(57)【要約】  本発明は、特定遺伝子の発現を活性化するヒストン修飾制御剤、具体的には特定の遺伝子の活性化剤として有用なヒストンアセチル化酵素活性化剤および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む複合体、並びにその製造方法を提供する。本発明の該複合体は、幹細胞もしくは前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子の群を特異的に活性化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンアセチル化酵素活性化剤、および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む、複合体。
【請求項２】
該ヒストンアセチル化酵素活性化剤が、式（Ｉ）：
【化１】
2016129680.tif 000039
［式中、
Ｒ１は、アルコキシ基であり、
Ｒ２は、トリハロゲン化アルキル基であり、そして、
Ｒ３は、ハロゲン原子、シアノ基、またはニトロ基である］
によって示される化合物である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
該ヒストンアセチル化酵素活性化剤が、下記式：
【化２】
2016129680.tif 000040
からなる群から選ばれる化合物である、請求項１または２のいずれかに記載の複合体。
【請求項４】
該標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドが、ピロールイミダゾールポリアミド（PIP）またはその修飾物である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
該標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
該細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
該幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ(Leukemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ−３／４遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＺＩＣ３遺伝子、ＬＩＮ２８Ｂ遺伝子、ＥＰＣＡＭ遺伝子、ＤＰＰＡ４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ(ＣＤＫＮ２Ａ)遺伝子、ＭＩＲ３０２Ｃ遺伝子である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
該細胞制御に関わる遺伝子が、癌抑制遺伝子、またはウイルス性疾患抑制遺伝子である、請求項５に記載の複合体。
【請求項９】
式：
【化３】
2016129680.tif 000041
【化４】
2016129680.tif 000042
によって示される化合物からなる群から選ばれる、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の複合体からなる、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌、またはウイルス性疾患を予防、治療または診断するための、請求項１０に記載の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の複合体を含む、予防、治療もしくは診断用または研究試薬用のキット。
【請求項１４】
癌、またはウイルス性疾患を予防、治療または診断するための請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１０に記載の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤、または請求項１１に記載の医薬組成物を用いた、癌、またはウイルス性疾患の予防、治療、または診断のための方法。
【請求項１６】
癌、またはウイルス性疾患を予防、治療、または診断するための医薬の製造における、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項１７】
１．（ａ）ＨＡＴ活性化剤である式（Ｉ）’：
【化５】
2016129680.tif 000043
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは請求項１と同義である］
によって示されるベンズアミド化合物のアミノ誘導体を調製する；
（ｂ）適宜必要に応じて、リンカーの部分構造としての式（III）：
【化６】
2016129680.tif 000044
［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基であり、そして、ｍは１〜６のいずれかの整数である］
によって示されるアルケニル二カルボン酸のモノアルキルエステル化合物を反応させて式（Ｉ）’の誘導体に結合させ、加水分解反応を行って、式（IV）：
【化７】
2016129680.tif 000045
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは前記の通りである］
によって示される化合物（IV）を製造する；
２．該得られた化合物（IV）と、Ｌ３
【化８】
2016129680.tif 000046
を有するピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）またはその修飾物とを、カップリング剤の存在下で固相合成技法を用いて結合し、次いで固相から試薬を用いて切り出して、粗複合体を得る；
３．適宜、該粗複合体を精製する、
ことを含む、請求項１乃至９のいずれか1項に記載の複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンアセチル化酵素（histone acetyltransferase）（「ＨＡＴ」と略す）活性化剤および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む複合体（コンジュゲート）に関する。より具体的には、式（Ｉ）によって示されるベンズアミド化合物、およびピロールイミダゾールポリアミド（「ＰＩＰ」と略す）を含む複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ある特定の分子を標的としてその機能を制御することにより治療する治療法である分子標的治療が広く注目されている。かかる分子標的治療においては、ある疾患の細胞（例えば、癌細胞）の表面にある遺伝子やタンパク質を標的とすることで、薬剤による正常な細胞への攻撃を減少することができ、副作用を低下させることができる。【０００３】
真核生物のゲノムはクロマチン（染色体）を構成することにより、核内に格納されている。クロマチン構造は、ＤＮＡとヒストンによって構成されるヌクレオソーム構造の反復によって形成されている。近年、クロマチンがエピジェネティクスという制御機構にも深く関与していることが分かっている（非特許文献１）。エピジェネティクスとは、ＤＮＡの配列の変化を伴わずに、後天的な修飾によって転写の活性化等を調節する制御機構のことである。中でも、ヌクレオソームを形成する主要タンパク質であるヒストンにおける修飾は、転写や、複製・修復に大きな影響を及ぼす。【０００４】
また、細胞の再プログラム化には、エピジェネティックな情報によって正確に調節されているゲノム全体にわたる遺伝子発現の大きな変化が関与すると考えられている。これまでにいくつかの低分子が、エピジェネティックな修飾を人為的に誘導することが知られている（非特許文献２、３）。【０００５】
ＰＩＰは抗生物質ディスタマイシンをモチーフとして開発された人工小分子であり、２本鎖ＤＮＡのマイナーグループへ配列特異的に結合することが報告されており、ＰＩＰによる標的配列の遺伝子の発現抑制に関する研究は、多く報告されている（非特許文献４、５、６）。さらにマウスを用いた動物実験により腎障害に対する薬剤や、抗癌剤、角膜外傷、肥厚性瘢痕、骨疾患等に対する治療薬としての研究も進められている。また近年では、ｉＰＳ細胞の研究の一環として京都大学のｉＰＳ細胞プロジェクトである物質−細胞統合システム拠点（ｉＣｅＭｓ）での研究においてもＰＩＰによるｉＰＳ細胞誘導の研究が行なわれる等、ＰＩＰは、様々な研究成果が期待されている有機小分子である。【０００６】
ＰＩＰの特徴として、（１）任意の遺伝子配列をターゲットとして設計することが可能、（２）ＤＮＡに対する結合能が転写因子よりも強い、（３）ベクターやドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）無しに細胞の核に取り込まれること、（４）核酸分解酵素に分解されず、細胞や生体内で安定であり、尿胆汁より未分解物として排泄されること、（５）Ｎ及びＣ末端を容易に修飾することが可能であり、様々な機能性小分子との複合体の形成が可能である、ことなどが挙げられる。【０００７】
ピロールイミダゾール（「ＰＩ」と略す）ポリアミドは、Ｐ／ＩペアがＣＧ、Ｐ／ＰペアがＡＴまたはＴＡ、Ｉ／ＰペアがＧＣ塩基対を認識し、これにより様々な任意の二重鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することが可能である。標的遺伝子に結合したＰＩＰは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺伝子発現を抑制する遺伝子スイッチとして研究されている。【０００８】
本発明者は、配列認識特異性が高いＰＩＰ構造を利用して、アルキル化官能性基とＰＩＰとの複合体を合成し、ＤＮＡの特定塩基配列をアルキル化するインドール誘導体（特許文献１）、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に対して特異的に結合するＰＩＰを設計し、設計したＰＩＰにアルキル化剤を結合させることにより、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を標的にアルキル化するアルキル化剤（特許文献２）、に関わる発明をそれぞれ完成することに成功していた。【０００９】
また、ヒストン修飾制御剤とＰＩＰとの複合体を合成し、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤に関わる発明（特許文献３）に関わる発明を完成することにも成功している。該文献においては、クロマチンを修飾するヒストン脱アセチル酵素（histone deacetylase）（「ＨＤＡＣ」と略す）阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（「ＳＡＨＡ」と略す）を用いることで、マウス胎児線維芽細胞でいくつかの全能性遺伝子をエピジェネティックな変化によって活性化することができることが報告されている。【００１０】
一方で、近年ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）を活性化する化合物として、Ｎ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−エトキシベンズアミド（「ＣＴＢ」と称する）である一種のベンジルアミド化合物が知られる（非特許文献７）。ＨＡＴ活性化剤は、上記のＨＤＡＣ阻害剤とヒストン修飾の観点で作用機構が相違するため、異なる特定の遺伝子を活性化することができ、またＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせることにより、相乗的または協同的に特定の遺伝子を活性化することができるものと期待される。しかしながら、これまで、ＨＡＴ活性化剤をＰＩＰ等と組み合わせた複合体については知られておらず、またその遺伝子発現におけるエピジェネティックな制御の影響についても知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８７７６２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／０５３４１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／００１９３３号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nat. Struct. Mol. Biol., 2007, 14, 1025-1040
【非特許文献２】Cell, 2007, 128, 693-705
【非特許文献３】Mol. Cell Biol., 2006, 26, 7913-7928
【非特許文献４】Bioorg. Med. Chem. 2001, 9, 2215-2235.
【非特許文献５】Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13, 284-299.
【非特許文献６】Curr. Med. Chem.: Anti-Cancer Agents 2005, 5, 373-387.
【非特許文献７】J. Phys. Chem., B 2007, 111, 4527-4534
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明者は鋭意研究した結果、ヒストンアセチル化酵素活性化剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを組み合わせた複合体を製造することができ、またその複合体が特定の遺伝子の発現を活性化することができることを見出した。特に、該ＨＡＴ活性化剤としてＣＴＢまたはその誘導体であるベンジルアミド化合物と、該ポリアミドとしてＰＩポリアミドとを含む複合体を製造し、また該複合体が、細胞制御に関わる遺伝子、例えば癌抑制遺伝子、遺伝性疾患抑制遺伝子、神経細胞制御物質をコードする遺伝子、嚢胞性線維症抑制遺伝子、消化器疾患抑制遺伝子、ウイルス性疾患抑制遺伝子、または幹細胞もしくは前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子の群を特異的に活性化することができることを見出した。よって、本発明は、特定の遺伝子の活性化剤として有用な、ヒストンアセチル化酵素活性化剤および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む複合体およびその製造方法を提供する。また、本発明は、該複合体を含む医薬組成物、例えば癌の治療のための医薬組成物、および治療用または研究試薬用のキットをも提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の態様を提供するが、これに限定されるものではない。【００１５】
複合体
項［１］  ヒストンアセチル化酵素活性化剤、および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む、複合体。
項［２］  該ヒストンアセチル化酵素活性化剤が、式（Ｉ）：
【化１】
2016129680.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、アルコキシ基であり、
Ｒ２は、トリハロゲン化アルキル基であり、そして、
Ｒ３は、ハロゲン原子、シアノ基、またはニトロ基である］
によって示される化合物である、項［１］記載の複合体。
項［３］  該ヒストンアセチル化酵素活性化剤が、下記式：
【化２】
2016129680.tif 000003
からなる群から選ばれる化合物である、項［１］または［２］のいずれかに記載の複合体。
項［４］  該標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドが、ピロールイミダゾールポリアミド（PIP）またはその修飾物である、項［１］乃至［３］のいずれか１項に記載の複合体。
項［５］  該標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、項［１］乃至［４］のいずれか１項に記載の複合体。
項［６］  該細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、項［５］に記載の複合体。
項［７］  該幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ(Leukemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ−３／４遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＺＩＣ３遺伝子、ＬＩＮ２８Ｂ遺伝子、ＥＰＣＡＭ遺伝子、ＤＰＰＡ４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ(ＣＤＫＮ２Ａ)遺伝子、またはＭＩＲ３０２Ｃ遺伝子である、項［６］に記載の複合体。
項［８］  該細胞制御に関わる遺伝子が、癌抑制遺伝子、またはウイルス性疾患抑制遺伝子である、項［５］に記載の複合体。
項［９］  式：
【化３】
2016129680.tif 000004
【化４】
2016129680.tif 000005
によって示される化合物からなる群から選ばれる、項［１］乃至［８］のいずれか１項に記載の複合体。【００１６】
用途
項［１０］  項［１］乃至［９］のいずれか１項に記載の複合体からなる、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
項［１１］  項［１］乃至［９］のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
項［１２］  癌、またはウイルス性疾患を予防、治療または診断するための、項［１０］に記載の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤または項［１１］に記載の医薬組成物。
項［１３］  項［１］乃至［９］のいずれか１項に記載の複合体を含む、予防、治療もしくは診断用または研究試薬用のキット。
項［１４］  癌、またはウイルス性疾患を予防、治療または診断するための項［１３］に記載のキット。
項［１５］  項［１０］に記載の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤、または項［１１］に記載の医薬組成物を用いた、癌、またはウイルス性疾患の予防、治療、または診断のための方法。
項［１６］  癌、またはウイルス性疾患を予防、治療、または診断するための医薬の製造における、項［１］乃至［９］のいずれか１項に記載の複合体の使用。【００１７】
複合体の製造方法
項［１７］  １．（ａ）ＨＡＴ活性化剤である式（Ｉ）’：
【化５】
2016129680.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは項［１］と同義である］
によって示されるベンズアミド化合物のアミノ誘導体を調製する；
（ｂ）適宜必要に応じて、リンカーの部分構造としての式（III）：
【化６】
2016129680.tif 000007
［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基であり、そして、ｍは１〜６のいずれかの整数である］
によって示されるアルケニル二カルボン酸のモノアルキルエステル化合物を反応させて式（Ｉ）’の誘導体に結合させ、加水分解反応を行って、式（IV）：
【化７】
2016129680.tif 000008
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは前記の通りである］
によって示される化合物（IV）を製造する；
２．該得られた化合物（IV）と、Ｌ３
【化８】
2016129680.tif 000009
を有するピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）またはその修飾物とを、カップリング剤の存在下で固相合成技法を用いて結合し、次いで固相から試薬を用いて切り出して、粗複合体を得る；
３．適宜、該粗複合体を精製する、
ことを含む、項［１］乃至［９］のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。【００１８】
項［１８］  式（IV）の化合物が、式：
【化９】
2016129680.tif 000010
である、項［１７］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の、ヒストンアセチル化酵素活性化剤および標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドを含む複合体は、細胞制御に関わる遺伝子（例えば、癌抑制遺伝子、遺伝性疾患抑制遺伝子、神経細胞制御物質をコードする遺伝子、嚢胞性線維症抑制遺伝子、消化器疾患抑制遺伝子、ウイルス性疾患抑制遺伝子、または幹細胞もしくは前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子）の群を特異的に活性化することができ、その活性化の増大の大きさも著しく高く、例えば既存のＳＡＨＡ−ＰＩポリアミド複合体（特許第４８７３５１０号）と同程度に著しく高い。更に、本発明のいわゆるＣＴＢ−ＰＩポリアミドは、簡便で且つ安価な製造方法によって製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるＳＡＨＡとヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤であるＣＴＢの各構造と、ヒストン上での作用機序を説明する図面である。ＳＡＨＡとＨＡＴは各々異なる対象の酵素に作用することで、クロマチン構造を緩めて転写因子の接近を容易にさせ、エピジェネティックに関連遺伝子の発現を上昇させる。
【図２】図２は、ＳＡＨＡ−ＰＩＰ−ＩとＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉとの構造式の比較を示した図面である。
【図３】図３Ａは、ＣＴＢ、ＳＡＨＡ、ＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉ、およびＳＡＨＡ−ＰＩＰ−Ｉを用いてゲノムワイドな遺伝子発現に与える影響をマイクロアレイ解析した結果を示す図面である。図３Ｂは、クラスタリング解析の結果を示す図面である。
【図４】図４は、９種の多能性関連遺伝子の発現誘導について、ＳＡＨＡ−ＰＩＰ−ＩとＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉとを比較したｑＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図面である。図中、ＤＭＳＯとＣＴＢを比較対象として、ＳＡＨＡ−ＰＩＰ−ＩとＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉによる標的遺伝子の発現上昇を比較した。
【図５】図５は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の構造、並びにＨＤＡＣ阻害活性に関してＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＣＴＢを比較評価した結果を示す図面である。
【図６】図６は、ＣＴＢとＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉとの細胞毒性アッセイの結果を示す図面である。
【図７】図７Ａは、クロマチン免疫沈降後のＣｈＩＰシークエンシング解析の結果における、Ｏｃｔ−３/４遺伝子プロモーター領域におけるＳＡＨＡ−ＰＩＰ−Ｉ及びＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの場合のアセチル化ピークを示す図面である。図７Ｂは、共沈したＤＮＡ中のＯｃｔ−３/４のプロモーター配列の量を示す図面である。
【図８】図８は、Ｏｃｔ−３/４遺伝子プロモーター領域に関する配列を示す図面である。図中において枠で示した６塩基配列は、ＳＡＨＡ−ＰＩＰ−ＩとＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉとが共通して認識した塩基配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
（定義）
以下に、本明細書および特許請求の範囲中で使用する用語の定義を示す。なお、本明細書において引用された全ての刊行物は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２２】
１．ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤
本発明のヒストンアセチル化酵素（histone acetyltransferase）（「ＨＡＴ」と略す）とは、ヒストンタンパク質を高アセチル化し、転写の活性化に関与する酵素である。ヒストンのアセチル化は、ヒストンタンパク質に負の電荷を持つアセチル基を付加させ、ヒストンを負に荷電させ、ヒストン間、およびＤＮＡヒストン間の相互作用を弱め、乖離を促進する。そのため、ヌクレソームの縮合が緩む結果、遺伝子調節領域でも縮合が緩み、その調節領域に転写因子が結合できるようになり、遺伝子の発現が促進されると考えられる。
【００２３】
ヒストンアセチル化酵素活性化剤とは、上記ヒストンアセチル化酵素によるアセチル化を活性化する分子を意味する。ヒストンアセチル化酵素活性化剤の例は、現在、J. Phys. Chem., B 2007, 111, 4527-4534（非特許文献７として前記）に基づく報告が全てであるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明のヒストンアセチル化酵素活性化剤の具体的な１態様としては、式（Ｉ）：
【化１０】
2016129680.tif 000011
［式（Ｉ）中、
Ｒ１は、アルコキシ基であり、
Ｒ２は、トリハロゲン化アルキル基であり、そして、
Ｒ３は、ハロゲン原子、シアノ基、またはニトロ基である。］
によって示される、ベンズアミド化合物が挙げられる。
【００２５】
式（１）中、Ｒ３は電子吸引性の基であり、ハロゲン原子が特に好ましい。
【００２６】
用語「アルコキシ基」とは、炭素数が１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３のアルキル基が酸素原子と結合した基を意味する。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、およびｎ−ヘキシルオキシ等を含み得るが、これらに限定されない。メトキシ、エトキシ、イソプロポキシがより好ましく、エトキシがより一層好ましい。
【００２７】
用語「トリハロゲン化アルキル」とは、炭素数が１〜３、好ましくは１〜２、より好ましくは１のアルキル基が３個のハロゲン原子（フッ素原子がより好ましい）で置換された基を意味する。具体的には、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、１,１,１−トリフルオロエチル、１,１,２−トリフルオロエチル等を挙げられるが、これらに限定されない。トリフルオロメチル、トリクロロメチルがより好ましく、トリフルオロメチルがより一層好ましい。
【００２８】
用語「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、およびヨウ素原子を挙げられる。フッ素原子、塩素原子がより好ましく、塩素原子がより一層好ましい。
【００２９】
Ｒ１置換基は、カルボキサミド基に対してオルト位、メタ位、またはパラ位のいずれであってもよいが、オルト位であることが好ましい。Ｒ２置換基は、アミド基に対してオルト位、メタ位、またはパラ位のいずれであってもよいが、メタ位であることが好ましく、Ｒ３置換基はアミド基に対してアミド基に対してオルト位、メタ位、またはパラ位のいずれであってもよいが、パラ位であることが好ましい。また、Ｒ２置換基とＲ３置換基は隣接位に存在することが好ましい。
【００３０】
好ましい１実施態様としては、本発明のヒストンアセチル化酵素活性化剤は、式（ＩＩ）：
【化１１】
2016129680.tif 000012
によって示される。
【００３１】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）中の置換基としては、以下に記載する化合物を含む。
Ｒ１は、炭素数が１乃至４のアルコキシ基であり、
Ｒ２は、炭素数が１のトリハロゲン化アルキルであり、そして、
Ｒ３は、ハロゲン原子である。］
である。
【００３２】
具体的な化合物の例を、以下に示すが、これらに限定されるものではない。
【化１２】
2016129680.tif 000013
【００３３】
上記の式（Ｉ）によって示されるベンズアミド化合物は、商業的に入手可能であるか、あるいは商業的に入手可能な出発原料から有機学的に一般に知られる方法を用いて製造することが可能である。例えば、J. Phys. Chem., B 2007, 111, 4527-4534に記載の方法に従って、これらの化合物は合成することができる。ここで、下記式で示される、Ｎ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−エトキシベンズアミドは本願明細書中において「ＣＴＢ」と略し、よって、上記式（Ｉ）によって示されるベンズアミド化合物はＣＴＢ誘導体と称することもある。
【００３４】
２．標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミド
本発明の複合体の構成要素である、「標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミド」とは、標的遺伝子の調節領域を認識するように設計されたポリアミドを意味する。ここで、「標的遺伝子の調節領域を認識する」とは、標的遺伝子の調節領域および／またはその近傍に標的認識ポリアミドが結合等（例えば、水素結合、又は架橋形成（クロスリンキング）による結合等）することを意味する。該ポリアミドの例としては、ピロール・ポリアミド（ＰＩＰ）（環状、ヘアピン構造、ヘアピン構造をつなげたタンデム型を含むＰＩＰ化合物）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｅｌｒｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ジンクフィンガー等のＤＮＡ結合タンパク質複合体のような複合体等のＤＮＡ結合化合物を挙げることができる。
【００３５】
Ｂｒｉｄｅｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）またはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は、標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、ＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間のメチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＢＮＡまたはＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−Ｂｒｉｄｇｅｄ  ＮｕｃｌｅｒｉｃＡｃｉｄｓ）として合成することができる。ＬＮＡは、Proligo社からも入手である。
【００３６】
本発明の「ピロールイミダゾールポリアミド（PIPと称する）」とは、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）と、γ−アミノ酪酸部部分とを含むポリアミドであり、ＰｙとＩｍとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Trauger et al, Nature, 382, 559-61 (1996); White et al., Chem Biol., 4, 569-78 (1997) および、Dervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35 (2001)）。ＰＩＰは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォーメーション（ヘアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォーメションにおいては、リンカーを挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ対、またはＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ−Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ−Ｔ塩基対およびＴ−Ａ塩基対の両方に結合することができる（White et al., Chem. Biol., 4, 569-78 (1997); Dervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35 (2001)）。また、ＰＩＰには、他に３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、またはβアラニンが含まれていてもよい。Ｈｐについては、Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ−Ａ塩基対に結合することができる（White et al., Nature, 391, 468-71 (1998)）。また、γ−リンカーについてはアミノ基を持つＮ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸及びＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸のような側鎖を持ち、またこれらがＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾されていてもよい。また、ＰＩＰのＮ末端はアセチル基だけでなく、ＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾されていてもよい。βアラニン／βアラニンについては、Ｔ−Ａ塩基対もしくはＡ−Ｔ塩基対に結合することができる。よって、標的のＤＮＡ配列に合わせてＰｙとＩｍの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号、ＷＯ０３／０００６８３号、特開２０１３−２３４１３５号、特開２０１４−１７３０３２号）。
【００３７】
また、ＤＮＡに対する結合能力を維持または向上するように修飾したＰＩＰ修飾物をも含まれる。該ＰＩＰ修飾物としては、例えば、ＰＩＰのγ−アミノ酪酸のα位またはβ位にアミンを付加した修飾物、Ｎ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、Ｎ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸の置換された側鎖を有する修飾物、前記修飾物をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩＰのＮ−末端ＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、およびＣ末端がイソフタル酸などの分子で修飾した修飾物等が挙げられる。
【００３８】
ＰＩＰの例としては、下式によって示される化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【化１３】
2016129680.tif 000014
【化１４】
2016129680.tif 000015
【００３９】
３．複合体
本発明の複合体は、上記ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤と、上記標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを結合すること等により合成することができる。合成方法は、例えば公知の方法によって行うことができる（J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2479-2490）。ここで、「結合」様式は、直結でもよいし、リンカーを介してもよい。リンカーとしては、ＨＡＴ活性化剤の作用を妨げず、且つ標的遺伝子の部位の認識を妨げないものであれば特に限定されないが、例えばアミド結合、エステル結合、ホスホジスルフィド結合、配位結合、またはエーテル結合等そのもの、あるいはこれらの結合様式の１種類以上を形成する官能基を含む分子を例示することができる。アミド結合またはアミド結合を形成する分子が好ましい。
【００４０】
１実施態様において、リンカーは、式Ｌ１：
【化１５】
2016129680.tif 000016
［式中、ｍおよびｎは各々独立して、１〜６の整数である］によって示される。例えば、ｍおよびｎが各々独立して１〜４の整数であることが好ましい。
【００４１】
上記式Ｌ１によって示されるリンカー部分において、例えば右端の位置はヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤と連結し、一方で左端の位置はポリアミドと連結するが、該連結位置は逆であってもよい。
【００４２】
ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤と連結する場合には、ベンゼン環上のアミノ（−ＮＨ２）基と結合し、その結合様式の代表的な１態様を以下に示す。
【化１６】
2016129680.tif 000017
ＰＩＰと連結する場合には、ＰＩＰの末端ピロールまたはイミダゾール環上のアミノ（−ＮＨ２）基と結合し、その結合様式の代表的な１態様を以下に示す。
【化１７】
2016129680.tif 000018
【００４３】
代表的な実施態様において、リンカーは、式Ｌ２：
【化１８】
2016129680.tif 000019
によって示される。
また、リンカーの部分構造としては、式Ｌ３：
【化１９】
2016129680.tif 000020
によって示される部分を挙げられる。
また、リンカーの部分構造としては、式Ｌ４：
【化２０】
2016129680.tif 000021
によって示される部分をも挙げられる。
【００４４】
ＨＡＴ活性化剤と連結するリンカーを有するPIPの１例を下記に示す。
【化２１】
2016129680.tif 000022
【００４５】
本発明の標的認識ポリアミドが認識する「標的遺伝子の調節領域」とは、例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー、またはインスレーターであり、好ましくはプロモーターである。標的認識ポリアミドが結合する遺伝子調節領域および／またはその近傍は、リンカーＤＮＡ（ヌクレソームにおけるヒストン非結合ＤＮＡ領域）であるのが好ましい。
【００４６】
本発明の複合体の代表的な例を、下記式に示すが、これらに限定されない。
【化２２】
2016129680.tif 000023
【化２３】
2016129680.tif 000024
【００４７】
本発明の複合体は、薬理学的に許容し得る塩の形態をとり得る。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩もしくはトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
【００４８】
本発明の複合体は、ヒストンアセチル化酵素活性化剤、および／または標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミド、および／または該ヒストンアセチル化酵素活性化剤と該標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを連結するリンカー部分の少なくとも１つ以上の部分または分子が、エナンチオマーもしくはジアステレオマーの形態またはこれらの混合物で存在し得る。本発明の複合体は、立体異性体の混合物またはそれぞれ純粋なもしくは実質的に純粋な異性体を包含する。本発明の複合体がジアステレオマーまたはエナンチオマーの形態で得られる場合、これらをこの技術分野で周知の慣用の方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶法等で分離することができる。
【００４９】
本発明の複合体は、ヒストンアセチル化酵素活性化剤、および／または標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミド、および／または該ヒストンアセチル化酵素活性化剤と該標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを連結するリンカー部分の少なくとも１つ以上の部分または分子上で、同位元素（例えば、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識された化合物および重水素変換体を包含する。
【００５０】
４．標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤
本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤とは、上記本発明の複合体を含む組成物である。また、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾方法は、上記本発明の複合体を用いる方法である。ここで、本発明の「標的遺伝子特異的」とは、標的とする１つ以上（ヒトでは、ゲノム領域としては約１００，０００個の遺伝子があるとされており、遺伝子発現に関与する配列としてはひとつの転写因子が数千個から数百個の領域で特異的配列を認識し発現調節するとされている。このため、例えば、このうちの１〜数千個（例、１〜５０００、１〜４０００、１〜３０００、１〜２０００または１〜１０００）、１〜数百個（例、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００または１〜１００）、または１〜５０個、好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個（５個、４個、３個、２個または１個））の遺伝子に特異的であることを意味する。例えば、転写因子によっては、５塩基の認識配列で、数百〜数千個の遺伝子群の発現を調節することで生物現象を調節する場合もあるため（例えば、MYC遺伝子は、３０００〜４０００個の下流遺伝子群をもつ。）、本発明の複合体が特異性の低い配列（数千個〜数百個の遺伝子に共通する配列）を認識する場合でも、生物現象を調節し、例えば、疾患治療や再生治療に有効である場合がある。尚、本発明の複合体は、例えば、ポリアミドが認識する配列の塩基数を増やすこと、ポリアミドが認識する配列として特異性の高い配列を選択することなどによって、標的とする遺伝子の数を減らすことができる。
【００５１】
本発明が指向する標的遺伝子としては、細胞制御遺伝子を挙げられる。細胞制御に関わる遺伝子としては、癌抑制遺伝子、遺伝性疾患抑制遺伝子、神経細胞制御物質をコードする遺伝子、ウイルス性疾患抑制遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を挙げることができる。好ましくは、癌抑制遺伝子、ウイルス性疾患抑制遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である。
【００５２】
癌抑制遺伝子としては、ｐ１６ＩＮＫ４ａ(ＣＤＫＮ２Ａ)遺伝子、ｐ２１(ＣＤＫＮ１Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ１遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ１遺伝子、ＮＦ２遺伝子、ｐ１９(ＣＤＫＮ２Ｄ)遺伝子、ＷＴ１遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、ＣＨＥＫ２遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ＤＰＣ４(ＳＭＡＤ４)遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、ＭＬＨ１遺伝子、ＰＭＳ２遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ５７ＫＩＰ２(ＣＤＫＮ１Ｃ)遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ１遺伝子、ＴＳＣ２遺伝子、ＥＸＴ１遺伝子、ＥＸＴ２遺伝子、ＲＥＣＫ遺伝子、またはｐ５３遺伝子などである。好ましくは、癌抑制遺伝子は、ｐ１６遺伝子、ｐ２１遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ１遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＲＥＣＫ遺伝子、またはｐ５３遺伝子などである。
【００５３】
神経細胞制御物質をコードする遺伝子としては、ＳＨＣ３遺伝子、ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子（例えばＮＲ２Ａ遺伝子もしくはＮＲ２Ｃ遺伝子など）、またはＤｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子（例えばＤＲＤ１もしくはＤＲＤ２など）などが挙げられる。
【００５４】
幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子としては、ＬＩＦ (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ３/４遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、またはｐ１６ＩＮＫ４ａ(ＣＤＫＮ２Ａ)遺伝子、ＭＩＲ３０２Ｃ遺伝子が挙げられ、好ましくはＭＹＣ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＯＣＴ３/４遺伝子、またはＫＬＦ４遺伝子などである。本発明の別の好ましい態様では、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＯＣＴ３/４遺伝子、またはＫＬＦ４遺伝子などである。
【００５５】
ウイルス性疾患抑制遺伝子としては、例えばＨＩＶウイルス抑制遺伝子（例えば、ＭＸ２、ＴＲＩＭ ５α（Nature 502, 563-566）などが挙げられる。
【００５６】
本発明の複合体または複合体を用いる方法が指向する標的遺伝子が、癌抑制遺伝子である場合、本発明の複合体もしくはそれを含む医薬組成物、またはそれらを用いる方法は、例えば癌の予防・治療などに利用することができる。
【００５７】
本発明の複合体または複合体を用いる方法が指向する標的遺伝子が、ウイルス性疾患抑制遺伝子である場合、本発明の複合体もしくはそれを含む医薬組成物、またはそれらを用いる方法は、例えばウイルス性疾患の予防・治療などに利用することができる。
【００５８】
本発明の複合体または複合体を用いる方法が指向する標的遺伝子が、遺伝性疾患抑制遺伝子である場合、本発明の複合体もしくはそれを含む医薬組成物、またはそれらを用いる方法は、例えば遺伝性疾患の予防・治療などに利用することができる。
【００５９】
本発明の複合体または複合体を用いる方法が指向する標的遺伝子が、神経細胞制御物質をコードする遺伝子である場合、本発明の複合体もしくはそれを含む医薬組成物、またはそれらを用いる方法は、例えば神経変性疾患の予防・治療などに利用することができる。
【００６０】
本発明の複合体または複合体を用いる方法が指向する標的遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である場合、本発明の複合体もしくはそれを含む医薬組成物、またはそれらを用いる方法は、例えばｉＰＳ細胞の作製などに利用することができる。
【００６１】
５．用途
前記の通り、本発明の「標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤」とは、上記本発明の複合体を含むが、本発明の複合体の使用において、使用目的に応じて、担体や添加物と組み合わせて用いてもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。
【００６２】
本発明の修飾剤及び修飾方法における本発明の複合体の使用量は、使用目的によって適宜調節することができる。
【００６３】
また、本発明は、標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤の製造のための本発明の複合体の使用を含む。更に、本発明は、標的遺伝子特異的にヒストンを修飾するための本発明の複合体の使用を含む。
【００６４】
「本発明の複合体を用いる」とは、例えば、本発明の複合体をin vitroで細胞に接触させて用いることのほか、哺乳動物（例えば、ヒト、あるいはヒトを除く、例えばラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）または実験生物（例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など）などに投与して用いること（in vivoで用いること）などを含む。「接触」とは、本発明の複合体と細胞とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に本発明の複合体を添加すること、細胞と本発明の複合体とを混合すること、細胞を本発明の複合体の存在下で培養することなどを含む。
【００６５】
本発明のある態様では、本発明の複合体により、ヒストン修飾を遺伝子部位特異的に制御することで、細胞機能の詳細な解析が可能となり、難知性の疾患の機序解明、または治療法の開発などに役立つことが期待される。本発明の研究試薬および／または研究方法は、哺乳動物（例えば、ヒトを除く。例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）またはその他の実験生物（例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など）などを対象とすることができる。本発明の研究用試薬および／または研究方法では、本発明の複合体の他、上記修飾剤で説明した、担体や添加物を含んでも良い。本発明の研究試薬および／または研究方法における本発明の複合体の使用量は、使用目的によって異なる。当業者であれば、使用目的に応じて、本発明の複合体の使用量を適宜選択することができる。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の複合体を含む組成物である。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を予防・治療することができる。本発明の医薬組成物の対象疾患は、遺伝子の変異を伴う疾患、例えば癌、神経変性疾患／精神性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、甲状腺ホルモン不応症、老化、嚢胞性線維症、ならびに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうち癌としては、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）及び急性リンパ性白血病（ALL）、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）など）、小児固形腫瘍（神経芽細胞腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫など）、網膜芽細胞腫およびメラノーマなどを挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病などを挙げることができる。皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症などを挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症などを挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着などを挙げることができる。神経変性疾患／精神性疾患としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡眠障害、痴呆などを挙げることができる。
【００６７】
癌は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化を活性化し、癌抑制遺伝子(例えば、ｐ１６遺伝子、ｐ２１遺伝子、ＡＰＣ１遺伝子、ＲＡＳＳＦ１遺伝子、ＲＢ遺伝子、またはｐ５３遺伝子)の発現を促すことにより、予防・治療することができる。
【００６８】
ウイルス性疾患（例えば、ＡＩＤＳ）は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化を活性化し、ＨＩＶウイルス抑制遺伝子（例えば、ＭＸ２、ＴＲＩＭ ５α）の発現を促すことにより、予防・治療することができる。
遺伝性疾患は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化を活性化し、遺伝性疾患抑制遺伝子の発現を促すことにより、予防・治療することができる。
【００６９】
神経変性疾患は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化を活性化し、ＧＤＮＦやｎｅｕｒｔｕｒｉｎ遺伝子の発現を促したり、遺伝子ＡＰＰ（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を抑制したりすることにより、予防・治療することができる。
【００７０】
嚢胞性線維症や消化器疾患は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化を活性化し、遺伝子ＣＦＴＲの発現を促したり、発現を抑制したりすることにより、予防・治療することができる。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれの剤形でもよい。これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００７２】
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００７３】
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸等)に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物または本発明の複合体の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば１日当たり、１回または２〜４回に分けてもよい。
【００７５】
本発明は、医薬組成物および／または予防、治療、もしくは診断方法は、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物、特に哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）を対象にすることができる。
【００７６】
また、本発明は、本発明の複合体を含むキットを含む。該キットは、本発明の複合体の他、前記医薬的に許容される担体や添加剤、試薬類、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含み得る。本発明のキットは、標的遺伝子特異的修飾制御のための、あるいは癌の予防、治療もしくは診断用の、または研究試薬用の、キットとして使用することができる。
【００７７】
６．製造方法
本発明の複合体の製造法の１例を下記に示すが、本発明の複合体の製造法はこれに限定されるものではない。製造法としては、液相反応による製造法と固相反応による製造法を挙げられる。
【００７８】
（液相反応による製造法）
代表的なＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの製造スキームを下記に示す。かかる製造法は、例えば、CTB部分の合成はJ. Phys. Chem., B 2007, 111, 4527-4534、PIP部分の固相合成は、Sci. Rep., 2012, 2, 544、Sci. Rep., 2014, 4, 3843 に記載の方法に準じて実施する。
【化２４】
2016129680.tif 000025
【化２５】
2016129680.tif 000026
製造手順としては、下記の工程に従う。
１．ＨＡＴ活性化剤である式（Ｉ）’によって示されるベンズアミド化合物の誘導体（例えば、アミノ誘導体）を調製する；
【化２６】
2016129680.tif 000027
２．（ａ）標的の配列特異性に対応して適宜、目的のＰＩＰを調製する。
（ｂ）適宜、必要に応じて、式Ｌ１’：
：
【化２７】
2016129680.tif 000028
を固相合成工程中に導入することで、リンカー部分を調製する。
３．工程１で調製したベンズアミド誘導体（式（Ｉ）’）をＣＴＢ合成ユニットとして、工程２で調製したカルボン酸部分を有するＰＩＰとを、液相条件下で縮合反応させることによって、連結させて所望するＣＴＢ−ＰＩＰ複合体を製造する。
【００７９】
（固相反応による製造法）
代表的なＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの製造スキームを下記に示す。かかる製造法は、本発明者らが新規に見出した製法である。
【化２８】
2016129680.tif 000029
【化２９】
2016129680.tif 000030
製造手順としては、下記の工程に従う。
１．（ａ）液相反応による製造法と同様に、ＨＡＴ活性化剤である式（Ｉ）’により示されるベンズアミド化合物のカルボン酸部分を有するＣＴＢ誘導体（例えば、６）を調製する。
（ｂ）適宜、必要に応じて、リンカーの部分構造としての式（III）：
【化３０】
2016129680.tif 000031
［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基であり、そして、ｍは１〜６のいずれかの整数である］によって示されるアルケニル二カルボン酸のモノアルキルエステル化合物を反応させて式（Ｉ）’の誘導体に結合させ、加水分解反応を行って、式（IV）：
【化３１】
2016129680.tif 000032
によって示される化合物（IV）を製造する；
２．得られた化合物（IV）をＰＩＰまたはその修飾物の固相合成中に導入し、固相担体から試薬を用いて切り出すことで、所望するＣＴＢ−ＰＩＰ複合体（例えば、ＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉ）を得る。
３．適宜、ＣＴＢ−ＰＩＰ複合体を精製する、
ことを含む。
【００８０】
用語「カルボキシル基の保護基」には、加水分解反応により除去可能なエステル基が最も好ましい。例えば、Ｒ基は、炭素数が１乃至３のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルを挙げられる。
【００８１】
ＰＩＰまたはその修飾物とは、前記の略号Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ＬまたはＸによって示される構造式を有する化合物を含む。本発明の複合体においては、上記（IV）中の式（III）に由来するリンカー部分のカルボン酸とＰＩＰのアミノ基が結合して、所望するＣＴＢ誘導体を製造する。
【００８２】
上記の固相反応による製造法は、液相反応による製造法と比べて多くの利点を有する。
液相反応による製造法においては、切り出しに使用したジメチルアミノプロピルアミンを除くために、合成中間体であるカルボン酸部分を有するＰＩＰを精製する必要がある。そのため、時間と労力がかかり、精製によって収量も減少する。加えて、最終縮合工程を液相反応で実施した後にも、ＣＴＢ−ＰＩＰ複合体の精製を必要とする問題がある。固相反応による製造法を用いることで、これらの問題点を全て解決することができる。
尚、固相反応による製造法の欠点は、固相反応の工程中にカルボン酸部分を有するＣＴＢ誘導体を使用するため、合成に必要な量が液相反応による製造法と比べて多くなる点が挙げられるが、これは固相反応による製造法のもつ利点を損なうものではない。
結果として、固相反応による製造法を適用することによって、様々な置換基を有する式（Ｉ）のベンズアミド誘導体とＰＩＰとの複合体を容易に製造することが可能である。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００８４】
（実施例１）
液相合成に使用するＣＴＢ誘導体４の製造法
（１）１の合成
【化３２】
2016129680.tif 000033
5-ニトロサリチル酸（1.00 g, 5.46 mmol）をDMF15 mLに溶かした溶液にK2CO3（4.52 g, 32.8 mmol）とヨードエタン（2.2 mL, 27.5 mol）を加え、50℃で6時間攪拌した。溶媒を留去した黄色残留物を水（20 mL）で洗浄し、黄色の粉体として化合物１（955 mg, 3.99 mmol, 73%）を得た。
1: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ8.67 (d, J = 2.7 Hz, 1H; Ar-H), 8.33 (dd, J = 2.7, 9.6 Hz, 1H; Ar-H), 7.02 (d, J = 9.6 Hz, 1H; Ar-H), 4.39 (q, J = 7.3 Hz, 2H; CH2), 4.23 (q, J = 7.3 Hz, 2H; CH2), 1.52 (t, J = 7.3 Hz, 3H; CH3), 1.41 (t, J = 7.3 Hz, 3H; CH3) 【００８５】
（２）２の合成
【化３３】
2016129680.tif 000034
化合物１（950 mg, 3.99 mmol）を水（15 mL）に溶かした溶液にNaOH（1.0 g, 25 mmol）を加え、40℃で15時間攪拌した。希塩酸で中和することで得られた白色沈殿物を濾過、水（10 mL）で洗浄後、白色粉体として化合物２（733 mg, 3.47 mmol, 87%）を得た。
1: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ9.06 (d, J = 2.8 Hz, 1H; Ar-H), 8.44 (dd, J = 2.8, 8.9 Hz, 1H; Ar-H), 7.16 (d, J = 8.9 Hz, 1H; Ar-H), 4.45 (q, J = 6.9 Hz, 2H; CH2), 1.64 (t, J = 6.9 Hz, 3H; CH3)【００８６】
（３）３の合成
【化３４】
2016129680.tif 000035
化合物２（733 mg, 3.47 mmol）をDMF（11 mL）に溶かした溶液にHCTU（1.58 g, 3.82 mmol）とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.73 mL, 4.16 mmol）を加えて10分攪拌した後、さらに5-アミノ-2-クロロベンゾトリフルオリド（680 mg, 3.47 mmol）を加えて25℃で14時間攪拌した。溶媒を留去した黄色残留物を5%塩酸（20 mL）と水（20 mL）を用いて生成物３（1.85 g, HCTU含む）を褐色粉体として得た。
3：ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C16H13ClF3N2O4+ [M+H]+ 389.0516; found 389.0527.【００８７】
（４）４の合成
【化３５】
2016129680.tif 000036
化合物３（500 mg、HCTU含む）を酢酸エチル（10 mL）に溶かした溶液に10% Pd-C（20 mg）を加え、水素ガス（0.2 MPa）の下、室温で16時間攪拌した。CH2Cl2-MeOH溶液を用いたセライト濾過後、溶媒を留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して黄色粉体４（387 mg, 1.08 mmol）を得た。
4：1H NMR (600MHz, CDCl3): δ 10.45 (s, 1H; NH), 7.99 (d, 1H; CH), 7.85 (d, 1H; CH), 7.60 (d, 1H; CH), 7.46 (d, 1H; CH), 6.87 (d, 1H; CH), 6.83 (dd, 1H; CH), 4.25 (q, 2H; CH2), 3.60 (br, 2H; NH2), 1.59 (t, 3H; CH3). ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C16H15ClF3N2O2+ [M+H]+ 359.0815; found 359.0774.【００８８】
（実施例２）
固相合成に使用するＣＴＢ誘導体６の製造法
（１）５の合成
【化３６】
2016129680.tif 000037
化合物４（660 mg, HCTU含む）をDMF（7 mL）に溶かした溶液にHCTU（820 mg, 1.98 mmol）とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.41 mL, 2.38 mmol）を加えて25℃で1時間攪拌した。溶媒を留去した褐色残留物に、HCTU除去のため1N NaOH（20 mL）を加えて濾過し、粗生成物５（580 mg, 1.13 mmol）を淡褐色粉体として得た。
5：ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C24H27ClF3N2O5+ [M+H]+ 515.1561; found 515.1127.【００８９】
（１）６の合成
【化３７】
2016129680.tif 000038
化合物５（580 mg、1.13 mmol）を水（20 mL）とEtOH（20 mL）に溶かした溶液にNaOH（1.0 g, 25 mmol）を加え90℃で2時間攪拌し、褐色溶液となった。EtOH除去、希塩酸で中和すると白色沈殿が得られ、濾取、水（10 mL）による洗浄を行い化合物６（503 mg, 1.04 mmol, 92%）を白色粉体として得た。
6 : 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ10.51 (s 1H; NH), 9.92 (s, 1H; NH), 8.33 (s, 1H; Ar-H), 7.95 (d, J = 8.9 Hz, 1H; Ar-H), 7.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H; Ar-H), 7.72 (m, 2H; Ar-H x 2), 7.13 (d, J = 8.9 Hz, 1H; Ar-H), 4.13 (q, J = 6.9 Hz, 2H; CH2), 2.29 (t, J = 7.3 Hz, 2H; CH2), 2.24 (t, J = 7.3 Hz, 2H; CH2), 1.59 (m, 2H; CH2), 1.52 (m, 2H; CH2), 1.36 (t, J = 6.9 Hz, 3H; CH3). ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C22H23ClF3N2O5+ [M+H]+ 487.1168; found 487.1248.【００９０】
（実施例３）
ＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの製造法
（１）液相反応に４を使用したＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの製造法
Ｆｍｏｃ固相合成法によるＰＩＰの合成：
固相合成にはPSSM-8ペプチド合成装置（島津、京都）を用いた。Fmoc-Py-oxime樹脂（約0.42 mmol/g, 100-200 mesh）43 mgからFmoc固相合成法により合成した。反応サイクルは以下の通りである。脱保護は4分を2回、20%ピペリジンのDMF溶液によった。カップリングは60分、カルボン酸、HCTU（88 mg）、N,N--ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（36 μL）、1-メチル-2-ピロリドン（NMP）を用いた。洗浄は1分を5回、DMFで行った。各々の一工程当たりのカップリング試薬は次の量をNMP溶液として準備した。Fmoc-Py-COOH (77 mg)、Fmoc-Im-COOH (77 mg)、Fmoc-PyIm-COOH (70 mg)、Fmoc-β-COOH (66 mg)、Fmoc-γ-COOH (69 mg)、アジピン酸 (31 mg)。すべての縮合工程はシングルカップリングで行い、窒素ガスのバブリングにより攪拌した。典型的な例として、樹脂40 mgと1 mLのNMPを2.5 mLのプラスチック製反応ヴェッセルに入れ、30分放置することで樹脂を膨潤させた。2 mLのプラスチック遠心チューブにFmocモノマ、HCTU、NMP 1 mLを加え、配列に応じた位置に置いた。すべてのラインは溶液移動後NMPにより洗浄した。合成完了後、樹脂は0.1N NaOH溶液にて洗浄、水洗後、1 mLのDMFで二度、1 mLのメタノールで二度洗い、室温下、デシケーター内で減圧乾燥した。【００９１】
切り出しと精製：
乾燥したサンプル樹脂に3-（ジメチルアミノ）-1-プロピルアミンを0.5 mL加え、45℃で3時間処理し、切り出しを行った。濾過により樹脂を除き、濾液からCH2Cl2-Et2Oにより粉体化し、Py-Imポリアミドの黄色未精製粉体33 mgを得た。その粉体はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製し（溶出溶液は0.1% TFA水溶液と0-45%の直線的勾配（0-45分）をかけたアセトニトリルで、流速は18 mL/分、検出は254 nm）、白色粉体として、PIP-I (10 mg)を得た。【００９２】
液相での縮合反応と精製：
精製したPIP-I (2.0 mg)の反応容器に CTB誘導体４(1.6 mg) とPyBOP (5.0 mg)、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA） (2.0 μL)を加え、DMF (100 μL)に溶かし、8時間窒素雰囲気下、室温で攪拌した。縮合反応が完結した後、溶媒を留去し、残留物を逆相HPLC（溶出溶液は0.1% TFA水溶液と0-50%の直線的勾配（0-40分）をかけたアセトニトリルで、検出は254 nm）にて精製した。目的物を凍結乾燥した後、白色粉体としてCTB-PIP-I（0.4 mg）を得た。ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C80H93 ClF3N24O142+ [M+2H]2+ 853.3511; found 853.3577.【００９３】
（２）固相合成反応に６を使用したＣＴＢ−ＰＩＰ−Ｉの製造法
Ｆｍｏｃ固相合法によるＰＩＰの合成：
固相合成は、（１）と同様の条件で実施した。各々のカップリング試薬は次の量をNMP溶液として準備した。Fmoc-Py-COOH (77 mg)、Fmoc-Im-COOH (77 mg)、Fmoc-PyIm-COOH (70 mg)、Fmoc-β-COOH (66 mg)、Fmoc-γ-COOH (69 mg)、CTB誘導体 6 (103 mg)。合成完了後、樹脂は1 mLのDMFで二度、1 mLのメタノールで二度洗い、室温下、デシケーター内で減圧乾燥した。【００９４】
切り出しと精製：
乾燥したサンプル樹脂に3-（ジメチルアミノ）-1-プロピルアミンを0.5 mL加え、45℃で3時間処理し、切り出しを行った。濾過により樹脂を除き、濾液からCH2Cl2-Et2Oにより粉体化し、PIPの黄色未精製粉体38 mgを得た。その粉体はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製し（溶出溶液は0.1% TFA水溶液と0-45%の直線的勾配（0-45分）をかけたアセトニトリルで、流速は18 mL/分、検出は254 nm）、白色粉体として目的のCTB-PIP-I (13 mg)を得た。ESI-TOF-MS (positive) m/z calcd for C80H93 ClF3N24O142+ [M+2H]2+ 853.3511; found 853.3577.
各種CTB-PIP-A、-G、-K、-L、-Xの合成に対しても固相合成反応に６を使用する製造法を適用しており、効率よい合成が実施可能であることを確認した。【００９５】
（実施例４）
遺伝子クラスタリング解析
細胞培養と処理条件の最適化：
54歳の白人女性のヒト皮膚線維芽細胞(HDF)をCell Applications, Inc.より購入した。P4で凍結保存した細胞を融解してから4継代目までにスクリーニング実験に用いた。細胞は10%ウシ胎児血清（FBS, Japan Serum）含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Nacalai Tesque, 日本）で培養した（Pandian, G. N. et al. Sci. Rep. 2014, 4, e3843）。P6のHDFを37℃、5分間トリプシン処理し、エフェクター(CTB、SAHA、CTB-PIP-I、SAHA-PIP-I)の最終濃度が1 μM、DMSOが0.5%とし、5%のCO2存在下、37℃で48時間培養した（Pandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t）。0.5% DMSOで処理した細胞をコントロールとした。CTB-PIP-Iの濃度最適化実験において、CTB-PIP-Iの濃度を500 nM, 1 μM, 5 μM、10 μMと変えた。1 μMより濃い濃度では誘導パターンに有意な影響を与えなかった。処理時間の最適化検討では24時間、48時間、72時間の条件を試したが、48時間の時に一貫性のある発現が確認でき、その時間が最適であることが示唆された。よって、すべての実験において1 μMのエフェクターで48時間処理することとした。【００９６】
マイクロアレイ解析：
HDFを1 μMのエフェクターで処理し、48時間後すべてのRNAをRNeasy MINI Kit (Qiagen, CA, USA)を用い取扱説明書に従い単離した。マイクロアレイ実験はHuman Gene 2.1 ST Array (Affymetrix, USA)を用いて行った（Pandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t）。生データと関連するサンプル情報はExpression Console (Affymetrix, USA)とTranscriptome Analysis Console (Affymetrix, USA)により処理した（図３Ａ）。マイクロアレイデータの解釈はIngenuity pathway analysisにより行った（Pandian, G. N. et al. Sci. Rep. 2014, 4, e3843; Pandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t）。目的変数なしクラスター解析にはCluster 3.0を用い、Java（登録商標） Treeviewにより可視化した（Pandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t）。得られたデータの、Ingenuity Pathway Knowledge Base 中のカノニカルパスウェイやライブラリに含まれる遺伝子に対する関連性は、フィッシャーの正確確率検定によりp値を算出することで評価した。散布図解析についてはCTB-PIP-Iで処理したHDFで発現上昇した転写産物（DMSO処理した細胞と比較して>2倍、p<0.05）を抽出し、SAHA-PIP-Iで処理したHDFで得られたデータに対してプロットした（図３Ｂ）。【００９７】
解析結果を、図３Ｂに示す。図３Ｂは、CTB、SAHA、CTB-PIP-I、SAHA-PIP-Iを用いてゲノムワイドな遺伝子発現に与える影響をクラスタリング解析した結果を示す。このマイクロアレイ解析によって、CTBは結合組織生涯関連遺伝子群の発現を、SAHAは癌及び心血管疾患関連遺伝子群の発現をそれぞれ活性化していることが分かった。対照的に、CTB-PIP-I、SAHA-PIP-Iは類似した多能性関連遺伝子群の発現を活性化していることが分かった。重要な点は、PIPのDNAに対する結合の特異性が上昇させる遺伝子に影響を与えたことであり、図３Ｂに示すように5倍以上活性化している遺伝子群の中から、SAHA、CTB、CTB-PIP、及びSAHA-PIPの三群間で共通している遺伝子は観察されなかった。また、このマイクロアレイの結果は、CTB、SAHA（図３Ａ中の縦の列）は、PIPと複合化させることによって全く異なる遺伝子群（図３Ａ中の横の行）の発現を活性化できる可能性を示唆している。【００９８】
（実施例５）
多能性遺伝子の発現誘導
遺伝子発現の定量化：
各々の遺伝子発現量はReverTra Ace qPCR kit (TOYOBO, 日本)を用いて定量化し、定量逆転写PCRはtriplicateでTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, 日本)で行い、ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)で解析した（Han, L. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 13410.; Pandian, G. N. et al. Sci. Rep. 2014, 4, e3843; Pandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t）。DMSO処理した細胞に対する相対発現量は、GAPDHを内部標準として計算した。逆転写PCRに用いたプライマーペアはPandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724tにて記載した通りであり、下記に示す。
LIN28B forward プライマーの配列: 5’-TGATAAACCGAGAGGGAAGC-3’（配列番号１）,
reverseプライマーの配列: 5’-TGTGAATTCCACTGGTTCTCC-3’（配列番号２）。
OCT3/4 forward プライマーの配列: 5’-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3’（配列番号３）,
reverseプライマーの配列: 5’-TGGGACTCCTCCGGGTTTTGC-3’（配列番号４）。
SOX2 forward プライマーの配列: 5’-GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3’(配列番号５),
reverseプライマーの配列: 5’-TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3’（配列番号６）。
DPPA4 forward プライマーの配列: 5’-ATTCCACTGCTCTCCTTGAG-3’(配列番号７),
reverseプライマーの配列: 5’-GTGAACCCAACCATCTGTGT-3’（配列番号８）。
EPCAM forward プライマーの配列: 5’-GGTGAGATGCATAGGGAACT-3’（配列番号９),
reverseプライマーの配列: 5’-AAGCCAGTTTCAAGCTGC-3’（配列番号１０）。
NANOG forward プライマーの配列: 5’-AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG-3’(配列番号１１),
reverseプライマーの配列: 5’-TGCGTCACACCATTGCTATTCTTC-3’（配列番号１２）。
ZIC3 forward プライマーの配列: 5’-CTAGCTACTTGCTGTTTCCC-3’(配列番号１３),
reverseプライマーの配列: 5’-CCACGTTCACTCCCATGTT-3’（配列番号１４）。
SALL4 forward プライマーの配列: 5’-TGAACCACCCAGGGAATGA-3’(配列番号１５),
reverseプライマーの配列: 5’-GAAGTCTTCTGAAGGCACAG-3’（配列番号１６）。
MIR302C forward プライマーの配列: 5’-GGGTACCTGCTGTGTGAAACAA-3’(配列番号１７),
reverseプライマーの配列: 5’-CCTCCACTGAAACATGGAAGCA-3’（配列番号１８）。
および、
GAPDH forward プライマーの配列: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(配列番号１９),
reverseプライマーの配列: 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（配列番号２０）。
統計的有意性はｔ検定により決定した。【００９９】
結果を、図４に示す。図４は、９種の多能性関連遺伝子群の発現誘導について、DMSOとCTBを比較対象にして、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-Iによる標的遺伝子の発現上昇を比較したqRT―PCR分析の結果である。9種の多能性関連遺伝子群は、下記に示す通りである：ＬＩＮ２８Ｂ遺伝子、ＯＣＴ−３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＤＰＰＡ４遺伝子、ＥＰＣＡＭ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＺＩＣ３遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＭＩＲ３０２Ｃ遺伝子。この結果は、CTB-PIP-IはCTBと異なり、多能性関連遺伝子群の発現を上昇させていることを示した。同時に、図３のマイクロアレイの結果と同様に、活性化する遺伝子の選択性が、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-I構造中のPIP部分のDNAに対する結合の特異性に由来していることを示唆している。同時に、図３のマイクロアレイの結果と同様に、活性化する遺伝子の選択性が、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-I構造中のPIP部分のDNAに対する結合の特異性に由来していることを示唆している。【０１００】
（実施例６）【０１０１】
HDAC阻害活性評価
トリコスタチンA (TSA)、SAHA、CTB、各々のColor de Lys（登録商標） Substrate Deacetylation に対する阻害活性をHeLa細胞の核抽出物液を用いて評価した。HeLa細胞の核抽出物は37℃で0.2 mMの基質とともにインキュベーションした。30分で反応を停止させた後、Color de Lys（登録商標）Developer を用いて405 nmの吸収を測定することで、HDAC阻害活性として評価した。強いHDAC阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）と、SAHA、CTBを、HDAC阻害活性を比較した。【０１０２】
結果を、図５に示す。この結果より、CTBがHDAC阻害活性を有していないことを確認した。【０１０３】
（実施例７）
細胞毒性アッセイ
比色法を用いた細胞毒性評価は以前報告している通り（Han, L. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 13410.）、WST-8（Dojindo、熊本、日本）と96ウェルプレートを用い、様々な濃度のCTBあるいはCTB-Iで細胞を処理して行った。【０１０４】
結果を、図６に示す。これらのグラフは、CTB、CTB-PIP-Iが共に例えば５μモル濃度の濃度下まで細胞毒性が観察されなかったことを示唆している。【０１０５】
（実施例８）
ChIPシークエンシング解析
CTB-PIP-Iで48時間処理したHDFを免疫沈降した後、共沈したDNA中に含まれるOCT-3/4のプロモーター配列の量を測定した。以前にPandian, G. N. et al. ACS Chem. Biol. 2014, 10.1021/cb500724t中で記載した条件と同様に、H3K14acに対する抗体を用いたChIP-seq実験を行って、CTB-PIP-Iによって仲介されているアセチル化について調べた。ChIPサンプルは混合して全部で50-100 ngのDNAを得た。ChIP-Seqライブラリーは標準的なIon Xpress（登録商標）Plus gDNA Fragment Library Preparation（Life technologies, USA）の試薬を用い、プロトコールに従ってChIP-Seqライブラリーを調製した。そのライブラリーのクォリティーと量は、Agilent DNA High sensitivity BioAnalyzer kit (Agilent technologies, USA)によって確認した。条件を満たしたライブラリーと、Ion one touch2のIon PGMTM template OT2 200 kitとIonPITM template OT2 200 kitを用いてテンプレートを調製した。テンプレートはその後Ion one touch ESにより濃縮した。濃縮されたライブラリーはリード長が100ヌクレオチドで、Ion PGMシークエンサーとIon PGMTM sequencing kit v2 / 318 chipを用いて、また、Ion ProtonTMシークエンサーとIon PITM Sequencing 200 kit / Ion PI chipを用いて、取扱説明書に従って操作した。
典型的にはフィルター後、ライブラリーごとに1800万から2300万のリードが得られた。データはIon torrent suitのプログラムパッケージにより処理した。リードのアラインメントにはTorrent Mapping Alignment Program 3.4.3-1 (TMAP)を用い、ChIP-Seqピークの呼び出しにはMACS1.4.2（Feng, J. et al. Nat. Protoc. 2012, 7, 1728）を用いた。【０１０６】
結果を、図７ＡおよびＢに示す。クロマチン免疫沈降後のChIPシークエンス解析の結果を示す。H3K14ac抗体を用いることで、Oct-3/4遺伝子プロモーター領域に結合するヒストンのアセチル化が誘導されていることを免疫沈降の後のChIPシークエンス解析によって確認した。Oct-3/4遺伝子プロモーター領域において、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-Iが共に同様なアセチル化ピークを示すことを観察した（図７Ａ）。また、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-Iが、共沈したDNA中のOct-3/4のプロモーター配列の量が同程度の量であることを観察した（図７Ｂ）。図７Ｂ中、右がH3K14ac、左がIgGに対する結果を示す。特に、Oct-3/4遺伝子プロモーター領域内に存在する配列に対するSAHA-PIP-Iと、CTB-PIP-Iに共通の特異性（5’-AAGGAA-3’）（配列番号２１）によって遺伝子発現が誘導された可能性を示唆している。
更に、図８に、Oct-3/4遺伝子プロモーター領域に関する配列（配列番号２２）を示す。このOct-3/4遺伝子プロモーター領域に含まれる1501塩基の配列情報の中には、SAHA-PIP-IとCTB-PIP-Iが共通して認識する6塩基配列（5’-A/T-A/T-G-G-A/T-A/T-3’）（配列番号２３乃至２８）が６箇所存在していた。この認識する塩基配列の位置と先のChIPシークエンス解析によるヒストンのアセチル化が活性化されている位置との間には関連性が観察された。
5’-TAGGAA-3’ （配列番号２３）
5’-TTGGAA-3’ （配列番号２４）
5’-ATCCTA-3’ （配列番号２５）  5’-AACCAA-3’ （配列番号２６）
5’-TTGGAA-3’ （配列番号２７）  5’-AAGGAA-3’ （配列番号２８）
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の「標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤」は、ウイルスベクターなどの遺伝子導入法とは異なる、遺伝子発現を活性化する機能分子を利用した薬剤として期待される。また、癌抑制遺伝子、ウイルス性疾患抑制遺伝子、または幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）の維持、分化もしくは誘導に関連する遺伝子等（例えば、Sox、Klf）への応用も期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１乃至２０はPCRプライマーを示す。
配列番号２１乃至２８はPIP-Iが認識して結合するプロモーター内の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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