(57)【要約】  本発明は、優れたイソプレンモノマー生産系の確立に有用な酵素などを提供する。具体的には、本発明は、下記：（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、所定のアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有する改変イソプレンシンターゼ；当該改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；当該ポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞；当該改変イソプレンシンターゼの存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有する改変イソプレンシンターゼ：
Ｓ２、Ｆ３１、Ｌ３５、Ｌ６７、Ｉ９０、Ｖ９７、Ｌ１１４、Ｑ１２３、Ｄ１２４、Ｖ１２５、Ｋ１２７、Ｒ１２８、Ｋ１３０、Ｄ１３１、Ｇ１３４、Ｃ１３７、Ｖ１４４、Ｖ１８７、Ｒ２０２、Ｌ２２４、Ｌ２４７、Ｓ２４８、Ｌ２４９、Ｔ２５７、Ｋ２５９、Ｒ２６４、Ｄ２６５、Ｒ２６６、Ｅ２６９、Ｃ２８６、Ｋ２９２、Ｔ２９８、Ｉ３００、Ｄ３０１、Ｙ３０４、Ｄ３０５、Ｅ３１２、Ｆ３１６、Ｅ３２１、Ｖ３２５、Ｉ３２８、Ｃ３３８、Ｌ３４０、Ｃ３７０、Ｅ３７１、Ｃ３７３、Ｅ３７９、Ｓ３８３、Ｋ３８６、Ｉ３８８、Ａ３９０、Ｙ３９４、Ｓ４０１、Ｓ４０２、Ｇ４０４、Ｖ４０５、Ｌ４１４、Ｃ４１６、Ｃ４４０、Ｒ４４４、Ｎ４４７、Ｒ４５８、Ｔ４６１、Ｔ４６２、Ｔ４６６、Ｅ４７１、Ｃ４８０、Ｋ４８１、Ｒ４８４、Ｋ４９２、Ｖ４９９、Ｐ５０５、Ｆ５０８、Ｉ５１８、Ｓ５１９、Ｈ５２０、Ｃ５２１、Ｙ５２３、およびＧ５３０。
【請求項２】
前記変異が、Ｓ２Ａ、Ｆ３１Ｅ、Ｆ３１Ｋ、Ｌ３５Ｅ、Ｌ３５Ｋ、Ｌ６７Ｅ、Ｉ９０Ｅ、Ｖ９７Ｅ、Ｌ１１４Ｅ、Ｑ１２３Ｃ、Ｄ１２４Ｅ、Ｖ１２５Ｅ、Ｋ１２７Ｄ、Ｋ１２７Ｅ、Ｋ１２７Ｎ、Ｋ１２７Ｒ、Ｒ１２８Ｋ、Ｋ１３０Ｇ、Ｄ１３１Ｃ、Ｇ１３４Ｐ、Ｃ１３７Ｅ、Ｃ１３７Ｉ、Ｃ１３７Ｌ、Ｃ１３７Ｍ、Ｃ１３７Ｓ、Ｖ１４４Ｅ、Ｖ１８７Ｅ、Ｒ２０２Ｄ、Ｒ２０２Ｎ、Ｌ２２４Ｅ、Ｌ２４７Ｄ、Ｌ２４７Ｅ、Ｌ２４７Ｑ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｒ、Ｌ２４９Ｅ、Ｌ２４９Ｋ、Ｌ２４９Ｒ、Ｌ２４９Ｔ、Ｔ２５７Ｌ、Ｋ２５９Ｄ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２５９Ｎ、Ｋ２５９Ｑ、Ｋ２５９Ｒ、Ｒ２６４Ｆ、Ｒ２６４Ｍ、Ｒ２６４Ｔ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｒ２６６Ｎ、Ｒ２６６Ｑ、Ｅ２６９Ｄ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｙ、Ｃ２８６Ｖ、Ｃ２８６Ｎ、Ｋ２９２Ｌ、Ｔ２９８Ｉ、Ｉ３００Ｎ、Ｄ３０１Ｒ、Ｙ３０４Ｆ、Ｄ３０５Ｒ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｒ、Ｆ３１６Ｅ、Ｅ３２１Ｄ、Ｖ３２５Ｋ、Ｉ３２８Ｅ、Ｃ３３８Ｖ、Ｃ３３８Ｌ、Ｌ３４０Ｋ、Ｃ３７０Ｅ、Ｃ３７０Ｎ、Ｃ３７０Ｋ、Ｃ３７０Ｖ、Ｅ３７１Ｄ、Ｃ３７３Ｖ、Ｃ３７３Ｙ、Ｅ３７９Ｔ、Ｓ３８３Ｉ、Ｋ３８６Ｒ、Ｉ３８８Ｃ、Ａ３９０Ｃ、Ｙ３９４Ｆ、Ｓ４０１Ｔ、Ｓ４０２Ｌ、Ｇ４０４Ａ、Ｇ４０４Ｍ、Ｖ４０５Ｃ、Ｌ４１４Ｃ、Ｃ４１６Ｅ、Ｃ４４０Ｓ、Ｒ４４４Ｔ、Ｎ４４７Ｌ、Ｎ４４７Ｒ、Ｒ４５８Ｑ、Ｔ４６１Ｒ、Ｔ４６２Ｍ、Ｔ４６２Ｓ、Ｔ４６６Ｆ、Ｔ４６６Ｃ、Ｔ４６６Ｗ、Ｔ４６６Ｍ、Ｔ４６６Ｙ、Ｔ４６６Ｈ、Ｔ４６６Ｐ、Ｔ４６６Ｑ、Ｔ４６６Ｎ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４７１Ｃ、Ｃ４８０Ｎ、Ｃ４８０Ｙ、Ｃ４８０Ｖ、Ｋ４８１Ｅ、Ｒ４８４Ｋ、Ｋ４９２Ｅ、Ｖ４９９Ｉ、Ｐ５０５Ｈ、Ｆ５０８Ｃ、Ｆ５０８Ｑ、Ｆ５０８Ｒ、Ｉ５１８Ｃ、Ｉ５１８Ｓ、Ｓ５１９Ｎ、Ｈ５２０Ｎ、Ｃ５２１Ｎ、Ｃ５２１Ｓ、Ｃ５２１Ｖ、Ｃ５２１Ｅ、Ｃ５２１Ｉ、Ｙ５２３Ｉ、Ｙ５２３Ｌ、およびＧ５３０Ｋからなる群より選ばれる、請求項１記載の改変イソプレンシンターゼ。
【請求項３】
Ｎ末端にシグナル配列をさらに有する、請求項１または２記載の改変イソプレンシンターゼ。
【請求項４】
下記：
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、あるいは
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有する、請求項３記載の改変イソプレンシンターゼ：
Ｓ４５、Ｆ７４、Ｌ７８、Ｌ１１０、Ｉ１３３、Ｖ１４０、Ｌ１５７、Ｑ１６６、Ｄ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７０、Ｒ１７１、Ｋ１７３、Ｄ１７４、Ｇ１７７、Ｃ１８０、Ｖ１８７、Ｖ２３０、Ｒ２４５、Ｌ２６７、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｌ２９２、Ｔ３００、Ｋ３０２、Ｒ３０７、Ｄ３０８、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｃ３２９、Ｋ３３５、Ｔ３４１、Ｉ３４３、Ｄ３４４、Ｙ３４７、Ｄ３４８、Ｅ３５５、Ｆ３５９、Ｅ３６４、Ｖ３６８、Ｉ３７１、Ｃ３８１、Ｌ３８３、Ｃ４１３、Ｅ４１４、Ｃ４１６、Ｅ４２２、Ｓ４２６、Ｋ４２９、Ｉ４３１、Ａ４３３、Ｙ４３７、Ｓ４４４、Ｓ４４５、Ｇ４４７、Ｖ４４８、Ｌ４５７、Ｃ４５９、Ｃ４８３、Ｒ４８７、Ｎ４９０、Ｒ５０１、Ｔ５０４、Ｔ５０５、Ｔ５０９、Ｅ５１４、Ｃ５２３、Ｋ５２４、Ｒ５２７、Ｋ５３５、Ｖ５４２、Ｐ５４８、Ｆ５５１、Ｉ５６１、Ｓ５６２、Ｈ５６３、Ｃ５６４、Ｙ５６６、およびＧ５７３。
【請求項５】
前記変異が、Ｓ４５Ａ、Ｆ７４Ｅ、Ｆ７４Ｋ、Ｌ７８Ｅ、Ｌ７８Ｋ、Ｌ１１０Ｅ、Ｉ１３３Ｅ、Ｖ１４０Ｅ、Ｌ１５７Ｅ、Ｑ１６６Ｃ、Ｄ１６７Ｅ、Ｖ１６８Ｅ、Ｋ１７０Ｄ、Ｋ１７０Ｅ、Ｋ１７０Ｎ、Ｋ１７０Ｒ、Ｒ１７１Ｋ、Ｋ１７３Ｇ、Ｄ１７４Ｃ、Ｇ１７７Ｐ、Ｃ１８０Ｅ、Ｃ１８０Ｉ、Ｃ１８０Ｌ、Ｃ１８０Ｍ、Ｃ１８０Ｓ、Ｃ１８０Ｍ、Ｖ１８７Ｅ、Ｖ２３０Ｅ、Ｒ２４５Ｄ、Ｒ２４５Ｎ、Ｌ２６７Ｅ、Ｌ２９０Ｄ、Ｌ２９０Ｅ、Ｌ２９０Ｑ、Ｓ２９１Ｅ、Ｓ２９１Ｋ、Ｓ２９１Ｒ、Ｌ２９２Ｅ、Ｌ２９２Ｋ、Ｌ２９２Ｒ、Ｌ２９２Ｔ、Ｔ３００Ｌ、Ｋ３０２Ｄ、Ｋ３０２Ｅ、Ｋ３０２Ｎ、Ｋ３０２Ｑ、Ｋ３０２Ｒ、Ｒ３０７Ｆ、Ｒ３０７Ｍ、Ｒ３０７Ｔ、Ｄ３０８Ｅ、Ｄ３０８Ｎ、Ｄ３０８Ｑ、Ｄ３０８Ｒ、Ｒ３０９Ｎ、Ｒ３０９Ｑ、Ｅ３１２Ｄ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｙ、Ｃ３２９Ｖ、Ｃ３２９Ｎ、Ｋ３３５Ｌ、Ｔ３４１Ｉ、Ｉ３４３Ｎ、Ｄ３４４Ｒ、Ｙ３４７Ｆ、Ｄ３４８Ｒ、Ｅ３５５Ｉ、Ｅ３５５Ｒ、Ｆ３５９Ｅ、Ｅ３６４Ｄ、Ｖ３６８Ｋ、Ｉ３７１Ｅ、Ｃ３８１Ｖ、Ｃ３８１Ｌ、Ｌ３８３Ｋ、Ｃ４１３Ｅ、Ｃ４１３Ｎ、Ｃ４１３Ｋ、Ｃ４１３Ｖ、Ｅ４１４Ｄ、Ｃ４１６Ｖ、Ｃ４１６Ｙ、Ｅ４２２Ｔ、Ｓ４２６Ｉ、Ｋ４２９Ｒ、Ｉ４３１Ｃ、Ａ４３３Ｃ、Ｙ４３７Ｆ、Ｓ４４４Ｔ、Ｓ４４５Ｌ、Ｇ４４７Ａ、Ｇ４４７Ｍ、Ｖ４４８Ｃ、Ｌ４５７Ｃ、Ｃ４５９Ｅ、Ｃ４８３Ｓ、Ｒ４８７Ｔ、Ｎ４９０Ｌ、Ｎ４９０Ｒ、Ｒ５０１Ｑ、Ｔ５０４Ｒ、Ｔ５０５Ｍ、Ｔ５０５Ｓ、Ｔ５０９Ｆ、Ｔ５０９Ｃ、Ｔ５０９Ｗ、Ｔ５０９Ｍ、Ｔ５０９Ｙ、Ｔ５０９Ｈ、Ｔ５０９Ｐ、Ｔ５０９Ｑ、Ｔ５０９Ｎ、Ｔ５０９Ａ、Ｅ５１４Ｃ、Ｃ５２３Ｎ、Ｃ５２３Ｙ、Ｃ５２３Ｖ、Ｋ５２４Ｅ、Ｒ５２７Ｋ、Ｋ５３５Ｅ、Ｖ５４２Ｉ、Ｐ５４８Ｈ、Ｆ５５１Ｃ、Ｆ５５１Ｑ、Ｆ５５１Ｒ、Ｉ５６１Ｃ、Ｉ５６１Ｓ、Ｓ５６２Ｎ、Ｈ５６３Ｎ、Ｃ５６４Ｎ、Ｃ５６４Ｓ、Ｃ５６４Ｖ、Ｃ５６４Ｅ、Ｃ５６４Ｉ、Ｙ５６６Ｉ、Ｙ５６６Ｌ、およびＧ５７３Ｋからなる群より選ばれる、請求項４記載の改変イソプレンシンターゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載の改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの発現単位を含む宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、メバロン酸経路およびメチルエリスリトールリン酸経路の双方によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項８〜１０のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、コリネバクテリウム属、パントエア属、エンテロバクター属、またはサッカロミセス属に属する微生物である、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１３】
改変イソプレンシンターゼを請求項８〜１２のいずれか一項記載の宿主細胞を用いて生成することを含む、改変イソプレンシンターゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項記載の改変イソプレンシンターゼの存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか一項記載の宿主細胞の培地中での培養によりイソプレンモノマーが生成される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；および
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリマーを含むゴム組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変イソプレンシンターゼおよびそれをコードするポリヌクレオチドなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパームとの競合で農園拡大は容易でないことから天然ゴムの収量増加は見込みにくく、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがあるが、原料モノマー（イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン））は、主にナフサのクラッキング解により得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。【０００３】
このような要望に対して、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを生産する方法などが開示されている（特許文献１〜１１、非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１８５６４号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／００７６７４３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１３／００４５８９１号公報
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０２９５６３２号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０３３０７０９号公報
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１３／０３３０７９６号公報
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１３／０２９５６３２号公報
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号公報
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１１／００３９３２３号公報
【特許文献１１】国際公開第２０１３／０１６５９１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｅｓｓｅｌｍｅｉｅｒ  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、第２３−８８頁、１９９９
【非特許文献２】Ｍｏｎｓｏｎ  Ｒ．Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第９８巻、第１１７５〜１１８０頁、１９９２年
【非特許文献３】Ｋｕｚｍａ  Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第１０１巻、第４３５〜４４０頁、１９９３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、酵素特性の観点から、より改良された酵素を用いて、イソプレンモノマーの高い生産性を実現することが望まれている。【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、優れたイソプレンモノマー生産系の確立に有用な酵素などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ  ｂｒａｃｔｅａｔａ）由来のイソプレンシンターゼのアミノ酸残基を変異させることにより、イソプレンモノマー生産能に優れた改変イソプレンシンターゼを作製することに成功し、本願発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本願発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有する改変イソプレンシンターゼ：
Ｓ２、Ｆ３１、Ｌ３５、Ｌ６７、Ｉ９０、Ｖ９７、Ｌ１１４、Ｑ１２３、Ｄ１２４、Ｖ１２５、Ｋ１２７、Ｒ１２８、Ｋ１３０、Ｄ１３１、Ｇ１３４、Ｃ１３７、Ｖ１４４、Ｖ１８７、Ｒ２０２、Ｌ２２４、Ｌ２４７、Ｓ２４８、Ｌ２４９、Ｔ２５７、Ｋ２５９、Ｒ２６４、Ｄ２６５、Ｒ２６６、Ｅ２６９、Ｃ２８６、Ｋ２９２、Ｔ２９８、Ｉ３００、Ｄ３０１、Ｙ３０４、Ｄ３０５、Ｅ３１２、Ｆ３１６、Ｅ３２１、Ｖ３２５、Ｉ３２８、Ｃ３３８、Ｌ３４０、Ｃ３７０、Ｅ３７１、Ｃ３７３、Ｅ３７９、Ｓ３８３、Ｋ３８６、Ｉ３８８、Ａ３９０、Ｙ３９４、Ｓ４０１、Ｓ４０２、Ｇ４０４、Ｖ４０５、Ｌ４１４、Ｃ４１６、Ｃ４４０、Ｒ４４４、Ｎ４４７、Ｒ４５８、Ｔ４６１、Ｔ４６２、Ｔ４６６、Ｅ４７１、Ｃ４８０、Ｋ４８１、Ｒ４８４、Ｋ４９２、Ｖ４９９、Ｐ５０５、Ｆ５０８、Ｉ５１８、Ｓ５１９、Ｈ５２０、Ｃ５２１、Ｙ５２３、およびＧ５３０。
〔２〕前記変異が、Ｓ２Ａ、Ｆ３１Ｅ、Ｆ３１Ｋ、Ｌ３５Ｅ、Ｌ３５Ｋ、Ｌ６７Ｅ、Ｉ９０Ｅ、Ｖ９７Ｅ、Ｌ１１４Ｅ、Ｑ１２３Ｃ、Ｄ１２４Ｅ、Ｖ１２５Ｅ、Ｋ１２７Ｄ、Ｋ１２７Ｅ、Ｋ１２７Ｎ、Ｋ１２７Ｒ、Ｒ１２８Ｋ、Ｋ１３０Ｇ、Ｄ１３１Ｃ、Ｇ１３４Ｐ、Ｃ１３７Ｅ、Ｃ１３７Ｉ、Ｃ１３７Ｌ、Ｃ１３７Ｍ、Ｃ１３７Ｓ、Ｖ１４４Ｅ、Ｖ１８７Ｅ、Ｒ２０２Ｄ、Ｒ２０２Ｎ、Ｌ２２４Ｅ、Ｌ２４７Ｄ、Ｌ２４７Ｅ、Ｌ２４７Ｑ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｒ、Ｌ２４９Ｅ、Ｌ２４９Ｋ、Ｌ２４９Ｒ、Ｌ２４９Ｔ、Ｔ２５７Ｌ、Ｋ２５９Ｄ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２５９Ｎ、Ｋ２５９Ｑ、Ｋ２５９Ｒ、Ｒ２６４Ｆ、Ｒ２６４Ｍ、Ｒ２６４Ｔ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｒ２６６Ｎ、Ｒ２６６Ｑ、Ｅ２６９Ｄ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｙ、Ｃ２８６Ｖ、Ｃ２８６Ｎ、Ｋ２９２Ｌ、Ｔ２９８Ｉ、Ｉ３００Ｎ、Ｄ３０１Ｒ、Ｙ３０４Ｆ、Ｄ３０５Ｒ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｒ、Ｆ３１６Ｅ、Ｅ３２１Ｄ、Ｖ３２５Ｋ、Ｉ３２８Ｅ、Ｃ３３８Ｖ、Ｃ３３８Ｌ、Ｌ３４０Ｋ、Ｃ３７０Ｅ、Ｃ３７０Ｎ、Ｃ３７０Ｋ、Ｃ３７０Ｖ、Ｅ３７１Ｄ、Ｃ３７３Ｖ、Ｃ３７３Ｙ、Ｅ３７９Ｔ、Ｓ３８３Ｉ、Ｋ３８６Ｒ、Ｉ３８８Ｃ、Ａ３９０Ｃ、Ｙ３９４Ｆ、Ｓ４０１Ｔ、Ｓ４０２Ｌ、Ｇ４０４Ａ、Ｇ４０４Ｍ、Ｖ４０５Ｃ、Ｌ４１４Ｃ、Ｃ４１６Ｅ、Ｃ４４０Ｓ、Ｒ４４４Ｔ、Ｎ４４７Ｌ、Ｎ４４７Ｒ、Ｒ４５８Ｑ、Ｔ４６１Ｒ、Ｔ４６２Ｍ、Ｔ４６２Ｓ、Ｔ４６６Ｆ、Ｔ４６６Ｃ、Ｔ４６６Ｗ、Ｔ４６６Ｍ、Ｔ４６６Ｙ、Ｔ４６６Ｈ、Ｔ４６６Ｐ、Ｔ４６６Ｑ、Ｔ４６６Ｎ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４７１Ｃ、Ｃ４８０Ｎ、Ｃ４８０Ｙ、Ｃ４８０Ｖ、Ｋ４８１Ｅ、Ｒ４８４Ｋ、Ｋ４９２Ｅ、Ｖ４９９Ｉ、Ｐ５０５Ｈ、Ｆ５０８Ｃ、Ｆ５０８Ｑ、Ｆ５０８Ｒ、Ｉ５１８Ｃ、Ｉ５１８Ｓ、Ｓ５１９Ｎ、Ｈ５２０Ｎ、Ｃ５２１Ｎ、Ｃ５２１Ｓ、Ｃ５２１Ｖ、Ｃ５２１Ｅ、Ｃ５２１Ｉ、Ｙ５２３Ｉ、Ｙ５２３Ｌ、およびＧ５３０Ｋからなる群より選ばれる、〔１〕の改変イソプレンシンターゼ。
〔３〕Ｎ末端にシグナル配列をさらに有する、〔１〕または〔２〕の改変イソプレンシンターゼ。
〔４〕下記：
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、あるいは
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有する、〔３〕の改変イソプレンシンターゼ：
Ｓ４５、Ｆ７４、Ｌ７８、Ｌ１１０、Ｉ１３３、Ｖ１４０、Ｌ１５７、Ｑ１６６、Ｄ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７０、Ｒ１７１、Ｋ１７３、Ｄ１７４、Ｇ１７７、Ｃ１８０、Ｖ１８７、Ｖ２３０、Ｒ２４５、Ｌ２６７、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｌ２９２、Ｔ３００、Ｋ３０２、Ｒ３０７、Ｄ３０８、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｃ３２９、Ｋ３３５、Ｔ３４１、Ｉ３４３、Ｄ３４４、Ｙ３４７、Ｄ３４８、Ｅ３５５、Ｆ３５９、Ｅ３６４、Ｖ３６８、Ｉ３７１、Ｃ３８１、Ｌ３８３、Ｃ４１３、Ｅ４１４、Ｃ４１６、Ｅ４２２、Ｓ４２６、Ｋ４２９、Ｉ４３１、Ａ４３３、Ｙ４３７、Ｓ４４４、Ｓ４４５、Ｇ４４７、Ｖ４４８、Ｌ４５７、Ｃ４５９、Ｃ４８３、Ｒ４８７、Ｎ４９０、Ｒ５０１、Ｔ５０４、Ｔ５０５、Ｔ５０９、Ｅ５１４、Ｃ５２３、Ｋ５２４、Ｒ５２７、Ｋ５３５、Ｖ５４２、Ｐ５４８、Ｆ５５１、Ｉ５６１、Ｓ５６２、Ｈ５６３、Ｃ５６４、Ｙ５６６、およびＧ５７３。
〔５〕前記変異が、Ｓ４５Ａ、Ｆ７４Ｅ、Ｆ７４Ｋ、Ｌ７８Ｅ、Ｌ７８Ｋ、Ｌ１１０Ｅ、Ｉ１３３Ｅ、Ｖ１４０Ｅ、Ｌ１５７Ｅ、Ｑ１６６Ｃ、Ｄ１６７Ｅ、Ｖ１６８Ｅ、Ｋ１７０Ｄ、Ｋ１７０Ｅ、Ｋ１７０Ｎ、Ｋ１７０Ｒ、Ｒ１７１Ｋ、Ｋ１７３Ｇ、Ｄ１７４Ｃ、Ｇ１７７Ｐ、Ｃ１８０Ｅ、Ｃ１８０Ｉ、Ｃ１８０Ｌ、Ｃ１８０Ｍ、Ｃ１８０Ｓ、Ｃ１８０Ｍ、Ｖ１８７Ｅ、Ｖ２３０Ｅ、Ｒ２４５Ｄ、Ｒ２４５Ｎ、Ｌ２６７Ｅ、Ｌ２９０Ｄ、Ｌ２９０Ｅ、Ｌ２９０Ｑ、Ｓ２９１Ｅ、Ｓ２９１Ｋ、Ｓ２９１Ｒ、Ｌ２９２Ｅ、Ｌ２９２Ｋ、Ｌ２９２Ｒ、Ｌ２９２Ｔ、Ｔ３００Ｌ、Ｋ３０２Ｄ、Ｋ３０２Ｅ、Ｋ３０２Ｎ、Ｋ３０２Ｑ、Ｋ３０２Ｒ、Ｒ３０７Ｆ、Ｒ３０７Ｍ、Ｒ３０７Ｔ、Ｄ３０８Ｅ、Ｄ３０８Ｎ、Ｄ３０８Ｑ、Ｄ３０８Ｒ、Ｒ３０９Ｎ、Ｒ３０９Ｑ、Ｅ３１２Ｄ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｙ、Ｃ３２９Ｖ、Ｃ３２９Ｎ、Ｋ３３５Ｌ、Ｔ３４１Ｉ、Ｉ３４３Ｎ、Ｄ３４４Ｒ、Ｙ３４７Ｆ、Ｄ３４８Ｒ、Ｅ３５５Ｉ、Ｅ３５５Ｒ、Ｆ３５９Ｅ、Ｅ３６４Ｄ、Ｖ３６８Ｋ、Ｉ３７１Ｅ、Ｃ３８１Ｖ、Ｃ３８１Ｌ、Ｌ３８３Ｋ、Ｃ４１３Ｅ、Ｃ４１３Ｎ、Ｃ４１３Ｋ、Ｃ４１３Ｖ、Ｅ４１４Ｄ、Ｃ４１６Ｖ、Ｃ４１６Ｙ、Ｅ４２２Ｔ、Ｓ４２６Ｉ、Ｋ４２９Ｒ、Ｉ４３１Ｃ、Ａ４３３Ｃ、Ｙ４３７Ｆ、Ｓ４４４Ｔ、Ｓ４４５Ｌ、Ｇ４４７Ａ、Ｇ４４７Ｍ、Ｖ４４８Ｃ、Ｌ４５７Ｃ、Ｃ４５９Ｅ、Ｃ４８３Ｓ、Ｒ４８７Ｔ、Ｎ４９０Ｌ、Ｎ４９０Ｒ、Ｒ５０１Ｑ、Ｔ５０４Ｒ、Ｔ５０５Ｍ、Ｔ５０５Ｓ、Ｔ５０９Ｆ、Ｔ５０９Ｃ、Ｔ５０９Ｗ、Ｔ５０９Ｍ、Ｔ５０９Ｙ、Ｔ５０９Ｈ、Ｔ５０９Ｐ、Ｔ５０９Ｑ、Ｔ５０９Ｎ、Ｔ５０９Ａ、Ｅ５１４Ｃ、Ｃ５２３Ｎ、Ｃ５２３Ｙ、Ｃ５２３Ｖ、Ｋ５２４Ｅ、Ｒ５２７Ｋ、Ｋ５３５Ｅ、Ｖ５４２Ｉ、Ｐ５４８Ｈ、Ｆ５５１Ｃ、Ｆ５５１Ｑ、Ｆ５５１Ｒ、Ｉ５６１Ｃ、Ｉ５６１Ｓ、Ｓ５６２Ｎ、Ｈ５６３Ｎ、Ｃ５６４Ｎ、Ｃ５６４Ｓ、Ｃ５６４Ｖ、Ｃ５６４Ｅ、Ｃ５６４Ｉ、Ｙ５６６Ｉ、Ｙ５６６Ｌ、およびＧ５７３Ｋからなる群より選ばれる、〔４〕の改変イソプレンシンターゼ。
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかの改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕〔６〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔８〕〔１〕〜〔５〕のいずれかの改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの発現単位を含む宿主細胞。
〔９〕前記宿主細胞が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔８〕の宿主細胞。
〔１０〕前記宿主細胞が大腸菌である、〔９〕の宿主細胞。
〔１１〕前記宿主細胞が、メバロン酸経路およびメチルエリスリトールリン酸経路の双方によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔８〕〜〔１０〕のいずれかの宿主細胞。
〔１２〕前記宿主細胞が、コリネバクテリウム属、パントエア属、エンテロバクター属、またはサッカロミセス属に属する微生物である、〔８〕の宿主細胞。
〔１３〕改変イソプレンシンターゼを〔８〕〜〔１２〕のいずれかの宿主細胞を用いて生成することを含む、改変イソプレンシンターゼの製造方法。
〔１４〕〔１〕〜〔５〕のいずれかの改変イソプレンシンターゼの存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
〔１５〕〔８〕〜〔１２〕のいずれかの宿主細胞の培地中での培養によりイソプレンモノマーが生成される、〔１４〕の方法。
〔１６〕前記宿主細胞の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、〔１５〕の方法。
〔１７〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）〔１４〕〜〔１６〕のいずれかの方法によりイソプレンモノマーを生成すること；および
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔１８〕〔１４〕〜〔１６〕のいずれかの方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
〔１９〕〔１８〕のポリマーを含むゴム組成物。
〔２０〕〔１９〕のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れたイソプレンモノマー生産系を確立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、種々の植物の葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量を示す図である。
【図２】図２は、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を示す図である。
【図３】図３は、染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。
【図４】図４は、染色体におけるｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、改変イソプレンシンターゼを提供する。
【００１３】
イソプレンシンターゼは、ジメチルアリルジホスフェートをイソプレンに転換する酵素である。本発明の改変イソプレンシンターゼは、ムクナに由来し得る。ムクナ由来のイソプレンシンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列によりコードされるタンパク質（シグナル配列が除去された成熟タンパク質）、または配列番号２のアミノ酸配列によりコードされるタンパク質（シグナル配列を有するタンパク質）である。ムクナ由来のイソプレンシンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端に人工的に付加されているメチオニン残基を欠失していてもよい。
【００１４】
一実施形態では、本発明の改変イソプレンシンターゼは、Ｎ末端にシグナル配列を有しないイソプレンシンターゼの変異体であり得る。Ｎ末端にシグナル配列を有しないイソプレンシンターゼは、下記：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、イソプレン合成活性を有するものである。
本発明において、イソプレン合成活性とは、ジメチルアリルジホスフェートをイソプレンに転換する活性をいう（以下同様）。
【００１５】
本発明の改変イソプレンシンターゼは、Ｎ末端にシグナル配列を有していてもよい。別の実施形態では、本発明の改変イソプレンシンターゼは、Ｎ末端にシグナル配列を有するイソプレンシンターゼの変異体である。シグナル配列としては、例えば、葉緑体移行シグナル配列（例、配列番号２のアミノ酸配列中、１〜４４位のアミノ酸残基からなる配列）等の移行シグナル配列、および分泌シグナル配列が挙げられる。Ｎ末端にシグナル配列を有するイソプレンシンターゼとしては、例えば、下記：
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、あるいは
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、イソプレン合成活性を有するものが挙げられる。
【００１６】
上記（ｂ）および（ｄ）のイソプレンシンターゼは、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
【００１７】
上記（ｃ）および（ｆ）のイソプレンシンターゼのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４および配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００１８】
アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１９】
上記（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）のアミノ酸配列において変異を導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして追加変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログ（既知のイソプレンシンターゼ）のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。
【００２０】
アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２１】
本発明の改変イソプレンシンターゼは、イソプレン生成量が改善するように少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものである。アミノ酸残基の変異としては、例えば、置換、欠失、付加および挿入が挙げられるが、置換が好ましい。変異されるべきアミノ酸残基は、天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入後のアミノ酸残基は、上述した変異されるべきアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
【００２２】
イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、Ｓ２、Ｆ３１、Ｌ３５、Ｌ６７、Ｉ９０、Ｖ９７、Ｌ１１４、Ｑ１２３、Ｄ１２４、Ｖ１２５、Ｋ１２７、Ｒ１２８、Ｋ１３０、Ｄ１３１、Ｇ１３４、Ｃ１３７、Ｖ１４４、Ｖ１８７、Ｒ２０２、Ｌ２２４、Ｌ２４７、Ｓ２４８、Ｌ２４９、Ｔ２５７、Ｋ２５９、Ｒ２６４、Ｄ２６５、Ｒ２６６、Ｅ２６９、Ｃ２８６、Ｋ２９２、Ｔ２９８、Ｉ３００、Ｄ３０１、Ｙ３０４、Ｄ３０５、Ｅ３１２、Ｆ３１６、Ｅ３２１、Ｖ３２５、Ｉ３２８、Ｃ３３８、Ｌ３４０、Ｃ３７０、Ｅ３７１、Ｃ３７３、Ｅ３７９、Ｓ３８３、Ｋ３８６、Ｉ３８８、Ａ３９０、Ｙ３９４、Ｓ４０１、Ｓ４０２、Ｇ４０４、Ｖ４０５、Ｌ４１４、Ｃ４１６、Ｃ４４０、Ｒ４４４、Ｎ４４７、Ｒ４５８、Ｔ４６１、Ｔ４６２、Ｔ４６６、Ｅ４７１、Ｃ４８０、Ｋ４８１、Ｒ４８４、Ｋ４９２、Ｖ４９９、Ｐ５０５、Ｆ５０８、Ｉ５１８、Ｓ５１９、Ｈ５２０、Ｃ５２１、Ｙ５２３、およびＧ５３０より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を含むものであってもよい。上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端にシグナル配列を有していてもよいこと、ならびに欠失および置換等の変異を有していてもよいから、上記位置は、シグナル配列の有無およびその長さ、ならびに変異の有無などによって変化し得る。例えば、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｓ４５、Ｆ７４、Ｌ７８、Ｌ１１０、Ｉ１３３、Ｖ１４０、Ｌ１５７、Ｑ１６６、Ｄ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７０、Ｒ１７１、Ｋ１７３、Ｄ１７４、Ｇ１７７、Ｃ１８０、Ｖ１８７、Ｖ２３０、Ｒ２４５、Ｌ２６７、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｌ２９２、Ｔ３００、Ｋ３０２、Ｒ３０７、Ｄ３０８、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｃ３２９、Ｋ３３５、Ｔ３４１、Ｉ３４３、Ｄ３４４、Ｙ３４７、Ｄ３４８、Ｅ３５５、Ｆ３５９、Ｅ３６４、Ｖ３６８、Ｉ３７１、Ｃ３８１、Ｌ３８３、Ｃ４１３、Ｅ４１４、Ｃ４１６、Ｅ４２２、Ｓ４２６、Ｋ４２９、Ｉ４３１、Ａ４３３、Ｙ４３７、Ｓ４４４、Ｓ４４５、Ｇ４４７、Ｖ４４８、Ｌ４５７、Ｃ４５９、Ｃ４８３、Ｒ４８７、Ｎ４９０、Ｒ５０１、Ｔ５０４、Ｔ５０５、Ｔ５０９、Ｅ５１４、Ｃ５２３、Ｋ５２４、Ｒ５２７、Ｋ５３５、Ｖ５４２、Ｐ５４８、Ｆ５５１、Ｉ５６１、Ｓ５６２、Ｈ５６３、Ｃ５６４、Ｙ５６６、およびＧ５７３より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を含むものであってもよい。本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記位置の変異を複数（例、１〜１０個、１〜５個、１〜３個または１もしくは２個）組み合わせて含んでいてもよい。後述する特定の実施形態におけるアミノ酸残基の変異も同様に、上記位置で同様の複数の変異を含んでいてもよい。
【００２３】
一実施形態では、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異は、ムクナ由来のイソプレンシンターゼ（以下、必要に応じて、改変前のイソプレンシンターゼと称する）に比し、イソプレン合成活性を増強するように導入される。イソプレン合成活性を増強するアミノ酸残基の変異としては、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列におけるＦ３１、Ｌ３５、Ｌ６７、Ｉ９０、Ｖ９７、Ｄ１２４、Ｖ１２５、Ｋ１２７、Ｒ１２８、Ｋ１３０、Ｄ１３１、Ｇ１３４、Ｃ１３７、Ｒ２０２、Ｌ２４７、Ｓ２４８、Ｌ２４９、Ｔ２５７、Ｋ２５９、Ｒ２６４、Ｄ２６５、Ｒ２６６、Ｅ２６９、Ｃ２８６、Ｋ２９２、Ｔ２９８、Ｄ３０１、Ｄ３０５、Ｅ３１２、Ｆ３１６、Ｅ３２１、Ｖ３２５、Ｉ３２８、Ｌ３４０、Ｃ３７０、Ｅ３７１、Ｃ３７３、Ｅ３７９、Ｓ３８３、Ｋ３８６、Ａ３９０、Ｓ４０１、Ｓ４０２、Ｇ４０４、Ｒ４４４、Ｎ４４７、Ｒ４５８、Ｔ４６１、Ｔ４６２、Ｅ４７１、Ｃ４８０、Ｋ４８１、Ｒ４８４、Ｋ４９２、Ｖ４９９、Ｐ５０５、Ｆ５０８、Ｉ５１８、Ｓ５１９、Ｈ５２０、Ｃ５２１、Ｙ５２３、およびＧ５３０より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異が挙げられる。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｆ７４、Ｌ７８、Ｌ１１０、Ｉ１３３、Ｖ１４０、Ｄ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７０、Ｒ１７１、Ｋ１７３、Ｄ１７４、Ｇ１７７、Ｃ１８０、Ｒ２４５、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｌ２９２、Ｔ３００、Ｋ３０２、Ｒ３０７、Ｄ３０８、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｃ３２９、Ｋ３３５、Ｔ３４１、Ｄ３４４、Ｄ３４８、Ｅ３５５、Ｆ３５９、Ｅ３６４、Ｖ３６８、Ｉ３７１、Ｌ３８３、Ｃ４１３、Ｅ４１４、Ｃ４１６、Ｅ４２２、Ｓ４２６、Ｋ４２９、Ａ４３３、Ｓ４４４、Ｓ４４５、Ｇ４４７、Ｒ４８７、Ｎ４９０、Ｒ５０１、Ｔ５０４、Ｔ５０５、Ｅ５１４、Ｃ５２３、Ｋ５２４、Ｒ５２７、Ｋ５３５、Ｖ５４２、Ｐ５４８、Ｆ５５１、Ｉ５６１、Ｓ５６２、Ｈ５６３、Ｃ５６４、Ｙ５６６、およびＧ５７３より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。改変前のイソプレンシンターゼ（例、配列番号４または配列番号２）に対する改変イソプレンシンターゼのイソプレン合成活性の増強の程度は、改変前のイソプレンシンターゼよりも活性が向上している限り特に制限されないが、例えば１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．３倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、最も好ましくは２倍以上である。
より具体的には、イソプレン合成活性を増強するアミノ酸残基の変異を含む改変イソプレンシンターゼは、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、Ｆ３１Ｅ、Ｆ３１Ｋ、Ｌ３５Ｅ、Ｌ３５Ｋ、Ｌ６７Ｅ、Ｉ９０Ｅ、Ｖ９７Ｅ、Ｄ１２４Ｅ、Ｖ１２５Ｅ、Ｋ１２７Ｄ、Ｋ１２７Ｅ、Ｋ１２７Ｎ、Ｋ１２７Ｒ、Ｒ１２８Ｋ、Ｋ１３０Ｇ、Ｄ１３１Ｃ、Ｇ１３４Ｐ、Ｃ１３７Ｅ、Ｃ１３７Ｉ、Ｃ１３７Ｌ、Ｃ１３７Ｍ、Ｃ１３７Ｓ、Ｒ２０２Ｄ、Ｒ２０２Ｎ、Ｌ２４７Ｄ、Ｌ２４７Ｅ、Ｌ２４７Ｑ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｒ、Ｌ２４９Ｅ、Ｌ２４９Ｋ、Ｌ２４９Ｒ、Ｌ２４９Ｔ、Ｔ２５７Ｌ、Ｋ２５９Ｄ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２５９Ｎ、Ｋ２５９Ｑ、Ｋ２５９Ｒ、Ｒ２６４Ｆ、Ｒ２６４Ｍ、Ｒ２６４Ｔ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｒ２６６Ｎ、Ｒ２６６Ｑ、Ｅ２６９Ｄ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｙ、Ｃ２８６Ｎ、Ｋ２９２Ｌ、Ｔ２９８Ｉ、Ｄ３０１Ｒ、Ｄ３０５Ｒ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｒ、Ｆ３１６Ｅ、Ｅ３２１Ｄ、Ｖ３２５Ｋ、Ｉ３２８Ｅ、Ｌ３４０Ｋ、Ｃ３７０Ｖ、Ｅ３７１Ｄ、Ｃ３７３Ｙ、Ｅ３７９Ｔ、Ｋ３８６Ｒ、Ａ３９０Ｃ、Ｓ４０１Ｔ、Ｓ４０２Ｌ、Ｇ４０４Ａ、Ｇ４０４Ｍ、Ｒ４４４Ｔ、Ｎ４４７Ｌ、Ｎ４４７Ｒ、Ｒ４５８Ｑ、Ｔ４６１Ｒ、Ｔ４６２Ｍ、Ｅ４７１Ｃ、Ｃ４８０Ｎ、Ｃ４８０Ｙ、Ｋ４８１Ｅ、Ｒ４８４Ｋ、Ｋ４９２Ｅ、Ｖ４９９Ｉ、Ｐ５０５Ｈ、Ｆ５０８Ｃ、Ｆ５０８Ｑ、Ｆ５０８Ｒ、Ｉ５１８Ｃ、Ｉ５１８Ｓ、Ｓ５１９Ｎ、Ｈ５２０Ｎ、Ｃ５２１Ｎ、Ｙ５２３Ｉ、Ｙ５２３Ｌ、およびＧ５３０Ｋより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｆ７４Ｅ、Ｆ７４Ｋ、Ｌ７８Ｅ、Ｌ７８Ｋ、Ｌ１１０Ｅ、Ｉ１３３Ｅ、Ｖ１４０Ｅ、Ｄ１６７Ｅ、Ｖ１６８Ｅ、Ｋ１７０Ｄ、Ｋ１７０Ｅ、Ｋ１７０Ｎ、Ｋ１７０Ｒ、Ｒ１７１Ｋ、Ｋ１７３Ｇ、Ｄ１７４Ｃ、Ｇ１７７Ｐ、Ｃ１８０Ｅ、Ｃ１８０Ｉ、Ｃ１８０Ｌ、Ｃ１８０Ｍ、Ｃ１８０Ｓ、Ｒ２４５Ｄ、Ｒ２４５Ｎ、Ｌ２９０Ｄ、Ｌ２９０Ｅ、Ｌ２９０Ｑ、Ｓ２９１Ｅ、Ｓ２９１Ｋ、Ｓ２９１Ｒ、Ｌ２９２Ｅ、Ｌ２９２Ｋ、Ｌ２９２Ｒ、Ｌ２９２Ｔ、Ｔ３００Ｌ、Ｋ３０２Ｄ、Ｋ３０２Ｅ、Ｋ３０２Ｎ、Ｋ３０２Ｑ、Ｋ３０２Ｒ、Ｒ３０７Ｆ、Ｒ３０７Ｍ、Ｒ３０７Ｔ、Ｄ３０８Ｅ、Ｄ３０８Ｎ、Ｄ３０８Ｑ、Ｄ３０８Ｒ、Ｒ３０９Ｎ、Ｒ３０９Ｑ、Ｅ３１２Ｄ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｙ、Ｃ３２９Ｎ、Ｋ３３５Ｌ、Ｔ３４１Ｉ、Ｄ３４４Ｒ、Ｄ３４８Ｒ、Ｅ３５５Ｉ、Ｅ３５５Ｒ、Ｆ３５９Ｅ、Ｅ３６４Ｄ、Ｖ３６８Ｋ、Ｉ３７１Ｅ、Ｌ３８３Ｋ、Ｃ４１３Ｖ、Ｅ４１４Ｄ、Ｃ４１６Ｙ、Ｅ４２２Ｔ、Ｋ４２９Ｒ、Ａ４３３Ｃ、Ｓ４４４Ｔ、Ｓ４４５Ｌ、Ｇ４４７Ａ、Ｇ４４７Ｍ、Ｒ４８７Ｔ、Ｎ４９０Ｌ、Ｎ４９０Ｒ、Ｒ５０１Ｑ、Ｔ５０４Ｒ、Ｔ５０５Ｍ、Ｅ５１４Ｃ、Ｃ５２３Ｎ、Ｃ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｅ、Ｒ５２７Ｋ、Ｋ５３５Ｅ、Ｖ５４２Ｉ、Ｐ５４８Ｈ、Ｆ５５１Ｃ、Ｆ５５１Ｑ、Ｆ５５１Ｒ、Ｉ５６１Ｃ、Ｉ５６１Ｓ、Ｓ５６２Ｎ、Ｈ５６３Ｎ、Ｃ５６４Ｎ、Ｙ５６６Ｉ、Ｙ５６６Ｌ、およびＧ５７３Ｋより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。
【００２４】
別の実施形態では、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異は、改変前のイソプレンシンターゼに比し、酵素安定性を改善するように導入される。酵素安定性の改善は、例えば、実施例にて後述するように、改変イソプレンシンターゼによるイソプレンの蓄積率を改変前のイソプレンシンターゼによるものと比較することにより確認することができる。酵素安定性を改善するアミノ酸残基の変異としては、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列におけるＳ２、Ｖ９７、Ｌ１１４、Ｑ１２３、Ｖ１２５、Ｄ１３１、Ｃ１３７、Ｖ１４４、Ｖ１８７、Ｌ２２４、Ｃ２８６、Ｔ２９８、Ｉ３００、Ｃ３３８、Ｃ３７０、Ｃ３７３、Ｓ３８３、Ｉ３８８、Ａ３９０、Ｖ４０５、Ｌ４１４、Ｃ４１６、Ｃ４４０、Ｅ４７１、Ｃ４８０、Ｋ４８１、Ｉ５１８、およびＣ５２１より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異が挙げられる。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、酵素安定性を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｓ４５、Ｖ１４０、Ｌ１５７、Ｑ１６６、Ｖ１６８、Ｄ１７４、Ｃ１８０、Ｖ１８７、Ｖ２３０、Ｌ２６７、Ｃ３２９、Ｔ３４１、Ｉ３４３、Ｃ３８１、Ｃ４１３、Ｃ４１６、Ｓ４２６、Ｉ４３１、Ａ４３３、Ｖ４４８、Ｌ４５７、Ｃ４５９、Ｃ４８３、Ｅ５１４、Ｃ５２３、Ｋ５２４、Ｉ５６１、およびＣ５６４より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。改変前のイソプレンシンターゼ（例、配列番号４または配列番号２）に対する改変イソプレンシンターゼの酵素安定性の改善の程度は、改変前のイソプレンシンターゼよりも酵素安定性が改善している限り特に制限されないが、例えば１．１倍以上、好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは２倍以上、最も好ましくは３倍以上である。
より具体的には、酵素安定性を改善するアミノ酸残基の変異を含む改変イソプレンシンターゼは、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、Ｓ２Ａ、Ｖ９７Ｅ、Ｌ１１４Ｅ、Ｑ１２３Ｃ、Ｖ１２５Ｅ、Ｄ１３１Ｃ、Ｃ１３７Ｅ、Ｃ１３７Ｉ、Ｃ１３７Ｍ、Ｃ１３７Ｓ、Ｖ１４４Ｅ、Ｖ１８７Ｅ、Ｌ２２４Ｅ、Ｃ２８６Ｖ、Ｃ２８６Ｎ、Ｔ２９８Ｉ、Ｉ３００Ｎ、Ｃ３３８Ｖ、Ｃ３３８Ｌ、Ｃ３７０Ｖ、Ｃ３７０Ｅ、Ｃ３７０Ｎ、Ｃ３７０Ｋ、Ｃ３７３Ｖ、Ｃ３７３Ｙ、Ｓ３８３Ｉ、Ｉ３８８Ｃ、Ａ３９０Ｃ、Ｖ４０５Ｃ、Ｌ４１４Ｃ、Ｃ４１６Ｅ、Ｃ４４０Ｓ、Ｅ４７１Ｃ、Ｃ４８０Ｎ、Ｃ４８０Ｖ、Ｃ４８０Ｙ、Ｋ４８１Ｅ、Ｉ５１８Ｃ、Ｃ５２１Ｅ、Ｃ５２１Ｉ、Ｃ５２１Ｓ、Ｃ５２１Ｎ、およびＣ５２１Ｖより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、酵素安定性を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｓ４５Ａ、Ｖ１４０Ｅ、Ｌ１５７Ｅ、Ｑ１６６Ｃ、Ｖ１６８Ｅ、Ｄ１７４Ｃ、Ｃ１８０Ｅ、Ｃ１８０Ｉ、Ｃ１８０Ｍ、Ｃ１８０Ｓ、Ｖ１８７Ｅ、Ｖ２３０Ｅ、Ｌ２６７Ｅ、Ｃ３２９Ｖ、Ｃ３２９Ｎ、Ｔ３４１Ｉ、Ｉ３４３Ｎ、Ｃ３８１Ｖ、Ｃ３８１Ｌ、Ｃ４１３Ｖ、Ｃ４１３Ｅ、Ｃ４１３Ｎ、Ｃ４１３Ｋ、Ｃ４１６Ｖ、Ｃ４１６Ｙ、Ｓ４２６Ｉ、Ｉ４３１Ｃ、Ａ４３３Ｃ、Ｖ４４８Ｃ、Ｌ４５７Ｃ、Ｃ４５９Ｅ、Ｃ４８３Ｓ、Ｅ５１４Ｃ、Ｃ５２３Ｎ、Ｃ５２３Ｖ、Ｃ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｅ、Ｉ５６１Ｃ、Ｃ５６４Ｅ、Ｃ５６４Ｉ、Ｃ５６４Ｓ、Ｃ５６４Ｎ、およびＣ５６４Ｖより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。
【００２５】
さらに別の実施形態では、イソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異は、改変前のイソプレンシンターゼに比し、宿主におけるイソプレン生成量を改善するように導入される。宿主におけるイソプレン生成量の改善は、例えば、イソプレン合成活性の増強および／または酵素安定性の改善により達成される。宿主におけるイソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異としては、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列におけるＹ３０４、Ｙ３９４、Ｔ４６２、およびＴ４６６より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異が挙げられる。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、宿主におけるイソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｙ３４７、Ｙ４３７、Ｔ５０５、およびＴ５０９より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。改変前のイソプレンシンターゼ（例、配列番号４または配列番号２）に対する改変イソプレンシンターゼの、宿主におけるイソプレン生成量の改善の程度は、改変前のイソプレンシンターゼよりも宿主におけるイソプレン生成量が改善している限り特に制限されないが、例えば１．０２倍以上、好ましくは１．０５倍以上、より好ましくは１．０７倍以上、さらにより好ましくは１．１倍以上、最も好ましくは１．１５倍以上である。
より具体的には、宿主におけるイソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む改変イソプレンシンターゼは、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、Ｙ３０４Ｆ、Ｙ３９４Ｆ、Ｔ４６２Ｓ、Ｔ４６６Ｆ、Ｔ４６６Ｃ、Ｔ４６６Ｗ、Ｔ４６６Ｍ、Ｔ４６６Ｙ、Ｔ４６６Ｈ、Ｔ４６６Ｐ、Ｔ４６６Ｑ、Ｔ４６６Ｎ、およびＴ４６６Ａより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。あるいは、Ｎ末端にシグナル配列を有する上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列が上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列である場合、宿主におけるイソプレン生成量を改善するアミノ酸残基の変異を含む本発明の改変イソプレンシンターゼは、上記（ｄ）〜（ｆ）のアミノ酸配列において、Ｙ３４７Ｆ、Ｙ４３７Ｆ、Ｔ５０５Ｓ、Ｔ５０９Ｆ、Ｔ５０９Ｃ、Ｔ５０９Ｗ、Ｔ５０９Ｍ、Ｔ５０９Ｙ、Ｔ５０９Ｈ、Ｔ５０９Ｐ、Ｔ５０９Ｑ、Ｔ５０９Ｎ、およびＴ５０９Ａより選ばれる、１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明の改変イソプレンシンターゼはまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の改変イソプレンシンターゼに付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００２７】
本発明はまた、本発明の改変イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００２８】
本発明の改変イソプレンシンターゼは、本発明の改変イソプレンシンターゼを発現する本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。
【００２９】
本発明は、発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、後述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００３１】
無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、目的タンパク質のｃＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
尚、細胞系ベクターを用いたタンパク質合成については、＜形質転換体＞において後述する。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質を精製してもよい。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
【００３２】
本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された同種プロモーターまたは異種プロモーターをさらに含む。用語「同種プロモーター」とは、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の天然プロモーターをいう。用語「異種プロモーター」とは、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の天然プロモーター以外のプロモーターをいう。したがって、異種プロモーターとしては、例えば、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子以外のムクナ由来遺伝子のプロモーター、ムクナ以外の他の生物（例、微生物、動物、昆虫、および植物）由来プロモーター、ウイルス由来プロモーター、ならびに人工合成プロモーターが挙げられる。異種プロモーターとしてはまた、異種タンパク質生産に汎用されるプロモーターを用いてもよい。
【００３３】
本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００３４】
本発明の発現ベクターはまた、開始コドンの上流にリボゾーム結合部位（例、シャイン・ダルガノ配列）をさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の発現ベクターはまた、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００３６】
本発明の発現ベクターはまた、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする１以上の領域をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位が一対の相同領域（例、宿主ゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位とは、発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドの転写を可能にする単位をいう。発現単位は、上述したようなターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。
【００３７】
本発明の形質転換体は、本発明の改変イソプレンシンターゼを産生できる、または本発明のポリヌクレオチドを発現して改変イソプレンシンターゼを産生できる宿主細胞である。具体的には、本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、本発明の発現ベクターが全体として導入された宿主細胞、および本発明の発現ベクター中の発現単位がそのゲノムに導入された宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明の改変イソプレンシンターゼを発現できる限り特に限定されない。宿主細胞は、本発明の改変イソプレンシンターゼおよび本発明のポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞はまた、上記プロモーターに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。より好ましくは、本発明に用いられる宿主細胞は、細菌又は真菌である。細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
【００３８】
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
【００３９】
グラム陰性細菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）およびパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）が挙げられる。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７  Ｍａｒ  ２７；９８（２）：３４０−３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００４０】
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
その他、本発明に用いられる宿主としては、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および／またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を備えていれば特に限定されず、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。
【００４１】
本発明の形質転換体は、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現単位が、上述したような発現ベクターにより本発明の形質転換体に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現単位が、上述したような発現ベクターにより本発明の形質転換体に導入されてもよい。このような酵素の発現単位はさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を含むものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現単位は、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
【００４２】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。
【００４３】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。
【００４４】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。
【００４５】
遺伝子が組込まれた発現単位の宿主への導入（形質転換）は、発現ベクターに関する従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００４６】
更に、本発明の形質転換体において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
係る酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。
【００４７】
本発明の形質転換体から本発明のタンパク質を抽出・精製して用いてもよく、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を培養してイソプレンを生産してもよい。
【００４８】
＜イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造方法＞
本発明は、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む。
【００４９】
本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下で行われる限り特に限定されず、例えば、本発明のタンパク質自体（例、精製タンパク質）を用いる酵素反応系を利用して、または本発明のタンパク質を産生する本発明の形質転換体の培養により行うことができる。好ましくは、本発明の形質転換体の培養により行われる。本発明のイソプレンモノマーの製造方法において本発明の形質転換体を用いる場合、イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、本発明の形質転換体により、培地中の炭素源から効率的に供給される。本発明の形質転換体は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産するため、形質転換体から発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーが回収される。イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。
本発明の形質転換体を培養する培地としては、イソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００５０】
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
【００５１】
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
【００５３】
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００５４】
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００５５】
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
【００５６】
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
【００５７】
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
【００５８】
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
【００５９】
本発明において、形質転換体の培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【００６０】
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
本発明の形質転換体において、本発明のタンパク質の発現を維持するために、糖、金属塩、抗菌物質等を培地に添加しておくことが好ましい。
【００６１】
本発明の形質転換体の培養条件としては、本発明のタンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５〜約９であることが好ましい。
また、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
【００６２】
培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。
バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
【００６３】
流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
【００６４】
連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。
【００６５】
本発明の発現ベクターまたは発現単位が有するプロモーターとしては、構成的プロモーターや誘導的プロモーターが挙げられる。本発明の発現ベクターまたは発現単位がｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加して、本発明のタンパク質の発現を誘導してもよい。
【００６６】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。
【００６７】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。
ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
【００６８】
イソプレンモノマーの回収は一段階又は多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
【００６９】
更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
【００７０】
本発明のタンパク質は、従来のイソプレンシンターゼと比較してイソプレン生産能に優れるため、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを効率よく生産することができる。
【００７１】
本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【００７２】
工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学的な合成法）により行うことができる。
【００７３】
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）、またはイソプレンおよびイソプレン以外の１以上のモノマー単位を含む異種ポリマー（例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー）であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの製造方法により製造される同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）である。本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、および／または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、ならびに／または他の成分（例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤）と混合することにより調製することができる。
【００７４】
本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ね、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとする。次いで、このグリーンタイヤを常法に従って加熱加硫することにより、所望のタイヤ（例、空気式タイヤ）を製造することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００７６】
実施例１：イソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳ）改変体の設計（１）および粗精製液を用いたイソプレンシンターゼ改変体の解析
（１−１）ＩｓｐＳ改変体の設計
効率的な改変体スクリーニングのために、立体構造情報を活用したラショナル改変を行った。イソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳ）遺伝子としては、ムクナ由来イソプレン合成酵素であるＩｓｐＳＭを利用した。ＩｓｐＳＭは、ムクナ由来のＩｓｐＳ遺伝子（ヌクレオチド配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す）の葉緑体移行シグナルを欠損させ、かつそのコドン使用頻度をＥ．ｃｏｌｉ用に最適化させた遺伝子によりコードされる酵素である。ＩｓｐＳＭをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を配列番号３、ＩｓｐＳＭのアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＩｓｐＳＭの立体構造は未知であるため、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｘ  ｃａｎｅｓｃｎｅｓ由来のイソプレン合成酵素の立体構造（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：３ｎ０ｇ）を鋳型としてｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ法により、ＩｓｐＳＭのモデル構造を取得した。
ＩｓｐＳの高機能化において、二つの点に注目した。一つ目は、ＩｓｐＳとその基質であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）分子との親和性を改善することである。Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒらの文献（Ｊ．Ｐ．Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｌａｎｔａ．，２００５，２２２，７７７）によると、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｘ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ由来のＩｓｐＳと基質であるＤＭＡＰＰのＫｍ値はｍＭオーダーであることが知られていた。一般的な酵素反応における基質親和性はμＭオーダーであることから、ＩｓｐＳの基質親和性を改善する余地があると考えた。一般的に、基質結合部位の近傍に存在するアミノ酸残基を改変することで、酵素と基質の親和性や特異性に変化させる事が可能である事が知られている（プロテインエンジニアリングの応用、渡辺公綱ら編、ＣＭＣ出版）。そこで、ＩｓｐＳとＤＭＡＰＰとの親和性を改善するため、ＤＭＡＰＰ結合部位の近傍に位置する残基を改変の対象とした。以降、本方針をコンセプト（１）とする。二つ目は、ＩｓｐＳの安定性を向上させる事である。酵素の安定性は酵素分子の立体構造と密接に関わっている事が知られている。ムクナ由来のＩｓｐＳ（ＩｓｐＳＭ）のモデル構造から、ＩｓｐＳＭは分子内に分子間ジスルフィド結合を持たず、また、分子表面の疎水性が高い領域が存在すると予測された。文献で報告されたように（例えば、Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２，２９１−２９３）、遊離Ｃｙｓ残基の改変や分子表面への親水性残基の導入により酵素がより安定化する事例が知られている。モデル構造よりＩｓｐＳのＮ末端領域が一定の構造を形成しないことが示唆された。このことから、Ｎ末端領域自体やその残基数を改変することによりＩｓｐＳの安定性を高めることができるものと期待された。Ｒａｙ  Ｆａｌｌらの報告よりＩｓｐＳはその機能発現において二量体を形成することが示唆されていることから、ＩｓｐＳ同士の分子間相互作用に着目することにより二量体構造を安定化させることができるものと期待された。（ＧＭ．Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，１３０１０）
以降、遊離Ｃｙｓ残基の改変、および、遊離Ｃｙｓ残基近傍の最適化、をコンセプト（２）と、分子表面への親水性残基の導入、ＩｓｐＳのＮ末端残基の最適化、及び、ＩｓｐＳ分子の二量体構造安定化をコンセプト（３）とする。【００７７】
（１−１−１）改変後のアミノ酸
酸性残基（Ｄ，Ｅ）、塩基性残基（Ｒ，Ｋ）、中性残基（Ｎ，Ｑ）、親水性残基（Ｍ，Ｓ）、芳香族残基（Ｙ，Ｆ）から二つの点に注意して選択した。一つ目は嵩高さで、アミノ酸の物理化学的性質の真理表（たとえば、Ｍ．Ｊ．Ｚｖｅｌｅｂｉｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９５，９５７）やアミノ酸相同性の指標であるＢＬＯＳＳＵＭテーブル（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．，１９９２，８９，１０９１５）を参考にして、改変前のアミノ酸と近いアミノ酸を選択した。二つ目は立体構造情報を目視し、改変導入残基の近傍の空間充填率が低い場合、その間隙を充填するのに適したアミノ酸を選択した。【００７８】
（１−１−２）改変導入残基の選択
コンセプト（１）では、ＩｓｐＳＭのモデル立体構造においてＤＭＡＰＰ分子を構成する全原子から最短７Å以内に存在するアミノ酸残基のうち、その側鎖をＤＭＡＰＰ分子に向けているものを改変の対象として選択した。コンセプト（１）の改変体は、表１−１に示す番号１〜８８の改変体に対応する。
次いで、コンセプト（２）では、遊離チオールとして存在するＣｙｓ残基９種全て（即ち、Ｃ１３７、Ｃ２８６、Ｃ３３８、Ｃ３７０、Ｃ３７３、Ｃ４４０、Ｃ４４６、Ｃ４８０、Ｃ５２１）を改変の対象として選択した。また、Ｃｙｓ残基の改変が上手くいかなった場合を想定し、遊離チオール近傍に位置し、かつ、当該残基と水素結合しうる距離にあるアミノ酸残基も改変の対象として選択した。コンセプト（２）の改変体は、表１−２に示す番号８９〜１７８の改変体に対応する。
最後に、コンセプト（３）では、ＩｓｐＳＭのモデル立体構造において分子表面に存在し、かつ、疎水性残基であるもので、特に、立体構造に大きな変化をもたらさない可能性があるＶａｌ残基を改変の対象として選択した。また、Ｎ末端の残基はプロテアーゼに対する抵抗性と関わっているといわれており、Ｇｌｙなど小さい側鎖を持つアミノ酸にすると抵抗性が向上するといわれている（Ａ．Ｂａｃｈｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３４，  １７９−１８６（１９８６）やＪ．Ｗ．Ｔｏｂｉａｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４，  １３７４−１３７７（１９９１））。そこで、当該文献情報に則って、ＧｌｙやＡｌａなどを選択して改変した。更に、ＩｓｐＳ分子の二量体化による安定については、立体構造情報から、二量体界面に存在し、かつ、ジスルフィド結合を形成しうる残基を選択した。コンセプト（３）の改変体は、表１−３に示す番号１７９〜２１１の改変体に対応する。【００７９】
（１−２）ＩｓｐＳＭ改変体の発現用プラスミドの構築
ムクナ由来イソプレンシンターゼの大量発現用プラスミドの構築を次の手順で行った。ベクター部分について、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ（ＴａＫａＲａＢｉｏ社製、カタログ番号３３６５、配列情報はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＢ２１３６５４）を鋳型とし、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ  ＰＣＲプライマー１とｐＣｏｌｄ−ＴＦ  ＰＣＲプライマー２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ〔参考例３−３）を参照〕を鋳型とし、ＩｓｐＳＭ  ＰＣＲプライマー１とＩｓｐＳＭ  ＰＣＲプライマー２をプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ法のポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａＢｉｏ社製、カタログ番号Ｒ０１０Ａ）を利用し、反応溶液はキットに添付された組成に従って調製した。また、反応条件は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。得られたこれらのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号６３９６４８）を用いて連結した。構築したプラスミドをｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭ（配列番号９）と名付けた。配列番号９で表されるヌクレオチド配列において、１６６３〜３３１８位のヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチドは、ＩｓｐＳＭをコードする。【００８０】
（使用したＰＣＲ用プライマー）
ｐＣｏｌｄ−ＴＦ  ＰＣＲプライマー１
５’−ＣＣＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣ−３’（配列番号５）
ｐＣｏｌｄ−ＴＦ  ＰＣＲプライマー２
５’−ＴＡＧＧＴＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号６）
ＩｓｐＳＭ  ＰＣＲプライマー１
５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＡ−３’（配列番号７）
ＩｓｐＳＭ  ＰＣＲプライマー２
５’−ＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＣＧＧＧＡＡＣＧＧＧＴＣＡＡ−３’（配列番号８）【００８１】
（１−３）発現プラスミドの調製
設計した改変体をコードするプラスミドは、以下の方法で取得した。前述の方法にて調製した発現用プラスミドｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭを鋳型とし、後述する表１−１〜１−３に示すアミノ酸変異を導入する合成オリゴヌクレオチドを変異体ごとに準備し、それらをプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ法のポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａＢｉｏ社）を利用した。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製した。ＰＣＲ反応は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。ＰＣＲ反応液にＤｐｎＩ（東洋紡社）による鋳型の消化反応を３７℃、２時間実施した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントセル（Ｅｃｏｓ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＤＨ−５α（ニッポンジーン社、カタログ番号３１０−０６２３１）に添加し、４２℃、４５秒のヒートショック後、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン（ナカライテスク社）を含むＬＢプレート〔ａ）Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ／Ｌ，ｂ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ，ｃ）ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ，ｄ）１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン、ｄ）３０ｇ／Ｌ  寒天：ａ）およびｂ）べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社、ｃ）〜ｄ）ナカライテスク社〕に播種した。当該プレートは、３７℃、１４時間の静置培養を行った。次いで、形成されたコロニーをＬＢ培地２ｍＬ〔ａ）Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ／Ｌ，ｂ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ，ｃ）ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ，ｄ）１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン：ａ）およびｂ）べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社、ｃ）およびｄ）ナカライテスク社〕に摂取し、３７℃、１２０ｒｐｍ、４時間の条件にて振とう培養した。菌体を１４０００ｘｇ、１分間の遠心分離で回収した後、Ｆａｓｔｇｅｎｅ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いることにより、変異が導入されたｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭ（以降、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ｍＩｓｐＳＭと記す）を回収した。その後、定法に従って、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ３．１（アプライドバイオスステムズ社）によるシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３１３０ｘｌ（ＡＢＩ社）により、目的とする変異が導入されたことを確認した。【００８２】
（１−４）改変体粗精製液の調製
前述の方法で調製した、改変体をコードするベクターｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ｍＩｓｐＳＭのプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にヒートショック法にて形質転換を行った。形質転換後、ＬＢプレートに播種して１４時間、３７℃で静置培養した。形成されたコロニーを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍ・３７℃にて４時間振とう培養した。続いて、２５０ｍＬ容積の坂口フラスコに１００ｍＬ  ＬＢ培地を張り込み、得られた培養液を全量植菌し、１２０ｒｐｍ・３７℃で振とう培養した。ＯＤ６６０が１を超えたところで、終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を添加して、１２０ｒｐｍ・１５℃・１４時間振とう培養した。得られた培養液３０ｍＬを５０００ｘｇ・１０分の条件で遠心分離し、上清を廃棄した。ここで得られた菌体に、破砕バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０：ナカライテスク社）を１ｍＬ添加・懸濁した後、２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れた。そして、マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型：安井器械社）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを２０サイクルの条件で菌体を破砕した。１．５ｍＬ  チューブにＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔ  ｎｉｃｋｅｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）を２００ｍＬ入れ、破砕バッファーでレジンを洗浄した後、破砕上清を全量添加した。４℃で１４時間インキュベーションした後、洗浄のため、切断反応バッファー（２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．０）を１ｍＬ添加した。タッピング操作の後、１４０００ｘｇ，１分間の条件で遠心分離を行い、上清を廃棄した。同一操作をもう一度繰り返したのち、切断反応バッファーを２００μＬ加え、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｍｅｒｃｋ社）を１μＬ添加して４℃・１４時間静置培養した。その後、１４０００ｘｇ・１分間遠心分離し、上清を回収してｍＩｓｐＳＭ粗精製液とした。【００８３】
（１−５）各改変体のイソプレン生産量の比較
氷上にて、０．２ｍｌ容積のＰＣＲチューブ（日本ジェネティクス社）に改変体粗精製液４６μＬを入れ、４μＬの４０ｍＭ  ＤＭＡＰＰ（Ｃａｙｍａｎ社、カタログ番号６３１８０）を添加した。軽くタッピングした後、蓋に穴を穿った。次に、このチューブを２０ｍＬ  バイアル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に入れ、直ちにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で密栓した。イソプレン生成反応は３７℃にて２０分間行った。４℃で１０分間冷却した後、１０分間室温で更にインキュベーションした。反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度を、参考例４−３）に記載される条件に基づきガスクロマトグラフィーにより測定した。ガスクロマトグラフィーにより測定した。有効な改変体を絞り込むため、各改変体のイソプレン変換量を、葉緑体移行シグナルを欠失したムクナ由来のイソプレンシンターゼ（以下、必要に応じて、野生型ＩｓｐＳＭと称する）のイソプレン変換量で除算して、相対活性値を算出した。その結果を表１−１〜１−３に示す。解析した２１１種のうち、活性を喪失したものが１１６種存在した。残る改変体のうち、相対活性値が３０％以上のものを有望改変体として位置付けたところ、６８種となった。その結果を表２−１および２−２に示す。【００８４】
【表１−１】
2015076392.tif 000002
【００８５】
【表１−２】
2015076392.tif 000003
【００８６】
【表１−３】
2015076392.tif 000004
【００８７】
【表２−１】
2015076392.tif 000005
【００８８】
【表２−２】
2015076392.tif 000006
【００８９】
（１−６）改変体イソプレン変換能の半定量的評価
前述の、各改変体のイソプレン生産量の比較は、定性的な解析のためにｍＩｓｐＳＭの酵素濃度を制御していない。そこで、有望改変体６８種のうち３６種について、ｍＩｓｐＳＭの粗精製液を４−１２％  ＮｕＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＮＰ０３２３ＢＯＸ）で展開し、各改変体由来のバンドをゲルアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社）でバンド強度として定量した。各改変体由来のバンド強度を野生型由来のバンド強度で割り返して相対強度を算出した。前述の各改変体のイソプレン生産量の比較と同一の方法により、２０分間でＤＭＡＰＰからｍＩｓｐＳＭにより変換されたイソプレン量を定量した。以降、２０分間の反応により生成したイソプレン量を、初期イソプレン生産量とする。更に、ｍＩｓｐＳＭの酵素安定性を評価するため、長時間の反応により生成されたイソプレン量を定量した。以降、イソプレン蓄積能と呼ぶ。イソプレン蓄積能を評価するため、４μＬ  ｍＩｓｐＳ粗精製液、４１μＬ  反応バッファー（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．０）、４μＬ  ４０ｍＭ  ＤＭＡＰＰの組成で３７℃にて１７時間反応させた。その後、参考例４−３）に記載される条件に基づきガスクロマトグラフィーにより、生成したイソプレンを定量した。得られた初期イソプレン生産量をバンド強度で割り返し、比初期イソプレン生産量を算出した（式１）。得られたイソプレン蓄積能をバンド強度で割り返し、比イソプレン蓄積能を算出した（式２）。比初期イソプレン生産量について、改変体と野生型酵素を比較できるように比率を計算した（式３）。比イソプレン蓄積能について、改変体と野生型酵素を計算できるように比率を計算した（式４）。【００９０】
式１  （比初期イソプレン生産量）＝（２０分反応後のイソプレン量）／（バンド強度）
式２  （比イソプレン蓄積能）＝（１７時間反応後のイソプレン量）／（バンド強度）
式３  （初期イソプレン生産量の対野生型比率）＝（改変体の式１）／（野生型の式１）
式４  （イソプレン蓄積能の対野生型比率）＝（改変体の式２）／（野生型の式２）【００９１】
結果を表３に示す。初期イソプレン生産量の対野生型比率、あるいは、イソプレン蓄積能の対野生型比率が１．１倍以上になったものを有効改変体として定義した。何れの比率も上昇した改変体は、Ｃ４４６Ｎ，Ｖ９７Ｅ，Ｄ１３１Ｃ，Ｃ１３７Ｉ，Ｃ１３７Ｓ，Ｅ４７１Ｃ／Ａ３９０Ｃ，Ｔ２９８Ｉ，Ｖ１２５Ｅ，Ｉ５１８Ｃとなり、イソプレン蓄積能の対野生型比率のみが上昇した改変体は、Ｃ５２１Ｖ，Ｃ５２１Ｅ，Ｃ４８０Ｖ，Ｃ２８６Ｉ，Ｄ３４８Ｅ，Ｃ３７０Ｖ，Ｉ３００Ｎ，Ｃ５２１Ｉ，Ｃ２８６Ｖ，Ｃ１３７Ｍ，Ｃ１３７Ｋ，Ｃ２８６Ｎとなり、初期イソプレン生産量の対野生型比率のみが上昇した改変体はＣ４８０Ｙ，Ｃ３４６Ｍ，Ｃ５２１Ｎ，Ｓ３８３Ｍとなった。【００９２】
【表３】
2015076392.tif 000007
【００９３】
実施例２：イソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳ）改変体の設計（２）および形質転換体を用いた発酵法によるイソプレンシンターゼ改変体の解析
（２−１）変異型ＩｓｐＳＭ発現用プラスミドの構築
ＩｓｐＳＭ遺伝子に変異を入れる方法は、以下の手順で行った。ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭを鋳型として、変異導入用プライマーおよびＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＩｓｐＳＭをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列はそれぞれ、実施例１にて説明したとおり配列番号３および４により示されるものである。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、７２℃にて３００秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＭ遺伝子に変異が導入されたＰＣＲ産物を取得した。得られたＰＣＲ産物を精製後、ＤｐｎＩ（タカラバイオ社製）による制限酵素処理を行った。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ産物は、ヒートショック法でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、クロラムフェニコール６０（ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃にて１６〜２４時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。得られた形質転換体から、定法に従いプラスミド抽出を行った。続いて、得られたプラスミドの目的位置に設計した通りの変異が入っていることを確認する為、シーケンサーにて塩基配列を解析した。このようにして、ＩｓｐＳＭタンパク質にアミノ酸置換が生じている事を確認した。表４にＩｓｐＳＭタンパク質のアミノ酸置換部位と変異型ＩｓｐＳＭ発現用プラスミドの名称を記した。【００９４】
【表４】
2015076392.tif 000008
【００９５】
（２−２）Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株への変異型ＩｓｐＳＭ発現プラスミドの導入
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株〔参考例７−４）を参照〕のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｙ３０４Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｙ３９４Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６２Ｓ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｃ）、  ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｗ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｍ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｙ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｈ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｐ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｑ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｎ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ａ）をそれぞれ導入した。形質転換体を含む培養液を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１６〜２４時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｙ３０４Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｙ３９４Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６２Ｓ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｆ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｃ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｗ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｍ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｙ）、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｈ）が導入された株をＰｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｙ３０４Ｆ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｙ３９４Ｆ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６２Ｓ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｆ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｃ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｗ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｍ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｙ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｈ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｐ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｑ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ｎ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ（Ｔ４６６Ａ）と命名した。【００９６】
（２−３）変異型ＩｓｐＳＭ導入株におけるイソプレン生産能の比較
ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭと各変異型ＩｓｐＳＭ発現プラスミドが導入されたＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株をクロラムフェニコール  ６０（ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＲＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＭ９グルコース（メバロン酸含有）培地１ｍＬに接種し、その後、２４時間の振とう培養を実施した。Ｍ９グルコース（メバロン酸含有）培地の組成を表５に記載した。本培地中で前記形質転換体を培養することにより、培地中の炭素源（メバロン酸）からＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）が供給される。培養終了時のＯＤ６００値とイソプレン生産量（ｍｇ／Ｌ）、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ株のイソプレン生産量と比較値を表６に記載した。バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。【００９７】
【表５】
2015076392.tif 000009
【００９８】
【表６】
2015076392.tif 000010
【００９９】
その結果、評価した全ての変異型ＩｓｐＳＭ導入株において、Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ＩｓｐＳＭ株よりも高いイソプレン生産量（ｍｇ／Ｌ）が観察された（表６）。【０１００】
参考例１：植物におけるイソプレン生産能の検討
１−１）葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量の測定
先ず、植物におけるイソプレン生産能を検討するため、植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、葛を用いた。
イソプレン発生量測定には、ガス交換式デシケーター（商品名：真空デシケーター、アズワン社製）を、インキュベーター（商品名：グロースチェンバーＭＬＲ−３５１ＨＳＡＮＹＯ社製）内に収容し、ガス交換式デシケーター内に設置した気体攪拌用ファンを作動させガス交換式デシケーターの空間内の雰囲気を攪拌させつつ、インキュベーターを高温誘導条件（照度１００μｍｏｌＥ／ｍ２／ｓで４０℃）に設定した。ガス交換式デシケーター内の雰囲気の温度が４０℃になった後、プランターに植えられたムクナ植物体を収容し、ガス交換式デシケーターを密閉した状態で３時間保持した。次いで、吸引ポンプにより、シリコンチューブ、吸着管および気体採取管を介して、ガス交換式デシケーター内の空間から、ムクナが放出したガス成分を吸引した。これにより、吸着管において、ムクナが放出したガス成分に含まれる水蒸気（水分）を吸着、分離するとともに、水蒸気が分離されたガス成分を気体採取管に導き、気体採取管において、そのガス成分を採取した。次いで、ガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、気体採取管に採取されたガス成分に含まれるイソプレンを定量分析した。
植物の葉乾燥重量は、新鮮個葉の葉面積と、８０℃の乾熱器によって新鮮個葉を８時間乾燥させたときの乾燥重には非常に良い正の相関関係が成り立つので、葉面積からの乾燥重換算式を導いておき、イソプレン発生量測定に用いたムクナ植物体の全葉面積から乾燥重を推定した。
植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量はムクナ植物体全体からのイソプレン発生量を植物体全体の葉の乾燥重量推定値で割ることにより求めた。
その結果、ムクナが葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図１）。【０１０１】
１−２）総タンパク質量あたりのイソプレン発生量の測定
次いで、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ（サンプル１、２）、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、クズを用いた。
タンパク質抽出には、バッファー液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ２０ｍＭ  ＭｇＣｌ，  ５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，  ｐＨ８．０）を作成し、使用直前にＰｏｌｙｃｌａｒ  ＡＴ  １０％、ＤＴＴ  ２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔａｂｌｅｔ  （１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌ）Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ  １ｍＭ（それぞれ終濃度）となるように加え蛋白抽出バッファーとして用いた。５ｇサンプルに対してタンパク抽出バッファー５０ｍｌ加えて、氷上で冷やしておいた乳鉢でよく摩砕した後、２重に重ねたＭｉｒａｃｌｏｔｈで摩砕液を濾過し、濾液を１２０００Ｇで２０分、４００００Ｇで４０分遠心分離した上清を取得し粗抽出液とした。
次いで、この粗抽出液について硫安分画を行った。硫安の終濃度４０％から５５％の範囲で析出する蛋白を４００００Ｇで４０分遠心分離し、得られた沈殿を蛋白抽出バッファーに再溶解させて硫安画分を得た。
総（硫安画分）タンパク質量は、ブラッドフォード法で硫安画分を測定することで求めた。標準蛋白Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎについて、ブラッドフォード試薬を反応させ分光光度計で測定した波長５９５ｎｍの吸光度に対する蛋白量の検量線を作成した。５０倍希釈した硫安画分液について同様に波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白の検量線から総（硫安画分）蛋白量を推定した。
イソプレン発生量は、４ｍｌガラスバイアルに粗抽出液ないしは１００℃で煮沸処理した粗酵素液を１００μｌ入れ、次いで０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液を２μｌ、０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ溶液を５μｌ加え、セプタム付きスクリューキャップをしっかり締めたあと、ゆるやかに振とう撹拌し４０℃恒温漕にセットした。０．５時間、１時間、２時間後に、ガスタイトシリンジでＨｅａｄｓｐａｃｅ気層を０．５〜２ｍｌサンプリングしガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてイソプレン発生量を測定した。粗酵素での０．５時間、１時間、２時間後の発生量は、それぞれの測定値から１００℃で煮沸処理した粗酵素液の測定値を引いて求めた。１時間あたりのイソプレン発生量からＴｏｔａｌ蛋白１ｍｇあたりの酵素活性（比活性）を求めた。なお、イソプレン発生量の測定は、イソプレンシンターゼの基質であるＤＭＡＰＰの量を一定にして行った。
その結果、ムクナが総タンパク質量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図２、表７）。以上より、ムクナがイソプレン生産能に優れることが示された。【０１０２】
【表７】
2015076392.tif 000011
【０１０３】
参考例２：ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
２−１）サンプリング時間の検討
４０℃の温度下で１，２，３，５時間光照射したムクナの葉が放出するイソプレンガスをサンプリングし、後述するガスクロマトグラフィーにてイソプレン生産量を定量したところ、それぞれ４，８，１２，１０μｇ  ｉｓｏｐｒｅｎｅ／ｇ  ＤＷ  ｌｅａｆのイソプレンの生産が確認され、最適な光照射時間は、３時間であることが確認された。【０１０４】
２−２）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液の抽出
以下の手順でムクナの葉からＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液を抽出した。
（１）４０℃の温度下で３時間光照射したムクナの葉をサンプリングした。
（２）葉組織１００ｍｇを液体窒素ですばやく凍結しながら乳鉢で粉砕した後、ＲＮａｓｅフリーの２ｍｌエッペンドルフチューブに液体窒素ごと分注し、液体窒素を気化させた。
（３）このエッペンドルフチューブに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）に備え付けの溶解バッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノール含有）を４５０μｌ添加し、ボルッテックスで激しく混和し、葉組織溶解物を得た。
（４）この葉組織溶解物をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにかけ、１５０００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行った。
（５）カラム濾液の上清のみを、ＲＮａｓｅフリーの新たな２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した後、このカラム濾液上清の１／２容量の特級エタノールを添加し、ピペッティングにより混和し、約６５０μｌの溶液を得た。
（６）この溶液をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＮｅａｓｙスピンカラムにかけ、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（７）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＷ１バッファー７００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（８）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（９）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、再度、ＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１０）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けの２ｍｌ回収用チューブにセットし、１５０００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１１）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けの１．５ｍｌ回収用チューブにセットした。
（１２）ピペットマンを用いて、このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＮａｓｅフリーの蒸留水を、ＲＮｅａｓｙスピンカラムの膜に直接添加し、１００００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。このステップを２回繰り返し、約１００μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。【０１０５】
２−３）ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列の解析
抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液について、バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社）のＲＮＡ用ｎａｎｏチップを用いて、ＲＮＡの品質チェックを行い、溶解液中にゲノムＤＮＡの混入がなく、溶解液中のＲＮＡが分解していないことを確認した。
このＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて二本鎖化した後、ネブライザーを用いて断片化した。３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有する１９８１７９個の断片の塩基配列を、４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＦＬＸ高速シークエンサー（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて解析した。得られた断片配列において、重複する配列を連結し、１３４８５個のコンティグ配列を得た。これらコンティグ配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、登録されている既知の葛及びポプラのイソプレンシンターゼ遺伝子配列と相同性（塩基配列の同一性）を有する６個のコンティグ配列が抽出された。更に配列を詳細に解析したところ、この６個のコンティグ配列のうち３個は、同一の遺伝子由来のものであることが分かり、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の部分配列が得られた。この部分配列に基づき、５’ＲＡＣＥを行い、配列番号１で表されるムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列を得た。【０１０６】
参考例３：各植物種由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドの調製
３−１）Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）  ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号１０、及び配列番号１１にそれぞれ示す。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号１２に示す。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫと名付けた。【０１０７】
３−２）Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ（ポプラ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  ＣＡＣ３５６９６：Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．  ｔｒｅｍｕｌａ  （ポプラ）ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）。Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号１３、及び配列番号１４にそれぞれ示す。この塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＰと名付けた。ＩｓｐＳＰの塩基配列を配列番号１５に示す。ＩｓｐＳＰ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰと名付けた。【０１０８】
３−３）ムクナ由来イソプレンシンターゼの化学合成
ムクナ由来イソプレンシンターゼの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルが付与されたものをＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付け、葉緑体移行シグナルを切断したものをＩｓｐＳＭと名付けた。ＩｓｐＳＭ（Ｌ）の塩基配列を配列番号１６に、ＩｓｐＳＭの塩基配列を配列番号３に示す。ＩｓｐＳＭ遺伝子とＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子は、それぞれ化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭとｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付けた。【０１０９】
３−４）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
Ｅ．ｃｏｌｉで各植物種由来ＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ）を化学合成した（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１７に示す）。得られたＰｔａｃ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号１８に示す）。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流にＩｓｐＳ遺伝子をクローニングすることで、ＩｓｐＳ遺伝子の発現増幅が可能となる。【０１１０】
３−５）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号１９と配列番号２０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号２１と配列番号２２の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号２３と配列番号２４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）を鋳型として、配列番号２５と配列番号２６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号２７と配列番号２８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）と命名した。【０１１１】
【表８】
2015076392.tif 000012
【０１１２】
参考例４：Ｅ．ｃｏｌｉ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
４−１）イソプレン生産能を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）が導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株と命名した。【０１１３】
４−２）粗酵素抽出液の調製方法
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３７℃にて６時間培養した。培養液より菌体を５０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。【０１１４】
４−３）イソプレン合成活性の測定
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株の粗酵素抽出液（総タンパク量として２ｍｇを含む量）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。【０１１５】
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  Ｔｕｒｂｏ  Ｍａｔｒｉｘ  ４０）
バイアル保温温度  ４０℃
バイアル保温時間  ３０ｍｉｎ
加圧時間  ３．０ｍｉｎ
注入時間  ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度  ７０℃
トランスファー温度  ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）  １２４ｋＰａ【０１１６】
ガスクロマトグラフィー（島津社製  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ：  長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ  ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度  ３７℃
圧力  ２４．８ｋＰａ
カラム流量  ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法  スプリット  １：０（実測１：１８）
トランスファー流量  ９０ｍＬ
ＧＣ注入量  １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量  ０．１ｍＬ
注入口温度  ２５０℃
検出機  ＦＩＤ（水素  ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気  ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス  ヘリウム  ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度  ２５０℃【０１１７】
イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。【０１１８】
表９に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。【０１１９】
【表９】
2015076392.tif 000013
【０１２０】
表９の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株となり、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株とＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株はほぼ同等の値となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【０１２１】
参考例５：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
参考例４の粗酵素活性の結果から、葉緑体移行シグナルを欠失したムクナ由来のイソプレンシンターゼで最も高い活性が確認された。その為、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。Ｍ９グルコース培地の組成は表１０に記載のとおりである。【０１２２】
【表１０】
2015076392.tif 000014
【０１２３】
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表１１に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。【０１２４】
【表１１】
2015076392.tif 000015
【０１２５】
表１１の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、野生株では、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１２６】
参考例６：ＭＥＰ（メチルエリスリトール）経路を強化したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
６−１）ｄｘｓ遺伝子発現用プラスミド（ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ）の構築
イソプレンシンターゼを導入したＥ．ｃｏｌｉでＭＥＰ経路を構成するｄｘｓ遺伝子（１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現強化を行うと、イソプレン生成量が向上する事が既に報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１１）９０，１９１５−１９２２）。そこで、ｄｘｓ遺伝子の発現を強化した株においても、イソプレンシンターゼの由来の違いで、イソプレン生産能に相違が生じるかを確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムの全塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）は既に明らかにされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，１４５３−１４７４）。遺伝子増幅を行うためにｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）を用いた。本プラスミドは、マルチクローニングサイトに目的遺伝子を導入する事で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加時に目的遺伝子の発現量を増加させる事が出来る。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列のｄｘｓ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５０６０  Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ｂ０４２０）に基づいて、配列番号２９と配列番号３０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを合成した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株のゲノムを鋳型として、配列番号２９と配列番号３０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｄｘｓ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９を鋳型として、配列番号３１と配列番号３２の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２４０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたｄｘｓ遺伝子断片と、ｐＭＷ２１９のＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｄｘｓ遺伝子発現用プラスミドをｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。【０１２７】
【表１２】
2015076392.tif 000016
【０１２８】
６−２）イソプレン生産能を有するＥ.ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株へのｐＭＷ２１９−ｄｘｓの導入
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＭＷ２１９−ｄｘｓを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコールとカナマイシンに耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株にｐＭＷ２１９−ｄｘｓがそれぞれ導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。【０１２９】
６−３）ＤＸＳの発現を強化したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、参考例５に記載したヘッドスペースバイアルでの培養評価を実施した。培養終了時のイソプレン生産量（μｇ/L）とＯＤ値を表１３に記載した。【０１３０】
【表１３】
2015076392.tif 000017
【０１３１】
表１３の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株となった。上記の結果から、ＭＥＰ経路強化株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１３２】
参考例７：ＭＶＡ（メバロン酸）経路を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
７−１）酵母由来のメバロン酸経路下流遺伝子のクローニング
メバロン酸経路の下流領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより取得した（ＷＯ２００９０７６６７６，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｊａｎ  ２０１２；４０：Ｄ７００−Ｄ７０５）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を次に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した（表１４）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  Ｐｒｅｍｉｘを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５５℃、５秒、７２℃、５秒／ｋｂ）×３０サイクルの条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐベクター（配列番号１８）にｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。これら増幅した遺伝子の塩基配列、およびその遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃にて取得可能である。【０１３３】
【表１４】
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【０１３４】
７−２）メバロン酸経路下流の人工オペロンの構築
メバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子を表１５に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ  ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１１８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋと名付けた。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋの塩基配列を配列番号４１に示す。【０１３５】
【表１５】
2015076392.tif 000019
【０１３６】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を表１６に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ  ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＴＷＶ２２８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉと名付けた。ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉの塩基配列を配列番号４６に示す。【０１３７】
【表１６】
2015076392.tif 000020
【０１３８】
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋを鋳型とし表１７に示すプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉを鋳型とし表１７に示すプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）の塩基配列を配列番号５１に示す。【０１３９】
【表１７】
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【０１４０】
７−３）メバロン酸経路下流の染色体固定
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を染色体上で発現させる事とした。遺伝子の発現にはグルコースイソメラーゼプロモーターを利用し、転写終結にはＥ．ｃｏｌｉのａｓｐＡ遺伝子の転写終結領域を利用した（ＷＯ２０１００３１０６２）。染色体固定部位としてＴｎ７の転移部位を用いた（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９８１；１８３（２）：３８０−７）。染色体固定後の薬剤マーカーとしてはｃａｔ遺伝子を利用した。表１８に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７下流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。表１８に示すプライマーを利用して、ｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲプラスミドを鋳型としたＰＣＲによりλファージアッタチメント部位を含むｃａｔ遺伝子領域の増幅を行った（ＷＯ２０１０−０２７０２２）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９５℃、３分、（９５℃、１分、３４℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２サイクル、（９５℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２５サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。表１８に示すプライマーを利用して、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）を鋳型としたＰＣＲによりプロモータと転写終結領域を付与したメバロン酸経路下流配列（以下ＫＫＤｙＩと略す）の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。これらのＰＣＲ産物と、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＭＷ２１９を用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡと名づけた。ｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡの塩基配列を配列番号５６に示す。【０１４１】
次に、表１９に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７上流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物と、制限酵素ＳａｌＩで処理したｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡを用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７と名づけた。構築したプラスミドの配列を配列番号５７に示す。【０１４２】
続いて、λ−Ｒｅｄ法を用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子、グルコースイソメラーゼプロモーター、メバロン酸経路下流オペロン、ａｓｐＡ遺伝子転写終結領域を含む領域の染色体固定を行った。染色体固定用の断片は、プラスミドｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７を抽出後、制限酵素ＰｖｕＩとＳａｌＩで処理した後、精製することで調整した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（以下ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  アクセッション番号  Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。エレクトロポレーションの後、クロラムフェニコール耐性を獲得したコロニーを取得した。続いてゲノムＤＮＡを抽出し、表２０に示すプライマーを用いたＰＣＲにより目的領域が染色体に固定されていることを確認した。更に、ＰＣＲ断片の配列を確認することで目的領域の配列を確認した。染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の塩基配列を配列番号５８に、構築概要を図３に示す。得られた変異体をＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１４３】
ＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩの薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。【０１４４】
ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はクロラムフェニコール耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからクロラムフェニコール感受性株を取得した。この後、４２度、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。このようにして取得した変異体をＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１４５】
【表１８】
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【０１４６】
【表１９】
2015076392.tif 000023
【０１４７】
【表２０】
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【０１４８】
７−４）染色体上メバロン酸経路下流のプロモーター置換
染色体上のメバロン酸経路下流オペロンのプロモーターをλ−ｒｅｄ法により置換した。ＰＣＲの鋳型として、ａｔｔＬ−Ｔｅｔ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーターとテトラサイクリン耐性薬剤マーカー及びλファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲが並ぶものである。これらの配列を配列番号６９に示す。表２１に示すプロモーターを用いてＰＣＲ断片を調整した。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５０℃、２０秒、７２℃、１分／ｋｂ）×４０サイクル、７２℃、７分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ（以下ＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  アクセッション番号  Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。プラスミドｐＫＤ４６はＰＣＲ産物をＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩに組み込むために必要である。【０１４９】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地中で３０℃、一晩培養したＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６を、アンピシリンとＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含んだ５ｍＬのＬＢ培地で１００倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ６００が約０．６になるまで生育させた後、氷冷した１０％  グリセロール溶液で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは５０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地［モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）］を加えて３７℃で１時間培養した後、ＬＢ寒天培地上、３７℃で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、テトラサイクリン入りのＬＢ寒天培地上、３７℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、ｐＫＤ４６が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。テトラサイクリン耐性遺伝子によって識別できるｔａｃプロモーター置換を含む変異体を取得した。得られた変異体をＭＧ１６５５  ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１５０】
薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５  ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるテトラサイクリン耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はテトラサイクリン耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからテトラサイクリン感受性株を取得した。この後、４２℃、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。得られた変異体をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。染色体上にてｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流およびその周辺領域の塩基配列を配列番号７０に、概要を図４に示す。【０１５１】
【表２１】
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【０１５２】
７−５）ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株への各植物種由来イソプレンシンターゼの導入
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株と命名した。【０１５３】
７−６）ＭＶＡ経路を強化したＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２  ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＭ９グルコース（メバロン酸含有）培地１ｍＬに接種し、その後、参考例２に記載した方法に従って、培養評価を実施した。Ｍ９グルコース（メバロン酸含有）培地の組成を表２２に記載した。培養終了時のイソプレン生産量とＯＤ値を表２３に記載した。【０１５４】
【表２２】
2015076392.tif 000026
【０１５５】
【表２３】
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【０１５６】
表２３の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ＭＶＡ経路導入株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１５７】
実施例３：特定事項に着目した改変対象のアミノ酸残基の選択と改変
（３−１）基質との相互作用に着目した改変対象のアミノ酸残基の選択と改変
以降、配列番号４に示すアミノ酸配列を基準にアミノ酸残基を示す。実施例１で構築した立体構造モデルとシミュレーションソフトウエアＭｏｌｇｅｒｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｍｏｌｅｇｒｏ社）を利用して、基質であるＤＭＡＰＰと相互作用する残基を計算した。その結果、Ｋ２５９、Ｒ２６４、Ｄ２６５、Ｒ２６６、Ｅ２６９、Ｋ２８８、Ｋ２９２、Ｆ２９４、Ｖ２９７、Ｄ３０１、Ｄ３０２、Ｄ３０５、Ｄ３１１、Ｅ３１２、Ｅ３２１、Ｋ３３６、Ｋ３６７、Ｅ３７１、Ｋ３７４、Ｆ３７６、Ｅ３７９、Ｋ３８１、Ｋ３８６、Ｋ３９３、Ｄ３９６、Ｓ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０３、Ｒ４３７、Ｆ４４３、Ｒ４４４、Ｎ４４７、Ｄ４４８、Ｅ４５５、Ｅ４５７、Ｒ４５８、Ｅ４６０、Ｅ４７１、Ｅ４７６、Ｋ４８１、Ｒ４８４、Ｅ４９０、Ｋ４９２、Ｋ４９３、Ｙ５２３、Ｄ５３３、Ｋ５４１の合計４７残基において基質の電磁気的な相互作用が予測された。Ｍｏｌｇｅｒｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｅｗｅｒの計算結果を表２４に示す。【０１５８】
実施例１においてＤ１３１Ｃの改変により野生型に対する活性値の上昇が確認された（表１−２）。この結果を受け、Ｄ１３１残基近傍に位置する荷電性残基であるＫ１２７とＫ１３０を改変対象に選んだ。また、基質ＤＭＡＰＰ近傍に存在する残基のうち、Ｔ４５１Ｅ、Ｔ４５１Ｓ、Ｅ４５５Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、Ｅ４５５Ｍ、Ｔ４６２Ｑ、Ｔ４６２Ｓは実施例１における改変後に、野生型に対して活性が低下したものの、依然として活性を保持していた（表１−１）。このことを踏まえ、Ｔ４５１、Ｅ４５５、Ｔ４６２を改変対象として選択した。また、これらの残基が位置する領域近傍に存在するＴ４６１とＬ４０７についても改変対象として選択した。【０１５９】
改変後のアミノ酸残基としては、主に、酸性残基（Ｄ，Ｅ）、塩基性残基（Ｒ，Ｋ）、中性残基（Ｎ，Ｑ）、親水性残基（Ｍ，Ｓ）、芳香族残基（Ｙ，Ｆ）から二つの点に注意して選択した。一つ目は嵩高さで、アミノ酸の物理化学的性質の真理表（たとえば、Ｍ．Ｊ．Ｚｖｅｌｅｂｉｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９５，９５７）やアミノ酸相同性の指標であるＢＬＯＳＳＵＭテーブル（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．，１９９２，８９，１０９１５）を参考にして、改変前のアミノ酸と近いアミノ酸を選択した。二つ目は立体構造情報を目視し、改変導入残基の近傍の空間充填率が低い場合、その間隙を充填するのに適したアミノ酸を選択した。【０１６０】
（３−２）Ｃｙｓ残基の最適化及びＣｙｓ残基の周辺環境の最適化に着目した改変対象のアミノ酸残基の選択と改変
実施例１に示すコンセプトであるＣｙｓ残基の最適化及びＣｙｓ残基の周辺環境の最適化に基づき、Ｃｙｓ残基近傍の分子運動性を変化させるため、Ｃｙｓ残基全９種の内７種（Ｃ１３７，Ｃ２８６，Ｃ３７０，Ｃ３７３，Ｃ４４０，Ｃ４８０，Ｃ５２１）をＧｌｙ残基へ改変した。【０１６１】
遊離Ｃｙｓ残基と相互作用する周辺残基、あるいは、改変により相互作用しうる周辺残基を改変対象として選択した。モデル構造を参照して確認したところ、Ｄ１３１、Ｌ２５６、Ｉ２９９、Ｙ３０４、Ｆ３１６、Ｖ３２０、Ｅ３２１、Ｆ３７６、Ｓ３９９、Ｇ４０４、Ｖ４０５、Ｙ４１２、Ｌ４１４、Ｖ４１５、Ｌ４４９、Ｓ４５２、Ｉ４６５、Ｐ５０５、Ｆ５０８、Ｉ５１８、Ｓ５１９、Ｈ５２０の２２種存在した。これらの残基について、周辺の化学環境を考慮して改変を実施した。【０１６２】
（３−３）酵素表面の親水性強化および分子間ジスルフィド結合形成に着目した改変対象のアミノ酸残基の選択と改変
分子表面に存在する疎水性残基の中から、パッキングに関与していないＶａｌ残基（Ｖ１０６，Ｖ１８７，Ｖ２８９，Ｖ３０６，Ｖ３２５）とＬｅｕ残基（Ｌ３５，Ｌ６７，Ｌ１６３，Ｌ３１０，Ｌ３４０，Ｌ３７７，Ｌ５２９）とＩｌｅ残基（Ｉ９０，Ｉ３２８，Ｉ３８７，Ｉ３８８）のほか、Ｐｈｅ残基（Ｆ３１，Ｆ１２９）やＧｌｙ残基（Ｇ５２８，Ｇ５３０）を改変の対象として選択した。次に、分子運動性を制御するために、ループ上に存在するＧｌｙ残基（Ｇ１３４，Ｇ１３５，Ｇ１５７，Ｇ１６０，Ｇ１８２）を選択し、Ｐｒｏ残基に改変した。次に、ヘリックス構造の安定化によりＩｓｐＳ分子の安定性を強化するため、ヘリックス上に存在する残基（Ｄ１２４，Ｒ１２８，Ｌ２４７，Ｔ２５７，Ｒ２６４，Ｅ２６９，Ｋ２９２，Ｆ２９４，Ｖ２９７，Ｔ２９８，Ｇ４０４，Ｌ４０７，Ｆ４４３，Ｖ４９９）を選択した。最後に、分子間ジスルフィド結合形成のためにＳ１６２を選択し、分子内ジスルフィド結合形成のためにＲ２０２をそれぞれ選択し、Ｃｙｓ残基に改変した。【０１６３】
（３−４）ボルニルシンターゼを参考にした改変対象のアミノ酸残基の選択と改変
葛やポプラ由来のＩｓｐＳの基質親和性はｍＭオーダーである事が知られている。一次配列上の類似性から、ＩｓｐＳＭの基質親和性もｍＭオーダーと推測された。一方、立体構造上の類似点が見られるボルニルシンターゼ（ＥＣ５．５．１．８）は、μＭオーダーの基質親和性を有している（Ｃｒｏｔｅａｓｕ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，２６１（２９），１３４３８−４５）。ＩｓｐＳＭのモデル構造とボルニルシンターゼの立体構造（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ｎ２０）とを比較した結果、Ｊ−ＫループとＮ末端領域に違いが見られた。より詳細には、ボルニルシンターゼのＮ末端が相互作用する残基はＳ２４８とＲ２４９であり、対応するＩｓｐＳＭ上の残基はＳ２４８とＬ２４９であった。そこで、当該残基をＫ、Ｅ、Ｒ、Ｔに改変してＮ末端との相互作用形成を検討した。【０１６４】
（３−５）活性測定法
本明細書の実施例１（１−４）に従って、各改変体を調製した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる溶液にて、得られた粗精製液を０．０２６ｍｇタンパク質／ｍＬとなるように希釈した。次に、４ｍＭ  ＤＭＡＰＰ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる基質溶液０．１ｍＬに１０μＬ混合した。混合液を３７℃で６０分間インキュベートし、イソプレンシンターゼをＤＭＡＰＰに作用させてイソプレンとピロリン酸を生成した。続いて、２０ｍｇ／ｍｌの活性炭懸濁液２０μＬを反応液と混合し、直ちに氷上に移して反応を停止した。２０ｍｇ／ｍｌ活性炭懸濁液は、塩酸洗浄活性炭粉末（ナカライテスク社）を１００倍量の蒸留水に懸濁後、グラスフィルターでろ過し、残渣に吸引しながら２０００倍量の蒸留水を加えて洗浄し、６０℃の乾燥機で完全に乾燥したものを２０  ｍｇ／ｍｌの濃度になるように蒸留水に懸濁して調整した。反応停止後の混合液を、２０，０００×ｇ、１０分、４℃の条件にて遠心分離後、上清を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて１０分の１に希釈し、×ｇ、１０分、４℃の条件で再度遠心分離した。上清を９６穴プレート（サンプラテック社製、＃３７１９）に５０μＬずつ分注し、発色溶液（Ｐｉｐｅｒ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃Ｐ２２０６１）を５０μＬ混合した。その後、３７℃で６０分間インキュベートし、プレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社、モデル６８０）にて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクは酵素溶液の代わりに０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる溶液を用いた。同時に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２に溶解した０，１０，２０，３０，４０，５０μＭのピロリン酸溶液５０μＬに発色溶液（Ｐｉｐｅｒ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃Ｐ２２０６１）を加えた系列によりピロリン酸濃度の検量線を作成した。実測値をブランクで補正した値から検量線により、各改変体により生成したピロリン酸濃度を算出した。
（３−６）結果
合計２９２種の変異体について活性測定を行った。結果を表２５−１〜２５−６に示す。７９種の改変体（Ｆ３１Ｅ、Ｆ３１Ｋ、Ｌ３５Ｅ、Ｌ３５Ｋ、Ｌ６７Ｅ、Ｉ９０Ｅ、Ｄ１２４Ｅ、Ｋ１２７Ｄ、Ｋ１２７Ｅ、Ｋ１２７Ｎ、Ｋ１２７Ｒ、Ｒ１２８Ｋ、Ｋ１３０Ｇ、Ｇ１３４Ｐ、Ｃ１３７Ｌ、Ｒ２０２Ｄ、Ｒ２０２Ｎ、Ｌ２４７Ｄ、Ｌ２４７Ｅ、Ｌ２４７Ｑ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｒ、Ｌ２４９Ｅ、Ｌ２４９Ｋ、Ｌ２４９Ｒ、Ｌ２４９Ｔ、Ｔ２５７Ｌ、Ｋ２５９Ｄ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２５９Ｎ、Ｋ２５９Ｑ、Ｋ２５９Ｒ、Ｒ２６４Ｆ、Ｒ２６４Ｍ、Ｒ２６４Ｔ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｒ２６６Ｎ、Ｒ２６６Ｑ、Ｅ２６９Ｄ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｙ、Ｋ２９２Ｌ、Ｄ３０１Ｒ、Ｄ３０５Ｒ、Ｅ３１２Ｉ、Ｅ３１２Ｒ、Ｆ３１６Ｅ、Ｅ３２１Ｄ、Ｖ３２５Ｋ、Ｉ３２８Ｅ、Ｌ３４０Ｋ、Ｅ３７１Ｄ、Ｅ３７９Ｔ、Ｋ３８６Ｒ、Ｓ４０１Ｔ、Ｓ４０２Ｌ、Ｇ４０４Ａ、Ｇ４０４Ｍ、Ｒ４４４Ｔ、Ｎ４４７Ｌ、Ｎ４４７Ｒ、Ｒ４５８Ｑ、Ｔ４６１Ｒ、Ｔ４６２Ｍ、Ｒ４８４Ｋ、Ｋ４９２Ｅ、Ｖ４９９Ｉ、Ｐ５０５Ｈ、Ｆ５０８Ｑ、Ｆ５０８Ｒ、Ｉ５１８Ｓ、Ｓ５１９Ｎ、Ｈ５２０Ｎ、Ｙ５２３Ｉ、Ｙ５２３Ｌ、Ｇ５３０Ｋ）について、野生型酵素の活性と比べ活性が１．１倍以上となった。特に、Ｆ３１Ｋ、Ｋ１２７Ｅ、Ｃ１３７Ｌ、Ｌ２４７Ｄ、Ｌ２４９Ｅ、Ｓ２４８Ｋ、Ｌ２４９Ｒ、Ｌ２４９Ｔ、Ｒ２６４Ｆ、Ｆ３１６Ｅ、Ｇ４０４Ｍ、Ｙ５２３Ｉ、Ｙ５２３Ｌ、Ｇ５３０Ｋは野生型酵素の活性と比べ活性が３倍以上になり、高い活性を示すことが明らかとなった。これら有効変異体を一覧としてまとめ、表２６−１および２６−２に示す。【０１６５】
【表２４】
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【０１６６】
【表２５−１】
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【０１６７】
【表２５−２】
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【０１６８】
【表２５−３】
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【０１６９】
【表２５−４】
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【０１７０】
【表２５−５】
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【０１７１】
【表２５−６】
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【０１７２】
【表２６−１】
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【０１７３】
【表２６−２】
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【０１７４】
実施例４：改変型イソプレン変換能の定量的評価
実施例１の（１−５）において、定性的な対野生型活性値が３０％以上だった改変体６７種のうち、Ｃ４１６Ｋを除いた６６種について、定量的な機能評価を実施した。機能評価は具体的には以下の通りである。簡易精製後のＩｓｐＳ変異体のタンパク質濃度をそれぞれ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。続いてＩｓｐＳ変異体を１μｇ分計量し、氷上にて、０．２ｍｌ容積のＰＣＲチューブ（日本ジェネティクス社）に入れた。続いて、５μＬの反応バッファー（２５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．０）を添加し、酵素液と合わせて４５μＬになるよう滅菌水を加えた。優しくタッピングした後、５μＬの４０ｍＭ  ＤＭＡＰＰ（Ｃａｙｍａｎ社、カタログ番号６３１８０）を添加して混合した。３７℃にて、１０分あるいは１７時間静置内容した後、ＧＣによりイソプレン生成量を測定した。各改変体により生成したイソプレン量を野生型ＩｓｐＳにより生成したイソプレン量で割り返し、野生型に対する改変体の酵素活性の相対値を算出した。反応時間１０分の相対値を活性、反応時間１８時間の相対活性を蓄積能と定義した。その結果を表２７−１〜２７−３に示す。活性、あるいは、蓄積能が少なくとも１．１以上の値を示した改変体はＳ２Ａ、Ｖ９７Ｅ、Ｌ１１４Ｅ、Ｑ１２３Ｃ、Ｖ１２５Ｅ、Ｄ１３１Ｃ、Ｃ１３７Ｅ、Ｃ１３７Ｉ、Ｃ１３７Ｍ、Ｃ１３７Ｓ、Ｖ１４４Ｅ、Ｖ１８７Ｅ、Ｌ２２４Ｅ、Ｃ２８６Ｖ、Ｃ２８６Ｎ、Ｔ２９８Ｉ、Ｉ３００Ｎ、Ｃ３３８Ｖ、Ｃ３３８Ｌ、Ｃ３７０Ｖ、Ｃ３７０Ｅ、Ｃ３７０Ｎ、Ｃ３７０Ｋ、Ｃ３７３Ｖ、Ｃ３７３Ｙ、Ｓ３８３Ｉ、Ｉ３８８Ｃ／Ｑ１２３Ｃ、Ｖ４０５Ｃ、Ｌ４１４Ｃ、Ｃ４１６Ｅ、Ｃ４４０Ｓ、Ｅ４７１Ｃ／Ａ３９０Ｃ、Ｃ４８０Ｎ、Ｃ４８０Ｙ、Ｃ４８０Ｖ、Ｋ４８１Ｅ、Ｆ５０８Ｃ、Ｉ５１８Ｃ、Ｃ５２１Ｅ、Ｃ５２１Ｖ、Ｃ５２１Ｉ、Ｃ５２１Ｓ、Ｃ５２１Ｎの４３種であった。実施例１の（１−６）にて有効改変体と評価したものの、表２７−１〜２７−３でその有効性が再現できなかった変異体はＣ１３７Ｋ、Ｃ２８６Ｉ、Ｖ３４６Ｍ、Ｄ３４８Ｅ、Ｓ３８３Ｍ、Ｃ４４６Ｎであった。【０１７５】
【表２７−１】
2015076392.tif 000037
【０１７６】
【表２７−２】
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【０１７７】
【表２７−３】
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【０１７８】
実施例５：ポリイソプレンの製造
イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した１００ｍＬガラス容器中で、窒素雰囲気下で３５ｇのヘキサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびに１０ｇのシリカゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２３６７７２）、および１０ｇのアルミナ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２６７７４０）と混合する。得られた混合液を、室温で５時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した５０ｍＬガラス容器中に加える。【０１７９】
一方で、グローブ・ボックスにおいて窒素雰囲気下、４０．０μｍｏｌのトリス［ビス（トリメチルシリル）アミド］ガドリニウム、１５０．０μｍｏｌのトリブチルアルミニウム、４０．０μｍｏｌのビス［２−（ジフェニルホスフィノ）フェニル］アミン、４０．０μｍｏｌのトリフェニルカーボニウム・テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート（Ｐｈ３ＣＢＣ６Ｆ５）４）をガラス溶液に用意し、これを５ｍＬのトルエン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２４５５１１）中に溶解させて、触媒液を得る。その後、触媒液をグローブ・ボックスから採り、モノマー液に加え、次いで、これをポリマー反応（５０℃で１２０分間）に供する。【０１８０】
ポリマー反応後、５質量％の２，２’−メチレン−ビス（４−エチル−６−ｔ−ブチルフェノール）（ＮＳ−５）を含む１ｍＬのイソプロパノール溶液を加えて、反応を停止させる。次いで、多量のメタノールをさらに加えて、ポリマーを単離し、７０℃で真空乾燥させて、ポリマーを得る。【０１８１】
実施例６：ゴム組成物の製造
表２８に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、１４５℃で３５分間加硫処理する。【０１８２】
【表２８】
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【０１８３】
その好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、本願の一部として参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015076392.tif 000046
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