(57)【要約】  観察方法であって、観察対象を観察する第１観察段階と、第１観察段階により得られた情報に基づいて、観察対象を観察する第２観察段階とを含み、第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する段階を有し、第２観察段階は、第１観察段階で検出された細胞の状態に基づいて、細胞を観察するか否かを判断する段階を有する。上記観察方法において、第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞が所定の状態であるか否かを判定する段階を有し、第２観察段階は、所定の状態であると判定された細胞の個数または観察領域内の細胞の個数に対する割合に基づいて、観察領域の観察をするか否かを判断する段階を有してもよい。
2015004917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象を観察する第１観察段階と、
前記第１観察段階により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察段階とを含み、
前記第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記第１観察段階で検出された前記細胞の状態に基づいて、前記細胞を観察するか否かを判断する段階を有する観察方法。
【請求項２】
前記第１観察段階は、前記観察領域に含まれる細胞が所定の状態であるか否かを判定する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記所定の状態であると判定された細胞の個数または前記観察領域内の細胞の個数に対する割合に基づいて、前記観察領域の観察をするか否かを判断する段階を有する請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
前記第２観察段階は、前記所定の状態であると判定された細胞の個数または前記観察領域内の細胞の個数に対する割合が所定の値以上である場合は、前記観察領域を観察対象から除外する請求項２に記載の観察方法。
【請求項４】
前記第２観察段階は、前記所定の状態であると判定された細胞の個数または前記観察領域内の細胞の個数に対する割合が所定の値以下である場合は、前記観察領域を観察対象とする請求項３に記載の観察方法。
【請求項５】
前記第２観察段階は、前記観察領域内の細胞のうち前記所定の状態であると判定された細胞を観察対象から除外する請求項４に記載の観察方法。
【請求項６】
前記第２観察段階は、前記観察領域内の細胞のうち前記所定の状態であると判定された細胞に関するデータの処理を行わない請求項４に記載の観察方法。
【請求項７】
前記第１観察段階は、前記観察領域に含まれる細胞が所定の状態であるか否かを判定する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記所定の状態であると判定された細胞を観察するか否かを判断する段階を有する請求項１に記載の観察方法。
【請求項８】
前記第２観察段階は、前記観察領域内の細胞のうち前記所定の状態であると判定されなかった細胞が前記所定の状態であるか否かを判定する請求項２から７のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項９】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階において前記所定の状態であるか否かの判定ができなかった細胞を観察する段階を有する請求項２から８のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１０】
前記所定の状態は、細胞が死んでいる状態である請求項２から９のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１１】
前記第１観察段階は、前記細胞が死にかけている状態であるか否かを判断し、死にかけている状態であると判断した場合は前記細胞を死細胞であると判定しない請求項１から１０のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１２】
前記第１観察段階は、前記細胞が死にかけている状態であるか否かを判断し、死にかけている状態であると判断した場合は前記細胞を死細胞であると判定する請求項１から１０のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１３】
前記第１観察段階は、既知の細胞から得られた検出画像を参照情報とし、前記観察対象の検出画像と前記参照情報との比較により細胞の状態を検出する請求項１から１２のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１４】
前記第１観察段階は、前記細胞の形状に基づいて細胞の状態を検出する請求項１から１３のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１５】
前記第１観察段階は、細胞の細胞膜および細胞核の少なくとも一方が破壊されているか否かにより細胞の状態を検出する請求項１から１４のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１６】
前記第１観察段階は、前記観察対象における屈折率界面および非線形感受率界面の分布を観察する段階を有する請求項１から請求項１５までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１７】
前記第１観察段階は、観察対象に含まれる細胞の細胞核を特定する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記第１観察段階において検出された細胞核を観察する段階を有する請求項１から請求項１６までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１８】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階において検出された前記細胞核のスペクトルを検出する段階を有する請求項１７に記載の観察方法。
【請求項１９】
前記第１観察段階は、前記第２観察段階よりも、単位時間当たりの観察面積が広い請求項１から請求項１８までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２０】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階に比較して、観察対象の深さ方向について、より高い解像度で観察をする段階を有する請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２１】
前記第１観察段階は、
照射光を照射された前記観察対象から線形光学現象により射出された射出光を検出する第１の検出段階を有する請求項１から請求項２０までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２２】
前記第１観察段階は、微分干渉観察および第３高調波検出のいずれかを含む請求項２１に記載の観察方法。
【請求項２３】
前記第２観察段階は、
照射光を照射された前記観察対象から非線形光学現象により射出された射出光を検出する第２の検出段階を有する請求項１から２２のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２４】
前記第２観察段階が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出および誘導ラマン散乱光検出のいずれかを含む請求項２３に記載の観察方法。
【請求項２５】
前記第１観察段階および前記第２観察段階は、前記観察対象に対して共通の照射光を照射する段階を有する請求項１から請求項２４までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２６】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階で観察した第１観察領域内に第２観察領域を特定する段階を有する請求項１から請求項２５までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２７】
前記第２観察段階は、３５０ｎｍよりも長い波長を有する照射光を前記観察対象に照射する請求項１から請求項２６までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項２８】
前記第２観察段階は、ラマン散乱光の光路に挿入した光路変更部材により光路を変更された前記ラマン散乱光を検出する段階を有する請求項１から請求項２７までのいずれか一項記載の観察方法。
【請求項２９】
前記第１観察段階および前記第２観察段階は、少なくとも一部が共通する光学系を用いる請求項１から請求項２８までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項３０】
前記第２観察段階は、前記観察対象から射出されたラマン散乱光の光路に挿入された光路分岐部材により分岐された前記ラマン散乱光の一部を検出する段階を有する請求項２９に記載の観察方法。
【請求項３１】
前記第１観察段階で検出された第１検出画像と前記第２観察段階で検出された第２検出画像とを表示する表示段階を含む請求項１から３０のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項３２】
前記第１検出画像を格納する格納段階を含み、
前記表示段階は、前記格納段階で格納された前記第１検出画像を取得し、取得した前記第１検出画像を表示する請求項３１に記載の観察方法。
【請求項３３】
前記第１観察段階は、前記第２観察段階が開始した後も前記観察対象の撮像を継続し、
前記表示段階では、前記第２観察段階が実施されているときに撮像された前記観察対象の検出画像を表示する請求項３１に記載の観察方法。
【請求項３４】
前記表示段階は、前記第１検出画像上に前記第２観察段階の観察領域を示す画像を表示する請求項３１から３３のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項３５】
前記観察対象は、複数の細胞を含む細胞シートである請求項１から請求項３４までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項３６】
観察対象を観察する第１観察段階と、
前記第１観察段階により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察段階とを含み、
前記第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記第１観察段階で検出された前記細胞の状態に基づいて、観察した前記観察対象のデータを処理するか否かを判断する段階を有する観察方法。
【請求項３７】
細胞を単離して細胞株を用意する用意段階と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養段階と、
請求項１から請求項３６までのいずれか一項に記載された観察方法により前記細胞を観察する観察段階と
を備える細胞シート製造方法。
【請求項３８】
前記観察段階は、前記細胞シートの良否を判定する判定段階を含む請求項３７に記載の細胞シート製造方法。
【請求項３９】
細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養部と、
請求項１から請求項３６までのいずれか一項に記載された観察方法により前記細胞を観察する観察部と
を備える細胞シート製造装置。
【請求項４０】
前記観察部は、前記細胞シートの良否を判定する判定部を有する請求項３９に記載の細胞シート製造装置。
【請求項４１】
観察対象を観察する第１観察部と、
前記第１観察部により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察部と
を備え、
前記第１観察部は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する検出部を有し、
前記第２観察部は、前記検出部で検出された前記細胞の状態に基づいて、前記細胞を観察するか否かを判断する判断部を有する観察装置。
【請求項４２】
観察対象を観察する第１観察部と、
前記第１観察部により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察部と
を備え、
前記第１観察部は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する検出部を有し、
前記第２観察部は、前記第１観察部で検出された前記細胞の状態に基づいて、観察した前記観察対象のデータを処理するか否かを判断する判断部を有する観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察方法、観察装置、細胞シート製造方法および細胞シート製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞等の生体を損傷することなく高精度に観察する方法のひとつとして、観察対象において発生するＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）を検出して観察画像を生成する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１  特開２００５−０６２１５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＣＡＲＳ光は、励起光が集光された狭い領域において発生する。このため、ＣＡＲＳ観察は高分解能になるうえに、組成（脂質あるいは蛋白）選択性がある。しかし、非線形過程を利用した観察方法であるために信号光が弱く、高い分解能と引き換えに、単位時間当たりに観察できる面積が狭く、観察に時間がかかる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第一態様においては、観察対象を観察する第１観察段階と、第１観察段階により得られた情報に基づいて、観察対象を観察する第２観察段階とを含み、第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する段階を有し、第２観察段階は、第１観察段階で検出された細胞の状態に基づいて、細胞を観察するか否かを判断する段階を有する観察方法が提供される。【０００５】
本発明の第二態様においては、観察対象を観察する第１観察段階と、第１観察段階により得られた情報に基づいて、観察対象を観察する第２観察段階とを含み、第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する段階を有し、第２観察段階は、第１観察段階で検出された細胞の状態に基づいて、観察した観察対象の画像データを処理するか否かを判断する段階を有する観察方法が提供される。【０００６】
本発明の第三態様においては、細胞を単離して細胞株を用意する用意段階と、細胞株を細胞シートに培養する培養段階と、上記観察方法により細胞を観察する観察段階とを備える細胞シート製造方法が提供される。【０００７】
本発明の第四態様においては、細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、細胞株を細胞シートに培養する培養部と、上記観察方法により細胞を観察する観察部とを備える細胞シート製造装置が提供される。【０００８】
本発明の第五態様においては、観察対象を観察する第１観察部と、第１観察部により得られた情報に基づいて、観察対象を観察する第２観察部とを備え、第１観察部は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する検出部を有し、第２観察部は、検出部で検出された細胞の状態に基づいて、細胞を観察するか否かを判断する判断部を有する観察装置が提供される。【０００９】
本発明の第六態様においては、観察対象を観察する第１観察部と、第１観察部により得られた情報に基づいて、観察対象を観察する第２観察部とを備え、第１観察部は、観察領域に含まれる細胞の状態を検出する検出部を有し、第２観察部は、第１観察部で検出された細胞の状態に基づいて、観察した観察対象の画像データを処理するか否かを判断する判断部を有する観察装置が提供される。【００１０】
上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションもまた発明となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】レーザ顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。
【図２】レーザ顕微鏡１０１の制御系のブロック図である。
【図３】レーザ顕微鏡１０１を用いた観察手順を示す流れ図である。
【図４】微分干渉光の検出による観察画像を示す図である。
【図５】第二検出系１５０による検出領域の決定過程を示す図である。
【図６】ＣＡＲＳ光の検出による生細胞の観察画像を示す図である。
【図７】ＣＡＲＳ光の検出による死細胞の観察画像を示す図である。
【図８】レーザ顕微鏡１０２の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、下記の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１３】
図１は、レーザ顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。レーザ顕微鏡１０１は、ステージ１１０、レーザ装置１２０、光学系１３０、第一検出系１４０、第二検出系１５０、制御系１６０および走査系１８０を備える。レーザ顕微鏡１０１は、微分干渉光による観察と、ＣＡＲＳ光検出による観察との両方に用いることができる。
【００１４】
ステージ１１０は、レーザ顕微鏡１０１により観察されるサンプル１１２を支持する。ステージ１１０に支持されたサンプル１１２に対しては、一方の面（図示の例では図中下面）から照射光としてのレーザ光が照射される。また、ステージ１１０に対して、レーザ光が照射される側とは反対の側から線形光学現象により射出された射出光、または、非線形光学現象により射出された射出光を検出して観察画像が形成される。本実施例では、線形光学現象により射出された射出光として微分干渉光を用い、非線形光学現象により射出された射出光としてＣＡＲＳ光を用いる。
【００１５】
レーザ装置１２０は、複数のレーザ光源１２２、１２４、１２６と、コンバイナ１２８とを有する。レーザ光源１２２、１２４、１２６は、互いに異なる波長λｄ、λＰ、λＳを有するレーザ光を個別に発生する。本実施例においては、ひとつのレーザ光源１２２が発生する波長λｄのレーザ光が、微分干渉光の検出による観察に、照明光として用いられる。
【００１６】
また、他のレーザ光源１２４、１２６は、ＣＡＲＳ光検出による観察に用いられるパルスレーザを発生する。レーザ光源１２４、１２６が発生するパルスレーザは、波長λＰ、λＳを有する。レーザ光源１２４、１２６としては、例えば、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。なお、レーザ光源１２４、１２６の一方を、他方のレーザ光源１２４、１２６が発生したパルスレーザの波長を変換する光パラメトリック発振器に置き換えてもよい。
【００１７】
レーザ光源１２４、１２６により発生した２波長のピコ秒パルスのうち、短い方の波長λＰを有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるポンプ光として利用される。また、レーザ光源１２４、１２６の発生するピコ秒パルスのうち、長い方の波長λＳ有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるストークス光として利用される。
【００１８】
レーザ光源１２２、１２４、１２６から射出されたレーザ光は、それぞれ、偏光板１２１、１２３を通してコンバイナ１２８に入射される。ポンプ光、ストークス光の偏光板１２１と、照明光の偏光板１２３は、互いに４５度ずれた偏光面を有する。これにより、ポンプ光、ストークス光および照明光は、互いに４５°ずれた偏光面Ｃ、Ｄを有する直線偏光となる。また、レーザ光源１２６の偏光板１２３は、微分干渉光による観察をする場合のポラライザとしても使用される。
【００１９】
なお、偏光面Ｃと偏光面Ｄの向きは、反射鏡１９２、ガルバノスキャナ１８２等の反射鏡に対してどちらをＰ偏光またはＳ偏光としても良い。また、ＣＡＲＳ光の検出感度を優先するのならば、偏光面Ｃがこれらに対してＰ偏光またはＳ偏光として入射するのが良い。
【００２０】
コンバイナ１２８は、複数のレーザ光源１２２、１２４、１２６が発生したレーザ光を統合して単一の光路上に照射光として射出する。これにより、ポンプ光とストークス光とを併せた照射光をサンプル１１２に照射してＣＡＲＳ光を発生させることができる。尚、コンバイナ１２８においては、ＣＡＲＳ光観察に用いるポンプ光およびストークス光と微分干渉光観察に用いる照明光の偏光度を維持できるダイクロイックミラーを用いることが好ましい。
【００２１】
なお、レーザ装置１２０には、レーザ光源１２２、１２４が発生するポンプ光とストークス光とを同期させる目的で遅延光路を設けてもよい。遅延光路は、互いの間隔を変更できる複数の反射鏡により形成できる。また、レーザ装置１２０においては、フォトニック結晶ファイバを用いてストークス光を広帯域化してもよい。
【００２２】
レーザ顕微鏡１０１において、走査系１８０は、ガルバノスキャナ１８２およびスキャンレンズ１８４を有する。ガルバノスキャナ１８２は、互いに向きが異なる２軸の周りを揺動する反射鏡を備え、入射した照射光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。スキャンレンズ１８４は、ガルバノスキャナ１８２から射出された照射光を、予め定められた一次像面１８６上に合焦させる。これにより、レーザ装置１２０から射出された照射光でサンプル１１２の観察領域を走査させ、予め定められた広さを有する観察領域に照射光を照射できる。
【００２３】
光学系１３０は、ステージ１１０に対してレーザ装置１２０側に配された一対の第一対物レンズ１３２、１３４と、ステージ１１０に対して対物レンズ１３２、１３４と反対側に配されたコンデンサレンズ１３６とを有する。対物レンズ１３２、１３４は、サンプル１１２に向かって照射される照射光を、サンプル１１２における観察領域内で合焦させる。
【００２４】
光学系１３０の入射端側において、レーザ装置１２０と対物レンズ１３２との間の照射光の光路上には、反射鏡１９２が配される。反射鏡１９２は、照射光の光路を折り曲げて、レーザ顕微鏡１０１の構造物が過剰に高くなることを防止する。
【００２５】
反射鏡１９２としては、全反射プリズムではなく、入射光を表面で反射させる金属鏡を用いてもよい。これにより、反射鏡１９２は、偏光方向により位相差が生じることを緩和できる。
【００２６】
また、光学系１３０は、照射光の光路上において、ステージ１１０に支持されたサンプル１１２を挟んで配された一対の複屈折プリズム１７２、１７４を有する。照射光の伝播方向についてサンプル１１２の上流側に配される一方の複屈折プリズム１７２は、一対の対物レンズ１３２、１３４の間に配される。サンプル１１２に対して下流側に配される他方の複屈折プリズム１７４は、サンプル１１２と共にコンデンサレンズ１３６を挟むように配される。
【００２７】
上流側の複屈折プリズム１７２は、サンプル１１２に向かって照射する照射光を、互いに偏光が直交する一対の光束に分離する。分離された一対の光束は空間的に僅かに異なる位置を平行に伝播して、サンプル１１２において非常に近い、しかしながら異なる位置を透過する。サンプル１１２における一対の偏光の間隔はシャー量と呼ばれ、例えば０．２μｍ程度である。
【００２８】
なお、複屈折プリズム１７２、１７４としては、入射した直線偏光を、開き角を持って非平行に取り出すことができるウォラトンプリズムを使用できる。更に、分割した２つの偏光の焦点をプリズムの外側に有するノマルスキスリズムを好ましく使用できる。
【００２９】
サンプル１１２において互いに異なる位置を透過した一対の偏光は、サンプル１１２に対して下流側の複屈折プリズム１７４においてひとつの光ビームに結合される。しかしながら、サンプル１１２を異なる位置で透過しているので、結合される偏光は互いに異なる光路長を伝播している。このため、一対の偏光には位相差が生じ、結合された光ビームの強度を変化させる。こうして、サンプル１１２の光学特性の分布を反映した微分干渉光を検出して画像化することにより、サンプル１１２の形状をよく反映した観察画像が得られる。
【００３０】
なお、複屈折プリズム１７２、１７４は、専ら、微分干渉光の検出による観察で利用される。よって、レーザ顕微鏡１０１をＣＡＲＳ光の検出により観察する場合には、複屈折プリズム１７２、１７４を、照射光の光路から外してもよい。一方、複屈折プリズム１７２、１７４を光路に対して挿抜した場合には、光学系１３０の特性が変化してサンプル１１２における観察位置がずれてしまう場合がある。よって、微分干渉光の検出による観察と、ＣＡＲＳ光の検出による観察との観察位置を高精度に一致させる場合は、複屈折プリズム１７２、１７４を装着したままＣＡＲＳ光検出による観察をしてもよい。
【００３１】
照射光の伝搬光路に沿って、複屈折プリズム１７４の下流側には、第一検出系１４０および第二検出系１５０が配される。第一検出系１４０は、サンプル１１２から射出された検出光のうち、微分干渉光の検出に用いられる。第二検出系１５０は、サンプル１１２から射出された検出光のうち、ＣＡＲＳ光の検出に用いられる。
【００３２】
第一検出系１４０は、偏光板１７６、集光レンズ１４２、リレーレンズ１４４および光電子増倍管１４６を有する。偏光板１７６は、微分干渉光による観察におけるアナライザとして用いられる。これにより、異なる光路を経由して入射した一対の偏光が干渉を生じ、照射光に対して透明なサンプル１１２の形状に応じた明暗を有する微分干渉光となる。
【００３３】
微分干渉光は、集光レンズ１４２およびリレーレンズ１４４により集光され、光電子増倍管１４６に効率よく検出され、観察画像が形成される。微分干渉光による観察は、位相差顕微鏡と異なり照明の開口数に制約がないので、光軸と垂直方向の解像力を顕微鏡対物レンズの限界まで発揮できる。また、微分干渉光により得られる観察画像は輪郭にハロが生じないので、高い解像度が得られる。
【００３４】
なお、第一検出系１４０の集光レンズ１４２とリレーレンズ１４４との間には、反射鏡１９４が配される。反射鏡１９４は、検出光の光路を折り曲げて、レーザ顕微鏡１０１の構造物が過剰に高くなることを防止する。
【００３５】
第二検出系１５０は、集光レンズ１５２、リレーレンズ１５４、光電子増倍管１５６およびダイクロイックミラー１５８を有する。ダイクロイックミラー１５８は、サンプル１１２から射出されたＣＡＲＳ光を、第一検出系１４０の偏光板１７６よりも上流側で分岐させ、集光レンズ１５２およびリレーレンズ１５４を通じて光電子増倍管１５６に導入する。よって、ＣＡＲＳ光は、光量が低下することなく光電子増倍管１５６に受光される。
【００３６】
なお、ダイクロイックミラー１５８は、ＣＡＲＳ光を検出する場合に限って使用される。よって、微分干渉光を観察する場合に、ダイクロイックミラー１５８を検出光の光路から抜き取ってもよい。また、サンプル１１２から射出される検出光の、ダイクロイックミラー１５８に対する入射角は、４５°よりも小さいことが好ましい。これにより、ＣＡＲＳ光を効率よく抽出することができる。
【００３７】
制御系１６０は、制御部１６２、キーボード１６４、マウス１６６および表示部１６８を有する。制御部１６２は、汎用パーソナルコンピュータに後述する制御手順を実行させるプログラムを実装することにより形成できる。
【００３８】
キーボード１６４およびマウス１６６は、制御部１６２に接続され、制御部１６２にユーザの指示を入力する場合に操作される。表示部１６８は、キーボード１６４およびマウス１６６によるユーザの操作に対してフィードバックを返すと共に、制御部１６２が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。
【００３９】
制御部１６２は、レーザ装置１２０、第一検出系１４０、第二検出系１５０および走査系１８０の各々に接続され、それぞれの動作を制御する。また、第一検出系１４０および第二検出系１５０の検出結果に基づいて、表示部１６８に表示する画像を生成する。また、制御部１６２は、第一検出系１４０および第二検出系１５０の検出結果に基づいて、サンプル１１２の状態を判定する。
【００４０】
制御系１６０は、ユーザから受け付けた指示に応じて、レーザ顕微鏡１０１全体の動作を制御する。また、制御系１６０は、第一検出系１４０および第二検出系１５０の検出結果に基づいて観察画像を生成する。また、制御系１６０は、サンプル１１２の状態を反映した判定結果を示す文字列または符号を併せて出力してもよい。
【００４１】
上記のようなレーザ顕微鏡１０１においては、微分干渉光による観察をするための照明光と、ＣＡＲＳ光の検出による観察をするためのポンプ光およびストークス光とが、互いに４５°で交わる偏光面Ｃ、Ｄを有する。サンプル１１２から射出されるＣＡＲＳ光を分離する目的で配されたダイクロイックミラー１５８は、微分干渉光がＰ偏光またはＳ偏光となるように配置される。よって、ダイクロイックミラー１５８に形成された干渉膜の偏光特性が微分干渉光の波長に対して小さくなり、微分干渉光による観察の観察精度が低下することが防止される。なお、このためにはダイクロイックミラー１５８と反射鏡１９２の配置される向きは、図１とは異なってもかまわない。
【００４２】
なお、ダイクロイックミラー１５８は、ＣＡＲＳ光を検出する場合に限って使用される。よって、微分干渉光による観察の画質を重視する場合に、ダイクロイックミラー１５８を検出光の光路から抜き取れるように設けてもよい。
【００４３】
図２は、レーザ顕微鏡１０１における制御系のブロック図である。レーザ顕微鏡１０１において、制御部１６２は、第一判定部３１０、格納部３２０、走査制御部３３０，検出制御部３４０および第二判定部３５０を備える。また、制御部１６２は、入出力部１６３を通じて、キーボード１６４、マウス１６６、表示部１６８、レーザ装置１２０、第一検出系１４０、第二検出系および走査系１８０に結合される。
【００４４】
第一判定部３１０は、第一検出系１４０の検出結果に基づいて検出制御部３４０が生成したサンプル１１２の検出画像と、格納部３２０から参照した参照情報とに基づいて、細胞の状態が所定の状態であるか否かを判定する。本実施例では、所定の状態は細胞が死んでいる状態である。本実施例では、生きている細胞を生細胞と称し、死んでいる細胞を死細胞と称す。
【００４５】
すなわち、第一判定部３１０は、第一検出系１４０で検出された細胞が生細胞であるか死細胞であるかを判定する。例えば、第一判定部３１０は、既知の細胞から得られた検出画像を格納部３２０から取得して参照情報とし、サンプル１１２から得られた検出画像と参照情報との類似性を評価することにより細胞の生死を判定してもよい。
【００４６】
また、第一判定部３１０は、既知の細胞から得られた検出画像から抽出した特徴事項を格納部３２０から取得して参照情報とし、サンプル１１２から得られた検出画像の特徴が参照情報に当てはまるか否かにより細胞の生死を判定してもよい。第一判定部３１０による判定結果は、表示部１６８を通じて外部に出力される。更に、第一判定部３１０は、表示部１６８を通じて参照情報と検出画像とをユーザに向かって表示することにより、判定処理の一部または全部をユーザに委ねてもよい。
【００４７】
第二判定部３５０は、第一判定部３１０で判定された細胞の状態に基づいて、第一検出系１４０で検出された細胞を第二検出系１５０で検出するか否かを判定する。第二判定部３５０は、第一判定部３１０で細胞が所定の状態すなわち死細胞であると判定された細胞を観察するか否かを判定する。本実施例では、第二判定部３５０は、第一判定部３１０で死細胞であると判定されなかった細胞の生死状態を判定する。
【００４８】
また、本実施例では、第二判定部３５０は、第一判定部３１０で細胞が生細胞であるか死細胞であるかの判定が明確にされなかった細胞を観察する。これにより、第一判定部３１０で生死が不明の細胞を第二検出系１５０で検出することができるので、細胞の生死を漏れなく判定することができる。
【００４９】
第二判定部３５０は、第二検出系１５０の検出結果に基づいて検出制御部３４０が生成したサンプル１１２の検出画像と、格納部３２０から参照した参照情報とに基づいて、細胞が生細胞であるか死細胞であるかを判定する。ここで、第二判定部３５０が判定の対象とするのは、サンプル１１２から発生したＣＡＲＳ光を検出して生成した観察画像に基づいて判定する。よって、第二判定部３５０による判定は、ＣＡＲＳ光観察の組成選択性に基づく高い精度を有する。
【００５０】
判定は、例えば、既知の細胞から得られた検出画像を格納部３２０から取得して参照情報とし、サンプル１１２から得られた検出画像と参照情報との類似性を評価することにより細胞の生死を判定してもよい。また、第二判定部３５０は、既知の細胞から得られた検出画像から抽出した特徴事項を格納部３２０から取得して参照情報とし、サンプル１１２から得られた検出画像の特徴が参照情報に当てはまるか否かにより細胞の生死を判定してもよい。
【００５１】
更に、第二判定部３５０は、サンプル１１２から検出された検出画像をフーリエ変換処理、微分処理等の画像処理により算出した評価値を、格納部３２０から取得した評価値と比較し、予め定められた閾値により細胞の生死を判定してもよい。第二判定部３５０による判定結果は、表示部１６８を通じて外部に出力される。また更に、第二判定部３５０は、表示部１６８を通じて参照情報と検出画像とをユーザに向かって表示することにより、判定処理の一部または全部をユーザに委ねてもよい。
【００５２】
格納部３２０は、制御部１６２自体の制御手順を記述した制御プログラムを格納する。制御部１６２は、格納部３２０に格納された制御プログラムを読み出して、レーザ顕微鏡１０１の動作を制御する。また、格納部３２０は、第一検出系１４０または第二検出系１５０が検出した検出結果を格納して、検出制御部３４０が検出画像を生成する場合に参照させる。
【００５３】
更に、格納部３２０は、サンプル１１２となる細胞の生死を判定する場合に参照される参照情報を格納する。参照情報は、生死が既知である細胞から検出された検出画像であってもよい。また、参照情報は、生死が既知である細胞から検出された検出画像の特徴事項を表す情報であってもよい。更に、参照情報は、生死が既知である細胞から検出された検出画像を、フーリエ変換処理、微分処理等により画像処理して算出された評価値と、当該評価値を算出した方法等を示す情報であってもよい。
【００５４】
走査制御部３３０は、第一検出系１４０または第二検出系１５０のいずれかを用いることを指示された場合に、使用する検出系に応じて、走査系１８０を動作させる。これにより、照射光でサンプル１１２の観察領域を走査させて、サンプル１１２において予め定められた観察領域を、ひとつの観察平面において観察できる。
【００５５】
検出制御部３４０は、照射光の走査タイミングとレーザ装置１２０の発光タイミングとを参照して、第一検出系１４０および第二検出系１５０の検出タイミングを指示する。また、検出制御部３４０は、サンプル１１２における照射光の照射位置と共に、第一検出系１４０または第二検出系１５０の検出結果を取得する。これにより、検出制御部３４０は、検出光の光強度を、サンプル１１２における発光位置にマッピングして、サンプル１１２の観察画像を生成する。
【００５６】
図３は、レーザ顕微鏡１０１を用いてサンプル１１２を観察する場合の手順を示す流れ図である。レーザ顕微鏡１０１を用いてサンプル１１２を観察する場合は、まず、レーザ光源１２６のよび第一検出系１４０を有効にして、微分干渉光によりサンプル１１２を観察する（ステップＳ１０１）。
【００５７】
これにより、サンプル１１２を広範囲且つ高速に観察して観察画像を生成できる。例えば動物細胞を観察した場合であれば、観察画像には複数の細胞が含まれる。サンプル１１２から得られる観察画像の解像度は微分干渉光の解像度に依存する。よって、観察画像からは、細胞の輪郭を示す細胞膜の他、細胞核等の比較的大きな細胞小器官を観察できる。
【００５８】
そこで、制御系１６０において、第一判定部３１０は、微分干渉光により得られた観察画像に基づいて、第一死細胞判定を実行する（ステップＳ１０２）。第一死細胞判定においては、細胞膜、核等が既に破壊されている等、歴然とした死細胞が判定される。
【００５９】
次に、制御系１６０において、検出制御部３４０は、第二検出系１５０による観察領域を特定する（ステップＳ１０３）。この段階においては、ステップＳ１０２において死細胞であることが判定された細胞が、第二検出系１５０により観察領域から除外される。
【００６０】
次に、引き続き検出制御部３４０は、レーザ光源１２２、１２４および第二検出系１５０を有効にして、ＣＡＲＳ光の検出による観察を実行する（ステップＳ１０４）。ステップＳ１０４における観察におい、検出制御部３４０は、ステップＳ１０３において特定された観察領域に基づいて走査制御部３３０を制御する。これにより、ステップＳ１０２の第一死細胞判定において死細胞であることが既に判定されている細胞は、観察対象から除かれる。
【００６１】
つまり、観察対象上でＣＡＲＳ光を走査するときに、死細胞が存在する箇所を観察せずに通過する。このため、画像データを取得しながら観察するときの走査速度に比べて、死細胞が存在する箇所の走査速度を速めることができる。死細胞が存在する箇所を通過するとき、当該箇所へのＣＡＲＳ光の照射を停止してもよい。よって、第一検出系１４０を用いずに観察対象の全ての領域を第二検出系１５０のみで観察する場合に比べて、第二検出系１５０による走査時間が短くなるため、第二検出系１５０による観察に要する時間を短縮できる。また、第二検出系１５０による検出対象領域の大きさが、第一検出系１４０を用いずに観察対象の全ての領域を第二検出系１５０のみで観察する場合に比べて小さくなるため、第二検出系１５０による観察に要する時間を短縮できる。よって、検出制御部３４０は、ＣＡＲＳ光による解像度の高い観察画像を迅速に生成できる。
【００６２】
続いて、第二判定部３５０は、ＣＡＲＳ光により得られた観察画像に基づいて、第二死細胞判定を実行する（ステップＳ１０５）。第二死細胞判定は、個々の分子結合まで検出し得る情報を有する観察画像によるので、観察対象の細胞を精度よく判定することができる。こうして、高い組成選択性を有するＣＡＲＳ光の観察画像精度で、サンプル１１２の広い領域を判定できる。また、ＣＡＲＳ光による観察は、照射光の照射方向、即ち、観察対象であるサンプル１１２の深さ方向（奥行き方向）についても高い解像度を有する。よって、深さ方向についても高い解像度でサンプル１１２を観察できる。
【００６３】
第二検出系１５０による検出時、または、第二判定部３５０による判定時に、第一検出系１４０で検出された第一観察画像と第二検出系１５０で検出された第二観察画像とを同時に表示してもよい。この場合、例えば、第一観察画像を格納部３２０に格納し、第二検出系１５０による検出時、または、第二判定部３５０による判定時に、格納された第一観察画像を取得し、取得した第一観察画像を表示してもよい。また、第二検出系１５０による検出が開始した後も第一検出系１４０による検出を継続し、第二検出系１５０による検出時、または、第二判定部３５０による判定時に、第一観察画像と第二観察画像とを表示してもよい。更に、第一観察画像上に第二検出系１５０による観察領域を示す画像を表示することにより、第二検出系１５０が第一観察画像のいずれの位置を検出しているのかが分かるようにしてもよい。
【００６４】
このように、レーザ顕微鏡１０１を用いて、高速且つ高精度にサンプル１１２を観察できる。また、サンプル１１２が生体細胞である場合には、微分干渉光による観察も、ＣＡＲＳ光による観察も、いずれもがサンプル１１２を損傷しないので、使用前の細胞シート等を観察することができる。
【００６５】
更に、上記の一連の手順を終えた後に、微分干渉光により生成した観察画像と、ＣＡＲＳ光の検出により生成した観察画像とを合成して、微分干渉光により検出した細胞の輪郭と、ＣＡＲＳ光により検出した脂質等の分布とを併せて表示する観察画像を生成できる。これにより、個々の細胞の生死判定等が容易になる。
【００６６】
なお、第一死細胞判定（ステップＳ１０２）において検出された細胞核に対して、第二死細胞判定（ステップＳ１０５）において、当該細胞核のスペクトルを検出する段階を設けてもよい。これにより、細胞の生死を、異なる方法によっても確認することができる。なお、細胞核のスペクトルは、例えば、第二検出系１５０において、光電子増倍管１５６に換えて、あるいは、光電子増倍管１５６に加えて、ポリクロメータを設けることにより測定できる。
【００６７】
図３で示した観察工程を、例えば同様のプロセスで製造された複数の細胞シートのうち最初の一枚の観察時に実行し、その結果、死細胞の数もしくは割合が所定の値よりも小さい場合には、残りの複数の細胞シートのそれぞれの観察時に、第一検出系１４０で死細胞と判定された細胞を第二検出系１５０での検出時に検出してもよく、または、残りの複数の細胞シートの観察時に第一検出系１４０および第二検出系１５０のいずれかによる観察を省略してもよい。
【００６８】
また、製造プロセス過程で入念に検査を行った方がよい旨の判断がされた細胞シートについては、第一検出系１４０で死細胞であると判定された細胞を第二検出系１５０で再度検査してもよく、または、第一検出系１４０による観察を省略し、他の細胞シートの観察時に図３に記載の観察工程を実行してもよい。つまり、第二判定部３５０は、第一判定部３１０で細胞が死細胞であると判定された細胞を第二検出系１５０で観察すると判定してもよい。
【００６９】
図４および図５は、上記ステップＳ１０１において微分干渉光に基づいて生成された観察画像を例示する図である。図示のように、観察されたサンプル１１２には、生細胞と死細胞とが混在している。図４において白い円で囲って示すように、生細胞は明瞭な細胞核を含むことが、観察画像から判別できる。よって、観察画像から、サンプル１１２に含まれる生細胞の数を容易に係数できる。
【００７０】
また、図５において白い円で囲って示すように、一部の細胞は、輝度の高い複数の小粒子を含む。このような細胞は、既に死細胞であるか、あるいは死につつある細胞と推定される。すなわち、第一判定部３１０は、細胞が死にかけている状態であるか否かを判断し、死にかけている状態であると判断した場合は、その細胞を死細胞であると判定する。よって、上記ステップＳ１０２において、死細胞判定された細胞は、ステップＳ１０３において、ＣＡＲＳ光の観察対象から除外される。また、細胞相互の間の空隙も、ＣＡＲＳ光による観察対象から除外される。第一判定部３１０は、死にかけている細胞を死細胞であると判定したが、これに代えて、死にかけている細胞を生細胞であると判定してもよい。
【００７１】
なお、微分干渉光により生死が判定された細胞は、ＣＡＲＳ光による観察の対象から除かれる。よって、第一検出系１４０を用いずに観察対象の全ての領域を第二検出系１５０のみで観察する場合に比べて、第二検出系１５０による走査時間が短くなる。また、ＣＡＲＳ光により観察する領域の面積は、第一検出系１４０を用いずに観察対象の全ての領域を第二検出系１５０のみで観察する場合に比べて小さくなる。よって、ＣＡＲＳ光による観察を終えるまでに要する時間を短縮することができる。
【００７２】
図６は、レーザ顕微鏡１０１の第二検出系１５０を用いて、ＣＡＲＳ光検出により生成した観察画像を示す図である。図示の検出画像は、生細胞により形成された細胞シートにおける、光軸と直交する単一の観察平面について生成された。
【００７３】
レーザ顕微鏡１０１のレーザ装置１２０からは、波長１０６４ｎｍのポンプ光と、波長１５５０ｎｍのストークス光とをサンプル１１２に照射した。これにより、サンプル１１２が含む細胞の各々において、脂質が含むＣＨ結合で波長８２０ｎｍのＣＡＲＳ光が発生する。
【００７４】
また、走査系１８０により光路を変位させながら照射光を繰り返しサンプル１１２に照射して、観察平面における一辺が５０μｍの正方形の領域から射出されたＣＡＲＳ光を、光電子増倍管１５６により検出した。検出制御部３４０は、検出したＣＡＲＳ光の光強度を、走査系１８０による走査に応じてプロットすることにより観察画像を生成した。
【００７５】
検出制御部３４０において生成された検出画像は、細胞シートが含む脂質の分布を反映した輝点を有する。また、検出画像に複数現れる黒い斑点は、脂質を含まない細胞核の配置に対応する。よって、例えば、これら斑点を計数することにより、生細胞における脂質の分布の特徴を検知できる。このように、微分干渉光の検出では判定できない個々の細胞について、観察対象が生細胞であることを精度よく判定できる。
【００７６】
なお、生細胞から検出された検出画像をフーリエ変換した場合には、高い空間周波数成分が少ないことにより特徴付けられる。よって、予め閾値を設定して、未知のサンプルから検出した検出画像の空間周波数が当該閾値よりも低い場合、サンプルの細胞は生細胞であると判定してもよい。
【００７７】
図７は、レーザ顕微鏡１０１の第二検出系１５０を用いて、ＣＡＲＳ光検出により生成した他の観察画像を示す図である。図示の検出画像は、ネクローシス死した死細胞により形成された細胞シートにおける、光軸と直交する単一の観察平面について生成された。
【００７８】
レーザ顕微鏡１０１における観察条件は、照射光の波長も含めて、図６に示した生細胞の細胞シートを観察した場合と同じとした。よって、図８に示した検出画像は、死細胞における脂質の分布を反映している。
【００７９】
図示の検出画像からは、脂質の存在により発生する輝点が分散して局部的に集中する分布の特徴が判る。なお、この検出画像では、輝点が周囲に対して著しく高い輝度を有するので、各輝点のピークが明瞭になるように検出画像全体の輝度を低下させて表示した。
【００８０】
上記のような死細胞から検出された検出画像をフーリエ変換した場合、空間周波数に高い成分が含まれることにより特徴付けられる。よって、予め閾値を設定して、未知のサンプルから検出した検出画像の空間周波数が当該閾値を超えた場合に、サンプルの細胞は死細胞であると判定できる。このように、微分干渉光の検出では判定できない個々の細胞について、観察対象が生細胞であることを精度よく判定できる。
【００８１】
なお、上記の例では、脂質に含まれる分子においてラマン散乱光を発生する照射光がサンプルに照射された。しかしながら、サンプルに含まれる細胞の種類に応じて、ラマン散乱光を発生させ得る他の種類の分子を検出対象として選択してもよい。また、例えば、脂質の分布を検出すると共に、蛋白質を検出した観察画像も生成し、脂質と蛋白質とが排他的に分布することを利用してノイズを除去してもよい。
【００８２】
検出画像に基づいて細胞の状態を判別する指標は、上記の例に限られるわけではない。例えば、細胞の判定指標のひとつとして、生細胞は動くが死細胞は動かないという特徴に基づいて生死を判定することを例示できる。
【００８３】
この場合、サンプルとなる細胞の同じ観察領域について、時間的な間隔をおいて２回以上観察し、観察により得られた画像を比較して変化がない細胞は死細胞であると判定できる。このような細胞の動きによる判定指標を用いる場合は、特に、ミトコンドリアなどの細胞小器官の位置が変化するか否かに着目し、細胞小器官に多く含まれる脂質の分布を検出した画像に基づいて、細胞の動きを容易に検知できる。
【００８４】
更に、レーザ顕微鏡１０１を用いて判定できる事項は、細胞の生死に限らない。例えば、同じ死細胞であっても、検出画像の特徴により、死細胞がネクローシス死したものかアポトーシス死したものかを判定することができる。
【００８５】
アポトーシス死した細胞の輪郭は、二次元的に見た場合に平たく細長かったかった生細胞に比較すると、丸い円の形状に近づく。また、細胞の内部においては核濃縮が起こる。更に、細胞膜は生きた状態より小さく縮む。更に、アポトーシス死した細胞においては、細胞質内のいくつかの小器官が脂質膜に閉じ込められ、周囲にある他の細胞からは剥れ、最終的に、複数に分裂したアポトーシス小胞体になる。
【００８６】
このように、広範囲を高速に観察できる微分干渉光により広い領域を観察した後に、解像度の高いＣＡＲＳ光検出により要所を観察することにより、サンプル１１２の広い領域について高精度な判定を迅速に下すことができる。
【００８７】
図８は、他のレーザ顕微鏡１０２の構造を模式的に示す図である。レーザ顕微鏡１０２は、次に説明する部分を除くと、図１に示したレーザ顕微鏡１０１と同じ構造を有する。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。
【００８８】
レーザ顕微鏡１０２は、第三検出系２１０を備える点で、レーザ顕微鏡１０１と異なる。第三検出系２１０は、第二検出系１５０と同様に、ダイクロイックミラー２１８、集光レンズ２１２、リレーレンズ２１４および光電子増倍管２１６を有する。ただし、ダイクロイックミラー２１８が反射する光の波長は、第二検出系１５０のダイクロイックミラー１５８と異なる。
【００８９】
レーザ顕微鏡１０２の第三検出系２１０におけるダイクロイックミラー２１８は、レーザ光源１２２、１２４のいずれかから照射されたポンプ光またはストークス光によりサンプル１１２において発生した第三高調波を含む帯域を反射する。よって、第三検出系２１０において、光電子増倍管２１６は、集光レンズ２１２およびリレーレンズ２１４により集光された第三高調波を受光して検出する。
【００９０】
第三高調波は、サンプル１１２における３次の感受率χ（３）に応じて発生する。よって、サンプル１１２として例えば細胞を観察した場合においては、細胞膜、細胞核等の界面において第三高調波が発生する。よって、第三検出系２１０において第三高調波を選択的に検出することにより、細胞、核等の輪郭を、ＣＡＲＳ光の検出による観察に匹敵する解像度で検出できる。
【００９１】
なお、微分干渉光の観察により、細胞膜の位置が予め判っている場合には、該当部分に対してのみ、レーザ光源１２２、１２４が発生するパルスレーザを照射することにより、細胞の輪郭を高解像度で検出できる。よって、第三検出系２１０により細胞膜を検出する段階を付加しても、観察領域全体を隈なくパルスレーザにより走査する場合に比較すると、観察に要する時間は大幅に短縮される。
【００９２】
また、ダイクロイックミラー２１８も、第三高調波を検出する場合に限って使用される。よって、微分干渉光を観察する場合に、ダイクロイックミラー２１８を検出光の光路から抜き取ってもよい。また、サンプル１１２から射出される検出光の、ダイクロイックミラー２１８に対する入射角は、４５°よりも小さいことが好ましい。これにより、第三高調波を効率よく抽出することができる。
【００９３】
更に、レーザ顕微鏡１０２は、第一検出系１４０および第二検出系１５０に加えて第三検出系２１０を設けた構造を有する。しかしながら、第一検出系１４０および第二検出系１５０のいずれかと交換して第三検出系２１０を設けてもよい。また、第一検出系１４０、第二検出系１５０および第三検出系２１０を、それぞれ個別の顕微鏡として形成してもよい。更に、３次の非線形光学効果のひとつである誘導ラマン散乱光を検出する検出系を用いて第三検出系２１０を形成してもよい。
【００９４】
上記した実施例では、第一判定部３１０において死細胞であると判定された細胞を第二検出系１５０の観察領域から除外することにより、第二検出系１５０による検出対象から死細胞を除外した例を示したが、これに代えて、以下のように死細胞を第二検出系１５０の検出対象から除外してもよい。
【００９５】
例えば、第一判定部３１０は、第一検出系１４０の観察領域に含まれる細胞が所定の状態すなわち死細胞であるか否かを判定し、第二判定部３５０は、第一検出系１４０の観察領域内において死細胞であると判定された細胞の個数、または、第一検出系１４０の観察領域内の全体の細胞の個数に対する死細胞の割合に基づいて、第一検出系１４０で観察された領域を第二検出系１５０で観察するか否かを判断する。
【００９６】
第二判定部３５０は、第一検出系１４０の観察領域において死細胞であると判定された細胞の個数または割合が所定の値以上である場合は、第一検出系１４０の観察領域を第二検出系１５０で観察しない旨の判定をする。すなわち、死細胞であると判定された細胞を含む観察領域を、第二検出系１５０の観察対象から除外する。第一検出系１４０の観察領域を第二検出系１５０の観察対象から除外するときの全体の細胞数に対する死細胞の割合は、例えば３０％以上であり、より好ましくは、１０％以上である。
【００９７】
また、第二判定部３５０は、死細胞であると判定された細胞の個数または割合が所定の値以下である場合は、第一検出系１４０の観察領域を第二検出系１５０の観察対象から除外せずに第二検出系で観察する。このとき、第一検出系１４０の観察領域内の細胞のうち死細胞であると判定された細胞以外の細胞を第二検出系１５０で観察する旨の判定をしてもよい。
【００９８】
また、上記した例では、観察対象の死細胞が存在する箇所もしくは死細胞を含む観察領域の上でＣＡＲＳ光を走査するときに、第二検出系１５０で観察せずに通過する例を示したが、これに代えて、死細胞が存在する箇所または領域を第二検出系１５０観察してもよい。この場合、第二判定部３５０による生死判定のためのデータ処理や細胞核のスペクトル検出等のデータ処理は行わない。これにより、観察対象の全ての領域について第二検出系１５０で検出したデータを処理する場合に比べて、第二検出系１５０による全体のデータ処理時間が短くなるため、第二検出系１５０による観察に要する時間を短縮できる。死細胞が存在する箇所または領域の観察により得られた画像データを格納部３２０に格納し、死細胞と判定された細胞の再検査等を行うときに、その画像データを格納部３２０から取得してデータ処理してもよい。
【００９９】
死細胞の個数または割合が所定の値以下である観察領域を第二判定部３５０により観察し、第二判定部３５０により生死判定した結果、死細胞の個数または割合が所定の値以下である場合には、第二判定部３５０は、その観察領域は良であると判定し、所定の値以上である場合には、第二判定部３５０は、その観察領域は不良であると判定する。
【０１００】
更に、細胞シートを製造する製造装置に上記細胞観察方法を用いることができる。即ち、細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、細胞株を細胞シートに培養する培養部と、上記の細胞観察方法により細胞シートにおける細胞の生死を判定する判定部とを備える製造装置に、上記細胞観察方法を用いることにより、死細胞が少ない、あるいは、生細胞が多く含まれた高品質な細胞シートを効率よく製造できる。また、この製造装置において、上記細胞観察方法を、培養中の細胞の観察に適用してもよく、それ以外の製造段階で用いてもよい。
【０１０１】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。
【０１０２】
請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【０１０３】
１０１、１０２  レーザ顕微鏡、１１０  ステージ、１１２  サンプル、１２０  レーザ装置、１２１、１２３、１７６  偏光板、１２２、１２４、１２６  レーザ光源、１２８  コンバイナ、１３０  光学系、１３２、１３４  対物レンズ、１３６  コンデンサレンズ、１４０  第一検出系、１４２、１５２、２１２  集光レンズ、１４４、１５４、２１４  リレーレンズ、１４６、１５６、２１６  光電子増倍管、１５０  第二検出系、１５８、２１８  ダイクロイックミラー、１６０  制御系、１６２  制御部、１６３  入出力部、１６４  キーボード、１６６  マウス、１６８  表示部、１７２、１７４  複屈折プリズム、１８０  走査系、１８２  ガルバノスキャナ、１８４  スキャンレンズ、１８６  一次像面、１９２、１９４  反射鏡、２１０  第三検出系、３１０  第一判定部、３２０  格納部、３３０  走査制御部、３４０  検出制御部、３５０  第二判定部
【図１】
2015004917.tif 000003
【図２】
2015004917.tif 000004
【図３】
2015004917.tif 000005
【図８】
2015004917.tif 000006
【図４】
2015004917.tif 000007
【図５】
2015004917.tif 000008
【図６】
2015004917.tif 000009
【図７】
2015004917.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月12日(2016.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象を観察する第１観察段階と、
前記第１観察段階により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察段階とを含み、
前記第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の生死を判定する段階を有し、
前記第２観察段階は、生きていると判定された細胞または死んでいると判定された細胞の個数または前記観察領域内における細胞の個数に対する割合に基づいて、前記観察領域の観察をするか否かを判断する段階を有する観察方法。
【請求項２】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階において生死が判定できなかった細胞を観察する段階を有する請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
前記第１観察段階は、既知の細胞から得られた検出画像を参照情報とし、前記観察対象の検出画像と前記参照情報との比較により細胞の生死を検出する請求項１または２に記載の観察方法。
【請求項４】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階に比較して、観察対象の深さ方向について、より高い解像度で観察をする段階を有する請求項１から３のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項５】
前記第１観察段階は、
照射光を照射された前記観察対象から線形光学現象により射出された射出光を検出する第１の検出段階を有する請求項１から４のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項６】
前記第１観察段階は、微分干渉観察および第３高調波検出のいずれかを含む請求項５に記載の観察方法。
【請求項７】
前記第２観察段階は、
照射光を照射された前記観察対象から非線形光学現象により射出された射出光を検出する第２の検出段階を有する請求項１から６のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項８】
前記第２観察段階が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出および誘導ラマン散乱光検出のいずれかを含む請求項７に記載の観察方法。
【請求項９】
前記第１観察段階および前記第２観察段階は、前記観察対象に対して共通の照射光を照射する段階を有する請求項１から８のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１０】
前記第２観察段階は、前記第１観察段階で観察した第１観察領域内に第２観察領域を特定する段階を有する請求項１から９のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１１】
前記第２観察段階は、３５０ｎｍよりも長い波長を有する照射光を前記観察対象に照射する請求項１から１０のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１２】
前記第１観察段階で検出された第１検出画像と前記第２観察段階で検出された第２検出画像とを表示する表示段階を含み、
前記第１観察段階は、前記第２観察段階が開始した後も前記観察対象の撮像を継続し、
前記表示段階では、前記第２観察段階が実施されているときに撮像された前記観察対象の検出画像を表示する請求項１から１１のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１３】
前記観察対象は、複数の細胞を含む細胞シートである請求項１から１２のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項１４】
観察対象を観察する第１観察段階と、
前記第１観察段階により得られた情報に基づいて、前記観察対象を観察する第２観察段階とを含み、
前記第１観察段階は、観察領域に含まれる細胞の生死を検出する段階を有し、
前記第２観察段階は、前記第１観察段階で検出された前記細胞の生死に基づいて、観察した前記観察対象のデータを処理するか否かを判断する段階を有する観察方法。
【請求項１５】
細胞を単離して細胞株を用意する用意段階と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養段階と、
請求項１から１４のいずれか一項に記載された観察方法により前記細胞を観察する観察段階と、
前記細胞シートの良否を判定する判定段階と
を備える細胞シート製造方法。
【請求項１６】
細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養部と、
請求項１から１４のいずれか一項に記載された観察方法により前記細胞を観察する観察部と、
前記細胞シートの良否を判定する判定部と
を備える細胞シート製造装置。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれか一項に記載された観察方法により前記細胞を観察する観察部を備える細胞シート観察装置。
【国際調査報告】
2015004917.tif 000011
2015004917.tif 000012
2015004917.tif 000013
2015004917.tif 000014