(57)【要約】  本発明が解決すべき課題は、遺伝子診断により被験者における食道癌の発症リスクを判定するための新規の指標を提供することである。本発明は、被験者のＢＡＰ１遺伝子における変異を検出し、該変異が検出された被験者を食道癌の発症リスクが存在すると判定する、食道癌の発症リスクを判定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のＢＡＰ１遺伝子における変異を検出し、該変異が検出された被験者を食道癌の発症リスクが存在すると判定する、食道癌の発症リスクを判定する方法。
【請求項２】
前記変異が、ＢＡＰ１遺伝子のイントロン９の塩基配列ctctから塩基配列ctまたはtcが欠失したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＡＰ１遺伝子の変異が、生殖細胞系列の遺伝子変異である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＢＡＰ１遺伝子における変異を検出するための手段を含む、食道癌の発症リスクを判定するためのキット。
【請求項５】
前記変異が、ＢＡＰ１遺伝子のイントロン９内の塩基配列ctctから塩基配列ctまたはtcが欠失したものである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
被験者のＢＡＰ１遺伝子における変異を検出し、該変異が検出された被験者を食道癌の発症リスクが存在すると判定する、食道癌の発症リスクを判定する工程、及び
前記工程により、食道癌の発症リスクが存在すると判定された被験者に、食道癌を発見するための診断を行う工程
を含む、食道癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道癌の発症リスクを判定する方法及びそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子診断は、癌、糖尿病等の疾患のリスクを判定するのに有用であり、疾患の予防、早期発見の観点から非常に重要である。【０００３】
BAP1（BRCA1 associated protein-1）は細胞周期に関与する蛋白質であり、癌抑制遺伝子として知られている。特許文献１には、ＢＡＰ１遺伝子の変異によって、癌になりやすい旨が記載されている。乳癌患者、腎臓明細胞癌患者、卵巣癌患者において、ＢＡＰ１遺伝子のイントロン部分に生殖細胞系列変異が見つかった旨が開示されている。また、イントロン６の変異によって、スプライシング工程でエクソン７が転写されなくなる（スキップされる）ことが開示されている。しかし、BAP1と悪性黒色腫、乳癌、腎臓明細胞癌、卵巣癌以外の癌との関連性については知られていない。【０００４】
一方、食道癌のリスクファクターとしてはアルコール等が知られており、アルコール分解酵素の活性が低いと食道癌のリスクが高くなることが知られている。【０００５】
しかし、食道癌は自覚症状があまりなく早期発見の困難な癌種であり、また現在知られている遺伝子診断法でも食道癌の十分なリスク評価はできず、例えば、複数の診断法を組合わせることにより精度の高いリスク評価が可能となるため、食道癌のリスクを評価するための新たな指標の開発が所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１１２８４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決すべき課題は、遺伝子診断により被験者における食道癌の発症リスクを判定するための新規の指標を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記のような状況の下、鋭意研究を重ねた結果、多種多様な遺伝子のなかから、ＢＡＰ１遺伝子上の変異が食道癌のリスク判定の指標となり得ることを見出した。本発明は当該新規の知見に基づくものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、これまで知られていた食道癌のリスク判定で用いられてきたものとは全く異なるBAP1遺伝子上の変異を指標として用いた、食道癌のリスク判定法を提供することができる。食道がんは初期症状に乏しく、早期発見が難しいため、本発明の方法は、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において発見されたBAP1遺伝子のイントロン領域にある２塩基欠失を示す
【図２】実施例３におけるReal time PCRの結果を示す
【図３】実施例５のfunctional splicing assay法におけるプラスミド設計の概略を示す
【図４】実施例５のfunctional splicing assay法の結果を示す。（ヒト２９３T細胞におけるファンクショナルスプライシングアッセイの結果（３つの独立した試験））
【図５】実施例５のfunctional splicing assay法の結果を示す。図５上：ファンクショナルスプライシングアッセイ及び各々の転写産物の予想されるサイズ。図５下：TaqMan  probeを用いたエクソン１０の転写の定量
【図６】図６〜９は、BAP1遺伝子の塩基配列を示す（配列番号１）
【図７】図６〜９は、BAP1遺伝子の塩基配列を示す（配列番号１）
【図８】図６〜９は、BAP1遺伝子の塩基配列を示す（配列番号１）
【図９】図６〜９は、BAP1遺伝子の塩基配列を示す（配列番号１）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
食道癌の発症リスクを判定する方法
本発明は、被験者のＢＡＰ１遺伝子における変異を検出し、該変異が検出された被験者を食道癌の発症リスクが存在すると判定する、食道癌の発症リスクを判定する方法を提供する。
【００１２】
本発明において、「（食道癌の）発症リスクの判定」とは、将来食道癌を発症する可能性の有無の判定することを意味する。「判定」は、「検査」と換言することもできる。
【００１３】
被験者（被験対象）は、特に限定されるものではないが、ヒトを含む哺乳類が例示される。非ヒト哺乳類としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。本発明の判定方法の好ましい被験対象は、ヒトである。被験対象の性別、年齢、人種は特に限定されない。
【００１４】
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、２本鎖DNA、１本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００１５】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００１６】
本発明において、ＢＡＰ１遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる（図６〜９）。本発明において、食道癌の発症リスクの指標となるＢＡＰ１遺伝子の変異とは、配列番号１で表される塩基配列に対し少なくとも１個（好ましくは１〜３個）の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されていること、好ましくは少なくとも１個（好ましくは１〜３個）の塩基が欠失していることを意味する。食道癌の発症リスクの指標となるＢＡＰ１遺伝子の変異が２個以上の塩基の場合、それらの塩基は連続していることが好ましい。ＢＡＰ１遺伝子の変異としては、将来の悪性腫瘍発生のリスク診断の観点からは生殖細胞系列の遺伝子変異を指標とすることが好ましい。
【００１７】
ＢＡＰ１遺伝子は、１７個のエクソン及び１６個のイントロンを有し、本発明の好ましい実施形態において、当該ＢＡＰ１遺伝子の変異としては、９番目のイントロンであるイントロン９における変異が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、当該ＢＡＰ１遺伝子の変異としては、当該ＢＡＰ１遺伝子のイントロン９内の塩基配列ctctから塩基配列ctまたはtcが欠失したものが挙げられる。また当該変異は、Human Genome variation societyが規定する表記（http://www.hgvs.org/mutnomen/examplesDNA.html#del）のうち、nucleotide numbering coding DNA Reference Sequenceに従えば、c.784-26〜c.784-23の塩基配列ctctから塩基配列ctまたはtcが欠失したものと換言することができる。当該欠失は、塩基配列ctctの５’の塩基配列ctが欠失したものでも、塩基配列ctctの３’の塩基配列ctが欠失したものでも、塩基配列ctctの中央の塩基配列tcが欠失したものでもよい。これらの欠失により、いずれの場合もＢＡＰ１遺伝子のイントロン９内の塩基配列ctctは、塩基配列ctとなる。
【００１８】
本発明において、特に明記しない限り、塩基配列及び遺伝子変異の記載法についてはHuman Genome Variation Societyが2013年1月26日に改訂したDescription of sequence changes: examples DNA-levelのnucleotide numbering  coding DNA  Reference Sequenceに従った。ここで、nucleotide numbering  coding DNA  Reference Sequenceの表記法に従うと、エクソンに含まれる塩基配列Ｘは、５’ＵＴＲ及びイントロンを除いたコーディング領域の塩基のうちＸ番目であることを意味する。ここでＢＡＰ１遺伝子のコーディング領域は、配列番号１でいう116〜152番目、251〜280番目、386〜440番目、1388〜1520番目、1917〜2036番目、2534〜2595番目、2678〜2820番目、3087〜3165番目、3618〜3741番目、4082〜4229番目、4700〜4884番目、5408〜5541番目、6100〜6578番目、6696〜6856番目、7123〜7215番目、7320〜7392番目、及び7573〜7706番目の塩基配列で表される。従って、例えば、エクソン３の最初の塩基（配列番号１でいう３８６番目の塩基ｇ）は、nucleotide numbering  coding DNA  Reference Sequenceの表記法に従うと、c.６８と表記される。イントロンの場合、直前のエクソンの最後の塩基よりいくつ後にあるか、または直後のエクソンの最初の塩基よりいくつ前にあるかで示される。例えば、イントロン２のうち最後から１０個目の塩基（配列番号１でいう３７６番目の塩基ｃ）は、c.６８−１０と表記される。
【００１９】
また、本発明において、ＢＡＰ１遺伝子中の塩基は、特に明記しない限り、nucleotide numbering  coding DNA  Reference Sequenceを参照配列として特定した塩基を示す。従って、被験者の検体におけるＢＡＰ１遺伝子に、本発明で食道癌の発症リスク判定の指標とする変異以外にも１個又は複数の塩基の付加、欠失、置換等の変異が存在する場合も、配列番号１を参照配列として特定した遺伝子座にある塩基に対応する塩基を示す。例えば、検体のＢＡＰ１遺伝子において配列番号１でいう４０５９〜４０８１番目の塩基配列の領域に１個又は複数の塩基の付加、欠失等があっても、「検体のＢＡＰ１におけるnucleotide numbering  coding DNA  Reference Sequenceの表記法でc.784-26〜c.784-23の塩基配列」とは、配列番号１でいう４０５６〜４０５９番目のctctに対応する塩基配列を意味する（図６）。
【００２０】
ＢＡＰ１遺伝子のイントロン９内の塩基配列ctctとは、ＢＡＰ１遺伝子のイントロン９内の塩基配列tttctcctctgagcc（配列番号２）における７〜１０番目の塩基配列ctctと換言できる。
【００２１】
ＢＡＰ１における変異を検出する方法としては、特に限定されず、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲを使用する方法等が挙げられる。ＰＣＲを使用する方法としては、変異を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる方法、ＰＣＲとシークエンスとを組合わせる方法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ後に制限酵素を利用する方法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を利用する方法等が挙げられ、real time ＰＣＲ法、ＰＣＲとシークエンスとを組合わせる方法等が好ましい。
【００２２】
変異を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ法を用いる場合、ＢＡＰ１遺伝子中における所定の変異部位を含むオリゴヌクレオチドをプライマーの一方に用いる。そして、当該プライマーを用い、ＢＡＰ１遺伝子が所定の変異部位を有する場合に、ＢＡＰ１遺伝子中の当該変異部位を含む部分が増幅され、かつ、ＢＡＰ１遺伝子が所定の変異部位を有さない場合に当該部分が有意に増幅されないような条件をあらかじめ設定しておく。当該設定された条件で検体をＰＣＲにかけ、ＢＡＰ１遺伝子中の当該変異部位を含む部分が増幅されるか否かで変異の有無を決定する。当該方法においてreal time ＰＣＲ法を用いると、短時間で評価ができ、簡便なため、特に初期のスクリーニング等として有効である。real time ＰＣＲ法を用いる場合には、例えば、ＲＦＵ（相対蛍光単位）等により示される目的のヌクレオチドの濃度が閾値を超えるまでのサイクル数を指標とし、当該サイクル数があらかじめ設定したcut off値よりも小さい場合に変異を有するとし、当該サイクル数があらかじめ設定したcut off値以上の場合もしくは目的のヌクレオチドの濃度が閾値を超えなかった場合に変異を無とする。
【００２３】
ＰＣＲとシークエンスとを組合わせる方法としては、所定の変異をはさむ位置にプライマーセットを設計し、当該プライマーを用いて検体をＰＣＲにかけ、増幅したヌクレオチドの塩基配列をシークエンスにより決定する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明において、変異の検出に用いるプローブ又はプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの塩基数は、15〜50塩基、好ましくは、15〜40塩基、より好ましくは18〜23塩基、より好ましくは19〜22塩基である。
【００２５】
各検出方法に用いる検体は、本発明の判定方法の被験対象に由来する。検体は被験対象に由来する血液検体を好適に使用することができ、血液検体には、例えば血液（全血）及び血液に由来する血清、血漿、白血球などが含まれる。本発明の好ましい態様の一つにおいて、検体は全血または白血球である。
【００２６】
検体は、当業者に公知の方法で採取することができる。例えば、血液は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。白血球は、血液から血清および血餅を除去した部分であり、例えば、全血を遠心分離し、中間層としてのbuffy coatとして得ることができる。検体はこれらのものに限られず、公知の方法により全血から抽出されたgenomic DNAも対象となり得る。検体は、被験対象の動脈由来、静脈由来、末梢血管由来のいずれであってもよい。
上記方法により、食道癌の発症リスクが存在すると判定された被験者には、上記ＢＡＰ遺伝子の変異を検出する方法以外の方法で食道癌の診断を行うことが有効である。例えば、上部消化管内視鏡検査、  上部消化管透視（バリウム）検査等の診断方法を行うことが有効であり、これらの診断方法を定期的に行うことにより食道癌の早期発見が期待できる。
従って、本発明は、被験者のＢＡＰ１遺伝子における変異を検出し、該変異が検出された被験者を食道癌の発症リスクが存在すると判定する、食道癌の発症リスクを判定する工程、及び
前記工程により、食道癌の発症リスクが存在すると判定された被験者に、食道癌を発見するための診断を行う工程
を含む、食道癌の診断方法も提供する。
【００２７】
食道癌の発症リスクを判定するためのキット
本発明は、ＢＡＰ１遺伝子における変異を検出するための手段を含む、食道癌の発症リスクを判定するためのキットを提供する。
【００２８】
ＢＡＰ１遺伝子における変異を検出するための手段としては、特に限定されないが、例えば、前述したサザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲを使用する方法等に用いる手段を挙げることができる。好ましくは、当該ＢＡＰ１遺伝子における変異を検出するための手段には、プライマー又はプローブとして、変異を有するＢＡＰ１遺伝子における当該変異部位を含むオリゴヌクレオチドが含まれ得る。
【００２９】
また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えば検体を採取するための道具（例えば、注射器等）、ポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これに限定されない。上記判定方法を行うための手順を書き記した書面等を含むこともできる。
【実施例】
【００３０】
実施例１
本発明者は、倫理委員会承認の元に（承認番号；2005-124、2008-31、2011-80、2011-432、2012-442）食道扁平上皮癌患者69名の切除標本（腫瘍部および正常粘膜部）からgenomic DNAを抽出し研究を行ってきた。具体的には、直接シークエンス法により、上記末梢血白血球由来または切除標本中のBAP1遺伝子中の変異を調べた。【００３１】
この研究の結果、これまでに報告の無い、BAP1遺伝子のイントロン領域にある２塩基欠失を発見した（図１）。これはイントロン９に存在し、イントロン９とエクソン１０のexon-intron junctionの上流２３塩基のCTの欠失である。尚、２５塩基上流のCTまたは２４塩基上流のTCの欠失でも結果として同じ塩基配列になるため、これら３種類のいずれかの欠失が生じていることが分かる。【００３２】
実施例２  real time PCR法によるスクリーニング法の確立
real time PCR法（Biorad社）を応用した迅速で簡便なスクリーニング法を確立した。具体的には、実施例１で示した２塩基欠失に特異的に反応するPCRプライマー（5’-GGGTCTACCCTTTCTCCTGA-3’（配列番号３）及び5’-GTCCACAAGAGGTCCCAAAC-3’（配列番号４））を作成し、この変異を有するＤＮＡ（ポジティブコントロール、Ｎｏ．１２２の検体）又はこの変異を有さない正常配列のDNA（Ｎｏ．１７０の検体）をtemplateとして、アニール温度を６０℃から７５℃まで変動させて、realtimePCR解析をおこなった。その結果、ＲＦＵが閾値を超えるまでのサイクル数を３０回でcut offとするとアニール温度が69℃で変異ありのDNAで陽性、変異無しの正常塩基配列のDNAで陰性の結果を得た。なお、このスクリーニング方法が有用であることは直接シークエンス法によって確認することが出来た。すなわち、下記実施例３において2例のPCR陽性例ではいずれも当該2塩基欠失を確認し、PCR陰性のうち，ランダムに抽出した29例はいずれも正常の塩基配列であった。【００３３】
なお，このRealtimePCRの詳細は以下の通りである：
反応液：１０μｌ
反応液組成：テンプレートＤＮＡ20ｎｇ（ナノグラム）、プライマーＤＮＡ（２０microM）各々0.25μL、SsoAdvanced SYBR Green Supermix  5 microL（Bio-rad  社製）
温度設定：
1: 95.0℃ for 3:00
2: 95.0℃ for 0:01
3: 69.0℃ for 0:30
Plate Read
4: GOTO 2, 39 more times
実施例３
上記条件に従い、実施例１及び２で検査したのとは別の食道扁平上皮癌患者２１７例（各検体をＳＴ１〜ＳＴ２１７とする）の末梢血白血球由来のgenomic DNAをスクリーニングした。Real time PCRの結果を図２に示す。その結果、上記ポジティブコントロールとしたＮｏ．１２２の検体と、ほぼ同じサイクル数でＳＴ２８とＳＴ１６６で陽性の結果を得た。尚、この２例についてはdirect sequence法により、２塩基欠失を持つことを確認した。食道扁平上皮癌患者２１７例中、ＳＴ２８及びＳＴ１６６以外の２１５例については、Real time PCRの結果、陰性であった。陰性例はランダムに選択した29例で同様にシークエンスを行い、２塩基欠失を持たないことを確認した。【００３４】
実施例４
前述の実施例１〜３に示すように、食道扁平上皮癌患者２８６名中、４名において、イントロン９とエクソン１０のexon-intron junctionの上流２３塩基のCTの欠失が見られた。【００３５】
一方、米国政府機関（National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine. 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA、以下NCBI）の発行する遺伝子多型の検索サイト（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=SNP&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）で検索したが、この変異の報告は正常人1089名ではない。この情報から統計学的解析を行うとChi二乗検定ではp<0.001、Fisherの正確法検定ではp=0.002で有意に食道扁平上皮癌患者と相関があるとの結果であった。【００３６】
以上の結果から、この遺伝子変異（あるいは多型）を上記に示した迅速かつ簡便な方法で末梢血白血球由来のgenomic DNAで検出することにより、将来の食道扁平上皮癌発生のリスクを明らかにすることが出来ることが分かる。高リスクと診断されれば、内視鏡検査などにより早期発見が可能となり、その結果として、リスクが高く、また術後の愁訴も極めて多い食道切除術の回避、あるいは副作用のリスクも高く、そのための支持療法や抗がん薬や分子標的薬に代表される高額医薬品による医療費の高騰に繋がる放射線化学療法の抑制も可能となる。個人および社会にとって，極めて意義の大きい発見であると考えられる。【００３７】
実施例５
前述のイントロン９における変異は、Genomeにおける位置からはsplicingに影響を与える可能性が予想される。これを直接、評価するために、functional splicing assay法を使用し（図３ および参考文献；Determination of splice-site mutations in Lynch syndrome (hereditary non-polyposis colorectal cancer) patients using functional splicing assay Hiromu Naruse et al. Familial Cancer  DOI 10.1007/s10689-009-9280-6 ）、このイントロン内の２塩基欠失の生物学的意義を評価した。上記文献に沿って、functional splicing assayを行い、電気泳動で評価したところ、２塩基欠失を導入した場合、正常の塩基配列をもつプラスミドに比べて、エクソン１０の転写効率が著しく低下することが示された（図４及び５）。
以上から病的な意義、すなわち、２塩基欠失ではエクソン１０の転写効率が低下しているために食道扁平上皮癌発癌の可能性が高まっていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
食道癌を含め癌の早期発見に対する要望は非常に大きいところ、本発明は、新規な食道癌リスクの判定方法を提供するものであるため、産業利用上、非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号３はプライマーである。【００４０】
配列番号４はプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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