(57)【要約】  目的タンパク質の高効率で安定的な分泌発現を可能とする、嫌気性菌を形質転換するための形質転換用プラスミド、該プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の診断または治療方法を提供することにある。  新規の分泌シグナル、該分泌シグナルを含む形質転換用プラスミド、該プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の診断または治療方法を提供すること。
2016117508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性菌の形質転換用プラスミドであって、プロモーターユニット、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌シグナルユニット、および虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを含む目的遺伝子ユニットを含む、前記形質転換用プラスミド。
【請求項２】
虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどの血管新生促進活性を有するタンパク質、プロスタグランジン類などの血管拡張に関与する因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）からなる群から選ばれる一種である、請求項１に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項３】
虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、請求項１または２に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項４】
分泌シグナルユニットが、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に続けて、スペーサーペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項５】
スペーサーペプチドが、１〜２５アミノ酸長であって、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸から始まる配列で表される、請求項４に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項６】
分泌シグナルユニットが、配列番号９または配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項７】
形質転換用プラスミドが、非シャトルプラスミドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項８】
プロモーターユニットに含まれるプロモーターが、配列番号１３で表される塩基配列またはその塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項９】
形質転換用プラスミドが、ｐＦＧＦ１１０（配列番号１４）またはｐＦＧＦ１１１（配列番号１５）の塩基配列で表される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体。
【請求項１１】
嫌気性菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１０に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１２】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項１１に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物が、虚血性疾患部位における、遺伝子輸送担体の生着・増殖促進剤をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
生着・増殖促進剤が、マルトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノースからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体を投与することを含む、虚血性疾患を診断または治療するための方法。
【請求項１７】
投与が、全身投与である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の分泌シグナル、該分泌シグナルを含む形質転換用プラスミド、該プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の診断または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、悪性腫瘍の治療方法において、形質転換嫌気性菌を遺伝子輸送担体として用いる方法が注目され、例えば、形質転換したクロストリジウムを用いて、抗腫瘍物質のプロドラッグを抗腫瘍物質に変換する酵素のニトロリダクターゼの発現遺伝子を腫瘍部位へ輸送する方法などが提案されている（特許文献１〜３参照）。【０００３】
ところが、従来これらの目的で用いられている微生物はいずれも病原性の菌を低毒性に変異化したものであり、逆変異化して元の病原性菌に戻り、有害性を発揮する可能性が否定できず、さらに、運動性、侵襲性のため、疾患組織のみでなく正常組織においても作用を発現して全身性の副作用症状を生じるおそれがあるなど、安全性において問題性が懸念される。【０００４】
そこで、ヒトの腸内に存在してフローラを形成する非病原性の腸内細菌で、極めて安全な偏性嫌気性細菌であることが知られているビフィズス菌が注目され、抗腫瘍物質の５−フルオロウラシルのプロドラッグの５−フルオロシトシンを５−ＦＵに変換する酵素のシトシン・デアミナーゼを発現するように形質転換したビフィズス菌や抗腫瘍性を有するタンパク質であるＴＮＦαを発現するように形質転換したビフィズス菌が開発された（特許文献４〜６参照）。【０００５】
この形質転換ビフィズス菌は、これを嫌気的疾患の固形腫瘍動物モデルに静脈内投与した場合、低酸素状態の嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖し、嫌気的環境下にない正常組織では速やかに消失するという特長を有している（非特許文献１、２参照）。【０００６】
一方、虚血性疾患の治療、特に重症虚血の治療において、血管の新生や側副血行を発達させることで血流を回復しようという血管新生療法が試みられている。血管新生療法は、大別すると細胞移植、タンパク投与および遺伝子治療の３種の治療法があるが、低侵襲性の観点から、近年特に遺伝子治療が注目されている。遺伝子治療による血管新生においては、例えば肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor：ＨＧＦ）や血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）などをコードする遺伝子を、患部付近に筋肉内注射や動脈内注入によって導入し、患部付近の血管新生を促すことにより血流を回復させる（例えば非特許文献３、４参照）。【０００７】
これらの血管新生療法は、細動脈レベルの障害により血行再建ができないかまたは効果が不十分である患者や、侵襲性の問題により外科的治療が行えない患者などに対する選択肢の一つとして注目されてきており、特に遺伝子治療による血管新生療法に関しては、近年多くの臨床試験が行われている。【０００８】
しかしながら、従来の遺伝子治療を利用した血管新生療法は、病変部位特異性がないため、全身投与が不可能であること、虚血部位よりも非虚血部位における血管新生が促進されてしまうスティール現象が懸念されること、遺伝子導入効率や導入遺伝子の発現期間のコントロールが困難であること、血管新生により症状が悪化し得る合併症を有している場合には適用に大きなリスクを伴うことなど、適用にはまだまだ多くの問題を解決する必要がある。【０００９】
そこで本発明者らは、嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖する嫌気性菌に着目し、形質転換ビフィズス菌を用いることで、虚血部位のみに特異的に集積し、当該虚血部位において所望のタンパク質を産生し、治癒とともに病変部位から消失してタンパク質を産生しなくなるという遺伝子輸送担体の作製に成功した（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６４１６７５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６６５２８４９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開２００３／０１０３９５２号明細書
【特許文献４】特開２００２−９７１４４号公報
【特許文献５】国際公開第２００７／１３６１０７号
【特許文献６】国際公開第２０１１／０９３４６５号
【特許文献７】国際公開第２０１３／００８８８１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Yazawa et al., Cancer Gene Therapy,  7 ( 2) : 269-274, 2000.
【非特許文献２】Yazawa et al., Breast Cancer Research and Treatment,  66 : 165-170, 2001.
【非特許文献３】Gupta et al., Circ. Res., 105: 724-736, 2009.
【非特許文献４】Morishita et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 31: 713-720, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、目的タンパク質の高効率で安定的な分泌発現を可能とする、嫌気性菌を形質転換するための形質転換用プラスミド、該プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の診断または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記特許文献７において、ヒトＦＧＦ２をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換用プラスミドｐＦＧＦ１２ａを作製し、これを用いて形質転換した偏性嫌気性菌、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＦＧＦ１２ａ、ビフィドバクテリウム・ブレーベＪＣＭ１１９２／ｐＦＧＦ１２ａなどが、全身投与によって虚血性疾患部位にのみ特異的に集積・生育し、当該虚血性疾患部位においてヒトＦＧＦ２タンパク質を発現・分泌可能であることを報告した（特許文献７）。
しかしながら、さらに研究を続けていくうちに、上記特許文献７において主に用いられている形質転換プラスミドｐＦＧＦ１２ａで形質転換したビフィドバクテリウム属細菌は発現タンパク質の分泌量が十分でなく、また分泌量も経時的に低下していくという安定性に欠けるものであるという新たな課題に直面した。【００１４】
そこで本発明者らは、当該課題を解決すべく、鋭意研究を続けた結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の新規な分泌シグナルペプチドＳＰ５６およびＳＰ６７を見出し、これらのシグナルペプチドをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを作製した結果、驚くべきことに、当該プラスミドで形質転換した嫌気性菌は、既存株よりもタンパク質分泌発現が格段に高く、長期培養しても安定的に発現タンパク質を分泌し、繰り返し継代培養を行っても高いプラスミド保持菌率を示すプラスミドであることを見出し、さらに研究を続けた結果、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）嫌気性菌の形質転換用プラスミドであって、プロモーターユニット、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌シグナルユニット、および虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを含む目的遺伝子ユニットを含む、前記形質転換用プラスミド。
（２）虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどの血管新生促進活性を有するタンパク質、プロスタグランジン類などの血管拡張に関与する因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）からなる群から選ばれる一種である、（１）の形質転換用プラスミド。
（３）虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、（１）または（２）の形質転換用プラスミド。
（４）分泌シグナルユニットが、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に続けて、スペーサーペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、（１）〜（３）の形質転換用プラスミド。
（５）スペーサーペプチドが、１〜２５アミノ酸長であって、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸から始まる配列で表される、（４）の形質転換用プラスミド。
（６）分泌シグナルユニットが、配列番号９または配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである、（１）〜（５）の形質転換用プラスミド。
（７）形質転換用プラスミドが、非シャトルプラスミドである、（１）〜（６）の形質転換用プラスミド。
（８）プロモーターユニットに含まれるプロモーターが、配列番号１３で表される塩基配列またはその塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、（１）〜（７）の形質転換用プラスミド。
（９）形質転換用プラスミドが、ｐＦＧＦ１１０（配列番号１４）またはｐＦＧＦ１１１（配列番号１５）の塩基配列で表される、（１）〜（８）の形質転換用プラスミド。
（１０）（１）〜（９）の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体。
（１１）嫌気性菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、（１０）の遺伝子輸送担体。
（１２）ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、（１１）の遺伝子輸送担体。
（１３）（１０）〜（１２）の遺伝子輸送担体を含む、医薬組成物。
（１４）医薬組成物が、虚血性疾患部位における、遺伝子輸送担体の生着・増殖促進剤をさらに含む、（１３）の医薬組成物。
（１５）生着・増殖促進剤が、マルトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノースからなる群より選択される少なくとも一種である、（１４）の医薬組成物。
（１６）（１０）〜（１２）の遺伝子輸送担体を投与することを含む、虚血性疾患を診断または治療するための方法。
（１７）投与が、全身投与である、（１６）の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の形質転換用プラスミドは、新規な分泌シグナルを有する、虚血性疾患を診断および／または治療するための形質転換嫌気性菌の作製に有用な新規プラスミドであり、本発明の形質転換用プラスミドにより形質転換された嫌気性菌は、目的タンパク質を大量かつ安定的に分泌することが可能である。【００１７】
そして本発明の遺伝子輸送担体は、本発明の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなるため、たとえ全身投与された場合でも嫌気的環境下にある虚血性疾患部位に特異的に生着、増殖し、当該疾患部位において、虚血性疾患の治療活性を有するタンパク質を十分に産生、分泌することができる。したがって遺伝子輸送担体として、ひいては虚血性疾患治療剤として極めて有用である。また、虚血性疾患部位特異的に生着するため、静脈注射などの全身投与であっても虚血性疾患部位に特異的に集積して効果を発揮するものである。したがって、大量投与や複数回の投与が必要なく、投与対象の負担を軽減できる。さらに、虚血が持続する間は虚血性疾患部位の嫌気的環境が維持されるため長期的に生育するが、いったん虚血が寛解すればもはや嫌気的環境ではなくなるため、生育できなくなって速やかに消失する。【００１８】
さらに本発明の遺伝子輸送担体は、遺伝子輸送担体そのものが治療に有用なタンパク質を発現することが可能であるため、従来のように虚血性部位またはその近傍の細胞への遺伝子導入効率を考える必要がなく、常に高いタンパク質発現効率を発揮することができる。さらに、虚血性部位に特異的に送達される担体であるため、合併症の危険性も少ない。したがって、従来よりもさらに低侵襲性で副作用も少なく、安全性の高い血管新生治療を施すことが可能となる。さらに、本発明の遺伝子輸送担体にマーカーを同時に発現させることにより、虚血性部位の診断や処置のモニターに用いることも可能である。さらに、本発明の遺伝子輸送担体は複数の遺伝子を同時に送達することが可能であり、複数の有効な増殖因子を組み込み投与することによって、より効率的かつ非侵襲的な治療が可能となると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ヒトＦＧＦ２分泌シャトルプラスミドの作製に関する模式図を示す。ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅプラスミドから、ＣＤをｈＦＧＦ２（Ｈｉｓタグ付き）で置き換えてｐＦＧＦ−Ｈｕを作製し、さらにプロモーターとｈＦＧＦ２遺伝子の間にＳＰ２６Ｌ２０を挿入してｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２を作製し、そこからＨｉｓタグを除去してｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓを作製した。
【図２】図２は、ヒトＦＧＦ２（タグ付）分泌シャトルプラスミドの作製に関する模式図を示す。直鎖化ｐＨｕ−ＦＧＦ２断片に、ＳＰ５６Ｌ２０またはＳＰ６７Ｌ２０を挿入し、夫々ｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２またはｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２を作製した。
【図３】図３は、ヒトＦＧＦ２（タグなし）分泌シャトルプラスミドの作製に関する模式図を示す。直鎖化ｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓ断片に、ＳＰ５６Ｌ２０またはＳＰ６７Ｌ２０を挿入し、夫々ｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓまたはｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓを作製した。
【図４】図４は、ヒトＦＧＦ２（タグなし）分泌非シャトルプラスミドの作製に関する模式図を示す。ｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓおよびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓから、ｐＵＣｏｒｉを夫々除去し、ｐＦＧＦ１１０およびｐＦＧＦ１１１を作製した。
【図５】図５は、ＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株培養上清のウェスタンブロッティングの結果を示す。Ｍ：分子量マーカー、ＦＧＦ１１０：ＦＧＦ１１０株の培養上清濃縮物、ＦＧＦ１１１：ＦＧＦ１１１株の培養上清濃縮物、１２ａ：ＦＧＦ１２ａ株の培養上清濃縮物、Ｒ：リコンビナントヒトＦＧＦ２。ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１１株、ＦＧＦ１２ａ株について、陽性対象であるリコンビナント（分子量約１７ｋＤａ）と同じ位置にバンドが確認された。
【図６】図６は、ＳＰ５６株およびＳＰ６７株より分泌されたヒトＦＧＦ２タンパク質のＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖促進活性を示す。縦軸：４５０−６３０ｎｍでの吸光度、横軸：ヒトＦＧＦ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。ＳＰ５６、ＳＰ６７株より分泌したヒトＦＧＦ２は、ｒｈＦＧＦ２と同様に、濃度依存的な細胞増殖促進活性を有していた。
【図７】図７は、長期培養時のヒトＦＧＦ２分泌量推移を示す。縦軸：ＦＧＦ２分泌量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸：培養時間。２ｄａｙ、４ｄａｙ、７ｄａｙのいずれの時点においても、ＦＧＦ２分泌量は、高い順から、ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１１株、ＦＧＦ１２ａ株であった。ＦＧＦ１２ａ株のＦＧＦ２分泌量は、培養４日目以降に大幅に低下したが、ＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株では最後まで安定した発現・分泌が観察された。
【図８】図８は、ＦＧＦ１１０の血流改善効果を示す。縦軸：患側／健側  血流比、横軸：２回目手術後日数。ＦＧＦ１１０投与群では、ｄａｙ１４以降でＰＢＳ、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ群に比べ有意な血流改善効果を示した。この効果はｄａｙ３６まで持続した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ビフィドバクテリウム属菌由来の新規な分泌シグナルペプチドおよび該ペプチドをコードする分泌シグナル、該分泌シグナルを含む形質転換用プラスミドなどに関する。
以下本発明について詳細に説明する。
【００２１】
＜形質転換用プラスミド＞
本発明の形質転換用プラスミドは、新規の分泌シグナルユニットの働きにより、より多くの発現タンパク質をより安定的に分泌することが可能となり、したがってかかる形質転換プラスミドを用いることにより、任意の目的タンパク質を発現し、高効率で分泌することができるという、優れた、実用性の高い形質転換された嫌気性菌を作製できるという点に特徴を有するものである。
【００２２】
一側面において、本発明は、嫌気性菌を形質転換するための形質転換用プラスミドであって、該形質転換用プラスミドは、プロモーターユニット、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌シグナルユニット、および虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質（目的タンパク質）をコードするＤＮＡを含む目的遺伝子ユニットを含む、前記形質転換用プラスミドに関する。
【００２３】
本明細書において、「嫌気性菌」とは、嫌気的性質を有する細菌を意味し、「嫌気的性質」とは、酸素が少ないまたはない条件下で生育可能な性質を意味する。一般的に嫌気性菌は、酸素の存在下でも生育可能な通性嫌気性菌と、酸素の存在下では生育できない偏性嫌気性菌とに分類できるが、本発明の一態様においては、例えばビフィドバクテリウム属菌などの偏性嫌気性菌が好ましい。本発明の嫌気性菌が有する嫌気的性質は、細菌が生来有する性質であっても、突然変異や形質転換などの変異化によって得られたものであってもよい。したがって本発明の一態様において、嫌気性菌は、偏性嫌気性菌となるように変異化されたものである。例えば、ラクトバチルスなどの通性嫌気性菌であっても偏性嫌気性に変異化したものであればよい。
【００２４】
好ましい態様において、本発明の形質転換用プラスミドは、ビフィドバクテリウム属細菌を形質転換するためのものであり、さらに好ましい態様において、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換するためのものである。
【００２５】
本明細書において、「発現カセット」とは、プラスミドに含まれる特定のタンパク質またはペプチド断片を発現させるための遺伝子のセットを意味し、該セットにはプロモーターユニットおよび目的遺伝子ユニットを含み、さらに任意に他の有用なユニットを含んでもよい。他の有用なユニットとしては、例えば分泌シグナルなどのシグナルペプチドをコードする遺伝子、目的遺伝子がコードするタンパク質の分子シャペロンをコードする遺伝子などが挙げられる。
【００２６】
本願明細書において、「目的遺伝子ユニット」とは、目的のタンパク質（発現タンパク質）をコードする遺伝子を含む、発現タンパク質に関する遺伝子のセットをいう。目的遺伝子ユニットは、目的のタンパク質をコードする遺伝子以外に、他のＤＮＡを含んでもよい。目的遺伝子ユニットに含まれ得る他のＤＮＡとしては、これに限定するものではないが、例えばＨｉｓ−Ｔａｇなどの発現タンパク質を標識するペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
本発明のプラスミドは、本発明の形質転換用プラスミドによりコードされるタンパク質が嫌気性菌体中で産生され、菌体外に放出されて治療効果を奏するように、分泌シグナルユニットを含む。
【００２７】
本願明細書において、「分泌シグナルユニット」とは、分泌シグナル配列を含む、発現タンパク質を菌体外に分泌するためのアミノ酸配列をコードする遺伝子のセットをいう。本明細書において、単に「分泌シグナル」という場合、または「分泌シグナル配列」という場合は、分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子またはそのＤＮＡ配列を意味する。分泌シグナルユニットは分泌シグナル配列の他、例えば目的遺伝子と分泌シグナル配列の間に挿入されるスペーサーペプチドをコードするＤＮＡなど、他のＤＮＡを含んでもよい。
【００２８】
本発明の分泌シグナルユニットに含まれる分泌シグナル配列は、ＳＰ５６（配列番号１）またはＳＰ６７（配列番号２）で表される新規な分泌シグナルペプチドをコードする配列である。なお、配列番号１および配列番号２で表される分泌シグナルペプチド配列に対応する分泌シグナル配列は、夫々配列番号３および配列番号４で表されるものの他、その縮重配列を含む。以下、本明細書において、アミノ酸配列を「コードするＤＮＡ」またはアミノ酸配列に「対応する塩基配列」などといった場合、別段の記載のない限り、例として示されている特定配列の他、その縮重配列を含むことを意図する。
【００２９】
ＳＰ５６（配列番号１）またはＳＰ６７（配列番号２）で表される新規な分泌シグナルペプチドは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのゲノムデータベースに登録された全アミノ酸配列から、分泌シグナルペプチド予測プログラムを用いて抽出された候補の中からさらに選抜された分泌シグナルペプチドであり、本発明者らにより初めて有用な分泌シグナルペプチドであることが確認されたものである。
【００３０】
本発明の分泌シグナルペプチドＳＰ５６およびＳＰ６７はとくに優れた分泌活性を有し、また非病原性の偏性嫌気性菌であるビフィズス菌で機能するため、ＳＰ５６およびＳＰ６７をコードするＤＮＡは、嫌気的疾患、とくに虚血性疾患の診断または治療用嫌気性菌の形質転換用プラスミドに用いるのに特に好適である。したがって、ＳＰ５６およびＳＰ６７をコードするＤＮＡを含む、任意の形質転換用プラスミドもまた、本発明に包含される。
【００３１】
一態様において、本発明の目的遺伝子ユニットは、発現タンパク質として虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
本明細書において、「虚血」とは、血管の狭窄や閉塞により、組織に供給される動脈血量が減少することによる組織の酸素・栄養欠乏状態を意味し、持続的な虚血は組織の萎縮や変性、壊死などを生じる。
【００３２】
本発明の形質転換用プラスミドは、主に血管新生治療、臓器の保護など、虚血によって引き起こされる好ましくない状態を改善する処置法において好適に用いられるものである。したがって本明細書において「虚血性疾患」とは、自覚症状の有無に拘わらず、動脈の狭窄や閉塞により、組織の虚血が持続している状態、またはかかる虚血により引き起こされる好ましくない状態をいう。虚血性疾患としては、これに限定するものではないが例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞などの脳虚血疾患、もやもや病などの慢性脳虚血疾患、脊髄虚血疾患、虚血性大腸炎、腸間膜動脈閉塞症などの虚血性腸疾患、閉塞性動脈硬化症やバージャー病などの下肢虚血疾患、糖尿病網膜症などの網膜虚血疾患などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において「虚血性部位」とは、虚血によって動脈血量、栄養および酸素が減少している状態の部位を意味し、「虚血性疾患部位」または「虚血性疾患組織」と互換的に用いられる。
【００３４】
虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質としては、これに限定するものではないが、例えば血管新生促進活性を有するタンパク質、血管拡張に関与するタンパク質などが挙げられる。血管新生促進活性を有するタンパク質としては、これに限定するものではないが、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどが挙げられ、血管拡張に関与する因子としては、プロスタグランジン類などが挙げられる。他の治療に有用なタンパク質としては、コロニー刺激因子（例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（例えばニューロトロフィン３など）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）などが挙げられる。虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質として、特に好ましくは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である。
【００３５】
本発明において、「プロモーターユニット」とは、プロモーターおよび任意に他の転写制御に関係する領域を含むユニットであり、他の転写制御に関係する領域としては、例えばオペレーター、ターミネーターなどが挙げられる。
本発明のプロモーターユニットに含まれるプロモーターは、嫌気性菌で機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、ビフィズス菌由来の分泌シグナルの上流に位置しているプロモーターまたはビフィズス菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（Hu promoter）などを含む。一態様において、本発明のプロモーターユニットに含まれるプロモーターは、例えばＨｕプロモーター（配列番号１３）や、Ｐ３７プロモーター（配列番号１６）であってもよく、好ましくはＨｕプロモーターである。本発明のプロモーターユニットに含まれるプロモーターは、プロモーターとしての機能を失わない範囲で、その塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加されたもの（機能的同等物）で表されてもよい。
【００３６】
本発明の一態様において、プロモーターユニットはターミネーターを含む。含まれ得るターミネーターとしては、ビフィズス菌で機能するものであればいかなるものでもよいが、ビフィズス菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のターミネーター（Ｈｕターミネーター）が好ましく、特に、配列番号３８の塩基配列またはその１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡが最も好ましい。
【００３７】
本発明の一態様において、分泌シグナルユニットは、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に続けて、スペーサーペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む。
【００３８】
本明細書において、「スペーサーペプチド」とは、分泌シグナルペプチドと目的タンパク質のＮ末端の間に挿入されるペプチドである。したがって、スペーサーペプチドをコードするＤＮＡは、発現カセット中、分泌シグナルの下流側かつ目的タンパク質をコードする遺伝子の上流側に存在するＤＮＡとなる。
【００３９】
スペーサーペプチドが存在することにより、目的タンパク質の分泌効率が上がる。したがって好ましい一態様において、スペーサーペプチドは、１〜２５アミノ酸長であり、より好ましくは１〜２０アミノ酸長、さらに好ましくは５〜２０アミノ酸長である。スペーサーペプチドの配列は特に限定されないが、好ましくは、ＳＰ５６の場合は配列番号５で表されるペプチドまたはそのＮ末端を含む部分ペプチドであり、ＳＰ６７の場合は配列番号６で表されるペプチドまたはそのＮ末端を含む部分ペプチドである。
【００４０】
配列番号５および６はそれぞれ、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいてＳＰ５６およびＳＰ６７により分泌されるタンパク質のＮ末端〜２５番目のアミノ酸までの配列で構成されるペプチドである。上記の好ましい態様において、本発明のスペーサーペプチドは、例えばＳＰ５６の場合、配列番号５で表されるペプチドの１番目のアミノ酸のみからなる１アミノ酸長の部分配列、配列番号５の１番目のアミノ酸から１５番目のアミノ酸までの１５アミノ酸長の部分配列、配列番号５の１番目のアミノ酸から２０番目のアミノ酸までの２０アミノ酸長の部分配列、または配列番号５の２５アミノ酸長の全配列で表されるペプチドなどであってよく、ＳＰ６７の場合、配列番号６で表されるペプチドの１番目のアミノ酸のみからなる１アミノ酸長の部分配列、配列番号６の１番目のアミノ酸から１５番目のアミノ酸までの１５アミノ酸長の部分配列、配列番号６の１番目のアミノ酸から２０番目のアミノ酸までの２０アミノ酸長の部分配列、または配列番号６の２５アミノ酸長の全配列で表されるペプチドなどであってよい。
なお、配列番号５および配列番号６で表されるアミノ酸配列に対応する塩基配列は、好ましくは、夫々配列番号７および配列番号８で表されるものである。
【００４１】
本発明のより好ましい一態様において、分泌シグナルユニットは、ＳＰ５６と２０アミノ酸分のスペーサーペプチドとからなる、配列番号９で表されるアミノ酸配列、またはＳＰ６７と２０アミノ酸分のスペーサーペプチドとからなる、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。なお、配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対応する塩基配列は、好ましくは夫々配列番号１１および配列番号１２で表されるものである。
【００４２】
本発明の一態様において、形質転換用プラスミドとしては、プロモーターユニット、配列番号１または配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌シグナルユニット、および虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを含む目的遺伝子ユニットを含み、嫌気性菌を形質転換するために機能し、該菌の嫌気的性質を損なうものでなければ、いかなるプラスミドも用い得る。しかしながら、形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体を医薬とする場合には、形質転換用プラスミドが、例えば大腸菌など、体内の別の細菌に水平伝達され、水平伝達された別の細菌でプラスミドが複製され、その結果意図しない部位でプラスミドがコードするタンパク質が発現する危険性が否定できない。したがって、好ましい態様において、形質転換用プラスミドは非シャトルプラスミドである。
【００４３】
本明細書において、「シャトルプラスミド」とは、２種以上の異なる宿主において複製可能なプラスミドを意味し、「シャトルベクタープラスミド」と互換的に用いられる。したがって、「非シャトルプラスミド」とは、１種の宿主のみにおいて複製可能なプラスミドを意味する。すなわち上記の態様において、形質転換用プラスミドは、形質転換対象の嫌気性菌で機能する複製開始点のみを具有し、それ以外の菌で機能する複製開始点を具有しないものであり、大腸菌など、形質転換嫌気性菌以外の菌では複製されないプラスミドである。
【００４４】
本発明の形質転換用プラスミドは、他の有用な遺伝子をさらに含んでも良い。他の有用な遺伝子には、例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰＣＭ）などの選択マーカー遺伝子、ビフィズス菌プラスミド複製開始点（ｐＴＢ６）などの複製開始点、ＧＦＰなどの標識タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００４５】
好ましい態様において、本発明の形質転換用プラスミドは、ｐＦＧＦ１１０（配列番号１４）またはｐＦＧＦ１１１（配列番号１５）である。
【００４６】
本発明の形質転換用プラスミドは、例えば、以下のようにして作製することができる。
例えば、通常の手法に従って、形質転換菌と形質転換菌以外の菌、例えばビフィズス菌と大腸菌でそれぞれ機能する複製開始点を有するシャトルプラスミドに、少なくとも１種の、プロモーターユニット、分泌シグナルユニット、所望の虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ（目的遺伝子ユニット）を挿入する事により、シャトルプラスミドを作製することができる。
【００４７】
そして、所望により、このシャトルプラスミドから形質転換菌以外の菌の複製開始点を除去することにより、非シャトルプラスミドを作製することができる。
なお、上記各工程における操作は、遺伝子工学分野の公知の方法に準じて行うことができる。
【００４８】
＜遺伝子輸送担体＞
一側面において、本発明は、上記本発明の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体に関する。
【００４９】
本発明の遺伝子輸送担体は、本発明の形質転換用プラスミドで形質転換された上記の嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体であり、嫌気的環境下にある組織内で生育でき、かつ、目的とする活性を有するタンパク質を発現・分泌することができるものである。
【００５０】
本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患部位特異的に生着するため、目的タンパク質は必然的に虚血性疾患部位で特異的に発現・分泌されることとなる。したがって、虚血性疾患の診断または治療に用いるタンパク質を発現できる本発明の遺伝子輸送担体は、効果的に虚血性疾患を診断または処置することができる。
【００５１】
本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患部位特異的に生着するため、該遺伝子輸送担体の存在を検出することで、虚血性疾患部位を診断することが可能となる。遺伝子輸送担体の検出は、例えば遺伝子輸送担体を標識することにより簡便に行うことができる。疾患の診断に用いるという観点から、検出は侵襲性が少ないことが好ましく、標識による生体への悪影響が少ないことが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、遺伝子輸送担体は、診断に有用なタンパク質として蛍光タンパク質を発現する。蛍光タンパク質としては、各種の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などを挙げることができる。
【００５２】
本発明の遺伝子輸送担体は、体内に投与することを前提とするものであるから、用いられる嫌気性菌は毒性を有さないかまたは毒性が低いものである必要がある。例えば、クロストリジウムやサルモネラなどの病原性の菌であっても非病原性化したものであれば本発明に用いることができる。したがって、本発明の一態様において、本発明の嫌気性菌は、病原性の菌を低毒性に変異化したものであり得る。しかしながら、低毒性に変異化した細菌は、逆変異化して元の病原性菌に戻り、有害性を発揮する可能性があるため、生来的に非病原性の細菌であることが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、嫌気性菌は非病原性の腸内細菌を用いる。
【００５３】
本発明に用い得る非病原性腸内細菌としては、好ましくはビフィドバクテリウム属菌（ビフィズス菌）が挙げられる。ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アングラタム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アステロイデス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ボウム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム、ビフィドバクテリウム・コエリナム、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ、ビフィドバクテリウム・クニクリ、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・ガリクム、ビフィドバクテリウム・ガリナラム、ビフィドバクテリウム・グロボサム、ビフィドバクテリウム・インディクム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・イノピナタム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス、ビフィドバクテリウム・リベロラム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・マグナム、ビフィドバクテリウム・メリシクム、ビフィドバクテリウム・ミニマム、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス、ビフィドバクテリウム・パルブロラム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウム・プロラム、ビフィドバクテリウム・ルミナレ、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム、ビフィドバクテリウム・サエクラレ、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ、ビフィドバクテリウム・サブタイル、ビフィドバクテリウム・スイス、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラムなどが挙げられ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが最も好ましい。
【００５４】
これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７等は、ＡＴＣＣ（The American Type Culture Collection）から容易に入手することができる。
【００５５】
また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株が好ましい。
【００５６】
ビフィドバクテリウム・ブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株が好ましい。
【００５７】
ビフィドバクテリウム・インファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株が好ましい。
また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２２０）を挙げることができる。
【００５８】
本発明の遺伝子輸送担体は、形質転換する任意の嫌気性菌を、上記本発明の形質転換用プラスミドを用いて、遺伝子工学分野の公知の方法にしたがって形質転換することにより作製することができる。
【００５９】
本発明の遺伝子輸送担体の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル（講談社）、高木康敬編遺伝子操作実験法（講談社）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning，2nd ed．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1989）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol．），194（1991）、等に記載された方法に従って行うことができる。
【００６０】
＜医薬組成物＞
一側面において、本発明は、上記本発明の遺伝子輸送担体を含む、医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。本発明の遺伝子輸送担体は、少なくとも１種含まれていればよく、２種以上含まれていてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体以外の虚血性疾患治療効果を示す化合物を含有する医薬組成物や虚血性疾患治療剤と組み合わせて用いることができる。
【００６１】
また、本発明の医薬組成物は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、遺伝子輸送担体の生着・増殖促進剤等が挙げられる。生着・増殖促進剤としては、これに限定するものではないが例えば、マルトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノースなどの本発明の遺伝子輸送担体に用いられている形質転換菌が資化可能な糖などが挙げられる。
【００６２】
本発明の医薬組成物の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液もしくは補液または医薬添加物を加えてアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプルまたはバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥またはＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥またはＬ乾燥した後これをアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射、すなわち全身投与が最も好ましい。
本発明の医薬組成物の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患部位において生育でき、且つ、有効治療量の活性タンパク質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点および副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。
【００６４】
本発明の医薬組成物における遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。
例えば、本発明の医薬組成物を用いる際には、用いる嫌気性菌の菌自体が示す疾患治療活性、用いる嫌気性菌が産生する疾患治療活性を有するタンパク質等の種類、および用いる嫌気性菌の当該活性タンパク質の産生量などによって、適宜設定する。
【００６５】
具体的には、例えば静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、または適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１日１〜複数回に分け、１〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、または適当な補液で希釈して、１日１〜数回に分け、１〜数日連続して投与する。
【００６６】
また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明のビフィズス菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１日１〜複数回、必要に応じ１〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、１日数回、必要に応じ１〜数日連続して投与する。
【００６７】
治療期間中に疾患組織中の菌が消失していることが確認された場合は、一旦治療を中断し、上記と同様にして菌を投与する。
なお、本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
【００６８】
本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患部位特異的に生着、増殖するものであり、嫌気的環境下にない正常組織においては増殖することがない。したがって、虚血性疾患部位を狙った局所投与でなくても、疾患部位特異的に遺伝子が送達される。したがって、投与の簡便さ、侵襲性の低さなどの観点から、好ましくは、本発明の医薬組成物は全身投与される。
【００６９】
＜診断方法または治療方法＞
一側面において、本発明は、前述されたいずれかの遺伝子輸送担体を投与することを含む、虚血性疾患を診断または治療するための方法に関する。
本発明の遺伝子輸送担体を用いることにより、高効率で安全性の高い診断または治療が可能となる。
本発明の方法において、本発明の遺伝子輸送担体を、虚血性疾患を有する対象に投与する。投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射、すなわち全身投与が最も好ましい。
【００７０】
したがって、本発明の方法の好ましい態様において、本発明の遺伝子輸送担体を全身投与する。本発明の遺伝子輸送担体は、遺伝子を虚血性疾患部位特異的に送達することができるため、カテーテルや筋肉内注射などを用いて患部に直接投与しなくても、静脈注射などにて全身投与した場合であっても、虚血性疾患部位特異的に生着、増殖して効果を発揮することができる。したがって、従来の治療法と比較しても非常に侵襲性が低い治療が可能となる。
【実施例】
【００７１】
以下、参考例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【００７２】
実施例１：分泌シグナルペプチドの同定
以下の手順で、分泌シグナルペプチドＳＰ５６およびＳＰ６７を同定した。
ＮＣＢＩのゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）に登録されているビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５株由来タンパクの全アミノ酸配列を分泌シグナルの有無を予測するシグナル配列予測プログラムSignalP 4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)で解析した。この解析により、タンパクのＮ末端に分泌シグナルペプチド配列を有すると予測されたタンパクの一部のアミノ酸配列に対し、膜貫通領域（ＴＭ）を推定するプログラムTMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)にてトポロジー解析を行った。このトポロジー解析結果より、タンパク質のＮ末端にＴＭが存在すると推定されたタンパク質を選定した。これらのタンパク質を、ＴＭを有すると予想されるビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５株由来の分泌シグナルペプチドとして選定した。選定した分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列に対応するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ株のアミノ酸配列において、各タンパク質のアミノ酸配列Ｎ末端からＳｉｇｎａｌＰ解析によってプロテアーゼ切断推定部位と推定されたアミノ酸配列までを各分泌シグナルペプチド配列（ＳＰ５６およびＳＰ６７）とした。また、スペーサーペプチド配列は、各シグナル配列のＣ末端より続く２０アミノ酸残基とし、これらを分泌シグナルユニットとした。用いた分泌シグナルユニットの配列を以下に示した。ＳＰ５６とそのスペーサーペプチド（配列番号９）、ＳＰ６７とそのスペーサーペプチド（配列番号１０）。【００７３】
実施例２：各種ｈＦＧＦ２分泌プラスミドの作製
プラスミド作製に使用したＰＣＲ用プライマーを表１に示す。
【表１】
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【００７４】
１．プラスミドｐＦＧＦ−Ｈｕの作製
（１）ヒトＦＧＦ２−ＨｉｓＴａｇインサート断片（インサート断片１）の調製
Ｃ末端にヒスチジンタグを融合したヒトＦＧＦ２をコードするＤＮＡを含むプラスミド「ｈＦＧＦ２  ｉｎ  ｐＵＣ５７」をGenScript社より入手した。ｈＦＧＦ２のＤＮＡ配列は、ｈＦＧＦ２（GenBank Accession No. #NM_002006のＡＵＧより翻訳開始の約１８ｋＤａのタンパク質）のアミノ酸配列に基づき、コドンをビフィズス菌用に最適化した人工ＤＮＡ配列(配列番号３１)である。このプラスミドｈＦＧＦ２  ｉｎ  ｐＵＣ５７  １ｎｇを鋳型として、ＦＧＦ４プライマー（フォワード）およびＦＧＦ３プライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量を５０μＬとして、PrimeSTAR HS（Premix）キット（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒(変性反応)、５５℃にて５秒(アニーリング反応)、７２℃にて３０秒（伸長反応）を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒追加伸長反応を行い、約０．５ｋｂｐのｈＦＧＦ２−ＨｉｓＴａｇインサート断片（インサート断片１）を調製した。【００７５】
（２）ベクター断片１の調製
プラスミドｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ（国際公開番号第２００９／１２８２７２号）（配列番号３２）  １ｎｇを鋳型として、ＦＧＦ１プライマー（フォワード）およびＦＧＦ２プライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を上記と同様に行った。ただし、ＰＣＲの伸長反応は、７２℃にて４分とした。ベクター断片１の長さは、約３．９ｋｂｐである。【００７６】
（３）インフュージョン反応
上記で調製したインサート断片１とベクター断片１をIn-Fusion（登録商標）HD Cloningキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結した。すなわち、マイクロチューブに、上記ベクター断片５０ｎｇとインサート断片１３ｎｇとを添加し、キット内の５×In-Fusion HD Enzyme premix  ２μＬ、Cloning Enhancer  １μＬをさらに添加し、０．１×ＴＥバッファー（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にて反応液容量を１０μＬに調整した。これを３７℃にて１５分間保温した後、さらに５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書に従い、インフュージョン反応液１を調製した。【００７７】
（４）大腸菌の形質転換およびプラスミドｐＦＧＦ−ＨｕのＤＮＡ配列確認
上記インフュージョン反応液１を用いて、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞（インビトロジェン）の形質転換を製品説明書に従い行った。形質転換後の菌懸濁液は、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養した。上記寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩振とう培養し、これよりQIAprep Spin Miniprepキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドにおける上記ヒトＦＧＦ２発現カセット含む領域（５’−Ｈｕプロモーター−ヒトＦＧＦ２タンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列を決定するため、Big Dye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencingキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシーケンス反応を行った。抽出したプラスミドをｐＦＧＦ−Ｈｕと名付けた。【００７８】
２．プラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２およびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２の作製
（１）ＳＰ５６Ｌ２０およびＳＰ６７Ｌ２０インサート断片（インサート断片２および３）の調製
ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に記載のＳＰ５６−ｉｎｓ＿Ｆ１プライマー（フォワード）およびＳＰ５６−ｉｎｓ＿Ｒ１＿ＦＧＦプライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量を２０μＬとして、PrimeSTAR HS（Premix）キット（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約０．２ｋｂｐのＳＰ５６Ｌ２０インサート断片増幅産物（インサート断片２）を調製した。
ＳＰ６７Ｌ２０インサート断片（インサート断片３）は、ＰＣＲ増幅プライマーとしてＳＰ６７−ｉｎｓ＿Ｆ１プライマー（フォワード）およびＳＰ６７−ｉｎｓ＿Ｒ１＿ＦＧＦプライマーを用いた以外は、上記と同様に調製した。【００７９】
（２）ヒトＦＧＦ２タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター断片２の調製
プラスミドｐＦＧＦ−Ｈｕを鋳型として、表１記載のＦＧＦ３５プライマー（フォワード）およびＨｕＰｒｏｍ＿Ｒプライマー（リバース）のプライマーセットを用いて、上記インサート断片の調製と同様の方法にてＰＣＲ増幅を行った。ただし、ＰＣＲの反応容量を５０μＬとした。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて４分３０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約４．３ｋｂｐのベクター断片増幅産物を調製した。このＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル（エチジウムブロマイド含有）にて電気泳動を行い、ＵＶにて照射しながら約４．３ｋｂｐのＤＮＡバンドを含むゲルを切出した。このゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ベクター断片２（直鎖化ｐＨｕ−ＦＧＦ２断片、配列番号３３）とした。【００８０】
（３）インフュージョン反応
上記で調製したインサート断片２またはインサート断片３とベクター断片２をそれぞれIn-Fusion（登録商標）HD Cloningキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結した。すなわち、マイクロチューブに、上記ベクター断片増幅産物６８ｎｇとインサート断片増幅産物６．１５ｎｇ（インサート断片２の場合）或いは６．５５ｎｇ（インサート断片３の場合）とを添加し、キット内の５×In-Fusion HD Enzyme premix  ２μＬ、Cloning Enhancer  １μＬをさらに添加し、０．１×ＴＥバッファー（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にて反応液容量を１０μＬに調整した。これを３７℃にて１５分間保温した後、さらに５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書に従い、インフュージョン反応液２を調製した。【００８１】
（４）大腸菌の形質転換１およびプラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２およびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２のＤＮＡ配列確認
上記インフュージョン反応液２を用いて、大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞（タカラバイオ株式会社製）の形質転換を製品説明書に従い行った。形質転換後の菌懸濁液は、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養した。上記寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩振とう培養し、これよりQIAprep Spin Miniprepキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドにおける上記ヒトＦＧＦ２分泌発現カセット含む領域（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ５６Ｌ２０−ヒトＦＧＦ２タンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）あるいは（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６７Ｌ２０−ヒトＦＧＦ２タンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列を上記１．（４）と同様に行った。抽出したプラスミドをそれぞれｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２およびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２と名付けた。各プラスミドのヒトＦＧＦ２分泌発現カセットを含む領域の配列をそれぞれ配列番号３４および３５に示す。【００８２】
３．プラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓの作製
（１）ＳＰ２６Ｌ２０インサート断片（インサート断片４）の調製
ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５ＡのゲノムＤＮＡ  ８０ｎｇを鋳型として、Ｈｕ＿ＳＰ２６＿Ｆプライマー（フォワード）およびＦＧＦ＿ＳＰ２６Ｌ２０＿Ｒプライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を上記２．（１）と同様に行った。ただし、ＰＣＲの伸長反応は、７２℃にて１４秒、ＰＣＲ溶液量は２０μＬとした。インサート断片の長さは、約０．１ｋｂｐである。【００８３】
（２）インフュージョン反応
上記で調製したインサート断片４とベクター断片２を用いて、上記２．（３）と同様に、In-Fusion反応を行い、インフュージョン反応液３を調製した。ただしIn-fusion反応に用いたベクター量を５０ｎｇ、インサート量を４．２ｎｇとした。【００８４】
（３）大腸菌の形質転換２およびプラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２のＤＮＡ配列確認
上記インフュージョン反応液３を用いて、上記１．（４）と同様の方法にて、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのＤＮＡ抽出、ヒトＦＧＦ２発現カセット含む領域（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ２６Ｌ２０−ヒトＦＧＦ２タンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２と名付けた。【００８５】
（４）ヒトＦＧＦ２インサート断片（インサート断片５）の調製
プラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２  １ｎｇを鋳型として、ＦＧＦ３５プライマー（フォワード）およびＦＧＦ−Ｈｉｓ＿Ｒプライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を上記２．（１）と同様に行った。ただし、ＰＣＲのアニーリング温度は６０℃、伸長反応は、７２℃にて３５秒とした。インサート断片の長さは、約０．５ｋｂｐである。
（５）ベクター断片３の調製
プラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２  １ｎｇを鋳型として、ＦＧＦ−Ｈｉｓ＿Ｆプライマー（フォワード）およびＦＧＦ＿ＳＰ２６Ｌ２０＿Ｒプライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を上記２．（２）と同様に行った。ただし、ＰＣＲのアニーリング温度は６０℃、伸長反応は、７２℃にて４分１０秒とした。ベクター断片の長さは、約４ｋｂｐである。【００８６】
（６）インフュージョン反応
上記で調製したインサート断片５とベクター断片３を用いて、上記２．（３）と同様に、In-Fusion反応を行い、インフュージョン反応液４を調製した。ただしIn-fusion反応に用いたベクター量を２０ｎｇ、インサート量を４ｎｇとした。
（７）大腸菌の形質転換３およびプラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓ配列確認
上記インフュージョン反応液４を用いて、上記２．（４）と同様の方法にて大腸菌の形質転換、組換え大腸菌からのＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡを用いて、ヒトＦＧＦ２発現カセット含む領域（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ２６Ｌ２０−ヒトＦＧＦ２タンパク質−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓと名付けた。【００８７】
４．プラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓおよびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓの作製
（１）ヒトＦＧＦ２タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター断片４の調製
プラスミドｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓを鋳型としたほかは、上記２．（２）と同様の方法にてＰＣＲを行い、ベクター断片４（直鎖化ｐＨｕＳＰ２６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓ断片、配列番号３６）を調製した。【００８８】
（２）インフュージョン反応
上記で調製したインサート断片２または３（ＳＰ５６またはＳＰ６７）およびベクター断片４を、上記２．（３）と同様の方法で行い、インフュージョン反応液５を調製した。ただし、ベクター量は７５ｎｇとした。【００８９】
（３）大腸菌の形質転換４およびプラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓおよびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓのＤＮＡ配列確認
上記２．（４）と同様の手順にて、上記インフュージョン反応液５を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドの全長配列の決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓおよびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓと名付けた。【００９０】
５．プラスミドｐＦＧＦ１１０およびｐＦＧＦ１１１の作製
（１）プラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓおよびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓからのｐＵＣｏｒｉ除去
上記プラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓまたはｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２−ｄＨｉｓ  ３μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（Thermo Scientific社）およびＢｇｌ  ＩＩ（Thermo Scientific社）にて消化し、約０．７  ｋｂｐのｐＵＣ  ｏｒｉを含むＤＮＡ断片とそれ以外の部分（約３．８ｋｂｐ）の２つの断片に切断した。この反応液を０．８％アガロースゲル（エチジウムブロマイド含有）にて電気泳動し、ＵＶにて照射しながら約３．８ｋｂｐのＤＮＡバンドを含むゲルを切出した。このゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出し、これらをそれぞれ直鎖化非シャトルプラスミドｐＦＧＦ１１０およびｐＦＧＦ１１１とした。【００９１】
（２）非シャトルプラスミドｐＦＧＦ１１０およびｐＦＧＦ１１１の作製
上記直鎖化非シャトルプラスミドのセルフライゲーションを、Rapid DNA Ligation Kit（Thermo Scientific社）を用いて以下のように行った。即ち、上記直鎖化非シャトルプラスミド４００ｎｇに、上記キット添付の５×Rapid Ligation Buffer  ８０μＬ、T4 DNA Ligase  ８μＬを加え、０．１×ＴＥにて４００μＬとした。これを８０μＬずつ５本のマイクロチューブに分注し、２２℃にて５分間反応させ、セルフライゲーション反応を行った。この反応液を一つにまとめ、Proteinase K処理、次いでフェノール・クロロホルムによる除タンパク質、クロロホルム抽出およびアルコール沈殿を常法にて行った。アルコール沈殿させたＤＮＡを０．１×ＴＥに溶解し、非シャトルプラスミドｐＦＧＦ１１０（配列番号１４）およびｐＦＧＦ１１１（配列番号１５）とした。【００９２】
実施例３：組換えビフィズス菌の作製
（１）ＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株の作製
上記で作製した非シャトルプラスミドｐＦＧＦ１１０およびｐＦＧＦ１１１のＤＮＡ溶液を用いて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステム（ジーンパルサーＩＩ、バイオ・ラッド社製）により行なった。電気ショック（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）後は、キュベット（２ｍｍギャップ）に８００μＬのＩＭＲ液体培地と５０μＬのビタミンＣ添加液（１００ｍＬあたりアスコルビン酸３５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物２ｇおよび炭酸ナトリウム１１ｇを含む溶液）との混合液を即時に添加し、これを滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに回収した。この２ｍＬチューブの蓋をゆるめて、脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック（登録商標）・ケンキ、三菱ガス化学株式会社製）とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて３時間保温した。【００９３】
保温後の各菌懸濁液を７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地に塗布した。これらのプレートを上記脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて２日間培養した。【００９４】
上記スペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地上に形成したコロニーのうち、プラスミドｐＦＧＦ１１０での形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＦＧＦ１１０株（以下、ＦＧＦ１１０株という）、プラスミドｐＦＧＦ１１１での形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＦＧＦ１１１株（以下、ＦＧＦ１１１株という）とした。【００９５】
（２）ＳＰ５６株およびＳＰ６７株の作製
シャトルプラスミドｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２およびｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２を用いて、上記（１）と同様の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換を行い、それぞれビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ５６Ｌ２０−ＦＧＦ２株（以下、ＳＰ５６株という）、およびビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ＦＧＦ２株（以下、ＳＰ６７株という）を得た。【００９６】
（３）陰性対照株の作製
ベクター骨格であるWO2011/093467に記載のｐＢＥｓｈｕｔｔｌｅ（配列番号３７）を用いて、上記（ＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株の作製）と同様の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換を行い、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株（以下、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株という）を得た。【００９７】
実施例４：発現タンパク質の解析
（１）組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養
上記ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１１株および特許文献７（WO2013/008881）に記載のビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＦＧＦ１２ａ株（以下、ＦＧＦ１２ａ株という）を、スペクチノマイシン（終濃度７５μｇ／ｍＬ）およびビタミンＣ添加液１００μＬを添加したＭＲＳ（ベクトン・ディッキンソン社製）液体培地１０ｍＬに植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養し、活性化培養液とした。次に、ＤＭＥＭ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１１８８５−０８４：ライフテクノロジーズ社製）：ＭＲＳを９：１の割合で混合した培地２０ｍＬに、ビタミンＣ添加液１００μＬ、スペクチノマイシンを７５μｇ／ｍＬになるよう添加し、上記活性化培養液１００μＬを植菌した。これを３７℃にて１５時間嫌気培養した。【００９８】
（２）サンプル調製
上記組換えビフィズス菌培養液の上清を常法に従いトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿し、１×ＳＤＳサンプルバッファーにて再溶解した。これを、９５℃にて３分間加熱処理し、ウェスタン解析に供した。
（３）ウェスタンブロッティング
上記各培養上清濃縮物（培養上清０．２ｍＬ相当）および陽性対照であるリコンビナントヒトＦＧＦ２（Peprotech社，分子量１７．２ｋＤａ）をミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸＴＭゲル（４〜２０％）（バイオ・ラッド社製）にて電気泳動し、ゲルをＰＶＤＦ膜（メンブラン）（iBlot Transfer Stacks、ライフテクノロジーズ社製）にiBlotトランスファーデバイス（ライフテクノロジーズ社製）を用いて転写した。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜をブロッキング（２％  ECL Prime Blocking agent（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製）ｉｎ  ＴＴＢＳ）した。一次抗体として、Anti FGF-2 human rabbit poly（Ｈ−１３１、Santa Cruz Biotechnology Inc.）を加え、４℃にて一晩振とうした。一次抗体反応後、メンブランをＴＴＢＳにて約５分の洗浄を６回繰り返し、二次抗体Goat anti-rabbit IgG HRP（Santa Cruz Biotechnology Inc.）を加え、室温にて１時間振とうした。抗体反応終了後のメンブランを、Western Lightning Ultra（パーキンエルマー社製）を用いて発光させた。これをイメージング装置（Fluor-S MAX、バイオ・ラッド）にて解析した。【００９９】
（４）結果
結果を図５に示す。ＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株について、予想される分子量、約２０ｋＤａのバンドが確認された。【０１００】
実施例５：ビフィズス菌よりＨｉｓ−ｔａｇ精製したＦＧＦ２の生理活性測定
（１）ＳＰ５６株およびＳＰ６７株の培養上清からのヒトＦＧＦ２精製
上記実施例４と同様の方法でＳＰ５６株およびＳＰ６７株の培養を行った。この培養液を遠心分離して上清を回収し、硫酸アンモニウム沈殿を常法にて行った。さらに、ヒスチジンタグを有するタンパク質用精製キット（TALON（登録商法） Metal Affinity Resin、タカラバイオ社製）を用いてアフィニティー精製した。これを、限外ろ過カセット（アミコンウルトラ−４、１０Ｋ、ミリポア）を用いてバッファーをＰＢＳに置換し、精製ヒトＦＧＦ２溶液を得た。この精製溶液中のヒトＦＧＦ２量を、Quantikine ELISA FGF2 basic Immunoassay（R&D Systems；ＤＦＢ５０）を用いて測定した。【０１０１】
（２）ＳＰ５６株およびＳＰ６７株分泌物中のＦＧＦ２タンパク質の増殖促進活性
ＦＧＦ２の生理活性は、ＳＰ５６株およびＳＰ６７株の培養上清より上記のように精製したヒトＦＧＦ２をＮＩＨ／３Ｔ３細胞（マウス線維芽用細胞株）に添加し、細胞増殖促進活性にて評価した。即ち、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養後、ＤＭＥＭ培地（５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）にて９６穴プレートに１×１０３個ずつ播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。次に、上記ＳＰ５６株およびＳＰ６７株由来ヒトＦＧＦ２精製物またはリコンビナントｈＦＧＦ２（R&D systems）を、ＦＧＦ２濃度が０．２５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬになるようＤＭＥＭ培地（５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）と混合した培地と交換した。陰性対照として、ＦＧＦ２溶液の代わりにＰＢＳ（−）を混合した培地への交換も同様に行った。このプレートを３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。
上記プレートに、Cell Counting kit-8（株式会社同仁化学研究所）１００μＬずつを添加後、さらに２時間３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で保温し、波長４５０ｎｍと６３０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定することにより上記ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対する細胞増殖促進活性を測定した。【０１０２】
（３）結果
結果を図６に示す。
ＳＰ５６、ＳＰ６７株より分泌したヒトＦＧＦ２は、濃度依存的な細胞増殖促進活性を有していた。【０１０３】
実施例６：ＦＧＦ２分泌量の安定性比較
（１）方法
WO2013/008881に記載のビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＦＧＦ１２ａ株および上記ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１０株のグリセリンストックを、ＭＲＳ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１％ビタミンＣ添加液）培地１０ｍＬに１％植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養し、活性化培養液とした。ついで、活性化培養液を同培地に１％植菌し、同様に２４時間培養して継代培養液とした。以降２４時間毎に同様の継代を繰り返した。
ヒトＦＧＦ２分泌量測定前日には、上記継代培養液を、ヒトＦＧＦ２測定用培地であるＤＭＥＭ：ＭＲＳ（９：１）（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１％ビタミンＣ添加液含有）培地へと０．５％植菌し、３７℃で１３時間培養した。ヒトＦＧＦ２分泌量測定はグリセリンストックからの培養後２日目、４日目、７日目に行った。
ヒトＦＧＦ２測定用培地での培養液を遠心分離して培養上清を得た。この培養上清中のＦＧＦ２タンパク量を、Quantikine ELISA FGF2 basic Immunoassay（R&D Systems；ＤＦＢ５０）を用いて測定した。【０１０４】
（２）結果
結果を図７に示す。
ＦＧＦ２分泌量は、高い順から、ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１１株、ＦＧＦ１２ａ株であった。
ＦＧＦ１２ａ株は、培養４日目以降にＦＧＦ２分泌量が大幅に低下した。【０１０５】
実施例７：ＦＧＦ１１０株投与慢性虚血モデルマウス患肢血流量の推移
本発明の遺伝子輸送担体の、虚血性疾患部位での治療効果を検証するため、下肢虚血のマウスモデルを作製し、ヒトＦＧＦ２分泌ビフィズス菌を投与して検討した。
（１）マウス下肢虚血モデル（necrotic model）の作製
実験動物は１９週齢、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー）を使用した。麻酔はソムノペンチル（共立製薬株式会社）を２．５ｍｇ／ｍＬに希釈したものを体重２０ｇあたり０．４ｍＬ腹腔内に注射した。麻酔と同時にヘパリンナトリウム（二プロ）（生理食塩水にて５０ｕ／ｍＬに希釈）を０．２ｍＬ腹腔内に注射した。腹部から下腿の除毛を行ったのち大腿動脈を９−０ポリプロピレン糸にて結紮し、大腿動脈中枢を切除した。創内を生理食塩水で洗浄後、創を６−０ナイロン糸にて縫合した。術後復温し、ヘパリン０．２ｍＬを皮下注射した。術後１、２日目にもヘパリン０．４ｍＬを皮下注射した。
初回術後６日目に初回同様麻酔を行い、ヘパリン投与後に大腿動脈末梢を結紮、切除した。初回同様術後２日目までヘパリン投与を行った。また組換えビフィズス菌投与後より連日１０％マルトース１ｍＬを腹腔内投与した。【０１０６】
（２）レーザードップラー血流計による血流測定
マウスを麻酔後、レーザードップラー血流計（Moor Instruments社製）を用いて血流測定を行った。足根下腿関節以下から指先までの血流を両側について血流を定量し、患側／健側比にて表した。血流測定は２回目手術をｄａｙ０として、ｄａｙ２、７、１４、２１、３６に行った。【０１０７】
（３）組換えビフィズス菌の投与
ヒトＦＧＦ２分泌ビフィズス菌であるＦＧＦ１１０株の凍結製剤にＰＢＳを添加して菌濃度を調製して使用した。下肢虚血モデル２回目手術をｄａｙ０として、ｄａｙ３、４、１１、１８、２５、３２に尾静脈より０．６×１０９ｃｆｕを一日二回投与した。対比群として、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の凍結製剤を同量投与した群、およびＰＢＳを同水分量（０．２ｍＬ）投与した群を設定した。【０１０８】
（４）結果
ＦＧＦ１１０投与群ではｄａｙ１４以降でＰＢＳ、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ群に比べ有意な血流改善効果を示した。この効果はｄａｙ３６まで持続した。（表２、図８）
【表２】
2016117508.tif 000004
【０１０９】
実施例８：非選択培地で継代培養後のプラスミド保持安定性
(１)方法
上記で作製したＦＧＦ１１０株およびＦＧＦ１１１株に加え、陰性対照株であるＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株のグリセリンストックをＭＲＳ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１％ビタミンＣ添加液）培地５ｍＬに１％植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養し、活性化培養液とした。この活性化培養液を同培地に１％植菌し、同様に２４時間培養し、前培養液とした。以降、スペクチノマイシンを含まない非選択培地であるＭＲＳ（１％ビタミンＣ添加液含有）培地５ｍＬへ植菌し、２４時間毎に同培地に継代し、非選択培地での継代培養を繰り返した。７回継代した培養液を嫌気性希釈液にて適宜薄め、これをＢＬ寒天培地に塗布し、３７℃にて２日間嫌気培養した。
ＢＬ寒天培地上に形成したコロニーを無作為に１００個選択し、これらコロニーをＢＬ−ｂＳおよびＢＬ寒天培地に穿刺し、３７℃にて１日間嫌気培養した。各培地上の穿刺痕におけるビフィズス菌の生育を確認し、（ＢＬ−ｂＳ寒天培地上での生育箇所）／（ＢＬ寒天培地上での生育箇所）×１００を算出し、プラスミド保持菌率とした。【０１１０】
（２）結果
結果を表３に示す。プラスミド保持安定性を測定した結果、ＦＧＦ１１０株、ＦＧＦ１１１株はいずれのも非常に高いプラスミド保持菌率を示した。
【表３】
2016117508.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の形質転換用プラスミドにより、目的タンパク質の高くて安定的な分泌発現を可能とする、嫌気性菌を形質転換するための形質転換用プラスミドを提供することが可能となる。したがって、従来の方法と比較して血管新生療法を低侵襲で高効率で簡便に行うことが可能となる。また、かかるプラスミドで形質転換された嫌気性菌そのものが遺伝子輸送担体となるため、目的部位への遺伝子の導入効率などが問題にならず、従来と比較して非常に高効率な処置を行うことが可能となる。これにより、高齢者など、本来血管新生療法が効果的であるはずなのに侵襲性の高さや全身性の副作用が障害となって処置できなかった対象などに対しても有効に処置が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月17日(2016.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換用プラスミドが、ｐＦＧＦ１１０（配列番号１４）の塩基配列で表される、嫌気性菌の形質転換用プラスミド。
【請求項２】
嫌気性菌の形質転換用プラスミドであって、プロモーターユニット、配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌シグナルユニット、および虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを含む目的遺伝子ユニットを含む、前記形質転換用プラスミド。
【請求項３】
虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどの血管新生促進活性を有するタンパク質、プロスタグランジン類などの血管拡張に関与する因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）からなる群から選ばれる一種である、請求項２に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項４】
虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、請求項２または３に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項５】
分泌シグナルユニットが、配列番号２で表される分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に続けて、スペーサーペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項６】
スペーサーペプチドが、１〜２５アミノ酸長であって、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸から始まる配列で表される、請求項５に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項７】
分泌シグナルユニットが、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項８】
形質転換用プラスミドが、非シャトルプラスミドである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項９】
プロモーターユニットに含まれるプロモーターが、配列番号１３で表される塩基配列またはその塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項１０】
形質転換用プラスミドが、ｐＦＧＦ１１１（配列番号１５）の塩基配列で表される、請求項２〜９のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体。
【請求項１２】
嫌気性菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１１に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項１２に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
医薬組成物が、虚血性疾患部位における、遺伝子輸送担体の生着・増殖促進剤をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
生着・増殖促進剤が、マルトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノースからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体を投与することを含む、虚血性疾患を診断または治療するための方法。
【請求項１８】
投与が、全身投与である、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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