(57)【要約】[課題]本発明は、分子凝集による免疫染色の染色効率低下を抑制することができる抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色試薬キットの提供を課題とする。[解決手段]抗体と蛍光体集積ナノ粒子とが、当該抗体のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を還元することによって生成したＳＨ基と、当該蛍光体集積ナノ粒子の表面にある結合基との反応によって結合している、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子であって、２−イミノチオランを使用してジスルフィド結合をＳＨ基に還元したストレプトアビジンが、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面の単位面積内にある所定数の結合基に対して結合しうる数をｎモルと表した場合、前記抗体が前記所定数の結合基に対して結合している数が２ｎモル以上である、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子とする。
2016129444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と蛍光体集積ナノ粒子とが、当該抗体のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を還元することによって生成したＳＨ基と、当該蛍光体集積ナノ粒子の表面にある結合基との反応によって結合している抗体結合蛍光体集積ナノ粒子であって、
２−イミノチオランを使用してジスルフィド結合をＳＨ基に還元したストレプトアビジンが、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面の単位面積内にある所定数の結合基に対して結合しうる数をｎモルと表した場合、
前記抗体が前記所定数の結合基に対して結合している数が２ｎモル以上である、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子。
【請求項２】
前記結合基がマレイミド基、アルデヒド基またはブロモアセトアミド基からなる群から選択された１種または２種以上である、請求項１に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子。
【請求項３】
前記抗体が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、システイン、２−メルカプトエチルアミンからなる群から選択された１種または２種以上の還元剤によって処理されたものである、請求項１または２に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子。
【請求項４】
前記抗体が免疫染色で用いられる２次抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法であって、
ＳＨ基の数／抗体数が１以上〜５以下となるように前記抗体のジスルフィド結合部分を還元剤により還元する工程、
該還元後の抗体を、結合基を有する蛍光体集積ナノ粒子に結合させる工程を含む、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記還元に用いられる還元剤が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１,２−プロパンジオール、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、システイン、２−メルカプトエチルアミンからなる群から選択された１種または２種以上である、請求項５に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
組織切片上の抗原に結合する１次抗体を含む抗体試薬と、
請求項４の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を含んだ標識試薬と、を備えた免疫染色試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、または請求項７に記載の免疫染色試薬キットを用い、前記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を抗原に固定して蛍光染色する免疫染色反応工程を含む、免疫染色法。
【請求項９】
染色対象が病理診断の対象となる疾病に関連する抗原である、請求項８に記載の免疫染色法。
【請求項１０】
前記抗原が２種以上であり、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は、抗体および蛍光波長が異なる２種以上の蛍光体集積ナノ粒子であり、２種以上の抗原を染め分ける多重免疫染色に用いられる、請求項８に記載の免疫染色法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、医学的診断の１つとして病理診断が行なわれている。病理医は人体から採取した組織片に対して行った生体検査の結果を示すデータから病気を診断し、治療や手術の要不要を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針、外科系の医師は手術を行うか否かを決定する。【０００３】
前記診断のためのデータを提供するために、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織切片（組織標本）を作成し、組織切片に対して所定の染色処理を行った後、様々な所見を得るために光学顕微鏡や蛍光顕微鏡を用いて観察することが広く行われている。多くの場合、組織切片は、採取した組織を固定するため脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。ここで、組織切片は光を殆ど吸収および散乱せず無色透明に近いため、上記観察に先立って、組織切片の細胞形態を観察するための形態観察染色（ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色））が標準的に行われる。他の形態観察染色としては、例えば細胞診用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等が挙げられる。【０００４】
さらに、被験者が対象疾患に罹患しているか否かを判断するためのデータを提供するために、被験者の組織切片等について免疫染色が行われている。この免疫染色では、例えば、前記罹患の有無によって発現量が増減する生体内の分子（抗原）に蛍光標識した抗体を特異的に結合させ、蛍光シグナルの量から疾患に関連する抗原の量を定量することが行われる。これにより、被験者が対象の疾患に罹患しているか否かを診断するためのデータが提供される。ここで、蛍光色素を粒子に内包または粒子表面に固定して集積したナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を抗体に直接的または間接的に結合させて抗原を蛍光標識する技術が知られている。【０００５】
たとえば、特許文献１では、内包する蛍光色素を異ならせることで励起波長および蛍光波長が異なる蛍光物質内包シリカナノ粒子を２種以上調製し、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて１次抗体としての２種以上の抗体（例；抗ＥＲ抗体、抗ＥＲ２抗体）をそれぞれ還元（ＳＨ基導入）した後、還元後の各抗体（抗ＥＲ抗体、抗ＥＲ２抗体）をマレイミド修飾した各蛍光シリカナノ粒子の表面に結合させ、同一切片上で異なる検出タンパク質を同時に染色することが可能としている例が開示されている。【０００６】
また、特許文献２には、蛍光体集積ナノ粒子が共有結合した１次抗体を組織切片上の抗原に結合させることで前記抗原を蛍光染色する方法（１次抗体法）、組織切片上の抗原に１次抗体を結合させた状態で、蛍光体集積ナノ粒子と共有結合を介して連結された２次抗体を前記１次抗体に結合させて抗原を蛍光染色する方法（２次抗体法）、ビオチン（またはアビジン）を付加した蛍光体集積ナノ粒子と、アビジン（またはビオチン）を付加した２次抗体とをそれぞれ調製し、組織切片上の抗原に対して１次抗体を結合させた後、該１次抗体に対して前記２次抗体を結合させ、さらに、該２次抗体に対してストレプトアビジン−ビオチン結合を介して蛍光体集積ナノ粒子を動的に結合させて前記抗原を蛍光標識する方法（ビオチン−アビジン法）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２０１２／０２９３４２号
【特許文献２】特開２０１４−１７４０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ビオチン−アビジン反応による結合は抗原−抗体反応による結合よりも結合力が強いため、ビオチン（またはアビジン）結合蛍光体集積ナノ粒子を利用する特許文献２に記載されたような免疫染色法は、抗体結合蛍光体ナノ粒子を利用する特許文献１に記載されたような免疫染色法よりも染色性に優れている。しかしながら、特許文献２の免疫染色法は、抗原が２種類以上存在し、各抗原を異なる波長の蛍光色素で染め分ける多重免疫染色を行う場合、その全ての種類の抗原の免疫染色において用いることはできない。すなわち、抗原の種類に応じて１次抗体と２次抗体とがそれぞれの抗原へ適正に固定されたとしても、２次抗体と蛍光体集積ナノ粒子との間の連結部分に一律にビオチン−アビジン結合を用いると、抗原の種類に対応して互いに異なる蛍光波長の蛍光体集積ナノ粒子を固定するということができず、２種以上の抗原を染め分けることはできない。【０００９】
そのため、多重免疫染色においては、結合性に優れるビオチン−アビジン結合は、多くとも１種類の抗原の免疫染色だけにしか利用することはできず、他の抗原の免疫染色には、特許文献１に記載されているように、抗体を直接結合させた蛍光体集積ナノ粒子を使用する必要がある。免疫染色法であれば、該抗体が抗原の種類に応じて特異的に結合して抗原の種類別にそれぞれ波長の異なる蛍光体集積ナノ粒子を固定させることができる、各種抗原を染め分けることができる。【００１０】
しかしながら、特許文献１に記載されているような抗体を直接結合させた蛍光体集積ナノ粒子には、免疫染色の染色効率や蛍光シグナルの強度（つまり感度）に改善の余地があり、また保存中に凝集を生じるなどの問題があった。ここで「感度が低い」とは、同じ蛍光体集積ナノ粒子濃度、反応時間（つまり、同一条件）で反応させて免疫染色しても、輝点数が少なくなるということを意味している。【００１１】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、免疫染色の染色効率を向上させ、分子凝集を抑制することができる抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キットの提供をすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、特許文献１の発明において蛍光シグナルが弱く凝集が起こる原因がジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて強力に還元していることにあることを見出した。特許文献１の発明のように、ＤＴＴを用いて１次抗体を強力に還元すると、１次抗体の分子中に多くのチオール基が生成してしまう。その結果、図３や図４に示すように、抗体のＳＨ基と蛍光体集積ナノ粒子の表面にあるマレイミド基との結合が多：多となり、抗体分子中にＳＨ基数が少数（例えば１つだけ）存在する場合に比べると、上記結合で消費されるフリーのマレイミド基の数が多くなって、蛍光体集積ナノ粒子に結合できる抗体数が非常に少なくなる。その上、貯蔵中に、図３に示すように、蛍光体集積ナノ粒子と抗体とが上記結合により巨大化して分子凝集および沈殿を引き起こしやすい。【００１３】
本発明者らは、抗体分子中のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）部分を還元する際に、還元の程度を調節することにより抗体１分子中に導入するＳＨ基の数を極力減らすように調節することで、上記凝集（図３参照）が抑えられることを見出して本発明に至った。【００１４】
すなわち、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は、抗体と蛍光体集積ナノ粒子とが、当該抗体のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を還元することによって生成したＳＨ基と、当該蛍光体集積ナノ粒子の表面にある結合基との反応によって結合している、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子であって、
２−イミノチオランを使用してジスルフィド結合をＳＨ基に還元したストレプトアビジンが、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面の単位面積内にある所定数の結合基に対して結合しうる数をｎモルと表した場合、
前記抗体が前記所定数の結合基に対して結合している数が２ｎモル以上である、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子である。【００１５】
上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を製造する方法は、
ＳＨ基の数／抗体数が１以上〜５以下となるように前記抗体のジスルフィド結合部分を還元剤により還元する工程、
該還元後の抗体を、結合基を有する蛍光体集積ナノ粒子に結合させる工程を含む、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法である。【００１６】
上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した免疫染色試薬キットは、組織切片上の抗原に結合する１次抗体を含む抗体試薬と、前記蛍光体集積ナノ粒子を含んだ標識試薬と、を備えた免疫染色試薬キットである。【００１７】
上述した目的のうち少なくとも一つを実現するための、本発明の一側面を反映した免疫染色法は、上記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、または上記の免疫染色試薬キットを用い、前記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を抗原に固定して蛍光染色する免疫染色反応工程を含む、免疫染色法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、免疫染色の効率が向上し、貯蔵中の分子凝集も抑制することができる抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色試薬キットが提供される。また、本発明によれば、抗体が結合した蛍光体集積ナノ粒子の抗体部分を、抗原または該抗原に結合した１次抗体に特異的に結合させて抗原を蛍光染色するものであり、前記抗体部分と結合可能な内因性の他の分子は存在しないことから、免疫染色で得られる輝点として非特異的な輝点の出現を抑えることができるという副次的な効果が得られる（アビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を用いた場合に生じる、抗原を標識するためのビオチンではなく内因性のビオチンに多少は結合してしまうという問題を回避することが可能である）。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の一例を示した図である。この抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は、例えば、何ら処理していない抗体分子の中に存在するジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）に対して還元処理を施す際に、ＳＨ基の数／抗体数が１〜５（図１の例では１）となるように記抗体のジスルフィド結合部分を還元剤により還元し、該還元後の抗体を、結合基（例；マレイミド基）を有する蛍光体集積ナノ粒子に結合させることで得られるものである。
【図２】本発明に係る免疫染色法の主な２つの態様を示したものである。図２の左側は、１次抗体法を示している。１次抗体法では、組織切片上の抗原に対して抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の１次抗体部分が直接結合して抗原が蛍光標識される。図２の右側は、２次抗体法を示している。２次抗体法では、組織切片上の抗原に対して１次抗体が結合した後、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の２次抗体部分が１次抗体に結合して抗原が蛍光標識される。
【図３】図３は、従来技術に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の分散液中の状態を示した図である。抗体分子のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）の多くが還元されてＳＨ基に変換されており、１つの抗体分子のＳＨ基が複数の蛍光体集積ナノ粒子の結合基と結合をしてしまうため、抗体分子が架橋剤のように機能して蛍光体集積ナノ粒子が連結され凝集沈降してしまい、凝集した抗体と蛍光体集積ナノ粒子のいずれもが免疫染色に寄与できなくなる。
【図４】図４は、図３の一部を表したものであり、結合基がマレイミド基の場合を示している。同一の蛍光体集積ナノ粒子の表面に存在する複数の結合基（例；マレイミド基等）が一つの抗体分子中に存在する複数のＳＨ基に結合すると、本来はＳＨ基とマレイミド基とが１：１でも結合できるところ、２：２で結合している分、結合基のリソースが奪われていることを示している。
【図５】図５は、従来のビオチンーアビジン法により２以上の抗原について多重免疫染色を行った場合に生じる問題を説明した図である。図５に示すように、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して２次抗体a、ｂと蛍光波長の異なる蛍光体集積ナノ粒子A、Bとを結合させようとすると、蛍光体集積ナノ粒子A（またはB）が抗原aにもｂにも結合しうるので、抗原の種類別に染め分けることはできない。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キットについて、図１〜図５を参照しながら説明する。
【００２１】
本発明に係る抗体結合蛍光集積ナノ粒子は、抗体と蛍光体集積ナノ粒子とが、当該抗体のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を還元することによって生成したＳＨ基と、当該蛍光体集積ナノ粒子の表面にある結合基（例；マレイミド基）との反応によって結合している、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子であって、２−イミノチオランを使用してジスルフィド結合をＳＨ基に還元したストレプトアビジンが、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面の単位面積内にある所定数の結合基に対して結合しうる数をｎモルと表した場合、前記抗体が前記所定数の結合基に対して結合している数が２ｎモル以上であるものである。
【００２２】
《蛍光体集積ナノ粒子》
蛍光体集積ナノ粒子は蛍光体を集積したナノメートルオーダーの粒子である。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、１粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標記する輝点の輝度を高めることができる。
【００２３】
［蛍光体］
本明細書において「蛍光体」とは、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
【００２４】
また、本発明にいう「蛍光体」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。このような蛍光体は、有機蛍光体（蛍光色素）および無機蛍光体に大別することができる。
【００２５】
［有機蛍光体］
蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
【００２６】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
【００２７】
［無機蛍光体］
蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。量子ドットは、市販されているものでもよい。具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００３０】
《蛍光体集積ナノ粒子の製造方法》
蛍光体集積ナノ粒子自体の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる（当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する）製造方法を用いることができる。
【００３１】
［有機蛍光体の場合］
有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂（熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂）を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、蛍光体を添加し、当該（共）重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
【００３２】
上記の熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。上記の熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、キシレン等の有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、色素樹脂に内包させた色素の溶出を抑制することができる点で好ましい。
【００３３】
例えば、有機の蛍光色素（蛍光体）を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができ、蛍光体集積ナノ粒子として用いることができる。
【００３４】
一方で、有機蛍光体をシリカからなる母体の内部または表面に固定化したシリカナノ粒子を製造することもできる。そのような製造方法としては、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカナノ粒子の合成方法を参考にすることができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光色素を内包したシリカナノ粒子を合成することができ、蛍光体集積ナノ粒子として用いることができる。
【００３５】
［無機蛍光体の場合］
無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
【００３６】
また、上記とは異なる蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、シリカビーズをシランカップリング剤で処理して末端をアミノ化し、カルボキシ基末端を有する蛍光体としての半導体微粒子をシリカビーズの表面にアミド結合により結合することで集積し、蛍光体集積ナノ粒子とする方法も挙げられる。
【００３７】
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル−ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス状の粒子を形成し、蛍光体集積ナノ粒子とする例が挙げられる。
【００３８】
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在化で、アミノ基末端の半導体ナノ粒子と、カルボキシ基末端の半導体ナノ粒子を混合し、半導体ナノ粒子間をアミド結合で介して結合することで半導体ナノ粒子を集積し、蛍光体集積ナノ粒子を製造する例が挙げられる。
【００３９】
さらに、無機蛍光体を樹脂からなる母体の内部または表面に固定化して蛍光体集積ナノ粒子を製造することもできる。たとえば、量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
【００４０】
［蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径］
蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径は、蛍光シグナルの強度の観点から、１５０ｎｍ以上〜８００ｎｍ以下が好ましく、１５０ｎｍ以上〜５００ｎｍ以下がより好ましい。
【００４１】
蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径は、公知の測定方法により調べることができる。例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により蛍光体集積ナノ粒子の粒子観察を行い、そこから粒子径分布の数平均粒子径として求める方法、動的光散乱法により半導体ナノ粒子の粒子径分布を測定し、その数平均粒子径として求める方法等が挙げられる。この他にも、例えば、ガス吸着法、光散乱法、Ｘ線小角散乱法（ＳＡＸＳ）、あるいは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して平均粒子径を計測する方法により測定できる。ＴＥＭを用いる場合、粒子径分布が広い場合には、視野内に入った粒子が全粒子を代表しているか否かに注意を払う必要がある。吸着法は、Ｎ2吸着等によりＢＥＴ表面積を評価するものである。
【００４２】
［表面修飾］
蛍光体集積ナノ粒子の表面は任意に親水性高分子で修飾されていてもよい。該親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。
【００４３】
《抗体》
本発明で用いられる抗体は、用途に応じて選択される、例えば疾病（悪性腫瘍等）に関連する抗原（例；ＨＥＲ２等）に対する抗体（１次抗体）、または該１次抗体と抗原抗体反応により結合する２次抗体〜ｎ次抗体を意味する（以下「所定の抗体」と称することもある。）。これら抗体のいずれかに対して、後述するように還元処理がなされる。ここで、「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。
【００４４】
《抗原》
上記抗原としては、例えば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）であるが、該タンパク質またはアミノ酸と、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子との複合体なども含まれる。具体的には、例えば上記病理診断の対象となる疾病に関連する抗原（腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなど）であり、特に限定されない。抗原として、例えば、がんの増殖制御因子，転移制御因子，増殖制御因子受容体および転移制御因子受容体等のがんに関連する抗原の他に、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α），ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）受容体などの炎症性サイトカイン、ＲＳＶ Ｆ蛋白質等のウィルス関連分子なども「抗原」に含まれる。
【００４５】
この他にも、例えば、がん関連遺伝子由来のタンパク質である、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴが挙げられる。さらに、上記抗原となりうるものであって各種癌関連遺伝子由来の蛋白質として知られているものとして、以下のものが挙げられる。また、上記抗原となりうるものであってチロシンキナーゼ関連遺伝子由来の蛋白質としては、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１−ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）が挙げられる。また、上記抗原となりうるものであって乳がん関連の遺伝子由来の蛋白質としては、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。さらに、上記抗原となりうるものであってカルチノイド腫瘍に関連する遺伝子由来の蛋白質としては、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。また、上記抗原となりうるものであって大腸がん関連遺伝子由来の蛋白質として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２（ｏｒ Ｋｉ−ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。さらに、上記抗原となりうるものであって肺がん関連の遺伝子由来の蛋白質としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。また、上記抗原となりうるものであって肝臓がん関連の遺伝子由来の蛋白質としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６  ＩＮＫ４Ａ、ｃ−ＥＲＢＢ−２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。上記抗原となりうるものであって腎臓がん関連遺伝子由来の蛋白質として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。上記抗原となりうるものであって甲状腺がん関連遺伝子由来の蛋白質としては、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。上記抗原となりうるものであって卵巣がん関連遺伝子由来の蛋白質として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。さらに、上記抗原となりうるものであって前立腺がん関連遺伝子由来の蛋白質として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。また、上記抗原となりうるものであって骨腫瘍関連遺伝子由来の蛋白質としては、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。また、免疫系由来のタンパク質として、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、Ｂ７．１が挙げられる。
【００４６】
《蛍光体集積ナノ粒子の表面の結合基修飾》
蛍光体集積ナノ粒子と抗体との結合は、還元後の抗体が有するＳＨ基と蛍光体集積ナノ粒子表面にある官能基との結合反応により達成されるので、蛍光体集積ナノ粒子の表面には、ＳＨ基と結合可能な官能基（結合基）を有している必要がある。
【００４７】
結合基としては、ＳＨ基と結合反応可能な、マレイミド基、アルデヒド基、ブロモアセトアミド基（ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基）等を挙げることができるが、ＳＨ基と結合反応が可能な官能基であればこれらに限定されない。このうちマレイミド基は、ＳＨ基との反応性がよく、また蛍光体集積ナノ粒子に導入するための試薬も入手、利用しやすいことから好ましい。
【００４８】
蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合基を導入する方法としては、特に限定されず、例えば、樹脂を母体とする蛍光体集積ナノ粒子を製造する際に、結合基を側鎖に有するモノマーを主鎖部分で重合することで蛍光体集積ナノ粒子に結合基を導入する方法、または、結合基を有するリンカーを蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合させて導入する方法を例示することができる。
【００４９】
後者のリンカーを用いる方法は、具体的には、上述した親水性高分子の一端部に結合基を有し、他端部に官能基（結合基と同一の基を含む）を有する二官能性のリンカー分子を用意し、該官能基と蛍光体集積ナノ粒子表面に導入した結合基以外の官能基とを結合させる方法である。この結合の組合せとしては、アミノ基−NHS基、アジ基−炭素間三重結合を有する基、等の組合せを挙げることができる。
【００５０】
（蛍光体集積ナノ粒子に結合基を直接導入する方法）
蛍光体集積ナノ粒子に結合基を直接導入する方法の別の例としては、例えば、ポリスチレンを母体とする蛍光体集積ナノ粒子を製造し、そのポリスチレン部分にマレイミド基を導入する場合、特開２００７−２３１２０に記載されているように、ポリスチレン鎖のフェニル基をクロロメチル化した状態で、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドのＯＨ基とクロロメチル基との間でＣｌ交換エーテル化反応をさせてマレイミド基を導入する方法がある。
【００５１】
蛍光体集積ナノ粒子の表面または該表面に付加された前述の親水性高分子がＯＨ基を有する場合には、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドのＯＨ基と脱水縮合エーテル化反応によりマレイミド基を蛍光体集積ナノ粒子の表面に導入することができる。この反応には酸性あるいは塩基性の公知のエーテル化触媒を使用することができる。例えば、塩基性の触媒としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等を使用することができ、これらのうち１種又は２種類以上混合して使用することができる。酸性の触媒としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の無機酸やｐ−トルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸、酢酸等の有機酸が使用することができ、これらの化合物は水和物の形態でもよい。また、ハイドロタルサイト類の固体触媒も使用することができる。
【００５２】
（導入された結合基の確認）
ＳＨ基と結合可能な官能基（結合基）が蛍光体集積ナノ粒子の表面に導入されたか否かおよびその量は、例えばＦＴ―ＩＲにより結合に該当する波長ピークと面積を計測する方法、または、結合基を定量するキットや測定方法を用いて調べることができる。例えば、マレイミド基（結合基）を定量する場合、「AmpliteTM 蛍光マレイミド定量キット」（コスモバイオ社製）を使用して定量することができる。アルデヒド基（結合基）を定量する場合は、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（2,4-dinitrophenylhydrazine；DNPH）法で定量する方法を挙げることができる。この方法は、蛍光体集積ナノ粒子表面のアルデヒド基とＤＮＰＨとを反応させてＤＮＰＨ誘導体を形成し、該ＤＮＰＨ誘導体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してカラムに吸着および溶出させて、ＤＮＰＨ誘導体に該当する溶出液のフラクションの吸光度（Ａｂｓ．３６０ｎｍ）の吸収量からアルデヒド基を分析・定量する方法である。ハロアセトアミド基（ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基）の場合には、実際にＳＨ基と反応させて副生されるハロゲンを公知の方法で定量することで導入量を調べることができる。
【００５３】
（蛍光体集積ナノ粒子表面の結合基の密度）
蛍光体集積ナノ粒子の表面（１ｍｍ2）当たりに存在する結合基（マレイミド基等）のモル数は、抗体のＳＨ基と反応できる所定数の結合基を有していれば特に制限されないが、２×１０-14モル〜５×１０-13モルであることが好ましい。なお、蛍光体集積ナノ粒子の総表面積については、前述したように測定した平均粒子径（ｎｍ）を半径（ｒ）として４πｒ2により算出し、上記定量した結合基の数（モル数）とから、結合基の数（モル数）／粒子表面積１ｍｍ2として算出することができる。
【００５４】
《抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法》
本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、蛍光体集積ナノ粒子の製造方法であって、ＳＨ基の数／抗体数が１以上〜５以下となるように前記抗体のジスルフィド結合部分を還元剤により還元する還元工程、該還元後の抗体を、結合基を有する蛍光体集積ナノ粒子に結合させる結合工程とを含むことを特徴としている。なお、ＳＨ基の数／抗体数が１となる場合とは、例えば、抗体フラグメント等を使用している場合に、抗体フラグメント分子内に存在する１つのジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）が還元され、抗体フラグメントが２つに分かれて各分子が一つＳＨ基を持つ抗体フラグメントになる場合等を意味する。
【００５５】
［還元工程］（ジスルフィド結合の還元）
還元工程の還元は、ｐＨ６〜８程度の中性付近に緩衝能を有するｐＨ緩衝液（例；リン酸緩衝液（ＰＢＳを含む）等）中に２５〜１００ｍＭトラウツリージェント(２−イミノチオラン塩酸塩)を溶解させたときに得られる還元力よりも弱い還元力で行われる抗体の還元であって、還元後の抗体と２−イミノチオランにより還元されたＳＡとの、蛍光体集積ナノ粒子表面の単位面積（例；１ｍｍ2）内にある所定数の結合基に結合可能なモル量の比（抗体／ＳＡ比）が２以上となる還元を意味する。なお、上記濃度範囲（２５〜１００ｍＭ）のトラウツリージェントを使用すれば、ほぼ同程度の還元がなされる。
【００５６】
上記還元をする場合、後述する還元反応の温度、還元反応のｐＨおよび／または還元剤と抗体の各濃度等の各条件を調節して、１つの抗体分子に導入するＳＨ基の数（ＳＨ基の数／抗体数）を極力少数（例えば１〜５）となるように調整することで行われる。このように抗体１分子に導入されるＳＨ基の数を極力少なくすることで、蛍光体集積ナノ粒子表面の単位面積無いに存在する一定量の結合基（例；マレイミド基等）に対してより多く抗体を結合させることができる。なお、還元されやすい抗体分子中のジスルフィド結合部分は可変領域ではなくＦＣ領域部分であるので還元後も抗体の抗原結合能が維持されやすいと考えられる（PIERCE / TaKaRa、［online］、タカラバイオ、［平成２６年１０月１日検索］、インターネット＜URL：http://www.takara-bio.co.jp/goods/info/pdf/pierce#western.pdf＞）。
【００５７】
（還元剤）
還元剤の種類によってジスルフィド結合（Ｓ―Ｓ結合）の還元量が大きく変化することから、上記還元を行うための好適な還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩およびシステイン、２−メルカプトエチルアミンからなる群から選択された１種または２種以上を挙げることができる。前述した２−イミノチオランを用いた還元よりも弱い還元力の所定の還元を実現することができれば、例示した還元剤の種類や還元条件（還元剤の濃度等）に限らず他の還元剤や還元条件を適用してもよい。
【００５８】
（ｐＨ緩衝液）
還元工程の還元は、使用する還元剤が還元力を発揮しうる中性領域のｐＨ緩衝液中で実施することが望ましい。使用可能なｐＨ緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳを含む）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシン緩衝液を挙げることができる。
【００５９】
（還元ｐＨ）
還元時のｐＨ（還元ｐＨ）がアルカリ側になるにつれて抗体分子に含まれるジスルフィド結合（Ｓ―Ｓ結合）の還元量が増加していくことから、還元ｐＨを還元剤の還元能が発揮できるｐＨ範囲内で、抗体１分子中にＳＨ基が極力少く導入されるように調節する必要がある。還元ｐＨとしては、還元剤にもよるが、ｐＨ６．５〜７．５に調整する例が挙げられる。還元ｐＨは、２−メルカプトエタノールを使用する場合はｐＨ７．０〜８．５、３−メルカプト−１，２−プロパンジオールを使用する場合はｐＨ３．５〜７．０、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)を使用する場合はｐＨ７．０〜８．５、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を使用する場合はｐＨ７．０〜８．５、およびシステインを使用する場合はｐＨ７．５〜９．０、２−メルカプトエチルアミンを使用する場合はｐＨ６．５〜８．０とする例が挙げられる。
【００６０】
（反応温度・反応時間）
還元反応の温度条件として４℃〜４０℃、好ましくは３５℃〜３７℃の範囲を選択することができる。還元反応の反応時間は温度条件によって異なるが、４℃〜８℃の場合、８時間〜３６時間、好ましくは１２時間〜２４時間の範囲を選択し、３５℃〜３７℃の場合、２０分〜２４０分、好ましくは３０分〜１８０分の範囲を選択し、かつ、単に反応溶液を室温放置して処理する方法等が例示できる。
【００６１】
（抗体と還元剤の濃度）
上記還元剤を用いる場合、還元処理の温度や時間のみならず、還元対象の抗体と還元剤とのモル比も重要である。前述のｐＨ、温度及び反応時間で上記還元剤により還元処理を行なう場合、還元前の抗体の１モルに対し、還元剤のモル濃度は１００，０００，０００，０００〜１０，０００，０００，０００，０００モルとするのが好ましい。
【００６２】
また、反応液中の抗体の終濃度としては、例えば１pmol／Ｌ〜１００pmol／Ｌ、好ましくは１〜１０pmol／Ｌとする例が挙げられる。また、反応液中に含める還元剤の終濃度の範囲としては、２−メルカプトエタノールの場合は終濃度０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、３−メルカプト−１，２−プロパンジオールの場合は終濃度０．０１Ｍ〜０．４Ｍ、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)の場合は終濃度０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩の場合は終濃度０．０３Ｍ〜０．１５Ｍ、システインの場合は終濃度０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、２−メルカプトエチルアミンの場合は終濃度を０．０１Ｍ〜０．３Ｍとするのが好ましい。
【００６３】
（抗体分子中のチオール基の定量）
抗体分子中のＳＨ基の定量は、例えば、公知のＳＨ基定量試薬（例： ５，５'−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）同仁品コード：Ｄ０２９ 製品名：ＤＴＮＢ）等のＳＨ基定量キットを使用する方法等の公知の方法により行うことができる。
【００６４】
［結合工程］（還元後の抗体と蛍光体集積ナノ粒子との結合）
結合工程は、前述の結合基（マレイミド基等）で表面修飾した蛍光体集積ナノ粒子と、上記還元後のＳＨ基を有する抗体（例；抗ＨＥＲ２抗体）とをｐＨ緩衝液中で混合し、両分子を結合させる工程である。なお、結合工程に続いて任意に後述する洗浄工程を行ってもよい。
【００６５】
結合反応における抗体と蛍光体集積ナノ粒子のモル比は、反応効率を高める観点から、蛍光体集積ナノ粒子１モルに対して、還元後のＳＨ基を有する抗体を１００，０００モル〜１００，０００，０００モル用いることが好ましい。結合反応の温度と時間は、結合反応を十分に行う観点から、室温（１〜４０℃）で１時間〜１２時間放置することが好ましい。なお、結合反応の停止は、反応液にメルカプトエタノール等の還元剤を３０〜５０ｎｍｏｌ程度添加することで行うことができる。
【００６６】
（ｐＨ緩衝液）
結合工程に使用するｐＨ緩衝液として、前述したｐＨ緩衝液を使用することができる。また、結合反応に使用するｐＨ緩衝液はキレート剤を含有することが望ましい。金属イオンが反応液中に存在すると、金属イオンが抗体分子のＳＨ基と反応してしまい、抗体のＳＨ基と蛍光体集積ナノ粒子表面の結合基との反応が阻害されてしまうからである。使用可能なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミペンタアセテート酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、Ｎ’−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸(ＴＴＨＡ)、ヒドロキシエチルイミノジ酢酸(ＨＩＤＡ)、ジヒドロキシエチルグリシン(ＤＨＥＧ)などが例示される。緩衝液中のキレート剤の濃度は結合反応に影響がでなければ制限なく、例えば１〜１０ｍＭ程度でよい。
【００６７】
［洗浄工程］
結合工程の後に任意に洗浄工程を設けることができる。結合工程後の反応溶液に対して遠心分離処理（例；１００００ｇ，６０分間）を行い、沈降したペレット状の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を前述のｐＨ緩衝液に分散させて再度遠心処理を行う、という一連の操作を１回の洗浄として、この操作を２〜３回繰り返す工程である。なお、このときのｐＨ緩衝液としては前述のキレート剤を含むｐＨ緩衝液（ＥＤＴＡを含むＰＢＳ等）が好ましい。
【００６８】
（粒子表面の単位面積内にある抗体数の計測）
抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の単位面積内（以下の例では１ｍｍ2）当たりの粒子表面に結合している抗体の数は、例えば、以下（１），（２）により調べることができる。（１）蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した抗体（例；抗ＨＥＲ抗体）は、それ自体はタンパク質である。そのため、ＢＣＡ法等を原理としたタンパク質定量キット（例；「バイオ・ラッドプロテインアッセイ」（バイオ・ラッド（Bio-Rad）社製）等）を用いて、夾雑タンパク質を除く精製処理（ゲル濾過、遠心処理等）を行った後の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の分散液中のタンパク質の定量を行うことで、蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した抗体の全重量（ｍｇ）を計測することができる。
【００６９】
そして、該抗体の分子量は既知であるため、抗体の全重量（ｍｇ）／抗体の分子量（例；抗ＨＥＲ２抗体の場合であれば１３８，０００Ｄａ）の式から、分散液中の蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した抗体のモル数を算出することができる。さらに、該モル数とアボガドロ定数とから蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した抗体の個数を算出することができる。
（２）一方、上述したようにＳＥＭ等の電子顕微鏡で計測した蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径の半値を半径（ｒ）として、球の表面積の公式：４πｒ2から１粒子当たりの蛍光体集積ナノ粒子の表面積（平均）を算出することができる。そして、上記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の分散液中に存在する粒子を計測する手段（パーティクルカウンタ（例；「Liquid Particle Counter」（リオン社製））や後述する方法）により、該分散液内に存在する蛍光体集積ナノ粒子の粒子数を計測する。１粒子当たりの表面積（平均）×上記粒子数から、上記分散液中の蛍光体集積ナノ粒子の全表面積を算出することができる。そして、上記の抗体のモル数（または個数）／全表面積の式から、粒子表面１ｍｍ2当たりの抗体のモル数（または個数）を算出することができる。
【００７０】
［粒子を計測する手段］
例えば、光散乱式の液中パーティクルカウンタ（Liquid Particle Counter  リオン社製等）を用いて測定することができる。あるいは、分散液中の蛍光体集積ナノ粒子を回収して乾燥重量を測定し、その乾燥重量を粒子１個の重量で除することで、その分散液中の色素粒子の総数を算出することもできる。粒子１個の重量は、粒子の比重（母体の密度、たとえば１とみなすことができるものとする）に、粒子の平均粒子体積を乗じることで算出することができる。粒子の平均粒子体積は、電子顕微鏡で確認した色素粒子の粒子径から算出することができる。
【００７１】
［ストレプトアビジンを用いた基準について］
前述した濃度範囲であれば２−イミノチオランを用いてストレプトアビジンを還元する際の還元条件が前述した還元工程の還元条件の範囲で変化しても、還元後のＳＨ基を有するストレプトアビジンが蛍光体集積ナノ粒子の表面にある所定数の結合基（ＳＨ基と結合可能な官能基でマレイミド基等）に結合可能なモル量（以下ＳＡモル量（またはＳＡの個数））は略一定の範囲となるため、このＳＡモル量（またはＳＡの個数）を基準として、還元処理した抗体分子が所定数の結合基に対して結合したモル量（または個数）をＳＡモル量（または個数）の相対値として表すことができる。
【００７２】
例えば、蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合基としてマレイミド基を一様に導入し、該粒子１ｍｍ2内に存在するマレイミド基を「所定数の結合基」とした場合、上述した方法により、この所定数の結合基に対して結合した還元後の抗体のモル量（または個数）を調べるとともに、この所定数の結合基に対して結合可能な還元後のストレプトアビジンのモル量（または個数）を調べて、前者を後者に対する相対値（抗体／ＳＡ）として表すことができる。
【００７３】
ここで、本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は、抗体／ＳＡの比が２以上のものであり、この抗体／ＳＡ≧２の比は、前述したように２−イミノチオランによる還元処理よりも弱い還元力の還元であって、抗体１分子あたりのＳＨ基の数が１〜５となる還元により達成される。このような還元により、抗体１分子当たりのＳＨ基の数を極力減らして、蛍光体集積ナノ粒子の表面に存在する所定数の結合基に対して、より多く抗体を結合させることができる。
【００７４】
《免疫染色試薬キット》
本発明に係る免疫染色試薬キットは、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を含む標識試薬を含むことを特徴とする。抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の抗体部分が１次抗体でなく２〜ｎ次抗体である場合には、任意に１次〜ｎ−１次抗体の溶液（抗体試薬）をさらに含んでいてもよい。
【００７５】
標識試薬中の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の濃度は、特に制限されないが、免疫染色の際の終濃度以上であることが好ましく、例えば、０．０５ｎＭ〜５ｍＭに設定される。
【００７６】
標識試薬の保存条件としては、標識試薬中に抗体が含まれることから、抗体の保存条件と同一の条件で保存するのが好ましく、例えば、−２０℃〜４℃の低温で保存するのが好ましい。凍結融解を繰り返さない目的で標識試薬を複数の容器に分けて保存することが望ましい。また、蛍光体集積ナノ粒子が半導体粒子である場合には、半導体部分が光を受けると有機質分解能を発揮し抗体が分解されてしまう観点から、遮光保存することが好ましい。
【００７７】
また、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の分散媒はアルカリまたは酸による抗体部分の分解を防止する観点から、ＰＢＳ等の中性付近のｐＨ緩衝液が好ましい。
《免疫染色法》
本発明に係る免疫染色法は、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を抗原に固定して蛍光染色する免疫染色反応工程を含むものであり、免疫染色反応工程を含む下記一連の工程を経て実施されることが好ましい。
【００７８】
《組織切片の調製》
組織切片は、一般に市販されているものを購入してもよいが、例えば抗原について前述したところの各種のガンが疑われる被験者（ヒト、イヌ、ネコ等）の組織について一般的な病理組織診断に用いる公知の方法で調製することができる。この場合、まず被験者の組織切片をホルマリン等により固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸してパラフィン包埋を行うことで組織切片を作製することができる。
【００７９】
（１）脱パラフィン処理工程
キシレンに組織切片を浸漬させてパラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００８０】
ついで、エタノールに組織切片を浸漬させてキシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００８１】
次に、水（例；蒸留水）に組織切片を浸漬させてエタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００８２】
（２）賦活化処理工程
組織化学染色として免疫組織化学染色を行う場合、公知の方法にならい、目的とする生体分子の賦活化処理を行うことが好ましい。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器としては、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。賦活化処理の加熱処理の温度は５０〜１３０℃、加熱処理の時間は５〜３０分で行うことができる。
【００８３】
ついで容器に入れたＰＢＳに賦活処理後の切片を浸漬させて洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００８４】
（３）免疫染色反応工程
免疫染色反応工程は、組織切片上の抗原（病理診断の対象となる疾病に関連する抗原など）に対して抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を固定させて抗原を蛍光標識する工程である。抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の抗体部分が１次抗体である場合には、該抗体部分と抗原との結合を介して蛍光体集積ナノ粒子を前記抗原に固定して抗原を蛍光標識する工程であり、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の抗体部分が２〜ｎ次抗体である場合には、組織切片上の抗原に１〜（ｎ−１）次抗体を結合させた後、該抗原に結合した１〜（ｎ−１）次抗体に対して２〜ｎ次抗体を結合させて蛍光体集積ナノ粒子を抗原に固定して抗原を蛍光標識する工程である。
【００８５】
具体的には、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子をｐＨ緩衝液に分散させた液（分散濃度例；０．０５ｎＭ〜０．５ｎＭ）を組織切片に載せて前記抗原と抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の１次抗体部分を結合させるか、または、上記抗体試薬を組織切片に載せて抗原と１〜（ｎ−１）次抗体とを結合させた後、上記手順と同様にして、該１〜（ｎ−１）次抗体に抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の２〜ｎ次抗体部分を結合させて抗原を蛍光標識する例が挙げられる。免疫染色反応工程の反応としては、例えば、上記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の分散液を組織切片上に載せて４℃で１晩反応させる例が挙げられる。
【００８６】
抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は抗体部分を有するので、分散媒として用いるｐＨ緩衝液にあらかじめブロッキング剤を１重量％以下の範囲で含有させてブロッキング処理を省略してもよい。このようなブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン（αカゼイン、βカゼイン、γカゼイン）、ゼラチン等の生物由来物質が挙げられる。
【００８７】
（多重染色の場合）
前記抗原が２種以上であり、これらをそれぞれ染め分ける多重染色を行う場合には、前述の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子として、抗体および蛍光波長が異なる２種以上の蛍光体集積ナノ粒子を用いればよい。つまり、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合させる抗体と、使用する蛍光体の蛍光波長とを、組織切片上の抗原の種類に応じて変更されているものを使用すればよい。
【００８８】
また、２種以上の蛍光体集積ナノ粒子は、検出のしやすさの観点から、その発光波長の帯域が互いに重ならないものであることが望ましい。このような２種以上の蛍光体集積ナノ粒子を用いる場合、蛍光体集積ナノ粒子を作製する際に、発光波長の帯域が互いに重ならない２種以上の蛍光体を用いて作製すればよい。
【００８９】
また、使用する抗体については、２種以上の抗原のそれぞれにユニークなエピトープを認識するような抗体を各蛍光体集積ナノ粒子について選択する必要がある。
【００９０】
（４）洗浄工程
免疫染色反応工程の後に、ＰＢＳにより組織切片を洗浄する洗浄工程を行って未反応の蛍光体集積ナノ粒子を除くことが好ましい。この洗浄工程としては、例えば、室温（１〜３０℃）に調節されたＰＢＳに組織切片を浸漬させて０．５〜１時間放置する洗浄工程を行うことができる。ここで、上記浸漬中にＰＢＳ等を交換してもよい。
【００９１】
（５）形態観察用処理工程
免疫染色反応工程の後に、組織切片に対してヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）等の染色を行って、組織切片の細胞の形状や細胞の各部の位置情報を得るための形態観察用処理工程を任意に行うことができる。この染色にともなって組織切片を観察用に透徹、封入すること等の処理を行ってもよい。ＨＥ染色は、例えば、免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行い、その後、該組織試料を４５℃の流水で３分間洗浄し、次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行う。
【００９２】
（６）観察工程
（明視野観察）
明視野観察は、組織切片の細胞または組織内の染色対象とする細胞器官の分布情報を取得するために行われる。明視野観察の一般的な方法として、例えば、上記したように免疫染色の後にヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った組織切片を光学顕微鏡で観察を行う。なお、形態観察染色に用いられるエオジンは、明視野において観察できるだけでなく、所定の波長の励起光を照射した時に自家蛍光も発するので、適切な波長および出力の励起光を染色された組織試料に照射することで、蛍光顕微鏡によっても観察できる。
【００９３】
一方、その他の染色としてＨＥＲ２タンパク質を検出対象の抗原として組織化学染色（ＤＡＢ染色等）を行った場合の明視野観察においては、適切な照明光の照射下で、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、検体組織内の癌細胞のＨＥＲ２タンパク陽性染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察する。次に対物レンズを１０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認し、必要に応じてさらに対物レンズ２０倍で検索する。
【００９４】
（蛍光観察）
染色した上記切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、広視野の顕微鏡画像から蛍光の輝点の数又は発光輝度を計測する。用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、市販の画像解析ソフト、例えば、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトＧ−Ｃｏｕｎｔを用いて行うことができる。なお、顕微鏡を使用した画像解析自体は周知であり、例えば、特開平９−１９７２９０に開示される手法を用いることができる。顕微鏡画像の視野は、３ｍｍ2以上であることが好ましく、３０ｍｍ2以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ2以上であることがさらに好ましい。顕微鏡画像から計測された輝点数、及び／又は発光輝度に基づいて、目的とする特定の遺伝子由来のタンパク質（前述）の発現量等を評価する。
【００９５】
（多重染色の場合）
一方、免疫染色反応工程で２種以上の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を用いて多重染色を行った場合については、抗原の種類に応じて使用した抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を、その種類ごとに励起および発光させ、抗原種別に蛍光の輝点の数や発光輝度の計測等を行う。ここで、蛍光波長の帯域が一部重複する２種以上の蛍光体集積ナノ粒子を用いて免疫染色反応工程を行った場合、重複する帯域をカットする蛍光フィルターを用いて、抗原の種類ごとに観察等を行うことが望ましい。
【００９６】
なお、取得した２種以上の蛍光免疫染色画像を合成して解析に用いてもよい。
【００９７】
（抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の評価）
免疫染色の検出対象のタンパク質が発現している病理組織切片を用意し、これに対して（１）抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を用いて上述した免疫染色および蛍光観察を行った際に所定の観察視野内に計測される特異的な輝点の数、（２）抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を含む標識試薬を所定条件で保管した後（凝集確認試験後）に目視で確認される粒子の凝集・沈降の有無、によって抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の染色性能を評価することができる。
【００９８】
検出対象のタンパク質をＨＥＲ２タンパク質として評価する場合、例えば、（１）ＨＥＲ２の発現がされているＩＨＣ法スコア＝３の病理組織切片（下記表１参照）を用意して、上述した免疫染色および蛍光観察を行い、該蛍光観察で１視野当たり（組織切片の視野一杯にして撮像した画像で縦１３２μｍ×横１７６μｍの矩形内）にＨＥＲ２抗原に基づく特異的な輝点数が３０００以上得られていること、および、（２）製造直後の抗体結合蛍光集積ナノ粒子を含む標識試薬を１週間４℃で保存した後に目視で観察した際に粒子の凝集沈降がないことを満たす場合に、評価対象の抗体結合蛍光集積ナノ粒子が凝集、沈降および抗体の変性せずに、ビオチン−アビジン法の場合（例；後述する比較例１）と同程度の染色能力を有すると判断することができる。なお、特異的な輝点かどうかは、例えばＤＡＢ法等の他の染色法により同一の病理切片を染色してＨＥＲ２抗原の発現位置を特定し、この発現位置と一致しているか否かで特異的な輝点かどうかを判断することができる。
【００９９】
また、ＩＨＣ法とは、「ＨＥＲ２検査ガイド第三版」（２００９年９月 トラスツズマブ病理部会作成）に記載の方法であり、ＩＨＣ法スコアとは「ＨＥＲ２検査ガイド第三版」に記載の評価基準である（下記表１参照）。
【０１００】
【表１】
2016129444.tif 000003
【０１０１】
以下、本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色試薬キットについての作用、効果を説明する。
【０１０２】
（１）本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子は、上述した抗体と蛍光体集積ナノ粒子とが、当該抗体のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を還元することによって生成したＳＨ基と、当該蛍光体集積ナノ粒子の表面にある結合基（例；マレイミド基等）との反応によって結合している抗体結合蛍光体集積ナノ粒子であって、２−イミノチオランを使用してジスルフィド結合をＳＨ基に還元したストレプトアビジンが、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面の単位面積内（例；１ｍｍ2）にある所定数の結合基に対して結合しうる数をｎモルと表した場合、前記抗体が前記所定数の結合基に対して結合している数が２ｎモル以上のものであることから、蛍光体集積ナノ粒子の表面に十分な量の抗体が結合されており、２ｎモル未満の従来技術に係る粒子とは異なり、免疫染色した際に組織切片上の抗原との抗原抗体反応の反応性が高まり、免疫染色をした際に特異的な輝点が免疫染色として問題ない精度で得られる。
【０１０３】
そのため、従来技術に係る粒子（２ｎモル未満のもの）では不可能であった多重免疫染色が可能となる。すなわち、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合させる抗体と、使用する蛍光体の蛍光波長とを組織切片上の抗体の種類に応じて変更して抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を製造し、各粒子を用いて免疫染色を行えば、各種抗原に対して蛍光波長の異なる蛍光体集積ナノ粒子が結合し、色分けした免疫染色（多重免疫染色）をすることができる。
【０１０４】
（２）  前記結合基がマレイミド基であれば、抗体のＳＨ基と反応して安定な共有結合を形成することができる。また、前記結合基が、マレイミド基、アルデヒド基またはブロモアセトアミド基からなる群から選択された１種または２種以上であれば、抗体のＳＨ基と反応して安定な共有結合を形成することができる観点から好ましい。
【０１０５】
（３）上記抗体が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩およびシステイン、２−メルカプトエチルアミンからなる群から選択された１種または２種以上の還元剤によって処理されたものであれば、（１）で述べた免疫染色における反応性を好適に高めることができる。
【０１０６】
（４）上記抗体が２次抗体であれば、２次抗体は１次抗体に複数箇所で結合するため、一つの１次抗体に対して複数の２次抗体、すなわち複数（種）の蛍光体集積ナノ粒子で標識することができる。したがって、２次抗体を使用することで増感効果、染色色素の色合成効果が得られる。
【０１０７】
（５）本発明に係る抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を製造方法は、ＳＨ基の数／抗体数が極力少数（好適には、例えば１〜５）となるように前記抗体のジスルフィド結合部分を還元剤により還元する工程、該還元後の抗体を、結合基を有する蛍光体集積ナノ粒子に結合させる工程を含むものである。上記還元工程により、図１に示すように、抗体１分子に導入されるＳＨ基の数が低く抑えられるので、蛍光体集積ナノ粒子の表面にある所定数の結合基に対してより多くの抗体を結合させることができる。ここで、抗体１分子中のＳＨ基数が１に近い程、より多くの抗体を蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合させることができる。
【０１０８】
（６）前記酸化還元に用いられる還元剤が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)、トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、システイン、２−メルカプトエチルアミンからなる群から選択された１種または２種以上であれば、上記還元工程を好適に行うことができる。
【０１０９】
（７）組織切片上の抗原に結合する１次抗体を含む抗体試薬と、上記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を含んだ標識試薬と、を備えた免疫染色試薬キットでれば、製造から一定期間過ぎても目視観察で凝集を生じず、上記効果を有する免疫染色キットが提供される。
【０１１０】
（８）  上記記載の抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、または免疫染色試薬キットを用い、前記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を抗原に固定して蛍光染色する免疫染色反応工程を含む、免疫染色法とでれば、十分に特異的な輝点が得られる。
【０１１１】
（９）  ここで、染色対象が病理診断の対象となる抗原であれば、従来より高い精度で、病理診断対象の疾病（（悪性）腫瘍等）を検出することができる点で好ましい。
【０１１２】
（１０）  前記抗原が２種以上であり、上記抗体結合蛍光体集積ナノ粒子が、抗体および蛍光波長が異なる２種以上の蛍光体集積ナノ粒子であり、２種以上の抗原を染め分ける多重免疫染色に用いられる免疫染色法であれば、抗原を染め分けする多重染色であっても染色効率が高く維持される。
【実施例】
【０１１３】
［製造例１］（ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の合成）
下記工程(1-1)〜(1-4)の方法により、蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（登録商標）（５−カルボキシテトラメチルローダミン）（以下単に「ＴＡＭＲＡ」と示す）を内包したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を作成した。【０１１４】
工程(1-1)：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル）２ｍｇと、テトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合した。【０１１５】
工程(1-2)：上記反応液とは別に、エタノール４０ｍＬと１４％アンモニア水１０ｍＬとを混合して混合液を調製した。【０１１６】
工程(1-3)：工程(1-2)で調製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(1-1)で調製した混合液を添加した。添加開始から室温で１２時間撹拌を行った。【０１１７】
工程(1-4)：反応混合物を１００００ｇで６０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させた後、再度上記遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純粋による洗浄を一回ずつ行った。【０１１８】
得られたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を走査型顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）により観察を行ったところ、ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の平均粒子径は１００ｎｍ、平均粒子径の変動係数は１５％であった。【０１１９】
［実施例１］
以下に示すように、製造例１で製造したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）に対してマレイミド基を導入し、抗ＨＥＲ２抗体にＳＨ基を導入した後、該ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子と抗ＨＥＲ２抗体とを結合させることで抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子（１次抗体結合蛍光体集積ナノ粒子）を製造した。そして、この免疫染色試薬キットを用いてＨＥＲ２抗原が発現している病理組織切片（ＩＨＣ法スコア＝３の病理組織切片）を載せた検体スライド（組織アレイスライド）について免疫染色、輝点についての評価等を行った。【０１２０】
《ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子のマレイミド基修飾》
以下の工程(2-1)〜(2-7)により、マレイミド基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を調製した。【０１２１】
工程(2-1)：製造例１で得られたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子１ｍｇを純水５ｍＬに分散させた。次に、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製、LS−3150またはKBE-903；下記式（１）参照）水分散液１００μＬを上記粒子の分散液に添加した後、室温で１２時間撹拌して反応させ、ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の表面にアミノ基を導入した。【０１２２】
工程(2-2)：反応液を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。【０１２３】
工程(2-3)：エタノールを加えて沈降物を分散させた後、上記遠心分離を再度行った。
同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。得られたアミノ基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来するスペクトル吸収が観測でき、アミノ基修飾ができたことを確認できた。【０１２４】
工程(2-4)：工程(2-3)で得られたアミノ基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２ｍＭ含有したリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて３ｎＭに調整した。【０１２５】
【化１】
2016129444.tif 000004
【０１２６】
工程(2-5)：工程(2-4)の調整後の溶液に対して終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、室温で１時間反応させた。【０１２７】
工程(2-6)：反応液を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。【０１２８】
工程(2-7)：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させた後、上記遠心分離を再度行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳに沈降物を再度分散させて、マレイミド基で修飾されたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液５００μＬを得た。【０１２９】
［還元工程］（抗ＨＥＲ２抗体の還元処理（ＳＨ基導入処理））
工程(3-1)：抗ＨＥＲ２抗体（ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」分子量１４８，０００ｇ／ｍｏｌ）１００μｇをＰＢＳ１００μＬに溶解させた。この抗体溶液に１Ｍの２−メルカプトエタノールを０．００２ｍＬ（０．２×１０-5モル）添加して、ｐＨ８．５、室温で３０分間反応させて抗体の還元を行った。【０１３０】
工程(3-2)：工程(3-1)後の反応液をゲル濾過カラムに供して、過剰の２−メルカプトエタノールを除去し、ＳＨ基を有する抗ＨＥＲ２抗体の溶液を得た。【０１３１】
工程(3-3)：ＳＨ基の定量
還元した抗体１μＬ（１μｇ分）を分取してＳＨ基定量キットレドックスアッセイ チオール定量キット（商品コード：TH01D、メーカー：メタロジェニクス）によりＳＨ基の量（モル数）を計測した。さらに同量の抗体１μＬを別に分取してＢＣＡ法を行うことで分取した抗ＨＥＲ２抗体の質量を定量した。この質量と抗ＨＥＲ２抗体の分子量とから分取した抗体のモル数を算出した。さらにＳＨ基のモル数／抗体のモル数により「ＳＨ基の数／抗体」を算出した。このＳＨ基の数／抗体は１．５であった。【０１３２】
［結合工程］（ＳＨ基を有する抗ＨＥＲ２抗体とマレイミド基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子との結合）
工程(4-1)：工程(2-7)を経て得られたマレイミド基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子０．０１μｇと、工程(3-2)を経て得られたＳＨ基を有する抗ＨＥＲ２抗体１０μｇとをＰＢＳ１ｍＬ中で混合し、室温で１時間、両分子を結合する反応を行った。【０１３３】
工程(4-2)：１０ｍＭの２−メルカプトエタノール４μＬを工程（４−１）後の反応液に添加して結合反応を停止させた。【０１３４】
工程(4-3)：工程(4-2)からの溶液を１００００ｇで６０分間遠心分離処理を行い、上澄みを除去した。その後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させた後、上記遠心分離を再度行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳにより分散させて、抗ＨＥＲ２抗体が結合したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子（抗体結合蛍光体集積ナノ粒子）を得た。【０１３５】
《粒子表面（１ｍｍ2）当たりの抗体のモル数、個数の計測》
抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液０．０１ｍＬについて、ＢＣＡ法により定量した。この定量した抗ＨＥＲ２抗体の全量（２．３３ｍｇ含有)を、抗ＨＥＲ２抗体の分子量１４８０００ダルトンで除することにより、分散液中に集団として存在する色素粒子の表面にある抗ＨＥＲ２抗体のモル数１．５７×１０-8（ｍｏｌ）を算出した。そして、抗ＨＥＲ２抗体のモル数とアボガドロ定数とから、１．５７×１０-8（ｍｏｌ）×６．０２×１０23（個／ｍｏｌ）を計算し、粒子表面にある抗ＨＥＲ２抗体の個数を９．４６×１０15と算出した。さらに、粒子カウンター（Liquid Particle Counter  リオン社製等）等で調べたところ測定対象とした粒子の数は３１５３０００００００００であった。よって粒子表面の抗ＨＥＲ２抗体の量は１粒子あたり３０００個（５回測定平均：３０４５、３０２８、２９８７、３０２２、２９６０）となる。同様にして合成された５種類の粒子の平均値も３０００であった。【０１３６】
《粒子表面（１ｍｍ2）当たりの抗体数の計測》
また、製造例１で調べたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の平均粒子径１００ｎｍから半径（ｒ）＝５０ｎｍとし、球表面積の公式：４πｒ2から１粒子の表面積３．１４×１０-14（ｍｍ2／粒子）を算出し、上記１粒子当たりの抗ＨＥＲ２抗体の数（３０００個／粒子）を１粒子当たりの表面積：３．１４×１０14（ｍｍ2／粒子）で除して、粒子表面１ｍｍ2当たりの抗ＨＥＲ２抗体の数＝９．５５５×１０16（個／ｍｍ2）を算出した。【０１３７】
［抗体／ＳＡ］
また、該抗体数のモル数（または個数）を後述する比較例１の蛍光体集積ナノ粒子１粒子の単位面積（１ｍｍ2）あたりに存在するＳＡのモル数（または個数）に対する相対値（以下「抗体／ＳＡ相対値」という）として表したところ、２.０であった（表１参照）。【０１３８】
（凝集確認試験）
製造した抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子をＰＢＳ１００μＬに１μｇ分散させた分散液を、室温で１週間放置した後、目視確認により凝集の有無を調べた結果、凝集や沈降は確認されなかった（表２参照）。表２では、凝集・沈降が目視確認された場合は「×」、凝集・沈降が目視確認されなかった場合は「○」と示している。【０１３９】
≪免疫染色≫（免疫組織化学（ＩＨＣ）法）
上記抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液（標識試薬）を含む免疫染色試薬のキットを用いて、以下に説明するように免疫染色を行った。【０１４０】
免疫染色では、パソロジー研究所製のＨＥＲ２  ポジコンスライド（ＰＳ−０９００１、ＨＥＲ２  ３＋、２＋、１＋、０のもの）を用いた。【０１４１】
免疫染色に先立ってＤＡＢ染色により上述した各組織切片のＨＥＲ２染色濃度を観察して、ＨＥＲ２高発現（ＨＥＲ２  ３＋）、ＨＥＲ２中発現（ＨＥＲ２  ２＋）、ＨＥＲ２低発現（ＨＥＲ２  ＋）、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２  −）であることを確認し、このうち１４１１１９−１のロットの組織アレイスライドについて免疫染色を行った。なお、上記「ＨＥＲ２  ３＋」、「ＨＥＲ２  ２＋」、「ＨＥＲ２  ＋」および「ＨＥＲ２  −」は、それぞれ上記表１のＩＨＣ法判定基準のスコア「３＋」「１＋」および「０」に該当する。【０１４２】
［脱パラフィン処理工程］
工程（1A）：組織アレイスライドをキシレンに３０分浸漬させて組織切片中のパラフィンを除去してキシレンで置換した。途中３回キシレンを交換した。【０１４３】
工程（1B）：工程（1A）を経た組織アレイスライドをエタノールに３０分浸漬させて組織切片中のキシレンをエタノールで置換した。途中３回エタノールを交換した。【０１４４】
工程（1C）：工程（1B）を経た組織アレイスライドを蒸留水に３０分浸漬させて、組織切片中のエタノールを蒸留水で置換した。途中３回蒸留水を交換した。【０１４５】
［賦活化処理工程］
工程（2A）：工程（1C）を経た組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に３０分浸漬させて、組織切片中の水をクエン酸緩衝液で置換した。【０１４６】
工程（2B）：工程（2A）を経た組織アレイスライドをオートクレーブ処理（１２１℃で１０分間）した。【０１４７】
工程（2C）：工程（2B）を経た組織アレイスライドの組織切片をＰＢＳに３０分浸漬させた。【０１４８】
工程（2D）：工程（2C）を経た組織アレイスライドの組織切片全体に対して、ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳを滴下して室温で１時間放置した。【０１４９】
［免疫染色反応工程］
工程（3A）：ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳでもって、上記抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を０．０５ｎＭに希釈した。次に、該希釈により得られた抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液を、工程（2D）を経た組織アレイスライドの組織切片全体に滴下して室温で３時間放置した。【０１５０】
［洗浄工程］
工程（4A）：工程（3A）を経た組織アレイスライドの組織切片をそれぞれ３０分ＰＢＳに浸漬させた。【０１５１】
［形態観察用処理工程］
工程（5A）：工程（4A）を経た組織アレイスライドの組織切片を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。ＨＥ染色は、免疫染色した組織切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオジン液で５分間染色してエオジン染色を行った。その後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。【０１５２】
工程（5B）：工程（5A）を経た組織アレイスライドの組織切片全体に対して「Aquatex（登録商標）」（製品番号108562、Merck Millipore社製）を滴下した後、カバーガラスを載せて室温で３０分以上放置することで前記組織切片を封入した。【０１５３】
［観察工程］
上記一連の工程を経た組織切片に対して所定の励起光を照射して蛍光を発するようにした。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（ＢＸ−５３，オリンパス社製）により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ＩｍａｇｅＪ  ＦｉｎｄＭａｘｉｍａ法により計測した。【０１５４】
上記励起光は、光学フィルターに通すことで５４５〜５６５ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターに通すことで５７０〜５９０ｎｍに設定した。【０１５５】
顕微鏡観察、画像取得時の励起波長条件は、５５０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。次に、蛍光顕微鏡等を用いて撮像した顕微鏡画像を用いて、輝度が所定の閾値を超えた部分を輝点として計測し、１細胞当たりの蛍光体集積ナノ粒子の数や蛍光シグナルの強度を算出した。【０１５６】
上記観察の結果、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は３８００であった（表２参照）。【０１５７】
［実施例２］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「３−メルカプト−１，２−プロパンジオール」（製品番号139-16452、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は３．５であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５６００であった（表２参照）。【０１５８】
［実施例３］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)」（製品番号Ｇ００７４、メーカー東京化成）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は４．２であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５４００であった（表２参照）。【０１５９】
［実施例４］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩」（製品番号322-91081 HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は３．８であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５５００であった（表２参照）。【０１６０】
［実施例５］
実施例１で使用した１Ｍのメルカプトエタノールの代わりに「システイン」（製品番号013-05133 HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は３．５であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は４８００であった（表２参照）。【０１６１】
［実施例６］
実施例１で使用した１Ｍのメルカプトエタノールの代わりに「２−メルカプトエチルアミン」（製品番号２０４０８ HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカーＴｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は４．８であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は６０００であった（表２参照）
［比較例１］（ビオチン−アビジン法による免疫染色）
実施例１において、抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を製造する代わりに、以下のように、ストレプトアビジン（ＳＡ）を結合したＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子およびビオチンを結合した抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）を製造し、得られたビオチン結合抗ＨＥＲ２抗体を組織切片上の抗原（ＨＥＲ２）に結合させた後、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介してその抗ＨＥＲ２抗体にＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を結合させた。それ以外は実施例１と同様に凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、粒子の凝集や沈降が発生し、輝点数は６２００であった（表２参照）。なお、「抗体／ＳＡ」の値は本比較例１を基準としているので１．０となっている。【０１６２】
（ＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造）
工程（1'-1）：製造例１で製造したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製、LS−3150またはKBE-903）２μＬを加えて８時間反応させて粒子表面のアミノ化処理を行った。【０１６３】
工程（1'-2）：アミノ化処理したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、スクシンイミジル−[（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）-ドデカエチレングリコール]エステル）を混合し、１時間反応させた。【０１６４】
工程（1'-3）：この混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離処理を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させた後、上記遠心分離処理を再度行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を得た。【０１６５】
（ＳＡのチオール基導入処理）
工程（1'-4）：一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）０．０３８４ｍｇをＰＢＳに分散した分散液３８．４μＬと、６４ ｍｇ/ｍＬとした２−イミノチオラン塩酸塩（「2-Iminothiolane・HCl」、サーモサイエンティフィック社製、Traut's Reagent）４．５μＬと混合して、混合液を室温で１時間撹拌してストレプトアビジンのチオール基付加処理を行った。この後、この反応液をゲルろ過カラムに供してマレイミド基が付いたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。なお、終濃度は４０ｍＭ程度である。【０１６６】
（ＳＨ基を付加したＳＡとマレイミド基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の結合）
工程（1'-5）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記マレイミド基で修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を０．６７ｎＭで含有する分散液を調製し、該分散液４０μＬと、ＳＨ基を導入した上記ストレプトアビジン全量（０．０４ｍｇ相当）７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。【０１６７】
工程（1'-6）：上記反応液に１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、上記反応を停止した。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を得た。【０１６８】
《粒子表面（１ｍｍ2）当たりのストレプトアビジン数の計測》
ＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液０．０１ｍＬについて、ＢＣＡ法によりストレプトアビジンの量（ｇ）を定量した。定量により得られたＳＡ量（ｇ）を、ＳＡの分子量５２０００ダルトン（＝ｇ／ｍｏｌ）で除することにより、分散液中に集団として存在する粒子の表面にあるストレプトアビジンのモル数７．６９×１０-10（ｍｏｌ）を算出した。そして、ＳＡのモル数とアボガドロ定数とから、７．６９×１０-10（ｍｏｌ）×６．０２×１０23（個／ｍｏｌ）を計算し、色素粒子の表面にあるＳＡの個数を４．６３×１０14と算出した。さらに、粒子カウンター（Liquid Particle Counter  リオン社製等）等で調べたところ測定対象とした色素粒子の数は３１５３００００００００であった。よって粒子表面のＳＡの量は１粒子あたり１５００個（５回測定平均：１５２１、１５１４、１４９０、１５０２、１４９５）となる。同様にして別途５回製造したいずれのＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子についての平均値（ＳＡ（個）／粒子）も１５００であった。【０１６９】
また、製造例１で調べたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の平均粒子径１００ｎｍから半径（ｒ）＝５０ｎｍとし、球表面積の公式：４πｒ2から粒子表面積３．１４×１０-14（ｍｍ2／粒子）を算出し、上記１粒子当たりのＳＡ数（１５００個／粒子）を１粒子当たりの表面積：３．１４×１０14（ｍｍ2／粒子）で除して、１ｍｍ2当たりのＳＡ数＝４．７７×１０16（個／ｍｍ2）を算出した。【０１７０】
《ビオチン化抗ＨＥＲ２抗体の製造》
トラスツズマブとして医薬品の形態でロッシュ社が製造している粉末状のハーセプチン（登録商標）を使用し、これに対して、「Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ−ＳＨ」（同仁化学）を用いてビオチン化を行うことにより、ビオチン化したトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）を得た。【０１７１】
《免疫染色》
実施例１の［免疫染色反応工程］に代えて、下記工程Ａを行った。【０１７２】
［工程Ａ］
実施例１の賦活化処理工程後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１０％ヤギ血清（ニチレイ社製）を添加し、室温下１時間放置した。この組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、上記ビオチン化した抗ＨＥＲ２抗体の溶液（濃度０．０５ｎＭ）を組織アレイスライドの組織切片全体に滴下して室温下３０分間放置した。その後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄後、ＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液（粒子濃度０．０５ｎＭ）を上記組織切片全体に滴下し、室温下２時間反応させた。【０１７３】
［比較例２］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「Traut's  Reagent」（製品番号I6256-100MG、メーカーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は０．８であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５００であった（表２参照）。【０１７４】
［比較例３］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「Biotin Labeling Kit - SH」（製品番号LK10、メーカー同人堂化学社）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は１．２であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は１６００であった（表２参照）。【０１７５】
［比較例４］
実施例１で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに、１Ｍの「（＋/−）−ジチオスレイトール」（製品番号041-08971、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例１と同様に抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は１．８であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は２５００であった（表２参照）。【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
蛍光色素内包樹脂粒子を用いたHER2染色結果（１次抗体結合型）
（結果・考察）
本発明の製造方法に従って製造した抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いた１次抗体結合型の免疫染色を行った場合、計測されたＨＥＲ２に特異的な輝点数は３８００〜６０００であり（実施例１〜６）、従来の製造方法に従って製造した抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いた場合（比較例２〜４）の輝点数５００〜２５００よりも著しく多く、ＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いた場合（比較例１）の輝点数６２００に近い輝点数が計測された（表２参照）。ここで、比較例１では、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を免疫染色に使用しており、そのＳＡが内因性ビオチンに結合する可能性があるため、上記輝点数６２００の中には非特異的な輝点が含まれていると考えられる。したがって、それを考慮すると、実施例１〜６の抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子は、十分に特異的な輝点数が得られており、免疫染色用として十分な染色能力を有するものであるといえる。【０１７８】
「発明が解決しようとする課題」として前述したように、多重免疫染色を行うためには、ビオチン−アビジン結合を利用して抗原に間接的に蛍光体ナノ粒子を結合させる（つまりＳＡ結合蛍光体ナノ粒子を使用する）免疫染色だけでなく、抗原−抗体結合を利用して抗原に直接的または間接的に蛍光体ナノ粒子を結合させる（つまり１次抗体結合蛍光体ナノ粒子または２次抗体結合蛍光体ナノ粒子を使用する）免疫染色が必要である。上記の結果から、本発明（実施例１〜６）の抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を使用すれば、ＳＡ結合蛍光体ナノ粒子に匹敵する十分な数の、かつ抗原に特異的な輝点数が得られており、従来の抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子（比較例２〜４）を使用したのでは困難であった多重染色が可能となることが理解される。【０１７９】
なお、本発明に基づく１次抗体結合型の免疫染色法である上記実施例１〜６の結果は、本発明に基づく２次抗体結合型の免疫染色法である後記実施例７〜１２の結果（表３参照）に近いものであるが、従来技術に基づく２次抗体結合型の免疫染色法である後記比較例５〜７の結果よりも優れている。一般的に、２次抗体結合型の免疫染色法は、１次抗体結合型の免疫染色法よりも染色性に優れる傾向にあるが、本発明に従えば、１次抗体結合型であっても、従来の２次抗体結合型より染色性に優れた免疫染色を行うことが可能であることが分かる。【０１８０】
［実施例７］
実施例１において、抗ＨＥＲ２抗体（ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」）に代えて、該抗体に結合可能な２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイ社製ビオチン標識抗ウサギIgG抗体）を使用して、抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子（２次抗体結合蛍光体集積ナノ粒子）を製造した。さらに、実施例１の免疫染色反応工程に代えて、以下の免疫染色反応工程を行った。それ以外は実施例１と同様に免疫染色、凝集確認試験等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は２．１であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は４０００であった（表３参照）。【０１８１】
［免疫染色反応工程］
工程（3'A）：実施例１の［賦活化処理工程］後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１０％ヤギ血清（ニチレイ社製）を添加し、室温下１時間放置した。この組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１８２】
工程（3'B）：その後、抗ＨＥＲ２抗体の溶液（濃度０．０５ｎＭ）を組織アレイスライドの組織切片全体に滴下して室温下３０分間放置した。この組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１８３】
工程（3'C）：１ｍＭでＢＳＡを含むＰＢＳに対して抗体結合蛍光体集積ナノ粒子を０．２ｎＭで分散させて標識試薬を調製した。次に、該標識試薬１００μＬを組織切片上に載せて室温下で３０分間放置した。【０１８４】
［実施例８］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「３−メルカプト−１，２−プロパンジオール」（製品番号139-16452、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は３．８であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５８００であった（表３参照）。【０１８５】
［実施例９］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「グルタチオン(γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン)」（製品番号Ｇ００７４、メーカー東京化成）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は４．６であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５９００であった（表３参照）。【０１８６】
［実施例１０］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩」（製品番号322-91081 HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は４．０であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５６００であった（表３参照）。【０１８７】
［実施例１１］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「システイン」（製品番号013-05133 HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は３．４であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は５０００であった（表３参照）。【０１８８】
［実施例１２］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「「２−メルカプトエチルアミン」（製品番号２０４０８ HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1  HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 、メーカーＴｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は４．９であり、粒子の凝集や沈降は見られなかった。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は６２００であった（表３参照）。【０１８９】
［比較例５］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「Traut's  Reagent」（製品番号I6256-100MG、メーカーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたこと以外は、実施例７と同様に２次抗体が結合した抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は１．０であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は６００であった（表３参照）。【０１９０】
［比較例６］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに「Biotin Labeling Kit - SH」（製品番号LK10、メーカー同人堂化学社）用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は１．５であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は１４００であった（表３参照）。【０１９１】
［比較例７］
実施例７で使用した１Ｍの２−メルカプトエタノールの代わりに１Ｍの「（＋/−）−ジチオスレイトール」（製品番号041-08971、メーカー和光純薬）を用いたこと以外は、実施例７と同様に抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の製造、凝集確認試験および免疫染色等を行った（表３参照）。その結果、「抗体／ＳＡ」の相対値は１．７であり、粒子の凝集や沈降が見られた。また、ＨＥＲ２に特異的な輝点数は２３００であった（表３参照）。【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
蛍光色素内包樹脂粒子を用いたHER2染色結果（２次抗体結合型）
（結果・考察）
１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギ抗体）と、本発明の製造方法に従って製造した２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子とを用いる２次抗体結合型の免疫染色を行った結果、計測されたＨＥＲ２に特異的な輝点数は４０００〜６０００であり（実施例７〜１２）、従来の製造方法に従って製造した抗ＨＥＲ２抗体結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いた場合（比較例５〜７）の輝点数６００〜２３００よりも著しく多く、ＳＡ結合ＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いた場合（比較例１）の輝点数６２００に近い輝点数が計測された（表３参照）。また、このような２次抗体結合型の実施例７〜１２の結果は、前記１次抗体結合型の実施例１〜６の結果（輝点数３８００〜６１００、表２参照）よりもやや高かった。この結果から、２次抗体を結合したＴＡＭＲＡ内包ナノ粒子を用いる２次抗体結合型の免疫染色であっても問題なく免疫染色が可能であることが分かり、多重免疫染色に適用できることも推認することができる。【０１９４】
以上、本発明の実施の形態および実施例を説明してきたが、本発明はこれらの実施の形態、実施例に限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更は許容される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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