(57)【要約】  下水道コンクリートの構造物、ヒューム管或いは組み立てマンホールの、微生物に起因する硫酸劣化を防止するための腐蝕抑制剤の混入を簡易に且つ迅速に検出できる方法を提供すること。  硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、腐蝕抑制剤を含むと予想される試料とを混合し、得られた液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出することを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、腐蝕抑制剤を含むと予想される試料とを混合し、得られた液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出することを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項２】
ｐＨを２〜３に調整する請求項１に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項３】
ｐＨ指示薬が、チモールブルー、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン又はブロモフェノールブルーである請求項１又は２に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項４】
ｐＨ指示薬が液体であって、一定期間放置前又は後に加えられる請求項１〜３のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項５】
ｐＨ指示薬が試験紙であって、一定期間放置後に得られた液に浸漬される請求項１〜３のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項６】
一定期間が１０〜６０分間である請求項１〜５のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項７】
硫黄酸化細菌が、アシディチオバチルスチオオキシダンス及びアシディチオバチルスフェロオキシダンスから選択される少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項８】
硫黄酸化細菌が、
アシディチオバチルスチオオキシダンス及びアシディチオバチルスフェロオキシダンスから選択される少なくとも１種と、
中性のｐＨ域で増殖可能な硫黄酸化細菌と、の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項９】
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌は、予め培養された後、固体硫黄が除去されたものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項１０】
ｐＨ調整するための酸が、硫酸である請求項１〜９のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項１１】
色の変化の検知を、目視及び吸光光度計の少なくとも１つの手段を用いて行う請求項１〜９のいずれか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項１２】
硫黄酸化細菌、前記培養液及び前記試料に加えて、
硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とはキレート化合物を形成するが腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないキレート剤が混合されることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の腐蝕抑制剤の簡易検出方法。
【請求項１３】
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、ｐＨ指示薬とを含むことを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出組成物。
【請求項１４】
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液とを含む第１の液、及びｐＨ指示薬を含む第２の液からなることを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌材等の腐蝕抑制剤が混入したコンクリート等の材料中における当該腐蝕抑制剤を簡易に検出する方法、並びにこの方法に用いられる腐蝕抑制剤の簡易検知組成物及び簡易検知キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
下水道コンクリート構造物、ヒューム管、組み立てマンホール等のコンクリートの二次製品等において、そのコンクリートの腐食が以前から問題となっている。最近、そのコンクリートの腐食が下水に繁殖する硫黄酸化細菌が生産する硫酸によるものであることが判明し、この硫酸の発生を防止するため、抗菌剤等の腐蝕抑制剤としてコンクリート中にニッケルやタングステン等の金属粉を混入させる技術が開発されている。【０００３】
しかしながら、この種の腐蝕抑制剤がコンクリート組成中に混入されているか否かは、肉眼で判別することはできない。また、その判別のために、コンクリート混練時の水に染料や顔料等の着色料を混入させ、コンクリートを着色することが考えられるが、この場合、着色料が水に均一に溶解或いは分散して混入されるため、肉眼で着色を判別できるようにするには多量の着色料が必要となり、コンクリートの物性に影響を及ぼすとともに、着色料がコンクリート製品の表面に一面に広がるため、これに接触した物体に対して色移り等が生じるとの問題があった。【０００４】
特許文献１には、少量の判別材料の混入によって、その材料（添加剤）の混入が、肉眼にて容易に判別することのできる添加剤判別可能コンクリートの製造方法が開示されている。即ち、セメントその他のコンクリート組成物と共に混合する粉状添加剤に、蛍光染料入りの添加剤（腐蝕抑制剤）を前記コンクリート組成物と共に混練し、コンクリート中の該蛍光染料の混入の判別を、例えばブラックライト等の不可視光線を照射することにより、添加剤の位置から発する蛍光により、添加材が混入されていないコンクリートと肉眼で識別するものである。腐蝕抑制剤を含むコンクリートの中で、蛍光染料と腐蝕抑制剤とを含むものについては、腐蝕抑制剤の存在を検出することができるが、蛍光染料が入っていない腐蝕抑制剤を含むコンクリートについては腐蝕抑制剤の検出は不可能との問題があるある。【０００５】
特許文献２には、鉄酸化能力を有する硫黄細菌に、硫黄細菌の栄養塩及び鉄酸化活性を促進するタンパク質構成成分を含む酸性の液を加え、これに腐蝕抑制剤を含むと予想されるコンクリート等の試料を加えて培養し、酸化還元指示薬を加えてその色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出する腐蝕抑制剤の簡易検出方法が開示されている。この方法は、コンクリート等の試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを１日程度で調査することができるもので、簡易で画期的な方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−１３５４号公報
【特許文献２】特開２０１４−１８９８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、コンクリート等の試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かの調査を、現場でさらに短時間で実施することができる腐蝕抑制剤の検出方法が求められており、それを見出すために発明者等は鋭意研究を重ねてきた。【０００８】
従って、本発明は、上記課題を解決した腐蝕抑制剤の簡易検出方法を提供することを目的とする。【０００９】
即ち、下水道コンクリートの構造物、ヒューム管或いは組み立てマンホール等の、コンクリートの二次製品における、微生物に起因する硫酸劣化を防止するための腐蝕抑制剤の混入を簡易に且つ迅速に検出することができる方法を提供することを目的とする。【００１０】
特に、腐蝕抑制剤の混入を、施工現場等の現場において短時間で検出することができる方法を提供することを目的とする。【００１１】
また、本発明は、上記本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法に有利に使用することができる腐蝕抑制剤の簡易検出組成物を提供することを目的とする。【００１２】
さらに、本発明は、上記本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法に有利に使用することができる腐蝕抑制剤の簡易検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的は、
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、腐蝕抑制剤を含むと予想される試料とを混合し、得られた液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出することを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出方法、によって達成される。【００１４】
硫黄酸化細菌は培養液の状態で用いられる。【００１５】
本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法の好適態様は以下の通りである。
（１）ｐＨを１〜３、特に２〜３に調整する。
（２）ｐＨ指示薬が、チモールブルー、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン又はブロモフェノールブルーである。
（３）ｐＨ指示薬が液体であって、一定期間放置前又は後（特に前に）に加えられる。
（４）ｐＨ指示薬が試験紙であって、一定期間放置後に得られた液に浸漬される。
（５）一定期間が１０〜６０分間である。
（６）硫黄酸化細菌が、アシディチオバチルスチオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)及びアシディチオバチルスフェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)から選択される少なくとも１種である。
（７）硫黄酸化細菌が、アシディチオバチルスチオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)及びアシディチオバチルスフェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)から選択される少なくとも１種と、中性のｐＨ域で増殖可能な硫黄酸化細菌と、の組み合わせである。これによれば、酸性域で増殖する硫黄酸化細菌と中性域で増殖する硫黄酸化細菌との組み合わせにより、酸性域に限らず、幅広いｐＨにおいて試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを迅速に検出することが可能となる。
（８）硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌は、予め培養された後、固体硫黄が除去された培養液である。すなわち、硫黄酸化細菌は培養液の状態で用いられることが好ましい。
（９）ｐＨ調整するための酸が硫酸である。
（１０）色の変化の検知を、目視及び吸光光度計の少なくとも１つの手段を用いて行う。
（１１）硫黄酸化細菌、前記培養液及び前記試料に加えて、硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とはキレート化合物を形成するが腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないキレート剤が混合される。これにより、キレート剤が試料からの溶出する硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とキレート化合物を形成することで硫黄酸化細菌の活性低下が抑制される。また、キレート化合物は腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないことから、試料に腐蝕抑制剤が含まれている場合に、硫黄酸化細菌の活性は抑制される。【００１６】
したがって、試料に硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属が含まれている場合であっても、硫黄酸化細菌の活性が維持され、試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを検出することが可能となる。【００１７】
上記目的は、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、ｐＨ指示薬とを含むことを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出組成物；及び
硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液とを含む第１の液、及びｐＨ指示薬を含む第２の液からなることを特徴とする腐蝕抑制剤の簡易検出のためのキットによっても達成される。【００１８】
前記本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法における好適態様は、上記本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出組成物及び簡易検出キットにも適用することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法では、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液、及び腐蝕抑制剤を含むと予想される試料を混合し、得られた液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知し、これにより腐蝕抑制剤を検出している。このため、簡単な作業で、数十分〜数時間の短い期間で腐蝕抑制剤の有無を確認することができる。従って、施工現場等の実際に作業が行われている現場でも検出試験が実施することができ、且つその試験を迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の実施例１における例Ａ〜例Ｄの硫黄酸化細菌等を含む液の０〜７日目までのｐＨの変化のグラフである。
【図２】図２は、例Ａ〜例Ｄの硫黄酸化細菌等を含む液の５日後の硫黄酸化細菌の菌数のグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２における例Ｅ〜例Ｈの硫黄酸化細菌等を含む液の０〜１２０分までのｐＨの変化のグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例３における例Ｉ〜例Ｋの硫黄酸化細菌等を含む液の０〜１５０分までのｐＨの変化のグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例４における例Ｌ〜例Ｍの硫黄化細菌等を含む液の０〜１２０分までのｐＨの変化のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法は、例えば、下記の工程に従って行われる。
【００２２】
ｉ）ビーカー等適当な容器に、ｐＨを１〜４（ｐＨ＝１〜３、特にｐＨ＝２〜３が好ましい）に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液を加える。
【００２３】
ｉｉ）上記培養液が加えられた容器に、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌の培養液を入れる。
【００２４】
ｉｉｉ）上記硫黄酸化細菌培養液が加えられた容器に、腐蝕抑制剤を含むと予想される試料を加えて混合する。これらの材料の添加順序は上記の順序が好ましいが、変更してもよい。例えば、先に試料を入れ、硫黄酸化細菌、培養液を加えてもよい。
腐蝕抑制剤を含むと予想される試料は、コンクリート資材の削り粉、建築物のコンクリートの削り粉、天然岩石の削り粉等である。従って、試料は一般に粉状である。また、硫黄又は硫黄化合物を含む培養液は、例えば硫黄酸化細菌用培地（例えば、水１Ｌに、硫酸アンモニウム３．０ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、リン酸二カリウム０．５ｇ、塩化カリウム０．１ｇ、硝酸カルシウム０．０１ｇ、元素硫黄粉末１０ｇを含むもの）である。培養液のｐＨの調整は、硫酸を適量添加して、ｐＨ＝１〜４（ｐＨ＝１〜３、特にｐＨ＝２〜３が好ましい）に調整することが好ましい。
【００２５】
ｉＶ）得られた混合液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出する。ｐＨ指示薬は色の変化を検知するときに入れてもよいし、一定期間放置する前に入れてもよい。一定期間放置する前に入れると、色の変化が分かるので便宜である。一定期間は、一般に少なくとも１０分間は必要である。１０〜１２０分間が好ましく、さらに１０〜６０分間、特に１０〜３０分間が好ましい。硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌を含む液は、硫黄酸化細菌を硫黄等で培養することにより硫酸が発生し、低いｐＨ（一般にｐＨ３以下）が維持されるか、或いは徐々にさらに低下するが、試料に腐蝕抑制剤が含まれている液では、硫黄酸化細菌の硫酸を発生させる酵素の働きが腐蝕抑制剤により阻害されるため、ｐＨが上昇する（数値が大きくなる）と考えられる。そして、このｐＨの変化は極めて短時間で現れる。すなわち、本発明の方法では、腐蝕抑制剤を含む試料中で硫黄酸化細菌を硫黄で培養した場合においてｐＨの変化が極めて短時間で現れることを利用したもので、試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを短時間で検出することができる簡便な方法であるということができる。
【００２６】
上記放置温度は２０〜３０℃が一般的で、２５〜３０℃が好ましい。このような条件は微生物の活動が最も活発になるので好ましい。
【００２７】
なお、硫黄酸化細菌、培養液及び試料を混合した液とともに、試料を含まない液も用意し、両方の液に対してｉｉ）の工程の操作を行ってもよい。これにより、色の変化を比較しながら観察することができる。
【００２８】
上記色の変化の検知は、目視で行うことが最も簡便である。吸光光度計を用いると機械的に行うことができ、また吸光光度計を用いることにより、腐蝕抑制剤の濃度或いは量を検出することも可能となる。
【００２９】
工程ｉ）で使用される硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌は、一般に、予め培養された後、固体硫黄が除去されたものである。
【００３０】
コンクリートを腐蝕する微生物の中で、酸性域に存在し、硫酸を生成する硫黄酸化細菌のその硫酸生成の能力に注目し、この能力を生かした腐蝕抑制剤の簡易検出方法を本発明者は見出した。本発明で使用されるのは、このような硫酸を生成する能力を有する硫黄酸化細菌であればどのような細菌でも使用することができる。硫黄酸化細菌としては、（アシディ）チオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)、（アシディ）チオバチルス・フェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)を挙げることができる。
【００３１】
また、上記酸性域に存在する硫黄酸化細菌との組み合わせで、中性域で増殖可能な硫黄酸化細菌を使用することも可能である。中性域で増殖可能な硫黄酸化細菌としては、例えば、チオ硫酸をエネルギー源として増殖するチオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）が挙げられる。これによれば、酸性域で増殖する硫黄酸化細菌と中性域で増殖する硫黄酸化細菌との組み合わせにより、酸性域に限らず、幅広いｐＨにおいて試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを迅速に検出することが可能となる。
【００３２】
硫黄酸化細菌の培養方法は、特に制限はなく、通常の液体培養で行うことができる。
【００３３】
たとえば、アシディチオバチルス・チオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)をシルバーマン等の９Ｋ液体培地（M. P. Silverman and D.G. Lundgren (1959) J. Bacteriol. 77, 642-647）に接種し、硫黄酸化細菌を２０〜３０℃において振とう培養することができる。液体培養した培地は、培養液中の固体硫黄をろ紙を用いて除去し、細菌を含むろ過後の培養液を用いることが好ましい。
【００３４】
チオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）は、例えば、酵母エキス５ｇ、チオ硫酸ナトリウム五水和物５ｇ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ、リン酸水素ナトリウム無水物４．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．１ｇおよび塩化アンモニウム０．３ｇを蒸留水１Ｌに添加し、硫酸によりｐＨを６．０に調整した液体培地（以下、中性硫黄酸化細菌培地という）に接種し、硫黄酸化細菌を約３０℃において振とう培養することができる。
【００３５】
また、アシディチオバチルス・チオオキシダンス（ＮＢＩ−３株）は、例えば以下のようにして得ることができる。即ち、元素硫黄無機塩培地（ｐＨ２．５）２０ｍｌ中に、腐食コンクリートを接種し、３０℃の好気条件下で保存する。培地のｐＨが２．０に低下したところで、培地を交換しこの培養操作を５回行う。培養により得られたアシディチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus tiooxidans)の黄色いコロニーをテトラチオン酸無機塩平板培地で単離し、この分離株をＮＢＩ−３株とする。
【００３６】
そして、このＮＢＩ−３株を、固体硫黄、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＣｌ、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ等を含む元素硫黄無機塩培地（ｐＨ２．５）２０ｍｌに、接種し、例えば、３０℃において７日間振とう培養する。これを、前述のようにして培地から固体硫黄を除き、ＮＢＩ−３株の培養菌液を得る。
【００３７】
チオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）は、例えば、以下のようにして得ることができる。即ち、中性硫黄酸化細菌培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中に、岡山県岡山市古都の水田土壌を接種し、３０℃の好気的条件下で保存する。培地のｐＨが４．０に低下したところで、培地を交換しこの培養操作を５回行う。培養により得られたチオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）の白色のコロニーを単離し、分離株を得る。
【００３８】
そして、この分離株を、上記中性硫黄酸化細菌培地２０ｍｌに接種し、例えば３０℃において２日間振とう培養し、チオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）の分離株の培養液とする。
【００３９】
なお、チオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）としては、単離することに限らず、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ｎｉｔｅ）のＮＲＢＣ番号：ＮＲＢＣ  １４５６４の菌株を用いることも可能であり、さらには、市販の保存菌株を用いることも可能である。
【００４０】
本発明の方法において、硫黄酸化細菌に加えられる培養液は、前述の硫黄酸化細菌に用いられた培地、即ち９Ｋ基本塩培地、或いは元素硫黄無機塩培地等に用いられる培養液を用いることができる。その際、硫黄酸化細菌の活性を高めるため、単体硫黄又は硫黄化合物を添加する。硫黄は３０以上の同素体を形成するが、どのような硫黄でも使用することができる。同素体の中でも、環状のＳ８硫黄が一般に用いられる。Ｓ８硫黄は３つの結晶形：α硫黄（斜方硫黄）、β硫黄（単斜硫黄）、γ硫黄（単斜硫黄）があり、斜方硫黄が安定で好ましい。硫黄化合物としては、硫黄含有無機化合物、例えば、金属スルファイド、テトラチオン酸等の硫化物を挙げることができる。単体硫黄（元素硫黄、固体硫黄ともいう）が好ましい。
【００４１】
なお、中性域で増殖可能な硫黄酸化細菌（チオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia））を併用する場合、培地にはエネルギー源としてチオ硫酸塩を添加することが好ましい。
【００４２】
硫黄等を含む培養液に適当な酸を適量添加して、液のｐＨを１〜４（好ましくはｐＨ＝２〜３、特に２．５）に調整する。使用する酸として、硫酸を挙げることができる。他の酸（亜硫酸、塩酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、チオシアン酸、炭酸及びホウ酸等）は、硫黄細菌の生育を阻害するので、一般に使用することができない。
【００４３】
工程ｉｉでは、ｐＨ調整された液を一定期間放置した後、ｐＨ指示薬で色の変化を検知することにより、腐蝕抑制剤の有無を検出する。
【００４４】
上記放置する期間は、一般に１０分以上であり、１０分〜１２０分間、さらに１０分〜６０分間、特に１５分〜４５分間が好ましい。この期間は、短いほど検査時間の短縮が図れるので好ましいが、そのためには、硫黄酸化細菌の濃度、培養液の種類等を調整する必要がある。特に硫黄酸化細菌の濃度を好適にする必要がある。例えば、混合液を１００ｍｌとした場合、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌の数は、２〜２０×１０８ｃｅｌｌ／１００ｍｌ、特に４〜１０×１０８ｃｅｌｌ／１００ｍｌの範囲が好ましく、硫黄又は硫黄化合物を含む培養液における硫黄換算含有量は、０．２〜２．０ｇ／１００ｍｌ、特に０．５〜１．５ｇ／１００ｍｌが好ましい。上記混合液１００ｍｌに対して、試料１００〜２００ｍｇ、特に１００ｍｇを使用することが好ましい。硫黄細菌が増殖する培養液中の最大量は、一般に５〜１０×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌである。
【００４５】
腐蝕抑制剤としては、例えば、ニッケル粉末、タングステン、銀、コバルト、銅、これらの合金等の金属、これらの金属の酸化物、これらの金属含有オキソ酸の金属塩、又はシュウ酸金属塩、ギ酸金属塩等の有機化合物、或いはこれらのゼオライト担持物を挙げることができる（但し、この金属塩の金属は一般にアルカリ金属又はアルカリ土類金属である）。本発明においては、特に、Ｎａ２ＷＯ４、ニッケル粉末が好ましい。
【００４６】
硫黄酸化細菌、試料等を混合して得た混合液は、混合時は通常ｐＨ３以下であるが、腐蝕抑制剤が存在する場合には硫黄酸化細菌の増殖が阻害されて硫酸の生成が阻害されるため、徐々にｐＨは上昇する。その上昇により色の変化が現れるｐＨ指示薬を指示薬として使用することが好ましい。すなわちｐＨ４以上、特に４〜６において色の変化するｐＨ指示薬が好ましい。このようなｐＨ指示薬として、チモールブルー、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン、ブロモフェノールブルー、メチルレッド、ブロモクレゾールパープルを挙げることができる。チモールブルー、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン、ブロモフェノールブルーが好ましい。
【００４７】
さらに、硫黄酸化細菌、試料等を混合する際に、それらに加えて、硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とはキレート化合物を形成するが腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないキレート剤を混合することも可能である。
【００４８】
硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とは、六価クロムが代表例として挙げられるが、これのみに限られるものではない。
【００４９】
腐蝕抑制剤の有効成分である金属は、腐蝕抑制剤の項目で述べた通りである。
【００５０】
キレート剤は、硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とはキレート化合物を形成するが腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないキレート剤であれば、どのようなものであっても良い。具体例としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩を挙げることができる。好ましくは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムである。
【００５１】
キレート剤の添加量は、例えば、試料を添加する前の培養液等の混合液に対して０．０５〜０．３０質量％の範囲とすることができ、０．１０〜０．２５質量％の範囲であることが好ましい。
【００５２】
キレート剤の添加により、キレート剤が試料から溶出する硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属とキレート化合物を形成することで硫黄酸化細菌の活性低下が抑制される。また、キレート剤は腐蝕抑制剤の有効成分である金属とはキレート化合物を形成しないことから、試料に腐蝕抑制剤が含まれている場合に、硫黄酸化細菌の活性は抑制される。
【００５３】
したがって、試料に硫黄酸化細菌の生育を阻害する金属が含まれている場合であっても、硫黄酸化細菌の活性が維持され、試料に腐蝕抑制剤が含まれているか否かを検出することが可能となる。
【００５４】
本発明は、上記本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出方法に有利に使用することができる腐蝕抑制剤の簡易検出組成物及び腐蝕抑制剤の簡易検出のためのキットも提供する。
【００５５】
本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出組成物は、前記の硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌培養液と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液と、ｐＨ指示薬とを含んでいる。これらの混合物を用いて検出方法を実施する場合は、混合物に試料を加える必要がある。
また、混合物には、上記のキレート剤を含ませることができる。
【００５６】
本発明の腐蝕抑制剤の簡易検出のためのキットは、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌培養液と、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液とを含む第１の液、及びｐＨ指示薬を含む第２の液からなる。或いは硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌培養液、ｐＨを１〜４に調整した硫黄又は硫黄化合物を含む培養液、及びｐＨ指示薬を含む液の３種をそれぞれ別個に有していてもよい。上記ｐＨ指示薬はｐＨ試験紙でもよい。
【００５７】
また、上記液のうちいずれかに、上記のキレート剤を含ませることができる。
【００５８】
上記腐蝕抑制剤の簡易検出組成物及び腐蝕抑制剤の簡易検出のためのキットにおいて、硫黄酸化能力を有する硫黄酸化細菌の数は、２〜２０×１０８ｃｅｌｌ／１００ｍｌ、特に、４〜１０×１０８ｃｅｌｌ／１００ｍｌの範囲が好ましく、硫黄又は硫黄化合物を含む培養液における硫黄換算含有量は、０．２〜２．０ｇ／１００ｍｌ、特に０．５〜１．５ｇ／１００ｍｌが好ましい。上記範囲は、組成物或いはキットを総量が１００ｍｌとした場合の値であり、一般に試料１００〜２００ｍｇに対して使用されるものである。従って、組成物或いはキットの総量を大きくする場合又は少なくする場合は、この濃度を保持して設計することが好ましい
【実施例】
【００５９】
［実施例１］
（１）硫黄酸化細菌培養液の作製
元素硫黄１．０％、(ＮＨ４)２ＳＯ４ ０．３％、ＭｇＳＯ４-７Ｈ２Ｏ ０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％、ＫＣｌ ０．０１％、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ０．００１％を含む元素硫黄無機塩培地（ｐＨ２．５）２０ｍｌ中に、腐食コンクリート１．０ｇを接種し、３０℃の好気条件下で保存した。培地のｐＨが２．０以下に低下したところで、培地を交換し、この培養操作を５回行った。培養により得られたアシディチオバチルス・チオオキシダンス(Acidthiobacillus tiooxidans)の黄色いコロニーをテトラチオン酸無機塩平板培地で単離し、この分離株をＮＢＩ−３株とした。
単体硫黄１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．３％、ＭｇＳＯ４-７Ｈ２Ｏ ０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％、ＫＣｌ ０．０１％、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ０．００１％を含む元素硫黄無機塩培地（元素硫黄９Ｋ基本培地；ｐＨ２．５）２０ｍｌ中に、上記ＮＢＩ−３株を添加し、１週間振とうして培養を行った。得られたＮＢＩ−３株培養液の菌数は７×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌであった。【００６０】
（２）腐蝕抑制剤の検出
例Ａ）
５００ｍＬ三角フラスコに、（１）で得られた硫黄酸化細菌（ＮＢＩ−３株）１．０ｍＬ（菌数５〜１０×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌ）、硫酸でｐＨ＝２．５に調整した９Ｋ基本塩培地２５０ｍＬ、単体硫黄２．５ｇを加えた。さらにビックリート（防菌コンクリート（腐蝕抑制剤のタングステン酸ナトリウム及び金属ニッケルを含有するコンクリート）、ヒダ株式会社製）を５００ｍｇ加えた。
得られた液に、ｐＨ指示薬としてチモールブルー試験紙（反応開始時は赤色）を用い、継時的な色の変化を目視で観察した。
上記９Ｋ基本塩培地は下記の構成を有する：
ｐＨ２．５の酸性水に、以下の無機塩（０．３％の硫酸アンモニウム、０．０５％の硫酸マグネシウム、０．０５％のリン酸二カリウム、０．０１％の塩化カリウム、０．００１％硫酸カルシウム）を含む。【００６１】
また、硫黄酸化細菌ＮＢＩ−３株の培養に用いた元素硫黄無機塩培地は、上記９Ｋ基本塩培地に元素硫黄を１％となるように添加し、ｐＨは硫酸を用いてｐＨ２．５に調整する。【００６２】
上記ビックリートは、ビックリート管表面をワイヤーブラシで切削して得た粉状（平均粒径：約１００μｍ）のものを用いた。腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートも同様にして粉状のものを得た。【００６３】
例Ｂ）
硫黄酸化細菌１．０ｍＬから２．０ｍＬに変更した以外は、例Ａと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてチモールブルー試験紙（反応開始時は赤色）を用い、継時的な色の変化を目視で観察した。【００６４】
例Ｃ）（比較）
ビックリートの代わりに腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートを用いた以外は、例Ａと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてチモールブルー試験紙（反応開始時は赤色）を用い、継時的な色の変化を目視で観察した。【００６５】
例Ｄ）（比較）
ビックリートの代わりに腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートを用いた以外は、例Ｂと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてチモールブルー試験紙（反応開始時は赤色）を用い、継時的な色の変化を目視で観察した。  【００６６】
（結果）
１日後、例Ａ、例Ｂの液は赤色から黄色に変化した。【００６７】
０〜７日目までのｐＨの変化のグラフを図１に示す。【００６８】
また、５日後の硫黄酸化細菌の菌数のグラフを図２に示す。硫黄酸化細菌の菌数は、分光光度計を用いて、波長６６０ｎｍの吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  （Ａ６６０ｎｍ））測定することにより決定した。細菌は液体培養液中で増殖すると、培養液は透明から白濁へと変化し、この菌の増殖に伴う白濁の強さは上記６６０ｎｍの吸光度（Ａ６６０ｎｍ）に比例するため上記測定により硫黄酸化細菌の増殖量を決定した。【００６９】
［実施例２］
（１）硫黄酸化細菌培養液の作製
実施例１と同様に行った。【００７０】
（２）腐蝕抑制剤の検出
例Ｅ）
２００ｍＬ三角フラスコに、（１）で得られた硫黄酸化細菌培養液０．２ｍＬ、硫酸でｐＨ＝２．５に調整した９Ｋ基本塩培地５０ｍＬ、単体硫黄０．５ｇ加えた。さらにビックリート（防菌コンクリート（腐蝕抑制剤のタングステン酸ナトリウム及び金属ニッケルを含有するコンクリート）、ヒダ株式会社製）を１００ｍｇ加えた。
得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）を使用し、継時的な色の変化を１５分毎に目視で観察した。【００７１】
例Ｆ）
硫黄酸化細菌０．２ｍＬから０．４ｍＬに変更した以外は、例Ｅと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）を使用し、継時的な色の変化を１５分毎に目視で観察した。【００７２】
例Ｇ）（比較）
ビックリートの代わりに腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートを用いた以外は、例Ｅと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）を使用し、継時的な色の変化を１５分毎に目視で観察した。【００７３】
例Ｈ）（比較）
ビックリートの代わりに腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートを用いた以外は、例Ｆと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）を使用し、継時的な色の変化を１５分毎に目視で観察した。  【００７４】
（結果）
３０分後、例Ｅ、例Ｆの液は黄色から緑色に変化し、６０分後に青色に変化した。【００７５】
０〜１２０分までのｐＨの変化のグラフを図３に示す。【００７６】
［実施例３］
（１）硫黄酸化細菌培養液の作製
実施例１と同様に行った。【００７７】
（２）腐蝕抑制剤の検出
例Ｉ）
１００ｍＬ三角フラスコに、（１）で得られた硫黄酸化細菌１．２ｍＬ、硫酸でｐＨ＝２．５に調整した硫黄細菌用培地５０ｍＬ、単体硫黄０．５ｇ加えた。さらに腐食抑制剤を含んでいないコンクリート試料１を１００ｍｇ加えた。
得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）、継時的な色の変化を１５分毎に目視で調査した。【００７８】
例Ｊ）
コンクリート試料１から未知のコンクリート試料２に変更した以外は、例Ｉと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色）、継時的な色の変化を１５分毎に目視で調査した。【００７９】
例Ｋ）
コンクリート試料１から未知のコンクリート試料３に変更した以外は、例Ｉと同様にして、得られた液に、ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールグリーン試験紙（反応開始時は黄色））、継時的な色の変化を１５分毎に目視で調査した。【００８０】
（結果）
１５分後、例Ｊの液は黄色から緑色に、例Ｋの液は黄色から青色に変化し、例Ｉの液は変化しなかった。０〜１２０分までのｐＨの変化のグラフを図４に示す。【００８１】
上記の結果から、例Ｊと例Ｋのコンクリートは、腐蝕抑制剤を含んでおり、例Ｉのコンクリートは、腐蝕抑制剤を含んでいないことを示している。【００８２】
［実施例４］
本実施例においては、硫黄酸化細菌として、実施例１〜３で用いた硫黄酸化細菌（以下、第１の硫黄酸化細菌という）に加えて、中性域で増殖可能な硫黄酸化細菌（以下、第２の硫黄酸化細菌という）を用いた。【００８３】
また、発明者らが実施例２の例Ｇ）および例Ｈ）の再現試験を行った場合に、腐蝕抑制剤を含有していないコンクリートを加えた場合であっても、実施例２の結果と反して、ｐＨが低下せずに上昇し、液色が青色のままであったコンクリート（以下、再現無コンクリートという）が数検体存在することが確認された。腐蝕抑制剤を含有するビックリートを加えた場合も液色は青色となることから、両者は判別がつかないこととなる。【００８４】
そこで、かかる再現無コンクリートであっても腐蝕抑制剤の有無の判別を可能とする腐蝕抑制剤の検出試験を、以下に行なった。【００８５】
（１）第１の硫黄酸化細菌培養液の作製
実施例１と同様に行った。【００８６】
（２）第２の硫黄酸化細菌培養液の作成
中性硫黄酸化細菌培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中に、岡山県岡山市古都の水田から採取した土壌試料１．０ｇを接種し、３０℃の好気条件下で保存した。培地のｐＨが４．０以下に低下したところで、培地を交換し、この培養操作を５回行った。培養により得られたチオモナス・インターメディア（Thiomonas intermedia）の白色のコロニーを単離し、分離株を得た。【００８７】
さらに、新たな上記中性硫黄酸化細菌培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中にこの分離株を添加し、３０℃で２日間振とう培養を行った。得られた分離株培養液の菌数は２×１０９ｃｅｌｌ／ｍｌであった。【００８８】
（３）腐蝕抑制剤の検出
例Ｌ）
３本の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ（コーニング社製）に、（１）で得られた第１の硫黄酸化細菌０．２ｍＬ、（２）で得られた第２の硫黄酸化細菌０．１ｍＬ、硫酸でｐＨを２．５に調整した９Ｋ基本塩培地２０ｍＬ（ｐＨ２．５）、単体硫黄２５０ｍｇ、ｐＨ２．０の０．１Ｍのβ−アラニン硫酸緩衝液３．３ｍＬ（ｐＨ２．０）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２２．３ｍｇ、ブロモクレゾールグリーン溶液１．０ｍＬ、チオ硫酸ナトリウム１００ｍｇをそれぞれ加えた。この時点で、液のｐＨは２．７５であった。【００８９】
さらに、上記再現無コンクリート試料１〜３を上記３本のＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ１本につき１試料ずつ１００ｍｇの量で加え（以下、それぞれ、例Ｌ−１、例Ｌ−２、例Ｌ−３という）、継時的な液色の変化を１０分後〜１２０分後まで目視で観察し、同時にｐＨの測定も行った。なお、ｐＨの測定値は、Ｌ−１〜３の平均値で示す。【００９０】
例Ｍ）
再現無コンクリート試料１〜３に代えてビックリート試料１〜３を用いたこと以外は、例Ｌ）と同様にして得られた液の（以下、得られた液を以下、それぞれ、例Ｍ−１、例Ｍ−２、例Ｍ−３という）、継時的な液色の変化を１０分後〜１２０分後まで目視で観察し、同時にｐＨの測定も行った。なお、ｐＨの測定値は、Ｌ−１〜３の平均値で示す。【００９１】
（結果）
図５に示すように、１２０分後、例Ｌ−１〜３の液は黄色から緑色までしか変化しなかった一方、例Ｍ−１〜３の液は黄色から青色にまで変化した。両者の液色の差は、１０分後から判別可能であった。【００９２】
また、同図に示すように、試験開始後３０分で例Ｌ及び例Ｍのサンプル間でｐＨで２程度の大きな差が生じ、１２０分後までその差は拡大し続けた。【００９３】
上記の結果は、例Ｌ−１〜３のコンクリートが腐蝕抑制剤を含んでおらず、例Ｍ−１〜３のコンクリートが腐蝕抑制剤を含んでいることを判別可能とする結果であった。【００９４】
発明者らが実施例２の例Ｇ）および例Ｈ）の再現試験を行った際に再現性ある結果が得られなかったことは、（ｉ）腐蝕抑制剤を含まないコンクリートであっても、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ成分を多く含んでいる場合には腐蝕抑制剤の検出試験時の液の初期ｐＨが高くなったこと、および、（ｉｉ）コンクリートからの六価クロム等の有害金属の溶出により、硫黄酸化細菌の活動が低下したことが原因として考えられていた。【００９５】
これに対し、中性域でも増殖可能な硫黄酸化細菌を酸性域で増殖可能な硫黄酸化細菌と併用したこと、および、六価クロム等の有害金属をキレート剤を添加して不溶性の固定化物としたことで、硫黄酸化細菌の活動が活発化し、実施例２の試験では判別不能なコンクリートを用いる場合であっても腐蝕抑制剤の有無を判別可能となったものと推察される。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
上記の本発明の方法を用いることにより、コンクリート等の材料或いは構築物中において腐蝕抑制剤が存在しているか否かを迅速に知ることができることが分かる。従って、この方法を用いることにより、既に建設された構築物のコンクリートの中に腐蝕抑制剤が存在しているか否かを、迅速に検知することができる。また、腐蝕抑制剤の有無を作業現場でもすぐに知ることができる。さらに、腐蝕抑制剤が混入するように設計されたコンクリート等の材料について、実際に混入しているか否かを検査する品質管理にも本発明の方法を利用することができる。
【図１】
2016104447.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2016104447.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月26日(2017.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
特許文献１には、少量の判別材料の混入によって、その材料（添加剤）の混入が、肉眼にて容易に判別することのできる添加剤判別可能コンクリートの製造方法が開示されている。即ち、セメントその他のコンクリート組成物と共に混合する粉状添加剤に、蛍光染料入りの添加剤（腐蝕抑制剤）を前記コンクリート組成物と共に混練し、コンクリート中の該蛍光染料の混入の判別を、例えばブラックライト等の不可視光線を照射することにより、添加剤の位置から発する蛍光により、添加材が混入されていないコンクリートと肉眼で識別するものである。腐蝕抑制剤を含むコンクリートの中で、蛍光染料と腐蝕抑制剤とを含むものについては、腐蝕抑制剤の存在を検出することができるが、蛍光染料が入っていない腐蝕抑制剤を含むコンクリートについては腐蝕抑制剤の検出は不可能との問題がある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
たとえば、アシディチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)をシルバーマン等の９Ｋ液体培地（M. P. Silverman and D.G. Lundgren (1959) J. Bacteriol. 77, 642-647）に接種し、硫黄酸化細菌を２０〜３０℃において振とう培養することができる。液体培養した培地は、培養液中の固体硫黄をろ紙を用いて除去し、細菌を含むろ過後の培養液を用いることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
そして、このＮＢＩ−３株を、固体硫黄、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＣｌ、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ等を含む元素硫黄無機塩培地（ｐＨ２．５）２０ｍｌに、接種し、例えば、３０℃において７日間振とう培養する。これを、前述のようにして培地から固体硫黄を除き、ＮＢＩ−３株の培養菌液を得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（結果）
１５分後、例Ｊの液は黄色から緑色に、例Ｋの液は黄色から青色に変化し、例Ｉの液は変化しなかった。０〜１５０分までのｐＨの変化のグラフを図４に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
例Ｍ）
再現無コンクリート試料１〜３に代えてビックリート試料１〜３を用いたこと以外は、例Ｌ）と同様にして得られた液の（以下、得られた液を以下、それぞれ、例Ｍ−１、例Ｍ−２、例Ｍ−３という）、継時的な液色の変化を１０分後〜１２０分後まで目視で観察し、同時にｐＨの測定も行った。なお、ｐＨの測定値は、Ｍ−１〜３の平均値で示す。
【国際調査報告】
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2016104447.tif 000009
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