(57)【要約】  ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化やｐ５３が失活した癌や、化学療法、放射線療法及びホルモン療法などの従来療法の有効性が低い腫瘍を含む幅広い腫瘍や癌の治療及び予防手段を提供するため、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤、好適にはＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９という、異なる分子標的薬を併用する。それにより、各分子標的薬単剤の処方では得ることができない、相乗的な、カスパーゼ経路の活性化、Ｂｉｍの発現増強、細胞内活性酸素種の蓄積増加、並びに、サバイビン及びＸＩＡＰタンパク質の発現抑制という複数の異なる顕著な薬理効果を同時に得ることが可能となり、幅広い腫瘍に適用できる有効な治療薬及び予防薬として、臨床的に有効な新たな腫瘍の治療・予防戦略を提供することが可能となる。
2014115859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項２】
ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有することを特徴とする、ＰＩ３Ｋ阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、ＯＢＰ−８０１と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項５】
前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍腫であることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項６】
ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを、有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項７】
ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、ＰＩ３Ｋ阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、ＯＢＰ−８０１と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有する医薬組成物、及び、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物からなる、腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキット。
【請求項１２】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１１に記載の腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキット。
【請求項１３】
前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項１１及び請求項１２のいずれか１項に記載の腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキット。
【請求項１４】
ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として投与することを特徴とする、腫瘍治療及び予防方法。
【請求項１５】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１４に記載の腫瘍治療及び予防方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項１４及び請求項１５のいずれか１項に記載の腫瘍治療及び予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療及び予防における分子標的併用療法並びに予防法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌などの悪性腫瘍は、疾患を原因とする主要な死因の一つである。化学療法剤を用いた腫瘍の化学療法の有効性は上昇しているが、依然として満足のいく臨床治療成績は得られていない。たとえば、子宮体癌は、世界中で年間１５万人が罹患していて（非特許文献１参照。）、最近では罹患数の著しい増加に伴い、再発性の症例数並びに進行性の症例数が増加しているため、有効な治療法の開発が課題となっており、新たな抗癌剤の開発が試行されている（非特許文献２〜５参照。)。また、腎細胞癌は、成人悪性腫瘍の２〜３％を占め、世界中で年間１０万２千人が死に至っている（非特許文献６〜８参照。）。【０００３】
上記のような既存の治療法では手に余る癌などの悪性腫瘍が未だに存在する。これらの悪性腫瘍に対処して克服するため、様々な分子標的薬の開発が行われている。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、癌細胞の成長阻害、細胞分化及びアポトーシスを誘導する活性を有するものがあることが報告された分子標的薬である（非特許文献９〜１０参照。）。本発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤が、ｐ５３の下流の分子に作用しｐ５３機能を回復させることで、ｐ５３変異を有する悪性腫瘍に対する抗腫瘍効果を示すことを見出している（非特許文献１１〜１７参照。）。また、本発明者らは、ｐ２１WAF1／Cip1−誘導物質をスクリーニングすることにより、新規なＨＤＡＣ阻害薬としてＯＢＰ−８０１／ＹＭ７５３（ｓｐｉｒｕｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ）も見出している（非特許文献１８、特許文献１及び特許文献２参照。）。しかし、ＳＡＨＡ／ボリノスタット及びロミデプシンによる皮膚Ｔ細胞性リンパ腫治療が承認された例を除き、臨床において癌などの悪性腫瘍に対する治療において用いることが認められたＨＤＡＣ阻害剤の報告はない。【０００４】
また、子宮体癌においては、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路がＰＩ３Ｋ及びＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １０）の変異に伴い活性化し（非特許文献１９参照。）、分子標的薬としてのＰＩ３Ｋ阻害剤が、上記変異を伴う癌細胞の増殖を抑制する作用を有する（非特許文献２０〜２１参照。）との報告、及び、ＰＩ３Ｋ阻害剤が腎細胞癌をはじめとする複数の悪性腫瘍細胞の細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する（非特許文献２２〜２６参照。）との報告はあるものの、臨床において、癌などの悪性腫瘍に対し分子標的薬であるＰＩ３Ｋ阻害剤を用いることが認められたという報告はない。【０００５】
また、腎細胞癌などを対象に、マルチチロシンキナーゼ阻害薬のソラフェニブ及びスニチニブ、又は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質 （ｍＴＯＲ）阻害薬のエベロリムス及びテムシロリムスなどの分子標的薬が開発されているが、薬剤耐性の発生が治療上の課題となっている（非特許文献２７〜２９参照。）。【０００６】
このように様々な試みがなされているも十分な成果があがっているとまではいえず、依然として、癌などの悪性腫瘍治療及び予防における臨床成績を改善するための新たな治療戦略の開発と、該治療戦略に基づく新たな治療薬の開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３５５４７０７号公報
【特許文献２】特開２００１−３４８３４０号公報
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献３】Rose PG. Endometrial carcinoma. N Engl J Med 1996;335:640-9.
【非特許文献４】Salvesen HB, Haldorsen IS, Trovik J, Markers for individualised therapy in endometrial carcinoma. Lancet Oncol 2012;13:353-61.
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【非特許文献６】Rini BI, Campbell SC, Escudier B. Renal cell carcinoma. Lancet. 2009; 373: 1119-32.
【非特許文献７】Gupta K, Miller JD, Li JZ, Russell MW, Charbonneau C. Epidemiologic and socioeconomic burden of metastatic renal cell carcinoma (mRCC): a literature review. Cancer treatment reviews. 2008; 34: 193-205.
【非特許文献８】Gupta K, Miller JD, Li JZ, Russell MW, Charbonneau C. Epidemiologic and socioeconomic burden of metastatic renal cell carcinoma (mRCC): a literature review. Cancer treatment reviews. 2008; 34: 193-205.
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【非特許文献１５】Yokota T, Matsuzaki Y, Sakai T. Trichostatin A activates p18INK4c gene: differential activation and cooperation with p19INK4d gene. FEBS Lett 2004;574:171-5.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、神経組織腫瘍など悪性の腫瘍を含む腫瘍を治療及び予防することができる、新たな治療薬並びに治療戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記腫瘍に対する合理的で有効性の高い新規治療戦略の確立を目指し、本発明者らが見出した、ｐ５３が失活している癌に対しても有効性が高いと考えられる分子標的薬であるＨＤＡＣ阻害剤のＯＢＰ−８０１と、分子標的薬であるＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２とを用い、有効な治療法が確立されていない腫瘍の例として子宮体癌並びに腎細胞癌を対象として、詳細に作用を検討した。その結果、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを併用することにより、興味深く、また、驚くべきことに、相乗的な癌治療・予防効果が発揮されることを見出し、その分子機構の解明を通して、合理的で有効性の高い、新たな治療戦略に基づく新規腫瘍治療用薬及び予防用医薬の発明を完成させた。【００１１】
さらに、本発明者は、見出されたＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用による相乗的な腫瘍の治療・予防効果を確認するため、分子標的薬であるＰＩ３Ｋ阻害剤として、ＬＹ２９４００２とは化合物構造や特性がそれぞれ異なるＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９及びＣＨ５１３２７９９を用い、いずれにおいても上記同様の相乗的な腫瘍の治療・予防効果を示すことを確認し、さらに、子宮体癌、腎細胞癌に加え、リンパ腫、乳癌においても上記同様の相乗的効果を示すことを確認し、本発明が、合理的で有効性の高い、新たな治療戦略に基づく新規腫瘍治療用薬及び予防用医薬の発明、腫瘍治療方法及び予防方法の発明であることを確認した。【００１２】
本発明は、腫瘍の治療及び予防を可能とするため、医薬並びに治療・予防方法を、分子標的薬であるＨＤＡＣ阻害剤のＯＢＰ−８０１と、同じく分子標的薬であるＰＩ３Ｋ阻害剤とを医薬の有効成分として併用するものとする点を、最も主要な特徴とする。【００１３】
上記の課題を解決するための本発明の手段は、請求項１の手段では、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。【００１４】
本発明の請求項２の手段は、ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有することを特徴とする、ＰＩ３Ｋ阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。【００１５】
本発明の請求項３の手段は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、ＯＢＰ−８０１と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。【００１６】
本発明の請求項４の手段は、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。【００１７】
本発明の請求項５の手段は、前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。【００１８】
本発明の請求項６の手段は、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。【００１９】
本発明の請求項７の手段は、ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、ＰＩ３Ｋ阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。【００２０】
本発明の請求項８の手段は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、ＯＢＰ−８０１と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。【００２１】
本発明の請求項９の手段は、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。【００２２】
本発明の請求項１０の手段は、前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。【００２３】
本発明の請求項１１の手段は、ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有する医薬組成物、及び、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物からなる、腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキットである。【００２４】
本発明の請求項１２の手段は、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１１に記載の腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキットである。【００２５】
本発明の請求項１３の手段は、前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項１１及び請求項１２のいずれか１項に記載の腫瘍治療用医薬、腫瘍予防用医薬、及び、該腫瘍治療用医薬及び該腫瘍予防用医薬のキットである。【００２６】
本発明の請求項１４の手段は、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として投与することを特徴とする、腫瘍治療及び予防方法である。【００２７】
本発明の請求項１５の手段は、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９であることを特徴とする、請求項１４に記載の腫瘍治療及び予防方法である。【００２８】
本発明の請求項１６の手段は、前記腫瘍が、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍であることを特徴とする、請求項１４及び請求項１５のいずれか１項に記載の腫瘍治療及び予防方法である。【００２９】
また、上記の課題を解決するため、上記請求項１〜１６に記載の手段におけるＰＩ３Ｋ阻害剤を、ＳＡＲ２４５４０８／ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０９／ＸＬ７６５、ＢＧＴ２２６、ＧＳ−１１０１／ＣＡＬ−１０１、ＧＤＣ−０９８０／ＲＧ７４２２、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ２１２６４５８、ＰＦ−４６９１５０２、ＰＫＩ−５８７／ＰＦ−０５２１２３８４、ＢＡＹ−８０−６９４６、ＡＺＤ−６４８２、ＳＦ１１２６、ｒｉｇｏｓｅｒｔｉｂ／ＯＮ  ０１９１０．Ｎａ、ＺＳＴＫ４７４、ＤＳ−７４２３、ＰＡ７９９、ＭＬＮ１１１７、ＧＳＫ２６３６７７１、ＰＷＴ３３５９７  ｍｅｓｙｌａｔｅ、ＩＰＩ−１４５、ＡＭＧ３１９、ＧＤＣ−００３２／ＲＧ７６０４、ＧＤＣ−００８４／ＲＧ７６６６、ＬＹ３０２３４１４又はＡＺＤ８１８６から選択されることを特徴とするものとしても良い。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分とし、医薬としてそれらを併用することで、相乗的な腫瘍細胞及び腫瘍組織に対するアポトーシス誘導並びに腫瘍増殖阻害効果が得られ、有効成分に起因した副作用を回避した、腫瘍治療及び予防が可能となる。更に、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤という異なる分子標的薬を組み合わせたことで、単剤では得ることができない相乗的な、カスパーゼ経路の活性化、Ｂｉｍの発現増強、細胞内活性酸素種の蓄積増加、サバイビン及びＸＩＡＰタンパク質の発現抑制といった異なる顕著な薬理効果を同時に得ることが可能となり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化やｐ５３が失活した癌や、化学療法、放射線療法及びホルモン療法などの従来療法の有効性が低い腫瘍を含む幅広い腫瘍に適用できる有効な治療薬及び予防薬として、また、腫瘍治療方法および予防方法として、臨床的に有効な、腫瘍に対する新たな治療・予防戦略を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒト−タイプ２子宮体癌細胞株ＨＥＣ−１−Ａ細胞におけるＯＢＰ−８０１の細胞増殖阻害効果を示したグラフである（試験例１）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１（ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【図２】ＨＥＣ−１−Ａ細胞におけるＬＹ２９４００２の細胞増殖阻害効果を示したグラフである（試験例１）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１（ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【図３】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１単剤処理によるウェスタンブロット解析結果である（試験例１）。
【図４】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＬＹ２９４００２単剤処理によるウェスタンブロット解析結果である（試験例１）。
【図５】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるコロニー形成阻害効果を示したグラフである（実施例２）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図６】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるコロニー形成阻害効果を示した写真である（実施例２）。
【図７】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるウェスタンブロット解析結果である（実施例２）。
【図８】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との２４時間の併用処理による細胞周期進行の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図９】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との２４時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１０】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との４８時間の併用処理による細胞周期進行の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１１】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との４８時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図１２】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との７２時間の併用処理による細胞周期進行の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１３】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との７２時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例３）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図１４】子宮体癌細胞株のＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＯＢＰ−８０１の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図１５】Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＬＹ２９４００２の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図１６】Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との２４時間の併用処理による細胞周期進行の解析結果である（実施例４）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１７】Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との２４時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例４）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１８】Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との４８時間の併用処理による細胞周期進行の解析結果である（実施例４）。データは平均値±ＳＤを示す。
【図１９】Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との４８時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例４）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図２０】腎細胞癌細胞株７８６−Ｏ細胞におけるＯＢＰ−８０１の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２１】７８６−Ｏ細胞におけるＬＹ２９４００２の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２２】腎細胞癌細胞株ＡＣＨＮ細胞におけるＯＢＰ−８０１の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２３】ＡＣＨＮ細胞におけるＬＹ２９４００２の細胞増殖阻害効果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２４】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との７２時間の併用処理によるｖｉａｂｉｌｉｔｙの解析結果である（実施例５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２５】ＡＣＨＮ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との７２時間の併用処理によるｖｉａｂｉｌｉｔｙの解析結果である（実施例５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２６】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との４８時間並びに７２時間の併用処理によるＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２７】ＨＥＣ−１−Ａをヌードマウス皮下へ移植した異種移植モデルマウスに対して、ＯＢＰ−８０１単剤、ＬＹ２９４００２単剤、又はＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２とを併用投与することによる、腫瘍体積抑制を解析したグラフである（実施例６）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２８】ＨＥＣ−１−Ａをヌードマウス皮下へ移植した異種移植モデルマウスに対して、ＯＢＰ−８０１単剤、ＬＹ２９４００２単剤、又はＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２とを併用投与することによる、腫瘍体積の変化を解析した瀑状プロットである（実施例６）。
【図２９】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導がカスパーゼ依存性であることを確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３０】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるウェスタンブロット解析結果である（実施例７）。
【図３１】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理による細胞内活性酸素種の蓄積増加効果を確認したグラフである（実施例７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３２】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果と細胞内活性酸素種との関係との解析結果である（実施例７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３３】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるウェスタンブロット解析結果である（実施例８）である。
【図３４】ｓｉＲＮＡによりＢｉｍをノックダウンしたＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるウェスタンブロット解析結果である（実施例９）である。
【図３５】ｓｉＲＮＡによりＢｉｍをノックダウンしたＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例９）である。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３６】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導がカスパーゼ依存性であることを確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１０）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図３７】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるウェスタンブロット解析結果である（実施例１０）。
【図３８】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理による細胞内活性酸素種の蓄積増加効果を確認したグラフである（実施例１１）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図３９】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果と細胞内活性酸素種との関係との解析結果である（実施例１１）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図４０】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるサバイビン及びＸＩＡＰの発現を確認したウェスタンブロット解析結果（実施例１２）である。
【図４１】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるＢｃｌ−２、ＢＡＸ及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質発現を確認したウェスタンブロット解析結果である（実施例１２）。
【図４２】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるサバイビン及びＸＩＡＰの発現抑制が細胞内活性酸素種の産生に依存することを確認したウェスタンブロット解析結果である（実施例１２）。
【図４３】サバイビン及び／又はＸＩＡＰを過剰発現させた７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるサバイビン及びＸＩＡＰの発現を確認したウェスタンブロット解析結果である（実施例１３）。
【図４４】サバイビン及び／又はＸＩＡＰを過剰発現させた７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導抑制効果の解析結果である（実施例１３）。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図４５】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＳＡＨＡと、ＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１４）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図４６】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＳＡＨＡと、ＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１４）。データは平均値±ＳＤを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図４７】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＢＫＭ１２０との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図４８】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＧＤＣ−０９４１との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図４９】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＢＥＺ２３５との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５０】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＢＹＬ７１９との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５１】７８６−Ｏ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＣＨ５１３２７９９との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１５）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５２】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＢＫＭ１２０との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１６）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５３】ＨＥＣ−１−Ａ細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＧＤＣ−０９４１との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１６）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５４】リンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５５】ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＢＫＭ１２０との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５６】ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＧＤＣ−０９４１との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１７）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５７】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＬＹ２９４００２との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１８）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５８】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＯＢＰ−８０１又はＧＤＣ−０９４１との併用処理によるアポトーシス誘導効果を確認したＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析結果である（実施例１８）。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物を提供する。
【００３３】
本明細書において「ＨＤＡＣ阻害剤」とは、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を分子標的とし、阻害する分子標的剤を指す。
【００３４】
本発明の組成物に含まれるＨＤＡＣ阻害剤のＯＢＰ−８０１は、オンコリスバイオファーマ株式会社（東京、日本）から入手、使用することができる。
【００３５】
ＨＤＡＣ阻害剤のＳＡＨＡ／ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット／ＬＢＨ５８９、ベリノスタット／ＰＸＤ１０１、モセチノスタット／ＭＧＣＤ０１０３、アベキシノスタット／ＰＣＩ−２４７８１、エンチノスタット／ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５、ＳＢ９３９、ＣＳ０５５／ＨＢＩ−８０００、レスミノスタット／４ＳＣ−２０１／ＢＹＫ４０８７４０、ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ／ＩＴＦ２３５７、ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ／ＪＮＪ−２６４８１５８５、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＤＡＣ−０６０、ＥＶＰ−０３３４、ＭＧＣＤ−２９０、ＣＸＤ−１０１／ＡＺＤ−９４６８、ＣＧ２００７４５、ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｕｔｙｒａｔｅ、４ＳＣ−２０２、ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ／ＡＣＹ−１２１５又はＳＨＰ−１４１は、本発明の組成物に含まれるＯＢＰ−８０１と同様にして用いてもよい。
【００３６】
また、本明細書において「ＰＩ３Ｋ阻害剤」とは、シグナル伝達因子であるＰＩ３Ｋを分子標的とし、阻害する分子標的剤を指す。
【００３７】
本発明の組成物に含まれるＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ＬＹ２９４００２(（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＢＥＺ２３５／ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＳＡＲ２４５４０８／ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０９／ＸＬ７６５、ＢＧＴ２２６、ＢＫＭ１２０／ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＧＳ−１１０１／ＣＡＬ−１０１、ＧＤＣ−０９４１／ＲＧ７３２１、ＧＤＣ−０９８０／ＲＧ７４２２、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ２１２６４５８、ＰＦ−４６９１５０２、ＰＫＩ−５８７／ＰＦ−０５２１２３８４、ＢＡＹ−８０−６９４６、ＡＺＤ−６４８２、ＳＦ１１２６、ｒｉｇｏｓｅｒｔｉｂ／ＯＮ  ０１９１０．Ｎａ、ＺＳＴＫ４７４、ＤＳ−７４２３、ＰＡ７９９、ＭＬＮ１１１７、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＣＨ５１３２７９９、ＰＷＴ３３５９７  ｍｅｓｙｌａｔｅ、ＩＰＩ−１４５、ＡＭＧ３１９、ＧＤＣ−００３２／ＲＧ７６０４、ＧＤＣ−００８４／ＲＧ７６６６、ＬＹ３０２３４１４又はＡＺＤ８１８６を用いることができる。本発明の組成物に含まれるＰＩ３Ｋ阻害剤としては、好ましくは、ＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９及びＣＨ５１３２７９９を用いることができる。
【００３８】
本発明の組成物に含まれるＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ビバリー，  マサチューセッツ州，米国）、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９及びＣＨ５１３２７９９は、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ヒューストン、テキサス州，米国）などから入手、使用することができる。
【００３９】
本発明において、「腫瘍」とは、癌などの上皮性悪性腫瘍や肉腫などの非上皮性悪性腫瘍である悪性腫瘍並びに良性腫瘍を包含する。悪性腫瘍としては、好ましくは、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、腎臓癌、副腎癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍腫が包含され、さらに好ましくは、腎細胞癌及び子宮体癌、さらにより好ましくは子宮体癌が包含される。
【００４０】
本発明において、「ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物」とは、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを、腫瘍の治療または予防において同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせた医薬組成物を意味する。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とが、共に含有される配合剤の形で提供することができる。また、ＯＢＰ−８０１を含有する医薬組成物とＰＩ３Ｋ阻害剤を含有する医薬組成物とが別々に医薬として提供され、これらの医薬組成物が、同時に、別々に、または順次に使用されてもよい。さらに、ＯＢＰ−８０１を含有する医薬組成物からなる医薬とＰＩ３Ｋ阻害剤を含有する医薬組成物からなる医薬から構成されるキットとして提供してもよい。
【００４２】
さらに、本発明にしたがって、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とが腫瘍治療及び予防において併用される場合には、 双方、もしくは、そのいずれか一方が、単独で用いられる投与量よりも各々が少ない投与量で投与され得る。
【００４３】
本発明の、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを含有する組成物は、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを必須の成分として含有し、所望により、製剤化のための添加物を含有していてもよい。好適には、ＯＢＰ−８０１、及び、ＰＩ３Ｋ阻害剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
【００４４】
本発明において、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有するとは、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤とを主要な活性成分として含むという意味であって、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤の含有率を制限するものではない。
【００４５】
本発明において、「治療」という用語は、本発明に係る医薬組成物が被験者に投与されることにより、腫瘍が死滅またはその細胞数が減少すること、腫瘍の増殖が抑制されること 、腫瘍に起因する様々な症状が改善されることを意味するものである。また、本発明において「予防」という語は、減少した腫瘍が再度増殖することによりその数が増加することの防止、増殖が抑制された腫瘍の再増殖の防止を意味する。
【００４６】
本発明の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを有効成分として含有させる工程を経ることにより製造することができる。また、本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、ＯＢＰ−８０１を有効成分として含有させる工程を経ることにより、また、ＯＢＰ−８０１と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有させる工程を経ることにより、製造することができる。さらに、上記各工程にくわえ、所望により、製剤化のための添加物を含有させる工程を加えたものとしてもよい。
【００４７】
本発明の医薬組成物において、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とが別々の医薬組成物に含有され提供される場合には、これらの医薬組成物の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が経口製剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が経口製剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。また、上記の医薬組成物には、 さらに異なる一種以上の製剤を組み合わせてもよい。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、バルク液体溶液若しくは懸濁液などの液体組成物、又は、バルク粉末、錠剤などの固形組成物の形態をとることができる。例えば、液体組成物の予め充填・測定したアンプル又は注射器、或いは固体組成物の場合には丸薬、錠剤、カプセルなどとする。これら製剤における有効成分量は腫瘍の治療及び／又は予防効果が得られるように設定される。
【００４９】
上記液体組成物としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが例示され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０と適宜併用され得る。油性液としてはゴマ油、大豆油が例示され、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と好適に配合され得る。
【００５０】
また、上記固形組成物としては、結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカント・ガム又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、又はトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；流動促進剤、例えばコロイド二酸化シリコン；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリン；又は、香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの、任意の成分、又は類似の性質の化合物を含むことができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内及び鼻腔内を含む様々な経路により、経口投与もしくは非経口投与することができる。非経口投与の場合には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが例示される。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の治療用抗体が全身または局部的に投与され得る。また、投与方法及び投与用量は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。
【００５２】
以下、本発明を実施例の記載によって具体的に説明するが、本発明は当該記載によって限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００５３】
腫瘍治療及び予防における、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用による顕著な腫瘍治療・予防効果を明らかにした。本実施例においては、本発明が治療対象とする腫瘍の例として、ヒト子宮体癌、ヒト腎細胞癌、ヒトリンパ腫及びヒト乳癌を用い、ＯＢＰ−８０１と併用するＰＩ３Ｋ阻害剤の例として、構造等が各々異なる、ＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９及びＣＨ５１３２７９９を用いた。【００５４】
＜材料と方法＞
〔１．細胞培養〕
ヒト−タイプ２子宮体癌由来細胞株のＨＥＣ−１−Ａ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト子宮体癌のＩｓｈｉｋａｗａ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト腎細胞癌細胞株７８６−Ｏ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト腎細胞癌細胞株ＡＣＨＮ細胞は、１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒトリンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。【００５５】
〔２．試薬〕
ＯＢＰ−８０１は、オンコリスバイオファーマ株式会社（東京、日本）から供給された。ＬＹ２９４００２は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ビバリー，  マサチューセッツ州，米国）より購入した。ＳＡＨＡは、バイオモル  リサーチ  ラボラトリーズ（プリマス ミーティング，ペンシルベニア州，米国）より購入した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、ナカライテスク（日本）から購入した。パンカスパーゼ阻害剤  ｚＶＡＤ−ｆｍｋは、Ｒ＆Ｄ  システムズ（ミネアポリス，ミネソタ州，米国）から購入した。ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９及びＣＨ５１３２７９９は、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ヒューストン、テキサス州，米国）より購入した。【００５６】
〔３．細胞生存率試験〕
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所、日本）を用い、マルチウェルスペクトロフォトメーター  Ｖｉｅｎｔｏ（ＤＳファーマバイオメディカル、日本）で波長４５０ｎｍにて測定し、決定した。【００５７】
〔４．コロニー形成アッセイ〕
細胞は、６ウェルプレートに１ウェルあたり２００細胞の濃度にて播種した。２４時間培養した後、各濃度で、ＯＢＰ−８０１を添加又は非添加とし、及び／又はＬＹ２９４００２を添加し、４８時間処理した。その後、増殖培地にて１０日間培養し、生存コロニー数を計測した。【００５８】
〔５．細胞周期及びアポトーシスの解析〕
細胞を、各濃度で、ＯＢＰ−８０１を添加又は非添加、及び／又は、ＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９を添加し、２４時間、４８時間又は７２時間処理したのち、細胞を回収した。細胞は、０．１％トライトン−Ｘ１００で透過処理された後、核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）にて染色した。ＤＮＡ量はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター（ベクトン−ディッキンソン，フランクリン  レイクス，ニュージャージー州，米国）にて測定され、ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴＴＭ（ベリティー  ソフトウェア  ハウス，トップシャム、メイン州，米国）及びＣｅｌｌ  ＱｕｅｓｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ベクトン−ディッキンソン）により解析された。【００５９】
〔６．併用係数〕
併用係数（ＣＩ）は、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙによる方法に基づき、ＣａｌｃｕＳｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，英国）を用いて算出した。ＣＩ＜１の場合は相乗効果、すなわち、予想される相加効果よりも大きいと判断される。ＣＩ＝１の場合は相加効果、また、ＣＩ＞１の場合は拮抗効果と判断される。【００６０】
〔７．異種移植モデルにおける抗腫瘍活性評価 〕
メスＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（５週齢）は清水実験材料（日本）より購入した。ＨＥＣ−１−Ａ細胞株（１ｘ１０８個）は、マウス背部に皮下注射により移植した。腫瘍体積は、１／２ｘ（長さ）ｘ（幅）２の計算式により算出した。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に到達したら、マウスを無作為に４つの群（５匹／群）に分け、処置を続けた。マウスには、週３回、２週にわたり（第１，４，６，８，１０及び１３日目に）、希釈液のみ（コントロールグループ）、ＯＢＰ−８０１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＹ２９４００２（２５ｍｇ／ｋｇ）又はその組み合わせを投与した。ＯＢＰ−８０１は、２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／生理食塩水に溶解し、尾静脈に注射した。ＬＹ２９４００２は、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）／１ｘＰＢＳ緩衝液（希釈倍率，１：１；ｖ／ｖ）に溶解し、腹腔内投与した。腫瘍体積は週３回（第２，５，７，８，１１及び１４日目）計測した。１４日目に、安楽死させたマウスから腫瘍を切除した。全ての実験及び術式は、研究施設内委員会が定めた指針に基づき実施された。【００６１】
〔８．ウェスタンブロット分析〕
細胞を溶解液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，１％ＳＤＳ，２μｇ／ｍＬ  ロイペプチン，２μｇ／ｍＬ  アプロチニン、０．１％  ２−メルカプトエタノール，及び１ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド）にて溶解した。タンパク抽出液をポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動処理し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットは、ブロッキング液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）にて室温１時間ブロッキング処理し、適切な一次抗体で室温１時間インキュベートする。シグナルは、ＥＣＬＴＭウェスタンブロット  アナライシス  システム（ＧＥヘルスケア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州，米国）又はＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ  化学発光検出キット（ナカライテスク、日本）を用いて検出した。
抗体は、ウサギポリクローナル抗体である、抗分裂型カスパーゼ抗体、抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体、抗ヒストンＨ４抗体（Ａｂｃａｍ，英国）、抗アセチル化ヒストンＨ４抗体（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）、抗サバイビン抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）、抗カスパーゼ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｂｃｌ−２抗体（Ａｂｃａｍ，ケンブリッジ，英国）、抗ＢＡＸ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー，サンタクルーズ，カリフォルニア州，米国）、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体（サンタクルーズ）、ウサギモノクローナル抗体である抗Ｂｉｍ抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）、マウスモノクローナル抗体である抗カスパーゼ９抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ又はＭＢＬ，日本）、抗カスパーゼ−８抗体（ＭＢＬ）、及び抗β−アクチン抗体（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を用いた。【００６２】
〔９．細胞内反応性酸素生成物の計測〕
細胞にＯＢＰ−８０１を添加又は非添加、及び／又はＬＹ２９４００２を添加して４８時間の前処理を行ったのち、１０μＭの５−（ＡＮＤ−６）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン  ジアセテート，アセチル  エステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州，米国）で処理した。１０μＭのＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡで３０分のインキュベーションを行った後、細胞をトリプシン処理にて集め、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭとＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（ベクトン−ディッキンソン）を用いたフローサイトメトリーにより解析した。【００６３】
〔１０．低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡトランスフェクション〕
Ｂｉｍのノックダウンは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）を用いた低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子導入により行った。【００６４】
〔１１．プラスミドＤＮＡトランスフェクション〕
ｐＣＭＶ６−ＸＬ５、ｐＣＭＶ６−ＸＬ５／ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びｐＣＭＶ６−ＸＬ５／ＸＩＡＰプラスミドは、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ロックヴィル，メリーランド州，米国）より購入した。７８６−Ｏ細胞は、１ｘ１０５細胞／ウェルを６ウェルプレートに、抗生物質を使用せずに播種した。２４時間後、プラスミドＤＮＡ４μｇを、ＨｉｌｙＭａｘトランスフェクション試薬（同仁化学研究所）を用い、使用説明書に記載の手法にて細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、培地を新鮮なものに交換し、さらにＯＢＰ−８０１及びＬＹ２９４００２を添加もしくは非添加の条件にて４８時間培養したのち、細胞を回収した。【００６５】
＜結果＞
〔試験例１：ＯＢＰ−８０１又はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２による、腫瘍細胞の増殖阻害〕【００６６】
ＯＢＰ−８０１又はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２が腫瘍細胞の増殖に与える影響を、ヒト−タイプ２子宮体癌細胞株であるＨＥＣ−１−Ａ細胞を用いて検討した。
その結果、ＯＢＰ−８０１は、３．１ｎＭ以上の濃度において細胞増殖を阻害し、１．６ｎＭ以上の濃度でアセチル化ヒストンＨ４が増加した（図１及び図３）。また、ＬＹ２９４００２は、６．３μＭ以上の濃度で細胞増殖を阻害し、同時にリン酸化Ａｋｔは減少した（図２及び図４）【００６７】
〔実施例２：ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２をＯＢＰ−８０１と併用処理することによる、腫瘍細胞のコロニー形成阻害効果の相乗的増強〕【００６８】
ＯＢＰ−８０１及びＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理が腫瘍組織中の腫瘍細胞に与える増殖阻害効果を、ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用いたコロニー形成アッセイにより検討した。
その結果、ＬＹ２９４００２を１２．５μＭの濃度で単剤処理してもコロニー形成数の減少は見られなかったが、ＯＢＰ−８０１は４ｎＭの濃度で単剤処理するとコロニー形成数が６０％にまで減少した。【００６９】
そして、上記条件において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２は、上記のように単剤ではコロニー形成数の減少を引き起こさなかったが、大変興味深いことに、ＬＹ２９４００２をＯＢＰ−８０１と併用することで、ＯＢＰ−８０１によるコロニー形成阻害を増強する効果を示すものであることを新たに見出した（図５及び図６）。上記条件において、アセチル化ヒストンＨ４の増加、並びに、リン酸化Ａｋｔの減少が確認された（図７）。【００７０】
〔実施例３：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果〕【００７１】
ＯＢＰ−８０１及びＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２が、腫瘍細胞の細胞周期進行に如何なる影響を与えるものであるのか、ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用い、フローサイトメトリー分析により検討した。ＯＢＰ−８０１は４ｎＭ、ＬＹ２９４００２は１２．５μＭの濃度で処理した。その結果、ＯＢＰ−８０１単剤ではＧ２／Ｍ期停止が、ＬＹ２９４００２単剤ではＧ１期停止が、２４時間から７２時間の処理によって引き起こされていた（図８、図１０及び図１２）。【００７２】
一方、興味深いことに、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２と４８時間から７２時間、併用処理すると、ＨＥＣ−１−Ａ細胞に顕著なアポトーシス誘導が生じることを見出した（図１１及び図１３）。更に、上記併用処理における併用係数は、相乗的なアポトーシス誘導率であることを示す１．０未満であることが判明した（表１）。【００７３】
【表１】
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【００７４】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２とを癌細胞に対して併用処理することで、癌細胞の増殖が相乗的に抑制され、更に、相乗的なアポトーシス誘導効果を得られることが、明らかとなった。【００７５】
〔実施例４：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果〕【００７６】
ＯＢＰ−８０１又はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２が腫瘍細胞の増殖に与える影響を、さらに、子宮体癌細胞株のＩｓｈｉｋａｗａ細胞を用い、検討した。その結果、ＯＢＰ−８０１及びＬＹ２９４００２は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の増殖を濃度依存的に抑制していた（図１４及び図１５）。【００７７】
一方、興味深いことに、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を用いた場合においても、ＯＢＰ−８０１（６．３ｎＭ）とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（１２．５μＭ）とを４８時間併用することにより、ＯＢＰ−８０１単剤又はＬＹ２９４００２単剤で用いるよりも相乗的にアポトーシスを誘導することを見出した（図１９）。【００７８】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２とを併用することで、相乗的な癌細胞の増殖抑制効果及びアポトーシス誘導効果を得られることが明らかとなった。【００７９】
〔実施例５：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理による、腫瘍細胞における相乗的細胞増殖阻害効果〕【００８０】
ＯＢＰ−８０１又はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２が腫瘍細胞の増殖に与える影響を、さらに、腎細胞癌細胞株７８６−Ｏ細胞並びに腎細胞癌細胞株ＡＣＨＮ細胞を用い、検討した。その結果、ＯＢＰ−８０１及びＬＹ２９４００２は、７８６−Ｏ細胞又はＡＣＨＮ細胞の増殖を濃度依存的に抑制していた（図２０〜図２３）。【００８１】
一方、興味深いことに、腎細胞癌細胞においても、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２は、低い濃度で併用すると、ＯＢＰ−８０１単剤又はＬＹ２９４００２単剤で用いるよりも相乗的に、７８６−Ｏ細胞又はＡＣＨＮ細胞株の細胞増殖を抑制したことを見出した（図２４及び図２５）。そして、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用時における併用係数は＜１．０となり、腫瘍細胞の増殖を相乗的に抑制する効果を有していることが示された（表２）。【００８２】
【表２】
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【００８３】
更に、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用による相乗的抑制効果の機構を明らかにするため、７８６−Ｏ細胞にてｓｕｂ−Ｇ１期の細胞数を計測し、アポトーシスに関する併用効果を検討した。その結果、上記腫瘍細胞においては、ＯＢＰ−８０１単剤又はＬＹ２９４００２単剤の処理では、僅かにアポトーシスが誘導されるのみであったが、興味深いことに、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２とを併用処理すると、７８６−Ｏ細胞においても相乗的なアポトーシスの誘導効果が生じたことが確認された（図２６）。【００８４】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２とを併用することで、腫瘍細胞の増殖が相乗的に抑制され、腫瘍細胞にアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。【００８５】
〔実施例６：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用投与による、マウスにおける腫瘍増殖抑制効果並びに腫瘍体積の縮小効果〕【００８６】
分子標的薬であるＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２とをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて併用投与することで、宿主動物体内の腫瘍細胞及び腫瘍組織の増殖を妨げることが可能となるか否か検討した。腫瘍細胞としてヒト−タイプ２子宮体癌細胞株ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用い、それをヌードマウスの皮下に移植して腫瘍を担持させ、異種移植モデルを得た。そして、それらをコントロール群、ＯＢＰ−８０１単剤投与群、ＬＹ２９４００２単剤投与群、及び、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用群に分け、各試薬を投与した。【００８７】
その結果、腫瘍体積は、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用投与処理群において、顕著に抑制された（図２７）。また、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２と併用投与することで、腫瘍成長の阻害効果が得られるのみならず、驚くべきことに、腫瘍増殖を減少に転じさせることもできた（図２８）。【００８８】
これらの結果から、腫瘍の治療・予防においては、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを併用投与することが、腫瘍増殖を減少に転じさせることができる点において、大変有効であることが明らかとなった。【００８９】
〔実施例７：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用による、カスパーゼ依存性アポトーシスの誘導及びＢｉｍの発現増加〕【００９０】
上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用による腫瘍細胞に生じるアポトーシスが、カスパーゼ依存性であるか検討するため、ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用い、カスパーゼ阻害剤を利用して解析した。図２９に示すように、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤の併用により誘導されたアポトーシスは、パンカスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ｆｍｋによって、ほぼ完全に抑制された。更に、上記併用により、明らかにカスパーゼの切断が促進され、アポトーシス促進性活性をもつＢｉｍの発現が増加した（図３０）。【００９１】
これらの結果から、腫瘍に対するＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用においては、Ｂｉｍの発現増強を含む内因性経路を介してカスパーゼ依存アポトーシスが誘発されていることが示唆される。【００９２】
〔実施例８：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用による、細胞内活性酸素種の蓄積増加〕【００９３】
上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用処理による腫瘍細胞のアポトーシス誘導に、細胞内活性酸素種が関係するのか確認するため、ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用い、ＯＢＰ−８０１及び／又はＬＹ２９４００２で処理した細胞における細胞内活性酸素種の蓄積効果を、活性酸素種インジケーターであるＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを利用して解析した。その結果、併用処理によって、顕著に細胞内活性酸素種の蓄積が増加し、その蓄積はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）により阻止された（図３１）。更に、併用処理によるアポトーシス誘導も、ＮＡＣによってほぼ完全に抑制された（図３２）。分子レベルにおいては、併用処理によって、ＮＡＣはカスパーゼの活性化とＢｉｍの誘導を阻害していた（図３３）。【００９４】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用処理によるアポトーシスの誘導は、細胞内活性酸素種の蓄積によるＢｉｍの発現上昇によって媒介されていることが示唆される。【００９５】
〔実施例９：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用による、アポトーシス誘導へのＢｉｍ発現上昇の寄与〕【００９６】
上記各実施例にて明らかとなった腫瘍細胞のアポトーシス誘導へのＢｉｍ発現上昇の寄与の程度を確認するため、ＨＥＣ−１−Ａ細胞を用い、ｓｉＲＮＡによりＢｉｍをノックダウンした。Ｂｉｍのノックダウンによって、併用処理によるカスパーゼ類の活性化が少なくとも部分的に抑制され（図３４）、併用処理によるアポトーシスの誘導は、コントロールに比べ、明らかに減少した（図３５）。【００９７】
これらの結果は、Ｂｉｍの発現上昇が、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用処理によるアポトーシスの増強に、少なくとも部分的に寄与することを示唆している。【００９８】
〔実施例１０：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用による、カスパーゼ依存性アポトーシスの誘導〕【００９９】
上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用により誘導される腫瘍細胞のアポトーシスがカスパーゼ類に依存したものであるのか検討するため、７８６−Ｏ細胞を用い、パンカスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ｆｍｋを利用し解析した。すると、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ処理により、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用により誘導されたアポトーシスが効果的に抑制された（図３６）。更に、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９をウェスタンブロッティングにより確認した。ＯＢＰ−８０１単剤又はＬＹ２９４００２単剤の処理では上記各カスパーゼの切断は誘導されなかったが、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理では、上記各カスパーゼの切断が誘導された（図３７）。【０１００】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理は、７８６−Ｏ細胞において、カスパーゼに依存したアポトーシスを誘導するものであることが示唆される。【０１０１】
〔実施例１１：ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用処理により誘導される腫瘍細胞のアポトーシスへの細胞内活性酸素種の関与〕【０１０２】
上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用により誘導される腫瘍細胞のアポトーシスに細胞内活性酸素種が関与するか、７８６−Ｏ細胞を用いて検討した。その結果、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用処理によって、７８６−Ｏ細胞において細胞内活性酸素種を誘導することができた。一方、フリーラジカル消去剤のＮＡＣを処理すると、上記併用処理による細胞内活性酸素種の誘導が抑止された（図３８）。更に、ＮＡＣは、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用処理による７８６−Ｏ細胞におけるアポトーシスの誘導をも抑止した（図３９）。【０１０３】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２の併用処理によるアポトーシスの誘導は、細胞内活性酸素種の産生に依存していることが示唆される。【０１０４】
〔実施例１２：ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の併用処理による腫瘍細胞の細胞内活性酸素種の産生を介したサバイビン及びＸＩＡＰタンパク質の発現抑制〕【０１０５】
上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用処理による腫瘍細胞のアポトーシス誘導効果の分子的な機構をさらに追及するため、７８６−Ｏ細胞を用い、ウェスタンブロット解析を行った。図４０に示されるように、サバイビン及びＸＩＡＰといった抗アポトーシス性の分子の発現は、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用により、ＯＢＰ−８０１単剤やＬＹ２９４００２単剤に比して、顕著に減少することが確認された。Ｂｃｌ−２、ＢＡＸ及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質の量は、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理では影響を受けなかった（図４１）。次に、細胞内活性酸素種の産生がサバイビン及びＸＩＡＰの発現抑制を引き起こすものであるのか検討した。図４２に示すように、サバイビン及びＸＩＡＰの発現低下は、ＮＡＣ処理により回復した。【０１０６】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用により誘導される腫瘍細胞におけるサバイビン及びＸＩＡＰの発現抑制は、細胞内活性酸素種に依存するものであることが示唆される。【０１０７】
〔実施例１３：サバイビン及びＸＩＡＰの発現抑制の、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用によって誘導されるアポトーシスへの関与〕【０１０８】
サバイビン及びＸＩＡＰを過剰発現させることで、上記各実施例にて明らかとなったＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用治療に抵抗を示すようになるか、腫瘍細胞である７８６−Ｏ細胞を用いて検討した。サバイビン及びＸＩＡＰの過剰発現による効果は、ウェスタンブロッティングにて確認した（図４３）。そして、図４４に示すように、サバイビン又はＸＩＡＰは、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用によるアポトーシスの誘導を部分的にしか抑制しなかったが、サバイビンとＸＩＡＰを共発現させた場合には、ＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用によるアポトーシスの誘導を十分に抑制することが確認された。【０１０９】
これらの結果から、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用によって腫瘍細胞のアポトーシスが引き起こされ、それは、少なくとも部分的には、サバイビンとＸＩＡＰの発現抑制を介したものであることが示唆される。【０１１０】
〔実施例１４：ＬＹ２９４００２との併用により、ＯＢＰ−８０１は、ＳＡＨＡと比べ、より強いアポトーシスを誘導した〕【０１１１】
ＳＡＨＡは、臨床的に最も用いられているＨＤＡＣ阻害剤である。ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２との併用における、ＯＢＰ−８０１とＳＡＨＡとのアポトーシス誘導効果を比較するため、フローサイトメトリーによりｓｕｂ−Ｇ１期解析を行った。図４５及び図４６に示すように、ＨＥＣ−１−Ａ細胞及び７８６−Ｏ細胞へのＬＹ２９４００２単剤処理又はＯＢＰ−８０１単剤処理では、ほぼ同等程度にアポトーシスが誘導されたが、上記各実施例にても確認したＯＢＰ−８０１とＬＹ２９４００２との併用処理では、ＳＡＨＡとＬＹ２９４００２との併用処理に比べ、より効果的にアポトーシスが誘導された。【０１１２】
これらの結果は、ＯＢＰ−８０１が、ＨＥＣ−１−Ａ細胞や７８６−Ｏ細胞などの腫瘍細胞へのＬＹ２９４００２との併用において、ＳＡＨＡよりも強い作用を有し、より腫瘍治療に適することを示している。【０１１３】
〔実施例１５：ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果の確認〕【０１１４】
ＯＢＰ−８０１、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及び、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用が、腫瘍細胞の増殖に与える影響を確認した。腫瘍細胞として、腎細胞癌細胞株の７８６−Ｏ細胞を用いた。ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、構造等が各々異なる、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＹＬ７１９又はＣＨ５１３２７９９を用いた。試験は上記実施例と同様の手法により行い、試薬添加７２時間後にＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析することで、各試薬による腫瘍細胞へのアポトーシス誘導効果を確認した。【０１１５】
その結果、上記検討したすべてのＰＩ３Ｋ阻害剤を用いた場合において、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを単剤処理では治療・予防効果が見られない濃度にて併用することにより、ＯＢＰ−８０１との併用によりマウスに担持させた腫瘍の増殖を減少に転じさせることが確認できたアポトーシス誘導と同様、腎細胞癌細胞に対して相乗的にアポトーシスを誘導する効果を発揮させることができるものであることが確認された（図４７〜図５１）。
上記試験を更に２回繰り返し、相乗的なアポトーシス誘導効果が、いずれも再現性をもって得られることを確認した。【０１１６】
〔実施例１６：ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＢＫＭ１２０又はＧＤＣ−０９４１との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果の確認〕【０１１７】
ＯＢＰ−８０１、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及び、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用が、腫瘍細胞の増殖に与える影響を確認した。腫瘍細胞として、ヒト−タイプ２子宮体癌細胞株のＨＥＣ−１−Ａ細胞を用いた。ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、構造等が各々異なる、ＢＫＭ１２０又はＧＤＣ−０９４１を用いた。試験は上記実施例と同様の手法により行い、試薬添加７２時間後にＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析することで、各試薬による腫瘍細胞へのアポトーシス誘導効果を確認した。【０１１８】
その結果、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを単剤処理では治療・予防効果が見られない濃度にて併用することにより、ＯＢＰ−８０１との併用によりマウスに担持させた腫瘍の増殖を減少に転じさせることが確認できたアポトーシス誘導と同様、子宮体癌細胞に対して相乗的にアポトーシスを誘導する効果を発揮させることができるものであることが確認された（図５２及び図５３）。
上記試験を更に２回繰り返し、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用による相乗的なアポトーシス誘導効果が、いずれも再現性をもって得られることを確認した。【０１１９】
〔実施例１７：ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０又はＧＤＣ−０９４１との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果の確認〕【０１２０】
ＯＢＰ−８０１、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及び、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用が、腫瘍細胞の増殖に与える影響を確認した。腫瘍細胞として、ヒトリンパ腫細胞株のＳＵ−ＤＨＬ−６細胞を用いた。ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、構造等が各々異なる、ＬＹ２９４００２、ＢＫＭ１２０又はＧＤＣ−０９４１を用いた。試験は上記実施例と同様の手法により行い、試薬添加７２時間後にＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析することで、各試薬による腫瘍細胞へのアポトーシス誘導効果を確認した。【０１２１】
その結果、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを単剤処理では治療・予防効果が見られない濃度にて併用することにより、ＯＢＰ−８０１との併用によりマウスに担持させた腫瘍の増殖を減少に転じさせることが確認できたアポトーシス誘導と同様、ヒトリンパ腫細胞に対しても、相乗的にアポトーシスを誘導する効果を発揮させることができるものであることが確認された（図５４〜図５６）。
上記試験を更に２回繰り返し、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用による相乗的なアポトーシス誘導効果が、いずれも再現性をもって得られることを確認した。【０１２２】
〔実施例１８：ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２又はＧＤＣ−０９４１との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果の確認〕【０１２３】
ＯＢＰ−８０１、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及び、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用が、腫瘍細胞の増殖に与える影響を確認した。腫瘍細胞として、ヒト乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた。ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、構造等が各々異なる、ＬＹ２９４００２又はＧＤＣ−０９４１を用いた。試験は上記実施例と同様の手法により行い、試薬添加７２時間後にＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合の解析することで、各試薬による腫瘍細胞へのアポトーシス誘導効果を確認した。【０１２４】
その結果、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを単剤処理では治療・予防効果が見られない濃度にて併用することにより、ＯＢＰ−８０１との併用によりマウスに担持させた腫瘍の増殖を減少に転じさせることが確認できたアポトーシス誘導と同様、ヒト乳癌細胞株に対しても相乗的にアポトーシス誘導効果を発揮させることができるものであることが確認された（図５７及び図５８）。
上記試験を更に２回繰り返し、ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用による相乗的なアポトーシス誘導効果が、再現性をもって得られることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
ＯＢＰ−８０１とＰＩ３Ｋ阻害剤とを医薬の有効成分とし、それらを併用する本願発明により、相乗的な腫瘍細胞及び腫瘍組織に対するアポトーシス誘導並びに腫瘍増殖阻害効果が得られ、有効成分に起因した副作用を回避した、腫瘍治療及び予防が可能になった。更に、ＯＢＰ−８０１と、ＰＩ３Ｋ阻害剤という異なる分子標的薬を組み合わせたことで、単剤の処方では得ることができない、相乗的な、カスパーゼ経路の活性化、Ｂｉｍの発現増強、細胞内活性酸素種の蓄積増加、サバイビン及びＸＩＡＰタンパク質の発現抑制という複数の異なる顕著な薬理効果を同時に得ることが可能となり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化やｐ５３が失活した癌や、化学療法、放射線療法及びホルモン療法などの従来療法の有効性が低い腫瘍を含む幅広い腫瘍に適用できる有効な治療薬及び予防薬として、臨床的に有効な新たな腫瘍の治療・予防戦略を提供することが可能になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【国際調査報告】
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