(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βとポリエチレングリコール非修飾のインターフェロン−βとが共存する試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βを検出及び定量するための試料液の前処理方法を提供することを目的としている。本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程と、を備える、前処理方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、
前記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、
前記酸処理工程で凝集したタンパク質を前記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程と、
を備える、前処理方法。
【請求項２】
前記試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、該糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備える、請求項１記載の前処理方法。
【請求項３】
前記糖鎖結合性タンパク質は、レクチンである、請求項２項記載の前処理方法。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βは、糖鎖を有しないポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βである、請求項２又は３記載の前処理方法。
【請求項５】
前記試料液は、血液、血漿、血清又は腹水である、請求項１〜４のいずれか一項記載の前処理方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、
前記前処理工程で前処理した前記試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程と、
を備える、試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項記載の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、
前記前処理工程で前処理した前記試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βを免疫学的又は生物学的に検出し、該ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの含有量を測定する測定工程と、
を備える、試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの定量方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載の酸処理工程で試料液を酸処理するために使用する酸と、
請求項６又は７記載の検出工程での試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βを検出するために使用する、抗インターフェロン−β抗体、インターフェロン感受性細胞に感染能を持つウイルス、インターフェロン刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びインターフェロン刺激応答領域の制御下のレポーター遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、
を備える、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−β検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法、検出方法及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン−β（以下「ＩＦＮ−β」と言う）は、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性や免疫調節活性等を有するタンパク質であり、慢性Ｂ型肝炎治療薬、慢性Ｃ型肝炎治療薬、癌治療薬及び多発性硬化症治療薬としての用途が広く知られている。【０００３】
また、ＩＦＮ−βとポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と言う）を共有結合することにより、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン−β（以下「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β」と言う）が得られることが報告されており（特許文献１及び２並びに非特許文献１）、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、生体内持続性が高いため、ＰＥＧ修飾されていないＩＦＮ−β（以下「ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β」と言う）と比べて少ない投与頻度で効果を発揮することが報告されている（特許文献２〜４）。【０００４】
ここで、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する方法としては、従来のＩＦＮ−βの含有量を測定する方法と同じ方法で実施できることが知られており、例えば、ＩＦＮ−βを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定方法）又は、抗ウイルス活性を指標としたＣＰＥ法（細胞変性効果測定方法）等で試料液中のＩＦＮ−βを検出できることが報告されている（特許文献３及び非特許文献２）。【０００５】
一方、タンパク質は、酸の添加やｐＨの変化により変性することが知られている。そのため、そのタンパク質の性質を利用して、試料液中に含まれるさまざまな夾雑タンパク質を除去し、試料液中の不要なタンパク質を低減するために、試料液を酸やアルカリ等で処理して精製を行う方法が知られており、また、目的のタンパク質を残して不要なタンパク質を低減させるためには、適切なｐＨを選択する必要があることが知られている。例えば、ＩＦＮ−βでは、中性緩衝液で夾雑タンパク質を除去した後、ｐＨ１．５〜３の酸性緩衝液にて溶出を行う方法が報告されている（特許文献５）。さらに、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βでは、約ｐＨ３〜６の緩衝液中にて安定であることが報告されている（特許文献６）。【０００６】
また、糖鎖を有するタンパク質の除去方法としては、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンを固定化した担体に糖鎖を有するタンパク質を吸着させて除去する方法が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４９１７８８８号
【特許文献２】特許第４８５０５１４号
【特許文献３】国際公開第１９９９／０５５３７７号
【特許文献４】国際公開第２０００／０２３１１４号
【特許文献５】特開昭６１−２４２５９３号
【特許文献６】特許第４６５８９６１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００１年、第２９７巻、ｐ．１０５９−１０６６
【非特許文献２】Ｈｕら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１１年、第３３８巻、ｐ．９８４−９９６
【非特許文献３】Ｏｇａｔａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７５年、第７８巻、ｐ．６８７−６９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、特許文献２〜４にはＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを医療用途に用いることが記載されているが、実際にＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを医療用途に用いるにあたって、具体的な用量や用法を設定するためには、臨床試験において被験者に投与後、被験者から採取された試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの濃度、特に血中濃度の時間推移を把握することが重要である。そのためには、臨床試験で生体から採取された多数の試料液に対して、高感度かつ多検体処理が可能なＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する方法が必須となる。【００１０】
しかしながら、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを生体に投与した後、分析のために生体から採取された試料液には、投与されたＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β以外に、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βのＰＥＧが投与後に外れることにより生じたＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β及び生体由来のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βが共存した状態となっている。そのため、特許文献３及び非特許文献２に記載される測定方法を用いた場合、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを区別して測定できないために、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を正確に測定することは困難である。【００１１】
さらに、特許文献５及び非特許文献３では、不要なタンパク質を除去する方法が記載されているが、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βが共存する試料液から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除く方法についての記載はなく、その方法に適した適切なｐＨについての記載もない。【００１２】
すなわち、従来において、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βが共存する試料液から、試料液中に含まれるＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出してその含有量を正確に測定する測定方法及び、そのために必要な、試料液からＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除く前処理方法はこれまで知られていなかった。【００１３】
そこで本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中に存在するＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出及び定量するための試料液の前処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液に酸を加え、試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整した後に凝集したタンパク質を除去することにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βに対してＩＦＮ−βを選択的に低減させる前処理方法を見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除くことを可能とする前処理方法を提供する。【００１６】
上記の前処理方法は、上記試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、上記糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備えていてもよく、上記の糖鎖結合性タンパク質は、レクチンであることが好ましく、レクチンはコンカナバリンＡであることがより好ましい。【００１７】
上記の糖鎖修飾物質除去工程を備えることで、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出感度が上がり、正確な定量を実現できる。【００１８】
上記の糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理方法において、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βであることが好ましい。【００１９】
上記の試料液は、生体試料液であることが好ましく、さらに、生体試料液については、血液、血漿、血清又は腹水であることがより好ましい。【００２０】
本発明は、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、上記前処理工程で前処理した上記試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程とを備える、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出方法を提供する。【００２１】
上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出方法によれば、高い感度でＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを特異的に検出することができる。【００２２】
また本発明は、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、上記前処理工程で前処理した上記試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的又は生物学的に検出し、上記ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する測定工程とを備える、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの定量方法を提供する。【００２３】
上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの定量方法によれば、高い感度でＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを特異的に検出し、ＰＥＧ非修飾ＩＦＮ−βの影響を受けることなく正確にＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを定量できる。【００２４】
さらに本発明は、上記酸処理工程で試料液を酸処理するために使用する酸と、上記検出工程で試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出するために使用する、抗ＩＦＮ−β抗体、ＩＦＮ感受性細胞に感染能を持つウイルス、ＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、を備える、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β検出キットを提供する。【００２５】
また、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液に酸を加え、試料液のｐＨを３以下に調整した後に凝集したタンパク質を除去することにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βに対してＩＦＮ−βを選択的に低減させる前処理方法を見出し、本発明を完成するに至った。【００２６】
すなわち、本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨを３以下に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除くことを可能とする前処理方法を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の前処理方法は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除くことができるため、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを特異的に検出でき、含有量を正確に定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β、天然型ＩＦＮ−β及びリコンビナントＩＦＮ−βに対する、酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。
【図２】血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β、天然型ＩＦＮ−β及びリコンビナントＩＦＮ−βに対する、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による効果を示す図である。
【図３】血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−αに対する、酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。
【図４】血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βに対する、各容量の酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法は、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除くことを可能とすることを特徴とする。
【００３０】
本明細書においては、「ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β」とは、ＰＥＧ修飾されていないＩＦＮ−βを意味し、「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β」とは区別して用いる。上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βは、天然に存在するＩＦＮ−β（以下「天然型ＩＦＮ−β」と言う）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＩＦＮ−βのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＩＦＮ−βとしての生物活性（以下「ＩＦＮ活性」と言う）を有するＩＦＮ−βのアミノ酸変異体を包含する。ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βのアミノ酸変異体としては、例えば、ヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列の第１番目メチオニンが欠失し、かつ第１７番目のシステインがセリンに置換されたＩＦＮ−β変異体であるベタフェロン（登録商標）が挙げられる。さらに、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βは、糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β（天然型ＩＦＮ−βの糖鎖が改変されたＩＦＮ−βも含む）及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βをも包含する。また、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βは、天然型ＩＦＮ−βのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製されたリコンビナントＩＦＮ−βも包含する。
【００３１】
「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β」とは、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているもの、又は、ＰＥＧの１分子に対して上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているもの、を意味するが、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているものが好ましい。ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、上記ＩＦＮ−βとＰＥＧとが直接結合したものであっても、リンカー等を介して結合したものであってもよい。
【００３２】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体、ＰＥＧで化学修飾したＩＦＮ−β、ＰＥＧ化ＩＦＮ−β又はＰＥＧ結合ＩＦＮ−βとも呼ばれるものである。
【００３３】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの、ＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合部位としては、例えば、ＩＦＮ−βのアミノ基、チオール基、Ｎ末端、Ｃ末端又は糖鎖が挙げられ、また、公知の遺伝子組換え技術を用いてＩＦＮ−βに導入した非天然アミノ酸も共有結合部位とすることができる。
【００３４】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βが、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものである場合、ＩＦＮ−βの１分子に結合するＰＥＧの分子量の合計は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。ただし、ＩＦＮ−βの１分子に分子量２０，０００のＰＥＧの２分子が共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βである場合は、ＩＦＮ−βの１分子に分子量４０，０００のＰＥＧが共有結合していることを意味する。
【００３５】
また、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βが、ＰＥＧの１分子に対して、ＩＦＮ−βの１分子又は２分子以上が共有結合したものである場合であっても、ＰＥＧの１分子の分子量は、５，０００以上５２０，０００以下が好ましく、１０，０００以上２００，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。
【００３６】
なお、ＰＥＧは、１個の分子が多数の繰り返しユニットからできており、ＰＥＧの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるＰＥＧの分子量とは、平均分子量の意味である。
【００３７】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの、ＰＥＧに結合したＩＦＮ−βは、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、ＩＦＮ−βを発現する天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得られたものであってよい。また、ＩＦＮ−βとして、市販のＩＦＮ−βであってよい。
【００３８】
酸処理工程及び凝集タンパク質除去工程を備えた、試料液の前処理方法は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β以外のタンパク質｛ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β（糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの両方）を含む｝を低減できる。ここで、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、糖鎖を有していても、糖鎖を有していなくてもよい。
【００３９】
また、試料液の前処理方法は、さらに試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備えることが好ましい。
【００４０】
酸処理工程及び凝集タンパク質除去工程に加えて、糖鎖修飾物質除去工程を備えることにより、試料液中に含まれる糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを除去することができるため、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量に対するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの含有量の比率をさらに低下させることができる。ここで、糖鎖修飾物質除去工程は、試料液から糖鎖を有するタンパク質を除去するため、糖鎖修飾物質除去工程を行う場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βであることが好ましい。
【００４１】
糖鎖を有するＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとしては、天然型ＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体、又は、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にて発現させたＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体が挙げられる。糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとしては、大腸菌にて発現させたＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体が挙げられる。
【００４２】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、以下の方法で作製されたものであってよい。例えば、ＩＦＮ−βのアミノ基にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号に記載の方法）、ＩＦＮ−βのチオール基にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、国際公開第１９９９／５５３７７号に記載の方法）、ＩＦＮ−βのＮ末端に高分子を共有結合する方法（例えば、国際公開第２０００／２３１１４号及び特開平９−２５２９８号に記載の方法）、ＩＦＮ−βの糖鎖にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８年、第１７９巻、ｐ．３０１、米国特許第４１０１３８０号又は米国特許第４１７９３３７号に記載の方法）、ＩＦＮ−βに導入した非天然アミノ酸にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第１４巻、ｐ．５７４３−５７４５に記載の方法）、ＩＦＮ−βのＣ末端にＰＥＧを共有結合する方法（ＩＦＮ−βのＣ末端又はその近傍にシステインや非天然アミノ酸を導入することで可能）が挙げられる。なお、上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βのＰＥＧは、ＩＦＮ−βとの共有結合反応に使用する際には、その結合の方法に応じて、ＰＥＧの末端を活性化する必要があるが、ＰＥＧの末端がヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたＰＥＧ誘導体であってよい。
【００４３】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの好ましい例としては、ヒト・ＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができ、例えば、特許第４８５０５１４号に記載された方法により作製されたＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βが挙げられる。ヒト・ＩＦＮ−βにおけるＰＥＧの結合部位としては、ヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列の第１９番目又は第１３４番目のリジンのアミノ基が好ましく、この部位にＰＥＧが１分子共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βがより好ましい。具体的には、ヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４０，０００以上（好ましくは、分子量４２，０００）のＰＥＧが１分子共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを例示できる。
【００４４】
ここで、「ヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジン」とは、１６６アミノ酸からなるヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端のアミノ酸（メチオニン）を１番としたときに、１３４番目に位置するアミノ酸であるリジンを意味する。すなわち、本明細書では、ＩＦＮ−βのＮ末端のアミノ酸を１番として、ＩＦＮ−βのアミノ酸残基の位置を表す。
【００４５】
「試料液」とは、水又は有機溶剤を主たる溶媒とする液体状の試料を意味する。試料液は、酸を加えることによりｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整できるものであればよく、生物由来の物質を含まなくてもよいし、含んでもよい。生物由来の物質を含まない試料液としては、緩衝液が好ましく、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液又はリン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。生物由来の物質を含む試料液としては、生体試料液が好ましい。「生体試料液」とは、哺乳動物から採取される組織、血液や排泄物から調製される水を主たる溶媒とした液体状の試料を意味する。例えば、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、尿や、腹腔等の体腔や消化管等の洗浄液や、糞、組織片等のホモジネートの遠心分離後上清等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿、血清又は腹水であり、さらに好ましくは、血漿又は血清である。
【００４６】
また、生体試料液の由来である哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ又はサル等が挙げられるが、特にヒトが好ましい。
【００４７】
上記の試料液の前処理方法において、「酸処理工程」とは、試料液に酸を加える工程であり、酸処理工程で使用する酸は、試料液に加えた時に、ｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整でき、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β以外の試料液中のタンパク質を凝集又は析出させることができる酸であればよく、例えば、塩酸若しくは硫酸等の無機酸、スルホフタル酸若しくはスルホサリチル酸クエン酸等の強酸性有機酸、又はクエン酸、酢酸（氷酢酸を含む）若しくはギ酸等の弱酸性有機酸が挙げられるが、塩酸、硝酸又は硫酸が好ましい。また、上記の酸は、酸そのもの又は希釈された酸であってもよく、希釈された酸としては、例えば、２Ｍ〜６Ｍの塩酸が挙げられる。さらに、上記の酸は、該酸を含む酸性緩衝液又は該酸の塩であってもよい。
【００４８】
上記の前処理方法において、酸処理工程は、試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整することが好ましく、試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．３２の範囲に調整することがより好ましく、試料液のｐＨを０．１７に調整することが特に好ましい。
【００４９】
上記の前処理方法において、酸処理工程は、塩酸を加えて、試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整することが好ましく、試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．３２の範囲に調整することがより好ましく、試料液のｐＨを０．１７に調整することが特に好ましい。
【００５０】
上記の前処理方法において、酸処理工程によって発生する試料液中タンパク質の凝集は、試料液中のタンパク質が多い場合は一般的には白濁することにより確認でき、試料液に酸を加え混合した直後に白濁する場合もある。試料液中のタンパク質が少ない場合は白濁を確認できない場合もある。試料液中のタンパク質の凝集は、試料液に酸を加えた後、数分〜数十分間程度のインキュベーションにより誘導することも可能である。この場合、白濁する場合もあれば白濁を確認できない場合もある。インキュベーションの時間は、１秒〜２時間程度であり、１秒〜３０分間程度が好ましく、１秒〜１５分間程度がより好ましい。酸処理工程により凝集したタンパク質は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β以外のタンパク質であり、それには、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β（糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−β及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの両方）が含まれ、さらに生体試料液を用いた場合、生体試料液由来の夾雑タンパク質が凝集したタンパク質に含まれる。
【００５１】
上記の前処理方法において、酸処理工程で凝集したタンパク質を試料液から除去する凝集タンパク質除去工程は、凝集したタンパク質を除去できる方法であればどのような方法でもよく、公知の一般的な方法を用いることができる。例えば、試料液を遠心分離して沈降物を除去（上清を回収）する方法（ペレッティング（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）法）又は試料液を凝集したタンパク質（固体）と液体とを分離できるフィルターに通して濾過（濾液を回収）する方法等が挙げられるが、遠心分離して沈降物を除去（上清を回収）する方法が好ましい。遠心分離は、１０，０００〜４０，０００×ｇの遠心力で５〜１０分間程度行えばよい。
【００５２】
上記の前処理方法において、酸処理工程後の試料液のｐＨはｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲に調整されているため、試料液のｐＨを中性付近（具体的にはｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ５〜７、より好ましくはｐＨ５〜６、さらに好ましくはｐＨ６）に調整する中和工程を行うことが好ましい。中和工程は、凝集タンパク質除去工程の前に行う工程であってもよいし後に行う工程であってもよい。また、糖鎖修飾物質除去工程を備える場合、中和工程は、糖鎖修飾物質除去工程の後に行う工程であってもよい。
【００５３】
すなわち、上記の前処理方法は、凝集タンパク質除去工程の前に中和工程を備える前処理方法、凝集タンパク質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法、又は、糖鎖修飾物質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法であることが好ましく、凝集タンパク質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法であることがより好ましい。
【００５４】
試料液のｐＨを中性付近（具体的にはｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ５〜７、より好ましくはｐＨ５〜６、さらに好ましくはｐＨ６）に調整する際に使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若しくは水酸化リチウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸（水素）ナトリウム、炭酸（水素）カリウム等の炭酸（水素）塩、アンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム等が挙げられる。また、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの安定性や溶解性に影響しないものであれば、上記のアルカリは、該アルカリを含むアルカリ性緩衝液又は該アルカリの塩であってもよい。
【００５５】
上記の前処理方法で前処理した試料液は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの安定性や溶解性を維持することを目的として、適当な緩衝液で希釈することができる。緩衝液は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの安定性や溶解性に影響しないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液や酢酸緩衝液が好ましい。緩衝液には、界面活性剤等を添加することができ、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤から選択される任意のものを用いることができる。例えば、陰イオン性界面活性剤としてはエマール２０Ｃ（登録商標）及びエマールＮＣ３５（登録商標）等、陽イオン性界面活性剤としては、コータミン８６Ｗ（登録商標）及びコータミン２４Ｐ（登録商標）等、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、ＮＰ−４０（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ７２１（登録商標）、ＭＥＧＡ−８、レオコールＳＣ７０（登録商標）、レオコールＴＤ９０（登録商標）及びレオドールＴＷ−０１２０（登録商標）等、両イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（登録商標）、ＣＨＡＰＳＯ（登録商標）、アンヒトール２０Ｎ（登録商標）及びアンヒトール２４Ｂ（登録商標）等が挙げられる。
【００５６】
上記の糖鎖修飾物質除去工程に用いる糖鎖結合性タンパク質としては、例えば、レクチンが挙げられる。レクチンとは、動植物、真菌、細菌又はウイルス等に存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質である。レクチンは、リシンＢ鎖スーパーファミリーに属する「Ｒ型レクチン」、糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン」及び「カルレティキュリン」、「セレクチン」又は「コレクチン」等の代表的なレクチンを含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」、ガラクトースに親和性を示す「ガレクチン」、植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、豆科レクチンと構造類似性を持ち動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」、リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６‐リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」、グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する「I型レクチン」等に分類される。
【００５７】
レクチンは、具体的には、実施例で使用したコンカナバリンＡ（タチタナ豆レクチン；以下「ＣｏｎＡ」と言う）の他、ＡＣＡ（センニンコクレクチン）、ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン）、ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン）、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン）、ＧＮＡ（ユキノハナレクチン）、ＧＳＬ  Ｉ（グリフォニアマメレクチン）、ＧＳＬ  ＩＩ（グリフォニアマメレクチン）、ＨＨＬ（アマリリスレクチン）、ジャカリン（ジャックフルーツレクチン）、ＬＢＡ（リママメレクチン）、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＬＥＬ（トマトレクチン）、ＬＴＬ（ロータスマメレクチン）、ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン）、ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン）、ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン）、ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン）、ＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＰＳＡ（エンドウレクチン）、ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン）、ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン）、ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン）、ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、ＳＪＡ（エンジュレクチン）、ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン）、ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン）、ＳＴＬ（ジャガイモレクチン）、ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン）、ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン）、ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン）、ＵＥＡ  Ｉ（ハリエニシダレクチン）、ＶＦＡ（ソラマメレクチン）、ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン）、ＷＦＡ（ノダフジレクチン）又はＷＧＡ（パンコムギレクチン）等が挙げられる。好ましくは、幅広い種類の糖鎖を認識する、ＣｏｎＡ（タチタナ豆レクチン）、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＷＧＡ（パンコムギレクチン）又はＰＮＡ（ピーナッツレクチン）であり、より好ましくは、ＣｏｎＡ（タチタナ豆レクチン）である。
【００５８】
上記の糖鎖修飾物質除去工程に用いる糖鎖結合性タンパク質固定化担体は、上記の糖鎖結合性タンパク質と支持担体とを含む。支持担体を構成する材料としては、糖鎖結合性タンパク質を結合させることのできるものであればよく、例えば、実施例で使用したセファロース（登録商標）の他、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレンとポリスチレンとのコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア又はセラミックス等が挙げられるが、セファロース（登録商標）又はアガロースが好ましい。また支持担体の構造としては、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造又は膜構造等を挙げることができる。アフィニティーカラムを用いる場合は、ゲル状構造が好ましい。
【００５９】
糖鎖結合性タンパク質は上記の支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。固定化する糖鎖結合性タンパク質の量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍＬである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してから糖鎖結合性タンパク質とカップリングさせることができる。活性化スペーサーを導入したゲルに糖鎖結合性タンパク質を固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルに糖鎖結合性タンパク質を固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。また、糖鎖結合性タンパク質固定化担体は市販のもの、例えば、ＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）又はＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＷＧＡ（サーモサイエンティフィック社製）等を使用することもできる。
【００６０】
上記の糖鎖修飾物質除去工程において、試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させると、試料液中の糖鎖を有するタンパク質が糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合するため、試料液中から除去できる。この糖鎖修飾物質除去工程で除去できる糖鎖を有するタンパク質には、生体由来の糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βが含まれる。したがって、この工程を加えることにより、特に生体試料液を用いた場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量に対するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの含有量の比率をさらに低下させることができる。一方で、この糖鎖修飾物質除去工程は、糖鎖を有するＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出及び含有量を測定するための前処理としては、適さない。なお、糖鎖を有するタンパク質の除去率を向上させるために、糖鎖結合性タンパク質固定化担体は、複数種の糖鎖結合性タンパク質固定化担体を組み合わせて用いてもよい。また、１種の糖鎖結合性タンパク質固定化担体に複数回、試料液を接触させてもよい。例えば、ＣｏｎＡ固定化担体に２回、試料液を接触させることが好ましい。
【００６１】
糖鎖修飾物質除去工程で用いられる、試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、試料液中の糖鎖修飾物を除去する方法は、公知の一般的な方法で実施できるが、例えば、担体を充填できる使い捨てのポリプロピレンスピンカラムにＣｏｎＡ固定化セファロースを充填したＣｏｎＡアフィニティーカラムに、試料液を添加し、室温で約１０〜３０分間、転倒混和した後、遠心分離して得られた濾液を回収する方法が挙げられる。また、市販の糖鎖結合性タンパク質固定化担体又はそのキットを使用する場合は、添付の説明書に従って行えばよい。
【００６２】
上記の前処理方法に必要な試料液の量は、使用する試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量及びその検出及び測定の方法に依存するが、１μＬ〜１０ｍＬであればよい。
【００６３】
また、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出方法は、上記の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、前処理工程で前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程とを備えることを特徴としており、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの定量方法は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出方法を包含するとともに、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、前処理工程で前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的又は生物学的に検出し、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する測定工程とを備えることを特徴としている。
【００６４】
上記の前処理方法により前処理した試料液は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的又は生物学的に検出する前に上記の中和工程を行なってもよいし、適当な緩衝液等（例えば、免疫学的に検出する系で使用する緩衝液、生物学的に検出する系で使用する細胞培養培地等）で希釈してもよい。これは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを免疫学的に検出又は生物学的に検出する方法の特性を考慮し、適宜行えばよい。
【００６５】
上記の前処理方法により前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出する方法及び含有量を測定方法としては、具体的には以下の方法が挙げられる。
【００６６】
免疫学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、ＩＦＮ−βを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定方法）等が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば以下の方法で実施できる。抗ＩＦＮ−βポリクローナル抗体を固相化したプレートのウェルに、上記の前処理方法により前処理した試料液を添加し、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとポリクローナル抗体とを結合させる。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下「ＨＲＰ」と言う）などの酵素で標識した抗ＩＦＮ−βモノクローナル抗体をプレートのウェルに添加し、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βと結合させる。ＴＭＢなどの発色基質を加え、酵素と反応させ発色させることにより、試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出するとともに、得られた発色量を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する。また、ＥＬＩＳＡ法は、市販のキット、例えば、ヒトインターフェロン−βＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス社製）等を用いることでも実施できる。
【００６７】
生物学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、例えば、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を指標としてＩＦＮ活性を測定できる、ＣＰＥ法（細胞変性効果測定方法）が挙げられる。具体的には、ＩＦＮに感受性の高い細胞（以下「ＩＦＮ感受性細胞」と言う）（例えば、ＦＬ細胞）に対して、上記の前処理方法により前処理した試料液を作用させた後に、これら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）又は水ほう性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶと略される）等を一定量添加して感染させ、ＩＦＮ−βにより誘導されたウイルス抵抗性の程度、すなわち、抗ウイルス活性を測定することで、ＩＦＮ活性を測定することにより試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出する。さらに、このＩＦＮ活性の数値を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する。抗ウイルス活性は、ウイルス増殖の抑制を指標に測定されるものであり、ウイルス増殖の結果として細胞を破壊させる細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥと略される）を５０％阻止する検体の希釈倍率から、ＩＦＮ力価（Ｕ）が算出される（小林ら、「免疫生化学実験法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年、ｐ．２４５）。
【００６８】
また、その他の生物学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、例えば、レポーターアッセイと呼ばれる方法が挙げられる。具体的には、インターフェロン応答遺伝子１５（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ１５；ＩＳＧ１５と略される）のプロモーター領域に存在するインターフェロン刺激応答領域（ＩＦＮ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＩＳＲＥと略される）の制御下でルシフェラーゼが発現するレポーター遺伝子を導入した細胞が発現するルシフェラーゼの量を指標にして、ＩＦＮ活性を測定することにより試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出する。さらに、このＩＦＮ活性の数値を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量を測定する。これは市販のキットを用いることができる。
【００６９】
上記の前処理方法により前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出する方法及び含有量を測定する方法としては、上記のＥＬＩＳＡ法又はＣＰＥ法が好ましく、キット化された簡便な測定試薬として提供されているＥＬＩＳＡ法がより好ましい。
【００７０】
さらに、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βキットは、酸処理工程で試料液のｐＨをｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲にするために使用する酸と、検出工程での試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを検出するために使用する、抗ＩＦＮ−β抗体、ＩＦＮ感受性細胞に感染能を持つウイルス、ＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びＩＦＮ刺激応答領域の制御下のレポーター遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、を備えることを特徴としている。上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βキットには、さらに、中和工程で試料液のｐＨを中性付近に調整するために使用するアルカリ及び糖鎖結合性タンパク質固定化担体が含まれていてもよい。また、ＩＦＮ感受性細胞又はＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクターを導入するための宿主細胞を構成品として含んでいてもよい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を示して本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７２】
（実施例１）  ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの作製：
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとして、リコンビナント・ヒト・ＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体を作製した。「リコンビナント・ヒト・ＩＦＮ−β」は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８０年、第８巻、ｐ．４０５７−４０７４に記載の方法に従って作製した（以下「リコンビナントヒトＩＦＮ−β」と言う）。このリコンビナントヒトＩＦＮ−βは、大腸菌で発現させているため、糖鎖を有しない。【００７３】
また、特許第４８５０５１４号の実施例６に記載の方法に従って、リコンビナントヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「リコンビナントヒトＩＦＮ−βとＰＥＧとの共有結合体」を調製した（以下「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β」と言う）。具体的には、まず、０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したリコンビナントヒトＩＦＮ−β（最終濃度２００μｇ／ｍＬ）に、エチレングリコールを（最終濃度２０％）添加した後、１Ｍ  リン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調整した。これに、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ＰＥＧ（分子量４２，０００、日油株式会社製；品番６１Ｇ９９１２２Ｂ０１）を加え混合し、４℃で一晩、結合反応させた。この結合反応溶液に５倍容の１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ  ６５０（Ｓ）；東ソー株式会社製）に供した。下記の展開溶媒で、タンパク質を溶出及び分画した。【００７４】
≪展開溶媒≫
溶媒Ａ：１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶媒Ｂ：１Ｍ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）【００７５】
上記溶媒Ａ、Ｂの混合液を陽イオン交換カラムの樹脂量に対して４０倍量通液させる間に溶媒Ｂの送液比率を０％から６５％に連続的に上昇させて溶出を行った。溶出された分画は、さらに、ＳＰ−５ＰＷカラム（東ソー株式会社製）に供し、リコンビナントヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β」を単離した。得られたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βは、糖鎖を有しない。【００７６】
（実施例２）  酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理によるＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの除去：
１．実験手法
健康成人より血液を採取し、常法により血清を調製した。血清に、天然型ヒトＩＦＮ−β｛フエロン（登録商標；東レ社製）｝又は、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ−β若しくはＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを、それぞれ加え、血清試料を調製した。【００７７】
各血清試料４００μＬに、６Ｍ  塩酸１００μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は０．１７（約０．２）であった。【００７８】
酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ−１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ−１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清３００μＬに８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料Ａとした。また、酸処理工程を備える前処理を行わない血清試料を対照試料（天然型ヒトＩＦＮ−β、リコンビナントヒトＩＦＮ−β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを含む）とした。【００７９】
糖鎖結合性タンパク質固定化担体として、ＣｏｎＡ固定化担体を用いた。懸濁させたＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）２５０μＬをフィルターカップ（バイオ・ラッド社製）に添加した後、ＰＢＳにてＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを２回洗浄し、溶媒置換を行ったものをＣｏｎＡアフィニティーカラムとして用いた。２５０μＬの測定試料ＡをＣｏｎＡアフィニティーカラムに添加し、ローテーターにて室温で約３０分間、転倒混和した後、低速冷却遠心機（ＲＬＸ−１３５、トミー精工社製、ローター型式：ＴＳ−３９）を用いて、遠心分離｛４℃、５，０００ｒｐｍ（５，３４０×ｇ）、５分間｝し、濾液を得た（糖鎖修飾物質除去工程）。得られた濾液を、測定試料Ｂとした。【００８０】
９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、ヤギ由来抗ヒトＩＦＮ−βポリクローナル抗体（天然型ＩＦＮ−βを抗原としてヤギに免疫して血清を得た後、抗原に対するアフィニティー精製により作製した）をＰＢＳで希釈した溶液を１３５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにて添加し、室温で約２時間又は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）静置した。ＰＢＳにてウェル内を洗浄した後、１ｇ／Ｌ  ＢＳＡを含む洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ  リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝に置換して室温で約２時間又は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）ブロッキングした。ブロッキング後は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて保管し、ブロッキングを行った日から５日間以内に使用した。使用時、ウェル内の水分を取り除き、これをＥＬＩＳＡプレートとして用いた。【００８１】
測定試料Ａ、Ｂ及び対照試料に対し、ヤギ由来抗ヒトＩＦＮ−βポリクローナル抗体の血清中タンパク質への非特異的結合をブロッキングする目的でヤギＩｇＧ（ベックマン・コールター社製）を添加した（最終濃度１２５μｇ／ｍＬ）後、測定試料Ａ、Ｂ及び対照試料を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温にて約１時間静置した。なお、バックグラウンドウェルとして、血清（ＩＦＮ−βは添加しない）を添加したウェルを設けた。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を２回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。【００８２】
ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出及び定量は発光量を指標として行った。基質溶液は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を等量混合したものを用いた。基質溶液を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、発光光度計（Ｅ６５２１、プロメガ社製）にて積分時間２分間あたりの光強度（単位：カウント）を測定した。各試料を添加したウェルのカウントから、バックグラウンドウェルのカウントを差し引いた値を、各試料の発光量とした。【００８３】
２．結果
結果を図１及び２に示す。図の縦軸は、発光量（カウント）を示し、横軸は、血清試料に加えた天然型ヒトＩＦＮ−β、リコンビナントヒトＩＦＮ−β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。酸処理工程を備える前処理による効果を図１に示し、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による効果を図２に示す。図中の、「対照試料（天然型ヒトＩＦＮ−β）」、「対照試料（リコンビナントヒトＩＦＮ−β）」又は「対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β）」はそれぞれ、天然型ヒトＩＦＮ−β、リコンビナントヒトＩＦＮ−β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを含む対照試料を示す。図中の「測定試料Ａ」、「測定試料Ｂ」の括弧内の記載についても、「対照試料」の括弧内の記載と同じ意味である。【００８４】
測定試料Ａ（天然型ヒトＩＦＮ−β）及び測定試料Ａ（リコンビナントヒトＩＦＮ−β）の発光量は、それぞれ、対照試料の２０％以下、１０％以下にまで低下した。これに対して、測定試料Ａ（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β）の発光量の低下は認められなかった（図１）。したがって、酸処理工程を備える前処理によって、血清中の天然型ヒトＩＦＮ−β及びリコンビナントヒトＩＦＮ−βは低減するが、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βは変化ないことが示された。【００８５】
測定試料Ｂ（天然型ヒトＩＦＮ−β）及び測定試料Ｂ（リコンビナントヒトＩＦＮ−β）の発光量は、それぞれ、対照試料の１％以下、５％以下にまで低下した。これに対して測定試料Ｂ（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β）の発光量の低下はほとんど認められなかった（図２）。したがって、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理によって、血清中の天然型ヒトＩＦＮ−β及びリコンビナントヒトＩＦＮ−βは著しく低減するが、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βは変化ないことが示された。【００８６】
この結果から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液に対して酸処理工程を備える前処理を行うことにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを低減し、取り除くことができることが明らかとなった。また、その効果は、さらに糖鎖修飾物質除去工程を行うことにより、高まることが明らかとなった。【００８７】
（実施例３）  酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの低減：
１．実験手法
健康成人より血液を採取し、常法により血清を調製した。血清に天然型ヒトＩＦＮ−β｛フエロン（登録商標；東レ社製）｝（最終濃度３３３ｐｇ／ｍＬ）と実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料（Ｉ）、及び、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ−β（最終濃度１００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料（ＩＩ）を調製した。【００８８】
各血清試料４００μＬに、６Ｍ  塩酸１００μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は０．１７（約０．２）であった。【００８９】
酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ−１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ−１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清３００μＬに８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、酸処理後試料とした。【００９０】
実施例２と同じ方法で作製したＣｏｎＡアフィニティーカラムに２５０μＬの酸処理後試料を添加し、ローテーターにて室温で約３０分間、転倒混和した後、低速冷却遠心機（ＲＬＸ−１３５、トミー精工社製、ローター型式：ＴＳ−３９）を用いて、遠心分離｛４℃、５，０００ｒｐｍ（５，３４０×ｇ）、５分間｝し、濾液を得た。得られた濾液全量を、別のＣｏｎＡアフィニティーカラムに添加し、上記と同様に遠心分離し、濾液を得た（糖鎖修飾物質除去工程）。得られた濾液を、測定試料とした。【００９１】
測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（ベックマン・コールター社製）を添加した（最終濃度１２５μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを、最終濃度２０、４０、８０、１６０、３２０ｐｇ／ｍＬとなるように加え、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ  リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を２回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。【００９２】
ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの検出及び定量は、発光量を指標として行った。基質溶液は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を等量混合したものを用いた。基質溶液を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、発光光度計（Ｅ６５２１、プロメガ社製）にて積分時間２分間あたりの光強度（単位：カウント）を測定した。【００９３】
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ（ｖｅｒ３．１．２、日本モレキュラーデバイス社製）を用い、標準試料の光強度から、４パラメーターのロジスティック回帰によって検量線を作成した。各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度（測定値）は、検量線を用いた逆回帰濃度として算出した。さらに、理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｒｒｏｒ）を下記の式１に従って求めた。
Ｒ．Ｅ．（％）＝｛（測定値−理論値）／理論値  ｝×１００・・・式１【００９４】
２．結果
結果を表１に示す。表中の血清試料（Ｉ）は、天然型ヒトＩＦＮ−β（最終濃度３３３ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料であり、血清試料（ＩＩ）は、リコンビナントヒトＩＦＮ−β（最終濃度１００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料である。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。【００９５】
【表１】
2016052584.tif 000002
【００９６】
いずれの血清試料においても、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度の測定値のＲ．Ｅ．が２０％未満であった。したがって、血清試料に、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行うことにより、ＥＬＩＳＡによって、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが示された。【００９７】
この結果から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液であっても、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行うことにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除き、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。【００９８】
（比較例１）  ＰＥＧ修飾されたヒトＩＦＮ−αに対する酸処理工程を備える前処理の影響：
１．実験手法
血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ロットナンバー：Ｈ１５Ｌ０３Ｚ）に、リコンビナントヒトＩＦＮ−α２ａとＰＥＧとの共有結合体｛ペガシス（中外製薬社製）；以下「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−α」と言う｝を加え、血清試料を調製した（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）。【００９９】
血清試料に、０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸を全容量の２０％になるよう添加した（酸処理工程）。０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸で酸処理後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、３．２５、０．７６、０．１７であった。【０１００】
酸処理により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ−１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ−１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清に８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。また、酸処理工程を備える前処理を行わない血清試料を対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−αを含む）とした。【０１０１】
測定試料及び対照試料中のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡは、ＶｅｒｉＫｉｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＰＢＬ社製）を用い、操作はキットに添付のプロトコールに従った。検出は、マイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、バイオ・ラッド社製）にて測定した吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を指標として行った。【０１０２】
２．結果
結果を図３に示す。図は、対照試料、及び、０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸で酸処理工程を行った測定試料の吸光度（４５０ｎｍ）を示す。【０１０３】
いずれの濃度の塩酸で酸処理工程を行った測定試料においても、対照試料の１５％未満にまで吸光度が低下した。したがって、血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−αは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βと異なり、酸処理工程を備える前処理によって著しく低減することが示された。【０１０４】
（実施例４）  酸処理工程におけるｐＨの下限：
１．実験手法
血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度４０００ｐｇ／ｍＬ）を加えた血清試料を調製して試料液とした。【０１０５】
血清試料３００μＬに、６Ｍ  塩酸７５μＬ（全容量の２０％）、１３０μＬ（全容量の３０％）、２００μＬ（全容量の４０％）、３００μＬ（全容量の５０％）又は９００μＬ（全容量の７５％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１７、０．０３、−０．１０、−０．２０、−０．４１であった。【０１０６】
酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５−２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。また、各測定試料と容量が揃うように蒸留水を添加した、酸処理工程を備える前処理を行なわない血清試料を対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを含む）とした。【０１０７】
測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）静置した。なお、バックグラウンドウェルとして、血清（ＩＦＮ−βは添加しない）を添加したウェルを設けた。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ  リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。【０１０８】
ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの検出及び定量は、吸光度を指標として行った。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１５〜４５分間静置した後、０．５Ｍ 硫酸を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加して、発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、バイオ・ラッド社製）にて吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を測定し、各試料を添加したウェルの測定値から、バックグラウンドウェルの測定値を差し引いた値を、各試料の吸光度とした。【０１０９】
対照試料と比較した、測定試料の吸光度低下度を式２に従って求めた。
吸光度低下度（％）＝（測定試料の吸光度／対照試料の吸光度）×１００  ・・・式２【０１１０】
さらに、６Ｍ  塩酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った測定試料を基準試料とし、基準試料の吸光度低下度を０％と設定した場合の相対的な吸光度低下度（％）を式３に従って求めた。
相対的な吸光度低下度（％）＝１００−測定試料の吸光度低下度／基準試料の吸光度低下度×１００  ・・・式３【０１１１】
２．結果
結果を図４及び表２に示す。図は、６Ｍ  塩酸を全容量の３０％、４０％、５０％又は７５％になるよう添加し酸処理工程を行った場合の、相対的な吸光度低下度（％）を示す。【０１１２】
【表２】
2016052584.tif 000003
【０１１３】
６Ｍ  塩酸を全容量の３０％及び４０％になるよう添加し、酸処理工程を行った場合、相対的な吸光度低下度（％）はそれぞれ１４．０％及び１０．０％であり、２０％未満であった。したがって、６Ｍ  塩酸添加量が全容量の４０％以下であれば、酸処理工程によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量に概ね影響を与えないことが示された。一方、６Ｍ  塩酸を全容量の５０％及び７５％になるよう添加し、酸処理工程を行った場合、相対的な吸光度低下度（％）はそれぞれ３５．７％及び７２．６％であり、酸処理工程によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量が低下することが示された。【０１１４】
この結果から、血清試料のｐＨが−０．１０以上の場合、酸処理工程を備える前処理によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量に概ね影響を与えず、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。【０１１５】
（実施例５）  酸処理工程におけるｐＨの上限：
１．実験手法
血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ−β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料を調製して試料液とした。【０１１６】
血清試料３００μＬに、６Ｍ  塩酸７５μＬ（全容量の２０％）、６５μＬ（全容量の１７．５％）、５６μＬ（全容量の１５％）又は４７μＬ（全容量の１２．５％）を添加した（酸処理工程）後、全ての試料の容量が３７５μＬになるよう、蒸留水を添加した。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１７、０．２１、０．２７、０．３２であった。【０１１７】
酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５−２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）後、全ての試料の容量が３６４μＬになるよう、蒸留水を添加した。これらを、測定試料とした。【０１１８】
測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを、最終濃度４００、８００、１６００、３２００、４８００、６４００ｐｇ／ｍＬとなるように加え、６Ｍ  塩酸を全容量の２０％、１７．５％、１５％又は１２．５％になるよう添加することによる酸処理工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ  リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。【０１１９】
ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの検出及び定量は、吸光度を指標として行った。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１５〜４５分間静置した後、０．５Ｍ  硫酸を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加して、発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、バイオ・ラッド社製）にて吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を測定した。【０１２０】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用い、標準試料の吸光度から、４パラメーターのロジスティック回帰によって検量線を作成した。各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度（測定値）は、対応する検量線を用いて、逆回帰濃度として算出した。さらに、理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｒｒｏｒ）を実施例３にて使用した式１に従って求めた。【０１２１】
２．結果
結果を表３に示す。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。【０１２２】
【表３】
2016052584.tif 000004
【０１２３】
６Ｍ  塩酸を全容量の２０％、１７．５％、１５％及び１２．５％になるよう添加し酸処理工程を行った場合の、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度の測定値のＲ．Ｅ．は、それぞれ３．１７％、６．９７％、１４．９％及び１９．９％であり、２０％未満であった。【０１２４】
この結果から、血清試料のｐＨが０．５０以下の場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中において、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βが選択的に低減し、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。【０１２５】
（実施例６）  複数種の酸を用いた酸処理工程を備える前処理による、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βの低減： 
１．実験手法
血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ−β（１５００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料を調製して試料液とした。【０１２６】
血清試料３００μＬに、６Ｍ  硝酸、硫酸、酢酸又はリン酸７５μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ−５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８−１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１４、０．２６、３．３３、０．８５であった。【０１２７】
６Ｍ  酢酸又はリン酸を用いた酸処理工程では、凝集物の形成は目視で確認されなかった。凝集物の形成が目視で確認された、６Ｍ  硝酸又は硫酸を用いた酸処理工程後の血清試料を、冷却遠心機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５−２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ  水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。【０１２８】
測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５〜２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βを、最終濃度４００、８００、１６００、３２００、４８００、６４００ｐｇ／ｍＬとなるように加え、６Ｍ  硝酸又は硫酸を用いた酸処理工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ  リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ  リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ−βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。【０１２９】
ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの検出及び定量は、実施例５に従った。【０１３０】
各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度（測定値）及び理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｒｒｏｒ）の算出は、実施例５に従った。【０１３１】
２．結果
結果を表４に示す。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
６Ｍ  酢酸又はリン酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った場合、酸処理工程後の血清試料のｐＨは、実施例３及び４にて明らかとなった、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できるｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲外であった。一方、６Ｍ  硝酸又は硫酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った場合、酸処理工程後の血清試料のｐＨは、ｐＨ−０．１０からｐＨ０．３２の範囲内であり、さらに、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−β濃度の測定値のＲ．Ｅ．が２０％未満であったことから、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが示された。【０１３４】
この結果から、ｐＨ−０．１０〜ｐＨ０．５０の範囲内で酸処理工程を備える前処理を行った場合、酸種によらず、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ−βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の前処理方法は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βとが共存する試料液中から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ−βを取り除くことができる。また、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの検出方法及び定量方法並びにＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β検出キットは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−β投与後に生体から採取された試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βの含有量の測定に使用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号１：ヒト・ＩＦＮ−βのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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