(57)【要約】  炭素数１〜１０のアルデヒドを効果的に除去することのできる酵素剤を提供する。この酵素剤は、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌が産生したアルデヒドデヒドロゲナーゼと、該アルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体を有効成分とする。酵素剤はｐＨ４〜７であり、酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、酵素剤でアセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムから生成するフェロシアン化第２鉄の水溶液（３．９ｍＬ）の吸光度（６６０ｎｍ）として０．０５〜３である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌が産生したアルデヒドデヒドロゲナーゼと、該アルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体を有効成分とする酵素剤であって、
ｐＨ４〜７であり、
酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、酵素剤でアセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムからフェロシアン化第２鉄を生成させる場合の該フェロシアン化第２鉄の水溶液（３．９ｍＬ）の吸光度（６６０ｎｍ）として０．０５〜３である酵素剤。
【請求項２】
請求項１記載の酵素剤であって、酢酸菌がグルコンアセトバクター・スウィングシ（Gluconacetobacter swingsii）である請求項１記載の酵素剤。
【請求項３】
請求項１記載の酵素剤であって、酢酸菌がグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）である請求項１記載の酵素剤。
【請求項４】
請求項１記載の酵素剤であって、酢酸菌がグルコンアセトバクター・ユーロペウス（Gluconacetobacter europaeus）である請求項１記載の酵素剤。
【請求項５】
請求項１記載の酵素剤であって、酢酸菌がグルコンアセトバクター・マルタセティ（Gluconacetobacter maltaceti）である請求項１記載の酵素剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素剤であって、粉末状である酵素剤。
【請求項７】
請求項１記載の酵素剤の製造方法であって、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）の酢酸菌を、糖質、ビタミン、ミネラル及びエタノールを含む培地により酢酸酸度４％未満で培養し、その培養液中の酢酸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼと細胞膜との複合体を有効成分として含有させる酵素剤の製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の酵素剤の製造方法であって、酢酸菌の培養を酢酸酸度２〜３．９％で停止する酵素剤の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８記載の製造方法であって、エタノール濃度３％以上の培地を使用する酵素剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の酵素剤の製造方法であって、酢酸酸度６％以上で生育可能なグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌を使用する酵素剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載の酵素剤の製造方法であって、酢酸菌として、グルコンアセトバクター・スウィングシ（Gluconacetobacter swingsii）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ユーロペウス（Gluconacetobacter europaeus）及びグルコンアセトバクター・マルタセティ（Gluconacetobacter maltaceti）から選ばれる少なくとも一種を使用する酵素剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素剤を有効成分として含有するアルデヒド除去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸菌の細胞膜から産生されたアルデヒドデヒドロゲナーゼと、該アルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体を酵素活性の有効成分とする酵素剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素数１〜１０のアルデヒドは、酸化力に富み、生体にとって有害であり、例えば、生活習慣病やガンの原因となったり、細胞の老化を促進させたりすることが知られている。例えば、ホルムアルデヒドは、粘膜への刺激を与える急性毒性がある。アセトアルデヒドは、飲酒時の悪酔いを引き起こし食道ガンの原因ともなる。【０００３】
また、多くのアルデヒドは特有の臭気を示す。例えば、オクタナールやノネナールは、ヒトの体表面から発せられる不快臭成分として感知され、アセトアルデヒドは、飲酒時又は喫煙時に口腔内や呼気から発せられる臭気として感知され、ヘキサナールやヘプタナールは、米や大豆等の食糧から発せられる劣化臭成分として感知される。【０００４】
上述のアルデヒドの生体への有害性は、５０年来言われ続けているが、特に現代人では、糖質や脂質の過剰摂取や生活ストレスが問題になることから、ヒトの体内外に存在する炭素数１〜１０のアルデヒドを低減させることが、重要な課題となっている。【０００５】
従来、アルデヒド除去剤として、表面をアミノ基で修飾した担体に、アルコール酸化酵素遺伝子を組み込んだ麹菌由来の酵素を固定化したものが知られている（特許文献１）。
しかしながら、このアルデヒド除去剤の有効性は、炭素数１〜１０のアルデヒドのうち炭素数１のホルムアルデヒドに限られている。【０００６】
また、中鎖アルデヒドを低減させるために、グルコノバクター属及びアセトバクター属から選ばれる酢酸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼを活用することが知られている（特許文献２、特許文献３）。
しかしながら、本発明者がAcetobacter pasteurianus(IFO3283)、Gluconobacter oxidans(IFO12528)を用いてこれらの実施例を検証したところ、アルデヒド又は培養物由来の臭いが感知され、アルデヒド臭の低減効果が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４３７４５９５号公報
【特許文献２】特許第２５２１４６０号公報
【特許文献３】特公平６−９７９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の従来技術に対し、本発明は、炭素数１〜１０のアルデヒドを効果的に除去することのできる酵素剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、酢酸の製造に使用される酢酸菌のうち、酢酸耐性の高いグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌をエタノールの存在下で培養し、かつ、その培養を酢酸酸度４％以上になる前に停止すると、酢酸菌の細胞膜に結合しているアルデヒドデヒドロゲナーゼが、高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を発揮することを見出し、本発明を想到するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌が産生したアルデヒドデヒドロゲナーゼと、該アルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体を有効成分とする酵素剤であって、
ｐＨ４〜７であり、
酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、酵素剤でアセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムからフェロシアン化第２鉄を生成させる場合の該フェロシアン化第２鉄の水溶液（３．９ｍＬ）の吸光度（６６０ｎｍ）として０．０５〜３である酵素剤を提供する。【００１１】
また、本発明は、上述の酵素剤の製造方法であって、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）の酢酸菌を、糖質、ビタミン、ミネラル及びエタノールを含む培地により酢酸酸度４％未満で培養し、その培養液中の酢酸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼと細胞膜との複合体を有効成分とする酵素剤の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の酵素剤によれば、炭素数１〜１０のアルデヒドを効果的に除去することができる。また、酢酸菌によるアルデヒドデヒドロゲナーゼと細胞膜との複合体は、従来、酢の製造に使用されており、安全に使用することができる。
このため、本発明の酵素剤を、経口剤、口腔内清浄剤、外用剤、化粧料、食品添加剤、住居用脱臭剤などとして使用することにより、生体に有害なアルデヒドを低減し、また、アルデヒドによる悪臭を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜３及び比較例１、２の、酢酸菌培養停止時の酢酸酸度と酢酸菌培養液のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性との関係図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別断らない限り、部は質量部を意味し、％は質量％を意味する。
【００１５】
＜酢酸菌＞
本発明の酵素剤は、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌を特定の条件で培養することにより得られるアルデヒドデヒドロゲナーゼと、そのアルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体を有効成分とする。
【００１６】
酢酸菌は、糖や糖アルコールを利用して生育し、エタノールを酸化して酢酸を生成する微生物の総称である。醸造酢の製造に使用される代表的な酢酸菌の種類として、アセトバクタ−（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、グルコンアセトバクタ−（Gluconacetobacter）属等を挙げることができるが、このうちグルコンアセトバクター属には酢酸耐性の高い株が存在し、グルコンアセトバクター属の酢酸菌を利用して、さらに酢酸耐性の高い形質転換株を得ることも行われている（特許４３２６９６７号公報参照）。
酢酸耐性が高い点から、本発明ではグルコンアセトバクター属の酢酸菌を使用する。
【００１７】
グルコンアセトバクター属の菌としては、
グルコンアセトバクター・ディアゾトロフィカス（gluconacetobacter diazotrophicus）、
グルコンアセトバクター・アゾトカプタンス（gluconacetobacter azotocaptans）、
グルコンアセトバクター・スウィングシ（Gluconacetobacter swingsii）、
グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、
グルコンアセトバクター・ユーロペウス（Gluconacetobacter europaeus）、
グルコンアセトバクター・マルタセティ（Gluconacetobacter maltaceti）、
グルコンアセトバクター・コンブチャ（Gluconacetobacter kombuchae）、
グルコンアセトバクター・ハンゼニイ（Gluconacetobacter hansenii）、及び
グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）等をあげることができ、中でも高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を得られることから、グルコンアセトバクター・スウィングシ、グルコンアセトバクター・キシリヌス、グルコンアセトバクター・ユーロペウス、及びグルコンアセトバクター・マルタセティ等を挙げることができる。これらの一種を用いてもよく、複数腫を用いてもよい。
【００１８】
通常、酢酸菌を培養すると、酢酸菌の増殖に伴って培地中の酢酸酸度が上がり、培地の酢酸酸度が６％以上になると、そのような培地中の酢酸菌は１２時間以内に殆どが死滅する。これに対し、本発明においては、酢酸酸度６％以上で生育可能なものが好ましく、グルコンアセトバクター属の酢酸菌を使用する。ここで、酢酸酸度６％以上で生育可能とは、酢酸酸度が６％以上でも、酢酸菌が酢酸を産生しつつ増殖できることをいう。
【００１９】
このように酢酸耐性の高い酢酸菌を使用するのは、本発明者が、酢酸耐性のある酢酸菌を使用し、その酢酸菌の培養を、少なくとも糖質、ビタミン、ミネラル及びエタノールを含む培地、特にエタノール濃度３％以上の培地で開始し、酢酸酸度４％未満で、特に酢酸酸度２〜３．９％になった時点で培養を停止することにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼ単位重量あたりの活性が顕著に高まること、即ち、活性のある酵素の数が顕著に増加するとの知見を得たことによる。
【００２０】
なお、酢酸菌の酢酸耐性に関し、生育可能な酢酸酸度の上限が１０％を超えるものでも、それが６％のものとアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性はほぼ同じとなる。
【００２１】
＜ｐＨ＞
本発明の酵素剤は、クエン酸などのｐＨ緩衝液を用い、ｐＨ４〜７、特にｐＨ５〜６．５に調整されている。
このｐＨ値は、酵素剤が液剤の場合には、そのままｐＨメータで測定することができる。酵素剤が粉末等の固形の場合には、固形分濃度１〜１０％となるように蒸留水に分散することにより測定される。
【００２２】
酵素剤のｐＨをｐＨ４〜７に維持することにより、酵素剤におるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を長く維持することができ、例えば、製剤化後１ヵ月が経過しても当初のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の７０％以上にすることができる。
【００２３】
＜酢酸菌の取得＞
本発明で使用する酢酸菌は、従来、醸造酢の製造に使用されているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性の高いもの、即ち、酢酸酸度５％以上で生育可能なもの、特に酢酸酸度６％以上で生育可能なものを、スクリーニングすることにより得ることができる。
【００２４】
また、酢酸酸度５％以上で生育可能な酢酸菌としては、特許４３２６９６７号公報等に記載されている方法で形質転換したグルコンアセトバクター属の酢酸菌を使用してもよい。
【００２５】
＜酵素剤の製造方法＞
本発明の酵素剤は、上述のように、従来、醸造酢の製造に使用されているグルコンアセトバクター属の酢酸菌をスクリーニングすることなどにより取得した、酢酸耐性の高い酢酸菌、好ましくは酢酸酸度６％以上で生育可能なものを用いて、次のようにして製造することができる。
＜酢酸菌の培養＞
グルコンアセトバクター属の酢酸菌を、少なくとも、グルコース等を由来とする糖質、酵母エキス等を由来とするビタミン及びミネラル類、並びにエタノール含む培地で培養する。この場合、培地におけるエタノール濃度は３％以上とし、品温２５〜３５℃、通気量は培地１Ｌあたり０．０２〜５Ｌ／ｍｉｎの培養条件で培養することが好ましい。この培養は、培養液中の酢酸酸度４％未満で行う。即ち、培地中酢酸菌の増殖に伴い、培地中のエタノールがアルデヒドを経て酢酸に酸化され、培地中の酢酸酸度は上昇するが、本発明においては酢酸酸度が４％になる前に、好ましくは酢酸酸度が２〜３．９％のとき、特に２．５〜３．５％のときに培養を停止する。
【００２６】
なお、日本農林規格（ＪＡＳ）による醸造酢の酢酸濃度が４％以上であり、家庭等で調味料として用いられている酢は、酢酸酸度４〜５％であるため、一般に酢を製造する場合、酢酸菌の培養は、培養液における酢酸酸度が４％以上になるまで続けられる。特に、醸造酢の生産効率を高める点からは、４％よりもできるだけ高い酢酸酸度になるまで培養を続け、酢酸酸度が高められた培養液を清水で希釈することで酢を製造する（特許3437324号公報）。
これに対し、本発明は、上述のように、グルコンアセトバクター属の酢酸菌が、酢酸酸度６％以上で生育可能なものであっても、培養液の酢酸酸度が４％になる前に停止する点で、従来の酢酸菌の培養方法と異なる。
【００２７】
培養の停止方法としては、酢酸菌が好気性微生物であることから、通気を停止し、酸素の供給を断つことが好ましい。
【００２８】
以上のように培養した酢酸菌において、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、酢酸菌の細胞膜と結合し、複合体を形成している。複合体を形成していることは、例えば、電子顕微鏡を用いることで視認することができる。
【００２９】
＜アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＞
本発明の酵素剤に含まれる、アルデヒドデヒドロゲナーゼと細胞膜との複合体のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたり、アセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムからフェロシアン化第２鉄を生成させる場合の該フェロシアン化第２鉄の水溶液（３．９ｍＬ）の吸光度（６６０ｎｍ）として０．０５〜３である。このアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、より具体的には、Ｗｏｏｄらによるフェリシアナイドを電子受容体とする方法（Methods in Enzymology,Volume5,1962,Page287-291）に準じて、次のように計測することができる。
【００３０】
即ち、培養停止後の培養液に遠心分離処理を行い、マックルベイン緩衝液（ｐＨ５）で濃度を調整することにより酢酸菌０．１ｍｇ／ｍＬの酢酸菌分散液を調製し、その０．１ｍＬ（酢酸菌体として０．０１ｍｇ）と、アセトアルデヒド０．０２ｍｍｏｌ、フェリシアン化カリウム０．０１ｍｍｏｌを含む水溶液０．９ｍＬを３７℃で２０分保持することにより、酢酸菌分散液中のアルデヒドデヒドロゲナーゼをアルデヒドに反応させてアルデヒドを酸化し、この酸化の副反応として、フェリシアン化カリウムをフェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）に還元する。この反応を、Ｄｕｐａｎｏｌ液０．５ｍＬを加えて停止し、さらに蒸留水２．５ｍＬを加え、フェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）の６６０ｎｍの吸光度を計測する。この場合、ブランク試験として、酢酸菌分散液を配合していない試料を測定する。
【００３１】
こうして６６０ｎｍの吸光度として測定される、酢酸菌０．０１ｍｇあたりのプルシアンブルーの生成量は、酢酸菌における蛋白質含量が６０％であることから、酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたりのプルシアンブルーの生成量となり、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって酸化されたアルデヒドの量に対応する。本発明では、こうして測定される酢酸菌由来の蛋白質０．００６ｍｇあたりの吸光度（６６０ｎｍ）が、前述のように０．０５〜３となるが、この数値は、従前のアルデヒドデヒドロゲナーゼと細胞膜との複合体では達成することができず、本発明で使用する複合体は、従前の複合体に対して、酢酸菌由来の蛋白質単位重量あたりの活性のある酵素の数が顕著に増加している点で異なっている。
【００３２】
なお、酢酸菌には複数種の蛋白質が含まれ、アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成する蛋白質は、８６ｋＤ及び５５ｋＤに確認されている。この蛋白質は、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供することで存在を確認することができる。
【００３３】
＜製剤化＞
上述のように培養を酢酸酸度４％未満で培養を停止した培養液には、アルデヒドデヒドロゲナーゼが細菌膜に結合した複合体として含まれている。また、培養液には、酢酸、アミノ酸、その他有機酸、ペプチド、セルロース等の産生多糖類、メライジン等のメイラード反応物なども含まれている。一般に、味噌、醤油等の発酵食品では、培養によって生成する複雑な香味を使用して食品中の臭みを抑制するが、本発明では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の経時的安定性の点から、アルデヒドデヒドロゲナーゼと細菌膜との複合体を、上述の酢酸などの発酵成分から分離して用いることが好ましい。そこで、まず、培養液に遠心処理（３０００〜１５０００ｒｐｍ）、膜濃縮処理、乾燥処理等を行うことにより酢酸菌体を１〜１００％に濃縮する。この菌体には、アルデヒドデヒドロゲナーゼが細胞膜に結合した状態のままで含まれている。次に、濃縮した培養液から、さらに培地成分を除去するため、洗浄してもよい。洗浄方法は特に限定されないが、例えば、酢酸菌体１０％に濃縮した培養液を、クエン酸やリン酸の緩衝液に希釈混合後、遠心処理を施し、その上清を除去することで培地成分を除去する。
【００３４】
濃縮し、必要により酢酸などの発酵成分を除去した後は、ｐＨ緩衝液を用いてｐＨを４〜７、特に５〜６．５に調整し、常法により、粉末剤、顆粒剤、カプセル、液剤、クリームなど、任意の剤型の酵素剤に形成することができる。このように緩衝液でｐＨを調整してから粉末剤などに製剤化すると、粉末剤が空気中の水分を吸収してもｐＨが変動せず、酵素活性が安定なｐＨを維持することができる。ｐＨの調整に使用する緩衝液としては、不揮発性で経時安定性に優れている点からクエン酸が好ましい。
【００３５】
製剤化の具体的方法としては、例えば、粉末剤は、酢酸菌体にデキストリン、乳糖等を配合し、噴霧乾燥処理又は凍結乾燥処理を施すことで、熱ダメージを抑えながら乾燥する。カプセル剤は、酢酸菌体を中心にゼラチンやグア―ガムの被膜処理を施し成型する。アルデヒドデヒドロゲナーゼと細菌膜との複合体は水に不溶であるため、液剤は澱粉などで粘度１Ｐａ・ｓ以上に増粘し、液剤中に酢酸菌体を分散させる。
【００３６】
なお、製剤化にあたり、賦形剤として乳由来の蛋白質や大豆由来の蛋白質などを使用した場合に、賦形剤として使用した蛋白質と酢酸菌由来の蛋白質とは、全蛋白質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供した際の泳動パターンにより区別することができる。
【００３７】
また、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、その酵素活性を発現させるために補酵素を必要とするが、補酵素も細胞膜に結合しているので、アルデヒドデヒドロゲナーゼを細胞膜に結合したまま製剤化することにより、製剤化した後も酵素活性を得ることができる。
【００３８】
＜酵素剤の用途＞
本発明の酵素剤は、炭素数１〜１０のアルデヒドを除去する効果を有する。ここで、炭素数１〜１０のアルデヒドとしては、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ブタナール、グリセルアルデヒド、マロンジアルデヒド、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノネナール、デカナール、イソオクタナール、イソノネナール、イソデカナール等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の酵素剤は、アルデヒドを低減したいあらゆる場面で使用することができる。例えば、生体内のアルデヒドを低減させるため経口摂取してもよく、外用剤として塗布してもよい。アルデヒドは、揮発時における濃度が僅か０．１から数十ｐｐｍで人体への酸化ストレスや臭いの原因となる。経口摂取や塗布により本発明の酵素剤を用いる場合、その使用量は、アルデヒドを低減できる量とすればよく、例えば経口摂取１食又は塗布１００平方センチあたり、１〜１００ｍｇとすることができる。
また、本発明の酵素剤は、建物の壁材やヒトの集まる公共施設の臭い等の環境中のアルデヒドを低減又は解消するために、壁材等に塗布又は噴霧してもよい。
【００４０】
本発明の酵素剤を食品に用いる場合、本発明の酵素剤の効果を損なわない範囲で、次の原料と組合せて用いることができる。即ち、トレハロース、スクロース、アスパルテーム、フェニルアラニン等の甘味料、クエン酸、酢酸、乳酸、リン酸、レモン果汁などの酸味料、蔗糖、乳糖、塩、醤油等のその他調味料、ウコン、肝臓エキス、ケイヒ、ウイキョウ、シャクヤク、甘草等の生薬、コラーゲン、ヒアルロン酸、プラセンタ、コエンザイムＱ１０、コンドロイチン、ローヤルゼリー等の美容原料、タウリン、アラニン等のアミノ酸、大豆多糖類、グアーガム、キサンタンガム等の増粘多糖類、グレープフルーツ、レモン等の香料が挙げられる。
【００４１】
化粧品に用いる場合、本発明の酵素剤に組み合わせて用いることのできるものとしては、シクロデキストリン、珪藻土、活性炭等の多孔質微粒子、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、又はデキストリン等の多糖類、ポリフェノール、ユーカリエキス、茶カテキン、又はメマツヨイグサ抽出物等の植物抽出物、イソプロピルメチルフェノール、トリクロ酸、安息香酸、ベンジルグリセリルエーテル、銀化合物、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベン、又はフェノキシエタノール、ヒドロキサム酸誘導体、クララエキス、又はアルキルジエタノール、エタノール等の殺菌又は防腐剤、ポリシロキサン、タルク、環状シロキサン等のシリコン油、ミリスチン酸イソプロピル、スクワラン、又はパラフィン等の油脂、グリセルリチン酸、尿素、オウゴンエキス、オウバクエキス等の抗炎症剤、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化アルミニウム等の収斂剤、ヒアルロン酸、コラーゲン、コエンザイムＱ１０、コンドロイチン、プラセンタ、セラミド、エラスチン、アスタキサンチン、ローヤルゼリー、アロエエキス、白金ナノコロイド、レチノイン酸、レチノール、加水分解コムギ、シカクマメエキス、ラクトフェリン、豆乳発酵液又はＥＧＦ等の美容成分、アルブチン、フラーレン、トラネキサム酸、ハイドロキノン、又はヨクイニンエキス等の美白成分、ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、又はメトキシ桂皮酸誘導体等の紫外線吸収剤、ペンチレングリコール、ヘキサンジオール、カプリリルグリコール、グリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、アデノシン等の保湿剤、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、オレフィンスルホン酸塩、脂肪酸塩、又はジアルキルスルホコハク酸塩等のアニオン界面活性剤、ポリエチレングリコール硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体等の非イオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、又は塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等の陽イオン界面活性剤、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、イミダゾリニウムベタイン、卵黄レシチン、又は大豆レシチン等の両性界面活性剤、各種アミノ酸、各種ビタミン、各種ペプチド、高級脂肪酸、多価アルコール、増粘剤、炭酸塩、乳化剤、香料等が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する。
実施例１【００４３】
グルコース０．５部、酵母エキス０．５部、エタノール４．８部、酢酸１．５部、清水９２．７部に、酢酸菌株（Gluconacetobacter swingsii QPJ株)０．０１部を添加し、品温３０℃、通気量は培地１Ｌあたり０．１Ｌ／ｍｉｎの条件で培養を開始した。Gluconacetobacter swingsii QPJ株は、醸造酢の製造に使用されているグルコンアセトバクター・スウィングシ（Gluconacetobacter swingsii）から、酢酸酸度６％以上で生育可能な菌株をスクリーニングすることにより得たものである。【００４４】
培養開始１８時間後、酢酸酸度２．２％となるところで通気を止め培養を停止し、酢酸菌培養液を得た。得られた酢酸菌培養液に、回転数１００００ｒｐｍの遠心処理を施して固形分１０％まで濃縮後、質量換算で濃縮物の１０倍量のクエン酸緩衝液（ｐＨ５）を用いて十分に混合した。再度、回転数１００００ｒｐｍの遠心処理を施し、上清を除くことで培養液成分を除去した。そして、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）で濃度調整し、液状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）（アルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞膜複合体を含有）を得た。【００４５】
＜消臭試験＞
濾紙を敷いた３００ｍＬ容の三角フラスコを用意した。この濾紙に、アセトアルデヒド１μＬと実施例１の液状の酵素剤１ｍＬとを注下し、蓋をした。この時、三角フラスコのヘッドスペースのアセトアルデヒド濃度は、ガス検知管により１００ｐｐｍであった。さらに、３７℃３０分間の保温処理を行った結果、アセトアルデヒド臭は消失し、三角フラスコのヘッドスペースの空気のアルデヒド濃度は、ガス検知管により０．２ｐｐｍ以下に軽減されていた。【００４６】
アセトアルデヒドに代えてノネナールを使用し、上述と同様に消臭試験を行った。その結果、保温処理後にノネナール臭は消失し、ガス検知管によるノネナール濃度は０．２ｐｐｍ以下に軽減されていた。【００４７】
実施例１の液状の酵素剤１ｍＬに代えて水を使用し、同様に消臭試験を行ったところ、アセトアルデヒド臭及びノネナール臭はそれぞれ消失せず、特有の不快臭を呈していた。また、ガス検知管によるアセトアルデヒド濃度は１００ｐｐｍを示していた。【００４８】
＜アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＞
実施例１の液状の酵素剤のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を次のように測定した。
マックルベリン緩衝液（ｐＨ５）０．１２５ｍＬ、０．１Ｍアセトアルデヒド０．２ｍＬ、実施例１の液状の酵素剤（酢酸菌０．１ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを混合し、蒸留水で総量０．８ｍＬに調整した。これに、０．１Ｍフェリシアン化カリウム０．１ｍＬを加え、３７℃で２０分間保温処理を施し、Ｄｕｐａｎｏｌ液０．５ｍＬを加えて酵素反応を停止した。次に、２．５ｍＬの蒸留水を混合し、室温で２０分間放置した後、生成したプルシアンブルーの呈色を吸光度６６０ｎｍで測定した。この場合、ブランク試験として、酢酸菌分散液を配合していない試料を測定した。【００４９】
その結果、実施例１の液状の酵素剤０．０１ｍＬのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、アルデヒドの酸化と並行して生成したプルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）として、０．７であった。【００５０】
また、実施例１の液状の酵素剤を３７℃で７日間保存した後、同様にアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）は０．６であった。【００５１】
＜酢酸菌の生育上限酸度＞
培養開始時のエタノール濃度を高める以外は同様にして酢酸菌を培養し、高酢酸酸度における生育の有無を確認したところ、酢酸酸度８％以上まで生育することが確認できた。【００５２】
実施例２、３及び比較例１、２
実施例１において、培養停止の酢酸酸度を表１のようにする以外は、実施例１と同様にして酢酸菌を培養し、得られた液状の酵素剤を用いて消臭試験を行い、また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
ここで、比較例１の酢酸培養液は、培養開始時の酢酸培養液である。【００５３】
実施例１〜３及び比較例１、２の消臭試験結果とアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の測定結果を表１に示す。また、これらの培養停止時の酢酸酸度と吸光度又はｐＨの関係を図１に示す。【００５４】
【表１】
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【００５５】
比較例３
実施例３で得た、酢酸酸度３．６％で培養停止した酢酸菌培養液について、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）で濃度調整する際に界面活性剤Triton０．１％を配合する以外は、実施例３に準じて、液状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）を得た。これを３７℃で７日間保管した結果、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）は０．００８に低下していた。この酵素剤では、遠心処理を施した際に上清の画分から酵素活性が得られたことより、酵素が細胞膜から分離していることを確認した。【００５６】
比較例４
実施例３で得た、酢酸酸度３．６％で培養停止した酢酸菌培養液について、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）を酢酸緩衝液（ｐＨ３）に置き変えた以外は、実施例３に準じて、液状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）を得た。これを３７℃で７日間保管した結果、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）は０．０６であった。【００５７】
比較例５
酢酸菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxidans）(IFO3287)を使用し、実施例１に準じて酢酸菌を培養し、酢酸酸度３％で培養を停止した酢酸菌培養液のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）は０．００２であった。また、この培養液について実施例１に準じて消臭試験を行ったところ、アセトアルデヒド特有の臭いが消失していなかった。
このグルコノバクター・オキシダンスの酢酸耐性は低く、酢酸酸度６％で生育することができなかった。【００５８】
実施例４
実施例１のGluconacetobacter swingsii QPJ株に代えてGluconacetobacter xylinum QPJ株を使用した。このGluconacetobacter xylinum QPJ株は、醸造酢の製造に使用されているグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）から、酢酸酸度６％以上で生育可能なものをスクリーニングすることにより得たものである。【００５９】
この菌株を使用し、酢酸酸度３．７％で培養停止する以外は、実施例１と同様にして液状の酵素剤を得、そのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）として、０．８であった。また、実施例１と同様にアセトアルデヒドとノネナールについて消臭試験を行ったところ、アセトアルデヒド臭及びノネナール臭がそれぞれ消失した。【００６０】
実施例５
実施例１のGluconacetobacter swingsii QPJ株に代えてGluconacetobacter europaeus QPJ株を使用した。このGluconacetobacter europaeus QPJ株は、醸造酢の製造に使用されているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸酸度６％以上で生育可能なものをスクリーニングすることにより得たものである。【００６１】
この菌株を使用し、酢酸酸度３．７％で培養停止する以外は、実施例１と同様にして液状の酵素剤を得、そのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）として、１．０であった。また、実施例１と同様にアセトアルデヒドとノネナールについて消臭試験を行ったところ、アセトアルデヒド臭及びノネナール臭がそれぞれ消失した。【００６２】
実施例６
実施例１のGluconacetobacter swingsii QPJ株に代えてGluconacetobacter maltaceti((IFO14815)を使用した。このGluconacetobacter maltaceti((IFO14815)は、醸造酢の製造に使用されており、酢酸酸度６％以上で生育可能である。【００６３】
この菌株を使用し、酢酸酸度３．７％で培養停止する以外は、実施例１と同様にして液状の酵素剤を得、そのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、プルシアンブルーの吸光度（６６０ｎｍ）として、０．３であった。また、実施例１と同様にアセトアルデヒドとノネナールについて消臭試験を行ったところ、アセトアルデヒド臭及びノネナール臭がそれぞれ消失した。【００６４】
実施例７（食品）
実施例２で得られた液状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）１％、デキストリン（乾燥質量）９％、清水９０％となるように、デキストリン及び清水により濃度調整を行った。これに凍結乾燥処理を施し粉末状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）を調製した。【００６５】
ぶどう糖７９．９部、ゼラチン１６部、クエン酸３部、上述の粉末状の酵素剤（酢酸菌由来の蛋白質６％含有）１部、アスパルテーム０．１部を混合し、常法により１粒４ｇタブレット錠剤を調製した。得られたタブレット錠剤を摂食したところ、アセトアルデヒドによる口腔の悪臭が改善された。【００６６】
実施例８（消臭スプレー）
液化石油ガス９０部、２エチルヘキサン酸セチル７．７部、無水シリカ１部、硬化ヒマシ油１部、グリセリン０．２部、実施例７と同様の粉末状の酵素剤０．１部を混合し、常法により１缶１８０ｍＬのスプレー剤を調製した。得られたスプレー剤を、５０代男性が２４時間着用した綿製の肌着に噴霧塗布したところ、ノネナールによる悪臭が低減した。【００６７】
実施例９（ウェットシート状化粧料）
エタノール１０部、クロルヒドロキシアルミニウム２部、実施例７と同様の粉末状の酵素剤０．１部、タルク１部、硬化ヒマシ油０．１部、メントール０．０５部、清水８６．７５部を、常法に則り、１０ｃｍ角のポリエステル製のシートに浸漬させた。５０代男性が、得られたウェットシート状化粧料を使用し首筋を拭いたしたところ、ノネナールによる悪臭が低減した。【００６８】
実施例１０（皮膚洗浄料）
グリセリン５５部、ジプロピレングリコール８部、ジグリセリン（商品名「ジグリセリン８０１」、阪本薬品工業（株）社製）８部、エタノール２部、硬化ヒマシ油０．５部、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（商品名「Ｔｗｅｅｎ  Ｌ１２０」、花王（株）社製）０．５部、香料０．２％部。ショ糖脂肪酸エステル０．１部、クエン酸０．１部、クエン酸ナトリウム０．１部、水酸化カリウム０．１部、フェノキシエタノール０．１部、清水１８．３部を混合した。次いで、酸化マグネシウム５部、実施例７と同様の粉末状の酵素剤０．１部、ビニルメチコン１部を添加し混合した。５０代男性が、得られた皮膚洗浄料を使用し腋の下を洗浄したところ、ノネナールによる悪臭低減効果に優れていた。【００６９】
実施例１１（飲料）
実施例７と同様の粉末状の酵素剤０．１部、ウコン粉末０．０５部、アラニン０．０５部、肝臓エキス０．０５部、ビタミンＣ０．０５部、ビタミンＥ０．０５部、クエン酸０．００５部、酢酸０．００５部、蔗糖４部、大豆食物繊維０．０５部、清水９５．５９部を混合し、常法により１本１００ｇの容器詰め飲料を調製した。ビール８００ｍＬを飲酒後、得られた容器詰め飲料を摂取したところ、アセトアルデヒドによる飲酒時の悪酔いが軽減された。
【図１】
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【国際調査報告】
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