(57)【要約】【課題】医薬組成物、例えば慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。  【解決手段】本発明者らは、ＥＰ４受容体拮抗作用を有する化合物について鋭意検討し、アミド化合物又はその塩がＥＰ４受容体拮抗作用を有することを知見し、本発明を完成した。アミド化合物又はその塩はＥＰ４受容体拮抗作用を有し、ＥＰ４が関与する種々の疾患、例えば、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として使用しうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸又はその塩。
【請求項２】
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メタンスルホン酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メタンスルホン酸塩の結晶である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度が１９２℃であり、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝４．７、９．５、１２．０、１３．２、１３．７、１５．３、１８．８、２０．３、２０．９、及び２２．８にピークを有する結晶である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項６】
慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である請求項５に記載の化合物又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項７】
慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための請求項１に記載の化合物又はその塩の使用。
【請求項８】
慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための請求項１に記載の化合物又はその塩の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物又はその塩の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物、例えば慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の治療用医薬組成物の有効成分として有用な４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸（以下、「化合物Ａ」ということがある。）、又はその塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンＥ２（以下、「ＰＧＥ２」と言う。）はアラキドン酸カスケードの代謝産物の一つとして知られている。ＰＧＥ２は種々の生理活性を示し、発痛増強作用、炎症促進作用、炎症抑制作用、子宮収縮作用、消化管蠕動運動促進作用、覚醒作用、胃酸分泌抑制作用、血圧降下作用、血小板凝集阻害作用、骨再吸収促進作用、血管新生作用等に関与している。
ＰＧＥ２の受容体には、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４の４種類のサブタイプが存在し、これらは種々の組織に広く分布している。ＥＰ１受容体の活性化は細胞内Ｃａ2+の増加を引き起こす。ＥＰ３受容体の活性化は細胞内Ｃａ2+の増加を引き起こすと共に、アデニル酸シクラーゼの抑制を引き起こし細胞内のｃＡＭＰレベルを減少させる。ＥＰ２及びＥＰ４受容体の活性化はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こし、細胞内のｃＡＭＰレベルを増加させる。特にＥＰ４受容体は平滑筋の弛緩、炎症反応の促進又は抑制、リンパ球分化、メサンギウム細胞の肥大又は増殖、胃腸からの粘液分泌等に関わっているとされている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０１３、１３８：４８５−５０２；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１３、６５：１０１０−１０５２；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００４、２８７、Ｆ６７３−Ｆ６８１）。
ＰＧＥ２受容体の阻害剤、つまりＥＰ受容体アンタゴニストはＥＰ受容体に対する結合活性を有し、ＰＧＥ２のＥＰ受容体を介した作用を阻害する。したがって、ＥＰ受容体アンタゴニストはＰＧＥ２に起因する疾患を治療する薬剤として期待されている。中でも、ＥＰ４受容体アンタゴニストはＥＰ４に関連した疾患、たとえば腎臓病、炎症性疾患、種々の疼痛等に対するヒト及び動物での治療薬として期待されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１０、２１：１６７８−１６９０；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１０、１０７：１２２３３−１２２３８；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２００８、３２５：４２５−４３４）。さらに、ＥＰ４受容体選択的アンタゴニストは、他のＥＰ１、ＥＰ２及びＥＰ３の拮抗に基づく副作用を回避できる点から望ましい（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９、７９：１１９３−１２２６；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００１、６３：５７９−６０５）。【０００３】
特許文献１ではＥＰ４受容体アンタゴニストとして、下記式（Ｂ）で示される化合物が報告されている。
【化１】
2015147020.tif 000002
（式中、環Ｄは次式（ＩＩＩ）の基等であり、次式中、環Ｄ1はフェニルで置換されてもよい単環又は二環式の含窒素ヘテロ環を、Ｒ41は−Ｘ2−Ｂ4を、Ｘ2はＣ1-6アルキレン等を、Ｂ4はＲ4から選択される同一又は異なる１〜５個の基でそれぞれ置換されてもよいアリール、ヘテロ環等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。）
【化２】
2015147020.tif 000003
【０００４】
当該特許文献の実施例２０５では下記実施例化合物が開示されているが、環Ｄ1がピラゾールである具体的な化合物としては、当該実施例化合物が開示されている。
【化３】
2015147020.tif 000004
【０００５】
特許文献２ではＥＰ４受容体アンタゴニストとして、下記式（Ｃ）で示される化合物が報告されている。
【化４】
2015147020.tif 000005
（式中、Ｒ2はメチル、フルオロメチル等を、Ｒ4はフルオロメチル、メトキシ等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。）【０００６】
特許文献３ではＥＰ４受容体アンタゴニストとして、下記式（Ｄ）で示される化合物が報告されている。
【化５】
2015147020.tif 000006
（式中、Ｒ2はメチル、フルオロメチル（例えば、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル）等を、Ｒ4はフルオロメチル、メトキシ等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。）【０００７】
特許文献４ではＥＰ４受容体リガンドとして、下記式（Ｅ）で示される化合物が報告されている。
【化６】
2015147020.tif 000007
（式中の記号は、当該特許文献を参照。）【０００８】
特許文献５ではＥＰ４受容体アンタゴニストとして、下記式（Ｆ）で示される化合物が報告されている。
【化７】
2015147020.tif 000008
（式中、環Ｂ及び環Ｄは、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロ環を、Ｘは単結合、−Ｒ00−等を、Ｒ00は低級アルキレンを、Ｒ1はＨ等を表す。Ａは次式（ＩＩ）の基等であり、次式中、ＹはＣＨ等を、Ｒ2はＲ0等を、Ｒ0は低級アルキルを、Ｚは単結合等を、Ｒ3は−ＣＯＯＨ等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。）
【化８】
2015147020.tif 000009
当該特許文献において、環Ｄがピラゾールである具体的な化合物の開示はない。【０００９】
特許文献１から特許文献５において、具体的に実施例に開示された化合物と化合物Ａの構造は異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３９３７３号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１０３０７１号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０３９９７２号
【特許文献４】国際公開第２００８／０１７１６４号
【特許文献５】国際公開第２００９／００５０７６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
医薬組成物、例えば慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＥＰ４受容体拮抗作用を有する化合物について鋭意検討し、式（Ｉ）で示される、４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸（化合物Ａ）又はその塩が優れたＥＰ４受容体拮抗作用を示すことを知見し、本発明を完成した。
【化９】
2015147020.tif 000010
即ち、本発明は、化合物Ａ又はその塩、並びに、化合物Ａ又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物に関する。【００１３】
また、本発明は、化合物Ａ又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物に関する。なお、当該医薬組成物は、化合物Ａ又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療剤を包含する。
また、本発明は、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための化合物Ａ又はその塩の使用、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための化合物Ａ又はその塩の使用、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための化合物Ａ又はその塩、並びに、化合物Ａ又はその塩の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法に関する。なお、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その予防又は治療を必要とするヒトである。
【発明の効果】
【００１４】
化合物Ａ又はその塩は、ＥＰ４受容体拮抗作用を有するため、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の化合物Ａ又はその塩のある態様を以下に示す。なお、本明細書中で単に化合物Ａと記載する場合は、塩を形成していない遊離化合物としての化合物Ａを意味する。
（１）  化合物Ａ又はその塩。
（１−１）化合物Ａ。
（１−２）化合物Ａのメタンスルホン酸塩。
（２）  （１）に記載された化合物Ａ又はその塩の結晶。
（３）  （１−１）に記載された化合物Ａの結晶。
（３−１）示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）における吸熱ピークのオンセット温度が２５３℃付近である（３）に記載の化合物Ａの結晶。
（３−２）管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝５．７付近、７．９付近、１１．５付近、１３．１付近、及び１７．９付近にピークを示すことを特徴とする（３）に記載の化合物Ａの結晶。
（３−３）管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝５．７付近、７．９付近、８．３付近、８．９付近、９．２付近、１１．５付近、１２．５付近、１３．１付近、１５．８付近、１６．３付近、１６．７付近、１７．２付近、１７．９付近、１８．５付近、及び１９．５付近にピークを示すことを特徴とする（３）に記載の化合物Ａの結晶。
（３−４）ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度が２５３℃付近であり、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝５．７付近、７．９付近、１１．５付近、１３．１付近、及び１７．９付近にピークを示すことを特徴とする（３）に記載の化合物Ａの結晶。
（３−５）ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度が２５３℃付近であり、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝５．７付近、７．９付近、８．３付近、８．９付近、９．２付近、１１．５付近、１２．５付近、１３．１付近、１５．８付近、１６．３付近、１６．７付近、１７．２付近、１７．９付近、１８．５付近、及び１９．５付近にピークを示すことを特徴とする（３）に記載の化合物Ａの結晶。
（４）  （１−２）に記載された化合物Ａのメタンスルホン酸塩の結晶。
（４−１）ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度が１９２℃付近である（４）に記載の化合物Ａのメタンスルホン酸塩の結晶。
（４−２）管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝４．７付近、９．５付近、１２．０付近、１３．２付近、１３．７付近、１５．３付近、１８．８付近、２０．３付近、２０．９付近、及び２２．８付近にピークを示すことを特徴とする（４）に記載の化合物Ａのメタンスルホン酸塩の結晶。
（４−３）ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度が１９２℃付近であり、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折において、２θ（°）＝４．７付近、９．５付近、１２．０付近、１３．２付近、１３．７付近、１５．３付近、１８．８付近、２０．３付近、２０．９付近、及び２２．８付近にピークを示すことを特徴とする（４）に記載の化合物Ａのメタンスルホン酸塩の結晶。
（５−１）（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
（５−２）（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
（５−３）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
（５−４）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
（６−１）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物の使用。
（６−２）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶の使用。
（７−１）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物。
（７−２）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶。
（８−１）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物の使用。
（８−２）慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶の使用。
（９−１）（１）〜（１−２）のいずれかに記載の化合物の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法。
（９−２）（２）〜（４−３）のいずれかに記載の結晶の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法。
【００１６】
さらに、本発明は、化合物Ａ又はその塩で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下でカルボキシル基に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Ｐｒｏｇ．  Ｍｅｄ．，  ５，  ２１５７−２１６１（１９８５）や、「医薬品の開発」（廣川書店、１９９０年）第７巻  分子設計１６３−１９８に記載の基が挙げられる。
【００１７】
本発明において、化合物Ａの塩とは、製薬学的に許容される塩であり、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明は、化合物Ａ又はその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物Ａ又はその塩も包含する。
【００１９】
本明細書中、粉末Ｘ線回折パターンにおける回折角（２θ（°））及びＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度（℃）の記載に含まれる「付近」は、当該データ測定法において通常許容される誤差範囲を含むことを意味し、おおよそその回折角及び吸熱ピークのオンセット値であることを意味する。粉末Ｘ線回折における回折角（２θ（°））の誤差範囲は、ある態様としては±０．２°であり、さらに別の態様としては、±０．１°である。ＤＳＣ分析における吸熱ピークのオンセット温度（℃）の誤差範囲は、ある態様としては±２℃であり、さらに別の態様としては、±１℃である。
なお、粉末Ｘ線回折パターンはデータの性質上、結晶の同一性認定においては、結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、回折角及び回折強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少変わりうるものである。
【００２０】
（製造法）
化合物Ａ又はその塩は、その基本構造あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ（Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ）及びグリーン（Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ）著、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第４版、２００６年）」に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
また、化合物Ａのプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で特定の基を導入、あるいは得られた化合物Ａを用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。
以下、化合物Ａの代表的な製造法を説明する。各製法は、当該説明に付した参考文献を参照して行うこともできる。なお、本発明の製造法は以下に示した例には限定されない。また、特に記載がない限り、当該製造法の構造式中に示される記号において、同一の記号は同一の意味を表す。
【００２１】
（第一製法）
【化１０】
2015147020.tif 000011
（式中、Ｒａは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキル、例えばメチル、エチル等である。）
【００２２】
式（Ｉ）で示される化合物Ａは、一般式（２）で表される化合物の加水分解により製造することができる。ここで、加水分解反応は、前記「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第４版、２００６年）」を参照して実施する事ができる。
【００２３】
（原料合成）
原料製法１
【化１１】
2015147020.tif 000012
【００２４】
原料化合物（５）は、化合物（３）と化合物（４）のアミド化反応により製造する事ができる。
反応は、化合物（３）と化合物（４）とを等量若しくは一方を過剰量用い、縮合剤の存在下、反応に不活性な溶媒中、冷却下から加熱下、好ましくは−２０℃〜６０℃において、通常０．１時間〜５日間撹拌することによって行われる。ここに、溶媒としては特に限定はされないが、例えば、ベンゼン、トルエン若しくはキシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）若しくはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、アセトニトリル又は水、あるいはこれらの混合物が挙げられる。縮合剤としては、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イウム−３−オキシド  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド  塩酸塩、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジフェニルリン酸アジド、オキシ塩化リン、または縮合剤を担持したポリスチレン樹脂、例えばＰＳ−カルボジイミド（ＰＳ−Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（アルゴノートテクノロジー（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）等を用いることが好ましい場合があるが、これらに限定されるものではない。また、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の添加剤を用いることが反応に好ましい場合があり、また、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）若しくはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）等の有機塩基、又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。さらに反応終了後の過剰なアミンを除去する目的でイソシアナートを担持したポリスチレン樹脂、例えばＰＳ−イソシアナート（ＰＳ−Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）（アルゴノートテクノロジー、米国）等を用いることができる。さらに反応終了後の過剰なカルボン酸及び前述の添加剤等を除去する目的で四級アンモニウム塩を担持したポリスチレン樹脂、例えばＭＰ−カルボナート（ＭＰ−Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（アルゴノートテクノロジー、米国）等を用いることができる。
また、化合物（３）を反応性誘導体へ導いた後に化合物（４）と反応させる方法も用いることができる。ここに化合物（３）の反応性誘導体としては、オキシ塩化リン、塩化チオニル等のハロゲン化剤と反応して得られる酸ハロゲン化物、クロロギ酸イソブチル等と反応して得られる混合酸無水物、ＨＯＢｔ等と縮合して得られる活性エステル等が挙げられる。これらの反応性誘導体と化合物（４）との反応は、前記ハロゲン化炭化水素類、芳香族炭化水素類、エーテル類等の反応に不活性な溶媒中、冷却下〜加熱下、好ましくは、−２０℃〜６０℃で行うことができる。
【００２５】
原料製法２
【化１２】
2015147020.tif 000013
（式中、Ｘは脱離基を示す。）
【００２６】
原料化合物（２）は、化合物（５）と化合物（６）のアルキル化反応により製造する事ができる。
Ｘで示される脱離基の具体例としては、ハロゲン、メタンスルホニルオキシ、ｐ−トルエンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基等が含まれる。
この反応では、化合物（５）と化合物（６）を等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、反応に不活性な溶媒中、又は無溶媒下、冷却下から加熱還流下、好ましくは０℃から８０℃において、通常０．１時間〜１０日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサン、ＤＭＥ等のエーテル類、ＤＣＭ、ＤＣＥ、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、１−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ若しくはＮＭＭ等の有機塩基、又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸セシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下で反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
【００２７】
化合物Ａは、遊離化合物、その塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。化合物Ａの塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
光学異性体は、ラセミ体の一般的な光学分割法（例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等）により得られ、また、適当な光学活性な原料化合物から製造することもできる。
【００２８】
化合物Ａの薬理活性は、以下の試験により確認した。
【００２９】
試験例１：ラットＥＰ４受容体親和性評価試験
ラットＥＰ４受容体発現ベクターの構築：
ラットＥＰ４受容体遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０３２０７６．１）を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。
ラットＥＰ４受容体の一過性発現：
ラットＥＰ４受容体の発現ベクターを、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後α−ＭＥＭ培地にて２０−２４時間培養した。
膜画分の調製： 
培地を吸引除去し、１５ ｃｍ ｄｉｓｈあたり１０ ｍＬの冷却リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））を加えてセルスクレーパー（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）を用いて細胞を掻きとった。細胞を回収し遠心（２５０ ｘ ｇ、４℃、５ ｍｉｎ）した後、ｄｉｓｈあたり６ ｍＬの冷却２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４；ナカライテスク、５ ｍｍｏｌ／Ｌ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、ナカライテスク）を含む）に懸濁し、ポリトロン（登録商標）を用いてホモジナイズし、そのホモジネートを遠心（６９，０００ ｘ ｇ、２０ ｍｉｎ、４℃）した。得られた沈殿を冷却２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁させ、再びホモジナイズし、そのホモジネートを遠心（６９，０００ ｘ ｇ、２０ ｍｉｎ、４℃）した。得られた沈殿をｄｉｓｈあたり１ ｍＬの５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ −ＮａＯＨ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ｐＨ７．５）に懸濁させたのちホモジナイズし、膜画分として−８０℃凍結保存した。この時、一部をタンパク濃度の測定に用いた。タンパク濃度の測定はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、添付の標準プロトコールに従ってデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ：
［3Ｈ］ＰＧＥ２、及び膜画分はアッセイバッファー（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５）にて、被験化合物、及びｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ）はＤＭＳＯ及びアッセイバッファーにて希釈した。反応液（２００ μＬ）の組成は、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、０．３ ｎｍｏｌ／Ｌ ［3Ｈ］ＰＧＥ２ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）５０ μＬ、ラットＥＰ４細胞膜画分（２００ μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）１００ μＬ及び試験化合物（最終濃度０．１，０．３，１，３，１０，３０および１００  ｎｍｏｌ／Ｌ）５０ μＬとした。非特異的結合の測定には最終濃度が１  μｍｏｌ／Ｌとなるようにｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ）を添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は１％とした。反応液を９６ ｗｅｌｌマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）で室温にて１時間インキュベートした。反応液はＦｉｌｔｅｒＭａｔｅハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて濾紙ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ ＧＦ／Ｂ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で濾過した。濾過後の濾紙は冷却アッセイバッファー３００ μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した後、乾燥機にて一晩乾燥させ、液体シンチレーターＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）５０ μＬ／ｗｅｌｌを加えた。放射活性はＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定はすべてデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で１回実施した。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を差し引いて求めた。Ｋｉ値は定法に従い算出した。
評価の結果、化合物ＡのラットＥＰ４受容体に対するＫｉ値は０．８７４ ｎｍｏｌ／Ｌであった。なお、特許文献１の実施例２０５の化合物のラットＥＰ４受容体に対するＫｉ値は１４０ ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００３０】
試験例２：ヒトＥＰ４受容体親和性評価試験
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ：
[3Ｈ]ＰＧＥ２、及びヒトＥＰ４細胞膜画分（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）はアッセイバッファー（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）、０．５％  ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）））にて、被験化合物、及びｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＰＧＥ２(Ｓｉｇｍａ)はＤＭＳＯ及びアッセイバッファーにて希釈した。反応液（２５０ μＬ）の組成は、［3Ｈ］ＰＧＥ２（最終濃度２．９ ｎｍｏｌ／Ｌ）を含むアッセイバッファー１７５ μＬ、膜画分（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、４０ μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）５０ μＬ、及び被験化合物（最終濃度０．１，１，１０，１００および１０００  ｎｍｏｌ／Ｌ）２５ μＬとした。非特異的結合の測定には最終濃度が１０  μｍｏｌ／Ｌとなるようにｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＰＧＥ２を添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は１％とした。反応液を２５℃で６０分間インキュベートした。その反応液をセルハーベスター（ブランデル）を用いて濾紙ＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した。濾過後の濾紙は５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡを含む溶液 １ ｍＬで３回洗浄した。濾紙ＧＦ／Ｃをアッセイバイアルに入れ、液体シンチレーターＡｔｏｍｌｉｇｈｔを５ ｍＬ加えた。放射活性は液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定はすべてデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で１回実施した。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を差し引いて求めた。Ｋｉ値は定法に従い算出した。
評価の結果、化合物ＡのヒトＥＰ４受容体に対するＫｉ値は１．４６ ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００３１】
試験例３：ヒトＪｕｒｋａｔ細胞におけるｃＡＭＰ量測定によるヒトＥＰ４受容体拮抗作用評価試験
細胞培養：
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔリンパ腫由来）を、１０％ ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））添加のＲＰＭＩ１６４０培地（品番１１８７９０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ2の条件下で培養した。コンフルエント（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）前まで増殖させた後、最終濃度５ μｍｏｌ／Ｌのインドメタシンを添加しさらに１８時間培養した。この細胞を１５ ｍＬスピッツ管に回収し、セルバンカー（三菱化学ヤトロン）にて１ｘ１０6 個／ｍＬに調製し、−８０℃にて保存した。
化合物処理：
被験化合物は０．５％ ＢＳＡを含むアッセイバッファー（１ｘＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、日水製薬）、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ナカライ）（ｐＨ ７．４）、０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＷＡＫＯ）、０．０２％ ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．５％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、２ μｍｏｌ／Ｌ インドメタシン（Ｓｉｇｍａ））にて最終濃度の３倍の濃度になるように希釈調整した。ＰＧＥ２は０．５％ ＢＳＡを含むアッセイバッファーにて３００ ｎｍｏｌ／Ｌに調整した。冷凍保存されたＪｕｒｋａｔ細胞は３７℃にて解凍し０．５％ ＢＳＡを含むアッセイバッファーを用い１ｘ１０6個／ｍＬに調製した。３８４ウェルＵ底型黒色マイクロプレート（コーニング）に試験化合物（最終濃度０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３および１０  ｎｍｏｌ／Ｌ）、細胞、ＰＧＥ２の順で各５ μＬずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌後、室温にて３０分インキュベートした。ＰＧＥ２非刺激状態のｃＡＭＰ量を求めるため、ＰＧＥ２非添加群を設けた。
ｃＡＭＰ量の測定および解析：
ｃＡＭＰ測定にはｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅキット（Ｃｉｓｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用した。インキュベート後、Ｌｙｓｉｓバッファー（５０ ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．８ ｍｏｌ／Ｌ ＫＦ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％ ＢＳＡ）にて０．６倍に希釈したキットのｄ２試薬を各ｗｅｌｌに５ μＬずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌した。続いてＬｙｓｉｓバッファーにて０．６倍に希釈したキットのユーロピウムクリプテート試薬を各ｗｅｌｌに５ μＬずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌後、遮光下室温にて６０分インキュベートした。インキュベート後、ＡＲＶＯ１４２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてクリプテートの蛍光強度を６２０ ｎｍ、ｄ２の蛍光強度を６６５ ｎｍにて測定した。標準曲線作成用に２８０、７０、１７．５、４．３８、１．０９、０．２７、０．０６８ ｎｍｏｌ／ＬのｃＡＭＰをそれぞれｗｅｌｌに入れ、上記と同様に蛍光強度を測定した。測定はすべてトリプリケイト（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）にて行った。ＰＧＥ２添加時のｃＡＭＰ量を１００％、ＰＧＥ２非添加時のｃＡＭＰ量を０％とし、化合物処理時のｃＡＭＰ量から、化合物によるＩＣ50値をＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰法により算出した。３回の実験結果から平均値を算出した。
評価の結果、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞において、化合物ＡのＰＧＥ２（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）によるｃＡＭＰ産生作用に対するＩＣ50値は０．１６ ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００３２】
試験例４：ｃＡＭＰ量測定によるラットＥＰ４受容体拮抗作用評価試験
ラットＥＰ４受容体発現ベクターの構築:
試験例１と同様に行った。
ラットＥＰ４受容体安定発現細胞の構築：
ラットＥＰ４受容体の発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）に導入した。導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後Ｇ４１８（ナカライテスク）含有α−ＭＥＭ培地（品番１２５７１０６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
細胞培養および化合物処理：
ラットＥＰ４を安定的に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を９６ ｗｅｌｌ プレートに０．５ｘ１０4 個／１００μＬで蒔き、終夜培養した。培地を２ μｍｏｌ／Ｌ インドメタシン／ ０．５％ ＢＳＡ／ α−ＭＥＭ培地に交換し、さらに６０分後、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸ／ ２ μｍｏｌ／Ｌ インドメタシン／ ０．５％ ＢＳＡ／ α−ＭＥＭ培地に交換した。１０分後、被験化合物（最終濃度０．１，０．３，１，３および１０  ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１０分後、最終濃度１００ ｎｍｏｌ／ＬになるようにＰＧＥ２を添加した（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％）。ＰＧＥ２添加によるｃＡＭＰ産生量を算出するため、ＰＧＥ２非添加群を設けた。細胞はＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ2）内にて培養、反応させた。３０分後に培地を除き、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−ＰＢＳ １００ μＬ／ｗｅｌｌを添加し細胞を溶解した。試験はデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にて２回実施した。
ｃＡＭＰ量の測定および解析：
細胞溶解液に含まれるｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅキットを用いて測定した。各ｗｅｌｌの細胞溶解液を３８４ｗｅｌｌ Ｕ底型黒色マイクロプレートに１０ μＬずつ分注し、ｄ２試薬、ユーロピウムクリプテート試薬の順に各５ μＬずつ添加後、遮光下室温にて６０分インキュベートした。インキュベート後、ＡＲＶＯ１４２０を用いてクリプテートの蛍光強度を６２０ ｎｍ、ｄ２の蛍光強度を６６５ ｎｍにて測定した。標準曲線作成用に２８０、７０、１７．５、４．３８、１．０９、０．２７及び０．０６８ ｎｍｏｌ／ＬのｃＡＭＰをそれぞれｗｅｌｌに入れ、上記と同様に蛍光強度を測定した。最終濃度１００ ｎｍｏｌ／ＬのＰＧＥ２添加時のｃＡＭＰ量を１００％、ＰＧＥ２非添加時のｃＡＭＰ量を０％とし、被験化合物処理時のｃＡＭＰ量から、被験化合物のＩＣ50値をＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰法により算出した。２回の実験結果から平均値を算出した。
評価の結果、ラットＥＰ４受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、化合物ＡのＰＧＥ２（１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）によるｃＡＭＰ産生作用に対するＩＣ50値は１．０４ ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００３３】
試験例５：ｉｎ  ｖｉｖｏラットＥＰ４受容体拮抗作用評価試験
非絶食下ＳＤラット（雄、６週齢）を試験に使用した。ＰＥＧ４００：２０％ Ｔｗｅｅｎ８０：１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ3水溶液＝１：４：５の混合液に溶解させた被験化合物を０．０３ ｍｇ／ｋｇで経口投与（ｐｏ）した（５ ｍＬ／ｋｇ）。１時間後、生理食塩水に溶解したＥＰ４アゴニストＯＮＯ−４８１９の活性代謝物（ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７（ＣＡＳ  Ｎｏ． ２５６３８２−２３−７））を０．０１ ｍｇ／ｋｇで背部に皮下投与（ｓｃ）した（５ ｍＬ／ｋｇ）。３０分後にＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、０．０１ ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内投与し（２ ｍＬ／ｋｇ）、その６０分後に麻酔下にてヘパリンを含むチューブに血液を約０．５ｍＬ採取した。遠心操作（１０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）により血液サンプルから血漿を分離した。ＥＬＩＳＡキット（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にて血漿中のラットＴＮＦ−α濃度を測定した。ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７非処置群（ｎ＝５）のＴＮＦ−αの濃度を阻害率１００％、ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７処置群（ｎ＝５）のそれを阻害率０％として、ＥＰ４アゴニストによるＴＮＦ−α産生阻害作用に対する被験化合物群（ｎ＝５）の抑制率を算出した。
評価の結果、化合物Ａ（０．０３ ｍｇ／ｋｇ，ｐｏ）はＥＰ４アゴニストＯＮＯ−ＡＥ１−４３７（０．０１ ｍｇ／ｋｇ，ｓｃ）のＴＮＦ−α産生阻害作用を３８％抑制した。
【００３４】
試験例６：ラット血漿中レニン活性に対する作用評価試験
非絶食下ＳＤラット（雄、７週齢）を試験に使用した。ＰＥＧ４００：２０％ Ｔｗｅｅｎ８０：１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ3水溶液＝１：４：５の混合液に溶解させた被験化合物を０．３ ｍｇ／ｋｇで経口投与した（５ ｍＬ／ｋｇ）。１時間後、生理食塩水に溶解したＥＰ４アゴニストＯＮＯ−４８１９ の活性代謝物（ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７）を０．０１ ｍｇ／ｋｇで背部に皮下投与した（５ ｍＬ／ｋｇ）。その１０分後に無麻酔下で断頭しＥＤＴＡ・２Ｎａ ３ ｍｇを含むチューブに血液を約２ ｍＬ採取した。遠心操作（１０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）により血液サンプルから血漿を分離した。血漿１００ μＬにアッセイバッファー（２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4 ２０．４ ｍＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4 ９．３ ｍＬ、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ １５ ｍＬ、ＣＨＡＰＳ ０．１ｇを混合し蒸留水で合わせて５０ ｍＬに希釈、ｐＨ５．５５）１０ μＬおよび１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩 １ μＬを添加した。半量を分取し３７℃にて９０分間インキュベートした。残りの半量は４℃に保存しブランク反応用とした。両サンプル中のＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定し、３７℃インキュベーションサンプルの値からブランク反応の値を減算した濃度を血漿中レニン活性（ｐｌａｓｍａ ｒｅｎｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＰＲＡ））とした。ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７非処置群（ｎ＝５）のＰＲＡを阻害率１００％、ＯＮＯ−ＡＥ１−４３７処置群（ｎ＝４）のそれを阻害率０％として、被験化合物群（ｎ＝５）の阻害率を算出した。
評価の結果、化合物Ａ（０．３ ｍｇ／ｋｇ，ｐｏ）はＥＰ４アゴニストＯＮＯ−ＡＥ１−４３７（０．０１ ｍｇ／ｋｇ，ｓｃ）によるＰＲＡ上昇を１０２％抑制した。
【００３５】
試験例７：２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの尿中アルブミンに対する効果検討試験
２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（雄、８週齢）を試験に使用した。２４時間採尿により得られた尿サンプルのアルブミン濃度を抗マウスアルブミン抗体（ＲＡＭ／Ａｌｂ／７Ｓ、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を用いたＥＬＩＳＡ法にて、尿中クレアチニン濃度をＣＲＥ−ＥＮカイノス（カイノス）を用いて測定した。尿中アルブミン−クレアチニン比（ＡＣＲ）を算出し、ＡＣＲに偏りのないよう被験化合物非処置群（ｎ＝１２）と被験化合物処置群（ｎ＝１２）に群分けを行った。被験化合物処置群には０．５％メチルセルロース（ＭＣ）溶液に懸濁した被験化合物を０．３ ｍｇ／ｋｇで１日１回1週間経口投与した（１０ ｍＬ／ｋｇ）。被験化合物非処置群には０．５％ＭＣ溶液を１０ ｍＬ／ｋｇの投与容量で１日１回１週間経口投与した。最終投与終了後より２４時間採尿を実施し、算出したＡＣＲを指標にして２型糖尿病マウスの早期腎症に対する被験化合物の改善効果を検討した。被験化合物非処置群のＡＣＲ値を１００％としたときの被験化合物処置群のＡＣＲの抑制率を求めた。
評価の結果、化合物Ａ（０．３ ｍｇ／ｋｇ，ｐｏ）は１週間の経口投与により２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスのＡＣＲを４４％抑制した。
【００３６】
試験例８：５／６腎臓摘出（５／６Ｎｘ）慢性腎不全ラットの腎機能に対する効果検討試験
Ｗｉｓｔａｒラット（雄、８週齢）を試験に使用した。ペントバルビタール麻酔下で左腎の３分の２を切除し、その１週間後に右腎を全摘出した（５／６Ｎｘ）。５／６Ｎｘの２週間後に、２４時間採尿により得られた尿サンプルの尿タンパク濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて、尿中クレアチニン濃度をデタミナーＬ ＣＲＥ（協和メデックス）を用いて測定した。尿中タンパク−クレアチニン比（ＵＰＣＲ）を算出し、ＵＰＣＲに偏りがないように被験化合物非処置群（ｎ＝１２）と被験化合物処置群（ｎ＝１２）に群分けを行った。その後、被験化合物処置群には０．５％ＭＣ溶液に懸濁した被験化合物を０．２ ｍｇ／ｋｇで１日１回６週間経口投与した（５ ｍＬ／ｋｇ）。被験化合物非処置群には０．５％ ＭＣ溶液を５ ｍＬ／ｋｇの投与容量で１日１回６週間経口投与した。最終投与終了後より２４時間採尿を実施し、算出したＵＰＣＲを指標にして慢性腎不全ラットの腎機能に対する被験化合物の改善効果を検討した。被験化合物非処置群のＵＰＣＲを１００％としたときの被験化合物処置群のＵＰＣＲの抑制率を求めた。
評価の結果、化合物Ａ（０．２ ｍｇ／ｋｇ，ｐｏ）は、６週間の経口投与により５／６腎臓摘出慢性腎不全ラットのＵＰＣＲを４７％抑制した。
【００３７】
試験例９：ラットＥＰ１／ＥＰ２／ＥＰ３受容体に対する受容体拮抗作用評価試験（選択性試験）
化合物Ａのラット由来ＰＧＥ２受容体の他のサブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３）に対する拮抗作用を評価した。ＥＰ１およびＥＰ３については細胞内Ｃａ2+量、ＥＰ２については細胞内ｃＡＭＰ量を指標に、被験化合物の作用を検討した。
ラットＥＰ１、ＥＰ２またはＥＰ３受容体発現ベクターの構築：
ラットＥＰ１受容体遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｄ８８７５１.１）、ラットＥＰ２受容体遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０３１０８８.１）、またはラットＥＰ３受容体遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１２７０４.１）を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれ導入した。
ラットＥＰ１、ＥＰ２またはＥＰ３受容体安定発現細胞の構築：
ラットＥＰ１、ＥＰ２またはＥＰ３受容体の発現ベクターを、ＨＥＫ−２９３細胞（ラットＥＰ１またはＥＰ３受容体安定発現用、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）またはＣＨＯ−Ｋ１細胞（ラットＥＰ２受容体安定発現用、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）に導入した。導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後Ｇ４１８（ナカライテスク）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（ラットＥＰ１またはＥＰ３受容体安定発現用）（品番１１８８５０８４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＧ４１８含有α−ＭＥＭ培地（ラットＥＰ２受容体安定発現用）にて細胞を培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
ＥＰ２受容体安定発現細胞の培養および化合物処理：
ラットＥＰ２を安定的に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を９６ ｗｅｌｌ プレートに１ｘ１０4 個／１００ μＬで蒔き、１０％ ＦＢＳ添加のα−ＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ2の条件下で終夜培養した。培地を２ μｍｏｌ／Ｌ インドメタシン／０．１％ ＢＳＡ／α−ＭＥＭ培地に交換し、さらに６０分後、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸ／ ２ μｍｏｌ／Ｌ インドメタシン／０．１％ ＢＳＡ／α−ＭＥＭ培地（品番１２５７１０６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。１０分後、被験化合物（最終濃度０．０１，０．１，１および１０  μｍｏｌ/ Ｌ ）を添加し、さらに１０分後、最終濃度１００  ｎｍｏｌ／ＬになるようにＰＧＥ２を添加した（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％）。ＰＧＥ２添加によるｃＡＭＰ産生量を算出するため、ＰＧＥ２非添加群を設けた。細胞はＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ2）内にて培養、反応させた。３０分後に培地を除き、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−ＰＢＳ １００ μＬ／ｗｅｌｌを添加し細胞を溶解した。試験はデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にて１回実施した。
ＥＰ２受容体安定発現細胞内のｃＡＭＰ量の測定および解析：
細胞溶解液に含まれるｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅキットにて試験例４と同様に測定した。最終濃度１００ ｎｍｏｌ／ＬのＰＧＥ２添加時のｃＡＭＰ量を１００％、ＰＧＥ２非添加時のｃＡＭＰ量を０％とし、被験化合物処理時のｃＡＭＰ量の割合を算出した。
評価の結果、化合物ＡはラットのＥＰ２受容体を介したＰＧＥ２による細胞内ｃＡＭＰ量の増加に対して１０，０００ ｎｍｏｌ／Ｌまで５０％以上の阻害作用を示さなかった。
ＥＰ１およびＥＰ３受容体安定発現細胞の培養および化合物処理：
ラットＥＰ１またはラットＥＰ３を安定的に発現させたＨＥＫ−２９３細胞を９６ ｗｅｌｌ プレートに１ｘ１０4 個／１００ μＬで蒔き、１０％ ＦＢＳ添加のＤ−ＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ2の条件下で終夜培養した。アッセイバッファー（１ｘＨＢＳＳ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、０．６ ｍｇ／ｍＬ ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％ ＢＳＡ）にＣａ３アッセイキット（モレキュラーデバイス）の蛍光試薬Ｄｙｅを７０：１の割合で加えた。培地をこの希釈したＤｙｅ溶液に交換し、３時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよび上記アッセイバッファーに溶解した化合物（最終濃度１および１０  μｍｏｌ／Ｌ）をそこに加えた。５分後に最終濃度１００ ｎｍｏｌ／ＬになるようにＰＧＥ２を添加した（最終ＤＭＳＯ濃度１％）。ラットＥＰ１またはラットＥＰ３受容体安定発現細胞を用いた試験は、それぞれデュプリケイト（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にて１回実施した。
ＥＰ１またはＥＰ３受容体安定発現細胞内Ｃａ2+濃度の測定および解析：
細胞内Ｃａ2+濃度はＤｙｅの蛍光強度を指標としてＦＬＩＰＲ ｔｅｔｒａ（モレキュラーデバイス）を用いて測定した。ＰＧＥ２添加による細胞内Ｃａ2+濃度を測定するため、ＰＧＥ２非添加群を設けた。最終濃度１００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＰＧＥ２添加時のＣａ2+濃度を１００％、ＰＧＥ２非添加時のＣａ2+濃度を０％とし、化合物処理時のＣａ2+濃度の割合を算出した。
評価の結果、化合物ＡはラットのＥＰ１またはＥＰ３受容体を介したＰＧＥ２による細胞内Ｃａ2+濃度の上昇に対して１０，０００ ｎｍｏｌ／Ｌまで５０％以上の阻害作用を示さなかった。
【００３８】
試験例１０：ラット消化管障害に対する評価
ＳＤラット（雄、７週齢）を使用した。ＰＥＧ４００：２０％ Ｔｗｅｅｎ８０：１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ3水溶液＝１：４：５の混合液に溶解した被験化合物を３ ｍｇ／ｋｇで７日間経口投与した（ｎ＝５，５ ｍＬ／ｋｇ）。被験薬非処置群（ｎ＝５）には上述の混合液を５ ｍＬ／ｋｇの投与容量で７日間経口投与した。最終投与の翌日に終夜絶食下で血液学・血液化学的検査用に採血した。採血後に、放血により安楽死させた動物を直ちに剖検し、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肝臓を摘出した。摘出臓器は１０％中性緩衝ホルマリン液に固定し、病理組織評価に使用した。
評価の結果、化合物Ａは異常を示す所見は認められなかった。
【００３９】
上記試験の結果、化合物Ａは、ＥＰ４受容体親和性を有し、優れたＥＰ４受容体拮抗作用を示すこと（試験例１〜５）が確認された。化合物Ａは、ＥＰ４アゴニスト誘発のＰＲＡ上昇を抑制すること（試験例６）が確認された。化合物Ａは、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの尿中アルブミンに対する効果検討試験、及び５／６腎臓摘出（５／６Ｎｘ）慢性腎不全ラットの腎機能に対する効果検討試験において改善効果を有すること（試験例７、８）が確認された。
したがって、化合物Ａ又はその塩は、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防若しくは治療等に使用できる。
【００４０】
上記試験例１の結果から、化合物Ａは特許文献１の実施例２０５と比較して、ＥＰ４受容体親和性が優れていることが示された。更に上記試験例１０の結果から、化合物Ａは、消化管障害の惹起の懸念が小さい化合物である事が示された。
【００４１】
上記試験の結果、化合物Ａ又はその塩はＥＰ４受容体拮抗作用を有することが確認され、ＥＰ４が関与する種々の疾患の予防又は治療用医薬組成物等の有効成分として使用できる。ＥＰ４が関与する種々の疾患としては、例えば、腎臓病（例えば腎硬化症、痛風腎、多発性嚢胞腎、ネフローゼ症候群、急性腎炎、再発性血尿、持続性血尿、慢性腎炎、急速進行性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、糖尿病性腎症、バーター症候群等）、炎症性皮膚疾患（例えば日焼け、火傷、湿疹、皮膚炎等）、動脈硬化症に起因する虚血性心疾患（例えば心筋梗塞、狭心症等）、動脈硬化症に起因する脳血管障害（例えば脳卒中、ラクナ梗塞も含む脳卒中、脳血栓、脳出血、くも膜下出血、脳梗塞等）、消化性潰瘍（例えば胃潰瘍、十二指腸潰瘍等）、悪性腫瘍及びその転移（例えば結腸癌、乳癌等）、疼痛（例えば術後急性痛、外傷性疼痛、抜糸後疼痛、頸肩腕疼痛、肩関節周囲炎、変形性関節症（ＯＡ）、手根管症候群、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、術後慢性痛、間質性膀胱炎、膀胱痛症候群、非細菌性慢性前立腺炎（ＣＰ／ＣＰＰＳ）、脊髄損傷後疼痛、脳梗塞後疼痛、多発性硬化症（疼痛）、パーキンソン病の疼痛、糖尿病性神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、ＨＩＶ神経因性疼痛、三叉神経痛、線維筋痛症、腰痛症（侵害受容性、神経因性を含む腰痛全般）、腰部脊柱管狭窄症、脊椎障害の疼痛（腰部脊柱管狭窄症、脊髄損傷を除く）、視床痛、偏頭痛、頭痛、下肢静止不能（むずむず足）症候群、癌性疼痛、過敏性腸症候群）等、特に慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症等の腎臓病を挙げることができる。
また、化合物Ａ又はその塩は、種々の浮腫（例えば、心臓性浮腫、脳浮腫等）、悪性高血圧症などのような高血圧症、月経前緊張症、尿路結石、急性又は慢性疾患によって引き起こされるような尿乏症、高リン血症等の治療及び／又は予防する薬剤として使用できる。
さらに、化合物Ａ又はその塩は、種々の多尿症（例えば、中枢性尿崩症、腎性尿崩症、心因性尿崩症、糖尿病、塩化ナトリウム吸収障害、多飲症等）の治療及び／又は予防する薬剤として使用できる。
【００４２】
化合物Ａまたはその塩を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００４３】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、有効成分を、少なくとも１種の不活性な賦形剤と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えば滑沢剤や崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００４４】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばエタノールのようなアルコール類がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
【００４５】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。
【００４６】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、ｐＨ調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００４７】
通常経口投与の場合、１日の投与量は、体重当たり約０．００１〜１００  ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜３０  ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは０．１〜１０  ｍｇ／ｋｇが適当であり、これを１回であるいは２回〜４回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、１日の投与量は、体重当たり約０．０００１〜１０  ｍｇ／ｋｇが適当で、１日１回〜複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約０．００１〜１００  ｍｇ／ｋｇを１日１回〜複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【００４８】
投与経路、剤形、投与部位、賦形剤や添加剤の種類によって異なるが、本発明の医薬組成物は０．０１〜１００重量％、ある態様としては０．０１〜５０重量％の有効成分である１種またはそれ以上の化合物Ａを含有する。
【００４９】
化合物Ａは、化合物Ａが有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例に基づき、式（Ｉ）で示される化合物Ａ又はその塩の製造法をさらに詳細に説明する。化合物Ａ又はその塩の製造法は、以下に示される具体的実施例の製造法（工程）のみに限定されるものではなく、当業者に自明である方法によっても製造されうる。
なお、ＤＳＣ分析及び粉末Ｘ線回折は以下の方法により行った。【００５１】
（１）ＤＳＣ分析  
ＤＳＣ分析は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製  Ｑ１０００およびＱ２０００を用いて行った。試料およそ２ｍｇを専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、サンプルパンに蓋をしない状態で、窒素雰囲気下（５０ｍＬ／分）において、測定範囲を室温〜３００℃とし、昇温速度１０℃／分で試料とリファレンス（空のアルミニウム製サンプルパン）との間に発生する熱量変化を連続的に測定し記録した。なお、データ処理を含む装置の取り扱いは、各装置で指示された方法及び手順に従った。
（２）粉末X線回折
粉末Ｘ線回折の測定は、ＲＩＮＴ−ＴＴＲＩＩを用い、管球：Ｃｕ、管電流：３００  ｍＡ、管電圧：５０  ｋＶ、サンプリング幅：０．０２０°、走査速度：４°／ｍｉｎ、波長：１．５４０５６Å、測定回折角範囲（２θ）：２．５〜４０°の条件で測定した。なお、データ処理を含む装置の取り扱いは、各装置で指示された方法及び手順に従った。【００５２】
また、実施例中、以下の略語を用いる。ＥＳＩ＋：ＥＳＩ−ＭＡＳＳにおけるｍ／ｚの値、ＮＭＲ−ＤＭＳＯ−ｄ6：ＤＭＳＯ−ｄ6中の  1ＨＮＭＲにおけるピークδ（ppm）。
なお便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。【００５３】
実施例１
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸  （Ｉ）の合成
【００５４】
工程１．  
４−［（１Ｓ）−１−｛［（４−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）カルボニル］アミノ｝エチル］安息香酸メチル  （５ａ）の合成
【化１３】
2015147020.tif 000014
４−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸（３）  （１．００ ｇ）、ＤＭＦ  （２０ ｍＬ）、４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］安息香酸メチル  塩酸塩  （１．２６ ｇ）、ＨＯＢｔ  （０．９９ ｇ）の混合物に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド  （１．２ ｍＬ）を加え、室温下終夜撹拌した。混合物に酢酸エチルを加え、氷冷下撹拌した。混合物に１０％クエン酸水溶液を加え、有機層及び水層に分離し、水層を酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、４−［（１Ｓ）−１−｛［（４−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）カルボニル］アミノ｝エチル］安息香酸メチル（５ａ）  （１．７５ ｇ）を得た。 
ＥＳＩ＋：  ３６６，  ３６８【００５５】
工程２．
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メチル  （２ａ）の合成
【化１４】
2015147020.tif 000015
４−［（１Ｓ）−１−｛［（４−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）カルボニル］アミノ｝エチル］安息香酸メチル（５ａ）  （１．７２ ｇ）、ＤＭＦ  （２０．０ ｍＬ）の混合物を氷冷下撹拌した。混合物にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド  （５８０ ｍｇ）を加え、０．５時間撹拌した。混合物に３−（ブロモメチル）イソキノリン  （１．１０ ｇ）とＤＭＦ  （１４ ｍＬ）の混合物を加え、室温に昇温して１０日間撹拌した。得られた混合物を氷冷下撹拌し、酢酸エチル、１０％クエン酸水溶液を加え、しばらく撹拌し、酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー  （ノルマルヘキサン：酢酸エチル＝６：４）にて精製し、４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メチル  （２ａ）  （５１８  ｍｇ）を得た。  
ＮＭＲ−ＤＭＳＯ−ｄ6：  ９．２８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ），  ９．２３  （１Ｈ，  ｓ），  ８．１３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ），  ７．８９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ），  ７．８１−７．７６  （１Ｈ，  ｍ），  ７．７２−７．６４  （３Ｈ，  ｍ），  ７．５０  （１Ｈ，  ｓ），  ７．３８  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ），  ５．６５−５．５４  （２Ｈ，  ｍ），  ５．１２−５．０４  （１Ｈ，  ｍ），  ３．８３  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１７  （３Ｈ，  ｓ），  １．３７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ）【００５６】
工程３．
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸  （Ｉ）の合成
【化１５】
2015147020.tif 000016
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メチル（２ａ）  （４８６ ｍｇ）、ＴＨＦ  （１０．０ ｍＬ）、メタノール  （１０．０ ｍＬ）の混合物に、氷冷下２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液  （５．０ ｍＬ）を加え、室温下１７時間攪拌した。混合物に氷冷下１Ｍ塩酸  （１０．０ ｍＬ）を加え、室温に昇温し、２時間攪拌した。析出した固体を濾取し、水で洗浄して４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸（Ｉ）  （４１１ ｍｇ）を結晶として得た。 
ＥＳＩ＋： ４９３，  ４９５
ＮＭＲ−ＤＭＳＯ−ｄ6：  １２．９−１２．７  （１Ｈ，  ｍ），  ９．３０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ），  ９．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ８．１３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ），  ７．９１  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ），  ７．８１−７．７６  （１Ｈ，  ｍ），  ７．７４−７．６６  （３Ｈ，  ｍ），  ７．５３  （１Ｈ，  ｓ），  ７．４０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ），  ５．６０  （２Ｈ，  ｓ），  ５．１４−５．０３  （１Ｈ，  ｍ），  ２．１６  （３Ｈ，  ｓ），  １．３７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ）
元素分析：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２４Ｈ２１ＢｒＮ４Ｏ３  ：Ｃ，５８．４３；  Ｈ，４．２９；  Ｎ，１１．３６；  Ｂｒ，１６．２０．
Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５８．３３；  Ｈ，４．３８；  Ｎ，１１．２４；  Ｂｒ，１６．０７．【００５７】
実施例１の工程３で得られた結晶の、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折測定を行った結果、２θ（°）＝５．７、７．９、８．３、８．９、９．２、１１．５、１２．５、１３．１、１５．８、１６．３、１６．７、１７．２、１７．９、１８．５、及び１９．５のピークを含むチャートが得られた。
実施例１の工程３で得られた結晶のＤＳＣ分析の結果、吸熱ピークのオンセット温度は２５３℃であった。【００５８】
実施例２
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メタンスルホン酸塩  （Ｉa）の合成
【化１６】
2015147020.tif 000017
４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸（Ｉ）  （１０００．０  ｍｇ）、ジオキサン  （３０  ｍＬ）の混合物に、氷冷下メタンスルホン酸  （１４０  μＬ）を加えた。得られた混合物を９０℃に昇温し、１時間撹拌した。室温まで放冷後、析出した固体を濾取し、４−［（１Ｓ）−１−（｛［４−ブロモ−１−（イソキノリン−３−イルメチル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸メタンスルホン酸塩  （Ia）を結晶  （１０３０  ｍｇ）として得た。
ＥＳＩ＋：  ４９３、  ４９５
ＮＭＲ−ＤＭＳＯ−ｄ6：  ９．３２  （１Ｈ，  ｓ），  ９．２７  （１Ｈ，  ｄ，Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ），  ８．１７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ），  ７．９５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ），  ７．９０−７．７９  （１Ｈ，  ｍ），  ７．７７−７．６６  （３Ｈ，  ｍ），  ７．５９  （１Ｈ，  ｓ），  ７．４０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ），  ５．７１−５．５４  （２Ｈ，  ｍ），  ５．１６−５．００  （１Ｈ，  ｍ），  ２．３３  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１７  （３Ｈ，  ｓ），  １．３７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ）
元素分析：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２４Ｈ２１ＢｒＮ４Ｏ３．ＣＨ４Ｏ３Ｓ  ：Ｃ，５０．９４；  Ｈ，４．２７；  Ｎ，９．５０；  Ｓ，５．４４；  Ｂｒ，１３．５６．
Ｆｏｕｎｄ  ：Ｃ，５０．６５；  Ｈ，４．２５；  Ｎ，９．３６；  Ｓ，５．４１；  Ｂｒ，１３．４２．【００５９】
実施例２で得られた結晶の、管球としてＣｕを用いた粉末Ｘ線回折測定を行った結果、２θ（°）＝４．７、９．５、１２．０、１３．２、１３．７、１５．３、１８．８、２０．３、２０．９、及び２２．８のピークを含むチャートが得られた。
実施例２で得られた結晶のＤＳＣ分析の結果、吸熱ピークのオンセット温度は１９２℃であった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
化合物Ａ又はその塩は、ＥＰ４受容体拮抗作用を有し、慢性腎不全及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として使用できる。
【国際調査報告】
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