(57)【要約】【課題】貴金属ナノ粒子を標識としたバイオセンシングにおいて検出精度を高める。【解決手段】検出液（１）は、被検出物質（５０）の第１の部位（５０Ａ）と特異結合する生体物質を含む第１のプローブ（２０Ａ）が第１の貴金属ナノ粒子（１０Ａ）の表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブ（Ｐ１）と、被検出物質（５０）の第２の部位（５０Ｂ）と特異結合する生体物質を含む第２のプローブ（２０Ｂ）が第２の貴金属ナノ粒子（１０Ｂ）の表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブ（Ｐ２）とが緩衝性水溶液（４０）に分散されてなり、第１の部位（５０Ａ）及び第２の部位（５０Ｂ）の、部位同士が近接する側の先端（５０Ａｔ（５０Ｂｔ））と、第１のプローブ（２０Ａ）及び第２のプローブ（２０Ｂ）の基端（２０Ａｂ（２０Ｂｂ））とが特異結合するように、第１のプローブ（２０Ａ）と第２のプローブ（２０Ｂ）がそれぞれ、第１の貴金属ナノ粒子（１０Ａ）と第２の貴金属ナノ粒子（１０Ｂ）に固定されてなる。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングに用いる検出液であって、
前記被検出物質の第１の部位と特異結合する生体物質を含む第１のプローブが第１の前記貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブと、
前記被検出物質の第２の部位と特異結合する生体物質を含む第２のプローブが第２の前記貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブとが緩衝性水溶液に分散されてなり、
前記第１の部位及び前記第２の部位の、該部位同士が近接する側の末端と、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの基端とが特異結合するように、
前記第１のプローブと前記第２のプローブがそれぞれ、前記第１の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子に固定されてなる検出液。
【請求項２】
前記第１のナノ粒子プローブ及び前記第２のナノ粒子プローブは、前記表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾が固定されてなり、前記両親媒性の表面修飾の前記粒子に固定されている側が、前記疎水性部である請求項１記載の検出液。
【請求項３】
前記表面修飾の前記第１の貴金属ナノ粒子及び前記第２の貴金属ナノ粒子に固定されていない側の末端の官能基の帯電状態が、前記生体物質の帯電状態と同じである請求項２記載の検出液。
【請求項４】
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブは、前記第１の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子に、前記表面修飾により前記特異結合が阻害されることを抑止する緩衝部を介して固定されてなることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の検出液。
【請求項５】
前記親水性部がポリエチレングリコール鎖であることを特徴とする請求項２〜４いずれか１項記載の検出液。
【請求項６】
前記親水性部が糖鎖であることを特徴とする請求項２〜４いずれか１項記載の検出液。
【請求項７】
前記親水性部が前記第１及び第２のプローブに対して相補鎖を生じさせない塩基配列であることを特徴とする請求項２〜４いずれか１項記載の検出液。
【請求項８】
前記両親媒性の表面修飾が、水溶性を有する自己組織化単分子膜であることを特徴とする請求項２〜７いずれか１項記載の検出液。
【請求項９】
前記緩衝部が、親水性部を有することを特徴とする請求項４〜８いずれか１項記載の検出液。
【請求項１０】
前記緩衝部の前記親水性部がポリエチレングリコール鎖であることを特徴とする請求項９に記載の検出液。
【請求項１１】
前記緩衝部の前記親水性部が糖鎖であることを特徴とする請求項９に記載の検出液。
【請求項１２】
前記緩衝部の前記親水性部が前記第１及び第２のプローブに対して相補鎖を生じさせない塩基配列であることを特徴とする請求項９に記載の検出液。
【請求項１３】
前記特異結合が核酸のハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１〜１２いずれか１項記載の検出液。
【請求項１４】
貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングにおいて、
前記請求項１〜１３いずれか１項記載の検出液を調製する工程（Ａ）と、
前記被検出物質と、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブとが前記特異結合を形成しうる条件で、前記第１の部位と前記第２の部位を有する前記被検出物質を含む被測定試料と前記検出液とを混合する工程（Ｂ）と、
該混合により得られた溶液を用いて、前記標識を検出することにより前記被測定試料中の前記特異結合した前記被検出物質の有無を検出する工程（Ｃ）とを有することを特徴とするバイオセンシング方法。
【請求項１５】
前記工程（Ｃ）において、前記被検出物質の有無の検出を、ゲル電気泳動により実施することを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンシング方法。
【請求項１６】
前記工程（Ｃ）において、前記被検出物質の有無を、散乱光の偏光異方指数により検出することを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンシング方法。
【請求項１７】
前記工程（Ｃ）において、前記被検出物質の有無を、光散乱相関分光法 により検出することを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンシング方法。
【請求項１８】
前記工程（Ｃ）において、前記被検出物質の有無を、貴金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴波長シフトにより検出することを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、貴金属ナノ粒子を用いたバイオセンシングに使用する検出液とその調製方法、更に、その検出液を用いたバイオセンシング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシングは、生体物質の特異的な結合（特異結合）を、光学的又は電気的な信号の変化を用いて検出することにより行われている。光学的な信号の変化を検出するバイオセンシングには、蛍光物質や貴金属ナノ粒子等を標識として用い、ＤＮＡやＲＮＡ，ペプチド核酸、オリゴヌクレオチド等の遺伝物質を検出する方法等がある。【０００３】
蛍光物質による標識は、被検出物質（例えば、ターゲット遺伝子）濃度が低い場合に信号が弱く、高感度検出が困難である。表面増強ラマン（SERS）などの増幅を用いる方法により高感度検出が可能であるが、多くの増幅過程を必要とするとともに、偶然性にも支配されるため、バラツキが大きく、医療診断のような定量測定には不向きである。【０００４】
１９９０年代後半より、特定の配列を有する核酸断片（オリゴヌクレオチド）を検出するバイオセンシングにおいて、一本鎖の核酸同士の塩基配列が相補的（特異的）である場合に、相補性を持つ塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成するハイブリダイゼーション法の標識として、貴金属ナノ粒子を用いる方法が精力的に検討されている（特許文献１〜２、非特許文献１〜４）。かかる方法では、検出する核酸断片と相補鎖を形成する生体物質を表面にブラシ状に担持した貴金属ナノ粒子をプローブとして用いている。【０００５】
例えば、特許文献１，特許文献２には、核酸の配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着した金ナノ粒子をプローブとして用い、このオリゴヌクレオチドが核酸に対してハイブリダイズした結果、金ナノ粒子の局在プラズモン共鳴波長が長波長シフトして得られる金ナノ粒子の呈色の変化を検出する遺伝子診断法が記載されている。【０００６】
しかしながら、これらの方法も、目視による検出であるため検出感度は蛍光法と同等であり検出限界は数十ｎＭレベルにとどまっている。【０００７】
貴金属ナノ粒子を用いたハイブリダイゼーションの有無の検出には、Ｍｉｒｋｉｎらにより進められてきた架橋型凝集反応系と、非特許文献１の筆者であるＭａｅｄａらが進めてきた非架橋型凝集反応系とがある。非特許文献１には、非架橋型凝集反応系において、高濃度の塩（ＮａＣｌ）添加することにより荷電反発を抑制して凝集を迅速化すること、また、検出感度を高めるために、表面プラズモン共鳴センサーを用いる方法が記載されている。【０００８】
更に、Ｍａｅｄａらは、非特許文献２において、非特許文献１に記載の高濃度の塩添加系において、凝集プロセスの迅速化と簡易化、そして貴金属粒子との結合部と反対側の末端基におけるミスマッチを、高感度検出のために、金ナノ粒子のサイズ、ターゲット遺伝子の種類、緩衝水溶液のｐＨ等のファクターを個々に最適化する必要があることを述べている。【０００９】
非特許文献３では、検出感度向上を目的とし、動的光散乱（ＤＬＳ）法により金ナノ粒子の粒子径を測定することにより、ハイブリダイゼーションの有無、すなわち、ターゲット遺伝子の有無を光学的に検出する方法を提唱している。これは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ハイブリダイゼーションにより、その相補鎖を持つ２つの金ナノ粒子が結合し、見かけの粒子径が大きくなることを利用したものであり、著者らは、数ｐＭの検出が可能であると主張している。【００１０】
非特許文献４には、非架橋型凝集反応系において、粒子径の小さな金ナノ粒子の光散乱を感度良く検出可能とするために、共鳴光散乱相関分光（RLSCS）法を用いる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００４−５１５２０８号公報
【特許文献２】特許４３４７０４９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】佐藤保信、前田瑞夫、「ＤＮＡ担持ナノ粒子による遺伝子診断」、ぶんせき、２００８年9月号、ｐ．４６８−４７１
【非特許文献２】Kae Sato et al., 「Rapid Aggregation of Gold Nanoparticles Induced by Non-Cross-Linking DNA Hybridization. 」, J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, p.8102-8103.
【非特許文献３】Qiu Dai et al., 「A One-Step Highly Sensitive Method for DNA Detection Using Dynamic Light Scattering. 」, J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, p.8138-8139.
【非特許文献４】Kanglin Wang et al., 「Single-Molecule Technology for Rapid Detection of DNA Hybridization Based on Resonance Light Scattering of Gold Nanoparticles. 」, ChemBioChem 2007, 8, p.1126-1129.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記貴金属ナノ粒子を標識としたバイオセンシングにおいて、塩基数の比較的多いターゲット遺伝子の検出には、複数のプローブを用いたハイブリダイゼーションにより１つのターゲット遺伝子を検出する方法が好適である。しかしながら、検出したいターゲット遺伝子の長さ（塩基数）は、一般に一定ではなく、上記特許文献及び非特許文献に記載のいずれの方法を適用しても、図１０（特許文献２の図４０）に示されるように、ターゲット遺伝子の種類によって、金ナノ粒子の間隔が異なり、塩基数の多いものについては、ハイブリダイズしても、標識となる金ナノ粒子同士が離れてしまう。例えば、金ナノ粒子径 φ＝３０ｎｍに対しターゲットＤＮＡが３０塩基（約１０ｎｍ）と短い場合は、ハイブリダイゼーションした２つの金ナノ粒子を「一体化した粒子」となるが、通常のウィルスのような長いターゲット遺伝子などを測定する場合、ハイブリダイゼーションした場合にも単独の２つの粒子となる。【００１４】
また、遺伝物質の構造は強固ではないため、測定中に捻れたり、折れ曲がってしまうため、同じターゲット遺伝子を用いた場合でも、金ナノ粒子の間隔は一定となりにくい。【００１５】
従って、金ナノ粒子の間隔の違いにより測定結果が異なるため、上記特許文献及び非特許文献１，２の方法では凝集反応による色の変化があいまいであり、また、非特許文献３，４の方法でも高い測定精度が得られない。非特許文献２では、高濃度の塩添加系においてターゲット遺伝子の種類によって最適化することが記載されているが、高濃度の塩添加系では、凝集の迅速化がなされる一方で、分散性の低下、それに伴う非特異結合による凝集が生じやすく検出感度は低いものとなってしまう。【００１６】
また、アガロースゲル等を用いてゲル電気泳動でハイブリダイゼーションの有無を検出する方法においても同様で、同じ２量体においても見かけの粒子サイズが異なってしまうため、ゲルマトリックス中での移動度に差が生じバンド間の区別が不明瞭となる。【００１７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングにおいて、検出感度及び精度の良好なバイオセンシング方法、及びそれを可能にする検出液を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の検出液は、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングに用いる検出液であって、
被検出物質の第１の部位と特異結合する生体物質を含む第１のプローブが第１の貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブと、
被検出物質の第２の部位と特異結合する生体物質を含む第２のプローブが第２の貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブとが緩衝性水溶液に分散されてなり、
被検出物質の第１の部位及び第２の部位の、これらの部位同士が近接する側の末端と、
第１のプローブ及び第２のプローブの基端とが特異結合するように、
第１のプローブと第２のプローブがそれぞれ、第１の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子に固定されてなることを特徴とするものである。【００１９】
本明細書において、緩衝性水溶液とは、一般に微生物の培養や化学物質、生体物質の保存、分離等に用いられる水溶液を意味し、外的要因（大気中の二酸化炭素など）あるいは内的要因（微生物自身の代謝産物など）によってほとんどｐＨが変動しない水溶液を意味する。【００２０】
第１のプローブ及び第２のプローブの基端とは、各プローブの貴金属ナノ粒子に結合している側の末端を意味するものとする。【００２１】
本発明の検出液の好ましい態様としては、第１のナノ粒子プローブ及び第２のナノ粒子プローブが、表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾が固定されてなり、この両親媒性の表面修飾の貴金属粒子に固定されている側が、疎水性部となっている態様が挙げられる。【００２２】
かかる態様において、表面修飾の第１の貴金属ナノ粒子及び第２の貴金属ナノ粒子に固定されていない側の末端の官能基の帯電状態は、生体物質の帯電状態と同じであることが好ましい。【００２３】
この、表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾が固定されてなる態様では、第１のプローブ及び第２のプローブが、第１の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子に、両親媒性の表面修飾により被検出物質との特異結合が阻害されることを抑止する緩衝部を介して固定されてなる態様がより好ましい。緩衝部は、少なくとも一部に親水性部を有していることが好ましい。【００２４】
表面修飾、及び、緩衝部における親水性部は、ポリエチレングリコール鎖又は糖鎖であることが好ましく、第１及び第２のプローブに対して相補鎖を生じさせない塩基配列を有することが好ましい。【００２５】
また、両親媒性の表面修飾は、水溶性を有する自己組織化単分子膜であることが好ましい。【００２６】
本発明は、上記特異結合が、核酸のハイブリダイゼーションである場合に好ましく適用することができる。【００２７】
本発明のバイオセンシング方法は、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングにおいて、
上記本発明の検出液を調製する工程（Ａ）と、
被検出物質と、第１のプローブ及び第２のプローブとが特異結合を形成しうる条件で、第１の部位と第２の部位を有する被検出物質を含む被測定試料と検出液とを混合する工程（Ｂ）と、
この混合により得られた溶液を用いて、貴金属ナノ粒子の標識を検出することにより被測定試料中の特異結合した被検出物質の有無を検出する工程（Ｃ）とを有するものである。【００２８】
工程（Ｃ）において、被検出物質の有無の検出は、ゲル電気泳動、散乱光の偏光異方指数により検出する方法、貴金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴波長シフトにより検出する方法、又は光散乱相関分光法により実施することが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の検出液は、被検出物質の第１の部位と特異結合する生体物質を含む第１のプローブが第１の貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブと、被検出物質の第２の部位と特異結合する生体物質を含む第２のプローブが第２の貴金属ナノ粒子の表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブとが緩衝性水溶液に分散されてなり、
被検出物質の第１の部位及び第２の部位の、これらの部位同士が近接する側の末端と、第１のプローブ及び第２のプローブの基端とが特異結合するように、第１のプローブと第２のプローブがそれぞれ、第１の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子に固定されてなるものである。かかる検出液によれば、第1の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子とが近接するように第1のプローブと第２のプローブが被検出物質に特異結合するため、第1の貴金属ナノ粒子と第2の貴金属ナノ粒子が個々の粒子として検出されることを抑制し、また、被検出物質の長さ（塩基数）によって生ずる、金ナノ粒子の間隔の違いを最小限にすることができる。従って、本発明によれば、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングにおいて、検出感度及び精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。【００３０】
また、第１のナノ粒子プローブ及び第２のナノ粒子プローブが、表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾が表面に固定されてなり、この両親媒性の表面修飾の貴金属粒子に固定されている側が、疎水性部となっている態様では、貴金属ナノ粒子表面付近が疎水性であるため、プローブが貴金属ナノ粒子表面から離れて、貴金属ナノ粒子表面付近においてプローブが絡まることにより生じる非特異的な凝集を抑制することができる。従って、特異結合反応効率が高く、より検出精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。【００３１】
更に、表面修飾の貴金属ナノ粒子に固定されていない側の末端の官能基（末端基）の帯電状態が、緩衝性水溶液中において、第１及び第２のプローブの帯電状態と同じである態様では、表面修飾の末端基と第１及び第２のプローブとが反発しあうことから、より効果的な、非特異的な凝集抑制効果及び特異結合の反応効率向上効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】本発明の検出液の構成を示す概略断面模式図
【図１Ｂ】本発明の検出液に含まれるナノ粒子プローブの第１実施形態の構成を示す模式図
【図１Ｃ】本発明の検出液に含まれるナノ粒子プローブの第２実施形態の構成を示す模式図
【図２Ａ】本発明の検出液に含まれる貴金属ナノ粒子の好適な態様を示す概略断面模式図。
【図２Ｂ】図２Ａの貴金属ナノ粒子表面の一実施形態を示す拡大概略模式図
【図３Ａ】本発明のバイオセンシング方法の工程（Ａ）の好適な態様を示す概略断面模式図
【図３Ｂ】本発明のバイオセンシング方法の工程（Ｂ）の好適な態様を示す概略断面模式図
【図３Ｃ】本発明のバイオセンシング方法の工程（Ｂ）の別の好適な態様を示す概略断面模式図
【図４Ａ】工程（Ｃ）の検出をゲル電気泳動法により実施した場合の検出結果の一例を示す模式図
【図４Ｂ】光偏光計測による検出に用いる装置の概略構成模式図
【図５】金ナノ粒子二量体による散乱光の偏光回転の説明図
【図６】図５の装置を用いて得られた計測結果の一例を示す図
【図７】異方指数を用いた検出例 (粒子形状と異方指数ＡＩとの相関)を示す図
【図８】光散乱相関分光法により得られた単量体及び二量体の自己相関関数
【図９】光散乱相関分光法による検出例（単体と二量体の減衰時間）
【図１０】特許文献２の図４０
【発明を実施するための形態】
【００３３】
「検出液」
図面を参照して本発明にかかる一実施形態の検出液及びそれを用いたバイオセンシング方法について説明する。図１Ａは本実施形態の検出液１の構成を示す概略断面模式図である。図２Ａは、検出液１に含まれる第１及び第２の貴金属ナノ粒子プローブＰ１、Ｐ２の好適な態様を示す概略断面模式図，図２Ｂは、図２Ａの貴金属ナノ粒子表面の拡大概略模式図である。本明細書の概略図及び模式図では、視認しやすくするため各部の縮尺は適宜変更して示してある。
【００３４】
貴金属ナノ粒子を標識として用いたバイオセンシングでは、塩基数の比較的多いターゲット遺伝子の検出に好適である、複数のプローブのハイブリダイゼーションによる検出方法においても、従来、貴金属ナノ粒子側に結合されているプローブ末端（基端）が、被検出物質の両端に特異結合される構成としている。
【００３５】
「背景技術」の項においても述べたように、本発明者は、従来の貴金属ナノ粒子プローブの構成では、ターゲット遺伝子の塩基数（長さ）によって、金ナノ粒子の間隔にばらつきを生じること、また、塩基数の多いターゲット遺伝子の検出では、第1の貴金属ナノ粒子と第２の貴金属ナノ粒子が個々の粒子として検出されやすいことが、測定精度や検出感度の低下の要因であることを見出し、本発明を完成させた。
【００３６】
生体物質の特異結合には、抗原―抗体結合、ＤＮＡやＲＮＡ、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid、ペプチド核酸）等の核酸の相補的結合（ハイブリダイゼーション）、ビオチンーアビジン結合、抗原―アプタマー結合、糖鎖―レクチン結合等があり、本発明はいずれの特異結合にも適用可能である。
【００３７】
また、本発明において、貴金属ナノ粒子は特に制限されず、使用する光の波長において呈色特性の良好な貴金属を選択することが好ましい。中でも金は、自然光において視認しやすい赤色の呈色を示すことから好ましく利用することができる。
【００３８】
以下、貴金属ナノ粒子が金ナノ粒子であり、親水性の生体物質（プローブ）が核酸断片であり、特異結合が核酸の相補的結合Ｈ(ハイブリダイゼーション)である場合を例に説明する。
【００３９】
図１Ａに示されるように、検出液１は、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングに用いる検出液であって、図１Ｂに示される被検出物質５０の第１の部位５０Ａと特異結合する生体物質を含む第１のプローブ２０Ａが第１の貴金属ナノ粒子１０Ａの表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブＰ１と、
被検出物質５０の第２の部位５０Ｂと特異結合する生体物質を含む第２のプローブ２０Ｂが第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂの表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブＰ２とが緩衝性水溶液４０に分散されてなるものである。
【００４０】
第１及び第２のナノ粒子プローブＰ１，Ｐ２は、図１Ｂ又は図１Ｃに示されるように、被検出物質５０の第１の部位５０Ａ及び第２の部位５０Ｂの、これらの部位同士が近接する側の末端５０Ａｔ，５０Ｂｔと、
第１のプローブ２０Ａ及び第２のプローブ２０Ｂの基端２０Ａｂ，２０Ｂｂとが特異結合するように、
第１のプローブ２０Ａと第２のプローブ２０Ｂがそれぞれ、第１の貴金属ナノ粒子１０Ａと第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂに固定されてなる。
【００４１】
また、本実施形態では、第１のナノ粒子プローブＰ１及び第２のナノ粒子プローブＰ２において、貴金属ナノ粒子１０Ａ，１０Ｂ表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾３０が表面に固定されてなる。
【００４２】
図１Ｂに示されるナノ粒子プローブＰ１及びＰ２の第１実施形態は、被検出物質５０のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２が特異結合する第１の部位５０Ａと第２の部位５０Ｂとが隣接している態様である。ナノ粒子プローブＰ１及びＰ２は、かかる態様に限定されるものではなく、図１Ｃに示されるように、第１の部位５０Ａと第２の部位５０Ｂとは隣接しておらず、間にいくつかの塩基配列を備えてなる態様であってもよい（第２実施形態）。
【００４３】
更に、図１Ｂ，図１Ｃでは、被検出物質５０の両末端に特異結合する第１のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２が特異結合する態様について示してあるが、被検出物質５０における特異結合部位については特に制限されない。
【００４４】
また、図２Ａに示されるように、本実施形態では、緩衝性水溶液４０中において、第１及び第２のナノ粒子プローブＰ１及びＰ２は、両親媒性の表面修飾３０の貴金属ナノ粒子１０Ａ，１０Ｂに固定されていない側の末端が負の電荷を有し、第１及び第２のプローブ２０Ａ，２０Ｂも負の電荷を有している。
【００４５】
両親媒性の表面修飾３０は、図２Ｂに示されるように、金ナノ粒子１０Ａ，１０Ｂに固定されている疎水性部３１と親水性部３２とを有している。図２Ｂでは、基端３０ａの官能基がチオール基であるアルキル基（炭素数１１）からなる疎水性部３１と、末端基３０ｅがカルボキシル基であるポリエチレングリコール（炭素数６）からなる親水性部３２とがエステル結合してなる表面修飾３０を例に図示してある。なお、図２Ｂでは、カルボキシル基として示してあるが、緩衝性水溶液中ではＣＯＯ−として存在する。
【００４６】
また、図２Ｂにおいては、第１のプローブ２０Ａ及び第２のプローブ２０Ｂが、第１の金ナノ粒子１０Ａと第２の金ナノ粒子１０Ｂに、両親媒性の表面修飾３０により被検出物質５０との特異結合が阻害されることを抑止する緩衝部２１を介して固定されてなり、金ナノ粒子１０Ａ（１０Ｂ）に固定された表面修飾３０の基端３０ａ及び緩衝部２１の基端２１ａの双方がチオール基である態様において、既に金と結合された状態を示してある。緩衝部２１と結合しているそれぞれプローブの基端２０Ａｂ（２０Ｂｂ）が、被検出物質５０の第１の部位５０Ａ及び第２の部位５０Ｂの、これらの部位同士が近接する側の末端５０Ａｔ，５０Ｂｔと特異結合する。
【００４７】
金ナノ粒子１０の大きさは、光の照射により局在プラズモンを誘起可能な大きさであれば特に制限されず、個々の粒径は光の波長の半分以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることがより好ましい。さらに光学的検出を行う場合、粒子径は、３０ｎｍ以上であることが好ましい。
【００４８】
検出液１中の金ナノ粒子１０の濃度は、感度の良い検出が可能であれば特に制限されないが、検出したい非検出物質の濃度（定量領域）に応じて、適宜、０.１ｐｍｏｌ／ｌ以上１００００ ｐｍｏｌ／ｌ以下の範囲に調整することが好ましい。
【００４９】
図２Ｂでは、第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）の基端２０Ａｂ（２０Ｂｂ）側に緩衝部２１を備え、緩衝部２１にチオール基を備えて金ナノ粒子１０に固定された態様について図示してあるが、金ナノ粒子１０と結合する側の官能基は、金ナノ粒子１０の金属と結合可能な官能基であれば特に制限されず、チオール基以外では、ジスルフィド基、メルカプト基等が挙げられる。これらの官能基の固定方法としては、特に制限されず既存の技術を利用することができる。
【００５０】
本発明者は、金ナノ粒子１０の粒径によっては立体障害により、近接させた状態で相補的結合Ｈ（ハイブリダイゼーション）を生じさせる際、金ナノ粒子１０に固定された側のプローブの基端（２０Ａｂ、２０Ｂｂ）の１０〜２０塩基程度がハイブリダイゼーションに寄与できず、これが、被検出物質５０とのハイブリダイゼーション効率の低下、および検出限界の悪化を招くことがあることを見出した。
【００５１】
立体障害を少なくするためには、粒径は小さい方が好ましいが、光の波長以下の粒径の金ナノ粒子の散乱光量、即ち光学的検出における信号光量は、レイリー散乱の法則により、粒子径の６乗に比例して急激に小さくなるため、粒径が小さすぎると信号光がノイズに埋もれてしまい、光学的な検出感度が大幅に悪化する（非特許文献３を参照）。従って、光学的検出を行う場合、金ナノ粒子１０（１０Ａ，１０Ｂ）の個々の粒径は、３０ｎｍ以上であることが好ましい。
【００５２】
一方、金ナノ粒子１０の粒径が充分な光学信号量を得られる粒径（例えば、φ≧３０ｎｍ）である場合、立体障害が問題になるだけでなく、プローブ２０に対して粒子の表面積が大きくなるため金ナノ粒子１０の表面にプローブ２０が吸着しやすく、反応効率が大幅に低下するとともに、複数のプローブ同士が絡み合うことによる非特異反応により検出感度が悪化してしまう問題を生じる。
【００５３】
本発明者らは、本実施形態に示すように、金ナノ粒子１０の表面に両親媒性の表面修飾３０を備えることにより、プローブ２０を表面に吸着させずにブラシ状に起立させ、更にプローブ２０を、緩衝部２１を介して金ナノ粒子１０の表面に固定することにより、両親媒性の表面修飾３０により被検出物質５０との特異結合が阻害されることを抑止して、非特異反応及び立体障害による検出感度及び反応効率の悪化を抑制することに成功した。
【００５４】
緩衝部２１は、被検出物質５０と相補的なプローブ部分を表面修飾（３０）の外側の金ナノ粒子の立体障害を受けにくい場所に配置し、被検出物質５０との特異結合が阻害されることを抑止することを可能にするものであるので、表面修飾３０の金ナノ粒子１０に接する疎水性部３１に埋もれないように、少なくとも一部に親水性部を有することが好ましい。
【００５５】
かかる親水性部としては、緩衝部２１は、少なくとも一部に親水性部を有することが好ましい。親水性部としては、緩衝性水溶液中への分散性（水溶性）を良好にしうるものであれば特に制限されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、糖鎖、親水性ポリエステル、プローブに対して相補鎖を生じさせない塩基配列（例えば、Ｔ；チミンの繰返し・羅列）等が挙げられる。
【００５６】
また、緩衝部２１の長さは、表面修飾３０の厚みよりも長いことが好ましく、緩衝部２１と結合する第１及び第２のプローブ２０（Ａ，Ｂ）の基端２０Ａｂ（２０Ｂｂ）が、表面修飾３０内に埋もれない長さであることがより好ましい。緩衝部２１は、金ナノ粒子１０Ａ（１０Ｂ）の粒径およびプローブ長を考慮し、適宜材料設計することが好ましい。
【００５７】
検出液１において、表面修飾３０は、第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）が、金ナノ粒子１０の表面１０ｓ付近で絡まり合うことにより生じる非特異結合の検出を抑制するためのものであるので、第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）の長さよりも１分子の長さが短いものであることが好ましい。
【００５８】
第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）が２０塩基のオリゴＤＮＡである場合は、その鎖長は７ｎｍ前後である。これに対して良好な効果が得られる表面修飾３０の厚み（表面１０ｓから末端までの距離）は、３．０ｎｍ程度が好ましい。
【００５９】
表面修飾３０において、疎水性部３１は、基端３０ａが金ナノ粒子１０と結合可能な官能基であるアルキル基であることが好ましい。基端３０ａの官能基としては、緩衝部２１と同様、チオール類やジスルフィド類等の硫黄化合物が挙げられる。
【００６０】
疎水性部３１の金ナノ粒子１０の固定側と反対側の末端には、親水性部３２が備えられている。親水性部３２は、疎水性部３１で覆われることにより緩衝性水溶液４０における分散性の低下を改善するものである。
【００６１】
疎水性の大きい表面修飾３０および疎水性部３１にて覆われた金ナノ粒子は、水溶性が低くなっているため、緩衝性水溶液中に良好に分散させるためには、アルコール等の相溶性の高い溶媒を一旦介して分散させる必要があるが、これにより、核酸等の生体物質を損傷して変性し、非特異の凝集が増えて良好なセンシングを行うことが難しくなる可能性が高い。非特異的な凝集の増加は特異結合反応の失活をも引き起こし、該反応の反応効率を低下させる。特に、疎水性部のアルキル鎖の炭素数が７以上である場合には疎水性が高いため水溶性（分散性）が非常に低くなる。
【００６２】
本発明者は、疎水性部３１の金ナノ粒子１０の固定側（基端）と反対側の末端に、親水性部３２を備えた表面修飾３０とすることにより、上記第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）同士の絡まりの抑制効果を維持しつつ、緩衝性水溶液中への分散性が良く生体物質へのダメージが殆どない検出液となることを見出している。
【００６３】
本実施形態によれば、金ナノ粒子表面１０ｓ付近に絡み合って存在する生体物質を該表面から剥がし、特異反応効率を高め、非特異結合による凝集を抑制することができる。
【００６４】
親水性部３２としては、緩衝性水溶液中への分散性（水溶性）を良好にしうるものであれば特に制限されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、糖鎖、親水性ポリエステル、プローブに対して相補鎖を生じさせない塩基配列（例えば、Ｔ；チミンの繰返し・羅列）等が挙げられ、水溶性を付与し、且つ、表面修飾３０が自己組織化単分子膜となり得るものが好ましい。
【００６５】
親水性部３２の末端基３０ｅは特に制限されず、ヒドロキシル基、カルボシキル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。末端基３０ｅがヒドロキシル基等の酸性官能基ではない官能基であっても、金ナノ粒子表面１０ｓ付近に絡み合って存在する生体物質を剥がすことはできるが、第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）を該表面から立ち上がった状態でブラシ状に固定するには至らない。
【００６６】
図２Ａ，Ｂに示されるように、親水性部３２の末端基３０ｅが、核酸断片２０の緩衝性水溶液中での帯電状態と同じである場合、表面修飾３０の表面（３０ｅ）と核酸断片２０とが反発しあい、核酸断片２０がより金ナノ粒子表面１０ｓから遠ざかるべく立ち上がるため、ブラシ状に固定される。その結果、同一配列のみの非特異凝集をより効果的に抑制することができる。
【００６７】
第１及び第２のプローブ２０Ａ（２０Ｂ）の緩衝性水溶液 中での帯電状態は負であることから、末端基３０ｅは緩衝性水溶液中において負イオンになるイオン化傾向が高い官能基、すなわち、酸性官能基であることが好ましい。ＰＥＧの場合はヒドロキシル基であり、酸性官能基ではないことから、図示されるカルボキシル基、やスルホン酸基等に置換して用いることが好ましい。これらの官能基の固定方法としては、特に制限されず既存の技術を利用することができる。
【００６８】
表面修飾３０は、上記のように、金ナノ粒子１０へ固定する側の末端にチオール類やジスルフィド類等の硫黄化合物の官能基を備えている。これらの硫黄化合物の官能基は、金等の貴金属表面上に自発的に吸着し、アルカンチオール類やアルカンジスルフィド類は、単分子サイズの超薄膜（単分子膜）を与える。また、その集合体は粒子の結晶状態や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化単分子膜と呼ばれており、貴金属表面への固定が容易であり好ましい。
【００６９】
好適な表面修飾３０としては、20-(11-メルカプトウンデカンイルオキシ)-3,6,9,12,15,18-ヘキサオキサエイコサン酸(英語名： 20-(11-Mercaptoundecanyloxy)-3,6,9,12,15,18-hexaoxaeicosanoic acid）の自己組織化単分子膜が挙げられる。この単分子の長さは２．５ｎｍ〜３．０ｎｍ程度であり、そのうち疎水性部３１長が約１．２ｎｍである。
【００７０】
表面修飾３０の検出液１中の濃度（単分子の濃度）は、感度の良い検出が可能であれば特に制限されないが、１０ｎｍｏｌ／ｌ以上１０００ｎｍｏｌ／ｌ以下の範囲が好ましく、貴金属ナノ粒子の材質や粒子径、および生体物質の種類によって最適化することが好ましい。
【００７１】
以上述べたように、検出液１は、被検出物質５０の第１の部位５０Ａと特異結合する生体物質を含む第１のプローブ２０Ａが第１の貴金属ナノ粒子１０Ａの表面に固定されてなる第１のナノ粒子プローブＰ１と、被検出物質の第２の部位５０Ｂと特異結合する生体物質を含む第２のプローブ２０Ｂが第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂの表面に固定されてなる第２のナノ粒子プローブＰ２とが緩衝性水溶液４０に分散されてなり、
被検出物質の第１の部位５０Ａ及び第２の部位５０Ｂの、これらの部位同士が近接する側の末端５０Ａｔ,５０Ｂｔと、第１のプローブ及び第２のプローブの基端２０Ａｂ，２０Ｂｂとが特異結合するように、第１のプローブ２０Ａと第２のプローブ２０Ｂがそれぞれ、第１の貴金属ナノ粒子１０Ａと第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂに固定されてなるものである。かかる構成によれば、第1の貴金属ナノ粒子１０Ａと第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂとが近接するように第1のプローブ２０Ａと第２のプローブ２０Ｂが被検出物質に特異結合するため、第1の貴金属ナノ粒子１０Ａと第２の貴金属ナノ粒子１０Ｂが個々の粒子として検出されることを抑制し、また、被検出物質の長さ（塩基数）によって生ずる、金ナノ粒子の間隔の違いを最小限にすることができる。
【００７２】
従って、検出液１を用いることにより、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなるターゲット遺伝子を検出するバイオセンシングにおいて、検出感度及び精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。
【００７３】
「バイオセンシング方法」
図面を参照して、本発明にかかる一実施形態のバイオセンシング方法について説明する。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃは本発明のバイオセンシング方法の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）の好適な態様を示す概略模式図である。
【００７４】
本発明のバイオセンシング方法は、貴金属ナノ粒子を標識として、被測定試料中に含まれる、生体物質からなる被検出物質を検出するバイオセンシングにおいて、
上記本発明の検出液を調製する工程（Ａ）と、
被検出物質と、第１のプローブ及び第２のプローブとが特異結合を形成しうる条件で、第１の部位と第２の部位を有する被検出物質を含む被測定試料と検出液とを混合する工程（Ｂ）と、
この混合により得られた溶液を用いて、貴金属ナノ粒子の標識を検出することにより被測定試料中の特異結合した被検出物質の有無を検出する工程（Ｃ）とを有するものである。
【００７５】
ここでも、被検出物質が核酸断片と相補的に結合する核酸断片５０であり、貴金属ナノ粒子１０が金ナノ粒子である場合を例に説明する。
【００７６】
＜工程（Ａ）＞
図３Ａに示されるように、工程（Ａ）では上記本発明の検出液１を調製する。検出液１には、第１のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２とが含まれている。従って、まず、それぞれのナノ粒子プローブを調製し、それらを混合することにより検出液１を得る。
【００７７】
まず、ビーカー等の容器に緩衝性水溶液４０を所定量注入し、その中に、複数の貴金属ナノ粒子１０Ａを添加する（Ａ−１）。この工程は、非加熱にて実施してよい。
【００７８】
次に、第１のプローブ２０Ａを金ナノ粒子１０Ａの表面に固定する（Ａ−２）。このとき、被検出物質５０の第１の部位５０Ａの、第２の部位５０Ｂと近接する側の末端５０Ａｔと、第１のプローブの金ナノ粒子１０Ａに結合される側の基端２０Ａｂとが特異結合するようにするために、第１のプローブの基端２０Ａｂを官能化しておく。基端２０Ａｂの官能基については既に述べたとおりであり、第1のプローブ２０Ａを、緩衝部２１を介して金ナノ粒子１０Ａに固定する場合は、緩衝部２１の金ナノ粒子１０Ａに固定される側を官能化しておく。官能化の方法は公知の方法を用いてよい。
【００７９】
次に、第１のプローブ２０Ａが固定された金ナノ粒子１０Ａの表面に、疎水性部３１と親水性部３２とを有する両親媒性の表面修飾３０を、疎水性部３１側の基端３０ａが金ナノ粒子１０の表面１０ｓに固定されるように固定して、第１のナノ粒子プローブＰ１を得る（Ａ−３）。
【００８０】
金ナノ粒子１０への表面修飾３０の固定温度及びその固定に要する反応時間は、単分子膜の材料に応じて適宜設定すればよく、20-(11-メルカプトウンデカンイルオキシ)-3,6,9,12,15,18-ヘキサオキサエイコサン酸の場合は、５０℃前後の温度にて３時間程反応させることにより形成することができる。
【００８１】
次に、被検出物質５０の第２の部位５０Ｂと特異結合するようにする以外は第１のナノ粒子プローブＰ１と同様にして第２のナノ粒子プローブＰ２を調製する。
【００８２】
最後に、第１のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２とを混合して、緩衝性水溶液４０中に第１のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２が分散されてなる検出液１を得る（Ａ−４）。
【００８３】
＜工程（Ｂ）＞
工程（Ｂ）は、検出液１中に被測定試料を混合して、被測定試料中の被検出物質５０と、検出液１中の第１及び第２のプローブ２０Ａ，２０Ｂとの相補的結合Ｈの形成（特異結合）反応を実施する工程である。
【００８４】
核酸同士の相補鎖の形成（ハイブリダイゼーション）は、核酸断片（一本鎖）が一本鎖として存在できる温度（融解温度）よりも若干低い温度条件で形成されることが知られている。工程（Ｂ）において、特異結合反応（ハイブリダイゼーション）の条件は、相補鎖の形成へ悪影響を及ぼす核酸断片の損傷及び、各核酸断片の金ナノ粒子への固定態様の悪化がない範囲で適宜設定することができる。
【００８５】
図３Ｂ，図３Ｃには、検出液１中に被検出物質５０を含む被測定資料を混合した際の、検出系の一例を示してある。図３Ｂは、図１Ｂに示される第１実施形態のナノ粒子プローブＰ１及びＰ２を用いた場合の検出系であり、被検出物質５０のナノ粒子プローブＰ１と第２のナノ粒子プローブＰ２が特異結合する第１の部位５０Ａと第２の部位５０Ｂとが隣接している。図３Ｃは、図１Ｃに示される第２実施形態のナノ粒子プローブＰ１，Ｐ２を用いた場合の検出系であり、第１の部位５０Ａと第２の部位５０Ｂとは隣接しておらず、間にいくつかの塩基配列を備えてなる態様である。
【００８６】
図３Ｂ，図３Ｃに示されるように、本発明の検出液１によれば、被検出物質の第１の部位５０Ａ及び第２の部位５０Ｂの、これらの部位同士が近接する側の末端５０Ａｔ,５０Ｂｔと、第１のプローブ及び第２のプローブの基端２０Ａｂ，２０Ｂｂとが特異結合するため、第１の金ナノ粒子１０Ａと第２の金ナノ粒子１０Ｂとが最も近接する形で相補鎖が形成される。
【００８７】
従って、相補鎖の形成により最も２量体に近い形で２つの金ナノ粒子が存在させることが可能となり、後工程（Ｃ）において良好な検出感度及び検出精度にて、相補鎖の形成を検出することができる。
【００８８】
図３Ｂに示される系では、後工程（Ｃ）において、相補鎖の形成時には２量体として略同じ大きさの粒子として検出することが可能となり、また図３Ｃに示される系においても、最も２量体に近い形での検出を可能にする。従来の検出液では、塩基数の長い場合に、相補鎖の形成後の第１の金ナノ粒子１０Ａと第２の金ナノ粒子１０Ｂとの距離が大きすぎて検出感度及び検出精度が大きく低下したが、本発明によれば、第１の金ナノ粒子１０Ａと第２の金ナノ粒子１０Ｂが個々の粒子として検出されることを抑制し、その低下を最小限にすることができる。
【００８９】
また、上記検出液１としては、第１のナノ粒子プローブＰ１及び第２のナノ粒子プローブＰ２が、表面に、疎水性部３１と親水性部３２とを有する両親媒性の表面修飾３０が表面に固定されてなり、この両親媒性の表面修飾３０の貴金属ナノ粒子１０Ａ，１０Ｂに固定されている側が、疎水性部３１となっている態様について説明した。かかる態様においては、貴金属ナノ粒子表面付近が疎水性であるため、プローブが貴金属ナノ粒子表面から離れて、貴金属ナノ粒子表面付近においてプローブが絡まることにより生じる非特異的な凝集を抑制することができる。従って、特異結合反応効率が高く、より検出精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。
【００９０】
更に、上記では、表面修飾３０の貴金属ナノ粒子に固定されていない側の末端３０ｅの官能基の帯電状態が、緩衝性水溶液４０中において、第１及び第２のプローブ２０Ａ，２０Ｂの末端の帯電状態と同じである態様とした。かかる態様では、表面修飾３０の末端基３０ｅと第１及び第２のプローブ２０Ａ，２０Ｂとが反発しあうことから、より効果的な、非特異的な凝集抑制効果及び特異結合の反応効率向上効果を得ることができる。
【００９１】
＜工程（Ｃ）＞
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）において混合された混合溶液を用いて、金ナノ粒子標識を検出することにより相補鎖の形成（特異結合）Ｈを検出し、被測定試料中の被検出物質５０の有無を検出する工程である。
【００９２】
工程（Ｃ）における検出方法は特に制限されず、ゲル電気泳動、散乱光の偏光異方指数により検出する方法、貴金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴波長シフトにより検出する方法、又は光散乱相関分光法により実施することが好ましい。
【００９３】
図４Ａは、被検出物質５０の有無の検出を、ゲル電気泳動により実施する態様について、ゲル電気泳動装置１００の概略構成と、バンドＤの検出例を示す上面模式図を示したものである。
【００９４】
ゲル電気泳動装置１００は、容器内にゲルマトリックス１０２が設置されてなり、検出する試料を分注するウェル１０１と電圧印加手段とを備えている。
【００９５】
本実施形態では、工程（Ｂ）にて調製した混合溶液をウェル１０１に分注し、ウェル１０１側がマイナスとなるように電圧を印加して電気泳動を実施する。電圧印加の際の方向は被検出物質の帯電状態によって決定する。
【００９６】
電気泳動では、ゲルマトリックス中を核酸断片又は核酸相補鎖が移動する際、その分子量よって移動度が変化するため、重いもの、すなわち相補鎖を形成しているものほど移動量が少なく手前側（ウェル側）となり、一本鎖はより遠くまで移動するため、一定時間電圧を印加した後に金ナノ粒子１０にプラズモンを誘起可能な波長の光を含む光を照射することにより、赤色に呈色したバンドＤとなって特異結合（ハイブリダイゼーション）の有無、すなわち、被検出物質の有無を検出することができる。
【００９７】
バンドＤにおける各バンドの同定は、バンドを切り出してＴＥＭ観察することにより実施することができる。より移動度の大きかった最下流のバンドでは相補鎖が形成されていない１個の金ナノ粒子１０が観察され、上流側に行くにつれ、金ナノ粒子１０が２個、３個結合された、すなわち相補鎖の形成が確認される。
【００９８】
ゲル電気泳動による検出は、比較的高濃度の検体が必要となるため、微量な検体の検出には、より高感度な検出方法により検出する必要がある。本発明者らは、図４Ｂに概略構成が示される光学異方性検出装置２００を用い、略等方性の貴金属ナノ粒子がハイブリダイズされて二量体となることにより出現する異方性を検出することによってハイブリダイゼーションの有無を検出する方法により、高感度な検出が可能となることを見出した。
【００９９】
光学異方性検出装置２００は、試料（混合溶液）を設置する透明の試料台２１０と、レーザ２３０と、ビームスプリッター２２１と対物レンズ２２２とからなる照射受光光学系２２０と、λ／２板２４０と、Ｐ偏光とＳ偏光に分離する偏光ビームスプリッタ２５０と、各偏光をそれぞれ検出するフォトダイオード２６１，２６２と、検出信号を表示するオシロスコープ２７０とから構成されている。
【０１００】
光学異方性検出装置２００による検出原理を、図５を参照して説明する。図５に示されるように、検体の含まれる試料内に直線偏光Ｅ０が入射されると、等方性の粒子に照射された直線偏光Ｅ０により生じる散乱光は直線偏光Ｅ０と略同様の偏光面を有している。一方、異方性を有する（Ｐlong≠Ｐshort）二量体等の多量体に照射された直線偏光Ｅ０により生じる散乱光は、長軸（Ｐlong方向）方向と短軸方向（Ｐshort方向）とで誘起される双極子モーメントが異なることに起因して偏光回転を生じる。この現象を利用し、偏光面の回転の有無を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【０１０１】
具体的には、倒立顕微鏡（例えば、Ｎｉｋｏｎ社製）等を用いて図４Ｂに示される検出装置を構成して測定を行う。まず、半導体レーザ２３０を対物レンズ２２２にて試料台２１０上の試料Ｓ内に集光して微小スポットを形成し、微小スポットをブラウン運動により回転しながら単量体や二量体粒子が通過することにより生じる散乱光を対物レンズ２２２にて集光し、集光された光を偏光ビームスプリッタ２５０で直交する偏光成分に分離する。分離された散乱光をそれぞれフォトダイオード２６１，２６２にて受光してオシロスコープ２７０にその強度の時間トレースを表示させ、それを下記式（１）で表される偏光異方指数ＡＩの時間トレースと照合することにより、試料内の貴金属ナノ粒子の光学異方性を定量化してハイブリダイゼーションの有無を検出する。
【０１０２】
微小スポットを通過する際、単量体や二量体の粒子は充分な回数回転するので、光の偏光方向に対してあらゆる配置をとることができる。従って、偏光異方指数ＡＩの最大値に着目し、該ＡＩ値を与える時間における各偏光強度及びその位相のずれから、二量体の有無、すなわちハイブリダイゼーションを検出する。
【０１０３】
図６に、二量体の存在している場合の上記方法による検出結果の一例を示す。図６上図は、オシロスコープにて検出された各偏光強度の時間トレース、下図はＡＩ値の時間変化を示しており、両図の時間軸は一致している。
【０１０４】
図６下図において、ＡＩの最大値を破線で囲んである。そのピークの時間における上図のスペクトルでは、ｘ方向の強度Ｉｘが凸部、Ｉｙが凹部となっている（ｘ方向の偏向強度が大きいとｙ方向の偏向強度が小さくなっている）ことが示されている。これは、二量体が存在していると、その回転により偏光方向も追随して回転することから、位相が逆転することによるものである。
ＡＩ＝（Ｉｘ−Ｉｙ）／（Ｉｘ＋Ｉｙ）      ・・・  （１）
（Ｉｘはｘ方向の散乱光強度，Ｉｙはｘ方向に直交する散乱光強度，ｘ方向は入射光の偏光方向である）
【０１０５】
実際の単量体と二量体に上記方法による各偏光強度の測定を実施し、偏光異方指数ＡＩを計算した結果を図７に示す。
【０１０６】
図７に示されるように、異方指数ＡＩ＝１．３を境に、単量体と二量体とを明確に区別することができる。
【０１０７】
微量な検体の検出は、上記の方法以外に、蛍光相関分光法における蛍光の代わりに、貴金属ナノ粒子のプラズモン共鳴による強い散乱光を用いた光散乱相関分光法により、貴金属ナノ粒子の試料液中での回転運動の時定数から検出することも可能である。
【０１０８】
光散乱相関分光法により得られた単量体及び二量体の自己相関関数を図８（左側は単量体（単体）、右側は二量体）に示す。二量体の回転拡散速度は単量体の約４倍程度であることが理論的に予測されており、図８に示される自己相関関数の減衰時間の差はその差を反映したものと考えられる。
【０１０９】
実際の単量体と二量体に光散乱相関分光法による各偏光強度の測定を実施した結果を図９に示す。図９に示されるように、異方指数を用いた方法に比して単量体と二量体との境界は不明確ではあるが、単量体と二量体とを区別することができる。
【０１１０】
更に、検出液１及び本発明のバイオセンシング方法は、工程（Ｃ）において、被検出物質５０の有無を、貴金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴波長シフトにより検出する態様にも好適である。
【０１１１】
本発明のバイオセンシング方法は、上記本発明の検出液を用いてセンシングを行うものであるので、本発明の検出液と同様の効果を奏する。
【０１１２】
（設計変更）
上記実施形態では、より検出感度及び検出精度が良好となる態様である、第１のナノ粒子プローブ及び第２のナノ粒子プローブが、表面に、疎水性部と親水性部とを有する両親媒性の表面修飾が表面に固定されてなる態様について説明したが、かかる表面修飾を備えていない態様であっても、被検出物質の長さ（塩基数）によって、金ナノ粒子の間隔の違いを最小限にすることができ、検出感度及び精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。
【０１１３】
更に、上記実施形態では、緩衝部を備えた構成について説明したが、緩衝部を備えていない態様であっても、被検出物質の長さ（塩基数）によって、金ナノ粒子の間隔の違いを最小限にすることができ、検出感度及び精度の良好なバイオセンシングを実施することができる。
【０１１４】
また、上記実施形態では、被検出物質が核酸断片であり、特異結合が核酸のハイブリダイゼーションである場合を例に説明したが、本発明はその構成に限定されるものではなく、既に述べたような、抗原抗体結合、アビジンービオチン結合等、様々な特異結合の有無のセンシングに適用することができる。
【０１１５】
被検出物質の末端基が酸性である場合について説明したが、塩基性である場合は、表面修飾３０の末端基３０ｅとしては、例えば、アミノ基、第４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジウム基等が挙げられる。
【図１Ａ】
2015159535.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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