(57)【要約】正常細胞においては目的遺伝子発現が低く、かつ種々の臓器由来のがんにおいて特異的に目的遺伝子を発現させることのできる手段、及びそれを用いてがん細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法を提供することを課題とする。その解決手段として、（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、及び（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列を含む、がん細胞標的ベクターであって、前記プロモーターカセット（Ａ）が、制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むことを特徴とする、がん細胞標的ベクターを提供する。
2015163086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、並びに
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含む、がん細胞標的ベクターであって、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むことを特徴とする、がん細胞標的ベクター。
【請求項２】
前記エレメント配列が、
配列番号１〜４でそれぞれ表されるDNA配列、並びに
前記DNA配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ制御を外れたE2Fに特異的に反応するDNA配列
からなる群より選択される少なくとも一種のDNA配列である、請求項１に記載のがん細胞標的ベクター。
【請求項３】
同一又は異種の前記エレメント配列を制御配列内に複数個含む、請求項１又は２に記載のがん細胞標的ベクター。
【請求項４】
前記コアプロモーター配列が、がん抑制遺伝子ARFのコアプロモーター配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクター。
【請求項５】
ウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターである、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のウイルスベクターを含む、抗がん剤。
【請求項８】
がん細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクターを細胞内に導入する工程
を含む方法。
【請求項９】
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、並びに
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含むベクターであって、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むベクターの、
がん細胞特異的に目的遺伝子を発現させるための使用。
【請求項１０】
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、並びに
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含み、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含む、医薬として用いられるベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞標的ベクター、がん細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法及びがん細胞特異的に目的遺伝子を発現させるための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年世界で7600万人もの人々ががんで死亡しているとされており、がんを完治する治療法の開発が必要とされている。現在、外科的治療適応外の進行がんに対する抗がん療法として、放射線と抗がん剤とが主に用いられている。これらの抗がん療法は増殖中の細胞を優先的に傷害するため、増殖能の高いがん細胞を優先的に傷害できる。【０００３】
しかし、生体内には骨髄細胞、腸管上皮細胞及び毛根細胞などの、増殖能が高い正常細胞も存在するため、これらのがん治療法にはこれらの正常細胞も傷害し、副作用が生じるという問題が存在する。そのため、現在のがん治療法では、がん細胞すべてを死滅させるようなことは不可能であり、がんを完治できないことが多い。【０００４】
そこで、副作用を軽減した治療法を開発するために、がん細胞をより特異的に傷害する方法の開発が試みられている。その１例として、がん細胞で特異的に転写活性を発揮するプロモーターで細胞傷害性遺伝子を発現制御するというアプローチがある。がん細胞特異的プロモーターに細胞傷害性遺伝子を連結し、細胞に導入することで、細胞傷害性遺伝子ががん細胞で優先的に発現し、がん細胞を優先的に傷害できるのではないかとかと考えられた。【０００５】
がん細胞で特異的に活性を示すプロモーターとして、AFPプロモーター（非特許文献１）、CEAプロモーター（非特許文献２、３）及びPSAプロモーター（非特許文献４−７）があり、これらのプロモーターを利用すればがん細胞を特異的に傷害できると考えられた。【０００６】
しかし、AFP、CEA及びPSAは特定の臓器由来のがん細胞でのみで高発現していることから、これらのプロモーターは特定のがんでのみ高い活性を示し（AFPプロモーターは肝臓癌、CEAプロモーターは膵臓癌、大腸癌及び胃癌、PSAプロモーターは前立腺癌で、それぞれ高い活性を示す）、これらのプロモーターを用いた細胞傷害法は特定のがんにのみ有用であるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kanai F、外5名、「Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene」、1996年、Hepatology、23、pp.1359-1368
【非特許文献２】Schrewe H、外5名、「Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen - Analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression」、1990年、Molecular and Cellular Biology、10、pp.2738-2748
【非特許文献３】Tanaka T、外5名、「Adenovirus-mediated prodrug gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human gastric carcinoma cells in vitro」、1996年、Cancer Research、56、pp.1341-1345
【非特許文献４】Luke MC、外1名、「Human androgen receptor-binding to the androgen response element of prostate-specific antigen」1994年、Journal of Andrology、15、pp.41-51
【非特許文献５】Luchman HA、外4名、「Temporally controlled prostate epithelium-specific gene alterations」、2008年、Genesis、46、pp.229-234
【非特許文献６】Shi CX、外3名、「Superior tissue-specific expression from tyrosinase and prostate-specific antigen promoters/enhancers in helper-dependent compared with first-generation adenoviral vectors」、2002年、Human Gene Therapy、13、pp.211-224
【非特許文献７】Lee SJ、外5名、「Novel prostate-specific promoter derived from PSA and PSMA enhancers」、2002年、Molecular Therapy、6、pp.415-421
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、正常細胞においては目的遺伝子発現が低く、かつ種々の臓器由来のがんにおいて特異的に目的遺伝子を発現させることのできる手段、及びそれを用いてがん細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。具体的には、本発明者らは、種々のがん細胞において普遍的にみられる変異に着目し、その変異によって活性化されるプロモーターを新たに見出してこれを利用することにより上記課題を解決することを着想した。本発明者は、その着想を具体化すべく試行錯誤を重ね、がん細胞で普遍的な変異として、二大がん抑制経路の1つであるRetinoblastoma (RB)経路の異常に着目した。【００１０】
がん細胞ではRB経路の異常によりRBが恒常的に不活性状態となっているため、がん細胞で特異的にE2F活性が亢進している。そのため、E2Fの標的であるE2F1のプロモーターはがん細胞で特異的に活性化されており、がん細胞特異的傷害法に利用できるのではないかと考えられた。しかし、正常な増殖細胞においても、増殖刺激によってRBは不活性化されているため、E2F1プロモーターはE2Fによって活性化されている。したがって、E2F1プロモーターを用いたアプローチは正常な増殖細胞も傷害する可能性があるという問題点が存在することを本発明者は見出した。さらに、よりがん細胞特異的にアプローチするためには、増殖刺激によるRBの不活性化では活性化されず、RB経路の異常により特異的に活性化されるプロモーターを用いる必要があることを本発明者は見出した。【００１１】
そこで、本発明者は、RB経路の標的であるE2Fに着目し、増殖刺激によるRB経路の不活性化とがん性変化であるRBの強制的不活性化で生じるE2F活性とを比較した結果、p14ARFプロモーター（以後、ARFプロモーターと略す）、TAp73プロモーター及びp27Kip1プロモーターは正常細胞に存在する増殖刺激によって誘導されたE2F活性によっては活性化されず、がん細胞でのみ検出されるRB経路の異常によって誘導されたpRBの制御を外れたE2F（deregulated E2F）に特異的に反応し活性化されることを見出した。さらに、これらのプロモーターの制御を外れたE2Fに特異的に反応するエレメントを、制御領域を欠くコアプロモーターと組み合わせて用いることで正常な増殖細胞に対する影響を軽減し、よりがん細胞特異的にアプローチできることを見出した。【００１２】
本発明はかかる知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、及び
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含む、がん細胞標的ベクターであって、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むことを特徴とする、がん細胞標的ベクター。
項２．
前記エレメント配列が、
配列番号１〜４でそれぞれ表されるDNA配列、並びに
前記DNA配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ制御を外れたE2Fに特異的に反応するDNA配列
からなる群より選択される少なくとも一種のDNA配列である、項１に記載のがん細胞標的ベクター。
項３．
同一又は異種の前記エレメント配列を制御配列内に複数個含む、項１又は２に記載のがん細胞標的ベクター。
項４．
前記コアプロモーター配列が、がん抑制遺伝子ARFのコアプロモーター配列である、項１〜３のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクター。
項５．
ウイルスベクターである、項１〜４のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクター。
項６．
アデノウイルスベクターである、項５に記載のウイルスベクター。
項７．
項５又は６に記載のウイルスベクターを含む、抗がん剤。
項８．
がん細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、
項１〜６のいずれか一項に記載のがん細胞標的ベクターを細胞内に導入する工程
を含む方法。
項９． 
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、及び
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含むベクターであって、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むベクターの、
がん細胞特異的に目的遺伝子を発現させるための使用。
項１０． 
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、及び
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含み、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含む、医薬として用いられるベクター。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のベクターを利用することにより、種々の臓器由来のがんにおいて特異的に目的遺伝子を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト正常線維芽細胞HFF及びWI-38での各プロモーターの活性をレポーターアッセイで調べた結果を示す図である（細胞間におけるトランスフェクション効率の違いはCMV-レニラルシフェラーゼを用いて補正した）。
【図２】正常細胞としてHFFを用いて、がん細胞特異性を求めた結果を示す図である（がん細胞株は、C-33A、H1299、A549、HeLa、293A、U-2 OS、Saos-2及び5637を用いた。遺伝子導入は、リポフェクション法を用いた。細胞間におけるトランスフェクション効率の違いはCMV-レニラルシフェラーゼを用いて補正した。**は有意差検定におけるp＜0.01を示す）。
【図３】図２と同様にして、正常細胞としてWI-38を用いて、がん細胞特異性を求めた結果を示す図である。
【図４】細胞傷害性遺伝子HSV-TK をARFプロモーターもしくはE2F1プロモーターで発現制御した組換えアデノウイルスである、Ad-ARF-TKとAd-E2F1-TKの模式図である（HSV-TKはウラシルのアナログ分子であるガンシクロビル（GCV）をリン酸化する。リン酸化されたGCVは、生体内でさらにリン酸化され、DNA複製時にDNA鎖に取り込まれる。リン酸化されたGCVがDNA鎖に取り込まれると、以後DNA鎖伸長が起こらなくなり、アポトーシスが誘導される。）。
【図５】Ad-ARF-TKとAd-E2F1-TKの正常細胞HFFに対する傷害作用を調べた結果を示す図である（それぞれのウイルスをMOI 10, 25, 50で感染させた後、ガンシクロビル(GCV)濃度50 μMの10 %FCS入りDMEMにて5日間培養した。70%エタノールで固定した後、RNase (50 μg/mL)を含む propidium iodide (50 μg/mL) 1 mLで染色し、subG1期細胞の割合を定量した。）。
【図６】Ad-ARF-TKとAd-E2F1-TKのがん細胞株に対する傷害作用を調べた結果を示す図である（がん細胞株は、C-33 A、H1299、A549、HeLa、U-2 OS、Saos-2、5637を用いた。C-33 A、A549、HeLa、U-2 OS、Saos-2、5637の場合はMOI: 1, 2.5, 5で、H1299の場合はMOI: 0.25, 0.5, 1で感染させた後、ガンシクロビル(GCV)濃度50 μMの10 %FCS入りDMEMにて5日間培養した。上記と同様にsubG1期細胞の割合を定量した。）。
【図７】レポーターアッセイを用い、正常細胞HFFでのSV40コアプロモーター、E2F1プロモーター、ARFコアプロモーター、ERE73(1+2)x3-ARFコアプロモーター、ERE73(3+4)x5-ARFコアプロモーターの活性を調べた。遺伝子導入はリポフェクション法を用いた結果を示す図である（細胞間におけるトランスフェクション効率の違いはCMV-レニラルシフェラーゼを用いて補正した。）。
【図８】レポーターアッセイを用い、がん細胞株Saos-2でのSV40コアプロモーター、E2F1プロモーター、ARFコアプロモーター、ERE73(1+2)x3-ARFコアプロモーター、ERE73(3+4)x5-ARFコアプロモーターの活性を調べた結果を示す図である。
【図９】レポーターアッセイを用い、がん細胞株5637でのSV40コアプロモーター、E2F1プロモーター、ARFコアプロモーター、ERE73(1+2)x3-ARFコアプロモーター、ERE73(3+4)x5-ARFコアプロモーターの活性を調べた結果を示す図である。
【図１０】レポーターアッセイを用い、がん細胞株U-2 OSでのSV40コアプロモーター、E2F1プロモーター、ARFコアプロモーター、ERE73(1+2)x3-ARFコアプロモーター、ERE73(3+4)x5-ARFコアプロモーターの活性を調べた結果を示す図である。
【図１１】がん細胞株Saos-2で各プロモーター活性とヒト正常細胞HFFでのプロモーター活性を利用してがん細胞特異性を求めた結果を示す図である。
【図１２】がん細胞株5637で各プロモーター活性とヒト正常細胞HFFでのプロモーター活性を利用してがん細胞特異性を求めた結果を示す図である。
【図１３】がん細胞株U-2 OSで各プロモーター活性とヒト正常細胞HFFでのプロモーター活性を利用してがん細胞特異性を求めた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明のベクター
本発明のベクターは、
（Ａ）制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセット、及び
（Ｂ）その制御下にある目的遺伝子配列
を含むベクターであって、
前記プロモーターカセット（Ａ）が、
制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列を制御配列内に含むことを特徴とするベクターである。
【００１６】
本発明のベクターは、特に限定されないが、例えば、プラスミドベクターであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。
【００１７】
本発明のウイルスベクターを対象となる生物に感染させることにより、効率的に目的遺伝子をその生物に発現させることができる。
【００１８】
本発明のウイルスベクターは、ウイルスの増殖に必要な領域を欠失しており、代わりにプロモーターカセット（Ａ）及び目的遺伝子配列（Ｂ）が組み込まれている。
【００１９】
ウイルスの種類は特に限定されないが、遺伝子導入効率の高さという点で、アデノウイルスが好ましい。
【００２０】
１．１  プロモーターカセット（Ａ）
本発明で用いられるプロモーターカセット（Ａ）は、制御配列及びコアプロモーター配列を含むプロモーターカセットである。
【００２１】
１．１．１  制御配列
制御配列は、特に限定されないが、通常、コアプロモーター配列の上流に位置している。制御配列は、特に限定されないが、通常、転写開始点から上流側1 kb程度以内に存在し、転写を制御する役割を有する。
【００２２】
制御配列は、制御を外れたE2Fに特異的に反応する、少なくとも一種のエレメント配列（本明細書において、「deregulated E2F応答性エレメント」ということがある）を制御配列内に含む。このため、制御配列は、がん細胞特異的に活性化を受ける。
【００２３】
制御を外れたE2F（deregulated E2F）は、pRBの制御を外れたE2Fであり、がん細胞に特異的に存在することが知られている。
【００２４】
deregulated E2F応答性エレメントとしては、特に限定されないが、例えば、がん抑制遺伝子のプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメント、又はその改変体を使用することができる。
【００２５】
がん抑制遺伝子のプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメントとしては、特に限定されないが、例えば、p14ARF、TAp73及びp27Kip1等のがん抑制遺伝子のプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメントが挙げられる。
【００２６】
deregulated E2F応答性エレメントの具体例としては、特に限定されないが、以下に示す配列等が挙げられる。
【００２７】
EREA（配列番号１）CTGAGCCGCCCGCGCGCGCGCCTCC
ERE73-(1+2) （配列番号２）GGAGCGACGCGCGCCAAAAGGCGGCGGGAAGGA
ERE73-(3+4) （配列番号３）TGCCTTCCCGCGCGCCGGGCTAAAAAGGCGCTAACGCCCGCGGCCGCC
EREK-(1+2) （配列番号４）TTAGGCGCCGCTGCGAACCCGCCAACGCA 
上記のEREAはがん抑制遺伝子p14ARFのプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメントである。
【００２８】
上記のERE73-(1+2)及びERE73-(3+4)はがん抑制遺伝子Tap73のプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメントである。
【００２９】
上記のEREK-(1+2)はがん抑制遺伝子p27Kip1のプロモーター領域に存在するderegulated E2F応答性エレメントである。
【００３０】
deregulated E2F応答性エレメントとしては、前記DNA配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ制御を外れたE2Fに特異的に反応するDNA配列も使用することができる。
【００３１】
例えば、上記配列番号１〜４のDNA配列については、それぞれ改変することによりderegulated E2F応答性を失う塩基の位置が明らかになっているので、それらの情報を活用することにより、適宜、上記の改変DNA配列を得ることができる。以下にこれらの情報を示す。
【００３２】
表１において、小文字で示した部分に変異を導入すると反応性が失われることが判っている。また、一般的に、GC繰り返し配列部分に変異を導入すると制御を外れたE2Fに対する反応性が失われる。
【００３３】
【表１】
2015163086.tif 000003
【００３４】
制御配列は、特に限定されないが、同一又は異種の前記エレメント配列を複数含んでいてもよい。特に限定されないが、制御配列は、例えば、同一又は異種の前記エレメント配列を２〜１５個含んでいてもよい。具体的には、制御配列は、ERE73-(1+2)を３個、ERE73-(3+4)を５個、あるいはEREK-(1+2)を９個、それぞれ含んでいてもよい。
【００３５】
特に限定されないが、制御配列は、deregulated E2F応答性エレメントのほかに、本発明の効果を妨げない限りにおいて、任意の配列をさらに含んでいてもよい。
【００３６】
１．１．２  コアプロモーター
コアプロモーター配列は、上流の制御領域を欠く配列である。
【００３７】
コアプロモーター配列は、特に限定されないが、典型的には、TATAボックス、イニシエーター配列及びDPE(downstream promoter element)配列を含む。
【００３８】
コアプロモーター配列としては、活性化されていない状態（基本転写レベル）における活性が低いものが好ましい。がん細胞特異的に活性化を受ける制御配列と組み合わせた場合に、正常細胞で活性を低く、かつがん細胞で活性を高くすることができるためである。
【００３９】
コアプロモーター配列としては、特に限定されないが、例えば、がん細胞で特異的に活性化されるプロモーターのコアプロモーター配列を使用することができる。特に、制御を外れたE2Fに特異的に反応するプロモーターのコアプロモーター配列を使用してもよい。
【００４０】
コアプロモーター配列としては、具体的には、がん抑制遺伝子ARFのコアプロモーター配列を使用することができる。
【００４１】
本発明で用いられるプロモーターカセット（Ａ）は、二種のプロモーターにそれぞれ由来する制御配列及びコアプロモーター配列を互いに組み合わせたものであってもよい。
【００４２】
本発明で用いられるプロモーターカセット（Ａ）として、天然由来のプロモーターカセットをそのまま使用することもできる。天然由来のプロモーターカセットとして、特に限定されないが、具体的には、deregulated E2F応答性エレメントとして制御配列内にEREAを有する、がん抑制遺伝子ARFのプロモーター配列（配列番号５）をそのまま使用することもできる。
【００４３】
１．２  目的遺伝子配列
目的遺伝子配列は特に限定されず、本発明のベクターの使用目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
特に限定されないが、例えば、自殺遺伝子を選択することにより、正常細胞への障害を回避乃至低減しつつ、がん細胞を選択的に死滅させることができる。
【００４５】
自殺遺伝子としては、目的に応じて適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、HSV-TK遺伝子、TP53遺伝子、Bax遺伝子及びCaspase 6又はCaspase 8遺伝子等を使用することができる。
【００４６】
２．本発明の抗がん剤・治療方法
本発明の抗がん剤は、本発明のベクターを有効成分として含み、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００４７】
がんを治療するのに有効な投与量、投与回数、投与間隔及び投与経路等は、がんの特性及び重度並びに被投与体の体重等に依存して適宜設定することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例及び試験例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
１．実験方法
１．１  細胞培養
ヒト正常線維芽細胞 Human Foreskin Fibroblast (HFF)及びヒトがん細胞株C-33 A、H1299、A549、HeLa、293A、U-2 OS、Saos-2は、10%牛胎仔血清 fetal calf serum (FCS) 入りの Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)を用い、CO2濃度5％、温度37℃の条件下で培養した。ヒトがん細胞株5637は、10% FCS入りのRPMI1640を用い、CO2濃度5％、温度37℃での条件下で培養した。
１．２  プラスミド
１．２．１  レポータープラスミド
（１）pE2F1(-728)-Luc
E2F1プロモーターをもつpE2F1(-728)-Lucは、E2F1プロモーターの-728から+70の領域をSma IとHind IIIとを利用して、pGL3-Basic (Promega)にクローニングすることで作製された。
（２）pARF(-736)-Luc
ARFプロモーターをもつpARF(-736)-Lucは、 ARF プロモーターの-736 から+49の領域をSma IとHind IIIとを利用して、pGL3-Basicにクローニングすることで作製された。
（３）pARF(-13)-Luc
ARFコアプロモーターをもつpARF(-13)-Lucは、ARF プロモーターの-66 から+49の領域を含むpARF(-66)-Lucの-66 から-14の領域をPst IとBgl IIとで切断し、平滑末端にしてBgl IIリンカーを連結することで作成された。
（４）pERE73(1+2)x3-ARF(-13)-Luc
pERE73(1+2)x3-ARF(-13)-Lucは、TAp73遺伝子のE2F反応性エレメントERE73(1+2)の3コピーを、Bgl IIサイトを利用してpARF(-13)-Lucにサブクローニングすることで作製した。
（５）pERE73(3+4)x5-ARF(-13)-Luc
pERE73(3+4)x5-ARF(-13)-Lucは、TAp73遺伝子のE2F反応性エレメントERE73(3+4)の3コピーを、Bgl IIサイトを利用してpARF(-13)-Lucにサブクローニングすることで作製した。
１．２．２  組換えアデノウイルス
I．ターゲット配列をウイルスベクターに組換えるためのエントリーベクターの作製
（１）pE2F1-HSV-TK
E2F1プロモーターの制御下に細胞傷害性遺伝子として単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）を発現する発現ベクターpE2F1-HSV-TKは、HSV-TKを含むpTK5（理研リソースバンク）からPolymerase chain reaction (PCR)を利用してHSV-TKをサブクローンニングすることにより作製した。PCRのDNA polymeraseは、PrimeSTAR（登録商標） GXL (タカラバイオ) を用いた。以下のプライマーを用いた。
Fw+Hind III: 5’- AACAAGCTTCAGATCTTGGTGGCGTGAAACTCC -3’（配列番号６）
Rv+Xba I: 5’- GTCTCTAGACAATGGGGTCTCGGTGGGGTATC -3’（配列番号７）
(アニーリング温度：60.6℃、Product length：1341 bp)
PCR産物をHind IIIとXba Iとで切断後、CMVプロモーターをもつ発現ベクターpENTR-CMVにクローニングした。次に、Not IとHind IIIとによりCMVプロモーターを除去し、E2F1プロモーターの-728から+70の領域をHSV-TKの上流に挿入してエントリーベクターpE2F1-HSV-TKを作製した。
（２）pARF-HSV-TK
ARFプロモーターの制御下にHSV-TKを発現する発現ベクターpE2F1-HSV-TKは、上と同様にAsp718とHind IIIとによりARFプロモーターの-736 から+49の領域をHSV-TKの上流に挿入して作製した。
II．ターゲット配列のウイルスベクターへの組換え
エントリーベクターであるpE2F1-HSV-TK及びpARF-HSV-TK 75 ngと組換えアデノウイルスゲノムをもつpAd/PL-DEST 150 ng とをLR clonase I enzyme buffer 2 μLとLR clonase I enzyme (Invitrogen) 2 μLとに混和し 、25℃で1時間反応させ、発現カセットを組換えアデノウイルスゲノムに乗せ変えた(pAd-E2F1-HSV-TK及びpAd-ARF-HSV-TK)。反応後、protein K solution を0.5 μL加え、37℃で10分間反応させてLR clonaseを失活させ、大腸菌DH5μに形質転換し、pAd-E2F1-HSV-TK及びpAd-ARF-HSV-TKを作製した。
III．組換えアデノウイルスの作製
pAd-E2F1-HSV-TK及びpAd-ARF-HSV-TKをPacIで切断して直鎖状にした後、1 μgの直鎖状のpAd-E2F1-HSV-TK及びpAd-ARF-HSV-TKをFuGENE6 Transfection Reagent (Roche) を用いて293A細胞（6 cm dish）に遺伝子導入した。組換えアデノウイルスが細胞を溶解した頃に、培地ごと細胞を回収した。3回凍結融解し、細胞を破砕した後、遠心し上清を回収し、それをウイルスの種として利用した。
IV．組換えアデノウイルスの大量培養
293A細胞15 cm dish 1枚当たり2x108個のウイルスを懸濁した2 mLのDMEM中で、37℃、5％CO2条件下で1 時間培養することで感染させた。感染後、細胞が全て剥離するまで3〜4日間培養した後培地ごと細胞を回収し、遠心後、20 mL のhomogenization bufferに懸濁した。
V．組換えアデノウイルスの精製
3回凍結融解し、細胞を破砕した。その後、ソニケーター (TOMY) を用いて、OUTPUT 3、duty 50で細胞を破砕した。まず細胞破砕液をそのまま5分間、次に200 μLの10% sodium deoxycholate (DOC) を加えて5分間ソニケーションした。氷上で30分間インキュベート後、さらに15分間ソニケーターで細胞を破砕した。20 mLのクロロホルムを加えて1分間激しく震盪し、遠心した後、上清を回収した。以上の操作を計2回行った。P28Sローター用のチューブ (HITACHI) に1.4 g/mL 塩化セシウム9 mLの上に8 mLの1.2 g/mL 塩化セシウムを重層し、その上にウイルス懸濁液を重層した。25,000 rpm、4℃、2時間遠心し、不連続密度勾配の間に形成されたウイルスのバンドを回収した。同様の操作をもう1回行い、透析チューブにウイルスを移し、1 Lの10%グリセロールを含むPBSで4℃一晩透析を行った。透析後、ウイルスの1/10倍量のstorage buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0)-1% BSA) と等量のグリセリンを加えて均一に懸濁し、-20℃で保存した。このウイルス溶液の感染力価を、293A細胞を用いて測定し、必要量のウイルスを実験に用いた。
１．３  トランスフェクションとレポーターアッセイ
トランスフェクションには、リポフェクション法を用いた。
（１）HFF、Saos-2の場合
細胞をsplit=1:15もしくは1：10で60 mm ディッシュに撒き、その12 時間後から16 時間後の間に FuGENE6 (Roche)を用いてプラスミドを細胞に導入した。24 時間培養後培地を除去した後、PBSにて細胞を洗浄し、4 mLの10%FCS添加DMEMにて24 時間培養した。その後、PBSにて細胞を洗浄し、PBSを1 mLを添加した後、セルスクレーパーで細胞を掻き取り、回収した。遠心して上清を除去した後、100 μLのPassive Lysis Buffer (Promega) を加えて凍結融解し、細胞を溶解させた。その後遠心し、その上清10 μLを用いて、 Dual Luciferase Assay System (Promega) でluciferase活性を測定した。実験はそれぞれ2回もしくは3回行い、2回もしくは３回分の実験データから平均値及び標準偏差を求めた。
（２）C-33 A、H1299、A549、HeLa、293A、U-2 OS及び5637の場合
細胞をsplit=1:15もしくは1：10で35 mm ディッシュに撒き、その12 時間後から16 時間後の間に FuGENE6 (Roche)を用いてプラスミドを細胞に導入した。24 時間培養後、培地を除去した後、PBSにて細胞を洗浄し、2 mLの10%FCS添加DEMEMにて、 24 時間培養した。その後、上記と同様に細胞を回収し、luciferase活性を測定した。実験はそれぞれ2回もしくは3回行い、２回分もしくは3回の実験データから平均値及び標準偏差を求めた。
１．４  FACSによる細胞傷害能の解析
HFFはsplit=1:10で60 mm ディッシュに撒き、24時間後、Ad-Con、Ad-E2F1-TK、Ad-ARF-TKを感染させた。必要量のウイルスを懸濁した350 μL のDMEM もしくはRPMI-1640中で、37℃、5％CO2条件下で1 時間培養することで感染させた。それぞれのウイルスは、HFFの場合はMOI: 10、25、50で、C-33A、A549、HeLa、U-2 OS、Saos-2、5637の場合はMOI: 1、2.5、5で、H1299の場合はMOI: 0.25、0.5、1で感染させた。感染後、濃度50 μMのガンシクロビル(GCV)を含む10 %FCS入りDMEMにて培養した。5日間培養した後細胞を回収し、遠心後0.3 mLのPBSにて細胞を懸濁した後、0.7 mL の100% エタノールを加え１晩細胞を固定した。固定後、遠心により固定液を除去した後、RNase (50 μg/mL)を含む propidium iodide (50 μg/mL) 1 mLを加え、染色した。室温で3時間以上染色後、FACSCalibur (Becton Dickinson)でsubG1期DNA含量の細胞の割合を定量した。実験はそれぞれ3回行い、3回分の実験データから平均値及び標準偏差を求めた。
２．結果
２．１  ARFプロモーターはE2F1プロモーターよりがん細胞で特異的に活性を示す
ARFプロモーターはがん細胞特異的アプローチにおいて有用なプロモーターであるかを調べるために、ARFプロモーターが既にがん細胞特異的に活性を示すと報告されているE2F1プロモーターよりがん細胞特異的に活性を示すかをレポーターアッセイで調べた。ARFプロモーターがE2F1プロモーターよりがん細胞特異的に活性を示すか否かは、がん細胞株でのプロモーター活性の値を正常細胞でのプロモーター活性の値で割った値（がん細胞特異性）を指標に判定した。【００４９】
まず、ヒト正常線維芽細胞HFF及びWI-38におけるARFプロモーター及びE2F1プロモーターの活性を調べた。その結果、いずれの細胞においても、ARFプロモーターはE2F1プロモーターより非常に低いプロモーター活性を示した（図１）。このことから、ARFプロモーターはヒト正常線維芽細胞でE2F1プロモーターより低い活性を示すことが示唆された。そこで、ARFプロモーターがE2F1プロモーターよりがん細胞特異的に活性を示すかを調べるために、9種類のがん細胞株におけるARFプロモーター及びE2F1プロモーターの活性を調べ、HFF及びWI-38でのプロモーター活性を基準にがん細胞特異性を求めた（図２（HFF）、図３（WI-38）、**:p＜0.01）。その結果、E2F1プロモーターがARFプロモーターより高いがん細胞特異性を示すがん細胞株の数が1種類である一方で、ARFプロモーターがE2F1プロモーターより高いがん細胞特異性を示すがん細胞株の数が5種類であることが分かった。
このことからARFプロモーターは、E2F1プロモーターより高いがん細胞特異性を示すがん細胞株の数がより多く、ARFプロモーターはE2F1プロモーターよりがん細胞で特異的に活性を示すことが強く示唆された。従って、ARFプロモーターは、E2F1プロモーターよりがん細胞特異的アプローチに有用なプロモーターである可能性が強く示唆された。
２．２  Ad-ARF-TKはAd-E2F1-TKよりがん細胞特異的に傷害活性を示す
レポーターアッセイの結果から、ARFプロモーターはE2F1プロモーターよりがん細胞特異的アプローチに有用なプロモーターである可能性が示唆された。そこで、実際にARFプロモーターを利用したアプローチがE2F1プロモーターを利用したアプローチよりがん細胞特異的に傷害できるかどうかを調べた。その為に、細胞傷害性遺伝子としてHSV-TK（Herpes simplex virus-thymidine kinase）をARFプロモーター及びE2F1プロモーターで発現制御した組換えアデノウイルス(Ad-ARF-TK及びAd-E2F1-TK)を作製した（図４）。HSV-TKは、不活性型のガンシクロビルを活性型に代謝することで細胞傷害活性を示す。そのため、これらの組換えアデノウイルスは細胞に感染させ、ガンシクロビル存在下で培養することにより傷害作用を示す（図４）。ウイルスの細胞傷害作用は、FACS解析によりSubG1期DNA含量をもつ細胞の割合を指標に判定した。【００５０】
まず、Ad-ARF-TK及びAd-E2F1-TKの正常細胞HFFに対する細胞傷害作用を調べた。それぞれのウイルスの感染力価（multiplicity of infection: MOI）を振って感染させた結果、同じMOIではAd-ARF-TKを感染させたサンプルはAd-E2F1-TKを感染させたサンプルより低いSubG1期DNA含量の細胞の割合を示した（図５、*:0.01＜p＜0.05、**:p＜0.01）。このことから、Ad-ARF-TKはAd-E2F1-TKより正常細胞に対する傷害作用が低いことが示唆された。 次に、Ad-ARF-TK及びAd-E2F1-TKのがん細胞株に対する細胞傷害作用を調べた。がん細胞株ではどちらのプロモーターも正常細胞より強いプロモーター活性を示すため、より低いMOIで感染力価を振って感染させた。その結果、7種類のがん細胞株でAd-ARF-TKを感染させたサンプルはAd-E2F1-TKを感染させたサンプルと同程度もしくはそれ以上SubG1期DNA含量の細胞の割合を示した（図６、**:p＜0.01）。このことから、これらのがん細胞株において、Ad-ARF-TKはAd-E2F1-TKと同程度、もしくはそれ以上の細胞傷害作用があることが示唆された。以上の結果より、Ad-ARF-TKはAd-E2F1-TKよりがん細胞を特異的に傷害できる可能性が示唆された。
２．３  ARFプロモーターよりがん細胞特異性の高い人工プロモーターの開発
ARFプロモーターは、E2F1プロモーターよりがん細胞で特異的に活性があることが分かった。ただ、ARFプロモーターは正常細胞で活性化されていないが、基本転写レベルで活性があるために、ARFプロモーターを用いたアプローチでは正常細胞まである程度傷害する。先行研究より、正常細胞において、ARFコアプロモーターはARFプロモーターより低いプロモーター活性を示すことが明らかになっている。また、pRBの制御を外れたE2F活性はがん細胞株のみに存在し、その活性に反応するエレメントとしてがん抑制遺伝子TAp73のERE73(1+2)とERE73(3+4)とが同定されている。これらのことから、ARFコアプロモーターを利用することで正常細胞での活性をより低くすることができ、pRBの制御を外れたE2F反応性エレメントを利用することでがん細胞でだけ活性を高めることができ、それらを併用することでよりがん細胞で特異的に活性を示す人工プロモーターを作製できると予想された。そこで、ARFコアプロモーターにpRBの制御を外れたE2F活性のエレメントであるERE73(1+2)又はERE73(3+4)をそれぞれタンデムに連結した人工プロモーター（ERE73(1+2)x3-ARFコアプロモーター及びERE73(3+4)x5-ARFコアプロモーター）を作製した。プロモーター活性は正常細胞HFF、がん細胞株U-2 OS、Saos-2及び5637で調べた。【００５１】
正常細胞HFFで人工プロモーターの活性を調べた結果、いずれの人工プロモーターもARFコアプロモーターより高い活性を示さず、ARFコアプロモーターと同程度であることが分かった（図７）。また、がん細胞株でプロモーター活性を調べてがん細胞特異性を求めたところ、がん細胞株U-2 OS、Saos-2、5637すべてにおいて、人工プロモーターはARFコアプロモーターより高いがん細胞特異性を示すことが分かった（図８〜１３）。【００５２】
なお、がん細胞特異性を示す図１１〜１３において、各記号は以下の意味を表す。
*：0.01≦p＜0.05 人工プロモーター vs E2F1プロモーター
**： P＜0.01 人工プロモーター vs E2F1プロモーター
#：0.01≦p＜0.05 人工プロモーター vs ARFプロモーター
##： P＜0.01 人工プロモーター vs ARFプロモーター
また、がん細胞株U-2 OS、Saos-2、5637すべてにおいて、人工プロモーターはARFプロモーター及びE2F1プロモーターより高いがん細胞特異性を示すことが分かった。これらのことから、pRBの制御を外れたE2F反応性エレメントを利用することでがん細胞株でのみプロモーター活性を高めることができ、がん細胞特異性を上げるのに有用であることが分かった。
【図１】
2015163086.tif 000004
【図２】
2015163086.tif 000005
【図３】
2015163086.tif 000006
【図４】
2015163086.tif 000007
【図５】
2015163086.tif 000008
【図６】
2015163086.tif 000009
【図７】
2015163086.tif 000010
【図８】
2015163086.tif 000011
【図９】
2015163086.tif 000012
【図１０】
2015163086.tif 000013
【図１１】
2015163086.tif 000014
【図１２】
2015163086.tif 000015
【図１３】
2015163086.tif 000016
【配列表】
2015163086000001.app
【国際調査報告】
2015163086.tif 000017
2015163086.tif 000018
2015163086.tif 000019
2015163086.tif 000020
2015163086.tif 000021
2015163086.tif 000022