(57)【要約】  本発明は、ＨＭＧＢ１タンパク質のＣ末端の８アミノ酸残基（ＥＥＥＤＤＤＤＥ）からなる配列に特異的し結合し、当該タンパク質と関連性がある各種炎症性疾患の治療又は予防に有効なヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体ならびにそれらの抗原結合性断片を提供すると共に、該抗体もしくはそれらの抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１タンパクのＣ末端ドメインに存在するアミノ酸配列（ＥＥＥＤＤＤＤＥ（配列番号６０））に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、ならびに
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、ならびに
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有する、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列をそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列として含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよく、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列をそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列として含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよい、
ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）においては、少なくても４９位および９４位の２箇所のアミノ酸残基は、ラット抗体＃１０−２２のＨ由来のアミノ酸残基（いずれもアラニン）であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）においては、少なくても４４位および４６位の２箇所のアミノ酸残基は、ラット抗体＃１０−２２のＬ鎖由来のアミノ酸残基（それぞれイソロイシンおよびアルギニン）であるアミノ酸配列、
を含有する、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）配列番号４１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記ヒト化抗体のクラス（サブクラス）がＩｇＧ１（λ）またはＩｇＧ２（λ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片であって、ヒトＨＭＧＢ１タンパクに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）を２５０ｎｇ／ｍｌで比較した場合、＃１０−２２キメラ抗体の２倍以上高い活性を有するヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体であって、ヒトＨＭＧＢ１タンパクのＲＡＧＥへの結合を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が５μｇ／ｍＬ（約３３ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＭＧＢ1タンパク質刺激によるＴＮＦ-α放出を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が、０．０２μｇ／ｍＬ（約０．１３ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
細胞からの遊離したＨＭＧＢ１により誘発される各種ＨＭＧＢ１関連疾患の治療または予防するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、脳梗塞、脳浮腫、脳血管攣縮、外傷性脳傷害、アテローム性動脈硬化症、神経因性疼痛、敗血症、関節炎、急性肺外傷、脳虚血、腎虚血、および肝虚血等の中のいずれか一つである疾患の治療または予防するための請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、もしくはこれら核酸のいずれかと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された核酸を組込んだ組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合し、ＨＭＧＢ１関連疾患の治療・予防に有効なヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体ならびにそれらの抗原結合性断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ  １）は、いまだに十分な治療法が確立されてない脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、アテローム性動脈硬化症、外傷性脳傷害、敗血症、神経因性疼痛、および各種関節炎などで、これまで見出されていた腫瘍壊死因子、および各種インターロイキン等の炎症性サイトカインとは異なる早期の炎症メディエイターまたは遅延性炎症メディエイターとして近年再発見され、それら疾病の治療法・予防法の標的と成り得るとして大きな注目を集めているタンパク質である（非特許文献１）。【０００３】
ＨＭＧＢ１は、約４０年前、真核生物の細胞核内に普遍的に存在しクロマチンと結合している非ヒストンタンパク質の１つで、電気泳動で高移動度を示すタンパク質として発見された。当初は、高移動度グループ（ＨＭＧ）タンパク質ファミリーに属する１つとしてＨＭＧ１（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  １）と呼ばれており、クロマチン構造の維持、転写活性調節、およびＤＮＡ修復等に重要な働きをすると考えられていた。その後、膜結合性タンパク質（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ）として再発見され、更には、種々の炎症性疾患に関与する炎症メディエイターとして再々発見されたこともあり、２００１年には、高移動度タンパク質ファミリーの命名法が見直され、ＨＭＧ１は、ＨＭＧＢ１と名称が変更された。【０００４】
ＨＭＧＢ１タンパク質は、リジン残基に富む２１５のアミノ酸からなる２５ｋＤａのタンパク質であり、哺乳動物間では非常に高度に保存されたアミノ酸配列を有する。その構造は、Ａ−ｂｏｘ（またはｂｏｘ−Ａ）およびＢ−ｂｏｘ（またはｂｏｘ−Ｂ）と呼ばれる２つのＤＮＡ結合ドメイン、およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のみで構成されているカルボキシル末端ドメイン（Ｃ末ドメイン又は酸性尾部とも呼ばれる。）から成る３つのドメインで構成されている。Ａ−ｂｏｘおよびＢ−ｂｏｘは、それぞれ高度に保存された約８０個のアミノ酸残基で構成されており、強く正に帯電している。Ｂ−ｂｏｘにはＴＬＲ４（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）結合ドメイン、およびＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）結合ドメインが存在する。ＨＭＧＢ１のＴＬＲ４への結合によりマクロファージ/単球からの炎症性サイトカインの分泌が誘導される。ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥへの結合により内皮細胞や他の体細胞（腫瘍細胞を含む）の増殖、分化、遊走、細胞表面タンパクの発現が誘導される。第三のドメイン、カルボキシル末端は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のみの３０個のアミノ酸配列からなる構造を有しており、極端に負に帯電している。このC末端部分のアミノ酸配列に関しても、哺乳動物間で２−３箇所の差異があるのみで、高度に保存されていることが知られている。【０００５】
ＨＭＧＢ１タンパク質の機能としては、当初は、クロマチン構造の維持機能や転写活性調節機能、ＤＮＡ 修復機能等が考えられていたが、特に、１９９９ 年にＴｒａｃｅｙ らの研究グループにより、敗血症における遅延性炎症メディエイターとして再発見された後は、種々の疾病の炎症性サイトカインカスケードの中で重要な役割を担っていることが次々と発見されてきた。ＨＭＧＢ１は、細胞の核内に局在しているのみならず、マクロファージや各種免疫系細胞の活性化に伴って核から細胞質へ移行し細胞外へ分泌される（能動的分泌）。あるいは虚血や傷害による細胞の壊死またはアポトーシスに伴って核に局在していたＨＭＧＢ１が速やかに放出されること（受動的放出）が明らかにされている。ところで、近年、ＨＭＧＢ１や熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等は、内因性のダメージ関連分子パターン（damage-associated molecular patterns：ＤＡＭＰｓ）の１つと考えられており、それらは、非微生物的な原因（例えば、虚血や外傷等）で生じた損傷細胞から放出される。一方、細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）などは、病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular patterns ：ＰＡＭＰｓ）と呼ばれ微生物由来のさまざまな産物（product）が含まれる。細胞表面および細胞質内の両方で後者を認識・応答する受容体は、パターン認識受容体（pattern recognition receptors：ＰＲＲｓ）と呼ばれているが、その代表的なファミリーとしてToll様受容体（ＴＬＲｓ）がある。しかし、ＴＬＲファミリーの一部、特にＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９においては、上記のＤＡＭＰｓを認識・活性化する。特に、ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４シグナル伝達などを活性化し炎症反応を誘導し、例えば、ＴＮＦαの分泌亢進等が生じることなどが知られている。また、ＨＭＧＢ１の受容体の１つであるＲＡＧＥに関しては、ＲＡＧＥのノックアウト動物を用いた研究や、ＲＡＧＥとＨＭＧＢ１の結合を阻害するペプチドや特異的な抗体を用いた研究で、虚血による脳障害（非特許文献２）および細菌感染に伴う敗血症（非特許文献３）などの疾患において、ＲＡＧＥを介した炎症情報の伝搬が、このＨＭＧＢ１の炎症反応の増幅に重要な役割を果たしていることが示されている。すなわち、これら細胞外に放出されたＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４やＲＡＧＥ等を介して強力な炎症メディエイターとして作用、それまで知られていた炎症性免疫応答を更に促進することより、種々の重大な疾病の要因ともなっている。【０００６】
これらＨＭＧＢ１が関与する疾患（ＨＭＧＢ１関連疾患：ＨＭＧＢ１−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、２つに大別される。１つは、敗血症ショックのような微生物感染に起因する免疫応答に由来するＨＭＧＢ１の細胞外分泌が認められる疾患群と、脳梗塞のような非微生物的な原因による細胞損傷に起因するＨＭＧＢ１の細胞外放出が認められる疾患群とである。前者では、例えば、感染により発生した細菌由来成分（細菌性リポ多糖（ＬＰＳ ）等）によりＴＬＲ４の活性化が誘導される。それに伴い単球、マクロファージ等から能動的なＨＭＧＢ１の分泌がおこり、後期の炎症メディエイターとして作用する。ＨＭＧＢ１関連疾患としては、敗血症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、各種感染症、及び各種免疫疾患等があげられる。後者は、虚血や外傷による細胞壊死に伴い、それまで核に存在していたＨＭＧＢ１が数時間以内に速やかに細胞外に放出され（受動的放出）、早期の炎症メディエイターとして各種炎症性サイトカインの産生を誘導する場合であり、関連疾患としては、脳梗塞、外傷性脳損傷、臓器移植時の虚血に由来する疾患、心筋梗塞等があげられる。【０００７】
近年、ＨＭＧＢ１関連疾患に対する治療法、または予防法としては、ＨＭＧＢ１の抗体を使用する方法（特許文献１、２、４、５）、ＨＭＧＢ１タンパク質の一部フラグメントをアンタゴニスト的に使用する方法（特許文献２および３）、ＨＭＧＢ１の分泌を阻害する化合物を使用する方法（非特許文献４）などに関する探索研究等が報告されている。特に、ＨＭＧＢ１に対する抗体を用いた動物モデルでの治療法としては、敗血症（特許文献１、４ 、および５）、急性肺損傷（非特許文献５）、火傷による結合組織の損傷（特許文献２）、関節炎（特許文献４、５および非特許文献６）、脳虚血（非特許文献７）、アミロイドーシス（特許文献６）、門脈内膵島移植時の肝障害（非特許文献８）、および神経因性疼痛（非特許文献９）等への適応の可能性が報告されているが、いずれの研究も治療薬・予防薬の研究としては、緒に就いたばかりと言える。【０００８】
そのような中、我々はラット由来の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、脳梗塞（特許文献８、非特許文献１０および１１）、脳血管攣縮（特許文献９）、アテローム動脈硬化（特許文献１０および非特許文献１２）、外傷性脳傷害（特許文献１１および非特許文献１３）および神経因性疼痛（非特許文献９）の動物モデルにおいて有効であることを示した。しかしながら、ラット由来の抗体では免疫原性の問題がありヒトでの使用は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2000/047104
【特許文献２】WO2002/074337
【特許文献３】WO2004/046345
【特許文献４】WO2005/026209
【特許文献５】WO2007/001422
【特許文献６】WO2008/075788
【特許文献７】WO2012/136250
【特許文献８】WO2007/049468
【特許文献９】WO2007/135992
【特許文献１０】WO2011/037227
【特許文献１１】WO2012/074043
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Annu. Rev. Immunol., 2011. (vol.29) p139
【非特許文献２】J. Neuros., 2008 (vol.28) p12023
【非特許文献３】Crit. Care, 2007 (vol.11) pR122
【非特許文献４】Biochem Pharmacol. 2012 p1492
【非特許文献５】J. Immunol., 2000 (165) p2950
【非特許文献６】Mol. Med., 2011 (vol.17) p1039
【非特許文献７】J. Neurosci., 2006 (vol.26) p6413
【非特許文献８】Am. J. Transplant., 2010 (vol.10) p1588
【非特許文献９】PLoS One. 2013（vol.8）e73640
【非特許文献１０】FASEB J., 2007 (vol.21) p3904
【非特許文献１１】Stroke., 2011 (vol.42) p1420
【非特許文献１２】Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2011 (vol.31) p313
【非特許文献１３】Ann Neurol., 2012 (72) p373
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗ＨＭＧＢ１抗体は、十分な治療法が確立されていない虚血・再潅流傷害、外傷性脳傷害、神経因性疼痛、および、敗血症などで見られる致死的な炎症反応の根幹となる炎症メディエイターに対するアンタゴニストとして、それらの疾病の治療法・予防法上の問題点を打開する薬剤と成り得る可能性を秘めており、大きな注目を集めている。そのような中、我々は、脳梗塞（特許文献８）、脳血管攣縮（特許文献９）、アテローム動脈硬化（特許文献１０）、外傷性脳傷害（特許文献１１）、および神経因性疼痛（非特許文献９）の動物モデルでラット由来の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（＃１０−２２）が有効であることを示した。しかしながら、ラット由来の抗体では臨床使用が困難であり、当該ラット抗体をヒトに使用するためには抗体のラット部分を可能な限りヒト抗体と置換し（ヒト化）、抗体の免疫原性を減弱させ、なおかつ、抗原特異性、親和性、中和活性を維持もしくは向上させる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そのような中、ラット抗体＃１０−２２を産生するハイブリドーマ中に存在する当該ラット抗体遺伝子を取得、ラット抗体＃１０−２２のＨ鎖、Ｌ鎖、それらの可変領域、およびそれらのＣＤＲのアミノ酸配列を解析し、相同性の高いヒト由来のフレームワークを選択、多くの試行錯誤の末に抗原特異性、親和性、in vitro中和活性がラット抗体と同等もしくはそれ以上であるヒト化抗体の作製に成功した。【００１３】
ところで、複数のヒト由来抗ＨＭＢＧ１モノクローナル抗体が先行技術として報告されているが、ＨＭＢＧ１のＲＡＧＥへの結合阻害活性が最も高く、かつＨＭＧＢ１のＣ末端領域に結合するヒト抗体としてＧ４が開示されている（WO2007/076200）。また、ＨＭＧＢ１のＴＬＲ４への結合を介したマクロファージ/単球からのＴＮＦαの分泌誘導を最も強力に阻害するヒト抗体としてＳ６が開示されている（WO2007/001422）。しかし、本発明のヒト化抗体は、ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥへの結合阻害活性に関しては、前記のヒト抗体Ｇ４より顕著に高いこと、およびin vitroでのＨＭＧＢ１のＴＬＲ４を介するＴＮＦα分泌誘導に対する阻害活性おいても、前記のヒト抗体Ｓ６と比較して優位に優れていること、更には、敗血症モデルマウスにおいても高い致死防御効果があることを確認し、本発明を完成した。【００１４】
即ち、本発明は、以下［１］〜［１６］に記載するＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合するヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体ならびにその抗原結合性断片、該抗体もしくはそれらの抗原結合性断片を含む医薬組成物などを提供する。【００１５】
［１］ＨＭＧＢ１タンパクのＣ末端ドメインに存在するアミノ酸配列（ＥＥＥＤＤＤＤＥ（配列番号６０））に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、ならびに
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、ならびに
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有する、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
［２］［１］に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［３］［１］または［２］に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列をそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列として含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよく、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列をそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列として含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよい、
ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）においては、少なくても４９位および９４位の２箇所のアミノ酸残基は、ラット抗体＃１０−２２のＨ由来のアミノ酸残基（いずれもアラニン）であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）においては、少なくても４４位および４６位の２箇所のアミノ酸残基は、ラット抗体＃１０−２２のＬ鎖由来のアミノ酸残基（それぞれイソロイシンおよびアルギニン）であるアミノ酸配列、
を含有する、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）配列番号４１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ ｉ ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［７］前記ヒト化抗体のクラス（サブクラス）がＩｇＧ１（λ）またはＩｇＧ２（λ）である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片であって、ヒトＨＭＧＢ１タンパクに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）を２５０ｎｇ／ｍｌで比較した場合、＃１０−２２キメラ抗体の２倍以上高い活性を有するヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
［９］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の抗体であって、ヒトＨＭＧＢ１タンパクのＲＡＧＥへの結合を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が５μｇ／ｍＬ（約３３ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［１０］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＭＧＢ1タンパク質刺激によるＴＮＦ-α放出を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が、０．０２μｇ／ｍＬ（約０．１３ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
［１２］細胞からの遊離したＨＭＧＢ１により誘発される各種ＨＭＧＢ１関連疾患の治療または予防するための［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、脳梗塞、脳浮腫、脳血管攣縮、外傷性脳傷害、アテローム性動脈硬化症、神経因性疼痛、敗血症、関節炎、急性肺外傷、脳虚血、腎虚血、および肝虚血等の中のいずれか一つである疾患の治療または予防するための［１１］に記載の医薬組成物。
［１４］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、もしくはこれら核酸のいずれかと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸。
［１５］［１４］に記載の単離された核酸を組込んだ組換え発現ベクター。
［１６］［１５］に記載の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に使用されＨＭＧＢ１に対するラット抗体は、いまだ十分な治療法が確立されていない脳梗塞、脳血管攣縮、外傷性脳傷害、アテローム性動脈硬化、および神経因性疼痛等の動物モデルで、これら関連疾患に対する治療法・予防法上の問題点を打開する薬剤と成り得る可能性を示したが、ラット由来の抗体であるため臨床使用が困難であった。当該ラット抗体を、抗原特異性を維持しながら親和性・中和活性を維持もしくは向上させヒト化抗体とすることによりラット抗体の免疫原性を減弱させることにより、これら多くの重篤なＨＭＧＢ１関連疾患に対して新しい治療法・予防法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】＃１０−２２ハイブリドーマからクローニングした抗体遺伝子産物のＨＭＧＢ１との反応性を示す。
【図２】＃１０−２２キメラ抗体のＨＭＧＢ１との反応性を示す。
【図３】ラット抗体＃１０−２２のＬ鎖可変領域、そのヒト化抗体（ＶＬｈｕｍ１０−２２）、および、ヒトＦＲ（Ｈｕｍａｎ_ＶＬ）のアミノ酸配列、ならびに＃１０−２２のＬ鎖ＦＲ配列と相同性が高い８種のヒト由来抗体またはｇｅｒｍｌｉｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｚ７３６６６、Ｘ９７４７４、Ｘ９７４６４，ＢＡＡ２０８８９，Ｚ７３６４７，およびＡＹ７０１７２８，ならびに、ｈＬＶ３＿ｃｏｎｓ（ヒトＩＧＬＶ３ファミリーのコンセンサス配列：WO2011/080350）およびＪＬ２-ｇｅｒｍ（ヒト・ラムダー鎖ＪＬ２  ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来配列））のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ示す。  本図で、＃１０−２２のＦＲ配列のうち、上記８種のヒト由来配列では認められないアミノ酸残基「ラット・アミノ酸残基」である１４箇所（図中、Ｈｕｍａｎ_ＶＬ配列の下に「Ｈ：ｈｕｍａｎ」または「Ｒ：ｒａｔ」の記号で表示。）について、それらすべてを上記８種のヒトＦＲ配列のコンセンサス配列に置換したＦＲ配列がＨｕｍａｎ_ＶＬである。  本図でＶＬｈｕｍ１０−２２は、ヒト化抗体（ＥＶ００７１５６）のＬ鎖可変領域を示しており、４４位と４６位以外のＦＲアミノ酸残基は、上記Ｈｕｍａｎ_ＶＬの配列と同一である。Ｌ鎖可変領域の１位（１Ｓ）については、ヒト抗体で使用されるシグナル配列の種類によっては、Ｓ１-Ｙ２の間で切断されることが知られており、本発明のヒトＦＲ（Ｈｕｍａｎ_ＶＬ）およびヒト化抗体（ＶＬｈｕｍ１０−２２）では、ラット抗体＃１０−２０のＬ鎖可変領域のＮ末と同様に「１Ｓ」が切断される配列を選択した。  尚、本図におけるアミノ酸残基の位置表示は、Ｋａｂａｔのナンバリング法（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）に従った。
【図４】＃１０−２２キメラ抗体Ｌ鎖部位置換後のＨＭＧＢ１に対する結合性評価を示す。ＨＭＧＢ１を固相化したイムノプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で実施した。コントロールとして＃１０−２２キメラ抗体を使用し、このＯＤ値を１００％としたときの＃１０−２２キメラ抗体Ｌ鎖部位置換体（１４種類）のＨＭＧＢ１に対する結合率を算出した。
【図５】＃１０−２２キメラ抗体Ｌ鎖ヒト化後の抗体のＨＭＧＢ１に対する結合性評価を示す。ＨＭＧＢ１を固相化したイムノプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で実施した。コントロールとして＃１０−２２キメラ抗体を使用し、このＯＤ値を１００％としたときの＃１０−２２（Ｌ鎖）ヒト化抗体（ＥＶ００７１５６Ｌ）と＃１０−２２キメラ抗体（Ｈ鎖）を共発現させて得られた抗体のＨＭＧＢ１に対する結合率を算出した。
【図６】ラット抗体＃１０−２２のＨ鎖可変領域、そのヒト化抗体（ＶＨｈｕｍ１０−２２）、およびヒトＦＲ（Ｈｕｍａｎ_ＶＨ）のアミノ酸配列、ならびに＃１０−２２のＨ鎖ＦＲ配列と相同性が高い６種のヒト由来抗体またはｇｅｒｍｌｉｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＭ９４０２２４、ＤＱ９２６３８６、ＦＪ４８８６８８、ＨＭ８５５４０２、ＤＱ８４０８９５、および  Ｚ１２３３２）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ示す。  本図で、ラット抗体＃１０−２２のＦＲ配列のうち、上記６種のヒト由来配列には認められないアミノ酸残基「ラット・アミノ酸残基」である１５箇所（図中、Ｈｕｍａｎ_ＶＬ配列の下に「Ｈ：ｈｕｍａｎ」または「Ｒ：ｒａｔ」の記号で表示。）について、それらすべてを上記６種のヒトＦＲ配列のコンセンサス配列に置換したＦＲ配列がＨｕｍａｎ_ＶＨである。  本図でＶＨｈｕｍ１０−２２は、ヒト化抗体（ＥＶ００７１５６）のＬ鎖可変領域を示しており、４９位と９４位以外のＦＲアミノ酸残基は、上記Ｈｕｍａｎ_ＶＨの配列と同一である。  尚、本図におけるアミノ酸残基の位置表示は、Ｋａｂａｔのナンバリング法（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）に従った。
【図７】＃１０−２２キメラ抗体Ｈ鎖部位換後のＨＭＧＢ１に対する結合性評価を示す。ＨＭＧＢ１を固相化したイムノプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で実施した。コントロールとして＃１０−２２キメラ抗体のＨ鎖を使用し、このＯＤ値を１００％としたときの＃１０−２２キメラ抗体Ｈ鎖部位置換体（１５種類）のＨＭＧＢ１に対する結合率を算出した。
【図８】＃１０−２２キメラ抗体ヒト化後のＨＭＧＢ１に対する結合性評価を示す。ＨＭＧＢ１を固相化したイムノプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で実施した。コントロールとして＃１０−２２キメラ抗体のＨ鎖を使用し、このＯＤ値を１００％としたときの＃１０−２２ヒト化抗体（ＥＶ００７１５６）のＨＭＧＢ１に対する結合率を算出した。
【図９】リコンビナントＨＭＧＢ１（Ｓｆ９細胞由来）に対する抗ＨＭＧＢ１抗体（＃１０−２２キメラ抗体、ＥＶ００７１５６、Ｓ６、Ｇ４）の結合性評価を示す。ＨＭＧＢ１を固相化したイムノプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で実施した（Ａ）。抗体濃度２５０ｎｇ／ｍｌにおける各ＨＭＧＢ１抗体の結合性をＥＶ００７１５６のＯＤ値を基準に各ＨＭＧＢ１（ウシ胸腺由来およびＳｆ９細胞由来）に対して算出した（Ｂ）。○：＃１０−２２キメラ、■：ＥＶ００７１５６、▲：Ｓ６、□：Ｇ４
【図１０】抗ＨＭＧＢ１抗体のＲＡＧＥへの結合阻害効果を示す。ＥＬＩＳＡによって得られたＯＤ値からＨＭＧＢ１量を定量した後、結合阻害アッセイに使用したＨＭＧＢ１量（２μｇ／ｍｌ）を１００％としてＨＭＧＢ１のＲＡＧＥへの結合率を算出した。○：＃１０−２２キメラ、■：ＥＶ００７１５６、□：Ｇ４、●：Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｇ
【図１１】ＰＢＭＣにおけるＨＭＧＢ１によるＴＮＦ−ａｌｐｈａ放出誘導活性に対する抗ＨＭＧＢ１抗体の阻害効果を示す。末梢血から得たＰＢＭＣをＨＭＧＢ１で刺激し、２４時間後に得られた培養上清に含まれるＴＮＦ−ａｌｐｈａの量を定量（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！）した。●：陰性コントロール（ＥＶ２００１）、▲：ＥＶ００７１５６、＊：Ｓ６、○：Ｇ４
【図１２】ＥＶ００７１５６を用いたマウス体内における薬物動態試験の結果を示す。ＥＶ００７１５６をＣ５７ＢＬ／６Ｎに１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、投与後０．２５日、投与後３日、７日、１４日、２４日に採血した血液中に含まれるＥＶ００７１５６をＥＬＩＳＡで定量した。○：抗ヒトＩｇＧ固相によるＥＶ００７１５６の定量、●：ＨＭＧＢ１固相によるＥＶ００７１５６の定量
【図１３】ＨＭＧＢ１のドメインと作製したデリーションコンストラクトを示す。各ドメインのアミノ酸範囲は、−３０〜０：Ｈｉｓタグおよびリンカー、１〜８８：Ａ−Ｂｏｘ、８９〜１８５：Ｂ−Ｂｏｘ、１８６〜１２５：Ｃ−ｔａｉｌ：１８６〜１２５（数字はメチオニンからのアミノ酸数）。Ｈｉｓタグを付加した全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトの構成ドメインをそれぞれ示す。
【図１４】作製したデリーションコンストラクトの抗Ｈｉｓ抗体による発現確認試験の結果を示す。Ｈｉｓタグを付加した全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクションし、抗Ｈｉｓ抗体で染色し、各デリーションコンストラクトの発現を確認した。Ａ：ＣＨＯ−Ｋ１、Ｂ：Ｈｉｓ−ＨＭＧＢ１（全長）、Ｃ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ｄ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｅ：Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｆ：Ａ−Ｂｏｘ、Ｇ：Ｂ−Ｂｏｘ、Ｈ： ＋Ｃ−ｔａｉｌ、をそれぞれ示す。
【図１５】作製したデリーションコンストラクトのＣＢＢ染色による発現確認試験の結果を示す。Ｈｉｓタグを付加した全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクションし、細胞ライセートを調整した後、Ｎｉ−セファロースを用いて発現しているタンパク質を精製した。それぞれのタンパク質をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＢＢで染色した。
【図１６−ａ】免疫蛍光染色法によるＥＶ００７１５６のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクションし、ＥＶ００７１５６で染色、ＥＶ００７１５６がどのデリーションコンストラクトを認識するか調べた。Ａ：ＣＨＯ−Ｋ１、Ｂ：Ｈｉｓ−ＨＭＧＢ１（全長）、Ｃ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ｄ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｅ：Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｆ：Ａ−Ｂｏｘ、Ｇ：Ｂ−Ｂｏｘ、Ｈ： ＋Ｃ−ｔａｉｌ、をそれぞれ示す。
【図１６−ｂ】免疫蛍光染色法によるＳ６のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクション後、Ｓ６で染色してどのデリーションコンストラクトを認識するか調べた。Ａ：ＣＨＯ−Ｋ１、Ｂ：Ｈｉｓ−ＨＭＧＢ１（全長）、Ｃ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ｄ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｅ：Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｆ：Ａ−Ｂｏｘ、Ｇ：Ｂ−Ｂｏｘ、Ｈ： ＋Ｃ−ｔａｉｌ、をそれぞれ示す。
【図１６−ｃ】免疫蛍光染色法によるＧ４のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１と６種のデリーションコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクション後、Ｇ４で染色してどのデリーションコンストラクトを認識するか調べた。Ａ：ＣＨＯ−Ｋ１、Ｂ：Ｈｉｓ−ＨＭＧＢ１（全長）、Ｃ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ｄ：Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｅ：Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｆ：Ａ−Ｂｏｘ、Ｇ：Ｂ−Ｂｏｘ、Ｈ： ＋Ｃ−ｔａｉｌ、をそれぞれ示す。
【図１７−ａ】ウェスタンブロットによるＥＶ００７１５６のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１および各デリーションコンストラクトをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＥＶ００７１５６で検出した。
【図１７−ｂ】ウェスタンブロットによるＳ６のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１および各デリーションコンストラクトをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｓ６で検出した。ＥＶ００７１５６と異なり、Ｂ−Ｂｏｘを含む領域を認識している。
【図１７−ｃ】ウェスタンブロットによるＧ４のエピトープマッピングを示す。全長ＨＭＧＢ１および各デリーションコンストラクトをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｇ４で検出した。ＥＶ００７１５６と異なり、Ｂ−Ｂｏｘを含む領域を認識している。
【図１８】ＨＭＧＢ１Ｃ末端領域の合成ペプチドによるＥＶ００７１５６のエピトープマッピングを示す。＃１〜＃１０の１０種のペプチドを合成し、ＥＶ００７１５６がどのペプチドを認識するかをドットブロット法で検出した。ドットされたペプチド量は一律４μｇ／ｓｐｏｔである。
【図１９】敗血症モデルマウスを用いたＥＶ００７１５６投与による致死防御効果を示す。ＣＬＰを実施したマウスにＥＶ００７１５６を１０ｍｇ／ｋｇで投与し、術後６日までの生存率を算出した。●：陰性対照群、▲：ＥＶ００７１５６投与群
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．用語の説明
本明細書において、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質と核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されているものである。
【００１９】
本発明は、ＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合し、ＨＭＧＢ１関連疾患の治療・予防に有効なヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体ならびにそれらの抗原結合性断片に関する。以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を実施する形態を詳細に説明する。
【００２０】
１）  ＨＭＧＢ１タンパク質
ＨＭＧＢ１タンパク質（又は、「ＨＭＧＢ１ポリペプチド」と呼ばれることがある。）は、クロマチン構造の維持機能や転写活性調節機能等が考えられていたが、敗血症における遅延性炎症メディエイターとして再発見された後は、種々の疾病の炎症性サイトカインカスケードの中で重要な役割を担っていることが次々と発見されてきた。ＨＭＧＢ１の構造は、リジン残基に富む２１５のアミノ酸からなる２５ｋＤａのタンパク質であり、哺乳動物間では非常に高度に保存されたアミノ酸配列を有する。その構造は、Ａ−ｂｏｘおよびＢ−ｂｏｘと呼ばれる２つのＤＮＡ結合ドメイン、およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のみで構成されているカルボキシル末端ドメイン（Ｃ末ドメイン又は酸性尾部とも呼ばれる。）から成る３つのドメインで構成されている。Ａ−ｂｏｘとＢ−ｂｏｘは、それぞれお互いに高度に保存された約８０個のアミノ酸残基で構成されており、強く正に帯電している。Ｂ−ｂｏｘにはＴＬＲ４（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）結合ドメイン、ＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）結合ドメインが存在する。ＨＭＧＢ１のＴＬＲ４への結合によりマクロファージ/単球からの炎症性サイトカインの分泌が誘導される。尚、最近の研究では、ＨＭＧＢ１によるin vitroでのＴＮＦ-α等のサイトカインの分泌誘導に関して、ＨＭＧＢ１の受容体としてＴＬＲ４/ＭＤ２（ミエロイド分化タンパク質２）複合体に更にＣＤ１４が関与していることが示されている（Mol. Med., 2013 (vol.19) p88 ）。一方、ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥへの結合により内皮細胞や他の体細胞（腫瘍細胞を含む）の増殖、分化、遊走、細胞表面タンパクの発現が誘導される。第三のドメイン、カルボキシル末端は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のみの３０個のアミノ酸配列からなる構造を有しており、極端に負に帯電している。このＣ末端部分のアミノ酸配列に関しても、哺乳動物間で２−３箇所の差異があるのみで、高度に保存されていることが知られている。特に、ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥ結合ドメインに関しては、虚血による脳障害（非特許文献２）および細菌感染に伴う敗血症（非特許文献３）などの疾患において、ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥ受容体の結合を阻害することにより、ＨＭＧＢ１−ＲＡＧＥを介したＨＭＧＢ１関連疾患での炎症反応の増幅を抑えることができることが示されている。
【００２１】
本明細書で用いるＨＭＧＢ１は、哺乳動物由来ＨＭＧＢ１（例えば、ヒトＨＭＧＢ１、ウシ胸腺ＨＭＧＢ１、および齧歯類由来ＨＭＧＢ１等）であるが、それらのアミノ酸配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＧ３３１４４、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＥ４８２６２、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＩ１５６００、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２１１９、および  ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０９４２９（以上はヒト由来）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ１０２９２９（ウシ胸腺由来）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＧＶ９３３５１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来）、ならびに、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ６３１５９（ラット由来）等に開示されている。本発明の抗体は、ＨＭＧＢ１タンパクのＣ末端ドメインに存在するアミノ酸配列（（EEEDDDDE（配列番号６０））に特異的に結合する。ヒト由来ＨＭＧＢ１のみならず、上記ウシ胸腺由来、ＣＨＯ由来、およびラット由来ＨＭＧＢ１のＣ末端には、配列番号６０と全く同じアミノ酸配列が存在する。
【００２２】
２）ＨＭＧＢ１関連疾患
ＨＭＧＢ１は、当初は、クロマチン構造の維持機能や転写活性調節機能、DNA 修復機能等が考えられていたが、特に、１９９９ 年以降、敗血症における遅延性炎症メディエイターとして再発見された後は、種々の疾病の炎症性サイトカインカスケードの中で重要な役割を担っていることが次々と発見されてきた。ＨＭＧＢ１が関与する炎症性サイトカインカスケードは、炎症およびアポトーシスを含む、多数の障害の有害な特性の一因となっており、以下のようなＨＭＧＢ１関連疾患（ＨＭＧＢ１−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）に関与すると考えられている。全てでないが、例えば、特に、(i) 炎症性疾患および自己免疫疾患に属する病状には、関節リウマチ/血清反応陰性関節症、変形性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、腸梗塞、全身性エリテマトーデス、虹彩炎/ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎/ウェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、睾丸炎/精管切除術、全身性硬化症および強皮症がある。(ii) 全身性炎症反応症候群には、敗血症症候群(グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿性敗血症、敗血症結膜炎を含む)、髄膜炎菌血症、外傷性出血、口ごもり、電離放射線暴露、急性および慢性前立腺炎、急性および慢性膵炎、虫垂炎、消化管、胃および十二指腸潰瘍、腹膜炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性大腸炎、憩室炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、腸炎、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)がある。(iii) 再潅流障害には、ポンプ不全後症候群および虚血再潅流障害がある。心臓血管疾患には、心臓性失神症候群、心筋梗塞および虚血、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心内膜炎、心膜炎、うっ血性心不全および再狭窄がある。(iv) 産科および婦人科疾患には、早期分娩、子宮内膜症、流産、膣炎および不妊症がある。(v) 感染性疾患には、HIV感染/HIVニューロパシー、髄膜炎、B型およびC型肝炎、単純ヘルペス感染、敗血症性関節炎、腹膜炎、大腸菌0157:H7、肺炎喉頭蓋炎、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、カンジダ症、フィラリア症、アメーバ症、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、らい病、毒素性ショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス炭疽、ヒト型結核菌、細胞内トリ型結核菌、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、睾丸炎/精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザA、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎がある。(vi) アレルギー性およびアトピー性疾患には、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、花粉症、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎がある。(vii) 悪性腫瘍(液状および固形腫瘍の病状)には、ALL、AML、CML、CLL、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、鼻咽腔癌、悪性組織球増殖症および腫瘍随伴症候群/悪性高カルシウム血症がある。(viii) 移植病には、臓器移植拒否反応および移植片対宿主病がある。(ix) 先天性疾患には、嚢胞性線維症、家族性血球食細胞性リンパ組織球症および鎌状赤血球貧血がある。(x) 皮膚疾患には、乾癬、乾癬性関節炎および脱毛症がある。神経疾患には、神経変性疾患(��発性硬化症、偏頭痛、頭痛、アミロイド関連病状、プリオン病/クロイツフェルト-ヤコブ病、アルツハイマー病およびパーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症)および末梢性ニューロパシー、偏頭痛、頭痛がある。(xi) 腎疾患には、ネフローゼ症候群、血液透析および尿毒症がある。(xii) 医原性中毒状態には、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法および慢性サリチル酸塩中毒がある。(xiii) 代謝性または突発性疾患には、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α-1アンチトリプシン欠乏症、糖尿病および糖尿病の合併症、体重減少、食欲不振、カヘキシー、肥満、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部-下垂体-副腎系の評価および原発性胆汁性肝硬変がある。(xiv) 眼科疾患には、緑内障、網膜症およびドライアイがある。(xv) 他の病状の雑集には、多臓器不全症候群、筋ジストロフィー、敗血性髄膜炎、アテローム性動脈硬化症、喉頭蓋炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、臓器壊死、発熱、敗血症、エンドトキシンショック、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、尿道炎、肺気腫、鼻炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、上皮バリア機能不全、塵肺症、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、播種性菌血症、包虫嚢胞、皮膚筋炎、火傷、日焼け、蕁麻疹、ワースト(warst)、膨疹、血管炎、脈管炎、心筋炎、動脈炎、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、脳炎、脳塞栓、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、医原性合併症/末梢神経病変、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、バーガー病、レティアー症候群、水疱性皮膚炎(水疱性類天疱瘡)、類天疱瘡および尋常性天疱瘡および脱毛症がある。
【００２３】
ところで、近年、ＨＭＧＢ１は、細胞の核内に局在しているのみならず、マクロファージや各種免疫系細胞の活性化に伴って核から細胞質へ移行しＨＭＧＢ１ＨＭＧＢ１細胞外へ放出されること（能動的放出）、あるいは虚血や障害による細胞の壊死に伴って核に局在していたＨＭＧＢ１が速やかに放出されること（受動的放出）が明らかにされて来た。すなわち、これらＨＭＧＢ１が関与する疾患（ＨＭＧＢ１関連疾患：ＨＭＧＢ１−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、２つに大別されると考えられる。１つは、敗血症ショックのような微生物感染に起因する免疫応答に類似する疾患群で、その際には免疫細胞の活性化に伴い炎症反応の後期にＨＭＧＢ１の細胞外分泌が認められる。他方は、脳梗塞のような非微生物的な原因（例えば、虚血や外傷等）による細胞損傷等に起因する疾患群で、細胞損傷に伴い急速なＨＭＧＢ１の細胞外放出が認められ、それにより各種サイトカイン類の産生が起こる。前者では、例えば、感染により活性化した単球、マクロファージ等からの能動的なＨＭＧＢ１の分泌であり、後期の炎症メディエイターとして作用する。関連疾患としては、敗血症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、各種感染症、及び各種免疫疾患等があげられる。後者は、虚血や外傷による細胞壊死に伴い、それまで核に存在していたＨＭＧＢ１が数時間以内に速やかに細胞外に放出され（受動的放出）、早期の炎症メディエイターとして各種炎症性サイトカインの産生を誘導する場合であり、関連疾患としては、脳梗塞、外傷性脳損傷、臓器移植時の虚血に由来する疾患、心筋梗塞等があげられる。
【００２４】
３）抗体
本明細書で使用される「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖であってジスルフィド結合によって相互結合されたものからなる免疫グロブリン分子を指すものとする。本発明におけるモノクローナル抗体も、各々２本の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）を含む免疫グロブリン分子からなる。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」と称す場合がある）とＨ鎖不変部領域（Ｈ鎖不変部領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」と称す場合がある（総称：ＣＨ））からなる。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」と称す場合がある）とＬ鎖不変部領域（Ｌ鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「ＣＬ」と称す場合がある）からなり、それぞれの不変部領域（不変領域、または定常領域とも呼ぶ）の始まる前までを可変部領域（または可変領域）と呼ぶ。
【００２５】
重鎖は定常領域の違いにより、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖に分けられ、この違いによりそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、IgEの5種類のクラス（アイソタイプ）の免疫グロブリンが形成される。さらにヒトの場合、IgGにはIgG1〜IgG4の4つのサブクラスが存在する。一方、軽鎖定常領域の違いにより、κ鎖、λ鎖に分けられる。
【００２６】
一方、ＶＨおよびＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＶＨおよびＶＬのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。更に、ＶＨおよびＶＬにおいても、各種抗体間でより一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している（図３および６参照）。
【００２７】
また、ＦＲ４は、Ｈ鎖可変領域の場合はＤ／Ｊ領域と、Ｌ鎖可変領域の場合はＪ領域とも称される。各領域へのアミノ酸の配分は、原則、Ｋａｂａｔの定義（http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum  参照）に従う。
【００２８】
また、本明細書にはこれら抗体の生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）由来の配列に関する記載もあるが、それら生殖細胞系列由来配列の区分（ファミリー：ｆａｍｉｌｙ）および遺伝子番号の表示は、主として、ＶＢＡＳＥ２（http://www.vbase2.org/vbase2.php）に記載されている「ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ」の表示に準じることとする。具体的には、例えば、軽鎖の中のλ（ラムダー：ｌａｍｂｄａ）鎖の可変領域配列のファミリーに関しては、ＩＧＬＶ１，ＩＧＬＶ２、もしくはＩＧＬＶ３等のように、それら遺伝子の「ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ」番号に関しては、ｈｕｍＩＧＬＶ１０４（＝ＩＧＬＶ３−１＊０１）、およびｈｕｍＩＧＬＶ０７９（＝ＩＧＬＶ３−２５＊０２）のように表示する。また、λ鎖のＪセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）のファミリーに関しては、ＪＬ１、ＪＬ２，もしくはＪＬ３等のように表示する。また、重鎖の可変領域のファミリーに関しては、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２，ＩＧＨＶ３，もしくはＩＧＨＶ４等のように、それらの遺伝子番号の表示は、原則、ＶＢＡＳＥ２（http://www.vbase2.org/vbase2.php）に記載されている「ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ」の表示に準じｈｕｍＩＧＶＨ０４８（＝ＩＧＨＶ３−７３＊０１）、ｈｕｍＩＧＨＶ２４０（＝ＩＧＨＶ３−７２）、およびｈｕｍＩＧＨＶ０２５（＝ＩＧＨＶＨ−１５）のように表示することとする。また、Ｈ鎖のＪセグメントのファミリーに関しては、ＪＨ１，ＪＨ２，ＪＨ３，もしくはＪＨ４等のように表示することとする。
【００２９】
４）  抗体の「抗原結合性断片」（または単に「抗体断片」）
本明細書で使用される抗体の「抗原結合性断片」（または単に「抗体断片」）という用語は、抗原（ＨＭＧＢ１タンパク質）に特異的に結合する能力を持つ１つまたは複数の抗体のフラグメント（例えばＶＨ）を指す。なお、そのフラグメントには抗原に特異的に結合する最小限のアミノ酸配列を有するペプチドも含むものとする。抗体の「抗原結合性断片」という用語内に含まれる結合部分の例としては、(i) Ｆａｂ断片、(ii) Ｆ（ａｂ’）２断片、(iii) ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、(iv) 抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、(v) ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Nature 341:544-546, 1989）(vi) 特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域、(vii) 二重特異性抗体、および(viii) 多特異性抗体などがあげられる。なお、本明細書においては、特に区別せずに「抗体」という場合、全長の抗体のみならず、これらの「抗原結合性断片」も含まれるものとする。
【００３０】
これらは哺乳類ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体であり、当該ＨＭＧＢ１のエピトープ部位、もしくはＨＭＧＢ１断片等に結合し得る。本明細書中で、「抗ＨＭＧＢ１抗体」、「ＨＭＧＢ１を中和し得る抗体」、「抗ＨＭＧＢ１タンパク質抗体」「ＨＭＧＢ１の断片に特異的に結合する抗体」、もしくは「ＨＭＧＢ１の生物活性を中和し得る抗体」とは、ＨＭＧＢ１に結合することによってＨＭＧＢ１の生物活性を阻害する抗体を指すもとする。
【００３１】
５）  ＨＭＧＢ１タンパク質に結合する抗体、またはそのヒト化抗体
哺乳類ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体であり、特に、本発明の抗体は、当該ＨＭＧＢ１タンパクのＣ末ドメインに存在するアミノ酸配列（ＥＥＥＤＤＤＤＥ（配列番号６０））に特異的に結合する。本明細書中で、「抗ＨＭＧＢ１抗体」、「ＨＭＧＢ１を中和し得る抗体」、「抗ＨＭＧＢ１タンパク質抗体」「ＨＭＧＢ１の断片に特異的に結合する抗体」、もしくは「ＨＭＧＢ１の生物活性を中和し得る抗体」とは、ＨＭＧＢ１の上記エピトープ部位に結合することによってＨＭＧＢ１の生物活性を阻害する抗体を指すもとする。前述のように、ＨＭＧＢ１のＣ末端アミノ酸配列（配列番号６０）においても、哺乳動物間で非常に高度に保存されており、ヒトＨＭＧＢ１の上記エピトープに対する抗体を取得するに際して、必ずしも、ヒト由来ＨＭＧＢ１を用いなくてもよく、ラット由来、ＣＨＯ由来、またはウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１タンパク質も使用可能である。
【００３２】
尚、本発明でのＨＭＧＢ１に対するヒト化抗体とは、前記齧歯類由来抗ＨＭＧＢ１抗体をドナーとして、原則、ヒト由来ＦＲにＣＤＲを移植した抗体で、ＦＲ配列の一部に齧歯類由来のアミノ酸残基を含み、元の齧歯類由来抗体またはそのキメラ抗体と同等以上のＨＭＧＢ１結合活性又は中和活性を有する完全長の抗体若しくはその抗原結合性断片を意味する。本願特許で開示した可変部領域を示すアミノ酸配列や、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、ＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合し、より高い結合活性を有するヒト化抗体、もしくは、免疫原性のより低いヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を得ることは容易であり、これらヒト化抗体は本発明の技術的範囲内に属するものである。
【００３３】
６）キメラ抗体およびヒト化抗体
「キメラ抗体」という用語は、そのＬおよびＨ鎖遺伝子が、典型的には、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子から遺伝子工学により構築された抗体を指す。典型的には、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域部位を、ヒト由来のＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４の定常領域部位と結合したものである。遺伝子工学的手法で改変してキメラ抗体を取得する典型的な方法の詳細は、US483457（Genentech特許）等に開示されている。「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリンもしくは抗体と称される）からの可変領域枠組み残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンもしくは抗体とも称される）からの最低１個の相補性決定領域を含んで成る最低１本の鎖を含んで成る抗体を指す。典型的には、キメラ抗体を、更に、ＦＲ配列を含めてヒト配列に近い構造に改変し、非ヒト由来抗体のヒトでの免疫原性を低下させる方法で、代表的な改変方法は、EP0239400；MRC特許、WO90/07861；Protein Design Labs特許、またはEP0626390；Celltech特許）等に開示されている。ヒト化、すなわち、ヒト可変領域のＦＲへのマウスＣＤＲの組み込みを行う際には、正しい空間的位置づけ（ｓｐａｃｉａｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の保持をもたらす可能性を高める必要がある。それを実現するには、用いるヒト抗体の可変領域のＦＲの配列が、ドナー可変領域のＦＲ配列と高度な配列同一性を有するヒト抗体からＦＲ配列を得ることにより達成される。その際、用いるヒト抗体配列としては、天然に存在するヒト抗体の配列を活用する場合、もしくは、ヒト抗体のコンセンサス配列もしくは生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）由来配列等を用いる場合などがある。
【００３４】
７）  等価物
本発明の抗体のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、付加しているか、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせがされた変異が生じており、かつ元の抗体の活性（例：抗原に対する結合能）が保持されているものは、本発明と等価物である。この場合、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加があってもよく、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
【００３５】
自然界のタンパク質を構成しているアミノ酸は、それらの側鎖の特性によって群分け可能であり、例えば、同様な特性を有するアミノ酸群としては、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性アミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、炭化水素鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、およびその他（グリシン、メチオニン、システイン）の群などに分類できる。
【００３６】
非天然型のアミノ酸も含めた相互に置換可能なアミノ酸残基の例としては、下記の様な群わけもあり、同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【００３７】
ところで、本明細書中では、抗体配列のある部位のアミノ酸残基を置換する場合、例えば「ＡＮＢ」の文字で表記する。その際、「Ｎ」は、当該置換部位のナンバー（Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで表記）を、「Ａ」は、置換前のアミノ酸残基をアルファベット１文字で表記、および、「Ｂ」は、置換後のアミノ酸残基をアルファベット１文字で表記したものである。
【００３８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（PNAS, 1990 (vol.87) p2264 ; PNAS, 1993 (vol.90) p5873）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（J Mol Biol , 1990 (vol.215) p403）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。もしくは、タンパク質のアミノ酸配列の同一性を求める際、比較する2種類のタンパク質のアミノ酸配列を並べ、目視で同じアミノ酸残基である部分の数を数えることにより「（同一なアミノ酸残基数／タンパク質全長のアミノ酸残基数）×１００（％）」により求めることもできる。
【００３９】
２．本発明に抗体産生ハイブリドーマの作製方法
上記ＨＭＧＢ１抗原タンパク質を使用して、本発明で使用するラット由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製するには、当該抗原でラットを免疫し、当該動物からリンパ細胞を採取し、常法に従い、ミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを取得することによって、ラット抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００４０】
すなわち、まず、例えば、ウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントとを混合したものを免疫原として用いてラットを免疫する。免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。次いで、常法に従い、免疫した動物からリンパ節を採取して、それから無菌的に得られたリンパ節細胞とマウス・ミエローマ細胞とを細胞融合させ、ＥＬＩＳＡ法などでＨＭＧＢ１への結合性を確認し、目的の抗体産生ハイブリドーマのクローニング操作を繰り返すことにより、モノクローナルな抗体産生細胞を得ることができる。
【００４１】
３．本発明に係るラット抗体の遺伝子取得を取得する工程
ラット抗体を産生するハイブリドーマ細胞から定法に従いＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製、続いてｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡより完全長のＨ鎖とＬ鎖の抗体遺伝子をそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行ない増幅することによりそれぞれの遺伝子断片を取得する。それらを真核細胞発現用ベクターにライゲーションすることにより、該抗体の遺伝子をクローニングすることができる。それら抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列は、それらをコードしているプラスミドベクターをＡＢＩシークエンサーにより塩基配列を確認、それに基づいて該抗体のアミノ酸配列の決定することができる。
【００４２】
４．ヒト化抗体の取得方法
以下に、齧歯類抗体からヒト化抗体を作製するに場合の一例を述べる。以下に記載する方法は、ヒト化の原則的な方法であり、当然ながら、そのバリエーションもあり得る。例えば、まず、ラット抗体の可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸を「カバット（Ｋａｂａｔ）らの定義および／もしくは「チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の定義」に従って決定する。このラット抗体のＣＤＲ配列をアクセプターとなるヒト抗体ＦＲに移植し、ラット抗体のＣＤＲとヒト抗体のＦＲを有する可変領域アミノ酸配列を設計する。この可変領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインし、ＰＣＲ法及び遺伝子組換え技術によりデザイン通りの核酸配列を持つ可変遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子、好ましくはＩｇＧクラスの抗体の定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。次いで、このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる。
【００４３】
上記ヒト化抗体の作製方法において、ラット抗体の可変領域遺伝子中の相補性決定領域遺伝子は、前述の「Ｋａｂａｔの定義」による相補性決定領域の範囲から決定することができる。但し、本明細書では、Ｈ鎖のＣＤＲ１に関してのみは、「Ｋａｂａｔの定義」と「Ｃｈｏｔｈｉａの定義」の両定義にまたがる領域をＣＤＲ１として扱うこととする。また、可変領域のアミノ酸残基の位置表示は、Ｋａｂａｔのナンバリング法（http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum、およびhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/  参照）に従うこととする。
【００４４】
一方、鋳型となるヒト抗体のフレームワーク領域遺伝子としては、前記ラット抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列と相同性の高い配列を、例えばヒト抗体もしくは、ヒト抗体のｇｅｒｍｌｉｎｅやヒト抗体ｇｅｒｍｌｉｎｅのｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列等の中から選び、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を常法により作製し、これを用いればよい。
【００４５】
上記したラット抗体の相補性決定領域遺伝子と鋳型となるヒト抗体のフレームワーク領域遺伝子とを連結し、さらに、この遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子（以下、単に「ヒト化抗体遺伝子」という）を作製する。
【００４６】
なお、一般的に相補性決定領域のアミノ酸だけを置換したヒト化抗体の場合には、オリジナルのラット抗体よりも抗原結合活性が大幅に低下することが多い。そこで、ドナーのラットの抗体および相補性決定領域周辺のアミノ酸のいくつかを合わせて移植する等の方法をとることが多い。上記したヒト化抗体は、オリジナルラット抗体と同等もしくはそれ以上の抗原結合活性を有し、かつラット抗体よりも抗原性の惹起や半減期の短縮等の問題が解消されたものとなる。但し、オリジナルのラット抗体と同等以上の結合活性、もしくは中和活性等を有するヒト化抗体を取得するためのアミノ酸置換に関しては、法則はなく、多くの試行錯誤が求められる。
【００４７】
５．本発明に係るヒト化抗体またはその抗原結合性断片
本発明は、一つの実施形態において、ＨＭＧＢ１に特異的に結合し、ＨＭＧＢ１の生物活性を中和し得るヒト化抗体またはその抗原結合性断片（以下、本発明の抗体と呼ぶ。）が提供される。本発明で明らかにされた、ラット抗ＨＭＧＢ１抗体（＃１０−２２）、そのキメラ抗体、および、そのヒト化抗体のアミノ酸配列の配列番号、ならびに、ヒトＦＲ配列として参考にしたヒト抗体配列またはヒト生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）由来アミノ酸配列の配列番号を（表１、２および３）に示す。
【００４８】
本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性断片としては、表３に配列番号で示されているＥＶ００７１５６の全長、可変領域、またはフレームワーク領域のアミノ酸配列を含むヒト化抗体およびその抗原結合性断片、ならびにそれらのアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を含むヒト化抗体およびその抗原結合性断片が含まれる。
【表１】
2014115430.tif 000002
【表２】
2014115430.tif 000003
【表３】
2014115430.tif 000004
【００４９】
ＧｅｎＧａｎｋ等に登録されているＩＧＬＶ３−ファミリーのＬ鎖可変領域を調べると、そのＮ末は「Ｓ」から開始していると報告されている場合が多数みられるが、ＩＧＬＶ３−ファミリーの配列においても、ｓｉｇｎａｌ配列として３ｊのアミノ酸配列（MAWTALLLSLLAHFTGSVA）または３ｒのアミノ酸配列（MAWIPLFLGVLAYCTGSVA）を選択した場合、２位の「Ｙ」の前で切断される場合があることより、本発明では、ヒト化のテンプレートとするヒトＦＲ配列（配列番号２５〜２８；図３の中では、Ｈｕｍａｎ＿ＶＬと表記。）としては、１位の「Ｙ」が切断された配列を選択した。
【００５０】
本発明の好ましい抗体または抗原結合性断片は、例えば、軽鎖の可変領域が（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖の可変領域が（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含有するヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片の場合である。しかし、ＨＭＧＢ１のＣ末端ドメインに存在する配列番号６０で示されるアミノ酸配列（EEEDDDDE）に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体であれば、上記ＣＤＲ配列の組合せにのみ限定される必要はなく、それら、配列番号７〜１２の６個のＣＤＲ配列において、１〜数個（具体的には、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列であってもよい。本発明がヒト化抗体であることを考えると、本発明のより好ましい形態としては、当然ながら６個のＣＤＲ配列と、および、少なくともＨ鎖の４９位と９４位、およびＬ鎖の４４位と４６位の４箇所のアミノ酸残基はラット由来であるが、それらを除いた部分のＦＲのアミノ酸配列は、ヒト由来配列であることが望ましい。
【００５１】
本願発明でＬ鎖可変領域のヒトＦＲ配列（ｈｕｍａｎ＿ＶＬ；配列番号２５〜２８（順番にＦＲ１，  ＦＲ２，  ＦＲ３，およびＦＲ４の配列））部分を、ヒトλ（ラムダー）鎖生殖細胞系列のＬＶ３ファミリー由来の配列と比較すると、ＦＲ１、２および３に相当する部分はヒトλ（ラムダー）鎖ＩＧＨＬＶ３ファミリー生殖細胞系列のｈｕｍＩＧＬＶ１０４（＝ＩＧＬＶ３−１＊０１）、ｈｕｍＩＧＬＶ０３４（＝ＩＧＬＶ３−２５＊０３）、ｈｕｍＩＧＬＶ０７９（＝ＩＧＬＶ３−２５＊０２）、ｈｕｍＩＧＬＶ１３５、ｈｕｍＩＧＬＶ０９４（＝ＩＧＬＶ３−１０＊０１）、およびｈｕｍＩＧＬＶ０７７（＝ＩＧＬＶ３−２７＊０１）（遺伝子番号は「ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ」で表示）と同一性が高く、数残基（１０個未満）の差異があるのみである。また、ＩＧＬＶ３のｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列（例えば、ＷＯ２０１１/０８０３５０参照）においても上記Ｈｕｍａｎ＿ＶＬと数アミノ酸残基の違いがあるのみである。一方、ヒトＦＲ配列のＦＲ４に相当する部分（配列番号２８）は、ヒトλ（ラムダー）鎖生殖細胞系列ＪセグメントのＪＬ２（配列番号２２；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１５６４１）、ＪＬ３（ＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）、およびＪＬ７（ＡＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ）とそのアミノ酸配列が一致していた。本願明細書中のＨ鎖可変領域のヒトＦＲ配列（配列番号３５〜３８；図６の中では、Ｈｕｍａｎ＿ＶＨと表記。）に関しては、ヒトＨ鎖生殖細胞系列のＩＧＨＶ３ファミリー由来の配列と比較すると、ＦＲ１、２，および３に相当する部分の配列は、ｈｕｍＩＧＨＶ０４８（＝ＨＶ３−７３＊１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１５４６７）およびＩＧＨＶ３−７３＊２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＭ９４０２２４）と１００％一致していた。更に、ＩＧＨＶ３ファミリー内でｈｕｍＩＧＨＶ０４８と同一性の高い配列を調べると、ｈｕｍＩＧＨＶ０２５、ｈｕｍＩＧＨＶ１７８、ｈｕｍＩＧＨＶ２１５、およびｈｕｍＩＧＨＶ２４０（いずれもＶＢＡＳＥ２  ＩＤ）があげられ、ｈｕｍＩＧＨＶ０４８がコードするアミノ酸配列と５箇所以下のアミノ酸残基に違いが見られたのみであり、ＩＧＨＶ３ファミリー内には高い同一性を有する生殖細胞系列の配列が複数存在する。ＩＧＨＶ３のｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列（例えば、ＷＯ２０１１/０８０３５０参照）においても上記Ｈｕｍａｎ＿ＶＨと数アミノ酸残基の違いがあるのみである。また、Ｈｕｍａｎ＿ＶＬの中のＦＲ４部分の配列（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に関しては、ヒトＨ鎖生殖細胞系列ＪセグメントのＪＨ１、ＪＨ４、およびＪＨ５と一致している（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２５６  参照）。
【００５２】
これらを鑑みると、本発明のより好ましい形態としては、ＨＭＧＢ１、好ましくはＨＭＧＢ１のＣ末端ドメインに存在する配列番号６０で示されるアミノ酸配列（EEEDDDDE）に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片であれば、（ ｉ ）重鎖可変領域（ＶＨ）においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列として配列番号７、８、および９のアミノ酸配列を、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列として配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列をそれぞれ含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列中１〜数個（具体的には、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよく、
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列として配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列として配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列をそれぞれ含有し、但し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４８、４９、および５０のアミノ酸配列中１〜数個（具体的には、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／もしくは付加の変異を有していてもよいヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片も本発明に含まれる。上記のＦＲ配列で、Ｈ鎖の場合は少なくとも４９位および９４位の２箇所アミノ酸残基は、ラット抗体＃１０−２２由来のアミノ酸残基である配列、およびＬ鎖の場合は少なくとも４４位および４６位の２箇所のアミノ酸残基はラット抗体＃１０−２２由来の配列である配列がさらに好ましい。さらに、最も好ましいのは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれるＦＲ配列をそれぞれ含有するヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片である。この場合も、ＨＭＧＢ１のＣ末端ドメインに存在する配列番号６０で示されるアミノ酸配列（EEEDDDDE）に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体であれば、配列番号３３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および、配列番号３４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含有する、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片も本発明に含まれる。
【００５３】
また、本願発明のヒト化抗体として好ましいクラス（サブクラス）は、ＩｇＧ１（λ）、およびＩｇＧ２（λ）などであるが、ＩｇＧ３（λ）およびＩｇＧ４（λ）も、本発明に含まれる。
【００５４】
６．本発明に係る抗体等をコードする核酸
本発明の別の実施形態によれば、ＨＭＧＢ１、好ましくはＨＭＧＢ１のＣ末端ドメインに存在する配列番号６０で示されるアミノ酸配列（ＥＥＥＤＤＤＤＥ）に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒト化抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸（ヌクレオチド）であって、配列番号７〜９の群、１０〜１２の群、３９、４０、４１、または４２のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸、および該核酸と高い同一性を有する単離された核酸も本発明に含まれる。ここで、「高い同一性を有する」とは、高ストリンジェントな条件下で所定の核酸配列に対してハイブリダイズすることができる程度の配列同一性を意味し、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％、またはそれを超える同一性を有することを意味する。高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から選択される単離された核酸が提供される。好ましくは、上記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくはＤＮＡである。
【００５５】
「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である（例えば、J.SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), 特に１１．４５節"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"参照）。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５６】
上記高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸としては、アミノ酸配列をコードする核酸と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の同一性を有する核酸が含まれる。
【００５７】
塩基配列の同一性は、上述した同一性検索アルゴリズムなどを利用して決定することが出来る（Proc. Natl． Acad．Sci． USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）。
【００５８】
なお、本発明でヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体として好ましい核酸は、配列番号３９または４１のアミノ酸配列のいずれかをコードする単離された遺伝子、または配列番号４０または４２のアミノ酸配列のいずれかをコードする単離された遺伝子、もしくは、これら核酸（ＤＮＡ）のいずれかと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸である。更に、より好ましい核酸としては、配列番号４１および４２のアミノ酸配列を共にコードする単離された核酸（ＤＮＡ）であり、最も好ましい核酸の１つとしては、配列番号３９および配列番号４０のアミノ酸配列を共にコードする単離された核酸である。
【００５９】
７．本発明に係るベクター、宿主細胞および抗体の作製方法
本発明は、上記核酸を組込んだベクターおよびそのベクターが導入された宿主細胞、これらを用いる抗体の作製方法にも関する。
【００６０】
本発明の抗体は、公知の方法を用いた組換えヒト抗体としても作製できる（Nature,312:643,1984 、Nature,321:522,1986など参照）。例えば、本発明の抗体は、本発明に係るベクターを導入した宿主細胞を培養し、培養上清などから、産生された抗体を精製することによって作製することができる。より具体的には、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを同一細胞または別のヒト細胞より作製したヒト抗体ＣＨおよび／またはヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を含有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
【００６１】
本発明の抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、ＥＦプロモーターおよび／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクターが挙げられる。また、通常ＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にコトランスフェクトするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。
【００６２】
発現ベクターを導入する宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、哺乳類細胞（ＣＯＳ−１、ＣＨＯ、ミエローマ細胞、ＹＢ２／０細胞等）が挙げられる。
【００６３】
組換抗体を工業的に生産するためには、一般的には当該抗体を安定して高生産する組換動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株が利用される。そのような組換細胞株の作製、クローン化、高発現のための遺伝子増幅およびスクリーニングは公知の方法を用いることができる（例えば、Omasa T.: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002等参照）。
【００６４】
本発明は重鎖２本と軽鎖２本からなる抗体のほかに、本発明の抗体の抗原結合性断片も含まれる。抗原結合性断片としては、例えばＦａｂ （fragment of antigen binding ）、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２があり、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Fv ：ｓｃＦｖ）やジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv ：ｄｓＦｖ）があり、抗体の活性断片を含むペプチドとして例えばＣＤＲ を含有するペプチドが挙げられる。これらは、本発明の抗体を適当な蛋白分解酵素で処理する方法または遺伝子組換技術等、公知の方法で製造することができる。
【００６５】
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。具体的には、抗ＨＭＧＢ１抗体を精製するには、選抜された細胞を、ディシュ、ローラ瓶、２リットル入りスピナー・フラスコ、または他の培養系で増殖させることができる。得られた培養上清を濾過し、濃縮してからプロテインＡあるいはプロテインＧ−セファロース（ＧＥヘルスケア社）などによるアフィニティ・クロマトグラフィにかけて当該タンパク質を精製することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、ＯＤ280または好ましくはネフェロメータ分析により、濃度を判定できる。アイソタイプはアイソタイプ抗原に特異的な方法で調べることができる。このようにして得られたヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体は、ラット抗体に比べ抗体に対する免疫原性が低いことが期待できる。
【００６６】
近年開発された抗体の糖鎖部分の修飾や定常領域の修飾・置換によりエフェクター活性を修飾した抗体等を取得することができるが、このようにして得られたヒト化抗体も、本発明の技術範囲に属する。更にまた、当該抗体にプロテアーゼ耐性能力を付加し、経口投与可能にするために行うＦｃ領域の部分的な置換技術（WO2006/071877参照）を応用して得られた抗体またはその抗原結合性断片であれば、本発明の技術的範囲内に属する。
【００６７】
８．本発明に係る抗体を含有する医薬組成物
次に、本発明は、上記抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容可能な担体を含む、ＨＭＧＢ１関連疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供する。
【００６８】
特に、本発明に係るヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＭＧＢ１の特異的に結合し、ＨＭＧＢ１の生物活性を中和する高い活性を有するので、ＨＭＧＢ１ が関与する疾患の予防または治療薬として有用である。本明細書で使用される「医薬品として許容される担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬品として許容される担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数、ならびにこれらの組合せが含まれる。注射剤などとして使用される場合、ｐＨ調節剤や等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬品として許容される担体には、さらに、湿潤剤や乳化剤、防腐剤、緩衝剤、安定化剤など、抗体または抗体部分の保存性または有効性を増大させる少量の補助物質を含めることができる。
【００６９】
本発明の組成物は、様々な剤型にすることができる。そのような組成物には、例えば、溶液（例えば注射可能であり輸液可能な溶液）や分散液、懸濁液、錠剤、カプセル、トローチ、ピル、粉末、リポソーム、坐剤など、液体、半固体、固体の剤型が含まれる。好ましい形は、意図される投与形態および治療の適用例により異なる。一般に好ましい組成物は、他の抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物など、注射可能または輸液可能な溶液の形にあるものである。好ましい投与形態は、非経口的なもの（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内から）である。好ましい実施形態では、抗体は、静脈輸液または静脈注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【００７０】
本発明の抗体および抗体断片は、非経口投与に適する医薬品組成物に組み込むことができる。抗体または抗体部分は、単独種類を使用する場合には、０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。一方、複数種類の抗体を混合して使用する場合には、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。なお、その複数種類の抗体の混合割合は、適宜設定することができる。
【００７１】
注射可能な製剤は、有効成分を液体に溶解したものまたは有効成分を凍結乾燥させたものを、フリントまたはアンバーバイアル、アンプル、またはプレフィルドシリンジに入れたもので構成することができる。緩衝剤は、ｐＨ５．０〜７．０（最適な場合、ｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）、最適な場合は５〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジンにすることができる。その他の適切な緩衝剤には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。濃度０〜３００ｍＭの溶液（液体剤型に関しては、最適な場合、１５０ｍＭ）の浸透圧を変えるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥させた剤型には、凍結保護物質、主に０〜１０％（最適な場合、０．５〜５．０％）のスクロースを含めることができる。その他の適切な凍結保護物質にはマンニトール、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥させた剤型には、増量剤、主に１〜１０％のマンニトール（最適な場合、２〜４％）を含めることができる。液体および凍結乾燥させた剤型の両方には、安定剤、主に１〜５０ｍＭ（最適な場合、５〜１０ｍＭ）のＬ−メチオニンを使用することができる。その他の適切な安定剤にはグリシン、アルギニンおよびポリソルベート８０等が含まれ、ポリソルベート８０の場合、０〜０．０５％（最適な場合、０．００５〜０．０１％）を含めることができる。他の界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
本医薬組成物は、一般に、製造および貯蔵の条件下で無菌または安定でなければならない。この組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に適するその他のオーダーされた構造として、処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物（すなわち抗体または抗体部分）を、必要な場合には上述の成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に混ぜ、その後、濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものから必要とされるその他の成分を含有する無菌ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に混ぜることによって、分散液を調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末製剤の場合、好ましい調製方法は、前に述べたその滅菌濾過溶液の凍結真空乾燥および噴霧乾燥であり、それによって、活性成分の粉末に加え、任意の他の所望の成分を含んだ組成物が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって行うことができる。
【００７３】
９．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性を評価する工程
抗体または抗体組成物の生物学的特性は、ＨＭＧＢ１の生物活性を当該抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制する能力を試験することによって評価することができる。抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価法には、ＥＬＩＳＡなどの結合アッセイ法および中和アッセイ法等が含まれる。
【００７４】
１）結合活性
ここで「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、所定の抗原を認識してそれに結合すること言う。抗体とＨＭＧＢ１との結合親和性を測定するには、公知の方法を用いることができる。例えば、チップ上に固定化したFタンパク質を用いてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（登録商標）のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。結合親和性（KD値）は、当該測定法で得られたKd(解離定数)とKa（結合定数）の比（KD=Kd/Ka）で表示される。ヒト由来ＨＭＧＢ１抗原を固相したイムノプレートを作成し、ＥＬＩＳＡ法によっても、抗原結合活性の差異を調べることができる。
【００７５】
本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性断片であって、ヒト由来ＨＭＧＢ１タンパク（リコンビナント）に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）を２５０ｎｇ／ｍｌで比較した場合、＃１０−２２キメラ抗体の１．５倍以上、好ましくは２倍以上、最も好ましくは２．５倍以上高い活性を有するヒト化抗体またはその抗原結合性断片も、本発明に含まれる。また、同じ方法でヒト抗ＨＭＢＧ１抗体Ｇ４（WO2007/001422）と比較した場合、Ｇ４の５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上高い活性を有するヒト化抗体またはその抗原結合性断片も、本発明に含まれる。
【００７６】
２）ＲＡＧＥ結合阻害活性
抗ＨＭＧＢ１抗体のＲＡＧＥ結合阻害活性は、例えばＲＡＧＥ-Ｆｃを用いて評価することができる。ＲＡＧＥ−Ｆｃを固相化したイムノプレートを作製、一定量のＨＭＧＢ１と種々の濃度の抗ＨＭＧＢ１抗体（＃１０−２２、ＥＶ００７１５６、Ｇ４）とを混和・インキュベートし、ＲＡＧＥに結合するＨＭＧＢ１量を検出することにより、各種抗体によるＨＭＧＢ１がＲＡＧＥへ結合するのを阻害する活性を調べることができる。尚、これまで報告されているヒトモノクローナル抗体の中では、Ｇ４が最も高いＲＡＧＥ結合阻害活性を有することが示されていた（WO2007/001422）。
【００７７】
３）ヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α放出阻害活性
抗ＨＭＧＢ１抗体のＴＮＦ−α放出阻害活性は、ヒトのＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）を用いて評価することができる。ヒト健常人よりＰＢＭＣを単離し、ＨＭＧＢ１で刺激した際に認められるＴＮＦ−αの放出量を抗ＨＭＧＢ１抗体の添加により、阻害するか否かを調べることが出来る。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＨＭＧＢ１によるＴＬＲ４シグナル伝達系の活性化には、ＭＤ２、ＣＤ１４等が共存していることを考慮すると、このヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価法は、単にＴＬＲ４分子とＨＭＧＢ１との結合に対する抗ＨＭＧＢ１抗体の阻害効果を評価する方法より、より意義のある評価系であると言える。
【００７８】
１０．Ｉｎ  vivoでの活性を評価する系
抗ＨＭＧＢ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、種々の動物モデルで評価できるが、その１例として敗血症による致死を防御効果を抗体投与後の生存率を算出することで評価する方法がある。マウスの敗血症モデルとしてはＣＬＰ法（Ｃｅｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ、Ｌｕｔｔｅｒｌｏｈ  ｅｔ．ａｌ．）があるが、詳細は実施例に示す。
【００７９】
本明細書で使用される、「中和」、「阻害効果」、「阻害」、「抑制」、「阻害し得る」等々の用語は、抗原（ＨＭＧＢ１）に起因する生物活性を約５〜１００％、好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２０〜１００％、より好ましくは３０〜１００％、より好ましくは４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、さらに好ましくは８０〜１００％、低減させることをいう。
【００８０】
ＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１タンパクの結合を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が、それぞれ２０μｇ／ｍＬ（約０．１３μＭ）以下、好ましくは、１０μｇ／ｍＬ（約６７ｎＭ）以下、より好ましくは５μｇ／ｍＬ（約３３ｎＭ）、最も好ましくは４．０５μｇ／ｍＬ（約２７ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片は、本発明に含まれる。また、抗体２μｇ／ｍｌの濃度におけるＨＭＧＢ１タンパクのＲＡＧＥへの結合阻害率（％）が、４０％以上であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片は、本発明に含まれる。
【００８１】
ヒトＰＢＭＣにおけるＨＭＧＢ1タンパク質によるＴＮＦ-α放出を５０％阻害する活性（ＩＣ５０）が０．０５μｇ／ｍＬ（約０．３３ｎＭ）以下、好ましくは０．０２μｇ／ｍＬ（約０．１３ｎＭ）以下、最も好ましくは０．０１６μｇ／ｍＬ（約０．１１ｎＭ）以下であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片は、本発明に含まれる。また、抗体０．０１μｇ／ｍｌの添加におけるＴＮＦ-α放出阻害効果が、３０％以上、好ましくは４０％以上、最も好ましくは４２．０％以上であるヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片は、本発明に含まれる。
【００８２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。本実施例において使用する手順は、特に言及しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001）で参照することができる。
【実施例】
【００８３】
実施例１ 抗ＨＭＧＢ１ラットモノクローナル抗体の調製
本願特許で使用したＨＭＧＢ１抗原に対するラット抗体＃１０−２２を産生するハイブリドーマ細胞の取得方法については、（WO2007/049468、US2009/0252739,およびFASEB J, 2007 (21) p3904等）に開示されているが、以下に要点を記す。
（a）  ラットの免疫
市販のウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２との混合物（和光純薬工業社製、コード番号：０８０−０７０７４１）をフロイント完全アジュバンドと共にラットの後肢足蹠に投与、２週間後に抗体価の上昇を確認、次いで５週間後に腫大した腸骨リンパ節からリンパ節細胞を無菌的に取り出した。
（b）  細胞融合と抗ＨＭＧＢ１抗体産生細胞のクローニング
上記腸骨リンパ節細胞とマウス・ミエローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２）細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を、９６穴マイクロプレートで培養し、ＥＬＩＳＡでの一次スクリーニングおよびウェスタンブロットによる二次スクリーニングを経て抗ＨＭＧＢ１抗体産生細胞をクローニングした。  【００８４】
実施例２  抗体遺伝子のクローニング
（ａ）抗体遺伝子クローニング
＃１０−２２を産生するハイブリドーマ細胞からＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、続いて、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらに、５‘ ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）−ＰＣＲ法を用いて、得られたｃＤＮＡより完全長のＨ鎖とＬ鎖の抗体遺伝子をそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行ない増幅した。増幅された＃１０−２２抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子断片を真核細胞発現用ベクターにクローニングした。【００８５】
（ｂ）クローニングした＃１０−２２の抗原結合性確認
Ｈ鎖、Ｌ鎖をコードしているプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時に導入した。遺伝子導入はリポフェクトアミンＬＴＸとプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。２日後に培養上清を回収し、イムノプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に固相化したウシ胸腺由来のＨＭＧＢ１（シノテスト、＃３２６０５９６８３、１００ ｎｇ/ｗｅｌｌ）と室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ０４５０）と室温で１時間反応させた。ＴＭＢ（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine；ＳｕｒｅＢｌｕｅ、ＫＰＬ、＃５２−００−０３）を加え、４５０ｎｍの吸光度で培養上清中の抗体がＨＭＧＢ１に結合することを確認した（図１）。【００８６】
（ｃ）塩基配列にもとづく＃１０−２２のアミノ酸配列の決定
＃１０−２２のＨ鎖、Ｌ鎖の塩基配列をＡＢＩシークエンサーにより確認した。得られた塩基配列により、＃１０−２２のＨ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸配列を決定した。シグナル配列を含むＨ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸配列を配列番号1及び２に、シグナル配列を含まぬＨ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸配列を配列番号３及び４に、および可変領域（ＶＨおよびＶＬ）のアミノ酸配列を配列番号５及び６にそれぞれ示す。【００８７】
また、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の解析には、「Ｋａｂａｔの定義」を用いた（www.bioinf.org.uk: Dr.Andrew C.R. Martin’s Group, Antibodies: General Information）。ただし、Ｈ鎖ＣＤＲ１に関しては、「Ｋａｂａｔの定義」と「Ｃｈｏｔｈｉａの定義」（http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum）の両定義でカバーされている配列とした。＃１０−２２のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７、８および９に、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示す。【００８８】
実施例３  キメラ抗体およびヒト化抗体の作製【００８９】
（ａ）  ＃１０−２２キメラ抗体の作製
ラット抗体を抗体医薬として使用可能にするため、抗体の抗原結合性はそのままに免疫原性を軽減することを目的に、抗体遺伝子工学を用いてキメラ抗体およびヒト化抗体を作製した。まず、ラット抗体の定常領域をヒト由来のアミノ酸配列（ＩｇＧ１（λ））と置換したキメラ抗体を作製した。作製されたキメラ抗体の抗原結合性は、ラット抗体と同様の方法で検出し、抗原結合性が維持されていることを確認した（図２）。キメラ抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号１３および１４にそれぞれ示す。【００９０】
（ｂ）  ＃１０−２２キメラ抗体Ｌ鎖のヒト化
ヒト化には＃１０−２２キメラ抗体の６つのＣＤＲ領域（＃１０−２２ ＶＬ−ＣＤＲ１/２/３と＃１０−２２ ＶＨ−ＣＤＲ１/２/３）を残し、ラット抗体＃１０−２２由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をヒトＦＲ（ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４）に組替える必要がある。まず、＃１０−２２キメラ抗体Ｌ鎖のＦＲ配列と相同性の高いヒトＦＲ配列候補の検索を、Ｖ―ＢＡＳＥ（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）およびＢｌａｓｔ(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)を用いて行い、ヒト由来のＬ鎖可変領域配列を８種（配列番号１５〜２４）選択した。それらの可変領域のアミノ酸配列および＃１０−２２キメラ抗体のアミノ酸配列でアライメントをとり、ヒトＦＲ配列では認められない「ラット・アミノ酸残基」を選定、それら１４箇所（５位、１１位、１４位、１５位、１７位、１９位、４１位、４２位、４４位、４６位、５９位、６０位、７６位、及び７７位）すべてを上記８種のヒトＦＲ配列のコンセンサス配列に置換したＬ鎖ＦＲのヒト・アミノ酸配列（Ｈｕｍａｎ＿ＶＬ；配列番号２５〜２８）を定めた（図３）。次に、ラット・アミノ酸残基部位の１４箇所について、１アミノ酸残基ずつ置換した部位置換キメラ抗体（Ｌ鎖）（Ｉ５Ｔ、Ａ１１Ｖ、Ｔ１４Ｓ、Ｌ１５Ｐ、Ｎ１７Ｑ、Ｖ１９Ａ、Ｄ４１Ｇ、Ｋ４２Ｑ、Ｉ４４Ｐ、Ｒ４６Ｌ、Ｓ５９Ｐ、Ｄ６０Ｅ、Ｒ７６Ｓ、および、Ｄ７７Ｇ）の遺伝子をそれぞれ作製した。得られた１４種の＃１０−２２キメラ抗体（Ｌ鎖）の部位置換体遺伝子それぞれと＃１０−２２キメラ抗体（Ｈ鎖）遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時に導入した。作製された１４種の抗体を抗ＩｇＧ抗体を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で定量し、抗体濃度を一律にした後、抗原結合性について調べた。これらの部位置換体のうち、Ｌ鎖可変領域内のＩ４４ＰとＲ４６Ｌの２種の部位置換体では、いずれも抗原結合性がキメラ抗体と比べて顕著に低下した（図４）。なお、置換部位の位置表示は、Ｋａｂａｔナンバリング法に従った。【００９１】
＃１０−１１キメラ抗体Ｌ鎖の中で、４４位、４６位および３つのＣＤＲ配列はラット抗体Ｌ鎖可変領域由来のアミノ酸配列をそのまま残し、それら以外の可変領域のアミノ酸配列は前記Ｈｕｍａｎ＿ＶＬのアミノ酸配列に全て組換えたＬ鎖をコードするヒト化抗体（Ｌ鎖）遺伝子を作製した。得られた＃１０−２２ヒト化抗体（Ｌ鎖）（以下、ＥＶ００７１５６Ｌと称す。）遺伝子と＃１０−２２キメラ抗体（Ｈ鎖）遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時に導入した。作製された抗体を、抗ＩｇＧ抗体を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で定量し、抗体濃度を一律にした後、抗原結合性について調べた。この抗体の抗原結合性はキメラ抗体と比べて同等、或いは僅かな向上が認められた（図５）。【００９２】
（ｃ）  ＃１０−２２キメラ抗体Ｈ鎖のヒト化
＃１０−２２キメラ抗体のＨ鎖ＦＲ配列と相同性の高いヒトＦＲ配列候補の検索をＬ鎖と同様に行い、ヒト由来のＨ鎖配列を６種（配列番号２９〜３４）選択、それらの可変領域およびラット抗体＃１０−２２由来Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列でアライメントをとった（図６）。これらヒトＦＲ配列では認められない「ラット・アミノ酸残基」１５箇所（１位、１５位、１６位、２０位、４１位、４９位、７６位、７７位、７８位、８２ａ位、８２ｂ位、８９位、９４位、１０７位、および１０８位）を選定、それらすべてを上記６種のヒトＦＲ配列のコンセンサス配列に置換したＨ鎖ＦＲのヒト・アミノ酸配列（Ｈｕｍａｎ＿ＶＨ；配列番号３５〜３８）を定めた（図６）。次に、上記キメラ抗体Ｈ鎖について、ＦＲ配列上にある非ヒト・アミノ酸残基部位１５箇所を１アミノ酸残基ずつ置換した部位置換キメラ抗体（Ｈ鎖）（Ａ１Ｅ、Ｋ１５Ｇ、Ｅ１６Ｇ、Ｉ２０Ｌ、Ｐ４１Ｓ、Ａ４９Ｇ、Ｓ７６Ｎ、Ｍ７７Ｔ、Ｖ７８Ａ、Ｄ８２ａＮ、Ｎ８２ｂＳ、Ｍ８９Ｖ、Ａ９４Ｒ、Ｖ１０７Ｔ、およびＭ１０８Ｌ）の遺伝子をそれぞれ作製した。得られた１５種の＃１０−２２キメラ抗体（Ｈ鎖）の部位置換体遺伝子それぞれとＥＶ００７１５６Ｌ遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時に導入した。作製された１５種の抗体を、抗ＩｇＧ抗体を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で定量し、抗体濃度を一律にした後、抗原結合性について調べた。これら部位置換抗体のうち、Ｈ鎖可変領域内のＡ４９ＧとＡ９４Ｒの２種の部位置換体では、抗原結合性がキメラ抗体（Ｈ鎖）遺伝子とＥＶ００７１５６Ｌ遺伝子の共発現から得られた抗体と比べていずれも顕著に低下した（図７）。【００９３】
＃１０−１１キメラ抗体Ｈ鎖の中で、４９位、９４位および３つのＣＤＲ配列はラット抗体Ｈ鎖可変領域由来のアミノ酸配列をそのまま残し、それら以外のＨ可変領域のアミノ酸配列は前記Ｈｕｍａｎ＿ＶＨのアミノ酸配列に全て組換えたＨ鎖をコードするヒト化抗体（Ｈ鎖）遺伝子を作製した。得られた＃１０−２２ヒト化抗体（Ｈ鎖）（以下、ＥＶ００７１５６Ｈと称す。）遺伝子とＥＶ００７１５６Ｌ遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時に導入した。作製された抗体を、抗ＩｇＧ抗体を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で定量し、抗体濃度を一律にした後、抗原結合性について調べた。この抗体の抗原結合性は、＃１０−２２キメラ抗体（Ｈ鎖）遺伝子とＥＶ００７１５６Ｌ遺伝子の共発現から得られた抗体と比べて顕著な向上が認められた（図８）。＃１０−２２ヒト化抗体（以下、ＥＶ００７１５６と称す。）のＨ鎖とＬ鎖の全長のアミノ酸配列を配列番号３９および４０に、可変領域のアミノ酸配列を配列番号４１および４２にそれぞれ示す。また、Ｈ鎖可変領域のＦＲ１，ＦＲ２．ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列を配列番号４３、４４、４５および４６に、Ｌ鎖可変領域のＦＲ１，ＦＲ２．ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列を配列番号４７、４８、４９、および５０にそれぞれ示す。【００９４】
尚、＃１０−２２キメラ抗体、およびＥＶ００７１５６のＨＭＧＢ１に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）を評価するために、ウシ胸腺由来のＨＭＧＢ１を２５ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で、４℃で一晩固相化したイムノプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にＮ１０１（日本油脂）を加えてプレートを２時間ブロッキングした後、＃１０−２２キメラ抗体、およびＥＶ００７１５６をそれぞれ４μｇ／ｍｌから４倍希釈したサンプル（７濃度分）を一次抗体として室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧガンマ抗体（ＭＢＬ、＃２０８）を室温で１時間反応させた。ＴＭＢを加えた後、４５０ｎｍの吸光で検出を行なった。この結果、抗体濃度を２５０ｎｇ／ｍｌとしたときのヒト化抗体ＥＶ００７１５６は＃１０−２２キメラ抗体よりも約５倍高い抗原結合性を示した。【００９５】
実施例４  各種ＨＭＧＢ１との結合性
（ａ）  各種ＨＭＧＢ１の調整
（ａ―１）ウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１
ウシ胸腺由来のＨＭＧＢ１はシノテスト社もしくはＣｈｏｎｄｒｅｘ社から入手した。
（ａ―２）ヒト由来リコンビナントＨＭＧＢ１（Ｓｆ９発現）【００９６】
ヒト由来のリコンビナントＨＭＧＢ１はＮ末端にＨｉｓタグを結合させた形でバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞から精製した。つまり、Ｓｆ９細胞にＨＭＧＢ１を発現するバキュロウイルスを感染させた後、７２時間回転培養し、遠心によりセルペレットを得た。その後、プロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに細胞を懸濁し、ソニケーション（１分ｘ４回）を行なって細胞を破砕した。続いて、１５，０００ｒｐｍで１５分遠心してＨＭＧＢ１を含む上清を回収した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｎｉ−ＮＴＡにて上清に含まれているＨＭＧＢ１を吸着させ精製し、１００ｍＭイミダゾールで溶出し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で透析を行なった。【００９７】
（ａ―３）ヌクレアーＨＭＧＢ１
ヌクレアーＨＭＧＢ１は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭで培養したＣＨＯ―Ｋ１細胞から作製した。つまり、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ、５％ＣＯ２、３７℃の条件化でＣＨＯ−Ｋ１を培養し、細胞密度がコンフルエントに達したところでＣＨＯ細胞をＰＢＳ（−）で２回洗い、セルスクレーパー（Ｎｕｎｃ、＃１７９６９３）で掻き取った後、遠沈管に回収した。細胞溶液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．２％になるように加え、ソニケーションで細胞破壊した。溶液を核型抗原とした。【００９８】
（ａ―４）ネクローティックＨＭＧＢ１
ネクローティックＨＭＧＢ１は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭで培養したＣＨＯ―Ｋ１細胞から作製した。つまり、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ、５％ＣＯ２、３７℃の条件化でＣＨＯ−Ｋ１を培養し、細胞密度がコンフルエントに達したところでＰＢＳ（−）を加えて２回洗浄した。その後、超純水を適量加えた後、セルスクレーパーを用いて細胞を掻き取った。恒温槽とドライアイスを用いて、凍結融解を５回繰り返して細胞を破壊し、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心して細胞屑を除去した。上清をネクローティックＨＭＧＢ１として−８０℃で保存した。【００９９】
（ａ―５）アポトーティックＨＭＧＢ１
アポトーティックＨＭＧＢ１は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭで培養したＣＨＯ―Ｋ１細胞から作製した。１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ、５％ＣＯ２、３７℃の条件化でＣＨＯ−Ｋ１を培養し、細胞密度がコンフルエントに達したところでＣＨＯ細胞にＵＶを２分間照射し、無血清ＤＭＥＭ培地に置換した後、１６時間培養後の培地を回収した。遠心で細胞を除いた上清をアポトーティックＨＭＧＢ１とした。【０１００】
（ａ―６）２次壊死ＨＭＧＢ１
２次壊死ＨＭＧＢ１は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭで培養したＣＨＯ―Ｋ１細胞から作製した。１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ、５％ＣＯ２、３７℃の条件化でＣＨＯ−Ｋ１を培養し、細胞密度がコンフルエントに達したところでＣＨＯ細胞にＵＶを２分間照射し、無血清ＤＭＥＭ培地に置換した。４８時間培養後に培地を回収し、遠心で細胞を除いたものを２次壊死ＨＭＧＢ１とした。【０１０１】
（ａ―７）活性化ＨＭＧＢ１
活性化ＨＭＧＢ１は１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩで培養したＲＡＷ細胞（ＲＩＫＥＮ）から作製した。１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ、５％ＣＯ２、３７℃の条件化でＲＡＷ細胞を培養し、細胞密度がコンフルエントに達したところでＲＡＷ細胞をＰＢＳ（−）で２回洗い、無血清ＲＰＭＩ培地に置換した後、１μｇ／ｍｌのＰｏｌｙＩＣで刺激した。刺激後２４時間の培養上清を回収し、遠心で細胞を除いたものを活性化ＨＭＧＢ１とした。【０１０２】
（ｂ）ウェスタンブロットによるＥＶ００７１５６の各種ＨＭＧＢ１との結合性
＃１０−２２、そのヒト化抗体（ＥＶ００７１５６）、Ｓ６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社）、およびＧ４（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社）の抗体について、上記で作製した種々のＨＭＧＢ１に対しての結合性をウェスタンブロットで調べた。つまり、ウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１、Ｓｆ６発現リコンビナントヒトＨＭＧＢ１、ヌクレアーＨＭＧＢ１、ネクローティックＨＭＧＢ１、アポトーティックＨＭＧＢ１、２次壊死ＨＭＧＢ１、活性化ＨＭＧＢ１それぞれに５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間煮沸した。ＨＭＧＢ１サンプルを段階希釈したものを、１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行なった後、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。５％スキムミルク−ＴＢＳＴで２時間ブロッキング後、＃１０−２２、ＥＶ００７１５６、Ｓ６、およびＧ４（それぞれ２μｇ／ｍｌ）を室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識の２次抗体を室温で１時間反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２２３２）を用いて検出行なった（表４）。なお、陽性対照抗体として、WO2007/001422に記載のヒト抗ＨＭＧＢ１抗体（Ｓ６およびＧ４）を、当該特許に開示されているアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成、抗体産生・精製を行い試験に供した。
【表４】
2014115430.tif 000005
【０１０３】
（ｃ）  ＃１０−２２キメラ抗体、ＥＶ００７１５６の抗原結合ＥＬＩＳＡ
上記ヒト由来のリコンビナントＨＭＧＢ１を２５ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で、４℃で一晩固相化したイムノプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にＮ１０１（日本油脂）を加えてプレートを２時間ブロッキングした後、＃１０−２２キメラ抗体、ＥＶ００７１５６、Ｓ６およびＧ４をそれぞれ４μｇ／ｍｌから４倍希釈したサンプル（７濃度分）を一次抗体として室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧガンマ抗体（ＭＢＬ、＃２０８）を室温で１時間反応させた。ＴＭＢを加えた後、４５０ｎｍの吸光で検出を行なった（図９の（Ａ））。また、抗体濃度を２５０ｎｇ／ｍｌとしたときの各ＨＭＧＢ１抗体の各ＨＭＧＢ１（リコンビナント）に対する結合率を図９の（Ｂ）に示した。ヒト化抗体ＥＶ００７１５６は＃１０−２２キメラ抗体よりもリコンビナントＨＭＧＢ１に対しては約２．５倍高い抗原結合性を示した。また、ＥＶ００７１５６は、リコンビナントＨＭＧＢ１に対してはＳ６よりも４５倍、Ｇ４よりも２２倍高い結合性を示した。【０１０４】
実施例５  結合阻害アッセイ
ＲＡＧＥ結合阻害アッセイ【０１０５】
ＲＡＧＥ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、２５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を４℃で一晩固相化したイムノプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に５％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ）を加えてプレートを２時間ブロッキングした後、ヒトモノクローナル抗体（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｇ）を加えてプレートを２時間ブロッキングした。ＨＭＧＢ１（Ｓｆ６由来リコンビナントＨＭＧＢ１、終濃度２μｇ／ｍｌ）に対し、終濃度が（０、０．０２、０．２、２、２０μｇ／ｍｌ）になるように抗ＨＭＧＢ１抗体（＃１０−２２キメラ、ＥＶ００７１５６、Ｇ４）および陰性対照コントロール抗体としてＨＭＧＢ１に特異性を有しないヒトモノクローナル抗体(Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｇ)を混和し、６０分インキュベートした。続いて、反応溶液をイムノプレートに加え、２時間反応させた。その後、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＬＫ０３）でビオチン化した抗ＨＭＧＢ１抗体（Ａｂｎｏｖａ、＃Ｈ００００３１４６−Ｍ０８、１μｇ／ｍｌ）を室温で１時間反応させた。最後に、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを室温で１時間反応させた。ＴＭＢ（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine；ＳｕｒｅＢｌｕｅ、ＫＰＬ、＃５２−００−０３）を加え、４５０ｎｍの吸光でＲＡＧＥに結合しているＨＭＧＢ１を検出した（図１０）。＃１０−２２キメラ、ＥＶ００７１５６、Ｇ４すべてにおいて添加した抗体濃度依存的にＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１の結合を阻害した。またその阻害効果は、抗体２μｇ／ｍｌの添加において、＃１０−２２キメラが４４．０％、ＥＶ００７１５６が４６．２％であるのに対し、Ｇ４が１．４％であった。また、抗体を２０μｇ／ｍｌ添加した場合においては、＃１０−２２キメラが７７．０％、ＥＶ００７１５６が５８．６％に対し、Ｇ４は３６．９％であった。また、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、＃１０−２２キメラで３．０４μｇ／ｍｌ（２０．３ｎＭ）、ＥＶ００７１５６で４．０５μｇ／ｍｌ（２７ｎＭ）、Ｇ４では２０μｇ／ｍｌ（１３０ｎＭ）以上であった。従って、＃１０−２２キメラ、ＥＶ００７１５６の方がＧ４よりもＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１結合に対する阻害効果が顕著に強いことがわかった。【０１０６】
実施例６  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ放出阻害アッセイ
ヒト健常人よりＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）を単離し、ＨＭＧＢ１で刺激した際に認められるＴＮＦ−ａｌｐｈａの放出量をＥＶ００７１５６の添加が阻害するかを調べた。先ず、ヒト末梢血をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳＩＧＭＡ、＃１０７７１）を用いて遠心し（１，４００ｒｐｍ、３０分）、ＰＢＭＣを分離、回収した。次に、得られたＰＢＭＣをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で２ｘ１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマルチプレート（ＢＤ、＃３５３０７２）に播いた。そこに予め３７℃、３０分でプレインキュベートしたウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、終濃度１μｇ／ｍｌ）および抗ＨＭＧＢ１抗体（ＥＶ００７１５６、Ｓ６、Ｇ４）もしくは陰性対照コントロール抗体としてＨＭＧＢ１に特異性を有しないヒトモノクローナル抗体（終濃度１０μｇ／ｍｌからの段階希釈）の混合液を加えた。添加培養後２４時間の培養上清を回収し、Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃８８−７３４６）を用いてＴＮＦ−ａｌｐｈａの定量を行った（図１１）。またその阻害効果は、抗体０．０１μｇ／ｍｌの添加において、ＥＶ００７１５６が４２．０％であるのに対し、Ｓ６が２１．３％、Ｇ４が２５．５％であった。また、抗体を０．１μｇ／ｍｌ添加した場合においては、ＥＶ００７１５６が７５．９％に対し、Ｓ６は４９．４％、Ｇ４が６８．５％であった。また、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＥＶ００７１５６で０．０１６μｇ／ｍｌ（０．１０６ｎＭ）であるのに対し、Ｓ６では０．１０６μｇ／ｍｌ（０．７０６ｎＭ）、Ｇ４では０．０２６μｇ／ｍｌ（０．１７３ｎＭ）以上であった。このことから、ＥＶ００７１５６の方がＳ６およびＧ４よりもＴＮＦ−ａｌｐｈａの放出阻害効果が優位に強いことが明らかとなった。【０１０７】
これらのことは、本発明のヒト化抗体ＥＶ００７１５６は、マクロファージおよび単球細胞でのＨＭＧＢ１によるＴＬＲ-４受容体を介したシグナル伝達活性化に対する阻害効果が実質的に高いことを示している。【０１０８】
実施例７  アフィニティ測定
表面プラズモン共鳴によって生体分子の結合相互作用を検出するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いて、ＨＭＧＢ１に対する抗体の親和性を測定した。先ず、センサーチップ（ＣＭ５）にＥＶ００７１５６、Ｓ６もしくはＧ４を０．５μｇ／ｍｌの濃度でリガンドとして吸着させた。次に１０ｎＭからの２倍希釈系列で調整したリコンビナントＨＭＧＢ１をアナライトとしてセンサーチップ上に流して結合親和性を計測した。得られた結果から各抗体のＫＤ（Ｍ）値は、ＥＶ００７１５６は３．２９× １０−１０Ｍ、Ｓ６およびＧ４はそれぞれ２．６７× １０−１０、６．７９× １０−１０Ｍであった（表５）。
【表５】
2014115430.tif 000006
【０１０９】
実施例８  薬物動態試験
ＥＶ００７１５６を８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ（メス）に１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、投与後６時間（０．２５日）、３日、７日、１４日、２４日に採血した。３，５００ｒｐｍ、１０分の遠心で血清を分離し、得られた血清を予め抗ヒトＩｇＧ抗体を２５０ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で一晩固相したイムノプレート（Ｎｕｎc、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）で１時間反応させた。次にＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＢＬ、＃２０８）で１時間反応させた。ＴＭＢ（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine；ＳｕｒｅＢｌｕｅ、ＫＰＬ、＃５２−００−０３）を加えた後、４５０ｎｍの吸光で抗体濃度の定量を行なった。また、ＥＶ００７１５６の抗原に対する結合性を確認するために、リコンビナントＨＭＧＢ１を２５ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で一晩固相化したイムノプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を用いて抗体定量と同様の手順で検出した。結果を図１２に示す。抗体投与６時間からすでに血中抗体濃度が上昇し、投与後３日には血中抗体濃度は８０μｇ／ｍｌで落ち着いた。その後、投与後２４日かけて徐々に減少し、最終的に４０μｇ／ｍｌとなった。投与されたＥＶ００７１５６のマウス体内での半減期は２２．８日と算出された。抗体当たりの抗原結合性については、投与後３日から２４日まで抗体量に対しての抗原結合性が低下していないことから、ＥＶ００７１５６はマウス体内中で２４日経過しても、抗体量に見合った抗原結合性を有しており、抗体としての安定性を保持していることがわかった。【０１１０】
実施例９  エピトープマッピング
（ａ）  デリーションコンストラクトの作製
デリーションコンストラクトの作製に先んじて、ＨＥＫ２９３からヒト由来のＨＭＧＢ１遺伝子をクローニングした。つまり、Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ＩＩ（ａｍｂｉｏｎ、＃ＡＭ１７２３）を用いてＨＥＫ２９３をＲＴ−ＰＣＲし、Ｎ末端にヒスチジンタグを付加して増幅したＰＣＲ断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。得られた遺伝子配列は、シークエンサー（ＡＢＩ、３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）にてヒトＨＭＧＢ１の遺伝子と相違ないことを確認した。【０１１１】
次に、ＥＶ００７１５６のエピトープを決定するためにＨＭＧＢ１をＡ−ＢＯＸ、Ｂ−ＢＯＸ、Ｃ−ｔａｉｌの３領域に分類し、計６種類のデリーションコンストラクト（全長ＨＭＧＢ１、Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ａ−Ｂｏｘ、Ｂ−ＢｏｘおよびＣ−ｔａｉｌ）を作製した（図１３）。各デリーションコンストラクトの発現は免疫蛍光染色およびＣＢＢ染色法で確認した。免疫蛍光染色での確認としては、各断片（全長を含む計７種類）を発現するプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。２４時間後に細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、その後、抗Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ、ＰＭ０３２）を１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させた。続いて、Ａｌｅｘａ４８８抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０７０）を１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させ、落射型蛍光顕微鏡で蛍光シグナルを観察した（図１４）。一方、ＣＢＢ法での確認としては、トランスフェクション後２４時間の細胞にＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて細胞を溶解した。細胞ライセートに含まれるデリーションコンストラクトをＮｉ−セファロース６Ｂ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。溶出液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出したサンプルを５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間煮沸した。各サンプルを１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＣＢＢで染色してデリーションコンストラクトの発現を確認した（図１５）。結果から、免疫蛍光染色、ＣＢＢ染色法ともにＣ−ｔａｉｌ以外のデリーションコンストラクトの発現が認められた。【０１１２】
（ｂ）  免疫蛍光染色法によるエピトープ領域の検出
各断片（全長を含む計７種類）を発現するプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。２４時間後に細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、その後、ＥＶ００７１５６（１μｇ／ｍｌ）を１時間反応させた。続いて、Ａｌｅｘａ４８８抗ヒトＩｇＧ抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させ、落射型蛍光顕微鏡で蛍光シグナルを観察した（図１６）。ＥＶ００７１５６は全長ＨＭＧＢ１の他にＡ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌおよびＢ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌつまりＣ末端を含むコンストラクトに反応することが分かった。このことから、ＥＶ００７１５６のエピトープはＨＭＧＢ１のＣ末端領域に存在する可能性が高いと判断した。次に、Ｓ６およびＧ４についても同様の実験を行った。結果から、Ｓ６（図１６−ｂ）およびＧ４（図１６−ｃ）ともにＢ−Ｂｏｘを含むコンストラクトに反応することが分かった。ＥＶ００７１５６の染色パターンとは異なる結果となった。【０１１３】
（ｃ）  ウェスタンブロット法によるエピトープ領域の検出
各断片を発現するプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。２４時間後に細胞にＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、細胞を溶解した。続いて、５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間煮沸した。各サンプルは１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、１００ｍＡ、１時間でＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク−ＴＢＳＴで２時間ブロッキングした後、ＥＶ００７１５６（１μｇ／ｍｌ）を室温で１時間反応させた。続いて、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（ＭＢＬ、＃２０８）を室温で１時間反応させた。ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２２３２）を用いてＥＶ００７１５６を検出した（図１７）。結果から、ＥＶ００７１５６は免疫蛍光染色の結果同様、全長ＨＭＧＢ１の他にＣ末端を含むコンストラクト（Ａ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌおよびＢ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ）に反応することが分かった。従って、ＥＶ００７１５６のエピトープはＣ末端領域に存在すると判断した。次に、Ｓ６およびＧ４についても同様の実験を行った。Ｓ６およびＧ４も免疫蛍光染色の結果同様、Ｂ−Ｂｏｘを含むコンストラクト（Ａ−Ｂｏｘ＋Ｂ−Ｂｏｘ、Ｂ−Ｂｏｘ＋Ｃ−ｔａｉｌ、Ｂ−Ｂｏｘのみ）に反応することが分かった。従って、Ｓ６およびＧ４のエピトープはＢ−Ｂｏｘに存在すると判断した。このことから、ＥＶ００７１５６はＳ６およびＧ４とは異なるエピトープを保有していることが明らかとなった。【０１１４】
（ｄ）  ペプチドマッピング（ドットブロット）
ＥＶ００７１５６のＨＭＧＢ１に対するエピトープがＨＭＧＢ１のＣ末端を構成するアミノ酸のどこにあるかを特定するために、ペプチドマッピングを実施した。つまり、１２残基の長さのアミノ酸を３残基の間隔で９種類および最Ｃ末端の８残基の１本を含めた計１０種類のペプチド（＃１．EEEEDEEDEEDE（配列番号５１）、＃２．EDEEDEEDEEEE（配列番号５２）、＃３．EDEEDEEEEEDE（配列番号５３）、＃４．EEDEEEEEDEED（配列番号５４）、＃５．DEEEEEDEEDED（配列番号５５）、＃６．EEEEDEEDEDEE（配列番号５６）、＃７．EEDEEDEDEEED（配列番号５７）、＃８．DEEDEDEEEDDD（配列番号５８）、＃９．EDEDEEEDDDDE（配列番号５９）、＃１０．EEEDDDDE（配列番号６０））を設計し、ＨＭＧＢ１のＣ末端領域を構成するアミノ酸を網羅した。合成したペプチド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、ＰＥＰＳｃｒｅｅｎ）を０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、ニトロセルローズ膜に４μｇ／ｓｐｏｔになるように滴下した。乾燥後、５％スキムミルク−ＴＢＳＴで９０分間ブロッキングした。次に、ＥＶ００７１５６を１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＢＬ、＃２０８）を１時間反応させた後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２２３２）を用いて検出した（図１８）。結果から、ＥＶ００７１５６はＨＭＧＢ１の最もＣ末端の領域である＃９．EDEDEEEDDDDEを強く認識し、より詳しくは最もＣ末端の８残基（＃１０．EEEDDDDE（配列番号６０））を認識していることが明らかになった。【０１１５】
実施例１０  ＥＶ００７１５６の敗血症モデルマウスに対する効果
ＥＶ００７１５６が敗血症による致死を防御できるかどうかを抗体投与後の生存率を算出することで調べた。マウスの敗血症モデルはＣＬＰ法（Ｃｅｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ、Ｌｕｔｔｅｒｌｏｈ  ｅｔ．ａｌ．）に準じて作製した。つまり、ＢＡＬＢ／ｃ（日本ＳＬＣ、メス、８週齢、１６匹）に８０ｍｇ／ｋｇになるようにペントバルビタールナトリウム（ナカライテスク、＃２６４２７−１４）を腹腔内投与して麻酔した。正中を１ｃｍ程切開してから盲腸を取り出し、その約９０％を縫合糸で結索した。次に、２３ゲージのシリンジニードル（テルモ、＃ＮＮ−２３３２Ｓ）を用いて盲腸壁を上下で１回ずつ（計２回）貫通させた。盲腸を腹腔の所定の場所に戻し、切開部を縫合糸で縫合した。切開部に終濃度が１％キシロカイン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）と１２５Ｕ／ｇのバラマイシン（小野薬品）を塗り込んだ。さらに、２５ｍｇ／ｋｇになるようにイスタミン（日医工）を筋肉投与した。翌日、術後２４時間に抗体投与群としてＥＶ００７１５６を１０ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与した。また、コントロール群においては生理的食塩水のみを腹腔内投与した。その後、抗体投与後６日まで状態観察を実施し、各群の生存率を算出した（図１９）。結果、術後４８時間でコントロール群において生存率が５０％に減少したものの、ＥＶ００７１５６を投与した抗体投与群においては生存率１００％を維持していた。この生存率の維持は術後５日まで続いた。また、術後６日の生存率はコントロール群の３７．５％に対し、抗体投与群においては８７．５％と高かった。この結果から、ＥＶ００７１５６の投与はＣＬＰ法による敗血症モデルマウスにおいてマウスの生存率を有意に向上させており、この抗体の投与が敗血症にともなう致死に対して極めて有効な手段であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明のヒト化抗ＨＭＧＢ１抗体またはその抗原結合性断片は、これまでのヒト由来抗ＨＭＧＢ１抗体と比較し、哺乳動物由来のＨＭＧＢ１に対する高い親和性・中和活性を有し、またヒト化によりラット抗体の免疫原性が減弱されるため、ヒトへの適用において有利であり、多くの重篤なＨＭＧＢ１関連疾患に対して新しい治療法・予防法を提供し得るものとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−ａ】
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【図１６−ｂ】
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【図１６−ｃ】
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【図１７−ａ】
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【図１７−ｂ】
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【図１７−ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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