(57)【要約】  如何なる種類の酵素であっても固定化酵素の酵素活性を向上させる。  固定化酵素と、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有する反応場とを備え、上記反応場で上記固定化酵素による酵素反応を行う。
2014098153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化酵素と、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有する反応場とを備え、上記反応場で上記固定化酵素による酵素反応を行うことを特徴とするバイオリアクター。
【請求項２】
上記反応場は、上記化合物を０．２〜５．０Ｍの濃度で含有することを特徴とする請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項３】
上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項４】
上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項３記載のバイオリアクター。
【請求項５】
上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項３記載のバイオリアクター。
【請求項６】
上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項７】
上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項８】
５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて固定化酵素による酵素反応を行うことを特徴とする固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項９】
上記化合物の濃度を０．２〜５．０Ｍとして酵素反応を行うことを特徴とする請求項８記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１０】
上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする請求項８記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１１】
上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項１０記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１２】
上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項１０記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１３】
上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする請求項８記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１４】
上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする請求項８記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。
【請求項１５】
カソード電極とアノード電極とが電解質を介して対向してなるバイオ燃料電池において、カソード電極及びアノード電極の少なくとも一方が固定化酵素を備え、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて当該固定化酵素の酵素反応を行うことを特徴とするバイオ燃料電池。
【請求項１６】
上記化合物は、アノード電極に接触する燃料及び/又はカソード電極に接触する溶液に含有されていることを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項１７】
上記化合物は、アノード電極における燃料と接触する表面及び/又はカソード電極における溶液に接触する表面に存在することを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項１８】
上記化合物の濃度を０．２〜５．０Ｍとして酵素反応を行うことを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項１９】
上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項２０】
上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項１９記載のバイオ燃料電池。
【請求項２１】
上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項１９記載のバイオ燃料電池。
【請求項２２】
上記アノード電極が固定化酵素を備え、イミダゾール環を有する化合物の存在下にてアノード電極における酵素反応を行うことを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項２３】
上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【請求項２４】
上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする請求項１５記載のバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素による酵素反応を利用するバイオリアクター、固定化酵素の活性向上方法に関し、また、固定化酵素の酵素反応を利用するバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオリアクターとは、酵素などによる生物反応を利用した装置を意味する。バイオリアクターにおいて利用される生物反応には、固定化酵素、固定化微生物、その他生細胞などが利用される。バイオリアクターは、アミノ酸、ペプチド有機酸等の生産、糖の異性化などに利用される。また、石油化学工業の一部のプロセスにも、酵素触媒を利用するバイオリアクターが適用されている。さらに、バイオリアクターとしては、各種診断などの分析目的に使用するものもある。【０００３】
バイオ燃料電池とは、酵素燃料電池とも呼称され、酵素や微生物による化学反応により発生した電気エネルギーを利用するものである。バイオ燃料電池は、一般の電池と同様にカソード電極及びアノード電極が電解質を介して対向した構造を有し、燃料としてメタノールやエタノールのようなアルコール類又はグルコースのような糖類を用いる。また、バイオ燃料電池におけるカソード電極及びアノード電極には、固定化酵素を電極に利用している。【０００４】
バイオリアクター及びバイオ燃料電池のいずれにおいても、酵素等による化学反応の反応効率が向上することができれば、物質の生産性や電気出力が大幅に改善されると期待できる。しかし、バイオリアクターやバイオ燃料電池について、固定化酵素の酵素反応を向上させるような技術については十分な検討がなされていないのが現状であった。したがって、固定化酵素を用いたバイオリアクターやバイオ燃料電池に対して汎用的に適用することができ、当該固定化酵素による酵素反応の効率を著しく向上させる技術が求められていた。【０００５】
非特許文献１及び特許文献１には、電子伝達メディエータ電極に固定したバイオ燃料電池が開示されている。非特許文献１及び特許文献１に開示されたバイオ燃料電池では、電子伝達メディエータを電極材料に固定化する際の固体化剤としてポリビニルイミダゾールを使用している。また、非特許文献１及び特許文献１に開示されたバイオ燃料電池では、電解液中に酵素が分散している。【０００６】
また、特許文献２には、正極と負極とが緩衝物質を含む電解質を介して対向した構造を有し、正極及び負極の少なくとも一方が固定化酵素を利用しており、緩衝物質としてイミダゾール環を含む化合物を使用した燃料電池が開示されている。特許文献２に開示された燃料電池では、正極にビリルビンオキシダーゼを固定化してなり、イミダゾール緩衝液を含む電解質を使用したときに、カソード単極評価において高い電流密度が達成できたとある。【０００７】
さらに、特許文献３には、酵素及び電子受容体を用いて血糖値を測定するセンサが開示されている。特許文献３に開示されたセンサは、酵素及び電子受容体に加えてイミダゾール等の複素環式化合物を含有することによって、酵素の保存安定性（保存期間の前後での電流値の変化の抑制）を改善している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−７１５８４号公報
【特許文献２】特開２００８−６００６７号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０４２９０３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Electrochemistry 76, No. 8, (2008) p. 594-596
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、バイオリアクターやバイオ燃料電池における固定化酵素の酵素活性を、酵素の種類に限定されず広汎な酵素についても、向上させることができる技術は知られていなかった。そこで、上述した実情に鑑み、如何なる種類の酵素であっても酵素活性に優れた固定化酵素を備えるバイオリアクター、如何なる種類の酵素であっても固定化酵素についてその酵素活性を向上させる固定化酵素の活性向上方法、及び優れた酵素活性の固定化酵素を備えるバイオ燃料電池を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、固定化酵素による反応系に、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を存在させることで、当該固定化酵素の酵素活性が顕著に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。【００１２】
（１）固定化酵素と、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有する反応場とを備え、上記反応場で上記固定化酵素による酵素反応を行うことを特徴とするバイオリアクター。【００１３】
（２）上記反応場は、上記化合物を０．２〜５．０Ｍの濃度で含有することを特徴とする（１）記載のバイオリアクター。【００１４】
（３）上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする（１）記載のバイオリアクター。【００１５】
（４）上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする（３）記載のバイオリアクター。【００１６】
（５）上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする（３）記載のバイオリアクター。【００１７】
（６）上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする（１）記載のバイオリアクター。【００１８】
（７）上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする（１）記載のバイオリアクター。【００１９】
（８）５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて固定化酵素による酵素反応を行うことを特徴とする固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２０】
（９）上記化合物の濃度を０．２〜５．０Ｍとして酵素反応を行うことを特徴とする（８）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２１】
（１０）上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする（８）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２２】
（１１）上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする（１０）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２３】
（１２）上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする（１１）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２４】
（１３）上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする（８）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２５】
（１４）上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする（８）記載の固定化酵素の酵素活性向上方法。【００２６】
（１５）カソード電極とアノード電極とが電解質を介して対向してなるバイオ燃料電池において、カソード電極及びアノード電極の少なくとも一方が固定化酵素を備え、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて当該固定化酵素の酵素反応を行うことを特徴とするバイオ燃料電池。【００２７】
（１６）上記化合物は、アノード電極に接触する燃料及び/又はカソード電極に接触する溶液に含有されていることを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００２８】
（１７）上記化合物は、アノード電極における燃料と接触する表面及び/又はカソード電極における溶液に接触する表面に存在することを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００２９】
（１８）上記化合物の濃度を０．２〜５．０Ｍとして酵素反応を行うことを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００３０】
（１９）上記固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００３１】
（２０）上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする（１９）記載のバイオ燃料電池。【００３２】
（２１）上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする（１９）記載のバイオ燃料電池。【００３３】
（２２）上記アノード電極が固定化酵素を備え、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にてアノード電極における酵素反応を行うことを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００３４】
（２３）上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００３５】
（２４）上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする（１５）記載のバイオ燃料電池。【００３６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−２７７２７１号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、バイオリアクターやバイオ燃料電池等に使用される固定化酵素における酵素活性を、酵素の種類によらず大幅に向上させることができる。本発明に係るバイオリアクターは、固定化酵素の酵素活性が向上しているため、反応場における反応効率が優れたものとなる。本発明に係るバイオ燃料電池は、固定化酵素の酵素活性が向上しているため、優れた電池特性を有するものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明を適用したバイオリアクターの一例を模式的に示す構成図である。
【図２】本発明を適用したバイオリアクターの他の例を模式的に示す構成図である。
【図３】本発明を適用したバイオ燃料電池の一例を模式的に示す構成図である。
【図４】各種固定化酵素の酵素活性をイミダゾール系化合物の存在下・非存在下で測定した結果を示す特性図である。
【図５】固定化酵素の酵素活性を各種複素環式化合物の存在下・非存在下で測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
【００４０】
本発明は、酵素の種類に限定されず、担体に酵素を固定化してなる固定化酵素を利用する場合に適用できる。本発明を適用することにより、固定化酵素における酵素活性を向上できる。すなわち、本発明による酵素活性向上効果は、特定の種類の酵素に限定されず、広汎な酵素において実現される。換言すれば、本発明に係る固定化酵素の活性向上方法は、あらゆる種類の酵素について作製された固定化酵素について酵素活性を向上できる技術である。本発明に係る固定化酵素の活性向上方法は、固定化酵素による酵素反応を、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下に行うことに特徴がある。
【００４１】
本発明に係る固定化酵素の活性向上方法は、固定化酵素を利用するあらゆる系に適用することができる。すなわち、固定化酵素を利用する系としては、バイオリアクター及びバイオ燃料電池を挙げることができるが、本発明に係る固定化酵素の活性向上方法はこれらに限定されるものではない。以下、本発明を適用したバイオリアクター及びバイオ燃料電池について説明する。
【００４２】
＜バイオリアクター＞
本発明においてバイオリアクターとは、固定化酵素と、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有する反応場とを備える装置を意味する。バイオリアクターでは、反応場において固定化酵素により酵素反応が進行するため、固定化酵素による酵素反応を５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下に行うこととなる。また、本発明においてバイオリアクターとは、固定化酵素による生物反応を利用した装置であれば、物質を生産する装置、物質等を感知する装置、物質等を定量的に測定する装置及び物質の変化を検出する装置等のいずれでも良い。すなわち、本発明において、バイオリアクターとは、バイオセンサーを含む意味である。
【００４３】
また、本発明が適用されるバイオリアクターの利用用途には特に限定されず、例えば各種物質の生産目的、各種物質の検出目的、各種診断等の分析目的等を利用用途として例示することができる。
【００４４】
本発明を適用したバイオリアクターの一例を図１に模式的に示す。図１に示すバイオリアクターは、担体１に酵素２を固定化してなる固定化酵素３と、固定化酵素３を収容した筐体４とから構成される。図１に示すバイオリアクターは、筐体４内部にて酵素反応を行い、酵素反応により目的物質を生産するものである。
【００４５】
すなわち、図１に矢印Ａとして示すように、目的物質の基質を含む反応液が筐体４に供給されると、筐体４内部において固定化酵素３による酵素反応が進行する。すなわち、反応液が筐体４に供給されると、筐体４内部に反応場が形成される。このとき、本発明を適用したバイオリアクターでは、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下で固定化酵素３による酵素反応が進行する。５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物は、反応液に予め混合しても良いし、反応液とは別に筐体４に供給され筐体４内部で反応液と混合しても良い。或いは、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物は、担体１に含侵させるなどして予め筐体４内部に存在させることもできる。
【００４６】
図１に示したバイオリアクターでは、筐体４内部における酵素反応が終了した後、目的物質を含む反応液を図中、矢印Ｂで示す方向に抜き取ることができる。また、図１に示したバイオリアクターでは、反応液を図中、矢印ＡからＢに向かって連続的に供給することで筐体４における酵素反応を連続的に行って、目的物質を連続的に生産することもできる。
【００４７】
また、本発明を適用したバイオリアクターの他の例を図２に模式的に示す。図２に示すバイオリアクターは、担体１に酵素２を固定化してなる固定化酵素３と、固定化酵素３を挟み込むように配置された一対の電極５と、固定化酵素３及び電極５を取り付ける基板６と、一対の電極５に対して電気的に接続された検出器７とから構成されている。図２に示すバイオリアクターは、固定化酵素３にて進行した酵素反応を反応により生じた変化を電気的に検出するものである。すなわち、図２に示すバイオリアクターは、溶液に含まれる物質を酵素反応を利用して検出するための装置（バイオセンサー）である。
【００４８】
図２に示したバイオリアクターでは、固定化酵素３に対して検査対象の溶液を接触させる。固定化酵素３に対して溶液を接触させるには、当該溶液を固定化酵素３上に滴下しても良いし、当該溶液中にバイオリアクターごと浸漬しても良い。固定化酵素３に対して反応する基質が溶液に含まれている場合には、酵素反応が進行して補酵素（NADH等）の酸化還元反応により、一対の電極５間の電流を検出器７にて検出することができる。このとき、本発明を適用したバイオリアクターでは、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下で固定化酵素３による酵素反応が進行する。５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物は、検査対象の溶液に予め混合しても良いし、溶液とは別に固定化酵素３に供給され当該溶液と固定化酵素３上で混合しても良い。或いは、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物は、担体１に含侵させるなどして予め存在させることもできる。
【００４９】
ここで、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物とは、炭素のみから構成される５員環又は６員環化合物において１以上の炭素、好ましくは２個の炭素が窒素に置換された化合物である。なお、この複素環式化合物は脂肪族化合物でも良いし芳香族化合物でも良い。５又は６員環の窒素を有する脂肪族の複素環式化合物としては、特に限定されないが、２−イミダゾリジノン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、及びピロリジン並びにこれらの誘導体を挙げることができる。５又は６員環の窒素を有する芳香族の複素環式化合物としては、特に限定されないが、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、１，２，３−トリアジン及びビピリジン並びにこれらの誘導体を挙げることができる。特に、ピラジン、２−イミダゾリジノン、及びイミダゾール環を有する化合物（イミダゾール誘導体、イミダゾール系化合物）を使用することが好ましい。これらピラジン、２−イミダゾリジノン、及びイミダゾール環を有する化合物を使用することで、固定化酵素の酵素活性を大幅に向上させることができるためである。
【００５０】
ここで、イミダゾール環を有する化合物としては、特に限定されないが、イミダゾールの他に、イミダゾール誘導体、すなわちヒスチジン、１−ビニルイミダゾール、１−メチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、イミダゾール−２−カルボン酸エチル、イミダゾール−２−カルボキシアルデヒド、イミダゾール−４−カルボン酸、イミダゾール−４，５−ジカルボン酸、イミダゾール−１−イル−酢酸、２−アセチルベンズイミダゾール、１−アセチルイミダゾール、Ｎ−アセチルイミダゾール、２−アミノベンズイミダゾール、Ｎ−（３−アミノプロピル) イミダゾール、５−アミノ−２−（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール、４−アザベンズイミダゾール、４−アザ−２−メルカプトベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、１−ベンジルイミダゾール、１−ブチルイミダゾール）等を挙げることができる。特に、イミダゾール系化合物としては、イミダゾール、ヒスチジン及び/又は１−ビニルイミダゾールを使用することが好ましい。イミダゾール、ヒスチジン及び/又は１−ビニルイミダゾールを使用することで、固定化酵素の酵素活性を大幅に向上させることができるためである。
【００５１】
また、イミダゾール環を有する化合物としては、ポリビニルイミダゾール及びポリベンゾイミダゾール並びにその誘導体といったポリマーを使用することができる。特に、ポリビニルイミダゾールを使用することが好ましい。ポリビニルイミダゾールを使用することで、固定化酵素の酵素活性を大幅に向上させることができるためである。なお、このとき、ポリマーの分子量は５０００〜１００００００とすることが好ましく、５０００〜２０００００とすることがより好ましく、１０００００〜２０００００とすることが最も好ましい。
【００５２】
また、反応場におけるイミダゾール系化合物の濃度は、イミダゾール系化合物を溶液に混合して使用する場合、特に限定されないが、０．２〜５．０Ｍとすることが好ましく、０．５〜２．０Ｍとすることがより好ましい。イミダゾール系化合物の濃度をこの範囲とすることで、固定化酵素３の酵素活性をより向上させることができる。イミダゾール系の濃度がこの範囲を下回る場合には、固定化酵素３の酵素活性を向上させる効果が低くなる虞がある。また、イミダゾール系化合物の濃度がこの範囲を上回る場合には、溶液の粘度が高くなって反応性が低下する虞があり、また固定化酵素３に対する毒性を生じる虞もある。
【００５３】
さらに、反応場におけるイミダゾール系化合物の濃度は、イミダゾール系化合物を担体に塗布して混合して使用する場合、２．０〜５０nmol/cm2とすることが好ましく、５．０〜２０nmol/cm2とすることがより好ましい。イミダゾール系化合物の濃度をこの範囲とすることで、固定化酵素３の酵素活性をより向上させることができる。イミダゾール系の濃度がこの範囲を下回る場合には、固定化酵素３の酵素活性を向上させる効果が低くなる虞がある。また、イミダゾール系化合物の濃度がこの範囲を上回る場合には、固定化酵素３に対する毒性を生じる虞がある。
【００５４】
一方、本発明に係るバイオリアクターにおいて、固定化酵素３として使用される酵素２は何ら限定されず、如何なる酵素でもよい。すなわち、本発明は、酵素の種類によらず広汎な種類の酵素（固定化酵素）について適用することができる。
【００５５】
具体的に、酵素２としては、図１に示すバイオリアクターに使用する場合、所定の基質から目的とする生産物を生成する反応を触媒する酵素を挙げることができる。このような酵素としては、特に限定されないが、アセチル-DL-アミノ酸をL-アミノ酸とするアミノアシラーゼ、グルコースを異性化糖とするグルコースイソメラーゼ、フマル酸をL-アスパラギン酸とするアスパルターゼ、ペニシリンGを6-アミノペニシラン酸とするペニシリンアミラーゼ、フマル酸をL-リンゴ酸とするフマラーゼ、牛乳を低乳糖ミルクとするラクターゼ、L-アスパラギンをL-アラニンとするL-アスパラギン酸β-脱炭酸酵素、アクリロニトリルをアクリルアミドとするニトリルヒドラターゼ、ショ糖をパラチノースとするアルファ-グルコシルトランスフェラーゼ、ショ糖をフラクトオリゴ糖とするβ-フルクトフラノシダーゼ、植物油をカカオバター様油脂とするリパーゼ、液化デンプンをマルトオリゴ糖とするマルトオリゴ糖生成酵素、卵白を乾燥卵白とするグルコース酸化酵素、天然果汁を無苦味果汁とするナリンジナーゼ、ビールの混濁を防止するパパイン、植物油を脂肪酸とするリパーゼ、ADPをATPとするアセテートキナーゼ等を挙げることができる。
【００５６】
また、具体的に、酵素２としては、図２に示すバイオリアクターに使用する場合、所定の分子を特異的に識別できる機能を有する酵素を使用することができる。すなわち、グルコースを検出するためのグルコース酸化酵素、コレステロールを検出するためのコレステロール酸化酵素、コレステロールエステルを検出するためのコレステロールエステラーゼ、中性脂肪を検出するためのリパーゼ、リン脂質を検出するためのアルカリホスファターゼ並びにホスホリパーゼC、遊離脂肪酸を検出するためのアシルCoA合成酵素、尿素を検出するためのウレアーゼ、アンモニアを検出するためのグルタミン酸脱水素酵素、尿酸を検出するためのウリカーゼ、クレアチニンを検出するためのクレアチニナーゼ、クレアチンを検出するためのクレアチナーゼ、ビリルビンを検出するためのビリルビン酸化酵素、メチオニンを検出するためのメチオニンγ-リアーゼ、乳酸又はピルビン酸を検出するための乳酸脱水素酵素、アミノ酸を検出するためのL-アミノ酸酸化酵素、クエン酸を検出するためのクエン酸リアーゼ及び無機リン酸を検出するためのグリーコーゲンホスホリラーゼ等を挙げることができる。
【００５７】
これら酵素２を固定化する担体１としては、特に限定されず、従来から固定化酵素に利用されてきた各種の担体（支持体と呼称されるものも含む）を使用することができる。より具体的に、担体としては、イオン交換基を有する多糖類誘導体、イオン交換樹脂等の合成高分子、多孔性アルキルアミンガラス、ナイロンポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、デンプン、コラーゲン、ポリウレタン等を挙げることができる。また、担体１に酵素２を固定化する方法としても、従来公知の手法を適宜使用することができる。具体的に酵素固定化方法は、担体結合法、架橋法、包括法等に大別することができる。担体結合法には、吸着法、共有結合法及びイオン結合法が挙げられる。架橋法は、各種架橋剤を用いて担体１と酵素２とを結合する方法である。また包括法は、高分子のなかに酵素を閉じこめるようにする方法である。
【００５８】
以上のように構成された本発明に係るバイオリアクターでは、固定化酵素３の酵素反応がイミダゾール系化合物の存在下で進行する。このため、固定化酵素３の酵素活性が大幅に向上しており、例えば図１に示すようなバイオリアクターでは、物質の生産性が大幅に向上する。また、図２に示すようなバイオリアクターでは、物質を高感度に検出することができる。なお、本発明に係るバイオリアクターは、図１及び２に示した構成のバイオリアクターに限定されるものではなく、所謂、酵素カラム、酵素チューブ、酵素膜、オートアナライザー及びフローインジェクション分析計（ＦＩＡ）に適用することができる。
【００５９】
＜バイオ燃料電池＞
本発明においてバイオ燃料電池とは、カソード電極とアノード電極とが電解質を介して対向してなるバイオ燃料電池であって、カソード電極及びアノード電極の少なくとも一方が固定化酵素を備える電池を意味する。バイオ燃料電池では、電極を構成する固定化酵素による酵素反応を、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下に行うこととなる。また、本発明においてバイオ燃料電池とは、固定化酵素による酵素反応を利用した電池であれば、その形状、酵素の種類、電解質の種類等に何ら限定されるものではない。
【００６０】
本発明を適用したバイオ燃料電池の一例を図３に模式的に示す。図３に示すバイオ燃料電池１０は、アノード側電極１１と、カソード側電極１２と、アノード側電極１１とカソード側電極１２との間に配されたイオン伝導性を有する膜１３（以下、電解質膜１３）とを備えている。なお、バイオ燃料電池１０において、アノード側電極１１はアノード極室１４内部に配設され、カソード側電極１２はカソード極室１５内部に配設されている。なお、アノード極室１４には燃料が充填又は供給される。
【００６１】
特に、本発明に係るバイオ燃料電池は、アノード側電極１１に固定化酵素を使用し、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて当該固定化酵素の酵素反応が進行するものであることが好ましい。ただし、本発明に係るバイオ燃料電池は、アノード側電極１１及びカソード電極１２ともに固定化酵素を使用し、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にてこれら固定化酵素の酵素反応が進行するものであってもよい。なお、本発明に係るバイオ燃料電池において使用できる５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の種類やその濃度としては、上記バイオリアクターの欄で説明した種類及び濃度と同じである。
【００６２】
本発明に係るバイオ燃料電池において、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物はアノード極室１４に充填又は供給される燃料に予め混合しても良いし、当該燃料とは別にアノード極室１４に供給されてもよい。同様に、本発明に係るバイオ燃料電池において、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物はカソード極室１５に充填又は供給される溶液に予め混合しても良いし、当該溶液とは別にカソード極室１５に供給されてもよい。また、本発明に係るバイオ燃料電池において、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物は、アノード側電極１１における燃料と接触する表面及び/又はカソード側電極１２における溶液と接触する表面に存在させても良い。例えば、上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含む溶液をアノード側電極１１における燃料と接触する表面及び/又はカソード側電極１２における溶液と接触する表面に塗布することで、当該表面に当該複素環式化合物を存在させることができる。或いは、アノード側電極１１を構成する電極材やカソード側電極１２を構成する電極材を作製する際に５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を混合しておいてもよい。
【００６３】
ここで、アノード側電極１１は、電極材と、酵素及びメディエータを含む酸化反応関連剤とから構成される。アノード側電極１１における酸化反応関連剤内のメディエータは、酸化反応関連剤の酵素−電極材間の電子の受け渡しを行う電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。電子伝達可能な生体由来のタンパク質とは、特に限定されないが、例えば、鉄、銅等を含む金属含有タンパク質であり、例えば、ヘモグロビン（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、フェレドキシン（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、シトクロム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｃ５１１、シトクロムＰ４５０、アズリン（Ａｚｕｒｉｎ）、プラストシアニン（Ｐｌａｓｔｏｃｙａｎｉｎ）、シトクロムａ，ａ１，ａ３，ｂ，ｂ２，ｂ３，ｂ５，ｂ６，ｂ５５５，ｂ５５９，ｂ５６２，ｂ５６３，ｂ５６５，ｂ５６６，ｃ，ｃ１，ｃ２，ｃ３，ｄ，ｅ，ｆ，ｏ，Ｐ−４５０、ヘモシアニン（Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）等が挙げられる。
【００６４】
より具体的には、電子伝達可能な生体由来のタンパク質の具体例として、ウシ由来のヘモグロビン（ナカライテクス社製）、クロストリジウム由来のフェレドキシン（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のシトクロムＣ５５１（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のアズリン（ＳＩＧＭＡ社製）等が挙げられる。
【００６５】
アノード側電極１１における酸化反応関連剤内の酵素は、アノード極室１４に充填又は供給される燃料の酸化反応に関与するものであり、下記に例示する燃料に応じて選択される。例えば、メタノールを燃料とする場合、メタノールからホルムアルデヒドへ酸化するアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。また、例えば、グルコースを燃料とする場合、グルコースからグルコノラクトンへ酸化するグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。これら酵素は、ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼ又はＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼであることが好ましい。ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が用いられ、ＮＡＤ＋の存在下において燃料の酸化反応が進行する。一方、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ＋の補酵素の非存在下でも燃料の酸化反応が進行する。
【００６６】
また、ＰＱＱ型デヒドロゲナーゼの具体例として、アセトバクターパステウリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、メチロバクテリウムエ クストルケヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒ ｑｕｅｎｓ）、パラコッカスデニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、コマモナステストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ＮＢＲＣ １２０４８）由来のＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトバクターカルコアセチクス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、大腸菌由来のＰＱＱ型グルコースデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。
【００６７】
また、酸化反応関連剤内の酵素のその他の例として、糖代謝に関与する酵素（例えばヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、マロン酸デヒドロゲナーゼ等）等を用いることができる。
【００６８】
アノード極室１４に充填又は供給する燃料は、例えば、メタノール等のアルコール類、グルコース等の糖類、脂肪類、タンパク質、糖代謝の中間生成物の有機酸（グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、トリオースリン酸イソメラーゼ、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、２−オキソグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、オキサロ酢酸等）、これらの混合物等が用いられる。
【００６９】
電極材としては、酵素及びメディエータを含む酸化反応関連剤をより多く浸漬又は固定化させることができる点において、多孔質材料を使用することが好ましい。例えば、カーボンフェルト、カーボンペーパ及び活性炭等が挙げられる。
【００７０】
アノード側電極１１は、特に限定されないが、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化反応関連剤をポリマー又は架橋剤により電極材に固定化させた固定化酵素として作製することができる。また、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化反応関連剤を緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材に浸漬させることでアノード側電極１１の固定化酵素を作製することもできる。ここで使用可能なポリマーとしては、ポリビニルイミダゾール、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリピロール、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンと無水マレイン酸のグラフト共重合体、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、オルソクレゾールノボラック型エポキシ樹脂等を例示できる。また、使用可能な架橋剤としては、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、スベリン酸ジスクシミジル、スクシミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等を例示できる。さらに、使用可能な緩衝溶液としては、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝溶液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等を例示できる。
【００７１】
次に、カソード側電極１２について説明する。カソード側電極１２は、電極材と還元反応関連剤とから構成される。カソード側電極１２における還元反応関連剤としては、例えば、電極触媒として白金等の金属触媒が担持された炭素粉末、又は酸素還元酵素及びメディエータにより構成されているものを使用することができる。
【００７２】
還元反応関連剤として使用可能な酸素還元酵素としては、ビリルビンオキシターゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。また、メディエータとしては、上記説明したものと同様のものを用いることができる。一方、還元反応関連剤が、金属触媒が担持された炭素粉末により構成されている場合、金属触媒として、例えば、白金、鉄、ニッケル、コバルト、ルテニウム等が用いられる。また、炭素粉末として、例えば、アセチレンブラック、ファーネスブラック、チャンネルブラック、サーマルブラック等のカーボンブラック等が用いられる。
【００７３】
カソード極室１５内のカソード側電極１２において、酸素とプロトンから水を生成する反応が進行する。よって、カソード側電極１２には、反応に使用するための酸素が供給される必要がある。これには、例えば、カソード極室１５内に酸素含有気体（例えば、空気）を導入することで、この反応に利用する酸素を供給しても良い。また、フェリシアン化カリウム等の犠牲試薬を添加した緩衝液（酸素が含まれている）等をカソード極室１５内に供給しても良い。また、カソード側電極１２を構成する還元反応関連剤が、白金等の金属触媒を担持した炭素粉末であれば、酸素ガスを用いることもできる。
【００７４】
酸素還元酵素及びメディエータを還元反応関連剤として用いる場合、カソード側電極１２は、上述したアノード側電極１１と同様に、酸素還元酵素及びメディエータをポリマー及び架橋剤により電極材に固定化させた固定化酵素として作製できる。また例えば、酸素還元酵素及びメディエータを緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材に浸漬させることでカソード側電極１２となる固定化酵素を作製することもできる。ここで使用可能なポリマー、架橋剤及び緩衝溶液は、上述したアノード側電極１１と同様のものを使用することができる。一方、金属触媒が担持された炭素粉末を用いる場合、カソード側電極１２は、金属触媒が担持された炭素粉末を、後述する電解質膜１３と同様の電解質（例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の電解質）により電極材に固定化させて作製することができる。
【００７５】
また、電解質膜１３は、電子伝導性を持たずプロトン伝導性を有するものであれば特に制限されるものではない。例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜等が挙げられる。具体的にはナフィオン（登録商標）が用いられる。なお、本発明に係るバイオ燃料電池において、電解質膜１３にも上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有させても良いが、電解質膜１３に５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有しない構成とすることもできる。
【００７６】
以上のように構成された本発明に係るバイオ燃料電池１は、例えば、アノード側電極１１に供される燃料がメタノールである場合、アノード側電極極１１及びカソード側電極１２での酸化還元反応は、それぞれ下式（１）及び（２）によって表される。
【００７７】
アノード：ＣＨ３ＯＨ → ＨＣＨＯ＋２Ｈ＋＋２ｅ− （１）
カソード：２Ｈ＋＋１／２Ｏ２＋２ｅ−→ Ｈ２Ｏ （２）
すなわちアノード側電極１１では、メタノールが酵素によってホルムアルデヒドと水素イオンと電子とにする反応が行われる。電子は、メディエータによって電極材に運ばれ、さらに外部回路を通じてカソード側電極１２に運ばれる。水素イオンは、電解質膜１３を介して、カソード側電極１２に移動する。一方、カソード側電極１２では、水素イオン、電子、酸素が反応して水を生成する反応が行われる。これらの反応によって、外部回路にエネルギーを放出する。
【００７８】
特に、本発明に係るバイオ燃料電池は、従来のバイオ燃料電池と比較して電池出力等の電池特性が向上する。ここで、従来のバイオ燃料電池とは、電極を構成する固定化酵素による酵素反応を上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の非存在下に行う電池を意味する。特に、本発明に係るバイオ燃料電池では、アノード電極を構成する固定化酵素による酵素反応を上述した５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下に行うといった特徴により、アノード電極を構成する固定化酵素の酵素活性を大幅に向上できる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００８０】
〔実施例１〜３〕
本実施例では、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物としてイミダゾール系化合物を使用し、種々の固定化酵素の酵素活性をイミダゾール系化合物の存在下で評価した。【００８１】
（１−１）固定化酵素の作製
1cm2に切り抜いた繊維状基材に塗布し、乾燥させた。そこに2.5%グルタルアルデヒド、20%ポリ-Ｌ-リジン、10mMＴｒｉｓ-HCl(pH8.0)、実施例１〜３の酵素を混和した液を繊維状材料に染み込ませ乾燥させたものを固定化酵素とした。実施例１〜３で使用した酵素を表１に示した。
【表１】
2014098153.tif 000003
【００８２】
なお、本実施例で使用したグルコースデヒドロゲナーゼは東洋紡社製、グルタミン酸デヒドロゲナーゼはフナコシ社製、ギ酸デヒドロゲナーゼはシグマアルドリッチ社製のものを使用した。【００８３】
（１−２）イミダゾールを用いた固定化酵素の評価
実施例１〜３では、表１に示した基質と１Ｍイミダゾール-ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を混和した溶液に固定化酵素を浸し、２５℃で３０分攪拌し反応させ、その後ＷＳＴ１とｍＰＭＳで発色させ分光光度計で吸光度を測定した。一方、比較例１〜３では、１Ｍイミダゾール-ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に代えて１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を使用した以外は実施例１〜３と同様にして固定化酵素を評価した。【００８４】
なお、本実施例で使用したグルコース、グルタミン酸ナトリウム、NAD及びNADPはナカライテスク社製のものを使用した。【００８５】
（１−３）結果
実施例１〜３及び比較例１〜３の結果を表２及び図４に示す。
【表２】
2014098153.tif 000004
【００８６】
表２及び図４から判るように、固定化酵素は、イミダゾール系化合物の存在下において優れた酵素活性を示すことが明らかとなった。以上の結果から、固定化酵素を備えるバイオリアクターにおいて、当該固定化酵素による酵素反応をイミダゾール系化合物の存在下にて行うことで、酵素活性を著しく向上できることがわかる。【００８７】
特に本実施例では、バイオ燃料電池のアノード電極に使用できる、酸化還元酵素を固定化した固定化酵素について酵素活性を著しく向上できることが示された。以上の結果から、酸化還元酵素の固定化酵素を備えるバイオ燃料電池において、特にアノード電極の酵素活性を著しく向上させることで、優れた電池特性を達成できることが示された。【００８８】
〔実施例４〜８〕
本実施例では、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物として種々の複素環式化合物を使用し、各化合物について固定化酵素の酵素活性向上効果を評価した。【００８９】
（１−１）固定化酵素の作製
1cm2に切り抜いた繊維状基材に塗布し、乾燥させた。そこに2.5%グルタルアルデヒド、20%ポリ-Ｌ-リジン、10mMＴｒｉｓ-HCl(pH8.0)、ギ酸デヒドロゲナーゼを混和した液を繊維状材料に染み込ませ乾燥させたものを固定化酵素とした。【００９０】
（１−２）複素環式化合物による固定化酵素の活性向上効果の評価
実施例４〜８では、上記複素環式化合物として表３に示す化合物を使用した。なお、実施例７において使用したポリビニルイミダゾールの分子量は１１１５００であった。
【表３】
2014098153.tif 000005
【００９１】
表３に示した複素環式化合物を混和した溶液に固定化酵素を浸し、２５℃で３０分攪拌し反応させ、その後ＷＳＴ１とｍＰＭＳで発色させ分光光度計（ＴＥＣＡＮ社製、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００）で吸光度を測定した。一方、比較例２として、複素環式化合物に代えて１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を使用した以外は同様にして固定化酵素を評価した。【００９２】
（１−３）結果
実施例４〜８及び比較例２の結果を表４及び図５に示す。
【表４】
2014098153.tif 000006
【００９３】
表４及び図５から判るように、固定化酵素は、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンといった５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下において優れた酵素活性を示すことが明らかとなった。以上の結果から、固定化酵素を備えるバイオリアクターにおいて、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下で当該固定化酵素による酵素反応を行うことで、酵素活性を著しく向上できることがわかる。【００９４】
特に、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物として、ピラジン、２−イミダゾリジノン又は１−ビニルイミダゾールを使用した場合には、固定化酵素における酵素活性をより大幅に向上できることがわかる。【００９５】
また、本実施例においても、バイオ燃料電池のアノード電極に使用できる、酸化還元酵素を固定化した固定化酵素（固定化ギ酸デヒドロゲナーゼ）について酵素活性を著しく向上できることが示された。以上の結果から、酸化還元酵素の固定化酵素を備えるバイオ燃料電池において、特にアノード電極の酵素活性を著しく向上させることで、優れた電池特性を達成できることが示された。【００９６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2014098153.tif 000007
【図２】
2014098153.tif 000008
【図３】
2014098153.tif 000009
【図４】
2014098153.tif 000010
【図５】
2014098153.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月30日(2016.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カソード電極とアノード電極とが電解質を介して対向してなるバイオ燃料電池において、カソード電極及びアノード電極のうち少なくともアノード電極が固定化酵素を備え、５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて当該アノード電極における固定化酵素の酵素反応を行い、
上記電解質は上記５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物を含有しないことを特徴とするバイオ燃料電池。
【請求項２】
上記化合物は、アノード電極に接触する燃料に含有されていることを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項３】
上記化合物は、アノード電極における燃料と接触する表面に存在することを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項４】
上記化合物の濃度を０．２〜５．０Ｍとして酵素反応を行うことを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項５】
上記アノード電極における固定化酵素は、酸化還元酵素を担体に固定したものであることを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項６】
上記酸化還元酵素は、NAD及び/又はNADPを電子受容体として酸化還元反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項５記載のバイオ燃料電池。
【請求項７】
上記酸化還元酵素は、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項５記載のバイオ燃料電池。
【請求項８】
上記複素環式化合物は、イミダゾール環を有する化合物であることを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項９】
上記複素環式化合物は、イミダゾール塩酸塩、ピラジン、２−イミダゾリジノン、１−ビニルイミダゾール、ポリビニルイミダゾール及びヒスチジンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項１０】
上記カソード電極が固定化酵素を備え、上記５又は６員環の窒素及び炭素を含む複素環式化合物の存在下にて当該カソード電極における固定化酵素の酵素反応を行うことを特徴とする請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項１１】
上記化合物は、カソード電極における溶液に接触する表面に存在することを特徴とする請求項１０記載のバイオ燃料電池。
【国際調査報告】
2014098153.tif 000012
2014098153.tif 000013
2014098153.tif 000014
2014098153.tif 000015