(57)【要約】  レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法を提供する。
2016104486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法。
【請求項２】
調節剤が、レチノイド代謝経路の阻害剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
阻害剤が、レチノールのレチナールへの変換、レチナールのレチノイン酸への変換、β-カロテンのレチナールへの変換、β-カロテンのβ-アポカロテナールへの変換、またはβ-アポカロテナールのレチナールおよびレチノイン酸への変換を阻害するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ１およびβ-カロテンオキシゲナーゼ２からなる群より選択される酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該酵素の作用を阻害する化合物、または該酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
阻害剤が、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、または該核酸分子を含むベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
調節剤が、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
促進剤が、レチノイン酸受容体アゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療の補助剤。
【請求項１１】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌の免疫療法の補助剤。
【請求項１２】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む免疫力増強剤。
【請求項１３】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる工程を含む、Ｔ細胞集団の作成方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法によって作成されるＴ細胞集団。
【請求項１５】
（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および
（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤
を含む、癌または感染症の予防および／または治療のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞、特にＴ細胞の分化を調節し、Ｔ細胞の集団を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法とは、一般に、患者の免疫系を種々の方法によって活性化すること、あるいは患者の体外で活性化された免疫細胞を患者の体内に導入すること等により、疾患を治療する方法をいう。免疫療法としては、免疫細胞療法、ペプチドワクチン療法、サイトカイン療法、抗体療法等、様々な方法がこれまでに開発されている。【０００３】
近年、癌遺伝子産物ＷＴ１由来の部分ペプチド（ＷＴ１ペプチド）を用いて免疫細胞（特に抗原提示細胞やＴ細胞）を刺激することにより、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導やヘルパーＴ細胞の活性化を達成し得ることが見出され（特許文献１〜４および非特許文献１）、ＷＴ１ペプチドワクチンによる癌免疫療法として実用化に向けた研究が進められている。【０００４】
しかし、上記ＷＴ１ペプチドワクチンのように臨床試験において有効性が示されている免疫療法は数少ない。また、免疫療法は患者における免疫の状態（免疫抑制、免疫細胞の分化ステージおよび活性）によっては効果が十分に得られない場合もあり、免疫療法の効果を高める方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００３／１０６６８２号公報
【特許文献２】国際公開２００５／０９５５９８号公報
【特許文献３】国際公開２００７／０９７３５８号公報
【特許文献４】国際公開２０１２／０４６７３０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、対象における免疫の状態を改変し、免疫療法の効果を増強することができる物質および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系を調節することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させ、対象における免疫応答を増強し得ることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
即ち、本発明は、
（１）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法（以下、「本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法」とも称する）；
（２）調節剤が、レチノイド代謝経路の阻害剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である、（１）に記載の方法；
（３）阻害剤が、レチノールのレチナールへの変換、レチナールのレチノイン酸への変換、β-カロテンのレチナールへの変換、β-カロテンのβ-アポカロテナールへの変換、またはβ-アポカロテナールのレチナールおよびレチノイン酸への変換を阻害するものである、（２）に記載の方法；
（４）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ１およびβ-カロテンオキシゲナーゼ２からなる群より選択される酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該酵素の作用を阻害する化合物、または該酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質である、（２）または（３）に記載の方法；
（５）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択されるものである、（４）に記載の方法；
（６）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物である、（４）に記載の方法；
（７）阻害剤が、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、または該核酸分子を含むベクターである、（２）に記載の方法；
（８）調節剤が、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である、（１）に記載の方法；
（９）促進剤が、レチノイン酸受容体アゴニストである、（８）に記載の方法；
（１０）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療の補助剤（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤」とも称する）；
（１１）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌の免疫療法の補助剤（以下、「本発明の癌免疫療法補助剤」とも称する）；
（１２）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む免疫力増強剤（以下、「本発明の免疫力増強剤」とも称する）；
（１３）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる工程を含む、Ｔ細胞集団の作成方法（以下、「本発明のＴ細胞集団作成方法」とも称する）；
（１４）（１３）の方法によって作成されるＴ細胞集団（以下、「本発明のＴ細胞集団」とも称する）；
（１５）（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療のためのキット（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療用キット」とも称する）；
（１６）Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるための、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤；
（１７）癌または感染症の予防および／または治療における使用のための、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤；
（１８）癌の免疫療法における使用のための、（１７）に記載の調節剤；
（１９）（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療における使用のための組合せ；
（２０）癌または感染症の予防および／または治療方法であって、有効量の癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞と、有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤とを対象に投与することを含む方法（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療方法」とも称する）；
（２１）有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を対象に投与することを含む、感染症の予防および／または治療方法（以下、「本発明の感染症予防／治療方法」とも称する）；
（２２）有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を対象に投与することを含む、対象の免疫力増強方法（以下、「本発明の免疫力増強方法」とも称する）；
（２３）癌または感染症の予防および／または治療のための医薬の製造における、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の使用； ならびに
（２４）癌または感染症の予防および／または治療のための医薬の製造における、（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の併用、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明において用いるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大を介して、対象における抗原に対する免疫応答を増強し得る。したがって、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法、癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、Ｔ細胞集団作成方法および該方法により作成されるＴ細胞集団、ならびに癌／感染症の予防／治療用キットは、癌および感染症を含む種々の疾患の予防／治療のために用いることができる。また、これらを癌および感染症を含む種々の疾患に対する免疫療法と組み合わせることにより、該免疫療法の効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｔ細胞の分化の概略を示す図である。
【図２】ｓｈＲＮＡを用いるレチノールデヒドロゲナーゼ１０発現抑制の、Ｔ細胞集団の構成に対する影響を示す図である。
【図３】レチノールデヒドロゲナーゼ１０の発現抑制および高発現による、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能に対する影響を示す図である。グラフはコントロール（ＤＭＳＯ）に対する変化率で示した。ｍｏｃｋはコントロールベクターを表す。
【図４】ＲＤＨ１０高発現によるレチノイド代謝への影響を示す図である。横軸はＨＰＬＣ分画のフラクション番号である。
【図５】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスの作成に用いたコンストラクトを示す図である。
【図６】ＲＤＨ１０遺伝子のノックアウトによるレチノイド代謝への影響を示す図である。横軸はＨＰＬＣ分画のフラクション番号である。「ｆ／ｆ」はコントロールマウス、「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウスを表す。
【図７】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加を示す図である。
【図８】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加を示す図である。
【図９】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞表面分子およびその転写因子の発現を示す図である。
【図１０】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるリンパ器官の細胞数を示す図である。
【図１１】ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞数を示す図である。
【図１２】リステリア菌感染症モデルを用いたＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞の機能解析とメモリーＴ細胞形成の評価試験の概略を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウスを表す。
【図１３】リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞の比率を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。
【図１４】リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞のフェノタイプを示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。右下の図においては、塗りつぶし無しの山がＲＤＨ１０ノックアウトマウス由来Ｔ細胞、塗りつぶし有りの山がコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。
【図１５】リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞のフェノタイプを示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。
【図１６】リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞の増殖能とリステリア菌排除能を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞を移入したマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を移入したマウスを表す。
【図１７】リステリア菌感染症モデルにおいて評価した、ＲＤＨ１０遺伝子ノックアウトの効果を模式的に示す図である。
【図１８】ビタミンＡ欠乏状態におけるＲＤＨ１０欠損の影響を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウスを表す。
【図１９】レチノイン酸によるＴ細胞の分化促進を示す図である。
【図２０】Ｔ細胞のアポトーシス感受性に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２１】Ｔ細胞の分裂能および増殖能に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２２】メモリーＴ細胞の割合に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２３】マウスにおけるＴ細胞集団の再構築に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２４】ＷＴ１３３２特異的メモリーＴ細胞の割合および増殖能に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２５】エフェクターＴ細胞からのメモリーＴ細胞の誘導実験の概略を示す図である。
【図２６】エフェクターＴ細胞に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２７】エフェクターＴ細胞から再形成されたＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合およびＴ細胞の増殖能に対する、レチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。
【図２８】ヒトＷＴ１ペプチドおよびＲＡＲアンタゴニストを用いる抗腫瘍免疫誘導実験の概略を示す図である。
【図２９】ヒトＷＴ１ペプチドおよびＲＡＲアンタゴニストを用いる抗腫瘍免疫誘導実験の結果を示す図である。
【図３０】各種ＲＡＲアゴニストによるメモリーＴ細胞の頻度の減少を示す図である。ＣＤ６２Ｌ発現量のグラフの縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。
【図３１】各種ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞の頻度の増加を示す図である。ＣＤ６２Ｌ発現量のグラフの縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。
【図３２】ＲＡＲアンタゴニストによるＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増強を示す図である。Ｅ／Ｔ比は、標的細胞数に対するＣＤ４＋Ｔ細胞数の比率を表す。
【図３３】細胞のミクロソーム画分に含まれるＲＤＨ１０タンパク質を検出するウェスタン解析の結果を示す図である。
【図３４】ＲＤＨ１０の酵素活性の測定結果を示す図である。
【図３５】ＲＤＨ１０の酵素活性に対する低分子阻害剤の影響を示す図である。
【図３６】インビトロでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。
【図３７】インビトロでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。
【図３８】組換えリステリア感染マウスに対するＲＤＨ１０阻害剤投与試験の概略を示す図である。
【図３９】インビボでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。
【図４０】インビボでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。
【図４１】ＲＤＨ１０阻害剤を用いる抗腫瘍免疫誘導実験の概略を示す図である。
【図４２】ＲＤＨ１０阻害剤のみを用いる腫瘍増殖抑制実験の概略を示す図である。
【図４３】ＲＤＨ１０阻害剤を用いる抗腫瘍免疫誘導実験の結果を示す図である。
【図４４】ＲＤＨ１０阻害剤のみを用いる腫瘍増殖抑制実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｔ細胞は、未分化な状態のナイーブＴ細胞から、様々な機能をもったＴ細胞のサブセットへと分化する。分化したＴ細胞のうち、免疫応答において大きな役割を果たすものがＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）およびＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれも、分化の段階によってメモリー細胞（セントラルメモリー細胞およびエフェクターメモリー細胞）およびエフェクター細胞（エフェクター細胞およびターミナルエフェクター細胞）に分類することができる。なお、本明細書において、ＣＤ抗原発現の陽性を「＋」、陰性を「−」の記号で表す。例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と表す。
【００１３】
これらのＴ細胞サブセットは、細胞が発現する表面抗原、産生するサイトカインやインターフェロン等を同定することにより決定できる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、表面抗原ＣＤ１２７およびＣＤ６２Ｌの発現によって、セントラルメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ−）、エフェクター細胞（ＣＤ１２７−、ＣＤ６２Ｌ＋）またはターミナルエフェクター細胞（ＣＤ１２７−、ＣＤ６２Ｌ−）のいずれかに分類することができる。刺激されたＴ細胞は、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、エフェクター細胞、ターミナルエフェクター細胞の順に分化する（図１）。これらの細胞のうち、セントラルメモリー細胞は最も高い増殖能を有し、最もＩＬ−２産生量が多い。ターミナルエフェクター細胞に向かって分化が進むにつれてＩＬ−２産生量が減少し、ＩＦＮ−γ産生量が増加し、かつ、アポトーシスを起こしやすくなる。メモリーＴ細胞の特徴として、アポトーシスを起こしにくいこと、および強い増殖能を有することが挙げられる。したがって、本発明の方法によるＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大は、より強い免疫の達成に寄与する。
【００１４】
本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法において用いるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、レチノイド代謝経路の阻害剤またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤であってもよく、該代謝経路の促進剤または該シグナル伝達系の促進剤であってもよい。一つの好ましい態様において、該調節剤は、レチノイド代謝経路の阻害剤またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である。別の好ましい態様において、該調節剤はレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である。これらの調節剤を２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤のＴ細胞集団への添加は、インビトロで行われるものであってもよく、インビボで行われるものであってもよい。インビトロにおける添加の例としては、Ｔ細胞集団を培養している培地へ該調節剤を添加することが挙げられる。インビボにおける添加の例としては、対象の体内へ該調節剤を注入することが挙げられる。
【００１６】
レチノイド代謝経路の阻害剤
本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法による、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大は、ナイーブＴ細胞もしくはメモリーＴ細胞からエフェクターＴ細胞への分化の抑制、および／またはエフェクター（もしくはターミナルエフェクター）Ｔ細胞からのメモリーＴ細胞（特にセントラルメモリーＴ細胞）の誘導を介して達成されるものであり得る。
【００１７】
一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイド代謝経路を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。本明細書において、レチノイド代謝経路の阻害とは、レチノールやβ-カロテン等のビタミンＡ（レチノイド）またはプロビタミンＡ（レチノイド前駆体）からレチノイン酸が生成される代謝経路中のいずれかの反応を阻害することをいう。本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、レチノールをレチナールへ変換する反応、レチナールをレチノイン酸へ変換する反応、β-カロテンをレチナールへ変換する反応、β-カロテンをβ-アポカロテナールへ変換する反応、およびβ-アポカロテナールをレチナールおよびレチノイン酸へ変換する反応のいずれか１つ以上を阻害するものである。
【００１８】
本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、レチノイド代謝経路中のいずれかの反応を触媒する酵素（以下、「レチノイド代謝酵素」とも称する）、例えば、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ1（BCMO1）、β-カロテンオキシゲナーゼ2（BCO2）等の発現または作用を阻害するものである。一つの好ましい態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤はレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるレチノールデヒドロゲナーゼ１０（該酵素をコードするＤＮＡの配列を配列番号２として示す）またはそのホモログの阻害剤である。ここで、レチノールデヒドロゲナーゼ１０のホモログとは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１個または数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００１９】
本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、上記レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、および該核酸分子を含むベクターのいずれかである。
【００２０】
レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、通常、レチノイド代謝酵素をコードするｍＲＮＡを標的とし、該ｍＲＮＡの分解誘導または翻訳阻害等によって該代謝酵素の産生を抑制するものである。かかるＲＮＡ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。好ましいＲＮＡ分子の例は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡである。一つの態様において、遺伝子発現の抑制対象となるレチノイド代謝酵素は、レチノールデヒドロゲナーゼであり、特にレチノールデヒドロゲナーゼ１０である。一つの好ましい態様において、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、配列番号２のヌクレオチド配列または該配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは９８％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを標的とし、レチノールデヒドロゲナーゼ１０の産生を抑制するものである。一つの好ましい態様において、該ＲＮＡ分子は、２本鎖部分のセンス鎖が配列番号３のヌクレオチド配列からなり、該２本鎖部分のアンチセンス鎖が配列番号４のヌクレオチド配列からなるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、特にｓｈＲＮＡである。
【００２１】
上記ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子とは、該ＲＮＡ分子を直接的または間接的に生じさせる核酸分子を意味し、例えば該ＲＮＡ分子に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡコンストラクトや組換えレトロウイルスＲＮＡが挙げられる。ここにいう「直接的」とは、例えばＤＮＡからの転写、または前駆体ＲＮＡのプロセシング（スプライシングやエディティング等）によって目的のＲＮＡ分子が生じる場合等を意味し、一方「間接的」とは、例えばＲＮＡからの逆転写によりＤＮＡが生じ、次いで該ＤＮＡからの転写によって目的のＲＮＡ分子が生じる場合等を意味する。
【００２２】
上記核酸分子を含むベクターは、目的のＲＮＡ分子の一過性発現（生産）をもたらす「発現ベクター」であってもよく、ＤＮＡ配列の染色体への組み込みによって目的のＲＮＡ分子の安定的発現（生産）をもたらす「形質転換ベクター」であってもよい。本発明において用い得るベクターの種類としては、プラスミドベクター、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等が挙げられるが、動物細胞、例えばヒト細胞において使用可能なベクターである限り、これらに限定されない。例えば、所望のＲＮＡ分子およびプロモーターのヌクレオチド配列を含むＲＮＡコンストラクトを包含するレトロウイルスベクターを細胞に感染させると、該ＲＮＡコンストラクトに対応するＤＮＡコンストラクトが逆転写によって生成され、該ＤＮＡコンストラクトが該細胞の染色体中に組み込まれ、該組み込まれたＤＮＡコンストラクトから該所望のＲＮＡ分子が転写される。
【００２３】
レチノイド代謝酵素の作用を阻害する化合物は、低分子化合物であってもよく、高分子化合物であってもよい。該高分子化合物としては、例えば、レチノイド代謝酵素に結合する抗体およびその抗原結合性断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等）ならびにＳｃＦｖ等が挙げられる。レチノイド代謝酵素の作用を阻害する低分子化合物は、例えば該酵素の活性に対する阻害作用を指標とした化合物ライブラリーからのスクリーニング等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。レチノイド代謝酵素に結合する抗体、その抗原結合性断片、ＳｃＦｖ等もまた、酵素を抗原として用いる動物免疫やファージディスプレイ等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。
【００２４】
一つの態様において、レチノイド代謝酵素の作用を阻害する化合物は、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物であり、好ましくはレチノールデヒドロゲナーゼ１０（配列番号１）の作用を阻害する化合物（以下、「ＲＤＨ１０阻害剤」とも称する）である。一つの態様において、ＲＤＨ１０阻害剤は、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物またはその塩である：
【化１】
2016104486.tif 000003
［式中、ＲはＨまたはＣＨ３であり、
ＺはＨＯ−またはＨＯＯＣ−Ｙ−ＣＯＯ−であり、
Ｙは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−またはフェニレン基である］。
好ましい態様において、式（Ｉ）中のＺはＨＯＯＣ−Ｙ−ＣＯＯ−である。より好ましくは、Ｙは−ＣＨ＝ＣＨ−またはフェニレン基である。
また、式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、ナトリウム塩が好ましい。
【００２５】
好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２、ＲＤＨＩ−００３、ＲＤＨＩ−００４、ＲＤＨＩ−００５、ＲＤＨＩ−００６、ＲＤＨＩ−００７、ＲＤＨＩ−００８、ＲＤＨＩ−００９、ＲＤＨＩ−０１０およびＲＤＨＩ−０１１からなる群より選択される１種以上の化合物である。
より好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２、ＲＤＨＩ−００３およびＲＤＨＩ−００４からなる群より選択される１種以上の化合物である。
さらに好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２およびＲＤＨＩ−００３からなる群より選択される１種以上の化合物である。
ＲＤＨＩ−００１〜ＲＤＨＩ−０１１は、それぞれ以下の式で表される化合物である。
【化２】
2016104486.tif 000004
【化３】
2016104486.tif 000005
【化４】
2016104486.tif 000006
【化５】
2016104486.tif 000007
【化６】
2016104486.tif 000008
【化７】
2016104486.tif 000009
【化８】
2016104486.tif 000010
【化９】
2016104486.tif 000011
【化１０】
2016104486.tif 000012
【化１１】
2016104486.tif 000013
【化１２】
2016104486.tif 000014
【００２６】
本発明において、レチノイド代謝酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質を、レチノイド代謝経路の阻害剤として用いることもできる。該ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、例えば、レチノイド代謝酵素の変異体タンパク質を作成し、基質との結合能を有するが本来の触媒作用を有さないものを選択すること等により取得可能である。また、酵素の機能部位を解析することにより、所望の変異体タンパク質の作成および選択工程を効率化することができる。
【００２７】
レチノイド代謝経路の促進剤または阻害剤は、いわゆるＳＢＤＤ（Structure-Based Drug Design）の手法によって取得することもできる。例えば、レチノールデヒドロゲナーゼ１０等のレチノイド代謝酵素を精製し、結晶化し、Ｘ線解析により立体構造を決定し、その立体構造に基づいて該レチノイド代謝酵素に結合する化合物をデザインし、該化合物の活性を試験することによって、レチノイド代謝経路の促進剤または阻害剤として機能する化合物を同定することができる。
【００２８】
レチノイン酸シグナル伝達系およびその阻害剤
レチノイン酸シグナル伝達系とは、レチノイン酸（以下、「ＲＡ」とも称する）が、細胞の核内のレチノイン酸受容体（以下、「ＲＡＲ」とも称する）と結合することにより生じるシグナル（例えば、レチノイン酸応答配列を有する遺伝子の転写調節等）の伝達系をいう。一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、かかるシグナル伝達系を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。一つの好ましい態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４陽性メモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。
【００２９】
レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤としては、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、および該核酸分子を含むベクター等が挙げられる。一つの好ましい態様において、該阻害剤はレチノイン酸受容体アンタゴニストである。
【００３０】
レチノイン酸受容体アンタゴニストとしては、ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＬＥ５５０、ＢＭＳ１９５６１４、ＭＭ１１２５３、ＡＧＮ１９４３１０、Ｒｏ４１−５２５３、ＡＧＮ１９３１０９、ＣＤ２６６５、ＢＭＳ４９３等の化合物およびそれらの類似体もしくは誘導体、ならびにレチノイン酸とレチノイン酸受容体の結合を遮断する抗体等が挙げられる。一つの好ましい態様において、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＢＭＳ１９５６１４およびＭＭ１１２５３ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される１種以上の化合物である。ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＬＥ５５０、ＢＭＳ１９５６１４、ＭＭ１１２５３、ＡＧＮ１９４３１０、Ｒｏ４１−５２５３、ＡＧＮ１９３１０９、ＣＤ２６６５およびＢＭＳ４９３は、それぞれ以下の式で表される。
【００３１】
【化１３】
2016104486.tif 000015
【００３２】
【化１４】
2016104486.tif 000016
【００３３】
【化１５】
2016104486.tif 000017
【００３４】
【化１６】
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【００３５】
【化１７】
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【００３６】
【化１８】
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【００３７】
【化１９】
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【００３８】
【化２０】
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【００３９】
【化２１】
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【００４０】
【化２２】
2016104486.tif 000024
【００４１】
レチノイン酸受容体アンタゴニストとして作用する上記以外の化合物は、レチノイン酸やＬＥ５４０等と類似の構造を有する化合物のライブラリーからのスクリーニング等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。
【００４２】
本発明において、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質を、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤として用いることもできる。該ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、例えば、レチノイン酸受容体の変異体タンパク質を作成し、レチノイン酸との結合能を有するが、シグナルを生じさせないものを選択すること等により取得することができる。また、受容体の機能部位を解析することにより、所望の変異体タンパク質の作成および選択工程を効率化することができる。
【００４３】
本発明の別の態様において、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子（ＲＡＲ遺伝子）の発現を抑制するＲＮＡ分子を、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤として用いることができる。ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、通常、ＲＡＲをコードするｍＲＮＡを標的とし、該ｍＲＮＡの分解誘導または翻訳阻害等によってＲＡＲの産生を抑制するものである。かかるＲＮＡ分子の種類としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。好ましいＲＮＡ分子の例は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡである。
【００４４】
例えばヒトにおいては、レチノイン酸受容体としてＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの３種のサブタイプが知られており、それぞれについて複数のアイソフォーム（バリアント）が報告されている。例えば、ＲＡＲαについてはＮＰ＿０００９５５、ＮＰ＿００１０１９９８０およびＮＰ＿００１１３８７７４、ＲＡＲβについてはＮＰ＿０００９５６およびＮＰ＿０５７２３６、ＲＡＲγについてはＮＰ＿０００９５７、ＮＰ＿００１０３６１９３、ＮＰ＿００１２３０６６１、ＮＰ＿００１２３０６５９およびＮＰ＿００１２３０６６０（いずれもＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号で示す）のアミノ酸配列からなるアイソフォームが知られており、本明細書においては、これらのアイソフォームをコードするＤＮＡの配列をそれぞれ配列番号５〜１４として示す。したがって、一つの好ましい態様において、ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、配列番号５〜１４のいずれかのヌクレオチド配列または該配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは９８％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを標的とし、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγのうち１種以上の産生を抑制するものである。
【００４５】
また、ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子を（直接的または間接的に）生じさせる「核酸分子」および該核酸分子を含む「ベクター」の定義および例示については、「レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子」を生じさせる核酸分子および該核酸分子を含むベクターについて上述した内容と同様である。
【００４６】
レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤
一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系を促進することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。例えば、ナイーブＴ細胞にレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を作用させることにより、効率的に該Ｔ細胞を分化させ、メモリーＴ細胞を増加させることができる。したがって、一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を、ナイーブＴ細胞を含むＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。かかる態様において、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を添加するＴ細胞集団におけるナイーブＴ細胞の割合は、好ましくは２０％以上、例えば３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上である。レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を添加するＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞のみからなるものであってもよい。
【００４７】
レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤としては、レチノイン酸受容体アゴニスト、レチノイン酸受容体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子等が挙げられ、好ましくはレチノイン酸受容体アゴニストである。一つの好ましい態様において、レチノイン酸受容体アゴニストは、レチノイン酸、特にオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）である。別の好ましい態様において、レチノイン酸受容体アゴニストは、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＬＥ５１１、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される１種以上の化合物である。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＬＥ５１１、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７は、それぞれ以下の式で表される。
【００４８】
【化２３】
2016104486.tif 000025
【００４９】
【化２４】
2016104486.tif 000026
【００５０】
【化２５】
2016104486.tif 000027
【００５１】
【化２６】
2016104486.tif 000028
【００５２】
【化２７】
2016104486.tif 000029
【００５３】
レチノイン酸受容体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子は、例えばレチノイン酸受容体を過剰発現させてレチノイン酸シグナル伝達系を促進するために、発現ベクター等の当該技術分野において公知の手法を用いてＴ細胞に導入することができる。
【００５４】
癌／感染症の予防／治療補助剤
本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤は、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を有効成分として含むものである。該代謝経路またはシグナル伝達系の調節（阻害または促進）により、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合が増大する。一つの好ましい態様において、本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤は、免疫療法、特に癌抗原ペプチドを用いる免疫療法による癌の治療効果を増大させるものである。癌免疫療法に用いる癌抗原ペプチドとしては、これらに限定されないが、各種のＷＴ１ペプチド、例えばヒトＷＴ１３３２（配列番号１５、国際公開２０１２／０４６７３０号等に記載）、ＭＡＧＥ−Ａ４２７８−２９９（配列番号１６）、サバイビン９７−１１１（配列番号１７）、ならびにそれらと同等の活性を有する変異ペプチド等が挙げられる。
【００５５】
また、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節（阻害または促進）は、メモリーＴ細胞の割合の増大のみならず、Ｔ細胞の数自体の増加をももたらす。したがって、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、感染症の予防（例えばワクチン）および治療（例えば免疫療法）における補助剤としても有効である。
【００５６】
また、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤（例えばＲＡＲアンタゴニスト）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強させ得る。したがって、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤は、癌または感染症の治療、特に癌または感染症の免疫療法における補助剤として有効である。
【００５７】
本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤の適用対象となる癌は、特に限定されず、癌腫、肉腫、造血器腫瘍等を含む。一つの好ましい態様において、該補助剤の適用対象は、ＷＴ１遺伝子を発現する各種の癌ないし腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、ならびに胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍などの固形癌ないし固形腫瘍である。
【００５８】
本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤の適用対象となる感染症は、特に限定されない。これは、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤により、Ｔ細胞数の増加とメモリーＴ細胞割合の増大を介して、感染症の種類を問わず強い免疫がもたらされるためである。一つの態様において、該補助剤の適用対象は、細菌、ウイルス、原生動物等による感染症であり得る。
【００５９】
免疫力増強剤
上述の通り、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、メモリーＴ細胞の割合の増大およびＴ細胞の数自体の増加をもたらす。したがって、該調節剤は、非特異的に対象の免疫力を向上させる免疫力増強剤の有効成分として用いることができる。
【００６０】
本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤は、有効成分であるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤に含まれる上記有効成分の量、該補助剤および増強剤の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。
【００６１】
Ｔ細胞集団の作成方法
本発明のＴ細胞集団作成方法は、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団へ添加することにより、通常用いられるＴ細胞の培養法と比較してメモリーＴ細胞の割合が増大したＴ細胞集団を得るものである。該方法において、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤のＴ細胞集団への添加は、インビトロまたはインビボで行い得るものであるが、好ましくはインビトロで行われるものである。インビトロにおける添加の例としては、Ｔ細胞集団を培養している培地へ該調節剤を添加することが挙げられる。インビボにおける添加の例としては、対象の体内へ該調節剤を投与することが挙げられる。
【００６２】
本発明のＴ細胞集団作成方法によって作成されるＴ細胞集団は、種々の疾患、好ましくは癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法において、該予防および／または治療の効果を増大させるために使用することができる。
【００６３】
治療方法およびキット
本発明の癌／感染症の予防／治療方法および癌／感染症の予防／治療用キットは、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤と、癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法における他の有効成分とを併用するものである。かかる有効成分としては、例えば、癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞等が挙げられる。
【００６４】
癌抗原とは、癌細胞または腫瘍細胞特異的に発現する表面抗原（いわゆる腫瘍特異抗原）および該抗原の部分ペプチドを意味し、例えば癌遺伝子ＷＴ１の産物であるＷＴ１タンパク質、該タンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１３３２等のＷＴ１ペプチドが挙げられる。感染症の病原体としては、細菌、真菌、ウイルス、原生動物等が挙げられる。病原体の抗原としては、細菌、真菌、ウイルス等の表面に発現するタンパク質、糖タンパク質および糖鎖等、ならびに細菌または真菌の細胞壁およびその構成成分（リポ多糖など）が挙げられる。抗原もしくは病原体により刺激または活性化される免疫細胞としては、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）、および該抗原提示細胞によって活性化されるＴ細胞等が挙げられる。
【００６５】
本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤は、種々の疾患、好ましくは癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法における有効成分と併用し得る。かかる有効成分としては、上記した癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞等が挙げられる。
【００６６】
本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法、癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、癌／感染症の予防／治療用キット、癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法を適用し得る対象は、免疫系、特に獲得免疫系を有する動物、即ち脊椎動物であれば特に限定されない。かかる対象としては、例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジー等が挙げられる。一つの好ましい態様において、かかる対象はヒトである。
【００６７】
本発明の癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法において、対象に投与するレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の有効量、ならびに癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞の有効量は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて、また、当業者に周知の方法（各種の非臨床および／または臨床試験を含む）を用いて、適宜決定することができる。本発明の癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法において用い得る癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞の例は、上述した通りである。
【００６８】
なお、本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、Ｔ細胞集団作成方法、癌／感染症の予防／治療用キット、癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法、および免疫力増強方法においても、「メモリーＴ細胞割合増大方法」に関して記載した各種のレチノイド代謝経路の阻害剤、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤として用いることができる。
【００６９】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００７０】
実施例１
ｓｈＲＮＡによるレチノールデヒドロゲナーゼ１０の発現抑制
レチノールデヒドロゲナーゼ１０を標的とする、配列番号１８に示す配列からなるｓｈＲＮＡ（ＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡ）を発現させるためのコンストラクトを、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に導入した。具体的には、レンチウイルスベクターのシステムを用い、クローニングサイトに配列番号１９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを組み込んだベクターと、パッケージングベクターとをパッケージング細胞（２９３Ｔ細胞株）に共トランスフェクトし、生成された組換えウイルスをヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に感染させた。染色体へのｓｈＲＮＡ発現コンストラクトの組み込みは、ｓｈＲＮＡ発現コンストラクトの下流に存在するＧＦＰの発現をレポーターとして確認した。かかる方法によりＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡを発現させたＴ細胞集団においては、対照ｓｈＲＮＡ（配列番号２０）を同様の方法で発現させたＴ細胞集団と比較して、ターミナルエフェクター細胞（ＣＤ１２７−、ＣＤ６２Ｌ−）の割合が減少し、セントラルメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋）の割合が増大した（図２）。【００７１】
ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に、レンチウイルスベクターを用いて上記のＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ＃１０−２、配列番号１８）や、コントロールとしてルシフェラーゼを標的としたｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ｌｕｃ、配列番号２０）を導入した。また、同様に、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞にＲＤＨ１０遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターを導入することによりＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞を作製した。
これらの細胞を抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２の存在下で、様々な濃度のレチノール（オールトランス型）とともに一週間培養し、細胞数の測定と共に細胞内サイトカインアッセイでＩＦＮ−γを産生する細胞の頻度を調べた。結果を図３に示す。
レチノールの存在により、レチノール濃度依存的に細胞数およびＩＦＮ−γ産生細胞が増加した。一方、ＲＤＨ１０の発現抑制によって、それらの増加率が抑えられ、また過剰発現によって増強された。【００７２】
上述のＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞（図４において＃１０と表記）およびコントロールベクター導入Ｔ細胞（図４においてｍｏｃｋと表記）をそれぞれ５×１０７個ずつ培養液とともに１０ｃｍの培養皿に入れ、３Ｈで標識されたオールトランスレチノールを１μＭの濃度で添加した。４時間、３７℃で培養したのち、細胞を回収し、ヘキサンを用いて細胞内のレチノイドを抽出した。抽出に用いたヘキサンを乾燥遠心により取り除いた後、濃縮されたレチノイドをアセトニトリルに溶解しＨＰＬＣを用いて分画を行い、各フラクションに含まれる３Ｈを液体シンチレーションカウンターで測定した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルがどのフラクションに分離されるか決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ ４ｕ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は１．５ｍｌ／分で行い、１分間毎のフラクションを作製した。結果を図４に示す。
ＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞では、オールトランスレチノールからオールトランスレチナールへの変換が促進されていた。【００７３】
実施例２
レチノールデヒドロゲナーゼ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞集団
（１）コンディショナルノックアウトマウスの作成
ターゲティングベクターを用い、染色体上のレチノールデヒドロゲナーゼ１０（以下、ＲＤＨ１０とも称する）遺伝子が図５に示すコンストラクトＡで置換されたマウスを作成した。該マウスを、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配することにより、ＬａｃＺおよびｎｅｏ遺伝子が除去された遺伝子構造（図５のＢ：以下において、かかる構造を「ｆｌｏｘアレル」と称する）を有するマウスを作成した。こうして得られたｆｌｏｘアレルを有するマウスと、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとを交配することにより、ＲＤＨ１０のエキソン２が除去された遺伝子構造（図５のＣ）を有するノックアウトマウスを得た。【００７４】
（２）ノックアウトマウスにおけるレチノイド代謝
上記の通りに作成したＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  ｃｒｅ）およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）の脾細胞よりセルソーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。分離したＣＤ４＋Ｔ細胞は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２を用いて活性化および増殖させた後、それぞれ３×１０７個ずつ培養液とともに１０ｃｍの培養皿に入れ、３Ｈで標識されたオールトランスレチノールを１μＭの濃度で添加した。４時間、３７℃で培養したのち、細胞を回収し、ヘキサンを用いて細胞内のレチノイドを抽出した。抽出に用いたヘキサンを乾燥遠心により取り除いた後、濃縮されたレチノイドをアセトニトリルに溶解しＨＰＬＣを用いて分画を行い、各フラクションに含まれる３Ｈを液体シンチレーションカウンターで測定した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルがどのフラクションに分離されるか決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ ４ｕ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は１．５ｍｌ／分で行い、１分間毎のフラクションを作製した。結果を図６に示す。
ＲＤＨ１０ノックアウトマウスでは、コントロールマウスと比較してオールトランスレチノールからオールトランスレチナールへの変換が抑制されていた。【００７５】
（３）ノックアウトマウスにおけるＴ細胞サブセットの同定
ＲＤＨ１０遺伝子座に関し野生型ホモ（ｗｔ／ｗｔ）、ｆｌｏｘアレル／野生型へテロ（ｆｌｏｘ／ｗｔ）またはｆｌｏｘアレルホモ（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）の遺伝子型を有するノックアウトマウスにＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスを交配して得られたマウス（以下、検定用マウスとも称する）において、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現を指標としてＴ細胞サブセットを同定した。その結果、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスに比して、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の双方において、ＣＤ６２Ｌの発現が高いメモリー型Ｔ細胞の割合が増大していた（図７）。【００７６】
（４）ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加
６−８週齢のＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆ／ｆ  ｃｒｅ）とコントロールマウス（ｆ／ｆ）の末梢リンパ節に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７発現をフローサイトメトリーで解析した。結果を図８に示す。ＲＤＨ１０ノックアウトマウスではＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の発現が高く、メモリー型Ｔ細胞の割合が増大していることが示された。【００７７】
（５）Ｔ細胞表面分子およびその転写因子の発現
上記検定用マウスにおいてＴ細胞表面分子およびその転写因子の発現を調べたところ、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスと比較して、メモリー型Ｔ細胞に特徴的な細胞表面分子（ＣＤ６２Ｌ（Ｓｅｌｌ）、Ｓ１ｐ１（Ｅｄｇ１）、Ｃｃｒ７、ＩＬ７ｒａ）およびその発現に関連する転写因子（Ｋｌｆ２、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３、Ｅｔｓ１、Ｓｐ１、Ｉｒｆ１）の発現が高かった（図９）。【００７８】
（６）リンパ器官の細胞数および該リンパ器官におけるＴ細胞数
上記検定用マウスにおいてリンパ器官の細胞数および該リンパ器官におけるＴ細胞数を調べたところ、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスと比較して、一次リンパ器官（胸腺）および二次リンパ器官（リンパ節、脾臓）の細胞数が増加しており、リンパ球の増殖が促進されていることが示唆された（図１０）。また、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスと比較して、リンパ節および脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数がともに増加していた（図１１）。【００７９】
（７）リステリア菌感染症モデルを用いたＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞の機能解析とメモリーＴ細胞形成の評価
［方法］
ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ遺伝子が導入され（トランスジェニック）、かつＲａｇ１遺伝子がノックアウトされたマウスから、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  ｃｒｅ）、およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）を作製した。また、両者のＴ細胞を区別するために、マーカー分子であるＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の２つの分子マーカーをＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウスに持たせた。一方、コントロールマウスにはＣＤ４５．１のみを持たせた。これらのマウスからＴ細胞（ＯＴ−Ｉ ＴＣＲのみを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞）を得て、１×１０４個ずつ１：１の比率で混合した後、ＣＤ４５．２のみを持つ野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）に尾静脈より投与した。
翌日、ＯＴ−Ｉ ＴＣＲが認識するＯＶＡペプチドを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス（ＬＭ−ＯＶＡ）を１×１０４ＣＦＵ感染させ、経時的に、移入したＴ細胞の比率の変化およびフェノタイプを脾臓およびリンパ節を摘出し解析した。
また、メモリーＴ細胞の機能を評価するために、メモリー期である感染後３０日以上経ったマウスの脾臓およびリンパ節より、移入したＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋）およびコントロールマウス由来Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２−）をＦＡＣＳソーターを用いて分離し、それぞれ１×１０４個ずつ別々の野生型マウスに移入した。翌日、ＬＭ−ＯＶＡを１×１０６ＣＦＵ感染させ（二次感染）、その５日後に脾臓および肝臓に存在するリステリア菌数と移入したＴ細胞の細胞数を解析した。
上記の試験の概略を図１２に示す。【００８０】
［結果］
ＬＭ−ＯＶＡ感染後における、移入したＴ細胞の比率の変化およびフェノタイプを図１３〜図１５に示す。脾臓およびリンパ節のいずれにおいても、コントロールマウス由来Ｔ細胞よりも、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞の比率が高かった（図１３）。また、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞では、コントロールマウス由来Ｔ細胞と比較して、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ１２７＋細胞）およびメモリー前駆エフェクター細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７＋細胞）の割合が高かった（図１４および１５）。
二次感染後において、ＲＤＨ１０ノックアウトマウス由来のＴ細胞は、コントロールマウス由来のＴ細胞と比較して、強い増殖能と強いリステリア菌排除能を有していることが示された（図１６）。
以上の結果から、ＲＤＨ１０ノックアウトマウスのＴ細胞は、メモリーＴ細胞をより多く産生し、かつ質的にもメモリー機能が高いことが確認された（図１７）。【００８１】
（８）ビタミンＡ欠乏状態におけるＲＤＨ１０欠損の影響
ＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現亢進が、ＲＤＨ１０によるビタミンＡ（レチノール）の代謝欠失が原因かどうかを解析するために、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  ｃｒｅ）およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）にビタミンＡ欠乏食を４週間与えた。その後、リンパ節（腋窩＋鼠径）、腸間膜リンパ節、および脾臓のＴ細胞のＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７発現をフローサイトメトリーで解析した。結果を図１８に示す。ビタミンＡ欠乏状態ではＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞におけるＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の発現上昇は認められないことから、ＲＤＨ１０がビタミンＡの代謝を介してこれらの分子の発現を調節していることが明らかとなった。【００８２】
実施例３
Ｔ細胞の分化促進および分化抑制
（１）レチノイン酸による分化促進
ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を様々な方法（ＩＬ−２、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２）で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）またはオールトランスレチノイン酸の存在下で培養した（なお、以下の実施例において使用したレチノイン酸はすべてオールトランスレチノイン酸である）。その結果、レチノイン酸存在下で培養した細胞集団において、セントラルメモリー細胞（グラフ右上）の割合が減少し、ターミナルエフェクター細胞（グラフ左下）の割合が増加した（図１９）。かかる結果は、レチノイン酸によってセントラルメモリー細胞からエフェクターメモリー細胞、エフェクター細胞、ターミナルエフェクター細胞への分化が促進されることを示す。【００８３】
（２）アポトーシス耐性
ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を抗Ｆａｓ抗体（７Ｃ１１）で刺激し、アポトーシス細胞および生細胞の割合を調査解析した。その結果、レチノイン酸でＴ細胞の分化を促進させることにより、アポトーシス細胞が増加し、生細胞が減少した。一方、ＲＡＲアンタゴニストで分化を抑制すると、アポトーシス細胞が減少し、生細胞が増加した（図２０）。【００８４】
（３）メモリーＴ細胞の分裂能および増殖能
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２、またはＩＬ−７で再刺激および培養し、分裂能および増殖能を評価した。分裂能の評価にはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ(商標) Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。その結果、レチノイン酸でＴ細胞の分化を促進させると分裂能および増殖能が共に低下する一方、ＲＡＲアンタゴニストで分化を抑制すると、分裂能および増殖能が共に増加することが判明した（図２１）。【００８５】
（４）メモリーＴ細胞集団形成能
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２、またはＩＬ−７で７日間再刺激および培養し、Ｔ細胞サブセットを同定した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養したＴ細胞集団からは再びメモリーＴ細胞が高頻度に出現した一方、ＤＭＳＯおよびレチノイン酸存在下の培養においてはメモリーＴ細胞の出現頻度は低かった（図２２）。【００８６】
メモリーＴ細胞は多分化能と自己複製能を有している。この自己複製能により、メモリーＴ細胞が多く含まれる細胞集団は、分裂・増殖を繰り返しても、メモリーＴ細胞を高頻度に維持できる。そのため、ＲＡＲアンタゴニスト存在下で培養したＴ細胞集団は、メモリーＴ細胞を多く含むものとなる。【００８７】
（５）マウス体内における再構築能
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞を除去したヒトＰＢＭＣと共に、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠損した免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）の体内に移入し、４週間後に脾臓におけるＴ細胞を解析した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫不全マウス体内での増殖能が高く、未分化であることが示された（図２３）。【００８８】
実施例４
ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞割合の増大
ヒトＷＴ１３３２特異的ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒトＷＴ１３３２で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で培養した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養するとメモリー型ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増大することが示された（図２４）。また、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養されたＴ細胞集団を、ヒトＷＴ１３３２でパルスしたＰＢＭＣを用いて再刺激および培養したところ（Ｔ細胞：30,000細胞/ウェル、ＰＢＭＣ:100,000細胞/ウェル、ＩＬ−２:なし）、ＤＭＳＯまたはレチノイン酸存在下で培養した細胞よりも増殖能が高いことが示された（図２４）。【００８９】
実施例５
ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞の誘導
方法：
単一細胞由来ヒトＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに含まれるターミナルエフェクター分画を、ヒトＷＴ１３３２でパルスした樹状細胞で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で７日間培養した。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、ヒトＷＴ１３３２でパルスした樹状細胞で再刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下でさらに培養した。４日または６日間の培養の後、ＦＡＣＳ解析および３Ｈチミジン取り込みアッセイ（細胞増殖アッセイ）を行った。試験の流れを図２５に示す。【００９０】
結果：
ターミナルエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を１０μＭのＬＥ５４０の存在下で培養したところ、再度セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導された（図２６）。また、再刺激後の評価においても、ＬＥ５４０の存在下での培養により、分裂能および増殖能の高いメモリーＴ細胞が生じることが確認された（図２７）。【００９１】
実施例６
癌免疫療法におけるＲＡＲアンタゴニストの効果
方法：
ＷＴ１タンパク質およびルシフェラーゼを共に発現する腫瘍細胞を、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）の腹側皮下に移植した。移植の３日後、１０６個のヒトＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ陽性）を静脈注射した（０日目）。該静脈注射の８時間後に、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＬＥ５４０を腹腔内に投与した。静脈注射の１日後に、ＣＤ３＋Ｔ細胞を除去し、ヒトＷＴ１３３２ペプチドをパルスしたヒト末梢血単核球２×１０６個を静脈注射した（１日目）。その後、生存期間を観察すると共に、毎週、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを投与し、ルシフェラーゼによって誘導される発光の強度を体外から測定することにより、腫瘍量を測定した。試験の流れを図２８に示す。【００９２】
結果：
マウスの生存曲線および腫瘍量の測定結果（２１日目）を図２９に示す。レチノイン酸投与群においては、対照よりも生存期間が短縮された。一方、ＬＥ５４０投与群では、対照よりも生存期間が延長された。また、ＬＥ５４０投与群では、ＤＭＳＯ群およびレチノイン酸群と比較して、有意に腫瘍のサイズが小さかった（０日目から何倍になったかで評価した）。かかる結果は、ＷＴ１ペプチド等の癌抗原ペプチド、癌抗原ペプチド特異的Ｔ細胞、または癌抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞等の投与による抗腫瘍効果が、ＲＡＲアンタゴニストの投与によって増強されることを実証するものである。【００９３】
実施例７
種々のＲＡＲアゴニストおよびアンタゴニストによるＴ細胞集団の分化調節
方法：
ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２で刺激し、ＤＭＳＯを対照として、様々なＲＡＲアゴニスト（図３０）もしくはＲＡＲアンタゴニスト（図３１）存在下で８日間培養した。【００９４】
結果：
オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ならびにそれぞれＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの選択的アゴニストであるＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７の存在下で培養した細胞集団のいずれにおいても、メモリーＴ細胞に特徴的な細胞表面分子であるＣＤ６２Ｌの発現が低下し、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋細胞）の割合が減少した（図３０）。【００９５】
一方、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの共通のアンタゴニストであるＬＥ５４０、ならびにそれぞれＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの選択的アンタゴニストであるＢＭＳ１９５６１４、ＬＥ１３５およびＭＭ１１２５３の存在下で培養した細胞集団のいずれにおいても、ＣＤ６２Ｌの発現が増加し、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋細胞）の割合が増大した（図３１）。【００９６】
実施例８
ＲＡＲアンタゴニストによる細胞傷害活性の増強
方法：
レンチウイルスベクターを用いてＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１（ＤＰ５）拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲを発現させたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）または対照としてのＤＭＳＯの存在下で、ＷＴ１３３２をパルスした末梢血単核球を用いて刺激し、培養した。培養開始から１１日後に、ＷＴ１を発現するがＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１を持たない白血病細胞株ＴＦ１（ＴＦ１はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２：０１およびＤＰＢ１＊０４：０１陽性）と、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１を発現させたＴＦ１（ＴＦ１−ＤＰ５と表記）を標的細胞として、上記の３条件で培養したＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を測定した。【００９７】
結果：
ＴＦ１およびＴＦ１−ＤＰ５のいずれの標的細胞に関しても、ＲＡＲアンタゴニスト存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の培養により、該ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性が増強された（図３２）。【００９８】
実施例９
レチノールデヒドロゲナーゼ１０の低分子阻害剤
（１）ＲＤＨ１０タンパク質の検出
２９３Ｔ細胞（１×１０６）、ＲＤＨ１０遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞（１×１０６）、および活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０７）をＰＢＳでよく洗浄した後、６００μｌの０．２５Ｍスクロース・０．１Ｍリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させた。細胞懸濁液をホモジナイズし、１０，０００ｇ、１０分、４℃の条件で遠心した後、上清を１００，０００ｇ、１時間、４℃の条件で遠心することでミクロソーム画分を得た。ミクロソーム画分は２０μｌの０．１Ｍリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁しウェスタンブロットに用いた。
ミクロソーム画分に含まれるＲＤＨ１０タンパクは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ブロッキングを行ったのち、一次抗体として抗ＲＤＨ１０抗体（ａｂ８７５８６）、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体と反応させ、Luminata Forte Western HRP Substrate（ミリポア社製）を用いて検出した。
その結果、ＲＤＨ１０遺伝子導入２９３Ｔ細胞と活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のミクロソーム画分にＲＤＨ１０タンパクが含まれていることが確認できた（図３３）。【００９９】
（２）ＲＤＨ１０の酵素活性の測定
Reaction buffer（９０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ ＫＣｌ）にオールトランスレチノール、ＢＳＡおよび補酵素としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をそれぞれ終濃度１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭになるように加えた。この混合液を２００μｌずつシリコナイズドチューブに取り、２９３Ｔ細胞およびＲＤＨ１０発現２９３Ｔ細胞から分離したミクロソーム画分を１０μｌずつ別々のチューブに加え、３７℃で１５分間反応させた。反応を停止させるためにメタノールを２００μｌ加えたのち、ヘキサンを用いてレチノイドを抽出し、濃縮した。濃縮したレチノイドを１５０μｌのアセトニトリルに溶解後、ＨＰＬＣを用いて分離し、波長３５０ｎｍの紫外光吸収を検出することで、基質（オールトランスレチノール）と生成物（オールトランスレチナール）を検出した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルの保持時間を決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ  ４ｕ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は２．０ｍｌ／分で行った。
その結果、２９３Ｔ細胞株由来ミクロソームではオールトランスレチノールからオールトランスレチナールが生成されなかったのに対し、ＲＤＨ１０遺伝子導入２９３Ｔ細胞株由来ミクロソームでは、オールトランスレチナールが生成された（図３４）。【０１００】
（３）低分子阻害剤によるＲＤＨ１０の酵素活性の阻害
Reaction buffer（９０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ ＫＣｌ）にオールトランスレチノール、ＢＳＡおよび補酵素としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をそれぞれ終濃度１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭになるように加えた。この混合液を２００μｌずつシリコナイズドチューブに取り、ＲＤＨ１０発現２９３Ｔ細胞から分離したミクロソーム画分を１０μｌずつ別々のチューブに加えた。それぞれのチューブにＤＭＳＯに溶解したＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ−００１〜０１１）を終濃度２０μＭになるように添加し、また、コントロールのチューブにはＤＭＳＯを同量添加した。３７℃で１５分間反応させ、メタノールを２００μｌ加えたのち、ヘキサンを用いてレチノイドを抽出し、濃縮した。濃縮したレチノイドを１５０μｌのアセトニトリルに溶解後、ＨＰＬＣを用いて分離し、波長３５０ｎｍの紫外光吸収を検出することで、基質（オールトランスレチノール）と生成物（オールトランスレチナール）を検出した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルの保持時間を決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ 酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ  ４ｕ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は２．０ｍｌ／分で行った。
酵素活性は、反応していない基質（オールトランスレチノール）の波形面積に対する生成物（オールトランスレチナール）の波形面積として求め、コントロールにおける酵素活性に対する相対値をグラフにまとめた（図３５）。【０１０１】
（４）インビトロでのＲＤＨ１０阻害剤によるメモリーＴ細胞の増幅
ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を、抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（２０ ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、ＤＭＳＯ（対照）またはＲＤＨ１０阻害剤（１０μＭ）と共に８日間培養した後、ＦＡＣＳ解析によりメモリーＴ細胞の頻度を求めた。
その結果、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ−００１〜００４）の存在下での培養により、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋）の頻度が増大することが示された（図３６）。また、メモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤濃度の影響を図３７に示す。【０１０２】
（５）インビボでのＲＤＨ１０阻害剤によるメモリーＴ細胞の増幅
ＲＤＨ１０阻害剤投与群およびコーン油投与コントロール群のＢ６マウスに、ＯＶＡタンパクを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス（ＬＭ−ＯＶＡ）を尾静脈より１×１０５ｃｆｕ（コロニー形成単位）感染させ、ＲＤＨ１０阻害剤（２００μｇ／日）を感染の前日（ｄａｙ −１）から感染後７日目（ｄａｙ ７）まで連続投与した。経時的（感染後５、７、１０および１４日目）に尾静脈より採血し、末梢血に含まれるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をテトラマー法で解析した。かかる試験の概略を図３８に示す。
解析の結果、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ−００１〜００３）の投与により、メモリー型（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋）のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が増大することが示された（図３９および４０）。【０１０３】
実施例１０
癌免疫療法におけるレチノールデヒドロゲナーゼ１０阻害剤の効果
方法：
ＥＧ７腫瘍細胞（ＯＶＡタンパクを発現しているＥＬ４細胞）２×１０６個を皮下注射により、Ｂ６マウスの腹部の皮下に移植した（０日目）。移植後５日目に、移植細胞の生着率を上げるためにマウスに放射線（３Ｇｙ）を照射した後、ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）２×１０５個を静脈注射した。次いで、移植後６日目、８日目および１０日目に、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２、またはＲＤＨＩ−００３）１００μｇ／マウスを静脈注射した。コントロールとして、ＲＤＨ阻害剤の溶剤であるＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ ５０μｌ+ＰＢＳ １５０μｌ／マウス）を静脈注射した。腫瘍体積をノギスを用いて長径、短径および高さを測定し、長径×短径×高さ÷２の計算式を用いて継時的に測定した。実験の流れを図４１に示す。
また、上記の腫瘍移植マウスに、ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を移入せず、移植の５日前、０日目および７日後に、ＲＤＨ１０阻害剤のみ（ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２、またはＲＤＨＩ−００３）１００μｇ／マウスを腹腔内注射した。コントロールとして、コーン油（１００μｇ／１００μｌ／マウス）を腹腔内注射した。上記と同様に、腫瘍体積を経時的に測定した。実験の流れを図４２に示す。【０１０４】
結果：
マウスの経時的腫瘍体積の測定結果を図４３に示す。ＲＤＨ１０阻害剤  ＲＤＨＩ−００１、ＲＤＨＩ−００２、ＲＤＨＩ−００３の３種類とも、腫瘍の増殖を抑制した。実施例９（５）では、これらの阻害剤の投与で、移入したＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）がマウス末梢血で著増していた。一方、ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を移入せず、阻害剤のみの投与では、腫瘍増殖抑制効果は見られなかった（図４４）。よって、ＲＤＨ１０阻害剤による腫瘍増殖抑制効果は、ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅を介して起こるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を用いてＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法、該調節剤を含む癌または感染症の予防および／または治療補助剤、該調節剤を含む免疫力増強剤等が提供される。これらは、医薬品等の分野、例えば、癌および感染症を含む種々の疾患の予防および／または治療のための医薬の開発および製造、ならびに該疾患の治療方法、特に免疫療法の開発等の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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