(57)【要約】  本開示は、組織修復にかかわる反応を促進可能な組織修復活性組成物を提供することを目的とする。本開示は、この目的のため、組織の修復活性組成物に、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分及びコンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのいずかれ１種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含めるようにする。
2014098249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有する第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有する第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、組織修復剤。
【請求項２】
少なくとも前記第１の成分及び前記第２の成分のいずれか又は双方を含む、請求項１に記載の組織修復剤。
【請求項３】
前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、請求項１又は２に記載の組織修復剤。
【請求項４】
前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項５】
前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項６】
前記第３の成分を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項７】
前記第１の成分、前記第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上の成分を、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の組織修復剤。
（ａ）炎症組織における組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、抗炎症剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、アルツハイマー症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病からなる群から選択される中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、急性および慢性間質性肺炎、I型およびII型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶からなる群から選択される非中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
【請求項１１】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤。
【請求項１２】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、抗炎症性サイトカインの産生促進剤。
【請求項１３】
生体外で、球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でと、ミクログリア又はマクロファージを培養する工程、を備える、組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法。
【請求項１４】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、ミクログリア／マクロファージ用の試薬キット。
【請求項１５】
前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、請求項１４に記載の試薬キット。
【請求項１６】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を損傷組織又は炎症組織に送達して組織修復を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、炎症性疾患における組織修復活性組成物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、異物、病原体の排除、組織の防御や修復にかかわる一連の過程である。炎症反応のプロセスにおいては、同時に非自己を積極的に排除する免疫反応も並行して進行する。例えば、中枢神経系を除く組織においては、マクロファージが、生体内に侵入した細菌、ウイルス、又は死んだ細胞を捕食し消化する。また抗原提示を行い、Ｂ細胞による抗体の作成に貢献する。また、中枢神経系では、ミクログリアグリアが免疫担当細胞であり、マクロファージ類似の作用を担っているとされている。【０００３】
ミクログリアやマクロファージには、組織破壊型と組織修復型の２種類があることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。炎症反応の病原体の排除や組織の防御のプロセスにおいては、組織破壊型のミクログリアやマクロファージが集積する。しかしながら、過剰な集積が生じると自己組織の損傷を生じさせたり、痛みを増悪させたりする。一方、組織修復プロセスでは、組織修復型のミクログリアやマクロファージが組織修復を促進する。【０００４】
損傷部の治療を目的として、歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清を含む組成物が有効であることが記載されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１１／１１８７９５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】David, S., & Kroner, A， Nature Reviews Neuroscience, 12(7), 388-399
【非特許文献２】Popovich, P. G., & Longbrake, E. E., Nature Reviews Neuroscience, 9(6), 481-493.
【発明の概要】
【０００７】
炎症反応が生じている組織においては、組織破壊型ミクログリアやマクロファージにおいて組織修復型のミクログリアやマクロファージの出現を積極的に促進することが、炎症の治療に有効であると考えられる。あるいは、組織修復型ミクログリアやマクロファージによって亢進される抗炎症性サイトカインが、炎症反応が生じている組織で亢進されることが有効であると考えられる。
【０００８】
しかしながら、現状において、組織修復型のミクログリアやマクロファージを誘導又は増殖を促進する因子や手法は未だ提供されていない。また、抗炎症性サイトカインを亢進する因子や手法も未だ提供されていない。
【０００９】
本明細書は、炎症反応が生じている組織を含む、損傷を受けているあるいは受ける可能性のある組織においてその修復にかかわる反応を促進可能な組織修復剤及びその利用を提供する。また、本開示によれば、同時に以下の組織修復剤及びその利用も提供される。
【００１０】
本発明者らは、歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清に含まれる種々の成分について検討していたところ、特定の３種成分が炎症組織においてが組織修復型のミクログリア／マクロファージを誘導し、あるいは抗炎症性サイトカインを亢進するという知見を得た。また、こうした成分のうち少なくとも一部を炎症反応が生じている組織に適用したところ、効果的に治癒するという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき、以下の手段を提供する。
【００１１】
（１）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質（以下、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９ともいう。）である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分、
からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む、組織修復活性組成物。
（２）前記第１の成分と、前記第２の成分と、を含む（１）及び（２）に記載の組成物。
（３）前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）さらに、コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）前記第１の成分及び前記第２の成分を、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（ａ）炎症組織における組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物である、抗炎症剤組成物。
（８）脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、アルツハイマー症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病からなる群から選択される中枢神経系疾患の治療用である、（７）に記載の組成物。
（９）劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、急性および慢性間質性肺炎、I型およびII型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶からなる群から選択される非中枢神経系疾患の治療用である、（７）に記載の組成物。
（１０）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分、
からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む、組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤。
（１１）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分、
からなる群から選択される少なくとも１種を含む、抗炎症性サイトカインの産生促進剤。
（１２）生体外で、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分、の存在下で、ミクログリア又はマクロファージを培養する工程を備える、組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法。
（１３）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を備える、ミクログリア及び／又はマクロファージ用の試薬キット。
（１４）前記第１の成分及び前記第２の成分を含む、（１３）に記載の試薬キット。
（１５）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分、
からなる群から選択される少なくとも１種を損傷組織又は炎症組織に送達して組織修復を促進する方法。
【００１２】
（１６）  単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有する第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有する第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、組織修復剤。
（１７）少なくとも前記第１の成分及び前記第２の成分のいずれか又は双方を含む、（１６）に記載の組織修復剤。
（１８）前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、（１６）又は（１７）に記載の組織修復剤。
（１９）前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１６）〜（１８）のいずれかに記載の組織修復剤。
（２０）前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１６）〜（１９）のいずれかに記載の組織修復剤。
（２１）前記第３の成分を含む、（１６）〜（２０）のいずれかに記載の組織修復剤。
（２２）前記第１の成分、前記第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上の成分を、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有する、（１６）〜（２１）のいずれかに記載の組織修復剤。
（ａ）炎症組織における組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
（２２）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、抗炎症剤。
（２３）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、アルツハイマー症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病からなる群から選択される中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
（２４）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、急性および慢性間質性肺炎、I型およびII型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶からなる群から選択される非中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
（２５）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤。
（２６）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、抗炎症性サイトカインの産生促進剤。
（２７）生体外で、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でと、ミクログリア又はマクロファージを培養する工程、を備える、組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法。
（２８）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、ミクログリア／マクロファージ用の試薬キット。
（２９）前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、（２８）に記載の試薬キット。
（３０）単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を損傷組織又は炎症組織に送達して組織修復を促進する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】劇症肝炎モデルラットにおける生存率を示す図である。
【図２】劇症肝炎モデルラットにおける血液検査による肝障害の評価結果を示す図である。
【図３】劇症肝炎モデルラットにおける肝細胞死（ＨＥ染色及びＴＵＮＥＬ染色）評価結果を示す図Ａ及びＢである。
【図４】劇症肝炎モデルラットにおける炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）死細胞のセンサーであるマンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）の遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図５】劇症肝炎モデルラットにおけるマクロファージ染色結果を示す図である。
【図６】ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果を示す図ａ〜ｆである。
【図７】ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果を示す図a〜ｃである、ａの上段写真は、ＧＦＡＰ及びＨ−Ｅ染色の結果を示し、下段は、ＳＣＩ後８週での組織腔面積の定量結果を示し、ｂは、５−ＨＴ陽性神経線維の免疫組織学的画像を示し、ｃは、組織腔の中央から５ｍｍ頭部側及び５ｍｍ尾側における５−ＨＴ陽性神経線維の定量結果を示す。
【図８】脊髄損傷部位におけるサイトカインと細胞表面マーカーの遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価した結果を示す図である。
【図９】脊髄損傷から７２時間後の部位を取り囲むミクログリア／マクロファージの典型的画像と定量結果を示す図である。
【図１０】脊髄挫傷後の後肢の機能回復の時間経過を示す図である。
【図１１】（Ａ）は、ＴＨＰ−１溶解物をＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＣＣＲ２で免疫沈降し、抗ＣＣＲ２抗体又はＭＡＨ−レクチンでイムノブロットした結果を示す。（Ｂ）は、ＣＳＰＧ処理が、ミクログリアのＣＣＲ２発言を増大させることを示す。（Ｃ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９がミクログリアにおいてＣＣＲ２と物理的に相互作用することを示す。
【図１２】ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群に関し、生存率及び体重の変化を示す図である。
【図１３】肺組織における構造変化と膠原線維の増殖をＨＥ染色およびマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて評価した結果を示す図である。
【図１４】肝硬変モデルマウスにおける肝組織のＨＥ染色結果を示す図である。
【図１５】肝硬変モデルマウスにおける肺組織のシリウスレッド染色（赤染色：線維素の染色）結果を示す図である。
【図１６】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織における炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法による解析結果を示す図である。
【図１７】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織における炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法による解析結果を示す図である。
【図１８】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びMCP-1投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群から採取した肝臓組織におけるα-SMAの染色結果を示す図である。
【図１９】関節炎の重症度に関する関節炎スコアの評価基準を示す図である。
【図２０】ＣＩＡマウスにおける、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による関節炎抑制効果の解析結果を示す図である。
【図２１】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による長期間の関節炎抑制効果を示す図である。
【図２２】（Ａ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与がＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−αの発現亢進を抑制することを示し、（Ｂ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与がヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞において、ＴＮＦ−α刺激によるＭＭＰ−３発現亢進に対して、明らかな抑制効果を示さないことを示す図である。
【図２３】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１をラット頭蓋骨欠損モデルに投与後、６週間での骨再生効果を示す図であり、Ｈ−Ｅ染色結果、マイクロＣＴ結果及び新生骨％を示す。
【図２４】ＭＩＮ細胞を用いてインスリン分泌能の比較検討を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書は、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分及びコンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む組織修復活性組成物（組織修復剤、以下、単に本剤という。）及びその利用に関する。本剤によれば、これらの成分中、少なくとも１種類を含むことにより、組織修復部位における残余の成分との相乗効果によりにより、免疫担当細胞であるミクログリア／マクロファージを組織修復型へ分化ないし変換することを誘導することができる。このため、炎症反応部位に本剤を送達することにより、組織修復型ミクログリア／マクロファージを積極的に作用させて、炎症反応部位の組織の修復を活性化できる。
【００１５】
第１の成分、第２の成分及び第３の成分は、炎症反応部位に存在しうる。いずれかが存在する場合には、当該炎症反応部位に存在する成分を本剤から排除することもできるし、当該成分を減量することができる。第1の成分は、炎症反応部位に存在することが知られている。また、第３の成分も炎症部位に普遍的に存在する成分である。なかでも、第１の成分は炎症反応部位、特に慢性の炎症反応部位に存在していることが知られている。また、第３の成分は、細胞膜ないし細胞間物質の構成成分である。第１の成分及び第３の成分が炎症反応部位に存在するときには、本剤は第２の成分を主体として又は第２の成分のみを含むことができる。
【００１６】
本剤は、好ましくはこれらの成分のうち、２種以上を含む。２種以上の成分を含むことで、より効果的にミクログリア／マクロファージの変換を促進できる。さらに、３種の成分を含むことがより好ましい。
【００１７】
本剤は、前記３種の成分中、前記第１の成分と前記第２の成分とを含んでいることが好ましい。コンドロイチン硫酸やコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである第３の成分は炎症部位に常在する成分であり、第１の成分と第２の成分と協動して組織修復型ミクログリア／マクロファージファージを誘導する。したがって、本剤は、前記第１の成分と前記第２の成分とのみからなっていてもよい。
【００１８】
以下、本明細書の開示の各種実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「修復」とは、標的組織における損傷によって失われた機能の一部又は全部が、損傷時における損傷部の機能と比較して維持又は拡幅していることを意味している。機能が回復することのみならず、機能的な組織として再生することを包含している。機能が維持又は回復しているか否かの評価手法は損傷部位における損傷内容に応じて異なる。損傷部位の外観、対象となる機能の程度を評価するために通常用いられるアッセイが用いられる。
【００１９】
本明細書において、「炎症」とは、異物の存在又は何らかの原因による組織損傷によって誘発される、身体を保護しようと働く哺乳動物における機構をいう。「炎症反応」とは、炎症において生じる一連のプロセスをいう。「炎症反応」には、炎症により誘発される組織破壊を含むことができる。「炎症性疾患」とは、身体組織の炎症により、又は炎症要素を有することにより特徴付けられる疾病、疾患又は症状を意味する。これらには局所的な炎症反応及び全身性の炎症反応が含まれる。
【００２０】
（修復活性組成物（組織修復剤））
本明細書に開示される組織修復剤が備えうるタンパク質である、第１の成分及び第２の成分は、動物などの生体から回収されるものであってもよいし、遺伝子工学的あるいは化学的に合成されたものであってもよい。第１の成分と第２の成分との総タンパク量が、修復剤全体のタンパク質成分として、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、一層好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上であることが好ましい。本修復剤において第１の成分と第２の成分との総タンパク質量が組成物全体のタンパク質量において上記範囲を占めることで、より組織修復活性の高い修復剤となる。
【００２１】
（第１の成分）
第１の成分は、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である。この種のタンパク質は、ヒトをはじめとして各種動物においてホモログが知られている。本剤においては、こうしたヒトなどの動物に由来する天然のＭＣＰ−１を天然の原料から回収したものであってもよいし、遺伝子工学的又は化学的に取得したものであってもよい。例えば、ヒトのＭＣＰ−１は配列番号２で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号：NP02973.1）を有している。また、ヒトのＭＣＰ−１は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされている。
【００２２】
第１の成分は、ＭＣＰ−１活性を有していれば足りる。すなわち、公知の天然のＭＣＰ−１他、新たに、本剤におけるＭＣＰ−１活性を有することが確認されたタンパク質であってもよい。また、天然のＭＣＰ−１に改変が加えられたものであって本剤におけるＭＣＰ−１活性を有しているものであってもよい。本剤におけるＭＣＰ−１活性としては、第２の成分及びコンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと協動してミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性、あるいは抗炎症性サイトカインの産生促進活性が挙げられる。こうした活性は、後述する実施例を参照すれば当業者であれば容易に評価することができる。
【００２３】
例えば、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立した第２の成分及び必要に応じて後述するＣＳ等の存在下、可能性ある第１の成分を供給して、組織修復型ミクログリア／マクロファージの指標となるＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１のタンパク質あるいはｍＲＮＡの産生を確認することなどで評価することができる。
【００２４】
また、例えば、抗炎症性サイトカインの産生促進活性は、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立された第２の成分及び必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第１の成分を供給して、例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１などの抗炎症性サイトカインの産生を確認することなどで評価することができる。
【００２５】
なお、改変ＭＣＰ−１など第１の成分のＭＣＰ−１活性は、上記の活性を有していれば足り、その程度は問わない。好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のＭＣＰ−１活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上である。
【００２６】
公知のＭＣＰ−１以外の第１の成分としては、データベース等において開示されるＭＣＰ−１の配列情報と一定の関係を有するタンパク質であってもよい。こうした一態様としては、開示されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度である。より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００２７】
また、他の一態様としては、開示されるＭＣＰ−１のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は、より好ましくは６５％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００２８】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で"同一性 "とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００２９】
第１の成分として使用できる各種のタンパク質は、ＭＣＰ−１の公知のアミノ酸配列や塩基配列のほか、ＭＣＰ−１の公知のアミノ酸や塩基配列と一定の関係を有するタンパク質であって本明細書におけるＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。例えば、ケモカインリガンド（ＣＣＬ）ファミリーが挙げられる。典型的には、ＣＣＬ１３，同７、同８、同１１等が挙げられる。
【００３０】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列との関係において、同一性が６０％以上のタンパク質としては、以下の４種が挙げられる。
（１）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン１３プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_005399.1、配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性は６５％、類似性は８２％）
（２）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン７プレカーサー（NCBIアクセッション番号:NP_6264.2、同同一性７３％、同類似性７８％）
（３）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン８プレカーサー（NCBIアクセッション番号:NP_005614.2、同同一性６９％、同類似性８４％）
（４）ヒトエオタキシンプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_002977.1、同同一性７０％、同類似性８４％）
【００３１】
さらに他の一態様として、開示されるＭＣＰ−１をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにまた好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、開示される塩基配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされ、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３２】
このようなタンパク質やそれをコードするＤＮＡは、例えば、開示される塩基配列等に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、ＭＣＰ−１をコードする遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００３３】
また、タンパク質やそれをコードするＤＮＡは、例えば、開示されるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００３４】
（第２の成分）
第２の成分は、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である。この種のタンパク質及びその全長タンパク質は、ヒトをはじめとして各種動物においてホモログが知られている。Ｓｉｇｌｅｃ−９は、単球、顆粒球及びマクロファージファージにおいて発現する膜貫通タンパク質であって、細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを備えている。本明細書においては、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインを好ましく用いることができる。細胞外ドメインは、免疫グロブリン様ドメインを含んでいることも知られている。
【００３５】
本剤においては、こうしたヒトなどの動物に由来する天然のＳｉｇｌｅｃ−９を天然の原料から回収したものであってもよいし、遺伝子工学的又は化学的に取得したものであってもよい。例えば、ヒトのＳｉｇｌｅｃ−９は配列番号４で表されるアミノ酸配列を有している。また、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされている。
【００３６】
第２の成分は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性を有していれば足りる。すなわち、公知の天然のＳｉｇｌｅｃ−９の他、新たに本剤におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインとして機能することが確認されたタンパク質であってもよい。また、天然のＳｉｇｌｅｃ−９に上述した改変が加えられたものであってもよい。本剤におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性としては、例えば、第１の成分及びコンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと協動してミクログリアを組織修復型に誘導できる活性、あるいは抗炎症性サイトカインの亢進活性を有しているタンパク質が挙げられる。
【００３７】
ヒトのＳｉｇｌｅｃ−９は、配列番号３７で表される４６３アミノ酸のアミノ酸配列からなる。このうち、第１位から第１７位までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドである。本開示の第２の成分としては、例えば、このアミノ酸配列の第１８位から第３４８位のアミノ酸配列（配列番号４）であってもよいし、このアミノ酸配列の全長アミノ酸を有していてもよいし、同第１８位〜第４６３位までのアミノ酸配列を有していてもよい。
【００３８】
こうした活性は、既述したように、後述する実施例を参照すれば当業者であれば容易に評価することができる。なお、改変Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインにおけるＳｉｇｌｅｃ−９細胞外ドメイン活性は、上記の誘導活性や産生促進活性を有していれば足り、その程度は問わない。
【００３９】
例えば、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立した第１の成分と必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第２の成分を供給して、組織修復型ミクログリア／マクロファージの指標となるＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１のタンパク質あるいはｍＲＮＡの産生を確認することなどで評価することができる。
【００４０】
また、例えば、抗炎症性サイトカインの産生促進活性は、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立された第１の成分及び必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第２の成分を供給して、例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１などの抗炎症性サイトカインの産生を確認することなどで評価することができる。
【００４１】
好ましくは配列番号４で表されるアミノ酸からなるタンパク質のＳｉｇｌｅｃ−９細胞外ドメイン活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上である。
【００４２】
第２の成分として使用できる各種のタンパク質は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインの公知のアミノ酸配列や塩基配列のほか、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインとして知られている公知のアミノ酸や塩基配列と一定の関係を有するタンパク質であって本明細書におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質が挙げられる。例えば、Ｓｉｇｌｅｃファミリータンパク質が挙げられる。典型的には、Ｓｉｇｌｅｃ−９、Ｓｉｇｌｅｃ−７，Ｓｉｇｌｅｃ−１２，Ｓｉｇｌｅｃ−８，ＣＤ３３等が挙げられる。
【００４３】
例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列との関係において、同一性が６０％以上のタンパク質としては、以下の１０種が挙げられる。
（１）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン９同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_055256.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は１００％、類似性は１００％、塩基配列は配列番号５で表され、アミノ酸配列は配列番号６で表される。）
（２）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン９同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001185487.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は１００％、類似性は１００％）
（３）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン７同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_00055220.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は８１％、類似性は８５％）
（４）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン１２同位体ｂプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_2015856.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６８％、類似性は７９％）
（５）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン１２同位体ａプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_443729.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６８％、類似性は７９％）
（６）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン８プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_055257.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は７０％、類似性は７８％）
（７）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体３プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001171079.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６３％、類似性は７４％）
（８）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP055257.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６３％、類似性は７４％）
（９）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン７同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_057627.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は７８％、類似性は８２％）
（１０）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001076087.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６５％、類似性は７７％）
【００４４】
（第３の成分）
第３の成分は、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）である。本発明者らによれば、炎症反応部位など組織損傷部位における組織修復活性は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分の共存下において発揮される。しかしながら、ＣＳ等は、炎症組織においては常在する多糖類であるため、特に、有効成分として含めなくとも、本剤が組織において作用することができる。もっとも、本剤が第３の成分を含むことでより確実にあるいはより広い範囲に適用できる組成物となる。一方、生体外において本剤を炎症部位やミクログリア／マクロファージに適用するときには、第３の成分であるＣＳ等を添加することが好ましい。
【００４５】
第３の成分は、天然から回収したものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。コンドロイチン硫酸における糖の結合形態も特に限定しない。また、コンドロイチン硫酸は、複数種類の混合物であってもよい。
【００４６】
（本剤における有効成分の配合）
本剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分から選択される少なくとも１種を含むことにより、炎症組織に送達されるとき、残余の成分の存在下、組織修復活性を呈することができる。したがって、本剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種の成分を有効成分としてもよいし、２種の成分を有効成分としてもよいし、３種の成分を有効成分としてもよい。本剤に含まれる有効成分は、疾患の種類、組織障害部位やその特性、さらには、本剤の投与形態に応じて決定される。好ましくは、本剤は、第１の成分及び／又は第２の成分を含んでいる。さらに好ましくは、第１の成分及び／又は第２の成分に加えて、第３の成分を含んでいる。
【００４７】
本剤が第１の成分及び／又は第２の成分を含むとき、第１の成分及び／又は第２の成分の濃度（含有量）は特に限定しない。本剤が組織修復活性を呈する有効量が含まれていればよい。より具体的には、例えば、第１の成分及び／又は前記第２の成分を、本剤中のあるいは組織修復部位における第３の成分と協動して、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有していればよい。これらの活性は、必要に応じて第３の成分の共存下で、生体において確認されるものであってもよいし、生体外で確認されるものであってもよい。
（ａ）組織修復型ミクログリア又はマクロファージの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
【００４８】
本剤が第１の成分及び第２の成分を含むとき、第１の成分及び第２の成分の配合比は、必要に応じて、設定される。例えば、質量比で第１の成分：第２の成分＝１００：１〜１：１００の範囲で適宜設定できる。好ましくは、第１の成分：第２の成分＝１：１０〜１０：１である。例えば、第１の成分：第２の成分＝５：１〜１：５や、２：１〜１：２等で含んでいてもよい。
【００４９】
本剤が第３の成分を含む場合には、その濃度は特に限定しない。本剤が組織修復活性を呈する有効量が含まれていればよい。また、本剤がさらに第１の成分及び／又は第２の成分を含むとき、第３の成分の第１の成分及び／又は第２の成分に対する濃度等も特に限定しない。組織修復活性を呈する有効量が含まれていればよい。いずれにおいても、より具体的には、例えば、本剤中のあるいは組織修復部位における第１の成分及び／又は前記第２の成分と協動して、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有していればよい。これらの活性は、生体内／生体外のいずれで確認されるものであってもよい。
（ａ）組織修復型ミクログリア／マクロファージの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
【００５０】
例えば、ＣＳ等の配合比は、必要に応じて、設定される。例えば、質量比で第１の成分及び第２の成分の総量：ＣＳ等＝１０００：１〜１：１０００の範囲で適宜設定できる。好ましくは、第１の成分及び第２の成分の総量：ＣＳ等＝１００：１〜１：１００であり、より好ましくは、１：１０〜１０：１である。例えば、第１の成分及び第２の成分の総量：ＣＳ等＝５：１〜１：５や、２：１〜１：２等で含んでいてもよい。
【００５１】
本剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分から選択される１種又は２種以上を配合し混合することで製造することができる。すなわち、それぞれ取得（天然原料からの抽出、遺伝子組換え、化学合成等による製造）され、必要に応じて精製された各成分を配合し混合して製造することができる。また、これらの成分を同時に含む原料がある場合には、アフィニティクロマトグラフィー等などで選択的にこれらの成分を抽出してもよい。また、第１の成分及び第２の成分の本剤全体あるいは本剤中の総タンパク質に対する濃度（純度）や配合比は適宜調製することができる。
【００５２】
本剤は、組織修復活性を有することから、種々の原因による組織の修復を活性化し、修復する、損傷組織の修復用組成物として用いることができる。また、各種の炎症に対する予防、治療、緩和する抗炎症剤組成物として利用できる。組織損傷を生じているあるいは生じる可能性のある疾患を、中枢神経系疾患と非中枢神経系疾患とに分類すると、中枢神経系疾患としては、特に限定されないで、中枢神経系における神経細胞の変性・脱落を生じる全ての病態を含むことができる。例えば、脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性各上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等）、ウイルス性又は自己免疫性脳炎、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経変性の変性・脱落、神経細胞の障害を伴う網膜疾患が挙げられる。網膜疾患としては、外傷性網膜剥離、網膜裂孔、網膜震盪症、視神経管骨折、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、網膜色素変性症、緑内障、コレイデレミア、レーベル先天盲、錐体ジストロフィ、家族性ドルーセン、中心性輪紋状絡膜ジストロフィ、常染色体優性視神経萎縮等が挙げられる。なかでも、本剤は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、脊髄損傷や脳梗塞等が挙げられる。さらに、末梢神経損傷による運動機能障害や知覚感覚異常が挙げられる。
【００５３】
また、非中枢神経系疾患としては、特に限定されないで、中枢神経系以外の組織における細胞の変性・脱落を生じる全ての病態を含むことができる。例えば、I型およびII型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症及び骨吸収増加に関連した骨疾患などの慢性炎症性関節疾患、回腸炎、潰瘍性大腸炎、バレット症候群及びクローン病などの炎症性腸疾患、喘息、急性および慢性間質性肺炎、成人呼吸窮迫症候群及び慢性閉塞性気道疾患などの炎症性肺疾患、トラコーマ、オンコセルカ症、ブドウ膜炎、交感性眼炎及び眼内炎などの炎症性眼疾患、歯肉炎及び歯周炎などの慢性炎症性歯周疾患、結核、ハンセン病、尿毒症合併症、糸球体腎炎及びネフローゼなどの炎症性腎疾患、硬化性皮膚炎、乾癬及び湿疹などの炎症性皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫複合体血管炎、全身性狼瘡及び紅斑症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、心筋症、虚血性心疾患、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症などの炎症性心疾患、並びに子癇前症、慢性肝不全、急性肝炎、劇症肝炎、脳、癌などの重大な炎症要素を有する他の様々な疾患が挙げられる。  あるいはグラム陽性又はグラム陰性細菌ショック、出血性若しくはアナフィラキシーショック、又は前炎症性サイトカインに応答する癌化学療法によって誘発されたショック（例えば前炎症性サイトカイン関連ショック）などの全身性の炎症も挙げられる。かかるショックは、例えば癌化学療法に用いられる化学療法剤によって誘発されうる。さらに、皮膚移植拒絶反応などの移植片拒絶反応も挙げられる。なかでも、本剤は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、急性肝炎や劇症肝炎が挙げられる。同時に、各種の肝障害の終末形態である肝硬変においても好ましく適用される。さらに、急性及び慢性の骨髄炎症疾患が挙げられる。かかる疾患としては、ビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死、外傷や感染に起因する急性及び慢性骨髄炎が挙げられる。また、歯周病や外傷などによる骨変形・骨損傷が挙げられる。こうした損傷等にに本剤を投与すると新生骨の形成を促進することができる。
【００５４】
なかでも、関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性炎症性関節疾患が挙げられる。関節リウマチは、慢性多発性滑膜炎を本体とする原因不明の炎症性自己免疫性疾患であり、遷延する滑膜炎は、骨・軟骨破壊と永続的な機能障害へとつながる。
【００５５】
慢性的に組織損傷を生じている疾患（炎症性疾患）では、継続的に生体側からＭＣＰ−１の供給が可能であるため、第２の成分の単独投与が有効な場合がある。したがって、慢性的に組織損傷が生じている疾患として、２型糖尿病、慢性肝炎及び肝硬変のほか、既述したような慢性及び自己免疫疾患において第２の成分の単独投与が有効である場合がある。一方、急性的に組織損傷が生じている疾患では、生体側からのＭＣＰ−１の供給が必ずしも十分でないため、第１の成分と第２の成分とを少なくとも投与することが好適である。
【００５６】
また、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む間質性肺炎が挙げられる。間質性肺炎は肺胞と肺胞の間の隔壁を主座とする炎症性疾患である。ＩＰＦの病態の特徴は、肺胞壁における線維化と肺胞構造の変化（蜂巣肺形成）であり、肺活量・肺コンプライアンス・肺拡散能が低下し、それに伴い患者のＱＯＬは低下する。慢性かつ進行性の経過をたどり、急性転化した場合の致命率は８０％ともいわれる。
【００５７】
本剤は、追加的に第１の成分、第２の成分及び第３の成分以外の成分を含むことができる。また、後述するように投与方法に応じた各種の製剤形態を取ることができる。
【００５８】
本剤は、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン、血小板血漿等の生体吸収性材料を含むことができる。また、本剤は、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリン糊などのゲル化材料を含んでいてもよい。本剤は、公知の製剤上許容される成分を含むことができる。例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩液などを含むことができる。これらの各種の添加剤としては、いずれも公知の各種の成分を適宜用いることができる。
【００５９】
本剤の製剤形態は特に限定されない。公知の各種の製剤形態を採ることができる。錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、用時溶解する固形の注射剤、坐剤などの固形性剤、液状の注射剤（静注／筋注）、注入剤、点滴用剤などの液状性剤、点眼剤、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤などの局所外用剤等が挙げられる。また、体内留置型の医療器具等に担持される形態を採ることもできる。そのほか、本剤は、公知の薬学上許容される塩を含むことができる。
【００６０】
本剤が２種類以上の成分を含むとき、予めこれら２種以上の成分を含む製剤（合剤）として提供されてもよいし、用時に２種以上の成分を使用可能に、これらの単剤の組み合わせ（キット）や単剤と２種成分の合剤との組み合わせ（キット）として提供されてもよい。あるいは、これらを用時に混合可能な一体の容器に収容されていてもよい。
【００６１】
本剤の投与形態は特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。たとえば、非経口投与は、全身投与であってもよいし局所投与であってもよい。より具体的には、炎症部位への注入、塗布又は噴霧が挙げられる。また、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。炎症部位が脳である場合には、鼻腔内投与が好ましい。
【００６２】
また、本剤の投与にあたり、組織修復を要する部位に第１の成分、第２の成分及び第３の成分が共存する形態であればよい。したがって、その具体的投与形態は特に限定されない。例えば、製剤として投与する有効成分を同時に投与してもよいし、順次（有効成分の種類と順序は任意である。）投与されてもよい。
【００６３】
本剤の用法用量は特に限定されない。被験対象の年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。
【００６４】
本剤が適用される被検対象としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラット及びマウス等が挙げられる。
【００６５】
（組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤）
本明細書に開示される組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上を含有する。本誘導剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分によって発揮される組織誘導型のミクログリア／マクロファージの誘導活性に基づくものである。第１の成分、第２の成分及び第３の成分については既に説明した通りであり、本誘導剤は、上記した本剤と同様の各種態様で構成することできまた製造できる。
【００６６】
（抗炎症性サイトカインの産生促進剤）
本明細書に開示される抗炎症性サイトカインの産生促進剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上を含有する。本産生促進剤は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分によって発揮される抗炎症性サイトカインの産生促進活性に基づくものである。本誘導剤と同様、本産生促進剤についても、本剤についての各種態様が適用される。
【００６７】
（組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法）
本明細書に開示される組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法は、生体外で、第１の成分、第２の成分及び第３の成分の存在下で、ミクログリア又はマクロファージを培養する工程、を備えることができる。この生産方法によれば、生体外で組織修復型ミクログリア又はマクロファージを製造することができる。こうした組織修復型は、例えば、ミクログリア／マクロファージをヒトなどの哺乳動物から採取したうえ、生体外で組織修復型に誘導（変換）して、当該哺乳動物に戻すことなどにより、組織修復を活性化し、炎症性反応を抑制し、炎症を予防、緩和又は治療できる。こうしたミクログリア／マクロファージの生産にあたっては、本誘導剤を上記各種形態で使用できる。
【００６８】
（試薬キット）
本明細書に開示される試薬キットは、第１の成分と、第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上を備えることができる。２種以上の成分を含むとき、予め混合されていてもよいし、用時に混合するように別々に備えられていてもよい。また、固形であってもよいし、液状であってもよく、用時溶解するものであってもよい。必要に応じて溶解液を別途備えることもできる。さらに、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを、第１の成分及びは第２の成分と予め混合し、あるいは別々に備えられていてもよい。
【００６９】
（組織修復の促進方法）
本明細書に開示される組織修復の促進方法は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上を炎症組織又は損傷組織に送達する工程を備えることができる。本法によれば、炎症組織又は損傷組織において第１の成分〜第３の成分の存在下、組織修復を効果的に促進し、あるいは組織障害を予防し緩和できる。本促進方法は、また、炎症疾患における予防、治療又は緩和方法として実施することができる。こうした第１の成分及、第２の成分及び第３の成分については、既に説明した本剤の各種態様を適用でき、対象に対する投与形態（送達形態）等も本剤に関して記載した各種態様を適用できる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。なお、以下の実施例において言及する図面において、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９と表記するほか、単にＳｉｇｌｅｃ−９又はＳｉｇｌｅｃと表記することがある。
【実施例１】
【００７１】
（劇症肝炎モデルを用いた歯髄幹細胞の治療有用性の解析）
（１）劇症肝炎モデルラットの作製
著しい肝障害を誘発する、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）溶液をＰＢＳ／ＮａＯＨ溶液に溶解し作製した。この溶液をSprague-Dawleyラット（２００〜２５０ｇ）に、Ｄ−ガラクトサミン１．２ｇ／ｋｇ（ラット体重）となるように腹腔内投与した。投与から２４時間後に採血を行ってＡＳＴ及びＡＬＴを測定し、著しい肝障害が誘発（劇症肝炎）されていることを確認した。【００７２】
（２）薬剤の調製
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（組換えヒトＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９のＧｌｎ１８〜Ｇｌｙ３４８を含むキメラタンパク質である。）単独１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液、ＭＣＰ−１リコンビナントタンパク質（組換えヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））単独１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１リコンビナントタンパク質各１μｇ／ｍｌ含有ＰＢＳ溶液をそれぞれ調製した。【００７３】
（３）投与
（２）で調製した３種の薬剤液各１ｍｌを、劇症肝炎の発症後２４時間（Ｄ−ガラクトサミン投与から４８時間）のラットに頸静脈から静注した。また、対照としてＰＢＳ１ｍｌを劇症肝炎の発症後２４時間のラットに頸静脈から静注した。【００７４】
（４）１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価
１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価をそれぞれ図１及び図２に示す。Sprague-Dawley rat（２００〜２５０ｇ）腹腔内に、著しい肝障害を誘発するＤ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ溶液を１．２ｇ／ｋｇの割合で投与した。図１に示すように、ＰＢＳ投与群では一週間生存率が３０％以下に低下した。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合液の静注群においては劇的に病態が改善され、１週間生存率は１００％であった。一方、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９やＭＣＰ−１の各単独投与群では病態改善効果が得られなかった。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９単独投与群の生存率は４０％、ＭＣＰ−１単独投与群の生存率は０％であった。【００７５】
また、図２に示すように、対照群では、血中ＡＳＴ及びＡＬＴがそれぞれ８０００Ｕ／Ｌ及び８３００Ｕ／Ｌであったのに対し、混合投与群では、いずれも２０００Ｕ／Ｌ以下、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９単独投与群では６０００／４０００Ｕ／Ｌ、ＭＣＰ−１単独投与群では７０００／５５００Ｕ／Ｌであった。これらの結果は、図１に示す生存率の結果を支持するものであった。なお、細胞傷害の示標値はＡＳＴ＝６０００Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ＝４０００Ｕ／Ｌとした。【００７６】
（５）劇症肝炎モデルにおける病理学的解析
劇症肝炎患者の肝臓では、一般に、広範な肝細胞死と肝細胞再生不全が認められる。本モデルラットにおいても、これらの発現を解析することにより、病態を評価した。肝細胞死は、ＨＥ染色及びＴＵＮＥＬ染色により評価を行った。結果を図３に示す。【００７７】
図３のＡ及びＢに示すように、対照群では激しい空砲変性や、多くのＴｕｎｅｌ陽性細胞（全肝臓細胞中２０％）を検出した。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与後１２時間の組織像は正常肝組織様であった。【００７８】
（６）劇症肝炎モデルにおける遺伝子解析
劇症性炎症反応では、炎症性組織破壊型Ｍ１マクロファージと抗炎症・組織再生型Ｍ２マクロファージが肝組織損傷に重要な役割を果たす。Ｍ１は、前炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現を亢進する。Ｍ２は、死細胞のセンサー：マンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）を大量に発現する。本モデルラットにおいても、これらの因子の産生量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析することにより、病態を評価した。結果を図４に示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示す。【００７９】
図４に示すように、対照群では、各種の炎症性サイトカインの発現が上昇することがわかった。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群では炎症性サイトカインの発現が抑制され、抗炎症性サイトカインの発現が亢進することがわかった。【００８０】
（７）劇症肝炎モデルにおけるＣＤ２０６免疫染色結果
図５には、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群及び対照群の劇症肝炎モデルの組織におけるＣＤ２０６染色結果を示す。図５に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群では、ＣＤ２０６の発現が顕著であり、組織修復型マクロファージへ変換が明らかに認められた。
【実施例２】
【００８１】
本実施例では、マウスミクログリア及び脊髄損傷ラットを用いて、ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの効果を確認した。以下、実験方法を示し、次いで結果を示す。【００８２】
（１）マウスミクログリアの単離と細胞培養
初代神経細胞は、新生児のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。１４日培養後、ミクログリアは、”振り切り”法（”ｓｈａｋｉｎｇ ｏｆｆ”ｍｅｔｈｏｄ）によって細胞混合物から単離した。Ｆｃ受容体の免疫染色によって決定された培養細胞の純度は９７〜１００％であった。培養物は、１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび０．２％グルコースを添加したＤＭＥＭ中で維持した。【００８３】
（２）ミクログリアCSPG活性化アッセイ
４８個のウェルの組織培養プレートは１μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；Ｓｉｇｍａ）又は１００ｎｇ／ｍｌの細胞外コンドロイチン硫酸プロテオグリカン混合物（ＣＳＰＧ；ミリポア）とともにコーティングした。ミクログリアは、ＰＬＬまたはＰＬＬ／ＣＳＰＧ上の無血清ＤＭＥＭ中に２．０×１０５個の細胞／ウェルで播種した。無血清ＤＭＥＭ中には、組換えヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）と組換えヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含んでいた。２４時間培養後、ＣＤ２０６タンパク質とｍＲＮＡの発現を、免疫組織化学的分析及びリアルタイム定量的ＰＣＲでそれぞれ分析した。４８時間培養後には、培養上清のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ＭｏｕｓｅＩＬ−１０，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で測定した。【００８４】
（３）リアルタイムＱ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、分光光度計によって定量し、ＲＮＡの状態を１％アガロースゲルで確認した。ＲＴ反応は、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。２５μｌの合計反応体積中全ＲＮＡ０．５μｇで使用した。リアルタイムＱ−ＰＣＲは、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ定量ＰＣＲミックス（東洋紡）を用い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ装置リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を稼働させて行った。ラット及びマウス用のプライマーは、以下のとおりとした。【００８５】
【表１】
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【００８６】
（４）ラット挫傷モデルと外科的処置
２００〜２３０グラムの重量の成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた。ラットは、ケタミン（６０〜９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。Ｔｈ９腰椎椎弓切除後、硬膜を露出させ、市販されている脊髄損傷装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｉｍｐａｃｔｏｒ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって２００ｋｄｙｎの外傷力を付与した。脊髄挫傷後すぐに、Ｔｈ１２部分椎弓切除術を行い、髄腔内にＳＭＰ−２００モデル（プライムテック株式会社）：ｉＰＲＥＣＩＯと接続した薄いシリコンチューブを手術用顕微鏡下で挿入した。管はそれを固定する棘突起に縫合して配置し、ポンプは動物の腋窩の皮膚の下に置かれた。術後、膀胱は１日２回手動腹圧によって圧縮して排尿させた。術後翌日に完全な麻痺（ＢＢＢスコア＝０）を示す動物を評価に用いた。後肢を動かすことができた動物、即死した動物は評価から除外した。【００８７】
（５）ＢＢＢのオープンフィールド運動スコア
後肢神経行動試験はＢＢＢの運動評価尺度を用いて行った。２２点（０〜２１）ＢＢＢスケールは、関節の動き、ステッピング能力、調整、体幹の安定性を含む後肢運動のリカバリを評価するために使用した。２１のスコアは、無傷のラットにおける損なわれていない運動を意味している。動物の治療内容に関して盲検化された二人の審査官が評価を行った。各セッションの継続時間は、ラットあたり４分であった。スコアは各時点において、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による反復測定分散分析により解析した。【００８８】
（６）免疫組織化学的分析
処理された脊髄の組織学的検査のために、動物を麻酔し、挫傷後７２時間後及び８週間後に、経心臓的に４％ＰＦＡの０．１ＭＰＢＳ溶液で灌流した。脊髄をＯＣＴコンパウンド（サクラファイン）に埋め込んで、区画されたクライオスタット（ライカ）に２０μｍで矢状又は横平面で切片とした。組織切片とミクログリアは、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液で５分間浸透処理した。ヤギ血清１０％（ｖ／ｖ）で３０分間ブロッキング後、一次抗体：５−ＨＴ（ウサギＩｇＧ、１：５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＦＡＰ（マウスＩｇＧ、１：５００、ミリポア）、Ｉｂａ１（ヤギＩｇＧ、１：５００、アブカム）、ＣＤ２０６（ウサギＩｇＧ、１：１０００、アブカム）、ＩＬ−１０（マウスＩｇＧ、１：２５０、アブカム）とインキュベートした。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ−のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、抗ヤギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６及び抗ウサギＩｇＧ−のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色後、組織像は、ユニバーサル蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００、キーエンス）で観察した。【００８９】
（７）免疫沈降、レクチンブロット及びウェスタンブロット
ＴＨＰ−１細胞の溶解物を、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９またはＣＣＲ２に対する抗体を用いて免疫沈降させ、沈殿物を抗ＣＣＲ２抗体またはＭＡＨ−レクチンでイムノブロットした。レクチンブロットは、ＴＨＰ−１（理研セルバンク、日本）溶解物（溶解緩衝液：１％トリトンＸ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭの塩化カルシウム）から抗ＣＣＲ２抗体（ウサギＩｇＧと、１：５０、Ａｂｃａｍ）で免疫沈降させたＣＣＲ２タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イモビロン−ＰのＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。ブロッティング後、その膜を、ＭＡＬ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で、１２時間、４℃でブロックした。その後、ＭＡＬ緩衝液中、１２時間、４℃で、５ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＭＡＬ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）でプローブした。ＭＡＬは、アビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）およびＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、ＬＡＳ−４０００ミニルミノイメージアナライザー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により分析した。【００９０】
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９とＣＣＲ２との間の物理的相互作用を分析するために、ＴＨＰ−１またはネイティブマウスミクログリア溶解物を０．１５ｎＭのＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９−ＦｃまたはＦｃを用いて４℃で一晩インキュベートした後、プロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア）で免疫沈降した。全細胞溶解物および再懸濁沈殿物は、マウスＣＣＲ２に対する抗体（ウサギＩｇＧ、１：５００、Abcam）を用いてイムノブロットした。【００９１】
（８）統計
Ｔｕｒｋｅｙの事後検定（ＳＰＳＳ１９．０）による反復測定分散分析を用いた。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。【００９２】
（結果）
（ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果）
マウスミクログリアについての結果を図６に示す。図６のａ〜ｄに示すように、ＣＳＰＧ上においてＭＣＰ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したミクログリアは、有意にＣＤ−２０６のタンパク質レベルでの発現及び遺伝子レベルでの発現を増大させるとともに、ＩＬ−１０の産生を増大させた。また、免疫染色により、ＣＳＰＧ上においてＭＣＰ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したミクログリアに関し、組織修復型ミクログリアの発現をＣＤ２０６で確認することができた。また、図６のｅ及びｆに示すように、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＣＳＰＧの濃度に依存して組織修復型ミクログリアのマーカーであるＣＤ２０６及び抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生が増大した。【００９３】
また、処置切片では、図７ａに示すように、ＧＡＦＰ及びＨ−Ｅ染色により、ＳＣＩ後８週で、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトの活性の減少を示すとともに、組織損失面積が減ったことがわかった。また、図７ｂに示すように、５−ＨＴにより、ＳＣＩ後８週で、陽性神経線維の修復が進行していることがわかった。さらに、図７ｃに示すように、５−ＨＴ染色により、損傷中心から頭側及び尾側においても神経線維の修復が進行していることがわかった。【００９４】
（ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の髄腔内投与による炎症性の脊髄損傷の抗炎症状態／組織再生状態への変換）
ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を各濃度１μｇ／ｍｌでＳＣＩ部位にｉＰＲＥＣＩＯ注入ポンプによって液３μｌ／ｈを送達した。シリコンチューブはくも膜下腔に挿入した。脊髄損傷部位におけるサイトカインと細胞表面マーカーの遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価した。総ＲＮＡは、ＳＣＩから７２時間後に病変部位から採取した。結果を図８に示す。Ｙ軸は、ＳＨＡＭモデル（偽手術モデル）での数値に対する比率を表す。【００９５】
図８に示すように、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）および誘導型一酸化窒素合成（ｉＮＯＳ）は、コントロールで亢進されたが、ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の併用投与で顕著に抑制された。これに対して、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与は抗炎症性サイトカインの発現（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１）およびＭ２ミクログリア／マクロファージのマーカー（ＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１）を増大させた。なお、実験は３回繰り返しで行い、いずれも同様の結果が得られた。図８中のデータは平均±ＳＥＭを表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。【００９６】
（ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９による脊髄損傷後のミクログリア／マクロファージの組織修復型への分化促進）
脊髄損傷から７２時間後の損傷部位を取り囲むミクログリア／マクロファージの典型的画像と定量結果を図９に示す。図９の上段に示すように、コントロール群では、Ｉｂａ１＋ミクログリアが観察されたが、ＣＤ２０６＋細胞が全く観察されなかった。これに対して、図９の中段に示すように、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理ラットにおいては、脊髄損傷から７２時間後、損傷部位に多数のＩｂａ＋細胞が移動し、これらＩｂａ１＋細胞のほとんどは、ＣＤ２０６を共発現していた。また、図９の下段に示すように、コントロールラットでは、損傷部位におけるＣＤ２０６＋細胞は、ＩＬ−１０も同時に発現することは観察されなかったのに対し、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理された損傷部位におけるＣＤ２０６＋細胞は、ＩＬ−１０も同時に発現していた。図中のデータは、平均±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＰＢＳ処理に対するＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理した脊髄損傷モデル）。【００９７】
（脊髄損傷におけるＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の治療上の利点）
脊髄挫傷後の後肢の機能回復の時間経過を図１０に示す。ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与ラットは、コントロールと異なり早期から明らかな機能回復傾向を呈した。図中のデータは、平均±ＳＤを表す。【００９８】
（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９とＭＣＰ−１レセプターであるＣＣＲ２との相互作用）
免疫沈降、レクチンブロット及びウェスタンブロットの結果を図１１に示す。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は、物理的に、ＴＨＰ−１細胞溶解液中のシアル化ＣＣＲ２と相互作用し、ＣＳＰＧ処理は、ミクログリアのＣＣＲ２発現を増加させ、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は物理的にミクログリアのＣＣＲ２と相互作用した。【００９９】
豊富に内因性ＣＣＲ２を発現するヒト単球細胞株ＴＨＰ−１を用いて、ＭＣＰ−１受容体、ＣＣＲ２およびＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９の物理的相互作用を分析した。図１１（Ａ）に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＴＨＰ−１は、異なる分子量（図１１（Ａ）Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）で複数のＣＣＲ２タンパク質を発現した。また、抗ＣＣＲ２抗体を用いたＴＨＰ−１溶解物の免疫沈降によって、５５および４２ｋＤａでのＣＣＲ２タンパク質の２つの主要な種が検出された（図１１（Ａ）ａｎｔｉ-ＣＣＲ２）。ＭＡＨブロットでは、特にＳｉｇｌｅｃ-9の主要な標的であるα２−３結合シアル酸を含む糖鎖を認識した。さらに、分子量が大きいＣＣＲ２タンパク質のみがＭＡＨによって検出され、シアリダーゼ処理によりＭＡＨは強く減少した（図１１（Ａ）ＭＡＨ-ｂｌｏｔ）。分子量の大きいシアル化ＣＣＲ２は、ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９-ＦｃとのＴＨＰ−１溶解沈殿物にのみ検出された（図１１（Ａ）ＣＣＲ２-ｂｌｏｔ）。また、シアリダーゼを用いたＴＨＰ−１溶解液の前処理は、ＣＣＲ２およびＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９間の物理的相互作用を阻害した（図１１（Ａ）ＣＣＲ２-ｂｌｏｔ（シアリダーゼ＋））。ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９及びＣＣＲ２の物理的な相互作用は、α２−３結合シアル酸を含むシアル化されたＣＣＲ２に依存していた。【０１００】
ＣＳＰＧ処理したネイティブミクログリアでは、異なる分子量のＣＣＲ２の発現を増加させた（図１１（Ｂ））。ＣＳＰＧがＣＣＲ２の発現の増大によって少なくとも部分的にＭ２の誘導に寄与していた。さらに、ネイティブミクログリアにおいても、分子量がより大きいシアル化ＣＣＲ２がＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９とミクログリア溶解沈殿物中において見出された。ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９が物理的にマウスミクログリアシアル化ＣＣＲ２と相互作用すること示した（図１１（Ｃ））。
【実施例３】
【０１０１】
（急性肺傷害（間質性肺炎）への適用）
本実施例では、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与によって急性肺傷害で生じる炎症および線維化が抑制されることを見出した。【０１０２】
（急性肺傷害モデルマウス）
肺胞上皮細胞に障害をもたらすＢｌｅｏｍｙｃｉｎ（ＢＬＭ）を３ｍｇ／ｍｌの割合でＰＢＳに溶解しＢＬＭのＰＢＳ溶液を調製した。この溶液をＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（７〜９週齢）に６Ｕ／ｋｇの量気管内投与を行い、２４時間後にベロクロラ音を聴取して肺傷害が起こっていることを確認した。【０１０３】
ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のリコンビナントタンパク質の各１μｇ／ｍｌ濃度のＰＢＳ溶液を肺傷害発生後２４時間のモデルマウスに対して頸静脈から静脈内投与し、その後の病態を観察した。ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群に関し、生存率及び体重の変化を図１２に示す。【０１０４】
（９日間の体重率および１４日間の生存率評価）
図１２に示すように、ＰＢＳ投与群では、ＢＬＭ溶液（６Ｕ／ｋｇ）が気管内投与されて肺傷害が引き起こされたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、９日間の体重率は７０％（ｎ＝１０）に低下し、１４日間の生存率は約４０％（ｎ＝１０）に低下することを確認した。【０１０５】
一方、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群では、９日間の体重率は約８０％（ｎ＝１５）に留まり、１４日間の生存率は約８０％（ｎ＝１５）であり、肺傷害が軽減されていることを確認した。【０１０６】
（肺傷害モデルにおける病理学的解析）
肺傷害患者の肺では線維化の進行と、肺胞構造の破壊を認める。ＢＬＭにより傷害されたモデルマウスの肺も同様の構造変化を示すため、その構造変化と膠原線維の増殖をＨＥ染色およびマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて評価した。結果を図１３に示す。【０１０７】
図１３に示すように、ＢＬＭ投与後７日目の非投与群では著しい線維化と肺胞構造の破壊を認めたが、それと比較して、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群では線維化が抑制され、より正常像に近い肺胞構造を示していた（ｎ＝５）。【０１０８】
以上の結果から、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９との投与は、肺における炎症性疾患に起因する組織障害に対しても修復活性を有し、その結果、肺線維症などの肺炎症性疾患や急性の肺疾患の治療や予防に有効であることがわかった。
【実施例４】
【０１０９】
（肝硬変（慢性肝炎）への適用）
本実施例では、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与によって肝硬変、慢性肝炎が寛解することを見いだした。【０１１０】
（肝硬変モデルマウスの作製）
四塩化炭素（ＣＣｌ4）を１．０ｍｌ／ｋｇの割合でオリーブオイルに溶解し肝障害を誘発する薬剤を作製した。この溶液をＣ５７ＢＬ６ ｍｉｃｅ（２０〜２５ｇ）に、１週間に２回、４週連続腹腔内投与し、肝硬変モデルマウスを作製した。このモデルマウスに対して、リコンビナントタンパクＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１をＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、混合溶液を調製した。この混合溶液を最終のＣＣｌ4溶液を投与（ＣＣｌ4投与開始から１ヶ月）してから２４時間後に、５００μｌを１回静脈内投与し、病態改善を検証した。【０１１１】
（肝硬変モデルにおける病理学的解析）
肝硬変、慢性肝炎患者の肝臓では、肝細胞死、炎症性細胞浸潤及び広範に不可逆性の線維性組織の増殖が認められる。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群について組織解析（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与から３日後）を行った。ＨＥ染色結果及びシリウスレッド染色（赤染色：コラーゲンＩの染色）結果をそれぞれ図１４及び図１５に示す。【０１１２】
図１４に示すように、Ｓｈａｍは正常肝臓組織を呈しているが、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与直前）の組織においては、多くの肝臓細胞死及びディッセ腔における線維化の亢進が観察された。一方、ＰＢＳ投与群においては、激しい細胞浸潤と著しい線維化が観察されたが、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群は正常肝像に近い組織像を呈していた。【０１１３】
また、図１５に示すように、シリウスレッド染色の結果からは、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔとＰＢＳ投与群で激しい線維化を確認した。一方、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群ではほとんど線維化が確認できなかった。【０１１４】
（肝硬変及び慢性肝炎モデルにおける遺伝子解析）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織からＲＮＡを採取し、炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法にて解析した。結果を図１６及び図１７に示す。【０１１５】
図１６に示すように、ＰＢＳ投与群では炎症促進型Ｍ１マクロファージが産生するＴＮＦ-αの発現が上昇していたのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群でＴＮＦ−αの発現は抑制されている。一方、抗炎症性Ｍ２マクロファージマーカーＹｍ−１，ＣＤ２０６，Ａｒｇｉｎａｓｅ−１の発現が上昇していた。【０１１６】
また、図１７に示すように、ＰＢＳ投与群では活性化した肝星状細胞hepatic stellate cellsが産生するα-Smooth muscle actin（α−ＳＭＡ）, Collagen α１の発現が上昇していた。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群では、α−ＳＭＡの発現が抑制された。一方、線維化溶解に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）やＩＧＦ−１，ＨＧＦなどの肝再生に関わる因子の発現レベルの上昇が観察できた。【０１１７】
（活性化hepatic stellate cellsのマーカーであるα-SMAの染色）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群から採取した肝臓組織に関しα−ＳＭＡの染色を行った。結果を図１８に示す。【０１１８】
図１８に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群では、α−ＳＭＡ陽性細胞数が激減していた。【０１１９】
以上のことから、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１を肝硬変に至る肝臓に投与することで、肝硬変に特徴的な肝細胞死、炎症性細胞浸潤及び不可逆性の線維性組織の増殖を抑制できることがわかった。
【実施例５】
【０１２０】
本実施例では、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の静注により自己免疫性関節炎が劇的に改善されることを見いだし、その作用点は自己免疫系そのものにあることが考えられた。【０１２１】
（コラーゲン誘発関節炎モデルマウスを用いた治療有用性の解析）
（コラーゲン誘発関節炎モデルマウスの作製）
コラーゲン誘発関節炎マウスは、関節リウマチの主要な動物モデルとして用いられている。DBA/1Jマウスの尾底部に、異種動物である牛由来の２型コラーゲンを皮下注射、更に21日後に再注射することにより、コラーゲン誘発性関節炎を発症させた。関節炎の重症度は関節炎スコアを用いて評価した。図１９に示すスコアリングシステムを用いて、各群の平均関節炎スコアを算出した。また各マウスで関節炎スコア1以上を、関節炎発症と定義した。【０１２２】
（１）コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスにおける、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による関節炎抑制効果の解析
まず、最適なＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与量を決定するために、コントロール群（生食）とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９群（０．１μｇ、１μｇ、１０μｇ／マウス）の４群（各ｎ＝７）で検討を行った。２回目コラーゲン投与の２日後、頚静脈より生食または各濃度のＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を投与し、その７日後の関節炎スコアを評価した。結果を図２０に示す。【０１２３】
図２０に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の０．１および１０μｇ群では、コントロール群と有意な違いを認めなかったのに対して、１μｇ投与群では、コントロール群と比較して有意に関節炎スコアが抑制された。同時に、関節リウマチにおける主要な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの血清中濃度を測定したところ、１μｇ群ではコントロール群と比較して有意に抑制されていた。【０１２４】
次いでＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の繰り返し投与による、長期間の関節炎抑制効果について検討した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与量は、１μｇとした。２回目コラーゲン投与の２日後から、７日に１回の頻度で、頚静脈より生食またはＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を投与した。関節炎スコアの評価結果を図２１に示す。【０１２５】
図２１に示すように、最終評価時において、コントロール群では関節炎発症率が１００％に達していたのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与群では発症率４０％と有意に抑制されていた。また関節炎スコアについても、コントロール群では平均４．３３であったのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９群では１．４と有意に抑制されていた。同時に、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与群及びコントロール群について、血清ＴＮＦ−α濃度と関節炎スコアの相関を検討したところ、相関係数（Ｒ）が０．８３７と非常に強い有意な正の相関関係を示した。【０１２６】
（マウス・マクロファージ、ヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞におけるＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９による遺伝子発現変化）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のｉｎ ｖｉｖｏ（ＣＩＡマウス）における関節炎抑制効果の作用機序を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検討した。関節リウマチでは、活性化された免疫細胞（マクロファージなど）により分泌される炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α等）が滑膜細胞を刺激し、活性化された滑膜細胞が蛋白分解酵素（ＭＭＰ−３等）を分泌して最終的に骨軟骨破壊を引き起こす。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の作用点が免疫系にあるのか、それとも炎症の主座である滑膜にあるのかを探るため、マクロファージ（自己免疫疾患における中心的免疫細胞の一つ）と、関節炎の主座である滑膜細胞を用いて実験を行った。【０１２７】
ＤＢＡ／１Ｊマウスの腹腔内よりマクロファージを単離（ｎ＝４）した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５−２０ｎｇ／ｍｌ）で１時間前処置、ＬＰＳ（０．２μｇ／ｍｌ）で１２時間刺激後、ｍＲＮＡを抽出しｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法にて遺伝子発現を測定した。結果を図２２（Ａ）に示す。【０１２８】
図２２（Ａ）に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α（関節リウマチにおける代表的な炎症性サイトカイン）の発現亢進を、用量依存的に抑制する傾向を示した。【０１２９】
次いで、関節リウマチ患者の、人工膝関節置換術施行時に採取した滑膜組織から酵素的に単離した、滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）を用いて実験を行った（ｎ＝３）。滑膜線維芽細胞を４８時間前培養、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在／非存在下において、ＴＮＦ−α（１０ｍｇ／ｍｌ）で１２時間刺激後、ｍＲＮＡを抽出しｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法にて遺伝子発現を測定した。結果を図２２（Ｂ）に示す。【０１３０】
図２２（Ｂ）に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９はヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞において、ＴＮＦ−α刺激によるＭＭＰ−３（滑膜炎で産生される代表的蛋白分解酵素）発現亢進に対して、明らかな抑制効果を示さなかった。【０１３１】
以上の結果からＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のＣＩＡマウスに対する作用点は、滑膜炎局所に対する抗炎症作用ではなく、自己免疫性関節炎の発症と進展の本体である、自己免疫系そのものであることが示唆された。
【実施例６】
【０１３２】
炎症性／組織破壊型Ｍ１−マクロファージおよび抗炎症性／組織再生型Ｍ２−マクロファージのバランスが組織再生環境の構築に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。急性および慢性炎症では無秩序なＭ１−マクロファージの活性化が組織損傷の拡大や線維化を促進し組織修復を妨げる。一方、抗炎症性Ｍ２−マクロファージは血管再生を促進、死細胞の貪食、生体内幹細胞の増殖や集積を促すことで組織修復を促す。しかしながら、生体のＭ２誘導能は限られており、ほとんどの組織破壊環境がＭ１優位である。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１がＭ１優位な組織破壊的炎症環境を抗炎症・組織再生環境に変換することを見出した。【０１３３】
（ラット頭蓋骨欠損モデル：形態学的解析）
全身および局所麻酔下にて７週齢ＳＤラットの頭頂部皮膚を骨膜とともに剥離し、直径５ｍｍの骨採取用トレフィンバーにて注水下で頭蓋骨を削除し、骨欠損を形成した。このとき骨膜は温存した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１各１００ｎｇ）をＰＢＳに溶解し、アテロコラーゲンをスキャフォールドとして骨欠損部に留置し、皮膚を復位して縫合、閉創した。術後６週で、μＣＴ、組織学的評価（Ｈ−Ｅ染色）を行った。結果を図２３に示す。【０１３４】
図２３に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１をラット頭蓋骨欠損モデルに投与し、術後６週間で著明な骨再生効果を、組織学的にもＣＴ上でも確認できた。以上の結果から、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１は骨再生促進因子製剤として臨床応用が可能であることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１３５】
本実施例では、グルコース応答性インスリン分泌実験を行った。ＭＩＮ６（１×１０6／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した。培養液をそれぞれＳＨＥＤ−ＣＭ，ＳＨＥＤ−ＣＭ＋各種抗体の添加（抗ヒトＩｇＧ：１／５００，抗ヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体：１／５００，抗ＭＣＰ−１抗体１／５００，抗ヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体：１／５００＋抗ＭＣＰ−１抗体：１／５００）に交換し、６時間培養を行った。その後、低グルコースＫＲＢ緩衝液（２．５ｍＭ）で３０分間スタベーションを行った後、低グルコースＫＲＢ緩衝液２．５ｍＭ）および高グルコースＫＲＢ緩衝液（１６．７ｍＭ）で３０分間刺激を行った。刺激後の上清を回収し、上清を回収した後、acid ethanol法にてインスリン含有量を回収した。ＨＴＲＦ（商標）法を用いて、上清中のインスリン量(release)および上清回収後のインスリン含有量(content)を測定し、release/content(%)にてインスリン分泌能の比較検討を行った。結果を図２４に示す。【０１３６】
図２４に示すように、中和抗体にて因子をブロックしたところ、抗ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９、抗ＭＣＰ−１及び抗ＭＩＸ（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９＋ＭＣＰ−１）では、SHED-CMに比べ、有意にインスリン分泌能が低下していた。コントロールであるＩｇＧでは、インスリン分泌能が低下していないことから、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１は膵β細胞に対してインスリン分泌に関与していることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号７〜３６：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月6日(2014.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有する第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有する第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群のうち少なくとも前記第２の成分を含む、組織修復剤。
【請求項２】
さらに、前記第１の成分又は前記第３の成分を含む、請求項１に記載の組織修復剤。
【請求項３】
前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、請求項１又は２に記載の組織修復剤。
【請求項４】
前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項５】
前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項６】
前記第３の成分を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組織修復剤。
【請求項７】
前記第１の成分、前記第２の成分及び第３の成分からなる群から選択される１種以上の成分を、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の活性を呈するのに有効量含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の組織修復剤。
（ａ）炎症組織における組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導活性
（ｂ）抗炎症性サイトカインの産生促進活性
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、抗炎症剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、アルツハイマー症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病からなる群から選択される中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組織修復剤を有効成分とする、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、急性および慢性間質性肺炎、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶からなる群から選択される非中枢神経系疾患の予防又は治療剤。
【請求項１１】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、組織修復型マクロファージ及び／又はミクログリアの誘導剤。
【請求項１２】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、抗炎症性サイトカインの産生促進剤。
【請求項１３】
生体外で、球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で、ミクログリア又はマクロファージを培養する工程、を備える、組織修復型ミクログリア又はマクロファージの生産方法。
【請求項１４】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を含む、ミクログリア／マクロファージ用の試薬キット。
【請求項１５】
前記第１の成分と前記第２の成分とを含む、請求項１４に記載の試薬キット。
【請求項１６】
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される少なくとも１種を損傷組織又は炎症組織に送達して組織修復を促進する方法。
【国際調査報告】
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