(57)【要約】  真菌の生育を促進する新規な方法を提供すること、また、当該方法に有用なポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供すること、更に、例えば、バイオエタノールの酵母による生産に最適な方法を提供することを目的とする。  真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの４３５位−グルタミンまでを含まず、少なくとも配列番号２の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでを含むアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
１)  配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの４３５位−グルタミンまでを含まない配列であって、少なくとも配列番号２の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでを含むアミノ酸配列；
２）  上記１）に対して少なくとも６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列；、又は
３）  上記１）のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
から成る、前記ポリペプチド。
【請求項２】
上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでの配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸或いは請求項４に記載のベクターを含む、真菌の生育を促進するための組成物。
【請求項７】
真菌の生育を促進する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸或いは請求項４に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
真菌のストレス耐性を向上する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸或いは請求項４に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌の生育を促進する方法、並びに当該方法に有用なポリペプチド及びそれをコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんど全ての発酵産業は、真菌を利用している。例えば、清酒、醤油、味噌の醸造にはアスペルギルス属の糸状菌が利用される。チーズの熟成にはペニシリウム属の糸状菌も利用される。清酒、ビールやワインの醸造には、サッカロミセス属の酵母が不可欠なことは言うまでもない。更にピキァ属等の酵母は、遺伝子組換え技術における宿主として多用されている。これらの発酵工程は、通常、用いられる真菌の生育にとって最適な環境下、例えば至適温度やｐＨで実施される。【０００３】
しかしながら、真菌の生育にとって最適な環境条件を維持するためには、多くのエネルギーと精緻なコントロールを必要とする。従って、発酵生産が、より広範な環境条件下（例えば、高温、低温、高ｐＨ、低ｐＨ、高アルコール濃度環境下等）でも生育可能な真菌、つまり環境ストレスに対して耐性を示す真菌が利用できれば、発酵工程の省エネルギー化や収量の増大を期待できるであろう。【０００４】
とりわけ、近年、バイオエタノール燃料生産における酵母の利用が脚光を浴びている。典型的なそれらの技術では、廃糖蜜、セルロース及びリグノセルロース等の植物体由来の原料を酵母により発酵してエタノールを得る。従って、当該技術の重要な課題は、その発酵工程に多大なエネルギーを費やさないということである。例えば、酵母の発酵には発熱を伴うので、酵母の最適な生育温度を維持するためには培養物を冷却しなければならないのが通常である。その他にも、酵母生育に最適なｐＨを維持するために多量の塩類を消費すると廃液による環境汚染の問題が生じるかもしれない。【０００５】
非特許文献１は、脂肪酸等の有用物質を出芽酵母により生産させる技術に関連している。当該文献は、外来遺伝子によりΔ１２不飽和化酵素及びω３不飽和化酵素を発現させたＳａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、親株よりもアルカリｐＨに対して耐性を示すことを記載している。非特許文献２は、バイオエタノール生産において有用な、高温耐性のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異株を、ＵＶ照射により得ている。非特許文献３も、ＵＶ照射により得られた高温耐性のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異株を記載している。【０００６】
ところで、最近、本発明者らは、特定のイネいもち病菌株に内在的に存在する新規なマイコウイルスを見出した。このマイコウイルス（以下、「ＭｏＣＶ１」と記載することもある。）は、既知のマイコウイルスＲＮＡの塩基配列のいずれとも異なる、２．８〜３．６ｋｂの４種類の二本鎖ＲＮＡをしていた。また、ＭｏＣＶ１に感染したイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）の分生子を、強毒性のイネいもち病菌の分生子と共にイネに接種することにより、病斑数を顕著に減少させ得た（特許文献１）。【０００７】
更に、本発明者らは、ＭｏＣＶ１の４つの主要蛋白質のうちのＰ７０蛋白質をコードするＯＲＦ４を過剰発現させたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、細胞の肥大化や細胞内の顆粒化といった形態異常を伴った生育不全示すことを見出した（非特許文献４）。【０００８】
しかしながら、本発明者らの知る限りにおいて、これまでにマイコウイルスを利用して真菌の生育を促進しようというアプローチはとられたことが無い。したがって、いずれの先行文献も、マイコウイルス及び当該ウイルス由来の蛋白質が、真菌の生育を促進することや、真菌にストレス耐性を付与し得ることを開示も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９/０９３４０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】植村  浩、「出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の脂肪酸組成とストレス耐性  〜エタノール耐性とアルカリ耐性の解析〜」、第１８３回酵母研究会例会、講演要旨（２０１２年１１月）
【非特許文献２】Ｈｏｓｅｉｎ  Ｓｈａｈｓａｖａｒａｎｉら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｈｕｂｒｉｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＪ１４  ｆｏｒ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏ−ｅｔｈａｎｏｌ」、酵母遺伝学フォーラム  第４５回研究報告会、講演要旨(２０１２年９月）
【非特許文献３】Ｍａｓａｈｉ  Ｋｏｂａｔａら、「Ｈｉｇｈ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｍｏｌａｓｓｅｓ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＪ１４−Ｕ５４  ｕｎｄｅｒ  ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」、酵母遺伝学フォーラム  第４５回研究報告会、講演要旨(２０１２年９月）
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１２，８６（１５），ｐ．８２８７−８２９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、真菌の生育を促進する新規な方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該方法に有用なポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記のとおり、ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４遺伝子翻訳産物（配列番号２）は、真菌の生育を阻害する。しかしながら、当該翻訳産物のＣ末端側には、真菌の生育を促進するドメインがコードされており、そのＮ末端側が真菌の生育抑制を担うことが見出された。単一のポリペプチド鎖が、真菌の生育を促進するドメインと、生育を抑制するドメインを有することは驚くべき知見であった。そして、ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のＣ末端側を発現する遺伝子組換酵母は、顕著なストレス耐性を示した。従って、本発明の第１の局面は、
［１］真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
１)  配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの４３５位−グルタミンまでを含まない配列であって、少なくとも配列番号２の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでを含むアミノ酸配列；
２）  上記１）に対して少なくとも６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列；、又は
３）  上記１）のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
から成る、前記ポリペプチド、
である。【００１３】
典型的な上記１）のポリペプチドは、後記実施例のとおり、４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのアミノ酸配列を含む。従って、本発明の好適な態様は、
［２］上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでの配列である、上記［１］記載のポリペプチド、
である。【００１４】
本発明のポリペプチドは、それをコードする核酸を適切な宿主細胞内で過剰発現させることにより好適に生産され得る。従って、本発明の第２の局面は、
［３］上記［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードする核酸、
［４］上記［３］に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター、及び
［５］上記［４］に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞、
である。【００１５】
本発明のポリペプチド及び核酸は、真菌の生育を促進するための組成物の有効成分として好適に使用できる。従って、本発明の更なる局面は、
［６］上記［１］又は［２］に記載のポリペプチド、上記［３］に記載の核酸或いは上記［４］に記載のベクターを含む、真菌の生育を促進するための組成物、
である。言うなれば、本発明のこの局面は、真菌の生育を促進するために用いる、上記［１］又は［２］のいずれかに記載のポリペプチドである。或いは、真菌の生育を促進するために用いる、上記［３］に記載の核酸である。更には、真菌の生育を促進するために用いる、上記［４］に記載のベクターである。【００１６】
更に、本発明は、有用な真菌の生育を促進する方法、及び当該真菌の耐ストレス性を向上させる方法を意図する。すなわち、本発明の別の局面は、
［７］真菌の生育を促進する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して上記［１］又は［２］に記載のポリペプチド、上記［３］に記載の核酸或いは上記［４］に記載のベクターを投与することを含む、前記方法、及び
［８］真菌のストレス耐性を向上する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して上記［１］又は［２］に記載のポリペプチド、上記［３］に記載の核酸或いは上記［４］に記載のベクターを投与することを含む、前記方法、
である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のポリペプチドは、顕著な真菌生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、当該ポリペプチド及びそれをコードする核酸は、真菌の生育を促進するための有効成分として有用である。更に、本発明のポリペプチドを過剰生産するように形質転換された真菌は、各種の発酵生産において有利に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、真菌生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、真菌の生育機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、本発明のポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図２】図２は、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＳ４２６のマップを示す。
【図４】図４は、発現用プラスミドｐＲＳＴ４２６のマップを示す。
【図５】図５は、発現用プラスミドｐＲＳＴ４２６の構築手順を示す。
【図６】図６は、全長ＯＲＦ４（参考例１）、２４（本発明）及び１Ｂ（参考例２）を導入した酵母の成育試験（ｐＨ、濁度、溶存酸素濃度、グルコース濃度及び生菌細胞数の経時変化）の結果である。陰性対照には、空のベクターのみを導入した。全てのグラフにおいて、■は陰性対照を表している。△は全長ＯＲＦ４を表している。＊は本発明の実施例（２４）を表している。〇は１Ｂを表している。
【図７】図７は、全長ＯＲＦ４（参考例１）、２４（本発明）及び１Ｂ（参考例２）を導入した酵母の顕微鏡による細胞形態観察の結果及びコロニー形態である。図中、「ｐＲＳＴ４２６」は、空のベクターを導入した陰性対照株である。「ｐＲＳＴ４２６−ＯＲＦ４」は、全長ＯＲＦ４を発現する形質転換体である。「ｐＲＳＴ４２６−２４」は、本発明のペプチドを発現する形質転換体である。「ｐＲＳＴ４２６−１Ｂ」は、本発明とは別の、ＯＲＦ４翻訳産物中の真菌生育阻害活性部分を発現する形質転換体である。細胞形態の顕微鏡写真中の白抜きバーは、１０μｍに相当する。
【図８】図８は、全長ＯＲＦ４（参考例１）、２４（本発明）及び１Ｂ（参考例２）を導入した酵母からタンパク質を抽出し、抗ＯＲＦ４ｐ抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。サンプルは全て不溶性画分である。上段の数字はそれぞれ培養時間を示す。使用したゲルは８％ゲルである。２４領域のサンプルからは、約２８ｋＤａのサイズにシグナルが見られる。
【図９】図９は、全長ＯＲＦ４（参考例１）、１Ｂ（参考例２）及び１３（参考例３）を導入した酵母の成育試験（ｐＨ、濁度及び生菌細胞数の経時変化）の結果である。全てのグラフにおいて、△は全長ＯＲＦ４を表している。〇は１Ｂを表している。◇は１３を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子翻訳産物ののＣ末端側配列を含む部分ポリペプチドである。本明細書において、用語「部分ポリペプチド」は、いかなる場合にもそのポリペプチドが、アミノ酸配列において全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物と同一ではないことを意味する。
【００２０】
前記のとおり、元の全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物が真菌の生育阻害活性を示すにもかかわらず、そのＣ末端側ポリペプチドは、真菌の生育を促進する活性だけでなく、真菌のストレス耐性を向上させる活性を示したことは、驚嘆すべき発見であった。
【００２１】
具体的に、後記の実施例のとおり、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのアミノ酸残基から成る部分ポリペプチドが、真菌の生育を有意に促進することが明らかにされた。そして、当該部分ポリペプチドを過剰生産するように形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、３５℃といった高温条件下でも良好に成育した。さらにその生育は、培地がｐＨ４．０を下回る酸性になった以降でさえも持続した。通常のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの最適生育温度は２５℃前後であり、最適ｐＨは約５．０〜６．０であるので、３５℃の温度及びｐＨ４．０を下回る水素イオン濃度は、当該酵母の生育にとって実質的なストレス条件と看做される。
【００２２】
一方、後記の各参考例のとおり、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１位から１５位までのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドは、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにｐＨ及びグルコース濃度の低下をいっそう強く抑制した。同様に、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１位から１５位まで及び４３６位以降の全てのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドも、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにｐＨの低下をいっそう強く抑制した。従って、これらの結果は、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のＮ末端側に、真菌の生育を阻害するドメインが存在することを意味する。（本発明者らは、この発明について、本願と同じ優先権主張及び出願日を有する日本国特許出願において開示及び特許請求している。）。単一のポリペプチド鎖上に、宿主細胞の成育を阻害する部分と促進する部分が共存していたことは、とりわけ驚嘆すべき発見であったが、ウイルスの種の存続という観点からすれば、その宿主を完全に殺滅してしまわないのは、ＭｏＣＶ１ウイルスにとって合理的な戦略かもしれない。いずれにせよ、真菌の生育を促進する活性に対して、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のＮ末端側は重要でないと考えられる。
【００２３】
従って、本発明のポリペプチドの最小単位は、以下に示すＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでの配列から成る。
【化１】
2014098089.tif 000002
【００２４】
ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子に対応するＤＮＡ配列（つまり、ＭｏＣＶ１ウイルスはｄｓＲＮＡウイルスであるので、その遺伝子は、本来はＲＮＡである。）及びその全長翻訳産物のアミノ酸配列は、特許文献１において、それぞれ、同文献の配列番号３及び配列番号７として開示されている。また、特許文献１は、ラ・フランス病ウイルスのｄｓＲＮＡ断片が、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子と相同性を有することを開示している。従って、当業者は、少なくともＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでの配列を含む本発明の部分ポリペプチドと高いアミノ酸配列相同性を示すポリペプチドを得て、その中から真菌の生育を促進する能力を有するものを容易に同定できるであろう。そして、そのようなポリペプチドも、本発明の範囲内である。当該アミノ酸配列の相同性としては、６０％以上、７０％以上、８０％以上のいずれかであればよい。特に、９０％以上のアミノ酸配列の相同性を示すポリペプチドが好ましい。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義される。
【００２５】
また、本発明の、少なくともＯＲＦ４遺伝子翻訳産物４３６位−グリシンから６９３位−システインまでの配列を含む部分ポリペプチドに対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するポリペプチドもまた、本発明において利用可能である。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともあり得る。従って、そのようなポリペプチドのうちで真菌の生育を阻害する能力を有するものは本発明の範囲内である。
【００２６】
核酸
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列をコードする核酸を適切な宿主内で過剰発現させることで、容易に得ることができる。また、そのような過剰発現は、その場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、つまり生育が促進されるべき真菌細胞内でも行い得る。そのような目的に用いることができる核酸は、本明細書の配列番号１の１４６７位−グリシンから２２４０位−チミンまでのヌクレオチド配列を少なくとも有するであろう。その部分が、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのアミノ酸配列をコードする天然型の配列である。しかしながら、本発明の核酸は、上記した本発明のポリペプチドに翻訳される限り、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
【００２７】
なお、本発明のポリペプチドはｄｓＲＮＡウイルスの蛋白質に由来するので、本発明の核酸はＤＮＡだけでなく、ＲＮＡであってもよい。更に、本発明の核酸は、修飾ＤＮＡ及び修飾ＲＮＡであってもよい。つまり、用途に応じて本発明の核酸を、例えばＣｙ３やＣｙ５等の蛍光物質、化学発光物質等により標識してもよい。或いは、本発明の核酸を、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート等の安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ等の安定なＲＮＡ誘導体として作製してもよい。それらの核酸も、全て本発明の核酸に含まれる。
【００２８】
ベクター
しかるに、本発明の核酸は、「発現カセット」として宿主細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルの本発明のポリペプチド生産を達成することを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写及び翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主に、「作動可能」に導入される。
【００２９】
プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。例えば、宿主細胞が真菌細胞である場合、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ並びにアミラーゼ系遺伝子及びｔｒｐＣのプロモーターが使用できるが、ＴＤＨ３プロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合、ＳＶ４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモーター等が例示できる。宿主が植物細胞である場合は、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ転写物、トウモロコシのユビキチン、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどが挙げらる。また、原核生物宿主細胞のためには、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）に記載されている。
【００３０】
上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主細胞中に挿入される。これらのベクターは、宿主細胞中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。真菌宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣより入手可能）、ｐＡＵＲ１０１及びｐＡＵＲ３１６（Ｔａｋａｒａ  ＢＩＯ  Ｉｎｃ．より入手可能）、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２や“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ”、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、ｐ．１−２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されたものが挙げられる。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。植物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ、ｐＧｒｅｅｎ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドが挙げられる。原核生物宿主細胞のための好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
【００３１】
上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法及びトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
【００３２】
本発明の組成物
上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、ｐＨ沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のポリペプチドを精製することができる。たとえば、本発明のポリペプチドの末端にＨｉｓタグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。従って、本発明の組成物の有効成分は、本発明のポリペプチドあり得る。また、本発明のポリペプチドは、真菌用ベクター内に作動可能に連結された本発明の核酸により、その生育を促進すべき真菌の細胞を直接形質転換することで、当該真菌自身に生産させてもよい。そのような生産は、形質転換された真菌に高い増殖能と向上したストレス耐性をもたらすであろう。従って、本発明の組成物の有効成分は、本発明の核酸又は本発明のベクターであってよい。
【００３３】
従って、本発明の組成物は、有効量の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターに加え、任意の担体を含むことができる。
【００３４】
そのような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３５】
その有効成分が核酸又はベクターである場合、本発明の組成物は、更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リボソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。つまり、本発明の核酸ないしベクターをアテロコラーゲン等に含ませることにより、本発明のポリペプチドを生産させるべき細胞に対して本発明の核酸又はベクターを効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。
【００３６】
本発明の組成物は、その生育を促進し、或いは耐ストレス性を向上させるべき真菌の培養物、例えば固体培養や液体培養に対して投与することができる。好ましくは、本発明の組成物を真菌の液体培養に混合する。本発明の組成物中の有効成分の含有量としては、例えば、組成物全体の約０．１ないし１００重量％が例示される。
【００３７】
本発明によりその増殖の促進、或いは耐ストレス性を向上させることが可能な真菌類として、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｘｕｌａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｐｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍａ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＺｙｇｏｚｙｍａ属等の子嚢菌系酵母；Ｂａｎｎｏａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｒｖｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｉｏｓｚｅｇｉａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｂｕｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍａｓｔｉｇｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｍｒａｋｉａ、Ｏｃｃｕｌｔｉｆｕｒ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓｉｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔａｕｓｏｎｉａ、Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ属等の担子菌系酵母；並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属等の糸状菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
特に、バイオエタノール生産に用いられる、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの天然或いはその変異体への本発明の適用は興味深い。つまい、本発明のベクターにより形質転換されたそれらの酵母は、通常の最適生育温度よりも高い、例えば３５℃でも十分に良好な生育を示すので、発酵工程のための特別に大きな冷却器を必要とせず、また多大なエネルギーを消費しないであろう。また、本発明のベクターにより形質転換されたそれらの酵母は、通常の最適なｐＨよりも低い環境下でも十分に良好な生育を示すので、発酵中にｐＨを高くするためのアルカリの添加の労力を減らすだけでなく、廃液の問題も低下させるであろう。
【００３９】
その他の用途
上記のとおり、本発明のポリペプチドは、真菌の生育促進機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、本発明のポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。そのような用途のために、本発明のポリペプチド、核酸及びベクターのいずれも、研究のための試薬として利用できる。当該試薬は、本発明のポリペプチド、核酸又はベクターを、例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、及び界面活性剤等の分散剤とともに、適切なｐＨの緩衝液に溶解して得ることができる。
【００４０】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載され、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端方向に向けて記載される。
【実施例】
【００４１】
参考例１：全長ＯＲＦ４コード化配列を導入した酵母の作製
ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４遺伝子中のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質を生産する形質転換体を、以下の手順で作製した。【００４２】
＜１−ａ＞  発現ベクターの構築
ＡＴＣＣより購入したプラスミドｐＲＳ４２６（図３）をもとにして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域の間に挟まれたマルチ・クローニング・サイトを有する、プラスミドｐＲＳＴ４２６を作製した（図４）。詳細には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ［Ｌ−Ａ−ｏ］株よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにてＴＤＨ３遺伝子のプロモーター領域（Ｐｒｉｍｅｒ１：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒ２：ｒｅｖｅｒsｅ）とターミネーター領域（Ｐｒｉｍｅｒ３：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒ４：ｒｅｖｅｒsｅ）を増幅し、それぞれ市販のｐＵＣ１９プラスミドへクローニングした。なお、ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。次に、プロモーター領域を含むプラスミドからＢｌｎＩ１／ＢａｍＨＩでプロモーター領域を切り出し、同じ制限酵素で切断したターミネーター領域を含むプラスミドに挿入した。ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩでこのプラスミドから遺伝子発現用カセット部分を切り出し、同じ制限酵素で切断したｐＲＳ４２６プラスミドに挿入した（図５）。
【化２】
2014098089.tif 000003
【００４３】
一方、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにてＯＲＦ４（ＰｒｉｍｅｒＡ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＢ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、全長ＯＲＦ４の発現ベクターを構築した。
【化３】
2014098089.tif 000004
【００４４】
＜１−ｂ＞  酵母の形質転換
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ａｄｅ２  Ｌ−Ａ−ｏ）株を３０℃で培養した後、遠心分離により回収してから蒸留水で懸濁し、再度遠心分離にかけて洗浄した。沈殿物にＳｏｌＡ（０．１Ｍ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて懸濁して遠心分離し、沈殿物に再びＳｏｌＡを加えて懸濁して酵母溶液とした。これを３０℃で５０分間インキュベートした後、熱処理したｓｓＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ、サーモンスパーム）１０μｌ、酵母溶液５０μｌ、上記の全長ＯＲＦ４の発現ベクター１０μｌ、ＳｏｌＡ  ２０μｌ、５０％  ポリエチレングリセロール７５０μｌの順に加えた後、３０℃で３０分間、４２℃で１５分間インキュベートした。遠心分離後、沈殿物に蒸留水を加えてＳＣ寒天平板培地（シャトルベクターの選択マーカーに合わせてドロップアウト培地を選択する）にまいて、３０℃で培養した。
【表１】
2014098089.tif 000005
【００４５】
参考例２：ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「１Ｂ」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて１Ｂ（ＰｒｉｍｅｒＣ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＢ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、１Ｂの発現ベクターを構築した。
【化４】
2014098089.tif 000006
【００４６】
上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた１Ｂ発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ａｄｅ２  Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。【００４７】
参考例３：ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「１３」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて１３（ＰｒｉｍｅｒＣ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＤ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、１３の発現ベクターを構築した。
【化５】
2014098089.tif 000007
【００４８】
上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた１３発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ａｄｅ２  Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。【００４９】
実施例１：ＯＲＦ４の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「２４」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて２４（ＰｒｉｍｅｒＥ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＦ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、２４の発現ベクターを構築した。
【化６】
2014098089.tif 000008
【００５０】
上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた２４発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ａｄｅ２  Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。【００５１】
実施例２：全長ＯＲＦ４、１Ｂ、１３及び２４導入酵母の生育試験
ジャーファーメンター培養により、それぞれの形質転換酵母の生育を試験した。【００５２】
＜２−ａ＞  全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び２４の比較
微生物培養装置（ＢＭ２−０２ＮＰ３、ＡＢＬＥ社製）を用いて標題の配列を導入した酵母を培養し、その生育を試験した。なお、陰性対照としては、ｐＲＳＴ４２６を導入した酵母を用いた。培地は全てＳＣ−ｕｒａ液体培地を用いた。詳細には、５ｍｌの液体培地（試験管）に３０℃、３日間寒天培地上で培養した酵母を植菌し、２８℃、１４５ｒｐｍで１６時間震盪培養した（前々培養）。この培養液をＯＤ６００＝０．１となるように５０ｍｌの液体培地（２００ｍｌコルベン）に加え、２８℃、１４０ｒｐｍで１２時間培養した（前培養）。この培養液をＯＤ６００＝０．０３となるように液体培地１Ｌを入れた微生物培養装置に植菌し、温度３５℃、空気流量１．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌１００ｒｐｍの条件で培養した（本培養）。溶存酸素濃度を、ＡＢＬＥ社製のＤＯセンサー（直径１２ミリ密閉型  Ｌ＝２２０ｍｍ）により測定した。【００５３】
上記の培養液を経時的にサンプリングした。詳細には、微生物培養装置のサンプルング口にシリコンチューブでシリンジを接続し、培養液１０ｍｌをシリンジで取り出し、滅菌遠心管に移した。そのようにして得た培養液サンプルの一部を滅菌水で希釈した後に寒天平板上に撒いた。それらの平板を２８℃で３日間インキュベートした後、平板上のコロニーの形成数を計測して、生菌細胞数を測定した。また、培養液サンプルの別の一部の吸光度を、分光光度計（ＵＶ−１８００、島津社製）により測定した。次いで、吸光度を測定した後のサンプルを遠心分離して、上清と菌体に分けた。上清中のグルコース濃度を、バイオセンサー（ＢＦ−５、ＢＦ−３０ＡＳ、グルコースセンサー：ＥＤ０５−０００３、王子計測機器社製）を用いて測定した。また、菌体からはタンパク質を抽出し、抗ＯＲＦ４ｐ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質が生産されていることを確認した（図８）。更に、一部の菌体について、顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡  ＩＸ７１  Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて細胞形態を観察した（倍率１，０００倍、微分干渉）。【００５４】
培養液サンプルの試験結果として、１Ｂ導入株で顕著な生育不良が認められた。一方、２４導入株では生育速度の上昇が見られた（図６）。なお、２４導入株において、濁度の上昇とＣＦＵの上昇が培養２６時間付近で停滞しているが、下記のように菌体の異常な凝集が確認されており、その影響と考えられた。【００５５】
また、細胞形態観察の結果として、ＯＲＦ４と１Ｂの導入株では細胞が肥大化し、細胞内が顆粒化しているのが認められた。一方、２４導入株では細胞の肥大化はあまり見られなかったが、多数の細胞が集まり、巨大な細胞凝集体を形成していた（図７）。また、プレート上のコロニーは、１Ｂ導入株でサイズが顕著に小さく、逆に２４導入株では凸凹したサイズの大きなコロニーが見られた（図７）。【００５６】
＜２−ｂ＞  全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び１３の比較
上記＜２−ａ＞の生育試験（ｐＨ、濁度及び生菌細胞数）を、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び１３を導入した酵母について行った。結果として、ｐＨの低下、濁度の上昇及び生菌細胞数の増加のいずれの項目においても、１Ｂ及び１３導入株は、全長ＯＲＦ４よりも著しい生育阻害活性を示した。なお、ｐＨの低下や濁度の上昇速度は１Ｂ導入株が最も緩やかであった。しかし、生菌細胞数は１３導入株でも１Ｂ導入株と同程度の抑制が見られ、常に低い値が示された（図９）。このことから、ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの領域は、真菌の生育を阻害する活性を有していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のポリペプチドは、顕著な真菌の生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、各種の発酵生産において利用可能である。また、研究用試薬としても利用可能であるので、化学品製造業においても有用であり得る。
【図１】
2014098089.tif 000009
【図２】
2014098089.tif 000010
【図３】
2014098089.tif 000011
【図４】
2014098089.tif 000012
【図５】
2014098089.tif 000013
【図６】
2014098089.tif 000014
【図７】
2014098089.tif 000015
【図８】
2014098089.tif 000016
【図９】
2014098089.tif 000017
【配列表】
2014098089000001.app
【国際調査報告】
2014098089.tif 000018
2014098089.tif 000019