(57)【要約】  ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する導入工程を含む膵内分泌細胞の製造方法などである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項２】
導入工程が、更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項３】
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物が、ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項１から２のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項４】
体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項１から３のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項５】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項１から４のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法により製造されたことを特徴とする膵内分泌細胞。
【請求項７】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項６に記載の膵内分泌細胞。
【請求項８】
体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを含むことを特徴とする分化転換剤。
【請求項９】
更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を含む請求項８に記載の分化転換剤。
【請求項１０】
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物が、ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項８から９のいずれかに記載の分化転換剤。
【請求項１１】
体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項８から１０のいずれかに記載の分化転換剤。
【請求項１２】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項８から１１のいずれかに記載の分化転換剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞から膵内分泌細胞を製造する膵内分泌細胞の製造方法、及び前記製造方法により製造された膵内分泌細胞、並びに体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵内分泌細胞は、糖尿病の再生医療の材料として、また、糖尿病治療薬のスクリーニングに用いる材料などとして用いることが期待されている。前記再生医療の観点からは、例えば、インスリンが不足しているＩ型糖尿病の患者に対し、膵内分泌細胞の１つであり、インスリンを産生するβ細胞を投与することが期待されている。
そのため、膵内分泌細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量に調製する方法の開発が強く求められている。【０００３】
これまでに、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」と称することがある）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」と称することがある）を用いてβ細胞を製造する方法が提案されている。しかしながら、前記方法では、細胞培養用の培地に様々な発生分化に関わる阻害剤を加えるなど培養環境を整える必要があり、煩雑であるという問題があり、また、再現性が得られない場合があるという問題もある。また、前記方法では、β細胞以外の細胞も製造されることから、効率面での問題もある。更に、β細胞を得るまでに、最低でも２１日〜３０日を要し、短期間で製造することができないという問題もある。【０００４】
したがって、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法の速やかな提供が強く求められているのが現状である。【０００５】
なお、ＧＬＩＳファミリーであるＧＬＩＳ１（ＧＬＩＳ  ｆａｍｉｌｙ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  １）は、ｉＰＳ細胞の樹立改善効率を改善することが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、ＧＬＩＳ３（ＧＬＩＳ  ｆａｍｉｌｙ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ３）は、ヒト多分化性または多能性細胞を、インスリンを産生する機能的膵β細胞へ分化誘導するために用いることができることが知られている（例えば、特許文献２参照）。また、Ｎｇｎ３（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３）は、膵発生において、膵内分泌細胞内に一過性に発現することが知られている。
しかしながら、ＧＬＩＳファミリー及びＮｇｎ３が、幹細胞を経ずに、体細胞を直接膵内分泌細胞に変換することに関与することは、全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１３−５１９３７１号公報
【特許文献２】特表２００９−５３３０４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法、及び前記製造方法により製造された膵内分泌細胞、並びに体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法である。
＜２＞  前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法により製造されたことを特徴とする膵内分泌細胞である。
＜３＞  体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを含むことを特徴とする分化転換剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法、及び前記製造方法により製造された膵内分泌細胞、並びに体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、試験例１におけるウイルス感染１２日間後のＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した結果を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２において、インスリン及びソマトスタチンの発現を解析した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２において、インスリン及びグルカゴンの発現を解析した結果を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験例２において、インスリン及びＰｄｘ１の発現を解析した結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３のｄＭＥＦにおける結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３のＨｕｍａｎ  ｉＰＳ（２５３Ｇ１３−６）由来繊維芽細胞における結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試験例３のヒトＨｅｐＧ２における結果を示すグラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、試験例３のマウスＮＩＨ−３Ｔ３における結果を示すグラフである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、試験例３のヒト胎児繊維芽細胞における結果を示すグラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、試験例３のヒト新生児繊維芽細胞における結果を示すグラフである。
【図３Ｇ】図３Ｇは、試験例３のヒトＨＥＫ２９３における結果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例４の結果を示すグラフ−１である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例４の結果を示すグラフ−２である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例４の結果を示すグラフ−３である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、試験例４の結果を示すグラフ−４である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例５におけるヒトＴ９８Ｇグリオブラストーマにおける結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例５におけるヒト間葉系幹細胞における結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例６におけるマウス膵臓より単離した膵島の様子を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例６におけるウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用い、ｄＭＥＦへレトロウイルスを感染させた細胞の様子を示す図である。
【図７】図７は、試験例７のグルコース応答性インスリン分泌試験の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、試験例８のグルコース応答性インスリン分泌試験の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、試験例９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（膵内分泌細胞及びその製造方法）
本発明の膵内分泌細胞は、本発明の膵内分泌細胞の製造方法により製造することができる。
以下、本発明の膵内分泌細胞の製造方法の説明と併せて本発明の膵内分泌細胞を説明する。
【００１２】
＜膵内分泌細胞の製造方法＞
本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１３】
＜＜導入工程＞＞
前記導入工程は、ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する工程である。
前記遺伝子産物とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質をいう。
【００１４】
−遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記導入工程で体細胞に導入する遺伝子乃至その遺伝子産物は、ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の遺伝子乃至その遺伝子産物を含む。
【００１５】
−−ＧＬＩＳファミリー遺伝子−−
前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記ＧＬＩＳファミリーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記ＧＬＩＳファミリーの中でも、膵内分泌細胞の生産効率に優れる点で、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ３が好ましく、ＧＬＩＳ１がより好ましい。
前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号が、ＮＭ＿１４７１９３（ヒトＧＬＩＳ１）、ＮＭ＿１４７２２１（マウスＧＬＩＳ１）、ＮＭ＿０３２５７５（ヒトＧＬＩＳ２）、ＮＭ＿０３１１８４（マウスＧＬＩＳ２）、ＮＭ＿１５２６２９（ヒトＧＬＩＳ３）、ＮＭ＿１７５４５９、及びＮＭ＿１７２６３６（マウスＧＬＩＳ３）で入手することができる。
【００１６】
−−Ｎｇｎ３遺伝子−−
前記Ｎｇｎ３遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記Ｎｇｎ３遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９（マウス）、ＮＭ＿０２０９９９（ヒト）で入手することができる。
【００１７】
−−その他の遺伝子乃至その遺伝子産物−−
前記その他の遺伝子乃至その遺伝子産物としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物が好ましい。
【００１８】
−−−Ｐｄｘ１遺伝子−−−
前記Ｐｄｘ１遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記Ｐｄｘ１遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０００２０９（ヒト）、ＮＭ＿００８８１４（マウス）で入手することができる。
【００１９】
前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びその他の遺伝子乃至その遺伝子産物の配列は、前記各遺伝子の配列のうち、タンパク質に翻訳される部分のみからなる態様であってもよいし、タンパク質に翻訳される部分以外の部分を含む態様であってもよい。また、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の配列は、変異が含まれていてもよい。
前記変異としては、例えば、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない変異、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列において、１個又は数個（２個〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加される変異などが挙げられる。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が変異を有する場合の野生型との配列相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、タンパク質に翻訳される部分の塩基配列において、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
【００２０】
前記導入工程で体細胞に導入される遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを少なくとも含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で膵内分泌細胞を製造することができる点で、（１）ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＮｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物からなる態様、（２）ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物とからなる態様が好ましい。
【００２１】
−体細胞−
前記体細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記体細胞は未分化な前駆細胞であってもよいし、最終分化した成熟細胞であってもよい。
前記体細胞は、ＥＳ細胞由来、又はｉＰＳ細胞由来のものであってもよい。
【００２２】
前記体細胞の具体例としては、脂肪組織由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、繊維芽細胞、肝細胞、上皮細胞、腎細胞、マクロファージ、リンパ球、筋肉細胞などが挙げられる。これらの中でも、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、肝細胞、上皮細胞、腎細胞が好ましく、繊維芽細胞、間葉系幹細胞がより好ましい。
【００２３】
前記体細胞を採取する個体の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記体細胞を採取する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、得られる膵内分泌細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、個体自身、又はＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他個体が好ましい。ここで、前記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、免疫抑制剤などの使用により、前記体細胞由来の膵内分泌細胞を個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
前記体細胞を採取する個体の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
前記体細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％などが挙げられる。
前記体細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％〜２０質量％の血清を含む、最小必須培地（以下、「ＭＥＭ」と称することがある）、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」と称することがある）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
【００２５】
−導入方法−
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターを用いる方法、合成したｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を用いる方法、組換えタンパク質を用いる方法などが挙げられる。
【００２６】
−−ベクター−−
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
前記非ウイルスベクターの具体例としては、プラスミドベクター、エピゾーマルベクターなどが挙げられる。
【００２７】
前記ベクターを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
例えば、前記レトロウイルスベクターを用いる場合の方法は、国際公開第２００７／６９６６６号、Ｃｅｌｌ，  １２６，  ６６３−６７６  （２００６）、Ｃｅｌｌ，  １３１，  ８６１−８７２（２００７）などに記載の方法を用いることができ、前記レンチウイルスベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８，  １９１７−１９２０（２００７）などに記載の方法を用いることができる。
また、前記プラスミドベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２，  ９４９−９５３（２００８）などに記載の方法を用いることができ、前記エピゾーマルベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２４：  ７９７−８０１（２００９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ４２６：  １４１−１４７  （２０１２）などに記載の方法を用いることができる。
【００２８】
前記ウイルスベクターを用いる場合には、パッケージング細胞を用いて得られたウイルス粒子を用いてもよい。
前記パッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であり、該細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターを導入すると、該目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルス粒子を産生する。
前記パッケージング細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス繊維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースとしたパッケージング細胞、長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）  ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）のコントロール下で発現させているパッケージング細胞Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（以下、「Ｐｌａｔ−Ｅ細胞」と称することがある）、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−Ａ細胞、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−ＧＰ細胞などが挙げられる。
前記パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
前記得られたウイルス粒子を前記体細胞へ感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【００２９】
前記ベクターは、前記各遺伝子の導入を確認するためのマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
前記マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。前記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。
前記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
前記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子などが挙げられる。
【００３０】
前記ベクターを用いて前記各遺伝子を体細胞に導入する方法では、１つのベクターに１つの遺伝子を組み込んでもよいし、２つ以上の遺伝子を組み込んでもよい。前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込むことにより、該２つ以上の遺伝子を同時に発現（以下、「共発現」と称することがある）させることができる。
【００３１】
前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記２つ以上の遺伝子を、連結配列を通じて組み込むことが好ましい。
前記連結配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、口蹄疫ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ  Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）由来２Ａペプチドをコードする遺伝子配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ）などが挙げられる。
【００３２】
前記ｍＲＮＡを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記組換えタンパク質を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
【００３３】
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の全てを同時期に導入してもよいし、異なる時期に導入してもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物を等量導入してもよいし、異なる量導入してもよい。
【００３４】
前記遺伝子乃至その遺伝子産物は、同一の遺伝子乃至その遺伝子産物について、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、両者を用いる態様であってもよい。
異なる遺伝子乃至その遺伝子産物との組合せとしても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、各遺伝子乃至その遺伝子産物について、同じものを使用してもよいし、異なるものを使用してもよい。
【００３５】
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程では、本発明の効果を損なわない限り、前記遺伝子乃至その遺伝子産物以外の物を導入してもよい。
【００３６】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程などが挙げられる。
【００３７】
−遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程−
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する工程である。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％〜２０質量％の血清を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培地の交換頻度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２日間〜３日間毎に交換するなどが挙げられる。
【００３８】
＜膵内分泌細胞＞
前記膵内分泌細胞の製造方法により、膵内分泌細胞が製造されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、膵内分泌細胞が発現するタンパク質の発現を確認する方法、膵内分泌細胞が発現する遺伝子の発現を確認する方法などが挙げられる。
例えば、膵内分泌細胞のα細胞が製造されたか否かは、グルカゴンの発現の有無により確認することができ、β細胞が製造されたか否かは、インスリンの発現の有無により確認することができ、δ細胞が製造されたか否かは、ソマトスタチンの発現の有無により確認することができる。
前記タンパク質の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、免疫染色により確認することができる。
前記遺伝子の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、定量ＰＣＲにより確認することができる。
【００３９】
本発明の膵内分泌細胞の製造方法によれば、分化転換により、体細胞から膵内分泌細胞を製造することができるため、腫瘍形成のリスクを有するｉＰＳ細胞を経ずに膵内分泌細胞を製造することができる点で、有利である。
なお、前記分化転換とは、ある細胞型から他の細胞型へ、幹細胞を経ずに直接変換することをいう。
【００４０】
また、本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、体細胞に遺伝子乃至その遺伝子産物を導入するという簡便で、且つ再現が容易な方法でありながら、膵内分泌細胞を短期間で、効率良く生産することができる。また、本発明の膵内分泌細胞の製造方法によれば、培地中に発生阻害剤等を添加するなどの培養環境を整える処理を行うなどの特殊な培地を用いることなく、膵内分泌細胞を製造することができる点でも、有利である。
【００４１】
前記膵内分泌細胞は、α細胞であってもよいし、β細胞であってもよいし、δ細胞であってもよいし、これらの混合物であってもよい。これらの中でも、糖尿病患者に対する再生医療の観点からは、β細胞が好ましい。
【００４２】
本発明の膵内分泌細胞は、糖尿病治療薬のスクリーニングに用いる膵内分泌細胞などととして好適に利用可能である、
【００４３】
（分化転換剤）
本発明の分化転換剤は、体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００４４】
＜体細胞＞
前記分化転換剤が対象とする体細胞は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００４５】
＜膵内分泌細胞＞
前記分化転換剤により得られる膵内分泌細胞は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００４６】
＜ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物＞
前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。また、前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記分化転換剤における前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子がベクターに組み込まれている態様、合成ｍＲＮＡの態様、組換えタンパク質の態様などが挙げられる。
前記ベクターとしては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
【００４７】
＜Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物＞
前記Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記分化転換剤における前記Ｎｇｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子がベクターに組み込まれている態様、合成ｍＲＮＡの態様、組換えタンパク質の態様などが挙げられる。
前記ベクターとしては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
【００４８】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことが好ましい。
【００４９】
前記Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記分化転換剤における前記Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子がベクターに組み込まれている態様、合成ｍＲＮＡの態様、組換えタンパク質の態様などが挙げられる。
前記ベクターとしては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
【００５０】
前記分化転換剤は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が、個別の容器に分けられている態様であってもよいし、１つの容器にまとめられている態様であってもよいし、任意の数ごとに容器にまとめられている態様であってもよい。
前記分化転換剤における前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の量としては、特に制限はなく、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物を等量としてもよいし、異なる量としてもよい。
【００５１】
前記分化転換剤は、膵内分泌細胞製造用キットの構成として、好適に用いることができる。
前記膵内分泌細胞製造用キットは、前記分化転換剤を少なくとも含み、更に必要に応じてその他の構成を含む。
前記膵内分泌細胞製造用キットにおけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッケージング細胞、培地などが挙げられる。
前記パッケージング細胞、培地としては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の試験例に何ら限定されるものではない。【００５３】
（試験例１：マウス繊維芽細胞からの膵内分泌細胞の製造−１）
＜細胞の調製＞
以下のようにして、体細胞の１種である２重蛍光標識されたマウス胎児繊維芽細胞（ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ−ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、以下、「ｄＭＥＦ」と称することがある）を調製した。【００５４】
−膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスの作製−
膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウス（Ｎｇｎ３遺伝子のプロモーター制御下にＥＧＦＰを発現するマウス（Ｎｇｎ３−ｅＧＦＰ））を以下のようにして作製した。
ＢＡＣクローンから単離したＮｇｎ３遺伝子のプロモーター（５ｋｂ）の下流に、ＧＦＰと核移行シグナル（以下、「ｎｌｓ」と称することがある）との融合タンパク質遺伝子を繋げたコンストラクトを約４００個の受精卵へマイクロインジェクションし、膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスを作製した。【００５５】
−膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスの作製−
膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウス（ラットインスリンプロモーター制御下にＤｓＲｅｄ２を発現するマウス（Ｉｎｓ−ＤｓＲ））を以下のようにして作製した。
ラットインスリン遺伝子のプロモーター（８００ｂｐ）の下流に、ＤｓＲｅｄ２遺伝子を繋げたコンストラクトを約４００個の受精卵へマイクロインジェクションし、膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスを作製した。【００５６】
−２重蛍光標識マウス胎児繊維芽細胞の作製−
前記膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスと、前記膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスとを交配させた後、産仔マウス（ヘテロ）の雌と雄とを交配し、ゲノミックサザン法によってホモ化された２重蛍光標識遺伝子改変マウス（Ｎｇｎ３−ｅＧＦＰ／Ｉｎｓ−ＤｓＲ）を作出した。前記ホモ化された２重蛍光標識遺伝子改変マウスの雌と雄とを交配（２ペア）し、胎生期１４．５日目の胎児１６匹をピンセットで子宮より摘出し、クリーンベンチ内にて１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（カナマイシン  １０ｍｇ／ｍＬ含有）入り１０ｃｍペトリ皿で血液を洗浄後、１０ｍＬのＤＭＥＭ（シグマ社製、＃Ｄ５７９６；ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ含有）入り１０ｃｍ細胞培養ディッシュ（ＴＰＰ社製、＃９３１５０）内にて胎児をハサミで細切した。細切した胎児組織を１５ｍＬチューブへ移し、１．４ｋｒｐｍで４分間、室温で遠心し、上清を捨て、ペレットに０．２５％トリプシン含有ＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業株式会社製、＃２０１−１６９４５）  １ｍＬ（０．２５％ＤＮａｓｅ  Ｉ含有）を加えて懸濁後、３７℃のウォーターバスでインキュベートした。１０分間おきに手で攪拌した。５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を１５ｍＬチューブへ入れ、１匹分の胎児組織断片をよく懸濁し、５ｍＬのＤＭＥＭ入り１０ｃｍ細胞培養皿へ移して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、翌日１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れ替え、以降は２日間に一度培地を交換した。約４日間後から５日間後、１０ｃｍ培養皿いっぱいに増えたｄＭＥＦを６ｍＬのリン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称することがある）で洗浄後、１ｍＬの０．２５％トリプシン含有ＥＤＴＡ溶液を入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２分間後、細胞が剥がれたことを確認した後、１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れよく懸濁し、培養皿１枚分のｄＭＥＦを新たな１０ｃｍ培養皿５枚に播種し、更に培養した。５日間から６日間後、ｄＭＥＦがコンフルエントに増殖したことを確認し、６ｍＬのＰＢＳで洗浄後、１ｍＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２分間後、細胞が剥がれたことを確認した後、６ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れ、よく懸濁し、５０ｍＬチューブに入れ、１．４ｋｒｐｍで４分間、室温で遠心後に上清を捨て、細胞ペレットに１０ｍＬのセルバンカー（タカラバイオ株式会社製、＃ＣＢ０１１）を加えて、懸濁後、０．５ｍＬずつバイアルチューブへ分注し、−１４５℃の超低温フリーザー内にて保管した。【００５７】
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−Ｅ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。【００５８】
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
ｐＭＸ−ＧＦＰベクターは、ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター及びｐＭＸｐｕｒｏべクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号Ｌ２９３４５で登録されている。【００５９】
［ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクターは、ＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１４７２２１で登録されている。【００６０】
［ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターは、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９で登録されている。【００６１】
［ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター］
ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクターは、Ｐｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記Ｐｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００８８１４で登録されている。【００６２】
−レトロウイルスの作製−
ＰＢＳで１０倍希釈したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（シグマ社製、Ｐ８９２０）で、コート処理（３７℃、５％ＣＯ２で１時間）した６ウェルプレート（ＴＰＰ社製、９２４０６）に、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞数播種し、一晩培養した。
翌日、前記プラスミドＤＮＡ  ４μｇを２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製、１１０５８０２１）が入った１．５ｍＬチューブへ入れ、タッピングで混和して室温で５分間放置した（以下、「プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。一方、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ入りの別の１．５ｍＬチューブへ、リポフェクタミン（登録商標）  ２０００（ＬＰ２０００）（ライフテクノロジーズ社製、１１６６８５００）を１０μＬ入れ、混和して室温５分間放置した（以下、「ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。前記プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液と、前記ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液とをよく混和し、室温で２０分間静置した（以下、「プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液」と称することがある）。
リポソームＤＮＡ複合体を形成させた前記プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を前日播種したＰｌａｔ−Ｅ細胞を培養する６ウェルプレートの１ウェルへ添加（トランスフェクション）した。混和後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。２４時間後、培地交換を行い、新たに１．５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を添加し、さらに２４時間培養した。
トランスフェクション後４８時間でウイルス粒子を含む培養上清を２．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製、ＳＳ−０２ＳＺ）で回収し、０．４５フィルター（ワットマン社製、プラディスクＦＰ３０（ＣＡ−Ｓ０．４５μｍ）、１０４６２１００）でＰｌａｔ−Ｅ細胞を除去し、ウイルス粒子を含む培養上清を２．０ｍＬチューブへ移した。
以上により、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液を得た。【００６３】
＜導入＞
前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。感染は、以下のようにして行った。
前記ｄＭＥＦを１２ウェルプレートへ、１ウェルあたり１×１０５細胞数播種した。
翌日、前記レトロウイルスの作製に記載のようにして回収したウイルス粒子を含む培養上清に、８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（シグマ社製、１０７６８９）を最終濃度８μｇ／ｍＬになるよう添加した。前記ｄＭＥＦの培養上清を吸引して除去後、下記のウイルス溶液を１２ウェルプレートの１ウェルあたり２００μＬ加えた。各々のウェルのウイルス溶液が均一になるように、ポリブレン８μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）溶液で調整した。ウイルス溶液添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養中は、２日間又は３日間毎に培地交換を行った。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１溶液」と称することがある）
（２）ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｎ溶液」と称することがある）
（３）ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｐ溶液」と称することがある）
（４）ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「ＮＰ溶液」と称することがある）
（５）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液及びｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１Ｎ溶液」と称することがある）
（６）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１Ｐ溶液」と称することがある）
（７）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１ＮＰ溶液」と称することがある）
（８）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール、以下、「ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液」と称することがある）【００６４】
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞の観察、及び細胞数の決定＞
前記導入を行い、培養数日後にＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞を蛍光顕微鏡（カールツアイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）装置で観察、撮影を行った。
統計解析は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ライフテクノロジーズ社製、Ｈ１３９９）を最終濃度０．１μｇ／ｍｌになるようにウェルに添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３０分間以上培養した細胞培養マルチウェルプレートをハイエンド細胞イメージング装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＸＴＩ）を用いて、各ウェルに対して対物レンズ１０倍設定にて１００視野を撮影し、１００視野中の全細胞数中のＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した。【００６５】
＜結果−１＞
前記導入の２日間後に蛍光顕微鏡（カールツアイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）装置で観察を行ったところ、ウイルス溶液として、Ｇ１Ｎ溶液を用いた場合、及びＧ１ＮＰを用いた場合に、ＤｓＲｅｄ２の蛍光が観察された。したがって、ウイルス溶液として、Ｇ１Ｎ溶液を用いた場合、及びＧ１ＮＰを用いた場合には、２日間という短期間で、膵内分泌細胞であるβ細胞を繊維芽細胞から製造できることが示された。【００６６】
＜結果−２＞
前記導入の１２日間後に前記統計解析を行った結果を図１に示す。図１中、横軸は、使用したウイルス溶液を示し、左から順に、Ｇ１溶液、Ｎ溶液、Ｐ溶液、ＮＰ溶液、Ｇ１Ｎ溶液、Ｇ１ＮＰ溶液の結果を示す。なお、縦軸は、１ウェルあたりのＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を示す。
図１の結果から、体細胞に、（Ｉ）ＧＬＩＳ１遺伝子、及びＮｇｎ３遺伝子を導入した場合、並びに（ＩＩ）ＧＬＩＳ１遺伝子と、Ｎｇｎ３遺伝子と、Ｐｄｘ１遺伝子とを導入した場合に膵内分泌細胞であるβ細胞数が顕著に増加していた。したがって、体細胞に、（Ｉ）ＧＬＩＳ１遺伝子、及びＮｇｎ３遺伝子を導入するか、（ＩＩ）ＧＬＩＳ１遺伝子と、Ｎｇｎ３遺伝子と、Ｐｄｘ１遺伝子とを導入することにより、体細胞から膵内分泌細胞を大量に製造できることが示された。【００６７】
＜結果−３＞
前記導入の１７日間後に前記統計解析を行った結果を表１に示す。【００６８】
【表１】
2016002937.tif 000002
【００６９】
表１の結果から、体細胞に、（Ｉ）ＧＬＩＳ１遺伝子、及びＮｇｎ３遺伝子を導入した場合、並びに（ＩＩ）ＧＬＩＳ１遺伝子と、Ｎｇｎ３遺伝子と、Ｐｄｘ１遺伝子とを導入した場合には、全細胞における膵内分泌細胞であるβ細胞数の割合が高くなっていた。したがって、体細胞に、（Ｉ）ＧＬＩＳ１遺伝子、及びＮｇｎ３遺伝子を導入するか、（ＩＩ）ＧＬＩＳ１遺伝子と、Ｎｇｎ３遺伝子と、Ｐｄｘ１遺伝子とを導入することにより、体細胞から膵内分泌細胞を効率良く製造できることが示された。【００７０】
（試験例２：マウス繊維芽細胞からの膵内分泌細胞の製造−２）
＜細胞の調製＞
試験例１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。【００７１】
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を作製した。【００７２】
＜導入＞
ウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用い、試験例１と同様にして、前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【００７３】
＜免疫染色解析＞
前記導入の２１日間後の細胞を用い、以下のようにして免疫染色を行い、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰｄｘ１の発現を調べた。
細胞を４％  パラホルムアルデヒド溶液内にて１０分間室温で固定した後、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳ溶液に浸し室温で１０分間処理し、４倍希釈したブロッキングＯＮＥ溶液（ナカライテスク株式会社製）にて室温で１時間処理後、抗インスリン抗体（４００倍希釈、モルモット、ＤＡＫＯ社製）、抗グルカゴン抗体（４００倍希釈、ウサギ、ＤＡＫＯ社製）、抗ソマトスタチン抗体（５００倍希釈、ウサギ、ＤＡＫＯ社製）、又は抗Ｐｄｘ１抗体（１，０００倍希釈、ウサギ、米国バンダービルト大学より入手）を用いて１次抗体反応を４℃で一晩行った後、ＰＢＳにて室温で５分間の洗浄を３回繰り返した。２次抗体反応は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−Ｃｙ３標識抗ウサギ抗体（４００倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識抗モルモット抗体（４００倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳにて５分間の洗浄を３回繰り返した後、倒立型蛍光顕微鏡（カールツアイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）にて観察、写真撮影を行った。【００７４】
免疫染色解析の結果を図２Ａ〜図２Ｃに示す。図２Ａは、インスリン及びソマトスタチンの発現を解析した結果を示し、図２Ｂは、インスリン及びグルカゴンの発現を解析した結果を示し、図２Ｃは、インスリン及びＰｄｘ１の発現を解析した結果を示す。図２Ａ〜図２Ｃ中、実線の矢印は、インスリンの発現が確認された細胞を示す。図２Ａ〜図２Ｃにおける点線の矢印は、図２Ａではソマトスタチン、図２Ｂではグルカゴン、図２ＣではＰｄｘ１の発現が確認された細胞を示す。
図２Ａ〜図２Ｃの結果から、膵内分泌細胞であるα細胞が発現するグルカゴン、β細胞が発現するインスリン、δ細胞が発現するソマトスタチンのタンパク質レベルでの発現が確認された。また、膵臓の発生に必須であるＰｄｘ１のタンパク質レベルでの発現も確認された。
したがって、本発明の製造方法により、インスリン産生細胞であるβ細胞のみならず、α細胞及びδ細胞も製造できることが示された。【００７５】
（試験例３：各種体細胞からの膵内分泌細胞の製造−１）
＜細胞の調製＞
以下の細胞を用意した。
（１）ｄＭＥＦ
試験例１と同様にして調製した。
（２）Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ（２５３Ｇ１３−６）由来繊維芽細胞
理化学研究所ＢＲＣより入手した。
（３）ヒトＨｅｐＧ２（ヒト肝癌由来細胞株）
理化学研究所ＢＲＣより入手した。
（４）マウスＮＩＨ−３Ｔ３（マウスの胎児皮膚から分離した培養細胞）
理化学研究所ＢＲＣより入手した。
（５）ヒト胎児繊維芽細胞（ＦＨＤＦ）
東洋紡株式会社より入手した。
（６）ヒト新生児繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）
宝酒造株式会社より入手した。
（７）ヒトＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞をアデノウイルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株）
理化学研究所ＢＲＣより入手した。【００７６】
＜レトロウイルスの作製＞
−マウス細胞用レトロウイルスの作製−
試験例１と同様にして、マウス細胞用のｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液を作製した。【００７７】
−ヒト細胞用レトロウイルスの作製−
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−ＧＰ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター、ＶＳＶＧベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。【００７８】
−−プラスミドＤＮＡの調製−−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。【００７９】
［ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター］
試験例１において、アクセッション番号ＮＭ＿１４７２２１で登録されているＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列を用いていた点を、アクセッション番号ＮＭ＿１４７１９３で登録されているＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列に代えた以外は、試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクターを調製した。【００８０】
［ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
試験例１において、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９で登録されているＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列を用いていた点を、アクセッション番号ＮＭ＿０２０９９９で登録されているＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列に代えた以外は、試験例１と同様にして、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。【００８１】
［ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター］
試験例１において、アクセッション番号ＮＭ＿００８８１４で登録されているＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列を用いていた点を、アクセッション番号ＮＭ＿０００２０９で登録されているＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列に代えた以外は、試験例１と同様にして、ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクターベクターを調製した。【００８２】
−−レトロウイルスの作製−−
ＰＢＳで１０倍希釈したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（シグマ社製、Ｐ８９２０）で、コート処理（３７℃、５％ＣＯ２で１時間）した６ウェルプレート（ＴＰＰ社製、９２４０６）に、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞数播種し、一晩培養した。
翌日、前記プラスミドＤＮＡ  ４μｇ（ｐＭＸベクターを２μｇ、ＶＳＶＧベクターを２μｇ）を２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製、１１０５８０２１）が入った１．５ｍＬチューブへ入れ、タッピングで混和して室温で５分間放置した（以下、「プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。一方、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ入りの別の１．５ｍＬチューブへ、リポフェクタミン（登録商標）  ２０００（ＬＰ２０００）（ライフテクノロジーズ社製、１１６６８５００）を１０μＬ入れ、混和して室温５分間放置した（以下、「ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。前記プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液と、前記ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液とをよく混和し、室温で２０分間静置した（以下、「プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液」と称することがある）。
リポソームＤＮＡ複合体を形成させた前記プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を前日播種したＰｌａｔ−ＧＰ細胞を培養する６ウェルプレートの１ウェルへ添加（トランスフェクション）した。混和後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。２４時間後、培地交換を行い、新たに１．５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を添加し、さらに２４時間培養した。
トランスフェクション後４８時間でウイルス粒子を含む培養上清を２．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製、ＳＳ−０２ＳＺ）で回収し、０．４５フィルター（ワットマン社製、プラディスクＦＰ３０（ＣＡ−Ｓ０．４５μｍ）、１０４６２１００）でＰｌａｔ−ＧＰ細胞を除去し、ウイルス粒子を含む培養上清を２．０ｍＬチューブへ移した。
以上により、ヒト細胞用のｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液を得た。【００８３】
＜導入＞
ウイルス溶液としてＧ１Ｎ溶液、又はＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用い、試験例１と同様にして、前記各細胞へ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【００８４】
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記導入の２０日間後の細胞を用い、以下のようにして定量ＰＣＲ解析を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するインスリン遺伝子の相対発現量を調べた。
前記細胞を細胞溶解液に懸濁し、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＆  ＲＴ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社製、＃ＳＣＱ−１０１）、又はＳＶ  ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、＃Ｚ３５０５）、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社製、＃ＦＳＱ−３０１）にてＲＮＡ調製及びｃＤＮＡ合成を行った後、ＧｅｎｅＡｃｅ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘα（日本ジーン株式会社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。
なお、定量ＰＣＲに用いたプライマーは、以下のとおりである。
−マウスＧＡＰＤＨ遺伝子−
フォワード：  ５’−ｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｃｃａａｇｔａｔｇ−３’（配列番号１）
リバース：  ５’−ｇｇａｇａｃａａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｃａｇ−３’（配列番号２）
−マウスインスリン２遺伝子−
フォワード：  ５’−ｔｔｔｇｔｃａａｇｃａｇｃａｃｃｔｔｔｇ−３’（配列番号３）
リバース：  ５’−ｇｇｔｃｔｇａａｇｇｔｃａｃｃｔｇｃｔｃ−３’（配列番号４）
−ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子−
フォワード：  ５’−ａｔｇｔｔｃｇｔｃａｔｇｇｇｔｇｔｇａａ−３’（配列番号５）
リバース：  ５’−  ｔｇｔｇｇｔｃａｔｇａｇｔｃｃｔｔｃｃａ−３’（配列番号６）
−ヒトインスリン遺伝子−
フォワード：  ５’−ｇｃｃａｔｃａａｇｃａｇａｔｃａｃｔｇｔ−３’（配列番号７）
リバース：  ５’−ｃａｇｇｔｇｔｔｇｇｔｔｃａｃａａａｇｇ−３’（配列番号８）【００８５】
定量ＰＣＲ解析の結果を図３Ａ〜図３Ｇに示す。図３Ａは、ｄＭＥＦにおける結果を示し、図３Ｂは、Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ（２５３Ｇ１３−６）由来繊維芽細胞における結果を示し、図３Ｃは、ヒトＨｅｐＧ２における結果を示し、図３Ｄは、マウスＮＩＨ−３Ｔ３における結果を示し、図３Ｅは、ヒト胎児繊維芽細胞における結果を示し、図３Ｆは、ヒト新生児繊維芽細胞における結果を示し、図３Ｇは、ヒトＨＥＫ２９３における結果を示す。図３Ａ〜図３Ｇ中、ＣＴＬは、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合の結果を示し、Ｇ１Ｎは、Ｇ１Ｎ溶液を用いた場合の結果を示す。なお、縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するインスリン遺伝子の相対発現量を示す。
図３Ａ〜図３Ｇの結果から、マウス繊維芽細胞以外の細胞においても、Ｇ１Ｎ溶液を用いることにより、インスリン遺伝子の発現が確認された。
したがって、本発明の製造方法により、様々な体細胞を用いて、膵内分泌細胞を製造できることが示された。【００８６】
（試験例４：ＧＬＩＳファミリーの分化転換能）
＜細胞の調製＞
試験例１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。【００８７】
＜レトロウイルスの作製＞
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。【００８８】
［ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター］
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクターを調製した。【００８９】
［ｐＭＸ−ＧＬＩＳ３ベクター］
ｐＭＸ−ＧＬＩＳ３ベクターは、ＧＬＩＳ３タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＬＩＳ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１７５４５９で登録されている。【００９０】
［ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。【００９１】
［ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター］
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクターを調製した。【００９２】
−レトロウイルスの作製−
前記プラスミドＤＮＡを用いた以外は、試験例１と同様にしてウイルス粒子を含む培養上清を調製し、ウイルス溶液とした。【００９３】
＜導入＞
下記ウイルス溶液を用いた以外は、試験例１と同様にして、前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール、以下、「ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液」と称することがある）
（２）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１溶液」と称することがある）
（３）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ３ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ３溶液」と称することがある」）
（４）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液及びｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１Ｎ溶液」と称することがある）
（５）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ３ベクター由来のウイルス溶液及びｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ３Ｎ溶液」と称することがある）
（６）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ１ＮＰ溶液」と称することがある）
（７）ｐＭＸ−ＧＬＩＳ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液（以下、「Ｇ３ＮＰ溶液」と称することがある）【００９４】
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞数の決定＞
前記導入１１日間後の細胞を用いた以外は、試験例１と同様にしてＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を数えた。【００９５】
ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を数えた結果を図４Ａ〜図４Ｄに示す。図４Ａは、左側から順に、ウイルス溶液として、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合（ＧＦＰ）、Ｇ１溶液を用いた場合（Ｇ１）、Ｇ１Ｎ溶液を用いた場合（Ｇ１Ｎ）の結果を示し、図４Ｂは、左側から順に、ウイルス溶液として、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合（ＧＦＰ）、Ｇ１溶液を用いた場合（Ｇ１）、Ｇ１ＮＰ溶液を用いた場合（Ｇ１ＮＰ）の結果を示し、図４Ｃは、左から順に、ウイルス溶液として、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合（ＧＦＰ）、Ｇ３溶液を用いた場合（Ｇ３）、Ｇ３Ｎ溶液（Ｇ３Ｎ）を用いた場合の結果を示し、図４Ｄは、左から順に、ウイルス溶液として、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合（ＧＦＰ）、Ｇ３溶液を用いた場合（Ｇ３）、Ｇ３ＮＰ溶液を用いた場合（Ｇ３ＮＰ）の結果を示す。なお、縦軸は、１ウェルあたりのＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を示す。
図４Ａ〜図４Ｄの結果から、ＧＬＩＳファミリーであるＧＬＩＳ３を用いた場合でも、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３及びＰｄｘ１と共に体細胞に導入することにより膵内分泌細胞を製造することができた。そのため、ＧＬＩＳファミリーをＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３及びＰｄｘ１と共に体細胞に導入することにより膵内分泌細胞を製造することができることが示唆された。また、ＧＬＩＳ１とＧＬＩＳ３とを比較すると、ＧＬＩＳ１を用いた場合のほうが、分化転換効率が１０倍程度優れていることが示された。【００９６】
（試験例５：各種体細胞からの膵内分泌細胞の製造−２）
＜細胞の調製＞
以下の細胞を用意した。
（１）ヒトＴ９８Ｇグリオブラストーマ
理化学研究所ＢＲＣより入手した。
（２）ヒト間葉系幹細胞
ロンザ株式会社より入手した。【００９７】
＜レトロウイルスの作製＞
試験例３におけるヒト細胞用レトロウイルスの作製と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター、及びｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液を作製した。【００９８】
＜導入＞
ウイルス溶液として、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液、Ｇ１Ｎ溶液、又はＧ１ＮＰ溶液を用い、試験例１と同様にして、前記各細胞へ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【００９９】
＜定量ＰＣＲ解析＞
試験例３と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するインスリン遺伝子の相対発現量を調べた。【０１００】
定量ＰＣＲ解析の結果を図５Ａ〜図５Ｂに示す。図５Ａは、ヒトＴ９８Ｇグリオブラストーマにおける結果を示し、図５Ｂは、ヒト間葉系幹細胞における結果を示す。図５Ａ〜図５Ｂ中、ＣＴＬは、ＧＦＰ  ＣＴＬ溶液を用いた場合の結果を示し、Ｇ１Ｎは、Ｇ１Ｎ溶液を用いた場合の結果を示し、Ｇ１ＮＰは、Ｇ１ＮＰ溶液を用いた場合の結果を示す。なお、縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するインスリン遺伝子の相対発現量を示す。
図５Ａ〜図５Ｂの結果から、ヒトＴ９８Ｇグリオブラストーマ、ヒト間葉系幹細胞を用いた場合にも、Ｇ１Ｎ溶液、又はＧ１ＮＰ溶液を用いることにより、インスリン遺伝子の発現が観察された。
したがって、本発明の製造方法により、様々な体細胞を用いて、膵内分泌細胞を製造できることが示された。【０１０１】
（試験例６：マウス膵島との比較）
＜細胞の調製＞
試験例１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。【０１０２】
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を作製した。【０１０３】
＜導入＞
ウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用い、試験例１と同様にして、前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【０１０４】
＜顕微鏡観察＞
前記導入の１６日間後の細胞の様子を顕微鏡（ＦＬＵＯＴＭ、ライカ社製、ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ、カールツアイス社製、×４倍）で観察した。また、マウス膵臓より単離した膵島についても顕微鏡で観察した。【０１０５】
顕微鏡観察の結果を図６Ａ〜図６Ｂに示す。図６Ａは、マウス膵臓より単離した膵島の様子を示し、図６Ｂは、ウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用いた結果を示す。
図６Ａ〜図６Ｂの結果から、本発明の製造方法で得られた膵内分泌細胞塊は、マウス膵臓より単離した膵島に似たものであることが確認された。【０１０６】
（試験例７：グルコース応答性インスリン分泌試験−１）
＜細胞の調製＞
試験例１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。【０１０７】
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を作製した。【０１０８】
＜導入＞
ウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用い、試験例１と同様にして、前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【０１０９】
＜グルコース応答性インスリン分泌試験＞
前記導入の２７日間後に、実体顕微鏡下で、直径１００μｍ〜３００μｍの均一な膵島様塊３０個をピペットでピックアップし、２４ウェルプレートへ移し、以下のようにしてグルコース応答性インスリン分泌試験を実施した。【０１１０】
前記膵島様塊を２．８ｍＭ  グルコース入りリンゲル溶液で３時間培養した後、培地を交換し、更に１時間培養し、この培養上清を基礎とした（以下、「基礎培養上清」と称することがある）。
次いで、前記膵島様塊を１６．８ｍＭ  グルコース入りリンゲル入り溶液で１時間培養し、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「高グルコース培養上清」と称することがある）。
その後、ウェルに２．８ｍＭグルコース入りリンゲル溶液を入れ、前記膵島様塊を１時間培養後、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「低グルコース培養上清」と称することがある）。【０１１１】
前記各培養上清におけるインスリン濃度を、ＥＬＩＳＡ試験（株式会社シバヤギ製、Ｔタイプ）により測定した。結果を図７に示す。
図７は、２つのウェルのそれぞれの結果を示し、（１）は基礎培養上清の結果、（２）は高グルコース培養上清の結果、（３）は低グルコース培養上清の結果を示す。
図７の結果から、グルコース濃度が高くなるとインスリンの量が上昇し、グルコース濃度が低くなるとインスリンの濃度が減少することが確認された。したがって、本発明の製造方法で得られた膵内分泌細胞は、膵内分泌細胞に求められる機能を有していることが確認された。【０１１２】
（試験例８：グルコース応答性インスリン分泌試験−２）
＜細胞の調製＞
ヒト新生児繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）（宝酒造株式会社製）を用意した。【０１１３】
＜レトロウイルスの作製＞
試験例３におけるヒト細胞用レトロウイルスの作製と同様にして、ｐＭＸ−ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−Ｐｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を作製した。【０１１４】
＜導入＞
ウイルス溶液としてＧ１ＮＰ溶液を用い、２４ウェルプレートを用いた以外は、試験例１と同様にして、前記ヒト新生児繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）へ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。【０１１５】
＜グルコース応答性インスリン分泌試験＞
前記導入の３４日間後に、膵島様塊全てをピペットでピックアップし、２４ウェルプレート（低接着プレート（ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ  ＩＩ、イワキ社製））へ移し、以下のようにしてグルコース応答性インスリン分泌試験を実施した。【０１１６】
前記膵島様塊を２．８ｍＭ  グルコース入りリンゲル溶液で３時間培養した後、培地を交換し、更に１時間培養し、この培養上清を基礎とした（以下、「基礎培養上清」と称することがある）。
次いで、前記膵島様塊を２５．０ｍＭ  グルコース入りリンゲル入り溶液で１時間培養し、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「高グルコース培養上清」と称することがある）。【０１１７】
前記各培養上清におけるインスリン濃度を、ＥＬＩＳＡ試験（ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ社製）により測定した。結果を図８に示す。
図８中、「低」は基礎培養上清の結果、「高」は高グルコース培養上清の結果を示す。
図８の結果から、ヒト由来細胞を用いて製造した場合でも、グルコース濃度が高くなるとインスリンの量が上昇し、グルコース濃度が低くなるとインスリンの濃度が減少し、膵内分泌細胞に求められる機能を有していることが確認された。【０１１８】
（試験例９：エピゾーマルベクターを用いた膵内分泌細胞の製造）
＜細胞の調製＞
試験例１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。【０１１９】
＜エピゾーマルベクターの調製＞
［ｐＣＩ−ＧＦＰベクター］
ｐＣＩ−ＧＦＰベクターは、ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子を、エピゾーマルベクターであるｐＣＩベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号Ｌ２９３４５で登録されている。【０１２０】
［ｐＣＩ−ＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＣＩ−ＧＬＩＳ１ベクターは、ＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子を、エピゾーマルベクターであるｐＣＩベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１４７２２１で登録されている。【０１２１】
［ｐＣＩ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
ｐＣＩ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターは、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子を、エピゾーマルベクターであるｐＣＩベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９で登録されている。【０１２２】
［ｐＣＩ−Ｐｄｘ１ベクター］
ｐＣＩ−Ｐｄｘ１ベクターは、Ｐｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子を、エピゾーマルベクターであるｐＣＩベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記Ｐｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００８８１４で登録されている。【０１２３】
＜導入＞
前記ｄＭＥＦへ、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ社製）を用いたエレクトロポレーション法により、下記ベクターを導入した。ベクター導入後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養中は、２日間又は３日間毎に培地（ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有））交換を行った。
［ベクター］
（１）ｐＣＩ−ＧＦＰベクター（コントロール、以下、「ＧＦＰ」と称することがある）
（２）ｐＣＩ−ＧＬＩＳ１ベクター、及びｐＣＩ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター（以下、「Ｇ１Ｎ」と称することがある）
（３）ｐＣＩ−ＧＬＩＳ１ベクター、ｐＣＩ−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター、及びｐＣＩ−Ｐｄｘ１ベクター（以下、「Ｇ１ＮＰ」と称することがある）【０１２４】
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞の決定＞
前記導入８日間後の細胞を用いた以外は、試験例１と同様にしてＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を数えた。【０１２５】
ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を数えた結果を図９に示す。図９中、横軸は、導入したエピゾーマルベクターを示し、左から順に、ＧＦＰ、Ｇ１Ｎ、Ｇ１ＮＰの結果を示す。なお、縦軸は、１ウェルあたりのＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を示す。
図９の結果から、エピゾーマルベクターを用いた場合でも、（Ｉ）ＧＬＩＳ１遺伝子、及びＮｇｎ３遺伝子を導入するか、（ＩＩ）ＧＬＩＳ１遺伝子と、Ｎｇｎ３遺伝子と、Ｐｄｘ１遺伝子とを導入することにより、体細胞から膵内分泌細胞を製造できることが示された。【０１２６】
本発明の体細胞に遺伝子乃至その遺伝子産物を導入する工程を含む膵内分泌細胞の製造方法は、従来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用い、培地中に発生阻害剤等を添加するなどの培養環境を整え、膵内分泌細胞を製造する方法と比較して、簡便で、且つ再現が容易な方法であり、また、製造期間を大幅に短縮することができる。また、本発明の製造方法によれば、膵内分泌細胞を効率良く生産することができる。
また、本発明の製造方法によれば、腫瘍形成のリスクを有するｉＰＳ細胞を経ずに膵内分泌細胞を製造することができる点でも有利である。
そのため、本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、例えば、糖尿病に対する再生医療用途の膵内分泌細胞の製造などに好適に利用可能である。【０１２７】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法である。
＜２＞  導入工程が、更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜３＞  ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物が、ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜４＞  体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜５＞  膵内分泌細胞が、β細胞である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法により製造されたことを特徴とする膵内分泌細胞である。
＜７＞  膵内分泌細胞が、β細胞である前記＜６＞に記載の膵内分泌細胞である。
＜８＞  体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを含むことを特徴とする分化転換剤である。
＜９＞  更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を含む前記＜８＞に記載の分化転換剤である。
＜１０＞  ＧＬＩＳファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物が、ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の分化転換剤である。
＜１１＞  体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載の分化転換剤である。
＜１２＞  膵内分泌細胞が、β細胞である前記＜８＞から＜１１＞のいずれかに記載の分化転換剤である。
【図１】
2016002937.tif 000003
【図２Ａ】
2016002937.tif 000004
【図２Ｂ】
2016002937.tif 000005
【図２Ｃ】
2016002937.tif 000006
【図３Ａ】
2016002937.tif 000007
【図３Ｂ】
2016002937.tif 000008
【図３Ｃ】
2016002937.tif 000009
【図３Ｄ】
2016002937.tif 000010
【図３Ｅ】
2016002937.tif 000011
【図３Ｆ】
2016002937.tif 000012
【図３Ｇ】
2016002937.tif 000013
【図４Ａ】
2016002937.tif 000014
【図４Ｂ】
2016002937.tif 000015
【図４Ｃ】
2016002937.tif 000016
【図４Ｄ】
2016002937.tif 000017
【図５Ａ】
2016002937.tif 000018
【図５Ｂ】
2016002937.tif 000019
【図６Ａ】
2016002937.tif 000020
【図６Ｂ】
2016002937.tif 000021
【図７】
2016002937.tif 000022
【図８】
2016002937.tif 000023
【図９】
2016002937.tif 000024
【配列表】
2016002937000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月28日(2015.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項２】
導入工程が、更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項１から２のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項５】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項１、２、及び４のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項６】
請求項１、２、４、及び５のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法により製造されたことを特徴とする膵内分泌細胞。
【請求項７】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項６に記載の膵内分泌細胞。
【請求項８】
体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物と、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物とを含むことを特徴とする分化転換剤。
【請求項９】
更にＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物を含む請求項８に記載の分化転換剤。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
体細胞が、繊維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項８から９のいずれかに記載の分化転換剤。
【請求項１２】
膵内分泌細胞が、β細胞である請求項８、９、及び１１のいずれかに記載の分化転換剤。
【国際調査報告】
2016002937.tif 000025
2016002937.tif 000026
2016002937.tif 000027