(57)【要約】本発明は、脳卒中の診断に関する。詳細には、本発明は、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを分子マーカーとする脳卒中の診断に関する。
2015163342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
被験試料が血液である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
【請求項６】
ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）の脳卒中のマーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳卒中の診断に関する。詳細には、本発明は、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを分子マーカーとする脳卒中の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は１９８０年以降、日本人の死亡原因として癌、心疾患についで第３位であり、脳に栄養を運ぶ頭蓋内の血管に異常が発生し、出血による炎症・圧排または虚血による脳組織の障害により発症する。日本脳卒中データバンクに登録された４７，７８２例の解析では脳卒中の病型別頻度は、一過性虚血発作（TIA）５．８％、アテローム血栓性梗塞５．１％、ラクナ梗塞２２．７％、心原性脳塞栓症１９．２％、その他の脳梗塞５．１％、高血圧性脳出血１３．７％、脳出血（その他）３．０％、クモ膜下出血６．４％となっており（非特許文献１）、虚血性疾患の中でも動脈硬化の破綻が直接の発症要因となる冠動脈疾患と比較して、動脈硬化以外の要因での発症が約半数存在する点が特徴である。【０００３】
脳卒中は、心筋梗塞と比較して３〜１０倍の発症率であり（非特許文献１）、仮に救命されたとしても脳卒中後遺症による障害を抱えた生活を余儀なくされ、介護が必要な寝たきりになる疾患の第一位である点が大きな社会的課題である。【０００４】
脳卒中の診断は、問診・病歴聴取、神経学的診察および一般臨床検査を経て、最終的には頭部CTまたはMRIによる画像診断により、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血など基本病型の診断が行われる。【０００５】
しかし、脳卒中を特異的に診断する生化学的マーカーはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】脳卒中治療ガイドライン２００９ p.２，日本脳卒中学会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
簡便な方法で、脳卒中を診断するための手段・方法を開発することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、末梢血中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールをマーカーにすることで、脳卒中を診断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
（２）ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）である、（１）に記載の方法。
（３）前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、（１）または（２）記載の方法。
（４）被験試料が血液である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
（７）ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を含有することを特徴とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別キット。
（８）ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの脳卒中のマーカーとしての使用。
（９）ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）の脳卒中のマーカーとしての使用。
（１０）被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中の罹患リスクの指標とする、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法。
（１１）ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）である、（１０）に記載の方法。
（１２）前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患する可能性があると判断する、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）被験試料が血液である、（１０）〜（１２）いずれかに記載の方法。
（１４）前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、（１０）〜（１３）いずれかに記載の方法。
（１５）（１０）〜（１４）いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、簡単に脳卒中を診断することができ、しかも被験者の負担が少なくて済むことを特徴としている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ホスファチジルイノシトール（３６：１）の例を示した図である。
【図２】図２は、対照群と脳卒中患者群の末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）濃度の相対値を示したものである。
【図３】図３は、対象群と脳卒中患者群の末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）濃度の相対値を示したものである。
【図４】図４は、ホスファチジルイノシトール（３６：１）のＲＯＣ曲線を示したものである。
【図５】図５は、対象群と脳卒中患者群のホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）濃度の相対値を示したものである。
【図６Ａ】図６Ａは、ホスファチジルイノシトール（３６：５）のＲＯＣ曲線を示したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ホスファチジルイノシトール（４０：５）のＲＯＣ曲線を示したものである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ホスファチジルイノシトール（４０：６）のＲＯＣ曲線を示したものである。
【図７】図７は、対象群と脳卒中患者群のリゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）、リゾホスファチジルイノシトール（２０：５）濃度の相対値を示したものである。
【図８】図８は、リゾホスファチジルイノシトール（２０：５）のＲＯＣ曲線を示したものである。
【図９】図９は、対象群と脳卒中患者群のホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）濃度の相対値を示したものである。
【図１０】図１０は、ＨＤＬコレステロールのＲＯＣ曲線を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、被験者が脳卒中に罹患している可能性の有無を判断する方法を提供する。該方法は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトール濃度を測定する工程を含み、ここで、被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトール濃度が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。
【００１３】
本発明の上記方法の特徴は、被験者由来の被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を分子マーカーとして用いることである。被験者から採取する被験試料は、尿、全血、血漿、血清、または血液に由来するものが含まれるが、簡便性の観点から末梢血から調製できる試料が好ましい。末梢血は被験者のいずれの部位から採取してもよいが、静脈からの採取が一般的である。例えば、腕静脈から末梢血を採取することにより、本発明を簡便かつ被験者への負担を少なくして実施できる。好ましくは、採取した末梢血から血漿を分離し、血漿中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する。
【００１４】
本発明における測定対象のホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の１つであり、ＰＩと略記されることもある。１位、２位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８、２重結合の合計が４と予測された場合、ホスファチジルイノシトール（３８：４）という表記を行う。
また、タンデム質量分析法によるフラグメントイオンの解析から１位あるいは２位にエステル結合した各脂肪酸の炭素数と２重結合の数が特定できる場合、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）という表記を行う。
【００１５】
本発明における測定対象のホスファチジルイノシトールは、以下の（１）〜（１４）のホスファチジルイノシトールから選択される。
（１）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３２で、２重結合の合計が０と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３２：０）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３２、０のホスファチジルイノシトール）
（２）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３４で、２重結合の合計が１と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３４：１）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３４、１のホスファチジルイノシトール）
（３）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３６で、２重結合の合計が１と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３６：１）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３６、１のホスファチジルイノシトール）
（４）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３６で、２重結合の合計が４と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３６：４）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３６、４のホスファチジルイノシトール）
（５）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３６で、２重結合の合計が５と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３６：５）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３６、５のホスファチジルイノシトール）
（６）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が２と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３８：２）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３８、２のホスファチジルイノシトール）
（７）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が３と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３８：３）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３８、３のホスファチジルイノシトール）
（８）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が４と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３８：４）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３８、４のホスファチジルイノシトール）
（９）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が６と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（３８：６）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、３８、６のホスファチジルイノシトール）
（１０）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が４０で、２重結合の合計が５と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（４０：５）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、４０、５のホスファチジルイノシトール）
（１１）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が４０で、２重結合の合計が６と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（４０：６）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、４０、６のホスファチジルイノシトール）
（１２）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が４０で、２重結合の合計が７と予測されるので、ホスファチジルイノシトール（４０：７）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、４０、７のホスファチジルイノシトール）
（１３）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が５と予測され、フラグメントイオンの解析から１位あるいは２位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が１８、二重結合の数が０、他方の脂肪酸の炭素数の合計が２０、二重結合の数が５と予想されるので、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ１８と０、２０と５のホスファチジルイノシトール）
（１４）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８で、２重結合の合計が５と予測され、フラグメントイオンの解析から１位あるいは２位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が１６、二重結合の数が０、他方の脂肪酸の炭素数の合計が２２、二重結合の数が５と予想されるので、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）（ｓｎ−１、２位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ１６と０、２２と５のホスファチジルイノシトール）
【００１６】
本発明における測定対象の１つのホスファチジルイノシトール（３６：１）の例を図１に示す。
【００１７】
本発明における測定対象のリゾホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の１つであり、ＬＰＩと略記されることもある。含有する脂肪酸の違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、リゾホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が１８、２重結合の合計が１と予測された場合、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）という表記を行う。
【００１８】
本発明における測定対象のリゾホスファチジルイノシトールは、以下の（１）〜（３）のリゾホスファチジルイノシトールから選択される。
（１）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が１８で、２重結合の合計が０と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）（脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、１８、０のリゾホスファチジルイノシトール）
（２）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が１８で、２重結合の合計が１と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）（脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、１８、１のリゾホスファチジルイノシトール）。
（３）質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が２０で、２重結合の合計が５と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール（２０：５）（脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、２０、５のリゾホスファチジルイノシトール）。
【００１９】
ホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルイノシトールの濃度の測定は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、第３５巻、１８４５−１８５３ページまたはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、第３７５巻、１２４−１３１ページなどを参照して、質量分析をすることにより行う。
【００２０】
抗体は、免疫原にホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを用いて調製することができる。ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールは、低分子化合物であるため単独で免疫原として抗体を産生することは難しいと考えられることから、キャリアタンパクと複合体を調製することが望ましい。免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。免疫後に哺乳動物から抗血清を採血し、ポリクローナル抗体を作製、あるいは形質細胞（免疫細胞）を採取し、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら １９９４）等に記載されている方法により、モノクローナル抗体を作製することができる。
また、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールに対する抗体を用いることによって、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定することもできる。このような測定には、抗体を用いるウェスタンブロットやＥＬＩＳＡなどの公知の手段を用いることができる。抗体には検出・定量可能な標識を付すことが好ましい。標識としては放射性標識、蛍光標識などが知られており、適宜選択して用いることができる。検出の利便性から、ビオチン化された抗体などが好ましい。  
【００２１】
次いで、被験者から得られた被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を基準値と比較し、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性がある被験者として選別されることになる。基準値は、当業者であれば目的に応じて別の基準値を設定することが出来る。
例えば、統計学上有意となるような適切な数の対照者の被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度の平均値や中央値なども基準値として用いることができる。対照者は、脳卒中に罹患していない被験者であり、好ましくは健康な被験者である。
いずれにしても、当業者であれば目的に応じて、適宜適当な基準値を設定することが出来る。
【００２２】
被験者が脳卒中に罹患している可能性とは、被験者が検査時に脳卒中に罹病している可能性がある場合のことを意味する。
【００２３】
脳卒中は、脳に栄養を運ぶ頭蓋内の血管に異常が発生し、出血による炎症・圧排または虚血による脳組織の障害を意味する。日本脳卒中データバンクに登録された４７，７８２例の解析では脳卒中の病型別頻度は、一過性虚血発作（TIA）５．８％、アテローム血栓性梗塞５．１％、ラクナ梗塞２２．７％、心原性脳塞栓症１９．２％、その他の脳梗塞５．１％、高血圧性脳出血１３．７％、脳出血（その他）３．０％、クモ膜下出血６．４％である（脳卒中治療ガイドライン２００９ p.２，日本脳卒中学会）。
【００２４】
本発明は、もう１つの態様において、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に使用するキットを提供する。
【００２５】
具体的には、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを特異的に認識する抗体を含有することを特徴とするキットを提供する。このようなキットは、更に一般的にアッセイを実行するために必要な１つ以上の構成要素を含む。構成要素は、標準品、試薬（希釈液、緩衝液など）、容器及び／又は装置であり得る。
【００２６】
本発明は、１の態様において、被験者が脳卒中に罹患するリスクの有無を判断する方法を提供する。該方法は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中の罹患リスクの指標とする、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、ここで、被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患する可能性があると判断する、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法に関するものである。
【００２７】
被験者が脳卒中に罹患する可能性があるとは、被験者が検査時以降に罹患する可能性がある場合のことを意味する。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２９】
末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）を分子マーカーとして用いる脳卒中の診断
脳卒中における新規マーカーとしてのホスファチジルイノシトール（３６：１）の性能を調べるために、血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度を対照者群２０名及び脳卒中の患者群１０名の間で比較した。【００３０】
対象は脳卒中患者であり、Proteogenex社より提供される患者由来血漿試料を用いた。対照群は脳卒中に罹患していない成人とした。この実験は塩野義製薬株式会社のヒト組織・遺伝子利用研究倫理委員会の審査承認を得て行った。血液は文書で同意を得て採血、分注して−８０℃にて凍結保存した。【００３１】
被験者の末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度は、液体クロマトグラフ質量分析計（以下、LC/MSともいう）を用いて定量した。
以下、本発明者らが、末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度を定量するために使用したLC/MSの系を具体的に示す。【００３２】
各対象からの血漿に内部標準溶液を加えた後、有機溶媒を加え除タンパク処理し、撹拌・遠心して上清を回収した。この上清をLC/MSにて測定し、血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）を定量した。LC/MSシステムには、Ultra Performance Liquid Chromatography（Waters）‐LTQ Orbitrap（Thermo Scientific）を用いた。逆相条件下で血中成分を分離・溶出した後、エレクトロスプレーイオン化法、ネガティブイオンモードにより検出を行った。Xcalibur（Thermo Scientific）にて、ホスファチジルイノシトール（３６：１）および内部標準物質のピークエリアを解析し、そのエリア比を算出することで、血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）を定量した。【００３３】
対照群および脳卒中患者群の血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の量の相対値を図２にまとめた。対照群の血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の相対値を１００とした。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度が約４１％ 減少し、有意差が認められた（Ｐ＜０．０００５）。
【実施例２】
【００３４】
末梢血中のホスファチジルイノシトール（３６：１）を分子マーカーとして用いる脳卒中の診断の検証
更に、ホスファチジルイノシトール（３６：１）の脳卒中の分子マーカーとしての有用性を検証するため、血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度を対照者群２０名及び脳卒中の患者群４０名の間で、実施例１と同様の方法で比較した。【００３５】
対象は脳卒中患者であり、Tissue Solutions社より提供される患者由来血漿試料を用いた。対照群は脳卒中に罹患していない成人とした。この実験は塩野義製薬株式会社のヒト組織・遺伝子利用研究倫理委員会の審査承認を得て行った。血液は文書で同意を得て採血、分注して−８０℃にて凍結保存した。【００３６】
対照群および脳卒中患者群の血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の量の相対値を図３にまとめた。対照群の血漿中のホスファチジルイノシトール（３６：１）の相対値を１００とした。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール（３６：１）の濃度が約５０％ 減少し、有意差が認められた（Ｐ＜０．０００１）。
【実施例３】
【００３７】
実施例２で得られた結果について、ＲＯＣ解析を行い、結果を図４にまとめた。ＡＵＣは０．８９６であった。
【実施例４】
【００３８】
ホスファチジルイノシトール（３６：１）以外の、ホスファチジルイノシトールも同様に脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを、実施例２のサンプルを用いて、実施例１と同様の方法で検証した。
対照群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの相対値を１００として、脳卒中患者群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの量の相対値を図５にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
【実施例５】
【００３９】
実施例４で得られたホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）の結果について、ＲＯＣ解析を行い、結果を図６Ａ〜図６Ｃにまとめた。ＡＵＣはホスファチジルイノシトール（３６：５）が０．９６５、ホスファチジルイノシトール（４０：５）が０．８２１、ホスファチジルイノシトール（４０：６）が０．８３９であった。
【実施例６】
【００４０】
また、リゾホスファチジルイノシトールも同様に脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを、実施例２のサンプルを用いて、実施例１と同様の方法で、検証した。
対照群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの相対値を１００として、脳卒中患者群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの量の相対値を図７にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのリゾホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのリゾホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
【実施例７】
【００４１】
実施例６で得られたリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）の結果について、ＲＯＣ解析を行い、結果を図８にまとめた。ＡＵＣは０．８６３であった。
【実施例８】
【００４２】
また、ホスファチジルイノシトール（３８：５）については、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数・２重結合について複数の組み合わせが考えられるので、それぞれが区別できる方法で、実施例２のサンプルを用いて、脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを検証した。
具体的には、各対象からの血漿に内部標準溶液を加えた後、有機溶媒を加え除タンパク処理し、撹拌・遠心して上清を回収した。この上清をLC/MS/MSにて測定し、血中のホスファチジルイノシトールを定量した。LC/MS/MSシステムには、Nexera（島津製作所）‐API5000（AB SCIEX）を用いた。逆相条件下で血中成分を分離・溶出した後、エレクトロスプレーイオン化法、ネガティブイオンモードにより検出を行った。Analyst（AB SCIEX）にて、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）および内部標準物質のピークエリアを解析し、そのエリア比を算出することで、血漿中のホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）を定量した。結果を図９にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）の濃度が、それぞれ約７５％、約３５％減少し、有意差が認められた。
【実施例９】
【００４３】
実施例２のサンプルを用いて、ＨＤＬコレステロール濃度を対照者群２０名及び脳卒中の患者群４０名の間で測定した。ＨＤＬコレステロールの濃度の測定は、ＨＤＬ−コレスレロール測定キット（コレステスト（R）Ｎ ＨＤＬ、積水メディカル株式会社）を用いて行った。
測定結果について、ＲＯＣ解析を行い、結果を図９にまとめた。ＡＵＣは０．８０１であった。このことから、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、リゾホスファチジルイノシトール（２０：５）の方が、脳卒中の分子マーカーとして、優れていることが判明した。【００４４】
以上より、ホスファチジルイノシトール（３２：０）、ホスファチジルイノシトール（３４：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：１）、ホスファチジルイノシトール（３６：４）、ホスファチジルイノシトール（３６：５）、ホスファチジルイノシトール（３８：２）、ホスファチジルイノシトール（３８：３）、ホスファチジルイノシトール（３８：４）、ホスファチジルイノシトール（３８：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：５）、ホスファチジルイノシトール（４０：６）、ホスファチジルイノシトール（４０：７）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：５）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／２２：５）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：０）、リゾホスファチジルイノシトール（１８：１）またはリゾホスファチジルイノシトール（２０：５）は、末梢血で定量可能な脳卒中の分子マーカーとして使用可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、医薬品の分野、特に脳卒中の診断のための体外診断用医薬品分野において利用可能である。
【図１】
2015163342.tif 000003
【図２】
2015163342.tif 000004
【図３】
2015163342.tif 000005
【図４】
2015163342.tif 000006
【図５】
2015163342.tif 000007
【図６Ａ】
2015163342.tif 000008
【図６Ｂ】
2015163342.tif 000009
【図６Ｃ】
2015163342.tif 000010
【図７】
2015163342.tif 000011
【図８】
2015163342.tif 000012
【図９】
2015163342.tif 000013
【図１０】
2015163342.tif 000014
【国際調査報告】
2015163342.tif 000015
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