(57)【要約】  本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸を特異的に検出できる方法および手段を提供する。  具体的には、本発明は、以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法を提供する：（１）核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。  本発明はまた、以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定用キットを提供する：（Ｉ）修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ；および（ＩＩ）異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体。
2016052368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【請求項２】
核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、請求項１記載の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、前記標的核酸および前記プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）前記異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【請求項３】
前記核酸サンプルを含有する溶液に前記プローブを添加して、前記核酸サンプルおよび前記プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、標的核酸の主鎖構造と異なる主鎖構造を有する人工核酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブまたは架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）核酸サンプル、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【請求項１０】
核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、請求項９記載の方法：
（１’）核酸サンプル、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、前記標的核酸ならびに前記ガイドプローブおよび捕捉プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）前記異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【請求項１１】
前記ガイドプローブが、前記標的核酸に対して異種であり、捕捉プローブが、前記標的核酸および前記ガイドプローブの双方に対して異種である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体を用いる修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定用キット：
（Ｉ）修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ；および
（ＩＩ）異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体。
【請求項１４】
前記プローブが、修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブであり、かつ（ＩＩＩ）捕捉プローブをさらに含む、請求項１３記載の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在する修飾核酸塩基（例、メチルシトシン、ヒドロキシルメチルシトシン）をイムノアッセイで検出する技術が、幾つか報告されている（例、特許文献１、および非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２３００１９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，３７−４２（２００６）
【非特許文献２】Ｋｕｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０１２，８４，７５３３−７５３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の方法では、核酸塩基と対合している修飾核酸塩基を認識できないが、非対合状態にある修飾核酸塩基を認識できる抗体が使用されていた。したがって、このような抗体を用いる従来の方法では、標的核酸内の特定の位置の修飾核酸塩基を測定するため、その修飾核酸塩基を非対合状態にする必要があった。このような方法としては、例えば、１）ａ）測定対象の修飾核酸塩基のみを含むように標的核酸を断片化し、次いで、ｂ）断片化された標的核酸（一本鎖核酸）、および修飾核酸塩基に対する抗体を用いて、標的核酸内の修飾核酸塩基を測定することを含む方法（一本鎖核酸における修飾核酸塩基の測定方法）、ならびに２）ａ）所定の核酸プローブを用いて、修飾核酸塩基を含む標的核酸と核酸プローブとの二本鎖核酸（二本鎖核酸において、修飾核酸塩基は非対合状態にある）を形成させ、次いで、ｂ）二本鎖核酸、および修飾核酸塩基に対する抗体を用いて、標的核酸内の修飾核酸塩基を測定することを含む方法（二本鎖核酸における修飾核酸塩基の測定方法）が挙げられる。【０００６】
１）の方法として、制限酵素による切断を利用する方法がある。しかし、測定対象の修飾核酸塩基のみが切断フラグメントに含まれるように切断できる制限酵素が都合よくあるとは限らない。【０００７】
２）の方法におけるａ）としては、例えば、ｉ）標的核酸内に存在する測定対象外の修飾核酸塩基に対合する核酸プローブを標的核酸に結合させることにより、測定対象外の修飾核酸塩基をマスクする方法、およびｉｉ）標的核酸内に存在する測定対象の修飾核酸塩基に対合しない核酸プローブを標的核酸に結合させることにより、測定対象の修飾核酸塩基を非対合状態にする方法（バルジ構造の形成）が挙げられる。しかし、ｉ）では、測定対象外の全ての修飾核酸塩基をマスクするには、非常に長い核酸プローブが必要となり、その合成が困難であるという問題がある。また、短鎖の核酸プローブを複数結合させる方法も考えられるが、それら核酸プローブ同士が複合体を形成する場合もあり、標的核酸に特異的かつ効率的に結合させることは困難であるという問題がある。さらに、測定対象外の全ての修飾核酸塩基を完全にマスクすることは困難であるという問題もある。また、ｉｉ）では、測定対象の修飾核酸塩基の部分でバルジ構造を形成させる場合、核酸プローブが標的核酸に対するミスマッチ等を保有することとなるため、核酸プローブの特異性、ひいては測定の特異性が低下するという問題がある。【０００８】
具体的には、特許文献１、および非特許文献１、２では、抗メチルシトシン抗体（クローン３３Ｄ３）を用いて、メチルシトシンが検出されている。しかしながら、この抗メチルシトシン抗体は、非対合メチルシトシンを認識できるものの、その相補的核酸塩基（グアニン）と対合しているメチルシトシンを認識できない。したがって、このような抗体を用いる特許文献１、および非特許文献１、２の方法では、標的核酸内の特定の位置の修飾核酸塩基を測定するため、その修飾核酸塩基を非対合状態にする必要があり、それ故、上述したような問題があった。【０００９】
上記イムノアッセイ系では、修飾核酸塩基を含む標的核酸のみならず、修飾核酸塩基を含む非標的核酸も検出され得るという問題がある。これは、上記イムノアッセイで用いられる修飾核酸塩基に対する抗体は、非対合状態にある修飾核酸塩基のみを認識することから、標的核酸および非標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を区別なく認識するためである。特に、修飾核酸塩基を含む標的核酸のみならず、修飾核酸塩基を含む多数の非標的核酸を含み得る天然由来サンプルを測定対象とする場合、この問題は深刻である。本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸を特異的に測定すること、特に、標的核酸の断片化、測定対象外の修飾核酸塩基（5-メチルシトシン）のマスク等の操作を要することなく、かかる特異的な測定を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、修飾核酸塩基を含む標的核酸を特異的に測定するためには、従来の抗体とは異なり、非対合状態にある修飾核酸塩基を認識できないが、核酸塩基と対合している修飾核酸塩基を認識できる抗体を用いることにより、測定の特異性を向上できることを着想した。即ち、このような抗体を用いることで、核酸プローブを適切に設計することにより、核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸中の修飾核酸塩基のみを特異的に測定できると考えられる。本発明者らはまた、このような抗体の使用に適合させるため、修飾核酸塩基との対合を可能にする核酸プローブを用いること、および測定精度の向上のため、このような核酸プローブの構成核酸として異種核酸を利用すること等を着想した。実際、本発明者らは、このような着想に基づき開発された方法により、修飾核酸塩基を含む標的核酸を特異的に測定することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、前記標的核酸および前記プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）前記異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕前記核酸サンプルを含有する溶液に前記プローブを添加して、前記核酸サンプルおよび前記プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記プローブが、標的核酸の主鎖構造と異なる主鎖構造を有する人工核酸を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記プローブが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブまたは架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブである、〔５〕の方法。
〔７〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）核酸サンプル、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔１０〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔９〕の方法：
（１’）核酸サンプル、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、前記標的核酸ならびに前記ガイドプローブおよび捕捉プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）前記異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔１１〕前記ガイドプローブが、前記標的核酸に対して異種であり、捕捉プローブが、前記標的核酸および前記ガイドプローブの双方に対して異種である、〔１０〕の方法。
〔１２〕前記抗体を用いる修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定用キット：
（Ｉ）修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ；および
（ＩＩ）異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体。
〔１４〕前記プローブが、修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブであり、かつ（ＩＩＩ）捕捉プローブをさらに含む、〔１３〕の測定用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法およびキットによれば、標的核酸中の修飾核酸塩基を特異的に測定できる。具体的には、修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ、および異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いる本発明によれば、当該プローブとハイブリッドを形成した部分中の修飾核酸塩基を特異的に測定することができる。本発明によれば、標的核酸の断片化、測定対象外の修飾核酸塩基のマスク等の操作が不要になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および核酸プローブ（例、修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ）を用いた修飾核酸塩基の特異的検出を示す図である。
【図２】図２は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の周辺配列非依存的検出を示す図である。
【図３】図３は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の用量依存的検出を示す図である。
【図４】図４は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の特異的検出を示す図である。
【図５】図５は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）を用いた修飾核酸塩基の特異的検出（１）を示す図である。
【図６】図６は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）を用いた修飾核酸塩基の特異的検出（２）を示す図である。
【図７】図７は、本発明の方法の概要を示す図である。
【図８】図８は、修飾核酸塩基の測定に関する課題（特定課題Ｉ）の概要を示す図である。二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度は一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基のものに比し低い。これは、修飾核酸塩基を含む標的核酸に対して、相補鎖および捕捉プローブが競合し、標的核酸と捕捉プローブとのハイブリッド形成効率（標的核酸の固相上への捕捉効率）が低いと考えられるためである。
【図９】図９は、修飾核酸塩基の測定に関する課題（特定課題ＩＩ）の概要を示す図である。捕捉プローブを用いて標的核酸中の修飾核酸塩基を測定する従来の方法では、標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される。従来の方法では、このハイブリッド中の非ハイブリダイズ領域（一本鎖領域）が二次構造を形成することで、この二次構造中に含まれる修飾核酸塩基を測定し難い（換言すれば、検出感度が低い）という課題が潜在的に存在していた。
【図１０】図１０は、捕捉プローブによる一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。
【図１１】図１１は、捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。ガイドプローブ（−）：捕捉プローブのみ；ガイドプローブ（＋）：捕捉プローブおよびガイドプローブ。
【図１２】図１２は、捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。ガイドプローブ（−）：捕捉プローブのみ；ガイドプローブ（＋）：捕捉プローブおよびガイドプローブ。
【図１３】図１３は、カオトロピック剤の存在下におけるガイドプローブの使用による、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ：ガイドプローブを使用；グアニジンチオシアネート（−）Ｂｕｆｆｅｒ：ガイドプローブを使用；グアニジンチオシアネート（＋）Ｂｕｆｆｅｒ：カオトロピック剤の存在下でガイドプローブを使用。
【図１４】図１４は、カオトロピック剤の存在下におけるガイドプローブの使用による、一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。
【図１５】図１５は、ガイドプローブの使用による、一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定を示す図である。本実験は、図１４に示される実験との対比のため行われた。
【図１６】図１６は、核酸変性剤の存在下におけるガイドプローブの使用による修飾核酸塩基の測定を示す図である。
【図１７】図１７は、ガイドプローブによる、修飾核酸塩基を含む部位における二次構造の形成の阻害を示す図である。１：ガイドプローブ１；２：ガイドプローブ２；３：ガイドプローブ３；４：ガイドプローブ４；２＋４：ガイドプローブ２および４を添加；２＋３＋４：ガイドプローブ２、３および４を添加。
【図１８】図１８は、種々の濃度の核酸変性剤の効果を示す図である。
【図１９】図１９は、ガイドプローブの主鎖の検討を示す図である。未添加：ガイドプローブの非存在下；２：ガイドプローブ２；４：ガイドプローブ４；２＋４：ガイドプローブ２および４の存在下；５：ガイドプローブ５；６：ガイドプローブ６；５＋６：ガイドプローブ５および６の存在下。−：ガイドプローブの非存在下；ＤＮＡ：ガイドプローブの主鎖がＤＮＡ；２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ：ガイドプローブの主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ；ＲＮＡ；ガイドプローブの主鎖がＲＮＡ。
【図２０】図２０は、核酸変性剤（カオトロピック剤および電子供与性化合物）または非核酸変性剤（界面活性剤）の存在下におけるガイドプローブの使用による修飾核酸塩基の測定を示す図である。
【図２１】図２１は、核酸変性剤および界面活性剤の双方の存在下で、ガイドプローブを用いた、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定（発光カウント）を示す図である。
【図２２】図２２は、核酸変性剤および界面活性剤の双方の存在下でガイドプローブを用いた、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定（Ｓ／Ｎ）を示す図である。シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）：標的核酸量（ｆｍｏｌ）の発光カウント／標的核酸の非存在下（即ち、０ｍｏｌ）の発光カウント。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）核酸サンプル、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【００１５】
核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有するサンプル、または当該標的核酸を含有することが疑われるサンプルである。核酸サンプルはまた、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含有する可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。このようなサンプルは、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。
【００１６】
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、ＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域（例、転写調節領域）である。標的核酸のヌクレオチド配列の一部または全体は、異種核酸プローブのヌクレオチド配列に対して相補的である。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、異種核酸プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸が含む修飾核酸塩基の数は、１個以上（例、１〜１００個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個）であれば特に限定されない。
【００１７】
本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４〜６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
【００１８】
修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５−カルボキシルシトシン）である。より好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
【００１９】
（修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ：プローブＸ）
本発明で用いられる修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブとは、標的核酸に対して異種の核酸から構成され、かつハイブリダイゼーションにより標的核酸を検出可能な異種核酸プローブであって、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むものをいう。以下、修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを単にプローブＸと称する場合がある。したがって、標的核酸およびプローブＸから形成される異種核酸ハイブリッドにおいて、修飾核酸塩基は相補的な核酸塩基と対合しており、修飾核酸塩基部分ではバルジまたはループ構造は形成されない。具体的には、修飾核酸塩基がアデニン（Ａ）である場合、プローブＸ中の対合核酸塩基はチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である。修飾核酸塩基がグアニン（Ｇ）である場合、プローブＸ中の対合核酸塩基はシトシン（Ｃ）である。修飾核酸塩基がシトシン（Ｃ）である場合、プローブＸ中の対合核酸塩基は、グアニン（Ｇ）である。修飾核酸塩基がチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である場合、プローブＸ中の対合核酸塩基は、アデニン（Ａ）である。用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体としてプローブＸが有することを意味する。したがって、プローブＸの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、プローブＸとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、プローブＸとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。標的核酸としてはＤＮＡが好ましいことから、プローブＸは、好ましくは、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブである。
【００２０】
プローブＸとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ）プローブまたは架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。
【００２１】
架橋型核酸（ＢＮＡ）の構成単位の好ましい例は、以下の式により表される。
【００２２】
【化１】
2016052368.tif 000003
【００２３】
上記一般式において、Ｘは、リンカー（原子または基）を示す。リンカー（原子または基）としては、例えば、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−が挙げられる。Ｒとしては、例えば、水素原子および炭化水素基〔例、後述するようなＣ１〜Ｃ６アルキル基等のアルキル基〕が挙げられる。Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅは、上述したような核酸塩基を示す。Ｘが−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−であるＢＮＡを、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）と表記することがある。
【００２４】
ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１〜Ｃ６アルキル化のＣ１〜Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１〜６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル）、ブチル基（例、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブである。
【００２５】
好ましくは、プローブＸは、天然核酸とは異なる部分構造を有する人工核酸を含んでいてもよい。このようなプローブＸは、好ましくは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を有する人工核酸を含んでいてもよい。このような主鎖構造を有する人工核酸としては、例えば、主鎖構造の構成部分である糖部分が修飾、または他の部分と交換された構造、主鎖構造の構成部分であるリン酸部分が他の部分と交換された構造、ならびに糖部分およびリン酸部分の双方が他の部分と交換された構造が挙げられる。プローブＸが人工核酸を含む場合、プローブＸを構成する全ての核酸が人工核酸であってもよい。あるいは、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドおよび/またはその隣接ヌクレオチド（例、修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドから５’末端および/または３’末端側に２個または１個までのヌクレオチド）が上述したような人工核酸であってもよいが、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドのみが上述したような人工核酸であることもまた好ましい。このようなプローブＸは、任意の核酸塩基をさらに含むが、好ましくは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる核酸塩基を含んでいてもよい。
【００２６】
より好ましくは、プローブＸは、ｉ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ（本プローブは、その全体または一部がＰＮＡである。一部がＰＮＡである場合、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドのみがＰＮＡであってもよい）、ｉｉ）架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ（本プローブは、その全体または一部がＢＮＡである。一部がＢＮＡである場合、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドのみがＢＮＡであってもよい）、あるいはｉｉｉ）ＰＮＡプローブおよび/またはＢＮＡプローブと上述したような別の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブである。
【００２７】
プローブＸを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、プローブＸの長さ）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。プローブＸを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。このようなプローブＸは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
【００２８】
プローブＸは、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、プローブＸは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（プローブＸに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（プローブＸに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、捕捉プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。
【００２９】
プローブＸが遊離の形態で用いられる場合、プローブＸは、修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブであってもよい。この場合、プローブとして、修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ（修飾核酸塩基の検出を支援するためのプローブ）に加えて、捕捉プローブ（標的核酸を固相に固定するためのプローブ）が用いられる。修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブおよび捕捉プローブの併用は、修飾核酸塩基の検出の役割、および標的核酸の固相への固定の役割を、異なるプローブに付与する実施形態である。
【００３０】
（異種ガイドプローブ：プローブＹ）
本発明で用いられる修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブは、専ら遊離の形態で用いられる以外は、プローブＸについて上述した特徴を有する核酸プローブである。以下、修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブを単にプローブＹと称する場合がある。プローブＹは、捕捉プローブがハイブリダイズする標的核酸中の領域とは異なる領域において、標的核酸にハイブリダイズできる。プローブＹは、捕捉プローブとハイブリダイズしないように設計される。１個または複数個（例、２個、３個、４個、または５個）のガイドプローブを、１つの標的核酸に対して用いることができる。例えば、複数個のプローブＹは、１つの標的核酸中の異なる領域にハイブリダイズするように設計することができる。
【００３１】
（捕捉プローブ）
本発明で用いられる捕捉プローブは、標的核酸とハイブリダイズする能力を有する核酸分子であって、固相に固定可能なものである。本発明において、捕捉プローブは、プローブＹとハイブリダイズしないように設計される。
【００３２】
捕捉プローブは、標的核酸に対して同種および／または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を、主鎖構造の全体として捕捉プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として捕捉プローブが有することを意味する。したがって、捕捉プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定されてもよい。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、捕捉プローブは、標的核酸に対して異種の核酸から構成されていてもよい。
【００３３】
捕捉プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ）プローブまたは架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。ＲＮＡプローブは、上述したものと同じである。
【００３４】
捕捉プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、捕捉プローブの長さ）は、標的核酸とハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１２個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは１８個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。捕捉プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下または５０個以下であってもよい。捕捉プローブにおいて標的核酸とハイブリダイズし得る領域中のＧＣ含有率は、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。この領域中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。捕捉プローブは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
【００３５】
捕捉プローブは、工程（１）で用いられる場合、遊離の形態、または固相に固定された形態で用いることができる。したがって、捕捉プローブは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば、捕捉プローブの５’末端または３’末端の一方にて行うことができる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、捕捉プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。捕捉プローブは、工程（１）において遊離の形態で用いられる場合、ハイブリッド形成後に、固相に固定されてもよい。
【００３６】
好ましくは、プローブＹは、ｉ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ（本プローブは、その全体または一部がＰＮＡである。一部がＰＮＡである場合、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドのみがＰＮＡであってもよい）、ｉｉ）架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ（本プローブは、その全体または一部がＢＮＡである。一部がＢＮＡである場合、標的核酸と異種核酸ハイブリッドを形成したとき修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチドのみがＢＮＡであってもよい）、あるいはｉｉｉ）ＰＮＡプローブおよび/またはＢＮＡプローブと上述したような別の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブである。この場合、捕捉プローブは、標的核酸およびプローブＹの双方に対して異種であることが好ましい。標的核酸は好ましくはＤＮＡであることから、捕捉プローブは、好ましくは、上述したような修飾ＲＮＡプローブ（例、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブ）である。
【００３７】
特定の実施形態では、上述したとおり、「プローブＸ」の代わりに、「プローブＹ」および「捕捉プローブ」を用いることができる。したがって、用語「プローブＸ」を「プローブＹ」および「捕捉プローブ」に交換した実施形態もまた、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【００３８】
工程（１）において、インキュベートは、核酸サンプル中に標的核酸が含まれる場合にプローブＸ（遊離、または後述する固相に固定）（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）と核酸サンプル中の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応が可能である条件下で適切な溶液中で行われる。このような溶液としては、例えば、塩（例、クエン酸ナトリウム）およびその他の成分（例、界面活性剤）を含む緩衝液を用いることができる。ハイブリダイゼーション温度は、例えば１５〜９５℃（好ましくは２５〜６５℃）である。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプルおよびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を溶液中でインキュベートしても、異種核酸ハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプルおよびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸およびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）が反応して、当該標的核酸およびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）から構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプルおよびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸およびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）が反応して、当該標的核酸およびプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）から構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
【００３９】
本発明において、異種核酸ハイブリッドは、ハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸およびプローブＸの二本鎖構造を有するハイブリダイゼーション複合体である。あるいは、プローブＸの代わりにプローブＹおよび捕捉プローブが用いられる場合、異種核酸ハイブリッドは、標的核酸とプローブＹとの間のハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸およびプローブＹの二本鎖構造、ならびに標的核酸と捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造を有する、標的核酸、プローブＹおよび捕捉プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体である。
【００４０】
異種核酸ハイブリッドにおいて、二本鎖構造部分に対応する標的核酸およびプローブＸのヌクレオチド残基の個数（即ち、二本鎖構造部分の長さ）、あるいは標的核酸およびプローブＹの二本鎖構造部分に対応する標的核酸およびプローブＹのヌクレオチド残基の個数、ならびに標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数は、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。二本鎖構造部分に対応する標的核酸およびプローブＸのヌクレオチド残基の個数、あるいは標的核酸およびプローブＹの二本鎖構造部分に対応する標的核酸およびプローブＹのヌクレオチド残基の個数、ならびに標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸とプローブＹとの間の融解温度（Ｔｍ１）、および標的核酸と捕捉プローブとの間の融解温度（Ｔｍ２）は、プローブＹおよび捕捉プローブの長さ（即ち、ヌクレオチド残基の個数）に応じて適宜調整できる。例えば、Ｔｍ１とＴｍ２との温度差が２０℃、１５℃、１０℃、または５℃の範囲内になるように、プローブＹおよび捕捉プローブが設計されてもよい。
【００４１】
本発明の方法は、核酸サンプルを含有する溶液にプローブＸ、またはプローブＹおよび捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよびプローブＸを含有する溶液、または核酸サンプル、プローブＹおよび捕捉プローブを含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。プローブＸ、またはプローブＹおよび捕捉プローブは、固体の形態、または溶液として、核酸サンプルに添加することができる。
【００４２】
修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルから上述したインキュベーション用溶液が調製される場合、溶液中の標的核酸の濃度は、本発明の方法により検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の標的核酸の濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。
溶液中のプローブＸの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中のプローブＸの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、プローブＸを溶液に添加してもよい。
【００４３】
あるいは、インキュベーション溶液中のプローブＹの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、プローブＹを溶液に添加してもよい。
インキュベーション溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
インキュベーション溶液中のプローブＹと捕捉プローブとの濃度比は、標的核酸中の修飾核酸塩基を測定できる限り特に限定されない。例えば、濃度比（異種ガイドプロー：捕捉プローブ）は、１：１００〜１００：１、１：５０〜５０：１、１：２０〜２０：１、または１：１０〜１０：１であってもよい。あるいは、捕捉プローブは、プローブＹに比し、高濃度で用いられてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、標的核酸は、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸であってもよい。ここで、標的核酸に含まれる可能性がある修飾核酸塩基の個数は、２以上である限り特に限定されないが、例えば、２〜３０個、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個（例、２、３、４もしくは５個）である。標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の個数が複数である場合、標的核酸とプローブＸとのハイブリダイゼーションに用いられる溶液中の標的核酸が極めて低い濃度であっても、修飾核酸を高感度に測定できることが確認されている。したがって、本発明の方法では、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸とハイブリダイズするように設計されたプローブＸ（またはプローブＹ）を用いることができる。測定すべき標的核酸中の修飾される可能性がある核酸塩基の個数が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
【００４５】
一つの好ましい実施形態では、核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む一本鎖の標的核酸（好ましくは、標的ＤＮＡ）を含有するサンプルである。この場合、工程（１）は、一本鎖の標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブのハイブリダイゼーション反応のためにインキュベートすることに加えて、一本鎖の標的核酸の変性反応のためにインキュベートすることを含んでいてもよい。例えば、ハイブリダイゼーション反応のためのインキュベートは、上述したハイブリダイゼーション条件下で行うことができ、変性反応のためのインキュベートは、７０〜１００℃（好ましくは８０〜９８℃）での１〜３０分間（好ましくは２〜１０分）の条件下で行うことができる。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む二本鎖の標的核酸（好ましくは、標的ＤＮＡ）を含有するサンプルである。この場合、工程（１）は、二本鎖の標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブのハイブリダイゼーション反応のためにインキュベートすることに加えて、二本鎖の標的核酸の解離および変性反応のためにインキュベートすることを含んでいてもよい。例えば、ハイブリダイゼーション反応のためのインキュベートは、上述したハイブリダイゼーション条件下で行うことができ、解離および変性反応のためのインキュベートは、７０〜１００℃（好ましくは８０〜９８℃）での１〜３０分間（好ましくは２〜１０分）の条件下で行うことができる。
【００４７】
さらに別の好ましい実施形態では、核酸変性剤の存在下で、核酸サンプル、捕捉プローブおよびガイドプローブが溶液中でインキュベートされる。核酸変性剤とは、核酸の高次構造を破壊することにより核酸を変性させる能力を有する物質をいう。インキュベーション溶液中の核酸変性剤の濃度は、好ましくは、標的核酸（特に、二本鎖の標的核酸）中の修飾核酸塩基の検出感度を向上するように設定される。このような濃度は、例えば０．５Ｍを超える濃度であり、好ましくは１Ｍ以上である。このような濃度はまた、２０Ｍ以下、１０Ｍ以下、８Ｍ以下、６Ｍ以下、４Ｍ以下、３Ｍ以下または２．５Ｍ以下であってもよい。核酸変性剤は、１種であってもよいが、複数（例、２または３種）であってもよい。
【００４８】
核酸変性剤としては、例えば、カオトロピック剤、および電子供与性化合物が挙げられる。
カオトロピック剤としては、例えば、グアニジニウムイオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、臭素イオン、ヨウ化物イオン、ウレア、およびそれらの塩（例、金属塩、無機塩、有機塩）が挙げられる。好ましくは、カオトロピック剤は、グアニジンチオシアネート、グアニジン塩酸塩、またはウレアである。
本発明において、電子供与性化合物とは、核酸の変性作用を有する、電子供与性のヘテロ原子含有化合物をいう。ヘテロ原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子が挙げられる。好ましくは、電子供与性化合物は、電子供与性を有する複素環化合物である。このような複素環化合物としては、例えば、非芳香族複素環化合物、およびπ電子過剰の芳香族複素環（例、５員環の芳香族複素環）を有する化合物が挙げられる。電子供与性を有する複素環化合物としては、例えば、電子供与性を有し、環中にヘテロ原子を１個または２個以上含んでなる５員環構造を有する単環式芳香族複素環化合物（例、ピロール、ピラゾール、イミダゾール）およびその縮合環化合物（例、インドール、ベンゾイミダゾール）、ならびに電子供与性を有し、環中にヘテロ原子を１個または２個以上含んでなる非芳香族複素環化合物（例、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン）が挙げられる。好ましくは、ヘテロ原子は、窒素原子である。
【００４９】
さらに好ましい実施形態では、核酸変性剤および界面活性剤の双方の存在下で、核酸サンプル、捕捉プローブおよびガイドプローブが溶液中でインキュベートされる。この場合、核酸変性剤、インキュベーション溶液中の核酸変性剤の濃度は、上述したとおりである。インキュベーション溶液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは、検出シグナルのバックグランド値を低減するように設定される。このような濃度は、例えば０．０５％（ｖ／ｖ）以上であり、好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．５％（ｖ／ｖ）以上である。このような濃度はまた、２０％（ｖ／ｖ）以下、１０％（ｖ／ｖ）以下、８％（ｖ／ｖ）以下、６％（ｖ／ｖ）以下、４％（ｖ／ｖ）以下、または２％（ｖ／ｖ）以下であってもよい。界面活性剤は、１種であってもよいが、複数（例、２または３種）であってもよい。
【００５０】
界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、例えば、ヘキシル硫酸、オクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸、ドデシルホスホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、ｎ−ラウロイルサルコシン、およびｎ−ドデカノイルサルコシン酸、ならびにこれらの塩（例、ナトリウム塩）が挙げられる。
カチオン性界面活性剤としては、例えば、４級アンモニウム化合物（例、セチルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、およびミリスチルトリメチルアンモニウム）および４級ホスホニウム化合物、ならびにこれらの塩（例、ハロゲン化物）が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＡＳＢ−１４、３−Ｎ（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−ｎ（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート酸、Ｎ−ドデシルＮ，Ｎ−ジメチル−３アンモニオ−１プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホン酸、ならびにこれらの塩が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−８０）、ＴｒｉｔｏｎＸ系界面活性剤（例、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＭＥＧＡ系界面活性剤（例、Ｍｅｇａ−８）、ＮＰ４０が挙げられる。
【００５１】
修飾核酸塩基は、異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いて測定される。測定に際しては、工程（１）で得られた溶液をそのまま用いてもよいが、抗体による修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定により適した溶液において測定を行うため、別の溶液の添加および／または溶液の別の溶液への交換を行ってもよい。このような交換は、例えば、工程（１）で得られた溶液を固相に添加して、溶液中に含有され得る異種核酸ハイブリッドを固相に固定化し、次いで固相から溶液を除去し、必要に応じて洗浄液で洗浄した後、別の溶液（例、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を含有する溶液）を添加することにより行うことができる。測定に用いられる溶液は、抗原・抗体反応に適切な溶液である限り特に限定されない。
【００５２】
測定は、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
【００５３】
異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体はさらに、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイにおいて１次抗体として用いられるものであってもよく、この場合、２次抗体が併用される。
【００５４】
異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体における用語「異種対合性修飾核酸塩基」とは、プローブＸ中の相補的な核酸塩基と対合している状態にある修飾核酸塩基をいう。したがって、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、異種核酸ハイブリッドを形成していない標的核酸中の修飾核酸塩基（例、一本鎖核酸中の修飾核酸塩基）を検出することができないが、異種核酸ハイブリッドを形成している標的核酸中の修飾核酸塩基を特異的に検出することができる。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合における異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体としては、１）２’−デオキシ修飾アデノシン、２’−デオキシ修飾グアノシン、２’−デオキシ修飾シチジンおよび２’−デオキシ修飾チミジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、ならびにその相補的な異種核酸（非デオキシリボヌクレオシド）から構成される対合単位に対する抗体、２）２’−デオキシ修飾アデノシン  ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾グアノシン  ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾シチジン  ５’−ホスフェートおよび２’−デオキシ修飾チミジン  ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオチド、ならびにその相補的な異種核酸（非デオキシリボヌクレオシド）から構成される対合単位に対する抗体が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合における異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体としては、例えば、１’）修飾アデノシン、修飾グアノシン、修飾シチジンおよび修飾ウリジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド、ならびにその相補的な異種核酸（非ノーマルＲＮＡ）から構成される対合単位に対する抗体、２’）修飾アデノシン  ５’−ホスフェート、修飾グアノシン  ５’−ホスフェート、修飾シチジン  ５’−ホスフェートおよび修飾ウリジン  ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチド、ならびにその相補的な異種核酸（非ノーマルＲＮＡ）から構成される対合単位に対する抗体が挙げられる。
【００５５】
異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、修飾核酸塩基を含む核酸およびプローブＸ（定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである）から構成される異種核酸ハイブリッドを抗原として用いることにより調製することができる（例、後述の調製例を参照）。例えば、モノクローナル抗体の作製方法であるファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４−８９（１９９３））、およびＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を用いてもよい。
【００５６】
ところで、本発明では、パリンドローム構造を有する修飾核酸塩基含有異種二重鎖を含む異種核酸ハイブリッドを抗原として用いることで、異種対合性修飾核酸塩基に対する良質な抗体を効率的に取得できることが確認されている(例、後述の調製例を参照)。したがって、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、パリンドローム構造を有する修飾核酸塩基含有異種二重鎖を含む異種核酸ハイブリッドを抗原として用いて作製された抗体であってもよい。パリンドローム構造を有する修飾核酸塩基含有異種二重鎖としては、例えば、以下の式（Ｉ）で表される異種二重鎖が挙げられる。この場合、修飾核酸塩基を含む標的核酸およびプローブＸから構成される異種核酸ハイブリッドは、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される部分構造を有していてもよい。
【００５７】
【化２】
2016052368.tif 000004
【００５８】
【化３】
2016052368.tif 000005
【００５９】
〔式（Ｉ）および（ＩＩ）中、
ｓおよびａは、それぞれ、センス鎖およびアンチセンス鎖中のヌクレオチド残基であることを意味し、センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに異種である（上記「異種」の定義および例示を参照）。
ＸｓおよびＸａを構成するヌクレオチド残基中の核酸塩基は、同じであり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる残基を示す。
ＹｓおよびＹａを構成するヌクレオチド残基中の核酸塩基は、同じであり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる残基を示す。
ＸおよびＹ中のヌクレオチド残基中の核酸塩基は相補的であり、ＸｓはＹａと対合しており、ＹｓはＸａと対合している。
センス鎖またはアンチセンス鎖の一方を構成するヌクレオチド残基中の少なくとも１つの核酸塩基（好ましくは１つの核酸塩基）が修飾されている。好ましくは、修飾核酸塩基と対合する核酸塩基を含むヌクレオチド残基は、当該一方の鎖の主鎖構造（修飾核酸塩基を含むヌクレオチド残基が有するもの）と異なる、上述したような主鎖構造を有する。〕
【００６０】
好ましくは、上記式（Ｉ）で表される異種二重鎖は、以下の式（Ｉ−１）または（Ｉ−２）で表される異種二重鎖であってもよい。また、上記式（ＩＩ）で表される異種二重鎖は、以下の式（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）で表される異種二重鎖であってもよい。以下の式（Ｉ−１）で表される異種二重鎖、および（Ｉ−２）で表される異種二重鎖の双方を含む異種核酸ハイブリッド、または以下の式（ＩＩ−１）で表される異種二重鎖、および（ＩＩ−２）で表される異種二重鎖の双方を含む異種核酸ハイブリッドを、抗原として用いてもよい。これらの場合、修飾核酸塩基を含む標的核酸およびプローブＸから構成される異種核酸ハイブリッドは、以下の式（Ｉ−１）および／または（Ｉ−２）、ならびに／あるいは以下の式（ＩＩ−１）および/または（ＩＩ−２）で表される部分構造を有していてもよい。
【００６１】
【化４】
2016052368.tif 000006
【００６２】
【化５】
2016052368.tif 000007
【００６３】
〔式（Ｉ−１）、（Ｉ−２）、（ＩＩ−１）および（ＩＩ−２）中、
Ｇはグアニン残基を示し、Ｃはシトシン残基を示す。
センス鎖を構成するシトシン残基が修飾されている。好ましくは、修飾シトシン残基と対合するグアニン残基は、センス鎖の主鎖構造（修飾シトシン残基が有するもの）と異なる、上述したような主鎖構造を有する。〕
【００６４】
異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、固相に固定化されて用いられてもよく、固相に固定されないで用いられてもよい。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチックおよび金属等の支持体、プレート（例、マルチウェルプレート）等の容器、ならびにデバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等の低分子化合物、ならびに緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。あるいは、標識物質がタンパク質の場合、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、タンパク質（例、上述したような酵素または蛍光タンパク質）と融合された形態で用いられてもよい。本発明の方法で２次抗体が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識されていてもよく、また、タンパク質（例、上述したような酵素または蛍光タンパク質）と融合された形態で用いられてもよい。
【００６５】
異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体による修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定は、定性的または定量的に行われ、修飾核酸塩基の有無または量を評価することができる。なお、本発明において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定とは、修飾核酸塩基自体の測定のみならず、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定もまた意図される。
【００６６】
例えば、修飾核酸塩基の有無の測定は、以下により行われてもよい：
（２−１）上記工程（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を含有する溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２−３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
【００６７】
また、修飾核酸塩基の量の測定は、例えば、バックグランド値の測定とともに行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’）上記工程（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を含有する溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２−３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２−４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
【００６８】
あるいは、修飾核酸塩基の量の測定は、標品を用いて行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を含有する溶液において、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２−３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡにより行われてもよい。例えば、核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、ＥＬＩＳＡによる本発明の方法は、以下により行われてもよい：
（ｉ−１）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルおよび第１の親和性物質で標識されたプローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）を溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該プローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）から構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ−１）異種核酸ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ−１）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定された異種核酸ハイブリッドと反応させて、１次抗体と異種核酸ハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ−１）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ−１）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成された異種核酸ハイブリッド（換言すれば、標的核酸中の修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること。
第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ−１）および（ｉｉ−１）の代わりに、（ｉ’−１）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および固相に固定されたプローブＸを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該プローブＸから構成される異種核酸ハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定されたプローブＸを得ること（例、第１の親和性物質で標識されたプローブＸを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ−１）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ−１）〜（ｖ−１）を含む本発明の方法は、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
【００７０】
ＥＬＩＳＡによる本発明の方法はまた、以下により行われてもよい：
（ｉ−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、プローブＹ、および第１の親和性物質で標識された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、当該プローブＹおよび捕捉プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ−２）異種核酸ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ−２）異種対合性修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定された異種核酸ハイブリッドと反応させて、１次抗体とハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ−２）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ−２）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成された異種核酸ハイブリッド（換言すれば、標的核酸中の修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること。
第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ−２）および（ｉｉ−２）の代わりに、（ｉ’−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、プローブＹ、および固相に固定された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、プローブＹおよび当該捕捉プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された捕捉プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された捕捉プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ−２）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ−２）〜（ｖ−２）を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
【００７１】
本発明はまた、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定用キットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下を含む：
（Ｉ）プローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）；および
（ＩＩ）異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体。
プローブＸ（またはプローブＹおよび捕捉プローブ）および修飾核酸塩基は、上述したとおりである。例えば、プローブＸ（または捕捉プローブ）は、親和性物質で標識されていてもよく、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
【００７２】
本発明のキットは、互いに隔離された形態または混合された形態にて各構成成分を含む。例えば、本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７４】
実施例１：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の特異的検出
配列１の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−［Ｃ］ＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ［Ｃ］−３’（配列番号１；［Ｃ］は５−メチルシトシン；３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖１（核酸プローブ）の主鎖はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、配列はＮ末端−ＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧ−Ｃ末端（配列番号２）であり、ファスマック社により人工合成されたものを使用した。
先ず、配列１（５００ｐｍｏｌ）と相補鎖１（７５０ｐｍｏｌ）を９５℃で５分間反応させた後、６０℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
配列２は、シトシン塩基がメチル化されていないこと以外は配列１と同一であり、相補鎖１（核酸プローブ）を使用して、配列１と同様の方法で、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
配列３の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＴＴＧ［Ｃ］ＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号４；［Ｃ］は５−メチルシトシン）であり、相補鎖２（核酸プローブ）の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号５；５’末端はビオチン標識）であり、いずれも北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用して、配列１と同様の方法で、同種核酸ハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を得た。
配列４の主鎖はＰＮＡであり、配列はＮ末端−ＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣ−Ｃ末端（配列番号６；３’末端はビオチン標識）であり、ファスマック社により人工合成されたものを使用した。
配列５の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧ−３’（配列番号７；３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。【００７５】
【表１】
2016052368.tif 000008
【００７６】
【表２】
2016052368.tif 000009
【００７７】
先ず、上記で調製した異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）、同種核酸ハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）、一本鎖ＰＮＡ、および一本鎖ＤＮＡをＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解することで２０ｎＭに調製した後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸を固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例１で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ１０−１−６Ｅは５倍希釈、１０−１−５−４Ｅ、１９−３−６Ｈは１０倍希釈）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを５０μＬずつ加え、室温で５分反応させた。その後、１Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００７８】
その結果、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブの使用により、異種核酸ハイブリッド中の修飾核酸塩基を特異的に検出できることが確認された（表３、図１）。【００７９】
【表３】
2016052368.tif 000010
【００８０】
実施例２：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の周辺配列非依存的検出
配列１（ＤＮＡ）と相補鎖１（ＰＮＡ）から構成される異種核酸ハイブリッド、および配列２（ＤＮＡ）と相補鎖１（ＰＮＡ）から構成される異種核酸ハイブリッドは、実施例１と同様の方法で得た。
配列６の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＴＡＧＡＡ［Ｃ］ＧＣＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＴ−３’（配列番号８；［Ｃ］は５−メチルシトシン；５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖３（核酸プローブ）の主鎖はＰＮＡであり、配列はＮ末端−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＡ−Ｃ末端（配列番号９）であり、ファスマック社により人工合成されたものを使用した。
先ず、配列６（２ｎｍｏｌ）と相補鎖３（４ｎｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた。９９℃で５分間反応させた後、６０℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
配列７の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＧＴ［Ｃ］ＧＴＴＴＴ［Ｃ］ＧＧ［Ｃ］ＧＧＣ［Ｃ］ＧＣ−３’（配列番号１０；［Ｃ］は５−メチルシトシン）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖４（核酸プローブ）の主鎖はＰＮＡであり、配列はＮ末端−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣ−Ｃ末端（配列番号１１；Ｎ末端はビオチン標識）であり、ファスマック社により人工合成されたものを使用した。
先ず、配列７（４ｎｍｏｌ）と相補鎖４（２ｎｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた。９９℃で５分間反応させた後、６０℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
配列８の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＧＣＣ［Ｃ］ＧＣＡ［Ｃ］ＧＴＣＣＴ［Ｃ］Ｇ［Ｃ］ＧＧ−３’（配列番号１２；［Ｃ］は５−メチルシトシン；５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖５（核酸プローブ）の主鎖はＰＮＡであり、配列はＮ末端−ＣＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＣ−Ｃ末端（配列番号１３）であり、ファスマック社により人工合成されたものを使用して、配列６と同様の方法で、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。【００８１】
【表４】
2016052368.tif 000011
【００８２】
【表５】
2016052368.tif 000012
【００８３】
先ず、上記で調製した異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）をＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解することで２０ｎＭに調製した後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸を固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例１で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ１９−３−６Ｈ、１００倍希釈）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを５０μＬずつ加え、室温で５分反応させた。その後、１Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００８４】
その結果、本発明の方法は、異種核酸ハイブリッド中の修飾核酸塩基の周辺配列に関係なく、修飾核酸塩基を特異的に認識できることが確認された（表６、図２）。【００８５】
【表６】
2016052368.tif 000013
【００８６】
実施例３：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の用量依存的検出
標的核酸の配列は上述した配列６（ＤＮＡ）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブの配列は上述した相補鎖３であり、ファスマック社により人工合成されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用した。
先ず、標的核酸（５００ｐｍｏｌ）と修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（１０ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０）２５μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、６０℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
また、核酸プローブとして、主鎖がＤＮＡである以外は上記と同一のプローブを使用して、同様の方法で、同種核酸ハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を得た。【００８７】
【表７】
2016052368.tif 000014
【００８８】
【表８】
2016052368.tif 000015
【００８９】
先ず、上記で調製した異種核酸ハイブリッド（２．５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、または０．１ｐｍｏｌ）をＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。また、上記で調製した同種核酸ハイブリッド（２．５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、または０．１ｐｍｏｌ）、相補鎖を伴わない一本鎖の標的核酸（２．５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、または０．１ｐｍｏｌ）、もしくは標的核酸を含まない溶液についても同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例１で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ１９−３−６Ｈ、１００倍希釈）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１０分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９０】
その結果、修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（ＰＮＡ）を用いた場合のみ、標的核酸量依存的に、シグナルが上昇した。したがって、本発明の方法により、標的核酸を定量できることが確認された（表９、図３）。【００９１】
【表９】
2016052368.tif 000016
【００９２】
実施例４：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の特異的検出
４−１）標的核酸の調製
標的核酸配列の調製には、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法を使用した。ＰＣＲ用の酵素としては東洋紡績社製ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（商品番号：ＫＯＤ−２０１）、核酸増幅用の２種類のプライマーとしては北海道システムサイエンス社により人工合成された、フォワードプライマー：５’−ＴＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１５）を使用した。ＰＣＲ増幅のプロトコールは、９４℃で２分間加熱した後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を１分、を１セットとして３０サイクルとした。
北海道システムサイエンス社により人工合成された核酸〔配列：５’−ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ−３’（配列番号１６）〕を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製することで、１３８塩基対の核酸配列を調製した。
上記で調製した１３８塩基対の核酸配列に関して、核酸配列中のＣｐＧのシトシンをメチル化するため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＣｐＧ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＳｓｓＩ）（商品番号：ＥＭ０８２１）で処理を行った。反応溶液は添付文書に従って調製した。３７℃で２０分間反応させた後、６５℃でさらに２０分間反応させた後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔを使用して精製することで、標的核酸を得た。【００９３】
４−２）標的核酸の検出
捕捉プローブは５’−ＵＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＵＣＧＡＧＧＣＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１７；核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ；５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブの配列はＮ末端−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＡ−Ｃ末端（配列番号１８）であり、ファスマック社により人工合成されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、実施例４−１）で調製したものをそれぞれ使用した。
同種ガイドプローブとして、主鎖がＤＮＡである以外は上記と同一のプローブを使用して、同様の操作を行った。同種ガイドプローブは北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
ガイドプローブを含まない条件についても同様の操作を行った。
また、標的核酸として、実施例４に記載してあるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＣｐＧ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＳｓｓＩ）での処理を実施しなかったもの、すなわち、標的核酸配列中のＣｐＧのシトシンをメチル化しなかった配列を使用した条件についても同様の操作を行った。【００９４】
先ず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（５００ｆｍｏｌ）、捕捉プローブ（１ｐｍｏｌ）、および異種または同種ガイドプローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）５０μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、５０℃で１時間反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および異種または同種ガイドプローブの３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例１で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ１９−３−６Ｈ、５０倍希釈）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９５】
その結果、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体、ならびに修飾核酸塩基対合性異種ガイドプローブ、および捕捉プローブを用いる本発明の方法は、修飾核酸塩基を特異的に検出することができた（表１０、図４）。【００９６】
【表１０】
2016052368.tif 000017
【００９７】
実施例５：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）を用いた修飾核酸塩基の特異的検出（１）
配列６の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＴＡＧＡＡ［Ｃ］ＧＣＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＴ−３’（配列番号８；［Ｃ］は５−メチルシトシン；５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖６（核酸プローブ）の主鎖はＤＮＡであるが、その一部に架橋型核酸（ＢＮＡ）が含まれており、配列は５’−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣ（Ｇ）ＴＴＣＴＡ−３’（配列番号２５；（Ｇ）はＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）構造を有するグアニン塩基）であり、ジーンデザイン社により人工合成されたものを使用した。
まず、配列６（１ｎｍｏｌ）と相補鎖６（２ｎｍｏｌ）を９５℃で５分間反応させた後、４２℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
相補鎖７（配列番号２６）は、ＢＮＡを含まないこと以外は相補鎖６と同一であり、配列６を使用して、相補鎖７と同様の方法で、同種核酸ハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を得た。【００９８】
【表１１】
2016052368.tif 000018
【００９９】
【表１２】
2016052368.tif 000019
【０１００】
まず、上記で調製した異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）、または同種核酸ハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）をＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解することで２０ｎＭに調製した後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸を固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例２で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ２０−Ｈ２、２０−Ｅ３、２０−Ｇ５、２０−Ｈ７）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを５０μＬずつ加え、室温で５分反応させた。その後、１Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１０１】
その結果、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）の使用により、異種核酸ハイブリッドを特異的に検出できることが確認された（表１３、図５）。【０１０２】
【表１３】
2016052368.tif 000020
【０１０３】
実施例６：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）を用いた修飾核酸塩基の特異的検出（２）
配列６の主鎖はＤＮＡであり、配列は５’−ＴＡＧＡＡ［Ｃ］ＧＣＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＴ−３’（配列番号８；［Ｃ］は５−メチルシトシン；５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。相補鎖６の主鎖はＤＮＡであるが、その一部にＢＮＡが含まれており、配列は５’−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣ（Ｇ）ＴＴＣＴＡ−３’（配列番号２５；（Ｇ）はＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）構造を有するグアニン塩基）であり、ジーンデザイン社により人工合成されたものを使用した。
まず、配列６（１ｎｍｏｌ）と相補鎖６（２ｎｍｏｌ）を９５℃で５分間反応させた後、４２℃で１時間、続いて３７℃で１時間反応させることで、異種核酸ハイブリッド（５−メチルシトシンを含むＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。
配列９（配列番号２７）は、シトシン塩基がメチル化されていないこと以外は配列６と同一であり、相補鎖６を使用して、配列６と同様の方法で、異種核酸ハイブリッド（５−メチルシトシンを含まないＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）を得た。【０１０４】
【表１４】
2016052368.tif 000021
【０１０５】
【表１５】
2016052368.tif 000022
【０１０６】
まず、上記で調製した２種の異種核酸ハイブリッドをＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解することで２０ｎＭに調製した後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸を固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、後述の調製例２で得られた細胞培養の上清（Ｃｌｏｎｅ２０−Ｈ２、２０−Ｅ３、２０−Ｇ５、２０−Ｈ７）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを５０μＬずつ加え、室温で５分反応させた。その後、１Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１０７】
その結果、異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブ（ＢＮＡプローブ）の使用により、異種核酸ハイブリッド中の修飾核酸塩基を特異的に検出できることが確認された（表１６、図６）。【０１０８】
【表１６】
2016052368.tif 000023
【０１０９】
調製例１：異種対合性修飾核酸塩基に対する抗体の取得（１）
異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）中の修飾核酸塩基を認識する抗体の取得は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体取得技術〔（ＡＤＬｉｂ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ）システム：例えば、ＷＯ２００４／０１１６４４を参照〕を利用して、以下の方法により行った。【０１１０】
１）目的抗体を産生する細胞の調製
１−１）ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０ライブラリーの多様化
ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０ライブラリーの多様化は、以下の方法により行った。
ａ）９％ＦＢＳ，１％ニワトリ血清含有ＩＭＤＭ培地〔ＣＳ（Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｓｅｒｕｍ）＋培地〕４０ｍＬを計り取り、バイオリアクターチューブに加えた。
ｂ）トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を２．５ｎｇ／ｍＬとなるように培地に加えた。
ｃ）１．５Ｘ１０７個のＤＴ４０細胞（ＷＯ２００４／０１１６４４に開示された技術を利用して多様化されたＤＴ４０細胞のライブラリー）を培地に加え、３９．５℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１日培養した。【０１１１】
１−２）ＤＴ４０ライブラリーの継代
ＤＴ４０ライブラリーの継代は、以下の方法により行った。
ａ）１日培養した細胞懸濁液を、４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
ｂ）上清除去後、１０ｍＬのＣＳ＋培地中で細胞を再び懸濁した。
ｃ）ＣＳ＋培地  ９５０μＬに細胞懸濁液５０μＬを加えて２０倍希釈し、撹拌した。
ｄ）生細胞数をカウントした。
ｅ）新しいバイオリアクターチューブにＣＳ＋培地４０ｍＬを加えた。
ｆ）１．５Ｘ１０７個のＤＴ４０細胞を培地に加え、３９．５℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１日培養した。
なお、セレクションを実施するまでにＴＳＡ処理を２回行った。【０１１２】
１−３）抗原の調製
抗原の調製は、実施例１に記載されている方法により行った。抗原としては、以下に示す異種核酸ハイブリッド〔配列１（ＤＮＡ）と相補鎖１（ＰＮＡ）から構成される二本鎖核酸〕を用いた。【０１１３】
核酸（ＤＮＡ）：      ５’−ＣＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１）
相補鎖１（ＰＮＡ）：  ３’−ＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧ−５’（配列番号２）
注）上記核酸（ＤＮＡ）中の２個のシトシン残基が５位でメチル化【０１１４】
１−４）抗原結合粒子の調製
抗原結合粒子の調製は、以下の方法により行った。
ａ）ストレプトアビジンが固定化してある磁性粒子に５４ｐｍｏｌｅのメチルシトシンを含むＤＮＡとＰＮＡの複合体を含む溶液を加えた。
ｂ）４℃，１ｈで反応させてＤＮＡとＰＮＡの複合体を磁性粒子に固相化した。
ｃ）０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで磁性粒子を４回洗浄した。【０１１５】
１−５）目的抗体を産生する細胞の培養
目的抗体を産生する細胞の培養は、以下の方法により行った。
ａ）バイオリアクターチューブ２本にＣＳ＋培地  ４０ｍＬをそれぞれ加えた。
ｂ）１．５Ｘ１０７個の細胞を培地に加え、１日培養した。
ｃ）細胞懸濁液を４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
ｄ）上清除去後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄して１．５ｍＬチューブに細胞を回収した。
ｅ）４℃，３５００ｒｐｍ，５ｍｉｎで溶液を遠心して上清を除去した。
ｆ）上記１−４）で調製した抗原結合粒子を１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。
ｇ）細胞と抗原結合粒子とを混合し、これらを４℃，３０ｍｉｎ反応させた。
ｈ）細胞・粒子を１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄し、余剰の細胞を除去した。
ｉ）ＣＳ−培地で細胞・粒子を分散させた。
ｊ）細胞を９６ｗｅｌｌプレートにまき、１週間培養した。【０１１６】
２）目的抗体を産生する細胞の選択
目的抗体を産生する細胞の選択は、抗原固相ＥＬＩＳＡにおいて、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）にメチルシトシンが含まれている場合と含まれていない場合での発色の差による評価に基づいて行った。【０１１７】
具体的には、方法は、以下のとおりである。
ａ）実施例１に記載されている方法で、配列１と相補鎖１のハイブリッドと、配列２と相補鎖１のハイブリッドを調整した。
ｂ）上記で調製した２種類のＤＮＡとＰＮＡのハイブリッドをＰＢＳ  ５０μＬ中に溶解することで２０ｎＭに調製した後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で１時間反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸を固定化した。
ｃ）３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、細胞培養上清を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
ｄ）３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗チキンＩｇＭ抗体（自社調製）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
ｅ）３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを５０μＬずつ加え、室温で５分反応させた。
ｆ）１Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１１８】
その結果、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＰＮＡから構成される二本鎖核酸）にメチルシトシンが含まれている場合と含まれていない場合で反応性に顕著な差のあるクローン（Ｃｌｏｎｅ１０−１−６Ｅ、１０−１−５−４Ｅ、１９−３−６Ｈ）を得ることに成功した。【０１１９】
調製例２：異種対合性修飾核酸塩基（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）に対する抗体の取得
異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）中の修飾核酸塩基を認識する抗体の取得は、調製例１と同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体取得技術（ＡＤＬｉｂシステム）を利用して、以下の方法により行った。【０１２０】
１）目的抗体を産生する細胞の調製
目的抗体を産生する細胞の調製は、実施例５において調製された異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）を抗原として用いたことを除き、調製例１と同様の方法により行った。【０１２１】
２）目的抗体を産生する細胞の選択
目的抗体を産生する細胞の選択は、調製例１と同様に、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）にメチルシトシンが含まれている場合と含まれていない場合での発色の差による評価に基づいて行った。具体的には、目的抗体を産生する細胞の選択は、実施例６に記載されている方法で、配列６と相補鎖６のハイブリッドと、配列９と相補鎖６のハイブリッドを調製・使用したことを除き、調製例１と同様の方法により行った。また、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）と同種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＤＮＡから構成される二本鎖核酸）での発色の差による評価も行った。具体的には、目的抗体を産生する細胞の選択は、実施例５に記載されている方法で、配列６と相補鎖６のハイブリッドと、配列６と相補鎖７のハイブリッド  を調製・使用したことを除き、調製例１と同様の方法により行った。
その結果、異種核酸ハイブリッド（ＤＮＡとＢＮＡから構成される二本鎖核酸）にメチルシトシンが含まれている場合と含まれていない場合で反応性に顕著な差のあるクローン（Ｃｌｏｎｅ２０−Ｈ２、２０−Ｅ３、２０−Ｇ５、および２０−Ｈ７）を得ることに成功した。【０１２２】
以下、捕捉プローブおよびガイドプローブを用いる方法（図７）について参考例を示す。【０１２３】
本発明者らは、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定系を検討するなかで、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度が一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基のものに比し低い（約１／１０）という課題（特定課題Ｉ）が存在することを確認した（参考例１）。これは、修飾核酸塩基を含む標的核酸に対して、相補鎖および捕捉プローブが競合し、標的核酸と捕捉プローブとのハイブリッド形成効率（標的核酸の固相上への捕捉効率）が低いと考えられるためである（図８）。【０１２４】
また、捕捉プローブを用いて標的核酸中の修飾核酸塩基を測定する従来の方法では、標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される（図９）。従来の方法では、このハイブリッド中の標的核酸の非ハイブリダイズ領域（一本鎖領域）が二次構造を形成することで、この二次構造中に含まれる修飾核酸塩基を測定し難い（換言すれば、検出感度が低い）という課題（特定課題ＩＩ）も潜在的に存在していた（図９）。【０１２５】
本発明の目的は、標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を向上させることを目的とする。
本発明の目的はまた、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を向上させること（即ち、特定課題Ｉの解決）を目的とする。
本発明の目的はさらに、上述した二次構造の形成を回避することにより、修飾核酸塩基の検出感度を向上させること（即ち、特定課題ＩＩの解決）を目的とする。
本発明の目的はまた、これらの特定課題を同時に解決できる方法論を開発することを目的とする。
以下、上記課題を解決できる、捕捉プローブおよびガイドプローブを用いる方法について参考例を示す。【０１２６】
参考例１：捕捉プローブによる標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
１−１）標的核酸の調製
標的核酸は下記に示す手順で調製した。
標的核酸の調製には、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法を使用した。ＰＣＲ用の酵素としては東洋紡績社製ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（商品番号：ＫＯＤ−２０１）、核酸増幅用の２種類のプライマーとしては北海道システムサイエンス社により人工合成された、フォワードプライマー：５’−ＴＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１５）を使用した。ＰＣＲ増幅のプロトコールは、９４℃で２分間加熱した後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を１分、を１セットとして３０サイクルとした。
北海道システムサイエンス社により人工合成された核酸（ヌクレオチド配列：５’−ＴＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＣＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１６））を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製することで、１３８塩基対の核酸を調製した。
上記で調製した１３８塩基対の核酸中のＣｐＧのシトシンをメチル化するため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＣｐＧ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＳｓｓＩ）（商品番号：ＥＭ０８２１）で処理を行った。反応溶液は添付文書に従って調製した。３７℃で２０分間反応させた後、６５℃でさらに２０分間反応させた後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔを使用して精製することで、標的核酸（配列番号１６のヌクレオチド配列からなるメチル化二本鎖ＤＮＡ）を得た。【０１２７】
１−２）捕捉プローブによる一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’−ＵＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＵＣＧＡＧＧＣＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１７）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、一本鎖の標的核酸（配列番号１６のヌクレオチド配列からなるメチル化一本鎖ＤＮＡ）は北海道システムサイエンス社により人工合成されたもの、二本鎖の標的核酸（配列番号１６のヌクレオチド配列からなるメチル化二本鎖ＤＮＡ）は参考例１−１）で調製したものをそれぞれ使用した。
まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、０．１ｆｍｏｌ、または０．０１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応〔変性反応（一本鎖の標的核酸）または解離および変性反応（二本鎖の標的核酸）〕させた後、３７℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１２５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１２５μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１１０μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により発光カウントを測定した。【０１２８】
その結果、二本鎖の標的核酸の場合、一本鎖の標的核酸と比較して発光カウントが低く、二本鎖の標的核酸は、一本鎖の標的核酸に比し、約１０分の１量しか磁性粒子上に捕捉されていなかった（表１７、図１０）。このことは、例えば、二本鎖の標的核酸の量が１００ｆｍｏｌの場合に測定された発光カウントが、一本鎖の標的核酸の量が１０ｆｍｏｌの場合に測定された発光カウントとほぼ同等であったことから理解できる（表１７、図１０）。このような事実は、捕捉プローブによる二本鎖の標的核酸の捕捉率（ハイブリッド形成率）が一本鎖の標的核酸のものに比し低いことを示す。【０１２９】
【表１７】
2016052368.tif 000024
【０１３０】
以上より、特定課題Ｉが確認された。【０１３１】
参考例２：捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
２−１）捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた測定
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、ガイドプローブのヌクレオチド配列は５’−ＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡ−３’（配列番号１９）（ガイドプローブ１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。ガイドプローブ１は、捕捉プローブがハイブリダイズする標的核酸中の領域とは異なる領域において、標的核酸にハイブリダイズできるように設計された。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、一本鎖の標的核酸（配列番号１６のヌクレオチド配列からなるメチル化一本鎖ＤＮＡ）は北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｆｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）、ガイドプローブ（１ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間変性反応させた後、３７℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させることで、標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１２５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１２５μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１１０μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により発光カウントを測定した。【０１３２】
２−２）捕捉プローブを用いた測定（ガイドプローブを使用しない従来の方法）
ガイドプローブを添加しなかったこと以外は、参考例２−１）と同様の方法で試験した。【０１３３】
２−３）結果
ガイドプローブを用いて測定された発光カウントは、ガイドプローブを用いずに測定された発光カウントに比し、著しく向上した（表１８、図１１）。
一本鎖の標的核酸とガイドプローブとのハイブリッドの形成により発光カウントが上昇したという事実は、ガイドプローブの非存在下では、捕捉プローブを介して固相（磁性粒子）上に捕捉された一本鎖の標的核酸が二次構造を形成しており、抗体が二次構造中の修飾核酸塩基を認識し難いことを示唆する（図９）。すなわち、特定課題ＩＩが潜在的に存在していたと考えられる。
一方、ガイドプローブは、一本鎖の標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッド中の非ハイブリダイズ領域（ガイドプローブの非存在下で二次構造を形成し得る一本鎖領域）とハイブリダイズすることにより、二次構造をほどくことができ、それにより抗体が修飾核酸を効率よく認識できること（換言すれば、検出感度の向上）が確認できた（表１８、図１１を参照）。すなわち、ガイドプローブの使用により特定課題ＩＩを解決できた。【０１３４】
【表１８】
2016052368.tif 000025
【０１３５】
以上より、ガイドプローブは、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を向上できることが示された。【０１３６】
参考例３：捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
３−１）捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた測定
５−メチルシトシンを含む標的核酸として、参考例１−１）で調製した二本鎖の標的核酸を使用した以外は、参考例２と同様の方法で試験した。【０１３７】
３−２）捕捉プローブを用いた測定（ガイドプローブを使用せず）
ガイドプローブを添加しなかったこと以外は、参考例３−１）と同様の方法で試験した。【０１３８】
３−３）結果
二本鎖の標的核酸においても、一本鎖の標的核酸と同様に、ガイドプローブの添加の効果が確認できた（表１９、図１２）。これは、標的核酸に対して相補鎖および捕捉プローブが競合していた状態であったものが、ガイドプローブの添加により、標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブのハイブリッド形成に傾いたためであると考えられる。同時に、二本鎖の標的核酸であっても、捕捉プローブとハイブリッドを形成したときに生じる非ハイブリダイズ領域が、ガイドプローブとハイブリダイズすることにより、二次構造の形成を回避できるためであると考えられる。【０１３９】
【表１９】
2016052368.tif 000026
【０１４０】
以上より、ガイドプローブは、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を向上できることが示された。【０１４１】
参考例４：カオトロピック剤の存在下におけるガイドプローブの使用による、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
４−１）カオトロピック剤の存在下におけるガイドプローブの使用による測定
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、ガイドプローブのヌクレオチド配列は配列番号１９のヌクレオチド配列（ガイドプローブ１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、参考例１−１）で調製した二本鎖の標的核酸を使用した。カオトロピック剤として、グアニジンチオシアネートを用いた。
まず、５−メチルシトシンを含む二本鎖の標的核酸（１０ｆｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）、ガイドプローブ（１ｐｍｏｌ）をグアニジンチオシアネート（＋）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４．２Ｍ  グアニジンチオシアネート、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間解離および変性反応させた後、３７℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させることで、標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上にハイブリッドを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１２５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１２５μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１１０μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により発光カウントを測定した。【０１４２】
４−２）ガイドプローブを用いた測定〔カオトロピック剤の非存在下（１）〕
標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させるときに、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）を使用したこと以外は、３−１）と同様の方法で試験した。【０１４３】
４−３）ガイドプローブを用いた測定〔カオトロピック剤の非存在下（２）〕
標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させるときに、グアニジンチオシアネート（−）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を使用したこと以外は、３−１）と同様の方法で試験した。【０１４４】
４−４）結果
カオトロピック剤を含む条件でハイブリダイゼーション反応を行うと、発光カウントが著しく上昇した（表２０、図１３）。このことは、二本鎖の標的核酸とガイドプローブとのハイブリッドの形成が促進され、固相（磁性粒子）上への標的核酸の捕捉効率が向上することを示す。【０１４５】
【表２０】
2016052368.tif 000027
【０１４６】
以上より、ガイドプローブは、カオトロピック剤の存在下で、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を著しく向上できることが示された。【０１４７】
参考例５：カオトロピック剤の存在下におけるガイドプローブの使用による、一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、ガイドプローブのヌクレオチド配列は配列番号１９のヌクレオチド配列（ガイドプローブ１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、一本鎖の標的核酸は北海道システムサイエンス社により人工合成されたもの、二本鎖の標的核酸は参考例１−１）で調製したものを使用した。カオトロピック剤として、グアニジンチオシアネートを用いた。
まず、一本鎖または二本鎖の５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、０．１ｆｍｏｌ、または０．０１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）、ガイドプローブ（１ｐｍｏｌ）をグアニジンチオシアネート（＋）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４．２Ｍ  グアニジンチオシアネート、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応〔変性反応（一本鎖の標的核酸）または解離および変性反応（二本鎖の標的核酸）〕させた後、３７℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させることで、標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１２５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１２５μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１１０μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により発光カウントを測定した。
その結果、驚くべきことに、一本鎖の標的核酸と二本鎖の標的核酸でほぼ同等の発光カウントが得られた（表２１、図１４）。このことは、ガイドプローブは、カオトロピック剤の存在下で、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基のものとほぼ同等に向上できることを示す。【０１４８】
【表２１】
2016052368.tif 000028
【０１４９】
以上より、ガイドプローブは、カオトロピック剤の存在下で、標的核酸の鎖数にかかわらず、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できることが示された。【０１５０】
参考例６：捕捉プローブおよびガイドプローブを用いた、一本鎖および二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の測定
標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させるときに、グアニジンチオシアネート（＋）緩衝液の代わりにハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）を使用したこと以外は、参考例５と同様の方法で試験した。
その結果、ハイブリダイゼーション緩衝液を用いる条件（即ち、ガイドプローブのみの使用）下では、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度に幾らかの向上が認められた（参考例１で認められた程の差異はない）ものの、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度は、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基のものに及ばなかった（表２２、図１５）。すなわち、ガイドプローブは、カオトロピック剤の存在下で、二本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を、一本鎖の標的核酸中の修飾核酸塩基のものとほぼ同等に向上できることが裏付けられた。【０１５１】
【表２２】
2016052368.tif 000029
【０１５２】
参考例７：核酸変性剤の存在下におけるガイドプローブの使用による修飾核酸塩基の測定
標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させるときに、核酸変性剤を含まない、または、４．２Ｍ  グアニジンチオシアネート、２．７Ｍ  イミダゾール、または４Ｍ  ウレアを含む緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を使用した以外は、参考例４−１）と同様の方法で試験した。
その結果、グアニジンチオシアネート以外の核酸変性剤もまた、グアニジンチオシアネートと同等の発光カウントを生じた（表２３、図１６）。このことは、ガイドプローブが、核酸変性剤の存在下で、標的核酸中の修飾核酸塩基の検出感度を向上できることを示す。【０１５３】
【表２３】
2016052368.tif 000030
【０１５４】
以上より、ガイドプローブは、核酸変性剤の存在下で、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できることが示された。【０１５５】
参考例８：ガイドプローブによる、修飾核酸塩基を含む部位における二次構造の形成の阻害
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、ガイドプローブのヌクレオチド配列は表２４に示されるヌクレオチド配列であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、参考例１−１）で調製した二本鎖の標的核酸を使用した。
ガイドプローブは、表２４に示す配列を未添加、または１種、２種、もしくは３種を各１０ｐｍｏｌで添加した以外は、参考例４−１）と同様の方法で試験した。
その結果、標的核酸中の修飾核酸塩基含有部位と相補性のあるガイドプローブ（即ち、ガイドプローブ１、２、および４）を添加した場合には、発光カウントの上昇が認められたが、標的核酸中の修飾核酸塩基非含有部位と相補性のあるガイドプローブ（即ち、ガイドプローブ３）を添加した場合には、発光カウントの上昇が認められなかった（表２５、図１７）。したがって、ガイドプローブによる、修飾核酸塩基を含む部位における二次構造の形成の阻害が、検出感度の向上に重要であることが実証された。【０１５６】
【表２４】
2016052368.tif 000031
【０１５７】
【表２５】
2016052368.tif 000032
【０１５８】
参考例９：核酸変性剤の濃度の検討
５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｆｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）、ガイドプローブ１（１ｐｍｏｌ）のハイブリッドを形成させるための緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グアニジンチオシアネート、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）中に含まれるグアニジンチオシアネートの濃度を、表２６に示される濃度に設定した以外は、参考例４−１）と同様の方法で試験した。また、グアニジンチオシアネート（−）緩衝液（即ち、０Ｍ）でも同様に試験した。
その結果、緩衝液中に含まれるグアニジンチオシアネートが１〜２．５Ｍの範囲のとき、最も効果的であることが確認された（表２６、図１８）。【０１５９】
【表２６】
2016052368.tif 000033
【０１６０】
参考例１０：ガイドプローブの主鎖の検討
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。また、ガイドプローブのヌクレオチド配列は表２７に示されるヌクレオチド配列であり、ガイドプローブ２および４に関しては核酸の主鎖がＤＮＡ、ガイドプローブ５および６に関しては核酸の主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡまたはＲＮＡのものを使用した。ガイドプローブ５および６はそれぞれ、ガイドプローブ２および４と同等の配列であるが、核酸の主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡまたはＲＮＡであるため、チミン塩基（Ｔ）をウラシル塩基（Ｕ）に変更したものとを使用した。各ガイドプローブは北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、参考例１−１）で調製した二本鎖の標的核酸を使用した。
ガイドプローブは表２７に示されるヌクレオチド配列を未添加、１種、または２種を各１ｐｍｏｌで添加した以外は、参考例４−１）と同様の方法で試験した。
ガイドプローブとして用いた核酸の主鎖がＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡと変わっても、ガイドプローブの非存在下の場合と比較して発光カウントの上昇が認められた（表２８、図１９）。このことは、ガイドプローブが、その主鎖構造にかかわらず、ガイドプローブとして機能することを示す。また、ガイドプローブの主鎖がＤＮＡの場合、もっとも効果的であることも確認された（表２８、図１９）。【０１６１】
【表２７】
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【０１６２】
【表２８】
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【０１６３】
参考例１１：核酸変性剤または非核酸変性剤の存在下におけるガイドプローブの使用による修飾核酸塩基の測定
標的核酸の捕捉プローブのヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、ガイドプローブのヌクレオチド配列は配列番号１９のヌクレオチド配列（ガイドプローブ１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸として、参考例１−１）で調製した二本鎖の標的核酸を使用した。
まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｆｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）と捕捉プローブ（１ｐｍｏｌ）、ガイドプローブ（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。また、上記緩衝液中に、１．５Ｍ  グアニジンチオシアネート、１．５Ｍ  イミダゾール、１．５Ｍ  ピラゾール、１．５Ｍ  ウレア、１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０、または１％（ｖ／ｖ）  ラウリル硫酸ナトリウムを含む緩衝液を用いて同様の溶液を調製した。９５℃で５分間解離および変性反応させた後、３７℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させることで、標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１２５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１２５μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１１０μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により発光カウントを測定した。【０１６４】
その結果、非核酸変性剤である界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＤＳ）は、変性剤なしの条件（−）に比し、発光カウントを有意に上昇させなかった（表２９、図２０）。一方、核酸変性剤であるカオトロピック剤（グアニジンイソチオシアネート、ウレア）および電子供与性化合物（イミダゾール、ピラゾール）は、変性剤なしの条件（−）に比し、発光カウントを有意に上昇させた（表２９、図２０）。【０１６５】
【表２９】
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【０１６６】
以上より、ガイドプローブの効果は、核酸変性剤で増強することができるが、非核酸変性剤では増強できないことが示された。【０１６７】
参考例１２：核酸変性剤および界面活性剤の双方の存在下におけるガイドプローブの使用による修飾核酸塩基の測定
標的核酸、捕捉プローブおよびガイドプローブから構成されるハイブリッドを形成させるときに、核酸変性剤を含まない緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、１．５Ｍ  グアニジンチオシアネート（＋）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、１．５Ｍ  グアニジンチオシアネートおよび１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、または１．５Ｍ  グアニジンチオシアネートおよび１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ８０を含む緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を使用した以外は、参考例１１と同様の方法で試験した。【０１６８】
その結果、核酸変性剤および界面活性剤を含む緩衝液は、核酸変性剤のみを含む緩衝液に比し、発光カウント（バックグランド値）の低下、およびＳ／Ｎの上昇を引き起こした（表３０、および図２１、２２）。すなわち、ガイドプローブおよび核酸変性剤を用いる本発明の方法において、界面活性剤は、核酸変性剤により引き起こされるバックグランド値の上昇を打ち消す効果があると考えられる。【０１６９】
【表３０】
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【０１７０】
以上より、ガイドプローブは、核酸変性剤および界面活性剤の双方の存在下で、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できることが示された。【０１７１】
（ガイドプローブの詳細）
参考のため、実験で用いたガイドプローブの詳細を、表３１に示す。【０１７２】
【表３１】
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【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明の方法およびキットは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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