(57)【要約】外来物質を細胞内へ導入するために用いる新規の材料を提供する。また、かかる材料を利用して、対象の細胞に外来物質を導入するための方法を提供する。本発明によると、外来物質を対象細胞内に導入するために用いるエクソソームであって、１種または２種以上の外来物質と、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、を内包するエクソソームが提供される。また、本発明によると、かかるエクソソームを含む組成物およびかかるエクソソームを用いて外来物質を細胞内に導入する方法が提供される。
2016076347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象細胞に対して外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いるエクソソームであって、
１種または２種以上の外来物質と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、
を内包する、エクソソーム。
【請求項２】
前記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質が、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を刺激する物質、またはＣＸＣケモカイン受容体４を刺激する物質である、請求項１に記載のエクソソーム。
【請求項３】
前記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質が、ＥＧＦもしくはそのアナログ、またはＳＤＦもしくはそのアナログである、請求項１または２に記載のエクソソーム。
【請求項４】
前記外来物質が、薬理活性を有する物質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエクソソーム。
【請求項５】
前記対象細胞がヒトの腫瘍細胞であり、且つ、前記外来物質が抗腫瘍活性を有する化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエクソソーム。
【請求項６】
対象細胞に対して、外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いる組成物であって、
薬学的に許容可能な１種または２種以上の担体と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、
１種または２種以上の外来物質を内包するエクソソームと、
を含む、組成物。
【請求項７】
対象細胞に対して外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いる組成物であって、
薬学的に許容可能な１種または２種以上の担体と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と１種または２種以上の外来物質のいずれも内包するエクソソームと、
を含む、組成物。
【請求項８】
インビトロにおいて、外来物質を対象細胞の細胞内に導入する方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、および
前記細胞培養物中に、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、１種または２種以上の外来物質とをいずれも内包するエクソソームを供給すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来物質の細胞内への導入方法ならびに該方法に用いる材料に関する。詳しくは、マクロピノサイトーシスによるエクソソーム（エキソソーム、Ｅｘｏｓｏｍｅ）の取り込みを利用して、外来物質を対象の細胞内へ導入する方法ならび該方法に用いる材料に関する。
なお、本出願は２０１４年１１月１３日に出願された日本国特許出願２０１４−２３０４７２号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
薬学分野において、体内の薬物分布を空間的、時間的、量的に制御するための技術の開発は、非常に重要なテーマの一つである。上記体内の薬物分布を好適に制御することで、例えば、薬理効果の増強、副作用の軽減、投与回数の低減、経費の削減等が可能となる。このような体内の薬物分布を空間的、時間的、量的に制御する技術は、一般的にドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ：Drug Delivery System）と呼ばれ、盛んに研究開発が行われている。【０００３】
近年、細胞レベルでのＤＤＳに関する技術、典型的には、外来物質を目的の細胞に効率よく導入する技術が注目されている。かかる技術を応用することで、例えば、疾患の原因細胞に対して目的の薬剤を効率よく供給（作用）させることが可能となる。特に、正常細胞に対する副作用が強い薬（例えば抗がん剤）を目的細胞（例えばがん細胞）に効率よく作用させることができれば、副作用を低減しつつ高い効果を発揮することを実現することができる。
また、かかる細胞レベルでのＤＤＳに関する技術は、再生医療分野においても注目度が高い。例えば、かかる技術を応用することで、初期化因子や分化誘導因子等を目的の細胞に効率よく導入することができる。また、再生医療用の移植材料（例えば、再生医療に用いる幹細胞、あるいは該幹細胞から分化誘導した細胞や組織等）を生体内に移植する際に、該移植材料が生体内で生着するまでに必要な因子等を、該移植材料に対して効率よく供給することに応用することも可能である。
特許文献１〜３には、かかる細胞レベルでのＤＤＳに関する技術として、種々のキャリア物質を用いて所望の物質（典型的には薬剤）を細胞内へ導入する手法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１２１９８６号公報
【特許文献２】特開２０１３−０６３９２６号公報
【特許文献３】特表２００３−５１７８８６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ケミストリー・アンド・バイオロジー（Chemistry & Biology）、１９巻、２０１２年、ｐｐ．１４３７−１４４６
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、２８９巻、２０１４年、ｐｐ．２２２５８−２２２６７
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・セルサイエンス（Journal of Cell Science）、９４巻、１９８９年、ｐｐ.１３５−１４２
【発明の概要】
【０００６】
ところで、例えば特許文献１〜３等に記載の従前のＤＤＳでは、外来物質を細胞内に導入するためのキャリア物質として、一般的に生体外の化合物を用いている。このような生体外の化合物を用いると、かかる担体に由来する細胞毒性や該担体に対する免疫反応等により、十分な効果が発揮できない場合があった。
このため、生体由来の物質を用いて外来物質を細胞内に導入する技術の確立が試みられている。
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑み、外来物質を細胞内へ導入するために用いる新規の材料の提供を目的として創出されたものである。具体的には、生体由来の物質を利用して外来物質を生体内に導入する技術の確立を目的とする。また、かかる材料を使用して、対象の細胞に外来物質を導入するための方法の提供を他の目的とする。
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために、生体内に広く分布して存在するエクソソームに着目した。エクソソームとは、生体内（典型的には体液中）に存在する脂質二重膜でできた小胞である。本発明者らは、エクソソームが細胞内へ取り込まれる機序に関する研究を鋭意推進したところ、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導することによって、エクソソーム内に内包した外来物質を対象細胞に好適に導入し得ることを見出した。さらに、本発明者らは、マクロピノサイトーシスを誘導する物質を内包するエクソソームを対象細胞に供給することで、該対象細胞における該エクソソームの取り込みが促進されることを新たに見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
ここで、非特許文献１には、特定の受容体を刺激する物質を細胞に供給することでマクロピノサイトーシスが活性化する現象について記載されており、また、非特許文献２には、マクロピノサイトーシスによりエクソソームが細胞内に取り込まれる現象について記載されている。しかし、マクロピノサイトーシスを誘導することによって、エクソソーム内に内包した外来物質を対象細胞に好適に導入し得ること、および、マクロピノサイトーシスを誘導する物質を内包するエクソソームを細胞に供給することによって、該細胞におけるエクソソームの取り込みが促進されることについては、開示も示唆もない。
【００１０】
本発明によると、上記目的を実現すべく、対象細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加された際）に、外来物質を該細胞内へ導入する能力を有するエクソソーム（以下、かかるエクソソームを「外来物質導入用エクソソーム」ともいう）が提供される。
即ち、ここで開示されるエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）は、対象細胞に対して外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いるエクソソームであって、
１種または２種以上の外来物質と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、
を内包する、エクソソームである。
【００１１】
ここで開示される外来物質導入用エクソソームは、該エクソソーム内にマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、外来物質とを内包することを特徴とする。このことにより、対象の細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導（活性化）し、対象細胞による該エクソソームの取り込みを促進させることができる。したがって、外来物質導入用エクソソーム中に内包した外来物質を、対象細胞の細胞内に効率よく導入することができる。
ここで、エクソソームとは生体由来の物質である。このため、生体外の化合物由来の物質と比較して、エクソソームによる細胞毒性やエクソソームに対する免疫反応を低減し得る。このため、エクソソームは、外来物質を導入するためのキャリアとして好ましい。
また、ここで開示される外来物質導入用エクソソームは、エクソソーム内に目的の外来物質とマクロピノサイトーシスを誘導する物質とを内包しているため、マクロピノサイトーシスを誘導する物質と外来物質を内包するエクソソームとを目的の細胞に対して各々供給する操作や、これらを混合する操作等を行う必要がない。このため、対象細胞に対して外来物質導入用エクソソームを供給するという簡便な操作によって、対象の細胞内に目的の外来物質を導入することができる。
また、エクソソームは、細胞培養液中で安定してその構造を維持し得る小胞である。また、生体内（例えば血中内等）でも分解されにくく安定して存在し得る。このため、エクソソーム内にマクロピノサイトーシスを誘導する物質および外来物質を内包することで、これらの物質が分解（代謝、失活）されることを低減することができる。例えば、肝臓での薬物代謝、排泄物としての排出、免疫細胞による排除等を好適に低減（回避）し得る。したがって、ここで開示の外来物質導入用エクソソームによると、マクロピノサイトーシスを誘導する物質および外来物質を安定して細胞（特に生体内の細胞）に供給することができる。
このため、ここで開示される外来物質導入用エクソソームは、外来物質を対象細胞内に導入する用途に用いられる組成物の成分として好ましい。また、外来物質を対象細胞内に導入する方法に利用することができる。
【００１２】
ここで開示されるエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）の好ましい一態様では、前記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質が、上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）を刺激（活性化）する物質、またはＣＸＣケモカイン受容体４（CXC Chemokine receptor 4：ＣＸＣＲ４、或いは、ＣＤ１８４またはＦｕｓｉｎともいう）を刺激（活性化）する物質である。
上皮成長因子受容体およびＣＸＣケモカイン受容体４は、該受容体を刺激することでマクロピノサイトーシスを誘導し得る受容体の典型例である。このため、上記上皮成長因子受容体を刺激（活性化）する物質およびＣＸＣケモカイン受容体４を刺激（活性化）する物質は、マクロピノサイトーシスを誘導する物質として好適である。
なかでも、前記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質として、ＥＧＦもしくはそのアナログ、またはＳＤＦ（stromal cell-derived factor：ストローマ細胞由来因子）もしくはそのアナログを内包するエクソソームは、ここで開示されるエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）の好適な一態様である。ＥＧＦ若しくはそのアナログは、上記上皮成長因子受容体を好適に刺激する物質であり、ＳＤＦ若しくはそのアナログは、上記ＣＸＣケモカイン受容体４を好適に刺激する物質である。
一般的に、ケモカインは分子内に保存された４つのシステイン残基（Ｃ）をもち、Ｎ末端側の２つのシステイン残基と他のアミノ酸残基との配列の関係の違いに応じて４つのサブファミリー（Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ）に分類される。このうちＣＸＣケモカインとは、上記Ｎ末端側の２つのシステイン残基（Ｃ）の間に１つの任意のアミノ酸残基（Ｘ）が存在するアミノ酸配列（「Ｃ−Ｘ−Ｃ」配列）を有するサブファミリーに属するケモカインをいう。
【００１３】
ここで開示されるエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）の好ましい一態様では、上記外来物質が、薬理活性を有する物質である。かかる構成とすることで、対象細胞に対して薬理活性を有する物質を効率よく供給することが可能となる。これにより、薬理活性を有する物質の薬理効果を高レベルで発揮することができる。
【００１４】
ここで開示されるエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）の好ましい一態様では、上記対象細胞がヒトの腫瘍細胞であり、且つ、上記外来物質が抗腫瘍活性を有する化合物である。抗腫瘍活性を有する化合物は、典型的には正常細胞に対する副作用が強いものが多い。かかる態様によると、抗腫瘍活性を有する化合物をヒトの腫瘍細胞に対して効率よく供給し得るため、抗腫瘍活性を有する化合物による正常細胞に対する副作用を低減しつつ、腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を高レベルに発揮することができる。
【００１５】
また、本発明は、他の側面として、対象細胞に対して、外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いる組成物（以下、かかる組成物を、「外来物質導入用組成物」ともいう）であって、
薬学的に許容可能な１種または２種以上の担体と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、
１種または２種以上の外来物質を内包するエクソソームと、
を含む、組成物（薬学的組成物）を提供する。
かかる構成の組成物（外来物質導入用組成物）は、マクロピノサイトーシスを誘導する物質を含むため、対象細胞に対してエクソソームの取り込みを好適に促進することができる。これにより、エクソソーム中に内包した外来物質を効率よく対象細胞内に導入することができる。
【００１６】
また、本発明は、他の側面として、対象細胞に対して外来物質を該細胞の外から細胞内へ導入するために用いる組成物（外来物質導入用組成物）であって、
薬学的に許容可能な１種または２種以上の担体と、
対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と１種または２種以上の外来物質のいずれも内包するエクソソームと、
を含む、組成物（薬学的組成物）を提供する。
かかる構成の組成物（外来物質導入用組成物）は、マクロピノサイトーシスを誘導する物質をエクソソーム内に内包するため、対象細胞に対して該エクソソームの取り込みを好適に促進することができる。これにより、エクソソーム内に内包した外来物質を効率よく対象細胞内に導入することができる。さらに、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質をエクソソーム内に内包するため、該マクロピノサイトーシスを誘導する物質を対象細胞に安定して供給することができる。
【００１７】
また、本発明は、他の側面として、インビトロにおいて、外来物質を対象細胞の細胞内に導入する方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、および
前記細胞培養物中に、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質と、１種または２種以上の外来物質とをいずれも内包するエクソソームを供給すること、
を含む方法を提供する。
かかる外来物質の導入方法によると、対象細胞を含む培養物中（典型的には当該細胞を培養する培地中）にエクソソームを供給するという簡易な方法により、外来物質を高効率に目的細胞に導入することができる。また、生体由来の物質であるエクソソームを、外来物質を細胞内に導入するためのキャリアとして用いることで、該キャリアによる細胞毒性を低減し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、ＥＧＦ存在下或いはＥＧＦ非存在下で培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた顕微鏡写真（画像）である。左側（ＣＤ６３−ＧＦＰ  ｅｘｏｓｏｍｅの列）に示す写真（画像）は、エクソソームの局在を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真（ＦＬ画像）である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、左側の列に示すＦＬ画像と、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。なお、写真中のスケールはいずれも２０μｍである。
【図２】図２は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、培地条件（ＦＢＳの有無およびＥＧＦの濃度）を変えて培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＦＢＳ無添加、且つＥＧＦ無添加の培地条件で培養した試験区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図３】図３は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）とデキストランとを対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、ＥＧＦ存在下で培養したときの、該細胞によるエクソソームおよびデキストランの取り込みについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた顕微鏡写真（画像）である。左上（Ｅｘｏｓｏｍｅ）に示す写真（画像）は、エクソソームの局在を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真である。また、左下（Ｄｅｘｔｒａｎ）に示す写真（画像）は、デキストランの局在を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真である。右（Ｍｅｒｇｅ）に示す写真（画像）は、左上に示す画像（Ｅｘｏｓｏｍｅ）と、左下に示す画像（Ｄｅｘｔｒａｎ）とを重ねた（マージした）画像である。写真（画像）中の矢印は、細胞内に取り込まれたエクソソームとデキストランが共局在している領域の典型例を指している。なお、写真中のスケールはいずれも１０μｍである。
【図４】図４は、培地中にマクロピノサイトーシスの阻害剤である5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride（以下、「ＥＩＰＡ」ともいう）を添加して培養し、その後一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給して培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、ＥＩＰＡ処理区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＥＩＰＡ無処理区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図５】図５は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、培地中のＥＧＦ濃度を変えて培養したときの、該細胞の細胞生存率（％）を調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における細胞生存率（％）を、コントロール区（エクソソームおよびＥＧＦのいずれも添加しない培養条件で培養した試験区）における細胞生存率（％）との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図６】図６は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル２）またはサポリンを対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、ＥＧＦ存在下またはＥＧＦ非存在下で培養したときの、該細胞の細胞生存率（％）を調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における細胞生存率（％）を、コントロール区（エクソソーム、サポリン、およびＥＧＦのいずれも添加しない培養条件で培養した試験区）における細胞生存率（％）との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図７】図７は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１、３、５）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給して培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、サンプル１添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図８】図８は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル２または４）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給して培養したときの、該細胞の細胞生存率（％）を調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、横軸に培地中のエクソソーム濃度を示し、縦軸に各試験区における細胞生存率（％）を、コントロール区（エクソソーム無添加、且つＥＧＦ無添加の培養条件で培養した試験区）における細胞生存率（％）との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値をそれぞれプロットして示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図９】図９は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル２または４）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給して培養したときの対象細胞の形態について、光学顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真（画像）を示す。図中の濃度（μｇ／ｍＬ）は培地中のエクソソーム濃度を示す。
【図１０】図１０は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、培地中のＥＧＦ濃度を変えて９６時間培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＥＧＦ無添加区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図１１】図１１は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（Ａ４３１細胞）に供給し、ＥＧＦ存在下或いはＥＧＦ非存在下で９６時間培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた顕微鏡写真（画像）である。左側の列（ＣＤ６３−ＧＦＰ  ｅｘｏｓｏｍｅの列）に示す写真（画像）は、エクソソームの局在を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真（ＦＬ画像）である。中央の列（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の列）に示す写真（画像）はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色画像である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、左側の列に示すＦＬ画像と、中央の列に示す核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。なお、写真中のスケールはいずれも２０μｍである。
【図１２】図１２は、対象細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ-２細胞を用いたときの、該細胞による一試験例に係るエクソソーム（サンプル１）の取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＥＧＦ無添加区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図１３】図１３は、対象細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ-２細胞を用いたときの、該細胞による一試験例に係るエクソソーム（サンプル１）およびデキストランの取り込みについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた顕微鏡写真（画像）である。最左（Ｅｘｏｓｏｍｅ）に示す写真（画像）は、エクソソームの局在を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。左から２つ目（Ｄｅｘｔｒａｎ）に示す写真（画像）は、デキストランの局在を蛍光観察により調べた蛍光写真（画像）である。右から２つ目（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）に示す写真（画像）はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色画像である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、最も左に示す画像（Ｅｘｏｓｏｍｅ）と、左から２つ目に示す画像（Ｄｅｘｔｒａｎ）と、右から２つ目に示す核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。なお、写真中のスケールはいずれも１０μｍである。
【図１４】図１４は、対象細胞としてＢｘＰＣ−３細胞を用いたときの、該細胞による一試験例に係るエクソソーム（サンプル１）の取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＥＧＦ無添加区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【図１５】図１５は、一試験例にかかるエクソソーム（サンプル１）を対象細胞（ＨｅＬａ細胞）に供給し、培地中のＳＤＦ濃度を変えて培養したときの、該細胞によるエクソソームの取り込みについて、フローサイトメーターを用いた分析により調べた結果を示すグラフである。かかるグラフは、各試験区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を、コントロール区（ＳＤＦ無添加区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度との相対比で示す。同様の試験を独立して３回繰り返したときの平均値を棒グラフで示し、標準偏差（±ＳＤ）をエラーバーで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の構成）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば所望の外来物質の合成方法および入手方法、細胞培養技法、薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００２０】
本明細書において、「エクソソーム」とは、種々の真核細胞から細胞外に分泌される脂質二重膜でできた小胞を意味する。典型的には、直径５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の小胞である。エクソソームは細胞が分泌する小胞（即ち、生体由来の物質）であるという点で、リポソーム（細胞膜を模して人工的に作製される小胞）とは明確に区別される。
エクソソームを分泌する細胞は特に限定されず、例えば、種々の培養細胞（例えば、細胞株、初代培養株等）および生体内に存在する種々の細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、免疫系細胞、造血系細胞等）がエクソソームを分泌し得る。正常細胞のみではなく、腫瘍細胞や病原体感染細胞等もエクソソームを分泌し得る。かかるエクソソームは、細胞を培養する培地中および生体内のあらゆる体液中に存在する。上記体液としては、血液（典型的には血清、血漿）、唾液、尿、胸水、骨髄、羊水等が挙げられる。エクソソームは、かかる体液中および培養液中で安定して（内包物が体液中で分解されることなく）存在し得る。
【００２１】
本明細書において、「マクロピノサイトーシス」とは、エンドサイトーシスの一種であり、細胞膜周辺のアクチン（アクチンフィラメント）の重合により細胞膜が突出する形で細胞外の物質（細胞外液を含む）を細胞内に取り込むものである。典型的には、細胞膜の波打ち現象（membrane ruffling）が観察される。
ここで、上記マクロピノサイトーシスと、細胞膜が細胞内に陥没する形で細胞外の物質を細胞内に取り込むエンドサイトーシスとは、以下の点で明確に区別される。上記細胞膜陥没型のエンドサイトーシスは、典型的に細胞膜表面のクラスリンタンパク質依存的に進行する。このため、クラスリン依存的エンドサイトーシスとも呼ばれる。一方、マクロピノサイトーシスはクラスリンタンパク質非依存的である。また、上記クラスリン依存的エンドサイトーシスにより形成されるエンドソームは直径が凡そ１００ｎｍ程度であるのに対して、マクロピノサイトーシスにより形成されるエンドソーム（マクロピノソームとも呼ばれる）は直径がおよそ２００ｎｍ〜５０００ｎｍ（０．２μｍ〜５μｍ）程度と大きい。
【００２２】
本明細書において、「外来物質」とは、本発明を適用する対象細胞からみた外来物質を意味する。即ち、上記対象細胞がインビトロ培養系において維持される培養細胞の場合であれば、該対象の培養細胞を単離した生物における外来物質か否かでは区別されない。例えば、対象の培養細胞に対して、該細胞外から細胞内へ導入する物質は、何れも外来物質であり得る。例えば、対象細胞と同じセルライン（細胞株）から単離した物質であっても、該物質を細胞外から細胞内に導入する点において、対象細胞に対する外来物質であり得る。また、上記対象細胞が生体内に存在する細胞であれば、該細胞が存在する生体（個体）における外来物質か否かは問題とならない。例えば、対象細胞が存在する生体外で人為的に合成された物質、対象細胞が存在する生体以外の生物由来の物質のみでなく、該対象細胞が存在する生体（同一の個体）から単離した物質も、上記外来物質の典型例である。
【００２３】
ここで開示されるエクソソームは、外来物質を対象細胞内に導入するために用いられ得ることが、本発明者によって初めて見出されたエクソソームである。上述のとおり、ここで開示されるエクソソームは、１種または２種以上の外来物質と、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質（以下、「マクロピノサイトーシス誘導物質」ともいう）とを内包するエクソソーム（外来物質導入用エクソソーム）である。即ち、ここで開示される外来物質導入用エクソソームは、典型的には、キャリアとしてのエクソソーム粒子と、該エクソソーム粒子中に内包された外来物質と、該エクソソーム粒子中に内包されたマクロピノサイトーシス誘導物質とを含む。以下、かかる外来物質導入用エクソソームを構成する各物質について、以下に説明する。
【００２４】
＜エクソソーム＞
ここで開示する外来物質導入用エクソソームに用いられるエクソソーム（即ち、キャリアとしてのエクソソーム粒子）としては、種々の細胞から分泌されるエクソソームを回収して用いることができる。例えば、血液（典型的には血清）、尿、唾液、リンパ液、胃腸液、肺洗浄液、脳脊髄液、炎症惨出液、羊水、母乳等の生体液中には、生体由来のエクソソームが存在する。このため、かかる生体液を採取し、該生体液中のエクソソームを回収して使用することができる。或いはまた、細胞を培養している培養液中にも該培養細胞から放出（分泌）されたエクソソームが存在するため、かかる細胞培養液から回収したエクソソームも特に制限なく使用することができる。
【００２５】
なお、上記生体液中から回収したエクソソームと上記細胞培養液中から回収したエクソソームとは、本発明における外来物質を対象細胞中に導入する観点からはどちらも区別なく使用することが可能であり、適宜選択して使用することができる。必要量のエクソソームを効率よく回収（準備）する観点からは、細胞培養液から回収したエクソソームを用いることが好適である。
【００２６】
また、エクソソームを分泌する細胞の種類によって、該エクソソームの性質、例えば、エクソソームを構成する脂質二重膜のプロファイル（例えば、該脂質二重膜中に含まれるペプチド（タンパク質を含む）、脂質、糖鎖等の組成）や、該エクソソーム中にもともと内包される物質（例えば、ペプチド（タンパク質を含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等）、細胞質内に含まれる可溶性成分等）の組成等が異なる場合がある。このため、特定の性質のエクソソームを利用する場合は、特定の細胞を培養している培養液中から回収したエクソソームを用いることが好ましい。これにより、同様の性質を有するエクソソームを純度の高い状態で入手し得る。
【００２７】
或いはまた、遺伝子工学的手法等により、エクソソームを構成する膜の表面に特定の分子を付与してもよい。例えば、エクソソームを分泌する細胞（エクソソーム産生細胞）の細胞膜表面に特定の分子（例えばペプチド、タンパク質等）を強制発現させることによって、エクソソームを構成する膜の表面に目的の分子を付与することができる。かかる特定分子として、対象細胞に高発現する分子と作用する（典型的には、対象細胞に高発現する受容体に結合する）分子を採用することで、対象細胞に対して高効率に外来物質を導入することができる。即ち、対象細胞に対する特異性が向上するため好ましい。
【００２８】
上記生体液および細胞培養液中からエクソソームを回収する方法としては、従来公知の方法を採用することができる。例えば、超遠心分離法（Thery C., Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3:Unit 3.22.）により、エクソソームを単離することができる。或いはまた、Total esosome isolation (from cel culture media) （Life Technologies（Invitrogen）社製）等の市販の試薬（キット）を用いてエクソソームを単離してもよい。エクソソームに特異的なマーカータンパク質（例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等）に対する抗体を用いる方法、適当なフィルターまたはカラムを利用する方法（フィルター法、カラム法等）等によっても、上記生体液および細胞培養液中からエクソソームを回収することができる。例えば、免疫沈降法、ＦＡＣＳ法、限外濾過法、ゲル濾過法、フィルター法、ＨＰＬＣ法、ポリマーやビーズ等に吸着させたエクソソームを沈殿する或いはカラムを用いて分離する方法等が挙げられる。
【００２９】
上述の方法によりエクソソームが回収されたことは、透過型電子顕微鏡を用いて観察（典型的にはネガティブ染色）する方法、或いは、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等の手法（典型的には免疫学的手法）によりエクソソームのマーカータンパク質（例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等）を検出する方法等が挙げられる。或いはまた、エクソソーム由来のＲＮＡを測定してもよい。
【００３０】
ここで、本明細書において、上述の方法により回収したエクソソーム量（ｇ）は、回収したエクソソームのトータルタンパク質量換算で示すものとする。即ち、回収したエクソソーム分散液中のトータルタンパク質量を測定することで、回収したエクソソーム量（ｇ）を算出することができる。具体的には、回収したエクソソーム分散液中に１μｇ／ｍＬのトータルタンパク質が含まれていた場合には、該エクソソーム分散液中には、１μｇ／ｍＬのエクソソームが含まれているものとして扱うこととする。
【００３１】
＜マクロピノサイトーシス誘導物質＞
ここで開示される外来物質導入用エクソソームに用いられるマクロピノサイトーシス誘導物質は、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導し得る物質であれば特に限定されない。
例えば、上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR）を刺激（活性化）する物質や、ＣＸＣケモカイン受容体４（CXC Chemokine Receptor 4: CXCR4）を刺激（活性化）する物質であり得る。或いはまた、血小板由来成長因子受容体（Platelet Derived Growth Factor Receptor: PDGFR）を刺激（活性化）する物質や線維芽細胞増殖因子受容体（Fibroblast Growth Factor Receptor: FGFR）および／またはシンデカン−４（Syndecan-4）を刺激（活性化）する物質であり得る。ＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ４およびＰＤＧＦＲは、いずれも該受容体を刺激（活性化）することでマクロピノサイトーシスを誘導し得る受容体である。また、ＦＧＦＲとSyndecan-4は、これらの受容体（またはこれらの受容体の複合体）を刺激（活性化）することでマクロピノサイトーシスを誘導し得る受容体である。
或いはまた、特定の受容体の刺激を必要とすることなくマクロピノサイトーシスを誘導し得ることが知られている物質も、上記マクロピノサイトーシス誘導物質として採用し得る。例えば、特定の受容体の刺激を必要とすることなく細胞内のＰＫＣ（Protein Kinase C）を活性化する物質であり得る。非特許文献３には、対象細胞の細胞内のＰＫＣを活性化することで、マクロピノサイトーシスを誘導し得ることが記されている。
【００３２】
ここで、上記ＥＧＦＲを刺激する物質としては、ＥＧＦＲを活性化することが従来から知られている物質を特に制限なく使用できる。典型的には、ＥＧＦＲのリガンドとして知られる物質を使用し得る。ここで、ＥＧＦＲのリガンドとしては、上皮成長因子（Epidermal growth factor、ＥＧＦ）、α型トランスフォーミング増殖因子（Transforming growth factor-α、ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子（heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor、ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＡＲＥＧ、ＡＲ）、ベタセルリン（Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、ＢＴＣ），エピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＥＲＥＧ）、エピジェン（Ｅｐｉｇｅｎ、ＥＰＧ）等が挙げられる。
かかるＥＧＦＲのリガンドおよびそのアナログは、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る物質である。或いは、これらＥＧＦＲのリガンドのアゴニストおよびそのアナログも、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る。
【００３３】
なかでも、ＥＧＦおよびそのアナログ、あるいはＥＧＦのアゴニストおよびそのアナログは、ＥＧＦＲを刺激することによってマクロピノサイトーシスを誘導する能力に優れているため、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る。特に、ＥＧＦおよびそのアナログは、本発明の実施に好適である。
【００３４】
また、上記ＣＸＣＲ４を刺激する物質としては、ＣＸＣＲ４を活性化することが従来から知られている物質を特に制限なく使用できる。典型的には、ＣＸＣＲ４のリガンドとして知られる物質を使用し得る。ここで、ＣＸＣＲ４を刺激する物質（典型的にはＣＸＣＲ４のリガンド）の例としては、ストローマ細胞由来因子１（Stromal cell-derived factor-1、ＳＤＦ-１）が挙げられる。
かかるＣＸＣＲ４のリガンド（典型的にはＳＤＦ−１）およびそのアナログは、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る物質である。或いは、かかるＣＸＣＲ４のリガンド（典型的にはＳＤＦ−１）のアゴニストおよびそのアナログも、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る。特に、ＳＤＦ−１およびそのアナログは、本発明の実施に好適である。
【００３５】
また、上記ＰＤＧＦＲを刺激する物質としては、ＰＤＧＦＲを活性化することが従来から知られている物質を特に制限なく使用できる。典型的には、ＰＤＧＦＲのリガンドとして知られる物質を使用し得る。ここで、ＰＤＧＦＲを刺激する物質（典型的にはＰＤＧＦＲのリガンド）の例としては、血小板由来成長因子（Platelet Derived Growth Factor: ＰＤＧＦ）が挙げられる。
かかるＰＤＧＦＲのリガンド（典型的にはＰＤＧＦ）およびそのアナログは、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る物質である。或いは、かかるＰＤＧＦＲのリガンド（典型的にはＰＤＧＦ）のアゴニストおよびそのアナログも、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る。特に、ＰＤＧＦおよびそのアナログは、本発明の実施に好適である。
【００３６】
また、上記ＦＧＦＲおよび／またはSyndecan-4を刺激する物質としては、少なくともＦＧＦＲおよびSyndecan-4のいずれかを活性化することが従来から知られている物質を特に制限なく使用できる。典型的には、ＦＧＦＲおよびSyndecan-4のリガンドとして知られる物質を使用し得る。ここで、ＦＧＦＲおよびSyndecan-4を刺激する物質（典型的にはＦＧＦＲのリガンド）の例としては、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor: FGF）が挙げられる。
かかるＦＧＦＲおよびSyndecan-4のリガンド（典型的にはＦＧＦ）およびそのアナログは、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る物質である。或いは、かかるＦＧＦＲおよびSyndecan-4のリガンド（典型的にはＦＧＦ）のアゴニストおよびそのアナログも、マクロピノサイトーシス誘導物質として好適に使用し得る。特に、ＦＧＦおよびそのアナログは、本発明の実施に好適である。
【００３７】
また、上記特定の受容体の刺激を必要とすることなく細胞内のＰＫＣを活性化する物質としては、該細胞内のＰＫＣを活性化することが従来から知られている物質を特に制限なく使用することができる。かかる細胞内のＰＫＣを活性化する物質として、例えばホルボールエステル（phorbol ester、具体的にはPhorbol 12-Myristate 13-Acetate（ＰＭＡ））が挙げられる。上記ホルボールエステル（典型的にはＰＭＡ）は、細胞内のＰＫＣを活性化することでマクロピノサイトーシスを誘導することが知られる物質である（非特許文献３）。
【００３８】
上記マクロピノサイトーシス誘導物質は、対象細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、対象細胞がＥＧＦＲを発現している細胞（典型的にはＥＧＦＲ高発現細胞）であれば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＥＧＦＲを刺激する物質を好適に採用し得る。また、対象細胞がＣＸＣＲ４を発現している細胞（典型的にはＣＸＣＲ４高発現細胞）であれば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＣＸＣＲ４を刺激する物質を好適に採用し得る。上記ＥＧＦＲおよびＣＸＣＲ４の場合と同様に、対象細胞がＰＤＧＦＲを発現している細胞（典型的にはＰＤＧＦＲ高発現細胞）であれば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＰＤＧＦＲを刺激する物質を好適に採用することが出来、また、対象細胞がＦＧＦＲおよび／またはSyndecan-4を発現している細胞（典型的にはＦＧＦＲおよびSyndecan-4を共に発現している細胞）であれば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＦＧＦＲおよび／またはSyndecan-4を刺激する物質を好適に採用し得る。
【００３９】
ここで開示されるマクロピノサイトーシスを誘導する物質は、上記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する能力を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。或いは、上記対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する能力を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「マクロピノサイトーシスを誘導する物質」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００４０】
なお、上記マクロピノサイトーシスを誘導する物質（典型的には上記ＥＧＦＲを刺激する物質、上記ＣＸＣＲ４を刺激する物質、上記ＰＤＧＦＲを刺激する物質、上記ＦＧＦＲおよびSyndecan-4を刺激する物質、および上記細胞内のＰＫＣを活性化する物質）は、市販品の購入により入手したものを使用可能である。或いはまた、公知の方法により作製してもよい。例えば、化学合成或いは生合成（例えば、遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成した物質であり得る。なお、上記マクロピノサイトーシスを誘導する物質の入手方法については本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は割愛する。
【００４１】
＜外来物質＞
ここで開示の外来物質導入用エクソソームは、該エクソソーム内に所望の外来物質を１種または２種以上（例えば３種以上）内包する。外来物質としては、対象の細胞の細胞内に導入することを望む物質であれば、特に限定されない。何らかの生理活性（典型的には薬理活性）を有する物質は、医療産業上の利用価値が高いため好ましい。外来物質導入用エクソソームを特定の疾患に対する治療目的で使用する観点からは、該疾患に対する治療効果を発揮する物質が本発明における外来物質として好ましい。例えば、医薬品或いは該医薬品の有効成分として用いられる物質であり得る。医薬品或いはその有効物質としては、医薬としての使用が認められている物質であれば特に限定されず、例えば、化学合成医薬（典型的には低分子医薬）およびバイオテクノロジー応用医薬（所謂、バイオ医薬）、生薬（例えば漢方薬）等であり得る。
【００４２】
上記外来物質が有する生理活性（典型的には薬理活性）としては、対象の細胞に対して特定の生理的調節機能に作用する性質であり得る。或いは特定の病原体の増殖を抑制する性質であり得る。例えば、抗腫瘍活性、所定の分化誘導活性、分化抑制活性、脱分化誘導活性、細胞増殖（分裂）促進活性、細胞増殖（分裂）抑制活性、抗血管新生作用、血管新生促進作用、免疫抑制作用、免疫亢進作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、造血促進作用、向精神作用、抗うつ作用、ホルモン様作用、抗ホルモン作用、特定の酵素反応に対する促進作用、特定の酵素反応に対する阻害作用、特定のシグナル伝達に対する促進作用、特定のシグナル伝達に対する抑制作用等であり得る。或いは、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗真菌作用、抗寄生虫作用等が挙げられる。或いはまた、糖尿病改善作用、高血圧改善作用、高脂質血症改善作用、抗血栓作用、鎮痛作用、利尿作用等であり得る。
【００４３】
従って、上記外来物質としては、抗腫瘍物質（抗がん物質）、分化誘導物質、分化抑制物質、脱分化誘導物質、細胞増殖（分裂）促進物質、細胞増殖（分裂）抑制物質、抗血管新生物質、血管新生促進物質、免疫抑制物質、免疫亢進物質、抗アレルギー物質、抗炎症物質、造血促進物質、ホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、ケモカイン、脂質メディエーター、神経伝達物質、ビタミン、ミネラル、抗菌物質、抗ウイルス物質、抗真菌物質、抗寄生虫物質等であり得る。また、これらの物質を含有する組成物であり得る。
【００４４】
上記外来物質としては、例えば、人為的に合成された化合物であり得る。かかる人為的に合成された化合物は、所望量の化合物を比較的容易に入手可能であるため、本発明の適用対象として好ましい。かかる人為的に合成された化合物としては、天然資源に由来する物質をリード物質として創製された化合物、天然資源に由来する物質と同等の物質を人為的に合成した化合物、および天然資源に由来する物質とは無関係に人為的に設計して合成した化合物等が挙げられる。合成方法は特に限定されず、例えば、一般的な化学合成（典型的には有機合成）、或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって合成した物質であり得る。或いはまた、上記外来物質は、天然抽出物であってもよい。例えば、ヒト或いはヒト以外の生物から抽出（典型的には単離）される物質であり得る。
【００４５】
上記外来物質の好適例として、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、プラスミド、遺伝子導入用ベクター、脂質、糖質等が例示される。
ここで、上記ペプチドおよびタンパク質は、複数のポリペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーであれば特に限定されない。ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数については特に限定されない。一般的に、ペプチドは分子量が比較的小さいものであり、例えば、全アミノ酸残基が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のものであり得る。かかるペプチドおよびタンパク質としては、例えば、種々の抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面因子等が挙げられる。
上記ポリヌクレオチドは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）であれば特に限定されない。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数についても特に限定されず、一本鎖および二本鎖の何れであってもよい。また、直鎖状、環状或いは適宜折りたたまれた形状であってもよい。例えば、種々の長さのＲＮＡフラグメント（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を含む）やＤＮＡフラグメント等が挙げられる。
上記アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、プラスミド、遺伝子導入用ベクター、脂質、糖質等は、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成した物質であり得る。或いは、ヒトあるいはヒト以外の生物から単離した物質であってもよい。
【００４６】
細胞から分泌されたエクソソーム中には該細胞由来のペプチド（タンパク質を含む）およびＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等）を内包しており、該内包物を安定して（典型的には分解されることなく）維持し得る。このため、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドは、外来物質導入用エクソソーム内において安定して保持され得る。特に、これらの物質は、生体内（典型的に血中）においてタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）および核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）等による分解や、免疫細胞による排除を受けやすい。これに対し、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドを外来物質導入用エクソソーム中に内包することで、これらの物質の生体内での安定性を向上することができる。同様の理由から、ウイルス粒子、プラスミド、遺伝子導入用ベクターに対しても、本発明を好適に適用し得る。
【００４７】
また、ここで開示の外来物質導入用エクソソームは、該エクソソーム中に内包する外来物質として、疎水性の高い物質を好適に内包し得る。
かかる疎水性の高い物質は、その可溶性の低さから、細胞培養液中に所望量供給することが困難な場合がある。かかる物質を外来物質導入用エクソソーム中に内包することで、培養細胞に対する疎水性物質の供給量を増大し得る。
また、上記疎水性の高い物質は、生体内（典型的には血中）において所望の濃度を達成し難いこと、また代謝および排せつにより生体外に排除されやすい等の理由から、生体内（典型的には血中）への高濃度での投与、高頻度での投与等が必要となりがちである。かかる物質を外来物質導入用エクソソーム中に内包することで、生体内における安定性を向上することができる。
【００４８】
或いはまた、医療産業上の観点からは、ドキソルビシン等の抗腫瘍活性を有する物質（典型的には抗がん薬）、および、タクロリムス水和物等の免疫抑制活性を有する物質（典型的には免疫抑制物質）等を含む医療用薬、および、磁性ビーズ、量子ドット等の金属性診断薬等は、ここで開示する外来物質導入用エクソソーム中に内包する外来物質として好ましい。
【００４９】
上記マクロピノサイトーシスを誘導する物質および外来物質をエクソソーム内に内包させる方法としては、特に制限されないが、例えばエレクトロポレーション法（電気穿孔法）が挙げられる。具体的には、エクソソームとマクロピノサイトーシス誘導物質および／または外来物質を懸濁した懸濁液を準備し、該懸濁液に対して所定の電気パルスを負荷してエクソソームの膜に微小な穴をあけることで、上記マクロピノサイトーシス誘導物質および／または外来物質をエクソソーム内に導入することができる。
【００５０】
上記マクロピノサイトーシス誘導物質および外来物質は、エクソソーム内に同時に内包させても（導入しても）よいし、数回に分けて別々に内包させても（導入しても）よい。操作性の観点およびエクソソームどうしの融合を回避する観点からは、上記マクロピノサイトーシスを誘導する物質および外来物質は、エクソソーム内に同時に導入することが好ましい。
【００５１】
上記懸濁液中に懸濁させるエクソソーム、マクロピノサイトーシス誘導物質および外来物質の割合は、エクソソーム中に導入（内包）する物質の種類、およびエクソソームあたりに内包したい物質の量および組成等に応じて適宜設定することができる。上記懸濁液中のエクソソームとマクロピノサイトーシス誘導物質との割合は、エクソソーム（ｇ）：マクロピノサイトーシスを誘導する物質（ｇ）＝１：０．１〜１：５（好ましくは１：０．３〜１：３、より好ましくは１：０．５〜１：２、例えば凡そ１：１）とすることができる。また、上記懸濁液中のエクソソームと外来物質（２種類以上の物質を用いる場合は、全外来物質の質量の総合計）との割合は、エクソソーム（ｇ）：外来物質（ｇ）＝１：０．１〜１：１０（好ましくは１：０．５〜１：８、より好ましくは１：１〜１：５、例えば凡そ１：２）とすることができる。ここで、上記懸濁液中のエクソソームの含有量（ｇ）は、エクソソームのトータルタンパク質量換算の含有量である。
典型的には、懸濁液中のエクソソーム含有量に対する懸濁液中のマクロピノサイトーシス誘導物質の含有量の比率（割合）を高くする程、エクソソーム内にマクロピノサイトーシス誘導物質を高濃度に内包させることができる。同様に、懸濁液中のエクソソーム含有量に対する外来物質の含有量の比率（割合）を高くする程、エクソソーム内に外来物質を高濃度に内包させることができる。また、典型的には、エクソソーム中に内包されるマクロピノサイトーシス誘導物質および外来物質の割合は、上記懸濁液中に懸濁させるマクロピノサイトーシス誘導物質および外来物質の割合に比例する。
【００５２】
ここで開示される外来物質を対象細胞の細胞外から細胞内へ導入するために用いられる組成物（外来物質導入用組成物）は、１種または２種以上の外来物質と、マクロピノサイトーシスを誘導する物質と、を内包するエクソソームを含む組成物である。即ち、上記外来物質導入用組成物は、上述した外来物質導入用エクソソームを含む組成物である。
【００５３】
ここで開示される外来物質導入用組成物は、エクソソームおよびマクロピノサイトーシス誘導物質を、エクソソームに内包した外来物質を対象細胞内に導入し得る状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。即ち、ここで開示される外来物質導入用組成物は、外来物質およびマクロピノサイトーシス誘導物質を、これらの活性が失われない状態でエクソソーム内に内包した状態で保持する組成物である。上記担体としては、希釈剤、賦形剤等として医薬品において一般的に使用される担体が好ましい。外来物質導入用組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、外来物質導入用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
【００５４】
或いはまた、ここで開示される外来物質導入用組成物は、１種または２種以上の外来物質を内包するエクソソームと、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質とを含む組成物であり得る。かかる外来物質導入用組成物は、エクソソーム内に内包した外来物質と、マクロピノサイトーシス誘導物質とを、これらの活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。かかる担体としては、上述した通りのものを特に制限なく使用し得る。
【００５５】
外来物質導入用組成物の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばPhosphate-Buffered Saline（ＰＢＳ））等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、外来物質を内包したエクソソームとマクロピノサイトーシスを誘導する物質、或いは外来物質およびマクロピノサイトーシスを誘導する物質を内包したエクソソーム（主成分）と種々の担体（副成分）とを材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００５６】
ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の適用対象細胞は特に制限されず、種々の細胞に対して外来物質を細胞内に導入することが可能である。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）の細胞が挙げられる。ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の適用対象細胞は、特にヒトの細胞（ヒト由来の細胞）が好ましい。
例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等の生体内の種々の組織に存在する（生体内の種々の組織に由来する）細胞であり得る。なお、適応対象細胞は、正常細胞に限らず、腫瘍細胞や病原体感染細胞等の疾患の原因となる細胞であってもよい。また、対象細胞の分化状態についても特に制限されず、成熟した体細胞、前駆細胞、体性幹細胞、多能性幹細胞といった種々の分化ステージの細胞に対して、外来物質を好適に導入することができる。
なお、外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の適用対象細胞は、生体外で維持されている培養細胞に限定されず、生体内に存在する細胞にも適用可能である。
【００５７】
ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の適用対象細胞としては、使用する外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物に含まれる（典型的にはエクソソーム中に内包される）マクロピノサイトーシス誘導物質によってマクロピノサイトーシスが誘導される細胞が好ましい。典型的には、マクロピノサイトーシス誘導物質として特定の受容体を刺激することでマクロピノサイトーシスを誘導する物質を用いる場合は、該マクロピノサイトーシス誘導物質によって刺激される受容体が発現している（典型的には高発現している）細胞が好ましい。例えば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＥＧＦＲを刺激する物質を用いる場合であれば、ＥＧＦＲ発現細胞（より好ましくはＥＧＦＲ高発現細胞）が対象細胞として好ましい。また、例えば、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＣＸＣＲ４を刺激する物質を用いる場合であれば、ＣＸＣＲ４発現細胞（より好ましくはＣＸＣＲ４高発現細胞）が対象細胞として好ましい。同様に、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＰＤＧＦＲを刺激する物質を用いる場合であれば、ＰＤＧＦＲ発現細胞（より好ましくはＰＤＧＦＲ高発現細胞）が対象細胞として好ましく、また、マクロピノサイトーシス誘導物質としてＦＧＦＲおよび／またはSyndecan-4を刺激する物質を用いる場合であれば、ＦＧＦＲおよびSyndecan-4の少なくとも一方を発現している細胞（より好ましくはＦＧＦＲおよびSyndecan-4を共に発現している細胞）が対象細胞として好ましい。これにより、対象細胞に対して高効率に外来物質を導入することができる。
【００５８】
ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物を培養細胞に適用する場合、適用対象の培養細胞は特に制限されない。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には哺乳動物）由来の初代培養細胞、継代細胞、細胞株（セルライン）等の各種培養細胞であり得る。
【００５９】
ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、生体外（インビトロ）で培養（継代）している細胞に対して外来物質を導入する場合においては、ここで開示される外来物質導入用エクソソームまたは外来物質導入用組成物の適当量を、対象の細胞に対し、培養過程のいずれかの段階（例えば、培養開始後初期の段階、または所定の期間培養（増殖）や継代を行った後）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のエクソソーム濃度が、概ね０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ（例えば０．４μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬ）の範囲内となるように、外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物を１〜複数回添加する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
また、ここで開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物は、エクソソーム内に内包した外来物質以外の生理活性を有する物質（典型的には薬理活性を有する物質）と併用することも可能である。
【００６０】
或いはまた、ここに開示される外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物を患者（即ち生体）に所望量供給することもできる。投与方法は特に限定されない。例えば、静脈内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内等への注射、経口投与、吸入投与、経皮投与、経粘膜投与、坐剤投与等が挙げられる。或いはまた、埋め込み製剤として皮下や筋膜下等に埋め込む方法で投与してもよい。
【００６１】
なお、かかる外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物の投与対象の生物は、ヒト、若しくはヒト以外の動物（典型的は哺乳動物）であり得る。ヒトを対象とした外来物質導入用エクソソームまたは外来物質導入用組成物の使用は、医療産業上の価値が高いため、特に好ましい。また、マウス、ラット、モルモット、ラビット、イヌ、カニクイザル等の試験動物を適応対象とすることは、種々の研究開発を促進する観点から好ましい。また、イヌ、ネコ等の愛玩動物を適応対象にすることは、動物医療産業上の利用価値が高いため好ましい。
【００６２】
外来物質導入用エクソソームおよび外来物質導入用組成物を生体中に投与する場合は、該エクソソームおよび該組成物に対する安全性の確保や、免疫反応の低減が強く要求される。
外来物質導入用エクソソームに対する安全性（例えば外来物質導入用エクソソームによる細胞毒性）の観点からは、該エクソソームを用いて外来物質を導入する細胞（以下、該細胞を「レシピエント細胞」とも呼ぶ）の生物種と、エクソソームを回収する生物或いは細胞（以下、該生物を「ドナー生物」、該細胞を「ドナー細胞」とも呼ぶ）の生物種が同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞中に外来物質を導入する場合であれば、ヒト（またはヒト由来の細胞）由来のエクソソームを用いることが好ましい。また、レシピエント細胞とドナー細胞（ドナー生物）の生物種が同一であることは、外来物質導入用エクソソームを効率よく対象細胞（レシピエント細胞）内に導入する観点からも好ましい。
また、外来物質導入用エクソソームに対する免疫反応を低減する観点からは、レシピエント細胞のヒト白血球抗原（human leukocyte antigen:ＨＬＡ）の型とドナー細胞（ドナー生物）のＨＬＡ型が同一であることが好ましい。或いはまた、ドナー細胞（ドナー生物）が、レシピエント細胞が有する２つのＨＬＡのうちの一方のＨＬＡのホモドナーであることが好ましい。これにより、外来物質導入用エクソソームを導入した生体内における外来物質導入用エクソソームに対する免疫反応（免疫拒絶反応）を低減（回避）することができる。より高度に免疫反応を低減する観点からは、レシピエント細胞とドナー細胞（ドナー生物）とが同一の生体（個体）由来であることが好ましい。換言すれば、外来物質導入用エクソソームを用いて外来物質を導入したい生体（典型的には患者）からエクソソームを回収し、該エクソソームを外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）に使用することが好ましい。
【００６３】
ここで開示の技術によると、外来物質として抗腫瘍活性を有する物質（典型的には抗がん薬）を内包する外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を腫瘍患者の生体内に投与することで、該抗腫瘍活性を有する物質を腫瘍細胞に好適に導入することができる。即ち、外来物質として抗腫瘍活性を有する物質を使用することで、本発明にかかる外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を腫瘍（がん）の治療目的に利用することができる。
また、ここで開示の外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）は、抗腫瘍活性を有する物質を腫瘍細胞に導入するためのドラッグデリバリーシステムに好適に利用可能である。また、ここで開示の技術によると、腫瘍の治療方法であって、外来物質として抗腫瘍活性を有する物質を内包する外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を生体内に投与する方法を提供し得る。
【００６４】
腫瘍細胞は、細胞外に存在する栄養成分を細胞内に取り込むために、マクロピノサイトーシスが誘導されやすい状態である場合が多い。典型的には、腫瘍細胞はＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ、ＰＤＧＦＲ、および／またはＦＧＦＲを高発現している場合が多い。このため、マクロピノサイトーシス誘導物質としてこれらの受容体を刺激する物質（典型的にはＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ、またはＦＧＦ）を用いることで、腫瘍細胞（典型的にはＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ、ＰＤＧＦＲおよび／またはＦＧＦＲを高発現している腫瘍細胞）のマクロピノサイトーシスを高レベルに誘導することができる。これにより、エクソソーム中に内包した外来物質（ここでは、抗腫瘍活性を有する物質）による抗腫瘍効果を腫瘍細胞（典型的にはＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ、ＰＤＧＦＲおよび／またはＦＧＦＲを高発現している腫瘍細胞）に対して選択的に発揮し得る。
【００６５】
また、直径が５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度であるエクソソーム粒子は、ＥＰＲ効果（enhanced permeability and retention effect）によって腫瘍組織に蓄積しやすい性質を有している。このため、エクソソーム中に内包した外来物質（ここでは、抗腫瘍活性を有する物質）による抗腫瘍効果を腫瘍細胞に対して選択的に発揮し得る。ここで、ＥＰＲ効果とは、（Ｉ）腫瘍組織（典型的には増殖中の腫瘍組織）およびその周囲の新生血管の血管壁（血管内皮）には凡そ数百ｎｍ程度の間隙が存在するために、粒径が数十ｎｍ〜２００ｎｍ程度（特に１００ｎｍ程度）の粒子が腫瘍組織周辺に浸潤（透過）しやすいこと、（ＩＩ）リンパ組織が未成熟であることが多いため、腫瘍組織周辺に浸潤（透過）した物質が排除されずに蓄積しやすいこと等により、特定のサイズの物質が腫瘍細胞周辺に蓄積しやすい特性をいう。
上述のとおりの理由から、本発明にかかる抗腫瘍活性を有する物質を内包した外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を腫瘍患者に対して供給（典型的には生体内に投与）することで、正常細胞に対する副作用を低減しつつ、抗腫瘍効果を高レベルに発揮することができる。
【００６６】
なお、本発明にかかる外来物質導入用エクソソームを腫瘍細胞に適用する場合、粒径が２０ｎｍ未満（例えば５ｎｍ以下、典型的には１ｎｍ以下、特に０．５ｎｍ以下）の外来物質に対して、特に好適に本発明を適用することができる。かかる粒径の物質は、上記ＥＰＲ効果により腫瘍細胞周辺に浸潤（透過）しやすい物質よりも比較的粒径が小さいため、上記ＥＰＲ効果が発揮され難い（即ち腫瘍組織特異的に蓄積（導入）し難い）物質である。このような比較的粒径の小さな物質をエクソソーム中に内包することで、ＥＰＲ効果により腫瘍組織特異的に蓄積しやすい粒径とすることができる。これにより、かかる外来物質の抗腫瘍効果を腫瘍細胞特異的に発揮させることが可能となる。
【００６７】
或いはまた、例えば、外来物質として分化誘導活性を有する物質（典型的には分化誘導剤）を内包した外来物質導入用エクソソーム（または該エクソソームを含む外来物質導入用組成物）を、幹細胞（例えば多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞等）に適用することで、該エクソソーム（または該エクソソームを含む外来物質導入用組成物）を再生医療用途に利用することができる。典型的には、生体外（インビトロ）で培養（継代）している幹細胞に対して、本発明にかかる外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を利用して分化誘導物質を導入することで、該幹細胞を所望の細胞に分化させることができる。これにより、所望の細胞等、典型的には分化細胞（細胞塊、組織、器官等を含む）および該細胞由来の生合成物等を作製（生産）し得る。かかる分化細胞等は、再生医療用資材（典型的には移植用の細胞資源）として好適に利用可能である。例えば、かかる分化細胞等を、修復や再生が必要とされる患部に（即ち患者の生体内）に戻すことにより、当該修復や再生を効果的に行うことができる。即ち、組織の再生が有力な治療法となる種々の疾患を効率的に治療することが可能となる。ここで、上記幹細胞から分化誘導して作製した分化細胞由来の生合成物としては、分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質（例えばインスリン等）が例示される。
【００６８】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００６９】
＜試験１：細胞培養物の準備（評価対象細胞の継代維持）＞
ここでは、表１に示す、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ａ４３１細胞（ヒト表皮癌由来）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ヒト膵臓癌由来）およびＢｘＰＣ−３細胞（ヒト膵臓癌由来）を用いて評価試験を行った。かかる４種類の細胞はいずれもヒト由来の培養細胞株である。これらの評価対象細胞は、以下のとおりに継代維持したものを使用した。
具体的には、１０ｍＬの継代培養用培地が入った直径１００ｍｍの培養皿（１００ｍｍディッシュ）中に各細胞を播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内に静置して培養した。ここで、上記継代培養培地としては、表１に示す組成のものをそれぞれ用いた。表１中の「培地」の欄には、各細胞の継代培養に用いた培地の種類を示し、表１中の「添加物」の欄には、各細胞に応じて表１中の「培地」欄に示す培地に添加した物質を示し、表１中の「含有量」の欄には、継代培養培地中に含まれる「添加物」の含有量を示している。なお、表１中の（Ｇ）は「Life Technologies（Gibco）社製」であること、（Ｈ）は「Thermo Scientific（Hyclone）社製」であること、（Ｓ）は「Sigma-Aldrich社製」であること、および（Ｗ）は「Wako社製」であることを示している。以下、特に言及しない場合は、各細胞の培養にはかかる培地を用いることとする。
また、上記対象細胞は、いずれも２〜３日に１回のペースで継代を行った。細胞の剥離は、trypsin（0.1g/L）- ethylenediaminetetraacetic acid （EDTA）（0.11 mmol/L）（Nacalai Tesque社製）を各培養皿に２ｍＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で５分間反応させて行った。
【００７０】
【表１】
2016076347.tif 000003
【００７１】
＜試験２：エクソソーム産生細胞の作製＞
以下の方法で、エクソソームのマーカータンパク質であるＣＤ６３と緑色蛍光タンパク質（GFP: green fluorescent protein）とを融合した融合タンパク質（以下、かかる融合タンパク質を単に「ＣＤ６３−ＧＦＰ」ともいう）を安定的に発現する細胞株を樹立した。かかる細胞株より回収したエクソソームはＣＤ６３に融合したＧＦＰにより緑色に蛍光発色するため、かかるＧＦＰの蛍光発色を観察することで、エクソソームの存在を確認することが可能となる。ここでは、ＣＤ６３−ＧＦＰ発現遺伝子をリポフェクション法により細胞内に遺伝子導入し、遺伝子が導入された細胞を適当な薬剤で選択することで上記ＣＤ６３−ＧＦＰ安定発現細胞株を樹立した。具体的には以下のとおりである。
【００７２】
先ず、ＣＤ６３−ＧＦＰ発現遺伝子として、System Biosciences社製のpCT-CD63-GFPを購入して準備した。かかるpCT-CD63-GFPは、レンチウイルスベクターにサイトメガロウイルス（CMV: Cytomegalovirus）プロモーターと、ＣＤ６３−ＧＦＰをコードする遺伝子と、ピューロマイシン耐性遺伝子とを搭載（挿入）したものである。また、上記リポフェクション法に用いるリポフェクション試薬として、Life Technologies（Invitrogen）社製のLipofectamine LTX Reagentを購入して準備した。
次に、ＨｅＬａ細胞を、２４穴培養皿（２４ウェルディッシュ）中に４．７×１０４個／ウェルの細胞密度となるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間培養した。培地は、上記試験１でＨｅＬａ細胞の継代培養培地として用いたものと同様の組成のもの（以下、かかる培地を「ＨｅＬａ培地」ともよぶ）を１ウェルあたり１．０ｍＬとなるように用いた。
【００７３】
そして、上記１日間の培養後のＨｅＬａ細胞について、各培養容器中の培地をpCT-CD63-GFPとLipofectamine LTX Reagentとの複合体を含むＨｅＬａ培地２００μＬに交換し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間培養して、ＣＤ６３−ＧＦＰ発現遺伝子を細胞内にトランスフェクションした。上記複合体は、Lipofectamine LTX Reagentに添付のマニュアルに従って、pCT-CD63-GFPとLipofectamine LTX Reagentとを、混合溶液中のpCT-CD63-GFP含有量が８００ｎｇ／ウェル、Lipofectamine LTX Reagentの含有量が１体積％（1%(v/v)）となるように混合して作製した。
次に、上記トランスフェクション後の細胞について、ピューロマイシン（Pyuromycin、Nacalai Tesque社製）を３μｇ／ｍＬ含むＨｅＬａ培地（以下、かかる培地を「ｐ−ＨｅＬａ培地」ともよぶ）１ｍＬ中で継代培養した。これにより、ＣＤ６３−ＧＦＰを安定発現する細胞（以下かかる細胞を「ＣＤ６３−ＧＦＰ−ＨｅＬａ」ともよぶ）を樹立した。
【００７４】
＜試験３：エクソソームの回収＞
上述の方法で作製したＣＤ６３−ＧＦＰ−ＨｅＬａ細胞を用いて、該細胞が培地中に分泌するエクソソームを回収した。ここでは、超遠心法（Thery C., Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3:Unit 3.22.）により、またはTotal exosome isolation (from cell culture media) （Life Technologies（Invitrogen）社製）を用いて、培地中のエクソソームを分離、回収した。具体的には以下のとおりである。
【００７５】
まず、上記ＣＤ６３−ＧＦＰ−ＨｅＬａ細胞を直径１０ｃｍの培養皿（１００ｍｍディッシュ）中に２×１０６個／ウェルの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間培養した。培地は上記ｐ−ＨｅＬａ培地を１ウェルあたり１０ｍＬずつ用いた。
上記１日間の培養後のＣＤ６３−ＧＦＰ−ＨｅＬａ細胞について、培養容器中の培地を除去し、α−ＭＥＭ培地（５ｍＬ）を用いて培養容器内を５回洗浄した。これにより、培地（典型的にはＦＢＳ）中に含まれ得るエクソソームを培養容器中から除去することができる。その後、エクソソームを含まないＦＢＳ（Exosome-depleted FBS Media Supplement、System Biosciences社製）を１０％と、ピューロマイシンを３μｇ／ｍＬと、を含むα−ＭＥＭ培地（Life Technologies（Gibco）社製）を１ウェルあたり１０ｍＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３〜４日間培養した。そして、上記所定期間の培養後、培養容器中の培地を回収した。
【００７６】
次に、上記回収した培地中に分泌されたエクソソームを超遠心法により分離、回収した。具体的には、３００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心を行った後、その上清を２，０００×ｇ、４℃の条件で１０分間の遠心を行い、その後さらにその上清を１０，０００×ｇ、４℃の条件で３０分間の遠心を行う遠心操作を一連に行い、培地中に浮遊し得る細胞の死骸等を沈殿させた。かかる遠心操作を行った後の上清を回収し、該上清を１００，０００×ｇ、４℃の条件で７０分間の遠心操作を２回繰り返してエクソソームを沈殿させた。その後、沈殿物を回収することで、ＣＤ６３−ＧＦＰ−ＨｅＬａ細胞が培地中に分泌したエクソソーム（以下、かかるエクソソームを、「ＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソーム」ともよぶ）を回収した。得られたエクソソームはＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline、Nacalai Tesque社製）に分散させてエクソソームストック液とした。
【００７７】
或いはまた、Total exosome isolation (from cell culture media) （Life Technologies（Invitrogen）社製）を使用して、上記所定期間の培養後に回収した培地中に分泌されたエクソソームを分離、回収した。上記Total exosome isolation (from cell culture media)とは細胞培養液中からエクソソームを単離するための市販のキットであり、具体的な操作はキットに添付のマニュアルどおりに行った。
【００７８】
回収したエクソソームの濃度は、BCA protein assay kit (Thermo Scientific（Pierce）社製)を用いて定量した。以下、かかる定量により得られたタンパク濃度（μｇ／ｍＬ）をエクソソーム濃度（μｇ／ｍＬ）として扱う事とする。なお、ウエスタンブロット法によるエクソソームマーカータンパク質（ＣＤ６３、ＣＤ９等）の検出や、透過型電子顕微鏡を用いた観察（ネガティブ染色）により、エクソソームの存在および形状等を確認した。
【００７９】
＜試験４：エクソソーム内への外来物質の導入（内包）＞
上記試験３で得られたエクソソーム（ＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソーム）内に、外来物質およびマクロピノサイトーシスを誘導する物質を導入した。外来物質としてはサポリン（Sigma-Aldrich社製、以下同じ）を用い、マクロピノサイトーシスを誘導する物質としてはＥＧＦ（Sigma-Aldrich社製、以下同じ）を用いた。また、比較例として、クラスリン依存的なエンドサイトーシスを誘導することで知られるトランスフェリン（Sigma-Aldrich社製、以下同じ）をエクソソーム内に内包した。これらの物質をエクソソーム内に導入する方法としては、エレクトロポレーション法を採用した。試験の詳細は以下のとおりである。
１００μＬのＤＰＢＳ中に、２５μｇのＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソームと、５０μｇのサポリン（saporin）および／または２５μｇのＥＧＦを分散させた分散液を準備した。或いはまた、１００μＬのＤＰＢＳ中に、２５μｇのＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソームと、２５μｇのトランスフェリンを分散させた分散液を準備した。そして、かかる分散液に対して、NEPA genes社製のSuper electropolator NEPA21 TypeIIを用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、以下の条件：poring pulse: twice pulse、200 V、5 msec；transfer pulse: five pulse、20 V、50 msec；1 cm electroporation cuvette；25 °C：で行った。
上記エレクトロポレーション後の溶液を、Merck Millipore社製のAmicon Ultra centrifugal filters（１００ｋＤａ）でろ過することで、エクソソーム内に導入（内包）されなかったサポリン、ＥＧＦ、およびトランスフェリンを除去した。ここで、上記ろ過は１８，０００×ｇ、４℃の条件下での１０分間の遠心操作にて行い、フィルター上に残存したエクソソームを回収した。そして、かかるフィルトレーション後のエクソソームを５００μＬのＤＰＢＳに分散し、１８，０００×ｇ、４℃の条件下での１０分間の遠心操作を行う洗浄操作を２回繰り返した。上述のとおりにして、サポリンおよび／またはＥＧＦが内包されたエクソソーム、或いはトランスフェリンが内包されたエクソソームを作製した。かかるエクソソームはＤＰＢＳ中に分散させてエクソソームストック溶液とした。
【００８０】
以下、上記試験３で得られたＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソームをサンプル１、上記試験４で得られたサポリン内包エクソソームをサンプル２、上記試験４で得られたＥＧＦ内包エクソソームをサンプル３、上記試験４で得られたＥＧＦおよびサポリンを内包したエクソソームをサンプル４、上記試験４で得られたトランスフェリン内包エクソソームをサンプル５とする。サンプル１〜５にかかるエクソソームについて、表２にまとめる。
【００８１】
【表２】
2016076347.tif 000004
【００８２】
＜試験５：エクソソームの取り込み試験＞
上記サンプル１に係るエクソソームと、マクロピノサイトーシスを誘導する物質としてのＥＧＦとを供試細胞の培地中に供給したときの、該供試細胞による該エクソソームの取り込みを、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察により評価した。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【００８３】
まず、Ａ４３１細胞を直径３５ｍｍのガラスベースディッシュに２．０×１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間の前培養を行った。培地は、上記試験１でＡ４３１の継代培養培地として用いたものと同様の組成のもの（以下、かかる培地を「Ａ４３１培地」ともよぶ）を１ウェルあたり２ｍＬずつ用いた。
上記１日間の培養（前培養）後のＡ４３１細胞について、培養容器中の培地を除去し、ＦＢＳを含まないＡ４３１培地（即ち、ＭＥＭ培地）を１ｍＬ用いて培養容器内を洗浄する操作を３回繰り返した。その後、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、５００ｎＭのＥＧＦを含むＭＥＭ培地を１ウェルあたり２００μＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。また、対照区として２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームを添加し且つＥＧＦを添加しない試験区（ＥＧＦ無添加区）を設けた。
【００８４】
上記エクソソーム存在下での培養後の細胞について、培養液中に５μｇ／ｍＬとなる量のHoechst33342（Life Technologies（Invitrogen）社製）を添加して３７℃の温度条件下で１５分間放置して細胞の核を染色した。かかる核染色後の細胞を上記Ａ４３１培地（１ｍＬ）を用いて３回洗浄した。そして、１ｍＬのＡ４３１培地を培養容器中に添加して、対象細胞を固定することなく（即ち、生細胞の状態で）共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察を行った。測定機器としては、Olympus社製のFV1200を用いた。
【００８５】
各試験区について、共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡）による蛍光観察を行った結果を図１に示す。これらの画像は各試験区におけるサンプル１に係るエクソソームの細胞内への取り込みを調べた顕微鏡写真（画像）である。具体的には、左側の列（ＣＤ６３−ＧＦＰ−ｅｘｏｓｏｍｅの列）に示す写真（画像）は、サンプル１に係るエクソソームの局在を調べた顕微鏡写真である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、Hoechst33342による核染色の画像と、左側の列に示すサンプル１に係るエクソソームの局在を調べた画像とを重ねた（マージした）画像である。
【００８６】
図１に示すように、ＥＧＦを添加して培養した試験区（ＥＧＦ添加区、図１の下段）は、ＥＧＦ無添加区（図１の上段）と比較して、ＧＦＰの蛍光発色が強かった。このことは、ＥＧＦ添加区の方が、ＥＧＦ無添加区と比較して、エクソソームの取り込みが活発であることを示している。以上の結果より、対象細胞にＥＧＦを供給することで、該細胞によるエクソソームの細胞内への取り込みを促進し得ることを確認した。
【００８７】
＜試験６：エクソソームの取り込み試験＞
上記サンプル１に係るエクソソームとマクロピノサイトーシスを誘導する物質としてのＥＧＦとを供試細胞の培地中に供給したときの、供試細胞による該エクソソームの取り込みを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
まず、Ａ４３１細胞を２４穴培養皿（２４ウェルプレート）に４．７×１０４個／ウェルの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間の前培養を行った。培地は、Ａ４３１培地を１ウェルあたり１．０ｍＬずつ用いた。
上記１日間の培養（前培養）後のＡ４３１細胞について、培養容器中の培地を除去し、ＭＥＭ培地（２００μＬ）を用いて培養容器内を３回洗浄した。その後、表３に示す組成の培地を１ウェルあたり２００μＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。具体的には、試験区６−１〜試験区６−３は、表３に示す濃度のＥＧＦおよびサンプル１にかかるエクソソームを含有させたＭＥＭ培地（即ち、ＦＢＳを含まないＡ４３１培地）を用いた。また、試験区６−４および試験区６−５は、表３に示す濃度のＥＧＦおよびサンプル１に係るエクソソームを含有させたＡ４３１培地（即ち、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地）を用いた。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
上記エクソソーム存在下での培養後の細胞について、ＤＰＢＳ（２００μＬ）を用いて３回洗浄した。その後、trypsin（0.1g/L）- ethylenediaminetetraacetic acid （EDTA）（0.11 mmol/L）（Nacalai Tesque社製）を培養容器中に２００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１０分間反応させて細胞を剥離した。剥離した細胞を遠心チューブに回収し、８００×ｇ、４℃の条件で５分間遠心を行った後、上清を除去した。次いで、各遠心チューブ内にＤＰＢＳを４００μＬずつ加えて細胞を該ＤＰＢＳ中に懸濁した後、再度８００×ｇ、４℃の条件で５分間遠心を行った後、上清を除去した。そして、各試験区の細胞をそれぞれ４００μＬのＤＰＢＳに懸濁した。
上述のとおりに準備した各試験区にかかる細胞懸濁液をフローサイトメーターを用いて分析した。測定装置としては、Merck Millipore社製のGuava easyCyteを用いた。具体的には、励起波長：４８８ｎｍ、発光波長：５２５ｎｍの条件でＧＦＰの蛍光発色を検出することで、各試験における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を測定した。
【００９０】
上述のとおりフローサイトメーターを用いて分析した結果を図２に示す。図２に示すグラフは、試験区６−１（コントロール区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときの各試験区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。図２に示す棒グラフは、左から順に、試験区６−１、６−２、６−３、６−４、６−５の結果を示す。
【００９１】
図２に示すように、試験区６−２および試験区６−３における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、試験区６−１に示す一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、顕著に高かった。また、かかる一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、培地中のＥＧＦの濃度が増大するに伴い（即ち、培地中のＥＧＦ濃度依存的に）増大した。具体的には、試験区６−１の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、試験区６−２における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は凡そ１９倍、試験区６−３の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度はおよそ２７倍であった。以上の結果より、対象細胞にＥＧＦを供給することで、エクソソームの細胞内への取り込みが顕著に促進されることを確認した。
【００９２】
また、図２に示すように、試験区６−５における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、試験区６−１および試験区６−４における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、顕著に高かった。具体的には、試験区６−５における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、試験区６−１の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較しておよそ３３倍であり、試験区６−４の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して凡そ５倍であった。即ち、試験区６−１〜６−５の結果から、対象細胞にＥＧＦを供給することで、培地中のＦＢＳの有無に関係なく、エクソソームの細胞内への取り込みを促進し得ることを確認した。
試験区６−４および６−５は、培地中にＦＢＳ由来のエクソソームを含有するため、該ＦＢＳ由来のエクソソームとサンプル１に係るエクソソームとが競合状態にある。かかる競合状態は、生体内に本発明にかかる外来物質導入用エクソソーム（外来物質導入用組成物）を供給（投与）したときに、内在性のエクソソーム（生体内にもともと存在するエクソソーム）と外来物質導入用エクソソームとが競合する状態をインビトロ実験系で再現したものである。即ち、試験区６−４および６−５の結果より、内在性のエクソソーム（ここではＦＢＳ由来のエクソソーム）が存在する環境下であっても、対象細胞にＥＧＦを供給することで、目的のエクソソーム（即ち、外来物質導入用エクソソーム）の細胞内への取り込みを顕著に促進し得ることを確認した。
【００９３】
＜試験７：ＥＧＦによるマクロピノサイトーシス誘導活性の評価試験＞
対象細胞にＥＧＦを供給することによって促進されたエクソソームの細胞内への取り込みがマクロピノサイトーシスによるものであるかを、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察により評価した。具体的には、マクロピノサイトーシスによる物質の取り込みを識別するマーカー物質の細胞内の局在と、サンプル１に係るエクソソームの細胞内の局在とを、共焦点顕微鏡を用いて蛍光観察して比較した。本試験では、上記マクロピノサイトーシスによる物質の取り込みを識別するマーカー物質として、マクロピノサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが知られるデキストラン（約７０ｋＤａの多糖類）を用いた。供試細胞としては、Ａ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【００９４】
具体的には、エクソソーム存在下での培養時に、ＥＧＦ（５００ｎＭ）およびサンプル１に係るエクソソーム（２０μｇ／ｍＬ）に加えてさらに０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のデキストランを含む培地を用いた以外は上記試験５と同様の条件および手法により分析した。ここで、上記デキストランとしては、蛍光色素（テキサスレッド）で標識したデキストラン（Texas red-dextran、Life Technologies（Molecular Probe）社製、以下同じ）を用いた。
【００９５】
共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡）による蛍光観察を行った結果を図３に示す。これらの画像は本試験における供試細胞による、サンプル１に係るエクソソームおよびTexas red-dextranの細胞内への取り込みを調べた顕微鏡写真（画像）である。具体的には、左上に示す写真（画像）は、サンプル１に係るエクソソームの局在を調べた顕微鏡写真である。左下に示す写真（画像）は、Texas red-dextranの局在を示す画像である。また、右に示す写真（画像）は、上記左上に示すサンプル１に係るエクソソームの局在を調べた画像と、上記左下に示すTexas red-dextranの局在を調べた画像とを重ねた（マージした）画像である。
【００９６】
図３に示すとおり、サンプル１に係るエクソソームの細胞内の局在と、デキストランの細胞内の局在が重複していた。即ち、サンプル１に係るエクソソームとデキストランとは細胞内において共局在していた。このことはエクソソームとデキストランとを細胞内に取り込む機構が同じであること、即ち、エクソソームとデキストランとがマクロピノサイトーシスによって細胞内に取り込まれたことを示している。以上の結果より、対象細胞にＥＧＦを供給することによって促進されたエクソソームの細胞内への取り込みは、マクロピノサイトーシスによるものであることを確認した。換言すると、ＥＧＦにより、マクロピノサイトーシスが誘導され、これによりエクソソームの細胞内への取り込みが促進されることを確認した。即ち、ＥＧＦはマクロピノサイトーシスを誘導する物質として好適に使用し得ることを確認した。
【００９７】
＜試験８：ＥＧＦによるマクロピノサイトーシス誘導活性の評価試験＞
対象細胞にＥＧＦを供給することによって促進されたエクソソームの細胞内への取り込みが、マクロピノサイトーシスによるものであるかを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。具体的には、マクロピノサイトーシスの阻害剤がエクソソームの取り込みに与える影響を、フローサイトメーターを用いて分析した。本試験では、上記マクロピノサイトーシス阻害剤として、ＥＩＰＡ（5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride、Sigma-Aldrich社製）を用いた。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【００９８】
まず、上記試験６と同様の条件および手法により、１日間の前培養をしたＡ４３１細胞を準備し、ＭＥＭ培地を用いて該細胞を３回洗浄した。そして、１００ｎＭのＥＩＰＡを含むＭＥＭ培地を１ウェルあたり２００μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下に３０分間放置した。次いで、かかるＥＩＰＡ含有ＭＥＭ培地中に、培地中の濃度が１００ｎＭとなる量のＥＧＦと、培地中の濃度が２０μｇ／ｍＬとなる量のサンプル１に係るエクソソームとを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３時間培養した。かかる試験区を、ＥＩＰＡ処理区とよぶ。なお、コントロールとして、ＭＥＭ培地中に上記ＥＩＰＡを添加しない以外は上記ＥＩＰＡ試験区と同様に処理を行った試験区（ＥＩＰＡ無処理区）を設けた。
上記エクソソーム存在下での培養後の細胞について、上記試験６と同様の条件および手法により、フローサイトメーターを用いた分析を行った。
【００９９】
結果を図４に示す。図４に示すグラフは、上記ＥＩＰＡ無処理区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときのＥＩＰＡ処理区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１００】
図４に示すとおり、ＥＩＰＡ処理区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、ＥＩＰＡ無処理区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、顕著に少なかった（凡そ５０％以下であった）。このことは、マクロピノサイトーシスの阻害剤であるＥＩＰＡを添加して培養することで、対象細胞によるエクソソームの取り込みが阻害されたことを示している。即ち、ＥＩＰＡによって、ＥＧＦによるマクロピノサイトーシス誘導活性が阻害されたことを示している。以上の結果より、対象細胞にＥＧＦを供給することによって促進されたエクソソームの細胞内への取り込みは、マクロピノサイトーシスによるものであることが確認された。換言すると、対象細胞にＥＧＦを供給することにより、該細胞のマクロピノサイトーシスが誘導され、これにより該細胞におけるエクソソームの取り込みが促進されることが確認された。即ち、ＥＧＦはマクロピノサイトーシスを誘導する物質として好適に使用し得ることを確認した。
【０１０１】
＜試験９：細胞生存率の評価試験＞
サンプル１に係るエクソソームを供試細胞に供給して培養したときの細胞生存率について、ＷＳＴ−１（4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate）（水溶性テトラゾリウム塩）を用いた吸光光度法による細胞増殖試験（ＷＳＴ−１アッセイ）を行うことで評価した。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【０１０２】
Ａ４３１細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ１．２×１０４個となるように９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで１日間培養（前培養）を行った。培地は上記Ａ４３１培地を用い、１ウェルあたりの培地量を１００μＬとした。
上記所定時間の培養（前培養）後、培養容器中の培地を、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、０ｎＭ（即ち、ＥＧＦ無添加）、１００ｎＭまたは５００ｎＭのＥＧＦとを含むＭＥＭ培地（即ち、ＦＢＳを含まないＡ４３１培地）にそれぞれ交換した。１ウェルあたりの培地量は５０μＬとした。なお、コントロール区として、培地中にサンプル１に係るエクソソームおよびＥＧＦのいずれも含有しない試験区を設けた。
【０１０３】
上記のようにしてエクソソームを細胞に供給した後、９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に配置し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で本培養した。そして、エクソソーム存在下での培養（本培養）開始から２４時間が経過した時点において、供試細胞の生存状態（生細胞数）を市販の発色測定キット（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System、Takara Bio社製）を使用して測定した。即ち、生細胞の酵素活性により試薬中のテトラゾリウム塩が還元されて水溶性ホルマザンが生成されることを利用し、培地中の水溶性ホルマザン量を吸光光度法（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：６２０ｎｍ）により測定して生細胞数を測定した。なお、以下に詳述する操作以外は上記測定キットに添付のマニュアルどおりに行った。
具体的には、上記所定の培養時間が経過した細胞培養ウェル中に、発色基材として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）」を含む試薬を１ウェルあたり１０μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４５分間インキュベートした。その後、該発色試薬を添加した細胞培養液について、波長４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）および波長６２０ｎｍの吸光度（Ａ６２０）を分光光度計（マイクロプレートリーダ）を用いて測定し、Ａ４５０をＡ６２０で補正した値Ａ４５０-６２０を算出し、各試験区の細胞生存率を算出した。そして、コントロール区における細胞生存率を１００％としたときの各試験区の細胞生存率（％）の相対値を以下の式：細胞生存率（％）＝（各試験区のＡ４５０-６２０）÷（コントロール区のＡ４５０-６２０）×１００；により算出した。結果を図５に示す。
【０１０４】
図５に示すとおり、サンプル１に係るエクソソームに加えてさらに０ｎＭ、１００ｎＭまたは５００ｎＭのＥＧＦを添加して培養したいずれの試験区についても、コントロール区と比較して、細胞生存率はほとんど変わらなかった（細胞生存率に有意な差はなかった）。このことから、培地中に添加した（対象細胞に供給した）サンプル１に係るエクソソーム（即ちＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソーム）およびＥＧＦは、対象細胞の細胞増殖に何ら影響を与えないことを確認した。即ち、培地中および細胞内に取り込まれたＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソームは細胞毒性および細胞増殖促進活性が無いことを確認した。また、ＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソームに加えて添加したＥＧＦによって、対象細胞の細胞増殖が亢進しないことを確認した。
【０１０５】
＜試験１０：エクソソームを用いた外来物質の細胞内導入試験＞
上記サンプル２にかかるエクソソームを用いて、エクソソーム内に内包した外来物質が細胞内へ供給される効率を評価した。具体的には、外来物質としてサポリンを用い、サポリン内包エクソソームを細胞に供給した時の細胞の生存率を調べることで、エクソソーム内に内包したサポリンが細胞内へ取り込まれる効率を評価した。ここで、サポリンとはタンパク質性毒素の一種（即ち、抗腫瘍活性を有する物質の一種）であり、サポリンを取り込んだ細胞は細胞死が引き起こされることが知られている。即ち、細胞生存率が低いほど、サポリンが細胞内に高効率に導入されたことを示す。
試験方法としては、エクソソーム存在下での培養（本培養）を以下の条件に変更した以外は上記試験９と同様の条件および手法により、供試細胞の細胞生存率（％）を測定した。即ち、本試験では、前培養後の培養容器中の培地を、４μｇ／ｍＬのサンプル２に係るエクソソーム（即ちサポリン内包エクソソーム）或いは７μｇ／ｍＬのサポリンと、０ｎＭ（即ちＥＧＦ無添加）または５００ｎＭのＥＧＦと、を含むＡ４３１培地（即ち、１０％のＦＢＳを含むＭＥＭ培地）に交換して４８時間培養した以外は上記試験９と同様の条件とした。ここで、各試験区を試験区１０−１〜試験区１０−４と呼ぶこととする。なお、コントロール区として、培地中にエクソソーム（サンプル２に係るエクソソーム、即ちサポリン内包エクソソーム）、サポリンおよびＥＧＦのいずれも含有しない試験区を設けた。各試験区の本培養に用いた培地の組成を、表４にまとめる。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
上記本培養後の各試験区について、上記試験９と同様の手法により、コントロール区における細胞生存率を１００％としたときの各試験区の細胞生存率（％）の相対値を算出した。結果を図６に示す。ここで、図中の棒グラフは、左から、コントロール区、試験区１０−１、１０−２、１０−３、１０−４の結果を示すものである。
【０１０８】
図６に示すとおり、試験区１０−２は、他の試験区（コントロール区、試験区１０−１、試験区１０−３、および試験区１０−４）と比較して、細胞生存率が顕著に低かった（細胞生存率がおよそ半分以下であった）。このことは、試験区１０−２にかかる細胞には、他の試験区と比較して、サポリンが細胞内に特に高効率に導入されたことを示している。さらに、試験区１０−１と試験区１０−２の結果の比較、および試験区１０−３と試験区１０−４の結果の比較から、対象細胞に対してＥＧＦを供給することで、ＥＧＦ無添加の場合と比較して細胞内へのサポリンの取り込みを促進し得ることを確認した。このことは、ＥＧＦは、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを高効率に誘導し得ることを示している。
ここで、試験区１０−３の結果より、単にサポリンを培地中に添加したのみでは、該サポリンは細胞内へほとんど取り込まれない（導入されない）ことを確認した。これに対して、試験区１０−１と試験区１０−３の結果の比較、および試験区１０−２および試験区１０−４の結果の比較から、エクソソーム内にサポリンを内包することにより、該サポリンを効率よく細胞内に導入し得ることを確認した。
以上の結果から、外来物質を内包したエクソソームと、マクロピノサイトーシスを誘導する物質とを対象細胞に供給することで、外来物質を対象細胞内に高効率に導入し得ることを確認した。
【０１０９】
＜試験１１：ＥＧＦ内包エクソソームの細胞内取り込み試験＞
サンプル３に係るエクソソーム（即ちＥＧＦ内包エクソソーム）を用いて、対象細胞による該エクソソームの取り込みを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【０１１０】
まず、上記試験６と同様の条件および手法により、１日間の前培養をしたＡ４３１細胞を準備し、ＭＥＭ培地を用いて該細胞を３回洗浄した。そして、２０μｇ／ｍＬのＣＤ６３−ＧＦＰ−エクソソーム（即ち、サンプル１）、２０μｇ／ｍＬのＥＧＦ内包エクソソーム（即ち、サンプル３）または２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｔｆ）内包エクソソーム（即ち、サンプル５）を含むＡ４３１培地（１０％のＦＢＳを含むＭＥＭ培地）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。各試験区を、それぞれサンプル１添加区、サンプル３添加区、サンプル５添加区と呼ぶこととする。
上記エクソソーム存在下での培養後の細胞について、上記試験６と同様の条件および手法により、フローサイトメーターを用いた分析を行った。
結果を図７に示す。図７に示すグラフは、上記サンプル１添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときのサンプル３添加区およびサンプル５添加区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１１１】
図７に示すように、サンプル３添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、サンプル１添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、顕著に高かった。具体的には、サンプル３添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、サンプル１添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度のおよそ８倍であった。このことは、ＥＧＦを内包したエクソソームを対象細胞に供給することで、該エクソソーム（典型的には該エクソソーム内に内包されたＥＧＦ）により対象細胞のマクロピノサイトーシスが誘導され、該細胞によるエクソソームの取り込みが促進されたことを示している。即ち、対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを誘導する物質を内包したエクソソームを対象細胞に供給することによって、該対象細胞に対してマクロピノサイトーシスを好適に誘導することが可能であること、および、該マクロピノサイトーシスの誘導によって対象細胞内への該エクソソームの取り込みを促進し得ることを確認した。
また、サンプル５添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、サンプル１添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して、若干増大していた（凡そ１．９倍）が、サンプル３添加区ほど顕著ではなかった。換言すると、サンプル３添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、サンプル５における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度よりも高かった（凡そ４．３倍であった）。ここで、トランスフェリンとは、トランスフェリン受容体を刺激することでクラスリン依存的なエンドサイトーシスを誘導する物質である。即ち、サンプル３添加区とサンプル５添加区の比較から、エクソソームは、クラスリン依存的なエンドサイトーシスよりも、マクロピノサイトーシスによって効率よく細胞内へ取り込まれることを確認した。
【０１１２】
＜試験１２：ＥＧＦ内包エクソソームを用いた外来物質の細胞内導入試験＞
サンプル２に係るエクソソーム（即ち、サポリン内包エクソソーム）およびサンプル４にかかるエクソソーム（即ち、ＥＧＦおよびサポリンの両方を内包するエクソソーム）を用いて、エクソソーム内に内包した外来物質が細胞内へ導入される効率を評価した。具体的には、外来物質としてサポリンを用い、かかるサポリンを内包するエクソソームを細胞に供給した時の細胞の生存率を調べることで、エクソソーム内に内包したサポリンが細胞内へ取り込まれる効率を評価した。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【０１１３】
試験方法としては、エクソソーム存在下での培養を以下の条件に変更した以外は上記試験１０と同様の条件および手法により、供試細胞の細胞生存率を測定した。具体的には、前培養後の細胞について、培養容器内の培地を、０．４μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、または２０μｇ／ｍＬのサンプル２またはサンプル４にかかるエクソソームを含むＡ４３１培地（即ち、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地）に交換して７２時間培養した以外は上記試験１０と同様の条件および手法により、供試細胞の細胞生存率を測定した。なお、コントロール区として、培地中にサンプル２およびサンプル４にかかるエクソソームをいずれも含有しない試験区を設けた。
【０１１４】
上記エクソソーム存在下での培養後の各試験区について、コントロール区における細胞生存率を１００％としたときの各試験区の細胞生存率（％）の相対値を算出した。結果を図８に示す。
【０１１５】
また、上記各試験区の細胞について、エクソソーム存在下での７２時間の培養後の細胞の状態を光学顕微鏡（位相差倒立顕微鏡）を用いて観察した。各試験区における顕微鏡観察の結果を図９に示す。
【０１１６】
図８に示すように、サンプル４添加区の細胞は、コントロール区および同濃度のサンプル２添加区の細胞と比較して、細胞生存率が低かった。また、培地中のサンプル４に係るエクソソーム濃度が少なくとも０．４〜２０μｇ／ｍＬの範囲内にある場合において、該エクソソームを供給した対象細胞の細胞生存率は低下し、該細胞生存率は培地中のサンプル４に係るエクソソーム濃度が増大するに伴って（サンプル４に係るエクソソームの濃度依存的に）低下することを確認した。特に、培地中のエクソソーム濃度が４μｇ／ｍＬ以上（４〜２０μｇ／ｍＬ）である場合に、顕著に細胞生存率が低下した。
また、図９に示すように、サンプル４添加区の細胞は、同濃度のサンプル２添加区の細胞と比較して、細胞の形態が不均一であり（典型的には細胞のサイズが縮小して細胞の辺縁が不明瞭であり）、白く光って観察される細胞が多かった。かかる細胞の形態が不均一であり、白く光って観察される細胞は、細胞死を起こしている（細胞死を起こしつつある）細胞である。
これらのことは、ＥＧＦを内包するエクソソームを用いることで、該エクソソーム内に内包したサポリンを対象細胞内に効率よく導入することができることを示している。以上の結果より、マクロピノサイトーシスを誘導する物質と外来物質とを内包するエクソソームを用いることで、該外来物質を対象細胞内に効率よく導入することができることを確認した。換言すると、マクロピノサイトーシスを誘導する物質と、外来物質とを内包するエクソソームは、該外来物質を対象の細胞内に導入する目的に好適に使用し得ることを確認した。
【０１１７】
＜試験１３：エクソソームの取り込み試験＞
エクソソームおよびマクロピノサイトーシスを誘導する物質が存在する条件下での培養期間を延長し、該条件における供試細胞によるエクソソームの取り込みを評価した。評価方法としては、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察およびフローサイトメーターを用いた分析を行った。供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【０１１８】
フローサイトメーターを用いた分析は、以下のとおりに行った。前培養後の細胞を、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、１００ｎＭ或いは５００ｎＭのＥＧＦを含有するＡ４３１培地（即ち、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地）に培地交換し、２４時間毎（即ち、エクソソーム存在下での培養開始後２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後）に該培地中に同濃度（１００ｎＭ或いは５００ｎＭ）のＥＧＦを添加しながら培養した以外は上記試験６と同様にして、該細胞をエクソソーム存在下で９６時間培養した。また、コントロール区として、培地中にＥＧＦを含有しない（２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームは含有する）試験区（以下、ＥＧＦ無添加区ともいう）を設けた。
【０１１９】
上記エクソソーム存在下での本培養後の各試験区の細胞について、該細胞によるエクソソームの取り込みを、上記試験６と同様の手法でフローサイトメーターを用いた分析を行い評価した。結果を図１０に示す。図１０に示すグラフは、ＥＧＦ無添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときの各試験区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１２０】
また、上記各試験区の細胞について、供試細胞によるエクソソームの取り込みを、上記試験５と同様の手法によって共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察を行い評価した。５００ｎＭのＥＧＦを添加した試験区およびＥＧＦ無添加区について蛍光観察を行った結果を図１１に示す。これらの画像は各試験区におけるサンプル１に係るエクソソームの細胞内への取り込みを調べた顕微鏡写真（画像）である。下段に５００ｎＭのＥＧＦを添加した試験区の結果を示し、上段にＥＧＦ無添加区の結果を示す。具体的には、左列に示す写真（画像）は、サンプル１に係るエクソソームの局在を調べた顕微鏡写真である。中央列に示す写真（画像）は、Hoechst33342による核染色の画像である。また、右列に示す写真（画像）は、上記左列に示すサンプル１に係るエクソソームの局在を調べた画像と、上記中央列に示すHoechst33342による核染色の画像とを重ねた（マージした）画像である。
【０１２１】
図１０および図１１に示すように、サンプル１に係るエクソソームおよびＥＧＦが存在する条件下で長期間培養した対象細胞は、ＥＧＦ無添加区の細胞と比較して、エクソソームの取り込み量が顕著に高い（凡そ４０倍以上）ことを確認した。特に、上記試験６の結果と本試験におけるフローサイトメーターを用いた分析の結果を比較すると、サンプル１に係るエクソソームおよびＥＧＦが存在する条件下で長期間培養することにより、対象細胞に対してより多くのエクソソームを取り込ませ得る（導入し得る）ことを確認した。以上の結果より、ここで開示する外来物質導入用エクソソーム（即ち、該外来物質導入用エクソソームを含む組成物）を対象の細胞に供給する期間（供給間隔）を調整することで、外来物質を効率よく対象細胞内に導入し得ることを確認した。
【０１２２】
＜試験１４：供試細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を用いたエクソソーム取り込み試験＞
供試細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を用いた場合の、該供試細胞によるエクソソームの取り込みを評価した。評価方法としては、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察およびフローサイトメーターを用いた分析を行った。なお、エクソソームとしてはサンプル１に係るエクソソームを用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【０１２３】
供試細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を用い、エクソソーム存在下での培養条件を以下に変更した以外は上記試験６と同様の条件および手法により、供試細胞によるエクソソームの取り込みを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。具体的には、前培養後のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、０ｎＭ（即ち、ＥＧＦ無添加）または５００ｎＭのＥＧＦを含む培地中で２４時間培養したことと、前培養およびエクソソーム存在下での培養にＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の継代培養に用いた培地と同様の組成の培地（以下、「ＭＩＡ  ＰａＣａ−２培地」ともいう）を用いたこと以外は上記試験６と同様の手法により評価した。
【０１２４】
結果を図１２に示す。図１２に示すグラフは、ＥＧＦ無添加区（コントロール区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときのＥＧＦ添加区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１２５】
また、上記ＥＧＦ添加区に係る細胞（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞）について、該細胞によるエクソソームの取り込みを、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察により評価した。なお、かかる蛍光観察に用いた細胞は、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、５００ｎＭのＥＧＦに加えて０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の蛍光色素（テキサスレッド）で標識したデキストラン（Texas red Dextran）を含むＭＩＡ  ＰａＣａ−２培地中で２４時間培養したものを用いた。共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察は、上記試験５と同様の手法により行った。結果を図１３に示す。これらの画像は本試験における、サンプル１に係るエクソソームおよびデキストランの細胞内への取り込みを調べた顕微鏡写真（画像）である。具体的には、最左に示す写真（画像）は、サンプル１に係るエクソソームの局在を調べた顕微鏡写真である。左から２番目に示す写真（画像）は、Texas red-dextranの局在を示す画像である。右から２番目に示す写真（画像）は、Hoechst33342による核染色の画像である。また、最右に示す写真（画像）は、上記最左に示すエクソソームの局在を調べた画像と、上記左から２番目に示すTexas red-dextranの局在を調べた画像と、上記右から２番目に示すHoechst33342による核染色とを重ねた（マージした）画像である。
【０１２６】
図１２および図１３に示すように、供試細胞（即ち対象細胞）としてＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を用いた場合であっても、ＥＧＦによりエクソソームの取り込みが促進されたことを確認した。このことは、対象細胞としてＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を用いた場合であっても、ＥＧＦによりマクロピノサイトーシスを誘導され得ることを示している。
【０１２７】
＜試験１５：供試細胞としてＢｘＰＣ−３細胞を用いたエクソソーム取り込み試験＞
供試細胞としてＢｘＰＣ−３細胞を用いた場合の、該供試細胞によるエクソソームの取り込みを評価した。評価方法としては、フローサイトメーターを用いた分析を行った。なお、エクソソームとしてはサンプル１に係るエクソソームを用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【０１２８】
供試細胞としてＢｘＰＣ−３細胞を用い、エクソソーム存在下での培養条件を以下に変更した以外は上記試験６と同様の条件および手法により、供試細胞によるエクソソームの取り込みを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。具体的には、前培養後のＢｘＰＣ−３細胞を、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、０ｎＭ（即ち、ＥＧＦ無添加）または５００ｎＭのＥＧＦを含む培地中で２４時間培養したことと、前培養およびエクソソーム存在下での培養にＢｘＰＣ−３細胞の継代培養に用いた培地と同様の組成の培地（以下、「ＢｘＰＣ−３細胞培地」ともいう）を用いたこと以外は上記試験６と同様の手法により評価した。
【０１２９】
結果を図１４に示す。図１４に示すグラフは、ＥＧＦ無添加区（コントロール区）における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときのＥＧＦ添加区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１３０】
図１４に示すように、供試細胞（即ち対象細胞）としてＢｘＰＣ−３細胞を用いた場合であっても、ＥＧＦによりエクソソームの取り込みが促進されたことを確認した。このことは、対象細胞としてＢｘＰＣ−３細胞を用いた場合であっても、ＥＧＦによりマクロピノサイトーシスが誘導され得ることを示している。
【０１３１】
ここで、試験１４および試験１５の結果から、供試細胞としてＡ４３１細胞を用いた試験の結果は該Ａ４３１細胞に特有の現象ではなく、他の細胞（典型的にはヒト由来の細胞、一般的には腫瘍細胞、特にＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞およびＢｘＰＣ−３細胞）に対しても適用可能であることが確認された。即ち、試験１４および試験１５の結果は、本発明における対象細胞はＡ４３１細胞に限定されず、他の細胞（典型的にはヒト由来の細胞、一般的には腫瘍細胞、特にＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞およびＢｘＰＣ−３細胞）においても、マクロピノサイトーシスを誘導する物質を供試細胞に供給して該細胞におけるマクロピノサイトーシスを誘導することで、エクソソーム中に内包した外来物質を該細胞内に好適に導入し得ることを示すものである。また、Ａ４３1細胞以外の細胞（典型的にはヒト由来の細胞、一般的には腫瘍細胞、特にＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞およびＢｘＰＣ−３細胞）を本発明における対象細胞とした場合であっても、マクロピノサイトーシスを誘導する物質と外来物質とを内包したエクソソームを対象細胞に供給することで、該エクソソームに内包した外来物質を対象細胞内に効率よく導入し得ることを示している。
【０１３２】
＜試験１６：ＳＤＦにおけるマクロピノサイトーシス誘導試験＞
マクロピノサイトーシスを誘導する物質としてＳＤＦを用いた場合の、供試細胞によるエクソソームの取り込みを、フローサイトメーターを用いた分析により評価した。エクソソームとして、サインプル１に係るエクソソームを用いた。また、供試細胞としてＨｅＬａ細胞を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
まず、ＨｅＬａ細胞を２４穴培養皿（２４ウェルプレート）に４．７×１０４個／ウェルの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で１日間培養した。培地は、ＨｅＬａ培地を１ウェルあたり１．０ｍＬずつ用いた。
上記１日間の培養（前培養）後のＨｅＬａ細胞について、培養容器中の培地を除去し、α―ＭＥＭ培地（２００μＬ）を用いて培養容器内を３回洗浄した。その後、２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームと、１００ｎＭまたは２００ｎＭのＳＤＦとを含む培地を１ウェルあたり２００μＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養（本培養）した。ここで、培地としてはＨｅＬａ培地（すなわち、１０％のＦＢＳを含む）を用いた。また、コントロール区として、培地中にＳＤＦを含有しない（２０μｇ／ｍＬのサンプル１に係るエクソソームは含有する）試験区（以下、「ＳＤＦ無添加区」ともいう）を設けた。
【０１３３】
上記エクソソーム存在下での培養後のＨｅＬａ細胞について、上記試験６と同様にして、対象細胞におけるエクソソームの取り込みをフローサイトメーターを用いて分析した。結果を図１５に示す。図１５に示すグラフは、ＳＤＦ無添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度を１００としたときの各試験区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すものである。
【０１３４】
図１５に示すとおり、ＳＤＦ添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、ＳＤＦ無添加区の一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度と比較して高かった。また、ＳＤＦ添加区における一細胞あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度は、培地中のＳＤＦの濃度が高くなるに伴い（培地中のＳＤＦ濃度依存的に）増大することを確認した。このことは、ＳＤＦを対象細胞に供給することにより、マクロピノサイトーシスを誘導し得ることを示している。即ち、ＳＤＦは、上述のＥＧＦと同様に、マクロピノサイトーシスを誘導する物質であり得ることを示している。以上の結果から、マクロピノサイトーシスを誘導する物質としてＳＤＦを好適に使用し得ることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
上述のように、ここで開示される技術によると、マクロピノサイトーシスによるエクソソームの取り込みを利用して、外来物質（典型的には薬理活性を有する物質）を対象の細胞内に効率よく導入することができる。また、ここで開示される技術によると、マクロピノサイトーシスによるエクソソームの取り込みを利用して、外来物質（典型的には薬理活性を有する物質）を対象の細胞内に効率よく導入するための組成物、および、外来物質を対象の細胞内へ効率よく導入可能なエクソソームを提供することができる。
このため、ここで開示される技術は、外来物質（典型的には薬理活性を有する物質）を目的の細胞に導入するためのドラックデリバリーシステムに好適に使用し得る。例えば、外来物質として抗がん（抗腫瘍）作用を有する物質や分化誘導作用を有する物質等を用いることで、がん治療の分野や再生医療分野において好適に使用し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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