(57)【要約】  容易に調製でき、かつ水への溶解性に優れる水溶性フラボノイド組成物を提供する。フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとを含有する水溶性フラボノイド組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとを含有する水溶性フラボノイド組成物。
【請求項２】
前記フラバノン配糖体と前記茶ポリフェノールとの会合体を含有する、請求項１に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項３】
前記茶ポリフェノールは、カテキン、プロトシアニジン、フラボノール配糖体及び紅茶ポリフェノールから選択される１種以上である請求項１又は２に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項４】
前記フラバノン配糖体はヘスペリジンであり、前記茶ポリフェノールは少なくともテアシネンシンＡを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する飲料。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する食品。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する医薬品。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する化粧品。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物の製造方法であって、前記フラバノン配糖体を含有する原料ａと前記茶ポリフェノールを含有する原料ｂとを揉捻して混合揉捻物を得る揉捻物調製工程と、前記混合揉捻物を抽出溶媒に浸漬する抽出工程と、を備える水溶性フラボノイド組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性フラボノイド組成物、これを含有する飲料、食品、医薬品、化粧品及び水溶性フラボノイド組成物の製造方法に関する。
本願は、２０１３年３月８日に日本に出願された特願２０１３−４７３２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
フラバノン配糖体はミカン等の柑橘類に多く含まれており、脂質の酸化防止作用等を有することが知られている。
中でもヘスペリジンは、血管強化、血圧低下、コレステロール低減、中性脂肪低減及び血流改善作用等の効能が認められているフラバノン配糖体である。しかし、ヘスペリジンは、水に溶けにくいため、生体内への吸収性が低く、効果が発揮されにくいという問題がある。【０００３】
こうした問題に対し、例えば、ヘスペリジンにＤ−グルコース残基が等モル以上α結合しているα−グリコシルヘスペリジンが提案されている（特許文献１）。特許文献１の発明は、ヘスペリジンの一部にグルコースを結合させ、酵素処理することによって、水溶性を付与するものである。
特許文献１の発明においては、ミカンからヘスペリジンを抽出する抽出工程と、ヘスペリジンを糖転移する糖転移工程とにより製造される。抽出工程では、未熟ミカンをエタノール溶液中に浸漬し、ヘスペリジンを溶出する。糖転移工程では、ヘスペリジン及びデキストリンを含有する水溶液中で、７０℃、１８時間の酵素（シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）処理を施し、次いで、酵素を加熱失活させる。糖転移工程を経ることで、ヘスペリジンにグルコースが結合し、α−グルコシルヘスペリジリンが得られる。その後、糖転移工程で生じた特異な風味をなくすために、５５℃、５時間の酵素（グルコアミラーゼ）処理を施し、エタノール濃度を段階的に高めながら濾過し、乾燥する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平３−７５９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の発明は、製造工程が煩雑であり、かつ歩留が低いためにコスト高である。加えて、特許文献１の発明では、廃液処理等の問題がある。
そこで、本発明は、容易に調製でき、かつ水への溶解性に優れる水溶性フラボノイド組成物を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとを含有する水溶性フラボノイド組成物が、水への溶解性に優れることを見出し、本発明に至った。【０００７】
即ち、本発明の一実施態様に係る水溶性フラボノイド組成物は、フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとを含有することを特徴とする。【０００８】
本発明の一実施態様に係る水溶性フラボノイド組成物は、前記フラバノン配糖体と前記茶ポリフェノールとの会合体を含有する。【０００９】
本発明の一実施態様に係る水溶性フラボノイド組成物は、前記茶ポリフェノールが、カテキン、プロトシアニジン、フラボノール配糖体及び紅茶ポリフェノールから選択される１種以上である。【００１０】
本発明の一実施態様に係る飲料は、前記フラバノン配糖体はヘスペリジンであり、前記茶ポリフェノールは少なくともテアシネンシンＡを含む。【００１１】
本発明の一実施態様に係る飲料は、前記の本発明の水溶性フラボノイド組成物を含有する。【００１２】
本発明の一実施態様に係る食品は、前記の本発明の水溶性フラボノイド組成物を含有する。【００１３】
本発明の一実施態様に係る医薬品は、前記の本発明の水溶性フラボノイド組成物を含有する。【００１４】
本発明の一実施態様に係る化粧品は、前記の水溶性フラボノイド組成物を含有することを特徴とする。【００１５】
本発明の一実施態様に係る水溶性フラボノイド組成物の製造方法は、前記水溶性フラボノイド組成物の製造方法であって、前記フラバノン配糖体を含有する原料ａと前記茶ポリフェノールを含有する原料ｂとを揉捻して混合揉捻物を得る揉捻物調製工程と、前記混合揉捻物を抽出溶媒に浸漬する抽出工程と、を備える。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の水溶性フラボノイド組成物によれば、容易に調製でき、かつ水への溶解性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２−１〜２−４、比較例２−１の溶解量比を示すグラフである。
【図２】フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとの会合状態を表した模式図である。
【図３】ヘスペリジンの構造を説明する図面である。
【図４】茶ポリフェノールの添加量に伴うヘスペリジンのケミカルシフト変化を示すグラフである。
【図５】紅茶熱水抽出物のＨＰＬＣチャートを示すグラフ図である。
【図６】紅茶熱水抽出物のＨＰＬＣ溶出フラクションの添加量ごとのヘスペリジンのピーク面積を示すグラフ図である。
【図７】ヘスペリジン標品の溶解性に対する紅茶熱水抽出物ならびに各画分の影響を示すグラフ図である。
【図８】紅茶熱水抽出物の各フラクションの相互作用によるヘスペリジン溶解性への影響を示すグラフ図である。
【図９】ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析によるヘスペリジン溶解性試験の結果を示すグラフ図である。
【図１０】ヘスペリジンの化学構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（水溶性フラボノイド組成物）
本実施形態の水溶性フラボノイド組成物は、フラバノン配糖体（以下、（Ａ）成分ということがある）と茶ポリフェノール（以下、（Ｂ）成分ということがある）とを含有する。
水溶性フラボノイド組成物は、粉粒状、タブレット状等の固体でもよいし、液体でもよい。
【００１９】
＜（Ａ）成分：フラバノン配糖体＞
（Ａ）成分はフラバノン配糖体である。（Ａ）成分は、フラバノン骨格を有するフラボノイドに糖が結合した配糖体であり、例えば、ヘスペリジン、ナリルチン、ナリンギン、ネオヘスペリジン等が挙げられる。
（Ａ）成分としては、例えば、未熟ミカン等の柑橘類から、公知の方法で抽出されたものが挙げられる。
【００２０】
水溶性フラボノイド組成物中の（Ａ）成分の含有量は、水溶性フラボノイド組成物の剤形に応じて適宜決定される。
【００２１】
＜（Ｂ）成分：茶ポリフェノール＞
（Ｂ）成分は、茶ポリフェノールである。（Ｂ）成分としては、茶葉に含まれるポリフェノールあるいは茶葉から抽出されるポリフェノールであれば特に限定されない。茶葉としては、緑茶等の非発酵茶葉、紅茶やウーロン茶等の発酵茶葉等のいずれでもよい。
（Ｂ）成分としては、カテキン、プロトシアニジン、フラボノール配糖体及び紅茶ポリフェノールから選択される１種以上が好ましい。水溶性フラボノイド組成物は、これらの（Ｂ）成分を含有することで、（Ａ）成分の水への溶解性のさらなる向上を図れる。
【００２２】
（Ｂ）成分の供給源としては、カテキン、プロトシアニジン、フラボノール配糖体又は紅茶ポリフェノール等の精製品でもよいし、例えば、紅茶抽出物である紅茶エキスや、緑茶抽出物である緑茶エキス等のエキスでもよい。
【００２３】
（Ｂ）成分を含有することで（Ａ）成分の水への溶解性が高まる理由は定かではないが、次のように推測される。
一般に（Ａ）成分は、疎水性の部位（例えば、ヘスペリジンにおいてはヘスペレチン部分）同士が強固に会合して結晶を形成しているため、水への溶解性に劣る。（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを共存させると、（Ｂ）成分が（Ａ）成分同士の会合部分を切り離し、（Ａ）成分との会合体を形成する。そして、形成された会合体は、水への溶解性が高いため、（Ａ）成分の水への溶解性を高められると考えられる。
【００２４】
水溶性フラボノイド組成物中、（Ｂ）成分／（Ａ）成分で表される質量比（以下、Ｂ／Ａ比ということがある）は、特に限定されないが、例えば、１〜１００が好ましく、１超１００以下がより好ましく、５〜５０がさらに好ましく、１０〜３０が特に好ましい。Ｂ／Ａ比が上記下限値未満では、（Ａ）成分の水への溶解性が低下するおそれがあり、上記上限値超としても、（Ａ）成分の水への溶解性のさらなる向上を図れないおそれがある。
【００２５】
＜任意成分＞
水溶性フラボノイド組成物は、例えば、剤形等に応じて、（Ａ）〜（Ｂ）成分以外の任意成分を含有してもよい。
例えば、固形の水溶性フラボノイド組成物においては、造粒又は成形性を高める観点から、デンプン等のバインダーを含有してもよい。
【００２６】
（製造方法）
水溶性フラボノイド組成物の製造方法は、剤形等に応じて適宜決定される。
例えば、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを水に分散し混合して、液体の水溶性フラボノイド組成物を得たり、この液体の水溶性フラボノイド組成物を凍結乾燥等により乾燥して、固体の水溶性フラボノイド組成物を得る方法が挙げられる。
【００２７】
あるいは、例えば、（Ａ）成分を含有する原料（以下、原料ａということがある）と、（Ｂ）成分を含有する原料（以下、原料ｂということがある）とから、水溶性フラボノイド組成物を得る方法が挙げられる。
【００２８】
原料ａと原料ｂとから水溶性フラボノイド組成物を得る製造方法の一例について、以下に説明する。
本例の水溶性フラボノイド組成物の製造方法は、原料ａと原料ｂとを揉捻して混合揉捻物を得る工程（揉捻物調製工程、揉捻工程）と、混合揉捻物から水溶性フラボノイド組成物を抽出する工程（抽出工程）とを備える。
【００２９】
＜揉捻物調製工程＞
揉捻物調製工程は、原料ａと原料ｂとの混合揉捻物を得る工程である。
まず、原料ａをスライスあるいは粉砕する等して小片とする。小片とした原料ａを原料ｂに混合し、揉捻して（揉捻操作）、混合揉捻物を得る。
【００３０】
原料ａとしては、（Ａ）成分を含有するものであればよく、例えば、ミカン、オレンジ、イヨカン、ポンカン、ブンタン、ヒュウガナツ、ハッサク、ダイダイ、ナツミカン、グレープフルーツ、ユズ、カボス又はカラタチ等、柑橘類の果実が挙げられ、中でも、ミカンの果実が好ましく、未熟ミカンの果実がより好ましい。これらの原料ａは、（Ａ）成分の含有量が多いためである。
原料ａは、青果でもよいし、乾燥物でもよく、中でも乾燥物が好ましい。乾燥物であれば、揉捻操作において水分が揉み出されにくくなって、原料ａ中の（Ａ）成分が流失されにくくなる。
【００３１】
原料ｂは、茶葉であり、茶生葉でもよいし、発酵茶葉でもよいし、これらが予め萎凋されたものでもよい。
原料ｂは、原料ａと混合されるに際し、予め萎凋されていることが好ましい。予め萎凋された原料ｂは、揉捻操作において水分が揉み出されにくくなって、原料ｂ中の（Ｂ）成分が流失されにくくなる。
萎凋された原料ｂの水分量は、例えば、４５〜６５質量％が好ましい。水分量は４５〜６０質量％であってもよい。
【００３２】
揉捻方法としては、特に限定されず、例えば、原料ｂを任意の時間揉捻し、次いで、原料ａを加えて揉捻してもよいし、予め原料ａと原料ｂとを仕込み、これを揉捻してもよい。
【００３３】
原料ｂ／原料ａで表される質量比（以下、ｂ／ａ比ということがある）は、原料ａ及び原料ｂの水分量等を勘案して決定される。例えば、原料ａが青果で、原料ｂが茶生葉であれば、ｂ／ａ比は、１〜１０が好ましく、２〜８がより好ましく、３〜６がさらに好ましい。ｂ／ａ比が上記下限値未満では、得られる水溶性フラボノイド組成物の水に対する溶解性が低下するおそれがあり、上記上限値超としても、水溶性フラボノイド組成物の水に対する溶解性のさらなる向上を図れないおそれがある。また、例えば、原料ｂとして茶、原料ａとして未熟ミカンを用いる場合、茶の量に対して未熟ミカンを１０〜５０重量％添加してもよい。さらに、茶の量に対して未熟ミカンを２１〜３０重量％添加してもさらによい。
【００３４】
揉捻操作における原料の温度は、例えば、２０〜４０℃とされる。
揉捻操作の時間は、例えば、１０〜６０分間が好ましく、１５〜２５分間がより好ましい。
【００３５】
揉捻物調製工程は、揉捻操作の後、発酵操作を行う工程（発酵工程）を備えてもよい。
発酵操作においては、混合揉捻物を数ｃｍの厚さに堆積させた状態で、温度２０〜２７℃、湿度３０〜６０％ＲＨの発酵室内等の環境下に静置する。
発酵操作の時間は、例えば、０〜４時間とされる。なお、揉捻操作の開始と同時に原料ａ又は原料ｂの発酵が開始する場合がある。その場合、発酵が早めに行われることを考慮すると、発酵操作の時間は、例えば０〜１時間であってもよい。
【００３６】
加えて、揉捻物調製工程は、揉捻操作の後（発酵操作を備える場合には、発酵操作の後）に、乾燥操作を備えてもよい。乾燥操作を備えることで、混合揉捻物中の酸化酵素（ポリフェノールオキシダーゼ等）を失活させ、水分量を低減させて、混合揉捻物の品質安定性を高められる。
乾燥操作は、例えば、連続式乾燥機に原料を投入し、これに温度８０〜１２０℃の熱風を吹き込み、排気温度が５０〜６０℃となるように操作する。乾燥操作の時間は、特に限定されず、例えば、１０〜６０分間とされる。
乾燥操作後の混合揉捻物の水分量は、例えば、５質量％以下が好ましい。
【００３７】
＜抽出工程＞
抽出工程は、揉捻物調製工程で得られた混合揉捻物から、水溶性フラボノイド組成物を抽出する工程である。
抽出工程としては、例えば、混合揉捻物を抽出溶媒に浸漬し、任意の温度で加熱して、抽出溶媒に水溶性フラボノイド組成物を抽出して、液体の水溶性フラボノイド組成物を得る方法が挙げられる。
【００３８】
抽出溶媒としては、例えば、水、炭素数１〜６の低級アルコール及びこれらの混合液等が挙げられる。
抽出工程における加熱温度は、特に限定されず、例えば、２０〜１００℃が好ましい。
抽出時間は、特に限定されず、例えば、３〜３０分間が好ましい。
【００３９】
抽出工程の後、液体の水溶性フラボノイド組成物を乾燥して、固体の水溶性フラボノイド組成物としてもよい。乾燥方法としては、例えば、凍結乾燥法等が挙げられる。
【００４０】
（飲料）
本実施形態の飲料は、水溶性フラボノイド組成物を含有するものである。
例えば、混合揉捻物を水やエタノールに浸漬し、これを任意の温度で加熱したり、混合揉捻物を任意の温度の水やエタノールに浸漬して得られる抽出液が挙げられる。即ち、従来公知の茶の飲用方法と同様にして、本実施形態の飲料を得られる。
あるいは、液体又は固体の水溶性フラボノイド組成物を任意の飲料（例えば、清涼飲料水、アルコール飲料）に添加する方法が挙げられる。
【００４１】
（食品）
本実施形態の食品は、水溶性フラボノイド組成物を含有するものである。
対象となる食品は、特に限定されない。例えば、上記した本実施形態の飲料に増粘多糖類やゼラチン等を加え、これを冷却して得られるゲル状食品等が挙げられる。
また、例えば、加工食品、菓子類等が挙げられる。
【００４２】
（医薬品）
本実施形態の医薬品は、水溶性フラボノイド組成物を含有するものである。
フラバノン配糖体、特にヘスペリジンは、血管強化、血圧低下、コレステロール低減、中性脂肪低減及び血流改善作用等を有している。
従って、本実施形態の医薬品は、水溶性フラボノイド組成物を血管強化剤、血圧低下剤、コレステロール低減剤、中性脂肪低減剤、血流改善剤として含有するものが好ましい。
【００４３】
医薬品中の水溶性フラボノイド組成物の含有量は、医薬品の剤形等を勘案して適宜決定される。
例えば、医薬品中の水溶性フラボノイド組成物の含有量は、１回の服用で、（Ａ）成分５００〜２０００ｍｇを摂取できる量が好ましい。
【００４４】
上述の通り、本実施形態の水溶性フラボノイド組成物は、水への溶解性に優れる。
加えて、本実施形態の水溶性フラボノイド組成物は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを混合したり、あるいは原料ａと原料ｂとが揉捻された混合揉捻物から水等の抽出溶媒で抽出するという簡単な方法で得られる。
さらに、本実施形態の水溶性フラボノイド組成物は、水への溶解性に優れるため、生体内への吸収性を高められる。
【００４５】
（化粧品）
本実施形態の化粧品は、水溶性フラボノイド組成物を含有するものである。対象となる化粧品は、特に限定されない。例えば、上記した本実施形態の水溶性フラボノイド組成物に水等の溶媒、又は各種の化粧品用添加物を加えた化粧品としてもよい。本実施形態の水溶性フラボノイド組成物は、水への溶解性に優れるため、生体内への吸収性を高められる。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例を示して本実施形態を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】
（実施例１−１）
生茶葉（原料ｂ）３０ｋｇを萎凋して、水分量５０質量％の原料ｂ１９ｋｇを得た。萎凋後の原料ｂ１９ｋｇと、スライスした未熟ミカンの青果（原料ａ）１０ｋｇとを混合し揉捻して、混合揉捻物を得た（揉捻操作）。揉捻時間は２０分間であり、揉捻温度は３５℃であった。
揉捻操作の後、得られた混合揉捻物を温度３５℃、湿度６５％ＲＨの発酵室内で、表１に示す発酵時間で発酵した（発酵操作）。
発酵操作後、混合揉捻物に１００℃の空気を３０分間当てて、乾燥した（乾燥操作）。
乾燥操作を施した混合揉捻物について、以下の抽出試験を行い、その結果を表１〜２に示す。
なお、表中の溶出率は、下記（１）式により求められる値である。【００４８】
溶出率（質量％）＝［ミカン単位の溶出量］÷［原料ａの乾燥物（１００ｍｇ）中のヘスペリジン量］×１００・・・（１）
［（１）式中、ミカン単位の溶出量は、後述する抽出試験で求められた溶出量（混合揉捻物から溶出した（Ａ）成分の量（ｍｇ））を、実施例１−１、１−２では４倍、実施例１−３、１−４では２倍した値である。］【００４９】
＜抽出試験＞
≪水抽出≫
２５℃の水１００ｍＬに各例の混合揉捻物１００ｍｇを浸漬し、２５℃で２４時間放置して、抽出液を得た。
得られた抽出液を０．４５μｍメンブランフィルターでろ過し、ろ液中のヘスペリジン量を超高速液体クロマトグラフィーＵＦＬＣ（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）で測定した。１試料につき３回測定し、得られた面積からヘスペリジンの溶出量を算出した。
ＨＰＬＣの分析条件は、以下の通りである。なお、原料ａの乾燥物（１００ｍｇ）に含まれるヘスペリジン量は２０．８ｍｇであった。【００５０】
［分析条件］
カラム・・・Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ｃ１８（３．０×５０ｍｍ、株式会社島津製作所製）。
移動相Ａ液・・・ＣＨ３ＣＮ：１０ｍＭリン酸＝２０：８０（体積比）。
移動相Ｂ液・・・ＣＨ３ＣＮ：１０ｍＭリン酸＝３０：７０（体積比）。
グラジェント構成・・・移動相Ａ液：移動相Ｂ液＝１００：０（体積基準）を７分間で直線的に、移動相Ａ液：移動相Ｂ液＝０：１００（体積基準）とした。
流速：０．６ｍＬ／分。
カラム温度：４０℃。
検出波長：２８０ｎｍ。【００５１】
≪熱水抽出≫
２５℃の水を１００℃の水に換えた以外は、「≪水抽出≫」と同様にして抽出液を得、このろ液中のヘスペリジン量を測定した。【００５２】
≪６０質量％アルコール抽出≫
２５℃の水を２５℃の６０質量％アルコールに換えた以外は、「≪水抽出≫」と同様にして抽出液を得、このろ液中のヘスペリジン量を測定した。【００５３】
（実施例１−２）
揉捻時間を４０分間とした以外は、実施例１−１と同様にして混合揉捻物を得た。
得られた混合揉捻物について抽出試験を行い、その結果を表１〜２に示す。【００５４】
（実施例１−３）
原料ａを２０ｋｇ、原料ｂを２０ｋｇとして揉捻した以外は、実施例１−１と同様にして混合揉捻物を得た。
得られた混合揉捻物について抽出試験を行い、その結果を表１〜２に示す。【００５５】
（実施例１−４）
揉捻時間を４０分間とした以外は、実施例１−３と同様にして混合揉捻物を得た。
得られた混合揉捻物について抽出試験を行い、その結果を表１〜２に示す。【００５６】
（比較例１−１）
原料ａについて抽出試験を行い、その結果を表１〜２に示す。【００５７】
【表１】
2014136681.tif 000002
【００５８】
【表２】
2014136681.tif 000003
【００５９】
表１〜２に示すように、原料ａと原料ｂとを揉捻した混合揉捻物を用いた実施例１−１〜１−４は、原料ａのみを用いた比較例１−１に比べて、総じて溶出率を高められた。
ヘスペリジンの溶出率は、水抽出に比べて、熱水抽出又は６０質量％エタノール抽出の方が高かった。ただし、熱水抽出と６０質量％エタノール抽出とでは、ヘスペリジンの溶出率に大きな差は見られなかった。
実施例１−１と実施例１−３との比較、実施例１−２と実施例１−４との比較において、ｂ／ａ比が３である実施例１−１、１−２はｂ／ａ比が１である実施例１−３、１−４に比べて溶出率が高まっていた。【００６０】
（調製例１〜３）フラクション１〜３の調製
以下の手順により、（Ｂ）成分（茶ポリフェノール）を含むフラクション１〜３を調製した。
紅茶２０ｇに１Ｌの熱水（９５℃）を加えて５分間抽出し、これをろ過した。ろ液をロータリーエバポレータで濃縮し、これを凍結乾燥して、紅茶ポリフェノールを含む紅茶エキス６．１ｇを得た。水で充填したＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（内径３．０ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に紅茶エキス４．８ｇを付し、これを水２００ｍＬと、４０体積％メタノール２００ｍＬとで順次溶出して、糖、カフェイン、フラボノール配糖体を主成分とするフラクション１（Ｆｒ．１）を得た。得られたＦｒ．１は３．０４ｇ（紅茶エキスの６３質量％）であった。
Ｆｒ．１を溶出した後、６０体積メタノール２００ｍＬと、８０体積％メタノール２００ｍＬとで順次溶出して、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸を主成分とするフラクション２（Ｆｒ．２）を得た。得られたＦｒ．２は０．９０ｇ（紅茶エキスの１９質量％）であった。
Ｆｒ．２を溶出した後、１００体積％メタノール２００ｍＬと、６０体積％アセトン２００ｍＬとで順次溶出して、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、テアフラビン、テアフラビン−３−ガレート、テアフラビン−３’−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジガレート、テアシネンシンＡ、テアシネンシンＢ、カテキン重合ポリフェノールを主成分とするフラクション３（Ｆｒ．３）を得た。得られたＦｒ．３は０．８５ｇ（紅茶エキスの１８質量％）であった。【００６１】
（実施例２−１）
１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、ヘスペリジンの結晶の水懸濁液（１０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを入れた。このエッペンドルフチューブに、紅茶エキス水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、ヘスペリジン２ｍｇに対して紅茶葉５３ｍｇに相当）、０．８ｍＬを加えた。
エッペンドルフチューブを密閉後、時々振り混ぜながら８０℃で１０分間加熱し、その後、室温（２５℃）で２時間放置した。
２時間放置した後、遠心分離し、上清をメンブランフィルター（０．４５μｍ）でろ過して試料とした。試料１０μＬを高速液体クロマトグラフィーで分析して、試料中のヘスペリジン量（ピーク面積）を測定した。同様の操作を３回行って、その平均値をヘスペリジンの水への溶解量とした。
後述する比較例２−１における溶解量（ピーク面積）に対する本例の溶解量（ピーク面積）の比（溶解量比）を求め、その結果を図１に示す。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は、以下の通りであった。【００６２】
＜分析条件＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＡＲＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）。
カラム温度：３５℃。
移動相Ｃ液：５０ｍＭリン酸。
移動相Ｄ液：ＣＨ３ＣＮ。
グラジェント構成・・・移動相Ｃ液：移動相Ｄ液＝９６：４（体積基準）を３９分間で直線的に、移動相Ｃ液：移動相Ｄ液＝７０：３０（体積基準）とし、次いで、１５分間で直線的に、移動相Ｃ液：移動相Ｄ液＝２５：７５（体積基準）とした。
流速：０．８ｍＬ／分。
カラム温度：４０℃。
検出方法：フォトダイオードアレイ検出（Ｍａｘ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）。【００６３】
（実施例２−２）
紅茶エキス水溶液に換えて、Ｆｒ．１水溶液（１２．６ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬを加えた以外は、実施例２−１と同様にして、溶解量比を求めた。その結果を図１に示す。【００６４】
（実施例２−３）
紅茶エキス水溶液に換えて、Ｆｒ．２水溶液（３．８ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬを加えた以外は、実施例２−１と同様にして、溶解量比を求めた。その結果を図１に示す。【００６５】
（実施例２−４）
紅茶エキス水溶液に換えて、Ｆｒ．３水溶液（３．６ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬを加えた以外は、実施例２−１と同様にして、溶解量比を求めた。その結果を図１に示す。【００６６】
（比較例２−１）
紅茶エキス水溶液に換えて、水０．８ｍＬを加えた以外は、実施例２−１と同様にして、ヘスペリジンの溶解量（ピーク面積）を求め、その結果を図１に示す。【００６７】
図１は、比較例２−１のヘスペリジンのピーク面積に対し、実施例２−１〜２−４におけるヘスペリジンのピーク面積を相対値で示したグラフである。
本実施形態を適用した実施例２−１〜２−４は、（Ｂ）成分を含有しない比較例２−１に比べて、ヘスペリジンの水への溶解量が多かった（即ち、水への溶解性に優れていた）。
中でも、（Ｂ）成分として紅茶エキスを用いた実施例２−１において、ヘスペリジンの溶解量が最も多く、（Ｂ）成分を含有しない比較例２−１におけるヘスペリジンの溶解量の約１０倍であった。
また、実施例２−２〜２−４の比較において、紅茶の主要ポリフェノールを主成分とするＦｒ．３を加えた実施例２−３において、ヘスペリジンの溶解量が最も多かった。なお、Ｆｒ．３の内、テアフラビン類４種、テアシネンシンＡ及びＢ、カテキン重合ポリフェノールが紅茶特有の成分である。【００６８】
（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが共存することにより、（Ａ）成分の水溶性が高まるイメージについて、図２を参照して説明する。
（Ａ）成分単独では、水中で複数のヘスペリジン１ａが互いに強固に会合し、ヘスペリジン結晶１を形成してしまう。
（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが共存すると、実施例２−１や２−４では、カテキン重合ポリフェノール２のベンゼン環がヘスペリジン１ａのヘスペレチン部分にスタッキングすることでヘスペリジン１ａ同士の強い会合が崩され、水溶性を高めていると推測される。実施例２−２や２−３では、カフェイン３、フラボノール配糖体、カテキン類（フラボノール配糖体及びカテキン類は、図２中の符号４）がヘスペリジン１ａのヘスペレチン部分にスタッキングして、（Ａ）成分の水溶性を高めていると推測される。紅茶エキスでは、これらの会合が相加的に作用して、水溶性を大きく高めていると考えられる。【００６９】
（実験例１）
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを測定した場合、測定している化合物の水素に共存物質のベンゼン環が近づくとベンゼン環のπ電子の影響を受けて、水素シグナルが高磁場側へシフトする。ポリフェノール類は多くのベンゼン環を有する。このため、水素シグナルが高磁場側へシフトする現象を利用して、（Ｂ）成分による（Ａ）成分の溶解性の向上が、（Ａ）成分への（Ｂ）成分の会合によるものであることを示すための実験を行った。（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが会合しているのであれば、両者を混合するとヘスペリジン分子の水素のシグナルが高磁場にシフトするはずである。【００７０】
ヘスペリジン１ｍｇを０．１ｍＬのジメチルスルホキシド−ｄ６に溶解し、ここに０．９ｍＬの重水を加えて、α１液とした。１ｍＬのα１液に１０ｍｇのＦｒ．３を溶解して、β１液とした。α１液０．７５ｍＬをＮＭＲ測定管に入れて、水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）でＮＭＲスペクトルを測定した。ＮＭＲスペクトルを測定した後、ＮＭＲ測定管にβ１液０．０５ｍＬを加えて混合し、この試料のＮＭＲスペクトルを測定した（スペクトル測定操作）。この時の測定試料中のＦｒ．３の濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬである。
この測定後のＮＭＲ測定管中にβ１液０．０５ｍＬを加え、ＮＭＲスペクトルを測定した。この時の測定試料中のＦｒ．３の濃度は、１．２ｍｇ／ｍＬである。
ＮＭＲ測定管中にβ１液０．０５ｍＬを加え、ＮＭＲスペクトルを測定する操作をさらに３回繰り返した。それぞれのＮＭＲスペクトルの測定時における測定試料中のＦｒ．３の濃度は、２．１ｍｇ／ｍＬ、２．９ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬである。このＮＭＲスペクトルの測定操作を通じて、測定試料中のヘスペリジンの濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬである。
各測定操作でのケミカルシフト値を比較した。観測可能なグルコース１位、ヘスペレチンＡ環６位及び８位、Ｂ環２位及びメトキシ基由来のシグナルのケミカルシフト変化を図４に示す。【００７１】
図３にヘスペリジンの構造を示す。
図３中、符号１０は、ヘスペレチンＡ環、符号２０は、ヘスペレチンＢ環、符号３０は、ヘスペレチンＣ環を表す。図３中、符号４０は、ラムノースを示し、符号５０は、グルコースを示す。【００７２】
図４は、縦軸にヘスペリジンのケミカルシフト変化を取り、横軸に測定試料中のＦｒ．３の濃度を取ったグラフである。
図４に示すように、Ｆｒ．３の濃度に依存して、（Ｂ）成分のヘスペレチン部分のケミカルシフト値が変化した。特にＢ環のケミカルシフトは、高磁場に大きくシフトし、メトキシ基とＡ環のシグナルも変化していた。この結果から、水酸基が存在せず最も疎水性が高いヘスペレチンＣ環付近で、（Ｂ）成分が（Ａ）成分に会合していることが確認された。この結果は（Ａ）成分の水への溶解性の向上が、（Ｂ）成分との会合によることを示すものである。【００７３】
（実験例２−１）
ヘスペリジン４．０ｍｇ（６．５６μＭ）を０．４ｍＬのジメチルスルホキシド−ｄ６に溶解し、これに重水３．６ｍＬを加えて、α２液（１．６４μＭ／ｍＬ−１０％ジメチルスルホキシド）とした。１ｍＬのα２液をＮＭＲ測定管に入れスペクトル測定を行った。本例の結果を表３に示す。【００７４】
（実験例２−２）
ＮＭＲ測定管に、（Ｂ）成分であるエピガロカテキンガレート１．５ｍｇ（３．２８μＭ）を測り取り、これを１ｍＬのα２液で溶解し、ＮＭＲスペクトルを測定した。本例の結果を表３に示す。
下記（Ｉ）式は、エピガロカテキンガレートの構造式である。【００７５】
【化１】
2014136681.tif 000004
【００７６】
（実験例２−３）
ＮＭＲ測定管に、カフェイン０．６ｍｇ（３．０９μＭ）を測り取り、これをα２液１ｍＬに溶解し、ＮＭＲスペクトルを測定した。本例の結果を表３に示す。
下記（ＩＩ）式は、カフェインの構造式である。【００７７】
【化２】
2014136681.tif 000005
【００７８】
【表３】
2014136681.tif 000006
【００７９】
表３に示すように、エピガロカテキンガレートを共存させた実験例２−２は、（Ａ）成分のみの実験例２−１に比べて、Ｃ環の２位及び３位のシグナルが高磁場に大きくシフトしていた。このことから、水中で、（Ａ）成分のＣ環の水素がエピガロカテキンガレートの芳香環に近接していることが示された。Ｃ環は、水分子が水和する水酸基がないため、ヘスペリジン分子で最も疎水性の高い部分である。この疎水性の高い部分がエピガロカテキンガレートで塞がれることで、（Ａ）成分の疎水性が減弱されて、水溶性が高まるものと考えられる。
（Ｂ）成分に換えて、カフェインを加えた実験例２−３においては、ケミカルシフトはほとんど変化していなかった。【００８０】
（実施例３−１）
生茶葉（原料ｂ）３０ｋｇを萎凋して、水分量５０質量％の原料ｂ１９ｋｇを得た。萎凋後の原料ｂ１９ｋｇと、スライスした未熟ミカンの青果（原料ａ）１０ｋｇとを混合し揉捻して、混合揉捻物を得た（揉捻操作）。揉捻時間は２０分間であり、揉捻温度は３５℃であった。本例における発酵時間は、０時間（即ち、発酵操作が施されていない）であった。
混合揉捻物に１００℃の空気を３０分間当てて、乾燥した（乾燥操作）。
乾燥操作を施した混合揉捻物に５０倍量（質量基準）の熱水（９０℃）を加え、３０分間放置して、水溶性フラボノイド組成物を抽出した。水溶性フラボノイド組成物を抽出した液をエバポレータで濃縮し、その後、凍結乾燥機にて乾燥して、固形の水溶性フラボノイド組成物を得た。
得られた水溶性フラボノイド組成物について、後述する方法で機能性を評価し、その結果を表４に示す。【００８１】
（比較例３−１）
水溶性フラボノイド組成物に換えて、糖転移ヘスペリジン（αＧヘスペリジンＨ（商品名）、２７％、株式会社林原）を用いた以外は、実施例３−１と同様にして機能性を評価し、その結果を表４に示す。【００８２】
＜機能性の評価＞
≪検体の採取≫
実験動物には、５週齢のＳＤ系雄ラット（日本クレア株式会社）を用いた。ラットを温度２２±１℃、湿度５５±５％ＲＨ、１２時間明暗サイクル（明期：８〜２０時）に設定した長崎県立大学動物実験室内で飼育した。動物を馴化させるために、ＭＦ固形飼料と蒸留水を自由に摂取させ、７日間の予備飼育を行った。
予備飼育終了後、ラットの体重に群間で差がないように、２群に群分けした。
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＡＩＮ）−７６組成に基づくコントロール食に、水溶性フラボノイド組成物を０．５質量％となるように加え、これを一方の群のラットに摂食させた。また、コントロール食に糖転移ヘスペリジンを０．２質量％となるように加え、これを他方の群のラットに摂食させた。
ＡＩＮ−７６の組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン２００、コーン油５０、コーンスターチ１５０、セルロース５０、ミネラル混合３５、ビタミン混合１０、ＤＬ−メチオニン３、重酒石酸コリン２及びショ糖５００である。水溶性フラボノイド組成物又は糖転移ヘスペリジンを添加した分をショ糖５００から減じた。
飼育期間中、体重及び摂食量を毎日測定した。４週間の飼育終了後、６時間絶食させ、断頭屠殺した後、血液、肝臓及び白色脂肪組織（腎臓、睾丸及び腸間膜周辺脂肪組織）を採取した。各組織を生理食塩水で洗浄後、質量を測定した。本試験は「長崎県立大学動物実験規程」（長崎県立大学動物実験委員会監修、平成２３年１２月６日改正）及び「実験動物の飼養及び保管等に関する基準」（昭和５５年３月総理府告示第６号）に則って実施した。【００８３】
≪血清コレステロール濃度の測定≫
血清コレステロール濃度は、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ・３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−ａｎｉｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ（ＤＡＯＳ）法によるコレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。血清コレステロール濃度の測定では、キットに付属の標準血清を用い、５０、１００、２００、３９７．４、５９２．２ｍｇ／ｄＬの標準溶液を作成した。
検体として採取した血液を、２５℃で２０分間静置した後、４℃、１２００ｘｇ（３０００ｒｐｍ）で２０分間、遠心処理した。遠心処理後、上清の血清を採取した。
試験管に盲検用の蒸留水、標準溶液又は血清を１０μＬサンプリングし、これに付属の発色試薬を１．５ｍＬ加え、攪拌し、ウォーターバスにて３７℃で５分間加温した。加温後、盲検を対象として、吸光度計を用いて波長６００ｎｍの吸光度を測定し、標準溶液を用いて得られた標準直線の式より、血清コレステロール濃度を算出した。【００８４】
≪肝臓中の中性脂肪濃度の測定≫
肝臓の総脂質は、Ｆｏｌｃｈら（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．；Ｌｅｅｓ，Ｍ．；Ｓｌｏａｎｅ−Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｇ．Ｈ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７，２２６，４９７−５０９）の方法に従って抽出した。摘出したラットの肝臓０．５ｇをガラスのホモジナイズチューブに入れた。１５ｍＬのメタノールを準備し、まず、５〜７ｍＬのメタノールを用い、肝臓片が完全に潰れるまでホモジナイズし、ホモジネートを５０ｍＬのメスフラスコにロートを用いて移した。残りのメタノールでホモジナイザー及びホモジナイズチューブを洗浄し、メスフラスコに加えた。その後、クロロホルム３０ｍＬを用いてホモジナイザーを３回に分けて洗浄しながら、メスフラスコに加えた。ロート及び５０ｍＬメスフラスコの内壁はクロロホルム：メタノール＝２：１（体積比）の溶媒で容量が約４９ｍＬになるまで洗い込んだ。続いて、メスフラスコに軽く栓をして４０℃の湯浴で振とうしながら３０分間インキュベートし、加温抽出を行った。その後、抽出液を室温まで冷却し、クロロホルム：メタノール＝２：１（体積比）の溶媒で５０ｍＬに調整した。この抽出液をＮｏ．２のろ紙でろ過し、ろ液を５０ｍＬの共栓付メスシリンダーに入れた。ろ液量を記録し、蒸留水９ｍＬを加え、２回、転倒混和した。−４℃で一晩静置して、分離した上層（蒸留水及びメタノール層）を廃棄して、脂質を含む下層（クロロホルム層）を得た。
下層をフラスコに移し、５０℃の湯浴上で、ロータリーエバポレータで減圧しながらクロロホルムを吸引除去した。次に、ヘキサンを用いてフラスコ内壁に付着した脂質を２５ｍＬのメスフラスコに回収し、フィルアップした。これを肝臓総脂質濃縮液とし、−２０℃で保存した。
肝臓中の中性脂肪濃度の測定には、肝臓総脂質濃縮液をヘキサンで１０倍量希釈（体積換算）した溶液０．５ｍＬをサンプリングし、窒素乾固したものを供した。乾固されたものに１００μＬのイソプロピルアルコールを加え、ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ・ＤＡＯＳ法によるトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。測定は「血清コレステロール濃度の測定」と同様に行った。標準溶液による標準曲線より抽出液中の中性脂肪濃度を算出した。【００８５】
【表４】
2014136681.tif 000007
【００８６】
表４は、白色脂肪組織質量（ラットの体重１００ｇ当たりの量）、血清コレステロール濃度（ｍｇ／１００ｍＬ）、肝臓中の中性脂肪濃度（ｍｇ／ｇ）を示したものである。
表４に示すように、水溶性フラボノイド組成物を摂食した群（実施例３−１）は、糖転移ヘスペリジンを摂食した群（比較例３−１）に比べ、白色脂肪組織質量、血清コレステロール濃度、肝臓中の中性脂肪濃度が低かった。【００８７】
（実験例３）
上述の実施例１〜４と同様の試験を行い、乾燥サンプル１００ｍｇあたりのヘスぺリジンの溶出量及び溶出率を求めた。溶出量及び溶出率の計算は以下のように行った。
平均値±標準偏差（ｎ＝３）
１）溶出量；乾燥サンプル１００ｍｇから溶け出しているヘスペリジンの量
２）溶出率の計算方法
茶生葉に含まれる水分含量７５％、青ミカンに含まれる水分含量８２％、青ミカン乾燥粉末に含まれるヘスペリジン含量は２０．８％
・ミカン１０ｋｇ：茶３０ｋｇの場合
ミカン  １０ｋｇ×０．１８＝１．８ｋｇ、茶  ３０ｋｇ×０．２５＝７．５ｋｇ  より、合計  ９．３ｋｇ乾燥サンプルが製造できる。全乾燥物に１９．３５％の青ミカンが含まれる。
よって、乾燥混合ミカン１００ｍｇにヘスペリジンが４．０２ｍｇ含まれている。
・ミカン２０ｋｇ：茶２０ｋｇの場合
ミカン  ２０ｋｇ×０．１８＝３．６ｋｇ、茶  ２０ｋｇ×０．２５＝５ｋｇ  より、合計  ８．６ｋｇ乾燥サンプルが製造できる。全乾燥物に４１．９％の青ミカンが含まれる。
よって、乾燥混合ミカン１００ｍｇにヘスペリジンが８．７２ｍｇ含まれている。【００８８】
上述の抽出を行い溶出量と溶出量を求めた結果を、表５（水抽出）、表６（熱湯抽出）、及び表７（６０％エタノール抽出）に示す。
【表５】
2014136681.tif 000008
【表６】
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【表７】
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【００８９】
表５〜７に示すように、ミカンと茶とを揉捻した混合揉捻物を用いた例は、総じて高いヘスぺリジンの溶出量及び溶出率を得られた。ヘスペリジンの溶出率は、水抽出に比べて、熱水抽出又は６０質量％エタノール抽出の方が高かった。熱水抽出と６０質量％エタノール抽出との比較では、短時間では熱湯抽出が、長時間ではエタノール抽出が、若干ながら高い溶出率という傾向が得られた。【００９０】
（実験例４：水溶性フラボノイド組成物の機能性評価）
（実験試料）
乾燥した水溶性フラボノイド組成物の熱水抽出物を凍結乾燥し、粉末にしたものを試料として用いた。２０ｇの水溶性フラボノイド組成物を熱水１Ｌ中で抽出、乾燥後、６．３８ｇの粉末が回収された。【００９１】
（動物実験）
動物は４週齢のＳＤ系雄ラット（九動、佐賀）を用いた。ラットを温度２２  ±  １℃、湿度５５  ±  ５％、１２時間明暗サイクル（明期：８〜２０時）に設定した長崎県立大学動物実験室内で飼育した。動物を馴化させるために、ＭＦ固形飼料と蒸留水を自由摂取させ１週間の予備飼育を行った。
予備飼育終了後、ラットの体重に群間で差がないように、コントロール群および水溶性フラボノイド組成物群に群分けし、試験食および蒸留水を２週間自由摂取させた。【００９２】
食餌はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  （ＡＩＮ）  −９３Ｇ組成に基づく純化食をコントロール食とした。ＡＩＮ−９３Ｇ組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン  ２００、大豆油７０、α−コーンスターチ  １３２、ショ糖  １００、セルロース５０、ミネラル混合３５、ビタミン混合１０、ｔ−ブチルヒドロキノン  ０．０１４、重酒石酸コリン２．５、Ｌ−シスチン  ３  およびβ−コーンスターチ３９７．４８６である。コントロール食に水溶性フラボノイド組成物粉末を食餌総重量の０．７５％になるように添加した食餌を水溶性フラボノイド組成物食とし、全量をβ−コーンスターチで調整した。その組成は（ｇ／ｋｇ）、水溶性フラボノイド組成物７．５、β−コーンスターチ  ３８９．９８６、その他の配合はコントロール食と同様に調製した。【００９３】
飼育期間中、体重および摂食量を２日に１回測定した。２週間の飼育終了後、それぞれの群内で平均的な体重のラットの肝臓を細胞培養に用いた。
肝細胞の分離および培養に用いた試薬、調製した溶液、器具および機器はすべて滅菌済みのものを用いた。ラットをペントバルビタールナトリウム（０．１ｍＬ  ／  １００ｇ体重）の腹腔内注射により麻酔した後、開腹した。門脈に留置針をカニュレーションして糸で結紮した。次いで、留置針にチューブをつなぎ、３７℃の湯浴中で保温された前灌流液をペリスタポンプで流入させた。下部大動脈に予め糸をかけておき、切断・脱血後糸で結紮した。次に、上部大静脈に留置針をカニュレーションして糸で結紮した後チューブをつなぎ、門脈から流入させた前灌流液が肝臓を通り上部大静脈から放血される状態を維持し、約２０ｍＬ／ｍｉｎの流速で約１０分間灌流した。肝臓が完全に脱血されたことを確認した後、３７℃の湯浴中で保温されたコラゲナーゼ溶液を同流速にて約１０分間再循環方式で灌流した。【００９４】
消化された肝臓を回収し、Ｈａｎｋｓ水溶液（９．８ｇ／Ｌ）を３０ｍＬ加え、はさみを用いて細分した後、ガーゼ（二重）を用いて遠心チューブへろ過した。ろ液をピペッティングして肝細胞を分散させた後、５０×ｇ（６００ｒｐｍ）で１分間遠心分離した。上清を廃棄した後、再びＨａｎｋｓ水溶液を加え、沈殿物となった肝細胞をピペッティングにより分散させ、同様に遠心分離および上清破棄を行った。このように、Ｈａｎｋｓ水溶液による肝細胞の洗浄操作を３回行い、得られた細胞画分を肝実質細胞とした。【００９５】
次にＷＥ培地を３０ｍＬ加え、ピペッティングにより分散させて細胞懸濁液を調製した。トリパンブルー染色法にて血球計測板を用いて生細胞数をカウントし、生細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＷＥ培地で希釈した。希釈する際、肝細胞の接着と伸長に必要なＦＢＳを培地中の含有量が１０％となるように加えた。コラーゲンコートディッシュ（３５ｍｍ，６ｗｅｌｌ）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌ播種し、ＣＯ２‐インキュベータ（３７℃，９５％  Ｏ２，５％  ＣＯ２、ＡＳＴＥＣ、福岡）で３時間前培養した。培地を廃棄し、ディッシュの底面に接着した細胞をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で２回洗浄後、引き続き５％  ＦＢＳ含有培地を用いて２４時間前培養し、コンフルエントに達したものを実験に用いた。【００９６】
コンフルエントに達した肝細胞に、脂質合成の基質として［１，２−１４Ｃ］  酢酸を１．４μＣｉ（１ｍＣｉ／ｍｍｏｌ／ｄｉｓｈ）  添加した無血清培地に交換し、５時間培養した。培養終了後、培地２ｍＬをすべて回収した。細胞はＰＢＳで２回洗浄した後、ラバーポリスマンを用いてはぎ取り、ＰＢＳ溶液として回収し、全量を１．５ｍＬとした。培地および細胞溶液は分析に供するまで−８０℃で保存した。【００９７】
培地および細胞中の総脂質抽出はＦｏｌｃｈらの方法に準じて行った。細胞はＰＢＳでホモジナイズし、全量を２．５ｍＬとした。細胞ホモジネートあるいは培地０．４ｍＬに、脂質画分のキャリアーとしてＡＩＮ−９３Ｇ組成に基づく純化食を２週間摂食させたＳＤ系雄ラットの血清を１００μＬ加えよく混合し、次いでクロロホルム：メタノール＝２：１溶液を１０ｍＬ加えよく混合した後、４０℃で３０分加温して総脂質を抽出した。２０％（ｖ／ｖ）量の水を加えて転倒混和し、上層を破棄した。破棄した上層とほぼ同量の割合のメタノール：水＝１６：９溶液を６ｍＬ加えて転倒混和し、再び上層を破棄した。下層（クロロホルム層）を５ｍＬサンプリングし窒素乾固した後、少量のメタノールを加えて再び窒素乾固することで純化した。クロロホルムを１、２滴加え、毛細管を用いて薄層板（ＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  ２０×２０ｃｍ，  Ｍｅｒｃｋ）にプロットした。展開溶媒（ｈｅｘａｎｅ  ：  ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ  ：  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ＝８０：２０：１ｍＬ）を満たした展開層に薄層板を入れた。展開終了後、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）およびコレステロールエステル（ＣＥ）画分のバンドは、ヨウ素の蒸気にさらして着色することで確認した後、薄層版から剥ぎ取り、トルエンベースのシンチレーションカクテルを１０ｍＬ入れたバイアルに回収し、液体シンチレーションカウンターにより、各脂質画分の［１４Ｃ］放射性活性を測定した。【００９８】
表８に、２週間実験食を摂食したラットの肝臓から分離した細胞および培地における［１４Ｃ］  酢酸の各脂質画分への取り込みを示す。
【表８】
2014136681.tif 000011
【００９９】
細胞中への取り込みは、肝臓の細胞での合成を示し、培地への取り込みは、肝臓からの分泌を示している。細胞中のトリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルおよび遊離脂肪酸画分への放射能活性の取り込みは、コントロール群と比較して、水溶性フラボノイド組成物添加群で有意に低値を示し、それぞれ４５％、４７％、２５％、６９％低下した。このことから肝臓細胞において、フラボノイド組成物は［１４Ｃ］  酢酸を基質とする脂質の合成を抑制することが示された。【０１００】
培地中のトリグリセリド画分への放射能活性の取り込みは、コントロール群に比べ水溶性フラボノイド組成物添加群で有意に低値を示した。食餌の違いはリン脂質画分への取り込みに影響しなかった。コレステロールエステル画分への取り込みは、水溶性フラボノイド組成物摂取によって低下傾向を示した。遊離脂肪酸画分への取り込みは水溶性フラボノイド組成物添加群において高値であったが、有意な差は認められなかった。このことから水溶性フラボノイド組成物は、肝細胞内で合成された脂質の培地への分泌を抑制することが示された。
これらの結果から、水溶性フラボノイド組成物は肝臓での脂質の合成と肝臓から血液中への脂質の分泌を抑制することで脂質代謝改善効果を発揮することが明らかとなった。【０１０１】
（実験例５：ヘスぺリジン可溶化実験）
（紅茶熱水抽出物の乾燥粉末の調製）
紅茶（２０１３年に長崎県農林技術開発センター茶業研究室で製造した）およそ４０ｇをワーリングブレンダーで粉砕し，得られた粉末状試料を沸騰水２Ｌで２分間煮沸後、吸引ろ過を行った。ろ液をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して紅茶熱水抽出物の乾燥粉末１１ｇを得た。これをＨＰＬＣにて分析し，茶カテキンやその他の各種ポリフェノール類のピークを確認した（図５）。【０１０２】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  （４．６×２５０ｍｍ，ナカライ）
カラム温度：３５℃
移動相：Ａ；５０ｍＭリン酸水溶液，Ｂ；アセトニトリル，Ｂを４％から３０％（３９分間），３０％から７５％（１５分間），７５％から９５％（６分間），５％から４％（５分間）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：フォトダイオードアレイ，検出波長２００−５５０ｎｍ【０１０３】
（紅茶熱水抽出物の乾燥粉末の分画）
上記のようにして得られた乾燥粉末の９．９ｇをダイアイオンＨＰ−２０ＳＳカラム（５×２４ｃｍ、三菱化学）を用いたクロマトグラフィーに付し，水から徐々にメタノール濃度を上げ、最後に６０％含水アセトンにて溶出させることで、４つの画分（フラクション１-４）に分画した。各画分を減圧濃縮後、凍結乾燥した。フラクション１（３．０ｇ）は主に糖、没食子酸、テオガリンを、フラクション２（１．９ｇ）は主にエピガロカテキン、テアシネンシンＢ、テアシネンシンＣ、テアルビジンを、フラクション３（１．７ｇ）は主にエピカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、テアシネンシンＡ、フラボノール配糖体、およびテアルビジンを、フラクション４（１．７ｇ）は主にカフェイン、テアフラビンを含むことをシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒トルエン：ギ酸エチル：ギ酸＝１：７：１，検出は紫外吸収および塩化鉄（ＩＩＩ）  試薬噴霧）ならびにＨＰＬＣ分析（フォトダイオードアレイ，検出波長２００−５５０ｎｍ）により確認した。【０１０４】
（未熟ミカン乾燥粉末からのヘスペリジン溶出に対する紅茶熱水抽出物ならびに各画分の影響）
エッペンドルフチューブ（容量１．５ｍＬ）に未熟ミカン乾燥粉末４．０ｍｇを入れ、紅茶熱水抽出物を４、８、１６ｍｇ、またはそれを分画して得た４つのフラクションを１、２、４、８ｍｇ加えた。各チューブに蒸留水１．０ｍＬを加えて懸濁し、湯浴中８０℃で１０分間加熱した。室温で２時間冷却した後、遠心器（２０００×ｇ）で約１分間の遠心分離を行った。上清はメンブランフィルター（０．４５μｍ）でろ過後、ろ液をＨＰＬＣで分析し、２８３ｎｍにおけるヘスペリジンのピーク面積を比較した。【０１０５】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  （４．６×２５０ｍｍ，ナカライ）
カラム温度：３５℃
移動相：Ａ；５０ｍＭリン酸水溶液，Ｂ；アセトニトリル，Ｂを１５％から４５％（１５分間），４５％から９０％（３分間），９０％で２分間，９０％から１０％（２分間）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２８３ｎｍにおけるＵＶ吸収【０１０６】
結果を図６に示す。何も加えず未熟ミカン乾燥粉末だけを抽出した場合に比べて、紅茶熱水抽出物を加えるとヘスペリジンの溶出量が増加した。抽出物を分画したフラクションのうち、フラクション１はヘスペリジンの溶出にほとんど寄与していないが、他のフラクションは添加量に依存してヘスペリジンの溶出量は増大した。【０１０７】
（ヘスペリジン標品の溶解性に対する紅茶熱水抽出物ならびに各画分の影響）
未熟ミカン乾燥粉末の代わりに市販のヘスペリジン（和光純薬）２ｍｇを用い、紅茶熱水抽出物、それを分画して得た４つの画分を加えて前記と同様の操作を行った。ただし、添加量は紅茶熱水抽出物を１６ｍｇ（未熟ミカン乾燥粉末に対する重量比１：４）とし、分画フラクションについてはそれぞれの収率を考慮してフラクション１を５．７ｍｇ、フラクション２を３．６ｍｇ、フラクション３を３．３ｍｇ、フラクション４を３．４ｍｇ加えた。結果を図７に示す。この結果から、テアシネンシンＡ、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピカテキン、フラボノール配糖体、およびテアルビジンを含むフラクション３が最もヘスペリジンの溶解に寄与しており、次いでエピガロカテキン、テアシネンシンＢ、テアシネンシンＣ、テアルビジンを含むフラクション２の寄与が大きいことが分かる。【０１０８】
（紅茶熱水抽出物の各画分の相互作用によるヘスペリジン溶解性への影響）
未熟ミカン乾燥粉末に、紅茶熱水抽出物を分画して得た４つの画分を単独もしくは全てのパターンの組合せ（計１５通り）で添加し、上述の操作を行った。添加量は分画前の熱水抽出物を１６ｍｇ（未熟ミカン乾燥粉末に対する重量比１：４）とし、さらにその中で各画分が占める割合を考慮してフラクション１を５．７ｍｇ、フラクション２を３．６ｍｇ、フラクション３を３．３ｍｇ、フラクション４を３．４ｍｇとした。結果を図８に示す。この結果から、ほとんどの組合せにおいてヘスペリジンの溶解性は相加的に向上することがわかる。ただし、フラクション１はほとんどヘスペリジン溶解に寄与しておらず、フラクション３の寄与が最も大きい。【０１０９】
（実験例６：ヘスぺリジンのＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ測定）
ヘスペリジン終濃度１ｍＭ及びエピガロカテキンガレート、テアシネンシンＡ、テアシネンシンＢ、カフェイン終濃度１０ｍＭとなるように、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて各種混合溶液を作製した。これらを３７ｏＣで２４時間静置した。遠心分離後（１０，０００×ｇ，  ２０ｏＣ，  ５ｍｉｎ）、回収した上清を１０％ＤＭＳＯで１００倍希釈した。これをＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に供した（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ  ；  ２０mＬ）。【０１１０】
＜ＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析条件＞
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：０  -  １００  ％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  ／  ０．１  ％  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  （  ２０  ｍｉｎ  ）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  −  ＭＳ  −  ＩＩ  （  φ２．０  ｍｍ  ×  １５０  ｍｍ  ）
Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４０  ｏＣ
Ｓａｍｐｌｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ：２０  mＬ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．２  ｍＬ／ｍｉｎ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，  Ｅｘｐｅｒｔ  ｍｏｄｅ
ｔａｒｇｅｔ  ｍａｓｓ  ｒａｎｇｅ：１００  −  １０００  ｍ／ｚ
ＥＳＩ  ｓｏｕｒｃｅ：Ｈｅｘａｐｏｌｅ  ＲＦ  ４００  Ｖｐｐ，  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｘｉｔ  −１３０  Ｖ
Ｄｒｙ  Ｇａｓ：８．０  Ｌ／ｍｉｎ
Ｄｒｙ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２００  ｏＣ
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｇａｓ：１．６  Ｂａｒ
・装置
ｍｉｃｒＯＴＯＦ  ＩＩ  −  ＭＡ１：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＪＡＮ３−０８Ｄ−ＭＳＦ：ＪＡＰＡＮ  ＴＨＥＲＭＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ
Ｃｏｍｐａｓｓ  １．３  ＳＲ１  ｆｏｒ  ｍｉｃｒＯＴＯＦ：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ
ｍｉｃｒＯＴＯＦ  ３．０
Ｈｙｓｔｅｒ  ３．２
ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ４．０
Ｔａｒｇｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒ：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ【０１１１】
（１Ｈ−ＮＭＲ測定）
全てのＮＭＲ  測定は、日本電子製  ＥＣＳ−４００  を使用した。サンプルは、ヘスペリジン終濃度１  ｍＭ  となるように  １０％  ＤＭＳＯ−ｄ６  を用いて作製した。内標準物質はＤＳＳ−ｄ６  を用い、内径５  ｍｍ  のサンプルチューブに液高  ４．２  ｃｍ  となるように添加した。本サンプルをＮＭＲ  装置に挿入後、グラジエントシム調整を行い、１Ｈ−ＮＭＲ測定  （ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔｓ：  １６，３８４；  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ：  １５  ｓｅｃ；  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：  ２５oＣ）に供した。得られたヘスペリジンのスペクトルを  ｄ  ヘスペリジン  （ｐｐｍ）とした。続いて、同サンプルを１Ｈ−ＮＭＲ−ＤＯＳＹ測定  （ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ：  ０．１ｍｓｅｃ；  ｆｉｅｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｕｌｓｅ：  ５０−３００ｍＴ／ｍ；  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔｓ：  １６，３８４；  ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｇａｉｎ：  ２４；  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ：  ５０ｓｅｃ；  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：  ２５  oＣ；  ｓｐｉｎｎｅｒ：  ＯＦＦ）に供した。測定終了後、ＳＰＬＭＯＤ  （ｄｉｓｐｌａｙ  ｒａｎｇｅ：  １．０−１００  ×１０−１０ｍ２／ｓｅｃ）  を用いて、２Ｄ  スペクトルを処理した。得られたスペクトルより、拡散係数  Ｄヘスペリジン  （×１０−１０ｍ２／ｓｅｃ）  を求めた。また、ヘスペリジン終濃度  １ｍＭ  及び  アシネンシンＡ  終濃度  １０ｍＭ  となるように、１０％ＤＭＳＯ−ｄ６  を用いてヘスペリジン−テアシネンシンＡ  混合溶液を作製した。本サンプルに内標準物質ＤＳＳ−ｄ６  を添加後、内径５ｍｍのサンプルチューブに液高  ４．２ｃｍとなるように添加し、前述と同様に１Ｈ−ＮＭＲ  測定及び１Ｈ−ＮＭＲ−ＤＯＳＹ  測定を行った。得られたスペクトルより、ｄヘスペリジン＋テアシネンシンＡ（ｐｐｍ）及びＤヘスペリジン＋テアシネンシンＡ（×１０−１０ｍ２／ｓｅｃ）  を求めた。ヘスペリジン及び  テアシネンシンＡ  を混合したことによる化学シフト値の変化を  Delta  ｄ  ＝  ｄヘスペリジン  −  ｄヘスペリジン＋テアシネンシンＡ、拡散係数の変化を  Delta  Ｄ  ＝  Ｄヘスペリジン  −  Ｄヘスペリジン＋テアシネンシンＡとし算出した。【０１１２】
（測定結果）
（１）ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析によるヘスペリジンの溶解性試験
ヘスペリジンの溶解性試験の結果を図９に示す。本結果より、ヘスペリジン及び  テアシネンシンＡ  １：１０  混合時に、溶解度が３倍程度増加することが明らかとなった。
（２）  １Ｈ−ＮＭＲ測定によるヘスペリジン及び  テアシネンシンＡ  の相互作用メカニズムの解明
ヘスペリジンの構造  （図１０）  並びにヘスペリジンの化学シフト値  ｄヘスペリジン（ｐｐｍ）  （表９）を示す。ヘスペリジン及びテアシネンシンＡ  を混合したことによる化学シフト値の変化  （表１０）より、ヘスペリジンの疎水性骨格部Ｃ環由来プロトンにおいて、顕著な変化  （＜  −０．２ｐｐｍ）  が観測された。また、ヘスペリジン及びテアシネンシンＡ  を混合したことにより、拡散係数についてDelta Ｄ  ＝  １．１×１０−１０ｍ２／ｓｅｃ  の変化が観測された（表１１）。以上のことから、ヘスペリジンは疎水性骨格部Ｃ環において、テアシネンシンＡ  と相互作用していることが示唆された。【０１１３】
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明の水溶性フラボノイド組成物によれば、容易に調製でき、かつ水への溶解性に優れ、これを含有する飲料、食品及び医薬品を得られる。
【図１】
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【図２】
2014136681.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年10月20日(2015.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラバノン配糖体と茶ポリフェノールとを含有し、
前記フラバノン配糖体はヘスペリジンであり、前記茶ポリフェノールは少なくともテアシネンシンＡを含む、水溶性フラボノイド組成物。
【請求項２】
前記フラバノン配糖体と前記茶ポリフェノールとの会合体を含有する、請求項１に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項３】
前記茶ポリフェノールは、カテキン、プロトシアニジン、フラボノール配糖体及び紅茶ポリフェノールから選択される１種以上を含む請求項１又は２に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項４】
前記ヘスペリジン：テアシネンシンＡの含有量比が約１：１０である、請求項１から３のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項５】
前記ヘスペリジンは柑橘類から抽出されたものである請求項１から４のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項６】
前記柑橘類はミカンである請求項５に記載の水溶性フラボノイド組成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する飲料。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する食品。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する医薬品。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物を含有する化粧品。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の水溶性フラボノイド組成物の製造方法であって、前記フラバノン配糖体を含有する原料ａと前記茶ポリフェノールを含有する原料ｂとを揉捻して混合揉捻物を得る揉捻物調製工程と、前記混合揉捻物を抽出溶媒に浸漬する抽出工程と、を備える水溶性フラボノイド組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記原料ａは柑橘類又はその抽出物である請求項１１に記載の水溶性フラボノイド組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記柑橘類はミカンである請求項１２に記載の水溶性フラボノイド組成物の製造方法。
【国際調査報告】
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