(57)【要約】  ＣｙＨＶ−２ウイルスを不活化することにより、効果の高いＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンが得られる。さらに、これまで困難であったＣｙＨＶ−２ウイルスの継続的な増殖方法を開発した。該増殖方法を利用すれば、ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンを量産することが可能となる。
2014185439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化されたコイ科ヘルペスウイルス−２（Ｃｙｐｒｉｎｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−２：ＣｙＨＶ−２）を含有する、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチン。
【請求項２】
ＣｙＨＶ−２がアルデヒドにより不活化されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
コイ科魚類に投与される、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
コイ科魚類がキンギョである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
不活化されたＣｙＨＶ−２の有効量を対象魚類へ投与することを含む、ＣｙＨＶ−２感染症の予防方法。
【請求項６】
不活化されたＣｙＨＶ−２の有効量を対象魚類へ投与すること、および当該対照魚類を飼育することを含む、該対象魚類の飼育方法。
【請求項７】
以下工程（ａ）〜（ｃ）を含む、ＣｙＨＶ−２ウイルスの製造方法：
（ａ）コイ科魚類由来の培養細胞を含む細胞培養液に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する工程；
（ｂ）ＣｙＨＶ−２添加後７日〜１４日間おきに、培養細胞を分散し、それまで使用していた細胞および培地を５０％以上残存させつつ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を加えて継代する工程；および
（ｃ）継代後、細胞全体の５０％以上の細胞が、培養容器の底面に対し接着性を失った際に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収する工程。
【請求項８】
以下工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンの製造方法：
（ａ）コイ科魚類由来の培養細胞を含む細胞培養液に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する工程；
（ｂ）ＣｙＨＶ−２添加後７日〜１４日間おきに、培養細胞を分散し、それまで使用していた細胞および培地を５０％以上残存させつつ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を加えて継代する工程；
（ｃ）継代後、細胞全体の５０％以上の細胞が、培養容器の底面に対し接着性を失った際に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収する工程；および
（ｄ）（ｃ）で回収したＣｙＨＶ−２ウイルスを不活化する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンおよびその製造方法、ならびにＣｙＨＶ−２ウイルス製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｙＨＶ−２感染症は１９９２年に愛知県で初めて発症して以来、日本のキンギョ養殖場において多大な被害をもたらしている（愛知県庁ホームページhttp://www.pref.aichi.jp/0000009518.html）。さらに、当該感染症による被害は日本のみに留まらず、世界中で発生しており、これまでにキンギョでは米国（非特許文献１および２）、台湾（非特許文献３）、オーストラリア（非特許文献４）、ニュージーランド（非特許文献５）、および英国（非特許文献６）からの発生報告がなされ、ギベリオブナではハンガリー（非特許文献７）、チェコ（非特許文献８）、および中国（非特許文献９）からの発生報告がなされている。【０００３】
ＣｙＨＶ−２はＧＦＨＮＶ（Goldfish hematopoietic necrosis virus）とも称されることがあり、感染した魚の造血組織に壊死を起こすことで知られる魚類ヘルペスウイルスの一種である。同じくコイ科の魚類に感染するＣｙＨＶ−１およびＣｙＨＶ−３と遺伝学的に近い関係にある（非特許文献１４）。【０００４】
これまで、培養細胞を用いた安定的なＣｙＨＶ−２ウイルスの増殖は困難であるとされてきた。ファットヘッドミノウ由来のＦＨＭ細胞を用いたＣｙＨＶ−２の増殖の報告（非特許文献１０）があるが、当該方法ではウイルスの継代は４回までしか行うことができない。また、コイのヒレ由来のＫＦ−１細胞を用いたＣｙＨＶ−２の増殖を行った報告（非特許文献６および９）があるが、この方法においてもＣｙＨＶ−２の継続的な増殖には成功していない。キンギョのヒレ由来のＧＦＦ細胞を用いてＣｙＨＶ−２を継続して増殖できるとする報告（非特許文献１１）がなされたが、当該報告においては増殖方法が十分に開示されておらず、また、逆にＧＦＦ細胞を用いてＣｙＨＶ−２を増殖させることは困難であるとの報告（非特許文献１２）もあり、当該増殖方法が優れた方法であるかに関しては議論の余地がある。【０００５】
ＣｙＨＶ−２感染症は世界規模で多大な被害をもたらしているが、ＣｙＨＶ−２を継続的に増殖させることが困難であったこと等に起因して、本感染症に対するワクチン開発の報告はなされていない。ＣｙＨＶ−２と遺伝的に近いＣｙＨＶ−３（ＫＨＶとも称される）はコイを宿主とし、世界中で大きな被害をもたらした（非特許文献１３）。ＣｙＨＶ−３感染症に対してはワクチンの開発が試みられたが、現在までに、ＣｙＨＶ−３感染症に対する安全で有効なワクチンは普及していない（非特許文献１４および１５）。通常ＣｙＨＶ−３感染症に対して腹腔内注射法による不活化ワクチンの投与は有効ではない（非特許文献１５）。ＣｙＨＶ−３については、不活化ワクチンが有効でないと考えられていたため、弱毒化した生ワクチンの開発が試みられている（非特許文献１４および１５）。ＣｙＨＶ−３の不活化ワクチンについては、一般的に有効でないと考えられているが、不活化したＣｙＨＶ−３をリポソームに封入し、コイに経口投与することによりＣｙＨＶ−３感染症を一定の割合で防ぐことができたとする報告がある（非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Groff JM, et al., J Vet Diagn Invest, Vol 10, pages 375-378, 1998
【非特許文献２】Goodwin AE, et al., J Aquat Anim Health, Vol 18, pages 11-18, 2006
【非特許文献３】Chang PH, et al., Fish Pathol, Vol 34, pages 209-210, 1999
【非特許文献４】Stephens FJ, et al., Aust Vet J, Vol 82, pages 167-169, 2004
【非特許文献５】Hine PM, et al., Surveillance, Vol 33, pages 3-5, 2006
【非特許文献６】Jeffery KR, et al., J Fish Dis, Vol 30, pages 649-656, 2007
【非特許文献７】Doszpoly A, et al., Magyar Allatorvosok Lapaja, Vol 133, pages 174-181, 2011
【非特許文献８】Danek T, et al., Dis Aquat Org, Vol 102, pages 87-95, 2012
【非特許文献９】Wang L, et al., Bull Eur Assoc Fish Path, Vol 32, pages 164-173, 2012
【非特許文献１０】Jung SJ and Miyazaki T, J Fish Dis, Vol 18, pages 211-220, 1995
【非特許文献１１】Li X and Hukuda H, J Shanghai Fisheries Univ, Vol 12, pages 12-18, 2003
【非特許文献１２】Jeffery KR, et al.,http://www.cefas.co.uk/publications/posters/32952web.pdf, 2006
【非特許文献１３】飯田貴次ら, ウイルス, 第55 巻  第１号, pages 145-152, 2005
【非特許文献１４】Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2012, CHAPTER 2.3.6, pages 328-344
【非特許文献１５】Ilouze M, et al., Ecol Res, Vol 26, pages 885-892, 2011
【非特許文献１６】Yasumoto S, et al., Fish Pathol, Vol 41, pages 141-145, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンおよびその製造方法を提供し、世界中で大きな被害をもたらしているＣｙＨＶ−２感染症による被害を防ぐことにある。また、ワクチン製造に有用である、ＣｙＨＶ−２ウイルスの継続的な増殖方法を提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、ＣｙＨＶ−２を生体外で継続的に増殖可能な方法を開発した。当該増殖方法においては、培養細胞を使用し、少なくとも１２回の継代培養が可能であることを確認している。
ＣｙＨＶ−２の近縁ウイルスであるＣｙＨＶ−３では不活化ワクチンは有効でないことが知られていることから、当初、本発明者は、ＣｙＨＶ−２不活化ワクチンについても効果を期待していなかった。しかしながら、予想に反し、本発明者は上記方法により増殖させたＣｙＨＶ−２を用いて不活化ＣｙＨＶ−２ワクチンを作製し、キンギョに摂取させたところ、ＣｙＨＶ−２感染症に対する生存率は顕著に改善することが明らかとなった（生存率０％から５７％に改善）。
本発明者は、以上の結果をもとに本発明を完成した。【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］不活化されたコイ科ヘルペスウイルス−２（Ｃｙｐｒｉｎｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−２：ＣｙＨＶ−２）を含有する、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチン。
［２］ＣｙＨＶ−２がアルデヒドにより不活化されている、［１］に記載のワクチン。
［３］コイ科魚類に投与される、［１］または［２］に記載のワクチン。
［４］コイ科魚類がキンギョである、［３］に記載のワクチン。
［５］不活化されたＣｙＨＶ−２の有効量を対象魚類へ投与することを含む、ＣｙＨＶ−２感染症の予防方法。
［６］不活化されたＣｙＨＶ−２の有効量を対象魚類へ投与すること、および当該対照魚類を飼育することを含む、該対象魚類の飼育方法。
［７］以下工程（ａ）〜（ｃ）を含む、ＣｙＨＶ−２ウイルスの製造方法：
（ａ）コイ科魚類由来の培養細胞を含む細胞培養液に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する工程；
（ｂ）ＣｙＨＶ−２添加後７日〜１４日間おきに、培養細胞を分散し、それまで使用していた細胞および培地を５０％以上残存させつつ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を加えて継代する工程；および
（ｃ）継代後、細胞全体の５０％以上の細胞が、培養容器の底面に対し接着性を失った際に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収する工程。
［８］以下工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンの製造方法：
（ａ）コイ科魚類由来の培養細胞を含む細胞培養液に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する工程；
（ｂ）ＣｙＨＶ−２添加後７日〜１４日間おきに、培養細胞を分散し、それまで使用していた細胞および培地を５０％以上残存させつつ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を加えて継代する工程；
（ｃ）継代後、細胞全体の５０％以上の細胞が、培養容器の底面に対し接着性を失った際に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収する工程；および
（ｄ）（ｃ）で回収したＣｙＨＶ−２ウイルスを不活化する工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＣｙＨＶ−２感染症に対する有効なワクチンが提供される。さらに、継続的に増殖可能な本発明のＣｙＨＶ−２の製造方法を利用することで、ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンを効率的に製造することが可能となる。
本願発明のワクチンはリポソームを使用することなく、腹腔内投与により有効性が認められる。したがって、本願発明のワクチンはリポソームに封入する工程を要さない、非常に簡便に作製及び投与できるＣｙＨＶ−２感染症に有効性のあるワクチンの作製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＣｙＨＶ−２ワクチンの安全性試験の結果を示す図である。無処理、ＭＥＭの腹腔内投与（ＩＰ−ＭＥＭ）、およびＣｙＨＶ−２不活化ワクチン腹腔内投与（ＩＰ−ワクチン）の各群につき、１５匹ずつのエドニシキを使用し、各処理後の累積死亡率（％）を調べた結果を示す。
【図２】ＣｙＨＶ−２ワクチンの有効性試験の結果を示す図である。図１の安全性試験で生存したエドニシキ（無処理；１５匹、ＩＰ−ＭＥＭ；１５匹、ＩＰ−ワクチン；１４匹）に対し、不活化処理をしていないＣｙＨＶ−２を感染させ、その後の生存率を調べた結果を示す。
【図３】リュウキンを用いた、ＣｙＨＶ−２ワクチンの有効性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、不活化されたＣｙＨＶ−２を含有する、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンを提供する。
ＣｙＨＶ−２はヘルペスウイルス科に属するヘルペスウイルスの一種であり、その近縁ウイルスとしてＣｙＨＶ−１およびＣｙＨＶ−３が知られている。本発明のワクチンに使用され得るＣｙＨＶ−２は、野生型のＣｙＨＶ−２に加え、自然のまたは人工的な変異が導入されたＣｙＨＶ−２のバリアントや亜型をも含み得る。ＣｙＨＶ−２としては、ＣｙＨＶ−２に感染した魚体から分離したウイルス、または培養細胞を使用して生体外で増殖したウイルスを用いてもよく、好ましくは培養細胞を使用して増殖したウイルスである。
【００１３】
ＣｙＨＶ−２ウイルスを魚体から回収する場合は、ＣｙＨＶ−２の感染により発症又は死亡したコイ科に属する魚、例えば、キンギョ、フナ類等から切除又は摘出した器官から分離できる。かかる器官としては、例えば、脾臓、腎臓、鰓、肝臓、鰭、腸管、心臓等を用いることができる。これらのウイルス分離材料は、例えば、眼科用鋏で細切れにし、これに常用の塩類溶液や培地等、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やＭＥＭ培地を添加してホモジナイザーで磨砕し、約５〜３０％（Ｗ／Ｗ）組織乳剤を調製の後、低速遠心し、その上清又は沈渣組織の再浮遊液をウイルス分離材料としてワクチン製造に用いることができる。なお、かかる材料は膜濾過法により除菌できるし、抗生物質を添加できる。加えて、眼科用鋏で細切れにした組織片を細胞培養用フラスコに定着させ、その定着した組織片より伸張し増殖・分裂した株化細胞も同様にウイルス分離材料としてワクチン製造に用いることができる。
【００１４】
ＣｙＨＶ−２を生体外で増殖・継代させるために使用し得る培養細胞は、ＣｙＨＶ−２が感染することができ、感染細胞内でＣｙＨＶ−２ウイルスが複製可能であれば特に限定されないが、コイ科に属する魚類に由来する培養細胞が好ましい。例として、コイ科魚類由来の種々の初代あるいはその継代培養細胞、株化細胞等が挙げられる。株化細胞としては、ＧＦＦ細胞、ＫＦ−１細胞、ＦＨＭ細胞、ＢＦ−２細胞、ＣＨＳＥ−２１４細胞、ＪＳＫＧ細胞、ＫＲＥ−３細胞、ＲＴＧ−２細胞、ＹＴＦ細胞等の公知の細胞株を挙げることができる。また、独立行政法人水産総合研究センター増養殖研究所玉城庁舎にて新たにキンギョのヒレから樹立されたＳＲＴＦ細胞も株化細胞の例として挙げられる。好ましい株化細胞は、ＧＦＦ細胞、ＫＦ−１細胞、ＦＨＭ細胞、およびＳＲＴＦ細胞であり、特に好ましいのはＧＦＦ細胞、およびＳＲＴＦ細胞である。
【００１５】
上記細胞の培養に使用し得る当業者に公知の培地等として、例えば、１９９培地、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地、ＢＭＥ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地、Ｈａｎｋｓ液、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等を使用できる。これらの組成と調製法は、ウイルス実験、細胞培養、組織培養等に関する常用テキスト、例えば、「組織培養の技術」（日本組織培養学会編，朝倉書店１９８２年発行）や市販製品カタログ等に詳述されている。また、かかる培地や塩類溶液は、添加剤を添加混合し修飾できる。添加剤としては、常用の物質、例えば、市販のヒト血清、ウシ胎児血清ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、抗生物質、炭酸水素ナトリウム溶液、塩化ナトリウム、非必須アミノ酸［大日本住友製薬（株）製］等から適宜選択し、適量使用できる。例えば、培地１Ｌ当たりに添加混合するこれ等の最終濃度は、血清類は約３〜２５％（Ｖ／Ｖ）、炭酸水素ナトリウムは約１〜６ｇ、塩化ナトリウムは約０．１〜０．２５モル、また、非必須アミノ酸は製品カタログに記載の標準量が望ましい。
【００１６】
ウイルスの増殖・継代において使用できる培養細胞は、１種の細胞に限定されず、ウイルスの増殖・継代の途中でウイルス増殖の可否に基づき変更できる。即ち、１種以上の細胞を組み合わせて使用できる。ウイルスを回収するには、培養液を低速遠心した上清、感染細胞画分を採取し超音波処理した破壊細胞懸濁液、ドライアイスと有機溶媒で凍結融解したウイルスとその感染細胞の浮遊液、かかる浮遊液を低速遠心した上清、その沈渣細胞の再浮遊液等をワクチン原液として用いることができる。なお、かかるワクチン原液は、膜濾過法により除菌できるし、抗生物質も添加できる。
【００１７】
また、上記の方法で回収したウイルスは、ショ糖密度勾配を用いる超遠心法により濃縮かつ精製できる。例えば、回収したウイルス液を約１０万Ｇで９０分間遠心し、ウイルスを含むその沈降物を適当な塩溶液、例えばトリス-塩化ナトリウム-EDTA緩衝液（ＴＮＥ）溶液にて再懸濁させ、そのウイルス含有液をショ糖濃度１０−６０％（Ｗ／Ｗ）の密度勾配溶液上に重層し、超遠心にかけ、ウイルス抗原を沈降させた後、その沈降物を回収し再浮遊液として精製ウイルス抗原を調製できる。この発明において採用できるショ糖濃度は約１０〜６０％（Ｗ／Ｗ）の範囲にあり、遠心条件は約５万〜１５万Ｇで、約６０〜１０００分である。
【００１８】
培養細胞を使用して増殖したＣｙＨＶ−２の好適な例としては、後述する本発明の製造方法により製造したＣｙＨＶ−２を挙げることができる。
【００１９】
本発明の一態様において、ワクチン用抗原として、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成成分とその翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のエピトープ等を使用できる。ビリオン構成成分とその翻訳後修飾体としては、例えば、ＣｙＨＶ−２由来のタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、およびこれらの修飾体などであり得、投与対象における免疫応答を惹起することができ、所望の効果を得られるのであれば、ウイルス粒子のどの部分の構成成分であってもよい。当該構成成分は、ＣｙＨＶ−２ウイルスビリオンに由来する天然由来の成分であってもよく、もしくは人工的に合成されたものであってもよい。また、本発明のワクチンは、該構成成分の１つ、または２以上の組み合わせを含み得る。
【００２０】
本発明のワクチンに含まれるＣｙＨＶ−２は不活化ウイルスである。ＣｙＨＶ−２の近縁ウイルスであるＣｙＨＶ−３については、不活化ウイルスワクチンは有効でないことが当業者に広く知られていたため、ＣｙＨＶ−２に関しても不活化ワクチンは有効ではないことが予想された。しかしながら、意外にも、不活化ＣｙＨＶ−２が高いワクチン効果を示すことが本発明者により明らかとなった。
不活化ウイルスの種類としては、ウイルス粒子の構造が保持されたまま不活化された不活化全粒子ウイルス、ウイルス粒子を破壊して不活化された不活化スプリットウイルスを挙げることができる。不活化全粒子ウイルスは、β-プロピオラクトン、フェノール、アルデヒド（ホルマリン、グルタルアルデヒド等）などの化学処理、紫外線照射、放射線照射、および加温処理などにより得ることができる。また、不活化スプリットウイルスは、エーテル等の化学処理などにより得ることができる。本発明において使用する不活化ウイルスは、抗原性の維持および高いワクチン効果の観点から、アルデヒドにより不活化されたＣｙＨＶ−２の全粒子であることが望ましい。不活化の方法は、不活化処理の種類や使用する不活化剤により適宜設定することができ、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチン効果が達成される限り特に限定されないが、一例として、不活化にホルマリンを使用する場合、魚体への安全性を考慮し添加量は最終濃度で０．１〜０．３％程度（Ｖ／Ｖ）、不活化を行う際の温度は４〜２０℃、不活化処理を行う時間は、２４〜７２時間が挙げられる。不活化により抗原性が損なわれる危険性がある場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下、不活化時間の短縮等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要なら、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。本発明では、十分な免疫原性を得るために、不活化全粒子ウイルスを用いることが好ましい。
【００２１】
本発明のワクチンを調製するには、有効量の不活化ＣｙＨＶ−２を塩類溶液や培地等、例えば、培地ＭＥＭで希釈する。即ち、かかる希釈により、ワクチン中の不活化ＣｙＨＶ−２量が抗体産生に必要な量になるよう調整する。さらにその際、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合できる。例えば、安定化剤として、糖類やアミノ酸類、また、アジュバントとして、鉱物油、植物油、ミョウバン、リン酸アルミニウム、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等を利用できる。次いで、適当な容積、例えば、約１０〜５００ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封の後、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤として使用に供することができる。なお、調製したワクチン製剤は、使用に供する前に、その品質を保証するため、安全性と有効性に関する検定を行う必要がある。かかる検定は、この発明に係るワクチンと類似の既存製剤、例えば、薬事法（昭和３５年法律第１４５号）に基づく「動物用生物学的製剤基準」に定める「日本脳炎不活化ワクチン」、「狂犬病組織培養不活化ワクチン」等の規程に準拠して行うことができる。
【００２２】
また、本発明のワクチンの調製のためには、不活化ＣｙＨＶ−２をリポソームに封入してもよい。不活化ＣｙＨＶ−３では、リポソームに封入することによりワクチンとしての有効性を見出した報告（非特許文献１６）があるため、不活化ＣｙＨＶ−２についても同様の態様によりワクチン効果が認められ得る。しかしながら、一態様において、本発明のワクチンに使用される不活化ＣｙＨＶ−２は、リポソームに封入されていない状態であっても所望の効果を発揮し得る。
【００２３】
本発明のワクチンは、ＣｙＨＶ−２に感染する可能性がある任意の齢の魚類に対し使用できる。養魚保全の観点から、幼魚ないしは稚魚への使用が好ましいが成魚に対しても使用可能である。使用法として、例えば、腹腔内、皮下、又は筋肉内接種、浸漬法、経口投与、混餌投与等が可能である。リポソームに封入した不活化ＣｙＨＶ−３ワクチンでは、経口投与以外の投与方法による該ワクチンの有効性は確認されていないため、本発明の好ましい態様において、本発明のワクチンの投与方法は、腹腔内、皮下、又は筋肉内接種、浸漬法等である。使用量は投与対象となる魚の種類、大きさ、齢、投与方法などにより適宜設定する必要があり、例えば接種の場合、上記の抗原量を、１ドーズ約０．０５〜１．０ｍＬ使用が望ましく、浸漬による免疫には飼育水又は低張飼育水でワクチンを約１０〜１００倍に希釈して用いることができる。ワクチンは、凍結しない冷温、例えば、約２〜８℃の冷暗所で保存することができる。
【００２４】
ＣｙＨＶ−２感染症に罹患した魚は、外観には特徴的な症状が現れないが、行動が不活発になり、水面や池の底で動かなくなる。また著しい貧血を起こすことが知られている。魚体内でのＣｙＨＶ−２の感染は、鰭、鰓、心臓、腸管、脾臓、脳、腎臓などあらゆる器官で認められる。
【００２５】
本発明のワクチンの投与対象は、ＣｙＨＶ−２に感染し、上記病態を示す可能性がある魚類である限り特に制限されないが、好ましい投与対象はコイ科魚類であり、より好ましい投与対象はキンギョ、フナ類であり、最も好ましい投与対象はキンギョである。
【００２６】
本発明のワクチンの投与対象となり得るキンギョの例としては、ランチュウ、エドニシキ、サクラニシキ、トサキン、アズマニシキ、ジキンおよびリュウキン等の一般に高級品種と称されるキンギョが挙げられ、好ましくはエドニシキおよびリュウキンである。
【００２７】
本発明のワクチンの効果の持続期間は、ワクチンの投与量、投与方法および投与回数など、ならびに投与対象となる魚類の種類、大きさおよび齢などにより異なり得るが、一態様において、本発明のワクチンの効果は、１回の投与で８週間以上持続し得る。
【００２８】
本発明は、上記ワクチンを対象魚類へ投与することを含む、ＣｙＨＶ−２感染症の予防方法および対象魚類の飼育方法を提供する。
本発明の予防方法によれば、ＣｙＨＶ−２に感染していない対象魚類に対し、例えば、腹腔内、皮下、又は筋肉内接種、浸漬法、経口投与、混餌投与等により本発明のワクチンを投与することで、ＣｙＨＶ−２感染症に対する抵抗力を付与し、該感染症による病態発症を未然に防ぐことが可能である。また、本発明は、同様の方法により本発明のワクチンを投与することにより、ＣｙＨＶ−２感染症の発症を防ぎながら、または該感染症に罹った魚類を治癒しながら、該魚類を飼育する方法を提供する。当該予防方法および飼育方法における投与は、１または複数回行うことができ、十分な抵抗力を付与する観点から、複数回投与が好ましい。複数回投与では１の投与方法で行う、または複数の投与方法を組み合わせて行うことができる。投与方法としては、腹腔内、皮下、又は筋肉内接種、浸漬法、経口投与、混餌投与等が挙げられる。不活化ＣｙＨＶ−３ワクチンで有効性が確認されていない、腹腔内、皮下、又は筋肉内接種、浸漬法等による投与が特に好ましい。投与間隔は対象魚類の大きさ、種類、齢、飼育環境などにより適宜設定する必要があるが、一例として、キンギョに対し腹腔内投与によりワクチンを投与し、投与後６〜１２日後に再度ワクチンを投与する方法が挙げられる。対象魚類の齢は、成魚、幼魚、稚魚のいずれであってもよいが、養魚保全の観点から、幼魚または稚魚が好ましい。
【００２９】
ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンを製造・販売する上では、ＣｙＨＶ−２ウイルスを継続的に量産することが可能な方法が求められる。しかし、上述したように、過去の研究から、培養細胞を用いたＣｙＨＶ−２の継続的な増殖が困難であることが当業者に周知である。従って、ＣｙＨＶ−２ワクチンの産業利用に対する限定要因を取り除く意味でも、培養細胞を用いた継続的なＣｙＨＶ−２ウイルスの製造方法を開発することは有用である。
【００３０】
一実施形態において、本発明はＣｙＨＶ−２ウイルスの製造方法を提供する。該製造方法は以下の工程を含む：
（ａ）コイ科魚類由来の培養細胞を含む細胞培養液に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する工程；
（ｂ）ＣｙＨＶ−２添加後７日〜１４日間おきに、培養細胞を分散し、それまで使用していた細胞および培地を５０％以上残存させつつ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を加えて継代する工程；および
（ｃ）継代後、細胞全体の５０％以上の細胞が、培養容器の底面に対し接着性を失った際に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収する工程。
【００３１】
本発明のＣｙＨＶ−２ウイルスの製造方法で使用し得る、コイ科魚類由来の培養細胞は、ＣｙＨＶ−２が感染することができ、感染細胞内でＣｙＨＶ−２ウイルスが複製可能であれば特に限定されないが、好ましくはＧＦＦ細胞、ＫＦ−１細胞、ＦＨＭ細胞、ＳＲＴＦ細胞であり、ＧＦＦ細胞およびＳＲＴＦ細胞が最も好ましい。これら細胞の培養に際しては、上記の当業者に公知の培地、添加剤を使用し得る。
上記方法により培養しているコイ科魚類由来の培養細胞の培養液に対し、ＣｙＨＶ−２ウイルスを添加する。ウイルスの添加量はワクチン製造に必要な量のウイルスが得られる限り制限されないが、通常、ＴＣＩＤ５０の対数値ｌｏｇ（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）に換算して１０２〜１０４のウイルス液を、培地量の１／１０〜１／２０添加する。ウイルス添加時の細胞は、培養容器の底面に接着した状態であっても良いし、定着前の培養液中に分散し、浮遊した状態であっても良い。好ましくは、ウイルス添加時の細胞は分散し、浮遊した状態である。
【００３２】
当該製造方法では、ＣｙＨＶ−２ウイルス添加後、７日〜１４日間おきに細胞を分散して継代する工程を含む。該継代の際には、継代以前に使用していた培地を５０％以上残存させ、該残存培地の１〜２倍量の新たな培地を添加する。該残存培地には、継代以前に製造されたウイルスが含まれているため、ウイルスのタイターを上げるためには、培地の多くを残存させる当該工程は重要である。故に、例えば、継代以前の培地を５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％残存させる工程は、継代以前に産生されたウイルスの多くを残存させる結果をもたらすので、本発明のウイルスの製造方法で採用し得る。
【００３３】
上記継代を行った後、顕微鏡下で細胞の状態を観察した際に、細胞全体の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の細胞が培養容器の底面に対し接着性を失っている場合に、ＣｙＨＶ−２ウイルスを回収することができる。継代後７〜１４日が経過し、次の継代を行うか否かを判断する際に、前記培養容器の底面に接着性を失っている細胞の割合が５０％未満であった場合は、上記方法によりさらなる継代を行うことを選択できる。該接着性を失っている細胞は、死細胞または生細胞であり得る。ＣｙＨＶ−２ウイルスの回収では、培地のみ、培養細胞のみ、または培地および培養細胞からウイルスを回収することができる。例えばウイルスは、培養液を低速遠心した上清、感染細胞画分を採取し超音波処理した破壊細胞懸濁液、ドライアイスと有機溶媒で凍結融解したウイルスとその感染細胞の浮遊液、かかる浮遊液を低速遠心した上清、その沈渣細胞の再浮遊液等から回収できる。
【００３４】
本発明は、上記方法で製造したＣｙＨＶ−２ウイルスを使用して、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチンを製造する方法をさらに提供する。当該ワクチン製造方法では、上記方法により製造されたＣｙＨＶ−２ウイルスを不活化する工程をさらに含む。該不活化は、所望のワクチン効果が得られるのであれば、いかなる方法によっても行い得るが、好ましい実施形態において、該不活化は、β-プロピオラクトン、フェノール、アルデヒド（ホルマリン、グルタルアルデヒド等）などの化学処理、紫外線照射、放射線照射、および加温処理などにより行うことができる。また、エーテル等の化学処理などにより、不活化スプリットウイルスとしてワクチンを製造することも可能である。不活化の方法は、不活化処理の種類や使用する不活化剤により適宜設定することができ、ＣｙＨＶ−２感染症に対するワクチン効果が達成される限り特に限定されないが、一例として、不活化にホルマリンを使用する場合、添加量は最終濃度で０．１〜０．３％程度（Ｖ／Ｖ）、不活化を行う際の温度は４〜２０℃、不活化処理を行う時間は、２４〜７２時間が挙げられる。不活化によりワクチンの抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下、不活化時間の短縮等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要なら、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、単に本発明をより具体的に例示するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。【００３６】
（実施例１）培養細胞を用いたＣｙＨＶ−２ウイルスの増殖
ＣｙＨＶ−２を増殖させるために、キンギョのヒレ由来の細胞であるＧＦＦ細胞（Li and Hukuda 非特許文献１４）を元東京海洋大学教授の福田穎穂氏より入手し、使用した。該ＧＦＦ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Equitech Bio, Inc.）および抗生物質（１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（和光純薬工業株式会社））を添加したＭＥＭ培地中で、２５℃で培養した。
増殖させる元となるＣｙＨＶ−２ウイルスは、元東京海洋大学教授の福田穎穂氏から入手した。０．２５％トリプシン溶液（life technologiesTM）を使用して、培養中のＧＦＦ細胞を培養フラスコから剥がし、新たな培地を加え、細胞を分散させた後、培養面積２５ｃｍ２の培養フラスコに播種した。該播種したＧＦＦ細胞に上記方法により得られたＣｙＨＶ−２（１０２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を５００μＬ添加し、培養器に静置した。
ウイルス添加から７日〜１４日間後、上記と同様の方法で細胞を剥がし分散させた後、それまで使用していた培地をほとんど残存させつつ、既存の培地量の１〜２倍量の新たな培地を加え、培養フラスコへ播種した。当該継代は７日〜１４日間おきに行った。上記方法により少なくとも１２回のウイルスの継代、増殖が可能であることを確認した。さらに、ＧＦＦ細胞だけでなく、独立行政法人水産総合研究センター増養殖研究所玉城庁舎にて新たにキンギョのヒレから樹立されたＳＲＴＦ細胞でも同様にＣｙＨＶ−２ウイルスの継代が可能であることを確認した。
継代を行った後、毎日顕微鏡下で細胞を観察し、少なくとも５０％、好ましくは８０％以上の細胞が培養フラスコに接着していなかった場合、細胞および培地を回収し、低速遠心し、その上清をウイルス液として得た。得られたウイルスのタイターは１０３．０ＴＣＩＤ５０/ｍＬであった。尚、継代後７〜１４日が経過したときに、培養フラスコに接着していない細胞の割合が５０％未満であった場合は、さらなる継代を行った。【００３７】
（実施例２）ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンの作製
上記方法により得られたＣｙＨＶ−２ウイルス液（ウイルス力価１０３．０ＴＣＩＤ５０/ｍＬに、ホルマリンを最終濃度０．１％（Ｖ／Ｖ）となるように添加し、４℃で４８時間処理した。【００３８】
（実施例３）ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチン投与による、ＣｙＨＶ−２感染後の生存率の改善
まず初めに、上記ワクチンの安全性試験を行った（図１）。投与対象のキンギョとしてＣｙＨＶ−２フリーのエドニシキ（独立行政法人水産総合研究センター増養殖研究所玉城庁舎より入手）を使用した。無処理、ＭＥＭ腹腔内接種、およびＣｙＨＶ−２ワクチン（１０３．０ＴＣＩＤ５０/ｍＬ）腹腔内接種の各区のエドニシキを用意し（それぞれ１５匹ずつ）、０．１ｍＬ／尾で腹腔内注射し、その９日後に再度同様に注射（ブースター）した。その後、２１日間死亡の有無を観察したところ、注射針が内臓に刺さり死亡した１尾を除き、死亡した個体は認められなかった。従って、本発明の方法により製造されたワクチンの安全性が確認された。
次にワクチンの有効性試験を行った（図２）。ワクチン作製に用いた同じロットウイルス液であるＣｙＨＶ−２ウイルス（１０３．０ＴＣＩＤ５０/ｍＬ）を１０００倍に希釈した液に、上記のワクチン安全性試験で使用したエドニシキを１時間浸漬し、ＣｙＨＶ−２ウイルスを感染させた。その後、各区のエドニシキの死亡の有無を観察した。無処理およびＭＥＭ接種の区では、感染後１１日以内に全てのエドニシキが死亡したのに対し、ワクチン接種をした区では５７％のエドニシキが生存した。Ｆｉｓｈｅｒの正確確立検定法により、これらの死亡率を比較した結果、ワクチン処理区とワクチン無処理区の間にはｐ＜０．０１％の危険率で有意差が示され、さらに、ワクチンの有効率（ＲＰＳ＝｛１−（ワクチン処理区の死亡率／ワクチン無処理区の死亡率）｝ｘ１００）は５７％であった。以上の結果より、本発明のワクチンの有効性が証明された。【００３９】
（実施例４）リュウキンを用いた、ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチン投与による、ＣｙＨＶ−２感染後の生存率の改善（図３）
試験には増養殖研究所玉城庁舎にて生産したＣｙＨＶ−２フリーのリュウキン２００尾を供した。供試魚を２５尾ずつ８つの水槽に分け、それぞれワクチン区(i)または(ii)；ワクチン＋ブースター区(i)または(ii)；無処理区(i)または(ii)；非感染区(i)または(ii)とした。ワクチン区(i)および(ii)、ならびにワクチン＋ブースター区(i)および(ii)におけるリュウキンには、実施例１に記載の方法に準じて調製したＣｙＨＶ−２ウイルス（ウイルス力価１０３．０ＴＣＩＤ５０  ｍＬ−１）を実施例２の方法に供して作製した、不活化ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンを腹腔内注射し、免疫した。ワクチン＋ブースター区(i)および(ii)には、最初の免疫時から４週間後に再度同じ方法で追加免疫（ブースター）した。初回のワクチン接種から８週間後に、ワクチン作製に用いたものと同じロットウイルス液であるＣｙＨＶ−２ウイルス（１０３．０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を１０００倍に希釈した液にキンギョを１時間浸漬する方法により、ワクチン区(i)および(ii)、ワクチン＋ブースター区(i)および(ii)、ならびに無処理区(i)および(ii)に対しウイルス攻撃試験を実施した。その後、３４日間死亡を観察した。非感染区(i)および(ii)については、ワクチン接種およびウイルス攻撃を行わずに飼育し、３４日間死亡を観察した。
無処理区では平均生存率が３４％であったのに対し、ワクチン区及びワクチン＋ブースター区ではそれぞれ平均７２％及び７６％の生存率であった。さらにワクチンの有効率（ＲＰＳ；＝｛１−（ワクチン処理区の死亡率／ワクチン未処理区の死亡率）｝ｘ１００）はワクチン区で平均５７．６％、ワクチン＋ブースター区で平均６３．６％であった。
これらのことから、ＣｙＨＶ−２感染症用ワクチンがリュウキンに対しても有効であること、当該ワクチンの有効期間が８週間以上であることが確かめられた。さらに、ワクチン＋ブースター区と無処理区の平均死亡率をｔ検定法により比較した結果、ｐ＜０．０５％の危険率でこれらの間に有意差が示され、追加免疫によりワクチン効果が向上することが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のワクチンにより、多大な被害をもたらすＣｙＨＶ−２感染症による被害を防ぐことが可能である。また、本願発明は、ＣｙＨＶ−２ウイルスの継続的な増殖方法も提供することで、ワクチンの量産を可能にする。【００４１】
本願は日本で出願された特願２０１３−１０３１２４（出願日：２０１３年５月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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