(57)【要約】癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を障害するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用の提供。  ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス。
【請求項２】
ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株又はＢ５Ｒ遺伝子が発現するように改変されたＬＣ１６ｍ８株である、請求項１に記載の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクター。
【請求項５】
外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、請求項４記載の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なワクシニアウイルス及びそれを利用したウイルスベクターに関する。具体的には、ウイルスタンパク質であるＶＧＦ（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とＯ１Ｌの機能を欠損させたワクシニアウイルスであって、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を破壊する腫瘍溶解性を有する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ウイルスを癌治療に用いる癌ウイルス治療に関する種々の技術が開発されている。このような治療に用いるウイルスとして、アデノウイルス、レトロウイルスの他、ワクシニアウイルスがある。
近年ワクシニアウイルスは、その広い宿主域と高い発現効率という特性から、外来遺伝子を導入した発現ベクターとして感染症（ＨＩＶやＳＡＲＳ）のための多価ワクチンとしても用いられている。
また、ワクシニアウイルスの癌細胞に対する溶解性を利用して、癌治療に利用する技術についても報告されている（特許文献１を参照）。
一方、ワクシニアウイルスにおいて、感染細胞のＥＲＫを活性化させ、ワクシニアウイルスの増殖を正に制御する遺伝子として、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子及びＯ１Ｌ遺伝子（非特許文献１を参照）が報告されていた。ＶＧＦ遺伝子に関しては、ＶＧＦ遺伝子を欠失させることにより、ワクチンの病原性が低下することが報告されていた（非特許文献２を参照）。また、ＶＧＦ遺伝子及びＴＫ（チミジンキナーゼ）遺伝子を欠損させたワクシニアウイルスを癌治療に適用することについても報告されていた（特許文献２及び非特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１１／１２５４６９号国際公開パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１３／０３８０６６号国際公開パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．４，ｐｐ．２３２３−２３３６，２０１２
【非特許文献２】Ｂｕｌｌｅｒ  ＲＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．３，ｐｐ．８６６−８７４，１９８８
【非特許文献３】ＭｃＣａｒｔ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．２４，ｐｐ．８７５１−８７５７，２００１
【発明の概要】
【０００５】
本発明は癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を障害するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用の提供を目的とする。
現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する前臨床研究、及び臨床治験が積極的に行われている。
ワクシニアウイルスの場合、感染の初期にＥＧＦ（上皮増殖因子）と高い相同性を持つワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）を産生する。分泌されたＶＧＦは感染細胞や周囲の細胞上のＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に結合し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を活性化することにより細胞分裂を促進する。最近、ワクシニアウイルスＯ１Ｌ遺伝子にコードされたＯ１Ｌタンパク質も、感染細胞内のＥＲＫを活性化することが報告されている。ＶＧＦとＯ１Ｌは同じ経路を活性化していると考えられることから、上流に作用するＶＧＦの機能を欠損することの影響は大きく、下流に作用するＯ１Ｌの機能を欠損することの影響は大きくないことが想定された。
本発明者らは、ＥＲＫを活性化する機能を有する遺伝子がコードするタンパク質の機能を欠損させることで、正常細胞に感染した場合はＥＲＫを活性化できないため、細胞分裂は促進されず、その結果、ウイルス増殖は著明に低下するが、一方、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が異常に活性化している癌細胞では、異常活性化がウイルスによるＥＲＫの活性化機能を補い、ウイルスが増殖し、癌細胞を溶解させ、かつ病原性が低下すると考え、鋭意検討を行った。この際、ＶＧＦタンパク質とＯ１Ｌタンパク質の両方の機能を欠損させることにより、正常細胞において予想外に安全性が向上する一方で、癌細胞に対する溶解性が予想外に高まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス。
［２］  ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株又はＢ５Ｒ遺伝子が発現するように改変されたＬＣ１６ｍ８株である、［１］の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス。
［３］  ［１］又は［２］のワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
［４］  ［１］又は［２］の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクター。
［５］  外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、［４］の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクター。
［６］  ［４］又は［５］の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−２４１２９９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ））依存性組換えワクシニアウイルスにより正常細胞が障害を受けず、癌細胞が障害を受ける原理を示す図である。
図２は、組換えワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ（ｍＯ）、ＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−（ＶＧＦ−）、ＬＣ１６ｍＯ／Ｏ１Ｌ−（Ｏ１Ｌ−）及びＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−Ｏ１Ｌ−（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）の構造を示す図である。
図３は、血清存在下での正常細胞・腫瘍細胞におけるＭＤ−ＲＶＶの細胞障害性を示す図である。
図４は、血清非存在下での正常細胞・腫瘍細胞におけるＭＤ−ＲＶＶの細胞障害性を示す図である。
図５−１は、血清非存在下での正常細胞・腫瘍細胞におけるウイルス感染とＥＲＫ活性を示す図である。
図５−２は、血清存在下及び非存在下での正常細胞及び腫瘍細胞におけるウイルスの感染とＥＲＫの活性化を示す図である。
図６Ａは、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるウイルス投与後のウイルスの体内分布を示す図である。
図６Ｂは、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるウイルス投与後の増殖ウイルスの数値化の結果を示す図である。
図７は、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるウイルス投与後の体重変化を示す図である。
図８は、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるウイルス投与３３週後のウイルスの体内分布を示す図である。
図９は、ヒト膵臓癌ＢｘＰＣ３腹膜播種マウスモデルにおける分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの抗癌効果を示す図である。
図１０Ａは、ＢｘＰＣ３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス投与後の腫瘍体内分布を示す図である。
図１０Ｂは、ＢｘＰＣ３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス投与後の腫瘍増殖の数値化の結果を示す図である。
図１１は、ＢｘＰＣ３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス投与後のウイルス体内分布を示す図である。
図１２は、ＢｘＰＣ３腹膜播種マウスモデルにおける腫瘍特異的ウイルス増殖とＥＲＫ活性を示す図である。図１２Ａは腹膜播種した腫瘍の状態を示し、図１２Ｂは腫瘍特異的ウイルスの増殖を示す。また、図１２ＣはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  （Ｒｌｕｃ）の検出結果を示し、図１２Ｄはリン酸化されたｐ４４／４２  ＭＡＰＫタンパク質（Ｅｒｋ１／２）（ｐＥＲＫ）の検出結果を示し、図１２Ｅはワクシニアウイルスの検出結果を示す。
図１３Ａは、ＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス用量と抗癌効果の関係を示す図である。
図１３Ｂは、ＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス用量と抗癌効果の関係の数値化の結果を示す図である。
図１４は、ＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス用量と安全性の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のワクシニアウイルスは、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ））依存性組換えワクシニアウイルス（ＭＤ−ＲＶＶ）であり、ワクシニアウイルスのワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ：ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＯ１Ｌの機能を欠失したワクシニアウイルスである。
ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの遺伝子配列を、それぞれ、配列番号１及び２に示す。
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）はセリン／スレオニンキナーゼの１つであり、代表的なものとしてＥＲＫがある。上皮増殖因子（ＥＧＦ）が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合すると、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫと続くシグナルカスケードの活性化を引き起こし、細胞分裂を促進する。
ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）は、ＥＧＦと高いアミノ酸配列相同性を有するタンパク質であり、ＥＧＦと同様にＥＧＦＲに結合し、上記のシグナルカスケードの活性化を引き起こし、細胞分裂を促進する。
ワクシニアウイルスが細胞に感染した場合、感染の初期にワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）を産生する。分泌されたＶＧＦは感染細胞や周囲の細胞上のＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に結合し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を活性化することにより細胞分裂を促進する。また、ワクシニアウイルスＯ１Ｌ遺伝子にコードされたＯ１Ｌも、感染細胞内のＥＲＫを活性化する。すなわち、ＶＧＦとＯ１Ｌは両者共にＥＲＫを活性化し、ワクシニアウイルス増殖を正に制御することになる。
ウイルスタンパク質ＶＧＦとＯ１Ｌの両者がＥＲＫを活性化し、ワクシニアウイルス増殖を制御しているので、この２つのワクシニアウイルスタンパク質の機能を欠損させることにより、感染した細胞において、ＶＧＦとＯ１ＬによるＥＲＫの活性化は生じない。正常細胞と癌細胞におけるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を比較すると、癌細胞においてＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路は異常に活性化されているので、ＶＧＦ及びＯ１Ｌによる活性化が生じなくともＥＲＫは活性化され、細胞分裂が促進される。従って、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能が欠損したワクシニアウイルスが正常細胞に感染した場合、正常細胞ではＥＲＫが活性化されないため、細胞分裂は促進されず、その結果、ワクシニアウイルス増殖は著明に低下する（図１左）。一方、癌細胞ではＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が異常に活性化しているため、それがワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１ＬによるＥＲＫの活性化機能を補うので、ワクシニアウイルスは増殖できる（図１右）。この結果、ワクシニアウイルスは癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し障害をもたらす。すなわち、本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは癌細胞特異的な腫瘍溶解性を有する。
本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ））依存性組換えワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株、リスター株から確立されたＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（橋爪  壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５等）、ＮＹＢＨ株等の株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株、ＷＲ株、ＭＶＡ株等が挙げられる。ＬＣ１６ｍＯ株は、Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６株を経て作出された株であり、ＬＣ１６ｍ８株は、さらにＬＣ１６ｍＯ株から作出された、ウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子であるＢ５Ｒ遺伝子にフレームシフト変異が認められ、このタンパク質が発現、機能しなくなったことで弱毒化された株である（蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４８Ｎｏ．１２（２００３），ｐ．１６９３−１７００）。
現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する前臨床研究、及び臨床治験が積極的に行われている。このウイルス療法における最大のキーポイントは、ウイルスが元来持っている正常組織に対する病原性をいかに排除するかという点にある。
ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。Ｂ５Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、Ｂ５Ｒ遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。Ｂ５Ｒ遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のＬＣ１６ｍ８株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させて確立されたｍ８Δ株（ＬＣ１６ｍ８Δ株とも呼ぶ）、が挙げられる。また、ＬＣ１６ｍＯ株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失して確立されたｍＯΔ株（ＬＣｍＯΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第ＷＯ２００５／０５４４５１号国際公開パンフレットに記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、Ｂ５Ｒタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、ＲＫ１３細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
本発明において用いるワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子を癌細胞中で発現させ、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なＢ５Ｒ遺伝子を発現することが望ましい。上記のようにＢ５Ｒ遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なＢ５Ｒ遺伝子を導入する。Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、Ｂ５Ｒ遺伝子を挿入して、本発明のワクシニアウイルス製造の材料として用いればよい。Ｂ５Ｒ遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のＢ５Ｒ遺伝子を挿入する位置は、もともとＢ５Ｒ遺伝子が存在していたＢ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、Ｂ５Ｒ遺伝子をＤＮＡコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。
相同組換えとは、細胞内で２つのＤＮＡ分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムＤＮＡを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、Ｂ５Ｒ遺伝子を連結したプラスミド（これをトランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスＤＮＡとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたＢ５Ｒ遺伝子がウイルスゲノム中に組み込まれる。このとき用いる細胞としては、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能の欠損とは、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子が発現しないか、又は発現してもその発現タンパク質がＶＧＦ、Ｏ１Ｌの正常な機能を保持していないことをいう。ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損させるためには、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子の総て又は一部を欠失させればよい。また、塩基を置換、欠失又は付加により遺伝子を変異させ、正常なＶＧＦ又はＯ１Ｌが発現できないようにしてもよい。また、ＶＧＦをコードする遺伝子又はＯ１Ｌをコードする遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失、変異は例えば公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により行うことができる。本発明において、遺伝子の欠失や変異により正常な遺伝子産物が発現されない場合、遺伝子が欠損しているという。
ＶＧＦ及びＯ１Ｌが機能を欠損しているか否かは、本発明のＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損した分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスを製造し、該ウイルスがこれらのタンパク質を発現しているかを決定すればよい。例えば、ＶＧＦに対する抗体又はＯ１Ｌに対する抗体を用いた免疫学的アッセイによりＶＧＦ又はＯ１Ｌの存在を確認することができる。また、ＰＣＲによりＶＧＦをコードする遺伝子やＯ１Ｌをコードする遺伝子の存在を決定することができる。
本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスは癌治療のために用いることができる。すなわち、本発明は分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスを含む癌治療用の医薬組成物を包含する。
対象とする癌は限定されず、例えば発生臓器別に分類した場合、肺癌、膵癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種が対象となる。特に、肺癌、膵癌、卵巣癌の治療に好適に用いることができる。
本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。また、癌部に局所投与してもよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約１０２〜１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０５〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。
さらに、本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするＤＮＡが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。これらの外来遺伝子を含む分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスを分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスベクターと呼ぶことができる。
治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子等が挙げられる。ルシフェラーゼやＧＦＰを発現する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、その感染細胞である癌細胞を簡便、迅速に検出することが可能となる。本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルスを癌治療に用いる場合、ワクシニアウイルスの有する腫瘍溶解性と共に癌に対する治療用遺伝子が癌治療効果を発揮することができる。
外来遺伝子（外来ＤＮＡ）としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするＤＮＡを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ＝サーズ）ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のＤＮＡ配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。
また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊  実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  遺伝子導入＆発現解析実験法  斎藤泉他編集、羊土社（１９９７年９月１日発行）、あるいは、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進  監訳ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−（第２版）ＴａＫａＲａ、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８７年  ６巻  ｐ．３３７９−３３８４等の記載に従えばよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスＭＤ−ＲＶＶ（ＭＡＰＫ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ）の構築
ウイルス蛋白ＶＧＦとＯ１Ｌの機能を無くした組換えワクシニアウイルスを作出するため、ワクチン株（ＬＣ１６ｍＯ）のＶＧＦ遺伝子にルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合遺伝子発現カセットを挿入した組換えウイルス（ＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−（ＶＧＦ−））、又はＯ１Ｌ遺伝子にルシフェラーゼーＧＦＰ融合遺伝子発現カセットを挿入した組換えウイルス（ＬＣ１６ｍＯ／Ｏ１Ｌ−（Ｏ１Ｌ−））、又はＶＧＦ遺伝子にルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合遺伝子発現カセットとＯ１Ｌ遺伝子にＤｓＲｅｄ発現カセットを挿入した組換えウイルス（ＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−Ｏ１Ｌ−（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−））（ＭＤ）を作製した。尚、ＬＣ１６ｍＯのウイルス増殖能に影響を及ぼさないＨＡ遺伝子にルシフェラーゼーＧＦＰ融合遺伝子発現カセットを挿入した組換えウイルス（ｍＯ）を、コントロールとして使用した。図２に作出した組換えワクシニアウイルスの構造を示す。図２中、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれＬＣ１６ｍＯ（ｍＯ）、ＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−（ＶＧＦ−）、ＬＣ１６ｍＯ／Ｏ１Ｌ−（Ｏ１Ｌ−）及びＬＣ１６ｍＯ／ＶＧＦ−Ｏ１Ｌ−（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）の構造を示す。
最初に、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔａｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔａｔｔｃｔｃｔ−３’（配列番号３）と５’−ｃｇｃａａｇｃｔｔａｇａｔｃｔｇｇａａａａｔｇｔｃｔｇｔｔａｇｔ−３’（配列番号４）によってＶＧＦ遺伝子領域を、又は２つのプライマー５’−ｇｃｇｃｔａｇｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｃａｔｔｔａｔａｔ−３’（配列番号５）と５’−ｇｃｇｃｔａｇｃａｔｇｔｔｃａｔｇｔａｔｃｃｇｇａａｔｔｔ−３’（配列番号６）によってＯ１Ｌ遺伝子領域を増幅した。その各ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ、又はＮｈｅＩで切断し、それをｐＵＣ１９ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＵＣ１９−ＶＧＦ、又はｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌを構築した。
一方ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃｇｃａｇｃｔｇａｇｃｔｔｔｔｇｃｇａｔｃａａｔａａａｔｇ−３’（配列番号７）と５’−ｔｔｃａｇｃｔｇａａｔａｔｇａａｇｇａｇｃａａ−３’（配列番号８）によって、ＴＫ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、それをｐＵＣ１９ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫを構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ａａｔｔｇｃａｔｇｃｇｔｃｇａｃａｔｔａａｔｇｇｃｃｇｇａｃｃｇｇｃｃｔｔｃｇａａｇ−３’（配列番号９）と５’−ａａｔｔｃｔｔｃｇａａｇｇｃｃｇｇｔｃｃｇｇｃｃａｔｔａａｔｇｔｃｇａｃｇｃａｔｇｃ−３’（配列番号１０））をアニールし、それを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＫにクローニングし、ｐＴＫ−ＭＳＣを構築した。合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｈａｍｍｏｎｄ  ＪＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７；６６（１）：１３５−１３８）を挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｔｃｇａａａｔｔｇｇａｔｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｇｃａｔａｔａａａｔａａｇｇｔｃｇａｇｇｔａｃｃａａａａａｔｔｇａａａａａｃｔａｔｔｃｔａａｔｔｔａｔｔｇｃａｃｇｇｃｃｇｇａｃ−３’（配列番号１１）と５’−ｃｇｇｃｃｇｔｇｃａａｔａａａｔｔａｇａａｔａｇｔｔｔｔｔｃａａｔｔｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｃｇａｃｃｔｔａｔｔｔａｔａｔｇｃｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇｃｔｇａｔｃｃａａｔｔ−３’（配列番号１２））をアニールし、それを制限酵素ＳｆｉＩとＳａｌＩで切断したｐＴＫ−ＭＳＣにクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣを構築した。ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩとＥｃｏＲＩの切断によって獲得したＬｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを構築した。
ｐＧＬ４．２０（プロメガ株式会社）のプラスミドＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃａａｃｃｃｇｇｇｃｃａｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａａａａａｃａ−３’（配列番号１３）と５’−ｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｇｇｃｇａｔｃｔｔｇｃｃｇｃｃｃｔ−３’（配列番号１４）によって、ホタルルシフェラーゼ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＳｍａＩとＮｏｔＩで切断し、それをｐＩＲＥＳベクター（クロンテック株式会社）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＩＲＥＳ−Ｌｕｃを構築した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック株式会社）のプラスミドＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａ−３’（配列番号１５）と５’−ｇｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａ−３’（配列番号１６）によって、ＥＧＦＰ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩで切断し、それをｐＩＲＥＳ−Ｌｕｃの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＩＲＥＳ−ＬｕｃＧＦＰを構築した。ｐＩＲＥＳ−ＬｕｃＧＦＰを制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断して得たＬｕｃＧＦＰ断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧをＳｆｉＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、ＥｃｏＲＩで切断して得たベクター断片へクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰを構築した。
ｐＴＫ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰを制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、そのＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ断片を、ｐＵＣ１９−ＶＧＦを制限酵素ＡｃｃＩで切断しＢｌｕｎｔ処理した部位へ、又はｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌを制限酵素ＸｂａＩで切断しＢｌｕｎｔ処理した部位へクローニングしｐＵＣ１９−ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ、又はｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰを構築した。同様に、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰを制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、そのＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ断片を、ｐＶＮＣ１１０（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９；２７（７）：９６６−９７１）を制限酵素ＳｐｅＩで切断しＢｌｕｎｔ処理した部位へクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰを構築した。
一方、合成ワクシニアウイルスプロモーターではなく、ｐ７．５ＫプロモーターをｐＴＫ−ＭＳＣの制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩ部位にクローニングし、ｐＴＫ−Ｐ−ＭＳＣを構築した。ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｎ１（クロンテック株式会社）のＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ遺伝子領域をｐＣＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、ｐＣＲ４−ＤｓＲｅｄを構築した。ｐＣＲ４−ＤｓＲｅｄを制限酵素ＰｍｅＩとＮｏｔＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理したＤｓＲｅｄ断片を、ｐＴＫ−Ｐ−ＭＳＣをＳａｌＩで切断しＢｌｕｎｔ処理した部位へクローニングし、ｐＴＫ−Ｐ−ＤｓＲｅｄを構築した。ｐＴＫ−Ｐ−ＤｓＲｅｄを制限酵素ＳｐｈＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、そのＰ−ＤｓＲｅｄ断片を、ｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌを制限酵素ＸｂａＩで切断しＢｌｕｎｔ処理した部位へクローニングしｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌ−Ｐ−ＤｓＲｅｄを構築した。
図２に示すウイルスゲノムを持つ各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの回収のため、６ｗｅｌｌディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ）をＭＯＩ＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９−ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ、ｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ、又はｐＶＮＣ１１０−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２〜５日間培養した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったＲＫ１３細胞に適当に希釈して接種し、０．８％メチルセルロースを含むＥａｇｌｅ  ＭＥＭ，５％ＦＢＳ培地を加え、３７℃で２〜５日間培養した。培地を除き、ラージプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浮遊させた。ＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その２００μＬを１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、沈査に５０μＬの滅菌蒸留水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加した。３０秒間ソニケーション後、９５℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。ＶＧＦに関しては２つのプライマー５’−ａｔｇｔｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｇａ−３’（配列番号１７）と５’−ｔｔａｔｇｇｃａｃａａｃｃａｔａｔｃｔ−３’（配列番号１８）によって、Ｏ１Ｌに関しては２つのプライマー５’−ａｃａｇｇｇａｔｔａａｇａｃｇｇａａａｇ−３’（配列番号１９）と５’−ｇｔｃａａｃａａｇｃａｔｃｔｔｃｃａａｃ−３’（配列番号２０）によって、ＨＡに関しては２つのプライマー５’−ｃｇａｃｔａｔａｇａｃａｔａａｔａｃｔａ−３’（配列番号２１）と５’−ｃａｇａｔｇａｔｇｃａｃｔｔａｃｔｇｔａ−３’（配列番号２２）によってＰＣＲを行い、所定の大きさのＰＣＲプロダクトが検出されたクローンについて、ＰＣＲプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養し精製した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。尚、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの回収のため、同様に培養されたＲＫ１３細胞にＶＧＦ−ウイルスをＭＯＩ＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌ−Ｐ−ＤｓＲｅｄ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２〜５日間培養した。以下、上記と同様の方法にて回収し、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−ウイルスとして実験に供した。
【実施例２】
【０００９】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの特性
図２に示すウイルスゲノムを持つ各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスを２４ｗｅｌｌで血清存在下、又は血清非存在下で培養した各ヒト正常肺線維芽ＮＨＬＦ細胞、及びヒト癌細胞株（肺癌Ａ５４９細胞、膵癌ＡｓＰＣ−１細胞、膵癌ＢｘＰＣ−３細胞、膵癌ＰａｎｃＩ細胞、卵巣癌ＳＫＯＶ３細胞）にＭＯＩ＝１で感染させ、３７℃で３０時間培養後、蛍光顕微鏡（オリンパス）で生細胞のまま明視野観察と蛍光観察し、それら両方の画像を重ね合わせた。その結果、血清存在下では、正常細胞、及び癌細胞における各ウイルスの細胞障害性はほぼ同等であり、そのＧＦＰ蛋白の発現もほぼ同等であった（図３、スケールバーは５００μＭを示す）。図３において、ヒト正常肺線維芽ＮＨＬＦ細胞、及びヒト癌細胞株（肺癌Ａ５４９細胞、膵癌ＡｓＰＣ−１細胞、膵癌ＢｘＰＣ−３細胞、膵癌ＰａｎｃＩ細胞、卵巣癌ＳＫＯＶ３細胞）にＭｏｃｋ（コントロール）、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を感染させた結果を示してある。各パネルの左に細胞を、上に感染させたワクシニアウイルスを示してある。図中の緑色の部分が蛍光染色された部位を示す（モノクロでは白に見える）。それに対し、血清非存在下では、癌細胞における各ウイルスのＧＦＰ発現・細胞障害性はほぼ同等であったが、正常細胞におけるＧＦＰ発現・細胞障害性はｍＯが最も高く、次いでＶＧＦ−とＯ１Ｌ−であった。そしてＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−におけるＧＦＰ発現・細胞障害性は他のウイルスと比べて極めて低く、模擬対照細胞（Ｍｏｃｋ）とほぼ同等であった（図４、スケールバーは５００μＭを示す）。図４の各パネルの意味は図３と同じである。
次に、図２に示すウイルスゲノムを持つ各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスｍＯ、又はＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−を、８ｗｅｌｌチャンバースライドガラス上で血清非存在下で培養した各ヒト正常乳腺上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞、及び肺癌Ａ５４９細胞にＭＯＩ＝１で感染させ、３７℃で１２時間培養後、４％ホルムアルデヒド固定、メタノール透過化処理した（これらの処理後ではＧＦＰ蛋白を確認することはできたが、ＤｓＲｅｄ蛋白は確認することができなかった）。そして、リン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質（Ｅｒｋ１／２）を検出する１次抗体（＃４３７０、ＣＳＴジャパン）で反応した。ＰＢＳで洗浄後、２次蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８）抗体（＃Ａ２１０６９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＤＡＰＩを含む核染色封入剤を加え蛍光顕微鏡（オリンパス）で観察し、得られた各染色画像を合成した。尚、陽性コントロールとして、固定１５分前に、上皮成長因子ＥＧＦ蛋白を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。図５−１において、ヒト正常乳腺上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞、又は肺癌Ａ５４９細胞（各パネルの左に示す）にＭｏｃｋ（コントロール）、ＥＧＦ刺激（陽性コントロール）、ｍＯ株又はＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を感染させた場合の結果を示す（スケールバーは５００μＭを示す）。ＭｏｃｋのＭＣＦ１０Ａ細胞では核のみが染色（青）されるのに対し、ＭｏｃｋのＡ５４９細胞では核と細胞質においてリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質が染色（赤）されている。一方、ＥＧＦ刺激細胞ではＭＣＦ１０Ａ細胞、Ａ５４９細胞共に細胞の核（青）と細胞質においてリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質が強く染色（赤）されている。ｍＯを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞、及びＡ５４９細胞では、ｍＯウイルス由来の発現ＧＦＰ蛋白が見られ、その感染細胞と周囲の感染していない細胞で核（青）と細胞質においてリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質が強く染色（赤）されている。ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−を感染させた細胞では、ＭＣＦ１０Ａ細胞においては核が染色（青）されているがリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質の染色は認められず、ｍＯと比べてＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−ウイルス由来のＧＦＰ蛋白を発現する細胞が減少していた。それに対しＡ５４９細胞においてはＭｏｃｋと同様にリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質が染色（赤）されており、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−ウイルス由来のＧＦＰ蛋白を発現する細胞もｍＯと同等であった。
一方、図２に示すウイルスゲノムを持つ各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスｍＯ、ＶＧＦ−、Ｏ１Ｌ−又はＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−を、９６ｗｅｌｌで血清存在下、又は血清非存在下で培養した各ヒト正常肺線維芽ＮＨＬＦ細胞、及びヒト膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞にＭＯＩ＝１で感染させ、３７℃で３０時間培養後、ＰｉｅｒｃｅＥＲＫ１／２Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（６２２０６、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、内在性レベルのリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質（Ｅｒｋ１／２）を検出した。結果を図５−２に示す。図５−２において、血清存在下（Ｓｅｒｕｍ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）、又は血清非存在下（Ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）で培養した正常ＮＨＬＦ細胞、又は膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞にＭｏｃｋ（コントロール）、ｍＯ株（ＶＧＦ＋／Ｏ１Ｌ＋）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ＋／Ｏ１Ｌ−）、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ＋）又はＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を感染させた場合の結果を示す（縦軸の吸光度４５０ｎｍは、リン酸化されたＥｒｋ１／２レベルを示す）。血清存在下の正常ＮＨＬＦ細胞、及び膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞では、ウイルスの種類やその感染にかかわらず、高いＥＲＫの活性化が認められる。それに比べ、血清非存在下の膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞では、そのリン酸化されたＥｒｋ１／２レベルはほぼ半減するものの、ウイルスの種類やその感染にかかわらず、同等のＥＲＫの活性化が認められる。それに対して、血清非存在下の正常ＮＨＬＦ細胞では、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−の感染細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１／２レベルは激減し、ウイルスが感染していないコントロール細胞におけるそのレベルと有意差が認められなかった。一方、ＶＧＦ＋／Ｏ１Ｌ＋、ＶＧＦ＋／Ｏ１Ｌ−、又はＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ＋の感染細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１／２レベルは、依然コントロール細胞におけるそのレベルに比べ有意に上昇していた。以上より、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が活性化されていない正常細胞ではその増殖性が著しく低下するが、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が活性化している癌細胞では、それがＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−ウイルスのＥＲＫ活性化機能を補ってウイルスは増殖できることが証明された。
【実施例３】
【００１０】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの安全性
この分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスのマウス体内におけるウイルス病原性を検討した。ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスが感染した正常細胞ではＥＲＫを活性化できないため、細胞分裂は促進されず、その結果、ウイルス増殖は著明に低下すると予想される。１０６ｐｆｕの図２に示すウイルスゲノムを持つ各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスをＳＣＩＤマウスに腹腔内投与した（各群２匹）。投与後、３日（Ｄ３）、９日（Ｄ９）、１６日（Ｄ１６）、２２日（Ｄ２２）後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現（＝増殖ウイルス数）をｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＮｉｇｈｔＤＨＡＤＥ  ＬＢ９８５）により非侵襲的にモニターし（図６Ａ）、数値化した（図６Ｂ）。その結果、ウイルス投与３日後では、ｍＯ投与マウスにおいて高いルシフェラーゼ発現が見られ、次いでＯ１Ｌ−投与マウス、ＶＧＦ−投与マウス、そしてＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与マウスとなっており、ウイルス投与９日後のＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与マウスではその発現が見られなかった。その後、ｍＯとＯ１Ｌ−投与マウスにおいては、ウイルスが感染、増殖し、時間経過に伴って投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られる発痘と一致していた。一方、ＶＧＦ−とＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与マウスにおいては、ウイルスが喪失していった。図６Ａと図６Ｂにおいて、各パネルの上と下記載は、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を示し、各パネル左と上の記載は投与後の日数を示す。図６Ａの右の棒はルシフェラーゼによる光源の光度つまり光の強さのスケールを示し、上から赤、オレンジ、黄色黄緑、青、紫の順で光の強さを表す。そして、図６Ｂではその光の強さの単位であるｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃの総数を縦軸に示している。
次に、これらのウイルス投与マウスの体重変化を長期的に観察した（図７）。ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与マウスにおいては、体重減少が見られず、ウイルスが体内から喪失したことと一致した。それに対してｍＯ投与マウスは、急激な体重減少を伴うウイルス毒性によって、投与３５日後と４９日後に死亡した。又、Ｏ１Ｌ−投与マウスは、同様に投与４９日後と７７日後に死亡した。一方、ＶＧＦ−投与マウス群の中には、投与２１７日後ごろから尾に発痘が見られ、それに伴ってその部位が壊死し、急激な体重減少を示すマウスがいた。又、投与２３１日後のルシフェラーゼ発現の非侵襲的イメージングでは、その発痘部位（→）に増殖ウイルスが確認された（図８）。尚、測定条件は図６Ａと同様であり、光の強さを示すスケールも同レンジで上から赤、オレンジ、黄色黄緑、青、紫の順で光の強さを表す。最終的にＶＧＦ−投与マウスは、投与２５２日後と２８７日後に死亡した（図７）。以上より、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を活性化するためのウイルス蛋白ＶＧＦとＯ１Ｌをコードする遺伝子が欠失しているため、正常細胞ではその増殖性が著しく低下することがマウス体内において証明された。
【実施例４】
【００１１】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスの抗癌効果
ウミシイタケルシフェラーゼを安定して発現するヒト膵癌ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０６ｐｆｕの各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスを腹腔内に投与した（各群５匹）。その結果、ＶＧＦ−、又はＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−は、ＢｘＰＣ−３腹膜播種モデルマウスにおいて強力な抗癌作用を示し、ウイルス投与無の模擬対照群と比べて、生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され（Ｐ＝０．００４７）、ウイルス毒性による副作用も見られなかった（図９）。さらに、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−は、ＶＧＦ−と比べても、生存率における有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認された（Ｐ＝０．０３１）。
次に、ウイルス投与２日前、及びウイルス投与１１日後に、ウミシイタケルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンを腹腔内投与することによって、マウス体内での腫瘍細胞（＝増殖細胞数）をｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＮｉｇｈｔＤＨＡＤＥ  ＬＢ９８５）により非侵襲的にモニターし（図１０Ａ）、数値化した（図１０Ｂ）。その結果、ウイルス投与２日前にはＢｘＰＣ−３細胞の腹膜播種が確認され、全てのウイルス投与群において治療１１日後の腹腔内の腫瘍がほぼ喪失していたが、コントロール群では治療効果がなく腫瘍が増大していた。最も生存率の向上が見られたＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与マウスでは、治療前に対して治療１１日後に９７．４〜９９．３％の腫瘍細胞が消失していた。図１０Ａと図１０Ｂにおいて、各パネルの上と右の記載は、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を示す。図１０Ａの右の棒はルシフェラーゼによる光源の光度つまり光の強さのスケールを示し、赤、オレンジ、黄色黄緑、青、紫の順で光の強さを表す。そして、図１０Ｂではその光の強さの単位であるｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃの総数を縦軸に示している。
次に、ウイルス投与３日後、及び１０日後に、ホタルルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを腹腔内投与することによって、マウス体内でのウイルス分布を非侵襲的にモニターした。その結果、投与３日後には腹腔内腫瘍における各ウイルス（ｍＯ、ＶＧＦ−、Ｏ１Ｌ−、及びＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）の同等の増殖が確認された。投与１０日後にはｍＯ、及びＯ１Ｌ−の投与マウスにおいて、腫瘍組織だけではなく正常組織におけるウイルス増殖が見られたが、ＶＧＦ−、及びＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−では、体内からウイルスが喪失するか、もしくはウイルス増殖が腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった（図１１）。図１１において、各パネルの上の記載は、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を示す。
さらに、同様のＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおいて、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−投与３日後にホタルルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを腹腔内投与し安楽死させ、直接腹腔内を観察した（図１２）。腹膜播種した腫瘍組織（図１２Ａの黄色点線部分）が確認され（図１２Ａ）、かつウイルスの増殖を示す発光も確認された（図１２Ｂ）。次に、正常組織を含む腫瘍組織を回収し、１０％ホルマリンで固定後、パラフィン切片を作製した。脱パラフィン処理、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いたマイクロウェーブ法による抗原賦活化処理後、ブロッキング液（ＴＢＳＴ／５％正常ヤギ血清）で連続切片を室温で１時間ブロッキングした。ＲｅｎｉｌｌａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを検出する１次抗体（ＰＭ０４７、ＭＢＬ）、リン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質（Ｅｒｋ１／２）を検出する１次抗体（＃４３７０、ＣＳＴジャパン）、又はワクシニアウイルスを検出する１次抗体（ａｂ３５２１９、ａｂｃａｍ）を各切片に添加し、４℃で一晩インキュベートし洗浄した後、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）Ｂｏｏｓｔ  ＩＨＣ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（＃８１１４、ＣＳＴジャパン）とＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（＃８０５９、ＣＳＴジャパン）を用いて発色させ、ヘマトキシリンで切片を対比染色した。図１２ＣがＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  （Ｒｌｕｃ）の検出結果を示し、図１２Ｄがリン酸化されたｐ４４／４２ＭＡＰＫタンパク質（Ｅｒｋ１／２）（ｐＥＲＫ）の検出結果を示し、図１２Ｅがワクシニアウイルスの検出結果を示す。図１２Ｃに示すように図の上部の組織が正常組織であり、図の下部の組織が腫瘍組織である。Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとワクシニアウイルスは、腫瘍細胞でのみ検出された。その腫瘍細胞では、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路の活性化が確認されたが、周囲の正常細胞ではその経路が活性化されていなかった。
【実施例５】
【００１２】
ＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおけるウイルス用量と抗癌効果、安全性の関係の検討
一方、同様のＢｘＰＣ−３腹膜播種マウスモデルにおいて、ウイルス用量と抗癌効果・安全性を評価した。ウミシイタケルシフェラーゼを安定して発現するヒト膵癌ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０５、１０６、又は１０７ｐｆｕの各分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスを腹腔内に投与した（各群５匹）。ウイルス投与２日前、及びウイルス投与１１日後に、ウミシイタケルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンを腹腔内投与することによって、マウス体内での腫瘍細胞（＝増殖細胞数）をｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＮｉｇｈｔＤＨＡＤＥ  ＬＢ９８５）により非侵襲的にモニターし（図１３Ａ）、数値化した（図１３Ｂ）。その結果、全てのウイルス投与２日前にはＢｘＰＣ−３細胞の腹膜播種が有意差なく同等に確認され、治療１１日後の腹腔内では、１０５ｐｆｕウイルス投与群で治療前の８７．７〜９８．３％、１０６ウイルス投与群で治療前の９２．４〜９９．３％、１０７ウイルス投与群で治療前の８８．３〜９８．９％の腫瘍が有意差なく同等に消失していた。コントロール群では治療効果がなく腫瘍が増大していた。図１３Ａと図１３Ｂにおいて、各パネルの上と右の記載は、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を示す。図１３Ａの右の棒はルシフェラーゼによる光源の光度つまり光の強さのスケールを示し、赤、オレンジ、黄色黄緑、青、紫の順で光の強さを表す。そして、図１３Ｂではその光の強さの単位であるｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃの総数を縦軸に示している。
次に、ウイルス投与３日後、及び１０日後に、ホタルルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを腹腔内投与することによって、マウス体内でのウイルス分布を非侵襲的にモニターした。その結果、投与３日後には腹腔内腫瘍における各ウイルス投与群（１０５、１０６、又は１０７ｐｆｕのＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）では、同等のウイルス増殖が確認された。そして投与１０日後には、体内からウイルスが喪失するか、もしくはウイルス増殖が腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった（図１４）。図１４において、各パネルの上の記載は、ｍＯ株、ＶＧＦ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−）、Ｏ１Ｌ欠損ｍＯ株（Ｏ１Ｌ−）及びＶＧＦとＯ１Ｌ欠損ｍＯ株（ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−）を示す。
以上より、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が活性化されていない正常細胞ではその増殖性が著しく低下するが、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が活性化している腫瘍細胞では、それがＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−ウイルスのＥＲＫ活性化機能を補ってウイルスは増殖できることがマウス体内において証明された。又、ＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−治療群の抗癌効果が、１０倍、１００倍のＶＧＦ−／Ｏ１Ｌ−治療群のそれと同等であることは、より低い投与量でも、感染した腫瘍細胞内で増殖しながら死滅させるというウイルス療法の利点が実証された。
【産業上の利用可能性】
【００１３】
本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を活性化する、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能が欠損している。従って、正常細胞においては、細胞のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路を活性化することができないので、細胞は増殖せず、その結果ワクシニアウイルスも増殖することができないので、正常細胞を障害することはない。一方、癌細胞においては、元々Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路が異常に活性化されているので、ＶＧＦ及びＯ１Ｌによる活性化がなくても、癌細胞は増殖し得る。従って、本発明の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは癌の治療に用い得る。
さらに、ワクシニアウイルスは、広い宿主域と高い発現効率を有しているため、他の外来遺伝子を導入するベクターとしても機能する。ルシフェラーゼやＧＦＰを発現する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルスは、その感染細胞を簡便、迅速に同定することが可能となる。また、細胞毒性効果や免疫賦活効果を有する治療遺伝子を発現させることによって、他の治療法との併用も可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００１４】
配列番号３−８、１３−２２  プライマー
配列番号９−１２  合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図５−２】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図９】
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【図１０Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図６Ａ】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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