(57)【要約】少なくとも一種類の真核細胞に対してカルレティキュリンの発現を促進させる方法と、該方法に利用可能な合成ペプチドを提供する。本発明によって提供される方法は、対象とする細胞の培養物を準備し、当該培養物中にカルレティキュリン発現促進活性を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドを少なくとも一回供給することを包含する。
2015098963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の真核細胞に対してカルレティキュリンの発現を促進させる方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
前記細胞培養物中に、カルレティキュリン発現促進活性を有する合成ペプチドを少なくとも１回供給すること、および
該ペプチドを少なくとも一回供給した前記細胞培養物を所定時間培養すること
を包含し、
前記合成ペプチドが、配列番号６〜７４のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、カルレティキュリン発現促進方法。
【請求項２】
上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞、幹細胞若しくは神経系細胞である、請求項１に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
【請求項３】
前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１又は２に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
【請求項４】
前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）；
を有する、請求項３に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
【請求項５】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
【請求項６】
前記合成ペプチドが、配列番号６、８、１７、２８，６３、６８、６９、７３のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
【請求項７】
カルレティキュリン高発現細胞を含む細胞培養物を製造する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法を包含する製造方法。
【請求項８】
少なくとも一種の真核細胞のカルレティキュリンの発現を促進させるために用いられるカルレティキュリン発現促進剤であって、
配列番号６〜７４のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドを有効成分として含む、カルレティキュリン発現促進剤。
【請求項９】
上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞若しくは幹細胞である、請求項８に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
【請求項１０】
前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項８又は９に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
【請求項１１】
前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）；
を有する、請求項１０に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
【請求項１２】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
【請求項１３】
前記合成ペプチドが、配列番号６、８、１７、２８、６３、６８、６９、７３のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
【請求項１４】
少なくとも一種の真核細胞のカルレティキュリンの発現を促進させるために用いられる合成ペプチドであって、
配列番号８〜４４のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチド。
【請求項１５】
上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞若しくは幹細胞である、請求項１４に記載の合成ペプチド。
【請求項１６】
前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１４又は１５に記載の合成ペプチド。
【請求項１７】
前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）；
を有する、請求項１６に記載の合成ペプチド。
【請求項１８】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１９】
配列番号８、１７、２８のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一種の真核細胞に対してカルレティキュリンタンパク質（Calreticulin、カルレティキュリン、カルレチクリンともいう）の発現を促進する方法と該方法に用いる合成ペプチドに関する。また、該合成ペプチドを有効成分とする組成物に関する。
なお、本出願は２０１３年１２月２６日に出願された日本国特許出願２０１３−２７０４７０号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
カルレティキュリンは、一般に、小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）の内腔（Lumen）に局在し、新規に合成されたタンパク質（糖タンパク質を含む）の品質的な管理及びフォールディング（折り畳み）等に関与する介添えタンパク質（シャペロンタンパク質）であることが知られている。また、細胞質内及びＥＲ内のカルシウム濃度の維持調整に重要な役割を果たすことも知られている。カルレティキュリン遺伝子欠損マウスは心臓形成中に障害を引き起し、胚性致死となることから、カルレティキュリンは、生体内で重要な役割を果たしていることが解る。
また、近年、カルレティキュリンは、ＥＲ内腔以外に、細胞質、細胞表面、細胞外分画等に存在し、細胞接着、細胞の走化性、細胞増殖、獲得免疫における抗原提示といった種々の重要な生物学的過程に関与していることが明らかになってきた（非特許文献１）。例えば、がん細胞や病原体に感染した細胞といったいわゆる異常な細胞において、カルレティキュリンは免疫原性の細胞死を起こす際に該細胞の表面（典型的には細胞膜上）に免疫賦活性タンパク質（いわゆるイートミーシグナル、eat-me signal）として発現促進されることが、非特許文献２、３に報告されている。
また、ＥＲ以外の場所（例えば、細胞表面や細胞外）の存在するカルレティキュリンの発現が種々の疾患に関連することが明らかになりつつある。例えば、萎縮性筋硬化症（amyotrophic lateral sclerosis；ＡＬＳ）、拡張型心筋症、アルツハイマー病および種々の免疫疾患（例えば、炎症性腸疾患やリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーテス等）とＥＲ外カルレティキュリンの発現との関係が報告されている（非特許文献１、４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９／０９３６９２号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】The FASEB Journal、２４巻（３号）、２０１０年、ｐｐ．６６５−６８３
【非特許文献２】セル・サイクル（Cell Cycle）、８巻（６号）、２００９年、ｐｐ．８６０−８６９
【非特許文献３】キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、６７巻（１７号）、２００７年、ｐｐ．７９４１−７９４４
【非特許文献４】ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience）、３２巻（１４号）、２０１２年、ｐｐ．４９０１−４９１２
【非特許文献５】PLOS ONE、８巻（６号）、２０１３年、ｅ６６７７９
【発明の概要】
【０００５】
上述のとおり、カルレティキュリンは生体内で重要な役割を果たしている。カルレティキュリンの発現量を調整することができれば、カルレティキュリンの発現異常が関与する疾患を治療する足掛かりとなり得る。例えば、カルレティキュリンの発現量を促進することができれば、カルレティキュリンの発現不足による望ましくない生理作用を発現させない（もしくは抑制する）ことが可能である。或いは、生体内において、いわゆる異常細胞の細胞表面に発現するカルレティキュリンを発現促進することができれば、免疫細胞が当該カルレティキュリンをeat-me signalとして認識することで、異常細胞を高効率に除去し得る。また、いわゆる異常細胞の細胞表面上のカルレティキュリンの発現促進は、正常細胞と異常細胞との区別を明確にし得るため、生体外（インビトロ、in vitro）での細胞の分別に利用可能である。
しかしながら、従来、カルレティキュリンの発現を簡便且つ高効率に促進するする方法、薬剤類は存在しなかった。そこで本発明は、少なくとも一種の真核生物においてカルレティキュリンの発現を促進する方法と、該方法に用いる合成ペプチドを提供することを目的として創出された発明である。さらに、そのようなペプチドを有効成分として含む組成物（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。
【０００６】
本発明者は、紡錘体の形成や維持に関連するタンパク質（以後、紡錘体形成関連タンパク質ともいう）に着目した。そして、種々の紡錘体形成関連タンパク質について、当該タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ配列）に対するｓｉＲＮＡ（small interfering RNA、低分子干渉ＲＮＡ）を構成するＲＮＡ配列から翻訳されるアミノ酸配（以下、ｓｉＲＮＡ関連配列ともいう）を含む合成ペプチドを合成した。そして、当該合成ペプチドは、対象の真核細胞、特に種々の腫瘍細胞、幹細胞または神経系細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）、なかでもゲノム不安定な細胞（所謂、異常細胞）に供給された際（典型的には該細胞培養物の培地中に供給される）に、当該細胞においてカルレティキュリン発現量を増大し得る或いはカルレティキュリンの発現を促進し得る能力（カルレティキュリン発現促進活性）を有することを見出した。
また、本発明者は、原核生物である細菌に存在し、細菌の細胞分裂に関与するＺリングと呼ばれるタンパク質集合体を構成するタンパク質であるフィラメント状温度感受性変異株Ｚ(Filamenting temperature-sensitive mutant Z：ＦｔｓＺ)タンパク質、或いは、該ＦｔｓＺタンパク質のＣ末端側に結合してＦｔｓＺタンパク質を細胞膜に繋ぎ止めるアンカーとして機能することが知られているフィラメント状温度感受性変異株Ａ(Filamenting temperature-sensitive mutant A：ＦｔｓＡ)タンパク質の活性（即ち、ＦｔｓＺタンパク質のＧＴＰアーゼ活性またはＦｔｓＡタンパク質のＡＴＰアーゼ活性）を阻害するペプチドとして、一般的なファージディスプレー法を採用して単離された幾つかのペプチド（即ちＦｔｓＺインヒビターまたはＦｔｓＡインヒビターとして機能し得るペプチド）にも着目した。そして、上記ＦｔｓＺインヒビターまたはＦｔｓＡインヒビターとして機能し得るペプチドを含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することも見出した。
また、本発明者は細胞分裂に関連するタンパク質（以後、細胞分裂関連タンパク質ともいう）にも着目した。そして、細胞分裂関連タンパク質の一部のアミノ酸配列、具体的には微小管（詳しくはチューブリン）に結合するタンパク質（microtubule-associated proteins；ＭＡＰ）の一種であるタウタンパク質（τ protein） の一部のアミノ酸配列、より具体的にはタウタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、タウタンパク質と微小管（チューブリン）との結合に関与する領域のアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列、を含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することも見出した。
さらに、本発明者は、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid Precursor Protein：ＡＰＰ）中のシグナルペプチドにも着目したところ、当該ＡＰＰのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列を含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することを見出した。
以上の知見より、本発明者は本発明を完成するに至った。
【０００７】
上記の目的を実現すべく、本発明によると、少なくとも一種の真核細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進するため（好ましくは、対象とする細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）におけるカルレティキュリンの存在量を増大するため）に用いられる合成ペプチド（以下、「カルレティキュリン発現促進ペプチド」ともいう）が提供される。
即ち、本発明は、そのようなペプチドとして、配列番号６〜７４のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドを提供する。
【０００８】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。また、物質自体が単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）であるため、取扱いが容易であり、例えば、対象細胞（典型的には当該細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現促進ペプチドを供給するという簡易な処理を行うことによって、対象細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進させる（好ましくは、対象とする細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）におけるカルレティキュリンの存在量を増大させる）ことができる。
【０００９】
上記配列番号６〜７２に開示するアミノ酸配列のうち、配列番号６〜４４としてここに開示されるアミノ酸配列は、紡錘体形成関連タンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列である。また、配列番号４５〜６６としてここに開示されるアミノ酸配列は、ＦｔｓＺインヒビター或いはＦｔｓＡインヒビターとして機能し得るペプチドのアミノ酸配列である。また、配列番号６７〜７２としてここに開示されるアミノ酸配列は、細胞分裂関連タンパク質（典型的にはタウタンパク質）の一部のアミノ酸配列である。また、配列番号７３、７４としてここに開示さえるアミノ酸配列は、ＡＰＰシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、それ単独で自然界において存在するものではない人為的に設計された合成ペプチドであり、優れたカルレティキュリン発現促進活性を発揮する。かかる合成ペプチドは、特に、ヒト由来の細胞に対して高いカルレティキュリン発現促進活性を奏する。なかでも、配列番号６、８、１７、２８，６３、６８、６９、７３としてここに示すアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、特に優れたカルレティキュリン発現促進活性を発揮する。
【００１０】
また、ここで開示される上記カルレティキュリン発現促進ペプチドの対象細胞は、好ましくはヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞、幹細胞若しくは神経系細胞（例えば、アストロサイト、ニューロン、オリゴデンドロサイト等）である。
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記の細胞（腫瘍細胞、幹細胞、神経系細胞）、なかでも、ヒト由来の当該細胞に対して高いカルレティキュリン発現促進活性を奏する。このような合成ペプチドは、医療産業上の利用価値が極めて高い。
【００１１】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する。
このような膜透過性ペプチドを有する上記カルレティキュリン発現促進ペプチドは、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列を高効率に細胞内（細胞膜及び／又は核膜の内側）に移入することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。
【００１２】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）；
を有する。
配列番号１としてここで開示されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、対象細胞のカルレティキュリンの発現を高効率に促進することができる。
【００１３】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現促進ペプチドは、該合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である。
このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱い性に優れるため、本発明の実施に特に好適に用いることができる。
【００１４】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現促進ペプチドは、細胞内（典型的にはＥＲ内）のカルレティキュリンが細胞表面（典型的には細胞膜表面）上に移行することを促進することができる。このため、細胞膜表面上のカルレティキュリンの存在量を増大させることができる。
従って、かかる態様のペプチドによると、細胞膜上のカルレティキュリン存在量の増大によって、免疫細胞に認識されるeat-me signalとしての作用を向上させることができる。或いはまた、該カルレティキュリンを目印としたカルレティキュリン高発現細胞の分別を実現することができる。
【００１５】
また、本発明によると、他の側面として、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドを有効成分として含む、少なくとも一種の真核細胞のカルレティキュリンの発現を促進するために用いられるカルレティキュリン発現促進剤（薬学的組成物）が提供される。
また、典型的には、上記カルレティキュリン発現促進剤は、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。
かかるカルレティキュリン発現促進剤は、単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）の合成ペプチドを有効成分として含むため、例えば、対象の細胞（典型的には当該細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現促進剤を供給するという簡易な処理を行うことによって、対象細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進することができる。特に、ここに開示されるカルレティキュリン発現促進剤によると、種々の腫瘍細胞、幹細胞および神経系細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）、なかでもゲノム不安定な細胞（所謂、異常細胞）におけるカルレティキュリン発現を効果的に促進し得る。また、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造され得る合成ペプチドを有効成分として含むため、所望量のカルレティキュリン発現促進剤を容易に調製することができる。
【００１６】
さらに、本発明によると、他の側面として、少なくとも1種の真核細胞に対してカルレティキュリンの発現を促進させる方法であって、対象とする真核細胞を含む細胞培養物を準備することと、該細胞培養物中に、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドを少なくとも１回供給することと、該ペプチドを少なくとも一回供給した前記細胞培養物を所定時間培養することと、を包含する方法を提供する。
かかるインビトロにおけるカルレティキュリン発現促進方法によると、対象細胞（典型的には当該細胞培養物の培地中）に上記のとおり単純な構成の合成ペプチドを供給するという簡易な手法によって、対象細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進することができる。特に、種々の腫瘍細胞、幹細胞および神経系細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）、なかでもゲノム不安定な細胞（所謂、異常細胞）に対してカルレティキュリンの発現を促進し得る。
従って、本発明によると、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド（即ちカルレティキュリン発現促進剤）を用いてカルレティキュリンを高発現する細胞を含む細胞培養物を製造することができる。換言すれば、本発明は、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進方法を包含することを特徴とする、カルレティキュリン高発現細胞を含む細胞培養物の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル１）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図２】図２は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル２）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図３】図３は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル３）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図４】図４は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル４）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図５】図５は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル５）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図６】図６は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル６）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図７】図７は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル７）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図８】図８は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル８）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図９】図９は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル９）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１０】図１０は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル１０）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１１】図１１は、ＨｅＬａＳ３細胞に一実形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル１１）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１２】図１２は、ＨｅＬａＳ３細胞に一比較例としてランダムにアミノ酸残基を組み合わせたて構築した合成ペプチド（サンプル１２）を添加して培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１３】図１３は、ＨｅＬａＳ３細胞をペプチド無添加で培養した後、当該ＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１４】図１４は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced pluripotent stem cell）に一実施形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル９）を添加して培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１５】図１５は、ｉＰＳ細胞をカルレティキュリン発現促進ペプチド無添加で培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１６】図１６は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、embryonic stem cell）に一実施形態に係るカルレティキュリン発現促進ペプチド（サンプル１）を添加して培養した後、当該ＥＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１７】図１７は、ＥＳ細胞をカルレティキュリン発現促進ペプチド無添加で培養した後、当該ＥＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００１９】
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えばカルレティキュリン発現促進剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００２０】
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記カルレティキュリン発現促進ペプチドが有するカルレティキュリン発現促進活性）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様にカルレティキュリン発現促進活性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
【００２１】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、１以上、好ましくは２以上の種々の細胞、組織、または臓器に分化し得る細胞をいう。本明細書において、幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞；embryonic stem cell）、ｉＰＳ細胞、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞；embryonic germ cell）、体性幹細胞（組織性幹細胞ともいう。例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、筋幹細胞、等が挙げられる）であり得るが、上記の能力を有している限り、それらに限定されない。
本明細書において「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胎盤などの胚体外組織を除く、一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化することが可能な能力を有し、さらに、未分化状態で自己複製能を有する幹細胞をいう。本明細書において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞であり得るが、上記の能力を有している限り、それらに限定されない。
【００２２】
本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変（白血病、リンパ腫等）を含む腫瘍一般（典型的には悪性腫瘍）をいう。また、「腫瘍細胞」とは、そのような腫瘍を形成する細胞であって、典型的には周囲の正常組織とは無関係に異常に増殖を行うに至った細胞（所謂がん化した細胞）をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞（がん細胞）に区別される細胞であれば、該細胞の起源や性状にかかわりなく腫瘍細胞と呼称される。上皮性腫瘍（扁平上皮癌、腺がん等）、非上皮性腫瘍（各種の肉腫、骨肉腫等）、各種の細胞腫（神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等）、リンパ腫、メラノーマ、等を構成する細胞は、ここでいう腫瘍細胞に包含され得る。
【００２３】
本明細書において「ゲノム安定」、「ゲノム不安定」とは、広義に解釈される用語であり、ゲノムの構造的な及び／又は機能的な異常の有無又はその程度を指標として区分（評価）される細胞の状態をいう。ゲノムの構造的な及び／又は機能的な異常として、例えば、染色体の異常（例えば、部分的な重複、逆位、欠失、転座、切断といった染色体の部分的異常、異数体といった染色体の数的異常、又は多核化等）の有無又はその程度等が挙げられる。ここで、染色体異常とは、いわゆる「核型異常」を包含してもよい。染色体異常のなかでも特に、異数体（好ましくは重複異常）の有無又はその程度は、本発明の実施に好適に用いられる指標である。ただし、上記染色体の異常とは、上記指標の例示であり、本発明を限定する意図はない。
【００２４】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、対象の真核細胞（典型的には該細胞を培養している培地中）に供給された際に、当該細胞におけるカルレティキュリン発現量（好ましくは、該細胞の細胞表面（典型的には細胞膜表面）におけるカルレティキュリン存在量）を増大し得る或いは該細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進し得る能力（即ち、カルレティキュリン発現促進活性）を有することが本発明者によって見出されたカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである。本発明の実施にあたって好ましく使用されるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列は、配列番号６〜７４に列挙されている。具体的には以下のとおりである。
【００２５】
配列番号６〜４４に示す各アミノ酸は、紡錘体形成関連タンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列である。
具体的には、配列番号６、７に示すアミノ酸配列は、それぞれ、ヒトのセントリン２（centrin2）タンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列である、合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでセントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、紡錘体形成に重要な役割を担うタンパク質である。また、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである。
配列番号８に示すアミノ酸配列は、細胞骨格関連タンパク質５（Cytoskeleton-associated protein 5；ＣＫＡＰ５）、或いは、大腸及び肝臓癌過剰発現遺伝子タンパク質（Colonic and hepatic tumor overexpressed gene protein；ＣＨ−ＴＯＧ）とも呼ばれるタンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。ここでＣＫＡＰ５とは、微小管のプラス端に結合し、微小管の動態および微小管形成等を制御するタンパク質である。また、細胞質微小管の伸長および核形成等を促進するタンパク質であり、紡錘極形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号９に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１０に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１１に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１２に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１３に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１４に示すアミノ酸配列は、ＣＫＡＰ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１５に示すアミノ酸配列は、中心体タンパク質１６４（Centrosomal protein of 164 kDa；ＣＥＰ１６４）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＣＥＰ１６４とは、微小管形成や一次シリア（一次繊毛）の構造の維持等に関与するタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。また、Ｇ２／Ｍチェックポイントや核分裂、染色体分離においても主要な役割を担うタンパク質である。
配列番号１６に示すアミノ酸配列は、ＣＥＰ１６４のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１７に示すアミノ酸配列は、ＣＥＰ１６４のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１８に示すアミノ酸配列は、ＣＥＰ１６４のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号１９に示すアミノ酸配列は、動原体タンパク質ＮＤＣ８０（kinetochore protein NDC80、ＮＤＣ８０ともいう）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＮＤＣ８０とは、外部キネトコアプレートにおける安定した微小管結合サイトの形成や動原体の保全等に関与するタンパク質であり、紡錘体の形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号２０に示すアミノ酸配列は、ＮＤＣ８０のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２１に示すアミノ酸配列は、ＮＤＣ８０のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２２に示すアミノ酸配列は、ＮＤＣ８０のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２３に示すアミノ酸配列は、細胞分裂制御タンパク質４８（Cell devision control protein ；ＣＤＣ４８）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＣＤＣ４８とは、紡錘体の分解やユビキチン化タンパク質の分解等に関与するタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号２４に示すアミノ酸配列は、中心体内部タンパク質（Inner centromere protein；ＩＮＣＥＮＰ）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＩＮＣＥＮＰとは、染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex；ＣＰＣ）を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号２５に示すアミノ酸配列は、ＩＮＣＥＮＰのｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２６に示すアミノ酸配列は、ＩＮＣＥＮＰのｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２７に示すアミノ酸配列は、ＩＮＣＥＮＰのｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号２８に示すアミノ酸配列は、アポトーシス阻害タンパク質ファミリータンパク質（inhibition of apoptosis family protein；ＩＡＰ family protein）に属するサバイビン（Survivin）（或いは、バキュロウイルスのＩＡＰ繰り返し配列含有タンパク質５（Baculoviral IAP repeat containing protein 5；ＢＩＲＣ５）ともいう）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＢＲＩＣ５とは、染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex；ＣＰＣ）を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号２９に示すアミノ酸配列は、ＢＩＲＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３０に示すアミノ酸配列は、ＢＩＲＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３１に示すアミノ酸配列は、ＢＩＲＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３２に示すアミノ酸配列は、ＢＩＲＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３３に示すアミノ酸配列は、ＢＩＲＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３４に示すアミノ酸配列は、微小管関連タンパク質２１５（Microtube-associated protein 215；ＭＡＰ２１５）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＭＡＰ２１５とは、微小管（詳しくはチューブリン）に結合するタンパク質（microtubule-associated proteins；ＭＡＰ）の一種であり、微小管の安定化や微小管の重合等に関与し、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号３５に示すアミノ酸配列は、ＭＡＰ２１５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３６に示すアミノ酸配列は、ＭＡＰ２１５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３７に示すアミノ酸配列は、カイネシン関連モータータンパク質であるＥＧ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＥＧ５とは、双極紡錘体の形成等に関わるタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号３８に示すアミノ酸配列は、ＥＧ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号３９に示すアミノ酸配列は、ＥＧ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号４０に示すアミノ酸配列は、ＥＧ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号４１に示すアミノ酸配列は、ＥＧ５のｓｉＲＮＡ関連配列である合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号４２に示すアミノ酸配列は、細胞分裂周期関連タンパク質８（Cell division cycle-associated protein 8；ＣＤＣＡ８）のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでＣＤＣＡ８とは、染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex；ＣＰＣ）を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号４３に示すアミノ酸配列は、ＣＤＣＡ８のｓｉＲＮＡ関連配列である合計５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号４４に示すアミノ酸配列は、ＣＤＣＡ８のｓｉＲＮＡ関連配列である合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
【００２６】
配列番号４５〜６６に示す各アミノ酸は、ＦｔｓＺインヒビター或いはＦｔｓＡインヒビターとして機能し得るペプチドのアミノ酸配列である。
具体的には、配列番号４５〜５４に示すアミノ酸配列は、ＦｔｓＺインヒビター或いはＦｔｓＡインヒビターとして機能する、合計１２アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
また、配列番号５５〜６６に示すアミノ酸配列は、ＦｔｓＺインヒビター或いはＦｔｓＡインヒビターとして機能する、合計９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
【００２７】
配列番号６７〜７２に示す各アミノ酸は、細胞分裂関連タンパク質の一部アミノ酸配列（典型的にはタウタンパク質の微小管結合領域の一部のアミノ酸配列を含む配列）である。
具体的には、配列番号６７に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号６８に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号６９に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計１７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号７０に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計１１アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号７１に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計１１アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号７２に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
【００２８】
配列番号７３、７４に示す各アミノ酸は、ＡＰＰのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列である。
具体的には、配列番号７３に示すアミノ酸配列は、マウス由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成する合計１７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号７４に示すアミノ酸配列は、ヒト由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成する合計１７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
【００２９】
或いはまた、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、配列番号６〜７４に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列又はその改変アミノ酸配列のみから成る合成ペプチドであってもよいが、カルレティキュリン発現促進活性を向上する観点からは、当該カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のＮ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドが好ましい。膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドであれば、目的の細胞に供給した際、細胞内に速やかに導入され得ることによりカルレティキュリン発現促進活性を向上させることができる。
上記膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、例えばＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）がカルレティキュリン発現促進ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。例えば、配列番号１に示すＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）に含まれるＮｏＬＳ並びに配列番号２に示すＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれるＮｏＬＳのアミノ酸配列が挙げられる。また、他の膜透過性ペプチド配列の例として、配列番号３〜５に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列（膜透過性を保持しているものに限られる）が挙げられる。配列番号３は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれる膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列を示している。配列番号４は、上記ＴＡＴを改変した膜透過性ペプチド配列（ＰＴＤ４）のアミノ酸配列を示している。配列番号５は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ関連アミノ酸配列を示している。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００３０】
特に、特許文献１にも記載されている配列番号１に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号１に示す膜透過性ペプチド配列と上記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列（配列番号６〜７４）又はその改変アミノ酸配列とを組み合わせることにより、高いカルレティキュリン発現促進活性を示す合成ペプチドを得ることができる。
【００３１】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したようなカルレティキュリン発現促進ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
なお、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されてもよい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
【００３２】
カルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記カルレティキュリン発現促進活性を失わない限りにおいて、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としてはカルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該カルレティキュリン発現促進ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にカルレティキュリン発現促進ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）でカルレティキュリン発現促進活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、本発明に適用するカルレティキュリン発現促進ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には６０以下、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下のアミノ酸残基数）のものが好適である。
【００３３】
全体のアミノ酸配列に対するカルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占めるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、カルレティキュリン発現促進活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一形態である。
なお、本発明のカルレティキュリン発現促進ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、カルレティキュリン発現促進活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００３４】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００３５】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいてカルレティキュリン発現促進ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望するカルレティキュリン発現促進ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のカルレティキュリン発現促進ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００３６】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のカルレティキュリン発現促進ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計したカルレティキュリン発現促進ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ちカルレティキュリン発現促進ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ（生体外、in vitro）合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能なWheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
【００３７】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、カルレティキュリン発現促進ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、カルレティキュリン発現促進ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００３８】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記対象細胞におけるカルレティキュリン発現促進活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記対象細胞におけるカルレティキュリン発現促進活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００３９】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤は、有効成分であるカルレティキュリン発現促進ペプチドのカルレティキュリン発現促進活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。カルレティキュリン発現促進剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、カルレティキュリン発現促進剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
カルレティキュリン発現促進剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ、即ちリン酸緩衝生理食塩水）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、カルレティキュリン発現促進ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴づけるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００４０】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド）の適応対象細胞は特に制限されず、種々の生物種（ただし真核生物に限る）の細胞においてカルレティキュリンの発現を促進することが可能である。例えば、ヒト又は他の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）の体細胞（例えば、神経系細胞、心筋細胞、皮膚細胞、生殖細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵臓細胞、等）、腫瘍細胞、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞、或いは体性幹細胞を含む）等が挙げられる。特に腫瘍細胞、幹細胞および神経系細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）がここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド）の適用対象として好ましい。
【００４１】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、インビトロで培養（継代）している細胞（典型的には培養細胞）対し、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド）の適当量を、培養過程のいずれかの段階（好ましくは培養開始と同時若しくは培養開始後の早い段階）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、対象細胞の種類や状態、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．１μＭ〜５０μＭの範囲内、より好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加する（例えば培養開始時並びに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
【００４２】
或いはまた、ここに開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ちカルレティキュリン発現促進ペプチド）を、例えば液剤として、或いは、錠剤等の個体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを生体内（即ち患者）に所望量供給（投与）することもできる。投与方法としては、例えば静脈内や目的組織等への注射あるいは経口投与等が挙げられる。これにより、生体内で、対象細胞、特にゲノム不安定な細胞においてカルレティキュリンの発現を促進することができる。このため、カルレティキュリン発現促進剤（即ちカルレティキュリン発現促進ペプチド）は、例えば、該カルレティキュリン発現促進剤被投与者自身の免疫反応を利用したゲノム不安定な細胞の生体内からの除去、或いは、生体内に存在するゲノム不安定な細胞の検出（スクリーニング）等に資する組成物として使用することができる。
【００４３】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進方法は、対象の真核細胞の培養物を準備し、カルレティキュリン発現促進ペプチド（即ち該合成ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤）を上記対象細胞の培養物中（典型的には当該細胞培養物の培地中）に少なくとも１回供給し、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した該細胞培養物を所定時間培養することを特徴とする。当該方法を利用することにより、カルレティキュリン高発現細胞を含む細胞培養物を製造することができる。
【００４４】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進方法（即ち、該方法を包含するカルレティキュリン高発現細胞の製造方法）の適応対象細胞は特に制限されず、種々の生物種（ただし真核生物に限る）由来の細胞においてカルレティキュリンの発現を促進することが可能である。例えば、ヒト又は他の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）由来の体細胞（例えば、神経系細胞、心筋細胞、皮膚細胞、生殖細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵臓細胞、等）、腫瘍細胞、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞、或いは体性幹細胞を含む）等が挙げられる。特に腫瘍細胞、幹細胞、および神経系細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）がここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤（即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド）の適用対象として好ましい。
なお、ここに開示される細胞培養物中の細胞は上記カルレティキュリン発現促進方法の適応対象細胞であれば特に限定されず、初代培養細胞、継代細胞、細胞株（セルライン）等の各種培養細胞であり得る。また、上記培養物中の細胞は、分子生物学的操作をされた細胞であってもよい。例えば、培養株樹立のためにテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）遺伝子が導入された細胞等であり得る。
【００４５】
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド（カルレティキュリン発現促進剤）を対象の培養細胞に供給する方法としては特別な処理を有しない。例えば、対象細胞を培養している培養物中（典型的には培養液中）に適当量のカルレティキュリン発現促進ペプチド（若しくは該ペプチドを有効成分とする組成物）を添加するとよい。
【００４６】
上記カルレティキュリン発現促進ペプチドを対象細胞の培養物中（典型的には該細胞培養物の培地中）に添加した後に当該培養物を培養する時間は、対象細胞においてカルレティキュリンの発現を促進可能或いはカルレティキュリンの発現量を増大可能な時間であれば、特に限定されない。典型的には数時間から数日間の培養を行う。例えば、２時間以上、好ましくは２４時間以上、より好ましくは４８時間以上の培養がよく、例えば培養開始から３日〜５日間、あるいは６日〜７日間、あるいは１０日間程度の培養を行うとよい。
【００４７】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００４８】
＜実施例１：ペプチド合成＞
合計１２種類のペプチド（サンプル１〜１２）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
表１に示すように、サンプル１〜８に係るペプチドは、それぞれ表中の各配列番号に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列からなる合成ペプチドである。
具体的には、サンプル１〜４に係るペプチドは、紡錘体形成関連タンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列から成る合成ペプチドである。即ち、それぞれ、サンプル１に係るペプチドは配列番号６に示すヒトのセントリン２タンパク質のｓｉＲＮＡ関連配列、サンプル２に係るペプチドは配列番号８に示すＣＫＡＰ５ＣのｓｉＲＮＡ関連配列、サンプル３に係るペプチドは配列番号１７に示すＣＥＰ１６４のｓｉＲＮＡ関連配列及びサンプル４に係るペプチドは配列番号２８に示すＢＲＩＣ５のｓｉＲＮＡ関連配列からなる合成ペプチドである。
サンプル５に係るペプチドは配列番号６３に示すＦｔｓＺインヒビター或いはＦｔｓＡインヒビターとして機能するアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。
サンプル６及び７に係るペプチドは、細胞分裂関連タンパク質の一部のアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。即ち、サンプル６及び７に係るペプチドは、配列番号６８又は６９に示すタウタンパク質のアミノ酸配列の一部の配列から成る合成ペプチドである。
サンプル８に係るペプチドは、配列番号７３に示すマウス由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。
【００５１】
また、表１に示すように、サンプル９〜１１に係るペプチドは、それぞれカルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とを組み合わせて構築した合成ペプチドである。
具体的には、サンプル９に係るペプチドは、ペプチド鎖のＣ末端側に配列番号６に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのＮ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号１）を有する合成ペプチド（配列番号７５）である。
サンプル１０に係るペプチドは、ペプチド鎖のＣ末端側に配列番号１７に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのＮ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号１）を有する合成ペプチド（配列番号７６）である。
サンプル１１に係るペプチドは、ペプチド鎖のＣ末端側に配列番号６３に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのＮ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号１）を有する合成ペプチド（配列番号７７）である。
なお、サンプル１２に係るペプチドは、カルレティキュリン発現促進ペプチドの比較例として、任意の１２アミノ酸残基をランダムに組み合わせて構築した合成ペプチド（配列番号７８）である。
【００５２】
なお、上記合成ペプチドは直鎖状のペプチドであり、上記合成ペプチドは市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成したサンプル１〜１２に係るペプチドは、ＰＢＳ（-）又はＤＭＳＯに溶かし、ペプチドストック液を調製した。
【００５３】
＜実施例２：腫瘍細胞に対する合成ペプチドのカルレティキュリン発現促進活性評価＞
上記実施例１で得られたサンプル１〜１２に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、ヒト子宮頸癌由来の培養細胞株であるＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）を用いた。上記ＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）は、多数の染色体重複が確認される、即ち染色体異常（核型異常）を有するゲノム不安定な培養細胞株として知られる細胞である。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００５４】
ＨｅＬａＳ３細胞を８穴（ウェル）スライド中に、１ウェルあたり凡そ１×１０３個の細胞密度となるように播種した。培地は１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む一般的なＤＭＥＭ培地（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った（上記ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を、以下、ＤＭＥＭ培地ともいう）。その一晩培養後、培地をペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有するＤＭＥＭ培地に交換し、５日間培養した。上記５日間の培養期間中は、毎日ペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有するＤＭＥＭ培地に培地交換をした。なお、コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。
【００５５】
上記培養終了後、以下の免疫蛍光抗体法（蛍光免疫染色ともいう）により、各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた。
具体的には、まず、各試験区の培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、冷メタノールを添加し、氷上に１５分静置してＨｅＬａＳ３細胞を固定した。その後、メタノールを除去し、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））を添加して室温で１時間のブロッキングを行った。所定時間経過後、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除去し、ＰＢＳ（−）にて洗浄した。
そして、一次抗体として抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683、Lot No. GR56669-4）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で最終濃度：２．５×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製した一次抗体希釈液を上記ＨｅＬａＳ３細胞の培養容器中に添加し、４℃で一晩静置した。かかる抗原抗体反応の所定時間経過後、一次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11001）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で最終濃度：１０×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製した二次抗体希釈液を添加し、室温で２時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。その後、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）含有封入液（Life Technologies社製）とカバーガラスを用いて封入を行い、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
【００５６】
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図１〜図１３に示す。これらの図面は各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図１〜図１２にはそれぞれ図の番号に対応してサンプル１〜サンプル１２添加区の結果を示し、図１３にはペプチド無添加区の結果を示す。
【００５７】
上記評価試験の結果、サンプル１〜８に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）を添加したＨｅＬａＳ３細胞（図１〜図８）は、該細胞のペプチド無添加区（図１３）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色していることを確認した。これに対し、サンプル１２に係る合成ペプチド（ランダムなアミノ酸配列からなるペプチド）を添加したＨｅＬａＳ３細胞（図１２）は、該細胞のペプチド無添加区（図１３）と同様にカルレティキュリンを検出する蛍光標識の発色がほとんど確認されなかった。即ち、サンプル１〜８に係る合成ペプチドが、ＨｅＬａＳ３細胞においてカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることを確認した。
また、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とを組み合わせて構築したサンプル９〜１１に係る合成ペプチドを添加したＨｅＬａＳ３細胞（図９〜図１１）と、当該カルレティキュリン発現促進発現ペプチド配列のみから成るサンプル１、３、または５に係るペプチドを添加したＨｅＬａＳ３細胞（図１、図３、図５）とをそれぞれ比較すると、サンプル９〜１１添加区のＨｅＬａＳ３細胞は、それぞれサンプル１、３、５添加区のＨｅＬａＳ３細胞と同等またはそれ以上にカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色することを確認した。即ち、サンプル９〜１１に係る合成ペプチドは、それぞれサンプル１、３または５に係る合成ペプチドと比べて同等もしくはそれ以上にＨｅＬａＳ３細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることを確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤）が腫瘍細胞（典型的にはＨｅＬａ細胞）のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド（組成物）であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
【００５８】
＜実施例３：幹細胞に対する合成ペプチドのカルレティキュリン発現促進活性評価＞
上記実施例１で得られたサンプル１〜１２に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、ヒト線維芽細胞から樹立されたｉＰＳ細胞（クローン名：２０１Ｂ２、以下単に２０１Ｂ２ともいう）を用いた（出典：Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872(2007)）。上記ｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたものを使用した。
【００５９】
供試細胞であるｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）を、マトリゲルコートした８穴（ウェル）スライド中に、１ウェルあたり凡そ１×１０４個の細胞密度となるように播種した。培地はｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（STEMCELL Technologies 社製）を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。その一晩培養後、ペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有する新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換し、同条件でさらに５日間培養した。上記５日間の培養期間中は、毎日ペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に培地交換した。なお、コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。
【００６０】
上記培養終了後、細胞の固定にメタノール１容量とアセトン１容量とを混和した溶液（メタノール／アセトン＝１：１溶液）を用いたことと一次抗体を最終濃度：４×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製したこと以外は実施例２と同様にして、各試験区におけるカルレティキュリンの発現を、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫蛍光抗体法（蛍光免疫染色）により調べた。
【００６１】
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図１４、図１５に示す。図１４にはサンプル９添加区の結果を示し、図１５にはペプチド無添加区の結果を示す。これらの図面は各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。
【００６２】
図１４および図１５に示すとおり、サンプル９に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）を添加したｉＰＳ細胞（図１４）は、該細胞のペプチド無添加区のｉＰＳ細胞（図１５）およびサンプル１２に係る合成ペプチド（ランダムなアミノ酸配列からなるペプチド）を添加したｉＰＳ細胞（図示せず）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色していることを確認した。また、ここでは図示していないが、サンプル１〜８およびサンプル１０、１１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）を添加したｉＰＳ細胞もまた、カルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色することも確認した。即ち、サンプル１〜１１に係る合成ペプチドが、ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることを確認した。
なお、膜透過性ペプチド配列を有するサンプル９〜１１に係る合成ペプチドが、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のみからなるサンプル１、３、５と比較して、同等もしくはそれ以上にｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることも確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤）が幹細胞（典型的にはヒト由来のｉＰＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド（組成物）であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
【００６３】
＜実施例４：幹細胞に対する合成ペプチドのカルレティキュリン発現促進活性評価＞
上記実施例１で得られたサンプル１〜１２に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、マウス由来のＥＳ細胞の培養細胞株であるＢＸＭ１４細胞（以下、単に「ＢＸＭ１４」ともいう）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００６４】
供試細胞であるＥＳ細胞（ＢＸＭ１４）を、４穴（ウェル）スライド中に、１ウェルあたり凡そ１×１０４個の細胞密度となるように播種した。培地としては、ＤＭＥＭ培地（和光純薬社製、Cat No.043-30085）中に１５％のKnockout（登録商標） Serum Replacement（以下、単に「ＫＳＲ」ともいう。Life Technologies社製品、Cat No.10828）、０．１ｍＭのNon-essential Amino Acids Solution（以下、単に「ＮＥＡＡ」ともいう。和光純薬社製、Cat No.139-15651）、０．１ｍＭの2-Mercaptoehanol（Sigma-Aldrich社製、Cat No.M7522）、および１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのStemSure（商標登録） LIF, Mouse, recombinant, Solution（以下、単に「ｍＬＩＦ」ともいう。和光純薬社製、Cat No.199-116051）を含ませた培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。上記ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、2-Mercaptehanol及びｍＬＩＦを含有するＤＭＥＭ培地を、以下、単に「ＥＳ用ＤＭＥＭ培地」ともいう。上記一晩の培養後、培地をペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有するＥＳ用ＤＭＥＭ培地に交換し、３日間培養した。上記３日間の培養期間中は、毎日ペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１〜１２に係るペプチドを含有するＥＳ用ＤＭＥＭ培地に培地交換をした。なお、コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。
【００６５】
上記培養終了後、一次抗体として抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で４００倍希釈して（即ち、最終濃度：２．５×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製して）用いたこと、および二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11029）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で２００倍希釈して（即ち、最終濃度：１０×１０−３ｍｇ／ｍＬに調整して）用いたこと以外は実施例３と同様にして、各試験区におけるカルレティキュリンの発現を抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫蛍光抗体法（蛍光免疫染色）により調べた。
【００６６】
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図１６、図１７に示す。図１６にはサンプル１添加区の結果を示し、図１７にはペプチド無添加区の結果を示す。これらの図面（画像）は各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でＥＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。
【００６７】
図１６および図１７に示すとおり、サンプル１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）を添加したＥＳ細胞（図１６）は、ペプチド無添加区のＥＳ細胞（図１７）およびサンプル１２に係る合成ペプチド（ランダムなアミノ酸配列からなるペプチド）を添加したＥＳ細胞（図示せず）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色していることを確認した。また、ここでは詳細な結果を図示していないが、サンプル２〜１１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）を添加したＥＳ細胞もまた、ペプチド無添加区のＥＳ細胞（図１７）およびサンプル１２に係る合成ペプチドを添加したＥＳ細胞と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色することも確認した。即ち、サンプル１〜１１に係る合成ペプチドが、ＥＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることを確認した。
なお、膜透過性ペプチド配列を有するサンプル９〜１１に係る合成ペプチドが、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のみからなるサンプル１、３、５と比較して、同等もしくはそれ以上にＥＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることも確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤）が幹細胞（典型的にはＥＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド（組成物）であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
【００６８】
＜実施例５：顆粒剤の調製＞
上記サンプル１〜１１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現促進ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
上述のように、本発明によると、少なくとも一種の真核細胞、例えば腫瘍細胞、幹細胞及び神経系細胞等、なかでも特にゲノム不安定な細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進する（あるいはカルレティキュリンの発現量を増大させる）ことができる。したがって、本発明は、例えば、ゲノム不安定な細胞（例えば腫瘍細胞等）の生体内からの除去、或いは、生体外での細胞選別（例えばゲノム安定な細胞とゲノム不安定な細胞の選別）等に利用し得る。本発明は、例えば、医療産業および医学研究等において好適に実施することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１〜７８    合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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