(57)【要約】本発明は新規のがん治療薬を提供することを目的とする。本発明は、式（Ｉ）［式中、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含む、がん治療または予防用医薬組成物に関する。2014200116.tif 000010
2014200116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
2014200116.tif 000007
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含む、がん治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
がんが固形癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）：
2014200116.tif 000008
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含む、がん転移抑制剤。
【請求項４】
がん治療を必要とする対象に、有効量の式（Ｉ）：
2014200116.tif 000009
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を投与することを含む、がんを治療または予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のがん治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは全世界において死亡原因の上位であり、高い割合を占める。がんの診断法および治療法の進歩により患者の生存率は高まってきているが、全世界人口の約７５％にあたる発展途上国に住む人々にとって、先進的ながん治療を受けることは難しい。そのため、より安価ながん治療法が求められている。
先進医療の一方で、ハーブなどを用いた自然療法も古くから知られている。アーユルヴェーダはインドに紀元前から伝わる自然療法の一種である。アーユルヴェーダで用いられる薬草アシュワガンダ（学名Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ、インド人参（Ｉｎｄｉａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ）や冬桜（Ｗｉｎｔｅｒ  ｃｈｅｒｒｙ）とも称される）の根は、滋養強壮作用や健康増進作用などを有することが知られている。
本発明者らは、そのアシュワガンダに関して、根よりも採取しやすい葉に着目し、葉の抽出物の薬理作用について研究を行った。その結果、本発明者らは、以前アシュワガンダの葉の水抽出物が抗がん活性を有することを見出している（国際公開第２００９／１１０５４６号公報）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、アシュワガンダの葉の水抽出物に含まれる成分のいずれが抗がん活性をもたらしているかは不明であった。アシュワガンダの葉の水抽出物に含まれる有効成分を特定することができれば、それに基づいて新規のがん治療薬を提供することが可能となる。そこで、本発明は、アシュワガンダの葉の水抽出物から有効成分を特定し、それに基づいた新規のがん治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、アシュワガンダの葉の水抽出物について研究を重ねた結果、抗がん活性を有する有効成分を特定し、それが実際にがん細胞に対して細胞毒性などの抗がん活性を有することを確認することに成功した。本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］式（Ｉ）：
2014200116.tif 000003
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含む、がん治療または予防用医薬組成物。
［２］がんが固形癌である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］式（Ｉ）：
2014200116.tif 000004
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含む、がん転移抑制剤。
［４］がん治療を必要とする対象に、有効量の式（Ｉ）：
2014200116.tif 000005
［式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６ハロアルキルから選択される］
で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を投与することを含む、がんを治療または予防するための方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、新規のがん治療薬を提供することが可能となる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１３−１２５８６０号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）およびヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）に対するＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの細胞毒性アッセイの結果を示す写真である。対照群（Ｃ）は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸで処理していないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）とヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）とを示す。
【図２】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびそのタンパク成分を不活性化したものについて、ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）を用いた細胞毒性アッセイを行った結果を示す写真である。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸのタンパク成分を不活性化したものとしては、熱変性により不活性化させたもの（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−ＨＩ）またはプロテイナーゼ分解により不活性化させたもの（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−ＰＩ）を使用した。対照群は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはそのタンパク成分を不活性化したもので処理していないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）と正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）とを示す。
【図３】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ２（本願明細書中の実施例４に記載された分画試験より得られたＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ由来の第２分画）およびトリエチレングリコールのＮＭＲチャートである。図３中、（ａ）および（ｂ）は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの分析結果を示し、（ｃ）および（ｄ）はトリエチレングリコールの分析結果を示す。
【図４】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸのＨＰＬＣチャートである。市販の精製されたトリエチレングリコールを標準物質として加えている。
【図５】トリエチレングリコールを用いたヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）に対する細胞毒性アッセイの結果を示す写真である。
【図６】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したヒト骨肉種細胞（Ｕ２ＯＳ）の細胞周期分析の結果を示すチャートおよびグラフである。対照群は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）とした。
【図７】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイの結果を示す写真およびグラフである。ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイは、ヌードマウスにＨＴ１０８０細胞を皮下注射および経尾静脈注射することで腫瘍を形成させ、当該ヌードマウスにＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ（経口投与）またはトリエチレングリコール（経口投与（ＴＥＧ）または腹腔内注射（ＴＥＧ−ｉｐ））を投与することにより行った。対照群のマウスには、腫瘍形成後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールの代わりに、２％カルボキシメチルセルロースを経口投与した。図７Ａは、２％カルボキシメチルセルロース投与（対照群）、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ投与、トリエチレングリコールの経口投与（ＴＥＧ）、またはトリエチレングリコールの腹腔内投与（ＴＥＧ−ｉｐ）した際の投与期間経過後のマウス腹部を撮影した写真である。図７Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ期間における腫瘍容積の変化を経時的に測定した結果のグラフである。
【図８】トリエチレングリコールの抗がん転移活性を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍転移アッセイの結果を示す。図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍転移アッセイ後、マウスより摘出した肺を撮影した写真である（丸印で囲まれた部分が腫瘍を示す）。なお、上段は２％カルボキシメチルセルロース投与群（対照群）、中段はＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ投与群、下段はトリエチレングリコール投与群を示す。図８Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍転移アッセイ後の各群の肺腫瘍容積の平均値を示すグラフである。
【図９】ＨＴ１０８０細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフである。試験対象物質として、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）またはＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを使用した。対照群はトリエチレングリコールまたはＡｓｈＬｅ−ＷＥＸで処理していないＨＴ１０８０細胞のアッセイ結果を示す。
【図１０】図１０Ａは、ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）または正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）をＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した際のがん抑制タンパク（ｐ５３、ｐ２１、ｐＲＢ）の発現量をウェスタンブロッティングにより測定した結果の写真およびグラフを示す。図１０Ｂは、ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）または正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）をＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した際の細胞周期調節タンパク（サイクリン−Ｂ１、サイクリン−Ｄ１、サイクリン−Ｅ１、ＣＤＫ−２、ＣＤＫ−４、およびＣＤＫ−６）の発現量をウェスタンブロッティングにより測定した結果の写真およびグラフを示す。また、図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、対照群はＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していない細胞の各タンパクの発現量を示す。
【図１１】ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）または正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）に対して、抗ｐＲＢ抗体を用いて免疫組織化学を行った結果を示す写真である。対照群はＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）または正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）を示す。
【図１２】ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）に対してＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを処理した際のテロメラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。ポジティブコントロール群はＴＲＡＰアッセイキットに含まれるテロメラーゼ活性がん細胞の結果を示し、ネガティブコントロール群はテロメラーゼ酵素を有しないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）の結果を示す。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していないヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）の結果を示す。
【図１３】ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）に対してＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを処理した際のＫｅａｐ１の発現量を調べた結果を示す写真である。なお、対照群は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していないヒト肺がん細胞におけるＫｅａｐ１の発現量を示す。
【図１４】ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）に対してＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを処理した際のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−２）の発現量を調べた結果を示す写真およびグラフである。なお、対照群では、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していないヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量を示す。
【図１５】膠芽腫細胞（Ｃ６  Ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌ）に対してＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを用いた分化誘導アッセイの結果を示す写真である。図１５Ａは、分化誘導処理後の細胞を光学顕微鏡下で撮影した写真を示す。図１５Ｂは、分化誘導処理後の細胞におけるＧＦＡＰ（膠細胞の分化マーカー）の発現を免疫組織化学により観察した写真を示す。図１５Ｃは、図１５Ｂよりもさらに高倍率で撮影した免疫組織化学の写真を示す。対照群は分化誘導処理における過酸化水素処理はしたが、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していない細胞を示す。
【図１６】神経芽細胞腫（ＩＭＲ３２；ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ）に対してＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを用いた分化誘導アッセイの結果を示す写真である。図１６Ａは、分化誘導処理後の細胞を光学顕微鏡下で撮影した写真を示す。図１６Ｂは、分化誘導処理後の細胞におけるニューロフィラメントタンパク（ＮＦ２００）の発現を免疫組織化学により観察した写真を示す。図１６Ａおよび図１６Ｂにおいて対照群は分化誘導処理における過酸化水素処理はしたが、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していない神経芽細胞腫（ＩＭＲ３２）を示す。図１６Ｃは、分化誘導処理後の細胞におけるＮＦ２００の発現量をウェスタンブロッティングにより測定した結果の写真を示す。図１６Ｃ中、左から一番目のレーンは、過酸化水素処理をせず、かつ、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していない対照群を示し、左から二番目のレーンは、過酸化水素処理はしたが、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理していない対照群を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の医薬組成物は、下記の一般式（Ｉ）で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体を有効成分として含むことを特徴とする。
2014200116.tif 000006
式（Ｉ）中、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル（好ましくはＣ１−３アルキル）、Ｃ１−６ハロアルキル（好ましくはＣ１−３ハロアルキル）、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３から選択され、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル（好ましくはＣ１−３アルキル）またはＣ１−６ハロアルキル（好ましくはＣ１−３ハロアルキル）から選択される。
より好ましくは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル（特にＣ１−３アルキル）、またはＣ１−６ハロアルキル（特にＣ１−３ハロアルキル）から選択される。とりわけ、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１−６アルキル、特に水素またはＣ１−３アルキルから選択されるのが好ましい。また、Ｒ１とＲ２のいずれか一方が水素であることがより好ましい。
本発明者らは、アシュワガンダの葉の水抽出物における抗がん活性を有する有効成分がトリエチレングリコールであることを特定することに成功した。この知見に基づき、上述の一般式（Ｉ）に記載の化合物であれば、その化合物自体が、あるいはその化合物が生体内で代謝されて生成する代謝生成物として、所望の抗がん作用を発揮するものと考えられる。
本明細書において、「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数が１〜６の、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を意味する。Ｃ１−６アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｎ−ペンチルが挙げられる。または「Ｃ１−３アルキル」は、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルを意味する。
「Ｃ１−６ハロアルキル」または「Ｃ１−３ハロアルキル」とは、それぞれ、少なくとも一つの水素がハロゲン、すなわちフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換された、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−３アルキルを意味する。
本明細書において、抗がん活性とは、がんの増殖を抑制する活性を意味し、より詳細には、がん細胞に対して細胞毒性を有し、がん細胞に対する増殖および浸潤の抑制、がん抑制タンパクｐ５３またはｐＲＢの活性化、テロメラーゼ活性の阻害、分化誘導などの作用を有することを意味する。本発明の医薬組成物は、単独で、あるいは他の抗がん剤を用いた化学療法あるいは放射線療法などと併用して、がんの治療または予防に用いることができる。本発明の医薬組成物は、がん細胞にのみ作用し、正常細胞にはほとんど影響を及ぼさない点で有利である。
また、本発明者らは、トリエチレングリコールが、がん細胞の転移を抑制する作用を有することを見出した。本発明の医薬組成物は、他の抗がん剤を用いた化学療法あるいは放射線療法などと併用したり、治療後のがん再発を予防したりするためのがん転移抑制剤としても用いることができる。
本明細書において「がん」とは、膵臓がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、骨髄がん、副腎がん、皮膚がん、メラノーマ、肺がん、小腸がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、乳がんまたは卵巣がんなどの上皮組織に生じる癌、および筋肉や骨などの非上皮性の部位に生じる悪性腫瘍である肉腫を含む固形癌、ならびにその他の白血病や悪性リンパ腫などの液性がんの全てを包含する。本発明の医薬組成物は、なかでも固形癌の治療または予防に有効である。
トリエチレングリコールは水分子を保持する能力において優れており、溶媒などとして使用されている。また、トリエチレングリコールは、空気中、液中および表面における細菌やウイルスに対する低毒性の緩効性殺菌剤としても既知である。トリエチレングリコールは市販されていて容易に入手可能であり、その誘導体についても市販されているか、あるいは当業者であれば市販の試薬を用いた公知の手法により容易に調製が可能である。従って、本発明の医薬組成物は比較的安価に提供することができる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じて製薬上許容される担体と共に、有効成分である式（Ｉ）の化合物を任意の剤形に製剤化してよく、種々の投与形態を採用可能である。剤形の具体例としては、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、散剤、顆粒剤、注射剤などが挙げられる。投与経路は、経口および非経口のいずれでもよく、非経口投与経路としては、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与などが挙げられる。
製薬上許容される担体としては、固形製剤では賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などが挙げられる。液剤では溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
経口固形製剤を調製する場合は、有効成分である式（Ｉ）の化合物に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、カプセル剤などとすることができる。
注射剤を調製する場合は、有効成分である式（Ｉ）の化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、または腹腔内投与用注射剤とすることができる。
本発明は、がん治療を必要とする哺乳動物、特にヒトに、式（Ｉ）で表されるトリエチレングリコールまたはその誘導体の有効量を投与することを含む、がんを治療または予防するための方法にも関する。「有効量」とは、例えば研究者または臨床医の望む、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する有効成分の量を意味する。本発明の有効成分である式（Ｉ）の化合物の有効量は、投与対象の年齢、体重、重症度、製剤の性質、および投与経路などに依存する。哺乳動物、特にヒトの治療のための式（Ｉ）の化合物の有効量は、例えば、経口投与で５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、特に５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、とりわけ１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、非経口投与で５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、特に５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、とりわけ５０〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。この有効量を１日１回、または２〜３回程度に分けて投与するのが好ましい。経口投与剤および非経口投与剤は投与単位あたり１０〜５００ｍｇ、特に５０〜２５０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含むことが好ましい。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．アシュワガンダ葉の水抽出物（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ）の調製
１０ｇのアシュワガンダ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）乾燥葉粉末（インド原産、ｉＧＥＮＥ社より購入）を１００ｍＬの水に加え、１０％の懸濁液を用意した。懸濁液を４５℃のインキュベータ内に入れ、一晩ゆっくり振盪させることにより抽出処理を行った。抽出処理を終えた懸濁液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄みを０．４５μｍのフィルタを用いて濾過して、アシュワガンダ葉の水抽出物（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ）を得た。
２．癌細胞に対するＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの細胞毒性アッセイ
ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）またはヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７、ＪＣＲＢ生物資源バンクより入手）を培養する培地に対して、０．８〜６．２％の最終濃度となるようにＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを添加した。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを添加後、４８時間、３７度で培養した後、クリスタルバイオレットで各細胞を染色した。なお、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを添加していない培地で同様に培養した細胞群を対照群とした。図１に示したように、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸは試験した両方の癌細胞に対して細胞毒性を示した。
３．ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸのタンパク成分不活性化
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの抗癌活性成分を特定するため、熱変性またはプロテイナーゼ分解によりＡｓｈＬｅ−ＷＥＸのタンパク成分を不活性化した試料を用意した（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−ＨＩおよびＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−ＰＩ）。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸとタンパク成分を不活性化した試料とを用いてヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１、ＪＣＲＢ生物資源バンクより入手）に対する細胞毒性を試験した。その結果を図２に示す。この試験により、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの細胞毒性は、そのタンパク成分から独立していることがわかった。
４．ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸの分画
上記１で得られたＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを、Ｃ１８カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ、東ソー社）を用いた逆相ＨＰＬＣで分画した。流速１ｍＬ／分、カラム温度４０℃とし、検出波長２２０ｎｍとし、溶液Ａとして水、溶液Ｂとしてエタノールを用いてグラジエント溶出を以下の条件に従って行った。
〜  ５分：溶液Ａ１００％一定
〜２０分：溶液Ｂ０．７５％までのグラジエント
〜２５分：溶液Ｂ０．７５％から５０％までのグラジエント
〜３０分：溶液Ｂ５０％一定
〜３２分：溶液Ｂ５０％から０％までのグラジエント
〜３７分：溶液Ａ１００％一定
グラジエント溶出により、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを４つの画分に分割することができた（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ１〜Ｆ４）。
５．ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびその画分の細胞毒性アッセイ
ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社）に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、加湿インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）中で培養した。細胞を４０〜６０％コンフルエントまで培養した後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ（最終濃度１％、２００μｇ／ｍＬ）ならびにその第１および第２画分（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ１およびＦ２）でそれぞれ処理した。処理は、細胞を３７℃で培養しながら、典型的には４８時間かけて行った。
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびその画分の細胞毒性を、ＭＴＴを用いたアッセイにより評価した。上記の処理の後、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に加え、４時間インキュベートした。次いで、ＭＴＴを含む培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに加えてフォルマザン結晶を完全に溶解させた。分光光度計（Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ）を用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。細胞毒性アッセイにより、第２画分（ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ２）に抗癌活性成分が含まれることがわかった。
６．抗癌活性成分の特定
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ２を、タンパク質を熱変性させた後、乾燥させ、重水に溶解させてＮＭＲ分析（１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ）を行った。得られたスペクトルを図３中の（ａ）および（ｂ）に示す。公知のスペクトルデータ（図３（ｃ）および（ｄ））と比較し、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ−Ｆ２の主成分がトリエチレングリコール（ＴＥＧ）であることを確認した。
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸにおけるトリエチレングリコールの存在を確認するためにＨＰＬＣによる分析を行った。ＬＵＮＡ  Ｃ１８（２）カラム（長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒子径５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）および示差屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所）を用い、水（注入量１０μＬ、流速２ｍＬ／分）を移動相とし、４０℃で行った。市販の精製されたトリエチレングリコールを標準物質として用いた。得られたチャートを図４に示す。分析結果から、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸにはトリエチレングリコールが含まれていることが確認された。
７．トリエチレングリコール（ＴＥＧ）の細胞毒性アッセイ
上記５と同様の手順により、トリエチレングリコールを用いてヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）に対する細胞毒性を試験した。その結果を図５に示す。トリエチレングリコールは、濃度０．５％以上の投与量で癌細胞の増殖を抑制する一方、正常ヒト繊維芽細胞に対してはほとんど毒性を示さないことがわかった。また、ヒト骨肉種細胞（Ｕ２ＯＳ）を用いた細胞周期分析を行ったところ、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸとトリエチレングリコールは、いずれもＧ１アレストを起こすことがわかった（図６）。すなわち、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールは、癌細胞特異的にＧ１期での細胞周期停止効果を有することがわかった。
８．ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ
高肺転移を伴う浸潤性腫瘍由来のＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫細胞、ＪＣＲＢ生物資源バンクより入手）による皮下異種移植および経尾静脈転移モデルのマウスを用いて、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールについてｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイを行った。
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（４週齢、雌、日本クレア社から購入）に、ＨＴ１０８０細胞（０．２ｍＬの成長培地に６×１０６個）を１匹あたり２箇所に皮下注射し、さらにそれと同量を経尾静脈注射した。対照群は２％カルボキシメチルセルロースを給餌により投与し、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ群は１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重／回のＡｓｈＬｅ−ＷＥＸを含むように２％カルボキシメチルセルロースと混ぜ合わせたものを給餌により投与し、ＴＥＧ群は５％のトリエチレングリコール水溶液を経口投与（２％カルボキシメチルセルロースと混合して調製した５％トリエチレングリコールを２５０μＬ／回で使用）または腹腔内注射（５％トリエチレングリコールを１００μＬ／回で使用）で処理した。処理はＨＴ１０８０細胞の注射後８日目から開始し、隔日で１２回行った。１ヶ月にわたって腫瘍形成を観察し、皮下の腫瘍の容積を算出した。転移アッセイのため、経尾静脈注射の５週間後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、肺を４％ホルムアルデヒドで固定し、腫瘍コロニーを数えた。このアッセイは各群につき３匹のマウスを用いて行い、２回繰り返した。
結果を図７に示す。トリエチレングリコールをマウスに給餌により経口投与した群（ＴＥＧ群）では腫瘍成長抑制効果がみられ、腹腔内注射した群（ＴＥＧ−ｉｐ群）でも、同様の腫瘍成長抑制効果がみられた。すなわち、トリエチレングリコールの経口投与および腹腔内注射のいずれによっても、腫瘍の成長に伴う腫瘍容積の増大を顕著に減少させる効果がみられた。
さらに、トリエチレングリコールは強力な抗転移活性を示した。図８にｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍転移アッセイの結果を示す。図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍転移アッセイ後、マウスより摘出した肺の画像データを示し、画像データ中において丸で囲まれた部分が転移により形成された腫瘍を示す。なお、図８Ａ中、上段は２％カルボキシメチルセルロース投与群（対照群）、中段はＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ投与群、下段はトリエチレングリコール投与群を示す。また、図８Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ後の各群の肺腫瘍容積の平均値を示すグラフである。対照群のマウスではいずれも肺に巨大な腫瘍がみられたが、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したマウスでは対照群のマウスの肺腫瘍と比較して肺腫瘍の数が少なく、容積は顕著に小さかった。また、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはＴＥＧで処理したＨＴ１０８０細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイを行ったところ、浸潤の減少がみられた（図９）。これらの結果は、トリエチレングリコールがＡｓｈＬｅ−ＷＥＸにおける主たる抗腫瘍因子であることを示唆していた。
９．トリエチレングリコールの抗癌活性メカニズム
トリエチレングリコールの細胞毒性の作用機序を調べるため、ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）をそれぞれＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコール（ＴＥＧ）で処理し、癌抑制タンパク質であるｐ５３およびｐＲＢの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで調べた。なお、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコール（ＴＥＧ）の処理は、各細胞を培養する培地にＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ（最終濃度０．５％）またはトリエチレングリコール（最終濃度０．５％、１．０％、または２．０％）を添加し、４８時間培養することにより行った。結果を図１０Ａに示す。なお、下段の発現量を示す棒グラフのそれぞれに示した１〜５の番号は、上段の写真の各レーンに付した１〜５の番号に対応するものである。Ｕ２ＯＳ細胞では、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した場合に対照群と比較してｐ５３の増加がみられた。また、正常細胞ではＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した場合に対照群と比較してｐ５３とｐ２１の増加がみられた。さらに、癌細胞および正常細胞の両方でリン酸化ｐ５３タンパク質が増加していることが抗ホスホセリン特異的抗体を用いた試験により判明した。リン酸−ｐ５３／ｐ５３の比に基づき、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した細胞では対照群と比較してリン酸化が３０〜４０％増加していることがわかった。このことは、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールが、癌細胞および正常細胞の両方でｐ５３を活性化させることを示唆している。一方、ｐＲＢについては、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した細胞では、対照群と比較してリン酸化ｐＲＢが癌細胞では減少するのに対し、正常細胞では増加することがわかった。リン酸−ｐＲＢ／ＲＢの比は、対照細胞における約０．５からトリエチレングリコール処理細胞における約０．３まで減少していた（約２０％減少）のに対し、正常細胞では逆に約２０％増加していた。
これらと並行して、サイクリン−Ｂ１、−Ｄ１およびＥ１、ならびにＣＤＫ−２、−４および−６の発現量を試験した。結果を図１０Ｂに示す。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した癌細胞ではサイクリン−Ｂ１の減少がみられたのに対し、正常細胞では逆に対照群と比較してサイクリン−Ｂ１が増加していた。一方、サイクリン−Ｄ１では反対の傾向を示し、トリエチレングリコールで処理した場合、癌細胞では増加したのに対し、正常細胞では減少した。サイクリン−Ｅ１では、癌細胞および正常細胞の両方で増加した。ＣＤＫ−４は正常細胞で減少していた。
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）および正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）におけるｐ５３およびｐＲＢのリン酸化状態を可視化するために免疫組織化学を行った。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールによる処理は、培地に最終濃度がそれぞれ０．５％となるようにＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを添加し、当該培地を用いて各細胞を４８時間培養することにより行った。細胞は、抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１）および抗ｐＲｂ抗体（Ｓ７８０）で染色した。免疫染色を、Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５９４標識二次抗体を用いて可視化した。サイクリン−ＣＤＫ複合体の下流エフェクタであるｐＲＢは、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した癌細胞におけるリン酸化が減少している一方、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理した正常細胞では増加していた（図１１）。
１０．テロメラーゼ活性測定
確立された癌細胞の特徴であるテロメラーゼ活性へのトリエチレングリコールの効果についてＴＲＡＰアッセイキット（ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ  ＰＬＵＳ；Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅより購入；Ｃａｔ＃１２  ０１３  ７８９  ００１）を使用して試験した。細胞は、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）を用いた。ヒト乳癌細胞は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールを最終濃度で０．５％含む培地で４８時間培養した後、テロメラーゼ活性の測定に使用した。試験の結果を図１２に示す。トリエチレングリコールとＡｓｈＬｅ−ＷＥＸは、２０〜４０％テロメラーゼ活性を阻害することがわかった。また、図１３に示したウェスタンブロッティングのアッセイの結果より、トリエチレングリコールとＡｓｈＬｅ−ＷＥＸは、酸化ストレス依存的に転写因子ＮＲＦ２を活性化するＫｅａｐ１の発現量を増加させることがわかった。
１１．トリエチレングリコールの抗転移活性メカニズム
ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびトリエチレングリコールの抗転移活性のメカニズムを調べるために、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９、−３および−２）の発現レベルを調べた。試験は、ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）を用いて行った。ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸ（最終濃度０．５％）またはトリエチレングリコール（最終濃度０．５％、１．０％、または２．０％）を含む培地で４８時間培養した後、マトリックスメタロプロテアーゼの発現量の測定に使用した。図１４に示されるように、癌細胞は、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸおよびＴＥＧで処理した際、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９の発現のレベルにおいて著しい減少を示し、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでみられた抗転移活性を示唆していた。この効果はＭＭＰ−２については観察されなかった。
１２．トリエチレングリコールの分化誘導活性
膠芽腫細胞と神経芽細胞腫のトリエチレングリコールによる分化誘導を試験した。なお、膠芽腫細胞の分化誘導は、当該細胞を１００μｍｏｌの過酸化水素で２〜３時間処理した後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコール（最終濃度０．６％）を含む培地で４８時間培養することにより行った。対照群の細胞は、上記と同様の過酸化水素処理の後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールのいずれも含まない培地で培養した。膠芽腫細胞の分化誘導アッセイの結果を図１５に示す。図１５Ａに示したように、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールにより処理した膠芽腫細胞は星状膠細胞様の形態を有し、分化を示した。さらに、ＧＦＡＰ（膠細胞分化のマーカータンパク）の誘導がＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコール処理した細胞で上方調節されていた（図１５Ｂ）。分化した細胞の高倍率写真によれば、星状膠細胞様の形態がみられ、ＧＦＡＰの高発現がみられる（図１５Ｃ）。
次に、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したＩＭＲ３２神経芽細胞腫に対する効果を調べた。神経芽細胞腫の分化誘導は、当該細胞を１００μｍｏｌの過酸化水素で２〜３時間処理した後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコール（最終濃度０．５％）を含む培地で４８時間培養することにより行った。対照群の細胞は、上記と同様の過酸化水素処理の後、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールのいずれも含まない培地で培養した群と、過酸化水素処理をせず、かつ、ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールのいずれも含まない培地で培養した群とを作成した。結果を図１６に示す。ＡｓｈＬｅ−ＷＥＸまたはトリエチレングリコールで処理したＩＭＲ３２は神経様の形態を示し、ニューロフィラメント・タンパク質（ＮＦ２００）の増加を示した（図１６Ａ、図１６ＢおよびＣ）。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図４】
2014200116.tif 000011
【図１２】
2014200116.tif 000012
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
2014200116.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
2014200116.tif 000025
【図１６】
2014200116.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月30日(2016.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014200116.tif 000027
［式中、
Ｒ１とＲ２は、いずれも水素である］
で表されるトリエチレングリコールを有効成分として含む、繊維肉腫細胞の肺転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化２】
2014200116.tif 000028
［式中、
Ｒ１とＲ２は、いずれも水素である］
で表されるトリエチレングリコールを有効成分として含む、繊維肉腫細胞の肺転移抑制剤。
【国際調査報告】
2014200116.tif 000029
2014200116.tif 000030
2014200116.tif 000031
2014200116.tif 000032
2014200116.tif 000033
2014200116.tif 000034