(57)【要約】  本発明は、優れた保存安定性と透明性とを両立し得るペプチド組成物を提供する。本発明のペプチド組成物は、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６であるペプチド組成物。
【請求項２】
前記ペプチド組成物中において、前記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和が、０を超え＋３以下である、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項３】
前記自己組織化ペプチドのＣ末端がアミド基である、請求項１または２に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
前記自己組織化ペプチドのＣ末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項１から３のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤がヒスチジン、チアミン硝化物、ピリジン、ビストリス、エチレンジアミン、および／またはＮ−メチルモルホリンである、請求項１から４のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤の濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１から５のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項７】
可視光線透過率が７０％以上である、請求項１から６のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項８】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を撹拌することを含む、請求項１から７のいずれかに記載のペプチド組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な用途にペプチド組成物が用いられている。例えば、自己組織化能を有するペプチドを用いたペプチドゲルが知られており、このペプチドゲルは優れた力学的強度および透明性を有することから、様々な用途に用いられている（例えば、特許文献１）。【０００３】
ペプチド組成物は用途に応じたｐＨに調整するために、緩衝剤を含む場合がある。例えば、心組織の保護および再生のための組成物を調製する際に、生理学的に許容可能なｐＨにするために受容可能な緩衝液が用いられ得ることが開示されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４６２０８０４号
【特許文献２】特許第５５５８１０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者らが検討したところ、従来のペプチド組成物は保存安定性に問題を有する場合があることがわかった。具体的には、炭酸ナトリウム等の緩衝剤を用いてｐＨ調整されたペプチド組成物を保存すると、経時的にｐＨが変動する場合がある。また、Ｃ末端カルボキシル基がアミド化されているペプチドを含むペプチド組成物においては、該ｐＨ変動に伴って該アミド基の加水分解が生じる場合があり、Ｃ末端のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基である場合にその傾向が大きいことを見出した。【０００６】
上記アミド基はペプチドのＣ末端の保護基として機能し得る。保存中に保護基であるアミド基が外れてカルボキシル基へと分解されると、ペプチドの所望の特性が損なわれる場合がある。さらに、分解による副産物が不純物となり、品質が低下するおそれもある。また、ペプチドに含まれるアミド基は生理活性の発現および特定の構造を持つ分子集合体の形成という観点からも重要な官能基である。特に、自己組織化能を有するペプチド（以下、自己組織化ペプチドと称する）に関しては、分子集合体の形成、すなわち自己組織化能に重要な官能基である。ペプチド分子内での電荷の数や配置は自己組織化能に関与するため、例えば、Ｃ末端のアミド基が他の官能基(例えば、カルボキシル基)に変化することにより、自己組織化能に影響し得る。具体的には、同じ配列の自己組織化ペプチドであっても、Ｃ末端がアミド基の場合には透明なペプチド組成物が得られるのに対し、Ｃ末端がカルボン酸の場合には組成物の透明性が損なわれ得る。【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は優れた保存安定性とペプチド組成物の所望の特性（例えば、透明性）とを両立し得るペプチド組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、ペプチド組成物が提供される。該ペプチド組成物は、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６である。
１つの実施形態において、上記ペプチド組成物中において、上記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和が、０を超え＋３以下である。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドのＣ末端がアミド基である。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドのＣ末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸である。
１つの実施形態において、上記緩衝剤がヒスチジン、チアミン硝化物、ピリジン、ビストリス、エチレンジアミン、および／またはＮ−メチルモルホリンである。
１つの実施形態において、上記緩衝剤の濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭである。
１つの実施形態において、上記ペプチド組成物の可視光線透過率が、７０％以上である。
本発明の別の局面によれば、上記ペプチド組成物の製造方法が提供される。該製造方法は、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を撹拌することを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のペプチド組成物は、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤および水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６である。本発明のペプチド組成物は、優れた保存安定性と所望の特性（例えば、透明性）とを両立し得る。そのため、本発明のペプチド組成物は一定期間保存した場合であっても品質を維持することができ、様々な用途に好適に用いることができ得る。【００１０】
上記効果が得られる理由は定かではないが、以下のように推測される。すなわち、従来のペプチド組成物においては、保存期間中に、気化等によって緩衝剤の含有量が徐々に減少して緩衝作用が弱まる。その結果、組成物のｐＨが変化し、ｐＨ安定性の小さいペプチドに対しては分解（例えば、Ｃ末端アミド基の分解）が惹起されると推測される。これに対し、本発明においては、上記特定の緩衝剤を選択することにより、経時的なｐＨ変化を抑制し得る。その結果、組成物のｐＨをペプチドの分解が生じ難い特定のｐＨ範囲に制御することができる。さらに、上記特定の緩衝剤によれば、例えば自己組織化ペプチド組成物における所望の特性（例えば、透明性）を維持し得るという効果も奏され得る。【００１１】
さらに、ペプチド組成物に気化しやすい緩衝剤を用いる場合には、一定のｐＨでの調製が困難であり、バッチごとにバラつきが生じるという課題もある。上記緩衝剤を用いることにより、ペプチド組成物のｐＨのコントロールが容易になり、ペプチド組成物のバッチごとの品質のバラつきをも抑制し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のペプチド組成物は、ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤および水を配合してなる組成物であって、そのｐＨが４．５〜６．６である。このような緩衝剤を用いることにより、優れた保存安定性と所望の特性（例えば、透明性）とを両立し得るペプチド組成物が提供される。
【００１３】
ペプチド組成物はｐＨが４．５〜６．６であり、好ましくは４．６〜６．５であり、より好ましくは５．０〜６．０である。ペプチド組成物のｐＨが上記の範囲内であることにより、ペプチド組成物の保存安定性がさらに向上し得る。また、用いられるペプチドがその構造内にアミド基を含む場合であっても、アミド基の分解が抑えられ優れた保存安定性が奏され得る。また、Ｃ末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸であり、かつ、Ｃ末端がアミド基であるペプチドを用いる場合に、特に本発明の効果が発揮され得る。上記範囲外のｐＨである場合、塩基性アミノ酸の側鎖の窒素原子が関与して、Ｃ末端アミド基の分解反応が起こり、Ｃ末端カルボン酸のペプチドが生成するおそれがあるためである。
【００１４】
ペプチド組成物は、可視光線透過率が好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは９５％以上である。ペプチド組成物の可視光線透過率が上記の範囲内であれば、透明性が要求される用途にも好適に用いることができる。本明細書において、可視光線透過率は波長３８０ｎｍ〜７８０ｎｍの光線透過率であり、例えば、分光光度計（具体的には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ２０００）を用いることにより測定することができる。
【００１５】
Ａ．自己組織化ペプチド
本発明のペプチド組成物に含まれるペプチドは、自己組織化ペプチドである。自己組織化ペプチドは、その特性から再生医療および細胞培養等の様々な分野での活用が期待されている。本発明のペプチド組成物では、自己組織化ペプチドがその自己集合性を良好に維持し得る。そのため、保存期間だけでなく、所望の用途に適用後も好適な機能を保持し得る。
【００１６】
本明細書において、「自己組織化ペプチド」とは、溶媒中において、ペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合するペプチドをいう。相互作用としては、特に限定されず、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。自己組織化ペプチドの中でも、特にβシート構造を介して自己組織化するペプチドが好ましい。当該βシート構造は、代表的には、相対的に親水性が高い面と親水性が低い面とを有する。一般に、自己組織化ペプチドを水等の溶媒に溶解させて組成物を調製すると、上述したペプチド分子同士の相互作用により、組成物はゲルとなることが多い。βシート構造の形成の確認は、例えば、円二色測定法により、ペプチド組成物のモル楕円率を測定し、２１６ｎｍのモル楕円率が負の値になることを確認することにより行われ得る。また、ＦＴ-ＩＲの分析を用いて、１６２０ｃｍ−１付近に現れるβシートによるピークや、１６９０ｃｍ−１付近に現れる逆平行βシートによるピークを検出することによっても確認できる。
【００１７】
本発明においては、自己組織化ペプチドと緩衝剤とを共に用いる。そのため、ペプチドが用いられる緩衝剤と対になるイオンを持ち合わせていることが好ましい。後述するように、緩衝剤としては、緩衝剤分子中で緩衝作用を担う窒素原子の電子対にプロトンが付加していない状態（このとき上記の窒素原子の形式電荷は±０）と、上記の窒素原子の電子対にプロトンが付加した状態（このとき上記の窒素原子の形式電荷は正電荷）との変化により緩衝作用を示す緩衝剤が好適に用いられる。そのため、窒素の電子対にプロトンが付加した状態で対となるイオン（陰イオン）を持つペプチドの形態、例えば、ペプチドの塩酸塩、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩、ペプチドのメタンスルホン酸塩などの塩（好ましくは、酸（例えば、ｐＫａ＜３の強酸）との塩）の形態が好ましい。なお、窒素の電子対にプロトンが付加した状態で対となるイオンを持つペプチドと、対となるイオンを持たないペプチドとを組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
また、一般に、自己組織化ペプチドは塩と組み合わせられることにより、塩から生じた電荷（イオン）でペプチドの電荷が遮蔽され、ペプチド分子同士が集合する方向に向かうと考えられている。そのため、ペプチドをより集合させるために塩が添加される場合がある。しかし他方では、塩によりペプチドが無秩序に近づきすぎ、結果としてペプチドの凝集が起こることも多い。ペプチドの凝集は、白濁による透明性の低下、ゲル組成物としての機械的安定性の低下(具体的には、脆くなる、離水する)をもたらし得る。これに対し、本発明では、ペプチド組成物のｐＨにおいて、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和が正となる自己組織化ペプチドが、特に好適に用いられる。電荷の総和が正であるペプチドを用いる場合、窒素原子を１以上含む緩衝剤と組み合わせた際に、組成物中のペプチド間に適度な静電気的斥力が維持され、ペプチドが凝集し難い。緩衝剤も水中で電荷を生ずるが、本発明の組成物は、所望の緩衝作用および透明性を有し、また、機械的処理に対する安定性が高いので、撹拌、混合等の処理を複数回経てもゲル組成物としての機械的安定性を維持することができる。
【００１９】
上記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和は、該ペプチドが含まれる組成物（すなわち、本発明のペプチド組成物）中において、好ましくは０を超え＋３以下であり、より好ましくは＋１〜＋３である。このように、組成物中において該アミノ酸残基の側鎖に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが相殺されないことにより、ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスが保たれ、その結果として、透明かつ安定なゲルを形成し得るからである。
【００２０】
上記自己組織化ペプチドの電荷は、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＡＬＣＵＬＡＴＯＲ  ｖ３．４のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）上で利用可能なプログラムにより行なわれ得る。
【００２１】
本発明で用いられる自己組織化ペプチドは、好ましくはＣ末端にアミド基を有する（Ｃ末端カルボキシル基がアミド化されている）。アミド基は、電子の非局在化が起こる官能基であるため、比較的分解し難い安定な官能基であり、保護基として用いられ得る。しかし、酸性条件および塩基性条件で分解することや、中性付近のｐＨであっても分解が起こり得る。本発明では、以下のＢ項で述べるｐＫａが３．５〜７．５であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤を用いて、ｐＨ４．５〜６．６の組成物とすることにより、Ｃ末端にアミド基を有するペプチドであっても、保存安定性に優れたペプチド組成物とすることができる。
【００２２】
１つの実施形態では、自己組織化ペプチドのＣ末端のアミノ酸はアルギニン、リシン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸であることが好ましく、アルギニンまたはリシンであることがより好ましく、アルギニンであることがさらに好ましい。Ｃ末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸であり、Ｃ末端がアミド基であるペプチドを用いる場合、塩基性アミノ酸の側鎖の窒素原子が関与して、Ｃ末端アミド基の分解反応が起こり、Ｃ末端カルボン酸のペプチドが生成し得る。そのため、このようなペプチドでは特に保存安定性が問題になり得るところ、本発明によれば、保存安定性と所望の効果との両立効果が好適に奏され得る。
【００２３】
自己組織化ペプチドとしては、例えば、特開２０１０−２８０７１９号公報に記載の自己組織化ペプチドが好適に用いられ得る。当該公報は、その全体の記載が本明細書に参考として援用される。この自己組織化ペプチドは、７位の疎水性アミノ酸残基を中心として、一残基おきに塩基性アミノ酸残基（１、５、９、および１３位）および酸性アミノ酸残基（３および１１位）をＮ末端方向およびＣ末端方向に対称の位置に有する１３残基のアミノ酸配列からなる。すなわち、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とを交互に有さないことを１つの特徴とする。また、この自己組織化ペプチドは、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とを等しい割合で有さないことを別の特徴とする。また、この自己組織化ペプチドは、７位の疎水性アミノ酸残基を中心として、４個の塩基性アミノ酸残基と２個の酸性アミノ酸残基とを所定の対称の位置に有し、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸残基がともに塩基性アミノ酸残基であることをさらに別の特徴とする。
【００２４】
具体的には、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドが挙げられる。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（上記アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は塩基性アミノ酸残基を表し；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基を表し、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基を表し；ｄは、疎水性アミノ酸残基を表す）。
【００２５】
上記アミノ酸配列で表される自己組織化ペプチドは、透明性および力学的強度に優れるゲルを形成し得るため、様々な用途に好適に用いられ得る。その一方で、上記の通り、末端に塩基性アミノ酸残基を有することから、保存安定性に改善の余地がある。本発明のペプチド組成物に含まれるペプチドとしてこの自己組織化ペプチドを用いることにより、上記の優れた特性を保持し、かつ、保存安定性にも優れたペプチド組成物が提供され得る。
【００２６】
本発明に好適に用いられ得る自己組織化ペプチドは、上記で例示したものに限定されない。本発明に好適に用いられ得る自己組織化ペプチドの具体例としては、上記で例示したものを含め、以下のものが挙げられる。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＳＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号３）
ｎ−ＫＲＬＤＬＮＬＲＬＤＬＲＫ−ｃ（配列番号４）
【００２７】
上記自己組織化ペプチドは、任意の適切な製造方法によって製造され得る。例えば、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法が挙げられる。これらの製造方法（特に、化学合成方法）は、酸を用いる精製工程および／または脱保護工程を含み得る。このような製造方法においては、酸をペプチドから完全に除去することが困難であることから、得られるペプチドにはごく微量の酸が混在し得、そのため、水に溶解した際に理論値よりも低いｐＨ（例えば、ｐＨ≦４．０）を示し得る。このようなペプチドを用いたペプチド組成物は、後述する緩衝剤によって、所望のｐＨに調整されると同時に緩衝作用が付与され得る。
【００２８】
上記自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもよく、Ｄ−アミノ酸であってもよい。また、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸である。
【００２９】
本発明で用いられる自己組織化ペプチドは任意の修飾がされたペプチド（以下、修飾ペプチドという）であってもよい。該修飾ペプチドは、ペプチドが所望の特性（例えば、自己組織化能）を有し、かつ、ペプチド組成物の保存安定性に影響しない範囲で、任意の修飾が施され得る。修飾が行われる部位は、ペプチドのＮ末端アミノ基であってもよく、Ｃ末端カルボキシル基であってもよく、その両方であってもよい。
【００３０】
上記修飾としては、例えば、Ｎ末端のアセチル化、Ｃ末端のアミド化等の保護基の導入；アルキル化、エステル化、またはハロゲン化等の官能基の導入；水素添加；単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖等の糖化合物の導入；脂肪酸、リン脂質、または糖脂質等の脂質化合物の導入；ＤＮＡの導入；その他生理活性を有する化合物等の導入が挙げられる。修飾は１種のみ行われてもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。例えば、ペプチドのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化してもよい。上記の通り、本発明の効果はＣ末端にアミド基を有する自己組織化ペプチドを含むペプチド組成物において好適に得られ得ることから、Ｃ末端に保護基としてアミド基が導入された修飾ペプチドを好適に用いることができる。
【００３１】
上記修飾は、その種類等に応じて、任意の適切な方法によって行われ得る。
【００３２】
自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、特に限定されない。該アミノ酸残基数は、自己組織化能を好適に発揮する観点から、好ましくは２〜２００であり、より好ましくは２〜２０であり、さらに好ましくは６〜２０であり、特に好ましくは１２〜２０、最も好ましくは１３〜１５である。
【００３３】
ペプチド組成物における自己組織化ペプチドの含有量は、目的等に応じて任意の適切な値に設定される。本発明のペプチド組成物は、例えば、０．０１ｗ／ｗ％〜１０ｗ／ｗ％、好ましくは０．１ｗ／ｗ％〜３．０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５ｗ／ｗ％〜３．０ｗ／ｗ％、さらに好ましくは０．５ｗ／ｗ％〜２．５ｗ／ｗ％、最も好ましくは１．０ｗ／ｗ％〜２．０ｗ／ｗ％の濃度で自己組織化ペプチドを含む。
【００３４】
Ｂ．緩衝剤
本発明では、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤を用いる。このような緩衝剤を用いることにより、ペプチド組成物の保存安定性と所望の特性（例えば、透明性）とを両立し得る。なかでも、自己組織化ペプチドとしてＣ末端にアミド基を有するペプチドを用いる場合に、本発明の効果がさらに発揮され得る。アミド基はペプチドのＣ末端の保護基として用いられ得る。アミド基は酸性条件および塩基性条件で分解することが知られている。また、中性条件下であってもアミド基の分解を完全に抑えることは困難である。そのため、保存中に保護基であるアミド基が外れてカルボキシル基へと分解され、ペプチドの所望の特性が損なわれる場合がある。さらに、分解による副産物が不純物となり、品質が低下するおそれもある。本発明のペプチド組成物では、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤を用いることにより、ペプチド組成物をペプチドの分解を抑制可能なｐＨに長期間維持することができる。そのため、保存安定性と所望の特性とを両立可能なペプチド組成物が得られ得る。さらに、ペプチド組成物に緩衝剤を用いる場合には、緩衝剤の気化等により、一定のｐＨでの調製が困難であり、バッチごとにバラつきが生じるという課題もある。本発明で用いる緩衝剤は、気化等によりペプチド組成物からその含有量が低減しにくい。そのため、ペプチド組成物が経時的に安定したｐＨを維持し得る。上記緩衝剤を用いることにより、ペプチド組成物のｐＨのコントロールが容易になり、バッチごとの品質のバラつきをも抑制し得る。
【００３５】
緩衝剤のｐＫａは３．５以上７．５未満であり、好ましくは３．８〜７．２、より好ましくは４．５〜６．５である。緩衝剤のｐＫａが上記の範囲内であれば、得られるペプチド組成物の保存安定性と所望の特性とを両立することができ得る。また、このような緩衝剤を用いることにより、ペプチド組成物のｐＨのコントロールが容易となり、バッチごとの品質のバラつきをも防止し得る。なお、多段解離する緩衝剤は、複数のｐＫａを有する。このような緩衝剤を用いる場合、複数のｐＫａの少なくとも１つが上記の範囲内であるものが用いられる。ｐＫａの値は、任意の適切な測定装置を用いて室温（２３℃程度）で測定してもよく、文献に記載の値を参照して用いてもよい。なお、本明細書では以下の文献に記載の値を参照した；化学便覧  基礎編II 改定３版，社団法人日本化学会編，１９８４（エチレンジアミン及びヒスチジン）、澤田清・大森大二郎，緩衝液  その原理と選び方・作り方，２００９（ビストリス）、日本公定書協会編，医療用医薬品品質情報集Ｎｏ．２３，２００５（チアミン硝化物）、Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｒａｕｄｅ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｎａｃｈｏｄ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９５５（ピリジン）、Ｈａｌｌ，Ｈ．Ｋ．，Ｊｒ．Ｊ．Ａ．ｍ．Ｓｏｃ．１９５７，７９，５４４１（Ｎ−メチルモルホリン）。
【００３６】
上記緩衝剤は窒素原子を１以上含む。該緩衝剤は、塩基性緩衝剤であり、代表的には、弱塩基とその共役酸とによって緩衝作用を示し得る。換言すれば、該緩衝剤は、窒素原子の電子対にプロトンが付加していない状態（窒素原子の形式電荷±０）と窒素原子の電子対にプロトンが付加した状態（窒素原子の形式電荷は正電荷）との変化により緩衝作用を示し得る。また、該緩衝剤をその塩と組み合わせることによって、より好適な緩衝作用が得られ得る。なお、本明細書において、このような緩衝剤に関しては、窒素原子の電子対にプロトンが付加した状態、すなわち、共役酸のｐＫａを緩衝剤のｐＫａとして扱う。このような緩衝剤を用いることにより、ペプチドの凝集が防止され、より透明性の高いペプチド組成物が得られ得る。さらに、別の観点からは、緩衝剤は単分子であることが好ましい。また、別の観点からは、スルホン酸基を含まない物質であることが好ましい。
【００３７】
１つの実施形態において、上記緩衝剤は、共役酸のｐＫａが３．５以上７．５未満、好ましくは３．８〜７．２、より好ましくは４．５〜６．５である塩基性官能基を１以上有する化合物である。該塩基性官能基としては、例えば、アミノ基または含窒素複素環が挙げられる。アミノ基は、一級アミノ基（−ＮＨ２）、二級アミノ基（−ＮＨＲ）、三級アミノ基（−ＮＲＲ’）のいずれであってもよい。また、該化合物中における上記塩基性官能基の数は、例えば４以下であり得、好ましくは３以下である。なお、該化合物は、本発明の効果を損なわない限りにおいて、ｐＫａが３．５未満または７．５以上である酸性または塩基性官能基をさらに有していてもよい。また、該化合物の分子量は、例えば５０〜４００、好ましくは６０〜３５０であり得る。
【００３８】
本発明に好適な緩衝剤としては、具体的には、エチレンジアミン（ｐＫａ：７．１（２５℃））、ヒスチジン（ｐＫａ：６．０（２５℃））、ビストリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＫａ：６．５（２０℃））、チアミン硝化物（ｐＫａ：４．８）、ピリジン（ｐＫａ：５．２（２０℃））、１−メチルイミダゾール（ｐＫａ：７．１）、Ｎ−メチルモルホリン（ｐＫａ：７．４）等が挙げられる（３．５以上７．５未満のｐＫａのみを記載した）。なかでも、ヒスチジンおよび／またはビストリスが好ましい。これらの緩衝剤によれば、生体適合性の高いペプチド組成物を容易に得ることができる。緩衝剤は１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。
【００３９】
ペプチド組成物における緩衝剤の濃度は、ペプチド組成物が所望のｐＨとなる濃度であればよい。緩衝作用を好適に発揮する観点から、緩衝剤の濃度は好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１５ｍＭ〜５０ｍＭ、さらにより好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍＭ、最も好ましくは３０ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００４０】
Ｃ．水
ペプチド組成物に含まれる水としては、任意の適切な水を用いることができる。例えば、蒸留水（例えば、注射用水）、脱イオン水等が挙げられる。
【００４１】
Ｄ．添加物
本発明のペプチド組成物は、用途等に応じて、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水以外に任意の適切な添加物を含み得る。例えば、等張化剤；単糖、二糖、オリゴ糖等の糖類；等が挙げられる。添加物は、１種類のみ添加されてもよく、２種類以上組み合わせて添加されてもよい。添加物の濃度は、目的、ペプチド組成物の用途等に応じて適切に設定され得る。
【００４２】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の塩化物；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の二糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明のペプチド組成物は、上記緩衝剤が含む窒素原子の電子対にプロトンが付加した状態で対となるイオンを持つ成分をさらに含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、塩酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸等の酸（例えば、ｐＫａ＜３の強酸）と無機化合物または有機化合物との塩（例えば、ナトリウム塩、上記自己組織化ペプチド以外のペプチド塩）が挙げられる。
【００４４】
Ｅ．ペプチド組成物の製造方法
本発明のペプチド組成物は、任意の適切な製造方法で製造され得る。該製造方法は、好ましくは、自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を撹拌することを含む。例えば、自己組織化ペプチドを所望の濃度となるよう水に溶解してペプチド水溶液を調製し、必要に応じてさらに任意の適切な添加物を添加した後に、ｐＨが４．５〜６．６となるよう上記緩衝剤を添加する。次いで、これらを必要により任意の適切な撹拌手段を用いて、撹拌することにより、ペプチド組成物が得られ得る。ペプチド濃度等にも依るが、１つの実施形態においては、上記調製直後のペプチド組成物は、流動性を有する形態（例えば、液状またはゾル状の形態）を示し得る。該流動性を有する形態のペプチド組成物を静置すること等によって自己組織化ペプチドを自己組織化させることにより、流動性を失った形態（例えば、ゲルの形態）のぺプチド組成物が得られ得る。
【００４５】
撹拌手段としては、例えば、プロペラ、棒、マグネチックスターラー、自転公転式の撹拌装置(さらには内部に凹凸を有する容器の併用)、超音波ホモジナイザー、超音波照射器などが使用され得る。なお、本明細書において、撹拌とは、かきまぜる、かきまわす、混合する、泡立てる、振動させる等、静置状態ではない状態を意味する操作を含む。
【００４６】
また、上記緩衝剤を別途水に溶解して緩衝液を調製し、該緩衝液を用いてペプチド組成物を調製してもよい。さらに、ペプチド、緩衝剤、および、任意の適切な添加剤を水へ投入し、その後撹拌しても良い。投入は徐々に行っても良く、成分ごとに行っても良く、一度に行っても良い。また、ペプチド、緩衝剤、および、任意の添加剤に水を投入し、次いで、これらを撹拌しても良い。
【００４７】
また、ペプチド組成物は、必要に応じて、加熱処理を施してもよい。本発明においては、窒素原子を含む緩衝剤を用いることから、加熱による緩衝剤の揮発や分解が抑制され得る。よって、加熱による滅菌または殺菌効果を得つつ、加熱後においても組成物を所望のｐＨに維持することができることから、組成物の長期保存に特に有利である。上記加熱処理の処理温度としては、例えば１００℃以上、好ましくは１２０℃〜１３０℃である。また、処理時間としては、例えば１０秒以上、好ましくは１分〜３０分、より好ましくは１５分〜２５分である。該加熱処理は、加圧下で行ってもよい。加熱処理の具体例としては、オートクレーブ処理（例えば、１２１℃、２気圧で１５分〜２５分の処理）が挙げられる。
【００４８】
Ｆ．ペプチド組成物の用途
本発明のペプチド組成物は、保存安定性と所望の特性とを両立し得る。そのため、ペプチド組成物の有する特性を生かした様々な用途に適用することができる。本発明のペプチド組成物が人工合成されたペプチドを含む場合、動物由来の感染症のおそれが無いことからヒトを対象とした用途に好ましく用いられ得る。ヒトを対象とした用途の具体例としては、スキンケア用品、ヘアケア用品等の化粧品；医薬品開発スクリーニング、再生医療等に用いられる細胞培養基材、褥瘡製剤、骨充填注入材、美容整形用注入材、眼科手術用補助材、人工硝子体、人工水晶体、関節潤滑剤、点眼剤、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）基材、細胞送達用担体、止血材、閉塞剤等の医薬品および医療機器；潤滑用保水剤、乾燥剤、医療機器等用のコーティング剤、液体・気体等の流出防止材等が挙げられる。
【００４９】
従来のペプチド組成物では、緩衝剤を含んだ状態で撹拌することにより、凝集および濁りにより透明性が損なわれる場合や、所望の形態のペプチド組成物（例えば、ゲル）が調製できない場合がある。しかしながら、本発明ではこのような課題が解決されており、透明性等が要求される用途にも好適に用いることができる。
【００５０】
本発明のペプチド組成物はｐＨが４．５〜６．６である。ペプチド組成物はその用途に応じて、上記範囲外の所望のｐＨに用時調整して用いてもよい。
【００５１】
また、本発明のペプチド組成物は、物理的な力や刺激を加えることにより一時的に流動性を高めることができる。さらに、その後しばらくすると再び流動性が低下し、物理的な力や刺激を加える前の強度に戻るという特徴を有し得る。例えば、特開２０１０−２８０７１９号公報に記載の自己組織化ペプチドを使用した組成物は、このような物性を有し得る。したがって、このような特性が要求される用途（例えば、シリンジ等による押し出しを経て適用される用途）にも好適に用いることができる。
【００５２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］
液相合成法により合成され、Ｎ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化させた配列番号１の自己組織化ペプチドＡ（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）の塩酸塩を用いた。
上記ペプチドＡ塩酸塩、および、注射用水（扶桑薬品工業株式会社製、商品名：注射用水ＰＬ「フソー」）をバイアル内に入れて撹拌し、ペプチド水溶液を得た。得られたペプチド水溶液に、緩衝剤としてヒスチジン（和光純薬工業(株)製、商品名：Ｌ−ヒスチジン、ｐＫａ：６．０）を加えた。次いで、ペプチド濃度が０．５ｗ／ｗ％、ヒスチジン濃度が７ｍＭとなるよう注射用水を添加し、さらに撹拌してペプチド組成物１を得た。得られた組成物のｐＨは５．５２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2017098627.tif 000002
【００５５】
（比較例１）
緩衝剤として炭酸ナトリウム（和光純薬工業(株)製、商品名：炭酸ナトリウム、ｐＫａ：６．４）を用いたこと、および、得られる組成物中の緩衝剤の濃度が５ｍＭとなるよう調製した以外は実施例１と同様にして、ペプチド組成物Ｃ１を得た。得られた組成物のｐＨは７．４２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００５６】
［実施例２］
ペプチド濃度が１．５ｗ／ｗ％、ヒスチジン濃度が３１ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例１と同様にして、ペプチド組成物２を得た。得られた組成物のｐＨは６．１４であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００５７】
（比較例２）
ペプチド濃度が１．５ｗ／ｗ％、炭酸ナトリウム濃度が１３ｍＭとなるよう組成物を調製した以外は比較例１と同様にして、ペプチド組成物Ｃ２を得た。得られた組成物のｐＨは７．１２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００５８】
［実施例３］
ペプチド濃度が２．５ｗ／ｗ％、ヒスチジンの濃度が３８ｍＭとなるようペプチド水溶液を調製した以外は実施例１と同様にして、ペプチド組成物３を得た。得られた組成物のｐＨは５．９１であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００５９】
（比較例３）
ペプチド濃度が２．５ｗ／ｗ％、炭酸ナトリウム濃度が２３ｍＭとなるよう組成物を調製した以外は比較例１と同様にして、ペプチド組成物Ｃ３を得た。得られた組成物のｐＨは７．６５であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６０】
［実施例４］
トレハロース・二水和物を得られる組成物中の濃度が７ｗ／ｗ％となるよう添加し、組成物を調製した以外は、実施例２と同様にして、ペプチド組成物４を得た。得られた組成物のｐＨは６．０６であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６１】
［実施例５］
緩衝剤としてチアミン硝化物（関東化学（株）製、商品名：チアミン硝酸塩、ｐＫａ：４．８）を用いたこと、チアミン硝化物濃度が３８ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物５を得た。得られた組成物のｐＨは５．０８であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６２】
［実施例６］
緩衝剤としてピリジン（ナカライテスク（株）製、商品名：ピリジン、ｐＫａ：５．２）を用いたこと、ピリジン濃度が２２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物６を得た。得られた組成物のｐＨは４．７０であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６３】
［実施例７］
緩衝剤としてビストリス（(株)同仁化学研究所製、商品名：Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ、ｐＫａ：６．５）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物７を得た。得られた組成物のｐＨは６．５１であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６４】
［実施例８］
緩衝剤としてエチレンジアミン（関東化学（株）製、商品名：エチレンジアミン（無水）、ｐＫａ：７．１）を用いたこと、エチレンジアミン濃度が９ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物８を得た。得られた組成物のｐＨは５．８５であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６５】
［実施例９］
緩衝剤としてＮ−メチルモルホリン（関東化学（株）製、商品名：Ｎ−メチルモルホリン、ｐＫａ：７．４）を用いたこと、Ｎ−メチルモルホリン濃度が１７ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物９を得た。得られた組成物のｐＨは６．１０であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６６】
（比較例４）
緩衝剤としてトロメタモール（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬（株）製、商品名：トロメタモール「製造専用」、ｐＫａ：８．３）を用いたこと、トロメタモール濃度が３０ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ４を得た。得られた組成物のｐＨは８．１３であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６７】
［実施例１０］
固相合成法により合成され、Ｎ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化させた配列番号１のアミノ酸配列である自己組織化ペプチドＢ（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）の塩酸塩を用いた。
上記ペプチドＢの塩酸塩を用いたこと、ヒスチジン濃度を２２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物１０を得た。得られた組成物のｐＨは５．５１であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６８】
（比較例５）
ペプチドＢの塩酸塩を用いたこと、および、炭酸ナトリウム濃度が１４ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は、比較例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ５を得た。得られた組成物のｐＨは６．９４であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００６９】
［実施例１１］
固相合成法により合成され、Ｎ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化させた配列番号２のアミノ酸配列である自己組織化ペプチドＣ（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＤＬＲＬＳＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）の塩酸塩を用いた。
上記ペプチドＣの塩酸塩を用いたこと、および、ヒスチジン濃度が２２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物１１を得た。得られた組成物のｐＨは５．５４であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７０】
（比較例６）
ペプチドＣの塩酸塩を用いたこと、および、炭酸ナトリウムの濃度が１２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は、比較例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ６を得た。得られた組成物のｐＨは７．１２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７１】
［実施例１２］
固相合成法により合成され、Ｎ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化させた配列番号３のアミノ酸配列である自己組織化ペプチドＤ（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）の塩酸塩を用いた。
ペプチドＤの塩酸塩を用いたこと、および、ヒスチジン濃度が２２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例２と同様にして、ペプチド組成物１２を得た。得られた組成物のｐＨは５．７３であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７２】
（比較例７）
ペプチドＤの塩酸塩を用いたこと、および、炭酸ナトリウム濃度が１２ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は、比較例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ７を得た。得られた組成物のｐＨは７．２２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７３】
［実施例１３］
固相合成法により合成され、Ｎ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化させた配列番号４のアミノ酸配列である自己組織化ペプチドＥ（［ＣＨ３ＣＯ］−ＫＲＬＤＬＮＬＲＬＤＬＲＫ−［ＮＨ２］）のトリフルオロ酢酸塩を用いた。
ペプチドＥのトリフルオロ酢酸塩を用いたこと、および、ヒスチジン濃度が４３ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例１と同様にして、ペプチド組成物１３を得た。得られた組成物のｐＨは５．５１であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７４】
［実施例１４］
緩衝剤としてチアミン硝化物（関東化学（株）製、商品名：チアミン硝酸塩、ｐＫａ：４．８）を用いたこと、および、チアミン硝化物濃度が５ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は実施例１３と同様にして、ペプチド組成物１４を得た。得られた組成物のｐＨは４．５６であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７５】
（比較例８）
ペプチドＥのトリフルオロ酢酸塩を用いたこと、および、炭酸ナトリウム濃度が３ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は、比較例１と同様にして、ペプチド組成物Ｃ８を得た。得られた組成物のｐＨは７．４２であった。得られたペプチド組成物の組成を表１に示す。
【００７６】
（比較例９）
緩衝剤としてクエン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製、商品名：クエン酸ナトリウム、ｐＫ１：３．１、ｐＫ２：４．８、ｐＫ３：６．４）を用いたこと、得られる組成物中の緩衝剤の濃度が２０ｍＭ、トレハロース・二水和物の濃度が８ｗ／ｗ％となるよう組成物を調製した以外は比較例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ９を得た。得られた組成物の組成を表１に示す。
【００７７】
（比較例１０）
緩衝剤としてマレイン酸（東京化成工業（株）製、商品名：マレイン酸、ｐＫ１：１．８４、ｐＫ２：５．８３）を用いたこと、得られる組成物中の緩衝剤の濃度が１９ｍＭとなるよう調製したこと、中和剤としてトロメタモール（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬（株）製、商品名：トロメタモール「製造専用」、ｐＫａ：８．３）を用いたこと、トロメタモール濃度が５０ｍＭとなるよう組成物を調製したこと以外は、比較例２と同様にして、ペプチド組成物Ｃ１０を得た。得られた組成物の組成を表１に示す。
【００７８】
得られたペプチド組成物１〜１４およびＣ１〜Ｃ１０を用いて、以下の保存および測定を行った。保存条件を表２に示し、測定結果を表３および表４に示す。
【００７９】
［ペプチド組成物の保存］
各組成物を、以下の操作により保存した。
得られたバイアル内のペプチド組成物を、同じ種類の新たなバイアルに半量分注し、両バイアルをそれぞれ密閉した。
オートクレーブ処理(ＡＣ処理)を行った組成物については、１２１℃２０分の条件で滅菌処理を行った。
２本のバイアルのうち１本を表２の条件で保存した。４０℃(湿度７５％)で保管したものについては、バイアルを恒温恒湿槽ＬＨ２１−１３Ｍ（ナガノサイエンス株式会社製)内で保存し、６０℃(湿度７５％)で保管したものについては、バイアルを恒温恒湿器ＣＳＨ−２１０（タバイエスペック株式会社製)内で保管した。
なお、４０℃で保存したものは保存日数を６倍した日数を、６０℃で保存したものについては保存日数を５０倍した日数を、実質保存期間（室温保存相当期間）とした。
他方のバイアルは、保存前サンプルとして開封し、ＨＰＬＣ測定および光線透過率測定を行った。また、必要な時以外は密閉し、測定後は室温にて保存した。
【００８０】
[ｐＨ測定]
ｐＨメーター（(株)堀場製作所製、製品名：Ｂ−７１２（本体）、Ｓ０１０（センサー））を用いて測定した。
【００８１】
[分解物の含有割合の増加量]
各組成物の調製に用いたペプチド（以下“原料”と表記）、および、保存後のペプチド組成物について、ＨＰＬＣによる逆相クロマトグラフィーにより分析した。また、オートクレーブ処理後（保存前）のペプチド組成物についても分析した。測定条件を以下に示す。下記の測定条件から明らかなとおり、測定条件はペプチド結合の吸光を利用した測定条件となっており、この条件では組成物のペプチド成分がピークとして検出される。
ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ社製、７１７  Ａｕｔｏ  ｓａｍｐｌｅｒ、５１５  ＨＰＬＣｐｕｍｐ，Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｄｅｇａｓｓｅｒ  ＡＦ、ｐｕｍｐ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｏｄｕｌｅII、２４１０  Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ(検出ではなく温度コントロールに使用)、カラムヒーターモジュール
カラム：ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８、３ｍｍ×２５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）
移動相：Ａ液：蒸留水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝７５０／２５０／１
Ｂ液：蒸留水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝５００／５００／１
検出器：Ｗａｔｅｒｓ社製、９９６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
測定した波長範囲：１９０〜２２０ｎｍ（結果は２０５ｎｍのデータを使用）
分析用試料：主成分ペプチドを約１２０ｐｐｍ含む水溶液
（原料の場合は水に溶かして上記ペプチド濃度の水溶液を調製、組成物の場合は水で希釈することにより上記ペプチド濃度の水溶液を調製して分析用試料とした。）
ソフトウェア：ＥｍｐｏｗｅｒＴＭ２（Ｗａｔｅｒｓ社製）
Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）  Ａ（％）  Ｂ（％）
０            １００      ０
３５              ６０    ４０
６５                ０  １００
７０                ０  １００
７０．０１      １００      ０
ソフトウェアを用いて、検出されたピークの面積および面積百分率を算出し、解析結果とした。解析結果の面積百分率は、小数第２位まで表示された。解析結果から、主成分ペプチド（合成対象のペプチド）、Ｃ末端分解物、その他（主成分ペプチドとＣ末端分解物以外）成分の各含有割合（％）を把握した。Ｃ末端分解物とは、主成分ペプチドに関して、Ｃ末端のアミド基が分解し、Ｃ末端がカルボン酸となったペプチドのことである。上記測定条件において、通常、Ｃ末端分解物は主成分ペプチドのピークよりわずかに遅い保持時間に検出される。組成物中のＣ末端分解物の含有割合（％）の増加量は、保存後（またはオートクレーブ後）の組成物中のＣ末端分解物の含有割合（％）から原料中のＣ末端分解物の含有割合（％）を減ずることにより算出した。
【００８２】
[可視光線透過率]
Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて吸光度を測定し、結果を基に可視光線透過率を算出した。
【００８３】
【表２】
2017098627.tif 000003
【００８４】
【表３】
2017098627.tif 000004
【表４】
2017098627.tif 000005
【００８５】
実施例１〜１４のペプチド組成物は長期間保存した場合であっても、ｐＨおよび透明性が維持されていた。ペプチドの分解は、組成物のオートクレーブ処理などの製造時、および、保存期間に起こり得る。実施例１〜１４の組成物では、組成物の保存後においても、分解物の生成が抑えられていた。実施例１〜５、７、９、１１、１２の組成物では、組成物のオートクレーブ後においても、分解物の生成が抑えられていた。実施例のペプチド組成物は、保存後であってもＣ末端分解物の含有割合の増加量が１．４％以下であった。このように、実施例で得られた組成物はいずれも、組成物が用いられ得る製品の保存期間（例えば、３ヶ月〜１年）において、ペプチドを保持し得ると考えられた。
【００８６】
一方、比較例の組成物では、保存後のＣ末端分解物の含有割合は３％以上増加し、２０％程度増加したものもみられた。さらに、比較例１〜４、６、７のペプチド組成物では、透明性は維持されたものの、組成物のオートクレーブ後でも分解物の含有割合が増加した。また、比較例９及び比較例１０のペプチド組成物は、透明性に劣るものであった（比較例９：１９％、比較例１０：６９％）。比較例９〜１０のペプチド組成物は保存前から透明性が劣っていたため、保存はとりやめた。
【００８７】
その他、性状については、実施例１〜１４は透明なゲルであり、保存後も透明なゲルの状態を維持していた。比較例１〜８は透明なゲルであり、保存後も透明なゲルの状態を維持していた。比較例１０はゲルであり、比較例９はゲルにならず液状の組成物であった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のペプチド組成物は、保存安定性と所望の特性とを両立し得る。そのため、医療用用途等に好適に用いることができる。
【配列表】
2017098627000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月14日(2016.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６であるペプチド組成物であって、
該自己組織化ペプチドのＣ末端が塩基性アミノ酸残基であり、かつ、Ｃ末端カルボキシル基がアミド化されている、ペプチド組成物。
【請求項２】
前記ペプチド組成物中において、前記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和が、０を超え＋３以下である、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項３】
前記自己組織化ペプチドのＣ末端のアミノ酸がアルギニンまたはリシンである、請求項１または２に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
前記自己組織化ペプチドがＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ（配列番号１）、ＲＬＤＬＲＬＳＬＲＬＤＬＲ（配列番号２）、ＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬＤＬＲ（配列番号３）、または、ＫＲＬＤＬＮＬＲＬＤＬＲＫ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から３のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤がヒスチジン、チアミン硝化物、ピリジン、ビストリス、エチレンジアミン、および／またはＮ−メチルモルホリンである、請求項１から４のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤の濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１から５のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項７】
可視光線透過率が７０％以上である、請求項１から６のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項８】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を撹拌することを含む、請求項１から７のいずれかに記載のペプチド組成物の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月3日(2017.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を配合してなり、ｐＨが４．５〜６．６であるペプチド組成物であって、
該自己組織化ペプチドがＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ（配列番号１）、ＲＬＤＬＲＬＳＬＲＬＤＬＲ（配列番号２）、ＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬＤＬＲ（配列番号３）、または、ＫＲＬＤＬＮＬＲＬＤＬＲＫ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチドであり、かつ、Ｃ末端カルボキシル基がアミド化されている、ペプチド組成物。
【請求項２】
前記ペプチド組成物中において、前記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和が、０を超え＋３以下である、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項３】
前記緩衝剤がヒスチジン、チアミン硝化物、ピリジン、ビストリス、エチレンジアミン、および／またはＮ−メチルモルホリンである、請求項１または２に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
前記緩衝剤の濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１から３のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項５】
可視光線透過率が７０％以上である、請求項１から４のいずれかに記載のペプチド組成物。
【請求項６】
自己組織化ペプチド、ｐＫａが３．５以上７．５未満であって、窒素原子を１以上含む緩衝剤、および、水を撹拌することを含む、請求項１から５のいずれかに記載のペプチド組成物の製造方法。
【国際調査報告】
2017098627.tif 000006
2017098627.tif 000007
2017098627.tif 000008
2017098627.tif 000009