(57)【要約】  本発明は、リモネンを含む、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤に関する。
2017078175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リモネンを含む、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤。
【請求項２】
リモネン及びローヤルゼリーを含む、認知障害改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リモネンを含む、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会を迎えた日本において高齢に起因する集中力、記憶力、整理能力、計画能力、問題解決能力などの認知障害、ことにその代表的な疾患であるアルツハイマー病の予防および治療が重大な社会問題となっている。【０００３】
リモネンは、多くの柑橘類果皮に多く含まれる単環式モノテルペノイドである。柑橘類の香りを構成する物質の一つであり、香料としての用途があり、化学的合成品も市販されている。【０００４】
ローヤルゼリーは（Ｒｏｙａｌ  ｊｅｌｌｙ）は、ミツバチの若い働き蜂の咽頭腺からの分泌物であり、女王蜂となる幼虫や成虫となった女王蜂の食物として給餌される。働き蜂の４０倍も長生きする女王蜂の生涯において唯一のエネルギー源である。また、蜂蜜とは比較にならないほど多くのビタミン、ミネラル、アミノ酸が含まれており、高タンパクで様々な栄養素を含んでいることが知られている。ことに、ローヤルゼリーが学習障害モデルに対して極めて優れた効果を示すことから、アルツハイマー病等の認知障害改善剤として有用であることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１５４１９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、リモネンがローヤルゼリーの示す抗認知症効果を顕著に増強することを初めて見いだし、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００８】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］リモネンを含む、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤、
［２］リモネン及びローヤルゼリーを含む、認知障害改善剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＰＣ１２細胞におけるＣＲＥ依存性転写活性に対するリモネンおよびリモネンとローヤルゼリー併用の効果を示す。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）である。＊は、ローヤルゼリー単独のルシフェラーゼ活性に対して、有意差を持つことを示す（ｐ＜０．０５）。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。ＲＪは、ローヤルゼリーを示す。
【図２】図２は、ＰＣ１２細胞における様々な濃度のローヤルゼリーのＣＲＥ依存性転写活性に対する１００μＭリモネンの効果を示す。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）である。＊は、ローヤルゼリー単独のルシフェラーゼ活性に対して、リモネン併用が有意差を持つことを示す（ｐ＜０．０５）。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。ＲＪは、ローヤルゼリーを示す。□はローヤルゼリー単独の活性、■はローヤルゼリーに１００μＭリモネン添加時の活性を示す。
【図３】図３は、ＰＣ１２細胞における様々な濃度のローヤルゼリーのＣＲＥ依存性転写活性に対する２００μＭリモネンの効果を示す。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）である。＊は、ローヤルゼリー単独のルシフェラーゼ活性に対して、リモネン併用が有意差を持つことを示す（ｐ＜０．０５）。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。ＲＪは、ローヤルゼリーを示す。□はローヤルゼリー単独の活性、■はローヤルゼリーに１００μＭリモネン添加時の活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のリモネンは、当業者に周知の方法を用いて化学的に合成することが出来る。また、ミカン科植物から抽出することも出来る。リモネンは、Ｄ体、Ｌ体、ラセミ体のいずれも本発明に用いることができる。
【００１１】
ミカン科植物としては、ヒラミレモン（Citrus depressa）、ウンシュウミカン（Citrus unshiu）、オベニミカン（Citrus tangerina）、コベニミカン（Citrus erythrosa）、ダイダイ（Citrus aurantium）、地中海マンダリン（Citrus deliciosa）、ザボン（Citrus grandis）、ヒラキシュウ（Citrus kinokuni）、ポンカン（Citrus reticulata）、タチバナ（Citrus tachibana）、サンキツ（Citrus sunki）などを挙げることができる。
【００１２】
本発明に用いられるミカン科植物の抽出物は、採取後の生の状態または乾燥された状態のいずれの状態から抽出されたものであってもよい。部位としては、成熟したまたは未成熟の、果実、果皮、種子、葉、葉柄、枝、根、花などを挙げることができる。好ましくは果実、果皮である。
【００１３】
本発明に用いることが出来るローヤルゼリーは、特に限定されることなく、市販されているローヤルゼリーを用いることが出来る。好ましくは、ジャパンローヤルゼリー社の製品を挙げることが出来る。
【００１４】
本発明においては、リモネンの含有量は、０．０００２重量％〜０．１０重量％、好ましくは０．０００５重量％〜０．０５重量％、より好ましくは０．００１重量％〜０．０１重量％である。一方、リモネンを０．５％含むエキスを使用した場合は、０．００４重量％〜２．０重量％、好ましくは０．０１重量％〜１．０重量％、より好ましくは０．０２重量％〜０．２重量％である。また、ローヤルゼリーの含有量は、ローヤルゼリーＦＤ末として、０．００１重量％〜６０重量％、好ましくは０．０１重量％〜４５重量％、より好ましくは０．１重量％〜３０重量％である。
【００１５】
本発明においては、リモネン含有量とローヤルゼリー含有量との比率は、１：５〜１：３０００００、好ましくは、１：２０〜１：９０００、より好ましくは１：１００〜１：３０００である。一方、リモネンを０．５％含むエキスを使用した場合は、４：１〜１：１５０００、好ましくは、１：１〜１：４５０、より好ましくは１：５〜１：１５０である。
【００１６】
本発明の認知障害改善剤は、医薬品、医薬部外品または食品などに配合することができる。また、本発明は経口投与または非経口投与のいずれにおいても使用することができる。
【００１７】
本発明の認知障害改善剤の投与量は特に限定されないが、たとえば、経口投与の場合には一日あたり１０〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、非経口投与の場合には一日あたり２〜６ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２〜３ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２〜３回に分けて投与することができ、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【００１８】
添加剤の具体例としては、マルチトール、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独または適宜組合わせて使用することができる。これら医薬品は、日本薬局方の記載に従い、各々の医薬品の形態に適した方法で製造することができる。また、香味料、着色料、甘味料など適宜使用することもできる。これら添加剤の含有量は当業者に適切に選択され得る。
【００１９】
医薬部外品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、ドリンク剤などが挙げられる。これら医薬部外品は、通常の医薬部外品製造における添加剤を使用して製造することができる。さらに、これら医薬部外品は、例えばビタミン類などの他の有効成分を含有することもできる。また、甘味料、香味料、着色料、酸化防止剤などの添加剤を単独または適宜組み合わせて使用することもできる。これら医薬部外品は、当業者に周知の方法で製造することができる。
【００２０】
食品の形態としては、麺、パスタ、顆粒、錠果、ゼリー、液体（飲料）などが挙げられる。これら食品は、様々な食品材料を適宜使用して製造することができる。食品材料の具体例は、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆粉、海藻粉、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどであり、これらを単独または適宜組み合わせて使用することができる。必要に応じて水などの使用により所望の形状にすることができる。さらに、香味料、着色料、甘味料、食用油、ビタミン類などを適宜添加することもできる。
【００２１】
以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢに依存するシグナル伝達経路は、ＣＲＥ依存性転写活性を亢進させ特異的な遺伝子を発現させ、脳の記憶・学習能力を形成することが証明されている。神経細胞のモデル細胞と考えられているＰＣ１２細胞では、認知障害改善剤であるローヤルゼリーがｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ経路を経てＣＲＥ依存性転写活性を上昇させることが知られている（特許文献１）。つまり、ＰＣ１２細胞においてＣＲＥ依存性転写活性を上昇させる物質は、認知障害あるいはアルツハイマー病の改善剤として有用であると考えられる。【００２３】
そこで、ＰＣ１２細胞における、ローヤルゼリーによるＣＲＥ依存性転写活性に対するリモネンの効果を、ＣＲＥリポータージーンアッセイで検討した。【００２４】
１．  実験方法
ＰＣ１２細胞の培養
ＰＣ１２細胞（理研ＢＲＣ）は、非働化した（５６℃，３０分）した１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ）を用い、継代培養した。細胞は、３７℃に加温した９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２を含むインキュベーター中で培養した。【００２５】
ローヤルゼリー水溶液の調製
ローヤルゼリー原乳は、山口喜久二式自然養蜂により採乳した（ジャパンローヤルゼリー株式会社）。ローヤルゼリー原乳の凍結乾燥粉末をＰＢＳで溶解し２５％（ｗ／ｖ）溶液とし、４℃で一晩撹拌した。その後、１２，０００×ｇで１０分間遠心し、上清をフィルター滅菌し、分注後−２０℃で凍結保存した。ローヤルゼリー中のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質定量法を用い定量した（Ｐｉｅｒｃｅ）。【００２６】
本実験で用いたＤ−リモネンは、ナカライテスクから購入した。【００２７】
ＣＲＥリポータージーンアッセイ
ＰＣ１２細胞１０，０００個を含む１０％ウシ胎児血清入り培養液１００μｌを、９６穴プレートに播種し、２４時間培養した。１穴当たり、０．１μｇ  ｐＣＲＥ（ＣＲＥ配列を持つルシフェラーゼリポータープラスミド）と０．０２μｇ  ｐｈＲＧ−ＴＫ（レニラルシフェラーゼプラスミド）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００を用い一過的に細胞導入し、６時間後、培養液を１％ウシ胎児血清、１％ウマ血清、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ）に交換した。１８時間後に、ローヤルゼリーあるいはリモネンを添加し５時間刺激した。細胞液を回収後、Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｋｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド導入効率を標準化するためレニラルシフェラーゼ活性で補正した。【００２８】
結果
ＰＣ１２細胞におけるＣＲＥ依存性転写活性に対するローヤルゼリーおよびリモネンの効果
ＰＣ１２細胞を１×１０４細胞／穴の細胞密度で９６−穴プレートに播種し、一晩培養した。ＣＲＥ依存性レポータープラスミドを導入し２４時間培養後の細胞を、ローヤルゼリーとリモネンで５時間処理した。処理した細胞を回収し、細胞抽出液中のＣＲＥ依存性転写活性を、ルシフェラーゼ活性として測定した。【００２９】
その結果、ＰＣ１２細胞において、リモネンがローヤルゼリーの示すＣＲＥ依存性転写活性を濃度依存的に促進することが判明した。ここで重要なことは、この実験で使用した濃度域でリモネン単独は、ＣＲＥ依存性転写活性を全く持たないにもかかわらず、ローヤルゼリーと併用するとそのＣＲＥ依存性転写活性を増強したことである（図１）。神経細胞におけるＣＲＥ依存性転写反応は、脳における記憶・学習の根本的な細胞機構の一つであるシナプス伝達の長期増強の主要機構であり、ＣＲＥ依存性転写活性の上昇は、記憶形成を促進すると考えられている。すなわち、リモネンはローヤルゼリーの抗認知症活性を増強させた。【００３０】
次に、様々な濃度のローヤルゼリーに対するリモネンの効果を検証した。１００μＭのリモネンは、１，１０，３０μｇ／ｍｌのローヤルゼリーのルシフェラーゼ活性を一様に増強させた（図２）。ことに、１μｇ／ｍｌのローヤルゼリーは、単独では有意なルシフェラーゼ活性の上昇を示さないが、リモネンとの併用により有意差を持って活性が上昇した。このことは、リモネンとの併用により低濃度のローヤルゼリーが顕著な抗認知症活性を持つことを示唆する。２００μＭのリモネンを用いた実験では、より顕著なリモネンの効果が得られた（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のリモネンを含む、ローヤルゼリーの抗認知症活性の増強剤は、認知障害の改善のために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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