(57)【要約】本発明は、留置後の内膜形成を促進し、内膜形成されるまでの間に抗血栓性を維持できる、長期開存可能な人工血管を提供することを目的としている。本発明は、極細繊維を含む繊維層の内側に、繊維径が１０ｎｍ以上３μｍ以下の極細繊維からなる極細繊維層を備える筒状織物であり、上記極細繊維には炭素数１０以下のアルキル基を有する第４級アンモニウム化ポリマーが共有結合され、上記第４級アンモニウム化ポリマーにはヘパリンがイオン結合され、生理食塩水により３７℃、３０分の条件で洗浄した後の残存ヘパリン活性が２０ｍＩＵ／ｃｍ２以上である、人工血管を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
極細繊維を含む繊維層の内側に、繊維径が１０ｎｍ以上３μｍ以下の極細繊維からなる極細繊維層を備える筒状織物であり、
前記極細繊維には炭素数１０以下のアルキル基を有する第４級アンモニウム化ポリマーが共有結合され、
前記第４級アンモニウム化ポリマーにはヘパリンがイオン結合され、
生理食塩水により３７℃、３０分の条件で洗浄した後の残存ヘパリン活性が２０ｍＩＵ／ｃｍ２以上である、人工血管。
【請求項２】
繊維表面に結合したカチオン量は、１μｇ／ｃｍ２以上である、請求項１記載の人工血管。
【請求項３】
１２０ｍｍＨｇにおける透水性能は、１００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以上、４０００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ未満である、請求項１又は２記載の人工血管。
【請求項４】
前記繊維層は、前記極細繊維と、総繊度が１〜６０デシテックスのマルチフィラメントと、からなる、請求項１〜３のいずれか一項記載の人工血管。
【請求項５】
前記マルチフィラメントを構成する単糸の繊度は、０．５〜１０．０デシテックスである、請求項４記載の人工血管。
【請求項６】
血小板付着率が２０％未満である、請求項１〜５のいずれか一項記載の人工血管。
【請求項７】
前記筒状織物は、ポリエステル繊維からなる、請求項１〜６のいずれか一項記載の人工血管。
【請求項８】
前記筒状織物の内径は、１ｍｍ以上１０ｍｍ未満である、請求項１〜７のいずれか一項記載の人工血管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷等を受けた血管の再建、修復又は代替に使用される人工血管に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化やメタボリックシンドロームの人口増加によって、動脈硬化を煩う患者の数が増加している。動脈硬化は動脈壁の異常であり、血液の高血糖状態や高脂質状態が血管壁を変性させ、血管壁が脆弱になったり、肥厚したり、あるいは石灰化して硬く脆くなる。このような血管の変性は体中の血管のいたる所で起こるが、特に末梢の血管ではその影響が著しい。【０００３】
このような変性した血管の治療には、従来からカテーテルを使ったバルーン拡張術やステント留置術などの低侵襲な血管内治療が行われているほか、損傷した血管を自己の血管又は人工血管で置換する外科手術が行われている。【０００４】
しかしながら、人工血管を留置した際に生体はこれを異物として認識し、人工血管の血液接触面では血液凝固反応が進行して血栓が形成される。また、生体の血管は血液と接触する面に血管内皮細胞を有する内膜があり、血栓形成を阻害する役割を担っているが、留置された人工血管でも、血管内皮細胞が人工血管の血液接触面を被覆して内膜を形成する。しかしながら、この内膜が、内皮細胞に被覆されるまでの間、人工血管は異物として認識されるため、内膜が形成されるまで血栓形成を防ぐ手段が必要となる。特に、細径の人工血管が使用される部位は血流量が少ないため血栓が沈着しやすく、少量の血栓でも血管を塞ぎ易い。細径の人工血管は長期的な成績が良好でなく臨床使用できるものが無いのが現状である。【０００５】
これらの問題を解決するため、従来から早期の内膜形成と抗血栓性の付与が、人工血管の開発において重要なポイントであった。【０００６】
内膜形成を促進する方法として、細胞の増殖因子や誘導因子を人工血管に担持させるほかに、人工血管そのものの構造素材としてポリエステルなどの繊維の織物、編物あるいは不織布が使用されてきた。とりわけ１０ミクロン未満の極細繊維を含有させた場合には、極細繊維のサイズあるいは繊維間隙のサイズが細胞の増殖や浸潤に適していることが知られている（特許文献１、２、３）。更に極細繊維は血小板の付着も促し、留置した際に血管壁から血液が漏れるのを防止する効果もあることが知られている（特許文献４）。【０００７】
また、人工血管に抗血栓性を付与する方法としては、従来からヘパリンを担持する方法が行われてきた。繊維自体にはヘパリンを担持する能力がないので、十分なヘパリンを担持させるための方法として、繊維間隙にヘパリンを含んだ、生分解性ポリマーやゼラチンなどからなるゲルを充填させる方法や（特許文献５）、ヘパリンを共有結合で繊維表面に固定する方法（特許文献６）が知られている。【０００８】
その他に、ヘパリンがイオン的に負電荷を帯びることから、正電荷を帯びる物質とイオン結合させることによって医療基材表面に担持させる方法が知られている。このような基材を体液や水溶液中に入れると、ヘパリンは時間と共に放出される。放出速度を制御することによって、抗血栓性が制御できることから、様々な正電荷物質との組み合わせが検討されてきた。第４級アンモニウム化合物とイオン複合体を形成させて表面に塗布する方法、（特許文献７）、３級アミノ基を含むポリマーを塗布して、該アミノ基を第４級アンモニウム化してヘパリンをイオン結合させる方法（特許文献８）、ポリカチオンであるポリエチレンイミンを結合した基材表面にヘパリンをイオン結合させる方法（特許文献９、１０）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第１８７５９９１号公報
【特許文献２】特許第１８７０６８８号公報
【特許文献３】特許第１３３８０１１号公報
【特許文献４】特許第４６２７９７８号公報
【特許文献５】特許第３７９９６２６号公報
【特許文献６】特表第２００９−５４５３３３号公報
【特許文献７】特許第４２７３９６５号公報
【特許文献８】特許第３３４１５０３号公報
【特許文献９】ＷＯ００／１３７１９号公報
【特許文献１０】特開平０８−３３６５８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献５に記載の人工血管のように、繊維間隙を充填してしまう場合、細胞浸潤が妨げられて内膜が遅れるだけでなく、ゼラチンなどに血小板が付着して血栓形成を却って助長してしまうという問題がある。また、特許文献６に記載の人工血管のように、ヘパリンを共有結合で繊維表面に固定する場合、ヘパリンの分子量が大きい故に、表面に結合できる量には限度があり、長期的な効果がないという問題がある。【００１１】
また、特許文献７に記載されるように、第４級アンモニウム低分子化合物とイオン複合体を形成させ、有機溶媒に溶かして基材表面に塗布する方法では、イオン複合体を溶解でき、更に塗布される基材を溶解しない溶媒を選ばなければならず溶媒が限定されるだけでなく、塗布して乾燥する間に、イオン複合体の中の親水性の高い部分が有機溶媒を避けて互いに凝集して相分離を引き起こし、均一に塗布できず、ヘパリン放出が制御できないという問題がある。また、第４級アンモニウム低分子化合物と基材表面との間が結合されていないために、第４級アンモニウム自体も基材から剥がれ、ヘパリン放出が制御できない理由となっている。特許文献８に記載されるように、３級アミノ基を含むポリマーを塗布して、該アミノ基を第４級アンモニウム化してヘパリンをイオン結合させる方法では、必要量のヘパリンを担持させるためには分厚いコーティングが必要となり、本発明にあるような微細な構造が要求される基材に塗布した場合には微細構造が埋もれてしまい、細胞との親和性が著しく劣化するという欠点がある。また、基材表面との間に結合がないため、強固に密着させたい場合には基材も溶かして相溶できるような溶媒を選ばなければならず溶媒が限定される。ポリエステルやポリテトラフルオロエチレンなど、人工血管に使用される基材を溶解する溶媒は極めて少ないため、一般的な溶媒を用いて特許文献８の処理を施すと直ぐに剥がれてしまい、ヒトに用いるには安全上の問題がある。【００１２】
さらに、特許文献９、１０に記載されるように、ポリカチオンであるポリエチレンイミンを結合した基材表面にヘパリンをイオン結合させる方法では、ポリエチレンイミンに含まれる１級から３級のアミノ基は弱塩基性であるが故に、ヘパリンとイオン結合させる水溶液中では一部のアミノ基は正に帯電しておらず、ヘパリンとのイオン相互作用が弱くなるため、ヘパリンの担持量に限界がある。【００１３】
このように、従来の技術を使ったとしても、従来の人工血管は、細胞親和性と抗血栓性との両立が達成されておらず、特に、臨床で長期使用に耐えうる細径の人工血管は未だに世の中に無い。【００１４】
そこで本発明は、留置後の内膜形成を促進し、内膜形成されるまでの間に抗血栓性を維持できる、長期開存可能な人工血管を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、極細繊維に第４級アンモニウム化ポリマーを結合させ、さらに第４級アンモニウム化ポリマーにヘパリンをイオン結合させることによって、極細繊維からなる微細な構造を保持したまま抗血栓性を付与できること、すなわち細胞親和性と抗血栓性の両立が実現できることを見出した。【００１６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）の人工血管を提供するものである。
（１）極細繊維を含む繊維層の内側に、繊維径が１０ｎｍ以上３μｍ以下の極細繊維からなる極細繊維層を備える筒状織物であり、上記極細繊維には炭素数１０以下のアルキル基を有する第４級アンモニウム化ポリマーが共有結合され、前記第４級アンモニウム化ポリマーにはヘパリンがイオン結合され、生理食塩水により３７℃、３０分の条件で洗浄した後の残存ヘパリン活性が２０ｍＩＵ／ｃｍ２以上である、人工血管。
（２）繊維表面に結合したカチオン量は、１μｇ／ｃｍ２以上である、（１）記載の人工血管。
（３）１２０ｍｍＨｇにおける透水性能は、１００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以上、４０００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ未満である、（１）又は（２）記載の人工血管。
（４）上記繊維層は、上記極細繊維と、総繊度が１〜６０デシテックスのマルチフィラメントと、からなる、（１）〜（３）のいずれか記載の人工血管。
（５）上記マルチフィラメントを構成する単糸の繊度は、０．５〜１０．０デシテックスである、（４）記載の人工血管。
（６）血小板付着率が２０％未満である、（１）〜（５）のいずれか記載の人工血管。
（７）上記筒状織物は、ポリエステル繊維からなる、（１）〜（６）のいずれか記載の人工血管。
（８）上記筒状織物の内径は、１ｍｍ以上１０ｍｍ未満である、（１）〜（７）のいずれか記載の人工血管。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、留置後の内膜形成を促進し、内膜形成されるまでの間に抗血栓性を維持できる、長期開存可能な人工血管を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の人工血管の繊維構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明でいう極細繊維とは、繊維径が１０ｎｍ以上３μｍ以下の繊維を指す。極細繊維を用いた人工血管は、繊維が極細であるが故に生体細胞が付着するに適した足場の数が著しく増大し、細胞の浸潤にも優れ、内膜形成が極めて早期にかつ良好に行われるだけでなく、血液の漏出も著しく低いという特徴がある。
【００２０】
極細繊維のみでは血圧や組織の動きに追従できる強度が発揮できないため、本発明の人工血管の繊維構造は、図１に示すように、太い繊維で構成された粗い織目、編目等で形成された基本組織の空隙に極細繊維１が散在する繊維層２と、繊維層２の内側に極細繊維１からなる極細繊維層３を備えた繊維構造となっている。本発明の人工血管は、この繊維構造を筒状にすることで形成されている。
【００２１】
粗い織目、編目等による筒状の基本組織の空隙に極細繊維が散在する繊維構造を形成する製法として、一般的な極細繊維の製法を採用することができ、基本組織の強度に適したサイズの繊維と共に、海島構造等を有する多成分系繊維を用いて織り、編み、組紐や不織布等に加工した後、アルカリなどを用いて多成分系繊維内の一部の繊維の海構造を溶解することで、極細化処理して基布中の極細繊維及び極細繊維層を作ることが好ましい。
【００２２】
さらに、極細化処理を行った後に、ウォータージェットやエアジェットなどで、基本組織に極細繊維を交絡させることによってより細胞にとって好ましい間隙構造が達成される。また、細胞親和性をより効果的に発揮する手段として、例えばヤスリ棒で血液接触面をこすって毛羽立たせる方法によって、血液接触面に極細繊維層を形成させることができる。
【００２３】
繊維素材としては、生体適合性を有するポリマーであれば特に限定されるものではない。例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリアミド、ナイロン等を用いることができる。これらの繊維素材の中でも、従来より人工血管の素材として臨床使用され、強度に優れる点でポリエステル、特にポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００２４】
繊維の形態としては、紡績糸、マルチフィラメント糸、モノフィラメント糸、フィルム割繊糸といった如何なる形態でもよいが、強度や物性の均一性、及び柔軟性から、マルチフィラメント糸が優れている。また、無撚りであってもよいが、撚糸であっても問題は無い。ある程度のケン縮加工が施されていてもよい。
【００２５】
繊維の総繊度は１〜６０デシテックス（Ｄｔｅｘ）であることが好ましく、１〜４０デシテックスであることがより好ましい。総繊度の下限はより好ましくは５デシテックス以上であり、最も好ましくは１０デシテックス以上である。総繊度の上限はより好ましくは３５デシテックス以下であり、最も好ましくは２５デシテックス以下である。１デシテックス以上であれば、人工血管の基本構造に必要な強力を維持することができ、４０デシテックス以下であれば、人工血管の基本構造の厚みを低減することができる。
【００２６】
繊維の単糸繊度は０．５〜１０デシテックス（Ｄｔｅｘ）であることが好ましく、０．５〜３．０デシテックスであることがより好ましい。単糸繊度の下限は好ましくは１デシテックス以上である。単糸繊度の上限は好ましくは２デシテックス以下である。３デシテックス以上であると、柔軟性が損なわれ、０．５デシテックス以下であると、加水分解速度が速く、強度劣化の問題が生じる。
【００２７】
また、人工血管を形成する筒状織物において、布帛の形態は、寸法安定性と強度に優れる点で織物を用いる。
【００２８】
また、繊維表面に固定化する第４級アンモニウム化ポリマーの量を拡大させるためには、上記布帛の一部に極細単糸繊度マルチフィラメント糸を配することも効果的で、この極細単糸繊度マルチフィラメント糸の単糸繊維直径は１０ｎｍ〜２０μｍであることが好ましく、１０ｎｍ〜３μｍであることがより好ましく、０．８〜１．２μｍであることが最も好ましい。
【００２９】
人工血管の繊維層及び極細繊維層における、繊維間隙のサイズと量は、１２０ｍｍＨｇの圧力下での透水性を指標として表すことができ、１００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以上４，０００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以下であることが好ましい。人工血管の血液接触面に安定した血管内皮細胞層を含む内膜が形成されるためには、それを下支えするための血管平滑筋や線維芽細胞を主体とする細胞層が重要であり、この細胞層中の細胞は、血管表面上を移動する血管内皮細胞と共に、繊維間隙を通って吻合部から内部へと侵入する。また、血管内皮細胞は吻合部から浸潤するだけでなく、人工血管外壁から繊維間隙を通して侵入してきた毛細血管が人工血管内壁で開通した部位からも浸潤する。
【００３０】
このことから、繊維間隙は、１００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以上であると、細胞や毛細血管が繊維層の内部に浸潤することによる内膜形成が起きやすくなるため好ましい。また、繊維間隙は、４，０００ｍＬ／ｃｍ２／ｍｉｎ以下であると、細胞の偽足が繊維層の内部に届きやすくなり、間隙を塞いで漏血を防止するようになるため好ましい。
【００３１】
本発明の人工血管のサイズは特に限定されるものではないが、内径が１ｍｍ以上、１０ｍｍ未満の細径の人工血管において最も効果的である。
【００３２】
本発明は、基本組織を構成する繊維及び極細繊維の表面に、炭素数１０以下のアルキル基を３つ有する第４級アンモニウム化ポリマーを結合させ、さらに第４級アンモニウム化ポリマーとヘパリンをイオン結合させることによって、細胞親和性と抗血栓性の両立を実現した。
【００３３】
ヘパリンは、血液凝固反応を阻害できるものであれば特に限定されず、臨床で一般的に広く使われているヘパリン、未分画ヘパリンや低分子量ヘパリンのほか、アンチトロンビンIIIに高親和性のヘパリンなども含まれる。
【００３４】
ヘパリンは分子量が３０，０００〜３５，０００ダルトンと大きな分子であるため、表面に固定化できる量には限度がある。ヘパリンよりも分子量の小さい低分子量ヘパリンも臨床使用されているが、低分子ヘパリンでさえも４，０００〜６，０００の分子量であり、合成抗トロンビン物質の分子量の約１０倍である。ヘパリンは、アンチトロンビンIIIおよびトロンビンと結合して初めてトロンビンの活性を阻害でき、アンチトロンビンIIIおよびトロンビンとの結合部位が分子内に別々に存在するため、これらの結合サイトを最適な配置で表面に固定化するのは極めて制御が難しく、表面固定化の反応効率が悪い原因にもなっている。従って、本発明は、繊維の表面に第４級アンモニウムポリマーを結合させ、ヘパリンを第４級アンモニウムポリマーにイオン結合させることで担持させている。
【００３５】
具体的には、ポリカチオンであるポリエチレンイミン、ポリアリルアミンやポリリジンなどのアミノ基を含有するポリマーを表面固定化して第４級アンモニウム化する方法、アミノ基を含有する重合可能なモノマーを表面にグラフト重合して第４級アンモニウム化する方法、あるいはポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドなどの第４級アンモニウムポリマーを繊維表面に固定化する方法が選ばれる。
【００３６】
アミノ基や第４級アンモニウムを含有するポリマーを繊維表面に固定化する方法は特に限定されず、ポリマー溶液を繊維表面にコーティングした後に溶媒を揮発させる方法以外の方法から選択される。繊維表面に反応性官能基を導入してから化学反応で固定化してもよいし、アミノ基や第４級アンモニウムを含有するポリマーの水溶液中に繊維を含浸させた状態でγ線、電子線などの高エネルギー線を照射する方法や、繊維をプラズマ処理した後にアミノ基や第４級アンモニウムを含有するポリマー溶液と接触させる方法などが好ましく用いられる。
【００３７】
使用するポリマーの分子量や化学構造は特に限定されないが、表面に多量の正電荷を導入する目的においては、分子量が１，０００〜５０，０００の低分子量のポリマーや、５０，０００よりも大きな高分子量でも枝分かれ構造を有するポリマーが好ましい。
【００３８】
繊維表面に固定化されたアミノ基含有ポリマーを第４級アンモニウム化する方法としては、臭化アルキルなどのハロアルキル化合物が溶存する溶液中で反応させる方法が最も好ましい。
【００３９】
第４級アンモニウムポリマーが有するアルキル基の炭素数は、多すぎると疎水性が高くなってカチオン基にヘパリンが結合できなくなることから、１つのアルキル基あたり１０以下が好ましく、ヘパリン結合性や第４級アンモニウム化反応時の取扱性の点から、２〜６が最も好ましい。第４級アンモニウムを構成する３つのアルキル基は全て同じ炭素数である必要はなく、異なっていてもよい。
【００４０】
表面を第４級アンモニウム化した繊維にヘパリンを結合させる方法は、ヘパリンの水溶液中に繊維を含浸させる方法が好ましい。水溶液の温度、時間、ｐＨなどが適宜選択できる。
【００４１】
本発明の人工血管が有する抗血栓性及び細胞親和性について、透水性、洗浄後の繊維表面の残存ヘパリン活性、繊維表面のカチオン量、血小板接着率、細胞接着率及び血栓付着の測定を用いて示す。
＜透水性＞
【００４２】
人工血管から無作為に２箇所をサンプリングし、各サンプルに対し下記方法で２回測定して、その相加平均を求める。人工血管を軸方向に沿って切り裂き、１ｃｍ角のサンプル断片を作成する。直径０．５ｃｍの打ち抜きをした直径４ｃｍのドーナッツ状パッキン２枚で、打ち抜き部分以外に通液のないよう、１ｃｍ角の織物試料を挟む。これを円形ろ過フィルター用ハウジングに収納する。この円形ろ過フィルターに温度２５℃の逆浸透膜ろ過水をサンプル断片が十分含水するまで２分以上通液する。温度２５℃、ろ過差圧１２０ｍｍＨｇの条件下で、逆浸透膜ろ過水の外圧全ろ過を３０秒間行い、直径１ｃｍの部分を透過する水の透過量（ｍＬ）を測定する。透過量は小数第１位を四捨五入して求める。その透過量（ｍＬ）を単位時間（ｍｉｎ）及びサンプル断片の有効面積（ｃｍ２）あたりの値に換算して、圧力１２０ｍｍＨｇにおける透水性能を測定する。
【００４３】
ヘパリン固定化後の人工血管について、繊維表面に結合したヘパリンの結合能は、以下の繊維表面の残存ヘパリン活性の測定方法により測定することができる。この繊維表面の残存ヘパリン活性について、残存ヘパリンの活性は高い程よく、２０ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることが好ましい。
＜繊維表面の残存ヘパリン活性測定方法＞
【００４４】
人工血管を軸方向に切り開き１ｃｍ角のサンプル断片を切り取る。断片を１０ｍＬの生理食塩水により３７℃、３０分の条件で洗浄する。洗浄したサンプルをテストチームヘパリンＳ（積水メディカル社）の操作手順に従って反応させ、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社、ＭＴＰ−３００）で測定して、キットの操作手順に従ってヘパリンの活性を算出する。
【００４５】
ヘパリン固定化後の人工血管について、繊維表面に結合したカチオン量は、以下の繊維表面のカチオン量測定方法により測定することができる。この繊維表面のカチオン量について、カチオン量は高い程よく、１μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。
＜繊維表面のカチオン量測定方法＞
【００４６】
人工血管を横断面方向に輪切りにしたリング状サンプル１ｇを元の血管の長軸方向０．１ｇずつ１０個の小片に分割し、サンプル１ｇ当たり１０ｍＬの生理食塩水で３７℃、２４時間の条件で抽出する。抽出後のサンプルをオレンジII（分子量：３５０．３３、和光純薬工業社）の酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３７℃、１時間染色した後、同バッファーと水でそれぞれ１０分洗浄する。サンプルを１ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液で３７℃、３０分処理してオレンジIIを抽出した後、抽出液を２１ｍＭ塩酸で中和し、４８２ｎｍと５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社、ＭＴＰ−３００）で測定し、４８０ｎｍの吸光度から、５５０ｎｍの吸光度を差し引く。別に作成した検量線を用いて、吸光度から結合したカチオンの量を定量する。
【００４７】
抗トロンビン活性物質固定化後の人工血管について、繊維表面の血小板付着率は、下記の繊維表面の血小板付着率測定方法により測定できる。この繊維表面の血小板付着率は低い程よく、２０％未満であることが好ましい。
＜繊維表面の血小板付着率測定方法＞
【００４８】
人工血管を軸方向に沿って切り裂き、打抜ポンチで直径１２ｍｍの円板サンプルを打ち抜く。細胞培養用の２４ウェル・マイクロプレート（住友ベークライト社）のウェルに血液接触面を上にして１枚入れ、上から肉厚３ｍｍの金属パイプ状錘を乗せる。別調整した多血小板血漿を、血小板数が１ウェル当たり１０８個程度になるように添加する。３７℃で２時間静置後、サンプルを取りだし、ＰＢＳ（−）（ニッスイ社）でリンスした後にＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社）に記載のプロトコール通りに、血小板を破壊して生成したＬＤＨの活性を測定する。別に作成した検量線から付着した血小板数を求める。以下の式１に示すように、サンプル断片に接触させる前の多血小板血漿の血小板数に対する、接触した血小板数の割合を求め、血小板付着率とする。
血小板付着率（％）＝（接触後の血小板付着数／多血小板血漿の血小板数）×１００・・・（式１）
＜細胞接着性＞
【００４９】
人工血管を軸方向に沿って切り裂き、打抜ポンチで直径１２ｍｍの円板サンプルを打ち抜く。細胞培養用の２４ウェル・マイクロプレート（住友ベークライト社）のウェルに１枚入れ、上から肉厚３ｍｍの金属パイプ状錘を乗せる。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（タカラバイオ社）を１ウェル当たり１０６個になるように添加する。３７℃で１２時間静置後、サンプルを取りだし、ＰＢＳ（−）（ニッスイ社）でリンスした後に酵素処理で細胞を剥がした後、ＭＴＴアッセイキット（フナコシ社）を用いて剥離した細胞数を測定する。以下の式２に示すように、サンプルに播種した細胞数に対する、接着した細胞数の割合を求め、細胞接着率とする。
細胞接着率（％）＝（接着した細胞数数／播種した細胞数）×１００・・・式２
＜血液循環における血栓付着＞
【００５０】
人工血管を長さ４ｃｍに切り、人工血管と同じ内径のポリ塩化ビニル製チューブ３２ｃｍと接続した。ヘパリンを終濃度０．５ＩＵ／ｍＬとなるよう添加したヒト新鮮血４．５ｍＬをチューブ内に導入し、ただちに両端を閉じてループとした。これを予め３７℃に調節した恒温恒湿乾燥機内で、回転速度１４ｒｐｍに調節したローテーターに貼り付けた枠へ固定し、１２０分間回転させた。ループを取り出し、ポリ塩化ビニル製チューブを切断して血液を除去しＰＢＳ（−）（ニッスイ社）でリンスした後、人工血管内の血栓形成の有無を定量する。試験はＮ＝３で行う。陰性対照として、ヒト新鮮血の代わりにＰＢＳ（−）を用いて同様の試験を行う。試験前と、血液を除去しリンス後の４ｃｍの人工血管の乾燥重量をそれぞれ測定し、その差を血栓重量とし、平均値及び標準偏差を算出する。試料の平均値が、陰性対照の（平均値＋３×標準偏差）以上であれば「＋」、未満であれば「−」と判定する。循環中に人工血管を通して血液が漏れた場合には、量の如何を問わず「漏出」として試験を止める。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明人工血管の具体的な実施例について実施例で詳細に説明する。
（実施例１）【００５２】
経糸５５Ｄｔｅｘ−４８ｆのポリエチレンテレフタレート、緯糸に２４５Ｄｔｅｘ−４０ｆの高分子配列体繊維を用いて平織組織で筒状織物を作製した。この時用いた高分子配列体繊維は海成分ポリスチレン２０部、島成分ポリエチレンテレフタレート８０部で島数３６／ｆであった。このチューブを８０℃の水酸化ナトリウム水溶液で十分に処理した後、トルエン中に浸漬し、次いで起毛機で起毛しさらにウォータージェットパンチを行った。【００５３】
上記処理後の筒状織物を０．５％水酸化ナトリウム水溶液で処理した後、次いで５％過マンガン酸カリウムで酸化処理した。つづいて、０．１％1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドの存在下で、ポリエチレンイミン（分子量６００、和光純薬工業社）を加えて筒状織物の繊維とポリエチレンイミンを反応させた。更に、臭化エチル、臭化ブチル、臭化ヘキシル、臭化オクチル、臭化デシルの１％メタノール溶液中、５０℃で繊維表面に固定化されたポリエチレンイミンの第４級アンモニウム化反応を行った。最後に、０．８％ヘパリンナトリウム（和光純薬工業）水溶液中に７０℃で浸漬処理してヘパリンをイオン結合させたものを、人工血管として用いる抗血栓筒状織物とした。【００５４】
それぞれの抗血栓筒状織物について、透水性、繊維表面の洗浄後の残存ヘパリン活性、繊維表面のカチオン量、血小板付着率、細胞接着率及び血栓付着を測定した性能評価結果を表１に示す。【００５５】
ここで、炭素数２のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理した抗血栓筒状織物をサンプル１、炭素数４のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理し抗血栓筒状織物をサンプル２、炭素数６のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理した抗血栓筒状織物をサンプル３、炭素数８のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理した抗血栓筒状織物をサンプル４、炭素数１０のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理した抗血栓筒状織物をサンプル５とした。
（実施例２）【００５６】
実施例１で作製した筒状織物を、それぞれポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＤＡ）の水溶液に浸漬し、浸漬した状態でコーガアイソトープにて５ｋＧｙγ線照射を行った。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００と水で洗浄して抗血栓筒状織物とした。ポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンを固定化した筒状織物については、実施例１と同様に臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化した。第４級アンモニウム化したポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、及びポリジアリルジメチルアンモニウムをそれぞれ固定化した筒状織物について、実施例１に記載の方法と同様の方法でヘパリンをイオン結合させ抗血栓筒状織物とした。【００５７】
ここで、ポリエチレンイミンをγ線照射により結合し、第４級アンモニウム化、ヘパリンをイオン結合させた抗血栓筒状織物をサンプル６、ポリアリルアミンをγ線照射により結合し第４級アンモニウム化、ヘパリンをイオン結合させた抗血栓筒状織物をサンプル７、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドをγ線照射により結合し第４級アンモニウム化、ヘパリンをイオン結合させた抗血栓筒状織物をサンプル８とした。【００５８】
それぞれの抗血栓筒状織物について、透水性、繊維表面の洗浄後の残存ヘパリン活性、繊維表面のカチオン量、血小板付着率、細胞接着率及び血栓付着を測定した性能評価結果を表１に示す。
（比較例１）【００５９】
実施例１記載のポリエチレンイミンを固定化した筒状織物を実施例１記載の方法と同様の方法でヘパリンをイオン結合し、サンプル９とした。また、ポリエチレンイミンを臭化ドデシルにより第４級アンモニウム化反応した炭素数１２のアルキル基を有する第四級アンモニウムポリマーを共有結合処理し、実施例１記載の方法と同様の方法でヘパリンをイオン結合した抗血栓筒状織物をサンプル１０とした。
（比較例２）【００６０】
実施例２記載のポリエチレンイミンまたはポリアリルアミンを固定化した筒状織物を実施例１記載の方法と同様の方法でヘパリンをイオン結合した。ここで、ポリエチレンイミンをγ線照射により結合し、ヘパリンをイオン結合させた抗血栓筒状織物をサンプル１１、ポリアリルアミンをγ線照射により結合し、ヘパリンをイオン結合させた抗血栓筒状織物をサンプル１２とした。
（比較例３）【００６１】
経糸５５Ｄｔｅｘ−４８ｆのポリエチレンテレフタレート、緯糸に２４５Ｄｔｅｘ−４０ｆの高分子配列体繊維を用いて高密度平織組織で筒状織物を作製した。実施例１のサンプル１と同様の操作を行い、抗血栓筒状織物のサンプル１３とした。
（比較例４）【００６２】
経糸、緯糸ともに５５Ｄｔｅｘ−４８ｆのポリエチレンテレフタレートを用いて平織組織で極細繊維を含まない筒状織物を作製した。実施例１のサンプル１と同様の操作を行い抗血栓筒状織物のサンプル１４とした。
（比較例５）【００６３】
重合度５５０のポリ塩化ビニル１２０ｇを２リットルのジメチルホルムアミドに溶解し、２．７０４ｇのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩を添加し、５０℃で３時間反応させ、メタノールに再沈後、乾燥させることにより、光グラフト活性化ポリ塩化ビニル（以下、ＤＴＣ化ポリ塩化ビニルと略す）を得た。このＤＴＣ化ポリ塩化ビニル８０ｇを１２５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、２００ｇのメトキシポリエチレングリコールメタクリレート（ポリエチレングリコール部分の重合度２０〜２３）と８０ｇのジメチルアミノエチルメタクリレートを添加し、光源内部浸漬型光反応装置中で１００Ｗ高圧水銀灯（ウシオ電機ＵＭ−１０２）を３０℃で９．５時間照射することにより光グラフト重合を行った。得られたポリマーの１０％テトラヒドロフラン溶液を、実施例１の筒状織物に塗布した。一昼夜減圧乾燥後、容器の中に、筒状織物臭化エチルを加え、５０℃で反応した。洗浄し、１％ヘパリン水溶液中、６０℃で浸漬処理しヘパリンをイオン結合させた。反応終了後、得られた抗血栓筒状織物をサンプル１５とした。コーティングの厚みは２０μｍであった。【００６４】
比較例の抗血栓筒状織物について、透水性、繊維表面の洗浄後の残存ヘパリン活性、繊維表面のカチオン量、血小板付着率、細胞接着率及び血栓付着を測定した性能評価結果を表１に示す。【００６５】
【表１】
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【００６６】
表１に示すとおり、第４級アンモニウム化ポリマーを固定した場合には人工血管の繊維表面の残存ヘパリン活性が高く、循環しても血栓が形成されなかったのに対し、第４級アンモニウム化していないポリマーを固定した場合には残存ヘパリン活性が低く、血栓が形成された。また、透水性が高すぎるサンプル１４においては、ループテストにおいて漏血した。第４級アンモニウム化ポリマーを固定した場合は表面ヘパリン活性が高く血栓形成抑制効果が高い。また、サンプル１５のように、コーティング膜厚が厚いと繊維組織が覆われて細胞接着性は低下した。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、抗血栓性と細胞親和性を両立し、留置後の内膜形成を促進し、内膜形成されるまでの間に抗血栓性を維持し、長期開存可能な人工血管として用いることができる。
【符号の説明】
【００６８】
１・・・極細繊維、２・・・繊維層、３・・・極細繊維層
【図１】
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【国際調査報告】
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