(57)【要約】  有毒なあるいは危険な有機溶媒を用いることなく簡便な操作によって、種々の臓器をその変化を引き起こすことなく十分に透明化できる技術として、２，２´−チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する手順を含む組織透明化方法を提供する。この組織透明化方法において、前記水溶性溶媒には、好ましくは２，２´−チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合溶媒が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，２´−チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する手順を含む組織透明化方法。
【請求項２】
前記溶媒が、２，２´−チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液であり、２，２´−チオジエタノール、グリセロール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比がそれぞれ１０〜５０％、１〜２０％及び１０〜７０％である請求項１記載の組織透明化方法。
【請求項３】
前記溶媒が、２，２´−チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液であり、２，２´−チオジエタノール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比が２０〜８０％、８０〜２０％である請求項１記載の組織透明化方法。
【請求項４】
前記溶媒が、２，２´−チオジエタノールとグリセロールとの混合液であり、２，２´−チオジエタノール及びグリセロールの容量比が７０〜９５％、５〜３０％である請求項１記載の組織透明化方法。
【請求項５】
前記溶媒が、さらにスクロース水溶液を含む請求項１記載の組織透明化方法。
【請求項６】
前記溶媒の屈折率が、１．４〜１．７である請求項１〜５のいずれか一項に記載の組織透明化方法。
【請求項７】
前記組織が、脳、脊髄、肝臓、肺、心臓、血管及び癌からなる群より選択される一以上である請求項１〜６のいずれか一項に記載の組織透明化方法。
【請求項８】
前記組織が１ｍｍ以上の厚さを有する請求項７記載の組織透明化方法。
【請求項９】
２，２´−チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒からなる組織透明化試薬。
【請求項１０】
２，２´−チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する透明化手順を含む組織観察方法。
【請求項１１】
前記組織を蛍光標識する標識手順と、
蛍光標識後の前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、
透明化後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含む請求項１０記載の組織観察方法。
【請求項１２】
前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、
透明化後の組織を蛍光標識する標識手順と、
透明化及び蛍光標識後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含む請求項１０記載の組織観察方法。
【請求項１３】
前記検出手順において、前記蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光実体顕微鏡、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡により観察する請求項１１又は１２記載の組織観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法に関する。より詳しくは、組織をその変化を引き起こすことなく、簡便かつ安全に透明化できる組織透明化方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、形質転換技術及び遺伝子導入技術の進展に伴い、様々な臓器において特定の細胞のみを蛍光タンパク質で標識し観察することが行われている。例えば、脳内の種々の神経回路を選択的に蛍光標識し、蛍光を指標に３次元的に神経回路を可視化し再構築する試みがなされてきている。【０００３】
従来、臓器の内部組織の観察は、固定、包埋した臓器（あるいは臓器片）を機械的に薄切して組織切片を作成し、光学顕微鏡下で観察することにより行われてきた。また、近年では、共焦点レーザー顕微鏡や多光子励起顕微鏡を用いて臓器を光学的に「切る」ことにより、内部組織の観察像を得られるようになっている。【０００４】
神経回路等の組織構造を３次元的に観察する場合、上述の機械的手法では、連続的な組織切片を多数作成し、それらの蛍光画像を積み上げていくことが必要となり、非常な労力を伴う。一方、光学的手法では、光が臓器内部で散乱するため、観察する部位が臓器表面から深くなるにつれて蛍光画像の取得が困難となる問題（観察深度限界）がある。【０００５】
観察深度限界は、一般に、共焦点レーザー顕微鏡で０．１５ｍｍ程度、二光子励起顕微鏡で最大４ｍｍ程度とされている。例えば研究に汎用されるマウスの脳の場合、表層の皮質の厚さが約１ｍｍであるので、皮質よりも脳の内側にある海馬や視床を観察するためには、観察深度限界を数ミリメートルまで広げる必要がある。【０００６】
そこで、臓器内部での光の散乱を抑制して観察深度限界を広げるための技術として、臓器を透明化する技術が検討されてきている。例えば、非特許文献１には、テトラヒドロフランを用いた手法によって脳脊髄を透明化したことが報告されている。また、特許文献１及び非特許文献２には、高濃度の尿素を用いた手法（Scale法）によって脳を透明化できたことが記載されている。【０００７】
非特許文献４には、２，２´−チオジエタノールを用いてトンボの胸部神経節やイカの皮膚などの組織を０．６ｍｍ程度の厚さまで透明化できたことが記載されている。また、これに先行する非特許文献５には、２，２´−チオジエタノールを封入剤に用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１３−５２２５９０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】"Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and  glial responses after injury." Nature Medicine,2011, Vol.18,  No.1, pp.166-71
【非特許文献２】"Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain." Nature Neuroscience, 2011, Vol.14, No.11, pp.1481-1488
【非特許文献３】"Visual properties of transgenic ratsharboring the channelrhodopsin-2 gene regulated by the thy-1.2 promoter." PLoS ONE, 2009, Vol.4, No.11, e7679
【非特許文献４】"Labeling and confocal imaging of neurons in thick invertebrate tissue samples." Cold Spring Harbor Protocol, 2013
【非特許文献５】"2,2'-thiodiethanol: a new water  soluble mounting medium for high resolution optical microscopy." Microscopy Research and Technique, 2007, 70:1-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献１に記載される透明化手法は、透明化度に優れるが、発癌性が疑われるジクロロメタンを含む有機溶媒を使用する必要があり、有機溶媒の易燃性や廃液管理の困難さの問題がある。また、固定した臓器を脱水する過程や透明化試薬そのものの影響で、臓器が硬化したり、臓器中に標識された蛍光タンパク質の蛍光シグナルが消失又は減衰したりする問題があった。【００１１】
一方、非特許文献２に開示される透明化手法（Scale法）は、生体材料の脱水を必要としない水溶性試薬を用いることができるため、非特許文献１に記載される手法の上記問題を解決し得るものである。しかしながら、Scale法では、透明化のための処理に長期間（２週間程度）を要し、透明化度も不十分である。また、臓器が過度に膨化し、かつ脆弱化するという問題があった。【００１２】
また、従来の２，２´−チオジエタノールを用いる方法では、透明化が可能な組織の厚さは０．６ｍｍ程度に過ぎず、観察深度が不十分であった（非特許文献４参照）。加えて、２，２´−チオジエタノールを８０〜８５％以上の高濃度で用いると、ＧＦＰなどの一部の蛍光タンパク質では、蛍光シグナルの消失又は減衰が生じていた（非特許文献５参照）。【００１３】
これらの従来技術における課題に鑑み、本発明は、有毒なあるいは危険な有機溶媒を用いることなく簡便な操作によって、種々の臓器をその変化を引き起こすことなく十分に透明化できる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、屈折率が１．４〜１．７である水溶性溶媒中に組織を浸漬する手順を含む組織透明化方法を提供する。
この組織透明化方法において、前記水溶性溶媒には、２，２´−チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液が好適に用いられる。この場合、水性溶媒中の２，２´−チオジエタノール、グリセロール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比は、それぞれ１０〜５０％、１〜２０％及び１０〜７０％とされる。
また、前記水性溶媒として、２，２´−チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液を用いることもできる。この場合、水性溶媒中の２，２´−チオジエタノール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比は、２０〜８０％、８０〜２０％とされる。
さらに、前記水性溶媒として、２，２´−チオジエタノールとグリセロールとの混合液を用いてもよい。この場合、水性溶媒中の２，２´−チオジエタノール及びグリセロールの容量比は、７０〜９５％、５〜３０％とされる。
水性溶媒中の２，２´−チオジエタノールの濃度を抑制して蛍光タンパク質の蛍光シグナルの消失又は減衰を防止するため、水性溶媒には、２，２´−チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液あるいはこれにグリセロールを加えたものを用いることが好ましい。
加えて、前記水溶性溶媒は、対象とする臓器に応じて、さらにスクロース水溶液を含むことができる。【００１５】
また、本発明は、屈折率が１．４〜１．７である水溶性溶媒を含んでなる組織透明化試薬を提供する。組織透明化試薬は、２，２´−チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒を含む。組織透明化試薬は、対象とする臓器に応じて、２，２´−チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液、あるいは２，２´−チオジエタノールとグリセロールとの混合液、より好ましくは２，２´−チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液とされる。
また、組織透明化試薬は、対象とする臓器に応じて、さらにスクロース水溶液を含んでいてもよい。【００１６】
さらに、本発明は、屈折率が１．４〜１．７である水溶性溶媒中に組織を浸漬する透明化手順を含む組織観察方法をも提供する。
この組織観察方法は、具体的には、前記組織を蛍光標識する標識手順と、蛍光標識後の前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、透明化後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含むことができる。
また、この組織観察方法は、前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、透明化後の組織を蛍光標識する標識手順と、透明化及び蛍光標識後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含むことができる。
この組織観察方法では、前記検出手順において、蛍光顕微鏡、蛍光実体顕微鏡、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による観察を好適に採用できる。【００１７】
本発明において、「組織」の用語は、「臓器」と同義に用いるものとし、生体組織を広く意味する。「組織（あるいは臓器）」には、脳、脊髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、血管、皮膚、皮下組織、腸、脂肪組織、リンパ節、筋肉、腱及び癌などが、特に限定されることなく、含まれる。また、骨も、胎仔又は新生仔の骨のように、カルシウム沈着が進んでいない骨であれば本発明に係る組織透明化方法等の対象とできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、有毒なあるいは危険な有機溶媒を用いることなく簡便な操作によって、種々の臓器をその変化を引き起こすことなく十分に透明化できる技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】透明化したラット脊髄を示す図面代用写真である。（Ａ）は従来方法、（Ｂ）は本発明に係る方法により透明化した脊髄を示す。
【図２】透明化したラット脳を示す図面代用写真である。（Ａ）は従来方法、（Ｂ）は本発明に係る方法により透明化した脳を示す。
【図３】神経軸索を蛍光標識したラット脊髄を透明化し、取得した蛍光画像を示す図面代用写真である。
【図４】透明化したラット損傷脊髄を示す図面代用写真である。
【図５】透明化したラット損傷脊髄の３次元蛍光画像を示す図面代用写真である。
【図６】透明化したマウス脊髄（Ａ）と脳（Ｂ）の炎症部位の観察像を示す図面代用写真である。
【図７】透明化したマウス炎症脳の３次元蛍光画像を示す図面代用写真である。
【図８】透明化マウス肺の炎症部位の観察像を示す図面代用写真（Ａ）とその階調反転写真（Ｂ）である。
【図９】透明化したマウス炎症肺の肺胞血管の３次元構築像を示す図面代用写真である。
【図１０】透明化した癌を示す図面代用写真である。
【図１１】透明化した癌の３次元蛍光画像を示す図面代用写真である。（Ａ）は本発明に係る方法、（Ｂ）は従来方法により透明化した癌を示す。
【図１２】透明化したラット心臓を示す図面代用写真である。
【図１３】透明化したマウス肝臓を示す図面代用写真である。
【図１４】透明化したラット脳の免疫染色像を示す図面代用写真である。
【図１５】透明化したラット脳の脂肪染色像を示す図面代用写真である。
【図１６】透明化したラット脳の核染色像を示す図面代用写真である。
【図１７】透明化したラット脳のニッスル染色像を示す図面代用写真である。
【図１８】透明化したラット個体を示す図面代用写真である。
【図１９】非イオン性有機ヨウ素化合物を含む組織透明化試薬により透明化した癌を示す図面代用写真である。
【図２０】透明化したマウス脳を示す図面代用写真である。
【図２１】脳血管を蛍光標識したマウス脳を透明化し、取得した蛍光画像を示す図面代用写真である。
【図２２】比較のためチオジエタノール単独溶液にラット脳を浸漬した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る組織透明化方法、及び該組織透明化方法を一手順として含む組織観察方法を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２１】
（１）組織透明化手順（組織透明化方法）
本発明に係る組織透明化方法及び組織観察方法は、屈折率が１．４〜１．７である水溶性溶媒（組織透明化試薬）中に組織を浸漬する透明化手順を含むことを特徴とする。水溶性溶媒の屈折率は、より好ましくは１．５０〜１．５２とされる。
【００２２】
［対象臓器］
本発明に係る組織透明化方法及び組織観察方法において、対象とする臓器（あるいは臓器片）は、特に限定されないが、脳、脊髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、血管、皮膚、皮下組織、腸、脂肪組織、リンパ節、筋肉、腱及び癌、並びに骨などとされる。本発明では、２，２´−チオジエタノール（以下、単に「チオジエタノール」と称する）にグリセロールを組み合わせて用いることで、１ｍｍ以上の厚さの組織、具体的には１ｍｍ〜２ｃｍ程度の厚みの組織であっても、透明化できることが初めて明らかにされた。
【００２３】
［組織透明化試薬］
水溶性溶媒（以下、「組織透明化試薬」とも称する）の屈折率は、対象臓器に応じて上記数値範囲内で適宜設定され得る。上記屈折率を満たす組織透明化試薬の好適な例として、チオジエタノール（屈折率１．５２）と非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液（ヨウ素含有量４０％の水溶液の屈折率約１．５１）の混合液、あるいはチオジエタノールとグリセロール（屈折率１．４７４）との混合液が挙げられ、より好ましくはチオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液が挙げられる。また、組織透明化試薬は、対象とする臓器に応じて所望により、さらにスクロース水溶液を含んでいてもよい。
【００２４】
チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液の場合、水性溶媒中のチオジエタノール、グリセロール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比は、それぞれ１０〜５０％、１〜２０％及び１０〜７０％とされる。
また、チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液を用いる場合、水性溶媒中のチオジエタノール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比は、２０〜８０％、８０〜２０％とされる。
さらに、チオジエタノールとグリセロールとの混合液を用いる場合、水性溶媒中のチオジエタノール及びグリセロールの容量比は、７０〜９５％、５〜３０％とされる。
スクロース水溶液を添加する場合には、スクロース水溶液の添加容量に応じて、チオジエタノール、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液のいずれか１以上の添加容量を減らせばよい。
【００２５】
組織透明化試薬中のチオジエタノール、グリセロール、非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液及びスクロース水溶液の容量比は、対象臓器に関して所望される透明化度の程度に応じ幅広い範囲で調整され得る。
【００２６】
組織透明化試薬中において、チオジエタノールの容量を増加させることで、臓器の透明化度をより高めることもできる。例えば、対象臓器を肺とする場合、チオジエタノール：グリセロール＝７０：３０の混合溶媒を用いると、太い気管支を完全に透明化されないようにして視認可能なまま残すことができる。一方、チオジエタノール：グリセロール＝８５：１５の混合溶媒を用いると、気管支の透明化度を高めて、肺全体を十分に透明化できる。
【００２７】
上述の通り、組織透明化試薬は、チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液を用いてもよいが、高い透明化度及び蛍光タンパク質の蛍光シグナルの高い保持性を得るためには、チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液にグリセロールを加えた試薬を用いることが最も好ましい。また、組織透明化試薬としてチオジエタノールとグリセロールとの混合液を用いる場合には、グリセロールを加えることで比較的高いチオジエタノール濃度（８０％よりも高い容量比）の条件であっても、蛍光タンパク質の蛍光シグナルの消失又は減衰を抑制しながら、臓器を透明化することが可能となる。
【００２８】
また、組織透明化試薬中に、上記屈折率範囲（１．４〜１．７）に該当する屈折率（ヨウ素含有量４０％の水溶液の屈折率約１．５１）を有する非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液を加えることで、チオジエタノールの使用量を１０〜５０％程度、好ましくは２０〜５０％程度に減らすことができる。これによって、透明化後も蛍光タンパク質の蛍光シグナルを良好なレベルに保つことができる。
【００２９】
組織透明化試薬中に非イオン性有機ヨウ素化合物を添加する場合、例えばヨウ素含有量４０％の水溶液の場合、容量比で１０〜８０％が好ましい。ヨウ素含有量（質量／体積％）は、非イオン性有機ヨウ素化合物の全体質量に占めるヨウ素原子の質量比と、水溶液中の非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度（質量／体積％）とから算出できる。なお、非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液のヨウ素含有量は適宜変更可能であり、４０％に限られない。組織透明化試薬中の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比も、ヨウ素含有量に応じて適宜調整され得る。
【００３０】
非イオン性有機ヨウ素化合物としては、例えばヨウ素原子を高濃度で含有する有機化合物に親水性を付与した非イオン性ヨード造影剤を用いることができる。非イオン性ヨード造影剤には、ジアトリゾ酸、アミドトリゾ酸、イオキサグル酸、イオキシラン、イオタラム酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオプロミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオポダートナトリウム、メトリゾ酸、ヨーダミド、ヨードキサム酸、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル等の従来公知の造影剤が挙げられる。
【００３１】
組織透明化試薬中にスクロースを添加する場合、３０％スクロース水溶液の容量比で２〜１０％が好ましい。スクロース水溶液を加えることで、組織透明化試薬の浸透度を向上させて臓器の透明化度を高めることができる。この要因としては、何ら論理に拘束されるわけではないが、スクロースを添加することで、組織の過度の固定による細胞膜や細胞質の混濁を防止できるものと推定される。
【００３２】
組織透明試薬の組成の好適な例として、チオジエタノール、グリセロール及びヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比が４５：５：５０である混合液が挙げられる。
【００３３】
組織透明化試薬には、ヂメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加してもよい。ＤＭＳＯは、組織透明化試薬の浸透度を向上させて臓器の透明化度を高めることに寄与する。ＤＭＳＯの添加濃度は、例えば０．１〜１０％とされる。ＤＭＳＯを添加する場合には、ＤＭＳＯの添加容量に応じて、チオジエタノール、グリセロール、非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液及びスクロース水溶液のいずれか１以上の添加容量を減らせばよい。
【００３４】
なお、屈折率１．４〜１．７を満たす水溶性溶媒として、上述した混合溶媒以外にも、多価アルコール類、多価アルコール類誘導体、含窒素溶媒、アルコール類、含硫黄溶媒及びこれらの混合溶媒などを使用できる場合もある。また、スクロース以外の他の単糖類及び／又は多糖類を水溶性溶媒中に添加できる場合もあるが、水中への溶解度の高さの観点からはスクロースが好ましいと考えられる。
【００３５】
［浸漬］
臓器は組織透明化試薬中に所定時間浸漬することにより透明化される。浸漬は４〜６０℃程度にて行うことが好ましく、２０〜４２℃程度にて行うことが特に好ましい。試薬を室温以上に加温することで、試薬の粘性が低下し、臓器内への浸透度が向上する。低温度下でのスクロースの析出を防止するため、スクロース水溶液には３０％程度の濃度の水溶液を用いることが好ましい。浸漬する時間は対象臓器によって異なるが、例えば２４時間〜６日間である。一例として、対象臓器が脳、脊髄、心臓、皮膚又は筋肉である場合、４〜６日程度の浸漬が行われる。また、対象臓器が肝臓、腎臓、肺、血管、リンパ節又は癌である場合、２４時間〜３日間の浸漬が好ましい。
【００３６】
臓器を組織透明化試薬中に浸漬する際には、チオジエタノール、グリセロール及び／又は非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液、並びに必要に応じてスクロース水溶液を上記容量比で混合した最終溶液への浸漬の前段手順として、チオジエタノールの容量比を小さくした前処理溶液への浸漬を行ってもよい。
【００３７】
前処理溶液は、チオジエタノールの容量比の異なる複数の溶液を用いてもよく、この場合、チオジエタノールの容量比がより少ない前処理溶液から順に臓器を一定時間ずつ浸漬していく。段階的な浸漬を行う場合、前段手順ではスクロースを含む処理溶液を用い、最終的にはスクロースを含まない処理溶液を用いてもよく、これはスクロースの析出が問題となるような場合に有効である。なお、このような多段階（２段階以上）での前処理は、組織透明化試薬としてチオジエタノール及びグリセロール並びに必要に応じてスクロース水溶液の混合液を最終溶液とする場合に特に有効であり、最終溶液として非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液を含む混合液を用いる場合は必ずしも必要とはならない。  
【００３８】
非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液を含まない組織透明化試薬を用いる場合の多段階前処理の一例として、対象臓器を脳又は脊髄とする場合、チオジエタノール：グリセロール：３０％スクロース＝２０：４０：４０の溶液、５０：４０：１０の溶液、７０：２５：５の溶液の各前処理溶液に順にそれぞれ２４時間ずつ浸漬した後、最終溶液（９０：５：５）への浸漬（２４時間）を行う。また、他の臓器では、例えばチオジエタノール：グリセロール＝２０：８０の溶液、５０：５０の溶液、７０：３０の溶液の各前処理溶液に順にそれぞれ２４時間ずつ浸漬した後、最終溶液（８５：１５）への浸漬（２４時間）を行う。
【００３９】
非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液を含む組織透明化試薬を用いる場合には一段階の前処理によって、脳を３〜４日間程度で、骨を除く他の全ての組織を２日間程度で透明化できる。この場合、例えば前処理液にチオジエタノール：グリセロール：３０％スクロース＝２０：４０：４０の溶液を用い、最終溶液（組織透明化試薬）にチオジエタノール：グリセロール：ヨウ素含有量４０％の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液：＝４５：５：５０の溶液を用いる。前処理液には例えば４℃〜２５℃で２４時間、最終溶液には例えば４℃〜２５℃で２４〜４８時間浸漬を行う。
【００４０】
本発明に係る組織透明化方法では、従来手法に比べて短時間の操作で十分な臓器の透明化度が得られる。また、本発明に係る組織透明化方法では、有毒なあるいは危険な有機溶媒を使用することなく、水溶性溶媒中への浸漬により臓器を透明化できる（後述する実施例参照）。このため、本発明に係る組織透明化方法は、有機溶媒の易燃性や廃液管理の困難さの問題がなく、安全性が高い。
【００４１】
さらに、本発明に係る組織透明化方法では、有機溶媒を使用しないため、固定した臓器を脱水する過程や組織透明化試薬そのものの影響で、臓器中に標識された蛍光タンパク質の蛍光シグナルが消失又は減衰したりすることがなく、ほぼすべての蛍光標識の蛍光が保持される。さらに、本発明に係る組織透明化方法では、水溶性溶媒中に添加されたグリセロールによって蛍光タンパク質の劣化（退色）を防止する効果も得られる。
【００４２】
（２）固定化手順
本発明に係る組織透明化方法及び組織観察方法では、上述の組織透明化手順の前に、従来公知の病理組織学的手法による固定化手順を行ってもよい。また、固定化手順には、必要に応じて従来公知の脱脂処理等を組み合わせてもよい。
【００４３】
固定化手順には、フォルマリン溶液（１０％中性フォルマリン溶液、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液）で臓器を灌流固定した後に臓器を摘出し、さらに同溶液に２４時間程度又はそれ以上の時間浸漬する手法を採用できる。あるいは、灌流固定を行うことなく摘出した臓器を、フォルマリン溶液に４８時間程度又はそれ以上の時間浸漬する手法も採用できる。固定化後フォルマリン雰囲気を除去し、組織透明化手順を行うことが好ましい。
【００４４】
（３）標識手順・検出手順
［透明化前の蛍光標識］
本発明に係る組織観察方法では、組織を蛍光標識した後に、上述の透明化手順を行って、透明化された組織中の蛍光標識から発せられる蛍光を検出することが可能である。上述のように、本発明に係る組織透明化方法は、ほぼすべての蛍光標識の蛍光を保持でき、かつ、蛍光タンパク質の劣化（退色）を防止できるため、複数の蛍光標識を用いた多重染色による組織観察にも好適である。
【００４５】
標識手順は、遺伝子導入により組織（例えば神経線維）に蛍光タンパク質を発現させる手法、蛍光タンパク質又は蛍光色素を臓器（例えば血管）中に注入する手法、蛍光タンパク質又は蛍光色素を標識した抗体を細胞に結合させる手法等の従来公知の手法によって行うことができる。なお、ここで、蛍光色素とは、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質よりも分子量の小さい低分子化合物(例えばフルオレセイン等）を指すものとする。蛍光タンパク質及び蛍光色素には従来公知の物質を使用できる。
【００４６】
透明化後の組織中の蛍光標識から発せられる蛍光の検出手順も、蛍光顕微鏡、蛍光実体顕微鏡、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による観察などの従来公知の蛍光検出手段を特に限定されることなく用いて行うことができる。本発明に係る組織透明化方法によれば臓器の高い透明度を達成できるため、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による観察深度限界を数ミリメートルまで広げることが可能である。
【００４７】
本発明に係る組織観察方法では、組織透明化手順により種々の臓器を硬化、膨化及び脆弱化させることなく透明化できる（後述する実施例参照）。従って、Scale法等の従来手法と異なり、摘出された臓器の状態を維持したまま観察を行うことが可能である。また、透明化後もナイフ等で簡単に臓器を薄切できるため、透明化後に組織染色を行って観察を行うこともできる。
【００４８】
さらに、本発明に係る組織観察方法では、上述したように、臓器中に標識された蛍光タンパク質の蛍光シグナルが消失又は減衰したりすることがないため、高精度な蛍光観察が可能である。特に、本発明に係る組織観察方法は、多光子顕微鏡を用いて非常に弱い励起エネルギーで臓器深部の観察を行う際に効果を発揮する。
【００４９】
［透明化後の蛍光標識］
また、本発明に係る組織観察方法では、上述の透明化手順を行った後に、透明化後の組織を蛍光標識して、透明化された組織中の蛍光標識から発せられる蛍光を検出することも可能である。
【００５０】
本発明に係る組織透明化方法は、臓器を過度に膨化させたり、脆弱化させたりするとなく透明化できるため、透明化後の臓器は薄切が可能である。このため、透明化後に薄切した臓器片を、蛍光標識抗体を用いた免疫組織化学的手法により染色すれば、透明化後の組織を蛍光標識できる。
【００５１】
また、透明化後の臓器あるいは臓器片は、各種染色液を用いて、従来公知の病理組織学的染色を行うこともできる。特に、本発明に係る組織透明化方法では、脂肪を保持させたまま臓器を透明化できるため、ズダンＩＩＩ染色やオイルレッド染色、ズダンブラック染色などの脂肪染色を行うことも可能である。
【００５２】
さらに、遺伝子導入により組織を蛍光標識した後、臓器を摘出して透明化を行い、透明化後の組織をさらに免疫染色によって蛍光標識し、透明化された組織中の２以上の蛍光標識から発せられる蛍光を検出するといった応用も可能である。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１：ラット脊髄の透明化＞
４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で灌流固定した後にラット脊髄を摘出し、さらに同溶液に２４時間浸漬して固定した。固定後の脊髄（径３ｍｍ）を、チオジエタノール：グリセロール：スクロース＝２０：４０：４０の溶液、５０：４０：１０の溶液、７０：２５：５の溶液の各前処理溶液に順にそれぞれ２４時間ずつ浸漬した後、９０：５：５の最終溶液に２４時間浸漬して透明化した。【００５４】
結果を図１Ｂに示す。なお、Ａは、非特許文献２記載のScale法による結果を示す。本発明に係る組織透明化方法（Ｂ）では、Scale法（Ａ）に比して透明度高く脊髄を透明化できた。また、Scale法（Ａ）では、脊髄が２倍に膨化してしまう問題があったのに対して、本発明に係る組織透明化方法（Ｂ）ではこのような問題は生じなかった。【００５５】
＜実施例２：ラット脳の透明化＞
ラット脳（組織厚６ｍｍ）を実施例１に記載の手順で固定し透明化した。【００５６】
結果を図２Ｂに示す。なお、Ａは、非特許文献２記載のScale法による結果を示す。本発明に係る組織透明化方法（Ｂ）では、Scale法（Ａ）に比して透明度高く脳を透明化できた。また、Scale法（Ａ）では、脳が顕著に膨張し、指で押圧すると容易に崩れてしまう問題があったのに対して、本発明に係る組織透明化方法（Ｂ）では膨化及び脆弱化は生じなかった。【００５７】
＜実施例３：ラット脊髄の蛍光観察＞
神経軸索に蛍光タンパク質ＶＥＮＵＳを発現するトランスジェニックラットを作成した。トランスジェニックラットの作成は、非特許文献３（"Visual  properties  of  transgenic  rats  harboring  the  channelrhodopsin-2  gene  regulated  by  the  thy-1.2  promoter."  PLoS ONE,  2009,  Vol.4,  No.11,  e7679）記載の手法により行った。実施例１に記載の手順で固定し透明化した脊髄を共焦点顕微鏡（Zeiss, LSA-700）により観察した。【００５８】
取得された蛍光画像を図３Ａに示す。Ｂは、Ａ中の点線で囲った領域の拡大画像である。本発明に係る組織観察方法によれば、神経軸索を高精度に観察することが可能であった。また、比較的高いチオジエタノール濃度（容量比９０％）の条件であっても、蛍光タンパク質の蛍光シグナルの消失又は減衰を抑制できた。【００５９】
＜実施例４：ラット損傷脊髄の観察＞
上述のトランスジェニックラットの第１２胸髄の背側を鋭利なハサミで半切して脊髄を損壊した後、傷口を閉じた。４週間後に、実施例１に記載の手順で脊髄を固定し透明化した。透明化後の脊髄を多光子励起顕微鏡（Nikon, A1MP）により観察した。【００６０】
透明化後の脊髄では、図４に示すように、外部から損壊された部位を透視することが可能となった。損壊部位は、ヘモジデリンによる着色で茶色く視認される。取得された３次元蛍光画像を図５に示す。画像中、緑は神経軸索からのシグナル、青は第二高調波発生（Second harmonic generation: ＳＨＧ）のシグナルを示す。コラーゲンからのＳＨＧによる蛍光が損壊部位で観察され、同部位でコラーゲンが増生し線維化が生じていることが確認される。【００６１】
＜実施例５：マウス脳脊髄炎の観察＞
マウスに実験的脳脊髄炎を誘起した。マウス尾根部に炎症誘起MOGペプチドエマルジョンを皮下注射し、３０日後に４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で灌流固定した後に脳脊髄を摘出し、さらに同溶液に２４時間浸漬して固定した。固定後の脳脊髄を、チオジエタノール：グリセロール＝２０：８０の溶液、５０：５０の溶液、７０：３０の溶液の各前処理溶液に順にそれぞれ２４時間ずつ浸漬した後、９０：１０の最終溶液に２４時間浸漬して透明化した。透明化後の脳脊髄を多光子励起顕微鏡により観察した。【００６２】
図６に透明化後の脊髄（Ａ）と脳（Ｂ）を示す。本実施例では、組織透明化試薬としてチオジエタノール及びグリセロールを含み、スクロース水溶液を含まない水溶性溶媒を用いることで最終的な臓器の透明化度を敢えて抑制した。これにより、図６（Ｂ）に示されるように、病変を脳幹内の混濁した部位として確認することができている。また、図７には、取得された３次元蛍光画像を示す。画像中、赤は血管、緑は骨髄由来細胞の蛍光像である。血管の蛍光標識は、蛍光試薬を結合したトマトレクチンを動物の血管に注入することによって実施した。また、骨髄由来細胞の蛍光標識は、蛍光標識した抗F4/80抗体を用いて行った。【００６３】
＜実施例６：マウス肺の観察＞
実施例１に記載の手順でマウス肺（下葉、縦：横：厚み＝７ｍｍ：５ｍｍ：５ｍｍ）を固定し透明化した。透明化後の肺を多光子励起顕微鏡により観察し、肺胞血管の３次元構造を構築した。【００６４】
透明化後の肺を図８Ａに示す。Ｂは、Ａの画像を階調反転させた画像である。透明化後の肺では、図８に示すように、外部から気管支を透視することが可能となった。また、図９には、取得された肺胞血管の３次元画像を示す。【００６５】
＜実施例７：癌の観察＞
ＧＦＰを遺伝子導入したヒト肺癌細胞をヌードマウスの皮下に移植し、６０日後に癌組織（５ｍｍ角）を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液に２４時間浸漬して固定した。実施例１に記載の手順により透明化を行った。透明化後の癌を多光子励起顕微鏡により観察した。【００６６】
透明化後の癌を図１０に示す。また、癌の３次元蛍光画像を図１１Ａに示す。なお、図１１Ｂは、Scale法により透明化を行った癌の蛍光観察像である。Scale法（Ｂ）による観察では、観察深度限界が１００μｍ程度であり、腫瘍血管は描出不能で、腫瘍細胞（画像中、緑）の分布は不明瞭であった。一方、本発明に係る組織透明化方法（Ａ）による観察では、観察深度限界が１０００μｍ以上であり、腫瘍血管（画像中、赤）が描出可能で、腫瘍細胞の分布も確認された。また、ＧＦＰの蛍光シグナルもよく保持されていることが分かった。【００６７】
＜実施例８：ラット心臓・マウス肝臓の透明化＞
ラットの心臓（１．２ｃｍ角）及びマウスの肝臓（縦：横：厚み＝１ｃｍ：１ｃｍ：６ｍｍ）を実施例１に記載の手順で固定し透明化した。結果を図１２、図１３に示す。図１２中矢印は、大動脈を示す。図１３中矢印は、門脈を示す。【００６８】
＜実施例９：透明化後の染色＞
実施例２で透明化したラット脳を薄切し、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ)に対する免疫染色、脂肪染色、核染色及びニッスル染色を行った。【００６９】
免疫染色は、抗ＧＦＡＰ抗体と、酵素（パーオキシダーゼ）と色素（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）を利用した市販の検出キットを用いて行った。脂肪染色にはズダンＩＩＩを用いた。核染色にはＤＡＰＩを用いた。ニッスル染色にはトルイジンブルーを用いた。【００７０】
結果を図１４〜図１７に示す。図１４はＧＦＡＰ陽性を示す小脳バーグマングリア細胞の免疫染色像を示し、図１５は脂肪染色、図１６は核染色、図１７はニッスル染色の結果を示す。図１４では、透明化によって優れた深部描出性が実現されている。また、脂肪染色、核染色及びニッスル染色においても、それぞれ目的とする小脳白質、細胞核及び神経細胞が染色されているのが確認できる。【００７１】
＜実施例１０：ラット個体の透明化＞
４日齢のラット個体を前処理液（チオジエタノール：３０％スクロース＝２０：８０）に４℃で２４時間、最終溶液（チオジエタノール：グリセロール：３０％スクロース＝９０：５：５）に４℃で４８時間浸漬して透明化した。結果を図１８に示す。ラット個体を丸ごと透明化できていることが確認される。【００７２】
＜実施例１１：有機ヨウ素化合物の検討＞
ＧＦＰを遺伝子導入したヒト肺癌細胞をヌードマウスの皮下に移植し、４週間成長させた。蛍光試薬を結合したトマトレクチンを動物の血管に注入した後、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で灌流固定した。癌組織を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液に２４時間浸漬して固定した。【００７３】
固定後の癌組織を、前処理液（チオジエタノール：３０％スクロース＝２０：８０）に４℃で２４時間、最終溶液（チオジエタノール：グリセロール：イオメプロール＝５０：５：４５）に４℃で２４時間浸漬して透明化した。結果を図１９Ｂに示す。なお、イオメプロールには、エーザイ社のイオメロン（登録商標）を用いた。イオメロン（登録商標）４００は、ヨウ素含有量４０％であり、屈折率は１．５１である。【００７４】
Ａは、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で固定後の癌組織を示す。Ｃは、前処理液（チオジエタノール：３０％スクロース＝２０：８０）に４℃で２４時間、最終溶液（チオジエタノール：グリセロール＝９０：１０）に４℃で２４時間浸漬して透明化した癌組織を示す。有機ヨウ素化合物を用いたＢで最も高い透明度が得られた。【００７５】
透明化後の癌組織においてトマトレクチンにより蛍光標識された血管を多光子励起顕微鏡により観察した。Ａに示した固定後の癌組織では、癌組織表面の結合織被膜のため内部は全く観察できなかった。Ｃに示した透明化後の癌組織では、観察深度限界は約８００μｍであった。Ｂに示した透明化後の癌組織では、顕微鏡の検出限界である約１８００μｍを超えて腫瘍血管の描出が可能であり、癌細胞のＧＦＰからの蛍光シグナルの減弱もみられなかった。この結果ら、非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液を加えた最終溶液を用いることによって、高い透明化度が得られることが明らかになり、チオジエタノールの使用量を抑えてＧＦＰの蛍光シグナルをより良好に保持できることが示された。【００７６】
＜実施例１２：マウス脳の透明化２＞
４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で灌流固定した後にマウス脳を摘出し、さらに同溶液に２４時間浸漬して固定した。固定後の脳（組織厚６ｍｍ）を、チオジエタノール：イオメプロール＝５０：５０の溶液に25℃で48時間浸漬した。結果を図２０Ａに示す。【００７７】
また、固定後の脳を、チオジエタノール：イオメプロール：グリセロール＝５０：４４．５：５．５の溶液に20℃で48時間浸漬した。結果を図２０Ｂに示す。【００７８】
図に示すように、イオメプロールを用いることで、チオジエタノールの容量比を５０％に抑制しながら、脳を透明化することができた。また、グリセロールを加えた場合（Ｂ）には、加えない場合（Ａ）に比して、透明化度は顕著に向上した。同様の手順により、胃、腎臓、子宮についても透明化できた（図示省略）。【００７９】
＜実施例１３：マウス脳血管の蛍光観察＞
ＥＧＦＰを発現するレトロウイルスベクターを用いてマウスの脳血管にＥＧＦＰを発現させた。実施例１２と同様の手順で固定し透明化した脳を共焦点顕微鏡（Zeiss, LSA-700）により観察した。【００８０】
取得された蛍光画像を図２１に示す。イオメプロールを用いた場合、ＥＧＦＰにより蛍光標識された脳血管を高精度に観察することが可能であった。【００８１】
＜比較例：チオジエタノール単独溶液の検討＞
４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で灌流固定した後にラット脳を摘出し、さらに同溶液に２４時間浸漬して固定した。固定後の脳（組織厚４ｍｍ）を、チオジエタノールに３日間浸漬した。【００８２】
結果を図２２に示す。Ａは、４％パラフォルムアルデヒド緩衝液で固定後の脳を示す。Ｂは、チオジエタノール単独溶液に浸漬した脳を示す。Ｃは、前処理液（チオジエタノール：３０％スクロース＝２０：８０）に４℃で２４時間、最終溶液（チオジエタノール：グリセロール＝９０：１０）に４℃で４８時間浸漬して透明化した脳を示す。チオジエタノール単独溶液への浸漬では、厚い脳組織を透明化することはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明に係る組織透明化方法によれば、有毒なあるいは危険な有機溶媒を用いることなく簡便な操作によって、種々の臓器をその変化を引き起こすことなく十分に透明化できる。従って、本発明に係る組織透明化方法は、病態解析や薬効評価、癌転移スクリーニングなどの種々の分野において、手間のかかる組織切片作成を行うことなく臓器の内部組織を観察するために用いられ得る。
【図１】
2014115206.tif 000002
【図２】
2014115206.tif 000003
【図３】
2014115206.tif 000004
【図４】
2014115206.tif 000005
【図５】
2014115206.tif 000006
【図６】
2014115206.tif 000007
【図７】
2014115206.tif 000008
【図８】
2014115206.tif 000009
【図９】
2014115206.tif 000010
【図１０】
2014115206.tif 000011
【図１１】
2014115206.tif 000012
【図１２】
2014115206.tif 000013
【図１３】
2014115206.tif 000014
【図１４】
2014115206.tif 000015
【図１５】
2014115206.tif 000016
【図１６】
2014115206.tif 000017
【図１７】
2014115206.tif 000018
【図１８】
2014115206.tif 000019
【図１９】
2014115206.tif 000020
【図２０】
2014115206.tif 000021
【図２１】
2014115206.tif 000022
【図２２】
2014115206.tif 000023
【国際調査報告】
2014115206.tif 000024
2014115206.tif 000025
2014115206.tif 000026
2014115206.tif 000027