(57)【要約】  本発明は、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する技術を提供することを主な課題とする。  前記課題は、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属する優性側Ｓハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持させつつ、花粉因子ＳＰ１１を不活性化させることにより解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自家不和合性アブラナ科植物から自家和合性アブラナ科植物を作出する方法であって、
アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属するＳIハプロタイプの逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持させつつ、花粉因子ＳＰ１１を不活性化させることを含む、前記作出方法。
【請求項２】
前記アブラナ科植物がＢｒａｓｓｉｃａ属植物である、請求項１に記載の作出方法。
【請求項３】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物が、アブラナ、ハクサイ、カブ、コマツナ、ミズナ、チンゲンサイ、ノザワナ及びパクチョイからなる群より選択されるいずれか１種のＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａである、請求項２に記載の作出方法。
【請求項４】
下記工程（１ａ）を含む自家和合性アブラナ科植物の育種方法：
（１ａ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程。
【請求項５】
下記工程（２ａ）を更に含む、請求項４に記載の育種方法：
（２ａ）前記工程（１ａ）で得られた自家和合性株のアブラナ科植物を自殖すること、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行うことにより、Ｓ0ハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程。
【請求項６】
前記工程（２ａ）を５〜７回繰り返す、請求項５に記載の育種方法。
【請求項７】
下記工程（１ｂ）〜（３ｂ）を含む、アブラナ科植物のＦ１ハイブリッド育種用親株の育種方法：
（１ｂ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程；
（２ｂ）前記工程（１ｂ）で得られた自家和合性のアブラナ科植物を自殖する、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行う工程；及び
（３ｂ）前記工程（２ｂ）において得られた株からクラスＩＩに属するＳIIハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程。
【請求項８】
前記工程（２ｂ）を５〜７回繰り返す、請求項７に記載の育種方法。
【請求項９】
下記工程（１ｃ）〜（３ｃ）を含む、自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法であって、
（１ｃ）被験アブラナ科植物からＤＮＡ試料を調製する工程；
（２ｃ）前記工程（１ｃ）で調製されたＤＮＡ試料から、逆位反復配列及びＳＰ１１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（３ｃ）前記工程（２ｃ）で増幅したＤＮＡ断片の分子量又は塩基配列に基づいて、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されている株を選択する工程。
【請求項１０】
自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング用キットであって、
アブラナ科植物における自家不和合性遺伝子座上のクラスＩに属するＳIハプロタイプにおいて、
（ｉ）逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持していることを検出可能な試薬；及び
（ｉｉ）花粉因子ＳＰ１１が不活性化されていることを検出可能な試薬
を含む、前記キット。
【請求項１１】
自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有するアブラナ科植物の株と、自家不和合性遺伝子座において、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有するアブラナ科植物の株の、
自家和合性アブラナ科植物の作出のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換することを可能とする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ科植物には、アブラナ、カブ、コマツナ、ハクサイ、チンゲンサイ、ダイコン等の植物体の全てが食用とされる植物が多く含まれるが、例えばアブラナはナタネ油の原料として種子に高い利用価値を有する植物も含まれる。従来、ナタネ油は食用や灯火燃料とされてきたが、近年ではバイオディーゼルの原料としても注目されている。【０００３】
現在、ナタネ油の生産には、主に西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）が利用されている。西洋アブラナは、自家和合性であり種子生産性にも優れていることから、北米やカナダでは盛んに栽培されているが、他の地域での生育・生産効率は良好とは言えず品種改良が必要とされている。しかしながら、西洋アブラナはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）とキャベツ類（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）が自然交配して生じた複二倍体種であるとされており、遺伝的多様性に乏しいため、交配によって有益な遺伝子を導入する従来の育種法を適用することは困難であった。【０００４】
一方、我が国においては古来ナタネ油の原料としてアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）が利用されてきた。アブラナは遺伝的多様性に富み、環境適合性や種子生産性の向上等の観点で有利な株を作出できる可能性を有している。しかし、アブラナは自家不和合性であるため単独系統で種子をつけることがなく、集団栽培で昆虫等の自然交配に頼って系統を維持する必要があることから、安定的に特定の系統を維持することが難しい。また、種子をつけるには他個体との交配が必要であるため種子生産性が低く、交配を行う集団全体に品種改良を加えなければならず、優良系統の育種は困難であった。【０００５】
このような背景から、アブラナをはじめとする自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換することによって自殖種子稔性を付与し、その遺伝的多様性を利用して効率的に優良品種を作出、維持することが可能な技術が求められていた。【０００６】
ここで、自家不和合性とは、植物が持つ自家受粉を抑制する機構の１つである。この機構がはたらくことによって、受粉の際に雌ずいと花粉の間で自他の認識反応が起き、他個体の花粉のみ受精が可能となる。即ち、自家不和合性の植物では、雌しべと花粉の遺伝子型が同じ場合、花粉が柱頭に到達しても花粉の発芽、粉管の伸長、胚珠の受精、受精胚の生育のいずれかの段階が停止するため、種子が形成されない。多くの植物において、このような自家不和合性の機構は、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）上に連鎖して存在する一連の複対立遺伝子群（Ｓ1、Ｓ2、…Ｓnハプロタイプ）によって制御されている。アブラナ科植物においては、Ｓハプロタイプはリガンドとなる花粉因子ＳＰ１１と、レセプターとして機能する雌ずい因子ＳＲＫをコードしており、同一Ｓ遺伝子上のＳＰ１１とＳＲＫが特異的に相互作用することによって自己の花粉が識別され、不和合反応が生じる。更に、Ｓ遺伝子座上には、ＳＲＫタンパク質と非常に類似した塩基配列を持っており、共同レセプターとして機能して自家不和合性反応を拡大するとされている柱頭タンパク質（ＳＬＧ：Ｓ  ｌｏｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が存在していることも知られている。【０００７】
アブラナ科植物には１００以上ものＳハプロタイプが存在し、中には２つのハプロタイプ間で優劣の関係が生じる場合がある。このような場合、クラスIとして分類される優性側Ｓハプロタイプ上の逆位転写配列（ＳＭＩ）の影響により、クラスＩＩとして分類される劣性側Ｓハプロタイプ上のＳＰ１１発現調節領域がＤＮＡメチル化を受け、劣性側Ｓハプロタイプの発現が完全に抑制されることが明らかとなっている（例えば、非特許文献１及び２、ならびに図１を参照）。【０００８】
このように、自家不和合性のメカニズムについて様々な知見が得られているが、自家不和合性のアブラナ科植物を効率的に自家和合性に変換するための実用的で簡便な手法については知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．（２０１２）５４，１２０−１２８
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｔａｒｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４６６，１９  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０，９８３−９８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する技術を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、アブラナの自家和合性変異株を解析した結果、アブラナ科植物における自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）上のクラスＩに属するＳハプロタイプにおいて、逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持したまま花粉因子ＳＰ１１を欠失したＳ0ハプロタイプ（Ｓ0株）を見出した。更に、本発明者らはこのＳ0ハプロタイプを持つ株と、自家不和合性遺伝子座上のクラスＩＩに属するＳハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物を交配させることにより、Ｆ１後代は花粉因子を発現しない自家和合性株となり、自殖種子稔性を有するアブラナが得られることを見出した。【００１２】
本発明は以上の知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。即ち、本発明は以下に掲げる態様の自家和合性アブラナ科植物の作出方法及び育種方法、アブラナ科植物のＦ１ハイブリッド育種用親株の育種方法、自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法、ならびにスクリーニング用キット等を提供する。【００１３】
項１．自家不和合性アブラナ科植物から自家和合性アブラナ科植物を作出する方法であって、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属するＳIハプロタイプの逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持させつつ、花粉因子ＳＰ１１を不活性化させることを含む、前記作出方法。
項２．前記アブラナ科植物がＢｒａｓｓｉｃａ属植物である、項１に記載の作出方法。
項３．前記Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物が、アブラナ、ハクサイ、カブ、コマツナ、ミズナ、チンゲンサイ、ノザワナ及びパクチョイからなる群より選択されるいずれか１種のＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａである、項２に記載の作出方法。
項４．下記工程（１ａ）を含む自家和合性アブラナ科植物の育種方法：
（１ａ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程。
項５．下記工程（２ａ）を更に含む、項４に記載の育種方法：
（２ａ）前記工程（１ａ）で得られた自家和合性株のアブラナ科植物を自殖すること、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行うことにより、Ｓ0ハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程。
項６．前記工程（２ａ）を５〜７回繰り返す、項５に記載の育種方法。
項７．下記工程（１ｂ）〜（３ｂ）を含む、アブラナ科植物のＦ１ハイブリッド育種用親株の育種方法：
（１ｂ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程；
（２ｂ）前記工程（１ｂ）で得られた自家和合性のアブラナ科植物を自殖する、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行う工程；及び
（３ｂ）前記工程（２ｂ）において得られた株からクラスＩＩに属するＳIIハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程。
項８．前記工程（２ｂ）を５〜７回繰り返す、項７に記載の育種方法。
項９．下記工程（１ｃ）〜（３ｃ）を含む、自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法であって、
（１ｃ）被験アブラナ科植物からＤＮＡ試料を調製する工程；
（２ｃ）前記工程（１ｃ）で調製されたＤＮＡ試料から、逆位反復配列及びＳＰ１１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（３ｃ）前記工程（２ｃ）で増幅したＤＮＡ断片の分子量又は塩基配列に基づいて、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されている株を選択する工程。
項１０．自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング用キットであって、
アブラナ科植物における自家不和合性遺伝子座上のクラスＩに属するＳIハプロタイプにおいて、
（ｉ）逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持していることを検出可能な試薬；及び
（ｉｉ）花粉因子ＳＰ１１が不活性化されていることを検出可能な試薬
を含む、前記キット。
項１１．自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有するアブラナ科植物の株と、自家不和合性遺伝子座において、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有するアブラナ科植物の株の、自家和合性アブラナ科植物の作出のための使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプのＳＰ１１遺伝子に対する逆位反復配列（ＳＭＩ）は保持されるためにクラスＩＩ−ＳＰ１１遺伝子の発現が抑制され、且つクラスＩに属するＳIハプロタイプのＳＰ１１遺伝子が不活性化されていることから、いずれの花粉因子ＳＰ１１も発現しないため自家和合性を有する株を得ることができる。また、本発明においては、クラスＩのＳＰ１１遺伝子を標的として不活性化させるため、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株を交配相手として交配を重ねる毎に自家和合性株が得られる割合が高くなる。従って、本発明の自家和合性アブラナ科植物の作出方法によれば、効率的且つ確実に自家和合性株に変換することが可能である。【００１５】
また、本発明の自家和合性アブラナ科植物の育種方法によれば、Ｆ１世代株が自家和合性を有することから、１回の交配によって自家和合性のアブラナ科植物（Ｓ0ＳII株）を得ることができる。このようにして得られる自家和合性アブラナ科植物は一般に雑種強勢により生育が良好であり、鞘が大きく、種子生産性の高いものとなる。そのため、本発明の技術を遺伝子資源に富む自家不和合性のアブラナ科植物に適用し、その中から種子生産性の高い自家和合性株を選抜することによって、食用およびバイオディーゼルの原料用に従来よりも少ない労力で効率よくナタネ種子を提供することができる。【００１６】
なお、種子生産性の高い株の選抜の過程においては、自家和合性を有することから蕾受粉などの受粉作業は必要とせず、自然に単独で種子をつける株の中から生産性の高い株を選抜することができる。単独で種子をつける自家和合性株の選抜を５〜７世代に渡り繰り返すことにより、種子生産性などの形質を固定できると共にＳ0ハプロタイプに関してホモ接合体である自家和合性株（Ｓ0Ｓ0株）の割合が増加することが期待され、得られたＳ0Ｓ0株は、以降自家和合性を保持し自殖によって単独系統で維持することが可能となる。【００１７】
また、本発明をアブラナ科植物のＦ１ハイブリッド育種用親株の育種によれば、蕾受粉によらず、劣性側Ｓハプロタイプをホモで有する近交系統を得ることができる。このような劣性側Ｓハプロタイプをホモで有する近交系統は、雑種強勢を目的としたＦ１ハイブリッド種子生産のための親株として利用することができる。【００１８】
更に、本発明によれば、効率的に自家和合性株をスクリーニングすることが可能な自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法、及び当該スクリーニング方法を簡便に実施することができるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＳＰ11対立遺伝子間の優劣性制御機構を表す図である。
【図２】Ｓ0ハプロタイプによる自家和合性発現機構を表す図である。
【図３】自殖種子稔性を持つアブラナの作出例を示す代表写真である。
【図４】実施例において作出されたアブラナにおいて１鞘当たりに採取された種子数を表すグラフ、及び各株の代表写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（１）自殖種子稔性アブラナ科植物の作出方法
本発明の自殖種子稔性アブラナ科植物の作出方法は、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）において、クラスＩに属する優性側Ｓハプロタイプの逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持させつつ、花粉因子ＳＰ１１を不活性化させることを特徴とし、これにより自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換し、自殖種子稔性を付与することができる。
【００２１】
本発明においてアブラナ科植物（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）とは、双子葉植物に分類され、十字状に並んだ４枚の花弁を有することを特徴とする植物を指す。本発明においてアブラナ科植物としては、例えばＢｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）属植物、Ｒｐｈａｎｕｓ（ダイコン）属植物、Ｗａｓａｂｉａ（ワサビ）属植物、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ（オランダガラシ）属植物等が挙げられ、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ属植物が例示される。
【００２２】
Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物としてより具体的には、アブラナ（在来ナタネ）、ハクサイ、カブ、コマツナ、ミズナ、チンゲンサイ、ノザワナ、パクチョイ等のＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ；キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ等のＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ；セイヨウカラシナ、タカナ等のＢｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａが例示される。また、Ｒｐｈａｎｕｓ属植物としては、ダイコン、ハツカダイコン等が例示され、Ｗａｓａｂｉａ属植物としてはワサビ等が例示され、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ属植物としてはクレソン等が例示される。
【００２３】
これらの植物の中でも、遺伝的多様性に富むことからＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａがより好ましいものとして挙げられ、アブラナ（在来ナタネ）が更に好ましい植物として例示される。
【００２４】
本発明においてアブラナ科植物としては、植物全体、花粉、種子；葉、茎、根、花器、成長点、種子、胚芽等の器官；表皮、師部、柔組織、木部、維管束等の組織；プロトプラスト、カルス等の植物培養細胞又は組織等のいずれもが包含される。
【００２５】
逆位反復配列（ＳＭＩ）とは、花粉因子ＳＰ１１をコードする遺伝子の近傍（例えば、ＳＰ１１遺伝子の上流又は下流約１００ｋｂ内）に存在する下記配列番号１で示される２４塩基を含む配列を指す。
5'-ATGTTTACGTGTAAAATAGTTACA-3'（配列番号１）
【００２６】
例えば、Ｓ9ハプロタイプやＳ12ハプロタイプについては、遺伝子上での逆位反復配列の位置が特定されており、Ｓ9ハプロタイプについてはＳＬＧ遺伝子の非翻訳領域（ｕｔｒ）から３．６ｋｂ下流、Ｓ12ハプロタイプについてはＳＬＧ遺伝子の非翻訳領域（ｕｔｒ）から３ｋｂ下流に存在している。その他のＳハプロタイプについては未だ位置が特定されていないが、前記配列番号１で示される２４塩基の存在に基づいて判別することが可能である。
【００２７】
アブラナ科植物のＳハプロタイプ間の優劣関係は次のようなメカニズムにより生じると考えられている。即ち、クラスＩ  ＳIハプロタイプ上に存在する逆位反復配列に基づいて２４ヌクレオチドからなる低分子ＲＮＡが作られ、相同性を有するクラスＩＩに属するＳIIハプロタイプのＳＰ１１遺伝子発現調節領域がメチル化を受けて、クラスＩＩ  ＳＰ１１の発現が数万分の１に抑制される。一方、クラスＩＩ  ＳIIハプロタイプの逆位反復配列からもクラスＩ  ＳIハプロタイプのＳＰ１１遺伝子発現調節領域に相同な低分子ＲＮＡが合成されるものの、１塩基置換によって標的部位との相同性が低下しており、ＳＰ１１遺伝子発現調節領域をメチル化しない。この機構により自他識別反応において優劣関係が生じる（図１を参照）。
【００２８】
本明細書において、クラスＩに属するＳIハプロタイプを優性側Ｓハプロタイプと表記することがある。また、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを劣性側Ｓハプロタイプと表記することがある。
【００２９】
花粉因子ＳＰ１１は葯タペート組織に発現し、レセプターである雌ずい因子ＳＲＫによって認識され、両者が同一の遺伝子型である場合に自家不和合性となる。花粉因子ＳＰ１１をコードする遺伝子のＳ遺伝子座上の位置や転写方向は各Ｓハプロタイプによって異なっており、明確に特定されていないものが多いが、例えば、Ｓ8、Ｓ9、Ｓ12ハプロタイプについてはＳＰ１１遺伝子のＳ遺伝子座上における位置が特定されており、いずれも雌ずい因子ＳＲＫとＳＬＧの間に存在する（Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７，ｎｏ．４，２０００，１９２０−１９２５を参照）。ＳＰ１１遺伝子の各Ｓハプロタイプの塩基配列は既に特定されており、公知のデータベースに登録されている。例えば、Ｓ8ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０３５５０４．１、Ｓ9ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０２２０７８．１、Ｓ12ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０３５５０３．１、Ｓ52ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０３５５０５．１、Ｓ60ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０６７４４６．１として、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information、US）に登録されている。従って、これらの登録されている配列に基づいてＳＰ１１遺伝子のＳ遺伝子座上の位置等を特定することができる。
【００３０】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化の態様は、ＳＰ１１がＳＲＫに認識されない態様である限り特に限定されないが、本発明においてはＳＰ１１遺伝子又はタンパク質の発現低下は含まれず、ＳＰ１１遺伝子が発現しない又は正常なＳＰ１１タンパク質が生成されないことを指すものとする。花粉因子ＳＰ１１の不活性化は、従来公知の遺伝子工学的手法に基づいてＳＰ１１をコードする遺伝子を改変することにより実現され得る。遺伝子改変は、遺伝子そのもの対して行われてもよいが、転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等の任意の段階について行うことができる。ＳＰ１１の不活性化の態様としては、例えばＳＰ１１をコードする遺伝子をノックアウト（若しくはノックイン）する場合、ＳＰ１１を構成するアミノ酸配列に変異が導入された結果、ＳＰ１１がＳＲＫに認識されない場合等が挙げられる。
【００３１】
ＳＰ１１遺伝子をノックアウト（若しくはノックイン）する手段としては、ＳＰ１１遺伝子からのｍＲＮＡの転写が起こらないものであれば特に限定されず、従来公知の方法を採用することができるが、例えば以下の方法が挙げられる。即ち、遺伝子改変の対象となる植物（即ち、少なくとも逆位反復配列（ＳＭＩ）とＳＰ１１遺伝子を有している自家不和合性アブラナ科植物）から常法に従ってＳＰ１１遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を単離し、（ａ）ＳＰ１１遺伝子のプロモーター領域やエキソン部分に選択マーカー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等）を含むＤＮＡ断片を挿入してプロモーター又はエキソンの機能を破壊する方法；（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）やＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮｓ）などを利用してＳＰ１１遺伝子を切断し当該遺伝子に変異を導入させる方法；（ｃ）ＳＰ１１タンパク質をコードする領域中に終始コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にする方法；（ｄ）転写領域中への転写終結シグナル（例えば、ポリアデニル化シグナル等）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にするように構築されたＤＮＡ断片を野生株の遺伝子座に組み込ませる方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
また、変異原処理によってＳＰ１１遺伝子に対して点突然変異、欠失又はフレームシフト突然変異等の機能欠損変異を導入することにより、遺伝子レベルでＳＰ１１を不活性化することができる。変異原処理は公知の手段を採用すればよいが、放射線照射（Ｘ線、γ線等）、重イオンビーム等の照射；メタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン等の薬剤による処理が例示される。本発明においては、ＳＰ１１遺伝子を欠失させる遺伝子改変手段を採用することが望ましい。
【００３３】
ＳＰ１１を構成するアミノ酸配列に変異を導入して、ＳＰ１１がＳＫＲに認識されないようにする方法としては、Ｓハプロタイプ間で保存性の高いアミノ酸残基に変異を導入する方法が挙げられる。ＳＰ１１タンパク質を構成するアミノ酸残基においては、８つのシステイン残基、及び２つのアミノ酸残基（具体的には、Ｎ末から第２番目のシステイン残基の２残基前にあるグリシン残基と、同第３番目のシステイン残基の４残基後にある芳香族アミノ酸残基（フェニルアラニン残基又はチロシン残基））が高度に保存されている（例えば、Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３６３８９−３６３９６，２００３等を参照）。従って、当該箇所をコードする塩基配列に変異を導入することによって、完全なＳＰ１１タンパク質の合成が阻害され、ＳＰ１１が不活性化され得ると考えられる。変異の導入方法は、ＳＰ１１が不活性化され得る限り特に限定されず、従来公知の方法に従えばよいが、例えば部位特異的変異導入法等が挙げられる。
【００３４】
各ＳハプロタイプのＳＰ１１タンパク質について、アミノ酸配列は既に特定されており、公知のデータベースに登録されている。例えば、Ｓ8、Ｓ9、Ｓ12、Ｓ52、Ｓ60ハプロタイプについて以下にアミノ酸配列を具体的に示す。
【００３５】
S8-SP11（Gen Bank; BAA92246.1：配列番号２）;
MKSAVYALLCFIFIVSGHIQELEANLMKRCTRGFRKLGKCTTLEEEKCKTLYPRGQCTCSDSKMNTHSCDCKSC
S9-SP11（Gen Bank; BAA85458.1：配列番号３）;
MKSAIYALLCFIFIVSSHVQEVEANLRKTCVHRLNSGGSCGKSGQHDCEAFYTNKTNQKAFYCNCTSPFRTRYCDCAIKCKVR
S12-SP11（Gen Bank; BAA92245.1：配列番号４）;
MKSAIYALLCFIFIILSRSQELTEVGADKQQCKKNFPGHCETSERCENTYKRLNKKVFDCHCQPFGRRRLCTCKC
S52-SP11（Gen Bank; BAA92247.1：配列番号５）;
MKSVLYALLCFIFIVSSHAQDVEANLMNRCTRELPFPGKCGSSEDGGCIKLYSSEKKLHPSRCECEPRYKARFCRCKIC
S60-SP11（Gen Bank; BAB86353.1：配列番号６）;
MRYATSIYTFLTNIHYLCFIFLILTYVQALDVGAWKCPEGIVYPSPISGRCINSRSTECKKHYEVEGQNVTNCRCDTYSMQNPARITCYCCKVKS
【００３６】
前記アミノ酸配列中に示される「Ｃ」はＳハプロタイプ間で保存されている８つのシステイン残基を表し、「Ｇ」及び「Ｙ」はＳハプロタイプ間で保存されているグリシン残基及びチロシン残基をそれぞれ表す。
【００３７】
上述のような保存性の高いアミノ酸配列に変異を有するＳＰ１１をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターにより形質転換を行い、花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたアブラナ科植物を得ることができる。当該発現ベクターにおいては、変異が導入されたＳＰ１１をコードするＤＮＡ断片がプロモーターに発現可能に連結されていてもよい。
【００３８】
ＳＰ１１遺伝子を遺伝子工学的手法により改変させるためには葯タペート組織において発現させる必要がある。従って、対象植物の細胞において機能し得るプロモーターとしては、植物体の葯のタペート組織で発現する遺伝子プロモーターであれば特に限定されず、例えばＳＰ１１プロモーターが挙げられる。また、発現ベクターは、必要に応じて公知のターミネーター領域、エンハンサー等のシス調節エレメント、薬剤耐性遺伝子等を有していてもよい。また、当該発現ベクターは、大量調製を容易にするため、大腸菌での自立複製を可能にする複製起点、大腸菌での選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）等を含んでいてもよい。
【００３９】
植物を形質転換する方法として、従来公知の方法を採用することができ、例えば、形質転換の対象となる植物にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の細胞壁分解酵素処理を行って、対象植物の細胞からプロトプラストを単離し、これにＰＥＧ法、リポソーム法、エレクトロポレーション法等により目的のＤＮＡ断片を導入してプロトプラストから植物体へ再分化させることにより形質転換された植物体を得ることができる。また、細胞壁を有する対象植物の細胞に対し、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の直接導入法を用いてもよい。更に、アグロバクテリウムによる感染を利用して形質転換を行うこともできる。目的のＤＮＡ断片を導入する場合、細胞が由来する植物体の部位は特に限定されず、採用する導入方法に従って適切な器官、組織、又は細胞を選択すればよいが、例えば、胚、胚軸切片、単離した成長点等が挙げられる。例えば、アグロバクテリウムによる感染を利用する形質転換方法としては、Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７：１２７−１３に記載される方法を採用することができる。
【００４０】
本発明の作出方法により得られる自家和合性アブラナ科植物は、従来公知の生育条件に従って生育させることができ、使用する土壌、肥料等について植物の種類、生育状況に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
アブラナ科植物を生育させる条件としては、例えば、温度４〜３０℃、好ましくは２０〜２３℃；光量４００〜１００，０００Ｌｕｘ、好ましくは１，０００〜５０，０００Ｌｕｘ；照射時間８〜２４時間、好ましくは１２〜１４時間；生育日数２０〜１５０日、好ましくは３０〜９０日が挙げられる。
【００４２】
また、アブラナ科植物の種子を播種する前に種子に対して消毒、予備吸水等の前処理を行ってもよい。消毒処理は、従来公知の方法に従えばよいが、例えば５％次亜塩素酸ソーダ溶液中に、１８〜２５℃で１０〜３０分間浸漬することにより行うことができる。予備給水処理についても従来の方法に従って行うことができるが、例えば、１８〜２５℃において水に１〜２４時間浸漬する方法が挙げられる。予備給水は、種子に水分を散布することにより行ってもよく、１８〜２５℃の水を種子１００粒当たり１０〜１００ｍｌ散布し、１〜２４時間放置してもよい。また、必要に応じて低温処理を行ってもよい。低温処理の条件についても従来公知の条件から適宜設定され得るが、例えば、種子を１〜５℃の環境下で１〜２か月間生育させることにより実施することができる。
【００４３】
このようにして作出される自家和合性アブラナ科植物において、逆位反復配列を保持しつつ、花粉因子ＳＰ１１が不活性化されていることを確認する方法としては、得られた植物個体から常法に従ってＤＮＡ試料を調製し、これを鋳型としてプライマーにより逆位反復配列及びＳＰ１１をそれぞれコードするＤＮＡ断片の増幅反応を行い、得られた増幅産物から分子量及び塩基配列に基づいて判定する方法が挙げられる。
【００４４】
植物個体からのＤＮＡ試料の調製は公知の方法を適宜使用して実施することができ、例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿による方法、ガラスビーズを用いる方法等が挙げられる。より簡便には、市販のＤＮＡ抽出試薬又はＤＮＡ抽出キットを使用して調製してもよい。ＤＮＡ試料を調製する際に使用される植物体の部位は特に限定されないが、例えば葉等が挙げられる。
【００４５】
調製されたＤＮＡ試料から逆位反復配列及びＳＰ１１をコードするＤＮＡ断片を得る方法についても、従来公知の方法に従えばよく、プライマーを利用して逆位反復配列及びＳＰ１１をコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅させて得ることができる。
【００４６】
プライマーは、標的のＤＮＡ断片の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズして当該ＤＮＡ断片を増幅することが可能な特有の配列を有するオリゴヌクレオチドであればよい。このようなプライマーは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のプログラム及びデータベースを利用して標的とする遺伝子の配列情報を取得し、これに基づいて適宜設計、合成することができる。プライマーの塩基配列長としては、通常３００〜１５００ｂｐ、好ましくは３００〜１０００ｂｐ、更に好ましくは３００〜５００ｂｐが挙げられる。
【００４７】
クラスＩに属するＳIハプロタイプについて、逆位転写配列（ＳＭＩ）が保持されつつＳＰ１１遺伝子が不活性化されていることを確認するために使用されるプライマー配列の例を以下に示す。なお、ＳＰ１１遺伝子については、Ｓ8ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子に対するプライマーを例に具体的な塩基配列を以下に示す。
【００４８】
S8ハプロタイプのSP11遺伝子の存在を確認するプライマーセット
S8sp11-genome-Forward（配列番号７）; 5'-CTGCAAGTAAAAGAGAGAATCTTTTATCAC-3'
S8sp11-genome-Reverse（配列番号８）; 5'-GCACCGCTTCATCAGATTTGC-3'
クラスI（S9, S8, S12, S52）のSMI配列の存在を確認するプライマーセット
(Tarutani, et al., (2010) Nature, vol. 466 (19), 983-986 Supplementary Table 5を参照)
SL-Forward 1（配列番号９）; 5'-ACACCTCGGACTARAWTTTATGTATTYTTTC-3'
SL-Reverse 1（配列番号１０）; 5'-TCATTAATATTTTATATGCACTAATCGTTTTG-3'
【００４９】
また、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプのＳＰ１１遺伝子又は逆位反復配列について、具体的には以下のプライマーセットによりそれぞれ確認することができる。
クラスII（S44, S60, S40, S29）のSP11遺伝子の存在を確認するプライマーセット
クラスII-SP11-Forward（配列番号１１）; 5'-CGTGTGAAATAGGCAATTAAGTGCAAG-3'
クラスII-SP11-Reverse（配列番号１２）; 5'-CTTTGCAACAGTAGCAAGTAATCCTC-3'
クラスIIのSMI配列（S44, S60, S40, S29）の存在を確認するプライマーセット
(Tarutani, et al., (2010) Nature, vol. 466 (19), 983-986 Supplementary Table 5を参照)
SL-Forward 2（配列番号１３）; 5'-TAACCATAGAAAAATATTCGTGTTC-3'
SL-Reverse １（配列番号１０）; 5'-TCATTAATATTTTATATGCACTAATCGTTTTG-3'
【００５０】
これらのプライマーを用いたＤＮＡ断片の増幅反応によって得られる増幅産物の分子量又は塩基配列に基づいて、逆位反復配列を保持し、ＳＰ１１が不活性化されていることを確認することができる。ＤＮＡ断片の増幅については、従来公知の方法を採用することができ、特に限定されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が挙げられ、より具体的にはＲＴ−ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、競合ＰＣＲが例示される。
【００５１】
クラスＩに属するＳIハプロタイプについてＳＰ１１が不活性化していることの確認は、例えば、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、切断されたＤＮＡ断片の大きさを電気泳動等により正常なＳＰ１１を発現する植物体から得られたＤＮＡ断片の分子量と比較することにより行うことができる。両者の分子量が一致しなければ、ＳＰ１１が不活性化されていると判定することができる。更に、ＳＰ１１遺伝子を欠失させた場合には、シーケンシングによって該当する配列が存在しないことを確認すればよい。また、ＤＮＡ断片に対してシーケンシングを行うことによって逆位反復配列が保持されていることを確認することができる。
【００５２】
なお、クラスＩに属するＳハプロタイプのＳＰ１１遺伝子は、Ｓハプロタイプ（Ｓ9、Ｓ8、Ｓ12、Ｓ52等）によって遺伝子長（主にイントロンの長さ）が異なり、アミノ酸配列で保存性の高い部分が第１エキソンのシグナル配列に限られるため共通のプライマーを設計してクラスＩに属するほぼ全てのＳＰ１１遺伝子の存在を確認することが困難である。従って、クラスＩのＳＰ１１遺伝子が不活性化されていることの確認は、クラスＩに属する各ＳハプロタイプのＳＰ１１遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、当該プライマーにより増幅させたＤＮＡ断片をシーケンシングすることによって実施することが望ましい。
【００５３】
一方、クラスIIに属するＳハプロタイプのＳＰ遺伝子及び逆位反復配列（ＳＭＩ）については上記配列番号１１〜１４で示される共通のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によりＳＰ１１遺伝子や逆位反復配列を増幅させ、その分子量や塩基配列に基づいて存在を確認することができる。
【００５４】
本発明の作出方法により得られる自家和合性アブラナ科植物（Ｓ0株）は、天然に存在するアブラナ科植物の自家和合性変異株より、取得することもできる。このような変異株は、具体的には、東北大学Ｂｒａｓｓｉｃａ種子バンクにＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｃ６３４として登録されているものが挙げられる。前記Ｓ0株は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｃ６３４のＳ５４ハプロタイプを起源とするものである。
【００５５】
また、下記配列番号１５〜１８で示されるプライマーセットを用いてＳ0ハプロタイプについてヘテロ接合体であるか、ホモ接合体であるかの確認を行うこともできる。即ち、配列番号１４及び１５で示されるプライマーセットを用いることにより、Ｓ0ハプロタイプを含むほぼ全てのクラスＩに属するＳＬＧ（Ｓ−ｌｏｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が増幅される（クラスＩＩのＳＬＧは増幅されない）。
SLGI-Forward： 5'-AGAACACTTGTATCTCCCGGT-3'（配列番号１４）
SLGI-Reverse： 5'- CATAGTCGGATCCGTGTTTT-3'（配列番号１５）
【００５６】
下記配列番号１６及び１７で示されるプライマーセットを用いることにより、クラスＩＩのＳＬＧが増幅される（クラスＩのＳＬＧは増幅されない）。
SLGII-Forward： 5'- ATGAAAGGGGTACAGAACAT-3'（配列番号１６）
SLGII-Reverse： 5'- CTCAAGTCCCACTGCTGCGG-3'（配列番号１７）
【００５７】
これらのプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、得られた植物体がＳ0ハプロタイプ又はＳIIハプロタイプについてホモ接合体であるか、ヘテロ接合体であるかを判別することができる。更に、必要に応じてシーケンシングによる塩基配列の確認を行ってもよい。
【００５８】
本発明の作出方法により得られたアブラナ科植物は、自家和合性に変換された自殖種子稔性植物である。Ｓ0ハプロタイプを持つ株をクラスIIに属するＳIIハプロタイプを持つ株と交配させて得た株（Ｓ0ＳII株）については、自家和合性を保持し、且つ雑種強勢により生育が良好であって種子生産性の高いものである。例えば、本発明の方法によりＳ0ハプロタイプを持つ株との交配により得られる自家和合性を有するナタネは、多くの場合親株に比べて、鞘の大きさや数、茎の太さや長さ、花の数、１鞘当たりの種子数が多いことを特徴とする。
【００５９】
（２）自家和合性を有するアブラナ科植物の育種方法
本発明は、自家和合性アブラナ科植物の育種方法を提供する。当該育種方法は、下記工程を含むことを特徴とする。
（１ａ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程。
【００６０】
工程（１ａ）における親株としては、Ｓ遺伝子についてＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株との組み合わせとなるように選択すればよく、各親株はＳ遺伝子についてホモ接合体又はヘテロ接合体のいずれであってもよく、自家和合性又は自家不和合性のいずれであってもよい。
【００６１】
工程（１ａ）において行われる「交配」とは、由来の異なる２株のアブラナ科植物について、片方の株の花粉がもう片方の株の柱頭に受粉し、その後受精、種子形成が進むことを指す。交配の方法としては、例えば、由来の異なる２株の植物全体を網袋で覆い、袋内にハチ等の昆虫を放って昆虫が蜜を採取する過程で受粉が行われる方法が挙げられる。また、人の手によって筆やピンセットを用いて人工的に授粉させてもよい。更に、ビニルハウス等に由来の異なる２集団の複数の株を育成し、ハウス内に昆虫を放って受粉させる方法（集団交配）を採用してもよい。
【００６２】
また、工程（１ａ）で行われる交配において、親株として使用されるＳ0ハプロタイプを有する株又はＳIIハプロタイプを有する株はＳ遺伝子以外の遺伝的バックグラウンドについては特に限定されず、交配により所望の表現型を有し且つ自家和合性の株が得られるように適宜調整すればよい。例えば、油脂等の植物貯蔵物質の産生量の増加、種子生産性の向上、害虫抵抗性、菌類抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌抵抗性、環境ストレス抵抗性（例えば耐寒性等）、窒素固定能の向上等の表現型が発現され得る遺伝子を有する株を親株として選択することにより、これらの有用な表現型を有するアブラナ科植物を自家和合性に変換して自殖種子稔性を付与することができる。
【００６３】
より具体的な例を挙げると、耐寒性を有するＳ0ハプロタイプを有する株（Ｓ0株）と害虫抵抗性を有するＳIIハプロタイプを有する株（ＳII株）を交配して耐寒性及び害虫抵抗性を有する自家和合性Ｓ0ＳII株を得ることができる。或いは、Ｓ0株と耐寒性を有するＳII株を交配して耐寒性を有する自家和合性Ｓ0ＳII株を得て、更に当該Ｓ0ＳII株を親株として害虫抵抗性を有するＳII株と交配して耐寒性及び害虫抵抗性を有する自家和合性Ｓ0ＳII株を得てもよい。
【００６４】
また、本発明の自家和合性アブラナ科植物の育種方法は、前記工程（１ａ）の後に、前記工程（１ａ）で得られた自家和合性株のアブラナ科植物を自殖する、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行うことにより、Ｓ0ハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程（２ａ）を更に含んでいてもよい。前記工程（１ａ）で得られる自家和合性アブラナ科植物はＳ0ハプロタイプに関してヘテロ接合体であることから、当該株を自殖又は近親交配することによってＳ0ハプロタイプに関してホモ接合体である株を得ることができる。本方法がアブラナに対して適用された場合、得られた植物（アブラナ）は自殖種子稔性を有しており種子を収穫できることから油脂（ナタネ油）生産用に好適に使用され得る。
【００６５】
ここで「自殖」とは、同一花において雄ずいの花粉が雌ずいの柱頭に受粉し、又はある株の花の花粉が同じ株の別の花の柱頭に受粉し、その後受精、種子形成が進むことを指す。自殖の方法としては、例えば、１若しくは複数の花序（花の集合体）又は１つの株全体を網袋で覆い、袋内にハチ等の昆虫を放って受粉させる方法が挙げられる。また、前述のように人工的に授粉させてもよい。また、ビニルハウス等に同じ親株に由来するアブラナ科植物を複数株育成し、ハウス内に昆虫を放って複数株間で受粉を行う方法（集団採種）を採用してもよい。
【００６６】
また、本明細書において「近親交配」とは、同じ親株から作出された兄弟株間で交配を行うことを指す。交配の方法は、前記自殖で採用される方法に準じて行うことができ、例えば同じ親株から作出された兄弟株をビニルハウス等に入れ、人工的な授粉や昆虫を介した受粉により行う方法が挙げられる。
【００６７】
本発明の自家和合性アブラナ科植物の育種方法において、工程（２ａ）で行われる自家和合性株のアブラナ科植物の自殖を、５〜７回、好ましくは６〜７回繰り返してもよい。当該技術分野においては、７回自殖を繰り返すことにより、ゲノム上の９９．９％の遺伝子がホモ接合体になるとされている。自殖又は近親交配を繰り返す場合には、最後の自殖又は近親交配で得られた株の中からＳ0ハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択すればよい。
【００６８】
従って、工程（１ａ）で得られるヘテロ接合体（Ｓ0ＳII）の株を自殖又は近親交配し、その中で自家和合性株を選択し、それを更に自殖又は近親交配して自家和合性株を選択するという操作を繰り返すことにより、ほとんどの株がＳ0ハプロタイプに関してホモ接合体（Ｓ0Ｓ0）となる。そのためホモ接合体の判別において遺伝子型の確認を必ずしも必要としないが、遺伝子型に基づいて判別する場合には、例えば前記「（１）自殖種子稔性アブラナ科植物の作出方法」に記載されるクラスＩＩ−ＳＰ１１（Ｓ44、Ｓ60、Ｓ40、Ｓ29）の存在を確認するプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、得られた自家和合性株（即ち、遺伝子型はＳ0Ｓ0又はＳ0ＳIIのいずれか）がクラスＩＩのＳハプロタイプを有していないことを確認することでＳ0ハプロタイプに関してホモ接合体であると判定できる。
【００６９】
（３）Ｆ１ハイブリッド育種用親株の育種方法
本発明は、更にアブラナ科植物のＦ１ハイブリッド育種用親株の育種方法を提供する。
当該育種方法は、下記工程を含むことを特徴とする。
（１ｂ）アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座において、クラスＩに属し、且つ逆位反復配列を保持しつつ花粉因子ＳＰ１１が不活性化されたＳ0ハプロタイプを有する株と、クラスＩＩに属するＳIIハプロタイプを有する株とを交配し、自家和合性株を得る工程；
（２ｂ）前記工程（１ｂ）で得られた自家和合性のアブラナ科植物を自殖する、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行う工程；及び
（３ｂ）前記工程（２ｂ）において得られた株からクラスＩＩに属するＳIIハプロタイプに関してホモ接合体である株を選択する工程。
【００７０】
工程（１ｂ）は、前記「（２）自家和合性アブラナ科植物の育種方法」における工程（１ａ）と同様である。また、工程（２ｂ）においては、前記工程（１ｂ）で得られた自家和合性のアブラナ科植物を自殖する、又はＳハプロタイプに関して同じ遺伝子型の株を用いて近親交配を行い、自殖又は近親交配については前記「（２）自家和合性を有するアブラナ科植物の育種方法」に記載される通りである。
【００７１】
工程（２ｂ）においては、自殖又は近親交配を行って得られた株の中から、Ｓ0ハプロタイプとＳIIハプロタイプをヘテロで有する自家和合性株を選択する。また、工程（２ｂ）においては自殖又は近親交配を繰り返して行ってもよく、これによって遺伝的に均質な近交系を作出することができる。本工程（２ｂ）において自殖又は近親交配を通常５〜７回行い、好ましくは６〜７回繰り返し行うことにより遺伝的に均質な株が作出される。
【００７２】
更に、工程（３ｂ）において、前記工程（２ｂ）における最後の自殖又は近親交配の結果得られた株の中からＳIIハプロタイプに関してホモ接合体である自家不和合性株を選択する。このようにして、得られた自家不和合性株をＦ１ハイブリッド育種用親株として利用することができる。
【００７３】
ＳIIハプロタイプに関してヘテロ接合体あるいはホモ接合体である株の選択については、ＳIIハプロタイプの公知の配列に基づいて設計されたプライマーを用いて行うことができる。ＳIIハプロタイプとしては、例えばＳ44、Ｓ60、Ｓ40、Ｓ29等が挙げられ、これらの配列については例えば、Ｋａｋｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．８１，６３−６７に開示されている。ＳIIハプロタイプに関してヘテロ接合体あるいはホモ接合体であることの確認方法についてより具体的には、前記「（１）自殖種子稔性アブラナ科植物の作出方法」に記載される、クラスＩＩ−ＳＰ１１（Ｓ44、Ｓ60、Ｓ40、Ｓ29）の存在を確認するプライマーセットを用いたＰＣＲ法により判別することができる。
【００７４】
本発明のＦＩハイブリッド育種用親株の育種方法によれば、工程（１ｂ）で得られる自家和合性株を自殖又は近親交配することによって劣性側ＳIIハプロタイプに関してホモ接合体である株を得ることから、従来多大な労力を必要としていた蕾受粉が不要となり、簡便且つ効率よくＦ１ハイブリッド育種用親株を育種することができる。蕾受粉は未開花の蕾の未熟な雌ずいに対して人工的に授粉することを指し、自家不和合性の植物であっても柱頭が未熟であるために自己の認識が行われず受粉から種子形成が行われること利用する方法である。
【００７５】
（４）自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法
本発明は、自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング方法を提供する。当該スクリーニング方法は、下記工程（１ｃ）〜（３ｃ）を含むことを特徴とする。
（１ｃ）被験アブラナ科植物からＤＮＡ試料を調製する工程；
（２ｃ）前記工程（１ｃ）で調製されたＤＮＡ試料から逆位反復配列及びＳＰ１１配列を含むＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（３ｃ）前記工程（２ｃ）で増幅したＤＮＡ断片の分子量または塩基配列に基づいて、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座においてクラスＩに属し、且つ逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持しつつ、花粉因子ＳＰ１１が不活性化されている株を選択する工程。
【００７６】
工程（１ｃ）における被験アブラナ科植物からのＤＮＡ試料の調製、工程（２ｃ）におけるＤＮＡ断片を増幅する方法、工程（３ｃ）における逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持しつつ、花粉因子ＳＰ１１が不活性化されている株を選択する方法については、前記「（１）自家和合性アブラナ科植物の作出方法」に記載の通りである。
【００７７】
（５）自家和合性アブラナ科植物のスクリーニング用キット
前述するように、アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座においてクラスＩに属し、且つ逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持しつつ、花粉因子ＳＰ１１が不活性化されているアブラナ科植物の株は、自家和合性であり、自殖種子稔性を有することが見出されている。かかる知見に基づいて、本発明は、更に自家和合性アブラナ科植物をスクリーニングする際に使用されるキットを提供する。当該キットには、アブラナ科植物における自家不和合性遺伝子座上のクラスＩに属するＳIハプロタイプにおいて、（ｉ）逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持していることを検出可能な試薬；及び（ｉｉ）花粉因子ＳＰ１１が不活性化されていることを検出可能な試薬が含まれる。
【００７８】
このような試薬としては、逆位反復配列、及びＳＰ１１をコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅するプライマーが挙げられる。本発明のキットに含まれる試薬として具体的には前記「（１）自殖種子稔性アブラナ科植物の作出方法」において記載されるプライマー等が挙げられる。
【００７９】
本発明のスクリーニング用キットには、緩衝液、塩、安定化剤、防腐剤等を更に含んでいてもよく、従来公知の方法に従い、製剤化されていてもよい。また、本発明のキットには、前記試薬の他に、検出を実施するために必要とされ得る、反応希釈液、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００８０】
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００８１】
１．自家和合性アブラナ科植物の育種
（１）自家和合性変異株（Ｓ0株）の取得
自家和合性変異株（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｃ６３４，東北大学Ｂｒａｓｓｉｃａ種子バンクより入手可能）は、Ｍ遺伝子座とＳ遺伝子座の両方に変異を持つ自家和合性株である（Ｍｕｒａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５１６−１５１９，２００４；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１，５７７−５８７，２００６を参照）。ここで、Ｍ遺伝子とは、ＭＬＰＫ（Ｍ  ｌｏｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）と名付けられた膜結合型のセリン／スレオニン型蛋白質キナーゼをコードしている。当該膜結合型のセリン／スレオニン型蛋白質キナーゼは、ＳＰ１１のシグナルがレセプターであるＳＲＫに受容された後に自家不和合性の情報を正に伝達する情報伝達因子とされている。【００８２】
本株におけるＳ遺伝子座においては、Ｓ５４−ＳＲＫ（雌ずい因子）の第１イントロンにおける塩基挿入及びＳ５４−ＳＰ１１プロモーター領域における塩基欠失が存在することが確認されている。また、本株は、クラスＩに属するＳハプロタイプ（Ｓ５４ハプロタイプ）を有し、ＳＰ１１の発現が抑制されていることが示されていた。さらに、登録されているゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１９０３５４．１）の解析により、クラスＩのＳＭＩ配列を保持していることが明らかとなった。【００８３】
そこでまず、本株Ｓ0Ｓ0ｍｍと自家不和合性の野生株Ｓ8Ｓ8ＭＭを交配してＦ１株Ｓ0Ｓ8Ｍｍを作出し、本Ｆ１株を蕾受粉により自殖することによってＦ２株を取得した。Ｆ２株の中には、自家和合性の株（Ｓ0Ｓ0ＭＭ、Ｓ0Ｓ0Ｍｍ、Ｓ0Ｓ0ｍｍ、Ｓ0Ｓ8ｍｍ、Ｓ8Ｓ8ｍｍ）が含まれていたが、それらの中からＭ遺伝子座に変異を持たない株（Ｓ0Ｓ0ＭＭ）を、ゲノムＰＣＲ法を用いて選抜し、当該株をさらに自殖を５回繰り返してＳ0株を取得した。Ｓ0株は、Ｓ0ハプロタイプはクラスＩＩに属する劣性Ｓハプロタイプの機能をドミナントに抑制することによって、自家和合性に変換されていると考えられる（図２を参照）。【００８４】
ゲノムＤＮＡの抽出には、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用し、植物体の葉片をサンプルとし、添付のプロトコール通りに抽出した。Ｍとｍの判別プライマーには、下記配列番号１８及び１９で示されるプライマーセットを使用した。
MLPK-Forward ：5'-GCTACGAAAATGTCTTCGCCAATC-3'（配列番号１８）
MLPK-Reverse：5'-CCTAGAATTTGAAAGGCTGGATGC-3' （配列番号１９）【００８５】
また、ＰＣＲ反応条件については以下の通りである。
９５℃で解離２０秒、５５℃でアニーリング２０秒、６８℃で伸長６０秒を３５サイクル繰り返した。当該ＰＣＲ条件のもとＭの場合約３００ｂｐ、ｍの場合約９００ｂｐが増幅される。【００８６】
（２）自家不和合性アブラナ科植物（Ｓ60Ｓ60株）の取得
Ｓ60Ｓ60株は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｃｖ．Ｏｓｏｍｅ（タキイ種苗（株）より入手）のＳ52Ｓ60株を蕾受粉により自殖させ、Ｓ60Ｓ60遺伝子型を有する株をゲノムＰＣＲ法を用いて選抜し、当該株をさらに自殖を３回繰り返したものを本実施例で使用した。【００８７】
Ｓ60を増幅させるプライマーセットは以下の通りである。当該プライマーセットを使用したＰＣＲ法により約２ｋｂｐが増幅される。なお、ＰＣＲ条件については前述の通りである。
S60-sp11pro-Forward： 5'-CCGAAGCTTGACAACAAAGACGGTTCTGATC-3'（配列番号２０）
S60-sp11pro-Reverse： 5'-CAGCCATGGCTTATGAGTATATAAGATTTTCGC-3'（配列番号２１）【００８８】
また、Ｓ５２を増幅させるプライマーセットは以下の通りである。当該プライマーセットを使用したＰＣＲ法により約６００ｂｐが増幅される。なお、ＰＣＲ条件については前述の通りである。
S52-Smi-Forward： 5'-CCATGCACCAAATAAATTTCCTATGG-3'（配列番号２２）
S52-Smi-Reverse： 5'-GAATACACCAAGATTGTGTAGAG-3'（配列番号２３）【００８９】
（３）培養条件
アブラナの種子は、水で湿らせたガーゼを入れたシャーレ上で発芽させ、２〜３ｃｍの大きさになった段階で、メトロミックス（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ２５０：株式会社ハイポネックスジャパン製）を入れたプラグトレイに移植する。本葉が７〜８枚になった段階で、有機培養土（花と野菜の有機培養土：（株）プロトリーフ製）を入れた黒ポット（９ｃｍ径）に移植し、一か月間低温室（温度４〜５℃、光照度２００〜３００Ｌｕｘ）で低温処理した。その後、ひゅうが土（中粒）（ひゅうが土販売株式会社製）を１／３ほど敷き詰め、有機培養土（花と野菜の有機培養土：（株）プロトリーフ製）を入れた７号鉢に移植して、除草剤噴霧などを適宜行いながら栽培した。Ｓ0株又はＳ60株として、人工気象室（温度２３度、光照度約１０００Ｌｕｘ（明時）、照射時間１２時間／日）で培養していた播種後２〜５ヶ月のものを使用した。なお、Ｓ0株についてはラピッドサイクル（ＲＣ）という早咲きになる遺伝子型で固定された品種を使用したため、低温処理を行わずに栽培した。【００９０】
（４）Ｓ0株とＳ60株の交配
上記Ｓ0株（Ｓ0Ｓ0）のアブラナと自家不和合性（Ｓ60Ｓ60）株のアブラナを人工授粉により交配（１回）し、得られた種子を前記培養条件下で９０日間栽培した。交配に使用した親株及び交配の結果得られた自家和合性株の代表写真を図３に示す。【００９１】
（５）結果
このようにして得られたアブラナ科植物（Ｓ0Ｓ60株）は自家不和合性を喪失しており、自殖種子稔性であった。また、１つの鞘当たりの種子の数について比較すると、Ｓ0Ｓ0株よりもＳ60とS0をヘテロで有する株の方が１鞘当たりの種子の数が多いことが示された（図４を参照）。比較対照として、クラスＩＳハプロタイプをホモで有する株（Ｓ8Ｓ8株）とクラスＩＩＳハプロタイプをホモで有する株（Ｓ60Ｓ60株）の１つの鞘当たりの種子数も併せてグラフに示す。これらの株は自家不和合性であるため種子が形成されない。【００９２】
また、Ｓ0Ｓ60株の鞘の大きさ、数、茎の太さや長さ、花の数についてＳ60Ｓ60株やＳ0Ｓ0株と比較すると、いずれについても明らかに生育が良好であった。このような表現型は雑種強勢の結果と考えられる（図３を参照）。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号７は、S8sp11-genome-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号８は、S8sp11-genome-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号９は、SL-Forward 1プライマーの塩基配列である。
配列番号１０は、SL-Reverse 1プライマーの塩基配列である。
配列番号１１は、クラスII-SP11-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号１２は、クラスII-SP11-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号１３は、SL-Forward 2プライマーの塩基配列である。
配列番号１４は、SLGI-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号１５は、SLGI-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号１６は、SLGII-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号１７は、SLGII-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号１８は、MLPK-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号１９は、MLPK-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号２０は、S60-sp11pro-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号２１は、S60-sp11pro-Reverseプライマーの塩基配列である。
配列番号２２は、S52-Smi-Forwardプライマーの塩基配列である。
配列番号２３は、S52-Smi-Reverseプライマーの塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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