(57)【要約】  ポリヒドロキシアルカン酸を効率よく分解しメタンを主成分とするバイオガスに変換する嫌気性微生物群集を使用したポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに、メタン発酵プロセスの種汚泥として使用可能な微生物製剤を提供する。  下記（Ａ）のメタン生成古細菌、及び、下記（Ｂ）の細菌を含んでなる微生物群集により、ポリヒドロキシアルカン酸を分解処理する。（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、下記（Ａ）のメタン生成古細菌、及び、下記（Ｂ）の細菌を含んでなる微生物群集により、ポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
【請求項２】
前記（Ａ）の古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌を含有することを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項３】
前記（Ａ）の古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌と、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌の両方を含有することを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項４】
前記（Ｂ）の細菌が、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌の少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１〜３のいすれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項５】
前記Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌が、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローンの割合として、前記微生物群集の全体に対し占める割合が５０％以上９５％以下であることを特徴とする請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項６】
前記Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌が、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科またはＴｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科に分類される細菌を合計で、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローンの割合として２０％以上９５％以下含有していることを特徴とする請求項４または５に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項７】
嫌気条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項８】
２０〜６５℃の温度条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸および３−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも１種類を繰り返し単位構造として含む重合体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を繰り返し単位構造として含む重合体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）のメタン生成古細菌、及び、下記（Ｂ）の細菌を含むポリヒドロキシアルカン酸分解及びメタン製造用微生物製剤。
（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに、その分解に使用される微生物製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、家庭、学校給食、レストランなどから出される生ゴミ等の有機系廃棄物を、メタン発酵法によりメタンを主成分とするバイオガスに変換する技術開発が推進されている。この技術で得られたバイオガスはエネルギーとして再利用できるため、廃棄物処理にかかる費用を低減させるだけでなく、創エネルギー産業の創造へと転換することが可能となる。【０００３】
しかし、有機系廃棄物をメタン発酵プロセスに利用するためには、その中に含まれるプラスチック廃棄物を分別除去する必要があり、このような分別除去には多大な労力を要することから、メタン発酵技術の大きな課題となっている。【０００４】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。３−ヒドロキシアルカン酸のホモポリマーあるいはコポリマーであるこれらのポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと称することがある。）は熱可塑性高分子であり、堆肥化や自然環境中で微生物によって分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。このためこのような生分解性プラスチックは、環境中で利用される農業用資材、使用後の回収・再利用が困難な食品容器、包装材料、衛生用品、ゴミ袋などへの幅広い応用を目指して開発が進められている。特に食品容器や包装材料、ゴミ袋などをメタン発酵に用いる際に分別除去の必要がなくなると、前記課題の解決につながり、大きな期待が寄せられている。【０００５】
しかし、現在のプラスチック使用量を考慮すると、自然界やメタン発酵プロセスに存在する微生物による分解を待っているだけでは処理しきれなくなることが予想される。そこでＰＨＡを分解する微生物を探索して、これを利用して積極的にＰＨＡを分解する方法が検討されている。【０００６】
ＰＨＡはｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡ（以下、ＰＨＡSCLと称することがある。；炭素数３〜５）とｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈＰＨＡ（以下ＰＨＡMCLと略す；炭素数６〜１４）に分類されている。ＰＨＡを分解する菌株は細菌やカビに広く分布し、ＰＨＡSCLやＰＨＡMCLを分解する微生物が多数分離されている（非特許文献１）。ほとんどの細菌はＰＨＡSCLまたはＰＨＡMCLを特異的に分解する。また、両タイプのＰＨＡを分解できる微生物としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓが見いだされているが、この微生物はそれぞれのタイプのＰＨＡに対応する２種類以上の分解酵素を持つために両タイプのＰＨＡを分解可能であることが分かっている（非特許文献２、非特許文献３）。【０００７】
近年、ＰＨＡSCLの一種である３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略すことがある）とＰＨＡMCLの一種である３−ヒドロキシヘキサン酸（以下３ＨＨと略すことがある）の共重合ポリエステル（以下ＰＨＢＨと略すことがある）およびその製造方法について研究がなされている。 【０００８】
ＰＨＢＨの分解酵素に関する研究は少ないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９株の生産するＰＨＢ分解酵素と、同株より単離されたＰＨＢ酵素遺伝子及びＰＨＢ酵素遺伝子発現ベクターにより形質転換された当該形質転換体を培養することにより得られるＰＨＢＨ分解酵素とがあることが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。前記株は生育条件温度が２０〜４５℃の範囲にある。【０００９】
また、ＰＨＢＨを分解するサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）が単離され、この株からクローン化したデポリメラーゼ遺伝子を宿主細胞で発現させることにより製造したデポリメラーゼの活性は、至適温度が６５〜７５℃と高く、そのＰＨＢＨ分解活性も非常に優れていることが見出された（特許文献１）。【００１０】
しかし、これらの優れた研究成果は全て好気的な環境で生息する微生物によるＰＨＡの分解に関する成果である。メタン発酵は嫌気性微生物群集の相互作用によって有機物をメタンへと変換するプロセスであるため、ＰＨＢＨを含むＰＨＡあるいはＰＨＢＨを含む有機系廃棄物のメタン発酵への利用のためには、ＰＨＢＨを含むＰＨＡの分解能を持つ嫌気性微生物群集を用いる必要がある。【００１１】
ところが、メタン発酵によるＰＨＡの分解については研究例がほとんど無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
特許文献１：特開２００９−２０７４２４号公報
【非特許文献】
【００１３】
非特許文献１：Ｊｅｎｄｒｏｓｓｅｋ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ５６，４０３．
非特許文献２：Ｓｃｈｉｒｍｅｒ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ５９，１２２０（１９９３） 
非特許文献３：Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ等，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ１４２，２１５（１９９６） 
非特許文献４：Ｔａｋａｋｕ等，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ２６４，１５２（２００６） 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＨＡを効率よく分解しメタンを主成分とするバイオガスに変換する嫌気性微生物群集を使用したＰＨＡ分解方法、並びに、メタン発酵プロセスの種汚泥として使用可能な微生物製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、嫌気性消化槽汚泥を種汚泥とし、ＰＨＡ粉末及び酢酸塩を炭素源として含有する合成廃水を連続供給することによって生成した特定の微生物群種が、ＰＨＡの分解性に優れ、ＰＨＡを効率的に分解しメタンを主成分とするバイオガスを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供するものである。
（１）ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、下記（Ａ）のメタン生成古細菌、及び、下記（Ｂ）の細菌を含んでなる微生物群集により、ポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
（２）前記（Ａ）の古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（３）前記（Ａ）の古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌と、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌の両方を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（４）前記（Ｂ）の細菌が、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌の少なくとも１種を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（５）前記Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌が、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローンの割合として、前記微生物群集の全体に対し占める割合が５０％以上９５％以下であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（６）前記Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌が、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科またはＴｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科に分類される細菌を、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローンの割合として合計で２０％以上９５％以下含有しているポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（７）嫌気条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（８）２０〜６５℃の温度条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（９）前記ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸および３−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも１種類を繰り返し単位構造として含む重合体であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（１０）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を繰り返し単位構造として含む重合体であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
（１１）下記（Ａ）のメタン生成古細菌、及び、下記（Ｂ）の細菌を含む、ポリヒドロキシアルカン酸分解及びメタン製造用微生物製剤。
（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌または単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＰＨＢＨ等のＰＨＡを、効率良く安価に分解し、メタンを主成分とするバイオガスを製造することが可能となる。これにより、ＰＨＢＨ等のＰＨＡから形成されたゴミ袋ごと生ゴミを処理し、エネルギーとして再利用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１（ａ）】ＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比２：８の合成廃水を希釈率０．０５ｄ−１で運転するリアクター槽内液の顕微鏡観察による位相差像
【図１（ｂ）】前記顕微鏡観察による蛍光像
【図２】リアクターから検出された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローンのＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門における系統樹を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、ＰＨＡを効率的に分解する方法であって、特定の微生物群を使用して、特に嫌気条件において、ＰＨＡを生物学的に分解しメタンを主成分とするバイオガスに変換する方法である。
【００２１】
本発明におけるＰＨＡは以下の一般式で表される。
【００２２】
【化１】
2015122190.tif 000002
【００２３】
（式中のＲは炭素数１〜１３のアルキル基を表し、ｍは２以上の整数を表す。ｍ個のＲは同一であってもよいし、異なっていてもよい。）
本発明において、ＰＨＡは、３ＨＢ及び３ＨＨのうち少なくとも１種類から構成されるＰＨＡが好ましく、より好ましくは、下記一般式：
【００２４】
【化２】
2015122190.tif 000003
【００２５】
（式中のｍ、ｎは１以上の整数を表す）で表される、３ＨＢと３ＨＨから構成される共重合体である。
【００２６】
本発明の微生物群集は、（Ａ）メタン生成古細菌と（Ｂ）ＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解し、酢酸、水素、二酸化炭素といった、メタン生成古細菌の基質となる物質を生成する過程を担う微生物（細菌）により構成される。
【００２７】
（Ａ）のメタン生成古細菌は、詳細には、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌または単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌である。ＰＨＡの分解性の点でＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌を含むことが好ましく、ＰＨＡの分解性が更に優れる点で、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌と単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌の両方の細菌を含有することがより好ましい。
【００２８】
（Ｂ）の細菌としては、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ＰＨＡを分解しうる細菌であれば、特に制限はないが、ＰＨＡの分解性に優れる点でＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌を含有することが好ましい。特に、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌が、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、前記微生物群集の全体に対して占める割合は、下限値が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、６９％以上が特に好ましい。また、その上限値は９５％以下が好ましく、８５％以下がより好ましく、７９％以下が特に好ましい。
【００２９】
また、更にＰＨＡの分解性の点で、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌として、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科またはＴｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科に分類される細菌を含有することが好ましく、さらに、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類される細菌のうち、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科またはＴｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科に分類される細菌が合計で占める割合は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、下限値が２０％以上が好ましく、２５％以上がより好ましく、２９％以上が特に好ましい。また、その上限値は９５％以下が好ましく、９０％以下がより好ましく、８３％以下が特に好ましい。
【００３０】
本発明による嫌気性微生物群集は、ＰＨＢ、ＰＨＢＨ等を含むＰＨＡを分解する活性を有している。
【００３１】
本発明によってＰＨＡを分解する際の分解処理温度は、微生物の活性に優れる点で、２０〜６５℃が好ましく、２５〜５０℃がより好ましく、３０〜４０℃が特に好ましい。
【００３２】
なお、一般的なメタン発酵プロセスは、通常の場合３０〜４０℃、あるいは５０〜６５℃の条件のいずれかで運転されている。
【００３３】
本発明の分解方法は、メタン発酵の設備を有する処理場等においてＰＨＡを分解しバイオガスに変換する際に、既存の設備に適用できる点できわめて有用である。
【００３４】
また、本発明で使用する微生物群集は、酢酸やタンパク質の加水分解物が共存することにより、その分解活性が向上する特徴も有している。
【００３５】
本発明の分解方法は、嫌気条件下で効率よくＰＨＡを分解できることを特徴としており、極めて有用である。
【００３６】
本発明による微生物群集はＰＨＡの分解を目的としたメタン発酵プロセスに使用できる微生物製剤を構成することができる。この微生物製剤はメタン発酵プロセスにおける種汚泥として使用可能である。
【００３７】
これら微生物製剤をもちいてメタン発酵プロセスを構築することによって、ＰＨＡを含む有機性廃棄物を原料として、メタンを主成分とするバイオガスを得ることが可能になる。
【００３８】
（ＰＨＡ分解嫌気性微生物群集の集積方法）
本発明の微生物群集は、既存の嫌気性消化槽汚泥等のメタン発酵プロセスの汚泥から集積することができる。しかし、ＰＨＡを効率的に分解できる微生物群を集積できればよく、集積する方法は特に限定されない。
【００３９】
以下に、集積方法として、汚泥を種汚泥とし、ＰＨＢＨおよび酢酸塩を炭素源として含有する合成廃水を連続的に供給するメタン発酵プロセスによる微生物群の集積方法を例に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４０】
好ましい集積方法としては、完全混合型リアクターを使用し、乳化したＰＨＢＨと酢酸塩を炭素源として含有する合成廃水を、リアクターに対して連続的に供給し、合成廃水の供給速度と同じ速度で槽内液を排出するケモスタット式の連続培養を行う方法が例示できる。
【００４１】
合成廃水におけるＰＨＢＨと酢酸塩の濃度比率は炭素濃度として目的の微生物群が集積できれば特に限定されないが、より、ＰＨＡ分解性を有する微生物群集を得られやすい点で、１：９〜５：５、特に１：９から３：７の範囲の合成廃水を使用することが好ましい。
【００４２】
種汚泥としては、本発明で使用する微生物群集を集積できれば特に制限されないが、効率よく集積できる点で、生ごみを処理するメタン発酵プロセスの槽内液を用いることが好ましい。
【００４３】
合成廃水中の有機態炭素濃度は、ＰＨＡ分解性を有する微生物群を得られやすい点で、５，０００ｍｇ／Ｌ〜１０，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、特に７，０００ｍｇ／L〜９，０００ｍｇ／Ｌが好ましい。
【００４４】
合成廃水の希釈率は、ＰＨＡ分解性を有する微生物群を得られやすい点で０．０１〜０．１ｄ−１が好ましく、特に０．０２５〜０．０５ｄ−１（水理学的滞留時間２０〜４０日）の範囲が好ましい。
【００４５】
運転温度は２５〜５０℃の範囲であれば問題ないが、ＰＨＡ分解性の高い微生物群を得られやすい点で３０〜４０℃で運転することが好ましい。
【００４６】
また、集積は、嫌気条件下にて行うことが好ましい。
【００４７】
水理学的滞留時間の２倍から３倍の時間の運転で定常状態に到達し集積が完了し、リアクターの槽内液中に、本発明に使用される微生物群集が集積している。
【００４８】
以上の方法により集積した微生物群集は、ＰＨＡを効率的に分解し、メタンを生成する性能を有している。
【００４９】
（ＰＨＡの分解方法）
以下に、集積した微生物群集を用いてＰＨＡを分解する方法を説明する。
【００５０】
集積した微生物群集には、（Ａ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌または単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌、及び、（Ｂ）Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ＰＨＡを分解しうる細菌を含有している。
【００５１】
ＰＨＡの分解は、例えば、バイアル瓶を用いた嫌気性回分培養により行うことができる。
【００５２】
ガラスバイアル瓶にリン酸二水素カリウム、炭酸水素カリウム等から作成された無機塩培地とシート状等のＰＨＡを入れ、バイアル瓶をブチルゴム栓等で密閉した後、密封状態を保ちながら微生物群集を含むリアクターの槽内液を添加し、バイアル瓶を振盪しながら回分培養することができる。
【００５３】
培養中の温度は、２０〜６５℃が好ましく、２５〜５０℃がより好ましく、３０〜４０℃が特に好ましい。
【００５４】
また、分解性に優れる点で、反応は嫌気条件下で行うことが好ましいため、密封前に、硫化ナトリウムやシステイン塩酸塩を注射器で添加し、絶対嫌気条件環境とすることができる。
【００５５】
本発明の分解方法により、培養開始後３０日以内でＰＨＡシートの分解が認められる。
【００５６】
また、理由は定かではないが、この回分培養においてトリプトンやＬブドウ糖などの有機物や酢酸塩等の有機酸塩等を共存させることにより分解を促進させることができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲を限定されるものではない。【００５８】
〔ポリヒドロキシアルカン酸粉末を用いた分解用微生物群の集積〕
（ＰＨＢＨ粉末合成法）
培養生産にはＫＮＫ−６３１株を用いた。【００５９】
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。【００６０】
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパーム核油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。【００６１】
ポリエステル樹脂生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ  塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％  ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。【００６２】
まず、ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００６３】
次に、前培養液を６Ｌのポリエステル樹脂生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源としてパーム油を使用した。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、得られた乾燥菌体の重量を測定した。【００６４】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステル樹脂を抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステル樹脂をろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、ポリエステル樹脂を得た。得られたポリエステル樹脂の３ＨＨ組成は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。【００６５】
乾燥ポリエステル樹脂２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ポリエステル樹脂分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル樹脂分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。【００６６】
ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、得られたポリエステル樹脂はＰＨＢＨであった。前記ＰＨＢＨにおける３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）の比率は、８９モル％、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）の比率は、１１モル％であった。【００６７】
培養後、培養液から国際公開第２０１０／０６７５４３号に記載の方法にてＰＨＢＨ粉末を得た。ＧＰＣで測定した重量平均分子量は６５万であった。【００６８】
（合成廃水調製例１）
１Ｌ容ビーカーに約８００ｍＬの蒸留水をいれ、撹拌子でかき混ぜながら、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸水素カリウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム六水和物、システイン塩酸塩一水和物、微量元素溶液、ビタミン溶液を添加し混合した。更に約１００ｍＬの蒸留水に懸濁させたＰＨＢＨ粉末を超音波ホモジナイザーにて分散し、上記の水溶液に添加し、蒸留水で１ＬにメスアップすることでＰＨＢＨと酢酸塩の炭素濃度比（ＰＨＢＨ：酢酸塩）＝１：９の合成廃水ａを調製した。尚、合成廃水ａは、総炭素濃度８，０００ｍｇ／Ｌとなるように調製した。合成廃水ａにおける各化合物の組成比を表１に示した。【００６９】
【表１】
2015122190.tif 000004
【００７０】
（合成廃水調製例２、３）
合成廃水調製例１の方法に従い、表１に示したＰＨＢＨと酢酸塩の炭素濃度比、および各化合物の組成比で、合成廃水ｂ、ｃを調製した。【００７１】
（ＣＯＤｃｒ除去率の測定方法、およびＰＨＢＨ分解率の算出方法）
各合成廃水およびリアクター槽内液のＣＯＤｃｒ（化学的酸素要求量：有機物量の指標）は、試料中の有機物をニクロム酸カリウムで酸化した際に要求される酸素量として、ＣＯＤ試薬ＨＲ (Ｈａｃｈ社)を用いて測定した。【００７２】
リアクター槽内液のＣＯＤｃｒを合成廃水のＣＯＤｃｒで除した値を１から引き、百分率で表した数値をＣＯＤｃｒ除去率とした。【００７３】
リアクター槽内液および合成廃水の水溶性ＣＯＤｃｒと、不溶性成分を含む全ＣＯＤｃｒをそれぞれ測定し、その差から不溶性成分のみのＣＯＤｃｒを算出した。この不溶性ＣＯＤｃｒから不溶性ＣＯＤｃｒ除去率を算出し、これをＰＨＢＨの分解率とした。【００７４】
（バイオガス発生速度の測定方法）
リアクターから発生したバイオガスはプラスチック製のガスホルダに集気し、２４時間間隔で発生バイオガス量を測定した。これを１時間当たりのバイオガス発生量に換算した数値をバイオガス発生速度とした。【００７５】
〔微生物群の集積〕
（実施例１）
表２に示した微生物群を含有する嫌気性消化槽汚泥を種汚泥として、実容積１Ｌの完全混合型リアクターを３７℃に設定した恒温水槽（実際の温度は３６〜３８℃）に浸漬し、嫌気的に運転した。乳化した合成廃水ａを完全混合型リアクターに対して連続的に供給した。【００７６】
合成廃水供給速度と同じ速度で槽内液を排出するケモスタット式の連続培養を行った。この連続培養を通して、種汚泥中に生息する微生物の中から、ＰＨＢＨの分解ならびにメタンガス生成に寄与する微生物群集を集積した。【００７７】
前記連続培養において、合成廃水ａを希釈率０．０２５ｄ−１の速度で供給し、培養を水理学的滞留時間（この場合４０ｄ）の三倍の期間継続し、培養が定常状態に到達した後のリアクター処理性能をＣＯＤｃｒ除去率ならびにバイオガス発生速度で評価し、その結果を表３に示した。【００７８】
【表２】
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【００７９】
【表３】
2015122190.tif 000006
【００８０】
この合成廃水ａに含まれる有機態炭素の１０％がＰＨＢＨ由来であり、供給されたＰＨＢＨのうち約４４重量％が分解され無機化された。【００８１】
（実施例２〜５）
表３に示した合成廃水、および希釈率とした以外は、実施例１と同様の方法でＰＨＢＨ粉末を処理し、それぞれの定常状態でのリアクター処理性能をＣＯＤｃｒ除去率ならびにバイオガス発生速度で評価し、その結果を表３に示した。【００８２】
ＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比２：８の合成廃水ｂを供給した条件では、ＣＯＤｃｒ除去率は希釈率０．０２５ｄ−１で９２．４％（実施例２）、０．０５ｄ−１で９１．７％であった（実施例３）。この合成廃水ｂに含まれる有機態炭素の２０％がＰＨＢＨ由来であり、供給したＰＨＢＨのうちそれぞれ約６２重量％、５８重量％が分解され無機化された。【００８３】
ＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比３：７の合成廃水ｃを供給した条件では、ＣＯＤｃｒ除去率は希釈率０．０２５ｄ−１で９３．７％（実施例４）、０．０５ｄ−１で８７．７％であった（実施例５）。この合成廃水ｃに含まれる有機態炭素の３０％がＰＨＢＨ由来であり、供給したＰＨＢＨのうちそれぞれ約７９重量％、５９重量％が分解され無機化されていた。【００８４】
バイオガスの発生速度は、合成廃水の種類によらず、希釈率０．０２５ｄ−１において約４ｍｌ／ｈ、０．０５ｄ−１において約８ｍｌ／ｈでほぼ一定しており、全てのリアクター運転条件において、ＰＨＢＨ粉末を約４０〜７９重量％分解できており、全リアクター槽内にはＰＨＢＨを嫌気的に分解してメタンを生成する微生物群が集積されたと考えられる。【００８５】
〔ポリヒドロキシアルカン酸シートの嫌気生分解性試験〕
実施例２〜５における各リアクター槽内に集積された微生物群のシート状ＰＨＢＨの分解性能を評価するために、嫌気環境におけるＰＨＢＨシートの分解試験を行った。【００８６】
（ＰＨＢＨシート作成法）
ＰＨＢＨ粉末（３ＨＨ比率１１モル％）を同方向噛合型二軸押出機（東芝機械社製：ＴＥＭ−２６ＳＳ）を用いて、設定温度１００〜１４０℃（出口樹脂温度１６０℃）、スクリュ回転数１００ｒｐｍで溶融混練し、ダイスからストランド状に引き取り、ペレット状にカットした。【００８７】
続いて、得られたペレットを６０℃で十分に乾燥させた後、横幅：１５０ｍｍ、リップ幅：０．２５ｍｍのＴ型ダイスを装着した単軸押出機（東洋精機製作所製「２０Ｃ２００型」ラボプラストミル）を用いて、成形温度：１４０〜１７０℃、スクリュ回転数：５０ｒｐｍの条件で押し出し、５５℃に温調した冷却ロールで引き取り、幅約１１０ｍｍ、厚み約５０μｍのＴダイシートを得た。【００８８】
（分解性の評価）
分解処理後の培地からＰＨＢＨシートを取り出し、ＰＨＢＨシートの分解状態を、以下の基準により４段階で評価した。
−：未分解（シートの形状に変化がみられない。）
＋：破損（分解により、切断や穴が開いたりしてシートの一部が破損しているが、長方形のシートの原型が保たれている。）
＋＋：崩壊（シートの原型が認められないが、分解されたシートの残骸が観察される。）
＋＋＋：消滅（シートの原型もシートの残骸も培養液中に見られない）
（実施例６）
１００ｍｌ容ガラスバイアル瓶に、表４に示した組成の無機塩培地４０ｍｌと、１ｃｍ×４ｃｍに切断した厚み５０μｍのＰＨＢＨシート１枚とを入れ、Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０の混合ガスで培地中の酸素を２０分間置換した後、バイアル瓶をブチルゴム栓で密閉し、硫化ナトリウムおよびシステイン塩酸塩を注射器で添加することで絶対嫌気環境とした。【００８９】
【表４】
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【００９０】
このバイアル瓶に実施例２のリアクターの槽内液を１０ｍｌ注射器で添加し、３７℃で振盪しながら回分培養しつつ、分解性評価を適時行い、その結果を表５に示した。培養開始後９日から２７日にかけて、ＰＨＢＨシートの分解が認められた。【００９１】
【表５】
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【００９２】
（実施例７〜９）
表５に示したリアクター槽内液を使用した以外は、実施例６と同様の方法で培養し、分解性評価を行い、その結果を表５に示した。【００９３】
使用した槽内液のリアクター運転条件によらず、培養開始後２１日から２７日にかけて顕著にＰＨＢＨシートが崩壊した。【００９４】
各リアクターに集積した微生物群集はシート状のＰＨＢＨに対しても分解能を持つことが判った。【００９５】
（比較例１）
実施例１の種汚泥である表２に示した微生物群を含有する嫌気性消化槽の槽内液を用いた以外は、実施例６と同様の方法で分解性評価を行い、その結果を表５に示した。【００９６】
〔酢酸塩添加系のポリヒドロキシアルカン酸シートの嫌気生分解性試験）
実施例１〜５においてリアクターに供給している合成廃水には酢酸塩が含まれている。酢酸塩の共存によるＰＨＢＨシートの分解能を評価した。【００９７】
（実施例１０）
バイアル瓶に６．８ｇ／Ｌの酢酸塩をさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例６と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表６に示した。【００９８】
酢酸塩を添加することにより酢酸塩無添加の条件よりもＰＨＢＨシートの分解性に優れることが判った。【００９９】
【表６】
2015122190.tif 000009
【０１００】
（実施例１１〜１３）
表６に示したリアクター槽内液を用いた以外は、実施例１０と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表６に示した。【０１０１】
いずれの場合でも、酢酸塩を添加することにより酢酸塩無添加の条件よりもＰＨＢＨシートの分解性に優れることが判った。【０１０２】
〔有機物添加系のポリヒドロキシアルカン酸シートの嫌気生分解性試験）
ＰＨＢＨシートをごみ袋に使用した場合、生ごみを袋ごとメタン発酵により処理する必要があるため、有機物の共存下でＰＨＢＨシートの分解性を評価した。【０１０３】
（実施例１４）
タンパク質の加水分解物であるトリプトンを１０ｇ／Ｌの濃度となるようにバイアル瓶にさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例６と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表７に示した。【０１０４】
タンパク質の加水分解物を添加した条件下であっても、分解性に低下は見られず、無添加の条件よりもＰＨＢＨシートの分解性に優れることが判った。【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
（実施例１５〜１７）
表７に示したリアクター槽内液を用いた以外は、実施例１４と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表７に示した。【０１０７】
いずれの場合でも、タンパク質の加水分解物を添加した条件下であっても、分解性に低下は見られず、無添加の条件よりもＰＨＢＨシートの分解性に優れることが判った。【０１０８】
（実施例１８）
１０ｇ／Ｌのトリプトンと共に、５ｇ／Ｌのブドウ糖をバイアル瓶にさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例１６と同様の方法で回分培養を行った。その結果、回分培養開始後５日でシートが崩壊した。このことから、タンパク質由来の有機物と炭水化物由来の有機物が共存した条件でも、リアクター槽内に集積した微生物群集はＰＨＢＨシートの分解性を示すことが判った。【０１０９】
〔各リアクターに生息する微生物の顕微鏡観察〕
（実施例１９）
実施例３のリアクター槽内液を採取し、落射蛍光顕微鏡（ＢＸ−４１，オリンパス社）を用いて槽内液に存在する細胞を観察し、その結果を図１に示す。【０１１０】
リアクター槽内には、凝集塊を形成する細胞が優占しており、それ以外に、球菌、桿菌、単桿菌からなる多様な微生物細胞が検出された。水素資化性メタン生成古細菌に特有な補酵素Ｆ４２０を蛍光観察により検出した結果、凝集塊を形成する細胞が青白い蛍光を発することが観察された。【０１１１】
補酵素Ｆ４２０の自家蛍光を発し、凝集塊を形成する細胞は、酢酸、水素および二酸化炭素を資化してメタンを生成するＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属のメタン生成古細菌と考えられる。また、同時に、自家蛍光を示す単桿菌状の細胞も観察されたことから、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属以外の水素資化性メタン生成古細菌の存在を示唆している。【０１１２】
自家蛍光を示さない球菌、桿菌、単桿菌からなる多様な微生物細胞が、ＰＨＢＨを直接あるいは間接的に分解している細菌である。これらの細菌がＰＨＢＨを分解して、メタン生成古細菌の基質である酢酸、水素および二酸化炭素を生成する。【０１１３】
（実施例２０〜２３）
実施例１、２、４、５のリアクター槽内液について実施例１９と同様に顕微鏡観察した結果、供給する合成廃水のＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比および希釈率の違いに関わらず、実施例１９と同様の結果が観察された。【０１１４】
〔１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のクローンライブラリの構築〕
（実施例２４）
実施例３のリアクター槽内液に生息する微生物のＤＮＡをＤＮＡ抽出キットＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン社）を用いて抽出した。得られたＤＮＡを鋳型として、前記微生物に含まれる細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、Ｇｏ Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。使用したＰＣＲプライマーは、ＥＵＢ３３８ｍｉｘＦと１４９０Ｒ（5‘-ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ-3’）である。【０１１５】
その結果、１１００塩基対のＤＮＡ断片がＰＣＲ産物として増幅された。得られたＤＮＡ断片は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片は、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ベクタープラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯに連結後、大腸菌に導入し、リアクターから約５０個の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のクローンからなる遺伝子ライブラリを構築した。【０１１６】
（実施例２５〜２７）
実施例２、実施例４、実施例５のリアクター槽内液を用いた以外は、実施例２４と同様の方法で各リアクターからそれぞれ約５０個の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のクローンからなる遺伝子ライブラリを構築した。【０１１７】
〔１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく各リアクターに生息する微生物の系統分類〕
（実施例２８）
実施例２４で得られた形質転換体に含まれるプラスミドに挿入された１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を、シーケンスプライマー９０７Ｒを用いて決定した。塩基配列の決定は、タカラバイオ社ドラゴンジェノミクスセンターにて行った。得られた塩基配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/）のＢＬＡＳＴプログラムにより相同性検索を行った。その後、ミュンヘン工科大学のＡＲＢプログラム（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ａｒｂ-ｈｏｍｅ.ｄｅ/）を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡのアライメントを行い分子系統学的な解析を行った。解読した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のＶ３−Ｖ４領域を含む約５００ｂｐに対して、配列の相同性がお互いに９７％以上であるものを同一のＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ）としてグループ化した。各ＯＴＵ代表配列の分類は、Ｂｌａｓｔプログラムの相同性検索によって得た最も相同性の高い遺伝子配列を、マックス・プランク研究所のＴｈｅ ＳＩＬＶＡ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ （ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ａｒｂ−ｓｉｌｖａ.ｄｅ） のデータベース ＳＩＬＶＡ ｖｅｒ. １１７ に照合し、その配列の属する分類とした。実際には、リアクター由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列から４４のＯＴＵに絞り込んだ。次に、各ＯＴＵの代表クローンの塩基配列とそれぞれに最も相同性の高い種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を用いて近隣結合法（ＮＪ法）ならびに最節約法（ＭＰ法）により最終的な系統樹を作成した。【０１１８】
リアクター由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を門および綱レベルで分類した結果を表８に示した。【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
（実施例２９〜３１）
実施例２、実施例４、実施例５のリアクター槽内液を使用した以外は、実施例２８と同様の方法で、リアクター由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を門および綱レベルで分類し、その結果を表８に示した。【０１２１】
リアクターの運転条件により細菌の構成は異なり、のべ９の門（門レベルの未分類群を含む）に分布していることが判明した。その中でも、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されたクローンが、リアクター運転条件に関わらず顕著に高頻度に検出された。ＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比２：８の合成廃水を希釈率０．０５ｄ−１で運転するリアクター（実施例３）、希釈率０．０２５ｄ−１で運転するリアクター（実施例２）、ＰＨＢＨ：酢酸塩の炭素濃度比３：７の合成廃水を希釈率０．０５ｄ−１で運転するリアクター（実施例５）、希釈率０．０２５ｄ−１で運転するリアクター（実施例４）から得られた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の、それぞれ６９．８％、７２．９％、７８．７％、７２．９％がＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類された。さらに、綱レベルで分類した結果、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱に分類されるクローンが多く検出された。ＰＨＢＨの分解リアクターの細菌の群集の特徴的な構成であり、この門に分類される細菌、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱に分類される細菌がＰＨＢＨを分解する主要な役割を果たしていると考えられる。【０１２２】
（実施例３２）
実施例３のリアクター由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の内、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されたものをさらに詳細に分類した。系統樹を作成した結果、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、さらに７つのグループに分類されることが示された（図２、表９）。【０１２３】
（実施例３３〜３５）
実施例２、実施例４、実施例５について、実施例３２と同様の方法で、各々のリアクター由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の内、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されたものをさらに詳細に分類し、その結果を図２および表９に示した。【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
尚、図２では、リアクターから検出された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローンのＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門における系統樹を示しており、実施例３２〜３５にて得られたクローンを太字で示し、カッコ内には、検出されたクローンの数と、全クローン数（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門以外のクローンも含む）１８６を示した。図中のバーの長さは１０％の塩基配列の不一致を示す。アウトグループには、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ門の細菌Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｖｒｙｅｎｓｉｓを用いた。【０１２６】
７つのグループの中でも、リアクターの運転条件によらず多くのクローンが分類されたグループが、Ｇｒｏｕｐ ５であり、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科ならびにＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科の細菌により構成されるグループである。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱の中でも、特にこのグループに属する細菌がＰＨＢＨを分解する主要な役割を果たしていると考えられる。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２】
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【国際調査報告】
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