(57)【要約】  損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断する活性を有する酵素を遺伝子操作用試薬等として提供し、さらに損傷塩基を該酵素を用いてＤＮＡ鎖から除去する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断する活性を有する酵素。
【請求項２】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含む請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加された配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含む請求項１に記載の酵素。
【請求項４】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の酵素。
【請求項５】
損傷塩基がヒポキサンチンである請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
損傷塩基がキサンチンである請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項７】
損傷塩基がウラシルである請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
損傷塩基が脱塩基（アベイシック）である請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
サーモコカケアエ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科由来である請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１０】
ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）由来である請求項１０に記載の酵素。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素を生成蓄積させ、培養物から該酵素を採取することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素の製造方法。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素と、Ｅｎｄｏ  Ｖとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素と、フラップエンドヌクレアーゼとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１８】
損傷塩基が、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシルおよび脱塩基（アベイシック）からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法によって損傷塩基を除去した後、ＤＮＡリガーゼ反応によって再結合する遺伝子操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試験管内（インビトロ）遺伝子試薬として有用なＤＮＡ切断酵素、遺伝子工学的手法を用いた該酵素の製造方法および該酵素を用いた遺伝子操作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の発展によって、種々の目的によって遺伝子（ＤＮＡ）解析を行う機会が急激に増している。そのため、試験管内でＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖を目的に応じて細工する遺伝子操作技術では、様々な活性を有する種々の酵素が必要とされている。そして現在の遺伝子操作技術はこれらの酵素抜きにしては成り立たない。【０００３】
遺伝子工学技術には、これまで様々なＤＮＡ関連酵素が利用されてきた。ＤＮＡを切断する酵素には、塩基配列を特異的に認識して切断する酵素と立体構造を認識して切断する酵素が知られている。なかでも塩基配列を特異的に認識して切断する酵素として頻繁に用いられているのは制限酵素と呼ばれるもので、一般的に二本鎖ＤＮＡの特異的な塩基配列の４〜８塩基を認識して切断する。一方、一本鎖ＤＮＡを特異的に切断する酵素としては、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに作用してモノヌクレオチドに分解するエンドヌクレアーゼであるＡｅｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＳ１ヌクレアーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ由来のＰ１ヌクレアーゼ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｅｓｐｅｊｉａｎａ由来のＢａｌ３１ヌクレアーゼなどが公知であり、市販されている。
また、ＤＮＡ鎖中に損傷塩基がある場合、それを認識し、特異的に損傷塩基の３’側を切る酵素として、エンドヌクレアーゼＶ［Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）］が知られている（非特許文献１）。エンドヌクレアーゼＶについては、例えば、大腸菌由来のＥｎｄｏ  Ｖが遺伝子工学用酵素として市販されている（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）。また、ＤＮＡ鎖中のデオキシリボースの酸化的損傷で生じる酸化的脱塩基損傷が知られており、その切断に関与する酵素として大腸菌のＥｎｄｏ  ＩＶやｈｕｍａｎのａｂａｓｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＡｐｅＩ）が知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｏ  Ｗ．（２０１２）Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ：ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１２  Ｄｅｃ  ２０．
【非特許文献２】Ｙｏｎｇ−ｊｉｅ  Ｘｕ，  Ｅｄｙ  Ｙｏｎｇ  Ｋｉｍ，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ｄｅｍｐｌｅ  （１９９８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９８  Ｏｃｔ  ３０；２７３（４４）：２８８３７―４４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの酵素によるＤＮＡ鎖切断にはＭｕｔＭやＤＮＡポリメラーゼｂｅｔａのリアーゼ活性が必要であり、また切断後に１ヌクレオチドギャップが生じることが分かっている（非特許文献２）。すなわち、損傷塩基を認識するエンドヌクレアーゼについては、損傷塩基の５’側のリン酸ジエステル結合を直接切断する活性はこれまでに知られておらず、そのような活性を有する酵素の存在は不明である。しかし、そのような酵素があれば、損傷塩基の３’側を切る酵素（エンドヌクレアーゼＶなど）と併用することにより、損傷塩基の両端を切って該塩基を除去することができるため、新規な遺伝子工学技術開発のために大いに役立つことが期待される。【０００６】
したがって、本発明の目的は、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、その損傷塩基のすぐ５’側を特異的に切断する活性を有する酵素を遺伝子操作用試薬等として提供することにあり、さらに該酵素を用いて、ＤＮＡ鎖から損傷塩基を除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、超好熱性アーキア（古細菌）の一種であるピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、以下Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓとも記載する。）のＥｎｄｏ  Ｖに着目し、この酵素が大腸菌や他生物由来の既知のＥｎｄｏ  Ｖと同様に、ＤＮＡ鎖中のアデニンが脱アミノ化されて生じた損傷塩基であるヒポキサンチンの存在する位置の３’側のヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断することを確認した。【０００８】
そして、さらなる鋭意努力の結果、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの細胞抽出液には、ヒポキサンチンの５’側が切断された産物を与える活性も含まれていることを見い出し、その活性のもとになるタンパク質の同定を行った。当該酵素は、このようにヒポキサンチンを有するＤＮＡ鎖を切断する酵素として同定されたが、その後、損傷塩基であるウラシルやキサンチンを含むＤＮＡ鎖や、塩基欠損（アベイシック）ＤＮＡ鎖なども切断する活性を有していることが確認された。さらに本発明者らは、当該タンパク質と相同性を有するタンパク質を、近縁種のアーキアであるサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）から得ることに成功し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、下記（１）から（１９）に関する。
（１）損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断する活性を有する酵素。
（２）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含む（１）に記載の酵素。
（３）１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加された配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含む（１）に記載の酵素。
（４）配列番号２または４に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む（１）に記載の酵素。
（５）損傷塩基がヒポキサンチンである（１）から（４）のいずれか一つに記載の酵素。
（６）損傷塩基がキサンチンである（１）から（４）のいずれか一つに記載の酵素。
（７）損傷塩基がウラシルである（１）から（４）のいずれか一つに記載の酵素。
（８）損傷塩基が脱塩基（アベイシック）である（１）から（４）のいずれか一つに記載の酵素。
（９）サーモコカケアエ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科由来である（１）から（８）のいずれか一つに記載の酵素。
（１０）ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である（９）に記載の酵素。
（１１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）由来である（１０）に記載の酵素。
（１２）（１）から（１１）のいずれか一つに記載の酵素をコードするＤＮＡ。
（１３）（１２）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１４）（１３）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１５）（１４）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）から（１１）のいずれか一つに記載の酵素を生成蓄積させ、培養物から該酵素を採取することを含む、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の酵素の製造方法。
（１６）（１）から（１１）のいずれか一つに記載の酵素と、Ｅｎｄｏ  Ｖとを使用して損傷塩基を除去する方法。
（１７）（１）から（１１）のいずれか一つに記載の酵素と、フラップエンドヌクレアーゼとを使用して損傷塩基を除去する方法。
（１８）損傷塩基が、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシルおよび脱塩基（アベイシック）からなる群から選択される少なくとも１つである（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）（１６）から（１８）のいずれか一つに記載の方法によって損傷塩基を除去した後、ＤＮＡリガーゼ反応によって再結合する遺伝子操作方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酵素は、ＤＮＡの塩基と糖の間のグリコシド結合が切れたアベイシックなＤＮＡ鎖や、アデニン、グアニン、シトシンがそれぞれ脱アミノされた損傷塩基であるヒポキサンチン、キサンチン、ウラシルを特異的に認識して、ＤＮＡ鎖を切断する活性を有する。詳細には、本発明の酵素は、損傷塩基のすぐ５’側を切断する特異性を示す全く新規のものであるため、その性質を利用した新規遺伝子工学技術開発への応用が期待される。さらに本発明の酵素を用いることで、損傷塩基をＤＮＡ鎖から除去する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＤＮＡ塩基の脱アミノ化を説明する概略図である。
【図２】図２は、ピロコッカス・フリオサスの細胞抽出液に含まれるヒポキサンチン除去修復に関与するタンパク質のスクリーニングの結果を示す電気泳動図である。
【図３】図３は、活性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図４】図４は、最終活性画分の電気泳動の結果を示す図であり、そこに含まれるタンパク質を検出した図である。
【図５】図５は、ＰＦ１５５１の活性測定の結果を示す図である。
【図６】図６は、サーモコッカス・コダカレンシス由来のＰＦ１５５１ホモログ（ＴＫ０８８７）の活性測定の結果を示す電気泳動図である。
【図７】図７は、Ｅｎｄｏ  Ｑの切断様式を示す概略図である。
【図８】図８は、Ｅｎｄｏ  Ｑの切断様式を示す概略図である。
【図９】図９は、Ｅｎｄｏ  Ｑによる切断後、Ｔ４リガーゼを用いた再結合を示す電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書におけるアミノ酸配列などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡｃ−ＩＵＢ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８；９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１３】
（Ｉ）本発明のＤＮＡ（遺伝子）
本発明の遺伝子は、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）の遺伝子ＰＦ１５５１であり、ＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断する活性を有するＤＮＡ切断酵素（タンパク質）をコードする遺伝子およびそのホモログである。
すなわち本発明の遺伝子は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）を含有するポリヌクレオチドである。
【００１４】
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有し、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質コードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）（ｅ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ｅ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
また本発明の遺伝子は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの近縁種のアーキア（古細菌）であるサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）の遺伝子ＴＫ０８８７であり、ＰＦ１５５１のコードするタンパク質と相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびそのホモログである。
すなわち本発明の遺伝子は、下記の（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）または（ｎ）を含有するポリヌクレオチドである。
【００１６】
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉ）（ｈ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｈ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）（ｈ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有し、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質コードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）（ｌ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ｌ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
本明細書でタンパク質または酵素の性質に関し、「ＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有する」とは、特別な場合を除き、ＤＮＡ中の少なくとも１つの損傷塩基を特異的に認識し、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断する活性を有することをいう。切断後には５’側にリン酸基、３’側に水酸基が残る型の切断様式をとり、ＤＮＡリガーゼによる再結合が可能である。
【００１８】
「損傷塩基」とは、ＤＮＡが変異原に曝露されることなどにより損傷を受けた塩基をいい、特に本明細書では、例えば高温、ＵＶ，電離放射線、亜硝酸などの変異原により、ＤＮＡの塩基と糖の間のグリコシド結合が切れたアベイシックなＤＮＡ鎖や、アミノ基が失われ酸素が結合することによって脱アミノ化された塩基をいう（図１）。脱アミノ化により、アデニンはヒポキサンチンに、グアニンはキサンチンに、シトシンはウラシルに変化する。
脱アミノ化による損傷塩基を修復しないでおくと、例えば、ヒポキサンチン（Ｈｘ）についてはシトシン（Ｃ）と対を作るので、その後のＤＮＡの複製・転写によって塩基対は、（Ａ：Ｔ→）Ｈｘ：Ｔ→Ｈｘ：Ｃとなり、もう一度複製が行われるとＨｘ：Ｃ→Ｇ：Ｃとなる。このようにして、Ａ：ＴがＧ：Ｃに点変異する。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じ、本発明では、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣまたはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を適用することができる。それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば約５０℃、さらに約６５℃としてもよい。
【００２０】
本明細書で「１もしくは複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列」という場合、置換等されるヌクレオチドの個数は、その塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、１〜９個または１〜４個程度であるか、同一または性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。
また、本明細書で「１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有するタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、１〜９個または１〜４個程度であるか、同一または性質の似たタンパク質を構成するような置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このような塩基配列またはアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手段は、当業者には周知である。
【００２１】
本発明の遺伝子には、配列番号１または３に記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
塩基配列に関し、高い同一性とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。また、本発明に係る遺伝子には、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列の全部または少なくともシグナル配列を除いた部分を含む一部と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。アミノ酸配列に関し、高い同一性とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２２】
ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性（相同性ということもある）に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア、ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＷおよびＪＡＬＶＩＥＷ等を用いる。）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
【００２３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、天然物からハイブリダイゼーション技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術等を利用して得ることができる。具体的には、好ましくは、サーモコッシ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｉ）綱、サーモコッカレス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目、サーモコカケアエ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科の菌、より好ましくは、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の菌；さらに好ましくは、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）に属する細菌；特に好ましくは、ピロコッカス・フリオサスから、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を調製し、あるいは同細菌体から全ＲＮＡを調製して逆転写によりｃＤＮＡを合成する。ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡから、本発明のＤＮＡ分解の適切な部分塩基配列をプローブまたはプライマーとして設計・利用して、全長の本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００２４】
本発明に係るポリヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡでありうる。本発明に係るポリヌクレオチドは、ピロコッカス属、またはサーモコッカス属に属する細菌；好ましくは、ピロコッカス・フリオサスまたはサーモコッカス・コダカレンシスに属する細菌；より好ましくは、ピロコッカス・フリオサス由来でありうる。
配列表の配列番号１にピロコッカス・フリオサス、配列番号３にサーモコッカス・コダカレンシスに由来する塩基配列を示す。
【００２５】
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチド（本発明のＤＮＡおよびそのホモログ）を含む組換えベクター、その組換えベクターにより形質転換された、形質転換体も提供する。本発明はさらに、本発明に係るポリヌクレオチドを用いて宿主（菌もしくは細菌、動物細胞、または植物細胞。例えば、大腸菌）を形質転換する工程を含む、形質転換方法も提供する。
【００２６】
本発明に係るポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、宿主内で挿入物を発現させることが可能なものであれば特に制限はなく、ベクターは、通常、プロモーター配列、ターミネーター配列、外的な刺激により誘導的に挿入物を発現させるための配列、目的遺伝子を挿入するための制限酵素により認識される配列、および形質転換体を選択するためのマーカーをコードする配列を有する。組換えベクターの作製、組換えベクターによる形質転換方法は、当業者に周知の方法を適用することができる。
【００２７】
（ＩＩ）本発明の酵素（タンパク質）
本発明の酵素は、本発明のＤＮＡであるＰＦ１５５１によってコードされるタンパク質またはそのホモログである。
すなわち本発明の酵素は、下記の（ｅ’）、（ｆ’）または（ｇ’）を含有するタンパク質である。
（ｅ’）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ’）（ｅ’）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質；
（ｇ’）（ｅ’）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質。
【００２８】
さらに、ＰＦ１５５１のコードするタンパク質と相同性を有するタンパク質が、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの近縁種のアーキア（古細菌）であるサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）の遺伝子ＴＫ０８８７にも認められた。
したがって、また本発明の酵素は、ＴＫ０８８７のコードするタンパク質と相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびそのホモログである。
すなわち本発明の酵素は、下記の（ｌ’）、（ｍ’）または（ｎ’）を含有するタンパク質である。
【００２９】
（ｌ’）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｍ’）（ｌ’）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質；
（ｎ’）（ｌ’）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ中の損傷塩基のすぐ５’側を切断するＤＮＡ切断活性を有するタンパク質。
【００３０】
本発明の酵素の精製および同定は、以下のように行われた。
まず、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）の細胞抽出液に、ＤＮＡ鎖中のアデニンが脱アミノ化されて生じた損傷塩基であるヒポキサンチン含有ＤＮＡを切断する活性が存在することを確かめた。ピロコッカス・フリオサスの細胞抽出液を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで分画し、その各フラクションを用いて、ヒポキサンチン含有の化学合成ＤＮＡ鎖を基質とした切断反応を行なった結果、図２に示すように、サンプル番号１〜４において、２４ｍｅｒの位置にバンドが検出される画分を得た。一方、精製された「エンドヌクレアーゼＶ」のみで処理されたサンプルにおいては、２６ｍｅｒの位置にバンドが検出されている。エンドヌクレアーゼＶによる切断反応では、ヒポキサンチンの３’側の１ヌクレオチド下流で切断されることが分かっているので、２４ｍｅｒが現れるということはヒポキサンチンの５’側で切断されていることを示している。したがって、２４ｍｅｒの位置にバンドが現れたサンプル番号１〜４の画分においては、５’側に切断活性が起きたことを示している。
【００３１】
なお、サンプル番号１〜４の画分にエンドヌクレアーゼＶも含まれることをウエスタン解析で確認されているので、エンドヌクレアーゼＶによる切断反応も同時に起きていることが予想される。ＤＮＡの標識は５’末端にされているので、同時に切断反応が起きても、検出されるのはより短い２４ｍｅｒだけである。
【００３２】
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ細胞抽出液を原理の異なる５種類のクロマトグラフィーで丁寧に分画していき、目的の活性を濃縮した。その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  に供し、銀染色を行なうと、図４に示すようなタンパク質を検出した。矢印に示す８つのバンドを切り出し（実施例２及び図４）、高感度質量分析に供し、そこに含まれるタンパク質のアミノ酸配列を求めた。その結果、目的の活性を与えるタンパク質の候補として、２０種のタンパク質がリストアップされた。
【００３３】
それらのタンパク質をコードする遺伝子をＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡよりクローニングし、大腸菌で発現させた。得られた組換え大腸菌の細胞抽出液を用いて、損傷塩基を含むＤＮＡを基質としたヌクレアーゼアッセイを行ったところ、候補タンパク質のうちの一つから、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの細胞中から検出された活性と同様の、ヒポキサンチン塩基の存在する位置の５’側が切断された産物を与える活性が検出された。従って、この活性を有するタンパク質は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの遺伝子番号ＰＦ１５５１の産物であることが分かった（図５）。
【００３４】
この遺伝子産物は、データベース上で、Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎとしてアノーテートされており、機能未知のタンパク質である。本発明では、この機能未知のタンパク質が、ヒポキサンチン塩基を含むＤＮＡの鎖の５’側を切断するという新規の活性を有する酵素であることを確定した。すなわち、遺伝子配列を翻訳して得られるアミノ酸配列は、既知のタンパク質との相同性を示さず、このような損傷塩基特異的なヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であることは、データベース上の配列からは全く予想できるものではない。
【００３５】
また本発明の酵素は、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）にも認められ、その遺伝子ＴＫ０８８７をクローニングして、組換え大腸菌を作製して、当該遺伝子を発現させた。その遺伝子産物に同様の切断活性があるのかどうかを調べた結果、図６に示すように、その細胞抽出液からもＰＦ１５５１の場合と同様の切断産物を与える活性が検出された。この切断活性はヒポキサンチン（Ｈｘ）のところがＧになっているＧ−Ｔミスマッチを含むＤＮＡ基質では検出されなかった（レーンＧ）。また、ＴＫ０８８７遺伝子を組み込んでいない大腸菌では基質にＨｘが含まれていても切断は起こらなかった（レーン“Ｅ．ｃｏｌｉ”）。
【００３６】
本発明の新規ＤＮＡ切断酵素（配列番号２の４２４アミノ酸からなる分子量４７，６５３のタンパク質）は、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｑ（Ｅｎｄｏ  Ｑ）と命名された。この酵素はヒポキサンチンを有するＤＮＡ鎖を切断する酵素として上記のように同定されたが、その基質特異性がどの程度厳密なものかを調べるために、他の損傷塩基として、その後の研究により、ヒポキサンチンを有するＤＮＡ鎖を切断するだけではなく、ウラシル、キサンチンを含むＤＮＡ鎖や、塩基欠損（アベイシック）ＤＮＡ鎖、ミスマッチ塩基対を含むＤＮＡについても切断反応を行なったところ、ウラシル、キサンチン、アベイシック部位を有するＤＮＡ鎖を同様の効率で切断することが示された。
【００３７】
図７に、ヒポキサンチンを含むＤＮＡ基質の場合とウラシルを含むＤＮＡ基質の場合を示す。図７中、＊Ｉ、＊Ｕ、＊Ａは、それぞれヒポキサンチン、ウラシル、アデニン（通常のＤＮＡ塩基）を含む標識した１本鎖ＤＮＡ基質を示し、＊Ｉ／Ｔ、＊Ｕ／Ｇ、＊Ａ／Ｔ、とは、それぞれヒポキサンチン、ウラシル、アデニン、がチミンまたはグアニンと向いあう部位を有する二本鎖ＤＮＡ基質を表し、ヒポキサンチン、ウラシル、アデニンを含む鎖が標識されていることを示す。また、Ｉ／＊Ｔはヒポキサンチンとチミンが向かい合う部位を有する二本鎖のチミンを含むほうの鎖が標識されたＤＮＡ基質を示す。また、図８に、アベイシック部位、ＧＴミスマッチ、キサンチンをそれぞれ有するＤＮＡ鎖を基質に用いた場合を示す。アベイシック部位、キサンチンを有するＤＮＡ基質は同様の効率で切断するが、通常の二本鎖、ＧＴミスマッチを含むＤＮＡ基質は全く切断されない。図８中、＊ＡＰ、＊Ａ、＊Ｘはアベイシック、アデニン、キサンチンを含む標識した１本鎖ＤＮＡ基質、＊ＡＰ／Ｔ、＊Ｇ／Ｔ、＊Ａ／Ｔ、＊Ｘ／Ｇとは、アベイシック、グアニン、アデニン、キサンチンがチミンまたはグアニンと向かい合う部位を有する二本鎖DNAのそれぞれアベイシック、グアニン、アデニン、キサンチンを含む鎖に標識をした二本鎖ＤＮＡ基質を示す。
【００３８】
なお、損傷塩基の種類によって切断産物のバンドの位置がヒポキサンチンの場合と異なるのは、基質ＤＮＡの塩基配列の都合で、損傷塩基の位置がＨｘの位置と異なることに起因しており、切断位置がすぐ隣りの５’側であることは変わらない。また、図７の右側のパネルは、ヒポキサンチンを含むＤＮＡ基質の場合で、標識するＤＮＡ鎖を変えて実験した結果、ヒポキサンチンを含む側の鎖のみが切断を受け、含まない方のＤＮＡ鎖は切断されないことを示す。
【００３９】
さらに、本発明の酵素（Ｅｎｄｏ  Ｑ）により切断されたＤＮＡは、前述のように、５’側にリン酸基、３’側に水酸基を有する形に切断することは、図９に示した実験で、Ｔ４リガーゼを用いることで切断産物が再結合することで証明される。
【００４０】
なお、Ｐ．  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＤＳＭ３６３８）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  ＧＥＲＭＡＮＹ）より入手し、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓを京都大学  大学院  工学研究科  合成・生物化学専攻  生物化学工学分野の研究室（京都市西京区京都大学桂）より入手し、本発明のタンパク質を得た。またＴ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ  １２３８０）は、Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（茨城県つくば市高野台３−１−１  独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室）より入手することも可能である。
【００４１】
本発明の酵素（Ｅｎｄｏ  Ｑ）を製造する方法は以下の工程に分けられる。
（１）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有する酵素をコードする塩基配列を調製する工程。
当該タンパク質をコードする遺伝子をゲノム配列のデータベースから抽出し、コーディング領域の両端の遺伝子配列を基に、ＰＣＲ用のプライマーを設計し、化学合成する。例えば、ＰＦ１５５１−Ｆ  （５′−ＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  Ａ−３′，  ｔｈｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＮｃｏＩ  ｉｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ＰＦ１５５１−Ｒ  （５′−  ＧＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  Ｃ−３′、  ｔｈｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＮｏｔＩ  ｉｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ）のようなものが考えられる。このプライマーセットを用いて、一般的なＰＣＲ条件（５０μＬの反応溶液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に８０ｎｇのＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓゲノムＤＮＡ、４００ｎＭ  各プライマー、２００μＭ  ｏｆ  各ｄＮＴＰｓ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＰｆｕＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む）により目的の遺伝子を試験管内で増幅する。
（２）塩基配列を発現ベクターに挿入し、組換えベクターを得る工程
例えば、大腸菌用の発現ベクターであるｐＥＴ２１ｄ（＋）を用いる場合、上記プライマーの配列中にそれぞれ、制限酵素ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ認識配列を含めておくと、ＰＣＲ増幅遺伝子を両酵素で処理すると、それぞれの認識配列が両末端に現れる。従って、ｐＥＴ２１ｄ（＋）を同じくＮｃｏＩ、ＮｏｔＩで切断し、その位置に当該遺伝子を挿入し、組換えベクターを得ることが可能になる。
（３）ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を得る工程
例えば、大腸菌を宿主に用いる場合、その形質転換法は確立されており、最も簡便には、大腸菌細胞を塩化カルシウム溶液に浸して氷中で静置することによって、外来ＤＮＡを細胞内に取り込み易くなる。試験管内で作成した組換えＤＮＡ溶液をこの細胞液に加えると宿主細胞は、そのＤＮＡによって形質転換され、形質転換体が得られる。ベクターとしてｐＥＴ２１ｄ（＋）を用いる場合、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ株が適している。
（４）形質転換体を培養する工程
当該遺伝子を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ株を培養する場合、アンピシリン５０μｌ／ｍｌ、クロラムフェニコール３４μｌ／ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃の振とう培養を行い、波長６００ｎｍで測定した濁度ＯＤ６００が０．６程度まで増殖した時に、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭになるように添加して、当該遺伝子発現の誘導をかけ、さらに３７℃で４時間振とう培養を続けると目的タンパク質が効率良く産生される。
（５）培養液から酵素を採取する工程
上記のように培養した大腸菌を遠心分離（５分、５０００×ｇ、４℃）によって集菌し、超音波破砕機で細胞を潰して細胞抽出液を得る。目的タンパク質は耐熱性であるが、宿主大腸菌は常温生物であり、そのタンパク質には耐熱性がない。従って、細胞抽出液を熱処理（例えば８０℃、２０分）すると、宿主の大部分のタンパク質は変性して不溶化するので、遠心分離（１０分、１５０００×ｇ、４℃）によって取り除ける。その後、さらに原理の異なるクロマトグラフィーを続けることによって、高純度に精製された目的タンパク質を調製することができる。
【００４２】
（ＩＩＩ）本発明の損傷塩基を除去する方法
本発明の損傷塩基を除去する方法は、本発明の酵素（エンドヌクレアーゼＱ）と、損傷塩基の３’側のヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断するＥｎｄｏ  Ｖまたはフラップエンドヌクレアーゼを組み合せることにより、損傷塩基を切り出して除去することができる方法である。
損傷塩基を除去した後は、切断後の界面をＤＮＡリガーゼ反応によって再結合することができる。
【実施例】
【００４３】
本発明のタンパク質は、以下に記載する実施例に記載した方法のほか、本願明細書に開示される配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製することができる。また、本願明細書に開示される配列を改変した配列を含むタンパク質についても、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製することができる。
また本発明はこれらの実施例によって何ら制限を受けるものではない。【００４４】
［実施例１］
本願発明の切断酵素の同定
＜Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの培養＞
Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ（ＢＤ）２０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ）：５ｇ、塩化ナトリウム：２３．９ｇ、塩化マグネシウム六水和物：１０．８ｇ、硫酸ナトリウム：４ｇ、Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｓｔａｒｃｈ：１０ｇ（ＤＩＦＣＯ）、１０ｍｌの１００×Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（３０％ＭｇＳＯ４、１０％ＮａＣｌ、１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％ＺｎＳＯ４、１％ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％ＣｏＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１％ＫＡｌ（ＳＯ４）２、０．１％Ｈ３ＢＯ２、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２５％ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０）を含む培地１０００ｍｌをオートクレーブ後、内温が１００℃まで低下したところで培地瓶を取り出し、２ｍｌのＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの菌種を添加した。その後、９８℃で静置培養を行った。ＯＤ６００が０．６になったところでインキュベーターから取り出し、培養液を１０分間水で冷却した。その後、培養液を遠心（６２６８×ｇ、１０分間、４℃）することにより集菌した。培地中の菌体数は血球計算盤を用いて計算した。【００４５】
＜細胞抽出液の調製とカラムクロマトグラフィーによる分画＞
集菌した菌体をプロテアーゼ阻害剤であるｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を溶解した１５ｍｌの溶液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（５秒間、ｏｎ／１０秒間、ｏｆｆで計１０分間）を行った。超音波破砕液を遠心（２３７０８×ｇ、１０分間、４℃）して得られた上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液Ｂ（１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．４）で透析した（４℃、１４時間）。同じ溶液で平衡化したｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｐ１１）カラムに供し、０．１−１Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配により、結合したタンパク質を分画した。目的の活性は０．２０−０．３７Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。【００４６】
この画分を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液Ａで透析し、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。０．１−１Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配で結合タンパク質を溶出したところ、目的の活性は０．２１−０．４１Ｍ  ＮａＣｌの位置に溶出した。【００４７】
この画分を溶液Ａで希釈し、ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍ以下に下げた。そして、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供し、０．１−１Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配で結合タンパク質を分画した。目的の活性は０．２７−０．４６Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。【００４８】
この画分を溶液Ｂで透析し、１ｍｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（ＥＣＯＮＯＰＡＣＫ  ＣＨＴ−ＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に供した。結合タンパク質を０．０１−０．５Ｍリン酸カリウム濃度勾配（溶液Ｂ中）で溶出し、目的の活性を０．２３−０．２６Ｍリン酸カリウムの位置に得た。【００４９】
その画分をさらに、１ｍｌ  ＭｏｎｏＳ  ＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供した。０−０．３Ｍ  ＮａＣｌ（溶液Ａ中）の直線濃度勾配で結合タンパク質を溶出した結果、図３に示すように、目的の切断活性を有する画分を得る事ができ、０．２３Ｍ  ＮａＣｌで溶出される画分において、最も高い活性を示した。【００５０】
図３によると、レーン６、７の画分に、目的の活性が最も多く含まれていると予想されたので、レーン６の画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、銀染色によって、この画分に含まれる含有タンパク質を検出した。その結果、図４に示すように、まだ多くの種類のタンパク質がこの画分に含まれていることが分かった。このうちはっきり見える８本のバンド（図４に矢印で示すバンド）を切り出し、それぞれを高感度質量分析に供した結果、目的の活性を与えるタンパク質の候補として、活性の強度とバンド強度の連動性、活性と関連すると予想されるドメインの有無、アーキア間における保存の有無、アノテーションの有無等の観点から、２０種の候補タンパク質をリストアップした。すなわち、他の画分についても電気泳動して、銀染色によるタンパク質検出を行い、バンドの濃さと、図３に示した活性の強さ（切断産物のバンド強度）の相対関係を調べたり、ＤＮＡと同語作用するタンパク質と予想されるような構造（配列）を有していないか、そのタンパク質がアーキア間でどの程度保存されているのか（重要な分子であれば保存度が高い）、データベース上で既に機能が予想されてアノーテーションされているものは、その名称（”ＤＮＡ結合タンパク質”など）をリストアップする、などの作業を行なって、候補タンパク質を絞り込んだ。【００５１】
２０種の候補タンパク質をコードする遺伝子を、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡよりクローニングし、大腸菌内でそれぞれの遺伝子を発現させた。細胞質中に産生されたそれぞれの遺伝子産物の活性を調べるために、組換え大腸菌細胞を培養して、集菌した後、超音波細胞破砕機（Ｍｉｓｏｎｉｘ社  ａｓｔｒａｓｏｎ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）で大腸菌細胞を破砕し、遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、４℃）して、細胞抽出液を遠心上清に得た。さらに、それを湯浴槽中で、８０℃、２０分の処理を行い、宿主大腸菌由来のタンパク質を変性させ、遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、４℃）によって除去して目的の分画サンプルを得た。【００５２】
＜エンドヌクレアーゼ活性測定＞
５’末端をＣｙ５で蛍光標識した、ヒポキサンチン（５’末端から２５ｎｔ目の位置）含む４５鎖長のオリゴヌクレオチド（Ｃｙ５−４５Ｎ−ｄＩ２５）と非標識の相補的配列を有する４５鎖長のオリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐ４５Ｎ−ｎｏｒｍａｌ）を用いて、ＴＡＭ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム）３０μｌ中でそれぞれ終濃度５００ｎＭ、７５０ｎＭとなるように混合し、９８℃から３０℃まで段階的に除冷し（ＰＣＲ装置を用いた）、ヒポキサンチンを含む二本鎖ＤＮＡ基質（Ｈｘ−ｄｓＤＮＡ）を調製した。【００５３】
また、損傷塩基を含まないＤＮＡ基質の調製のために、ヒポキサンチンの部位がアデニンになっているノーマルなＤＮＡ鎖（４５Ｎ）をｔｅｍｐ４５Ｎ−ｎｏｒｍａｌと同様の条件でアニーリングして調製した。用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。【００５４】
Ｃｙ５−４５Ｎ−ｄＩ２５：５’−ｃｇａａｃｔｇｃｃｔｇｇａａｔｃｃｔｇａｃｇａｃｉｔｇｔａｇｃｇａａｃｇａｔｃａｃｃｔｃａ−３’（配列番号５）
ｔｅｍｐ４５Ｎ−ｎｏｒｍａｌ：５’−ｔｇａｇｇｔｇａｔｃｇｔｔｃｇｃｔａｃａｔｇｔｃｇｔｃａｇｇａｔｔｃｃａｇｇｃａｇｔｔｃｇ−３’（配列番号６）
４５Ｎ：５’−ｃｇａａｃｔｇｃｃｔｇｇａａｔｃｃｔｇａｃｇａｃａｔｇｔａｇｃｇａａｃｇａｔｃａｃｃｔｃａ−３’（配列番号７）【００５５】
反応液２０μｌ（１０ｎＭ  Ｈｘ−ｄｓＤＮＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および分画サンプル２μｌ）を調製し、６０℃で１時間反応させた。反応後、反応停止液（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ）４０μｌを反応液中に加えて反応を停止させ、９８℃で３分間熱処理し、急冷した。この反応液１．５μｌを８Ｍ  尿素−１２％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ  ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、および２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、２０Ｗで５０分間の電気泳動を行った。電気泳動終了後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅイメージアナライザーを用いて反応液中のＤＮＡを可視化した。【００５６】
質量分析によって得られた候補タンパク質遺伝子について、それぞれクローニングして組換え大腸菌を作成し、その活性を調べることによって、候補遺伝子のうちの遺伝子番号ＰＦ１５５１を有する組換え大腸菌から、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの細胞中から検出された活性と同様のヒポキサンチン塩基の存在する位置の５’側が切断された産物を与える活性が検出された。従って、この活性を有するタンパク質は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの遺伝子番号ＰＦ１５５１の産物であることが分かった（図５）。【００５７】
［実施例２］
本発明の酵素（Ｅｎｄｏ  Ｑ）により切断されたＤＮＡの末端がＤＮＡ鎖の連結酵素であるＤＮＡリガーゼで再結合できるかどうかを確かめるために、デオキシイノシンを含む  ＤＮＡ（配列番号５）及びそのすぐ５’側のＣがＵに変わったＤＮＡ基質を配列番号６のＤＮＡ鎖とアニールして二本鎖を形成させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む反応液中でＴｋｏＥｎｄｏＱ（１０  ｎＭ）と７５℃、２０分間反応させ、９８℃、１０分間静置して酵素を失活させた。その後、９８℃から２５℃まで２時間かけて下げていくことによって、ＤＮＡを二本鎖に戻し、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、室温で３０分間ライゲーション反応を行なった。９８℃で５分間置いた後、すぐに氷中に移して急冷した。そのサンプルを８Ｍ  尿素を含む１２％  ＰＡＧＥに供し、その電気泳動イメージを蛍光イメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により可視化した（図９）。切断産物である２３ｍｅｒ（Ｕの場合）、および２４ｍｅｒ（Ｉの場合）が、ＤＮＡリガーゼを加えることによって、元の長さ（４５ｍｅｒ）に戻ることが示された。
その結果、本発明の酵素（Ｅｎｄｏ  Ｑ）により、切断されたＤＮＡは、Ｔ４リガーゼを用いることで再結合することが確認された（図９）。【００５８】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１３年５月１０日付で出願された米国仮出願（６１／８２１，８６６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の酵素は、例えば、細胞中のＤＮＡが様々な外的要因、内的要因によってどのくらいの頻度で損傷を受けるかという検出キットの開発や、損傷を受けたＤＮＡだけを切断することでＰＣＲの鋳型から除去し、損傷が原因で生じるＰＣＲ時の変異率を下げる技術などに応用することが可能である。さらに本発明の酵素は、超好熱菌由来であるため、超好熱性であり、極めて熱安定性に優れているため、操作性に優れ、種々の遺伝子工学技術で使用される遺伝子工学用酵素として新たな技術開発への応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2014181875000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月10日(2015.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するために用いる酵素。
【請求項２】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するために用いる酵素。
【請求項３】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するために用いる酵素。
【請求項４】
損傷塩基がヒポキサンチンである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項５】
損傷塩基がキサンチンである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
損傷塩基がウラシルである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項７】
損傷塩基が脱塩基（アベイシック）である請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
サーモコカケアエ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科由来である請求項１から７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である請求項８に記載の酵素。
【請求項１０】
ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）由来である請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素を生成蓄積させ、培養物から該酵素を採取することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素と、Ｅｎｄｏ  Ｖとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素と、フラップエンドヌクレアーゼとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１７】
損傷塩基が、ピポキサンチン、キサンチン、ウラシルおよび脱塩基（アベイシック）からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法によって損傷塩基を除去した後、ＤＮＡリガーゼ反応によって再結合する遺伝子操作方法。
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月8日(2015.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有する酵素を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するための酵素試薬。
【請求項２】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する酵素を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するための酵素試薬。
【請求項３】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素を含み、損傷塩基を含むＤＮＡ鎖において、該損傷塩基を有するデオキシリボヌクレオチドと、前記デオキシリボヌクレオチドの５’側に隣接するデオキシリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合を切断するための酵素試薬。
【請求項４】
損傷塩基がヒポキサンチンである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素試薬。
【請求項５】
損傷塩基がキサンチンである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素試薬。
【請求項６】
損傷塩基がウラシルである請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素試薬。
【請求項７】
損傷塩基が脱塩基（アベイシック）である請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素試薬。
【請求項８】
酵素がサーモコカケアエ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科由来である請求項１から７のいずれか一項に記載の酵素試薬。
【請求項９】
酵素がピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である請求項８に記載の酵素試薬。
【請求項１０】
酵素がピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）由来である請求項９に記載の酵素試薬。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素を生成蓄積させ、培養物から該酵素を採取することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素試薬と、Ｅｎｄｏ  Ｖとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素試薬と、フラップエンドヌクレアーゼとを使用して損傷塩基を除去する方法。
【請求項１７】
損傷塩基が、ピポキサンチン、キサンチン、ウラシルおよび脱塩基（アベイシック）からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法によって損傷塩基を除去した後、ＤＮＡリガーゼ反応によって再結合する遺伝子操作方法。
【国際調査報告】
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