(57)【要約】  本発明は、細胞の癌化を精度よく判定することができ、且つ種々の細胞の癌化を判定することができる癌の判定方法並びに癌マーカーの提供を課題とし、「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号３で示される塩基配列を含み、塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである癌マーカー」、「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである癌マーカー」、及び「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部又は全部について、バイサルファイト反応によりメチル化率を測定し、当該メチル化率に基づいて細胞の癌化を判定する方法」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号３で示される塩基配列を含む連続する塩基配列であって、当該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである、癌マーカー。
【請求項２】
細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号３で示される塩基配列からなり、当該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの４０％以上がメチル化されているものである、請求項１記載の癌マーカー。
【請求項３】
細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、当該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである、癌マーカー。
【請求項４】
細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号２で示される塩基配列からなり、当該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの４０％以上がメチル化されているものである、請求項３記載の癌マーカー。
【請求項５】
細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部又は全部について、バイサルファイト反応によりメチル化率を測定し、当該メチル化率に基づいて細胞の癌化を判定する方法。
【請求項６】
前記メチル化率が３０％以上である場合に癌と判定する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも配列番号３で示される塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンのメチル化率を全て測定する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記メチル化率が４０％以上である場合に癌と判定する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
少なくとも配列番号２で示される塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンのメチル化率を全て測定する、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化率が４０％以上である場合に癌と判定する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
癌マーカー及びそれを用いた癌の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォークヘッド又はウイングド・ヘリックス DNA 結合ドメインを持った転写因子の一群をFOX (Forkhead box)と呼んでおり、ヒトでは 約50 種類存在している。主に発生調節因子、組織特異的調節因子、細胞周期調節因子として機能しているが、作用がほとんど解明されていないものも多数ある。その中で、FOXB2は、アフリカツメガエルでは胚の神経形成に関与しているとの報告がなされているが、哺乳動物での機能については未だ解明されていない。
一方、DNAのメチル化は癌化と関連があることが知られており、特開2008-283947では、FOXB2遺伝子のCpG アイランド（CpGジヌクレオチド：-CG-配列）におけるメチル化率を元に食道癌を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2008-283947
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１には、癌細胞がCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化を受けることが多いと記載されており、更に、食道癌のFOXB2遺伝子をBAMCA法で測定し、CpGジヌクレオチドのシトシンがメチル化されていることを確認したことが記載されている。しかしながら、BAMCA法はCCCGGG配列のメチル化を測定するため、その測定箇所は非常に限定されている。一方、本願発明者らは、癌細胞中のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化について鋭意研究した結果、癌細胞であっても全てのCpGジヌクレオチドがメチル化されているわけではなく、また、CpGジヌクレオチドの位置によりそのメチル化率が異なることを見出した。そのため、BAMCA法のような数ヶ所のメチル化による癌の判定は精度が低く、より精度の高い細胞の癌化判定方法が望まれていた。
また、多くの細胞種で癌は発生しており、特定の細胞の癌化のみではなく、種々の細胞に応用することができる癌の判定方法も望まれていた。そこで、本発明は、細胞の癌化を精度よく判定することができ、且つ種々の細胞の癌化を判定することができる癌の判定方法並びに癌マーカーの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記状況に鑑みて鋭意研究した結果、各種正常細胞、健常人の血液及び各種がん細胞由来ゲノムDNAを鋳型としてFOXB2遺伝子の特定の領域をバイサルファイト法で解析したところ、当該特定領域のCpGジヌクオレチドのシトシンが、各種正常細胞及び健常人全血ゲノムDNAでは非メチル化状態であり、各種がん細胞ではメチル化状態であることを見出した。そして、この結果より、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号３で示される塩基配列を含み、塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである癌マーカー」、「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの３０％以上がメチル化されているものである癌マーカー」、及び「細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部又は全部について、バイサルファイト反応によりメチル化率を測定し、当該メチル化率に基づいて細胞の癌化を判定する方法」に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の癌マーカーを指標とすることにより、また、本発明の方法により、細胞の種類に拘わらず種々の細胞について細胞の癌化を判定することができる。更に、本発明の方法は、特定の領域のCpGジヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化率を測定するため、精度よく細胞の癌化を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例１のhiPS（ヒト正常皮膚由来線維芽細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２】図２は、実施例１のHDF（ヒト正常皮膚由来線維芽細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図３】図３は、実施例１のWI-38（ヒト正常肺由来繊維芽細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図４】図４は、実施例１のCCD-8Lu（正常ヒト肺2倍体細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図５】図５は、実施例１のHE23（正常ヒト胎児細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図６】図６は、実施例１の全血中のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図７】図７は、FOXB2 プロモーター領域の塩基配列（PCR増幅領域、GenBank Accession No. AL353637 : 106566-107058、配列番号１０）を表す。
【図８】図８は、実施例２のIMR-32（ヒト腹部神経芽細胞腫細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図９】図９は、実施例２のHEK293（ヒト胎児腎細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１０】図１０は、実施例２のHeLa（ヒト子宮頸部癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１１】図１１は、実施例２のHepG2（ヒト肝癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１２】図１２は、実施例２のMDA-MB-231（ヒト乳腺癌）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１３】図１３は、実施例２のTYK-nu（ヒト卵巣未分化癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１４】図１４は、実施例２のHCC2998（ヒト大腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１５】図１５は、実施例２のHCT-15（ヒト結腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１６】図１６は、実施例２のHCT 116（ヒト結腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１７】図１７は、実施例２のLoVo（ヒト結腸腺癌細胞(鎖骨リンパ節)）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１８】図１８は、実施例２のSW620（ヒト結腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図１９】図１９は、実施例２のSW837（ヒト直腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２０】図２０は、実施例２のCOLO 205（ヒト結腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２１】図２１は、実施例２のWiDr（ヒト結腸腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２２】図２２は、実施例２のLNCap. Clone FGC（ヒト前立腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２３】図２３は、実施例２のNCI-H460（ヒト非小細胞性肺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２４】図２４は、実施例２のACHN（ヒト腎腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２５】図２５は、実施例２のMCF-7（ヒト乳腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２６】図２６は、実施例２のPANC-1 （ヒト膵臓腺癌細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２７】図２７は、実施例２のCFPAC-1（ヒト膵臓腺癌）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２８】図２８は、実施例２のDAUDI（ヒトバーキットリンパ腫細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図２９】図２９は、実施例２のHL60（ヒト前骨髄性白血病細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図３０】図３０は、実施例２のJurkat（ヒトT細胞性白血病細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図３１】図３１は、実施例２のMono Mac 6（ヒト単球性白血病細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【図３２】図３２は、実施例２のTHP-1（ヒト急性単球性白血病細胞）のFOXB2遺伝子について、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシンであるかメチル化シトシンであるかを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［本発明の癌マーカー］
本発明の癌マーカーは、細胞由来のFOXB2遺伝子中のプロモーター領域に存在する配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなり、少なくとも配列番号３で示される塩基配列を含むもの、又は少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含むもの（以下、これらを、本発明に係る癌マーカー塩基配列と略記する場合がある）であり、当該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンが３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上メチル化されているものである。
【０００９】
上記本発明に係る癌マーカー塩基配列は、具体的には、配列番号１で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列とその３’側に隣接する１〜７２塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基、配列番号２で示される塩基配列とその５’側 に隣接する１〜２１塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基、配列番号２で示される塩基配列とその３’側 に隣接する１〜７２塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基と配列番号２の５’側 に隣接する１〜２１塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基（配列番号１で示される塩基配列は除く）、配列番号３で示される塩基配列とその３’側に隣接する１〜７２塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基、配列番号３で示される塩基配列とその５’側 に隣接する１〜５６塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基、配列番号３で示される塩基配列とその３’側 に隣接する１〜７２塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基と配列番号３の５’側 に隣接する１〜５６塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基とからなる連続する塩基（配列番号１で示される塩基配列は除く）等が挙げられる。
【００１０】
本発明に係る癌マーカー塩基配列は、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（図７における、丸６〜丸２１の塩基配列）；配列番号２で示される塩基配列（図７における、丸８〜丸１７の塩基配列）；配列番号３で示される塩基配列（図７における、丸１３〜丸１７の塩基配列）；配列番号２で示される塩基配列と、該塩基配列の３’側に隣接する２３塩基、４０塩基、５４塩基又は７２塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸８〜丸１８の塩基配列、丸８〜丸１９の塩基配列、丸８〜丸２０の塩基配列又は丸８〜丸２１の塩基配列）；配列番号２で示される塩基配列と該塩基配列の５’側 に隣接する１１塩基又は２１塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸７〜丸１７の塩基配列又は丸６〜丸１７の塩基配列）；配列番号２で示される塩基配列と、該塩基配列の３’側に隣接する２３塩基、４０塩基、５４塩基又は７２塩基と、配列番号２で示される塩基配列の５’側 に隣接する１１塩基又は２１塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸７〜丸１８の塩基配列、丸７〜丸１９の塩基配列、丸７〜丸２０の塩基配列、丸７〜丸２１の塩基配列、丸６〜丸１８の塩基配列、丸６〜丸１９の塩基配列、丸６〜丸２０の塩基配列、又は丸６〜丸２１の塩基配列）；配列番号３で示される塩基配列と、該塩基配列の３’側に隣接する２３塩基、４０塩基、５４塩基又は７２塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸１３〜丸１８の塩基配列、丸１３〜丸１９の塩基配列、丸１３〜丸２０の塩基配列又は丸１３〜丸２１の塩基配列）；配列番号３で示される塩基配列と、該塩基配列の５’側 に隣接する８塩基、１０塩基、１４塩基、３２塩基、３５塩基、４６塩基又は５６塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸１２〜丸１７の塩基配列、丸１１〜丸１７の塩基配列、丸１０〜丸１７の塩基配列、丸９〜丸１７の塩基配列、丸８〜丸１７の塩基配列、丸７〜丸１７の塩基配列又は丸６〜丸１７の塩基配列）；配列番号３で示される塩基配列と、該塩基配列の３’側に隣接する２３塩基、４０塩基、５４塩基又は７２塩基と、配列番号３で示される塩基配列の５’側 に隣接する８塩基、１０塩基、１４塩基、３２塩基、３５塩基、４６塩基又は５６塩基とからなる連続する塩基配列（図７における、丸６〜丸１２を５’末端として丸１８〜丸２１を３’末端とする塩基配列）等が挙げられ、中でも配列番号１で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等が好ましく、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等がより好ましく、配列番号３で示される塩基配列が更に好ましい。
尚、本発明に係る癌マーカー塩基配列は、配列中に含まれる-CG-配列のシトシンが同じものであれば同じ癌マーカーとして用いることができるため、上記具体的な塩基配列は、５’末端方向又は／及び３’末端方向の次の-CG-配列のシトシンの１塩基前までの塩基配列の一部又は全部を含んでいてもよい。即ち、例えば上記配列番号１で示される塩基配列は、５’側 に隣接する５３塩基のうち配列番号１に隣接する少なくとも１塩基又は／及び３’側に隣接する３８塩基のうち配列番号１に隣接する少なくとも１塩基を含んでいてもよい。例えば、配列番号２で示される塩基配列は、５’側 に隣接する１０塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基又は／及び３’側に隣接する２２塩基のうち配列番号２に隣接する少なくとも１塩基を含んでいてもよい。例えば、配列番号３で示される塩基配列は、５’側 に隣接する７塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基又は／及び３’側に隣接する２２塩基のうち配列番号３に隣接する少なくとも１塩基を含んでいてもよい。
本発明に係る癌マーカー塩基配列が配列番号２で示される塩基配列又は配列番号３で示される塩基配列の場合、該癌マーカーにおける-CG-配列のシトシンは４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上がメチル化されているものである。
【００１１】
上記配列番号１で示される塩基配列は、Genbank Accession No. AL353637の塩基番号106812-106961に記載されている。上記配列番号２で示される塩基配列は、Genbank Accession No. AL353637の塩基番号106833-106889に記載されている。上記配列番号３で示される塩基配列は、Genbank Accession No. AL353637の塩基番号106868-106889に記載されている。
配列番号１及び２で示される塩基配列は、生物の種差、個体差若しくは細胞や組織の差異等により生じる変異による塩基の欠失、置換又は付加が生じたものも含まれる。
【００１２】
本発明の癌マーカーにおけるFOXB2遺伝子は、細胞由来のものであればよく、判定する癌に応じてその細胞の種類は選択される。例えば、肝癌を判定する場合には肝細胞由来の遺伝子を用い、前立腺癌を判定する場合には前立腺細胞由来の遺伝子を用いればよい。また、白血球の癌化を判定する場合には、血液から白血球を取り出す、又は血液そのものを用いて白血球由来の遺伝子を用いればよい。FOXB2遺伝子の由来となる細胞は、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものが特に好ましい。好適に用いられる細胞としては、例えば、神経芽細胞、腎臓、子宮、肝臓、乳腺、卵巣、大腸（結腸、直腸）、前立腺、肺、膵臓、骨髄細胞、T細胞等が挙げられる。
【００１３】
本発明に係る癌マーカー塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンのメチル化率は、本発明に係る癌マーカー塩基配列をバイサルファイト反応に付して-CG-配列のメチル化シトシンを検出し、その数を元に算出される。本発明に係る癌マーカー塩基配列をバイサルファイト反応に付すと、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはウラシルに変換されない。そのため、バイサルファイト反応後の塩基配列を解析して正常の塩基配列と比較することによりメチル化シトシンを検出することができ、-CG-配列中のメチル化シトシン数を-CG-配列のシトシンの数で除することにより、メチル化率を算出することができる。なお、バイサルファイト反応の詳細については、本発明の癌化の判定方法の項で後述する。
【００１４】
本発明の癌マーカーは、例えば哺乳動物由来の細胞からゲノムDNAを取得した後、該ゲノムDNAから本発明に係る癌マーカー塩基配列を取得することにより得ることができる。
【００１５】
上記の細胞からゲノムDNAを取得する方法としては、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載のアルカリSDS法等公知のDNA抽出方法に従って、或いは、市販のゲノムDNAの抽出キットを用いて、細胞、微生物、ウィルス等から抽出することにより得られる。
【００１６】
上記で得られたゲノムDNAから本発明に係る癌マーカー塩基配列を取得する方法としては、この分野で用いられる自体公知の方法を用いればよく、例えば目的とする塩基配列が取得できるようなプライマーを設計しPCRにより得る方法等が挙げられる。この場合に用いられるプライマーとしては、例えば以下のものが挙げられる。
【００１７】
フォワードプライマー
GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG（配列番号４）
GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG（配列番号５）
リバースプライマー
CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC（配列番号６）
CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC（配列番号７）
PCRの具体的な方法としては、後述する［本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAの取得］の項で記載のPCR反応に準じて行われればよい。
【００１８】
［本発明の癌化の判定方法］
本発明の癌化の判定方法は、細胞由来のFOXB2遺伝子中の配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部の塩基配列（以下、本発明に係る目的の塩基配列と略記する場合がある）について、該塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部又は全部のメチル化率を、バイサルファイト反応により測定し、そのメチル化率に基づいて細胞の癌化を判定することによりなされる。具体的には、当該メチル化率が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上の場合、細胞が癌化されていると判定する。
【００１９】
上記本発明に係る目的の塩基配列としては、上記本発明に係る癌マーカー塩基配列と同じものが挙げられ、中でも配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等が好ましく、配列番号２で示される塩基配列がより好ましい。
本発明に係る目的の塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部のメチル化率を測定する場合には、癌の判定に用いる-CG-配列のシトシンを適宜選定して、それらシトシンのメチル化率を測定すればよい。癌の判定に用いる-CG-配列のシトシンの組合せとしては、例えば図７における、丸７〜丸１６、丸７〜丸１７、丸８〜丸１６、丸８〜丸１７、丸１３〜丸１６、丸１３〜丸１７、丸７〜丸１０と丸１３〜丸１６の組合せ、丸７〜丸１０と丸１３〜丸１７の組合せ、丸８〜丸１０と丸１３〜丸１６の組合せ、丸８〜丸１０と丸１３〜丸１７の組合せ等が挙げられ、中でも丸８〜丸１７（配列番号２で示される塩基配列に相当）、丸１３〜丸１７（配列番号３で示される塩基配列に相当）等が好ましく、丸１３〜丸１７等が好ましい。上記丸８〜丸１７又は丸１３〜丸１７の-CG-配列のシトシンのメチル化を測定した場合、或いは、配列番号１で示される塩基配列の一部が配列番号２で示される塩基配列又は配列番号３で示される塩基配列である場合、本発明の癌化の判定方法においては、その塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンのメチル化率が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上で細胞が癌化されていると判定される。
【００２０】
本発明の癌化の判定方法は、具体的には、細胞由来のFOXB2遺伝子のゲノムDNAをバイサルファイト反応に付した後、本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAを取得する。その後、その塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの全部についてメチル化率を測定する、又は、その塩基配列内に存在する-CG-配列のシトシンの一部を上記の如く選定し、選定したシトシンのメチル化率を測定する。その後、得られたメチル化率に基づいて細胞の癌化を判定することによりなされる。
【００２１】
［ゲノムDNAの取得］
上記本発明の癌化の判定方法において、細胞由来のFOXB2遺伝子のゲノムDNAは、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載のアルカリSDS法等公知のDNA抽出方法により、或いは、市販のゲノムDNAの抽出キットを用いて目的の細胞から抽出することにより、得ることができる。目的の細胞としては、判定する癌に応じて適宜選択されればよい。該細胞は、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものが特に好ましい。また、上記細胞は、培養細胞であっても哺乳動物等から採取した細胞であってもよく、採取した細胞は、直接採取した細胞であっても血液等の体液中から採取した細胞であってもよい。
【００２２】
［バイサルファイト反応］
上記本発明の癌化の判定方法におけるバイサルファイト反応としては、自体公知のバイサルファイト法に準じてなされればよく、具体的には、例えば上記で得られたゲノムDNAを一本鎖化処理に付し、亜硫酸塩と反応させてシトシンをスルホン酸化した後、スルホン酸化したシトシンを加水分解させ、更に、アルカリ存在下で脱スルホン酸化させることによりなされる。該反応によれば、メチル化シトシンは反応せずそのままであり、非メチル化シトシンのみがウラシルに変換される。
【００２３】
上記バイサルファイト反応においては、WO2013/089063に記載の下記一般式［１］〜［８］で示される化合物の少なくとも１種の存在下でバイサルファイト反応を行ってもよい。その場合のこれら化合物中の置換基（R1〜R39）の具体例、化合物の具体例、化合物の使用量、その使用方法等については、WO2013/089063の記載に準じて設定・実施されればよい。  
【００２４】
一般式［１］で示される化合物
2016027794.tif 000002
（式中、R1〜R6は、それぞれ独立して、水素又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜３の整数を表す）、
【００２５】
一般式［２］で示される化合物
2016027794.tif 000003
（式中、Yは、炭素原子、酸素原子又は窒素原子を表し、R7〜R12は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、kは0〜2の整数を表すが、Yが酸素原子の場合は0を、Yが窒素原子の場合は１を、Yが炭素原子の場合は２を表す。）
【００２６】
一般式［３］で示される化合物
2016027794.tif 000004
（式中、R13〜R15は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す）、
【００２７】
一般式［４］で示される化合物
2016027794.tif 000005
（式中、R17及びR19は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、R16、R18及びR20は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数２〜６のジアルキルアミノ基を表し、R16とR17は、R16の隣の炭素原子、R17の隣の炭素原子と共にベンゼン環を形成してもよい。）、
【００２８】
一般式［５］で示される化合物
2016027794.tif 000006
（式中、R21及びR22はそれぞれ独立して炭素数１〜６のアルキル基を表し、X1はカウンターアニオンを表す）、
【００２９】
一般式［６］で示される化合物
2016027794.tif 000007
（式中、R23は炭素数１〜６のアルキル基を表し、R24〜R28は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、X2はカウンターアニオンを表す）、
【００３０】
一般式［７］で示される化合物
2016027794.tif 000008
（式中、R29〜R34は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す）
一  
【００３１】
般式［８］で示される化合物
2016027794.tif 000009
［式中、Zは窒素原子又は炭素原子を表し、mは０又は１の整数を表し、Zが窒素原子の場合は０を表し、Zが炭素原子の場合は１を表す。R35〜R39はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜６のアルキル基を表す］。
【００３２】
上記バイサルファイト反応におけるゲノムDNAは、ゲノムDNAを溶解した溶液で供されればよく、該溶液としては、例えばpH6〜8の、MES、HEPES等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、滅菌水等に溶解したもの等が挙げられ、中でも滅菌水に溶解したものが好ましい。該溶液中のDNA量は特に限定はされないが、通常溶液1〜10μL中に10〜100ngである。
【００３３】
バイサルファイト反応におけるゲノムDNAの一本鎖化処理は、自体公知の一本鎖化処理により行えばよい。例えば通常80〜100℃で、好ましくは85〜95℃で通常30秒〜10分、好ましくは1〜3分間加熱することによりなされる熱処理や、例えばDNAをアルカリに接触させることによりなされるアルカリ処理等が挙げられるが、熱処理が好ましい。特に、一般式［１］〜［８］で示される化合物の存在下でバイサルファイト反応を行う場合、反応温度を80〜100℃にしてもDNAが分解することなく反応を進めることができるため、ゲノムDNAを80〜100℃でバイサルファイト反応に付し、一本鎖化処理とバイサルファイト反応を同時に進めてもよく、処理が簡素化されるため、一本鎖化処理を行う場合該方法がより好ましい。
【００３４】
上記アルカリ処理としては、具体的には例えばアルカリ又はその水溶液を上記ゲノムDNA又はゲノムDNAを含む溶液に添加して溶液を通常pH10〜14、好ましくは12〜14のアルカリ性にすることによりなされる。該アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、アンモニア、アミン類が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、これらの中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００３５】
上記バイサルファイト反応において、DNAと亜硫酸塩の反応における亜硫酸塩としては、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸アンモニウム等が挙げられ、亜硫酸水素ナトリウムが好ましい。その使用量は、通常DNA50〜500ngを含む1〜500μLの溶液に対して反応液中の終濃度が1〜6mol／Lとなるように添加される。該DNAと亜硫酸塩との反応は、通常30〜100℃、好ましくは50〜100℃、より好ましくは80〜95℃で、通常60分〜20時間、好ましくは60分〜5時間、より好ましくは60〜120分反応させることによりなされる。該反応により、シトシンがスルホン酸化される。
【００３６】
上記バイサルファイト反応におけるスルホン酸化したシトシンの加水分解は、通常この分野でなされている方法であれば特に限定はされないが、通常30〜100℃、好ましくは80〜95℃で、通常60分〜20時間、好ましくは60分〜5時間、より好ましくは60〜120分加熱することによりなされる。尚、該加水分解処理は、上記DNAと亜硫酸塩の反応と同時に進めてもよい。その場合には、DNAと亜硫酸塩の反応における反応温度及び反応時間を、スルホン酸化したシトシンの加水分解条件に合わせて設定すればよい。
【００３７】
上記加水分解を行ったDNAについては、脱スルホン酸化処理をする前に、精製処理に付すのが好ましい。該精製処理は、バイサルファイト反応において用いられる高濃度の亜硫酸塩等を取り除くことを目的としてなされるものであり、通常この分野でなされるDNAの精製方法に準じてなされればよい。具体的には、例えばDNA又はDNAを含む溶液に、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム等のカオトロピック剤を添加し、それを、HPLC法等により分離精製する方法や、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出精製、アルコール沈殿法、シリカゲルを充填したカラムによる精製、フィルターろ過法等が挙げられ、中でもアルコール沈殿法が好ましい。該アルコール沈殿法としては、具体的には以下のようになされる。
【００３８】
即ち、加水分解処理後のDNAを含む溶液10μLに対して、通常アルコール40〜110μL、緩衝液30〜100μLを添加し、遠心分離を行う。遠心分離後、上清を除去しアルコールで洗浄することにより、DNAを分離精製することができる。上記アルコール及び緩衝液添加の際、分離後の上清の除去を容易にするために、DNAを含む溶液10μLに対して0.1〜1μLのエタチンメイトやグリコーゲンを添加してもよい。上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられるが、イソプロパノールが特に好ましい。イソプロパノールを用いると、DNAのみを効率よく沈殿させることができ、効率よく反応を進めることが可能となる。上記緩衝液としては、例えばMES、HEPES等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられ、中でも、MES、HEPES等のグッド緩衝液、トリス緩衝液等が好ましく、トリス緩衝液が特に好ましい。これら緩衝液のpHは、通常7〜8、好ましくは7〜7.5であり、緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常0.1〜5 mol／L、好ましくは0.1〜2 mol／Lの範囲である。上記遠心分離は、通常この分野でなされる態様であれば特に限定されないが、通常12,000〜22,000gで10〜30分間なされる。
【００３９】
上記バイサルファイト反応中のアルカリ存在下での脱スルホン酸化反応としては、上記一本鎖化処理の項のアルカリ処理と同じ方法が挙げられ、その好ましい態様も同じものが挙げられる。具体的には、例えば以下の如くなされればよい。
即ち、加水分解処理後の溶液又は加水分解処理後精製処理に付した溶液10μLに対して、0.5〜3mol／Lのアルカリ水溶液を通常1〜10μL、好ましくは1〜5μL添加して、反応溶液のpHを11〜14、好ましくは12〜14にし、通常5〜60分間、好ましくは5〜30分間、通常25〜70℃、好ましくは30〜50℃で加温することにより脱スルホン酸化反応を行う。
【００４０】
上記バイサルファイト反応の好ましい具体例を以下に説明する。
即ち、例えば、DNA抽出キット等を用いて目的の細胞からDNAを抽出し、DNA 1μｇを例えば滅菌水5〜15μLに溶解する。該溶液3〜5μLに、例えば2〜5mol／Lの亜硫酸水素ナトリウム（pH5.0〜7.0）50〜100μL、及び、一般式［１］〜［８］で示される化合物が液体の場合には、反応溶液中の濃度が3〜10%となるように、一般式［１］〜［８］で示される化合物が固体の場合には、反応溶液中の濃度が1〜1000mmol／Lとなるように、一般式［１］〜［８］で示される化合物又はそれらを含有する水溶液1〜12μLを添加して、80〜100℃で60〜120分間加熱する。該反応により、ゲノムDNAは一本鎖DNAになり、該一本鎖DNA中のシトシンをスルホン酸化すると同時にスルホン酸化されたシトシンを加水分解することができる。次いで、1mol／L トリス緩衝液（pH7.0〜8.0）及びイソプロパノールを、40：60〜60：40、好ましくは40：60〜50：50の割合でそれぞれ加水分解後の溶液の5〜10倍量添加し、加水分解後のDNAを沈殿させる。この際、エタチンメイトやグリコーゲンを1〜3μL添加するとDNA沈殿の確認が容易となる。その後、12,000〜20,000gで10〜20分間遠心分離し、上清を取り除き、得られたDNAをエタノールで洗浄する。これにより、加水分解後のDNAを抽出精製することができる。更に、得られたDNA 1μｇを例えば滅菌水30〜40μLに溶解し、該溶液に、1〜3mol／Lの水酸化ナトリウム5〜20μLを添加し、30〜40℃で20〜60分間反応させ、脱スルホン酸化する。その後、要すれば、例えば市販のキット等を用いて低分子量のDNAを取り除き精製する。これにより、本発明に係るバイサルファイト反応が完了し、ゲノムDNA中の非メチル化シトシンが効率よくウラシルに変換されたDNA（以下、ウラシル化DNAと略記する場合がある）が得られる。
【００４１】
［本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAの取得］
バイサルファイト反応に付したゲノムDNAから、本発明に係る目的の塩基配列（配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる塩基配列）を有するDNAを取得する方法としては、上記ウラシル化DNAを、本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAを増幅するように設計されたプライマーを用いてPCR反応に付すことによりなされ、該方法により、非メチル化シトシンがウラシルに変換された、目的の塩基配列を有するDNAの増幅物を得ることができる。
【００４２】
上記PCR反応は、自体公知の方法例えばNucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134−1137に記載の方法に準じて行えばよいが、具体的には以下のようになされる。即ち、鋳型となるウラシル化DNAの核酸量1〜100ngに、２種のプライマーをそれぞれ通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、DNAポリメラーゼを通常1〜10 Units、好ましくは2.5〜5Units、並びに４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）を通常0.01〜20μmol、好ましくは、0.01〜10μmol添加し、pH7〜9のトライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば（1）93〜98℃、1〜10分→（2）93〜98℃、10〜30秒→（3）50〜60℃、10〜30秒→（4）68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして20〜40サイクル行うことにより、ウラシル化DNAを増幅して得ることができる。尚、用いられるDNAポリメラーゼに応じて、上記サイクルの実施後に、3’アデニン付加のために68〜72℃で１〜５分間の加熱を行ってもよい。
【００４３】
上記PCR反応においては、反応後、通常この分野で用いられている精製方法、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により得られたDNAを精製するのが好ましい。また、上記精製の後、目的の塩基対（bp）を有するDNAを抽出するのがより好ましい。該抽出方法としては、自体公知の方法、例えばアガロースゲル電気泳動を用いる方法、液体クロマトグラフィー法を用いる方法や増補版ラボマニュアル遺伝子工学,1990,27−28に記載のポリアクリルアミドゲル等の電気泳動を用いた方法等が挙げられる。また、上記の如きPCR反応により得たDNA（PCR産物）については、より多くの量を得るため、更に同様の条件でPCR反応に付してもよい。
【００４４】
上記PCR反応における２種のプライマーとしては、本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAを増幅するように設計されたものであればよい。そのヌクレオチド数は通常20〜45、好ましくは22〜40、より好ましくは25〜35である。２種のプライマーの具体例としては例えば、例えば以下のものが挙げられる。
【００４５】
フォワードプライマー
GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG（配列番号４）
GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG（配列番号５）
リバースプライマー
CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC（配列番号６）
CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC（配列番号７）
【００４６】
上記PCR反応におけるDNAポリメラーゼとしては、通常この分野で用いられるDNAポリメラーゼであれば何れでもよいが、5’→3’ポリメラーゼ活性を有するものが好ましく、中でも、エキソヌクレアーゼ活性を有するが3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有さないものがより好ましい。具体的には、例えばKAPA2Gポリメラーゼ等の変異型Taq DNAポリメラーゼ、Taq DNA ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼが好ましく、中でもKAPA2Gポリメラーゼが特に好ましい。
【００４７】
上記PCR反応におけるdNTPsは、通常この分野で用いられる４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の混合物であれば特に限定はされない。
【００４８】
本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAの取得方法の好ましい具体例を以下に説明する。
即ち、まず、上記［バイサルファイト反応］の項で記載したように、ゲノムDNAを一本鎖化処理した後、バイサルファイト反応に付して、ウラシル化DNAを得る。その後、得られたウラシル化DNAを、本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAを増幅するように設計されたプライマーを用いたPCR反応に付す。具体的には、バイサルファイト反応により得られたウラシル化DNA 1〜100ngを含む溶液1〜3μLに、1〜10μmol／Lの増幅対象となるDNAのフォワードプライマー（例えばGTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG：配列番号５）5〜10μLと1〜10μmol／Lの増幅対象となるDNAのリバースプライマー（例えばCCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC：配列番号７）5〜10μL、1〜5mmol／Lの４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の混合溶液5〜10μL、並びに、1〜5UnitsのKAPA DNAポリメラーゼ 10〜20μLを添加して、例えば93〜98℃、1〜10分→93〜98℃、10〜30秒→50〜60℃、10〜30秒→68〜72℃、68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして20〜40サイクル行う。これにより、ウラシル化DNAが増幅され、非メチル化シトシンがウラシルに変換された本発明に係る目的の塩基配列を有するDNA（以下、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAと略記する場合がある）を得ることができる。
なお、後述のウラシル化された目的塩基配列を有するDNAをベクターに組み込む方法としてTAクローニング法を用いるために、DNAポリメラーゼの3’末端のアデニン付加活性を利用する場合、上記サイクル反応後、更に68〜72℃、30秒〜5分間反応させてもよい。次いで、該増幅されたDNAを例えばアガロースゲル又は未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、目的の鎖長のDNAを抽出する。尚、必要に応じて、得られたDNAを、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出等で精製してもよい。
【００４９】
［-CG-配列のシトシンのメチル化率の測定および癌化の判定方法］
-CG-配列のシトシンのメチル化率の測定は、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAをシークエンサー等による塩基配列解析に付した後、得られた塩基配列と正常の塩基配列とを比較し、本発明に係る目的の塩基配列の-CG-配列中のメチル化シトシン数を、或いは、本発明に係る目的の塩基配列中の特定のCG-配列のシトシンのメチル化数を測定し、その値を元にメチル化率を算出することによりなされる。癌化の判定方法においては、そのメチル化率が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上あれば、細胞が癌化されていると判定される。本発明に係る目的の塩基配列が配列番号２で示される塩基配列又は配列番号３で示される塩基配列である場合、或いは図７における、丸８〜丸１７又は丸１３〜丸１７の-CG-配列のシトシンのメチル化を測定した場合には、メチル化率が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上で細胞が癌化されていると判定することができ、より精度良く癌の判定をすることができる。
【００５０】
上記塩基配列解析としては、通常この分野でなされている塩基配列解析方法であれば特に限定されず、例えば、ラボマニュアル遺伝子工学、遺伝子工学ハンドブック等に記載の蛍光ダイターミネーター法、サンガー法等の常法に従ってなされればよい。具体的には、例えばウラシル化された目的塩基配列を有するDNAをベクターに組み込み、得られた組換えベクターをコンピテントセルに形質転換し、該コンピテントセルを培養し、そこからウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを含むプラスミドを抽出し、該プラスミドを用いて例えばシークエンサー等で解読することによりなされる。
【００５１】
上記ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAをベクターに組み込む方法としては、具体的には、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド等のベクター並びにウラシル化された目的塩基配列を有するDNAをT4DNAポリメラーゼ等で平滑末端化した後、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを、T4DNAリガーゼを用いてベクターに挿入する方法や、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAにアデニン（A）を付加し、該アデニンが付加されたウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを、T4DNAリガーゼを用いてチミン塩基が付加されているベクターに組み込むTAクローニング法等が挙げられる。中でも、挿入するDNAとベクター両者を制限酵素により切断する必要がなく簡便なTAクローニング法が好ましい。
【００５２】
該TAクローニング法としては具体的には例えば以下の如くなされる。即ち、PCR反応後のウラシル化された目的塩基配列を有するDNA 100ngに対してTaq DNAポリメラーゼ1〜5 Unitsを添加し、55〜75℃で10〜30分間反応させ、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAの3’末端にアデニンを付加させる。尚、PCR反応の際に3’末端のアデニン付加活性を有するDNAポリメラーゼを用いる場合は、上記アデニン付加工程の必要はない。また、該反応の際、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNA 100ngに対してdATP0.01〜20nmolを反応液中に添加してもよいが、PCR反応溶液をそのままTAクローニングに用いる場合には、dATPが残存しているため、dATPを添加する必要はない。また、アデニンが付加されたウラシル化された目的塩基配列を有するDNAについては、合成反応後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により得られたDNAを精製するのが好ましい。次いで、アデニンが付加されたウラシル化された目的塩基配列を有するDNA 10〜100ngに対して、チミン塩基が付加されている大腸菌形質転換用ベクター及びT4 DNAリガーゼ300〜3000 Unitsを付与して10〜40℃で30〜90分間反応させことにより、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを組み込んだ組換えベクターを得ることができる。
【００５３】
上記組換えベクターのコンピテントセルへの形質転換方法としては、例えば35〜45℃で20〜90秒加熱するヒートショック法や1.5〜2.5kVの電気パルスをかけるエレクトロポレーション法等が挙げられる。ここで用いられるコンピテントセルとしては、通常用いられる大腸菌や枯草菌等であれば何れでも用いることができ、その使用量は通常用いられる範囲内で適宜設定されればよい。
【００５４】
上記コンピテントセルの培養は、例えばアンピシリンを30〜150μg／ml含むＬＢ寒天培地やアンピシリンを30〜150μg／ml含むＭ９寒天培地等の培地上で30〜40℃で12〜20時間培養することによりなされる。尚、上記培地としては、微生物の栄養源となる炭素源、窒素源、無機塩類や生育因子としての酵母エキス等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。該炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。該窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、トリプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００５５】
培養したコンピテントセルからウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを含むプラスミドを抽出する方法としては、例えば、先ず、コロニーPCR法により、コロニー中のウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを含むプラスミド由来のDNAを増幅する。その後、目的のプラスミドがコロニー中で増幅しているかを例えば電気泳動法により確認し、目的のプラスミドの挿入が確認されたコロニーから目的のプラスミドを抽出することによりなされればよい。
【００５６】
該コロニーPCR法としては、例えば以下の如くなされる。即ち、培養したコロニーに、本発明に係る目的の塩基配列の検出のための2種のPCRプライマーそれぞれ通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）通常0.01〜20nmol、好ましくは、0.01〜10nmol、並びにDNAポリメラーゼ通常1〜10Units、好ましくは1〜5Units添加し、pH7〜9のトライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば（1）93〜98℃、1〜10分→（2）93〜98℃、10〜30秒→（3）50〜60℃、10〜30秒→（4）68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして25〜40サイクルの反応を行うことによりなされる。上記2種のプライマーとしては、目的のDNAを増幅できるように設計されたもの、即ち、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAの全部又は一部を含むもの、又は、挿入されているウラシル化された目的塩基配列を有するDNAの両端に位置するベクター由来の配列等が挙げられるが、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAの両端に位置するベクター由来の配列が好ましい。即ち、本発明のDNA増幅方法及び本発明のメチル化シトシン検出方法においては、非メチル化シトシンがウラシル化され、該ウラシルはPCR反応の時にチミンとして読まれるため、シトシンが全て非メチル化シトシンであった場合、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAは３塩基から構成されることとなる。そのため、効率よくPCR反応をするためには、４塩基で構成することができる、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAの両端に位置するベクター由来の配列が好ましい。上記プライマーのヌクレオチド数は通常12〜30、好ましくは15〜25、より好ましくは18〜22である。上記DNAポリメラーゼとしては例えば通常この分野で用いられるDNAポリメラーゼであれば何れでもよいが、具体的には、例えばTaq DNA ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼ等が挙げられ、中でもTaq DNA ポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼ等が好ましい。
【００５７】
上記コロニーPCR反応後になされる電気泳動法としては、通常この分野で用いられる、移動度により塩基数を求めることができるゲル電気泳動法であればいずれでもよいが、アガロースゲル電気泳動法が好ましい。尚、該電気泳動法における泳動条件については公知の方法に準じて適宜設定されればよい。
【００５８】
上記コロニー部からプラスミドを取り出す方法としては、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載の、振とう培養の後、アルカリSDS法等公知のプラスミド抽出方法によりプラスミドを抽出すればよい。尚、プラスミド抽出は、市販のキットを用いて行ってもよい。上記振とう培養における培地は、寒天を用いずに溶液とした以外は、コンピテントセルの培養の項に記載された培地と同じものを用いることができ、好ましい培養時間、培養温度についてもコンピテントセルの項で記載した範囲と同じである。
【００５９】
上記塩基配列解析により得た、バイサルファイト反応に付した塩基配列と、シトシンがメチル化されていない正常なDNAの塩基配列とを比較することにより、メチル化シトシンを検出することができる。即ち、本発明に係るバイサルファイト反応ではメチル化シトシン以外のシトシン（非メチル化シトシン）は全てウラシル化されるため、得られた塩基配列においてウラシル化されていないシトシンを見つけ出すことによってメチル化シトシンを検出することができる。本発明に係る目的の塩基配列の-CG-配列中のメチル化シトシンの数を、-CG-配列のシトシン数で除することにメチル化率は算出される。そのメチル化率が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上であれば、細胞は癌化されていると判定される。また、本発明に係る目的の塩基配列が配列番号２で示される塩基配列又は配列番号３で示される塩基配列である場合、或いは図７における、丸８〜丸１７又は丸１３〜丸１７の-CG-配列のシトシンのメチル化を測定した場合には、メチル化率が４０％、好ましくは５０％、より好ましくは６０％以上で癌化されていると判定することができ、より精度良く癌の判定をすることができる。
【００６０】
本発明の癌化の判定方法の好ましい例を以下に説明する。
【００６１】
即ち、まず、［バイサルファイト反応］及び［本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAの取得］の項で記載したように、ゲノムDNAを一本鎖化処理に付し、バイサルファイト反応、PCR反応の順に付して、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを得る。該ウラシル化された目的塩基配列を有するDNA 10〜100ngを含む1〜5μLの滅菌水等に、チミン塩基が付加されている10〜100ngの大腸菌形質転換用ベクター1〜3μL及び300〜3000 UnitsのT4 DNAリガーゼ1〜3μLを付与して10〜20℃で30〜240分間反応させ、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAを組み込んだ組換えベクターを得る。尚、PCR反応の際にアデニン付加活性を有さない、例えばα−DNAポリメラーゼを用いた場合には、ベクターに組み込む前に、ウラシル化された目的塩基配列を有するDNAにアデニンを付加する。該アデニン付加方法としては、例えば100ng〜1μｇの本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAを含むPCR反応溶液5〜10μLに1〜5 UnitsのTaq DNAポリメラーゼ0.5〜1μLを添加して55〜75℃で10〜30分間反応させ、本発明に係る目的の塩基配列を有するDNAの3’末端にアデニンを付加させることによりなされればよい。尚、アデニン反応後は、精製操作に付すのが好ましい。
組換えベクターを取得した後、得られた組換えベクター10〜100ngをコンピテントセル108〜109細胞に添加し、35〜45℃で20〜90秒加熱して形質転換を行う。更に、例えばアンピシリン30〜150μg／ml、トリプトンを1% （w／v）、酵母エキスを0.5% （w／v）、塩化ナトリウムを1% （w／v）含む寒天培地上で30〜40℃で12〜20時間培養する。次いで、得られた培養物をコロニーPCRに付す。具体的には、コロニーを溶解した滅菌水1〜10μLに、目的のDNAを増幅できるように設計された1〜10μmol／Lの2種のPCRプライマーそれぞれ1〜5μL、1〜5mmol／Lの４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）通常1〜5μL、並びに1〜5UnitsのTaq DNAポリメラーゼ0.5〜1μLを添加し、pH7〜9のトライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば（1）93〜98℃、1〜10分→（2）93〜98℃、10〜30秒→（3）50〜60℃、10〜30秒→（4）68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして30〜40サイクルの反応を行うことによりなされる。その後、アガロースゲル電気泳動法にて、コロニー中の目的のDNAの存在を確認し、確認できたコロニーを採取する。採取したコロニーを、LB培地で振とう培養した後、培養液から例えば市販のプラスミド抽出キット等を用いて目的のDNAを取り出し、シークエンサー等によりDNAの塩基配列を解読する。得られた塩基配列と、シトシンがメチル化されていない正常な塩基配列とを比較し、本発明に係る目的の塩基配列中の-CG-配列のシトシンのメチル化率を測定する。そのメチル化率より、細胞の癌化率を判定することができる。
【００６２】
以下に、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１  正常細胞中のFOXB2遺伝子のメチル化解析
（１）ゲノムDNAの抽出
下記５種類の細胞を用いて、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績）によりその現品説明書に従ってゲノムDNAを抽出した。
・ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（hiPS、Cell name : 201B7) 
・ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（HDF）
・ヒト正常肺由来線維芽細胞（WI-38）
・正常ヒト肺2倍体細胞（CCD-8Lu）
・正常ヒト胎児細胞（HE23）【００６４】
（２）バイサルファイト反応
（１）で得た５種類のゲノムDNA及び健常人全血からのゲノムDNAとしてHuman Genomic DNA（プロメガ社製）各400ngに蒸留水を加えて10μL水溶液を調製した。その後、EpiSight Bisulfite Conversion Kit（和光純薬工業(株)製）を用いて説明書に従ってそれぞれをバイサルファイト反応に付した。【００６５】
（３）FOXB2 プロモーター領域の増幅（PCR反応）
（２）で得たバイサルファイト反応産物 1μLそれぞれに、蒸留水17.3μL、10×Buffer for Blend Taq（東洋紡）2.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡）2μL、Blend Taq-Plus（東洋紡）0.2μL（0.5Ｕ）、Forward primer（10μM）1μL、及びReverse primer（10μM）1μLを加えて混合し、反応溶液とした。
各Primerの塩基配列は下記の通りである。これらによる増幅鎖長 は、493bpである。
Forward primer : GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG（配列番号４）
Reverse primer : CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC（配列番号６）
上記反応溶液それぞれをサーマルサイクラーにセットし下記条件で反応を行った。
94℃ 2分間
94℃ 20秒間→55℃ 20秒間→72℃ 30秒間を1サイクルとして36サイクル
72℃ 2分間
次いで、PCR増幅産物25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（(株)ニッポンジーン製）5μLを加えて混合し、混合物を1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、GelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）で染色し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて現品説明書に従ってPCR増幅産物を回収した。【００６６】
（４）PCR増幅産物に制限酵素認識部位を付加するためのPCR反応
（３）で得たPCR増幅産物1μLそれぞれに、蒸留水17.3μL、10×Buffer for Blend Taq（東洋紡）2.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡）2μL、Blend Taq-Plus（東洋紡）0.2μL（0.5Ｕ）、Forward primer（10μM）1μL、及びReverse primer（10μM）1μLを加えて混合した。
Forward primerは、上記のPCR Forward primerに制限酵素認識部位（HindIII：配列中の下線部）を付加した下記配列のものを、Reverse Primerは、上記のPCR Reverse primerに制限酵素認識部位（BamHＩ：配列中の下線部）を付加した下記配列のものを用いた。
Forward primer : TTACCATAAGCTTGGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG（配列番号８）
Reverse primer : TAATTAAGGATCCCCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC（配列番号９）
上記反応溶液それぞれをサーマルサイクラーにセットし下記条件で反応を行った。
94℃ 2分間
94℃ 20秒間→55℃ 20秒間→72℃ 30秒間を1サイクルとして10サイクル
72℃ 2分間
次いで、PCR増幅産物25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（(株)ニッポンジーン製）5μLを加えて混合し、混合物を1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、GelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）で染色し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）にて現品説明書に従ってPCR増幅産物を回収した。【００６７】
（５）制限酵素処理
（４）で得たPCR増幅産物43μLそれぞれに、10×B Buffer（(株)ニッポンジーン製）5μL、HindIII（(株)ニッポンジーン製）1μL、及びBamHＩ（(株)ニッポンジーン製）1μLを加えて混合した後、37℃で1時間インキュベートした。同様にpUC19（(株)ニッポンジーン製）500ngに蒸留水を加えて43μLに調製し、更に、HindIII（(株)ニッポンジーン製）1μL、及びBamHＩ（(株)ニッポンジーン製）1μLを加えて混合した後、37℃で1時間インキュベートした。次いで、結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6（和光純薬工業(株)製））を250μL加えて混合した後、エコノスピン（(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（(株)ニッポンジーン製）、80%エタノール（和光純薬工業(株)製））を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に、12000×g、室温、1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5）（(株)ニッポンジーン製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離した。これにより、制限酵素処理したPCR増幅産物及びpUC19を回収した。【００６８】
（６）形質転換
制限酵素処理したPCR増幅産物1μLそれぞれに、制限酵素処理したpUC19、及びDNA Ligation Kit （Mighty Mix）（タカラバイオ(株)製）2μLを加えて混合し、16℃で1時間インキュベートした。次いで、全量を4μLをECOSTM Competent E. coli  DH5α（(株)ニッポンジーン製）に形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加LB培地で37℃で16時間培養した。更に、プラスミドキットS II（倉敷紡績）を用いて現品説明書に従ってプラスミド抽出を行った。
得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ（株）のシーケンス受託サービスにて塩基配列を解析した。【００６９】
塩基配列解読結果に基づき、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの何れであるかを表した図を、図１〜６に示す。尚、図中の○は、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化のものであることを、●は、CpGジヌクレオチドのシトシンがメチル化されているものであることを表す。
図面と用いた細胞又は全血との関係を、下記表１に示す。【００７０】
【表１】
2016027794.tif 000010
【００７１】
また、図１〜６中の丸数字のシトシンの位置を、図７記載のFOXB2 プロモーター領域の塩基配列（PCR増幅領域、GenBank Accession No. AL353637 : 106566-107058：配列番号１０）中に記載する。【００７２】
図１〜６の結果を元に算出した、配列番号２の範囲（図中の丸8-丸17）に相当するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率と、配列番号１の範囲（図中の丸6-丸21）に相当するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率は、実施例２の結果と併せて表３に示す。【００７３】
実施例２  癌細胞中のFOXB2遺伝子のメチル化解析
下記表２中の２５種類の癌細胞を用いて、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績）によりその現品説明書に従ってゲノムDNAを抽出した。その後の処理については、実施例１の（２）〜（６）記載の方法と同様にして行い、各種癌細胞のFOXB2遺伝子の塩基配列を解析した。
塩基配列解読結果に基づき、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの何れであるかを表した図をそれぞれ図８〜３２に示す。尚、図中の丸数字のシトシンの位置は、図７に記載されている通りである。また、○は、CpGジヌクレオチドのシトシンが非メチル化のものであることを、●は、CpGジヌクレオチドのシトシンがメチル化されているものであることを表す。
図面と用いた細胞の関係を、下記表２に示す。【００７４】
【表２】
2016027794.tif 000011
【００７５】
図８〜３２の結果を元に算出した、配列番号２の範囲（図7中の丸8-丸17）に相当するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率と、配列番号１の範囲（図7中の丸6-丸21）に相当するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率を下記表３に、配列番号３の範囲（図7中の丸13-丸17）に相当するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率を下記表４に示す。【００７６】
【表３】
2016027794.tif 000012
【００７７】
【表４】
2016027794.tif 000013
【００７８】
上記実施例１の結果より、配列番号２又は配列番号３に存在するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率が20%以下であれば癌化していない正常細胞と判定することができ、また、配列番号１に存在するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率が15%以下であれば、癌化していない正常細胞と判定できることが分かった。即ち、メチル化率が30％以上の場合には、細胞が癌化している可能性が高いと判定できることが分かった。【００７９】
また、実施例２の結果より、配列番号２又は配列番号３に存在するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率が60%以上であれば癌化している細胞と判定することができ、また、配列番号１に存在するCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率が50%以上であれば、癌化している細胞と判定できることが明らかとなった。よって、正常細胞でのシトシンのメチル化率が少なくとも20%以下であることを考慮すると、非常に高い精度で癌化を判定できることが分かった。
更に、２５種類の異なる細胞であっても、FOXB2遺伝子の同一の領域のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化率を測定することにより、それぞれの癌化を精度よく判定できることも分かった。即ち、本発明の方法によれば、癌の種類にかかわらず、癌の判定ができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の癌マーカーを用いれば、又は本発明の方法によれば、種々の細胞についての細胞の癌化の判定をすることができる。また、特定のCpGジヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化率を測定するため、精度よく細胞の癌化を判定することができる。即ち、癌の再発、転移の予防的な判定に利用することができる。
【図１】
2016027794.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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