(57)【要約】  ＰＱＢＰ−１をコードする所定のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、及びスクリーニング方法を提供する。  神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ等、又はこれらＤＮＡ等がコードするポリペプチドを有効成分として含有する。また、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ等、又はこれらＤＮＡ等がコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
2016002854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＰＱＢＰ−１）をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進することができるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ神経幹細胞の増殖を促進することができるＤＮＡ
【請求項２】
前記神経幹細胞の増殖の促進は、細胞周期の延長の抑制によるものである、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項４】
ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項５】
ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項６】
前記ＤＮＡがベクターに組み込まれている請求項１から５いずれか記載の製剤。
【請求項７】
神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記動物細胞又はヒトを除く動物の、内在性ＰＱＢＰ−１の発現量又はＰＱＢＰ−１による神経幹細胞増殖促進の程度を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法。
【請求項８】
シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記動物細胞又はヒトを除く動物の、内在性ＰＱＢＰ−１の発現量又はＰＱＢＰ−１によるシナプス後部形成の促進の程度を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（以下、本明細書において、ＰＱＢＰ−１と称する）は、変性疾患ポリグルタミン病において中間病態を担うタンパク質であることが、従来知られている（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
このＰＱＢＰ−１遺伝子の変異が、Ｘ染色体連鎖知的障害／精神遅滞家系（ＸＬＩＤ／ＸＬＭＲ）で高頻度に見つかり、ＰＱＢＰ−１が知的障害の主要な原因遺伝子であり得ることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。また、ＰＱＢＰ−１がＲＮＡのスプライシングに関わり得ることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗａｒａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＱＢＰ−１，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｔｒａｃｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｒｎ−２  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ”，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１９９９；８（６）：ｐ．９７７−９８７
【非特許文献２】Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３；３５（４）：ｐ．３１３−３１５
【非特許文献３】Ｏｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ａｔａｘｉｎ−１  ａｎｄ  ＰＱＢＰ−１  Ａｆｆｅｃｔｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ”，Ｎｅｕｒｏｎ，２００２；３４：ｐ．７０１−７１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、ＰＱＢＰ−１が知的障害の原因遺伝子である可能性や、ＲＮＡのスプライシングに関わることが報告されているが、ＰＱＢＰ−１がいかなる知的障害と実際に関連していることは未だに不明である。【０００６】
本発明は、ＰＱＢＰ−１をコードする所定のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、及びスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、神経幹細胞の細胞周期が長くなること、及び、シナプス後部形成が減少することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。【０００８】
（１）ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＰＱＢＰ−１）をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進することができるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ神経幹細胞の増殖を促進することができるＤＮＡ【０００９】
（２）前記神経幹細胞の増殖の促進は、細胞周期の延長の抑制によるものである、（１）記載の製剤。【００１０】
（３）ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列からなるＤＮＡ【００１１】
（４）ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ【００１２】
（５）ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ【００１３】
（６）前記ＤＮＡがベクターに組み込まれている（１）から（５）いずれか記載の製剤。【００１４】
（７）神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記動物細胞又はヒトを除く動物の、内在性ＰＱＢＰ−１の発現量又はＰＱＢＰ−１による神経幹細胞増殖促進の程度を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法。【００１５】
（８）シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記動物細胞又はヒトを除く動物の、内在性ＰＱＢＰ−１の発現量又はＰＱＢＰ−１によるシナプス後部形成の促進の程度を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＰＱＢＰ−１をコードする所定のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する、神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、シナプス後部形成の促進に用いられる製剤、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤、及びスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＱＢＰ−１遺伝子が変異した患者の脳形状を磁気共鳴画像により解析した画像を示す図である。図１中、（ａ）は水平面の画像であり、（ｂ）は冠状面の画像であり、（ｃ）は矢状面の画像を示す。
【図２】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）のそれぞれの脳の写真である。
【図３】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）の脳の質量を示すグラフであり、（ａ）は雄のマウスについてのグラフであり、（ｂ）は雌のマウスについてのグラフである。
【図４】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）の脳の写真である。
【図５】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウスの脳の質量を示すグラフであり、（ａ）は雄のマウスについてのグラフであり、（ｂ）は雌のマウスについてのグラフである。
【図６】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウス（２ヶ月）のそれぞれの冠状面の写真であり、（ａ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄成体マウスについての写真であり、（ｂ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄成体マウスについての写真であり、（ｃ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雌成体マウスについての写真であり、（ｄ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雌成体マウスについての写真である。
【図７】ＢｒｄＵを妊娠マウスに腹腔内注射してから２４時間後の、神経新生の細胞数、幹細胞プール中に残っている細胞数、ラベルされてない神経幹細胞の数の相対的な割合のグラフである。
【図８】ＴＵＮＥＬ染色による、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていないＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスの、大脳皮質の細胞死のレベルのグラフである。
【図９】（ａ）は、野生型マウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、ＡＰＣ４が形質転換された野生型マウスと、ＡＰＣ４が形質転換された、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの、それぞれのＥ１４の胚から準備した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。（ｂ）は、それぞれのマウスの胚における、ＡＰＣ４、ＰＱＢＰ−１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ、ＧＡＰＤＨの発現量をウエスタンブロッティングにより分析した結果の写真である。
【図１０】ＦＡＣＳ分析による、（ａ）野生型マウスと、（ｂ）ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、（ｃ）ＡＰＣ４が形質転換された、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、（ｄ）ＡＰＣ４が形質転換された野生型マウスの、それぞれのマウスのＥ１４の胚から抽出した神経幹細胞における、それぞれの細胞数の数を表すグラフである。
【図１１】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていないＮｅｓｔｉｎ−ＣｒｅマウスのそれぞれのＥ１３の胚にＡＰＣ４―ＧＦＰ又はＧＦＰを導入した後の、Ｅ１８の脳組織の写真である。
【図１２】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていないＮｅｓｔｉｎ−ＣｒｅマウスのそれぞれのＥ１３の胚にＡＰＣ４―ＧＦＰ又はＧＦＰを導入した後の、Ｅ１８の脳組織における、頂端表面に対する軟膜表面の割合のグラフである。
【図１３】野生型マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月）の脳におけるタンパクを、ウエスタンブロッティングにより分析した結果の写真である。
【図１４】野生型マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月）の脳におけるタンパクの量の比を、ウエスタンブロッティングにより分析したグラフである。
【図１５】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていないコントロールの雄及び雌マウス（２ヶ月）と、それぞれにＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したマウス（２ヶ月）における、脳の重量のグラフである。（ａ）は雄マウスのグラフを、（ｂ）は雌マウスのグラフをそれぞれ示す。
【図１６】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入した雄の成体マウス（２ヶ月）の脳の形態の写真である。
【図１７】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄の成体マウス（２ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入した雄の成体マウス（２ヶ月）の脳の冠状面の写真である。（ａ）は、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入していないマウスの冠状面の写真を示し、（ｂ）は、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したマウスの冠状面の写真を示す。
【図１８】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄の成体マウス（２．５ヶ月）と、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入した雄の成体マウス（２．５ヶ月）の、皮質の全体の厚さに対する各層の相対厚さの割合のグラフである。
【図１９】ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ成体マウス（３ヶ月）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ成体マウス（３ヶ月）についての、回転ロッドの試験における、それぞれのマウスが、ロッドから落ちる平均時間のグラフである。
【図２０】野生型成体マウス（３ヶ月）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ成体マウス（３ヶ月）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトし、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ成体マウス（３ヶ月）についての、フィアコンディショニングの試験における、マウスの止まった時間のグラフである。
【図２１】野生型成体マウス（３ヶ月）、Ｆｌｏｘ成体マウス（３ヶ月）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯ成体マウス（３ヶ月）についての、回転ロッドの試験における、それぞれのマウスが、ロッドから落ちる平均時間のグラフである。
【図２２】野生型マウス（３ヶ月）、Ｆｌｏｘマウス（３ヶ月）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ成体マウス（３ヶ月）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス野生型成体マウス（３ヶ月）についての、フィアコンディショニングの試験における、マウスの止まった時間のグラフである。
【図２３】Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス、Ｆｌｏｘマウス、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのシナプス後部形成の程度を示す図である。
【図２４】Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス、Ｆｌｏｘマウス、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのシナプス後部における、樹上の直径、突起ヘッドの直径、樹上突起の数のグラフである。
【図２５】Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス、ＦｌｏｘマウスＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのシナプス後部形成の程度の経時変化を示す図である。
【図２６】Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス、Ｆｌｏｘマウス、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのシナプス後部形成の樹上突起の動態形態変化のグラフである。
【図２７】高脂肪食を与えたマウスにおけるＰＱＢＰ−１の発現を、ウエスタンブロッティングにより分析した結果の写真である。
【図２８】高脂肪食を与えたマウスにおけるＰＱＢＰ−１の発現を、ウエスタンブロッティングにより分析した結果のグラフである。
【図２９】高脂肪食を与えたマウスにおける、シナプス後部の数のグラフを示す図である。ＰＱＢＰ−１の発現を、ウエスタンブロッティングにより分析した結果のグラフである。
【図３０】高脂肪食を与えたマウスのシナプス後部形成の樹上突起の動態形態変化のグラフである。
【図３１】（ａ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された野生型のマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像を示し、（ｂ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像を示し、（ｃ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクター及びＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像を示す。
【図３２】ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された野生型のマウス（ｎ＝８）、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウス（ｎ＝５）、及びＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターとＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウス（ｎ＝８）についてのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。
【００１９】
＜製剤＞
本発明の製剤は、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＰＱＢＰ−１）をコードする所定のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。以下、本発明の製剤について説明する。
【００２０】
（神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤）
本発明の神経幹細胞の増殖の促進に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２１】
本発明者らは、ＰＱＢＰ−１異常となることで、細胞周期が延長されることを見いだした。この細胞周期の延長により、神経幹細胞の分裂回数が減少し、神経幹細胞が減少する。しかし、本発明の製剤によると、細胞周期の延長を抑制することができるのでこれにより、神経幹細胞の減少を抑制することができる。
【００２２】
（神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤）
本発明の神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、神経幹細胞の増殖を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２３】
なお、本明細書における「神経幹細胞の減少に関連する疾患」は、神経幹細胞の減少により生じる疾患のことを指し、例えば、小頭症（例えば、脳の形状に異常を伴わない小頭症）、精神遅滞等の先天性知的障害や、自閉症、学習障害等の発達障害が挙げられる。ここで「神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療効果」は、小頭症、精神遅滞等の先天性知的障害、自閉症、学習障害等の発達障害のうちの少なくとも１種の症状が改善され又は症状悪化が抑制される効果であって、改善又は抑制が統計的に有意である効果を指す。これらのうち、特に予防又は治療効果が高い点で、小頭症に用いるのが好ましい。また、神経幹細胞の減少によって関連する疾患の予防又は治療効果は、Ｘ連鎖性疾患の場合は、特に、ヒトの男性に対して有効である。
【００２４】
（シナプス後部形成の促進に用いられる製剤）
本発明のシナプス後部形成の促進に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２５】
（シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤）
本発明のシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤は、ＰＱＢＰ−１をコードする以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、シナプス後部形成を促進する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２６】
なお、本明細書における「シナプス後部形成の減少に関連する疾患」は、シナプス後部形成の減少により生じる疾患のことを指し、例えば、アルツハイマー病等の認知症、筋萎縮性側索硬化症、精神発達遅滞、前頭側頭葉型認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、汎発性レヴィー小体病、脊髄小脳失調症等の疾患が挙げられる。ここで「シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療効果」は、アルツハイマー病等の認知症、筋萎縮性側索硬化症、精神遅滞の少なくとも１種の症状が改善され又は症状悪化が抑制される効果であって、改善又は抑制が統計的に有意である効果を指す。これらのうち、特に予防又は治療効果が高い点で、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、精神遅滞に用いるのが好ましい。
【００２７】
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡである。
【００２８】
配列番号１は、ヒトＰＱＢＰ−１をコードする塩基配列である。この配列番号１記載の塩基配列は、神経幹細胞の増殖及びシナプス形成を促進する。ここで、本明細書において、「塩基配列が神経幹細胞の増殖又はシナプス形成を直接促進する」とは、塩基配列がコードするポリペプチドが神経幹細胞の増殖又はシナプス形成を促進することを意味する。配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００２９】
配列番号２は、ヒトＰＱＢＰ−１タンパク質を構成することが知られている。本発明のＤＮＡには、かかる配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。神経幹細胞の増殖又はシナプス形成を促進する作用を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００３０】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列は、配列番号２記載のアミノ酸配列と相同性が高い方が好ましい。ここで、配列番号２記載のアミノ酸配列（ヒトＰＱＢＰ−１のアミノ酸配列）とマウスＰＱＢＰ−１のアミノ酸配列との相同性は８６．８％であるが（Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｏｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＱＢＰ−１  （Ｎｐ／ＰＱ）：  Ａ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｔｒａｃｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２００１，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏｓ．３／４，ｐｐ．２７３−２８０）、ヒトＰＱＢＰ−１タンパク質は、マウスにおいても、高い効果（神経幹細胞の増殖の促進効果、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果、シナプス後部形成の促進効果、又はシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果）を奏する。この観点から、配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２記載のアミノ酸配列との相同性は、８５％以上が好ましくは、９０％以上がより好ましく、９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が更に好ましい。
【００３１】
上記ＤＮＡの最も好ましい態様は、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡであるが、本発明のＤＮＡには、更に、神経幹細胞の増殖の促進効果又は神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果を有する種々の変異体やホモログや、シナプス後部形成の促進効果又はシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果を有する種々の変異体やホモログが含まれる。ここで、ＰＱＢＰ−１のＮ末端側のＷＷドメイン（配列番号３）、Ｃ末端側のＣターミナルドメイン（配列番号４）が知られている。ＷＷドメインは、ＲＮＡポリメラーゼとの作用において重要な役割を担う配列であり、プロリンリッチな配列特異的に結合することが知られている。また、Ｃターミナルドメインは、スプライシングにおいて重要な役割を担う天然変性タンパクとして知られている。そのため、本発明のＤＮＡは、ＰＱＢＰ−１の機能を発揮するためには、配列番号３、４のいずれか一方、又は両方の配列を含むのが好ましい。
【００３２】
更に、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号１記載の塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列番号１記載の塩基配列と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００３３】
なお、上記配列番号１〜４は、ＮＣＢＩ  ＣＣＤＳ  ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＣＣＤＳ１４３０９．１（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＣＤＳ／ＣｃｄｓＢｒｏｗｓｅ．ｃｇｉ？ＲＥＱＵＥＳＴ＝ＣＣＤＳ＆ＤＡＴＡ＝ＣＣＤＳ１４３０９．１＆ＯＲＧＡＮＩＳＭ＝０＆ＢＵＩＬＤＳ＝ＣＵＲＲＥＮＴＢＵＩＬＤＳ）に由来する。
【００３４】
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３５】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３６】
（ポリペプチド）
本発明の予防又は治療剤で使用されるポリペプチドは、前述のＤＮＡによりコードされ、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を有し、又は配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、例えば、前述のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで、作製できる。すなわち、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするタンパク質（ポリペプチド）を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００３８】
形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【００３９】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。なお、本発明で使用できるベクター及び形質転換体を以下に説明する。
【００４０】
（ベクター）
発現ベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００４１】
また、ベクターは、ポリペプチドを合成するのみならず、本発明の製剤にも利用することができる。すなわち、上述のＤＮＡが組み込まれたベクターを含む本発明の製剤は、ヒトに直接導入することで、神経幹細胞の増殖の促進、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療、シナプス後部形成の促進、又はシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いることができる。この場合におけるベクターは、ヒトの細胞内に導入可能なベクターを用いる。かかるベクターとしては、例えば、ＡＡＶベクターが挙げられる。
【００４２】
（形質転換体）
形質転換体は、前述のＤＮＡを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）、あるいは、ヒト、マウス等の動物が挙げられる。
【００４３】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、例えば、細菌を宿主とした場合、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４４】
また、ヒトを宿主とした場合、例えば、上述のＡＡＶベクターを用いて妊娠したヒトに形質転換する場合、腹部に注射することで形質転換することができる。
【００４５】
本明細書における「有効成分」は、神経幹細胞の増殖の促進効果、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果、シナプス後部形成の促進効果、又はシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療効果を得るために必要な量で含有される成分を指し、効果が所望のレベル未満にまで損なわれない限りにおいて、他の成分も含有されてよい。また、製剤の投与経路は、経口又は非経口のいずれであってもよく、適宜設定される。
【００４６】
経口投与の場合、製剤は、一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加剤を含有してよく、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等の種々の形状に製剤化される。また、製剤は、内用水剤、懸濁剤、乳剤シロップ剤等の液体状態であってもよく、使用時に再溶解される乾燥状態であってもよい。
【００４７】
非経口投与の場合、製剤は、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有してよく、通常、単位投与量アンプルもしくは多投与量容器又はチューブ内に収容された状態で流通される。また、製剤は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。
【００４８】
以上で述べた本発明の製剤は、上記で述べたような方法で、ヒトに投与することにより、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療、又は、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いることができる。
【００４９】
＜スクリーニング方法＞
本発明に係るスクリーニング方法は、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法、又は、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法である。
【００５０】
（神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法）
本発明の神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法は、被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、被験物質が投与された動物細胞又はヒトを除く動物の、ＰＱＢＰ−１による神経幹細胞増殖促進の程度を測定する工程と、測定結果に基づいて、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有する。
【００５１】
（シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法）
本発明のシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質のスクリーニング方法は、被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程と、被験物質が投与された動物細胞又はヒトを除く動物の、ＰＱＢＰ−１によるシナプス後部形成の促進の程度を測定する工程と、測定結果に基づいて、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防又は治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有する。
【００５２】
上記の各スクリーニング方法によれば、症状改善が検出された被検物質により、ＰＱＢＰ−１の機能を補完又は代替できるため、神経幹細胞の減少に関連する疾患又はシナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いられる製剤の候補物質として特定できる。以下に上記の両スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００５３】
（投与工程）
投与工程は、被験物質を、動物細胞又はヒトを除く動物に投与する工程である。
【００５４】
被験物質は、特に限定されず、天然又は合成の有機又は無機の低分子又は高分子物質等の任意の物質であってよい。
【００５５】
動物細胞は、ＰＱＢＰ−１を発現する細胞（神経細胞、神経幹細胞等）であれば、特に限定されず、ヒト、マウス等の従来の公知の動物の細胞を使用することができる。また、動物細胞は、野生型でもよく、あらかじめＰＱＢＰ−１の発現が抑制されたものでもよい。
【００５６】
ヒトを除く動物は、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳等物等を使用することができる。
【００５７】
投与方法は、特に限定されず、例えば、動物細胞に投与する場合、動物細胞を含む組織検体等と、被験物質を混合してもよく、被験物質の存在下で動物細胞を培養してもよい。あるいは、ヒトを除く動物に投与する場合、例えば、非経口投与であってもよい。非経口投与は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等であってもよい。また、経口投与であってもよい。
【００５８】
（測定工程）
測定工程は、被験物質が投与された動物細胞又はヒトを除く動物の、内在性ＰＱＢＰ−１の発現量又はＰＱＢＰ−１による神経幹細胞増殖促進の程度、もしくは、ＰＱＢＰ−１によるシナプス後部形成の促進の程度を測定する工程である。
【００５９】
測定方法は、特に限定されず、従来の公知の方法を使用することができ、例えば、被験物質の投与後の動物細胞又はヒトを除く動物中から抽出したＰＱＢＰ−１を発現する細胞の、被験物質の投与前のＰＱＢＰ−１の発現量、又は神経幹細胞の数もしくはシナプス後部形成と、被験物質の投与後のＰＱＢＰ−１の発現量、又は神経幹細胞の数もしくはシナプス後部形成を比較することで、神経幹細胞増殖促進の程度又はシナプス後部形成の促進の程度を測定することができる。この測定結果に基づいて、後述の選択工程において、候補物質を選択することができる。
【００６０】
（選択工程）
選択工程は、上記測定結果に基づいて、神経幹細胞の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いられる製剤、又は、シナプス後部形成の減少に関連する疾患の予防もしくは治療に用いられる製剤の候補物質として被験物質を選択する工程である。
【００６１】
選択方法は、特に限定されず、従来公知の選択方法により候補物質を選択すればよい。例えば、ＰＱＢＰ−１の発現量、神経幹細胞増殖の程度又はシナプス後部形成の促進の程度に基づいて、候補物質を選択してもよい。これらは、他のＰＱＢＰ−１の発現量、神経幹細胞増殖の程度又はシナプス後部形成の促進の程度と比較することで、選択してもよい。比較対象の具体例としては、ＰＱＢＰ−１の発現量が減少している動物細胞又はヒトを除く動物や、神経幹細胞増殖の程度、シナプス後部形成の促進の程度が減少しているものであってもよく、あるいは被験物質が投与されていないネガティブコントロールであってもよい。また、選択は、ＰＱＢＰ−１の発現量、神経幹細胞増殖の程度又はシナプス後部形成の促進の程度が回復することを確認することで、被験物質を候補物質として選択してもよく、これらがネガティブコントロールより上昇していることを確認することで選択してもよい。
【実施例】
【００６２】
（ＰＱＢＰ−１遺伝子ノックアウトマウスの作製）
個体の発生に必須な遺伝子は単純な方法ではノックアウト個体を得ることができないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いることで特定の条件下でのみ遺伝子ノックアウトすることが可能である。本実施例では、Ｎｅｓｔｉｎが神経幹細胞で選択的に発現すること、及び、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１が成熟神経細胞で選択的に発現することを利用して、神経幹細胞を標的とするノックアウトマウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）、及び、成熟神経細胞を標的とするノックアウトマウス（Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）を作成した。以下、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスは、神経幹細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたマウス、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスは、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたマウスをいう。【００６３】
ターゲティングベクターを作製するために、まず、マウスのＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（ＩＤ：ＲＰ２３−４０４Ｎ１５）から、ＰＣＲによって３種類のＰＱＢＰ−１ゲノムフラグメントを合成した。そのうち、エキソン１及びエキソン２を含む約３．６ｋｂの５’側フラグメントを、ＦＬＰ認識標的配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子の配列の上流に組み込み、エキソン３から７を含む約３．９ｋｂのフラグメントを２つのＬｏｘＰ配列の間に組み込み、約４．１ｋｂのイントロンのフラグメントを３’側に付加し、３’側の配列の外側に、組み替え時のランダム挿入を防ぐためにジフテリア毒素遺伝子（ＤＴＡ）を付加した。この操作により、ターゲティングベクターを作製した。【００６４】
作成したターゲティングベクターをＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）にエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８（株式会社シグマ社製、２００ｍｇ／ｍｌ）により相同組換えが行われたＥＳ細胞を選択後、ＰＣＲにより目的遺伝子が導入されたことを確認した。選択されたＥＳ細胞について、制限酵素処理し、その後のゲノムをサザンブロッティングにより分析することで、目的遺伝子が導入されたことを更に確認した。【００６５】
選別されたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス胚盤胞へインジェクションすることで、キメラマウスを作製した。このキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配して、目的の対立遺伝子を有するマウスを作製した。ネオマイシン耐性遺伝子は、ＣＡＧ−ＦＬＰｅ組換えトランスジェニックマウスと交配することで取り除いた。これにより得られた、ＰＱＢＰ−１−ｆｌｏｘヘテロ接合型雌マウスを、更にＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄マウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ  （Ｎｅｓ−Ｃｒｅ）１Ｋｌｎ／Ｊ；  Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）と交配させ、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ノックアウト（ｃＫＯ）マウスを作製した。また、ＰＱＢＰ−１−ｆｌｏｘヘテロ接合型雌マウスを、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ雄マウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ  （Ｓｙｎ１−Ｃｒｅ）６７１Ｊｘｍ／Ｊ；  Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）と交配させ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ノックアウト（ｃＫＯ）マウスを作製した。なお、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスは、それぞれ雄と雌両方のマウスについて作製した。
ＰＱＢＰ−１遺伝子は、Ｘ染色体上の遺伝子であるから、これらｃＫＯマウスは、Ｘ染色体が１本の雄ではＰＱＢＰ−１遺伝子はノックアウトされているが、Ｘ染色体が２本の雌ではＰＱＢＰ−１遺伝子は正常とノックアウトのヘテロ接合となる。【００６６】
（脳の解析）
ＰＱＢＰ−１遺伝子が変異した患者の脳の構造を磁気共鳴画像により解析した。その結果を図１に示す。図１中、（ａ）は、水平面、（ｂ）は冠状面、（ｃ）は矢状面を示す。その結果、ＰＱＢＰ−１が変異した患者において、通常の皮質構造であることが確認された。【００６７】
次に、２ヶ月の成体マウスから脳を取り出した。脳からの取り出しは、常法に従って行った。成体マウスは、（神経幹細胞で）ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌マウス、（成熟神経細胞で）ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ雄及び雌マウス、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされていないコントロールの雄及び雌マウスを用いた。図２は、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌マウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされていないコントロールの雄及び雌マウスの脳の写真であり、図４はＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ雄及び雌マウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされていないコントロールの雄及び雌マウスの脳の写真である。また、各のマウスのそれぞれの脳の質量を測定した。その結果を図３、図５に示す。図３、図５中、（ａ）は雄マウスについての結果を示し、（ｂ）は雌マウスについての結果を示す。なお、図中の「ＸＹ」は、野生型のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを意味し、「ＸＸ」は、野生型のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを意味し、「ＸＦｌｏｘＹ」及び「ＸＦＹ」は、ＰＱＢＰ−１−ｆｌｏｘヘテロ接合型雄マウスを意味し、「ＸＦｌｏｘＸ」及び「ＸＦＸ」は、ＰＱＢＰ−１−ｆｌｏｘヘテロ接合型雌マウスを意味する。また、図中の「＋」の記号は、該記号が付されたマウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウス又はＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウスとを交配して作製したマウスを意味し、「−」の記号は、該記号が付されたマウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウス又はＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウスとを交配せずに、野生型のＣ５７ＢＬ／６と交配して作製されたマウスを意味する。図３、５の各棒グラフの上の数値は、各マウスのｎ数を示す。【００６８】
図２、３から、胎生期の神経幹細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ雄マウスにおいて、脳が小さくなり、脳の質量が有意に減少することが確認された。これにより、ＰＱＢＰ−１の減少による小頭症は、ヒトの男性で特に発症しやすいことが示された。また、図４，５から、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯにおいては、小頭症は発症しないことが示された。これにより、ＰＱＢＰ−１の減少によって発症する小頭症は、先天性であることが示された。【００６９】
また、２ヶ月の成体マウスの冠状面の写真を撮影した。成体マウスとしては、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌の成体マウスと、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄及び雌の成体マウスを用いた。図６中、（ａ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雄成体マウスについての写真であり、（ｂ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄成体マウスについての写真であり、（ｃ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしていない雌成体マウスについての写真であり、（ｄ）はＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雌成体マウスについての写真である。【００７０】
図６から、ＰＱＢＰ−１遺伝子が変異したヒトと同様に（図１を参照）、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスの雄においては、脳の構造に特に異常は観察されないことが示された。これにより、ＰＱＢＰ−１の減少が原因となる小頭症は、脳の構造の異常を伴わないタイプの小頭症であることが示された。【００７１】
（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの細胞周期の分析）
Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの神経幹細胞（ＮＳＰＣ）の細胞周期の分析を行った。まず、ＢｒｄＵ（シグマ社製、１００ｍｇ／ｋｇ体重）を、Ｅ１４（胎生１４日）の各妊娠マウスの腹腔内に注入した（妊娠マウスの種類は後述の表１に示す）。妊娠マウスにＢｒｕＵを繰り返し注入し（３時間間隔）、累積してラベリングを行った。各マウスは、最初のＢｒｄＵの注入後、１、１．５、２、３．５、６．５、１５．５又は２４．５時間にそれぞれの胚脳を取り出した。取り出した胚脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに組み込んだ。胚脳の断片は、３ｍｍの間隔で作製し、パラフィンを除き、再水和し、それから、１５分間、ｐＨが６．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液中にいれた状態で電子レンジで加熱した。その後、抗体のインキュベーションを、マウス抗ＢｒｄＵ抗体（１：２００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ウサギ抗ホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨ３）抗体、Ｍ期の細胞のマーカー（１：５００、ミリポア社製）を用い、４℃、オーバーナイトで行った。二次抗体のインキュベーションは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又はＣｙ３複合体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行った。脳室帯における、ＢｒｄＵ／ｐＨ３ダブル陽性細胞のｐＨ３陽性細胞に対する割合を、Ｇ２／Ｍ期の長さを決定するためにＢｒｄＵの単一の注射した後、１、１．５、２時間で計算した。１、１．５、２、３．５及び６．５時間における標識化指数値（ＬＩｓ）の直線グラフによって、Ｙ軸切片（０時間でのＬＩ）を推定し、傾きを計算した。野生型マウスの脳室帯での成長率（増殖する細胞の割合）が、１．０に近いため、０時間におけるＬＩと傾きは、全細胞周期（Ｔｓ／Ｔｃ）に対するＳ期の割合と、全細胞周期（１／Ｔｃ）の逆数をそれぞれ表す。ＴｓとＴｃは、Ｓ期、全細胞周期の長さを表す。これらの値（Ｔｓ／Ｔｃと１／Ｔｃ）から、ＴｓとＴｃを算出した。それぞれの細胞周期の長さを、表１に示す。【００７２】
【表１】
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【００７３】
表１から、細胞周期の長さが、コントロールと比較して、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、細胞周期が長くなっていることが確認された。特に、Ｇ２／Ｍ期は、コントロールと比較して６７パーセントと大幅に延び、Ｇ１期は６％と僅かに延長したことが観察された。このように、ＰＱＢＰ−１をノックアウトすることで、特にＭ期の細胞周期が長くなったことが示された。【００７４】
（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの細胞数の割合の分析）
幹細胞プールからの神経新生をＢｒｄＵ及びＫｉ６７の共染色によって分析した。ＢｒｄＵを妊娠マウスに腹腔内注射して２４又は７２時間後に、神経新生の細胞数（ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７−）、幹細胞プール中に残っている細胞数（ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７＋）、ラベルされてない神経幹細胞（ＢｒｄＵ−／Ｋｉ６７＋）の数を計算するためにＥ１５のそれぞれの胚脳を分析した。その結果、２４時間後、７２時間後において、各グループの細胞の割合に差は検出されなかった。図７は、注入して２４時間後の、神経新生の細胞数、幹細胞プール中に残っている細胞数、ラベルされてない神経幹細胞（ＢｒｄＵ−／Ｋｉ６７＋）の数の相対的な割合を示すグラフである。【００７５】
（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの細胞死の分析）
Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスにおける、大脳皮質の細胞死のレベルを、Ｅ１０、Ｅ１５、Ｅ１８、Ｐ０、及びＰ６０において、ＴＵＮＥＬ染色によって評価した。その結果を図８に示す。図８より、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスとの間で、細胞死した細胞の数に差がないことが確認された。【００７６】
従来、小頭症は、神経幹細胞の分化効率が上昇する（このために幹細胞が枯渇する）、神経幹細胞の細胞死が亢進する、分化ニューロンの細胞移動が障害される等のメカニズムによるものであると考えられていた。しかしながら、上記の結果より、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスは、小頭症を発症するが、上記のメカニズムが生じおらず、そのかわりに細胞周期時間が延長していることが示された。この細胞周期の延長により、神経幹細胞の分裂回数を減らし、結果としてニューロン産生が減少していると考えられる。【００７７】
（ＰＱＢＰ−１によるスプライシングと関連性の強い遺伝子の分析）
ＰＱＢＰ−１によるスプライシングと関連性の強い遺伝子の分析を行うために、野生型のマウスとＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたマウスとのそれぞれのエキソンのシグナルを比較して、エキソンのレベルが著しく変化した遺伝子を見つける「エキソンエキソン分析」を行った。その差は、２つの試料の手段が同じであるという帰無仮説に基づいて、ストゥーデントのｔ検定により調べた。また、エキソン間の相対的な発現レベルの変化を検出する「バリアンス分析」を行った。これは、野生型及びＰＱＢＰ−１をノックアウトしたマウスの各遺伝子におけるエキソンレベルのプローブセットを用いて実施した。その差は、これら２つのサンプルが同じパターン及び分散を有するという帰無仮説に基づくＦ−ｔｅｓｔによって調べた。なお、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたマウスのエキソンは、Ｅ１５のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、生後４週齢のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの皮質、又は、生後４週齢のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの皮質を用いて、それぞれを野生型マウスと比較した。その結果を表２〜４に示す。なお、遺伝子が複数のエキソンプローブを保有する場合、最も低いｐ−値を用いた。表２は、Ｅ１５のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと野生型マウスの神経幹細胞を比較した結果を示す。表３は、生後４週齢のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと野生型マウスの皮質を比較した結果を示す。表４は、生後４週齢のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと野生型マウスの皮質とを比較した結果を示す。【００７８】
【表２】
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【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４】
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【００８１】
その結果（表２、表３、表４）、ＡＰＣ１とＰＱＢＰ−１は、両方の分析で、Ｅ１５のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス、生後４週齢のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス」、及び、生後４週齢のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのすべての遺伝子型において、それぞれの発現レベルが著しく影響を受けたことが確認された。一方、ＡＰＣ４は、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの皮質では発現レベルの変化は有意であるとはいえないが、神経幹細胞では有意であることが示された。一方、エキソンアレイデータの２つの分析（エキソンエキソン分析とバリアンス分析）と、スプライシング／転写の寄与は、結果が相関していると推測される。この推測から、転写とスプライシングの両方がＡＰＣ１とＰＱＢＰ−１に影響を与えているのに対し、ＡＰＣ４では転写の影響が比較的大きいことが示唆された。【００８２】
ＰＱＢＰ−１によるスプライシングと関連性の強い遺伝子の分析を更に行うために、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を行った。分析には、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、野生型のマウスとをそれぞれ３種用いた。ＧＳＥＡにより選択された、Ｍ期に関係のある遺伝子について、ＰＰＩ分析を行った。その結果、Ｍ期においてＰＱＢＰ−１と強い関連性のある遺伝子が、Ｕ−５１５ｋｄ、ＡＰＣ２、ＡＰＣ４であることが確認された。【００８３】
（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスに対するＡＰＣ４遺伝子の導入試験）
ＡＰＣ４遺伝子を、ＰＱＢＰ−１がノックアウトされたマウスに導入する試験を行った。まず、マウスのＡＰＣ４のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０２４２１３）を、ＲＴ−ＰＣＲにより準備し、これを、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＩＲＥＳ２−ｈｒＥＧＦＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、ｐＡｐｃ４−ＩＲＥＳ２−ｈｒＥＧＦＰＩＩを作製した。この遺伝子を用い、野生型マウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの胚の脳室にエレクトロポレーションにより導入した。【００８４】
図９（ａ）は、野生型のマウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスと、Ａｐｃ４が形質転換された野生型マウスと、Ａｐｃ４が形質転換されたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの、それぞれのＥ１４の胚から準備した神経幹細胞の増殖を示す。これにより、ＡＰＣ４をＰＱＢＰ−１をノックアウトしたマウスに導入することで，神経幹細胞の増殖が、有意に回復することが確認された。また、図９（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによる、ＡＰＣ４、ＰＱＢＰ−１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ、ＧＡＰＤＨのそれぞれの発現量を示す。これにより、ＡＰＣ４が形質転換されたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、ＰＱＢＰ−１が発現していないこと、ＡＰＣ４の発現量が、ＡＰＣ４を導入していないマウスより増えていることが確認された。また、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂの発現量が、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて増えているのに対し、ＡＰＣ４を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいては、発現が抑えられていることが確認された。【００８５】
また、ＦＡＣＳ分析により、それぞれのマウスのＥ１４の胚から抽出した神経幹細胞において、それぞれの細胞数の数を確認した。その結果を図１０に示す。（ａ）は、野生型マウス、（ｂ）は、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス、（ｃ）は、ＡＰＣ４が形質転換されたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス、（ｄ）はＡＰＣ４が形質転換された野生型マウスにおける、それぞれの細胞数の数を示す。これにより、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、Ｇ２／Ｍ期の割合が野生型マウスより上昇していたが、ＡＰＣ４を導入することで、Ｇ２／Ｍ期の割合の上昇が抑えられることが確認された。【００８６】
また、頂端表面に対する軟膜表面の割合が、子宮内電気穿孔法により形質転換されたＥＧＦＰ陽性細胞の増殖に対して影響を与えるかを試験した。具体的には、まず、マウスのＡＰＣ４のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０２４２１３）を、ＲＴ−ＰＣＲにより準備し、これを、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に組み込み、ｐＡｐｃ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰを作製した。野生型マウスと、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのＥ１３の胚の脳室に、ｐＡｐｃ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ又はｐＩＲＥＳ２−ＥＧを導入し、Ｅ１８の胚の脳組織を分析した。その結果を図１１、１２に示す。この結果から、頂端表面に対する軟膜表面の割合が、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたマウスにおいて減少していたが、ＡＰＣ４を外部から加えることにより、回復した。これにより、細胞周期の延長が、ＡＰＣ４を加えることで、回復することが示された。【００８７】
（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスに対する、ＰＱＢＰ−１遺伝子の導入試験）
まず、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたマウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）にヒトＰＱＢＰ−１遺伝子を導入した。具体的には、ベクターとしてＡＡＶベクタープラスミドを用いた。ＡＡＶベクタープラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）からなる発現カセットを含有し、その後ろ側に、ヒトＰＱＢＰ１又はヒトＰＱＢＰ１−ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡ、ＡＡＶ３ゲノムの逆方向末端反復の間のシミアンウイルス４０ポリアデニル化シグナル配列（ＳＶ４０ポリ（Ａ））が続くように設計した。組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）は、ベクタープラスミド、ＡＡＶ２  ｒｅｐ及びＡＡＶ１  ｖｐ発現プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞への一過的な導入により作製した。組換えウイルスは、２つの経時的な塩化セシウム勾配の分離形成によって精製し、ウイルス価を定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）のインビボでの投与は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ妊娠マウス（Ｅ１０のＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ胎児マウスを妊娠）に腹腔内投与することにより、ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター（２．０×１０１１ゲノムコピー）をＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯ胎児マウスに導入した。このＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクターが導入されたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月（１０週齢））を用いて、以下の試験を行った。【００８８】
野生型マウス（２ヶ月（１０週齢））と、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月（１０週齢））と、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（２ヶ月（１０週齢））の脳におけるタンパクを、ウエスタンブロッティングにより分析した。ウエスタンブロッティングの写真を図１３に、ＰＱＢＰ−１のタンパク量の割合を示すグラフを図１４にそれぞれ示す。ヒトＰＱＢＰ−１タンパク質のアミノ酸配列と、マウスＰＱＢＰ−１タンパク質のアミノ酸配列は、上記のとおり、高い相同性を有するため、ウエスタンブロッティングにおいても、タンパク質のサイズが略同じものとして検出される。これにより、ＰＱＢＰ−１遺伝子を導入することにより、ＰＱＢＰ−１のタンパク量が約２．５倍増えることが確認された。【００８９】
また、２ヶ月（１０週齢）の成体マウスから脳を取り出した。成体マウスとしては、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄及び雌マウス、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされていないコントロールの雄及び雌マウスと、それぞれにＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したマウスとを用いた。それぞれのマウスの脳の重量を図１５に示す。（ａ）は雄マウス、（ｂ）は雌マウスの結果を示す。これにより、特に、ＰＱＢＰ−１がノックアウトされた雄のマウス（白の棒グラフ）において減少した脳の重量が、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入すること（黒の棒グラフ）で有意に回復したことが示された。【００９０】
また、２ヶ月（１０週齢）の成体マウスの脳の形態の写真（図１６）と冠状面の写真（図１７）を撮影した。成体マウスとしては、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄の成体マウスと、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入した、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトした雄の成体マウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）を用いた。図１７中、（ａ）はＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入していないマウスの冠状面の写真を示し、（ｂ）は、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したマウスの冠状面の写真を示す。これにより、ＰＱＢＰ−１がノックアウトされた雄のマウスにおいて、脳の形態、冠状面においても、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入することで脳の重量が回復することが確認された。【００９１】
また、２．５か月の成体マウスの皮質の全体の厚さに対する各層の相対厚さの定量分析を行った。成体マウスとしては、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトしたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ雄の成体マウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）（白の棒グラフ）と、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入した、ＰＱＢＰ−１遺伝子をノックアウトした雄の成体マウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）（黒の棒グラフ）を用いた。また、各層の特異的なマーカーとして、Ｃｕｘ、Ｔｂｒ１、ＧＡＤ６７、Ｆｏｘｐ１を用いた。その結果を図１８に示す。この結果より、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入しても、特に層の厚さに変化はみられなかったことから、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入しても脳の厚さに影響を与える等の副作用はないことが確認された。【００９２】
以上の結果より、神経幹細胞が減少し、それによって発症する小頭症等の知的障害を、ＰＱＢＰ−１によって予防又は治療できることが示された。【００９３】
（行動解析）
３か月の成体マウス（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）について、回転ロッドの試験を行った。まず、マウスを回転ロッド（直径３ｃｍ）に置き、回転速度を３．５回転から３００秒で３５ｒｐｍに直線的に増加させ、６００秒経過するまで３５ｒｐｍの回転数で続けた。各試験の間に１０分の休憩間隔をおき、９回の試験（３日間連続して行い、１日３試験）を行った。ロッドから落下する時間を記録し、ロッドから落ちる平均時間を記録した。その結果を図１９に示す。【００９４】
図１９より、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスは、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入していないＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスより、回転ロッドに滞在する時間が長かったことが示された。【００９５】
次に、３か月の成体マウス（野生型マウス、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス）について、フィア（恐怖）コンディショニングの試験を行った。この試験は、コンディショニングトライアルとテストトライアルの２つのパートにより構成した。フィアコンディショニングは、ステンレス製の格子床（３４ｃｍ×２６ｃｍ×３０ｃｍ〔Ｈ〕）を搭載した透明なプラスチック容器で実施した。ＣＣＤカメラを、容器の天井に備え付け、ビデオモニターとコンピュータに接続した。格子床は、ショック発生器に接続した。ホワイトノイズ（６５ｄｂ）は、聴覚信号としての（条件刺激、ＣＳ）拡声器から供給した。２秒間連続での０．４ミリアンペアのフットショック（無条件刺激、ＵＳ）を３０秒間、ＣＳの期間の終了時に行った。コンディショニングトライアルは、３０秒ごとに区切られた３つのＣＳ−ＵＳの組み合わせによって、２分間の探査期間で構成した。テストは、コンディショニングトライアルの２４時間後にフットショックを行わずに、５分間、同じコンディショニングチャンバー中で行った。マウスの止まった反応の速度を、フィアメモリーの指標として測定した。その結果を図２０に示す。これにより、ＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスでは、野生型マウスより止まった時間が少なかったが、ＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター）を導入したことで、止まった時間が有意に上昇した。【００９６】
（Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスに関する行動解析）
野生型マウス、Ｆｌｏｘマウス、Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスについて、上記Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスでの行動解析と同様の方法で回転ロッドによる回転速度の試験を行ったところ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスが、他のコントロールのマウスより、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス同様、有意に回転ロッドに滞在した時間が短かったことが確認された（図２１）。【００９７】
更に、野生型マウス、Ｆｌｏｘマウス、Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅマウス、Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスについて、上記と同様の方法でフィアコンディショニングの試験を行ったところ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスが、他のコントロールのマウスより、Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス同様、有意に止まった時間が少なかったが確認された（図２２）。【００９８】
（Ｓｙｎａｐｓｉｎ−１−Ｃｒｅ−ｃＫＯのシナプス形成の分析）
Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｆｌｏｘマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（ｎ＝３、４週齢）の成熟神経細胞のシナプス後部形成の程度を測定した。測定は、それぞれのマウスの成熟神経細胞を、２光子顕微鏡を用いて観察することによって行った。より具体的には、あらかじめＡＡＶ−ＧＦＰ（５ｘ１０１１ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｍｌ）をｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ  ｄｙｓｇｒａｎｕｌａｒ  （ＲＳＤ）  ｃｏｒｔｅｘ（ｂｒｅｇｍａより前後方向−２．０ｍｍ、内外方向０．６ｍｍ）内に注入しておいたそれぞれのマウスに、イソフルランによる吸入麻酔し（０．１ｍｌ／ｍｉｎ）、観察部皮膚を切開し、ドリルを用いて頭蓋骨を薄く削り観察用のウインドウを作成した（ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ法）。マルチフォトンレーザーＭａｉＴａｉ  ＨＰ  ＤｅｅｐＳｅｅ−ＯＬ（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ社製）、水浸型対物レンズＸＬＰｌａｎＮ２５ｘＷ（オリンパス社製）を搭載した２光子レーザー顕微鏡システムＦＶ１０００ＭＰＥ（オリンパス社製）を用いてスパインと樹状突起のイメージングデータを取得した。ＧＦＰはレーザー波長８９０ｎｍで励起し、ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ法によるウインドウよりＲＳＤ  ｃｏｒｔｅｘを観察し、１μｍ間隔で１０２４×１０２４ピクセルを持つ解像度のイメージングデータを取得した。その観察結果を図２３に示す。これにより、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、シナプス後部の形成が減少していることが確認された。【００９９】
また、上記のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｆｌｏｘマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（ｎ＝３、４週齢）、の成熟神経細胞のシナプス後部における、樹上の直径、突起ヘッドの直径、樹上突起の数（ｎｕｍｂｅｒ／１０μｍ）を測定した。測定は、上記のそれぞれのマウスから得られたイメージングデータをＩＭＡＲＩＳ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）に読み込ませ、フィラメントツール（樹状突起直径：０．２９７−４．９５０μｍ、スパインヘッド直径：０．２−３．０μｍ）を用いて樹状突起とスパインを認識させ３次元モデルを構築し解析することによって行った。その結果を図２４に示す。これにより、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、樹上の直径、突起ヘッドの直径、樹上突起の数が有意に減少していることが確認された。【０１００】
また、上記のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｆｌｏｘマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（ｎ＝３、４週齢）の成熟神経細胞のシナプス後部形成の程度の経時変化を確認した。測定は、上記のそれぞれのマウスのイメージングデータの観察を０、８、２４時間で行った。その結果を図２５に示す。これにより、経時変化とともに、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスのシナプス後部形成が減少することが確認された。【０１０１】
また、上記のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｆｌｏｘマウス（ｎ＝３、４週齢）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウス（ｎ＝３、４週齢）の成熟神経細胞のシナプス後部形成の樹上突起の動的形態の変化を測定した。測定は、上記のそれぞれのマウスから得られたイメージングデータをＩＭＡＲＩＳ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）に読み込ませ、フィラメントツール（樹状突起直径：０．２９７−４．９５０μｍ、スパインヘッド直径：０．２−３．０μｍ）を用いて樹状突起とスパインを認識させ３次元モデルを構築し解析することによって行った。その結果を図２６に示す。図２６中「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」は、新たに形成されたシナプス後部の割合を示し、「Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ」は、形成されていたシナプス後部のうち、なくなったものの割合を示し、「Ｓｔａｂｌｅ」は、変化がなかったシナプス後部の割合を示す。この結果から、成熟神経細胞でＰＱＢＰ−１遺伝子がノックアウトされたＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスにおいて、新たに形成されたシナプス後部の割合が減少することが確認された。【０１０２】
以上のことから、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスの行動異常（学習障害、認知障害）は、シナプス後部形成異常との相関性が強く示唆された。【０１０３】
（Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯを用いたＰＱＢＰ−１と関連性の遺伝子の解析）
４週齢のＳｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯ（ｎ＝３）及び野生型のマウス（ｎ＝３）の脳をサンプルとし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いてエキソンアレイデータを取得し、以下の手順によりエキソンアレイデータ分析を行った。【０１０４】
まず、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプロトコールに従い、各エキソンに対応するプローブセットのシグナル値を推定した。得られた各プローブセットのシグナル値を転写物単位でグルーピングし、各転写物に対応するプローブセット群のシグナル値の合計が一定となるように正規化を行った。次に、各転写物ごとに、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯ及び野生型の各群におけるプローブセット群のシグナル値の分散に関する等分散の検定を行い、二群間で分散が有意に変化した転写物のリストを作成した。更に、各プローブセットについて、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１−Ｃｒｅ−ｃＫＯと野生型の二群間におけるシグナル値の平均値の差の検定を行うことにより、発現量が有意に変化したエキソンのリストを作成した。【０１０５】
以上の操作により得られた転写物のリストとエキソンのリストの共通集合を求めることにより、ＰＱＢＰ−１に関連性の遺伝子を解析した。その結果を表５に示す。【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
表５より、ＰＱＢＰ−１遺伝子は、精神発達遅滞（Ｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ（ＭＲ））、アルツハイマー病（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ＡＬＳ））、シナプスに関連する遺伝子群と、密接な関連性があることが示唆された。【０１０８】
以上の結果から、シナプス後部形成が減少することによって発症するアルツハイマー病等の疾患は、ＰＱＢＰ−１によって予防又は治療可能であることが示唆された。【０１０９】
（高脂肪食摂取マウスにおけるＰＱＢＰ１−１の発現の解析）
高脂肪食を与えたマウスの脳におけるＰＱＢＰ−１の発現を、ウエスタンブロッティングにより分析した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は、６週齢から６週間の高脂肪食群（ｎ＝３、図２７−３０の「ＨＦＤ６Ｗ」に相当）と、１１週齢から１週間の高脂肪食群（ｎ＝３、図２７−３０の「ＨＦＤ１Ｗ」に相当）を用いた。また、比較として高脂肪食を与えない通常食群（ｎ＝３、図２７−３０の「ＨＦＤ０Ｗ」に相当）のマウスを用いた。分析は、それぞれのマウスの１２週齢目に分析を行った。なお、高脂肪食としては、日本クレア社のＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２を用い、これをマウスに自由摂取させた。高脂肪食を摂取する以外の期間の高脂肪食群と、通常食群には、通常食（日本クレア社のＣＥ−２）を自由摂取させた。水分も自由摂取とし、飼育室の明暗コントロールは１２時間ごとに行い、室温２５±２℃、湿度５０±１０％で飼育した。分析結果の写真を図２７に示し、タンパク量の割合を示すグラフを図２８に示す。従来より、肥満はアルツハイマー病の危険因子であると考えられていたが、この結果より、肥満によるＰＱＢＰ−１の減少が、アルツハイマー病の原因となることが示唆された。【０１１０】
（高脂肪食摂取マウスにおけるシナプス形成の程度の測定）
上記の高脂肪食を与えた高脂肪食群のマウスと、通常食を与えた通常食群のマウスにおける、シナプス後部の数を測定した。測定は、まず、１０週齢でマウスにＡＡＶ−ＧＦＰ（５ｘ１０１１ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｍｌ）がｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ  ｄｙｓｇｒａｎｕｌａｒ  （ＲＳＤ）  ｃｏｒｔｅｘ（ｂｒｅｇｍａより前後方向−２．０ｍｍ、内外方向０．６ｍｍ）内に注入し、１２週齢でイソフルランによる吸入麻酔し（０．１ｍｌ／ｍｉｎ）、観察部皮膚を切開し、ドリルを用いて頭蓋骨を薄く削り観察用のウインドウを作成した（ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ法）。マルチフォトンレーザーＭａｉＴａｉ  ＨＰ  ＤｅｅｐＳｅｅ−ＯＬ（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ社製）、水浸型対物レンズＸＬＰｌａｎＮ２５ｘＷ（オリンパス社製）を搭載した２光子レーザー顕微鏡システムＦＶ１０００ＭＰＥ（オリンパス社製）を用いてスパインと樹状突起のイメージングデータを取得した。ＧＦＰはレーザー波長８９０ｎｍで励起し、ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ法によるウインドウよりＲＳＤ  ｃｏｒｔｅｘを観察し、１μｍ間隔で１０２４ｘ１０２４ピクセルを持つ解像度のイメージングデータを取得した。得られたイメージングデータをＩＭＡＲＩＳに読み込ませ、フィラメントツール（樹状突起直径：０．２９７−４．９５０μｍ、スパインヘッド直径：０．２−３．０μｍ）を用いて樹状突起とスパインを認識させ３次元モデルを構築し解析することによって、測定を行った。その結果を図２９に示す。これにより、シナプス後部の数が、高脂肪食を与えることにより減少することが確認された。この結果は、肥満によるＰＱＢＰ−１の減少は、シナプス後部の形成の減少を引き起こし、それがアルツハイマー病の原因となることが示唆する。【０１１１】
上記の高脂肪食を与えた高脂肪食群のマウスと、通常食を与えた通常食群のシナプス後部形成の樹上突起の動態形態変化を測定した。測定は、得られたイメージングデータをＩＭＡＲＩＳに読み込ませ、フィラメントツール（樹状突起直径：０．２９７−４．９５０μｍ、スパインヘッド直径：０．２−３．０μｍ）を用いて樹状突起とスパインを認識させ３次元モデルを構築し解析することによって行った。その結果を図３０に示す。これにより、高脂肪食をマウスに与えることにより、形成されていたシナプス後部のうち、なくなるものの割合が増えることが確認された。【０１１２】
以上の結果から、肥満によりＰＱＢＰ−１が減少して、その結果、シナプス後部形成が減少することにより発症するアルツハイマー病等の疾患は、ＰＱＢＰ−１によって予防又は治療可能であることが示唆された。【０１１３】
（ＡＡＶ−ＰＱＢＰ−１ベクター投与によるマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの形態観察）
５．５か月齢の５ｘＦＡＤマウス（アルツハイマー病モデルマウス）又は野生型マウスに、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクター（１ｘ１０９ｖｇ／ｍｌ）又はＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクター（１ｘ１０９ｖｇ／ｍｌ）１００μｌを、ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐに充填後、マウス背部に皮下移植し、連結したガラスマイクロピペットでクモ膜下腔に７２時間持続投与した。ウイルス投与開始日より１４日後、ｔｈｉｎ−ｓｋｕｌｌ法（脳表の頭蓋骨を厚さ２０−５０μｍ程度まで薄く剥離する方法）にて、ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ  ｄｙｓｇｒａｎｕｌａｒ（ＲＳＤ）  ｃｏｒｔｅｘの第１−２層の神経細胞のスパインを二光子顕微鏡により観察した。撮影した画像から画像解析ソフトｉｍａｒｉｓ７．６．１を用いて、単位樹状長当たりのスパイン数の定量評価を行った。マウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像を図３１に示す。図３２に、マウスの大脳皮質神経細胞の樹上突起の数（ｎｕｍｂｅｒ／１０μｍ）示す。【０１１４】
なお、５ｘＦＡＤマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手した。また、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクターは、上述の「Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ−ｃＫＯマウスに対する、ＰＱＢＰ−１遺伝子の導入試験」におけるＣＭＶプロモーターからなる発現カセットを含有するＡＡＶベクタープラスミドにおいて、ＥＧＦＰ−ヒトＰＱＢＰ−１をコードするｃＤＮＡが発現するように構成されたベクターである。ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーターからなる発現カセットを含有するＡＡＶベクタープラスミドにおいて、ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡが発現するように構成されたベクターである。【０１１５】
図３１中、（ａ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された野生型のマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像であり、（ｂ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像であり、（ｃ）は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターとＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウスの大脳皮質神経細胞のスパインの画像である。図３２中、「ＷＴ＋ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ」は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された野生型のマウス（ｎ＝８）についてのグラフであり、「５ｘＦＡＤ＋ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ」は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウス（ｎ＝５）についてのグラフであり、「５ｘＦＡＤ＋ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＱＢＰ−１＋ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ」は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰウイルスベクターとＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＱＢＰ−１ウイルスベクターが投与された５ｘＦＡＤマウス（ｎ＝８）についてのグラフである。【０１１６】
図３１に示すように、５ｘＦＡＤマウスにおいては、野生型マウスよりスパインの数が減少しているのに対し、ＰＱＢＰ−１が投与された５ｘＦＡＤマウスにおいては、スパインの数が増えていることが確認された。また、図３２に示すように、５ｘＦＡＤマウスにおいては、野生型マウスより樹状突起の数が有意に減少しているのに対し、ＰＱＢＰ−１が投与された５ｘＦＡＤマウスにおいては、樹状突起の数が、野生型マウスと同程度まで有意に改善されたことが確認された。この結果により、ＰＱＢＰ−１は、シナプス後部形成を促進することで、アルツハイマー病を治療又は予防できることがわかった。
【図１】
2016002854.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016002854.tif 000041
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