(57)【要約】  【課題】さまざまな疾患に対する治療薬・予防薬や、美容品、機能性食品などに利用するため、生体内で肝細胞増殖因子の産出を顕著に誘導する誘導剤が求められている。  【解決手段】本発明は、植物由来の有効成分を含む肝細胞増殖因子産出誘導剤を提供する。さらに、植物が、紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、益智仁、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯から選ばれる１又は複数である肝細胞増殖因子産出誘導剤を提供する。  【選択図】図１
2016117705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の有効成分を含む、肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項２】
前記植物が、紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、益智仁、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯から選ばれる１又は複数である、請求項１に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項３】
前記有効成分には少なくとも２種類の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子が存在し、１の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は陰性荷電であり、別の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は中性荷電である、請求項１又は２に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項４】
前記有効成分は、製薬上又は食品衛生上許容される極性溶媒により抽出して得られる抽出物である、請求項１〜３いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項５】
前記植物が複数であり、前記複数の植物を混合してから抽出して抽出物を得ることを特徴とする、請求項４に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項６】
極性溶媒が、水、エタノール、酢酸又はそれらの混合物である、請求項４又は請求項５記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項７】
抽出温度が、常温から常圧又は加圧下で溶媒の沸点までの範囲である、請求項４〜請求項６いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項８】
粉末製剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、又は液状製剤の形態である、請求項１〜７いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤
【請求項９】
請求項１〜７いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む治療薬及び／又は予防薬
【請求項１０】
請求項１〜７いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む美容品
【請求項１１】
請求項１〜７いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む機能性食品
【請求項１２】
請求項１〜７いずれか一項に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤を緩衝液とともに陰イオン交換樹脂に添加する添加工程と、
該陰イオン交換樹脂から、イオン強度0 mM〜500 mMの塩を含む緩衝液で溶出する溶出工程を含有する、肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法
【請求項１３】
前記溶出工程が、イオン強度100 mM及び／又は300 mMの塩を含む緩衝液で溶出する溶出工程である、請求項１２に記載の肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来の有効成分を含む、肝細胞増殖因子産出誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor）とは、生体内で組織再生や修復に関与するサイトカインの一種である。肝細胞増殖因子は、肝細胞以外にもさまざまな細胞に作用する。具体的には、上皮細胞や内皮細胞の増殖を促進することや、神経細胞に対し神経栄養因子として働くことが知られている。また、肝細胞増殖因子は、抗線維化、抗炎症、血管新生促進や細胞死抑制作用などを示し、さまざまな疾患の治療及び／又は予防に有効であると考えられている。【０００３】
肝細胞増殖因子産出誘導剤としては、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びアンジオテンシンII受容体拮抗薬（特許文献１参照）、デルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンを有効成分とするもの（特許文献２参照）、ガゴメコンブ由来のフコイダン等の糖化合物（特許文献３参照）等が知られている。【０００４】
また、肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する植物からの抽出物としては、ニガウリ加工処理物を有効成分とするもの（特許文献４参照）、冬虫夏草加工処理物を有効成分とするもの（特許文献５参照）、キク科のモウコタンポポ（Taraxacum mongolicum）等の各種Taraxacum属植物の根つき全草である蒲公英（ホコウエイ）から得られる抽出物を有効成分とするもの（特許文献６参照）、枸杞子、熟地黄、杜仲等の抽出物（特許文献７参照）、タケの葉、サザバルヨモギ、莪朮等の抽出物（特許文献８参照）、田七人参、鬱金、及び蛇胆を配合した顆粒状食品（特許文献９参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2001-002587号公報
【特許文献２】特開2002-003384号公報
【特許文献３】特開2001-226392号公報
【特許文献４】特開2008-201748号公報
【特許文献５】特開2008-201749号公報
【特許文献６】特開2010-043013号公報
【特許文献７】特開2003-171240号公報
【特許文献８】国際公開第01/076614号パンフレット
【特許文献９】特開2005-204504号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さまざまな疾患に対する治療薬・予防薬や、美容品、機能性食品などに利用するため、生体内で肝細胞増殖因子の産出を顕著に誘導する誘導剤が求められている。その一方で、安全性を担保するためには、誘導剤は、漢方薬として長年使用されてきた実績のある植物等の生薬から得られることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者らは生薬として用いられる植物からの抽出物を種々検討したところ、ある種の植物由来の有効成分に肝細胞増殖因子産出誘導活性を見出した。また、特定の生薬の抽出物の組み合わせが、これまでにない肝細胞増殖因子産出誘導活性を有することも見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、植物由来の有効成分を含む、肝細胞増殖因子産出誘導剤である。本発明における植物は、紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、益智仁、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯から選ばれる１又は複数であり得る。【０００９】
また、別の本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤が含む有効成分は、製薬上又は食品衛生上許容される極性溶媒により抽出して得られる抽出物である。好ましくは、植物が複数であり、複数の植物を混合してから抽出して得られる抽出物である。【００１０】
さらに好ましい本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯を、混合してから抽出して得られる抽出物である。【００１１】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤の有効成分には少なくとも２種類の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子が存在し、１の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は陰性荷電であり、別の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は中性荷電である。【００１２】
極性溶媒が、水、エタノール、酢酸又はそれらの混合物であり得る。また、抽出温度が、常温から常圧又は加圧下で溶媒の沸点までの範囲であり得る。【００１３】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、粉末製剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、又は液状製剤の形態であり得る。【００１４】
また、本発明は、肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む治療薬及び／又は予防薬、肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む美容品、さらに肝細胞増殖因子産出誘導剤を含む機能性食品を提供する。【００１５】
さらに本発明は、肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法を提供する。すなわち、上述の肝細胞増殖因子産出誘導剤を緩衝液とともに陰イオン交換樹脂に添加する添加工程と、該陰イオン交換樹脂から、イオン強度0 mM〜500 mMの塩を含む緩衝液で溶出する溶出工程とを含有する、肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法である。イオン強度100 mM及び／又は300 mMの塩を含む緩衝液で溶出することが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、肝細胞増殖因子産出細胞に作用し、肝細胞増殖因子をコードするmRNAの転写を促進、又は肝細胞増殖因子のタンパク質合成を促進することで、肝細胞増殖因子の産出を誘導することができる。また、本発明に用いられる植物は、漢方薬として長年使用されてきた生薬であり、安全性が高いものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤の活性を示す図である。
【図２】本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤のSephadex LH-20カラムでの溶出曲線を示す図である。
【図３】本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤のSephadex LH-20カラムの溶出で得られた画分の肝細胞増殖因子産出誘導活性を示す図である。
【図４】本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤のDEAE陰イオン交換カラムでの溶出曲線を示す図である。
【図５】本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤からDEAE陰イオン交換カラムの溶出で得られた画分の肝細胞増殖因子産出誘導活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、植物由来の有効成分を含む。より好ましくは、紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、益智仁、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯から選ばれる１又は複数由来の有効成分を含む。なお、本明細書において日本薬局方は、第一六改正日本薬局方をいう。
【００１９】
紅花（コウカ）は、キク科ベニバナ属の一年草又は越年草のベニバナ（Carthamas tinctorius L）をいい、古くから紅色染料や食用油として広く一般に知られている。紅花の根は、浄血薬として、とくに婦人薬として繁用され、例えば生理不順、冷え性、更年期障害などにも効き目があり、また、血行障害によるお血の改善にも効き目がある。乾燥させた花は、血行促進作用がある生薬として日本薬局方にも収載されており、種々の漢方処方に用いられている。
【００２０】
本発明においては、紅花の葉、茎、花、根などの各部位及び全草をそのまま又は乾燥したものを用いることができる。花もしくは地上部位全草が好ましく、管状花をそのまま又は黄色色素の大部分を除いた日本薬局方に記載の紅花を用いることがより好ましい。また、紅花は、圧搾して板状としたものも好ましく用いることができる。
【００２１】
莪朮（ガジュツ）は、ショウガ科ウコン属の1種である多年草のガジュツ（Curcuma zedoaria）をいい、日本薬局方に収録される芳香健胃作用を有する生薬である。また、莪朮から抽出される成分が神経成長因子産生増強作用を有することが知られている
【００２２】
本発明においては、莪朮の根茎もしくは湯通ししたものをそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の莪朮がより好ましい。
【００２３】
枸杞子（クコシ）は、クコの実をいい、中国原産のナス科の落葉低木であるクコ（Lycium chinense Miller又はLyciumbarbatum L.）が好ましく用いられる。日本薬局方に収載されている生薬で、抗疲労抗老化作用、免疫賦活作用、肝細胞保護作用、抗脂肪肝作用、血中脂肪降下作用、血糖降下作用、血圧降下作用などが知られている。本発明においては、枸杞子の果実をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の枸杞子がより好ましい。
【００２４】
石菖蒲（セキショウブ）は、中国医学では芳香開竅、寧心安神の効能が認められており、他の安神薬草類を配合して用いられ、癲狂、痴呆の治療、あるいは健忘、耳鳴、難聴などにも使用されている。本発明においては、石菖蒲は、サトイモ科のセキショウ（Acorus gramineusAcorus gramineus）の根又は茎、葉をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができる。
【００２５】
益智仁（ヤクチニン）は、日本薬局方に収載されている生薬であり、健胃、抗利尿、唾液分泌抑制作用が知られている。本発明においては、益智仁は、ショウガ科に属する益智（ヤクチ；Alpinia oxyphylla Miquel）の果実をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の益智（仁）がより好ましい。
【００２６】
欝金は、ショウガ科の多年草で、香料、着色料、生薬として用いられ、英語名のターメリックとしてよく知られ、インド料理のカレーの材料としても使われている。生薬としての薬効には、胆汁の分泌促進や健胃作用などが知られている。
【００２７】
本発明においては、鬱金は、ショウガ科の多年草ウコンの根又は茎をそのまま乾燥したものを好ましく用いることができる。また、ウコンには春に赤色の花をつける春ウコン（Curcuma aromtica S）と、秋に白色の花をつける秋ウコン（Curcuma longa L）とがあり、主な薬効成分であるクルクミンを多く含む秋ウコンがより好ましい。
【００２８】
仙茅は、生薬として「温腎壮陽、去寒除湿」の効果があり強壮を目的に使用されてきた。また、老人の夜間尿、婦人の更年期による諸症状にも応用されている。また、免疫力賦活や興奮性機能も知られている。本発明においては、仙茅は、ヒガンバナ科のキンバイザサ（Curculigo orchioides GAERIN.）の根茎をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができる。
【００２９】
人参は、日本薬局方に収載されている生薬で種々の漢方処方に配合されている。その効能としては、抗糖尿作用、抗癌作用、心臓強化及び血圧調整、肝機能強化、胃腸機能強化、ストレス解消及び強壮効果、体力（精力）増進、脳機能強化、老化抑制、放射線照射防御作用、貧血回復効果及び造血作用、免疫機能増進、消炎作用及び虚弱体質改善効果などが知られている。
【００３０】
本発明においては、人参は、ウコギ科の多年草オタネニンジン（Panax ginseng C.A. Meyer）の細根を除いた根又は軽く湯通ししたものを用いることができ、日本薬局方に記載の人参がより好ましい。また人参の皮を剥ぎ、自然乾燥又は６０℃以下で熱風乾燥させて水分を１５％以下とした白参、蒸気を当てて蒸したものを乾燥した紅参も好ましく用いることができる。
【００３１】
田七人参（デンシチニンジン）は、ウコギ科の薬用植物であり、中国南部原産で、雲南省や広西チワン族自治区の高地で栽培されている。田七人参の効能としては、止血作用と活血（血液循環の改善）作用を併せ持つことが知られている。また、抗ウイルス作用、抗コレステロール作用、抗腫瘍作用なども知られている。
【００３２】
本発明においては、田七人参は、三七人参（サンシチニンジン）とも呼ばれるウコギ科の多年草（Panax notoginseng）の根又は茎をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができる。
【００３３】
忍冬藤は、単に忍冬ともいわれ、日本薬局方にも記載された漢方生薬である。昔から忍冬を癰疽（体内外の炎症）に有効であるとして関節炎、気管支炎などの治療に使用されてきた。また、流行性風邪、各種化膿性感染症、湿熱による関節の発赤、腫脹、肝毒性保護及び細胞免疫能力低下に有効であることも知られている。
【００３４】
本発明においては、忍冬藤は、スイカズラ（Loniceraj aponica Thunberg （Caprifoliaceae））の葉及び茎をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の忍冬がより好ましい。
【００３５】
大棗（タイソウ）は、クロウメモドキ科のナツメの果実で糖、粘液質、リンゴ酸、酒石酸などを含み、強壮作用・鎮静作用などが知られている。また、甘味があり、また副作用の緩和などを目的に種々の漢方薬に配合されている。本発明においては、クロウメモドキ科のナツメ（Zizyphus jujube Mill. var. inermis Rehder (Rhamnaceae)）又はその品種の果実をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の大棗がより好ましい。
【００３６】
甘草（カンゾウ）は、日本薬局方に収載されている生薬で、グリチルリチンや配糖体などを含有し、鎮痛、抗炎症、胃痛、鎮咳去痰、解毒、十二指腸潰瘍などの効果が知られている。本発明においては、マメ科のウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis Fisch）又はナンキンカンゾウ（Glycyrrhiza glabra Linne (Leguminosae）)の根及びストロン、又はそれらの周皮を除いたもの（皮去リカンゾウ）をそのままあるいは乾燥したものを好ましく用いることができ、日本薬局方に記載の甘草がより好ましい。
【００３７】
蓮子芯（レンシシン）は、通常お茶として飲まれ、心臓や肝臓に有効で精神安定にも効果があるといわれている。本発明においては、スイレン科の植物である蓮Nelumbo nuciferaの成熟した種子の胚芽部分をそのまま又は乾燥したものを好ましく用いることができる。
【００３８】
また、別の本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、前述の植物から製薬上又は食品衛生上許容される極性溶媒により有効成分を抽出して得られる抽出物である。本発明で用いられる抽出物は、前述の植物からなる生薬（好ましくは、乾燥生薬）をそのまま又は裁断、細切、破砕（好ましくは、数ｍｍ〜１ｃｍ前後に裁断、細切、破砕）、もしくは粉砕したもの、あるいは粉末にしたものを抽出溶媒にて抽出することによって得ることができる。
【００３９】
本発明が２種以上の植物から抽出された有効成分を含む場合は、各植物からそれぞれ抽出した有効成分を混合することで本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤を得ることができる。より好ましくは、各植物を混合して得られた混合物から抽出することで得られた肝細胞増殖因子産出誘導剤である。抽出物を混合して得られた肝細胞増殖因子産出誘導剤よりも、各植物を混合して得られた混合物から抽出することで得られた肝細胞増殖因子産出誘導剤の方が、顕著に高い肝細胞増殖因子産出効果が確認されたためである。
【００４０】
抽出溶媒は、製薬上又は食品衛生上許容される極性溶媒が好ましい。極性溶媒としては、例えば、水（例えば、精製水、蒸留水、水道水等）、エタノール、水とエタノールとの混合溶媒（含水エタノール）、酢酸、酢酸と水との混合溶媒、水とエタノールと酢酸との混合溶媒等が挙げられる。好ましくは水、又は含水エタノールである。含水エタノールにおける含水率は１〜９９容量％である。水又は含水エタノールには、酸を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸等の無機酸、リンゴ酸又はクエン酸等の有機酸などが挙げられる。
【００４１】
抽出方法は特に限定されず、浸漬法や向流抽出法を採用することができる。また、常温抽出又は常圧下で溶媒の沸点までの範囲で加熱抽出できる。必要により、減圧又は加圧下で抽出してもよい。加圧は、１気圧を超える圧力であればよく、約２〜３気圧が好ましい。
【００４２】
抽出溶媒（極性溶媒）を植物又は植物の混合物に対し１０〜１００倍量、好ましくは１０〜４０倍量を加え、通常、常温から常圧下又は加圧下で溶媒の沸点までの範囲で３０分〜５時間、好ましくは１〜３時間（１、２、３時間）浸漬し、公知の方法でろ過することにより抽出液を得ることができる。抽出液は、そのまま又は他の抽出液と混合することで、抽出物として使用することができる。また、抽出液を濃縮したもの又は、濃縮乾燥もしくは凍結乾燥したものを抽出物として使用することもできる。
【００４３】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤の有効成分には少なくとも２種類の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子が存在し、１の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は陰性荷電であり、別の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子は中性荷電である。本発明の有効成分には、４種類の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子が存在する場合もある。
【００４４】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、抽出物と所望により配合される医薬上又は食品衛生上許容される担体とを、公知の方法により混合して製剤化することにより、経口的に摂取できる医薬又は食品として容易に調製できる。食品とは、健康食品、機能性食品及びサプリメントを含む。また、経鼻的又は経皮的に摂取する医薬や、注射により投与する医薬、経皮的に使用する美容品としての調整も可能である。
【００４５】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、医薬上又は食品衛生上許容される担体を用いて製剤化してもよい。製剤としては、例えば固形製剤又は液状製剤が挙げられる。医薬上又は食品衛生上許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤や、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤（乳化剤、増粘剤）等が挙げられる。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香料等の製剤添加物を用いることもできる。
【００４６】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、治療薬、予防薬、美容品、又は機能性食品として調製することができる。本発明の治療薬、予防薬、美容品、又は機能性食品における肝細胞増殖因子産出誘導剤の含有量は、例えば固形製剤であれば、植物由来の有効成分を抽出した抽出物として、製剤の約１〜９９重量％であり、好ましくは約５〜９０重量％であり、より好ましくは、約１０〜８０重量％である。液状製剤であれば、抽出乾燥物として製剤の約０．０００１〜８０重量％であり、好ましくは約１０〜５０重量％であり、より好ましくは、約２０〜３５重量％である。
【００４７】
また液状製剤は、植物の抽出液をそのまま又は濃縮した濃縮物をそのまま使用することもできる。好ましくは、有効成分の由来となる植物に対し、１０〜４０倍の極性溶媒（好ましくは、水）を用い、１〜３時間（１、２、３時間）抽出した場合の抽出率（エキスの回収率）が２５％〜３３％である抽出液を液状製剤とすることができる。
【００４８】
本発明の治療薬、予防薬、美容品、又は機能性食品は、経口的に摂取されることが好ましい。食後、食前又は食間に摂取することがより好ましい。本発明の摂取量及び摂取回数は、年齢、体重、投与形態などにより異なるが、通常成人一日あたり植物由来の有効成分を抽出した抽出物として、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ〜３００ｍｇとなるように服用できる。この量を、通常１〜数回、好ましくは１〜３回に分けて服用することが好ましい。
【００４９】
液状製剤の場合、極性溶媒（好ましくは、水）で抽出して得られる抽出液を摂取することが好ましく、通常１〜数回、好ましくは１〜３回に分けて摂取することがさらに好ましい。
【００５０】
さらに、本発明の治療薬又は予防薬は、経鼻的、経皮的に投与されるものでもよく、注射器を用いて、静脈、腹腔、皮内、皮下、筋肉等に投与されてもよい。本発明の美容品は、経皮的に投与されるものであってもよい。
【００５１】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤は、生体内での肝細胞増殖因子の産出を誘導する。したがって、肝細胞増殖因子の産出によって治療及び／又は予防されるさまざまな疾患に効果を発揮する。具体的には、肝疾患（肝炎、肝硬変、肝不全、その他の肝障害）、腎疾患（糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、その他の腎障害）、皮膚疾患、眼疾患（角膜潰瘍等）、肺疾患（肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺線維症、その他の肺障害）、胃十二指腸疾患（胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、その他の胃十二指腸障害）、癌疾患や癌治療における障害、心臓又は四肢の虚血性疾患又は動脈疾患、血液疾患（血小板減少症、血流障害等）、骨疾患（骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎、その他の骨障害）、又は中枢疾患（神経分化異常症等）等が挙げられる。本発明の治療薬、予防薬、美容品、又は機能性食品は、これらの疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
【００５２】
本発明の治療薬、予防薬、美容品、又は機能性食品の投与又は摂取対象としては、ヒトが好ましいが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ブタ等の哺乳類や、鳥類、爬虫類、両生類、魚類に属する愛玩動物や畜産・養殖種、実験用動物等に投与又は摂取させてもよい。
【００５３】
また、本発明は別の肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法を提供する。具体的には、上述の肝細胞増殖因子産出誘導剤を緩衝液とともに陰イオン交換樹脂に添加する添加工程と、該陰イオン交換樹脂から、イオン強度0 mM〜500 mMの塩を含む緩衝液で溶出する溶出工程を含有する、肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法である。
【００５４】
本発明において、陰イオン交換樹脂としては、ジエチルエタノールアミン（DEAE）等を用いることができる。また、溶出する緩衝液に含まれる塩としては、塩化ナトリウム等を用いることができる。
【００５５】
本発明において、より好ましくは、溶出工程は、イオン強度100 mM及び／又は300 mMの塩を含む緩衝液で溶出する溶出工程であり得る。本条件で溶出された分画は、他の条件で溶出された分画よりも、高い肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子を含み得るためである。
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
紅花由来抽出物の作製
乾燥された紅花を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた紅花に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、紅花由来の有効成分を含む抽出物を作製した。【００５８】
実施例１の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、肝細胞増殖因子産出能を有するヒト皮膚線維芽細胞（SF4-1細胞）を用いて測定した。SF4-1細胞を、1.5 x104 cells/well の細胞密度で、96 穴プレートに播種した。1重量％ のFCSを添加したDMEM培地に交換し、実施例１の抽出物をSF4-1細胞の培養液に複数の濃度となるよう添加した。また、陽性対照として肝細胞増殖因子産出活性を有することが知られているヘパリンを1μg/mL添加し、陰性対照として蒸留水を添加した。SF4-1細胞を48時間培養し、培養液中の肝細胞増殖因子量をELISA法で測定した。肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例１の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例１の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で1.4倍であった。
【実施例２】
【００５９】
莪朮由来抽出物の作製
乾燥された莪朮を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた莪朮に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、莪朮由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例２の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例２の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例２の抽出物をSF4-1細胞の培養液に1容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で1.6倍であった。
【実施例３】
【００６０】
枸杞子由来抽出物の作製
乾燥された枸杞子を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた枸杞子に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、枸杞子由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例３の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例３の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例３の抽出物をSF4-1細胞の培養液に1容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で1.3倍であった。
【実施例４】
【００６１】
石菖蒲由来抽出物の作製
乾燥された石菖蒲を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた石菖蒲に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、石菖蒲由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例４の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例４の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例４の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で2.8倍であった。
【実施例５】
【００６２】
欝金由来抽出物の作製
乾燥された欝金を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた欝金に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、欝金由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例５の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例５の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例５の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で2.3倍であった。
【実施例６】
【００６３】
人参由来抽出物の作製
乾燥された人参を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた人参に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、人参由来の有効成分を含む抽出物を作製した。【００６４】
実施例６の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例６の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例６の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で2.5倍であった。
【実施例７】
【００６５】
田七人参由来抽出物の作製
乾燥された田七人参を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた田七人参に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、田七人参由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例７の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例７の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例７の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で3.1倍であった。
【実施例８】
【００６６】
忍冬藤由来抽出物の作製
乾燥された忍冬藤を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた忍冬藤に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、忍冬藤由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例８の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例８の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例８の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で1.8倍であった。
【実施例９】
【００６７】
大棗由来抽出物の作製
乾燥された大棗を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた大棗に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、大棗由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例９の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例９の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例９の抽出物をSF4-1細胞の培養液に1容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で1.6倍であった。
【実施例１０】
【００６８】
甘草由来抽出物の作製
乾燥された甘草を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた甘草に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、甘草由来の有効成分を含む抽出物を作製した。
【実施例１１】
【００６９】
仙茅由来抽出物の作製
乾燥された仙茅を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた仙茅に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、仙茅由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例１１の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例１１の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例１１の抽出物をSF4-1細胞の培養液に1容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で3.4倍であった。
【実施例１２】
【００７０】
蓮子芯由来抽出物の作製
乾燥された蓮子心を数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工した。得られた蓮子心に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、蓮子心由来の有効成分を含む抽出物を作製した。実施例１２の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例１２の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例１２の抽出物をSF4-1細胞の培養液に3容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で2.5倍であった。
【実施例１３】
【００７１】
複数種の植物を用いた抽出物の作製（１）
実施例１〜実施例１２の抽出物を等量ずつ混合した抽出物を作製した。実施例１３の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、実施例１と同様の方法で測定したところ、肝細胞増殖因子の産出量が最も高い実施例１３の抽出物の添加条件は、0.5 mg当量/mLの実施例１３の抽出物をSF4-1細胞の培養液に1容量％添加した場合であり、肝細胞増殖因子産出量は、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で3.1倍であった。
【実施例１４】
【００７２】
複数種の植物を用いた抽出物の作製（２）
乾燥された紅花、莪朮、枸杞子、石菖蒲、欝金、人参、田七人参、忍冬藤、大棗、甘草、仙茅及び蓮子芯を、それぞれ数ミリ〜１ｃｍ前後に裁断加工し、混合した。得られた混合物に水を加え、加圧抽出機にて、２〜３気圧で２時間煮沸抽出後濾過した。得られた濾液をアルミパックに分包し、これら１２種類の植物由来の有効成分を含む抽出物を作製した。
【実施例１５】
【００７３】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤による肝細胞増殖因子産出誘導活性
実施例１４の抽出物が有する肝細胞増殖因子産出誘導活性を、肝細胞増殖因子産出能を有するヒト皮膚線維芽細胞（SF4-1細胞）を用いて測定した。SF4-1細胞を、1.5 x104 cells/well の細胞密度で、96 穴プレートに播種した。1重量％ のFCSを添加したDMEM培地に交換し、0.5 mg当量/mLの実施例１５の抽出物をSF4-1細胞の培養液にそれぞれ1容量％、3容量％、10容量％添加した。また、陽性対照として肝細胞増殖因子産出活性を有することが知られているヘパリンを1μg/mL添加し、陰性対照として蒸留水を添加した。SF4-1細胞を48時間培養し、培養液中の肝細胞増殖因子量をELISA法で測定した。図１に、各培養液中における肝細胞増殖因子の量を、陰性対照における肝細胞増殖因子量を1とした相対量で示す。実施例１４の抽出物を添加したSF4-1細胞で、大量の肝細胞増殖因子が産出されていることがわかった。
【実施例１６】
【００７４】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法（１）
実施例１４の抽出物に２倍量の蒸留水を加え、室温で１時間混和し、遠心した。遠心後の上清を20% エタノール/水混合液により平衡化したSephadex LH-20カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、同溶液を用いて溶出し、各画分を培養液に5%添加して肝細胞増殖因子産出誘導活性をELISA法で測定した。溶出曲線を図２に、HGF産出誘導活性測定結果を図３に示す。早く溶出される画分がメインの活性であり、遅く溶出される画分にも弱い活性が認められた。
【実施例１７】
【００７５】
本発明の肝細胞増殖因子産出誘導剤の製造方法（２）
実施例１４の抽出物に２倍量の蒸留水を加え、室温で１時間混和し、遠心した。遠心後の上清を50 mM Tris-HCl[pH 8.0]で平衡化し、DEAE Sepharose FFカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加した。添加したカラムを50 mM Tris-HCl[pH 8.0]で洗浄後、100 mM、300 mM、及び500 mMの塩化ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl[pH 8.0]で順に溶出した。溶出された各画分を培養液に3%添加して肝細胞増殖因子産出誘導活性をELISA法で測定した。溶出曲線を図４に、測定結果を図５に示す。緩衝液のみの溶出画分及び各濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液の溶出画分で活性が認められた。したがって、上述の方法により、新たな肝細胞増殖因子産出誘導剤が製造されることが明らかとなった。また、実施例１４の抽出物には、少なくとも４種類の肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子が存在し、うち肝細胞増殖因子産出誘導活性を有する分子の３種類は陰性荷電であり、１種類は中性荷電であると考えられた。【００７６】
また、本実施例で得られた各画分の活性を比較すると、100 mMの塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出して得られた分画と、300 mMの塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出して得られた分画の肝細胞増殖因子産出誘導活性が高いことがわかった。したがって、上述の製造方法により、肝細胞増殖因子産出誘導活性の高い分画を含む、別の肝細胞増殖因子産出誘導剤を製造することができる。
【実施例１８】
【００７７】
マウスに対する肝細胞増殖因子産出誘導剤の肝細胞増殖因子産出誘導活性
実施例１４の抽出物をマウスに投与して血漿および大脳中の肝細胞増殖因子量の測定を行った。健常マウス（ICR、8週齢、雌）に１日１回 30 mg量の抽出物を経口投与し、７日後に血液および大脳を回収した。表１に示すように、実施例１４の抽出物の投与によって肝細胞増殖因子の産出量の増加が認められたことから、顕著な肝細胞増殖因子誘導活性を有することが確認された。【００７８】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、医薬、美容、及び食品分野において、肝細胞増殖因子の産出を誘導することによるさまざまな疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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