(57)【要約】  （１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で、処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で、所定時間加熱処理することにより、一本鎖βグルカンを得ることができる。一本鎖の状態を長期間維持することのできるβグルカンを化学処理によらずに製造することができる。
2017104686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖（１，３）（１，６）‐βグルカンを製造する方法であって、
（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で
処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で、
所定時間加熱処理することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記温度範囲が１４５℃以上、１９０℃以下であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記温度範囲が１４５℃以上、１８０℃以下であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液が、
黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属の高粘性培養液であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
加熱処理前にｐＨ２．０より高く、６．０より低く調整することを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
加熱処理前にｐＨ２．３以上５．５以下に調整することを特徴とする請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
（１，３）（１，６）‐βグルカン総量のうち一本鎖βグルカンの割合が７０％以上含まれることを特徴とする長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物。
【請求項８】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンが、
黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属が生産する（１，３）（１，６）‐βグルカンであることを特徴とする請求項７記載の一本鎖βグルカン組成物。
【請求項９】
（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で
処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で
所定時間加熱処理することによって得られる長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物。
【請求項１０】
請求項７〜９いずれか１項記載の一本鎖βグルカン組成物が含有された液状組成物であって、前記液状組成物がサプリメント飲料、液状化粧品、又は液状医薬部外品のいずれかであることを特徴とする液状組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然では三本鎖で存在するβグルカンを一本鎖にする方法、及び一本鎖βグルカン組成物に関する。特に、食品、サプリメント等として、摂取する場合に安全な水熱処理を用いて、一本鎖のβグルカンを高濃度含む組成物を製造する方法、及び該方法によって得られる一本鎖βグルカンを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
βグルカンには、グルコースがβ１‐３型の結合で連なった多糖と、β１‐４型で連なった多糖であるセルロースとがある。一般にβグルカンといった場合には通常β１‐３型のグルカンを指す。本願明細書で特に断りのない限り、βグルカンと記載する場合には、β１‐３型のグルカンを指す。βグルカンは六単糖が１→３方向で水素結合した三重螺旋構造の鎖状構造をとる多糖類である。【０００３】
βグルカンは植物、菌類、細菌など自然界に広く分布することが知られている。また、アガリクス、メシマコブ、霊芝などのキノコ、ビール酵母、パン酵母、黒酵母などの酵母に由来するβグルカンは、強い免疫賦活作用、制癌作用、抗ウイルス活性、抗菌活性があることが知られており、食品、サプリメントや化粧料などに活用されている。【０００４】
βグルカンはビール酵母、パン酵母、黒酵母といった酵母の細胞壁に多く含まれていることから、これら酵母を培養して精製されることが多い。特に、黒酵母から精製されたβグルカンは免疫賦活作用が強く、また保水作用が強いことから、サプリメントだけではなく食品改質材、化粧料等としても広く活用されている。【０００５】
βグルカンを含む黒酵母培養液は、見かけ上は生卵白のようで高粘度である。水溶液中で１％（ｗ/ｖ）濃度になるとゲル状になり、凝集性を有するため水に溶解することが困難である。また、黒酵母βグルカン０．１％（ｗ/ｖ）水溶液に、エチルアルコールを添加すると粘性が増加してゼリー状となる。水、アルコールに溶解困難であること、高粘度であることから、凝集剤、食品改質剤、サプリメント等として使用する際に非常に扱いづらかった。【０００６】
また、βグルカンをサプリメントとして摂取したとしても、分子量が非常に大きいことから、消化吸収される率は低い。消化吸収率を増加させるためには、消化器官で吸収されやすい程度の分子量に加水分解する必要がある。しかしながら、低分子量のβグルカンは生理活性が低下することが予想されるため、免疫賦活作用、制癌作用を備えたまま糖類を加水分解する技術の開発が望まれていた。所望の分子量にするためには酵素を用いて分解する方法があるが、黒酵母のβグルカンは培養液から抽出した状態では全く酵素分解することができなかった。【０００７】
自然界では三本鎖の三重螺旋構造として存在するβグルカンであるが、酸、アルカリ等による化学的な加水分解法によって糖鎖を切断することが可能である。通常は、加水分解によって三本鎖のまま切断されるが、条件によっては三本鎖βグルカンを一本鎖βグルカンとすることもできる。また、三本鎖のβグルカンを一本鎖にすることにより、免疫賦活作用等に対してより高い効果が得られることが示されている。【０００８】
非特許文献１には、スエヒロタケが生産するシゾフィラン（ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎ）の構造の違いによる活性について開示されている。非特許文献２には、種々のβグルカンの構造と生物活性について比較検討がなされており、一本鎖βグルカンとして、アルカリ処理したシゾフィランを用いて検討が行なわれている。シゾフィランは、抗腫瘍活性があることが知られているβグルカンであり、ジメチルスルホキシドのような有機溶媒や、ｐＨ１３以上のアルカリ条件下では三重螺旋構造から一本鎖のランダム構造をとる。非特許文献１及び２には、シゾフィランをアルカリ処理によって一本鎖にすると、三本鎖シゾフィランと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで高い一酸化窒素（ＮＯ）合成を示し、インターフェロンγの発現を増強するだけではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＯ合成を増強し、インターロイキン１-α、インターロイキン-６、ＴＮＦ-αの発現が増加することが開示されている。【０００９】
また、βグルカンを一本鎖にすることによって分子量が小さくなることから、粘性が低くなり溶解性が向上し、扱いやすくなることが期待される。溶解性が向上すると、糖分解酵素による処理を行ないやすくなることから、消化吸収率の増加が期待できるだけではなく、食品添加剤、サプリメントとして用いる場合の加工がしやすくなることが期待される。【００１０】
また、βグルカンを酵素分解にて得られるラミナリオリゴ糖は、それを原料とし化学修飾したものがＨＩＶウイルスの感染防御剤として効果を有することが報告されており、医薬原料としての用途も期待されている（非特許文献３）。上記のように一本鎖βグルカンのより高い効果が示されていることから、一本鎖βグルカンを調整する技術が求められている。【００１１】
βグルカンを一本鎖にする技術ではないが、近年、高温高圧条件下で水熱処理を行なうことにより、βグルカンの粘性を低下させる方法が開示されている（特許文献１、２）。特許文献１には、黒酵母から得られたβグルカン水溶液を処理温度において飽和水上気圧以上に加圧した状態である０．５〜２．０ＭＰａの圧力で、１４０℃より高温で、２００℃を超えない温度範囲で所定時間加熱処理することにより、粘性の低い溶液が得られることが開示されている。【００１２】
また、特許文献２には、鹿角霊芝菌体から加圧熱水により低分子のβグルカンを抽出することが開示されている。これによれば、粉砕された固体の鹿角霊芝菌体に加圧熱水を接触させることによって、菌体の細胞壁の構成糖である（１，３）（１，６）‐βグルカンが加水分解し、水に溶解する程度の分子量まで低分子化し、抽出することができるというものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ohno, N. et al., 1996, Immunology Letters, Vol.53, p.157-163.
【非特許文献２】宿前  利郎  YAKUGAKU ZASSHI, 2000, Vol.120(5), p.413-431.
【非特許文献３】Uryu.T et al.,Biochemical Pharmacology,1992, Vol.43, p.2385-2392.
【非特許文献４】Sato T et al., Polym. J., 1983, Vol.15, p.87-96.
【非特許文献５】T. M. McIntire & D. A. Brant, J. Am. Chem. Soc., 1998, Vol.120,p.6909-6919.
【非特許文献６】Nagi, N. et al., Biol. Pharm. Bull., 1993, Vol.16(9), p.822-828.
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２０１１−１０３８７７号公報
【特許文献２】特開２００８−１３８１９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、高濃度で一本鎖βグルカンを含み、かつ粘性の低下した組成物を得ることを課題とする。一本鎖βグルカンとすることによって、強い免疫賦活作用や抗腫瘍作用の増強が期待できるだけではなく、一般食品、食品添加物として扱いやすい粘度のβグルカンを製造できるからである。【００１６】
一本鎖βグルカンを製造する方法としては、上述のような酸、アルカリ等による化学的処理方法がある。しかしながら、一般食品、食品添加剤、サプリメントとして使用する態様を考えると、酸、アルカリ、あるいはジメチルスルホキシドといった有機溶媒を用いた化学的処理は新たな化合物を生成する可能性を否定することができないため、好ましい処理方法とはいえない。また、酸、アルカリを用いた化学処理の場合には処理後に中和し、さらに薬品を除去する必要性がある。有機溶媒を用いた場合にも薬品の除去の必要性が生じる。このように、化学的処理を行なうと、多くの工程を必要とし、薬品等のコストがかかるという問題があるだけではなく、処理工程で使用した薬品の除去及び廃棄という問題が生じる。【００１７】
また、アルカリ処理や有機溶媒の添加により、一本鎖βグルカンを得たとしても、中和もしくは透析により処理を行なうと保存中に三本鎖βグルカンに戻ることが報告されている（非特許文献４、５）。したがって、食品やサプリメントとして用いたとしても、安定性が低く、保存可能期間の短い製品しか製造することができない。【００１８】
βグルカンの粘性を低下させる方法として知られている水熱処理は、化学薬品を使用しないことから、安全性の面で非常に優れている。しかしながら、粘度の低下を指標として処理していることから、βグルカンがどのような状態で分子量が低下しているのかは不明である。すなわち、三本鎖のまま短くなり、分子量が低下しているおそれがある。三本鎖のまま短くなったβグルカンを得たとしても、抗腫瘍活性や免疫賦活力の増強は期待することができない。【００１９】
さらに、食品、化粧品等に含有させる一本鎖βグルカンを提供するためには、一定量のβグルカンを工業的に生産する必要がある。しかし、文献１の方法は実験室レベルの処理方法であり、少量のβグルカンを処理できるだけであったことから、連続的な処理方法を検討する必要があった。実際に文献１の方法を用いて水熱処理用のスラリーを調整すると固化してしまい、連続的に水熱処理装置に供給することができず、水熱処理そのものを行うことができなかった。そのため、水熱処理による一本鎖βグルカンを製造するためにはスラリー調整条件を検討することが必要であった。【００２０】
本発明は、一般食品、食品添加物、サプリメント等としての摂取に適した一本鎖のβグルカンを高濃度で含む液状組成物を製造することを課題とするとともに、一本鎖の状態を維持したまま長期保存することができるβグルカン組成物を製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたβグルカン組成物及び該組成物を製造する方法、該βグルカン組成物が含有された液状組成物に関する。
（１）一本鎖（１，３）（１，６）‐βグルカンを製造する方法であって、（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で、所定時間加熱処理することを特徴とする製造方法。
（２）前記温度範囲が１４５℃以上、１９０℃以下であることを特徴とする（１）記載の製造方法。
（３）前記温度範囲が１４５℃以上、１８０℃以下であることを特徴とする（１）又は（２）記載の製造方法。
（４）前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液が、黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属の高粘性培養液であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の製造方法。
（５）前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、加熱処理前にｐＨ２．０より高く、６．０より低く調整することを特徴とする（１）〜（４）いずれか１つ記載の製造方法。
（６）前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、加熱処理前にｐＨ２．３以上５．５以下に調整することを特徴とする（５）記載の製造方法。
（７）（１，３）（１，６）‐βグルカン総量のうち一本鎖βグルカンの割合が７０％以上含まれることを特徴とする長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物。
（８）前記（１，３）（１，６）‐βグルカンが、黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属が生産する（１，３）（１，６）‐βグルカンであることを特徴とする（７）記載の一本鎖βグルカン組成物。
（９）（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で所定時間加熱処理することによって得られる長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物。
（１０）（７）〜（９）いずれか１つ記載の一本鎖βグルカン組成物が含有された液状組成物であって、前記液状組成物がサプリメント飲料、液状化粧品、又は液状医薬部外品のいずれかであることを特徴とする液状組成物。
【発明の効果】
【００２２】
食品やサプリメントに添加しても安全性の高い一本鎖βグルカンを高濃度で含む組成物を製造することが可能となった。また、本発明の製造方法により製造された一本鎖βグルカン組成物は、保存安定性が高いことから、長期間保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｐＨによるスラリーの変化を示す図。
【図２】温度と酵素による分解率との関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、適切な水熱処理を行うことによって、三本鎖βグルカンが一本鎖βグルカンに分解される温度範囲があるのではないかと考え、鋭意検討を行った。その結果、１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲の温度範囲で所定の時間処理することによって、７０％以上一本鎖βグルカンの含まれる組成物を得られることが明らかとなった。
【００２５】
２００℃以上の高温で処理すると、試料の褐変が激しいため、食品に添加するのには適さない。酵素処理による分解効率からは、１９０℃より高温で処理した場合の分解効率が懸念されるため、１９０℃以下で水熱処理することが好ましく、酵素処理効率の高さを鑑みると１８０℃以下で水熱処理することがより好ましい。また、１７０℃以下の温度で処理すれば褐変はほとんど生じず、また、一本鎖βグルカンも７０％以上の高濃度で含有される。
【００２６】
したがって、１４５℃以上、２００℃以下、好ましくは１４５℃以上、１９０℃以下、より好ましくは１４５℃以上、１８０℃以下の温度範囲で水熱処理することにより、７０％以上が一本鎖βグルカンであり、かつ酵素処理効率の高い組成物を得ることができる。
【００２７】
水熱処理に要する時間は、１０分以上〜６０分未満が好ましい。いずれの処理温度であっても１０分よりも短時間の場合には、一本鎖が生じる割合が低下する可能性がある。また、６０分よりも長時間処理すると褐変が生じることから、一般食品、食品添加物としては適さない。
【００２８】
また、工業的な生産規模で一本鎖βグルカンを製造する場合には、原材料である酵母培養液の圧搾物を懸濁する際のｐＨ条件が重要であることが明らかとなった。ｐＨが弱酸性でなければ、スラリー状とならず固化してしまい、連続的に水熱処理装置に供給することができず、水熱処理を行うことができなかった。
【００２９】
本発明の一本鎖酵母βグルカン組成物は、水溶性が高く粘性も低いため非常に扱いやすい。また、水溶液は透明で味も無味な為、混ぜ合わせる素材の邪魔をする事が無い。そのため、一般食品、健康食品、サプリメントなどの食品や化粧品、医薬部外品に添加して免疫賦活機能を付与することが期待できる。また、水への溶解性がよいことから、形態も、水溶液、粉末状、固形状、ゼリー状と様々な形態のものに添加することができる。さらに、以下に示す温度範囲で製造した一本鎖βグルカンは、水溶液中で長期保存しても安定性があり、一本鎖の状態を保つことができる。そのため、ドリンク状、ゼリー状の食品、あるいは化粧品、医薬部外品などの液状組成物に添加しても、アルカリなどの薬品によって製造した一本鎖βグルカンと比べて保存安定性が高く、一本鎖の状態を保つことができる。
【００３０】
一般食品であれば、例えば、飴、焼き菓子、チョコレート、麺、シリアルなどに、飲料であれば、ミネラルウォーター、お茶、コーヒー、ジュース、青汁飲料などの清涼飲料水、アルコール飲料などに好適に添加することができる。また、各種形態のサプリメントに添加した場合も長期に一本鎖βグルカンの形態を安定に維持することができる。また、ヒト用の食品だけではなく、ペット用飼料に混入してもよい。いずれも免疫を賦活する機能を期待することができる。その他にも化粧水、乳液、保湿液、ハンドクリーム、シャンプーなどの化粧品、うがい薬、歯磨き粉などの医薬部外品にも好適に添加することができる。
【００３１】
さらに、水熱処理によって得られた一本鎖βグルカンは、水溶液中でも粉末でも長期間安定であることが明らかとなった。アルカリで処理し一本鎖βグルカンを生成した場合には、１週間程度で７０％以上が三本鎖βグルカンに戻り粘性の高い状態になることが知られている。そのため、従来は一本鎖βグルカンとしての機能を備えた製品を安定的に供給することは困難であった。これに対し、水熱処理により一本鎖βグルカンとした場合には、溶液中であっても１年以上一本鎖βグルカンの割合にほとんど変化がなかった。したがって、飲料や、化粧水など溶液状の製品にβグルカンを含有させる場合であっても、長期間安定にその効力を保ったまま製品を供給することが可能となった。
【００３２】
ここで、一本鎖βグルカンの保存安定性とは少なくとも１週間以上、７０％以上が一本鎖βグルカンの状態で存在することをいう。また、好ましくは１か月以上、より好ましくは３か月以上、さらに好ましくは６か月以上、７０％以上が一本鎖βグルカンの状態で存在することをいう。
【００３３】
［水熱処理装置］
水熱処理装置としては、加圧、加熱ができるものであればどのような装置を用いてもよく、高温高圧装置、高温高圧反応試験装置等を使用することができる。具体的には、単回式（バッチ式）の亜臨界水反応装置、あるいは連続的に水熱処理を行うことのできる連続式亜臨界水反応装置を使用することができる。例えば、ＥＭＩ-ＳＹＳＴＥＭ（テクノＥＭＩ株式会社製）、水熱合成／分解装置（株式会社ＡＫＩＣＯ製）、チューブリアクター型水熱反応装置（木村化工株式会社製）などを挙げることができる。
【００３４】
［原料］
βグルカンの原料としては、大麦、オーツ麦などの穀物類、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）、スエヒロタケ（Ｓｈｉｚｏｐｈｙｉｉｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、マイタケ（Ｇ．Ｆｒｏｎｄｏｓａ）、ハナビラタケ（Ｓｐａｒａｓｓｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）等の子実体もしくは培養液、パン酵母やビール酵母の培養液など、どのようなものを使用してもよい。ここでは黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養して得られた高粘性の培養液を原料として説明するが、βグルカンの原料として、黒酵母の培養液だけではなく、同様にβグルカンを産生することが知られている他の酵母の培養液や原料も好適に使用できることはいうまでもない。
【００３５】
培養液には０．５％前後の（１，３）（１，６）‐βグルカンと菌体及び発酵残渣が含まれている。この培養液には黒酵母が培養液中に放出したβグルカンをはじめとする多糖が含まれているため、生卵の卵白様の非常に高い粘性が生じている。黒酵母の培養液はそのまま使用してもよいし、以下の方法で圧搾物として使用してもよい。
【００３６】
黒酵母培養液を圧搾物として使用する場合には、培養液に凝集剤を加えて凝集塊とし、凝集塊をフィルタープレスで圧搾し、発酵残渣及び菌体を除去し、圧搾濾過すればよい。具体的には、黒酵母培養液に硫酸アルミニウム液を終濃度０．１％となるように加え、不溶性の多糖アルミニウム複合体を形成させる。多糖アルミニウム複合体は、室温で３０分〜６０分ゆっくり撹拌する。形成された多糖アルミニウム複合体をフィルタープレスに導入し、水道水を通水して発酵残渣及び菌体を洗浄除去して圧搾物を得る。圧搾濾過処理により、発酵残渣や菌体がほぼ除去され含水率６５−８０％の多糖に富んだ圧搾物が得られる。
【００３７】
以下、実験例を挙げながら本発明の一本鎖βグルカンの製造方法について詳細に説明する。
１．一本鎖βグルカンの製造方法
［実施例１］
（１）水熱処理試料の調整方法（小規模スケール試料での調整方法）
黒酵母圧搾物２００ｇ（湿重量、固形分含量２０％）をとり、７２０ｍＬの蒸留水を加え、ミキサーで粉砕した。圧搾物が良く粉砕できたら、８０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、スターラーで良く撹拌した。粉砕溶液のＮａＯＨ濃度は終濃度０．１Ｎであった。撹拌した試料は、６０００ｒｐｍ、１０分遠心分離を行い、上清を回収した。回収した上清に対し、２倍量の無水エタノールを加え沈殿させた。βグルカンはエタノールにより沈殿することから、沈殿物を濾過して回収し、６０℃のオーブンの中で１時間程度エタノールを蒸発させた。エタノールを蒸発させた沈殿物は、再度蒸留水を加え溶解しβグルカンを回収した。回収したβグルカンは、０．３５％（ｗ／ｖ）になるように、蒸留水で希釈し、ｐＨ６．０になるように、１Ｎ  ＨＣｌ、または１Ｎ  ＮａＯＨで調整した。ｐＨ調整した試料は水熱反応装置に入れ、１１０℃〜１９０℃の温度範囲において所定の温度に加熱し、各温度で１０分反応を行った。このときの反応時の圧力は、０．５〜２．０ＭＰａとなる。
【００３８】
［実施例２］
（２）水熱処理試料の調整方法（連続生産用試料の調整方法）
工業的に一本鎖βグルカンを製造する場合には、連続的に水熱処理を行う。圧搾物を連続的に水熱処理する場合には、水熱処理用のスラリーが流動性を備えている必要がある。ｐＨ条件によって、スラリーの状態が変化することが製造を行っている際に明らかとなったので、スラリーを調整する際のｐＨ条件について解析を行った。
【００３９】
培養圧搾物５０ｇを１１００ｍｌの水中で粉砕し、スラリーを作製する。このときのβグルカン濃度は約２％（ｗ/ｖ）程度であると推定される。なお、ここではβグルカンが２％（ｗ/ｖ）程度になるように調整しているが、１〜５％（ｗ/ｖ）程度の濃度範囲となるように調整すればよい。次に１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを２．０〜６．５に調整し、スラリーの変化を解析した。ｐＨ調整を行ったスラリーを１時間静置した後、Ｂ型粘度計（（株）東京計器製製作所社製）で粘度を測定した（図１）。
【００４０】
ｐＨ２．０、あるいはｐＨ６．０以上にして静置しておくと、スラリーは完全に固化していた。したがって、ｐＨは２．０より高く、ｐＨ６．０より低い条件にする必要がある。また、ｐＨ２．３の条件、あるいは、ｐＨ５．５の条件では粘度は高いもののスラリーの流動性はあることから、ｐＨ２．３以上５．５以下にスラリーのｐＨを調整することが好ましい。
【００４１】
ｐＨ２．３以上５．５以下に調整したスラリーは連続的に水熱処理を行うことができる。また、水熱反応の際に、ｐＨが３．０より低い場合にはβグルカンの過分解が起こり、回収率が低下することが分かった。したがって、スラリー調整時にｐＨ３．０以上５．５以下の範囲にｐＨを調整し、水熱処理を行うことがより好ましい。この範囲のｐＨに調整した試料を連続的に水熱反応が可能な装置に入れ、１４５℃〜１９０℃の温度範囲において所定の時間加熱する。なお、このときの反応時の圧力は、０．５〜２．０ＭＰａとなる。
【００４２】
さらに、水熱処理後のβグルカンは以下のようにして精製すれば、純度の高い一本鎖βグルカンを得ることができる。水熱反応後の処理液は、濾過により反応残渣物を除去する。減圧濾過方式、加圧濾過方式、遠心濾過方式など、一般的な濾過方法にて濾液を回収すればよい。
【００４３】
回収した濾液は、必要があれば濃縮を行う。濃縮は凍結乾燥、限外濾過等、どのような方法を用いてもよい。限外濾過を行うのであれば、クロスフロー方式、全量濾過方式などが選択でき、クロスフロー方式についても有機膜型、セラミック型などのモジュールを用いて行う事ができる。限外濾過を行うのであれば、分子量約３０，０００以下を排除分子量とする限外濾過濃縮を行い、低分子量の糖を除去し濃縮を行えば粗精製を同時に行うことができる。このとき、濃縮されたことの確認は、糖度計を用いて確認すればよい。ここでは、濃縮液の固形分濃度を糖度計（株式会社アタゴ製、糖度計ＰＡＬ）で、Ｂｒｉｘが１％から５％まで濃縮されることを確認している。その後、凍結乾燥を行い、粉砕処理することで、純度の高い粉末を得ることができる。
【００４４】
［実施例３］
（３）一本鎖グルカンの割合測定方法
一本鎖グルカンと三本鎖グルカンはリムルステストによって区別することができる。そこで、実施例１で調整した水熱処理試料を用い各温度で水熱処理したβグルカンをリムルステストによって測定し、一本鎖βグルカンの割合を求めた。コントロールの一本鎖グルカンは、０．５Ｎ  ＮａＯＨに溶解することによって得た（非特許文献６）。なお、実施例２で示すように連続的に水熱処理を行った場合も、実施例１で示したように小スケールで水熱処理を行っても一本鎖グルカンが同程度の割合で生成していた。
【００４５】
アルカリによって溶解したグルカンは一本鎖になっており、上述のようにリムルステストにより三本鎖βグルカンと区別することができる。０．５Ｎ  ＮａＯＨによりアルカリ処理したβグルカンを１００％一本鎖に分解しているβグルカンとし、アルカリ処理を行っていないβグルカン試料を一本鎖が含まれていないものとして、アルカリ処理βグルカンと所定の割合で混合し、リムルステストの検量線を作成した。
【００４６】
具体的には以下のようにしてリムルステスト用のβグルカン試料を作製した。上記と同様にして圧搾物からエタノール沈殿により回収したβグルカンは、水により適度に希釈した後凍結乾燥して粉末化する。この状態のβグルカンは三本鎖のβグルカンである。以下、このβグルカンを未処理βグルカンという。
【００４７】
次に、凍結乾燥により粉末化した未処理βグルカンを１０ｍｇ/ｍＬになるように０．５Ｎ  ＮａＯＨで溶解した。０．５Ｎ  ＮａＯＨで溶解することにより一本鎖βグルカンとなる。溶解した一本鎖βグルカンは、蒸留水に対して１日透析し、再度凍結乾燥を行い粉末として回収した。凍結乾燥した状態で保存することにより、アルカリ処理したβグルカンであっても一本鎖を維持したまま保存することができる。
【００４８】
水熱処理試料は、未処理βグルカンを実施例１の方法により各温度で水熱処理を行なった後、１日間蒸留水に対して透析を行ない凍結乾燥し回収した。
【００４９】
測定する試料は、すべて１０ｍｇ/ｍＬに調整した後、１０-7ｇ／ｍＬまで希釈した。検量線は、アルカリ処理一本鎖βグルカンが１００％、８０％、４０％、２０％、０％になるように、未処理βグルカン（三本鎖βグルカン）と混合したもの用いて作成した。
【００５０】
測定に使用する希釈水は、大塚蒸留水（注射用、大塚製薬株式会社製）を用いた。また、チューブ等、使用する器具はすべてパイロジェンフリーのものを使用した。また、実験操作はすべて無菌室で行なった。リムルステストは、ＧＬＵＣＡＴＥＬＬ、発色試薬はＰｙｒｏｃｏｌｏｒ  ＤＩＡ６０-ＳＴＶ（いずれも生化学バイオビジネス製）を用いて行なった。発色は吸光度計（株式会社日立ハイテクサイエンス製）を用いて、５４０ｎｍの吸光度を測定することによって行なった。各処理温度で処理したβグルカンの一本鎖の割合を検量線に基づいて算出した。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2017104686.tif 000003
【００５２】
表１に示すように、１４０℃で水熱処理をした試料は、７％の一本鎖βグルカンしか含まれておらず、未処理のサンプルとほとんど変わらなかった。これに対し、１４５℃で水熱処理した試料は、７７％が一本鎖βグルカンになっていた。さらに、１５０℃以上の温度で水熱処理した試料はいずれも９０％以上の一本鎖βグルカンを含有していた。
【００５３】
したがって、１４５℃以上の温度で水熱処理をすれば、組成物中のβグルカンは７０％以上一本鎖βグルカンになるものと考えられる。１４５℃より高い温度で水熱処理することにより、三本鎖βグルカンが、一本鎖βグルカンになるものと考えられるが、２００℃以上の高温で処理すると試料の褐変が激しい。１９０℃以下の温度で処理すれば褐変はほとんど生じず、また、一本鎖βグルカンも７０％以上の高濃度で含有されるため１４５℃以上、１９０℃以下の温度範囲で水熱処理することが好ましい。
【００５４】
［実施例４］
一本鎖βグルカンの割合と酵素反応の関係
分子量が大きいと腸からの吸収効率が低いため、ある程度低分子に分解して食品、サプリメントに含有させることが好ましい。しかし、三本鎖βグルカンは、ほとんど酵素による分解反応が起こらない。そこで、一本鎖βグルカンが、酵素によって分解されるか解析した。
【００５５】
上記と同様に水熱処理を行なったβグルカン試料、及び未処理のβグルカンを希ＨＣｌ、希ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整し、３．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈した。水熱処理は１１０℃から１９０℃まで１０℃毎の温度で行なった。糖分解酵素はＬｙｓｉｎｇＥｎｚｙｍｅ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来、シグマアルドリッチ社製）を４０ｍｇ/ｍＬの濃度に溶解し、βグルカン試料１ｍｇあたり粗酵素０．８ｍｇを添加した。バックグラウンド測定には蒸留水を用いた。酵素反応は４０℃で行い、３０時間目まで、６時間毎にサンプリングした。サンプリングした試料は、１０倍に蒸留水で希釈し、１０分煮沸することによって酵素反応を停止させた。
【００５６】
分析はＨＰＬＣで行なった。分析は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＳ−８０１カラム（昭和電工株式会社製）を用い、６０℃、流速０．５ｍＬ/ｍｉｎ、溶媒は超純水を用いて行なった。反応開始時のβグルカンのピーク高さに対しての減少で分解率を評価した。結果を図２示す。
【００５７】
水熱処理温度１４０℃以下では、長時間酵素で処理してもほとんど分解が起こらず、三本鎖βグルカンは酵素分解されないことが確認された。一方、水熱処理温度１５０℃以上、すなわち、９０％以上が一本鎖βグルカンになっている状態では効率良く糖の分解が生じる。１５０℃以上１７０℃以下では、分解効率にほとんど差が見られないが、水熱処理温度１８０℃で非常に効率よく酵素による分解が生じ、水熱処理１９０℃では、１５０℃、１７０℃と同等の分解効率を示した。１９０℃という温度帯ではβグルカンは完全に一本鎖になっていると考えられるが、水熱処理の過程においてβグルカン由来の多くの過分解物が生成され、それらが酵素反応の妨げとなっていると推察される。
【００５８】
上記結果から、酵素による分解効率は、βグルカンの構造と相関関係があることが明らかとなった。すなわち、βグルカンの構造が一本鎖であることが酵素による分解効率に関与し、さらに加熱による過分解物は酵素反応を阻害するものと考えられる。したがって、一本鎖βグルカンを用いて酵素処理を行う場合には、１４５℃以上の温度で水熱処理をすることが好ましく、特に酵素分解効率からは１８０℃以下の温度で水熱処理を行うことがより好ましいと結論付けた。
【００５９】
［実施例５］
一本鎖βグルカンの長期保存安定性
アルカリ処理による一本鎖βグルカンは、酸による中和、あるいは透析を行なうと保存期間中に、三本鎖に戻ることが指摘されていた。三本鎖構造に戻ったβグルカンには一本鎖βグルカンに見られるような強い免疫賦活力は期待できない。したがって、一本鎖βグルカンの長期安定性は重要な問題である。そこで、水熱処理により一本鎖βグルカンを生成させ、長期保存し安定性の解析を行なった。
【００６０】
１日の推奨されるβグルカンの摂取量は３０ｍｇ程度であると言われている。そこで、３０ｍｇのβグルカンを配合した５０ｍＬのドリンク（エリスリトール１６％、βグルカン濃度０．０６％、酸味料０．５％、香料０．３％）を製造し、長期保存後に一本鎖の割合を測定した。
【００６１】
水熱処理（１７０℃、反応時間１５分）βグルカンを０．０６％濃度に配合した上記ドリンク剤を室温で１年半保存した試料と、コントロールとして、βグルカンを混合直後のドリンク溶液を用い、リムルステストにより一本鎖割合の測定を行った。結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
一年半保存していたサンプルも製造直後のサンプルも、一本鎖の割合は８４％と同等であった。アルカリ処理によって得られたβグルカンは、水溶液中で保存することにより一週間程度で三本鎖に戻ることが指摘されているが、水熱処理によって一本鎖にしたβグルカンは一年半という長期保存後も一本鎖の状態を維持していることが明らかとなった。すなわち、水熱処理によって一本鎖としたβグルカンと、アルカリ処理によって一本鎖にしたβグルカンとは、どちらも一本鎖βグルカンであることには変わりがないが、現時点では特定できない構造上の何らかの違いがあるものと考えられる。
【００６４】
上記結果は、水熱処理により得られた一本鎖βグルカンは、長期にわたって安定であることを示している。特に、水溶液として安定に供給できることは、ドリンク剤形状のサプリメント、飲料に添加してもその品質の安定性が保証される。したがって、サプリメント等として用いた場合に、一本鎖の状態を長期間維持し、高い免疫賦活活性等を有することを示している。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月24日(2017.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖（１，３）（１，６）‐βグルカンを製造する方法であって、
（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
加熱処理前にｐＨ２．０より高く、６．０より低く調整し、
１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で
処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で、
所定時間加熱処理することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記温度範囲が１４５℃以上、１９０℃以下であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記温度範囲が１４５℃以上、１８０℃以下であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液が、
黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属の高粘性培養液であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記製造方法が、連続生産であることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
加熱処理前にｐＨ２．３以上５．５以下に調整することを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
（１，３）（１，６）‐βグルカン総量のうち一本鎖βグルカンの割合が７０％以上含まれることを特徴とする長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物が含有された液状組成物であって、前記液状組成物がサプリメント飲料、液状化粧品、又は液状医薬部外品のいずれかであることを特徴とする液状組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月1日(2017.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖（１，３）（１，６）‐βグルカンを製造する方法であって、
（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液を、
加熱処理前にｐＨ２．０より高く、５．５より低く調整し、
連続生産によって、
１４５℃以上、２００℃以下の温度範囲で、
処理温度における飽和蒸気圧以上の圧力で、
所定時間加熱処理することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記温度範囲が１４５℃以上、１９０℃以下であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記温度範囲が１４５℃以上、１８０℃以下であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記（１，３）（１，６）‐βグルカンを含有する溶液が、
黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属の高粘性培養液であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
（１，３）（１，６）‐βグルカン総量のうち一本鎖βグルカンの割合が７０％以上含まれることを特徴とする長期保存安定性のある一本鎖βグルカン組成物が含有された液状組成物であって、前記液状組成物がサプリメント飲料、又は液状化粧品のいずれかであることを特徴とする液状組成物。
【国際調査報告】
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