(57)【要約】  本発明の目的は、常温で長期間保存が可能であり、未処理の微細藻類と同等又はそれ以上の動物プランクトンに対する餌料価値を有する微細藻類含有動物プランクトン用飼料組成物を提供することにある。  １０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。
【請求項２】
高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物が封入された、レトルトパウチ。
【請求項８】
微細藻類を、１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付し、滅菌処理された微細藻類を得ることを含む、動物プランクトン用飼料組成物の製造方法。
【請求項９】
高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項８又は９記載の製造方法。
【請求項１１】
組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項８〜１１のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１３】
動物プランクトンがワムシ又はアルテミアである、請求項８〜１２のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１４】
動物プランクトンに対して、１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を給餌することを含む、動物プランクトンの養殖方法。
【請求項１５】
高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、請求項１４記載の養殖方法。
【請求項１６】
滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項１４又は１５記載の養殖方法。
【請求項１７】
滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項１６記載の養殖方法。
【請求項１８】
微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項１４〜１７のいずれか１項記載の養殖方法。
【請求項１９】
動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の養殖方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物、及び動物プランクトンを含む、動物プランクトンの養殖用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物プランクトン用餌料組成物、その製造方法、及び動物プランクトンの養殖方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの魚介類の種苗生産においてシオミズツボワムシ（以下、ワムシ）は初期餌料として必須であり、ほぼすべての種苗生産施設でワムシの培養が行われている。ワムシの培養は、市販の淡水クロレラ濃縮液が餌料として利用可能となったことで著しく培養が安定し、大量培養が容易になってきた。また、多くの魚介類の仔稚にとって必須脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのｎ−３系高度不飽和脂肪酸（ｎ−３ＨＵＦＡ）を細胞内に含有する淡水クロレラが商品化され、ＥＰＡを多く含有するナンノクロロプシスとともに、ワムシの栄養強化剤、又は種苗生産水槽への添加剤としても利用されている。【０００３】
本発明者らが実施したキジハタの種苗生産では、全長２９．３ｍｍの種苗１５万尾を生産するために要した経費（光熱水費、人件費を除く）のうち、ワムシ培養と飼育水への添加に要した淡水クロレラの経費は、実に７８％を占めた。このように、淡水クロレラ濃縮液購入費は種苗生産費の中で最も大きい割合を占めており、その市場規模は大きい。近年は韓国で生産された冷蔵淡水クロレラ濃縮液の日本への輸入販売も行われている。【０００４】
微細藻類の培養水槽に存在する細菌や原生動物などの微生物は、微細藻類を濃縮する過程で微細藻類と同様に濃縮されるため、微細藻類濃縮液には多くの微生物が混入している。これらの微生物の中には、微細藻類の細胞壁を分解する細菌が存在し（非特許文献１）、このような細菌によって微細藻類の分解と腐敗が進むと餌料価値が著しく低下してワムシ培養や種苗生産の不調の原因となる（非特許文献２）。【０００５】
微生物の繁殖と腐敗を防ぐために、微細藻類濃縮液は４℃で冷蔵保存する必要があり、冷蔵保存した場合の使用期限は製造から２０日間とされている。しかし、使用期限内であっても経時的な品質低下によるワムシ培養不調や種苗への悪影響を避けるために、種苗生産現場では可能な限り新鮮な微細藻類濃縮液を使用することが技術的な常識となっている。このため、ワムシ培養担当者と種苗生産担当者は微細藻類濃縮液の在庫管理に細心の注意を払う必要がある。また、このような冷蔵保存下での経時的な品質低下と短い使用期限のため、日本国内で生産された高品質な微細藻類濃縮液を海外へ輸出することは困難である。使用期限を超過した微細藻類濃縮物は微生物の増殖によって品質が低下し、ワムシの培養不調や種苗の疾病を引き起こす。【０００６】
淡水クロレラ等の濃縮液が市販されておらず冷蔵輸送技術が十分に発達していない諸外国（特に発展途上国）においては、飼料価値の劣る酵母類や自家培養したナンノクロロプシス等をワムシ培養の餌料として利用しており、不安定なワムシ培養に起因するワムシ給餌量の不足が種苗の大量生産のボトルネックとなっている。【０００７】
ワムシと同様に種苗生産の初期餌料として用いられるアルテミアのノープリウスは頑丈な細胞壁を持つ淡水クロレラやナンノクロロプシスを消化することができない。淡水クロレラやナンノクロロプシスをアルテミアが消化できるようになれば、アルテミア養殖の餌料、栄養強化、種苗生産水槽中での飢餓防止などの多くのメリットがある。現在ではアルテミアが消化できるように高圧ホモジナイザーで細胞壁を破砕したナンノクロロプシス（特許文献１）がマリンテック株式会社から市販されている（商品名：マリンアルファ）。【０００８】
非特許文献３には、クロレラの加熱処理による変化が記載されている。【０００９】
非特許文献４には、魚類養殖への藻類細菌の影響が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2005/027651
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Org Geochem, 25, 117-130, 1996
【非特許文献２】Aquaculture, 83, 237-248, 1989
【非特許文献３】Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 290, 81-91, 2003
【非特許文献４】Aquaculture, 256, 50-73, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、常温で長期間保存が可能であり、未処理のものと同等又はそれ以上の動物プランクトンに対する餌料価値を有する微細藻類濃縮液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ワムシやアルテミアに対する餌料価値を維持したまま、微藻類濃縮液中に混入した微生物を除去する方法について鋭意検討を行った。その結果、淡水クロレラやナンノクロロプシスの濃縮液を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）処理に付して滅菌すると、微細藻類自体死滅するものの、意外にも、生きた微細藻類の濃縮液と同等のワムシ又はアルテミアに対する餌料価値を維持していることを見出した。オートクレーブ処理した微細藻類濃縮液は、瓶やパウチなどの密閉容器に保存することで、微生物による腐敗が進行することなく、長期間室温で保存することができた。【００１４】
発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：【００１５】
［１］１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。
［２］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、［１］記載の組成物。
［３］組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［１］又は［２］記載の組成物。
［４］組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［３］記載の組成物。
［５］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［１］〜［４］のいずれか記載の組成物。
［６］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［１］〜［５］のいずれか記載の組成物。
［７］［１］〜［６］のいずれか記載の組成物が封入された、レトルトパウチ。
［８］微細藻類を、１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付し、滅菌処理された微細藻類を得ることを含む、動物プランクトン用飼料組成物の製造方法。
［９］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、［８］記載の製造方法。
［１０］組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［８］又は［９］記載の製造方法。
［１１］組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［１０］記載の製造方法。
［１２］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［８］〜［１１］のいずれか記載の製造方法。
［１３］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［８］〜［１２］のいずれか記載の製造方法。
［１４］動物プランクトンに対して、１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰaにて１〜６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を給餌することを含む、動物プランクトンの養殖方法。
［１５］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９〜１２３℃、０．２０〜０．２２ＭＰa、１５〜２５分間である、［１４］記載の養殖方法。
［１６］滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［１４］又は［１５］記載の養殖方法。
［１７］滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［１６］記載の養殖方法。
［１８］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［１４］〜［１７］のいずれか記載の養殖方法。
［１９］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［１４］〜［１８］のいずれか記載の養殖方法。
［２０］［１］〜［６］のいずれか記載の組成物、及び動物プランクトンを含む、動物プランクトンの養殖用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の組成物は、微細藻類の高圧蒸気滅菌処理により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能である。さらに、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付しているにもかかわらず、本発明の組成物は、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンに対して、未処理の微細藻類と同等か、それ以上の餌料価値を有している。特に、ナンノクロロプシスについては、高温高圧処理により、細胞壁が破壊され、アルテミア等による良好な消化吸収が可能となる。また、高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、微細藻類に含まれる重要な栄養成分である総脂質、ＥＰＡ、ｎ−３ＨＵＦＡ等の含有量が減ずることはない。その結果、高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアは、未処理のナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアと比較して、総脂質、ＥＰＡ、ｎ−３ＨＵＦＡ等の含有量が増加する等、栄養価の高いアルテミアを得ることができる。【００１７】
高圧蒸気滅菌処理はレトルトパウチ食品の殺菌方法として定められていることから、動物プランクトン用飼料についても、常温で長期間保存可能なレトルトパウチ商品の開発が可能となる。本発明の組成物は、無菌のため、動物プランクトン培養不調や種苗の疾病の原因を養殖設備へ持ち込む心配がない。常温での長期保存が可能なため、冷蔵輸送や冷蔵保存のコスト削減や、微細藻類濃縮液の海外への輸出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】加熱殺菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシス濃縮液中の一般細菌数を示す。
【図２】加熱殺菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシス濃縮液の細胞写真を示す。
【図３】淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。
【図４】淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。
【図５】淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの生残率に及ぼす影響を示す。
【図６】淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの成長に及ぼす影響を示す。
【図７】高圧蒸気滅菌処理が微細藻類濃縮液の総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ−３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響を示す。
【図８】高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスの給餌がアルテミアの総脂質、ＥＰＡ、およびｎ−３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響を示す。
【図９】淡水クロレラの殺菌温度と圧力の違いがワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。
【図１０】淡水クロレラの殺菌温度と圧力の違いがワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。
【図１１】淡水クロレラの殺菌時間の違いがワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。
【図１２】淡水クロレラの殺菌時間の違いがワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。
【図１３】ナンノクロロプシスの処理の違いがアルテミアの消化に及ぼす影響（ナンノクロロプシスの残留率の推移）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物を提供する。
【００２０】
微細藻類とは、微小な藻の総称であり、光合成色素を有するため、植物プランクトンとも呼ばれる、微細藻類には、緑藻、珪藻、ラン藻、ハプト藻、褐藻等が包含される。本発明において使用される微細藻類は、水産飼料となり得るものであれば、特に限定されないが、具体的には、クロレラ、ナンノクロロプシス、スピルナ、ドナリエラ、ユーグレナ等が挙げられるが、これらに限定されない。微細藻類は、好ましくは、クロレラ又はナンノクロロプシスである。
【００２１】
本発明の組成物は、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、製造することができる。本発明はこのような動物プランクトン用飼料組成物の製造方法をも提供する。
【００２２】
微細藻類には、培養した微細藻類、乾燥した培養微細藻類および処理した培養微細藻類ならびに微細藻類および培養上清を含む培養液が包含される。詳しくは、微細藻類には、微細藻類そのものの他、例えば、微細藻類の懸濁液、凍結乾燥物、スプレー乾燥物などを含む。好ましくは微細藻類懸濁液を用いる。
【００２３】
微細藻類懸濁液は、微細藻類を、水、食塩水、緩衝水溶液、培地等の適切な生理的水溶液に懸濁することにより調製することができる。微細藻類懸濁液における微細藻類の細胞濃度は、特に限定されないが、水産飼料として使用するのに十分な濃度であることが好ましい。該細胞濃度は、通常、１０８〜１０１２細胞／ｍｌ、好ましくは１０９〜１０１１細胞／ｍｌである。
【００２４】
高圧蒸気滅菌処理の条件は、微細藻類が、餌料価値を有したまま、混入微生物数を減ずることができる範囲で適宜、設定することができる。滅菌処理の温度は、通常１０５〜１３５℃、好ましくは、１１５℃〜１３０℃、より好ましくは１１９〜１２３℃（例、１２１℃）である。滅菌処理時の圧力は、通常０．１２〜０．３２ＭＰａ、好ましくは、０．１７〜０．２７ＭＰａ、より好ましくは、０．２０〜０．２２ＭＰａ（例、０．２１ＭＰａ）である。滅菌処理時間は、通常１〜６０分、好ましくは５〜４５分、より好ましくは１５〜２５分（例、２０分）である。尚、本明細書において、滅菌処理時の圧力は、絶対圧として示す。
【００２５】
高圧蒸気滅菌処理条件の組み合わせは、
例えば、１０５〜１３５℃、０．１２〜０．３２ＭＰａ、１〜６０分であり；
好ましくは、１１５℃〜１３０℃、０．１７〜０．２７ＭＰａ、５〜４５分であり；
より好ましくは、１１９〜１２３℃（例、１２１℃）、０．２０〜０．２２ＭＰa（例、０．２１ＭＰａ）、１５〜２５分（例、２０分）である。
【００２６】
微細藻類の高圧蒸気滅菌処理は、微細藻類を適切な容器に入れ、これを高圧蒸気滅菌装置を用いて所定の条件におくことで実施することができる。当該容器は、高温、高圧に耐性の容器であることが好ましく、例えば、ガラス、耐熱性の樹脂、磁器、金属等の容器が好ましい。
【００２７】
一態様において、微細藻類（好ましくは、微細藻類懸濁液）をレトルトパウチに封入し、これを高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、本発明の組成物が封入されたレトルトパウチを製造することができる。本明細書において、レトルトパウチとは、プラスチックフィルム若しくは金属はく又はこれらを多層に合わせたものを袋状その他の形に成形した容器に所望の組成物を詰め、熱溶融により密封し、加圧加熱殺菌したものをいう。当該容器は、気密性であることが好ましい。また、当該容器は遮光性を有することが好ましい。レトルトパウチに封入された本発明の組成物は、常温での長期保存が可能であり、さらに軽量であるため、冷蔵輸送や冷蔵保存のコスト削減に寄与し、さらに海外への輸出が可能となる。
【００２８】
高圧蒸気滅菌処理された微細藻類懸濁液中の一般細菌数は、通常、３．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、好ましくは、２．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、より好ましくは、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、更に好ましくは０．１（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、最も好ましくは０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である。微細藻類懸濁液中の一般細菌数は、所定容量の微細藻類懸濁液を寒天培地（Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６、Ｄｉｆｆｃｏ社製）上に塗抹し、２５℃で４〜６日間培養した後に、培地上のコロニー数をカウントすることにより算出することができる。
【００２９】
本発明の組成物には、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類に加え、本発明の効果を損なわない範囲で、賦形剤、増量剤、栄養補強剤、飼料添加物、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤等を配合してもよい。本発明の組成物は、性状は問わず、いかなる性状でも提供できる。例えば、固体（固形状、粉末状）、ペースト、液体（溶液、溶液状）または懸濁液（懸濁状）として提供できる。本発明の組成物は、好ましくは、懸濁液（懸濁状）として提供される。
【００３０】
本発明の組成物中の、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類の含有量は、通常、溶液０．１〜１００％（ｗ／ｗ）である。本発明の組成物が、懸濁液として提供される場合、該懸濁液中の微細藻類の含有量は、通常、１０８〜１０１２細胞／ｍｌ、好ましくは１０９〜１０１１細胞／ｍｌである。本発明の組成物が、懸濁液として提供される場合、本発明の組成物中の一般細菌数は、通常、３．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、好ましくは、２．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、より好ましくは、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、更に好ましくは０．１（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、最も好ましくは０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である。
【００３１】
好ましい態様において、本発明の組成物は、上述の高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類懸濁液からなる。
【００３２】
本発明の組成物は、水産飼料用として、動物プランクトン用の餌料として有用である。動物プランクトンとは、ワムシ、アルテミア、ミジンコなどの一般に種苗生産において生物餌料として利用されているものをいう。ワムシは、袋形動物門、輪虫綱、真正輪毛虫亜綱に属する微小な生物である。ワムシには大型のワムシであるＬ型ワムシ（シオミズツボワムシ、Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）及び小型のワムシであるＳ型ワムシ（Ｂ. ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓ）が含まれる。アルテミアは、甲殻亜門、鰓脚綱、サルソストラカ亜綱、無甲目、ホウネンエビモドキ科の生物である。本発明は、ワムシ又はアルテミアに対して、上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物を給餌することを含む、ワムシ又はアルテミアの養殖方法をも提供する。ワムシやアルテミアの養殖方法は、公知であり、適切な人為的な条件下で上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物を給餌しながら、種苗魚の餌料として十分な大きさ及び量になるまでワムシ又はアルテミアを飼育する。
【００３３】
本発明の組成物は、微細藻類の高圧蒸気滅菌処理により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能である。さらに、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付しているにもかかわらず、本発明の組成物は、ワムシやアルテミアに対して、未処理の微細藻類と同等か、それ以上の餌料価値を有している。特に、ナンノクロロプシスについては、高温高圧処理により、細胞壁が破壊され、アルテミア等の動物プランクトンによる良好な消化吸収が可能となる。また、高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、微細藻類に含まれる重要な栄養成分である総脂質、ＥＰＡ、ｎ−３ＨＵＦＡ等の含有量が減ずることはない。その結果、高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアは、未処理のナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアと比較して、総脂質、ＥＰＡ、ｎ−３ＨＵＦＡ等の含有量が増加する等、栄養価の高いアルテミアを得ることができる。
【００３４】
また、本発明は、上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物、及びワムシ又はアルテミアを含む、ワムシ又はアルテミアの養殖用キットを提供する。本発明のキットを用いることにより、上記本発明の養殖方法により、ワムシ又はアルテミアを容易に養殖することができる。
【００３５】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
加温処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの殺菌
市販の淡水クロレラ濃縮液として、クロレラ工業（株）製スーパー生クロレラＶ１２（淡水クロレラの細胞にＥＰＡ、ＤＨＡ、及びビタミンＢ１２を取り込ませたもの、細胞密度１２４億細胞／ｍｌ）、ナンノクロロプシス濃縮液としてクロレラ工業（株）製ヤンマリンＫ−１（１３７億細胞／ｍｌ）を用いた。各濃縮液を表１の方法に従って加熱、または加熱加圧処理した。以後、スーパー生クロレラＶ１２を淡水クロレラ、ヤンマリンＫ−１をナンノクロロプシスと記述する。【００３７】
【表１】
2015159700.tif 000003
【００３８】
［実施例２］
加温処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの殺菌効果
未処理の淡水クロレラ及びナンノクロロプシス、実施例１において得られた各殺菌方法で処理した淡水クロレラ及びナンノクロロプシス、並びに処理後４℃で４８時間保存したものを、それぞれ、寒天培地（Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６、Ｄｉｆｆｃｏ社製）上に塗抹し、２５℃で４〜６日間培養した後に、培地上のコロニーを一般細菌数として計数した。実験は２回実施した。【００３９】
結果を表２及び図１に示す。処理温度が高くなるほど殺菌効果が高い傾向があった。高圧蒸気滅菌（ＨＴＨＰ）処理した場合にのみ、すべての細菌が完全に殺菌された。【００４０】
【表２】
2015159700.tif 000004
【００４１】
［実施例３］
高圧蒸気滅菌処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの細胞形状と凝集率の変化
未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスの細胞を生物顕微鏡下で観察した。単独で浮遊している細胞と２つ以上の細胞が接着している細胞を血球計算盤を用いて計数し、２つ以上の細胞が接着している割合を細胞凝集率として算出した。処理前と処理後の細胞凝集率の違いを、Ｗｅｌｃｈのｔ検定で比較した。【００４２】
結果を表３及び図２に示す。淡水クロレラとナンノクロロプシスともに高温高圧処理により細胞凝集率が有意に上昇し、特にナンノクロロプシスで処理後の凝集率が高くなった。しかし、凝集した細胞はほとんどが２細胞の接着によるものであり、凝集した細胞も水中に浮遊していた。また、生物顕微鏡下（４００倍）では処理による細胞形状の違いは見られなかった。また、高温高圧処理によりクロロフィルａが破壊されて、本来の濃緑色から濃茶色へ変色した（Ｊ Ｅｘｐ Ｍａｒ Ｂｉｏｌ ２９０： ８１−９１, ２００３）。【００４３】
【表３】
2015159700.tif 000005
【００４４】
［実施例４］
淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの増殖と成長に及ぼす影響
１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均９７個体／ｍｌ（範囲８４〜１１０個体／ｍｌ）の密度で接種し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）、ナンノクロロプシス６００億細胞（６００万細胞／ｍｌ）を毎日1回添加して５日間培養した。試験区ごとに３水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２５℃に調整した。毎日１回午前７時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。培養５日目のワムシ比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ−ｔ検定で比較した。【００４５】
ワムシの密度の結果を表４及び図３に示す。無添加区では３日目からワムシ密度が減少に転じたのに対し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスを添加した区では、ワムシ密度（比増殖率）は培養期間を通して増加した。培養５日目のワムシ密度は高圧蒸気滅菌処理ナンノクロロプシスを添加した区で他区よりも有意に低かったが、高圧蒸気滅菌処理淡水クロレラは未処理淡水クロレラと同等のワムシ密度が得られた。これらのことから、ナンノクロロプシスについては高圧蒸気滅菌処理によって餌料価値の減少がみられるが、淡水クロレラについては餌料価値が減少しないことが示された。【００４６】
【表４】
2015159700.tif 000006
【００４７】
ワムシ携卵率の結果を表５及び図４に示す。ワムシの携卵率の推移は、減少を続けた無添加区を除いて、未処理ナンノクロロプシス区で培養２日目に高くなったほかは、すべての試験区でほぼ同様の推移を示した。【００４８】
【表５】
2015159700.tif 000007
【００４９】
［実施例５］
淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの生残と成長に及ぼす影響
（方法）
海水を満たした１Ｌビーカーに２５℃で２４時間かけてふ化させたアルテミアノープリウス（アメリカソルトレイク産）を平均１０．７個体／ｍｌ（範囲１０．０〜１２．０個体/ｍｌ）の密度で接種し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ１０億細胞（１００万細胞/ｍｌ）、ナンノクロロプシス２０億細胞（２００万細胞/ｍｌ）を毎日２回添加して６日間培養した。試験区ごとに３ビーカーずつ設け、培養水温はヒーターを用いて２５℃に調整した。毎日1回午前８時にアルテミアの密度を計数し、各ビーカーからサンプリングした３０個体のアルテミアの全長を２日毎に測定した。培養６日目の各試験区間のアルテミアの生残率と全長の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ-ｔ検定で比較した。【００５０】
結果を表６、表７、図５及び図６に示す。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスを添加した場合に、アルテミアの生残が最も高く、成長も最も早かった。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスはアルテミアが消化可能となることが示された。【００５１】
【表６】
2015159700.tif 000008
【００５２】
【表７】
2015159700.tif 000009
【００５３】
［実施例６］
高圧蒸気滅菌処理が淡水クロレラとナンノクロロプシスの総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ−３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響
未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、沈殿物の一部を１１０℃のオーブンで恒量に達するまで水分を蒸発させて乾燥重量を求めた。沈殿物にクロロホルム・メタノール混液を加えてホモジナイズし、溶媒を除去して抽出された脂質重量を計測して総脂質含量を求めた。総脂質に水酸化カリウムを加えて加熱してケン化し、ケン化物を三フッ化ホウ素酸メタノールによりメチル化した。精製した脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフ（島津製作所ＧＣ−１７Ａ）に導入して分離・検出し、市販の標準試料と比較して各脂肪酸を同定した。また、ｎ−３系の不飽和脂肪酸のうち炭素数２０以上のものの合計をｎ−３系高度不飽和脂肪酸（ｎ−３ＨＵＦＡ）含量として算出した。淡水クロレラとナンノクロロプシスのそれぞれについて、未処理と高温高圧処理したものの乾燥重量当たりの総脂質含量、ＥＰＡ 、およびＤＨＡ含量を算出し、Ｗｅｌｃｈのｔ検定で比較した。【００５４】
結果を表８及び図７に示す。高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスは未処理のものと同程度の総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、及びｎ−３ＨＵＦＡ含量を有しており、脂肪酸含有量の観点からは滅菌処理による栄養価の低下はなかった。【００５５】
【表８】
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【００５６】
［実施例７］
高圧蒸気滅菌処理した微細藻類濃縮液がアルテミアの総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ−３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響
ソルトレイク産のアルテミア耐久卵を２５℃で２４時間かけて海水中でふ化させたのち、２５℃の海水を満たした１００Ｌ水槽に２００万個体ずつ収容した。未処理または高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス２０億細胞（２００万細胞／ｍｌ）を毎日２回添加して４８時間培養した。対照として、微細藻類を添加しない水槽（無添加）も設けた。培養終了後にプランクトンネットでアルテミアをサンプリングして蒸留水で洗浄後し、−８０℃で保存した。後日、微細藻類と同様の方法でアルテミアの総脂質含量と脂肪酸組成を分析した。【００５７】
結果を表９及び図８に示す。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス濃縮液を添加して培養したアルテミアは、未処理のものを添加した区と無添加区と比較して、総脂質含量とＥＰＡ含量が増加していた。アルテミアが高温高圧処理ナンノクロロプシスを消化吸収可能であることが示されるとともに、高圧蒸気滅菌処理ナンノクロロプシスの給餌でアルテミアの栄養価が向上することが示された。【００５８】
【表９】
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【００５９】
［実施例８］
淡水クロレラの殺菌温度と圧力がワムシの増殖に及ぼす影響
１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均１２６個体／ｍｌ（範囲１１６〜１３８個体／ｍｌ）の密度で接種し、無添加、未処理、１０５℃（０．１２ＭＰａ）、１１５℃（０．１７ＭＰａ）、１２１℃（０．２１ＭＰａ）、および１３５℃（０．３２ＭＰａ）で２０分間高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を毎日１回添加して３日間培養した。試験区ごとに２水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２４．７℃に調整した。毎日１回午前８時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。実験終了時の比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ−ｔ検定で比較した。【００６０】
結果を表１０〜１１及び図９〜１０に示す。
無添加区では２日目からワムシ密度（比増殖率）が減少に転じたのに対し、未処理または各温度（圧力）で処理した淡水クロレラを添加した区では、ワムシ密度は培養期間を通して増加した。培養３日目のワムシの比増殖率は未処理または処理温度間で有意差は認められず、１０５℃（０．１２ＭＰａ）〜１３５℃（０．３２ＭＰａ）までの高温高圧処理はワムシに対する餌料価値に影響しないことが示された。【００６１】
【表１０】
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【００６２】
【表１１】
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【００６３】
［実施例９］
淡水クロレラの殺菌時間がワムシの増殖に及ぼす影響
１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均９８個体／ｍｌ（範囲８７〜１１５個体／ｍｌ）の密度で接種し、無添加、未処理、１０５℃および１３５℃で１分間または６０分間高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を毎日１回添加して４日間培養した。試験区ごとに２水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２１．２℃に調整した。毎日１回午前８時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。実験終了時の比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ−ｔ検定で比較した。【００６４】
結果を表１２〜１３及び図１１〜１２に示す。【００６５】
【表１２】
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【００６６】
【表１３】
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【００６７】
［実施例１０］
市販可消化ナンノクロロプシスと高温高圧処理ナンノクロロプシスのアルテミアの消化速度の比較
海水を満たした１Ｌビーカーに２７℃で２４時間かけてふ化させたアルテミアノープリウス（アメリカソルトレイク産）を１０個体／ｍｌの密度で接種し、市販可消化ナンノクロロプシス（マリンテック社製マリンアルファ）、および未処理または高圧蒸気滅菌処理（１２１℃２０分間）したナンノクロロプシス３０億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を１回添加し、添加直後から２４時間後まで３時間ごとにナンノクロロプシスの残留密度を計測した。試験区ごとにビーカーを３つずつ用いた。ナンノクロロプシスの計測には、顕微鏡下でビルケルチュルク血球計算盤を用いた。添加時の密度を１００とした各時間の残留割合を算出した。また、計測時間とナンノクロロプシスの種類の違いを説明変数、残留密度を応答変数として一般化線形混合モデルを用いて、ナンノクロロプシスの種類の違いの影響を比較した。【００６８】
結果を表１４〜１５及び図１３に示す。未処理区では２４時間以内のナンノクロロプシス残留密度の低下は見られなかった。高圧蒸気滅菌処理区とマリンアルファ区では時間の経過に伴い残留密度が低下したが、高温高圧処理区が未処理区とマリンアルファ区よりも有意に減少が早かった（Ｐ＜０．０００１）。この結果から、高温高圧処理により、アルテミアがナンノクロロプシスを消化可能になることが再確認されるとともに、市販の可消化ナンノクロロプシスよりもアルテミアによる消化吸収が優れていることが示された。【００６９】
【表１４】
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【００７０】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能な、動物プランクトン用飼料組成物が提供される。【００７２】
本出願は、日本で出願された特願2014-83934（出願日：2014年4月15日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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