(57)【要約】  β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする、免疫賦活化剤が提供される。当該免疫賦活化剤はβ−グルカンの免疫活性化作用を強力に増強することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする、免疫賦活化剤。
【請求項２】
β−グルカンが、１つ以上のβ−１，３結合および／または１つ以上のβ−１，６結合で連結されたグルコースの重合体である、請求項１に記載の免疫賦活化剤。
【請求項３】
β−グルカン修飾体が、β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖で構成されるグラフト型ポリマーである、請求項１または２に記載の免疫賦活化剤。
【請求項４】
β−グルカンセグメントの比率が１〜５０％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項５】
β−グルカンが、カードラン、パキマン、ラミナラン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカンまたはパキマランである、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項６】
β−グルカンの数平均分子量が５００〜１００，０００である、請求項１〜５のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項７】
ポリ（ヒドロキシ酸）が、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリ乳酸またはポリグリコール酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項８】
β−グルカン修飾体の微粒子を有効成分とする、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の免疫賦活化剤を有効成分として含有する、医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の免疫賦活化剤および抗原を有効成分として含有する、ワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の免疫賦活化剤および癌抗原を有効成分として含有する、癌の治療および／または予防のためのワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の免疫賦活化剤または請求項９に記載の医薬を、生体に投与する、免疫賦活化方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１３年１０月９日に出願された日本出願特願２０１３−２１２１０３号に基づく優先権の主張を伴うものであり、この日本出願の全開示内容は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする免疫賦活化剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
多糖類は、生体に対して様々な作用を有していることが知られており、中でもβ−グルカン類は、生体中の免疫細胞に存在するレセプター（Ｄｅｃｔｉｎ−１など）などと結合して免疫反応を活性化することが知られている（非特許文献１参照）。これまでにβ−グルカン類の持つ免疫活性化作用を利用した免疫賦活化剤の開発研究が行われてきたものの（特許文献１参照）、β−グルカン類の免疫活性化作用は強力とはいえず、十分な効果を得るために他の免疫賦活化剤との併用が検討されてきた（特許文献２参照）。【０００４】
一方、多糖類は生体適合性の材料としても知られており、多糖類の持つ生体適合性を利用することで、ヒドロゲルや徐放製材料の基材として使用されている。また、生分解性ポリマーを多糖類に修飾することで、生体適合性を保持したまま、その物性を変換することが可能となっている（特許文献３および非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１９４９７７号公報
【特許文献２】特開２０１１−５０４４８７号公報
【特許文献３】特開２０１３−６７７０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マイコロジカル・リサーチ、２００７年１１１号、６３５−６５２ページ
【非特許文献２】ポリマー、２００３年４４号、３９２７−３９３３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、β−グルカンの免疫活性化作用を増強することによって強力な免疫賦活化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を克服するために、本発明者は、β−グルカンの免疫活性化作用を増強する手段を検討した結果、β−グルカンをポリ（ヒロドキシ酸）で修飾することによって生体内で高い免疫活性化能を有することを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）の構成を有する。
（１）β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする、免疫賦活化剤。
（２）β−グルカンが、１つ以上のβ−１，３結合および／または１つ以上のβ−１，６結合で連結されたグルコースの重合体である、（１）に記載の免疫賦活化剤。
（３）β−グルカン修飾体が、β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖で構成されるグラフト型ポリマーである、（１）または（２）に記載の免疫賦活化剤。
（４）β−グルカンセグメントの比率が１〜５０％（ｗ／ｗ）である、（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
（５）β−グルカンが、カードラン、ラミナラン、パキマン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカンまたはパキマランである、（１）〜（４）のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
（６）β−グルカンの数平均分子量が５００〜１００，０００である、（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
（７）ポリ（ヒドロキシ酸）が、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリ乳酸またはポリグリコール酸である、（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
（８）β−グルカン修飾体の微粒子を有効成分とする、（１）〜（７）のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫賦活化剤を有効成分として含有する、医薬。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫賦活化剤および抗原を有効成分として含有する、ワクチン。
（１１）（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫賦活化剤および癌抗原を有効成分として含有する、癌の治療および／または予防のためのワクチン。
（１２）（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫賦活化剤または（９）に記載の医薬を、生体に投与する、免疫賦活化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、従来よりも強力に免疫を活性化する免疫賦活化剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラミナランおよびラミナラン加水分解物（１）〜（３）のＧＰＣ測定の結果を表す。
【図２】ラミナラン修飾体（５）のＧＰＣ測定の結果を表す。
【図３】ＴＭＳ化ラミナラン（３）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図４】ラミナラン修飾体（５）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図５】カードラン加水分解物（４）〜（６）のＧＰＣ測定の結果を表す。
【図６】カードラン修飾体（９）のＧＰＣ測定の結果を表す。
【図７】ＴＭＳ化カードラン（５）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図８】カードラン修飾体（９）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図９】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験の結果を表す。
【図１０】β−グルカン修飾体を基材とした微粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験１の結果を表す。
【図１１】β−グルカン修飾体を基材とした微粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験２の結果を表す。
【図１２】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験１の結果を表す。
【図１３】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験２の結果を表す。
【図１４】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験３の結果を表す。
【図１５】パキマン修飾体（１６）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図１６】シゾフィラン修飾体（１７）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図１７】黒酵母グルカン修飾体（１８）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図１８】スクレログルカン修飾体（１９）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図１９】パキマラン修飾体（２２）の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果を表す。
【図２０】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験２の結果を表す。
【図２１】β−グルカン修飾体を基材とした微粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験３の結果を表す。
【図２２】β−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験４の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする、免疫賦活化剤に関する。
【００１３】
グルカンとはグルコース含有多糖類であり、β−グルカンはグルコースサブユニット間に１つ以上のβ−結合を含むものである。すなわち、本発明で使用されるβ−グルカンはβ−結合を含むものであり、β−結合のみを含むものであってもよい。また、本発明で使用されるβ−グルカンは分枝状であっても線状であってもよい。
【００１４】
本発明で使用される好ましいβ−グルカンとしては、１つ以上のβ−１，３結合および／または１つ以上のβ−１，６結合を含むものや、１つ以上のβ−１，２結合および／またはβ−１，４結合を含むものが挙げられるが、１つ以上のβ−１，３結合および／または１つ以上のβ−１，６結合を含むものがより好ましく、１つ以上のβ−１，３結合を含むものがさらに好ましい。１つ以上のβ−１，３結合を含むβ−グルカンの具体例としては、カードラン、パキマン、ラミナラン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカン（好ましくは、黒酵母由来β−１，３グルカンもしくはβ−１，６グルカン）またはパキマランが挙げられ、好ましくはカードラン、パキマン、ラミナラン、シゾフィラン、スクレログルカン、黒酵母グルカンまたはパキマランが挙げられる。
【００１５】
１つ以上のβ−１，３結合を含む線状のβ−グルカンとしては、主としてβ−１，３結合からなるβ―グルカン（例えば、カードランやパキマン）や、β−１，３結合とβ−１，３結合以外のβ−結合からなるβ−グルカン（例えば、ラミナランやリケナン）が挙げられる。
【００１６】
１つ以上のβ−１，３結合を含む分枝状のβ−グルカンとしては、β−１，３結合とβ−１，６結合からなるβ−グルカン（例えば、シゾフィランやレンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカン）が挙げられる。
【００１７】
また、本発明で使用されるβ―グルカンは誘導体化されていてもよい。誘導体化の例としては、カルボキシメチル基の付加反応や酸化的開裂反応が挙げられる。誘導体化されたβ−グルカンの例としては、カードランにカルボキシメチル基が付加されたカルボキシメチルカードランや、パキマンが開裂されたパキマランが挙げられる。
【００１８】
β−グルカンの数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは５００〜１００，０００であり、より好ましくは１，０００〜５０，０００であり、さらに好ましくは１，９００〜２５，０００である。数平均分子量とは、分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、β−グルカンの数平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めることができる。
【００１９】
ポリ（ヒドロキシ酸）は特に限定されないが、免疫賦活化剤の構成成分であるという観点から生体投与時に著しく有害な影響を与えない生体適合性ポリマーであることが好ましい。ここで言う生体適合性とはラットに該ポリマーを経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを指す。また、複数種類のヒドロキシ酸の共重合体であってもよいが、好ましくは２種類以下のヒドロキシ酸の重合体である。
【００２０】
ポリ（ヒドロキシ酸）の好ましい具体例としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（２−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプロン酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプリン酸）、ポリ（リンゴ酸）またはこれらの高分子化合物の誘導体ならびに共重合体が挙げられるが、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリ乳酸またはポリグリコール酸がより好ましく、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体がさらに好ましい。ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体である場合のポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル）は、本発明の目的が達成される限りにおいて特に限定されないが、１００／０〜３０／７０のものが好ましく、６０／４０〜４０／６０のものがより好ましい。
【００２１】
ポリ（ヒドロキシ酸）の数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは５００〜１，０００，０００であり、より好ましくは１０，０００〜１００，０００であり、さらに好ましくは１４，７００〜６８，３００である。ポリ（ヒドロキシ酸）の数平均分子量は、β−グルカン修飾体の数平均分子量とβ−グルカンの数平均分子量の差より求められる。
【００２２】
β−グルカン修飾体の構造は特に限定されず、具体例としては、β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）がつながった直鎖状のブロック型ポリマー、β−グルカンまたはポリ（ヒドロキシ酸）が複数個存在する分岐を持った分岐ポリマー、β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマー、ポリ（ヒドロキシ酸）の主鎖およびβ−グルカンの側鎖からなるグラフト型ポリマーが挙げられるが、好ましくは、β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマーである。
【００２３】
β−グルカン修飾体は、長期に渡って免疫賦活化作用を持続させるため、生体内ですぐに排泄されないよう全体として水不溶性であることが好ましい。ここでいう水不溶性とは、水への溶解度が１ｇ（β−グルカン修飾体）／１００ｍｌ（水）以下であることをいう。
【００２４】
β−グルカン修飾体の数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは１，０００〜１，０００，０００であり、より好ましくは１０，０００〜１００，０００であり、さらに好ましくは１３，８００〜８４，０００である。β−グルカン修飾体の数平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）より求められる。
【００２５】
β−グルカン修飾体におけるβ−グルカンセグメントの比率（β−グルカンセグメント／β−グルカン修飾体）は特に限定されないが、好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）であり、より好ましく５〜４５％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは８．３〜４２．５％（ｗ／ｗ）ある。β−グルカン修飾体におけるβ−グルカンセグメントの比率はβ−グルカンの数平均分子量とβ−グルカン修飾体の数平均分子量の比を用いて求められる。
【００２６】
β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマーの場合、各グラフト鎖の数平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは１,０００〜１０,０００であり、より好ましくは１，３００〜６，４００である。各グラフト鎖の数平均分子量は核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定によって末端残基のピーク積分値と末端残基以外のピーク積分値の比から求められる。
【００２７】
β−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマーの場合、グラフト鎖の数は、特に限定されないが、好ましくは３から１５である。グラフト鎖数は、β−グルカン修飾体の数平均分子量からβ−グルカンの数平均分子量を引いた値を、各グラフト鎖の数平均分子量で割ることで求められる。
【００２８】
β−グルカン修飾体は既知の方法で製造すれば良く、具体的には、β−グルカンにポリ（ヒドロキシ酸）を加えて縮合反応を行い製造する方法、β−グルカンにヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い製造する方法が例として挙げられる。
【００２９】
特に、β−グルカン修飾体がβ−グルカンの主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマーである場合、以下の（１）、（２）または（３）のようにして製造することができる。
（１）すず触媒存在下、β−グルカンにヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することでグラフト型ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，ｐ．１０３２−１０３９（１９９８年）］
（２）水酸基の大部分が置換基で保護されたβ−グルカンの一部未保護の水酸基を塩基で活性化後、ヒドロキシ酸活性化モノマーを加えてポリ（ヒドロキシ酸）からなるグラフト鎖を導入し、最後に保護基を取り除くことにより、グラフト型ポリマーを製造する方法［Ｐｏｌｙｍｅｒ，４４，ｐ．３９２７−３９３３，（２００３年）］
（３）β−グルカンに対して、ポリ（ヒドロキシ酸）の共重合体を脱水剤および／または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより、グラフト型ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３３，ｐ．３６８０−３６８５（２０００年）］。
【００３０】
β−グルカン修飾体を免疫賦活化剤として使用する場合の形態は、ファイバー、フィルム、微粒子などが挙げられるが、免疫賦活化剤を生体内に投与する場合、投与の容易性から微粒子が好ましい。
【００３１】
β−グルカン修飾体微粒子を製造する方法は特に限定されず、液中乾燥法、噴霧乾燥法、粉砕法などが挙げられるが、液中乾燥法によって好ましく製造される。
【００３２】
液中乾燥法によって微粒子を製造する方法としては、Ｏ／Ｗエマルジョン法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法などが挙げられる。
【００３３】
Ｏ／Ｗエマルジョン法により微粒子を製造する場合の例を挙げると、β−グルカン修飾体を溶解した水非混和性有機溶媒と表面改質剤水溶液を混合し、Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、およびＯ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して微粒子を得る工程によって製造することができる。
【００３４】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法により微粒子を製造する場合の例を挙げると、水系溶媒とβ−グルカン修飾体を溶解した水非混和性有機溶媒を混合しＷ／Ｏエマルジョン溶液を調製する工程、Ｗ／Ｏエマルジョン溶液と表面改質剤水溶液を混合しＷ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、およびＷ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して微粒子を得る工程によって製造することができる。
【００３５】
Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法により微粒子を製造する場合の例を挙げると、水系溶媒とβ−グルカン修飾体を溶解した水非混和性有機溶媒を混合しＷ／Ｏエマルジョン溶液を調製する工程、Ｗ／Ｏエマルジョン溶液から溶媒を除去し固形分を得る工程、固形分を水非混和性有機溶媒に分散させＳ／Ｏサスペンジョン溶液を得る工程、Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液と表面改質剤水溶液を混合しＳ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、およびＳ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して微粒子を得る工程によって製造することができる。
【００３６】
微粒子調製に使用する表面改質剤は水溶性ポリマーまたは界面活性剤であることが好ましい。ここでいう水溶性ポリマーとは、水への溶解度が１ｇ（親水性ポリマー）／１００ｍｌ（水）以上の高分子化合物である。
【００３７】
表面改質剤となる水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類多糖類が挙げられるが、ポリビニルアルコールがより好ましい。
【００３８】
表面改質剤となる界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩またはレシチンが挙げられるが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールがより好ましい。
【００３９】
微粒子調製に使用する水非混和性有機溶媒は、β−グルカン修飾体が可溶で且つ、β−グルカンが難溶または不溶であることが好ましい。水非混和性有機溶媒の水への溶解度は、好ましくは３０ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下である。水非混和性有機溶媒の具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロホルムが挙げられる。
【００４０】
微粒子調製に使用する水系溶媒は、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液である。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられる。
【００４１】
β−グルカン修飾体微粒子の微粒子表面には、前記製造過程で使用される表面改質剤が結合していてもよい。ここでいう結合とは非共有結合であっても共有結合であっても良い。非共有結合は、好ましくは疎水的な相互作用であるが、静電相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールスカでも良く、それらが複合した結合でもよい。
【００４２】
前記微粒子の平均粒径は０．０１〜１０μｍであることが好ましく、０．１〜１μｍであることがさらに好ましい。ここでいう平均粒径は、動的光散乱装置（ＤＬＳ：例えば、大塚電子株式会社、ＥＬＳ−Ｚ）を用いて、光散乱強度分布及び拡散係数を測定し、キュムラント法によって解析することによって算出した。
【００４３】
免疫賦活化剤とは、生体内で免疫応答を活性化させる薬剤であり、本発明の免疫賦活化剤はβ−グルカン修飾体を有効成分とすることを特徴としている。免疫賦活化剤が活性化させる免疫応答の種類は限定されず、生じさせる免疫応答の種類としてはＴｈ１型免疫応答やＴｈ２型免疫応答があり、抗原や投与部位、投与方法の種類によってどちらかの免疫応答に優位に生じることが知られるが、本発明の免疫賦活化剤はＴｈ１型、Ｔｈ２型両方のタイプの免疫応答を生じさせうる。
【００４４】
本発明の免疫賦活化剤は、単独または他の薬剤と併用して医薬として使用することができる。本発明の免疫賦活化剤と他の薬剤を併用する場合、これらを配合して製剤化してもよく、別々に投与することを目的にそれぞれ独立して製剤化してもよい。
【００４５】
本発明の免疫賦活化剤と併用する薬剤は特に制限はないが、抗原が好ましく用いられる。ここでいう抗原とは、生体内で免疫を惹起する物質であって、疾患の治療および／または予防を目的としたワクチンとして利用されるものである。本発明の免疫賦活化剤と抗原を併用することによって、抗原によって惹起される免疫応答を強化することができる。
【００４６】
抗原の例としては、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、脂質、炭水化物、核酸、多糖類およびこれらを含むウイルス、菌体、アレルギー原因物質、組織、細胞、などが挙げられる。具体的には、花粉由来抗原、Ａ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｂ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｃ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｄ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｅ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｆ型肝炎ウイルス由来抗原、ＨＩＶウイルス由来抗原、インフルエンザウイルス由来抗原、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）由来抗原、炭疽菌由来抗原、クラジミア由来抗原、肺炎球菌由来抗原、日本脳炎ウイルス由来抗原、麻疹ウイルス由来抗原、風疹ウイルス由来抗原、破傷風菌由来抗原、水痘ウイルス由来抗原、ＳＡＲＳウイルス由来抗原、ＥＢウイルス由来抗原、パピローマウイルス由来抗原、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）菌由来抗原、狂犬病ウイルス由来抗原、ウエストナイルウイルス由来抗原、ハンタウイルス由来抗原、連鎖球菌由来抗原、ブドウ球菌由来抗原、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌由来抗原、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来抗原、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）由来抗原、ポリオウイルス由来抗原、各種人畜共通感染症由来抗原、各種食物アレルギー由来抗原、自己抗原などが挙げられる。
【００４７】
その他、抗原の好ましい例として癌抗原が挙げられる。癌抗原とは、癌細胞に特異的に発現するタンパク質に由来する物質であって、生体外から生体内に投与されることで免疫応答によって癌の治療および／または予防の効果を奏する抗原である。本発明の免疫賦活化剤と癌抗原をともに使用することで、癌の治療および／または予防のためのワクチンとして使用することができる。
【００４８】
本発明の免疫賦活化剤がβ−グルカン修飾体微粒子である場合は、抗原は該微粒子に封入されることが好ましい。β−グルカン修飾体微粒子に抗原を封入させる方法としては、水系溶媒として抗原水溶液を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルジョン法またはＳ／Ｏ／Ｗエマルジョン法によりβ−グルカン修飾体微粒子を製造する方法が挙げられる。
【００４９】
抗原がβ−グルカン修飾体微粒子に封入される場合、その封入率（抗原／β−グルカン修飾体）は好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｗ）である。封入率の定量方法としては、β−グルカン修飾体微粒子より有機溶媒を用いて抗原を抽出し、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーにより定量する方法が挙げられる。
【００５０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の免疫賦活化剤または医薬を、生体（被験体）に投与する、免疫賦活化方法が提供される。本発明の免疫賦活化剤または医薬を用いて免疫反応を活性化（賦活化）させる方法については限定されず、免疫賦活化剤または医薬を生体に投与しても良いし、生体外に摘出した免疫担当細胞に接触させても良い。生体への投与方法に特に限定はないが、例を挙げると、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経肺投与、経口投与、経皮投与、舌下投与、腟内投与、腹腔内投与、リンパ節投与などであり、好ましくは皮内投与または皮下投与である。投与する生体はヒトであってもヒト以外の動物であってもよいが、好ましくはヒトあるいは家畜、愛玩動物または実験動物として飼育されているブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、イヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、サル、ラット、マウスまたはモルモットである。
【００５１】
本発明の免疫賦活化剤を医薬（ワクチンを含む）として用いる場合、製剤学的に有用な各種添加剤を配合して製剤化しても良く、添加剤の具体例としては、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖が挙げられる。
【００５２】
本発明の免疫賦活化剤を医薬として用いる場合のβ−グルカン修飾体の投与量については、投与方法、投与回数によって適宜設定されるが、例えばヒトに対して本発明の免疫賦活化剤を皮下投与する場合、β−グルカン修飾体の量として１回あたり０．０１〜１，０００ｍｇが投与される。
【００５３】
本発明の免疫賦活化剤を抗原と併用する場合の抗原等他の薬剤の投与量については、０．００１〜１００ｍｇが好ましい。
【００５４】
本発明の好ましい態様によれば、β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする免疫賦活化剤であって、該β−グルカンが、カードラン、パキマン、ラミナラン、シゾフィラン、スクレログルカン、黒酵母グルカンまたはパキマランであり、該ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体である、免疫賦活化剤が提供される。
【００５５】
本発明の別の好ましい態様によれば、β−グルカンとポリ（ヒドロキシ酸）が共有結合したβ−グルカン修飾体を有効成分とする免疫賦活化剤および癌抗原を有効成分として含有するワクチンであって、該β−グルカンが、カードラン、パキマン、ラミナラン、シゾフィラン、スクレログルカン、黒酵母グルカンまたはパキマランであり、該ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体であるワクチンが提供される。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。【００５７】
実施例１  ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体が修飾されたラミナラン（ラミナラン修飾体（１）〜（８））の合成
（１）ラミナランの加水分解反応（ラミナラン加水分解物（１）〜（３）の合成）
ラミナラン（数平均分子量２５，０００、東京化成工業株式会社）１０ｇをジメチルスルホキシド１２０ｍｌに溶解した後、０．５規定塩酸水溶液１５ｍｌを加え、１０５℃で０．５時間攪拌した。該反応溶液を透析膜に移し、水中で透析を行った後に、凍結乾燥を行い、ラミナラン加水分解物（１）（数平均分子量１２，７００）を粉末として得た。同様の条件で、１．５時間反応させることでラミナラン加水分解物（２）（数平均分子量６，７００）を、２時間反応させることでラミナラン加水分解物（３）（数平均分子量４，１００）を合成した。【００５８】
ラミナランおよびラミナラン加水分解物の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソー  −ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ−ＣＰ×２、酢酸緩衝液系溶媒（１０ｍＭ、ｐＨ＝５）、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図１：ラミナランおよびラミナラン加水分解物（１）〜（３））。【００５９】
（２）ラミナランのトリメチルシリル（ＴＭＳ）化反応（ＴＭＳ化ラミナラン（１）〜（４）の合成）
ラミナラン（数平均分子量２５，０００、東京化成工業株式会社）２．４ｇにホルムアミド４８ｍｌに加え、８０℃に加熱した。この溶液に１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン４８ｍｌを２０分掛けて滴下し、８０℃で２．５時間攪拌した。該反応溶液を分液漏斗に移し、二層に分離するまで静置した。上層を回収し、減圧下濃縮した後、メタノール  １４４ｍｌを加え、得られた固体をろ過、乾燥し、ＴＭＳ化ラミナラン（１）３．１４ｇを白色固体として得た。同様の方法で、ラミナラン加水分解物（１）からＴＭＳ化ラミナラン（２）を、ラミナラン加水分解物（２）からＴＭＳ化ラミナラン（３）を、ラミナラン加水分解物（３）からＴＭＳ化ラミナラン（４）を合成した。【００６０】
ＴＭＳ化反応進行は、１Ｈ−ＮＭＲ測定（図３：ＴＭＳ化ラミナラン（３））により確認した。【００６１】
（３）ラミナランに対するポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の修飾反応（ラミナラン修飾体（１）〜（８）の合成）
ＴＭＳ化ラミナラン（１）０．５ｇとｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（ｔＢｕＯＫ）２６ｍｇを加熱減圧下２時間乾燥後、テトラヒドロフラン１０ｍｌを加え、１．５時間室温で攪拌し、活性化溶液を得た。活性化溶液の調製に使用したｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマー（（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドのモル比１：１の混合物）をテトラヒドロフランに溶解し、モノマー溶液を得た。該活性化溶液に、該モノマー溶液を滴下し、３０分間攪拌後、酢酸０．５ｍｌ加えて反応を停止させた。反応終了後の溶液を減圧下濃縮し、クロロホルム（良溶媒）−メタノール（貧溶媒）系およびクロロホルム（良溶媒）−シクロヘキサン（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、白色固体を得た。得られた白色固体をクロロホルム５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸０．５ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した。該反応溶液を減圧下濃縮し、クロロフホルム（良溶媒）−ジエチルエーテル（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、ラミナラン修飾体（１）を白色固体として得た。【００６２】
同様の方法で、ＴＭＳ化ラミナラン（１）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（２）を、ＴＭＳ化ラミナラン（２）にｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（３）を、ＴＭＳ化ラミナラン（２）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（４）を、ＴＭＳ化ラミナラン（３）にｔＢｕＯＫの３０倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（５）を、ＴＭＳ化ラミナラン（３）にｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（６）を、ＴＭＳ化ラミナラン（３）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（７）を、ＴＭＳ化ラミナラン（４）にｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマーを反応せることでラミナラン修飾体（８）を合成した。【００６３】
ラミナラン修飾体（１）〜（８）の評価結果を表１に示す。ラミナラン修飾体の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−  ＴＳＫ−ｇｅｌ  α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図２：ラミナラン修飾体（５））。ラミナラン修飾体に含まれるラミナランセグメントの比率（ｗ／ｗ）は、合成に使用したラミナランの数平均分子量とラミナラン修飾体の数平均分子量より決定した。各グラフト鎖の数平均分子量は、１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した（図４：ラミナラン修飾体（５））。グラフト鎖数の平均は、ラミナラン修飾体の数平均分子量からラミナランの数平均分子量を引いた値を、各グラフト鎖の数平均分子量で割ることで決定した。【００６４】
【表１】
2015053354.tif 000002
【００６５】
実施例２  ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体が修飾されたカードラン（カードラン修飾体（９）〜（１４））の合成
（１）カードランの加水分解反応（カードラン加水分解物（４）〜（６）の合成）
カードラン（数平均分子量：約９０，０００、和光純薬工業株式会社）１２．８ｇをジメチルスルホキシド３８４ｍｌに溶解した後、１規定塩酸水溶液１９．２ｍｌを加え、１１０℃で０．７５時間攪拌した。該反応溶液を透析膜に移し、水中で透析を行った後に、凍結乾燥を行い、カードラン加水分解物（４）（数平均分子量２，８００）を粉末として得た。同様の条件で、０．８時間反応させることでカードラン加水分解物（５）（数平均分子量２，３００）を、０．８５時間反応させることでカードラン加水分解物（６）（数平均分子量１，９００）を合成した。【００６６】
カードランの数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ−ＣＰ×２、酢酸緩衝液系溶媒（１０ｍＭ、ｐＨ＝５）、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図５：カードラン加水分解物（４）〜（６））。【００６７】
（２）カードランのトリメチルシリル（ＴＭＳ）化反応（ＴＭＳ化カードラン（５）〜（７）の合成）
カードラン加水分解物（４）１ｇをホルムアミド２０ｍｌに加え、８０℃に加熱した。この溶液に１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン２０ｍｌを２０分掛けて滴下し、８０℃で２．５時間攪拌した。該反応溶液を分液漏斗に移し、二層に分離するまで静置した。上層を回収し、減圧下濃縮した後、メタノール６０ｍｌを加え、得られた固体をろ過、乾燥し、ＴＭＳ化カードラン（５）１ｇを白色固体として得た。同様な方法で、カードラン加水分解物（５）からＴＭＳ化カードラン（６）を、カードラン加水分解物（６）からＴＭＳ化カードラン（７）を合成した。【００６８】
ＴＭＳ化反応進行は１Ｈ−ＮＭＲ測定により確認した（図７：ＴＭＳ化カードラン（５））。
（３）カードランに対するポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の修飾反応（カードラン修飾体（９）〜（１４）の合成）
ＴＭＳ化カードラン（５）０．２ｇとｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（ｔＢｕＯＫ）１４ｍｇを加熱減圧下２時間乾燥後、テトラヒドロフラン５ｍｌを加え、１．５時間室温で攪拌し、活性化溶液を得た。活性化溶液の調製に使用したｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマー（（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドのモル比１：１の混合物）をテトラヒドロフランに溶解し、モノマー溶液を得た。該活性化溶液に、該モノマー溶液を滴下し、３０分間攪拌後、酢酸０．２ｍｌ加えて反応を停止させた。反応終了後の溶液を減圧下濃縮し、クロロホルム（良溶媒）−メタノール（貧溶媒）系およびクロロホルム（良溶媒）−シクロヘキサン（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、白色固体を得た。得られた白色固体をクロロホルム５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸０．４ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した。該反応溶液を減圧下濃縮し、クロロフホルム（良溶媒）−ジエチルエーテル（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、カードラン修飾体（９）を白色固体として得た。【００６９】
同様の方法で、ＴＭＳ化カードラン（５）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでカードラン修飾体（１０）を、ＴＭＳ化カードラン（６）にｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマーを反応せることでカードラン修飾体（１１）を、ＴＭＳ化カードラン（６）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでカードラン修飾体（１２）を、ＴＭＳ化カードラン（７）にｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマーを反応せることでカードラン修飾体（１３）を、ＴＭＳ化カードラン（７）にｔＢｕＯＫの５０倍モルのモノマーを反応せることでラカードラン修飾体（１４）を合成した。【００７０】
カードラン修飾体（９）〜（１４）の評価結果を表２に示す。カードラン修飾体の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−  ＴＳＫ−ｇｅｌ  α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図６：カードラン修飾体（９））。カードラン修飾体に含まれるカードランセグメントの比率（ｗ／ｗ）は、合成に使用したカードランの数平均分子量とカードラン修飾体の数平均分子量より決定した。各グラフト鎖の数平均分子量は、１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した（図８：カードラン修飾体（９））。グラフト鎖数の平均は、カードラン修飾体の数平均分子量からカードランの数平均分子量を引いた値を、各グラフト鎖の数平均分子量で割ることで決定した。【００７１】
【表２】
2015053354.tif 000003
【００７２】
比較例１  ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体が修飾されたデキストラン（デキストラン修飾体（１５））の合成
デキストラン（数平均分子量４，１００、ＳＥＲＶＡ社）５ｇを用い、上記の実施例１および実施例２と同様の方法で、ＴＭＳ化デキストラン（８）５．２ｇを白色固体として得た。次いで、ＴＭＳ化デキストラン（８）０．５ｇに、上記の実施例１および実施例２と同様の方法で、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（ｔＢｕＯＫ）とｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマー（（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドのモル比１：１の混合物）を反応させることで、デキストラン修飾体（１５）０．９ｇを白色固体として得た。【００７３】
デキストラン修飾体（１５）の評価結果を表３に示す。各値については、上記の実施例１および実施例２と同様の方法で算出した。【００７４】
【表３】
2015053354.tif 000004
【００７５】
実施例３  Ｏ／Ｗエマルジョン法を用いた微粒子（カードラン微粒子（１）〜（５）、ラミナラン微粒子（６）、（７）、ＰＬＧＡ比較微粒子（８）、デキストラン比較微粒子（９））の調製
表４に記すカードラン修飾体（９）〜（１３）１０ｍｇを酢酸エチル１ｍｌに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液４ｍｌに滴下し、ミキサー（ポリトロン社、ＰＴ２１００Ｓ）を用いた１１，０００ｒｐｍ、１分間の撹拌によりＯ／Ｗエマルジョン溶液を調製した。該Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から液中乾燥により酢酸エチルを除去して、微粒子懸濁液とした。該懸濁液を１５ｍｌチューブに移し、８，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により微粒子を沈殿させた。上清を除いた後に、微粒子を１０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、上記条件での遠心により微粒子を再度沈殿させた。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除いた後に微粒子を５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液１．８ｍｌに懸濁させた。該懸濁液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、カードラン微粒子（１）〜（５）を得た。【００７６】
同様の方法で、ラミナラン修飾体（３）、（８）をそれぞれ基材としたラミナラン微粒子（６）、（７）を得た。【００７７】
また比較例として、同様な方法で、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ、数平均分子量５，０００、和光純薬工業株式会社）を基材としたＰＬＧＡ比較微粒子（８）、およびデキストラン修飾体（１５）を基材とした、デキストラン比較微粒子（９）を得た。【００７８】
微粒子の平均粒径は、動的光散乱装置（大塚電子株式会社、ＥＬＳ−Ｚ）を用いて、光散乱強度分布及び拡散係数を測定し、キュムラント法によって解析することによって算出した。結果を表４に示す。【００７９】
【表４】
2015053354.tif 000005
【００８０】
実施例４  Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法を用いた微粒子（ＯＶＡ含有カードラン微粒子（１０）、カードラン微粒子（１１）、ＯＶＡ含有ラミナラン微粒子（１２）〜（１４）、ＯＶＡ含有デキストラン比較微粒子（１５））の調製
カードラン修飾体（１３）１００ｍｇを炭酸ジメチル１．８ｍｌおよびｔｅｒｔ−ブタノール２００μｌに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＶＡ（卵白アルブミン、シグマ社））水溶液１ｍｌを滴下し、ミキサー（ポリトロン社、ＰＴ２１００Ｓ）を用いた１１，０００ｒｐｍ、１分間の撹拌によりＷ／Ｏエマルジョン溶液を製造した。該Ｗ／Ｏエマルジョン溶液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａに１２時間凍結乾燥した。得られた固形分を酢酸エチル１０ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液４０ｍｌに滴下し、ミキサー（シルバーソン社、Ｌ５Ｍ−Ａ）を用いた６，０００ｒｐｍ、５分間の撹拌によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液から液中乾燥により酢酸エチルを除去して、微粒子懸濁液とした。該懸濁液を５０ｍｌチューブに移し、８，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により微粒子を沈殿させた。上清を除いた後に、微粒子を５０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、上記条件での遠心により微粒子を再度沈殿させた。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除いた後に微粒子を５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液８ｍｌに懸濁させた。該懸濁液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、ＯＶＡ含有カードラン微粒子（１０）を得た。【００８１】
同様の方法で、ＯＶＡ水溶液の代わりに蒸留水を用いることでＯＶＡを含まないカードラン微粒子（１１）を得た。同様な方法で、ラミナラン修飾体（１）、（３）、（５）を用いることでＯＶＡ含有ラミナラン微粒子（１２）〜（１４）を得た。【００８２】
比較例として、同様な方法で、デキストラン修飾体（１５）を基材として用いることでＯＶＡ含有デキストラン比較微粒子（１５）を得た。【００８３】
微粒子の評価結果を表５に示す。微粒子の平均粒径は、動的光散乱装置（大塚電子株式会社、ＥＬＳ−Ｚ）を用いてキュムラント法により算出した。抗原の封入率（ｗ／ｗ）は、微粒子より有機溶媒を用いて抗原を抽出し、抽出した抗原をゲル電気泳動装置（ＴＥＦＣＯ社）でゲル電気泳動後に、コロイドＣＢＢ染色キット（ＴＥＦＣＯ社）を用いて染色を行うことにより決定した。【００８４】
【表５】
2015053354.tif 000006
【００８５】
参考例１  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の誘導
オスＣ５７ＢＬ／６マウス８週齢を炭酸ガスで安楽死させた後に、大腿骨を採りだした。大腿骨の両端をハサミで切断し、大腿骨の内部に注射器を用いて１０％ＦＢＳ（シグマ社）、１００単位／ｍｌペニシリン（ライフテクノロジー社）、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（ライフテクノロジー社）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地（以下、ＲＰＭＩ培地）を注入し、骨髄溶液を回収した。該骨髄溶液は１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去した。回収した細胞は、溶血用バッファー（１．６６％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム水溶液）１ｍｌに懸濁させた後に、４℃で４分間静置することで溶血させた。溶血後の細胞懸濁液に、ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを加え、１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去した。細胞は１０％ＦＢＳ（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ、１００単位／ｍｌペニシリン（ライフテクノロジー社）、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（ライフテクノロジー社）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地（以下、培養培地）に懸濁させた後に、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ，Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に播種した。播種したプレートは５％ＣＯ２、３７℃、湿度１００％の条件に設定したＣＯ２インキュベーター（ＮＡＰＣＯ社）内で３時間培養し、マイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞のみを回収した。回収した細胞は培養培地に再懸濁させた後に、６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養２日目および４日目に培養培地の交換を行い、培養５日目にマイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞、すなわち誘導された樹状細胞のみを回収した。【００８６】
実施例５  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いたβ−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験
＜方法＞
実施例２で得られたβ−グルカン修飾体（カードラン修飾体（９）〜（１２））１０ｍｇを秤量し、アセトニトリル１０ｍｌに溶解しポリマー溶液を得た。該ポリマー溶液１００μｌ（ポリマー１００μｇ分）を６ウェルプレートに滴下し、乾燥させることでポリマーコートプレートを得た。該ポリマーコートプレーに参考例１で得られた樹状細胞を培養培地とともに１ウェルあたり１×１０６個となるよう播種した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した後に、マイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞のみを回収した。回収した細胞は、１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去し、ＲＰＭＩ培地１００μｌに懸濁させた。該細胞懸濁液に、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体およびＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体を添加し、４℃で１５分間静置することで抗体標識反応を行った。抗体標識反応終了後、フローサイトメトリーにより活性化マーカー（ＣＤ８６）の発現量を蛍光強度（ＭＦＩ）により評価した。【００８７】
比較例としては、比較例１で得られたデキストラン修飾体（１５）、実施例１で得られたＴＭＳ化カードラン（１）またはポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ、和光純薬株式会社、ＰＬＧＡ−５０２０）を同様にコートしたプレートを用いて、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。また別の比較例として、実施例１で得られたカードラン加水分解物（１）１００μｇまたは免疫活性化能が知られているｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）１００μｇを培養培地に添加して、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。【００８８】
＜結果＞
ＣＤ８６の発現量の指標である蛍光強度（ＭＦＩ）を図９に示す。ＣＤ８６は樹状細胞の活性化マーカーの１つである。カードラン修飾体（９）〜（１２）を用いた場合は、デキストラン修飾体（１５）およびポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体を用いた場合と比較して、ＣＤ８６の発現量が高いことより、β−グルカン修飾体は強い樹状細胞が活性化能を有することが明らかとなった。また、カードラン加水分解物（１）およびＴＭＳ化カードラン（１）を用いた場合は、β−グルカン修飾体を用いた場合と比較してＣＤ８６の発現量が低いことより、樹状細胞の活性化にはβ−グルカンへのポリ（ヒドロキシ酸）の修飾が重要であることが明らかとなった。【００８９】
実施例６  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いたβ−グルカン修飾体を基材とした微粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験１
＜方法＞
参考例１で得られた樹状細胞を培養培地とともに１ウェルあたり１×１０６個となるよう６ウェルプレートに播種し、さらに実施例３で調製した微粒子（カードラン微粒子（１）〜（５）、ＰＬＧＡ比較微粒子（８）、デキストラン比較微粒子（９））０．２ｍｇを添加した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養し、マイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞のみを回収した。回収した細胞は、１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去し、ＲＰＭＩ培地１００μｌに懸濁させた。該細胞懸濁液に、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体およびＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体を添加し、４℃で１５分間静置することで抗体標識反応を行った。抗体標識反応終了後、フローサイトメトリーにより活性化マーカー（ＣＤ８６）の発現量を蛍光強度（ＭＦＩ）により評価した。【００９０】
比較例として、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）１００μｇを培養培地に添加して、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。【００９１】
＜結果＞
各微粒子におけるＣＤ８６の発現量の指標である蛍光強度（ＭＦＩ）を図１０に示す。微粒子（カードラン微粒子（１）〜（５）、ＰＬＧＡ比較微粒子（８）、デキストラン比較微粒子（８））を用いた場合は、未添加の場合と比べて、ＣＤ８６の発現量が高いことより、微粒子が樹状細胞活性化能を有することが明らかとなった。さらにカードラン修飾体を基材とした微粒子（カードラン微粒子（１）〜（５））を用いた場合は、デキストラン修飾体を基材とした微粒子（デキストラン比較微粒子（９））やＰＬＧＡを基材とした微粒子（ＰＬＧＡ比較微粒子（８））を用いた場合と比較して、より強力な樹状細胞活性能を有することが明らかとなった。β−グルカン修飾体を基材とした微粒子は強い免疫活性化能を有することが確認された。【００９２】
実施例７  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いたβ−グルカン修飾体を基材とした微粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験２
＜方法＞
実施例６と同様の方法で、参考例１で得られた樹状細胞を播種したプレートに、実施例３で調製した微粒子（ラミナラン微粒子（６）、（７）、ＰＬＧＡ比較微粒子（８）、デキストラン比較微粒子（９））０．２ｍｇを添加し、活性化マーカー（ＣＤ８６）の発現量を蛍光強度（ＭＦＩ）により評価した。【００９３】
比較例として、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）１００μｇを培養培地に添加して、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。【００９４】
＜結果＞
各微粒子におけるＣＤ８６の発現量の指標である蛍光強度（ＭＦＩ）を図１１に示す。ラミナラン修飾体を基材とした微粒子（ラミナラン微粒子（６）、（７））を用いた場合は、デキストラン修飾体を基材とした微粒子（デキストラン比較微粒子（９））やＰＬＧＡを基材とした微粒子（ＰＬＧＡ比較微粒子（８））を用いた場合と比較して、より強い樹状細胞活性能を有することが明らかとなった。つまりラミナラン修飾体を基材とした微粒子は、実施例６のカードラン修飾体を基材とした微粒子と同様に強い樹状細胞活性化能を有することとが明らかとなった。【００９５】
実施例８  マウスを用いたβ−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験１（ＩＦＮ−γ産生能による評価）
＜方法＞
実験に使用するマウスは、日本ＳＬＣ社より５週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウス５週齢オスを社内飼育施設で昼夜１２時間サイクルの自由給餌下で1週間飼育し馴化した。【００９６】
マウスに表６に示す条件で投与を行った。条件（１）、（２）および比較条件（３）は、実施例４で調製した微粒子（ＯＶＡ含有カードラン微粒子（１０）、ＯＶＡ含有デキストラン比較微粒子（１５））を４％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液５０μｌに分散し、後ろ両足フットパッドに２９Ｇ注射針（テルモ社マイジェクター）を用いて投与した。比較条件（４）は、同様の方法で、ＯＶＡ（シグマ社）およびｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）を投与した。比較条件（５）は、同様の方法で、抗原を含まない溶液を投与した。【００９７】
条件（２）および比較条件（３）、（４）は、最初の投与の３日後に同様の方法で２回目の投与を、最初の投与の６日後に同様の方法で３回目の投与を行った。【００９８】
投与後のマウスは自由給餌、給水可能な環境で飼育し、最初の投与より2週間後に炭酸ガスを用いて安楽死させた。投与部位近傍の膝下リンパ節を無菌的に摘出し、内包される細胞を分散させた後、２００μｍフィルター（アズワン社、ＦＩＬＣＯＮＳ，１２０−２２Ｓ）で濾過しデブリを除去した。回収した細胞は１０％ＦＢＳ（シグマ社）、１００単位／ｍｌペニシリン（ライフテクノロジー社）、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（ライフテクノロジー社）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地（以下、ＲＰＭＩ培地）に懸濁し、１ウェルあたり５×１０５個となるように９６穴プレート（ＩＷＡＫＩ社、Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に播種し、さらにＯＶＡ１０μｇ、２メルカプトエタノール０．７５μｇを含むＲＰＭＩ培地を加えて刺激した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベート後、培養上清を回収しＥＬＩＳＡ法（ＭａｂＴｅｃｈ社、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＨＲＰ））により各細胞群から産生されたＩＦＮ−γ濃度を測定した。【００９９】
＜結果＞
リンパ節細胞の産生するＩＦＮ−γ量を図１２に示す。ＩＦＮ−γは、細胞性免疫の活性化を表す指標である。ＯＶＡ含有微粒子を投与した条件（条件（１）、（２）、比較条件（３））では、抗原を投与していない条件（比較条件（５））やＯＶＡとｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを投与した条件（比較条件（４））と比較して、強いＩＦＮ−γの産生が確認されたことより、抗原を含有した微粒子が抗原特異的な免疫の活性化に有効であることが明らかとなった。カードラン修飾体を基材とした微粒子を投与した条件（条件（１）、（２））では、デキストラン修飾体を基材とした微粒子を投与した条件（比較条件（３））と比較して、さらに強いＩＦＮ−γの産生が確認された。つまり、β−グルカン修飾体を基材とし抗原を含有した微粒子は、抗原特異的な免疫を増強することが明らかとなった。また、微粒子を３回投与した条件（条件（２））では、微粒子を１回投与した条件（条件（１））と比較して、ＩＦＮ−γの産生量が高いことより、複数回の投与が免疫のさらなる増強に有効であることも明らかとなった。【０１００】
【表６】
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【０１０１】
実施例９  マウスを用いたβ−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験２（ＩＦＮ−γ産生能による評価）
＜方法＞
実施例８と同じ条件で飼育したマウスに表７に示す条件で投与を行った。条件（６）〜（８）および比較条件（９）は、実施例４で調製した微粒子（ＯＶＡ含有ラミナラン微粒子（１２）〜（１４）、ＯＶＡ含有デキストラン比較微粒子（１５））を４％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液１００μｌに分散し、後ろ両足フットパッドに２９Ｇ注射針（テルモ社マイジェクター）を用いて投与した。比較条件（１０）は、同様の方法で、ＯＶＡ（シグマ社）およびｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）を投与した。比較条件（１１）は、同様の方法で、ＯＶＡ（シグマ社）を投与した。比較条件（１２）は、同様の方法で、抗原を含まない溶液を投与した。【０１０２】
投与後のマウスは自由給餌、給水可能な環境で飼育し、最初の投与より2週間後に炭酸ガスを用いて安楽死させた。実施例８と同様の方法で、リンパ節に内包される細胞を取り出し、ＯＶＡで刺激後のＩＦＮ−γ産生量を測定した。【０１０３】
＜結果＞
リンパ節細胞の産生するＩＦＮ−γ量を図１３に示す。ＯＶＡ含有ラミナラン微粒子を投与した条件（条件（６）〜（８））では、ＯＶＡ含有デキストラン比較微粒子を投与した条件（比較条件（９））やＯＶＡとｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを投与した条件（比較条件（１０））と比較して、強いＩＦＮ−γ産生が観察された。ラミナラン修飾体を基材として抗原を含有した微粒子は、実施例８のカードラン修飾体を基材として抗原を含有した微粒子と同様に、抗原特異的な免疫を増強することが明らかとなった【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
実施例１０  マウスを用いたβ−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験３（抗腫瘍効果）
＜方法＞
担癌細胞としてＯＶＡ発現マウス癌細胞Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（ＡＴＣＣ社）を事前に対数増殖状態を保ち、ＲＰＭＩ培地を用いて一週間培養した後、滅菌したＰＢＳで３回洗浄し、移植細胞を調製した。【０１０６】
ホスト動物としては日本ＳＬＣ社より５週齢で購入したオスＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウスを弊社飼育施設で昼夜１２時間サイクルの自由給餌下で飼育し馴化した後、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞  ２×１０６個を含むＰＢＳ１００μｌを腹部皮下に２５Ｇ注射針を用いて担癌した。【０１０７】
担癌から０日目、３日目、７日目、１０日目および１５日目に、表８に示す条件で投与を行った。条件（１３）および条件（１４）では、実施例４で調製した微粒子（ＯＶＡ含有カードラン微粒子（１０）、カードラン微粒子（１１））を４％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液１００μｌに分散し、担癌部位近傍に２９Ｇ注射針（テルモ社マイジェクター）を用いて投与した。比較条件（１５）では、同様の方法で、ＯＶＡ（シグマ社）およびｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）を投与した。比較条件（１６）では、同様の方法で、抗原も粒子を含まない溶液を投与した。【０１０８】
投与後のマウスは自由給餌、給水可能な環境で飼育し、腫瘍組織の体積を測定した。【０１０９】
＜結果＞
各条件５匹の担癌後の腫瘍組織の体積平均値を図１４に示す。抗原を含まない微粒子を投与した条件（条件（１４））では、抗原も粒子も投与していない条件（比較条件（１６））と比較して、腫瘍体積の増加が抑えられていることより、β−グルカン修飾体を基材とした微粒子が抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。抗原を含有した微粒子を投与した条件（１３）では、抗原を含まない微粒子を投与した条件（条件（１４））やＯＶＡとｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを投与した条件（比較条件（１５））と比較して、腫瘍体積の増加がより抑えられていたことより、β−グルカン修飾体を基材として抗原を含有した微粒子は、より強い抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
実施例１１  ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体が修飾されたβ−グルカン（パキマン修飾体（１６）、シゾフィラン修飾体（１７）、黒酵母グルカン修飾体（１８）、スクレログルカン修飾体（１９）、カードラン修飾体（２０）（２１））の合成
（１）β−グルカンの加水分解反応（パキマン加水分解物（７）、シゾフィラン加水分解物（８）、黒酵母グルカン加水分解物（９）、スクレログルカン加水分解物（１０）、カードラン加水分解物（１１）（１２）の合成）【０１１２】
パキマン（バイオサプライ社）３２０ｍｇをジメチルスルホキシド２７ｍｌに溶解した後、１規定塩酸水溶液１．２ｍｌを加え、１１０℃で０．５時間攪拌した。該反応溶液を透析膜に移し、水中で透析を行った後に、凍結乾燥を行い、パキマン加水分解物（７）（数平均分子量１，９００）を粉末として得た。【０１１３】
同様の条件で、シゾフィラン（インビボジェン）を１．３時間反応させることでシゾフィラン加水分解物（８）（数平均分子量４，４００）を、黒酵母グルカン（ダイソー株式会社）を０．１５時間反応させることで黒酵母グルカン加水分解物（９）（数平均分子量２，７００）を、スクレログルカン（エチシチル社製）を１．１５時間反応させることでスクレログルカン加水分解物（１０）（数平均分子量３，０００）を、カードラン（和光純薬工業株式会社）を０．１時間反応させることでカードラン加水分解物（１１）（数平均分子量１８，７００）を、０．７５時間反応させることでカードラン加水分解物（１２）（数平均分子量１，９００）を得た。【０１１４】
β−グルカンの数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ−ＣＰ×２、酢酸緩衝液系溶媒（１０ｍＭ、ｐＨ＝５）、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した。【０１１５】
（２）β―グルカンのトリメチルシリル（ＴＭＳ）化反応（ＴＭＳ化パキマン（９）、ＴＭＳ化シゾフィラン（１０）、ＴＭＳ化黒酵母グルカン（１１）、ＴＭＳ化スクレログルカン（１２）、ＴＭＳ化カードラン（１３）（１４）の合成）
パキマン加水分解物（７）１８０ｍｇジメチルスルホキシド２５ｍｌに加え、８０℃に加熱した。この溶液に１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン２０ｍｌを２０分掛けて滴下し、８０℃で１６時間攪拌した。該反応溶液を分液漏斗に移し、二層に分離するまで静置した。上層を回収し、減圧下濃縮した後、メタノール５ｍｌを加え、得られた固体をろ過、乾燥し、ＴＭＳ化パキマン（９）２５０ｍｇを白色固体として得た。【０１１６】
同様の方法で、シゾフィラン加水分解物（８）よりＴＭＳ化シゾフィラン（１０）を、黒酵母グルカン加水分解物（９）よりＴＭＳ化黒酵母グルカン（１１）を、スクレログルカン加水分解物（１０）よりＴＭＳ化スクロレログルカン（１２）を、カードラン加水分解物（１１）よりＴＭＳ化カードラン（１３）を、カードラン加水分解物（１２）よりＴＭＳ化カードラン（１４）を合成した。【０１１７】
ＴＭＳ化反応進行は１Ｈ−ＮＭＲ測定により確認した。【０１１８】
（３）β−グルカンに対するポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の修飾反応（パキマン修飾体（１６）、シゾフィラン修飾体（１７）、黒酵母グルカン修飾体（１８）、スクレログルカン修飾体（１９）、カードラン修飾体（２０）、（２１）の合成）
ＴＭＳ化パキマン（９）２３０ｍｇとｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（ｔＢｕＯＫ）２２ｍｇを加熱減圧下２時間乾燥後、テトラヒドロフラン１０ｍｌを加え、１．５時間室温で攪拌し、活性化溶液を得た。活性化溶液の調製に使用したｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマー（（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドのモル比１：１の混合物）をテトラヒドロフランに溶解し、モノマー溶液を得た。該活性化溶液に、該モノマー溶液を滴下し、３０分間攪拌後、酢酸０．２ｍｌ加えて反応を停止させた。反応終了後の溶液を減圧下濃縮し、クロロホルム（良溶媒）−メタノール（貧溶媒）系およびクロロホルム（良溶媒）−シクロヘキサン（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、白色固体を得た。得られた白色固体をクロロホルム９ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸１ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した。該反応溶液を減圧下濃縮し、クロロフホルム（良溶媒）−ジエチルエーテル（貧溶媒）系で再沈殿精製を行い、パキマン修飾体（１６）２８７ｍｇを白色固体として得た。【０１１９】
同様の方法で、ＴＭＳ化シゾフィラン（１０）よりシゾフィラン修飾体（１７）を、ＴＭＳ化黒酵母グルカン（１１）より黒酵母グルカン修飾体（１８）を、ＴＭＳ化スクレログルカン（１２）よりスクレログルカン修飾体（１９）、ＴＭＳ化カードラン（１３）よりカードラン修飾体（２０）、ＴＭＳ化カードラン（１４）よりカードラン修飾体（２１）を合成した。【０１２０】
β−グルカン修飾体の評価結果を表９に示す。β−グルカン修飾体の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−  ＴＳＫ−ｇｅｌ  α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した。β―グルカン修飾体に含まれるβ―グルカンセグメントの比率（ｗ／ｗ）は、合成に使用したβ―グルカンの数平均分子量とβ―グルカン修飾体の数平均分子量より決定した。各グラフト鎖の数平均分子量は、１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した（図１５：パキマン修飾体（１６）、図１６：シゾフィラン修飾体（１７）、図１７：黒酵母グルカン修飾体（１８）、図１８：スクレログルカン修飾体（１９））。グラフト鎖数の平均は、β―グルカン修飾体の数平均分子量からβ―グルカンの数平均分子量を引いた値を、各グラフト鎖の数平均分子量で割ることで決定した。【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
実施例１２  ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体が修飾されたパキマラン（パキマラン修飾体（２２））の合成
（１）パキマンの酸化開裂反応（パキマランの合成）
パキマン（バイオサプライ社）１ｇに水１２０ｍｌに混合させ、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４０ｍｌを加え、室温で４０時間攪拌した後に、遠心分離により反応物を回収した。該反応物に水５４ｍｌに混合させ、水素化ホウ素ナトリウム２１６ｍを含む水溶液２７ｍｌを加え、室温で２８時間攪拌した後に、遠心分離により反応物を回収した。該反応物に０．０５Ｍ硫酸水溶液７０ｍＬに混合させ、室温で２４時間攪拌した後に、遠心分離によりパキマラン０．９１ｇを回収した。【０１２３】
（２）パキマランの加水分解反応（パキマラン加水分解物（１３）の合成）
上記の実施例１１と同様の方法で加水分解を行い、パキマラン３６０ｍｇを用いて、パキマラン加水分解物（１３）（数平均分子量２，１００）２２９ｍｇを粉末として得た。
（３）パキマランのトリメチルシリル（ＴＭＳ）化反応（ＴＭＳ化パキマラン（１５）の合成）【０１２４】
上記の実施例１１と同様の方法でＴＭＳ化を行い、パキマラン加水分解物（１３）２００ｍｇを用いて、ＴＭＳ化パキマラン（１５）３２５ｍｇを白色固体として得た。
（４）パキマランに対するポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の修飾反応（パキマラン修飾体（２２）の合成）
上記の実施例１１と同様の方法で、ＴＭＳ化パキマラン（１５）３００ｍｇに、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（ｔＢｕＯＫ）とｔＢｕＯＫの３５倍モルのモノマー（（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドのモル比１：１の混合物）を反応させることで、パキマラン修飾体（２２）３５３ｍｇを白色固体として得た。【０１２５】
パキマラン修飾体（２２）の評価結果を表１０に示す。各値については、上記の実施例１１と同様の方法で、ＧＰＣ測定および１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した（図１９：パキマラン修飾体（２２）の１Ｈ−ＮＭＲ測定）。【０１２６】
【表１０】
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【０１２７】
実施例１３  Ｏ／Ｗエマルジョン法を用いた微粒子２（パキマン微粒子（１６）、シゾフィラン微粒子（１７）、黒酵母グルカン微粒子（１８）、スクレログルカン微粒子（１９）、カードラン微粒子（２０）、パキマラン微粒子（２１）、デキストラン比較微粒子（２２））の調製
パキマン修飾体（１６）１０ｍｇを酢酸エチル１ｍｌに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液４ｍｌに滴下し、ミキサー（ポリトロン社、ＰＴ２１００Ｓ）を用いた１１，０００ｒｐｍ、５分間の撹拌によりＯ／Ｗエマルジョン溶液を調製した。該Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から液中乾燥により酢酸エチルを除去して、微粒子懸濁液とした。該懸濁液を１５ｍｌチューブに移し、８，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により微粒子を沈殿させた。上清を除いた後に、微粒子を１０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、上記条件での遠心により微粒子を再度沈殿させた。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除いた後に微粒子を５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液１．８ｍｌに懸濁させた。該懸濁液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、パキマン微粒子（１６）を得た。【０１２８】
同様の方法で、シゾフィラン修飾体（１７）を基材としたシゾフィラン微粒子（１７）を、黒酵母グルカン修飾体（１８）を基材とした黒酵母グルカン微粒子（１８）を、スクレログルカン修飾体（１９）を基材としたスクレログルカン微粒子（１９）を、カードラン修飾体（２０）を基材としたカードラン微粒子（２０）を、パキマラン修飾体（２２）を基材としたパキマラン微粒子（２１）を得た。【０１２９】
また、比較例として、同様の方法で、デキストラン修飾体（１５）を基材としたデキストラン比較微粒子（２２）を得た。【０１３０】
微粒子の平均粒径を、動的光散乱装置（大塚電子株式会社、ＥＬＳ−Ｚ）を用いてキュムラント法により算出した結果を表１１に示す。【０１３１】
【表１１】
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【０１３２】
実施例１４  Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法を用いた微粒子（ＯＶＡ含有カードラン微粒子（２３）、（２４）、ＯＶＡ含有スクレログルカン微粒子（２５））の調製
カードラン修飾体（２１）１００ｍｇを炭酸ジメチル２．６ｍｌおよびｔｅｒｔ−ブタノール２００μｌに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、０．５％（ｗ／ｖ）ＯＶＡ（卵白アルブミン、シグマ社））水溶液１ｍｌを滴下し、ミキサー（ポリトロン社、ＰＴ２１００Ｓ）を用いた１１，０００ｒｐｍ、１分間の撹拌によりＷ／Ｏエマルジョン溶液を製造した。該Ｗ／Ｏエマルジョン溶液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａに１２時間凍結乾燥した。得られた固形分を酢酸エチル１０ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液４０ｍｌに滴下し、ミキサー（シルバーソン社、Ｌ５Ｍ−Ａ）を用いた６，０００ｒｐｍ、５分間の撹拌によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液から液中乾燥により酢酸エチルを除去して、微粒子懸濁液とした。該懸濁液を５０ｍｌチューブに移し、８，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により微粒子を沈殿させた。上清を除いた後に、微粒子を５０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、上記条件での遠心により微粒子を再度沈殿させた。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除いた後に微粒子を５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液８ｍｌに懸濁させた。該懸濁液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、ＯＶＡ含有カードラン微粒子（２３）を得た。【０１３３】
同様の方法で、カードラン修飾体（２０）を用いることでＯＶＡ含有カードラン微粒子（２４）を、スクレログルカン修飾体（１９）を用いることでＯＶＡ含有スクレログルカン微粒子（２５）を得た。
微粒子の評価結果を表１２に示す。微粒子の平均粒径は、動的光散乱装置（大塚電子株式会社、ＥＬＳ−Ｚ）を用いてキュムラント法により算出した。抗原の封入率（ｗ／ｗ）は、微粒子より有機溶媒を用いて抗原を抽出し、抽出した抗原をゲル電気泳動装置（ＴＥＦＣＯ社）でゲル電気泳動後に、コロイドＣＢＢ染色キット（ＴＥＦＣＯ社）を用いて染色を行うことにより決定した。【０１３４】
【表１２】
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【０１３５】
実施例１５  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いたβ−グルカン修飾体（パキマン修飾体（１６）、シゾフィラン修飾体（１７）、黒酵母グルカン修飾体（１８）、パキマラン修飾体（２２））のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験２
＜方法＞
実施例１１で得られたβ−グルカン修飾体（パキマン修飾体（１６）、シゾフィラン修飾体（１７）、黒酵母グルカン修飾体（１８）、パキマラン修飾体（２２））１０ｍｇを秤量し、アセトニトリル１ｍｌに溶解しポリマー溶液を得た。該ポリマー溶液１００μｌ（ポリマー１ｍｇ分）を１２ウェルプレートに滴下し、乾燥させることでポリマーコートプレートを得た。該ポリマーコートプレーに参考例１で得られた樹状細胞を培養培地とともに１ウェルあたり３×１０５個となるよう播種した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した後に、マイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞のみを回収した。回収した細胞は、１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去し、ＲＰＭＩ培地１００μｌに懸濁させた。該細胞懸濁液に、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体およびＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体を添加し、４℃で１５分間静置することで抗体標識反応を行った。抗体標識反応終了後、フローサイトメトリーにより樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）における活性化マーカー（ＣＤ８６）の発現量を蛍光強度（ＭＦＩ）により評価した。【０１３６】
比較例としては、比較例１で得られたデキストラン修飾体（１５）同様にコートしたプレートを用いて、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。また、別の比較例としては、実施例１１で得られた未修飾のβ−グルカン（パキマン加水分解物（７）、シゾフィライン加水分解物（８）、黒酵母グルカン加水分解物（９）、パキマラン加水分解物（１３））１ｍｇまたは免疫活性化能が知られているｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（シグマ社）１００μｇを培養培地に添加して、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。【０１３７】
＜結果＞
樹状細胞の活性化マーカーであるＣＤ８６の発現量の指標である蛍光強度（ＭＦＩ）を図２０に示す。β―グルカン修飾体を用いた場合は、デキストラン修飾体（１５）を用いた場合と比較して、ＣＤ８６の発現量が高いことより、β−グルカン修飾体は強い樹状細胞が活性化能を有することが明らかとなった。未修飾のβ−グルカンを用いた場合は、β―グルカン修飾体を用いた場合と比較して、ＣＤ８６の発現量が低いことより、β−グルカンへのポリ（ヒドロキシ酸）の修飾が免疫活性化能に重要であることが明らかとなった。また、線状のβ−グルカンの修飾体（実施例４：カードラン修飾体（９）〜（１２）、本実施例：パキマン修飾体（１６））のみならず、分枝上のβ−グルカンの修飾体（本実施例：シゾフィラン修飾体（１７）、黒酵母グルカン修飾体（１８））や誘導体化されたβ−グルカンの修飾体（本実施例：パキマラン修飾体（２２）も、免疫活性化能を有することが確認された。【０１３８】
実施例１６  マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いたβ−グルカン修飾体を基材とした微粒子（パキマン微粒子（１６）、シゾフィラン微粒子（１７）、黒酵母グルカン微粒子（１８）、スクレログルカン微粒子（１９）、カードラン微粒子（２０）、パキマラン微粒子（２１））のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激試験２
参考例１で得られた樹状細胞を培養培地とともに１ウェルあたり３×１０５個となるよう１２ウェルプレートに播種し、さらにβ−グルカン修飾体を基材とした微粒子（パキマン微粒子（１６）、シゾフィラン微粒子（１７）、黒酵母グルカン微粒子（１８）、スクレログルカン微粒子（１９）、カードラン微粒子（２０）、パキマラン微粒子（２１））０．０５ｍｇを添加した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養し、マイクロピペットを用いて強く懸濁することで、プレートに接着していない細胞のみを回収した。回収した細胞は、１，５００ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞を沈殿させ、上清を除去し、ＲＰＭＩ培地１００μｌに懸濁させた。該細胞懸濁液に、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体およびＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体を添加し、４℃で１５分間静置することで抗体標識反応を行った。抗体標識反応終了後、フローサイトメトリーにより樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）の活性化マーカー（ＣＤ８６）の発現量を蛍光強度（ＭＦＩ）により評価した。【０１３９】
比較例として、デキストランを基材とした微粒子（デキストラン比較微粒子（２２））０．０５ｍｇを培養培地に添加して、同様に活性化マーカーの発現量を比較した。【０１４０】
＜結果＞
各微粒子におけるＣＤ８６の発現量の指標である蛍光強度（ＭＦＩ）を図２１に示す。β−グルカン修飾体を基材とした微粒子（パキマン微粒子（１６）、シゾフィラン微粒子（１７）、黒酵母グルカン微粒子（１８）、スクレログルカン微粒子（１９）、カードラン微粒子（２０）、パキマラン微粒子（２１））を用いた場合は、未添加の場合およびデキストラン修飾体を基材とした微粒子（デキストラン比較微粒子（２２））を用いた場合と比べて、ＣＤ８６の発現量が高いことより、β−グルカン修飾体を基材とした微粒子が樹状細胞を強く活性していることが明らかとなった。【０１４１】
実施例１７  マウスを用いたβ−グルカン修飾体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験４（ＩＦＮ−γ産生能による評価）
＜方法＞
実験に使用するマウスは、日本ＳＬＣ社より５週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウス５週齢オスを社内飼育施設で昼夜１２時間サイクルの自由給餌下で1週間飼育し馴化した。【０１４２】
マウスに表１３に示す条件で投与を行った。条件（１７）〜（１９）は、実施例１４で調製した微粒子（ＯＶＡ含有カードラン微粒子（２３）、（２４）、ＯＶＡ含有スクレログルカン微粒子（２５））を４％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液５０μｌに分散し、後ろ両足フットパッドに２９Ｇ注射針（テルモ社マイジェクター）を用いて投与した。比較条件（２０）は、同様の方法で、ＯＶＡ（シグマ社）およびカードラン加水分解物（１２）を投与した。【０１４３】
すべての条件で、初回投与の３日後に同様の方法で２回目の投与を、初回投与の７日後に同様の方法で３回目の投与を、初回投与の１０日後に同様の方法で４回目の投与を行った。【０１４４】
投与後のマウスは自由給餌、給水可能な環境で飼育し、初回投与より１６日後に炭酸ガスを用いて安楽死させた。投与部位近傍の膝下リンパ節を無菌的に摘出し、内包される細胞を分散させた後、２００μｍフィルター（アズワン社、ＦＩＬＣＯＮＳ，１２０−２２Ｓ）で濾過しデブリを除去した。回収した細胞は１０％ＦＢＳ（シグマ社）、１００単位／ｍｌペニシリン（ライフテクノロジー社）、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（ライフテクノロジー社）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地（以下、ＲＰＭＩ培地）に懸濁し、１ウェルあたり５×１０５個となるように９６穴プレート（ＩＷＡＫＩ社、Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に播種し、さらにＯＶＡ１０μｇ、２メルカプトエタノール０．７５μｇを含むＲＰＭＩ培地を加えて刺激した。播種したプレートは、ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベート後、培養上清を回収しＥＬＩＳＡ法（ＭａｂＴｅｃｈ社、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＨＲＰ））により各細胞群から産生されたＩＦＮ−γ濃度を測定した。【０１４５】
＜結果＞
リンパ節細胞の産生するＩＦＮ−γ量を図２２に示す。ＩＦＮ−γは、細胞性免疫の活性化を表す指標である。カードラン修飾体を基材としたＯＶＡ含有微粒子を投与した条件（条件（１７））では、ＯＶＡと未修飾のカードランを投与した条件（比較条件（２０））と比較して、強いＩＦＮ−γの産生が確認されたことより、ｉｎ  ｖｉｖｏのおいてもβ−グルカン修飾体が未修飾のβ−グルカンと比較して強い免疫活性化能を有することが明らかとなった。また、高分子量のカードラン修飾体を基材としたＯＶＡ含有微粒子を投与した条件（条件（１８））や分枝上のスクレログルカン修飾体を基材としたＯＶＡ含有微粒子を投与した条件（条件（１９））においても、強いＩＦＮ−γの産生が確認されたことより、分子量や線状と分枝状の違いによらず、β−グルカン修飾体が強い免疫活性化能を持つことが示された。【０１４６】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明の免疫賦活化剤は医薬として、特に感染症や癌などの治療および／または予防のためのワクチンのための免疫賦活剤として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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