(57)【要約】  本発明は、アレルギー誘発性を簡便に検査することに関する。詳細には、本発明は、被験物質のアレルギー誘発性を検査するための方法であって、該方法は：Ａ）試験系における肺胞マクロファージに被験物質を曝露する工程；およびＢ）該試験系においてインターロイキン１α（ＩＬ−１α）を測定する工程、を包含し、ここで、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質のアレルギー誘発性を検査するための方法であって、該方法は：
Ａ）試験系における肺胞マクロファージに被験物質を曝露する工程；および
Ｂ）該試験系においてインターロイキン１α（ＩＬ−１α）を測定する工程、
を包含し、ここで、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す、方法。
【請求項２】
前記方法はインビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、非ヒト動物を用いてなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記曝露は、前記被験物質とは異なる物質である抗原とともになされ、前記ＩＬ−１αは、該被験物質が、該抗原のアレルギー反応を増強するかどうかの指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験物質のアレルギー誘発性を検査するためのキットであって、該キットは、
Ａ）肺胞マクロファージ、および
Ｂ）ＩＬ−１αを測定する手段
を含み、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す、キット。
【請求項６】
前記キットは、試験するための容器をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記ＩＬ−１αを測定する手段は、ＩＬ−１αに対する特異的な抗体またはその誘導体および免疫反応試験手段を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記免疫反応試験手段は、ＥＬＩＳＡを含み、および／または前記肺胞マクロファージは、培養装置とともに提供される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記肺胞マクロファージに対してアレルゲンであることが知られる物質をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１０】
インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤を含む、アレルギーを治療または予防するための組成物。
【請求項１１】
前記阻害剤は、ＩＬ−１α特異的である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記阻害剤は、ＩＬ−１βを阻害しない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記阻害剤は、ＩＬ−１αに特異的な抗体またはその抗原結合性断片、ＩＬ−１αに特異的なアンチセンス、ＩＬ−１αに特異的なｓｉＲＮＡ、低分子化合物およびそれらの組合せから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記低分子化合物は、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）、ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ（１，８，９−トリヒドロキシ−３−メトキシ−６Ｈ−［１］ベンゾフロ［３，２−ｃ］クロメン−６−オン）およびＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アレルギーは微粒子誘発性のものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アレルギーは、Ｉ型アレルギーである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アレルギーは、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、アレルギー性炎症、アレルギー性胃腸炎、じんましん、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、血清病、食物アレルギーおよび薬物アレルギーからなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害または症状を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
アレルギーを治療または予防するための、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤。
【請求項１９】
その治療または予防を必要とする被験体におけるアレルギーを治療または予防するための方法であって、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーの診断および治療、ならびにその検査方法およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患増加は社会問題の一つとなっており、その原因の解明と効果的な治療法の開発が急務とされている。アレルギー性疾患の増加の要因としては、アレルゲンの増加、感染症の減少（衛生仮説）、食生活の変化、生活環境における化学物質の増加などが考えられている。化学物質の増加に関しては、産業の発達とともに産出されてきた様々な微粒子状物質（工場からの煤塵、ディーゼル粒子、砂塵、ナノ粒子、粒子状物質（Particulate  Matter）２．５（いわゆるPM２．５）等）のアレルギー性疾患への関与が示唆されている（非特許文献１）。【０００３】
特に近年、喘息や鼻炎といったアレルギー性疾患に罹患する患者の数が、特に先進国において増大している。その理由は不明であるが、多くの研究が、ディーゼル排気や砂塵などの粒子状汚染物質および環境粒子がアレルギー反応を悪化させ得ることを実証している（非特許文献２〜９）。さらに、直径２．５μｍ未満の粒子状物質２．５（ＰＭ２．５）のようないくつかのｎｍ〜μｍサイズの非常に小さい粒子状物は、気道内に入り、肺の深部に定着して、喘息のような慢性の肺炎症を引き起こし得る（非特許文献１）。実際、疫学研究は、空気中の粒子状物質の増加が、喘息による入院加療の増加と有意に関係していたことを報告した（非特許文献１０）。アレルギー反応は、２型免疫反応によって媒介される（非特許文献１１）。粒子状物質および結晶は免疫系を刺激して炎症性反応を誘導し、特に、アルミニウム塩（アラムと称する）およびシリカ結晶は、インビボでの投与部位における好酸球の蓄積と抗原特異的な血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１レベルの上昇によって特徴づけられる２型反応を誘導する（非特許文献１２〜１７）。粒子状汚染物質および環境粒子を含む粒子状物の多くは、免疫アジュバントとして機能して、肺炎症およびＩｇＥ産生を増強するものと考えられる。しかしながら、これらの粒子状物質のアジュバント効果と、これらが免疫反応を誘発する機構については明らかにされていない。【０００４】
このように、粒子状物質の多くがIgE誘導や好酸球の活性化等のアレルギー性反応の原因となるTh２型免疫反応を誘導することが知られているが、どのような機構で免疫反応を活性化し、Th2型免疫反応を誘導するかについては明らかにされていない。【０００５】
マウスのモデルとして、現在まで種々の粒子状物質を気管内に注入することで、ＩｇＥや好酸球の活性化が誘導されることが示されている（非特許文献２）が、その分子機構については明らかにされないままでいる。【０００６】
また、非特許文献１８−１９では、アレルギーの治療の試みがなされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Granum  B  and  Lovik  M.,  TOXICOLOGICAL  SCIENCES  65,  7-17  (2002)
【非特許文献２】Hiyoshi  K  et  al.,  Environmental  research.  2005;99(3):361-8.
【非特許文献３】Inoue  K  et  al.,  Toxicology  and  applied  pharmacology.  2009;237(3):306-16.
【非特許文献４】Nygaard  UC  et  al.,  Toxicological  sciences  :  an  official  journal  of  the  Soci  ety  of  Toxicology.  2009;109(1):113-23.
【非特許文献５】Honda  A  et  al.,  JAT.  2014;34(3):250-7.
【非特許文献６】Granum  B  et  al.,  Toxicology  letters.  2001;118(3):171-81.
【非特許文献７】Ichinose  T  et  al.,  Toxicology.  1997;122(3):183-92.
【非特許文献８】Lovik  M  et  al.,  Toxicology.  1997;121(2):165-78.
【非特許文献９】Bartra  J  et  al.,  Journal  of  investigational  allergology  &  clinical  immunology.  2007;17  Suppl  2:3-8.
【非特許文献１０】Ueda  K  et  al.,  Environmental  health  and  preventive  medicine.  2010;15(6):350-7.
【非特許文献１１】Pulendran  B  and  Artis  D、Science.  2012;337(6093):431-5.
【非特許文献１２】Mancino  D  et  al.,  International  archives  of  allergy  and  applied  immunology.  1983;71(3):279-81.
【非特許文献１３】Reese  TA  et  al.,  Nature.  2007;447(7140):92-6.
【非特許文献１４】Kuroda  E  et  al.,  International  reviews  of  immunology.  2013;32(2):209-20.
【非特許文献１５】Kuroda  E  et  al.,  Immunity.  2011;34(4):514-26.
【非特許文献１６】Kool  M  et  al.,  Immunity.  2011;34(4):527-40.
【非特許文献１７】Marichal  T  et  al.,  Nature  medicine.  2011;17(8):996-1002.
【非特許文献１８】Experimental  and  Toxicologic  Pathology  Volume  54,  Issue  2,  2002,  Pages  109-126
【非特許文献１９】Int  Archs  Allergy  Appl.  Immun.  71:279-281  (1983)  Mancino  et  al.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、粒子状物質によるアレルギー誘導の分子機構を解明することで、粒子状物質によるアレルギー性炎症等に対する新たな治療法、粒子自体が持つアレルギー感作性を調べるための検査法へとつながる知見を見出し本発明を完成させた。したがって、本発明は従来存在しなかった、粒子状物質によるアレルギー感作性を調べる簡便な検査技術、方法、キット、システム、装置等、および粒子によって引き起こされるアレルギー性炎症の新規治療技術、方法、医薬、組成物、キット、システム等を提供する。本発明は肺胞マクロファージ（MΦ）ならびに肺胞上皮細胞に対する細胞傷害活性や液性因子（例えば、インターロイキン１α）を誘導するシグナル伝達系の因子またはその発現産物もしくはそのフラグメントもしくは誘導体等、粒子状物質により誘導されるアレルギー性炎症を識別するためのマーカー、検出剤、阻害剤、および粒子状物質によって誘導されるアレルギー性炎症を予防または治療するための組成物に関する。【０００９】
一例として、本発明は以下を提供する。
＜検査法＞
（１）被験物質のアレルギー誘発性を検査するための方法であって、該方法は：
Ａ）試験系における肺胞マクロファージに被験物質を曝露する工程；および
Ｂ）該試験系においてインターロイキン１α（ＩＬ−１α）を測定する工程、
を包含し、ここで、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す、方法。
（２）前記方法はインビトロで行われる、項目１に記載の方法。
（３）前記方法は、非ヒト動物を用いてなされる、項目１に記載の方法。
（４）前記曝露は、前記被験物質とは異なる物質である抗原とともになされ、前記ＩＬ−１αは、該被験物質が、該抗原のアレルギー反応を増強するかどうかの指標である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（４Ａ）前記抗原は、前記肺胞マクロファージに対してアレルゲンであることが知られる物質である、項目４に記載の方法。
（４Ｂ）前記アレルゲンは、卵白アルブミン、ダニアレルゲンまたは花粉である、項目３４Ａに記載の方法。
（５）被験物質のアレルギー誘発性を検査するためのキットであって、該キットは、
Ａ）肺胞マクロファージ、および
Ｂ）ＩＬ−１αを測定する手段
を含み、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す、キット。
（６）前記キットは、試験するための容器をさらに含む、項目５に記載のキット。
（７）前記ＩＬ−１αを測定する手段は、ＩＬ−１αに対する特異的な抗体またはその誘導体および免疫反応試験手段を含む、項目５または６に記載のキット。
（８）前記免疫反応試験手段は、ＥＬＩＳＡを実施するための手段を含み、および／または前記肺胞マクロファージは、培養装置とともに提供される、項目７に記載のキット。
（９）前記肺胞マクロファージに対してアレルゲンであることが知られる物質をさらに含む、項目５〜８のいずれか１項に記載のキット。
＜治療剤または予防剤＞
（１０）インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤を含む、アレルギーを治療または予防するための組成物。
（１１）前記阻害剤は、ＩＬ−１α特異的である、項目１０に記載の組成物。
（１２）前記阻害剤は、ＩＬ−１βを阻害しない、項目１０または１１に記載の組成物。
（１３）前記阻害剤は、ＩＬ−１αに特異的な抗体またはその抗原結合性断片、ＩＬ−１αに特異的なアンチセンス、ＩＬ−１αに特異的なsiＲＮＡ、低分子化合物およびそれらの組合せから選択される、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
（１４）前記低分子化合物は、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）、ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ（１，８，９−トリヒドロキシ−３−メトキシ−６Ｈ−［１］ベンゾフロ［３，２−ｃ］クロメン−６−オン）およびＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む、項目１３に記載の組成物。
（１５）前記アレルギーは微粒子誘発性のものである、項目１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
（１６）前記アレルギーは、Ｉ型アレルギーである、項目１０〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
（１７）前記アレルギーは、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、アレルギー性炎症、アレルギー性胃腸炎、じんましん、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、血清病、食物アレルギーおよび薬物アレルギーからなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害または症状を含む、項目１０〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
（１８）アレルギーを治療または予防するための、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤。
（１８Ａ）前記阻害剤は、ＩＬ−１α特異的である、項目１８に記載の阻害剤。
（１８Ｂ）前記阻害剤は、ＩＬ−１βを阻害しない、項目１８または１８Ａに記載の阻害剤。
（１８Ｃ）前記阻害剤は、ＩＬ−１αに特異的な抗体またはその抗原結合性断片、ＩＬ−１αに特異的なアンチセンス、ＩＬ−１αに特異的なsiＲＮＡ、低分子化合物およびそれらの組合せから選択される、項目１８、１８Ａまたは１８Ｂのいずれか１項に記載の阻害剤。
（１８Ｄ）前記低分子化合物は、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）、ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ（１，８，９−トリヒドロキシ−３−メトキシ−６Ｈ−［１］ベンゾフロ［３，２−ｃ］クロメン−６−オン）およびＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む、項目１８Ｃに記載の阻害剤。
（１８Ｅ）前記アレルギーは微粒子誘発性のものである、項目１８、１８Ａ、１８Ｂ，１８Ｃ、１８Ｄまたは１８Ｅのいずれか１項に記載の阻害剤。
（１８Ｇ）前記アレルギーは、Ｉ型アレルギーである、項目１８、１８Ａ、１８Ｂ，１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅまたは１８Ｆのいずれか１項に記載の阻害剤。
（１８Ｈ）前記アレルギーは、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、アレルギー性炎症、アレルギー性胃腸炎、じんましん、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、血清病、食物アレルギーおよび薬物アレルギーからなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害または症状を含む、項目１８、１８Ａ、１８Ｂ，１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、１８Ｆまたは１８Ｇのいずれか１項に記載の阻害剤。
（１９）その治療または予防を必要とする被験体におけるアレルギーを治療または予防するための方法であって、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（１９Ａ）前記阻害剤は、ＩＬ−１α特異的である、項目１９に記載の方法。
（１９Ｂ）前記阻害剤は、ＩＬ−１βを阻害しない、項目１９または１９Ａに記載の方法。
（１９Ｃ）前記阻害剤は、ＩＬ−１αに特異的な抗体またはその抗原結合性断片、ＩＬ−１αに特異的なアンチセンス、ＩＬ−１αに特異的なsiＲＮＡ、低分子化合物およびそれらの組合せから選択される、項目１９、１９Ａまたは１９Ｂのいずれか１項に記載の方法。
（１９Ｄ）前記低分子化合物は、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）、ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ（１９，９−トリヒドロキシ−３−メトキシ−６Ｈ−［１］ベンゾフロ［３，２−ｃ］クロメン−６−オン）およびＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む、項目１９Ｃに記載の方法。
（１９Ｅ）前記アレルギーは微粒子誘発性のものである、項目１９、１９Ａ、１９Ｂ，１９Ｃ、１９Ｄまたは１９Ｅのいずれか１項に記載の方法。
（１９Ｇ）前記アレルギーは、Ｉ型アレルギーである、項目１９、１９Ａ、１９Ｂ，１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅまたは１９Ｆのいずれか１項に記載の方法。
（１９Ｈ）前記アレルギーは、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、アレルギー性炎症、アレルギー性胃腸炎、じんましん、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、血清病、食物アレルギーおよび薬物アレルギーからなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害または症状を含む、項目１９、１９Ａ、１９Ｂ，１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆまたは１９Ｇのいずれか１項に記載の方法。【００１０】
本発明において、上述した１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。【００１１】
簡潔に説明すると、本発明の原理は以下のとおりである。【００１２】
免疫反応は、自然免疫および適応免疫の２つのタイプに分類される。自然免疫は、外来の抗原および病原体に対する防御の最前線として機能するマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）によって媒介される。これに対し、適応免疫は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および記憶細胞によって媒介される、抗原特異的な応答を伴う。自然免疫反応は、適応免疫反応が誘発されるまでの一時的な防御系として機能するものと長く考えられていたが、最近の研究は、自然免疫が、適応免疫の効率的な誘導に必須であることを実証した（Akira  S、Phil  Trans  R  Soc  B.  2011;366:2748-55.；Iwasaki  A  et  al.,  Science.  2010;327:291-5.；Coquerelle  C  and  Moser  M、Immunol  Rev.  2010;234:317-34.）。一般に、病原体由来の因子（病原体関連分子パターン：ＰＡＭＰ）が、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して自然免疫細胞によって認識され、このＰＲＲが、細胞に活性化シグナルを伝達して適応免疫を誘導する（Kawai  T  and  Akira  S、Immunity.  2011;34:637-50.；Elinav  E  et  al.,  Immunity.  2011;34:665-79.；Loo  Y-M  and  Gale  M、Immunity.  2011;34:680-92.；Osorio  F  and  Reis  e  Sousa  C、Nat  Rev  Immunol.  2012;12:479-91.）。加えて、死細胞またはストレスを加えられた細胞から放出される因子であるダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）もまた、様々な炎症細胞の遊走および活性化を介して炎症の誘発に寄与する。ＤＡＭＰとして、脂質、糖、代謝産物、核酸およびサイトカインが挙げられ、これらは自然免疫担当細胞上に発現したＰＲＲまたはサイトカイン受容体によって認識される。ＤＡＭＰは、アジュバント活性および無菌性炎症の誘発にとって重要である（Desmet  CJ  and  Ishii  KJ、Nat  Rev  Immunol.  2012;12:479-91.；Said-Sadier  N  and  Ojcius  DM、Biomedical  journal.  2012;35(6):437-49.；Jounai  N  and  Ishii  KJ、Frontiers  in  cellular  and  infection  microbiology.  2012;2:168.；Willart  MA  and  Lambrecht  BN、Clinical  and  experimental  allergy:  journal  of  the  British  Society  for  Allergy  and  Clinical  Immunology.  2009;39(1):12-9.；Shen  H  et  al.,  Journal  of  immunology.  2013;191(6):2857-63.；Ghaemi-Oskouie  F,  and  Shi  Y、Current  rheumatology  reports.  2011;13(2):160-6.；Kono  H  et  al.,  The  Journal  of  clinical  investigation.  2010;120(6):1939-49.）。いくつかの報告から、アラムおよびシリカのような粒子状物質が、自然免疫担当細胞を刺激して、ＤＡＭＰを放出させ、そして、ＤＡＭＰ依存性の自然免疫反応が獲得免疫反応の誘導に必要とされることが実証されている（Kool  M  et  al.,  Immunity.  2011;34(4):527-40.；Marichal  T  et  al.,  Nature  medicine.  2011;17(8):996-1002.；Kool  M  et  al.,  J  Exp  Med.  2008;205:869-82.；McKee  AS  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2013;110(12):E1122-31.）。加えて、一部の低分子の細胞傷害性化学薬剤が、抗原特異的なＩｇＧ１やＩｇＥの産生を誘導するためのアジュバントとして機能し得る（Jacobson  LS  et  al.,  The  Journal  of  biological  chemistry.  2013;288(11):7481-91.；Tonti  E  et  al.,  Cell  reports.  2013;5(2):323-30.）。このように、粒子状物質により誘発されたＤＡＭＰは、アレルギー反応の誘導と悪化に関与し得る。【００１３】
砂塵のような一部の環境粒子は、ケイ素およびアルミニウムのような無機元素から構成される（Ichinose  T  et  al.,  Inhalation  Toxicology.  2008;20(7):685-94.）。本願では、本発明者らは、粒子状物質であるアラムおよびシリカの気管内注入による粒子状物誘発性の肺炎症モデルを確立した。粒子状物質の気管内注入は、抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＥ抗体およびＢＡＬ細胞を誘導した。驚くべきことに、粒子状物質の気管内注入から２週間後の抗原曝露は、抗原特異的な抗体応答を誘導した。周知のアレルギー促進性サイトカインＩＬ−３３および胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、粒子状物質による肺炎症には関与しない。本発明者らは、粒子状物質の気管内注入後の肺においてＤＡＭＰとしての宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αを検出し、そして、各ＤＡＭＰは、異なる機構によって肺炎症に関与していた。粒子状物質は肺胞マクロファージからを刺激し、ＩＬ−１αを誘導したが、他の組織マクロファージでは誘導されなかった。このように、粒子状物質の曝露によって引き起こされるされるＩＬ−１αおよび宿主ＤＮＡのようなのＤＡＭＰの放出は、全身性ＩｇＥの誘導とアレルギー反応の悪化させるアジュバントとして機能し得る。【００１４】
上記のように、本発明者らは、粒子状物質によって誘導されるアレルギー性炎症、特にアレルギー疾患において最も重要とされるＩｇＥの誘導に関して解析を進めた。【００１５】
本発明者らは、種々の遺伝子改変マウスを用い、粒子の気管内への投与によって誘導されるアレルギー性炎症をＩｇＥの誘導を指標に解析を行い、粒子の気管内への投与によって細胞傷害が引き起こされ、核酸やインターロイキンＩα（ＩＬ−１α）が誘導されること、さらに、ＩＬ−１αに反応しないＭｙＤ８８欠損マウスやＩＬ−１受容体欠損マウスでは、細胞傷害を引き起こすことが確認された粒子の投与によるＩｇＥの誘導が生じないことが見出された。興味深いことに、粒子の腹腔内や皮下への投与では、同様の現象は見られなかった。したがって、この現象が肺において特異的に認められる現象であることが明らかになった。【００１６】
さらに、肺においてＩＬ−１αが誘導される機構について研究を行ったところ、肺に常在する肺胞マクロファージが粒子に反応してＩＬ−１αを産生することが明らかになった。また、この現象に関しても腹腔または骨髄由来のマクロファージを用いた際には認められず、肺胞マクロファージの活性化パターンが粒子に対する組織特異的な反応を誘導する一因であることが示唆された。【００１７】
これらの結果から、肺胞マクロファージの特性を利用した粒子状物質の性質の解析、すなわち粒子で刺激された肺胞マクロファージがＩＬ−１αを産生するか否かを評価することによって、その粒子がアレルギー性炎症を引き起こすか否かを評価する評価法への応用が可能であることが示唆される。さらに、肺胞マクロファージの機能を制御することによってアレルギー性炎症を引き起こすＩｇＥの誘導をコントロールできる可能性が提供される。【００１８】
上述したように、粒子状汚染物質は、アレルギー反応を悪化させると考えられている。砂塵のような粒子状物質は、ケイ素およびアルミニウムのような無機元素から構成される。これらは、肺炎症および全身性ＩｇＥを誘導することが知られているが、これまでの知見では、肺炎症における粒子状物の作用機構はあまり理解されていなかった。本発明では、本発明者らは、粒子状物質が細胞死を誘導し、宿主のＤＮＡおよびＩＬ−１αを放出させ、これらがその後、肺炎症およびＩｇＥの誘導のためのアジュバントとして機能することを実証した。粒子状物質の気管内注入は、抗原特異的なＩｇＥ応答を誘導した。粒子状物の気管内注入から２週間後の抗原曝露は、ＩｇＥおよび肺炎症を誘発し、そして、宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αは、気管内注入後２週間まで、肺内に放出された。粒子状物質によるこの遅延型かつ持続性のアジュバント効果は、気管内注入に特有であり、腹腔内投与では見られず、さらにＭｙＤ８８依存性のＩＬ−１シグナル伝達経路によって制御されている。しかしながら、インフラマソームおよびアレルギー促進性サイトカインＩＬ−３３および胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、粒子状物誘発性の肺炎症に関与しなかった。粒子状物質によるＩＬ−１α放出は、肺胞マクロファージでは見られたが、他の組織マクロファージおよびＩＩ型肺胞細胞では見られなかった。本発明者らの結果から、粒子状物質曝露により放出される宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αが肺炎症および全身性ＩｇＥの誘導において重要な役割を果たすものと理解される。【００１９】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解することにより、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、従来存在しなかった吸入性粒子状物質のアレルギー性感作性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価法および粒子によって引き起こされるアレルギー性炎症の新規治療法を提供する。これまでは、アレルギー性炎症を誘導する疑いがある粒子に関しては、マウスまたはラットを用いた吸入曝露実験もしくは気管内注入実験を行い、血清ＩｇＥの上昇や好酸球の浸潤をマーカーとして検査または解析を行っていた。しかし、この方法では、クリーンな状態で動物を飼育する施設、曝露や気管内注入を行うための基材や特殊技術を必要とし、さらに結果が得られるまでに約１か月以上、通常２カ月程度の時間を要するのが欠点であった。本発明では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの検査法であるため、細胞の培養をする設備を有しさえすれば、どの施設でも実施することができ、さらに、結果を２日以内に得ることができる点も有利である。また、動物を飼育する費用も不要であるため、比較的安価で行うことが可能である。このように迅速、安価かつ簡便な吸入性粒子状物質のアレルギー感作成の検査法は従来存在しなかった。また、簡便さから、毒性またはアレルギー性感作成のある種々の粒子または今後新たに生成される粒子状物質のマススクリーニング、安全性検査等も可能になる。加えて、粒子によって引き起こされるアレルギー性炎症は、これまでその発症機序が不明であったため、効果的かつ根本的な治療法が存在しなかった。この点、本発明は、粒子によって引き起こされるアレルギー性炎症の一因である肺胞マクロファージの活性化を制御する物質（例えば、ポリ−２−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド：ＰＶＮＯ）あるいは、ＩＬ−１αの抑制剤を用いてアレルギー性炎症の治療を可能にしたという点で画期的であるといえる。【００２１】
これまでの研究では、ＩＬ−１αを介してＩ型アレルギー反応の検査、予防または治療を行うことができることは知られていないため、本発明における知見は、予想外の知見であるといえＩ型アレルギー反応の今後の検査、予防および治療において重要な知見であるといえる。マクロファージに関して言えば、ＩＶ型アレルギーとの関連が知られるところであるが、このＩＶ型アレルギーはＴ細胞によるマクロファージの活性化によって、マクロファージ自体が組織損傷に関与し炎症を引き起こすメカニズムであり、Ｉ型アレルギーとは異なるため、相互に関連があるとは考えられていない。そして、本発明で判明した知見によれば、はマクロファージが損傷されることがアレルギー反応に関与するため、全く異なった（むしろ正反対の）メカニズムであるといえ、アレルギーに関して予想以上に複雑な現象があることが示されたといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１は、粒子状物質が肺炎症および抗体産生を誘導することを示す。（図１Ａ）生理食塩水、ＯＶＡ、または、ＯＶＡ（１０μｇ）と混合したアラム（１００μｇ）を、気管内注入によりマウスに投与した（上パネル参照）。投与から１０日後に、マウスを１日おきに３回ＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬ細胞数（下右パネル）と、ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ下中パネルおよび下左パネル）について分析した。グラフ中ｓａｌｉｎｅは生理食塩水のみ、ＯＶＡはオボアルブミンのみ、ＯＶＡ＋ａｌｕｍはオボアルブミンと混合したアラムを示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｂ】生理食塩水またはアラムを、気管内注入により投与した。投与後１日目、３日目、７日目または１４日目に、マウスを１日おきに３回ＯＶＡエアロゾルに曝露した。７日間の間隔を空けた後、マウスを再度１日おきに３回ＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収した（上パネル参照）。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬ細胞数（下右パネル）と、ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ下中パネルおよび下左パネル）について分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｃ】生理食塩水、アラム、シリカ（２５０μｇ）またはＮｉＯ（１００μｇ）を、気管内注入により投与した（プロトコルは、上パネル参照）。投与から７日後、マウスを（Ｂ）と同様にＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収した（上パネル参照）。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬ細胞数（下右パネル）と、ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ下中パネルおよび下左パネル）について分析した。各グラフにおいて、左から、データは、生理食塩水、アラム、シリカまたはＮｉＯの気管内注入を示す。少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｄ】アラムを−７日目に腹腔内投与し、０日目および７日目にＯＶＡを腹腔内投与した（アラム→ＯＶＡ→ＯＶＡ）。ＯＶＡのみ（ＯＶＡ→ＯＶＡ）またはＯＶＡと混合したアラム（アラム＋ＯＶＡ→ＯＶＡ）の注射をコントロールとして用いた（プロトコルは左に示す。グラフ中左からＯＶＡ→ＯＶＡ、アラム＋ＯＶＡ→ＯＶＡ、アラム→ＯＶＡ→ＯＶＡを示す。）。ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ右グラフおよび左グラフ）について分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｅ】Ｍｙｄ８８＋／−またはＭｙｄ８８−／−マウスをＯＶＡ＋アラムの腹腔内投与によって２回免疫した（０日目および７日目）。最後の注射から１０日後に、血清を回収した。ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ右グラフおよび左グラフ）について分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。）。
【図１Ｆ】Ｍｙｄ８８＋／−またはＭｙｄ８８−／−マウスにアラムを気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを（Ｂ）と同様にＯＶＡエアロゾルに曝露した。ＥＬＩＳＡによるＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体（それぞれ右グラフおよび左グラフ）について分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｇ】Ａｌ２Ｏ３およびヒドロキシアパタイトは、肺において炎症性反応を誘導しないことを示す。生理食塩水または示される粒子状物をマウスに気管内注入した。注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清を回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって（それぞれ右グラフおよび左グラフ）分析した。グラフ中左から生理食塩水、Ａｌ２Ｏ３、ヒドロキシアパタイトおよびアラムを示す。
【図２Ａ】図２はＩＬ−１Ｒシグナルが肺炎症および抗体応答に必要とされることを示す。アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（それぞれ、左グラフ、右グラフ、中央グラフ）。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（それぞれ、左グラフ、右グラフ、中央グラフ）。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｃ】アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（それぞれ、左グラフ、右グラフ、中央グラフ）。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｄ】アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（それぞれ、左グラフ、右グラフ）。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図２Ｅ】アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図２Ｆ】アラム（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）またはシリカ（Ｃ）をＩｌ１ｒ−／−マウス（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａｓｃ−／−マウス（Ｄ）、Ｔｓｌｐｒ−／−マウス（Ｅ）またはＩｌ３３−／−マウス（Ｆ）に投与した。気管内注入から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した、最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図２Ｇ】生理食塩水または１００μｇのアラムを気管内注入により投与した。投与後１日目、３日目、７日目または１４日目（グラフ中左から示す）に、ＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬＦ内のＩＬ−１α（Ｇ）およびＩＬ−１β（Ｈ）をＥＬＩＳＡにより分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ｈ】生理食塩水または１００μｇのアラムを気管内注入により投与した。投与後１日目、３日目、７日目または１４日目（グラフ中左から示す）に、ＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬＦ内のＩＬ−１α（Ｇ）およびＩＬ−１β（Ｈ）をＥＬＩＳＡにより分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図２ＡＡ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図２ＢＢ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図２ＣＣ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図２ＤＤ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図２ＥＥ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図２ＦＦ】アラム（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥおよびＦＦ）またはシリカ（ＤＤ）をＴｌｒ２／４−／−マウス（ＡＡ）、Ｔｌｒ７／９−／−マウス（ＢＢ）、Ｉｌ１８−／−マウス（ＣＣ）、Ｉｌ１ｒ−／−マウス（ＤＤ）、カスパーゼ−１−／−マウス（ＥＥ）またはＮｌｒｐ３−／−マウス（ＦＦ）に気管内注入により投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩｇＥのものを右に、ＩｇＧ１のものを左に示す。ＡＡ〜ＦＦはＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験を示す。
【図３Ａ】図３は、粒子状物質により放出される宿主ＤＮＡは、肺炎症および抗体応答に部分的に関与することを示す。（図３Ａ）生理食塩水または１００μｇのアラムを気管内注入により投与した。投与後１日目、３日目、７日目または１４日目に、ＢＡＬＦを回収し、ＤＮＡ含量について分析した（グラフ中左から示す。）。＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｂ】示される粒子状物質（１ｍｇ）を１０分間ＤＮＡ（２μｇ）と混合した。水相中のＤＮＡの残量を測定することにより、粒子状物上に吸着されたＤＮＡを推定した。グラフ中左からアラム、シリカ、ＮｉＯ、Ａｌ２Ｏ３およびＴｉＯ２を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｃ】生理食塩水、ＯＶＡ、Ａｌ２Ｏ３またはＡｌ２Ｏ３−ＤＮＡ複合体（各グラフ中左からそれぞれ示される）を、気管内注入により投与し、その翌日に、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収した。左グラフはＯＶＡ−ＩｇＧ１を示し、右グラフはＯＶＡ−ＩｇＥを示す。＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図３Ｄ】アラムを気管内注入によりマウスに投与し、投与から６日後に、２ｍｇのＤＮａｓｅを気管内注入した。ＤＮａｓｅ投与から２４時間後に、ＢＡＬＦを回収した。各グラフ中左は生理食塩水を示し、右はＤＮａｓｅ投与を示す。左グラフはＢＡＬＦ中のＤＮＡ量を示し、右グラフはＢＡＬ細胞を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｅ】アラムを気管内注入によりマウスに投与し、２ｍｇのＤＮａｓｅを、実施例においても記載したように気管内注入により２回投与した。ＯＶＡ曝露の後に血清を回収した。各グラフ中左は生理食塩水を示し、右はＤＮａｓｅ投与を示す。左グラフはＯＶＡ−ＩｇＧ１を示し、右グラフはＯＶＡ−ＩｇＥを示す。＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図３Ｆ】アラムを気管内注入によりマウスに投与した。投与から７日後、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す。左グラフはＯＶＡ−ＩｇＧ１を示し、右グラフはＯＶＡ−ＩｇＥを示す。ｎ．ｓ．は統計学的に優位ではないことを示す。
【図３ＡＡ】図３ＡＡ〜ＥＥにおいては、宿主ＤＮＡは、粒子状物質による抗体応答に部分的に関与することを示す。（図３ＡＡ）生理食塩水または示された粒子状物１００μｇを気管内注入により投与した。投与後１日目、３日目、７日目または１４日目（各グラフ中左から示す。）に、ＢＡＬＦを回収し、ＢＡＬＦ内のＤＮＡ含量を分析した。左上はシリカ、右上はＮｉＯ、左下はヒドロキシアパタイトおよび右下はＴｉＯ２を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図３ＢＢ】アラム腹腔内投与後の腹腔における宿主ＤＮＡ放出。マウスにＰＢＳまたは１ｍｇのアラムを．注射した。腹腔内投与後の示される日に、腹腔液を回収し、ＤＮＡ含量を測定した。グラフ中横軸はＰＢＳ１日目、アラム１日目、２日目、３日目、４日目および５日目を示す。
【図３ＣＣ】ＯＶＡ、または、ＯＶＡと混合したＤＮＡ（それぞれ左、右に示す）を気管内注入によりマウスに投与し、その翌日に、マウスを図３ＣのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清を回収し、ＥＬＩＳＡに用いた。
【図３ＤＤ】アラムを、Ｉｒｆ３／７−／−マウス（ＤＤ）またはＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔ変異マウス（ＥＥ）に気管内注入により投与した。投与から７日後に、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清を回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１（それぞれ右グラフ、左グラフ）をＥＬＩＳＡによって分析した。
【図３ＥＥ】アラムを、Ｉｒｆ３／７−／−マウス（ＤＤ）またはＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔ変異マウス（ＥＥ）に気管内注入により投与した。投与から７日後に、マウスを図１ＢのようにＯＶＡエアロゾルに曝露した。最後の曝露から２４時間後に、血清を回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１（それぞれ右グラフ、左グラフ）をＥＬＩＳＡによって分析した。
【図４Ａ】図４は、肺胞マクロファージは、粒子状アジュバントに応答してＩＬ−１αを放出することを示す。肺より直接単離した肺胞マクロファージ（Ａ）または培養の肺胞マクロファージ（ＢおよびＥ）をＬＰＳ（１μｇ）または示される粒子状物質（１００μｇ）で６時間刺激した。上清を回収し、サイトカインＥＬＩＳＡまたはＬＤＨ放出について分析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｂ】肺より直接単離した肺胞マクロファージ（Ａ）または培養の肺胞マクロファージ（ＢおよびＥ）をＬＰＳ（１μｇ）または示される粒子状物質（１００μｇ）で６時間刺激した。上清を回収し、サイトカインＥＬＩＳＡまたはＬＤＨ放出について分析した。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。各グラフでは、それぞれ、左からＰＢＳ、ＬＰＳ、アラム、シリカ、Ａｌ２Ｏ３、およびヒドロキシアパタイトを示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｃ】ＭｙＤ８８欠損（Ｃ）またはＡＳＣ欠損（Ｄ）の培養肺胞マクロファージを、ＬＰＳまたはアラムで６時間刺激した。グラフはＩＬ−１α生成を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｄ】ＭｙＤ８８欠損（Ｃ）またはＡＳＣ欠損（Ｄ）の培養肺胞マクロファージを、ＬＰＳまたはアラムで６時間刺激した。グラフはＩＬ−１α生成を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｅ】肺より直接単離した肺胞マクロファージ（Ａ）または培養の肺胞マクロファージ（ＢおよびＥ）をＬＰＳ（１μｇ）または示される粒子状物質（１００μｇ）で６時間刺激した。上清を回収し、サイトカインＥＬＩＳＡまたはＬＤＨ放出について分析した。グラフは、左から、ＩＬ−１α生成、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｆ】チオグリコール酸誘導の腹腔マクロファージまたは培養肺胞マクロファージをＰＢＳ，ＬＰＳ、アラムまたはシリカ（グラフ中左から示す）で６時間刺激した。グラフはＩＬ−１α生成を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｇ】培養肺胞マクロファージを、ＡＴＰまたはＬＬＯＭｅで６時間処理するか、または、細胞を、３回の凍結−融解サイクル（Ｆ／Ｔサイクル）により溶解させた。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。各グラフでは、それぞれ、左からＰＢＳ、アラム、ＡＴＰ、ＬＬＯＭｅ、およびＦ／Ｔサイクルを示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｈ】培養肺胞マクロファージを、シグナル阻害剤であるサイトカラシンＤ（ＣｙｔｏＤ）、Wortmannin（ＷＭ）、LY294002（ＬＹ）、SB203580（ＳＢ）またはWedelolactone（Ｗｅｄ）の存在下、シリカまたはアラムで刺激した。６時間後、上清を回収した。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４ＡＡ】図４ＡＡ〜ＦＦでは肺胞マクロファージは、粒子状物質に応答してＩＬ−１αを産生することが示される。（ＡＡ）インビトロ由来のＩＩ型肺胞細胞を抗肺サーファクタントタンパク質Ａ抗体で染色し、共焦点顕微鏡により検出した。左はコントロール抗体を示し、右は抗肺サーファクタントタンパク質Ａ抗体を示す。
【図４ＢＢ】ＭｙＤ８８／ＡＳＣ／ＩＰＳ−１三重ＫＯ由来の培養肺胞マクロファージをアラムまたはシリカで６時間刺激した。培養上清中のＩＬ−１αをＥＬＩＳＡによって分析した。左は野生型を示し、右はＭｙＤ８８／ＡＳＣ／ＩＰＳ−１三重ＫＯ由来の培養肺胞マクロファージを示す。グラフはＩＬ−１α生成を示す。
【図４ＣＣ】野生型、ＭＡＲＣＯ  ＫＯまたはＳＲ−Ａ  ＫＯ（それぞれ左、中央および右）の肺胞マクロファージを、アラムまたはシリカで６時間刺激した。培養上清中のＩＬ−１αをＥＬＩＳＡによって分析した。グラフはＩＬ−１α生成を示す。
【図４ＤＤ】ＧＭ−ＣＳＦ由来の骨髄マクロファージ（ＧＭ−Ｍφ）（ＤＤ）またはＩＩ型肺胞細胞（ＥＥ）を１００μｇのアラムまたは１μｇのＬＰＳで６時間刺激した。培養上清を回収し、ＬＤＨアッセイおよびＩＬ−１α  ＥＬＩＳＡに用いた。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。
【図４ＥＥ】ＧＭ−ＣＳＦ由来の骨髄マクロファージ（ＧＭ−Ｍφ）（ＤＤ）またはＩＩ型肺胞細胞（ＥＥ）を１００μｇのアラムまたは１μｇのＬＰＳで６時間刺激した。培養上清を回収し、ＬＤＨアッセイおよびＩＬ−１α  ＥＬＩＳＡに用いた。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。
【図４ＦＦ】培養肺胞マクロファージを、U0126、SP600125、Ｓｙｋ阻害剤（Merck社より購入、＃574711）またはネクロスタチン−１（Santa  Cruz社より購入、#SC-200142）の存在下または不在下で、アラムを用いて６時間刺激した。左からPBS、アラムのみ、アラム＋U0126、アラム＋SP600125、アラム＋Syk阻害剤、およびアラム＋ネクロスタチン−１を示す。
【図５Ａ】図５はＩＬ−１αの放出はインビボで細胞死によって媒介されることを示す。（図５Ａ）培養肺胞マクロファージを、２０μｇのＰＶＮＯの存在下でシリカを用いて刺激した。６時間後、上清を回収し、サイトカインＥＬＩＳＡまたはＬＤＨ放出について分析した。左グラフはＩＬ−１α生成を示し、右グラフは細胞傷害性を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図５Ｂ】シリカ、材料および方法に記載したようにまたは100μgのPVNOを添加したシリカを気管内注入により投与した。１日おきに3回ＰＶＮＯを気管内注入によりマウスに投与した。粒子状物質の投与から７日後にＢＡＬＦを回収した。グラフは左からＢＡＬ細胞、ＢＡＬＤ中のＤＮＡ量およびＩＬ−１α生成を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、本発明に基づくＩＬ−１αを経由したアレルギーの発症メカニズム模式図を示す。このようなＩＬ−１αおよび肺胞マクロファージの関与は本発明において初めて見出されたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２４】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００２５】
１つの局面において、本発明は、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の反応性を指標として被験物質のアレルギー誘発性を検査するための方法を提供する。別の局面において、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の作用を阻害することによってアレルギーを治療または予防する方法、医薬、組成物等を提供する。そこで、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）についてまず説明する。
【００２６】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）としては、歴史的な経緯および現象的な経緯から、ＩＬ−１αのほか、ＩＬ−１αとは構造が顕著に相違するＩＬ−１βが存在し、いずれもマクロファージ、単球および樹状細胞により産生される。これらは感染に対する生体の炎症応答の重要な部分を形成する。大半の場合、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは同一の細胞受容体と結合する。この受容体は所定の他の受容体とほぼ共通の経路を介して細胞内シグナルを伝達する、同一ではないが近縁の２つのサブユニットから構成される。これらはＴｏｌｌファミリーの先天性免疫受容体とＩＬ−１８受容体である。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは類似した生物学的性質をさらに有しており、そのような性質としては、発熱、徐波睡眠および好中球増加症の誘導、Ｔリンパ球およびＢリンパ球活性化、線維芽細胞増殖、所定細胞に対する細胞傷害性、コラゲナーゼの誘導、肝臓における急性期タンパク質の合成、ならびにコロニー刺激因子およびコラーゲンの産生亢進が挙げられる。
【００２７】
ＩＬ−１βについては、以下のように、ＩＬ−１αとは異なる機能が知られており、ＩＬ−１Ｒを阻害すると、ＩＬ−１αおよび１βの両方が阻害されるため、１βの阻害による副作用が問題となる。
【００２８】
すなわち、ＩＬ−１αとβは同一の受容体に結合することから同一の機能を有していると考えられていたが、最近、両者の機能的な違いが報告されている（Rider  P．  et  al  J．  Immunol．  2011;187:4835−43．）。この報告では、炎症部位ではＩＬ−１αは主に好中球の遊走に関与し、ＩＬ−１βは単球やマクロファージの遊走に関与することが示されている。また、Ｙａｚｄｉら（Yazdi  A.S.，  et  al．，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA．  2010;107:19449−54．）によって、肺の急性炎症におけるＩＬ−１αとβの役割が報告されており、急性炎症時の好中球の浸潤にはＩＬ−１αが重要であることが示されている。このような機能的な差異が生じるメカニズムは明らかにされていないが、αとβの炎症における役割が異なりうることから、両方を作用を阻害するＩＬ−１Ｒの阻害剤は思わぬ副作用を引き起こす可能性があるため、ＩＬ−１αのみを特異的に阻害する方法が望ましい。
【００２９】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡはいずれも単離・発現されており、これらのｃＤＮＡはＩＬ−１α（Lomedico  et  al。（1984）Nature  312:458）およびＩＬ−１β（Auron  et  al。（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA  81:7909）と呼ばれる２種類の異なる遺伝子産物に相当する。８種類のインターロイキン１ファミリー遺伝子が染色体２上にサイトカイン遺伝子クラスターを形成する。ＩＬ−１βはｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両者でヒト単球により産生される主要な形態である。これらの２種類のヒトＩＬ−１はアミノ酸相同度が２６％に過ぎない。これらの２種類のＩＬ−１はポリペプチド配列が異なるが、構造類似性があり（Auron  et  al。（1985）J．Mol．Cell  Immunol．2:169）、アミノ酸相同性はＩＬ−１分子の不連続領域に限定される。
【００３０】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは前駆体ペプチドとして産生される。換言するならば、これらは長いタンパク質として産生された後、プロセシングされ、成熟タンパク質と呼ばれる短い活性分子を放出する。ＩＬ−１αはプロタンパク質として産生され、カルパインによりタンパク質分解プロセシングされ、未だ十分に研究されていないメカニズムで放出される。例えば成熟型ＩＬ−１βはカスパーゼ１又はインターロイキン１変換酵素（ＩＣＥ）と呼ばれるカスパーゼファミリータンパク質の所定のメンバーによる開裂後にＰｒｏ−ＩＬ−１βから放出される。ヒトＩＬ−１スーパーファミリーの各メンバーの成熟形態の三次元構造は樽型タンパク質を産生する１２〜１４本のβ鎖から構成される。
【００３１】
ＩＬ−１αは軟骨吸収の亢進に効果があることから当初は「カタボリン」と呼ばれたが、滑膜細胞でコラゲナーゼとプロスタグランジンに刺激作用を与えることから「単核球細胞因子」（ＭＣＦ）とも呼ばれ、急性期反応に刺激作用を与える「白血球内因性因子」（ＬＥＭ）とも呼ばれる。ＩＬ−１αは単球、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞およびリンパ球等の多数の種類の細胞により合成され、多くの細胞はＩＬ−１αに特異的な受容体を有することから、ＩＬ−１αは広範な生物学的活性を有する。ＩＬ−１αはＩＬ−２放出、Ｂ細胞成熟および増殖、ならびに線維芽細胞増殖因子活性を誘導することにより胸腺細胞増殖を刺激する。ＩＬ−１αタンパク質は内因性発熱物質とみなされ、滑膜細胞からのプロスタグランジンとコラゲナーゼの放出を刺激すると報告されている。従って、ＩＬ−１αは各種障害および障害の症状の誘因として中心的な位置を占める。これらの障害は治療法が殆ど又は全く存在しない重度の障害が大半である。これらの遺伝子の多型は関節リウマチとアルツハイマー病に関係があることが示唆されている。ＩＬ−１全般は関節炎、肺線維症、中枢神経系疾患、糖尿病および所定の心血管疾患を含む多数のヒト疾患に関係があるとされている。
【００３２】
ＩＬ−１αは、ＩＬ１Ａ、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ１、ＩＬ１−ＡＬＰＨＡ、ＩＬ１Ｆ１等とも表示されることがあり、そのヒトアミノ酸配列については、アクセッション番号が、ＮＰ＿０００５６６、ｍＲＮＡ配列については、アクセッション番号が、ＮＭ＿０００５７５である。ＩＬ−１αのアミノ酸配列は、例えば、配列番号１である。ＩＬ−１αmRNAの塩基配列は、例えば、配列番号２である。ＩＬ−１αは、ＩＬ−１αの活性を有していれば、そのアミノ酸配列は限定されない。したがって、本発明の具体的な目的に合致する限り、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその類似体もしくは誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、本発明において用いることができることが理解される。
【００３３】
本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、対象となるタンパク質（例えば、ＩＬ−１α）に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、（高度に）ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を改変した産物であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なin  vitroアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。本発明では、ＩＬ−１αについてヒトが主に論じられるが、ヒト以外の多くの動物がＩＬ−１αを発現していることが知られているため、これらの動物、特に哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００３４】
したがって、ＩＬ−１αの代表的なヌクレオチド配列は、
（a）配列番号１記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（e）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（f）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（g）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＩＬ−１αの有する活性またはマーカーとして同じ生物内に存在する他のタンパク質から識別し得ることをいう。
ＩＬ−１αのアミノ酸配列としては、
（a）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（b）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（c）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（d）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（e）（a）〜（d）のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＩＬ−１αの有する活性またはマーカーとして同じ生物内に存在する他のタンパク質から識別し得ること（例えば、抗原として用いられる場合特異的エピトープとして機能し得る領域を含むこと）をいう。
【００３５】
本発明の関連において、「ＩＬ−１αに結合する物質」、「ＩＬ−１α（の）結合剤」または「ＩＬ−１α相互作用分子」は、少なくとも一時的にＩＬ−１αに結合する分子または物質である。検出目的では好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）ことが有利であり、治療目的では、さらに治療用薬剤が結合していることが有利である。ＩＬ−１αに結合する物質は、例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、siRNA、低分子量分子（LMW）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（peptidomimetic）等を挙げることができる。ＩＬ−１αに結合する物質または「ＩＬ−１α相互作用分子は、ＩＬ−１αの阻害剤であってもよく、例えばＩＬ−１αに対して向けられる、特にＩＬ−１αの活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＩＬ−１α遺伝子に対して向けられる核酸も含まれる。ＩＬ−１αに対する核酸は、例えばＩＬ−１α遺伝子の発現またはＩＬ−１αの活性を阻害する、二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そしてアンチセンス核酸、アプタマー、siRNA（低分子干渉RNA）およびリボザイムを含むがこれらに限定されない。本明細書において、ＩＬ−１αについて「結合タンパク質」または「結合ペプチド」とは、ＩＬ−１αに結合する任意のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＩＬ−１αに対して指向される抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）、抗体フラグメントおよび機能的等価物を含むがこれらに限定されない。
【００３６】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本発明の実施形態に係る抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がL型、またはD型であってもよい。それらのような場合でも、本発明の実施形態に係る蛋白質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、N末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、C末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００３７】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine−modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.19:5081(1991);Ohtsuka  et  al.,  J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini  et  al.,  Mol.Cell.Probes  8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００３８】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００３９】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50％同一である場合、好ましくは少なくとも70％同一である場合、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
【００４０】
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST  2.2.28（2013.4.2発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００４１】
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、または2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Mark  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.1984  Sep;81(18):5662-5666.、Zoller  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  1982  Oct  25;10(20):6487-6500.、Wang  et  al.,  Science.  1984  Jun  29;224(4656):1431-1433.）。欠失等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD  -Plus-  Mutagenesis  Kit  (TOYOBO  CO.,  LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
【００４２】
本発明の一実施形態において「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、または100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。
【００４３】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1〜2倍濃度のSSC（saline-sodium  citrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM  塩化ナトリウム、15mM  クエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley  Interscience  Publishers,  (1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular  Cloning  2nd  ed.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Supplement  1-38,  DNA  Cloning  1:Core  Techniques,A  Practical  Approach,  Second  Edition,  Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、第3版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０°Cでの、約５０％ホルムアミド、��×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２°Cでの約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０°C、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００４４】
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
【００４５】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＩＬ−１α）において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいい、複合分子にあっては対応する部分（例えば、膜貫通ドメイン等）をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、S−S結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。このような対応する領域またはドメインは、本発明において複合分子を設計する場合に有用である。
【００４６】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒトのＩＬ−１αは、それぞれ、他の動物（特に哺乳動物）において、対応するＩＬ−１αを見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＩＬ−１α等）は、配列番号１または配列番号２等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。
【００４７】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがn）に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカー、治療剤または標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカー、治療剤または標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００４８】
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【００４９】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、ＩＬ−１αは、肺胞マクロファージの機能との関連および／またはアレルギー誘発性との関連で機能することが提示されているため、その関連性を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子の間の結合およびそれによって生じる生物学的変化であり得、そして、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【００５０】
本明細書においてインターロイキン１α（ＩＬ−１α）の「値」とは、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）のタンパク質の量、ｍＲＮＡの発現量、酵素活性等、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）に関する何らかの値であればよい。この「値」はアレルギー誘発性の指標として本発明において用いることができる。
【００５１】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍRNAを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、ＩＬ−１αの発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＩＬ−１αのmRNAの量、ＩＬ−１αタンパク質の量、そしてＩＬ−１αタンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＩＬ−１αの発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。ＩＬ−１αのmRNAやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。
【００５２】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ＩＬ−１α」またはその抗体の機能的等価物は、ＩＬ−１αまたはその抗体自体ではないが、ＩＬ−１αまたはその抗体の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、ＩＬ−１αの持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＩＬ−１αまたはその抗体自体またはこのＩＬ−１αまたはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＩＬ−１αまたはその抗体自体またはＩＬ−１αまたはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＩＬ−１αまたはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＩＬ−１αまたはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul  et  al.,  J.Mol.Biol.  215:403-410(1990))、FASTA(Pearson  &  Lipman,  Proc.Natl.Acad.Sci.,  USA  85:  2444-2448(1988)）、Smith  and  Waterman法（Smith  and  Waterman,  J.Mol.Biol.  147:195-197(1981)）、およびNeedleman  and  Wunsch法（Needleman  and  Wunsch,  J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびin  situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００５３】
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＩＬ−１αのアミノ酸配列において1または複数個（好ましくは1もしくは数個または1、2、3、もしくは4個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５４】
本明細書において「阻害剤」または「抑制剤」または「インヒビター」（いずれも英文では、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒに該当する）とは、対象となる実体（例えば、レセプターまたは細胞）に対してそのレセプターまたは細胞の生物学的作用を阻害する物質または因子をいう。本発明のＩＬ−１αの阻害剤としては、対象となるＩＬ−１αまたはＩＬ−１αを発現する細胞等の作用または機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子が挙げられる。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、機能的等価物、アンチセンス、siRNA等のRNAi因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５５】
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現またはそれを増強する物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用の発現を抑制または阻害する物質をいう。天然のアンタゴニストのほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に抑制または阻害するもののほか、非競合的に抑制または阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を抑制または阻害することから、アンタゴニストは阻害剤（阻害剤）または抑制（する）因子の概念に包含されうる。したがって、本明細書においては実質的にアンタゴニストは「阻害剤」と同義で用いられる。
【００５６】
本明細書において「抗体」は、広義にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばFvフラグメント、Fab’フラグメント、F（ab’）2およびFabフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体または機能的等価物（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（oligospecific）抗体、単鎖抗体、scFV、ダイアボディー（diabody）、sc（Fv）2（single  chain  （Fv）2）、scFv−Fc）を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＩＬ−１α抗体は、ＩＬ−１αのタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＩＬ−１αタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
【００５７】
本発明の一実施形態において「抗ＩＬ−１α抗体」は、ＩＬ−１αに結合性を有する抗体を含む。この抗ＩＬ−１α抗体の生産方法は特に限定されないが、例えば、ＩＬ−１αを哺乳類または鳥類に免疫することによって生産してもよい。
【００５８】
また、「ＩＬ−１αに対する抗体（抗ＩＬ−１α抗体）、または、そのフラグメント」の「機能的等価物」は、例えば、抗体の場合、ＩＬ−１αの結合活性、必要であれば抑制活性を有する抗体自体およびそのフラグメント自体のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（oligospecific）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  （Ｆｖ）２）、ｓｃＦｖ−Ｆｃなども包含されることが理解される。
【００５９】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、悪性腫瘍の増殖が特に強く抑制される観点からは、ＩＬ−１αの特定のエピトープに特異的に結合する抗ＩＬ−１α抗体であることが好ましい。
【００６０】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にＩＬ−１αに対して作用させることができる。抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体を効率的に生産する観点からは、ＩＬ−１αをニワトリに免役することが好ましい。
【００６１】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体の抗体クラスは特に限定されないが、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＹであってもよい。
【００６２】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、抗原結合活性を有する抗体断片（以下、「抗原結合性断片」と称することもある）であっても良い。この場合、安定性または抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。
【００６３】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、融合蛋白質であってもよい。この融合蛋白質は、抗ＩＬ−１α抗体のＮまたはＣ末端に、ポリペプチドまたはオリゴペプチドが結合したものであってもよい。ここで、オリゴペプチドは、Ｈｉｓタグであってもよい。また融合蛋白質は、マウス、ヒト、またはニワトリの抗体部分配列を融合したものであってもよい。それらのような融合蛋白質も、本実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体の一形態に含まれる。
【００６４】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、例えば、精製ＩＬ−１α、ＩＬ−１α発現細胞、またはＩＬ−１α含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体であってもよい。ＩＬ−１α陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＩＬ−１α発現細胞を免疫に使用することが好ましい。
【００６５】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、精製ＩＬ−１α、ＩＬ−１α発現細胞胞またはＩＬ−１α含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体の、ＣＤＲセットを有する抗体であってもよい。ＩＬ−１α陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＩＬ−１α発現細胞を免疫に使用することが好ましい。ＣＤＲセットとは、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、並びに、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３のセットである。
【００６６】
本発明の一実施形態において「ＩＬ−１α発現細胞」は、例えば、ＩＬ−１αをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入後、ＩＬ−１αを発現させることによって得てもよい。ここでＩＬ−１αは、ＩＬ−１α断片を含む。また本発明の一実施形態において「ＩＬ−１α含有脂質膜」は、例えば、ＩＬ−１αと脂質二重膜を混合することによって得てもよい。ここでＩＬ−１αは、ＩＬ−１α断片を含む。また本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、ＩＬ−１α陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、抗原をニワトリに免疫する工程を経て得られる抗体、またはその抗体のＣＤＲセットを有する抗体が好ましい。
【００６７】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、目的を達成する限り、どのような結合力を有していてもよく、例えば、少なくとも１．０×１０６以上、２．０×１０６以上、５．０×１０６以上、１．０×１０７以上を挙げることができるがこれらに限定されず、通常は、ＫＤ値が、１．０×１０７以上であってもよい。
【００６８】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を有していてもよい。
【００６９】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、ＩＬ−１αの野生型または変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。野生型または変異型のＩＬ−１αのアミノ酸配列は、配列番号８に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有している。
【００７０】
本発明の一実施形態において「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団を含むまた抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、全長抗体（Ｆａｂ領域とＦｃ領域を有する抗体）、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、多価特異的抗体（例えば、二価特異的抗体）、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド、キメラ抗体（例えば、マウス-ヒトキメラ抗体、ニワトリ-ヒトキメラ抗体等）、マウス抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらの同等物（または等価物）からなる群から選ばれる1種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＩＬ−１α抗体は、ＩＬ−１αのタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＩＬ−１αタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
【００７１】
本発明の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック、羊土社(2003):86-91.）。
【００７２】
本発明の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、"Kohler  G,  Milstein  C.,  Nature.  1975  Aug  7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、"Clackson  et  al.,  Nature.  1991  Aug  15;352(6336):624-628."、または"Marks  et  al.,  J  Mol  Biol.  1991  Dec  5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、"タンパク質実験ハンドブック,  羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法でよって作製してもよい。
【００７３】
抗体の大量生産については、当該分野で公知の任意の手法を用いることができるが、例えば、代表的な抗体の大量生産系の構築および抗体製造としては、以下を例示することができる。すなわち、CHO細胞にH鎖抗体発現ベクターおよびL鎖抗体発現ベクターをトランスフェクションし、選択試薬であるG418およびZeocinを用いて培養を行い、限界希釈法によるクローニングを行う。クローニング後、安定的に抗体を発現しているクローンをELISA法により選択する。選択したCHO細胞を用いて拡大培養し、抗体を含む培養上清を回収する。回収した培養上清からProtein  AもしくはProtein  G精製により抗体を精製することができる。
【００７４】
本発明の一実施形態において「Fv抗体」は、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。
【００７５】
本発明の一実施形態において「Fab抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Fabは、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体を、蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
【００７６】
本発明の一実施形態において「F(ab’)2抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabに相当する部位を2つ含む抗体である。F(ab’)2は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体を、蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のFab’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。
【００７７】
本発明の一実施形態において「Fab’抗体」は、例えば、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、F(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
【００７８】
本発明の一実施形態において「scFv抗体」は、VHとVLとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。scFv抗体は、例えば、本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、VH-ペプチドリンカー-VLをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
【００７９】
本発明の一実施形態において「diabody」は、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、例えば、scFvをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
【００８０】
本発明の一実施形態において「dsFv」は、VHおよびVL中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はReiterらにより示された方法(Reiter  et  al.,  Protein  Eng.  1994  May;7(5):697-704.)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００８１】
上記のFv抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、scFv抗体、diabody、dsFv抗体、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド（以下、「Fv抗体等」と称することもある）の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体におけるFv抗体等の領域をコードするDNAを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。または、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBOC法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって生産してもよい。なお本発明の一実施形態に係る抗原結合性断片は、上記Fv抗体等の1種以上であってもよい。
【００８２】
本発明の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス-ヒトキメラ抗体は、例えば、"Roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1994  Feb  1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。
【００８３】
本発明の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（FR）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro  et  al.,  FRont  Biosci.  2008  Jan  1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング（Ozaki  et  al.,  Blood.  1999  Jun  1;93(11):3922-3930.）、Re-surfacing  (roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1994  Feb  1;91(3):969-973.)、またはFRシャッフル（Damschroder  et  al.,  Mol  Immunol.  2007  Apr;44(11):3049-3060.  Epub  2007  Jan  22.）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Riechmann  et  al.,  Nature.  1988  Mar  24;332(6162):323-327.）。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。
【００８４】
本発明の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg  et  al.,  Int  Rev  Immunol.  1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質（g3p、g10p等）のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan  et  al.,  Nat  Biotechnol.  1996  Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。
【００８５】
また抗体は、CDR-grafting  (Ozaki  et  al.,  Blood.  1999  Jun  1;93(11):3922-3930.)によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをグラフティングすることで作製してもよい。または、本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをコードするDNAと、公知のヒトまたはヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域をコードするDNAとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗ＩＬ−１α抗体の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法（例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、またはファージディスプレイ法等）を用いて、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、FRシャッフル（Damschroder  et  al.,  Mol  Immunol.  2007  Apr;44(11):3049-3060.  Epub  2007  Jan  22.）、またはバーニヤゾーンのアミノ酸残基またはパッケージング残基を置換する方法（特開2006-241026、またはFoote  et  al.,  J  Mol  Biol.1992  Mar  20;224(2):487-499.）を用いて、FR領域を最適化してもよい。
【００８６】
本発明の一実施形態において「重鎖」は、典型的には、全長抗体の主な構成要素である。重鎖は、通常、軽鎖とジスルフィド結合および非共有結合によって結合している。重鎖のN末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域（VH）と呼ばれる領域が存在し、一般的に、VHが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、"Reiter  et  al.,  J  Mol  Biol.  1999  Jul  16;290(3):685-98."にはVHのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、"Wolfson  W,  Chem  Biol.  2006  Dec;13(12):1243-1244."には、ラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。
【００８７】
本発明の一実施形態において「CDR（相補性決定領域）」は、抗体において、実際に抗原に接触して結合部位を形成している領域である。一般的にCDRは、抗体のFv（可変領域:重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む）上に位置している。また一般的にCDRは、5〜30アミノ酸残基程度からなるCDR1、CDR2、CDR3が存在する。そして、特に重鎖のCDRが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またCDRの中でも、CDR3が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、"Willy  et  al.,  Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  Volume  356,  Issue  1,  27  April  2007,  Pages  124-128"には、重鎖CDR3を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。CDR以外のFv領域はフレームワーク領域（FR）と呼ばれ、FR1、FR2、FR3およびFR4からなり、抗体間で比較的よく保存されている（Kabat  et  al.,「Sequence  of  Proteins  of  Immunological  Interest」US  Dept.  Health  and  Human  Services,  1983.）。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因はCDRにあり、特に重鎖CDRにあるといえる。
【００８８】
CDRの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Kabatの定義(Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  5th  ed.,  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  MD.  (1991))、またはChothiaの定義(Chothia  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,1987;196:901-917)を採用してもよい。本発明の一実施形態においては、Kabatの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるCDRの重複部分を、または各々の定義によるCDRの両方を含んだ部分をCDRとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford  Molecular's  AbM  antibody  modeling  softwareを用いたMartinらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,  1989;86:9268-9272）がある。このようなCDRの情報を用いて、本発明に使用されうる変異体を生産することができる。このような抗体の変異体では、もとの抗体のフレームワークに１または数個（例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個）の置換、付加もしくは欠失を含むが、該CDRには変異を含まないように生産することができる。
【００８９】
本明細書において「抗原」（antigen）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。本発明の抗体は、エピトープが同じであれば、他の配列を有する抗体であっても同様に利用することができることが理解される。
【００９０】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられる限り、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００９１】
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「測定する手段」とは、ある対象を何らかの方法で測定することができる手段をいう。
【００９２】
本明細書において「マーカー（物質または遺伝子）」とは、ある状態（例えば、疾患状態、障害状態、あるいは悪性状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、癌等の疾患の状態）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「発現産物」（遺伝子産物ともいう）とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはmRNAをいう。本明細書では、アレルギー誘発性、特にＩ型アレルギーとの関連が示されていない、ＩＬ−１αがアレルギー誘発性の指標として使用可能であることが見出された。
【００９３】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
【００９４】
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、血清等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
【００９５】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、70％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９６】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態（例えば、アレルギー）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
【００９７】
本明細書において「検出薬（剤）」または「検査薬（剤）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。
【００９８】
本明細書において「診断薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、アレルギー等の疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
【００９９】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、アレルギー）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
【０１００】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、アレルギー等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なおアレルギーの治療薬は、アレルギーの予防のために用いられる薬物（予防薬）、またはアレルギー抑制剤を含む。
【０１０１】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、アレルギー）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、アレルギー等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【０１０２】
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、アレルギー等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【０１０３】
本明細書において「曝露」とは、ある物質を別の物質と相互作用し得る状態に置くことをいう。本明細書において「相互作用」とは、2つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした2つの物質は、会合または結合している状態にある。本発明の検出、検査および診断は、このような相互作用を利用して実現することができる。
【０１０４】
本明細書中で使用される用語「結合」は、2つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０１０５】
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が30％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０１０６】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の反応、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。2種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、抗体と、その抗原との間の相互作用（または結合）が包含される。このような特異的な相互作用または結合の反応を利用することにより、試料中の対象物の検出または定量お行うことができる。
【０１０７】
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、検出剤、検査剤または診断剤への結合または相互作用を含む、mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはPCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるELISA法、RIA法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（LIA）、免疫沈降法（IP）、免疫拡散法（SRID）、免疫比濁法（TIA）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ELISA法またはRIA法などが例示される。アレイ（例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat  Genet．2002  Dec;32  Suppl:526−532に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、in  vitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（2002）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１０８】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはmRNA等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのmRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはmRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
【０１０９】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「消失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいい、特に「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「減少」または「抑制」に包含される。
【０１１０】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
【０１１１】
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、DNAまたはRNAなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【０１１２】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出、検査または診断の手段としてもちいられる。
【０１１３】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、RI（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、10nm以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、AlexaTMFluorが望ましい。AlexaTMFluorは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またpH感受性が低い。蛍光極大波長が10nm以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、AlexaTM555とAlexaTM633の組み合わせ、AlexaTM488とAlexaTM555の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、CyDyeTMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、2−アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が10nm以上である蛍光物質としては、例えば、Cy5とローダミン6G試薬との組み合わせ、Cy3とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン6G試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、mycタグ、Hisタグ、HA、Aviタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカーの検出剤、検査剤、診断剤（プライマーまたはプローブ等であり得る）にはこのようなタグを結合させてもよい。
【０１１５】
本明細書において「インビボ」（in  vivo）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
【０１１６】
本明細書において「インビトロ」（in  vitro）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０１１７】
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。
【０１１８】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【０１１９】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package  insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１２０】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【０１２１】
＜アレルギー誘発性の検査技術＞
１つの局面において、本発明は、被験物質のアレルギー誘発性を検査するための方法を提供する。この方法は：Ａ）試験系における肺胞マクロファージに被験物質を曝露する工程；およびＢ）該試験系においてインターロイキン１α（ＩＬ−１α）を測定する工程、を包含する。この方法では、このＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標である。このＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す。１つの応用例として、都心部に多く存在する微粒子が呼吸器系を介して免疫を異常に活性化させるアジュバントとして働き、アレルギー性炎症が引き起こされるといわれているが、本発明の方法では、このようなアジュバントとしての活性を有する粒子を検査することができる。例えば、本発明によって検査したところ、水酸化アルミニウム（粒子径１００〜５００ｎｍ）、シリカ（粒子径０．５〜５μｍ）、酸化ニッケル（粒子径１０〜１００μｍ）等はアレルギーを引き起こしやすい粒子であることがわかり、二酸化チタン（粒子径１．５μｍ）、酸化アルミニウム（粒子径５０〜１００ｎｍ）、ヒドロキシアパタイト（粒子径６０ｎｍ）等は、アレルギーを引き起こしにくい粒子であることが分かった。これらの実験結果から、アレルギーを引き起こしやすい微粒子はアレルゲンとともに肺内の肺胞マクロファージに作用し、ＩＬ−１αが放出され、これがＢ細胞に作用してＩｇＥが生成され、アレルギー性炎症になると考えられる（図６を参照）。
【０１２２】
本発明の方法は、インビトロで肺胞マクロファージを用いて実施されてもよく、あるいは、本発明の方法は、肺胞マクロファージを含む非ヒト動物を用いてなされてもよい。好ましくは、肺胞マクロファージを用いて行ってもよい。
【０１２３】
インビトロで行う方法は以下のとおりである。
【０１２４】
すなわち、肺胞マクロファージを入手し、これを通常の培養条件で培養する。培養条件としては、通常使用される任意の条件を用いることができ、当業者が適宜調節し得ることが理解される。次に、この肺胞マクロファージに被験物質を曝露させ、さらに培養を続ける。曝露時間は、特に限定されないが、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、約６時間以上、約８時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、約１８時間以上、約２４時間以上等を挙げることができ、好ましくは、約１時間から約１２時間、１例としては約６時間を挙げることができるがそれに限定されない。好ましくは、対照（コントロール）として、陰性対照（無刺激のもの）、および陽性対照（陽性対照）を同様の実験系で実施する。対照は、定型化したならば省略してもよいが、好ましくは並行して実施する。
【０１２５】
非ヒト動物を用いて行う場合の一般的な動物モデルの方法を以下に記載する。
【０１２６】
マウス等のモデル動物にアレルギーを増強される可能性がある被験物質（例えば、粒子（対象粒子））を抗原（例えば、タンパク抗原（卵白アルブミンやダニ抗原等））をミックスしたものを点鼻もしくは気管内注入によりこの動物（例えば、マウス）に投与する。投与量は被験物質（例えば、粒子）について例えば、５０〜１００μｇ、抗原（例えば、タンパク抗原）について例えば１０〜１００μｇで、例えば、５０μｌの液量で投与する。対照群として生食のみの投与、抗原（例えば、同様のタンパク抗原）のみの投与、および陰性対照群（例えば、アレルギーを引き起こしにくいことが判明している物質（例えば、二酸化チタン粒子またはハイドロキシアパタイト粒子）と抗原（例えば、タンパク抗原）とを混ぜたもの）も必要に応じて並行して実施する。統計学的な観点から、通常、一群５匹以上の動物が必要であるため、対照群と合わせて最低２０匹が必要となる。
【０１２７】
典型的な投与の例としては、投与をｄａｙ０およびｄａｙ７に行い、その後ｄａｙ１４からタンパク抗原のみ（粒子無し）を２日に一回の頻度で４〜５回投与する。
【０１２８】
本発明の場合は、適宜の時期に、肺胞マクロファージを取り出し、肺胞マクロファージにおけるＩＬ−１αの量を測定することで、被験物質のアレルギー誘発性を判断することができる。すなわち、マウス等の動物の肺に試験物質を気管内注入し、３〜７日後に肺胞洗浄液を回収し、ＩＬ−１αを測定すれば、２５日はかからないことから、動物モデルとしても期間を短縮することができる。他方、従来の技術では、おおよそ２５日程度でマウスの血清を回収し、血清中のＩｇＥを測定し、必要に応じて、マウスの肺の標本を作成し、炎症具合を検討することが必要であるとされている。
【０１２９】
このように、本発明を用いた場合、結果を得るまでの時間が短縮できる。また本発明の好ましい実施形態として、インビトロの系で行う場合は、培養以外の技術が不要となり、動物に粒子を曝露する機材および技術が不要となるため検査が簡便となること、結果を得るまでの時間がさらに短縮され検査期間がさらに短縮される、通常２日以内程度で結果が得られること、動物の使用を減らすこと（いわゆる３Ｒの理念）にもかなった実験系が提供される等、種々の利点が提供される。このように、インビトロのスクリーニングにはアレルゲンは必要なく、粒子自体がアレルギー反応を増強するか否かの評価法になります。言い換えると、アレルゲンとしての危険性が少ない物質（抗原）でも、粒子が存在することで、その抗原に対してアレルギーを誘発するようになるか否かを評価する方法になる。他方で、動物モデルの実験では、アレルゲンを設定する必要がある。
【０１３０】
本発明の方法において、１つの実施形態では、被験物質の曝露は、この被験物質とは異なる物質である抗原とともになされる。ここで、前記ＩＬ−１αは、この被験物質が、該抗原のアレルギー反応を増強するかどうかの指標である。ここで、１つの好ましい実施形態では、前記抗原は、前記肺胞マクロファージに対してアレルゲンであることが知られる物質である。このようなアレルゲンとしては、一般的には、例えば、吸入性アレルゲン（室内塵（ハウスダスト、ヒョウヒダニの虫体、糞等）、皮膚（例えば、ペット類等のフケ）、花粉（スギ花粉、ヒノキ花粉、ブタクサ花粉、ヤシャブシ花粉、イネ科花粉、キク科花粉等）、真菌（カビ、例えば、アルテルナリア）、昆虫（ユスリカ、ゴキブリ等））、刺咬性アレルゲン（ハチ毒等）、食餌性アレルゲン（大豆、卵、牛乳等）、薬剤性アレルゲン（注射、内服用のもの、例えば、ペニシリン等）、その他動物の体成分、排泄物、植物誌微細物質等を挙げることができるが、これらに限定されない。代表的には、アレルゲンであることが著明である、卵白アルブミン、ダニアレルゲンまたは花粉等が簡易に用いられる。
【０１３１】
別の局面において、本発明は、被験物質のアレルギー誘発性を検査するためのキットを提供する。このキットは、Ａ）肺胞マクロファージ、およびＢ）ＩＬ−１αを測定する手段を含む。ここで、このキットで測定されるように、該ＩＬ−１αは該被験物質のアレルギー誘発性の指標であり、該ＩＬ−１αの値が該被験物質による曝露前の値に比べて上昇することは、該被験物質がアレルギー誘発性を有することを示す。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明のキットは、試験するための容器をさらに含んでいてもよい。このような容器は、肺胞マクロファージの培養が可能であり、また、被験物質の肺胞マクロファージの曝露を許容するものであればどのような形状、材質、サイズのものであってもよいことが理解される。特定の実施形態では、前記ＩＬ−１αを測定する手段は、ＩＬ−１αに対する特異的な抗体またはその誘導体（例えば、抗原結合性フラグメント等）および免疫反応試験手段を含む。特定の実施形態では、この免疫反応試験手段は、任意の免疫学的測定方法を実現手段を用いることができ、そのような免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるELISA法、RIA法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（LIA）、免疫沈降法（IP）、免疫拡散法（SRID）、免疫比濁法（TIA）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ELISA法またはRIA法などが例示される。好ましい実施形態では、使用される肺胞マクロファージは、培養装置とともに提供されてもよい。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明のキットは、肺胞マクロファージに対してアレルゲンであることが知られる物質をさらに含む。含まれ得るアレルゲンとしては、どのようなものでもよく、本明細書において他の箇所において記載した任意のものが例示され、代表的には、アレルゲンであることが著明である、卵白アルブミン、ダニアレルゲンまたは花粉等が簡易に用いられる。
【０１３４】
ＩＬ−１αの測定は当該分野において公知の技術を用いて実施することができる。例えば、ＩＬ−１αに結合または相互作用する物質を用いることができる。このような検出、検査または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。
【０１３５】
このような検出剤、検査剤または診断剤は、ＩＬ−１αに結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸、特にＩＬ−１αを増幅し得る核酸プライマーもしくはＩＬ−１αに結合もしくは相互作用し得るプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１３６】
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出キット、検査キットまたは診断キットとして利用することができる。
【０１３７】
１つの実施形態では、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出、検査または診断可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、2以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する2以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。2以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
【０１３８】
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＩＬ−１αと特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＩＬ−１αの発現は脳マラリアの指標であり、指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、脳マラリアを識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、1つの実施形態では、ＩＬ−１αの発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖cDNAも組織insituハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖cDNAも含まれる。組織中のRNAの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、RNAプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
【０１３９】
特定の実施形態において、本発明はプライマーの形態をとることができる。通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70％相同な、より好ましくは、少なくとも80％相同な、さらに好ましくは、少なくとも90％相同な、少なくとも95％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【０１４０】
特定の実施形態において、本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。特定の実施形態において、本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in  situ  PCR法、LAMP法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【０１４１】
本発明によるプライマーセットはＩＬ−１α等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、PCR法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＩＬ−１α等目的のタンパク質の二本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖DNAのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、LAMP法（WO00／28082号公報）においては、標的遺伝子に対して3’末端側からF3c、F2c、F1cという3つの領域を、5’末端側からB1、B2、B3という3つの領域を、それぞれ規定し、この6つの領域を用いて4種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”Molecular  Cloning，  A  Laboratory  Manual  2nd  ed．”（Cold  Spring  Harbor  Press（1989））、”Current  Protocols  in  Molecular  Biology”（John  Wiley  ＆  Sons（1987-1997））に従って実施することができる。
【０１４２】
特定の実施形態において、本発明は「プローブ」の形態をとることができる。通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相同なまたは相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70％相同な、より好ましくは、少なくとも80％相同な、さらに好ましくは、少なくとも90％相同な、少なくとも95％相同な核酸配列が含まれる。
【０１４３】
1つの実施形態において、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、タグを結合させたものであってもよい。本発明で使用される標識またはタグは、本明細書において説明された任意の形態をとることができる。
【０１４４】
1つの局面において、本発明は、ＩＬ−１αを、アレルギー誘発性の指標とするための方法、あるいはアレルギー誘発性を検出、検査または診断する方法を提供する。
【０１４５】
１つの実施形態では、本発明の方法では、ＩＬ−１αを、アレルギー誘発性を識別する指標とするために、例えば、ＩＬ−１αの発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＩＬ−１αの発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAに結合する物質を含む検出剤、検査剤または診断剤を用いることができる。そのような検出剤、検査剤または診断剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、必要に応じて当該分野で公知の技術を用いて当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。
【０１４６】
本発明の方法は、本発明の検出剤、検査剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＩＬ−１αの発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAがあるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。
【０１４７】
本発明において「接触」は、複数の物質の間の相互作用または結合が生じるようにその複数の物質を配置することであり、本発明では、検出剤、検査剤、診断剤として機能し得る物質（たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカーまたはそれを含む試料に対して物理的に近接させることによって達成することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。具体的なＩＬ−１αの発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出する方法は、試料（例えば、血清等）におけるＩＬ−１αの発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。ここで、試料として使用されるものとしては、発現産物を含むと考えられる試料であればよく、例えば、肺胞マクロファージ自体、またはその細胞調製物を用いることができる。細胞調製物は慣用の方法により取得することができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、本発明による検出、検査または診断は、本発明によるプローブを核酸試料（mRNA、またはそれから転写された相補的DNA（cDNA）等）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＩＬ−１αの発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual  2nd  ed.”(Cold  Spring  Harbor  Press(1989)、特にSection  9.47-9.58)”Current  Protocols  in  Molecular  Biology”(John  Wiley  &Sons(1987-1997)、特にSection  6.3-6.4)、”DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Practical  Approach  2nd  ed.”(Oxford  University(1995)、条件については特にSection  2．10）を参照しうる。
【０１４９】
ハイブリダイゼーション法を利用したＩＬ−１αの発現産物、例えば、ｍRNAの検出は、例えば、：（a）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（b）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（a）において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、32P、14C、および35S）、蛍光（例えば、FITC、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された試料は、ＩＬ−１αを発現していることを示すので、該試料について、アレルギー誘発性の可能性が高いと判定することができる。
【０１５０】
本発明による検出、検査または診断の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（mRNAまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＩＬ−１αの発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。
【０１５１】
核酸増幅法を利用したＩＬ−１αの発現の検出は、例えば、（i）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ii）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。
【０１５２】
工程（i）において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP法等の核酸増幅法を用いて実施できる。この試料中に増幅産物が検出されることは、被験者の組織がＩＬ−１αを発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。
【０１５３】
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるＩＬ−１αの発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。
【０１５４】
抗原抗体反応を利用したＩＬ−１αの発現の検出は、例えば、（I）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（II）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、血清中のＩＬ−１αを検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。抗原抗体複合体が検出される試料は、ＩＬ−１αを高く発現しているので、アレルギー誘発性の可能性が高いと判定することができる。
【０１５５】
前記の各検出工程は1回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、アレルギー誘発性の診断精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出、検査または診断方法によれば、前記の工程を2回以上行うことにより、アレルギー誘発性の判断をより高精度に行うことができる。
【０１５６】
本発明の診断薬、検査薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
【０１５７】
1つの局面において、本発明によれば、本発明による検出、検査および／または診断のための方法を実施するための検出、検査および／または診断のためのキットが提供される。このキットは、本発明の検出剤、検査剤および／または診断剤を含む。その実施形態としては、本明細書において記載された任意の実施形態を単独または組み合わせ用いることができる。
【０１５８】
1つの実施形態では、本発明による検出、検査または診断キットとしては、本発明による実施形態の検出、検査または診断を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＩＬ−１αの発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＩＬ−１αの発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＩＬ−１αの発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＩＬ−１αの発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を
実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、PCRが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１６０】
さらなる実施形態において、本発明による検出、検査または診断キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＩＬ−１αのタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＩＬ−１αの発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばELISA法等に用いる2次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１６１】
これらのキット、組成物またはシステムは、ＩＬ−１αを同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
【０１６２】
1つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
【０１６４】
1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。
【０１６５】
1つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
【０１６６】
（アレルギーの治療剤・予防剤）
１つの局面において、本発明は、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤を含む、アレルギーを治療または予防するための組成物を提供する。本発明では、従来関与するとは知られていなかったＩＬ−１αがアレルギー、特にＩ型アレルギーに関与することが見いだされ、その作用を阻害することによって、アレルギー、特にＩ型アレルギーを治療または予防することができることが明らかになった。
【０１６７】
別の局面では、本発明は、アレルギーを治療または予防するための、ＩＬ−１αの阻害剤を提供する。
【０１６８】
別の局面では、本発明は、その治療または予防を必要とする被験体におけるアレルギーを治療または予防するための方法であって、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）の阻害剤の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。有効量は、本明細書の記載に照らし、当業者が適宜決定することができる。
【０１６９】
１つの特定の実施形態では、本発明が対象とするアレルギーは、Ｉ型アレルギーである。
【０１７０】
さらなる実施形態では、本発明が対象とするアレルギーは、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、アレルギー性炎症、アレルギー性胃腸炎、じんましん、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、血清病、食物アレルギーおよび薬物アレルギーからなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害または症状を挙げることがでいるが、それらに限定されない。
【０１７１】
本発明において使用される阻害剤は、ＩＬ−１α特異的であることが好ましい。本発明で示される抗アレルギー効果は、ＩＬ−１αを経由するものであり、ＩＬ−１βは経由しないことが明らかになった。ところで、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは共通の受容体に反応することもあるとされており、このような共通の受容体およびそれに基づくシグナル伝達経路の存在に起因して、両方のＩＬ−１に共通の阻害剤もよく使用されている。したがって、このような共通の阻害剤を使用した場合、ＩＬ−１βが阻害されることによる弊害、有害作用も危惧される。この点、本発明では、肺胞マクロファージを経由したＩｇＥの生成およびアレルギー反応がＩＬ−１α特異的であることが判明したことから、ＩＬ−１αを特異的に阻害するものが好ましいといえる。あるいは、ＩＬ−１βを阻害すると本明細書でも説明したように、ＩＬ−１βの阻害による副作用がありこれが有害であり得ることが予想されることから、本発明の阻害剤は、好ましくはＩＬ−１βを阻害しないものでありうる。活性化Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）はＩＬ−１βやＩＬ−２３がその増殖や生存に重要な役割を果たしていることが知られており、このような活性を阻害せずにアレルギーを治療し得ることが考えられる。
【０１７２】
１つの特定の実施形態では、本発明で用いられる阻害剤は、ＩＬ−１αに特異的な抗体またはその抗原結合性断片、ＩＬ−１αに特異的なアンチセンス、ＩＬ−１αに特異的なｓｉＲＮＡ、低分子化合物およびそれらの組合せから選択される。このような低分子化合物としては、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）、ＮＦ−ｋＢの阻害剤としても知られるｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ（１，８，９−トリヒドロキシ−３−メトキシ−６Ｈ−［１］ベンゾフロ［３，２−ｃ］クロメン−６−オン）、ｐ３８ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅの阻害剤としても知られるＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）が、ＩＬ−１αの阻害剤として挙げることができる。
【０１７３】
特定した実施形態では、本発明の阻害剤は、低分子化合物、抗体またはその断片もしくは機能的等価物、siRNA、shRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。これらは、２種以上使用してもよい。
【０１７４】
好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＩＬ−１α抗体、またはその断片もしくは機能的等価物を含む。
【０１７５】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、重鎖CDR1、2、および3、ならびに軽鎖CDR１、２および３のアミノ酸配列のセットを含み、さらに、重鎖FR1、2、3、4、軽鎖FR1、2、3、および4のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、あるいはすべてのフレームワークが特定されたもののいずれかのものと同一または実質的に同一あるいは保存的置換を除き同一であるものであり得る。1種以上の抗体であってもよい。また本発明の別の実施形態は、上に列挙した重鎖FR1、2、3、および4のアミノ酸配列のセットのうち、少なくとも1つのセットを含む抗ＩＬ−１α抗体等である。
【０１７６】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体は、scFvの形態であってもよく、その場合、重鎖と軽鎖間のリンカーは、重鎖と軽鎖との間のアミノ酸配列を有していてもよい。上に列挙したアミノ酸配列は、抗ＩＬ−１α抗体が所望の効果を有する限り、(i)上記のアミノ酸配列において、1または数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加しているアミノ酸配列、(ii)上記のアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列、および(iii)上記のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列、からなる群から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列であってもよい。
【０１７７】
本発明の一実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入することによって、形質転換体を作成できる。この形質転換体を用いれば、本発明の実施形態に係る抗ＩＬ−１α抗体を作製できる。形質転換体は、ヒトまたはヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等）の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、サル細胞COS-7などが挙げられる。または、形質転換体はEscherichia属菌、酵母等であってもよい。
【０１７８】
上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばpET-Blue）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110）、酵母由来プラスミド（例えばpSH19）、動物細胞発現プラスミド（例えばpA1-11、pcDNA3.1-V5/His-TOPO）、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、または抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
【０１７９】
上記のポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる（改訂第4版新遺伝子工学ハンドブック、羊土社(2003):152-179.）。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):128-142."に記載の方法を使用できる。抗体の精製においては、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインA、プロテインG、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、またはレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):27-52.）。
【０１８０】
本発明を実施するために、本発明の核酸形態の抑制剤としてはアンチセンス活性を指標に核酸を選択することができる。ここで、「アンチセンス活性」とは、標的となる遺伝子の発現を特異的に抑制または減少させることができる活性をいう。より具体的には細胞内に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、その配列と相補的なヌクレオチド配列領域をもつ遺伝子のｍＲＮＡ量を特異的に低下させることで、タンパク発現量を減少させ得る活性をいう。手法としては、標的となる遺伝子からつくられるｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子を直接的に細胞に導入する方法と、細胞内に目的遺伝子と相補的なＲＮＡを発現させ得る構築ベクターを導入する方法に大別される。
【０１８１】
アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２１の連続するヌクレオチド長の、２２の連続するヌクレオチド長の、２３の連続するヌクレオチド長の、２４の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。したがって、本明細書において、アンチセンス活性には、遺伝子の発現量の減少が含まれるがそれらに限定されない。
【０１８２】
一般的なアンチセンス技術については、教科書に記載されている（Murray，JAH  eds．，Antisense  RNA  and  DNA，Wiley−Liss  Iｎｃ，１９９２）。さらに最新の研究でＲＮＡ干渉（RNA  interference；RNAi）と呼ばれる現象が明らかになり、アンチセンス技術の発展をもたらした。
【０１８３】
本明細書において「RNA干渉」または「RNAi」とは、RNA  interferenceの略称で、当該分野で一般に知られており、RNAiを引き起こす因子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する生物学的プロセスである。例えば、二本鎖RNA（dsRNAともいう）のようなRNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なmRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において「RNAi」はまた、場合によっては、「RNAiを引き起こす因子」、「RNAiを起こす因子」、「RNAi因子」などと同義に用いられ得る。RNAiについては、例えば、Zamore  and  Haley，2005，Science，309，1519−1524;Vaughn  and  Martienssen，2005，Science，309，1525−1526;Zamore  et  al．，2000，Cell，101，25−33；Bass，2001，Nature，４１１，428−429;Elbashiretal．，2001，Nature，411，４９４−498;及びKreutzer他、国際公開第00／44895号；Zernicka−Goetz他、国際公開第01／36646号；Fire、国際公開第99／32619号;Plaetinck他、国際公開第００／０１８４６号；MelloおよびFire、国際公開第01／29058号；Deschamps−Depaillette、国際公開第99／07409号およびLi他、国際公開第00／44914号；Allshire，2002，Science，297，1818−1819;Volpe  et  al．，2002，Science，297,1833−1837;Jenuwein，2002，Science，29７，2215−2218;及びHall  et  al．，2002，Science，297，2232−223７；Hutvagner  and  Zamore，2002，Science，297，2056−60;  McManus  et  al．，2002，RNA，8,842−850;Reinhart  et  al．，2002，gene  ＆  Dev．，16，1616−1626;およびReinhart  ＆  Bartel，2002，Science，297，1831を参照。）。また、本明細書では、RNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉の記述に用いられる他の用語と同義のものを示すものとして理解される。本明細書では、「RNAiを起こす因子」は「RNAi」を起こす限りどのようなものであってもよい。
【０１８４】
本明細書では「RNAiを起こす因子」としては、「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「siRNA」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」等が挙げられ、これらの用語は、ＲＮＡ干渉「RNAi」または遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールも表し得る。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。
【０１８５】
本発明で代表的に用いられる「siRNA」は、短い長さ、通常、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡである。このようなsiRNAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのsiRNAの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。本発明において用いられるsiRNAは、RNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【０１８６】
本発明において、siRNA等のRNAiを起こす因子では、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖または二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約１５から約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対でありうるが、これらより長くてもよい。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、その分子の約１５から約２５個またはそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に相補的である）。あるいは、これらの分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、これらの分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカーまたは非核酸リンカーによって連結されている。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸（ｓｔｅｍ）とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングを受けて、RNAiを媒介し得る活性な分子を生成し得る。これらの因子は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る（例えば、これらの因子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がこれらの因子内に存在する必要がない。）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Martinez  et  al．，2002，Cell．，110，563−574およびSchwarz  et  al．，2002，Molecular  Cell，10,537−568参照）、５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態においては、本発明のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当該分野で公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、またはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および／またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。
【０１８７】
ある実施形態においては、本発明のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態においては、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、２’ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いていてもよいく。ある実施形態において、本発明はRNAiを媒介するのに２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸でありうる。したがって、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、RNAiを維持するのにインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤内のリボヌクレオチドの存在が不要である場合は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、または他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、本発明のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等を阻害する因子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０または５０％においてリボヌクレオチドを含み得る。本明細書ではインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等の抑制剤は、配列特異的RNAiを媒介し得る核酸分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（shRNA）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）であってもよい。
【０１８８】
本明細書においてRNAiを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【０１８９】
あるいは、本発明において用いられるRNAiとしては、例えば、短い逆向きの相補的配列（例えば、１５ｂｐ以上であり、例えば、２４ｂｐなど）のペアが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９０】
理論に束縛されないが、RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなRNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（siRNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「siRNA」とは、short  interfering  RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（RNA−induced−silencing−complex）が形成される。この複合体は、siRNAと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってsiRNAの中央部でｍＲＮＡを切断する。siRNAの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、siRNAの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にRNAiによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNAiによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したsiRNAを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、siRNAそのものを、RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、siRNAを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【０１９１】
また、理論に束縛されることを希望しないが、siRNAは、上記経路とは別に、siRNAのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなsiRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、siRNA自体およびsiRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、siRNA自体およびsiRNAが生じるような因子が有用であることが理解される。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明のRNAiを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（shRNA；short  hairpin  RNA）であり得る。本明細書において「shRNA」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなshRNAは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなshRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなshRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、siRNAと同様にRNAiを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、shRNAは、siRNAと同様にRNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。shRNAはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。本発明において用いられるRNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【０１９３】
本発明において用いられるRNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてRNAiが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法等の任意の適切な方法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。本発明のRNAiを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明において有用である。
【０１９４】
本発明の一実施形態は、ＩＬ−１αをコードする核酸に対するRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを含む、アレルギーの治療または予防薬である。このRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを用いれば、アレルギーを抑制することができる。本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、10以上のヌクレオチドを有する、ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物であってもよい。
【０１９５】
本発明の一実施形態において「RNAi分子」は、RNAi作用を有するRNA鎖であり、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、またはRNAi作用を有するsmallRNA等を挙げることができる。
【０１９６】
本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、miRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは2本鎖RNA、またはそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、またはサイレンシングされる現象を含む。
【０１９７】
RNAi分子のデザインには、例えば、siDirect2.0（Naito  et  al.,  BMC  Bioinformatics.  2009  Nov  30;10:392.）等を使用できる。また、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）に委託してもよい。RNAi作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノーザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対するsiRNAまたはshRNAを生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）から購入することができる。
【０１９８】
本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。上記ガイド鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、そのガイド鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。
【０１９９】
本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。
【０２００】
本発明の一実施形態において「miRNA」は、siRNAと類似の機能を有しているRNA鎖を含み、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。
【０２０１】
本発明の一実施形態において「small  RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、1または2本鎖の低分子RNAなどを挙げることができる。
【０２０２】
上記RNAi分子は、5’末端または3’末端に1〜5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、または10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、または3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。塩基配列は、所望の効果を有する限り、1または複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加していてもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5’末端、右側が3’末端である。
【０２０３】
上記RNAi分子の長さは、例えば、15、18、20、25、30、40、50、60、80、100、200、または400塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数は、アレルギーに対する治療または予防効果を高める観点からは、15以上、または100以下が好ましい。
【０２０４】
本発明の一実施形態において「RNA鎖」は、RNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。また本発明の一実施形態において「DNA鎖」は、DNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。このRNA鎖またはDNA鎖は、1本鎖または複数本鎖（例えば、2本鎖）の形態のRNA鎖またはDNA鎖を含む。RNA鎖またはDNA鎖は、細胞取込促進物質（例えば、PEGまたはその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、またはリンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）等と結合していてもよい。RNA鎖またはDNA鎖は、核酸合成装置を用いて合成可能である。その他、受託会社（例えば、インビトロジェン社等）から購入することもできる。生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、塩または溶媒和物を形成することがある。また、生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、化学修飾を受けることがある。RNA鎖またはDNA鎖の用語は、例えば、塩もしくは溶媒和物を形成しているRNA鎖もしくはDNA鎖、または化学修飾を受けているRNA鎖もしくはDNA鎖等を含む。またRNA鎖またはDNA鎖は、RNA鎖のアナログ、またはDNA鎖のアナログであってもよい。
【０２０５】
上記RNAi分子は、安定的にRNAi作用を発揮する観点からは、ＩＬ−１αのmRNAの塩基配列の一部に対して、相補的な塩基配列を含むことが好ましい。上記「一部」は、例えば、5、10、15、18、20、22、24、26、28、30、35、40、または50塩基以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
【０２０６】
本発明の一実施形態において「タンパク質の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からmRNAへの転写機構を阻害、またはmRNAからタンパク質への翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、mRNA、またはタンパク質の分解を誘導することによって、結果的にタンパク質量を減少させることを含む。本発明の一実施形態において「タンパク質の機能を阻害すること」は、タンパク質に構造変化を生じさせ、タンパク質の活性を低下させることを含む。また、例えば、遺伝子の発現を阻害した結果、mRNAまたはタンパク質の生成量が低下することを含む。
【０２０７】
本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。発現量はmRNA量、またはタンパク質量を指標としてもよい。本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定（片側または両側）を使用して評価し、p＜0.05であるときを含んでいてもよい。または、実質的に差異が生じている状態を含む。本発明の一実施形態において「機能が阻害されている状態」は、活性が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。
【０２０８】
別の局面において、本発明は、有効量のＩＬ−１αの阻害剤またはこれを含む組成物または医薬（治療薬または予防薬）を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者のアレルギーを予防または治療するための方法を提供する。
【０２０９】
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体またはポリヌクレオチドを投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、またはNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。
【０２１０】
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E．W．Martin,  Remington’s  Pharmaceutical  Sciences(Mark  Publishing  Company,  Easton,  U.S.A）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
【０２１１】
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Berge  et  al.,  J.Pharm.Sci.,1977,  66,  1-19に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、J.  Honiget  al.,  The  Van  Nostrand  Chemist’s  Dictionary  P650  (1953)を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、PEGもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。
【０２１２】
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位（例えば、食道）に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（bolus）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が肺で使用される場合、さらに、肺に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
【０２１３】
治療剤が核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をin  vivo投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞DNA内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
【０２１４】
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【０２１５】
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【０２１６】
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、in  vitroアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.001、1、5、10、15、100、または1000mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1、7、14、21、または28日あたりに1または2回投与してもよく、それらいずれか2つの値の範囲あたりに1または2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、in  vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【０２１７】
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の1種以上）を含む。また患者または被験体は、ＩＬ−１αの発現が異常であると判断または診断された患者または被験体であってもよい。このとき、判断または診断は、ＩＬ−１αのタンパク質レベルを検出することにより行われることが好ましい。
【０２１８】
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
【０２１９】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の1以上の成分が充填された、1以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【０２２０】
本発明のキットはまた、本発明の組成物、治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための指示書（添付文書）、並びに／あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【０２２１】
特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
【０２２２】
１つの実施形態では、前記アレルギーは微粒子誘発性のものである。そのような微粒子誘発性のものとしては、代表的には、ＰＭ２．５によるもの、砂塵（黄砂等）、工場等からの煤塵、ディーゼル粒子、ハウスダストによるもの等を挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２２３】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  fromCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,M.A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.  (1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.A.  et  al.(1995).  PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.  et  al.(1999).  PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０２２４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.(1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.  L.  et  al.(1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.  M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.  (I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０２２５】
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化DNA合成装置（Biosearch，  Applied  Biosystems等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Steinら（Stein  et  al.,  1988,  Nucl.  Acids  Res.  16:3209）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Sarinet  al.,  1988,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:7448-7451）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【０２２６】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【０２２７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２２８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２２９】
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、医薬基盤研究所および／または大阪大学において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D  Systems、USCN  Life  Science  INC等）の同等品でも代用可能である。【０２３０】
（実施例１：肺胞マクロファージおよびＩＬ−１αのアレルギー誘発性との関与）
本実施例では、肺胞マクロファージおよびＩＬ−１αのアレルギー誘発性との関与を調べた。以下に詳述する。【０２３１】
（材料および方法）
（動物）
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本クレア株式会社（大阪）から購入した。Ｔｎｆ−／−Ｔｂｋ−／−マウスは、以前に記載されたとおりのものを使用した（Ishii  KJら、Nature.  2008;451(7179):725-9.）。Ｉｌ１８−／−マウスは、兵庫医科大学の中西憲司先生から寄贈された。Ｉｌ３３−／マウスは、以前に記載されたようにして得た（Haenuki  Yら、The  Journal  of  allergy  and  clinical  immunology.  2012;130(1):184-94  e11.；Yasuda  Kら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2012;  109(9):3451-6.）。Ｔｓｌｐｒ−／−マウスは、Ｄｒ．Ｚｉｅｇｌａｒから寄贈された（Zhou  Bら、Nat  Immunol.  2005;6(10):1047-53.）。Ｍｙｄ８８−／−、Ｔｌｒ２／４−／−およびＴｌｒ７／９−／マウスは、株式会社オリエンタルバイオサービス（京都）から入手した。Ｉｌ１ｒ−／−およびＳＴＩＮＧ変異マウス（Ｓｔｉｎｇｇｔ／ｇｔ）は、Jackson  Laboratories（Bar  Harbor，ME，USA）から入手した。Ａｓｃ−／−、Ｎｌｒｐ３−／−およびＣａｓｐａｓｅ１−／−マウスは、以前に記載されたようにして得た（Mariathasan  Sら、Nature.  2004;430(6996):213-8.；Mariathasan  Sら、Nature.  2006;440(7081):228-32.）。Ｉｒｆ３／７−／−マウスは、文部科学省のナショナルバイオリソースプロジェクトを通じてＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ（茨城）により提供されたＩｒｆ３−／−（Tang  CKら、PloS  one.  2013;8(3):e60038.）およびＩｒｆ７−／−に由来した（Honda  Kら、Nature.  2005;434(7034):772-7.）。Ｍａｒｃｏ−／−およびＳｒａ−／−マウスは、Dr．Tryggvason（Karolinska  Institute，Stockholm，Sweden）から寄贈された（Suzuki  Hら、Nature.  1997;386(6622):292-6.；Chen  Yら、Journal  of  immunology.  2005;175(12):8173-80.）。Ｍｙｄ８８−／−Ａｓｃ−／−ＩＰＳ−１−／−マウスは、奈良先端科学技術大学院大学の河合太郎先生から寄贈されたＭｙｄ８８−／−、Ａｓｃ−／−およびＩＰＳ−１−／−マウスに由来した（Kawai  Tら、Nat  Immunol.  2005;6(10):981-8.）。Ｔｎｆ−／−Ｔｂｋ−／−マウス（１２９／Ｏｌａ×Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を除く全てのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドであった。Ｔｎｆ（＋／−）Ｔｂｋ１（−／−）同腹仔をコントロールとして用いた。全ての動物実験は、大阪大学および独立行政法人  医薬基盤研究所により承認された実験動物の管理および使用に関するガイドラインに従って行った。【０２３２】
（試薬）
Alhydrogel（アラム）は、Invivogen（San  Diego，CA，USA）から購入した。シリカ結晶（Ｍｉｎ−ｕ−ｓｉｌ  ５シリカ）は、U．S．Silica（Berkeley  Springs，WV，USA）から購入した。ＮｉＯは、真空冶金株式会社（千葉）から購入した。Ａｌ２Ｏ３（粒径：４０〜５０ｎｍ）、ＴｉＯ２およびＡＴＰは、和光純薬工業株式会社（大阪）から購入した。ヒドロキシアパタイト（粒径：５９ｎｍ）は、株式会社ソフセラ（東京）から購入した。インビボ実験に使用した粒子状物は全て、エンドトキシンフリー（１ＥＵ／ｍｌ（１０ｍｇ）未満）で調製した。ＯＶＡは、関東化学株式会社（大阪）から購入した。エンドトキシンレベルは、トキシカラー（登録商標）（生化学工業株式会社、東京）によって測定すると１ＥＵ／ｍｇ未満であった。ＰＩ３キナーゼ阻害剤Wortmanninは、Sigma  Aldrichから購入した。Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤（SB203580）、ＭＥＫ１／２（Ｅｒｋ）阻害剤（U０１２６）、ＪＮＫ阻害剤（SP600125）、ＮＦ−κＢ阻害剤（Wedelolactone）は、Calbiochem（Merck;Darmstadt，Germany）から購入した。サイトカラシンＤは、Enzo  Life  Science（Plymouth  Meeting，PA）から購入した。Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（ＬＬＯＭｅ）は、Chem-Impex  International（Wood  Dale，IL）から購入した。ポリ−２−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）は、Polysciences（Warrington，PA）から購入した。ネクロスタチン−１はSanta  Cruz社より購入した（#SC-200142）。Ｓｙｋ阻害剤はMerck社より購入した（＃574711）。LY294002はCayman  Chemichal社より購入した（＃70920）。【０２３３】
（インビボ実験）
粒子状物質を、気管内注入により投与した。簡単に述べると、マウスに麻酔をかけ、その門歯によりボード上に引っ掛けた。プラスチック製の細い針を取り付けた１ｍｌシリンジを気管内に挿入し、５０μｌの粒子状物溶液を肺内に直接注入した。【０２３４】
本発明者らは、以下のとおりにいくつかの粒子状物誘発性実験的肺炎症モデルを設計した。【０２３５】
実験１では、５０μｌの生理食塩水、ＯＶＡ（１０μｇ）またはアラム（１００μｇ）に吸着させたＯＶＡ（１０μｇ）を、−１０日目に気管内注入により投与した。０日目に開始して、マウスを２日おきに３回１０分間にわたってＯＶＡエアロゾル（Ｈ２Ｏ中１％ＯＶＡ）に曝露させた。ＯＶＡエアロゾルは、ネブライザー（コンフォート２０００、新鋭工業株式会社、埼玉）により生成させた。マウスには、チャンバボックス（２５×２５×３０ｃｍ）内で曝露させた。最後の曝露から２４時間後に、血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、そして、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＯＶＡ特異的抗体、または、ＢＡＬ細胞数について分析した。簡単な実験設計を図１Ａに示す。【０２３６】
実験２（本研究における標準的なプロトコール）では、５０μｌの粒子状物を気管内注入により投与した。本発明者らは、アラム（１００μｇ）、シリカ（２５０μｇ）、ＮｉＯ（１００μｇ）、Ａｌ２Ｏ３（１００μｇ）またはヒドロキシアパタイト（１００μｇ）を使用し、生理食塩水をネガティブコントロールとして使用した。一部の実験では、ゲノムＤＮＡ（１００μｇ）またはＡｌ２Ｏ３とＤＮＡの複合体を投与した。気管内注入から７日後（滴下注入の７日後を０日目とカウントする）、０日目、２日目および４日目に（１日おきに３回）ＯＶＡエアロゾルにマウスを暴露させた。さらに７日後、マウスを再度、１日おきに３回（１１日目、１３日目および１５日目）ＯＶＡに曝露させた。最後の曝露から２４時間後に、血清およびＢＡＬＦを回収した。一部の実験では、ＯＶＡへの曝露は、アラムの気管内注入から１日後、３日後または１４日後に開始した。簡単な実験設計を図１Ｂに示す。【０２３７】
実験３では、５０μｌの粒子状物を気管内注入により投与した。粒子状物の気管内注入から１日後、３日後、７日後または１４日後にＢＡＬＦを回収した。ＢＡＬＦは、ＤＮＡまたはサイトカインＥＬＩＳＡの測定に使用した。【０２３８】
実験４（ＤＮａｓｅ処理）では、５０μｌのアラムを気管内注入により投与した（−１日目）。気管内注入から６日後、２０００ＵのＤＮａｓｅを肺内に注入し、その２４時間後、実験２と同様にマウスをＯＶＡに曝露させた（０日目）。ＤＮａｓｅを１日目に再度注入した。一部の実験では、ＢＡＬＦを０日目に回収し（ＯＶＡ曝露なし）、ＤＮＡ測定またはＢＡＬ細胞数について分析した。【０２３９】
実験４（ＰＶＮＯ処理）では、５０μｌのシリカまたはＰＶＮＯ（１００μｇ）と混合したシリカを気管内注入により投与した。次いで、ＰＶＮＯを１日おきに３回注入し、気管内注入から７日後に、ＢＡＬＦを回収し、ＤＮＡ測定およびＩＬ−１αもしくはＢＡＬ細胞数について分析した。【０２４０】
ＢＡＬＦは、肺を洗浄することにより回収した。簡単に述べると、プラスチックカニューレ（テルモ株式会社、東京）を、切開した気管に挿管し、５５０μｌのＰＢＳで２回肺を洗浄した。回収した合計容量は約１ｍｌであった。得られたＢＡＬＦを１５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、細胞と液体とを分離した。【０２４１】
（宿主ＤＮＡの測定、ゲノムＤＮＡの調製および粒子状物上へのＤＮＡ吸着の分析）
ＢＡＬＦまたは腹水中の二本鎖ＤＮＡを、Quant−iTＴＭ  Picogreen（登録商標）ｄｓ  ＤＮＡアッセイキット（Invitrogen，San  Diego，CA，USA）により測定した。ゲノムＤＮＡは、Wizard（登録商標）ＳＶゲノムＤＮＡ精製システム（Promega，Madison，WI）を用いてマウスの脾細胞から単離した。粒子状物上へのＤＮＡ吸着の分析について、粒子状物（１ｍｇ）を室温で５分間ＤＮＡ（２μｇ）と混合した。サンプルを１００００ｒｐｍにて１分間遠心分離して、粒子状物を沈殿させ、粒子状物を含まない上清を回収した。上清中のＤＮＡ含量を、Quant-iTTM  Picogreen（登録商標）ｄｓ  ＤＮＡアッセイキットにより測定した。粒子状物上へのＤＮＡ吸着は、上清中のＤＮＡの残量によって推定した。【０２４２】
（細胞の調製）
新たに単離した肺胞マクロファージを、ＢＡＬ細胞から粘着細胞として調製した。腹膜マクロファージおよびＧＭ−ＣＳＦ由来骨髄マクロファージの調製は、以前に記載されたとおりに行った（Kuroda  Eら、Immunity.  2011;34(4):514-26.）。培養肺胞マクロファージは、以前に記載されたとおりの、ミクログリアおよびクッパー細胞の調製方法に従って調製した（Kitani  Hら、Journal  of  immunological  methods.  2010;360(1-2):47-55.；Suzumura  Aら、Journal  of  neuroimmunology.  1987;15(3):263-78.）。肺を単離し、２００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩおよび１．５Ｕ／ｍｌのLiberase  DL  Research  Grade（Roche  Diagnostics  GmbH,  Indianapolis，  IN，USA）を含む５ｍｌのＲＰＭＩ中に懸濁させた。肺をハサミでさいの目状に刻み、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、サンプルをｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳＴＭ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（プログラムＢ．０１）（Miltenyi  Biotech，  Gladbach，  Germany）によりホモジェナイズした。細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、３０μｍのPre-Separation  Filter（Miltenyi  Biotech）を通した。細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、５μｇ／ｍｌインスリンを補充した、抗生物質を含まないＤＭＥＭに再懸濁させ、１７５ｃｍ２培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種した。培地を、２４時間後に、次いで１日おきに交換した。線維芽細胞が増殖し、そして、７日間の培養の後に、細胞シート上にマクロファージが増殖した。マクロファージは、３７℃における２時間の往復振盪（１７０ストローク／分）により簡単に剥がれた。浮遊細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳと抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させた。培養マクロファージは、９５％超がフローサイトメトリーによりＦ４／８０＋と判定された。付着細胞は、免疫組織化学により肺サーファクタントタンパク質Ａ陽性細胞と判定され、これをＩＩ型肺胞細胞として使用した（図４ＡＡ〜ＦＦ）。【０２４３】
（インビトロでの刺激）
すべての実験において、細胞は、４８ウェルまたは９６ウェルプレート（BD  Biosciences;Franklin  Lake，NJ）内で１×１０６／ｍｌの密度にて培養した。細胞を、６時間にわたり、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ、１００μｇ／ｍｌ粒子状物（シリカ、アラム、Ａｌ２Ｏ３またはヒドロキシアパタイト）、２．５ｍＭ  ＡＴＰまたは１ｍＭ  ＬＬＯＭｅにより刺激した。一部の実験では、シリカおよびアラムと一緒に阻害剤を肺胞マクロファージに添加した。阻害剤の使用濃度は以下の通りである：サイトカラシンＤ  ２μＭ、SB203580  １０μＭ、Wortmannin  １００ｎＭ、Wedelolactone  ２０μＭ、ＰＶＮＯ  ２０μｇ／ｍｌ、および、Ｓｙｋ阻害剤（Merck社より購入、＃574711）  １μＭ。刺激後、細胞を含まない上清を回収し、ＥＬＩＳＡに用いた。【０２４４】
（ＥＬＩＳＡおよび細胞傷害性アッセイ）
サイトカインは、サイトカインＥＬＩＳＡキット（R＆D  systems，Minneapolis，MN，USAまたはBiolegend，San  Diego，CA，USA）を、製造業者の説明書に従って用いて測定した。血清ＯＶＡ−ＩｇＥレベルは、ＤＳマウスＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ（ＯＶＡ）キット（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社、大阪）により決定した。ＯＶＡ−ＩｇＧ１の分析については、血清の段階希釈を、１０μｇ／ｍｌ  ＯＶＡでコーティングした９６ウェルプレート内に調製した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ（Bethyl  Laboratories，Montgomery，TX）を二次抗体として使用した。０．５の吸光度（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を持つ血清希釈物の逆数の値を、抗原特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃの力価として規定した。細胞傷害性は、Promega製のCytotox  96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイを用いて乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を定量することによって測定した。【０２４５】
（インビボ試験）
シリカまたは１００μｇのＰＶＮＯを添加したシリカを気管内注入により投与した。１日おきに３回ＰＶＮＯを気管内注入によりマウスに投与した。粒子状物質の投与から７日後にＢＡＬＦを回収した。【０２４６】
（統計分析）
全ての実験を少なくとも２回繰り返し、代表的な結果を示す。統計分析は、Studentのｔ検定またはMann-WhitneyのＵ検定を用いて行った。群間での０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなし、アスタリスク（＊）で示した。【０２４７】
（共焦点顕微鏡分析）
チャンバースライド（松浪硝子工業株式会社、大阪）上で培養した細胞を、BD  Cytofix／CytopermTMPlus固定／透過キット（BD  Biosciences）を用いて、製造業者の指示に従い、固定および透過化した。細胞を、４℃にて１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー中の抗肺サーファクタントタンパク質Ａ抗体（Santa  Cruz  Biotechnology）で一晩染色した。一次抗体での染色の後、細胞を、室温にて２時間、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー中のAlexa  fluor  488結合抗ウサギＩｇＧ（Cell  signaling  technology）で染色した。Fluoview（ＦＶ１０ｉ）共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社、東京）により像を記録した。【０２４８】
（結果）
（粒子状物曝露の遅延型かつ持続性のアジュバント効果は気道に特有である）
以前の報告では、アラムに吸着させたＯＶＡの腹腔内投与後にＯＶＡタンパク質を曝露することで確立されたマウス喘息モデルを使用していた。しかしながら、自然に生じる感作は、腹腔内投与によって生じないので、この実験方法は生理学的に適切ではない可能性がある。より生理学的に適切な様式においてマウス喘息モデルを検討するために、本発明者らは、気道に対する粒子状物質および抗原の直接的な曝露によってマウスを感作させた。マウスに、気管内注入により、生理食塩水、ＯＶＡ、または、アラムに吸着させたＯＶＡを投与し、次いで、ネブライザーを用いてＯＶＡのエアロゾルに曝露させた。ＯＶＡと混合させたアラムの気道投与は、ＯＶＡ特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＥを誘導し、ＢＡＬ細胞の浸潤を増大させた（図１Ａ）。生理食塩水またはＯＶＡ単独の気道投与は、検出可能な免疫反応を示さなかった。【０２４９】
アラムの気管内注入は、肺炎症とＩｇＥ産生を誘導した。これは、抗原（アレルゲン）および粒子状物の同時曝露のモデルである。しかしながら、一部の場合において、抗原と粒子状物質は、別々に曝露され得る。粒子状物質の投与後の抗原の曝露が、肺炎症およびＩｇＥ応答に何らかの影響をおよぼすどうかを調べるために、マウスにアラムを気管内注入し、その後、１４日後、７日後、３日後または１日後に、エアロゾルＯＶＡに曝露させる。ラグタイムにかかわらず、アラム気管内注入後のエアロゾルＯＶＡ曝露は、高いＯＶＡ特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＥレベルを誘導し、そして、ＢＡＬ細胞の浸潤を増大させた（図１Ｂ）。抗体応答は、アラム投与から１４日後にＯＶＡを曝露したマウスにおいて検出され、抗原およびアジュバントが別々に投与された場合でも免疫反応が活性化されることを示唆した。それゆえ、アラムのアジュバント効果は肺内で長く継続し、アラムへの抗原の吸着や抗原のデポ効果を必要としない。【０２５０】
本発明者らはこれまでに、結晶シリカと酸化ニッケルナノ粒子（ＮｉＯ）もまた強力なアジュバント活性を有し、ＩｇＥ応答を誘導すると報告した（Kuroda  Eら、Immunity.  2011;34(4):514-26.）。マウスに、アラム、シリカまたはＮｉＯを気管内注入し、その７日後に、マウスをＯＶＡエアロゾルに曝露させた。シリカおよびＮｉＯの気管内注入は、ＯＶＡ特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＥと、ＢＡＬ細胞の有意な増加を示した（図１Ｃ）。したがって、一度肺の中に投与されると、アラム、シリカおよびＮｉＯは、ＩｇＧ１およびＩｇＥの誘導について強力な長く続くアジュバント活性を有する。酸化アルミニウムおよびヒドロキシアパタイトのような他の非炎症性粒子状物質を用いた同様の実験は、免疫反応を誘導しなかった（図１Ｇ）。これは、これらの非炎症性粒子状物が弱いアジュバント活性しか有さないからである。このように、気管内注入された粒子状物質の全てが肺炎症およびＩｇＥ産生を誘導するわけではない。−７日目にアラムを腹腔内投与し、次いで、ＯＶＡを２回腹腔内投与した別の実験では、ＯＶＡ特異的な血清抗体応答は検出されなかった（図１Ｄ）。したがって、肺は、粒子状物質誘発性の肺炎症に対してより感受性である。【０２５１】
アラムの気管内注入により誘導した抗体応答の誘導機構は、腹腔内投与または皮下注射とは異なる可能性がある。以前の報告は、ＭｙＤ８８−／−マウスでは、アラムを用いたのＯＶＡの感作によって、通常レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧおよびＩＧＥを産生することを実証した（Gavin  ALら、Science.  2006;314:1936-8.；Schnare  Mら、Nat  Immunol.  2001;2:947-50.）。これと一致して、ＯＶＡ＋アラムにより腹腔内にて免疫した野生型（ＷＴ）およびＭｙＤ８８−／−マウスからのＯＶＡ−ＩｇＧ１およびＩｇＥレベルは同等であった（図１Ｅ）。極めて対照的に、アラムの気管内注入の７日後にＯＶＡに曝露させたＭｙＤ８８−／−マウスでは、ＯＶＡ−ＩｇＧ１およびＩｇＥレベルが低下した（図１Ｆ）。このように、肺内での粒子状物質によるＩｇＥ産生誘導は、投与経路に依存して異なる機構によって調節された。【０２５２】
（ＭｙＤ８８依存性のＩＬ−１シグナル伝達が粒子状物質誘発性の肺炎症に必要とされる）
ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ、ならびに、ＩＬ−１、ＩＬ−１８およびＩＬ−３３などのサイトカイン受容体と関連している。次に、本発明者らは、どの受容体がアラムによって誘発される肺炎症に関与するかを決定しようとした。ＩＬ−１８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９欠損マウスを用いたインビボ実験は、すべてのマウスからの血清において、同様のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥレベルを示した（図２ＡＡ〜ＦＦ）。これに対し、Ｉｌ１ｒ−／−マウスは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１レベルが低下し、ＯＶＡ−ＩｇＥは検出されなかった（図２Ａ）。本発明者らはまた、ＢＡＬＦにおけるＯＶＡ特異的抗体レベルを測定したが、Ｉｌ１ｒ−／−マウスのＢＡＬＦ内には、ＩｇＧ１もＩｇＥも検出されなかった（図２Ｂ）。アラムの気管内注入と同様に、シリカの気管内注入は、Ｉｌ１ｒ−／−マウスにおいて、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＥレベルの有意な減少を示した（図２Ｃおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）。加えて、Ｔｈ１型抗体に分類されるＯＶＡ−ＩｇＧ２ｃ応答は、Ｉｌ１ｒ−／−マウスの血清およびＢＡＬＦにおいて有意に減少していた（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）。これらの結果は、粒子状物によって誘導されるＩＬ−１が、ＭｙＤ８８シグナル伝達経路を介してインビボでのＯＶＡ特異的な抗体産生に寄与することを示す。【０２５３】
アラムおよびシリカのような粒子状物質が樹状細胞およびマクロファージを刺激して、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化によりＩＬ−１βを産生させることを多数の報告が示している（Hornung  Vら、Nat  Immunol.  2008;9:847-56.；Eisenbarth  SCら、Nature.  2008;453:1122-6.；Coban  Cら、Allergol  Int.  2010;59:115-24.；McKee  ASら、Journal  of  immunology.  2009;183:4403-14.；Franchi  LおよびNunez  G、European  journal  of  immunology.  2008;38:2085-9.；Kool  Mら、Journal  of  immunology.  2008;181:3755-9.）。インフラマソームが粒子状物質誘発性の肺炎症に関与するかどうかを調べるために、本発明者らは、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１およびアポトーシス関連スペック様ＣＡＲＤタンパク質（ＡＳＣ）欠損マウスを用い、上記のものと同様の実験を行った。予期せぬことに、血清中のＩｇＧ１およびＩｇＥレベルはＷＴマウスと遺伝子欠損マウスで同等であった（図２Ｄおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）。ＴＳＬＰおよびＩＬ−３３は、アレルギー性炎症における重要な分子である（Haenuki  Yら、The  Journal  of  allergy  and  clinical  immunology.  2012;130(1):184-94  e11.；Imai  Yら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2013;110(34):13921-6.；Nakajima  Sら、The  Journal  of  allergy  and  clinical  immunology.  2012;129(4):1048-55  e6.；Al-Shami  Aら、J  Exp  Med.  2005;202(6):829-39.；Zhou  Bら、Nat  Immunol.  2005;6(10):1047-53.；Chen  ZGら、PloS  one.  2013;8(1):e51268.）。しかしながら、Ｔｓｌｐｒ−／−またはＩｌ−３３−／−マウスを用いた実験は、ＷＴマウスと同等のＯＶＡ−ＩｇＧ１およびＩｇＥを示した（図２Ｅおよび２Ｆ）。【０２５４】
ＡＳＣ−カスパーゼ１の欠損、すなわちインフラマソームが関与していない（図２Ｄおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）ことを考慮すると、ＩＬ−１βではなく、インフラマソームとは独立して制御されるＩＬ−１αが、粒子状物質の気管内注入によって誘導される免疫反応の生成に関与する可能性がある。ＩＬ−１αがアラム誘発性の肺炎症に関与し得るというこのような仮説に基づき、本発明者らは実際に、アラムの気管内注入後の様々な時間にＢＡＬＦ内でＩＬ−１αを検出した（図２Ｇ）。興味深いことに、肺内のアラムのアジュバント活性と同様に、アラムの気管内注入後１４日目にもＩＬ−１αが検出された（図１Ｂ）。ＩＬ−１βは、いずれの時点においてもＢＡＬＦにおいて検出されなかった（図２Ｈ）。【０２５５】
（粒子状物質誘導性の宿主ＤＮＡ放出が肺炎症に部分的に関与する）
近年、多数の報告が、尿酸、ＡＴＰおよび脂質メディエーターのようなＤＡＭＰが、内因性アジュバントとして機能することを示しており、さらに、死細胞から放出されたＤＮＡが粒子状物質によるアジュバント活性において重要な役割を有することも報告されている（Marichal  Tら、Nature  medicine.  2011;17(8):996-1002.；Desmet  CJおよびIshii  KJ、Nat  Rev  Immunol.  2012;12:479-91.；Jounai  NおよびIshii  KJ、Frontiers  in  cellular  and  infection  microbiology.  2012;2:168.；Willart  MAおよびLambrecht  BN、Clinical  and  experimental  allergy  :  journal  of  the  British  Society  for  Allergy  and  Clinical  Immunology.  2009;39(1):12-9.；Ghaemi-Oskouie  F,  and  Shi  Y、Current  rheumatology  reports.  2011;13(2):160-6.；Kono  Hら、The  Journal  of  clinical  investigation.  2010;120(6):1939-49.）。興味深いことに、アラムは、ＢＡＬＦ内のＤＮＡ放出を誘導し、そして、ＩＬ−１α放出（図２Ｇ）と同様に、アラムの気管内注入後１４日目までＤＮＡが検出された（図３Ａ）。シリカとＮｉＯも肺内でＤＮＡ放出を誘導したが、生理食塩水または非炎症性粒子状物質はＤＮＡを誘導しなかった（図３ＡＡ〜ＥＥ）。ＤＮＡ放出は、アラムの腹腔内投与後４日目の腹腔洗浄液においては検出されなかった（図３ＡＡ〜ＥＥ）。【０２５６】
ＯＶＡ、または、脾細胞由来のゲノムＤＮＡと混合したＯＶＡの気管内注入とＯＶＡの曝露は、抗原特異的な応答を誘導しなかった、この結果からＤＮＡ自体はアジュバント活性と直接関係しないかもしれない（図３ＡＡ〜ＥＥ）。それゆえ、本発明者らは、放出されるＤＮＡのある種の修飾が、アジュバント活性を調節し得るという仮説を立てた。放出された宿主ＤＮＡは、アラムに速やかに吸着し、その複合体がアジュバント活性にとって重要であることが示されている（McKee  ASら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2013;110(12):E1122-31.）。粒子状物質へのＤＮＡ吸着量を推定するために、粒子状物質とＤＮＡの混合物の水相内の残留ＤＮＡを測定した。アジュバント活性を持つ粒子状物は、強力なＤＮＡ吸着力を有した（図３Ｂ）。酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）のアジュバント活性はひくいが、これは低い細胞傷害活性と弱いＤＮＡ放出性に起因する。しかしながら、Ａｌ２Ｏ３は、強力なＤＮＡ吸着力を有した（図３Ｂ）。そこで、酸化アルミニウムを用いて粒子状物−ＤＮＡ複合体がインビボの免疫反応の調節において役割を有するかどうかを検討した。生理食塩水、ＤＮＡ、Ａｌ２Ｏ３またはＡｌ２Ｏ３−ＤＮＡ複合体を気管内注入し、翌日に、マウスをＯＶＡに曝露した。粒子状物−ＤＮＡ複合体は、ＯＶＡ特異的な血清ＩｇＧ１濃度の有意な増加を誘導した（図３Ｃ）。これに対し、生理食塩水、ＤＮＡ、またはＡｌ２Ｏ３単独の気管内注入は、より弱い抗体応答しか誘導しなかった（図３Ｃ）。このように、放出されたＤＮＡは、粒子状物上に吸着され、この複合体が肺内で免疫反応を誘導し得る。【０２５７】
次に、本発明者らは、死細胞から放出されたＤＮＡがどのように肺炎症に関与するかを調べた。肺内のＤＮＡを分解するためにＤＮａｓｅで処理したマウスは、ＢＡＬＦ中のＤＮＡ放出の低下と、アラムの気管内注入によって誘導されるＢＡＬ細胞数の有意な減少を有した（図３Ｄ）。本発明者らはまた、アラムおよびＤＮａｓｅの気管内注入により、アジュバント活性に対するＤＮａｓｅ処理の効果を調べた。ＯＶＡ−ＩｇＧ１レベルは、ＤＮａｓｅ処理マウスにおいてコントロールよりも幾分（約５倍）低かった。一方、ＤＮａｓｅ処理マウスのＩｇＥレベルは同等であった（図３Ｅ）。ここでは、アラムを気管内注入によりマウスに投与し、２ｍｇのＤＮａｓｅを、気管内注入により２回投与した。ＯＶＡ曝露の後に血清を回収した。（ＤＮＡ活性化シグナル伝達経路の大部分は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ１）を活性化する（Ishii  KJら、Nature.  2008;451(7179):725-9.）。加えて、抗原特異的ＩｇＥは、Ｉｒｆ３−／−およびＴｎｆ−／−Ｔｂｋ−／−マウスにおいて有意に低下しているが、ＩｇＧ１応答は低下しない（Marichal  Tら、Nature  medicine.  2011;17(8):996-1002.）。しかしながら、ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルは、Ｔｎｆ−／−Ｔｂｋ−／−マウスとＴｎｆ−／−Ｔｂｋ＋／−マウスの間で同等であった（図３Ｆ）。ＯＶＡ−ＩｇＧ１レベルはまた、Ｔｎｆ−／−Ｔｂｋ−／−マウスにおいてコントロールよりも幾分（約３倍）低かったが、有意ではなかった。ＩＲＦ３およびＳＴＩＮＧは、宿主ＤＮＡにより活性化されたシグナル伝達経路に関連する分子としてアラムのアジュバント活性に関与する（McKee  ASら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2013;110(12):E1122-31）。しかしながら、ＩＲＦ−３もＳＴＩＮＧも、アラムの気管内注入によって誘導されたＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥ応答には関与しなかった（図３ＡＡ〜ＥＥ）。まとめると、死細胞由来の宿主ＤＮＡは、粒子状物上に吸着され得、そして、ＢＡＬ細胞の早期浸潤とＩｇＧ１産生に部分的に関与する。【０２５８】
（肺胞マクロファージは粒子状物に応答してＩＬ−１αを特異的に誘導する）
肺に曝露された粒子状物は、肺胞マクロファージのような食細胞によって貪食され得る。本発明者らは、肺胞マクロファージに対するアラムの効果を調べた。マウスの肺から単離した肺胞マクロファージを、アラムで刺激するとＩＬ−１αが産生された（図４Ａ）。さらに、インビトロで培養した肺胞マクロファージもまた、アラムおよびシリカに応答してＩＬ−１αを産生した（図４Ｂ）。しかしながら、ＩｇＥ応答を誘導しないＡｌ２Ｏ３およびヒドロキシアパタイトは、肺胞マクロファージ内でＩＬ−１α産生および細胞死を誘導しなかった。Ｇｒｏｓｓら（Gross  Oら、Immunity.  2012;36(3):388-400.）は、アラムおよび尿酸一ナトリウム結晶のような粒子状物質が、リポ多糖（ＬＰＳ）プライミングされた樹状細胞を誘導して、ＩＬ−１βと同様にＩＬ−１αを産生させることを示した。本発明者らのインビトロ実験は、ＬＰＳプライミングなしの肺胞マクロファージを用いた。加えて、ＭｙＤ８８−／−の培養肺胞マクロファージは、アラムでの刺激によりＩＬ−１αを放出したが、ＬＰＳ刺激では放出しなかったことから、ＭｙＤ８８シグナル伝達は、ＩＬ−１α誘導に不必要であった（図４Ｃ）。以前の報告は、ＩＬ−１α産生が、ＡＳＣ活性化と密接に関係していることを示した（Yazdi  ASら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.2010;107(45):19449-54.）。しかしながら、粒子状物質は、ＷＴとＡｓｃ−／−の肺胞マクロファージにおいて、同等のＩＬ−１αレベルを誘導した（図４Ｄ）。これらの結果は、インフラマソームが粒子状物誘導性のＩｇＥ産生に不必要であることを示す本発明者らのインビボデータ（図２Ｂおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）と一致する。加えて、ＭｙＤ８８／ＡＳＣ／ＩＦＮ−βプロモーター刺激因子（ＩＰＳ）−１三重ノックアウト（ＫＯ）マウス由来の培養肺胞マクロファージが、アラムまたはシリカに応答してＩＬ−１αを放出したことから、ＴＬＲ、インフラマソームおよびＲＩＧ様受容体（ＲＬＲ）がＩＬ−１α放出に関与しないことを示している（図４ＡＡ〜ＦＦ）。コラーゲン性の構造を持つマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）のようなスカベンジャー受容体は、環境粒子の結合にとって重要な役割を果たす（Palecanda  Aら、J  Exp  Med.  1999;189(9):1497-506.）。しかしながら、ＭＡＲＣＯも、マクロファージスカベンジャー受容体クラスＡ（ＳＲ−Ａ）も、アラムまたはシリカにより誘導されるＩＬ−１α放出に関与していなかった（図４ＡＡ〜ＦＦ）。アラムで刺激した培養肺胞マクロファージにおいて、他の炎症性サイトカインまたは脂質メディエーターの誘導を測定したが、いずれも検出されなかった（図４Ｅ）。他の組織マクロファージがアラムに応答してＩＬ−１αを放出するどうかを調べるために、腹膜マクロファージ、ＧＭ−ＣＳＦ由来骨髄マクロファージ（ＧＭ−Ｍａｃ）およびＩＩ型肺胞細胞を用いたインビトロ実験を行った。全ての細胞型が、アラムおよびシリカに応答してＩＬ−１αを産生しなかった（図４Ｆおよび図４ＡＡ〜ＦＦ）。したがって、粒子状物質誘導性の特異的なＩＬ−１α放出は、肺胞マクロファージのみで観察され、他の組織マクロファージにおいては観察されなかった。【０２５９】
ＩＬ−１αは、死細胞から放出され、ＤＡＭＰのように機能する（Kim  Bら、Frontiers  in  immunology.  2013;4:391.；Werman  Aら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences.  2004;101(8):2434-9.；Cohen  Iら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2010;107(6):2574-9.；Rider  Pら、Journal  of  immunology.  2011;187(9):4835-43.；Eigenbrod  Tら、Journal  of  immunology.  2008;181(12):8194-8.）。本発明者らの結果は、アラムに応答したＩＬ−１α放出が、死細胞と密接に関連していたことを示唆する。培養肺胞マクロファージを、細胞死を誘導するいくつかの因子、ＡＴＰ（ピロトーシス誘導因子）、ＬＬＯＭｅ（アポトーシス誘導因子）でインキュベート、または凍結融解誘導性の壊死（Ｆ／Ｔサイクル）を行った。全ての処理が細胞死を誘導したが、アラムのみがＩＬ−１α放出を誘導した（図４Ｇ）。このように、肺胞マクロファージにおけるＩＬ−１α放出には、死シグナル以外の追加のシグナルが必要とされる。粒子状物質が肺胞マクロファージでＩＬ−１α放出を誘導する機構やシグナル伝達経路は不明である。本発明者らは、様々なシグナル伝達阻害剤の存在下で、アラムを用いて培養肺胞マクロファージを刺激した。ファゴサイトーシス阻害剤であるWortmannin、LY294002（Cayman  Chemichal社より購入、＃70920）およびサイトカラシンＤは、ＩＬ−１α放出と細胞死の両方を有意に抑制した（図４Ｈ）。SB203580（Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤）とWedelolactone（ＩＫＫ阻害剤）も、ＩＬ−１α放出と細胞死を有意に抑制した。ＲＩＰ−１はＩＬ−１α放出に関与する（Lukens  JRら、Nature.  2013;498(7453):224-7.）が、ネクロスタチン−１（Santa  Cruz社より購入、#SC-200142）は効果は弱く（図４ＡＡ〜ＦＦ）、ネクロプトーシスが、アラム誘導性の細胞死と関連していないことが示された。同様に、U0126（ＥＲＫ阻害剤）、SP600125（ＪＮＫ阻害剤）およびＳｙｋ阻害剤（Merck社より購入、＃574711）も効果がなかった（図４ＡＡ〜ＦＦ）。このように、ファゴサイトーシス、ＰＩ３ＫおよびＮＦ−κＢ経路は、細胞死とＩＬ−１α放出に関与する。【０２６０】
（細胞死からのレスキューはインビボでの宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αの放出とＢＡＬ細胞の補充を抑制する）
本発明者らおよび他のグループはこれまでに、ポリ−２−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド（ＰＶＮＯ）がリソソーム安定化剤であり、マクロファージのＰＶＮＯ処理が、シリカ誘導性の細胞死を抑制することを報告した（Mancino  Dら、International  archives  of  allergy  and  applied  immunology.  1983;71(3):279-81.；Kuroda  Eら、Immunity.  2011;34(4):514-26.）。ＰＶＮＯでの処理は、肺胞マクロファージを細胞死からレスキューし、シリカに応答してＩＬ−１α放出を減少させた（図５Ａ）。同様に、ＰＶＮＯでのインビボ処理は、シリカの気管内注入後の肺において、粒子状物質誘導性のＢＡＬ細胞浸潤を有意に抑制した（図５Ｂ）。加えて、ＢＡＬＦにおける宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１α放出はまた、ＰＶＮＯ処理によって有意に減少された。これらの結果は、粒子状物質誘導性のＩＬ−１αが、本発明者らのインビトロ分析と同様に細胞死によって媒介されることを示し、そして、細胞死のレスキューが、肺炎症の抑制のための有望な戦略であることを示唆する。【０２６１】
（考察）
粒子状汚染物質および環境粒子を含む粒子状物質は、アレルギー性炎症のリスクを増加させる。しかしながら、粒子状物質がアレルギー反応を悪化させる機構はあまり理解されていないままである。本明細書において、発明者らは、肺炎症の分子機構と、粒子状物質曝露により誘導されるＩｇＥの誘導を検討し、そして、粒子状物質によって誘導される宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αのようなＤＡＭＰが肺炎症を誘発することを見い出した。【０２６２】
本発明は、後天的免疫反応およびＩｇＥ誘導の活性化に関する、ＭｙＤ８８およびＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の重要性を示した。以前の研究は、ＭｙＤ８８シグナル伝達がアラムの作用に関与せず、ＩｇＥの負の調節因子として機能し得ることが示された（Gavin  ALら、Science.  2006;314:1936-8.；Schnare  Mら、Nat  Immunol.  2001;2:947-50.）。本発明者らはまた、気管内注入とは対照的に、アラムを腹腔内投与した場合、ＭｙＤ８８−／−マウスにおいてＷＴコントロールよりもわずかに高いＯＶＡ−ＩｇＥレベルが観察された（図１Ｅ）。ＩＬ−３３およびＴＳＬＰはアレルギー性炎症におけるＩｇＥ誘導にとって決定的な因子である（Haenuki  Yら、The  Journal  of  allergy  and  clinical  immunology.  2012;130(1):184-94  e11.；Imai  Yら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2013;110(34):13921-6.；Nakajima  Sら、The  Journal  of  allergy  and  clinical  immunology.  2012;129(4):1048-55  e6.；Al-Shami  Aら、J  Exp  Med.  2005;202(6):829-39.；Zhou  Bら、Nat  Immunol.  2005;6(10):1047-53.；Chen  ZGら、PloS  one.  2013;8(1):e51268.；Yasuda  Kら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2012;109(9):3451-6.）が、いずれのサイトカインも、粒子状物質誘発性肺炎症におけるＩｇＥ産生には関与していなかった（図２Ｅおよび２Ｆ）。したがって、肺特異的な免疫反応は、粒子状物質の気管内注入によって誘導されるのであろう。ＩＬ−１は、マウスアレルギー性喘息モデルにおける重要なサイトカインであり、最近の研究は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−３３が、抗原の鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与によるＴｈ２応答とＩｇＥ産生の誘導のためのアジュバントとして機能することを報告した（Nakae  S、Immunology.  2003;15(4):483-90.；Besnard  AGら、Allergy.  2011;66(8):1047-57.；Gasse  Pら、The  Journal  of  clinical  investigation.  2007;117(12):3786-99.；Nambu  AおよびNakae  S.  IL-1  and  Allergy.  Allergol  Int.  2010;59(2):125-35.；Schmitz  Nら、European  journal  of  immunology.  2003;33(4):991-1000.；Kobayashi  Tら、Nat  Rev  Immunol.  2014;14(2):81-93.）。本願は、粒子状物質誘発性肺炎症におけるＩＬ−１Ｒシグナル伝達の重要性を実証した。今日までに、大部分の研究が、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βが同等の効果があること、あるいは、インフラマソーム（およびＩＬ−１β）の作用が、肺のアレルギー性炎症における重要なメディエーターであることを報告している。しかしながら、ＩＬ−１産生の供給源および分子機構は不明である。本願において、発明者らは、ＤＡＭＰとして放出されたＩＬ−１αが、肺炎症の悪化およびＩｇＥ産生において重要な役割を有することを示し、インフラマソーム（そして、おそらくはＩＬ−１β）は関与していないことを示唆する（図２Ｄおよび図２ＡＡ〜ＦＦ）。興味深いことに、ＩＬ−１αは、アラムの気管内注入により２週間にわたって放出され続け（図２Ｇ）、そして、本発明者らのインビトロでの観察は、マクロファージがＩＬ−１αの供給源であり得ることを示唆する（図４）。ＩＬ−１βとは異なり、プロＩＬ−１αは生物活性であり、最近の論文は、無菌の炎症におけるＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの異なる役割を実証した（Cohen  Iら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  2010;107(6):2574-9.；Eigenbrod  Tら、Journal  of  immunology.  2008;181(12):8194-8.）。さらに、死細胞���らのＩＬ−１αが好中球の補充に関与しているのに対し、ＩＬ−１βはマクロファージの浸潤を誘導する（Rider  Pら、Journal  of  immunology.  2011;187(9):4835-43.）。損傷を受けた細胞由来の物質（他のDAMP）が、ＩＬ−１αとβの異なの細胞活性に寄与し得る。Ｙａｚｄｉら（Yazdi  ASら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.2010;107(45):19449-54.）は、ＩＬ−１αが、粒子状物質誘発性の急性肺炎症および好中球の補充にとって、ＩＬ−１βよりも重要であると報告した。本発明者らは、粒子状物質曝露により誘導されたＩＬ−１αが、急性の反応、後天的な免疫反応およびＩｇＥ産生の活性化において機能することを見い出した。アラムの気管内注入後の肺においてＩＬ−１αが放出される傾向は、宿主ＤＮＡの放出の傾向と似ていた。加えて、インビトロ実験は、細胞死が、アラムまたはシリカに応答したマクロファージからのＩＬ−１α放出と密接に関連していることを明らかにし、粒子状物質の気管内注入後のＤＡＭＰの放出が、アレルギーの悪化と関連することを示した。シリカにより誘導された細胞死をレスキューするインビボＰＶＮＯ処理は、宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αレベル、そして、シリカの気管内注入後のＢＡＬＦ内の炎症性細胞を減少させた（図５）。このように、ＩＬ−１αは宿主ＤＮＡと共同で炎症性反応を調節し、死細胞またはＤＡＭＰ放出の制御が、アレルギー性炎症の治療のための新たな可能性を開き得ることを示唆した。【０２６３】
ＩＬ−１βはインフラマソームの活性化によって誘導されるが、ＩＬ−１α誘導の機構は不明である。本願において、本発明者らは、肺胞マクロファージが、アジュバント活性を持つ粒子状物に応答してＩＬ−１αを特異的に放出することを実証した（図４）。Ｇｒｏｓｓら（Gross  Oら、Immunity.  2012;36(3):388-400.）は、樹状細胞が粒子状物に応答してＩＬ−１αを誘導すると報告した。プライミングしていない肺胞マクロファージを用いた本発明者らの研究とは対照的に、Ｇｒｏｓｓらは、ＬＰＳでプライミングした樹状細胞を用い、ＩＬ−１αの放出には以下の２つの独立したシグナルが必要とされることを実証した：細胞内発現の誘導のためのプライミングシグナルと、ＩＬ−１β放出と同様の分泌のための第二シグナル。加えて、Ｇｒｏｓｓらは、プライミングされていない細胞が、粒子状物に応答してＩＬ−１αを誘導しないことも示しており、これは、本発明者らの腹膜マクロファージおよび骨髄マクロファージでの実験結果と一致している。本発明者らは、ＭｙＤ８８−／−肺胞マクロファージがアラムに応答してＩＬ−１αを放出することを観察し、肺胞マクロファージからのＩＬ−１α放出にＬＰＳでのプライミングが必要とされないことを示した（図４Ｃ）。さらに、ＭｙＤ８８／ＡＳＣ／ＩＰＳ−１三重ＫＯマウス由来の肺胞マクロファージを用いて、主なＰＲＲが粒子状物質によるＩＬ−１α放出に関与しないことを明らかにした（図４ＡＡ〜ＦＦ）。このように、粒子状物質に応答した特異的なＩＬ−１α放出は、肺胞マクロファージでのみ見られる特別な特徴であり、他の組織マクロファージでは見られない。近年、肺胞マクロファージの特異性および適応性、そして、肺の感染および炎症に対するユニークな見張り役としてのその機能が報告された（Hussell  TおよびBell  TJ、Nat  Rev  Immunol.  2014;14(2):81-93.）。まとめると、本発明者らは、組織マクロファージの特異性はその組織特異的な応答を反映し得ること、そして、この特異性が、アレルギー性炎症にとっての原因因子となり得ることを示唆する。実際、腹腔内へのアラムまたはシリカの投与は、ＭｙＤ８８（およびＩＬ−１Ｒ）経路とは無関係に免疫反応（ＩｇＥ誘導）を活性化した。【０２６４】
ＩＬ−１α放出は、ファゴサイトーシスおよび細胞死と関連しているようである。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤またはサイトカラシンＤを用いたファゴサイトーシスの阻害は、アラム活性化肺胞マクロファージにおける細胞死およびＩＬ−１α産生を抑制した（図４Ｈ）。興味深いことに、気管内注入によってＩｇＥを誘導しない非炎症性の粒子状物質であるヒドロキシアパタイトまたはＡｌ２Ｏ３は、細胞死またはＩＬ−１α放出を誘導しなかった（図４Ｂ）。このように、マクロファージに対する粒子状物質の細胞傷害性と、その後のＩＬ−１α放出は、粒子状物質がアレルギー性炎症を誘発するかどうかの評価において重要である。しかしながら、ＡＴＰ、ＬＬＯＭｅおよびＥ／Ｔサイクルにより誘導された細胞死は、細胞死を誘導するにもかかわらず、ＩＬ−１αを誘導しなかった。また、ＮＦ−κＢまたはｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤は、ＩＬ−１α放出を有意に抑制した（図４Ｇおよび４Ｈ）。このように、肺胞マクロファージにおけるＩＬ−１α誘導には、細胞死に対する追加のシグナルが必要とされるが、他の組織マクロファージでは必要とされない。本発明者らは現在、どの細胞内因子または事象が、粒子状物質により刺激されたマクロファージにおけるＩＬ−１α放出と関連するかを調査中である。【０２６５】
重要な知見は、アジュバント（粒子状物質）と抗原（ＯＶＡ）が肺に別々に投与されるとしても免疫反応が活性化され得たということである。従来、アジュバントは、抗原と同時に投与された場合に、抗原特異的な免疫反応を増強すると考えられていた。しかしながら、粒子状物質の気管内注入後の抗原吸入が、抗原特異的なＩｇＥを増強した（図１Ｂおよび１Ｃ）。さらに、宿主ＤＮＡおよびＩＬ−１αのようなＤＡＭＰは、アラムの気管内注入により少なくとも２週間放出され続けた（図２Ｇおよび図３Ａ）。このように、抗原特異的なＩｇＥは、肺におけるＤＡＭＰ放出の間に抗原に曝露されると誘導され得る。Ｇｒａｎｕｍら（Granum  Bら、Toxicology.  2001;156(2-3):149-59.）は、抗原特異的なＩｇＥが、ポリスチレン粒子の腹腔内投与から３日後のＯＶＡ投与によって誘導されることを示した。しかしながら、本発明者らは、宿主ＤＮＡの放出が、アラムの腹腔内投与から４日後に腹腔において検出されなかったことから、アラム接種から７日後のＯＶＡ注射による抗体応答を検出しなかった（図３ＡＡ〜ＥＥ）。本発明者らは、肺が他の臓器よりも粒子状物質誘発性の炎症に対して感受性であることを示唆する。一部の場合において、粒子状物と抗原に対する曝露は、同時には生じない可能性がある。本発明者らは、別々に暴露する本願のモデルが、アレルゲン感作に対する粒子状アジュバントの後発効果の機構の理解にとって有用であることを示唆する。すなわち、ひとたび粒子状物質または環境粒子に曝露されると、アレルゲン感作のリスクは、２週間まで持続し得る。【０２６６】
まとめると、本発明者らは、粒子状物質誘発性の肺炎症を調べ、ＤＡＭＰ、ＩＬ−１αおよびＭｙＤ８８シグナル伝達のような肺特異的な応答がＩｇＥの誘導に重要であることを見い出した。ＩｇＧ１およびＩｇＥに加え、ＯＶＡ−ＩｇＧ２ｃの量の減少がＩｌ１ｒ−／−マウスにおいて見られ、肺における抗原特異的な抗体応答が、Ｉｌ１ｒ−／−マウスにおいて完全に減少していることを示した（図２）。これらのデータは、肺において粒子状物質によって誘導されたＩＬ−１αが、Ｂ細胞活性化のアジュバントとして機能することを示唆する。Matsushitaらは、ＭｙＤ８８のシグナル伝達が、Ｂ細胞活性化に必要とされること、そして、ＩＬ−１ファミリーサイトカインのシグナル伝達がＩｇＥ誘導に関与することを報告した。肺炎症についての新規治療を開発するために、本発明者らは、粒子状物質アジュバントの作用様式、組織特異的な免疫反応、そして、粒子状物質自体の特徴を理解しなければならない。【０２６７】
（実施例２：スクリーニング法）
本実施例では、本発明のスクリーニング法の模式的プロトコルを開発する。【０２６８】
実施例１では、２種類のものを使用しており、これらはいずれも使用することができる。一つはマウスから直接単離した肺胞マクロファージで、本文中では新鮮に単離した肺胞マクロファージ（Freshly  isolated  alveolar  macrophages）と示しています。このマクロファージの使用が一番いいのですが、一匹のマウスから取れる細胞数が少ないため、多くの粒子状物質を一度に評価したい場合には、以下の培養肺胞マクロファージを用いることもできる。この方法ですと、マウス２〜３匹から大量のマクロファージが回収でき、その性質はほぼ新鮮に単離した肺胞マクロファージと変わらないことがわかっている。実施例１では培養肺胞マクロファージ（Cultured  alveolar  macrophages）と示しているものであり、いずれも、実施例１に調製方法が記載されている。いずれの場合でもスクリーニング法として成功裏に実施することができる。【０２６９】
（材料および方法）
・上述のように調製した肺胞マクロファージ（新鮮に単離したものか、培養したもの）
・被験物質（水酸化アルミニウム、シリカ、酸化アルミニウム、ヒドロキシアパタイト、他の物質、粒子状物質等）
・ＩＬ−１α測定キット
（方法）
（１）肺胞マクロファージを上述のように調製する。
（２）培養した肺胞マクロファージに被験物質を上記容器に入れる。
（３）適宜の時間（例えば、３時間〜９時間、通常６時間程度）培養を継続する。
（４）培養後上清から培地を一部取り出し、ＩＬ−１αの量を市販のキット（例えば、Biolegend社から入手可能なもの（San  Diego,  CA,  USA、#433402））というキットで製造者のマニュアルに従い測定する。【０２７０】
このスクリーニング手法により、被験物質のアレルギー誘発性が検査することができる。そして、粒子状物質によるインビトロアレルゲン感作の評価法は培養肺胞マクロファージを使う方が簡便であると考えられる。【０２７１】
（実施例３：アレルギーの治療（低分子））
本実施例では、ＰＶＮＯ等の低分子を用いた場合のアレルギーの治療の試験を記載する。【０２７２】
（方法）
マウスおよび他の試薬は、実施例１に記載されるのと同様のものを利用することができる。
１）マウスにシリカを２５０μｇ／マウスで気管内注入する。
２）マウスにＰＶＮＯ（生理食塩水にて作成）１０〜１００μｇ気管内注入する。
３）ＰＶＮＯは１日おき３回投与する。
４）ネブライザーを用いてＯＶＡ曝露する（１日おき３回）。
５）ＯＶＡ曝露後、再びＰＶＮＯを１日おき３回投与する。
６）ネブライザーを用いてＯＶＡ曝露（１日おき３回）する。
７）マウスの血清ＩｇＥ抗体価の測定およびＢＡＬＦ細胞浸潤の評価をする。【０２７３】
以上を実施することにより、例えば、PVNOの投与により、血清IgE抗体価の低下とBALF細胞浸潤の低下が予想される
（実施例４：アレルギーの治療（抗体または核酸））
本実施例では、抗体またはsiRNA等を用いた場合のアレルギーの治療の試験を記載する。【０２７４】
（方法）
１）マウスにシリカ（２５０μｇ／マウス）、またはアラム（１００μｇ／マウス）で気管内注入する。
２）マウスに抗ＩＬ−１α抗体（０．５ｍｇ／マウス）を静注により投与またはＩＬ−１αのｓｉＲＮＡ（投与量は適宜設定することができる。）を気管内注入により投与する。
３）ｓｉＲＮＡは１日おき３回投与、抗体は１週間おきに３回投与する。
４）ネブライザーを用いてＯＶＡ曝露（１日おき３回）する。
５）ＯＶＡ曝露後、再びｓｉＲＮＡを１日おき３回投与（抗体は１週間おきに３回）する。
６）ネブライザーを用いてＯＶＡ曝露（１日おき３回）する。
７）マウスの血清ＩｇＥ抗体価の測定およびＢＡＬＦ細胞浸潤の評価をする。【０２７５】
上述の試験を行うことにより、例えば、抗体またはｓｉＲＮＡの投与により、血清ＩｇＥ抗体価の低下とＢＡＬＦ細胞浸潤の低下が予想される。【０２７６】
（実施例５：製剤）
本実施例では、製剤例として、本発明の抗ＩＬ−１α剤を含有する治療液を以下のようにして製造する。【０２７７】
常法により下に示す液を調製する。
ＰＶＮＯ                適量（気管内注入で１０〜１００μg/マウス）
適宜の緩衝液            適量
全量                                    １００ｍＬ
ＰＶＮＯはPolysciences（Warrington，PA）から入手され得る。【０２７８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国出願特願2014-111576（2014年5月29日出願）に対して優先権主張をするものであって、その内容は、すべて本願において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２７９】
アレルギー誘発性のスクリーニングおよびアレルギー誘発性の制御技術が提供され、アレルギーの診断、治療および予防に関連する技術に関与する産業（試薬、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０２８０】
配列番号１：Ｉｌ−１αの核酸配列
配列番号２：Ｉｌ−１αのアミノ酸配列
【図１Ａ】
2015182121.tif 000002
【図１Ｂ】
2015182121.tif 000003
【図１Ｃ】
2015182121.tif 000004
【図１Ｄ】
2015182121.tif 000005
【図１Ｅ】
2015182121.tif 000006
【図１Ｆ】
2015182121.tif 000007
【図１Ｇ】
2015182121.tif 000008
【図２Ａ】
2015182121.tif 000009
【図２Ｂ】
2015182121.tif 000010
【図２Ｃ】
2015182121.tif 000011
【図２Ｄ】
2015182121.tif 000012
【図２Ｅ】
2015182121.tif 000013
【図２Ｆ】
2015182121.tif 000014
【図２Ｇ】
2015182121.tif 000015
【図２Ｈ】
2015182121.tif 000016
【図２ＡＡ】
2015182121.tif 000017
【図２ＢＢ】
2015182121.tif 000018
【図２ＣＣ】
2015182121.tif 000019
【図２ＤＤ】
2015182121.tif 000020
【図２ＥＥ】
2015182121.tif 000021
【図２ＦＦ】
2015182121.tif 000022
【図３Ａ】
2015182121.tif 000023
【図３Ｂ】
2015182121.tif 000024
【図３Ｃ】
2015182121.tif 000025
【図３Ｄ】
2015182121.tif 000026
【図３Ｅ】
2015182121.tif 000027
【図３Ｆ】
2015182121.tif 000028
【図３ＡＡ】
2015182121.tif 000029
【図３ＢＢ】
2015182121.tif 000030
【図３ＣＣ】
2015182121.tif 000031
【図３ＤＤ】
2015182121.tif 000032
【図３ＥＥ】
2015182121.tif 000033
【図４Ａ】
2015182121.tif 000034
【図４Ｂ】
2015182121.tif 000035
【図４Ｃ】
2015182121.tif 000036
【図４Ｄ】
2015182121.tif 000037
【図４Ｅ】
2015182121.tif 000038
【図４Ｆ】
2015182121.tif 000039
【図４Ｇ】
2015182121.tif 000040
【図４Ｈ】
2015182121.tif 000041
【図４ＡＡ】
2015182121.tif 000042
【図４ＢＢ】
2015182121.tif 000043
【図４ＣＣ】
2015182121.tif 000044
【図４ＤＤ】
2015182121.tif 000045
【図４ＥＥ】
2015182121.tif 000046
【図４ＦＦ】
2015182121.tif 000047
【図５Ａ】
2015182121.tif 000048
【図５Ｂ】
2015182121.tif 000049
【図６】
2015182121.tif 000050
【配列表】
2015182121000001.app
【国際調査報告】
2015182121.tif 000051
2015182121.tif 000052
2015182121.tif 000053
2015182121.tif 000054
2015182121.tif 000055
2015182121.tif 000056
2015182121.tif 000057
2015182121.tif 000058
2015182121.tif 000059
2015182121.tif 000060