(57)【要約】  未知濃度の試料を分析する際、ダイナミックレンジ不足し、再分析を行う事態が頻発することがある。そこで、蛍光分析器として、１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出するものを提案する。
2015151812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に励起光を照射する光源と、
前記試料から発生される蛍光を集光するレンズと、
集光後の蛍光を入射して分光する分光素子と、
集光後の蛍光を強度が異なる複数の像に分割する像分割素子と、
特定の分光について前記複数の像を同一検出面内の異なる領域に結像する結像素子と、
前記同一検出面内の異なる領域で、異なる蛍光強度に対応する複数の像を同時に検出する検出器と
を有する蛍光分析器。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光分析器において、
前記像分割素子は、前記分光素子を通過した蛍光を入力する入射面と、第１の蛍光成分を透過する第１の射出面と、第２の蛍光成分を透過する第２の射出面とを有するプリズムである
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項３】
請求項２に記載の蛍光分析器において、
前記第１及び第２の射出面は、それぞれに透過率の異なる蒸着膜が形成されている
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項４】
請求項２に記載の蛍光分析器において、
前記第１及び第２の射出面の少なくとも一方は、前記入射面に対して数°から十数°の範囲で傾いている
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項５】
請求項２に記載の蛍光分析器において、
前記検出器は、２次元検出器である
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項６】
請求項２に記載の蛍光分析器において
前記第１及び第２の射出面の透過率が異なる
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項７】
請求項２に記載の蛍光分析器において
前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線が泳動方向と平行に配置される
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項８】
請求項２に記載の蛍光分析器において
前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線がレーザ射出方向と垂直に配置される
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項９】
請求項２に記載の蛍光分析器において
前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線が分光方向と垂直に配置される
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１０】
請求項２に記載の蛍光分析器において
前記第１及び第２の射出面は互いに異なる傾斜角を有し、前記傾斜角の違いは数°から十数°である
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１１】
請求項２に記載の蛍光分析器において、
前記第１及び第２の射出面は異なる面積を有する
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１２】
請求項１に記載の蛍光分析器において、
前記像分割素子は、前記レンズから入力した蛍光を第１の透過率で透過して前記分光素子に出力するビームスプリッタと、前記分光素子から入力した前記蛍光のうち前記ビームスプリッタで反射された蛍光成分を反射して前記分光素子に出力する反射ミラーとを有する
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１３】
請求項１に記載の蛍光分析器において、
前記像分割素子は、前記分光素子から入力した分光を第１の透過率で透過して前記検出器に出力するビームスプリッタと、前記分光素子から入力した前記分光のうち前記ビームスプリッタで反射された分光を反射して前記検出器に出力する反射ミラーとを有する
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の蛍光分析器において、
前記ビームスプリッタは、透過率と反射率の値が異なる
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の蛍光分析器において、
前記検出器は、２次元検出器である
ことを特徴とする蛍光分析器。
【請求項１６】
請求項１３又は１４に記載の蛍光分析器において、
前記分光素子は、複数の透過特性を切り替え可能なフィルタ機構であり、
前記検出器はライン検出器である
ことを特徴とする蛍光分析器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸やタンパク質などの分析に使用される蛍光分析器に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光分析器の一つにキャピラリ電気泳動装置がある。キャピラリ電気泳動装置は、主にＤＮＡの塩基配列や塩基長の決定に使用される。キャピラリ電気泳動では、キャピラリと呼ばれる細い管にゲル等の泳動媒体を充填し、このキャピラリ内でサンプルのＤＮＡ断片を泳動させる。そして、サンプルが一定距離（通常はキャピラリの端から端まで）だけ泳動し終えるまでに要した時間を計測することで、ＤＮＡ断片長を調べる。各サンプル、すなわち各ＤＮＡ断片は蛍光色素で標識されており、キャピラリ終端部に置かれた光学検出器により、泳動されたサンプルの蛍光シグナルを検出する。【０００３】
複数のキャピラリにレーザ光を照射する方式の一つに、特許文献１に記載されたマルチフォーカス方式がある。この方式では、平面基板上に並んだ複数のキャピラリで構成されたキャピラリアレイの一方又は両側の端に位置するキャピラリにレーザ光を照射する。そして、照射されたレーザ光は、隣接するキャピラリを次々に伝搬し、キャピラリアレイを横断する。キャピラリアレイにおいて発生する発光は、光検出器によって検出する。蛍光色素によって標識されたＤＮＡを含む試料をキャピラリ内に導入し、１列に並べられた複数のキャピラリを伝播するようにレーザ光を照射している。キャピラリに照射されたレーザ光によって、蛍光標識されたＤＮＡは蛍光を発する。キャピラリの各々からの蛍光を測定することにより、各キャピラリに導入された試料のＤＮＡ解析を行うことができる。タンパク質等の解析を行う場合も同様である。【０００４】
上記装置における蛍光検出は、キャピラリ終端部に特定の波長のレーザ光を照射して得られる各蛍光色素の蛍光を回折格子によって波長成分に分離し、空間方向と波長方向の画像をＣＣＤ等の２次元検出器にて検出する。検出器によって撮像された画像は、特定のキャピラリにおけるスペクトルデータとして保存され、データ解析に用いる。特許文献２に記載されているような蛍光分光器は、取得した蛍光を、回折格子を用いて連続的に分散させ、スペクトル（実際は画素毎に離散的）を計測することで分析を行う。【０００５】
現在、蛍光検出器を用いた分析機器は、研究市場から応用市場に拡大しており、濃度の異なる（検出強度がばらつく）サンプルに対応する必要がある。上述したキャピラリ電気泳動装置も、その１つである。従来使用されている主な蛍光検出器は、１つの検出器により蛍光を検出する。そのダイナミックレンジや検出レンジは、蛍光サンプルの励起効率やカメラレンズのＮＡ、２次元検出器の性能そのものに依存する。【０００６】
広いダイナミックレンジや検出レンジが必要な機器では、光路の途中にビームスプリッタやフィルタを設けて検出像を分割し、蛍光強度の異なる複数の像を、複数の検出器で取得する方法が用いられる。しかし、高価な検出器を複数必要とするため、装置コストの増加、検出ユニットの巨大化というデメリットがある。【０００７】
なお、蛍光強度は、照射検出時間や照射強度に依存する。このため、照射側のパラメータを制御することで、強度の異なるデータを取得することができる。そこで、単一の検出器を用いた分析中に、照射時間又は検出時間を長短変化させ、蛍光強度の異なるデータを取得する方法も提案されている。しかし、時系列にデータを取得する装置では、単位時間当たりの測定点数が減少し、データ取得に必要なサンプリング点数が不足する場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５５８２７０５号
【特許文献２】米国特許第６６９０４６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以下では、発明者の鋭意検討の結果判明した従来技術の課題を記載する。通常、キャピラリ電気泳動装置では、ＤＮＡ量を調整したサンプルについて分析を行っている。しかし今後は、キャピラリ電気泳動装置の用途を、臨床診断、ＤＮＡ鑑定等の応用市場へ拡大することが予想される。その場合、キャピラリ電気泳動装置には、未知の濃度のサンプルへの対応能力が求められると考えられる。しかし、ダイナミックレンジが不十分な場合、濃い濃度のサンプルの分析では検出信号値の飽和が生じ、薄い濃度のサンプルの分析では検出信号を検出できない事態が頻発すると考えられる。この場合、分析者は、濃度再調整した後、分析をやり直す必要がある。【００１０】
例えば特許文献１に記されている方法では、複数のサンプルを同時に測定するため、サンプル濃度は、装置のダイナミックレンジの範囲内に限定される。通常、電気泳動を用いた遺伝子配列解析では、電気泳動の前処理工程で、試料の精製に時間をかけ、ほぼ均一の試料濃度を整えた上で、分析を行っている。例えばＲＮＡによる濃度チェックを行った後、電気泳動装置に仕掛けられる。【００１１】
しかし、現在の電気泳動装置が臨床用の遺伝子機能解析の分野に適用されると、十分な前処理工程を経ないサンプルも測定対象となる。例えば濃度チェックを行うにはサンプル量が少なく、濃度を確認しないまま直接電気泳動装置に仕掛けられるもの、発現解析のため予め高濃度にしたものなども測定対象となる。その場合、分析中の測定信号値が、検出限界範囲を超えてしまう場合が生じる。そこで、分析者は、サンプル注入時の電圧や時間を調整すると共にサンプル注入量を制御し、分析をやり直すことになる。【００１２】
この他、実際の分析手法には、励起光の照射時間を２通り設定し、信号強度が飽和しない方を解析に用いるという方法がある。しかし、サンプリング時間中に、照射時間を２通り設けることは、データ処理・転送時間などを十分に確保できない場合がある。例えばサンプリング時間が１５０ミリ秒の場合、１つのデータ処理に４０ミリ秒を設けると、２通りの照射時間として合計７０ミリ秒しか確保できない。本来の感度を保つために、励起光の照射時間として１００ミリ秒を必要とする場合、本方法は適切でないことが分かる。また、２台の検出器を設けて、励起光の照射時間を２通り測定する方法もあるが、装置が高価になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明に係る蛍光分光器では、１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出する手法を提案する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、同一サンプルに関して、蛍光強度の異なる信号を同時に計測するので、見掛け上、ダイナミックレンジを増やすことができる。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各実施例で使用する遺伝子解析装置の概略構成を示す図。
【図２】実施例１で使用する電気泳動装置の照射部の概略構成を示す図。
【図３】実施例１で使用する電気泳動装置の蛍光分析器の概略構成を示す図。
【図４】実施例１で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【図５】実施例１で使用する遺伝子解析装置の処理フローを示す図。
【図６Ａ】従来の結像系による光線追跡を示す図。
【図６Ｂ】実施例に係る結像系による光線追跡を示す図。
【図６Ｃ】像分割プリズムの諸元を説明する図。
【図７】実施例１で使用する像分割プリズムの概略図を示す図。
【図８】実施例１で使用する像分割プリズムの具体例を示す図。
【図９Ａ】θ１５°のプリズムによる像分割の特徴を示す図。
【図９Ｂ】θ５°のプリズムによる像分割の特徴を示す図。
【図１０】実施例１による像分割効果を示す図。
【図１１】実施例２で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【図１２】実施例３で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【図１３】実施例３で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【図１４】実施例４で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【図１５】実施例４で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
まず、後述する各実施例で説明する蛍光分析器の概略構成を説明する。各実施例に係る蛍光分析器は、いずれも１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出する点で共通する。なお、蛍光分析器は、前述の像分割素子と分光素子とを組み合わせて使用する。
【００１７】
いずれの蛍光分析装置も、同一サンプルについて、蛍光強度の異なる複数の信号を同時に計測するので、見掛け上、ダイナミックレンジを増やすことができる。例えば、信号強度が１０倍異なる強弱２種類の像を取得することが可能となり、濃度が１０倍異なるサンプルを分析することができる。例えば濃い濃度のサンプルの場合、蛍光強度が強く、検出器上の像は飽和して正確な分析が行えないことがある。その場合は、蛍光強度が弱い側の像を使用して分析を行う。薄い濃度のサンプルの場合は、蛍光強度の強い像を使って分析する。濃度が１０倍異なっても、検出器上の強弱２つのデータを使い分けることで、分析が行えるようになる。
【００１８】
蛍光検出器は、励起光と蛍光を分離するための光学フィルタ、像を取得するための集光レンズ、蛍光を分光するための分光素子（回折格子やプリズム、光学フィルタ）、像を分割するための光学素子（プリズム、ビームスプリッタ）、結像レンズ、分光した像をデータとして取得するための２次元検出器（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）から構成される。
【００１９】
光学フィルタは、物体面と集光レンズの間及び集光レンズの後に配置される。また、蛍光を分光するための分光素子と像を分割するための光学素子は、集光レンズ後のコリメートされた光路上に配置される。結像レンズは、分光及び像分割後の光路、２次元検出器の手前に配置される。
【００２０】
像を分割するために使用される像分割素子（例えばプリズム）の構造は、コリメートされた蛍光の光軸（光路）に垂直な平面と、光路を分割する数と同じ数の平面から構成される。それら像分割する面は、コリメートされた蛍光の光軸に垂直な平面と平行な面より数~十数°傾いている。例えば１°〜２０°未満の範囲で傾いている。そのため、プリズムの像分割面で光軸が変化する。像分割面の数だけ複数の蛍光光路が生成されることで、像が分割される。それぞれの分割面に誘電膜又は蒸着膜を形成し、透過率を可変させれば、分割された像の蛍光強度を制御することができる。または、各分割面の面積の比率を変えることで、各像の蛍光強度を制御することもできる。
【００２１】
また、別な構造を持つ像分割素子（例えばビームスプリッタ）は、平板状であり、透過と反射により光路を分割する。透過と反射の割合は、制御することができる。像分割素子は、コリメートされた蛍光の光軸と４５°傾斜させて配置される。透過光軸と反射光軸は、９０°と大きな角度を持つため、透過光路又は反射光路上に全反射型ミラーを配置し、分割された光路をほぼ平行にする。
【００２２】
以下、蛍光分析器内における像分割及び複数像の結像の仕組みについて説明する。各実施例に係る蛍光分析器の場合も、従来技術と同様、キャピラリ等にレーザ光を照射し、サンプル中の蛍光色素を励起する。励起された蛍光を光学フィルタ等で励起光成分を防ぎながら分析に必要な蛍光を透過させ、レンズで集光し、コリメートする。コリメートされた蛍光から、再度光学フィルタで不要な成分を取り除き、回折格子で分光する。回折格子により分光された光は、０次光、１次光、２次光成分へ分けられる。実施例に係る蛍光分析器では、分光後に最も信号強度の高い１次光の光路上に像分割素子を配置する。回折格子後の光も、コリメートされた状態が保持される。
【００２３】
像分割プリズムでは、光軸に垂直なプリズム面を通り、その面とは平行ではなく、平行面より数°傾斜した面で光軸が変化する。プリズムと空気との界面上でのスネルの法則により光が屈折する。傾斜した面が複数有ると、その面の数だけ新たな光路が発生し、プリズムに入射した１つの像が、複数の像を形成すべく分割される。その際、像分割に用いられる各面に誘電体膜を蒸着し、透過率を制御すれば、信号強度が異なる像に分割することができる。
【００２４】
最後に、分光及び複数の像、つまり複数の光路に分割された蛍光を、カメラレンズ等を用いて２次元検出器に結像させる。２次元検出器上には分割された複数の物体及び分光された像が結像される。複数の光路に分割する際、分割面の光量に依存して、結像の信号強度が決定される。なお、後述するように、検出器は２次元検出器に限られるものではなく、使用する像分割素子と分光素子の組み合わせによっては１次元検出器を使用する。
【００２５】
以下、添付図面を参照して実施例について説明する。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２６】
［実施例１］
図１は、キャピラリ電気泳動装置を蛍光検出に使用する遺伝子解析装置の構成例を示す。なお、この装置構成は、後述する各実施例についても共通である。遺伝子解析装置は、蛍光分析器の一例である。
【００２７】
遺伝子解析装置１００は、データ解析装置１２８と電気泳動装置１０１から構成される。電気泳動装置１０１は、サンプルを光学的に検出するための検出部１１６、キャピラリを恒温に保つための恒温槽１１８、キャピラリ陰極端に様々な容器を搬送するための搬送機１２５、キャピラリに高電圧を加えるための高圧電源１０４、高圧電源から発せられる電流を検出するための第１電流計１０５、陽極側電極に流れる電流を検出するための第２電流計１１２、単数又は複数本のキャピラリ１０２により構成されるキャピラリアレイ１１７、キャピラリにポリマーを注入するためのポンプ機構１０３により構成される。
【００２８】
キャピラリアレイ１１７は、複数本（例えば４本）のキャピラリを含む交換部材であり、ロードヘッダ１２９、検出部１１６、キャピラリヘッドを含む。測定手法を変更する場合、キャピラリアレイ１１７を置き換え、キャピラリ１０２の長さを調節する。また、キャピラリに破損や品質の劣化が見られたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。
キャピラリ１０２は、内径が数十〜数百ミクロン、外径が数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ１０２の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。
【００２９】
検出部１１６は、試料に依存した情報を取得する部材であり、励起光が照射され、試料に依存した波長の光を放出する。４本のキャピラリの光照射部近傍を、光学フラット平面に高さ数ミクロンの精度で配列固定している。電気泳動時、略同軸の２本のレーザ光が両側から照射され、全ての光照射部を連続して透過する。このレーザ光により、試料から情報光（試料に依存した波長を有する蛍光）が生じ、光照射部から外部に放出される。この情報光を光学検出器１１５により検出して、試料を分析する。
【００３０】
キャピラリ陰極端１２７は、それぞれ金属製の中空電極１２６を通して固定されており、キャピラリ先端が中空電極１２６から０.５ｍｍ程度突き出た状態になっている。また、キャピラリ毎に装備された中空電極はすべてが一体となってロードヘッダ１２９に装着される。さらに、すべての中空電極１２６は装置本体に搭載されている高圧電源１０４と導通しており、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。
【００３１】
キャピラリ陰極端１２７と反対側のキャピラリ端部（他端部）は、キャピラリヘッドにより１つに束ねられており、キャピラリヘッドを通じ、束のまま耐圧機密でブロック１０７に着脱される。ブロック１０７内の流路の１つにはシリンジ１０６が接続されており、このシリンジ１０６により、前記他端部側からキャピラリ内に新規ポリマーが充填される。キャピラリ中のポリマーの詰め替えは、測定の性能を向上するために測定ごとに実施される。
【００３２】
ポンプ機構１０３は、シリンジ１０６とそのシリンジを加圧するための機構系で構成される。また、ブロック１０７は、シリンジ１０６、キャピラリアレイ１１７、陽極バッファ容器１１０、ポリマー容器１０９をそれぞれ連通させるための接続部である。光学検出部は、検出部１１６を照射するための光源１１４と、検出部１１６内の発光を検出するための光学検出器１１５で構成される。電気泳動により分離されたキャピラリ中のサンプルを検出するときは、光源１１４でキャピラリの光照射部を照射し、光照射部からの発光を光学検出器１１５で検出する。
【００３３】
恒温槽１１８は、恒温槽内を一定の温度に保つために、断熱材で覆われ、加熱冷却機構１２０により温度が制御される。また、ファン１１９が恒温槽内の空気を循環及び攪拌させ、キャピラリアレイ１１７の温度を位置的に均一かつ一定に保つ。搬送機１２５は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下、左右、および奥行き方向の３軸に移動可能である。また、搬送機１２５の移動ステージ１３０には、少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。さらに移動ステージ１３０には、電動のグリップ１３１が備えられており、各容器を掴んだり放したりできる。このため、搬送機１２５は、グリップ１３１を使用して、陰極バッファ容器１２１、洗浄容器１２２、廃液容器１２３及びサンプル容器１２４を、必要に応じて、陰極端まで搬送することができる。なお、不必要な容器は、装置内の所定収容所に保管されている。
【００３４】
電気泳動装置１０１は、データ解析装置１２８と通信ケーブルで接続された状態で使用される。オペレータは、データ解析装置１２８により、装置の保有する機能の制御し、装置内の検出器で検出されるデータを授受できる。
【００３５】
図２に、遺伝子解析装置１００の光学系レーザ照射部とキャピラリアレイ１１７の検出部付近の構成と、レーザ光の導入経路を模式的に示す。レーザ用のシャッタ，フィルタ等はこの分野で周知事項であり、本発明の直接の対象ではないので、簡略化のため、表示していない。（ａ）図はレーザ照射部の概略側面図であり、（ｂ）図は概略正面図である。ただし、（ａ）図と（ｂ）図における配置関係は、製図上の配置関係を表すものではない。
【００３６】
光源である固体レーザ２０１から射出されたレーザ光２０２は、反射ミラー２０３やビームスプリッタ２０５を通じ、キャピラリアレイへ照射される。４本のキャピラリ１０２を基準ベース２０９上に並べて固定したものがキャピラリアレイである。基準ベース２０９上の４本のキャピラリ１０２の中心軸が形成する平面及びその平面を全空間に延長した仮想の平面をキャピラリ配列平面と呼ぶ。また、キャピラリ配列平面にあって、４本のキャピラリ軸に垂直であり、検出部の中央を貫く仮想の直線を、以下、照射光軸基本軸２１０と呼ぶ。
【００３７】
キャピラリアレイの両端から導入されるレーザ光２０２は、キャピラリ配列平面に対して平行であり、照射光軸基本軸２１０と同軸である。キャピラリ１０２は、石英のガラス管がポリマー薄膜（ポリイミド）で覆われたものであるが、検出部においては、ポリマー被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。石英管の内径／外径は５０／３２０μｍ、ポリマー薄膜を含めたキャピラリ外径は３６３μｍである。キャピラリ１０２のピッチは、キャピラリ外径に等しく３６３μｍ、キャピラリアレイの幅は８．７ｍｍ（＝３６３μｍ×４）である。
【００３８】
キャピラリアレイの蛍光検出部（石英がむき出しの部分）に、アレイの片側側面からレーザ光２０２を照射し、検出部から発せられる蛍光を観測することにより、ＤＮＡを検出する。レーザ光２０２は、レーザ集光レンズ２０６（ｆ＝６０ｍｍ）によって集光される。キャピラリアレイの端に位置し、レーザが導入されるキャピラリ１０２を、以下、第１キャピラリとする。レーザ集光レンズ２０６と第１キャピラリの距離は６２ｍｍであり、第１キャピラリに導入されたレーザ光は、隣接するキャピラリに次々と伝搬し、４本のキャピラリを横断する。
【００３９】
レーザ光２０２がキャピラリ１０２へ到達する前に、レーザ光２０２の直線偏光を円偏光に変えるために、キャピラリアレイの両端位置には、波長板（λ/４）２０７が配置される。片側の波長板２０７で円偏光にされたレーザ光２０２は、もう片方の波長板２０７で、再び直線偏光にされる。この際、波長板２０７を２回通過した直線偏向の直線偏向方向は、最初の波長板２０７に導入される前の直線偏光方向に対して偏光方向が９０度回転している。また、戻り光対策として、固体レーザ２０１の直後には、偏光子２０４が配置される。偏光子２０４は、偏光板やポラライズキューブといった一方向の偏光のみを透過させる光学素子である。偏光子２０４によって、波長板２０７を２回通過したレーザ光は遮られるため、光源まで届くことはない。
【００４０】
図３を用い、照射部と検出部の配置について説明する。前述の通り、複数本のキャピラリ１０２（例えば４本）を、平坦な表面であるセラミック製の基準ベース２０９上に並べて固定し、キャピラリアレイを形成している。図示の例では、４本のキャピラリ１０２をキャピラリ保持面上に並べ、シリコン製の平板マスク３０１で抑え、接着剤等で固定し、キャピラリアレイを形成している。
【００４１】
基準ベース２０９上の４本のキャピラリの中心軸が形成する平面及びその平面を全空間に延長した仮想の平面を、キャピラリ配列平面と呼ぶ。また、照射光軸基本軸２１０に垂直かつキャピラリ配列平面とも垂直な直線を検出光軸基本軸３１０と呼ぶ。キャピラリアレイの両端から導入されるレーザ光２０２は、キャピラリ配列平面に対して平行であり、照射光軸基本軸２１０と同軸である。一本一本のキャピラリ１０２は、石英のガラス管がポリマー薄膜で覆われたものであるが、レーザ照射部３０２（検出部位）は、ポリマー被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。
【００４２】
図３の（ｂ）図に、検出部の一部をキャピラリに直交する面に沿って切断した断面の模式図を示す。キャピラリ１０２は４本であり、レーザ光２０２は、先ず、一番端のキャピラリ１０２を照射し、それを通過すると、次のキャピラリ１０２を照射する。こうしてレーザ光２０２は、複数のキャピラリを次々に通過し、反対側の端のキャピラリ１０２より出る。キャピラリ１０２は円筒形状を有し、その中にポリマーが充填されているから、凸レンズと同様な集光機能を提供する。これにより、レーザ光２０２の発散を抑制する。レーザ光２０２をキャピラリアレイの左右両方向から照射することにより、略全てのキャピラリ１０２に、均一強度のレーザ光２０２を照射させることができる。そのため、レーザ強度を保ちながら４サンプルを同時に照射することができる。蛍光検出器３０３は、検出光軸基本軸３１０上に配置され、４サンプルの蛍光を効率良く同時に集光することができる。つまり、全サンプルにおいて高感度を保ちながら同時に検出することができる。
【００４３】
図４に、蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。図４の（ａ）図は、キャピラリ１０２の軸と検出光軸基本軸３１０により作られる面上の図を示し、図４の（ｂ）図はその側面図、つまり、照射光軸基本軸２１０と検出光軸基本軸３１０により作られる平面上の図である。ただし、（ｂ）図では、説明を容易にするため、回折格子４０５以降の光学系の配置に修正を加えている。本来的には、（ａ）図の配置に合わせて、（ｂ）図中の薄型プリズム（「像分割プリズム」ともいう）４０９や結像レンズ４０６等が傾斜しているように表す必要がある。
【００４４】
蛍光検出器３０３は、励起光と蛍光を分離するための第１の光学フィルタ４０２と第２の光学フィルタ４０４、像を取得するための集光レンズ４０３、蛍光を分光するための回折格子４０５、像を分割するための薄型プリズム４０９、像を結像させる結像レンズ４０６、分光した像をデータとして取得するための、２次元検出器４０７（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）から構成される。
【００４５】
以下、光学素子の詳細配置と、検出器内の像分割及び複数像の結像される仕組みを説明する。キャピラリ１０２にレーザ光２０２を照射し、サンプル中の蛍光色素を励起する。第１の光学フィルタ４０２、集光レンズ４０３、第２光学フィルタ４０４、回折格子４０５は、検出光軸基本軸３１０上に配置する。従来技術と同様に、キャピラリ１０２からの発光を、第１の光学フィルタ４０２で励起光と必要な蛍光成分に分離し、集光レンズ４０３にて集光及びコリメートする。コリメートされた蛍光は、再度、第２の光学フィルタ４０４に入射され、不要な成分が取り除かれる。不要な成分が取り除かれた蛍光は、回折格子４０５において分光される。回折格子４０５により分光された光は、０次光、１次光、２次光成分へ分けられる。本実施例では、分光後に最も信号強度の高い１次光の光路を、分光後検出光軸４１０とし、それ上に、像分割素子である薄型プリズム４０９、像を結像させる結像レンズ４０６、分光した像をデータとして取得するための２次元検出器４０７（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）を配置する。
【００４６】
薄型プリズム４０９の構造は、コリメートされた蛍光の光軸（光路）−検出光軸基本軸３１０に垂直な平面と、光路を分割する数と同じ数の平面から構成される。それら像分割する面は、コリメートされた蛍光の光軸に垂直な平面と平行な面より数〜十数°傾いている（図６にて後述する）。そのため、薄型プリズム４０９の像分割面において光軸が変化する。本実施例では、面積の等しい２つの像分割面を持ち、２つの蛍光光路４１１、４１２が生成されることで、像が分割される。像分割プリズムでは、光軸に垂直なプリズム面を通り、その面とは平行ではなく、平行面より数°傾斜した面で光軸が変化する。プリズムと空気との界面上でのスネルの法則により、光が屈折する。傾斜した面が複数面有ると、その数だけ新たな光路が発生し、プリズムに入射した１つの像が、複数の像を形成すべく分割される。それぞれの分割面には、誘電膜又は蒸着膜が形成され、透過率を可変させることで、分割された像の蛍光強度を制御することができる。本実施例では、透過率９０％の像分割面と透過率１０％の像分割面を持つ薄型プリズム４０９を配置する。
【００４７】
最後に、分光及び複数の像つまり光路に分割された蛍光を、結像レンズ４０６を用いて２次元検出器４０７に結像させる。２次元検出器４０７の同一検出面を構成する複数の領域には、特定の分光（１次光）を分割した複数の物体像が結像される。複数の光路に分割する際、分割面の光量に依存して、結像する物体像の信号強度が決定される。
【００４８】
蛍光光路４１１を通る蛍光は、透過率９０％の像分割面を透過するため、２次元検出器４０７上に信号強度の強い第１の像（強）を結像する。蛍光光路４１２を通る蛍光は、透過率１０％の像分割面を透過するため、２次元検出器４０７上に信号強度の弱い第２の像（弱）を結像する。第１の像と第２の像の信号強度比は、透過率の比と同じおよそ９：１になる。つまり、２次元検出器４０７上に、第１の像（強）と第２の像（弱）の２種類のデータを同時に取得する
【００４９】
以下、主に図５を参照して、電気泳動分析の基本的手順について説明する。電気泳動を行い、任意のサンプルの分析を行う前に、キャピラリを交換毎に波長校正を行う（５００）。波長校正は、分析する色素群、例えば4色の蛍光色素から校正された既知のDNAサンプルを泳動し、基準となるスペクトルデータを取得する。キャピラリ１０２の劣化による分析性能の低下、分析によってキャピラリ１０２の長さを変更する場合、キャピラリアレイを交換した後は、必ず行う作業である。
【００５０】
電気泳動分析の基本的手順は、事前準備、泳動媒体充填（５０３）、予備泳動（５０６）、試料導入（５０９）及び電気泳動（５１２）による分析に大別できる。まず、電気泳動を開始前の準備について説明する。オペレータは、測定を開始する前に次のものを装置にセットする。すなわち、バッファ液の入った陰極バッファ容器１２１、キャピラリ洗浄用の純水が入った洗浄容器１２２、キャピラリ中のポリマーを排出するための廃液容器１２３、分離媒体となるポリマーが入ったポリマー容器１０９、これから測定するサンプルを入れたサンプル容器１２４がセットされる。
【００５１】
陽極バッファ容器１１０には、電極（ＧＮＤ）１１１及び連通管の双方を十分に漬す程度のバッファが満たされる。緩衝液は、各社から電気泳動用として市販されている電解質液を使用する。また、サンプル容器１２４のウェルには、分析対象である試料が分注される。試料は、例えばＤＮＡのＰＣＲ産物である。また、洗浄容器１２２には、キャピラリ陰極端１２７を洗浄するための洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば純水である。また、シリンジ１０６内に、試料を電気泳動する為の分離媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲル（以下、ポリマー）である。
【００５２】
このときに、サンプル容器１２４にセットされるサンプルには、解析の対象であるDNAの実サンプルの他、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、アレリックラダーがあり、それぞれ異なるキャピラリにおいて電気泳動される。ポジティブコントロールは、例えば既知のＤＮＡを含むＰＣＲ産物であり、ＰＣＲによってＤＮＡが正しく増幅されていることを確認するための対照実験用のサンプルである。ネガティブコントロールとは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ産物であり、ＰＣＲの増幅物にオペレータのＤＮＡや塵などのコンタミネーションが生じていないことを確認するための対照実験用のサンプルである。
【００５３】
また、陰極バッファ容器１２１は、中空電極１２６とキャピラリ陰極端１２７が十分に浸る程度のバッファを満たす。バッファの液量が足りない、又は、陰極バッファ容器１２１が空の状態で測定を開始すると、高電圧印加時に高電位の陰電極と、電位の低い他のものの間で放電が起こる危険があるためである。さらに双方のバッファレベルは同等であることが望ましい。それは、高低差による圧力でキャピラリ内のポリマーが動かないようにするためである。また、電気泳動に利用される流路、あるいはその流路にポリマーを搬送するために使用される流路はすべて測定開始前にポリマーで満たされておく必要がある。通常、連続して装置を使用する場合は前記の流路はポリマーで満たされている。また、キャピラリアレイの交換、流路内の洗浄等の後で流路をポリマーで再置換するときは、オペレータが、装置のポンプ機構を操作するか手動でシリンジを操作するなどして流路内をポリマーで再置換する。その後、流路内に気泡の残留や異物の混入がないようにオペレータは目視にて確認する。そして、事前準備が完了した後、オペレータは本装置を操作して、分析を開始する。その分析とは、ここでは電気泳動路に高電圧を加えるような分析である。
【００５４】
本装置は、データ解析装置１２８からの命令により分析を開始する（５０１）。装置は、はじめに、キャピラリへのポリマー注入に備え、搬送機１２５により、廃液容器をキャピラリ陰極端に運ぶ（５０２）。その後、ポンプ機構１０３によってキャピラリにポリマーを注入する。すなわち泳動媒体充填（５０３）が開始される。このステップは、分析開始後に自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動媒体充填とは、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。
【００５５】
本実施例における泳動媒体充填（５０３）では、まず、搬送機１２５により廃液容器１２３をロードヘッダ１２９の直下に運び、キャピラリ陰極端５２７から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ１０６を駆動して、キャピラリ１０２に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器１２２内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端１２７を浸し、泳動媒体により汚れたキャピラリ陰極端１２７を洗浄する。
【００５６】
所定の量の泳動媒体の充填が終了すると、搬送機１２５は、洗浄容器１２２をキャピラリ陰極端１２７まで搬送し、キャピラリ陰極端１２７を洗浄容器内の純水に浸すことにより洗浄を行う（５０４）。次に、搬送機１２５は、キャピラリ陰極端１２７に陰極バッファ容器１２１を搬送する（５０５）。
【００５７】
次に、予備泳動（５０６）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。所定の電圧を印加し、予備泳動を開始する（５０６）。予備泳動とはサンプル導入から電気泳動を行う本来の分析工程に先立って、キャピラリ内のポリマーの状態を分析に適した状態にするためのものである。予備泳動では通常数〜数十キロボルト程度の電圧が数〜数十分間加えられる。
【００５８】
予備泳動が終了すると、再び洗浄容器でキャピラリ陰極端１２７を洗浄した後（５０７）、キャピラリ陰極端にサンプル容器１２４を搬送する（５０８）。そして、サンプル容器１２４に収納されたサンプル液中でキャピラリ陰極端１２７に数キロボルト程度の電圧を加えると、前記サンプル液から陽極側電極の間で電界が発生する。この電界によりサンプル液中のサンプルがキャピラリ内に導入される（５０９）。サンプルの導入を終えると、キャピラリ陰極端１２７を洗浄容器で洗浄した後（５１０）、再びキャピラリ陰極端１２７に陰極バッファ容器１２１を搬送する（５１１）。その後、所定の電圧を加えることで電気泳動を開始する（５１２）。
【００５９】
次に電気泳動（５１２）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。電気泳動（５１２）とは、陰極及び陽極バッファ間で発生した電界の作用によりキャピラリ中のサンプルに移動度を与え、サンプルの性質に依存する移動度の差によりサンプルを分離することである。本実施例における電気泳動（５１２）では、まず、搬送機１２５により、陰極バッファ容器１２１内の緩衝液にキャピラリ陰極端１２７を浸し、通電路を形成する。次に、高圧電源１０４により、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各サンプル成分は、各サンプル成分の性質に依存した速度で検出部１１６へ移動する。つまり、サンプル成分は、その移動速度の差により分離される。そして、検出部１１６に到達したサンプル成分から順番に検出される。
【００６０】
例えば、サンプルが、塩基長の異なるDNAを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いDNAから順に検出部１１６に到達する。各DNAには、その末端塩基配列に依存した蛍光色素が取り付けられている。検出部１１６に光源１１４から励起光が照射されると、サンプルから情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）が生じ、外部に放出される。この情報光を光学検出器１１５により検出する。泳動分析中は、光学検出器１１５では、一定の時間間隔でこの情報光を検出し、画像データをデータ解析装置１２８へ送信する。もしくは送信する情報量を減らすため、画像データではなく、画像データ中の一部の領域のみの輝度を送信してもよい。例えば、キャピラリ毎に、一定間隔の波長位置のみの輝度値を送信してもよい。最後に、電圧印加開始から所定の時間が経過し、予定していたデータを取り終えたら電圧印加を停止し、電気泳動を終了する（５１３）。以上が一連の測定シーケンスである。
【００６１】
図６Ａ〜図６Ｃを用い、強弱２像が分割される原理及び像分割プリズム構造について説明する。図６Ａ〜図６Ｂでは、回折格子４０５による分光の効果を省き、単に結像系を示す。図６Ａに、従来技術による蛍光分光器による結像系を示す。キャピラリ１０２が配列されており、第２の集光レンズ４０４Ａによりコリメートされた蛍光の光線追跡６０１は、結像レンズ４０６により１つの像６０２が２次元検出器４０７上に結像される。１対１の結像系の場合、物体像と同じ像が、結像される。
【００６２】
図６Ｂに、本実施例の光線追跡を示す。本実施例の場合、従来の蛍光分光器の構成に加え、像分割ブリズム４０９が配置される。この像分割プリズム４０９透過後の蛍光は、像分割プリズム４０９の像分割面と空気との界面で屈折する。分割面が２つあるため、１点からの光線は２方向に屈折し、２つの光線追跡６０３と６０４になる。それぞれ、結像レンズ４０６により２つの像６０５、６０６が結像される。
【００６３】
以下、像分割プリズム４０９から出射される光線の角度や、２つの像が重ならないためのプリズム設計について述べる。各添え字は、以下の値を示す。
ｆ1：集光レンズの焦点距離
ｆ2：結像レンズの焦点距離
Y  ：像高（物体面）（アレイ幅の半分）
Y’：像高（結像面）
【００６４】
次に、集光レンズ等への角度を以下と定義する。
θ1  ：集光レンズへの入射角
θ'1 ：プリズムへの入射角
θ2  ：プリズムからの出射角
θ   ：プリズムの傾斜角（頂角＝２π−２θ）
【００６５】
まず、像高（結像面）Y'を計算する。Y'は次式で与えられる。
Y'＝tanθ2×f2／f1×f2
２つに分割された像が重ならないためには、次式の条件を満たす必要がある。
Tanθ2×f2＝Y'＞2Y      …（１）式
（ただし、f1＝f2の１:１結像系の場合）
【００６６】
また、Y/f1＝tanθ1であるので、θ1は次式で与えられる。
θ1＝tan-1(Y／f1)
ここで、プリズム材質の屈折率n、プリズム内の光路の角度をθ3〜θ4（図６Ｃ参照）とすると、θ1とθ2の関係は、スネルの法則より、次式となる。
ｎ×sinθ'2＝sinθ1
【００６７】
さらに、図６Ｃより、次式となる。
θ'3＝θ'2＋θ
＝sin-1（sinθ1/n）＋θ
また、像分割面では、再度、スネルの法則より、次式が成立する。
n×sinθ'3＝sinθ'4
図６Ｃより、θ'4を求めると、次式となる。
θ'4＝sin-1(n×sinθ'3)
＝sin-1(n×sin(sin-1（sinθ1/n）＋θ))
【００６８】
さらに、像分割プリズム４０９からの出射角θ２は、
θ2＝θ'4−θ
＝sin-1(n×sin(sin-1（sinθ1/n）＋θ))−θ      …（２）式
となる。
【００６９】
これらの（１）式と（２）式を満たすように、元の物体像Yから像分割プリズム４０９の傾斜角θを求めることができる。
【００７０】
図７に、像分割プリズム４０９の概略を示す。集光レンズ４０３によってコリメートされた蛍光は、図示する入射面から入射する。像分割プリズム４０９は、入射面を基準として、それと平行な面から角度θだけ傾いた２面を分割面として構成される。像分割プリズム４０９の頂角αは、π−２θとなる特徴を持つ。像分割プリズム４０９の材質は、例えばＢＫ７（屈折率1.517）である。
【００７１】
図８に、像分割プリズム４０９の具体例を示す。例えば８本のキャピラリ１０２でキャピラリアレイが構成される場合、キャピラリ１０２のピッチはキャピラリ外径に等しく３６３μｍであり、アレイの幅は２．９６ｍｍ（＝３６３μｍ×８）であり、中心からの像高（物体面）は半分の１．５ｍｍである。集光レンズ４０３、結像レンズ４０６の焦点距離を５０ｍｍとすると、入射角θ１＝１．７２°、出射角θ２＝６．４７°となる。物体側の像高は６．７ｍｍとなり、キャピラリ幅２．９６ｍｍより十分大きいため、分割されたそれぞれの像を検出器上で取得できる。
【００７２】
図示はしないが、各キャピラリ間隔が十分に大きい場合（例えば、キャピラリ外径以上の場合）、第１の像と第２の像をキャピラリ間隔分だけずらし、第１の像のキャピラリ間に、第２の像のキャピラリ像を結像させ、撮像することも可能である。
【００７３】
図９Ａに、像分割プリズム４０９の傾斜角θが１５°の場合の光線追跡図及び２次元検出器上の結像の様子を示す。例えば３本のキャピラリ１０２を用いる場合、光線追跡（全キャピラリ）９０１には、それぞれ３本分の光線が微妙な角度の違いで表現される。像分割プリズム４０９の後は、第１の像の光線追跡（第１キャピラリ）９０２〜（第２キャピラリ）９０４に分割される。同様に、第２の像の光線追跡も３本分が存在する。第１の像の光線追跡（第１キャピラリ）９０２〜（第２キャピラリ）９０４、第２の像の光線追跡は、２次元検出器上に到達し、それぞれ、キャピラリ像を表す。傾斜角が大きいため、第１の像と第２の像は、２次元検出器上で離れて得られる。
【００７４】
一方で、図９Ｂに、像分割プリズム４０９の傾斜角θが５°の場合の光線追跡図及び２次元検出器上の結像の様子を示す。傾斜角θは、３本のキャピラリ１０２に対して的確な値であり、２次元検出器上で、第１の像と第２の像は、ほぼ隣り合って得られる。このため、本例の場合、像分割プリズム４０９の傾斜角θを５°に設定すると、検出器領域を無駄なく使用できるという効果がある。
【００７５】
以下では、図１０を用い、図４において強弱２種類の信号強度の像を取得することの効果を説明する。図１０の（ａ）図に、２次元検出器上に結像される第１の像（強）と第２の像（弱）の例を示す。それぞれ、縦軸がキャピラリの空間方向つまりキャピラリ番号、横軸波長分散方向を示す。ここで、２次元検出器上のＡ点（例えば、第２のキャピラリ、波長６００ｎｍ）に着目する。
【００７６】
図１０の（ｂ）図に、第１の像と第２の像おける各Ａ点の時系列データを示す。横軸が時間、縦軸が信号強度を示す。ＤＮＡ断片が流れてくると、レーザにより励起されて発せられた蛍光の強度を表す信号が検出され、時系列的にピークとして観測される。通常、ＤＮＡの断片長さに応じてピークが生じる時間が異なるため、複数のピークが観測できる。サンプル濃度が的確な値に調整されている場合、通常全てのＤＮＡ断片を観測することができる。
【００７７】
一方で、未知のサンプルに対応する場合、濃度の濃いＤＮＡ断片を分析する必要がある。その際、信号強度が飽和限界値（図中では“１２”）を上回ってしまい、正確な値が検出できないことがある。第１の像の「信号値の飽和状態」に示す箇所がその場合である。そこで、第２の像に着目すると、そもそも信号強度を小さくして、データを取得しているため、飽和限界値を超えておらず、同じＤＮＡ断片のデータを取ることができる。再度、分析をする必要もなく、サンプルの無駄や分析コストを挙げることなく、効率良く分析が行える。第１の像、第２の像を使い分けることで、一辺に、濃度の異なるサンプルを分析することも可能となる。
【００７８】
第１の像、第２の像の信号強度比は、像分割プリズムの各分割面の透過率に従う。透過率を１：１０などとすることで、１０倍異なる濃度のサンプルに対応出来ることになる。第１の像、第２の像のどちらを通常モードとして利用するかは、装置システムごとに決めることができ、本実施例では、どちらのデータも取得するができる。操作画面上に、第１の像、第２の像を時系列に表示するなど（図示無）、ユーザが事前にチェックする機能を設けることで、解析を行う際、ユーザが選択することも可能である。
【００７９】
本実施例では、１台の検出器で、見掛け上２種類の分析をすることになる。従来技術で例えれば、照射検出時間や照射強度を変えて、複数回分析するところ、長短２種類の照射検出時間を１回の分析で行うことと同義である。このように、本実施例に係る蛍光分析器は、当該装置を構成する各部品や性能が同じ２つの検出器をあたかも備えたかのような機能を有する。つまり、分析可能なＳＮ比・感度を保ちつつ、見かけ上、装置のダイナミックレンジが拡大したことになる。
【００８０】
このように、見かけ上、ダイナミックレンジが拡大することで、本実施例に係る蛍光分析器では、分析最中に測定信号値が検出レンジに対して飽和することに起因する再測定を極力低減させることができる。特に、複数のサンプルを同時測定する際、各サンプル濃度のばらつきが大きくても、同時に測定することができる。また、濃度が未知のサンプルを測定するのにも効果的である。
【００８１】
また、本実施例に係る蛍光検出器は、１つの検出器によって、強弱複数の検出像を同時取得できるので、小型かつ低価格、非常に広域の検出レンジを持つ装置を提供することができる。例えば、キャピラリ型遺伝子検査装置で、ダイナミックレンジを、従来比１０倍以上に拡大できる。また、強弱複数の検出像を同時取得することで、測定点数を維持し、高精度な分析を行うことができる。
【００８２】
［実施例２］
続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第２の実施例を説明する。実施例１における蛍光分析器では、薄型プリズム４０９を像分割素子として用いた。この実施例１におけるプリズムの像分割面は等面積（図４参照）であり、透過率を変化させることで、分割された像の蛍光強度を制御した。しかし、像分割面に、異なる特性を持つ誘電多層膜を蒸着するのは、以下のようなデメリットがある。
１）製造上複数の蒸着工程を経るため高コストである。
２）透過率を下げることは、元々の集光した光量を無駄にする。
【００８３】
そこで、実施例２においては、像分割面の面積比で蛍光強度を制御するプリズムを使用する。図１１に、本実施例で使用する蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。主な構成は、実施例１と同様であるが、像分割する光学素子に、異なる面積比の像分割面を持つ像分割プリズム１１０９を使用する。
【００８４】
本実施例では、回折格子４０５で分光された蛍光を、面積が異なる複数の像分割面を持つ像分割プリズム１１０９を通過させ、通過する面積の違いによって信号強度の異なる複数の像に分割する。実施例１において、図６Ｂを用いて説明したように、像分割面と空気との境界面で光軸が屈折するため、蛍光の光線方向が変化する。像分割面の面積に比例した光線量が、結像する際の蛍光強度になる。つまり、像分割面の面積比に応じて、２次元検出器４０７で検出される信号強度が決まる。
【００８５】
図１１の場合、像分割プリズム１１０９の２つの像分割面の面積比が９：１であるので、実施例１と同様、９：１の信号強度を持つ２つの像を取得することができる。本実施例に係る蛍光分析器の場合、像分割面に異なる誘電多層膜を蒸着する必要もなく、透過率の高いARコーティングを全面に施すだけで良い。また、もともとの光量をロスすることなく、２つの像の信号強度を９：１に分割することができ、SN比や感度を高く保つことができる。
【００８６】
［実施例３］
続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第３の実施例を説明する。実施例１による蛍光分析器では、薄型のプリズムを像分割素子として用いている。しかし、プリズムは、波長分散素子の一つであり、回折格子と同様に、集光した蛍光成分を波長ごとに分散させる機能を持つ。このため、像分割方向について、プリズムによる波長分散の影響が多少発生する。アプリケーションや検出像の種類によっては、微小の波長分散が分析に影響を及ぼす場合がある。
【００８７】
そこで、本実施例では、像分割素子をビームスプリッタ（ハーフミラー）と全反射ミラーで構成する。プリズムを使用しない像分割であるので、実施例１や実施例２のように像分割プリズムによる波長分散の影響は無い。
【００８８】
以下、図１２を参照して実施例３に係る蛍光分析器の詳細構成を説明する。実施例３による遺伝子解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。前述したように、本実施例では、像分割素子として、入射光を透過光と反射光に分割する像分割光学素子（例えばハーフミラーやビームスプリッタ）と全反射ミラーの組み合わせ構造を使用する。以下では、像分割光学素子として、ビームスプリッタ１２０９を使用するものとする。
【００８９】
本実施例の場合、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０を、集光レンズ４０３と第２の光学フィルタ４０４の間に配置する。図１２に示すように、ビームスプリッタ１２０９は、検出光軸基本軸３１０に対してほぼ４５°、全反射ミラー１２１０は、検出光軸基本軸３１０に対して４５°以下（例えば４３〜４４°）に配置する。
【００９０】
ビームスプリッタ１２０９は、平板状の光学素子であり、透過と反射により光路を２つに分割する。すなわち、透過率（又は反射率）を制御し、入射光を所定の分割比で２つの光に分割する。分割の際、ダイクロイックミラーのように波長に依存して、透過・反射特性が違うのではなく、ある波長領域において、一意に透過及び反射率が決まっている。偏光の種類としては、非偏光タイプ、無偏光タイプ、偏光タイプとあるが、本実施例では、入射光の偏光状態も含めて非偏光タイプを用いる。
【００９１】
発光点４０１の蛍光は、集光レンズ４０３によってコリメートされ、入射角４５°でビームスプリッタ１２０９へ入射する。例えばビームスプリッタ１２０９の透過率：反射率を９０％：１０％とすると、集光された光量の９割が透過し、１割が反射する。９割の光は、蛍光光路（強）４１１に示すように、検出光軸基本軸３１０と平行であり、回折格子４０５により分光され、２次元検出器４０７上に結像される。一方、反射した1割の光は、蛍光光路（弱）４１２に示すように、全反射ミラー１２１０により、検出光軸基本軸３１０とほぼ平行に戻される。この際、全反射ミラー１２１０は、検出光軸基本軸３１０に対して４５°以下（例えば４３〜４４°）に配置されており、蛍光光路（弱）４１２は、検出光軸基本軸３１０に対して完全に並行ではなく、１〜２°角度を持って入射する。
【００９２】
回折格子４０５により分光された後も、検出光軸基本軸３１０と角度を持ちながら、結像レンズ４０６によって、２次元検出器４０７上に結像される。その際、蛍光光路（強）４１１による像と異なる位置に像が結ばれるため、２次元検出器４０７上には２つの像が形成される。集光された光量９割分が結像する蛍光光路（強）４１１による像の信号強度は高く、蛍光光路（弱）４１２による信号強度は低い。それぞれの信号強度比は、ビームスプリッタ１２０９の透過率：反射率を９０％：１０％に従い、９：１になる。実施例１と同様に、強弱２種類のデータを取得することができる。
【００９３】
ここで、ビームスプリッタ１２０９は、キューブ型ビームスプリッタを用いることもできる。透過光の屈折が一切ないこと、また入射角条件が垂直入射のため、プレート型のように４５°で入射にする必要がなく、アライメント作業が容易になることのメリットがある。
【００９４】
以上に述べたように、本実施例による蛍光分析器では、ビームスプリッタ１２０９によって集光レンズ４０３で集光された蛍光を２つに分割し、一方の蛍光はそのまま２次元検出器４０７に集光し、もう一方の蛍光は全反射ミラー１２１０で反射させた後、２次元検出器４０７に集光する。ビームスプリッタ１２０９による集光像の２分割であるので、波長分散は生じずに済む。
【００９５】
なお、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系の配置位置は、図１２に示す配置位置に限らない。例えば図１３に示すように、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系を、回折格子４０５と結像レンズ４０６の間の分光後検出光軸４１０上に配置しても良い。この場合、ビームスプリッタ１２０９は、分光後検出光軸４１０に対してほぼ４５°に配置する。全反射ミラー１２１０は、分光後検出光軸４１０に対して４５°以下(例えば４３°〜４４°)に配置する。
【００９６】
［実施例４］
続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第４の実施例を説明する。実施例１〜３による蛍光分析器では、波長分散素子（分光素子）として回折格子４０５を用いていた。本実施例では、回折格子４０５を用いない実施例を説明する。具体的には、各蛍光色素に対して最も感度の高い波長帯域のみを透過するフィルタを高速に切り変える、又は、蛍光色素の数だけ撮像素子とその各蛍光色素に対応するフィルタを備え、同時に各蛍光素子を撮像する手法を採用する。本実施例の手法は、各蛍光色素に対応するサンプル位置においてスペクトルをサンプリングしたことに相当する。
【００９７】
図１４に、本実施例で使用する蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。図１４に示すように、本実施例における蛍光検出器３０３は、高速回転をするフィルタホイール１３０１を備えている。フィルタホイール１３０１は、各蛍光色素に対応する最も感度の高い波長帯域のみを透過する蛍光フィルタ１３０２を複数備えている。蛍光フィルタ１３０２は、検出光軸基本軸３１０に垂直に配置されている。本実施例では、実施例３と同様、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０により像分割が実施される。分割された蛍光は、蛍光フィルタ１３０２に入射し、光路上に位置する蛍光フィルタ１３０２の透過特性に合わせて分光され、２次元検出器４０７上に結像される。
【００９８】
本実施例の場合、蛍光フィルタ１３０２による切り替えで分光が行われるため、検出器を２次元検出器ではなく１次元のライン検出器を採用することができる。また、検出領域が狭く、回折格子を使用しないため、像歪等の影響を受けずに済む。
【００９９】
なお、本実施例の場合も、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系の配置位置は、図１４に示す配置位置に限らない。例えば図１５に示すように、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系を、フィルタホイール１３０１と結像レンズ４０６の間の分光後検出光軸４１０上に配置しても良い。
【０１００】
［他の実施例］
以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。
【符号の説明】
【０１０１】
１００…遺伝子解析装置
１０１…電気泳動装置
１０２…キャピラリ
１０３…ポンプ機構
１０４…高圧電源
１０５…第１電流計
１０６…シリンジ
１０７…ブロック
１０９…ポリマー容器
１１０…陽極バッファ容器
１１１…電極（ＧＮＤ）
１１２…第２電流計
１１３…電動バルブ
１１４…光源
１１５…光学検出器
１１６…検出部
１１７…キャピラリアレイ
１１８…恒温槽
１１９…ファン
１２０…加熱冷却機構
１２１…陰極バッファ容器
１２２…洗浄容器
１２３…廃液容器
１２４…サンプル容器
１２５…搬送機
１２６…中空電極
１２７…キャピラリ陰極端
１２８…データ解析装置
１２９…ロードヘッダ
１３０…移動ステージ
１３１…グリップ
２０１…固体レーザ
２０２…レーザ光
２０３…反射ミラー
２０４…偏光子
２０５…ビームスプリッタ
２０６…レーザ集光レンズ
２０７…波長板（λ/４）
２０９…基準ベース
２１０…照射光軸基本軸
３０１…平板マスク
３０２…レーザ照射部
３０３…蛍光検出器
３１０…検出光軸基本軸
４０１…発光点
４０２…第１の光学フィルタ
４０３…集光レンズ
４０４…第２の光学フィルタ
４０４Ａ…第２の集光レンズ
４０５…回折格子
４０６…結像レンズ
４０７…２次元検出器
４０９…薄型プリズム（像分割プリズム）
４１０…分光後検出光軸
４１１…蛍光光路（強）
４１２…蛍光光路（弱）
６０１…従来技術による光線追跡
６０２…従来技術による結像
６０３…第１の光線追跡
６０４…第２の光線追跡
６０５…第１の結像
６０６…第２の結像
９０１…光線追跡（全キャピラリ）
９０２…光線追跡（第１キャピラリ）
９０３…光線追跡（第２キャピラリ）
９０４…光線追跡（第３キャピラリ）
９０５…結像（第１キャピラリ）
９０６…結像（第２キャピラリ）
９０７…結像（第３キャピラリ）
１１０９…像分割プリズム（面積比）
１２０９…ビームスプリッタ
１２１０…全反射ミラー
１３０１…フィルタホイール
１３０２…蛍光フィルタ
１３０３…フィルタ回転軸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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