(57)【要約】  誘電体である樹脂からなるプリズムと、プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する測定チップを準備する。次いで、第１光学ブランク値を測定する。次いで、蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する。第１光学ブランク値に基づいて、蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を算出する。最後に、蛍光値から第２光学ブランク値を引いて、シグナル値を算出する。
2016147774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて放出した蛍光を検出して、前記被測定物質の存在または量を示すシグナル値を測定する測定方法であって、
誘電体である樹脂からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する測定チップを準備する工程と、
前記蛍光物質が前記金属膜上に存在しない状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射しときに、前記測定チップから放出される光を検出して、第１光学ブランク値を測定する工程と、
前記第１光学ブランク値を測定した後に、前記蛍光物質で標識された前記被測定物質が前記金属膜上に存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する工程と、
前記第１光学ブランク値に基づいて、前記蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を算出する工程と、
前記蛍光値から前記第２光学ブランク値を引いて、前記シグナル値を算出する工程と、
を含む、測定方法。
【請求項２】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数は、予め測定された一定の値であり、
前記第１光学ブランク値の測定は、１回行われ、
前記第２光学ブランク値は、予め測定された前記減衰係数を含む近似式と、前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、
請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記第２光学ブランク値は、対数近似式である以下の式（１）と、前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、請求項２に記載の測定方法。
【数１】
2016147774.tif 000015
［式（１）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数である。ｂは、定数である。］
【請求項４】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数ａは、事前に前記プリズムに励起光を照射して光学ブランク値を複数回測定した後に、以下の式（２）および式（３）と得られた複数の測定値とに基づいて予め算出された値である、請求項３に記載の測定方法。
【数２】
2016147774.tif 000016
【数３】
2016147774.tif 000017
［式（２）および式（３）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記光学ブランク値である。ｎは、前記光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項５】
前記第２光学ブランク値は、指数近似式である以下の式（４）と、前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、請求項２に記載の測定方法。
【数４】
2016147774.tif 000018
［式（４）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数である。ｂは、定数である。］
【請求項６】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数ａは、事前に前記プリズムに励起光を照射して光学ブランク値を複数回測定した後に、以下の式（５）および式（６）と得られた複数の測定値とに基づいて予め算出された値である、請求項５に記載の測定方法。
【数５】
2016147774.tif 000019
【数６】
2016147774.tif 000020
［式（５）および式（６）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記光学ブランク値である。ｎは、前記光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項７】
前記第１光学ブランク値の測定は、複数回行われ、
前記第２光学ブランク値は、減衰係数を含む近似式と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、
請求項１に記載の測定方法。
【請求項８】
前記第２光学ブランク値は、対数近似式である以下の式（７）と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、請求項７に記載の測定方法。
【数７】
2016147774.tif 000021
［式（７）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（８）および式（１０）で表される値である。ｂは、以下の式（９）および式（１０）で表される値である。］
【数８】
2016147774.tif 000022
【数９】
2016147774.tif 000023
【数１０】
2016147774.tif 000024
［式（８）〜（１０）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記第１光学ブランク値である。ｎは、前記第１光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項９】
前記第２光学ブランク値は、指数近似式である以下の式（１１）と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて算出される、請求項７に記載の測定方法。
【数１１】
2016147774.tif 000025
［式（１１）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（１２）および式（１４）で表される値である。ｂは、以下の式（１３）および式（１４）で表される値である。］
【数１２】
2016147774.tif 000026
【数１３】
2016147774.tif 000027
【数１４】
2016147774.tif 000028
［式（１２）〜（１４）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記第１光学ブランク値である。ｎは、前記第１光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項１０】
前記第１光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の前記測定チップ内の光路は、前記第２光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の前記測定チップ内の光路と重複し、
前記第１光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の波長およびパワーは、前記第２光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の波長およびパワーと同じである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１１】
誘電体である樹脂からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する測定チップが装着され、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質を表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被測定物質の存在または量を示すシグナル値を測定するための測定装置であって、
前記測定チップを保持するためのホルダーと、
前記蛍光物質を励起するための励起光を前記ホルダーに保持された前記測定チップに照射する光照射部と、
前記光照射部が前記測定チップに励起光を照射したときに、前記測定チップから放出される光を検出する光検出部と、
前記光検出部により得られた検出値を処理する処理部と、
を有し、
前記蛍光物質が前記金属膜上に存在しない状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が前記測定チップから放出される光を検出して、第１光学ブランク値を測定する工程と、
前記第１光学ブランク値を測定した後に、前記蛍光物質で標識された前記被測定物質が前記金属膜上に存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が前記蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する工程と、
前記処理部が、前記第１光学ブランク値に基づいて、前記蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を算出するとともに、前記蛍光値から前記第２光学ブランク値を引いて前記シグナル値を算出する工程と、
を行う、
測定装置。
【請求項１２】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数は、予め測定された一定の値であり、
前記光検出部は、前記第１光学ブランク値を１回測定し、
前記処理部は、予め測定された前記減衰係数を含む近似式と、前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、
請求項１１に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記処理部は、対数近似式である以下の式（１）と、前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、請求項１２に記載の測定装置。
【数１５】
2016147774.tif 000029
［式（１）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数である。ｂは、定数である。］
【請求項１４】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数ａは、
事前に、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射して、前記光検出部が光学ブランク値を複数回測定し、
前記処理部が、以下の式（２）および式（３）と得られた複数の測定値とに基づいて予め算出した値である、
請求項１３に記載の測定装置。
【数１６】
2016147774.tif 000030
【数１７】
2016147774.tif 000031
［式（２）および式（３）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記光学ブランク値である。ｎは、前記光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項１５】
前記処理部は、指数近似式である以下の式（４）と、前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、請求項１２に記載の測定装置。
【数１８】
2016147774.tif 000032
［式（４）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数である。ｂは、定数である。］
【請求項１６】
前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数ａは、
事前に、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射して、前記光検出部が前記光学ブランク値を複数回測定し、
前記処理部が、以下の式（５）および式（６）と得られた複数の測定値とに基づいて予め算出した値である、
請求項１５に記載の測定装置。
【数１９】
2016147774.tif 000033
【数２０】
2016147774.tif 000034
［式（５）および式（６）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記光学ブランク値である。ｎは、前記光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項１７】
前記光検出部は、前記第１光学ブランク値を複数回測定し、
前記処理部は、減衰係数を含む近似式と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、
請求項１１に記載の測定装置。
【請求項１８】
前記処理部は、対数近似式である以下の式（７）と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、請求項１７に記載の測定装置。
【数２１】
2016147774.tif 000035
［式（７）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（８）および式（１０）で表される値である。ｂは、以下の式（９）および式（１０）で表される値である。］
【数２２】
2016147774.tif 000036
【数２３】
2016147774.tif 000037
【数２４】
2016147774.tif 000038
［式（８）〜（１０）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記第１光学ブランク値である。ｎは、前記第１光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項１９】
前記処理部は、指数近似式である以下の式（１１）と、複数の前記第１光学ブランク値とに基づいて前記第２光学ブランク値を算出する、請求項１７に記載の測定装置。
【数２５】
2016147774.tif 000039
［式（１１）において、ｙは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘ照射したときの前記第１光学ブランク値または前記第２光学ブランク値である。ａは、前記プリズムから放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（１２）および式（１４）で表される値である。ｂは、以下の式（１３）および式（１４）で表される値である。］
【数２６】
2016147774.tif 000040
【数２７】
2016147774.tif 000041
【数２８】
2016147774.tif 000042
［式（１２）〜（１４）において、ｙｉは、前記プリズムに励起光を合計照射エネルギーｘｉ照射したときの前記第１光学ブランク値である。ｎは、前記第１光学ブランク値の測定回数である。］
【請求項２０】
前記光照射部の光源のパワーは、１ｍＷ／ｍｍ２以上である、
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２１】
前記光照射部は、前記第１光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の前記測定チップ内の光路が、前記第２光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の前記測定チップ内の光路と重複するように、励起光を前記金属膜に照射し、
前記第１光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の波長およびパワーは、前記第２光学ブランク値を測定する工程で照射される励起光の波長およびパワーと同一である、
請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質を測定するための測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定できる測定装置が求められている。【０００３】
被測定物質を高感度に測定できる測定装置として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
特許文献１に記載の測定装置では、プリズム（透明支持体）と、プリズム上に形成された金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体（例えば、抗体）とを有する測定チップを使用する。金属膜上に被測定物質を含む検体を供給すると、被測定物質が捕捉体により捕捉される（１次反応）。捕捉された被測定物質は、さらに蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態で、表面プラズモン共鳴が生じる角度で、プリズムを介して励起光を、金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被測定物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。この測定装置では、蛍光を検出して、被測定物質の存在またはその量を測定する。このとき、測定チップから放出される自家蛍光などの影響を排除するために、２次反応を行う前に光学ブランク測定が行われる。蛍光の検出値（以下、単に「検出値」ともいう）から光学ブランク値を引いてシグナル値を算出することで、被測定物質を高精度で測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−０５３９０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微量の被測定物質を標識する蛍光物質からの蛍光は微弱であるため、ＳＰＦＳを利用した測定装置では、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などの高感度な受光センサーを使用するのが一般的である。しかし、これらの高感度な受光センサーは、微弱な光の検出には適しているものの、受光感度が温度により大きく変化するため、高精度な温度制御が必要となるという問題を有している。【０００７】
そこで、本発明者らは、温度が変化しても受光感度の変化が小さい受光センサー（例えば、フォトダイオード（ＰＤ））を使用することを検討した。本発明者らは、励起光の光源をハイパワー化（例えば、１ｍＷ／ｍｍ２以上）することで、ＰＤのように高感度でない受光センサーを用いても、ＳＰＦＳを利用して微量の被測定物質を高精度に測定しうることを見出した。【０００８】
しかしながら、本発明者らの予備実験によれば、ハイパワーの励起光を測定チップに照射すると、測定チップから放出される自家蛍光の光量が減衰することがわかった。このように測定チップから放出される自家蛍光の光量が減衰する場合、蛍光を測定するときの自家蛍光の光量は、光学ブランク値を測定するときの自家蛍光の光量よりも小さくなる。このため、蛍光値から光学ブランク値を引いたときに、正しいシグナル値を算出することができず、不正確に小さい値を算出してしまうこととなる。【０００９】
以上のように、ＳＰＦＳを利用した測定方法および測定装置において、ハイパワーの励起光を照射する場合、測定チップから放出される自家蛍光の光量の減衰により、被測定物質を高精度で測定することができないおそれがある。【００１０】
本発明の目的は、ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置であって、ハイパワーの励起光を照射する場合であっても、測定チップから放出される自家蛍光の光量の減衰による影響を受けることなく、高精度に被測定物質を測定することができる測定方法および測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、被測定物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて放出した蛍光を検出して、前記被測定物質の存在または量を示すシグナル値を測定する測定方法であって、誘電体である樹脂からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する測定チップを準備する工程と、前記蛍光物質が前記金属膜上に存在しない状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射しときに、前記測定チップから放出される光を検出して、第１光学ブランク値を測定する工程と、前記第１光学ブランク値を測定した後に、前記蛍光物質で標識された前記被測定物質が前記金属膜上に存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する工程と、前記第１光学ブランク値に基づいて、前記蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を算出する工程と、前記蛍光値から前記第２光学ブランク値を引いて、前記シグナル値を算出する工程と、を含む。【００１２】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定装置は、誘電体である樹脂からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する測定チップが装着され、前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質を表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被測定物質の存在または量を示すシグナル値を測定するための測定装置であって、前記測定チップを保持するためのホルダーと、前記蛍光物質を励起するための励起光を前記ホルダーに保持された前記測定チップに照射する光照射部と、前記光照射部が前記測定チップに励起光を照射したときに、前記測定チップから放出される光を検出する光検出部と、前記光検出部により得られた検出値を処理する処理部と、を有し、前記蛍光物質が前記金属膜上に存在しない状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が前記測定チップから放出される光を検出して、第１光学ブランク値を測定する工程と、前記第１光学ブランク値を測定した後に、前記蛍光物質で標識された前記被測定物質が前記金属膜上に存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記プリズムを通して前記金属膜に励起光を照射したときに、前記光検出部が前記蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する工程と、前記処理部が、前記第１光学ブランク値に基づいて、前記蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を算出するとともに、前記蛍光値から前記第２光学ブランク値を引いて前記シグナル値を算出する工程と、を行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、測定チップの自家蛍光の減衰に起因する測定誤差を抑えて被測定物質を高感度かつ高精度で測定することができる。たとえば、本発明によれば、臨床検査における誤診を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の構成を示す図である。
【図２】図２は、表面プラズモン増強蛍光測定装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３Ａは、測定チップのプリズムに照射された励起光の合計照射エネルギーと、光学ブランク値との関係を示すグラフであり、図３Ｂ、Ｃは、測定チップのプリズムに対する励起光の照射の効果について説明するための概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。以下の説明では、本発明に係る測定装置の代表例として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、被測定物質を測定する表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
【００１６】
図１は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、測定チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー１１０と、測定チップ１０に光を照射するための光照射ユニット（光照射部）１２０と、測定チップ１０から放出された光（自家蛍光、プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）を検出するための受光ユニット（光検出部）１３０と、これらを制御する制御部（処理部）１４０と、測定チップ１０に送液するための送液ユニット（不図示）とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０に測定チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、測定チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１７】
（測定チップの構成）
図１に示されるように、測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、成膜面２２上または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、測定チップ１０は、測定（分析）のたびに交換される。
【００１８】
プリズム２０は、励起光αに対して透明であり、誘電体である樹脂からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。
【００１９】
入射面２１は、光照射ユニット１２０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。
【００２０】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが光照射ユニット１２０に戻らないように形成されている。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。
【００２１】
ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）βの光量が最大となるときの、入射角を意味する。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２２】
プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）や、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィン系ポリマーなどが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂は、好ましくは、屈折率が１．４〜１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。このように樹脂（組成物）を用いてプリズム２０を形成した場合、通常、プリズム２０は、光を照射されたときに自家蛍光を放出する。
【００２３】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴；ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２４】
また、特に図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定されている。捕捉体を固定することで、被測定物質を選択的に測定することが可能となる。このように金属膜３０の表面の少なくとも一部は、反応場として設定される。本実施の形態では、金属膜３０表面の中央部分が反応場として設定されている。反応場には、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片である。
【００２５】
流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）とともに、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。反応場は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口および排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は反応場の捕捉体に接触する。
【００２６】
流路蓋４０は、金属膜３０の反応場から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）に対して透明な材料からなる樹脂部材である。流路蓋４０の材料は、これらの光に対して透明であれば特に限定されない。これらの光を受光ユニット１３０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２７】
なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２８】
図１に示されるように、プリズム２０へ導かれた励起光αは、入射面２１でプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。上記の界面からの反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射される（図示省略）。このとき、励起光αがプリズムを通過することによって、プリズム２０内の励起光αの光路となる領域からは、自家蛍光が放出される。この自家蛍光の一部は、金属膜３０および流路蓋４０を透過して受光ユニット１３０の方向に向かう。また、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが上記の界面に入射することで、反応場からは、プラズモン散乱光βや蛍光γなどが、受光ユニット１３０の方向へ放出される。
【００２９】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０、光照射ユニット（光照射部）１２０、受光ユニット（光検出部）１３０および制御部（処理部）１４０を有する。
【００３０】
チップホルダー１１０は、所定の位置で測定チップ１０を保持する。測定チップ１０は、チップホルダー１１０に保持された状態で、光照射ユニット１２０からの励起光αを照射される。
【００３１】
光照射ユニット１２０は、チップホルダー１１０に保持された測定チップ１０のプリズム２０の入射面２１に向けて、励起光α（シングルモードレーザー光）を照射する。より具体的には、光源ユニット１２１は、測定チップ１０のプリズム２０側から捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、励起光αを全反射角度となるように出射する。
【００３２】
光照射ユニット１２０は、励起光αを出射する光源ユニット１２１と、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１２２と、光源ユニット１２１に含まれる各種機器を制御する光源制御部１２３とを有する。
【００３３】
光源ユニット１２１は、励起光αを出射する。たとえば、光源ユニット１２１は、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも図示省略）を有する。
【００３４】
光源の種類は、特に限定されないが、受光センサー１３５としてフォトダイオード（ＰＤ）などの高感度でない光検出器を使用する観点からは、ハイパワーの光源であることが好ましい。光源は、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の種類の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。たとえば、光源の発光パワーは、１ｍＷ／ｍｍ２以上である。
【００３５】
また、光源から出射される励起光αがビームでない場合は、光源から出射される励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、光源から出射される励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、光源から出射される励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３６】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。
【００３７】
コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。
【００３８】
バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。
【００３９】
直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００４０】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００４１】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００４２】
角度調整部１２２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１２２は、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置（反応場の裏側）に所定の入射角で照射させるために、励起光αの光軸とチップホルダー１１０とを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１２２は、光源ユニット１２１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０（成膜面２２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置とプリズム２０の入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００４３】
光源制御部１２３は、光源ユニット１２１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１２１からの励起光αのパワーや照射時間などを調整する。光源制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４４】
受光ユニット１３０は、チップホルダー１１０に保持された測定チップ１０の金属膜３０のプリズム２０と対向しない面に対向するように配置されている。受光ユニット１３０は、測定チップ１０から放出される自家蛍光と、金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）とを検出する。受光ユニット１３０は、受光光学系ユニット１３１に配置された第１レンズ１３２、光学フィルター１３３、第２レンズ１３４および受光センサー１３５と、位置切替え機構１３６と、光センサー制御部１３７とを有する。
【００４５】
第１レンズ１３２は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３４は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３２で集光された光を受光センサー１３５の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行になっている。
【００４６】
光学フィルター１３３は、第１レンズ１３２と第２レンズ１３４との間に配置されている。光学フィルター１３３は、蛍光成分のみを受光センサー１３５に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光β）を除去する。光学フィルター１３３の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３３は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【００４７】
受光センサー１３５は、測定チップ１０から放出される自家蛍光、プラズモン散乱光βおよび蛍光γを検出する。受光センサー１３５の種類は、上記の目的を達成することができれば特に限定されないが、受光量が増加しても測定値のばらつきが小さいものが好ましい。受光センサー１３５は、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）である。前述のように、本発明者らは、励起光αの光源をハイパワー化（例えば、１ｍＷ／ｍｍ２以上）することで、ＰＤのように高感度でない受光センサー１３５を用いても、ＳＰＦＳを利用することで微量の被測定物質を高精度に測定しうることを確認している。
【００４８】
位置切替え機構１３６は、光学フィルター１３３の位置を、受光光学系ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３５が光学ブランク値または蛍光値を測定する時には、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１における光路上に配置し、受光センサー１３５がプラズモン散乱光βを検出する時には、光学フィルター１３３を光路外に配置する。
【００４９】
光センサー制御部１３７は、受光センサー１３５の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３５の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３５の感度を制御する。光センサー制御部１３７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５０】
制御部１４０は、角度調整部１２２、光源制御部１２３、位置切替え機構１３６および光センサー制御部１３７を制御する。また、制御部１４０は、受光センサー１３５の検出結果に基づいて蛍光値に含まれる光学ブランク値を推定し、かつ被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出するための処理部としても機能する。制御部１４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５１】
［ＳＰＦＳ装置の動作］
次に、ＳＰＦＳ装置１００の動作（ＳＰＦＳ装置１００を用いた測定方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、プリズム２０から放出される自家蛍光の性質に応じて、２つの動作手順のいずれかに従って被測定物質の測定を行う。
【００５２】
（第１の動作手順）
まず、第１の動作手順について説明する。第１の動作手順は、プリズム２０から放出される自家蛍光の光量の減衰係数が予め測定されている一定の値である場合に採用される手順である。制御部１４０には、予め減衰係数が記憶されている。
【００５３】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１１０に測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５４】
次いで、増強角を測定する（工程Ｓ２０）。具体的には、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する。制御部１４０は、光源制御部１２３および角度調整部１２２を制御して、光源ユニット１２１から励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。また、制御部１４０は、位置切替え機構１３６を制御して、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１の光路外に移動させる。これとともに、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５でプラズモン散乱光βを検出する。制御部１４０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。このとき、プリズム２０に照射された励起光αの照射エネルギーも制御部１４０に記憶される。そして、制御部１４０は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００５５】
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、工程Ｓ２０で決定した増強角に設定する（工程Ｓ３０）。具体的には、制御部１４０は、角度調整部１２２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
【００５６】
次いで、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で蛍光γと同じ波長の光を含む光の測定を行い、第１光学ブランク値を１回測定する（工程Ｓ４０）。ここで、「光学ブランク値」とは、測定チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。この背景光は、主として、励起光αを照射したときに測定チップ１０（プリズム２０）から放出される自家蛍光に起因する。また、第１光学ブランク値とは、後述する蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）における蛍光値に含まれる光学ブランク値（第２光学ブランク値）を推定するために測定される光学ブランク値をいう。
【００５７】
具体的には、制御部１４０は、位置切替え機構１３６を制御して、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１の光路上に移動させる。次いで、制御部１４０は、光源制御部１２３を制御して、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、光源ユニット１２１からプリズム２０を通して金属膜３０に励起光αを照射させる。これと同時に、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５で測定チップ１０から放出された光を検出し、第１光学ブランク値を得る。測定された第１光学ブランク値は、制御部（処理部）１４０に送信され、励起光αの合計照射エネルギーとともに記憶される。
【００５８】
次いで、検体中の被測定物質と捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ５０）。具体的には、送液ユニット側において流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉体とを接触させる。検体中に被測定物質が存在する場合は、被測定物質の少なくとも一部は捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。
【００５９】
次いで、捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ６０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を提供する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に提供されると、蛍光標識液が被測定物質に接触し、被測定物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
【００６０】
次いで、測定チップ１０に蛍光物質で標識された被測定物質が存在する状態で、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、反応場の被測定物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１２３を制御して、蛍光物質で標識された被測定物質が金属膜３０上に存在する状態で、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、プリズム２０を通して金属膜３０に光源ユニット１２１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５で被測定物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γを検出する。測定された蛍光値は、制御部（処理部）１４０に送信され、励起光αの照射エネルギーとともに記憶される。
【００６１】
次いで、処理部１４０は、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）で得られた蛍光値に含まれる光学ブランク値（第２光学ブランク値）を推定する（工程Ｓ８０）。具体的には、制御部（処理部）１４０は、予め測定された減衰係数を含む対数近似式である以下の式（１）と、工程Ｓ４０で得られた第１光学ブランク値とに基づいて第２光学ブランク値を算出する。
【数１】
2016147774.tif 000003
［式（１）において、ｙは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘ照射したときの光学ブランク値（第１光学ブランク値または第２光学ブランク値）である。ａは、プリズム２０から放出される自家蛍光の光量の減衰係数である。ｂは、定数である。］
【００６２】
このとき、減衰係数ａは予め決定されているため、工程Ｓ４０で測定した第１光学ブランク値をｙに代入し、かつ第１光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ４０）以前にプリズム２０に照射された励起光αの合計照射エネルギーをｘに代入することで、定数ｂ（本実施の形態では、ｂはｘが１ｍＷ・秒／ｍｍ２のときの第１光学ブランク値に相当する）を得ることができる。本実施の形態では、ｘは、増強角を測定する工程（工程Ｓ２０）において入射角が増強角のときの励起光αの照射エネルギーと、第１光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ４０）における励起光αの照射エネルギーとの合計照射エネルギーである。次いで、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ８０）以前にプリズム２０に照射された励起光αの合計照射エネルギーを、ａおよびｂの値が明らかとなっている式（１）のｘに代入することで、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ８０）における第２光学ブランク値を算出することができる。
【００６３】
なお、予め測定される減衰係数ａの測定方法は、特に限定されない。たとえば、減衰係数ａは、事前に測定された光学ブランク値を用いて最小二乗法により算出することができる。具体的には、減衰係数ａは、事前にプリズム２０そのもの、または同種のプリズムに励起光αを照射して光学ブランク値を複数回測定した後に、以下の式（２）および式（３）と、得られた複数の測定値とに基づいて算出することができる。より正確に減衰係数ａを測定する観点からは、光学ブランク値を測定する回数ｎは、多いほど好ましく、求められる測定精度に応じて適宜設定されうる。
【数２】
2016147774.tif 000004
【数３】
2016147774.tif 000005
［式（２）および式（３）において、ｙｉは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘｉ照射したときの光学ブランク値である。ｎは、光学ブランク値の測定回数である。］
【００６４】
最後に、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ９０）。蛍光値は、主として、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、測定チップ１０の自家蛍光に由来する蛍光成分（第２光学ブランク値）とを含む。したがって、制御部１４０は、工程Ｓ７０で得られた蛍光値から工程Ｓ８０で推定された第２光学ブランク値を引くことで、被測定物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。シグナル値は、予め作成しておいた検量線により、被測定物質の量や濃度などに換算されうる。
【００６５】
（第２の動作手順）
次いで、第２の動作手順について説明する。第２の動作手順は、プリズム２０から放出される自家蛍光の光量の減衰係数が予め測定されている場合に採用してもよいが、例えば、減衰係数が予め測定されていないか、またはプリズム２０から放出される自家蛍光の光量のプリズム２０間でのばらつきが大きい場合に採用される。第２の動作手順は、第１光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ４０’）および第２光学ブランク値を推定する工程（工程Ｓ８０’）だけが第１の動作手順と異なる。そこで、工程Ｓ４０および工程Ｓ８０以外の工程については、その説明を省略する。
【００６６】
第２の動作手順では、第１光学ブランク値を複数回測定する（工程Ｓ４０’）。第１光学ブランク値は、工程Ｓ４０と同様に測定され、測定された複数の第１光学ブランク値は、制御部（処理部）１４０に送信され、励起光αの合計照射エネルギーとともに記憶される。
【００６７】
また、処理部１４０は、工程Ｓ４０’で得られた複数の第１光学ブランク値を用いて、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）で得られた蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を推定する（工程Ｓ８０’）。具体的には、制御部（処理部）１４０は、減衰係数を含む対数近似式である以下の式（４）と、工程Ｓ４０’で得られた複数の第１光学ブランク値とに基づいて第２光学ブランク値を算出する。この場合、減衰係数ａおよび定数ｂは、複数の第１光学ブランク値を用いて最小二乗法により算出される。
【数４】
2016147774.tif 000006
［式（４）において、ｙは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘ照射したときの光学ブランク値（第１光学ブランク値または第２光学ブランク値）である。ａは、プリズム２０から放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（５）および式（７）で表される値である。ｂは、以下の式（６）および式（７）で表される値である。］
【数５】
2016147774.tif 000007
【数６】
2016147774.tif 000008
【数７】
2016147774.tif 000009
［式（５）〜（７）において、ｙｉは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘｉ照射したときの第１光学ブランク値である。ｎは、第１光学ブランク値の測定回数である。］
【００６８】
式（５）〜（７）と、測定された複数の第１光学ブランク値とに基づいて、減衰係数ａおよび定数ｂを得ることができる。したがって、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）以前にプリズム２０に照射された励起光αの合計照射エネルギーを式（４）のｘに代入することで、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ８０’）における第２光学ブランク値を推定することができる。なお、より正確に減衰係数ａおよび定数ｂを測定する観点からは、第１光学ブランク値を測定する回数ｎは、多いほど好ましく、求められる測定精度に応じて適宜設定されうる。
【００６９】
以上の２つの動作手順のいずれかを行うことにより、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、自家蛍光の減衰に起因する測定誤差を抑えて被測定物質を高精度に測定することができる。なお、より高精度でシグナル値を算出する観点からは、第１光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ４０、Ｓ４０’）と、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）とでは、励起光αの照射条件が同一であることが好ましい。たとえば、両工程において、同一の光源を用いて、同一のパワー、波長および偏光方向の励起光を、重複する光路を通過させて測定チップ１０に照射することが好ましい。
【００７０】
また、本実施の形態では、１次反応（工程Ｓ５０）および２次反応（工程Ｓ６０）を連続して行い、両工程の間で測定チップ１０を、送液ユニット側から光照射ユニット１２０および受光ユニット１３０側に移動させていない。このため、測定チップ１０の移動時間分、検出にかかる合計時間を短縮することができる。また、１次反応時間と、２次反応時間と、１次反応および２次反応の間隔時間とを一定に保つことにより、測定精度を向上させることもできる。
【００７１】
一方で、工程Ｓ２０〜工程Ｓ８０の順番は、上記の順番に限定されない。１次反応（工程Ｓ５０）を行った後に、増強角の測定（工程Ｓ２０）、入射角の増強角への設定（工程Ｓ３０）および第１光学ブランク値の測定（工程Ｓ４０、Ｓ４０’）を行ってもよい。この場合、１次反応（工程Ｓ５０）と２次反応（工程Ｓ６０）との間に測定チップ１０を移動させる必要があるものの、捕捉体に被測定物質が捕捉された状態で増強角および光学ブランク値の測定をすることができる。その結果、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）に、より近い状態で増強角および光学ブランク値を測定できるため、増強角および光学ブランク値をより正確に測定することができ、測定精度をより向上させることができる。また、第２ブランク値を推定する工程（工程Ｓ８０，Ｓ８０’）を行う順番は、シグナル値を算出する工程（工程Ｓ９０）の前であれば特に限定されない。たとえば、第２ブランク値を推定する工程（工程Ｓ８０，Ｓ８０’）は、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）の前に行ってもよい。この場合は、蛍光値を測定する工程以前の励起光αの合計照射エネルギーは、推定値を用いる。
【００７２】
（参考実験）
ここで、測定チップ１０の樹脂部材（プリズム２０）に対する励起光α照射の効果について調べた結果を示す。参考実験では、測定チップ１０の金属膜３０に、入射角が増強角となるようにプリズム２０側から励起光αを照射して、光学ブランク値の測定を行った。このとき、測定チップ１０のプリズム２０には、照射エネルギー４７．６ｍＷ・秒／ｍｍ２の光を、断続的に照射した。光源としてはハイパワーＬＤを使用し、受光センサー１３５としてはフォトダイオード（ＰＤ）を使用した。プリズム２０の材料はシクロオレフィン系ポリマーである。
【００７３】
図３Ａは、測定チップ１０のプリズム２０に照射された励起光αの合計照射エネルギーと、光学ブランク値との関係を示すグラフであり、図３Ｂ、Ｃは、測定チップ１０のプリズム２０に対する励起光αの照射の効果について説明するための概念図である。図３Ａにおいて、横軸はプリズム２０に照射された励起光αの合計照射エネルギー（ｍＷ・秒／ｍｍ２）を示し、縦軸は光学ブランク値（ａ．ｕ．）を示す。図３Ｂ、Ｃは、第１光学ブランク値、第２光学ブランク値、蛍光値およびシグナル値の関係を示す概念図である。図３Ｂ、Ｃにおいて、ＯＢ１は第１光学ブランク値を示し、ＯＢ２は第２光学ブランク値を示し、Ｆは蛍光値を示し、Ｓ（Ｓ１およびＳ２）はシグナル値を示す。ＯＢ（ＯＢ１およびＯＢ２）、ＦおよびＳは、以下の式（８）を満たす。
【数８】
2016147774.tif 000010
【００７４】
図３Ａに示されるように、測定チップ１０のプリズム２０にハイパワーで励起光を照射した場合、光学ブランク値は、励起光αを照射するほど対数関数的（または指数関数的）に減少した。この結果から、測定チップ１０の樹脂部材に光を照射するほど、測定チップ１０から放出される自家蛍光の光量が減衰することがわかる。
【００７５】
ここで、比較のために、第２光学ブランク値ＯＢ２の推定を行わずにシグナル値を算出する場合について説明する。この場合、図３Ｂに示されるような光量で、第１光学ブランク値ＯＢ１および蛍光値Ｆが測定される（説明の便宜上、光学ブランク値の光量を大きくしている）。前述のとおり、蛍光値Ｆの測定は、第１光学ブランク値ＯＢ１の測定の後に行われるため、図３Ａのグラフを考慮すると、第１光学ブランク値ＯＢ１の測定時と比較して、蛍光値Ｆの測定時における第２の光学ブランク値ＯＢ２も減衰している。したがって、図３Ｃに示されるように、自家蛍光の光量の減衰を考慮せずに蛍光値Ｆから第１光学ブランク値ＯＢ１を引いてシグナル値Ｓ１を算出すると、シグナル値Ｓ１は、真のシグナル値Ｓ２よりも光学ブランク値の減衰量ΔＯＢ（＝ＯＢ１−ＯＢ２）の分だけ小さい値として算出されてしまう。
【００７６】
これに対して、本実施の形態に係る測定方法および測定装置では、第１光学ブランク値ＯＢ１の測定値に基づいて、蛍光値Ｆの測定時における第２光学ブランク値ＯＢ２を推定することができる。励起光αの照射により、測定チップ１０から放出される自家蛍光の光量が減衰したとしても、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を高精度に算出することができる。
【００７７】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係る測定方法および測定装置によれば、蛍光値に含まれる第２光学ブランク値を推定することができる。このため、本実施の形態に係る測定方法および測定装置によれば、自家蛍光の減衰に起因する測定誤差を抑えて検体中の被測定物質を高精度に測定することができる。また、本実施の形態に係る測定方法および測定装置では、受光センサー１３５としてＰＤを使用しているため、蛍光の受光量が多くても被測定物質を高精度に測定することができる。したがって、本実施の形態に係る測定方法および測定装置では、幅広いダイナミックレンジで被測定物質を測定することができる。
【００７８】
なお、上記実施の形態では、対数近似により第２光学ブランク値を推定する態様について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置はこの態様に限定されない。たとえば、上記の式（１）または式（４）の代わりに以下の式（９）で表される指数近似式を使用して、第２光学ブランク値を推定してもよい。この場合は、減衰係数ａおよび定数ｂを算出するために、上記の式（２）および式（３）の代わりに下記の式（１０）および式（１２）を使用し、上記の式（５）〜（７）の代わりに以下の式（１０）〜（１２）を使用する。
【数９】
2016147774.tif 000011
［式（９）において、ｙは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘ照射したときの光学ブランク値（第１光学ブランク値または第２光学ブランク値）である。ａは、プリズム２０から放出される自家蛍光の光量の減衰係数であり、以下の式（１０）および式（１２）で表される値である。ｂは、以下の式（１１）および式（１２）で表される値である。］
【数１０】
2016147774.tif 000012
【数１１】
2016147774.tif 000013
【数１２】
2016147774.tif 000014
［式（１０）〜（１２）において、ｙｉは、プリズム２０に励起光αを合計照射エネルギーｘｉ照射したときの（第１）光学ブランク値である。ｎは、（第１）光学ブランク値の測定回数である。］
【００７９】
また、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用した測定方法および測定装置について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置は、これに限定されず、ハイパワーの光源と、樹脂部材を含む測定チップとを使用する他の蛍光測定にも使用されうる。
【００８０】
本出願は、２０１５年３月１８日出願の特願２０１５−０５４８９６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明に係る測定方法および測定装置は、被測定物質を高感度、かつ高精度で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【００８２】
１０  測定チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  流路
１００  表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０  チップホルダー
１２０  光照射ユニット
１２１  光源ユニット
１２２  角度調整部
１２３  光源制御部
１３０  受光ユニット
１３１  受光光学系ユニット
１３２  第１レンズ
１３３  光学フィルター
１３４  第２レンズ
１３５  受光センサー
１３６  位置切替え機構
１３７  光センサー制御部
１４０  制御部
α  励起光
β  プラズモン散乱光
γ  蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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