(57)【要約】  本発明は、ヘプシジンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の新規スプライシングバリアント並びに該バリアントによりコードされるタンパク質および該タンパク質に対する抗体を提供する。本発明はまた、前記バリアントおよびタンパク質の存在を指標として癌を診断する方法および診断薬を提供する。  ヘプシジンをコードするｍＲＮＡにおいてエキソン２が欠失した核酸断片。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘプシジンをコードするｍＲＮＡにおいてエキソン２が欠失した核酸断片。
【請求項２】
配列番号３の塩基配列を有する、請求項１に記載の核酸断片。
【請求項３】
請求項１若しくは２に記載の核酸断片をコードするｃＤＮＡ、または、エキソン１とエキソン３との連結部分を含んでなる該ｃＤＮＡの断片。
【請求項４】
請求項１若しくは２に記載の核酸断片によりコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質に対する抗体または免疫学的に活性なその断片。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体または免疫学的に活性なその断片であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質には結合しない、抗体または免疫学的に活性なその断片。
【請求項７】
請求項３に記載のｃＤＮＡ若しくはその断片を検出するためのプライマーペア、または請求項５に記載の抗体若しくは免疫学的に活性なその断片を含んでなる、癌診断用組成物。
【請求項８】
抗体または免疫学的に活性なその断片が、請求項６に記載の抗体または免疫学的に活性なその断片である、請求項７に記載の癌診断用組成物。
【請求項９】
癌が、肝癌である、請求項７または８に記載の癌診断用組成物。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、癌診断用キット。
【請求項１１】
癌が疑われる対象から得られた生検試料中のエキソン２を欠失したヘプシジンｍＲＮＡの存在若しくは存在量、または、該ｍＲＮＡから翻訳されるプレプロヘプシジンタンパク質の存在若しくは存在量を指標として、生検試料中の癌細胞を検出する方法。
【請求項１２】
癌が疑われる対象から得られた生体液由来の試料中のエキソン２を欠失したヘプシジンｍＲＮＡの存在若しくは存在量、または、該ｍＲＮＡから翻訳されるプレプロヘプシジンタンパク質の存在若しくは存在量を指標として、対象中の癌細胞を検出する方法。
【請求項１３】
生体液由来の試料が、血清または血漿である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生体液由来の試料が、エキソソームである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
癌が、肝癌である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、２０１４年８月２１日に出願された特願２０１４−１６８２００号の優先権の利益を享受する出願であり、その明細書の全体は引用することにより本願に組み込まれるものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ヘプシジンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の新規スプライシングバリアント並びに該バリアントによりコードされるタンパク質および該タンパク質に対する抗体に関する。本発明は、前記バリアントおよびタンパク質の存在を指標として癌を診断する方法および診断薬にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘプシジン（hepcidin）は、鉄代謝制御に重要な液性因子であることから、ヘプシジン測定が様々な鉄代謝異常症の鑑別診断に応用されている。（非特許文献１）。ヘプシジンの主要産生臓器は肝臓であり、ヘプシジンをコードする遺伝子としてＨＡＭＰ遺伝子が同定された(非特許文献２、非特許文献３)。これまで、ヘプシジンと癌との関連についての報告は散見できる程度であり、2008年Kijimaらは肝細胞癌患者の腫瘍部位でヘプシジンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現が低下していること、および、にもかかわらず、ｍＲＮＡレベルの低下が血清中のヘプシジンレベルとは相関しなかったことを報告し（非特許文献４）、2009年Elmonemらは肝細胞癌患者において肝臓のヘプシジンのｍＲＮＡレベルが低下していたことを報告した（非特許文献５）が、腫瘍組織中のｍＲＮＡレベルと血清中のｍＲＮＡレベルとの相関が得られず、ヘプシジンと癌との関係は不明のままである。また、ここでの肝臓のヘプシジンのｍＲＮＡレベルを定量するためのサンプリングは、侵襲性の高い肝生検であり、かつ、手術を伴う採取である点で、肝癌検査を困難なものとしていた。【０００４】
肝生検の困難性を回避するため、これまでのような臓器中のヘプシジンのｍＲＮＡ量を測定する方法に代わり、尿(非特許文献６)や血清(非特許文献７)といった体液中に存在するヘプシジン分子を直接測定する方法が開発された。その測定手段は、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析(SELDI-TOF MS: surface-enchanced laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry)法(非特許文献７)をはじめとする質量分析法（以下、「ＭＳ」と略す）と抗ヘプシジン抗体を用いたＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法(非特許文献８)とに大別することができる。【０００５】
しかし、これら測定方法もそれぞれ課題を抱えている。例えば、ＭＳ法は一般的に定量性が低いといわれる。ＭＳ法では定量性の問題を克服するため、SELDI-TOF MSに続いて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS: matrix assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry)法、液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ（LC-MS/MS: liquid chromatography-tandem mass spectrometry/mass spectrometry)法、弱カチオン交換−飛行時間型質量分析（WCX-TOF MS: weak cation exchanger time of-flight mass spectrometry)法などが開発され、これらはいずれも放射性同位元素で標識したヘプシジン分子による内部標準を用いることで正確な定量性を確保した。また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、ヘプシジンがその内部開裂部位で開裂して生成する3種類のヘプシジンのアイソフォーム（すなわち、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２２およびヘプシジン−２５）を同時定量可能なシステムは有効な手段である（非特許文献９）。しかし、放射性同位元素を使用する点を含め、質量分析計本体は限られた施設にしか設置されていないため利便性が悪い。【０００６】
一方、ＥＬＩＳＡ法の主流は合成ヘプシジン分子をトレーサーとした競合的ＥＬＩＳＡ法である。ヘプシジン−２５はわずか２５アミノ酸からなり、さらに分子内に４つのジスルフィド結合によりコンパクトに折りたたまれた構造をとるため(非特許文献１０)、高力価で特異性の高い抗体を作製することが困難である。また、仮に抗体が得られたとしても、競合的ＥＬＩＳＡ法で得られたヘプシジン−２５の値はＭＳ法で得られた値より見かけ上高い値を示す傾向にある。その理由はＥＬＩＳＡで使用されている抗体がヘプシジン−２５以外のアイソフォーム（すなわち、ヘプシジン−２０およびヘプシジン−２２）などとも反応し、ヘプシジン−２５のみを検出することが困難であるためである(非特許文献１１)。【０００７】
このように、ヘプシジンはその検出が困難である上に、癌との関係もよくわかっていなかった。また、貧血を伴う患者ではヘプシジンの発現が向上している場合があり、ヘプシジンは癌の診断に適した指標ではないと考えられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本内科学会雑誌, 100:2412-2424, 2011
【非特許文献２】FEBS Letters, 480:147-150,2000
【非特許文献３】JBC, 276:7806-7810,2001
【非特許文献４】BMC Cancer, 8:167
【非特許文献５】J. Egyptian Nat. Cancer Inst., 21:333-342
【非特許文献６】Blood, 106:3268-3270, 2005
【非特許文献７】Blood, 108:1381-1387, 2006
【非特許文献８】Blood, 112:4292-4297, 2008
【非特許文献９】Proteomics-Clinical Applications, 3:1256-1264, 2009
【非特許文献１０】JBC, 277:37597-37603,2002
【非特許文献１１】Clinical Chemistry, 56:1570-1579, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘプシジンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の新規スプライシングバリアント並びに該バリアントによりコードされるタンパク質および該タンパク質に対する抗体を提供する。本発明はまた、前記バリアントおよびタンパク質の存在を指標として癌を診断する方法および診断薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、癌患者から、エキソン２を欠失した特徴的なヘプシジンｍＲＮＡのスプライシングバリアントが検出されることを見出した。本発明者らは、このヘプシジンｍＲＮＡのスプライシングバリアントが健常者では検出されないことも見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。【００１１】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ヘプシジンをコードするｍＲＮＡにおいてエキソン２が欠失した核酸断片。
（２）配列番号３の塩基配列を有する、上記（１）に記載の核酸断片。
（３）上記（１）若しくは（２）に記載の核酸断片をコードするｃＤＮＡ、または、エキソン１とエキソン３との連結部分を含んでなる該ｃＤＮＡの断片。
（４）上記（１）若しくは（２）に記載の核酸断片によりコードされるタンパク質。
（５）上記（４）に記載のタンパク質に対する抗体または免疫学的に活性なその断片。
（６）上記（５）に記載の抗体または免疫学的に活性なその断片であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質には結合しない、抗体または免疫学的に活性なその断片。
（７）上記（３）に記載のｃＤＮＡ若しくはその断片を検出するためのプライマーペア、または上記（５）に記載の抗体若しくは免疫学的に活性なその断片を含んでなる、癌診断用組成物。
（８）抗体または免疫学的に活性なその断片が、上記（６）に記載の抗体または免疫学的に活性なその断片である、上記（７）に記載の癌診断用組成物。
（９）癌が、肝癌である、上記（７）または（８）に記載の癌診断用組成物。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれかに記載の組成物を含んでなる、癌診断用キット。
（１１）癌が疑われる対象から得られた生検試料中のエキソン２を欠失したヘプシジンｍＲＮＡの存在若しくは存在量、または、該ｍＲＮＡから翻訳されるプレプロヘプシジンタンパク質の存在若しくは存在量を指標として、生検試料中の癌細胞を検出する方法。
（１２）癌が疑われる対象から得られた生体液由来の試料中のエキソン２を欠失したヘプシジンｍＲＮＡの存在若しくは存在量、または、該ｍＲＮＡから翻訳されるプレプロヘプシジンタンパク質の存在若しくは存在量を指標として、対象中の癌細胞を検出する方法。
（１３）生体液由来の試料が、血清または血漿である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）生体液由来の試料が、エキソソームである、上記（１２）に記載の方法。
（１５）癌が、肝癌である、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。【００１２】
本発明によれば、ヘプシジンのスプライシングバリアントを検出することにより癌を診断することができる。本発明によればまた、体液の検査、例えば、血液検査により癌を診断することができ、検査が簡便である点で有利である。本発明によればさらに、ヘプシジンｍＲＮＡの産生が増加を伴う患者（例えば、貧血を伴う患者）においても、癌を診断し得る点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、肝癌細胞株におけるヘプシジンｍＲＮＡの発現を示す図である。図１Ａは、ヘプシジンｍＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物のアガロース電気泳動の結果を示し、図１Ｂは、図１Ａの矢尻で示された短いｍＲＮＡに由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の配列解読の結果を示し、図１Ｃは、ヘプシジン遺伝子（ＨＡＭＰ）のエキソンおよびイントロンの構造と、選択的スプライシングの様式を示す図である。
【図２】図２は、細胞に正常型またはバリアント型のヘプシジンをコードするｃＤＮＡを導入して、細胞外に分泌されたヘプシジン−２０、２２および２５の量を測定した結果を示す。
【図３】図３は、正常型またはバリアント型のヘプシジンをコードするｃＤＮＡを導入した細胞の培地および細胞溶解物中のヘプシジンのウェスタンブロットの結果を示す。図３Ｂは、図３Ａの部分拡大写真である。
【図４】図４は、肝癌細胞株における、バリアント型（異常型）ｍＲＮＡの細胞内コピー数を測定した結果を示す。２０,０００反応ウェルを搭載したチップを用いたポリメラーゼ連鎖反応による絶対定量システム（デジタルＰＣＲ法）により得られた結果である。
【図５】図５は、肝癌組織における、バリアント型（異常型）ｍＲＮＡの細胞内コピー数を測定した結果を示す。図５Ｂは、異常型と正常型とのコピー数の比を示す。
【図６】図６は、精製したＲＮＡの品質を確認した結果である。図６Ａは、肝癌組織から精製したＲＮＡの電気泳動の結果を示し、図６Ｂは、ＨＬＦ細胞から精製したＲＮＡの電気泳動の結果を示し、図６Ｃは、健常人の血清中エキソソームから精製したＲＮＡの電気泳動の結果を示す。
【図７】図７は、肝癌患者の血清から精製して得たエキソソームにおける、正常型とバリアント型（異常型）ｍＲＮＡのコピー数および異常型の存在比を測定した結果を示す。
【図８】図８は、血清から精製して得たエキソソームにおける異常型ペプシジンｍＲＮＡのコピー数を肝癌患者、慢性肝疾患患者および健常人間で比較した結果を示す。
【図９】図９は、ヘプシジン遺伝子、ヘプシジンの正常型ｍＲＮＡ（図９Ａ）、およびヘプシジンの正常型プレプロタンパク質（図９Ｂ）並びにヘプシジン−２５（図９Ｃ）の構造を例示する図である。
【発明の具体的な説明】
【００１４】
ヘプシジン（hepcidin）とは、哺乳類において、鉄代謝制御に重要な液性因子として知られるタンパク質である。ヘプシジンは、ヒトでは、図９Ａに示されるように１９番染色体に２．６ｋｂにわたり存在するＨＡＭＰ遺伝子によりコードされ、ここから０．４ｋｂのヘプシジンのｍＲＮＡが転写される。この０．４ｋｂのヘプシジンのｍＲＮＡは、コーディング領域としてエキソン１、エキソン２およびエキソン３に対応する塩基配列を有する。ヒトヘプシジンｍＲＮＡは、コーディング領域として、例えば、配列番号１で示される塩基配列を有し、例えば、配列番号２で示される８４アミノ酸のプレプロペプシジンをコードする。ここで、配列番号１の塩基配列において、エキソン１は、１番〜９０番の塩基配列により示され、エキソン２は、９１番〜１５０番の塩基配列により示され、エキソン３は、１５１番〜２５５番の塩基配列により示される。本明細書では、「ヘプシジンｍＲＮＡ」には、天然に存在するヘプシジンの変異体も含まれる。
【００１５】
ヒトヘプシジンｍＲＮＡからは、８４アミノ酸のプレプロヘプシジンが翻訳される（図９Ｂ参照）。プレプロヘプシジンは、アミノ末端（Ｎ末端）の２４アミノ酸のシグナルペプチドが切除されて６０アミノ酸のプロヘプシジンになる（図９Ｂ参照）。プロヘプシジンは、さらにＣ末端側で切断されて、２０アミノ酸のヘプシジン−２０、２２アミノ酸のヘプシジン−２２、または２５アミノ酸のヘプシジン−２５を生成する（図９ＢおよびＣ参照）。これらのヘプシジン−２０、２２および２５がヘプシジンの機能する形態として知られている。具体的には、３種のアイソフォームはそれぞれ抗菌ペプチドとして知られ、中でもヘプシジン−２５は、鉄代謝制御に関わり、腸細胞および網内系細胞表面の細胞内鉄排出トランスポーターであるフェロポルチン（ferroportin）を標的分子として、鉄の吸収および再利用を制御していることが知られている。ヘプシジン−２０は、例えば、配列番号７のアミノ酸配列を有し、ヘプシジン−２２は、例えば、配列番号８のアミノ酸配列を有し、ヘプシジン−２５は、配列番号９のアミノ酸配列を有し得る。
【００１６】
本明細書で用いられる「正常型」または「野生型」とは、ヘプシジンのｍＲＮＡまたはタンパク質が、エキソン１、２および３をすべて備えたｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから翻訳されるヘプシジンタンパク質であることを意味する。
【００１７】
本明細書で用いられる「異常型」または「バリアント型」とは、ヘプシジンのｍＲＮＡまたはタンパク質が、エキソン２を完全に欠失し、エキソン１およびエキソン３とが直接連結してなるｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから翻訳されるヘプシジンタンパク質であることを意味する。すなわち、異常型ヘプシジンは、エキソン２を欠失するヘプシジンｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントである。すなわち、一例として配列番号１の塩基配列および配列番号２のアミノ酸配列に基づいて説明すると、異常型ヘプシジンのｍＲＮＡは、そのコーディング領域として配列番号３の塩基配列を有し、該ｍＲＮＡから翻訳されるヘプシジンタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本明細書で用いられる「コーディング領域」とは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡのタンパク質をコードする領域を意味する。ｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡから転写され、その後、スプライシング、ポリアデニン付加およびキャップ付加等の編集を経て成熟ｍＲＮＡになる。成熟ｍＲＮＡはコーディング領域のほかに、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含んでなる。３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、その３’末端にポリアデニン（ポリＡ）を有する。
【００１９】
本明細書で用いられる「エキソソーム」とは、細胞から細胞外に分泌される直径数十〜１００ｎｍ程度の膜小胞体を意味する。エキソソームは、血中に含まれ、例えば、血清または血漿から単離または濃縮することができる。エキソソームを単離または濃縮する方法は、当業者に周知であり、例えば、エキソソームと他の成分との比重差を利用した超遠心分離による方法、エキソソームの膜表面タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＬＡＭＰ１／２、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）に対する抗体を用いて免疫沈降させる方法、またはエキソソームの血清若しくは血漿中での溶解度に基づく析出方法などが挙げられ、本発明に用いることができる。あるいは、エキソソームの単離または濃縮は、市販されるさまざまなエキソソーム濃縮キットまたは単離キットを用いて行うことができる。エキソソームは膜小胞体であるので、エキソソームの内容物（ヘプシジンのｍＲＮＡを含有し得る）は、細胞溶解用の界面活性剤を含む緩衝液などを用いて抽出することができる。
【００２０】
異常型ヘプシジンは、本発明者らにより初めて発見されたものである。したがって、本発明の一つの側面では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡおよび該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が提供される。ヒトの異常型ヘプシジンｍＲＮＡは、６０塩基からなるエキソン２を欠失するものであり、９０塩基からなるエキソン１と１０５塩基からなるエキソン３とが連結してなるスプライシングバリアントであり得る。エキソン２が６０塩基であるため、異常型ヘプシジンｍＲＮＡでは、エキソン１と３とはインフレームで連結しており、異常型ヘプシジンから翻訳されるタンパク質は、正常型よりも２０アミノ酸短い。異常型ヘプシジンｍＲＮＡは、具体的には、ヘプシジン遺伝子から転写されて選択的スプライシングを経て生成され、例えば、配列番号３に示す塩基配列をコーディング領域として有するｍＲＮＡである。
【００２１】
本発明によれば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡは、癌患者の血液中、より具体的には、血清または血漿中、さらにより具体的には、血液由来のエキソソームに含まれ得る。したがって、本発明のある側面では、異常型ヘプシジンのｍＲＮＡを含んでなるエキソソーム、血清若しくは血漿、または血液が提供される。ヘプシジンは、尿、肺水、唾液、腹水および脳脊椎液などの生体液中に存在するエキソソーム中にも見いだされる。したがって、異常型ヘプシジンｍＲＮＡは、尿、肺水、唾液、腹水および脳脊椎液などの生体液中、並びにこれらの生体液由来のエキソソームにも含まれ、これらの生体液や生体液由来のエキソソームが検査対象の試料であり得る。
【００２２】
異常型ヘプシジンｍＲＮＡは、ヘプシジンのエキソン１と３とがインフレームで直接連結したｍＲＮＡである。本発明によれば、異常型ヘプシジンタンパク質では、シグナルペプチドの切除も、Ｃ末端の２０〜２５アミノ酸の切断も、ほとんど見られない。したがって、本発明では、異常型ヘプシジンタンパク質を、異常型プレプロヘプシジンタンパク質と呼ぶことがある。異常型プレプロヘプシジンタンパク質は、正常型プレプロヘプシジンタンパク質と比較すると、シグナルペプチドの切断部位も、Ｃ末端の２０〜２５アミノ酸の切断部位も有しており、シグナルペプチドの切断部位とＣ末端の２０〜２５アミノ酸の切断部位とに挟まれた領域に存在する、エキソン２に対応する２０アミノ酸が欠失している。したがって、異常型ヘプシジンｍＲＮＡから翻訳されて得られるタンパク質も、異常型である。
【００２３】
本発明では、ヘプシジンのエキソン１と３とがインフレームで直接連結したｍＲＮＡをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が提供される。本発明のｃＤＮＡは、好ましくは、配列番号６の塩基配列を有する。本発明ではまた、本発明のｃＤＮＡの断片が提供される。本発明のｃＤＮＡの断片は、好ましくは、ヘプシジンのエキソン１と３との連結部分を含んでなる断片である。異常型ヘプシジンｃＤＮＡにおいて、配列番号６の９０番目の塩基と９１番目の塩基との連結部が、エキソン１と３との連結部である。したがって、本発明の異常型ヘプシジンのｃＤＮＡの断片は、配列番号６で示される塩基配列の一部の塩基配列を有し、かつ、配列番号６の９０番目の塩基と９１番目の塩基とを含んでなる。ｃＤＮＡは、当業者に周知の方法によりｍＲＮＡから得ることができる。例えば、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として用い、プライマーとしてポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）を用い、逆転写酵素により逆転写することにより得ることができる。本発明のｃＤＮＡの断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡの増幅法により増幅して得られた断片であってもよい。本発明のｃＤＮＡ断片はまた、そのプラス鎖およびマイナス鎖の３’末端に１塩基の突出、例えばアデニン（Ａ）の突出を有していてもよい。アデニン（Ａ）の突出は、エキソポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（通常のＰＣＲに用いられる耐熱性ポリメラーゼ）により得ることができる。アデニンの突出は、ＴＡクローニングに用いられるＴベクターへの目的ＤＮＡ断片のクローニング効率を格段に高める。
【００２４】
本発明のある側面では、異常型プレプロヘプシジン（配列番号４のアミノ酸配列を有する異常型ヘプシジンタンパク質）に対する抗体が提供される。本発明の抗体は、好ましくは、異常型プレプロヘプシジンに対して特異的な抗体であり、例えば、正常型プレプロヘプシジン（配列番号２のアミノ酸配列を有するプレプロヘプシジンタンパク質）を認識しないか、異常型プレプロヘプシジンへの親和性と比較して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．１％以下、または０．０１％以下の親和性を有する。本発明の抗体は、好ましくは、正常型プレプロヘプシジンを認識しないか、異常型プレプロヘプシジンに対して特異的な抗体であり、異常型プレプロヘプシジンへの解離定数（Ｋd1）と正常型プレプロヘプシジンへの解離定数（Ｋd2）の比（すなわち、Ｋd1／Ｋd2）が、例えば、１０-4以下、１０-5以下、１０-6以下、１０-7以下、１０-8以下、１０-9以下、１０-10以下、１０-11以下、または１０-12以下である。あるいは、本発明の抗体は、正常型プレプロヘプシジンを認識しないか、異常型プレプロヘプシジンに対して特異的な抗体であり、正常型プレプロヘプシジンへの解離定数（Ｋd2）が１以下、１０-2以下、１０-3以下、１０-4以下、１０-5以下または１０-6以下であり、かつ、異常型プレプロヘプシジンへの解離定数（Ｋd1）が１０-7以下、１０-8以下、１０-9以下、１０-10以下、１０-11以下、または１０-12以下である。このような抗体は、当業者であれば常法により得ることができる。例えば、正常型プレプロヘプシジンを発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラットおよびウサギ）に異常型プレプロヘプシジンタンパク質を免疫して得ることができる。あるいは、動物（例えば、マウス、ラットおよびウサギ）に異常型プレプロヘプシジンタンパク質を単に免疫して、その後、正常型プレプロヘプシジンタンパク質に親和性を有する抗体を除去することによっても得ることができる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とすることができる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫した動物から常法により得ることができる。本発明の抗体は、異常型プレプロヘプシジンタンパク質を検出することに用いることができる。
【００２５】
本明細書では、抗体の「免疫学的に活性な断片」とは、その抗体の抗原に対する結合能を有する断片であり、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディーおよびｄｓＦｖなどの抗体の断片を意味する。上記抗体断片を得る方法は当業者に周知であり、本発明の断片を得るために用いることができる。
【００２６】
本明細書では、「抗体」は、キメラ抗体およびヒト化抗体を意味することがある。本明細書で用いられる「キメラ抗体」とは、一般的にはヒト以外の哺乳動物由来の抗体の可変領域と、ヒト由来の抗体の定常領域とからなる抗体を意味し、「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト由来の抗体のフレームワーク領域および定常領域とからなる抗体を意味する。キメラ抗体およびヒト化抗体を得る方法は、当業者に周知であり、本発明の抗体を得るために用いることができる。抗体においてＣＤＲを特定する方法も当業者に周知である。
【００２７】
本発明者らは、癌患者（例えば、肝癌患者）の癌組織中（例えば、生検試料中）または血液中には、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が含まれることを見出した。そして、健常者の組織中または血液中には、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質はほとんど検出されなかった。したがって、本発明によれば、癌を有すると疑われる対象の組織中または血液中における異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の存在または存在量を指標として、対象中の癌細胞（例えば、肝癌細胞）を検出することができる（あるいは、対象が癌（例えば、肝癌）であるか否かを診断することができる）。このように、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質は、癌のバイオマーカーとして用いることができる。
【００２８】
ヘプシジンは、肝臓以外にも、脳、肺および食道で発現することが知られている（FEBS Letters 480:147-150,2000）。したがって、本発明のある態様では、癌は、脳癌、肺癌または食道癌であり得る。また、例えば、脳癌は脳脊椎液、肺癌は肺水、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液若しくは喀痰、血液若しくは唾液、食道癌は血液若しくは唾液、またはこれら生体液に含まれるエキソソーム中の異常型ヘプシジンを検査することにより、癌細胞を検出することができる（または癌を診断することができる）が、これに検査する生体液は上記に限定されない。癌と疑われる組織中の異常型ヘプシジンを検査することによっても癌細胞を検出することができる（あるいは、癌を診断することができる）。
【００２９】
異常型ヘプシジンｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質は、異常型プレプロヘプシジンとして翻訳され、その後、その一部はＮ末端の２４アミノ酸のシグナルペプチドが除去されて異常型プロヘプシジンとなる。上記の異常型プレプロヘプシジンおよび異常型プロヘプシジンのいずれも、正常型プレプロヘプシジンおよび正常型プロヘプシジンとはアミノ酸配列が異なり、異常型に特異的な抗体を用いて、特異的に検出することが可能である。本明細書では、異常型ヘプシジンタンパク質とは、異常型プレプロヘプシジンおよび異常型プロヘプシジンを意味する。
【００３０】
本発明のある側面では、異常型ヘプシジンタンパク質を検出する試薬または異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬を含んでなる、癌診断用組成物が提供される。本発明の癌診断用組成物は、例えば、肺癌診断用、食道癌診断用、脳癌診断用または肝癌診断用であり、好ましくは肝癌診断用組成物である。本発明のある態様では、異常型ヘプシジンタンパク質を検出する試薬は、例えば、異常ヘプシジンタンパク質に対する抗体、好ましくは異常型ヘプシジンタンパク質に特異的な抗体を含んでなる。
【００３１】
本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬は、例えば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出するためのプライマーペアであり、例えば、(i)正常型および異常型ヘプシジンｍＲＮＡを増幅することができるプライマーペア、(ii)異常型ヘプシジンｍＲＮＡを増幅するが、正常型ヘプシジンｍＲＮＡを増幅することができないプライマーペア、および、(iii)正常型ヘプシジンｍＲＮＡを増幅するが、異常型ヘプシジンｍＲＮＡ増幅することができないプライマーペアから選択される１以上のプライマーペアとすることができる。ｍＲＮＡの増幅は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行うことができる。以下、プライマーの設定位置と増幅断片の関係を表１に示す。
【００３２】
【表１】
2016027469.tif 000002
【００３３】
本発明のある態様では、プライマーペアは、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せを含んでなり、例えば、フォワードプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン１に対応する部分に設計され得（例えば、配列番号１２、１５または１８）、リバースプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン３に対応する部分に設計され得る（例えば、配列番号１３または１９）。あるいは、フォワードプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン１に対応する部分に設計され得（例えば、配列番号１２、１５または１８）、リバースプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン２に対応する部分に設計され得る（例えば、配列番号１６）。あるいは、フォワードプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン２に対応する部分に設計され得、リバースプライマーは正常型ヘプシジンｍＲＮＡのエキソン３に対応する部分に設計され得る（例えば、配列番号１３または１９）。本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬またはキットは、上記のプライマーペアの１以上を含んでいてもよい。プライマーの設計部位および長さは、増幅させたい核酸の配列に基づいて当業者であれば適宜設定することができる（表１参照）。
【００３４】
本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬は、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出するためのプライマーペアであり、プライマーがそれぞれエキソン１および３に設計されており、正常型と異常型とを該プライマーによる増幅産物の長さの違いにより区別することができる。ある態様では、エキソン２に存在する制限酵素切断部位（例えば、PvuIIの切断部位「CAGCTG」）を制限酵素（例えば、PvuII）で切断し、制限酵素断片長の差異によって正常型と異常型とを区別してもよい。異常型および／または正常型ヘプシジンｍＲＮＡの有無および量の評価には、上記(ii)または(iii)から選択されるプライマーペアをさらに用いてもよい。
【００３５】
当業者であれば、本明細書の記載および表１に基づいてプライマーペアを設計し、増幅の有無や増幅産物の長さに基づいて異常型および／または正常型ヘプシジンｍＲＮＡの有無および量を評価することができる。
【００３６】
本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬は、異常型ヘプシジンｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子であってもよい（例えば、配列番号１１または１７）。異常型と正常型とでは、ヘプシジンはｍＲＮＡの長さが異なるので、例えば、標識核酸とハイブリダイズさせることにより、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出することができる。あるいは、標識核酸をエキソン１と２の連結部（例えば、配列番号１０または１４）、エキソン１と３の連結部（例えば、配列番号１１または１７）、またはエキソン２と３の連結部に設計することにより、異常型または正常型への標識核酸の親和性の差を利用して異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出することができる。標識としては、例えば、蛍光標識、ラジオアイソトープ標識およびビオチン標識が挙げられ、本発明で用いることができる。核酸分子としては、ＤＮＡが挙げられる。
【００３７】
本発明のある側面では、本発明の癌診断用組成物を含んでなるキットが提供される。また、本発明のある態様では、本発明の癌診断用組成物と採血用の容器とを含んでなる癌診断用キットが提供される。本発明のある態様では、本発明の癌診断用キットは、生体液からエキソソームを濃縮する試薬若しくはキット（例えば、エキソソームの膜表面タンパク質に対する抗体若しくは該抗体を固定化したビーズまたはエキソソームの析出試薬）および／または生体液中のエキソソームｍＲＮＡを濃縮する試薬若しくはキット（例えば、ｍＲＮＡの濃縮試薬またはｍＲＮＡの濃縮カラム等）をさらに含んでなる。本発明のある態様では、癌診断用キットには、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する更なる試薬として、制限酵素PvuIIが含まれていてもよい。本発明の癌診断用組成物またはこれを含んでなるキットは、本発明の診断方法を実施するために用いることができる。
【００３８】
本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬またはキットは、エキソン１と３の連結部位に対するプローブを含んでいてもよい。プローブは、標識核酸であり得る。本発明のある態様では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出する試薬またはキットは、エキソン１と３の連結部位にハイブリダイズする核酸（例えば、ＤＮＡ）を表面に固定化した核酸チップである。
【００３９】
本発明のある側面では、癌を有すると疑われる対象の組織中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の存在または存在量を指標として、組織中の癌細胞を検出する方法が提供される。本発明の方法では、癌は、例えば、肺癌、食道癌または脳癌であり得、好ましくは肝癌である。本発明の方法では、癌を有すると疑われる対象の組織から得られた試料中に異常型ヘプシジンｍＲＮＡまた異常型ヘプシジンタンパク質が存在する場合には、該組織中に癌細胞が存在すると判定してよい。あるいは、本発明の方法では、癌を有すると疑われる対象の組織から得られた試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の存在量が、健常者と比較して向上している場合には、該組織中に癌細胞が存在すると判定してもよい。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在量を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が、所定の値であるときに該組織中に癌細胞が存在すると判定することができる。本発明では、所定の値は、０を超える、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１０００以上の値とすることができる。
【００４０】
本発明では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在量の指標として、癌を有すると疑われる対象の組織から得られた試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡと正常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは全ヘプシジンｍＲＮＡとの存在比（すなわち、異常型／正常型の比、または異常型／（正常型＋異常型）の比）を用いてもよく、前記比が健常者と比較して向上している場合には、該組織中に癌細胞が存在することが示される。本発明では、異常型ヘプシジンタンパク質の存在量の指標として、癌を有すると疑われる対象の組織から得られた試料中の異常型ヘプシジンタンパク質と正常型プレプロヘプシジンタンパク質または全プレプロヘプシジンタンパク質との存在比（すなわち、異常型／正常型の比、または異常型／（正常型＋異常型）の比）を用いてもよく、前記比が健常者と比較して向上している場合には、該組織中に癌細胞が存在することが示される。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在比を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型／（正常型＋異常型）の比が、所定の値であるときに該組織中に癌細胞が存在すると判定してもよい。本発明では、所定の値は、０を超える、０．０１以上、０．０２以上、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、０．９５以上、０．９８以上、または０．９９以上の値とすることができる。
【００４１】
本発明のある側面では、癌を有すると疑われる対象の生体液由来の試料（例えば、血液、好ましくは血清または血漿、より好ましくは血液由来のエキソソーム）中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の存在または存在量を指標として、対象が癌細胞を有するかを判定する方法、または対象中の癌細胞を検出する方法が提供される。本発明の方法では、癌は、例えば、肺癌、食道癌または脳癌であり得、好ましくは肝癌である。本発明の方法では、癌を有すると疑われる対象の生体液由来の試料中に異常型ヘプシジンｍＲＮＡまた異常型ヘプシジンタンパク質が存在する場合には、該対象が癌細胞を有する、または、該対象中に癌細胞が存在することが示される。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在量を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が、所定の値であるときに該対象が癌細胞を有する、または該対象中に癌細胞が存在すると判定してもよい。本発明では、所定の値は、０を超える、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１０００以上の値とすることができる。
【００４２】
あるいは、本発明の方法では、癌を有すると疑われる対象の生体液由来の試料（例えば、血液、好ましくは血清または血漿、より好ましくは血液由来のエキソソーム）中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の存在量が、健常者と比較して向上している場合には、該対象が癌細胞を有する、または、該対象中に癌細胞が存在すると判定してもよい。本発明では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在量の指標として、癌を有すると疑われる対象の試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡと正常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは全ヘプシジンｍＲＮＡとの存在比（すなわち、異常型／正常型の比、または異常型／（正常型＋異常型）の比）を用いてもよく、前記比が健常者と比較して向上している場合には、該対象が癌細胞を有する、または、該対象中に癌細胞が存在することが示される。本発明では、異常型ヘプシジンタンパク質の存在量の指標として、癌を有すると疑われる対象の試料中の異常型ヘプシジンタンパク質と正常型プレプロヘプシジンタンパク質または全プレプロヘプシジンタンパク質との存在比（すなわち、異常型／正常型の比、または異常型／（正常型＋異常型）の比）を用いてもよく、前記比が健常者と比較して向上している場合には、該対象が癌細胞を有する、または、該対象中に癌細胞が存在することが示される。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在比を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型／（正常型＋異常型）の比が、所定の値であるときに該対象が癌細胞を有する、または、該対象中に癌細胞が存在すると判定してもよい。本発明では、所定の値は、０を超える、０．０１以上、０．０２以上、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、０．９５以上、０．９８以上、または０．９９以上の値とすることができる。
【００４３】
血清エキソソームからのｍＲＮＡの抽出は、当業者に周知の方法により行うことができ、例えば、エキソソームを構成する膜の可溶化により行うことができる。血清エキソソームからのｍＲＮＡの抽出は、タンパク質の変性、ＤＮＡの除去および／またはＲＮＡの濃縮を伴ってもよい。
【００４４】
本発明のある側面では、癌の診断方法であって、癌を有すると疑われる対象の生検試料または血液由来の試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質を測定する、方法が提供される。本発明のある側面では、癌の診断方法であって、癌を有すると疑われる対象の生検試料または血液由来の試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡまた異常型ヘプシジンタンパク質の存在または存在量を指標とする、方法が提供される。本発明の方法では、癌を有すると疑われる対象の生検試料または血液由来試料中に異常型ヘプシジンｍＲＮＡまた異常型ヘプシジンタンパク質が存在する場合には、患者が癌であると診断することができる。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在量を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が、所定の値であるときに対象が癌細胞を有すると判定してもよい。あるいは、本発明の方法では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまた異常型ヘプシジンタンパク質の存在量が、健常者と比較して向上している場合には、患者が癌であると診断することができる。本発明では、異常型ヘプシジンタンパク質の存在量の指標として、癌を有すると疑われる対象の生検試料または血液由来の試料中の異常型ヘプシジンタンパク質と正常型プレプロヘプシジンタンパク質または全プレプロヘプシジンタンパク質との存在比（すなわち、異常型／正常型の比、または異常型／（正常型＋異常型）の比）を用いてもよく、前記比が健常者と比較して向上している場合には、患者が癌であると診断することができる。異常型ヘプシジンｍＲＮＡの存在比を指標とする場合には、例えば、試料中の異常型／（正常型＋異常型）の比が、所定の値であるときに該組織中に癌細胞が存在すると判定してもよい。異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の存在や存在量は、そのｍＲＮＡまたはタンパク質の存在または存在量に基づいて測定できる。本発明の方法では、癌は、例えば、肺癌、食道癌または脳癌であり得、好ましくは肝癌である。また、本発明の診断方法において、所定の値はそれぞれ、上述した通りの値とすることができる。
【００４５】
上記のように、本発明によれば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡや異常型ヘプシジンタンパク質の存在または量を指標として、対象が癌（例えば、肝臓癌、脳癌、肺癌または食道癌）であるかを診断できるか、対象における癌細胞を検出することができるので、ある種の貧血の原因となる正常型ヘプシジンの産生向上が生じていても検査または診断が可能である点で有利である。なお、正常型ヘプシジンの過剰産生は、鉄のリサイクルを抑制して造血系で利用可能な鉄の量が低下させるために貧血を引き起こすことが知られている。従って、本発明のある態様では、癌診断用組成物または癌診断用キットは、診断対象は、正常型ヘプシジンの産生向上を伴う貧血を有する対象であり得る。また、本発明のある態様では、組織中の癌細胞を検出する方法は、対象が正常型ヘプシジンの産生向上を伴う貧血を有する対象であり得る。また、本発明のある態様では、癌の診断方法における診断対象が正常型ヘプシジンの産生向上を伴う貧血を有する対象であり得る。
【００４６】
本発明によれば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質は、癌の縮小に伴い減少し得る。従って、本発明によれば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の量を指標として、癌治療法または癌治療薬の癌に対する効果を評価することができる。すなわち、治療に伴い、例えば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の量が減少するか、量の増加速度が低下するか、量が変化しない場合には、その癌治療法または癌治療薬が効果を有すると評価することができる。従って、本発明のある態様では、癌診断用組成物または癌診断用キットは、インビトロ若しくはインビボで、癌治療法または癌治療薬の癌に対する効果を評価することに用いることができる。また、本発明のある側面では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡ若しくは異常型ヘプシジンタンパク質の存在または存在量を指標として、癌治療法または癌治療薬の癌に対する効果を評価するインビトロ若しくはインビボの方法が提供される。また、本発明のある側面では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡ若しくは異常型ヘプシジンタンパク質の存在または存在量を指標として、対象の予後を判定することができる。例えば、治療しても、例えば、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の量が低下しないか、増加速度が低下しない場合などには、対象は予後が悪いと判定することができ、例えば、治療に伴い、異常型ヘプシジンｍＲＮＡまたは異常型ヘプシジンタンパク質の量が減少するか、量の増加速度が低下するか、量が変化しない場合には、対象は予後が良いと判定することができる。
【００４７】
本発明では、対象は、哺乳動物、例えば、ペット（例えば、イヌまたはネコ）またはヒトであり、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００４８】
実施例１：肝癌におけるヘプシジンｍＲＮＡの発現
本実施例では、さまざまな肝癌細胞株におけるヘプシジンｍＲＮＡの発現を調べた。【００４９】
肝癌細胞株は、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＷＲＬ６８細胞（DS Pharma Biomedical社製）、並びにＨＬＥ細胞およびＨＬＦ細胞（Health Science Research Resources Bankより供与）とした。対照として、ヒト胎児肝臓から抽出した全ＲＮＡ（Human Fetal Liver Total RNA、製品番号「636540」、Clontech社製）およびヒト肝臓から抽出した全ＲＮＡ（Human Liver Total RNA、製品番号「636529」、Clontech 社製）を用いた。これらの細胞をそれぞれ常法に従って細胞培養した。次いで、常法により細胞から全ＲＮＡを抽出した。具体的には、ReliaPrep RNA Cell Miniprep System（製品番号「Z6011」、Promega社製）を用い、製造者マニュアルに従って細胞から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡは、Qubit RNA HS Assay Kit（製品番号「Q32852」、Life technologies社製）でRNA濃度を算出し、ｃＤＮＡの合成には各１００ｎｇをテンプレートとして用いた。全ＲＮＡの測定結果を表２に示す。【００５０】
【表２】
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【００５１】
さらに、全ＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡは、PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（製品番号「6110A」、TAKARA Bio社製）を用い、製造者マニュアルに従って調製した。具体的な条件は以下の通りとした。【００５２】
【表３】
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【００５３】
反応溶液を６５℃で５分間インキュベートし、反応チューブを急速に氷冷した。さらに表４の組成の反応溶液を反応チューブに添加した。
【表４】
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【００５４】
反応チューブをサーマルサイクラーで４２℃で３０分間インキュベートし、続いて９５℃で５分間インキュベートし、チューブを氷冷した。使用までチューブは−２０〜−３０℃で凍結保存した。【００５５】
次に、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてヘプシジンｍＲＮＡの全長（すなわち、１番目〜２５５番目の塩基）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を２％アガロース電気泳動により確認した。電気泳動されたＰＣＲ増幅産物は、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Lonza社製）蛍光色素で染色した。【００５６】
すると、図１Ａに示されるように、Ｈｅｐ３Ｂを除くいずれの肝癌細胞株においてもヘプシジンｍＲＮＡの全長（２５５塩基）に由来するＰＣＲ増幅産物が確認されたが、ＨＬＦ細胞から抽出したヘプシジンｍＲＮＡに基づく逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物からは、約２００塩基長の短いＰＣＲ増幅産物が観察された（図１Ａの矢尻）。【００５７】
この短いＰＣＲ増幅産物を常法によりクローニングしてその配列をシークエンスにより解読したところ、ヘプシジン遺伝子のエキソン１と３とが直接連結した（すなわち、６０塩基長のエキソン２全体が欠失した）１９５塩基長のスプライシングバリバリアントであることが明らかとなった（図１Ｂおよび１Ｃ）。このスプライシングバリアントは、健常者由来の胎児肝臓または成人肝臓では観察されなかった（図１Ａ）。すなわち、エキソン１と３とが連結したヘプシジンのスプライシングバリアントは、癌細胞株に特徴的であることが示唆された。【００５８】
実施例２：癌特異的スプライシングバリアントからの翻訳
本実施例では、実施例１により明らかとなった新規の癌特異的スプライシングバリアントからの翻訳産物を確認した。【００５９】
健常者の細胞から検出される２５５塩基長のヘプシジンｍＲＮＡ（正常型）と、癌細胞で検出された１９５塩基長の上記スプライシングバリアント（バリアント型）をそれぞれ哺乳動物細胞発現ベクターｐＣＡｃｃのＥｃｏＲＩ切断部位とＢｇｌＩＩ切断部位の間に組み込んだ。得られた発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランジェントにトランスフェクションし、２４時間後および４８時間後に培養上清を回収して、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によりヘプシジンタンパク質の存在の有無や存在量を確認した。【００６０】
その結果、正常型からはヘプシジン−２５タンパク質が検出されたが、バリアント型からはヘプシジン−２５タンパク質はほとんど検出されなかった（図２ＡおよびＢ）。ヘプシジン−２０とヘプシジン−２２に関しては、正常型からは微量に検出されたが、バリアント型では検出されなかった（図２Ｂ）。このことから、癌細胞では選択的スプライシングが変化することにより、ヘプシジン−２０、２２および２５のいずれの発現量も低下した。ヘプシジン−２０、２２および２５は、ヘプシジンの機能的な形態であると知られ、これらの発現が低下したことは、ヘプシジン遺伝子がその機能を失っていることを示唆する。すなわち、癌細胞ではヘプシジン遺伝子が正常に機能していないことが示唆された。【００６１】
次に、ヘプシジンタンパク質の存在の有無や存在量をウェスタンブロット法によっても確認した。具体的には、Ｃ末端にｍｙｃタグおよび６×Ｈｉｓタグを有する正常型プレプロヘプシジンをコードするｃＤＮＡと、エキソン２を欠失するそのバリアント型ヘプシジンをコードするｃＤＮＡを発現ベクターに導入し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に培養上清と細胞を回収して、細胞からは１％ＮＰ−４０を含む細胞溶解緩衝液で細胞溶解物を得た。それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズと接触させてヘプシジンタンパク質を精製した。得られた精製タンパク質を抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した。【００６２】
すると、図３に示されるように、正常型プレプロヘプシジンｃＤＮＡからは、そのＮ末端側のシグナルペプチドが切断されたプロヘプシジンと、さらにＣ末端の２５アミノ酸からなるヘプシジン−２５とが発現した。一方で、バリアント型ヘプシジンｃＤＮＡからは、プレプロヘプシジンのみが観察された。このことから、バリアント型のプレプロヘプシジンでは、シグナルペプチドの切断やヘプシジン−２５の産生が阻害されていることが明らかとなった。したがって、癌細胞ではヘプシジン遺伝子が正常に機能していないことが示唆された。【００６３】
実施例３：各肝癌細胞株におけるバリアント型ヘプシジンｍＲＮＡの発現
本実施例では、実施例１で用いた各細胞株でのバリアント型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数を定量した。【００６４】
正常型ヘプシジンｍＲＮＡの定量は、TaqMan（商標）ケミストリを利用し、遺伝子発現定量に最適なデザイン済みのプライマー & プローブセット（ready-to-use）、TaqMan（商標）Gene Expression Assays, Inventoried, 20×（製品番号「4331182」、Applied biosystems/Life technologies社製）の中から、ヒトヘプシジンを標的としたHs00221783_m1を選択した。プライマーは、キット付属のプライマーを用い、プローブは、5’- TCCCACAACAGACGGGACAACTTGC- 3’の配列（配列番号１０）を有し、５’末端はＦＡＭ（商標）で標識され、３’末端はＮＦＧで標識され、アニール部位はヘプシジンのエキソン１とエキソン２のジャンクションに設定されていた。【００６５】
異常型ヘプシジンｍＲＮＡの定量は、蛍光標識プローブをエキソン１とエキソン３の連結部位に設定し、このプローブの上流側にフォワードプライマーを、下流側にリバースプライマーをそれぞれ配置した。設計したプローブおよびプライマーをCustom TaqMan（商標）Gene Expression Assays, SM, 20×（ready-to-use）（製品番号「4331348」、Applied biosystems/Life technologies社製）で依頼合成した。設計したプローブ（配列番号１１）、フォワードプライマー（配列番号１２）およびリバースプライマー（配列番号１３）の配列は、表５に示される。プローブは、５’末端はＦＡＭ（商標）で標識され、３’末端はＮＦＧで標識された。【００６６】
【表５】
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【００６７】
次に、表６に示される通りに、逆転写反応液（cDNA溶液）、プローブ／プライマーセット（20×）およびQuantStudio 3D Digital PCR Master Mix（2×）（製品番号「4482710」、Applied biosystems/Life technologies社製）を混合し反応溶液を調製した。【００６８】
【表６】
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【００６９】
ｍＲＮＡは、デジタルＰＣＲにより定量した。具体的には、QuantStudio（商標） 3D Digital PCR 20K Chip Kit、製品番号「4485507」、Applied biosystems/Life technologies社製）を用いてチップに上記反応液を塗布し、蓋をした。その後、QuantStudio（商標） 3D Digital PCR UV Sealing Kit（製品番号「4488475」、Applied biosystems/Life technologies社製）でチップを完成させた。ProFlex（商標） 2×flat block thermal cycler（Applied biosystems/Life technologies社製）にセットして以下の条件でＰＣＲを行った。【００７０】
【表７】
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【００７１】
ＰＣＲ増幅反応終了後のチップをQuantStudio（商標）3D Digital PCR Instrument（Applied biosystems/Life technologies社製）にアプライし、チップ上の20,000個のウェル中、蛍光を発しているウェルをカウントした。QuantStudio（商標）3D AnalysisSuite（商標）にアクセス、Absolute Quantification を開き、生データをインポートし解析し、全ＲＮＡ１００ｎｇ中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数を求めた。【００７２】
結果は、図４に示される通りであった。図４中の肝癌由来細胞株６種類のうち、Ｈｅｐ３Ｂを除いた５種類の細胞株：ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＷＲＬ６８で異常型ヘプシジンのｍＲＮＡを確認することができた。【００７３】
このように、実施例１〜３では、肝癌細胞がエキソン２を欠失した異常型スプライシングバリアントであるヘプシジンｍＲＮＡを発現することが明らかになった。【００７４】
実施例４：肝癌組織における異常型ヘプシジンｍＲＮＡの発現
本実施例では、肝癌患者の肝癌組織におけるヘプシジンｍＲＮＡの発現を確認した。【００７５】
具体的には、ヒト肝癌組織から抽出した全ＲＮＡ（Total RNA - Human Tumor Tissue:Liver、製品番号「R1235149-50」、BioChain社製）におけるヘプシジンｍＲＮＡの発現を確認した。対照として、ヒト胎児肝臓から抽出した全ＲＮＡ（Human Fetal Liver Total RNA、製品番号「636540」、Clontech社製）を用いた。【００７６】
ＲＮＡ溶液の原液を５μＬを分子生物学用超純水（Ultrapure Water for Molecular Biology、製品番号「H20MB0501」、Merck/Millipore社製）で希釈して０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、および１００ｎｇ／μＬの濃度の全ＲＮＡ溶液を調製した。【００７７】
実施例３に記載された通りに逆転写反応およびデジタルＰＣＲを行い、各全ＲＮＡ中に含まれる正常型および異常型のヘプシジンｍＲＮＡのコピー数を算出した。【００７８】
その結果は図５に示される通りであった。図５Ａのデータを直線回帰して得た近似曲線を図５Ａのプロット上に重ねた。上記近似曲線から全ＲＮＡ１ｎｇ中の異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数を計算すると、図５Ｂの通りであった。すなわち、異常型／正常型比を算出したところ、ヒト肝癌組織においては、その比率が高まることが明らかとなった。【００７９】
実施例５：血清試料中のヘプシジンｍＲＮＡの検出
本実施例では、血清試料中のヘプシジンｍＲＮＡを検出可能かを確認した。【００８０】
まず、１３人の肝癌患者から血清を得た。血清からエキソソームを得て、エキソソーム中のｍＲＮＡを分析した。具体的には、Total Exosome Isolation from serum（製品番号「4478360」、Invitrogen/Life Technolpgies社製）を用いて製造者マニュアルに従って血清から血清エキソソームを回収した。すなわち、
１．血清を解凍し、氷中保存した。
２．マイクロチップを使って凝固物を吸い込まないようにして上清1,200μLを1.5-mLチューブに分取した。
３．2,000×g、30分、4℃で遠心分離した。
４．18G針付2.5mLシリンジで上清を吸い上げた。
５．針を外して、ディスクフィルター（Millex-GV，0.22μm Filter Unit，13mmφ、製品番号「SLGJ13SL」、Merck Millipore社製）をセットした。
６．濾過液を1.5-mLチューブに回収した。
７．濾過液1.0mLを新しい1.5-mLチューブに分取した。
８．Total Exosome Isolation from serum（製品番号「4478360」、Invitrogen/Life Technolpgies社製）を用いてエキソソームを抽出した。
i．以下に示す割合で血清にエキソソーム分離試薬を添加した。
血清：1,000μL
Total Exosome Isolation from serum：200μL
ii．1分間撹拌し均一な溶液とした。
iii．4℃、30分静置した。
iv．10,000×g、10分、室温で遠心分離した。
v．沈殿物を崩さないように上清を除去、廃棄した。
vi．チューブを遠心分離機でフラッシュし、残液を回収、廃棄した。
vii．ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS(-)100μLを添加した。
viii． 室温で20分間攪拌し、沈澱物を均一に懸濁した。
ix．-20〜-30℃で凍結保存した。【００８１】
次に得られたエキソソームからＲＮＡを抽出した。具体的には、Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit（製品番号「4478545」、Invitrogen/Life Technolpgies社製）を用い、製造者マニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。すなわち、
１．エキソソーム懸濁液（D-PBS(-)）100μLを解凍し、氷中保存した。
２．2×変性溶液（Denaturing Solution）100μLを添加した。
３．攪拌し混合液を均一にし、チューブを10秒間フラッシュした後，氷中で5分間静置した。
４．遠心操作により有機層と水層の間にバリアーを形成するPhase-Lock Gel Heavy，2mL（製品番号「2302830」、5PRIME/フナコシ社製)に混合液200μLを移した。
５．酸−フェノール：クロロホルム（Acid-Phenol:Chloroform）溶液200μLを添加した。
６．30秒間攪拌した後、13,200×g、5分、室温で遠心分離した。
７．ＲＮＡを含む上相200μLを新しい1.5-mLチューブに回収した（ライセート）。
８． ライセート200μLに1.25倍量の分子生物学用エタノール(99.5)（製品番号「054-07225」、Wako社製）250μLを添加した。
９．攪拌し混合液を均一にし、チューブを10秒間フラッシュした。
１０．回収チューブ（Collection Tube）にフィルターカートリッジ（Filter Cartridge）をセットした。
１１．ライセート/エタノール混液を上記回収チューブに移した。
１２．10,000×g，15秒間、室温で遠心分離した。
１３．フィルターカートリッジを持ち上げ、回収チューブ内の濾過液を廃棄した。
１４．miRNA Wash Solution 1 700μLをフィルターカートリッジに添加した。
１５．10,000×g、15秒間、室温で遠心分離した。
１６．フィルターカートリッジを持ち上げ、回収チューブ内の濾過液を廃棄した（１回目の洗浄）。
１７．Wash Solution 2/3 500μLをフィルターカートリッジに添加した。
１８．10,000×g、15秒間、室温で遠心分離した。
１９．フィルターカートリッジを持ち上げ、回収チューブ内の濾過液を廃棄した（２回目の洗浄）。
２０．ステップ １７，１８，１９ を繰り返し３回目の洗浄を行った。
２１．３回目の洗浄液を廃棄した後、回収チューブを10,000×g、1分間、室温で遠心分離した。
２２．フィルターカートリッジを新しい回収チューブに移した。
２３．95℃に加温した超純水 50μLをフィルターカートリッジのフィルター中央に注いだ。
２４．回収チューブを10,000×g、30秒間、室温で遠心分離した。
２５．ステップ ２３，２４ を繰り返し、1回目の抽出液と合わせた。
２６．RNA溶液を-20〜-30 ℃で保存した。【００８２】
次いで得られたＲＮＡ溶液のＲＮＡを濃縮した。具体的には、
１．RNA溶液のチューブの蓋に18G針を用いてピンホールを開けた。
２．チューブの蓋をしたまま、遠心式濃縮機（超小型遠心式濃縮機スピンドライヤーミニ、製品番号「VC-15SP」、タイテック社製）にセットした。
３．2- 4時間の処理で水分を完全に飛ばした。
４．超純水10μLを添加しRNAを再溶解した。
５．蓋のピンホールをシール（MicroAmp Optical Adhesive Film、製品番号「4311971」、Applied Biosystems/Life Technologies社製）した。
６．得られたＲＮＡ溶液を-20〜-30℃で保存した。【００８３】
さらに得られたＲＮＡの品質を評価した。Agilent 2200 TapeStation核酸分析用システム（製品番号「G2965AA」、Agilent社製）と、ゲル充填済みのready-to-use のHigh Sensitivity RNA ScreenTape（製品番号「5067-5579」、Agilent社製）を用いて、得られたＲＮＡを電気泳動して分析した。具体的には、
１．濃縮後の再溶解したRNA溶液10μLのうち1μLを分取し、超純水 1μLを追加し全量を2μLとした。
２．High Sensitivity RNA サンプルバッファー (製品番号「5067-5580」、Agilent社製)1μLを加えた。
３．チューブをサーマルサイクラーにセットし、72℃、3分間の熱変性を行った。
４．Agilent 2200 TapeStationにHigh Sensitivity RNA Screen Tape、ローディングチップならびに変性済RNA試料をセットし、解析を行った。【００８４】
品質評価の結果は、図６に示される通りであった。図６Ｃは、エキソソームから抽出した全ＲＮＡの電気泳動結果を示す。エキソソームから抽出したＲＮＡは、肝癌組織から抽出したＲＮＡ（図６Ａ）やＨＬＦ細胞から抽出したＲＮＡ（図６Ｂ）と比較して、低分子量のＲＮＡを確認することができ、リボソームＲＮＡ（１８Ｓおよび２８Ｓ）を確認することはできなかった。このことから、エキソソームからのＲＮＡの抽出が成功していることが明らかとなった。【００８５】
さらに、血清エキソソーム中のヘプシジンｍＲＮＡの正常型および異常型のコピー数を分析した。本実施例では、正常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出するために、TaqMan MGB遺伝子発現検出キット（Small size）（製品番号：「4324034」、Applied biosystems/Life technologies社製）のプローブ／プライマーセットの設計ならびに合成依頼した。表８に示されるように、正常型ヘプシジンｍＲＮＡを特異的に検出するための蛍光標識プローブ（配列番号１４）はエキソン１とエキソン２との連結部位に設定し、このプローブの上流側にフォワードプライマー（配列番号１５）を、下流側にリバースプライマー（配列番号１６）を設計した。プローブを４μＭ、各プライマーを６μＭとなるようTris-EDTA, 1×Solution (pH7.6, Molecular Biology)（製品番号：「BP2474-100」、Fisher Scientific社製）（以下、１×ＴＥと略す）で希釈した。また、本実施例では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡを検出するために、表８に示されるように、蛍光標識プローブ（配列番号１７）はエキソン１とエキソン３との連結部位に設定し、このプローブの上流側にフォワードプライマー（配列番号１８）を、下流側にリバースプライマー（配列番号１９）を設計した。１×ＴＥでプローブを４μＭ、各プライマーを６μＭに調製した。【００８６】
【表８】
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【００８７】
次に、１段階目増幅反応を行った。具体的には、逆転写反応液（cDNA溶液）5.0μl、ヘプシジンｍＲＮＡ増幅用プライマーセット（あるいはプローブ／プライマーセット）のpre-mixture（20×）2.5μＬおよびQuantStudio 3D Digital PCR Master Mix（2×）２５．０μＬを混合し全量５０μＬの反応溶液を０．２−ｍＬ  ＰＣＲチューブに調製した。次に、ステップ２を１９サイクルとする以外は表７に記載の条件で１段階目の増幅反応を行った。【００８８】
さらに、２段階目増幅反応を行った。１段階目増幅反応液5.00μＬ、ヘプシジンｍＲＮＡ増幅用プローブ／プライマーセットのpre-mixture（20×）0.75μＬおよびQuantStudio 3D Digital PCR Master Mix（2×）7.5μＬを混合し全量15.00μＬの反応溶液を調製した。次に、ステップ２を２９サイクルとする以外は表７に記載の条件で２段階目の増幅反応を行った。【００８９】
さらに、ＰＣＲ増幅反応終了後のチップをQuantStudioTM3D Digital PCR Instrumentにアプライし、チップ上の20,000個のウェル中、蛍光を発しているウェルをカウントした。QuantStudioTM3D AnalysisSuiteTM にアクセスして、Absolute Quantification を開き、生データをインポートし解析した。【００９０】
その結果、図７に示されるように、１３人中１０人から異常型のスプライシングバリアントが検出され（図７Ａ）、この１０人は異常型と全ヘプシジンの比において高い値を示した。また、健常者のエキソソームからは異常型のスプライシングバリアントは検出されなかった（図７ＡおよびＢ）。【００９１】
これらの実施例から、癌患者（例えば、肝癌患者）に特徴的なヘプシジンスプライシングバリアントが存在することが明らかになり、この異常型バリアントは、癌組織中および血清中で検出することが可能であった。したがって、癌組織または血液中のヘプシジンのスプライシングバリアントの存在を調べることにより、癌患者を決定することができると分かった。【００９２】
さらに、ヘプシジン遺伝子の異常コピー数を肝細胞癌患者、慢性肝疾患患者および健常者間で比較した。【００９３】
肝細胞癌患者は、５６歳〜８３歳の男性１４名と女性６名の合計２０名であり、平均年齢は、７０．２歳であった。慢性肝疾患患者は、３８歳〜８０歳の男性９名と女性８名の合計１７名であり、平均年齢は６７．４歳であった。健常者は、２３歳〜５５歳の男性１８名と女性１２名の合計３０名であり、平均年齢は３４．１歳であった。【００９４】
本実施例に記載の方法により、血清中のエキソソームを単離してRNAを抽出し、ヘプシジンｍRNAの異常型バリアントのコピー数を測定した。統計解析は、GraphPad Prism 3.00 for Windows（登録商標） (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて、Dunnett法により行った。ｐ値が０．０５未満であるときに、統計学的に有意であると評価した。結果は、表９および図８に示される通りであった。【００９５】
【表９】
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【００９６】
表９に示される通り、肝癌患者では、異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が平均値および中央値共に健常者の平均値および中央値よりも顕著に高かった。このことから、異常型ペプシジンｍＲＮＡのコピー数を測定することにより、コピー数が多い場合に肝癌患者であると決定することができることが分かった。【００９７】
また、慢性肝疾患患者のうち、肝癌既往歴を有する患者において、異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が平均値および中央値共に肝癌既往歴を有しない患者よりも顕著に高かった。また、肝癌既往歴を有しない慢性肝疾患患者と健常人とではほとんど差は見られなかった。【００９８】
さらに、図８に示される通り、異常コピー数が多い患者は、肝癌患者であるか、慢性肝疾患患者のうち肝癌既往歴を有する患者であることが分かった。このことから、異常型ヘプシジンｍＲＮＡのコピー数が多い場合に肝癌患者であると決定することができることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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