(57)【要約】  組成物は、γ−オリザノールと、γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、を含む。生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含んでもよい。当該組成物は、インスリン抵抗性の改善に使用される。また、当該組成物は、肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される。
2014098190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む組成物。
【請求項２】
前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
インスリン抵抗性の改善に使用される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
小胞体ストレスの抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌の抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
患者に対して１日以上の投与間隔をあけて投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記投与間隔は、
７日以上１４日以下である、
ことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の組成物を含む飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物及び飲食物に関する。
【背景技術】
【０００２】
玄米食はインスリン抵抗性を改善し、糖尿病の発症を遅らせることが知られている。玄米には生理活性物質であるγ−オリザノールが含まれており、その生理活性のメカニズムが明らかにされつつある。非特許文献１には、γ−オリザノールを経口投与（３２０ｍｇ／ｋｇ）された肥満モデルマウスにおける、小腸からの脂質の吸収抑制、インスリンの分泌促進と血糖値の低下、及び高脂肪食に対する嗜好の抑制が示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋｏｚｕｋａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｏｗｎ  Ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，γ−Ｏｒｙｚａｎｏｌ，Ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ｂｙ  Ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１２，６１，３０８４−９３
【非特許文献２】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，２００１，４７，３９−５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、肥満、脂質異常症及び糖尿病等の患者において、γ−オリザノールの上記作用を得るための１日の用量は大量になってしまう（患者の体重を６０ｋｇとすると１９．２ｇ）。このような大量のγ−オリザノールを連日にわたって経口投与した場合、副作用が懸念される。また、１日の用量を複数回に分けて投与したとしても、投与回数が多くなり、投与管理が煩雑になる。このため、大量のγ−オリザノールの連日にわたる経口投与は現実的ではない。【０００５】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、より少ない用量でγ−オリザノールの作用を得ることができる組成物及び飲食物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のように大量のγ−オリザノールを必要とする一因として、腸管からのγ−オリザノールの吸収効率の低さが考えられる。このため、本発明者は、薬剤を封入することでその薬剤の動態を変化させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に着目した。一般に、ＤＤＳに利用されるマイクロサイズの粒子は、腸管粘膜層に粘着しやすい性質がある。さらにナノサイズの粒子は、粘膜層内への進入、薬剤の放出及び腸管内への送達等の機能を付加できる（非特許文献２参照）。これまでにＤＤＳを利用したγ−オリザノールの生体での作用は確認されたことがない。そこで、本発明者は、実用的な低用量のγ−オリザノールでも上記作用が得られるか否かを鋭意検討し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明の第１の観点に係る組成物は、
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む。【０００８】
この場合、前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
こととしてもよい。【０００９】
また、上記組成物は、
インスリン抵抗性の改善に使用される、
こととしてもよい。【００１０】
また、上記組成物は、
小胞体ストレスの抑制に使用される、
こととしてもよい。【００１１】
また、上記組成物は、
腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌の抑制に使用される、
こととしてもよい。【００１２】
また、上記組成物は、
肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、
こととしてもよい。【００１３】
この場合、上記組成物は、
患者に対して１日以上の投与間隔をあけて投与される、
こととしてもよい。【００１４】
また、前記投与間隔は、
７日以上１４日以下である、
こととしてもよい。【００１５】
本発明の第２の観点に係る飲食物は、
上記本発明の第１の観点に係る組成物を含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、生体適合性粒子に封入することでγ−オリザノールの腸管からの吸収効率が高まるため、より少ない用量でγ−オリザノールの作用を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける体重の経時変化を示す図である。（Ｂ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける体重の経時変化を示す図である。
【図２】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける血糖値の経時変化を示す図である。（Ｂ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける血糖値の経時変化を示す図である。
【図３】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスに対するブドウ糖負荷試験における血糖値の経時変化を示す図（その１）である。（Ｂ）は、図３（Ａ）の結果から得られたＡｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を示す図である。（Ｃ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスに対するブドウ糖負荷試験における血糖値の経時変化を示す図（その１）である。（Ｄ）は、図３（Ｃ）の結果から得られたＡＵＣを示す図である。
【図４】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける血漿中の中性脂肪の濃度を示す図である。（Ｂ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける糞便中の脂質の濃度を示す図である。
【図５】γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける血漿中のインスリンの濃度を示す図である。
【図６】γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける小胞体（ＥＲ）ストレスマーカー遺伝子の発現量を示す図である。（Ａ）はＣｈｏｐの発現量を示す。（Ｂ）はＥＲｄｊ４の発現量を示す。（Ｃ）は、Ｘｂｐ１ｓの発現量を示す。
【図７】ＴＮＦ−αで刺激した腸管上皮細胞から分泌されたＩＬ−８の量を示す図である。（Ａ）は、γ−オリザノールで前処理した場合、（Ｂ）は、γ−オリザノール封入粒子で前処理した場合、（Ｃ）は、ＰＬＧＡ粒子の対照として用いたＦＩＴＣ封入粒子で前処理した場合である。
【図８】腸管上皮細胞に取り込まれたＦＩＴＣの量を共焦点レーザー顕微鏡で解析した蛍光強度として示す図である。（Ａ）は、ＦＩＴＣ封入粒子の添加後０日目の蛍光強度を示す。（Ｂ）は、ＦＩＴＣ封入粒子の添加後１日目の蛍光強度を示す。（Ｃ）は、ＦＩＴＣ封入粒子の添加後３日目の蛍光強度を示す。（Ｄ）は、ＦＩＴＣ封入粒子の添加後７日後の蛍光強度を示す。
【図９】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける４週間の体重の経時変化を示す図である。（Ｂ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける４週間の体重の経時変化を示す図である。
【図１０】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスにおける４週間の血糖値の経時変化を示す図である。（Ｂ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける４週間の血糖値の経時変化を示す図である。
【図１１】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスに対するブドウ糖負荷試験における血糖値の経時変化を示す図（その２）である。（Ｂ）は、図１１（Ａ）の結果から得られたＡＵＣを示す図である。（Ｃ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスに対するブドウ糖負荷試験における血糖値の経時変化を示す図（その２）である。（Ｄ）は、図１１（Ｃ）の結果から得られたＡＵＣを示す図である。
【図１２】（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与した遺伝性肥満マウスに対するインスリン耐性試験における血糖値の経時変化を示す図である。（Ｂ）は、図１２（Ａ）の結果から得られたＡＵＣを示す図である。（Ｃ）は、γ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスに対するインスリン耐性試験における血糖値の経時変化を示す図である。（Ｄ）は、図１２（Ｃ）の結果から得られたＡＵＣを示す図である。
【図１３】γ−オリザノール封入粒子又はγ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける血漿中の中性脂肪の濃度を示す図である。
【図１４】γ−オリザノール封入粒子又はγ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおけるＥＲストレスマーカー遺伝子の発現量を示す図である。（Ａ）は視床下部でのＣｈｏｐの発現量を示す。（Ｂ）は視床下部のＥＲｄｊ４での発現量を示す。（Ｃ）は膵島でのＥＲｄｊ４の発現量を示す。（Ｄ）は膵島でのＸｂｐ１ｓの発現量を示す。
【図１５】γ−オリザノール封入粒子又はγ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおけるＥＲストレスマーカー遺伝子の発現量を示す図である。（Ａ）は腸間膜の脂肪組織でのＣｈｏｐの発現量を示す。（Ｂ）は腸間膜の脂肪組織でのＸｂｐ１ｓの発現量を示す。（Ｃ）は肝臓でのＣｈｏｐの発現量を示す。（Ｄ）は肝臓でのＸｂｐ１ｓの発現量を示す。
【図１６】γ−オリザノール封入粒子又はγ−オリザノールを投与した遺伝性肥満マウスにおける炎症性サイトカイン及びケモカイン遺伝子の発現量を示す図である。（Ａ）は精巣上体の脂肪組織でのＴＮＦαの発現量を示す。（Ｂ）は精巣上体の脂肪組織でのＭＣＰ−１の発現量を示す。（Ｃ）は皮下の脂肪組織でのＴＮＦαの発現量を示す。（Ｄ）は皮下の脂肪組織でのＭＣＰ−１の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１について説明する。本実施の形態に係る組成物は、γ−オリザノールと、γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子とを含む。
【００１９】
γ−オリザノールは、米糠等の脂質に含有される生理活性物質である。γ−オリザノールは、ステロールもしくはトリテルペンアルコールとフェルラ酸とがエステル結合した化合物又はそれらの混合物である。γ−オリザノールは、主に米糠油や米胚芽油より抽出することができる。また、市販のγ−オリザノールを利用することもできる（和光純薬社製）。
【００２０】
γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーから製造することができる。生体適合性ポリマーは、その様々な平均鎖長によって、内部粘性及びポリマー特性の差異をもたらす。本実施の形態で用いられるポリマーは、生体への刺激や毒性が低い生体適合性を備え、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが好ましい。生体内分解性のポリマーとしては、例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート等の高分子及びコラーゲン、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、ハイアミロースコーンスターチ、澱粉、キトサン等の天然高分子等が挙げられる。
【００２１】
生体適合性ポリマーから得られた生体適合性粒子は、封入するγ−オリザノールを持続して放出、すなわち徐放することが好ましい。このため、生体適合性ポリマーとしては、例えば分子量５，０００〜２００，０００のもの、分子量１５，０００〜２５，０００のものが好ましい。
【００２２】
生体適合性粒子は、生体適合性ポリマー、例えば生体適合性ポリエステルから製造することができる。生体適合性ポリエステルは、例えばＤ，Ｌ‐ラクチド、Ｄ‐ラクチド、Ｌ‐ラクチド、Ｄ，Ｌ‐乳酸、Ｄ‐乳酸、Ｌ‐乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε‐カプロラクトン、ε‐ヒドロキシヘキサン酸、γ−ブチロラクトン、γ−ヒドロキシ酪酸、δ‐バレロラクトン、δ‐ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸等から選択される１種又はそれ以上のモノマーを重合することにより合成されるポリエステルである。好ましくは、生体適合性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又は乳酸・アスパラギン酸共重合体、とりわけポリラクチドグリコライド共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリエチレングリコール／キトサン修飾‐ＰＬＧＡ（ＰＥＧ／ＣＳ‐ＰＬＧＡ）である。
【００２３】
生体適合性ポリマーとしてのＰＬＧＡは、例えば１：９９〜９９：１、好ましくは３：１の割合で、乳酸又はラクチドとグリコール酸又はグリコライドとからなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから一般的な方法で合成してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）が挙げられる。乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトン等の有機溶媒に可溶である点で好ましい。
【００２４】
上記生体適合性粒子をＰＬＧＡから製造する場合、生体適合性粒子は、その粒子径が１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜３００ｎｍ、最も好ましくは１００〜２５０ｎｍのＰＬＧＡを含むようにしてもよい。粒子径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験等で測定できる。粒子径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、粒子径は、複数の粒子を測定対象として、その平均で表した個数平均粒子径、体積平均粒子径、面積平均粒子径等であってもよい。例えば、個数平均粒子径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒子径である。具体的には、粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を平均粒子径としてもよい。
【００２５】
ＰＬＧＡで製造された生体適合性粒子は、腸管（小腸）の粘膜層、腸管壁に停留しやすく、封入するγ−オリザノールを腸管の粘膜層、腸管壁等で持続して放出する点で好ましい。
【００２６】
また、上記生体適合性粒子の製造には、ＰＬＧＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体を用いてもよい。ＰＬＧＡの表面をＰＥＧで修飾すると、血中安定性が向上する点で好ましい。
【００２７】
上記生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーとγ−オリザノールとを、例えば、レーザー回折・散乱法等で測定したときに１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜３００ｎｍ、最も好ましくは１００〜２５０ｎｍの個数平均粒子径を有する粒子に加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造することができる。生体適合性粒子は、例えば、球形晶析法で製造することができる。球形晶析法は、晶析操作中に析出する結晶を球状に造粒する方法である。球形晶析法によれば、製造する化合物の物性を制御して化合物を加工できる。例えば、球形晶析法には、エマルジョン溶媒拡散法（以下、単に「ＥＳＤ法」とする）がある。
【００２８】
ＥＳＤ法では、生体適合性ポリマーが溶解する良溶媒と、生体適合性ポリマーが溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、生体適合性ポリマーが溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒及び貧溶媒の種類は、封入される物質の種類等に応じて決定されるものであり、特に限定されるものではない。本実施形態に係る生体適合性粒子は、主に人体に作用させる組成物の原料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、かつ環境負荷の少ないものを用いることが好ましい。
【００２９】
貧溶媒としては、水が挙げられ、水に界面活性剤を添加してもよい。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール水溶液が好ましい。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。なお、ポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去の後に、遠心分離等によりポリビニルアルコールを除去してもよい。
【００３０】
良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ又はアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。
【００３１】
ＥＳＤ法では、まず、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、生体適合性ポリマーが析出しないように、γ−オリザノール溶解液を良溶媒中へ添加混合する。生体適合性ポリマーとγ−オリザノールとを含む混合液を、攪拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、直径数μｍ程度の良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマー及びγ−オリザノールの溶解度が低下する。最終的には、γ−オリザノールを封入した球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離又は減圧留去し、生体適合性粒子粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、又は必要に応じて凍結乾燥等により再分散可能な凝集粒子に複合化される。複合化された粒子は、γ−オリザノール封入粒子として、容器内に充填される。このようにして得られたγ−オリザノール封入粒子には、好ましくは、γ−オリザノールが０．１〜９９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましく３〜５％（ｗ／ｖ）封入される。
【００３２】
上記球形晶析法では、得られるγ−オリザノール封入粒子が略球形であるため触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要がない。また、球形晶析法によれば、粒子径のばらつきが少ないγ−オリザノール封入粒子を容易に形成することができる。
【００３３】
なお、生体適合性粒子内部へのγ−オリザノールの封入率を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子を貧溶媒中に添加した場合は、生体適合性粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルション滴表面に存在するγ−オリザノールと相互作用し、貧溶媒中へのγ−オリザノールの漏出を抑制することができると考えられる。
【００３４】
カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）等が挙げられる。特にキトサン又はその誘導体が好適に用いられる。
【００３５】
キトサンは、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合した天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性等の特徴を有するため、化粧品、食品、衣料品及び医薬品等の原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、生体への悪影響がなく、安全性の高いγ−オリザノール封入粒子を製造することができる。
【００３６】
上記のようにして得られたγ−オリザノール封入粒子は、凍結乾燥等により粉末化させる際に再分散可能な凝集粒子（ナノコンポジット）に複合化できる。このとき、有機又は無機の物質を再分散可能に複合化させ、γ−オリザノール封入粒子と共に乾燥させることが好ましい。例えば、糖アルコール又はショ糖を用いることにより、封入率のばらつきを効果的に防止するとともに、糖アルコール等が賦形剤となりγ−オリザノール封入粒子の取り扱いやすさを高めることができる。糖アルコールとしては、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトース、キシリトース等が挙げられ、この中でも特にトレハロースが好ましい。
【００３７】
この複合化により、γ−オリザノール封入粒子は、取り扱いやすい凝集粒子となっている。そして、使用時に水分に触れることで凝集粒子が解消され、γ−オリザノール封入粒子は高反応性等の特性を示す。なお、凍結乾燥法に代えて、例えばアグロマスタＡＧＭ（ホソカワミクロン社製）を使用した流動層乾燥造粒法により複合化して、再度分離可能な状態で一体化することもできる。
【００３８】
本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）のγ−オリザノール封入粒子を含む。
【００３９】
本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、医薬用途においては、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤及び口腔内吸収剤等として用いることができる。特にγ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、腸管での吸収効率が高いことから経口投与剤として用いられるのが好ましい。このとき、当該組成物は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として酸化ストレス疾患治療薬に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００４０】
賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ‐マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等である。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ‐マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等である。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等である。
【００４１】
溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール等である。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ‐マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤は、界面活性剤、親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等である。
【００４２】
等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ‐マンニトール等である。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコール等である。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等である。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等である。
【００４３】
本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、下記実施例２、５に示すように、インスリン抵抗性の改善に使用されるのが好適である（インスリン抵抗性改善剤）。また、当該組成物は、血糖値、体重増加及び脂質吸収の抑制作用を有するのに加えて、血漿中の中性脂肪の濃度を低下させるため、抗動脈硬化作用を有すると考えられる。これらのことから、当該組成物は、例えば、肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病及び動脈硬化症から選択される疾患の治療又は予防に使用するのが好適である。なお、当該組成物は、ＥＲストレスを抑制するため、ＥＲストレスの抑制、又はＥＲストレスに関連する疾患の治療若しくは予防に使用されてもよい（ＥＲストレス抑制剤）。特に、下記実施例５で示されたように、当該組成物は、視床下部におけるＥＲストレスを有意に抑制する。摂食調節を行う視床下部におけるＥＲストレスは、高脂肪食に対する嗜好性に関与しているため、当該組成物は、低用量でも高脂肪食への依存性を軽減する。この点でも、当該組成物は、肥満症、糖尿病等の治療又は予防に好適である。この他、γ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、ＥＲストレスに関連する疾患である冠動脈疾患、高血圧、メタボリックシンドローム、神経変性疾患及び双極性障害等の疾患の治療又は予防に使用されてもよい。
【００４４】
本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、下記実施例３に示すように、腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌を抑制する。よって、当該組成物は、腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌の抑制に使用するのが好適である（ＩＬ−８分泌抑制剤）。ＩＬ−８の分泌が亢進すると、好中球などの免疫細胞が誘引される。免疫細胞が多量の炎症性サイトカインを放出することによって炎症性疾患がさらに進行する。このため、γ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、潰瘍性大腸炎、クローン病などの腸管上皮における炎症性疾患の治療又は予防に使用されてもよい。実施例５に示すように、当該組成物は、腸管上皮のみならず、精巣上体の脂肪組織及び皮下の脂肪組織における炎症性サイトカイン及びケモカインの発現も抑制することが示された。このため、当該組成物は、炎症性疾患の治療又は予防に使用するのが好適である。
【００４５】
本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。当該組成物は、γ−オリザノールが治療上有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なγ−オリザノールの量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。当該組成物の投与量は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。当該組成物を分割して投与する場合、当該組成物は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、当該組成物は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００４６】
本実施の形態に係るγ−オリザノールを封入する粒子、例えばＰＬＧＡ粒子は、下記実施例４に示されたように、腸管上皮細胞への取り込みが長期間にわたって維持される。このため、下記実施例２、５に示されたように、本実施の形態に係るγ−オリザノール封入粒子を含む組成物を１週毎又は２週毎に投与することで、インスリン抵抗性の改善、血糖値、体重増加並びに脂質吸収の抑制、血漿中の中性脂肪の濃度の低下、ＥＲストレスの抑制、及び炎症の抑制等の作用を得ることができる。よって、当該γ−オリザノール封入粒子を含む組成物は、患者に対して１日以上の投与間隔をあけて投与されてもよい。当該投与間隔は、
７日以上１４日以下であってもよい。
【００４７】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る組成物は、生体適合性粒子に封入することでγ−オリザノールの腸管からの吸収効率が高まるため、より少ない用量でγ−オリザノールの作用を得ることができる。
【００４８】
また、本実施の形態に係る組成物は、γ−オリザノールを生体適合性粒子に封入しない場合と比較して、低用量で十分な作用が得られるので、投与回数を減らすことができる。また、投与が容易で、かつ大量投与による副作用を防止できるため、安全性を高めることができる。
【００４９】
なお、本実施の形態では、γ−オリザノールを封入する生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのＰＬＧＡ又はそのＰＥＧ修飾体を含むものでもよいこととした。ＰＬＧＡは、生体に対する刺激や毒性が低い生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性を備えるため、人体への投与に適している。また、ＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、血中安定性が向上するため、代謝吸収安定性等の薬物動態プロファイルを最適化するのに有用である。また、γ−オリザノールを封入したＰＬＧＡ及びＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、腸管の粘膜層及び腸管壁に停留し、封入するγ−オリザノールを徐放すると考えられる。このため、より少ない用量で比較的長期にわたってγ−オリザノールの作用を得ることができる。
【００５０】
また、本実施の形態に係る組成物を患者に投与することにより肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患を治療又は予防する方法であってもよい。また、本実施の形態に係る組成物は、肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患の治療薬又は予防薬としての使用のためのものであってもよい。また、本実施の形態は、肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患を治療又は予防するための医薬の製造のための本実施の形態に係る組成物の使用であってもよい。
【００５１】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
【００５２】
本実施の形態に係る飲食物は、上記実施の形態１に係る組成物を含む。下記実施例２にあるように当該組成物は、経口投与で各種作用をもたらすため、飲食物の原料として用いることができる。
【００５３】
上記組成物を飲食物の原料として用いる場合の飲食物の形態は、例えば、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶、緑茶等の飲料、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム、ゼリー等の菓子、麺、パン、米飯、ビスケット等の穀類加工品、ソーセージ、ハム、かまぼこ等の練り製品、バター、ヨーグルト等の乳製品、ふりかけ、調味料等である。なお、当該飲食物には、甘味料、香料、着色料等の添加物が含まれてもよい。
【００５４】
本実施の形態に係る飲食物は、血糖値、体重増加及び脂質吸収の抑制作用等を有する上記組成物を含むため、インスリン抵抗性の改善のために飲食されるのが好適である。また、当該飲食物は、例えば、肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病及び動脈硬化症から選択される疾患の治療又は予防のために飲食されてもよい。当該飲食物は、ＥＲストレスを抑制するため、ＥＲストレスの抑制、又はＥＲストレスに関連する疾患の治療又は予防のために飲食されてもよい。この他、当該飲食物は、冠動脈疾患、高血圧、メタボリックシンドローム、神経変性疾患及び双極性障害等の疾患の治療又は予防のために飲食されてもよい。
【００５５】
また、本実施の形態に係る飲食物は、腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌を抑制する上記組成物を含むため、腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌を抑制するために飲食されるのが好適である。また、本実施の形態に係る飲食物は、炎症性疾患の治療又は予防のために飲食されてもよい。
【００５６】
飲食物中の有効成分としての上記組成物の含有量は通常０．０００１〜１００重量％、好ましくは１〜９５重量％である。有効成分としての上記組成物の摂取量が、成人１日当たり１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｇ、より好ましくは１００ｍｇ〜５０ｇの範囲であればよい。
【００５７】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る飲食物は、上記実施の形態１に係る生体適合性粒子に封入されたγ−オリザノールを含む。このため、当該飲食物を摂取することで、γ−オリザノールを効率よく体内に取り入れることができる。また、飲食物として加工することで、味、におい、風味等を嗜好に合わせて加えることができる。さらに、飲食物として加工することで、生体適合性粒子に封入されたγ−オリザノールを、食事を介して手軽に摂取することができる。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００５９】
実施例１：γ−オリザノール封入粒子の作製
γ−オリザノールを封入したＰＬＧＡ粒子を作製した。２ｇのＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ７５２０、乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）と０．１ｇのγ−オリザノール（和光純薬工業社製）とを、アセトン４０ｍｌ及びエタノール２０ｍｌの混合溶媒に溶解しポリマー溶液とした。これを４０℃、４００ｒｐｍで攪拌した０．５重量％ポリビニルアルコール溶液（ゴーセノール（商標）ＥＧ５０、日本合成化学工業社製）１２０ｍｌ中に一定速度（４ｍｌ／ｍｉｎ）で滴下し、γ−オリザノール封入粒子懸濁液を得た。続いて減圧下４０℃、１００ｒｐｍで攪拌を続けながら、混合溶媒を留去した。約２時間の混合溶媒留去後、懸濁液をフィルターろ過（目開き３２μｍ）し、ろ液を一晩凍結乾燥し、γ−オリザノール封入粒子の乾燥粉末を得た。得られた乾燥粉末の、個数平均粒子径は１９８ｎｍ、ＰＬＧＡに対するγ−オリザノールの封入率は３．４９±０．１１％（ｗ／ｖ）であった。γ−オリザノール封入粒子のゼータ電位は、２１．０ｍＶであった。
ここで、個数平均粒子径の定義は以下のように定義した。その粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を累積中位径（平均粒子径）として一般的に粒度分布を評価するパラメータとして定義した。平均粒子径は、ナノ粒子を蒸留水に懸濁したサンプルをＭｉｃｒｏｔｒａｃｋ  ＵＰＡ１５０（日機装社製）を用いて光散乱法で計測した。【００６０】
実施例２：遺伝性肥満マウスにおけるγ−オリザノール封入粒子の評価（１）
実施例１で作製したγ−オリザノール封入粒子をマウスに経口投与して評価した。
まず、γ−オリザノール封入粒子を精製水に５％、１．２５％、０．３１％（ｗ／ｖ）で懸濁した。対照としてのγ−オリザノールは、０．５％（ｗ／ｖ）メチルセルロース溶液（和光純薬社製）に０．０５％、３．２％（０．５、３２ｍｇ／ｍｌ）で懸濁した。
次に、ｏｂ／ｏｂマウス（５週齢、雄、Ｂ６．Ｌｅｐｏｂ／Ｊマウス（ホモ接合体（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ））、日本チャールズリバー社製）にγ−オリザノール封入粒子懸濁液及びγ−オリザノール懸濁液を、それぞれゾンデを用いて経口投与した（ｎ＝６）。詳細には、γ−オリザノール封入粒子懸濁液を、γ−オリザノールとして２週間おきに２日間、５日間の休薬期間をおいて、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重／１４日間でマウスに投与を行い、１４日間観察した。１日あたりの投与量はそれぞれ１．１、４．４及び１７．５μｇ／ｇ体重／日である。一方、γ−オリザノール懸濁液を、１日あたり５及び３２０μｇ／ｇ体重／日でマウスに２８日間連続経口投与を行い、４週間観察した。【００６１】
投与開始から１週間後と２週間後のマウスの体重及び血糖値を測定した。血糖値の測定には簡易血糖測定器（メディセーフ（登録商標）ミニ；テルモ社製）を用いた。また、耐糖能を評価するために、投与開始から１０日後に経口ブドウ糖負荷試験を行った。当該試験では、１８時間の絶食後、ゾンデを用いて０．７５ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、投与から２時間後までの血糖値を測定した。【００６２】
γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスに関して、５μｇ／ｇ体重／日投与群について血漿中の中性脂肪及びインスリンと糞便中の脂質とを定量、及びβ細胞におけるＥＲストレスを評価するために、投与開始から２週間後に血液、糞便、膵島をマウスから採取した。血漿中の中性脂肪は、トリグリセリドＥ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。糞便中の脂質は、Ｆｏｌｃｈ法により抽出した。なお、糞便中の脂質の定量はｎ＝２で行った。血漿中のインスリン濃度は、超高感度マウスインスリン測定キット（森永生化学研究所社製）を用いて測定した。【００６３】
β細胞におけるＥＲストレスの評価では、ＥＲストレスマーカー遺伝子（Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４、Ｘｂｐ１ｓ）の発現量を解析した。まず、膵島中のＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、合成したｃＤＮＡよりＥＲストレスマーカー遺伝子の発現量を解析した。【００６４】
（結果）
γ−オリザノール封入粒子投与後のマウスの体重を図１（Ａ）に示す。γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスでは、いずれの投与量においてもｖｅｈｉｃｌｅと比較して投与２週間後の体重増加が有意に抑制された（ｐ＜０．０５又は０．０１）。一方、図１（Ｂ）に示すように、γ−オリザノールを投与したマウスでは、体重増加の有意な抑制が見られなかった。【００６５】
γ−オリザノール封入粒子投与後のマウスの血糖値を図２（Ａ）に示す。γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスでは、１．３μｇ／ｇ体重投与群において、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して投与１週間後（ｐ＜０．０５）及び２週間後（ｐ＜０．０１）の血糖値が有意に減少した。また、５μｇ／ｇ体重投与群及び０．３μｇ／ｇ体重投与群において、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して投与２週間後の血糖値が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。一方、図２（Ｂ）に示すように、γ−オリザノールを投与したマウスでは、血糖値の有意な減少が見られなかった。【００６６】
経口ブドウ糖負荷試験の結果を図３に示す。図３（Ａ）に示すように、γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスにおいて、０．３μｇ／ｇ体重投与群では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してブドウ糖負荷後１５、１２０分における血糖値が有意に減少した。１．３μｇ／ｇ体重投与群及び５μｇ／ｇ体重投与群では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してブドウ糖負荷後１５、３０、１２０分における血糖値が有意に減少した。図３（Ｂ）は、ブドウ糖負荷後１２０分間におけるＡＵＣを示す。γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスのすべての群において、ＡＵＣは、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して有意に小さかった。一方、γ−オリザノールを投与したマウスでは、ｖｅｈｉｃｌｅと同程度の血糖値を示し（図３（Ｃ）、（Ｄ））、血糖値の減少は見られなかった。【００６７】
図４（Ａ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与したマウス（５μｇ／ｇ体重投与群）における血漿中の中性脂肪の濃度を示す。血漿中の中性脂肪の濃度は、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して減少する傾向にあることが確認された。図４（Ｂ）は、γ−オリザノール封入粒子を投与したマウス（５μｇ／ｇ体重投与群）における糞便中の脂質の量を示す。糞便中の脂質の量は、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して増加する傾向にあることが確認された。これらの結果から、γ−オリザノール封入粒子を投与することによって、マウスの脂質吸収が抑制されることが示唆された。【００６８】
図５は、γ−オリザノール封入粒子を投与したマウス（５μｇ／ｇ体重投与群）における血漿中のインスリンの濃度を示す。γ−オリザノール封入粒子を投与してもインスリンの濃度に変化はほとんど見られなかった。ｏｂ／ｏｂマウスは、インスリン抵抗性を示すモデルマウスであることと、γ−オリザノール封入粒子を投与したマウスでは血糖値が有意に減少したこととを考慮すると（図２（Ａ）参照）、γ−オリザノール封入粒子によってインスリン抵抗性が改善されたことが示唆された。【００６９】
図６は、ｖｅｈｉｃｌｅと比較したγ−オリザノール封入粒子を投与したマウス（５μｇ／ｇ体重投与群）におけるＥＲストレスマーカー遺伝子（Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４、Ｘｂｐ１ｓ）の発現量を示す。Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４、Ｘｂｐ１ｓの発現量は、いずれも低下する傾向にあることが確認された。これにより、γ−オリザノール封入粒子によるβ細胞におけるＥＲストレスの抑制作用が示唆された。【００７０】
実施例３：ヒト腸管上皮細胞株を用いたγ−オリザノール封入粒子のＴＮＦ−α刺激に対するＩＬ−８分泌抑制作用の評価
（細胞の調製）
細胞は、Ｃａｃｏ−２（ＲＣＢ０９８８、理化学研究所）を用いた。Ｃａｃｏ−２を１００ｍｌの培養皿でセミコンフルまで培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｄ５７９６、シグマアルドリッチ社製）を用いた。培地には、非必須アミノ酸（Ｍ７１４５、シグマアルドリッチ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（以下、「ＰＳ」とする。Ｇｉｂｃｏ、ライフテクノロジーズジャパン社製）を添加した。
継代５０の細胞を、０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡではがし、２４穴ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの濃度で播いた。１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％非必須アミノ酸及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭで１４日間培養した。１日おきに培地を交換し、十分に分化させた細胞を以下の実験に用いた。【００７１】
（前処理）
ＴＮＦ−αで刺激する２４時間前に培地を取り除き、１ウェルに対して１ｍｌのＰＢＳで細胞を２回洗浄した。続いて、各ウェルの培地を、用時調製したγ−オリザノール、γ−オリザノール封入粒子又はＦＩＴＣ封入粒子を加えた１％ＰＳを含む１ｍｌのＤＭＥＭに交換し、２４時間培養した。ここで使用したγ−オリザノール、γ−オリザノール封入粒子又はＦＩＴＣ封入粒子を含む培地は、次のように調製した。
γ−オリザノールに関しては、γ−オリザノール（１５２−０１２７２、和光純薬工業社製）を１０ｍｇ／ｍｌになるようにアセトンに溶解し、希釈系列をアセトンで調製後、培地に添加した（アセトンの最終濃度は０．１％）。【００７２】
γ−オリザノール封入粒子に関しては、実施例１と同様に作製した封入率３．１８±０．０６％（ｗ／ｖ）、個数平均粒子径２２０ｎｍのγ−オリザノール封入粒子を用いた。γ−オリザノール封入粒子を、ＰＬＧＡとして滅菌水で１５．７２ｍｇ／ｍｌ（原末５００μｇ／ｍｌ相当）に調製した。さらに培地で３．１４ｍｇ／ｍｌ（原末１００μｇ／ｍｌ相当）に希釈し、これを培地で１０倍希釈系列に調製した。
ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）封入粒子に関しては、実施例１と同様に作製した封入率４．０６％（ｗ／ｖ）、個数平均粒子径２２５ｎｍのＦＩＴＣ封入粒子を、上記γ−オリザノール封入粒子と同様に培地で調製した。
なお、前処理で用いる培地は用時調製した。【００７３】
（ＴＮＦ−α刺激）
前処理用の培地を取り除いた後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。続いて、ＴＮＦ−α（Ｔ６６７４‐１０ＵＧ、シグマアルドリッチ社製）を５０ｎｇ／ｍｌあるいは１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した１％ＦＢＳ及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭを各ウェルに加え、２４時間培養した。２４時間培養後、培養上清を１．５ｍｌチューブに回収した。なお、ＴＮＦ−αは、１００μｇ／ｍｌで蒸留水に溶解し、−２０℃に保存したものを用いた。なお、培地は用時調製した。【００７４】
（ＩＬ−８の定量）
回収した上清に対してＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を行い、上清中のＩＬ−８の量を測定した。ＥＬＩＳＡ用キット（Ｄ８０００Ｃ、Ｒ＆Ｄ社製）のプロトコールに従って行った。同時に上清中の総タンパク量をビシンコニン酸法（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。データの統計解析には、１ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔを用いた。【００７５】
（結果）
図７は、ＥＬＩＳＡで測定されたＩＬ−８の量を総タンパク量で補正した値を示す。図７（Ａ）は、γ−オリザノールで前処理した場合の上清中のＩＬ−８の量を示す。１μｇ／ｍｌのγ−オリザノールでＩＬ−８の量の低下がみられたが、γ−オリザノールなし（０μｌ／ｍｌ）、０．１μｇ／ｍｌと比較して有意差はなかった。
図７（Ｂ）は、γ−オリザノール封入粒子で前処理した場合の上清中のＩＬ−８の量を示す。γ−オリザノールなし（０μｌ／ｍｌ）と比較して、１μｇ／ｍｌのγ−オリザノール原末相当量でＩＬ−８の量の有意な低下がみられた。
図７（Ｃ）は、ＰＬＧＡ粒子の対照として用いたＦＩＴＣ封入粒子で前処理した場合の上清中のＩＬ−８の量を示す。ＦＩＴＣ封入粒子なしと比較して、いずれの濃度でも有意な差はみられなかった。【００７６】
ＩＬ−８の産生量は、種々の因子によって刺激された腸管上皮細胞において増大する。ＩＬ−８の分泌亢進は、好中球などの免疫細胞を誘引し、誘引された免疫細胞が多量の炎症性サイトカインを放出することによって炎症がさらに進行する。本実施例の結果により、γ−オリザノール封入粒子は、腸管上皮細胞における優れた抗炎症作用を有する。【００７７】
実施例４：ヒト腸管上皮細胞へのＦＩＴＣ封入粒子の取り込みの評価
（細胞の調製）
上記実施例３で用いたＣａｃｏ‐２を同様に培養した。継代４９の細胞を、０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡではがし、３５ｍｍガラス（Ｄ１１０４００、松波ガラス社製）に３×１０５細胞／ウェルの濃度で播いた。１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭで２１日間培養した。１日おきに培地を交換し、十分に分化させた細胞を以下の実験に用いた。【００７８】
（前処理）
ＦＩＴＣ封入粒子の添加３０分前に培地を取り除き、１ウェルに対して２ｍｌのＰＢＳで細胞を２回洗浄した。続いて、各ウェルの培地を、１％ＰＳを含むＤＭＥＭ（血清なし）に交換した。次に、培地をＦＩＴＣ封入粒子又はＦＩＴＣを加えた１％ＰＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭに交換し、２時間、３７℃でインキュベーションした。ここで使用したＦＩＴＣ封入粒子及びＦＩＴＣを含む培地は、次のように調製した。
ＦＩＴＣ封入粒子に関しては、実施例１と同様に作製した封入率４．０６％（ｗ／ｖ）、個数平均粒子径２２５ｎｍのＦＩＴＣ封入粒子を、水に溶解して１ｍＭ（９．５９ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に調製し、１％ＰＳを含むＤＭＥＭで希釈した。粒子濃度は、０．０９５９ｍｇ／ｍｌ（ＦＩＴＣとして１０μＭ）であった。
ＦＩＴＣに関しては、ＦＩＴＣ原末（ＦＩＴＣ−Ｉ  ３４３−０３６６４、同仁化学研究所製）を０．１％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で１０ｍＭに調製し、１％ＰＳを含むＤＭＥＭで希釈した。【００７９】
（サンプルの取得と共焦点レーザー顕微鏡による評価）
上記２時間のインキュベーション後、７．５μＭ  ｃｅｌｌＭａｓｋ（商標）及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭを２ｍｌ／ウェルで添加し、３７℃でインキュベーションし、ＨＢＳＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ  １４１７５−０９５、ライフテクノロジーズジャパン社製）で５分間×３回洗浄した。そして、冷却したメタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩで封入し、０日（２時間）後のサンプルを得た。
ＰＢＳで洗浄後、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭに培地で細胞を培養し（１日おきに培地交換）、上記前処理でのインキュベーション開始から１日、３日、７日後それぞれの時点で細胞を固定した。固定前に７．５μＭ  ｃｅｌｌＭａｓｋ（商標）及び１％ＰＳを含むＤＭＥＭを２ｍｌ／ウェルで添加し、３７℃でインキュベーションし、ＨＢＳＳバッファーで５分間×３回洗浄した。続いて、メタノールで固定した際、細胞膜を染めるｃｅｌｌＭａｓｋ（商標）が溶出したため、細胞をホルマリンで固定し、０．１％ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘを含むＰＢＳで１０分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩで封入し、１日後、３日後及び７日後のサンプルを得た。
上記のように得た各サンプルは、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン共焦点顕微鏡システムＡ１＋、ニコン社製）で撮影し、各濃度における蛍光強度を評価した。【００８０】
（結果）
図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ０日（２時間）後、１日後、３日後及び７日後のサンプルにおいて共焦点レーザー顕微鏡で撮影されたＦＩＴＣ封入粒子及びＦＩＴＣの蛍光強度の平均値を示す。ＦＩＴＣ封入粒子は、細胞への暴露後少なくとも７日間以上は、ＰＬＧＡに封入されていないＦＩＴＣよりも細胞内に多く取り込まれていることが示された。【００８１】
以上の結果をまとめると、γ−オリザノール封入粒子は、２週に一度、２日間経口投与された肥満マウス（０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重）のインスリン抵抗性及び糖代謝を改善した。これらの作用は、ＰＬＧＡ粒子に封入していないγ−オリザノールを１４日間経口投与（γ−オリザノールの総投与量は５μｇ／ｇ体重投与群と同じ）された肥満マウスでは全く見られなかった。本実施例におけるγ−オリザノール封入粒子は、上記非特許文献１におけるγ−オリザノールの１４日間経口投与（３２０μｇ／ｇ×１４＝４４８０μｇ／ｇ）と比較して、１／５３３〜１／６４の用量で同じ作用をもたらしたことになる。また、γ−オリザノール封入粒子には、脂質代謝を改善し、ＥＲストレスを抑制する傾向が見られた。【００８２】
また、γ−オリザノール封入粒子は、腸管上皮細胞に対するＴＮＦ−α刺激で誘導されるＩＬ−８の分泌を抑制した。これにより、γ−オリザノール封入粒子は、腸管上皮においてＩＬ−８が関連する潰瘍性大腸炎、クローン病などの炎症性疾患などに有効であることが示唆された。【００８３】
γ−オリザノールを封入するＰＬＧＡ粒子は、少なくとも７日以上にわたって、腸管上皮細胞への取り込みが増加した結果から、γ−オリザノール封入粒子の上記実施例で示した優れた各種作用は、経口投与したγ−オリザノール封入粒子が主に腸管に分布し、投与後７日間以上にわたって粘膜層及び腸管壁に停留し、γ−オリザノールを放出することによると考えられる。すなわち、γ−オリザノールをＰＬＧＡ粒子に封入することによって、γ−オリザノールの腸管における停留及び吸収が格段に亢進し、本実施例におけるγ−オリザノールの低用量での格別な作用をもたらしたと推測される。なお、ＰＬＧＡ粒子の細胞への取り込みは、１４日にわたって維持されることも確認した。【００８４】
実施例５：遺伝性肥満マウスにおけるγ−オリザノール封入粒子の評価（２）
（実験動物）
ｏｂ／ｏｂマウスを２４℃で明期１２時間／暗期１２時間のサイクルで飼育した。マウスは、飼料及び水を自由に摂取することができる状態で飼育された。マウスの体重を毎週測定した。【００８５】
（γ−オリザノールの投与）
ＰＬＧＡ粒子に封入されたγ−オリザノールを蒸留水に溶解し（以下、「Ｎａｎｏ  Ｏｒｚ」とする）、２週毎に２日間、ゾンデで１日に０．３、１．３又は５μｇ／ｇ体重の投与量でマウスに投与した。ＰＬＧＡ粒子に封入されていないγ−オリザノール溶液として、γ−オリザノール（和光純薬工業社製）を０．５％メチルセルロース溶液に溶解した（以下、「Ｏｒｚ」とする）。Ｏｒｚを４週間毎日、ゾンデで胃内に投与した（５又は３２０μｇ／ｇ体重／日）。【００８６】
（代謝の評価）
マウスの尾静脈から全血を採取し、簡易血糖測定器を用いて血糖を測定した。さらに血液試料を眼窩後静脈の網状組織から採取した。ブドウ糖負荷試験のために、マウスに、１８時間絶食後に０．７５ｇ／ｋｇ体重でグルコースを投与した。血糖値を、所定の時間で測定した。また、インスリン耐性試験のために、インスリン（０．５ユニット／ｋｇ体重；イーライリリー社製）を、４時間絶食後にマウスの腹腔内に注射した。血漿中の中性脂肪（トリグリセリド）の濃度は、トリグリセリドＥ−テストワコーで決定された。【００８７】
（組織におけるＥＲストレス、炎症の評価）
マウスから視床下部、膵島、腸間膜の脂肪組織、肝臓、精巣上体の脂肪組織及び皮下の脂肪組織を採取し、ＥＲストレスマーカー遺伝子（Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓ）、炎症マーカー遺伝子（ＴＮＦα及びＭＣＰ−１）の発現量を、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いて定量した。膵島は、コラゲナーゼ消化（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ；ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってマウスから単離し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（商標）勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７；シグマ−アルドリッチ社製）で精製した。【００８８】
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、全ＲＮＡを各組織から抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、定量リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆａｓｔ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、及びＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ｍＲＮＡレベルは、１８Ｓ  ｒＲＮＡで正規化した。【００８９】
（統計解析）
データは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）で表した。１要因分散分析、反復測定分散分析及び反復測定分散分析に続く多重比較検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ法）を適宜用いた。２群間の差の解析では、スチューデントのｔ検定を用いた。差は、Ｐ＜０．０５で有意とみなした。【００９０】
（結果）
以下、本実施例の結果を示す。図９は、遺伝性肥満マウスの体重の経時変化を示す（ｎ＝１４）。図９（Ａ）によれば、ＰＬＧＡ粒子に封入したＮａｎｏ  Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、かなり低い投与量でも有意な体重増加抑制が示された。一方、図９（Ｂ）によれば、ＰＬＧＡ粒子に封入されていないＯｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、３２０μｇ／ｇ体重／日で投与しても体重増加の有意な抑制が見られなかった。【００９１】
図１０は、遺伝性肥満マウスの血糖値の経時変化を示す（ｎ＝１４）。図１０（Ａ）によれば、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、Ｏｒｚの最大投与量の約１／１００でも高血糖が確実に改善された。一方、図１０（Ｂ）によれば、Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、３２０μｇ／ｇ体重／日で投与しても血糖値に有意な変化が見られなかった。よって、遺伝性肥満マウスにおける高血糖は、Ｏｒｚと比較して、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚによって顕著に改善されることが示された。【００９２】
ブドウ糖負荷試験の結果を図１１に示す（ｎ＝１４）。図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）によれば、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、低い投与量でも耐糖能の著しい低下が顕著に改善された。一方、図１１（Ｃ）及び図１１（Ｄ）によれば、Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、３２０μｇ／ｇ体重／日で投与しても耐糖能の著しい低下の改善は見られなかった。【００９３】
インスリン耐性試験の結果を図１２に示す（ｎ＝１４）。図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）によれば、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、低い投与量でもインスリン耐性が有意に改善された。一方、図１２（Ｃ）及び図１２（Ｄ）によれば、Ｏｒｚを投与した遺伝性肥満マウスでは、３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもインスリン耐性の改善は見られなかった。【００９４】
図１３は、遺伝性肥満マウスにおける血漿中の中性脂肪の濃度を示す（ｎ＝６）。中性脂肪の濃度は、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚを投与した場合に低い投与量でも有意に抑制したが、同じ投与量のＯｒｚでは中性脂肪の濃度は抑制されなかった。【００９５】
図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）は、それぞれ視床下部におけるＣｈｏｐ及びＥＲｄｊ４の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＣｈｏｐの発現量を抑制しなかった。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＥＲｄｊ４の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＣｈｏｐの発現量を抑制しなかった。【００９６】
図１４（Ｃ）及び図１４（Ｄ）は、それぞれ膵島におけるＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＥＲｄｊ４の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＥＲｄｊ４の発現量を抑制しなかった。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を抑制しなかった。【００９７】
図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）は、それぞれ腸間膜の脂肪組織におけるＣｈｏｐ及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｏｒｚは、３２０μｇ／ｇ体重／日でＣｈｏｐの発現を有意に抑制した。一方、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制した。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、５μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制しなかった。【００９８】
図１５（Ｃ）及び図１５（Ｄ）は、それぞれ肝臓におけるＣｈｏｐ及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＥＲｄｊ４の発現量を抑制しなかった。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を抑制しなかった。【００９９】
図１６（Ａ）及び図１６（Ｂ）は、それぞれ精巣上体の脂肪組織におけるＴＮＦα及びＭＣＰ−１の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＴＮＦαの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＴＮＦαの発現量を抑制しなかった。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＭＣＰ−１の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＭＣＰ−１の発現量を抑制しなかった。【０１００】
図１６（Ｃ）及び図１６（Ｄ）は、それぞれ皮下の脂肪組織におけるＴＮＦα及びＭＣＰ−１の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＴＮＦαの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＴＮＦαの発現量を抑制しなかった。また、Ｎｏｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＭＣＰ−１の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＭＣＰ−１の発現量を抑制しなかった。【０１０１】
図１４及び図１５の結果から、γ−オリザノールは、過剰量である３２０μｇ／ｇ体重／日を投与しても視床下部、膵島及び肝臓におけるＥＲストレスを抑制することができなかったが、ＰＬＧＡ粒子に封入したγ−オリザノールは、かなり低い投与量で視床下部、膵島、腸間膜の脂肪組織及び肝臓におけるＥＲストレスを抑制することが示唆された。また、図１６の結果から、γ−オリザノールは、過剰量である３２０μｇ／ｇ体重／日を投与しても精巣上体の脂肪組織及び皮下の脂肪組織における炎症を抑制することができなかったが、ＰＬＧＡ粒子に封入したγ−オリザノールは、かなり低い投与量で精巣上体の脂肪組織及び皮下の脂肪組織における炎症を抑制することが示唆された。【０１０２】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲、実施の形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１０３】
本出願は、２０１２年１２月２１日に出願された日本国特許出願２０１２−２８０３０３号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１２−２８０３０３号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、インスリン抵抗性の改善、あるいは肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び潰瘍性大腸炎、クローン病などの腸管炎症性疾患を含む炎症性疾患等の疾患の治療又は予防に好適である。本発明を適用することにより、当該疾患の治療又は予防の成績が向上し、患者の生活の質が確保される。
【図１】
2014098190.tif 000003
【図２】
2014098190.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月21日(2014.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む組成物であって、
前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む組成物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
インスリン抵抗性の改善に使用される、
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
小胞体ストレスの抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌の抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、
ことを特徴とする請求項１、３乃至５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
患者に対して１日以上の投与間隔をあけて投与される、
ことを特徴とする請求項１、３乃至６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記投与間隔は、
７日以上１４日以下である、
ことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１、３乃至８のいずれか一項に記載の組成物を含む飲食物。
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月23日(2015.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む組成物であって、
前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む組成物。
【請求項２】
インスリン抵抗性の改善に使用される、
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
小胞体ストレスの抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
腸管上皮細胞からのＩＬ−８の分泌の抑制に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
患者に対して１日以上の投与間隔をあけて投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記投与間隔は、
７日以上１４日以下である、
ことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組成物を含む飲食物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すなわち、本発明の第１の観点に係る組成物は、
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む組成物であって、
前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１，０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）は、それぞれ視床下部におけるＣｈｏｐ及びＥＲｄｊ４の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＣｈｏｐの発現量を抑制しなかった。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＥＲｄｊ４の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＥＲｄｊ４の発現量を抑制しなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
図１４（Ｃ）及び図１４（Ｄ）は、それぞれ膵島におけるＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＥＲｄｊ４の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＥＲｄｊ４の発現量を抑制しなかった。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を抑制しなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）は、それぞれ腸間膜の脂肪組織におけるＣｈｏｐ及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｏｒｚは、３２０μｇ／ｇ体重／日でＣｈｏｐの発現を有意に抑制した。一方、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制した。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、５μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制しなかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
図１５（Ｃ）及び図１５（Ｄ）は、それぞれ肝臓におけるＣｈｏｐ及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＣｈｏｐの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＣｈｏｐの発現量を抑制しなかった。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＸｂｐ１ｓの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＸｂｐ１ｓの発現量を抑制しなかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
図１６（Ａ）及び図１６（Ｂ）は、それぞれ精巣上体の脂肪組織におけるＴＮＦα及びＭＣＰ−１の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＴＮＦαの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＴＮＦαの発現量を抑制しなかった。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３及び１．３μｇ／ｇ体重の投与量でＭＣＰ−１の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＭＣＰ−１の発現量を抑制しなかった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
図１６（Ｃ）及び図１６（Ｄ）は、それぞれ皮下の脂肪組織におけるＴＮＦα及びＭＣＰ−１の発現量を示す（Ｎ＝８）。Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＴＮＦαの発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＴＮＦαの発現量を抑制しなかった。また、Ｎａｎｏ  Ｏｒｚは、０．３、１．３及び５μｇ／ｇ体重の投与量でＭＣＰ−１の発現量を有意に抑制したが、Ｏｒｚは３２０μｇ／ｇ体重／日で投与してもＭＣＰ−１の発現量を抑制しなかった。
【国際調査報告】
2014098190.tif 000019
2014098190.tif 000020
2014098190.tif 000021
2014098190.tif 000022
2014098190.tif 000023