(57)【要約】  プラントアクチベーター処理により発現が誘導されるプロモーターの下流に配した花芽形成誘導遺伝子Hd3a遺伝子をイネ科植物に導入することにより、プラントアクチベーター処理の時期に応じて、当該イネ科植物の開花期を制御することが可能であることを見出した。花芽形成抑制に機能するGhd7遺伝子を当該植物にさらに導入することにより、内因性のHd3a遺伝子の発現を抑制し、開花期の制御の効率を高めることが可能であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物が導入され、プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体。
【請求項２】
プラントアクチベーターがプロべナゾールまたはイソチアニルである、請求項１に記載のイネ科植物体。
【請求項３】
プロモーターが下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAである、請求項２に記載のイネ科植物体。
（ａ）配列番号：1、133または137に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：1、133または137に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNA
（ｃ）配列番号：1、133または137に記載の塩基配列と70％以上の相同性を有する塩基配列からなり、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNA
【請求項４】
内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子の発現構築物がさらに導入されている、請求項１から３のいずれかに記載のイネ科植物体。
【請求項５】
内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質が、Ghd7タンパク質である、請求項４に記載のイネ科植物体。
【請求項６】
内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子が、恒常的発現プロモーターの下流に連結されている、請求項４または５に記載のイネ科植物体。
【請求項７】
恒常的発現プロモーターが、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターである、請求項６に記載のイネ科植物体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のイネ科植物体の子孫またはクローンである、イネ科植物体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のイネ科植物体の繁殖材料。
【請求項１０】
プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体の生産方法であって、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物をイネ科植物の細胞に導入し、植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１１】
イネ科植物体の開花を誘導する方法であって、請求項１から８のいずれかに記載のイネ科植物体をプラントアクチベーターで処理する工程を含む方法。
【請求項１２】
プラントアクチベーターを有効成分として含む、請求項１から８のいずれかに記載のイネ科植物体の開花を誘導するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体に関し、より詳しくは、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流に配した花芽形成誘導遺伝子Hd3a遺伝子が導入されたイネ科植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
開花は、植物において繁殖に関わる極めて重要な現象である。農業生産においては、作物の開花期は、収量性を規定する主要形質の一つであり、それぞれの品種が有する遺伝背景に基づいて固有の環境応答特性を示すため、その品種の栽培に適した地域、作期の制限要因でもあった。逆の見方をすると、栽培する品種と作付け時期を決めるとその地域における開花期や収穫期が自動的に決定され、同時におおよその収量性も規定されていた。こうしたことから、作物の開花期形質は盛んに研究がされており、品種改良における重要な育種目標となっている。【０００３】
従来、植物の開花期の改変には、交雑により得られる雑種後代における早生・遅生系統の選抜、変異誘発剤や放射線を使用した人為的突然変異の誘発により得られる変異体系統からの選抜などによって行われてきた。しかしながら、これらの手法は、多大な時間と労力を要し、また変異の方向性や程度を予測できないなどの問題を抱えていた。また最近では、開花を制御する遺伝子（開花制御遺伝子）が多数単離され、これらの遺伝子が開花期の調節に利用できると報告されている。イネでは、開花の促進遺伝子としてフロリゲン（花成ホルモン）をコードするHd3a遺伝子やRFT1遺伝子などが、開花の抑制遺伝子としてGhd7遺伝子（Lhd4遺伝子）などが単離されており、これらの開花制御遺伝子の導入や内在の開花制御遺伝子の機能阻害による開花期の改変法が提示されている（特許文献1、特許文献2、特許文献3、非特許文献1、非特許文献2）。例えば、恒常的発現プロモーターであるCaMV35Sプロモーターの下流にGhd7遺伝子を配したDNAカセットを組み込んだ形質転換イネが100日を越えても咲かないことが知られている（特許文献3）。また、CaMV35Sプロモーターの下流にHd3a遺伝子を配したDNAカセットを通常のイネに形質転換すると親系統よりも早咲きになった植物体を得ることができることも知られている（非特許文献1）。こうした手法は、比較的短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる利点がある。しかしながら、上記の手法は全て、親系統よりも早咲き又は遅咲きに開花期が移動した植物体を得ることができるものの、いずれにおいても、作出された系統では開花期が、導入遺伝子の性質（環境応答性等ではなく、過剰発現性・異所発現性等）に規定され自由に変更できない。また、イネにおいて必要以上のフロリゲンの存在は、極小な花序を作ることが報告されており（非特許文献3）、遺伝子の恒常的な高発現をもたらすCaMV35Sプロモーター等の下流にHd3a遺伝子を配したDNAカセットを植物に形質転換した場合には、Hd3a遺伝子の恒常的かつ過剰な発現の結果、正常な開花期と比較して異常に早期に開花が開始され極小な花序しかできない可能性が高い。【０００４】
一方、Hd3a遺伝子を誘導型プロモーターであるHSPプロモーターの下流に配して熱ショック刺激によりHd3a遺伝子を発現誘導することの試みもなされている（非特許文献4）。しかしながら、該実験においては非誘導条件下においても出穂が認められており、これは非誘導条件下における低レベルのHd3a遺伝子発現によるものと考えられる。【０００５】
また、植物の病害に対する抵抗力を高める薬剤であるプラントアクチベーターについて、抵抗性関連遺伝子の遺伝子発現の誘導や、その作用により活性化される抵抗性関連遺伝子のプロモーターについて種々の報告がある（特許文献4、非特許文献5、非特許文献6）。しかしながら、プラントアクチベーター感受性プロモーターが、植物の開花期の制御に用いられた例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2002-153283号公報
【特許文献２】特開2004-89036号公報
【特許文献３】特開2004-290190号公報
【特許文献４】特開平9-270号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kojima  et  al.  Plant  Cell  Physiol.  2002;  43(10):1096-105
【非特許文献２】Xue  et  al.,  Nat  Genet.  2008;  40(6):761-7
【非特許文献３】Izawa  et  al.,  Genes  Dev.  2002;  16(15):2006-20
【非特許文献４】Endo-Higashi  and  Izawa  2011;  Plant  Cell  Physiol.  2011  52(6):1083-94
【非特許文献５】Shimono  et  al.,  Plant  Cell  2007;  19:2064-2076
【非特許文献６】Umemura  et  al.,  Plant  J.  2009;  57:463-472
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、任意の時期に人為的な花芽誘導を行い、それにより、開花期を制御することが可能なイネ科植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流に配した花芽形成誘導遺伝子Hd3a遺伝子をイネ科植物に導入することにより、プラントアクチベーター処理の時期に応じて、当該イネ科植物の開花期を制御することが可能であることを見出した。ここで本発明者は、圃場でプラントアクチベーター処理を施したイネのトランスクリプトーム解析から、イネ科植物の開花期の制御に適した遺伝子発現を保証するプロモーターを新たに単離することにも成功した。【００１０】
また、本発明者は、花芽形成抑制に機能するGhd7遺伝子を当該イネ科植物にさらに導入することにより、内因性のHd3a遺伝子の発現を抑制し、開花期の制御の効率を高めることが可能であることを見出した。Ghd7タンパク質は、内因性のHd3a遺伝子の発現を抑制することは知られているが、上記結果は、Ghd7タンパク質がHd3aタンパク質の活性を抑制しないことを意味する。このように、本発明により、イネ科植物の開花期の制御において、Ghd7タンパク質を、人為的に発現させたHd3aタンパク質との組み合わせで利用できることも明らかとなった。【００１１】
本発明は、上記知見に基づくものであり、より詳しくは、以下の発明に関するものである。【００１２】
（１）プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物が導入され、プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体。【００１３】
（２）プラントアクチベーターがプロべナゾールまたはイソチアニルである、（１）に記載のイネ科植物体。【００１４】
（３）プロモーターが下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAである、（２）に記載のイネ科植物体。
（ａ）配列番号：１、133または137に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：１、133または137に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNA
（ｃ）配列番号：１、133または137に記載の塩基配列と70％以上の相同性を有する塩基配列からなり、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNA【００１５】
（４）内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子の発現構築物がさらに導入されている、（１）から（３）のいずれかに記載のイネ科植物体。【００１６】
（５）内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質が、Ghd7タンパク質である、（４）に記載のイネ科植物体。【００１７】
（６）内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子が、恒常的発現プロモーターの下流に連結されている、（４）または（５）に記載のイネ科植物体。【００１８】
（７）恒常的発現プロモーターが、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターである、（６）に記載のイネ科植物体。【００１９】
（８）（１）から（７）のいずれかに記載のイネ科植物体の子孫またはクローンである、イネ科植物体。【００２０】
（９）（１）から（８）のいずれかに記載のイネ科植物体の繁殖材料。【００２１】
（１０）プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体の生産方法であって、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物をイネ科植物の細胞に導入し、植物体を再生させる工程を含む方法。【００２２】
（１１）イネ科植物体の開花を誘導する方法であって、（１）から（８）のいずれかに記載のイネ科植物体をプラントアクチベーターで処理する工程を含む方法。【００２３】
（１２）プラントアクチベーターを有効成分として含む、（１）から（８）のいずれかに記載のイネ科植物体の開花を誘導するための薬剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により作製された植物体においては、従来技術では不可能であった開花期の柔軟な制御が可能である。従って、栽培環境（栽培地域、作期）、遺伝背景、利用目的などに応じて、最適な時期に植物の花芽形成を誘導して収穫することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ghd7遺伝子恒常発現系統（Ghd7ox）の開花（出穂）期に関する図である。(A)Ghd7oxのT0世代をガラス温室で生育した場合の開花期を示す棒グラフである。図下部の数字は独立なT0個体を示し、「Cont.」はベクターのみを形質転換した対照系統を示す。(B)Ghd7oxにおけるGhd7タンパク質蓄積量を示す写真である。(C)BのGhd7タンパク質検出後のメンブレンをポンソーSで染色した写真である。
【図２】開花期制御プラスミドを示す図である。(A)pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3aの構成を示す。(B)pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3aの構成を示す。HPT：ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ghd7：Ghd7  cDNA、Hd3a：カサラス型Hd3a  cDNA、P35S：カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター、PUbi：トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、Tg7：g7ターミネーター、Tnos：nosターミネーター、ADH5’UTR：OsADH2  5’UTR、RBとLB：T-DNAの左右ボーダー配列。
【図３】Ghd7遺伝子が恒常発現した背景で、異なるプロモーターを用いて外来導入のHd3aを発現させた場合のイネ形質転換体の出穂期を示す図である。棒グラフは、T0世代の形質転換系統をガラス温室に移植し、出穂期を調査した結果である。棒グラフ下部の数字は独立なT0個体を示す。下段の表は、各系統における導入遺伝子の有無を示し、外来導入のGhd7  cDNA又はHd3a  cDNAの有無を+/-で示す。
【図４】圃場での二種類のプラントアクチベーター（オリザメート・ルーチン）散布処理により発現変化がみられた遺伝子の数を示すグラフである。(A)薬剤散布により2倍以上（白色）あるいは1/2以下（黒色）に発現レベルが増減した遺伝子の数を示す。(B)薬剤散布により10倍以上（白色）あるいは1/10以下（黒色）に発現レベルが増減した遺伝子の数を示す。
【図５】プラントアクチベーター誘導性遺伝子あるいはSAR関連遺伝子のマイクロアレイ解析による発現データを示すグラフである。
【図６】開花期制御関連遺伝子のマイクロアレイ解析による発現データを示すグラフである。
【図７Ａ】マイクロアレイ解析により選抜した遺伝子(1)〜(6)の発現データを示すグラフである。
【図７Ｂ】マイクロアレイ解析により選抜した遺伝子(7)〜(12)の発現データを示すグラフである。
【図７Ｃ】マイクロアレイ解析により選抜した遺伝子(13)の発現データを示すグラフである。
【図８】遺伝子(2)、遺伝子(4)、遺伝子(5)のプロモーターを用いた形質転換体における定量RT-PCR解析による発現データを示すグラフである。生育は、人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で行った。(A)外来導入Hd3aの発現量を示す。(B)プロモーターを利用した候補遺伝子自体の内在性の発現量を示す。
【図９】遺伝子(6)、遺伝子(7)、遺伝子(9)から遺伝子(10)、遺伝子(13)のプロモーターを用いた形質転換体における定量RT-PCR解析による発現データを示す図である。生育は、ガラス温室で行った。(A)外来導入Hd3aの発現量を示す。(B)図８同様に、候補遺伝子の発現量を示す。
【図１０】遺伝子(3)のプロモーターを用いた形質転換体の発現解析（A、B、D、E、F）と開花調査（C）に関するグラフである。生育は、人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で行った。
【図１１】遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体の発現解析（A、B）と開花調査（C）に関するグラフである。生育は、ガラス温室で行った。横軸の番号は、独立なT0個体を示す。C1乃至C4は、ベクターのみ導入した独立なT0個体を示す。T0系統の31は、止葉の出現が確認されたが、出穂に到らなかった系統であり、(C)においては、止葉が確認された日数を示している。
【図１２】遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体の発現解析（A、B、C）に関するグラフである。生育は、ガラス温室で行った。横軸の番号は、独立なT0個体を示す。C1乃至C4は、ベクターのみ導入した独立なT0個体を示す。
【図１３】遺伝子(12)のプロモーターを用いた開花誘導系統の写真である。（A）実施例4で作出したT0-41系統の写真である。オリゼメート粒剤処理後65日目に開花（出穂）した。（B）T0-41系統の穂辺りの写真である。（C）実施例4の図11Cに示したT0-30系統の写真である。ルーチン粒剤処理後45日目に開花した。（D）T0-30系統の穂辺りの写真である。両系統ともに、プラントアクチベーター処理を施した個体のみが開花した。
【図１４】図11に示す形質転換体の薬剤処理後2週間目の葉サンプルを用いた発現解析を示すグラフである。
【図１５】遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体における穂の形態調査に関するグラフである。実施例4の図11Cに示した系統の主茎についた穂の(A)一穂粒数、(B)一次枝梗数/穂、(C)平均粒数/一次枝梗、(D)穂長を調べた。
【図１６】遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体における穂の形態調査に関するグラフである。実施例4の図11Cに示した系統から収穫した全穂の一穂粒数、一次枝梗数/穂、平均粒数/一次枝梗、穂長を調べた。(A)一穂粒数に対する一次枝梗数/穂の散布図、(C)一穂粒数に対する平均粒数/一次枝梗の散布図、(E)一穂粒数に対する穂長の散布図。（B)、(D)、(F）は、それぞれ(A)、(C)、(E)に対応した平均値と標準偏差を示す。「Cont.（無処理）」はn=27、「(12)T0系統（無処理）」はn=29、「Cont.（処理）」はn=26、「(12)T0系統（処理）」はn=33である。
【図１７】遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換後代における開花誘導試験に関する図である。(A)後代試験に用いた系統のT0世代での開花状況を示す。(B)ゲノミックサザンブロッティング解析の結果を示す。(C)導入遺伝子が分離している形質転換自殖後代における開花状況を示す。図下部の数字はT1世代の系統名を示す。
【図１８】圃場での開花誘導試験に関する図である。(A)圃場での薬剤試験における開花状況を示すグラフである。中段の図（導入遺伝子）は、導入遺伝子の有無を示す図であり、黒丸はPCR解析により導入遺伝子の存在が確認された個体を示し、白丸は導入遺伝子が存在すると推定される個体を示し、Ｘは導入遺伝子が存在しないと推定される個体を示す。(B)ゲノムPCR解析の結果を示す写真である。
【図１９】翻訳エンハンサーを導入した開花期制御DNAカセットを用いた形質転換体TO世代（形質転換当代）における開花誘導試験に関するグラフである。遺伝子(12)のプロモーターを図2Bに示す開花期制御プラスミドに導入して、形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤処理試験を行った。各図下部の数字はT0世代の系統名を示す。(A)外来導入Hd3aの発現量を示す。(B)内在性の遺伝子(12)の発現量を示す。(C)薬剤処理後到穂日数を示す。T0系統の14と20は、止葉の出現が確認されたが、出穂に到らなかった系統であり、（C）においては、止葉が確認された日数を示している。
【図２０】翻訳エンハンサーを導入した開花期制御DNAカセットを用いた形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。遺伝子(12)のプロモーターを図2Bに示す開花期制御プラスミドに導入して、形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤処理試験を行った。(A)Ghd7の発現量を示す。(B)内在Hd3aの発現量を示す。横軸の番号は、独立なT0個体を示す。C1及びC2は、ベクターのみ導入した独立なT0個体を示す。
【図２１】翻訳エンハンサーを用いた開花誘導系統（実施例8の図19Cに示した形質転換体）の写真である。（A）T0-8系統の写真である。ルーチン粒剤処理後38日目に開花（出穂）した。（B）T0-8系統の穂辺りの写真である。（C）T0-24系統の写真である。ルーチン粒剤処理後35日目に開花した。（D）T0-24系統の穂辺りの写真である。両系統ともに、プラントアクチベーター処理を施した個体のみが開花した。
【図２２】飼料イネ品種を遺伝背景とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。飼料イネ品種タチスガタとキタアオバを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤処理試験を行った。(A)外来導入Hd3aの発現量を示す。(B)遺伝子(12)の発現量を示す。(C)株分け移植後到穂日数を示す。各図下部の「タチスガタ1」等、又は「キタアオバ1」等は、タチスガタ又はキタアオバを開花期制御プラスミドで形質転換して得た独立のT0個体を示す。「タチスガタC1」、「タチスガタC2」、及び「キタアオバC1」はベクターのみを形質転換した対照個体を示す。T0系統のキタアオバ5は、止葉の出現が確認されたが、出穂に到らなかった系統であり、（C）においては、止葉が確認された日数を示している。
【図２３】飼料イネ品種を遺伝背景とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。飼料イネ品種タチスガタとキタアオバを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤処理試験を行った。(A)Ghd7の発現量を示す。(B)内在Hd3aの発現量を示す。(C)OsMADS14の発現量を示す。
【図２４】再開花誘導試験に関する図。実施例8に記載の系統（図19Cに示したT0-24系統）の未開花の無処理個体の分げつを処理用／無処理用に再度株分けして、再プラントアクチベーター剤処理試験を行った。上段に、試験系統の写真と、下段に、再開花誘導試験の実験手法の模式図を示している。
【図２５】実施例4に記載の系統（図11Cに示すT0-30系統）と実施例8に記載の2系統（図19Cに示すT0-8系統とT0-24系統）の再開花誘導試験における開花状況を示すグラフである。
【図２６】トウモロコシにおけるイネ遺伝子(12)のオーソログ遺伝子のプラントアクチベーター誘導性を示したグラフである。(A)実数軸表記。(B)対数軸表記。各値は、それぞれ独立の3サンプルからの平均値と標準偏差で示す。
【図２７】トウモロコシ用ベクターコンストラクトの模式図である。
【図２８】トウモロコシの形質転換に用いた開花期制御プラスミドを示す図である。(A)pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3aの構成を示す。(B)pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3aの構成を示す。ZmALS：トウモロコシ由来2点変異型ALS阻害型除草剤耐性遺伝子、Ghd7：Ghd7 cDNA、Hd3a：カサラス型Hd3a cDNA、PZmALS：トウモロコシ由来ALSプロモーター、PZmUbi：トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、TALS：トウモロコシ由来ALSターミネーター、Tnos：nosターミネーター、ADH5’UTR：OsADH2 5’UTR、RBとLB：T-DNAの左右ボーダー配列。
【図２９】トウモロコシの形質転換用ベクターコンストラクトの模式図である。（A）pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3aに、イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）、あるいは、2種類のトウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133、又は137）をそれぞれ組み込んだ場合のベクターコンストラクトの構成を示す。（B）pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3aに、イネ由来遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）、あるいは、2種類のトウモロコシ由来遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133、又は137）をそれぞれ組み込んだ場合のベクターコンストラクトの構成を示す。
【図３０Ａ】イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）、あるいは、トウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133）を用いたトウモロコシ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関し、外来導入したHd3aの発現データを示すグラフである。VCはベクターコントロールを示し、Mi29は野生型トウモロコシ系統を示している。
【図３０Ｂ】イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）、あるいは、トウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133）を用いたトウモロコシ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関し、トウモロコシの遺伝子(12)オーソログの内在発現データを示すグラフである。VCはベクターコントロールを示し、Mi29は野生型トウモロコシ系統を示している。
【図３１】トウモロコシ由来遺伝子(12)オーソログプロモーターを用いたイネ形質転換用ベクターコンストラクトの模式図である。pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a（図2A）に、2種類のトウモロコシ由来遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133、又は137）をそれぞれ組み込んだ場合のベクターコンストラクトの構成を示す。
【図３２Ａ】トウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133と137）を用いたイネ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関し、外来導入したHd3aの発現データを示すグラフである。C1とC2は、ベクターコントロールを示す。アステリスクが付与された系統のデータは、株分けせずに、同一個体を用いて、処理前・処理後にそれぞれ葉を採取して解析した場合の結果を示している。
【図３２Ｂ】トウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133と137）を用いたイネ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関し、遺伝子(12)の発現データを示すグラフである。C1とC2は、ベクターコントロールを示す。アステリスクが付与された系統のデータは、株分けせずに、同一個体を用いて、処理前・処理後にそれぞれ葉を採取して解析した場合の結果を示している。
【図３３】イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）を用いたサトウキビ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関し、薬剤処理前に採取した葉サンプルでの外来導入したGhd7遺伝子の発現量を示すグラフである。グラフ横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「12GH」と「Q165(WT)」は、対照個体を示す。
【図３４】イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）を用いたサトウキビ形質転換体（T0個体）における薬剤誘導試験に関するグラフである。該サトウキビ形質転換体を薬剤にて処理し（処理区）、または水のみにて処理し（無処理区）、その１６日後に採取した葉サンプルでの外来導入したHd3a遺伝子の発現量を示すグラフである。グラフ横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「１２ＧＨ」と「Ｑ１６５（ＷＴ）」は、対照個体を示す。なお、各形質転換体等において、１個体の形質転換植物を株分けにより４個体ずつ用意し、これらを処理個体２個体、無処理個体２個体に分けて実験した結果を、１個体ずつ図３４には示してある。
【図３５Ａ】飼料イネ品種キタアオバを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。キタアオバを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、薬剤処理後3日目に採取した葉サンプルでの外来導入したHd3a遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３５Ｂ】飼料イネ品種キタアオバを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。キタアオバを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、薬剤処理後3日目に採取した葉サンプルでの遺伝子(12)の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３５Ｃ】飼料イネ品種キタアオバを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関する図である。キタアオバを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、株分け移植後から出穂までにかかった日数を示す。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３６Ａ】飼料イネ品種キタアオバを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関し、薬剤処理後3日目に採取した葉サンプルでの外来導入したGhd7遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３６Ｂ】飼料イネ品種キタアオバを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関し、薬剤処理後3日目に採取した葉サンプルでの内在のHd3a遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３７Ａ】図35と図36に示すキタアオバを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルにおいて、外来導入したHd3a遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３７Ｂ】図35と図36に示すキタアオバを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルにおいて、遺伝子(12)の発現量を解析した結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３７Ｃ】図35と図36に示すキタアオバを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルにおいて、外来導入したGhd7遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３７Ｄ】図35と図36に示すキタアオバを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルにおいて、内在のHd3a遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３８Ａ】飼料イネ品種タチスガタを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。タチスガタを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、薬剤処理後5日目に採取した葉サンプルでの外来導入したHd3a遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３８Ｂ】飼料イネ品種タチスガタを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。タチスガタを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、薬剤処理後5日目に採取した葉サンプルでの遺伝子(12)の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３８Ｃ】飼料イネ品種タチスガタを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関するグラフである。タチスガタを遺伝背景に、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体を作製し、プラントアクチベーター剤による開花誘導試験を行い、株分け移植後から出穂までにかかった日数を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３９Ａ】飼料イネ品種タチスガタを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関し、薬剤処理後5日目に採取した葉サンプルでの外来導入したGhd7遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図３９Ｂ】飼料イネ品種タチスガタを背景品種とする形質転換体における開花誘導試験に関し、薬剤処理後5日目に採取した葉サンプルでの内在のHd3a遺伝子の発現量を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図４０Ａ】図38と図39に示すタチスガタを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルでの、外来導入したHd3a遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図４０Ｂ】図38と図39に示すタチスガタを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルでの、遺伝子(12)の発現解析結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図４０Ｃ】図38と図39に示すタチスガタを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルでの、外来導入したGhd7遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【図４０Ｄ】図38と図39に示すタチスガタを背景品種とする形質転換体における薬剤処理後2週間目の葉サンプルでの、内在のHd3a遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。図下部の横軸の番号は、独立なT0個体を示す。「C1」と「C2」は、ベクターのみを形質転換した対照個体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、プラントアクチベーターの作用により活性化されるプロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物が導入され、プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体を提供する。
【００２７】
本発明において「プラントアクチベーター」とは、病原菌に直接作用することによるのではなく、植物が持つ病害抵抗性を高めることにより、病害防除効果を示す薬剤を意味する。プラントアクチベーターは、直接の抗菌活性を持たないため、耐性菌が発生しにくいという環境への安全性、および一度の処理による効果の継続性の長さといった利点を有する。
【００２８】
本発明に用いるプラントアクチベーターとしては、例えば、プロべナゾールまたはイソチアニルを好適に用いることができるが、これらに制限されない。プロべナゾールを成分とする市販農薬としては、オリゼメート（明治製菓社）が知られており、また、イソチアニルを成分とする市販農薬としては、ルーチン（バイエルクロップサイエンス社）が知られている。本発明において、これらプラントアクチベーターでイネ科植物を処理する際には、これら農薬の形態とされているもので処理してもよい。
【００２９】
また、本発明において「プラントアクチベーター感受性プロモーター」とは、プラントアクチベーターの作用により活性化され、その下流に連結した遺伝子の発現を誘導することができるプロモーターを意味する。当該プロモーターとしては、特に制限はないが、非誘導時（プラントアクチベーターで処理していない状態）においては、その下流に連結されたHd3a遺伝子の発現を強く抑制し、かつ、誘導時（プラントアクチベーターで処理した状態）においては、その下流に連結されたHd3a遺伝子を適切な場所で適切なレベルで発現させるものであることが好ましい。Hd3a遺伝子のようなフロリゲン遺伝子の発現は、栄養成長期では抑制されており、日長などの条件が満たされたときに劇的に誘導されることが知られている（Suarez  et  al.,  Nature  2001;410(6832):1116-20、Izawa  et  al.,  Genes  Dev.  2002;16(15):2006-20、Itoh  et  al.,  Nat.  Genet.  2010;42(7):635-8）。したがって、開花の過程においては、フロリゲン遺伝子の発現レベルにある閾値があり、これを超えることで開花のプロセスが開始されることが推察されている。また、フロリゲン遺伝子は、葉の維管束師部で特異的に発現し、その産物であるフロリゲンタンパク質が維管束を通じて茎頂分裂組織に至ることで開花の素過程である花芽形成が始まることが知られている（Abe  et  al.,  Science  2005;309(5737):1052-6、Tamaki  et  al.,  Science  2007;316(5827):1033-6）。その一方で、花芽誘導時のフロリゲンの量が、花序の形態に影響を与える例も報告されており（Endo-Higashi  and  Izawa,  Plant  Cell  Physiol.  2011）、イネにおいて必要以上のフロリゲンの存在は、極小な花序を作るとされている（Izawa  et  al.,  Genes  Dev.  2002;16(15):2006-20）。また、本発明者による予備実験において、異所的に発現するOSH1プロモーター（茎頂分裂組織で発現、Sato  et  al.,  PNAS  1996;93(15):8117-22）を用いた場合では、導入遺伝子を持たない野生型系統と比較して早咲きだが、穂の形態異常が認められた。このように、誘導時におけるフロリゲン遺伝子の発現レベルには、好適な範囲が存在する。
【００３０】
プラントアクチベーター感受性プロモーターは、誘導時には、ユビキチンと比べて、少なくとも1/1000以上（好ましくは1/100以上、さらに好ましくは1/10以上、最も好ましくは同等以上）の発現レベルを保証し、一方、非誘導時には、ユビキチンと比べて、少なくとも1/10以下（好ましくは1/100以下、さらに好ましくは1/1000以下、最も好ましくは1/10000以下）の発現レベルに発現を抑制しうるものを用いることが好ましい。また、該プロモーターは、誘導時における発現レベルが非誘導時の発現レベルに比較して少なくとも5倍以上（好ましくは10倍以上、さらに好ましくは30倍以上、最も好ましくは100倍以上）に上昇するものを用いることが好ましい。
【００３１】
このような発現特性を示し、本発明において好適に用いられるプロモーターの一つの態様は、配列番号：1に記載の塩基配列からなるイネ由来のプロモーター（本実施例に記載の遺伝子(12)のプロモーター）である。このプロモーターは、プロべナゾール（オリゼメート）とイソチアニル（ルーチン）を用いた圃場試験における遺伝子発現のマイクロアレイ解析の結果、好適な発現特性を保証するプロモーターとして選抜されたものである（実施例3参照のこと）。本発明においては、イネのプロモーター以外に、本発明を適用する他の植物種（例えば、トウモロコシ、サトウキビ、オオムギ、コムギ、ソルガム）におけるオーソログ遺伝子のプロモーターも好適に用いることができる。特に、トウモロコシやソルガムといった植物においてイネの遺伝子(12)のオーソログ遺伝子が存在することが確認されており、それらのオーソログ遺伝子のプロモーターはイネの(12)遺伝子のプロモーターと同等の発現特性を有すると考えられる。さらに、トウモロコシにおける遺伝子(12)のオーソログ遺伝子がプラントアクチベーター誘導性の発現を示すことが実施例11において確認されている。これらの事実から、イネの遺伝子(12)のオーソログであるトウモロコシ遺伝子のプロモーター（配列番号：133）も本発明において好適に用いることができる。
【００３２】
サトウキビ（Saccharum  officinarum）のサリチル酸誘導性シス配列と全身獲得抵抗性（Systemic  acquired  resistance:  SAR）に関わるWRKY型転写因子の認識配列をもつScMYBAS1プロモーターが、イネ科単子葉植物よりもより進化的に隔たった双子葉植物（タバコ）で、サリチル酸誘導性を示す報告がある（Prabu  and  Prasad,  Plant  Cell  Rep.  2012;31(4):661-9）。プラントアクチベーターは、全身獲得抵抗性の誘導剤であり、サリチル酸を介したシグナル伝達系上で作用することが知られている。このように単子葉イネ科植物のサリチル酸誘導性プロモーターは、双子葉植物でも機能する。また、プラントアクチベーターで誘導されるSAR関連遺伝子は、イネでもタバコでも、サリチル酸で誘導される。これらのことから、プラントアクチベーターに反応するプロモーター（あるいは、シス配列）の互換性は植物種間で高いと考えられるが、特に、イネと他イネ科植物種間での互換性は極めて高いと想定される。このように本発明は広範なイネ科植物において好適に利用しうる。
【００３３】
また、当業者であれば、一旦、特定の遺伝子のプロモーター領域が見出された場合、汎用技術を利用して、当該プロモーター領域の中に含まれる、より短い活性断片を同定したり、あるいは、当該プロモーター領域の塩基を改変して、同様の活性を有する変異DNAを作製することが可能である。また、塩基配列が変異することは、自然界においても生じ得る。
【００３４】
従って、本発明において用いられるプロモーターをコードするDNAとしては、配列番号：1、133または137に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNAを用いることも可能である。変異する塩基の数は、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有する範囲である限り特に制限はないが、通常、50塩基以内、好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは10塩基以内（例えば、5塩基以内、3塩基以内、2塩基以内）である。変異DNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed  mutagenesis法（Kramer,  W.&  Fritz,H.-J.  (1987)  Oligonucleotide-directed  construction  of  mutagenesis  via  gapped  duplex  DNA.Methods  in  Enzymology,  154:  350-367）が挙げられる。
【００３５】
さらに、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Southern,  E.  M.,  Journal  of  Molecular  Biology,  98:503,  1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki,  R.  K.,  et  al.  Science,  230:1350-1354,  1985、Saiki,  R.  K.  et  al.  Science,  239:487-491,  1988）などを利用して、配列番号：１、133または137に記載の塩基配列情報を利用して、他のイネ品種や他のトウモロコシ品種、あるいは他の植物（例えば、サトウキビ、オオムギ、コムギ、ソルガムなどのイネ科植物など）から、配列番号：１に記載のDNAと高い相同性を有し、かつ、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNA（例えば、オーソログ遺伝子のプロモーター）を取得することが可能である。
【００３６】
従って、本発明において用いられるプロモーターをコードするDNAとしては、配列番号：１、133または137に記載の塩基配列と70％以上の相同性を有し、かつ、プラントアクチベーター感受性プロモーターの活性を有するDNAを用いることも可能である。相同性は、好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）である。なお、本発明における相同DNAには、その相同性の範囲内にある限り、上記変異DNAが含まれる（以下、同様）。
【００３７】
本発明において、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流に連結する「Hd3a遺伝子」としては、その形態に特に制限はなく、cDNA、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。これらDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。
【００３８】
本発明における「Hd3a遺伝子」としては、典型的には、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするイネカサラス型のDNA（例えば、配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA）、および配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするイネ日本晴型のDNA（例えば、配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNA）が挙げられる。
【００３９】
また、当業者であれば、特定のHd3a遺伝子の塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列は異なるが、同じく植物の開花を誘導する活性を有するDNAを取得することが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明のHd3a遺伝子には、イネのカサラスあるいは日本晴におけるHd3aタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：3または5）において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物の開花を誘導する活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。ここで「複数」とは、改変後のHd3aタンパク質が植物の開花を誘導する活性を維持する範囲における、アミノ酸の改変数であり、通常、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、2アミノ酸）である。
【００４０】
さらに、当業者であれば、特定のHd3a遺伝子が得られた場合、上記のハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術により、その塩基配列情報を利用して、イネの他の品種や他の植物（例えば、トウモロコシ、サトウキビ、オオムギ、コムギ、ソルガムなどのイネ科植物など）から、同じく植物の開花を誘導する活性を有する相同タンパク質をコードするDNA（例えば、オーソログ遺伝子）を取得することが可能である。従って、本発明のHd3a遺伝子には、イネのカサラスあるいは日本晴におけるHd3a遺伝子のアミノ酸（配列番号：3または5）と70%以上の相同性を有し、かつ、植物の開花を誘導する活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。相同性は、好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）である。
【００４１】
こうして得られた変異DNAや相同DNAが、植物の開花を誘導する活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、後述するGhd7遺伝子の恒常発現により開花を抑制した植物に、配列番号：１に記載の塩基配列からなるプロモーターの下流に被検DNAが連結された発現構築物を導入し、プラントアクチベーター処理により、開花（イネであれば、出穂）が誘導されるか否かを調べることにより評価することができる。
【００４２】
なお、上記プロモーター、上記Hd3a遺伝子、および後述のGhd7遺伝子について、相同DNAを単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。
【００４３】
また、単離されたDNAの配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul  et  al.  J.  Mol.  Biol.,  215:403-410,  1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  87:2264-2268,  1990、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:5873-5877,  1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped  BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402,  1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped  BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。また、配列を比較する際には、両配列の対応する領域同士を比較する。
【００４４】
本発明のイネ科植物においては、さらに、内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子の発現構築物が導入されている植物も含まれる。一般的に、すべての植物は、子孫を残すために、生殖成長への移行が遅かれ早かれ始まるように遺伝的に制御されていて、そうでないものは進化上淘汰されていると考えられている。この性質は、人為的な花芽誘導の制御においては、内因性の遺伝子による花芽誘導が人為的制御を乱す要因となりうることを意味する。上記発現構築物が導入された植物体においては、内因性のHd3a遺伝子の発現が抑制されている一方、異種プロモーターの制御下にある外因性のHd3a遺伝子の発現は抑制されず、かつ、発現した外因性のHd3aタンパク質の活性も抑制されない。本発明においては、花芽形成を抑制するための発現構築物による内因性のHd3a遺伝子発現のオフと花芽形成を誘導するための発現構築物による外因性のHd3a遺伝子発現のオンという2種類のスイッチを組み合わせた遺伝子発現のスイッチングにより効率的に開花期を制御することが可能となる。
【００４５】
内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子としては、特に制限はないが、Ghd7遺伝子を好適に用いることができる。主に長日条件下で働くGhd7の開花抑制機能は、短日植物であるイネの開花期調節に多大に貢献している。このGhd7の開花抑制機能は、開花促進遺伝子Ehd1（イネあるいは単子葉植物特異的開花制御遺伝子、特開2003-339382、Doi  et  al.,  Genes  Dev.  2004;18(8):926-36）の発現抑制を介してフロリゲン遺伝子Hd3a/RFT1の発現を抑制することで達成すると考えられている（Itoh  et  al.,  Nat.  Genet.  2010;42(7):635-8、Osugi  et  al.,  Plant  Physiol.  2011）。しかしながら、Ghd7タンパク質がHd3aタンパク質の活性を抑制しないことは知られておらず、本発明者らにより初めて見いだされた。
【００４６】
本発明における「Ghd7遺伝子」は、典型的には、配列番号：7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号:6に記載の塩基配列からなるDNA）である。本発明における「Ghd7遺伝子」としては、上記Hd3a遺伝子と同様に、変異DNAや相同DNA（例えば、オーソログ遺伝子）を用いることもできる。すなわち、本発明の「Ghd7遺伝子」は、配列番号：7に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNA、および配列番号：7に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつ、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含む。実際、最近、イネ科作物であるトウモロコシにおいても、Ghd7のオーソログの報告があり、イネと同様に開花期を遅らせる機能をもつことが報告されている（Hung  et  al.(2012)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  109:E1913-E1021）。
【００４７】
さらに、イネ科植物ソルガムでも、Ghd7に似た配列の遺伝子が見つかり、同じくイネ科植物のコムギやオオムギでも、Ghd7類似の配列を持つホモログ遺伝子が、開花期を遅らせる機能を持つことが報告されている(Trevaskis  et  al.,  Plant  Physiol.  2006;140(4):1397-405.、Hemming  et  al.,  Plant  Physiol.  2008;147(1):355-66.)。
【００４８】
当該遺伝子は、内因性のHd3a遺伝子の発現を効果的に抑制するために、発現構築物において恒常的発現プロモーターの下流に連結されていることが好ましい。恒常的発現プロモーターとしては、例えば、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターが好適である。当該プロモーターは、イネにおいては35Sプロモーターよりもより強力な恒常的発現プロモーターとして機能することが知られている（Cornejo  et  al.,  Plant  Mol.  Biol.  1993;23(3):567-81）。
【００４９】
本発明における発現構築物においては、上記プロモーター、上記遺伝子に加えて、転写終結因子を含むことができる。転写終結因子としては、例えば、nosターミネーターや35Sターミネーターを用いることができる。
【００５０】
本発明のイネ科植物体は、例えば、上記発現構築物を植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることで作出することができる。発現構築物を導入する「植物細胞」としては、種々の形態の植物細胞、例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片などが挙げられる。植物細胞の由来するイネ科植物としては、特に制限はなく、イネの他、トウモロコシ、サトウキビ、オオムギ、コムギ、ソルガムなどが挙げられる。
【００５１】
植物細胞へのベクターの導入は、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら  (1995)  Plant  Physiol.  100:1503-1507参照）。
【００５２】
例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei  et  al.  (1994)  Plant  J.6:  271-282.）、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K.  (1995)  In  Gene  Transfer  To  Plants(Potrykus  I  and  Spangenberg  Eds.)  pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki  et  al  (1992)  Plant  Physiol.  100,  1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christouet  et  al.  (1991)  Bio/technology,  9:  957-962.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００５３】
トウモロコシにおいて形質転換植物体を作出する方法としては、例えば、Ishida  Y  et  al.  (2007)  Nat  Protocols  2:  1614-1621.、Hiei  Y  et  al.  (2006)  Plant  Cell  Tiss  Organ  Cult  87:  233-243.、及び、Ishida  Y  et  al.  (1996)  Nat  Biotechnol  14:  745-750に記載の方法がある。
【００５４】
サトウキビにおいて形質転換植物体を作出する方法としては、例えば、Arencibia,  A.D.  et  al.  (1998)  Transgenic  Research  7:213-222;1998、Bower,  R.  and  Birch,  R.G.(1992)  Plant  J  2:409-416、Chen,  W.H.  et  al.  (1987)  Plant  Cell  Rep.  6:  297-301、Elliott,  A.R.  et  al.  (1998)  Aust  J  Plant  Physiol  25:739-743、Manickabasagam,  M.  et  al.(2004)  Plant  Cell  Rep  23:134-143、Zhangsun  D.  et  al.  (2007)  Biologoa,  Brarislava  62:386-393に記載の方法が挙げられる。
【００５５】
ソルガムにおいて形質転換植物体を作出する方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（J．A.Able  et  al．，In  Vitro  Cell．Dev．Biol．37:341-348，2001、A.M．Casas  et  al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  90:11212-11216，1993、V．Girijashankar  et  al．，Plant  Cell  Rep  24:513-522，2005、J．M．JEOUNG  et  al．，Hereditas  137:20-28，2002、V  Girijashankar  et  al．，Plant  Cell  Rep  24（9）:513-522，2005、Zuo-yu  Zhao  et  al．，  Plant  Molecular  Biology  44:789-798，2000、S．Gurel  et  al．，Plant  Cell  Rep  28（3）:429-444，2009、ZY  Zhao，Methods  Mol  Biol，  343:233-244，2006、AK  Shrawat  and  H  Lorz，Plant  Biotechnol  J，4（6）:575-603，2006、D  Syamala  and  P  Devi  Indian  J  Exp  Biol，41（12）:1482-1486，2003、Z  Gao  et  al．，Plant  Biotechnol  J，3（6）:591-599，2005）。
【００５６】
コムギにおいて形質転換植物体を作出する方法としては、例えば、「小川泰一、日本農薬学会誌、2010年、35巻、2号、160〜164ページ」に記載の方法を挙げることができる。
【００５７】
オオムギにおいて形質転換植物体を作出する手法としては、Tingayら（Tingay  S.  et  al.  Plant  J.  11:  1369-1376,  1997）、Murrayら（Murray  F  et  al.  Plant  Cell  Report  22:  397-402,  2004）、およびTravallaら（Travalla  S  et  al.  Plant  Cell  Report  23:  780-789,  2005）に記載された方法を挙げることができる。
【００５８】
一旦、ゲノム内に発現カセットが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、上記本発明のイネ科植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びにそれらの繁殖材料が含まれる。
【００５９】
このように本発明は、プラントアクチベーター処理により開花期を制御することが可能なイネ科植物体の生産方法であって、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物をイネ科植物の細胞に導入し、植物体を再生させる工程を含む方法をも提供するものである。また、内因性のHd3a遺伝子の発現は抑制するが、Hd3aタンパク質の活性は抑制しないタンパク質をコードする遺伝子の発現構築物をさらに導入する工程を含む上記方法をも提供するものである。また、プラントアクチベーター感受性プロモーターの下流にHd3a遺伝子が連結された発現構築物をイネ科植物の細胞に導入した後、該発現構築物が染色体中に１コピー挿入されている細胞を選抜する工程をさらに含む、上記方法をも提供するものである。なお、染色体中に挿入されている該発現構築物のコピー数については、後述の実施例６において示す通り、ゲノミックサザンブロッティング解析、ＰＣＲ解析などにより確認することができる。本方法の具体的な態様は上記の通りである。
【００６０】
本発明の方法により作出されたイネ科植物体は、散布などの方法でプラントアクチベーター処理することにより、任意の時期に開花を誘導することができる。本発明は、本発明のイネ科植物体をプラントアクチベーターで処理する工程を含むイネ科植物体の開花を誘導する方法をも提供するものである。本方法の具体的態様は上記の通りである。
【００６１】
また、本発明は、プラントアクチベーターを有効成分として含む、本発明のイネ科植物体の開花を誘導するための薬剤をも提供するものである。プラントアクチベーターの具体的態様は上記の通りであるが、本発明の薬剤には、プラントアクチベーター以外にも、農薬などにおいて通常用いられている担体、乳化剤、分散剤、展着剤、湿展剤、固着剤、崩壊剤などの補助剤を含有させることができる。
【００６２】
担体としては、例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類、酢酸エチルなどのエステル類、並びに、固体担体、例えば、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、消石灰、ケイ砂、硫安、尿素などが例示される。
【００６３】
担体以外の補助剤としては、通常、界面活性剤が用いられ、例えば、陰イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤または両性イオン系界面活性剤があげられ、これらは単独または２種以上を混合して使用することができる。
【００６４】
本発明の薬剤の剤形は特に限定されず、乳剤、懸濁剤、粉剤、水和剤、水溶剤、粒剤、ペースト剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００６５】
本発明の薬剤中のプラントアクチベーターの含有量、およびその投与量は、植物の種類、含有させるプラントアクチベーターの種類、剤形、使用方法、使用時期などによって異なるが、当業者であればこれらの条件に合わせて適宜調製することができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６７】
（実施例1）  Ghd7遺伝子の花芽形成抑制能の検証
花芽形成抑制に働くイネGhd7遺伝子をトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターで恒常発現させた形質転換イネを作出し、栽培して開花期（出穂期）を調べた。【００６８】
Ghd7oxの作出に用いた形質転換用プラスミドは、次のように作製した。まず、ヘマグルチニン（HA:YPYDVPDYA）とStrep-tagII（WSHPQFEK、IBA、http://www.iba-go.com)がタンデムにつながるように二つのオリゴDNA（BamHI-HA-F（5’-cgggatccatgtatccatacgatgttccagattatgctgtcggcgccggttgg-3’／配列番号：8）とStrepII-R（5’-ggcgcctcctttttcaaattgaggatgagaccaaccggcgccgacagcata-3’／配列番号：9））を合成し、アニーリングさせ、T4  DNA  polymerase（タカラバイオ）で二本鎖DNAにしたHA-StrepII断片を調製した。下線は付加したBamHI配列を示している。また、HAとStrep-tagIIの結合部位には、アミノ酸配列VGAGをリンカー配列として挿入している。このHA-StrepII断片をBamHIで処理し、T4  Polynucleotide  Kinase（タカラバイオ)でリン酸化して、pENTR1Aベクター（ライフテクノロジーズ）へのクローニング断片とした。次に、イネ品種日本晴で、Ghd7が発現している時期に採取したRNAから合成したcDNAを鋳型にして、Ghd7のコード領域を含むcDNAをプライマーGhd7-F（5-ATGTCGATGGGACCAGCAGCCGGAG-3／配列番号：10）とプライマーGhd7-EcoRI-R（5’-CGGAATTCTATCTGAACCATTGTCCAAGC-3’／配列番号：11）を用いてPCR増幅した。下線は付加したEcoRI配列を示している。Ghd7  cDNAをEcoRIで処理し、T4  Polynucleotide  Kinaseでリン酸化したDNA断片を、上記のように調製したHA-StrepII断片と合わせて、pENTR1AのBamHIとEcoRI部位に一度にクローニングし、配列決定して、エントリーベクターpENTR1A/HA-StrepII-Ghd7を作製した。HA-StrepIIタグ配列とGhd7の開始コドンの間には、アミノ酸配列GGAを同一の読み枠になるようにリンカー配列として挿入している。最後に、LR反応（LRクロナーゼII、インビトロジェン）により、デスティネーションベクターpEASY-Ubipro（Matsui  et  al.,  Plant  Cell  Physiol  2010;51(10):1731-1744)のトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターとnosターミネーターの間にHA-StrepII-Ghd7断片を組み込み、形質転換用のバイナリープラスミドpEASY/PUbi-HA-StrepII-Ghd7を作製した。これをイネ品種キタアケ（Ghd7遺伝子機能欠損品種）の形質転換に用い、Ghd7oxを作出した。【００６９】
イネの形質転換には、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入手法を用いた。具体的には、公知のイネの形質転換法（寺田および飯田：モデル植物ラボマニュアル(岩渕雅樹・岡田清孝・島本功編、シュプリンガー・フェアラーク東京)  pp.110-121,  2000、Hiei  et  al.,  Plant  J.  1994;6:  271-282、Toki  et  al.,  Plant  Molecular  Biology  Reporter,  1997;15(1):16-21）を利用した。アグロバクテリウムはEHA105を用い、エレクトロポレーションで上記のプラスミドを導入した菌体をカルスへの感染に使用した。また、形質転換体の薬剤選抜には、終濃度50mg/Lのハイグロマイシンを用いた。【００７０】
Ghd7oxの形質転換当代（T0世代）をガラス温室に移植して出穂期を調査した結果、Ghd7タンパク質を強く恒常的に発現している系統では、4年以上も咲かないことが確認された（図1A）。この結果は、Ghd7遺伝子が強く働く限り、花芽形成が起こらず永続的に開花しないことを示している。【００７１】
Ghd7oxの葉から粗タンパク質を抽出し、10%アクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行った。粗タンパク抽出には、2xSDS  Sample  buffer（0.1M  Tris-HCl(pH6.8),  4%  SDS,  12%  β-2Mercaptoethanol,  50%  Glycerol）を用いた。20mA  ccで泳動し、泳動色素BPBがゲルの最下部に到達した時点で泳動を止め、PVDFメンブレン（ポール社フルオロトランスW）に転写した。転写装置はセミドライのトランスブロットSDセル（バイオラッド）を用い、15mA/cm2で60分、メンブレンへの転写を行った。終濃度2%のECL  Advance  Blocking  Reagent（GEヘルスケア）をTBS-T（150mM  NaCl,  20mM  Tris-HCl（pH7.5,  0.05%  Tween20）バッファーに添加した溶液をブロッキングバッファーとして用いた。ブロッキングは一時間以上行い、その後抗原抗体反応を行った。一次抗体として、抗HA抗体（Anti-HA.11、Mouse-Mono(16B12)、COVANS）を5000倍に希釈してブロッキング溶液に添加し、室温で一時間抗原抗体反応を行った。その後、TBS-T溶液で15分間のメンブレンの洗浄を二回行った。次に、二次抗体による抗原抗体反応を行った。ブロッキング溶液に10000倍に希釈した抗IgG抗体（Anti-mouse  IgG、peroxidase-linked  species-specific  whole  antibody(from  sheep)、GEヘルスケア）を添加し、室温で一時間抗原抗体反応を行った。その後、TBS-T溶液で15分間のメンブレンの洗浄を二回行った。シグナル検出には、ECL  Plus  Western  Blotting  Detection  System（GEヘルスケア）を用い、X線フィルム（Hyperfilm  ECL、GEヘルスケア）に露光し、レンドール（富士フィルム）およびレンフィックス（富士フィルム）で現像・定着した。図1Bに、Ghd7oxにおけるGhd7タンパク質の蓄積量を示した。また、図1Cに、前述のシグナル検出後のメンブレンを1%  ポンソーS溶液で染色した結果を示した。サンプル毎に著しい偏りのない粗タンパク質量を用いて解析していることが確認された。【００７２】
（実施例2）  Ghd7遺伝子恒常発現下での外来導入のHd3a遺伝子の発現による開花の検証
Ghd7の恒常発現により開花を強力に抑制した背景で、フロリゲン遺伝子Hd3aを幾つかの異なるプロモーターで発現させた形質転換イネを作出し、開花期（出穂期）を調査した。【００７３】
開花期制御プラスミドは、バイナリーベクターpRiceFOX（Nakamura  et  al.,  Plant  Mol.  Biol.  2007;65:357&#8211;371）を基礎として作製した。まず、pRiceFOXをHindIIIとSalIで処理し、それぞれの末端を平滑化した後、セルフライゲーションすることによりHindIIIとSalIで切り出されるインサート断片を除いた改変pRiceFOXを用意した。そして、pHellsgate  8（Helliwell  and  Waterhouse,  Method  2003;30(4):289-295）からXhoI処理で切り出されたAttR1-ccdB-AttR2断片を改変pRiceFOXのXhoI部位に挿入してGatewayシステム（インビトロジェン）に対応したpRiceFOX/Gateを作製した。【００７４】
次に、イネ品種カサラス型Hd3a  cDNAをプライマーHd3a-F-XbaI（5′-tctagaatggccggaagtgg-3′）とプライマーHd3a-R-KpnI（5′-ggtaccctagttgtagaccc-3′）を用いてPCR増幅し、pCR  8/GW/TOPO（インビトロジェン）にクローニングして配列決定した。また、翻訳エンハンサー（ADH5’UTR（OsADH2  5’UTR）、Sugio  et  al.,  J  Biosci  Bioeng.  2008;105(3):300-2）をHd3a  cDNA上流に挿入したADH5’UTR:Hd3a断片を用意するため、それぞれPCR増幅したHd3a  cDNA断片（プライマーOsAdh_Hd3a_fw（5’-AAAAGAGGGGGATTAatggccggaagtggc-3’／配列番号：12）とプライマーHd3a_kpn_rv（5’-GGAAATTCGAGCTCGGTACCctagttgtag-3’／配列番号：13）でPCR増幅）とADH5’UTR断片（プライマーOsAdh_enhancer_fw（5’-GAATTCCAAGCAACGAACTGCGAGTGA-3’／配列番号：14）とプライマーOsAdh_enhancer_rv（5’-TAATCCCCCTCTTTTTCAAAGAACAAG-3’／配列番号：15）でPCR増幅）の等モル数の混合物を鋳型に、プライマーOsAdh_enhancer_fw2（5’-CATAAGGGCCTCTAGAGAATTCCAAGCAAC-3’／配列番号：16）とプライマーHd3a_kpn_rvでPCR増幅した。そして、PCRにより連結させたADH5’UTR:Hd3a断片をpCR8/GW/TOPOにクローニングし、配列決定した。これら2種類のプラスミドからHd3a  cDNA断片あるいはADH5’UTR:Hd3a断片をXbaIとKpnIで処理してそれぞれ切り出し、pRiceFOX/GateのAttR1-ccdB-AttR2領域の下流に位置するXbaI部位とKpnI部位にそれぞれを挿入し、pRiceFOX/Gate:Hd3aとpRiceFOX/Gate:ADH5’UTR:Hd3aを作製した。プライマー配列中の下線は、付加したXbaI配列とKpnI配列をそれぞれ示している。【００７５】
また、実施例1に記載のpEASY/PUbi-HA-StrepII-Ghd7を鋳型にプライマーUbi-HindIII-F（5’-AAGCTTTGCAGCGTGACCCG-3’／配列番号：17）とプライマーNosT-HindIII-R（5’-AAGCTTgatctagtaacatag-3’／配列番号：18）を用いてPCR増幅し、Ghd7の恒常発現に関わるPUbi-HA-StrepII-Ghd7（PUbi:Ghd7）領域をpCR  8/GW/TOPOにサブクローニングした。そして、このプラスミドをHindIII処理し、切り出されたPUbi:Ghd7断片をpRiceFOX/Gate:Hd3aあるいはpRiceFOX/Gate:ADH5’UTR:Hd3aのHindIII部位に挿入し、開花期制御プラスミドpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a（図2A、配列番号：19）と翻訳エンハンサーが付加された開花期制御プラスミドpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a（図2B、配列番号：20）を構築した。【００７６】
UBQプロモーター、Hd3aプロモーター、OSH1プロモーター、PLA1プロモーターをPCR増幅し、pCR  8/GW/TOPO（インビトロジェン）にクローニングして各プロモーターに対するエントリーベクターを構築した。各プロモーター領域の増幅に用いたプライマーは次の通りである。UBQプロモーター（2.0kb）：UbiF（5’-TGCAGCGTGACCCGGTCGTGC&#8212;3’／配列番号：21）とUbiR（5’-AGTAACACCAAACAACAGG&#8212;3’／配列番号：22）、Hd3aプロモーター（2.0kb）：PHd3a-F1(5’-aagaacatttacataataagcagg-3’／配列番号：23)とPHd3a-R1（5’-gggctgctggatcgagctgtgg-3’／配列番号：24）、OSH1プロモーター（1.8kb）：OSH1-F（5’-ttctccaaccgtgcgtgtagg-3’／配列番号：25）とOSH1-R（5’-gagagaagctcaagacacgca-3’／配列番号：26）、PLA1プロモーター（2.0kb）：PLA1-F2（5’-AAGCCACTTCCACGACAGGC-3’／配列番号：27）とPLA1-R1（5’-ggcggacacaaggtgtttgtgg-3’／配列番号：28）。次に、図2に示すpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3aのプロモーター導入部（AttR1-ccdB-AttR2）に、各プロモーター断片をLR反応（LRクロナーゼ、インビトロジェン）で導入し、それぞれの形質転換用プラスミドを作製した。これら4つの異なるプロモーターを用いたプラスミドを実施例1に記載の方法でイネ品種日本晴に形質転換した。【００７７】
図3に、Ghd7が恒常発現した遺伝背景で、外来導入のHd3aを異なるプロモーターで発現させた場合のイネ形質転換体の出穂期を示した。図3の棒グラフは、T0世代の形質転換イネ系統をガラス温室に移植し、出穂期を調査した図である。また図3の下段の表は、各系統における導入遺伝子の有無を示している。【００７８】
導入遺伝子の有無は、各系統からのゲノムDNAを鋳型にPCR解析により確認した。ゲノムDNAは、形質転換体からの葉（1cm程度）をTPSバッファー（100mM  Tris-Cl、10mM  EDTA、1M  KCl）中で破砕し、遠心（3000rpm、1分）した後の上清をイソプロパノール沈殿し、最後にTEバッファーに溶かして抽出した（簡易抽出法）。PCR解析に用いたプライマーは次の通りである。Ghd7：3UBQMF2（5’-tttagccctgccttcatacgct-3’／配列番号：29）と3Lhd4R1（5’-CGTCGTTGCCGAAGAACTGG-3’／配列番号：30）、Hd3a：Hd3a/F(Xba)（5’-tctagaatggccggaagtgg-3’／配列番号：31）とHd3a/Rsac（5’-gagctcctagttgtagaccc-3’／配列番号：32）、Hpt：P35S1（5’-TCCACTGACGTAAGGGATGA-3’／配列番号：33）とNos3（5’-ATCAGCTCATCGAGAGCCT-3’／配列番号：34）。【００７９】
UBQプロモーター、OSH1プロモーター、PLA1プロモーターでHd3a遺伝子を発現させた形質転換イネを栽培した結果、Ghd7を恒常的に発現しているにも関わらず、各プロモーターに連結した外来導入のHd3aを有する系統では、開花が観察された。また一方で、Ghd7により転写の抑制調節を受けるHd3aプロモーターを用いた場合では、開花しなかった。これらの結果は、Ghd7が高いレベルで恒常的に発現していても、外来導入したHd3aを発現させてやることができれば、開花させることができることを示している。加えて、これらの結果は、Ghd7の花芽形成抑制機能が、Hd3aに対する転写レベルでの抑制制御を介してのものであり、Hd3aタンパク質の花芽形成促進機能を阻害するものではないことを示している。【００８０】
本実施例は、外来性のGhd7を恒常的に高発現しその結果開花が抑制された形質転換体においても、Ghd7による転写レベルでの調節を受けない誘導型プロモーターを用いてHd3aを発現させることができれば、開花期制御が可能であることを示している。【００８１】
（実施例3）  圃場でのプラントアクチベーター散布によるトランスクリプトーム解析
遺伝子発現を介して人為的に花芽形成を制御するための化学物質としてプロべナゾール（オリゼメート1kg粒剤（24%プロべナゾール含有、明治製菓））とイソチアニル（ルーチン1kg粒剤（3%イソチアニル含有、バイエルクロップサイエンス））の2種類の異なるプラントアクチベーターを用いて、圃場に展開したイネ日本晴に対する散布処理試験を施行し、経時的に採取した葉身サンプルでのトランスクリプトームの変化をマイクロアレイで解析した。【００８２】
圃場でのプラントアクチベーター散布処理（オリゼメート粒剤：1kg/a、ルーチン粒剤：1kg/a）は、対照区（薬剤無処理区）と薬剤処理区（オリゼメート散布用とルーチン散布用の2処理区）を互いの水が行き来しないように設けて行った。薬剤散布（2010/7/5開始）後、1日目（2010/7/6）、3日目（2010/7/8）、7日目（2010/7/12）、14日目（2010/7/19）、30日目（2010/8/4）に各処理区で葉身をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結した後、全RNAをRNeasy  Plant  Mini  Kit（キアゲン）で抽出した。全RNAの定量には、Nanodrop（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いた。全RNAは、業者推奨のプロトコルに従って2色法（Cy3あるいはCy5）で標識し、800ngの標識されたcRNAプローブを一つのマイクロアレイとのハイブリダイゼーションに用いた。【００８３】
マイクロアレイは、イネオリゴDNAマイクロアレイ（イネ44Kカスタムアレイ、アジレントテクノロジー）を用いた。このマイクロアレイは、イネアノテーションプロジェクト（Rice  Annotation  Project:RAP、http://rapdb.dna.affrc.go.jp)に基づいて設計されており、44000個からなるDNAプローブを搭載している。また、複数のプローブが一つの遺伝子に対して重複して配されている場合があり、それらをまとめると27201遺伝子分に相当する。一つの遺伝子に対して複数プローブが存在する場合は、各プローブのシグナル強度の平均値を対応する遺伝子のシグナル強度としている。マイクロアレイデータは、RとBioconductorパッケージ（http://www.r-project.org/;Workman  et  al.,  Genome  Biol.  2002;3(9):research0048）に実装されたqspline法で処理し、正規化して得られたデータをExcelで解析した。【００８４】
圃場で採取した葉身サンプルでのトランスクリプトームの経時変化を解析し、薬剤の処理区と無処理区のサンプル間で発現レベルを採取のタイミング毎に比較した結果、2種類の薬剤それぞれにおいて、2000個程度の遺伝子で発現レベルの増減（2倍以上と2分の1以下）がみられた（図4a）。また、発現レベルが10倍以上増加する遺伝子も数十以上見つかった（図4b）。さらに、プロベナゾールやBTH等のプラントアクチベーターに対する誘導性が報告されている遺伝子やWRKY45といったSAR関連遺伝子（Shimono  et  al.,  Plant  Cell  2007;19:2064-2076、Umemura  et  al.,  Plant  J.  2009;57:463-472）のマイクロアレイデータを調べてみると、オリゼメート粒剤やルーチン粒剤に対する発現誘導性が確認された（図5）。一方、開花期制御関連遺伝子（Izawa,  J  Exp  Bot.  2007;58(12):3091-7、Izawa,  Plant  Cell  Environ.  2012;35(10):1729-41）の発現を調べてみたところ、プラントアクチベーターに対する明らかな発現変化はみられなかった（図6）。これらの結果は、圃場でプラントアクチベーター処理により遺伝子発現が十分に誘導されることを示しており、花芽形成を促す目的でHd3a発現を誘導するための化学物質として、プラントアクチベーターを適用できることを示している。【００８５】
次に、圃場試験のトランスクリプトーム解析の結果において、プラントアクチベーターに対する誘導性がみられた遺伝子群の中から、外来導入するHd3aの発現を誘導するための最適な誘導型プロモーターを探索した。まず、2種類の薬剤を用いたそれぞれのマイクロアレイデータにおいて、薬剤処理後1日目、3日目、7日目、14日目の各データ点の無処理区のシグナル強度に対しての処理区のシグナル強度の倍率変化をイネ44KオリゴDNAマイクロアレイに搭載されている27201遺伝子毎に求め、4データ点のFold  change値を用いてRank  product（Breitling  et  al.,  FEBS  Lett.  2004;573(1-3):83-92）値を算出し、この値の昇順位60番以内を探索範囲の誘導性遺伝子群とした。【００８６】
Hd3a遺伝子本来の発現は、1）日長などの条件が満たされたときに強く発現するが、栄養成長期では抑えられており、通常ほとんど発現していない、2）葉の維管束師部で特異的に発現するが、根や茎などの他器官・組織では発現していない。これらの条件を考慮して、まず、上記の探索範囲の遺伝子群の中から非誘導時の発現レベルが低い（シグナル強度が250以下）遺伝子をオリゼメートを用いた場合では38個、ルーチンを用いた場合では41個それぞれ選び出した。そして、この選別で残った遺伝子において、RiceXpro（イネのトランスクリプトームデータベース、Sato  et  al.,  Nucleic  Acids  Research  2011;  39:D1141-1148）を利用して、葉で発現するが、他器官・組織では発現しない／低発現（生殖器官で発現している場合は除く）のものを選り分けた。オリゼメートを用いたデータからは10個、ルーチンを用いたデータからは13個の該当遺伝子が見つかり、これらの中から合わせて10個の遺伝子のプロモーターを目的の誘導型プロモーター候補として選び出した（表1）。また、プラントアクチベーターとして知られるBTHを処理した葉でのマイクロアレイデータ（Shimono  et  al.,  Plant  Cell.  2007;  19(6):2064-76）から、オリゼメートとルーチンを用いたデータからそれぞれ選び出した遺伝子と重複しないものを3つ選択し、合計13個の遺伝子のプロモーターを誘導型プロモーターの候補とした（表1、表2、図7）。オリゼメートを用いた場合とルーチンを用いた場合の両方で選び出された遺伝子については、Rank  product値の順位がどちらかで高い方で採用した。なお、遺伝子(1)から(11)、(13)のプロモーターの塩基配列を配列番号：35〜46に示した。遺伝子(12)のプロモーターの塩基配列は、上記の通り、配列番号：1に示した。【００８７】
【表１】
2014136793.tif 000002
【００８８】
【表２】
2014136793.tif 000003
【００８９】
（実施例4）  開花誘導系統の作出と開花誘導の検証
選抜した13個の遺伝子の推定プロモーター領域を表3に示すプライマーを用いてPCR増幅し、pCR  8/GW/TOPO（インビトロジェン）にクローニングして各遺伝子のプロモーターに対するエントリーベクターを構築した。【００９０】
【表３】
2014136793.tif 000004
【００９１】
そして、開花期制御プラスミド（pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a、図2a）における花芽形成誘導DNAカセットのプロモーター導入部位にLR反応により各遺伝子プロモーターを組込み、形質転換用のバイナリープラスミドを作製した。遺伝子(3)については、プロモーター領域以外に3’UTR領域（配列番号：75）をHd3a  cDNAのすぐ下流に位置するkpnI部位に挿入して、形質転換用バイナリープラスミドを作製した。これらをイネ品種日本晴の形質転換にそれぞれ用いた。形質転換は、実施例1に記載の方法で行った。遺伝子(6)と遺伝子(8)については、互いにパラログ遺伝子（重複遺伝子）であるため、遺伝子(8)のプロモーターを用いた形質転換体は作製しなかった。【００９２】
各遺伝子プロモーターを用いて作製した形質転換体において、系統毎に分げつを株分けして二つの複製個体を用意し、一方の個体をプラントアクチベーターの処理区に、もう一方の個体をプラントアクチベーターの無処理区にそれぞれ移植して、薬剤散布試験を行った。具体的には、処理用／無処理用の個体を別々のポットに土植えし、水を張った処理用／無処理用のコンテナにポットごと浸けこんで、湛水状態で生育および薬剤散布（ポットに薬剤を散布）を行った。【００９３】
株分け移植の際には、ゲノムPCR解析を行い、導入遺伝子を欠損することなく持つことを確認した系統を移植した。ゲノムDNA抽出は、実施例2に記載の簡易的な方法に従い、PCR解析に用いたプライマーは、以下の通りである。Ghd7：3UBQMF2（5’-tttagccctgccttcatacgct-3’／配列番号：76）と3Lhd4R1（5’-CGTCGTTGCCGAAGAACTGG-3’／配列番号：77）、Hd3a：Hd3a/F（XbaI）（5’-tctagaatggccggaagtgg-3’／配列番号：78）とHd3a/R（sacI）（5’-gagctcctagttgtagaccc-3’／配列番号：79）、Hpt：P35S1（5’-TCCACTGACGTAAGGGATGA-3’／配列番号：80）とNos3（5’-ATCAGCTCATCGAGAGCCT-3’／配列番号：81）。遺伝子(3)と遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体における導入遺伝子Hd3aの確認には、順向き側のプライマーとしてHd3a/F（XbaI）の代わりに、遺伝子(3)_colony_fw（5’-ttgtggatgcccTAACAGCTTGG-3’／配列番号：82）と遺伝子(12)_seqfw16（5’-GCTATTAGCTTGCTTTGG-3’／配列番号：83）をそれぞれ使用した。【００９４】
薬剤散布処理は、株分けした植物体を2週間〜4週間、ガラス温室あるいは人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で生育してから施した。遺伝子(1)と遺伝子(11)のプロモーターを用いた形質転換体については、移植段階あるいは薬剤散布処理段階で止葉／出穂が認められたため、それ以降の解析は行わなかった。遺伝子(2)から遺伝子(7)、遺伝子(9)、遺伝子(10)のプロモーターを用いた形質転換体には、ルーチン1kg粒剤あるいはオリゼメート1kg粒剤を1.0g/個体で薬剤処理した。また、遺伝子(12)と遺伝子(13)のプロモーターを用いた形質転換体には、ルーチン1kg粒剤あるいはオリゼメート1kg粒剤を0.5g/個体で5日毎に合計3回薬剤処理した。薬剤処理後、各系統において無処理区と処理区の植物から葉身をそれぞれ採取し、薬剤に対する遺伝子発現の誘導性を定量RT-PCR解析により調べた。【００９５】
採取した葉身からの全RNA抽出にはトリゾル試薬（インビトロジェン）を用いた。また、cDNA合成は、2μgの全RNAをオリゴd(T)12-18プライマー（インビトロジェン）を用いてSuperscriptII逆転写酵素（インビトロジェン）でマニュアルに従い合成した。リアルタイムPCRには、ABI7900リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズ）を使用し、SYBR  Green法（試薬は、Power  SYBR  Green  PCR  Master  Mix（アプライドバイオシステムズ）を使用）とTaq  Manプローブ法（試薬は、qPCR  Mastermix（Eurogentec）を使用）で定量RT-PCR解析を行った。定量RT-PCR解析に用いたプライマーとTaq  Manプローブの配列は表3にそれぞれ示している。【００９６】
各種遺伝子プロモーターを用いた形質転換系統において、用いた遺伝子プロモーターに対応する遺伝子の内在性発現をそれぞれ調べた結果、特に、遺伝子(3)、遺伝子(4)、遺伝子(5)、遺伝子(6)、遺伝子(12)で、無処理区の個体と比較して、処理区の個体での顕著な発現レベルの上昇がみられ、10倍以上の上昇を示す系統も確認できた（図8、図9、図10B、図11B）。また、各遺伝子プロモーターを連結して導入したHd3a（外来導入Hd3a）の発現を調べた結果、遺伝子(3)と遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体では、薬剤処理によるフロリゲンの発現誘導の有無の系統間差とプロモーターに用いた候補遺伝子自身の薬剤による発現誘導の有無の系統間が類似する系統をそれぞれ確認できた（図10AB、図11AB）。特に、遺伝子(3)のプロモーターを用いた場合では、誘導は、誘導が確認できた系統内で、一桁程度の差だったが、遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体では、外来導入Hd3aの誘導時の発現レベルが百倍以上増加する系統が複数みられた（図11A中のT0個体5、6、及び30）。【００９７】
作製した全ての形質転換体において系統毎に見られる外来導入Hd3aの非誘導時の基礎的な発現レベル（無処理個体で見られるような外来導入Hd3aの発現レベル）の差は、アグロバクテリウム法による遺伝子導入では、染色体中にランダムに導入遺伝子が挿入されるため、その位置効果に起因するものと考えられる。加えて、染色体中に挿入された導入遺伝子のコピー数の違いも影響すると考えられる。【００９８】
次に、開花（出穂）状況を調査した結果、遺伝子(3)プロモーターを用いた形質転換体では、今回作出した系統中のほとんどの系統で、薬剤の処理／無処理に関わらず未開花のままだったが、1系統で薬剤処理個体の14日早い出穂が観察された（図10C）。しかし、無処理個体でも開花が観察された。一方、遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換体では、無処理個体と比べて、処理個体でより早く咲く系統が多数みられ、一ヵ月以上の差を示す系統だけでなく、処理個体のみが咲く系統が複数観察された（図11Cの#25、#30を含む4系統以上）（図13）。【００９９】
また、本形質転換体では、高く恒常的に発現させるトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターを連結してGhd7を共導入している。遺伝子(3)と遺伝子(12)のプロモーターをそれぞれ用いた形質転換体で発現解析をした結果、Ghd7の発現は意図したように高いレベルを示しており、これに応じて内在性のHd3aの発現も低いレベルに抑えられていることも確認できた（図10DE、図12AB）。さらに、遺伝学的解析からHd3a/RFT1の下流で機能するとされるOsMADS14の発現を調べてみると、基本的に外来導入Hd3aの発現変動に対応した挙動を示した（図10F、図12C）。一部系統で完全に一致しない変動を示す系統もみられたが、これは、現時点では、OsMADS14の転写のフィードバック制御等が完全に理解されていないことによるものと考えられる。花芽分化に関わるAP1/FUL相同遺伝子OsMADS14やOsMADS15は、茎頂分裂組織ではHd3a/RFT1に活性化され、それらの下流で機能するとされるが、葉においてはHd3a/RFT1の上流で転写を活性化する報告もあり、Hd3a/RFT1と共に相互に転写を活性化しあうことも考えられている（Komiya  et  al.,  Development.  2008;135,767-774、Kobayashi  et  al.,  Plant  Cell.  2012;24(5):1848-59）。このように、OsMADS14の転写制御については、理解が不十分な点がある。また、シロイヌナズナのHd3a/RFT1オーソログFTにおいては、自身の転写を抑制するネガティブフィードバック制御も報告（Liu  et  al.,  PLoS  Biol.  2012;10(4):e1001313）されていることから、本実施例でみられた一部の系統での発現不一致は、OsMADS14自身の転写レベルでのネガティブフィードバック制御による可能性も考えられる。【０１００】
また、多数の系統で開花誘導がみられた遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換体において再度発現解析（薬剤処理後2週間目の葉サンプルを用いた解析）した結果、各系統において再現的な発現様式が確認できた（図14）。【０１０１】
本実施例において、非誘導時に比して、誘導時には外来導入Hd3aの発現レベルが百倍以上の増加を示す系統を作製することができ、かつ、単に開花の誘導がみられるだけでなく、実際に処理区の植物で一ヵ月以上開花を早め、無処理の場合では咲かないという薬剤で花芽分化の制御可能な形質転換系統を作製できた。【０１０２】
（実施例5）  穂の形態調査
実施例4で述べた遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換系統において、穂の形態調査を行った。【０１０３】
図15は、遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換体（(12)T0系統）の主茎についた穂の一穂粒数、一次枝梗数、一次枝梗あたりの平均粒数（平均粒数/一次枝梗）、穂長の計数結果を示している。対照系統（Cont.：Ghd7とHd3aの両導入遺伝子を持たない系統）と比較して、遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換体では、一穂粒数、一次枝梗数、平均粒数/一次枝梗、穂長でいずれもはっきりとした差はみられず、明らかな穂の形態異常は観察されなかった（図15）。【０１０４】
また、出穂した個体の登熟した全ての穂を回収（実施例4の図11Cの#28系統の無処理個体の出穂後40日目時点に回収）し、同様の調査を行った結果でも、明確な穂の形態異常はみられなかった（図16）。【０１０５】
（実施例6）  後代での開花誘導試験
遺伝子(12)のプロモーターを用いた形質転換体の後代（T1世代）において、プラントアクチベーター処理による開花誘導試験を行った。【０１０６】
プラントアクチベーターによる開花誘導が観察された形質転換当代（T0世代）のT0-35とT0-40（図17A）のT1分離世代をそれぞれ播種し、播種後40日目の植物の分げつを薬剤の処理用／無処理用に株分けして移植した。移植生育後、17日目に処理区の個体にルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を散布処理（0.5g/個体、5日後に同量を再処理）した（図17C）。T0-35系統のT1個体#4とT0-40系統のT1個体#8と#9については、播種後40日の時点で、止葉／節間伸長が観察されたので株分けしなかった。生育は、人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で行った。【０１０７】
株分けの際に、導入遺伝子をゲノムPCR解析により確認したところ、T0-35系統のT1世代の5個体（T1-1、T1-2、T1-8、T1-9、T1-10）とT0-40系統のT1世代の2個体（T1-2、T1-3）で導入遺伝子が検出されず、両系統ともにT1集団の分離がみられた。また、T0-35系統とT0-40系統のT1世代をそれぞれ3個体ずつゲノミックサザンブロッティング解析した結果、T0-35系統由来とT0-40系統由来でサイズは異なるが、全てのT1個体で単一のバンドがそれぞれ検出され、どちらの親系統もシングルコピーで導入遺伝子をもつことが分かった（図17B）。したがって、メンデルの法則に則って、1（ホモ）:2（ヘテロ）:1（導入遺伝子無）の割合で導入遺伝子が次の世代に伝わることから、株分け時に止葉が確認されたT0-35系統のT1-4とT0-40系統のT1-8、T1-9は、導入遺伝子を各々ホモに持つ系統であると推定される。【０１０８】
ゲノムPCR解析に用いたゲノムDNAは、実施例2に記載の簡易的な方法に従い抽出した。導入遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hpt）をプライマーP35S1（5’-TCCACTGACGTAAGGGATGA-3’／配列番号：84）とプライマーNos3（5’-ATCAGCTCATCGAGAGCCT-3’／配列番号：85）でPCR増幅することで確認した。【０１０９】
ゲノミックサザンブロッティング解析に用いた全ゲノムDNAは、植物の葉からCTAB法で抽出した。葉を液体窒素で凍結させながら、乳棒・乳鉢によりパウダー状に破砕し、予め温めておいた5mlの2xCTABバッファー（2%  CTAB、1.4M  NaCl、100mM  Tris-HCl（pH8.0）、20mM  EDTA、使用時に75lの2-メルカプトエタノールを添加）中でインキュベート（55℃、60分）した。その後、CIA溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール=24:：1）を等量加えてローテーターで30分間撹拌し、遠心分離（8000rpm、20分、室温）した。上清をイソプロパノール沈殿し、70%エタノールで洗浄した後400μlのTEバッファー（10mM  Tris-HCl、1mM  EDTA（pH8.0））に溶解し、RNase処理（1μlのRNase  G.S（10mg/ml  RNase、Wako）を加えて37℃、60分インキュベート）を施した。フェノール・クロロホルム処理を行い、上清をエタノール沈殿した後、50μlのTEバッファーに溶解して全ゲノムDNAを抽出した。【０１１０】
DNAのブロッティングは、Molecular  cloning:  A  Laboratory  Manual  3rd  Edition（ed.  Sambrook  J.  and  Russell  D.W.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  New  York,  2001）に記載の常法に従い行った。まず、日本晴と解析する形質転換体の全ゲノムDNA（3μg）をHindIIIでそれぞれ処理して、0.8％アガロースゲルで電気泳動（電圧50V、120分）により分離した。電気泳動後のゲルは、脱プリン化（0.25M塩酸溶液中で15分振とう）、アルカリ変性（アルカリ変性溶液（1.5M  NaCl、0.5M  NaOH）中で45分間振とう）、中和（中和溶液（1.0M  Tris-HCl（pH7.4）、1.5M  NaCl）中で45分間振とう）の各処理を行った後に、常法に従いブロッティング台を組み立て20xSSC溶液（3M  NaCl、300mM  クエン酸ナトリウム）を用いてナイロンメンブレン（Nylon  Membranes  positively  charged、Roche）にブロッティング（16時間以上）した。ブロッティング後のナイロンメンブレンへのDNAの架橋固定には、UVクロスリンカーを用いた。DNAプローブの作製、DNAハイブリダイゼーション、シグナル検出は、DIGシステム（Roche）に基づき、マニュアルに従い行った。検出シグナルは、X-線フィルム（GEヘルスケア）に感光させ、その画像をスキャナーでPCに取り込み解析した。【０１１１】
T1世代で開花調査をした結果、T0-35系統の3個体（T1-3、T1-6、T1-7）とT0-40系統の5個体（T1-1、T1-4、T1-5、T1-6、T1-7、T1-10）において、無処理個体よりも処理個体で顕著に早い開花が観察され、後代で薬剤による開花誘導が掛かることが分かった（図17C）。【０１１２】
本実施例は、導入形質が後代に安定的に伝わることを示している。【０１１３】
（実施例7）  圃場での開花誘導試験
実験環境下で薬剤処理による開花誘導が確認された遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換体の野外（韓国における圃場での栽培）での開花誘導試験を行った。【０１１４】
プラントアクチベーター剤が互いに行き来しないように設けられた薬剤散布の処理区と無処理区に、対照系統（日本晴）と1コピーの導入遺伝子をヘミに持つ系統（実施例5に記載のT0-40系統）のT1分離世代のそれぞれを10個体ずつ移植（12/5/5播種、12/6/5幼苗田植え）し、移植後3週間目（12/7/26）に処理区の植物にプロベナゾール6%粒剤（バイエルクロップサイエンス）の散布処理（一回45g/m2、5日毎に初回含め3回処理）を施した。【０１１５】
圃場で薬剤散布処理をし、開花状況を調査した結果、対照系統の日本晴は、薬剤の処理／無処理に関わらず、全ての個体が同じ時期（8月半ばから後半）に開花したが、一方で、形質転換体では、処理区の個体は全て開花したが、無処理区の個体は11月になっても3個体で開花しなかった（12/11/1時点）（図18A）。【０１１６】
咲かなかった無処理区の3個体（#4、#6、#9）と咲いた処理区の2個体（#17、#19）の葉からゲノムDNAをそれぞれ抽出し、PCR解析した結果、いずれの個体でも、導入遺伝子を持つことを確認した（図18B）。これらの結果は、遺伝子(12)プロモーターを用いた形質転換系統が野外でもプラントアクチベーター処理により開花誘導可能であることを示している。【０１１７】
葉からのゲノムDNA抽出は、FTAプラントキット（ワットマン）を用い、マニュアルに従い行った。PCR解析のプライマーは、HPT_probe_F（5’-GTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAA-3’／配列番号：86）とHPT_probe_R（5’-GCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3’／配列番号：87）を用いた。【０１１８】
本実施例は、実験環境だけでなく、野外環境でも、本発明が実際利用できることを示している。【０１１９】
（実施例8）  翻訳エンハンサーを導入した開花期制御DNAカセットを用いた例
前述の開花誘導に適した遺伝子(12)のプロモーターについて、翻訳エンハンサーが付加された開花期制御プラスミドpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a（図2B）を用いて、形質転換体（日本晴背景）を作製し、開花誘導試験を行った。【０１２０】
形質転換体の分げつを系統毎に株分けして、プラントアクチベーターの処理用と無処理用に複製個体を用意し、人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）に移植して生育した。移植生育後25日目の処理用の植物に薬剤散布処理を開始した。薬剤には、ルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を用い、1回あたり0.5g/個体の薬剤を5日毎に施し、初回を含め3回施した。【０１２１】
開花誘導試験の結果、無処理個体と比較して、薬剤処理個体でより早く咲く系統が複数観察された（図19C）。特に、#8と#24の系統においては、薬剤処理個体が38日目と35日目にそれぞれ出穂したが、無処理個体ではいずれの系統でも出穂が認められなかった（図19C、図21）。また、薬剤処理後3日目の葉を採取して定量RT-PCR解析により発現を調べた結果、顕著な開花誘導が観察された系統では、遺伝子(12)の発現誘導とともに、外来導入したHd3aの発現誘導が確認された（図19AB）。加えて、Ghd7遺伝子は恒常的に高く発現しており、同時に、内在のHd3a遺伝子の発現が抑えられていることも確認できた（図20AB）。【０１２２】
この試験においても、薬剤処理することでのみ開花する系統を複数得ることができた。【０１２３】
定量RT-PCR解析に付随するRNA抽出、cDNA合成、リアルタイムPCRについては、実施例4に記載の方法に従った。また、各遺伝子の定量RT-PCR解析は、表4に記載のプライマーおよびプローブを用いて行った。【０１２４】
【表４】
2014136793.tif 000005
【０１２５】
（実施例9）  飼料イネ品種に開花期制御DNAカセットを適用した例
つぎに、日本晴以外のイネ品種への本発明の適用を試みた。遺伝子(12)のプロモーターを導入した開花期制御プラスミド（pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a、図2a）を飼料イネ品種タチスガタとキタアオバの形質転換に用い、作出した形質転換体の開花誘導試験を行った。【０１２６】
人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で、プラントアクチベーターの処理用と無処理用に、形質転換体の分げつを系統毎に株分けして用意した複製個体を生育し、66日目に処理用の個体に薬剤処理を施した。薬剤には、ルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を用い、1回あたり0.5g/個体の薬剤を5日毎に施し、合計で3回施した。【０１２７】
定量RT-PCR解析により葉（薬剤処理後3日目の葉身）での発現を解析した結果、タチスガタとキタアオバのそれぞれの背景品種の形質転換体において、遺伝子(12)の発現誘導とともに、外来導入したHd3aの発現誘導が複数の系統で確認できた（図22AB）。系統によっては、十倍〜数百倍以上の外来導入Hd3aの誘導がみられている。また、Ghd7とHd3a両導入遺伝子を保有しない対照系統（タチスガタC1、タチスガタC2、キタアオバC1）とそれぞれで対応する背景品種の形質転換体系統と比較して、タチスガタとキタアオバの両背景品種の形質転換体で、Ghd7遺伝子の高い恒常発現とともに、内在のHd3aの発現も抑制されていることが確認できた（図23ABC）。次に、開花状況を調べてみると、タチスガタ1で10日以上、キタアオバ3で一月以上と、無処理個体と比べて処理個体でより早く開花する系統が観察され、両背景品種の形質転換体でも開花誘導が確認できた（図22C）また、両系統（タチスガタ1とキタアオバ3）では、いずれも、遺伝的にHd3aの下流で働くとされるOsMADS14の発現誘導も確認できた（図23C）。【０１２８】
本実施例は、本発明の適用が、イネであれば、品種に依らないことを示している。【０１２９】
（実施例10）  開花誘導系統の再開花誘導試験
これまでの実施例で、薬剤処理することで開花が誘導されるが、処理しなければ開花しない系統が複数系統作出できたと述べてきた。本実施例では、実施例4（図11C）に記載のT0-30系統および実施例8（図19C）に記載のT0-8系統とT0-24系統において、未開花のままの無処理個体の分げつを薬剤の処理用／無処理用に再度株分けして、再びの開花誘導試験を行った。【０１３０】
各系統の初回開花誘導試験後の無処理個体を株分けし、ガラス温室（温室）あるいは人工気象室（GC）（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で2週間〜4週間程度生育した後に、薬剤処理（ルーチン1kg粒剤、1回あたり0.5g/個体の薬剤を5日毎に処理、合計で3回処理した）を施して開花調査を行った。その結果、試験したいずれの系統においても薬剤処理個体での再度の開花が観察された（図24、図25）。【０１３１】
本実施例では、本発明で作出した系統が安定に／再現的に開花誘導可能であることを示している。【０１３２】
（実施例11）  トウモロコシにおける遺伝子(12)オーソログの発現誘導試験
トウモロコシ（Zea  Mays）のゲノム配列情報データベース（Maize  GDB;http://www.maizegdb.org/）において、イネ遺伝子(12)のアミノ酸配列をクエリーにBLAST検索を行った結果、遺伝子(12)のオーソログ遺伝子（GRMZM2G169947;http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaygenemodelrecord.cgi?id=GRMZM2G169947）が見つかった。このトウモロコシにおける遺伝子(12)オーソログのプラントアクチベーター処理に対する発現誘導性を試験した。【０１３３】
トウモロコシ（品種:Mi29）を人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で生育し、播種後2週間目の植物にルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）の散布処理（0.4g/個体）を施した。薬剤処理後、3日目、1週間目、2週間目に、葉をそれぞれ採取して定量RT-PCR解析を行った。定量RT-PCR解析は、実施例4に記載の方法に従った。プライマーの配列情報は表4に示している。定量RT-PCR解析の結果、トウモロコシにおける遺伝子(12)オーソログにおいても、薬剤処理したサンプルの方で発現レベルの顕著な上昇（10倍以上）がみられ、プラントアクチベーター誘導性が確認された（図26）。【０１３４】
本実施例では、本発明がイネ科作物トウモロコシへ適用可能であることを示しており、本発明の開花誘導DNAカセット（図2）のトウモロコシへの適用が可能であることを示している。【０１３５】
（実施例12）  トウモロコシにおける形質転換植物体の作製
（１）トウモロコシ未熟胚の準備
温室で、トウモロコシを1ポットにつき1個体ずつ育てた。昼間温度30〜35℃、夜間温度20〜25℃を維持した。光量は60,000  lx以上、明期12時間以上の光条件とした。受粉後8〜15日目の間に、正常な発達段階にある未熟胚を含む雌穂を採取した。雌穂の皮をはがし、メスの刃で穀粒の上部約半分を切りとり、メスの刃を残った穀粒の中に挿入し、メスの先端上に未熟胚を乗せて取り出した。1.0〜1.2mmの未熟胚が形質転換に向いている。2mlのチューブに入れた室温のLS-inf  medium  2mlに胚を浸しながら、200個ほど集めた。1時間以内に胚を集めることが好ましい。2,700r.p.m.、室温、5秒間胚を入れたチューブを攪拌し、その後LS-inf  mediumを取り除いた。2mlのLS-inf  mediumを新たに加え、同様に攪拌した。【０１３６】
（２）前処理と遠心
未熟胚を入れたチューブごと、46℃の恒温槽で3分間インキュベートした。未熟胚を入れたチューブごと、氷上で1分間冷やした。LS-inf  mediumを取り除いて、2mlのLS-inf  mediumを新たに加えた。未熟胚を入れたチューブを20,000g、4℃、10分間遠心した。【０１３７】
（３）アグロバクテリウムの準備
必要な選抜用薬剤を含むYP培地上で、アグロバクテリウム（LBA4404）を暗所にて28℃で2日間培養した。ループで菌を集め、1x109cfu/ml（660nmでOD=1.0）の菌密度になるようにLS-inf-AS培地1mlに懸濁した。なお、アグロバクテリウムに導入したトウモロコシ用ベクターコンストラクトの模式図を図27に示す。植物ゲノムへの外来遺伝子導入効率を上昇させるために、アグロバクテリウムには、さらにヘルパープラスミド（特許4534034号）を導入することが好ましい。【０１３８】
（４）接種と共培養
遠心後のチューブから培地を取り除き、アグロバクテリウムの懸濁液1mlを加えた。チューブを2700r.p.m.で30秒懸濁した。室温で5分間静置した。未熟胚とアグロバクテリウムの懸濁液を空のシャーレ（60x15mm）に移した。懸濁液から液体部分0.7mlを取り除き、廃棄した。胚盤が上になるように未熟胚をLS-AS固体培地に移し、パラフィルムでシャーレをシールした。約100個の未熟胚を1枚のシャーレに静置した。暗所にて25℃で14日間前後、共存培養させた。【０１３９】
（５）形質転換されたカルスの選抜
未熟胚をLSD1.5A培地に移し、シャーレをパラフィルムでシールした。約25個の胚を1シャーレに置いた。暗所にて25℃で10日間培養した（一次選抜）。未熟胚をLSD1.5B培地に移し、シャーレをサージカルテープでシールした。約25個の胚を１シャーレに置いた。暗所にて25℃で10日間培養した（二次選抜）。【０１４０】
（６）形質転換植物の再分化
さらに増殖させたタイプIカルスをLSZ培地に移し、パラフィルムでシャーレをシールした。約25個のカルスを1シャーレに置いた。5，000  lxの連続光に、25℃で14日間以上当てた。再分化したシュートをLSF培地を含むチューブに移し、ポリプロピレンのキャップをはめた。5，000  lxの連続光に、25℃で14日間以上当てた。それぞれの植物体を、適切な土を入れたポットに移した。形質転換植物体を上述した温室で3-4ヶ月生育させた。【０１４１】
なお、本実施例において用いた培養用試薬ストックおよび培地の組成は以下の通りである。【０１４２】
＜培養用試薬ストック組成＞
[10  x  LS  major  solts]
KNO3  19.0g
NH4NO3  16.5g
CaCl2・2H2O  4.4g
MgSO4・7H2O  3.7g
KH2PO4  1.7g      /1000ml【０１４３】
[100  x  FeEDTA]
FeSO4・7H2O  2.78g
Na2EDTA  3.73g      /1000ml【０１４４】
[100  x  LS  minor  salts]
MnSO4・5H2O  2.23g
ZnSO4  1.06g
H3BO4  620mg
KI  83mg
Na2MoO4・2H2O  25mg
CuSO4・5H2O  2.5mg
CoCl2・6H2O  2.5mg      /1000ml【０１４５】
[100  x  modified  LS  vitamins]
myoinositol  10g
thiamine  hydrochloride  100mg
pyridoxine  hydrochloride  50mg
nicotinic  acid  50mg      /1000ml
100mg/L  2,4-D
100mg/L  zeatin
100mg/L  IBA
100mg/L  6BA
100mM  acetosyringone
100mM  X-gluc
50mM  Na2HPO4
50mM  NaH2PO4【０１４６】
＜培地組成＞
[YPプレート（アグロバクテリウム用）]
yeast  extract  5g
peptone  10g
NaCl  5g      /1000ml
pH6.8
agar  15g
オートクレーブ後シャーレに分注【０１４７】
[LS-inf  medium（未熟胚の準備用）]
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
100mg/L  2,4-D  15ml
sucrose  68.46g
glucose  36.04g
casamino  acid  1.0g      /1000ml
pH5.2
0.22μM  セルロース−アセテートフィルターにて滅菌【０１４８】
[LS-inf-AS  medium（感染用）]
LS-inf  medium  1ml
100mM  acetosyringone  1μl【０１４９】
[LS-AS  medium（共存培養用）]
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
100mg/L  2,4-D  15ml
100mM  CuSO4  0.05ml
sucrose  20g
glucose  10g
proline  0.7g
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
agarose  8g
オートクレーブ
100mM  acetosyringone  1ml
100mM  AgNO3  0.05ml
シャーレに分注【０１５０】
[LSD  1.5A  medium]
（形質転換細胞の一次選抜用）
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
agar  8g
オートクレーブ
250g/L  carbenicillin  1ml
250g/Lcefotaxime  0.4ml
100mM  AgNO3  0.1ml
20g/L  phosphinothricin  0.25ml  or
(bar  selection)
50g/L  Hygromycin  0.3ml
(hpt  selection)
シャーレに分注【０１５１】
[LSD  1.5B  medium]
（形質転換細胞の二次・三次選抜用）
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
agar  8g
オートクレーブ
250g/L  carbenicillin  1ml
250g/Lcefotaxime  0.4ml
100mM  AgNO3  0.1ml
20g/L  phosphinothricin  0.5ml  or
(bar  selection)
50g/L  Hygromycin  0.6ml
(hpt  selection)
シャーレに分注【０１５２】
[LSF  medium（発根用）]
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
100mg/L  IBA  2ml
sucrose  15g
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
gellan  gum  3g
チューブに分注後、オートクレーブ【０１５３】
[LSZ  medium]
（形質転換細胞の再分化用）
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100  x  modified  LS  vitamins  10ml
100mg/L  zeatin  50ml
100mM  CuSO4  0.1ml
sucrose  20g
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
agar  8g
オートクレーブ
250g/L  carbenicillin  1ml
250g/L  cefotaxime  0.4ml
20g/L  phosphinothricin  0.25ml  or
(bar  selection)
50g/L  Hygromycin  0.6ml
(hpt  selection)
シャーレに分注【０１５４】
[ELA  medium]
10  x  LS  major  salts  100ml
100  x  FeEDTA  10ml
100  x  LS  minor  salts  10ml
100mg/L  6BA  5ml
MES  0.5g      /1000ml
pH5.8
agar  8g
オートクレーブ
Basta  0.1ml
(bar  selection)
50g/L  Hygromycin  2ml
(hpt  selection)
シャーレに分注。【０１５５】
（実施例13）  トウモロコシにおける形質転換植物体の作製
（１）  トウモロコシにおける遺伝子(12)オーソログのプロモーター領域の単離
実施例11に記載のトウモロコシにおける遺伝子(12)オーソログのプロモーター領域を単離するために、トウモロコシ（品種：Mi29）のゲノムDNAを鋳型に、プライマーGRMZM2G169947_pro_Fw（5’-CGGGATCATTGTCGGCCCTTTAACCCCATT-3’／配列番号：134）とプライマーGRMZM2G169947_pro_Rv（5’-CGATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCACACAGCCCTCTCTGTCTCTAGATAC-3’／配列番号：135）、あるいは、プライマーGRMZM2G169947_pro6.5_Fw（5’-CAGAAGGTTGTAACCAAGCAACTCTACTAG-3’／配列番号：136）とプライマーGRMZM2G169947_pro_Rv（5’-CGATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCACACAGCCCTCTCTGTCTCTAGATAC-3’／配列番号：135）の組み合わせで用いてPCR増幅を行い、サイズの異なる2種類のプロモーター断片（配列番号：133と配列番号：137）をpCR  8/GW/TOPO（インビトロジェン）にそれぞれクローニングした。【０１５６】
（２）  形質転換用のベクタープラスミドの作製
トウモロコシの形質転換体に用いたベクタープラスミドは、次のように作製した。まず、2種類の開花期制御プラスミドpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a（図2A、配列番号：19）とpRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a（図2B、配列番号：20）をそれぞれ鋳型に、プライマーKLB525_UbiGhd7_fw_inf（5’-TACCGAGCTCGAATTCTGCAGCGTGACCCGGTCGTG-3’／配列番号：138）とプライマーKLB525_Tnos_rv2_inf（5’-AGTTTAAACTGAATTCCCGATCTAGTAACA-3’／配列番号：139）を用いてPCR増幅した。次に、pKLB525ベクター（クミアイ化学）を制限酵素EcoRIで処理した部位に、上記のPCR増幅した2種類の断片をIn-Fusion HDクローニングキット（タカラ）を用いて、それぞれクローニングして、プロモーターを組み込む前の基礎となるバイナリーベクタープラスミドpKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a（図28のA、配列番号：140）とpKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a（図28のB、配列番号：141）を作製した。そして、2種類のトウモロコシ由来遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133と配列番号：137）および、イネ由来遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）をpKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3aとpKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3aのプロモーター導入部位に、LR反応によりそれぞれを組込み、6種類の形質転換用のベクタープラスミドを作製した（図29）。【０１５７】
（３）  トウモロコシにおける形質転換体の作製
予め行ったスクリーニングにより、植物組織培養適性ならびにF1品種の親としての能力にも優れる我が国（九州沖縄農業研究センター）育成のデント型トウモロコシ自殖系統Mi29を材料に用いた。【０１５８】
Mi29の形質転換は、選抜に用いる薬剤を除きIshida  et.  al.の方法（Nature Protocol  2(7):1614-1621,2007）に準じ、未熟胚へのアグロバクテリウム感染により行った。記載のない限り、培養は直径9ｃｍの滅菌済みペトリディッシュを用い、MS固形培地を基本とした。受精後7〜10日のMi29の未熟胚を摘出し、形質転換用のベクタープラスミドと形質転換効率を高める補助ベクターを保有するアグロバクテリウム菌（LBA4404株）に浸した後、46℃3分間の高温処置と4℃,20000G10分間の遠心分離処理を行い0.1ｍMのアセトシリンゴンを含むMS培地（LS-AS培地）で25℃暗所で約1週間培養した。未熟胚からは数日後にカルスが形成されるが、その後ビスピリバックナトリウム塩0.5μM、250mg/lカルベニシリンならびに100mg/lセフォタキシムを含む培地に移し25℃暗所で2週間培養した。ビスピリバックナトリウム塩に耐性を示して生き残ったカルスをさらに同一培地で2週間培養した後、28℃連続照明下で5mg/lのゼアチンを含むMS培地（LSZ培地）で2週間&#12316;１ヶ月培養し、シュート形成を促した。シュートが形成されたカルスは、棒びん中の0.2mg/lのIBAを含むMS培地（LSF培地）に移植し発根を促した。約2週間〜1ヵ月後、棒びん内で十分発根した組換え体をクレハ園芸培土を詰めた直径9ｃｍのビニールポット鉢上げした。【０１５９】
棒びん中あるいは鉢上げ後の植物体から葉を約25〜50mg切り取り、簡易法によりDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、以下のプライマーにより形質転換体における導入遺伝子の確認を行った。Hd3a遺伝子：GRMZM2G169947_pro_colonyfw2（5’-CTGTGGACTGTAGATCTCCATATGTA-3’／配列番号：142）とHd3a/R（sacI）（5’-gagctcctagttgtagaccc-3’／配列番号：79）、Ghd7遺伝子：3UBQMF2（5’-tttagccctgccttcatacgct-3’／配列番号：76）と3Lhd4R1（5’-CGTCGTTGCCGAAGAACTGG-3’／配列番号：77）。【０１６０】
（実施例14）  トウモロコシ形質転換体におけるプラントアクチベーター処理による発現誘導試験
実施例13に記載の鉢上げした形質転換体は、朝夕2時間ずつ植物育成用蛍光灯で補光した自然光下閉鎖系温室で栽培し、約2週間後にさらに深型ワグナーポットに移植した。【０１６１】
イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）とトウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター(配列番号：133)を用いた場合の導入遺伝子を持つ形質転換体7個体を薬剤誘導試験に用い、ワグナーポットの下底部の排水穴をシリコ栓で塞ぎ、地表面から約1ｃｍ湛水させた液面中にルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を0.5ｇ投入し、薬餌で攪拌して懸濁、融解させた。24時間後にシリコ栓を抜き、排水させた。また、薬剤誘導の5時間前に、薬剤の無処理サンプルとして予め葉身をサンプリングしておき、薬剤処理の一週間後に、再度、同一個体から葉身サンプルを採取し、RNA抽出に供した。【０１６２】
葉身サンプルからのRNA抽出、cDNA合成、定量RT-PCR解析は、実施例4に記載の方法で行った。また、定量RT-PCR解析に用いたプライマー配列は表4に示している。【０１６３】
トウモロコシ形質転換体で発現解析した結果、イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）とトウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133）のいずれを用いた場合でも、無処理時と比較して、処理時の葉での外来導入したHd3aの発現レベルはより高い値（差の大きい系統では数十倍から数百倍以上の誘導性がみられている）を示し、薬剤に対してのプロモーターの転写誘導性がトウモロコシでも確認できた（図30A）。また、各系統で、トウモロコシ遺伝子(12)オーソログの内在発現を調べたところ、同様に、無処理時と比較して、処理時の葉での発現レベルの方がより高く、薬剤処理の効果が確認できた（図30B）。【０１６４】
本実施例は、トウモロコシの遺伝子(12)オーソログプロモーターの活性がプラントアクチベーター誘導性を示すこと、並びに、イネ遺伝子(12)プロモーターが、イネでの実施例と同様に、イネ科作物であるトウモロコシでも機能することを示している。従って、イネ科作物品種においては、遺伝子(12)相同遺伝子であれば、そのプロモーターを用いての本発明の適用が可能であることを示している。【０１６５】
（実施例15）  トウモロコシの遺伝子(12)オーソログのプロモーターを用いたイネ形質転換体におけるプラントアクチベーター処理による発現誘導試験
（１）  形質転換用のバイナリーベクターの作製
実施例2に記載の開花期制御プラスミド（pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a、図2A、配列番号：19）のプロモーター導入部位に、サイズの異なるトウモロコシ由来の遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133又は配列番号：137）のプロモーター断片をLR反応によりそれぞれ組込み、2種類の形質転換用のバイナリーベクターを作製した（図31）。【０１６６】
（２）  イネの形質転換
2種類の形質転換ベクターのイネ（品種：日本晴）への形質転換には、上述の実施例1に記載の方法を用いた。作製したイネ形質転換体については、以下のプライマーを用いて、ゲノムPCR解析により導入遺伝子の確認を行った。Hd3a遺伝子：GRMZM2G169947_pro_colonyfw2（5’-CTGTGGACTGTAGATCTCCATATGTA-3’／配列番号：142）とHd3a/R（sacI）（5’-gagctcctagttgtagaccc-3’／配列番号：79）、Ghd7遺伝子：3UBQMF2（5’-tttagccctgccttcatacgct-3’／配列番号：76）と3Lhd4R1（5’-CGTCGTTGCCGAAGAACTGG-3’／配列番号：77）、HPT遺伝子：P35S1（5’-TCCACTGACGTAAGGGATGA-3’／配列番号：80）とNos3（5’-ATCAGCTCATCGAGAGCCT-3’／配列番号：81）。【０１６７】
（３）  プラントアクチベーター処理による発現誘導解析
一つの系統の形質転換体をプラントアクチベーターの処理用／無処理用に分けて扱うために、系統毎に分げつを二つに株分けして、ガラス温室に移植し、湛水状態で生育した。そして、生育後34日目の処理用の個体に薬剤散布処理を施し、誘導試験を開始した。薬剤には、ルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を用い、個体あたり0.5gの薬剤を施した。処理開始の5日後に、各系統において無処理個体と処理個体から葉身をそれぞれ採取し、薬剤に対する遺伝子発現の誘導性を定量RT-PCR解析により調べた。一方で、一分げつしかなく、株分けできない系統については、薬剤処理前に葉を採取しておき、処理後に再び同一個体から葉を採取するという解析手法を用いた。葉身サンプルからのRNA抽出、cDNA合成、定量RT-PCR解析は、実施例4に記載の方法で行った。また、定量RT-PCR解析に用いたプライマーとTaqManプローブの配列は表4にそれぞれ示している。【０１６８】
発現解析の結果、サイズの異なる2種類のトウモロコシ遺伝子(12)オーソログプロモーター（配列番号：133と配列番号：137）のいずれを用いた場合においても、無処理葉と比較して、処理葉で、外来導入したHd3aのより高いレベルの発現（差の大きい系統では数十倍から数百倍以上の誘導性がみられている）が検出され、薬剤に対しての誘導発現が確認できた（図32A）。また、薬剤誘導性の陽性対照であるイネ遺伝子(12)の内在発現を解析しても、処理葉でのより高い誘導発現が確認できた（図32B）。【０１６９】
本実施例は、トウモロコシ由来の遺伝子(12)オーソログのプロモーターが、イネでも、プラントアクチベーター誘導性を発揮することを示しており、イネ由来のみならず、トウモロコシ由来のものも本発明に用いることが出来ることを示している。従って、イネ科作物品種においては、遺伝子(12)相同遺伝子であれば、そのプロモーターを用いての本発明の適用が可能であることを示している。【０１７０】
（実施例16）  サトウキビにおける形質転換植物体の作製
（１）形質転換体の作製
（ａ）形質転換用ベクター
形質転換用ベクターとして、実施例４に記載の遺伝子(12)プロモーターを導入した形質転換用プラスミドを使用した。【０１７１】
（ｂ）アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法
約3か月程度温室で生育させたサトウキビ品種  Saccharum  spp.  Q165の梢頭部の巻葉内部の白色巻葉1cmを無菌的に摘出、カルス誘導用N6D培地に置床、28℃暗条件下で約４カ月継代培養、黄色のカルス塊を得た。その間、3週間に一度新しい培地に組織片を移植した。得られたカルスに対し、アグロバクテリウム法によって（ａ）項に記載のベクターの形質転換を行った。形質転換にはアグロバクテリウムEHA105株を利用した。アグロバクテリウムを処理したカルスをN6D培地に置床し、28℃、暗条件で3日間の共存培養を行った。その後、滅菌水及びカルベニシリン溶液でアグロバクテリウムを除菌し、50mg/lのハイグロマイシン、500mg/lのカルベニシリンを含む選抜用N6D培地に置床した。カルスの選抜は、28℃暗条件下で1-2ヶ月行った。途中、2週間に一度新しい培地にカルスを移植した。得られたハイグロマイシン耐性カルスを50mg/lのハイグロマイシン、500mg/lのカルベニシリンを含む再分化培地N6REに置床し、28℃、16L/8D（16時間明期、8時間暗期）条件下で約1ヶ月培養した。その間、２週間に一度新しい培地に組織片を移植した。得られた再分化植物体は、50mg/lのハイグロマイシン、500mg/lを含むホルモンフリーのMS培地に移植し、28℃、16L/8D（16時間明期、8時間暗期）、50μmol/m2/s条件下で約1ヶ月培養した。その間、2週間に一度新しい培地に組織片を移植した。再分化した個体を、組換え体として実験に用いた。【０１７２】
なお、各培地の組成は以下の通りである。【０１７３】
[N6D培地]
N6培地3.95g/l、スクロース30g/l、植物培地用Agar  0.9g/l、N6ビタミン(＊)1ml/l、ミクロ+α(※)1ml/l、2,4-D  5mg/l、pH5.8【０１７４】
[N6RE培地]
N6培地3.95g/l、スクロース30g/l、植物培地用Agar  0.9g/l、N6ビタミン(＊)1ml/l、ミクロ+α(※)1ml/l、BAP  1mg/l、カザミノ酸500mg/l、pH5.8【０１７５】
[MS培地]
N6培地3.95g/l、スクロース30g/l、Gellan  Gum  2g/l、  N6ビタミン(＊)1ml/l、ミクロ+α(※)1ml/l、pH5.8【０１７６】
[(＊)  N6ビタミン  ストック液]
グリシン2mg/l、チアミン塩酸塩  1mg/l、塩酸ピリドキシン  0.5mg/l、ニコチン酸  0.5mg/l、myo-イノシトール  100mg/l【０１７７】
[(※)  ミクロ+α  ストック液]
CuSO4・5H2O  0.025mg/ml、CoCl2・6H2O  0.025mg/ml、Na2MoO2・2H2O  0.25mg/ml【０１７８】
（２）オリゼメート処理試験
（ａ）栽培条件
12GH組換え体等の植物体は、気温28℃、16L/8D（16時間明期、8時間暗期）、210μmol/m2/s、湿度55％に設定した人工気象室（コイトトロン、コイト電工）内で栽培した。灌水は、鉢上面より実施した。【０１７９】
（ｂ）オリゼメート処理方法
鉢上げ後12日経過した植物体に対し、オリゼメート処理を実施。オリゼメート処理区については、9ｇ/Lで懸濁したオリゼメート粒剤（プロベナゾール8％、Meiji  Seika  ファルマ社製）を1株あたり100ｍｌ、1日目（1回目）、4日目（2回目）、10日目（3回目）に鉢上面より散布した。オリゼメート無処理区については、処理区と同量の水を鉢上面より散布した。【０１８０】
（ｃ）サンプリング
オリゼメート処理4日目（2回目）、10日目（3回目）のオリゼメート処理前の植物体成葉を取得した。【０１８１】
（３）発現解析
（ａ）RNA抽出、逆転写
上記で取得した植物体成葉について、RNeasy  Plant  Mini  Kit(QIAGEN社製）を用いて総ＲＮＡを抽出精製し、PrimeScript  RT  reagent  Kit（タカラバイオ社製）を用いて鋳型ｃDNAを合成した。【０１８２】
（ｂ）発現解析
リアルタイムPCRによるRNA発現解析についてはABI  7500  Real  Time  PCR  System（Applied  Biosystems社製）を用いて行なった。【０１８３】
Actin、Hd3a遺伝子の増幅産物の定量は、SYBRGreen法（SYBR  premix  Ex  Taq  タカラバイオ社製）を用いて行なった（Actin用プライマー：T06F  CA000593_F,  T06R  CA000593_R、Hd3a用プライマー：AgqOsH3-F,  AgqOsH3-R）。【０１８４】
Ghd7遺伝子の増幅産物の定量は、TaqMan法（Premix  Ex  Taq  タカラバイオ社製）を用いて行なった（Ghd7用プライマー：OsBrqtG7-F,  OsBrqtG7-R、TaqManプローブ：OsBrqtG7-P）。【０１８５】
（実施例17）  サトウキビにおける形質転換植物体の作製
（１−１）  材料
・サトウキビの梢頭部（最上位の節部分、品種：Q165）
・12AGHベクター
なお、12AGHベクターは、開花期制御プラスミド（pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a、図2B）のプロモーター導入部位にイネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）を導入した形質転換用ベクターである。【０１８６】
（１−２）  カルス作製
先ず、クリーンベンチ内で、梢頭部の外皮を剥がし、表面を70％エタノールで除菌した。次いで、直径8ｍｍ程度の太さまで表皮を剥がし、再度表面を70％エタノールで除菌した。直径が5ｍｍ程度の太さになるまで、さらに表皮を剥がした。そして、生長点近辺より上部を5ｍｍ程度に切断し、1シャーレずつに7切片ずつカルス誘導培地に置床し、28℃、暗黒下で、3-4ヶ月培養した。その際、1ヶ月毎に経代した（カルス誘導培地：N6  1L分、Sucrose  30ｇ、植物用Agar  9g、MS  vitamine  1ml、チアミン塩酸塩  1mg、ミクロ+α  1ml、2-4,D  5mg、ココナツウォーター  50ml、シャーレ50ｍｌ、pH5.8）。【０１８７】
（１−３）  感染用アグロバクテリウムの準備
12AGHベクターをアグロバクテリウムEHA105にエレクトロポレーションで導入し、ハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB寒天培地にて培養した。得られたシングルコロニーをハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB液体培地にて培養し、80％グリセロール溶液に懸濁、これをストックソリューションとした。【０１８８】
（１−４）  感染用菌液と共存培地の調製
ストックソリューションをハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB液体培地にて一晩培養し、菌を回収、N6液体培地に懸濁した。懸濁したアグロ液に20mg/Lアセトシリンゴンを添加し、N6液体培地にて希釈し感染用菌液とした。共存用培地には、深型シャーレにろ紙（φ9mm）3枚を押し込み、共存液体培地5mLで湿らしたものを使用した（共存液体培地：N6  1L分、Sucrose  30ｇ、MS  vitamine  1ml、チアミン塩酸塩  1mg、ミクロ+α  1mｌ、2-4,D  5mg、アセトシリンゴン  20mg、シャーレ9ｍｌ、pH5.8）。【０１８９】
（１−５）  感染および共存培養
（１−４）で調製した感染用菌液に、（１−２）にて作製したカルスを浸し感染を行った。約10分浸した後、感染用菌液を良く吸い取り、共存培地に置床、28℃、暗黒下にて4日間培養した（共存培地：N6  1L分、Sucrose  30ｇ、植物用Agar  9g、MS  vitamine  1ml、チアミン塩酸塩  1mg、ミクロ+α  1mｌ、2-4,D  5mg、アセトシリンゴン  20mg、シャーレ9ｍｌ、pH5.8）。【０１９０】
（１−６）  選抜培養
4日間の共存培養後、選抜培地に置床した（選抜培地：N6  1L分、Sucrose  30ｇ、植物用Agar  9g、MS  vitamine  1ml、チアミン塩酸塩  1mg、ミクロ+α  1mｌ、2-4,D  5mg、ハイグロマイシン  50ml、カルベニシリン  500mgl、シャーレ50ｍｌ、pH5.8）。28℃暗黒下にて2-3ヶ月培養を行い、1ヶ月毎に経代を行った。【０１９１】
（１−７）  再分化培養
選抜培地上のカルスを、黄色のやや固めのカルスを4ｍｍ大に分け、再分化培地上に移植した（再分化培地：Ｎ6  1L分、Sucrose  30g、植物用Agar  9g、MS  vitamine  1ml、チアミン塩酸塩  1mg、ミクロ+α  1mｌ、BAP  1mg、カザミノ酸  500mg、シャーレ50ｍｌ、pH5.8）。28℃、16時間日長、50μmol/m2/sで、1ヶ月培養を行った。【０１９２】
（１−８）  発根培養
再分化誘導中にシュートが2-3cm以上に生長後、発根培地に移植（発根培地：Ｎ6  1L分、ゲランガム  2ｇ、MS  vitamine  1ml、ミクロ+α  1ｍｌ、100ｍＬ/ポット、ｐＨ：5.8）。28℃、16時間日長、50μmol/m2/sで、1ヶ月培養を行った。【０１９３】
（１−９）  馴化
発根培地中で、全長5ｃｍとなり発根した個体について、馴化を行った。植物を培養ポットから取り出し、根についた培地を除去した後、バーミキュライトを入れたセルトレーに移植した。水を供給後、水分ストレスが起こらないよう、セルトレーをコンテナに入れ、全体をビニールで覆った。一週間毎にビニールとコンテナの隙間を広げ、1ヶ月で馴化を完了した（栽培室条件：28℃、16時間日長、250μmol/m2/s、湿度60％）。【０１９４】
（１−１０）  PCRでの遺伝子導入確認
目的遺伝子導入用の下記プライマーを用い、PCRにより遺伝子導入確認を行い、導入確認ができたものを遺伝子導入系統として用いた。
使用プライマー：
HPT：Nos3（配列番号：81、P35S1（配列番号：80）
Ubi:Ghd7：3UBQMF2（配列番号：76）、3Lhd4R1（配列番号：77）
(12)プロモーターHd3a：(12)Fw（配列番号：83）、Hd3a/R（Sac）（配列番号：79）【０１９５】
（１−１１）  組換え体作製の結果
上記の方法にて再分化系統を40個体得ることができたが、（1-10）に記載の通り、HPT用プライマーを用いたPCR解析により、HPT遺伝子導入の確認を行ったところ、該遺伝子が導入されている系統（hpt導入系統）は18系統であったことが確認された。【０１９６】
これらhpt導入18系統について、Ubi:Ghd7プライマー、(12)プロモーターHd3aプライマー及びHd3a cDNA用プライマーを用いて、PCR解析を行ったところ、以下の通り、各遺伝子が導入されている系統が得られていることが確認された。【０１９７】
(12)プロモーターHd3a、Hd3a  cDNA及びUbi:Ghd7の導入が確認された系統：10系統（No.3,5,7,10,11,12,13,14,16,18）
(12)プロモーターHd3a及びHd3a  cDNAの導入が確認された系統：1系統(No.17)。【０１９８】
（実施例18）  イネ由来遺伝子(12)プロモーターを用いたサトウキビ形質転換体におけるプラントアクチベーター処理による発現誘導試験
（２−１）  材料
・12AGH組換え体
・対照系統（コントロール）【０１９９】
（２−２）  誘導試験供試系統の準備
12AGH系統については遺伝子の導入確認済系統を1鉢2本植えで、処理区と無処理区用として、各2鉢ずつ用いることとした。【０２００】
対照系統（コントロール）については、鉢上げの3週間前に各系統のサトウキビ腋芽（茎）を5ｃｍ長に切断後、バーミキュライトを入れたセルトレーに植え付けて、植物体を確保した。上記同様、1鉢2本植えで、処理区と無処理区用として各2鉢ずつ用いることとした（対照系統：12GH、Q165(wild  type)）。なお、12GHは、開花期制御プラスミド（pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a、図2A）のプロモーター導入部位に、イネ遺伝子(12)のプロモーター（配列番号：1）を導入した形質転換用ベクターを用いて作製したサトウキビ形質転換体の一イベント系統である。【０２０１】
（２−３）  誘導試験供試系統の鉢上げ
12AGH導入系統および対照系統について、約20ｃｍに生長した後、1鉢に2本植えで、各2鉢移植した（ボンソル2号  住友化学、植栽ポットR18（直径18ｃｍ）グンゼ）。28℃、16時間日長、250μmol/m2/s、湿度60％で栽培した。【０２０２】
（２−４）  誘導処理とサンプル取得
鉢上げから2週間以上経過させた後、薬剤処理を開始した。また、オリゼメート処理は処理開始日を1日目として、処理区に対し、1、6、10日目に行った。なお、処理については、9ｇ/Lで懸濁したオリゼメート粒剤（プロベナゾール8％、Meiji  Seika  ファルマ社製）を1株あたり100ｍｌ、鉢上面より散布した。無処理区については、処理区と同量の水を鉢上面より散布した。そして、サンプル取得は、処理区無処理区共、1、6、10、16日目とし、各々オリゼメートの処理直前に、各植物体の先端の葉2枚より50mg分取得し、液体窒素で凍結させ、-80℃で保存した。【０２０３】
（２−５）  RNA取得
凍結させたサンプルを、液体窒素を用いて、乳鉢にて粉状になるまで破砕した。破砕したサンプルをRｎeasy  Plant  Mini  Kit(QIAGEN)を用いてRNAを取得した。DNaseI処理については、RNase-Free  DNase  Set（QIAGEN）を用いてカラム上で処理を行った。濃度については、NanoDrop2000(Thermo  Scientific)、Bioanalyzer  2100(RNA6000  kit、Agilent)を用いて測定し、逆転写の際の持込み量を決定した。【０２０４】
（２−６）  逆転写
PrimeScripr  RT  reagent  Kit(Takara)を用いて、逆転写を行った。【０２０５】
（２−７）  Ghd7発現解析
誘導処理前サンプルについて、Ghd7発現解析を実施した。Premix  Ex  Taq(Takara)を用いて、以下の条件にて、各サンプルを3反復で解析した。【０２０６】
検量線サンプルとして12GHベクター希釈系列（107〜102）を用い、プライマーセットとしてOsBrqtG7-F及びOsBrqtG7-Rを用い、TaqManプローブとしてOsBrqtG7-Pを用いた。そして、これらを含む反応混合物を、95℃にて30秒間加熱した後、95℃にて5秒間及び60℃にて34秒間から構成される反応サイクルを4回実施した。得られた結果を図33に示す。【０２０７】
（２−８）  Ghd7発現解析の結果
（１−１１）にてHPT遺伝子の導入が確認された18系統について、（２−７）に記載の通りGhd7の発現解析を実施した。その結果、図33に示す通り、hpt導入系統  No.3、5、7、10、16及び18において、Ghd7遺伝子の高い発現量が認められた。【０２０８】
（２−９）  Hd3a発現解析
Hd3a発現解析誘導処理サンプルについて、処理区、無処理区サンプル共、SYBR  premix  Ex  Taq(Takara)を用いて、以下の条件にて、各サンプルを3反復で解析し、各サンプルにおけるHd3a遺伝子の発現量を解析した。なお、Ghd7発現量の高い系統を優先して解析した。【０２０９】
Hd3a検量線サンプルとして12GHベクター希釈系列（107〜102）を用い、Hd3aプライマーセットとしてAgqOsH3-F及びAgqOsH3-Rを用いた。またActin検量線サンプルとしてサトウキビQ165ｇDNA、Actin増幅サンプル希釈系列（107〜102）を用い、ActinプライマーセットとしてScActinT06F及びScActinTo6Rを用いた。そして、これらを含む反応混合物を、95℃にて30秒間加熱した後、95℃にて5秒間及び60℃にて34秒間から構成される反応サイクルを４０回実施した後、さらに95℃にて15秒間、60℃にて1分間、95℃にて15秒間加熱した。得られた結果を図34に示す。【０２１０】
（２−１０）  Hd3a発現解析の結果
（２−８）にて明らかになったGhd7発現量が高い系統（No.3、5、7、10、16及び18）について、（２−９）に記載の通り、イネ遺伝子(12)プロモーターに連結して外来導入したHd3a遺伝子の発現量を調べた。その結果、図34に示す通り、Hd3a遺伝子のサトウキビでの発現を検出することができた。また、無処理時と比較して、処理時においては、外来Hd3a遺伝子のより高い発現値が検出され、プラントアクチベーター処理による薬剤誘導性を、サトウキビにおいても確認することができた。【０２１１】
（実施例19）  飼料イネ品種キタアオバに開花期制御DNAカセットを適用した例2
飼料イネ品種キタアオバの形質転換に、イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）を導入した開花期制御プラスミド（pRiceFOX//Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a、図2B）を用い、作出した形質転換体（T0世代）においてプラントアクチベーター処理による開花誘導試験を行った。キタアオバの形質転換は、実施例1に記載の方法に従って行った。【０２１２】
系統ごとに形質転換体の分げつを株分けして、プラントアクチベーターの処理用と無処理用に用意した複製個体を人工気象室（長日条件：14.5時間明期：9.5時間暗期、温度設定：明期28℃:暗期25℃、照明：メタルハライドランプ500μE）で生育し、その後37日目に処理用の個体にプラントアクチベーター散布処理を開始した。薬剤には、ルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を用い、1回あたり0.5g/個体の薬剤を5日毎に施し、合計で3回施した。薬剤処理を開始してから、3日目および2週間目に、各系統からそれぞれ葉身を採取し、定量RT-PCR解析に供した。【０２１３】
葉身サンプルからのRNA抽出、cDNA合成、定量RT-PCR解析は、実施例4に記載の方法で行った。また、定量RT-PCR解析に用いたプライマーとTaq  Manプローブの配列は表4にそれぞれ示している。【０２１４】
定量RT-PCR解析により葉（薬剤処理後3日目の葉身）での発現を解析した結果、陽性対照である遺伝子(12)の誘導発現とともに、外来導入したHd3a遺伝子の誘導発現が多数の系統で確認できた（図35Aおよび図35B）。系統によっては、数十倍以上の誘導性がみられている。また、Hd3a遺伝子と同時に、外来導入したGhd7遺伝子の発現を調べてみると、恒常的に発現していることが確認でき、対照系統（C1とC2）と比較して、内在のHd3a遺伝子の発現が抑えられていることも確認できた（図36Aおよび図36B）。さらに、薬剤処理後2週間目の葉サンプルを用いて再度発現解析をした結果においても、各系統において再現的な発現様式が確認された（図3７A〜図3７D）。次に、開花状況を調べてみると、#20と#21の系統で、無処理個体と比較して処理個体でのより早い出穂が観察され、薬剤処理による開花誘導が確認できた（図35C）。【０２１５】
（実施例20）  飼料イネ品種タチスガタに開花期制御DNAカセットを適用した例2
飼料イネ品種タチスガタの形質転換に、イネ遺伝子(12)プロモーター（配列番号：1）を導入した開花期制御プラスミド（pRiceFOX//Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a、図2B）を用い、作出した形質転換体（T0世代）においてプラントアクチベーター処理による開花誘導試験を行った。タチスガタの形質転換は、実施例1に記載のイネの形質転換法に従って行った。【０２１６】
作出した形質転換体を系統ごとにプラントアクチベーターの処理用／無処理用に分けて扱うために各系統の分げつを株分けし、ガラス温室に移植して薬剤による誘導試験を行うまで生育した。移植生育後49日目に処理を行う方の個体に薬剤散布処理を施し、誘導試験を開始した。薬剤には、ルーチン1kg粒剤（バイエルクロップサイエンス）を用い、1回あたり0.5g/個体の薬剤を5日毎に施し、合計で3回施した。薬剤処理を開始してから、5日目および2週間目に、各系統の無処理個体と処理個体からそれぞれ葉身を採取し、定量RT-PCR解析に供した。【０２１７】
葉身サンプルからのRNA抽出、cDNA合成、定量RT-PCR解析は、実施例4に記載の方法で行った。また、定量RT-PCR解析に用いたプライマーとTaq  Manプローブの配列は表4にそれぞれ示している。【０２１８】
定量RT-PCR解析により葉（薬剤処理後5日目の葉身）での発現を解析した結果、無処理時と比較して、処理時で外来導入したHd3a遺伝子のより高いレベルの発現（差の大きい系統では数十倍以上の誘導性がみられている）が多数の系統において検出され、薬剤に対しての発現誘導性が確認できた（図38A）。また、薬剤誘導性の陽性対照である遺伝子(12)の発現を解析しても、処理時でのより高い誘導発現が確認できた（図38B）。加えて、対照系統（C1とC2）と比較して、形質転換体では外来導入したGhd7遺伝子の高いレベルの恒常発現とともに、内在のHd3a遺伝子の発現が抑制されていることも確認できた（図39Aおよび図39B）。さらに、薬剤処理後2週間目の葉サンプルを用いて再度発現解析をした結果においても、各系統において再現的な発現様式が確認された（図40A〜図40D）。次に、出穂状況を調べてみると、複数の系統で処理個体の方が無処理個体よりもより早く出穂することが観察され、薬剤処理による開花の誘導性が確認できた（図38C）。特に、#15と#30の系統では、薬剤処理した個体のみが出穂した（図38C）。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
作物の重要な栽培特性の一つに開花期が挙げられる。作物品種の改良の際には、収量性、品質（食味など）、環境耐性（耐病性、耐倒伏性など）などを目標として、あるいは飼料用や燃料資源用（バイオエタノールなど）といった用途に応じて、改良が試みられてきた。しかしながら、これまでの品種はそれぞれの遺伝背景に基づいて特有の開花期をもち、品種ごとの開花期の違いは、栽培に適した地域、時期を制限していた。例えば、イネの栽培では、ある地域で優良な品種が育成されても、他の地域で同じように栽培することは困難となっていた。特に、日本においては地理的に南北に広がりがみられるため、その地域の日長などの自然条件に応じたイネ品種の選択が不可欠であった。したがって、開花期が栽培しようとする地域に適さない場合は、新たに品種改良を行う必要が生じていた。本発明は、このような品種固有の開花期の違いによる、栽培可能な地域や時期の拡大に利用することができる。【０２２０】
農作物の生産性を考えた場合、開花期の違いがしばしば収量性形質に大きな影響を与える。これは、栄養成長期の期間の長さの違いにより、早咲きでは植物体が小さい状態で、遅咲きでは植物体が大きい状態で開花することが収量性に影響するためと考えられる。実際に、栄養成長期間の延長は、植物体の草丈や乾燥重量の増大をもたらし、バイオマス増大に結びつく。また、開花制御遺伝子の開花期以外への影響も報告されてきている。例えば、イネでは、Ghd7遺伝子は開花期を遅らせる働きを持つだけでなく、圃場での試験で粒数や草丈にも影響することが知られているし、Ehd1遺伝子とHd1遺伝子といったHd3a遺伝子/RFT1遺伝子の発現制御に関わる開花制御遺伝子が穂の形態形成に作用することが報告されている（Xue  et  al.,  Nat  Genet.  2008;  40(6):761-7、Endo-Higashi  et  al.,  Plant  Cell  Physiol.  2011;52(6):1083-96）。このように、開花制御遺伝子の収量性形質といった開花期以外の形質への影響も注目されている。また一方で、現在の作物のすべての品種は、独自の開花期によって、その潜在能力が大きく制限されていると考えられる。例えば、光合成能力が高くても、遺伝的に早生なら、植物体が小さいまま、早く咲いてしまう。実例として、北海道に適応したイネ品種は、本州で栽培すると、さらに早生になり、収量性は北海道での栽培以下になることが知られている。また、開花期がずれると、例えば、高温登熟による品質低下というように、品質への影響が懸念される。しかしながら、これまでに述べてきたように、現生の農業品種は、栽培する品種と移植日を決めると、開花期はほぼ確定してしまい、おおよその収量性も規定されていた。したがって、本発明における柔軟な開花期調節は、これまでにない収量性やバイオマス向上といった栽培品種としてのポテンシャル向上にも貢献し得ると考えられる。【０２２１】
イネの品種には、育種・産業利用上の目的から、Ghd7遺伝子の機能が欠損した品種が幾つかある。これらの品種は、主に、北に位置する地方で栽培するために改良を施されてきた。こうしたことから、それらの品種を本州で栽培すると早咲きになり、本来の収量性が得られなくなってしまっていた。また、たとえ北での栽培に適していたとしても、遺伝的には早咲きなので、限られた栄養成長期を経ての開花を迫られるが、これを克服するために、そのような品種は、収量性に優れた品種であることが多い。したがって、本発明は、中緯度やより南の地方では、Ghd7遺伝子機能の欠損による開花期の不適合から潜在能力を発揮できない品種への適用が考えられる。【０２２２】
また、植物は、昼間の葉で光合成により合成された糖をデンプンとして葉に蓄積するか、ショ糖の形で他器官に転流することが知られている。イネの場合では、転流されたショ糖は葉の根本部分（稈）にデンプンとして蓄積されるが、花芽誘導すると葉等に蓄積されたデンプンがコメ部分の生育のためにショ糖として転流されるようになる。したがって、開花期の制御により茎葉での糖の蓄積の制御が可能と考えられる。こうしたことから、茎葉部分を含む地上部全体を刈り取って供するWCS（ホールクロップサイレージ）のような飼料用イネ品種への本発明の適用も考えられる。【０２２３】
また、サトウキビやトウモロコシといった他のイネ科単子葉作物品種への本発明の適用により、バイオエタノール生産性の効率を大きく変えることが可能になると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０２２４】
配列番号:1
<223>  遺伝子12のプロモーター（イネ）
配列番号：2
<223>  Hd3a  cDNA（カサラス）
配列番号：4
<223>  Hd3a  cDNA（日本晴）
配列番号：6
<223>  Ghd7  cDNA
配列番号：8〜18
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：19
<223>  pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a
配列番号：20
<223>  pRiceFOX/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a
配列番号：21〜34
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：35
<223>  遺伝子1のプロモーター
配列番号：36
<223>  遺伝子2のプロモーター
配列番号：37
<223>  遺伝子3のプロモーター
配列番号：38
<223>  遺伝子4のプロモーター
配列番号：39
<223>  遺伝子5のプロモーター
配列番号：40
<223>  遺伝子6のプロモーター
配列番号：41
<223>  遺伝子7のプロモーター
配列番号：42
<223>  遺伝子8のプロモーター
配列番号：43
<223>  遺伝子9のプロモーター
配列番号：44
<223>  遺伝子10のプロモーター
配列番号：45
<223>  遺伝子11のプロモーター
配列番号：46
<223>  遺伝子13のプロモーター
配列番号：47〜74
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：75
<223>  遺伝子3の3’UTR
配列番号：76〜132
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：133
<223>  遺伝子12のプロモーター1（トウモロコシ）
配列番号：134〜136
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：137
<223>  遺伝子12のプロモーター2（トウモロコシ）
配列番号：138〜139
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：140
<223>  pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Hd3a
配列番号：141
<223>  pKLB525/Ubi:Ghd7/Gate:Adh5’UTR:Hd3a
配列番号：142
<223>  人工的に合成されたプライマーの配列
【図３】
2014136793.tif 000006
【図４】
2014136793.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
2014136793.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2014136793.tif 000015
【図１１】
2014136793.tif 000016
【図１２】
2014136793.tif 000017
【図１４】
2014136793.tif 000018
【図１５】
2014136793.tif 000019
【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２４】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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