(57)【要約】【課題】ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織に含まれるＤ−細胞を可視化する方法を提供すること。【解決手段】ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を固定するステップと、前記固定された脳組織をスライスするステップと、前記スライスされた脳組織に含まれるペルオキシダーゼを不活性化させるステップと、前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップと、前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップと、前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップと、を含む、Ｄ−細胞の可視化方法。【選択図】図１
2014115571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を固定するステップと、
（２）前記固定された脳組織をスライスするステップと、
（３）前記スライスされた脳組織に含まれるペルオキシダーゼを不活性化させるステップと、
（４）前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップと、
（５）前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップと、
（６）前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップと、
を含む、
Ｄ−細胞の可視化方法。
【請求項２】
前記固定された脳組織をスライスするステップ（１）が、前記固定された脳組織を、３０〜１００μｍにスライスするステップであり、
前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップ（４）が、前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清を反応させるステップである、請求項１に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項３】
前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップ（５）が、前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、ビオチンで標識した二次抗体である抗動物血清反応させるステップと、
前記ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を反応させるステップと、
を含む、請求項２に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項４】
前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップ（６）が、前記アビジン−ビオチン複合体を反応させた脳組織を発色させるステップである、請求項３に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項５】
前記脳組織を固定するステップ（１）が、
剖検後に得られる脳組織を５ｍｍ〜３ｃｍの厚さにスライスし、パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝溶液に１〜３日間浸漬するステップ（１−１）と、
ショ糖およびアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液に３日以上２０年未満の範囲で浸漬するステップ（１−２）と、
を含む、請求項１に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項６】
前記ペルオキシダーゼを不活性化させるステップ（３）が、
前記スライスされた脳組織を、メタノールおよび過酸化水素水を含むリン酸緩衝溶液に５〜１２０分間浸漬するステップ（３−１）を含む、
請求項１に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項７】
前記一次抗体を反応させるステップ（４）が、
前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清を１〜１０℃の範囲で、７〜１０日間反応させるステップ（４−１）を含む、請求項２に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項８】
前記動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清が、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジおよびモルモットからなる群より選ばれる少なくとも一つに由来する、請求項７に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項９】
前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップ（５）が、前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記ビオチンで標識した抗動物血清を１〜１０℃の範囲で、１２〜４８時間反応させるステップ（５−１）を含む、請求項３に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項１０】
前記ビオチンで標識した抗動物血清が、ビオチンで標識した抗ウサギ血清、ビオチンで標識した抗マウス血清、ビオチンで標識した抗ラット血清、ビオチンで標識した抗ニワトリ血清、ビオチンで標識した抗ヤギ血清およびビオチンで標識した抗ヒツジ血清からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項９に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項１１】
前記アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を反応させるステップが、
前記ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を、０．５〜４時間の範囲で反応させるステップ（５−２）を含む、請求項３に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【請求項１２】
前記アビジン−ビオチン複合体を反応させた脳組織を発色させるステップが、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジアミノベンチジン四塩酸塩および過酸化水素水を含む溶液中で実施するステップ（６−１）を含む、請求項４に記載のＤ−細胞の可視化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤ−細胞の可視化方法に関し、詳細にはトレースアミン関連受容体に作用する神経活性物質を産生する細胞の一つと考えられるＤ−細胞の可視化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症の病態における中脳辺縁ドーパミン系過活動の分子レベルにおける作用機構は謎とされてきた。
近年、ドーパミンの作用を調節するtyramine、β-phenylethylamineなど生体に微量存在するトレースアミンの受容体研究が進み、中脳腹側被蓋野ドーパミンニューロンに存在するトレースアミン関連受容体１型(trace amine-associated receptor, type1: TAAR1)への刺激減弱が、中脳腹側被蓋野ドーパミンニューロンの発火頻度を増加させることが判明している。
前記トレースアミン関連受容体１型は、統合失調症をはじめとする神経精神疾患や睡眠障害の病態を改善する新規抗精神病薬開発のための標的受容体として位置付けられる。
実際に前記トレースアミン関連受容体１型に作用する２−アゼチジンメタンアミンおよび２−ピロリジンメタンアミン等の化合物が、うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症、パーキンソン病やアルツハイマー病のような神経変性障害、てんかん、偏頭痛、高血圧症、物質乱用及び代謝障害、例えば摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満症、脂質代謝異常、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害及び心血管障害の症状改善に使用できることが報告されている（特許文献１）。【０００３】
前記トレースアミン関連受容体に作用する神経活性物質を産生する細胞の一つであるＤ−細胞は、1983年、Jaeger らにより「芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素(aromatic L-amino acid decarboxylase: AADC = dopa decarboxylase: DDC)を含有するが、ドーパミン（ＤＡ）、セロトニンなどのモノアミンを含有しない細胞」と定義され、ラット中枢神経系に存在するトレースアミン合成細胞としてScience誌に報告されている（非特許文献１）。【０００４】
この一方、統合失調症の病態における中脳辺縁ドーパミン系過活動の分子基盤に関連して、「Ｄ−細胞仮説」が池本により提唱されている（非特許文献２）。
図１は、「Ｄ−細胞仮説」を解説するためのブロック図である。
前記「Ｄ−細胞仮説」の概要を図１のブロック図に沿って説明すると次の通りである。
ヒトの脳内にある側脳室脳室下帯の神経幹細胞の機能低下により、ヒトの脳内の側坐核Ｄ−ニューロン数が減少し、側坐核Ｄ−ニューロンの近傍に存在するトレースアミンの濃度が減少する。このトレースアミンの減少により腹側被蓋野ドーパミン神経終末上の前記トレースアミン関連受容体１型への刺激が減弱し、脳内における腹側被蓋野ドーパミンニューロンの発火頻度が増加する。そして脳内の側坐核におけるドーパミン放出量が増加して、脳内の中脳辺縁ドーパミン系の活動が活発となる。脳内の中脳辺縁ドーパミン系の過剰な活動は、ドーパミンによる神経幹細胞上のＤ２受容体刺激を増加させ、神経幹細胞の増殖を抑制すると考えられる。
これまで開発されている従来の抗精神病薬は、例えば、図１におけるステップ１００をブロックすることを念頭に開発されている。【０００５】
しかしながら前記Ｄ−細胞はその存在は知られているものの、前記Ｄ−細胞がヒトの脳のどの部位に存在するのか、また統合失調症の病態の進行に応じて前記Ｄ−細胞に増減があるのかといった基本情報を的確に把握することはこれまで困難であった。【０００６】
また腹側被蓋野にあるドーパミンニューロンを可視化する技術についても研究されている（非特許文献３）。
しかし、この先行技術にもＤ−細胞を可視化する方法についての詳細な言及はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０-５３４７０１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】28.  Jaeger, C.B., Teitelman, G., Joh, T.H., Albert, V.R., Park, D.H. and Reis, D.J. (1983) Some neurons of the rat central nervous system contain aromatic-L-amino-acid decarboxylase but not monoamines. Science, 219: 1233-1235.
【非特許文献２】Keiko Ikemoto: Why D-neuron? Importance in schizophrenia research, Open Journal of Psychiatry, 2012, 2, 393-398 OJPsych  doi:10.4236/ojpsych.2012.224055 Published Online November 2012(http://www.SciRP.org/journal/ojpsych/)
【非特許文献３】Keiko Ikemoto et al.: Case Reports in Neurological MedicineVolume 2011, Article ID 381059
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織に含まれるＤ−細胞を可視化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく本発明者が鋭意検討した結果、ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を固定するステップと、
前記固定された脳組織をスライスするステップと、
前記スライスされた脳組織に含まれるペルオキシダーゼを不活性化させるステップと、
前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップと、
前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップと、
前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップと、
を有する、
Ｄ−細胞の可視化方法が、本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち本発明は、
［１］（１）ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を固定するステップと、
（２）前記固定された脳組織をスライスするステップと、
（３）前記スライスされた脳組織に含まれるペルオキシダーゼを不活性化させるステップと、
（４）前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップと、
（５）前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップと、
（６）前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップと、
を含む、
Ｄ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１２】
また本発明の一つは、
［２］前記固定された脳組織をスライスするステップ（１）が、前記固定された脳組織を、３０〜１００μｍにスライスするステップであり、
前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原を反応させて得られた一次抗体を反応させるステップ（４）が、前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清を反応させるステップである、
上記［１］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１３】
また本発明の一つは、
［３］前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップ（５）が、前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、ビオチンで標識した二次抗体である抗動物血清反応させるステップと、
前記ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を反応させるステップと、
を含む、上記［２］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１４】
また本発明の一つは、
［４］前記二次抗体と反応させた脳組織を発色させるステップ（６）が、前記アビジン−ビオチン複合体を反応させた脳組織を発色させるステップである、
上記［３］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１５】
また本発明の一つは、
［５］前記脳組織を固定するステップ（１）が、
剖検後に得られる脳組織を５ｍｍ〜３ｃｍの厚さにスライスし、パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝溶液に１〜３日間浸漬するステップ（１−１）と、
ショ糖およびアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液に３日以上２０年未満の範囲で浸漬するステップ（１−２）と、
を含む、上記［１］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１６】
また本発明の一つは、
［６］前記ペルオキシダーゼを不活性化させるステップ（３）が、
前記スライスされた脳組織を、メタノールおよび過酸化水素水を含むリン酸緩衝溶液に５〜１２０分間浸漬するステップ（３−１）を含む、上記［１］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１７】
また本発明の一つは、
［７］前記一次抗体を反応させるステップ（４）が、
前記ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清を１〜１０℃の範囲で、７〜１０日間反応させるステップ（４−１）を含む、
上記［２］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１８】
また本発明の一つは、
［８］前記動物に抗原である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体である抗動物血清が、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジおよびモルモットからなる群より選ばれる少なくとも一つに由来する、上記［７］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００１９】
また本発明の一つは、
［９］前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を反応させるステップ（５）が、前記一次抗体を反応させた脳組織に対し、前記ビオチンで標識した抗動物血清を１〜１０℃の範囲で、１２〜４８時間反応させるステップ（５−１）を含む、
上記［３］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００２０】
また本発明の一つは、
［１０］前記ビオチンで標識した抗動物血清が、ビオチンで標識した抗ウサギ血清、ビオチンで標識した抗マウス血清、ビオチンで標識した抗ラット血清、ビオチンで標識した抗ニワトリ血清、ビオチンで標識した抗ヤギ血清およびビオチンで標識した抗ヒツジ血清からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［９］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００２１】
また本発明の一つは、
［１１］前記アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を反応させるステップが、
前記ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を、０．５〜４時間の範囲で反応させるステップ（５−２）を含む、
上記［３］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。【００２２】
また本発明の一つは、
［１２］前記アビジン−ビオチン複合体を反応させた脳組織を発色させるステップが、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジアミノベンチジン四塩酸塩および過酸化水素水を含む溶液中で実施するステップ（６−１）を含む、
上記［４］に記載のＤ−細胞の可視化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のＤ−細胞の可視化方法によれば、ヒトの剖検脳より得られる脳組織に含まれるＤ−細胞を簡単かつ鮮明に可視化することができる。
Ｄ−細胞は、前記非特許文献１に記載された定義より、「芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素免疫陽性であるが、ＤＡ、セロトニンを含有しない細胞」であるため、Ｄ−細胞には、ＤＡとセロトニンの生合成酵素、すなわちチロシン水酸化酵素とトリプトファン水酸化酵素が発現しない。
したがって、チロシン水酸化酵素およびトリプトファン水酸化酵素に対する一次抗体を用いて上記方法によって免疫染色を施し、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素免疫陽性であるが、その細胞にチロシン水酸化酵素およびトリプトファン水酸化酵素を可視化できないことを示すことができれば、定義上のＤ−細胞であることを証明することができる。
このステップを、同一切片および連続切片を用いた免疫二重染色を施すことによって施行する。ＤＡとセロトニンは、ヒトの死後脳において速やかに酸化分解されるため、ＤＡとセロトニンそのものを可視化することは困難であり、より安定な生体物質である生合成酵素を標識して可視化する必要が生じたからである。
この方法を使って、前記脳組織に含まれるＤ−細胞の局在同定、形態観察、定量を施行できる。
本発明のＤ−細胞の可視化方法により、統合失調症などの精神神経疾患の病態とＤ−細胞の関連を解明し、その病態と新規抗精神病薬の投薬前後におけるＤ−細胞の増減との関係を比較することが可能となる。
本発明のＤ−細胞の可視化方法により得られた知見により、本発明者が提唱した先の図１に示した「Ｄ−細胞仮説」を具体的に検証することが可能となる。
本発明のＤ−細胞の可視化方法を用いて、さらに統合失調症の分子レベルの病態解明を詳細に行い、Ｄ−細胞のシグナル伝達を解析し、他の精神神経疾患の分子レベルでの病態解明をも飛躍的に加速することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ｄ−細胞仮説を説明するためのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に実施例に基づき、本発明について詳細に説明する。なお本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を固定するステップ（１）］
ヒトの死後、剖検後に得られる脳組織を取り出し、１ｃｍの厚さにスライスし、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で１〜３日間固定する。
この固定の間、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液を１〜２回、新たな４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液と交換する。【００２７】
次に固定された脳組織を、１５％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に移す。１５％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶を新たな１５％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液と１〜２回交換し、１５％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液中に３日以上２０年未満の期間保存する。【００２８】
［固定された脳組織を、３０〜１００μｍにスライスするステップ（２）］
次にＤ−細胞が含まれると予測される領域を含むブロックを作成し、クリオスタットもしくはミクロトームで５０μｍの厚さにスライスして薄切切片を作成する。得られた薄切切片を保存液中で保存する。【００２９】
＜免疫組織化学：（Ｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ  法）＞
［スライスされた脳組織に含まれるペルオキシダーゼを不活性化させるステップ（３）］
得られた薄切切片の脳組織に含まれる内在性ペルオキシダ−ゼを抑制するために、４０％メタノール、１％過酸化水素水を含む０．１Ｍ リン酸緩衝溶液で２０分室温で処理し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００と０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸緩衝溶液で１０分×３回リンスする。【００３０】
［ペルオキシダーゼが不活性化した脳組織に対し、動物に芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクを反応させて得られた一次抗体を反応させるステップ（４）］
本発明に使用する動物に特に限定はないが、一例を挙げるとすれば、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の一種もしくは二種以上を挙げることができる。本実施例では前記動物としてウサギを使用した。後述する二次抗体の場合も同様である。
芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクをウサギに反応させて得られた一次抗体（自家特異抗体）を０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００と０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝溶液により１〜７万倍に希釈し、容器に入れて、その中に切片を浸漬し、シェーカーを用いて、４℃でゆっくりと振盪しながら、１週間から１０日間反応させる。
ここでゆっくりと振盪する、とは、好ましくは０．２〜２ｒｐｍの回転の速度によりシェーカーを振盪することをいう。以下も同様である。【００３１】
［一次抗体を反応させた脳組織に対し、ビオチンで標識した抗動物血清を反応させるステップ（５）］
０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００と０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸緩衝溶液で１０分間×３回リンスしたのち、二次抗体としてビオチンで標識した抗ウサギ血清を０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００と０．９％ＮａＣｌを含む０．０１リン酸緩衝溶液により１０００倍希釈し、その中で、同様に４℃で一晩ゆっくり振盪しながら反応させる。【００３２】
［ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を反応させるステップ］
０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００と０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸緩衝溶液で１０分間×３回リンスしたのち、前記ビオチンで標識した抗動物血清と反応させた脳組織に対し、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼとが多数結合したアビジン−ビオチン複合体を含む、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘと０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸緩衝溶液に２時間ゆっくり振盪しながら反応させる。【００３３】
［アビジン−ビオチン複合体を反応させた脳組織を発色させるステップ（６）］
０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含む０．０１Ｍ リン酸緩衝溶液で１０分間×３回リンスしたのち、脳組織を以下の反応液で発色させる。
反応液：５０ｍｌの０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸を含む緩衝液、ｐＨ７．６）に硫酸アンモニウムニッケル０．５ｇを撹拌器で撹拌しながら、溶解し、完全に溶解したのち、ジアミノベンチジン四塩酸ナトリウム（ＤＡＢ）５ｍｇを完全に溶解させる。
この溶液を、１０ｍｌシャーレに入れ、上記切片を入れたのち、１％過酸化水素液を３μｌ滴下し、実体顕微鏡下で時々振盪させながら発色反応を観察する。
十分に発色したところで、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に移し、反応を停止させる。発色反応が不十分なときは反応液に１％過酸化水素水を追加する。１５分以上観察しても、反応が不十分な時は、新たな反応液に移し替えて同様に発色を試みる。
以下、ゼラチンコートしたスライドグラスにマウントし、乾燥後、脱水、透徹し、エンテランとカバーグラスを用いて封入する。
乾燥後、光学顕微鏡下で観察することにより、可視化されたＤ−細胞を観察することができる。【００３４】
[比較例１]
実施例１の場合で、前記芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクに代えてチロシン水酸化酵素タンパクを使用して同様に実験を行った場合、Ｄ−細胞にはチロシン水酸化酵素タンパクが存在しないことからＤ−細胞を可視化することができない。【００３５】
[比較例２]
実施例１の場合で、前記芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素タンパクに代えてトリプトファン水酸化酵素タンパクを使用して同様に実験を行った場合、Ｄ−細胞にはトリプトファン水酸化酵素タンパクが存在しないことからＤ−細胞を可視化することができない。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によりトレースアミン関連受容体に作用する神経活性物質を産生する細胞の一つと考えられるＤ−細胞を簡単に可視化することができる。
他にＤ−細胞の可視化方法として考えられるものに、in situ hybridizationがあるが、これは、標識物質を粒子として可視化するものである。しかし、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素遺伝子からタンパクを合成する際に生成されるｍＲＮＡを可視化したとしても、粒子として同定されるｍＲＮＡが、細胞体内に存在するという局在についての情報を得るための手技が煩雑となる。そのために現時点では、Ｄ−細胞の可視化方法はまだ試みられていない。
トレースアミンは、ヒトの脳内に微量に含まれる不安定な生体物質であり、ヒトの死後、剖検脳において定量化することは不可能である。それゆえ、合成酵素の一つであり、死後脳においても比較的安定した生体物質である芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素に着目した。現在のところ、この方法がトレースアミンニューロンを可視化する唯一の方法である。今後、ヒトにおけるトレースアミンの生合成と代謝に関わる別の経路が解明されれば、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素以外の生体物質を標識して同様の可視化法を試みる必要が生じる。
本発明を応用することにより、統合失調症の病態における中脳辺縁ドーパミン系過活動の分子レベルにおける作用機構、および他の精神神経疾患の発症機序におけるＤ−細胞の役割を解明する道を拓き、新規抗精神病薬の開発に必要不可欠な情報を提供することができる。
また本発明のＤ−細胞の可視化方法を用いて、さらに統合失調症の分子レベルの病態解明を詳細に行い、Ｄ−細胞のシグナル伝達を解析し、他の精神神経疾患の分子レベルでの病態解明をも飛躍的に加速することができる。
【符号の説明】
【００３７】
１００    ステップ
【図１】
2014115571.tif 000003
【国際調査報告】
2014115571.tif 000004
2014115571.tif 000005