療用材料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、正常細胞又は歯牙腫細胞の培養方法が提供される。本発明の方法において、Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤を使用することで、正常細胞、中でも口腔組織由来の正常細胞の初代培養、及び歯牙腫細胞の初代培養を確立することができ、さらに形態を維持したまま長期安定培養も可能であった。従って、本発明の方法は、細胞を用いた種々の実験に使用することが可能となり、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は、Ｒｏｃｋ阻害薬を用いて唾液腺細胞を培養した結果を示す図である。
図２は、唾液腺細胞でのアミラーゼ発現量を解析した結果を示す図である。
図３は、唾液腺細胞におけるアミラーゼのタンパク発現解析を行った結果を示す図である。
図４は、唾液腺細胞における形態学的変化を解析した結果を示す図である。
図５は、唾液腺細胞の染色体の核型解析結果を示す図である。
図６は、唾液腺細胞における細胞増殖、細胞死及び不死化を解析した結果を示す図である。
図７は、マウスの血液学的検査結果を示す図である。
図８は、Ｒｏｃｋ阻害薬をマウスの腹腔内に投与した後の体重推移を示す図である。
図９は、Ｒｏｃｋ阻害薬をマウスの腹腔内に投与した後の臓器の病理組織学的検査結果を示す図である。
図１０は、放射線照射による唾液腺委縮モデルラットにおいて唾液腺細胞を移植した後の唾液分泌量を示す図である。
図１１は、歯牙腫細胞を培養した結果を示す図である。
図１２は、口腔粘膜上皮細胞を培養した結果を示す図である。
図１３は、線維芽細胞を培養した結果を示す図である。
図１４は、癌関連線維芽細胞を培養した結果を示す図である。
図１５は、血管内皮細胞を培養した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、歯牙腫細胞又は正常細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とするこれらの細胞の培養方法である。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を用いて歯牙腫細胞、又は正常細胞（例えば唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ））の培養をＲｏｃｋ阻害薬存在下で行うことにより、初代培養が困難である歯牙腫細胞又は正常細胞を、歯牙腫の特徴又は正常細胞の特徴を維持したまま継代可能な長期培養法を確立するとともに、長期培養が困難な正常細胞の初代培養を行うことに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
歯牙腫細胞は、Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤なしの培養では２〜３継代すると細胞形態が変化し、死滅してしまうのに対し、Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤添加によって形態を維持したまま培養が可能となった。また、初代培養が困難な正常細胞（例えば唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、癌関連線維芽細胞、血管内皮細胞）についても同様にＲｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤を用いることで初代培養に成功することが可能であった。
【００１４】
１．細胞
本発明に使用する細胞の一つである歯牙腫細胞は、外胚葉性間葉組織の誘導を伴う上皮性腫瘍の一種であり、歯牙腫摘出時に摘出物の一部として採取して得ることができる。
【００１５】
「正常細胞」とは、悪性腫瘍細胞ではない細胞を意味する。特に、本発明は、初代培養及び長期培養が困難である細胞に有用な培養方法を提供するものである。初代培養及び長期培養が困難な細胞として、たとえば、口腔組織の正常細胞が挙げられる。口腔組織とは、頬、口唇、口蓋、唾液腺、歯肉などの口腔を構成する組織であって、神経や血管を内在する組織である。口腔組織の正常細胞としては、例えば唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、血管内皮細胞などが挙げられる。
また、口腔領域以外では初代培養および長期培養が困難な細胞として、前立腺細胞、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、血管内皮細胞などが挙げられる。
正常細胞は、生体から正常組織を採取した後、破砕、トリプシン処理等を施すことにより得ることができる。
【００１６】
口腔組織のうち唾液腺細胞は、生体材料を原料とする場合はヒト口唇腺より採取することができる。採取後は、培養液又は生理食塩水等で洗浄後、細片化し、培養の原材料とする。
また、口腔粘膜上皮細胞は、外来での智歯抜歯術時に採取した上皮細胞を培養することで得ることもできる。線維芽細胞、癌関連線維芽細胞、血管内皮細胞は、口腔組織の悪性腫瘍の手術時にそれぞれ正常組織と悪性腫瘍の組織から採取し培養することができる。
【００１７】
悪性腫瘍を切除する場合、一般には正常組織も含めマージン部を設けて一塊として切除する。従って、線維芽細胞は切除物の正常組織から分離し培養することができ、癌関連線維芽細胞及び血管内皮細胞は切除物の悪性腫瘍組織から分離することができる。癌関連線維芽細胞及び血管内皮細胞は、悪性腫瘍組織から採取されるが、正常細胞である癌関連線維芽細胞及び血管内皮細胞のみを分離培養している。
【００１８】
このようにして得られた細胞は、培養容器に播種して培養することにより初代培養を行う。
本発明において使用される細胞は、継代培養されたものであってもよい。継代回数は特に制限されないが、１〜１０回が好ましく、２〜７回がより好ましく、２〜５回がさらに好ましい。継代培養後の細胞として、市販の樹立正常細胞を本発明の方法において使用することもできる。
【００１９】
２．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）はタンパク質リン酸化酵素（プロテインキナーゼ）の１つであり、Ｒｈｏ−ＲＯＣＫ情報伝達に基づく細胞応答の制御機構に関与する酵素である。本発明において使用するＲｈｏキナーゼ阻害剤は、そのようなＲｈｏキナーゼを阻害する物質である限り限定されるものではなく、任意に選択することができる。本発明において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（以下「Ｒｏｃｋ阻害剤」という）としては、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１０７７、ＨＡ１１００、Ｙ−３９９８３などが挙げられる。
【００２０】
Ｙ−２７６３２は、（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドの塩酸塩であり（下記式Ｉ）、ＲＯＣＫのシグナル伝達系による血管平滑筋の収縮、がん細胞の浸潤や細胞分化制御を阻害する物質として知られている。
2016103776.tif 000002
【００２１】
Ｙ−２７６３２は市販されており（和光純薬）、容易に入手することができる。
【００２２】
ＨＡ１０７７は、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンの塩酸塩である（下記式ＩＩ）。
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【００２３】
ＨＡ−１１００は市販されており（ＡＬＥＸＩＳ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）、容易に入手することができる（下記式ＩＩＩ）。
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【００２４】
Ｙ−３９９８３は市販されており（Ｍｅｄｃｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）、容易に入手することができる（下記式ＩＶ）。
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【００２５】
３．培養
上記歯牙腫細胞又は正常細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤の存在下で培養する。「Ｒｏｃｋ阻害剤の存在下で培養する」とは、Ｒｏｃｋ阻害剤と培養の対象となる細胞とが接触し得る状態で培養することを意味し、歯牙腫細胞又は正常細胞を含む培地にＲｏｃｋ阻害剤を添加して培養すること、歯牙腫細胞又は正常細胞とＲｏｃｋ阻害剤とを培地に添加して培養すること、Ｒｏｃｋ阻害剤を含む培地に歯牙腫細胞又は正常細胞を播種して培養することのいずれをも意味する。
【００２６】
歯牙腫細胞又は正常細胞の培養に用いる細胞培養用液体培地は特に限定されず、例えばダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウィリアムズＥ培地、ＨａｍのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ培地などの公知の細胞培養用基礎培地が挙げられ、必要に応じて上記細胞の培養に適合した添加剤を加えることができる。
【００２７】
添加剤としては、例えば、成長因子又は細胞増殖因子、抗生物質、有機化合物、ウシ胎児血清などが挙げられる。成長因子又は細胞増殖因子としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）などを用いることができる。
【００２８】
さらに、細胞培養用液体培地を含むコラーゲンゲル又はアガロースゲルなどで歯牙腫細胞又は正常細胞細胞を覆った状態で細胞を培養することもできる。これにより、培地交換等の際に細胞に加わる物理的傷害から細胞を保護することができる。
培養時の温度は、通常の動物細胞の培養時に適用される温度とすることができ、例えば３６〜３７℃である。培養は、５〜１０％のＣＯ２濃度、好ましくは５％ＣＯ２濃度の雰囲気下で、インキュベータ中で行う。
【００２９】
このようにして得られた細胞が歯牙腫細胞又は正常細胞であることの確認は、例えば細胞表面マーカー、細胞内に存在するｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素などの細胞内マーカー、細胞外に分泌されるペプチド、タンパク質、酵素、化合物などの細胞外マーカーなどを指標とすることができる。マーカーの検出方法は、特に制限されず、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。
上記の通り得られた正常細胞は、医用生体材料用細胞として再生医療に使用することができる。
【００３０】
４．再生医療又は治療方法
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の方法で製造された正常細胞を患者に移植することを特徴とする治療方法及び又は再生医療方法に関する。移植部位、投与経路は細胞の種類に応じて適宜変更することができる。移植するときの細胞数は１．０×１０５〜１．０×１０８個、好ましくは１．０×１０７〜１．０×１０８個である。
例えば唾液腺の再生医療を目的とする場合は、上記方法により、加齢、自己免疫疾患、放射線治療等による唾液腺委縮を起こした患者に、唾液腺の再生を促すことができる。前記移植は、例えば、コラーゲンゲルなどに前記細胞を播種し、そのゲルを唾液腺機能低下している唾液腺に配置すればよい。
【００３１】
本発明によれば、歯牙腫細胞又は正常細胞（例えば、唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ））の長期培養が可能である。このため、疾患の発生機序の解明につながる実験系を組むことが可能となり、今後の研究発展に寄与できる。
歯牙腫細胞は、細胞培養が難しいという点から、歯牙腫という疾患に対しての実験はほとんど行われていない。本発明者は、歯牙腫細胞を初代培養する際に、Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤を使用することで、長期安定培養が可能になった。そのため、この培養法を応用し、研究を進めることで今後の研究に寄与できるものと考えられる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
唾液腺初代培養法の確立【００３４】
＜材料・方法＞
１．Ｒｏｃｋ阻害薬（Ｙ２７６３２，Ｗａｋｏ，コードＮｏ．２５１−００５１４）を用いた唾液腺細胞培養
１．１  唾液腺細胞の初代培養法
（ｉ）原材料となる患者由来の唾液腺細胞は、口唇腺より必要量を採取した。
（ｉｉ）細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し３回洗浄した。
（ｉｉｉ）細胞を滅菌済み虹彩剪刀、メス（Ｎｏ．１１）を用い細片化した。
（ｉｖ）細胞をトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｇｉｂｃｏ，コードＮｏ．Ａ１２１７７−０１）を加え３７℃、３０分間撹拌した。
（ｖ）細胞にＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ニチレイバイオサイエンス，１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）を混和し、遠心（１０００ｒｐｍ５分）を３回繰り返した。
（ｖｉ）細胞をＤＭＥＭ（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｒｏｃｋ  ｋｉｎａｓｅ阻害薬１０μＭ，Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．３μＭ含有：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＤＭＥＭ＋）に混和後、コラーゲンタイプＩでコートされた細胞培養皿（ＩＷＡＫＩ）へ播種した。
（ｖｉｉ）３日に１回ＰＢＳで細胞を洗浄し、上記培地を交換した。【００３５】
１．２  培養細胞継代方法
（ｉ）培養細胞は、８０％コンフルエントで継代した。リン酸緩衝生理食塩水を用い細胞を３回洗浄した。
（ｉｉ）培養容器にトリプシンを添加し、７分間、３７℃培養した。
（ｉｉｉ）細胞をＤＭＥＭ＋で混和し遠心（１０００ｒｐｍ５分）した。
（ｉｖ）上澄みを除去した後、ＤＭＥＭ＋を加えコラーゲンタイプＩでコートされた細胞培養皿へ播種した。【００３６】
２．アミラーゼ発現量の解析
２．１  アミラーゼの発現解析
唾液腺細胞をＲｏｃｋ阻害薬の有無で培養を行い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にて唾液腺細胞でのアミラーゼの発現解析を行った。アミラーゼに使用したプライマーは以下の通りであり、ユニバーサルプローブは＃１８を使用した。
2016103776.tif 000006
【００３７】
内在性コントロールとして用いたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に使用したプライマーは以下の通りであり、ユニバーサルプローブは＃６０を使用した。
2016103776.tif 000007
【００３８】
ＰＣＲ反応は、通法に従い１０μｌのＰｒｏｂｅ  ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、各々のプローブマスターの０．２μｌ、プライマーを含む最終反応容量２０μｌの混合液を使用した。反応条件として、初期変性は９５℃５分、増幅のためのサイクル数は５０回で、変性９５℃１０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応６０℃６０秒とした。目的遺伝子のｍＲＮＡ量は、コントロールとして用いたＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値として表現した。【００３９】
２．２  細胞免疫蛍光染色法を用いたアミラーゼのタンパク発現解析
（ｉ）スライドグラス上で培養した唾液腺細胞に４％パラホルムアルデヒド（ＷａＫｏ）を用いて１０分間作用させ固定した。
（ｉｉ）固定した細胞をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３回洗浄した。
（ｉｉｉ）固定した細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＷａＫｏ）で１５分間浸透処理をした。
（ｉｖ）固定した細胞を１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＴＢＳを３０分間反応させた。
（ｖ）固定した細胞をＴＢＳで３回洗浄した。
（ｖｉ）一次抗体（ａｎｔｉ−Ｇｏａｔアミラーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））をＴＢＳと混和し１：２００の濃度で４℃、１６時間反応させた。
（ｖｉｉ）ＴＢＳで３回洗浄した．
（ｖｉｉｉ）ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をリン酸緩衝生理食塩水と混和し１：２００の濃度で室温、１時間反応させた。
（ｉｘ）ＴＢＳで３回洗浄した。
（ｘ）ダピ含有マウンティングメディウム（ＤａＫｏ）を使用しマウントした。
（ｘｉ）共焦点顕微鏡（ＦＶ１０ｉ−ＬＩＶ：ＯＬＹＭＰＵＳ）にて観察した。【００４０】
３．細胞形態学的変化の解析
本節では、Ｒｏｃｋ阻害薬の有無によって引き起こされる細胞形態学的変化を細胞骨格の細胞免疫蛍光染色法を用いて解析した。
３．１  検体処理
上記（２．２）と同様の実験方法で検体処理を行った。抗体はＡｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ６７０  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｈａｌｌｏｄｉｎ（Ｆ−ａｃｔｉｎ）（サイトスケルトン）を室温、１時間反応させた。【００４１】
４．臨床応用を考慮した細胞障害性（安全性）の確認
４．１  核型解析
初代培養した唾液腺細胞をＲｏｃｋ阻害薬の含まれる培地で培養し、遺伝子障害の有無を核型解析法を用いて解析した。核型解析検査はＱバンド法にて行った。【００４２】
４．２  唾液腺細胞の解析
初代培養した唾液腺細胞をＲｏｃｋ阻害薬を含む培地で培養を行い、細胞増殖をＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、アポトーシスはＣａｓｐａｓｅ−３（ＣＳＴ）のウエスタンブロット法を用いて解析した。不死化についてはＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＥＲＴ）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。
上記（２．１）と同様の方法でＴＥＲＴの定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行った。使用したプライマーは以下の通りである。【００４３】
2016103776.tif 000008
ユニバーサルプローブは＃１９を使用した。【００４４】
ＰＣＮＡ、Ｃａｓｐａｓｅ−３のタンパク質レベルでの測定はウエスタンブロッティング法を用いた。また内在性コントロールとしてα−ｔｕｂｕｌｉｎを使用した。
（ｉ）タンパク質抽出溶液を４−１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて電気泳動を行った。
（ｉｉ）ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ転写した。
（ｉｉｉ）０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＷａＫｏ）含有トリス緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄後、ブロッキングワン（ナカライテスク）でブロッキングを３０分行った．
（ｉｖ）ＰＣＮＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、α−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を４℃にて１６時間反応した。
（ｖ）ＴＢＳＴで３回洗浄した。
（ｖｉ）ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を室温で１時間反応させ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）で発光し可視化させた。シグナル強度は、ＣＳ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ）にて定量化し、コントロールとして測定したα−ｔｕｂｕｌｉｎのタンパク質レベルとの相対値で表現した。【００４５】
４．３  Ｒｏｃｋ阻害薬を腹腔内投与した後のマウス臓器障害性の病理組織学的解析
使用動物：Ｂ６Ｃ３Ｆ１／Ｃｒｌｊマウス（日本クレア）
各群ｎ＝１２（♂：６、♀：６）、調整群ｎ＝４（♂：２、♀：２）
薬物：Ｙ−２７６３２
投与量：１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（体重２５ｇで０．２５ｍｇ／ｄａｙ）
Ｙ−２７６３２はＰＢＳで溶解し、腹腔内投与を行った。対照群には同量ＰＢＳを投与した。
投与期間：１日１回投与で連続１４日間投与した。
各群の半数は投与後１４日間の経過観察を行った。【００４６】
測定群：
（ｉ）Ｒｏｃｋ阻害薬投与群（ＲＩ＋）：ｎ＝１２（♂：６，♀：６）
Ａ．投与終了時（投与開始１４日後）に採血および剖検を行った群。ｎ＝６（♂：３，♀：３）
Ｂ．投与終了時（投与開始２８日後）に採血および剖検を行った群。ｎ＝６（♂：３，♀：３）
（ｉｉ）Ｒｏｃｋ阻害薬非投与群（ＲＩ−）：ｎ＝１２（♂：６，♀：６）
Ａ．投与終了時（投与開始１４日後）に採血および剖検を行った群。ｎ＝６（♂：３，♀：３）
Ｂ．投与終了時（投与開始２８日後）に採血および剖検を行った群。ｎ＝６（♂：３，♀：３）
（ｉｉｉ）調整群：ｎ＝４（♂：２，♀：２）
＊：薬剤の投与等を行わずに、他群の投与開始日に採血および剖検を行い、ベースデータを作成するための群。【００４７】
測定項目：
１）一般状態
１日１回一般状態を目視で観察する。
２）体重・摂餌／摂水量の測定
毎日、体重・摂餌／摂水量の測定を行った。
３）血液学的検査
全てのマウスにおいて投与前および、投与終了後（１４日目）に行った。【００４８】
＊  各群において♂：３、♀：３匹は投与１４日目で採血および剖検を行った。残りの♂：３、♀：３匹は投与終了後から１４日間は投与を行わずに一般状態の観察および体重・摂餌／摂水量の測定を行い、投与開始から２８日目に血液検査および剖検を行った。【００４９】
血算：赤血球数、白血球数、血小板数、ヘマトクリット値、赤血球分画．
生化：ＴＰ、ＡＬＢ、ＣＲＥ、Ｎａ、Ｋ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、Ｔ−ＣＨＯ、Ｇｌｕ
剖検
投与終了後１４日目に各群から♂：３、♀：３匹を剖検した。残りの♂：３、♀：３は経過観察終了後の２８日目に剖検を行った。
肉眼的観察
病理学的観察：  肉眼的病変部および心臓、肺、膵臓、肝臓、脾臓、腎臓、生殖腺、骨格筋についてはＨＥ染色にて病理学的観察を行った。【００５０】
結果
１．  Ｒｏｃｋ阻害薬を用いた唾液腺細胞培養。
通常の培地にて唾液腺細胞を培養した場合、継代を繰り返す毎に細胞形態が線維芽細胞様変化を示し（図１、Ｒｏｃｋ阻害薬（−））、細胞増殖も極端な低下がみられた。Ｒｏｃｋ阻害薬含有の培地にて唾液腺細胞を培養すると敷石状の細胞形態が継代を繰り返しても保持されている（図１、Ｒｏｃｋ阻害薬（＋））。【００５１】
２．唾液腺細胞をＲｏｃｋ阻害薬の有無で培養を行い、唾液腺細胞でのアミラーゼ発現量を解析した。
Ｒｏｃｋ阻害薬含有の培地にて唾液腺細胞を培養し、継代を繰り返してもアミラーゼのｍＲＮＡ（図２）およびタンパク質（図３）の発現が有意に高いことが判明し、Ｒｏｃｋ阻害薬によってアミラーゼの発現量を高いまま維持されていることが示された。【００５２】
３．  Ｒｏｃｋ阻害薬の有無によって引き起こされる細胞形態学的変化を細胞骨格の細胞免疫蛍光染色法を用いて解析した。
形態学的変化を検証するために細胞骨格であるＦ−ａｃｔｉｎを用いて細胞免疫蛍光染色法を行ったところ、Ｒｏｃｋ阻害薬を含まない培地にて唾液腺細胞を培養した場合、線維芽細胞様骨格が著明に見られた。一方、Ｒｏｃｋ阻害薬含有の培地にて培養した唾液腺細胞は蜂巣状の骨格が認められた（図４）。【００５３】
４．臨床応用を考え細胞障害性（安全性）の確認を行った。
４．１．初代培養した口唇腺細胞をＲｏｃｋ作用薬の含まれる培地で培養することで引き起こされる染色体障害の有無を核型解析法で検討した。核型解析において遺伝子学的異常は認めなかった（図５）。
４．２．唾液腺細胞をＲｏｃｋ阻害薬含有の培地で培養しても、ＰＣＮＡ、Ｃａｓｐａｓｅ−３の発現に差は認められなかった（図６Ａ）。また、ＴＥＲＴの発現でも鎖は認められず、唾液腺細胞において発現が検出できなかった（図６Ｂ）。
４．３．Ｒｏｃｋ阻害薬をマウスの腹腔内投与し、マウスへの障害性を血液学的検査（図７）、体重変化（図８）、マウス各臓器への影響（図９）を比較検討した。血液学検査、体重推移、病理組織学的検索において異常所見は認めず、Ｒｏｃｋ阻害薬の安全性が確認された。
【実施例２】
【００５４】
唾液腺細胞の移植及び再生試験
雌の４週齢ヌードラット（オリエンタル酵母）（以下ヌードラット）のＳｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｇｌａｎｄ（ＳＭＧ）に対し放射線の１５Ｇｙ単回照射を行い、放射線による唾液分泌量低下ラットを作製した。【００５５】
ラットの処置
実験対照群を、ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎのみを使用した群（以下ｃｏｎｔｒｏｌ群）、ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎと細胞の併用し使用した群（以下ｃｅｌｌ群）、放射線照射を行っていない非照射群（以下ｎｏｒｍａｌ群）の３群に分類した。
ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎは、ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ（ＩＰＣ５０  ＫＯＫＥＮ）を、ワルトン管より注入する直前にｐＨが中性となるように培地で処理した。ｃｏｎｔｒｏｌ群、ｃｅｌｌ群は、照射直後に両側のワルトン管より、それぞれａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ（２００μｌ）、ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ（２００μｌ）と約２．０×１０６個の細胞（ＧＦＰラットのＳＭＧ細胞）を注入した。【００５６】
唾液腺測定試験
ｃｏｎｔｒｏｌ群、ｃｅｌｌ群、ｎｏｒｍａｌ群の３群に対して唾液測定試験を行った。唾液の測定は、流量（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：以下ＳＦＲ）を比較した。唾液を測定するために、Ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎ  ｎｉｔｒａｔｅ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．０８１Ｍ１５３２Ｖ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を使用した。Ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎ  ｎｉｔｒａｔｅは、使用直前に生理食塩水で１．０ｍｇ／ｍｌに調製し、５ｍｇ／ｋｇをヌードラットの腹腔内に投与した。唾液の流量は３０分間の唾液量を計測、比較した結果を図１０に示す。
図１０に示すようにｎｏｒｍａｌ群と比較し、ｃｏｎｔｒｏｌ群、ｃｅｌｌ群の唾液流量は、放射線照射の影響により減少していた。しかし、放射線照射８週後のＳＦＲ、総量では、ｃｏｎｔｒｏｌ群と比べ、ｃｅｌｌ群において唾液量が増加し、唾液腺の機能回復が認められた。
【実施例３】
【００５７】
＜材料・方法＞
１．  Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤（Ｙ２７６３２，Ｗａｋｏ，コードＮｏ．２５１−００５１４）を用いた細胞培養
（１）細胞
歯牙腫細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）
（２）方法
（ｉ）原材料となる患者由来の細胞は、上記のように必要量を採取した。
（ｉｉ）細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し３回洗浄した。
（ｉｉｉ）細胞を滅菌済み虹彩剪刀、メス（Ｎｏ．１１）を用い細片化した。
（ｉｖ）細胞をトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｇｉｂｃｏ，コードＮｏ．Ａ１２１７７−０１）を加え３７℃、３０分間撹拌した。【００５８】
（ｖ）細胞にＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ニチレイバイオサイエンス，１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）を混和し、遠心（１０００ｒｐｍ５分）を３回繰り返した。
（ｖｉ）細胞をＤＭＥＭ（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｒｏｃｋ  ｋｉｎａｓｅ阻害薬１０μＭ，Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．３μＭ含有：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＤＭＥＭ＋）に混和後、コラーゲンタイプＩでコートされた細胞培養皿（ＩＷＡＫＩ）へ播種した。
（ｖｉｉ）３日に１回ＰＢＳで細胞を洗浄し、上記培地を交換した。
（ｖｉｉｉ）培養細胞は、８０％コンフルエントで継代した。リン酸緩衝生理食塩水を用い細胞を３回洗浄した。
（ｉｘ）培養容器にトリプシンを添加し、７分間、３７℃培養した。
（ｘ）細胞をＤＭＥＭ＋で混和し遠心（１０００ｒｐｍ５分）した。
（ｘｉ）上澄みを除去した後、ＤＭＥＭ＋を加えコラーゲンタイプＩでコートされた細胞培養皿へ播種した。【００５９】
２．Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ阻害剤（Ｙ２７６３２，Ｗａｋｏ，コードＮｏ．２５１−００５１４）を用いた細胞培養
（１）細胞
血管内皮細胞
（２）方法
（ｉ）原材料となる患者由来の細胞は、上記のように必要量を採取した。
（ｉｉ）細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し３回洗浄した。
（ｉｉｉ）細胞を滅菌済み虹彩剪刀、メス（Ｎｏ．１１）を用い細片化した。
（ｉｖ）細胞をコラゲナーゼ（０３２‐１０５３４：Ｗａｋｏ）に加え３７℃、６０分間撹拌した。
（ｖ）細胞に等量のｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ニチレイバイオサイエンス）を加え、遠心（１０００ｒｐｍ１０分）を行い、ＰＢＳで遠心（１０００ｒｐｍ５分）を３回繰り返した。その後、ＭＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、遠心（１０００ｒｐｍ５分）を行った。【００６０】
（ｖｉ）磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３１  Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ，１１１５５Ｄ：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞分離を行った。
（ｖｉｉ）細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）（２０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｒｏｃｋ  ｋｉｎａｓｅ阻害薬１０μＭ）に混和後、フィブロネクチンでコートされた細胞培養皿（ＩＷＡＫＩ）へ播種した。
（ｖｉｉｉ）３日に１回ＰＢＳで細胞を洗浄し、上記培地を交換した。
（ｉｘ）培養細胞は、８０％コンフルエントで継代した。リン酸緩衝生理食塩水を用い細胞を３回洗浄した。
（ｘ）培養容器にトリプシンを添加し、７分間、３７℃培養した。
（ｘｉ）細胞をＥＧＭ−２ＭＶで混和し遠心（１０００ｒｐｍ５分）した。
（ｘｉｉ）上澄みを除去した後、ＥＧＭ−２ＭＶを加えフィブロネクチンでコートされた細胞培養皿へ播種した。【００６１】
３．結果
細胞形態観察によるコントロール（阻害剤なし）との比較を行った。その結果、阻害剤を含有する培地を用いて培養した場合は、継代を繰り返しても細胞形態を維持していた。阻害剤を含有しない培地を用いて培養した場合は、２〜３代継代すると細胞形態が変化し、培養継続が困難であった。また、継代前にすでに細胞形態が変化してしまうものもあった（図１１〜１５）。【００６２】
図１１：歯牙腫細胞、    阻害剤あり  継代５    阻害剤なし  継代０
図１２：口腔粘膜上皮細胞、阻害剤あり  継代５    阻害剤なし  継代０
図１３：線維芽細胞、    阻害剤あり  継代７    阻害剤なし  継代２
図１４：癌関連線維芽細胞、阻害剤あり  継代７    阻害剤なし  継代１
図１５：血管内皮細胞、阻害剤あり  継代８    阻害剤なし  継代０
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
［配列表］
2016103776.tif 000009
2016103776.tif 000010
2016103776.tif 000011
【図１】
2016103776.tif 000012
【図２】
2016103776.tif 000013
【図３】
2016103776.tif 000014
【図４】
2016103776.tif 000015
【図５】
2016103776.tif 000016
【図６】
2016103776.tif 000017
【図７】
2016103776.tif 000018
【図８】
2016103776.tif 000019
【図９】
2016103776.tif 000020
【図１０】
2016103776.tif 000021
【図１１】
2016103776.tif 000022
【図１２】
2016103776.tif 000023
【図１３】
2016103776.tif 000024
【図１４】
2016103776.tif 000025
【図１５】
2016103776.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月25日(2015.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞又は歯牙腫細胞からなる細胞試料を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする当該細胞の培養方法。
【請求項２】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
正常細胞が、唾液腺細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び癌関連線維芽細胞からなる群から選ばれるいずれかの細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
正常細胞が、唾液腺細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
唾液腺細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
歯牙腫細胞が、生体から採取されたもの又は幹細胞から分化させたものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
唾液腺細胞からなる細胞試料を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする移植用唾液腺細胞の製造方法。
【請求項８】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法によって得られた唾液腺細胞を含む、再生医療用材料。
【請求項１０】
移植用細胞を得るために培養する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ワルトン管に移植されるための、請求項９に記載の材料。
【国際調査報告】
2016103776.tif 000027
2016103776.tif 000028
2016103776.tif 000029
2016103776.tif 000030