(57)【要約】【課題】大量の多能性幹細胞を培養するに適したシステムを提供する。【解決手段】培養システム１０は、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養バッグ１１と、培養バッグ１１と接続されており、使用済みの培地を貯留する廃液容器１２と、培養バッグ１１と接続されており、新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器１３と、培養バッグ１１から廃液容器１２又は新鮮培地容器１３などへの流路を切り換える三方活栓５１〜５５と、廃液容器１２側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部１４と、トラップ部１４と培養バッグ１１とを接続する第１流路４１と平行に設けられた第４流路及び第５流路４５に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュ３１を有する継代用フィルタ部１５と、各流路において液体を流通させるためのポンプ１６と、を具備する。【選択図】  図１
2014136581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養容器と、
液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器から流出した使用済みの培地を貯留する廃液容器と、
液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器へ供給する新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器と、
上記培養容器から上記廃液容器又は上記新鮮培地容器への流路を切り換える第１切替部と、
上記第１切替部より上記培養容器側の流路に設けられており、上記廃液容器側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部と、
上記トラップ部と上記培養容器との間において、上記トラップ部と上記培養容器とを接続する流路と平行に設けられた流路に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュを有する継代用フィルタ部と、
上記トラップ部から上記培養容器又は上記継代用フィルタ部への流路を切り換える第２切替部と、を具備する多能性幹細胞の培養システム。
【請求項２】
上記培養容器と上記継代用フィルタ部とを接続する流路に液体を流通可能に設けられており、継代用フィルタ部へ供給する逆洗用培地を貯留する逆洗用容器を、更に具備する請求項１に記載の多能性幹細胞の培養システム。
【請求項３】
上記各流路における液体の流速を制御するための制御部を更に具備しており、当該制御部は、上記継代用フィルタ部のメッシュを通過する液体の単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とするものである請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養システム。
【請求項４】
上記各流路において液体を流通させるためのポンプと、当該ポンプの駆動を制御する制御部を更に具備しており、当該制御部は、少なくとも上記トラップ部から上記継代用フィルタ部への流れにおいて、上記ポンプを毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で駆動するものである請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養システム。
【請求項５】
上記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である請求項１から４のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養システム。
【請求項６】
上記多能性幹細胞が、ヒト由来のものである請求項１から５のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養システム。
【請求項７】
多能性幹細胞の細胞塊を浮遊培養する培養工程と、
培養された多能性幹細胞の細胞塊を、培地が流通可能な流路に設けられたメッシュに培地ともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第１分割工程と、
上記培養容器への流路を閉鎖した後、上記メッシュへ上記分割工程と逆方向へ培地を流通させて、メッシュに目詰まりした細胞塊を除去する逆洗工程と、
上記培養容器への流路を開放した後、除去された細胞塊を培地とともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第２分割工程と、を含む多能性幹細胞の継代方法。
【請求項８】
上記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である請求項７に記載の多能性幹細胞の継代方法。
【請求項９】
上記多能性幹細胞が、ヒト由来のものである請求項７又は８に記載の多能性幹細胞の継代方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を培養するシステム、及び多能性幹細胞を継代する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌化などを起こすことなく無制限に増殖可能で多分化能をもつ多能性幹細胞は、細胞移植治療や創薬スクリーニングなどへの応用が期待されている。【０００３】
従来、ヒト多能性幹細胞株は、フィーダー細胞又は各種高分子などに接着させる平面培養によって増殖維持されてきた。しかしながら、高品質のヒト多能性幹細胞を、安定して大量に培養する技術は未だ確立されていない。特に、実用化に必要となる大量の多能性幹細胞を調製するには、従来法である培養容器に接着させて継代により増殖させる方法では限界がある。例えば、ヒト多能性幹細胞用の接着基質材料として、品質面とコスト面で最適なものは開発されていない。また、継代には複雑な多段階の操作が必要であり、酵素処理など、安全面及びコスト面で不利なステップが含まれている。【０００４】
最近、接着基質が不要な浮遊培養法が報告されている（特許文献１〜５）。浮遊培養法によれば、三次元的な培養が可能なので、より小さなスペースで大量の多能性幹細胞を培養することができる。【０００５】
また、継代のときの酵素処理に代替する方法として、多能性幹細胞の細胞塊をマイクログリッドに通過させて分割する方法が考案されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５８５５８号
【特許文献２】国際公開第２００９／１１６９５１号
【特許文献３】国際公開第２００８／１２０２１８号
【特許文献４】国際公開第２００８／０１５６８２号
【特許文献５】国際公開第２００７／００２０８６号
【特許文献６】特表２０１０−５２６５３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、実用化に必要となる大量の多能性幹細胞を培養するシステムとして、自動化可能のものは未だ開発されていない。また、多能性幹細胞の細胞塊をマイクログリッドに通過させて分割する方法を、大量の多能性幹細胞の培養に採用すると、マイクログリッドの目詰まりが生じて、適切かつ効率的な継代が実現されないという問題が生じ得る。【０００８】
本発明は前述された問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、大量の多能性幹細胞を培養するに適したシステムを提供することにある。【０００９】
また、本発明の他の目的は、大量の多能性幹細胞の継代に適した方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
(1)  本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養容器と、液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器から流出した使用済みの培地を貯留する廃液容器と、液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器へ供給する新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器と、上記培養容器から上記廃液容器又は上記新鮮培地容器への流路を切り換える第１切替部と、上記第１切替部より上記培養容器側の流路に設けられており、上記廃液容器側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部と、上記トラップ部と上記培養容器との間において、上記トラップ部と上記培養容器とを接続する流路と平行に設けられた流路に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュを有する継代用フィルタ部と、上記トラップ部から上記培養容器又は上記継代用フィルタ部への流路を切り換える第２切替部と、を具備する。【００１１】
多能性幹細胞の培養における培地の交換に際しては、培養容器から廃液容器へ培地が流出される。培養容器から培地とともに多能性幹細胞が流出するが、多能性幹細胞はトラップ部によってトラップされるので、廃液容器へは流入しない。第１切替部が切り換えられた後、新鮮培地容器から新鮮な培地が培養容器へ流出される。新鮮な培地がトラップ部を培養容器へ向かって通過することにより、トラップ部にトラップされていた多能性幹細胞は、新鮮な培地とともに培養容器へ流れ込む。このとき、第２切替部は、トラップ部から継代用フィルタ部を介さずに培養容器へ流れる流路に切り換えられている。これにより、培養容器の培地が交換され、新鮮な培地中で多能性幹細胞が培養される。【００１２】
継代に際しては、前述と同様にして、培養容器から廃液容器へ培地が流出され、多能性幹細胞はトラップ部にトラップされる。新鮮培地容器から新鮮な培地が培養容器へ流出される前に、第２切替部は、トラップ部から継代用フィルタ部を介して培養容器へ流れる流路に切り換えられる。新鮮な培地とともにトラップ部から継代用フィルタ部へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュを通過するときに分割される。分割されて継代に適した大きさとなった多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養容器へ流れ込む。これにより、多能性幹細胞が継代される。【００１３】
(2)  本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記培養容器と上記継代用フィルタ部とを接続する流路に液体を流通可能に設けられており、継代用フィルタ部へ供給する逆洗用培地を貯留する逆洗用容器を、更に具備するものであってもよい。【００１４】
継代に際して、新鮮な培地とともにトラップ部から継代用フィルタ部へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュを通過するときに分割されるが、分割されずにメッシュに目詰まりする細胞塊が存在する。逆洗用容器から逆洗用培地がメッシュへ流通されることにより、目詰まりした細胞塊が逆洗用培地に流されてメッシュから離れる。これにより、メッシュの目詰まりを解消することができる。【００１５】
(3)  本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記各流路における液体の流速を制御するための制御部を更に具備しており、当該制御部は、上記継代用フィルタ部のメッシュを通過する液体の単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とするものであってもよい。【００１６】
継代に際して、継代用フィルタ部のメッシュの単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とすることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。【００１７】
(4)  本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記各流路において液体を流通させるためのポンプと、当該ポンプの駆動を制御する制御部を更に具備しており、当該制御部は、少なくとも上記トラップ部から上記継代用フィルタ部への流れにおいて、上記ポンプを毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で駆動するものであってもよい。【００１８】
継代に際して、毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で培地を継代用フィルタ部へ流通させることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。【００１９】
(5)  上記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。【００２０】
(6)  上記多能性幹細胞として、ヒト由来のものが挙げられる。【００２１】
(7)  本発明に係る多能性幹細胞の継代方法は、多能性幹細胞の細胞塊を浮遊培養する培養工程と、培養された多能性幹細胞の細胞塊を、培地が流通可能な流路に設けられたメッシュに培地ともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第１分割工程と、上記培養容器への流路を閉鎖した後、上記メッシュへ上記分割工程と逆方向へ培地を流通させて、メッシュに目詰まりした細胞塊を除去する逆洗工程と、上記培養容器への流路を開放した後、除去された細胞塊を培地とともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第２分割工程と、を含む。【００２２】
これにより、第１分割工程においてメッシュに目詰まりした細胞塊を、逆洗工程においてメッシュから離れさせて目詰まりを解消し、第２分割工程においてメッシュにより離れた細胞塊を分割することができるので、継代の際の多能性幹細胞の回収率が向上する。【００２３】
(8)  上記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。【００２４】
(9)  上記多能性幹細胞として、ヒト由来のものが挙げられる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る多能性幹細胞の培養システムによれば、大量の多能性幹細胞を培養することができ、自動化されたシステムが実現可能である。【００２６】
また、本発明に係る多能性幹細胞の継代方法によれば、メッシュの目詰まりを抑制して、大量の多能性幹細胞の継代が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施形態に係る培養システム１０の概要を示す概略図である。
【図２】トラップ部１４の内部構造を示す断面図である。
【図３】継代用フィルタ部１５の内部構造を示す断面図である。
【図４】メッシュ３１を通過する培地の流速に対する細胞の回収率を示す図である。
【図５】メッシュ３１を通過した細胞塊の大きさの分布を示す図である。
【図６】メッシュ３１の開口率に対する細胞の回収率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面が参照されつつ本発明の実施形態が説明される。なお、本実施形態は、本発明の一例にすぎず、本発明の要旨が変更されない範囲において、本実施形態が適宜変更されてもよいことは言うまでもない。
【００２９】
［培養システム１０］
図１に示されるように、多能性幹細胞の培養システム１０は、培養バッグ１１と、廃液容器１２と、新鮮培地容器１３と、トラップ部１４と、継代用フィルタ部１５と、ポンプ１６と、逆洗用容器１７，１８と、が流路により接続されたものである。
【００３０】
培養バッグ１１は、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養可能な樹脂製のバッグであり、内部空間に液体を封入可能である。また、培養バッグ１１の外壁を構成する樹脂シートは、二酸化炭素などのガス透過性の高いものが好適である。培養バッグ１１には、その内部空間に培地などの流動体を流出入可能とするポートが適宜設けられている。培養バッグ１１は、平面視において矩形の外形であるが、形状は特に限定されるものではなく、充填される培地の容量、操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。
【００３１】
なお、図１には示されていないが、培養バッグ１１は、その周囲の環境が培養に適した温度及び湿度となるように、インキュベータ等に収納されている。また、多能性幹細胞の細胞塊が凝集することを防ぐために、必要に応じて培養バッグ１１を姿勢変化させる機構が設けられていてもよい。
【００３２】
廃液容器１２は、培養バッグ１１から培地交換のために流出された使用済みの培地などを貯留可能な容器である。廃液容器１２の形状及び容量は、培養バッグ１１の容量や使用済み培地を貯留する日数などに応じて適宜設定される。
【００３３】
新鮮培地容器１３は、培地交換において培養バッグ１１へ供給する新鮮な培地を貯留可能な容器である。新鮮培地容器１３の形状及び容量は、培養バッグ１１の容量や培地交換の頻度などに応じて適宜設定される。
【００３４】
図２に示されるように、トラップ部１４は、培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊をトラップして、培地のみを流出させるものである。トラップ部１４は、概ね筒形状の本体２０の下側に流入口２１が形成されており、本体２０の上側に流出口２２が形成されている。流入口２１は、本体２０の内部空間へ通じている。流入口２１を通じて本体２０の内部空間へ培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流入可能である。
【００３５】
流出口２２は、本体２０の内部空間へ通じており、本体２０の内部空間への出口にメッシュ２３が設けられている。メッシュ２３は、多能性幹細胞の細胞塊が通過できない大きさの孔が多数形成された薄膜形状である。流入口２１から本体２０の内部空間へ培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊は、自重によって本体２０の内部空間の下側に滞留する。本体２０の内部空間において上側まで到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュ２３に阻まれて、流出口２２から流出することがない。
【００３６】
なお、各図には示されていないが、トラップ部１４は、多能性幹細胞の細胞塊の凝集や、メッシュ２３の目詰まりを防ぐために、必要に応じて本体２０を弾性的に変形させたり、メッシュ２３に振動を与えたりする機構が設けられていてもよい。
【００３７】
図３に示されるように、継代用フィルタ部１５は、培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊を分割するものである。継代用フィルタ部１５は、メッシュ３１を収容する本体３０を有する。本体３０は、流入口３２及び流出口３３を有する。流入口３２及び流出口３３は、本体３０の内部空間へ通じている。本体３０の内部空間には、流入口３２から流出口３３へ通じる流路を隔てるようにメッシュ３１が設けられている。
【００３８】
メッシュ３１の素材は、滅菌可能なものであれば特に制限されず、例えば、ナイロンやポリエチレンテレフタレートなどの合成樹脂や、ステンレスなどの金属が採用され得る。ステンレス製のメッシュ３１は、メッシュ３１を構成する繊維の太さを細くして、開口率（メッシュ３１の単位面積当たりに開口（孔）が占める率）を大きくできるので好ましい。メッシュ３１の開口率が大きいほど、培養バッグ１１に回収される多能性幹細胞の回収率がよくなる傾向にある。
【００３９】
メッシュ３１の孔径は、分割後の細胞塊の平均直径が約８０〜１２０μｍ、好ましくは約８０μｍとなるような孔径であればよく、例えば、ステンレス製のメッシュであれば、孔径が約４０〜１００μｍ、好ましくは約５０〜７０μｍ、より好ましくは約５０μｍが挙げられる。ここで「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。メッシュ３１の形状等の特に限定されないが、細胞にできるだけダメージを与えないような太さと形状であることが好ましい。また、メッシュ３１において細胞塊が通過しうる領域の面積が広いほど、細胞塊の数が増えても目詰まりが生じ難くなるので好ましい。
【００４０】
ポンプ１６は、各流路において培地等を流通させるためのものであり、典型例としてペリスタポンプが挙げられる。各図には示されていないが、ポンプ１６は演算装置を制御部として備えており、入力された流速に応じて、ポンプ１６が一定の流速で培地等を流通させるように動作する。
【００４１】
なお、本実施形態では、各流路において培地等を流通させる駆動源としてポンプ１６が用いられるが、ポンプ１６に代えて、例えば、培養バッグ１１等を圧縮変形させたり、廃液容器１２等の空気層の圧力を変動させたりして、培養バッグ１１等から培地を流出させたり、廃液容器１２等へ培地が流入したりするようにしてもよい。また、例えば、重力を利用して、培養バッグ１１と、廃液容器１２及び新鮮培地容器１３との相対的な高さ関係を変化させて、培養バッグ１１と、廃液容器１２及び新鮮培地容器１３との間で培地等を流通させることとしてもよい。
【００４２】
以下、培養バッグ１１、廃液容器１２、新鮮培地容器１３、トラップ部１４、継代用フィルタ部１５、ポンプ１６、及び逆洗用容器１７，１８をそれぞれ接続する流路が説明される。各流路は、例えば樹脂製のチューブにより構成され、流量や流速などに応じて内径や長さなどが適宜選択される。また、各流路を構成するチューブは１本で構成されていても、複数本のチューブがジョイントなどにより接続されて構成されていてもよい。
【００４３】
培養バッグ１１は、第１流路４１によってトラップ部１４と接続されている。第１流路４１は、培養バッグ１１のポートとトラップ部１４の流入口２１とを接続する。トラップ部１４は、第２流路４２によって廃液容器１２と接続されている。第２流路４２は、トラップ部１４の流出口２２と廃液容器１２とを接続する。第２流路４２に、ポンプ１６が設けられている。ポンプ１６は、第２流路４２の一部を構成するチューブをトラップ部１４側又は廃液容器１２側へ選択的に脈動させることにより、第２流路４２において一方向へ送液する。
【００４４】
第２流路４２における廃液容器１２とポンプ１６との間に三方活栓５１が設けられている。三方活栓５１は、第３流路４３によって新鮮培地容器１３と接続されている。三方活栓５１が切り替えられることによって、トラップ部１４が廃液容器１２又は新鮮培地容器１３と選択的に接続される。
【００４５】
第１流路４１には２つの三方活栓５２，５３が設けられている。三方活栓５２は、第４流路４４によって継代用フィルタ部１５と接続されている。第４流路４４は、三方活栓５２と継代用フィルタ部１５の流入口３２とを接続する。三方活栓５２が切り替えられることによって、トラップ部１４が培養バッグ１１又は継代用フィルタ部１５と選択的に接続される。
【００４６】
三方活栓５３は、第５流路によって継代用フィルタ部１５と接続されている。第５流路４５は、三方活栓５３と継代用フィルタ部１５の流出口３３とを接続する。三方活栓５３が切り替えられることによって、培養バッグ１１がトラップ部１４又は継代用フィルタ部１５と選択的に接続される。
【００４７】
第２流路４２におけるトラップ部１４とポンプ１６との間に三方活栓５４が設けられている。三方活栓５４は、第６流路４６によって逆洗用容器１７と接続されている。三方活栓５４が切り替えられることによって、ポンプ１６が、トラップ部１４又は逆洗用容器１７と選択的に接続される。
【００４８】
第５流路４５における培養バッグ１１と継代用フィルタ部１５との間に三方活栓５５が設けられている。三方活栓５５は、第７流路４７によって逆洗用容器１８と接続されている。三方活栓５５が切り替えられることによって、継代用フィルタ部１５が培養バッグ１１又は逆洗用容器１８と選択的に接続される。
【００４９】
なお、各図には示されていないが、各三方活栓５１〜５５は、モータなどの駆動源から駆動伝達されることによって切り替え可能に構成されていてもよい。また、各流路の切り替えは、三方活栓以外の弁などによって実現されていてもよい。三方活栓５１，５４が第１切替部に相当し、三方活栓５２〜５５が第２切替部に相当する。
【００５０】
［多能性幹細胞の培養］
培養システム１０は、多能性幹細胞の培養に用いることができる。培養システム１０によって培養可能な多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されない。このような多能性幹細胞として、例えば、ＥＳ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の他、始原生殖細胞に由来するmutipotent germline stem (mGS)細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell (MAPC)などが挙げられる。ＥＳ細胞は、体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。これらのうち好ましいものとして、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。培養システム１０による培養は、多能性幹細胞が樹立されているか又は樹立可能である、任意の哺乳動物において適用することができる。このような哺乳動物として、例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなどが挙げられ、好ましくはヒト又はマウスであり、特に好ましくはヒトである。
【００５１】
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、内部細胞塊を繊維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor (LIF)）、塩基性繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor (bFGF)）などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒト及びサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、USP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7844-7848; Tomson JA, et al. (1998), Science. 282: 1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222: 273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444: 481-485などに記載されている。
【００５２】
ＥＳ細胞作成のための培養液として、例えば、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、２０％  ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培養液（又は、合成培地：mTeSR、Stem Proなど）を使用し、３７℃、２％ＣＯ２／９８％空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（O. Fumitake et al. (2008）, Nat. Biotechnol., 26: 215-224）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％  ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％  トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍＬ  コラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
【００５３】
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法により行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、Oct-3/4、Nanog、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（E. Kroon et al. (2008）, Nat. Biotechnol., 26: 443-452）。
【００５４】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)及びWA09(H9)は、WiCell Research Instituteから入手可能であり、また、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００５５】
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（M. Kanatsu−Shinohara et al. (2003） Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)）を含む培養液で自己複製可能であるし、また、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８）、実験医学、２６巻、５号（増刊）、４１〜４６頁、羊土社（東京、日本））。
【００５６】
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子（stem cell factor）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y. Matsui et al. (1992）, Cell, 70: 841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551）。
【００５７】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Tkahashi et al. (2007）, Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al. Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); 国際公開第２００７−０６９６６６号）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物若しくはnon-cording RNA又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはnon-cording RNA、或いは低分子化合物によって構成されていてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Salll4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlislなどが例示される。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。初期化因子の組み合わせとしては、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797; Shi Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528; Eminli S et al. (2008), Stem Cells. 26: 2467-2474; Huangfu D et al. (2008), Nat. Biotecnol. 26: 1269-1275; Shi Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 568-574; Zhao Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479; Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3: 132-135; Feng B et al. (2009), Nat Cell Biol. 11: 197-203; R.L.Judson et al. (2009), Nat. Biotech., 27: 459-461; Lyssiotis CA et al. (2009), Proc. Natl. Acad Sci. USA. 106: 8912-8917; Kim JB et al. (2009), Nature. 461: 643-649; Ichida JK et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503; Heng JC et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-174; Han J et al. (2010), Nature. 463: 1096-1100; Mali P et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720; Maekawa M et al. (2011), Nature. 474: 225-229に記載の組み合わせが例示される。
【００５８】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤（例えば、バルプロ酸（VPA）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、MC1293, M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例：HDAC1 si RNA Smartpool（登録商標）、millipore）、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など）、MEK阻害剤（例えば、PD184352, PD98059, U0126, SL327, PD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、Bio, CHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294等の低分子阻害剤、Suv39HL, Suv39h2, SetDB1,G9aに対するsiRNA及びshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えば、Bayk8644）、酪酸、TGFβ阻害剤又はALK5阻害剤（例えば、LY364947, SB431542, 616453, A-83-01）、p53阻害剤（例えば、p53に対するsiRNA及びshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNA及びshRNA）、miR-291-3p, miR-294, miR-295, miR-302などのmiRNA）、Wnt Signaling（例えば、soulble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2及びプロスタグランジンJ2）、hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【００５９】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTAT及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００６０】
一方、DNA形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（国際公開第２０１０／００８０５４号）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC, PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322: 949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイドなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子又はプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子をともに切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
【００６１】
また、RNA形態の場合、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよく、分解を抑制するために、５−メチルシチジン及びpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いてもよい（Warren L, (2010） Cell Stem Cell. 7: 618-630）。
【００６２】
iPS細胞誘導のための培養液（これらの培養液は、さらに、LIF, penicillin/streptomycin, puromycin, Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）又は市販の培養液（例えば、マウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボＸ社）、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR, Stemcell Technology社）などが含まれる。
【００６３】
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ、約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、接触から約３０〜４５日又はそれ以上の後に、ｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００６４】
あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これらの培養液は、さらに、LIF, penicillin/streptomycin, puromycin, Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜３０日又はそれ以上の後に、ＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K et al. (2009）, PLoS One. 4: e8067、又は国際公開第２０１０／１３７７４６号）、もしくは、細胞外基質（例えば、Laminin（国際公開第２００９／１２３３４９号）、マトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
【００６５】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N et al. (2009）, Proc Natl Acad Sci USA. 106: 15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、底酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立してもよい（Yoshida Y et al. (2009）, Cell Stem Cell. 5: 237-241、国際公開第２０１０／０１３８４５号）。
【００６６】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２当たり約５×１０３〜５×１０６細胞の範囲である。
【００６７】
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4, Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は、蛍光顕微鏡で観察することにより樹立したiPS細胞を選択することができ、発光酵素遺伝子の場合は、発光基質を加えることにより樹立したiPS細胞を選択することができ、発色酵素遺伝子の場合は、発色基質を加えることにより樹立したiPS細胞を選択することができる。
【００６８】
［多能性幹細胞の浮遊培養（培養工程）］
前述されたようにして調製された多能性幹細胞を、培養システム１０にて浮遊培養する。具体的には、培養バッグ１１に、多能性幹細胞を培地とともに充填して、多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約２００〜３００μｍとなるまで浮遊培養する。ここで、「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。細胞塊の直径が３００μｍを超えると、細胞が分泌するサイトカイン等の影響で微小環境が形成され、分化が誘導されてしまう。また、細胞塊の中心部で壊死が起こるため、生細胞の回収率が悪くなるという問題がある。一方、細胞塊の平均直径の下限は、浮遊培養開始時（継代後の浮遊培養では継代時）の細胞塊の平均直径より大きいサイズであれば特に制限はないが、多能性幹細胞の収率を考慮すれば約２００μｍ以上まで培養を続けることが好ましい。
【００６９】
浮遊培養用の培地としては、前述された付着培養用の培地と同様の組成のものを使用することができるが、好ましくは、細胞塊の移動と細胞塊同士の密着を防ぐため、培地に適度な粘性を付与することが望ましい。ここで、適度な粘性とは、培地交換を妨げないで細胞塊同士の接着が起こらない程度の粘性を意味する。
【００７０】
培地に粘性を付与する手段は特に限定されないが、例えば、水溶性高分子を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。水溶性高分子としては、培地に適度な粘性を付与しうるものであって、粘性を付与しうる濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、如何なる水溶性高分子も使用することができる。例えば、セルロース、アガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸、カラゲーナン、デンプンなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。これら水溶性高分子は単独で用いてもよいし、何種類かの水溶性高分子の混合物として用いることもできる。また、これら水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、又はそれらの混合物である、より好ましくはメチルセルロースである。
【００７１】
例えば、粘性を付与するためにメチルセルロースを培地に添加する場合、メチルセルロースの濃度としては、０．２５ｗ／ｖ％より高く、０．５ｗ／ｖ％より低い濃度が好ましい。メチルセルロースの濃度が０．２５ｗ／ｖ％以下では粘性が低すぎて所望の効果が得られず、また、０．５ｗ／ｖ％以上ではトラップ部１４や継代用フィルタ部１５を通過し難くなる。好ましくは、メチルセルロースの濃度は、０．２６〜０．３ｗ／ｖ％であり、特に好ましくは、０．２８ｗ／ｖ％である。他の水溶性高分子を用いる場合でも、当業者は前述された適度な粘性を得るために、他の水溶性高分子も濃度を適宜選択することができる。
【００７２】
また、別の好ましい態様においては、水溶性高分子として、昇温型温度感受性ハイドロゲルを用いることができる。「昇温型温度感受性ハイドロゲル」とは、低温では液体であるが、昇温によりゲル化し、室温に冷却すると再ゾル化する可逆的なゾル−ゲル相転移を示すハイドロゲルを意味する。昇温型温度感受性ハイドロゲルの例として、２７〜３２℃のゲル化転移温度を示す商品名「Mebiol gel」シリーズ（メビオール株式会社）等が挙げられるが、これに限定されない。昇温型温度感受性ハイドロゲルを用いる場合は、浮遊細胞塊の移動及び細胞塊同士の密着を阻止するのに十分な粘性を付与しうる濃度でハイドロゲルを添加し、継代に適したサイズまで浮遊培養により増殖させた後、ゲル化転移温度以下にまで冷却して培養液をゾル化し、トラップ部１４又は継代用フィルタ部１５を通過させることにより容易に細胞を回収することができる。
【００７３】
培養は、付着培養した多能性幹細胞を酵素処理により解離し、培養バッグ１１中に、例えば、約０．５〜５０×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは、約１〜１０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように播種し、培養システム１０におけるＣＯ２環境の中、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％ＣＯ２濃度の雰囲気下、約３０〜４０℃、好ましくは約３７度で、１〜７日間、好ましくは３〜６日間、より好ましくは４，５日間行われる。
【００７４】
前述された培養の間に、好ましくは１，２日毎に培養バッグ１１中の培地が新鮮な培地と交換される。培地の交換に際しては、培養バッグ１１から廃液容器１２へ培地が流出される（矢印１０１）。三方活栓５１〜５４が操作されることによって、培養バッグ１１からトラップ部１４を介して廃液容器１２への流路が開かれる。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で培養バッグ１１から第１流路４１及び第２流路４２を通じて廃液容器１２へ培地が流れる。流速は、毎分約５〜５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８〜１０ｍＬの範囲の一定の流速である。
【００７５】
培養バッグ１１から培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流出するが、細胞塊はトラップ部１４によってトラップされるので、廃液容器１２へは流入しない。具体的には、本体２０の下側の流入口２１から本体２０の内部空間へ培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流入する。本体２０の内部空間において細胞塊は、自重によって本体２０の内部空間の下側に滞留する。一方、培地は、流出口２２を本体２０の内部空間から流出する。また、本体２０の内部空間において上側まで到達した細胞塊は、メッシュ２３に阻まれて流出口２２から流出することがない。
【００７６】
培養バッグ１１中の培地がすべて流出されると、三方活栓５１が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とがトラップ部１４を介して接続される。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で新鮮培地容器１３から第１流路４１、第２流路４２及び第３流路４３を通じて培養バッグ１１へ新鮮な培地が流れる（矢印１０２）。流速は、毎分約５０〜１５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８０〜１００ｍＬの範囲の一定の流速である。
【００７７】
新鮮培地容器１３から流出した新鮮な培地は、トラップ部１４の流出口２２から本体２０の内部空間へ流入する。そして、本体２０の内部空間の下側に滞留した多能性幹細胞の細胞塊とともに、流入口２１から流出し、第１流路４１を通じて培養バッグ１１へ流れる（矢印１０３）。これにより、トラップ部１４にトラップされていた多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養バッグ１１へ流れ込む。
【００７８】
なお、トラップ部１４のメッシュ２３に細胞塊が目詰まりしている場合には、目詰まりした細胞塊を除去するために、逆洗用容器１７から逆洗用培地をトラップ部１４へ流入させてもよい。
【００７９】
逆洗用培地は、例えば、前述された浮遊培養に用いられる培地であって、水溶性高分子が添加されてないものが好ましい。粘性の低い逆洗用培地がトラップ部１４のメッシュ２３を通過することによって、メッシュ２３に目詰まりした細胞塊がメッシュ２３から剥がれやすくなる。逆洗用培地の流量や流速は、メッシュ２３の目詰まりの程度に応じて適宜選択される。
【００８０】
具体的には、培養バッグ１１からトラップ部１４を通じて廃液容器１２へ培地が流出されているときに、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５４が切り替えられて、逆洗用容器１７とポンプ１６とが第６流路４６を通じて接続される。そして、ポンプ１６が再び動作されると、逆洗用容器１７から逆洗用培地が第６流路４６を通じて第２流路４２を新鮮培地容器１３へ向かって流れる（矢印１０４）。第２流路４２内に逆洗用培地が予め定められた量だけ流れ込むと、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５４が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とがトラップ部１４を介して接続される。そして、ポンプ１６が逆向き（矢印１０２の向き）、つまり新鮮培地容器１３からトラップ部１４へ向かって動作されることによって、第２流路４２内に流入した逆洗用培地がトラップ部１４の流出口２２を通じて本体２０の内部空間へ流入する。このとき、逆洗用培地によって、トラップ部１４のメッシュ２３に目詰まりした細胞塊が剥がれる。その後、ポンプ１６の向きが切り替えられて、前述と同様にして、培養バッグ１１から廃液容器１２側へ培地が流出される。
【００８１】
前述されたようにして、浮遊培養において、１，２日毎に培養バッグ１１中の培地が新鮮な培地と交換される。
【００８２】
例えば、浮遊培養開始時の多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約８０μｍであり、これを約２５０μｍまで増殖されるとすると、細胞塊の細胞数を約３３＝２７倍に増幅させる必要がある。例えば、ヒトＥＳ細胞は、約２４時間に１回分裂するので、計算上も４，５日培養すれば、所望のサイズにまで増殖すると考えられる。
【００８３】
［多能性幹細胞の継代］
多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約２００〜３００μｍである均一なサイズの多能性幹細胞の細胞塊は、次いで、平均直径が約８０〜１２０μｍである略均一な小細胞塊に分割され、継代される。ここで「約」とは、±２０％を許容する意味で用いられる。細胞塊の平均直径が５０μｍ以下となるように分割すると、細胞がアポトーシス等の細胞死を起こしやすくなるので好ましくない。分割後の平均直径の上限は特に制限されないが、サイズが大きくなるほど次回の継代後の浮遊培養による増幅の効率が悪くなるので、約１２０μｍ以下であることが好ましく、約４０〜８０μｍとすることが特に好ましい。
【００８４】
培養バッグ１１において、多能性幹細胞の細胞塊が平均直径が約２００〜３００μｍまで増殖した後、三方活栓５１〜５４が操作されることによって、培養バッグ１１からトラップ部１４を介して廃液容器１２への流路が開かれる。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で培養バッグ１１から第１流路４１及び第２流路４２を通じて廃液容器１２へ培地が流れる（矢印１０１）。流速は、毎分約５〜５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８〜１０ｍＬの範囲の一定の流速である。
【００８５】
培養バッグ１１から培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流出するが、前述されたように、細胞塊はトラップ部１４によってトラップされるので、廃液容器１２へは流入しない。培養バッグ１１中の培地がすべて流出されると、三方活栓５１，５２，５３が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とが、トラップ部１４及び継代用フィルタ部１５を介して接続される。
【００８６】
ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で新鮮培地容器１３から第２流路４２、第３流路４３、第４流路４４及び第５流路４５を通じて培養バッグ１１へ向かって新鮮な培地が流れる（矢印１０２）。新鮮培地容器１３から流出した新鮮な培地は、トラップ部１４の流出口２２から本体２０の内部空間へ流入して、前述と同様に、本体２０の内部空間の下側に滞留した多能性幹細胞の細胞塊とともに、流入口２１から流出する。これにより、トラップ部１４にトラップされていた多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに継代用フィルタ部１５へ流れ込む（矢印１０５）。
【００８７】
新鮮な培地とともにトラップ部１４から継代用フィルタ部１５へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュ３１を通過するときに分割される。多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１に通すときの流速は、約９０〜３００ｍＬ／ｍｉｎの範囲の一定の流速であることが好ましい。ここで「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。また、流速は、ポンプ１６の駆動力による第２流路４２又は第４流路４４内の流速である。流速が約９０ｍＬ／ｍｉｎより遅いと、メッシュ３１を通過できない細胞塊が多くなり、培養バッグ１１に回収される多能性幹細胞の回収率が悪くなる。流速の上限は特に制限されないが、流速が約３００ｍＬ／ｍｉｎより速いと、メッシュ３１を通過した細胞塊の平均直径が小さくなる傾向がある。
【００８８】
なお、メッシュ３１において多能性幹細胞の細胞塊が通過し得る面積（有効面積）を大きくすると、第４流路４４の断面積に対して、本体３０におけるメッシュ３１が存在する空間の断面積が大きくなり、その結果、特にメッシュ３１の周縁となるほど、その領域を通過する細胞塊（培地）の流速が遅くなる傾向がある。したがって、メッシュ３１の有効面積が変化すると、メッシュ３１を通過する細胞塊の面積も変化し得るので、他の婦性感細胞の細胞塊をメッシュ３１に通すときの流速は、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速として把握されてもよい。例えば、円盤形状のメッシュ３１の有効径が１１ｍｍであれば、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速は、約９５〜３１５ｍＬ／ｍｉｎの範囲であることが好ましい。
【００８９】
前述されたようにして、新鮮培地とともに多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１を通過させて分割する工程が、第１分割工程に相当する。
【００９０】
なお、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１に細胞塊が目詰まりしている場合には、目詰まりした細胞塊を除去するために、逆洗用容器１８から逆洗用培地を継代用フィルタ部１５へ流入させてもよい。具体的には、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５５が切り替えられて、逆洗用容器１８と継代用フィルタ部１５とが第７流路４７を通じて接続される。そして、ポンプ１６が逆向き（図１の継代用フィルタ部１５における右向き）に動作されると、逆洗用容器１８から逆洗用培地が継代用フィルタ部１５の流出口３３から流入口３２へ向かってメッシュ３１を逆流する（矢印１０６）。
【００９１】
逆洗用培地は、例えば、前述された浮遊培養に用いられる培地であって、水溶性高分子が添加されてないものが好ましい。粘性の低い逆洗用培地が継代用フィルタ部１５のメッシュ３１を通過することによって、メッシュ３１に目詰まりした細胞塊がメッシュ３１から剥がれやすくなる。逆洗用培地の流量や流速は、メッシュ３１の目詰まりの程度に応じて適宜選択される。
【００９２】
逆洗が終了すると、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５５が切り替えられて、培養バッグ１１と継代用フィルタ部１５とが接続される。そして、ポンプ１６が再び正向き（図１の継代用フィルタ部１５における左向き）動作されることによって、前述と同様にして、新鮮培地容器１３から新鮮な培地が培養バッグ１１へ流出される（矢印１０５）。
【００９３】
前述されたようにして、逆洗用培地とともに多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１から一旦除去して、再びメッシュ３１を通過させて分割する工程が、第２分割工程に相当する。
【００９４】
このように分割されて継代に適した大きさとなった多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養バッグ１１へ流れ込む。これにより、多能性幹細胞が継代される。
【００９５】
［本実施形態の作用効果］
本実施形態に係る多能性幹細胞の培養システム１０によれば、大量の多能性幹細胞を培養することができ、自動化されたシステムが実現可能である。
【００９６】
また、継代に際して、新鮮な培地とともにトラップ部１４から継代用フィルタ部１５へ到達した多能性幹細胞の細胞塊が分割されずにメッシュ３１に目詰まりしても、逆洗用容器１８から逆洗用培地がメッシュ３１へ流通されることにより、目詰まりした細胞塊が逆洗用培地に流されてメッシュ３１から離れる。これにより、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１の目詰まりを解消することができる。
【００９７】
また、継代に際して、毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で培地を継代用フィルタ部１５へ流通させることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。
【実施例】
【００９８】
［継代用フィルタ部１５を通過する培地の流速］
継代フィルタ部１５を通過する培地の流速を、毎分１０ｍＬ，５０ｍＬ，９０ｍＬ，１５０ｍＬ，３００ｍＬにしたときの細胞の回収率を測定した。メッシュ３１の有効径が１１ｍｍなので、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速に換算すると、毎分１０．５ｍＬ，５２．６ｍＬ，９４．７ｍＬ，１５７．９ｍＬ，３１５．８ｍＬとなる。【００９９】
（試薬の調製）
基礎培地（ベリタス、ST-05850）３５０ｍＬに対してサプリメント（ベリタス、ST-05850）１００ｍＬを添加して、よく撹拌した。さらに、Y-27632溶液（SIGMA、Y0503-5MG）５００ｍＬを、終濃度が１０μＭとなるように加えた。さらに、メチルセルロース液（R&D、HSC001）５０ｍＬを加えて、よく撹拌して、継代用培地を調製した。【０１００】
DMEM/F12培地（Life Technologies）４５０ｍＬに対してメチルセルロース液５０ｍＬを加えて、よく撹拌して、逆洗用培地とした。【０１０１】
（継代操作）
培養バッグ１１から、トラップ部１４へ多能性幹細胞の細胞塊と共に培地を流出させた。トラップ部１４において細胞塊を捕捉して、培地のみを廃液容器１２側へ流出させた。この操作において、逆洗用容器１７から逆洗用培地を適宜トラップ部１４へ逆流させて、メッシュ２３の目詰まりを解消しながら、培地を流出させた。続いて、新鮮培地容器１３からトラップ部１４、継代用フィルタ部１５を通じて培養バッグ１１へ新鮮培地を流出させた。これにより、トラップ部１４にトラップされていた細胞塊を、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１（ステンレス製、孔径５０μｍ、開口率６４％）を通過させ、分割することにより、継代を行った。継代において、逆洗用容器１８から逆洗用培地を適宜継代用フィルタ部１５へ逆流させて、メッシュ３１の目詰まりを解消し、再びメッシュ３１を通過させることによって、目詰まりした細胞塊も分割させた。【０１０２】
（回収率の算定）
継代後に培養バッグ１１に回収された多能性幹細胞の回収率を算定した。回収率は、以下の式により求めた。
（回収率）＝（継代後の総細胞数）／（継代前の総細胞数）
その結果が図４に示される。図４から明らかなように、継代用フィルタ部１５を培地が通過するときの流速が速くなるにつれて回収率が向上し、毎分９０ｍＬ以上の流速では回収率が一定になる傾向が確認された。【０１０３】
（継代後の細胞塊の大きさ）
継代後に培養バッグ１１に回収された多能性幹細胞の細胞塊の大きさ及び分布を測定した。その結果が図５に示される。図５から明らかなように、流速が遅いとメッシュ３１の孔径より大きな細胞塊の分布が多くなる傾向にあり、細胞塊の大きさの分布が全体として拡がる傾向にあった。流速が速いとメッシュ３１の孔径に近い細胞塊の分布が多くなる傾向にあり、細胞塊の大きさの分布が全体として狭まる傾向にあった。【０１０４】
［継代用フィルタ部１５のメッシュ３１の開口率］
継代用フィルタ部１５のメッシュ３１を、開口率が７２％（ステンレス製、孔径４６μｍ）、７１％（ステンレス製、孔径５５μｍ）、６４％（ステンレス製、孔径５０μｍ）、５８％（ＰＥＴ製、孔径９８μｍ）のものを用いて、それぞれについて前述した継代操作を行った。継代用フィルタ部１５を通過する培地の流速は、毎分９０ｍＬとした。【０１０５】
それぞれの開口率のメッシュ３１について回収率を算定した結果が図６に示される。図６から明らかなように、メッシュ３１の素材が同一（ステンレス製）であれば、樹赤穂率が高いほど、回収率が向上する傾向が確認された。
【符号の説明】
【０１０６】
１０  培養システム
１１  培養バッグ
１２  廃液容器
１３  新生培地容器
１４  トラップ部
１５  継代用フィルタ部
１６  ポンプ
１７，１８  逆洗用容器
３１  メッシュ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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