(57)【要約】本発明は、下記工程（１）〜（３）を含む、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法を提供する。  斯かる課題を解決する手段として、下記の発明を提供する：（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞の細胞質におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を含む、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項２】
陽性細胞が、染色強度に基づき２＋又は３＋と判定された細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
結腸直腸癌患者が、標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であって、当該患者が、下記工程（１）〜（３）を含む方法により当該抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者であることを特徴とする抗腫瘍剤：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項５】
結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測するための、ＴＫ１タンパク質を特異的に認識する抗体を試薬として含有するキットであって、下記工程（１）〜（３）により治療効果を予測することを特徴とするキット：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学染色法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項６】
下記工程（１）〜（４）を含む、結腸直腸癌患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学染色法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（４）上記工程（３）で当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に、当該抗腫瘍剤を投与する工程。
【請求項７】
トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であって、
下記工程（１）〜（３）を含む方法の結果、当該抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された結腸直腸患者の治療に用いるための、抗腫瘍剤：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年５月１７日に出願された、日本国特許出願第２０１３−１０５０８２号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、トリフルリジン（以下、「ＦＴＤ」とも称す）とチピラシル塩酸塩（以下、「ＴＰＩ」とも称す）をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を使用する化学療法に対する治療効果を予測する方法、抗腫瘍剤及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
結腸直腸癌患者に対する化学療法としては、フルオロピリミジン系抗腫瘍剤を含む化学療法（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とロイコボリン（ＬＶ）の併用）をベースに、さらにイリノテカン又はオキサリプラチンを併用した多剤併用療法（ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸ等）が標準療法として実施されており、一定の治療効果が得られている（非特許文献１）。しかしながら、５−ＦＵ、イリノテカン、オキサリプラチンを含む標準療法に対して不応又は不耐となってしまった結腸直腸癌患者に対しては、生存期間を有意に延長できる抗腫瘍剤が非常に限られている。【０００４】
一方、新たな結腸直腸癌に対する抗腫瘍剤としてＦＴＤ及びＴＰＩをモル比１：０．５で含有する配合剤（以下、「ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤」という場合がある。）が開発中である。ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤は、抗腫瘍効果を示す有効成分であるＦＴＤと、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）によるＦＴＤの分解を抑制する成分であるＴＰＩとを、モル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であり、ＦＴＤによるチミジン酸シンターゼ（ＴＳ）の阻害、及びチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）によりリン酸化されたＦＴＤのＤＮＡへの取り込みによって抗腫瘍効果を発揮することが知られている（非特許文献２）。また、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤は、標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者を対象とした大規模な臨床試験において、優れた全生存期間の延長が確認されたことから、結腸直腸癌に対する抗腫瘍剤として非常に期待されている（非特許文献３）。【０００５】
また、上記のＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の作用機序から、ＴＫ１等がＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の治療効果予測因子として期待されていた。しかしながら、標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者を対象としたＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の臨床試験において、免疫組織化学的評価法であるＨスコア法にてＴＫ１タンパク質の発現を解析したところ、ＴＫ１タンパク質の発現と全生存期間とが相関しないことが報告された（非特許文献４）。「Ｈスコア法」とは、以下の計算式により求められるＨスコアに基づく評価法をいう：Ｈスコア＝Σ（染色強度×陽性細胞占有率（％））（染色強度０：染色なし、１：弱い染色、２：中程度の染色、３：強い染色）（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９５；４８：８７６−８７８）。【０００６】
以上のとおり、結腸直腸癌患者に対する化学療法が精力的に開発されているが、その治療効果は満足できるものではなく、特に標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者においては実質的に有効な化学療法が確立されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＮＣＣＮ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （ＮＣＣＮ  ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓTM）；Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．２０１１）、Ｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ４．２０１１）
【非特許文献２】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００４；１３（２）：２４９−５５．
【非特許文献３】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１１；４７（Ｓｕｐｐｌ．１）：３９２、＃６００５．
【非特許文献４】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１１；４７（Ｓｕｐｐｌ．１）：４２１、＃６０９９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、結腸直腸癌患者に対して、顕著な延命効果を奏し、且つ副作用が少ない化学療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述のとおり、ＴＫ１タンパク質の発現とＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の治療効果の相関が否定された状況において、本発明者らは、生体試料の中の全ての腫瘍細胞における陽性細胞（特に、免疫組織化学法による判定スコアが２＋又は３＋である細胞）の占有率とＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の治療効果の関係性に着目し、当該占有率が３０％以上である結腸直腸癌患者は、当該占有率が３０％未満である患者と比較して、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤が顕著に奏効しやすいことを見出し、本発明は完成に至った。【００１０】
なお、一般的に、ＴＫ１が高発現していると、癌患者の予後が悪いことが知られており、当該占有率が３０％以上の時に、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤の治療効果が顕著に高いことは当業者にとって予想外な成果である。【００１１】
すなわち本発明は、以下の方法、抗腫瘍剤及びキットを包含する。【００１２】
項１、下記工程（１）〜（３）を含む、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。【００１３】
項２、陽性細胞が、染色強度に基づき２＋又は３＋と判定された細胞である、項１記載の方法。【００１４】
項３、結腸直腸癌患者が、標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者である、項１又は２記載の方法。【００１５】
項４、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であって、当該患者が、下記工程（１）〜（３）を含む方法により当該抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者であることを特徴とする抗腫瘍剤：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。【００１６】
項５、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測するための、ＴＫ１タンパク質を特異的に認識する抗体を試薬として含有するキットであって、下記工程（１）〜（３）により治療効果を予測することを特徴とするキット：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学染色法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。【００１７】
項６、下記工程（１）〜（４）を含む、結腸直腸癌患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学染色法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（４）上記工程（３）で当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に、当該抗腫瘍剤を投与する工程。【００１８】
項７、トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であって、
下記工程（１）〜（３）を含む方法の結果、当該抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された結腸直腸患者の治療に用いるための、抗腫瘍剤：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。【００１９】
本発明は、さらに以下の態様をも包含する。【００２０】
・下記工程（１）〜（３）を含む、結腸直腸癌患者におけるトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を検査する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果から、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。【００２１】
・下記工程（１）〜（３）を含む、トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が、結腸直腸癌患者に対する治療効果を示すか否かを試験する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程、
（２）上記工程（１）で得られた検出結果から、腫瘍細胞を陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られた算出結果を、当該占有率が３０％以上である場合、当該患者に対するトリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いという基準と比較する工程。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の予測方法は、結腸直腸癌患者（特に、従来は、抗腫瘍剤に対する応答性が低く、生存期間を有意に延長させる抗腫瘍剤がほとんどなかった標準療法に不応又は不耐となった結腸直腸癌患者）に対して、より顕著な延命効果を示す化学療法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の予測方法は、結腸直腸癌患者においてＦＴＤ及びＴＰＩをモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示すか否かを、腫瘍細胞におけるＴＫ１陽性細胞の占有率に基づき予測、試験又は検査するものである。
【００２４】
本発明で指標であるＴＫ１タンパク質は、チミジンをリン酸化することによりデオキシチミジン一リン酸を合成する酵素であり、ＤＮＡ合成に不可欠なピリミジンの合成に関与していることが知られている。また、多くの癌種においてＴＫ１タンパク質の高発現と腫瘍の悪性度に関連性があることが報告されている。
【００２５】
本発明の対象となる患者は、結腸直腸癌患者である。本発明において「結腸直腸癌」とは結腸又は直腸から発生した悪性腫瘍を指し、原発性結腸直腸癌のほか、局所的に再発した結腸直腸癌及び他の組織（例えば、肝臓）に転移した結腸直腸癌も含まれる。なお、ここで結腸直腸癌患者には、結腸直腸癌の腫瘍組織を現に有する患者のみならず、結腸直腸癌の腫瘍組織の切除を受けた患者も含む。従って、本明細書において、化学療法の治療効果は、結腸直腸癌の縮小及び増殖抑制、患者の延命だけでなく、結腸直腸癌の腫瘍組織の切除後の再発の抑制を包含する。
【００２６】
また、本発明の対象となる結腸直腸癌患者の前治療歴は、上記抗腫瘍剤が投与できる状態であれば、特に制限されないが、本発明の予測精度の点から、標準療法に不応又は不耐の結腸直腸癌患者であることが好ましい。本発明において標準療法とは、結腸直腸癌の治療に標準的に用いられている化学療法であり、フルオロピリミジン系抗腫瘍剤（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）、イリノテカン、オキサリプラチンを含む化学療法などをいう。具体的には、フルオロピリミジン系抗腫瘍剤を含む化学療法（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とロイコボリン（ＬＶ）の併用）、及び当該化学療法にイリノテカン又はオキサリプラチンを併用した化学療法（ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸ等）などが挙げられる。ここで「標準療法に不応又は不耐」とは、標準療法を実施していたものの治療効果が認められなくなった場合（例えば、標準療法の実施中に増悪（ＰＤ）した症例、術後補助化学療法として標準療法を実施中若しくは終了後６ヶ月以内に再発した症例などを含む）及び病状の悪化や副作用等により標準的な投与量を投与することができなくなった場合などをいう。「標準療法に不応又は不耐」とは、「標準的な治療が困難」と換言することができる。
【００２７】
本発明の抗腫瘍剤は、トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤であり、経口投与により主に結腸直腸癌等の固形癌に抗腫瘍効果を奏することが知られている（国際公開ＷＯ９６／３０３４６号パンフレット）。
【００２８】
「トリフルリジン」（別名：α，α，α−トリフルオロチミジン。）は、チミジンの５位のメチル基をトリフルオロメチル基に置換した公知の核酸誘導体であり、ＤＮＡ合成阻害作用による抗腫瘍効果を有することが知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８４：３５９７−３５９８，１９６２；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７：１−５，１９６４；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１５０８６−１５０９４，１９９４）。トリフルリジンは、下記化学式（１）で示される。
【００２９】
【化１】
2014185528.tif 000002
【００３０】
「チピラシル塩酸塩」（化学名：５−クロロ−６−［（２−イミノピロリジン−１−イル）メチル］ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン塩酸塩。）は、チミジンホスフォリラーゼ活性阻害作用を有する公知の化合物であり、抗腫瘍効果の増強作用（国際公開ＷＯ９６／３０３４６号パンフレット）、癌転移抑制作用（国際公開ＷＯ９８／１３０４５号パンフレット）、抗腫瘍剤の消化管障害の軽減作用（国際公開ＷＯ００／５６３３７号パンフレット）、放射線治療の増強作用（国際公開ＷＯ２００８／００１５０２号パンフレット）が知られている。チピラシル塩酸塩は、下記化学式（２）で示される。
【００３１】
【化２】
2014185528.tif 000003
【００３２】
本発明の抗腫瘍剤は、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩を配合剤（複数の有効成分を含有する製剤）として一の剤型に製剤化したもの（１剤型形態）であっても、上記有効成分の各々を単剤として複数の剤型に製剤化したもの（多剤型形態）であってもよい。このうち、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩は配合剤で用いることが好ましい。
【００３３】
抗腫瘍剤の投与形態に特に制限は無く、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。このうち、トリフルリジンとチピラシル塩酸塩の配合剤は経口剤の形態が好ましい。各抗腫瘍剤は、それぞれの投与形態に応じ薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００３４】
本発明における「トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法」とは、少なくとも本発明の抗腫瘍剤を投与する化学療法を意味し、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤を単独で用いた化学療法のみならず、本発明の抗腫瘍剤と他の抗腫瘍剤を併用した化学療法をも含むものである。
【００３５】
当該化学療法の投与スケジュールは患者の年齢、性別、病期、転移の有無、前治療暦などの条件により適宜選択される。例えば、４週間のうち、初日から５日目及び８日目から１２日目に本発明の抗腫瘍剤をＦＴＤ量として２０〜８０ｍｇ／ｍ２（体表面積）／ｄａｙで1日２〜４回に分けて投与する、好適には５０〜７０ｍｇ／ｍ２（体表面積）／ｄａｙで1日２〜３回に分けて投与する、より好適には７０ｍｇ／ｍ２（体表面積）／ｄａｙで1日２回に分けて投与するスケジュールを１コースとして、当該コースを繰り返す投与スケジュールが好ましい。１日あたりの投与回数は、特に限定されるものではないが、２〜４回、好適には２〜３回、より好適には２回とすることができる。
【００３６】
なお、当該化学療法は、当該化学療法の後に腫瘍の摘出を行う術前補助化学療法であっても、腫瘍の摘出の後に当該化学療法を行う術後補助化学療法であってもよい。
【００３７】
ＦＴＤ及びＴＰＩをモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤は、日本国において、「ロンサーフ配合錠」として、製造販売が承認されている。
【００３８】
本発明において「治療効果」は、上述の通り、腫瘍縮小効果、再発抑制効果、延命効果などにより評価することができ、再発抑制効果は無再発生存期間の延長や再発率の改善の程度、延命効果は全生存期間や無増悪生存期間の中央値の延長の程度などにより表すことができる。「トリフルリジンとチピラシル塩酸塩をモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す」とは、本発明の抗腫瘍剤を投与することにより、非投与の場合と比較して、生存期間を顕著に延長させたり、再発を顕著に抑制させたりする程度の優れた治療効果をいう。
【００３９】
本発明の予測方法は、後述の（１）〜（３）の工程を含むものである。
【００４０】
工程（１）は、結腸直腸癌患者から採取された生体試料に含まれる腫瘍細胞におけるＴＫ１タンパク質の発現を免疫組織化学法により検出する工程である。
生体試料としては、結腸直腸癌患者から採取したものであり腫瘍細胞を含む試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できるが、腫瘍細胞を含む組織が好ましい。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じ適宜選択することができる。
【００４１】
本発明におけるＴＫ１タンパク質の発現の検出方法としては、腫瘍細胞毎にＴＫ１タンパク質の発現を染色強度に基づく判定スコアとして半定量的に判定できる免疫組織化学法であれば特に制限されず、公知の検出方法を使用することができる。本発明における染色強度に基づく判定スコアとしては、０（染色なし）、１＋（染色あり）の２段階評価、又は０（染色なし）、１＋（弱い染色）、２＋（中程度の染色）、３＋（強い染色）の４段階評価が好ましい。４段階評価は、例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８；  ５２：  ７９７-８０５におけるＨＥＲ２タンパク質の発現強度の４段階評価に準じて行うことができる。
【００４２】
生体試料は、検出方法に応じて、適切な処理をされることにより生検組織又は臓器からの組織切片標本等として調製される。また、組織切片標本は、例えば、新鮮、凍結、またはホルマリン、アルコールまたはアセトンまたは他の方法で固定および／またはパラフィン包埋および脱パラフィンされ得る。好ましくは、事前にホルマリン固定パラフィン包埋ブロックの連続切片のうちの一枚についてヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、細胞の形態に基づき腫瘍細胞と正常細胞との鑑別を実施し、腫瘍細胞の部分のみを、本発明における判定に用いる。染色強度の陰性コントロールや陽性コントロールに関しては、ホルマリン固定パラフィン包埋された細胞株（あらかじめタンパク質発現量が明らかな数種の株）を用いることができる。または、コントロールの検体がない場合には、複数の検体を同時に評価し全体の標本の染色強度の分布を確認後、染色強度を設定する場合もある。評価部位に関しては、標本全体を評価することが望ましいが、代表的な１視野のみの評価でも可能である。
【００４３】
また、検出に用いられるＴＫ１タンパク質を特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片であってもよい。抗体の由来生物種は、特に限定されない。
【００４４】
また、当該抗体は、公知であるヒトＴＫ１のアミノ酸配列情報（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＡＡＨ０７９８６）に基づき、通常公知の手法により作製することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。例えば、ポリクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌で発現し精製した上記ポリペプチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、例えばモノクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記ポリヌクレオチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該実験動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、該細胞中から得ることができる。また、公知の抗ヒトＴＫ１抗体を用いても良い（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．２００１；２０（１）：２５−３４．）。
【００４５】
工程（２）は、上記工程（１）における検出結果に基づき、判定した腫瘍細胞を細胞毎に陽性細胞と陰性細胞に分類し、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率を算出する工程である。
本発明における陽性細胞とは、免疫組織化学法によりＴＫ１タンパク質の発現が確認された腫瘍細胞をいう。具体的には、上記工程（１）で得られた腫瘍細胞毎の染色強度に基づき、２段階評価の場合は１＋、４段階評価の場合は２＋又は３＋と判定された腫瘍細胞である。
【００４６】
工程（３）は、上記工程（２）における算出結果に基づき、腫瘍細胞における陽性細胞の占有率が３０％以上である場合、当該患者に対する本発明の抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程である。本発明において、診断基準となる陽性細胞の占有率の閾値（カットオフポイント）は３０％である。後述の実施例を含め、種々のカットオフポイントによる解析を行ったところ、カットオフポイントが３０％のとき、予測精度及び治療効果（全生存期間の延長効果等）の観点から、最も層別効果が高かった。
【００４７】
かくして、結腸直腸癌患者における本発明の抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測することができる。
【００４８】
本発明の予測方法により本発明の抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された結腸直腸癌患者に、当該抗腫瘍剤を投与することで、結腸直腸癌の縮小及び増殖抑制、患者の延命、並びに結腸直腸癌の腫瘍組織の切除後の再発の抑制等の優れた化学療法の治療効果を奏する治療方法も提供される。本発明は、このような治療方法及び本発明の抗腫瘍剤の使用形態をも提供する。
【００４９】
本発明はまた、結腸直腸癌患者における本発明の抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測するためのキットをも提供する。本発明のキットは、上記する本発明の予測方法により化学療法の治療効果を予測するために好適に用いられる。
【００５０】
本発明のキットは、ＴＫ１タンパク質を特異的に認識する抗体を試薬として含有することを特徴とする。本発明のキットは、一次抗体であるＴＫ１タンパク質を特異的に認識する抗体を検出するための手段などの免疫組織化学法を実施するためのその他の試薬及び／又は器具、染色強度の陰性コントロールや陽性コントロールなどが含まれていてもよい。一次抗体を検出するための手段としては、例えば、二次抗体が挙げられる。二次抗体は、必要に応じて、ペルオキシターゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素；フルオレセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシメチルインドシアニン（Ｃｙ３）等の蛍光もしくは発光物質等で標識されていてもよい。二次抗体が酵素で標識されている場合は、本発明のキットは、さらに、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色基質を含むことが好ましい。さらに、本発明のキットは、本発明の予測方法を実施するための手順などを記載した取扱説明書、手順書などが含まれていてもよい。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。【００５２】
［実施例１］
前治療歴が２レジメン以上で、５−ＦＵ、イリノテカン、オキサリプラチンを含む標準療法に不応又は不耐な進行再発結腸直腸癌患者（１６９例）をＦＴＤ及びＴＰＩをモル比１：０．５で含有する抗腫瘍剤（以下、「ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤（FTP・TPI combination drug）」という。）の投与群（１１２例）とプラセボ群（５７例）に群分けした。なお、両患者群のバックグラウンドに顕著な違いはなかった（男性比率（ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群、５７．１％；プラセボ群、４９．１％）、平均年齢（ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群、６３才；プラセボ群、６２才）、ＥＣＯＧ  ＰＳ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ）  ０（ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群、６４．３％；プラセボ群、６１．４％）、前治療歴が３レジメン以上の比率（ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群、８４．８％；プラセボ群、７７．２％））。ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群に対しては、４週間のうち、初日から５日目及び８日目から１２日目にＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤をＦＴＤ量として３５ｍｇ／ｍ２（体表面積）／回を１日２回、すなわち１日あたり合計７０ｍｇ／ｍ２（体表面積）／ｄａｙ投与するスケジュールを１コースとして、繰り返し行った。一方、プラセボ群に対してはＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤を含むあらゆる抗腫瘍剤を投与しなかった。【００５３】
全症例において全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ：ＯＳ）を評価した。また、全症例中１４５例（ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤投与群（FTD・TPI combination drug）：９５例、プラセボ群（Placebo）：５０例）に対し投薬前に生体試料として病変組織を採取し、ホルマリン固定処理を行った後パラフィン包埋処理を行い、３〜４μｍに薄切した。薄切した標本をパラフィン熔融器内で一晩乾燥させた後、キシレンとエタノールにより脱パラフィン処理を施した。さらに０．３％過酸化水素加メタノール処理による内因性ペルオキシダーゼの阻止を行った後、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で圧力鍋処理（１０分間）により抗原の賦活化を行った。その後流水洗洗浄、ＰＢＳ（−）による洗浄の後、一次抗体（配列番号１（ＦＫＫＡＳＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣ）で表されるヒトＴＫ１タンパク質のＣ末側のアミノ酸配列を認識する抗ＴＫ１ウサギポリクローナル抗体、大鵬薬品）を常温で一晩反応させた。さらにＰＢＳ（−）による洗浄の後、ペルオキシダーゼ・二次抗体結合ポリマー試薬（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）、株式会社ニチレイバイオサイエンス）を室温で３０分反応させ、ＰＢＳ（−）で洗浄した。その後、シンプルステインＤＡＢ溶液（株式会社ニチレイバイオサイエンス）により発色させた後、カラッチのヘマトキシリン液で核を染色し、脱水・透徹処理を行い、マリノールで封入し、ＴＫ１染色標本を作製した。【００５４】
次いで個別に２名の病理専門家によって、顕微鏡下にて、腫瘍細胞の細胞質中における染色強度に応じて、腫瘍細胞毎にＴＫ１タンパク質の発現を０（染色なし）、１＋（弱い染色）、２＋（中程度の染色）、３＋（強い染色）の４段階評価で判定し、２＋又は３＋と判定された腫瘍細胞の全腫瘍細胞における占有率を症例毎に算出した。【００５５】
症例をＴＫ１高発現群（High）及びＴＫ１低発現群（Low）に分けるためのカットオフポイント（Cutoff）として、２０％又は３０％を採用した場合の、各群の症例数を表１に示す。また、それぞれのカットオフポイントでの、高発現群と低発現群における全生存期間の中央値及びハザード比（ＨＲ）を表２に示す。高発現群と低発現群との有意差を評価するためのｐ値は、ログランク検定により算出した。【００５６】
カットオフポイントが２０％のとき、プラセボ群のＴＫ１高発現群の全生存期間の中央値は５．９ヶ月であるの対し、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤治療群のＴＫ１高発現群の全生存期間の中央値は７．８ヶ月であり、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤治療群とプラセボ群のハザード比の差は小さかった。一方、カットオフポイントが３０％のとき、プラセボ群のＴＫ１高発現群の全生存期間の中央値は７．７ヶ月であるの対し、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤治療群のＴＫ１高発現群の全生存期間の中央値は１０．４ヶ月であり、ＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤治療群とプラセボ群のハザード比の差が非常に大きかった。【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
以上から、ＴＫ１タンパク質の発現に関わらず、結腸直腸癌患者においてＦＴＤ・ＴＰＩ配合剤は臨床上有用であるが、特にＴＫ１タンパク質の発現に応じて２＋又は３＋と判定された腫瘍細胞の全腫瘍細胞における占有率が３０％以上である患者において非常に優れた治療効果をもたらすことが証明された。なお、一般的に、ＴＫ１が高発現していると、癌患者の予後が悪いことが知られており、当該治療効果は当業者にとって予想外な成果である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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