(57)【要約】  本願のある態様の反応促進剤は、プロテアーゼによるタンパク質の分解反応に用いられる反応促進剤であって、下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む。【化１】2016076408.tif 000037［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］【化２】2016076408.tif 000038［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
2016076408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼによるタンパク質の分解反応に用いられる反応促進剤であって、
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤。
【化１】
2016076408.tif 000025
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化２】
2016076408.tif 000026
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項２】
前記第１陰イオン界面活性剤は、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸、ミリストイルサルコシン酸、及びココイルサルコシン酸からなる群から選択される少なくとも一種であり、
前記第１陰イオン界面活性剤の塩は、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸の塩、ミリストイルサルコシン酸の塩、及びココイルサルコシン酸の塩からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１に記載の反応促進剤。
【請求項３】
前記第２陰イオン界面活性剤は、ココイルグルタミン酸であり、
前記第２陰イオン界面活性剤の塩は、ココイルグルタミン酸の塩である請求項１又は２に記載の反応促進剤。
【請求項４】
プロテアーゼと、
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、
を含むヘモグロビン分解用組成物。
【化３】
2016076408.tif 000027
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化４】
2016076408.tif 000028
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項５】
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のヘモグロビンＡ１ｃとを反応させて糖化ペプチドを生成する工程と、
酸化体の存在下で前記糖化ペプチドをフルクトシルペプチドオキシダーゼにより酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において前記糖化ペプチドにより前記酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程と、
前記酸化体還元物の量を検出する工程と、
検出した前記酸化体還元物の量に基づいて、前記検体中のヘモグロビンＡ１ｃの濃度を算出する工程と、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【化５】
2016076408.tif 000029
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化６】
2016076408.tif 000030
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項６】
前記プロテアーゼは、前記ヘモグロビンＡ１ｃからフルクトシル−バリルヒスチジンを生成する請求項５に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項７】
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のヘモグロビンＡ１ｃとを反応させて糖化アミノ酸を生成する工程と、
酸化体の存在下で前記糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において前記糖化アミノ酸により前記酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程と、
前記酸化体還元物の量を検出する工程と、
検出した前記酸化体還元物の量に基づいて、前記検体中のヘモグロビンＡ１ｃの濃度を算出する工程と、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【化７】
2016076408.tif 000031
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化８】
2016076408.tif 000032
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項８】
前記プロテアーゼは、前記ヘモグロビンＡ１ｃからフルクトシル−バリンを生成する請求項７に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項９】
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、
ヘモグロビンＡ１ｃから糖化ペプチドを生成するプロテアーゼと、
前記糖化ペプチドを酸化還元反応させるフルクトシルペプチドオキシダーゼと、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【化９】
2016076408.tif 000033
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化１０】
2016076408.tif 000034
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項１０】
下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、前記第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び前記第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、
ヘモグロビンＡ１ｃから糖化アミノ酸を生成するプロテアーゼと、
前記糖化アミノ酸を酸化還元反応させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【化１１】
2016076408.tif 000035
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化１２】
2016076408.tif 000036
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【請求項１１】
前記酸化還元反応で生成される過酸化水素を検出する試薬をさらに含む請求項９又は１０に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１２】
前記過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する発色試薬と、を含む請求項１１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１３】
前記過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して発光する発光試薬と、を含む請求項１１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、反応促進剤、ヘモグロビン分解用組成物、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃの測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」と略する。）の濃度は、２〜３ヶ月間の血液中のグルコース濃度の平均値と相関性を有する。それ故、血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、糖尿病の診断指標として用いられている。ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、酵素アッセイ法による手法が提案されている（例えば、特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１１０６５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のＨｂＡ１ｃの測定方法では、ＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮したいという要望があった。【０００５】
本願はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願のある態様は反応促進剤である。当該反応促進剤は、プロテアーゼによるタンパク質の分解反応に用いられる反応促進剤であって、下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【化１】
2016076408.tif 000003
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化２】
2016076408.tif 000004
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【発明の効果】
【０００７】
本願によれば、ＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮するための技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】反応促進剤がメタロプロテアーゼのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。
【図２】反応促進剤がシステインプロテアーゼのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。
【図３】ＨｂＡ１ｃの測定結果の一例を示す図である。
【図４】反応促進剤がフィシンのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。
【図５】反応促進剤としてココイルグルタミン酸Ｎａを用いた場合のヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
【００１０】
本願発明者は、特許文献１に開示されたＨｂＡ１ｃの測定方法を詳細に検討した。特許文献１に開示されたＨｂＡ１ｃの測定方法では、酵素アッセイ法が用いられてる。具体的には、特許文献１の測定方法では、まず、（１）プロテアーゼ（Protease）によりＨｂＡ１ｃが分解され、ＨｂＡ１ｃの特徴的な構造であるフルクトシルペプチド断片（Fructosyl Peptide Fragment）が生成される。次いで、（２）フルクトシルペプチド断片がフルクトシルペプチドオキシダーゼ（Fructosyl Peptide Oxidase：以下、「ＦＰＯＸ」と略する。）と反応することで過酸化水素が生成される。その後、（３）生成された過酸化水素の量が検出され、その量に基づきＨｂＡ１ｃが定量される。
【００１１】
上述した特許文献１の測定方法では、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応に時間を要するため、迅速にＨｂＡ１ｃを測定する上で改善の余地があった。
【００１２】
一方、ＨｂＡ１ｃの測定方法には、酵素アッセイ法以外にも、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：以下、「ＨＰＬＣ」と略する。）法や免疫アッセイ法が知られている。しかしながら、ＨＰＬＣ法や免疫アッセイ法は、酵素アッセイ法と比較して測定操作が複雑である。
【００１３】
また、ＨＰＬＣ法や免疫アッセイ法では通常、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応の時間を短縮するために、反応促進剤としてドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate：以下、「ＳＤＳ」と略する。）が用いられる。しかしながら、ＳＤＳは少量であっても酵素を失活させてしまう。このため、溶血、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解、過酸化水素の生成といった一連の反応が同一反応槽で実施される酵素アッセイ法には、ＳＤＳは適さない。
【００１４】
そこで、本願発明者は、酵素アッセイ法を用いた場合でも、迅速にＨｂＡ１ｃを測定することができる技術について鋭意検討を重ね、新規な反応促進剤、ヘモグロビン分解用組成物、ＨｂＡ１ｃの測定方法及びＨｂＡ１ｃの測定キットを想到した。本願の一実施の形態の概要は、以下の通りである。
【００１５】
本実施の形態に係る反応促進剤は、プロテアーゼによるタンパク質の分解反応に用いられる反応促進剤であって、下記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、下記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【化３】
2016076408.tif 000005
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【化４】
2016076408.tif 000006
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【００１６】
また、本実施の形態に係るヘモグロビン分解用組成物は、プロテアーゼと、上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、を含む。
【００１７】
また、本実施の形態の一例に係るＨｂＡ１ｃの測定方法は、（１）上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のＨｂＡ１ｃとを反応させて糖化ペプチドを生成する工程Ａ１と、（２）酸化体の存在下で糖化ペプチドをＦＰＯＸにより酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において糖化ペプチドにより酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程Ｂ１と、（３）酸化体還元物の量を検出する工程Ｃ１と、（４）検出した酸化体還元物の量に基づいて、検体中のＨｂＡ１ｃの濃度を算出する工程Ｄ１と、を含む。
【００１８】
また、本実施の形態の他の例に係るＨｂＡ１ｃの測定方法は、（１）上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のＨｂＡ１ｃとを反応させて糖化アミノ酸を生成する工程Ａ２と、（２）酸化体の存在下で糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Fructosyl Amino acid Oxidase：以下、「ＦＡＯＸ」と略する。）により酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において糖化アミノ酸により酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程Ｂ２と、（３）酸化体還元物の量を検出する工程Ｃ２と、（４）検出した酸化体還元物の量に基づいて、検体中のＨｂＡ１ｃの濃度を算出する工程Ｄ２と、を含む。
【００１９】
また、本実施の形態の一例に係るＨｂＡ１ｃの測定キットは、上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、ＨｂＡ１ｃから糖化ペプチドを生成するプロテアーゼと、糖化ペプチドを酸化還元反応させるＦＰＯＸと、を含む。
【００２０】
また、本実施の形態の他の例に係るＨｂＡ１ｃの測定キットは、上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む反応促進剤と、ＨｂＡ１ｃから糖化アミノ酸を生成するプロテアーゼと、糖化アミノ酸を酸化還元反応させるＦＡＯＸと、を含む。
【００２１】
＜反応促進剤＞
反応促進剤は、第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む。第１陰イオン界面活性剤は、下記一般式（１）で表される構造を有する。
【００２２】
【化５】
2016076408.tif 000007
［式中、Ｒ１は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｘは水素原子又はメチル基である。］
【００２３】
一般式（１）で表される第１陰イオン界面活性剤又はその塩としては、例えば、一般式（１）中のＲ１が炭素数８〜１８の直鎖アルキル基であるものや、一般式（１）中のＲ１が炭素数６〜２２の直鎖アルキル基であるものが存在する。後述する実施例（Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムの比較）から、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応を促進させる上で、一般式（１）中のＲ１以外の構造が重要であることが示される。このため、本実施の形態で用いられる第１陰イオン界面活性剤又はその塩は、Ｒ１のアルキル基の炭素数と分岐の有無は特に限定されない。したがって、第１陰イオン界面活性剤又はその塩としては、一般式（１）中のＲ１が、炭素数６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基であるものを採用することができる。
【００２４】
一般式（１）で表される第１陰イオン界面活性剤又はその塩としては、例えば、下記式（２）で表されるＮ−ドデカノイルサルコシン酸又はその塩、下記式（３）で表されるミリストイルサルコシン酸又はその塩、及び下記式（４）で表されるココイルサルコシン酸又はその塩等を挙げることができる。これらの界面活性剤は、親水基末端にＮ−メチルアミノ酢酸基（サルコシン酸骨格）を有する陰イオン界面活性剤である。これらは１種類が単独で用いられてもよく、２種以上の組み合わせで用いられてもよい。
【００２５】
【化６】
2016076408.tif 000008
【００２６】
【化７】
2016076408.tif 000009
【００２７】
【化８】
2016076408.tif 000010
［式中、Ｒ３は、炭素数が１１〜１７の直鎖アルキル基である。］
【００２８】
第２陰イオン界面活性剤は、下記一般式（６）で表される構造を有する。
【００２９】
【化９】
2016076408.tif 000011
［式中、Ｒ２は、炭素数が６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基である。Ｙは水素原子又はメチル基である。］
【００３０】
第２陰イオン界面活性剤又はその塩についても、第１陰イオン界面活性剤と同様に、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応を促進させる上で、一般式（６）中のＲ２以外の構造が重要である。このため、本実施の形態で用いられる第２陰イオン界面活性剤又はその塩は、Ｒ２のアルキル基の炭素数と分岐の有無は特に限定されない。したがって、第２陰イオン界面活性剤又はその塩としては、一般式（６）中のＲ２が、炭素数６〜２２の直鎖アルキル基、又は主鎖の炭素数が６〜２２の分岐鎖アルキル基であるものを採用することができる。
【００３１】
一般式（６）で表される第２陰イオン界面活性剤又はその塩としては、例えば、下記式（７）で表されるココイルグルタミン酸又はその塩等を挙げることができる。この界面活性剤は、親水基末端にグルタミン酸骨格を有する陰イオン界面活性剤である。これらは１種類が単独で用いられてもよく、２種以上の組み合わせで用いられてもよい。また、第１陰イオン界面活性剤又はその塩と、第２陰イオン界面活性剤又はその塩とが組み合わされてもよい。
【化１０】
2016076408.tif 000012
［式中、Ｒ５は、炭素数が１１〜１７の直鎖アルキル基である。］
【００３２】
＜プロテアーゼ＞
本実施の形態に係るヘモグロビン分解用組成物に用いられるプロテアーゼは、ヘモグロビンを分解できるものであれば特に限定されないが、例えば、キモトリプシン及びスブチリシン等のセリンプロテアーゼ；パパイン、カスパーゼ及びフィシン等のシステインプロテアーゼ；ペプシン及びカテプシンＤ等のアスパラギン酸プロテアーゼ；サーモリシン等のメタロプロテアーゼ；Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ；グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。プロテアーゼとしては、複数種のプロテアーゼが混合されて用いられてもよい。複数種のプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、システインプロテアーゼとメタロプロテアーゼとの組み合わせや、同じシステインプロテアーゼの中でもパパインとカスパーゼとの組み合わせ等を挙げることができる。また、同種のプロテアーゼであっても、由来の異なるものが混合されて用いられてもよい。
【００３３】
本実施の形態に係るＨｂＡ１ｃの測定方法及び測定キットに用いられるプロテアーゼは、当該測定方法及び測定キットがＦＰＯＸを用いる系の場合には、ＨｂＡ１ｃから糖化ペプチドとしてのフルクトシル−バリルヒスチジン（Ｆｒｕ−ＶａｌＨｉｓ）を生成することができるものであれば、特に限定されない。これは、ＦＰＯＸがフルクトシル−バリルヒスチジンの酸化還元反応を触媒するためである。このようなプロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００３４】
ＨｂＡ１ｃの測定方法及び測定キットがＦＡＯＸを用いる系の場合には、プロテアーゼは、ＨｂＡ１ｃから糖化アミノ酸としてのフルクトシル−バリン（Ｆｒｕ−Ｖａｌ）を生成することができるものであれば、特に限定されない。これは、ＦＡＯＸがフルクトシル−バリンの酸化還元反応を触媒するためである。このようなプロテアーゼとしては、例えば、小麦由来のセリンカルボキシペプチダーゼ、セリ科、ショウガ科又はパイナップル科に属する植物から抽出されたカルボキシペプチダーゼ、及びスミチームＦＬ−Ｇ（新日本化学工業社製）等が挙げられる。
【００３５】
＜酸化体還元物＞
本実施の形態に係るＨｂＡ１ｃの測定方法において、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸによる糖化ペプチド又は糖化アミノ酸の酸化還元反応により生成される酸化体還元物とは、当該酸化還元反応における酸化体が、糖化ペプチド又は糖化アミノ酸から電子を供与されて還元されてなる物質を示す。当該酸化還元反応において、糖化ペプチド及び糖化アミノ酸は、還元体として機能する。還元体とは、酸化体に電子を付与して酸化体を還元させ、自身は酸化されるものである。ＦＰＯＸの場合、還元体は糖化ペプチドであり、ＦＡＯＸの場合、還元体は糖化アミノ酸である。酸化体とは、還元体から電子を受け取って還元体を酸化させ、自身は還元されて酸化体還元物となるものである。酸化体の具体例としては、反応溶液中の溶存酸素、あるいは反応溶液に添加した電子メディエータを挙げることができる。酸化体が溶存酸素である場合、酸化体還元物は過酸化水素である。
【００３６】
＜酸化体還元物の量の検出方法＞
上述した工程Ｃ１及びＣ２において酸化体還元物の量を検出する手法としては、例えば、比色法、電気化学的手法又は化学発光法等を採用することができる。酸化体還元物の量を検出する手法として比色法が採用され、また酸化体還元物が過酸化水素である場合、例えば、以下のようにして酸化体還元物の量を検出することができる。すなわち、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸによる糖化ペプチド又は糖化アミノ酸の酸化還元反応で生じる過酸化水素を、ペルオキシダーゼ（ＥＣ番号：１．１１．１．７）の存在下で発色試薬と反応させる。発色試薬は、ペルオキシダーゼにより促進される過酸化水素との反応で水素が奪われて発色する物質である。これにより、過酸化水素の量に応じた色素を生成させることができる。したがって、発色試薬に対応する波長における吸光度の測定等によって、生成した色素を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。
【００３７】
酸化体還元物の量を検出する手法として電気化学的手法が採用される場合、例えば、酸化体還元物としての過酸化水素を電気化学的に検出する手法、又は電子メディエータの還元物を電気化学的に検出する手法を採用することができる。過酸化水素を電気化学的に検出する手法では、酸化体としての溶存酸素が還元されてなる過酸化水素に所定の電圧を印加すると、過酸化水素の量に応じた電流値が検出される。したがって、この電流値を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。
【００３８】
電子メディエータの還元物を電気化学的に検出する手法の場合には、例えば、以下のように実施することができる。すなわち、工程Ｂ１又は工程Ｂ２において、酸化型電子メディエータ（酸化状態にある電子メディエータ）の存在下で、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸによる糖化ペプチド又は糖化アミノ酸の酸化還元反応が実施される。これにより、酸化型電子メディエータが還元型電子メディエータ（電子を受け取って還元状態にある電子メディエータ、すなわち酸化体還元物）に変換される。得られた還元型電子メディエータに電圧を印加すると、還元型電子メディエータの量に応じた電流値が検出される。したがって、この電流値を検出することで、還元型電子メディエータの量を定量することができる。
【００３９】
酸化型電子メディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウム（Potassium Ferricyanide）を挙げることができ、還元型電子メディエータとしては、例えば、フェロシアン化カリウム（Potassium Ferrocyanide）を挙げることができる。また、他の酸化型電子メディエータとしては、ｍＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルスルファート：1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate）；シトクロムａ〜ｃ等のタンパク質性電子メディエータ等を挙げることができる。さらに、他の酸化型電子メディエータの例示として、キノン類化合物又はその誘導体を挙げることができる。キノン類化合物の具体例としては、ベンゾキノン（benzoquinone）、ナフトキノン（Naphthoquinone）、フェナントレンキノン（Phenanthraquinone）及びフェナントロリンキノン（phenanthrolinequinone）等を挙げることができる。
【００４０】
酸化体還元物の量を検出する手法として化学発光法が採用され、また酸化体還元物が過酸化水素である場合、例えば、以下のようにして酸化体還元物の量を検出することができる。すなわち、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸによる糖化ペプチド又は糖化アミノ酸の酸化還元反応で生じる過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下で発光試薬と反応させる。発光試薬は、ペルオキシダーゼにより促進される過酸化水素との反応で水素が奪われて発光する物質である。これにより、過酸化水素の量に応じて発光させることができる。したがって、発光試薬の発光量を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。
【００４１】
本実施の形態に係るＨｂＡ１ｃの測定方法は、工程Ａ１〜Ｃ１の一連の反応、及び工程Ａ２〜Ｃ２の一連の反応を、同一反応槽で行うことができる。これは、プロテアーゼ、ＦＰＯＸあるいはＦＡＯＸ、及びペルオキシダーゼの活性に対する反応促進剤の影響が小さく、且つ、反応促進剤がプロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応を促進することができるためである。
【００４２】
一連の反応を同一反応槽で行う場合、反応促進剤に含まれる第１陰イオン界面活性剤又はその塩の濃度は、反応溶液全量に対して、好ましくは０．０１〜１０．０質量％であり、より好ましくは０．１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．３〜３．０質量％である。また、反応促進剤に含まれる第２陰イオン界面活性剤又はその塩の濃度は、反応溶液全量に対して、好ましくは０．１質量％以上１．０質量％未満であり、より好ましくは０．１〜０．５質量％以下であり、さらに好ましくは、０．２５％前後（例えば０．２３〜０．２７％）である。
【００４３】
＜ＨｂＡ１ｃの濃度の算出方法＞
ＨｂＡ１ｃの濃度は、検出した過酸化水素あるいは電子メディエータの量、すなわち酸化体還元物の量に基づいて、算出される。酸化体還元物の量に基づくＨｂＡ１ｃの濃度の算出には、検出された酸化体還元物の量とＨｂＡ１ｃの濃度とが予め対応付けられた濃度情報に基づいて算出する方法と、検出された発色、電流値又は発光量とＨｂＡ１ｃの濃度とが予め対応付けられた濃度情報に基づいて算出する方法とを含めることができる。これらの濃度情報は、従来公知のものを用いることができる。
【００４４】
＜酸化体還元物の検出試薬＞
本実施の形態に係るＨｂＡ１ｃの測定キットは、糖化ペプチドあるいは糖化アミノ酸の酸化還元反応で生成される、酸化体還元物としての過酸化水素を検出する試薬を含む。過酸化水素の量を検出する手法として比色法が採用されるＨｂＡ１ｃの測定キットの場合、過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する発色試薬と、を含む。
【００４５】
一方、過酸化水素の量を検出する手法として化学発光法が採用されるＨｂＡ１ｃの測定キットの場合、過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して発光する発光試薬と、を含む。酸化体還元物として還元型電子メディエータが用いられる場合、ＨｂＡ１ｃの測定キットは、酸化ペプチド又は酸化アミノ酸の酸化還元反応系に添加される酸化型電子メディエータを含む。
【００４６】
以上説明したように、本実施の形態に係る反応促進剤は、上記一般式（１）で表される構造を有する第１陰イオン界面活性剤、第１陰イオン界面活性剤の塩、上記一般式（６）で表される構造を有する第２陰イオン界面活性剤、及び第２陰イオン界面活性剤の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む。これにより、採取した血液中のＨｂＡ１ｃを、より短時間のうちにプロテアーゼと反応する状態にすることができ、その結果プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応を促進させることができる。よって、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応に要する時間を短縮することができるため、迅速にＨｂＡ１ｃを測定することができる。したがって、この反応促進剤、またこの反応促進剤を含むヘモグロビン分解用組成物及びＨｂＡ１ｃの測定キット、この反応促進剤を用いるＨｂＡ１ｃの測定方法によれば、ＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮することができる。
【００４７】
また、本実施の形態に係る反応促進剤は、プロテアーゼ、ＦＰＯＸあるいはＦＡＯＸ、及びペルオキシダーゼの活性に対する影響が小さい。このため、ヘモグロビン分解用組成物における、プロテアーゼの酵素活性の低下に起因するヘモグロビン分解性能の低下を抑制することができる。また、ＨｂＡ１ｃの測定方法において、工程Ａ１〜Ｃ１の一連の反応、及び工程Ａ２〜Ｃ２の一連の反応を、同一反応槽で行うことができるため、ＨｂＡ１ｃの測定操作を簡略化することができる。
【００４８】
なお、本実施の形態に係る反応促進剤、ヘモグロビン分解用組成物及びＨｂＡ１ｃの測定キットは、酵素アッセイ法によるＨｂＡ１ｃの測定に有用であるが、使用可能な測定法は酵素アッセイ法に限定されず、ＨＰＬＣ法や免疫アッセイ法によるＨｂＡ１ｃ測定にも用いることができることは言うまでもない。
【００４９】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などのさらなる変形を加えることも可能であり、さらなる変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれる。上述した実施の形態への変形の追加によって生じる新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態、及び変形それぞれの効果をあわせもつ。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００５１】
＜Ｉ．反応促進剤がプロテアーゼ（メタロプロテアーゼ）のヘモグロビン分解能に与える影響の評価試験＞
反応促進剤の存在下で、プロテアーゼによるヘモグロビンの分解反応を実施し、反応促進剤がプロテアーゼのヘモグロビン分解能に与える影響を評価した。本試験では、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼの一例であるサーモリシン（ＥＣ番号：３．４．２４．２７）を用いた。【００５２】
また、本試験では、反応促進剤の一例として、第１陰イオン界面活性剤である、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム（Sodium N-Dodecanoylsarcosinate）、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム（Sodiumu N-Myristoyl Sarcosinate）及びココイルサルコシン酸ナトリウム（Sodiumu Cocoyl Sarcosinate）の３種を用いた。また、反応促進剤の比較対象として、陰イオン界面活性剤であるＳＤＳ、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０を用いた。また、本試験にあたって、以下のようにして試薬（ａ）〜（ｈ）を調製した。【００５３】
（ａ）リン酸緩衝液（Phosphate Buffer）
脱イオン水に、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸水素二ナトリウムをそれぞれの最終濃度が０．２Ｍとなるように溶解させた。その後、溶液のｐＨを７．４に調整することで、リン酸緩衝液（ａ）を調製した。【００５４】
（ｂ）サーモリシン溶液
リン酸緩衝液（ａ）に、サーモリシン（和光純薬工業社製）を最終濃度が１５０，０００Ｕ／ｍｌとなるように溶解させ、サーモリシン溶液（ｂ）を調製した。【００５５】
（ｃ）ＳＤＳ溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、ＳＤＳ（和光純薬工業社製、１９１−０７１４５）１０質量部を溶解させ、ＳＤＳ溶液（ｃ）を調製した。【００５６】
（ｄ）Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ（和光純薬工業社製、１９０−１０３８３）１０質量部を溶解させ、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）を調製した。【００５７】
（ｅ）Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ（川研ファインケミカル社製、ソイポンＭ−３０）１０質量部を溶解させ、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を調製した。【００５８】
（ｆ）ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、ココイルサルコシン酸Ｎａ（川研ファインケミカル社製、ソイポンＳＣＥ）１０質量部を溶解させ、ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を調製した。【００５９】
（ｇ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社製、８０７４２４）１０質量部を溶解させ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を調製した。【００６０】
（ｈ）Ｔｗｅｅｎ２０溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、Ｔｗｅｅｎ２０（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社製、１９４８４１）１０質量部を溶解させ、Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を調製した。【００６１】
（実施例Ｉ−１）
ヒト全血（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ＳＡＧ）１０体積部と、リン酸緩衝液（ａ）９０体積部とを混合し、サンプル溶液を調製した。次いで、サンプル溶液にサーモリシン溶液（ｂ）と、反応促進剤としてのＮ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）とを加えて、実施例Ｉ−１に係る試料を調製した。サーモリシン溶液（ｂ）は、最終濃度が７，５００Ｕ／ｍｌとなるように加えた。また、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．５質量％となるように加えた。そして、得られた試料を１０℃で５分間反応させた。その後、試料をＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供して、サーモリシンによるヘモグロビン分解反応の結果を確認した。【００６２】
（実施例Ｉ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして実施例Ｉ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６３】
（実施例Ｉ−３）
反応促進剤としてＮ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を用いた点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして実施例Ｉ−３に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６４】
（実施例Ｉ−４）
Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｉ−３と同様にして実施例Ｉ−４に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６５】
（実施例Ｉ−５）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用いた点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして実施例Ｉ−５に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６６】
（実施例Ｉ−６）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｉ−５と同様にして実施例Ｉ−６に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６７】
（比較例Ｉ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして比較例Ｉ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６８】
（比較例Ｉ−２）
反応促進剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を用いた点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして比較例Ｉ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００６９】
（比較例Ｉ−３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例Ｉ−２と同様にして比較例Ｉ−３に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００７０】
（比較例Ｉ−４）
反応促進剤としてＴｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を用いた点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして比較例Ｉ−４に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００７１】
（比較例Ｉ−５）
Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例Ｉ−４と同様にして比較例Ｉ−５に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００７２】
（参考例Ｉ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例Ｉ−１と同様にして参考例Ｉ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。参考例Ｉ−１は、ネガティブコントロールに相当する。【００７３】
各実施例、各比較例及び参考例の組成を表１に示す。【００７４】
【表１】
2016076408.tif 000013
【００７５】
図１は、反応促進剤がメタロプロテアーゼのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。図１には、実施例Ｉ−１〜Ｉ−６、比較例Ｉ−１〜Ｉ−５及び参考例Ｉ−１のＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅの結果が示されている。図１中「Ａ」は、全血をＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した結果を示す。また「Ｂ」は、ヘモグロビンをＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した結果を示す。また「Ｃ」は、アルブミンを含む血漿成分をＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した結果を示す。図１に示されるように、ヘモグロビン（分子量約６４，５００）に相当するバンドについて、比較例Ｉ−１〜Ｉ−５は、ネガティブコントロールである参考例Ｉ−１と比較してほとんど差異がないことが確認された。このことから、比較例Ｉ−１〜Ｉ−５では、ヘモグロビンを分解できないか、あるいは迅速にヘモグロビンを分解できないことが理解される。【００７６】
一方、ヘモグロビンに相当するバンドについて、実施例Ｉ−１〜Ｉ−６は、参考例Ｉ−１と比較して顕著な差異があることが確認された。特に、反応促進剤の最終濃度を１．０質量％とした実施例Ｉ−２，Ｉ−４，１−６では、いずれもヘモグロビンに相当するバンドがほぼ消失した。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤を用いる場合は、迅速にヘモグロビンを分解できることが理解される。すなわち、当該反応促進剤は、ヘモグロビンの分解反応を促進できること分かる。【００７７】
なお、本願発明者は、反応活性剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用いた予備実験を行い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度が０．１質量％で、プロテアーゼやフルクトシルペプチドオキシダーゼが失活することを確認した。すなわち、反応活性剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用いた場合は、最終濃度が０．１質量％であっても酵素アッセイ法に採用できないことを確認した。このため、比較例Ｉ−１では、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした。【００７８】
＜ＩＩ．プロテアーゼによるヘモグロビン分解反応の確認試験＞
本試験では、反応促進剤の存在下でプロテアーゼによりＨｂＡ１ｃが分解され、分解反応の生成物が得られること、及びその生成効率を確認した。プロテアーゼとしては、上述した試験Ｉと同様にサーモリシンを用いた。サーモリシンによりＨｂＡ１ｃを分解した場合、フルクトシル−バリルヒスチジンが生成される。また、本試験では、反応促進剤として試験Ｉと同様にＮ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムを用いた。また、反応促進剤の比較対象として、陰イオン界面活性剤であるＳＤＳ（ポジティブコントロール）を用いた。【００７９】
（実施例ＩＩ−１）
実施例ＩＩ−１に係る試料として実施例Ｉ−１と同一の試料を用い、この試料を１０℃で５分間反応させた。次いで、反応後の試料を２０，４００Ｇの条件で３０分間遠心分離し、上清を回収した。そして、回収した上清を純粋で５倍希釈した。希釈した上清を遠心式ろ過フィルター（アミコン、３ｋＤａフィルター）でろ過し、ろ液を回収した。続いて、回収したろ液をＬＣ／ＭＳ（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry）分析装置（島津製作所社製、ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ）に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は、以下の条件で実施した。
使用したカラム：東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ３μｍ（２．０ｍｍ×１５ｃｍ）
分離液Ａ：０．１％  ヘプタフルオロ酪酸
分離液Ｂ：０．０５％ヘプタフルオロ酪酸、アセトニトリル
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
イオン化モード：大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ：Atomospheric Pressure Chemical Ionization）
最大イオン蓄積時間：３０ｓｅｃ
積算回数：４回
測定範囲：２００〜１０００ｍ／ｚ
測定温度：４０℃【００８０】
（実施例ＩＩ−２）
実施例ＩＩ−２に係る試料として、実施例Ｉ−２と同一の試料を用いた点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。【００８１】
（実施例ＩＩ−３）
実施例ＩＩ−３に係る試料として、実施例Ｉ−３と同一の試料を用いた点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。【００８２】
（実施例ＩＩ−４）
実施例ＩＩ−４に係る試料として、実施例Ｉ−４と同一の試料を用いた点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。【００８３】
（実施例ＩＩ−５）
実施例ＩＩ−５に係る試料として、実施例Ｉ−５と同一の試料を用いた点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。【００８４】
（実施例ＩＩ−６）
実施例ＩＩ−６に係る試料として、実施例Ｉ−６と同一の試料を用いた点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。【００８５】
（比較例ＩＩ−１）
比較例ＩＩ−１に係る試料として、比較例Ｉ−１と同一の試料を用い、反応条件を３７℃で３０分間とした点を除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。本願発明者は、ＳＤＳ溶液とサーモリシンとの組み合わせでは、３７℃、３０分間の反応でＨｂＡ１ｃの分解反応がほぼ完全に終了することを確認した。このため、比較例ＩＩ−１をポジティブコントロールとして用いた。【００８６】
（参考例ＩＩ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＩＩ−１と同様にして試料を反応させ、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。参考例ＩＩ−１は、ネガティブコントロールに相当する。【００８７】
（切断効率の算出）
各実施例、比較例及び参考例のＬＣ／ＭＳ分析の結果から、フルクトシル−バリルヒスチジン由来（分子量４１７，１９５２）のピーク面積を算出した。そして、各実施例及び参考例について、得られたピーク面積からサーモリシンの切断効率、すなわちＨｂＡ１ｃの分解反応生成物の生成効率を算出した。切断効率は、比較例ＩＩ−１におけるフルクトシル−バリルヒスチジン由来のピーク面積（Ａ）に対する各実施例及び参考例における当該ピーク面積（Ｂ）の割合（切断効率（％）＝Ｂ／Ａ×１００）とした。結果を表２に示す。【００８８】
【表２】
2016076408.tif 000014
【００８９】
表２に示されるように、参考例ＩＩ−１における切断効率が約０．５％であったのに対し、実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−６における切断効率は、それぞれ約４５％、約１００％、約５０％、約１００％、約４５％及び約１００％と、非常に高い値であった。すなわち、実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−６では、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解によって、当該分解反応の生成物であるフルクトシル−バリルヒスチジンが得られることが確認された。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤が、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃの分解反応の促進剤として有用であることが理解される。【００９０】
＜ＩＩＩ．反応促進剤がプロテアーゼ（システインプロテアーゼ）のヘモグロビン分解能に与える影響の評価試験＞
試験Ｉでは、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼを用いて反応促進剤が与える影響を評価したが、本試験ではプロテアーゼとしてシステインプロテアーゼを用いて同様の評価を実施した。本試験では、システインプロテアーゼの一例であるパパイン（ＥＣ番号：３．４．２２．２）を用いた。また、反応促進剤として、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムの３種を用いた。また反応促進剤の比較対象として、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０を用いた。【００９１】
本試験にあたって、以下の試薬（ｉ）を調製した。
（ｉ）パパイン溶液
リン酸緩衝液（ａ）に、パパイン（Ｒｏｃｈｅ社製、１０１０８０１４００１）を最終濃度が３００Ｕ／ｍｌとなるように溶解させ、パパイン溶液（ｉ）を調製した。【００９２】
（実施例ＩＩＩ−１）
実施例ＩＩＩ−１に係る試料として、プロテアーゼとしてパパイン溶液（ｉ）を用い、またその最終濃度を３０Ｕ／ｍｌとし、反応条件を３７℃で１０分間とした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９３】
（実施例ＩＩＩ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして実施例ＩＩＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９４】
（実施例ＩＩＩ−３）
反応促進剤としてＮ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を用いた点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして実施例ＩＩＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９５】
（実施例ＩＩＩ−４）
Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＩＩ−３と同様にして実施例ＩＩＩ−４に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９６】
（実施例ＩＩＩ−５）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用いた点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして実施例ＩＩＩ−５に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９７】
（実施例ＩＩＩ−６）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＩＩ−５と同様にして実施例ＩＩＩ−６に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９８】
（比較例ＩＩＩ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして比較例ＩＩＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【００９９】
（比較例ＩＩＩ−２）
反応促進剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を用いた点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして比較例ＩＩＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１００】
（比較例ＩＩＩ−３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＩＩＩ−２と同様にして比較例ＩＩＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１０１】
（比較例ＩＩＩ−４）
反応促進剤としてＴｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を用いた点を除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして比較例ＩＩＩ−４に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１０２】
（比較例ＩＩＩ−５）
Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＩＩＩ−４と同様にして比較例ＩＩＩ−５に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１０３】
（参考例ＩＩＩ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＩＩＩ−１と同様にして参考例ＩＩＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。参考例ＩＩＩ−１は、ネガティブコントロールに相当する。【０１０４】
各実施例、各比較例及び参考例の組成を表３に示す。【０１０５】
【表３】
2016076408.tif 000015
【０１０６】
図２は、反応促進剤がシステインプロテアーゼのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。図２には、実施例ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−６、比較例ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−５及び参考例ＩＩＩ−１のＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅの結果が示されている。図２中の「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」は、図１と同様である。図２に示されるように、ヘモグロビン（分子量約６４，５００）に相当するバンドについて、比較例ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−５は、ネガティブコントロールである参考例ＩＩＩ−１と比較してほとんど差異がないことが確認された。このことから、比較例ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−５では、ヘモグロビンを分解できないか、あるいは迅速にヘモグロビンを分解できないことが理解される。【０１０７】
一方、ヘモグロビンに相当するバンドについて、実施例ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−６は、参考例ＩＩＩ−１と比較して差異があることが確認された。特に、反応促進剤の最終濃度を１．０質量％とした実施例ＩＩＩ−２，ＩＩＩ−４，ＩＩ１−６では、いずれも参考例ＩＩＩ−１との差が大きかった。さらに、実施例ＩＩＩ−２では、ヘモグロビンに相当するバンドがほぼ消失した。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤を用いる場合は、迅速にヘモグロビンを分解できることが理解される。すなわち、当該反応促進剤は、ヘモグロビンの分解反応を促進できること分かる。【０１０８】
＜ＩＶ．反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響の評価試験＞
本試験では、反応促進剤がＦＰＯＸに与える影響を確認するために、酵素反応系を用いた。この酵素反応系は、（１）糖化ペプチドであるフルクトシル−バリルヒスチジンをＦＰＯＸの存在下で酸化還元反応させて、過酸化水素を生成させること、及び（２）得られた過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色試薬と酸化還元反応させて、呈色させること（比色法）、とを含む。また、反応促進剤として、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムの３種を用いた。さらに、反応促進剤の比較対象として、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０を用いた。【０１０９】
本試験にあたって、以下の試薬（ｊ）を調製した。
（ｊ）フルクトシル−バリルヒスチジン溶液
リン酸緩衝液（ａ）に、フルクトシル−バリルヒスチジン（ペプチド研究所製）を最終濃度が２ｍＭとなるように溶解させ、フルクトシル−バリルヒスチジン溶液（ｊ）を調製した。【０１１０】
（実施例ＩＶ−１）
ＦＰＯＸ（キッコーマン社製、ＦＰＯＸ−ＣＥ、６０１２３）、ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ６７８２−５ＭＧ）、発色試薬（和光純薬工業社製、ＤＡ−６７）及び反応促進剤としてのＮ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）を、リン酸緩衝液（ａ）に溶解させ、実施例ＩＶ−１に係る試料を調製した。ＦＰＯＸは、最終濃度が１．４Ｕ／ｍｌとなるように加えた。また、ペルオキシダーゼは、最終濃度が１Ｕｍｌとなるように加えた。発色試薬は、最終濃度が０．１ｍＭとなるように加えた。Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．５質量％となるように加えた。【０１１１】
そして、得られた試料を５分間混合した後、マイクロプレートに試料を９５μｌ分注した。マイクロプレートに分注された試料に対し、フルクトシル−バリルヒスチジン溶液（ｊ）５μｌを加え、速やかに混合した。混合した時点を反応開始時点とし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ）を用いて、反応開始時点から１分毎に６６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。【０１１２】
（実施例ＩＶ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして実施例ＩＶ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１３】
（実施例ＩＶ−３）
反応促進剤としてＮ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を用いた点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして実施例ＩＶ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１４】
（実施例ＩＶ−４）
Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＶ−３と同様にして実施例ＩＶ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１５】
（実施例ＩＶ−５）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用いた点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして実施例ＩＶ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１６】
（実施例ＩＶ−６）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＶ−５と同様にして実施例ＩＶ−６に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１７】
（比較例ＩＶ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして比較例ＩＶ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１８】
（比較例ＩＶ−２）
反応促進剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を用いた点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして比較例ＩＶ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１１９】
（比較例ＩＶ−３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＩＶ−２と同様にして比較例ＩＶ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１２０】
（比較例ＩＶ−４）
反応促進剤としてＴｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を用いた点を除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして比較例ＩＶ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１２１】
（比較例ＩＶ−５）
Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＩＶ−４と同様にして比較例ＩＶ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１２２】
（参考例ＩＶ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＩＶ−１と同様にして参考例ＩＶ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例ＩＶ−１は、ポジティブコントロールに相当する。【０１２３】
参考例ＩＶ−１で得られた吸光度におけるＦＰＯＸの酵素活性を１００％として、実施例ＩＶ−１〜ＩＶ−６及び比較例ＩＶ−１〜ＩＶ−５のそれぞれについて、得られた吸光度から、参考例ＩＶ−１の酵素活性に対する酵素活性の割合（相対残存活性）を算出した。そして、算出した相対残存活性に基づいて、反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価した。各実施例、各比較例及び参考例の組成、及び相対残存活性を表４に示す。【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
表４に示されるように、ＳＤＳが用いられた比較例ＩＶ−１では、相対残存活性が０％であった。このことから、ＳＤＳの存在下ではＦＰＯＸの酵素活性がほぼ失活することが確認された。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定に酵素アッセイ法を用いる場合、ＳＤＳは適さないことが理解される。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が用いられた比較例ＩＶ−２，ＩＶ−３と、Ｔｗｅｅｎ２０が用いられた比較例ＩＶ−４，ＩＶ−５では、相対残存活性は低くても９０％以上であった。このことから、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０の存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が９０％以上保持されることが確認された。また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０は、少なくとも０．５〜１．０ｗｔ％の範囲であれば、ＦＰＯＸの酵素活性に濃度依存性はほぼないと考えられる。【０１２６】
一方、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＩＶ−１，ＩＶ−２、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＩＶ−３，ＩＶ−４及びココイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＩＶ−５，ＩＶ−６では、相対残存活性は低くても７５％以上であった。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤の存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が７５％以上保持されることが確認された。【０１２７】
ＦＰＯＸの酵素活性が参考例や各比較例と比べて若干低下することで、ＨｂＡ１ｃの分解で生成される糖化ペプチドあるいは糖化アミノ酸の定量に要する時間は多少長くなり得るが、反応促進剤によりＨｂＡ１ｃの分解に要する時間を大幅に短縮することができる。このため、トータルのＨｂＡ１ｃの測定時間は、短縮することができる。したがって、この反応促進剤は、ＦＰＯＸの酵素活性に若干の影響を与えるものの、ＳＤＳのように酵素活性を失活させるものではなく、ＨｂＡ１ｃの測定方法や測定キットへの使用に適することが理解される。【０１２８】
また、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ及びココイルサルコシン酸Ｎａのいずれにおいても、優れた相対残存活性が示された。Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ及びココイルサルコシン酸Ｎａは、疎水基部分（一般式（１）中のＲ１）のアルキル基における炭素数の違いのみが構造上の相違点である。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩は、疎水基部分の構造に違いがあっても、いずれも反応促進剤として有用であることが理解される。【０１２９】
＜Ｖ．反応促進剤及びプロテアーゼ（メタロプロテアーゼ）がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響の評価試験＞
試験ＩＶにおいて、反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に大きな影響を与えないことが確認された。そこで、本試験では、反応促進剤とプロテアーゼとの組み合わせによって、ＦＰＯＸの酵素活性が影響を受けるか否かを評価した。本試験では、試験ＩＶと同様に、反応促進剤及びプロテアーゼがＦＰＯＸに与える影響を確認するために、比色法を含む酵素反応系を用いた。また、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼの一例であるサーモリシンを用いた。また、反応促進剤としてＮ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムを用いた。また、反応促進剤の比較対象として、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０を用いた。【０１３０】
（実施例Ｖ−１）
ＦＰＯＸ（キッコーマン社製、ＦＰＯＸ−ＣＥ、６０１２３）、サーモリシン溶液（ｂ）、ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ６７８２−５ＭＧ）、発色試薬（和光純薬工業社製、ＤＡ−６７）及び反応促進剤としてのＮ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）を、リン酸緩衝液（ａ）に溶解させ、実施例Ｖ−１に係る試料を調製した。ＦＰＯＸは、最終濃度が１．４Ｕ／ｍｌとなるように加えた。サーモリシン溶液（ｂ）は、最終濃度が７，５００Ｕ／ｍｌとなるように加えた。ペルオキシダーゼは、最終濃度が１Ｕｍｌとなるように加えた。発色試薬は、最終濃度が０．１ｍＭとなるように加えた。Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．５質量％となるように加えた。【０１３１】
そして、得られた試料を５分間混合した後、マイクロプレートに試料を９５μｌ分注した。マイクロプレートに分注された試料に対し、フルクトシル−バリルヒスチジン溶液（ｊ）５μｌを加え、速やかに混合した。混合した時点を反応開始時点とし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ）を用いて、反応開始時点から１分毎に６６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。【０１３２】
（実施例Ｖ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして実施例Ｖ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３３】
（実施例Ｖ−３）
反応促進剤としてＮ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を用いた点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして実施例Ｖ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３４】
（実施例Ｖ−４）
Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｖ−３と同様にして実施例Ｖ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３５】
（実施例Ｖ−５）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用いた点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして実施例Ｖ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３６】
（実施例Ｖ−６）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｖ−５と同様にして実施例Ｖ−６に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３７】
（比較例Ｖ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして比較例Ｖ−１に係る試料を調製し、吸光度を測定した。【０１３８】
（比較例Ｖ−２）
反応促進剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を用いた点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして比較例Ｖ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１３９】
（比較例Ｖ−３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例Ｖ−２と同様にして比較例Ｖ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１４０】
（比較例Ｖ−４）
反応促進剤としてＴｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を用いた点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして比較例Ｖ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１４１】
（比較例Ｖ−５）
Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例Ｖ−４と同様にして比較例Ｖ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１４２】
（参考例Ｖ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例Ｖ−１と同様にして参考例Ｖ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例Ｖ−１は、ポジティブコントロールに相当する。【０１４３】
参考例Ｖ−１で得られた吸光度におけるＦＰＯＸの酵素活性を１００％として、実施例Ｖ−１〜Ｖ−６及び比較例Ｖ−１〜Ｖ−５のそれぞれについて、得られた吸光度から、参考例Ｖ−１の酵素活性に対する酵素活性の割合（相対残存活性）を算出した。そして、算出した相対残存活性に基づいて、反応促進剤及びメタロプロテアーゼがＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価した。各実施例、各比較例及び参考例の組成、及び相対残存活性を表５に示す。【０１４４】
【表５】
2016076408.tif 000017
【０１４５】
表５に示されるように、ＳＤＳが用いられた比較例Ｖ−１では、相対残存活性が０％であった。このことから、ＳＤＳ及びメタロプロテアーゼの存在下ではＦＰＯＸの酵素活性がほぼ失活することが確認された。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が用いられた比較例Ｖ−２，Ｖ−３では、相対残存活性は低くても９５％以上であった。また、Ｔｗｅｅｎ２０が用いられた比較例Ｖ−４，Ｖ−５では、相対残存活性は低くても７０％以上であった。このことから、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びメタロプロテアーゼの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が９５％以上保持され、Ｔｗｅｅｎ２０及びメタロプロテアーゼの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が７０％以上保持されることが確認された。【０１４６】
一方、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例Ｖ−１，Ｖ−２、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例Ｖ−３，Ｖ−４及びココイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例Ｖ−５，Ｖ−６では、相対残存活性は低くても７０％以上であった。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤とメタロプロテアーゼとの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が７０％以上保持されることが確認された。したがって、この反応促進剤は、ＨｂＡ１ｃの測定方法や測定キットへの使用に適することが理解される。【０１４７】
また、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ及びココイルサルコシン酸Ｎａのいずれにおいても、優れた相対残存活性が示された。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩は、疎水基部分の構造に違いがあっても、いずれも反応促進剤として有用であることが理解される。【０１４８】
＜ＶＩ．反応促進剤及びプロテアーゼ（システインプロテアーゼ）がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響の評価試験＞
試験Ｖでは、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼを用いて、反応促進剤及びプロテアーゼがＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価したが、本試験ではプロテアーゼとしてシステインプロテアーゼを用いて同様の評価を実施した。本試験では、システインプロテアーゼの一例であるパパインを用いた。また、影響確認の方法として、試験Ｖと同様に比色法を含む酵素反応系を用い、反応促進剤としてＮ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸ナトリウム及びココイルサルコシン酸ナトリウムを用い、反応促進剤の比較対象として、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０を用いた。【０１４９】
（実施例ＶＩ−１）
実施例ＶＩ−１に係る試料として、プロテアーゼとしてパパイン溶液（ｉ）を用い、またその最終濃度を３０Ｕ／ｍｌとした点を除いて、実施例Ｖ−１と同様にして試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５０】
（実施例ＶＩ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして実施例ＶＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５１】
（実施例ＶＩ−３）
反応促進剤としてＮ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）を用いた点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして実施例ＶＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５２】
（実施例ＶＩ−４）
Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｅ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＶＩ−３と同様にして実施例ＶＩ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５３】
（実施例ＶＩ−５）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用いた点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして実施例ＶＩ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５４】
（実施例ＶＩ−６）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＶＩ−５と同様にして実施例ＶＩ−６に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５５】
（比較例ＶＩ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして比較例ＶＩ−１に係る試料を調製し、吸光度を測定した。【０１５６】
（比較例ＶＩ−２）
反応促進剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）を用いた点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして比較例ＶＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５７】
（比較例ＶＩ−３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ｇ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＶＩ−２と同様にして比較例ＶＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５８】
（比較例ＶＩ−４）
反応促進剤としてＴｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）を用いた点を除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして比較例ＶＩ−４に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１５９】
（比較例ＶＩ−５）
Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｈ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、比較例ＶＩ−４と同様にして比較例ＶＩ−５に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１６０】
（参考例ＶＩ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＶＩ−１と同様にして参考例ＶＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例ＶＩ−１は、ポジティブコントロールに相当する。【０１６１】
参考例ＶＩ−１で得られた吸光度におけるＦＰＯＸの酵素活性を１００％として、実施例ＶＩ−１〜ＶＩ−６及び比較例ＶＩ−１〜ＶＩ−５のそれぞれについて、得られた吸光度から、参考例ＶＩ−１の酵素活性に対する酵素活性の割合（相対残存活性）を算出した。そして、算出した相対残存活性に基づいて、反応促進剤及びシステインプロテアーゼがＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価した。各実施例、各比較例及び参考例の組成、及び相対残存活性を表６に示す。【０１６２】
【表６】
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【０１６３】
表６に示されるように、ＳＤＳが用いられた比較例ＶＩ−１では、相対残存活性が０％であった。このことから、ＳＤＳ及びシステインプロテアーゼの存在下ではＦＰＯＸの酵素活性がほぼ失活することが確認された。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が用いられた比較例ＶＩ−２，ＶＩ−３では、相対残存活性は低くても９５％以上であった。また、Ｔｗｅｅｎ２０が用いられた比較例ＶＩ−４，ＶＩ−５では、相対残存活性は低くても７５％以上であった。このことから、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びシステインプロテアーゼの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が９５％以上保持され、Ｔｗｅｅｎ２０及びシステインプロテアーゼの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が７５％以上保持されることが確認された。【０１６４】
一方、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＶＩ−１，ＶＩ−２、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＶＩ−３，ＶＩ−４及びココイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＶＩ−５，ＶＩ−６では、相対残存活性は低くても６５％以上であった。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤とシステインプロテアーゼとの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が６５％以上保持されることが確認された。したがって、この反応促進剤は、ＨｂＡ１ｃの測定方法や測定キットへの使用に適することが理解される。【０１６５】
また、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ、Ｎ−ミリストイルサルコシン酸Ｎａ及びココイルサルコシン酸Ｎａのいずれにおいても、優れた相対残存活性が示された。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩は、疎水基部分の構造に違いがあっても、いずれも反応促進剤として有用であることが理解される。【０１６６】
＜ＶＩＩ．反応促進剤に含まれる陰イオン界面活性剤又はその塩の構造についての評価試験＞
試験Ｉ〜ＶＩにおいて、第１陰イオン界面活性剤又はその塩が、反応促進剤、ヘモグロビン分解用組成物、ＨｂＡ１ｃの測定方法及びＨｂＡ１ｃの測定キットに有用であることを確認した。本試験では、第１陰イオン界面活性剤又はその塩と、第２陰イオン界面活性剤又はその塩とで、ＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を比較した。【０１６７】
本試験では、試験ＩＶ〜ＶＩと同様に、ＦＰＯＸへの影響確認のために、比色法を含む酵素反応系を用いた。また、第１陰イオン界面活性剤の塩としてココイルサルコシン酸ナトリウムを用い、第２陰イオン界面活性剤の塩として下記式（５）で表されるココイルグルタミン酸ナトリウムを用いた。【０１６８】
【化１１】
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［式中、Ｒ４は、炭素数が１１〜１７の直鎖アルキル基である。］【０１６９】
本試験にあたって、以下の試薬（ｋ）を調製した。
（ｋ）ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液
リン酸緩衝液（ａ）９０質量部に、ココイルグルタミン酸Ｎａ（旭化成ケミカルズ社製、ＡＣＤＳ−Ｌ）１０質量部を溶解させ、ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｋ）を調製した。【０１７０】
（実施例ＶＩＩ−１）
ＦＰＯＸ（キッコーマン社製、ＦＰＯＸ−ＣＥ、６０１２３）、ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ６７８２−５ＭＧ）、発色試薬（和光純薬工業社製、ＤＡ−６７）及び反応促進剤としてのココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を、リン酸緩衝液（ａ）に溶解させ、実施例ＶＩＩ−１に係る試料を調製した。ＦＰＯＸは、最終濃度が１．４Ｕ／ｍｌとなるように加えた。ペルオキシダーゼは、最終濃度が１Ｕｍｌとなるように加えた。発色試薬は、最終濃度が０．１ｍＭとなるように加えた。ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．５質量％となるように加えた。【０１７１】
そして、得られた試料を５分間混合した後、マイクロプレートに試料を９５μｌ分注した。マイクロプレートに分注された試料に対し、フルクトシル−バリルヒスチジン溶液（ｊ）５μｌを加え、速やかに混合した。混合した時点を反応開始時点とし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ）を用いて、反応開始時点から１分毎に６６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。【０１７２】
（実施例ＶＩＩ−２）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＶＩＩ−１と同様にして実施例ＶＩＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１７３】
（比較例ＶＩＩ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例ＶＩＩ−１と同様にして比較例ＶＩＩ−１に係る試料を調製し、吸光度を測定した。【０１７４】
（参考例ＶＩＩ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＶＩＩ−１と同様にして参考例ＶＩＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例ＶＩＩ−１は、ポジティブコントロールに相当する。【０１７５】
（参考例ＶＩＩ−２）
反応促進剤としてココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｋ）を用いた点を除いて、実施例ＶＩＩ−１と同様にして参考例ＶＩＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１７６】
（参考例ＶＩＩ−３）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｋ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、参考例ＶＩＩ−２と同様にして参考例ＶＩＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０１７７】
参考例ＶＩＩ−１で得られた吸光度におけるＦＰＯＸの酵素活性を１００％として、実施例ＶＩＩ−１，ＶＩＩ−２、比較例ＶＩＩ−１及び参考例ＶＩＩ−２，ＶＩＩ−３のそれぞれについて、得られた吸光度から、参考例ＶＩＩ−１の酵素活性に対する酵素活性の割合（相対残存活性）を算出した。そして、算出した相対残存活性に基づいて、反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価した。各実施例、比較例及び各参考例の組成、及び相対残存活性を表７に示す。【０１７８】
【表７】
2016076408.tif 000020
【０１７９】
表７に示されるように、ＳＤＳが用いられた比較例ＶＩＩ−１では、相対残存活性が０％であった。このことから、ＳＤＳの存在下ではＦＰＯＸの酵素活性がほぼ失活することが確認された。ココイルグルタミン酸Ｎａが最終濃度０．５質量％で用いられた参考例ＶＩＩ−２では、相対残存活性は１０％以下であり、ココイルグルタミン酸Ｎａが最終濃度１．０質量％で用いられた参考例ＶＩＩ−３では、相対残存活性は０％であった。このことから、最終濃度１．０質量％のココイルグルタミン酸Ｎａの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性がほとんど保持されないが、最終濃度０．５質量％のココイルグルタミン酸Ｎａの存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が保持されることが確認された。【０１８０】
一方、ココイルサルコシン酸Ｎａが用いられた実施例ＶＩＩ−１，ＶＩＩ−２では、相対残存活性は低くても７５％以上であった。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤の存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が７５％以上保持されることが確認された。したがって、反応促進剤に用いられる陰イオン界面活性剤又はその塩としては、第１陰イオン界面活性剤又はその塩の方が、第２陰イオン界面活性剤又はその塩よりも、使い勝手がよいことが理解される。【０１８１】
＜ＶＩＩＩ．ＨｂＡ１ｃの測定＞
本試験では、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤を用いて、実際にＨｂＡ１ｃを測定した。上述したように、ＨｂＡ１ｃの測定方法には、比色法、電気化学的手法及び化学発光法のいずれが用いられてもよいが、本試験では、一例として比色法を用いてＨｂＡ１ｃを測定した。また、試験ＩＶ〜ＶＩＩと同様の酵素反応系を用いた。【０１８２】
より具体的には、反応促進剤の存在下で、メタロプロテアーゼの一例であるサーモリシンによりＨｂＡ１ｃを分解して、フルクトシル−バリルヒスチジンを生成させた。次いで、ＦＰＯＸによりフルクトシル−バリルヒスチジンを酸化させて過酸化水素を生成した。その後、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と発色試薬とを酸化還元反応させて、呈色させた。ヘモグロビンサンプルとしては、予めＨｂＡ１ｃ濃度が分かっているＩＦＣＣ法ＨｂＡ１ｃ測定常用参照物質（医学検査標準物質機構、ＪＣＣＲＭ４１１−３、ＪＤＳ  Ｌｏｔ５）を使用した。また、反応促進剤としては、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを使用した。【０１８３】
また、本試験ではＦＰＯＸを用いた。なお、ＦＡＯＸを用いても同様にＨｂＡ１ｃを測定できることは言うまでもない。ＦＡＯＸを用いる場合、プロテアーゼとしては、小麦由来のセリンカルボキシペプチダーゼ、セリ科、ショウガ科又はパイナップル科に属する植物から抽出されたカルボキシペプチダーゼ、あるいはスミチームＦＬ−Ｇ（新日本化学工業社製）等を用いる必要がある。【０１８４】
（実施例ＶＩＩＩ−１）
ＦＰＯＸ（キッコーマン社製、ＦＰＯＸ−ＣＥ、６０１２３）、サーモリシン溶液（ｂ）、ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ６７８２−５ＭＧ）、発色試薬（和光純薬工業社製、ＤＡ−６７）、アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製、１９５−１１０９２）及び反応促進剤としてのＮ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）を、リン酸緩衝液（ａ）に溶解させ、実施例ＶＩＩＩ−１に係る試料を調製した。ＦＰＯＸは、最終濃度が１．４Ｕ／ｍｌとなるように加えた。サーモリシン溶液（ｂ）は、最終濃度が７，５００Ｕ／ｍｌとなるように加えた。ペルオキシダーゼは、最終濃度が１Ｕｍｌとなるように加えた。発色試薬は、最終濃度が０．１ｍＭとなるように加えた。アジ化ナトリウムは、最終濃度が溶液全体に対して０．０１質量％となるように加えた。Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．５質量％となるように加えた。【０１８５】
得られた試料をマイクロプレートに１９０μｌ分注した。マイクロプレートに分注された試料に対し、ＨｂＡ１ｃ濃度が異なるＩＦＣＣ法ＨｂＡ１ｃ測定常用参照物質（ＨｂＡ１ｃ濃度：５．１０％、５．７７％、７．３９％、９．６０％及び１１．９８％）のそれぞれを１０μｌ加え、速やかに混合した。混合した時点を反応開始時点とし、反応開始時点から３７℃で３分間反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ）を用いて、反応開始時点から３分後の試料について、６６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。【０１８６】
（参考例ＶＩＩＩ−１）
発色試薬を添加しなかったことを除いて、実施例ＶＩＩＩ−１と同様にして参考例ＶＩＩＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例ＶＩＩＩ−１の吸光度は、検量線用のブランクとして用いた。【０１８７】
実施例及び参考例の組成を表８に示す。【０１８８】
【表８】
2016076408.tif 000021
【０１８９】
図３は、ＨｂＡ１ｃの測定結果の一例を示す図である。図３において、横軸はＨｂＡ１ｃの濃度（％）であり、縦軸は吸光度である。吸光度は、参考例ＶＩＩＩ−１の吸光度をブランクとして、それぞれのＨｂＡ１ｃ濃度について、実施例ＶＩＩＩ−１の吸光度から参考例ＶＩＩＩ−１の吸光度を差し引いた値（ΔＯＤ６６０）とした。図３に示されるように、実施例ＶＩＩＩ−１の吸光度（ΔＯＤ６６０）と、ＨｂＡ１ｃ濃度との間には相関が見られた。また、ＨｂＡ１ｃの分解から発色までの一連の反応を３分間で実施しても、十分にＨｂＡ１ｃを測定できることが確認された。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤、この反応促進剤を含むヘモグロビン分解用組成物及びＨｂＡ１ｃの測定キット、及びこの反応促進剤を用いるＨｂＡ１ｃの測定方法によれば、ＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮可能であることが理解される。【０１９０】
＜ＩＸ．反応促進剤がプロテアーゼ（システインプロテアーゼ）のヘモグロビン分解能に与える影響の評価試験＞
試験ＩＩＩでは、システインプロテアーゼとしてパパインを用いて、反応促進剤がプロテアーゼのヘモグロビン分解能に与える影響を評価したが、本試験ではシステインプロテアーゼとしてフィシン（ＥＣ番号：３．４．２２．３）を用いて同様の評価を実施した。また、反応促進剤として、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを用いた。また比較対象として、試験Ｉの実施例Ｉ−１，Ｉ−２と同様の試料（サーモリシンの最終濃度のみ異なる）を用いた。試験Ｉの結果から、実施例Ｉ−１，Ｉ−２がヘモグロビン分解反応を促進することは確認されている。【０１９１】
本試験にあたって、以下の試薬（ｌ）を調製した。
（ｌ）フィシン溶液
リン酸緩衝液（ａ）に、フィシン（イチジク由来、販売元：和光純薬工業社（販売元コード：５９３−３１０３２）、製造元：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社（製造元コード：１９８７６１、ＣＡＳ．Ｎｏ，９００１−３３−６））を、最終濃度が１００，０００Ｕ／ｍｌとなるように溶解させ、フィシン溶液（ｌ）を調製した。【０１９２】
（実施例ＩＸ−１）
プロテアーゼとしてフィシン溶液（ｌ）を用い、またその最終濃度を５，０００Ｕ／ｍｌとした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして実施例ＩＸ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１９３】
（実施例ＩＸ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＩＸ−１と同様にして実施例ＩＸ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１９４】
（参考例ＩＸ−１）
プロテアーゼとしてサーモリシン溶液（ｂ）を用い、またその最終濃度を３，０００Ｕ／ｍｌとした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして参考例ＩＸ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１９５】
（参考例ＩＸ−２）
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｄ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、参考例ＩＸ−１と同様にして参考例ＩＸ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０１９６】
各実施例及び各参考例の組成を表９に示す。【０１９７】
【表９】
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【０１９８】
図４は、反応促進剤がフィシンのヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。図４には、実施例ＩＸ−１，ＩＸ−２及び参考例ＩＸ−１，ＩＸ−２のＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅの結果が示されている。図４に示されるように、ヘモグロビン（分子量約６４，５００）に相当するバンドについて、実施例ＩＸ−１，ＩＸ−２と参考例ＩＸ−１，ＩＸ２とは、ほとんど差異がないことが確認された。このことから、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤によれば、プロテアーゼとしてフィシンを用いる場合においても、迅速にヘモグロビンを分解できることが理解される。すなわち、当該反応促進剤は、ヘモグロビンの分解反応を促進できること分かる。【０１９９】
＜Ｘ．反応促進剤がプロテアーゼ（メタロプロテアーゼ）のヘモグロビン分解能に与える影響の評価試験＞
試験Ｉでは、反応促進剤として第１陰イオン界面活性剤又はその塩を用いて、反応促進剤がプロテアーゼのヘモグロビン分解能に与える影響を評価したが、本試験では反応促進剤として第２陰イオン界面活性剤又はその塩を用いて同様の評価を実施した。具体的には、第２陰イオン界面活性剤の塩として、ココイルグルタミン酸ナトリウムを用いた。また、プロテアーゼとしてサーモリシンを用いた。また比較対象として、試験Ｉの実施例Ｉ−５，Ｉ−６と同様の試料（サーモリシンの最終濃度のみ異なる）を用いた。試験Ｉの結果から、実施例Ｉ−５，Ｉ−６がヘモグロビン分解反応を促進することは確認されている。【０２００】
本試験にあたって、以下の試薬（ｍ）を調製した。
（ｍ）ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液
０．３Ｎ  ＮａＯＨ溶液１００ｍＬに、ココイルグルタミン酸Ｎａ（旭化成ケミカルズ社製、ＡＣＤＳ−Ｌ）１０ｇを溶解させ、ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）を調整した。【０２０１】
（実施例Ｘ−１）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）を用い、またその最終濃度を０．１質量％とし、サーモリシン溶液（ｂ）の最終濃度を３，０００Ｕ／ｍｌとした点を除いて、実施例Ｉ−１と同様にして実施例Ｘ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０２】
（実施例Ｘ−２）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）の最終濃度を、０．２５質量％とした点を除いて、実施例Ｘ−１と同様にして実施例Ｘ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０３】
（実施例Ｘ−３）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）の最終濃度を、０．５質量％とした点を除いて、実施例Ｘ−１と同様にして実施例Ｘ−３に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０４】
（実施例Ｘ−４）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）の最終濃度を、１．０質量％とした点を除いて、実施例Ｘ−１と同様にして実施例Ｘ−４に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０５】
（参考例Ｘ−１）
サーモリシン溶液（ｂ）の最終濃度を３，０００Ｕ／ｍｌとした点を除いて、実施例Ｉ−５と同様にして参考例Ｘ−１に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０６】
（参考例Ｘ−２）
ココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）の最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、参考例Ｘ−１と同様にして参考例Ｘ−２に係る試料を調製し、反応させて、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅに供した。【０２０７】
各実施例及び各参考例の組成を表１０に示す。【０２０８】
【表１０】
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【０２０９】
図５は、反応促進剤としてココイルグルタミン酸Ｎａを用いた場合のヘモグロビン分解反応に与える影響を確認した結果の一例を示す図である。図５には、実施例Ｘ−１〜Ｘ−４及び参考例Ｘ−１，Ｘ−２のＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅの結果が示されている。図５中の「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」は、図１と同様である。ヘモグロビン（分子量約６４，５００）に相当するバンドについての実施例Ｘ−１〜Ｘ−４と参考例Ｘ−１，Ｘ−２との比較から、反応促進剤としてココイルグルタミン酸Ｎａを用いた場合でも、ココイルサルコシン酸Ｎａを用いた場合と同様にヘモグロビンを分解できることが確認された。このことから、第２陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤を用いる場合にも、迅速にヘモグロビンを分解できることが理解される。【０２１０】
また、実施例Ｘ−１〜Ｘ−４を比較すると、反応促進剤の最終濃度が高いほどヘモグロビンの分解がより促進されることが確認された。なお、本試験では反応条件を１０℃で５分間としているため、実施例Ｘ−１，Ｘ−２では実施例Ｘ−３，Ｘ−４に比べてヘモグロビンの分解促進の度合いが低い。しかしながら、反応時間を延ばすことで実施例Ｘ−１，Ｘ−２についても十分にヘモグロビンの分解促進効果を奏することができる。また、本実施の形態に係る反応促進剤を用いない場合、ヘモグロビンの分解に１日程度の時間を要する。このため、反応時間を延ばしたとしてもＨｂＡ１ｃの測定時間を短縮したいという要望に十分応えることができる。【０２１１】
＜ＸＩ．反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響の評価試験＞
試験ＩＶでは、第１陰イオン界面活性剤又はその塩がＦＰＯＸに与える影響を評価したが、本試験では第２陰イオン界面活性剤又はその塩がＦＰＯＸに与える影響を評価した。具体的には、第２陰イオン界面活性剤の塩として、ココイルグルタミン酸ナトリウムを用いた。また比較対象として、ココイルサルコシン酸Ｎａ及びＳＤＳを用いた。また、本試験では、試験ＩＶ〜ＶＩＩＩと同様に、ＦＰＯＸへの影響確認のために、比色法を含む酵素反応系を用いた。【０２１２】
（実施例ＸＩ−１）
ＦＰＯＸ（キッコーマン社製、ＦＰＯＸ−ＣＥ、６０１２３）、ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ６７８２−５ＭＧ）、発色試薬（和光純薬工業社製、ＤＡ−６７）及び反応促進剤としてのココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）を、リン酸緩衝液（ａ）に溶解させ、実施例ＸＩ−１に係る試料を調製した。ＦＰＯＸは、最終濃度が１．４Ｕ／ｍｌとなるように加えた。ペルオキシダーゼは、最終濃度が１Ｕｍｌとなるように加えた。発色試薬は、最終濃度が０．１ｍＭとなるように加えた。ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）は、最終濃度が溶液全体に対して０．１質量％となるように加えた。【０２１３】
そして、得られた試料を５分間混合した後、マイクロプレートに試料を９５μｌ分注した。マイクロプレートに分注された試料に対し、フルクトシル−バリルヒスチジン溶液（ｊ）５μｌを加え、速やかに混合した。混合した時点を反応開始時点とし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ）を用いて、反応開始時点から１分毎に６６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。【０２１４】
（実施例ＸＩ−２）
ココイルグルタミン酸Ｎａ溶液（ｍ）の最終濃度を０．２５質量％とした点を除いて、実施例ＸＩ−１と同様にして実施例ＸＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０２１５】
（比較例ＸＩ−１）
反応促進剤としてＳＤＳ溶液（ｃ）を用い、ＳＤＳ溶液（ｃ）の最終濃度を０．１質量％とした点を除いて、実施例ＸＩ−１と同様にして比較例ＸＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０２１６】
（参考例ＸＩ−１）
反応促進剤を添加しなかったことを除いて、実施例ＸＩ−１と同様にして参考例ＸＩ−１に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。参考例ＸＩ−１は、ポジティブコントロールに相当する。【０２１７】
（参考例ＸＩ−２）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用い、その最終濃度を０．５質量％とした点を除いて、実施例ＸＩ−１と同様にして参考例ＸＩ−２に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０２１８】
（参考例ＸＩ−３）
反応促進剤としてココイルサルコシン酸Ｎａ溶液（ｆ）を用い、その最終濃度を１．０質量％とした点を除いて、実施例ＸＩ−１と同様にして参考例ＸＩ−３に係る試料を調製し、反応させて、吸光度を測定した。【０２１９】
参考例ＸＩ−１で得られた吸光度におけるＦＰＯＸの酵素活性を１００％として、実施例ＸＩ−１，ＸＩ−２、比較例ＸＩ−１及び参考例ＸＩ−２，ＸＩ−３のそれぞれについて、得られた吸光度から、参考例ＸＩ−１の酵素活性に対する酵素活性の割合（相対残存活性）を算出した。そして、算出した相対残存活性に基づいて、反応促進剤がＦＰＯＸの酵素活性に与える影響を評価した。各実施例、比較例及び各参考例の組成、及び相対残存活性を表１１に示す。【０２２０】
【表１１】
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【０２２１】
表１１に示されるように、ＳＤＳが用いられた比較例ＸＩ−１では、相対残存活性が０％であった。このことから、ＳＤＳの存在下ではＦＰＯＸの酵素活性がほぼ失活することが確認された。また、ココイルサルコシン酸Ｎａが用いられた参考例ＸＩ−２，ＸＩ−３では、相対残存活性が７５％以上であった。したがって、第１陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤の存在下では、ＦＰＯＸの酵素活性が高い状態で保持されることが確認された。また、ココイルグルタミン酸Ｎａが用いられた実施例ＸＩ−１，ＸＩ−２では、相対残存活性が５０％以上であった。したがって、第２陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤の存在下においても、ＦＰＯＸの酵素活性を保持できることが確認された。したがって、第２陰イオン界面活性剤又はその塩を含む反応促進剤は、ＨｂＡ１ｃの測定方法や測定キットへの使用に有用であることが理解される。【０２２２】
なお、参考例ＶＩＩ−２，ＶＩＩ−３、実施例Ｘ−１〜Ｘ−４、及び実施例ＸＩ−１，ＸＩ−２の結果から以下のことを理解することができる。すなわち、ＨｂＡ１ｃ測定の一連の反応を同一反応槽で実施する場合、相対残存活性と反応時間とに鑑みて、第２陰イオン界面活性剤又はその塩の最終濃度は、１．０質量％未満であることが好ましく、０．５質量％以下であることがより好ましく、０．２５％前後であることがさらに好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０２２３】
本願は、反応促進剤、ヘモグロビン分解用組成物、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃの測定キットに利用可能である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月3日(2016.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼによるタンパク質の分解反応に用いられる反応促進剤であって、
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤。
【請求項２】
前記ミリストイルサルコシン酸又はその塩の含有量は、反応促進剤を投入した反応溶液全量に対して１．０質量％となる量である請求項１に記載の反応促進剤。
【請求項３】
プロテアーゼと、
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤と、
を含むヘモグロビン分解用組成物。
【請求項４】
前記ミリストイルサルコシン酸又はその塩の含有量は、ヘモグロビン分解用組成物を投入した反応溶液全量に対して１．０質量％となる量である請求項３に記載のヘモグロビン分解用組成物。
【請求項５】
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のヘモグロビンＡ１ｃとを反応させて糖化ペプチドを生成する工程と、
酸化体の存在下で前記糖化ペプチドをフルクトシルペプチドオキシダーゼにより酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において前記糖化ペプチドにより前記酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程と、
前記酸化体還元物の量を検出する工程と、
検出した前記酸化体還元物の量に基づいて、前記検体中のヘモグロビンＡ１ｃの濃度を算出する工程と、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼは、前記ヘモグロビンＡ１ｃからフルクトシル−バリルヒスチジンを生成する請求項５に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項７】
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤の存在下で、プロテアーゼと検体中のヘモグロビンＡ１ｃとを反応させて糖化アミノ酸を生成する工程と、
酸化体の存在下で前記糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化還元反応させて、当該酸化還元反応において前記糖化アミノ酸により前記酸化体が還元されてなる酸化体還元物を生成する工程と、
前記酸化体還元物の量を検出する工程と、
検出した前記酸化体還元物の量に基づいて、前記検体中のヘモグロビンＡ１ｃの濃度を算出する工程と、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼは、前記ヘモグロビンＡ１ｃからフルクトシル−バリンを生成する請求項７に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項９】
前記ミリストイルサルコシン酸又はその塩の濃度は、反応促進剤を投入した反応溶液全量に対して１．０質量％である請求項５乃至８のいずれか１項に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項１０】
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤と、
ヘモグロビンＡ１ｃから糖化ペプチドを生成するプロテアーゼと、
前記糖化ペプチドを酸化還元反応させるフルクトシルペプチドオキシダーゼと、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１１】
陰イオン界面活性剤としてのミリストイルサルコシン酸又はその塩を含む反応促進剤と、
ヘモグロビンＡ１ｃから糖化アミノ酸を生成するプロテアーゼと、
前記糖化アミノ酸を酸化還元反応させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、
を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１２】
前記酸化還元反応で生成される過酸化水素を検出する試薬をさらに含む請求項１０又は１１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１３】
前記過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する発色試薬と、を含む請求項１２に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１４】
前記過酸化水素を検出する試薬は、ペルオキシダーゼと、当該ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して発光する発光試薬と、を含む請求項１２に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【請求項１５】
前記ミリストイルサルコシン酸又はその塩の含有量は、反応促進剤を投入した反応溶液全量に対して１．０質量％となる量である請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定キット。
【国際調査報告】
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