(57)【要約】ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高い抗体、並びにＨＭＧＢ１分解産物のみを正確に定量測定することができる測定方法及び測定試薬を提供する。  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体；並びに前記抗体、及びＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体であって、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が高い抗体を使用するＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
【請求項２】
ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍である、請求項１記載のＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
【請求項３】
ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２記載のＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
【請求項４】
試料に含まれるＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の免疫学的測定方法であって、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を使用する測定方法。
（ａ）  請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
（ｂ）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体であって、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が高い抗体。
【請求項５】
請求項４における（ｂ）の抗体が、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
である、請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
（ａ）の抗体が、請求項２記載の抗体である、請求項４又は５記載の測定方法。
【請求項７】
（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体がモノクローナル抗体である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
固相化抗体及び標識抗体を用いるものであって、（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】
試料に含まれるＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の免疫学的測定試薬であって、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を含有する測定試薬。
（ａ）  請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
（ｂ）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体であって、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が高い抗体。
【請求項１０】
請求項９における（ｂ）の抗体が、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
である、請求項９記載の測定試薬。
【請求項１１】
（ａ）の抗体が、請求項２記載の抗体である、請求項９又は１０記載の測定試薬。
【請求項１２】
（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体がモノクローナル抗体である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項１３】
固相化抗体及び標識抗体を含有するものであって、（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭＧＢ１に比べ細胞障害性が低減したＨＭＧＢ１の分解産物と特異的に結合する抗体、並びにＨＭＧＢ１の分解産物の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＭＧＢ（ハイ  モビリティー  グループ  ボックス  プロテイン；Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、以前、ＨＭＧ（ハイ  モビリティー  グループ  プロテイン；Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれていたが、これはクロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。
また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。
生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧＢはＤＮＡと結合する際に二重らせん構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
ＨＭＧＢには、いくつかの種類が存在する。
例えば、ＨＭＧＢ１（ハイ  モビリティー  グループ  ボックス  プロテイン１）、ＨＭＧＢ２（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン２）、ＨＭＧＢ３（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン３）、ＨＭＧＢ８（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン８）、ＨＭＧＢ１７（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン１７）、ＨＭＧＢ  Ｉ（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン  Ｉ）、ＨＭＧＢ  Ｙ（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン  Ｙ）、ＨＭＧＢ  Ｉ（Ｙ）（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン  Ｉ（Ｙ））、ＨＭＧＢ  Ｉ−Ｃ（ハイモビリティー  グループ  ボックス  プロテイン  Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧＢ１に対して、ウシＨＭＧＢ１の相同性は９８．６％であり、ブタＨＭＧＢ１の相同性は９９．１％であった。
また、同様に、ヒトのＨＭＧＢ１に対して、ヒトのＨＭＧＢ２の相同性は８１．２％であり、ウシＨＭＧＢ２との相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧＢ２との相同性は７９．４％であった。
ワング（Ｗａｎｇ）らは１９９９年に、ＨＭＧＢ１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧＢ１の定量測定を行った。
その結果、ワングらは、ＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。
そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧＢ１を測定することによって可能であることを示した（非特許文献１参照。）。
なお、先に、ＨＭＧＢ１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧＢ１に結合する抗体については、パーキネン（Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ）らや、レップ（Ｌｅｐｐ）らによって調製可能なことが示されていた（非特許文献２及び非特許文献３参照。）。
この抗体を用いてレップらはＨＭＧＢ１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。
また、カバート（Ｃａｂａｒｔ）らにより、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２の調製方法が示されていた（非特許文献４参照。）。
また、ＨＭＧＢ１は、炎症でも誘導され、このことが各種サイトカインの大量分泌の原因と考えられるという文献も発表されている（非特許文献５参照、非特許文献６参照及び非特許文献７参照。）。
なお、本発明者らは、先に、ヒトＨＭＧＢ１には結合するが、ヒトＨＭＧＢ２には結合しない抗体、及びＨＭＧＢ２を測り込むことなく、誤差を含まない正確な測定値を得ることができるヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法を開発した（特許文献１参照。）。
また、本発明者らは、先に、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であって、かつ当該抗体を高い確率で取得することができる抗ヒトＨＭＧＢ１抗体、試料中にごく微量に含まれるヒトＨＭＧＢ１までも正確に測定することができる高感度な試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬等を開発した（特許文献２参照。）。
ところで、本発明者らは、トロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体により、ヒトＨＭＧＢ１の１０番目のアルギニン（Ｒ１０）−１１番目のグリシン（Ｇ１１）が切断され、このＨＭＧＢ１のＮ末端の「ＭＧＫＧＤＰＫＫＰＲ」の１０のアミノ酸残基よりなるペプチドが分離して、新たに露呈したＮ末端「ＧＫＭＳＳ・・・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解産物が生じることを見出した。（本発明者らは、このヒトＨＭＧＢ１の分解産物を「ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１」と名付けた。）
本発明者らの検討の結果、このＨＭＧＢ１の分解産物は、ＨＭＧＢ１に比べその細胞障害性が低いものであることが分かった。
このことより、ＨＭＧＢ１の細胞障害性を減じるため、トロンビンやトロンビン・トロンボモジュリン複合体を用いて、ＨＭＧＢ１を前記の通り分解（切断）して、より細胞障害性の低いＨＭＧＢ１の分解産物に変換することが発想された。
そして、このトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体によるＨＭＧＢ１の分解の効果を把握するため、このＨＭＧＢ１の分解産物の定量測定が求められ、測定方法が検討されたが、従来の方法は、このＨＭＧＢ１の分解産物と共にＨＭＧＢ１等も測り込んでしまうものであって、ＨＭＧＢ１の分解産物だけを特異的に測定することはできないものであった（非特許文献８参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−９６０９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０７５７８８号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行
【非特許文献２】Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行
【非特許文献３】Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行
【非特許文献４】Ｐ．Ｃａｂａｒｔら，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １３，１２５〜１３３頁，１９９５年発行
【非特許文献５】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２巻，５６５〜５７０頁，２０００年発行
【非特許文献６】Ｓｃａｆｆｉｄｌら，Ｎａｔｕｒｅ，４１８巻，１９１〜１９５頁，２００２年発行
【非特許文献７】Ｐａｒｋら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９巻，２７号，２００４年発行
【非特許文献８】Ｉｔｏら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８巻，１８２５〜１８３０頁，２００８年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を正確に定量測定することが求められた。
しかしながら、従来の抗体は、前記のＨＭＧＢ１の分解産物に対する特異性が高いものではなく、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性とＨＭＧＢ１に対する親和性が同程度のものであった。
そして、従来の測定方法及び測定試薬も、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高いものではなく、前記ＨＭＧＢ１分解産物を測定するのみならず、ＨＭＧＢ１等も測り込んでしまうものであり、すなわちその測定値がＨＭＧＢ１等に由来する正の誤差を含んでしまうものであった。
また、ＨＭＧＢ１の分解産物の全アミノ酸配列は、ＨＭＧＢ１中に存在するため、当該分解産物に対する親和性がＨＭＧＢ１に対する親和性よりも高い抗体を得ることは困難であると予想された。
しかしながら、本発明者らは、前記課題の解決を目指して検討を重ねた結果、目的とする抗体を得ることに成功し、更に当該抗体と、特定の抗体を組み合わせることにより、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを正確に定量測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
（２）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍である、前記（１）記載のＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
（３）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体がモノクローナル抗体である、前記（１）又は（２）記載のＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体。
（４）  試料に含まれるＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の免疫学的測定方法であって、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を使用する測定方法。
（ａ）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（ｂ）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体であって、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が高い抗体。
（５）  前記（４）における（ｂ）の抗体が、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
である、前記（４）記載の測定方法。
（６）  （ａ）の抗体が、前記（２）記載の抗体である、前記（４）又は（５）記載の測定方法。
（７）  （ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体がモノクローナル抗体である、前記（４）〜（６）のいずれかに記載の測定方法。
（８）  固相化抗体及び標識抗体を用いるものであって、（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用される、前記（４）〜（７）のいずれかに記載の測定方法。
（９）  試料に含まれるＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の免疫学的測定試薬であって、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を含有する測定試薬。
（ａ）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（ｂ）  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体であって、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が高い抗体。
（１０）  前記（９）における（ｂ）の抗体が、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
である、前記（９）記載の測定試薬。
（１１）  （ａ）の抗体が、前記（２）記載の抗体である、前記（９）又は（１０）記載の測定試薬。
（１２）  （ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体がモノクローナル抗体である、前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の測定試薬。
（１３）  固相化抗体及び標識抗体を含有するものであって、（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用される、前記（９）〜（１２）のいずれかに記載の測定試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗体は、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍高い抗体であり、すなわち、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高い抗体である。
また、本発明の測定方法及び測定試薬は、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する特異性が高いものであって、ＨＭＧＢ１等の測り込みが抑制され、すなわちＨＭＧＢ１等に由来する正の誤差が生じることが抑制され、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを正確に定量測定することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ泳動したときのゲルの写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＨＭＧＢ１、レーン３は前記ＨＭＧＢ１分解産物、レーン４はＨＭＧＢ２、レーン５は前記ＨＭＧＢ２分解産物、レーン６はトロンビンを示す。
【図２】図２は抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性（親和性）を確かめたウエスタンブロット法の写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＨＭＧＢ１、レーン３は前記ＨＭＧＢ１分解産物、レーン４はＨＭＧＢ２、レーン５は前記ＨＭＧＢ２分解産物を示す。
【図３】図３は本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性（親和性）を確かめたウエスタンブロット法の写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＨＭＧＢ１、レーン３は前記ＨＭＧＢ１分解産物、レーン４はＨＭＧＢ２、レーン５は前記ＨＭＧＢ２分解産物を示す。
【図４Ａ】図４Ａはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（２Ｄ４）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（４Ｆ１２）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（８Ｈ４）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（２Ｈ６）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（５Ｄ１）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（２Ａ１０）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（６Ｈ３）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｈ】図４Ｈはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（ＭＤ７８）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｉ】図４Ｉはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（ＭＤ７７）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｊ】図４Ｊはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（４Ｃ３）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｋ】図４Ｋはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（Ｊ２Ｅ１）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図４Ｌ】図４Ｌはマイクロタイタープレートに固定化した前記ＨＭＧＢ１分解産物等への抗体（ＨＡＰ４６．５）の反応性を確認した図である。横軸は試料として用いた各抗体溶液中の抗体の濃度、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図５】図５は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体及び他のＨＭＧＢ１に結合する抗体等を用いＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物をそれぞれ測定したときの結果を示す図である。横軸の上段は当該測定に使用したＰＯＤ標識抗体液の抗体の産生細胞株を表す文字を示し、横軸の下段は当該測定に使用した抗体固相化マイクロプレートの抗体の産生細胞株を表す文字を示し、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図６】図６は従来試薬・方法のＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物をそれぞれ測定したときの検量線を示す図である。横軸は試料中のＨＭＧＢ１、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度（０〜８０ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図７】図７は本発明にしたがってＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物をそれぞれ測定したときの検量線を示す図である。横軸は試料中のＨＭＧＢ１、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度（０〜８０ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図８】図８は本発明にしたがって抗体（ａ）として本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）、抗体（ｂ）として抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）を用いてＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ測定したときの検量線を示す図である。横軸は試料中のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、又は前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度の値を示す。
【図９】図９は本発明にしたがって抗体（ａ）として本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）、抗体（ｂ）として抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）を用いてＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ測定したときの検量線を示す図である。横軸は試料中のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、又は前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度（０〜８０ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度差の値を示す。
【図１０】図１０は本発明にしたがって抗体（ａ）として本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）、抗体（ｂ）として抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）を用いてＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ測定したときの検量線を示す図である。横軸は試料中のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、又は前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度（０〜８０ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したときの吸光度差の値を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体
（１）本発明の抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体
本発明の抗体は、「ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体」である。（なお、この本発明の抗体を、以下、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」ということがある。）
なお、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、「少なくとも１．５倍」とは、当該抗体の濃度が０．６２５〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、後述の「親和性の測定方法」で測定した時の親和性が少なくとも１．５倍であることをいう。
この本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体としては、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍であるものが好ましい。（抗体濃度：０．６２５〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度））
また、この本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体としては、モノクローナル抗体が好ましい。
なお、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、モノクローナル抗体、又はこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’など）等のいずれのものであってもよい。
（２）ＨＭＧＢ１分解産物
本発明における「ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物」はトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体によりヒトＨＭＧＢ１が加水分解されることによって生じたタンパク質又はペプチドであるが、本発明においては、特に、トロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体により、ヒトＨＭＧＢ１の１０番目のアルギニン（Ｒ１０）−１１番目のグリシン（Ｇ１１）が切断され、このＨＭＧＢ１のＮ末端の「ＭＧＫＧＤＰＫＫＰＲ」の１０のアミノ酸残基よりなるペプチドが分離することにより生じる、新たに露呈したＮ末端「ＧＫＭＳＳ・・・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解産物のことをいう。
ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列を配列番号１として、また、前記のヒトＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物のアミノ酸配列を配列番号２として、配列表に示した。
なお、本発明において、前記のヒトＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物としては、前記の配列番号２として示したアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるタンパク質、あるいはこのタンパク質に糖類又は脂質などが結合したものであってもよい。
なお、前記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加又は修飾におけるアミノ酸残基数は、通常１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。
また、本発明において、前記のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体としては、ヒトの体内に存在するトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体はもちろんのこと、遺伝子組換え体などの人工的に調製されたもの又は人工的に単離されたもの等も含むものである。
（なお、以上述べた「ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物」を、以下、「前記ＨＭＧＢ１分解産物」ということがある。）
（３）  親和性の測定方法
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体は、前記の通り、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍であるものである。
この抗体の親和性の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、次のように行うことができる。
〔Ａ〕測定試薬の調製
（ｉ）ＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレート
ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物（以下、「前記ＨＭＧＢ２分解産物」ということがある。）のそれぞれをリン酸緩衝生理食塩水により１μｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものを、各々９６穴マイクロタイタープレート〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社（米国・イリノイ州）〕のウェルに１００μＬ注入し、２５℃で１８時間静置し、前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれを、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化した。
次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除去した後、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）〔ｐＨ８．０〕の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、ブロッキング処理を行った。
この後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。
これを、ＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートとした。
（ｉｉ）ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液
ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を、０．５％カゼインナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）によって１０００倍希釈した。
これをＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液とした。
（ｉｉｉ）洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。
（ｉｖ）希釈液
０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、希釈液とした。
（ｖ）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。
（ｖｉ）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。
（ｖｉｉ）発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
（ｖｉｉｉ）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。
〔Ｂ〕試料
ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれとの親和性を測定しようとする抗体を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記〔Ａ〕の（ｉｖ）の希釈液により希釈して、前記４濃度の抗体溶液をそれぞれ調製した。
〔Ｃ〕測定
（ｉ）  前記〔Ａ〕の（ｉ）のＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記〔Ａ〕の（ｉｉｉ）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（ｉｉ）  次に、前記〔Ｂ〕の４濃度の抗体溶液それぞれの１００μＬを試料として各ウェルに分注した後、２５℃で２時間静置し、これらの各濃度の抗体溶液に含まれていた抗体を、このＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートのウェルに固相化された前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物の各々と、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（ｉｉｉ）  次に、各ウェルを、前記〔Ａ〕の（ｉｉｉ）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（ｉｖ）  次に、前記〔Ａ〕の（ｉｉ）のＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置し、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（ｖ）  次に、各ウェルを、前記〔Ａ〕の（ｉｉｉ）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（ｖｉ）  次に、各ウェルに、前記〔Ａ〕の（ｖｉｉ）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）による発色反応を行わせた。
（ｖｉｉ）  次に、各ウェルに、前記〔Ａ〕の（ｖｉｉｉ）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（ｖｉｉｉ）  次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の４濃度の抗体溶液それぞれを試料として測定した場合の吸光度を得た。
そして、この吸光度の値を前記の親和性を測定しようとする抗体の前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれとの親和性を示す値とした。
例えば、親和性を測定しようとする抗体の溶液（例えば、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度）を試料として、前記の通り測定を行ったときに、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルで得られた前記吸光度差の値が１．３５であり、前記のＨＭＧＢ１を固相化したウェルで得られた前記吸光度差の値が０．９であった場合には、この抗体は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、といえる。
すなわち、この場合、この抗体は、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体である。
（４）免疫原
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するための免疫原について、以下説明を行う。
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するための免疫原としては、例えば、ヒトＨＭＧＢ１、ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列との相同性が高い動物（例えば、ウシ又はブタ等）のＨＭＧＢ１、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物の全体又は一部等を挙げることができる。
なお、前記ＨＭＧＢ１分解産物の一部としては、例えば、この前記ＨＭＧＢ１分解産物のＮ末端の「ＧＫＭＳＳＹＡＦＦＶＱＴＣＲＥＥＨＫＫＫ」の２０のアミノ酸残基よりなるペプチド等を挙げることができる。
また、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するための免疫原としては、これまで述べた免疫原としてのタンパク質又はペプチドについて、１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加又は修飾を施すことにより得られるタンパク質又はペプチドであってもよい。
なお、前記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加又は修飾におけるアミノ酸残基数は、通常１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。
また、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するために動物等に免疫するものとしては、これまで述べた免疫原としてのタンパク質又はペプチドについて、担体（キャリア）を結合させたものであってもよい。
特に、前記の免疫原としてのタンパク質又はペプチドが低分子量のものである場合には、担体との結合により抗体産生能が向上するので、担体を結合させたものを免疫原として用いることが好ましい。
なお、この担体としては、例えば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
（５）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体の免疫原等の取得方法
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するために動物等に免疫する免疫原等の取得方法について、以下説明を行う。
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得するための免疫原であるが、前記（４）に記載したヒトＨＭＧＢ１、又はヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列との相同性が高い動物のＨＭＧＢ１は、例えば、ヒト又はヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が高いヒト以外の哺乳類動物（ブタ、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス又はラットなど）等の体液、細胞、組織又は臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
また、前記ＨＭＧＢ１分解産物は、例えば、ヒトＨＭＧＢ１、又はヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列との相同性が高い動物（例えば、ウシ又はブタ等）のＨＭＧＢ１を、前記のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体に接触させて、加水分解し、そして、これについて、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
また、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよい。
例えば、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年；泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができる。
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年；日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
例えば、前記の配列番号１で示されるヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列、若しくは前記の配列番号２で示される前記ＨＭＧＢ１分解産物のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部に対応する遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。
次に、この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、前記のアミノ酸配列又はその一部よりなるタンパク質又はペプチドを発現させることができる。
なお、遺伝子の塩基配列をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
なお、前記のタンパク質又はペプチドに担体を結合させたものを動物等に免疫する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
前記のタンパク質又はペプチドと担体との結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に前記のタンパク質又はペプチドを吸着させたものも、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体の取得のため、前記の動物等への免疫に用いることができる。
（６）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（ポリクローナル抗体）の取得方法
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により取得することができる。
（ｉ）  まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）又は鳥類（ニワトリ等）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、例えば、ウサギの場合にはウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を含む抗血清を得る。
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
（ｉｉ）  ここで得られたポリクローナル抗体は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性がＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して少なくとも１．５倍である抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）と、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性がＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して１．５倍未満である抗体（従来の抗体）の両方を含むものであるので、更に、これをＨＭＧＢ１をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させる。
前記の従来の抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧＢ１）を介して固相に結合し、捕集される。
これに対して、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧＢ１）に結合し難く、このカラムを素通りするものが多いので、素通りした画分を得ることにより、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得することができる。
なお、これを、前記ＨＭＧＢ１分解産物をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体をこのカラムのリガンド（前記ＨＭＧＢ１分解産物）を介して固相に結合させるとともに、他の抗体等はこのカラムを素通りさせて分離し、その後、この固相に結合させていた本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体をリガンド（前記ＨＭＧＢ１分解産物）から分離し、このカラムから流出する画分を得ることにより、更に純度の高い本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を取得することができる。
（ｉｉｉ）  なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
（７）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（モノクローナル抗体）の取得方法
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
また、前記のハイブリドーマの培養上清を、ＨＭＧＢ１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ＨＭＧＢ１等には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
この２種類のハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（モノクローナル抗体）、即ち「ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に結合する抗体」（モノクローナル抗体）の産生細胞株を単離して得ることができる。
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（モノクローナル抗体）を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（モノクローナル抗体）を得ることもできる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。
〔ＩＩ〕試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法
（１）総論
本発明の試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法（以下、「本発明の免疫学的測定方法」又は「本発明の測定方法」ということがある。）は、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を使用する測定方法である。
（ａ）  本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体。
（ｂ）  前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体。
前記の（ｂ）の抗体としては、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
が好ましい。
前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）としては、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍であるものが好ましい。（抗体濃度：０．６２５〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度））
また、前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）、及び／又は前記の（ｂ）の抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。
なお、前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）、及び／又は前記の（ｂ）の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、モノクローナル抗体、又はこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’など）等のいずれのものであってもよい。
また、本発明の測定方法は、固相化抗体及び標識抗体を用いるものであって、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用されるものであってもよい。
本発明の測定方法は、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体を使用することにより、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高く、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを正確に定量測定することができる。
なお、前記の（ａ）の抗体は、前記の通りの抗体であれば特に制限なく使用することができる。
また、前記の（ｂ）の抗体は、前記の通りの抗体であれば特に制限なく使用することができる。
なお、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体はそれぞれ、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
（２）前記の（ａ）の抗体
前記の（ａ）の抗体、すなわち本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体の詳細については、前記の「〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」の項などに記載した通りである。
（３）前記の（ｂ）の抗体
（ｉ）  前記の（ｂ）の抗体は、「前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体」である。
なお、前記の（ｂ）の抗体としては、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
が好ましい。
（ｉｉ）  親和性の測定方法
前記の（ｂ）の抗体は、前記の通り、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体である。
なお、前記の（ｂ）の抗体としては、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
が好ましい。
（ｉｉ−１）  前記抗体（イ）における吸光度の測定方法
前記抗体（イ）における吸光度の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、次のように行うことができる。〔本発明における「抗体の親和性の測定方法」と同じ。〕
〔Ａ〕測定試薬の調製
〔ｉ〕ＨＭＧＢ１分解産物固相化マイクロプレート
前記ＨＭＧＢ１分解産物をリン酸緩衝生理食塩水により１μｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものを、各々９６穴マイクロタイタープレート〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社（米国・イリノイ州）〕のウェルに１００μＬ注入し、２５℃で１８時間静置し、前記ＨＭＧＢ１分解産物を、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化した。
次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除去した後、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）〔ｐＨ８．０〕の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、ブロッキング処理を行った。この後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。これを、ＨＭＧＢ１分解産物固相化マイクロプレートとした。
〔ｉｉ〕ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液
ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を、０．５％カゼインナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）によって１０００倍希釈した。これをＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液とした。
〔ｉｉｉ〕洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。
〔ｉｖ〕希釈液
０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、希釈液とした。
〔ｖ〕発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。
〔ｖｉ〕基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。
〔ｖｉｉ〕発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
〔ｖｉｉｉ〕反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。
〔Ｂ〕試料
前記抗体（ｂ）のそれぞれを、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、及び／又は２．５ｎｇ／ｍＬとなるように前記〔Ａ〕の〔ｉｖ〕の希釈液により希釈して、前記３濃度の抗体溶液をそれぞれ調製した。
〔Ｃ〕測定
〔ｉ〕  前記〔Ａ〕の〔ｉ〕のＨＭＧＢ１分解産物固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記〔Ａ〕の〔ｉｉｉ〕の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
〔ｉｉ〕  次に、前記〔Ｂ〕の３濃度の抗体溶液それぞれの１００μＬを試料として各ウェルに分注した後、２５℃で２時間静置し、これらの各濃度の抗体溶液に含まれていた前記の抗体（ｂ）を、このＨＭＧＢ１分解産物固相化マイクロプレートのウェルに固相化された前記ＨＭＧＢ１分解産物と、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
〔ｉｉｉ〕  次に、各ウェルを、前記〔Ａ〕の〔ｉｉｉ〕の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
〔ｉｖ〕  次に、前記〔Ａ〕の〔ｉｉ〕のＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置し、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
〔ｖ〕  次に、各ウェルを、前記〔Ａ〕の〔ｉｉｉ〕の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
〔ｖｉ〕  次に、各ウェルに、前記〔Ａ〕の〔ｖｉｉ〕の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）による発色反応を行わせた。
〔ｖｉｉ〕  次に、各ウェルに、前記〔Ａ〕の〔ｖｉｉｉ〕の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
〔ｖｉｉｉ〕  次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の３濃度の前記の抗体（ｂ）の抗体溶液それぞれを試料として測定した場合の吸光度を得た。
そして、この吸光度の値を前記の抗体（ｂ）の前記ＨＭＧＢ１分解産物との親和性を示す値とした。
例えば、親和性を測定しようとする抗体の溶液（例えば、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度）を試料として、前記の通り測定を行ったときに、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルで得られた前記吸光度差の値が１．２５であった場合には、１．２５÷２．５ｎｇ／ｍＬ＝０．５（ｎｇ／ｍＬ）−１となり、この抗体は、『当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体である』、といえる。
すなわち、この場合、この抗体は、前記の（ｂ）の抗体である。
（ｉｉ−２）  前記抗体（ロ）における吸光度の測定方法
前記抗体（ロ）における吸光度の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、前記「（ｉｉ−１）  前記抗体（イ）における吸光度の測定方法」における〔Ａ〕〜〔Ｃ〕と同様にして行うことができる。〔本発明における「抗体の親和性の測定方法」と同じ。〕
例えば、親和性を測定しようとする抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲において、前記の通り測定を行ったときに、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルで得られた当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られた前記吸光度差の値が１．２であり、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値が０．２あった場合には、１．２÷０．２＝６となり、この抗体は、『当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、前記の基準とする抗体産生細胞より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体である』、といえる。
すなわち、この場合、この抗体は、前記の（ｂ）の抗体である。
（ｉｉｉ）免疫原
前記の（ｂ）の抗体を取得するための免疫原としては、例えば、前記の「〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」の「（４）免疫原」に記載の免疫原等を用いることができる。
（ｉｖ）前記の（ｂ）の抗体の免疫原等の取得方法
前記の（ｂ）の抗体を取得するために動物等に免疫する免疫原等の取得方法については、例えば、前記の「〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」の「（５）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体の免疫原等の取得方法」に記載の取得方法等を用いることができる。
（ｖ）前記の（ｂ）の抗体（ポリクローナル抗体）の取得方法
前記の（ｂ）の抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により取得することができる。
（Ａ）  まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）又は鳥類（ニワトリ等）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、例えば、ウサギの場合にはウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して前記の（ｂ）の抗体を含む抗血清を得る。
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
（Ｂ）  ここで得られたポリクローナル抗体について、前記（ｉｉ）の記載のように抗体の親和性を測定し、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体を選択することにより、前記の（ｂ）の抗体を取得することができる。
例えば、前記（ｉｉ）の記載のようにして、この抗体の親和性の測定を行ったときに、親和性を測定しようとする抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い、といえる。
なお、これを、前記ＨＭＧＢ１分解産物をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、前記の（ｂ）の抗体をこのカラムのリガンド（前記ＨＭＧＢ１分解産物）を介して固相に結合させるとともに、他の抗体等はこのカラムを素通りさせて分離し、その後、この固相に結合させていた前記の（ｂ）の抗体をリガンド（前記ＨＭＧＢ１分解産物）から分離し、このカラムから流出する画分を得ることにより、更に純度の高い前記の（ｂ）の抗体を取得することができる。
（Ｃ）  なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
（ｖｉ）前記の（ｂ）の抗体（モノクローナル抗体）の取得方法
前記の（ｂ）の抗体において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
そして、このようにして選択したハイブリドーマの培養上清について、前記（ｉｉ）の記載のように抗体の親和性を測定し、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体を選択することにより、前記の（ｂ）の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
これらのハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、前記の（ｂ）の抗体（モノクローナル抗体）、即ち「前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体」（モノクローナル抗体）の産生細胞株を単離して得ることができる。
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から前記の（ｂ）の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より前記の（ｂ）の抗体（モノクローナル抗体）を得ることもできる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された前記の（ｂ）の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。
（４）免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法は、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法であって、前記の（ａ）の抗体〔本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体〕及び前記の（ｂ）の抗体を使用するものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の免疫学的測定方法を適用することができる。
また、本発明の免疫学的測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
（５）試料
本発明の免疫学的測定方法における試料としては、ヒトの血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液；大便；血管若しくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、前記ＨＭＧＢ１分解産物が含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
（６）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法を、標識物質を抗体（若しくは抗原）に結合した標識抗体（若しくは標識抗原）、及び抗体（若しくは抗原）を固相担体に固相化した固相化抗体（若しくは固相化抗原）を用いる、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施することが好ましい。
本発明の免疫学的測定方法を、前記のサンドイッチ法により実施する時には、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用されるものであってもよい。
前記の免疫学的測定方法に用いる固相化抗体（若しくは固相化抗原）に使用する固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を使用することができる。
固相化抗体（若しくは固相化抗原）は、前記の（ａ）の抗体若しくは前記の（ｂ）の抗体等の抗体又は抗原と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体（若しくは抗原）と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（若しくは抗原）と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基などと反応させること等により行うことができる。
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体（若しくは抗原）を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、例えば、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、例えば、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ反応系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ反応系、アクリジニウムエステル反応系、又はジオキセタン化合物反応系などの反応系に係わる物質等を用いることができる。
前記の（ａ）の抗体又は前記の（ｂ）の抗体等の抗体（若しくは抗原）と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（若しくは抗原）と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
前記の酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定方法における測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。
例えば、固相化抗体（「固相担体−抗体」）と試料を反応させ、同時に標識抗体（「抗体−標識物質」）を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体−抗体」＝「前記ＨＭＧＢ１分解産物」＝「抗体−標識物質」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相担体−抗体」＝「前記ＨＭＧＢ１分解産物」＝「抗体−標識物質」の結合により固相担体に間接的に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量を測ることにより試料に含まれていた前記ＨＭＧＢ１分解産物の量（濃度）を測定することができる。
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下等で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を測定する。
そして、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
更に、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
（７）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法を、免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測ることにより、試料に含まれていた前記ＨＭＧＢ１分解産物の量（濃度）を測定する、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法によっても実施することができる。
前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相担体に固相化させて用いる場合には、固相担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相担体に固相化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が前記の（ａ）の抗体又は前記の（ｂ）の抗体及び測定対象物質（前記ＨＭＧＢ１分解産物）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度、前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体と試料中に含まれていた「前記ＨＭＧＢ１分解産物」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。
そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
本発明の免疫学的測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法により実施する場合には、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
前記の免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法における測定の操作法は、公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と前記の「前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体」、又は試料と固相担体に固相化させた「前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に固相化させた「前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
〔ＩＩＩ〕試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定試薬
（１）総論
本発明の試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定試薬（以下「本発明の免疫学的測定試薬」又は「本発明の測定試薬」ということがある。）は、次の（ａ）の抗体及び（ｂ）の抗体を含有する測定試薬である。
（ａ）  本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体。
（ｂ）  前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体。
前記の（ｂ）の抗体としては、当該抗体の濃度が０．６２５〜２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度）において、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物を固相化したＥＬＩＳＡ法で、
（イ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値を当該抗体の濃度の値で除したときの値が０．５以上となる抗体、又は
（ロ）当該分解産物に結合する当該抗体の量を測定するときに得られる吸光度の値が、基準とする抗体産生細胞であるハイブリドーマＭＤ７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上となる抗体
が好ましい。
前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）としては、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍であるものが好ましい。（抗体濃度：０．６２５〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の少なくともいずれかの濃度（好ましくは当該範囲のすべての濃度））
また、前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）、及び／又は前記の（ｂ）の抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。
なお、前記の（ａ）の抗体（本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体）、及び／又は前記の（ｂ）の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、モノクローナル抗体、又はこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’など）等のいずれのものであってもよい。
また、本発明の測定試薬は、固相化抗体及び標識抗体を用いるものであって、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用されるものであってもよい。
本発明の測定試薬は、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体を使用することにより、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高く、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを正確に定量測定することができる。
なお、前記の（ａ）の抗体は、前記の通りの抗体であれば特に制限なく使用することができる。
また、前記の（ｂ）の抗体は、前記の通りの抗体であれば特に制限なく使用することができる。
なお、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体はそれぞれ、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
（２）前記の（ａ）の抗体
前記の（ａ）の抗体、すなわち本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体の詳細については、前記の「〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」の項などに記載した通りである。
（３）前記の（ｂ）の抗体
前記の（ｂ）の抗体の詳細については、前記の「〔ＩＩ〕試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法」の「（３）前記の（ｂ）の抗体」の項などに記載した通りである。
（４）免疫学的測定試薬
本発明の免疫学的測定試薬においては、その測定原理として、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫学的測定方法（サンドイッチ法又は競合法等）のもの、又は免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法若しくは粒子凝集反応法などの免疫複合体凝集物の生成を測定する免疫学的測定方法のもの等、特に制限なく適用することができる。
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法又は発光免疫測定法等におけるサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体のうち、いずれか一方の抗体が固相化抗体として使用され、他の一方の抗体が標識抗体として使用されるものであってもよい。
また、例えば、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、ラテックス粒子等の固相担体に固相化させる抗体が前記の（ａ）の抗体及び／又は前記の（ｂ）の抗体であればよく、また、免疫比濁法を測定原理とする測定試薬においては、抗体として前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体を用いればよい。
なお、本発明の免疫学的測定試薬は、前記の（ａ）の抗体及び前記の（ｂ）の抗体を含有することを特徴とするものであるので、本発明の免疫学的測定試薬に含有させる「前記の（ａ）の抗体」の詳細は前記の「〔Ｉ〕抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体」の項などに記載した通りであり、また、本発明の免疫学的測定試薬に含有させる「前記の（ｂ）の抗体」の詳細は前記の「〔ＩＩ〕試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法」の「（３）前記の（ｂ）の抗体」の項などに記載した通りであり、本発明の免疫学的測定試薬の測定原理などの詳細は前記の「〔ＩＩ〕試料に含まれるＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法」の項などに記載した通りである。
（５）その他の試薬成分
本発明の免疫学的測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
また、本発明の免疫学的測定試薬には、前記の（ａ）の抗体若しくは前記の（ｂ）の抗体などの抗体を固相担体に固相化した「固相化抗体」、及び／又は前記の（ｂ）の抗体若しくは前記の（ａ）の抗体などの抗体と酵素などの標識物質を結合させた「標識抗体」等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；アミン塩若しくは第４級アンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
（６）測定試薬の構成
本発明の免疫学的測定試薬は、そのもの単独にて、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定に使用することができる。そして、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明の免疫学的測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の免疫学的測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の免疫学的測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
また、本発明の免疫学的測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又は前記のその他の試薬などの複数の構成試薬等からなる測定試薬キットであってもよい。
【実施例】
【００１０】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔参考例１〕（ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及びＨＭＧＢ２分解産物の調製）
ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物、ＨＭＧＢ２、及びＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物それぞれの調製を下記のようにして行った。
〔１〕  ＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２の調製
（１）  まず、ウシの胸腺５００ｇを、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む６００ｍＬの緩衝液中で破砕を行った。
（２）  次に、この破砕物を遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。
（３）  これに、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液を加えて撹拌した後、遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。この洗浄操作を２回繰り返して行った。
（４）  次に、得られた沈殿物に、０．７５Ｍの過塩素酸の３００ｍＬを加えた。
そして、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。残った沈殿物に０．７５Ｍの過塩素酸の４００ｍＬを加えた。これについても、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。この上澄み液と先に分取した上澄み液とを合わせた。なお、沈殿物は廃棄した。
（５）  前記の合わせた上澄み液に０．７５Ｍの過塩素酸を加えて、全体の容量を１，０００ｍＬとした。次に、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液をグラスフィルター（グレード４）で濾過した。
（６）  前記の濾過の濾液に、３，５００ｍＬのアセトンと２１ｍＬの濃塩酸の混合液を加えた。濁りが生じてくるので、遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分取した。この上澄み液に、アセトン２，５００ｍＬを加えた。そして、再度、濁りが生じてくるので、これを遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分離し、残った沈殿物を集めた。
（７）  この集めた沈殿物を室温で自然乾燥させた。以上の操作により、ＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２を含むタンパク質画分が、およそ２００ｍｇ得られた。
（８）  前記のＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２を含むタンパク質画分を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍＬに溶解した後、この２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で充分に透析を行った。
（９）  この透析の後、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに添加した。そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
（１０）  ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりＨＭＧＢ１を含む画分、及びＨＭＧＢ２を含む画分を各々特定した。
以上の操作により、ＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２をそれぞれ調製した。
〔２〕  ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の調製
ＨＭＧＢ１のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の調製を次のようにして行った。
（１）  前記〔１〕において調製したＨＭＧＢ１（３００μｇ／ｍＬ）に、トロンビン〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国）〕を１００Ｕ／ｍＬとなるように添加し〔場合により更に、遺伝子組み換え可溶性トロンボモジュリン（旭化成ファーマ社〔日本国〕）を含んでもよい〕、３７℃で３時間インキュベートした。
（２）  前記（１）の反応により、ＨＭＧＢ１の１０番目のアルギニン（Ｒ１０）と１１番目のグリシン（Ｇ１１）の間を切断し、新たに露呈したＮ末端「ＧＫＭＳＳ・・・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解産物を生成させ、すなわち前記ＨＭＧＢ１分解産物を調製した。
〔３〕  ＨＭＧＢ２のトロンビン又はトロンビン・トロンボモジュリン複合体による分解産物の調製
前記〔１〕において調製したＨＭＧＢ２について、前記〔２〕の記載の通りに操作を行い、前記ＨＭＧＢ２分解産物の調製を行った。
〔参考例２〕（調製したＨＭＧＢ１分解産物等の確認）
前記参考例１で調製したＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で確認した。
１．試薬
次の（１）〜（４）の試薬をそれぞれ調製又は用意した。
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｅａｓｙ−Ｇｅｌ（ＩＩＩ）  プリキャスト・ゲル（１５％）（フナコシ社〔日本国〕）を使用した。
（２）泳動槽用緩衝液
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕１．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム〔ＳＤＳ〕０．５ｇ、及びグリシン７．２ｇを純水に添加、混合した後５００ｍＬとして、泳動槽用緩衝液〔０．１％ＳＤＳ−１９２ｍＭグリシン−２５ｍＭトリス緩衝液〕を調製した。
（３）クマシーブリリアントブルー染色液
Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬工業社〔日本国〕）を使用した。
（４）試料処理液
ドデシル硫酸ナトリウム〔ＳＤＳ〕０．４ｇ、２−メルカプトエタノール１．２ｍＬ、１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）の１ｍＬ、及びグリセリン２ｍＬを純水に添加、混合した後１０ｍＬとして、試料処理液〔４％ＳＤＳ−１２％２−メルカプトエタノール−２０％グリセリン−１００ｍＭトリス緩衝液〕を調製した。
２．試料
次の前記参考例１の〔１〕〜〔３〕で調製したＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ試料とした。また、次の分子量マーカー及びトロンビンも試料とした。
（ａ）分子量マーカー〔Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓマーカー；マーカー分子量  １０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３７ＫＤａ、５０ＫＤａ、７５ＫＤａ、１００ＫＤａ、１５０ＫＤａ及び２５０ＫＤａ；ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）〕
（ｂ）ＨＭＧＢ１
（ｃ）前記ＨＭＧＢ１分解産物
（ｄ）ＨＭＧＢ２
（ｅ）前記ＨＭＧＢ２分解産物
（ｆ）トロンビン〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国）〕
３．電気泳動
前記１で調製した試薬を使用し、前記２の試料のそれぞれについて、次の操作によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法での電気泳動を行った。
（１）  前記２の（ｂ）〜（ｆ）の試料のそれぞれについて、前記１の（４）の試料処理液と１：１の量比で混合し、１００℃で５分間処理した。
（２）  下部泳動槽に前記１の（２）の泳動槽用緩衝液を入れた。次に、前記１の（１）のゲルを泳動槽にセットした。そして次に、上部泳動槽に前記１の（２）の泳動槽用緩衝液を入れた。
（３）  前記（１）の処理を行った各試料の１０μＬ及び前記２の（ａ）の分子量マーカーの試料２μＬのそれぞれについて、前記（２）のゲルのコウム穴に注入した。
なお、このゲルに注入した前記（１）の処理を行った試料及び前記２の（ａ）の分子量マーカーの試料であるが、レーン１に前記の「分子量マーカー」を、その右側のレーン２に前記の「ＨＭＧＢ１」を、その右側のレーン３に前記の「前記ＨＭＧＢ１分解産物」を、その右側のレーン４に前記の「ＨＭＧＢ２」を、その右側のレーン５に前記の「前記ＨＭＧＢ２分解産物」を、そしてその右側のレーン６に前記の「トロンビン」を注入した。
（４）  次に、２０ｍＡの電流で９０分間泳動を行った。
（５）  前記（４）の泳動を終了した後、ゲルを前記１の（３）のＱｕｉｃｋ−ＣＢＢを用いて染色した。
４．結果
前記３の（５）で染色したゲルを図１に示した。
このゲルの電気泳動像において、「前記ＨＭＧＢ１分解産物」（「３」と表記したレーン）のバンドは「ＨＭＧＢ１」（「２」と表記したレーン）のバンドよりも低分子量側に存在し、そして、「前記ＨＭＧＢ２分解産物」（「５」と表記したレーン）のバンドは「ＨＭＧＢ２」（「４」と表記したレーン）のバンドよりも低分子量側に存在することが分かる。
すなわち、「前記ＨＭＧＢ１分解産物」及び「前記ＨＭＧＢ２分解産物」をそれぞれ調製できていることが確認できた。
〔実施例１〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製−１）
前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製を下記のようにして行った。
（１）  前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）を免疫原として用いた。
この免疫原としての前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）の溶液の１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＦＲＥＵＮＤ完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を１容量の割合で混合して、ＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ完全アジュバントとの混合物を調製した。
また、この免疫原としての前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）の溶液の１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＦＲＥＵＮＤ不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を１容量の割合で混合して、ＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ不完全アジュバントとの混合物を調製した。
（２）  次に、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に免疫原として、３００〜５００μｇ／匹／回の前記のＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ完全アジュバントとの混合物を注射し、２週間後及び４週間後に、マウスの腹腔内に前記のＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ不完全アジュバントとの混合物を注射した。
（３）  最終免疫より４週間後に、前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）の原液を３００μｇ／匹によりブースターを行い、その翌日に、免疫したマウスの脾臓の細胞と、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール〔ＰＥＧ１５００；Ｒｏｃｈｅ社（スイス国）〕を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記脾臓細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール〔ＰＥＧ１５００；Ｒｏｃｈｅ社（スイス国）〕１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加える操作を２回行い、その後、血清不含培地７ｍＬを２分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、前記の参考例１で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）を固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
（ｉ）  前記の参考例１で調製したＨＭＧＢ１、及びＨＭＧＢ２のそれぞれをリン酸緩衝生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）により１μｇ／ｍＬの濃度となるように調製したもの、又は対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を、各々９６穴マイクロタイタープレート〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社（米国・イリノイ州）〕のウェルに１００μＬ注入し、５℃、１６〜２４時間（又は３７℃、２時間）静置し、前記のＨＭＧＢ１、及びＨＭＧＢ２のそれぞれを、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化し、更に１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水にて５℃で１６〜２４時間（又は３７℃、２時間）静置し、ブロッキングした。
（ｉｉ）  次に、前記（ｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを洗浄液〔０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水〕で３回洗浄した。
（ｉｉｉ）  次に、前記（ｉｉ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートのウェルに、これらの融合細胞培養上清溶液のそれぞれを試料として１００μＬ注入し、３７℃で２時間静置し、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化された前記のＨＭＧＢ１、及びＨＭＧＢ２のそれぞれと、前記の各融合細胞培養上清溶液に含まれるモノクローナル抗体とを各々反応させた。
（ｉｖ）  次に、前記（ｉｉｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で３回洗浄した。
（ｖ）  次に、前記（ｉｖ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートの各ウェルに、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水によって１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を１００μＬ注入し、３７℃で２時間静置し、反応を行わせた。
（ｖｉ）  次に、前記（ｖ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で３回洗浄した。
（ｖｉｉ）  次に、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）よりなる発色液と、５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）よりなる基質液とを、１：１で混合して調製した発色基質液の１００μＬを、前記（ｖｉ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、室温にて５〜３０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。その後、０．７Ｎ硫酸よりなる反応停止液を各ウェルに１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（ｖｉｉｉ）  次に、前記（ｖｉｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、分光光度計を用いて、主波長４５０ｎｍ及び副波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。前記の測定により、ＨＭＧＢ１に結合する抗体を産生する融合細胞株を選別し、そして、生育した融合細胞株の中から１つのクローンを確立し、２Ｈ６株と命名した。
（４）  この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を次のように精製した。このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＡカラム〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国）〕に結合させた。結合させたＩｇＧを、１００ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液１容量に対して、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）緩衝液１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、前記のＨＭＧＢ１に結合する抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。
この抗体は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であった。すなわち、２Ｈ６株のモノクローナル抗体産生細胞株から前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」という）を得ることができた。
なお、この本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）は、後述するように、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、１．５倍以上であった。
また、この本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）は、これも後述するように、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ２に対する親和性及び前記ＨＭＧＢ２分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々１０倍以上であった。
すなわち、この本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）は、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定方法及び測定試薬における（ａ）の抗体である。
なお、この「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」のモノクローナル抗体産生細胞株である２Ｈ６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５７０」として２０１３年３月１５日付けにて受領されている。
〔実施例２〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製−２）
前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製に当たり、前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）を免疫原として用いた。
以下、前記実施例１の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製を行った。
その結果、生育した融合細胞株の中から１つのクローンを確立し、５Ｄ１株と命名した。そして、５Ｄ１株のモノクローナル抗体産生細胞株から前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」という）を得ることができた。なお、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）は、後述するように、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体であった。すなわち、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）は、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定方法及び測定試薬における（ｂ）の抗体である。
なお、この「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」のモノクローナル抗体産生細胞株である５Ｄ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５７１」として２０１３年３月１５日付けにて受領されている。
〔実施例３〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製−３）
前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製に当たり、前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）を免疫原として用いた。
以下、前記実施例１の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製を行った。
その結果、生育した融合細胞株の中から１つのクローンを確立し、２Ａ１０株と命名した。そして、２Ａ１０株のモノクローナル抗体産生細胞株から前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）」という）を得ることができた。なお、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）は、後述するように、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体であった。すなわち、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）は、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定方法及び測定試薬における（ｂ）の抗体である。
なお、この「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）」のモノクローナル抗体産生細胞株である２Ａ１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５７２」として２０１３年３月１５日付けにて受領されている。
〔実施例４〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製−４）
前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製に当たり、前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１（全体長のもの）を免疫原として用いた。
以下、前記実施例１の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の調製を行った。
その結果、生育した融合細胞株の中から１つのクローンを確立し、６Ｈ３株と命名した。そして、６Ｈ３株のモノクローナル抗体産生細胞株から前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）」という）を得ることができた。なお、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）は、後述するように、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体であった。すなわち、この抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）は、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定方法及び測定試薬における（ｂ）の抗体である。
なお、この「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）」のモノクローナル抗体産生細胞株である６Ｈ３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５７３」として２０１３年３月１５日付けにて受領されている。
〔実施例５〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の反応性の確認）
前記実施例１、及び実施例２において取得した、ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の各々について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性を確認した。
〔１〕抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）
前記実施例２において取得した「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性を以下の通り確かめた。
１．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（１）試薬
次の（ａ）〜（ｃ）の試薬をそれぞれ調製した。
（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｅａｓｙ−Ｇｅｌ（ＩＩＩ）  プリキャスト・ゲル（１５％）（フナコシ社〔日本国〕）を使用した。
（ｂ）泳動槽用緩衝液
前記参考例２の１の（２）の記載の通りに調製を行い、泳動槽用緩衝液〔０．１％ＳＤＳ−１９２ｍＭグリシン−２５ｍＭトリス緩衝液〕を調製した。
（ｃ）試料処理液
ドデシル硫酸ナトリウム〔ＳＤＳ〕０．１ｇ、２−メルカプトエタノール０．１ｍＬ、５００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）の１ｍＬ、及びグリセリン２ｍＬを純水に添加、混合した後１０ｍＬとして、試料処理液〔１％ＳＤＳ−１％２−メルカプトエタノール−２０％グリセリン−５０ｍＭトリス緩衝液〕を調製した。
（２）試料
前記参考例１の〔１〕〜〔３〕で調製した、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれを試料（標準試料）として用いた。
また、分子量マーカー〔Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓマーカー；マーカー分子量  １０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３７ＫＤａ、５０ＫＤａ、７５ＫＤａ、１００ＫＤａ、１５０ＫＤａ及び２５０ＫＤａ；ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）〕も試料として用いた。
（３）電気泳動
前記（１）で調製した試薬を使用し、前記（２）の試料のそれぞれについて、次の操作によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法での電気泳動を行った。
（ａ）  前記（２）の試料のそれぞれについて、前記（１）の（ｃ）の試料処理液により試料濃度が１μｇ／ｍＬとなるように調製し、１００℃で５分間、煮沸処理を行った。
（ｂ）  下部泳動槽に前記（１）の（ｂ）の泳動槽用緩衝液を入れた。次に、前記（１）の（ａ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを泳動槽にセットした。そして次に、上部泳動槽に前記（１）の（ｂ）の泳動槽用緩衝液を入れた。
（ｃ）  前記（ａ）の処理を行った試料の１０μＬ（１０ｎｇ）を前記（ｂ）のゲルのコウム穴に注入した。また、前記（２）の分子量マーカーの試料の２μＬを前記（ｂ）のゲルのコウム穴に注入した。
なお、このゲルに注入した前記の試料及び分子量マーカーであるが、向かって左側のレーンより、次の「１」の「分子量マーカー」、「２」の「ＨＭＧＢ１」、「３」の「前記ＨＭＧＢ１分解産物」、「４」の「ＨＭＧＢ２」、及び「５」の「前記ＨＭＧＢ２分解産物」を順に注入した。
「１」：「分子量マーカー」
「２」：「ＨＭＧＢ１」
「３」：「前記ＨＭＧＢ１分解産物」
「４」：「ＨＭＧＢ２」
「５」：「前記ＨＭＧＢ２分解産物」
（ｄ）  次に、２０ｍＡの電流で９０分間泳動を行った。
（ｅ）  前記（ｄ）の泳動を終了した後、ゲルをガラスプレートより取り出した。
以上の操作により、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれを、その分子量に従ってゲル中に位置させ、このゲルを取得した。
２．ウエスタンブロッティング法
（１）  抗体希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕により２μｇ／ｍＬとなるように、実施例２で取得した「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」を希釈し、この抗体の溶液を調製した。
（２）  前記１の（３）の（ｅ）で取得したゲルの転写を、トランスブロットＳＤセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社〔米国〕）を用いて、その使用説明書に従い、セミドライ方式で行った。
まず、前記１の（３）の（ｅ）で取得したゲルを転写用装置上に置いた。
次に、このゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのポリビニルジフルオライド膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社〔米国〕）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕、３９ｍＭグリシン、及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流１００ｍＡで１時間転写を行い、その分子量に従ってゲル中に位置している前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物等のタンパク質を前記ゲルより前記ポリビニルジフルオライド膜に転写した。
（３）  この前記の各々のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物等のタンパク質の転写を行ったポリビニルジフルオライド膜を、ブロッキング液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕の２０ｍＬに室温で一晩浸漬して、ブロッキングを行った。
（４）  次に、前記（１）で調製した「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」の溶液に、前記（３）のポリビニルジフルオライド膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
これにより、ポリビニルジフルオライド膜に転写された、前記の各々のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物と、前記の「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」とを反応させた。
（５）  前記（４）の操作を行ったポリビニルジフルオライド膜を、２０ｍＬの洗浄液〔０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水〕の中で５分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
（６）  次に、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を、標識抗体希釈液〔０．５％のカゼイン、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕により１０００倍に希釈して調製した溶液に、前記（５）のポリビニルジフルオライド膜を室温で９０分間浸漬して反応させた。
（７）  前記（６）の操作を行ったポリビニルジフルオライド膜を、２０ｍＬの前記洗浄液中で５分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
（８）  ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記（７）のポリビニルジフルオライド膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
これにより、このポリビニルジフルオライド膜において、前記の「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」が認識し結合した、前記の各々のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、又は前記ＨＭＧＢ２分解産物の分子量に応じた位置に、発色を生じさせた。
このポリビニルジフルオライド膜上の発色の有無及びその発色した位置（分子量）より、前記の「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれとの反応性を確認した。
３．結果
（１）  前記２の（８）で発色させたポリビニルジフルオライド膜を図２に示した。
この図において、左側のレーンより順に、「分子量マーカー」のレーン（「１」と表記）、「ＨＭＧＢ１」のレーン（「２」と表記）、「前記ＨＭＧＢ１分解産物」のレーン（「３」と表記）、「ＨＭＧＢ２」のレーン（「４」と表記）、及び「前記ＨＭＧＢ２分解産物」のレーン（「５」と表記）を表す。
（２）  この図より、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」においては、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ示す位置において発色が認められることが分かる。
このことより、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」は、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のいずれをも認識し結合することが確かめられた。
〔２〕本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）
前記実施例１において取得した「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性を確かめた。
すなわち、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」に代えて、前記実施例１において取得した「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」を用いること以外は、前記〔１〕の記載の通りに操作を行い、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの反応性を確かめた。
この反応性を確かめた結果である、発色させたポリビニルジフルオライド膜を図３に示した。
この図において、左側のレーンより順に、「分子量マーカー」のレーン（「１」と表記）、「ＨＭＧＢ１」のレーン（「２」と表記）、「前記ＨＭＧＢ１分解産物」のレーン（「３」と表記）、「ＨＭＧＢ２」のレーン（「４」と表記）、及び「前記ＨＭＧＢ２分解産物」のレーン（「５」と表記）を表す。
この図より、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」においては、前記ＨＭＧＢ１分解産物を示す位置において濃い発色が認められるものの、ＨＭＧＢ１を示す位置においては極めて薄い発色らしきものが見られるにすぎない。そして、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物をそれぞれ示す位置においては、発色は認められない。
このことより、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」は、前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く認識し結合することが確かめられた。そして、ＨＭＧＢ１とはわずかに結合し、ＨＭＧＢ２及び前記ＨＭＧＢ２分解産物とは結合しないことが確かめられた。
〔実施例６〕（ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体の親和性の確認）
前記実施例１〜実施例４において取得したＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体及び他のＨＭＧＢ１に結合する抗体等の各々について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの親和性を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により確認した。
１．測定試薬
（１）ＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレート
前記参考例１の〔１〕〜〔３〕で調製した、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれをリン酸緩衝生理食塩水により１μｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものを、各々９６穴マイクロタイタープレート〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社（米国・イリノイ州）〕のウェルに１００μＬ注入し、２５℃で１８時間静置し、前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物のそれぞれを、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化した。
次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除去した後、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）〔ｐＨ８．０〕の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、ブロッキング処理を行った。この後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。これを、ＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートとした。
（２）ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液
ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を、０．５％カゼインナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）によって１０００倍希釈した。これをＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液とした。
（３）洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。
（４）希釈液
０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、希釈液とした。
（５）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。
（６）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。
（７）発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
（８）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。
２．試料
ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの親和性を確認する抗体の溶液を、次の通り調製し、試料として用いた。
（１）抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）
モノクローナル抗体産生細胞株の２Ｄ４株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）の抗体溶液を調製した。
（２）抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｆ１２）
モノクローナル抗体産生細胞株の４Ｆ１２株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｆ１２）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｆ１２）の抗体溶液を調製した。
（３）抗ＨＭＧＢ１等抗体（８Ｈ４）
モノクローナル抗体産生細胞株の８Ｈ４株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（８Ｈ４）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（８Ｈ４）の抗体溶液を調製した。
（４）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）
本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）の抗体溶液を調製した。
（５）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）
抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）の抗体溶液を調製した。
（６）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）
抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）の抗体溶液を調製した。
（７）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）
抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）の抗体溶液を調製した。
（８）抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７８）
モノクローナル抗体産生細胞株のＭＤ７８株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０５として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。）から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７８）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７８）の抗体溶液を調製した。
（９）抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）
モノクローナル抗体産生細胞株のＭＤ７７株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０４として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。）から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）の抗体溶液を調製した。
（１０）抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｃ３）
モノクローナル抗体産生細胞株の４Ｃ３株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体；商品名：Ａｎｔｉ−ＨＭＧＢ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ［４Ｃ３］（Ａｂｃａｍ社））〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｃ３）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｃ３）の抗体溶液を調製した。
（１１）抗ＨＭＧＢ１等抗体（Ｊ２Ｅ１）
モノクローナル抗体産生細胞株のＪ２Ｅ１株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体；商品名：ＨＭＧ−１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊ２Ｅ１）：ｓｃ−１３５８０９（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社））〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（Ｊ２Ｅ１）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（Ｊ２Ｅ１）の抗体溶液を調製した。
（１２）抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＨＡＰ４６．５）
モノクローナル抗体産生細胞株のＨＡＰ４６．５株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合する抗体（モノクローナル抗体；商品名：Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＨＡＰ４６．５］  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（Ａｂｃａｍ社））〔以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＨＡＰ４６．５）」という〕を、その濃度が各々、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬとなるように前記１の（４）の希釈液により希釈して、各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＨＡＰ４６．５）の抗体溶液を調製した。
３．測定
（１）  前記１の（１）のＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（２）  次に、前記２の（１）の４濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）の溶液それぞれの１００μＬを試料として各ウェルに分注した後、２５℃で２時間静置し、これらの各濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）を、このＨＭＧＢ１分解産物等固相化マイクロプレートのウェルに固相化された前記のＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物の各々と、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（３）  次に、各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（４）  次に、前記１の（２）のＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体液の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置し、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（５）  次に、各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（６）  次に、各ウェルに、前記１の（７）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）による発色反応を行わせた。
（７）  次に、各ウェルに、前記１の（８）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（８）  次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の４濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）の溶液それぞれを試料として測定した場合の吸光度を得た。
（９）  前記（２）における４濃度の抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）の溶液の代わりに、前記２の（２）〜（１２）の各抗体の抗体溶液（各々４濃度ずつ）をそれぞれ試料として用いる以外は、前記（１）〜（８）の記載の通りに行い、これらの各抗体の抗体溶液それぞれを試料として測定した場合の吸光度を得た。
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、前記の各抗体について、ＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ１分解産物、ＨＭＧＢ２、及び前記ＨＭＧＢ２分解産物それぞれとの親和性を確認した結果を、図４Ａ〜Ｌに示した。
これらの図において、図の上方に当該親和性を確認した抗体の産生細胞株を表す文字を示した。
また、これらの図において、横軸は試料として用いた抗体溶液中の抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕を示す。
また、これらの図において、「◆」はＨＭＧＢ１を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を示し、「■」は前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を示し、「▲」はＨＭＧＢ２を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を示し、そして「●」は前記ＨＭＧＢ２分解産物を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表１に示した。
【表１】
2014147873.tif 000002
これらの表において、表の上方に当該親和性を確認した抗体の産生細胞株を表す文字を示した。
また、これらの表において、左側の欄には試料として用いた抗体溶液中の抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、そしてウェルに固相化した物ごとに測定により得られた吸光度〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕を示した。
なお、これらの表においては、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を試料として用いた抗体溶液中の抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）値で除したときの値を示した欄（ウェルに固相化した物ごとに左から３番目の欄）も設けた。
５．まとめ
（１）  前記の酵素免疫測定法の結果である図４及び表１より、前記測定により当該親和性を確認した各抗体は、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の３種類のものに分けることができることが分かる。
（ｉ）  前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である抗体（抗体濃度：０．６２５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ）：  「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」
〔  ※  なお、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性において、ＨＭＧＢ２に対する親和性及び前記ＨＭＧＢ２分解産物に対する親和性とそれぞれ比較して、各々少なくとも１０倍である。（抗体濃度：０．６２５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ）〕
〔  ※  本発明の試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び測定試薬における、（ａ）の抗体〕
（ｉｉ）  前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体：  「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）」、及び「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）」
〔  ※  なお、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）を試料として用いた抗体溶液中の抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）値で除したときの値が０．５以上である。（抗体濃度：０．６２５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ）〕
〔  ※  また、前記ＨＭＧＢ１分解産物を固相化したウェルにおける測定値（前記の吸光度）が、基準とする抗体産生細胞（「ＭＤ７８」）より産生される抗体における当該吸光度の値の６倍以上である。（抗体濃度：０．６２５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ）〕
〔  ※  本発明の試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び測定試薬における、（ｂ）の抗体〕
（ｉｉｉ）  前記（ｉ）及び（ｉｉ）以外の抗体：  「抗ＨＭＧＢ１等抗体（２Ｄ４）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｆ１２）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（８Ｈ４）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７８）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（４Ｃ３）」、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（Ｊ２Ｅ１）」、及び「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＨＡＰ４６．５）」
（２）  これらのことより、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が、ＨＭＧＢ１に対する親和性と比較して、少なくとも１．５倍である抗体であることが確かめられた。
また、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）」、及び「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）」はそれぞれ、前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体であって、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する親和性が高い抗体であることが確かめられた。
〔実施例７〕（ＨＭＧＢ１分解産物の測定の確認）
前記実施例１〜実施例４において取得したＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体及び他のＨＭＧＢ１に結合する抗体等を用い、本発明によるＨＭＧＢ１分解産物の測定が可能であることを確認した。
１．測定試薬
（１）抗体固相化マイクロプレート
下記の（ｉ）〜（ｖ）の５種類の抗体の各々について、プロテインＡを用いて精製し、これらの抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でその濃度が２．５μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ希釈した。
（ｉ）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）
（ｉｉ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）
（ｉｉｉ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）
（ｉｖ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）
（ｖ）抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）
次に、これらの抗体溶液の各々を、マイクロタイタープレート（マイクロプレート）〔Ｎｕｎｃ社、商品名：Ｍａｘｉｓｏｒｐ〕の各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で一晩静置し、これらの抗体のそれぞれを個別にマイクロプレートのウェルに固相化した。
次に、マイクロプレートのウェル中の液を除去し、０．５％カゼインナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）〔ｐＨ８．０〕の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。
これを、前記の（ｉ）〜（ｖ）の５種類の抗体の各々についての抗体固相化マイクロプレートとした。
（２）ＰＯＤ標識抗体液
下記の（Ａ）〜（Ｆ）の６種類の抗体の各々について、それぞれ「パーオキシダーゼ  ラベリングキット−ＮＨ２」（同仁化学社）により所定の方法にて、６種類のパーオキシダーゼ標識抗体を調製し、これらをＰＯＤ標識抗体液とした。
（Ａ）本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）
（Ｂ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）
（Ｃ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）
（Ｄ）抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）
（Ｅ）抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）
（Ｆ）抗ＨＭＧＢ１等抗体（０４）  〔モノクローナル抗体産生細胞株の０４株から産生されるＨＭＧＢ１等に結合するマウス抗体（モノクローナル抗体）［以下、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（０４）」という］。〕
（３）洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。
（４）希釈液
０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、希釈液とした。
（５）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。
（６）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。
（７）発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
（８）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。
２．試料
（１）試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）
前記参考例１の〔２〕で調製した前記ＨＭＧＢ１分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）により、１６ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものを試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
（２）試料（ＨＭＧＢ１）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）により、１６ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものを試料（ＨＭＧＢ１）とした。
（３）試料（試薬盲検）
対照としての試薬盲検（試薬ブランク）測定のための、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〔前記ＨＭＧＢ１分解産物及びＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬ〕を、試料（試薬盲検）とした。
３．測定
（１）  前記１の（１）の（ｉ）〜（ｖ）の５種類の抗体の各々についての抗体固相化マイクロプレートそれぞれの各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（２）  次に、前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の１００μＬを各ウェルに分注した後、３７℃で一晩静置し、この試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を、それぞれの抗体固相化マイクロプレートのウェルに固相化された前記の５種類の抗体の各々と、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（３）  次に、各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（４）  次に、前記１の（２）の（Ａ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液の１００μＬを各ウェルに分注し、３７℃で９０分間静置し、それぞれ抗原抗体反応を行わせた。
（５）  次に、各ウェルを、前記１の（３）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（６）  次に、各ウェルに、前記１の（７）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で３０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）による発色反応を行わせた。
（７）  次に、各ウェルに、前記１の（８）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（８）  次に、各ウェルの液の吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、前記の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）を測定した場合の吸光度を得た。
（９）  前記（２）における試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）、及び前記２の（３）の試料（試薬盲検）をそれぞれ試料として用いる以外は、前記（１）〜（８）の記載の通りに行い、これらの各試料を測定した場合の吸光度を得た。
（１０）  前記（４）における「前記１の（２）の（Ａ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」の代わりに、「前記１の（２）の（Ｂ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」、「前記１の（２）の（Ｃ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」、「前記１の（２）の（Ｄ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」、「前記１の（２）の（Ｅ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」、及び「前記１の（２）の（Ｆ）の抗体をパーオキシダーゼ標識したＰＯＤ標識抗体液」をそれぞれＰＯＤ標識抗体液として用いる以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに行い、各試料を測定した場合の吸光度を得た。〔なお、測定に使用した抗体固相化マイクロプレートとＰＯＤ標識抗体液の組み合わせは、図５及び表２に示した通りである。〕
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、前記実施例１〜実施例４において取得した前記ＨＭＧＢ１分解産物に結合する抗体及び他のＨＭＧＢ１に結合する抗体等を用い、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、前記ＨＭＧＢ１分解産物及びＨＭＧＢ１の測定を行った結果を、図５に示した。
この図において、横軸の上段は当該測定に使用したＰＯＤ標識抗体液の抗体の産生細胞株を表す文字を示し、横軸の下段は当該測定に使用した抗体固相化マイクロプレートの抗体の産生細胞株を表す文字を示し、縦軸は測定により得られた吸光度（４５０ｎｍ）を示す。
また、この図（棒グラフ）において、各々の棒は、当該測定に使用したＰＯＤ標識抗体液及び抗体固相化マイクロプレート毎に、左側より順に、試料（ＨＭＧＢ１）について測定したときの測定値（前記の吸光度）、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）について測定したときの測定値（前記の吸光度）、及び試料（試薬盲検）について測定したときの測定値（前記の吸光度）をそれぞれ示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表２に示した。
【表２】
2014147873.tif 000003
この表においては、左側より順に、当該測定に使用した抗体固相化マイクロプレートの抗体の産生細胞株を表す文字、当該測定に使用したＰＯＤ標識抗体液の抗体の産生細胞株を表す文字、試料（ＨＭＧＢ１）について測定したときの測定値（前記の吸光度）、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）について測定したときの測定値（前記の吸光度）、及び試料（試薬盲検）について測定したときの測定値（前記の吸光度）をそれぞれ示した。
５．まとめ
（１）  前記の酵素免疫測定法による測定の結果である図５及び表２より、次のことが分かる。
すなわち、「本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）」と、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）」、「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）」又は「抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）」を組み合わせて測定に使用した場合には、ＨＭＧＢ１の測定値（吸光度）は低いものであるのに対し、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度）は高いことが分かる。また、この場合、試薬盲検（試薬ブランク）はいずれも低いものであることも分かる。
つまり、「前記実施例６の５の（１）の（ｉ）の抗体」（本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬における（ａ）の抗体）と、「前記実施例６の５の（１）の（ｉｉ）の抗体」（本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬における（ｂ）の抗体）を組み合わせて測定に使用した場合には、試料に含まれるＨＭＧＢ１の測り込みを抑制することができ、そして試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を感度高く測定できることが分かる。
（２）  これに対して、「抗ＨＭＧＢ１等抗体（ＭＤ７７）」又は「抗ＨＭＧＢ１等抗体（０４）」を測定に使用した場合には、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度）が極めて低いものであったり、又は前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度）とＨＭＧＢ１の測定値（吸光度）が同程度のものであって殆ど差がないものであることが分かる。
つまり、「前記実施例６の５の（１）の（ｉｉｉ）の抗体」（前記実施例６の５の（１）の（ｉ）及び（ｉｉ）以外の抗体）を測定に使用した場合には、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を感度高くかつ特異性高く測定することができないことが分かる。
（３）  従って、本実施例における検討結果より、本発明の「試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬」における「（ａ）の抗体」と「（ｂ）の抗体」を組み合わせて測定に使用することにより、試料に含まれるＨＭＧＢ１の測り込みを抑制することができ、そして試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を感度高く測定できることが分かった。
〔実施例８〕（ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び測定試薬−１）
本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬、並びに従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物及び試料に含まれるＨＭＧＢ１の測定を行った。
〔１〕従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬による測定
１．測定試薬
固相化抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体、及びパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法を測定原理とする、ＨＭＧＢ１の測定試薬（研究用試薬）である「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」（シノテスト社〔日本国〕）を、従来の免疫学的測定試薬として用いた。
２．試料
（１）試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）
前記参考例１の〔２〕で調製した前記ＨＭＧＢ１分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
（２）試料（ＨＭＧＢ１）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（ＨＭＧＢ１）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）とした。
３．測定
（１）  前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕のそれぞれ、及び前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕のそれぞれについて、前記１の従来の免疫学的測定試薬である「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」（シノテスト社〔日本国〕）を用いて、その添付文書の記載の通りに測定の操作を行った。
（２）  前記（１）の測定により、各試料の測定の結果として、それぞれ吸光度（４５０ｎｍ）を得た。
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物及び試料に含まれるＨＭＧＢ１の測定を行った結果を、図６に示した。
なお、この図において、横軸は試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物又は試料に含まれるＨＭＧＢ１の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度（４５０ｎｍ）を示す。
また、この図において、「■」は前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「◆」は前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表３に示した。
【表３】
2014147873.tif 000004
なお、この表においては、左側より順に、「（ｉ）  試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物又は試料に含まれるＨＭＧＢ１の濃度（ｎｇ／ｍＬ）」、「（ｉｉ）  前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）」、「（ｉｉｉ）  前記（ｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）における当該測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｖ）  後記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｖ）  前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）」、「（ｖｉ）  前記（ｖ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における当該測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）〕を差し引いた値（吸光度差）」をそれぞれ示した。
〔２〕本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬による測定
１．測定試薬
（１）抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）
前記実施例２の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）をプロテインＡを用いて精製し、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でその濃度が２．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した。
次に、これを、マイクロタイタープレート（マイクロプレート）〔Ｎｕｎｃ社、商品名：Ｍａｘｉｓｏｒｐ〕の各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で一晩静置し、前記の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）をマイクロプレートのウェルに固相化した。
次に、マイクロプレートのウェル中の液を除去し、０．５％カゼインナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）〔ｐＨ８．０〕の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。
これを、抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）とした。
（２）ビオチン標識抗体液（２Ｈ６）
前記実施例１の本抗ＨＭＧＢ１分解産物抗体（２Ｈ６）を、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社、商品コード番号：２１３３５）を用いてビオチン標識を行った。
このビオチン標識抗体を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％カゼインナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、及び１０％マウス血清を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に、２μｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、これをビオチン標識抗体液（２Ｈ６）とした。
（３）ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社〔ドイツ国〕；商品コード番号：ＳＰ４０Ｃ）を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％カゼイン（ビタミンフリー）及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で１０，０００倍に希釈した。
これを、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液とした。
（４）洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。
（５）希釈液
１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％カゼインナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、及び１０％マウス血清を含む１００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）を、希釈液とした。
（６）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。
（７）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。
（８）発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
（９）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。
２．試料
（１）試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）
前記〔１〕の２の（１）の記載の通りに、前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度がそれぞれ、０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）を調製した。
（２）試料（ＨＭＧＢ１）
前記〔１〕の２の（２）の記載の通りに、ＨＭＧＢ１の濃度がそれぞれ、０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）を調製した。
３．測定
（１）  前記１の（１）の抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）の各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。
（２）  次に、各ウェルに、前記１の（５）の希釈液の１００μＬを分注した。
（３）  次に、前記２の（１）の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）それぞれの１０μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、５℃で一晩静置し、このマイクロプレートのウェルに固相化された抗体と試料に含まれていた前記ＨＭＧＢ１分解産物との抗原抗体反応を行わせた。
（４）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（５）  次に、前記１の（２）のビオチン標識抗体液（２Ｈ６）の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で２時間静置し、前記の固相化抗体に結合した前記ＨＭＧＢ１分解産物とビオチン標識抗体との抗原抗体反応を行わせた。
（６）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（７）  次に、各ウェルに、前記１の（３）のストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液を１００μＬ分注し、２５℃で１時間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。
（８）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（９）  次に、各ウェルに、前記１の（８）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼによる発色反応を行わせた。
（１０）  次に、各ウェルに、前記１の（９）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（１１）  次に、各ウェルの液の吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、前記の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１２）  前記（３）における計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（２）の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ１）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ１）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物及び試料に含まれるＨＭＧＢ１の測定を行った結果を、図７に示した。
なお、この図において、横軸は試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物又は試料に含まれるＨＭＧＢ１の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度（４５０ｎｍ）を示す。
また、この図において、「■」は前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「◆」は前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表４に示した。
【表４】
2014147873.tif 000005
なお、この表においては、左側より順に、「（ｉ）  試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物又は試料に含まれるＨＭＧＢ１の濃度（ｎｇ／ｍＬ）」、「（ｉｉ）  前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）」、「（ｉｉｉ）  前記（ｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）における当該測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｖ）  後記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｖ）  前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）」、「（ｖｉ）  前記（ｖ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における当該測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）〕を差し引いた値（吸光度差）」をそれぞれ示した。
〔３〕まとめ
（１）  前記〔１〕における測定結果である図６及び表３、並びに前記〔２〕における測定結果である図７及び表４より、次のことが分かる。
すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値は、約８．５〜１４．９の範囲にあった。
つまり、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、ＨＭＧＢ１の測定値（吸光度差）は大変低いものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１の測り込みが非常に抑制されていることが分かる。
これに対して、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度差）は高く、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く測定できていることが分かる。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、当該測定の検量線のグラフである図７より、この検量線が試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度に比例してほぼ直線的に伸びており、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を低濃度域から高濃度域までの広い範囲にわたって定量的に測定できていることも分かる。
（２）  これに対して、従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値は、約０．７２〜０．７９の範囲にあった。
つまり、従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、いずれの濃度においても、同じ濃度における前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度差）よりもＨＭＧＢ１の測定値（吸光度差）の方が高いことが分かる。
すなわち、従来の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、試料に含まれるＨＭＧＢ１の方をより高感度に測り込んでしまうものであり、このＨＭＧＢ１に由来する正の誤差による影響が非常に大きいものであり、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く測定することが不可能なものであることが分かる。
（３）  従って、本実施例における検討結果より、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高いものであって、ＨＭＧＢ１の測り込みが抑制され、すなわちＨＭＧＢ１に由来する正の誤差が生じることが抑制され、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを特異性高く、正確かつ高感度に定量測定することができるものであることが確かめられた。
〔実施例９〕（ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び測定試薬−２）
本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、及び試料に含まれるＨＭＧＢ２の測定を行った。
１．測定試薬
（１）抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）
前記実施例８の〔２〕の１の（１）の記載の通りに調製し、これを、抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）とした。
（２）ビオチン標識抗体液（２Ｈ６）
前記実施例８の〔２〕の１の（２）の記載の通りに調製し、これを、ビオチン標識抗体液（２Ｈ６）とした。
（３）ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液
前記実施例８の〔２〕の１の（３）の記載の通りに調製し、これを、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液とした。
（４）洗浄液
前記実施例８の〔２〕の１の（４）の記載の通りに調製し、これを、洗浄液とした。
（５）希釈液
前記実施例８の〔２〕の１の（５）の記載の通りに調製し、これを、希釈液とした。
（６）発色液
前記実施例８の〔２〕の１の（６）の記載の通りに調製し、これを、発色液とした。
（７）基質液
前記実施例８の〔２〕の１の（７）の記載の通りに調製し、これを、基質液とした。
（８）発色基質
前記実施例８の〔２〕の１の（８）の記載の通りに調製し、これを、発色基質とした。
（９）反応停止液
前記実施例８の〔２〕の１の（９）の記載の通りに調製し、これを、反応停止液とした。
２．試料
（１）試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）
前記参考例１の〔２〕で調製した前記ＨＭＧＢ１分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々１．５ｎｇ／ｍＬ、３．１ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
（２）試料（ＨＭＧＢ１）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々１．５ｎｇ／ｍＬ、３．１ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（ＨＭＧＢ１）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）とした。
（３）試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）
前記参考例１の〔３〕で調製した前記ＨＭＧＢ２分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々１．５ｎｇ／ｍＬ、３．１ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）とした。
（４）試料（ＨＭＧＢ２）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ２を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々１．５ｎｇ／ｍＬ、３．１ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（ＨＭＧＢ２）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、ＨＭＧＢ２の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ２）とした。
３．測定
（１）  前記１の（１）の抗体固相化マイクロプレート（５Ｄ１）の各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。
（２）  次に、各ウェルに、前記１の（５）の希釈液の１００μＬを分注した。
（３）  次に、前記２の（１）の計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）それぞれの１０μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、５℃で一晩静置し、このマイクロプレートのウェルに固相化された抗体と試料に含まれていた前記ＨＭＧＢ１分解産物との抗原抗体反応を行わせた。
（４）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（５）  次に、前記１の（２）のビオチン標識抗体液（２Ｈ６）の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で２時間静置し、前記の固相化抗体に結合した前記ＨＭＧＢ１分解産物とビオチン標識抗体との抗原抗体反応を行わせた。
（６）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（７）  次に、各ウェルに、前記１の（３）のストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液を１００μＬ分注し、２５℃で１時間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。
（８）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（９）  次に、各ウェルに、前記１の（８）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼによる発色反応を行わせた。
（１０）  次に、各ウェルに、前記１の（９）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（１１）  次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１２）  前記（３）における計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（２）の計８濃度の試料（ＨＭＧＢ１）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計８濃度の試料（ＨＭＧＢ１）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１３）  前記（３）における計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（３）の計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１４）  前記（３）における計８濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（４）の計８濃度の試料（ＨＭＧＢ２）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計８濃度の試料（ＨＭＧＢ２）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、及び試料に含まれるＨＭＧＢ２それぞれの測定を行った結果を、図８に示した。
この図において、図の上方に、測定に使用した固相化抗体及び標識抗体それぞれの産生細胞株を表す文字を示した。
なお、この図において、横軸は試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、又は試料に含まれるＨＭＧＢ２の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕を示す。
また、この図において、「■」は前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計８濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「◆」は前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計８濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「●」は前記２の（３）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）〔計８濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「▲」は前記２の（４）の試料（ＨＭＧＢ２）〔計８濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表５に示した。
【表５】
2014147873.tif 000006
この表において、表の左上方に、測定に使用した固相化抗体及び標識抗体それぞれの産生細胞株を表す文字を示した。
なお、この表においては、左側より順に、「（ｉ）  試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、又は試料に含まれるＨＭＧＢ２の濃度（ｎｇ／ｍＬ）」、「（ｉｉ）  前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計８濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｉｉｉ）  前記（ｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｖ）  後記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｖ）  前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計８濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｖｉ）  前記（ｖ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｖｉｉ）  前記２の（４）の試料（ＨＭＧＢ２）〔計８濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｖｉｉｉ）  前記（ｖｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ２の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ２）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｘ）  前記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｖｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ２）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｘ）  前記２の（３）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）〔計８濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｘｉ）  前記（ｘ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｘｉｉ）  前記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｘｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における値（吸光度差）で除した値」をそれぞれ示した。
５．まとめ
（１）  前記３における測定結果である図８及び表５より、次のことが分かる。
すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔濃度：１２．５〜１００ｎｇ／ｍＬ〕において、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値は、約７〜３０の範囲にあった。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔濃度：１２．５〜１００ｎｇ／ｍＬ〕において、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ２）における値（吸光度差）で除した値は、約１７〜３９の範囲にあった。
そして、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔濃度：１２．５〜１００ｎｇ／ｍＬ〕において、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における値（吸光度差）で除した値は、約−３３〜７６の範囲にあった。
つまり、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、ＨＭＧＢ１の測定値（吸光度差）、前記ＨＭＧＢ２分解産物の測定値（吸光度差）、及びＨＭＧＢ２の測定値（吸光度差）はいずれも大変低いものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ２分解産物、及びＨＭＧＢ２それぞれの測り込みが非常に抑制されていることが分かる。
これに対して、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度差）は高く、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く測定できていることが分かる。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、当該測定の検量線のグラフである図８より、この検量線が試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度に比例してほぼ直線的に伸びており、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を低濃度域から高濃度域までの広い範囲にわたって定量的に測定できていることも分かる。
（２）  従って、本実施例における検討結果からも、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高いものであって、ＨＭＧＢ１等の測り込みが抑制され、すなわちＨＭＧＢ１等に由来する正の誤差が生じることが抑制され、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを特異性高く、正確かつ高感度に定量測定することができるものであることが確かめられた。
〔実施例１０〕（ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び測定試薬−３）
本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、及び試料に含まれるＨＭＧＢ２の測定を行った。
１．測定試薬
（１）抗体固相化マイクロプレート
（ｉ）抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）
前記実施例８の〔２〕の１の（１）における抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）の代わりに、前記実施例３の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（２Ａ１０）を用いる以外は、前記実施例８の〔２〕の１の（１）の記載の通りに調製を行い、これを、抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）とした。
（ｉｉ）抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）
前記実施例８の〔２〕の１の（１）における抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（５Ｄ１）の代わりに、前記実施例４の抗ＨＭＧＢ１分解産物等抗体（６Ｈ３）を用いる以外は、前記実施例８の〔２〕の１の（１）の記載の通りに調製を行い、これを、抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）とした。
（２）ビオチン標識抗体液（２Ｈ６）
前記実施例８の〔２〕の１の（２）の記載の通りに調製し、これを、ビオチン標識抗体液（２Ｈ６）とした。
（３）ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液
前記実施例８の〔２〕の１の（３）の記載の通りに調製し、これを、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液とした。
（４）洗浄液
前記実施例８の〔２〕の１の（４）の記載の通りに調製し、これを、洗浄液とした。
（５）希釈液
前記実施例８の〔２〕の１の（５）の記載の通りに調製し、これを、希釈液とした。
（６）発色液
前記実施例８の〔２〕の１の（６）の記載の通りに調製し、これを、発色液とした。
（７）基質液
前記実施例８の〔２〕の１の（７）の記載の通りに調製し、これを、基質液とした。
（８）発色基質
前記実施例８の〔２〕の１の（８）の記載の通りに調製し、これを、発色基質とした。
（９）反応停止液
前記実施例８の〔２〕の１の（９）の記載の通りに調製し、これを、反応停止液とした。
２．試料
（１）試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）
前記参考例１の〔２〕で調製した前記ＨＭＧＢ１分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）とした。
（２）試料（ＨＭＧＢ１）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ１を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（ＨＭＧＢ１）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）とした。
（３）試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）
前記参考例１の〔３〕で調製した前記ＨＭＧＢ２分解産物を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）とした。
（４）試料（ＨＭＧＢ２）
前記参考例１の〔１〕で調製したＨＭＧＢ２を、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水により、各々２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように調製したものをそれぞれ試料（ＨＭＧＢ２）とした。
また、０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を、ＨＭＧＢ２の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ２）とした。
３．測定
（１）  前記１の（１）の（ｉ）の抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）の各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで３回洗浄した。
（２）  次に、各ウェルに、前記１の（５）の希釈液の１００μＬを分注した。
（３）  次に、前記２の（１）の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）それぞれの１０μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、５℃で一晩静置し、このマイクロプレートのウェルに固相化された抗体と試料に含まれていた前記ＨＭＧＢ１分解産物との抗原抗体反応を行わせた。
（４）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（５）  次に、前記１の（２）のビオチン標識抗体液（２Ｈ６）の１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で２時間静置し、前記の固相化抗体に結合した前記ＨＭＧＢ１分解産物とビオチン標識抗体との抗原抗体反応を行わせた。
（６）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（７）  次に、各ウェルに、前記１の（３）のストレプトアビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート液を１００μＬ分注し、２５℃で１時間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。
（８）  次に、各ウェルを、前記１の（４）の洗浄液の４００μＬで５回洗浄した。
（９）  次に、各ウェルに、前記１の（８）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるパーオキシダーゼによる発色反応を行わせた。
（１０）  次に、各ウェルに、前記１の（９）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
（１１）  次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１２）  前記（３）における計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（２）の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ１）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ１）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１３）  前記（３）における計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（３）の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１４）  前記（３）における計７濃度の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）の代わりに、前記２の（４）の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ２）を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計７濃度の試料（ＨＭＧＢ２）をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
（１５）  前記（１）における抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）の代わりに、前記１の（１）の（ｉｉ）の抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を用いる以外は、前記（１）〜（１４）の記載の通りに行い、前記の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕、試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕、試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）〔計７濃度〕、及び試料（ＨＭＧＢ２）〔計７濃度〕をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。
４．測定結果
（１）  前記３における測定結果、すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬により、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、及び試料に含まれるＨＭＧＢ２それぞれの測定を行った結果を、図９〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）を使用した場合の測定の結果〕及び図１０〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を使用した場合の測定の結果〕に示した。
これらの図において、図の上方に、測定に使用した固相化抗体及び標識抗体それぞれの産生細胞株を表す文字を示した。
なお、これらの図において、横軸は試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、又は試料に含まれるＨＭＧＢ２の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕を示す。
また、これらの図において、「■」は前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「◆」は前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「●」は前記２の（３）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示し、「▲」は前記２の（４）の試料（ＨＭＧＢ２）〔計７濃度〕について測定したときの測定値（前記の吸光度）を示す。
（２）  また、前記３における測定結果の測定値を、表６〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）を使用した場合の測定の結果〕及び表７〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を使用した場合の測定の結果〕に示した。
【表６】
2014147873.tif 000007
【表７】
2014147873.tif 000008
これらの表において、表の左上方に、測定に使用した固相化抗体及び標識抗体それぞれの産生細胞株を表す文字を示した。
なお、これらの表においては、左側より順に、「（ｉ）  試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物、試料に含まれるＨＭＧＢ１、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ２分解産物、又は試料に含まれるＨＭＧＢ２の濃度（ｎｇ／ｍＬ）」、「（ｉｉ）  前記２の（２）の試料（ＨＭＧＢ１）〔計７濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｉｉｉ）  前記（ｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ１の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ１）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｖ）  後記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｖ）  前記２の（１）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｖｉ）  前記（ｖ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｖｉｉ）  前記２の（４）の試料（ＨＭＧＢ２）〔計７濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｖｉｉｉ）  前記（ｖｉｉ）の測定値から試薬盲検の値〔ＨＭＧＢ２の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（ＨＭＧＢ２）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｉｘ）  前記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｖｉｉｉ）の試料（ＨＭＧＢ２）における値（吸光度差）で除した値」、「（ｘ）  前記２の（３）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）〔計７濃度〕について測定したときの測定値〔主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの〕」、「（ｘｉ）  前記（ｘ）の測定値から試薬盲検の値〔前記ＨＭＧＢ２分解産物の濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における当該測定値［主波長（４５０ｎｍ）における吸光度から副波長（５５０ｎｍ）における吸光度を差し引いたもの］〕を差し引いた値（吸光度差）」、「（ｘｉｉ）  前記（ｖｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を前記（ｘｉ）の試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における値（吸光度差）で除した値」をそれぞれ示した。
５．まとめ
〔ａ〕抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）を使用した場合
（１）  前記３における測定結果である図９及び表６〔いずれも抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）を使用した場合の測定の結果〕より、次のことが分かる。
すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値は、約３．６〜１５の範囲にあった。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ２）における値（吸光度差）で除した値は、約−７８〜２９の範囲にあった。
そして、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における値（吸光度差）で除した値は、約−５〜２９の範囲にあった。
つまり、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、ＨＭＧＢ１の測定値（吸光度差）、前記ＨＭＧＢ２分解産物の測定値（吸光度差）、及びＨＭＧＢ２の測定値（吸光度差）はいずれも大変低いものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ２分解産物、及びＨＭＧＢ２それぞれの測り込みが非常に抑制されていることが分かる。
これに対して、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度差）は高く、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く測定できていることが分かる。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、当該測定の検量線のグラフである図９より、この検量線が試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度に比例してほぼ直線的に伸びており、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を低濃度域から高濃度域までの広い範囲にわたって定量的に測定できていることも分かる。
（２）  従って、本実施例における検討結果〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（２Ａ１０）を使用した場合の測定の結果〕からも、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高いものであって、ＨＭＧＢ１等の測り込みが抑制され、すなわちＨＭＧＢ１等に由来する正の誤差が生じることが抑制され、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを特異性高く、正確かつ高感度に定量測定することができるものであることが確かめられた。
〔ｂ〕抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を使用した場合
（１）  前記〔１〕における測定結果である図１０及び表７〔いずれも抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を使用した場合の測定の結果〕より、次のことが分かる。
すなわち、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ１）における値（吸光度差）で除した値は、約３．１〜５．８の範囲にあった。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（ＨＭＧＢ２）における値（吸光度差）で除した値は、約−４７〜２２７の範囲にあった。
そして、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、測定を行った試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）〔２．５〜８０ｎｇ／ｍＬ〕のいずれにおいても、試料（前記ＨＭＧＢ１分解産物）における値（吸光度差）を試料（前記ＨＭＧＢ２分解産物）における値（吸光度差）で除した値は、約−６８０〜７７の範囲にあった。
つまり、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、ＨＭＧＢ１の測定値（吸光度差）、前記ＨＭＧＢ２分解産物の測定値（吸光度差）、及びＨＭＧＢ２の測定値（吸光度差）はいずれも大変低いものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１、前記ＨＭＧＢ２分解産物、及びＨＭＧＢ２それぞれの測り込みが非常に抑制されていることが分かる。
これに対して、前記ＨＭＧＢ１分解産物の測定値（吸光度差）は高く、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を特異性高く測定できていることが分かる。
また、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬においては、当該測定の検量線のグラフである図１０より、この検量線が試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物の濃度に比例してほぼ直線的に伸びており、試料に含まれる前記ＨＭＧＢ１分解産物を低濃度域から高濃度域までの広い範囲にわたって定量的に測定できていることも分かる。
（２）  従って、本実施例における検討結果〔抗体固相化マイクロプレートとして抗体固相化マイクロプレート（６Ｈ３）を使用した場合の測定の結果〕からも、本発明の前記ＨＭＧＢ１分解産物の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬は、前記ＨＭＧＢ１分解産物に対する特異性が高いものであって、ＨＭＧＢ１等の測り込みが抑制され、すなわちＨＭＧＢ１等に由来する正の誤差が生じることが抑制され、前記ＨＭＧＢ１分解産物のみを特異性高く、正確かつ高感度に定量測定することができるものであることが確かめられた。
［配列表］
2014147873.tif 000009
2014147873.tif 000010
2014147873.tif 000011
2014147873.tif 000012
【図４Ａ】
2014147873.tif 000013
【図４Ｈ】
2014147873.tif 000014
【図４Ｉ】
2014147873.tif 000015
【図４Ｊ】
2014147873.tif 000016
【図４Ｋ】
2014147873.tif 000017
【図６】
2014147873.tif 000018
【図７】
2014147873.tif 000019
【図１】
2014147873.tif 000020
【図２】
2014147873.tif 000021
【図３】
2014147873.tif 000022
【図４Ｂ】
2014147873.tif 000023
【図４Ｃ】
2014147873.tif 000024
【図４Ｄ】
2014147873.tif 000025
【図４Ｅ】
2014147873.tif 000026
【図４Ｆ】
2014147873.tif 000027
【図４Ｇ】
2014147873.tif 000028
【図４Ｌ】
2014147873.tif 000029
【図５】
2014147873.tif 000030
【図８】
2014147873.tif 000031
【図９】
2014147873.tif 000032
【図１０】
2014147873.tif 000033
【国際調査報告】
2014147873.tif 000034
2014147873.tif 000035
2014147873.tif 000036
2014147873.tif 000037