(57)【要約】[課題]希少細胞などの目的細胞と非希少細胞などの非目的細胞とが混在する複数細胞種を含む試料の細胞画像から、目的細胞を検出するための細胞画像解析装置において、細胞質が局所的に染色されている場合にも、目的細胞を検出することができる細胞画像解析方法及び細胞画像解析装置を提供する。[解決手段]目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、目的細胞、非目的細胞、残余細胞を全て染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像とに基づいて、目的細胞を検出する目的細胞検出工程とを備える。
2016104308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析方法であって、
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程と、
を備える細胞画像解析方法。
【請求項２】
前記第３細胞画像は、染色された残余細胞が含まれる画像である請求項１に記載の細胞画像解析方法。
【請求項３】
前記目的細胞検出工程は、前記第２細胞画像の輝度値を反転させた反転第２細胞画像と、前記第１細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する請求項１または２に記載の細胞画像解析方法。
【請求項４】
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成工程をさらに備え、
前記目的細胞検出工程は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する請求項１または２に記載の細胞画像解析方法。
【請求項５】
前記目的細胞検出工程は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域とを比較し、両方の染色領域が重畳または近接する領域を前記目的細胞と判別する請求項４に記載の細胞画像解析方法。
【請求項６】
前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域との距離が１５μｍ以下である場合に、両方の染色領域が近接すると判断する請求項５に記載の細胞画像解析方法。
【請求項７】
前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域との最短距離が７μｍ以下である場合に、両方の染色領域が近接すると判断する請求項５または６に記載の細胞画像解析方法。
【請求項８】
前記複数種類の細胞を含む試料についての明視野画像を取得する明視野画像取得工程をさらに備え、
前記目的細胞検出工程は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域と、前記明視野画像とを比較し、前記中間画像における染色領域と前記第１細胞画像における染色領域の両方が、前記明視野画像での同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が前記目的細胞であると判別する請求項４に記載の細胞画像解析方法。
【請求項９】
前記第２細胞画像は、前記非目的細胞が特異的に、かつ、前記非目的細胞の輪郭が識別可能に染色を施された画像である請求項１から８のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項１０】
前記第３細胞画像は、各細胞が局所的に染色された画像である請求項１から９のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項１１】
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析装置であって、
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、
を備える細胞画像解析装置。
【請求項１２】
前記第３細胞画像は、染色された残余細胞が含まれる画像である請求項１１に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１３】
前記目的細胞検出手段は、
前記第２細胞画像の輝度値を反転させて反転第２細胞画像を生成し、
前記第１細胞画像と、前記反転第２細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する請求項１１または１２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１４】
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成手段をさらに備え、
前記目的細胞検出手段は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する請求項１１または１２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１５】
前記目的細胞検出手段は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域とを比較し、両方の染色領域が重畳または近接する領域を前記目的細胞と判別する請求項１４に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１６】
前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域との距離が１５μｍ以下である場合に、両方の染色領域が近接すると判断する請求項１５に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１７】
前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域との最短距離が７μｍ以下である場合に、両方の染色領域が近接すると判断する請求項１５または１６に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１８】
前記細胞画像取得手段は、前記複数種類の細胞を含む試料についての明視野画像をさらに取得するように構成され、
前記目的細胞検出手段は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域と、前記明視野画像とを比較し、前記中間画像における染色領域と前記第１細胞画像における染色領域の両方が、前記明視野画像での同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が前記目的細胞であると判別する請求項１４に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１９】
前記第２細胞画像は、前記非目的細胞が特異的に、かつ、前記非目的細胞の輪郭が識別可能に染色を施された画像である請求項１４から１８のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項２０】
前記第３細胞画像は、各細胞が局所的に染色された画像である請求項１１から１９のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項２１】
請求項１から１０のいずれかに記載の細胞画像解析方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプログラムを記録したコンピュータ可読記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数細胞種を含む試料を撮像した細胞画像を自動的に解析し、目的の細胞を抽出する細胞画像解析装置に関し、特に、非希少細胞群の中に混在する希少細胞を検出する細胞画像解析方法及び細胞画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）は、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。【０００３】
しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１〜１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。【０００４】
従来、このような希少細胞を複数細胞種が混在した試料から識別するため、目的の希少細胞に特異的な染色を施した状態で複数細胞種を含む試料を撮像し、得られた明視野像や蛍光画像などの細胞画像において特定の細胞種のコントラストを上げるなどの画像処理をして、特異的な染色が施された希少細胞を検出している。【０００５】
このように希少細胞に対して特異的な染色を行った場合であっても、ある程度の割合で非希少細胞に対して非特異的な染色がなされる場合があり、細胞種の推定の特異度を高めるために、複数の染色を施すこともある。【０００６】
この場合、例えば、目的の細胞種に特異的な染色を施すとともに、それ以外の細胞種のいずれかに特異的な染色を施し、２通りの蛍光画像を組み合わせて、目的の細胞種を推定している。これにより、目的外の細胞種を確実に除外でき、希少細胞の検出結果の信頼性を高めている。【０００７】
このように、細胞画像を用いて画像解析により目的の細胞種を検出する方法では、細胞画像内の細胞密度が低い場合、特に、関心領域に１つしか細胞が無い場合には、単一の細胞からの信号であることが明らかであるため、単に透過光や反射光、散乱光、蛍光（以下、「検出光」と呼ぶ。）の強度（以下、「検出光強度」と呼ぶ。）を測定することで、細胞種の推定が可能である。【０００８】
一方で、細胞画像内の細胞密度が高い場合、特に、細胞同士が近接、密集、凝集している場合には、隣接する細胞との重なりが生じ、検出光強度を測定したとしても、どの細胞に由来する信号であるかが判別しにくいため、細胞種の推定が容易ではないことが多く、細胞画像内の目的細胞数を計数することも困難である。【０００９】
このため、特許文献１では、目的の細胞種に対して特異的な染色がなされた複数細胞種を含む試料の細胞画像について、細胞核領域及び細胞質領域についての形態、すなわち、細胞核の輪郭及び細胞質の輪郭の検出を行い、細胞核と細胞質の重なりから、検出光がどの細胞に由来するかを決定し、細胞画像から目的の細胞種の検出を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−２７５４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、目的の細胞種に対して特異的に染色する染色手段では、必ずしも細胞質全体を染色するわけではなく、細胞質の輪郭を検出出来ない場合があり、特許文献１に記載された方法では、目的の細胞種を検出出来ないことがある。【００１２】
また、細胞が局所的に染色される場合、細胞核と細胞質の染色領域が重ならないこともあり、このような場合にも、特許文献１に記載された方法では、目的の細胞種を検出出来ないことがある。【００１３】
さらには、目的細胞を特異的に染色する際に、非目的細胞が非特異的に染色され目的細胞と間違えて検出されてしまったり、目的細胞が局所的に染色され細胞核と細胞質の領域が重ならなかったりするという問題も生じる。【００１４】
また、細胞同士が重なった際には、目的細胞が染色された箇所なのか、非目的細胞が染色された箇所なのかの判別が困難である。【００１５】
本発明では、このような現状に鑑み、希少細胞などの目的細胞と非希少細胞などの非目的細胞とが混在する複数細胞種を含む試料の細胞画像から、目的細胞を検出するための細胞画像解析装置において、細胞質が局所的に染色されている場合にも、目的細胞を検出することができる細胞画像解析方法及び細胞画像解析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、前述したような従来技術における課題を解決するために発明されたものであって、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した細胞画像解析方法は、
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析方法であって、
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程とを備える。【００１７】
本発明の一側面を反映した細胞画像解析装置は、
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、
を備える。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、異なる染色が施された複数の細胞画像を用い、それぞれの細胞画像の染色領域の違いにより、画像解析によって目的細胞の染色領域を確実に特定することができ、細胞画像内の目的細胞を確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一態様における細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図２は、画像解析工程を説明するための工程図である。
【図３】図３は、目的細胞検出工程において、中間画像の染色領域と第１細胞画像の染色領域が近接しているか否かを判断する方法を説明するための模式図である。
【図４】図４は、目的細胞検出工程において、中間画像の染色領域と第１細胞画像の染色領域が近接しているか否かを判断する別の方法を説明するための模式図である。
【図５】図５は、別の実施例における画像解析工程の工程図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。
【００２１】
図１は、本発明の一態様における細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。
【００２２】
図１に示すように、本実施例の細胞画像解析装置１０は、複数種類の細胞を含む試料（以下、「被検試料」と呼ぶ）についての細胞画像を取得する細胞画像取得手段１２と、細胞画像取得手段１２で取得した複数の細胞画像から後述するように中間画像を生成する中間画像生成手段１６と、細胞画像及び中間画像から後述するように検出対象である目的細胞を検出する目的細胞検出手段１８とを備えている。
【００２３】
なお、細胞画像解析装置１０は、コンピュータなどによって構成することができ、細胞画像取得手段１２、中間画像生成手段１６、目的細胞検出手段１８は、コンピュータにより実行されるソフトウェアであってもよい。
【００２４】
また、細胞画像取得手段１２は、目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第２細胞画像と、目的細胞、非目的細胞、残余細胞を全て染色した細胞画像である第３細胞画像とを取得するように構成されている。
【００２５】
本明細書において、「目的細胞」とは、細胞画像解析装置１０によって検出する任意の細胞であって、例えば、血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）などの希少細胞とすることができる。
【００２６】
また、「非目的細胞」とは、被検試料中に含まれる細胞のうち「目的細胞」以外の細胞であって、比較的、被検試料中の含有量が多い非希少細胞とすることができる。なお、「非目的細胞」には、複数種類の細胞が含まれていてもよい。
【００２７】
また、「残余細胞」とは、被検試料中に含まれる「目的細胞」でも「非目的細胞」でもない細胞を意味する。すなわち、通常であれば、目的細胞を特異的に染色する抗体にも、非目的細胞を特異的に染色する抗体にも染色されない細胞である。なお、本実施例では残余細胞が存在する場合で説明するが、残余細胞が存在しない場合もある。
【００２８】
このような目的細胞、非目的細胞、残余細胞が含まれる試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液など、ヒトまたはその他の動物から採取された検体などが挙げられる。
【００２９】
なお、細胞画像取得手段１２は、事前に撮影されデータ化された細胞画像を細胞画像解析装置１０に取り込むためのソフトウェアのみによって構成することもできるし、図１に示すように、さらに、細胞画像を撮影するためのデジタルカメラなどの画像撮影装置１４も含まれる構成とすることもできる。
【００３０】
中間画像生成手段１６は、第２細胞画像と第３細胞画像とから中間画像を生成する。第２細胞画像には、通常であれば、非目的細胞のみが撮像されており、また、第３細胞画像には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞の全てが撮像されている。
【００３１】
しかしながら、残余細胞の一部や細胞ではない異物が、非目的細胞を特異的に染色した際に染色されてしまい、第２細胞画像に撮像されてしまうことがある。
【００３２】
このため、第３細胞画像から、第２細胞画像が重畳する部分を除去することで、目的細胞と残余細胞（場合によっては残余細胞の一部）のみが撮像された中間画像を生成することができる。
【００３３】
また、目的細胞検出手段１８は、中間画像と第１細胞画像とから目的細胞を検出する。第１細胞画像には、通常であれば、目的細胞のみが撮像されているが、非目的細胞の一部や細胞ではない異物が、目的細胞を特異的に染色した際に染色されてしまい、第１細胞画像に撮像されてしまうこともある。
【００３４】
このため、目的細胞、非目的細胞の一部、細胞ではない異物が撮像されている第１細胞画像と、目的細胞、残余細胞（場合によっては残余細胞の一部）が撮像されている中間画像とを比較し、例えば、両方の染色領域が重畳または近接する領域を目的細胞として判別している。
【００３５】
以下、このように構成された細胞画像解析装置１０を用いて被検試料から目的細胞を検出する流れをより詳細に説明する。
【００３６】
１．染色工程
まず、被検試料に対して、目的細胞、非目的細胞に対してそれぞれ特異的に染色を施すとともに、目的細胞、非目的細胞、残余細胞の全て、すなわち、細胞全てに対して染色を施す。
【００３７】
なお、目的細胞を特異的に染色する方法としては、検出対象となる細胞が有する抗原に結合する標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。
【００３８】
検出対象となる細胞が有する抗原と特異的な反応を示す抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＤ４５抗体、抗β-アクチン抗体、抗α-チューブリン抗体、抗β-チューブリン抗体、抗ビメンチン抗体などを用いることができる。
【００３９】
また、非目的細胞を特異的に染色する方法としては、細胞膜全域を染色するような標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。
【００４０】
細胞膜全域を染色するような抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＫ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体などを用いることができる。
【００４１】
なお、非目的細胞を特異的に染色する場合には、複数の染色剤によって染色を施し、細胞画像において、非目的細胞の輪郭が識別可能な程度に、非目的細胞全体を染色することが好ましい。
【００４２】
また、このような標識抗体としては、公知の蛍光色素によって標識された抗体や、色素によって標識された抗体などによって標識された抗体などを用いることができる。なお、蛍光色素を用いる場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素と、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素とを分離して測定できるように、それぞれ異なる励起波長、蛍光波長を有する蛍光色素を用いればよい。
【００４３】
また、細胞全てに対して染色を施す方法としては、細胞核を染色することで行うことができ、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、Hoechst系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）、Acridine Orange、ＤＡＭＯ、Ethidium Bromide（臭化エチジウム）、Ethidium Homodimer、Propidium Iodideなどを用いることができる。
【００４４】
このように染色を施しているため、細胞全てに対して染色を施す場合には、細胞それぞれについて、局所的に染色が行われることになる。
【００４５】
なお、非目的細胞を特異的に染色する方法と、細胞全てに対して染色を施す方法としては、以下のいずれかの条件を満たすようにすることが好ましい。
（１）非目的細胞と特異的に染色する方法で染色した場合の非目的細胞の染色領域が、細胞全てに対して染色を施す方法により染色した場合の非目的細胞の染色領域に含まれる。（２）非目的細胞と特異的に染色する方法で染色した場合に、非目的細胞の細胞膜全域または細胞質全域を染色し、非目的細胞の染色領域が、非目的細胞の輪郭を描出するとともに、細胞全てに対して染色を施す方法により染色した場合の非目的細胞の染色領域が、細胞の一部であって、非目的細胞の輪郭とは一致しない。
【００４６】
このように染色を施すことによって、第３細胞画像２６における非目的細胞の染色領域が、第２細胞画像２４における非目的細胞の染色領域よりも小さくなるため、後述するように中間画像生成手段１６により、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４を除去した場合に、第３細胞画像２６における非目的細胞の染色領域が確実に除去された中間画像を生成することができる。
【００４７】
また、このように第２細胞画像２４が第３細胞画像２６と重畳するように染色を施すことによって、第２細胞画像２４と第３細胞画像２６とが一部だけ重畳しているものについては、非目的細胞ではないと判断することができ、細胞同士が重なっていた場合にも、目的細胞と非目的細胞とを区別することができる。
【００４８】
なお、このように被検試料に対して染色を施す前に、適切な前処理を行うことが好ましい。以下、被検試料として代表的な検体である血液を用いた場合の前処理方法について説明する。
【００４９】
・抗凝固処理
採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。
【００５０】
全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンIIIと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。
【００５１】
・密度勾配遠心処理
密度勾配遠心処理は、細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができ、特に血液中に多量に含まれている赤血球を除去して、ＣＴＣ等の目的細胞を含む白血球のみを細胞観察の対象とするために用いることができる。
【００５２】
密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう溶接できるものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などのショ糖溶液を用いることができる。
【００５３】
この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。
【００５４】
例えば、分離液の比重を好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」への赤血球の混入率を２〜６％またはそれ以下に抑えることができる。「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」を用いて細胞
観察を行うと、ＣＴＣ等の目的細胞が赤血球に紛れて検出し損ねる危険性が低下し、診断の精度を高めることができるため好ましい。
【００５５】
また、被検試料に含まれる細胞に対して必要に応じて、固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理、その他の前処理を行うこともできる。これらの前処理は、所期の効果が発揮される限り、任意の時点で、任意の順序で行うことができる。
【００５６】
例えば、密度勾配遠心処理で細胞画分を得た後、観察用基板に固相化する前に、細胞の固定化処理をし、観察用基板に固相化した後、浸透化処理およびブロッキング処理を同時に行う（つまり浸透化剤およびブロッキング剤の両方を含む溶液で細胞を処理する）ようにしてもよい。
【００５７】
なお、観察用基板に固相化する前に細胞を固定化する場合、固定化によっても細胞は観察用基板に吸着する能力を失っていないので、固相化の際には細胞の吸着（細胞と基板との物理的（分子間）相互作用）を利用することができる。
【００５８】
また、観察用基板に固相化した後に細胞を固定化する場合、すでに細胞が観察用基板に吸着していれば、その後に固定化しても吸着による固相化を保持することができる。
【００５９】
また、場合によっては、細胞に対する前処理を、血液等の検体から細胞画分を分離する前に行う（例えば血液検体を採取した直後に血液の抗凝固処理とともに細胞の固定化処理等を行い、その後密度勾配遠心処理を行って細胞画分を得る）ようにすることも可能である。
【００６０】
・固定化処理
固定化処理は、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するために行われる処理であり、本発明では、ＣＴＣ等の目的細胞の検出性を高めるとともに、抗原抗体解離工程で用いる酸等の解離剤が細胞または抗原に与えるダメージを抑えることが可能となる。
【００６１】
特に結合と解離を複数回繰り返して実験を行うような場合、解離剤のダメージが細胞に与える影響は格段に大きくなるため、通常であれば細胞劣化が大きくなり実験が継続出来ないこともあり得る。
【００６２】
しかし本工程のように固定化処理を行うことで細胞が形態や抗原性の保持力が高まり、複数回繰り返して実験を行うような場合であっても免疫染色性が劣化しにくくなるという効果をもたらす。
【００６３】
固定化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール等のアルデヒド類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；エタノール、メタノール等のアルコール類が挙げられる。このうち、ホルムアルデヒド等のアルデヒド類およびアセトン等のケトン類は、アルデヒド基およびケトン基が特定のアミノ酸残基と反応して共有結合を形成し、架橋剤として作用する固定化剤であり、タンパク質構造を安定化すると共に細胞の原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができるため、本発明における好ましい固定化剤である。
【００６４】
また、それ自体が固定化剤として直接作用するものではないが、加水分解等を受けることによって固定化剤を遊離する供与体、たとえばホルムアルデヒド供与体も固定化剤の一形態として用いることができる。これらの固定化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解した（あるいはホルマリンのようにもとから水溶液で市販されているものを希釈した）水溶液を固定化処理液として用いることができる。
【００６５】
固定化処理は、適切な濃度の固定化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。固定化処理液中の固定化剤の濃度は適宜調節することができるが、たとえばアルデヒド類の場合は０．１〜１０ｗ／ｗ％程度、アルコール類の場合は７０〜１００ｖ／ｖ％程度である。固定化処理液と細胞との接触時間（固定化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。
【００６６】
固定化処理は、染色工程前または工程中に実施することができ、１回目の染色工程前または工程中の１回だけであってもよいし、第Ｎ回の解離工程後かつ第（Ｎ＋１）回の染色工程前または工程中に繰り返し実施してもよい。
【００６７】
・浸透化処理
浸透化処理は、細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質が浸透しやすくするための処理であり、本発明では、細胞内（原形質）にある抗原に対して蛍光標識抗体を結合させやすくして免疫染色性を向上させるという効果をもたらす。
【００６８】
浸透化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、サポニン、ジギトニン、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、ＮＰ−４０などの界面活性剤（商品）が挙げられる。これらの浸透化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解させた水溶液を浸透化処理液として用いることができる。
【００６９】
浸透化処理は、適切な濃度の浸透化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。浸透化処理液中の浸透化剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば上記のような界面活性剤であれば、０．０１〜１．０ｖ／ｖ％程度である。浸透化処理液と細胞との接触時間（浸透化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。
【００７０】
・ブロッキング処理
ブロッキング剤は、細胞の目的抗原以外の部位が非特異的に染色されるのを防ぐために用いられる。細胞のブロッキング処理は、染色工程前あるいは染色工程中に実施すればよく、いずれか一方で実施しても、両方で実施してもよい。
【００７１】
ブロッキング剤を入れた細胞を固相化する場合は、上述したように観察用基板にマイクロチャンバー等を形成しておく（後述する細胞の固相化方法に関する構造的手法を用いる）必要がある。
【００７２】
また、細胞表面の観察用基板との吸着（相互作用）を起こしやすい部位を被覆することにより、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着してしまうことを防止し、所定の部位に細胞を収容されるようにするためにも用いられる。
【００７３】
ブロッキング剤としては様々なものが公知であるが、例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール等の親水性高分子、リン脂質、エチレンジアミン、アセトニトリル等の低分子化合物が挙げられる。これらのブロッキング剤をＰＢＳ等の適切な溶媒で希釈した水溶液をブロッキング処理液として用いることができる。
【００７４】
ブロッキング処理は、適切な濃度のブロッキング処理液を適切な時間、細胞あるいは観察用の基板に接触させることで行うことができる。ブロッキング処理液中のブロッキング剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば、０．０１〜２０ｗ／ｖ％程度である。ブロッキング処理液と細胞との接触時間（ブロッキング処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、５〜１２０分間程度である。
【００７５】
２．撮影工程
上述する染色工程において、３種類の染色が施された被検試料について画像撮影装置１４を用いて細胞画像の撮影を行う。
【００７６】
なお、蛍光色素による標識を行っている場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、細胞全てを標識する蛍光色素のそれぞれを励起する励起光を順次照射し、それぞれの蛍光色素から発光する蛍光に基づく細胞画像を撮影すればよい。
【００７７】
このような細胞画像を撮影する画像撮影装置１４としては、特に限定されるものではないが、コンピュータで実行されるソフトウェアにより取り扱うことが可能な画像データとして細胞画像を撮影する装置であることが好ましく、例えば、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどを用いたデジタルカメラとすることができる。
【００７８】
画像撮影装置１４により撮影された細胞画像の画像データは、細胞画像取得手段１２により細胞画像解析装置１０に読み込まれ、細胞画像の画像解析が行われる。
【００７９】
３．画像解析工程
中間画像生成手段１６及び目的細胞検出手段１８では、図２に示す工程図のように、細胞画像取得手段１２によって取り込まれた目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第１細胞画像２２と、非目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第２細胞画像２４と、目的細胞、非目的細胞、残余細胞を全て染色した細胞画像である第３細胞画像２６とに基づいて、被検試料中の目的細胞を検出する。
【００８０】
（中間画像生成工程）
中間画像生成手段１６では、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４の重畳部分を除去することで中間画像２８を生成する。
【００８１】
具体的には、画像処理演算によって、まず、第３細胞画像２６及び第２細胞画像２４を２値化処理した後、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４を減算処理すればよい。
【００８２】
本明細書において「減算処理」とは、画像処理における減算を意味し、一方の細胞画像の画素の値から、他方の細胞画像の同じ位置の画素の値を引くことを全ての位置の画素において行うことにより求めることができる。なお、画素の値は通常、最低値を０とし、減算処理の結果、画素の値が負となった場合には、０とすることが好ましい。
【００８３】
なお、本実施例における２値化処理では、任意の閾値を設定し処理することができる。また、２値化処理（１ビット画像化）には限らず、８ビット画像化や１６ビット画像化（グレースケール化）としてもよいし、このような処理を行わず、細胞画像取得手段１２によって取得した細胞画像をそのまま利用しても構わない。
【００８４】
表１に示すように、第３細胞画像２６には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞が染色され撮像されており、一方で、第２細胞画像２４には、通常であれば非目的細胞のみが染色され撮像されているはずであるが、場合によって、残余細胞の一部や細胞ではない異物の一部が染色され撮像されている場合がある。このため、中間画像２８には、通常であれば、目的細胞と残余細胞が撮像されており、場合によって、目的細胞と残余細胞の一部のみが撮像されていることがある。
【００８５】
【表１】
2016104308.tif 000003
なお、表１中において、○は、その画像に撮像されていることを意味し、×は、その画像に撮像されていないことを意味する。なお、○ or ×は、その画像に撮像されている場合も、撮像されていない場合もある。
【００８６】
（目的細胞検出工程）
次いで、目的細胞検出手段１８では、中間画像２８と第１細胞画像２２とを比較することによって、目的細胞を検出する。
【００８７】
表２に示すように、第１細胞画像２２には、通常であれば、目的細胞のみが染色され撮像されているはずであるが、場合によって、非目的細胞や細胞でない異物の一部が染色され撮像されてしまうことがある。
【００８８】
【表２】
2016104308.tif 000004
なお、表２中において、○は、その画像に撮像されていることを意味し、×は、その画像に撮像されていないことを意味する。なお、○ or ×は、その画像に撮像されている場合も、撮像されていない場合もある。
【００８９】
具体的には、以下のようにして、中間画像２８の染色領域２９（目的細胞と残余細胞の一部が染色された領域）と、第１細胞画像２２の染色領域２３（目的細胞、非目的細胞、細胞でない異物の一部が染色された領域）とを比較し、両方の染色領域が重畳または近接する領域を目的細胞として検出している。
【００９０】
なお、両方の染色領域が近接しているか否かの判定は、例えば、以下のように行うことができる。
【００９１】
中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図３に示すように、両方の染色領域の各画素同士の距離の最小値ｔを算出し、この最小値ｔを中間画像２８の染色領域２９と第１細胞画像２２の染色領域２３との最短距離とする。この最短距離が所定の近接判定値ｊ以下であれば近接していると判断することができる。
【００９２】
なお、近接判定値ｊは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、例えば、目的細胞の平均的な大きさが白血球と同等と考えられる場合には、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を７μｍとすることが望ましい。また、白血球の半径が１５μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を１５μｍとすることが望ましい。これは白血球などの半径の範囲にお互いの細胞が位置していれば、細胞同士が上下方向に重複していない限り１つの細胞であると判断できるからである。
【００９３】
また、中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図４に示すように、両方の染色領域を既知の画像処理アルゴリズム（例えば、最近傍法、バイリニア補間法、バイキュービック補間法、Lanczos補間法等）に基づいて所定の膨張値ｄだけ膨張させ、膨張後の染色領域２９ａ，２３ａが重畳する場合に近接していると判断することもできる。
【００９４】
なお、膨張値ｄは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、近接判定値ｊの半分よりやや大きい値とすることができる。例えば、目的細胞の大きさが白血球と同等と想定される場合、染色対象同士が白血球の直径の範囲内に存在すれば同一の可能性があるため、白血球の直径が１５μｍ程度であると想定する場合には、膨張値を８μｍとすることができる。
【００９５】
また、染色対象同士が白血球の半径の範囲内に存在すれば上記以上に同一の可能性が高いと判断することができ、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、膨張値ｄを４μｍとすることができる。
【００９６】
また、上述する近接判定を組み合わせて行うことにより、より正確に、両方の染色領域が近接しているか否かを判定することができる。
【００９７】
また、一方の染色領域の中心（重心）位置と、他方の染色領域の中心（重心）位置との距離が、所定の近接判定値よりも小さい場合に、両染色領域が近接していると判定するようにしてもよい。
【００９８】
このように目的細胞が検出された場合には、例えば、ディスプレイなどの表示手段に、目的細胞の位置を示す判別画像３０を表示する。
【００９９】
なお、上記実施例では、第３細胞画像と第２細胞画像とから中間画像を生成するように構成しているが、必ずしも中間画像を生成する必要はなく、第１細胞画像２２、第２細胞画像２４、第３細胞画像２６を適宜組み合わせて目的細胞を検出するように構成することができる。
【０１００】
例えば、第２細胞画像２４の輝度値を反転させた反転第２細胞画像と第１細胞画像と第３細胞画像とを乗算処理することによって、目的細胞を検出することができる。
【０１０１】
なお、本明細書において「乗算処理」とは、画像処理における乗算を意味し、一方の細胞画像の画素の値と、他方の細胞画像の同じ位置の画素の値の積を画像の色深度（例えば、８ビット画像であれば２５６もしくは２５５）で乗算することを全ての位置の画素において行うことにより求めることができる。
【０１０２】
図５は、別の実施例における画像解析工程の工程図である。なお、この実施例では、第１細胞画像２２、第２細胞画像２４、第３細胞画像２６とは別に明視野画像３２を画像撮影装置１４によって撮影し、細胞画像取得手段１２によって細胞画像解析装置１０に取り込んでいる。
【０１０３】
また、この実施例でも、中間画像生成工程については、上記と同様に行うことができるため、その説明は省略する。
【０１０４】
（目的細胞検出工程）
目的細胞検出手段１８では、まず、明視野画像３２を既知の画像処理アルゴリズム（例えば、Sobelフィルタ、Robertsフィルタ、Prewittフィルタ等）に基づいて、細胞等の輪郭を抽出し、輪郭画像３４を生成する。
【０１０５】
なお、輪郭画像３４には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞、細胞ではない異物の輪郭が全て表示されることになる。
【０１０６】
次いで、中間画像２８と第１細胞画像２２と輪郭画像３４とを重ね合わせることによって、中間画像２８の染色領域と、第１細胞画像２２の染色領域が、輪郭画像３４における同一輪郭内、すなわち、同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が目的細胞であると判別する。
【０１０７】
以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、上記実施例では、目的細胞としてＣＴＣ等の希少細胞を検出するようにしているが、目的細胞としては希少細胞に限定されるわけではなく、任意の細胞を検出するために用いることができるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【０１０８】
また、上述する細胞画像解析方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム及び該プログラムを記録した、例えば、磁気テープ（デジタルデータストレージ（ＤＳＳ）など）、磁気ディスク（ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）など）、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、光磁気ディスク（ＭＯ）、フラッシュメモリ（ＳＳＤ（Solid State Drive）、メモリーカード、ＵＳＢメモリなど）などのコンピュータ可読記録媒体も本発明の一態様として含まれる。
【符号の説明】
【０１０９】
１０      細胞画像解析装置
１２      細胞画像取得手段
１４      画像撮影装置
１６      中間画像生成手段
１８      目的細胞検出手段
２２      第１細胞画像
２３      染色領域
２３ａ    膨張後の染色領域
２４      第２細胞画像
２６      第３細胞画像
２８      中間画像
２９      染色領域
２９ａ    膨張後の染色領域
３０      判別画像
３２      明視野画像
３４      輪郭画像
【図１】
2016104308.tif 000005
【図２】
2016104308.tif 000006
【図３】
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【図４】
2016104308.tif 000008
【図５】
2016104308.tif 000009
【国際調査報告】
2016104308.tif 000010
2016104308.tif 000011
2016104308.tif 000012
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