(57)【要約】【課題】糖尿病を治療及び合併症の発症を予防するため並びに糖尿病の自然史を変える治療法、進行を防止する有効な手段として、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした炎症性サイトカイン活性阻害剤の提供を目的とする。また、炎症性サイトカイン活性阻害作用が有効な自己炎症性疾患の治療・予防剤の提供を目的とする。【解決手段】ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有していることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体（化学合成したものを含む）ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有する、炎症性サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の活性阻害剤。
【請求項２】
前記アルカロイドはセファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，テトランドリン，シクレアニン，Ｅ６−ベルバミンのうちいずれか１種以上である請求項１記載のインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の活性阻害剤。
【請求項３】
ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有する炎症性サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記アルカロイドはセファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，テトランドリン，シクレアニン，Ｅ６−ベルバミンのうちいずれか１種以上である請求項３記載の炎症性疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有する糖尿病の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記アルカロイドはセファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，テトランドリン，シクレアニン，Ｅ６−ベルバミンのうちいずれか１種以上である請求項５記載の糖尿病の治療又は予防剤。
【請求項７】
膵β細胞保護作用又はβ細胞機能維持作用によるものである請求項５又は６記載の糖尿病の治療又は予防剤。
【請求項８】
ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有するメタボリックシンドロームの改善・予防剤。
【請求項９】
前記アルカロイドはセファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，テトランドリン，シクレアニン，Ｅ６−ベルバミンのうちいずれか１種以上である請求項８記載のメタボリックシンドロームの改善・予防剤。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の活性阻害剤、治療又は予防剤及び改善・予防剤のうち、いずれかを含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病、インスリン抵抗性を特徴とする疾患状態および病態、機能的膵β細胞量の低下、高血糖、高脂血症、肥満、代謝異常症候群、動脈硬化症、自己炎症性疾患（痛風など）ならびに慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症の治療あるいは予防のため医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はインスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、様々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群であり、病態の進行に伴い、眼、腎臓、神経、及び血管を含む種々の器官に重篤な衰弱性合併症を引き起こす。
遺伝的素因に、高脂肪食・運動不足・肥満といったインスリン抵抗性増大をきたす生活環境因子が加わって発症するものと考えられている。
インターロイキン１（ＩＬ−１）はマクロファージ、単球、線維芽細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞など多くの細胞から産生、分泌される炎症性サイトカインである（非特許文献１）。
産生細胞から放出されたＩＬ−１は種々の細胞に表現されているＩＬ−１受容体を介して局所的および全身的炎症作用を惹起することが知られている。
また、ＩＬ−１はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２），腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，コルチコトロピンなどの他の炎症メディエータの誘導を通して媒介される一連の生物作用を引き起こす。
ＩＬ−１ファミリーのサイトカインは１１のメンバーで構成されているが、ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１Ｒａ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）、及びＩＬ−１８の作用がヒト、実験動物の炎症性疾患状態で研究されている。
ＩＬ−１α，ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲａはＩＬ−１受容体に同程度の親和性で結合するが、異なる遺伝子によって発現され、異なる一次アミノ酸配列を有し、生理学的活性も互いに異なる。
近年、糖尿病の発症、悪化やインスリン分泌障害、インスリン抵抗性にＩＬ−１βが関与していることを示す研究が多数報告されている（例えば、非特許文献２）。
メタボリック症候群は、高インスリン血症、耐糖能異常、肥満、内臓脂肪蓄積、高血圧、ならびに高脂血を特徴とする脂質代謝異常などを集合したものである。
インスリン抵抗性は、これらの疾患状態に密接に関連しており、将来、２型糖尿病、心臓発作、脳卒中、動脈硬化症を発症する強力なリスク因子である。
ＩＬ−１を含む炎症性サイトカインがインスリン抵抗性に関与すると考えられる脂肪組織内の炎症を媒介することが示されている（非特許文献６）。
ＴＮＦα、ＩＬ−６は脂肪細胞をインスリン抵抗性にすることは知られていたが、ＩＬ−１もＩＲＳ−１（Insulin Receptor Substrate 1）のセリン残基をリン酸化することによりインスリンシグナルの阻害、インスリン抵抗性を誘発することが報告された（非特許文献７）。
自己炎症性疾患は発熱、皮疹など炎症に由来する症状を主徴とするもののうち、自己免疫疾患でみられるような自己抗体の関与が否定される症候群の総称である。
近年、その多くがインフラマソームの機能異常によって発症することが解ってきた。
インフラマソームによるカスパーゼー１の活性化とそれに引き続く活性型ＩＬ−１β産生の亢進が、全身性炎症を惹起すると考えられている。
現在、抗ＩＬ−１薬が診療に用いられており、いずれも著しい効果をあげている。
多くの自己炎症性疾患は遺伝性疾患であるが、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａのバランスシステムの崩壊が自己炎症性疾患発症の原因と考え、一部の変形関節症、痛風、２型糖尿病を自己炎症性疾患に分類することを提唱している（非特許文献８）。
炎症性サイトカインの自己免疫疾患に対する関与については、関節リウマチのモデルマウス及び関節リウマチ患者を中心に解析が進められ、ＩＬ−１阻害療法としてＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害療法として抗ＴＮＦ抗体、ＩＬ−６阻害療法としてＩＬ−６受容体阻害抗体が関節リウマチの治療薬として承認され診療に用いられており、いずれも従来の標準的薬物療法を上回る効果をあげている。【０００３】
特許文献１には、ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来のアルカロイドを有効成分とするＮＦ−κβ活性阻害剤を開示する。
しかし、本発明が後述するように、膵β細胞機能の改善、機能的膵β細胞量の温存、インスリン抵抗性の改善により、糖尿病の治療、糖尿病発症の予防、肥満の改善と予防及び炎症性サイトカインが関与する自己炎症性疾患の治療、予防に有用であることを見出したものである点で、特許文献１に開示する発明と目的及び作用が相違する。【０００４】
【特許文献１】日本国特開平１１−１８０８７３号公報
【非特許文献１】Dinarello CA, Annu.Rev.Immunolol.2009.27;519-50
【非特許文献２】Mandrup-Poulsen et al. Diabetologia. 1986,29:63-67, Bendzen et al. Science. 1986,232:1545-1547
【非特許文献３】Maedler et al. J. Clin. Invest.,2002,110:851-860, Butler et al. Diabetes. 2003,52:2304-2314, Maedler et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004,101:8138-8143
【非特許文献４】Mandrup-Poulsen et al. Diabetologia. 1996,39:1005-1029
【非特許文献５】Tran POT. et al. J. Biol. Chem., 1999,274:31245-31248
【非特許文献６】Vandanmagsar B. et al.  Nat. Med., 2011,17:179-188
【非特許文献７】Weisberg SP. et al. J. Clin. Invest., 2003,112:1796-1808; Xu H. et al. J. Clin. Invest., 2003,112:1821-1830
【非特許文献８】Dinarello CA. N. Engl. J. Med., 2009,360:2467-2470
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、糖尿病を治療及び合併症の発症を予防するため並びに糖尿病の自然史を変える治療法、進行を防止する有効な手段として、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした炎症性サイトカイン活性阻害剤の提供を目的とする。
また、炎症性サイトカイン活性阻害作用が有効な自己炎症性疾患の治療・予防剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る炎症性サイトカインであるインターロイキン−１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の活性阻害剤は、ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも１種以上を有効成分して含有していることを特徴とする。
ここで、アルカロイドはビスベンジルイソキロリン（Bisbenzylisoquinoline）化合物であり、具体的には、セファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，テトランドリン，シクレアニン，Ｅ６−ベルバミンのうちいずれか１種以上であってよい。
また、これらの化合物は、化学合成されたものを含む。【０００７】
上記のアルカロイドのうち、セファランチン，ベルバミン，イソテトランドリン，及びシクレアニンの構造式を（１）〜（４）にそれぞれ示す。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０００８】
本発明に用いられるツヅラフジ科ステファニア属に属する植物としては、タマサキツヅラフジ（Stephania cepharantha），コウトウツヅラフジ（Stephania merrilli），イボツヅラフジ（Stephania crispa），ステファニア（Stephania venosa）等が例として挙げられる。
本発明の有効成分としては、タマサキツヅラフジ由来のアルカロイドを用いるのが好ましい。
本発明の有効成分としてはタマサキツヅラフジからのアルカロイド含有画分、また常法により分離精製して得られる結晶、公知の方法により製造される当該アルカロイド誘導体などを用いることができる。
例えばタマサキツヅラフジの根茎、茎、葉、種子などを使用し、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルなどの溶媒で抽出し、抽出液を濃縮し、濃縮液を希塩酸、希硫酸、クエン酸水溶液、シュウ酸水溶液などの酸性水溶液に溶解し、溶解液をアルカリ性にして生じた沈殿物を採取することによりアルカロイド画分を分離できる。
得られた画分を各種クロマトグラフィー、再結晶などの公知の方法によりアルカロイドを精製して用いてもよい。
本発明に用いられるアルカロイドの誘導体としては、アシル誘導体、アルキル誘導体、カルバモイル誘導体などが挙げられる。【０００９】
本発明の薬剤を投与する場合、当該有効成分をそのまま用いてもよく、また、錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤などに製剤化して経口的に投与してもよい。
さらに、坐剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、外用剤などに製剤化して非経口的に投与してもよいが、経口剤として投与することが望ましい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造する。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
本発明の薬剤の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、当該アルカロイド、その誘導体、その塩として０．１〜５ｍｇ／ｋｇを１日１回〜数回に分けて投与する。
本発明の薬剤は単独あるいは異なる作用様式で働く少なくとも１つまたは複数の活性薬剤と併用して用いることもできる。
活性薬剤としては糖尿病治療薬剤の１）スルホニル尿素薬  ２）ビグアナイド薬  ３）αグルコシダーゼ阻害薬  ４）インスリン抵抗性改善薬  ５）グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）類似薬、６）ＤＰＰ−４阻害薬  ７）インスリン  ８）ＳＧＬＴ阻害剤が挙げられる。
更に別の態様において、併用する活性薬剤は高脂血症治療剤、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド剤であっても良い。
本発明の薬剤の使用方法には、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、高血糖、インスリン分泌障害、インスリン抵抗性並びにインスリン抵抗性を特徴とする疾患状態及び病態を処置または病態の進行予防、合併症の発生を予防するために哺乳動物に使用することができる。
さらに、ＩＬ−１、ＴＮＦα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤として使用できる。
本発明に係る薬剤は、上記に示した肥満等の改善又は予防にも使用できることから、メタボリックシンドロームの改善・予防剤にもなる。
本発明に係る薬剤を含有した飲食品にすることもでき、その場合飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。
本発明の有効成分を飲食品に使用するには、そのまま又は種々の栄養成分とともに加工肉、清涼飲料等の飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、本発明の有効成分を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。
上記の飲食品における本発明の有効成分の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、０．０１〜１重量％配合するのが望ましい。
【発明の効果】
【００１０】
ＩＬ−１受容体拮抗薬（アナキンラ）は高価なタンパク質製剤で連日皮下注射することが必要であり、長期に渡る糖尿病治療薬としては適さない。
患者は自己注射による治療システム遵守に関する問題を引き起こし、有効性の低下、安全性、簡便性などの課題がある。
これに対して本発明に係る医薬は、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした膵β細胞機能温存する糖尿病治療剤・予防剤となり、ＩＬ−１、ＴＮＦα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤となる。
本発明の有効成分は、膵β細胞保護又はβ細胞機能維持、糖質代謝改善、脂質代謝改善、高脂血症改善などの効果を有する。更に、天然物に由来するため安全性に優れており、メタボリックシンドロームの予防・改善剤として飲食品の形態で日常的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＩＬ−１阻害化合物の評価系を示す。
【図２】ヒト株化細胞のヒトIL-１β、マウスIL-１βによる細胞死とヒトIL-1レセプターアンタゴニストの阻害作用、ヒトIL-1β中和抗体の効果を示す。
【図３】ヒトＩＬ−１βによる細胞死に対する植物由来アルカロイド化合物の阻害作用を示す。
【図４】ヒトＴＮＦα、ヒトＩＬ−１αによる細胞死とＭＢ５Ｃ（セファランチン）の阻害作用を示す。
【図５】ヒトＩＬ−１βによる細胞死に対するＭＢＭＸ（タマサキツヅラフジ抽出アルカロイド製剤）の阻害作用を示す。
【図６】ＩＬ−１βによる膵β細胞（ＭＩＮ６）死に対するＭＢＭＸの抑制作用を示す。
【図７】ＩＬ−１βによる膵β細胞（ＭＩＮ６）死に対するビスベンジルイソキノリン化合物の抑制作用を示す。
【図８】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（予防的投与試験）を示す。
【図９】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（予防的投与試験）を示す。
【図１０】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（予防的投与試験）を示す。
【図１１】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（治療的投与試験）を示す。
【図１２】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（治療的投与試験）を示す。
【図１３】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（治療的投与試験）を示す。
【図１４】高脂肪食給餌肥満モデルにおけるＭＢＭＸの効果（治療的投与試験）を示す。
【図１５】ＩＬ−１β刺激によるＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２産生に対するＭＢＭＸの抑制作用を示す。
【図１６】ＩＬ−１α刺激によるＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２産生に対するＭＢＭＸの抑制作用を示す。
【図１７】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸの効果（体重変化）を示す。
【図１８】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸの糖代謝改善効果を示す。
【図１９】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸの効果（耐糖能試験）を示す。
【図２０】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）の摂食行動に対するＭＢＭＸの効果を示す。
【図２１】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸ配合食給餌の効果（体重変化）を示す。
【図２２】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸ配合食給餌の効果（血糖値変化）を示す。
【図２３】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸ配合食給餌の効果（摂餌量変化）を示す。
【図２４】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸ配合食給餌の効果（耐糖能試験）を示す。
【図２５】２型肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＭＢＭＸ配合食給餌の効果（インスリン応答能試験）を示す。
【図２６】ＭＢＭＸ配合食給餌ｄｂ／ｄｂマウスにおける膵臓中インスリン含量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明に係る有効成分が細胞死に対するＩＬ−１，ＴＮＦαの活性阻害作用を有し、肥満予防効果及び肥満改善効果を有することを試験したので説明する。
また、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β刺激によるプロスタングランジンＥ２の産生に対する抑制作用も確認した。【００１３】
まず初めに確認試験に用いた試薬及び試験条件を説明する。
＜試薬及び医薬品＞
ヒト及びマウスのインターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ヒトの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン受容体拮抗因子（ＩＬ−１Ｒａ）は、R&D Systems Inc.(Minneapolis,MN)及び大塚製薬（株）(Tokushima,Japan)で製造されたリコンビナント製品を使用した。
抗ヒトＩＬ−１β中和抗体は大塚製薬（株）(Tokushima,Japan)より入手した。
タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイド原末（以下ＭＢＭＸという。）、セファランチン、イソテトランドリン、ベルバミン、シクレアニン、及びその誘導体であるＥ６−ベルバミンはWAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)より入手した。
血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、ＧＯＴ及びＧＰＴなどの測定キットは、WAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)、ＰＧＥ２測定ＥＬＩＳＡキット(R&D Systems Inc.)は平野純薬工業より入手した。
＜株化細胞＞
ＩＬ−１阻害化合物の評価は、ＩＬ−１感受性株化細胞Ａ３７５Ｓ２を使用した細胞培養法により行った(Nakai S,Hirai Y,et al. Biochem.Biophy.Res.Commun.154,1189,1988)。
ＭＩＮ６マウス膵β細胞は大阪大学大学院医学研究科  宮崎博士より入手した。
＜ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌試験  −２０週間投与試験−＞
（ａ）動物
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系、５−６週令、雄性）を三協ラボサービスより購入し、１週間の予備飼育の後に試験に供した。
（ｂ）マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食（Ｄ１２４９２、６０％  Ｋｃａｌ％  Ｆａｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）に０．０５％ＭＢＭＸ（化研生薬）または０．５％メトフォルミン（和光純薬）を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存した。
給餌は、２日毎に行ない、摂餌量を計量した。
また、対照群では、普通食（Ｄ１２４５０Ｂ、１０％  Ｋｃａｌ％  Ｆａｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を給餌した。
マウスに被検物配合食を２０週間給餌した後、解剖に付した。マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後、血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、ＧＯＴ及びＧＰＴなどの測定は、市販キット（和光純薬）を用いて測定した。
（ｃ）インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌１９週目のマウスを４時間絶食し，尾静脈より採血した後インスリン（０．８ＩＵ／ｋｇ、牛膵臓由来、シグマ）溶液を腹腔内投与し，３０，６０及び１２０分後に各々採血して血糖値を測定した．
＜ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌試験  −８週間投与試験−＞
（ａ）動物
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系、５−６週令、雄性）を三協ラボサービスより購入し、１週間の予備飼育の後に試験に供した。
（ｂ）マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食（Ｄ１２４９２、６０％  Ｋｃａｌ％  Ｆａｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）に０．０５％ＭＢＭＸ（タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイドであるセファランチン原末、化研生薬）または０．０２％ピオグリタゾン（フナコシ）を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存し、給餌は２日毎に行なった。
また、普通食（Ｄ１２４５０Ｂ、１０％  Ｋｃａｌ％  Ｆａｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）についても同様に給餌した。
マウスに１２週間高脂肪食を給餌した後、被検物配合高脂肪食に交換し、さらに８週間給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、ＧＯＴ及びＧＰＴなどの測定は、市販キット（和光純薬）を用いて測定した。
（ｃ）インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌７週目のマウスを４時間絶食し，尾静脈より採血した後インスリン（０．８ＩＵ／ｋｇ、牛膵臓由来、シグマ）溶液を腹腔内投与し，３０，６０及び１２０分後に各々採血して血糖値を測定した．
＜ＭＢＭＸ配合食給餌試験  −糖尿病発症予防試験−＞
（ａ）動物  自然発症糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ系、５週令、雄性）を三協ラボサービスより購入し、１週間の予備飼育の後に試験に供した。
（ｂ）ｄｂ／ｄｂマウスへの被検物配合食の給餌
被検物配合食は、普通食（ラボＭＲストック粉末、日本農産）に０．０５％ＭＢＭＸまたは０．０２％ピオグリタゾン（フナコシ）を均一に混合した後給餌し、２日毎に摂餌量を計量した。
マウスに１０週間配合食を給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、ＧＯＴ及びＧＰＴなどの測定は、市販キット（和光純薬）を用いて測定した。
（ｃ）耐糖能試験
被検物配合食給餌９週目のマウスを一晩絶食し、尾静脈より採血した後グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ）を経口投与し、３０，６０及び１２０分後に各々採血して血糖値を測定した。
＜プロスタグランジンＥ２産生試験＞
Ａ３７５Ｓ２細胞をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）或いはＩＬ−１α（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で１８時間培養し、産生された培養液中のＰＧＥ２量はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて測定した。【００１４】
まず初めに本試験に係る評価系の確認をした。
図１に示すグラフはヒト株化細胞の培養日数と縦軸，生細胞量の増加に対するＩＬ−１βの作用を示す。
具体的には、次のように試験を行った。
組織培養プレートの各ウェルに細胞培養液又はＩＬ−１β（２．５ｎｇ／ｍｌ）を入れる。
２日から５日間培養後、０．０５％ニュトラルレッド液を各ウェルに加え、細胞培養器内で２時間培養し、生細胞に色素を取り込ませる。
細胞内に取り込まれなかった色素を洗浄する。
次に、色素溶出液を各ウェルに加え、室温でプレートシェーカーで撹拌し、生細胞に取り込まれた色素を溶出する。マイクロプレート用自動吸光度計でＯＤ５４０ｎｍを測定する。測定した吸光度より生細胞量を算出する。
この結果、ＩＬ−１βは、ヒト株化細胞に細胞死を起こし、生細胞量が増加しないことが確認できた。
次に、ヒトＩＬ−１β（ｈＩＬ−１β），マウスＩＬ−１β（ｍＩＬ−１β）のヒト株化細胞の細胞死に対するヒトＩＬ−１レセプタ−アンタゴニスト（ｈＩＬ−１Ｒａ）とヒトＩＬ−１β中和抗体（ｈＩＬ−１βＡｂ）の作用を確認した結果を図２のグラフに示す。
ヒトＩＬ−１β（ｈＩＬ−１β）はマウスＩＬ−１β（ｍＩＬ−１β）によるヒト株化細胞の細胞死評価系にヒトＩＬ−１Ｒａ（ｈＩＬ−１Ｒａ）を加えると、細胞死が阻害される。
ヒトＩＬ−１β中和抗体（ｈＩＬ−１β  Ａｂ）はヒトＩＬ−１βによる細胞死は阻害するが、マウスＩＬ−１βによる細胞死は阻害しない。
この評価系を用いれば、ＩＬ−１Ｒａ類似活性を持つ化合物がスクリーニングできることが確認できた。【００１５】
植物由来の各種アルカロイド化合物のヒトＩＬ−１βによる細胞死に対する阻害作用を試験評価した結果を図３のグラフに示す。
グラフ中、ＭＢ５Ｃ：セファランチン，ＭＢ１Ｄ：Ｅ６−ベルバミン，ＭＢ２Ｄ：ベルバミン，ＭＢ７Ｒ：イソテトランドリン，ＭＢ１Ｒ：シクレアニン、ＩＬ−１Ｒａ：IL-1 receptor antagonistをそれぞれ示す。
ビスベンジルイソキノリン化学構造を有するアルカロイド化合物が用量依存的にIL-1βによる細胞死を阻害することが確認できた。【００１６】
ヒトＴＮＦα及びヒトＩＬ−１αに対するセファランチン（ＭＢ５Ｃ）の阻害作用を試験した結果を図４のグラフに示す。
この結果、セファランチンがヒトＴＮＦα，ヒトＩＬ−１αによる細胞死を阻害することが分かる。
また、グラフは省略するが、図３に示した他のアルカロイドも同様の阻害作用が認められた。【００１７】
ヒトＩＬ−１βによる細胞死に対するタマサキツヅラフジから抽出したアルカロイド製剤（ＭＢＭＸ）の阻害作用試験した結果を図５のグラフに示す。
ＭＢＭＸは、化研生薬株式会社が販売するセファランチン原末を用いた。
ＭＢＭＸの主なアルカロイド成分は、セファランチン，イソテトランドリン，ベルバミン，シクレアニンである。
ＭＢＭＸが、ヒトＩＬ−１βによる細胞死に対して量依存的に阻用作用を示した。【００１８】
ＩＬ−１による膵β細胞（ＭＩＮ６）死に対するＭＢＭＸの抑制作用の試験結果を図６のグラフに示す。
（方法）  組織培養プレートの各ウエルに１ｘ１０５個の膵β細胞（ＭＩＮ６）、マウスＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）及びＭＢＭＸを加え培養する。４８時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図６のグラフに示すように、ＩＬ−１βにより膵β細胞死が起こるが、ＭＢＭＸはＩＬ−１による膵β細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。【００１９】
ＭＢＭＸの主なアルカロイド成分、セファランチン、イソテトランドリン、ベルバミン、シクレアニンの、ＩＬ−１による膵β細胞（ＭＩＮ６）死に対する抑制作用の結果を図７のグラフに示す。
（方法）組織培養プレートの各ウエルに１ｘ１０５個のＭＩＮ６細胞、マウスＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）及び各アルカロイド化合物を加え培養する。７２時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図７のグラフに示すようにＩＬ−１βによりＭＩＮ６細胞死が起こるが、ＭＢＭＸの主なアルカロイド各成分は濃度依存的にＭＩＮ６細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。【００２０】
高脂肪食給餌肥満モデルに対するアルカロイド製剤（ＭＢＭＸ）の効果を試験した。
体重変化を図８のグラフに示し、インスリン応答性試験結果を図９のグラフに示す。
また、血液生化学値を図１０の表に示す。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（♂  ６週令、１群Ｎ＝６）に普通食(ND,Research diet D12450B 10% Kcal fat)或いは高脂肪食(HFD, Research diet D12492 60% Kcal fat)を２０週間給餌した。
試験薬物は０．０５％  ＭＢＭＸ（５００μｇ／ｇ）、陽性対照薬として糖尿病薬メトホルミン（Ｍｅｔ）０．５％（５ｍｇ／ｇ）を高脂肪食に配合し２０週間給餌した。
体重及び４週ごとに血糖値を測定した。
試験開始１９週目にインスリン応答性試験、２０週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。ＭＢＭＸは高脂肪食給餌による肥満を抑制する効果が得られた。
１９週間、高脂肪食を給餌されたマウスは、普通食のマウスに比べてインスリン応答能が低下していた。
０．０５％  ＭＢＭＸ配合した高脂肪食を給餌されたマウスではインスリン応答能は、普通食給餌マウスと同等であり、インスリン応答能の低下を防止する効果が得られた。
結果は、普通食給餌マウスに比べ、高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加、脂肪肝に起因する肝機能の異常が見られた。
０．０５％  ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加抑制、肝機能悪化の防止の効果が得られた。【００２１】
次に高脂肪食給餌肥満モデルにおける治療的投与試験を行った。
図１１はマウスの体重変化のグラフを示し、図１２はインスリン応答性試験結果を示す。
また、図１３及び図１４に血液生化学検査結果を示す。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（♂  ６週令、１群Ｎ＝６）に普通食或いは高脂肪食を１２週間給餌した。
その後、高脂肪食給餌マウスは、高脂肪食あるいは試験薬物配合高脂肪食を８週間給餌した。
試験薬物として、０．０５％  ＭＢＭＸ（５００μｇ／ｇ）、陽性対照薬物として、０．０２％ピオグリタゾン（Ｐｉｏ，糖尿病薬）を給餌した。
体重及び４週ごとに血糖値を測定した。
試験開始１９週目にインスリン応答性試験、２０週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。
ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌マウスでは、肥満を改善する効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスではインスリン応答能の低下（インスリン抵抗性）が見られた。
０．０５％  ＭＢＭＸ配合高脂肪食を７週間給餌したマウスでは、インスリン応答能の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値の上昇、レプチン値の上昇が見られた。
８週間、０．０５％  ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値、レプチン値の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、血清脂質レベルの上昇が見られた。
０．０５％  ＭＢＭＸ配合高脂肪食給餌マウスでは血清脂質プロファイルの改善効果が得られた。【００２２】
ＩＬ−１β及びＩＬ−１α刺激によるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生に対するアルカロイド製剤（ＭＢＭＸ）の抑制作用を評価した結果を図１５及び図１６のグラフに示す。
図１５のグラフはＩＬ−１β刺激、図１６のグラフはＩＬ−１α刺激に対してである。
Ａ３７５Ｓ２細胞株をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−１α（２ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激すると約５０倍量のＰＧＥ２が産生される。
ＩＬ−１Ｒａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を共存させるとＰＧＥ２産生は１０％以下に抑制された。ＭＢＭＸも濃度依存的にＰＧＥ２産生を抑制した。【００２３】
２型肥満糖尿病マウスに対するアルカロイド製剤（ＭＢＭＸ）の効果を試験した結果（その１）を図１７〜図２０に示す。
図１７は体重変化、図１８は血糖値変化、図１９は耐糖能試験結果、図２０は摂餌変化を示す。
ｄｂ／ｄｂマウス（♂  ６週令  １群Ｎ＝６）にＭＢＭＸは０．０５％（５００ｕｇ／ｇ）、ピオグリタゾンは０．０２％（２００ｕｇ／ｇ）を給餌した。
ＭＢＭＸ給餌群は２週目頃より体重増加が抑制された。
ピオグリタゾン群ではＰＰＡＲγアゴニスト作用の多面性の故、体重増加（脂肪蓄積、水分貯留など）がみられた。
ＭＢＭＸ群では、給餌開始３週目より血糖値が低下し始め、８週目には２００ｍｇ／ｄｌ以下にまで低下した。
また、ピオグリタゾン群では、給餌開始後血糖値の上昇は見られず、１５０ｍｇ／ｄｌ前後の値を維持した。
試験開始８週目の空腹時血糖値は、ＭＢＭＸ群、ピオグリタゾン群で対照群より有意に低値であった。【００２４】
２型肥満糖尿病マウスに対するアルカロイド製剤（ＭＢＭＸ）の効果を試験した結果（その２）を図２１〜図２５に示す。
図２１は体重変化、図２２は血糖値変化、図２３は摂餌量、図２４は耐糖能試験結果、図２５はインスリン応答能試験を示す。
（方法）食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるｄｂ／ｄｂマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす糖尿病病態モデル動物である。
８週令の雄性ｄｂ／ｄｂマウスに０．０１％あるいは０．０５％ＭＢＭＸ配合食を１０週間給餌した。
試験開始１０週目に耐糖能試験、試験開始１１週目にインスリン応答能試験、試験開始１２週目に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
耐糖能試験、インスリン応答能試験は絶食後、常法にて行った【００２５】
０．０５％ＭＢＭＸ給餌群では、対照群に比べで体重増加は抑制され、随時血糖値は有意に低値であった。
０．０５％ＭＢＭＸ配合食群では、給餌開始２週目より血糖値がコントロール群に比べ有意に低く、９週目には２００ｍｇ／ｍｌ以下に低下した。
また、０．０５％ＭＢＭＸ給餌群では、機序は不明であるが、肥満動物の食欲を抑える作用も見られた。０．０５％ＭＢＭＸ給餌１０週目に行った耐糖能試験では、空腹時血糖値はコントロール群に比べて有意に低値であり、膵β細胞機能の有意な改善効果が認められた。
０．０５％ＭＢＭＸ給餌１１週目に行ったインスリン応答能試験では、コントロール群に比べてインスリン感受性の有意な改善が認められた。【００２６】
ｄｂ／ｄｂ肥満２型糖尿病モデルマウスを用いたＭＢＭＸの膵β細胞保護作用の結果を図２６に示す。
（方法）食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるｄｂ／ｄｂマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす病態モデル動物である。
ＭＢＭＸの膵β細胞保護作用を明らかにするため、ｄｂ／ｄｂマウスの膵臓中のインスリン含量を試験開始１２週目に測定した。
すなわち、雄性ｄｂ／ｄｂマウスに、０．０１％あるいは０．０５％ＭＢＭＸ配合食を摂食させた。１２週間後に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
エッペンドルフチューブの中に入れた膵臓に酸アルコール混液（７５％アルコール、２３．５％蒸留水、１．５％濃塩酸）１ｍｌ加えてペレットミキサーで破砕した。４℃で一晩静置しインスリンを抽出後、インスリン量を、インスリンＥＬＩＳＡ測定キットを用いて測定した。
その結果、図２６に示すように食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるｄｂ／ｄｂマウスでは、膵臓中のインスリン含量の著しい減少が認められた。
０．０５％ＭＢＭＸ配合食を摂食したｄｂ／ｄｂマウスでは、膵臓中インスリン含量は保持されていることが示された。
これはＭＢＭＸが膵β細胞の疲弊、細胞死を保護したためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、炎症性サイトカインＩＬ−１、ＴＮＦα活性阻害作用が有効な炎症性疾患（糖尿病、肥満関連疾患、認知症、自己炎症性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血など）の治療剤、予防剤として広く利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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