(57)【要約】真核生物細胞と原核生物とが混在する試料において、真核生物細胞を特異的に識別することができる、真核生物細胞の可視化方法及び改変レポーター遺伝子の提供。  本発明の真核生物細胞の可視化方法は、１又は２以上の真核生物細胞と１又は２以上の原核生物とが混在する試料を準備する工程と、光関連タンパク質のコード配列を含み且つ該原核生物において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変された１又は２以上の改変レポーター遺伝子を、該真核生物細胞内及び該原核生物内に導入する工程と、該試料を、該光関連タンパク質を光検出することが可能な条件下に置く工程と、該試料中の該光関連タンパク質を光検出する工程と、を含む。本発明の改変レポーター遺伝子は、光関連タンパク質のコード配列と、真核生物細胞でスプライシングされるイントロンと、を含み、該イントロンが、該光関連タンパク質のコード配列中に挿入されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上の真核生物細胞と１又は２以上の原核生物とが混在する試料を準備する工程と、
光関連タンパク質のコード配列を含み且つ該原核生物において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変された１又は２以上の改変レポーター遺伝子を、該真核生物細胞内及び該原核生物内に導入する工程と、
該試料を、該光関連タンパク質を光検出することが可能な条件下に置く工程と、
該試料中の該光関連タンパク質を光検出する工程と、
を含むことを特徴とする、真核生物細胞の可視化方法。
【請求項２】
前記改変レポーター遺伝子が、前記光関連タンパク質のコード配列中に、前記真核生物細胞でスプライシングされるイントロンを含む、請求項１に記載の可視化方法。
【請求項３】
前記イントロンが、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列を有する、請求項２に記載の可視化方法。
【請求項４】
前記イントロンが、配列番号１の塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の可視化方法。
【請求項５】
前記１又は２以上の真核生物細胞が、植物細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の可視化方法。
【請求項６】
前記１又は２以上の真核生物細胞が、動物細胞を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可視化方法。
【請求項７】
前記動物細胞が、哺乳動物の細胞を含む、請求項６に記載の可視化方法。
【請求項８】
前記光関連タンパク質が、発光タンパク質であり、該発光タンパク質の種類に応じて発光量が調節される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の可視化方法。
【請求項９】
前記発光タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の可視化方法。
【請求項１０】
光関連タンパク質のコード配列と、
真核生物細胞でスプライシングされるイントロンと、
を含み、
該イントロンが、該光関連タンパク質のコード配列中に挿入されていることを特徴とする、真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子。
【請求項１１】
前記イントロンが、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列を有する、請求項１０に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１２】
前記イントロンが、配列番号１の塩基配列を有する、請求項１１に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１３】
植物細胞の可視化可視化用である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１４】
動物細胞の可視化用である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１５】
哺乳動物の細胞の可視化用である、請求項１４に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１６】
前記光関連タンパク質が、発光タンパク質である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１７】
前記発光タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の改変レポーター遺伝子。
【請求項１８】
請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の改変レポーター遺伝子を含むことを特徴とする、真核生物細胞の可視化用の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物細胞の可視化方法、並びに真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子及び発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、種々の生命現象を観察する目的で、レポーターアッセイ技術や細胞イメージング技術が広く行われている。特に、細胞イメージング技術では、蛍光タンパク質や発光タンパク質などの光関連タンパク質をコードするレポーター遺伝子を使用して生物細胞を改変し、蛍光や発光を指標として、生物細胞における種々の生命現象を解析することが行われている。この技術は、生細胞における目的遺伝子の発現や活性化の状態などをはじめとする種々の生命現象を視覚的且つ経時的にモニタリングして解析することができる点で、非常に有用である。【０００３】
かかるイメージングを高精度に行うためには、対象の生物細胞におけるレポーター（光関連タンパク質）由来の光を特異的に検出することが必要である。そのため、観察対象の細胞でのレポーター由来の光以外のバックグラウンドを低減させる努力がなされている。一般に、試験される試料や試験系は、必要最低限の要素で構成されるように設計されており、必要に応じて、観察対象以外の細胞などの不純物を含まないように予備精製され得る。【０００４】
しかしながら、試験される試料において、観察対象の細胞と他の細胞との分離が困難な場合がある。例として、観察対象の植物細胞や動物細胞（すなわち、真核生物細胞）に、細菌（原核生物）が感染している場合などが挙げられる。例えば、生きた植物細胞のレポーターアッセイにおいて、その植物細胞が細菌に感染していると、植物細胞と細菌とが混在し、植物細胞だけでなく細菌にもレポーター遺伝子が導入される。その結果、混在する細菌からもレポーターの活性化を示す光が生じ、バックグラウンドが増加して、試験精度を低下させ得る。【０００５】
このため、かかる試料においても、観察対象の植物細胞のみでレポーターを活性化して、細菌によるバックグラウンドを低減し、レポーターアッセイの試験精度を向上させる方法が考えられている。例えば、感染により土壌細菌が混在している植物細胞のレポーターアッセイにおいて、ジャガイモのＬＳ１遺伝子が持つイントロンをｌｕｃ＋遺伝子（発光レポータ遺伝子）に挿入することにより、土壌細菌中に取り込まれた該レポーター遺伝子の活性を抑えて土壌細菌からのバックグラウンドを低減できたことが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｒｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ．”，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，（１９９７）１５：１８６−１９６
【非特許文献２】“Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｔｉｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｓ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｃｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ｃｕｅｓ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＬＲｓ．”，Ｃｅｌｌ，（２０１３）１５３：８１２−８２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の方法は、旧来型の発光レポーター遺伝子を用いて行った植物細胞に限定された方法であり、近年に開発された新型の発光レポーター遺伝子において植物細胞や動物細胞などの真核生物の細胞に共通に用いることのできる方法は提案されていない。また近年、生体メカニズムにおいて、観察対象の動物細胞での目的遺伝子の活性化が、原核生物の影響を受ける可能性が示唆されている。例えば、非特許文献２に記載されるように、哺乳動物の腸の生物時計における時計遺伝子の機能のオンオフが腸内の細菌叢によって維持されていることが報告されている。これをきっかけに、真核生物細胞と原核生物とが混在する（例えば、哺乳動物の腸管細胞と腸内の細菌叢とが混在する）試料において、真核生物細胞を特異的に識別することが可能なレポーターアッセイが求められている。【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、真核生物細胞と原核生物とが混在する試料において、真核生物細胞を特異的に識別することができる、真核生物細胞の可視化方法、並びに真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子及び発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、原核生物における光関連タンパク質由来の光量が低減するように改変した改変レポーター遺伝子を用いることにより、真核生物細胞と原核生物（原核細胞）とが混在する試料において、真核生物細胞に由来するシグナルを高精度に検出できることを見出した。本発明は、これら知見に基づき、鋭意研究を行うことにより、実現されたものである。【００１０】
すなわち、本発明の真核生物細胞の可視化方法は、
１又は２以上の真核生物細胞と原核生物とが混在する試料を準備する工程と、
光関連タンパク質のコード配列を含み且つ該原核生物において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変された１又は２以上の改変レポーター遺伝子を、該真核生物細胞内及び該原核生物内に導入する工程と、
該試料を、該光関連タンパク質を光検出することが可能な条件下に置く工程と、
該試料中の該光関連タンパク質を光検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
本発明の真核生物細胞の可視化方法によると、真核生物細胞と原核生物とが混在する試料において、真核生物細胞を特異的に可視化することができる。【００１１】
本発明の真核生物細胞の可視化方法では、前記改変レポーター遺伝子が、前記光関連タンパク質のコード配列中に該真核生物細胞においてスプライシングされるイントロンを含むことが好ましい。この構成によれば、比較的簡便な原理で、真核生物細胞において特異的に光関連タンパク質由来の光を発生させることができる。【００１２】
本発明の真核生物細胞の可視化方法では、前記イントロンが、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列であることが好ましく、配列番号１の塩基配列であることがより好ましい。これらの構成によれば、動物細胞及び／又は植物細胞を含む複数の真核生物細胞と原核生物との組み合わせで使用できることから、汎用性、経済性（例えば、試薬としてのリーズナブルさ）に優れた方法を提供することができる。【００１３】
本発明の真核生物細胞の可視化方法では、前記１又は２以上の真核生物細胞が、植物細胞を含むことができる。この構成によれば、例えば、感染により土壌細菌が混在している植物細胞において、植物細胞における目的遺伝子の活性化を特異的に可視化することができる。【００１４】
本発明の真核生物細胞の可視化方法では、前記１又は２以上の真核生物細胞が、動物細胞を含むことができる。この構成によれば、例えば、感染により病原性細菌が混在している動物細胞において、動物細胞における目的遺伝子の活性化を特異的に可視化することができる。前記動物細胞は、哺乳動物由来の動物細胞を含むことが好ましい。これらの構成によれば、動物種、特に哺乳動物種における疾患及び外傷の治療又は予防並びに身体機能の解明及び向上といった目的で生命現象の解明を行うことができる。【００１５】
本発明の真核生物細胞の可視化方法では、前記光関連タンパク質が、発光タンパク質であり、該発光タンパク質の種類に応じて発光量が調節されることが好ましい。この構成によれば、イントロンに基づく検出原理とは実質的に関係なく、発光タンパク質の種類（生物由来や改変）を適切に選択することにより、発光量の調節及び最適化を行うことができる。前記発光タンパク質は、発光強度が強い配列番号３のアミノ酸配列を有することが好ましい。【００１６】
本発明の真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子は、
光関連タンパク質のコード配列と、
真核生物細胞でスプライシングされるイントロンと、
を含み、
該イントロンが、該光関連タンパク質のコード配列中に挿入されていることを特徴とする、真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子。
を特徴とする。前記改変レポーター遺伝子は、本発明の前記可視化方法において、好適に使用することができる。【００１７】
本発明の前記改変レポーター遺伝子は、前記イントロンが、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列を有することが好ましく、配列番号１の塩基配列を有することがより好ましい。これら構成によれば、哺乳動物を含む複数の真核生物由来細胞と原核生物との組み合わせで使用できることから、汎用性、経済性（例えば、試薬としてのリーズナブルさ）に優れた改変レポーター遺伝子を提供することができる。【００１８】
本発明の前記改変レポーター遺伝子は、植物細胞の可視化用とすることができる。この構成によれば、本発明の可視化方法において、可視化対象が植物細胞である場合に好適に使用することができる。【００１９】
本発明の前記改変レポーター遺伝子は、動物細胞の可視化用とすることができる。この構成によれば、本発明の可視化方法において、可視化対象が動物細胞である場合に好適に使用することができる。本発明の前記改変レポーター遺伝子は、哺乳動物の細胞の可視化用であることが好ましい。この構成によれば、動物種、特に哺乳動物種における疾患及び外傷の治療又は予防並びに身体機能の解明及び向上といった目的で生命現象の解明に好適に用いることができる。【００２０】
本発明の前記改変レポーター遺伝子は、前記光関連タンパク質が、発光タンパク質であり、該発光タンパク質の種類に応じて発光量が調節されることが好ましい。この構成によれば、発光タンパク質の種類（生物由来や改変）を適切に選択することにより、発光量が調節及び最適化された改変レポーター遺伝子を提供することができる。前記発光タンパク質は、発光強度が強い配列番号３のアミノ酸配列を有することが好ましい。【００２１】
本発明の真核生物細胞の可視化用の発現ベクターは、本発明の前記改変レポーター遺伝子を含むことを特徴とする。前記発現ベクターは、本発明の前記可視化方法において、好適に使用することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、１又は２以上の真核生物細胞と１又は２以上の原核生物とが混在する試料において、真核生物細胞を特異的に識別することができる、真核生物細胞の可視化方法、真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子及び発現ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子を土壌細菌に導入してルミノメーターで計測した結果を示す。
【図２】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子を土壌細菌に導入してイメージングを行った結果を示す。
【図３】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子を植物に導入してイメージングを行った結果を示す。
【図４】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子を大腸菌に導入してルミノメーターで計測した結果を示す。
【図５】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子を大腸菌に導入してイメージングを行った結果を示す。
【図６】本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子をヒト細胞に導入してイメージングを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を、その実施形態に基づき具体的に例示説明する。
【００２５】
＜真核生物細胞の可視化方法＞
本発明の真核生物細胞の可視化方法は、
１又は２以上の真核生物細胞と１又は２以上の原核生物とが混在する試料を準備する工程と、
光関連タンパク質のコード配列を含み且つ該原核生物において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変された１又は２以上の改変レポーター遺伝子を、該真核生物細胞内及び該原核生物内に導入する工程と、
該試料を、該光関連タンパク質を光検出することが可能な条件下に置く工程と、
該試料中の該光関連タンパク質を光検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明の可視化方法は、光関連タンパク質のコード配列を含み且つ原核生物（原核細胞）において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変された１又は２以上の改変レポーター遺伝子を使用する。前記改変レポーター遺伝子は、原核生物に導入されると、原核生物における前記光関連タンパク質由来の光量が低減される一方、真核生物細胞に導入されても、真核生物細胞における前記光関連タンパク質由来の光量は低減されない。そのため、真核生物細胞における前記光量の検出強度が相対的に強まり、真核生物細胞を高精度に光検出し可視化することができる。
【００２７】
本発明の可視化方法は、例えば、真核生物を宿主とする原核生物が混在するような試験環境（例えば培養チャンバー）に使用することができる。また、試験環境は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。本発明の可視化方法によると、該原核生物が取りこんだ改変レポーター遺伝子由来の光は検出されず、実質的には真核生物細胞が取りこんだ改変レポーター遺伝子からの光のみが検出される。そのため、真核生物細胞単独での又は原核生物との間の生物学的な相互作用に由来する生物学的機能のオンオフを精度よく検出し可視化することができる。
【００２８】
本発明の可視化方法は、１又は２以上の真核生物細胞と１又は２以上の原核生物とが混在する試料を準備する工程を含む。「１又は２以上の」とは、単一の種類に分類されるもののみであっても、異なる種類に分類されるものの混合物であってもよいことを意味する。
【００２９】
前記１又は２以上の真核生物細胞は、本発明の可視化方法で可視化される真核生物細胞を含む。前記１又は２以上の真核生物細胞は、特に限定されず、植物細胞及び動物細胞を単独で又は組み合わせて含むことができる。前記動物細胞は、哺乳動物の細胞を含むことが好ましい。生命現象の解明は、哺乳動物種における疾患及び外傷の治療又は予防並びに身体機能の解明及び向上といった目的で行われることが多く、かかる生命解明には、哺乳類由来の動物細胞が汎用されるからである。
【００３０】
前記原核生物は、特に限定されず、細菌類、藻類のいずれであってもよい。具体的には、可視化される真核生物細胞を宿主とするもの、該真核生物細胞の生命現象に影響を与え得るもの、該真核生物細胞から分離することが困難なものなどが挙げられる。例えば、植物細胞に感染する土壌細菌や、動物細胞に感染する病原性細菌などが挙げられる。
【００３１】
試験環境がｉｎ  ｖｉｔｒｏである場合、前記試料は、可視化される真核生物細胞が生存可能な条件下に準備することが好ましい。かかる条件の例としては、培地の組成及びｐＨ、大気組成（例えば、酸素濃度）、温度、光度、容器などが挙げられる。これらは、可視化される真核生物細胞に応じて適切に選択することができる。容器の例は、特に限定されないが、培養チャンバー、ペトリディッシュ、ウェルプレートなどが挙げられる。準備した試料は、時間をおかずに次の工程を行ってもよく、又は、一定期間経過した後に次の工程を行ってもよい。あるいは、必要に応じて、試料中の真核生物細胞又は原核生物を培養した後に次の工程を行ってもよい。試料は、以降の工程においても、可視化される真核生物細胞が生存可能な条件下に置かれることが好ましい。
【００３２】
本発明の可視化方法は、１又は２以上の改変レポーター遺伝子を、１又は２以上の真核生物細胞内及び１又は２以上の原核生物内に導入する工程を含む。該改変レポーター遺伝子は、光関連タンパク質のコード配列を含む。前記光関連タンパク質とは、その存在を直接的又は間接的に光により検出することができるタンパク質を意味し、例えば、発光タンパク質、蛍光タンパク質などが挙げられる。
【００３３】
発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。例としては、ルシフェラーゼ、イクオリン、それらの変異体などが挙げられる。ルシフェラーゼは、ＡＴＰが存在する場合に、基質であるルシフェリンの酸化反応を触媒する。その反応の際、ルシフェリンが発光する。イクオリンは、基質であるセレンテラジンを分子内に含むタンパク質複合体であり、カルシウムイオンがトリガーとなってイクオリン自体が発光する。
【００３４】
蛍光タンパク質とは、自ら蛍光を発するか、励起光を照射するとその励起エネルギーを吸収して蛍光を発するタンパク質を意味する。蛍光タンパク質の例としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、それらの変異体などが挙げられる。
【００３５】
光関連タンパク質として、公知の発光タンパク質及び蛍光タンパク質のいずれをも用いることができるが、発光タンパク質であることがより好ましく、中でもルシフェラーゼが更に好ましい。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応といった酵素−基質反応を利用して発光のオンオフを制御することができ、酵素と基質との組み合わせの種特異性が強い、半減期は蛍光タンパク質の半減期よりも比較的短い、細胞の発する自己蛍光がバックグラウンドとならない、ダイナミックレンジが広い、といった多くの利点を有するからである。ルシフェラーゼは、ホタルやバクテリアといった種々の生物に由来するものであってよい。ルシフェラーゼは、例えば、ｌｕｃ２ルシフェラーゼ、Ｅｌｕｃルシフェラーゼ、ＣＲＢルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼといった市販のものを使用することができる。
【００３６】
前記改変レポーター遺伝子は、原核生物において該光関連タンパク質に由来する光量が低減されるように改変されている。例えば、原核生物（原核細胞）と真核細胞との間の遺伝子発現メカニズムにおける相違を利用して、原核生物における改変レポーター遺伝子の発現を阻害又は低減できるように改変されている。かかる改変は、例えば、イントロンの導入、変異導入、修飾といった遺伝学的手法により行うことができる。このような改変を、光関連タンパク質のコード配列を予め含有する市販のベクターに導入してもよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のベクターの例としては、ｐＧＬ４ベクター（プロメガ社）、Ｅｌｕｃベクター（東洋紡）、ＣＲＢベクター（プロメガ社）およびＲｅｎｉｌｌａベクター（プロメガ社）などが挙げられる。
【００３７】
本発明では、前記改変レポーター遺伝子が、前記光関連タンパク質のコード配列中に、可視化される真核生物細胞においてスプライシングされるイントロンを含むことが好ましい。コード配列中にイントロンを含むとは、コード配列を分断する形でイントロンが挿入されていることを意味する。前記改変レポーター遺伝子は、真核生物細胞内で転写されると、前記イントロンの相補配列を含むｍＲＮＡ前駆体が形成される。該ｍＲＮＡ前駆体から前記イントロン領域のみがスプライシングされる。次いで、分断されていたエクソン配列の相補配列が連結されて、光関連タンパク質のコード配列の相補配列を完全な形で含む成熟ｍＲＮＡが形成される。この成熟ｍＲＮＡが翻訳されて、光関連タンパク質の全長アミノ酸配列を含むポリペプチド鎖が形成され、光関連タンパク質が完全な形態で形成される。すなわち、光関連タンパク質が正常に発現される。このようにして、真核生物細胞においては、光関連タンパク質の正常な発現を、光として検出すること、すなわち、光検出することが可能となる。
【００３８】
一方、原核生物（原核細胞）において前記改変レポーター遺伝子は、前記イントロン領域も含むｍＲＮＡへと転写される。スプライシングは、真核細胞に特有の現象であるため、前記イントロン領域がスプライシングされることなく前記ｍＲＮＡが翻訳される。前記イントロン領域が停止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＧＡなど）を含む場合は、該停止コドンの位置で改変レポーター遺伝子の転写が終結するため、前記光関連タンパク質のコード配列が一部のみしか翻訳されない。このように翻訳されたポリペプチド鎖は、前記光関連タンパク質の全長アミノ酸配列のうちＮ末端側の一部断片のみを含む。そのため、前記光関連タンパク質を、完全な形態で形成することができない。
【００３９】
一方、前記イントロン領域が停止コドンを含まない場合、又は変異などによって停止コドンが機能しない場合、原核生物において、前記改変レポーター遺伝子の途中で転写が終結せずに完了し、イントロン領域も含めて翻訳される。このように翻訳されたポリペプチド鎖は、前記光関連タンパク質の全長アミノ酸配列を含むが、そのアミノ酸配列を分断するようにイントロンの翻訳配列も含む。そのため、前記ポリペプチド鎖は正常なフォールディングが困難となり、実質的に前記光関連タンパク質を形成することができない。このように、原核生物においては、光関連タンパク質が正常に発現されず、光関連タンパク質に由来する光が実質的に検出されない。
【００４０】
前記イントロンは、特に限定されず、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列であっても、可視化される真核生物細胞の生物由来に応じて特異的にスプライシングされる塩基配列であってもよい。前記イントロンは、真核生物種間で共通にスプライシングされる塩基配列であることが好ましい。種にかかわらず複数の真核生物由来の植物細胞及び／又は動物細胞と原核生物との組み合わせを含む試料で使用できることから、汎用性、経済性（例えば、試薬としてのリーズナブルさ）に優れた方法を提供することができる。かかるイントロンの例としては、５’末端側（スプライス供与部位）の塩基配列がＧＴであり、３’末端側（スプライス受容部位）の塩基配列がＡＧであるものが挙げられる。
【００４１】
前記イントロンの例として、例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＬＳ１遺伝子が持つ２番目のイントロン（以下、ＳＴ−ＬＳ１イントロンと呼ぶ）が挙げられる。ＳＴ−ＬＳ１イントロンは、典型的なスプライスジャンクション（すなわち、イントロン５’末端（スプライス供与部位）におけるＧＴ及びイントロン３’末端（スプライス受容部位）におけるＡＧ）と、多重停止コドン（全ての翻訳読み枠で、少なくとも１つの停止コドンが存在する）とを有し、配列番号１で表される１８９ｂｐの長さの塩基配列を有する。
【００４２】
本発明者は、先行技術において（例えば、先行技術文献１）、植物細胞と土壌細菌の組み合わせにおいてのみ利用されてきた、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを持つレポーター遺伝子による試験方法を、哺乳類由来の細胞にも応用できることを突き止めた。つまり、植物観察のために設計されたイントロンを有するレポーター遺伝子が、意外にも、そのまま、動物細胞（例えば、哺乳類由来）に対しても同様に適用できることが判明した。更に、本発明者らは、植物細胞の可視化の目的で先行技術において検討されていた発光輝度の低い旧来型の発光レポーター遺伝子とＳＴ−ＬＳ１イントロンとの組み合わせに替えて、より発光強度の強い発光遺伝子ｌｕｃ２ルシフェラーゼとＳＴ−ＬＳ１イントロンとの組み合わせを利用できることを見出した。真核生物細胞内でのスプライシングにおいて、スプライシング反応を受けるＲＮＡは１本鎖核酸であるため、該細胞内で高次の立体構造を形成することが予想されている。このような状況下、光関連タンパク質のコード配列における相違や、植物細胞・動物細胞間の相違を考慮すると、目的のスプライシング反応が理論通りに進行するか否かをイントロンの前後における共通配列の類似度のみに基づき予測することは、当業者といえども予測が困難である。事実、本発明者は、霊長類由来の動物細胞と植物細胞とでイントロン近傍の配列を比較すると、５’側の−２、−１、＋３の塩基の出現頻度や３’側の−６、−５、−４、−３の塩基の出現頻度が異なるとの知見を得ている。この事実は、イントロン近傍の配列においても植物細胞・動物細胞間で異なる遺伝子発現メカニズムが働いていることを示唆している。これらの事実から、植物細胞、動物細胞に関わらず、真核生物細胞で共通に利用することができる本発明の新規な改変レポーター遺伝子及び可視化方法は、先行技術に対して大きな進歩をもたらすものである。
【００４３】
光関連タンパク質のコード配列中、イントロンを挿入する部位は、特に限定されないが、可視化対象の真核生物細胞種においてイントロン近傍の配列として出現頻度が高い塩基配列がイントロン近傍に位置するように挿入することが好ましい。植物細胞を可視化する目的においては、例えば、イントロンの５’末端（スプライス供与部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＡＡＧ又はＣＴ、イントロンの３’末端（スプライス受容部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＧとなる部位が挙げられる。また、哺乳動物の細胞（例えば、霊長類由来）においては、例えば、イントロンの５’末端（スプライス供与部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＡＧ、イントロンの３’末端（スプライス受容部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＧとなる部位が挙げられる。前記イントロンを挿入する部位は、例えば、イントロンの５’末端（スプライス供与部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＡＧ、イントロンの３’末端（スプライス受容部位）に隣接する光関連タンパク質の塩基配列がＧとなる部位が好ましい。この例では、光関連タンパク質のコード配列中、ＡＧＧの塩基配列を有する部位のＡＧとＧの間にイントロンが挿入される。光関連タンパク質のコード配列中、本来存在する所望の塩基配列の部位にイントロンを挿入してもよく、又は変異を導入して生成した所望の塩基配列の部位にイントロンを挿入してもよい。
【００４４】
光関連タンパク質とイントロンとの好ましい組み合わせの一例として、配列番号２の塩基配列でコードされ、塩基配列３のアミノ酸配列を有する、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼｌｕｃ２と、ＳＴ−ＬＳ１イントロンとの組み合わせが挙げられる。また、前記改変レポーター遺伝子の好ましい一例として、前記ルシフェラーゼｌｕｃ２にＳＴ−ＬＳ１イントロンを挿入した配列番号４の塩基配列が挙げられる。配列番号４の塩基配列を有する改変レポーター遺伝子では、ｌｕｃ２の４７８番目の塩基と４８９番目の塩基との間にＳＴ−ＬＳ１イントロンの塩基配列（配列番号１）が挿入されている。
【００４５】
光関連タンパク質の種類、イントロンの種類、光関連タンパク質とイントロンとの組み合わせ、イントロンと光関連タンパク質コード配列との配置などを変化させることにより、真核生物細胞及び原核生物における光の調節（例えば、発生、増強、抑制又は停止など）を行うことができる。当業者であれば、イントロンおよび／または光関連タンパクの由来又は配列の種類に応じて、最適な組合せを決定することができる。
【００４６】
前記改変レポーター遺伝子は、ＤＮＡ鎖であってもＲＮＡ鎖であってもよい。本発明の改変レポーター遺伝子は、光関連タンパク質のコード配列と前記イントロンのみで構成されていてもよく、又は、該改変レポーター遺伝子及び光関連タンパク質の機能及び発現を損なわない限りにおいて、１個以上の塩基配列の置換、欠失若しくは付加といった変異又は付加的な塩基配列を有していてもよい。
【００４７】
また、本発明の可視化方法は、真核生物細胞と原核生物とが混在する試料を、前記光関連タンパク質を光検出することが可能な条件下に置く工程を含む。かかる条件は、使用する光関連タンパク質に応じて異なる。当業者は、適宜適切な条件を選択することができる。例えば、光関連タンパク質が、ルシフェラーゼである場合には、該ルシフェラーゼと反応するルシフェリンを試料に添加する。光関連タンパク質がイクエリオンである場合には、カルシウムイオンを試料に添加する。光関連タンパク質が蛍光タンパク質である場合には、蛍光タンパク質を励起させることができる特定波長の励起光を試料に照射する。
【００４８】
本発明の可視化方法は、試料中の光関連タンパク質を光検出する工程を含む。光検出は、使用する光関連タンパク質由来の光を検出可能ないずれかの装置を使用して行うことができる。例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を使用する撮像によって光検出することができる。また、光検出した光をフォトマル等の光電子倍増手段により増幅して可視化することもできる。光関連タンパク質として発光タンパク質、特にルシフェラーゼを使用することにより、高感度、高精度、短時間での光検出及び可視化を行うことができる。発光タンパク質の光検出及び可視化を行うことができる装置は、発光イメージングシステムとも呼ばれ、例として、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）などが挙げられる。
【００４９】
光の撮像素子による撮像は、経時的に行うことができる、すなわち、任意の間隔で連続的に行うことができる。例えば、撮像は、５分から１時間の間隔で行われる。また、１回の撮像の時間は、光関連タンパク質の光量に応じて、任意に設定される。１回の撮像時間は、十分な光量を検出できるように調整することができる。これらの経時的な撮像により、経時的な可視化を行うことができる。従って、真核生物細胞における生命現象を経時的にモニタリングすることができる点で非常に有意である。
【００５０】
本発明の真核生物細胞の可視化方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも実施することができる。また、異なる複数種の真核生物細胞を含む試料において、種類ごとに光関連タンパク質が異なる複数の改変レポーター遺伝子を使用して、各種類の真核生物細胞ごとに可視化することもできる。更に、光関連タンパク質として発光タンパク質、例えばｌｕｃ２などの高輝度のルシフェラーゼを使用することにより、高感度化及び／又は検出時間の短縮化も達成できる。また、本発明の可視化方法は、技術常識に基づき、改変レポーター遺伝子、光検出条件、改変レポーター遺伝子の導入方法などに様々な改変を行うことができる。
【００５１】
＜真核生物細胞の遺伝的可視化用の改変レポーター遺伝子＞
本発明の真核生物細胞用の改変レポーター遺伝子は、
光関連タンパク質のコード配列と、
真核生物細胞でスプライシングされるイントロンと、
を含み、
該イントロンが、該光関連タンパク質のコード配列中に挿入されていることを特徴とする。この改変レポーター遺伝子は、本発明の真核生物細胞の可視化方法において、好適に使用することができる。
【００５２】
本発明の前記改変レポーター遺伝子の構成及び好ましい実施形態は、上述の通りである。この改変レポーター遺伝子は、市販の発光タンパク質や蛍光タンパク質などの光関連タンパク質のコード配列中に、いずれかの遺伝学的手法を用いて、可視化される真核生物細胞においてスプライシングされるイントロンを挿入することによって、作製することができる。前記遺伝学的手法の例として、制限酵素での切断、リガーゼによるライゲーション、市販の組み換え技術などが挙げられる。
【００５３】
例えば、発光タンパク質や蛍光タンパク質のコード配列を予め含有する市販のベクターに、前記イントロンを挿入してもよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のベクターの例としては、ｐＧＬ４ベクター（プロメガ社）、Ｅｌｕｃベクター（東洋紡）、ＣＲＢベクター（プロメガ社）およびＲｅｎｉｌｌａベクター（プロメガ社）などが挙げられる。
【００５４】
＜真核生物細胞の可視化用の発現ベクター＞
本発明の真核生物細胞の可視化用の発現ベクターは、本発明の真核生物細胞の可視化用の改変レポーター遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記改変レポーター遺伝子が発現可能にベクターに含まれていればよい。例えば、発現ベクター内においては、前記改変レポーター遺伝子が、プロモーター遺伝子領域の下流に、発現可能に連結されている。ベクターの種類は、真核生物細胞で発現可能なものであれば特に限定されず、市販のものを使用することができる。例として、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドなどが挙げられる。
【００５５】
当業者であれば、技術常識に照らして、クローニングサイト、プロモーター遺伝子その他の制御因子、発現させる真核生物細胞の生物由来などの諸条件に基づき、適切なベクターを選択し、常法に従って、所望する発現ベクターを構築することができる。あるいは、上述するように、発光タンパク質や蛍光タンパク質のコード配列を予め含有する市販のベクターに、イントロンを挿入してもよい。
【００５６】
本発明の前記発現ベクターは、真核生物細胞への導入用の試薬、形成される光関連タンパク質の光検出に必要な試薬、及び／又はアッセイプロトコルなどを含むキットの形態で提供することもできる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。【００５８】
［実験例１：改変レポーター遺伝子を有する哺乳動物細胞発現用ベクターの構築］
本発明の一実施形態に係る改変レポーター遺伝子として、北アメリカ産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２の塩基配列（配列番号２）内にジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳ１遺伝子のイントロン（ＳＴ−ＬＳ１イントロン）の塩基配列（配列番号１）を挿入したｉｎｔＧＬ４（配列番号４）を構築した。具体的には、哺乳動物細胞形質転換用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターの下流にｌｕｃ２遺伝子を挿入してｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４を作製し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４中のｌｕｃ２遺伝子内にＳＴ−ＬＳ１イントロンを挿入することによって、改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４を有する哺乳動物細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を構築した。実験手順は、以下の通りである。【００５９】
［ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４の作製］
最初にｌｕｃ２遺伝子の塩基配列を持つプラスミドｐＧＬ４．１４（プロメガ社）を鋳型として用いて、ｌｕｃ２遺伝子のＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応液は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）に添付された標準プロトコルに従って次のように調製した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のバッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ）に、９８ｎｇのｐＧＬ４．１４プラスミドＤＮＡ、各ｄＮＴＰ（最終濃度：０．２ｍＭ）、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｌｕｃ２増幅用プライマー（各最終濃度：３００ｎＭ）を添加して、最終容量４０μＬとした。ｌｕｃ２増幅用プライマーの塩基配列を下記に示す。
2016117135.tif 000002
ＰＣＲの反応条件は、次の通りであった。第１ステップ：９５℃で５分間、第２ステップ：９４℃で１５秒間（変性）、５５℃で１５秒間（アニーリング）、７２℃で３分間（伸長）のサイクルを４０サイクル、第３ステップ：７２℃で７分間。このＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけて、目的とする約１６６０ｂｐの増幅産物の存在を確認した。確認後、同サイズのゲルを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製して、ｌｕｃ２遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。これを更に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動及びＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、約１６５０ｂｐのｐｃＤＮＡ３．１挿入用ｌｕｃ２遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。
哺乳動物細胞形質転換用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌで消化した後、アガロース電気泳動及びＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、約５５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このｐｃＤＮＡ３．１のＤＮＡ断片と前記ｐｃＤＮＡ３．１挿入用ＤＮＡ断片とをライゲーションして、ＣＭＶプロモーターの下流にｌｕｃ２遺伝子が挿入されたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４を得た。シークエンサーにより塩基配列を解読することで、ｌｕｃ２遺伝子の挿入を確認した。【００６０】
［ＳＴ−ＬＳ１イントロンの増幅及び精製］
ＳＴ−ＬＳ１イントロンのＤＮＡは、Ｏｐｅｒｏｎ社が提供する遺伝子合成サービスで全合成した。このＳＴ−ＬＳ１イントロンＤＮＡを、ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２に挿入するため、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ反応によって増幅させた。ＰＣＲ反応液を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付された標準プロトコルに従って次のように調製した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のバッファに、０．５ｎｇのＳＴ−ＬＳ１イントロンＤＮＡ、各ｄＮＴＰ（最終濃度：０．２ｍＭ）、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＴ−ＬＳ１イントロン増幅用プライマー（各最終濃度：３００ｎＭ）を添加して、最終容量４０μＬとした。ＳＴ−ＬＳ１イントロン増幅用プライマーの塩基配列を下記に示す。
2016117135.tif 000003
これら両プライマーには、ｌｕｃ２塩基配列中の挿入部位と相同な配列を付加してデザインした。また上記５’側のフォワードプライマー（配列番号７）は、イントロン部位としての認識を高めるために、ｌｕｃ２の４７６〜４７９番目の塩基配列ＡＧＧＧを改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４ではＡＡＧＧとするサイレント変異が含まれるようにデザインした。ＰＣＲの反応条件は、次の通りであった。第１ステップ：９５℃で５分間、第２ステップ：９４℃で２０秒間（変性）、５６℃で２０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）のサイクルを５０サイクル、第３ステップ：７２℃で７分間。このＰＣＲ産物を、アガロース電気泳動にかけて、目的とする増幅産物の存在を確認した。確認後、目的とする増幅産物のサイズのゲルを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて精製して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４に挿入するためのＳＴ−ＬＳ１イントロンのＤＮＡ断片を得た。【００６１】
［ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４の構築］
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４プラスミド中のｌｕｃ２遺伝子の塩基配列の４９２番目に存在するＢｓｐ１４０７１の制限酵素サイトを切断し、アガロース電気泳動及びＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４のＤＮＡ断片を回収した。ＧｅｎｅＡＲＴ（登録証商標）  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、ＳＴ−ＬＳ１イントロンのＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４のＤＮＡ断片へクローニングし、改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４を有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を得た。シークエンサーにより塩基配列を解読することで、目的の改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４（配列番号３）が得られたことを確認した。
ヒト細胞、大腸菌への遺伝子導入、発光シグナルの確認は後述する。【００６２】
［実験例２：植物細胞及び土壌細菌用発現ベクターの構築］
改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４の植物での発現のために、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１ＡＮ（ＴＡＫＡＲＡ社）を使用し、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーターの下流の制限酵素サイトＮｄｅｌとＳａｌＩとの間にｉｎｔＧＬ４遺伝子を挿入して、植物細胞発現用ベクターｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を構築した。具体的な手順は、次の通りである。
上記実験例１で構築したｉｎｔＧＬ４遺伝子の塩基配列を持つプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を鋳型として用いて、ｉｎｔＧＬ４遺伝子のＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応液は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付された標準プロトコルに従って次のように調製した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のバッファに、９８ｎｇのｐＧＬ４．１４−ｉｎｔＧＬ４  ＤＮＡ、各ｄＮＴＰ（最終濃度：０．２ｍＭ）、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｉｎｔＧＬ４増幅用プライマー（各最終濃度：３００ｎＭ）を添加して、最終容量４０μＬとした。ｉｎｔＧＬ４増幅用プライマーの塩基配列を下記に示す。
2016117135.tif 000004
ＰＣＲ反応の条件は、次の通りであった。第１ステップ：９５℃で５分間、第２ステップ：９５℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で２分３０秒間（伸長）のサイクルを４０サイクル、第３ステップ：２℃で７分間。
ＰＣＲ産物を、アガロース電気泳動にかけて、目的とする約１８５０ｂｐの増幅産物の存在を確認した。確認後、同サイズのゲルを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて精製して、ｉｎｔＧＬ４遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。回収したｉｎｔＧＬ４遺伝子のＤＮＡ断片を、更に制限酵素Ｎｄｅｌ及びＳａｌＩで消化し、約１８４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収して、ｐＲＩ２０１ＡＮ挿入用ｉｎｔＧＬ４遺伝子のＤＮＡ断片とした。プラスミドｐＲＩ２０１ＡＮを制限酵素Ｎｄｅｌ及びＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動及びＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、約１０５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このｐＲＩ２０１ＡＮの断片に、前記ｐＲＩ２０１ＡＮ挿入用ｉｎｔＧＬ４遺伝子のＤＮＡ断片をライゲーションし、ｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を得た。シークエンサーにより塩基配列を解読することで、ｉｎｔＧＬ４遺伝子の挿入を確認した。
コントロールとして、プラスミドｐＲＩ２０１ＡＮと、３５Ｓプロモーターの下流にｌｕｃ２遺伝子のみを挿入したプラスミドｐＲＩ２０１ＡＮ−ＧＬ４も準備した。植物、土壌細菌への遺伝子導入、発光シグナルの確認は後述する。【００６３】
［実験例３：土壌細菌への改変レポーター遺伝子導入及び発光シグナルの検出］
植物細胞発現用ベクターｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（ＴＡＫＡＲＡ社）にエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションには、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いた。比較のため、ｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４と同様に、試薬のみ、プラスミドｐＲＩ２０１ＡＮ、ｐＲＩ２０１ＡＮ−ＧＬ４の導入も行った。遺伝子導入は、ＴＡＫＡＲＡ社から示された実験プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ＰＤＦＳ／９１１５＿ｊ．ｐｄｆ）に従って行った。【００６４】
土壌細菌における発光シグナルの検出は、培養後の菌体のルミノメーター計測と、菌コロニーのイメージングとの、２通りの方法によって行った。【００６５】
菌体のルミノメーター計測では、まず、コロニーからピックアップした土壌細菌を１晩ほど２８℃にて振盪培養した。翌日に、ほぼ同等の増殖を示した培養液を５００μＬ取って、４℃、１００００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離を行い、集菌した。上清を捨てて、ペレットとＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）中の再溶解後の基質溶液を３００μＬ混合した。よく混ぜた後、混合液から１５０μＬ取って、ルミノメーター（ＡＴＴＯ社製Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＪＮＲＩＩ  ＡＢ−２３００）で計測した。結果を図１に示す。尚、グラフ縦軸の発光量は１５秒の積算値である。
ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２のみを挿入したプラスミドｐＲＩ２０１ＡＮ−ＧＬ４を導入した土壌細菌では、高い発光量が検出された。一方、改変レポーター遺伝子を挿入したｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を導入した土壌細菌では、試薬のみを導入した場合、プラスミドｐＲＩ２０１ＡＮを導入した場合と同様に、非常に低い発光量が検出された。【００６６】
菌コロニーのイメージングでは、コロニーに２．５ｍＭのルシフェリン水溶液をスプレーし５分ほど暗黒下に静置した後、ＧＥ社のＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉで発光シグナルを取得した。計測条件は、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉモードの「Ｕｌｔｒａ」で露光時間は１５秒であった。結果を図２に示す。
ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２のみを挿入したプラスミドｐＲＩ２０１ＡＮ−ＧＬ４を導入した土壌細菌では、発光シグナルを検出することができた。一方、改変レポーター遺伝子を挿入したｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を導入した土壌細菌では（図２黒太枠内）、試薬のみを導入した場合及びプラスミドｐＲＩ２０１ＡＮを導入した場合と同様に、発光シグナルが検出できなかった。これらの結果から、土壌細菌において、本発明の改変レポーター遺伝子に含まれるｌｕｃ２遺伝子断片により発光シグナルを示すことはなく、ｌｕｃ２遺伝子中のイントロンがスプライシングされなかったことが示唆された。【００６７】
［実験例４：植物への改変レポーター遺伝子導入及び発光シグナルの検出］
植物（シロイズナズナ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）への遺伝子導入は、ＦＡＳＴ（Ｆａｓｔ  Ａｇｒｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法を用いて行った。ＦＡＳＴ法のプロトコルは、Ｊｉａｎ−Ｆｅｎｇ  Ｌｉら、“Ｔｈｅ  ＦＡＳＴ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｌａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ”、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９年、第５巻第６号記載の通りに行った。遺伝子導入に用いた土壌細菌はｐＲＩ２０１ＡＮ（ネガティブコントロール）を持つ菌体とｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を持つ菌体である。それぞれの遺伝子を導入後の植物は、発光シグナル確認のために発光イメージングを行った。発光イメージングの観察条件は、露光時間を１０秒に変更した以外は、上述の実験例３で用いた方法と同様であった。【００６８】
植物での発光シグナルの検出結果を図３に示す。図３左図は、ルシフェリン添加後の白色照明下の画像であり、左半分はネガティブコントロールであるｐＲＩ２０１ＡＮを導入した植物、右半分はｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を導入した植物である。  図３右図は、ルシフェリンを添加してルシフェラーゼを発光させ、その発光シグナルを撮影した写真である。その左半分はネガティブコントロールであるｐＲＩ２０１ＡＮを導入した植物、右半分はｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を導入した植物である。図３右図の写真において、図３左図の写真に示されるｐＲＩ２０１ＡＮ−ｉｎｔＧＬ４を導入した植物体に対応する位置で発光が撮像されていることが分かる。この結果から、本発明の改変レポーター遺伝子を導入した植物では、本発明の可視化方法により、植物細胞において有意な発光を検出し可視化できたことが示された。【００６９】
上記実験から、改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４を使用することにより、植物細胞と土壌細菌とが混在する試料において、植物細胞を有意に可視化できることが分かる。次いで、改変レポーター遺伝子ｉｎｔＧＬ４を使用して、ヒト細胞と大腸菌とが混在する試料においても、動物細胞であるヒト細胞を有意に可視化できることを確かめるため、以下の実験を行った。【００７０】
［実験例５：大腸菌への改変レポーター遺伝子導入及び発光シグナルの検出］
発光シグナル確認のために大腸菌ＤＨ５α株（ＴＡＫＡＲＡ社）にプラスミドをヒートショック法により導入した。プロトコルの詳細は、ＴＡＫＡＲＡ社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ＰＤＦＳ／９０５７＿ｊ．ｐｄｆ）で示される通りである。大腸菌における発光シグナルの検出は、培養後の菌体のルミノメーター計測、菌コロニーのイメージング、の２通りの方法で行った。【００７１】
菌体のルミノメーター計測は、発光量の積算時間を５秒に変更した以外は、上記実験例４で用いた方法と同様であった。結果を図４に示す。
ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２のみを挿入したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４を導入した大腸細菌では、高い発光量が検出された。一方、改変レポーター遺伝子を挿入したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を導入した大腸細菌では、試薬のみを導入した場合、ネガティブコントロールとしてのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））を導入した場合と同様に、非常に低い発光量が検出された。【００７２】
菌コロニーのイメージングの観察条件は、露光時間を１０秒に変更した以外は、上記実験例４で用いたものと同様であった。発光シグナルの検出結果を図５に示す。
ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２のみを挿入したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＬ４を導入した大腸菌では、発光を可視化することができた。一方、改変レポーター遺伝子を挿入したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を導入した大腸菌では（図５黒太枠内）、試薬のみを導入した場合、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した場合と同様に、発光が可視化されなかった。これらの結果から、大腸菌において、本発明の改変レポーター遺伝子に含まれるｌｕｃ２遺伝子断片により発光シグナルを示すことはなく、ｌｕｃ２遺伝子中のイントロンがスプライシングされなかったことが示唆された。【００７３】
［実験例６：ヒト培養細胞への改変レポーター遺伝子導入及び発光シグナルの検出］
ヒト培養細胞株Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手）に発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｉｎｔＧＬ４を一過的に導入した。遺伝子導入には、ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ（プロメガ社）を利用した。遺伝子導入の実験プロトコルは、プロメガ社のホームページにあるプロトコルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ＦｕｇｅｎｅＨｄＴｏｏｌ／）のＨｅｌａ細胞、３５ｍｍ  ｄｉｓｈで検索されるページで示されるものに従った。具体的には次の通りである。遺伝子導入の前日に、Ｈｅｌａ細胞を３５ｍｍディッシュに３×１０５の細胞数で播種した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭを培地として使用した。１２８μＬのＯＰＴＩＭＥＭ中に２．８μｇのプラスミドＤＮＡと８．３μＬのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  ｒｅａｇｅｎｔが含まれるように調製し、室温で５分間インキュベーションした。その後、前記３５ｍｍディッシュに添加して、Ｈｅｌａ細胞に遺伝子導入した。【００７４】
プラスミド導入後、２４〜４８時間の間に発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）で観察した。対物レンズは４０倍のものを使用した。撮像用カメラはＩｍａｇｅＭカメラ（浜松ホトニクス株式会社製）を使用し、ＥＭＣＣＤモードにて露光１分で撮影した。
ヒトＨｅｌａ細胞における発光シグナルの検出結果を図６に示す。図６左図は、ルシフェリン添加後の顕微鏡下での明視野画像である。図６右図（黒太枠内）は、ルシフェリンを添加してルシフェラーゼを発光させ、その発光シグナルを撮影した写真である。図６右図の写真において、図６左図の写真に示されるヒト細胞に対応する位置でルシフェラーゼの発光シグナルが撮影されていることが分かる。この結果から、本発明の改変レポーター遺伝子及び本発明の可視化方法により、ヒトＨｅｌａ細胞において有意な発光を検出し可視化できたことが示された。【００７５】
上記実験例の結果から、本発明の可視化方法、並びに本発明の改変レポーター遺伝子及び発現ベクターが、動物細胞と原核生物とが混在する試料において、動物細胞を高精度に識別できるといえる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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