(57)【要約】  蛍光画像から蛍光強度を読取る際に、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現する。  本発明は、蛍光を発する領域が複数存在する試料から蛍光画像を読取る画像読取り方法であって、（ａ）第１の撮像条件を設定する工程と、（ｂ）前記第１の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、（ｃ）撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する工程と、（ｄ）前記算出された各領域の蛍光強度に基づいて、撮像を終了するか否か判定する工程と、（ｅ）前記（ｄ）工程で撮像を終了しないと判断された場合、前記（ｃ）工程で算出された各領域の蛍光強度に基づいて、次の撮像条件を設定する工程と、（ｆ）前記次の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、（ｇ）前記（ｃ）工程から（ｆ）工程を、前記（ｄ）工程で撮像を終了すると判定されるまで、繰返す工程とを有する。
2015037724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を発する領域が複数存在する試料から蛍光画像を読取る画像読取り方法であって、
（ａ）第１の撮像条件を設定する工程と、
（ｂ）前記第１の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｃ）撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する工程と、
（ｄ）前記算出された各領域の蛍光強度に基づいて、撮像を終了するか否か判定する工程と、
（ｅ）前記（ｄ）工程で撮像を終了しないと判断された場合、前記（ｃ）工程で算出された各領域の蛍光強度に基づいて、次の撮像条件を設定する工程と、
（ｆ）前記次の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｇ）前記（ｃ）工程から（ｆ）工程を、前記（ｄ）工程で撮像を終了すると判定されるまで、繰返す工程と、
を有する画像読み取り方法。
【請求項２】
前記（ｄ）工程は、
（ｄ−１）前記（ｃ）工程で算出した、前記各領域の蛍光強度について、蛍光強度が有意であるか否かを判定する工程と、
（ｄ−２）蛍光強度が有意であると判定された領域について、前記（ｃ）工程で算出した蛍光強度を当該領域の蛍光強度の読取り値として採用する工程を有し、
前記（ｅ）工程は、
（ｅ−１）蛍光強度が有意でないと判定された領域が存在する場合、前記（ｄ）工程における判定対象となった蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件を当該領域の次の撮像条件として設定する工程を有する、
請求項１記載の画像読取り方法。
【請求項３】
前記（ｄ）工程は、
（ｄ−３）前記（ｄ−１）工程で、前記蛍光画像に含まれる複数の領域について、全て蛍光強度が有意である、と判定されたとき、撮像を終了すると判定する工程を有する、
請求項２記載の画像読取り方法。
【請求項４】
前記（ｄ−２）工程において、前記算出工程で算出した蛍光強度を採用した領域に関しては、
前記（ｇ）工程中の、前記（ｃ）工程の適用を省略する、
請求項２又は３に記載の画像読取方法。
【請求項５】
前記（ｄ）工程は、
（ｄ−１）前記（ｃ）工程で算出した、前記各領域の蛍光強度について、蛍光強度が有意であるか否かを判定する工程を有し、
前記（ｅ）工程は、
（ｅ−２）蛍光強度が有意であると判定されたそれぞれの領域について、前記撮像条件の受光量よりも多い受光量となる、１つ又は２つ以上の撮像条件を抽出する工程と、
（ｅ−３）以下の式により、各抽出された撮像条件に関する予測蛍光強度をそれぞれ算出する工程と、
式：予測蛍光強度＝（領域の蛍光強度／基準撮像条件）×抽出された撮像条件
（ここで、基準撮像条件は、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件）
（ｅ−４）各抽出された撮像条件について算出された前記予測蛍光強度のうち、有意の予測蛍光強度の中から、最も高い予測蛍光強度に対応する撮像条件を、その領域の確定撮像条件とする工程と、
（ｅ−５）前記（ｅ−４）工程において、前記抽出された各撮像条件について算出された前記予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件をその領域の前記次の撮像条件として設定する工程と、
（ｅ−６）蛍光強度が有意でないと判定されたそれぞれの領域について、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件をその領域の前記次の撮像条件として設定する工程とを有し、
前記（ｆ）工程はさらに、
（ｆ−１）各領域について前記（ｅ−４）工程で得られた確定撮像条件により蛍光画像を撮像する工程を有し、
前記（ｄ）工程はさらに、
（ｄ−４）各領域について前記（ｆ−１）工程で撮像され、前記（ｃ）工程で算出された蛍光強度を、前記各領域の読取り値として採用して、撮像を終了すると判定する工程を有する、
請求項１記載の画像読取り方法。
【請求項６】
前記（ｅ−５）工程の代わりに、
（ｅ−５’）前記（ｅ−４）工程において、前記抽出された各撮像条件について算出された前記予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、前記撮像条件をその領域の確定撮像条件とする工程を有する、
請求項５記載の画像読取り方法。
【請求項７】
前記（ｅ−５’）工程において、前記撮像条件がその領域の確定撮像条件とされた場合、当該領域について、前記（ｃ）工程で算出した蛍光強度を読取り値として採用し、前記（ｆ−１）工程を省略する、請求項６記載の画像読取り方法。
【請求項８】
前記撮像条件は、あらかじめ３つ以上の撮像条件が準備され、前記第１の撮像条件として、この３つ以上の撮像条件を受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を採用する、
請求項５乃至７のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項９】
前記（ｅ−５）工程及び（ｅ−６）工程における、前記次の撮像条件として、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも受光量が少ない撮像条件を、受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を採用する、
請求項８に記載の画像読取り方法。
【請求項１０】
前記（ｄ−１）工程における、蛍光強度が有意であるか否かの判定において、蛍光強度が飽和しておらず、かつ蛍光強度がバックグラウンド値よりも大きい場合に、蛍光強度が有意であると判定する、請求項２乃至９のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１１】
前記撮像条件は、あらかじめ複数の撮像条件が準備され、該複数の撮像条件を受光量順に並べた際、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記撮像条件が準備されている、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１２】
前記撮像条件は、さらに、バックグラウンド値を減算した後でも、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記撮像条件が準備されている、請求項１１に記載の画像読取り方法。
【請求項１３】
前記（ｅ）工程で、前記次の撮像条件を設定できない場合、前記（ｅ）工程に続く（ｆ）工程で撮像を行わず、続く（ｄ）工程で撮像を終了すると判定する、
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１４】
前記試料が、バイオチップである、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる蛍光強度を発する領域が複数存在する試料の蛍光画像の読取り方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光レーザスキャナや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置を用いた蛍光観察において、観察する試料によっては観察視野内に異なる蛍光強度を発する領域が複数存在するものがある。
数十から数万個の異なる種類のＤＮＡ、タンパク質、抗体等の生体関連物質がプローブとして固定された試料としてバイオチップが知られている。バイオチップから検出する蛍光強度は、弱いものから強いものまで幅広い範囲で存在する。
通常、蛍光を読取る場合、出来る限り受光量が多くなるような条件で撮像したほうが、情報量が多くなる。
しかし、検出する際、強い蛍光を発する領域の蛍光強度が飽和しないように励起光の出力強度や露出時間等の露光条件を調整して撮像すると、弱い蛍光を発する領域の明るさが不十分となり正確な蛍光量を検出できない。
一方、弱い蛍光を発する領域の明るさが十分になるように、励起光の出力強度や露出時間等の露光条件を調整して撮像すると、強い蛍光を発する領域の蛍光強度が飽和して正確な蛍光量を検出できないという現象が発生する。これは、撮像対象の発する蛍光量のダイナミックレンジが、検出装置で読取れるダイナミックレンジよりも大きいために発生する問題である。
このような問題を解決するために、受光量を変化させながら複数の画像を取得したのち、これらの複数の画像同士を比較して、領域ごとに適正露光条件である画像を選択することで、大きなダイナミックレンジで検出する方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３８３４５１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上述した特許文献１に記載された方法では、試料の種類を問わず、機械的に複数の画像を取得するため、1枚の画像のダイナミックレンジで補えることが可能な試料についても、検出に全く必要としない画像まで取得する必要がある。そのため、検出時間の高速化、検出データ容量の低減化は非常に困難である。
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、所定の撮像条件で蛍光画像を撮像し、この撮像された蛍光画像に含まれる各領域の蛍光強度に基づいて、撮像の終了の判定や、さらなる撮像の撮像条件の設定を行うことで、各領域に関する適切な条件での撮像を実現して、検出時間の高速化、検出データ容量の低減化を実現する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、蛍光を発する領域が複数存在する試料から蛍光画像を読取る画像読取り方法であって、
（ａ）第１の撮像条件を設定する工程と、
（ｂ）第１の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｃ）撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する工程と、
（ｄ）算出された各領域の蛍光強度に基づいて、撮像を終了するか否か判定する工程と、
（ｅ）（ｄ）工程で撮像を終了しないと判断された場合、（ｃ）工程で算出された各領域の蛍光強度に基づいて、次の撮像条件を設定する工程と、
（ｆ）次の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｇ）（ｃ）工程から（ｆ）工程を、（ｄ）工程で撮像を終了すると判定されるまで、繰返す工程と、
を有することを特徴とする。【０００６】
このように構成された本発明によると、所定の撮像条件で撮像した結果に基づいて、それ以降の撮像を行うので、効率的に撮像を行うことができ、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。【０００７】
本発明において、好ましくは、（ｄ）工程は、
（ｄ−１）（ｃ）工程で算出した、各領域の蛍光強度について、蛍光強度が有意であるか否かを判定する工程と、
（ｄ−２）蛍光強度が有意であると判定された領域について、（ｃ）工程で算出した蛍光強度を当該領域の蛍光強度の読取り値として採用する工程を有し、
（ｅ）工程は、
（ｅ−１）蛍光強度が有意でないと判定された領域が存在する場合、（ｄ）工程における判定対象となった蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件を当該領域の次の撮像条件として設定する工程を有する。【０００８】
このように構成された本発明によると、撮像する毎に領域の蛍光強度を算出し、次の撮像条件の画像が必要かどうかを都度判断することで、検出に使用しない画像の取得を回避するとともに、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。【０００９】
本発明において好ましくは、（ｄ）工程は、
（ｄ−３）（ｄ−１）工程で、前記蛍光画像に含まれる複数の領域について、全て蛍光強度が有意である、と判定されたとき、撮像を終了すると判定する工程を有する。【００１０】
このように構成された本発明によると、検出に使用しない画像の取得を回避するとともに、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。【００１１】
また、本発明において好ましくは、（ｄ−２）工程において、前記算出工程で算出した蛍光強度を採用した領域に関しては、
（ｇ）工程中の、（ｃ）工程の適用を省略する。【００１２】
このように構成された本発明によると、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。【００１３】
また、本発明において好ましくは、（ｄ）工程は、
（ｄ−１）（ｃ）工程で算出した、各領域の蛍光強度について、蛍光強度が有意であるか否かを判定する工程を有し、
（ｅ）工程は、
（ｅ−２）蛍光強度が有意であると判定されたそれぞれの領域について、撮像条件の受光量よりも多い受光量となる、１つ又は２つ以上の撮像条件を抽出する工程と、
（ｅ−３）以下の式により、各抽出された撮像条件に関する予測蛍光強度をそれぞれ算出する工程と、
式：予測蛍光強度＝（領域の蛍光強度／基準撮像条件）×抽出された撮像条件
（ここで、基準撮像条件は、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件）
（ｅ−４）各抽出された撮像条件について算出された予測蛍光強度のうち、有意の予測蛍光強度の中から、最も高い予測蛍光強度に対応する撮像条件を、その領域の確定撮像条件とする工程と、
（ｅ−５）前記（ｅ−４）工程において、抽出された各撮像条件について算出された予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件をその領域の次の撮像条件として設定する工程と、
（ｅ−６）蛍光強度が有意でないと判定されたそれぞれの領域について、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件をその領域の次の撮像条件として設定する工程とを有し、
（ｆ）工程はさらに、
（ｆ−１）各領域について（ｅ−４）工程で得られた確定撮像条件により蛍光画像を撮像する工程を有し、
（ｄ）工程はさらに、
（ｄ−４）各領域について（ｆ−１）工程で撮像され、（ｃ）工程で算出された蛍光強度を、各領域の読取り値として採用して、撮像を終了すると判定する工程を有する。【００１４】
このように構成された本発明によると、基準撮像条件で撮像した蛍光画像から各領域の蛍光強度が適切に得られる撮像条件を領域ごとに算出し、その撮像条件で撮像した画像から蛍光強度を読取ることで有意かつダイナミックレンジの広い数値化が可能となる。さらには、検出に使用しない画像の取得を回避するとともに、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。【００１５】
また、本発明において好ましくは、（ｅ−５）工程の代わりに、
（ｅ−５’）（ｅ−４）工程において、抽出された各撮像条件について算出された予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、撮像条件をその領域の確定撮像条件とする工程を有する。【００１６】
このように構成された本発明によると、検出時間の高速化を実現することが可能となる。【００１７】
また、本発明において好ましくは、（ｅ−５’）工程において、撮像条件がその領域の確定撮像条件とされた場合、当該領域について、（ｃ）工程で算出した蛍光強度を読取り値として採用し、前記（ｆ−１）工程を省略する。【００１８】
このように構成された本発明によると、検出時間の高速化を実現することが可能となる。【００１９】
また、本発明において好ましくは、撮像条件は、あらかじめ３つ以上の撮像条件が準備され、第１の撮像条件として、この３つ以上の撮像条件を受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を採用する。【００２０】
このように構成された本発明によると、検出時間の高速化を実現することが可能となる。【００２１】
また、本発明において好ましくは、（ｅ−５）工程及び（ｅ−６）工程における、次の撮像条件として、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件よりも受光量が少ない撮像条件を、受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を採用する。【００２２】
このように構成された本発明によると、検出時間の高速化を実現することが可能となる。【００２３】
また、本発明において好ましくは、（ｄ−１）工程における、蛍光強度が有意であるか否かの判定において、蛍光強度が飽和しておらず、かつ蛍光強度がバックグラウンド値よりも大きい場合に、蛍光強度が有意であると判定する。【００２４】
このように構成された本発明によると、蛍光強度として意味のある値を読取るので、適切な画像読取りが可能となる。【００２５】
また、本発明において好ましくは、撮像条件は、あらかじめ複数の撮像条件が準備され、該複数の撮像条件を受光量順に並べた際、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め撮像条件が準備されている。【００２６】
このように構成された本発明によると、読取り可能な蛍光強度値が連続しているため、様々な試料に対して、適切な画像読取りが可能となる。【００２７】
また、本発明において好ましくは、撮像条件は、さらに、バックグラウンド値を減算した後でも、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め撮像条件が準備されている。【００２８】
このように構成された本発明によると、バックグラウンド値を減算した後でも、読取り可能な蛍光強度値が連続しているため、様々な試料に対して、適切な画像読取りが可能となる。【００２９】
また、本発明において好ましくは、（ｅ）工程で、次の撮像条件を設定できない場合、（ｅ）工程に続く（ｆ）工程で撮像を行わず、続く（ｄ）工程で撮像を終了すると判定する。【００３０】
このように構成された本発明によると、適切な撮像条件が設定できない試料に関して、撮像を的確に終了することができる。【００３１】
また、本発明において好ましくは、試料がバイオチップである。【００３２】
このように構成された本発明によると、検出時間が高速化され、検出データ容量が低減化された画像読取り方法をバイオチップを対象にして用いることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、所定の撮像条件で蛍光画像を撮像し、この撮像された蛍光画像に含まれる各領域の蛍光強度に基づいて、撮像の終了の判定や、さらなる撮像の撮像条件の設定を行うことで、各領域に関する適切な条件での撮像を実現して、検出時間の高速化、検出データ容量の低減化を実現する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】バイオチップの蛍光画像の例を示す図である。
【図２】露光時間と試料からの蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図３】撮像された領域の蛍光画像の拡大図である。
【図４】輝点のある領域の蛍光画像の拡大図である。
【図５】本発明に係る画像読取り方法の第１の実施形態の処理を示すフローチャート図である。
【図６】本発明に係る画像読取り方法の第２の実施形態の処理を示すフローチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
はじめに、本明細書中に記載する用語の説明を行う。
蛍光を発する領域が複数存在する試料であって、「異なる蛍光強度を発する領域が複数存在する試料」の一例として、図１に示すようなバイオチップの蛍光画像が相当する。バイオチップ１１は、蛍光強度を発する領域１２が、２次元状に複数配置されており、個々の領域が発する蛍光は、弱いものから強いものまで多数存在しているものである。配置されている領域の大きさ、形状、個数やピッチは特に制限されるものではない。
【００３６】
「バイオチップ」とは、担体上に多数のプローブを高密度にそれぞれ独立に固定化したものである。バイオチップは、支持体上に、プローブ（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）が固定されたものであれば、限定はされない。
バイオチップについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  ７６７−７７３（１９９１）等参照）。
【００３７】
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、オリゴヌクレオチドプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるバイオチップが好ましく例示できる。このバイオチップは、貫通孔基板にオリゴヌクレオチドプローブを固定化したタイプのものと説明することができる（特許第３５１０８８２号公報等を参照、図１）。
【００３８】
支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。
【００３９】
「蛍光画像」とは、試料に励起光源からの励起光を照射して試料が発する蛍光を、撮像装置にて取得した画像のことである。励起光を発する励起光源として利用できるものは、レーザー、水銀ランプ、ＬＥＤ等があるが、観察したい蛍光を励起する波長の光を照射できるものであればどのようなものでもよい。撮像装置として利用できるものは、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳセンサ、ＰＭＴ等があるが、特に限定されるものではない。
【００４０】
「撮像条件」とは、特に受光量について、試料の蛍光強度をどの程度撮像装置で受光するかを決める条件である。受光量を変える方法としては、サンプルへ照射する励起光の照射強度を変更することや、撮像装置の設定を変更することで実現できる。照射強度を変更する場合、励起光源の出力を直接変更することや、励起光の光路中にＮＤフィルタ等を挿入することで、サンプルへの励起光の照射強度を変更することができる。また、撮像装置の設定を変更する場合、例えば、撮像装置としてＣＣＤカメラを使用するときは、撮像の露光時間を変更することや、ゲインを変更することによって受光量を変更することができる。条件を変更するために使用する励起光源や撮像装置ごとの特性があるため、事前に、同一試料を用いてそれぞれの条件を変更させて取得した蛍光強度から、条件と受光量の関係を算出しておくほうが良い。
【００４１】
例えば、16bitのＣＣＤカメラを撮像装置として使用した場合、試料の蛍光強度は、図２に示すような露光時間と受光量の関係で撮像装置に取り込むことができる。ＣＣＤカメラが読取れる試料からの蛍光強度を1秒相当に換算すると、露光時間1秒では1〜65535、0.1秒では10〜655350、10秒では0.1〜6553.5、100秒では0.01〜655.35の明るさを読取ることができる。このような複数の撮像条件はあらかじめ準備されており、設定する複数の撮像条件の基準は、これら複数の撮像条件を受光量順（昇順又は降順）に並べた際、1秒相当に換算した蛍光強度に重なりが生じる条件とするのが良く、すなわち各々の撮像条件で読取れる換算後の蛍光強度の間にギャップが生じないようにするのが良い。また、撮像された蛍光画像のバックグラウンド値を減算した後でも、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め撮像条件を準備するのが好ましい。
【００４２】
図３に、例として、ある試料の所定領域の蛍光画像の拡大図を示す。領域３１は、２次元状の画素３２によって構成される。
【００４３】
「領域の蛍光強度を算出する」とは、領域の境界３３の内側にある各画素３２の蛍光強度の値に基づいて、領域３１の蛍光強度の値の情報を得ることであり、領域の境界３３の内側にある画素３２の全ての蛍光強度について、例えば、平均値、中央値、最小値、最大値、標準偏差、ＣＶ（変動係数）などの代表的な統計量を算出することである。この場合に使用する画像は、撮像した直後の蛍光画像だけでなく、例えば、バックグラウンド補正（バックグラウンド値を減算する）やシェーディング補正等の画像補正を行った蛍光画像を用いても良く、使用者が適宜選択すればよい。
【００４４】
以下の各実施形態において「蛍光強度が有意である」とは、ある撮像条件で撮像された試料の蛍光強度が飽和していないことを示している。「飽和」の意味については後述する。逆に、蛍光強度が飽和しているか又は蛍光強度がバックグラウンド値以下である場合は、得られた蛍光強度の値には、測定値としての意味が無いと判断される。このような場合は蛍光強度が有意ではない、と判定される。なお、蛍光強度が飽和しておらず、かつ蛍光強度がバックグラウンド値よりも大きいことを、蛍光強度が有意であることの条件としてもよい。
【００４５】
「飽和」とは、例えば、撮像装置が16bitのＣＣＤカメラを用いた場合、読取り上限値である65535が飽和状態に相当するが、機器のノイズ等の外因によって蛍光強度の数値は振れるため、例えば60000以上の場合に飽和していると判断するというように使用者が任意の値を設定すればよい。領域内の画素に1画素でも飽和値が存在すると、例えば平均値については正しい蛍光強度を算出することができないが、中央値を使用すれば、領域内を構成する画素のうち飽和画素、輝点画素及びこれらによって影響を受けた画素の合計が、全画素の5割を超えない限り、意味のある値を算出できるため、領域の代表値としては平均値より中央値を用いる方が好ましい。その領域の蛍光強度が飽和しているかどうかを判断する画素数は、必要に応じて使用者が任意の値を設定すればよい。
【００４６】
図４に、図３とは異なる別の領域の蛍光画像の拡大図を示す。領域４１の上には異物が乗っているため、その異物が励起されて蛍光を発し、輝点４２として撮像される。その場合、領域内の正確な蛍光強度を算出できないため、更に受光量の弱い撮像条件で撮像した蛍光画像から領域の蛍光強度を算出しなければならない。ここで、当領域内の全画素の蛍光強度に対して公知の輝点除去処理（特許第4979516号）を適用することで、輝点の影響を除外した蛍光強度の算出が可能となる。
【００４７】
この処理のため、まず、領域４１の全画素を昇順に並べた後、中央値、第１四分位数、第３四分位数をそれぞれ求める。その後、輝点と判断するための閾値を、以下の式に基づいて算出する。
閾値＝中央値＋（第３四分位数―第１四分位数）×α        ・・・式１
（α：輝点除去の感度）
【００４８】
領域４１を構成する１つ１つの画素の蛍光強度が、閾値以上かどうかを比較し、閾値以上のものは輝点として、領域４１を構成する画素から除外する。その後、残った画素に飽和があるかないかを判断し、飽和していなければその領域の蛍光強度を算出することが可能となる。
【００４９】
また、装置バックグラウンド補正やシェーディング補正等の画像補正を行った蛍光画像から領域の蛍光強度を算出する場合でも、輝点除去処理を組合せることもできる。撮像直後、すなわち未補正の蛍光画像に予め決めた画像補正を施した補正画像に対して輝点除去を行い、そこで輝点と判断された画素をメモリ上に記憶し、未補正の蛍光画像に対してメモリ上に記憶した位置の画素を輝点として除去した後、残ったその領域の画素に飽和があるかを判断する。その際飽和していなければ、補正画像の輝点除去後の蛍光強度を算出する。
【００５０】
「採用、非採用」とは、その領域内に飽和画素が存在するか存在しないかを判定し、飽和画素が存在する場合は、当撮像条件の数値結果は採用しない（非採用）と判定し、飽和画素が存在しない場合は、算出した蛍光強度をその領域の数値結果として採用する（採用）ことである。ここで、複数の撮像条件から算出した蛍光強度を比較できるようにするため、事前に算出した、撮像条件と受光量の関係式を用いて同一条件となるように換算することで、複数の撮像条件の結果を比較することが可能となる。全ての領域において採用と判定された時点で同一条件となるように換算した結果を出力してもよいし、採用または非採用を判定するごとに結果を出力しても良い。
【００５１】
次に、本発明に係る画像読取り方法の第１の実施形態について図５のフローチャート図を参照して説明する。本実施形態に係る画像読取り方法を実行する場合、画像読み取りの対象となる蛍光画像の撮像は、公知の撮像装置を用いて取得したものを使用することができる。例えば、特許第３８３４５１９号公報に記載された装置の構成を用いることができる。本来、実際に蛍光強度の測定を実行するまでは、試料の各領域から発する蛍光強度は不明であるが、ここでは説明の都合上予め以下の状態の試料を用いたものと仮定する。
【００５２】
試料の状態
蛍光強度を発する領域の数：4個
撮像装置(16bitのＣＣＤカメラ)を用いた場合の1.0秒露光相当の蛍光強度：
領域Ａ：100、領域Ｂ：2000、領域Ｃ：20000、領域Ｄ：100000
【００５３】
本実施形態では、一連の処理を開始するにあたって、予め設定した、受光量の異なる複数の撮像条件を、受光量が降順となる順序に整列する開始処理を行う（ステップＳ１０１）。本実施形態では、複数の撮像条件について、それぞれ受光量を変えて設定する。本実施形態では撮像装置（16bitのＣＣＤカメラ）の露光時間を、0.1秒、1.0秒、4.0秒、40.0秒の4種類とした。本撮像条件を受光量が降順となる順序に整列すると、ａ：40.0秒、ｂ：4.0秒、ｃ：1.0秒、ｄ：0.1秒の順に整列できる。なお、撮像装置の設定と受光量の関係として、ＣＣＤカメラでは露光時間と受光量が比例することが一般的に知られている。
各露光時間の設定で撮像した蛍光強度を、その露光時間で割ることによって、1秒あたりの蛍光強度に換算することが可能となり、このようにして得られた蛍光強度に基づいて、蛍光強度の比較が可能となる。
【００５４】
次に、上述した撮像条件のうち、第１番目の撮像条件で蛍光画像を撮像する撮像工程を行う（ステップＳ１０２）。本実施形態では、試料に励起光を照射した状態で、第１番目の撮像条件である、40.0秒で露光した蛍光画像を撮像する。蛍光物質は、励起光を照射し続けると退色することが知られており、蛍光画像の撮像時以外は試料に励起光が照射されないよう、シャッター等で遮ることが望ましい。なお、本実施形態では、予め複数の撮像条件について、受光量が降順となる順序で整列設定し、まず第１番目の撮像条件で撮像工程を行うが、このような複数の撮像条件を予め整列設定する以外にも、後述する繰り返し工程の開始点となる撮像の初期設定として所定の撮像条件を適用しても構わない。
【００５５】
続いて、上述した撮像工程で撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する算出工程を行う（ステップＳ１０３）。本実施形態において、各領域の蛍光強度の算出は公知の技術を用いることが可能であり、一般的な画像解析ソフトを利用することで容易に算出することができる。ここで実際の蛍光強度は領域Ａ：4000、領域Ｂ：80000、領域Ｃ：800000、領域Ｄ：4000000であるが、ＣＣＤカメラが16bitであるため領域Ｂ〜Ｄについて算出される蛍光強度はそれぞれ65535となる。
【００５６】
次に、算出工程で算出した各領域の蛍光強度について、蛍光強度が飽和しているか否かを判定し、蛍光強度が飽和していないと判定された領域について、算出工程で算出した蛍光強度を採用する飽和判定工程を行う（ステップＳ１０４）。本実施形態において、蛍光強度が有意であるか否かは、蛍光強度が飽和しているか否かに基づいて判断される。蛍光強度が飽和していなければ蛍光強度は有意であり、蛍光強度が飽和していれば蛍光強度は有意ではない。本実施形態において、各領域の蛍光強度について飽和していること（すなわち蛍光強度が有意ではないこと）を判断する指標として、領域内に65000を超える蛍光強度が1画素以上存在した場合を飽和と定めた場合、領域Ｂ〜Ｄは飽和しているため第1番目の撮像条件での蛍光強度は非採用と判定され、一方、領域Ａは飽和していないため、蛍光強度は有意であり、本露光時間の蛍光強度は採用と判定される。
【００５７】
続いて、上述した飽和判定工程を経た蛍光画像について、読取り終了条件を満たすか否かを判定する終了判定工程を行う（ステップＳ１０５）。この読取り終了条件として、例えば、蛍光画像に含まれる複数の領域について、蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在しなくなったこと（すなわち全ての領域で蛍光強度が有意であること）を条件とすることが可能である。本実施形態において、領域A〜Dの各領域について、蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在しなくなった、すなわち領域A〜Dのすべてが飽和しておらず、すべての蛍光強度が採用、と判定された場合、読取りを終了する（ステップＳ１０５のＹｅｓからステップＳ１０６）。
【００５８】
終了判定工程において、蛍光強度が飽和していると判定された領域（すなわち蛍光強度が有意ではないと判定された領域）が存在する場合、本実施形態は処理を継続する（ステップＳ１０５のＮｏ）。蛍光強度が飽和していると判定された領域については、撮像工程Ｓ１０２で適用された撮像条件が適切ではなかったと考えられる。そこで、撮像工程Ｓ１０２で適用された撮像条件よりも受光量が少ない撮像条件を適用する（ステップＳ１０７）。本実施形態の例では、飽和判定工程Ｓ１０４において、領域Ｂ〜Ｄの3つの領域が飽和していると判定されたため、より受光量が少ない次の撮像条件、すなわち第2番目の撮像条件である、ｂ：4.0秒で露光するように設定する。
【００５９】
そして、試料に励起光を照射した状態で、新たな撮像条件を適用して、蛍光画像を撮像する（ステップＳ１０７からステップＳ１０２）。本実施形態の例では、新たに適用された次の撮像条件、ｂ：4.0秒で露光した蛍光画像を撮像する。その後、上述した算出工程（ステップＳ１０３）や飽和判定工程（ステップＳ１０４）、終了判定工程（ステップＳ１０５）が繰り返し適用される。
【００６０】
本実施形態の例において、第２番目の撮像条件であるｂ：4.0秒で露光する設定で撮像された蛍光画像について、算出工程（ステップＳ１０３）で蛍光強度を算出する領域は、Ｂ〜Ｄの3つの領域についてであり、既に算出された蛍光強度を採用した領域Ａについては、処理の高速化・効率化のために、この算出工程以下、各工程の実施を省略する。算出工程が行なわれる領域Ｂ〜Ｄの実際の蛍光強度は、領域Ｂ：8000、領域Ｃ：80000、領域Ｄ：400000であるが、ＣＣＤカメラが16bitであるため領域Ｃ〜Ｄについて算出される蛍光強度はそれぞれ65535となる。
【００６１】
本実施形態の例において、第2番目の撮像条件で撮像された蛍光画像から算出された蛍光強度について、さらに飽和判定工程を行う。上述したように、第2番目の撮像条件においても、領域Ｃ〜Ｄは飽和しているため第2番目の撮像条件での蛍光強度は非採用と判定され、一方、領域Ｂは飽和していないため第2番目の撮像条件での蛍光強度を採用と判定される。以下、同様に処理が継続され、撮像条件を変え続け、蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在しなくなると、読取り処理が終了する。
本実施形態の例において、最終的に、採用した撮像条件（露光時間）と、その露光時間での蛍光強度、それを基に露光時間1秒相当に換算した蛍光強度は表１に示す結果を得ることが可能となる。
【表１】
2015037724.tif 000003
【００６２】
このように、本発明の実施形態によると、撮像する毎に領域の蛍光強度を算出することで、検出に使用しない画像の取得を回避するとともに、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。
【００６３】
なお、本実施形態の画像読取り方法では、全ての領域の蛍光強度が飽和しない（すなわち全ての領域で蛍光強度が有意である）と判定された時点で、本蛍光画像の読取りを終了するが、最も受光量の少ない撮像条件においても蛍光強度が飽和する領域が存在した場合については、その領域が飽和して正確な蛍光強度が算出できなかったことを使用者に適宜結果として出力すればよい。この場合、読取り終了条件として、「蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在しなくなったこと」の他に、「撮像条件をこれ以上変えられないこと」が条件として付け加えることになる。
【００６４】
上述した第１の実施形態では、蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在しなくなったことを読取り終了条件としているが、この他にも、全領域の面積に対して、蛍光強度が飽和していると判定された領域の面積が所定比率以下になったことを読取り終了条件とすることも可能である。
【００６５】
次に、本発明に係る画像読取り方法の第２の実施形態について図６のフローチャート図を参照して説明する。上述した第１の実施形態と同様に、本実施形態に係る画像読取り方法を実行する場合も、画像読み取りの対象となる蛍光画像の撮像は、公知の撮像装置を用いて取得したものを使用することができる。例えば、特許第３８３４５１９号公報に記載された装置の構成を用いることができる。本来、実際に蛍光強度の測定を実行するまでは、試料の各領域から発する蛍光強度は不明であるが、ここでは説明の都合上予め以下の状態の試料を用いたものと仮定する。
【００６６】
試料の状態
蛍光強度を発する領域の数：5個
撮像装置(16bitのＣＣＤカメラ)を用いた場合の1.0秒露光相当の蛍光強度：
領域Ａ：500、領域Ｂ：2000、領域Ｃ：20000、領域Ｄ：100000、領域Ｅ：1000000
【００６７】
本実施形態に関し、以下の説明において「基準撮像条件」とは、領域ごとの最適な撮像条件である確定撮像条件を求めるために基準として用いられる撮像条件であり、下記のステップＳ２０４で蛍光強度を算出した蛍光画像の撮像条件である。後述するステップＳ２０２で第１の撮像条件が設定され、これが最初の基準撮像条件に対応する。その後、確定撮像条件が決定できない領域がある場合は、新たに次の撮像条件が設定され、これが次の基準撮像条件に対応する。
【００６８】
また、本実施形態に関し、以下の説明において「予測蛍光強度」とは、基準撮像条件となる撮像条件で撮像された蛍光画像から算出した領域の蛍光強度をもとに、別の撮像条件で撮像された場合について予測される蛍光強度である。前述したように、ＣＣＤカメラの場合、露光時間と受光量は比例した関係にある。基準撮像条件が10秒の露光時間として、ある領域の蛍光強度が1000であった場合、別の撮像条件が20秒の露光時間であったとすると、その蛍光強度は、2000程度になると予測できる。
【００６９】
本実施形態では、あらかじめ受光量の異なる３つ以上の撮像条件が準備されており、具体的には以下で説明する７つの撮像条件を準備している。本実施形態では、一連の処理を開始するにあたって、これらの受光量の異なる複数の撮像条件を、受光量が昇順となる順序に整列する開始処理を行う（ステップＳ２０１）。本実施形態では、複数の撮像条件について、それぞれ受光量を変えて設定する。本実施形態では撮像装置（16bitのＣＣＤカメラ）の露光時間を、0.01秒、0.1秒、1.0秒、4.0秒、40.0秒、100.0秒、400.0秒の７種類とした。本撮像条件を受光量が昇順となる順序に整列すると、ａ：0.01秒、ｂ：0.1秒、ｃ：1.0秒、ｄ：4.0秒、e：40.0秒、f：100.0秒、g：400.0秒の順に整列できる。なお、撮像装置の設定と受光量の関係として、ＣＣＤカメラでは露光時間と受光量が比例することが一般的に知られている。各露光時間の設定で撮像した蛍光強度を、その露光時間で割ることによって、1秒あたりの蛍光強度に換算することが可能となり、このようにして得られた蛍光強度に基づいて、蛍光強度の比較が可能となる。なお、本実施形態では撮像条件を受光量が昇順となる順序に整列しているが、降順となる順序に整列しても構わない。つまり、昇順であっても降順であっても、撮像条件が受光量順に並べられていればよい。
【００７０】
次に、撮像条件（基準撮像条件となる第１の撮像条件）の設定を行う（ステップＳ２０２）。本実施形態では、ステップＳ２０１に続いて、上述した撮像条件の中央値、すなわち、第4番目の撮像条件であるｄを基準撮像条件となる第１の撮像条件に設定する。なお、本実施形態では、あらかじめ準備された撮像条件が奇数個であったため、ちょうど中央に位置する第４番目の撮像条件を第１の撮像条件に設定した。あらかじめ準備された撮像条件が偶数個であった場合、中央付近の２つの撮像条件のいずれかを第１の撮像条件に設定するのがよい。つまり、複数の撮像条件を受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を第１の撮像条件として採用すればよい。
続いて、設定された撮像条件（ステップＳ２０１、ステップＳ２０２の流れにおいては、基準撮像条件となる第１の撮像条件）で蛍光画像を撮像する（ステップＳ２０３）。試料に励起光を照射した状態で、4.0秒で露光した蛍光画像を撮像する。蛍光物質は、励起光を照射し続けると退色することが知られており、蛍光画像の撮像時以外は試料に励起光が照射されないよう、シャッター等で遮ることが望ましい。
【００７１】
上述した撮像工程（ステップＳ２０３）で撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する算出工程を行う（ステップＳ２０４）。本実施形態において、各領域の蛍光強度の算出は公知の技術を用いることが可能であり、一般的な画像解析ソフトを利用することで容易に算出することができる。ここで実際の蛍光強度は、領域Ａ：2000、領域Ｂ：8000、領域Ｃ：80000、領域Ｄ：400000、領域Ｅ：4000000であるが、ＣＣＤカメラが16bitであるため領域Ｃ〜Ｅについて算出される蛍光強度はそれぞれ65535となる。この算出工程（ステップＳ２０４）で蛍光強度を算出した蛍光画像は、撮像工程（ステップＳ２０３）で撮像されたものであり、この撮像工程（ステップＳ２０３）の撮像条件はステップＳ２０２で設定されたものであり、この撮像条件が基準撮像条件である。
【００７２】
次に、確定撮像条件の算出を行う（ステップＳ２０５）。まず、上述した判断撮像条件から算出した各領域の蛍光強度について、飽和の判定（すなわち蛍光強度が有意であるか否かの判定）を行う。本実施形態において、各領域の蛍光強度について飽和していることを判断する指標として、領域内に65000を超える蛍光強度が1画素以上存在した場合を飽和と定めた場合、領域Ａ〜Ｂは飽和していない（すなわち蛍光強度が有意である）、領域Ｃ〜Ｅは飽和している（すなわち蛍光強度が有意ではない）と判定される。
続いて、受光量が基準撮像条件（ステップＳ２０３で撮像された蛍光画像の撮像条件）における受光量以上となる撮像条件を抽出する。本実施形態では、撮像条件ｄ〜ｇの４種類が抽出される。
次に、予測蛍光強度の算出を行う。予測蛍光強度の算出は、上述した飽和していない領域Ａ〜Ｂに対して、上述したように抽出された撮像条件ｄ〜gについて算出する。
【００７３】
予測蛍光強度＝（領域の蛍光強度／基準撮像条件）×抽出された撮像条件  ・・・式２
上記式２にもとづいて算出した予測蛍光強度は表２に示す結果となる。
【００７４】
【表２】
2015037724.tif 000004
【００７５】
続いて、領域ごとの確定撮像条件の決定を行う。表２の予測蛍光強度が、飽和していない、かつ、最も高い予測蛍光強度を選択すると、領域Ａは撮像条件ｆ：100.0秒、領域Ｂは撮像条件ｄ：4.0秒がそれぞれ確定撮像条件として決定される。
【００７６】
次に、全ての領域に対して確定撮像条件が決定したかの判定を行う（ステップＳ２０６）。これまでに、領域Ｃ〜Ｅは確定撮像条件が決定していないため（ステップＳ２０６のＮｏ）、領域Ｃ〜Ｅについて、次の撮像条件の設定（ステップＳ２０２）から同じ計算処理を行う。
次の撮像条件は、上述した第１の撮像条件とは異なる新たな撮像条件を設定する。ここまでのステップにおいて、撮像条件ｄ〜ｇを確定撮像条件の設定に使用しているため、残りの撮像条件ａ〜ｃの中から選択する。ステップＳ２０２について上述した方法と同様に、基準撮像条件よりも受光量が少ない残りの撮像条件を受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する撮像条件を次の撮像条件とする。これら３種類の条件の中央値を選択すると、領域Ｃ〜Ｅに関する確定撮像条件を求めるための基準となる次の撮像条件はｂ：0.1秒となる。
【００７７】
以下、次の撮像条件ｂ：0.1秒に基づいて同様にステップＳ２０３〜ステップＳ２０５の操作を行うことで、領域Ｃの確定撮像条件が撮像条件ｃ、領域Ｄの確定撮像条件が撮像条件ｂとなる。領域Ｅについては確定撮像条件が決定していないため、引き続きステップＳ２０２に戻り、次の撮像条件として撮像条件ａが選択され、同様にステップＳ２０３〜ステップＳ２０５の操作が行われる。結果として、各領域の確定撮像条件は、領域Ａが撮像条件ｅ、領域Ｂが撮像条件ｄ、領域Ｃが撮像条件ｃ、領域Ｄが撮像条件ｂ、領域Ｅが撮像条件ａとなる。
確定撮像条件を決定する中で、全ての領域が飽和しない状態にたどり着いた時点で、全ての領域に関する確定撮像条件が決定され、一連の確定撮像条件の決定を終了する（ステップＳ２０６のＹｅｓ）。また、最も受光量の少ない撮像条件においても飽和が存在した場合は、その領域が飽和して正確な蛍光強度が算出できなかったことを使用者に適宜結果として出力すればよい。
【００７８】
【表３】
2015037724.tif 000005
【００７９】
【表４】
2015037724.tif 000006
【００８０】
次に、確定撮像条件で撮像を行う（ステップＳ２０７）。撮像を行った後、それぞれの領域に対して、対応する撮像条件の蛍光強度のみ算出し、読取り（ステップＳ２０８）、一連の処理が終了する（ステップＳ２０９）。
本実施形態の例において、最終的に、採用した確定撮像条件（露光時間）と、その露光時間での蛍光強度、それを基に露光時間１秒相当に換算した蛍光強度は表５に示す結果を得ることが可能となる。
【００８１】
【表５】
2015037724.tif 000007
【００８２】
このように、本発明の実施形態によると、基準撮像条件で撮像した蛍光画像から各領域の蛍光強度が最適に得られる撮像条件を領域ごとに算出し、その撮像条件で撮像した画像から蛍光強度を読取ることで有意かつダイナミックレンジの広い数値化が可能となる。さらには、検出に使用しない画像の取得を回避するとともに、検出時間の高速化及び検出データ容量の低減化を実現することが可能となる。
【００８３】
なお、本実施形態において、確定撮像条件の算出に当たり、蛍光強度が飽和していない領域について、受光量が基準撮像条件における受光量以上となる撮像条件を抽出し、これらの中から確定撮像条件を算出するようになっている。上述したように、抽出された撮像条件について算出された予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、当該領域について、基準撮像条件を再設定して同様の処理を行うようにしている。再設定された基準撮像条件に基づいて、同様の処理が行われると、最終的に、再設定前の基準撮像条件が確定撮像条件として算出されることになる。このため、本実施形態の処理の代わりに、蛍光強度が飽和していない領域に関して、抽出された各撮像条件について算出された予測蛍光強度のうち、有意のものが存在しない場合、当該領域について、基準撮像条件を再設定するかわりに、現在の算出に使用されている基準撮像条件を当該領域の確定撮像条件とすることも可能である。このようにすると、計算処理の効率を上げることが可能となる。
【００８４】
また、本実施形態において、各領域について確定撮像条件を得た後、確定撮像条件で撮像を行い（ステップＳ２０７）、撮像を行った後、それぞれの領域に対して、対応する撮像条件の蛍光強度のみ算出する（ステップＳ２０８）ようにしている。一方、上述したように、基準撮像条件を再設定するかわりに、現在の算出に使用されている基準撮像条件を当該領域の確定撮像条件とする実施形態においては、既に確定撮像条件での撮像がされていると考えることも可能である。よって、撮像時間を節約するために、確定撮像条件での撮像等を省略して、基準撮像条件とされた撮像条件で撮像され算出工程（ステップＳ２０４）で蛍光強度を算出した蛍光強度を読取り値として採用することも可能である。
【００８５】
なお、上述した実施形態では、全領域について確定撮像条件を求めるようにしているが、この他にも、全領域の面積に対して、確定撮像条件が得られていない領域の面積が所定比率以下になった段階で、それ以上は確定撮像条件を求めずに、既に得られた確定撮像条件に基づいて撮像を行い、読取りを行うようにすることも可能である。
【図２】
2015037724.tif 000008
【図５】
2015037724.tif 000009
【図６】
2015037724.tif 000010
【図１】
2015037724.tif 000011
【図３】
2015037724.tif 000012
【図４】
2015037724.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月26日(2016.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を発する領域が複数存在する試料から蛍光画像を読取る画像読取り方法であって、
（ａ）第１の撮像条件を設定する工程と、
（ｂ）前記第１の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｃ）撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する工程と、
（ｄ）前記算出された各領域の蛍光強度に基づいて、撮像を終了するか否か判定する工程であって、
（ｄ−１）前記（ｃ）工程で算出した、前記各領域の蛍光強度について、蛍光強度が飽和しているか否かを判定する工程と、
（ｄ−２）蛍光強度が飽和していないと判定された領域について、前記（ｃ）工程で算出した蛍光強度を当該領域の蛍光強度の読取り値として採用する工程と、
（ｄ−３）前記（ｄ−１）工程で、前記蛍光画像に含まれる複数の領域について、全て蛍光強度が飽和していない、と判定されたとき、撮像を終了すると判定する工程を有する、
工程と、
（ｅ）前記（ｄ）工程で撮像を終了しないと判断された場合、前記（ｃ）工程で算出された各領域の蛍光強度に基づいて、次の撮像条件を設定する工程であって、
（ｅ−１）蛍光強度が飽和していると判定された領域が存在する場合、前記（ｄ）工程における判定対象となった蛍光画像の撮像条件よりも、受光量が少ない撮像条件を当該領域の次の撮像条件として設定する工程を有する、
工程と、
（ｆ）前記次の撮像条件で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｇ）前記（ｃ）工程から（ｆ）工程を、前記（ｄ）工程で撮像を終了すると判定されるまで、繰返す工程と、を有し、
前記（ｄ−２）工程において、前記算出工程で算出した蛍光強度を当該領域の蛍光強度の読取り値として既に採用した領域に関しては、前記（ｇ）工程中の繰返しの際、前記（ｃ）工程の適用を省略する、画像読み取り方法。
【請求項２】
前記撮像条件は、あらかじめ複数の撮像条件が準備され、該複数の撮像条件を受光量順に並べた際、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記撮像条件が準備されている、請求項１に記載の画像読取り方法。
【請求項３】
前記撮像条件は、さらに、バックグラウンド値を減算した後でも、各々の撮像条件で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記撮像条件が準備されている、請求項２に記載の画像読取り方法。
【請求項４】
前記（ｅ）工程で、前記次の撮像条件を設定できない場合、前記（ｅ）工程に続く（ｆ）工程で撮像を行わず、続く（ｄ）工程で撮像を終了すると判定する、
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項５】
前記試料が、バイオチップである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項６】
蛍光を発する領域が複数存在する試料から蛍光画像を読取る画像読取り方法であって、
（ａ）第１の露光時間を設定する工程と、
（ｂ）前記第１の露光時間で蛍光画像を撮像する工程と、
（ｃ）撮像された蛍光画像に含まれる複数の領域について、各領域の蛍光強度を算出する工程と、
（ｄ）前記算出された各領域の蛍光強度に基づいて、撮像を終了するか否か判定する工程であって、
（ｄ−１）前記（ｃ）工程で算出した、前記各領域の蛍光強度について、蛍光強度が飽和しているか否かを判定する工程を有する、
工程と、
（ｅ）前記（ｄ）工程で撮像を終了しないと判断された場合、前記（ｃ）工程で算出された各領域の蛍光強度に基づいて、次の露光時間を設定する工程であって、
（ｅ−２）蛍光強度が飽和していないと判定されたそれぞれの領域について、前記露光時間の受光量よりも多い受光量となる、１つ又は２つ以上の露光時間を抽出する工程と、
（ｅ−３）以下の式により、各抽出された露光時間に関する予測蛍光強度をそれぞれ算出する工程と、
式：予測蛍光強度＝（領域の蛍光強度／基準露光時間）×抽出された露光時間
（ここで、基準露光時間は、（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の露光時間）
（ｅ−４）各抽出された露光時間について算出された前記予測蛍光強度のうち、飽和していない予測蛍光強度の中から、最も高い予測蛍光強度に対応する露光時間を、その領域の確定露光時間とする工程と、
（ｅ−５）前記（ｅ−４）工程において、前記抽出された各露光時間について算出された前記予測蛍光強度のうち、飽和していないものが存在しない場合、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の露光時間よりも、受光量が少ない露光時間をその領域の前記次の露光時間として設定する工程と、
（ｅ−６）蛍光強度が飽和していると判定されたそれぞれの領域について、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の露光時間よりも、受光量が少ない露光時間をその領域の前記次の露光時間として設定する工程とを有する、
工程と、
（ｆ）前記次の露光時間で蛍光画像を撮像する工程であって、
（ｆ−１）各領域について前記（ｅ−４）工程で得られた確定露光時間により蛍光画像を撮像する工程を有する、
工程と、
（ｇ）前記（ｃ）工程から（ｆ）工程を、前記（ｄ）工程で撮像を終了すると判定されるまで、繰返す工程と、
を有し、
前記（ｄ）工程はさらに、
（ｄ−４）各領域について前記（ｆ−１）工程で撮像され、前記（ｃ）工程で算出された蛍光強度を、前記各領域の読取り値として採用して、撮像を終了すると判定する工程を有する、
画像読み取り方法。
【請求項７】
前記（ｅ−５）工程の代わりに、
（ｅ−５’）前記（ｅ−４）工程において、前記抽出された各露光時間について算出された前記予測蛍光強度のうち、飽和していないものが存在しない場合、前記露光時間をその領域の確定露光時間とする工程を有する、
請求項６記載の画像読取り方法。
【請求項８】
前記（ｅ−５’）工程において、前記露光時間がその領域の確定露光時間とされた場合、当該領域について、前記（ｃ）工程で算出した蛍光強度を読取り値として採用し、前記（ｆ−１）工程を省略する、請求項７記載の画像読取り方法。
【請求項９】
前記露光時間は、あらかじめ３つ以上の露光時間が準備され、前記第１の露光時間として、この３つ以上の露光時間を受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する露光時間を採用する、
請求項６乃至８のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１０】
前記（ｅ−５）工程及び（ｅ−６）工程における、前記次の露光時間として、前記（ｃ）工程で蛍光強度を算出した蛍光画像の露光時間よりも受光量が少ない露光時間を、受光量順に並べた場合に、中央付近に位置する露光時間を採用する、
請求項９に記載の画像読取り方法。
【請求項１１】
前記露光時間は、あらかじめ複数の露光時間が準備され、該複数の露光時間を受光量順に並べた際、各々の露光時間で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記露光時間が準備されている、請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１２】
前記露光時間は、さらに、バックグラウンド値を減算した後でも、各々の露光時間で読取れる蛍光強度の間にギャップが生じないように、予め前記露光時間が準備されている、請求項１１に記載の画像読取り方法。
【請求項１３】
前記（ｅ）工程で、前記次の露光時間を設定できない場合、前記（ｅ）工程に続く（ｆ）工程で撮像を行わず、続く（ｄ）工程で撮像を終了すると判定する、
請求項６乃至１２のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【請求項１４】
前記試料が、バイオチップである、請求項６乃至１３のいずれか１項に記載の画像読取り方法。
【国際調査報告】
2015037724.tif 000014
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