(57)【要約】  ＩＬ−６受容体遺伝子（ＩＬ−６Ｒ遺伝子）の遺伝子多型を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。また、ＩＬ−６Ｒ遺伝子の遺伝子多型を検出することを含むがん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、１０〜２００塩基のヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子配列の部分配列またはその相補鎖配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物またはキット。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む１０〜２００塩基の塩基配列またはその相補鎖配列からなるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片と特異的にハイブリダイズするプローブ、および／または該遺伝子断片を増幅できるプライマーである、請求項１または請求項２に記載の組成物またはキット。
【請求項４】
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａを検出する、請求項１−３のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項５】
ヒト血液中のＩＬ−６、ＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための抗体を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット。
【請求項６】
ヒト血液中のＩＬ−６、ＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための抗体をさらに含む、請求項１−４のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかに記載の組成物またはキットを含み、さらに、がん免疫療法用組成物を含む、がん治療用キット。
【請求項８】
がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項１−７のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項９】
ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対する抗体価を測定するための試薬をさらに含む、請求項８に記載の組成物またはキット。
【請求項１０】
がんが大腸がんである、請求項１−９のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項１１】
被験者由来の試料から、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法。
【請求項１２】
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａを検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験者由来の試料が、がん免疫療法治療前の被験者由来の試料である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出されたヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／Ｃまたは
Ａ／Ｃであるとき、被験者が、がん免疫療法が有効な被験者であると予測する、請求項１１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
検出されたヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであるとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測する、請求項１１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
がん免疫療法治療前の被験者の血中のＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法。
【請求項１７】
がん免疫療法治療前の被験者の血中のＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定することをさらに含む、請求項１１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
がん免疫療法治療前の被験者の血中において、
（ｉ）ＩＬ−６蛋白質量が高い；
（ｉｉ）ＩＰ−１０蛋白質量が高い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が低いとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
がん免疫療法治療前の被験者の血中において、
（ｉ）ＩＬ−６蛋白質量が低い；
（ｉｉ）ＩＰ−１０蛋白質量が低い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が高いとき、被験者が、がん免疫療法が有効である被験者であると予測する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項１１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
がんが、大腸がんである、請求項１１−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
がんペプチドワクチン投与前および投与後の被験者由来の血中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量を測定することをさらに含む、請求項１１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
がんペプチドワクチン投与後の被験者由来の血中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、投与前に比較し増加したとき、被験者が、がん免疫療法が有効な被験者であると予測する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がん免疫療法治療前の被験者の血中においてＩＬ−６蛋白質量が高い患者に投与される、ＩＬ−６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤。
【請求項２５】
ＩＬ−６阻害剤が、ヒト化抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のがん免疫療法増強剤。
【請求項２６】
がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項２４または請求項２５に記載の免疫療法増強剤。
【請求項２７】
請求項１−１０のいずれかに記載の組成物またはキット、および請求項２４−２６のいずれかに記載の免疫療法増強剤を含む、がん治療用キット。
【請求項２８】
がんが大腸がんである、請求項２４−２６のいずれかに記載の免疫療法増強剤または請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型とその使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は日本人の死亡原因の第1位を占め年間約33万人が死亡している。また、世界では年間約600万人ががんで死亡している。現在、がん治療法としては外科的切除、抗がん剤、放射線療法などが行われているが、これらの治療法ではＱＯＬが低下することが多い。また、これらの治療法に対して耐性、再発をきたした場合には他に有効な治療法がないため、がんワクチン療法を含むがん免疫療法が第4の治療法として待望されている。しかしながら、がん免疫療法では、あらかじめその治療効果を予測する方法がなく、治療効果が期待できる患者を選別する方法が無いというのが現状である。
これまで、ＩＬ−６受容体遺伝子（以下、ＩＬ−６Ｒ遺伝子とも称す）の遺伝子多型については、（１）ＩＬ−６の遺伝子多型は食道がん患者（外科的手術後）の予後と相関するが、ＩＬ−６受容体の遺伝子多型IL-6R 48892A>Cは予後と相関しない；（２）脳腫瘍患者においてもＩＬ−６の遺伝子多型は予後と相関するが、IL-6受容体遺伝子多型IL-6R 48892A>Cは予後と相関しない、と報告されている(非特許文献１および２)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Motoyama S, Nakatsu T, Miura M, Hinai Y, Minamiya Y, Ogawa J. Interleukin-6 -634G>C genetic polymorphism is associated with prognosis following  surgery for  advanced thoracic esophageal squamous cell carcinoma. Dig Surg. 2012;29(3):194-201
【非特許文献２】Lagmay JP, London WB, Gross TG, Termuhlen A, Sullivan N, Axel A,Mundy B, Ranalli M, Canner J, McGrady P, Hall B. Prognostic significance of interleukin-6 single nucleotide polymorphism genotypes in neuroblastoma:  rs1800795 (promoter) and rs8192284 (receptor). Clin Cancer Res. 2009 Aug15;15(16):5234-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題の一つは、がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型を同定し、これを用いてがん免疫療法の治療効果予測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、第一の側面（aspect）において、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。【０００６】
本発明は、第二の側面において、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための試薬を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。【０００７】
本発明は、第三の側面において、被験者由来の試料から、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。【０００８】
本発明は、第四の側面において、被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。【０００９】
本発明は、第五の側面において、ＩＬ−６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キットを提供する。【００１０】
本発明は、第六の側面において、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカーを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法により、被験者にとってがん免疫療法が有効であるか否かが予測される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】結腸直腸がん（colorectal cancer）組織に発現するがんワクチン抗原の免疫組織学的解析結果を示す。ワクチンを投与していない結腸直腸がん患者のがん組織におけるワクチン抗原の発現を免疫組織化学により検討した。代表的なデータを示す。全ての写真はｘ２００である。
【図２】Kaplan-Meier survival analysisの結果を示す。（Ａ）６０名の患者のペプチドワクチン投与後の生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した（実線）。（Ｂ）ペプチドワクチン療法の開始前に、２つ以上の化学療法の治療歴があり、そして、イリノテカン、オキサリプラチンおよびフルオロピリミジンの全てに忍容性がなかった患者の生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した（実線）。破線は９５％信頼区間を示す。
【図３】ペプチドワクチンを投与した結腸直腸がん患者におけるIL-6R 48892A>C遺伝子多型と予後との関係を示す。（Ａ）IL-6R 48892A>C遺伝子多型（IL-6R 48892A/CまたはC/C（n=40）vs IL-6R 48892A/A（n=20））に基づいて、ペプチドワクチンで治療した患者を２つのサブグループに分けた。生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した。生存カーブ間の違いは、log-rank testを用いて統計的に解析した。（Ｂ）IL-6R 48892A>C遺伝子多型（IL-6R 48892A/CまたはC/C vs IL-6R 48892A/A）およびワクチン投与前血漿のＩＬ−６レベルに基づいて、ペプチドワクチンで治療した患者を４つのサブグループに分けた。生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した。生存カーブ間の違いは、log-rank testを用いて統計的に解析した。ＩＬ−６陰性の患者において、IL-6R 48892A/CまたはC/CおよびIL-6R 48892A/Aの遺伝子多型間で有意差があった（IL-6(-),IL-6R 48892A/CまたはC/C (n=18) vs IL-6(-),IL-6R 48892A/A (n=11)；p=0.0252）が、ＩＬ−６陽性患者においては有意差がなかった（IL-6(+),IL-6R 48892A/CまたはC/C (n=21) vs IL-6(+),IL-6R 48892A/A (n=9)；p=0.1184）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
用語の説明
本明細書において、「ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型」は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のＳＮＰデータバンクで用いられているReference SNP IDが、rs8192284と表示されている遺伝子多型である。この遺伝子多型は、配列番号１または配列番号２で表されるＩＬ−６Ｒのアミノ酸配列において、３５８番目のアミノ酸残基がＡｓｐまたはＡｌａとなる相違に関係している。ヒトＩＬ−６受容体遺伝子（ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子）の４８８９２番目の遺伝子型（Reference SNP ID：rs8192284）には、Ｃ／Ｃ、Ａ／ＣおよびＡ／Ａが挙げられる。
本明細書において、「がん免疫療法」とは、非特異的免疫療法（例えば、免疫賦活剤投与による治療、免疫チェックポイント阻害剤による治療）、能動特異的免疫療法（例えば、ペプチドワクチン療法、自家がん細胞ワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法）および受動特異的免疫療法（例えば、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞療法、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）療法、遺伝子改変Ｔ細胞療法）を含む。例えばがん免疫療法は、ペプチドワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法、または免疫チェックポイント阻害剤による治療であり、好ましくはペプチドワクチン療法である。
本明細書において、「がん」は、がん免疫療法の対象となり得るものであり、例えば、がんの例としては、限定はされないが、前立腺がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮体がん、胃がん、メラノーマ、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器種、食道がん、肝臓がん、大腸がん（結腸直腸がん）、胆道がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、骨軟部腫瘍、精巣がん、頭頸部がんおよび卵巣がんが挙げられる。また、がんは進行した（advanced）がんであり得る。
【００１４】
がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット
本発明は、第一の側面において、ヒトＩＬ−６受容体遺伝子（ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子）の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
【００１５】
本発明で使用されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドは、プライマーであっても、プローブであってもよく、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、１０〜２００塩基、好ましくは１０〜５０塩基、より好ましくは１５塩基〜３０塩基のヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子配列の部分配列またはその相補鎖配列からなるポリヌクレオチドであり得る。例えば、上記プローブは、配列番号３または配列番号４で表されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子またはその断片と特異的にハイブリダイズするプローブであってもよい。また、例えば、上記プライマーは、配列番号３または配列番号４で表されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子またはその断片をＰＣＲにて増幅できるプライマーであってもよい。
特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーは、該プローブやプライマーがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと１００％相補的であるプローブやプライマーであってもよく、また、該プローブやプライマーがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブやプライマーであってもよい。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., etc., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA 2nd edition, 1989等に記載される方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する工程を含むハイブリダイゼーションが挙げられる。洗浄ステップにおける塩濃度や温度を適宜調整することにより、高ストリンジェンシーな条件（塩濃度が低く, 高温）や低ストリンジェンシーな条件（塩濃度が高く、低温）とすることができる。高ストリンジェンシーでの洗浄条件では、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃で洗浄（例えば１５分間×２回）が実施され、低ストリンジェンシーでの洗浄条件では、例えば、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中にて室温で洗浄（例えば５分間×２回）が実施される。
プローブおよび／またはプライマーは、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子と同一性が無い、または低い（例えば、０〜１０％）配列からなる付加的配列を含んでもよく、放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、SYBR（登録商標）Green）、発光物質（例えば、ルミノール、ルシフェリン、イクオリン）、アビジン、ビオチン等の標識物質で標識されていてもよい。標識は、１物質による標識であっても、複数物質による標識であってもよく、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャーが結合されていてもよい。
【００１６】
遺伝子多型の検出方法によって、それに適したヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドであるプライマーやプローブが使用される。遺伝子多型の検出方法としては、限定はされないが、リアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）、Invaderプローブ法、DNAチップを用いたＳＮＰタイピング法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法などが挙げられる。
【００１７】
一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ検出法を採用することができる。この場合、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片を増幅することができるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーとリバースプライマーが使用され得、そして、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含む、該フォワードプライマーと該リバースプライマーで増幅されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片に結合するオリゴヌクレオチドであってレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したプローブが使用され得る。プライマーおよびプローブは、例えば１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３５塩基のオリゴヌクレオチドである。レポーター蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素が使用でき、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が使用できる。リアルタイムＰＣＲ法としては、TaqMan（登録商標）プローブを用いた方法を使用でき、アプライドバイオシステムズ社から必要な試薬を入手することができる。
【００１８】
一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてInvaderプローブ法を採用することができる。この場合、３種類のプローブ：アリルプローブ、インベーダープローブおよび検出プローブを使用して、遺伝子多型を検出することができる。アリルプローブは、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型と違う塩基を含み、それより５’側はヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子と異なる配列からなる検出プローブに相補的な配列からなるフラップ配列からなり、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の多型と違う塩基より３’側は、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。アリルプローブの塩基長は、例えば、１５〜数百塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基である。インベーダープローブは、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型を含み、それより上流のヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。インベーダープローブの塩基長は、例えば、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基である。検出プローブは、フラップ配列と相補的な塩基配列を一部に含むプローブであって、Cleavaseと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりアリルプローブが切断されることにより生じるフラップ配列からなるオリゴヌクレオチドが結合するプローブである。該検出プローブは、例えば、１５〜数百塩基、１５〜１００塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用することができる。この場合、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして採用することができる。該プローブの塩基長は、例えば、１０〜１００塩基、１５〜５０塩基、１５〜３５塩基であり得る。Affymetrix,Inc.やIllumina,Inc.から入手できるDNAチップを用い、推奨されている方法で、遺伝子多型を検出することができる。
【００２０】
一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法として、PCR-RFLP法やPCR-SSCP法を用いることができる。この場合、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片を増幅することができる、例えば１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３５塩基のオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーとリバースプライマーが使用され得る。
【００２１】
本発明に使用されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチド（例えば、プローブ、プライマー）は、各々別個に、または混合して、凍結乾燥状態で、適切な緩衝液（例えば、TE buffer）中に適当な濃度（例えば、１〜５０μＭ）で溶解し、−２０℃で凍結した状態で、組成物として提供することができる。
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドの他に、当業者は、採用する遺伝子多型の検出方法に適した試薬、器材等の物質を含めて、がん免疫療法の治療効果の予測用キットとして提供できる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ検出法を採用する場合には、10XPCR反応液、10XMgCl2水溶液、Taq DNAポリメラーゼ等をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてInvaderプローブ法を採用する場合には、Cleavase（エンドヌクレアーゼ）をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用する場合には、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含むDNAチップ、ハイブリダイゼーション用洗浄液（例えば、0.1% Tween 20を含む1XTBS）をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法として、PCR-RFLP法やPCR-SSCP法を用いる場合には、制限酵素や電気泳動用ゲルをキットに含めることができる。
【００２２】
本発明は、第二の側面において、被験者の血液試料中のヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための試薬を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
血液試料は、血清または血漿であり得る。
被験者の血液中のＩＬ−６、ＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）を検出するための試薬は、例えば、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＰ−１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
一つの実施態様として、がん免疫療法の治療開始前の被験者の血液中のＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量が、本発明が提供するキットにより測定される。
本発明が提供するキットは、例えば、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＰ−１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体を含む他、血液から血清を調製するために使用するEDTA、クエン酸またはヘパリンを含んだ溶液を含んでもよい。抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＰ−１０抗体および抗ヒトＢＡＦＦ抗体は、凍結乾燥状態で、または、１〜１０mg/mlの濃度でＰＢＳ等の緩衝液に溶解した状態で提供され得る。本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットには、ＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定するための試薬、器材等を含んだＥＬＩＳＡキットであってもよい。このようなＥＬＩＳＡキットには、上記抗体の他、プレート（例えば、９６穴プレート）、ブロッキング溶液（例えば、BSA溶液、乳蛋白質溶液）および洗浄液（界面活性剤を含むリン酸緩衝液（例えば、Tween20を含むPBS））が含まれ得る。
【００２３】
本発明が第一の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを、本発明が第二の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットと組み合わせて使用することにより、がん免疫療法の治療効果をより正確に予測でき得る。よって、一つの実施態様において、本発明は、第一の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットに加え、さらに第二の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用キットを提供する。
【００２４】
がん免疫療法がペプチドワクチン療法である場合、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットは、さらに、被験者の血液中のペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対する抗体のレベルを測定するための試薬（例えば、ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチド）を含んでもよい。一つの実施態様として、ペプチドワクチン投与後の被験者の血液中における、ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対するIgG抗体のレベルを測定してもよい。例えば、抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定できる（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。Luminex（商標）法を採用する場合、例えば、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットは、さらに、カラーコードビーズ（Luminex Corp., Austin, TX, USA)およびビオチン化ヤギ抗ヒトIgGを含んでもよい。
【００２５】
本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットは、がん免疫療法剤とあわせて提供すれば、予測に基づいたがん治療ができる。よって、一つの実施態様として、本発明は、がん免疫療法剤および本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを含む、がん治療用キットを提供する。
がん免疫療法剤に含まれる活性成分の例としては、限定はされないが、サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン２）、免疫賦活剤（例えば、BCG、OK-432、レンチナン）、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）、ＮＫ細胞）、樹状細胞、ペプチドワクチンが挙げられる。
ペプチドワクチンに使用できるペプチドの例としては、CypB-129：KLKHYGPGWV（配列番号５）、EGFR-800：DYVREHKDNI（配列番号６）、EZH2-735：KYVGIEREM（配列番号７）、HNRPL-140：ALVEFEDVL（配列番号８）、HNRPL-501：NVLHFFNAPL（配列番号９）、Lck-90：ILEQSGEWWK（配列番号１０）、Lck-208：HYTNASDGL（配列番号１１）、Lck-246：KLVERLGAA（配列番号１２）、Lck-422：DVWSFGILL（配列番号１３）、Lck-449：VIQNLERGYR（配列番号１４）、Lck-486：TFDYLRSVL（配列番号１５）、Lck-488：DYLRSVLEDF（配列番号１６）、MAP-432：DLLSHAFFA（配列番号１７）、MRP3-503：LYAWEPSFL（配列番号１８）、MRP3-1293：NYSVRYRPGL（配列番号１９）、PAP-213：LYCESVHNF（配列番号２０）、PAP-248：GIHKQKEKSR（配列番号２１）、PSA-248：HYRKWIKDTI（配列番号２２）、PSMA-624：TYSVSFDSL（配列番号２３）、PTHrP-102：RYLTQETNKV（配列番号２４）、SART2-93：DYSARWNEI（配列番号２５）、SART2-161：AYDFLYNYL（配列番号２６）、SART3-109：VYDYNCHVDL（配列番号２７）、SART3-302：LLQAEAPRL（配列番号２８）、SART3-309：RLAEYQAYI（配列番号２９）、SART3-511：WLEYYNLER（配列番号３０）、SART3-734：QIRPIFSNR（配列番号３１）、UBE-43：RLQEWCSVI（配列番号３２）、UBE-85：LIADFLSGL（配列番号３３）、WHSC2-103：ASLDSDPWV（配列番号３４）、WHSC2-141：ILGELREKV（配列番号３５）およびこれらの誘導体が挙げられる。
ペプチドの誘導体の例としては、ペプチドのアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ患者にマッチしたHLA分子（例えば、HLA-A24分子）に結合でき、ペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するペプチドが挙げられる。ペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するか否かは、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（PBMC）が対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（IFN）-γのようなサイトカインを産生するか否かをELISA法等で測定して調べることができる。また、誘導されたCTLの細胞傷害活性は、51Cr放出試験等により確認することができる。CTLによる認識性を考慮すると、ペプチドの誘導体のアミノ酸残基数は８〜１４個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは８〜１１個、特に好ましくは９または１０個である。
ペプチドワクチンは、１種類のペプチドまたは誘導体を含むものであってもよく、２種類以上（例えば、２種、３種または４種）のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて含んでも良い。がん患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類のペプチドおよび／また誘導体を組み合わせて使用してもよい。また、ペプチドワクチンに使用するペプチドは、投与対象となる患者の血中に結合する抗体が見いだされるペプチドを選択してもよい。
【００２６】
がん免疫療法剤は、活性成分と、医薬として許容できる担体と共に製剤化され得る。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
がん免疫療法剤に含まれる活性成分の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができる。例えば、がん患者に投与される医薬組成物中のペプチドまたは誘導体の量は、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１〜５ｍｇまたは０．５〜３ｍｇである。投与方法も適宜選択することができ、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与により投与することができる。ペプチドワクチンであれば、好ましくは、皮内投与または皮下投与で投与される。
【００２８】
活性成分が蛋白質またはペプチドの場合、それらをコードする遺伝子を含むベクターを調製し、それを患者に投与することにより、がん免疫療法を行うこともできる。よって、このようなベクターは、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含まれ得る。また、患者体外において例えば患者由来の樹状細胞にベクターを導入し、所望のペプチドを発現させた細胞を患者に戻しても良い。これら方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。
ベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P.  Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。
【００２９】
ベクターを患者に投与する場合、投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、例えばがん患者に投与されるDNA量として、0.1μg〜100mg、好ましくは1μg〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
【００３０】
ペプチドワクチンに使用できるペプチドをin vitroでCTLを誘導するために用いてもよい。例えば、患者から採取されたPBMCを、in vitroでペプチドまたはその誘導体の存在下培養することによりCTLを誘導することができる。当該CTLを、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含ませてもよい。また、ペプチドワクチンに使用できるペプチドをin vitroで樹状細胞と培養し、得られたペプチドを提示した樹状細胞を本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含ませてもよい。
【００３１】
がん免疫療法の治療効果の予測方法
本発明は、第三の側面において、被験者由来の試料から、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
被験者は、がん患者であり得、例えば、がん免疫療法を受ける前のがん患者または既にがん免疫療法を受けているがん患者であり得る。また、被験者は、化学療法（例えば、イリノテカン、オキサリプラチンおよび／またはフルオロピリミジンによる化学療法）を受けており、当該化学療法が有効でなかったがん患者であってもよく、ペプチドワクチン療法に用いる予定のペプチドに対する抗体を血中に有するがん患者であってもよい。がん免疫療法は、能動免疫療法であっても受動免疫療法であってもよく、限定はされないが、ペプチドワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法および免疫チェックポイント阻害剤による治療が例示され、好ましくは、ペプチドワクチン療法である。がんの例としては、限定はされないが、前立腺がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮体がん、胃がん、メラノーマ、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器種、食道がん、肝臓がん、大腸がん（結腸直腸がん）、胆道がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、骨軟部腫瘍、精巣がん、頭頸部がん、卵巣がんが挙げられ、例えば、初期または進行した大腸がんが挙げられる。
被験者由来の試料は、がん患者由来の遺伝子サンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ）であり得る。がん患者の組織由来の遺伝子サンプルの例には、限定はされないが、血液から得られた遺伝子サンプル、口腔粘膜から得られた遺伝子サンプルが挙げられる。被験者由来の試料は、例えば、被験者の末梢血単核球（Peripheral blood mononuclear cells）から抽出されたＤＮＡであってもよい。
【００３２】
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出は、リアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）、Invaderプローブ法、DNAチップを用いたＳＮＰタイピング法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法等の当業者に周知の方法により達成することができる。
【００３３】
一つの実施態様では、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてリアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）を採用することができる。リアルタイムＰＣＲ検出は、例えば以下の工程を含む：
（ｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを用意する（ここで、フォワードプライマーとリバースプライマーは、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片を増幅することができる、例えば１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３５塩基のオリゴヌクレオチドである；プローブは、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含む、該フォワードプライマーと該リバースプライマーで増幅されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片に結合する例えば１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３５塩基のオリゴヌクレオチドであってレポーター蛍光色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素）とクエンチャー蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素）が結合する）、
（ｉｉ）（ｉ）で用意したプライマーとプローブを用い、被験者由来のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行う。
上記（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を行うことにより、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
TaqMan（登録商標）プローブ法を採用する場合は、アプライドバイオシステムズ社が提供するキットを用いることができる。適切なフォワードプライマー、適切なリバースプライマーおよび適切なTaqManプローブを用いたＰＣＲを行うことにより、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
【００３４】
一つの実施態様では、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてInvaderプローブ法を採用することができる。Invaderプローブ法は、例えば、J Hum Genet 2001;46:471-477、Nature Biotechnology 17, 292 - 296 (1999)およびWO9823774号公報に記載の方法に準じて実施することができる。例えば、以下の工程を含む：
（ｉ）アリルプローブ、インベーダープローブおよび検出プローブを用意する（ここで、アリルプローブは、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型と違う塩基を含み、それより５’側はヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子と異なる配列からなる検出プローブに相補的な配列からなるフラップ配列からなり、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の多型と違う塩基より３’側は、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり（塩基長は、例えば、１５〜数百塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基であり得る）、インベーダープローブは、検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型を含み、それより上流のヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子配列からなるオリゴヌクレオチドであり（塩基長は、例えば、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基であり得る）、検出プローブは、一本鎖部分と二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであって、一本鎖部分はフラップ配列と相補的な配列（例えば、１５〜５０塩基、１５〜３５塩基、２０〜３０残基）からなり、二本鎖部分はフラップ配列と相補的な数残基（例えば、１〜１０残基、３〜５残基）の配列を５’側に含み、二本鎖部分に蛍光基とそれを消光するクエンチャーが結合しているオリゴヌクレオチドである（塩基長は、例えば、１５〜数百塩基、１５〜１００塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基））；
（ｉｉ）被験者由来のＤＮＡをアリルプローブとインベーダープローブを混合し、二本鎖形成反応を行う；
（ｉｉｉ）アリルプローブの二本鎖を形成していないフラップ配列部分をエンドヌクレアーゼ：Cleavaseで切断する；
（ｉｖ）切断されたフラップ配列からなるオリゴヌクレオチドを検出プローブと結合させる；
（ｖ）結合により、検出プローブ内の二本鎖の一部であって蛍光基を有する部分が一本鎖となり、生じた一本鎖部分がCleavaseで切断され、蛍光基がクエンチャーから乖離する；および
（ｖｉ）乖離の結果生じた蛍光を検出する。
【００３５】
一つの実施態様では、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用することができる。例えば、口腔粘膜、血液等の被験者由来の試料よりｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡより蛍光基を結合させたｃＤＮＡを調製し、調製したｃＤＮＡをＤＮＡチップに添加し、ＤＮＡチップ上の検出したいヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含むプローブとハイブリダイズさせ、洗浄後蛍光を測定することにより、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
【００３６】
一つの実施態様では、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてPCR-RFLP法またはPCR-SSCP法を採用することができる。例えば、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子断片を増幅することができるフォワードプライマーとリバースプライマー（両プライマーは、例えば、１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３５塩基のオリゴヌクレオチドである）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を、PCR-RFLP法では適切な制限酵素で分解し、PCR-SSCP法では、ホルムアミドの存在下で熱変性（加熱・急冷）させて、電気泳動（アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動）することにより、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
【００３７】
本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法において検出されるヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型は、Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａであり得る。
検出されたヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ｃ／ＣまたはＡ／Ｃであるとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。この場合、医師は被験者にがん免疫療法による治療を選択することができる。ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃであることはまた、被験者においてがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。検出されたヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ａ／Ａであるとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。この場合、医師は、がん免疫療法以外の治療法を選択できる。検出されたヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであることはまた、被験者においてがん免疫療法が有効でないことのひとつの指標として用いることができる。
【００３８】
本発明は、第四の側面において、被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
被験者は、がん患者であり得、例えば、がん免疫療法を受ける前のがん患者または既にがん免疫療法を受けているがん患者であり得る。また、被験者は、化学療法（例えば、イリノテカン、オキサリプラチンおよび／またはフルオロピリミジンによる化学療法）を受けており、当該化学療法が有効でなかったがん患者であってもよく、ペプチドワクチン療法に用いる予定のペプチドに対する抗体を血中に有するがん患者であってもよい。がん免疫療法は、能動免疫療法であっても受動免疫療法であってもよく、限定はされないが、好ましくは、ペプチドワクチン療法である。がんの例としては、限定はされないが、大腸がん（例えば、結腸直腸がん）、例えば、初期または進行した大腸がんが挙げられる。
血液試料は、例えば血清または血漿である。
ヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０および／またはヒトＢＡＦＦの蛋白質量は、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＰ−１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体を用いて測定できる。
被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＰ−１０およびヒトＢＡＦＦからなる群から少なくとも１つの蛋白質量を測定した結果、がん免疫療法治療前の被験者の血液試料において、
（ｉ）ＩＬ−６蛋白質量が高い；
（ｉｉ）ＩＰ−１０蛋白質量が高い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が低いとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測される。かかる結果はまた、被験者においてがん免疫療法が有効でないことのひとつの指標として用いることができる。
また、がん免疫療法治療前の被験者の血液試料において、
（ｉ）ＩＬ−６蛋白質量が低い；
（ｉｉ）ＩＰ−１０蛋白質量が低い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が高いとき、被験者が、がん免疫療法が有効である被験者であると予測される。かかる結果はまた、被験者においてがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。
一つの実施態様として、蛋白質量が高いまたは低いか否かは、基準値と比較して判定され得、基準値の例としては、健常人の血液試料中の蛋白質量またはがん患者の血液試料中の蛋白質量の中央値が挙げられる。例えば、ＩＬ−６については、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1.0 pg/ml以上存在すれば、ＩＬ−６蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1.0 pg/ml未満存在すれば、ＩＬ−６蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。ＩＰ−１０については、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中170 pg/ml以上存在すれば、ＩＰ−１０蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中170 pg/ml未満存在すれば、ＩＰ−１０蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。ＢＡＦＦについては、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1200 pg/ml以上存在すれば、ＢＡＦＦ蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1200 pg/ml未満存在すれば、ＢＡＦＦ蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。
【００３９】
本発明が第三の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法を、本発明が第四の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法と組み合わせて使用することにより、がん免疫療法の治療効果をより正確に予測でき得る。よって、一つの実施態様において、本発明は、第三の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法に加え、さらに第四の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。この実施態様において、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ−６量が高い；ＩＰ−１０蛋白質量が高い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が低く、そして、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａのとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ−６量が低い；ＩＰ−１０蛋白質量が低い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が高く、そして、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃのとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。
【００４０】
がん免疫療法が、ペプチドワクチン療法の場合、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法は、さらに、ペプチドワクチン投与前および／または投与後の被験者由来の血液試料中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量を測定することを含んでもよい。例えば、抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定できる（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。一つの実施態様において、ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。かかる結果はまた、被験者において当該ペプチドワクチンによるがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。例えば、ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。一つの実施態様において、ペプチドワクチン投与直前の血清または血漿のペプチド特異的ＩｇＧの量と、１週間１回投与で６回投与後の血清または血漿のペプチド特異的ＩｇＧの量を比較し、２倍以上増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。
【００４１】
よって、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法により、例えば、（ｉ）ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃであり、（ｉｉ）がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ−６量が低い；ＩＰ−１０蛋白質量が低い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が高い、そして、（ｉｉｉ）ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加したとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。一方、（ｉ）ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであり、（ｉｉ）がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ−６量が高い；ＩＰ−１０蛋白質量が高い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が低く、そして、（ｉｉｉ）ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加しなかったとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。
【００４２】
本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法は、in vitroで実施することができる。
【００４３】
一つの実施態様では、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法に基づき、がん免疫療法（例えば、ペプチドワクチン療法）が有効であると予想されるがん患者を選択することができる。
また、一つの実施態様では、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法の結果に基づき、医師は、がん免疫療法を選択するか否かを決定でき、患者を治療することができる。
【００４４】
がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キット 
本発明は、第五の側面において、ＩＬ−６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キットを提供する。
ＩＬ−６阻害剤は、ＩＬ−６の作用を阻害するものであればよい。ＩＬ−６阻害剤の例としては、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体（例えば、tocilizumab）が挙げられる。
ＩＬ−６阻害剤をがん患者に投与することにより、好ましくは、がん免疫療法の効果が増強される。がん患者は、血漿のＩＬ−６蛋白質量が多い（例えば、1.0pg/ml以上）患者であってもよい。がん免疫療法の治療前に血漿のＩＬ−６蛋白質量を測定し、血漿のＩＬ−６蛋白質量が多い（例えば、1.0pg/ml以上）患者であることが判定されれば、がん免疫療法剤とあわせてＩＬ−６阻害剤を投与してもよい。
一つの実施態様において、がん免疫療法はペプチドワクチン療法である。がんは、例えば、大腸がん（結腸直腸がん）である。
また、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットに、癌ペプチドワクチンおよびＩＬ−６阻害剤を含めて、がん免疫療法治療用キットとして提供することができる。
【００４５】
がん免疫療法増強剤は、ＩＬ−６阻害剤と、医薬として許容できる担体と共に製剤化され得る。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＩＬ−６阻害剤のがん患者への投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１〜５ｍｇまたは０．５〜３ｍｇである。投与方法は適宜選択することができ、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与により投与することができる。
【００４６】
がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカー
本発明は、第六の側面において、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカーを提供する。
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型は、がん免疫療法の治療効果の予測マーカーとして有用である。
ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ｃ／ＣまたはＡ／Ｃであるとき、当該遺伝子型を有する被験者は、がん免疫療法が有効な被験者である可能性が高い。ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ａ／Ａであるとき、当該遺伝子型を有する被験者は、がん免疫療法が有効でない被験者である可能性が高い。
本発明が提供する遺伝子マーカーは、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型のみからなっていてもよく、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含む配列またはその相補的な配列からなっていてもよく、例えば、ヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含む、５、８、１０、１５または２０塩基の配列からなる遺伝子マーカーであってもよい。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
進行した結腸直腸がん（advanced colorectal cancer）患者においてペプチドワクチン治療の臨床的実用性を明らかにし、治療前に治療効果を予測するために有用なバイオマーカーを特定するために、以下のphase II試験を実施した。【００４９】
材料および方法
患者
標準的な化学療法および／または分子標的療法の少なくとも１つのレジメンが成功しなかった前治療歴のある進行した結腸直腸がん（以下ａＣＲＣと称す）患者のうち、３１種の候補ワクチンペプチド(表１)の中で少なくとも２つに対して液性応答反応を有する（ペプチド特異的なIgG力価の測定により判定）ならば、本試験における対象として適格である。その他の試験対象者選定基準は、次のとおりであった：２０歳以上；Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)の一般状態が０または１；ＨＬＡ-Ａ２、−Ａ３、−Ａ１１、−Ａ２４、−Ａ２６、−Ａ３１、または−Ａ３３が陽性；少なくとも１２週間の平均余命；十分な血液学的機能、腎臓機能、および肝機能(白血球細胞＞２,５００/μｌ、リンパ球＞１,０００/μｌ、血小板＞８０,０００/μｌ、血清クレアチニン＜１.５ ｍｇ/ｄｌ、および全ビリルビン＜２.５ ｍｇ/ｄｌ)。排除基準としては、肺疾患、心臓疾患、またはその他の全身性疾患；急性感染；重度のアレルギー反応の既往；妊娠中または授乳中；または臨床医により登録が不適切と判断されるような病状、などが含まれる。プロトコールは、久留米大学の倫理委員会にて承認されており、ＵＭＩＮに臨床試験登録(UMIN000006493)された。全てのプロトコールの説明後に、全ての患者から書面によるインフォームド・コンセントを登録前に得た。【００５０】
【表１】
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【００５１】
臨床プロトコール
これはオープンラベル第ＩＩ相臨床試験であり、エンドポイントは、個人至適化ペプチドワクチン（以下、ＰＰＶと称す）の臨床的実用性および安全性を分析すること、ならびにａＣＲＣ患者におけるＰＰＶ後の生存期間（以下ＯＳと称す）予測に有用なバイオマーカーを同定することである。以前に実施された臨床試験において安全性および免疫学的効果が確認されている３１種のワクチンペプチドを、ポリペプチド・ラボラトリー(Polypeptide Laboratories)(San Diego, CA)およびアメリカン・ペプチド社(American Peptide Company)(Vista, CA)(表１)により、グッド・マニュファクチュアリング・プラクティス(Good Manufacturing Practice)(ＧＭＰ)の条件下で調製した。既に報告されたとおり、個々の患者において各ペプチドに特異的なＩｇＧの力価を測定し、ワクチン接種前に既存の宿主免疫を評価することにより、３１種のペプチドから２―４種のペプチドを選択した。ＰＳＡおよびＰＳＭＡを含む前立腺関連抗原の発現はaＣＲＣ組織切片において検出できなかったため(表１)、それらから得られた該ペプチドは、他のペプチドに対して既存のＩｇＧ応答がなかった場合にのみ選択した。【００５２】
該選択されたペプチド(３ ｍｇ/各ペプチド)を、６週間連続して１週間に１回、不完全フロイントアジュバンド(Montanide ISA51；Seppic, Paris, France)と共に皮下投与した。第一サイクルとして６回のワクチン接種が終了した後には、ペプチド特異的なＩｇＧの力価に従って４つまでの抗原ペプチドを再度選択し、２〜４週毎に投与した。可能であれば、化学療法および／または分子標的療法をワクチン接種期間中に併用した。有害事象を、米国国立がん研究所の有害事象(ＮＣＩ-ＣＴＣＡＥ)共通用語規準第４.０版に従って追跡した。全血球計算値および血清生化学試験を、６回のワクチン接種の前後に行った。【００５３】
液性免疫応答の測定
ワクチンペプチドに特異的な液性免疫応答を検討するために、既に報告されたように、Luminex 200 system(Luminex, Austin, TX)を用いたビーズベースの多重アッセイを用いて、ペプチド特異的ＩｇＧ力価を測定した。ワクチン接種後の血漿中のペプチド特異的ＩｇＧ力価が、ワクチン接種前の血漿中のものより２倍以上高かった場合には、その変化は有意であると見なした。有意な増加が、少なくとも１つのワクチンペプチドにおいて観察された場合には、抗原特異的液性免疫応答は増大したと見なした。【００５４】
免疫組織化学(ＩＨＣ)
１５種のワクチン抗原の発現を、ワクチン接種していないａＣＲＣ患者由来の２０の腫瘍組織(１５の原発性腫瘍および５つの転移性肝臓腫瘍)を用いてＩＨＣにより検討した。パラフィン埋包組織サンプルから４ μｍ切片を作成して、被覆したスライドガラス上で解析した。ワクチン抗原に特異的な抗体を用いる免疫染色を、全自動 Bond-Max system (Leica Microsystems, Newcastle, UK)で実施した。免疫染色における色原体としてＤＡＢを使用した。ワクチン抗原を検出するために使用した抗体は、既に記載されている。前立腺関連ワクチン抗原、即ちＰＳＡおよびＰＳＭＡは、ＩＨＣにより検出できなかったため示さなかった。【００５５】
検査マーカーの測定
ワクチン接種前の血漿中のＣ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ(ＳＡＡ)、およびＩＬ−６のレベルを、R&D systems (Minneapolis, MN), Invitrogen (Carlsbad, CA)およびeBioscience (San Diego, CA)由来のキットを用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。Luminex 200 system (Luminex, Austin, TX) によるビーズベースの多重アッセイを用いて、サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＰ−１０(interferon gamma-induced protein 10)、ＢＡＦＦ(B-cell activating factor)、およびＴＧＦ-βを測定した。一人の患者からのワクチン接種前の血漿が、この分析には利用できなかった(ｎ＝５９)。凍結した血漿サンプルを溶解し、希釈して、製造者の指示書に従って２連でアッセイを行った。２連のサンプルの平均を統計学的分析に使用した。【００５６】
ＩＬ−６、およびＩＬ−６受容体(ＩＬ-６Ｒ)遺伝子多型
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ワクチン接種前に末梢血からFicoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)密度遠心法により分離した。ＤＮＡを、QIAamp Blood kit(Qiagen, Hilden, Germany)を用いてＰＢＭＣから抽出して、分析まで−８０℃で貯蔵した。抽出したＤＮＡを用いて、ＩＬ−６ −６３４Ｇ＞Ｃ(rs1800796)、ＩＬ−６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃ(rs8192284, Asp358Ala)遺伝子多型を調べた。遺伝子型判定は、Motoyama S, et al., Dig Surg. 2012;29: 194-201およびMotoyama S, et al., Ann Surg Oncol. 2013;20: 1978-1984に報告されたとおり、ポリメラーゼ連鎖反応-制限酵素断片長多型方法を用いて行った。使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素は以下のとおりである。
ＩＬ−６Ｒの遺伝子多型の検出に使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素
CCT TTG AGG CTT TTG ACA G（配列番号３６）
ACC CAT CTC ACC TCA GAA CAA（配列番号３７）
制限酵素  Hind III
ＩＬ−６の遺伝子多型の検出に使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素
GAG ACG CCT TGA AGT AAC TG（配列番号３８）
AAC CAA AGA TGT TCT GAA CTG A（配列番号３９）
制限酵素  Bsr BI【００５７】
統計学的分析
ＯＳ期間を、ペプチドワクチン接種または第一選択の化学療法の初日から死亡日までの期間と規定した。生存している患者では、連絡をとった最終日に打ち切りとした。ＯＳについての予後因子を、コックス比例ハザード回帰モデルを用いる単変量および多変量解析により評価した。このコックス回帰を適用する際に、各バイオマーカーの分布が非常に歪んでいたので、ｌｏｇ(バイオマーカー＋１)の変換を用いた。単変量解析における統計学的に有意なバイオマーカー(Ｐ＜０.１)を、多変量分析に含めた。スピアマンの順位相関係数を用いて、多変量分析に含める変数を選択した。全ての統計学的分析を、JMP version 10 またはSAS version 9.3 software package (SAS Institute Inc., Cary, NC)を用いて行った。【００５８】
結果
aＣＲＣ組織中のワクチン抗原発現の免疫組織化学分析
ＰＰＶに用いるワクチン抗原の発現を、１５人のワクチン接種を受けていないａＣＲＣ患者由来の２０の腫瘍組織(１５の原発性腫瘍および５つの転移性肝臓腫瘍)においてＩＨＣにより検討した。ＰＰＶに用いた１５種のワクチン抗原のなかで、２つの前立腺関連ワクチン抗原(ＰＳＡおよびＰＳＭＡ)以外の１３種のワクチン抗原が、aＣＲＣ組織において検出できた。代表的な染色パターンを、図１に示した。それらのうち、１１種は大部分の癌細胞に一様に発現したが、ｐ５６ｌｃｋおよびＰＡＰは局所的に発現していた。詳細な抗原発現の頻度を表１に示した。【００５９】
患者の特徴
２００９年１月から２０１２年１１月の期間、６０人のａＣＲＣ患者をこの試験に登録した。登録患者の臨床病理的特徴を表２に要約する。年齢の中央値は６０歳（３５〜８３歳）で、男性被験者３３人および女性被験者２７人であった。全ての患者(ステージＩＶ、ｎ＝２６；再発、ｎ＝３４)は、化学療法および／または分子標的療法の少なくとも１つのレジメンに対して抵抗性であった。原発性腫瘍の位置は、右側の結腸(ｎ＝１４)または左側の結腸/直腸(ｎ＝４６)であった。全ての患者は、転移性腫瘍[肝臓(ｎ＝３３)、肺(ｎ＝３１)、腹膜播種(ｎ＝２３)、またはリンパ節(ｎ＝１４)]を有した。登録前に、化学療法、分子標的療法および／またはそれらの組合せの１つ(ｎ＝１７)、２つ(ｎ＝１５)、３つ(ｎ＝９)、４つ(ｎ＝１３)または５つ(ｎ＝６)のレジメンに抵抗性であった。ＰＰＶ治療開始前の治療期間の中央値は５５２.５日であり、９〜１８１９日の範囲にわたった。第一サイクル中にワクチン接種に使用したペプチドの数は、３６人の患者にて４つのペプチド、１６人の患者にて３つのペプチド、８人の患者にて２つのペプチドであった。６０人の患者のうち、５１人(８５％)は、第一サイクルの６回のワクチン接種を完了したが、残り９人の患者は、急速な疾患進行により完了しなかった。ワクチン接種回数の中央値は１２であり、２〜３３の範囲であった。ＰＰＶの期間に、４９人の患者(８２％)は、化学療法および／または分子標的療法を、例えばＦＯＬＦＯＸ/ＸＥＬＯＸとベバシズマブ(ｎ＝１０)、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ベバシズマブ(ｎ＝５)、ＦＯＬＦＩＲＩ(ｎ＝５)、Ｓ−１(ｎ＝５)、イリノテンカン＋セツキシマブ(ｎ＝５)、セツキシマブ(ｎ＝５)、ＦＯＬＦＯＸ/ＸＥＬＯＸ(ｎ＝２)、ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ(ｎ＝２)、または他のレジメン(ｎ＝１０)を併用した。残り１１人の患者(１８％)は、併用化学療法について選択肢をもたないか、またはそれらを耐容できなかった。【００６０】
【表２】
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【００６１】
有害事象
毒性を表３に示した。最も頻度が高い有害事象は、注射部位での皮膚反応(ｎ＝５５, ９２％)、貧血(ｎ＝２７, ４５％)、リンパ球減少症(ｎ＝２３, ３８％)および低アルブミン血症(ｎ＝２０, ３３％)であった。グレード４の貧血が、２人の患者において見られた。グレード３の重篤な有害事象(ＳＡＥ)として、白血球減少症(ｎ＝３)、リンパ球減少症(ｎ＝２)、γグルタミルトランスペプチダーゼ増加(ｎ＝２)、低ナトリウム血症(ｎ＝２)、腸閉塞(ｎ＝２)、ＡＳＴ増加(ｎ＝１)、高血糖(ｎ＝１)、高コレステロール血症(ｎ＝１)、および発疹(ｎ＝１)を認めた。しかし、独立した安全性評価委員会では、これら全てのグレード３または４のＳＡＥはワクチン接種とは直接関係せず、他の病因、例えば併用した化学療法および／または分子標的療法および癌の進行と関係すると評価された。【００６２】
【表３】
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【００６３】
ワクチンペプチドに対する免疫応答
ワクチン接種前およびワクチン接種後の血漿におけるワクチンペプチドに特異的なＩｇＧ力価を測定し、液性応答反応を分析した。ワクチン接種後の血漿サンプルは、第一サイクル(６回のワクチン接種)および第二サイクル(１２回のワクチン接種)各々の終了時に５１人および３５人の患者から採取した。少なくとも１つのワクチンペプチドに特異的なＩｇＧ応答は、ワクチン接種の第一サイクル終了時には５１人の患者の内２４人(４７％)で、第二サイクル終了時には３５人の患者の内３３人(９４％)で増強された(表６−１〜６)。【００６４】
臨床結果
６０人の患者での最初のワクチン接種からのＯＳ期間中央値(ＭＳＴ)は４９８日(９５％ 信頼区間, ２３３-６５４日数)で、１生存率５３％および２年生存率２２％であった(図２Ａ)。第一選択の化学療法の初日から計算した場合、ＭＳＴは１１７９日(９５％信頼区間、８８５-１２７２日数)で、１年生存率は９７％、２年生存率は７７％、３年生存率は５３％、４年生存率は２４％、５年生存率はであった(データ示さず)。注目すべきは、登録した６０人の患者の中で、２つ以上の標準的な化学療法レジメンでの治療歴を有し、かつ登録前にイリノテカン、オキサリプラチン、およびフルオロピリミジンの全てに対し抵抗性または非寛容であった３２人の患者が、５１％(図２Ｂ)の１年生存率で、最初のワクチン接種から３７５日のＭＳＴ(９５％ 信頼区間, １９１−５６１日数)を示したことである。【００６５】
臨床的所見または検査値とＯＳとの相関
コックス比例ハザードモデルを使用して、ワクチン接種前の臨床的知見または検査値から、ＯＳと有意に相関のある因子を同定した。表４に示したとおり、ワクチン接種前の臨床的所見を用いた単変量解析では、PPV治療前の化学療法レジメン数が、予後因子(Ｐ＝０.０４８)である可能性があった。さらに、単変量解析ではワクチン接種前の血中のアルブミン、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、およびＢＡＦＦがＯＳと有意に相関した(Ｐ＝０.０２１、Ｐ＝０.００２、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００１、Ｐ＝０.００５、およびＰ＝０.００５、各々)。しかし、その他の因子は、ＯＳとの有意な相関はなかった。【００６６】
多変量コックス回帰分析をさらに行い、単変量解析においてＯＳと有意に相関することが示された各因子の影響を評価した(Ｐ＜０.１)。ＳＡＡおよびＣＲＰのレベルがＩＬ−６のレベルと高い相関を示したので、ＳＡＡおよびＣＲＰをこの分析には含めなかった(ＳＡＡ ｖｓ ＩＬ−６：スピアマンの順位相関係数＝０.４８１；ＣＲＰ ｖｓ ＩＬ−６：スピアマンの順位相関係数=０.６５１)。表４に示したとおり、ワクチン接種前の血漿中のより高いＩＬ−６およびＩＰ−１０レベルならびにより低いＢＡＦＦレベルが、予後不良の予測因子として有意であった[１ＳＤのユニットに対するハザード比(ＨＲ)＝１.５０３, ９５％信頼区間(ＣＩ)=１.００８-２.２４１, Ｐ＝０.０４５；ＨＲ＝１.５７４, ９５％ＣＩ＝１.０６０−２.３３８, Ｐ＝０.０２５；ＨＲ=０.５１０, ９５％ＣＩ＝０.３３０-０.７８８, Ｐ＝０.００２；各々]。しかし、他の因子は、有意に相関しなかった。【００６７】
【表４】
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【００６８】
ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ遺伝子多型とＯＳとの関係
ＰＰＶで治療した患者において炎症マーカーであるＩＬ−６が、予後因子である可能性があるため、我々は関連遺伝子であるＩＬ−６  -６３４Ｇ＞ＣおよびＩＬ−６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃ (表５)の遺伝子多型を検討した（Motoyama S, et al., Dig Surg. 2012;29: 194-201およびMotoyama S, et al., Ann Surg Oncol. 2013;20: 1978-1984参照）。ＩＬ-６  -６３４Ｇ＞Ｃの多形型とＯＳ(各々Ｐ＝０.２５９およびＰ＝０.１１４)と間には有意な相関はなかった(Ｐ＝０.３１９)。しかし、ＩＬ−６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃの多型は、ＯＳに対して有意な相関を示した。図３Ａに示したように、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ｃまたは４８８９２Ｃ／Ｃ遺伝子型を有する患者は、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ａ遺伝子型を有するものよりも良好な予後を示す傾向があった(Ｐ＝０.０５８３)。この遺伝子多型を、ワクチン接種前の血漿(図３Ｂ)中のＩＬ−６が陽性または陰性の患者においてさらに評価した。その結果、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/ＣまたはＣ/Ｃ遺伝子型を有する患者とＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ａ遺伝子型を有する患者との差異は、ＩＬ−６陽性の患者では統計学的に有意ではなかった(Ｐ＝０.１１８４)が、ＩＬ−６陰性の患者においては有意であった(Ｐ＝０.０２５２)。【００６９】
【表５】
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【００７０】
結論
上記研究結果より、ＩＬ−６Ｒ  ４８８９２Ａ＞Ｃの遺伝子多型がペプチドワクチン投与後の生存期間に対して有意な効果を示した。すなわち、ＩＬ−６Ｒ  ４８８９２の遺伝子型Ａ／ＣまたはＣ／Ｃを有する患者はＩＬ−６Ｒ  ４８８９２Ａ／Ａを有する患者より予後が良い傾向にあり、特にワクチン投与前の患者血漿のＩＬ−６が低濃度である患者では、その傾向が強かった。
また、上記研究は、ＰＰＶが重篤な副作用なしにワクチン抗原に対する免疫応答を惹起したこと、前治療歴を有するａＣＲＣ患者において、たとえがんが難治性ステージであるとしても、臨床的に有益である可能性を示した。さらに、統計学的解析により、ペプチドワクチン投与前の血漿において、低いＩＬ−６と低いＩＰ−１０のレベルおよび高いＢＡＦＦのレベルがＰＰＶのレスポンスを良くする可能性があることを示唆した。ワクチン投与前にこれらの因子を評価することは、ａＣＲＣ患者においてペプチドワクチン療法の効果を期待できる患者を選択するのに有用である。【００７１】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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