(57)【要約】高効率、短期間でTCR cDNAを増幅する方法として、下記の工程(1)および工程(2)を含む、T細胞受容体（TCR）cDNAの増幅方法を提供する。（1）下記のLプライマーの少なくとも１つと、下記のCプライマー1またはUTRプライマー1とを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程；15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2またはUTRプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程(1)および工程(2)を含む、T細胞受容体（TCR）cDNAの増幅方法：
（1）下記のLプライマーの少なくとも１つと、下記のCプライマー1またはUTRプライマー1とを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程；
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；
（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2またはUTRプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
【請求項２】
工程(1)において、
Lプライマーとして、TCRαに対応したLプライマー（AL）の少なくとも一つ、およびTCRβに対応したLプライマーの少なくとも一つ（BL）を使用し；
Cプライマー1として、TCRαに対応したCプライマー1（Ca_RV1）、およびTCRβに対応したCプライマー1（Cb_RV1）を使用し、またはUTRプライマー1として、TCRαに対応したUTRプライマー1（AC_UTR1）、およびTCRβに対応したUTRプライマー1（BC_UTR1）を使用し、
TCRαとTCRβとが同時に増幅される、請求項1に記載の増幅方法。
【請求項３】
ALのリーダー領域会合部分が、配列番号87〜140のいずれか１つの塩基配列の一部からなり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列の一部からなる、請求項2に記載の増幅方法。
【請求項４】
ALのリーダー領域会合部分が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合部分が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなるか、またはALのリーダー領域会合部分が、配列番号283〜328のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合部分３が、配列番号329〜350のいずれか一の塩基配列からなる、請求項2に記載の増幅方法。
【請求項５】
Lプライマーとして、配列番号1〜41のそれぞれに対応した41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLを用いるか、またはLプライマーとして、配列番号283〜328のそれぞれに対応した46種類のALと、配列番号329〜350のそれぞれに対応した22種類のBLを用いる、請求項４に記載の増幅方法。
【請求項６】
ALのアダプター部分が、配列番号81の塩基配列からなり、BLのアダプター部分が配列番号82の塩基配列からなる、請求項2〜5のいずれか1項に記載の増幅方法。
【請求項７】
Ca_RV1が、配列番号83または配列番号351の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、 Cb_RV1が、配列番号84または配列番号353および配列番号354の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、または
AC_UTR1が、配列番号277の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、 BC_UTR1が、配列番号279および／または配列番号280の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、
請求項2〜6のいずれか1 項に記載の増幅方法。
【請求項８】
Cプライマー2として、TCRαに対応したCプライマー2（Ca_RV2）、およびTCRβに対応したCプライマー2（Cb_RV2）を使用し、Ca_RV2が、配列番号85または配列番号352の塩基配列からなり、 Cb_RV2が、配列番号86または配列番号355の塩基配列からなる、または
UTRプライマー2として、TCRαに対応したUTRプライマー2（AC_UTR2）、およびTCRβに対応したCプライマー2（BC_UTR2）を使用し、AC_UTR2が、配列番号278の塩基配列からなり、 BC_UTR2が、配列番号281および／または配列番号282の塩基配列からなる、
請求項2〜7のいずれか1 項に記載の増幅方法。
【請求項９】
以下を含む、TCR cDNAの増幅のための、キット：
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
【請求項１０】
ALのリーダー領域会合部分が、配列番号85〜140のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能であり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能である、請求項9に記載のキット。
【請求項１１】
ALのリーダー領域会合配列が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合配列が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなる、請求項10に記載のキット。
【請求項１２】
配列番号1〜41のそれぞれに対応した。41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLを含む、請求項11に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞受容体（TCR）遺伝子を増幅する方法に関する。本発明は、がんや感染症のTCR遺伝子治療に関連する、ライフサイエンス、医療等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
主として特定のがんへの適用が検討されているT細胞受容体（TCR）遺伝子治療においては、がん患者のリンパ球に、がん抗原特異的なTCRの遺伝子が導入される。抗原特異的なTCRの遺伝子を得るには、患者から回収した末梢血リンパ球（PBL）中のT細胞の中からがん抗原を認識できるT細胞を特定し、TCR遺伝子をクローニングする必要がある。そのために一般に行われるアプローチは、抗原特異的T細胞クローンの樹立を含み、これには通常、数ヶ月を必要とする。一方、本発明者らは、細胞クローンの樹立を要さず、１個の細胞から、5’-RACE法を用いて遺伝子を増幅する方法を開発している（特許文献１）。【０００３】
さらに本発明者らは、がん患者末梢血のTリンパ球の中から、がん特異的T細胞を検出し、１個のがん特異的T細胞より、がんを認識するTCRのcDNAを増幅し、そのがん特異性を検証するまでを最短10日で行うことができるシステムを構築している（特許文献2、非特許文献1）。この方法において目的のcDNAを増幅するに際しては、上記の5’-RACE法を利用した。【０００４】
他方、TCR遺伝子の増幅およびワン-ステップ発現クローニングがMoyseyらによって提案されている（非特許文献1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許4069133公報
【特許文献２】特願2012-1644424（PCT2012/070028）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kobayashi E et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nature Medicine, Published online: 13 October 2013 | doi:10.1038/nm.3358
【非特許文献２】Moysey R et al. Amplification and one-step expression cloning of human T cell receptor genes.Anal Biochem. 326:284-286, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
TCRのcDNAはV（可変）領域とC（定常部）領域が組み合わさって構築される。ヒトのからだの中ではV領域は50種類ほどあり、各V領域に対応するプライマーを用いてTCRのcDNAを増幅することは可能であるが、この場合、翻訳開始コドンやリーダー配列が含まれないcDNAが増幅されるため、動物細胞での発現や、遺伝子治療のためのT細胞への遺伝子導入の際には、リーダー配列を付加する必要がある。それを避けるために、特許文献2および非特許文献1の技術は、5’-RACE法でTCR cDNAを増幅していた。しかしながら、5’-RACEを行う際は、通常reverse transcriptaseを用いてmRNAから作製したcDNAを材料として用い、このcDNAには短いものから長いものまで様々な長さのものが含まれる。そのようなcDNAに対してPCRを行うと、様々な長さのcDNAが増幅され、その後の解析が煩雑になる傾向があった。また、5’-RACE法は、一般的なRT-PCRに較べ、TdTを用いるステップが余分に必要であり、実験の時間や材料費用などが余分にかかる不利益があった。【０００８】
また、Moyseyらの方法は2回PCRを行うが、2回目のPCRには、V領域の5’側の配列を用いるため、作製されたTCR cDNAにはリーダー配列が含まれておらず、細胞で発現させるためにはリーダー配列を付加する必要があった。さらにMoyseyらの方法は、TCRを増幅するために、500個程度の細胞が必要であるため、まずがん特異的T細胞のクローンを作製し、増殖させ、500個のクローンを得る必要があり、目的のTCRを増幅するためには約3ヶ月要するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、各V領域の5’側に存在するリーダー配列のデータを元に、翻訳開始コドンを含むリーダー配列に対応するプライマーを80種類作製し、それらを用いて、通常のRT-PCRにより１個のT細胞からTCR cDNAを増幅することを試みた。当初、多種類のプライマーを混合して用いるために、PCRの増幅効率が下がるのではないかと危惧したが、結果は、１個のT細胞から非常に効率良くTCR cDNAを取得することができることを見出し、本発明を完成した。本発明は、以下を提供する。【００１０】
[１]  下記の工程(1)および工程(2)を含む、T細胞受容体（TCR）cDNAの増幅方法：
（1）下記のLプライマーの少なくとも１つと、下記のCプライマー1とを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程；
・15〜25塩基長のアダプター配列からなるアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分からなるLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長の塩基配列からなるCプライマー1；
（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長の塩基配列からなるアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能なCプライマー2。
[２]  工程(1)において、
Lプライマーとして、TCRαに対応したLプライマー（AL）の少なくとも一つ、およびTCRβに対応したLプライマーの少なくとも一つ（BL）を使用し；
Cプライマー1として、TCRαに対応したCプライマー1（Ca_RV1）、およびTCRβに対応したCプライマー1（Cb_RV1）を使用し、
TCRαとTCRβとが同時に増幅される、[１]に記載の増幅方法。
[３]  ALのリーダー領域会合部分が、配列番号87〜140のいずれか１つの塩基配列の一部からなり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列の一部からなる、[２]に記載の増幅方法。
[４]  ALのリーダー領域会合配列が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合配列が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなる、[３]に記載の増幅方法。
[５]  配列番号1〜41のそれぞれに対応した。41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLからなる、[４]に記載の増幅方法。
[６]  ALのアダプター部分が、配列番号81の塩基配列からなり、BLのアダプター部分が配列番号82の塩基配列からなる、[２]〜[５]のいずれか1項に記載の増幅方法。
[７]  Ca_RV1が、配列番号83の塩基配列からなり、Cb_RV1が、配列番号84の塩基配列からなる、[２]〜[６]のいずれか1 項に記載の増幅方法。
[８]  Cプライマー2として、TCRαに対応したCプライマー2（Ca_RV2）、およびTCRβに対応したCプライマー2（Cb_RV2）を使用し、Ca_RV2が、配列番号85の塩基配列からなり、 Cb_RV2が、配列番号86の塩基配列からなる、[２]〜[７]のいずれか1 項に記載の増幅方法。
[９]  以下を含む、TCR cDNAの増幅のための、キット：
・15〜25塩基長のアダプター配列からなるアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分からなるLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長の塩基配列からなるCプライマー1；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長の塩基配列からなるアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能なCプライマー2。
[１０]  ALのリーダー領域会合部分が、配列番号85〜140のいずれか１つの塩基配列の一部からなり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列の一部からなる、[９]に記載のキット。
[１１]  ALのリーダー領域会合配列が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合配列が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなる、[１０]に記載のキット。
[１２]  配列番号1〜41のそれぞれに対応した。41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLからなる、[１１]に記載のキット。【００１１】
[１]  下記の工程(1)および工程(2)を含む、T細胞受容体（TCR）cDNAの増幅方法：
（1）下記のLプライマーの少なくとも１つと、下記のCプライマー1またはUTRプライマー1とを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程；
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；
（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2またはUTRプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
[２]  工程(1)において、
Lプライマーとして、TCRαに対応したLプライマー（AL）の少なくとも一つ、およびTCRβに対応したLプライマーの少なくとも一つ（BL）を使用し；
Cプライマー1として、TCRαに対応したCプライマー1（Ca_RV1）、およびTCRβに対応したCプライマー1（Cb_RV1）を使用し、またはUTRプライマー1として、TCRαに対応したUTRプライマー1（AC_UTR1）、およびTCRβに対応したUTRプライマー1（BC_UTR1）を使用し、
TCRαとTCRβとが同時に増幅される、1に記載の増幅方法。
[３]  ALのリーダー領域会合部分が、配列番号87〜140のいずれか１つの塩基配列の一部からなり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列の一部からなる、2に記載の増幅方法。
[４]  ALのリーダー領域会合部分が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合部分が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなるか、またはALのリーダー領域会合部分が、配列番号283〜328のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合部分３が、配列番号329〜350のいずれか一の塩基配列からなる、2に記載の増幅方法。
[５]  Lプライマーとして、配列番号1〜41のそれぞれに対応した41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLを用いるか、またはLプライマーとして、配列番号283〜328のそれぞれに対応した46種類のALと、配列番号329〜350のそれぞれに対応した22種類のBLを用いる、４に記載の増幅方法。
[６]  ALのアダプター部分が、配列番号81の塩基配列からなり、BLのアダプター部分が配列番号82の塩基配列からなる、2〜5のいずれか1項に記載の増幅方法。
[７]  Ca_RV1が、配列番号83または配列番号351の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、 Cb_RV1が、配列番号84または配列番号353および配列番号354の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、または
AC_UTR1が、配列番号277の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、 BC_UTR1が、配列番号279および／または配列番号280の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、
2〜6のいずれか1 項に記載の増幅方法。
[８]  Cプライマー2として、TCRαに対応したCプライマー2（Ca_RV2）、およびTCRβに対応したCプライマー2（Cb_RV2）を使用し、Ca_RV2が、配列番号85または配列番号352の塩基配列からなり、 Cb_RV2が、配列番号86または配列番号355の塩基配列からなる、または
UTRプライマー2として、TCRαに対応したUTRプライマー2（AC_UTR2）、およびTCRβに対応したCプライマー2（BC_UTR2）を使用し、AC_UTR2が、配列番号278の塩基配列からなり、 BC_UTR2が、配列番号281および／または配列番号282の塩基配列からなる、
2〜7のいずれか1 項に記載の増幅方法。
[９]  以下を含む、TCR cDNAの増幅のための、キット：
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
[１０]  ALのリーダー領域会合部分が、配列番号85〜140のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能であり、BLのリーダー領域会合部分が、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能である、9に記載のキット。
[１１]  ALのリーダー領域会合配列が、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列からなり、かつBLのリーダー領域会合配列が、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列からなる、10に記載のキット。
[１２]  配列番号1〜41のそれぞれに対応した。41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLを含む、11に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の増幅方法により、1個のT細胞から、翻訳開始コドンを含むリーダー配列と完全な可変領域を含んだTCR cDNAを効率よく増幅することができる。本発明の増幅方法は、TCRαβペアが高い確率で増幅できる。また本発明の増幅方法は、目的のTCRを取得するためにT細胞クローンを作製しなくてよいので、短期間でTCRのcDNAが増幅できる。
本発明の増幅方法により最終的に得られた増幅産物は、翻訳開始コドンを含むリーダー配列と完全な可変領域を含むので、そのまま発現ベクターに挿入して用いることができ、またT細胞に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で設計したプライマーの配列（AL  SEQ ID NO.:1〜41、BL  SEQ ID NO.:42〜80）の一覧表。
【図２】実施例で設計したプライマー配列と従来法（Moyseyら、非特許文献2）のプライマー配列（SEQ ID NO.:189〜276）との比較。従来法では、ここに記載した1st PCR用のものに加えて、ほぼ同数の2nd PCR用5'-Primerが必要である。
【図３】従来法（Moyseyら、非特許文献2）で得られるcDNAと、本発明の方法で増幅されるcDNAとの相違点。Moyseyらの方法(上図)では、大腸菌での発現を目的にcDNAを増幅している。翻訳開始コドンを含まないLeader配列の5'-Primerを用いて1st PCRを行った後、V領域の5'-Primerで2nd PCRを行い、Leader配列をコードする領域を含まないcDNAを増幅している。Leader配列は大腸菌の発現系では、不必要な配列であるが、動物細胞にTCRを発現させる場合には必要不可欠な配列である。従って彼らの方法で得られるcDNAは、細胞での発現に適していない。本発明の方法(下図)では、翻訳開始コドンを含んだLeader配列の5'-Primerを用いて1st PCRを行った後、1st PCRのPrimerに付加してあるadaptor配列のPrimerを用いてPCRを行うことで、完全なリーダー配列を含んだcDNAが増幅される。
【図４】Leader Primerを用いたcDNA増幅。本発明の一態様を模式的に示した。
【図５】5’-RACE法(従来法)を用いた1個のT細胞からのTCR cDNAの増幅例（比較例）。CD4/CD25陽性T細胞から、TCR cDNAを増幅した。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物 4 ulを1.5% アガロースゲルで電気泳動した。αβのペアでの増幅率は63％。
【図６】CD4/CD25陽性T細胞からのTCR cDNA増幅例（実施例1）。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物 4 μlを1.5% アガロースゲルで電気泳動した。αβのペアでの増幅率は86.6％。
【図７】ガン抗原特異的CD8陽性T細胞クローンからのTCR cDNA増幅例（実施例2）。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物 4 ulを1.5% アガロースゲルで電気泳動した。上段がTCRα、下段がTCRβサンプルで単一の長さのcDNAの増幅が見られる。
【図８】CD4陽性T細胞からのTCR cDNA増幅例（実施例3）。数字は個々の細胞の番号を、aはTCRα、bはTCRβを示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物 4 ulを1.5% アガロースゲルで電気泳動した。TCRαは15サンプル中13サンプルで、TCRβは全てのサンプルでcDNAの増幅が見られた。αβのペアでの増幅率は86.7％。
【図９】CD8陽性T細胞からのTCR cDNA増幅例（実施例4）。数字は個々の細胞の番号を、aはTCRα、bはTCRβを示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物 4ulを1.5% アガロースゲルで電気泳動した。TCRαβのペアでの増幅率は84％。
【図１０Ａ】ヒト TCRα翻訳開始コドン付近の配列（SEQ ID NO.:87〜140）。
【図１０Ｂ】ヒト TCRβ翻訳開始コドン付近の配列（SEQ ID NO.:141〜188）。
【図１１】ヒトCD8陽性T細胞からのOne-STEP RT-PCR法を用いたTCR cDNA増幅例。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物4ulを1.5% アガロースゲルでTCRα、TCRβを別々に電気泳動した。TCRαβのペアでの増幅率は93％。
【図１２】ヒトCD8陽性T細胞からのOne-STEP RT-PCR法を用いた完全なTCR cDNA増幅例。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物4ulを1.0% アガロースゲルでTCRα、TCRβを別々に電気泳動した。TCRαβのペアでの増幅率は92％。
【図１３】実施例7で設計したプライマーの配列（mAL  SEQ ID NO.:283〜328、mBL  SEQ ID NO.:329〜350）の一覧表。
【図１４】マウスCD4陽性T細胞からのOne-STEP RT-PCR法を用いたTCR cDNA増幅例。数字は個々の細胞の番号を示し、NCはネガティブコントロール（細胞なし）を示す。2nd PCR産物4ulを1.5% アガロースゲルでTCRα、TCRβを別々に電気泳動した。TCRαβのペアでの増幅率は88％。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
数値範囲を「x〜y」で表す場合、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の数値xおよびyを含む。「aおよび／またはb」は、aとbのうち少なくとも一方を意味し、aのみである場合、bのみである場合、およびaとbとの双方である場合とを含む。cDNAに関し、増幅とは、特に記載した場合を除き、cDNAの製造を意味する。すなわち、cDNAの増幅方法は、cDNAの製造方法を意味し、cDNAの製造方法と言い換えることができる。
【００１５】
本発明は、下記の工程(1)および工程(2)を含む、T細胞受容体（TCR）cDNAの増幅方法を提供する。
（1）下記のLプライマーの少なくとも１つと、下記のCプライマー1またはUTRプライマー1とを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程；
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1；
（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2またはUTRプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
【００１６】
なお、あるプライマー（プライマーX）が会合する領域より上流である一部に会合可能というときの上流とは、本発明の一態様を模式的に示した。図4におけるCプライマー1およびCプライマー2の位置関係から明らかであるように、プライマーX によるDNA鎖の伸長方向側（3'側ということもできる。）を指す意である。「（プライマーXが）会合する領域より上流である一部に会合可能」なプライマーは、プライマーXによる増幅産物に会合可能である。「（プライマーXが）会合する領域より上流である一部に会合可能」は、「（プライマーXが）会合する領域より内側である一部に会合可能」、「（プライマーXが）会合する領域より、プライマーXによる伸長方向側である一部に会合可能」または「（プライマーXが）会合する領域より、3'側である一部に会合可能」と言い換えることができる。ここでいう「内側」の意味は、Nested PCR、すなわち一組のプライマー対で増幅される標的配列の内側に第2のプライマー対をデザインして行われる多段のPCRについて説明されるときと同じであり、当業者には明らかである。
【００１７】
〔工程(1)〕
工程(1)では、下記のプライマーが使用される：
・15〜25塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、リーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流に会合可能な、15〜25塩基長のリーダー領域会合部分を含む、30〜60塩基長のLプライマー
・定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長の塩基配列からなるCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1
【００１８】
工程(１)では、典型的には、Lプライマーとして、TCRαに対応したLプライマー（AL）の少なくとも一つ、およびTCRβに対応したLプライマーの少なくとも一つ（BL）を使用し、Cプライマー1として、TCRαに対応したCプライマー1（Ca_RV1）、およびTCRβに対応したCプライマー1（Cb_RV1）を使用し、またはUTRプライマー1として、TCRαに対応したUTRプライマー1（AC_UTR1）、およびTCRβに対応したUTRプライマー1（BC_UTR1）を使用し、TCRαとTCRβとが1つの反応系で同時に増幅される。このとき、複数のALプライマーおよび複数のBLプライマーを1つの反応系に存在させることができる。TCRβの定常領域の遺伝子は、ヒト、マウスとも2種類ある。アミノ酸をコードしている領域のDNA配列は良く似ているが、UTRの部分は同一性が低い。そのため、両方を増幅可能なように、それぞれに会合する2種類のBC_UTR1（BC1_UTR1およびBC2_UTR1と表すことがある。）を用いてもよい。
【００１９】
これらのプライマーは、従来のPCR法のプライマーの設計方法を参考に、適宜設計できる。PCRプライマーの設計のためには、ソフトウェアが市販されており、本発明のためにも使用できる。設計の際には、プライマーの長さ、プライマー内部に二次構造を含まないこと、GC 含有率が40 〜 60％の間であること、GC リッチ領域とAT リッチ領域の分布のバランスがとれていること、それぞれの3' 末端同士が相補的でなく、各プライマー自体に自己相補的な配列を含まないこと、アニーリングのための融解温度（T m）に配慮することができる。
【００２０】
好ましい態様においては、アダプタープライマーは、最終的に得られるPCR産物を発現させる際利便性を考慮して設計することができる。例えば、ALまたはBLの15〜25塩基長のアダプター部分は、self-cleaving2Aペプチド(P2A)配列の全部または一部を含んでいてもよい。この場合、クローニングしたTCRαβの遺伝子を細胞で発現する際に、TCRβの遺伝子とTCRαの遺伝子を、P2A配列で繋いで、1つのmRNAとして発現させることができる(TCRβ-P2A-TCRαまたはTCRα-P2A-TCRβ)。そしてP2A配列のところで、リボゾームスキップがおこるので、TCRβとTCRαが別々のタンパクとして合成される。特に好ましい態様においては、P2A配列の3'末端を含む連続する15〜25merの部分配列（好ましくは18〜22mer）を、アダプター部分として利用することができる。この配列がPCR産物の5'末端に付いているとαβペアでの遺伝子の作製が容易となる。別の好ましい態様においては、ALまたはBLの15〜25塩基長のアダプター部分は、制限酵素（例えば、BamHI、 EcoRI、SbfI）の認識配列を繋げた配列とすることができる。特に好ましい態様においては、AL、BLの一方がP2Aの部分配列を含み、他方が制限酵素の認識配列を含む。P2Aの部分配列を含むアダプター部分の配列の例は、配列番号81であり、制限酵素の認識配列を含むアダプター部分の配列の例は、配列番号82である。  
【００２１】
好ましい態様においては、ALのリーダー領域会合部分は、配列番号87〜140のいずれか１つの塩基配列に基づいて設計することができる。ALのリーダー領域会合部分は、具体的には、配列番号87〜140のいずれか１つの塩基配列の、翻訳開始コドン（配列番号87〜140において、61〜63番目の塩基、atg）を含む一部であるか、もしくは翻訳開始コドンの上流の配列を含む一部とすることができる。翻訳開始コドンの上流の配列を含む場合、翻訳開始コドンは含んでいても含んでいなくてもよい。ALのリーダー領域会合部分の長さは、当業者であれば、PCRのためのプライマーであることを考慮して、適宜設計できるが、例えば、12〜30塩基長とすることができ、13〜27塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。
【００２２】
ALのリーダー領域会合部分の構成がいずれの場合であっても、BLのリーダー領域会合部分は、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列に基づいて設計することができる。BLのリーダー領域会合部分は、具体的には、配列番号141〜188のいずれか１つの塩基配列の、翻訳開始コドン（配列番号141〜188において、61〜63番目の塩基、atg）を含む一部であるか、もしくは翻訳開始コドンの上流の配列を含む一部とすることができる。翻訳開始コドンの上流の配列を含む場合、翻訳開始コドンは含んでいても含んでいなくてもよい。BLのリーダー領域会合部分の長さは、当業者であれば、PCRのためのプライマーであることを考慮して、適宜設計できるが、例えば、12〜30塩基長とすることができ、13〜27塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。
【００２３】
好ましい態様においては、ALのリーダー領域会合部分は、配列番号1〜41のいずれか一の塩基配列、またはALのリーダー領域会合配列が、配列番号283〜328のいずれか一の塩基配列からなるものとすることができる。ALのリーダー領域会合部分の構成がいずれの場合であっても、BLのリーダー領域会合部分は、配列番号42〜80のいずれか一の塩基配列、または配列番号329〜350のいずれか一の塩基配列からなるものとすることができる。
【００２４】
工程(1)においては、配列番号1〜41のそれぞれに対応した41種類のALと、配列番号42〜80のそれぞれに対応した39種類のBLを、1つの反応系に存在させてもよい。または配列番号283〜328のそれぞれに対応した46種類のALと、配列番号329〜350のそれぞれに対応した22種類のBLを、1つの反応系に存在させてもよい。本発明者らの検討によると、複数のプライマーを同時に存在させた場合であっても、効率よく増幅することができる。
【００２５】
Lプライマーのアダプター部分は、当業者であれば適宜設計することができる。アダプター部分は、必要に応じ、増幅したcDNAをベクターに組み込むために必要な、制限酵素により認識される配列を含んでいてもよい。アダプター部分はまた、工程(2)において、アダプタープライマーが会合する領域となるので、そのために必要な長さを考慮して設計することができる。長さは、例えば、12〜30塩基長とすることができ、13〜27塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。ALのアダプター部分の一例は、配列番号81の塩基配列からなるものである。また、BLのアダプター部分の一例は、配列番号82の塩基配列からなるものである。
【００２６】
Lプライマー全体の長さは、構成するアダブター部分、リーダー領域会合部分、場合によりそれ以外の部分を足した長さとなる。24〜65塩基長としてもよく、30〜60塩基長としてもよい。
【００２７】
工程(1)では、Lプライマーとともに、定常領域の一部に会合可能な15〜25塩基長の塩基配列のCプライマー1または3'非翻訳領域の一部に会合可能な15〜25塩基長のUTRプライマー1を用いる。これらのプライマーの配列は、好ましくは、ベクターのコンタミによる増幅を回避する観点から選択するとよい。 Cプライマー1を用いる態様により得られた最終産物であるTCRのcDNAは、通常、定常領域が不完全である。そのため、不足の配列をOverlap PCRや相同組換を用いてPCR産物に付加することで定常領域を再構築して、発現ベクターへ組込むこととなる。この場合、再構築する部分のDNA配列は、通常ヒト遺伝子のコドン使用頻度に基づいてコドンが最適化されたDNA配列を持つように設計される。コドン最適化配列と野生型配列とで塩基配列が異なっている部位が3’末端となるようにCプライマー1を設計することにより、野生型の定常領域を有するDNAからのみ、PCRにより増幅されうる。UTRプライマー1を用いる態様により得られた産物であるTCRのcDNAは、通常、終止コドンを含む完全なcDNAである。
【００２８】
Cプライマー1またはUTRプライマー1の全体の長さは、12〜30塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。Ca_RV1の一例は、配列番号83または配列番号351の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。 Cb_RV1の一例は、配列番号84または配列番号353および配列番号354の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。AC_UTR1の一例は、配列番号277の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。BC_UTR1の一例は、配列番号279および／または配列番号280の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２９】
工程(1)に使用するプライマーはいずれも、公知の方法により合成することができる。
【００３０】
工程(1）は、上述のプライマーを用いて、1個の細胞からのcDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物1を得る工程である。目的のT細胞を特定し、1個をPCRのための容器へソートするには、種々の既存の手段、例えばフローサイトメトリーまたは特殊なチップを用いたイムノスポットアッセイ（Immunospot-array assay on a chip、ISAAC）法により、実施することができる。
【００３１】
フローサイトメトリー (flow cytometry) は、典型的には、2種類の表面マーカーに着目し、双方が陽性である細胞を、分類するために用いられる。2種類の表面マーカーの一方は、CD4またはCD8であり得、そのため目的の1個の細胞のソートには、CD4抗体または抗CD8抗体を用いることができる。目的の1個の細胞のソートは、ISAAC法によっても実施することができる。この方法は、基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルが1つのT細胞のみが入る大きさであるマイクロウェルアレイ(チップ)を用いて行うものである。この方法に関しては、本発明者らの先の出願（例えば、特開2009-34047公報（特許4148367））を参照することができる。ソートには、抗原、抗原ペプチド、またはMHC分子と抗原ペプチドとの複合体を多量体化したもの（例えば、MHC/p四量体）等を用いることもできる。
【００３２】
必要に応じ、用いる1個の細胞は、予めTCR遺伝子増幅上有効な条件で刺激してもよい。TCR遺伝子増幅上有効な条件とは、PCRによる増幅が有効に行えるようにT細胞を処理する条件であり、これは通常、PCRを行うのに十分な程度にまで、鋳型となりうるmRNAを増やす条件である。この条件は、例えば、少なくともIL-2の存在下で、好ましくはIL-2およびPHAの存在下で、処理上有効な期間、T細胞を維持することある。また、刺激の際に、T細胞を集団で維持すると、鋳型となりうるmRNAを効果的に増やせる場合がある。TCR遺伝子増幅上有効な条件での刺激に関しては、本発明者らの先の出願（例えば、WO2014/017533）を参考にすることができる。なお、本発明者らの検討によると、CD4陽性T細胞であってもCD8陽性T細胞であっても、刺激処理なしで本発明によりTCRを増幅することができている。
【００３３】
1個の細胞から鋳型となるcDNAは、細胞からmRNAを得て、得られたmRNAから逆転写反応を経て、得ることができる。mRNA から逆転写によりcDNAを増幅するRT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)法においては、total RNAやmRNAの抽出操作を行うことなく、細胞からダイレクトにmRNAを分離する方法が開発されている。例えば、Oligo（dT）でコーティングした 磁気ビーズを用いる方法は、mRNAの分離が短時間で完了できる。本発明においてはこのような方法を好適に利用できる。
【００３４】
工程(1)のPCRを実施するための条件は、当業者であれば適宜設計できる。工程(1)は、1〜数十ulの系で行うことができ、緩衝液、dNTP、ポリメラーゼ等、一般的なPCRに用いられる試薬および酵素が、工程(1)にも同様に使用できる。プライマーの濃度は、特に限定されないが、例えばLプライマー各々は、0.01〜1uMとすることができ、Cプライマー１またはUTRプライマー1各々は、Lプライマーと同様か、またはその数倍〜数十倍の濃度、例えば0.02〜5uMとすることができる。PCRのための温度および時間は、使用するポリメラーゼに応じて、一般的なPCRの場合と同様に設定できる。また、工程(1)を実施するために、既存のPCRのための装置が利用できる。
【００３５】
工程(1)においては、LプライマーとCプライマー1またはUTRプライマー1に挟まれた領域が増幅される。得られる増幅産物1は、LプライマーとCプライマー1またはUTRプライマー1を含んでおり、したがって、アダプター部分、翻訳開始コドン、リーダー領域、V領域、および定常領域の全部または一部を含む。好ましい態様においては、工程(1)においては、TCRαおよびTCRβがペアで増幅され、したがって、増幅産物1はTCRαおよびTCRβのペアを含み、TCRαおよびTCRβのそれぞれが、アダプター部分、翻訳開始コドン、リーダー領域、V領域、および定常領域の全部または一部を含む。
【００３６】
工程(1)の鋳型となる1個の細胞からのcDNAを得るための逆転写反応と工程(1）のPCRとは、別々のチューブで順次行ってもよく、同一チューブで連続的に行ってもよい。同一チューブで行う場合、逆転写反応のプライマーとして、dT primerの代わりにTCRの定常領域に特異的なPrimerへ変更することができ、また工程(1)のPCRの際の反応容積が、別々のチューブで行う場合に比較して、減じたものとなる。これらの条件の変更は、最終的に得られるTCRαβのペアでの増幅率を上昇させうる。
【００３７】
〔工程(2)〕
工程(2)では、下記の2つのプライマーが使用される：
（2）下記のアダプタープライマーと、下記のCプライマー2またはUTRプライマー2とを用いて、増幅産物1を鋳型としてPCRを行い、増幅産物2を得る工程；
・増幅産物1のアダプター部分に会合可能な、15〜25塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のCプライマー2または3'非翻訳領域の一部であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流である一部に会合可能な、15〜25塩基長のUTRプライマー2。
工程(1)でアダプター部分を含むLプライマーを使用しているために、工程(2)では1組または2組のプライマーペアを用いて増幅を行うことができる。
【００３８】
工程(2)では、TCRαの2段階目の増幅のためのアダプタープライマーおよびCプライマー2（Ca_RV2）またはUTRプライマー2（AC_UTR2）を使用し、TCRβの2段階目の増幅のためのアダプタープライマーおよびCプライマー2（Cb_RV2）またはCプライマー2（BC_UTR2）を使用することができる。工程(2)は、TCRαを増幅するための反応と、TCRβを増幅するための反応とを別々に実施してもよい。この場合、TCRαを増幅するための反応系では、TCRαのためのアダプタープライマーとCa_RV2またはAC_UTR2を使用し、TCRβを増幅するための反応系では、TCRβのためのアダプタープライマーとCb_RV2またはBC_UTR2を使用する。すでに述べたように、TCRβの定常領域の遺伝子は2種類あり、非翻訳領域の部分の同一性は低いので、両方を増幅可能なように、それぞれに会合する2種類のBC_UTR2（BC1_UTR2およびBC2_UTR2と表すことがある。）を用いてもよい。
【００３９】
アダプタープライマーは、工程(1)で使用したLプライマーのアダプター部分に基づき、設計することができる。長さは、例えば、12〜30塩基長とすることができ、13〜27塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。アダプタープライマーの配列は、アダプター部分に会合可能である限り特に限定されないが、例えば、アダプター配列に相補的な配列の全部または一部とすることができる。
【００４０】
Cプライマー2は、TCRのcDNAの定常領域の一部であって、Cプライマー1が会合する領域より上流に会合可能なように設計される。好ましくは、Cプライマー1を設計する場合と同様に、ベクターのコンタミによる増幅を回避する観点から、配列を選択するとよい。UTRプライマー2は、TCRの3'非翻訳領域であって、UTRプライマー1が会合する領域より上流に会合可能なように設計される。
【００４１】
Cプライマー2またはUTRプライマー2の全体の長さは、12〜30塩基長としてもよく、15〜25塩基長としてもよい。 Ca_RV2の一例は、配列番号835または配列番号352の塩基配列からなる。 Cb_RV2の一例は、配列番号86または配列番号355の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。AC_UTRの一例は、配列番号278の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。BC_UTR2の一例は、配列番号281および／または配列番号282の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４２】
工程(2)に使用するプライマーはいずれも、公知の方法により合成することができる。
【００４３】
工程(2)のPCRを実施するための条件は、当業者であれば適宜設計できる。工程(2)は工程(1)と同様、1〜数十ulの系で行うことができ、緩衝液、dNTP、ポリメラーゼ等、一般的なPCRに用いられる試薬および酵素が、工程(2)にも同様に使用できる。プライマーの濃度は、特に限定されないが、アダプタープライマーおよびCプライマー2は各々、例えば0.02〜5uMとすることができる。PCRのための温度および時間は、使用するポリメラーゼに応じて、一般的なPCRの場合と同様に設定できる。また、工程(2)を実施するために、既存のPCRのための装置が利用できる。
【００４４】
工程(2)においては、アダプタープライマーとCプライマー2またはUTRプライマー2に挟まれた領域が増幅される。得られる増幅産物2は、アダプタープライマーとCプライマー2またはUTRプライマー2を含んでおり、したがって、アダプター部分、翻訳開始コドン、リーダー領域、V領域、および定常領域の全部または一部を含む。好ましい態様においては、工程(2)においては、TCRαおよびTCRβは別々の反応系で増幅されるが、TCRαおよびTCRβのそれぞれが、アダプター部分、翻訳開始コドン、リーダー領域、V領域、および定常領域の全部または一部を含む。
【００４５】
工程(1)でCプライマー1の代わりに、3'非翻訳領域の一部に会合可能なUTRプライマー1を用い、工程(2)でCプライマー2の代わりに、3'非翻訳領域の一部に会合可能なUTRプライマー2を用いた場合、得られるPCR産物（完全なcDNA）を鋳型に、in vitro で合成して得られるIVT RNAを細胞に遺伝子導入することで、TCRを細胞に発現することができる。Cプライマー1を用いて得られるPCR産物を鋳型に合成したIVT RNAでは、定常領域が不完全であるので、TCRを細胞に発現させることはできない。RNAを用いてTCRを細胞に発現させたい場合は、UTRプライマー1を用いる方法が、より好ましい。
〔キット、その他〕
本発明により、TCR cDNAの増幅のためのプライマー、プライマーセット、およびキットが提供される。キットは、上述の各種プライマーを含むほか、緩衝液、dNTP、ポリメラーゼ等のPCRのために必要な試薬や酵素を含んでいてもよい。また、キットを使用するためのインストラクションを含んでもよい。
【００４６】
本発明によりTCR cDNAを増幅するために用いる1個の細胞は、TCR遺伝子治療により処置可能な疾患または状態にある対象（患者）由来のT細胞とすることができる。このような疾患または状態の典型的な例は、がんまたは感染症であり、好ましくは、がんである。本発明の適用が期待できる疾患には、がんまたは感染症が含まれ、がんには、成人のがんおよび幼児期のがんが含まれ、また消化器がん、肺がん、および難治性の食道がん、頭頸部がん、卵巣がん、多発性骨髄種等が含まれる。感染症には、ウイルス感染症（例えば、後天性免疫不全症候群(AIDS)、成人T細胞性白血病、エボラ出血熱、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群 (SARS)、進行性多巣性白質脳症、水痘、帯状疱疹、手足口病、デング熱、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹 、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、ハンタウイルス腎出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱）、細菌感染症、リケッチア感染症、寄生性感染症、プリオン病が含まれる。「処置」は、特に記載した場合を除き、発症リスクの低減、予防、治療、進行の抑制を含む。
【００４７】
〔従来法との比較等〕
上述のように、工程(1)および工程(2)を含み、2段階で実施される本発明の増幅方法は、従来法とは様々な点で相違する、従来法との相違点を、図3に基づき説明する。
【００４８】
Moyseyら（非特許文献2）の従来法（(図3の上方)では、大腸菌での発現を目的にcDNAを増幅している。翻訳開始コドンを含まないリーダー配列の5'-プライマーを用いて1段階目のPCRを行った後、V領域の5'-プライマーで2段階目のPCRを行い、リーダー配列をコードする領域を含まないcDNAを増幅している。リーダー配列は大腸菌の発現系では、不必要な配列であるが、動物細胞にTCRを発現させる場合には必要不可欠な配列である。従って彼らの方法で得られるcDNAは、細胞での発現に適していない。得られたTCR cDNAを細胞で発現させるためには、別途、リーダー配列を付加する必要があった。これに対し本発明の方法(図3の下方)では、翻訳開始コドンを含んだリーダー配列の5'-プライマーを用いて第一段階目のPCRを行った後、第一段階目において使用したLプライマーに付加してあるアダプター部分に会合するアダプタープライマーを用いて、2段階目のPCRを行う。そのため、完全なリーダー領域を含んだTCR cDNAが増幅できる。
【００４９】
従来法では、TCRを増幅するために、500個以下の細胞が必要であり、１個のT細胞からTCRを増幅することができていない。そのため、がん特異的T細胞からがん特異的TCRを取得するためには、がん特異的T細胞のクローンを作製して増殖させ、500個以下の細胞からTCRを増幅する必要があり、時間がかかった（約3ヶ月）。これに対し本発明の増幅方法では、１個のT細胞よりTCR cDNAを効率良く増幅することが可能であり、がん特異的TCRを取得するのに、T細胞クローンを得る必要がなく、最短10日間でがん特異的TCR cDNAを取得し、検証することが可能である。
【００５０】
本発明によるTCR cDNAの増幅のためのより詳細な例を、図4に模式的に示した。以下、本発明を比較例および実施例を示して説明する。
【実施例】
【００５１】
〔RT-PCR  比較例〕
5’-RACE法(従来法)を用いた1個のCD4/CD25陽性T細胞からのTCR cDNAの増幅を試みた。非特許文献1の方法にしたがって実施した。結果を図5に示した。αβのペアでの増幅率は63％であった。また増幅産物の長さは均一ではなかった。【００５２】
〔PCR Primerの設計〕
IMGT(http://www.imgt.org)より、ヒトTCRのLeader peptideの配列を取得し、翻訳開始コドンを含む20 塩基の配列にアダプター配列を付加したオリゴヌクレオチドをLeader Primerとして合成した。塩基配列が同一のものを除き、最終的にαについては41種類、βについては39種類のLeader Primerを合成した(図1)。PCRの際は定常領域から設計した下記のConstant PrimerとLeader Primerを組みわせてTCR cDNAの増幅を行った。
Ca_RV1: AGGTTCGTATCTGTTTCAAAGCTT（配列番号83）
Ca_RV2: GGTAAAGCCACAGTCTGCTCTA（配列番号84）
Cb_RV1: TGTGACACATTTGTTTGAGAA（配列番号85）
Cb_RV2: CTGTGCACCTCCTTCCCA（配列番号86）【００５３】
〔RT-PCR  実施例1〕 
1. 単一CD4/CD25陽性T細胞の取得
ヒト末梢血からリンホセパールI (IBL)を用いて末梢血リンパ球を単離し、抗CD4抗体および抗CD25抗体で染色後、セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD4/CD25陽性の単一細胞を、7 ulのLysis Buffer [Dynabeads dT(25) 10〜35 ug, Lysis/Binding Buffer 7 ul (Dynabeads mRNA Direct Kit, Ambion)]の入った各PCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００５４】
2. 逆転写反応
1.の過程より得られたサンプルを解凍し、混合後5分間、室温でインキュベーションした後、DynaMag 96 side Magnet (Life technologies)にセットして20秒間静置し、Lysis Bufferを取り除き、10 mM Tris-Cl, pH8.5を10 ul加え、ビーズを懸濁し、ふたたびDynaMag 96 side Magnetにセットして20秒間静置し、10 mM Tris-Cl, pH8.5を取り除いた。cDNAの合成にはPrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)を用いた。RT反応液 [RNase free dH2O 13.5 ul, 5×PrimeScript II Buffer 4.0 ul, dNTP mixture (10 mM each), 1.0 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 1.0 ul, RNase Inhibitor(40 U/ul) 0.5 ul]の5 ulを各PCRチューブへ加え混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、42℃で60分間、逆転写反応を行った。【００５５】
3. 1st PCR
2.の過程により得られたRT反応液をDynaMag 96 side Magnetにセットして20秒間静置し、RT反応液を取り除き、10 ulの1st PCR反応液[2× PrimeStar GC buffer (TaKaRa) 10.0 ul, H20 1.7 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, AL primer mix (each 2 uM) 0.4 ul, BL primer mix (each 2 uM) 0.4 ul, Ca_RV1 (10uM) 0.4 ul, Cb_RV1(10uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase (TaKaRa) 0.1 ul]を加え混合し、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にて98℃, 1 min, 35 cycle [98 ℃, 10 sec, 50℃, 5 sec, 72℃, 40 sec]の反応を行った。AL: TCRαに対するLeader Primer、BL: TCRβに対するLeader Primer。【００５６】
4．2nd PCR
3.の過程より得られた1st PCR反応液をH2Oで10倍希釈したもの2 ulを18 ulの2nd PCR反応液の入った各PCRチューブへ加え混合し、98℃, 1 min, 35 cycle [98℃, 10 sec, 52℃, 5 sec, 72℃, 30 sec]で反応を行った。2nd PCRではLeader Primerに付加してあるAdaptor配列のPrimer、P2A-CおよびBES-AP (図1)とConstant Primerを用いてTCRαおよびTCRβを、それぞれ別のチューブで増幅した。2nd PCR反応液組成は次の通り。TCRα 2nd PCR 溶液[2x PrimeStar GC buffer 10.0 ul, H20 5.5 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, P2A- (10uM) 0.4 ul, Ca_RV2(10uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase 0.1 ul]、TCRβ 2nd PCR 溶液[2× PrimeStar GC buffer 10.0 ul, H20 5.5 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, BES-AP(10uM) 0.4 ul, Cb_RV2 (10uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase 0.1 ul]。【００５７】
5. TCR cDNAの増幅確認
4.の過程で得られた反応液4 μlを、1.5% アガロースゲルを用いて電気泳動を行いPCR産物の増幅を確認した。結果を図6に示した。αβのペアでの増幅率は86.6％であった。【００５８】
〔RT-PCR  実施例2〕
1. ガン抗原特異的単一CD8陽性T細胞の取得
抗原刺激され活性化したガン抗原T細胞クローンを抗CD8抗体で染色後、セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD8陽性の単一細胞を3 ulのPrimer mix [Oligo dT primer (50 uM) 0.25 ul, dNTP mixture (2.5 mM each) 1.0 ul, RNase free dH2O 1.75 ul]の入ったPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００５９】
2. 逆転写反応
cDNAの合成にはPrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)を用いた。1.の過程より得られたサンプルを解凍・混合した後、65℃で5分間インキュベーションし、氷上で急冷した。各PCRチューブへRT反応液 [RNase free dH2O 2 ul, 5×PrimeScript II Buffer 10 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 1.0 ul, RNase Inhibitor (40 U/ul) 2 ul]の2 ulを加え、混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、42℃で60分間、逆転写反応を行い、70℃, 15 minで酵素を失活させた。【００６０】
3. 1st PCR
2.の過程により得られたRT反応液5 ul含む各PCRチューブへ、15 ulの1st PCR反応液[2× PrimeStar GC buffer (TaKaRa) 10.0 ul, H20 1.7 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, AL primer mix (each 2 uM) 0.4 ul, BL primer mix (each 2 uM) 0.4 ul, Ca_RV1 (10uM) 0.4 ul, Cb_RV1 (10 uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase (TaKaRa) 0.1 ul]を加え混合し、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にて98℃, 1 min, 35 cycle[98℃, 10 sec, 50℃, 5 sec, 72℃, 40 sec]の反応を行った。【００６１】
4. 2nd PCR
実施例1の4.と同様に実施した。【００６２】
5. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図7に示した。単一の長さのcDNAの増幅が見られた。【００６３】
〔RT-PCR  実施例3〕
1. 単一CD4陽性T細胞の取得
ヒト末梢血からリンホセパールI (IBL)を用いて末梢血リンパ球を単離し、抗CD4抗体で染色後セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD4陽性の単一細胞を空のPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００６４】
2. 逆転写反応
cDNAの合成にはPrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)を用いた。RT反応液 [RNase free dH2O 12.5 ul, 5×PrimeScript II Buffer 4.0 ul, dNTP mixture (10 mM each), 1.0 ul, Oligo dT primer (50 uM) 1.0 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 1.0 ul, RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.5 ul]の5 ulを1.の過程より得られた各PCRチューブへ加え、混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、42℃で60分間、逆転写反応を行った。【００６５】
3. 1st PCR
実施例2の3.と同様に実施した。【００６６】
4. 2nd PCR
実施例1の4.と同様に実施した。【００６７】
5. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図8に示した。TCRαは15サンプル中13サンプルで、TCRβは全てのサンプルでcDNAの増幅が見られ、αβのペアでの増幅率は86.7％であった。【００６８】
〔RT-PCR  実施例4〕
1. 単一CD8陽性T細胞の取得
ヒト末梢血からリンホセパールI(IBL)を用いて末梢血リンパ球を単離し、抗CD8抗体で染色後セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD8陽性の単一細胞を空のPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００６９】
2. 逆転写反応
実施例3の2.と同様に実施した。【００７０】
3. 1st PCR
実施例2の3.と同様に実施した。【００７１】
4. 2nd PCR
実施例1の4.と同様に実施した。【００７２】
5. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図9に示した。TCRαβのペアでの増幅率は84％であった。【００７３】
〔RT-PCR  実施例5〕
1. 単一CD8陽性T細胞の取得
ヒト末梢血からリンホセパールI(IBL)を用いて末梢血リンパ球を単離し、抗CD8抗体で染色後セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD8陽性の単一細胞を空のPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００７４】
2. One STEP RT-PCR
逆転写反応および1st PCRを連続的に行うために、RT-PCR反応液[2×PrimeSTAR GC Buffer 2.5 ul, RNase free dH2O 1.475 ul, AL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, BL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, Ca_RV1 (10uM) 0.1 ul, Cb_RV1 (10 uM) 0.1 ul, 2.5 mM dNTP 0.4 ul, RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.1 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 0.1 ul, PrimeStar HS DNA polymerase (TaKaRa) 0.025 ul]の5 ulを1.の過程より得られた各PCRチューブへ加え、混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、45 ℃, 40 min, 98 ℃, 1 min, 30 cycle[98 ℃, 10 sec, 52 ℃, 5 sec, 72 ℃, 1 min]の反応を行い、逆転写反応と1st PCRを同一チューブで連続的に行った。【００７５】
3. 2nd PCR
実施例1の4.と同様に実施した。【００７６】
4. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図11に示した。TCRαβのペアでの増幅率は93％であった。【００７７】
〔RT-PCR  実施例6〕
1. 単一CD8陽性T細胞の取得
ヒト末梢血からリンホセパールI(IBL)を用いて末梢血リンパ球を単離し、抗CD8抗体で染色後セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD8陽性の単一細胞を空のPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００７８】
2. One STEP RT-PCR
開始コドンから終止コドンを含む完全なcDNAを増幅するために、3’非翻訳領域から設計した下記のPrimerを用いていてRT-PCRを行った。
AC_UTR1: AGAGGGAGAAGAGGGGCAAT（配列番号277）
AC_UTR2: AGGGAGCACAGGCTGTCTTA（配列番号278）
BC1_UTR1: CTGGCAAAAGAAGAATGTGT（配列番号279）
BC2_UTR1: ACACAGATTGGGAGCAGGTA（配列番号280）
BC1_UTR2: CCATGACGGGTTAGAAGCTC（配列番号281）
BC2_UTR2: GGATGAAGAATGACCTGGGAT（配列番号282）【００７９】
逆転写反応および1st PCRを連続的に行うために、RT-PCR反応液[2×PrimeSTAR GC Buffer 2.5 ul, RNase free dH2O 1.375 ul, AL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, BL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, AC_UTR1 (10uM) 0.1 ul, BC1_UTR1 (10 uM) 0.1 ul, BC2_UTR1 (10 uM) 0.1 ul, 2.5 mM dNTP 0.4 ul, RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.1 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 0.1 ul, PrimeStar HS DNA polymerase (TaKaRa) 0.025 ul]の5 ulを1.の過程より得られた各PCRチューブへ加え、混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、45 ℃, 40 min, 98 ℃, 1 min, 30 cycle[98 ℃, 10 sec, 52 ℃, 5 sec, 72 ℃, 1 min]の反応を行い、逆転写反応と1st PCRを同一チューブで連続的に行った。【００８０】
3．2nd PCR
2.の過程より得られた1st PCR反応液をH2Oで10倍希釈したもの2 ulを18 ulの2nd PCR反応液の入った各PCRチューブへ加え混合し、98 ℃, 1 min, 35 cycle [98 ℃, 10 sec, 52 ℃, 5 sec, 72 ℃, 30 sec]で反応を行った。2nd PCRではLeader Primerに付加してあるAdaptor配列のPrimer、P2A-CおよびBES-AP (図1)と3’UTR  Primerを用いてTCRαおよびTCRβを、それぞれ別のチューブで増幅した。2nd PCR反応液組成は次の通り。TCRα 2nd PCR 溶液[2x PrimeStar GC buffer 10.0 ul, H20 5.5 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, P2A-C (10uM) 0.4 ul, AC_UTR2  (10uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase 0.1 ul]、TCRβ 2nd PCR 溶液[2× PrimeStar GC buffer 10.0 ul, H20 5.1 ul, 2.5 mM dNTP 1.6 ul, BES-AP(10uM) 0.4 ul, BC1_UTR2 (10uM) 0.4 ul, BC2_UTR2 (10uM) 0.4 ul, PrimeStar HS DNA polymerase 0.1 ul]。【００８１】
4. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図12に示した。TCRαβのペアでの増幅率は92％であった。【００８２】
〔RT-PCR  実施例7〕
1．マウスTCR用Primerの設計
ヒトTCRと同様にLeader Primerを設計した。図13にその配列を示す。また、定常領域のConstant Primerの配列を下記に示す。
mCa_RV1: CATCACAGGGAACGTCTGAACTG（配列番号351）
mCa_RV2: TCGGCACATTGATTTGGGAGTCA（配列番号352）
mCb1_RV1: GTAATCCCACAGTCTGCTCG（配列番号353）
mCb2_RV1: GTGATTCCACAGTCTGCTCG（配列番号354）
mCb_RV2: CAAGCACACGAGGGTAGCCTTT（配列番号355）【００８３】
2. マウスCD4陽性T細胞の取得
マウス脾臓よりリンパ球を単離し、抗CD4抗体で染色後セルソーターFACS Aria (BD)を用いてCD4陽性の単一細胞を空のPCRチューブへ取得した。取得したサンプルは-80℃フリーザーで凍結保管した。【００８４】
3． One STEP RT-PCR
逆転写反応および1st PCRを連続的に行うために、RT-PCR反応液[2×PrimeSTAR GC Buffer 2.5 ul, RNase free dH2O 1.425 ul, mAL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, mBL primer mix (each 2 uM) 0.1 ul, mCa_RV1 (10uM) 0.1 ul, mCb1_RV1 (10 uM) 0.075 ul, mCb2_RV1 (10 uM) 0.075 ul, 2.5 mM dNTP 0.4 ul, RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.1 ul, PrimeScript II RTase (200 U/ul) 0.1 ul, PrimeStar HS DNA polymerase (TaKaRa) 0.025 ul]の5 ulを1.の過程より得られた各PCRチューブへ加え、混合した後、GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)にセットし、45℃, 40 min, 98 ℃, 1 min, 30 cycle[98 ℃, 10 sec, 52 ℃, 5 sec, 72 ℃, 1 min]の反応を行い、逆転写反応と1st PCRを同一チューブで連続的に行った。【００８５】
4. 2nd PCR
PrimerをCa_RV2をmCa_RV2に、Cb_RV2をmCbRV2に変更し、実施例1の4.と同様に実施した。【００８６】
5. TCR cDNAの増幅確認
実施例1の5.と同様に実施した。結果を図14に示した。TCRαβのペアでの増幅率は88％であった。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
SEQ ID NO.:1〜41  AL
SEQ ID NO.:42〜80  BL
SEQ ID NO.:81  P2A-C
SEQ ID NO.:82  BES-AP
SEQ ID NO.:83  Ca_RV1
SEQ ID NO.:84  Ca_RV2
SEQ ID NO.:85  Cb_RV1
SEQ ID NO.:86  Cb_RV2
SEQ ID NO.:87〜140  TCRα翻訳開始コドン付近の配列（上流60bp+リーダー配列全長）
SEQ ID NO.:141〜188  TCRβ翻訳開始コドン付近の配列（上流60bp+リーダー配列全長）
SEQ ID NO.:189〜276  従来法の1stPCR用5'-Primer
SEQ ID NO.:277  AC_UTR1
SEQ ID NO.:278  AC_UTR2
SEQ ID NO.:279  BC1_UTR1
SEQ ID NO.:280  BC2_UTR1
SEQ ID NO.:281  BC1_UTR2
SEQ ID NO.:282  BC2_UTR2
SEQ ID NO.:283〜328  mAL
SEQ ID NO.:329〜350  mBL
SEQ ID NO.:351  mCa_RV1
SEQ ID NO.:352  mCa_RV2
SEQ ID NO.:353  mCb_RV1
SEQ ID NO.:354  mCb_RV1
SEQ ID NO.:355  mCb_RV2
【図１】
2015182749.tif 000002
【図２】
2015182749.tif 000003
【図３】
2015182749.tif 000004
【図１０Ａ】
2015182749.tif 000005
【図１０Ｂ】
2015182749.tif 000006
【図１３】
2015182749.tif 000007
【図４】
2015182749.tif 000008
【図５】
2015182749.tif 000009
【図６】
2015182749.tif 000010
【図７】
2015182749.tif 000011
【図８】
2015182749.tif 000012
【図９】
2015182749.tif 000013
【図１１】
2015182749.tif 000014
【図１２】
2015182749.tif 000015
【図１４】
2015182749.tif 000016
【配列表】
2015182749000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月30日(2016.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（１）および工程（２）を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ｃＤＮＡの増幅方法：
（１）下記のＬプライマーの少なくとも１つと、下記のＣプライマー１またはＵＴＲプライマー１とを用いて、１個の細胞からのＴＣＲ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物１を得る工程；
・１５〜２５塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、ＴＣＲ  ｃＤＮＡのリーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流のＴＣＲ  ｃＤＮＡの一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のリーダー領域会合部分を含む、３０〜６０塩基長のＬプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な１５〜２５塩基長のＣプライマー１または３’非翻訳領域の一部に会合可能な１５〜２５塩基長のＵＴＲプライマー１；
（２）下記のアダプタープライマーと、下記のＣプライマー２またはＵＴＲプライマー２とを用いて、増幅産物１を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物２を得る工程；
・増幅産物１のアダプター部分に会合可能な、１５〜２５塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Ｃプライマー１が会合する領域より内側である一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のＣプライマー２または３’非翻訳領域の一部であって、ＵＴＲプライマー１が会合する領域より内側である一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のＵＴＲプライマー２。
【請求項２】
工程（１）において、
Ｌプライマーとして、ＴＣＲαに対応したＬプライマー（ＡＬ）の少なくとも一つ、およびＴＣＲβに対応したＬプライマーの少なくとも一つ（ＢＬ）を使用し；
Ｃプライマー１として、ＴＣＲαに対応したＣプライマー１（Ｃａ＿ＲＶ１）、およびＴＣＲβに対応したＣプライマー１（Ｃｂ＿ＲＶ１）を使用し、またはＵＴＲプライマー１として、ＴＣＲαに対応したＵＴＲプライマー１（ＡＣ＿ＵＴＲ１）、およびＴＣＲβに対応したＵＴＲプライマー１（ＢＣ＿ＵＴＲ１）を使用し、
ＴＣＲαとＴＣＲβとが同時に増幅される、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
ＡＬのリーダー領域会合部分が、配列番号８７〜１４０のいずれか１つの塩基配列の一部からなり、ＢＬのリーダー領域会合部分が、配列番号１４１〜１８８のいずれか１つの塩基配列の一部からなる、請求項２に記載の増幅方法。
【請求項４】
ＡＬのリーダー領域会合部分が、配列番号１〜４１のいずれか一の塩基配列からなり、かつＢＬのリーダー領域会合部分が、配列番号４２〜８０のいずれか一の塩基配列からなるか、またはＡＬのリーダー領域会合部分が、配列番号２８３〜３２８のいずれか一の塩基配列からなり、かつＢＬのリーダー領域会合部分３が、配列番号３２９〜３５０のいずれか一の塩基配列からなる、請求項２に記載の増幅方法。
【請求項５】
Ｌプライマーとして、配列番号１〜４１のそれぞれに対応した４１種類のＡＬと、配列番号４２〜８０のそれぞれに対応した３９種類のＢＬを用いるか、またはＬプライマーとして、配列番号２８３〜３２８のそれぞれに対応した４６種類のＡＬと、配列番号３２９〜３５０のそれぞれに対応した２２種類のＢＬを用いる、請求項４に記載の増幅方法。
【請求項６】
ＡＬのアダプター部分が、配列番号８１の塩基配列からなり、ＢＬのアダプター部分が配列番号８２の塩基配列からなる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の増幅方法。
【請求項７】
Ｃａ＿ＲＶ１が、配列番号８３または配列番号３５１の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、Ｃｂ＿ＲＶ１が、配列番号８４または配列番号３５３および配列番号３５４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、または
ＡＣ＿ＵＴＲ１が、配列番号２７７の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ＢＣ＿ＵＴＲ１が、配列番号２７９および／または配列番号２８０の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、
請求項２〜６のいずれか１項に記載の増幅方法。
【請求項８】
Ｃプライマー２として、ＴＣＲαに対応したＣプライマー２（Ｃａ＿ＲＶ２）、およびＴＣＲβに対応したＣプライマー２（Ｃｂ＿ＲＶ２）を使用し、Ｃａ＿ＲＶ２が、配列番号８５または配列番号３５２の塩基配列からなり、Ｃｂ＿ＲＶ２が、配列番号８６または配列番号３５５の塩基配列からなる、または
ＵＴＲプライマー２として、ＴＣＲαに対応したＵＴＲプライマー２（ＡＣ＿ＵＴＲ２）、およびＴＣＲβに対応したＣプライマー２（ＢＣ＿ＵＴＲ２）を使用し、ＡＣ＿ＵＴＲ２が、配列番号２７８の塩基配列からなり、ＢＣ＿ＵＴＲ２が、配列番号２８１および／または配列番号２８２の塩基配列からなる、
請求項２〜７のいずれか１項に記載の増幅方法。
【請求項９】
以下を含む、ＴＣＲ  ｃＤＮＡの増幅のための、キット：
・１５〜２５塩基長のアダプター部分、およびその下流に連結された、ＴＣＲ  ｃＤＮＡのリーダー領域の翻訳開始コドンを含む一部またはその上流のＴＣＲ  ｃＤＮＡの一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のリーダー領域会合部分を含む、３０〜６０塩基長のＬプライマー、
・定常領域の一部に会合可能な１５〜２５塩基長のＣプライマー１または３’非翻訳領域の一部に会合可能な１５〜２５塩基長のＵＴＲプライマー１；
・増幅産物１のアダプター部分に会合可能な、１５〜２５塩基長のアダプタープライマー、
・定常領域の一部であって、Ｃプライマー１が会合する領域より内側である一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のＣプライマー２または３’非翻訳領域の一部であって、ＵＴＲプライマー１が会合する領域より内側である一部に会合可能な、１５〜２５塩基長のＵＴＲプライマー２。
【請求項１０】
ＡＬのリーダー領域会合部分が、配列番号８５〜１４０のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能であり、ＢＬのリーダー領域会合部分が、配列番号１４１〜１８８のいずれか１つの塩基配列からなる領域に会合可能である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ＡＬのリーダー領域会合配列が、配列番号１〜４１のいずれか一の塩基配列からなり、かつＢＬのリーダー領域会合配列が、配列番号４２〜８０のいずれか一の塩基配列からなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
配列番号１〜４１のそれぞれに対応した。４１種類のＡＬと、配列番号４２〜８０のそれぞれに対応した３９種類のＢＬを含む、請求項１１に記載のキット。
【国際調査報告】
2015182749.tif 000017
2015182749.tif 000018
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