(57)【要約】  ５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤の提供等。  ８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤。
【請求項２】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の剤を含む抗うつ薬。
【請求項４】
研究用試薬である、請求項１又は２に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）の新規用途、より詳細にはＤＣＰ−ＬＡの、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病は精神疾患の中で最も一般的な疾患であるが、診断が見過ごされて治療が施されないことが多いため、罹患率が高く、患者は社会心理的な不適応に陥る。うつ病は、主に、激しい気分の変動が認められる両極性疾患と、重度の抑うつ状態を示すが躁状態は伴わないことを特徴とする大うつ病と、特定の診断基準（例えば、気分変調性障害）を満たさない、より不確定で軽症の両極性および大うつ病とに分類することができる。【０００３】
うつ病とセロトニン作動性神経伝達路には深い関係があることが知られている。セロトニン輸送担体阻害剤は、セロトニンの再吸収を阻害することでシナプス間隙のセロトニン濃度を高め、セロトニン作動性神経伝達を促進させる働きがあり、抗うつ薬として臨床的に広く使用されている。【０００４】
セロトニン受容体の中でも特に、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体がうつ病に関連することが指摘されているが、選択的に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体を介したセロトニン作動性神経伝達を促進させる薬剤は未だ、存在しない。【０００５】
一方、リノール酸誘導体である８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）は、体内での代謝の遅延を可能とし、且つシナプス伝達の安定なＬＴＰ（long-term potentiation）様増強を持続できる、シナプス伝達効率の長期増強作用を有する化合物である（特許文献１）。
ＤＣＰ−ＬＡについてはまた、幾つかの報告がなされている。例えば、ＤＣＰ−ＬＡが選択的かつ直接的にＰＫＣ−εを活性化すること（非特許文献１）、ＤＣＰ−ＬＡが老化促進マウスの認知機能障害を改善すること（非特許文献２）、ＤＣＰ−ＬＡが海馬神経細胞からのγアミノ酪酸の放出を増加させること（非特許文献３）、ＤＣＰ−ＬＡがアミロイドβペプチドあるいはスコポラミン処理ラットの認知機能障害を改善すること（非特許文献４）、ＤＣＰ−ＬＡがグルタミン酸作動性シナプス前細胞に発現するα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的として海馬シナプス伝達を促進させること（非特許文献５）が報告されている。さらに、近年ＤＣＰ−ＬＡに酸化ストレスによって誘導される神経細胞死を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／５００１３号
【特許文献２】特開２００８−１４３８１９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kanno Tら，J Lipid Res., 2006, 47(6):1146-56.
【非特許文献２】Yaguchi Tら，Neuroreport, 2006, 23;17(1):105-8.
【非特許文献３】Kanno Tら，J Neurochem., 2005, 95(3):695-702.
【非特許文献４】Nagata Tら, Psychogeriatrics, 2005, 5:122-126.
【非特許文献５】Yamamotoら, Neuroscience 2005, 130(1):207-213.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を解明し、新規用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を詳細に検討する過程で、驚くべきことに、ＤＣＰ−ＬＡに従来知られていた認知機能の改善に有用な薬理作用以外に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用があること、かかる作用によりＤＣＰ−ＬＡが抗うつ薬として効果的に機能し得ることを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤。
［２］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制剤。
［３］上記［１］又は［２］に記載の剤を含む抗うつ薬。
［４］研究用試薬である、上記［１］又は［２］に記載の剤。
［５］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する方法。
［６］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する方法。
［７］ＤＣＰ-ＬＡの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、うつを予防及び／又は改善する方法。
【発明の効果】
【００１０】
ＤＣＰ−ＬＡは、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有し、それらの作用に基づいた各種試薬（剤）、並びに抗うつ薬として有用である。本発明の剤は、既存の薬物とは異なる作用機序を有するので、既存の薬物において問題となっていたような副作用を回避することができる。また、本発明の剤は、そのような予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＤＣＰ−ＬＡが、ラット海馬及び視床下部切片中の細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体を増加させることを示したグラフである。切片をＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で２０分間処理し、次いで該切片を溶解して細胞膜画分と細胞質画分に分離した。得られた各画分について５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体に対する抗体と５−ＨＴ２Ａセロトニン受容体に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体あるいは５−ＨＴ２Ａセロトニン受容体の、全細胞中の量に対する細胞膜上の量の割合の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、unpaired t-test. NS, not significant.
【図２】図２は、ＤＣＰ−ＬＡが５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体のエキソサイトーシスをＣａＭＫＩＩ依存的な様式で促進することを示したグラフである。ラット視床下部切片をＰＫＣ阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ（ＧＦ）（１００ｎＭ）、小胞エキソサイトーシス阻害剤であるボツリヌス毒素Ａ型（ＢｏＴＸ−Ａ）（０．１Ｕ／ｍｌ）あるいはＣａＭＫＩＩ阻害剤であるＫＮ−９３（ＫＮ）（３μＭ）の存在下あるいは非存在下、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で処理して、あるいは未処理で、次いで、該細胞を溶解して細胞質画分（Ｃ）と細胞膜画分（Ｍ）とに分離した。得られた各画分について５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の、全細胞におけるシグナル強度に対する細胞膜上のシグナル強度の割合の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.
【図３】図３は、ＤＣＰ−ＬＡが、延長された無動時間を用量依存的に改善することを示したグラフである。拘束ストレスの４日後に強制水泳試験を行なった。拘束ストレスを与えたマウス及びコントロールとして拘束ストレスを与えていないマウスに対しＰＥＧ又はＤＣＰ−ＬＡ（０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ）を経口ゾンデを用いて、試験開始７日前から終了まで（計１１日間）、１日１回経口投与した。グラフ中、各カラムは、無動時間の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.
【図４】図４は、ＤＣＰ−ＬＡが、ストレス誘発性の、視床下部における細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の減少を回復することを示したグラフである。ＰＥＧ又はＤＣＰ−ＬＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を経口ゾンデを用いて、試験開始７日前から終了まで（計１１日間）経口投与した。強制水泳試験の後、マウス脳から海馬及び視床下部を取り出し溶解した。ライセートを細胞質画分（Ｃ）と細胞膜画分（Ｍ）とに分離した。得られた各画分について５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の、全細胞におけるシグナル強度に対する細胞膜上のシグナル強度の割合の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.
【図５】図５は、うつ行動が細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の量に相関していることを示すグラフである。強制水泳試験の後、マウス脳から視床下部を取り出し溶解した。ライセートを細胞質画分（Ｃ）と細胞膜画分（Ｍ）とに分離した。得られた各画分について５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の、全細胞におけるシグナル強度に対する細胞膜上のシグナル強度の割合を算出した。その割合と無動時間との関係をプロットし、ピアソンの相関係数を得る為に、線形回帰分析を行なった（ｎ＝１４）。
【図６】図６は、ＤＣＰ−ＬＡが、ストレス誘発性のＧＳＫ−３βのＳｅｒ９での脱リン酸化を回復することを示したグラフである。強制水泳試験の後、拘束ストレスを与えた、あるいは与えていないマウス脳から視床下部を取り出し溶解した。ライセートについてホスホ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ−３β（ｐＳ９−ＧＳＫ−３β）及びＧＳＫ−３βに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。拘束ストレスを与えたマウスあるいは与えていないマウスにＰＥＧ又はＤＣＰ−ＬＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を経口ゾンデを用いて、試験開始の７日前から終了まで（計１１日間）経口投与した。グラフ中、各カラムは、全ＧＳＫ−３βにおけるシグナル強度に対するリン酸化ＧＳＫ−３βの強度の割合の平均値（±ＳＥＭ）を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において有効成分として用いられる８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（本明細書中、必要に応じてＤＣＰ−ＬＡと省略）は、以下の構造式を有する。
【００１３】
【化１】
2014185481.tif 000002
【００１４】
ＤＣＰ−ＬＡは、例えば、ＷＯ０２／５００１３で示される方法によって製造することができる。また、ＤＣＰ−ＬＡには４つの光学異性体が存在する（α，α−ＤＣＰ−ＬＡ、α，β−ＤＣＰ−ＬＡ、β，α−ＤＣＰ−ＬＡ、β，β−ＤＣＰ−ＬＡ）が、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。これらの異性体は、例えば、ＷＯ２０１２／０６７１１１で示される方法によって製造することができる。
【００１５】
本発明においてＤＣＰ−ＬＡはまた、その塩として用いられてもよい。かかる塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、被験体（対象）は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００１７】
ＤＣＰ−ＬＡは、実施例にてデータで示されるように、（１）５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用、及び（２）ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有する。これらの優れた薬理作用により、本発明はうつ病の予防又は治療用として、すなわち抗うつ薬（以下、本発明の医薬とも称する）として有用である。本発明において、抗うつ薬とは、うつ病及びうつ症状を改善する為に用いられる医薬であって、うつ病の予防及び／又は治療薬と同義である。
【００１８】
うつ病は、脳の働きが一時的に低下することにより生じると考えられており、適切な治療を行えば寛解に至る疾患である。比較的軽症のうつ病では、身体症状に軽い意欲低下を伴う程度であるが、中等症のうつ病では、不眠や食欲低下、心気抑うつなどの症状が比較的強く、仕事や家事などに支障が出る。また、重症のうつ病では、意欲低下が顕著で、うつ病性の妄想（心気、罪業、貧困などの妄想がよく見られる）を伴う例、メランコリーを伴ううつ病や、中高年以上の女性のうつ病に多い不安焦燥の強い、いわゆる激越うつ病、希死念慮の強い例、自殺未遂のある例が見られる。他に、倦怠感、易徒労感、頭痛なども見られる。また、日本でも汎用されている米国精神医学会の診断基準としては、以下に示す大うつ病エピソードを呈している患者を指し、大うつ病エピソードとは、以下の９項目のうち５項目以上が認められる状態を指す。（１）抑うつ気分、（２）興味、喜びの著しい減退、（３）体重減少または増加、食欲減退または増加、（４）不眠または睡眠過多、（５）精神運動性の焦燥または制止、（６）易疲労性または気力の減退、（７）無価値観または罪責感、（８）思考力や集中力の減退または決断困難、（９）自殺念慮や自殺企図（樋口輝彦：気分障害の病態、診断と治療概説．臨床と研究  ８０（９）：１５８２−１５８７，２００３）。
【００１９】
本発明は、上記したうつ病の予防及び／又は治療に有効である。
本明細書中で用いられる場合、「予防」とは、うつ症状を示さない被験体において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味し、「治療」とは、うつ症状を示す被験体において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。
【００２０】
本発明において明らかになったＤＣＰ−ＬＡの薬理作用としては以下のものが挙げられる。
（１）５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用
選択的に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進することにより、選択的に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体を介したセロトニン作動性神経伝達を増強させることができる。又、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体アゴニストが抗うつ作用を示すことが数多く報告されている（参考文献）。ＤＣＰ−ＬＡは、選択的に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進することで抗うつ作用が期待できるので抗うつ薬として有用であると言える。
（参考文献）
Popova NK, Naumenko VS. 5-HT1Areceptor as a key player in the brain 5-HT system. Rev Neurosci 2013;24(2):191-204.
（２）ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制作用
ＧＳＫ−３βの抑制（ＧＳＫ−３βリン酸化）が抗うつ作用を示すことが数多く報告されている（参考文献）。拘束ストレス等のストレスによってＧＳＫ−３βのリン酸化が抑制されることは後述の実施例に示す通りであるが、ＤＣＰ−ＬＡはかかるリン酸化の抑制を阻害するのみならず、リン酸化を促進することができる。
ＤＣＰ−ＬＡはストレス誘導性のＧＳＫ−３β活性化を抑制することで抗うつ作用が期待できるので抗うつ薬として有用であると言える。
（参考文献）
Latapy C, Rioux V, Guitton MJ, Beaulieu JM. Selective deletion of forebrain glycogen synthase kinase 3β reveals a central role in serotonin-sensitive anxiety and social behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2012;367(1601):2460-2474. 
【００２１】
本発明の医薬は、治療する各々の個別の患者（対象）の年齢及び状態に応じて変動するが、静脈内投与の場合には、ＤＣＰ−ＬＡの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１００ｍｇ、筋肉内投与の場合には、該化合物の１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇ、経口投与の場合には、該化合物の１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇが、うつ病の予防及び／又は治療のために一般的に与えられる。
【００２２】
本発明の医薬は、有効成分であるＤＣＰ−ＬＡ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２３】
一つの実施態様において、本発明の医薬は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２４】
別の実施態様において、本発明の医薬は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２５】
ＤＣＰ−ＬＡは、食品として提供することができる。有効成分であるＤＣＰ−ＬＡは、上述の通り、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して（１）５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用、及び（２）ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有し、うつ病の予防・治療に効果的な機能性食品として提供することができる。
【００２６】
本発明において「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の医薬は、該医薬の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
本発明の医薬が、単一の製剤として提供される場合には、該医薬の単位摂取量又はその分割量は、ＤＣＰ−ＬＡの単位摂取量又はその分割量である。
【００２８】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬品あるいは食品としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬品あるいは食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬品あるいは食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬品あるいは食品はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００２９】
さらに、ＤＣＰ−ＬＡは、上述の通り、（１）５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送を促進する作用、及び（２）ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有し、従って各種試薬としても提供され得る。当該試薬としては、具体的には、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進剤、及びストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制剤が挙げられる。いずれの試薬も、従来にない新しい作用メカニズムを有する、副作用の軽減された、及び／又はより効果が増強された、抗うつ薬を開発する有用なツールとなる。
【００３０】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３２】
（材料と方法）
動物に関する取扱い
全ての手法は兵庫医科大学動物実験委員会の認可を受け、ＮＩＨ（米国国立衛生研究所）の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。【００３３】
５−ＨＴ受容体輸送の解析
95％O2及び5%CO2で酸素化した人工脳脊髄液(ACSF；117 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 及び11.5 mMグルコース)中、ラット海馬及び視床下部の切片（雄性ウイスターラット、６週齢、400μm）をDCP-LA(100 nM)の存在下または非存在下、GF109203X(100 nM)、KN-93(3 mM)又はボツリヌス毒素A型(BoTX-A)(0.1 U/ml)を添加して、あるいは未添加で、34℃で20分間インキュベートした。GF109203X又はKN-93を添加する場合はDCP-LA処理の20分前から、BoTX-Aを添加する場合にはDCP-LA処理の12時間前からACSF中に添加した。別の実験セットでは、強制水泳試験後のマウスの脳から海馬と視床下部を単離した。切片と組織を1%(v/v)プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する氷冷したミトコンドリアバッファー(210 mMマンニトール, 70 mMシュクロース, 及び1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH 7.5)中で音波処理し、3,000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。視床下部と海馬の上清の一部を全ライセートとしてウエスタンブロッティングに用いた。残りの上清は11,000 rpm、4℃で15分間遠心分離し、上清を回収してさらに100,000 X g、4℃で60分間超遠心分離した。上清及びペレットを、それぞれ、細胞質画分及び細胞膜画分として用いた。細胞質成分及び細胞膜成分が首尾よく分離されたか否かは、抗LDH抗体（細胞質マーカー）及び抗カドヘリン抗体（細胞膜マーカー）を用いるウエスタンブロット解析で確認した。各画分のタンパク質濃度はBCAプロテインアッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)を用いて測定した。【００３４】
ウエスタンブロッティング
細胞質画分、細胞膜画分及び全ライセートの蛋白質を1% (w/v)ドデシル硫酸ナトリウムで溶解した。タンパク質をTGXゲル(BioRad, Hercules, CA, USA)を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳道で分離し、ポリビニリデンフルオライド膜に転写した。ブロッティング膜は5% (w/v)BSAを含むTBS-T[150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20及び20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、続いて、以下の抗体とそれぞれ反応させた。
抗5-HT1Aセロトニン受容体抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)
抗5-HT2Aセロトニン受容体抗体(Calbiochem, San Diego, CA, USA)
抗ホスホGSK-3β(Ser9)抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
抗GSK-3β抗体(Cell Signaling)
洗浄後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体あるいはヤギ抗マウスIgG抗体と反応させた。免疫反応性は、ECLキット(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて検出し、化学発光検出システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて可視化した。シグナル密度をImageQuant ソフトウェア(GE Healthcare)で測定した。【００３５】
うつ病モデル
現在、実験動物の行動を用いたうつ病の研究では、うつ病の両側面である抗うつ薬の効能とストレスに対する反応が主に利用される。うつ病のモデルでは、主に孤立、電気ショック、強制的に水につけること、周辺環境や温度変化などのストレスを加えることにより、動物にうつ病を誘発する方法を使用している。本実験例では、拘束ストレス（restraint stress）の動物モデルを使用した。動けない狭い空間に実験動物を閉じ込めるストレスを加えて、うつ病に相当する症状を誘発し、試験化合物を投与した時、抗うつ効果があるか否かを調べた。雄性C57BL/6Jマウスを8週齢の時点でJapan SLC Inc. (Shizuoka. Japan)から入手した。マウスを11.5ｃｍのプラスチック製のシリンダー(直径, 2.7 cm)に１日３時間閉じ込め、それを４日間連続して行いストレスを与えた。【００３６】
強制水泳試験
強制水泳試験は、化合物の抗うつ効果をスクリーニングするために用いられる行動学的な試験である。本実験例においても、拘束ストレスの後、強制水泳試験を既報に従って行なった（Porsolt RD, Le Pichon M, Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature 1977;266:730-732.）。マウスを、15ｃｍの高さまで水を満たしたプラスチック製のシリンダー（高さ：25ｃｍ、直径：10ｃｍ）に入れ23℃で6分間放置した。後半の４分間の間に観察される、後肢を動かすことも泳ぐこともせず浮いている時間を、無動時間として測定した。
DCP-LAはポリエチレングリコール(PEG)に溶解した。DCP-LA又はPEGは実験開始７日前から終了までの全１１日間、１日１回経口ゾンデを用いて投与した。【００３７】
（結果）
１．ＤＣＰ−ＬＡは細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体を増加させる。
海馬（Ａ）、視床下部（Ｂ）の細胞膜画分及び細胞質画分における５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体及び５−ＨＴ２Ａセロトニン受容体の存在比を測定し、さらにＤＣＰ−ＬＡで処理した場合と処理しない場合とでその変化を調べた。結果を図１に示す。
ＤＣＰ−ＬＡで処理することにより、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜上での発現が選択的に増加した。この結果は、ＤＣＰ−ＬＡが選択的に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体を細胞膜上に輸送し、細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の発現を増加させることを示している。これは、ＤＣＰ−ＬＡが５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体神経伝達を増強することを意味する。５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体神経伝達障害とうつ病との関連が指摘されており、この結果はＤＣＰ−ＬＡがうつ病の治療薬となる可能性を示唆している。【００３８】
２．ＤＣＰ−ＬＡの５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進作用はＣａＭＫＩＩ依存的である。
結果を図２に示す。ＤＣＰ−ＬＡによる視床下部における５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進作用はＢｏＴＸ及びＫＮにより有意に抑制された。この結果は、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩ依存性に５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜への小包輸送を刺激し、細胞膜上での受容体発現量を増加させることを示している。【００３９】
３．ＤＣＰ−ＬＡの用量依存的にうつ状態を改善する。
拘束ストレスによりうつ状態にしたマウスに対して強制水泳試験を行い、ＤＣＰ−ＬＡの抗うつ効果を調べた。結果を図３に示す。
ＤＣＰ−ＬＡの用量を０．５、０．７５、１．０、５．０ｍｇ/ｋｇと変化させて調べたところ、用量依存的に無動時間の減少効果を示した。この結果は、ＤＣＰ−ＬＡが用量依存性にうつ状態を改善することを示している。【００４０】
４．ＤＣＰ−ＬＡは、ストレスにより誘導される海馬（Ａ）、視床下部（Ｂ）における細胞膜上５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の減少を回復する。
結果を図４に示す。拘束ストレスにより細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体が減少することをウエスタンブロット解析により確認した。さらに、かかる細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の減少はＤＣＰ−ＬＡを投与することにより回復した。この結果は、ストレスにより細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体が減少し、ＤＣＰ−ＬＡはそれを回復させる作用を有していることを示している。【００４１】
５．うつ行動と細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の量は相関している。
強制水泳試験におけるマウスの無動時間と細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の量との関係を統計学的に解析した。結果を図５に示す。この結果は、細胞膜上の５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体発現数の減少とうつ状態の程度に相関があることを示している。【００４２】
以上の結果を総合すると、ＤＣＰ−ＬＡは細胞膜上５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体発現数を増加させることにより、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体神経伝達を促進する作用を有し、抗うつ薬として有効である可能性を示唆している。【００４３】
６．ＤＣＰ−ＬＡは、ストレス誘発性のＧＳＫ−３βのＳｅｒ９での脱リン酸化を回復する。
マウスにおけるＧＳＫ−３βのリン酸化に及ぼす拘束ストレスの影響及び当該影響に対するＤＣＰ−ＬＡの効果を調べた。結果を図６に示す。拘束ストレスを与えることによりＧＳＫ−３βのリン酸化が抑制（即ちＧＳＫ−３βが活性化）され、ＤＣＰ−ＬＡは当該リン酸化の抑制を改善することが確認された。
また、拘束ストレスの有無とは関係なく、ＤＣＰ−ＬＡを投与することによってリン酸化が促進（即ちＧＳＫ−３βが不活性化）することが確認された。
これらの結果は、拘束ストレスによってＧＳＫ−３βのリン酸化が抑制され（ＧＳＫ−３βの活性化）、ＤＣＰ−ＬＡは当該ストレス誘発性ＧＳＫ−３βの活性化を抑制するだけでなく、定常レベル以上にＧＳＫ−３βを不活性化することを示している。ＧＳＫ−３βの活性化はうつ状態を悪化させると考えられており、ＤＣＰ−ＬＡはＧＳＫ−３βの不活性化によりうつ病を改善する可能性を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
ＤＣＰ−ＬＡは、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体の細胞膜輸送促進作用、及びストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有し、従って抗うつ薬として有用である。またかかる薬理作用に基づいて種々の研究用試薬としても有用である。
さらに、うつ病との同時罹患率が高い疾患（症状）として不安症があり、現在では、抗うつ薬を用いてうつ病と不安症の両方を治療するのが標準的な治療法となっている。従って、ＤＣＰ−ＬＡは抗不安薬としても有用である。【００４５】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−１０５６０９（出願日２０１３年５月１７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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