(57)【要約】  細胞増殖に有益な因子を多数含む安価なウシ血清組成物の製造方法を提供する。ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、取得した白血球と血小板を一定の温度で一定以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、を有する。
2017086356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、
抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、
取得した白血球と血小板を一定の温度で一定以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、
を有することを特徴とするウシ血清組成物の製造方法。
【請求項２】
前記バフィーコートより重い比重分画は、1.071〜1.084の比重分画であることを特徴とする、請求項１に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項３】
前記一定の温度は、常温〜40℃、時間は5分以上の条件であることを特徴とする、請求項1又は２に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項４】
前記バフィーコートの更なる活性化に、ガラス材料を添加することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抗凝固剤は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項６】
前記再凝固剤は、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項７】
前記バフィーコートの取得は、遠心機又は連続遠心機によることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項８】
前記液性因子は、TGF-beta1、Basic FGF、Eotaxin、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、TNF-alphaであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項９】
ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理し、
抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得し、取得した白血球と血小板を常温〜40℃の温度で5分以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより白血球及び／又は血小板により分泌・放出される液性因子を含み、再凝固剤により再凝固処理することにより得られるウシ血清組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、増殖性に優れた細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、組織因子経路インヒビターの発現を誘導し、血液凝固を誘導しにくい細胞を培養する方法。
【請求項１２】
前記細胞は、骨髄、脂肪組織、又は羊膜・臍帯を含む胎児付属物を由来とする間葉系幹細胞又は間葉系細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ血清組成物及びそのウシ血清組成物を添加剤として使用する細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の培養増殖では、培地に対しウシ血清を添加すれば効果的であることが知られている。特にウシ胎児血清は増殖因子を含む多くの液性因子を含有しており、細胞培養のスタンダードとなっている。【０００３】
しかしながら、牛海綿状脳症(BSE)問題により、ウシ胎児血清はBSE発生国以外のオセアニア産が汎用されており、価格高騰に繋がっている。胎児由来ではない成獣ウシ血清も細胞培養に使用可能であるが、ウシ胎児血清ほど増殖因子を含む液性因子を含有しないことが知られている。【０００４】
一方、これまでに抗凝固処理を行ったヒト全血から遠心処理等により血小板を高濃度に濃縮した多血小板血漿（platelet rich plasma:PRP）を調整し、これを添加した培地は細胞の培養増殖に有用であることが報告されている（非特許文献１）。【０００５】
多血小板血漿には、血小板由来のトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、血小板由来成長因子-BB(PDGF-BB)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)等が多く含まれており、これらが細胞増殖を誘導している（非特許文献２）。【０００６】
血小板は、上記増殖因子の他、血小板第４因子(platelet factor 4:PF4)と呼ばれる好中球や単球に対する走化因子を含有しており、白血球の活性化を誘導する（非特許文献３）。【０００７】
また、全血に含まれる血球成分には血小板以外にも白血球がある。白血球はインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子の他、血小板活性化因子(PAF)を分泌し、これは血小板を活性化させることが知られている（非特許文献４）。【０００８】
バフィーコートは、抗凝固処理を行ったヒト全血から静置や簡単な遠心処理等により得られ、ヒトの場合、血漿や赤血球と明確に比重が異なることから、血小板や白血球両者を高濃度に含む白い層を呈する。そこで、バフィーコート層に含まれる血小板や白血球を相互に活性化させた、上記の血小板や白血球が分泌する増殖因子や走化因子、活性化因子等を含む各種液性因子を豊富に含有する血清は、細胞培養に相応しいと考えられる。【０００９】
しかしながら、ウシの場合、後述するようにヒトと比べ赤血球の比重が軽いことから、白血球と赤血球の比重が重なる部分があり、結果、バフィーコートは白血球の含有が少ないことから不明瞭な層となる。従って、白血球および血小板両者を採取するには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が、本願発明において明らかとなっている。【００１０】
近年、細胞の製剤化による、再生医療製品としての治療応用が期待されている。一方、普段存在しない細胞を、例えば静脈内に投与されることは血液の凝固を誘導するとの報告がある（非特許文献５）。そこで、血液凝固を誘導しにくい細胞の培養法の確立が、再生医療の実現化に重要である。【００１１】
特許文献１には、凝固臍帯血の液性成分を含む間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤が記載されている。特許文献１では、まず非凝固臍帯血に赤血球沈降剤を添加して、赤血球を含む画分と上清画分とに分離し、次にその上清画分に関し、造血幹細胞を含む沈降画分と血小板を含む液体画分とに分離している。そしてその血小板を含む液体画分にガラスビーズを接触させて増殖促進剤を製造している。則ち、造血幹細胞を含む白血球が存在する沈降画分は、増殖促進剤に含まれない。一方で本願発明は、後述するように、バフィーコート中の白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定時間以上かけ活性化させ、得られた液性成分を含む血液成分を再凝固処理させて得られる血清成分であり、本願発明は特許文献１記載の発明と全く相違する。【００１２】
特許文献２には、抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿、及び有形成分を分離した後の血漿に、ガラス材料からなる吸着部材を投入し、血漿内の繊維素原を吸着除去する血清の分離方法が記載されている。特許文献２では、繊維素原がガラス材料の表面に付着することを利用し、血漿内の繊維素原を除去する吸着材料としてガラス材料を使用している。本願発明は、後述するように、ガラス材料の添加は、バフィーコート中の白血球と血小板との相互作用を更に活性化させるものであり、本願発明は特許文献２記載の発明と全く相違する。【００１３】
特許文献３には、採取されたヒト血液を、凝固する前に抗凝固剤を入れずに遠心分離し、上清の血漿の８０％を除去し血小板を含む残りの血液成分をよく懸濁し、血液凝固促進材としてガラスビーズを添加することで、血小板を活性化し、血液凝固させるとともに、前記血小板から増殖因子を放出させ濃縮血清を得ている。【００１４】
また、特許文献４には、採取されたヒト血液に抗凝固剤を入れ遠心分離し、上清の血漿の８０％を除去し血小板を含む残りの血液成分をよく懸濁し、血液凝固促進材として塩化カルシウム水溶液を添加することで、血小板を活性化し、血液凝固させるとともに、前記血小板から増殖因子を放出させ濃縮血清を得ている。本願発明では、後述するように、抗凝固剤の添加されたウシ血液において、バフィーコートおよびバフィーコートよりも比重の重い分画（ウシの場合、白血球を含有）を含む比較的広範囲の比重分画を取得し、白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定時間以上かけ活性化させ、得られた液性成分を含む血液成分を再凝固処理させて得られる血清成分であり、本願発明は特許文献３および４記載の発明と全く相違する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７９９号公報
【特許文献２】特開２００６−１０４１０６号公報
【特許文献３】特開２０１４−１１８３６２号公報
【特許文献４】特開２０１４−１１７３４７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Tissue Eng Part C Methods. 2009 Sep;15(3):431-5.
【非特許文献２】Plast Reconstr Surg. 2004;114:1502-1508.
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jul;78(7):4584-7.
【非特許文献４】Nature. 1974 Jun 7;249(457):581-2.
【非特許文献５】Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 8;431(2):203-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は従来にないウシ血清組成物の製造方法を提供するものであって、具体的には、細胞増殖に有益な因子、及び細胞による血液凝固を抑制する因子を多数含む安価なウシ血清組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法は、ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、取得した白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定以上時間をかけ活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法で得られるウシ血清組成物は、安価且つ細胞増殖因子を多数包含する。即ち、本発明によれば、例えばウシ全血から、ウシ胎児血清と同等以上の増殖促進作用を持つ血清組成物を製造できる。ウシ胎仔血清は胎仔の屠殺により血清を得ることから、感染症に関しウインドウピリオド（検査で感染が確認できない空白期間）を考慮に入れた血液検査が後からできないが、飼育ウシであれば例えばウインドウピリオドが３ヶ月の感染症であれば、血清組成物を製造した３ヶ月後に血液検査を行い、その感染症を完全に否定することで、安全性の高い血清組成物を得ることができる。そのため、本発明により得られるウシ血清組成物は、ウシ胎児血清と比較し、安価且つ安全、細胞増殖能は同等以上であり、また、細胞による血液凝固を誘導しにくい。本発明により得られるウシ血清組成物は細胞培養の添加剤として極めて優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒトの各血液成分の比重を示す図である。
【図２】抗凝固処理されたウシ及びヒトの全血における、遠心分離の結果を示す図である。
【図３】抗凝固処理されたウシの各比重の全血における、遠心分離の結果を示す図である。
【図４】抗凝固処理されたウシの全血における、連続遠心分離の結果を示す図である。
【図５】ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞増殖曲線を示す図である。
【図６】ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の細胞増殖曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（血清組成物の製造方法）
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本実施形態にかかるウシ血清組成物は、
(i)抗凝固処理工程：抗凝固剤でウシ全血を抗凝固処理し、
(ii)白血球および血小板取得工程：抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得し、
(iii)白血球および血小板活性化・再凝固処理工程：取得した白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定以上時間をかけ、必要に応じガラス材料の添加及び静置により、活性化させることにより白血球及び／又は血小板により分泌・放出される液性因子を含有し、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤により再凝固処理する
ことにより得られる。以下、各工程について説明する。
【００２３】
(i)抗凝固処理工程
全血は、ウシ由来であり、成獣・幼若・新生児又は胎児ウシの何れも適用可能である。全血は血管に針を刺し、針からチューブを介して採血バッグ等に採取することが可能である。全血は、血球成分（赤血球、白血球、血小板）と液体成分である血漿とからなる。血漿は凝固成分を含むのに対し、血清は凝固成分をほとんど含まないか、含んだとしても少量の液体である。
【００２４】
ウシ全血を採取時あるいは採取後に、抗凝固剤を用いた抗凝固処理を行う。血液内には、フィブリノーゲン（血液凝固I因子）、プロトロンビン（血液凝固II因子）、血液凝固V因子、血液凝固VIII因子等の血液凝固因子が含まれているため、後述するように全血からバフィーコートを取得する際に、血液の凝固を防止するためである。抗凝固剤は、特に限定されるものではなく、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、ヘパリン等が挙げられる。
【００２５】
(ii)白血球および血小板取得工程
抗凝固処理されたウシ全血からの白血球および血小板の取得は、例えば遠心機又は連続遠心機によりなされる。バフィーコートとは、凝固していない血液を遠心分離した際に、赤血球層と血漿との間に生じる白血球と血小板との層である。しかしながら、ウシの場合、後述するようにヒトと比べ赤血球の比重が軽いことから、白血球と赤血球の比重が重なる部分があり、結果、バフィーコートは白血球の含有が少ないことから不明瞭な層となる。従って、白血球および血小板両者を採取するには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が、本願発明において明らかとなっている。後述するように、ウシ血小板の比重は例えば1.032〜1.058であり、ウシ白血球の比重は例えば1.032〜1.084であり、ウシ赤血球の比重は例えば1.071〜1.110である。そのためウシ全血の場合、赤血球層と血漿との間に位置するバフィーコートは比重1.032〜1.071の層となるが、この層は白血球の含有が少ないためバフィーコートより比重が重い例えば1.071〜1.084の分画も取得する。このようにして、抗凝固処理されたウシ全血から、例えば遠心機又は連続遠心機により、血漿および比重の重い赤血球を除いた、白血球と血小板双方を多く含む血漿が調整される。
【００２６】
この調整は、ヒトであれば各血液成分の比重の明確な違いにより(下記表１及び図１参照)、長時間静置や簡便な遠心操作にて各血液成分が容易に分離し、赤血球と血漿の間に浮遊し、白血球と血小板を多く含むバフィーコートを容易に得ることができる。
【００２７】
【表１】
2017086356.tif 000003
【００２８】
一方、各血液成分の比重の差が乏しいウシの場合、ヒトと同様な操作では、白血球と血小板のみを採取することが難しい。例えばウシの場合、後述のように赤血球と白血球の比重の重なる部分が多く、これらを分離することが難しいが、より多くの血液を連続して遠心することができる連続遠心機を使用することで、各血液成分の比重の違いが僅かであっても、取得することが可能となる。
【００２９】
遠心分離の条件は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心加速度2900〜11760ｍ／ｓ２（300〜1200×ｇ）、温度4〜37℃、時間3分以上とすることが可能である。
【００３０】
(iii)白血球および血小板活性化・再凝固処理工程
次に、取得した白血球及び血小板を多く含有する血漿を常温〜40℃にて一定時間静置し、白血球と血小板との相互作用を促す。ここで常温とは10℃〜30℃とする。この際、ガラス材料等が接触することにより、白血球と血小板との相互作用が更に活性化され、白血球及び／又は血小板から大量の液性因子が分泌・放出される。ガラス材料は、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸ガラス、又はこれらの混合からなる成分を有するガラスである。
【００３１】
白血球および血小板にガラス材料が接触するとは、(i)バフィーコートにガラス材料を投入すること、(ii)バフィーコートにガラス材料で形成されたガラス棒を投入して、そのガラス棒によってバフィーコートを攪拌すること、(iii)バフィーコートを、ガラス材料を材質として形成されたガラス材料容器中に投入すること、のいずれも包含する概念である。
【００３２】
活性化の温度・時間条件は、37℃・1時間以上が望ましいが、例えば、常温〜40度・5分以上とすることが可能であり、また37℃〜40℃・1〜３時間とすることが可能であり、更には38℃〜40℃・１〜３時間とすることが可能であるまた、活性化の時間中に再凝固剤を添加し、次の再凝固処理工程を同時に実施することも可能である。
【００３３】
投入されるガラス材料の形状は、特に限定されるものでなく、例えば、粒状物、シート、ブロック等の形状とすることが可能である。粒状物は、例えば、ガラスビーズ状、ビー玉状、おはじき玉状、サイコロ状、円柱状、角柱状、中空円筒状、ドーナツ状、涙滴状、板状等の定形形状や、カレット等の不定形状とすることが可能である。好ましくはガラスビーズである。粒状物の粒径は、特に限定されるものでなく、例えば、１〜２０ｍｍ、好ましくは５〜９ｍｍとすることが可能である。
【００３４】
ガラス材料を添加させることにより濃度増加して分泌・放出される液性因子は、血小板由来、白血球由来、又はこれらの双方由来のものが含まれる。血小板由来の液性因子は、例えば、TGF-beta1、Basic FGF、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-alpha等が挙げられる。白血球由来の液性因子は、例えば、Eotaxin、IL-12(p70)等が挙げられる。血小板及び白血球の双方由来の液性因子は、例えばIL-5、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB等が挙げられる。
【００３５】
同時に、上澄みである血清成分を取得するために、上述した液性因子を含む血液成分を再凝固剤により再凝固処理する。再凝固剤は、特に制限されるものではなく抗凝固剤の種類に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、塩化カルシウム、プロタミン等が挙げられる。抗凝固剤がクエン酸の場合、再凝固剤は例えば塩化カルシウム液等のカルシウム液が好ましく、抗凝固剤がヘパリンの場合、再凝固剤は例えばプロタミン等が好ましい。
【００３６】
上述の工程を経て得られたウシ血清組成物は細胞増殖因子を多数含有しており、優れた細胞増殖能を有する血清組成物を得ることができる。更に、得られた細胞は血液凝固の誘導が抑制されており、より安全性が高い。
【００３７】
（細胞の培養方法）
本発明の細胞の培養方法は、本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として含む培地にて細胞を培養することにより、細胞の増殖を促進し、血液凝固の誘導を抑制する工程を含む。
【００３８】
細胞は、特に限定されるものではなく、例えば骨髄、脂肪組織、又は羊膜・臍帯を含む胎児付属物を由来とする間葉系幹細胞又は間葉系細胞である。細胞の由来は、特に限定されるものでなく、例えば、ヒト、及び、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等が挙げられる。
【００３９】
ウシ血清組成物が添加剤として包含される培地は、特に限定されるものでなく、例えば間葉系幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体的には、例えば、a-Minimal essential medium培地(aMEM培地）、Dulbecco’s modified eagle medium培地(DMEM培地)等が挙げられる。
【００４０】
培地におけるウシ血清組成物の濃度は、特に限定されるものでなく、血清組成物に包含される液性因子の濃度が、例えば０．０１〜２０ｖ／ｖ％とすることが可能である。培地１ｍＬあたりの細胞数は、例えば１０００〜１０万個とすることが可能である。
【００４１】
細胞の培養条件は、特に限定されるものではなく、例えば、温度は３７℃であり、時間は２〜１０日である。また培地は、例えば１〜５日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましく、培地の取換え方法は、例えば所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的又は断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば新たな培地の供給にあわせて、古い培地の一部を連続的又は断続的に廃棄することが好ましい。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
遠心型血液成分分離装置(コンポーネントコレクションシステム：CCS、ヘモネティクス製)を用い、抗凝固処理血液から様々な濃度の白血球・血小板分画を採取し、白血球・血小板を相互活性化後、再凝固処理により血清組成物を調整し、その液性因子を解析した。【００４３】
具体的には、同装置専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と供血者血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により得られる様々な濃度の白血球・血小板分画を経時的に分割して採取した。得られた白血球・血小板分画(バフィーコート)は、自動血球計数装置（LC-660、フクダ電子製）にて白血球・血小板数を測定した。結果を表２に示す。【００４４】
【表２】
2017086356.tif 000004
【００４５】
表２に示すように、1回の抗凝固処理血液から遠心型血液成分分離装置を用いることにより、様々な濃度の白血球・血小板分画を得ることができた。【００４６】
得られた白血球・血小板分画に対し、ガラスビース（血液成分50mlあたり1個：BZ-6、アズワン製）を加えたもの（ガラス有）、及び加えなかったもの（ガラス無）を用意し、更に最終添加濃度が10mMとなるように1M塩化カルシウム水溶液を加えて常温にて1時間以上静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、−80℃にて保存した。同血清組成物を解凍し、TGF-beta1 ELISA kit(#88-8350-22、Affimetrix製)にてTGF-beta1濃度を測定した。結果を表３に示す。【００４７】
【表３】
2017086356.tif 000005
【００４８】
表３に示すように、TGF-beta1濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のTGF-beta1は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びTGF-beta1濃度共ほぼ同じ数字であり、TGF-beta1は血小板由来であることが強く示唆された。【００４９】
更に、血清組成物に関し、Bio-Plex Proヒトサイトカイン27-Plexアッセイ(#M50-0KCAF0Y、Bio-Rad製)を用い、網羅的サイトカイン解析（Basic FGF, Eotacin, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1RA, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-BB, RANTES, TNF-alpha, VEGF）を行った（内、GM-CSF, IL-15, IL-17, IL-2, MIP-1aは、ほぼ全てのサンプルが検出感度以下であったため、除外）。結果を表４〜２５に示す。【００５０】
【表４】
2017086356.tif 000006
【００５１】
表４に示すように、Basic FGF濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のBasic FGFは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとC（ガラス有）を比較すると、血小板数及びBasic FGF濃度共ほぼ同じ数字であり、TGF-beta1は血小板由来であることが強く示唆された。【００５２】
【表５】
2017086356.tif 000007
【００５３】
表５に示すように、Eotaxin濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球のデータと高い相関を認め、血清組成物中のEotaxinは白血球由来が多いことが推察された。サンプルBとC（ガラス有）を比較すると、白血球数及びEotaxin濃度共ほぼ同じ数字であり、Eotaxinは白血球由来であることが強く示唆された。【００５４】
【表６】
2017086356.tif 000008
【００５５】
表６に示すように、G-CSF濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のG-CSFは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びG-CSF濃度共ほぼ同じ数字であり、G-CSFは血小板由来であることが強く示唆された。【００５６】
【表７】
2017086356.tif 000009
【００５７】
表７に示すように、IFN-gamma濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIFN-gammaは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIFN-gamma濃度共ほぼ同じ数字であり、IFN-gammaは血小板由来であることが強く示唆された。【００５８】
【表８】
2017086356.tif 000010
【００５９】
表８に示すように、IL-10濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-10は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-10濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-10は血小板由来であることが強く示唆された。【００６０】
【表９】
2017086356.tif 000011
【００６１】
表９に示すように、IL-12(p70)濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-12(p70)は白血球由来が多いことが推察された。サンプルAとDを比較すると、白血球数及びIL-12(p70)濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-12(p70)は白血球由来であることが強く示唆された。【００６２】
【表１０】
2017086356.tif 000012
【００６３】
表１０に示すように、IL-13濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-13は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、白血球数及びIL-13濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-13は血小板由来であることが強く示唆された。【００６４】
【表１１】
2017086356.tif 000013
【００６５】
表１１に示すように、IL-1RA濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-1RAは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-1RA濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-1RAは血小板由来であることが強く示唆された。【００６６】
【表１２】
2017086356.tif 000014
【００６７】
表１２に示すように、IL-1b濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-1bは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-1b濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-1bは血小板由来であることが強く示唆された。【００６８】
【表１３】
2017086356.tif 000015
【００６９】
表１３に示すように、IL-4濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-4は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-4濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-4は血小板由来であることが強く示唆された。【００７０】
【表１４】
2017086356.tif 000016
【００７１】
表１４に示すように、IL-5濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、ガラス有・無に関わらず、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。傾向としては血小板数と近い関係であるが、（１）ガラス無の場合、サンプルBは他のサンプルに比べ血小板数が多いにもかかわらず、IL-5濃度は低い。（２）ガラス有の場合、サンプルAとCを比較すると、血小板数はほぼ同じであるにも関わらず、IL-5濃度はサンプルCが最も高い。これらのことから、IL-5は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルCは、白血球数が多く、血小板数はサンプルA及びBと同等、であるのに、IL-5濃度は（１）ガラス無の場合、他と比べて少ない、（２）ガラス有の場合、他と比べて比較的多い点が指摘できる。【００７２】
【表１５】
2017086356.tif 000017
【００７３】
表１５に示すように、IL-6濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-6は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-6濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-6は血小板由来であることが強く示唆された。【００７４】
【表１６】
2017086356.tif 000018
【００７５】
表１６に示すように、IL-7濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。しかしながら、サンプルAに対する比率をみると、表２の血小板数のデータと相関を認め、血清組成物中のIL-7は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-7濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-7は血小板由来であることが示唆された。【００７６】
【表１７】
2017086356.tif 000019
【００７７】
表１７に示すように、IL-8濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-8は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-8濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-8は血小板由来であることが強く示唆された。【００７８】
【表１８】
2017086356.tif 000020
【００７９】
表１８に示すように、IL-9濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、ガラス有・無に関わらず、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルBはAと比べ血小板数が多いにもかかわらず、IL-9濃度は同等、（２）ガラス有の場合、血小板数に近い関係であるが、サンプルAとBを比較すると、血小板数はほぼ同じであるにも関わらず、IL-9濃度はサンプルBが一番高い。これらのことから、IL-9は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、IL-9濃度は（１）ガラス無の場合、少ないレベル、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。【００８０】
【表１９】
2017086356.tif 000021
【００８１】
表１９に示すように、IP-10濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、傾向としては血小板数と近い関係であるが、サンプルDはAと比較し血小板数は半分であるが、IP-10濃度は約8割、（２）ガラス有の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルBとCを比較すると、血小板数は同等であるのに、IP-10濃度に違いを認めた。これらのことから、IP-10は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、IP-10濃度は（１）ガラス無の場合、平均以下、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。【００８２】
【表２０】
2017086356.tif 000022
【００８３】
表２０に示すように、MCP-1濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、サンプルDのMCP-1濃度が最も高く、白血球数・血小板数と相関がない。（２）ガラス有の場合、傾向としては血小板数と近い関係であるが、サンプルAとCを比較すると、血小板数は同じであるにも関わらず、MCP-1濃度は25％の違いがある。これらのことから、MCP-1は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、MCP-1濃度は（１）ガラス無の場合、最も低い、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。【００８４】
【表２１】
2017086356.tif 000023
【００８５】
表２１に示すように、MIP-1b濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。しかしながら、サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数のデータと相関を認め、血清組成物中のMIP-1bは白血球由来が多いことが推察された。サンプルAとDを比較すると、白血球数及びMIP-1b濃度共ほぼ同じ数字であり、MIP-1bは白血球由来であることが示唆された。【００８６】
【表２２】
2017086356.tif 000024
【００８７】
表２２に示すように、PDGF-BB濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、サンプルBのPDGF-BB濃度が最も低く、白血球数・血小板数と相関がない。（２）ガラス有の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルAとDを比較すると、血小板数は半分にもかかわらず、PDGF-BB濃度は同等である。これらのことから、PDGF-BBは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、PDGF-BB濃度は（１）ガラス無の場合、最も低い、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。【００８８】
【表２３】
2017086356.tif 000025
【００８９】
表２３に示すように、RANTES濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めない。これらのことから、RANTESは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が否定できない。【００９０】
【表２４】
2017086356.tif 000026
【００９１】
表２４に示すように、TNF-alpha濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のTNF-alphaは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-8濃度共ほぼ同じ数字であり、TNF-alphaは血小板由来であることが強く示唆された。【００９２】
【表２５】
2017086356.tif 000027
【００９３】
表２５に示すように、VEGF濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。ガラス有において、傾向としては白血球数と近い関係であるが、例えばサンプルAとDを比較すると、血小板数とVEGF濃度に相関が認められず、このことは、VEGFは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が否定できない。【００９４】
これらの結果をまとめると、表２６のようになる。【００９５】
【表２６】
2017086356.tif 000028
【００９６】
表２６のように、白血球及び血小板を含んだ血球成分において、ガラスビーズ添加により、白血球及び血小板両者の相互作用が増強され、多くの液性因子が分泌・放出されることが明らかとなった。【００９７】
（実施例２）
更に、得られた白血球・血小板分画の相互活性化における温度・時間条件の至適化を目的とした検討を行った。【００９８】
具体的には、実施例１同様、同装置専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と供血者血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により白血球・血小板分画を採取した。得られた白血球・血小板分画に対し、最終添加濃度が5mMとなるように塩化カルシウム水溶液を添加し、(1)4℃、20℃、37℃、40℃、50℃の各条件にて5分間静置、(2)37℃の条件にて5分、1時間、6時間静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、−80℃にて保存した。同血清組成物を解凍し、TGF-beta1 ELISA kit(#88-8350-22、Affimetrix製)にてTGF-beta1濃度を測定した。結果を表に示す。【００９９】
【表２７】
2017086356.tif 000029
【０１００】
表２７に示すように、TGF-beta1濃度は、温度に関しては20℃〜40℃が高値であり、時間は1時間以上が高値であった。以上から、白血球・血小板分画の相互活性化に関する温度・時間条件は、常温〜40℃・1時間以上であると考えられた。【０１０１】
（実施例３）
抗凝固処理された全血からの白血球・血小板分画採取に関し、動物種による違いを検討した。【０１０２】
具体的には、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と、ヒトあるいはウシ血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液14mlを、15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に添加し、200×g、常温にて、20分遠心し（ユニバーサル冷却遠心機5922、久保田商事株式会社製）、状態を写真撮影した。結果を図２に示す。【０１０３】
図２において左がウシ、右がヒトである。通常の遠心では、ウシは赤血球の比重が比較的軽いと判断され、赤血球が容易に沈降しないのに対し、ヒトは赤血球比重が重く、赤血球が容易に沈降している。則ち、ウシにおいて、静置あるいは簡便な遠心操作によって、赤血球は沈降しにくく、結果、それよりも比較的軽い白血球・血小板分画が容易には出現しないことが想定される。【０１０４】
（実施例４）
そこで、ウシにおける各血液成分の比重検討を行った。Percoll原液(1.130g/ml、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製、17-0891-01)、1.5M NaCl、及び滅菌水を適量混合し、比重1.123, 1.110, 1.097, 1.084, 1.071, 1.058, 1.045, 1.032, 1019, 1.006の等張Percoll液を調整した。15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に、これら等張Percoll液を3ml添加した。抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と、ウシ血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液3mlを、等張Percoll液を加えた15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に3ml重層した。400×g、常温にて、10分遠心し（ユニバーサル冷却遠心機5922、久保田商事株式会社製）、状態を写真撮影した。結果を図３に示す。【０１０５】
上記の如く、ウシ血液には、比重1.071の等張Percoll液に浮遊する、比重1.071よりも軽い赤血球が多く存在することが分かった。【０１０６】
更に、各チューブ（6ml）を、上部3ml・下部3mlに分割し、それぞれにおける血球成分を自動血球計算装置（IDEXX  Laboratories製 プロサイトDx）にて測定した。結果を表２８に示す。【０１０７】
【表２８】
2017086356.tif 000030
【０１０８】
表２８の結果から、ウシの各血球成分の比重は、表２９のように示された。【０１０９】
【表２９】
2017086356.tif 000031
【０１１０】
このように、図２の結果を踏まえた考察が正しいこと、則ち、ウシの場合、赤血球の比重が比較的軽いため、赤血球が静置あるいは簡便な遠心操作では、容易には赤血球が沈降しないことが明らかとなった。【０１１１】
更に、ヒトの場合であれば、簡便な操作で白血球・血小板分画（いわゆるバフィーコート）が出現するが、ウシの場合、白血球と赤血球の比重が重なる部分が多いため、静置あるいは簡便な遠心操作では、すべての白血球を分離することが難しいことが明らかとなった。【０１１２】
（実施例５）
そこで、ウシ全血からの安定した白血球・血小板分画の採取を目指し、連続遠心機を用いた検討を行った。【０１１３】
具体的には、遠心型血液成分分離装置(CCS、ヘモネティクス製)に専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）とウシ全血を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心を行い、出現した白血球・血小板分画を写真撮影した。結果を図４に示す。【０１１４】
図４に示されるように、遠心ボウルの外側に位置する赤血球と内側に位置する血漿の間に、白い帯状の円を描くバフィーコート（白血球・血小板分画）が明確に存在している。これは、連続遠心機を用いると、一度の処理血液量が多いため（＞250ml）、僅かな比重の差であったとしても比較的容易にバフィーコートが出現したものと思われる。【０１１５】
そこで、出現したバフィーコート前後の分画を経時的に分割して採取し（サンプル１〜８、各約5ml）、それぞれにおける血球成分を自動血球計算装置（IDEXX  Laboratories製 プロサイトDx）にて測定した。結果を表３０に示す。【０１１６】
【表３０】
2017086356.tif 000032
【０１１７】
バフィーコートに位置するサンプル６は、白血球＋血小板分画であることが証明された。また、バフィーコートより比重の重いサンプル６において、最も白血球が多いことが明らかとなった。結果、抗凝固処理されたウシ全血からのより多くの白血球・血小板を得るには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が確認された。【０１１８】
（実施例６）
そこで、抗凝固処理を行ったウシ全血に関し、遠心型血液成分分離装置(CCS、ヘモネティクス製)を用い、白血球・血小板分画を採取し、ガラスビース添加により活性化後、再凝固処理により血清組成物（以下本血清組成物）を調整し、細胞培養を目的とした添加剤としての可能性を検討した。【０１１９】
具体的には、同装置専用血液回路（970E、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤チトラミン液「フソー」4％（クエン酸ナトリウム水和物4%、扶桑薬品工業株式会社製）とウシ血液を１：１６の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により白血球・血小板分画を採取した。得られた白血球・血小板分画に対し、ガラスビース（血液成分50mlあたり1個：BZ-6、アズワン製）を加え、更に最終添加濃度が5mMとなるように塩化カルシウム水溶液を加えて37℃にて6時間以上静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、−20度にて保存した。本血清組成物を解凍し、aMEM培地（Life Technologies社製、41061）に10％の割合で添加し、細胞培養用培地とした。対照はウシ胎児血清（Moregate Biotech社製）を10％添加したaMEM培地とした。【０１２０】
細胞培養用培地の評価として、市販ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Lonza社製、PT-2501）、及び我々が樹立したヒト羊膜由来間葉系幹細胞を用い、増殖曲線を作成した。このヒト羊膜由来間葉系幹細胞は下記工程にて培養した。即ち、帝王切開により得られた羊膜を、コラゲナーゼとサーモリシンとにより35℃にて30分酵素処理を行い、その酵素処理した羊膜をポアサイズ100μｍのメッシュに通すことにより細胞を回収し、回収した細胞を培養した。コラゲナーゼの濃度は500CDU/mlであり、サーモリシンの濃度は400PU/mlであった。結果をそれぞれ図５及び図６に示す。図５及び図６のように、骨髄及び羊膜由来間葉系幹細胞いずれの培養においても、本血清組成物は、通常細胞培養に用いられるウシ胎児血清と比較し、細胞増殖能に優れた血清組成物であることが分かった。【０１２１】
（実施例７）
また、本血清組成物が細胞径に与える影響を検討した。上記実施例６と同様、本血清組成物を10％の割合で添加したaMEM培地（対照はウシ胎児血清を10％添加したaMEM培地）を用い、我々が樹立したヒト羊膜由来間葉系幹細胞の培養を行い、適宜継代培養した。継代ごとに平均細胞径(μm)を測定し、両者の差違を検討した。結果を表３１に示す。【０１２２】
【表３１】
2017086356.tif 000033
【０１２３】
本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、細胞径が各継代において常に小さい細胞径であった。実施例６において、本血清組成物は、ウシ胎児血清と比較し細胞増殖能が高いことが示されており、細胞分裂までの時間が早いことが、その要因と考えられた。【０１２４】
（実施例８）
培養間葉系幹細胞を用いた細胞製剤の経静脈的投与において、しばしば投与細胞による血液凝固促進が問題になる。そこで、本血清組成物にて培養した細胞が血液凝固を誘導するかについて、検討を行った。実施例６・７同様、10%本血清組成物添加aMEM培地にて培養したヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、1×105細胞/mlとなるように生理食塩水にて調整した。対照は10%ウシ胎児血清添加aMEM培地で培養した同細胞とした。これら細胞懸濁液160μLにヒト血漿40μLを添加し、37℃ 5分間インキュベーションの後、20μM CaCl2を100μL添加し、血液凝固自動測定装置（KC1 Delta、Tcoag社製）にて凝固時間を測定した。結果を表３２に示す。【０１２５】
【表３２】
2017086356.tif 000034
【０１２６】
本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、凝固時間の延長を認め、血液凝固を誘導しにくい細胞であることが分かった。【０１２７】
（実施例９）
そこで、本血清組成物にて培養した細胞が血液凝固を誘導しにくい要因の探索を目的とした検討を行った。細胞が分泌し、細胞膜に結合している強力な凝固阻止因子である組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor：TFPI）に関し、10%本血清組成物添加aMEM培地にて培養したヒト羊膜由来間葉系幹細胞（継代数4）の培養上清における濃度測定を、ELISAキット（Human TFPI Quantikine ELISA Kit）（DTFP10、R&D systems社）を用いて行った。対照は10%ウシ胎児血清添加aMEM培地にて培養した同細胞の培養上清、及び細胞培養前のこれら培地とした。結果を表３３に示す。【０１２８】
【表３３】
2017086356.tif 000035
【０１２９】
本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、TFPIをより多く分泌していることから、血液凝固を誘導しにくい細胞であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
血清組成物の製造に利用できる。
【図１】
2017086356.tif 000036
【図２】
2017086356.tif 000037
【図３】
2017086356.tif 000038
【図４】
2017086356.tif 000039
【図５】
2017086356.tif 000040
【図６】
2017086356.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月7日(2017.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、
抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、
取得した白血球と血小板を一定の温度で一定以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、
を有することを特徴とするウシ血清組成物の製造方法。
【請求項２】
前記バフィーコートより重い比重分画は、1.071〜1.084の比重分画であることを特徴とする、請求項１に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項３】
前記一定の温度は、常温〜40℃、時間は5分以上の条件であることを特徴とする、請求項1又は２に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項４】
前記バフィーコートの更なる活性化に、ガラス材料を添加することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抗凝固剤は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項６】
前記再凝固剤は、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項７】
前記バフィーコートの取得は、遠心機又は連続遠心機によることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項８】
前記液性因子は、TGF-beta1、Basic FGF、Eotaxin、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、TNF-alphaであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項９】
ウシ全血を、クエン酸ナトリウム又はクエン酸である抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、
抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコートを包含する1.032〜1.084の比重分画を取得する工程と、
取得した白血球と血小板を37〜40℃、30分〜１時間で相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を塩化カルシウム溶液である再凝固剤で再凝固処理する工程と、
を有することを特徴とする、ウシ血清組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、増殖性に優れた細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、組織因子経路インヒビターの発現を誘導し、血液凝固を誘導しにくい細胞を培養する方法。
【請求項１２】
前記細胞は、骨髄、脂肪組織、又は羊膜・臍帯を含む胎児付属物を由来とする間葉系幹細胞又は間葉系細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞の培養方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月9日(2017.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）抗凝固剤で抗凝固処理されたウシ全血から、連続遠心により、バフィーコート及びバフィーコートより重い、白血球と血小板を含有する比重分画を取得する工程と、
（２）工程（１）で取得した分画を、一定の温度で一定以上時間インキュベートすることで、該分画中の白血球と血小板の相互作用を促し、それらを活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、
を有することを特徴とするウシ血清組成物の製造方法であって、前記バフィーコートより重い比重分画は、バフィーコートより白血球濃度の高い分画である、方法。
【請求項２】
前記バフィーコートより重い比重分画は、1.071〜1.084の範囲から選択される比重分画であることを特徴とする、請求項１に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項３】
前記一定の温度は、常温〜40℃、時間は5分以上の条件であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項４】
前記白血球と血小板の更なる活性化に、ガラス材料を添加することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抗凝固剤は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項６】
前記再凝固剤は、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項７】
前記液性因子は、TGF-beta1、Basic FGF、Eotaxin、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、及びTNF-alphaからなる群より選択される１以上の因子であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項８】
ウシ全血の比重1.032〜1.084の範囲から選択される比重分画より採取されたウシ血清組成物であって、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１以上の性質を有する組成物。
（ａ）ウシ胎児血清と同等もしくはそれ以上に、ヒト間葉系幹細胞の細胞増殖を支持する
（ｂ）ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の継代培養において、ウシ胎児血清と比較して、各継代における細胞径を安定して小さく維持する
（ｃ）該組成物の存在下でヒト羊膜由来間葉系幹細胞を培養すると、ウシ胎児血清の存在下で培養した場合と比較して、血液凝固を誘導しにくい細胞培養物を製造し得る
（ｄ）ウシ胎児血清と比較して、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞における組織経路因子インヒビターの発現誘導能が高い
【請求項９】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の製造方法により得られるウシ血清組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のウシ血清組成物の存在下で、ヒト間葉系幹細胞又はヒト間葉系細胞を培養することを特徴とする、該細胞の培養方法。
【請求項１１】
ウシ胎児血清の存在下で培養した場合と比較して、細胞が血液凝固を誘導しにくいことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のウシ血清組成物を含有してなる、ヒト間葉系幹細胞又はヒト間葉系細胞を培養するための培地。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
バフィーコートに位置するサンプル６は、白血球＋血小板分画であることが証明された。また、バフィーコートより比重の重いサンプル７において、最も白血球が多いことが明らかとなった。結果、抗凝固処理されたウシ全血からのより多くの白血球・血小板を得るには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が確認された。
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月3日(2017.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）抗凝固剤で抗凝固処理されたウシ全血から、連続遠心により、バフィーコート及びバフィーコートより重い、白血球と血小板を含有する比重分画を取得する工程と、
（２）工程（１）で取得した分画を、一定の温度で一定以上時間インキュベートすることで、該分画中の白血球と血小板の相互作用を促し、それらを活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、
を有することを特徴とするウシ血清組成物の製造方法であって、前記バフィーコートより重い比重分画は、バフィーコートより白血球濃度の高い分画である、方法。
【請求項２】
前記バフィーコートより重い比重分画は、1.071〜1.084の範囲から選択される比重分画であることを特徴とする、請求項１に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項３】
前記一定の温度は、常温〜40℃、時間は5分以上の条件であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項４】
前記白血球と血小板の更なる活性化に、ガラス材料を添加することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抗凝固剤は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項６】
前記再凝固剤は、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項７】
前記液性因子は、TGF-beta1、Basic FGF、Eotaxin、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、及びTNF-alphaからなる群より選択される１以上の因子であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
【請求項８】
ウシ全血の比重1.032〜1.084の範囲から選択される比重分画より採取されたウシ血清組成物であって、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１以上の性質を有する組成物。
（ａ）ウシ胎児血清と同等もしくはそれ以上に、ヒト間葉系幹細胞の細胞増殖を支持する
（ｂ）ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の継代培養において、ウシ胎児血清と比較して、各継代における細胞径を安定して小さく維持する
（ｃ）該組成物の存在下でヒト羊膜由来間葉系幹細胞を培養すると、ウシ胎児血清の存在下で培養した場合と比較して、血液凝固を誘導しにくい細胞培養物を製造する
（ｄ）ウシ胎児血清と比較して、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞における組織経路因子インヒビターの発現誘導能が高い
【請求項９】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の製造方法により得られるウシ血清組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のウシ血清組成物の存在下で、ヒト間葉系幹細胞又はヒト間葉系細胞を培養することを特徴とする、該細胞の培養方法。
【請求項１１】
ウシ胎児血清の存在下で培養した場合と比較して、細胞が血液凝固を誘導しにくいことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のウシ血清組成物を含有してなる、ヒト間葉系幹細胞又はヒト間葉系細胞を培養するための培地。
【国際調査報告】
2017086356.tif 000042
2017086356.tif 000043
2017086356.tif 000044
2017086356.tif 000045
2017086356.tif 000046