(57)【要約】  虚血再灌流障害の発生を効果的に防止することのできる移植用の臓器保存液を提供する。（ａ）塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、及びＤ−グルコース；（ｂ）塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、グリシン、及びＤ−グルコース；（ｃ）塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、及びＤ−グルコース；（ｄ）塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、鉄化合物、及びＤ−グルコース；のそれぞれに示される各成分の配合物を含有する臓器保存液を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、及びＤ−グルコースの配合物を含有する臓器保存液。
【請求項２】
配合物が、さらにグリシンを含むことを特徴とする請求項１記載の臓器保存液。
【請求項３】
配合物が、さらにＬ−システインを含むことを特徴とする請求項２記載の臓器保存液。
【請求項４】
配合物が、さらに鉄化合物を含むことを特徴とする請求項３記載の臓器保存液。
【請求項５】
配合物におけるＬ−アスコルビン酸濃度が０．２〜０．３ｍＭであり、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル濃度が０．４〜０．５ｍＭであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項６】
配合物におけるリン酸水素二ナトリウム濃度が３５〜５０ｍＭであり、リン酸二水素ナトリウム濃度が１２〜１８ｍＭであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項７】
浸透圧が３２６〜３６３ｍＯｓｍ／ｋｇになるまでＤ−グルコースが配合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項８】
配合物におけるグリシン濃度が５〜１５ｍＭであることを特徴とする請求項２〜７のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項９】
配合物におけるＬ−システイン濃度が０．５〜０．７ｍＭであることを特徴とする請求項３〜８のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項１０】
鉄化合物が、硫酸第一鉄であることを特徴とする請求項４〜９のいずれか記載の臓器保存液。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか記載の臓器保存液を用いて臓器を保存する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臓器保存液、より詳しくはＬ−アスコルビン酸とＬ−アスコルビン酸リン酸エステルが配合されてなる臓器保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器保存液は、臓器移植の際、切除した臓器を灌流・浸漬するための液体として知られている。生体内の臓器は長時間血流が途絶えると壊死に陥るため、移植のために摘出した臓器を長時間輸送するための様々な方法が開発されてきたが、その中で最も臨床的に応用されているのは単純冷却法である。主にこの単純冷却法に使われるのが臓器保存液である。摘出された臓器は臓器保存液で灌流され、摘出後に同様の冷却した臓器保存液により浸漬されることで壊死を予防する。【０００３】
現在の臓器移植の臨床現場において一般的に使用されている臓器保存液は、ウィスコンシン大学液（University of Wisconsin：ＵＷ液／腎臓・肝臓・膵臓等）、ユーロコリンズ液（Euro-Collins：ＥＣ液／腎臓)、Celsior（登録商標／心臓）、ラクトリンゲル液（肺）、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸液（Histidine-tryptophan-ketoglutarate：ＨＴＫ液／肝臓・心臓・膵臓・腎臓・小腸）、ET-Kyoto液等である。緩衝液として働くほか、凍結による細胞の膨張を防ぐために糖を添加する、あるいは抗酸化剤を添加することにより、虚血再灌流障害の発生を防ぐなどの工夫がなされている。【０００４】
ここで虚血再灌流障害とは、虚血状態にある臓器、組織に血液再灌流が起きた際に、その臓器・組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起され引きおこされる障害であり、臓器移植後にみられることが多い。障害を引きおこす機序として、スーパーオキサイド（Ｏ２−）やハイドロキシルラジカル（ＨＯ・）等の活性酸素や一酸化窒素（ＮＯ）等のフリーラジカル産生による障害、各種サイトカイン、エンドセリン、アラキドン酸など各種ケミカルメディエータ産生による障害、活性化好中球と血管内皮細胞の相互作用に基づく障害などの機序が考えられている。【０００５】
アスコルビン酸は強力な抗酸化剤であることから、移植臓器へのダメージの一因である虚血再灌流障害時に発生する活性酸素を除去するために有用であると考えられている。しかし、アスコルビン酸は自動酸化により急速に消失する（例えば、非特許文献１参照）ため、臓器保存液の組成物としては使われず、アスコルビン酸２−グルコシドと呼ばれる酸化還元反応に関与する部位をグルコースの結合によりマスクした安定型アスコルビン酸をin vitroで添加した知見（例えば、非特許文献２参照）がある。なお、アスコルビン酸２−グルコシドは細胞内に入らないと効果がないプロドラッグであり、実際に摘出臓器の保存に用いた場合、臓器の保存効果が得られるとは限らない。【０００６】
一方、細胞培養の培地へ特定の濃度比でアスコルビン酸とアスコルビン酸リン酸を添加することで、安定的にアスコルビン酸を存在させることができることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）が、あくまでこの結果は細胞培養時にアスコルビン酸が安定して存在することを示すのみであり、摘出した臓器が長くその機能を保持できるかどうかは示されていない。【０００７】
また、システイン（例えば、非特許文献４及び５参照）やグリシン（例えば、非特許文献６及び７参照）を含む臓器保存液や、日本では比較的頻繁に使われているトレハロースを含む臓器保存液ET-KYOTO（例えば、非特許文献８）にさらにプロテアーゼ阻害剤を含むM-KYOTOが知られている。【０００８】
その他臓器保存液として、特定のフラボノイド配糖体を含む臓器保存液（特許文献１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含有する臓器保存用溶液（特許文献２）、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼを含有する臓器保存液（特許文献３）、高含有量で硫酸塩を、低含有量で塩素を含む臓器の保存用溶液（特許文献４）、平均分子量５０万〜６５万のヒドロキシエチル澱粉を含有し、カリウムイオンとナトリウムイオンのモル比が０．４〜０．８、ｐＨ値が７．１〜７．５、浸透圧が２８０〜３３０ｍＯｓｍ／Ｌ、粘度が１．８〜２．５ｃｐである臓器保存液（特許文献５）、Ｄ−アロース等の希少糖を含有する保存液（特許文献６）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２２１１２８
【特許文献２】特開２００５−３０６７４９
【特許文献３】特開２００２−６０３０１
【特許文献４】特開平１０−２４５３０１
【特許文献５】特開平９−３２８４０１
【特許文献６】ＷＯ２００５／１１５１４１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Free Radic Res Commun. 1986; 1(6): 349-53.
【非特許文献２】Cell Transplant. 2003; 12(6): 599-606.I
【非特許文献３】In Vitro Cell. Dev. Biol.--Animal 37: 26-30, January 2001
【非特許文献４】Transplant Proc. 2011 Oct; 43(8): 2897-9
【非特許文献５】J Heart Lung Transplant. 2005 Sep; 24(9): 1369-77.
【非特許文献６】Transplantation. 2003 Mar 15; 75(5): 591-8.
【非特許文献７】Transpl Int. 1994 May;7(3): 195-200
【非特許文献８】Yonsei Med J. 2004 Dec 31; 45(6): 1107-14.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、全阻血時間の延長による虚血再灌流障害の発生を効果的に防止することのできる臓器保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前述の従来提案されている臓器保存液に添加されている各成分についてその組合せ等について試行錯誤を重ね、Ｌ−アスコルビン酸及びＬ−アスコルビン酸リン酸エステルに加え、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム、さらに塩化カリウムとＤ−グルコースが配合され、さらにまたグリシンやＬ−システインや鉄化合物が配合された臓器保存液が、現状用いられている臓器保存液に比べて虚血再灌流障害の発生防止の点で優れていることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は以下の事項に特定されるものである。
（１）塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、及びＤ−グルコースの配合物を含有する臓器保存液。
（２）配合物が、さらにグリシンを含むことを特徴とする上記（１）記載の臓器保存液。
（３）配合物が、さらにＬ−システインを含むことを特徴とする上記（２）記載の臓器保存液。
（４）配合物が、さらに鉄化合物を含むことを特徴とする上記（３）記載の臓器保存液。
（５）配合物におけるＬ−アスコルビン酸濃度が０．２〜０．３ｍＭであり、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル濃度が０．４〜０．５ｍＭであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の臓器保存液。
（６）配合物におけるリン酸水素二ナトリウム濃度が３５〜５０ｍＭであり、リン酸二水素ナトリウム濃度が１２〜１８ｍＭであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の臓器保存液。
（７）浸透圧が３２６〜３６３ｍＯｓｍ／ｋｇになるまでＤ−グルコースが配合されていることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の臓器保存液。
（８）配合物におけるグリシン濃度が５〜１５ｍＭであることを特徴とする上記（２）〜（７）のいずれか記載の臓器保存液。
（９）配合物におけるＬ−システイン濃度が０．５〜０．７ｍＭであることを特徴とする上記（３）〜（８）のいずれか記載の臓器保存液。
（１０）鉄化合物が、硫酸第一鉄であることを特徴とする上記（４）〜（９）のいずれか記載の臓器保存液。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれか記載の臓器保存液を用いて臓器を保存する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の臓器の保存液に移植用臓器を浸漬することで、全阻血時間の延長による虚血再灌流障害の発生を効果的に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＨＴＫ液、ＥＣ液、ＵＷ液及び保存液(ａ)〜(ｃ)の各保存液のいずれかに２４時間浸漬した心臓を異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ＨＴＫ液、ＥＣ液及び保存液(ａ)〜(ｃ)の各保存液のいずれかに４８時間浸漬した心臓を異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ＵＷ液、保存液(ｄ)３及び保存液(ｄ)６の各保存液のいずれかに２４時間浸漬した心臓を異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ＵＷ液、保存液(ｄ)３及び保存液(ｄ)６の各保存液のいずれかに２４時間浸漬した心臓を異所性心臓移植した各マウス個体について、移植後の経過日数と心臓生着率の関係を示すグラフである。
【図５】ＵＷ液、保存液(ｄ)３、保存液(ｄ)６、及び保存液(ｄ)７の各保存液のいずれかに４８時間浸漬した心臓を異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した結果を示すグラフである。
【図６】ＵＷ液、保存液(ｄ)３、保存液(ｄ)６、及び保存液(ｄ)７の各保存液のいずれかに４８時間浸漬した心臓を異所性心臓移植した各マウス個体について、移植後の経過日数と心臓生着率の関係を示すグラフである。
【図７】異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植された心臓の拍動が開始されるまでの時間を示すグラフである。
【図８】異所性心臓移植をした各マウスの血清中のＬＤＨ及びＣＰＫの産生量を示すグラフである。
【図９】移植された心臓の生着率を示すグラフである。
【図１０】摘出及び又は移植された心臓の、ＡＴＰ量を示すグラフである。
【図１１】ＴＴＣ染色された移植心臓切片を示す。
【図１２】（上段のグラフ）血管周囲領域に対する血管周囲浮腫領域の割合を示す。（下段の写真）Ｈ／Ｅ（ヘマトキシリン／エオシン）染色をされた移植心臓切片を示す。
【図１３】抗ＣＤ６８抗体（clone: FA-11, BioLegend社製）を用いて酵素抗体法により、青紫に染色された移植心臓切片を示す。
【図１４】ＴＵＮＥＬ染色された移植心臓切片を示す。
【図１５】移植心臓切片におけるアポトーシスを起こした細胞の割合を示すグラフである。
【図１６】抗８−ＯＨｄＧ抗体で酵素抗体法にて染色し、同時に核を青く染めるヘマトキシリンによっても染色された移植心臓切片を示す。
【図１７】移植された心臓の全細胞中の８−ＯＨｄＧ陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図１８】異所性心臓移植をした各マウスの血清中の８−ＯＨｄＧ量を示すグラフである。
【図１９】マウスの移植された心臓について、組織を破砕し定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った際の、各種炎症・酸化ストレスマーカー関連遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各グラフのバーは左から、Ｎａｉｖｅ、Ｆｒｅｓｈ、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の臓器保存液としては、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、及びＤ−グルコースの各成分の配合物を含む臓器保存液（ａ）や、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、グリシン、及びＤ−グルコースの各成分の配合物を含む臓器保存液（ｂ）や、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、及びＤ−グルコースの各成分の配合物を含む臓器保存液（ｃ）や、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、鉄化合物、及びＤ−グルコースの各成分の配合物を含む臓器保存液（ｄ）であれば特に制限されず、本発明の臓器保存液は、蒸留水等に上記各成分を添加・溶解した配合物として調製することができる。また、各成分の配合濃度は、移植用臓器の保存液として本発明の課題を達成することができる範囲であれば特に限定されない。
【００１７】
上記成分の内、無機塩は電離して溶液中に存在することから、本発明の臓器保存液（ａ）は、塩化物イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、及びＤ−グルコースを含み、臓器保存液（ｂ）は、塩化物イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、グリシン、及びＤ−グルコースを含み、臓器保存液（ｃ）は、塩化物イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、及びＤ−グルコースを含み、臓器保存液（ｄ）は、塩化物イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−システイン、グリシン、鉄イオン、及びＤ−グルコースを含むことになる。
【００１８】
例えば、配合物における塩化カリウムの濃度としては、５〜２５ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭ、より好ましくは１３〜１７ｍＭを好適に例示することができる。すなわち、配合物における塩化物イオンやカリウムイオンの濃度としては、５〜２５ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭ、より好ましくは１３〜１７ｍＭを好適に例示することができる。
【００１９】
配合物におけるリン酸水素二ナトリウムの濃度としては、２５〜６０ｍＭ、好ましくは３５〜５０ｍＭ、より好ましくは４０〜４５ｍＭを好適に例示することができる。すなわち、配合物におけるＨＰＯ４２−の濃度としては、２５〜６０ｍＭ、好ましくは３５〜５０ｍＭ、より好ましくは４０〜４５ｍＭを好適に例示することができる。また、配合物におけるリン酸二水素ナトリウムの濃度としては、１０〜２０ｍＭ、好ましくは１２〜１８ｍＭ、より好ましくは１４〜１６ｍＭを好適に例示することができる。すなわち、Ｈ２ＰＯ４−の濃度としては、１０〜２０ｍＭ、好ましくは１２〜１８ｍＭ、より好ましくは１４〜１６ｍＭを好適に例示することができる。そして、配合物におけるナトリウムイオンの濃度としては、３５〜８０ｍＭ、好ましくは４７〜６８ｍＭ、より好ましくは５４〜６１ｍＭを好適に例示することができる。
【００２０】
リン酸水素二ナトリウムと塩化カリウムの濃度比は４：１〜２：１が好ましい。また、リン酸二水素ナトリウムと塩化カリウムの濃度比は１：２〜２：１が好ましい。そして、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムの濃度比は４：１〜２：１が好ましい。
【００２１】
配合物におけるＬ−アスコルビン酸の濃度としては、０．１〜０．５ｍＭ、好ましくは０．２〜０．４ｍＭ、より好ましくは０．２〜０．３ｍＭを好適に例示することができる。また、Ｌ−アスコルビン酸と塩化カリウムの濃度比は１：５０〜１：７０が好ましい。
【００２２】
配合物におけるＬ−アスコルビン酸リン酸エステルの濃度としては、０．３〜０．６ｍＭ、好ましくは０．４〜０．５ｍＭ、より好ましくは０．４３〜０．４７ｍＭを好適に例示することができる。また、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルと塩化カリウムの濃度比は１：２５〜１：４０が好ましい。そして、Ｌ−アスコルビン酸とＬ−アスコルビン酸リン酸エステルの濃度比は１：１〜１：３が好ましい。
【００２３】
配合物におけるグリシンの濃度としては、３〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍＭを好適に例示することができる。また、グリシンと塩化カリウムの濃度比は１：１〜１：２が好ましい。
【００２４】
配合物におけるＬ−システインの濃度としては、０．３〜０．９ｍＭ、好ましくは０．５〜０．７ｍＭ、より好ましくは０．６０〜０．６５ｍＭを好適に例示することができる。また、Ｌ−システインと塩化カリウムの濃度比は１：２０〜１：２５が好ましい。
【００２５】
配合物におけるＤ−グルコースの配合濃度としては、臓器保存液の浸透圧が、２７０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは３００〜３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは３２６〜３６３ｍＯｓｍ／ｋｇを好適に例示することができる。
【００２６】
配合物における鉄化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸第一鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、硫化グリシン鉄を挙げることができるが、中でも硫酸第一鉄が好ましい。鉄化合物の濃度、すなわち鉄イオン濃度としては、０．１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５μＭ〜５ｍＭを挙げることができる。
【００２７】
本発明の臓器保存液には、上記各成分の他、水、生理食塩水、各種緩衝剤、ビタミン類、５−アミノレブリン酸、糖類、プロテアーゼ阻害剤、フラボノイド配糖体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ、ヒドロキシエチル澱粉、抗酸化剤、抗炎症性サイトカイン、制御性Ｔ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等を適宜配合することができる。
【００２８】
本発明の臓器保存液のｐＨとしては、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、より好ましくはｐＨ７付近である。また本発明の臓器保存液は通常０℃付近で使用される。本発明の臓器保存液に臓器を浸漬する時間すなわち冷虚血（冷阻血時間）は、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内であるが、浸漬時間が２４〜４８時間であっても、虚血再灌流障害の発生を効果的に防止することができる。
【００２９】
本発明の臓器保存液の適用対象となる臓器としては、移植を行うことができる臓器であれば特に制限されず、ドナーから摘出した臓器のみならず、in vitroで作製した移植片や細胞、再生医療技術により人工的に構築した組織・臓器の他、万能細胞から作製された臓器等でもよい。また、臓器の種類としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、眼球、角膜、毛髪、皮膚等を例示することができるが、中でも、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸を好適に例示することができる。
【００３０】
本発明の臓器保存液を用いての臓器移植は、常法により行うことができ、ドナー等から提供された臓器を本発明の臓器保存液に浸漬した後、レシピエントの対応臓器を取り除いてレシピエントにおける同じ場所に移植する同所性臓器移植であっても、ドナー等から提供された臓器を、レシピエントの臓器を残したままでレシピエントの別の部位に移植する異所性臓器移植であってもよい。
【００３１】
本発明の臓器保存液を用いての臓器移植におけるドナー及び／又はレシピエントとしては、ヒト、ヒヒ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物を挙げることができ、かかる臓器移植の態様としては、ドナーからレシピエントへの臓器の移植が可能な態様であれば特に制限されないが、マウスからマウスへ、ラットからラットへ、ウサギからウサギへ、イヌからイヌへ、ネコからネコへ、ブタからブタへ、サルからサルへ、ヒヒからヒヒへ、ヒトからヒトへ等の同種臓器移植や、ブタからヒトへ、ウシからヒトへ、サルからヒトへ、ヒヒからヒトへ等の異種臓器移植を挙げることができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（保存液の調製）
新規に調製された３種類の臓器保存液（保存液(ａ)〜保存液(ｃ)）を検討対象とした。蒸留水に添加・溶解した成分の詳細を以下の表１に示す。これらの保存液に、従来品の保存液において規定されている最大阻血許容時間を超えて、移植用臓器を浸漬した場合に、移植後に臓器の機能が維持できるか否かについて検討した。具体的には、上記３種類の保存液に浸漬したドナーマウスの心臓が、同系統マウスに移植された場合に、移植後再拍動を開始するまでの時間を指標とした。周知の現行品としてユーロコリンズ液（ＥＣ液）、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸液（ＨＴＫ液）、ウィスコンシン大学液（University of Wisconsin：ＵＷ液）の保存液３種類を比較検討のため用いた。これら３種類の現行品の成分の詳細を以下の表２に示す。【００３４】
【表１】
2015182019.tif 000002
【００３５】
【表２】
2015182019.tif 000003
【００３６】
（マウス異所性心臓移植１）
移植する心臓を提供するドナーマウス、及びドナーマウスから摘出した心臓を移植するレシピエントマウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ（（Ｈ２−Ｋｂ）系統のマウス（雄、６〜１０週齢）を用いた。マウス異所性心臓移植の手術の手順は、Ｗｕら（European Heart Journal (2011) 32, 509-516）の記載を参考としたが、以下に概要を示す。【００３７】
ドナーマウスを麻酔後に胸郭を開き、心臓の上大静脈を結紮し、腕頭動脈を切断した。ヘパリン生理食塩水（１００ＩＵ／ｍＬ）１ｍＬを用いて潅流した後、上記表１に記載されている各保存液(ａ)〜(ｃ)又は上記表２に記載されている比較検討用の現行品の３種類の保存液１ｍＬを、それぞれ各ドナーマウスの下大静脈から潅流し、腕頭動脈から排出させた。各ドナーマウスの下大静脈を結紮後、上行大動脈と肺動脈とを切断し、他のすべての血管を結紮した。引き続いてドナーマウスの摘出心臓は、上記保存液(ａ)〜(ｃ)及び表２に記載されている３種類の現行品の各保存液１５ｍＬのいずれかに０℃にて２４時間浸漬した。【００３８】
上記各保存液に浸漬されたドナーマウスの摘出心臓はレシピエントマウスへ移植された。全身麻酔下においてレシピエントマウスの腹部が開かれた後、ドナーマウスの摘出心臓の上行大動脈はレシピエントマウスの腹部大動脈へ吻合され、ドナーマウスの下大静脈はレシピエントマウスの下大静脈に吻合し、手術を完了した。臓器移植時の温虚血の時間は、４０分に統一された。【００３９】
（異所性心臓移植された心臓の再拍動時間１）
上記各保存液に２４時間浸漬後の摘出心臓について、異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植された心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した。これ以降拍動が開始されたか否かは触診により判断する。結果を図１に示す。【００４０】
（結果１）
図１より明らかなとおり、ＵＷ液の再拍動開始時間は２４０秒程度で、現行品３種類のうち再拍動開始時間が最短であった一方で、保存液(ｃ)の再拍動開始時間は１００秒程度であり、ＵＷ液の半分以下の時間に短縮された。また、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、リン酸二水素ナトリウム・２水和物、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物、グリシン、Ｄ（＋）−グルコースを含む保存液(ｃ)からＬ−システイン塩酸塩１水和物を除いた保存液(ｂ)はＵＷ液と同等程度の再拍動開始時間であった。保存液(ｃ)から、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物並びにグリシンを除いた保存液(ａ)もＥＣ液よりも再拍動開始時間が短縮した。したがって、保存液(ａ)〜(ｃ)のいずれの保存液に移植臓器を浸漬した場合であっても、現行品である、ＨＴＫ液、ＥＣ液、ＵＷ液の３種類を用いる場合と比較して、再拍動開始時間が短縮したことが確認され、臓器の血流が止まってから臓器を移植した後、血流が再開できるまでの時間である臓器の最大阻血許容時間が現行品を用いて保存を行う場合よりも長くなることが示唆された。
【実施例２】
【００４１】
（マウス異所性心臓移植２）
各保存液への浸漬時間を４８時間とし、比較検討のため現行品のＨＴＫ液、ＥＣ液を用いた他は、上記実施例１（マウス異所性心臓移植１）の手順にしたがい、マウス異所性心臓移植を行った。異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植された心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した。結果を図２に示す。【００４２】
（結果２）
図２より明らかなとおり、ＨＴＫ液、ＥＣ液ともに再拍動開始時間は１５００秒以上であった一方で、保存液(ａ)の再拍動開始時間は５００秒程度であり、保存液(ｂ)の再拍動開始時間は１２５０秒程度であり、保存液(ｃ)の再拍動開始時間は６００秒程度であった。したがって、保存液(ａ)〜(ｃ)のいずれも現行品と比較して、高い再拍動開始時間短縮効果を示した。しかしながら、浸漬時間を４８時間とした場合、レシピエントマウスの死亡率は高くなった。
【実施例３】
【００４３】
（マウス異所性心臓移植３）
上記保存液(ｃ)に硫酸鉄（II）を添加した保存液(ｄ)を鉄添加シリーズ保存液として、さらに調製し検討を続けた。各保存液の成分の詳細を以下の表３に示す。【００４４】
【表３】
2015182019.tif 000004
【００４５】
鉄添加シリーズ保存液として、保存液(ｄ)３及び保存液(ｄ)６を用い、比較検討のため現行品のＵＷ液を用いた他は、上記実施例１（マウス異所性心臓移植１）の手順にしたがい、マウス異所性心臓移植を行った。２４時間保存液に浸漬後、異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した。結果を図３に示す。【００４６】
さらに、上記異所性心臓移植をしたマウス個体について、心臓の移植後、異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓が停止するまでの時間について計測した。結果を図４に示す。【００４７】
（結果３−１）
図３からも明らかなとおり、現行品のＵＷ液の再拍動開始時間は２３０秒程度であった一方で、保存液(ｄ)３の再拍動開始時間は１２秒、保存液(ｄ)６の再拍動開始時間は約１４４秒であり、現行品ＵＷ液と比較して、有意に再拍動開始時間短縮効果を示した。とりわけ保存液(ｄ)３は、上記実施例１における保存液(ｃ)よりもさらに高い再拍動開始時間短縮効果を示した。【００４８】
（結果３−２）
上記のように、２４時間冷保存液に浸漬した後に心臓を移植し、その後心臓が生着しているかを心臓が拍動しているかどうかを触診することで判断し、拍動が停止していることを確認した日を心臓脱落日とした。すなわち、上記異所性心臓移植をしたマウス個体について、移植心臓が拍動停止するまでの時間について計測した。図４からわかるように、保存液（ｄ）３及び保存液（ｄ）６は、ＵＷ液と同様に、心臓の生着を確認することができた。
【実施例４】
【００４９】
（マウス異所性心臓移植４）
鉄添加シリーズ保存液として、保存液(ｄ)３、保存液(ｄ)６、保存液(ｄ)７を用い、比較検討のため現行品のＵＷ液を用い、各保存液への浸漬時間を４８時間とした他は、上記マウス異所性心臓移植１の手順にしたがい、マウス異所性心臓移植を行った。異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した。結果を図５に示す。【００５０】
さらに、上記異所性心臓移植をしたマウス個体について、移植心臓が停止するまでの時間について、実施例３と同様に、計測した。結果を図６に示す。【００５１】
（結果４−１）
ＵＷ液において、移植心臓の再拍動が開始された個体はなかった。各保存液における再拍動開始時間は、保存液(ｄ)３が２６０秒程度、保存液(ｄ)６が９０秒程度、保存液(ｄ)７が８２０秒程度でいずれも移植心臓の再拍動が起こった。【００５２】
（結果４−２）
ＵＷ液に浸漬した摘出心臓を移植したマウスは、再拍動がなかった；
保存液(ｄ)３に浸漬した摘出心臓を移植したマウス（ｎ＝５）では、長期拍動マウスがあった。より詳細には、初日（０日）に２匹、１日目に１匹、２日目に１匹の移植心臓が拍動停止したが、６０日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が１匹あった；
保存液(ｄ)６に浸漬した摘出心臓を移植したマウス（ｎ＝１）では、長期拍動マウスがあった。より詳細には、６０日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が１匹あった；
保存液(ｄ)７に浸漬した摘出心臓を移植したマウス（ｎ＝６）では、長期拍動マウスがあった。より詳細には、７日目に１匹の移植心臓が拍動停止したが、３０日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が５匹あった；
これ以降、ＨＴＫをコントロールとして、上記保存液(ｃ)について、さらに検討した。
【実施例５】
【００５３】
（マウス異所性心臓移植５）
保存液として、保存液(ｃ)又はＨＴＫ液を用い、ドナーマウスからの摘出心臓が２４時間又は４８時間保存液に浸漬されたことの他は、上記実施例１（マウス異所性心臓移植１）の手順で、マウス異所性心臓移植の手術を完了し、異所性心臓移植を行ったマウスを調製した。【００５４】
（異所性心臓移植された心臓の再拍動時間２）
異所性心臓移植をした各マウス個体について、移植された心臓の拍動が開始されるまでの時間を測定した。なお、すべての再拍動は３０分以内に計測した。再灌流後３０分経っても拍動を開始しない場合、１８００秒とカウントした。結果を図７（ａ）（ｂ）に示す。【００５５】
（結果５）
図７からも明らかなとおり、摘出心臓の保存液への浸漬時間が２４時間（図７（ａ）参照）及び４８時間（図７（ｂ）参照）のいずれの場合でも、摘出心臓をＨＴＫ液に浸漬したよりも、摘出心臓を保存液(ｃ)に浸漬した方が、レシピエントマウスに移植された心臓の再拍動を開始するまでの時間が短かった。浸漬時間が２４時間の場合、保存液(ｃ)に浸漬した移植心臓の再拍動開始時間（約１００秒）は、ＨＴＫ液に浸漬した移植心臓の再拍動開始時間（約３００秒）の約３分の１であり、浸漬時間が４８時間の場合、保存液(ｃ)に浸漬した移植心臓の再拍動開始時間（約６００秒）は、ＨＴＫ液に浸漬した移植心臓の再拍動開始時間（約１５００秒）の約５分の２であった。
【実施例６】
【００５６】
（マウス異所性心臓移植６）
上記実施例５（マウス異所性心臓移植５）と同様の手順で、手術を完了し、異所性心臓移植を行ったマウスを調製した。【００５７】
（移植直後の急性炎症抑制効果の検討）
以下の各マウスについて、検討を行った。
（１）保存液(ｃ)に２４時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス  （ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
（２）保存液(ｃ)に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス  （ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
（３）ＨＴＫ液に２４時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス  （ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
（４）ＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス  （ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
（以下、上記４種類のマウスをまとめて「（１）〜（４）のマウス」ということがある。）
さらに、以下のマウスをコントロールとして調製した。
（５）摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植し手術完了から２４時間経過したマウス  （Ｆｒｅｓｈ）；
（６）移植手術をしていないマウス（Ｎａｉｖｅ）；【００５８】
上記各マウスについて、各々のマウスから採血し、血清を抽出した。得られた各血清について、細胞への傷害の指標として用いられるＣＰＫ（クレアチンフォスフォキナーゼ）とＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の量を測定した。ＣＰＫは富士ドライケムスライドＣＰＫ−ＰＩII（FUJIFILM社製）、ＬＤＨは富士ドライケムスライドＬＤＨ−ＰIII（FUJIFILM社製）を用いて測定した。結果を図８に示す。【００５９】
（結果６）
図８からも明らかなとおり、血清中のＬＤＨの産生量については、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４が、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４よりも有意に少なかった（図８（ａ）参照）。また、血清中のＣＰＫの産生量についても、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４は、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４よりも少なかった（図８（ｂ）参照）。ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４と、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４とでは、血清中のＬＤＨの産生量やＣＰＫの産生量に差は生じなかった。以上の結果より、保存液に４８時間浸漬した場合には、保存液(ｃ)に浸漬した心臓を異所移植したマウスにおいては、ＨＴＫ液に浸漬した心臓を異所移植したマウスよりも、血清中のＬＤＨの産生が有意に抑制され、また、血清中のＣＰＫの産生も抑えられることが確認された。
【実施例７】
【００６０】
（移植された心臓の長期生着率効果の検討）
上記（１）〜（４）のマウス、及び、摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植し手術完了から２４時間経過したマウス（ｆｒｅｓｈ）の各マウスについて、移植した心臓がいつまで生着するかを確認した。移植心臓の拍動を触診により確認し、拍動が停止していたら機能停止により臓器が脱落した（生着しなかった）とみなした。最初の２週間は毎日触診確認し、その後２．５か月は週に２回触診確認した。結果を図９に示す。【００６１】
（結果７）
図９から明らかなとおり、保存液(ｃ)に２４時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ｃ−２４ｈｒ（ｎ＝４））は術後６０日目において１００％生着していたのに対し、ＨＴＫに２４時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ＨＴＫ−２４ｈｒ（ｎ＝７））の生着率は５０％強にとどまった。また、保存液(ｃ)に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ｃ−４８ｈｒ（ｎ＝４））は６０日後でも５０％が生着していたのに対し、ＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ＨＴＫ−４８ｈｒ（ｎ＝０））は初日（０日）にすべての移植心臓が脱落した。以上の結果より、浸漬時間が２４時間及び４８時間のいずれにおいても、保存液(ｃ)に浸漬された心臓の方が、ＨＴＫ液に浸漬された心臓よりも、長期生着率が高いことが確認された。
【実施例８】
【００６２】
（移植心臓のＡＴＰ量上昇効果の検討）
上記実施例１（マウス異所性心臓移植１）の手順にしたがって調製された摘出心臓について、ＡＴＰ量上昇効果についての検討を行った。
１）保存液(ｃ)に２４時間浸漬された摘出心臓（移植せず）
（ｃ−２４ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥ）；
２）保存液(ｃ)に４８時間浸漬された摘出心臓（移植せず）
（ｃ−４８ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥ）；
３）ＨＴＫ液に２４時間浸漬された摘出心臓（移植せず）
（ＨＴＫ−２４ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥ）；
４）ＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓（移植せず）
（ＨＴＫ−４８ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥ）；
５）保存液(ｃ)に４８時間浸漬された摘出心臓をマウスに移植し、移植手術完了から２４時間経過した移植心臓  （ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
６）ＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓をマウスに移植し、移植手術完了から２４時間経過した移植心臓  （ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）；
７）摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植し、移植手術完了から２４時間経過した移植心臓  （ｆｒｅｓｈ）；
８）切除したばかりの心臓であって、移植していないマウスの心臓  （ｎａｉｖｅ）；【００６３】
上記各心臓からＡＭＥＲＩＣ−ＡＴＰキット（Ｃａｔ．６３２−２３８８１和光純薬社製）によりＡＴＰを抽出し、その量を各群比較した。結果を図１０に示す。【００６４】
（結果８）
図１０から明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥから抽出されたＡＴＰ量は、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥから抽出されたＡＴＰ量よりも少なかった。一方、ｃ−４８ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥから抽出されたＡＴＰ量と、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ｗ／ｏ ＯＰＥから抽出されたＡＴＰ量とにおいて、有意な差はなかった。ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４から抽出されたＡＴＰ量は、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４から抽出されたＡＴＰ量よりも多かった。したがって、摘出後４８時間保存液に浸漬された後移植された心臓においては、保存液(ｃ)に浸漬した心臓から抽出されたＡＴＰ量は、ＨＴＫに浸漬した心臓から抽出されたＡＴＰ量よりも多かった。
【実施例９】
【００６５】
（組織染色による壊死部分抑制効果の検討）
上記実施例５（マウス異所性心臓移植５）と同様の手順で、手術を完了し、異所性心臓移植を行ったマウスを調製した。保存液(ａ)に２４時間浸漬された後レシピエントマウスに移植して１時間経過したマウス（ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ１、ｎ＝２）の心臓と、ＨＴＫ液に２４時間浸漬された後レシピエントマウスに移植して１時間経過したマウス（ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ１、ｎ＝２）の心臓について、壊死部分抑制効果についての検討を行った。組織の健康な部分のみを赤く染色するＴＴＣ（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（Cat:0765; AMRESCO社製））染色を行い、染色されず白いままである壊死部分の表面積を比較した。コントロールとして、切除したばかりの心臓で移植していない心臓（ｎａｉｖｅ、ｎ＝２）を用いた。三分割した心臓内部を撮影（ＥＯＳ、Canon株式会社製）した写真を図１１（ａ）〜（ｃ）に示す。【００６６】
（結果９）
図１１から明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ１の心臓（図１１（ｃ））は、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ１の心臓（図１１（ｂ））と比較して、壊死していることを示す白い部分が少なく、保存液(ｃ)に摘出心臓を浸漬する方がＨＴＫ液に摘出心臓を浸漬するよりも、移植心臓の壊死を防ぐことが確認された。
【実施例１０】
【００６７】
（組織染色による検討）
上記実施例５（マウス異所性心臓移植５）の手順にしたがって調製された摘出心臓について、組織染色による観察を行った。摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植し、移植手術完了から２４時間経過した移植心臓（ｆｒｅｓｈ）と、ＨＴＫ液に２４時間又は４８時間浸漬された後レシピエントマウスに移植して２４時間経過したマウス（ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）の心臓と、保存液(ｃ)に２４時間又は４８時間浸漬された後レシピエントマウスに移植して２４時間経過したマウス（ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４又はｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）の心臓について、固定切片を作製し、核を青に、細胞質を赤紫に染色する手法である、Ｈ／Ｅ（ヘマトキシリン／エオシン）染色を行い、心筋の様子を×２００にて顕微鏡観察により比較した。筋細胞損傷を染色した結果を図１２（下段の写真）左（Myocyte lesion;a-e）に、血管周囲の浮腫を染色した結果を図１２（下段の写真）右（Perivascular edema;a'-e'）に示す。また、図１２（上段のグラフ）に、血管周囲領域に対する血管周囲浮腫領域の割合を示す。【００６８】
（結果１０）
図１２（下段の写真）から明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４やｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓は、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓と比較して、心筋線維間の浮腫、心筋線維の断裂、壊死心筋細胞核の消失、好中球の浸潤等の点で、心筋の損傷、血管周囲の浮腫ともに軽減されていることが確認された。また、図１２（上段のグラフ）から、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４やｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓においては、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓と比較して、血管周囲領域に対する血管周囲浮腫領域の割合が大幅に低下していることがわかる。
【実施例１１】
【００６９】
（マクロファージ集積抑制効果の検討）
上記（１）〜（４）のマウスの移植された心臓について、各心臓の固定切片を作製し、抗ＣＤ６８抗体（clone: FA-11, BioLegend社製）を用いて酵素抗体法により、青紫に染色し、ＣＤ６８陽性であるマクロファージの分布を×２００で顕微鏡観察し、組織に集積しているマクロファージの数を比較した。マクロファージが組織に集積していることは、その組織が炎症を起こしていることを示唆する。コントロールとして、切除したばかりの心臓で移植していない心臓（ｎａｉｖｅ）と、摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植して２４時間経過したマウスの心臓（ｆｒｅｓｈ）を用いた。結果を図１３に示す。【００７０】
（結果１１）
図１３から明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓は、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓よりも、また、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓は、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓よりも、ＣＤ６８陽性であるマクロファージの青紫への染色部分の密度が小さく、心臓へのマクロファージの集積が少なかった。したがって、摘出心臓が浸漬された時間が２４時間及び４８時間いずれの場合も、摘出心臓を浸漬する保存液として保存液(ｃ)を用いる方が、ＨＴＫ液を用いるよりも組織における炎症が抑えられることが確認された。
【実施例１２】
【００７１】
（細胞死抑制効果の検討）
上記（１）〜（４）の各マウスの移植された心臓について、各心臓の固定切片を作製し、細胞死抑制効果についての検討を行った。アポトーシスをおこした細胞を青紫に染色するＴＵＮＥＬ(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling)染色をCardioTACS in situ Apoptosis Detectionキット（Trevigen社 Cat.4827-30-K）を用いて行ったのち、×１００、×２００にて顕微鏡観察し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を比較した。また、任意の９ＨＰＦ／ｓａｍｐｌｅ（≧３匹／ｇｒｏｕｐ）中の染色されたアポトーシス細胞の数を数え、全細胞中における割合を計算し比較した。コントロールとして、切除したばかりの心臓で移植していない心臓（ｎａｉｖｅ）と、摘出心臓を保存液に浸漬せずに移植して２４時間経過したマウスの心臓（ｆｒｅｓｈ）を用いた。結果を図１４と、図１５のグラフに示す。【００７２】
（結果１２）
図１４から明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓（図１４（ｄ）参照）とＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨの心臓（図１４（ｃ）参照）とにおいては、青紫色の量に有意差はなかったが、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓（図１４（ｅ）参照）は、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓（図１４（ｆ）参照）よりも有意に青紫色が多かった。また、図１５から明らかなとおり、アポトーシスを起こした細胞の割合は、ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓においては、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓やｆｒｅｓｈの心臓と比べて有意に多かった。したがって、摘出心臓の浸漬時間が４８時間である場合は、保存液として保存液(ｃ)を用いる方が、ＨＴＫ液を用いるよりもアポトーシスが有意に抑制されることが確認された。
【実施例１３】
【００７３】
（細胞におけるＤＮＡ損傷抑制効果の検討）
上記保存液(ｃ)又はＨＴＫ液に２４時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４）の各心臓について、心臓の固定切片を作製し、ＤＮＡ損傷抑制効果についての検討を行った。核を褐色に染める抗８−ＯＨｄＧ抗体で酵素抗体法（MOG-100P、Japan Institute for Control of Aging、NIKKEN SEIL Co.）にて染色し、同時に核を青く染めるヘマトキシリンによっても染色した。この切片を×１００、×２００で顕微鏡観察し、８−ＯＨｄＧ養成細胞の数を比較した。なお、８−ＯＨｄＧはＤＮＡ損傷マーカーであり、活性酸素による細胞の損傷の程度を示す。コントロールとして、切除したばかりの心臓(ｎａｉｖｅ)と、切除してすぐ移植し２４時間経過した心臓(ｆｒｅｓｈ-ＰＯＨ２４)を用いた。また、任意の９ＨＰＦ／ｓａｍｐｌｅ（≧３匹／ｇｒｏｕｐ）中の染色された８−ＯＨｄＧ陽性細胞の数を数え、全細胞中の割合を計算した。結果を図１６の染色図と図１７のグラフに示す。【００７４】
（結果１３）
図１６より明らかなとおり、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓（図１６（ｄ）参照）が、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓（図１６（ｃ）参照）よりも褐色に染色された８−ＯＨｄＧ陽性細胞の数が少ないことから、ＤＮＡ損傷が抑制されており、また、図１７から明らかなとおり、ＨＴＫ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４は、ｃ−２４ｈｒ−ＰＯＨ２４やｆｒｅｓｈ−ＰＯＨ２４と比較して、染色された８−ＯＨｄＧ陽性細胞数が有意に多く、摘出心臓の浸漬時間が２４時間である場合は、保存液として保存液(ｃ)を用いる方が、ＨＴＫ液を用いるよりも活性酸素によるＤＮＡ傷害が有意に抑制されることが確認された。なお、摘出心臓の浸漬時間が４８時間である場合のデータは、心筋の組織破壊によりバックグラウンドが高くなり陽性細胞のカウントができなかったためデータは示していない。
【実施例１４】
【００７５】
（血清におけるＤＮＡ損傷抑制効果の検討）
上記保存液(ｃ)又はＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）について、各々のマウスから採血し、血清を抽出し、ＤＮＡ損傷抑制効果についての検討を行った。各々のマウスから採血し、血清を抽出した。血清中の８−ＯＨｄＧ量についてＨｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡキット ｆｏｒ ８−ＯＨｄＧ (KOG-HS10/E, Japan Institute for Control of Aging, NIKKEN SEIL Co.社製)を用い比較した。コントロールとして、移植手術をしていないマウス(Ｎａｉｖｅ)と、摘出してすぐ移植し２４時間経過したマウス（Ｆｒｅｓｈ）を用いた。結果を図１８に示す。【００７６】
（結果１４）
図１８から明らかなとおり、摘出心臓の浸漬時間が４８時間である場合は、保存液として保存液(ｃ)を用いる方が、ＨＴＫ液を用いるよりもＤＮＡ傷害が有意に抑制されていることが確認された。
【実施例１５】
【００７７】
（炎症・酸化ストレスマーカー遺伝子発現の変化の検討(定量的ＲＴ−ＰＣＲ)）
上記保存液(ｃ)又はＨＴＫ液に４８時間浸漬された摘出心臓が移植され手術完了から２４時間経過したマウス（ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４又はＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４）の移植された心臓について、組織を破砕後ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）にてｃＤＮＡを逆転写し、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM（タカラバイオ社製）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより炎症・酸化ストレスに関連した遺伝子群の発現を比較した。
無処置群として、切除したばかりの心臓（ｎａｉｖｅ）と、切除してすぐ移植し２４時間経過したマウスの心臓（ｆｒｅｓｈ）を用いた。結果を図１９に示す。図１９において、ＩＬ−６については左からＮａｉｖｅ（ｎ＝５），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝４）；ＨＯ−１はＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝４），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ｉＮＯＳについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝４），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ＣＤ１１ｂについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝４），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝４）；Ｎｒｆ２については左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ＮＦ−ｋＢについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ＴＮＦ−αについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；Ａｒｇ−１はＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ＨＩＦ−１αについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）；ＴＧＦ−βについては左からＮａｉｖｅ（ｎ＝６），Ｆｒｅｓｈ（ｎ＝３），ＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝３），ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４（ｎ＝５）である。【００７８】
（結果１５）
ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓がＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓よりも有意に低い値を示した項目は、ＩＬ−６：炎症性サイトカイン遺伝子、ＨＯ−１：抗酸化タンパクの遺伝子、ｉＮＯＳ：抗酸化タンパクの遺伝子、ＣＤ１１ｂ：損傷部位に集積するマクロファージのマーカー遺伝子であり、他方、ｃ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓がＨＴＫ−４８ｈｒ−ＰＯＨ２４の心臓よりも有意に高い値を示した項目は、Ｎｒｆ２、ＮＦ−ｋＢ、ＨＩＦ−１α：細胞のストレス応答に関与する転写因子、ＴＧＦ−β：炎症抑制性サイトカイン遺伝子であり、保存液として保存液(ｃ)を用いる方が、炎症が抑えられることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、臓器移植という医療分野において有用である。
【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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