(57)【要約】本発明は、細胞の検出方法の提供を目的とする。  本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程を含む、細胞の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程を含む、細胞の検出方法。
【請求項２】
組換えウイルスの増殖を検出する工程が、レポーター遺伝子を利用するものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えウイルスが組換えアデノウイルスである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
組換えアデノウイルスが、Ｅ１遺伝子を含み、当該遺伝子の発現がテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、体液中に浮遊する腫瘍細胞である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
体液中に浮遊する腫瘍細胞が、循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
体液が、血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液又は体腔液である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
死細胞検出用試薬をさらに用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
体液中に浮遊する腫瘍細胞が、上皮間葉移行を起こしたもの又は上皮間葉移行を起こしていないものである請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えウイルスの増殖の検出結果が陽性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしたものであると判定する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えウイルスの増殖の検出結果が陰性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陽性、かつ前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであると判定する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えアデノウイルスの増殖の検出結果が陰性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陽性、前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記死細胞検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであり、かつ、生存していると判定する、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法により検出された検出結果を指標として、被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発を予測することを特徴とする、癌の検査又は診断方法。
【請求項１５】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が低い、（ｉｉ）治療耐性を獲得した、（ｉｉｉ）予後が悪い、（ｉｖ）再発の可能性が高い、又は（ｖ）病理組織学的悪性度が高いと予測することの指標とする、癌の検査又は診断方法。
【請求項１６】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が高い、（ｉｉ）予後が良好である、（ｉｉｉ）再発の可能性が低い、又は（ｉｖ）病理組織学的悪性度が低いと予測することの指標とする、癌の検査又は診断方法。
【請求項１７】
癌が固形癌である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固形癌が脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固形癌が肺癌である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
癌が早期癌又はオリゴ再発である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス、上皮由来細胞の検出用試薬、及び白血球検出用試薬を含む、細胞の検出用キット。
【請求項２２】
組換えウイルスが、レポーター遺伝子を含むものである請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
組換えウイルスが組換えアデノウイルスである請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
組換えアデノウイルスが、Ｅ１遺伝子を含み、当該遺伝子の発現がテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるものである請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むものである請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
細胞が、体液中に浮遊する腫瘍細胞である請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
体液中に浮遊する腫瘍細胞が、循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
体液が、血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液又は体腔液である請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
死細胞検出用試薬をさらに含むことを特徴とする請求項２１〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
体液中に浮遊する腫瘍細胞が、上皮間葉移行を起こしたもの又は上皮間葉移行を起こしていないものである請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出を指標として被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発の予測を行うための、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
癌が固形癌である請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
固形癌が脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
固形癌が肺癌である請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
癌が早期癌又はオリゴ再発である請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
請求項６〜２０のいずれか１項に記載の方法により検出された、体液中に浮遊する腫瘍細胞を含む、癌の診断用、癌の治療効果の判定若しくは予測用、又は癌の予後若しくは再発の予測用バイオマーカー。
【請求項３７】
体液中に浮遊する腫瘍細胞が循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である請求項３６に記載のバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の検出方法、特に循環腫瘍細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌はクローン進化と選択の結果として、全身的治療に対する抵抗性を獲得する。治療の結果としての耐性癌遺伝子変異などを調べるために繰り返し生検を行うことは、困難かつ侵襲的である。また、腫瘍マーカーを利用した血液検査が普及しているが、慢性炎症性疾患などの非腫瘍性疾患、喫煙、糖尿病などでも数値が上昇してしまったり、早期癌の検出ができなかったりするなど、癌の検出感度及び特異度が十分であるとは言えない。また、肺癌は癌死亡原因の一位を占め、固形癌種の中では最も予後の悪い悪性疾患であるため、早期発見する技術が強く求められている。
近年、これらの問題を解決するため固形腫瘍の診断並びに転移、再発及び予後の予測に有用なバイオマーカーとして、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ；ＣＴＣ）が非常に注目されている。乳癌の研究では、治療開始前及び初回治療後のＣＴＣ数が無増悪生存期間や全生存期間と強い相関を示し、ＣＴＣ数を測定することで治療効果予測、予後予測が可能であることが報告されている（非特許文献１：Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５１：７８１−７９１，２００４、非特許文献２：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２９：１５５６−１５６３，２０１１）。ＣＴＣの検出や計数は、通常の採血により得られる末梢血を用いて非侵襲的に行うことができるので、被検者に負担をかけずに何度でも行うことができる。
他方、癌の進行に伴い上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）を起こしたＣＴＣにおいて、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＥｐＣＡＭ）抗原の発現が低下することが報告されている（非特許文献３：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １；３３９（６１１９）：５８０−４．）。抗ＥｐＣＡＭ抗体をマーカーとして用いるＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ｓｙｓｔｅｍは、既にＦＤＡの認可を受け最も普及しているＣＴＣ測定法であるが、ＥＭＴを起こしたＣＴＣの検出ができなかったり、死んだＣＴＣを偽陽性細胞として検出してしまったりするために、検出感度及び特異度が低いという課題を持ち、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）症例での有用性は否定的である。また、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ以外のＣＴＣ検出方法においても、非小細胞腫癌患者から高感度にＣＴＣを検出できたという報告はなく、非小細胞肺癌、特に早期の非小細胞肺癌ににおいては血中にＣＴＣが存在するかどうかも明らかとなっていなかった。
また、制限増殖型アデノウイルスを用いた、癌細胞の検出用又は癌の診断用試薬の発明が提案されている（特許文献１：ＷＯ２０１３／０２７４２７号公報）。どのような癌細胞に対し検出できるのか、あるいはどのような癌の進行度に応じた検出が可能なのかどうかは知られておらず、また、検出する癌細胞又は診断する癌種に応じた最適な条件については検討がなされていなかった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、循環腫瘍細胞を、高感度かつ高特異度で、ひいては高精度に検出する方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＷＯ２０１３／０２７４２７号公報に記載のアデノウイルスと、上皮由来細胞の検出用試薬及び白血球検出用試薬とを組み合わせることで、細胞、例えば循環腫瘍細胞を高感度かつ高特異度で、ひいては高精度に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程を含む、細胞の検出方法。
（２）組換えウイルスの増殖を検出する工程が、レポーター遺伝子を利用するものである（１）に記載の方法。
（３）組換えウイルスが組換えアデノウイルスである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）組換えアデノウイルスが、Ｅ１遺伝子を含み、当該遺伝子の発現がテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるものである（３）に記載の方法。
（５）Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むものである（４）に記載の方法。
（６）細胞が、体液中に浮遊する腫瘍細胞である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）体液中に浮遊する腫瘍細胞が、循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である（６）に記載の方法。
（８）体液が、血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液又は体腔液である（６）又は（７）に記載の方法。
（９）死細胞検出用試薬をさらに用いることを特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）体液中に浮遊する腫瘍細胞が、上皮間葉移行を起こしたもの又は上皮間葉移行を起こしていないものである（６）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）前記組換えウイルスの増殖の検出結果が陽性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしたものであると判定する、（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）前記組換えウイルスの増殖の検出結果が陰性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陽性、かつ前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであると判定する、（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）前記組換えアデノウイルスの増殖の検出結果が陰性、前記上皮由来細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陽性、前記白血球検出用試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記死細胞検出用試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであり、かつ、生存していると判定する、（９）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）前記（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法により検出された検出結果を指標として、被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発を予測することを特徴とする、癌の検査又は診断方法。
（１５）前記（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が低い、（ｉｉ）治療耐性を獲得した、（ｉｉｉ）予後が悪い、（ｉｖ）再発の可能性が高い、又は（ｖ）病理組織学的悪性度が高いと予測することの指標とする、癌の検査又は診断方法。
（１６）前記（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が高い、（ｉｉ）予後が良好である、（ｉｉｉ）再発の可能性が低い、又は（ｉｖ）病理組織学的悪性度が低いと予測することの指標とする、癌の検査又は診断方法。
（１７）癌が固形癌である（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）固形癌が脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１つである（１７）に記載の方法。
（１９）固形癌が肺癌である（１７）に記載の方法。
（２０）癌が早期癌又はオリゴ再発である（１４）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス、上皮由来細胞の検出用試薬、及び白血球検出用試薬を含む、細胞の検出用キット。
（２２）組換えウイルスが、レポーター遺伝子を含むものである（２１）に記載のキット。
（２３）組換えウイルスが組換えアデノウイルスである（２１）又は（２２）に記載のキット。
（２４）組換えアデノウイルスが、Ｅ１遺伝子を含み、当該遺伝子の発現がテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるものである（２３）に記載のキット。
（２５）Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むものである（２４）に記載のキット。
（２６）細胞が、体液中に浮遊する腫瘍細胞である（２１）〜（２５）のいずれか１項に記載のキット。
（２７）体液中に浮遊する腫瘍細胞が、循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である（２６）に記載のキット。
（２８）体液が、血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液又は体腔液である（２６）又は（２７）に記載のキット。
（２９）死細胞検出用試薬をさらに含むことを特徴とする（２１）〜（２８）のいずれか１項に記載のキット。
（３０）体液中に浮遊する腫瘍細胞が、上皮間葉移行を起こしたもの又は上皮間葉移行を起こしていないものである（２６）〜（２９）のいずれか１項に記載のキット。
（３１）体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出を指標として被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発の予測を行うための、（２６）〜（３０）のいずれか１項に記載のキット。
（３２）癌が固形癌である（３１）に記載のキット。
（３３）固形癌が脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１つである（３２）に記載のキット。
（３４）固形癌が肺癌である（３２）に記載のキット。
（３５）癌が早期癌又はオリゴ再発である（３１）〜（３４）のいずれか１項に記載のキット。
（３６）前記（６）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法により検出された、体液中に浮遊する腫瘍細胞を含む、癌の診断用、癌の治療効果の判定若しくは予測用、又は癌の予後若しくは再発の予測用バイオマーカー。
（３７）体液中に浮遊する腫瘍細胞が循環腫瘍細胞又は癌幹細胞である（３６）に記載のバイオマーカー。
（３８）さらに、本発明は、体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出方法であって、被検者から採取された生体試料に対して、以下の（ａ）の組換えアデノウイルスを接触させてレポーター遺伝子の発現を検出する工程、以下の（ｂ）の試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び以下の（ｃ）の試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む前記方法である。
（ａ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチド、並びにｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９及びｌｅｔ−７からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに対する標的配列を含むポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた複製カセットと、
レポーター遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた標識カセットと、
ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質をコードする遺伝子とを含む、組換えアデノウイルス
（ｂ）上皮由来細胞の検出用試薬
（ｃ）白血球検出用試薬
また、本発明は、体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出用キットであって、以下の（ａ）の組換えアデノウイルス並びに（ｂ）及び（ｃ）の試薬を含む前記キットである。
（ａ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチド、並びにｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９及びｌｅｔ−７からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに対する標的配列を含むポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた複製カセットと、
レポーター遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた標識カセットと、
ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質をコードする遺伝子とを含む、組換えアデノウイルス
（ｂ）上皮由来細胞の検出用試薬
（ｃ）白血球検出用試薬
さらに、本発明は、前記方法により検出された、体液中に浮遊する腫瘍細胞を含む、癌の診断用、癌の治療効果の判定若しくは予測用、又は癌の予後若しくは再発の予測用バイオマーカーである。
本発明の方法、キット及びバイオマーカーにおいて、体液中に浮遊する腫瘍細胞としては循環腫瘍細胞が挙げられる。また、生体試料として血液、リンパ液、組織液、髄液又は体腔液を使用することができる。
さらに、本発明の方法においては、（ｄ）死細胞検出用試薬を用いて死細胞の検出を行うことができる。
本発明の方法、キット及びバイオマーカーにおいて、体液中に浮遊する腫瘍細胞は、上皮間葉移行を起こしたもの又は上皮間葉移行を起こしていないものである。
本発明の方法において、前記（ａ）の組換えアデノウイルスによるレポーター遺伝子発現の検出結果が陽性、前記（ｂ）の試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記（ｃ）の試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしたものであると判定することができる。
また、前記（ａ）の組換えアデノウイルスによるレポーター遺伝子発現の検出結果が陰性、前記（ｂ）の試薬を用いた検出結果が陽性、かつ前記（ｃ）の試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであると判定することができる。
さらに、前記（ａ）の組換えアデノウイルスによるレポーター遺伝子発現の検出結果が陰性、前記（ｂ）の試薬を用いた検出結果が陽性、前記（ｃ）の試薬を用いた検出結果が陰性、かつ前記（ｄ）の試薬を用いた検出結果が陰性のときは、体液中に浮遊する腫瘍細胞は上皮間葉移行を起こしていないものであり、かつ、生存していると判定することができる。
さらに、本発明は、前記方法により検出された検出結果を指標として、被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発を予測することを特徴とする、癌の検査又は診断方法である。
さらに、本発明は、前記方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が低い、（ｉｉ）治療耐性を獲得した、（ｉｉｉ）予後が悪い、（ｉｖ）再発の可能性が高い、又は（ｖ）病理組織学的悪性度が高いと予測することの指標とする、癌の検査又は診断方法である。
さらに、本発明は、前記方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものではないと判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が高い、（ｉｉ）予後が良好である、（ｉｉｉ）再発の可能性が低い、又は（ｉｖ）病理組織学的悪性度が低いと予測することの指標とするものである。
本発明において、癌としては固形癌が挙げられ、固形癌は、例えば脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１つである。本発明においては、固形癌は肺癌であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、癌は早期癌又はオリゴ再発である。
また、本発明の好ましい態様において、体液中に浮遊する腫瘍細胞は癌幹細胞である。
さらに、本発明においては、標識カセットが、さらにｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９及びｌｅｔ−７からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに対する標的配列を含むことが好ましい。
本発明において、レポーター遺伝子は、蛍光を発するタンパク質をコードする遺伝子又は酵素反応により発光物質若しくは発色物質を生じる酵素タンパク質をコードする遺伝子である。
また、レポーター遺伝子の発現を制御しうるプロモーターは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター又はサイトメガロウイルスプロモーターであることが好ましい。
さらに、ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質としては、３４型又は３５型アデノウイルスのファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を含むものが挙げられる。
上皮由来細胞の検出用試薬は、上皮細胞接着分子に対する抗体を含むものが挙げられ、白血球検出用試薬は、ＣＤ４５に対する抗体を含むものが挙げられる。
本発明により、高感度かつ高特異度で、ひいては高精度で、体液中に浮遊する腫瘍細胞を検出することができる。また、本発明により、上皮間葉移行を起こした体液中に浮遊する腫瘍細胞を検出でき、従来の方法では検出することができなかった早期癌又はオリゴ再発において、体液中に浮遊する腫瘍細胞を検出することができる。また、本発明により、上皮間葉移行を起こした体液中に浮遊する腫瘍細胞と上皮間葉移行を起こしていない体液中に浮遊する腫瘍細胞とをフェノタイプ別に検出でき、検出された体液中に浮遊する腫瘍細胞を、癌の診断用マーカーとしてだけでなく、治療奏功／耐性、病理組織学的悪性度及び癌幹細胞性の獲得の予測用若しくは判定用、並びに、予後及び再発の予測用マーカーとして利用することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＣＴＣが検出された患者のうち、ＥＭＴ−ＣＴＣとｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣとの対比を示す図である。
図２は、組織学的グレードが異なる患者におけるＣＴＣ数を示す図である。
図３は、抗癌剤投与前と投与後におけるＣＴＣの推移を示す図である。
図４は、ＣＤ１３３陽性細胞の検出結果を示す図である。
図５は、食道癌術後肺転移再発、胃癌術後肺転移再発、直腸癌及び腎癌症例におけるＥＭＴ−ＣＴＣの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１４年５月１３日に出願された日本国特許出願（特願２０１４−０９９９５５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程を含む、細胞の検出方法である。
また、本発明は、前記方法により検出された検出結果を指標として、被検者の癌の有無を判定し、癌の治療奏功及び／又は耐性を予測若しくは判定し、又は癌の予後若しくは再発を予測することを特徴とする、癌の検査又は診断方法である。
また、本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス、上皮由来細胞の検出用試薬、及び白血球検出用試薬を含む、細胞の検出用キットである。
さらに、本発明は、前記方法により検出された、体液中に浮遊する腫瘍細胞を含む、癌の診断用、癌の治療効果の判定若しくは予測用、又は癌の予後若しくは再発の予測用バイオマーカーである。
本発明の好ましい態様において、本発明は、被検者から採取された生体試料に対して、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターを含む組換えウイルスを接触させて該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び白血球検出用試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出方法である。
さらに好ましくは、本発明は、体液中に浮遊する腫瘍細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出方法であって、被検者から採取された生体試料に対して、以下の（ａ）の組換えアデノウイルスを接触させてレポーター遺伝子の発現を検出する工程、以下の（ｂ）の試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び以下の（ｃ）の試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む前記方法である。
（ａ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチド、並びにｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９及びｌｅｔ−７からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに対する標的配列を含むポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた複製カセットと、
レポーター遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた標識カセットと、
ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質をコードする遺伝子とを含む、組換えアデノウイルス
（ｂ）上皮由来細胞の検出用試薬
（ｃ）白血球検出用試薬
本発明においては、組換えアデノウイルスを用いた検出に加え、上皮由来細胞の検出、白血球の検出を併用することによって高感度かつ高特異度で、ひいては高精度にＣＴＣの測定が可能となった。
現在、ＣＴＣ検出機器でＦＤＡの承認を受けているのはＶｅｒｉｄｅｘ社のＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍのみであり、臨床試験で用いられているＣＴＣ検出方法のほとんどは、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍによるものである。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍは、癌細胞をＥｐＣＡＭ抗体及びＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体で検出することを基本技術とする。
しかしながら、ＣＴＣ検出技術は、血液細胞１０億個の中から数個〜数十個の細胞を検出する方法であるため、感度及び精度を向上させることが極めて困難であり、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍを利用したＣＴＣ検出方法にもいくつかの課題が指摘されている。例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ＳｙｓｔｅｍによるＣＴＣ検査で陰性の癌細胞が別の検査で陽性として検出されたり、癌種により感度や特異度に大きな差があることなどが指摘されている（Ａｌｌａｒｄ  Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，６８９７−６９０４）。また、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍは、臨床現場において非小細胞肺癌のＣＴＣ検出率が低いことも課題として挙げられている（同）。
また、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍは、ＥＭＴを起こした癌細胞でＥｐＣＡＭを含む細胞表面抗原の発現が低下するので、ＣＴＣ検出率が低下することも課題として挙げられている（Ａｎｉｅｔａ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１０１，２００９，６１−６６、Ｊａｎｉｃｅ  Ｌｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１２６（３），２０１０，６６９−６８３）。ＥＭＴは、癌細胞が上皮としての特性を失い、周辺組織に移動しやすい間葉系細胞としての特徴を獲得する現象であり、癌の進展（浸潤・転移など）、悪性度、治療抵抗性、癌幹細胞性の獲得などへの関与が指摘されている。
ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ｓｙｓｔｅｍに代表される従来のＣＴＣ検出方法と、組換えアデノウイルスを用いるＣＴＣ検出方法では、その原理の違いから、検出されるＣＴＣのフェノタイプが異なることはある程度予想されていたが、本発明らによる鋭意研究の結果、初めて組換えアデノウイルスを用いるＣＴＣ検出方法により検出されるＣＴＣのフェノタイプが明らかとなった。すなわち、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ等の従来のＣＴＣ検出方法では、少なくともＥｐＣＡＭ陽性を示す細胞をＣＴＣと判定することから、上皮間葉移行を起こしていないＣＴＣ（「ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣ」と言う。）しか検出されなかったが、組換えアデノウイルスを用いるＣＴＣ検出方法では、上皮間葉移行を起こしたＣＴＣ（「ＥＭＴ−ＣＴＣ」と言う。）が主に検出されることが後述する実施例で明らかとなった。そこで、本発明者らは、異なるフェノタイプのＣＴＣを漏れなく検出するために試行錯誤を繰り返した結果、上記（ａ）の組換えアデノウイルスを用いた検出に加え、（ｂ）上皮由来細胞の検出及び（ｃ）白血球の検出を組合せることが最適であるとの結論に至り、さらには、この方法によりＥＭＴ−ＣＴＣとｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣとをフェノタイプ別に判定できることを見出した。
ＥＭＴ−ＣＴＣの臨床的重要性の報告が過去になされている。例えば、ＥｐＣＡＭ抗体／ＥＧＦＲ抗体／ＨＥＲ２抗体を利用したＣＴＣの検出と、ＦＩＳＨ法による上皮及び間葉系の１０種のＲＮＡプローブのマーカーとを用いたフェノタイプの解析を組合せ、化学療法後のＥＭＴ−ＣＴＣの推移を観察した結果が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １；３３９（６１１９）：５８０−４）。組織学的悪性度の高い乳癌に対し化学療法を開始後、治療耐性が示された際に、ＥＭＴ−ＣＴＣの増加が見られることから、ＥＭＴ−ＣＴＣこそがキーバイオマーカーとして有用であることが報告されている。しかしながら、抗体のみを利用してＣＴＣを検出する方法は、生きた癌細胞だけでなく死んだ癌細胞を検出してしまうという課題があり、また、ＦＩＳＨ法は１サンプルあたりの測定に、膨大なコスト、人員及び時間を要する。本発明は、上記の複数の抗体とＲＮＡプローブを用いる方法と比較すると、高感度かつ高特異度で、ひいては高粘度にＣＴＣを検出できるだけでなく、簡易かつ短時間にＣＴＣを検出することができる点でも有利である。
また、本発明により検出されたＣＴＣは、病期を問わず癌の診断に有用である。従来のＣＴＣ検出方法や腫瘍マーカーも癌の診断に利用されているが、早期癌の検出感度が低い又は検出できないという課題がある。前述のように、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ｓｙｓｔｅｍにより非小細胞肺癌のＣＴＣを検出する場合、ステージＩＩＩ  Ｂの進行癌でＣＴＣが同定さたという報告はあるが、それより早期の癌でＣＴＣが同定されたという報告はされていない。また、後述する実施例で示すように、癌のドック・検診の血液検査において普及しているＣＥＡ、ＳＬＸなどの腫瘍マーカーは、病期が早期になるほど著しく感度が低下する。これに対し、本発明のＣＴＣ検出方法は、ＣＴＣの検出が困難な非小細胞肺癌において、超早期のステージＩＡの患者からも高感度かつ高特異度でＣＴＣを同定することが可能となった。従って、本発明により検出されたＣＴＣは、特に癌の早期発見に有用である。
なお、非小細胞肺癌は、原発巣の腫瘍がＥＭＴ化しやすいことが知られている（ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ．２０１３  Ｊｕｌ；８１（１）：１１７−２２．）。そのため、従来のＣＴＣ検出方法と比べ、本発明のＣＴＣ検出方法が非小細胞肺癌、特に早期の非小細胞肺癌において、高感度かつ高特異度でＣＴＣを検出できた理由も、ＥＭＴ−ＣＴＣの検出能力の差が反映されたことによると考えられる。また、様々な固形癌においてもＥＭＴ化することが知られている（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；６８（１８）：３０３３−３０４６．）。従って、本発明により、非小細胞肺癌だけでなく、腫瘍の少なくとも一部がＥＭＴ化する固形癌において、従来のＣＴＣ検出方法よりも高感度かつ高特異度でＣＴＣを検出することができ、特に、ドック・検診への応用展開が期待できる。
また、本発明により、ＥＭＴ−ＣＴＣとｎｏｎ−ＥＭＴ−ＣＴＣとをフェノタイプ別に検出できるので、検出されたＣＴＣは、癌の診断用マーカーとしてだけでなく、治療奏功／耐性、病理組織学的悪性度及び癌幹細胞性の獲得の予測用若しくは判定用、並びに、予後及び再発の予測用マーカーとして有用であることが明らかとなった。
後述する実施例に示すように、化学療法開始前にｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣが検出された症例については、化学療法開始後１週間でｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣがすべて消失した。かつ、化学療法開始前にｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣのみ検出された症例はｒｅｓｐｏｎｄｅｒであったことから、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣは化学療法による治療効果が高いことの指標として利用可能であることが明らかとなった。また、化学療法開始前にＥＭＴ−ＣＴＣが検出された症例ではｎｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＳＤ  ｏｒ  ＰＤ）が多いことから、ＥＭＴ−ＣＴＣは化学療法による治療効果が低いことの指標として利用可能であることが明らかとなった。従来の非小細胞肺癌のＲＥＣＩＳＴの効果判定では、３〜４週間おきのサイクルで２コースの投与期間、即ち２か月弱の期間を要していたが、本発明では、化学療法開始前又は化学療法開始後１週間で、治療奏功／耐性の予測若しくは判定が可能となった。また、化学療法を１サイクル実施した後の判定においても高い粘度での予測若しくは判定が可能になると考えられる。
また、後述の実施例に示すように、化学療法開始後１週間経過した時点で依然ＥＭＴ−ＣＴＣが残存する症例において、治療の早期段階で遠隔臓器再発例を認めたことから、本発明によりＥＭＴ−ＣＴＣを検出することにより、化学療法開始後１週間で、再発を予測することが可能となった。また、化学療法を１サイクル実施した後の判定においても高い精度での予測が可能になると考えられる。
また、後述する実施例に示すように、病理組織学的悪性度が高いほどＣＴＣ数の増加が認められたことから、本発明によりＣＴＣを検出することにより、病理組織学的悪性度の予測若しくは判定が可能であることが明らかとなった。また、病理組織学的悪性度の高い癌は、早期癌と比較して予後不良であることは周知の事実であるので、本発明によりＣＴＣを検出することにより、予後を予測することが可能となった。
また、後述する実施例に示すように、組換えアデノウイルスにより癌幹細胞が検出可能であったことから、本発明により癌幹細胞が検出可能であることが示唆された。
また、後述する実施例に示すように、オリゴ再発症例においてＣＴＣが検出されたことから、ＣＴＣの検出をもって術後の遠隔転移又は再発の早期発見が可能であることが示された。癌根治術後に定期的にＣＴＣモニタリングを実施することで再発の有無を早期に発見し、ＣＴＣ陽性症例に対し速やかに全身ＣＴやＰＥＴ／ＣＴにより全身の新規転移精査を行うことで、早期に再発病巣を発見することができる。
２．細胞の検出方法
前述の通り、本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程を含む、細胞の検出方法である。
好ましくは、本発明は、被検者から採取された生体試料に対して、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターを含む組換えウイルスを接触させて該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び白血球検出用試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出方法である。
より好ましくは、本発明は、体液中に浮遊する腫瘍細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出方法であって、被検者から採取された生体試料に対して、以下の（ａ）の組換えアデノウイルスを接触させてレポーター遺伝子の発現を検出する工程、以下の（ｂ）の試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び以下の（ｃ）の試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む前記方法である。
（ａ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチド、並びにｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９及びｌｅｔ−７からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに対する標的配列を含むポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた複製カセットと、
レポーター遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた標識カセットと、
ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質をコードする遺伝子とを含む、組換えアデノウイルス
（ｂ）上皮由来細胞の検出用試薬
（ｃ）白血球検出用試薬
［１］  組換えウイルス
本発明において使用される組換えウイルスは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーターを含む組換えウイルスであり、当該テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される。テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーターとしては、哺乳類動物由来のものを使用することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ等由来のＴＥＲＴプロモーターを使用することができる。ヒトを含む哺乳類動物のＴＥＲＴプロモーターはクローニングされており、その配列情報は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから入手可能である。本発明においては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴプロモーター）が好ましい。
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスを作製するための宿主となるウイルスとしては、特に制限はなく、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられ、アデノウイルスが好ましい。
組換えアデノウイルスとしては、ｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びマイクロＲＮＡの標的配列を含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれるとともに、レポーター遺伝子、該遺伝子の発現を制御しうるプロモーター及びマイクロＲＮＡの標的配列を含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれ、かつ、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスであることが好ましい（ＷＯ２０１３／２７４２７号公報）。
以下、組換えウイルスについて説明するが、説明の便宜上、組換えアデノウイルスを組換えウイルスとして説明する。
（１）複製カセット
複製カセットは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含み、かつマイクロＲＮＡの標的配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明において使用される組換えアデノウイルスは、癌細胞で特異的に増殖することが可能であり、また目的のｍｉＲＮＡが発現する細胞においてウイルスの増殖を抑制することができる。例えば、複製カセットに含まれるｍｉＲＮＡの標的配列が、血液細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列である場合、本発明において使用される組換えアデノウイルスは、ｈＴＥＲＴを発現する癌細胞で特異的に増殖し、かつ血液細胞で増殖が抑制される。
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターは、ヒトテロメラーゼの構成成分である逆転写酵素のプロモーターである。ｈＴＥＲＴプロモーターを使用することにより、癌細胞特異的にその下流の遺伝子を発現させることができる。本発明においては、ｈＴＥＲＴプロモーターを、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子の上流に配置することにより、ｈＴＥＲＴを発現している癌細胞で特異的にウイルスを増殖させることができる。
ｈＴＥＲＴは、その５’末端の上流１．４ｋｂｐの領域において多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がｈＴＥＲＴプロモーターと考えられる。中でも、翻訳開始部位の上流１８１ｂｐの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明においては、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流３７８ｂｐ程度の配列をｈＴＥＲＴプロモーターとして使用することが好ましい。この３７８ｂｐ程度の配列は、１８１ｂｐのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。４５５ｂｐの長さのｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。
ｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列は、配列番号１に示されるもののほか、配列番号１からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつｈＴＥＲＴプロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。
Ｅ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子は、アデノウイルスのＥ１遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このＥ１遺伝子とは、ウイルスの有するＤＮＡ複製に関する初期遺伝子（ｅａｒｌｙ：Ｅ）と後期遺伝子（ｌａｔｅ：Ｌ）のうちの初期遺伝子の一つを意味し、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子によりコードされるＥ１Ａタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４等）の転写を活性化する。アデノウイルスのＥ１Ｂ遺伝子によりコードされるＥ１Ｂタンパク質は、後期遺伝子（Ｌ遺伝子）のｍＲＮＡが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。
Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示す。Ｅ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示されるもののほか、配列番号２及び配列番号３からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ハイブリダイゼーションの方法及びストリンジェントな条件等については上記ｈＴＥＲＴプロモーターと同様である。
ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）配列は、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、１８ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来ｍＲＮＡはこの配列を介して翻訳されることが知られている。ＩＲＥＳ配列からの翻訳効率は高く、ｍＲＮＡの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。従って、本発明において使用されるウイルスでは、ｈＴＥＲＴプロモーターによりＥ１Ａ遺伝子とＩＲＥＳ配列の下流にあるＥ１Ｂ遺伝子の両方が独立に翻訳される。ＩＲＥＳ配列を使用することにより、ｈＴＥＲＴプロモーターの発現制御がＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子に独立して及ぶために、Ｅ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子のいずれか一方をｈＴＥＲＴプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。また、ＩＲＥＳ配列をＥ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子との間に挿入することにより、宿主細胞におけるウイルスの増殖能を高めることができる。
ＩＲＥＳ配列の塩基配列を配列番号４に示す。ＩＲＥＳ配列の塩基配列は、配列番号４に示されるもののほか、配列番号４からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＩＲＥＳ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ハイブリダイゼーションの方法及びストリンジェントな条件等については上記ｈＴＥＲＴプロモーターと同様である。
ｍｉＲＮＡは、一般に１５〜２５塩基程度の短い１本鎖ＲＮＡと言われており、ｍＲＮＡに存在する標的配列に結合することにより、様々な遺伝子の翻訳制御を行うと考えられている。従って、例えば、ｍｉＲＮＡを発現する細胞に、目的遺伝子と当該ｍｉＲＮＡの標的配列を含む組換えアデノウイルスを感染させた場合、その細胞において目的遺伝子の発現は抑制される。ｍｉＲＮＡの標的配列の挿入箇所としては、目的遺伝子の発現を抑制することができれば特に制限はないが、目的遺伝子の非翻訳領域に挿入することが好ましく、目的遺伝子の下流に挿入することがより好ましい。
本発明に使用されるｍｉＲＮＡの標的配列としては、非癌細胞で発現するｍｉＲＮＡの標的配列が挙げられる。非癌細胞は、悪性腫瘍細胞ではない細胞を意味し、例えば、正常細胞、良性腫瘍細胞などが含まれる。正常細胞には、例えば正常の血液細胞、正常の内皮細胞、正常の繊維芽細胞、正常の幹細胞などが含まれる。一方、循環腫瘍細胞は、悪性腫瘍に由来する細胞であると考えられており、本発明においては、悪性腫瘍細胞に含まれる。
また、本発明に使用されるｍｉＲＮＡの標的配列としては、血液細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列が挙げられる。本発明において、「血液細胞」は、正常の血液細胞だけでなく癌化した血液細胞を含んでいてもよい。すなわち、血液細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡは、正常血液細胞で特異的に発現していてもよく、正常の血液細胞及び癌化した血液細胞の両方に特異的に発現していてもよい。正常の血液細胞及び癌化した血液細胞の両方に特異的に発現する場合においても、循環腫瘍細胞を検出する際に正常血液細胞の偽陽性を減らし、固形癌から遊離した循環腫瘍細胞を正確に検出することができる。「血液細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡ」としては、正常の血液細胞で発現するが癌化した血液細胞では発現しないｍｉＲＮＡがより好ましい。
本発明において、血液細胞としては、限定されるものではないが、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）、単球、樹状細胞）、ＣＤ３４陽性細胞、造血細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などが挙げられる。また、癌化した血液細胞としては、白血病細胞、リンパ腫細胞などが挙げられる。
本発明において、ある細胞で「特異的に発現する」とは、その細胞のみで発現することを意味するだけではなく、他の細胞に比べてその細胞で発現量が高いことも意味する。例えば、「血液細胞で特異的に発現する」とは、血液細胞のみで発現することを意味するだけではなく、血液細胞以外の細胞に比べて血液細胞で発現量が高いことも意味する。
血液細胞で特異的に発現しているｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６などが挙げられるが、好ましくはｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５及びｍｉＲ−１６である。
ｍｉＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであるが、ｐｒｅｍａｔｕｒｅの二本鎖ＲＮＡのうち目的遺伝子の発現を抑制することができる限り、どちら側の一本鎖ＲＮＡの標的配列を使用してもよい。例えば、ｍｉＲ−１４２にはｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐが存在するが、本発明においてはどちらの標的配列を使用してもよい。すなわち、本発明において、「ｍｉＲ−１４２」には、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐの両者が含まれ、好ましくはｍｉＲ−１４２−３ｐである。また同様に、本発明において、「ｍｉＲ−１５」には、ｐｒｅｍａｔｕｒｅの二本鎖ＲＮＡのうち、センス鎖（「ｍｉＲ−１５Ｓ」と表記）及びアンチセンス鎖（「ｍｉＲ−１５ＡＳ」と表記）が含まれる。他のｍｉＲＮＡについても同様である。
ｍｉＲ−１４２−３ｐの遺伝子は、Ｂ細胞白血病（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）において転座が起こる部位に存在しており、造血組織（骨髄、脾臓、胸腺等）で発現しているが、その他の組織では発現していないことが知られている。また、ｍｉＲ−１４２−３ｐは、マウス胎児肝臓（胎児の造血組織）において発現が認められ、造血系の分化に関与していると考えられている（Ｃｈａｎｇ−Ｚｈｅｎｇ  Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４）。本態様においては、ｈＴＥＲＴプロモーターの作用により癌細胞における特異的な遺伝子発現が行なわれ、ｍｉＲＮＡの作用により血液細胞での遺伝子発現が制御されるため、二段階の選択的な遺伝子発現制御が行なわれる。
また、別の態様において、本発明に使用されるｍｉＲＮＡの標的配列としては、癌細胞において発現が抑制されているｍｉＲＮＡの標的配列が挙げられる。癌細胞において発現が抑制されているｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、ｌｅｔ−７などが挙げられる。本態様においては、ｈＴＥＲＴプロモーターとｍｉＲＮＡの作用により癌細胞における特異的な遺伝子発現が二重に制御される。
ｍｉＲＮＡは、当初、線虫、酵母などから発見されたが、現在はヒトやマウスで数百個発見されている。これらの配列は公知であり、公共のＤＢ（例えばｍｉＲＢａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  （ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／））にアクセスすることにより、配列情報等を取得することができる。
ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲＮＡ−１５、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、ｌｅｔ−７の各配列を以下に示す。
2015174539.tif 000002
2015174539.tif 000003
本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位はｍｉＲＮＡの全部又は一部に対して相補的な配列からなり、塩基長は７〜３０塩基長であり、好ましくは１９〜２５塩基長であり、より好ましくは２１〜２３塩基長である。本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位とは、あるｍｉＲＮＡが標的としうる最低限の長さの塩基配列をいう。具体的には、配列番号５〜２６のいずれかの塩基配列の相補配列から選択される少なくとも７塩基長のオリゴヌクレオチドをいい、いずれかの箇所において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、付加又は削除されていてもよい。
本発明において、組換えアデノウイルスに組み込まれる標的配列全体としては、ｍｉＲＮＡと標的配列の相互作用を効果的に発揮させるために、１単位の標的配列を複数含むものであってもよい。組換えアデノウイルスに組み込む標的配列全体の長さは、当該ウイルスゲノムに組み込み可能な長さであればよく、特に限定されない。例えば、１単位の標的配列を１〜１０コピー、好ましくは２〜６コピー、より好ましくは２コピー又は４コピー含んでいてもよい（Ｊｏｈｎ  Ｇ．Ｄｏｅｎｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００３  １７：４３８−４４２）。標的配列全体の中に含まれる標的配列１単位の配列と配列との間には、適当な長さのオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。適当な長さのオリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、標的配列全体として組換えアデノウイルスゲノムに組み込み可能な長さであればよく、例えば０〜８塩基長のオリゴヌクレオチドであってもよい。また、複数単位のｍｉＲＮＡの標的配列を含む場合には、それぞれの単位の標的配列が同じｍｉＲＮＡに対する標的配列であってもよく、異なるｍｉＲＮＡに対する標的配列であってもよい。さらに、同じｍｉＲＮＡに対する標的配列を含む場合においても、それぞれの単位の標的配列の長さや標的配列の塩基配列が異なっていてもよい。
本発明において使用されるポリヌクレオチド（又はこれを含む複製カセット）に含まれるｍｉＲＮＡの標的配列については、当該ポリヌクレオチドが組換えアデノウイルスに組み込まれた場合に、組換えアデノウイルスに存在する他のｍｉＲＮＡの標的配列と区別するために、「第一のマイクロＲＮＡの標的配列」と称することもできる。
本発明において、ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−１４２−３ｐを使用する場合、その標的配列としては、例えば以下の配列を含む配列が挙げられる。
（ｉ）ｍｉＲ−１４２−３ｐの標的配列２単位を含む配列：
2015174539.tif 000004
（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２−３ｐの標的配列４単位を含む配列：
2015174539.tif 000005
本発明においては、ｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ遺伝子−ＩＲＥＳ配列−Ｅ１Ｂ遺伝子のコンストラクトの下流にｍｉＲＮＡの標的配列を配置し、ｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びｍｉＲＮＡの標的配列をこの順に含むポリヌクレオチド（複製カセットという）をアデノウイルスゲノムに組み込むことにより、当該ｍｉＲＮＡを発現する細胞において、Ｅ１遺伝子の発現を抑制し、ウイルスの増殖を抑制することができる。
本発明において、Ｅ１Ｂ遺伝子又は後述するレポーター遺伝子の下流にｍｉＲＮＡの標的配列を組み込むことにより、その上流に存在する遺伝子の発現は抑制される。このメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のような機構が考えられる。まず、ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）がｍＲＮＡ上の標的配列を切断することにより、ｍＲＮＡのポリＡが除去される。これにより、ｍＲＮＡの安定性が低くなり、ｍＲＮＡが分解され、遺伝子の発現が抑制されると考えられる。あるいは、ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣが、通常のｍｉＲＮＡと同様にポリＡ分解酵素をリクルートし、ポリＡが分解された結果、ｍＲＮＡの安定性が低くなり、遺伝子の発現が抑制されるものと考えられる。
なお、従来、ＩＲＥＳ配列の下流に挿入された遺伝子の発現（翻訳）に対しては、ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制効果が得られなかったことが報告されていたが（Ｒａｍｅｓｈ  Ｓ．Ｐｉｌｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１５７３（２００５）；Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ  Ｍａｔｈｏｎｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７，１７６４（２００７））、本発明者が本発明において使用されるｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びｍｉＲＮＡの標的配列をこの順に含む組換えアデノウイルスについて遺伝子発現を確認したところ、ｍｉＲＮＡによりＩＲＥＳ配列の下流に挿入されたＥ１Ｂ遺伝子の発現は充分に抑制された。
本発明において、複製カセットに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えは、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ４ｔｈ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列は、標的配列１単位毎にｍｉＲＮＡの全部又は一部の塩基配列に対し相補的になるように設計し、合成することにより取得することができる。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐの標的配列は、ｍｉＲ−１４２−３ｐの塩基配列に相補的になるようにＤＮＡを合成することにより取得することができる。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のＤＮＡ断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、例えば、ｐＩＲＥＳベクターを使用することができる。ｐＩＲＥＳベクターは、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）配列が含まれており、１種類のｍＲＮＡから２箇所のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を翻訳することが可能なベクターである。ｐＩＲＥＳベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含み、かつマイクロＲＮＡの標的配列を含むポリヌクレオチド」を作製することができる。ｍｉＲＮＡの標的配列の挿入箇所は特に制限はないが、ｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂのコンストラクトの下流に挿入することがより好ましい。ＤＮＡの連結には、ＤＮＡリガーゼを用いることができる。また、必要に応じて、ｐＳｈｕｔｔｌｅなどの公知ベクターに含まれるＣＭＶプロモーターを公知の制限酵素により取り除き、その部位にｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ−ｍｉＲＮＡ標的配列から適当な制限酵素を用いて切り出した配列を挿入することができる。ｈＴＥＲＴプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なＥ１遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
（２）標識カセット
本発明は、組換えウイルスにレポーター遺伝子を組み込むことにより、これを後述の組換えウイルスの増殖の検出に使用することができる。レポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を、「標識カセット」という。
また別の態様において、本発明は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に前記複製カセットが組み込まれ、Ｅ３領域にさらに標識カセットが組み込まれた組換えアデノウイルスに関する。標識カセットは、レポーター遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含むものであり、さらにｍｉＲＮＡの標的配列を含んでいてもよい。
アデノウイルスＥ３領域には１１．６ｋＤａのＡＤＰ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が存在し、ＡＤＰは細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有している。本発明において使用される組換えアデノウイルスは、ＡＤＰを含むＥ３領域のような細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有するタンパク質をコードするウイルスゲノム領域が除去されているため、細胞死のタイミングが遅れ、ＧＦＰ等の蛍光発現による癌組織の同定が容易となっている。このことは、循環腫瘍細胞を長時間生きたまま検出できる点でも有効である。
本発明において使用される組換えアデノウイルスの標識カセットに含まれるレポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、例えば、蛍光を発するタンパク質をコードする遺伝子、酵素反応により発光物質若しくは発色物質を生じる酵素タンパク質をコードする遺伝子、抗生物質をコードする遺伝子、タグ融合タンパク質をコードする遺伝子、細胞表面に発現し特定の抗体に結合するタンパク質をコードする遺伝子、膜輸送タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。蛍光を発するタンパク質（標識タンパク質）としては、例えば、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、それを改変したＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＧＦＰ）、ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰなどが挙げられ、これらをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。上記蛍光を発するタンパク質としては、ＧＦＰ又はＥＧＦＰが好ましい。
また、酵素反応により発光物質若しくは発色物質を生じる酵素タンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。β−ガラクトシダーゼは、酵素反応により、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）から、青色の発色物質を生じる。また、ルシフェラーゼは、ルシフェリンと酵素反応し、発光物質を生じる。ルシフェラーゼとしては、ホタルルシフェラーゼやバクテリアルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどが知られており、当業者は公知のルシフェラーゼから適宜選択することができる。
上記のようにレポーター遺伝子を構成することにより、レポーター遺伝子の発現を、レポーター遺伝子から発現したタンパク質に起因する蛍光又は色として検出することができる。また、レポーター遺伝子の発現を検出する他の方法としては、例えば、レポーター遺伝子から発現したタンパク質を、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などにより検出したり、レポーター遺伝子から発現したｍＲＮＡを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動、ノーザンブロッティング、質量分析などにより検出したりすることができる。
また、上記遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとは、目的とする上記遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、ＣＭＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーター、βアクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ−１ａプロモーター等が挙げられるがこれに限定されるものではない。好ましくはＣＭＶプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターを用いることができる。
標識カセットに組み込まれるｍｉＲＮＡの標的配列は、複製カセットに組み込まれるｍｉＲＮＡの標的配列と同じであってもよいし、異なるものであってもよい。
本発明においては、ｍｉＲＮＡの標的配列を、レポーター遺伝子の非翻訳領域、好ましくは当該遺伝子の下流に配置することにより、レポーター遺伝子の発現を抑制することができる。すなわち、本発明において、標識カセットは、レポーター遺伝子を制御しうるプロモーター、レポーター遺伝子及びマイクロＲＮＡの標的配列をこの順に含むことが好ましい。本明細書において、複製カセットに含まれるｍｉＲＮＡの標的配列と標識カセットに組み込まれるｍｉＲＮＡの標的配列とを区別するために、複製カセットに含まれるｍｉＲＮＡの標的配列を「第一のマイクロＲＮＡの標的配列」、標識カセットに組み込まれるｍｉＲＮＡの標的配列を、「第二のマイクロＲＮＡの標的配列」と称する。
本発明において、標識カセットに含まれる組換え遺伝子の取得方法、精製方法、配列決定方法等については上記複製カセットの場合と同様である。
（３）ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質
本発明において使用される組換えアデノウイルスは、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスファイバータンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
現在、一般に使用されているアデノウイルスベクターは、５７種類の血清型のヒトアデノウイルスのうち、Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ｃに属する５型（若しくは２型）アデノウイルスを基本骨格として作製されている。５型アデノウイルスは、その優れた遺伝子導入特性から広く使用されているが、標的細胞のＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）に結合して感染するため、ＣＡＲの発現の低い細胞には感染することが困難であるという課題がある。特に、浸潤、転移及び増殖能が高く、悪性度の高い癌細胞はＣＡＲの発現が低下しているため、５型アデノウイルスのファイバータンパク質を有するアデノウイルスは、このような悪性度の高い癌細胞に感染できない可能性がある。
これに対し、ＣＤ４６は、ヒトでは赤血球を除くほぼ全ての細胞で発現しており、悪性度の高い癌細胞においても発現している。従って、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスファイバータンパク質をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、ＣＡＲ陰性で悪性度の高い癌細胞にも感染することができる。例えば、３４型及び３５型アデノウイルスは、受容体としてＣＤ４６に結合し、細胞に感染する（Ｍａｒｋｏ  Ｍａｒｔｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（２２）：１４４２９−３６）。前記の通り、ＣＤ４６はヒトでは赤血球を除くほぼ全ての細胞で発現していることから、３４型及び３５型アデノウイルスは、ＣＡＲ陰性細胞を含め、広汎の細胞に対し、感染することが可能である。また、アデノウイルスのファイバーは、ノブ領域、シャフト領域及びテイル領域からなり、アデノウイルスはファイバーノブ領域が受容体に結合することにより細胞に感染することから、ファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を５型アデノウイルス由来のものから３４型又は３５型アデノウイルス由来のものに置換することにより、当該ウイルスはＣＤ４６を介してＣＡＲ陰性細胞に感染することができる。
現在、ヒトアデノウイルスは５７種類の血清型が同定されており、それらはＡ〜Ｆ群の６つのグループに分類されている。そのなかで、Ｂ群に属するアデノウイルスは、ＣＤ４６に結合することが報告されている。Ｂ群に属するアデノウイルスとしては、３４型及び３５型アデノウイルスのほか、例えば、３型、７型、１１型、１６型、２１型、５０型のアデノウイルスが挙げられる。
本発明において、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質としては、Ｂ群に属するアデノウイルスのファイバータンパクが好ましく、３型、７型、３４型、３５型、１１型、１６型、２１型及び５０型アデノウイルスのファイバータンパクがより好ましく、３４型及び３５型アデノウイルスのファイバータンパクがさらに好ましい
３４型、３５型、３型、７型、１１型、１６型、２１型又は５０型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋなど公知の遺伝子情報データベースから入手することができる。また、本発明において、３４型、３５型、３型、７型、１１型、１６型、２１型又は５０型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、上記データベースから入手した各遺伝子の塩基配列のほか、当該塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＣＤ４６への結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
ＣＤ４６への結合活性は、当該塩基配列を含むＤＮＡを有する組換えアデノウイルスのＣＤ４６発現細胞への感染性を測定することにより、評価することができる。組換えアデノウイルスの感染性の測定は、例えばＣＤ４６発現細胞に感染したウイルスが発現するＧＦＰを蛍光顕微鏡やフローサイトメトリー等で検出するなど、公知の方法を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法及びストリンジェントな条件等については上記と同様である。
本発明において使用される組換えアデノウイルスは、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質の全部又は一部の領域を含むものであってもよく、当該ファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域がＣＤ４６に結合するものであればよい。すなわち、本発明において、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質は、Ｂ群に属するアデノウイルスのファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を含むものであればよく、３４型、３５型、３型、７型、１１型、１６型、２１型及び５０型からなる群から選択される型のアデノウイルスのファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を含むものがより好ましく、３４型又は３５型アデノウイルスのファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を含むことがさらに好ましい。また、本発明の技術的思想は、ＣＤ４６に結合するものであれば、ファイバータンパク質に限定されず、ＣＤ４６に結合可能な様々なタンパク質やＣＤ４６に結合可能なモチーフを有するタンパク質にまで及ぶ。
また、本発明において、ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質は、Ｂ群に属するアデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域からなる領域を含むものであってもよく、３４型、３５型、３型、７型、１１型、１６型、２１型及び５０型からなる群から選択される型のアデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域からなる領域を含むものがより好ましく、３４型又は３５型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域からなる領域を含むことがさらに好ましい。
本発明において、ＣＤ４６に結合するファイバータンパク質は、Ｂ群に属するアデノウイルスのファイバータンパク質のファイバータンパク質の少なくともファイバーノブ領域を含むものであれば、前記型以外の型（例えば２型、５型）のアデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーシャフト領域又はファイバーテイル領域を含むものであってもよい。
このようなファイバータンパク質としては、例えば、３４型、３５型、３型、７型、１１型、１６型、２１型及び５０型からなる群から選択される型のアデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域並びに５型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーテイル領域からなる領域を含むファイバータンパク質が挙げられるが、これに限定されない。
３４型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域をコードする遺伝子、ファイバーシャフト領域をコードする遺伝子、並びにファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域からなる領域をコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号２９、３０及び３１で示す。
また、３４型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域並びに５型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーテイル領域からなる領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３２で示す。
本発明において、前記遺伝子の塩基配列には、配列番号２９〜３２で示される塩基配列のほか、当該塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＣＤ４６への結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ＣＤ４６への結合活性の評価方法、ハイブリダイゼーションの方法及びストリンジェントな条件等については上記と同様である。
本発明において使用される組換えアデノウイルスは、複製カセット及び標識カセットを含むポリヌクレオチドを、適当な制限酵素を用いて切り出し、適当なウイルス発現ベクターに挿入することにより作製することができる。ウイルス発現ベクターとしては、アデノウイルスベクターが好ましく、５型アデノウイルスベクターがより好ましく、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質（例えば３４型又は３５型アデノウイルスのファイバータンパク質）をコードする遺伝子を含む５型アデノウイルスベクターが特に好ましい。
本発明において、組換えアデノウイルスは、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、ｐＨＭＣＭＶ５（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０；２０１３−２０１７，１９９９）を制限酵素処理してｍｉＲＮＡの標的配列を挿入し、ｍｉＲＮＡの標的配列を有するベクターを作製する。次に、ｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂのコンストラクトを含むｐＳｈ−ｈＡＩＢ（ＷＯ  ２００６／０３６００４）を制限酵素処理し、得られたｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂのコンストラクトを含む断片を、上記ｍｉＲＮＡの標的配列を有するベクターに挿入し、ｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ−ｍｉＲＮＡ標的配列を含むベクターを得る。他方、ｐＨＭＣＭＶＧＦＰ−１（ＥＧＦＰ遺伝子が挿入されたｐＨＭＣＭＶ５）を制限酵素処理し、ＣＭＶプロモーター及びＥＧＦＰ遺伝子を含む断片を取得し、この断片を、上記ｍｉＲＮＡの標的配列を有するベクターに挿入し、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ標的配列のコンストラクトを含むベクターを得る。そして、ｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ−ｍｉＲＮＡ標的配列を含むベクターとＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ標的配列を含むベクターをそれぞれ制限酵素処理し、ライゲーションすることにより、アデノウイルスゲノムのＥ１欠損領域にｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ−ｍｉＲＮＡ標的配列が組み込まれ、かつＥ３欠損領域にＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ標的配列が組み込まれたベクターを得ることができる。また、コンストラクトを含むＤＮＡ断片を挿入するベクターとして、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを使用することにより、アデノウイルスゲノムのＥ１欠損領域にｈＴＥＲＴプロモーター−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ−ｍｉＲＮＡ標的配列が組み込まれるとともに、Ｅ３欠損領域にＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ標的配列が組み込まれ、かつＣＤ４６に結合するアデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを得ることができる。そして、このベクターを公知の制限酵素で線状化した後、２９３細胞等の培養細胞にトランスフェクションすることで、感染性のある組換えアデノウイルスを作製することができる。なお、当業者であれば、上記製造方法をわずかに改変することで、本発明において使用される全てのウイルスを容易に作製することができる。
［２］  上皮由来細胞の検出用試薬
上皮由来細胞の検出用試薬としては、上皮由来細胞を検出できる限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
上皮由来細胞とは、体表面を覆う「表皮」、管腔臓器の粘膜を構成する「上皮（狭義）」、外分泌腺を構成する「腺房細胞」や内分泌腺を構成する「腺細胞」などを意味する。上皮由来細胞を検出するために、上皮由来細胞において特異的に発現することが知られている細胞表面マーカーを利用することができ、例えば、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＺＯ−１などの上皮細胞接着分子が挙げられる。
従って、本発明において使用する試薬としては、上記細胞表面マーカーに対する抗体、例えば抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗Ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体、抗ＺＯ−１抗体などの上皮細胞接着分子に対する抗体が挙げられる。
これらの抗体は市販されており、容易に入手することができる。
上皮由来細胞の検出のために抗体を使用する場合は、免疫組織染色法が一般的である。例えば、被検試料に抗体を添加して抗原抗体反応を行ない、標識用２次抗体を添加して陽性、陰性の有無を確認する。
また、上皮由来細胞の検出は、染色以外の方法でも行うことができ、例えば、予め上記抗体を結合させたビーズや磁気粒子を利用してもよい。あるいは、例えば、細胞表面マーカーを、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などにより検出したり、細胞表面マーカーのｍＲＮＡを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動、ノーザンブロッティング、質量分析などにより検出したりすることができる。
被検試料中に上皮由来細胞が存在することは、本来上皮由来細胞が含まれない血液やリンパ液等の被検試料において、上皮由来細胞の癌が原発巣又は転移巣から遊離した可能性を意味することになるので、検出の結果が陰性であれば被検者の体内に上皮由来細胞の癌が存在しない又は上皮由来細胞以外の癌が存在する可能性があり、陽性であれば被検者の体内に上皮由来細胞の癌が存在する可能性があると判断できる。
［３］  白血球検出用試薬
白血球検出用試薬としては、白血球を検出できる限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
白血球を検出するために、白血球において特異的に発現することが知られている細胞表面マーカーを利用することができ、例えば、ＣＤ４５などが挙げられる。
従って、本発明において使用する試薬としては、上記細胞表面マーカーに対する抗体、例えば抗ＣＤ４５抗体などが挙げられる。
これらの抗体は市販されており、容易に入手することができる。
白血球の検出のために抗体を使用する場合は、免疫組織染色法が一般的である。例えば、被検試料に抗体を添加して抗原抗体反応を行ない、標識用２次抗体を添加して陽性、陰性の有無を確認する。
また、白血球を検出するための試薬として、ギムザ液（エオシン，ａｚｕｒｅ  Ｂの混合液）などが挙げられる。ギムザ液により偽陽性となりうる白血球細胞の形態的識別も行う。以下、白血球細胞の典型的染色像を説明する。桿状から分葉の核を有し細胞質顆粒がピンクに染まる好中球、２分葉の核を有し橙黄色に染まる均質・粗大な顆粒を有する好酸球、不定形の核を有し暗紫色に染まる大型の顆粒を有する好塩基球、そら豆型の核を有する単球、細胞質が少なく球状の核を有するリンパ球を含む場合は陽性、そのような特徴を持つ細胞が見られないときは陰性と判断する。
また、白血球細胞の検出は、染色以外の方法でも行うことができ、例えば、予め上記抗体を結合させたビーズや磁気粒子を利用してもよい。あるいは、例えば、細胞表面マーカーを、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などにより検出したり、細胞表面マーカーのｍＲＮＡを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動、ノーザンブロッティング、質量分析などにより検出したりすることができる。
被検試料中の白血球細胞を検出することは、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５や上皮由来細胞の検出用試薬により検出されるＣＴＣ候補が、白血球細胞による偽陽性かどうかを判定することを意味するので、検出の結果が陰性であればＣＴＣ候補が白血球による偽陽性である可能性が排除され、陽性であればＣＴＣ候補は白血球細胞であり、ＣＴＣではないと判断できる。
［４］  細胞及び生体試料
本発明において、検出の対象となる細胞は、真核生物の細胞であれば特に限定されるものではないが、動物細胞であることが好ましく、ヒトへの細胞であることがより好ましい。
動物細胞としては、特に限定されるものではないが、腫瘍細胞などが挙げられ、中でも、体液中に浮遊する腫瘍細胞であることが好ましい。
本発明において、体液中に浮遊する腫瘍細胞としては、原発巣若しくは転移巣から遊離した腫瘍細胞である限り、特に限定されるものではなく、例えは、ＣＴＣや、体腔液中に浮遊する腫瘍細胞なとが挙げられる。本発明において、「浮遊」とは、組織から離れて体液中に移行している状態を意味し、少なくとも遊離及び循環の意味を包含するものとする。なお、体液中に浮遊する腫瘍細胞は、常に組織から離れている必要はなく、一時的に組織上に留まっている場合や、採血や穿刺の一般的な方法で体液を採取する際に体液の撹拌や吸引に伴って体液中に浮遊する場合も含まれる。
体液は、動物体内の細胞外に存在する液体の総称であり、血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液、体腔液などが挙げられる。体腔液は、左右の胸腔、腹腔、心膜腔の４つの体内空間に貯留した液体を意味し、例えは、胸水、腹水、心嚢水などが挙げられる。また、本発明においては、体腔を洗浄して得られた体腔洗浄液（胸腔洗浄液、腹腔洗浄液、心膜腔洗浄液）も体腔液に含まれる。
本発明において腫瘍細胞として検出又は診断の対象となる癌又は腫瘍の種類は、限定されるものではなく、あらゆる種類の癌の細胞を用いることができる。例えば、癌又は腫瘍のとして、固形癌又は血液腫瘍が挙げられるが、固形癌が好ましい。固形癌としては、具体的には、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマが挙げられるが、肺癌が好ましい。肺癌としては、非小細胞肺癌、小細胞癌、カルチノイド、円柱腫、粘表皮癌などが挙げられ、非小細胞肺癌が好ましい。非小細胞肺癌としては、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺大細胞癌などが挙げられ、肺扁平上皮癌及び肺腺癌が好ましく、肺腺癌がより好ましい。
血液腫瘍としては、例えば白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫（ＭＭ）が挙げられる。ただし、ＣＴＣが血液腫瘍細胞の場合、本発明において使用されるアデノウイルスに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列としては、正常血液細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列であることが好ましい。
なお、ヒトの組織由来の癌細胞のほとんど（８５％以上）はテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明はそのようなテロメラーゼを発現する癌細胞を全般的に検出することが可能である。
また、本発明によれば、癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を検出することができる。本発明において、癌幹細胞とは、癌細胞の起源となる細胞（幹細胞）をいう。癌幹細胞には薬物耐性を有する細胞や休眠中の細胞も含まれる。
本発明において、生体試料としては、体液を含む限り限定されるものではなく、例えば血液、リンパ液、組織液、細胞間液、髄液、体腔液などが挙げられるが、被検者への負担を軽減できる点で、血液が好ましい。なお、一般にＣＴＣは血液又はリンパ液中を循環していると考えられているが、循環の過程や細胞・組織の障害により、組織液、髄液又は体腔液中への浸潤・移動・漏出は起こりうる。従って、本発明において、ＣＴＣを検出する場合の生体試料としても、血液やリンパ液のみならず、組織液、細胞間液、髄液、体腔液をも利用が可能である。
採取する生体試料の量としては、特に制限はないが、例えば血液の場合、１〜５０ｍＬが好ましく、５〜１０ｍＬがより好ましく、７〜８ｍＬが特に好ましい。後述する実施例において、同一体積あたりの体腔液中を浮遊する腫瘍細胞の数は、血液中に含まれるＣＴＣの数よりも多いことが明らかとなったため、生体試料が血液以外の場合には、血液よりも少量で腫瘍細胞を検出できると考えられるが、被検者にかかる負担や、一回の穿刺により採取可能な量等を考慮し、適宜増減させることができる。
［５］  細胞の検出手順
細胞の検出は次の通り行う。
ＴＥＲＴプロモーターにより制御される組換えウイルス増殖を利用して当該組換えウイルスの増殖を検出する。
「組換えウイルスの増殖を検出する」とは、生体試料に組換えウイルスを接触させることにより、生体試料中の細胞に組換えウイルスが感染し、増殖したことを検出するものであり、例えば、組換えウイルス全体、ウイルス由来の成分（タンパク質、核酸、脂質、糖等）、組換えウイルスに組み込まれた外来遺伝子由来の成分（タンパク質、核酸、脂質、糖等）などが挙げられ、特に外来遺伝子由来の成分であることが好ましい。外来遺伝子としては、特に制限はないが、レポーター遺伝子であることが特に好ましい。
本発明において使用する組換えアデノウイルスには、レポーター遺伝子を含む標識カセットが組み込まれている。生体試料に組換えアデノウイルスを接触させることにより、生体試料中の細胞に組換えアデノウイルスが感染し、増殖したときに、細胞内でレポーター遺伝子が発現する。レポーター遺伝子の発現が検出された場合には陽性、検出されなかった場合には陰性と判断する。
以下、体液中に浮遊する腫瘍細胞の検出手順について説明するが、説明の便宜上、体液中に浮遊する腫瘍細胞をＣＴＣとして検出手順を説明する。
本発明では、被検者から採取された生体試料に対して、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターを含む組換えウイルスを接触させて該組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び白血球検出用試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む。
好ましくは、本発明では、被検者から採取された生体試料に対して、（ａ）の組換えアデノウイルスを接触させてレポーター遺伝子の発現を検出する工程、（ｂ）の試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程、及び（ｃ）の試薬を用いて白血球の検出を行う工程を含む。
「接触」させるとは、生体試料に組換えウイルスが感染できる状態にすることを意味し、生体試料に組換えウイルスを添加又は接種する工程が含まれる。
採取された生体試料に対して、組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程の順序は任意であり、この順に順次行ってもよく、別の順序で行ってもよい。
上皮由来細胞の検出用試薬を用いて上皮由来細胞の検出を行う工程により、上皮由来細胞が検出された場合には陽性、検出されなかった場合には陰性と判断する。
白血球検出用試薬を用いて白血球の検出を行う工程により、白血球が検出された場合には陽性、検出されなかった場合には陰性と判断する。
各工程において陽性又は陰性と判断された結果と、ＣＴＣのフェノタイプとの関係を以下にまとめる。
（ｉ）組換えアデノウイルスの増殖の検出結果が陽性、上皮由来細胞の検出結果が陰性、かつ白血球の検出結果が陰性のときは、検出されたＣＴＣがＥＭＴ−ＣＴＣであると判定する。
（ｉｉ）組換えアデノウイルスの増殖の検出結果が陰性、上皮由来細胞の検出結果が陽性、かつ白血球の検出結果が陰性のときは、検出されたＣＴＣがｎｏｎ−ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定する。
したがって、本発明においては、上記方法により検出された検出結果を指標として、以下の事項を判定又は予測することができる。
・被検者の癌の有無の判定
・癌の治療奏功及び／又は耐性の予測又は判定
・癌の悪性度、予後又は再発の予測
ところで、上記（ｉ）の判定のように、組換えアデノウイルスを用いた検出が陽性のときは、最終的に検出される細胞は生きた細胞であると判断することができる。一方で、上記（ｉｉ）の判定のように、組換えアデノウイルスを用いた検出が陰性のときは、死細胞が含まれている可能性がある。そのため、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣから、増殖や転移する能力がなく臨床的重要性の低い死細胞を除外することを目的として、上記のウイルス又は試薬を用いた検出工程に加え、死細胞検出用試薬を用いて死細胞の検出を行う死細胞染色の工程を加えてもよい。死細胞の検出を行う工程も順序は任意であり、組換えウイルスの増殖を検出する工程、上皮由来細胞の検出用試薬を用いる工程、及び白血球検出用試薬を用いる工程の次に行ってもよく、その途中や最初に行ってもよい。
死細胞検出用試薬を用いて死細胞の検出を行う工程により、死細胞が検出された場合には陽性、検出されなかった場合には陰性と判断する。
上記（ｉｉ）の判定に、死細胞検出用試薬を用いて検出する工程を含める場合には、下記（ｉｉｉ）のようにまとめることができる。
（ｉｉｉ）組換えアデノウイルスの増殖の検出結果が陰性、上皮由来細胞の検出結果が陽性、白血球の検出結果が陰性、かつ死細胞の検出結果が陰性のときは、ＣＴＣはｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであり、かつ、生存していると判定する。
死細胞の検出用試薬としては、死細胞を検出できる限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、死細胞を染色する試薬が挙げられる。
死細胞の検出には、一般にトリパンブルー染色による観察、もしくはヨウ化プロピジウム染色や７−アミノアクチノマイシンＤ染色による蛍光観察などの手法が採用されているが、例えば、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ販売）を好適に利用することができる。
これらの試薬は市販されており、容易に入手することができる。
また、死細胞の検出用試薬の代わりに生細胞の検出用試薬を利用し、生細胞の検出用試薬を用いた検出結果が陽性のときに、生存していると判定してもよい。
本発明では、ＥＭＴ−ＣＴＣ又はｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣと癌との関係は以下のとおり評価できる。
（ａ）ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定された場合
上記方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞がＥＭＴ−ＣＴＣであると判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞がｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が低い、（ｉｉ）治療耐性を獲得した、（ｉｉｉ）予後が悪い、（ｉｖ）再発の可能性が高い、又は（ｖ）病理組織学的悪性度が高いと予測することの指標とする。
ＥＭＴ−ＣＴＣは、早期癌から末期癌まで同定されるので、癌発見の判断試料となる。特に、他の癌診断方法やＣＴＣ検出方法において検出が困難な早期癌でも同定されることから、早期癌発見の判断試料となる。また、早期治療としての根治的治療を行っても、再発しやすい、又は予後が悪いと予測するための指標となる。
「早期癌」とは、癌種によって定義は異なるが、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤のないもの、あるいは浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものを言う。本発明における早期癌は、肺癌の場合にはステージＩＩまでの段階の癌を意味し、ステージＩであることが好ましく、ステージＩＡであることがより好ましい。また、癌種によらず腫瘍の病期を分類する場合には、ＴＮＭ分類（ＴＮＭ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｕｒｓ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ刊行）が一般的に用いられる。ＴＮＭ分類において、Ｔとは原発腫瘍の進展度をＴ０〜Ｔ４で表し、Ｎとはリンパ節転移の有無及び範囲をＮ０〜Ｎ４で表し、Ｍとは転移の有無をＭ０又はＭ１で表す。ここで肺癌におけるステージＩＩとは、ＴＮＭ分類でＴ１〜Ｔ２ｂ，Ｎ１，Ｍ０又はＴ２ｂ〜Ｔ３，Ｍ０，Ｎ０，に相当し、ステージＩとは、ＴＭＮ分類でＴ２ａ，Ｎ０，Ｍ０に相当し、ステージＩａとはＴＭＮ分類でＴ１，Ｎ０，Ｍ０に相当する。したがって、本発明における早期癌としては、癌種によらず、Ｔ２ｂ，Ｎ１，Ｍ０又はＴ３，Ｎ０，Ｍ０より早期の段階の癌を意味し、Ｔ２ａ，Ｎ０，Ｍ０より早期であることが好ましく、Ｔ１，Ｎ０，Ｍ０であることがより好ましい。
「再発」とは、癌治療により癌の縮小傾向若しくは癌の存在が確認できない状態になった後に、同所又は他の臓器・組織に、原発巣に由来する癌細胞が再び増殖し新たな病巣が出現することを意味し、本発明では、手術、化学療法又は放射線療法といった治療後で癌が確認できない状態となった後、又は癌が縮小した後に、原発巣に由来する癌細胞が同所的・異所的に新たに出現した状態になったときに「再発」したと判断する。
「オリゴ再発」（ｏｌｉｇｏ−ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）とは、原発巣が切除後に制御されている状況において、１又は複数の臓器で１又は少数個の遠隔転移又は再発が生じることを意味する（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１０；４０（２）−１０７−１１１）。オリゴ再発は、１９９５年にＨｅｌｌｍａｎ及びＷｅｃｈｓｅｌｂａｕｍにより提唱された概念である「オリゴ転移」（ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を改訂し、２００６年にＮｉｉｂｅらにより提唱された概念である。癌の再発は予後が悪いことが知られているが、オリゴ再発に対しては手術や放射線治療などの局所治療が有効な可能性が指摘されている。遠隔転移又は再発する臓器の数としては、１つであることが好ましい。遠隔転移又は再発の個数としては、５個（箇所）以下が好ましく、２個以下がより好ましく、１個（単発）であることが特に好ましい。
「予後」とは、癌患者の全生存期間を意味する。
「治療奏功及び／又は再発」は、ＲＥＳＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）ガイドライン第１．１版（Ｎｅｗ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ  ＲＥＣＩＳＴ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１），ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＡＮＣＥＲ４５（２００９）２２８−２４７）の基準に従い判定する。本明細書における完全奏功（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＣＲ）、部分奏効（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＰＲ）、進行（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）及び安定（Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＳＤ）の定義は、同ガイドラインに準拠する。
（ｂ）ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定された場合
上記方法により、体液中に浮遊する腫瘍細胞がｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定したときは、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が高い、（ｉｉ）予後が良好である、（ｉｉｉ）再発の可能性が低い、又は（ｉｖ）病理組織学的悪性度が低いと予測することの指標とする。
ただし、ＥＭＴ−ＣＴＣと比較して、従来の治療法による治療に奏功しやすく、再発しにくく、予後が良好であると予測するための指標となる。
（ｃ）ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであり、かつ、生存していると判定された場合
この場合も、当該判定結果を、体液中に浮遊する腫瘍細胞が上皮間葉移行を起こしたものであると判定したときと比較して、（ｉ）被検者の癌の治療効果が高い、（ｉｉ）予後が良好である、（ｉｉｉ）再発の可能性が低い、又は（ｉｖ）病理組織学的悪性度が低いと予測することの指標とする。
被検者が癌である又は癌の可能性があることの指標とする。ただし、ＥＭＴ−ＣＴＣと比較して、従来の治療法による治療に奏功しやすく、再発しにくく、予後が良好であると予測するための指標となる。
更に、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣは全て生存している細胞であるので、上記（ｂ）によりｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣであると判定された場合に比べ、より臨床的重要性の高いｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣを検出することができる。
従って、上記の通り検出されたＣＴＣは、癌の診断用バイオマーカーとして利用可能である。さらに上記検出されたＣＴＣは、癌の治療効果の判定若しくは予測用、又は癌の予後若しくは再発の予測用バイオマーカーとして利用可能である。
ところで、本発明の方法では、予め規定された数の被検者（１次母集団）においてフェノタイプ別にＣＴＣの検出を行い、得られた検出結果から、それぞれのフェノタイプ（ＥＭＴ−ＣＴＣ又はｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣ）と癌とを関連づけている。従って、被検者個人の癌を検出する場合、上記複数の被検者由来のデータを母集団として、当該個人の被検者のデータが母集団のデータのどこに位置するか又は当てはまるかを調べることによって、被検者個人の癌の可能性を知ることができる。
また、被検者個人の検査が独立して行われた場合、上記母集団データを参照データとして、当該検査結果を当てはめることで、癌を検査又は診断することができる。
さらに、上記測定された被検者個人由来のデータを前記母集団の値に組み込んで、ＣＴＣの傾向（例えば、フェノタイプや個数）と癌のリスクレベルとを再度データ処理しておくと、対象となる被検者（母集団）の例数を増やすことができ、解析の精度を高めることができる。
本発明により検出されるＣＴＣは、癌細胞そのものの存在が検出されたものであり、ドック・検診に使われる腫瘍マーカーよりも信頼性は高い。従って、本発明は、将来的に、ドック・検診における癌の簡易診断にも利用可能であると考えられる。
３．循環腫瘍細胞の検査キット又は癌の診断用キット
本発明のキットは、組換えアデノウイルス、上皮由来細胞の検出用試薬、及び白血球検出用試薬を含むものであり、さらに死細胞検出用試薬を含めることができる。
本発明において、組換えアデノウイルスは、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる）などと混合することにより、製造することができる。
上皮由来細胞の検出用試薬は、上皮由来細胞を検出できればよく、種々の固体や液体の形態とすることができる。白血球検出用試薬は、白血球を検出できればよく、種々の固体や液体の形態とすることができる。死細胞検出用試薬は、死細胞を検出できればよく、種々の固体や液体の形態とすることができる。
本発明のキットには、上記のほか、緩衝液、酵素液、二次抗体、希釈用溶液、使用説明書などを含めることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
実施例１．組換えアデノウイルス（本実施例において「ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５」又は単に「Ｆ３５」ともいう）を使用したＣＴＣ検出法
１．ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５の作製
（１）ｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴの作製
ｐＨＭＣＭＶ５（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０；２０１３−２０１７，１９９９）をＮｏｔＩ／ＫＰｎＩ処理したフラグメントを、下記の合成オリゴＤＮＡをアニーリングすることにより作製したダブルストランドオリゴとライゲーションすることによりｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ（ｐｒｅ）を作製した。
ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ−Ｓ１：
2015174539.tif 000006
ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ−ＡＳ１：
2015174539.tif 000007
次に、ｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ（ｐｒｅ）をＰａｃＩ／ＫｐｎＩ処理したフラグメントを、以下の合成オリゴＤＮＡをアニーリングすることにより作製したダブルストランドオリゴとライゲーションすることにより、ｍｉＲ−１４２−３ｐ標的配列の４回繰返し配列を有するｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴを得た。
ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ−Ｓ２：
2015174539.tif 000008
ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ−ＡＳ２：
2015174539.tif 000009
（２）Ｅ１  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄであるｐＨＭ５−ｈＡＩＢ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴの作製
ｐＳｈ−ｈＡＩＢ（ＷＯ  ２００６／０３６００４）をＩ−ＣｅｕＩ／ＰｍｅＩで消化し、消化産物をアガロースゲルを用いて電気泳動した。約４．５ｋｂｐ（ｈＡＩＢ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）のバンドをゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ社）を用いてＤＮＡ断片を精製回収した。精製したＤＮＡ断片（ｈＡＩＢ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）とｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴをＮｈｅＩで消化した後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔで処理し、さらにＩ−ＣｅｕＩで消化したフラグメントをライゲーションすることによりｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びｍｉＲ−１４２−３ｐＴ標的配列を有するｐＨＭ５−ｈＡＩＢ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴを得た。
（３）Ｅ３  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄであるｐＨＭ１３ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴの作製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＡｐａＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られた消化産物をｐＨＭＣＭＶ５のＡｐａＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＨＭＣＭＶＧＦＰ−１を得た。ｐＨＭＣＭＶＧＦＰ−１をＰｍｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化産物をアガロースゲルを用いて電気泳動した。約７５０ｂｐ（ＥＧＦＰ）のバンドをゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いてＤＮＡ断片を精製回収した。精製したＤＮＡ断片（ＥＧＦＰ）とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋をＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したフラグメントをライゲーションすることによりｐＢＳＫＳ−ＥＧＦＰを作製した。ｐＢＳＫＳ−ＥＧＦＰをＡｐａＩ／ＸｂａＩで消化し、消化産物をアガロースゲルを用いて電気泳動した。約７５０ｂｐ（ＥＧＦＰ）のバンドをゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いてＤＮＡ断片を精製回収した。精製したＤＮＡ断片（ＥＧＦＰ）とｐＨＭＣＭＶ５−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴをＡｐａＩ／ＸｂａＩで消化したフラグメントをライゲーションすることによりｐＨＭＣＭＶ５−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴを取得した。ｐＨＭＣＭＶ５−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴをＢｇｌＩＩで消化し、消化産物をアガロースゲルを用いて電気泳動した。約２ｋｂｐ（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ）のバンドをゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いてＤＮＡ断片を精製回収した。精製したＤＮＡ断片（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴ）とｐＨＭ１３（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０；１１１２−１１１６，２００１）をＢａｍＨＩで消化した後、ＣＩＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔ）で処理したフラグメントをライゲーションすることによりｐＨＭ１３ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴを得た。
（４）ｐＡｄＨＭ４９−ｈＡＩＢ１４２−３ｐＴ−ＣＧ１４２−３ｐＴの作製
ｐＡｄＨＭ４９（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１０；２０２−２１１，２００５）をＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ処理して得られたフラグメントと、同じくＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ処理したｐＨＭ５−ｈＡＩＢ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴをライゲーションすることにより、ＡｄベクターのＥ１欠損領域にｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びｍｉＲ−１４２−３ｐＴ標的配列が組み込まれたｐＡｄＨＭ４９−ｈＡＩＢ１４２−３ｐＴを作製した。ｐＡｄＨＭ４９は、５型アデノウイルスファイバーのファイバーノブ及びファイバーシャフトをコードする遺伝子を含む領域が、３４型アデノウイルスファイバーのファイバーノブ及びファイバーシャフトをコードする遺伝子を含む領域に置換された組換えアデノウイルスであり、３４型アデノウイルスのファイバータンパク質のファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域からなる領域をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３１）を含むものである。ｐＡｄＨＭ４９のファイバータンパク質（３４型アデノウイルスファイバーのファイバーノブ領域及びファイバーシャフト領域並びに５型アデノウイルスファイバーのファイバーテイル領域）をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３２で示す。配列番号３２で示される塩基配列において、５型アデノウイルスファイバーのファイバーテイル領域をコードする遺伝子の塩基配列は１〜１３２番目の塩基配列であり、３４型アデノウイルスファイバーのファイバーシャフト領域をコードする遺伝子の塩基配列は１３３〜４０２番目の塩基配列であり、３４型アデノウイルスファイバーのファイバーノブ領域をコードする遺伝子の塩基配列は４０３〜９７５番目の塩基配列である。すなわち、配列番号３２で示される塩基配列において、５型アデノウイルスファイバー由来の領域の塩基配列は１〜１３２番目の塩基配列であり、３４型アデノウイルスファイバー由来の領域の塩基配列は１３３〜９７５番目の塩基配列である。
次に、ｐＡｄＨＭ４９−ｈＡＩＢ１４２−３ｐＴをＣｓｐ４５Ｉで消化したフラグメントとｐＨＭ１３ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１４２−３ｐＴをＣｌａＩで消化したフラグメントをライゲーションした。これにより、アデノウイルスベクターのＥ１欠損領域にｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子及びｍｉＲ−１４２−３ｐＴ標的配列が組み込まれ、Ｅ３欠損領域にＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰ及びｍｉＲ−１４２−３ｐＴ標的配列が組み込まれ、さらに３４型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子を含む、ｐＡｄＨＭ４９−ｈＡＩＢ１４２−３ｐＴ−ＣＧ１４２−３ｐＴを得た。
（５）ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５の作製
ｐＡｄＨＭ４９−ｈＡＩＢ１４２−３ｐＴ−ＣＧ１４２−３ｐＴの中のアデノウイルスゲノム両末端に認識部位が存在する制限酵素ＰａｃＩで切断することにより線状にし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて６０ｍｍ培養ティッシュに播種した２９３細胞にトランスフェクションした。約２週間後に、組換えアデノウイルスＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５を取得した。
２．ＰＢＭＣ分画の回収及びウイルス感染
生体試料としては、特に記載がない限り、生検又は手術により取得された肺組織の病理的標本により、肺癌と確定した患者から採取した血液を使用した。
被検者の血液７．５ｍＬをＣＰＤ（Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）溶液入りの真空採血管に採取し、１５−２５℃を保持した。採血後２４時間以内に、７．５ｍＬの血液に対して１２０ｍＬのＲｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（（塩化アンモニウム８．９９ｇ／Ｌ，炭酸水素カリウム１．０ｇ／Ｌ，ＥＤＴＡ  ０．０４２ｇ／Ｌ））を添加して赤血球の溶血を行い、遠心によりＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ，ＣＴＣが含まれる白血球分画）を回収した。回収したＰＢＭＣｓを１０％血清入り培地を使用して２回の洗浄を行った。洗浄したＰＢＭＣｓを１ｍＬの１０％血清入り培地に懸濁し、１×１０９ＶＰのＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５を加え、３７℃で２４時間培養後、下記（ｉ）又は（ｉｉ）の染色を行った。
（ｉ）ＣＤ４５／Ｖｉｍｅｎｔｉｎ免疫染色
感染が完了したＰＢＭＣｓを遠心により回収し、１０％血清入りＰＢＳにより１０分間のブロッキングを行い、抗ＣＤ４５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０４００２）により３０分間の１次抗体反応を行った。洗浄により１次抗体を取り除き、蛍光標識された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２３５）を３０分間反応させた。４％パラフォルムアルデヒドにより１０分間の固定を行った後、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００／１０％ＦＢＳ／ＰＢＳにより１０分間の浸透化を行った。１０％血清入りＰＢＳにより１０分間のブロッキングを行い、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ４５９３９）を使用し、３０分間の１次抗体反応を行った。洗浄により１次抗体を取り除き、蛍光標識された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０４６）を１５分間反応させた。
（ｉｉ）ＣＤ４５／ＥｐＣＡＭ／死細胞染色
感染が完了したＰＢＭＣｓを遠心により回収し、ＰＢＳで１回の洗浄を行った。洗浄後、死細胞染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌ−２３１０５）を使用して３０分間反応させた。反応後、１０％血清入りＰＢＳにより１０分間のブロッキングを行い、抗ＣＤ４５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０４００２）により３０分間の１次抗体反応を行った。洗浄により１次抗体を取り除き、蛍光標識された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２３５）を３０分間反応させた。洗浄により２次抗体を取り除き、直接標識試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｚ２５００５）を使用して蛍光標識したＥｐＣＡＭ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ７５０４）を３０分間反応させた。抗体反応後、４％パラフォルムアルデヒドにより１０分間の固定を行った。
３．検体の解析
上記（ｉ）又は（ｉｉ）の染色を行った検体を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＩＸ７１）による観察を行った。効率的に観察するため、（ｉ）の染色の場合には、まずＦＩＴＣ  ｆｉｌｔｅｒによりＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５由来のＧＦＰ陽性細胞を探査し、検出されたＧＦＰ陽性細胞についてＧＦＰ，ＣＤ４５染色像，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色像及び明視野の画像取得を行った。（ｉｉ）の染色の場合には、まずＦＩＴＣ  ｆｉｌｔｅｒによるＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５由来のＧＦＰ陽性細胞の探査と、ＲＦＰ  ｆｉｌｔｅｒによるＥｐＣＡＭ陽性細胞の探査を行い、いずれかの陽性細胞について、引き続きＧＦＰ，ＣＤ４５染色像，ＥｐＣＡＭ染色像，死細胞染色像及び明視野の画像取得を行った。取得した画像から各シグナルの陰性／陽性の判定を行った。
４．結果
＜結果１＞
予備実験として、非小細胞肺癌患者の検体に対し、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５感染、及びＣＤ４５／Ｖｉｍｅｎｔｉｎ免疫染色を行った結果、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性かつＣＤ４５陰性の細胞におけるＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の割合は、８９％であり、極めて相関が高いことが示された。従って、以後の実験では、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性かつＣＤ４５陰性の組合せによりＥＭＴ−ＣＴＣが検出されると判定することとし、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色は省略した。
＜結果２＞
ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性かつＣＤ４５陰性の組合せでは、主にＥＭＴ−ＣＴＣが検出され、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣが検出されない可能性が示されたことから、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣを検出するために、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５感染及びＣＤ４５染色に加え、ＥｐＣＡＭ染色及び／又は死細胞染色を行った。
結果を表１〜３に示す。
【表１】
2015174539.tif 000010
表１〜３における各割合（％）は、全症例中、１個以上のＥＭＴ−ＣＴＣ、ｎｏｎ  ＥＭＴ  ＣＴＣ又は総ＣＴＣが検出された症例の割合を示す。また、表１〜３において、ＥＭＴ−ＣＴＣは、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性（ＧＦＰ陽性）／ＣＤ４５陰性／ＥｐＣＡＭ陰性により判定されたものを意味し、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣは、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陰性（ＧＦＰ陰性）／ＣＤ４５陰性／ＥｐＣＡＭ陽性／死細胞染色陰性により判定されたものを意味し、総ＣＴＣは、前記組合せにより判定されたｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣ又はＥＭＴ−ＣＴＣが１個以上検出された症例の割合を意味する。
なお、表中に示していないが、健常人の検体に対し、同様のＣＴＣ検出を行ったところ、全２３例において、ＥＭＴ−ＣＴＣもｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣも検出されず、特異度１００％の結果が示された。
【表２】
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【表３】
2015174539.tif 000012
表１に示すように、非小細胞肺癌３３症例についてＣＴＣを検出した結果、３９．４％の陽性率でＣＴＣを同定可能であった。このうち、ＥＭＴ−ＣＴＣの陽性率は３６．４％であり、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣの陽性率は１２．５％であり、総ＣＴＣの陽性率は３９．４％であった。また、表には示していないが、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣにおいて死細胞染色の結果が陰性（生細胞）のものだけでなく陽性（死細胞）も含めると、死細胞であるＣＴＣを含めた総ＣＴＣ（生細胞＋死細胞）の陽性率は４８．５％（１６／３３）であった。なお、ＥＭＴ−ＣＴＣに対して死細胞染色を行ったところ、ＥＭＴ−ＣＴＣは全症例ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性（ＧＦＰ陽性）であるのと同時に、全て死細胞染色陰性（１００％）、すなわち生細胞であることが確認された。本発明により、癌患者の臨床検体から、ＥＭＴ−ＣＴＣとｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣの両者を検出できることが示された。なお、非小細胞肺癌におけるＣＴＣの陽性率は、扁平上皮癌より腺癌の方が高かった。
表２に示すように、病期進行するほどＣＴＣの陽性率が上昇する傾向（ステージＩ  ｖｓ  ＩＶ：３３．３％  ｖｓ  ７５％）が認められた。
ＡＩＳはａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ（上皮内癌）を意味する。
ステージＩＡにおいては、ＣＴＣ陽性率及びＥＭＴ−ＣＴＣ陽性率がいずれも４６．２％であり、有意に高値であった。
ステージＩＶでは、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣの陽性率も同時に増加した。
表３において、「ＣＥＡ陽性率」及び「ＳＬＸ陽性率」は、それぞれ血清検査により判定されたＣＥＡ及びＳＬＸの陽性率を示し、ＣＥＡは３．０ｎｇ／ｍｌ以上、ＳＬＸは３８ｎｇ／ｍｌ以上を陽性としている。
表３に示すように、全病期においてはＣＥＡとＣＴＣの陽性率に差が認められなかったが、ステージＩにおいては有意にＣＴＣの陽性率が高値であった（ステージＩＡ  ＣＴＣ  ｖｓ  ＣＥＡ：  ４６．２％  ｖｓ  ２３．１％）。
なお、ステージＩの肺腺癌においては、ＣＴＣの陽性率はＣＥＡ及びＳＬＸよりも更に有意に高値であった。
表２に示すように病期進行するほど本発明の方法によるＣＴＣ陽性率は増加するが、従来ステージＩＩＩＡより早期の非小細胞肺癌を検出できるＣＴＣ検出技術が存在していなかったこと、及び、表３に示すようにＣＥＡやＳＬＸといった腫瘍マーカーと比較しても陽性率に顕著な差が見られたことを考慮すれば、本発明の方法は特に早期癌の診断に有用であることが示された。
以下、図１〜図３について説明する。図１〜３における縦軸は、１検体から検出されたＣＴＣ数を示す。
また、図１〜３におけるＥＭＴ−ＣＴＣは、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性（ＧＦＰ陽性）／ＣＤ４５陰性／ＥｐＣＡＭ陰性により判定されたものを意味し、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣは、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陰性（ＧＦＰ陰性）／ＣＤ４５陰性／ＥｐＣＡＭ陽性／死細胞染色陰性により判定されたものを意味し、ＣＴＣ数は、前記組合せにより判定されたｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣの数とＥＭＴ−ＣＴＣの数との合計を意味する。
図１は、非小細胞肺癌患者のうち、ＥＭＴ  ＣＴＣとｎｏｎ−ＥＭＴ  ＣＴＣとを対比した結果を示す図である。図１から分かる通り、ＥＭＴ−ＣＴＣはｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣより高値であった。
図２は、組織学的グレードが異なる患者におけるＣＴＣ数を示す図である。病理組織学的悪性度が高いほど、ＣＴＣ数の増加を認めた。病理組織学的悪性度の高い癌は、早期癌と比較して予後不良であることは周知の事実であるので、本発明の方法により検出されるＣＴＣは、予後予測マーカーとして利用できることが示された。
図３は、抗癌剤投与前と投与後（１週後）におけるＣＴＣ数の推移を示す図である（ｎ＝７）。
図３に示すように、化学療法開始前にｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣが検出された症例については、化学療法開始後１週間でｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣがすべて消失した。かつ、化学療法開始前にｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣのみ検出された症例はｒｅｓｐｏｎｄｅｒであったことから、ｎｏｎ  ＥＭＴ−ＣＴＣは化学療法による治療効果が高いことの指標として利用可能であることが判明した。また、化学療法開始前にＥＭＴ−ＣＴＣが検出された症例ではｎｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが多いことから（ＳＤ：３，ｏｒ  ＰＤ：１）、ＥＭＴ−ＣＴＣは化学療法による治療効果が低いことの指標として利用可能であることが判明した。
また、図３に示すように、化学療法開始後１週間経過した時点で依然ＥＭＴ−ＣＴＣが残存する症例において、治療の早期段階で遠隔臓器再発例を認めた（データなし）。従って、ＥＭＴ−ＣＴＣの検出と治療効果が低いこととは相関があることが予測されるため、ＥＭＴ−ＣＴＣを検出することにより、化学療法開始後１週間で、再発を予測することが可能であることが判明した。
実施例２．癌幹細胞の検出
１ｘ１０４のＨ６９（ＣＤ１３３陽性）を７．５ｍＬの血液に懸濁し、赤血球を溶血させてＰＢＭＣを回収した。
そこに１ｘ１０９ＶＰの量のウイルスを添加し、ローテーターで回転させながら３７℃で２４時間感染させた。
感染させた細胞を回収し、ＣＤ４５抗体，ＣＤ１３３抗体（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ  １３０−０９０−４２２）を使用した免疫染色及びＤＡＰＩによる核染色を行った。
蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性細胞を検出し、ＣＤ４５，ＣＤ１３３の発現を評価した。
結果を図４に示す。図４はＣＤ１３３陽性細胞株の検出結果を示すものである。組換えアデノウイルスにより癌幹細胞が検出可能であったことから、本発明により癌幹細胞が検出可能であることが示唆された。
実施例３．胸水中に浮遊する腫瘍細胞の検出
生体試料としては、生検又は手術により取得された肺組織の病理的標本により、肺癌と確定した患者から採取した胸水２０ｍｌを使用した。
実施例１と同様の方法により、ＰＢＭＣ分画の回収及びウイルス感染、（ｉｉ）ＣＤ４５／ＥｐＣＡＭ／死細胞染色、及び、検体の解析を行った。
６例の胸水を解析した結果、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性／ＥｐＣＡＭ陰性／ＣＤ４５陰性の細胞の数と、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陰性／ＥｐＣＡＭ陽性／ＣＤ４５陰性／死細胞染色陽性の数は、それぞれ、約３４，０００個，１２，０００個，３００，０００個，１７０個，５００個，７０個と、６４，０００個，６，６００個，２３，０００個，０個，０個，０個であった。これらの結果から、本発明により胸水中に浮遊している腫瘍細胞も詳細に検出できることが示された。ＣＴＣ同様体腔液中の腫瘍細胞のフェノタイプ解析結果からも癌性胸膜炎、心膜炎、腹膜炎の局所制御予測としての治療奏効・耐性・再発や悪性度・予後予測が計数の情報と同様に有用な情報となりうる。
実施例４．食道癌術後肺転移再発、胃癌術後肺転移再発、直腸癌及び腎癌症例におけるＥＭＴ−ＣＴＣの検出
生体試料としては、生検又は手術により取得された癌組織の病理的標本により、食道癌術後肺転移再発、胃癌術後肺転移再発、直腸癌及び腎癌と確定した患者から採取した血液７．５ｍｌを使用した。食道癌術後肺転移再発及び胃癌術後肺転移再発症例における転移はそれぞれ単発であり、オリゴ再発に分類される。
実施例１と同様の方法により、ＰＢＭＣ分画の回収及びウイルス感染、（ｉｉ）ＣＤ４５／ＥｐＣＡＭ／死細胞染色、及び、検体の解析を行った。
食道癌術後肺転移再発、胃癌術後肺転移再発、直腸癌及び腎癌症例において検出された、ＴｅｌｏｍｅＳｃａｎ  Ｆ３５陽性／ＥｐＣＡＭ陰性／ＣＤ４５陰性の細胞の写真を図５に示す。直腸癌症例の写真は、順天堂大学  小見山博光医師により提供された。腎癌症例の写真は、順天堂大学  河野春奈医師により提供された。これらの結果から、本発明により肺癌以外の癌種であっても、ＥＭＴ−ＣＴＣが検出できることが示された。また、本発明によりオリゴ再発においてＥＭＴ−ＣＴＣが検出できることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０００７】
配列番号４〜２８、３２〜３６：合成核酸
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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