(57)【要約】  生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法であって、例えば、下記の構造式（Ｉ）で表される、生細胞により還元され難い電子メディエーターを用いることを特徴とする測定方法、下記の構造式（Ｉ）で表される電子メディエーター、当該電子メディエーターを含む脱水素酵素及びその基質用測定試薬が開示されている。    Ａ−Ｌ−Ｍ    （Ｉ）  〔構造式（Ｉ）中、Ａは少なくとも1種類のアニオン性基を含有する構造部位を表し、Ｍは電子授受を行う構造部位を表し、Ｌは前記ＡとＭとを連結するリンカー部位を表す。〕
2015159969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法であって、生細胞により還元され難い電子メディエーターを用いることを特徴とする生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法。
【請求項２】
前記生細胞により還元され難い電子メディエーターが、下記の構造式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法。
Ａ−Ｌ−Ｍ    （Ｉ）
〔構造式（Ｉ）中、Ａは少なくとも1種類のアニオン性基を含有する構造部位を表し、Ｍは電子授受を行う構造部位を表し、Ｌは前記ＡとＭとを連結するリンカー部位を表す。〕
【請求項３】
前記電子授受を行う構造部位Ｍが、下記の構造式（II）で表されることを特徴とする請求項２記載の生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法。
【化１】
2015159969.tif 000015
〔構造式（II）中、Ｘは、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基、アルキル硫酸、アルキルスルホン酸を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基もしくはアルコキシ基、水酸基、又はハロゲン原子、又はニトロ基、又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１〜Ｒ７のいずれか１が前記リンカー部位Ｌである。〕
【請求項４】
下記の構造式（Ｉ）で表される電子メディエーター。
Ａ−Ｌ−Ｍ    （Ｉ）
〔構造式（Ｉ）中、Ａは少なくとも１種類のアニオン性基を含有する構造部位を表し、Ｍは電子授受を行う構造部位を表し、Ｌは前記ＡとＭとを連結するリンカー部位を表す。〕
【請求項５】
前記電子授受を行う構造部位Ｍが、下記の構造式（II）で表されることを特徴とする請求項４記載の電子メディエーター。
【化２】
2015159969.tif 000016
〔構造式（II）中、Ｘは、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基、アルキル硫酸、アルキルスルホン酸を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基もしくはアルコキシ基、水酸基、又はハロゲン原子、又はニトロ基、又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１〜Ｒ７のいずれか１が前記リンカー部位Ｌである。〕
【請求項６】
下記の式（Ｉ−１）〜（Ｉ−１６）のいずれかで表されることを特徴とする請求項５記載の電子メディエーター。
【化３】
2015159969.tif 000017
【化４】
2015159969.tif 000018
【請求項７】
請求項４から６のいずれか１項記載の電子メディエーターを含むことを特徴とする脱水素酵素及びその基質用測定試薬。
【請求項８】
乳酸脱水素酵素用測定試薬である請求項７記載の脱水素酵素及びその基質用測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養液や血液中の成分測定の技術分野に属し、特に、生細胞存在下での脱水素酵素及びその基質濃度の測定に有用な脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法、該方法に用いられる電子メディエーター並びに該電子メディエーターを含む脱水素酵素及びその基質用測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養液や血液中のグルコース等の基質濃度の測定には、酸化酵素や脱水素酵素等の基質特異的な酵素を利用した検出系が利用されている。特に脱水素酵素を用いる測定系は、大気中の酸素の影響を受けないため利用価値が高い。脱水素酵素が基質と反応すると、ニコチンアミドジヌクレオチド(ＮＡＤ)やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰ)等の補酵素が還元される(ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋→ＮＡＤＰＨ)。生成した補酵素の還元体から、ＰＭＳ(フェナジンメトサルフェート)、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（１−メトキシフェナジンメトサルフェート）やＰＥＳ（フェナジンエトサルフェート）等の電子メディエーターを介して、電極や還元発色色素に電子を渡すことにより、電流値や発色強度から基質濃度を求めることができる。また、外部から基質を加えれば、同様の系で脱水素酵素の濃度を測定することが可能である。【０００３】
一方、上記のような電子メディエーターは、生細胞から電子を受け取る特性を有している。例えば、創薬におけるドラッグスクリーニングや、各種物質の毒性分析等において利用されている細胞増殖・細胞毒性試験においては、生細胞と電子授受を行う１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳやＰＥＳ等の電子メディエーターを介して生細胞活性を測定する各種手法が利用されている。死細胞の一部から培養液中に漏出した酵素の活性を、電子メディエーターを介して測定することにより、細胞毒性を評価する方法も用いられているが、上記の電子メディエーターは、生細胞との間でも電子授受を行うため、細胞培養液を生細胞と分離した上で、測定試料を調製する必要があった（非特許文献１参照）。生細胞を分離しない方法も提案されているが、生細胞の影響を回避できているわけではなく、反応温度を低くしたり、反応時間を短くしたりする必要がある（特許文献１参照）。【０００４】
基質濃度の測定
細胞毒性試験において、低分子電子メディエーターの代わりに、電子授受を行う酵素であるジアホラーゼを用いることで生細胞からの電子授受を抑え、生細胞存在下に死細胞由来の脱水素酵素濃度又は活性を測定する方法も提案されているが、酵素を用いることから試薬溶液の安定性が悪く、使い易いものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５２３０２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】F.  K.-M.  Chan  et  al.,  Methods  Mol.  Biol.,  2013,  979,  65-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術における上述の問題点を解消し、生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度を測定する新しい技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、検討を重ねた結果、生細胞とほとんど電子授受を行わず、生細胞存在下においても脱水素酵素及びその基質濃度を測定可能な電子メディエーターの合成に成功して本発明を導き出した。【０００９】
本発明の第１の態様は、生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法であって、生細胞により還元され難い電子メディエーターを用いることを特徴とする測定方法を提供することにより上記課題を解決するものである。【００１０】
本発明の第１の態様に係る測定方法において、前記生細胞により還元され難い電子メディエーターが、下記の構造式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。
Ａ−Ｌ−Ｍ      （Ｉ）
〔構造式（Ｉ）中、Ａは少なくとも１種類のアニオン性基を含有する構造部位を表し、Ｍは電子授受を行う構造部位を表し、Ｌは前記ＡとＭとを連結するリンカー部位を表す。〕【００１１】
本発明の第１の態様に係る測定方法において、前記電子授受を行う構造部位Ｍが、下記の構造式（II）で表されるものであってもよい。
【化１】
2015159969.tif 000003
〔構造式（II）中、Ｘは、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基、アルキル硫酸、アルキルスルホン酸を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基もしくはアルコキシ基、水酸基、又はハロゲン原子、又はニトロ基、又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１〜Ｒ７のいずれか１が前記リンカー部位Ｌである。〕【００１２】
本発明の第２の態様は、上記の構造式（Ｉ）で表される電子メディエーターを提供することにより上記課題を解決するものである。【００１３】
本発明の第２の態様に係る電子メディエーターにおいて、前記電子授受を行う構造部位Ｍが、上記の構造式（II）で表されるものであってもよい。【００１４】
本発明の第２の態様に係る電子メディエーターが、下記の式（Ｉ−１）〜（Ｉ−１６）のいずれかで表されるものであってもよい。【００１５】
【化２】
2015159969.tif 000004
【００１６】
【化３】
2015159969.tif 000005
【００１７】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に係る電子メディエーターを含むことを特徴とする脱水素酵素及びその基質用測定試薬を提供することにより上記課題を解決するものである。【００１８】
本発明の第３の態様に係る脱水素酵素及びその基質用測定試薬は、乳酸脱水素酵素用測定試薬であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法、電子メディエーター及びそれを含む脱水素酵素及びその基質用測定試薬を用いれば、生細胞と電子メディエーターとの間での電子授受が殆ど起こらない。そのため、生細胞を分離することなく生細胞が存在するままの状態で脱水素酵素及びその基質濃度の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】生細胞の存在下において脱水素酵素及びその基質濃度を測定する本発明の原理を従来の技術と比較して模式的に示す図である。
【図２】生細胞の存在下において死細胞から漏れ出る乳酸脱水素酵素濃度又は活性を測定する本発明に従う死細胞アッセイの原理を従来の技術と比較して模式的に示す図である。
【図３】生細胞との電子授受に関して、本発明の電子メディエーターと従来の電子メディエーターの違いを比較して示した図である。
【図４】本発明の電子メディエーターを用いた生細胞存在下での死細胞依存的な発色反応を示した図である。
【図５】死細胞由来のＬＤＨを指標とした、本発明の電子メディエーターを用いた生細胞存在下での死細胞アッセイと、生細胞の分離が必要な既存製品での死細胞アッセイの比較を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第１の実施の形態に係る生細胞存在下に脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法（以下、「測定方法」と略称する場合がある。）において、本発明の第２の実施の形態に係る、下記の構造式（Ｉ）で表される電子メディエーター（生細胞により還元され難い電子メディエーターの一例。以下、「電子メディエーター」と略称する場合がある。）が用いられている。
【００２２】
Ａ−Ｌ−Ｍ      （Ｉ）
構造式（Ｉ）中、Ａは少なくとも１種類のアニオン性基を含有する構造部位を表し、Ｍは電子授受を行う構造部位を表し、Ｌは前記ＡとＭとを連結するリンカー部位を表す。
【００２３】
上記構造式（Ｉ）において、Ａは少なくとも１種類のアニオン性基を含有する構造部位を有している。このアニオン性基によって、生細胞と電子授受を行わないという特性が付与される。
【００２４】
Ａとしては、特に限定されるものではないが、例えば、アスパラギン酸やグルタミン酸等のアミノ酸、タウリン、ホモタウリン等のアミノスルホン酸、パミドロン酸やアレンドロン酸等のアミノホスホン酸、ニコチンアミドジヌクレオチド、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸等のヌクレオチド類等が挙げられる。
【００２５】
上記構造式（Ｉ）において、Ｍは電子授受を行う部位として機能する酸化型構造部位を表す。この酸化型構造部位は、電子の伝達を仲介し、それ自体も酸化型／還元型の構造を呈する。
【００２６】
電子メディエーターを構成する、構造式（Ｉ）の化合物における酸化型構造部位としては、従来より脱水素酵素及びその基質の検出に利用されるような各種の構造に由来するものが原理的には適用可能であるが、特に好ましいのは、下記の式（II）で表されるフェナジニウム構造を有するものである。
【００２７】
【化４】
2015159969.tif 000006
【００２８】
構造式（II）中、Ｘは、炭素数１〜５の分岐を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜６の分岐を有していてもよいアルキル基もしくはアルコキシ基、又は水酸基、又はハロゲン原子、又はニトロ基、又は置換基を有してもよいアミノ基を表す。なお、構造式（II）中、Ｌはリンカー部位（後述）を表すと共に、Ｒ１〜Ｒ７のいずれか１が前記リンカー部位Ｌであることを意味している。
【００２９】
上記構造式（Ｉ）及び（II）において、ＬはＡ（少なくとも１種類のアニオン性基を含有する構造部位）とＭ（電子授受を行う酸化型構造部位）とを連結するリンカー部位を表す。リンカー部位の構造は特に限定するものではない。
【００３０】
電子メディエーターを構成する、構造式（Ｉ）で表される化合物の好ましい例として、下記の式（Ｉ−１）〜（Ｉ−１６）で表されるものが挙げられるが、電子メディエーターはこれらに限定されるものではない。
【００３１】
【化５】
2015159969.tif 000007
【００３２】
【化６】
2015159969.tif 000008
【００３３】
かくして、本発明に従えば、本発明の別の態様として、生細胞が存在し得る細胞培養液や血液試料中の脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法であって、生細胞を分離することなく当該試料に、式（Ｉ）の化合物から成る電子メディエーターと還元発色色素とを加えて脱水素酵素及びその基質を定量する方法、並びに、その方法に用いられる測定試薬であって、式（Ｉ）の化合物から成る電子メディエーター及び還元発色色素を含む脱水素酵素及びその基質の測定試薬が提供される。
【００３４】
本発明の第１の実施の形態に係る脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法において用いられる還元発色色素は、電子受容体として働き、自らは還元されて発色（色変化）を呈する化合物である。この還元発色色素として好ましい例は、各種のテトラゾリウム塩であり、還元されて容易にホルマザン（formazan）になり発色する。テトラゾリウム塩として特に好ましいのは、下記の式（III）で表されＷＳＴと称されるものであり、４３０ｎｍ〜４９０ｎｍにおける吸光度を測定できる高感度水溶性ホルマザンを生成する。還元発色色素としては、テトラゾリウム塩に限定されるものではなく、その他に、例えば、レサズリン等も使用可能である。
【００３５】
【化７】
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【００３６】
本発明に従う測定例の一つに、死細胞から漏れ出た乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)を指標とする死細胞アッセイがある。図２は、生細胞の存在下においても死細胞を測定（アッセイ）することのできる原理を従来の技術の場合と比較して模式的に示すものである。
【００３７】
図２（Ｂ）に示すように、生細胞と電子授受を行う従来の電子メディエーター（Ｍｅｄ：例えば、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳやＰＥＳ）、基質である乳酸（Lactate）、補酵素であるＮＡＤと還元発色色素を細胞試料（細胞培養培地）に添加すると、死細胞から漏れ出したＬＤＨが乳酸の脱水素反応を行い、それに伴うＮＡＤの還元→Ｍｅｄの還元→還元発色色素（例えば、ＷＳＴ−８）の還元による発色に加えて、生細胞内のＮＡＤＨによってもＭｅｄが還元されてＷＳＴ−８が発色してしまうので、死細胞のみを選択的に測定することはできない。そこで、従来の技術においては、培地の一部を別のプレートに移して測定したり、浮遊細胞では遠心操作を行ってから測定する等、生細胞を分離することが必要であった。
【００３８】
これに対して図２（Ａ）に示す本発明の第１の実施の形態に係る測定方法においては、電子メディエーターが生細胞内のＮＡＤＨによっては還元され難いため、生細胞存在下においても、死細胞由来のＬＤＨの量を測定することができる。このように、本発明に従えば、生細胞が存在する状態で発色液（Ａ−Ｌ−Ｍ、基質、補酵素及び還元発色色素を含む）を加えるだけで、培地の一部を別プレートに移したり、浮遊細胞を遠心することなく、死細胞を測定することができる。また、上記発色液はタンパク質である電子伝達酵素を含んでいないことから、非常に安定性が高く、溶液での長期保存が可能である。かくして、本発明に従う死細胞測定技術は、特に創薬の研究開発において、薬候補の細胞毒性スクリーニングを大量かつ迅速に行う場合等に有用である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の特徴をさらに具体的に示すために実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。【００４０】
実施例１：Ｉ−１の合成【００４１】
【化８】
2015159969.tif 000010
【００４２】
5-Methyl-1-carboxybutyl  phenazine誘導体(１）は、既報（国際公開第２００９／１１８１５７号）の方法に従って合成した。４０ｍｇ（５７μｍｏｌ）のＮ６−２ＡＥ−ＮＡＤ（同仁化学研究所）を１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液(ｐH ７．４）１ｍＬに溶解し、４０ｍｇ（２０９μｍｏｌ）のＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride）及び８５．８ｍｇ（２０９μｍｏｌ）の化合物１を加え、室温で２０時間反応させた。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにて精製し、デシケーター内で減圧乾燥してＩ−１の赤色固体１２ｍｇを得た。【００４３】
実施例２：Ｉ−４の合成【００４４】
【化９】
2015159969.tif 000011
【００４５】
5-Ethyl-1-carboxybutyl  phenazine誘導体(２）は、既報（国際公開第２００９／１１８１５７号）の方法に従って合成した。４４．８ｍｇ（５７μｍｏｌ）のＮ６−２ＡＥ−ＮＡＤＰ（同仁化学研究所）を１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液(ｐH ７．４）１ｍＬに溶解し、４０ｍｇ（２０９μｍｏｌ）のＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride）及び８８．７ｍｇ（２０９μｍｏｌ）の化合物２を加え、室温で２０時間反応させた。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにて精製し、デシケーター内で減圧乾燥してＩ−４の赤色固体１５ｍｇを得た。【００４６】
実施例３：Ｉ−６の合成【００４７】
【化１０】
2015159969.tif 000012
【００４８】
5-Ethyl-1-carboxybutyl  phenazine誘導体(２）は、既報（国際公開第２００９／１１８１５７号）の方法に従って合成した。４０ｍｇ（３０１μｍｏｌ）のアスパラギン酸を１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液(ｐH ７．４）１ｍＬに溶解し、４０ｍｇ（２０９μｍｏｌ）のＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide  hydrochloride）及び８８．７ｍｇ（２０９μｍｏｌ）の化合物２を加え、室温で２０時間反応させた。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにて精製し、デシケーター内で減圧乾燥してＩ−６の赤色固体４５ｍｇを得た。【００４９】
実施例４：Ｉ−１０の合成【００５０】
【化１１】
2015159969.tif 000013
【００５１】
5-Ethyl-1-carboxybutyl  phenazine誘導体(２）は、既報（国際公開第２００９／１１８１５７号）の方法に従って合成した。４０ｍｇ（３２０μｍｏｌ）のタウリンを１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液(ｐH ７．４）１ｍＬに溶解し、４０ｍｇ（２０９μｍｏｌ）のＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride）及び８８．７ｍｇ（２０９μｍｏｌ）の化合物２を加え、室温で２０時間反応させた。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにて精製し、デシケーター内で減圧乾燥してＩ−１０の赤色固体５０ｍｇを得た。【００５２】
実施例５：Ｉ−１５の合成【００５３】
【化１２】
2015159969.tif 000014
【００５４】
5-Methyl-1-carboxybutyl  phenazine誘導体(１）は、既報（国際公開第２００９／１１８１５７号）の方法に従って合成した。７５ｍｇ（３０１μｍｏｌ）のアレンドロン酸を１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液(ｐH ７．４）１ｍＬに溶解し、４０ｍｇ（２０９μｍｏｌ）のＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride）及び８５．８ｍｇ（２０９μｍｏｌ）の化合物１を加え、室温で２０時間反応させた。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにて精製し、デシケーター内で減圧乾燥してＩ−１５の赤色固体４０ｍｇを得た。【００５５】
実施例６：生細胞との電子授受の評価
電子メディエーターと生細胞との電子授受を評価した例を示す。比較のために、生細胞と電子授受を行うことが知られている電子メディエーターである１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳについても同様の実験を行った。ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）を２５，０００〜０細胞／ｗｅｌｌとなるよう、９６穴マイクロプレートに播種し、終濃度が下記となるよう測定試薬を添加し、３７℃で３時間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定試薬終濃度：ＷＳＴ−８（５００μＭ）、電子メディエーター（１０μＭ）。【００５６】
測定結果を図３に示す。１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳを用いた場合、生細胞から１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳが電子を受け取り、ＷＳＴ−８を還元し、黄色の色素であるホルマザンを生成して吸光度の上昇がみられる。これに対し、本発明の電子メディエーターはいずれの誘導体を用いた場合も生細胞由来のホルマザンの生成が１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳに比べ著しく抑えられていることがわかる。【００５７】
実施例７：生細胞存在下での死細胞由来のＬＤＨの測定
血球計算盤で細胞数計測後のヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）を２つに分け、一方を凍結融解により死滅させた(死細胞サンプル)。残ったもう一方（生細胞サンプル）と死細胞サンプルを、比率を変えて混合し、全細胞数は同一で、死細胞と生細胞の比率が異なるサンプルを作製した。【００５８】
終濃度が下記となるようＬＤＨの基質である乳酸、還元発色試薬、補酵素、及び電子メディエーターを添加し、室温で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試薬終濃度：乳酸（０．３７５％）、ＷＳＴ−８（５００μＭ）、ＮＡＤ（１０μＭ）、電子メディエーター（１０μＭ）。【００５９】
測定結果を図４に示す。横軸は、死細胞数０のときは生細胞２０,０００、死細胞数１０,０００のときは生細胞１０,０００、死細胞２０,０００のときは生細胞０となる。本発明の電子メディエーターはいずれの誘導体を用いた場合も、死細胞に対して直線的に吸光度が上昇するグラフとなり、生細胞の影響がほとんど無いことがわかる。【００６０】
実施例８：死細胞を指標とした細胞毒性試験
本発明の電子メディエーターを含む発色試薬溶液を調製して、死細胞から漏れ出るＬＤＨを指標とする細胞毒性試験を行った例を示す。細胞毒性試験のモデルとして、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞に対する薬剤マイトマイシンＣ（mitomycin  Ｃ：ＭＭＣ）の細胞毒性を評価した。【００６１】
ＣＨＯ細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度となるよう、血清含有培地を用いて懸濁液を調製し、１００μＬずつ９６ｗｅｌｌマイクロプレートに播種した。３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした後、１０μＬのＭＭＣを終濃度が１ｍＭ〜０．０００１ｍＭになるように加えた。３７℃で２０時間、ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。ｗｅｌｌ中のすべての細胞が死滅した場合の発色を測定するために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を一部のｗｅｌｌに加えて細胞をすべて死滅させた。発色試薬溶液（実施例７の終濃度となるよう調製したもの）を１０μＬずつ全ｗｅｌｌに加えた。３７℃で２０分間、ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした後、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。【００６２】
市販のＬＤＨを指標とした死細胞アッセイキット(biopioneer社  LDH-Cytotoxicity  Assay  Kit)を比較対象として実験も行った。使用方法は製品添付のプロトコルに従った。吸光度の測定法は上述と同様であるが、発色反応を行う際に生細胞が混在しないように培養上清をとり、別のプレートに移すことが必要とされている。【００６３】
測定結果を図５に示す。薬剤マイトマイシンＣのＣＨＯ細胞に対する細胞毒性の程度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値は、本発明の電子メディエーターを用いた場合でも（図５（Ａ）参照）、死細胞アッセイとして受け入れられている既存製品の場合（図５（Ｂ）参照）と比較して差がなく、本発明の電子メディエーターは生細胞存在下で死細胞の測定に適用できることが確認された。【００６４】
上記には脱水素酵素濃度又は活性の測定例を示したが、原理的には脱水素酵素だけでなく、脱水素酵素の基質濃度を測定することも可能である。このように本発明の化合物を用いれば、生細胞の混在下においても、脱水素酵素及びその基質の濃度を測定することができる。【００６５】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【００６６】
本出願は、２０１４年４月１８日に出願された、日本国特許出願特願２０１４−０８６１８０号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０１４−０８６１８０号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【図１】
2015159969.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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