(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞からCD8陽性T細胞の誘導における各工程において、ビタミンC類を培養液へ添加して培養することで、効率よくCD8陽性T細胞を誘導する方法を提供する。さらに、CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞の誘導工程において、副腎皮質ホルモン剤を培養液へ添加して培養することで、効率よくCD8陽性T細胞を誘導する方法を提供する。
2016076415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、多能性幹細胞からCD8陽性T細胞を誘導する方法；
（１）多能性幹細胞を、ビタミンC類を添加した培養液中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、ビタミンC類を添加した培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、および
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で培養し、CD8陽性T細胞を誘導する工程。
【請求項２】
前記工程（３）において、培養液はさらにビタミンC類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各工程において、ビタミンC類は１日毎に培養液へ補充される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（１）において、多能性幹細胞はC3H10T1/2細胞上で培養される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（１）が、５％以下の低酸素条件で行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（１）において、培養液はさらにvascular endothelial growth factor （VEGF）、Stem cell factor （SCF）およびFlt3 Ligand （FLT-3L）を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（２）において、工程（１）で得られた細胞はOP9-DL1細胞上で培養される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（２）において、培養液はさらにFLT-3L、およびinterleukin (IL)-7を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中でCD4CD8両陽性T細胞を培養する工程を含む、CD8陽性T細胞を誘導する方法。
【請求項１１】
前記副腎皮質ホルモン剤がデキサメタゾンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養液は、さらに抗CD3抗体、ビタミンC類、IL-2およびIL-7を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ビタミンC類を添加した培養液中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、造血前駆細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ビタミンC類は１日毎に培養液へ補充される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞を培養する工程が、C3H10T1/2細胞上で多能性幹細胞を培養する工程である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記多能性幹細胞を培養する工程が、５％以下の低酸素条件で行われる、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養液は、さらにVEGF、SCFおよびFLT-3Lを含む、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する各工程においてビタミンC類を添加した培養液を利用してCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法、ならびに当該CD4CD8両陽性T細胞を副腎皮質ホルモン剤を含む培養液中で培養する工程を含むCD8陽性T細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
T細胞は、細菌やウィルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているが、様々な原因によりT細胞の機能が低下し、易感染性やがん等に罹患すると考えられている。このような疾患に対して、免疫細胞等の補充や再生をすることができれば、疾患の病態改善や治療効果の向上などに極めて有効な手段となる。このような免疫細胞の補充療法において、細胞性免疫を担うＴリンパ球の機能補充や再生が強く求められているが、現在有効な治療方法は確立されていない。
このようなＴリンパ球の補充療法として、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を各種リンパ球系細胞に遺伝子導入し、特異的免疫反応を補充や賦活させることが提案されている（非特許文献１または２）。これらの試みでは遺伝子導入細胞として骨髄前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞や、ナイーブＴリンパ球などが用いられているが、これらは、Ｅｘ−ｖｉｖｏでの自己再生能が低い、遺伝子導入の効率が低い、遺伝子導入による分化の調節が困難である、など多くの課題を有している。
また、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から誘導したＴリンパ球を用いた補充療法も提案されている（非特許文献３または特許文献１）。多能性幹細胞からＴリンパ球の誘導方法においては、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、（２）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞を誘導する工程、（３）ＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞を誘導する工程、および（４）ＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞からＴリンパ球を誘導する工程が提案されている。
（１）の工程では、多能性幹細胞からネット様構造物サック（ＥＳ−ｓａｃ）を形成させ造血前駆細胞を製造する方法が知られている（非特許文献４）。また、（２）および（３）の工程は、ＯＰ９−ＤＬ１細胞層上でＩＬ−７およびＦｌｔ−３Ｌを添加した培地で培養する方法が知られている（非特許文献５または６）。さらに、（４）の工程は、抗CD3抗体（ＯＫＴ−３）およびＩＬ−２を添加した培地で培養する方法が知られている。
しかし、これらの方法によって多能性幹細胞からＴリンパ球を製造する効率は十分ではなく、改良が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2011096482
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gattinoni L, et al., Nat Rev Immunol. 6(5):383-393, 2006
【非特許文献２】Morgan RA, et al., Science. 314(5796):126-129, 2006
【非特許文献３】Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013.
【非特許文献４】Takayama N, et al., Blood. 111(11):5298-5306, 2008
【非特許文献５】Timmermans F, et al., J Immunol. 182(11):6879-6888, 2009
【非特許文献６】Ikawa T, et al., Science. 329(5987):93-96, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、多能性幹細胞から造血前駆細胞を効率良く製造することにある。さらなる本発明の目的は、当該方法で得られた造血前駆細胞由来のCD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を効率よく製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、多能性幹細胞から造血前駆細胞を効率よく誘導するために有効な物質の探索を行った。その結果、多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化の各工程にて、ビタミンC類を培養液へ添加して培養することで、効率よく造血前駆細胞が誘導されることを見出した。さらに、本発明者らは、CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を効率よく誘導するために有効な物質の探索を行った。その結果、副腎皮質ホルモン剤を培養液へ添加して培養することで、効率よくCD8陽性T細胞が誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］以下の工程を含む、多能性幹細胞からCD8陽性T細胞を誘導する方法；
（１）多能性幹細胞を、ビタミンC類を添加した培養液中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、ビタミンC類を添加した培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、および
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で培養し、CD8陽性T細胞を誘導する工程。
［２］前記工程（３）において、培養液はさらにビタミンC類を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、［１］または［２］に記載の方法。［４］各工程において、ビタミンC類は1日毎に培養液へ補充される、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程（１）において、多能性幹細胞はC3H10T1/2細胞上で培養される、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記工程（１）が、５％以下の低酸素条件で行われる、［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記工程（１）において、培養液はさらにVEGF、SCFおよびFLT-3Lを含む、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記工程（２）において、工程（１）で得られた細胞はOP9-DL1細胞上で培養される、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記工程（２）において、培養液はさらにFLT-3L、およびIL-7を含む、［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中でCD4CD8両陽性T細胞を培養する工程を含む、CD8陽性T細胞を誘導する方法。
［１１］前記副腎皮質ホルモン剤がデキサメタゾンである、［１０］に記載の方法。
［１２］前記培養液は、さらに抗CD3抗体、ビタミンC類、IL-2およびIL-7を含む、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、［１２］に記載の方法。
［１４］ビタミンC類を添加した培養液中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、造血前駆細胞を誘導する方法。
［１５］前記ビタミンC類が、リン酸ビタミンCである、［１４］に記載の方法。
［１６］ビタミンC類は1日毎に培養液に補充される、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］前記多能性幹細胞を培養する工程が、C3H10T1/2細胞上で多能性幹細胞を培養する工程である、［１４］から［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記多能性幹細胞を培養する工程が、５％以下の低酸素条件で行われる、［１４］から［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記培養液は、さらにVEGF、SCFおよびFLT-3Lを含む、［１４］から［１８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ビタミンC類を培養液へ添加することで、多能性幹細胞から効率よくCD8陽性T細胞を製造することが可能である。さらに、本発明によれば、副腎皮質ホルモン剤を培養液へ添加することで、CD4CD8両陽性T細胞から効率よくCD8陽性T細胞を製造することが可能である。従って、本発明によれば、多能性幹細胞からCD8陽性T細胞を効率よく生産することが可能であり、また、多能性幹細胞由来のCD8陽性T細胞を含む免疫機能を賦活する治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、37日間培養した後の細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。左図は、FSCとSSCで展開した図を示し、中央図は、CD3とCD45の染色強度で展開した図を示し、右図は、CD4とCD8の染色強度で展開した図を示す。
【図２】図２は、CD4CD8両陽性T細胞を3日間培養した後の細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。左図は、FSCとSSCで展開した図を示し、中央図は、CD3とCD45の染色強度で展開した図を示し、右図は、CD4とCD8の染色強度で展開した図を示す。
【図３】図３は、iPS細胞（GPC株）から誘導されたCD4CD8両陽性T細胞を3日間培養した後の細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。FSCとSSC、CD3とCD45の染色強度、CD4とCD8αの染色強度、CD8αとCD8βの染色強度およびCD5とCD7の染色強度で展開した図を示す。
【図４】図４は、iPS細胞（GPC株）から誘導されたCD4CD8両陽性T細胞を3日間培養した後の細胞をGPC3 Dextramerと接触させた後のフローサイトメトリーの結果を示す。左図は、CD4とCD8αの染色強度で展開した図を示し、右図は、GPC3 DextramerとCD8αの染色強度で展開した図を示す。
【図５】図５は、iPS細胞（GPC株）から誘導されたCD4CD8両陽性T細胞を3日間培養した後の細胞をGPC3 Dextramerと接触させた後のフローサイトメトリーの結果を示す。FSCとSSC、CD3とCD45の染色強度、CD4とCD8αの染色強度、CD8αとCD8βの染色強度およびGPC3 DextramerとCD8αの染色強度で展開した図を示す。
【図６】図６は、iPS細胞（TKT3v 1-7株および4GAD 1-8株）からフィーダー細胞を用いずに製造したCD4CD8両陽性T細胞を3日間培養した後の細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。FSCとSSC、CD3とCD45の染色強度、CD4とCD8αの染色強度、CD8αとCD8βの染色強度およびCD5とCD7の染色強度で展開した図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、多能性幹細胞からCD8陽性T細胞を製造する方法を提供する。当該製造方法は、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、（２）当該造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、および（３）当該CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程に分割することができる。
【００１１】
多能性幹細胞
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される造血前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
【００１２】
iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
【００１３】
体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００１４】
本発明では、CD8陽性T細胞を製造する目的に使用するため、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）の遺伝子再編成が行われたリンパ球（好ましくは、T細胞）を体細胞として用いてiPS細胞を製造することが好ましい。本発明において、リンパ球を用いる場合、初期化の工程に先立ち当該リンパ球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＩＬ−２、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を添加して前記リンパ球を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらに、ヒトＴ細胞が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
【００１５】
本発明において製造されるCD8陽性T細胞は、所望の抗原特異性を有することが好ましい。従って、iPS細胞の元となるリンパ球は、所望の抗原特異性を有することが望ましく、当該リンパ球は、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製により特異的に単離されても良い。この精製では、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するリンパ球を精製する方法も採用することができる。
【００１６】
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。本発明によって調製されたCD8陽性T細胞を輸血に使用する場合、輸血される患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、iPS細胞の元となる体細胞は、CD8陽性T細胞が輸血される対象から単離されることが好ましい。
【００１７】
多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程
本発明において、造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells（HPC））とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である、本発明において、造血前駆細胞と造血幹細胞は、区別されるものではなく、特に断りがなければ同一の細胞を示す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるCD34および/またはCD43が陽性であることによって認識できる。
【００１８】
本発明において、造血前駆細胞は、ビタミンC類を添加した培養液中で多能性幹細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
【００１９】
本発明において、ビタミンC類とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-L-アスコルビン酸Naまたはリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-L-アスコルビン酸塩が挙げられる。
【００２０】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へビタミンC類を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
【００２１】
本発明において好ましい基礎培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むIMDM培地である。
【００２２】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いる培養液は、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、SCF (Stem cell factor)およびFLT-3L (Flt3 Ligand)から成る群より選択されるサイトカインがさらに添加されていてもよい。より好ましくは、VEGF、SCFおよびFLT-3Lを添加された培養液である。
【００２３】
本発明において、ビタミンC類は、培養期間中、４日毎、３日毎、２日毎、または１日毎に、別途添加（補充）することが好ましく、より好ましくは１日毎に添加される。当該ビタミンC類は、培養液において、5ng/mlから500ng/mlに相当する量を添加する。好ましくは、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、または500ng/mlに相当する量である。
【００２４】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いるBMP4の培養液中における濃度は、10 ng/mlから100 ng/mlであり、例えば、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、または100 ng/mlである。好ましくは、20 ng/mlまたは40 ng/mlである。
【００２５】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いるVEGFの培養液中における濃度は、10 ng/mlから100 ng/mlであり、例えば、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、または100 ng/mlである。好ましくは、20 ng/mlである。
【００２６】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いるSCFの培養液中における濃度は、10 ng/mlから100 ng/mlであり、例えば、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、または100 ng/mlである。好ましくは、30 ng/mlである。
【００２７】
本発明において造血前駆細胞の製造に用いるFLT-3Lの培養液中における濃度は、1 ng/mlから100 ng/mlであり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/mlである。好ましくは、10 ng/mlである。
【００２８】
本発明の造血前駆細胞の製造において、多能性幹細胞は、接着培養または浮遊培養であってもよく、接着培養の場合、コーティング剤をコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、また他の細胞と共培養してもよい。共培養する他の細胞として、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）が例示される。コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）が例示される。浮遊培養では、Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62、およびSaeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67に記載の方法が例示される。
【００２９】
本発明では、造血前駆細胞は、多能性幹細胞を培養することで得られるネット様構造物（ES−sac又はiPS−sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「ネット様構造物」とは、多能性幹細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含む構造体である。
【００３０】
本発明において、造血前駆細胞を製造するための培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造においては問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。
【００３１】
本発明の造血前駆細胞を製造するための培養は上記の条件を適宜組み合わせて行うことができる。組み合わせとして、（i）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した基礎培地中で、C3H10T1/2上において低酸素条件下にて培養する工程、および（ii）VEGF、SCFおよびFLT-3Lを（１）の培養液へさらに添加し、通常の酸素条件下で培養する工程が例示される。当該工程（i）を行う期間は、少なくとも6日間以上であり、好ましくは、7日以上であり、より好ましくは、7日である。当該工程（ii）を行う期間は、少なくとも6日間以上であり、好ましくは、7日以上であり、より好ましくは、7日である。
【００３２】
造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD4およびCD8が共に陽性である細胞（CD8+CD4+）を意味し、T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識することができることから、CD4CD8両陽性T細胞は、CD4、CD8、CD3およびCD45が陽性である細胞として同定することができる。CD4CD8両陽性T細胞は、誘導によってCD4陽性細胞またはCD8陽性細胞へと分化させることができる。
【００３３】
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞は、ビタミンC類を添加した培養液中で造血前駆細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
【００３４】
本発明においてCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へビタミンC類を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
【００３５】
本発明のCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いる好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、およびL-グルタミンを含むαMEM培地である。当該基礎培地へ添加するビタミンC類は、上述した造血前駆細胞の誘導の場合と同様である。
【００３６】
本発明のCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いる培養液は、FLT-3LおよびIL-7から成る群より選択されるサイトカインをさらに培養液に添加してもよい。より好ましくは、FLT-3LおよびIL-7を添加された培養液である。
【００３７】
本発明においてCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いるIL-7の培養液中における濃度は、1 ng/mlから50 ng/mlであり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、または50 ng/mlである。好ましくは、5 ng/mlである。
【００３８】
本発明においてCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いるFLT-3Lは上述と同じ条件で用いることができる。
【００３９】
本発明のCD4CD8両陽性T細胞の製造において、造血前駆細胞を接着培養または浮遊培養してもよく、接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。共培養するフィーダー細胞として、骨髄間質細胞株OP9細胞（理研BioResource Centerより入手可能）が例示される。当該OP9細胞は、好ましくは、Dll1を恒常的に発現するOP-DL1細胞であってもよい（Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)）。本発明において、フィーダー細胞としてOP9細胞を用いる場合、別途用意したDll1またはDll1とFc等の融合タンパク質を適宜培養液に添加することによっても行い得る。本発明において、Dll1には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM#005618、マウスの場合、NM#007865に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらと高い配列同一性（例えば９０％以上）を有し、同等の機能を有する天然に存在する変異体が包含される。CD4CD8両陽性T細胞を製造する際にフィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、５日毎、４日毎、３日毎、または２日毎にて行い得る。
【００４０】
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞を製造するために造血前駆細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4CD8両陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上であり、好ましくは23日である。
【００４１】
本発明において、得られたCD4CD8両陽性T細胞は、単離して用いてもよく、他の細胞種が含有される細胞集団としてもよい。単離する場合、CD4、CD8、CD3およびCD45から成るいずれか一つの指標を用いて単離することができ、当該単離の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、CD4、CD8、CD3およびCD45の抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
【００４２】
CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程
本発明において、CD8陽性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD8が陽性である細胞（CD8+CD4-）を意味し、細胞傷害性T細胞とも呼ばれる。T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識することができることから、CD8陽性T細胞は、CD8、CD3およびCD45が陽性であり、CD4が陰性である細胞として同定することができる。
【００４３】
本発明において、CD8陽性T細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中でCD4CD8両陽性T細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
【００４４】
本発明において用いる副腎皮質ホルモン剤は、糖質コルチコイドあるいはその誘導体であり、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが例示される。好ましくは、デキサメタゾンである。
【００４５】
副腎皮質ホルモン剤が、デキサメタゾンである場合、培養液中におけるその濃度は、1nMから100nMであり、例えば、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nMまたは100nMである。好ましくは、10nMである。
【００４６】
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へ副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
【００４７】
本発明において好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むαMEM培地である。
【００４８】
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いる培養液は、CD3抗体、ビタミンC類、サイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインは、IL-2およびIL-7等が例示される。CD8陽性T細胞の製造に用いるより好ましいサイトカインは、IL-2およびIL-7の組み合わせである。
【００４９】
本発明において、CD3抗体とは、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。CD3抗体の培養液中における濃度は、10ng/mlから1000ng/mlであり、例えば、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/mlまたは1000 ng/mlである。好ましくは、500 ng/mlである。
【００５０】
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いるビタミンC類は上述と同じ条件で用いることができる。
【００５１】
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いるIL-2の培養液中における濃度は、10 U/mlから1000 U/mlであり、例えば、10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、500 U/mlまたは1000 U/mlである。好ましくは、100 U/mlである。
【００５２】
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いるIL-7の培養液中における濃度は、1ng/mlから100ng/mlであり、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlである。好ましくは、10 ng/mlである。
【００５３】
本発明において、CD8陽性T細胞を製造するためにCD4CD8両陽性T細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日間以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上であり、好ましくは3日である。
【００５４】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
【実施例１】
【００５５】
細胞
iPS細胞(TKT3v 1-7株)は、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013に記載の方法を用いて、告知後に同意を得て単離されたヒトCD3陽性T細胞より樹立した。
C3H10T1/2細胞およびOP9-DL1細胞は、理化学研究所・理研 BioResource Center より入手して用いた。【００５６】
CD4CD8両陽性細胞の誘導
10cm dishにおいてコンフルエントなC3H10T1/2細胞上にTKT3v 1-7株の小塊を播種し（Day0）、EB培地（１５％ウシ胎児血清（FBS）、10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、2mM Ｌ−グルタミンと、0.45mM α−モノチオグリセロール、および50μg/mL アスコルビン酸を添加したIMDM）中で、低酸素条件下(5% O2)にて7日間培養した（Day7）。【００５７】
続いて、20ng/mL VEGF、30ng/mL SCF及び10ng/mL FLT-3L（Peprotech社製）を添加し、常圧酸素条件下にて7日間培養した（Day14）。【００５８】
得られたネット様構造物（iPS-SACともいう）に含まれている造血細胞（CD34+造血幹／前駆細胞）を回収し、OP9-DL1細胞上に播種した。10ng/mL FLT-3L、および5ng/mL IL-7を添加したOP9培地（１５％ FBS、2mM Ｌ−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリンおよび5ng/mL 亜セレン酸ナトリウムを添加したαMEM）中で、常圧酸素条件下にて23日間培養した（Day37）。細胞は、3-4日毎に新たなOP9-DL1細胞上へ播種した。【００５９】
Day0からDay37の培養期間中、L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium saltを最終濃度50ng/mlになるよう毎日添加した。【００６０】
Day37にて、CD3(+) CD45(+) CD4(+) CD8(+) 分画細胞をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性（Double positive）細胞（DP細胞という）を得た（図１）。【００６１】
CD4CD8両陽性細胞から分化誘導
上記の方法で得られたDP細胞を24wellプレートに播種し、500ng/ml抗CD3抗体（OKT3）、10nM Dexamethasone(デキサートR Fuji Pharma)、15％ FBS、2mM Ｌ−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、50ng/ml L-Ascorbic acid 2-phosphate、Non essential Amino Acid、100U/ml IL-2、10ng/ml IL-7を添加したαMEM中で、3日間培養した。得られた細胞をFACSにて調べたところ、CD3(+) CD45(+) CD4(-) CD8(+) 分画細胞であることが確認された（図２）。
【実施例２】
【００６２】
細胞
iPS細胞(GPC3株)は、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013に記載の方法を用いて、告知後に同意を得て単離されたヒトCD3陽性T細胞より樹立した。用いたヒトCD3陽性T細胞はCD8陽性のキラーT細胞であり、肝細胞がんでの発現が知られるGPC3抗原に特異的なT細胞受容体を持つ。【００６３】
フィーダー細胞上でのCD4CD8両陽性細胞を経たCD8陽性細胞の誘導
C3H10T1/2細胞上にGPC3株の小塊を播種し、実施例１と同様の方法にて培養し、CD4CD8両陽性を得た。さらに、得られたCD4CD8両陽性を実施例１と同様の方法にて培養し、CD8陽性細胞を誘導した。【００６４】
CD8陽性細胞の評価
GPC3株から上述の方法で誘導した細胞群をフローサイトメーターにてCD3、CD45、CD4、CD8α、CD8β、CD5およびCD7の発現を確認したところ、CD8αβ両陽性のCD8陽性細胞が誘導されることが確認された（図３）。【００６５】
さらに、得られた細胞にGPC3 Dextramer（Immudex）を加え4℃ 30分反応させた後、CD3、CD45、CD4、CD8α抗体を加えフローサイトメトリーにて解析したところ、得られたCD8陽性細胞は、MHC-GPC3ペプチドの複合体であるDextramerを特異的に認識できることが確認された （図４および５）。
【実施例３】
【００６６】
細胞
iPS細胞(4GAD 1-8株)は、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013に記載の方法を用いて、告知後に同意を得て単離されたヒトCD3陽性T細胞より樹立した。用いたヒトCD3陽性T細胞はCD4陽性のヘルパーT細胞であり、膵臓での発現が知られるGAD65抗原に特異的なT細胞受容体を持つ。【００６７】
フィーダー細胞を用いないCD4CD8両陽性細胞を経たCD8陽性細胞の誘導
10cm dishにTKT3v 1-7株または4GAD 1-8株の小塊を播種し（Day0）、EB培地（１５％ウシ胎児血清（FBS）、10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、2mM Ｌ−グルタミン、0.45mM α-モノチオグリセロール、および50μg/mL アスコルビン酸を添加したIMDM）中で、低酸素条件下(5% O2)にて7日間培養した（Day7）。【００６８】
続いて、20ng/mL VEGF、30ng/mL SCF及び10ng/mL FLT-3L（Peprotech社製）を添加し、常圧酸素条件下にて7日間培養した（Day14）。【００６９】
さらに、10ng/mL FLT-3L、および5ng/mL IL-7を添加したOP9培地（１５％ FBS、2mM Ｌ−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリンおよび5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム添加したαMEM）中で、常圧酸素条件下にて23日間培養した（Day37）。【００７０】
Day0からDay37の培養期間中、L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium saltを最終濃度50ng/mlになるよう毎日添加した。【００７１】
Day37にて、CD3(+) CD45(+) CD4(+) CD8(+) 分画細胞をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性（Double positive）細胞（DP細胞という）を得た（図１）。【００７２】
得られたDP細胞を24wellプレートに播種し、500ng/ml抗CD3抗体（OKT3）、10nM Dexamethasone(デキサートR Fuji Pharma)、15％ FBS、2mM Ｌ−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、50ng/ml L-Ascorbic acid 2-phosphate、Non essential Amino Acid、100U/ml IL-2、10ng/ml IL-7を添加したαMEM中で、3日間培養した。【００７３】
CD8陽性細胞の評価
GPC3株から上述の方法で誘導した細胞群をフローサイトメーターにてCD3、CD45、CD4、CD8α、CD8β、CD5およびCD7の発現を確認したところ、CD8αβ両陽性のCD8陽性細胞が誘導されることが確認された（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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