(57)【要約】白血病や固形癌といった癌の診断や骨髄移植時期の決定に利用できるヒトWT1のmRNAの発現量を簡便且つ短時間に、感度よく定量するための方法を提供する。当該方法は、ヒトWT1 mRNAの発現量を１ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子（mRNA）の逆転写反応および伸長反応を、同時かつ、同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料におけるヒトWT1 mRNAの発現量を１ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、
ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子（mRNA）の逆転写反応および伸長反応を、当該被験試料において同時かつ同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法。
【請求項２】
ハウスキーピング遺伝子がGAPDH mRNAである請求項１に記載する方法。
【請求項３】
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４ に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
（ａ’）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、または
（ｂ’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、請求項１または２に記載する方法。
【請求項５】
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を用いる、請求項３または４に記載する方法。
【請求項６】
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
（ｃ’）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、請求項３または４に記載する方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４ に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項８】
（ａ’）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、または
（ｂ’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブ、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項９】
さらに（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを含む、
請求項７または８に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項１０】
さらに（ｃ’）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、請求項７または８に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病や固形癌といった癌の診断や骨髄移植時期の決定に利用できるヒトWT1のmRNAの発現量を定量する新しい方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルムス腫瘍-1（Wilms tumor gene-1。以下、「WT1」と称する。）遺伝子は、1990年にCallらにより小児ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として同定された遺伝子である (非特許文献１)。その後、WT1 mRNAは、小児ウイルムス腫瘍のみならず、固形癌細胞株である胃癌細胞株，大腸癌細胞株，肺癌細胞株，及び乳癌細胞株等の固形癌細胞においても高率に発現していることが示され (非特許文献２)、いまでは、WT1遺伝子は小児ウイルムス腫瘍のみならず、多くのがんに関連する癌関連遺伝子と考えられるようになっている。【０００３】
Callらは白血病細胞株であるK562細胞及びCCRF-CEM細胞でWT1 mRNAの発現を報告しており(非特許文献１参照)、Miwaらはノーザン・ブロット解析により急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia。以下、「AML」という。）の22例中15例にWT1 mRNAが発現することを報告している (非特許文献３)。さらにInoueらにより、WT1 mRNAはAMLの初診時に100%（45/45）の症例で発現が認められたと報告されている（非特許文献４.)。また、診断時のWT1 mRNA発現量が予後と関係していること (非特許文献５)、WT1 mRNA発現量は治療により一度陰性化しても再発時に再上昇すること (非特許文献６)、また再発時のWT1 mRNA発現量は診断時の発現量よりも増加していることが報告されている (非特許文献７)。【０００４】
このように、WT1遺伝子が、単一の遺伝子としてAML患者に高頻度に出現すること、及び治療により陰性化し再発時に再上昇する等の事実から、WT1遺伝子は、AMLの治療において新しい微小残存病変（minimal residual disease。以下、「MRD」とも称する。）のモニタリングマーカーとして有用であるとして、従来から体外診断用医薬品として販売されている。【０００５】
ヒトWT1 mRNAの測定方法としては、従来、β−アクチンを基準する競合定量法が知られている（特許文献１）。しかし、その測定方法では、WT1 mRNAとβ−アクチンのmRNAとを個別に測定するだけでなく、逆転写反応させた後に伸長反応を行う、いわゆる２ステップRT-PCR法を行う必要があり、非常に時間を要する。【０００６】
また別のヒトWT1 mRNAの測定方法として、特許文献２にはWT1 mRNAの１ステップRT-PCR法が開示されている。しかし、この測定方法では、WT1遺伝子の発現量を補正するためのハウスキーピング遺伝子の発現量を、別途測定する必要があり、煩雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平11−89599号公報
【特許文献２】特開平11−89596号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Call, K. M. et al., Cell 1990; 60: 509-520.
【非特許文献２】Jpn. J. Cancer Res. 1999; 90: 194-204.
【非特許文献３】Miwa, H., et al., Leukemia 1992; 6: 405-409.
【非特許文献４】Inoue, K., et al., Blood, 1994, 84(9), 3071-3079
【非特許文献５】Blood 1997; 90: 1217-1225.
【非特許文献６】Blood 1996; 88: 2267-2278.
【非特許文献７】Blood 1996; 88: 4396-4398.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、WT1遺伝子の発現量を定量する方法として、公知の方法は、多大な時間を要し、また煩雑という問題があり、簡便かつ短時間でヒトWT1遺伝子の発現量を定量することができる手法が求められている。従って、本発明の目的は、簡便かつ短時間で実施できる新しいWT1 mRNAの定量法を提供することである。特に、本発明は、ヒトWT1 mRNAとハウスキーピング遺伝子の両者の発現量を同時に定量することで、簡便かつ短時間での実施を可能にした新しいWT1 mRNAの定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本件発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討をしていたところ、目的遺伝子であるヒトWT1遺伝子（mRNA）と補正用遺伝子であるハウスキーピング遺伝子（mRNA）の逆転写反応および伸長反応を、同時かつ、同一容器内で連続して進行させることで（１ステップ）、短時間でかつ簡便に、目的とするヒトWT1 mRNAの発現量を定量することができることを見出した。しかも当該１ステップRT-PCR法を用いることで、目的遺伝子と補正用遺伝子の増幅を別々に行う２ステップRT-PCR法よりも、簡便で、且つ殆ど同程度の短時間で、目的遺伝子をより感度高く検出することが可能となることを確認した。【００１１】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を包含するものである。【００１２】
（Ｉ）ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法
（I-1）ヒトWT1 mRNAの発現量を１ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子（mRNA）の逆転写反応および伸長反応を、同時かつ、同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法。
（I-2）ハウスキーピング遺伝子がGAPDH mRNAである（I-1）に記載する方法。
（I-3）ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を用いる（I-1）または（I-2）に記載する方法。
（I-4）ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
（ａ’）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、または
（ｂ’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる（I-1）または（I-2）に記載する方法。
（I-5）ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を用いる（I-3）または（I-4）に記載する方法。
（I-6）ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
（ｃ’）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる（I-3）または（I-4）に記載する方法。【００１３】
（II）ヒトWT1 mRNAの発現量定量用のリアルタイムPCR用キット
（II-1）（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４ に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
（II-2）（ａ’）配列番号３に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、または
（ｂ’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブ、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
（II-3）さらに（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを含む、
（II-1）または（II-2）に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
（II-4）さらに（ｃ’）配列番号６に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号７若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、（II-1）または（II-2）に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、従来のWT1 mRNAの発現量の定量方法と比較して、簡便な操作と労力でしかも短時間に測定することができるWT1 mRNA発現量の定量方法を提供することができる。また、本発明の方法によれば、従来の２ステップRT-PCR法を用いた測定方法よりも高い感度で検出することも可能になる。つまり、本発明の方法またはリアルタイムPCR用キットを用いることで、簡便且つ短時間で、感度よくヒトWT1 mRNAの発現量を定量することが可能になる。【００１５】
斯くして定量されるヒトWT1 mRNAの発現量は、白血病や固形癌の発症及び再発の診断、及び予後判断、並びに骨髄移植の時期決定において有用な指標となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各種濃度（図中、１：2.5x105 copies/test、２：2.5x104 copies/test、３: 2.5x103 copies/test、４：2.5x102 copies/test、５：2.5x101 copies/test）のWT1 RNA標準品を対象として、WT1 mRNAを単独で増幅した場合のWT1 mRNA増幅曲線を示す（実施例１）。
【図２】各種濃度（図中、１：1.0x108 copies/test、２：1.0x107 copies/test、３: 1.0x106 copies/test、４：1.0x105 copies/test、５：1.0x104 copies/test）のGAPDH RNA標準品を対象として、GAPDH mRNAを単独で増幅した場合のGAPDH mRNA増幅曲線を示す（実施例１）。
【図３】各種濃度（図中、１：2.5x105 copies/test、２：2.5x104 copies/test、３: 2.5x103 copies/test、４：2.5x102 copies/test、５：2.5x101 copies/test）のWT1 RNA標準品を対象として、WT1 mRNAとGAPDH mRNAとを同時に増幅した場合のWT1 mRNA増幅曲線を示す（実施例１）。
【図４】各種濃度（図中、１：1.0x108 copies/test、２：1.0x107 copies/test、３: 1.0x106 copies/test、４：1.0x105 copies/test、５：1.0x104 copies/test）のGAPDH RNA標準品を対象として、WT1 mRNAとGAPDH mRNAとを同時に増幅した場合のGAPDH mRNA増幅曲線を示す（実施例１）。
【図５】WT1 mRNAとGAPDH mRNAを同時に増幅する１ステップRT-PCRを、プライマーおよびプローブとして、（Ａ）表８に示すセット（配列セットＢ）、及び（Ｂ）表９に示すセット（比較セット）をそれぞれ用いて実施し、得られた増幅産物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（Ｉ）ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法
本発明の方法は、ヒトWT1 mRNAの発現量を１ステップRT-PCR法を用いて定量する方法である。
【００１８】
本発明が測定の対象とするヒトWT1遺伝子は、前述するように小児ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として同定された3037bpからなる遺伝子であり、「Homo sapiens Wilms tumor 1 (WT1), transcript variant D, mRNA」として、NCBIに登録されている（NM_024426.4）。その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００１９】
本発明の方法で測定対象とする被験試料は、上記ヒトWT1 mRNAを含むものであれば特に限定はなく、例えばヒト由来の細胞、組織、血液、喀痰、糞便、尿のような生体試料など、WT1 mRNAを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られる全RNA、あるいはmRNAを富化した試料等が使用できる。RNA試料は水溶液、あるいは適切な固相に吸着又は固定化した状態で用いることができる。全RNA量としては反応液100μｌ当り0.01ng〜1μｇが適している。
【００２０】
ハウスキーピング遺伝子とは、細胞の分化に関係なく、どの細胞にも常に発現し存在し、特殊な機能は果たさないがそれらの生存に必須な役割を持つ遺伝子であり、例えば、ＲＮＡ合成酵素、エネルギー生成系酵素、リボソームのタンパク質、細胞骨格タンパク質などの遺伝子を例示することができる。具体的には、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），β-アクチン，β2-マイクログロブリン，HPRT 1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）などの遺伝子が挙げられる。本発明で使用されるハウスキーピング遺伝子は、測定目的であるヒトWT1遺伝子とRT-PCRによる増幅が競合しないもの、例えば塩基配列の相同性が低いものであることが好ましい。好ましくはGAPDHである。
【００２１】
GAPDHは「Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), mRNA」としてNCBIに登録されている遺伝子である（NM_002046.3）。その塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
【００２２】
本発明において１ステップRT-PCR法（逆転写反応及び伸長反応）に使用される反応緩衝液としては、逆転写活性を有する酵素が活性を示すのに適した水溶性緩衝液であればよく、例えばｐＨ７〜１０、好ましくはｐＨ８〜９の緩衝液、例えばトリス緩衝液を挙げることができる。更にこの緩衝液の中には逆転写活性を有する酵素またはDNAポリメラーゼの活性に必要な種々のイオンを含む。中でもNaイオンやKイオンは塩の形で5〜50mMの濃度で添加される。Mgイオンは塩の形で1〜10mMで添加される。その他、必要に応じて界面活性剤、ウシ血清アルブミン（BSA）、ゼラチン等、逆転写活性を有する酵素またはDNAポリメラーゼの活性を促進または安定化する薬剤を配合することもできる。また、試料中のRNA及びRNA競合物の分解を抑制するためにリボヌクレアーゼ阻害剤が添加されていてもよい。
【００２３】
逆転写活性を有する酵素としては、トリ骨芽球症ウイルス由来逆転写酵素（AMV）、ラウス関連ウイルス由来逆転写酵素（RAV2）、モロニー・ネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（MMLV）、サーマス・サーモフィルス（Thermusthermophilus）由来DNAポリメラーゼ（Tth）、バチルス・カルドテナクス（Bacillus cardotenax ）由来DNAポリメラーゼ（Bca）、並びにそれらの誘導体が挙げられるが、中でもTthが最も本発明に適している。Tthとして、具体的にはThermus species Z05に由来するThermostable enzymeのDNAポリメラーゼを例示することができる。なお、これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質のいずれであってもよい。
【００２４】
反応液にはcDNA合成並びにPCRにおいて基質となる４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP；本明細書ではこの４種を総称して「dNTP」ともいう記載）が添加される。また、dNTPはそのすべて又は一部が、プライマーから合成されるDNA鎖の伸長を可能とする範囲で修飾及び／又は標識されたdNTPに置き換えることもできる。
【００２５】
本発明において標的RNAからのcDNA合成（逆転写反応及び伸長反応）に用いられるプライマーとしては、少なくとも標的RNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、採用される反応条件において標的RNAにアニールするものである必要がある。オリゴヌクレオチドの長さとしては6〜100ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さを例示することができる。また修飾及び／又は標識されたプライマーも使用できる。該プライマーは、例えば公知方法により化学的に合成することができる。また、PCRにおいて使用されるプライマーは、少なくとも標的RNA由来のcDNAを鋳型としたDNAの増幅が可能である必要がある。このためには、少なくとも鋳型cDNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、採用される反応条件において当該cDNAにアニールするものである必要がある。好ましくは、上記の標的RNAからcDNAの合成（逆転写反応及び伸長反応）にプライマーとして機能するとともに、cDNAを鋳型としたDNAにもプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
本発明の目的遺伝子であるヒトWT1 mRNAをcDNAに逆転写し伸長、増幅するために好適に使用されるプライマーセットとしては、下記表１に記載する（A1）Forwardプライマー及び（A2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＡ、並びに表２に記載する（B1）Forwardプライマー及び（B2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＢを挙げることができる。なお、表１及び２には、これらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブ（（A3）Probe、（B3）Probe）も併せて示す。なお、かかるプローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。
【００２７】
また、本発明の方法においてハウスキーピング遺伝子として好適に使用されるヒトGAPDH mRNAをcDNAに逆転写し伸長、増幅するために好適に使用されるプライマーセットとしては、下記表１に記載する（a1）Forwardプライマー及び（a2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＡ、並びに表２に記載する（b1）Forwardプライマー及び（b2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＢを挙げることができる。なお、表１及び２には、これらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブ（（a3）Probe、（b3）Probe）も併せて示す。なお、かかるプローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。
【００２８】
プローブの標識法には、RI法と非RI法とがあるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法には蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法が好適に使用される。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されないが、シアニン色素（Cy DyeTMシリーズのCy3やCy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン及びそのヨウ素誘導体などを用いることが出来る。
【００２９】
【表１】
2014115779.tif 000002
【００３０】
【表２】
2014115779.tif 000003
【００３１】
本発明において使用されるRNA標準品は公知の方法で作製することができる。例えば、「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 第87巻, 第2725〜2729頁（1990）」、「Clinical Chemistry（Clin. Chem. ）, 第41巻, 第819〜825頁（1995）」、「Blood，第82巻，第1929〜1936頁（1993）」等の記載を参照して作製することができる。
【００３２】
具体的には以下の通りである。増幅対象の2本鎖DNA配列に、RNA合成酵素，例えばT7 RNAポリメラーゼ等の反応基点となるプロモーター配列を付加して、RNA合成の鋳型となるDNA配列を作成する。反応容器内に、RNAポリメラーゼと、RNAプロモーター配列を含む2本鎖DNA、ヌクレオシド三リン酸を加え、３７℃で３０分〜２時間反応することにより、RNAプロモーター下流の鋳型DNAに相補的な一本鎖RNAを合成する。
【００３３】
本発明で使用する１ステップRT-PCRの反応操作及び反応条件としては、制限されないものの、下記を例示することができる。
【００３４】
反応容器内に、例えばcNTP、Mg塩、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写活性を有する酵素、プライマー等を含む反応液を加え、反応開始までは４℃以下で保冷しておく。これに測定しようとするヒトWT1 mRNAを含み得る被験試料及びハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDH mRNA）を添加し５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃で２〜３０分、好ましくは２〜１０分程度、複数回反応させcDNA合成を行う（逆転写反応）。引続き９０〜９９℃で１０秒〜２分間程度加熱し、RNA-cDNA複合体を変性させる（熱変性）。更に９０〜９９℃での熱変性、４５〜６５℃のアニーリング反応、及び６０〜８０℃のＤＮＡ伸長反応からなる温度サイクル反応を２〜５０サイクル行って標的RNA由来のDNA断片を増幅する。更に感度及び／又は特異性を向上するためにネステッドPCRを行う場合には、１段階目、２段階目のPCRに使用するプライマーを共に最初から反応容器内に添加しておき、２段階のPCRを連続して行うこともできる。この場合１段階目のPCR用プライマー量は２段階目のPCR用プライマー量より少なくすることが必要で、好ましくは１００倍以下の量が適している。
【００３５】
以上説明する本発明の方法によれば、ヒトWT1 mRNAの発現量を、同一容器内における１ステップ反応により簡便に測定することができるとともに、実施例２に示すように、目的遺伝子のRT-PCR反応とハウスキーピング遺伝子のRT-PCR反応を別個に行う２ステップRT-PCRよりも感度高く検出することができる。言い換えれば、本発明の方法によれば、ヒトWT1 mRNAの発現量が低濃度の試料であっても精度高く検出することができる。
【００３６】
当該方法は、下記に説明するリアルタイムPCRキットを用いることでより簡便に実施することができる。
【００３７】
（II）ヒトWT1 mRNAの発現量定量用のリアルタイムPCR用キット
本発明のRT-PCR用試薬キットは、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットと、ハウスキーピング遺伝子、好ましくはGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットの両方を包含することを特徴とする。また当該キットには、RT-PCR法で増幅されたヒトWT1 mRNAの増幅産物、及びハウスキーピング遺伝子の増幅産物を検出するために使用されるプローブを含めることができる。
【００３８】
キットの一例として、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表１に示す「（A1）Forwardプライマー（配列番号３）」及び「（A2）Reverseプライマー（配列番号４）」からなるプライマーセットＡ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表１に示す「（A3）Probe（配列番号５）」を含み、且つ、ハウスキーピング遺伝子として好適に使用されるヒトGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表１に示す「（a1）Forwardプライマー（配列番号６）」及び「（a2）Reverseプライマー（配列番号７）」からなるプライマーセットＡ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅産物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表１に示す「（a3）Probe（配列番号８）」を含むものを挙げることができる。
【００３９】
なお、プローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。
【００４０】
プローブの標識法には、RI法と非RI法とがあるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法には蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法が好適に使用される。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されないが、シアニン色素（Cy DyeTMシリーズのCy3やCy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン及びそのヨウ素誘導体などを用いることが出来る。
【００４１】
キットの他の一例として、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表２に示す「（B1）Forwardプライマー（配列番号９）」及び「（B2）Reverseプライマー（配列番号１０）」からなるプライマーセットＢ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表２に示す「（B3）Probe（配列番号１１）」を含み、且つ、ハウスキーピング遺伝子として好適に使用されるヒトGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表２に示す「（b1）Forwardプライマー（配列番号６）」及び「（b2）Reverseプライマー（配列番号１２）」からなるプライマーセットＢ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅産物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表２に示す「（b3）Probe（配列番号８）」を含むものを挙げることができる。
【００４２】
本発明のRT-PCR用キットは、上記成分のほか、逆転写反応とPCRの２つの反応に必要な各種成分（dNTP、Mg塩、ｐＨ調整のための緩衝成分等）、逆転写活性を有する酵素を含むことができる。更に酵素を安定化するような成分やリボヌクレアーゼ阻害剤等が添加されたものであってもよい。
【００４３】
該反応液はその必要量を適当な反応容器にとり、測定しようとする試料を添加するだけで反応を開始することができるため、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量を簡便に行うことができる。特に、多数の被験試料についてヒトWT1 mRNAの発現量の定量する場合に有用である。また、あらかじめ該反応液の１回分の必要量が分注された反応容器を準備しておくことにより、更に操作効率を改善することができる。本発明のRT-PCR用キットは、上記の方法に従って、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量を簡便、迅速に、かつクロスコンタミネーションの問題なく行えるキットである。該キットとしては、例えば上記方法に使用する各種試薬を含有するキット、上記の本発明に使用される反応液を含有するキット、該反応液の１回分が分注された反応容器を含有するキット等が挙げられる。該キットは特に種々の検査、中でも臨床診断用キットとして有用であり、白血病の検査、固型がんの微小転移の検査、残存微小病変の検査、感染症の検査などに広く利用できる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００４５】
［実施例１］  1ステップかつマルチプレックスRT-PCRの測定
（１）プライマーとプローブの設計
測定対象の目的遺伝子としてヒトWT1 mRNA，測定対象の発現量を補正する内在性コントロール遺伝子（補正用遺伝子）としてGAPDH mRNAを選択し、それぞれの遺伝子に対して特異的増幅と検出を可能とするプライマーセット及びプローブを設計し、合成した。【００４６】
蛍光標識プローブは、目的遺伝子（ヒトWT1 mRNA）と補正用遺伝子（GAPDH mRNA）を同時に検出するために、目的遺伝子を検出するためのプローブの5’末端をFAM（6-カルボキシフルオレセイン）で標識し、補正用遺伝子を検出するためのプローブの5’末端をHEX（6-ヘキサクロロフルオレセイン）で標識した。またそれぞれのプローブの3’末端を消光色素としてATTO-540Q（ATTO-TEC GmbH社）で標識した。【００４７】
本実施例で使用したプライマー及びプローブの配列を表３に示す。【００４８】
【表３】
2014115779.tif 000004
【００４９】
（２）標準品（WT1 mRNA，GAPDH mRNA）の調製
標準品は、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAを発現している白血病細胞株K562よりRNAを抽出し、このRNAを鋳型として、 WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの塩基配列にそれぞれ相補的なプライマーを用いて、RT-PCRを行い、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの一部の塩基配列を得た。得られたWT1 mRNA配列およびGAPDH mRNA配列をpT7blueプラスミドベクターにクローニングし、大腸菌DH5α株を形質転換した。次いでこの形質転換大腸菌を培養し、プラスミドDNAを抽出した。プラスミドDNA中、WT1 mRNA配列およびGAPDH mRNA配列が挿入されている部分より後ろにある配列を、制限酵素EcoRIを用いて切断し、直鎖状のDNAとした。プラスミドDNAに含まれるT7プロモーター配列を認識し、DNAを鋳型としてRNAを合成する酵素であるT7 RNAポリメラーゼを用いて、WT1 mRNA及びGAPDH mRNAのRNA配列を合成した。合成したRNAを、反応容器への非特異的な吸着を防ぐために50 ng/μLの大腸菌トランスファーRNAを含むTE バッファーで希釈し、それぞれの遺伝子（WT1およびGAPDH）のRNA標準品を調製した。【００５０】
斯くして調製したWT1 RNA標準品の濃度を2.5×101，2.5×102，2.5×103，2.5×104，2.5×105 copies/testに、またGAPDH RNA標準品の濃度を1.0×104，1.0×105，1.0×106，1.0×107，1.0×108copies/testに調整した。【００５１】
（３）RT-PCR反応
RT-PCR反応は、逆転写反応とPCR反応を一つのチューブ内で連続して行う1ステップRT-PCR法を行った。【００５２】
（３−１）逆転写酵素：
Z05 DNA polymerase（Thermostable enzyme from Thermus species Z05：Roche Diagnostics社）を使用した。【００５３】
（３−２）反応条件：
（a）逆転写反応とPCR反応
55℃で5分間、60℃で5分間、65℃で5分間の計15分間かけて逆転写反応を行った後、92℃で15秒間の熱変性、60℃で40秒間のアニーリング、及びDNA伸長反応からなるPCR反応を45サイクロ繰り返した。【００５４】
（b）試薬濃度
反応液の容量を20μLとし、その中のPrimer濃度は、Forward primer、及びReverse primerそれぞれ終濃度を0.2μMとした。Probe濃度は終濃度を0.1μMとした。【００５５】
（３−３）反応・測定装置：
RT-PCR法は、Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system（ライフテクノロジーズ社）を用いて行った。【００５６】
（４）結果
（４−１）蛍光増幅曲線の確認
（a）WT1 RNA標準品をWT1 mRNAを単独で増幅を行った場合、（b）GAPDH RNA標準品をGAPDH mRNAを単独で増幅を行った場合、及び（c）WT1 RNA標準品及びGAPDH RNA標準品のそれぞれについてWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅を行った場合の、蛍光増幅曲線と増幅サイクル数を確認した。【００５７】
図１に（a）各種濃度のWT1 RNA標準品をWT1 mRNAを単独で増幅を行った場合のWT1 mRNA増幅曲線、図２に（b）各種濃度のGAPDH RNA標準品をGAPDH mRNA単独で増幅を行った場合のGAPDH mRNA増幅曲線、図３に（c）各種濃度のWT1 RNA標準品をWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合のWT1 mRNA増幅曲線を、及び図４に（d）各種濃度のGAPDH RNA標準品をWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合のGAPDH mRNA増幅曲線を、それぞれ示した。表４に、各種濃度のWT1 RNA標準品についてWT1 mRNAを単独で増幅した場合及びWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合のWT1 mRNAの増幅サイクル数を示した。表５に、各種濃度のGAPDH RNA標準品についてGAPDH mRNAを単独で増幅した場合及びWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合のGAPDH mRNAの増幅サイクル数を示した。【００５８】
【表４】
2014115779.tif 000005
【００５９】
【表５】
2014115779.tif 000006
【００６０】
WT1 mRNAを単独で増幅した場合のWT1 mRNA増幅曲線を図１に示す。ここに示すように、WT1 mRNAを単独で増幅した場合、WT1 mRNAを2.5×105 〜 2.5×101copies/testまで検出することが可能であった。WT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合も、図３に示すように、WT1 mRNAを2.5×105 〜 2.5×101copies/testまで検出することが可能であった。【００６１】
また表４に示すように、WT1 mRNAを単独で増幅した場合の増幅サイクル数（増幅サイクル数18.63〜32.09）と、WT1 mRNA及びGAPDH mRNAをそれぞれ同時に増幅した場合の増幅サイクル数（増幅サイクル数18.67〜31.94）との差は-0.15〜0.06と小さく、単独増幅と同時増幅とで増幅サイクル数に有意な差はなかった。このことから、目的遺伝子であるWT1 mRNAと補正用遺伝子とを同時に増幅しても、目的遺伝子（WT1 mRNA）を単独で増幅する場合と同様に、同程度の増幅サイクル数にて、WT1 mRNAを検出することが可能と考えられた。【００６２】
GAPDH mRNAを単独で増幅した場合のGAPDH mRNA増幅曲線を図２に示す。ここに示すように、GAPDH mRNAを単独で増幅した場合、GAPDH mRNAを1.0×108 〜 1.0×104copies/testまで検出することが可能であった。【００６３】
表５に示すように、GAPDH mRNAを単独で増幅した場合の増幅サイクル数（10.18〜23.68）と、WT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅した場合の増幅サイクル数（10.30〜23.85）との差は0.10〜0.20と、単独増幅と同時増幅とで増幅サイクル数の差は大きくなかった。このことから、補正用遺伝子であるGAPDH mRNAと目的遺伝子であるWT1 mRNAとを同時に増幅する場合でも、また補正用遺伝子（GAPDH mRNA）を単独で増幅する場合と同様に、同程度の増幅サイクル数にて、GAPDH mRNAを検出することが可能と考えられた。【００６４】
［実施例２］  K562抽出RNAを用いた希釈試験
本実施例では、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを同時に増幅する、１ステップかつマルチプレックスなRT-PCR法と、逆転写反応とPCRを別の容器でそれぞれ行い、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを別個に増幅する２ステップRT-PCR法とで、測定感度を比較した。なお、２ステップRT-PCR法は、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」（大塚製薬株式会社）を使用して行った。【００６５】
（１）プライマーとプローブの配列
１ステップRT-PCR法によるWT1 mRNA測定及びGAPDH mRNA測定に使用したプライマー及びプローブの配列を表６に示す。なお２ステップ RT-PCR法は、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」を使用したため、プライマー及びプローブは不明である。【００６６】
【表６】
2014115779.tif 000007
【００６７】
（２）標準品の調製
標準品（WT1 mRNA、GAPDH mRNA）として、１ステップ RT-PCR法では、実施例１に記載した方法と同様の方法で調製したRNA標準品を用いた。WT1 RNA標準品の濃度を2.5×101，2.5×103，2.5×105，2.5×107copies/test，GAPDH RNA標準品の濃度を1.0×103，1.0×105，1.0×107，1.0×109copies/testとした。２ステップ RT-PCR法では、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」に備え付けられた標準品を使用した。【００６８】
（３）被験試料
被験試料として、WT1陽性白血病細胞株K562より抽出したRNAを用いた。具体的には、K562より抽出したTotal RNAを、チューブへの非特異的な核酸の吸着を防ぐためにキャリアRNAとして大腸菌トランスファーRNAを終濃度50ng/μLとなるようにあらかじめ添加したTE bufferを用いて、最終濃度が2、5、10 pg/μLになるように希釈して、これを被験試料とした。【００６９】
（４）RT-PCR反応
１ステップRT-PCR反応は、実施例１と同様の方法で行った。２ステップRT-PCRは、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」（大塚製薬株式会社）を用いてその添付文書に従って行った。測定は各被験試料について２重測定で行った。測定結果はWT1 mRNA測定キット「オーツカ」の添付文書に従い、Total RNA 1μg当たりのWT1 mRNA数であるcopy/μgRNAとして算出した。【００７０】
（５）結果
（５−１）K562抽出RNAによる希釈測定結果
表７にK562抽出RNAを被験試料として、１ステップRT-PCR法及び２ステップRT-PCR法を用いて実施した希釈試験の結果を示す。【００７１】
【表７】
2014115779.tif 000008
【００７２】
表７からわかるように、１ステップRT-PCR法では、K562希釈RNAをRNA濃度が2.5 pg/μLになるまで希釈しても測定可能であったのに対して、２ステップRT-PCR法では、K562希釈RNAをRNA濃度が2.5 pg/μLとなるまで希釈するとPCRによる増幅シグナルが検出されず、5 pg/μLにおいても、２重測定のデータが、17.2及び1.9 copy/μgRNAと乖離し、有効値として測定可能な範囲は10 pg/μLまでと考えられた。これらの結果から、１ステップRT-PCR法は、２ステップRT-PCR法よりも測定感度が良いことが判明した。【００７３】
［実施例３］  交差反応性試験
本実施例では、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを同時に増幅する１ステップRT-PCRを、プライマーおよびプローブとして、表８に示すセット（配列セットＢ）、及び表９に示すセットをそれぞれ用いて実施し、交差反応性を評価した。【００７４】
【表８】
2014115779.tif 000009
【００７５】
【表９】
2014115779.tif 000010
【００７６】
被験試料として、Human Genome DNA (Merck KGaA, Darmstadt, German, Cat No. 69237) 250 ng，50 ng,及び10 ng、並びにWT1陽性白血病細胞株K562（WT1 K562）より抽出したTotal RNA 250ngを用いた。【００７７】
1ステップRT−PCR反応は実施例１と同様の方法で行った。さらに、Human Genome DNA及びWT1 K562 mRNAをPCRして得られた増幅産物を、下記条件でアガロースゲル電気泳動して増幅産物を確認した。アガロース電気泳動の方法は常法に従った。
＜アガロースゲル電気泳動条件＞
泳動条件：15min、4％E-gal、
Photo条件：SYBR用filter、
E-gal装置より直接photo、
シャッタースピード：1/15、
しぼり：4.5
Apply条件：Sample 2.5μL+dH2O 16.5μL
Marker 2.5μL+dH2O 16.5μL
［結果］
Human Genomic DNAにはGAPDHの遺伝子は存在しないものの、GAPDHの偽遺伝子が存在することが知られている。本実施例では、表８に示したプライマーおよびプローブ配列を用いて1ステップRT-PCRを実施すると、図５（Ａ）のレーン１〜３に示すように、Human Genome DNAにおいて電気泳動でGAPDHと一致するバンドは認められなかった。すなわち、本発明のプライマーおよびプローブを用いた1ステップRT-PCRによれば、GAPDHとGAPDHの偽遺伝子とが明確に識別でき、GAPDHの偽遺伝子をGAPDHと誤認することがないことが確認できた。一方、表９に示したプライマーおよびプローブ配列を用いて1ステップRT-PCRを実施すると、図５（Ｂ）のレーン１〜３に示すように、電気泳動でGAPDHと一致するバンドが認められた。すなわち、当該プライマーおよびプローブを用いた1ステップRT-PCRではGAPDHとGAPDHの偽遺伝子とを区別することができなかった。【００７８】
なお、参考までに、表８（実施例）及び表９（比較例）のプライマーおよびプローブ配列をそれぞれ用いて1ステップRT-PCRを行った場合の増幅サイクル数を、GAPDHについては表１０に、WT1については表１１にそれぞれ示す。表中、「ND」は検出出来なかったことを意味する。【００７９】
【表１０】
2014115779.tif 000011
【００８０】
【表１１】
2014115779.tif 000012
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号３〜１２に示す塩基配列は、表３に記載するプライマー及びプローブを意味する。対応関係は表３に詳述した通りである。配列番号１３に示す塩基配列は、表９に記載するプライマーの塩基配列を意味する。当該塩基配列は、ヒトGAPDH遺伝子（NM_002046.3：配列番号２）の56〜74領域の塩基配列に相当する。
【図１】
2014115779.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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