(57)【要約】  多能性幹細胞の培養方法は、支持体の細胞培養表面上で、かつ、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列；（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列；又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、を含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドの存在下で、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の細胞培養表面上で、
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は
（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドの存在下で、
２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項２】
２−メルカプトエタノールの濃度が９．０μＭ以下である、請求項１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項３】
培地が２−メルカプトエタノールを含まない請求項１または請求項２に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
培地が、水、塩、アミノ酸、ビタミン、セレン、炭素源、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン及びトランスフェリンを含む請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
培地が無血清培地である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項６】
ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項７】
ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−1．７〜−０．９７５である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、下記（３−ｉ）〜（３−iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法：
（３−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
（３−ii）  （３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び、
（３−iii）  （３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個〜３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
【請求項９】
ポリペプチドが、下記（４−ｉ）〜（４−iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法：
（４−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
（４−ii）  （４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び、
（４−iii）  （４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個〜３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
【請求項１０】
ポリペプチドが、
（ａ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列に対して、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、並びに、
（ｃ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１３】
支持体が、プラズマ処理細胞培養表面を有するポリスチレン製である請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１６】
ポリペプチドの細胞培養表面への付与量が、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１７】
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は
（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを、支持体の細胞培養表面に付与して、支持体のポリペプチドコート細胞培養表面を得ることを更に含む請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１８】
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は
（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドと
２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地と、
を含む多能性幹細胞の培養用キット。
【請求項１９】
２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下である、多能性幹細胞培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の培養方法、培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷した組織の機能回復等を目的として種々の再生医療が開発されている。なかでも組織そのものの再生などを最終的な目的とする霊長類、特にヒトの全能性又は多能性幹細胞に関する技術が多く報告されている。特に、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚性幹細胞とは異なり体細胞から誘導されるため、倫理面の問題が少ないという利点を有する。
これらの霊長類の全能性又は多能性幹細胞（これらの両者を総称して、本発明では単に「多能性幹細胞」と称する。）を培養する場合には、未分化状態で長期間にわたって維持することが要求される。未分化状態の多能性幹細胞を長期間培養するためには、一般に、マウス繊維芽細胞等のフィーダー細胞が用いられる。【０００３】
しかしながら、マウス繊維芽細胞のような異種動物由来のフィーダー細胞を使用することで、異種動物由来の抗原性物質などの異物が培養液中に混入する可能性が指摘されている。このため、全能性又は多能性幹細胞を、医療用途、若しくはそれに準ずる用途に使用する場合には、これらの細胞をフィーダー細胞非存在下にて培養することが求められている。【０００４】
このような事情に鑑み、フィーダー細胞の機能を代替する細胞接着性素材の開発が行われている。例えばNature Biotechnology, 2001, Vol19, pp.971-974では、フィーダー細胞の代替物としてマウス肉腫抽出成分であるマトリゲルを使用し、未分化状態を維持したヒト胚性幹細胞を首尾よく培養したことが開示されている。【０００５】
特開２００１−１７１８３号公報には、フィーダー細胞を含まず、且つ増殖する霊長類始原細胞を含む細胞性組成物が開示されており、好ましい態様として、細胞外マトリクスを更に含む細胞性組成物が開示されている。また特開２０１０−２９１８６号公報には、所定濃度の細胞外マトリックスタンパク質と水性溶媒を含むコーティング溶液で、プラズマ重合された細胞培養表面を更にコーティングした細胞培養基質が開示されており、この細胞培養基質によれば、胚性幹細胞の分化を回避するのに役立つ良好な接着性を有すると記載されている。【０００６】
Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、胚性幹細胞の長期培養に寄与しうるビトロネクチン部分配列からなる組換えペプチド、若しくは合成ペプチド、具体的には、天然ビトロネクチンの１番目〜５２番目のアミノ酸配列（Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288参照）、及びＲＧＤ配列を含む第４１番目〜第５２番目のアミノ酸配列（Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610）がそれぞれ開示されている。これらのペプチドは非生体試料であるが故に抗原性物質等の混入可能性を回避でき、かつ工業的に生産できる点で優れていると、知られている。具体的に、Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8288及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610では、ヒトビトロネクチンの部分配列からなる組換えペプチド又は合成ペプチドを使用して、胚性幹細胞の長期培養を実施した例が開示されている。【０００７】
一方、胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの未分化細胞は、一般に増殖能が低い傾向があるため、フィーダー細胞との共培養が実施されることが多い。しかしながら、フィーダー細胞を用いた共培養では培地中にフィーダー細胞由来の天然成分が混入する。また、未分化細胞は、多能性を維持しつつ培養することが求められる傾向があるため、細胞の状態を厳密に管理する必要があり、培地成分についても厳密な管理が求められている。【０００８】
このような観点から、無血清かつ細胞増殖活性の高い培地が種々提案されており、具体的には、エッセンシャル８（Essential8：商品名、以下省略、Nature Methods, 2011, Vol.8, pp.424-429参照）等が知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特開２０１０−２９１８６号公報及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610に開示されているヒトビトロネクチンの部分配列からなる組換えペプチド又は合成ポリペプチドは、培養器に対する吸着性が一様に低いため、培養器にて対して化学的に結合させる工程を必要とする。このため、これらのポリペプチドを結合させる培養表面を自由に選択することができず、汎用性及び簡便性に劣る。また、従来のポリペプチドでは、胚性肝細胞（ＥＳＣ）及び誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ）等の多能性幹細胞を未分化状態を維持して増殖を誘導する細胞培養性能として充分とは言えない。【００１０】
また、多能性幹細胞は、成熟した細胞又は細胞株とは性質が大きく異なるため、多能性幹細胞の培地成分については、検討の余地がまだある。【００１１】
従って、本発明の目的は、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導可能な多能性幹細胞の培養方法並びにそのための培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下のとおりである。
［１］  支持体の細胞培養表面上で、以下の第１の領域及び第２の領域：（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドの存在下で、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法。
［２］  培地が２−メルカプトエタノールを含まない［１］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［３］  培地が、水、塩、アミノ酸、ビタミン、セレン、炭素源、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン及びトランスフェリンを含む［１］又は［２］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［４］  培地が無血清培地である［１］〜［３］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［５］  ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である［１］〜［４］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［６］  ポリペプチドが、下記（３−ｉ）〜（３−iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］〜［５］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法：（３−ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（３−ii）（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び、（３−iii）（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個〜３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
［７］  ポリペプチドが、下記（４−ｉ）〜（４−iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む［１］〜［６］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法：（４−ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（４−ii）（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び、（４−iii）（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個〜３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
［８］  ポリペプチドが、（ａ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列に対して、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、並びに、（ｃ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である［１］〜［７］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［９］  ポリペプチドが、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである［１］〜［８］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１０］  ポリペプチドが、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである［１］〜［９］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１１］  支持体が、プラズマ処理細胞培養表面を有するポリスチレン製である［１］〜［１０］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１２］  多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である［１］〜［１１］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１３］  多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である［１］〜［１２］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１４］  ポリペプチドの細胞培養表面への付与量が、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である［１］〜［１３］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１５］  以下の第１の領域及び第２の領域：（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを、支持体の細胞培養表面に付与して、支持体のポリペプチドコート細胞培養表面を得ることを更に含む［１］〜［１４］のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１６］  以下の第１の領域及び第２の領域：（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドと、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地と、を含む多能性幹細胞の培養用キット。
［１７］  ２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下である、多能性幹細胞培養用培地。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導可能な多能性幹細胞の培養方法並びにそのための培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の参考例における各ポリペプチドの培養プレート表面の吸着試験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の参考例における各ポリペプチドを用いたｉＰＳ細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、本発明の参考例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図５】図５は、本発明の実施例３における、ＲＣＰ−１１被覆細胞培養表面上で、各培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合のポリペプチドの吸着残存量評価の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３における、ＲＣＰ−５被覆細胞培養表面上で、各培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合のポリペプチドの吸着残存量評価の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４における、ＲＣＰ−１１被覆細胞培養表面上で、種々の濃度の２−メルカプトエタノールを含む培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合のポリペプチドの吸着残存量評価の結果を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＯＣＴ３／４染色像（右欄）である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＳＳＥＡ−３染色像（右欄）である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＳＳＥＡ−４染色像（右欄）である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＴｒａ−１−６０染色像（右欄）である。
【図９Ｆ】図９Ｆは、本発明の実施例６における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＴｒａ−１−８１染色像（右欄）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の多能性幹細胞の培養方法は、支持体の細胞培養表面上で、以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は
（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドの存在下で、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法である。
【００１６】
本発明者らは、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にする組換えタンパク質を開発するべく鋭意研究を重ね、所定のヒトビトロネクチンＮ末端部分配列を含み支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸残基からなる所定のポリペプチドが、異種動物由来成分を含まない培養液中にて多能性幹細胞を長期にわたって未分化状態を維持しながら増殖させることが可能であることを見出した。また、本発明者らは、支持体の細胞培養表面上で、このような所定のポリペプチドを用いて多能性幹細胞を増殖させる際に、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いることによって、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導できることを見いだした。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１７】
従って、本発明によれば、支持体の細胞培養表面上で、かつ、所定のポリペプチドの存在下で、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養するので、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導可能な多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。
以下、本発明について説明する。
【００１８】
本発明に係る、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、を含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを、本明細書では、「培養用ポリペプチド」と称する場合がある。
【００１９】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００２０】
本明細書において、「同種」とは、ヒトを意味し、「異種」とは、ヒト以外の動物を意味する。本発明に適用される成分又は物質が、霊長類動物に由来する成分又は物質であれば、同種動物由来の成分又は物質として本発明に好ましく適用可能である。
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Gly」）で表記する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知のやり方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れたうえで、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させた場合に、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、4ｔｈＥｄ  −  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号２に対して配列同一性５０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が５０以上であることを示す。
【００２２】
本発明において、ビトロネクチンとは、ヒトビトロネクチンを意味し、具体的には、配列番号３で示される全長４９５アミノ酸残基で構成されたポリペプチドである。なお、天然のビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることも確認されている。
【００２３】
配列番号３：
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
【００２４】
本発明の培養方法は、支持体の細胞培養表面上で、かつ、培養用ポリペプチドの存在下で、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養すること（以下、培養工程という）を含み、必要に応じて他の工程を含んでもよい。
【００２５】
＜多能性幹細胞＞
培養対象となる多能性幹細胞は、霊長類動物の多能性幹細胞であり、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞及び初期胚細胞等が包含される。多能性幹細胞としては、これらの細胞を１種、又は必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。ｉＰＳ細胞には、Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317；Cell, 2006, August 25; Vol.126(4), pp.663-676に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。
なかでも、本発明において好ましく適用される多能性幹細胞の例には、ｉＰＳ細胞を挙げることができ、ｉＰＳ細胞であることが特に好ましい。
なお、霊長類動物としては、ヒト、サル、ゴリラなどが挙げられ、培養用ポリペプチドと同属となるヒトであることが特に好ましい。
【００２６】
＜支持体＞
培養工程では、多能性幹細胞を支持体の細胞培養表面上で培養する。
多能性幹細胞を、支持体の細胞培養表面上で培養するには、多能性幹細胞を支持体の細胞表面上に播種すればよい。
培養に用いられる支持体は、細胞培養に用いられる表面、即ち、細胞培養表面を有する。ここで、細胞培養表面とは、細胞を播種し成育する際に、細胞が付着し得る表面を意味する。
支持体としては、当業界で細胞培養用支持体として周知のものをそのまま用いることができる。支持体の例には、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂）、ガラス、微孔質のフィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステル、及びポリカーボネート）、バッチ式若しくは連続式で細胞培養において、又は遺伝子工学（例えばバイオリアクター等）において用いられるバイオリアクター用材料（中空繊維チューブ又はマイクロキャリアビーズを含めてもよい。）並びに、ポリエチレンテレフタレート、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、セラミック及びその関連ポリマー材料等を含めてもよい。
また、支持体は、プラズマ重合薄膜により細胞培養表面を被覆することにより得られるプラズマ処理細胞培養表面を有する支持体であることが好ましく、細胞培養表面の疎水性の点で、プラズマ処理細胞培養表面を有するポリスチレン製の支持体であることが特に好ましい。
【００２７】
支持体の形態としては特に制限はなく、多能性幹細胞の培養に適用可能な如何なる形態であってもよい。このような形態の容器の例としては、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、及び９６ウェル）、培養皿（例えば、ペトリディッシュ等）、チューブ、培養フラスコ、ローラーボトル、及び振盪培養フラスコ）を挙げることができる。
【００２８】
＜培養用ポリペプチド＞
培養工程では、多能性幹細胞を、培養用ポリペプチドの存在下で培養する。
培養用ポリペプチドは、以下の第１の領域と第２の領域とを含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列（以下、単にＲＧＤ配列と称する）からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域。
【００２９】
培養用ポリペプチドでは、所定のアミノ酸配列を含む第１の領域が、優れた細胞接着性を有することから、多能性幹細胞を、未分化状態に維持しながら長期にわたって良好に増殖させることができる。
また、所定の配列を含む第２の領域が、支持体の細胞培養表面に対する吸着性に寄与する。このため、化学結合による培養表面への固定処理を必要としない。また、第２の領域が第１の領域と共にポリペプチドに含まれることによって、多能性幹細胞は、培養期間中に支持体の細胞培養表面から剥がれにくい傾向を示す。この結果、多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら長期にわたって増殖させることができ、また、培養操作における取扱い性を向上させることができる。
【００３０】
また、培養用ポリペプチドは、天然ヒトビトロネクチンと比べて抗原性物質又は感染症源の混入リスクを排除すると同時に、天然ビトロネクチンと同等の性能、即ち多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖性、及び未分化維持性を保持することができる。
【００３１】
一方、培養用ポリペプチドの存在下（好ましくは、更に異種動物由来成分等の非存在下）で培養した多能性幹細胞は、試料等に由来する抗原性物質等の異物の混入可能性を、ほとんど完全に、又は大幅に排除することが可能であり、当該培養方法にて培養した多能性幹細胞は医療用途、若しくはそれに準じた用途への使用に対し、充分に安全性を担保することができる。
【００３２】
第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択された少なくとも一方を含む。
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における２５番目〜３１番目の７アミノ酸残基に相当する。また、ＲＧＤ配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における４５番目〜４７番目の３アミノ酸残基に相当する細胞接着性モチーフである。これらのアミノ酸配列はいずれも、天然ビトロネクチンの比較的Ｎ末端側に位置する配列であり、未分化多能性幹細胞との接着性を発揮し、その結果、未分化状態に維持された多能性幹細胞を増殖可能にしていると推測される。このため、これらのアミノ酸配列のいずれも含まないポリペプチドでは、細胞接着性に劣り、未分化状態に維持された多能性幹細胞を増殖することができないと考えられるが、この理論に拘束されない。
なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基は、これら両者間で架橋していてもよい。これにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列において高次構造が形成されて、多能性幹細胞との接着性が向上する傾向がある。
【００３３】
ここで、「多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能である」とは、多能性幹細胞が培養期間において分化能を維持していることを意味する。多能性幹細胞が未分化状態であるか否かは、既知の評価方法で行うことができる。例えば、分子マーカーの発現（ＳＳＥＡ−４、及び／又はＯｃｔ−４等のフローサイトメトリーによる発現測定、Ｏｃｔ−４及び／又はＮＡＮＯＧ等の免疫染色など）、インビトロ実験における多能性分化の確認、及び免疫不全マウス等への移植によるテラトーマ形成の確認などの当業者既知の方法によりなされる。増殖しているか否かは、常法により、各種顕微鏡を用いた目視による観察若しくは、ＡＬＰ活性等の反応試験、フローサイトメトリーなどを利用した手法、又はその他の手段により行えばよい。また、本発明における多能性幹細胞が分化能を維持培養期間としては、培養条件及び多能性幹細胞の細胞状態によって異なるが、例えば、１ヶ月の培養期間とすることができる。
【００３４】
培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択されるいずれか一方を有していればよく、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、これらの配列の双方を含むことが好ましい。
【００３５】
第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列以外のアミノ酸配列を有していてもよい。このような他のアミノ酸配列としては、例えば、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、（１ａ）配列番号３で示されるヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の１番目〜２４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（１ｂ）４８番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は（１ｃ）３２番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列等、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。なお、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列はそれぞれ、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性を損なわない範囲で、１個〜３０個のアミノ酸残基を置換、欠失又は削除した配列を有するものであってもよく、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列それぞれの配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列に加えて、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができ、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列の双方を含み、且つ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又はこれに近似した若しくはその一部のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３６】
第１の領域のアミノ酸残基数は、細胞接着性及び増殖性の観点から、３〜６０アミノ酸残基数とすることができ、１０〜５５アミノ酸残基数であることが好ましい。
【００３７】
第２の領域は、配列番号２で示される３２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、培養用ポリペプチドの精製容易性の観点から好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然ビトロネクチンのＣ末端側に位置するヘモペキシン様ドメインIIの一部に含まれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の第３４２番目〜第３７３番目のアミノ酸残基で構成されたヘパリン結合ドメインに相当する。以下、配列番号２で示されるアミノ酸配列をヘパリン結合ドメインと称する場合がある。
【００３８】
培養用ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを有することにより、支持体の細胞培養表面への吸着能を有すると推測される。この結果、未分化多能性幹細胞を、未分化状態を維持して長期にわたり培養することができるが、本発明はこの理論に拘束されない。
また、培養用ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含むことにより、培養用ポリペプチドの親水性を担保し、ポリペプチドの疎水凝集を抑制する傾向がある。この結果、培養用ポリペプチドが精製しやすくなり、製造効率を高めることができる。
【００３９】
ここで、「支持体の細胞培養表面への吸着能を有する」とは、培養用ポリペプチドが、対象となる支持体の細胞培養表面（以下、単に「培養表面」ということがある）に対して化学的な反応をすることなく物理的に吸着することを意味する。支持体の培養表面に対して吸着能を有するか否かについては、例えば、プラズマ処理したポリスチレン製支持体の培養表面に、２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるように当該ポリペプチドを含有する溶液を添加して３７℃で２時間放置した後、リン酸緩衝液にて２回洗浄した場合に、支持体の細胞培養表面に残存するポリペプチドが１０ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上存在するか否かにより評価することができる。
ここで細胞培養表面に残存するポリペプチドの量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を定量するＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法又は、吸着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸をＨＰＬＣなどによって定量することにより測定できる。
【００４０】
またヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、５０％以上（つまり、５０％〜１００％）、好ましくは８０％以上（つまり、８０％〜１００％）、より好ましくは９０％以上（つまり、９０％〜１００％）、更に好ましくは９５％以上（つまり、９５％〜１００％）の配列同一性を有し、また、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能、且つ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００４１】
また更にヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、１個〜３０個、好ましくは１個〜１５個、好ましくは１個〜６個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００４２】
培養用ポリペプチドは、第１の領域と、第２の領域とを有していればよく、その相対位置には特に制限はない。培養用ポリペプチドでは、第１の領域が、第２の領域のＮ末端側に位置していることが好ましい。
【００４３】
培養用ポリペプチドは、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなる。４０アミノ酸残基未満では、細胞接着性若しくは細胞増殖性又は支持体の細胞培養表面への吸着能が充分とはいえない。一方、４５０アミノ酸残基を超えると、細胞接着性又は細胞増殖性及び支持体の細胞培養表面への吸着能が適切に発揮されない場合があり、さらに、タンパク質同士の会合、架橋又は凝集の形成が起こりやすくなる。培養用ポリペプチドは、凝集の形成等を起こりにくくするという観点から、８０個以上であることが好ましく、９０個以上であることがより好ましく、１００個以上であることが更に好ましく、一方、４００個以下であることが好ましく、２５０個以下であることがより好ましく、１７０個以下であることが更に好ましく、１５０以下であることが更により好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、４０個〜４００個のアミノ酸残基からなることが好ましく、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなることがより好ましく、８０個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましく、１００個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更により好ましい。
【００４４】
培養用ポリペプチドは、−２．０〜−０．９５のＧＲＡＶＹ値を有することが、疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132） は、ポリペプチドの疎水度の総平均を表す。ＧＲＡＶＹの値が大きいほど、疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が−０．９５以下であれば、疎水凝集の発生を容易に抑制できる傾向がある。一方、−２．０以上であれば、支持体の細胞培養表面への吸着及び未分化細胞の増殖をしやすくなり、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて吸着性及び細胞増殖性が向上する傾向がある。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値としては、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、−１．７０〜−０．９７５がより好ましく、−１．６０〜−１．１０が更に好ましい。アミノ酸残基数が少ないほど凝集する傾向があるため、アミノ酸残基数が８０〜１７０個のポリペプチドである場合に、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であることが好ましく、−１．６０〜−１．１０であることが更に好ましい。
【００４５】
ＧＲＡＶＹ値を調整するには、配列中の、例えば疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＭｅｔ）の割合の増減、又はアミノ酸残基数の増減等により調整することができる。
【００４６】
培養用ポリペプチドは、第１の領域及び第２の領域以外の他のアミノ酸配列を有することが好ましい。細胞接着性及び支持体の細胞培養表面への吸着能を適切に発揮する観点から、培養用ポリペプチドは、配列番号３で示されるポリペプチド、即ち、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の部分配列を含むことが好ましい。これにより、培養用ポリペプチドは、ヒトビトロネクチンに近い性質、例えば、多能性幹細胞に対する優れた接着性及び増殖性を獲得することができる。
【００４７】
培養用ポリペプチドに含まれうるヒトビトロネクチンの部分アミノ酸配列としては、培養用ポリペプチドの細胞接着性及び細胞増殖性、又は支持体の細胞培養表面への吸着能、又は凝集形成抑制の観点から、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つが含まれることが好ましい：
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第３の領域、及び、
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第４の領域。
【００４８】
第３の領域としては、ポリペプチドの作製時、疎水凝集を抑制する傾向があるという観点から、（３ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、１３２番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｂ）２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、（３ｃ）２７４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｄ）２９４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。（３ａ）〜（３ｄ）のアミノ酸配列では、アミノ酸残基数を減らすことによって疎水凝集を軽減できる傾向がある。中でも、（３ｄ）のアミノ酸配列を選択することが、疎水凝集をより確実に抑制できる傾向があるため好ましい。
【００４９】
第４の領域としては、支持体の細胞培養表面への吸着性の観点から、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目〜４０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目〜３７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。
なかでも、支持体の細胞培養表面への吸着性に加えて、ポリペプチド作製時に疎水凝集を抑制しやすいという点で、３７４番目〜３７９番目が好ましく、選択するアミノ酸数を減らすことによって疎水凝集が軽減される傾向がある。
【００５０】
第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、所定範囲のアミノ酸残基のうち、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。これらの部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数は、上述した培養用ポリペプチドの総アミノ酸残基数を超えない範囲で選択すればよい。
【００５１】
なお、第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列と、５０％以上（つまり５０％〜１００％）、好ましくは８０％以上（つまり８０％〜１００％）、より好ましくは９０％以上（つまり９０％〜１００％）、更に好ましくは９５％以上（つまり９５％〜１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸配列は、培養用ポリペプチドの細胞接着性及び支持体の細胞培養表面への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
【００５２】
また第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列に対して、１個〜３０個、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸残基が欠失等されたアミノ酸配列は、培養用ポリペプチドの細胞接着性及び支持体の細胞培養表面への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
【００５３】
培養用ポリペプチドは第３の領域を含むことにより、培養用ポリペプチドは支持体の細胞培養表面との吸着性を高める利点を有する傾向がある。第４の領域を含むことにより、培養用ポリペプチドは、支持体の細胞培養表面との吸着性をさらに高める利点を有する傾向がある。培養用ポリペプチドは、第３及び第４の領域のいずれか一方を有していてもよい。
また、培養用ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、調整容易性の観点から、第３及び第４の領域を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数の増減、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等により調整されることが好ましく、特に、第３の領域を構成するアミノ酸配列の長さを調整することがより好ましい。
【００５４】
培養用ポリペプチドには、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜１３１番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、５６番目〜２６８番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、２６９番目〜２７３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、あるいは、５０番目〜２９３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよい。これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、培養用ポリペプチドの多能性細胞培養への性能に寄与しないものであると推測され、支持体の細胞培養表面との吸着の観点で適した配列が選択される。
【００５５】
第３の領域が、配列番号３で示される配列のシステイン残基に対応するアミノ酸残基を含む場合、当該システイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内又は分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、特に制限はなく、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基等を挙げることができる。なかでも、システインと類似の構造を有する点で、セリン残基、アラニン残基が好ましい。
【００５６】
また培養用ポリペプチドは、細胞接着性及び支持体の細胞培養表面への吸着性が損なわれない範囲で、上記以外の他の付加的な任意のアミノ酸残基を有していてもよい。このような他の付加的な任意のアミノ酸残基からなる配列としては、例えば、培養用ポリペプチドを組換え技術によって容易に作製するために付加される付加配列を挙げることができる。このような付加配列としては、Ｎ末端側のメチオニン残基、Ｎ末端側のＧＰＬＧ配列、タグ配列（例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間に付加可能なリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＧＳ等）などを挙げることができる。
【００５７】
培養用ポリペプチドは、当業者に既知のアミノ酸合成技術又は遺伝子組み換え技術によって製造することができる。
遺伝子組み換え技術により本発明の培養用ポリペプチドを得る場合、具体的にはまず、対象となるアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、得られた遺伝子のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、得られた組換え発現ベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から目的とするポリペプチドを常法により回収することにより、本発明に係るポリペプチドを得ることができる。
【００５８】
培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目〜４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む８０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ａ）であることが好ましい。
【００５９】
また、培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列とＲＧＤ配列を含む）からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つ：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域と、を含む１００個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ｂ）であることが好ましい。
【００６０】
また、ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であるポリペプチドであることが好ましい。
また、上記ポリペプチド（Ａ）は、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個であることが好ましい。
更に、ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また、ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個であることが好ましい。
更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜１７０個のポリペプチドであることが好ましい。
培養用ポリペプチドの一例を以下に挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
【００６１】
【表１】
2015037622.tif 000002
【００６２】
培養用ポリペプチドとしては、リコンビナントタンパク質としての発現効率の観点から、１位のアミノ酸残基としてメチオニン残基を有していてもよい。１位にメチオニン残基を有する好ましい培養用ポリペプチドの一例として、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１を以下に示す。
【００６３】
【表２】
2015037622.tif 000003
【００６４】
培養用ポリペプチドは、好ましくは、（ａ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ａ）という）、（ｂ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｂ）という）、並びに、（ｃ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｃ）という）からなる群より選択された少なくともひとつである。
【００６５】
ポリペプチド（ｃ）は、より好ましくは、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドであり、更に好ましくは、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである。
【００６６】
また、培養用ポリペプチドは、好ましくは、（ａ−１）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ａ−１）という）、（ｂ−１）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列に対して、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｂ−１）という）、並びに、（ｃ−１）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｃ−１）という）からなる群より選択された少なくともひとつである。
【００６７】
ポリペプチド（ｃ−１）は、より好ましくは、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドであり、更に好ましくは、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである。
【００６８】
ポリペプチド（ｂ）及び（ｂ−１）のアミノ酸配列において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、ポリペプチドの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個〜１５個、好ましくは２個〜５個とすることができる。
【００６９】
「培養用ポリペプチドの存在下で」とは、多能性幹細胞の培養系において培養用ポリペプチドが存在していればよいことを意味する。好ましくは、培養用ポリペプチドは、支持体の細胞培養表面上を被覆している。支持体が、プラズマ処理細胞培養表面を有するポリスチレン製である場合には、プラズマ処理により形成されたプラズマ重合薄膜上を、培養用ポリペプチドが被覆していればよい。細胞培養表面にプラズマ重合薄膜を形成する方法については、常法をそのまま適用すればよい。
【００７０】
多能性幹細胞の培養において存在しうる培養用ポリペプチドは、１種単独で、又は２種以上を組み合わせたものであってもよい。
培養用ポリペプチドにより被覆された細胞培養表面は、培養用ポリペプチドを特定の量で含有する吸着液を調製し、調製された吸着液を細胞培養表面に付与し、一定時間保持することによって得ることができる。吸着液が付与された細胞培養表面において、吸着液に含まれる培養用ポリペプチドは、細胞培養表面に吸着し、細胞培養表面を被覆することができる。なお、細胞培養表面は、本発明の効果を損なわない範囲で培養用ポリペプチドにより被覆されていない部分を有してもよい。培養用ポリペプチドは、好ましくは細胞培養表面の約７５％以上、より好ましくは細胞培養表面の約８５％以上を被覆することができる。
【００７１】
吸着液における培養用ポリペプチドの含有量は、吸着対象となる培養表面の種類又は大きさによって異なり、適宜調製することができる。培養用ポリペプチドの細胞培養表面への付与量としては、培養表面に対する培養用ポリペプチドの吸着能の観点から、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることがより好ましい。吸着液を調製するために用いられる水性媒体としては特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、超純水等を挙げることができる。
吸着は、吸着液を付与した後、所定時間、例えば３０分〜２４時間程度保持すればよく、これにより特別な処理を要せずに、細胞培養表面に培養用ポリペプチドを吸着させることができる。
【００７２】
＜培地＞
多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地である。つまり、多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、２−メルカプトエタノールの濃度が０μＭ〜１０μＭの培地である。
２−メルカプトエタノールの濃度を１０μＭ（μｍｏｌ／リットル（ｌ））以下とすることにより、多能性幹細胞の未分化状態で、効率よく増殖可能にすることができる。本発明における培地における２−メルカプトエタノールの濃度は、９．０μＭ以下であることが好ましく（つまり、本発明における培地における２−メルカプトエタノールの濃度は、０μＭ〜９．０μＭであることが好ましく）、本発明における培地における２−メルカプトエタノールの濃度は０μＭであることが特に好ましい、即ち、培地として２−メルカプトエタノールを含まないものであることが特に好ましい。
【００７３】
培地は、２−メルカプトエタノールの含有量が１０μＭ以下であれば、他の成分については特に制限はなく、多能性幹細胞の培養に通常用いられる培地が適用可能である。
【００７４】
培養に用いられる培地としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培地としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加してもよい。なお、培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清等の血清を含まない無血清培地であることが、培地成分の品質管理、及び培養細胞の安全性を保証する観点で好ましい。
【００７５】
多能性幹細胞の培養は、異種動物由来成分の非存在下で行うことが好ましい。これにより、異種動物由来の異物混入の可能性を高い精度で排除することができる。異種細胞由来成分の非存在下での培養としては、異種動物由来成分を含有しない培地を使用する培養、異種動物由来のフィーダー細胞等を使用しない培養などが挙げられる。
更に、多能性幹細胞を異種動物由来成分及び血清成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、よりいっそう、異種動物由来成分の混入を排除することができる。
【００７６】
異種動物由来成分を含有しない培養液としては、水；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の無機塩及びピルビン酸ナトリウム等の有機塩を含む塩；必須アミノ酸及び非必須アミノ酸であるアミノ酸；Ｌ−アスコルビン酸、リボフラビン、ビオチン、シアノコバラミン等のビタミン；セレン、鉄、亜鉛、銅、マンガン、ニッケル、カドミウム等の微量元素；Ｄ−グルコース等の炭素源；塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２等のＦＧＦ；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、インスリン、トランスフェリン等の因子などの通常用いられる培地成分の少なくとも１種を含有する低浸透圧培地からなる混合培地を使用することができる。
なかでも、水、塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の無機塩、及びピルビン酸ナトリウム等の有機塩）、アミノ酸（必須アミノ酸及び非必須アミノ酸）、ビタミン（Ｌ−アスコルビン酸、リボフラビン、ビオチン、シアノコバラミン等）、微量元素（セレン、鉄、亜鉛、銅等）、炭素源（Ｄ−グルコース等）、ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子 ＦＧＦ−２等）、ＴＧＦ−β、インスリン及びトレンスフェリンを含む培地であることが好ましい。多能性幹細胞の未分化状態で、効率よく増殖を行う観点からＦＧＦを含む培地であることが好ましく、ＦＧＦおよびＴＧＦ−βを含む培地であることがより好ましい。具体的にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商品名、以下、省略。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｉｎｃ）、ＮｕｒｔｉｎＳｔｅｍ（登録商標、以下、省略。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．）等が挙げられ、なかでも、血清成分を含有せず、多能性幹細胞の増殖効率が優れるとの観点から、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）であることが特に好ましい。
【００７７】
特に好ましいＥｓｓｅｔｉａｌ８は、基本となる８の成分のみを含有する培地であり、具体的には、基本培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２に、炭酸水素ナトリウム、セレン、インスリン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）を所定濃度添加することで調製される培地である。Ｅｓｓｅｉｔｉａｌ８は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃより購入可能であり、別途各構成成分を混合することにより調製してもよい。
【００７８】
なお、細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％（v/v）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【００７９】
多能性幹細胞の継代方法には、上述した培地を好ましく適用することができる。培地への多能性幹細胞の播種は常法により行う。なお、一連の継代において用いる培地は必ずしも同一でなくてもよく、多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる培地であってもよい。
【００８０】
多能性幹細胞の播種密度及び培養条件については、特に制限はなく、一般に行われる条件をそのまま適用すればよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度として、上述した培養及び継代条件にて培養すればよい。また１０μｍ〜１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２〜５個／ｃｍ２程度の播種密度として上述した培養及び継代条件にて培養してもよい。
【００８１】
また、多能性幹細胞の培養方法は、培養用ポリペプチドを、支持体の細胞培養表面に付与して、支持体のポリペプチドコート細胞培養表面を得ることを更に含んでいてもよい。支持体上に細胞培養表面を付与する方法としては、培養用ポリペプチドを含有する吸着液を調製して、支持体の細胞培養表面へ付与すればよい。培養用ポリペプチドを含有する吸着液及びこれを用いた付与方法の条件等については、上述した事項を適用する。
【００８２】
本発明の培養方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導可能であるので、本発明の培養用キットは、多能性幹細胞に培養する際、特に多能性幹細胞を長期にわたって培養する際に好ましく適用される。
【００８３】
また、本発明の培養用キットは、培養用ポリペプチドと、２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地と、を含む多能性幹細胞の培養用キットである。本発明の培養用キットによれば、本発明の多能性幹細胞の培養方法を簡便に実行することができる。
培養用ポリペプチド及び２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地については、上述した事項を適用する。
【００８４】
本発明のキットは、必要に応じて他の構成要素を含むことができる。他の構成要素としては、例えば、支持体、細胞剥離剤および剥離器具、本発明の培養方法を記載した取扱説明書等を挙げることができる。キットに含まれる他の構成要素としての支持体については、培養方法に関連して前述した事項をそのまま適用することができる。
また、本キットが支持体を含む場合には、培養用ポリペプチドは、支持体と独立して本キットに含まれていてもよく、支持体の細胞培養表面へ付与された形態として、本キットに含まれていてもよい。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００８６】
［参考例］
＜ポリペプチドの調製＞
１．培養用ポリペプチドの調製
ＰＣＲを利用した常法にて、表３のアミノ酸配列を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１の各ポリペプチドをコードする遺伝子配列を増幅した。表３中、「ＮＯＴＥ」欄の数値は、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号３）における位置を示す。
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１については、あらかじめＮｃｏＩ（タカラバイオ株式会社）にて切断処理したｐＥＴ−２８ｂ（＋）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Clontech Laboratories, Inc）を用いて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。発現用ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。【００８７】
【表３】
2015037622.tif 000004
【００８８】
作製したＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１の発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業株式会社）を添加して、３７℃、５時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【００８９】
菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）にて再懸濁した。ソニケーションにて菌体を破砕した後、１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、不溶性画分を回収した。０．５質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）にて再懸濁し、ソニケーション処理を行った。遠心処理にて不溶性各分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、ソニケーション処理にて不溶性各分を可溶化した。【００９０】
上記の方法により得られた目的ペプチドを含む溶液を、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）及びＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製した。高濃度尿素バッファを結合用バッファとして、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして段階的溶出を行い、目的のポリペプチドを精製した。【００９１】
２．比較用のポリペプチドの調製
比較用のポリペプチドとして、下記のＲＣＰ−２１〜２６を、あらかじめＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社）にて切断処理したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた以外は、ＲＣＰ−１〜１１と同様にして目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。なお、ＲＣＰ−１１は天然ヒトビトロネクチンの配列に相当する。表４中、「ＮＯＴＥ」欄の数値は、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号３）における位置を示す。【００９２】
【表４】
2015037622.tif 000005
【００９３】
上記で作製されたＲＣＰ−２１〜ＲＣＰ−２６の発現ベクターを、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、アンピシリン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１００μＭのＩＰＴＧを添加して、２０℃、２４時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【００９４】
菌体を遠心処理にて回収し、Ｂ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて再懸濁したのち、ソニケーションにて菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心して不溶性画分を除去し、上清をＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、及びＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製した。溶出画分をＨｉｐｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて脱塩し、更に、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を、溶液量の１／２０００で添加して４℃で２４時間インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。再度ＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２にて精製し、切断したＧＳＴタグをカラムに吸着させ除去した。カラム通過画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、以下、同じ）を用いて透析し、ＰＢＳに置換した。【００９５】
３．培養用ポリペプチドの性状解析
＜ＧＲＡＶＹ値及び凝集特性＞
上記のようにして得られたＲＣＰ−１のポリペプチドを、レディーゲル（１２．５％，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で泳動し、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した。その結果、アミノ酸配列から予想される分子量２８．３ｋＤａに相当する箇所に単一のバンドが確認できた。その他のポリペプチドに対しても同様の結果が得られた。【００９６】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１について、精製後の各ポリペプチド溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｒｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。透析後の凝集の有無を表５に示す。【００９７】
またＧＲＡＶＹ値は、アミノ酸ごとに決められている疎水性の指標を総和し、アミノ酸数で割った値として計算した（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132参照）。ＧＲＡＶＹ値は各ポリペプチドに含まれるアミノ酸の疎水度から計算されるポリペプチドの親疎水性の指標であり、値が大きいほど疎水的、小さいほど親水的であることを示す。結果を表５に示す。
また凝集有無については、以下のＧ、Ａ及びＢで評価した。結果を表５に併せて示す。
Ｇ：凝集物形成が見られない。
Ａ：粒径１００ｎｍ程度の粒子形成が認められる。
Ｂ：粒径１ｍｍ以上の可視凝集の形成が認められる。【００９８】
【表５】
2015037622.tif 000006
【００９９】
表５に示されるように、ＲＣＰ−２〜ＲＣＰ−５、ＲＣＰ−７〜ＲＣＰ−８、及びＲＣＰ−１１は、アミノ酸残基数が約８０個〜約１７０個のポリペプチドであり、凝集が生じやすいが、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であるため、凝集形成が抑制されていることがわかる。【０１００】
＜細胞培養表面への吸着性評価＞
上記の方法により得られたＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−２１〜２６の各ポリペプチドを、所定のバッファにて、０〜２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の所定の最終濃度でウェルへ添加できるように希釈し、プラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ―Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｆａｌｃｏｎ社）に６４μＬずつ添加した。３７℃、２時間インキュベートして各ポリペプチドをプレートに吸着させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−２１〜ＲＣＰ−２６の各ポリペプチド被覆表面を得た。【０１０１】
上記のようにして得られた各ポリペプチド被覆表面のうち、ＲＣＰ−１及びＲＣＰ−２１〜２６を被覆した表面に対し、ホウ酸バッファと１ＮのＮａＯＨをそれぞれ６４μＬ付与し、８０℃、湿度１００％で２４時間インキュベートした。空冷後、各ウェルにホウ酸バッファを７５μＬ添加し、さらにＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド：和光純薬工業株式会社）／メタノール溶液（１６０ｍｇ／ｍｌ）と、ＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン：和光純薬工業株式会社）／ホウ酸バッファ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を１：１００（質量比）に混合した反応液を５０μＬ添加した。４０℃で３０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度を測定した（励起３５５ｎｍ／蛍光４８６ｎｍ）。別途各ポリペプチド溶液より検量線を作成し、吸着量を算出した。結果を図１に示す。図１において黒菱形はＲＣＰ−１、黒四角はＲＣＰ−２１、黒三角はＲＣＰ−２２、黒丸はＲＣＰ−２３、白菱形はＲＣＰ−２４、白四角はＲＣＰ−２５、白三角はＲＣＰ−２６をそれぞれ示す。【０１０２】
図１に示されるように、試験に使用したポリペプチドのうち、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２［配列番号３における３４２番目〜３７３番目］）を含むＲＣＰ−１、ＲＣＰ−２５、及びＲＣＰ−２６のポリペプチドを用いた場合に、ヒトビトロネクチンの配列を有するＲＣＰ−２１と同等の良好なプレートへの吸着性を有することがわかる。一方でＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮを含まないＲＣＰ−２３及びＲＣＰ−２４の吸着量は、当該配列を含むポリペプチドに対して約１／４と低く、細胞培養表面への吸着材として不適当であることがわかる。【０１０３】
＜細胞接着性評価１＞
上記ポリペプチドへのヒトｉＰＳ細胞（「Ｔｉｃ」：細胞番号Ｎｏ．ＪＣＲＢ１３３１：独立行政法人  医薬基盤研究所［５６７−００８５  大阪府茨木市彩都あさぎ７丁目６番８号］より分譲）の細胞接着性評価は、以下のとおりに行った。
ヒトｉＰＳ細胞を維持するためのフィーダー細胞として、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）（初代マウス胚性線維芽細胞：ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済み, Ｃ５７／ＢＬ６由来、継代３代目）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ (v/v) ウシ胎児血清培地を使用して２４時間培養し、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上に接着させた。ヒトｉＰＳ細胞用培地は、表６の組成のものに、ＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したものを使用した。【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
ｉＰＳ細胞は、上記培地を用いて、３７℃、５％（v/v、以下同じ）ＣＯ２インキュベーター内で維持培養した。培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。継代操作は ディスパーゼII（ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＧｒａｄｅII、Ｒｏｃｈｅ社）で細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。【０１０６】
上述のようにして培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ遠心して細胞を回収し、終濃度１０μＭ  Ｙ−２７３６２（（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業株式会社）を含むＴｅＳＲ２（異種動物由来成分及び血清成分不含培地、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁した。【０１０７】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１と、比較対象であるＲＣＰ−２１、ＲＣＰ−２５及びＲＣＰ−２６と、ヒトビトロネクチン（ヒト血漿より抽出、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、リコンビナントラミニン（ｒＬａｍｉｎｉｎ−５：オリエンタル酵母社、及び、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１：Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）とを、それぞれ表７に示す添加濃度となるように、所定のバッファ（ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１は、上記の＜ＧＲＡＶＹ値及び凝集特性＞で用いた透析用バッファ、ＲＣＰ−２１、２５、ヒトビトロネクチン、及びリコンビナントラミニンはＰＢＳ）に懸濁して、試料１〜１７を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させた。
得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、ｉＰＳ細胞を、３００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。２４時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４％（v/v）パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表７に示す。表７中、細胞接着率は、天然ビトロネクチンを用いた試料１５による細胞接着率を１００％とする割合で示す。ｎ＝３。【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
表７に示されるように、配列番号３に記載された配列の１番目〜５５番目を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−２１と天然ヒトビトロネクチンは、ｉＰＳ細胞の細胞接着率が良好であった。特に、配列番号３に記載された配列の第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部若しくは全てを含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１は、天然ヒトビトロネクチン及び、天然ヒトビトロネクチンと同一アミノ酸配列を有するＲＣＰ−２１よりも細胞接着率が良好であった。これより、配列番号３に記載された配列の１番目〜５５番目に細胞接着に重要な配列が存在することがわかる。【０１１０】
＜細胞接着性評価２＞
表８に示すポリペプチドをＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた表面を作製した後、１００μＭの上記合成ペプチドを添加した細胞懸濁液を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種した。播種２４ｈ後の接着細胞数を、＜細胞接着性評価１＞と同様の手法にて算出した。結果を表８に示す。表８中、細胞接着率は、合成ポリペプチドを含まない培養液を用いた場合の細胞接着率を１００％とする割合で示す。ｎ＝３。【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
表８に示されるように、ＣＳＹＹＱＳＣ又はＲＧＤを含むＰｅｐｔｉｄｅ−４、５及び６を添加することで天然ビトロネクチンへの細胞の接着が有意に阻害されたのに対し、ＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤを含まないＰｅｐｔｉｄｅ−１、２、３及びＰｅｐｔｉｄｅ−５、６のＲＧＤ配列をＲＧＥに置換したＰｅｐｔｉｄｅ−７、８を添加した場合は接着阻害が無いことがわかる。従って、ポリペプチドがＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤの少なくとも一方を含むことにより、細胞接着能が発揮されることがわかる。【０１１３】
＜増殖評価＞
＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＲＣＰ−１、２１及び天然ヒトビトロネクチンを吸着させた９６ウェルプレートに対し、２５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で８日間培養した。各経時後の接着細胞数を、上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測し、増殖曲線を得た。増殖曲線を図２に示す。なお図２において黒菱形はＲＣＰ−１を用いた例、黒四角はＲＣＰ−２１を用いた例を示す。
同様にＲＣＰ−１〜１１と、比較対照として、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１をそれぞれ表９に示す添加濃度となるように、試料１〜１２を調製し、＜細胞接着性評価１＞と同様にして各ポリペプチドを吸着させた９６ウェルプレートに対して５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。３日後の細胞数を上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測した。結果を表９に示す。表９中、３日後の細胞数は、試料１を用いた場合の細胞数を１００％とする割合で示す。【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
図２より、ＲＣＰ−１は、天然ビトロネクチンのアミノ酸配列を有するＲＣＰ−２１よりも高い細胞増殖性を示し、ＲＣＰ−２１は、培養８日目でＲＣＰ−１を用いた場合よりも約１／３程度の細胞数であった。得られた細胞数の増減から倍加時間を算出したところ、ＲＣＰ−１を用いた場合には４６．４±２．１時間、ＲＣＰ−２１を用いた場合には６７．７±２．１時間であった。
また表９より、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１はいずれも、ビトロネクチンと同じ細胞外マトリクスであるラミニンよりも細胞増殖率が高いことがわかる。このような高い細胞増殖率は、配列番号３における２７４番目のシステイン残基をセリン残基に置換しても同様に得られることがわかる。【０１１６】
図２及び表９の結果から、驚くべきことに、細胞増殖と細胞培養表面への吸着に有効な配列からなり、天然ヒトビトロネクチンの第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部若しくは全てに相当する配列を含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１は、ヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−２１、及び比較例であるＬａｍｉｎｉｎ−５１１よりも高い増殖能を有していることがわかる。
さらに、表９より、ＣＳＹＹＱＳＣの配列及びＲＧＤ配列と、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列の双方を含むＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１はいずれも高い細胞増殖性を示すことがわかった。【０１１７】
＜細胞接着性評価３＞
ＲＣＰ−１を、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度にＰＢＳで調整して使用した以外は、＜細胞接着性評価１＞と同様にして細胞接着性を評価した。結果を表１０に示す。表１０中、細胞接着率は、天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた細胞培養表面に対する細胞接着率を１００％とする割合で示す。ｎ＝３。【０１１８】
【表１０】
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【０１１９】
表１０に示されるように、ＲＣＰ−１に対するｉＰＳ細胞の接着性は、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上の添加量（付与量）の場合に、天然ビトロネクチンと同等の細胞接着率を示した。【０１２０】
＜未分化維持評価＞
＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＴｅＳＲ２中に懸濁した。＜細胞接着性評価１＞で用いた試料１、試料２、試料５、試料６及び試料７をそれぞれ、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして吸着させた６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ，Ｆａｌｃｏｎ社）にｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。６日毎に前述と同様の方法にて継代を行った。それぞれの試料上で培養したｉＰＳ細胞の形態を図３に示す。【０１２１】
また本条件で１ヶ月間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳにて膜透過性を亢進させた。Ｉｍａｇｅ  ＩＴ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてブロッキング処理を行った後、抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及びＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、株式会社同仁化学研究所）を添加して標識し、蛍光顕微鏡にて撮像した。これらの蛍光顕微鏡像を図４に示す。【０１２２】
図３及び図４のそれぞれにおいて、（Ａ）はＲＣＰ−１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｂ）はＲＣＰ−１１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｃ）は天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｄ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｅ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５１１上で培養したｉＰＳ細胞を、それぞれ示す。スケールバー：１００μｍ。図３において左欄はコロニー全体像、右欄は拡大像であり、図４において左欄はＤＡＰＩ染色像、右欄は抗ＮＡＮＯＧ抗体による染色像を示す。図３及び図４中のスケールバー：２００μｍ。【０１２３】
図３に示されるように、細胞増殖と細胞培養表面への吸着に有効な配列を含むＲＣＰ−１、ＲＣＰ−２１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は均質なコロニー、かつ高い核占有率を有する未分化細胞に特徴的な形態を示していた。また図４に示されるように、細胞増殖ドメイン及び吸着ドメインを有するＲＣＰ−１、ＲＣＰ−２１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は、ＮＡＮＯＧをコロニー全体に強く発現しており、未分化状態が良好に維持されていることがわかった。【０１２４】
上記の各評価結果から、ＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤ配列のいずれか一方とＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列を含む４０〜４５０アミノ酸残基からなるポリペプチドは、細胞培養表面への吸着性に優れていた。また、このようなポリペプチドは、ｉＰＳ細胞との共培養条件下では、ｉＰＳ細胞の細胞接着性、及び未分化状態の維持において、天然ビトロネクチン及びヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−１１と同等であり、かつｉＰＳ細胞の増殖性においてはＲＣＰ−２１よりも優れる結果であった。ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１１はいずれもｉＰＳ細胞の細胞接着性及び未分化状態の維持の点で良好であることがわかる。このような各能力の全てにおいて良好の結果は、比較対照であるその他のポリペプチド又はリコンビナントラミニンでは得られなかった。【０１２５】
［実施例１］
上記で得られたＲＣＰ−１〜ＰＣＲ−１１のうち、ＲＣＰ−１１及びＰＣＲ−５を、以下の実施例に用いた。
なお、ＲＣＰ−１１のポリペプチドは、ＲＣＰ−１等と同様に、レディーゲル（１２．５質量％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動を行い、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した結果、アミノ酸配列から予想される分子量１６．３ｋＤａに相当する箇所に単一のバンドとして確認されている。ＲＣＰ−５についても、アミノ酸配列から予想される分子量１４．６ｋＤａに相当する場所に単一のバンドが確認されている。【０１２６】
また、評価には、参考例の＜細胞接着性評価１＞に記載のとおりに維持培養されているヒトｉＰＳ細胞（「Ｔｉｃ」）を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ遠心して細胞を回収し、各培地にそれぞれ懸濁し、各実施例の評価に用いた。なお、全ての培地について、終濃度１０μＭ  Ｙ−２７３６２（（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業株式会社）を添加した。【０１２７】
＜細胞増殖性評価１＞
ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５と、比較対照として、リコンビナントラミニン（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１：Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）を、それぞれ表１１に示す最終濃度となるように、所定のバッファ（ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５に対しては、参考例の＜ＧＲＡＶＹ値及び凝集特性＞で用いた透析用バッファ、リコンビナントラミニンに対してはＰＢＳ）に懸濁して、ポリペプチド液を調製し、プラズマ処理細胞培養表面を有するプラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させ、ポリペプチド被覆表面を有するペプチド処理９６ウェルプレートを得た。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、表１１に示す各培地に懸濁したｉＰＳ細胞を、１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。７２時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４質量％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表１１に示す。表１１中、細胞増殖率は、ＲＣＰ−１１とＥｓｓｅｎｔｉａｌ８の組合せで多能性幹細胞を培養した場合の７２時間後の細胞数を１００％とする割合で示す。ｎ＝３。
なお、表中の培地は、以下の市販品を用いた。
Ｅｓｓｅｉｔｉａｌ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、以下、「Ｅ８」と表示する場合がある。）
ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
ＴｅＳＲ２（商品名、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
ＲｅｐｒｏＦＦ２（商品名、リプロセル（株））
ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、以下、「Ｓｔｅｍｐｒｏ」と表示する場合がある。）
なお、表１１中、２−メルカプトエタノールの濃度における「質量％」は、培養時の培地の総容量１００ｍＬあたりの質量（ｇ）の割合（ｗ／ｖ％）である。【０１２８】
【表１１】
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【０１２９】
表１１に示されるように、ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を吸着させた細胞培養表面上で、２−メルカプトエタノールを含まないＥｓｓｔｎｔｉａｌ８又はＮｕｔｒｉＳｔｅｍを使用して培養した場合、２−メルカプトエタノールを含むその他の培地を使用して培養したものと比較して細胞培養表面の細胞増殖性が良好であった。一方でリコンビナントラミニンを吸着させた細胞培養表面上では、２−メルカプトエタノールの有無と細胞増殖性との間に明確な相関が確認できないことがわかる。【０１３０】
［実施例２］
＜細胞増殖性評価２＞
実施例１の＜細胞増殖性評価１＞と同様にＲＣＰ−１１を被覆した細胞培養表面を作製した。＜細胞増殖性評価１＞と同様の方法で回収したｉＰＳ細胞を、表１２に示す培地組成となるように各培地に懸濁し、１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。７２時間培養した後、＜細胞増殖性評価１＞と同様の方法で細胞数を定量し、ＲＰＣ−１１を用いた場合の細胞数を１００％とする割合を細胞増殖率として評価した。結果を表１２に示す。【０１３１】
【表１２】
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【０１３２】
表１２に示されるように、２−メルカプトエタノールの濃度に依存して、細胞培養表面の細胞増殖性が低下する傾向にあることがわかる。このような特性はリコンビナントラミニンを被覆した細胞培養表面上で培養した場合には観察されなかった。【０１３３】
［実施例３］
＜吸着残存量評価１＞
ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を１００μｇ／ｍｌとなるように所定のバッファ（参考例の＜ＧＲＡＶＹ値及び凝集特性＞で用いた透析用バッファ）を用いて調整し、プラズマ処理細胞培養表面を有するプラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させ、ポリペプチド被覆表面を得た。ＰＢＳで洗浄した後、各培地を添加し、所定時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、２０質量％イムノブロック溶液（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を添加して３７℃で３０分インキュベートし、ブロッキング処理を施した。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中、０．０５質量％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、抗ヒトビトロネクチン抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を含む５質量％イムノブロック溶液（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を添加して室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を含む５質量％イムノブロック溶液（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（和光純薬工業株式会社）を添加して発色させ、１Ｎ塩酸を添加して発色反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を測定し、残存するＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を定量した（吸収波長４５０ｎｍ、対照波長６５０ｎｍ）。ＲＣＰ−１１を用いた場合の結果を図５に、ＲＣＰ−５を用いた結果を図６にそれぞれ示す。
また表１３に培養開始４日後のＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５の残存率を示す。表１３中、ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５の残存率は、培養開始直後の吸着量を１００とした場合の割合（％）とした。【０１３４】
【表１３】
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【０１３５】
図５、図６及び表１３に示されるように、２−メルカプトエタノールを含まない培地で培養した場合と比較して２−メルカプトエタノールを含む培地で培養した場合には、時間の経過と共に、ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５の吸着残存率が減少していることがわかる。【０１３６】
［実施例４］
＜吸着残存量評価２＞
実施例３と同様にＲＣＰ−１１を被覆した細胞培養表面を作製した後、８９．６ｍＭ（０．７質量％）、８．９６ｍＭ（０．０７質量％）、８９５．９４μＭ（０．００７質量％）、８９．５９μＭ（０．０００７質量％）又は８．９６μＭ（０．００００７質量％）の各最終濃度となるように２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを添加し、所定時間３７℃でインキュベートした。その後、実施例３と同様の方法で、吸着したＲＣＰ−１１を定量し、吸着残存率を求めた。結果を図７に示す。図中、ＲＣＰ−１１の吸着残存量は、インキュベート開始直後の吸着量を１００％とする割合とした。また、「２−ＭＥ」は２−メルカプトエタノールを示す。【０１３７】
図７より、２−メルカプトエタノールの濃度が高くなるに従って、ＲＣＰ−１１の残存量が低下する傾向にあることがわかる。このことは２−メルカプトエタノールがＲＣＰ−１１の脱吸着を促進することを示している。【０１３８】
［実施例５］
＜吸着残存量と細胞増殖性との関係＞
実施例３の＜吸着残存量評価１＞と同様にしてＲＣＰ−１１を各ウェルに添加して被覆した細胞培養表面を作製した後、表１４に示す濃度に予め調整した２−メルカプトエタノール／ＰＢＳ溶液を添加し、２４時間インキュベートして、ＲＣＰ−１１の脱吸着を促させた。
一方、実施例３の＜細胞増殖性評価１＞と同様の方法でｉＰＳ細胞を回収し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８中に懸濁して１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように、２−メルカプトエタノールを添加してＲＰＣ−１１の脱吸着を促進させた各ウェルに播種し、培養を開始した。
７２時間培養した後、実施例３の＜細胞増殖性評価１＞と同様の方法で細胞数を定量した。結果を表１４に示す。表中、ＲＣＰ−１１の吸着残存率、及び細胞増殖率性は、ＰＢＳで前処理した場合の吸着残存率及び細胞増殖率をそれぞれ１００％とした場合の割合を示す。【０１３９】
【表１４】
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【０１４０】
表１４より、２−メルカプトエタノール処理によるＲＣＰ−１１の吸着残存率量と細胞増殖率との間に相関が認められることがわかる。このことから、２−メルカプトエタノールによるＲＣＰ−１１の脱吸着によって、細胞培養表面の細胞増殖性が損なわれることが確認できる。【０１４１】
［実施例６］
＜未分化維持製評価＞
ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を被覆した細胞培養表面にｉＰＳ細胞を播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８中で培養した。播種５〜７日毎に新たにＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を被覆した細胞培養表面を作製した。ｉＰＳ細胞をＴｒｙＰＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔで処理してシングルセルに分離してから回収し、新たに作製したＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を被覆した細胞培養表面に播種して継代した。各々上記条件で１０継代培養した。１０継代後の細胞の形態を図８に示す。【０１４２】
また、ＲＣＰ−１１を被覆した表面で１０継代培養したｉＰＳ細胞を４v/v％パラホルムアルデヒドで固定し、１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳにて膜透過性を亢進させた。Ｉｍａｇｅ  ＩＴ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてブロッキング処理を行った後、抗ＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、抗ＯＣＴ３／４抗体、抗ＳＳＥＡ−３抗体、抗ＳＳＥＡ−４抗体、抗Ｔｒａ−１−６０抗体、抗Ｔｒａ−１−８１抗体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＤＡＰＩ（株式会社同仁化学研究所）を添加して標識し、蛍光顕微鏡にて撮像した。これらの蛍光顕微鏡像を図９に示す。【０１４３】
図８において、（Ａ）はＲＣＰ−１１を被覆した細胞培養表面上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ８を使用して培養したｉＰＳ細胞を、（Ｂ）はＲＣＰ−５を被覆した表面上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ８を使用して培養したｉＰＳ細胞を、（Ｃ）はＲＣＰ−１１を被覆した表面上でＮｕｔｒｉＳｔｅｍを使用して培養したｉＰＳ細胞を、（Ｄ）はＲＣＰ−５を被覆した表面上でＮｕｔｒｉＳｔｅｍを使用して培養したｉＰＳ細胞をそれぞれ示す。図８において左欄はコロニー全体像、右欄は拡大像を示す。図８中のスケールバー：５００μｍ。
図９において、各染色像はＲＣＰ−１１を被覆した表面上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ８を用いて培養したｉＰＳ細胞の染色像であり、左欄はＤＡＰＩ染色像、右欄はそれぞれ（Ａ）ＮＡＮＯＧ、（Ｂ）ＯＣＴ３／４、（Ｃ）ＳＳＥＡ−３、（Ｄ）ＳＳＥＡ−４、（Ｅ）Ｔｒａ−１−６０、（Ｆ）Ｔｒａ−１−８１による染色結果を示す。図９中のスケールバー：１００μｍ。【０１４４】
図８に示されるように、ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を被覆した細胞培養表面上で２−メルカプトエタノールを含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ８、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍを使用して培養したｉＰＳ細胞は、均質なコロニーかつ高い核占有率を有する未分化細胞に特徴的な形態を示していた。また図９に示されるように、ＲＣＰ−１１を被覆した細胞培養表面上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ８を用いて培養したｉＰＳ細胞は、未分化細胞特異的なマーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１をそれぞれ発現しており、未分化状態を維持できていることが確認された。【０１４５】
実施例１〜実施例６の評価結果から、ＲＣＰ−１１及びＲＣＰ−５を被覆した細胞培養表面でｉＰＳ細胞を培養するにあたり、２−メルカプトエタノールの含有率が１０μＭ以下である培地と組み合わせて培養することで、多能性幹細胞が優れた増殖性を示し、未分化維持状態も良好に維持することがわかる。一方で２−メルカプトエタノールを、１０μＭを超える濃度で含む培地で培養した場合は、多能性幹細胞の増殖活性が低下してしまうことがわかる。多能性幹細胞の増殖活性の低下の原因が、１０μＭを超える濃度で培地に含まれる２−メルカプトエタノールによって、支持体の細胞培養表面に吸着したＲＣＰの脱離が促進されることによるものであることは、実施例１〜実施例６の評価結果から明らかである。【０１４６】
従って、本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持し、かつ、多能性幹細胞に対して高い増殖活性を誘導可能な多能性幹細胞の培養方法が提供される。【０１４７】
２０１３年９月１０日に出願された日本国特許出願２０１３−１８７４４０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月14日(2016.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明において、ビトロネクチンとは、ヒトビトロネクチンを意味し、具体的には、配列番号３で示される全長４５９アミノ酸残基で構成されたポリペプチドである。なお、天然のビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることも確認されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の細胞培養表面上で、
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、又は
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドの存在下で、
２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地を用いて、多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項２】
２−メルカプトエタノールの濃度が９．０μＭ以下である、請求項１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項３】
培地が２−メルカプトエタノールを含まない請求項１又は請求項２に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
培地が、水、塩、アミノ酸、ビタミン、セレン、炭素源、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン及びトランスフェリンを含む請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
培地が無血清培地である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項６】
ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項７】
ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−1．７〜−０．９７５である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、下記（３−ｉ）及び（３−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法：
（３−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、及び
（３−ii）  （３−ｉ）の前記部分アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項９】
ポリペプチドが、下記（４−ｉ）及び（４−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法：
（４−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、及び
（４−ii）  （４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項１０】
ポリペプチドが、
（ａ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列に対して、１個〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、並びに、
（ｃ）配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号４〜配列番号２５のいずれかひとつで示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するポリペプチドである請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
支持体が、プラズマ処理細胞培養表面を有するポリスチレン製である請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１５】
ポリペプチドの細胞培養表面への付与量が、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１６】
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、又は
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、
を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを、支持体の細胞培養表面に付与して、支持体のポリペプチドコート細胞培養表面を得ることを更に含む請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１７】
以下の第１の領域及び第２の領域：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域、並びに、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、又は
（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、支持体の細胞培養表面への吸着能を有するアミノ酸配列、
を含む第２の領域、
を含み、かつ、４０個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドと
２−メルカプトエタノールの濃度が１０μＭ以下の培地と、
を含む多能性幹細胞の培養用キット。
【国際調査報告】
2015037622.tif 000041
2015037622.tif 000042
2015037622.tif 000043
2015037622.tif 000044