(57)【要約】  糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便に特有の非特異反応を抑制する方法およびこれに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することを課題とする。  抗ＩｇＡ抗体の存在下で、イムノクロマト反応を行うことにより糞便由来サンプル中の被検出物質を、非特異反応の影響を受けることなく検出する方法およびこれに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供する。
2017029992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法であって、抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
【請求項２】
免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、請求項１に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
【請求項４】
（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法における非特異反応抑制方法であって、抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
【請求項６】
免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在で行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、請求項５に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
【請求項８】
（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）及び（２）を含む、前記テストストリップ。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗ＩｇＡ抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
【請求項１０】
コンジュゲートが溶出可能に保持されているコンジュゲートパッドを含む請求項９に記載のテストストリップ。
【請求項１１】
サンプルパッドに、さらに抗ＩｇＭ抗体が溶出可能に保持されている、請求項９又は１０に記載のテストストリップ。
【請求項１２】
抗ＩｇＡ抗体を有効成分とする、糞便由来サンプル用の免疫反応における非特異反応抑制剤。
【請求項１３】
さらに抗ＩｇＭ抗体を含有する、請求項１２に記載の非特異反応抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糞便由来サンプルに起因する免疫反応における非特異反応抑制剤、これを利用した非特異反応抑制方法及び免疫学的検出方法に関する。
特に、イムノクロマトグラフィーを利用した免疫反応における非特異反応抑制剤、これを利用した非特異反応抑制方法、検出方法及びイムノクロマトグラフィー用テストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検出方法は、特異性や感度の高い検出が可能であることから広く普及している。特に、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、簡便性の点で広く普及している。当該検出に適用される試料としては、尿、糞便、唾液、血液、血清などが挙げられ、これらは臨床検査試料として好適であり、診断上有用な試料として広く利用されている。
これらの試料中に含まれる被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出するためには、試料中に含まれるさまざまな検出妨害物質を排除する必要がある。妨害物質としては、イムノクロマトグラフィーによる試料の展開そのものの妨げになるような、つまり、展開用の不溶性メンブレンの詰まりの原因となるような物質や、被検出物質が存在しないにも関わらず、呈色反応を示すような、いわゆる非特異反応の原因となるような物質が挙げられる。
一般に、不溶性メンブレン中の詰まりの原因となるような物質を排除するためには、サンプルパッドにその分離機能を担保させたり、全血を試料とする場合には、血球を排除するために血球分離膜をサンプル添加部の下流に配置する方法が知られている。しかし、非特異反応については種々の原因が考えられるが未だ明らかではなく、したがって対応策も確立されていないのが現状である。
このような抗原抗体反応における非特異反応をブロッキングする試薬として一般的には、ゼラチン、カゼイン、ウシ血清アルブミン、合成高分子などが知られており、これらをイムノクロマトグラフィーを利用した反応の系内に共存させる方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。
このように、非特異反応による影響を排除するための方法は種々知られているが、糞便由来サンプルに起因する非特異反応の抑制に対して効果があるのかどうかについては不明であった。
ところで、特許文献３には、糞便を検体に用いたＥＬＩＳＡ等では検出感度が低く、また非特異反応が多いことから結果の判定に苦慮していたという糞便を検体とする場合の問題点が挙げられ、これを解決するために、ノロウイルス又はサポウイルスをイムノクロマトグラフィーを利用して検出するに際し、ｐＨ９．０〜１０．０の検体用希釈液を使うことで非特異反応を抑制する方法が開示されている。しかし、本方法では検体希釈液として一般的ではないアルカリ性にする必要があるため、取扱いの点において問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−３４４４０６号公報
【特許文献２】特開２００２−１４８２６６号公報
【特許文献３】特開２００４−３０１６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法において、糞便に特有な非特異反応を抑制する非特異反応抑制剤及びこれを利用した非特異反応抑制方法、免疫学的検出方法を提供することを課題とする。
特に、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法における非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法、イムノクロマトグラフィー検出方法及びイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出するに際して、これまで一般的に使われてきたブロッキング剤では一定のサンプルに効果は有するものの、いずれのブロッキング剤でも非特異反応が抑制されないサンプル、すなわち、糞便由来サンプルに特有の非特異反応原因物質が存在することをつきとめた。
そして、このような特有の原因物質に対して、非特異反応を抑制する効果を有する物質を検索したところ、意外にも抗ＩｇＡ抗体を存在させた条件下で免疫測定法を利用した反応を行うことにより、非特異反応を抑制し、偽陽性反応を防止して対象物質を正確に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法であって、抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
＜２＞免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在で行われる＜１＞に記載の方法。
＜３＞免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、＜１＞に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
＜４＞（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である＜３＞に記載の方法。
＜５＞糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法における非特異反応抑制方法であって、抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
＜６＞免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在で行われる＜５＞に記載の方法。
＜７＞免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、＜５＞に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
＜８＞（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である＜７＞に記載の方法。
＜９＞糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）及び（２）を含む、前記テストストリップ。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗ＩｇＡ抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
＜１０＞コンジュゲートが溶出可能に保持されているコンジュゲートパッドを含む＜９＞に記載のテストストリップ。
＜１１＞サンプルパッドに、さらに抗ＩｇＭ抗体が溶出可能に保持されている、＜９＞又は＜１０＞に記載のテストストリップ。
＜１２＞抗ＩｇＡ抗体を有効成分とする、糞便由来サンプル用の免疫反応における非特異反応抑制剤。
＜１３＞さらに抗ＩｇＭ抗体を含有する、＜１２＞に記載の非特異反応抑制剤。
【発明の効果】
【０００６】
抗ＩｇＡ抗体存在下で免疫反応を行うことにより、糞便由来サンプルに起因する非特異反応を抑制し、サンプル中の被検出物質を正確に検出することが可能となった。特に、免疫反応としてイムノクロマトグラフィーを利用することにより、糞便由来サンプル中の被検出物質を簡便かつ正確に検出することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明のテストストリップの模式構成図である。
【図２】本発明の非特異反応抑制剤を添加した場合のウイルス検出感度への影響を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（抗ＩｇＡ抗体）
本発明における抗ＩｇＡ抗体は、糞便由来サンプル中の非特異反応原因物質に結合し、非特異反応を抑制できる抗体であればポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。抗ＩｇＡ抗体は常法にしたがって調製できる。また、これらの抗体の分子全体のほかに、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片も本発明では同じく抗体として取り扱う。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２  、Ｆａｂ’などが挙げられる。これらの機能性断片は前記抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。また、抗体は修飾して用いることもでき、高分子化合物を抗体に結合したり、化学修飾して誘導体化したものも利用することができる。
本発明の抗ＩｇＡ抗体は、サンプル中の非特異反応を抑制できる状態で存在すればよく、免疫反応系に添加して用いることができる。例えば、サンプル希釈液に含まれていてもよく、また、イムノクロマトグラフィーを利用する場合には、サンプルパッド、サードパッド、コンジュゲートパッド、検出抗体を含む不溶性メンブレンに含まれていてもよい。
不溶性メンブレンに含ませる場合は、検出抗体の存在部位（検出部）よりも上流側であることが望ましい。このうちでもとくに、サンプル希釈液、サンプルパッド、またはサードパッドに含まれていることが望ましい。なお、サンプルパッドと不溶性メンブレンが同一のパッドからなり、同一パッド上で異なる部位にサンプル供給部と検出部の役割を担わせる場合には、抗ＩｇＡ抗体は、サンプル供給部に存在していることが望ましい。
抗ＩｇＡ抗体は、各デバイスに非特異反応を抑制できる量が含まれていればよく、例えば１デバイスあたりの含有量が１０〜１００００μｇ／ｔｅｓｔが挙げられ、１０〜１０００μｇ／ｔｅｓｔが好ましく、２５〜５００μｇ／ｔｅｓｔが更に好ましく、４０〜２００μｇ／ｔｅｓｔ、４０〜１００μｇ／ｔｅｓｔが更によりいっそう好ましい。
また、糞便由来サンプル中に起因する非特異反応をより完全に近い形で抑制すべく、本発明の抗ＩｇＡ抗体の他に、抗ＩｇＡ抗体の非特異反応作用を阻害しない範囲で、他の非特異反応抑制物質と組み合わせることも可能である。そのような物質としては、いわゆる市販のブロッキング剤や抗ＩｇＡ抗体以外の抗体、例えば、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体等が挙げられる。該ブロッキング剤としては、例えばＮＥＯ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＡＶＥＲ（東洋紡エンザイム株式会社）、イムノブロックＴＭ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、Ａｐｐｌｉｅ  Ｂｌｏｃｋ（生化学バイオビジネス株式会社）、ＳＥＡ  ＢＬＯＣＫＴＭ/ＥＩＡ/ＷＢ（Ｅａｓｔ  Ｃｏａｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡エンザイム株式会社）、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ＢｌｏｃｋＴＭ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｍａｒｔ  ＢｌｏｃｋＴＭ(ＣＡＮＤＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  社)、ＨｅｔｅｒｏＢｌｏｃｋ(ＯＭＥＧＡ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社)、等から、反応系に影響のないものを適宜選択可能である。抗体としては、前記のうちでもとくに抗ＩｇＭ抗体が望ましい。
本発明者らは、抗ＩｇＡ抗体単独及び抗ＩｇＭ抗体単独では抑制できず、両者を存在させることによって初めて抑制できる非特異反応があることをつきとめたことから、両者を組み合わせることで原因物質を広く抑制することに初めて成功した。抗ＩｇＭ抗体は、それが主成分である試薬として市販されているものとして、ＨＢＲ（異好性阻止試薬、スカンティボディー社）が挙げられる（Clinical Chemistry 45:7，942-956，1999）。
抗ＩｇＭ抗体は、１デバイスあたりの含有量が５〜５００μｇ／ｔｅｓｔが好ましく、１０〜２５０μｇ／ｔｅｓｔが更に好ましく、２０〜１００μｇ／ｔｅｓｔ、４０〜１００μｇ／ｔｅｓｔがよりいっそう好ましい。
【０００９】
（サンプル）
本発明において、試料としては糞便を用いる。糞便は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜希釈液によって希釈してサンプルとして用いてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。
【００１０】
（被検出物質）
本発明の被検出物質としては、試料である糞便中に含まれ、抗原抗体反応を利用して検出し得るものであればいずれでもよく、ウイルス、寄生虫、タンパク質などが挙げられる。
例えば感染性胃腸炎は、ウイルスおよび寄生虫が主な原因であり、被検出物質となるウイルスとしては、ノロウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、エンテロウイルス等があげられ、被検出物質となる寄生虫としてはクリプトスピリジウム、アメーバ赤痢、ジアルジア等があげられる。
このほかにも、被検出物質となるウイルスとしてインフルエンザウイルス、被検出物質となるタンパク質としては、ヒトヘモグロビン、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
【００１１】
（免疫学的検出方法）
本発明により提供される免疫学的検出方法は、免疫反応を利用する検出方法であればいずれでもよく、例えば、粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）、代表的な標識イムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法等が挙げられるが、このうちでも特にイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が望ましい。
【００１２】
（ＬＴＩＡ法）
ＬＴＩＡ法は、典型的には、２種以上の抗検出対象抗体を用いて、少なくとも１種をラテックスに固定化させ、糞便サンプル中の被検出物質とラテックス固定化抗体との免疫複合体を形成させて凝集させることにより対象物質を検出する方法である。
臨床検査で使用されるＬＴＩＡ法の試薬は、通常、第一試液、第二試液の形態で提供され、順次サンプルと混合して使用される。
本発明の抗ＩｇＡ抗体は、第一試液または第二試液のいずれか一方あるいは両方に含まれる場合があるが、少なくとも第一試液に含まれていることが望ましい。また、本発明において抗ＩｇＭ抗体を含む場合も、第一試液または第二試液のいずれか一方あるいは両方に含まれる場合があるが、少なくとも第一試液に含まれていることが望ましい。
ＬＴＩＡ法に使用されるラテックス粒子は、感度向上などの所望の性能を得るため、材質や粒子径、表面荷電量を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗検出対象抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体と検出対象との凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２〜１．６μｍであり、特に０．０３〜０．５μｍが好ましい。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
【００１３】
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法は、典型的には２種の抗検出対象抗体を用いて、（ａ）第１の抗検出対象抗体を固定化した固相（プレートなど）に試料を添加し糞便由来サンプル中の対象物と固定化抗体の複合体を形成し、（ｂ）標識物質で標識された第２の抗検出対象抗体により当該複合体とサンドイッチを形成し、これを検出する方法である。
本発明の抗ＩｇＡ抗体は、試料を希釈する希釈液に含まれている場合、（ａ）の固相にあらかじめ添加されて液状で存在する場合、添加された後乾燥されて使用されるまで乾燥状態で存在する場合、あるいは（ｂ）の抗体を含有する溶液に含まれている場合など、固相上で免疫反応が行われる際に存在していれば、いずれでもよく、このうち試料を希釈する希釈液に含まれている場合が望ましい。
【００１４】
より詳しくは、第１の抗検出対象抗体を固定化した固相（プレートなど）は、糞便由来サンプル中の検出対象を捕捉して検出対象−抗体複合体を形成する。標識物質で標識された第２の抗検出対象抗体は、当該検出対象−抗体複合体に反応してサンドイッチを形成し、標識物質に応じた方法で標識物質の量を測定することにより、サンプル中の検出対象を測定することができる。第１の抗検出対象抗体の固相への固定化の方法、第２の抗検出対象抗体の標識物質での標識の方法など、測定試薬（キット）を構成する上での具体的な方法は本明細書中に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定系として構成することもできるが、ヘテロジーニアスな測定系として構成することが好ましい。
【００１５】
（イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法）
イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、典型的には、以下のようなテストストリップを利用する。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）及び（２）を有している。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗ＩｇＡ抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
【００１６】
コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
【００１７】
以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度あるいは反射光を検出する手段により検出される。
【００１８】
次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
【００１９】
次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、検体希釈液を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
【００２０】
（サンプルパッド）
本発明に用いられるサンプルパッドは、サンプルを受け入れる部位（サンプル供給部）を有する。パッド状に成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。  
【００２１】
（サードパッド）
サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。具体的には、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、特に、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性の部材であることが望ましい。
また、本発明の多孔質性サードパッドの孔径は、平均孔径で１〜１００μｍであることが望ましく、より望ましくは１０〜１００μｍ、よりいっそう望ましくは２０〜８０μｍであり２５〜７０μｍがもっとも望ましい。１μｍ未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が不良となるからであり１００μｍより大きいと前記非特異反応物質を捕捉することができないためと思われるからである。
【００２２】
（不溶性メンブレン）
本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体または抗原の濃度は０．１〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５〜２μＬ／ｃｍが好適である。
なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
また、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体または抗原を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０〜９．５の範囲が好ましく、６．５〜８．５がより好ましく、７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
不溶性メンブレンに抗体または抗原を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体または抗原を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）をコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
【００２３】
本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
【００２４】
上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
【００２５】
（被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原）
本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、被検出物質に結合可能な抗体または抗原であり、被検出物質がウイルスや抗原の場合は抗体、被検出物質が抗体の場合は抗原が好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、後述する標識体および検出部に固定化される。標識体および検出部に固定化される抗体または抗原は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。
【００２６】
（標識体）
本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
【００２７】
（コンジュゲート）
本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されたものである。コンジュゲートは、被検出物質としてノロウィルスを検出する場合、金コロイド粒子に抗ノロウイルスモノクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
【００２８】
（その他）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、さらに測定条件、サンプルに応じて他の試薬や構成を含み得る。
他の試薬としては、例えば非特異反応を防止するブロッキング剤が挙げられる。
他の構成としては、例えば、不溶性メンブレンを移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する吸収パッドが挙げられる。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
【００２９】
（キット）
本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットは、前記イムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むものであればよい。本検出キットは、他に検出に必要な試薬、試料の希釈液、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
【００３０】
(その他)
本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
【実施例】
【００３１】
[実施例１]非特異反応抑制剤のスクリーニング
一般に非特異反応抑制剤として知られているブロッキング剤や界面活性剤とともに抗ＩｇＡ抗体の非特異反応抑制効果を調べた。
１．イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
1）金コロイド標識抗ノロウイルスモノクローナル抗体（抗ノロウイルス抗体コンジュゲート）の調製
（i）金コロイド溶液の調製
８０℃に加温した精製水５，０００ｍＬに、５．０％クエン酸三アンモニウム水溶液および５．０％  テトラクロロ金（III）酸水溶液をそれぞれ１０ｍＬずつ加え、撹拌しながら１０分間反応させた。その後反応液を再び加温し、３５分後氷水中で冷却して平均粒子径５０ｎｍの金コロイド溶液を作製した。当該金コロイド溶液を、ＲＯ水にて、極大吸収波長での吸光度が１．０  ＯＤ／ｍＬの平均粒子径５０ｎｍ金コロイド溶液（ｐＨ８．５）に調整した。
（ii）抗ノロウイルス抗体コンジュゲートの調製
上記（ｉ）で得られた金コロイド溶液（ｐＨ８．５）２０ｍＬに対し、５０μｇ／ｍＬ抗ノロウイルス抗体（コスモバイオ社）を含む２ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸水溶液（ｐＨ８．５）１．０ｍＬを添加し、１０分間撹拌した。その後、１０％ＢＳＡを１．５ｍＬ添加し、さらに５分間撹拌して抗体感作金コロイド溶液を作製した。抗体感作金コロイド溶液を１０℃で１０，０００ｒｐｍ  ４５分間遠心し、上清を除き、遠心により沈殿した抗体感作金コロイドをコンジュゲート用希釈液（Conjugate Dilution Buffer、SCRIPPS社)で希釈して回収した。回収した抗体感作金コロイドを極大吸収波長の吸光度が１．５  Ｏ．Ｄ．／ｍＬとなるよう０．５％カゼインを含むコンジュゲート用希釈液で希釈して、コンジュゲートパッド塗布液とした（コンジュゲートパッド塗布液１）。
上記１０％ＢＳＡに代えて他のブロッキング剤であるＢＰＦ(Blocking Peptide Fragment)（東洋紡エンザイム社製BPF-301）又はＮＰＳ（Neo Protein Saver）（東洋紡エンザイム社製  ＮＰＳ−３０１）を同濃度で添加した以外は同様にして抗体感作金コロイド溶液を作製した（コンジュゲートパッド塗布液２，３）。
コンジュゲートパッド塗布液１に、界面活性剤であるエパンＵ１０８（第一工業製薬株式会社製）、エパン４８５（第一工業製薬株式会社製）、プルロニックＦ６８（株式会社ＡＤＥＫＡ社製）をそれぞれ０．１％、０．１％、０．０５％となるように添加したものも併せて調整した（コンジュゲートパッド塗布液４，５，６）。
（iii）コントロールライン用金コロイド標識ＫＬＨ（ＫＬＨコンジュゲート）の調製
上記１．０  ＯＤ／ｍＬの金コロイド溶液（ｐＨ６．１）２０ｍＬに対し、２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）で６２０μｇ／ｍＬとなるよう溶解したＫＬＨ（シグマ社製）を１ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドとＫＬＨとの混合液に対し、１０％ＢＳＡ水溶液を１ｍＬ添加し、室温で５分間攪拌した。
その後、１０℃にて、１１９００×ｇで４５分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、上記コンジュゲート希釈液を１ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、ＫＬＨコンジュゲートを得た。【００３２】
２）コンジュゲートパッドの作製
上記１）で調製した各抗ノロウイルス抗体コンジュゲートパッド塗布液を３  ＯＤ／ｍＬ、ＫＬＨコンジュゲートを、それぞれ１．３３％カゼイン、４％スクロース溶液（ｐＨ７．５）と混合してコンジュゲート液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に該パッド体積の１．１３倍容量滲みこませた。７０℃のドライオーブン内で４５分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。【００３３】
３）抗ノロウイルスモノクローナル抗体固定化メンブレン（不溶性メンブレン）の作製
標識抗体とはエピトープを異にする抗ノロウイルス抗体（コスモバイオ社）を０．７５ｍｇ／ｍＬとなるよう２．５％スクロースを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で調製し、テストライン塗布液とした。また、同様に抗ＫＬＨ抗体（ウサギ由来）を０．７５ｍｇ／ｍＬとなるよう２．５％  スクロースを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で調製し、コントロールライン塗布液とした。
テストライン塗布液およびコントロールライン塗布液をニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）に幅１ｍｍのライン状に間隔をあけて塗布した。塗布はイムノクロマト法用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社製）を用い、塗布量を１．０μＬ／ｃｍに設定して実施した。７０℃のドライオーブン内で４５分間加温することにより乾燥させて抗体固相化メンブレンを作製した。【００３４】
４）サンプルパッドの作製  
０．５％スクロース、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）を調製し、サンプルパッド塗布液とした（サンプルパッド塗布液１）。
また、前記サンプルパッド塗布液１に抗ＩｇＡ抗体（コスモバイオ社）を１．５ｍｇ／ｍＬ（９０．７ｍｇ／ｔｅｓｔ）となるよう添加したものを併せて調製した（サンプルパッド塗布液２）。
一定体積のグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社製）に該パッドの２．５８倍容量となるようにサンプルパッド塗布液１またはサンプルパッド塗布液２を塗布し、７０℃のドライオーブン内で４５分間加温することにより乾燥させて各サンプルパッドを作製した。【００３５】
５）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの組み立て
図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
プラスチック製粘着シート（ａ）に不溶性メンブレン（ｂ）を貼り、次いで、サードパッド(Pall社製) （ｇ）、コンジュゲートパッド（ｄ）、サンプルパッド（ｅ）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(Whatman社製) （ｆ）を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗ノロウイルス抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗ノロウイルス抗体（ｃ１）およびコントロール試薬（ｃ２）が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化され、テストラインが流れ方向の上流側になるように配置されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗ノロウイルス抗体（ｃ１）からなるラインをテストライン、コントロール試薬（ｃ２）からなるラインをコントロールラインという。サードパッドはポリスルホンからなり、平均孔径２０〜５０μｍの多孔質膜を用いた。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にすることもできる。【００３６】
２．試験手順
正常人９人の糞便を検体として用いた（検体はいずれもノロウイルスフリーの陰性検体である）。各検体を界面活性剤を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁して０．１ｇ／ｍＬとし、ボルテックスにより良く撹拌したのち３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離をし、得られた上清をサンプルとした。
上記（ｉ）で作製した各種のテストストリップに上記サンプル１２０μＬを滴下し、１５分後に偽陽性の有無を目視観察した。【００３７】
３．試験結果
観察結果を表１に示す。非特異反応抑制効果があった場合を○、効果がなかった場合を×で示す。市販のブロッキング剤又は界面活性剤を添加した場合はいずれも非特異反応抑制効果が見られず、偽陽性を観察した。これに対して抗ＩｇＡ抗体を添加した場合は、非特異反応が抑制された。【００３８】
【表１】
2017029992.tif 000003
【００３９】
[試験例２]抗ＩｇＡ抗体の非特異反応抑制効果の確認試験
１．イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
サンプルパッド塗布液として以下（１）〜（４）、コンジュゲートパッド塗布液として試験例１のコンジュゲートパッド塗布液１を用いて、試験例１と同様にテストストリップを作製した。なお、ＨＢＲは、有効成分を抗ＩｇＭ抗体とする非特異反応抑制剤である（Clinical Chemistry 45:7，942-956， 1999）。
（１）試験例１のサンプルパッド塗布液１
（２）試験例１のサンプルパッド塗布液１にＨＢＲ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｙ社製）を０．７５ｍｇ／ｍＬ（４５．４μｇ／ｔｅｓｔ）となるように添加
（３）試験例１のサンプルパッド塗布液１に抗ＩｇＡ抗体（ヤギ由来）を１．５ｍｇ／ｍＬ（９０．７μｇ／ｔｅｓｔ）となるように添加
（４）試験例１のサンプルパッド塗布液１に抗ＩｇＡ抗体（ヤギ由来）を１．５ｍｇ／ｍＬ（９０．７μｇ／ｔｅｓｔ）、ＨＢＲを０．７５ｍｇ／ｍＬ（４５．４μｇ／ｔｅｓｔ）となるように添加【００４０】
２．試験手順
正常人４２人の糞便を検体として用いた（検体はいずれもノロウイルスフリーの陰性検体である）。各検体を、界面活性剤を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁して０．１ｇ／ｍＬとし、ボルテックスにより良く撹拌したのち３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離をし、得られた上清をサンプルとした。
上記（ｉ）で作製したテストストリップに上記サンプル１２０μＬを滴下し、１０、１５、３０分後に偽陽性の有無を目視観察した。目視観察結果は、テストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて数値化した。カラーチャートによる発色強度は０〜４まで０．２５刻みの値で数値化されている。発色強度の評価結果から、非特異反応の強さの評価を行った。
各評価基準は、以下のとおりである。
＋＋：強い非特異反応あり（１．０以上）
＋：弱い非特異反応あり（０．２５以上１．０未満）
−：非特異反応なし（０）【００４１】
【表２】
2017029992.tif 000004
【００４２】
３．試験結果
（１）非特異反応抑制効果
４２検体のうち、抗ＩｇＡ抗体を添加しない場合でも非特異反応が観察されない検体（すなわち、陰性検体）があった（結果は表に示さず）。これらの陰性検体を除いた残りの１７検体は、抗ＩｇＡ抗体を添加しなかった場合に非特異反応が起こる検体（偽陽性検体）であった。この偽陽性検体（検体番号１−１７）についてＨＢＲ（主成分：抗ＩｇＭ抗体）のみ添加、抗ＩｇＡ抗体のみ添加、ＨＢＲおよび抗ＩｇＡ抗体の両方を添加した場合の非特異反応抑制効果を調べ、結果を表２に示した。
検体番号１−３については、抗ＩｇＡ抗体を添加した場合に効果があり、ＨＢＲを添加しても非特異反応は抑制されなかったことがわかる。
検体番号４−７については、ＨＢＲを添加した場合に非特異反応抑制効果があり、抗ＩｇＡ抗体を添加しても非特異反応は抑制されなかったことがわかる。
検体番号８−１５については、ＨＢＲまたは抗ＩｇＡ抗体のいずれか一方を添加すれば非特異反応が抑制されたことがわかる。
検体番号１６，１７については、ＨＢＲのみ、あるいは抗ＩｇＡ抗体のみの一方の添加では効果が見られず、両者を添加して初めて非特異反応が抑制されたことがわかる。
以上より、市販のＨＢＲと同様に、抗ＩｇＡ抗体単独でも約７０％の偽陽性検体に効果があり、両者を組み合わせることでほぼすべての偽陽性検体の非特異反応を抑制することができた。【００４３】
[試験例３]ウイルス検出感度への影響確認試験
抗ＩｇＡ抗体を添加することによるウイルスの検出感度について調べた。参考例として市販の非特異反応抑制剤であるＨＢＲを添加した場合についても調べた。
１．イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
試験例２と同じ。
２．試験手順
ノロウイルス陽性コントロールを生理食塩液にて任意の濃度に希釈した。希釈したノロウイルス陽性コントロールを検体希釈液１，０００μＬに１０μＬ添加し、サンプル液とした。
上記１．で作製したテストストリップに上記サンプル液を１２０μＬ滴下し、１５分後のテストラインにおけるライン強度をカラーチャートを用いて数値化して評価した。
３．試験結果
結果を図２に示す。抗ＩｇＡ抗体を添加したものは、ノロウイルス陽性コントロールに対する感度の低下が見られなかった。一方、参考例のＨＢＲを添加した例では、検出感度の低下が見られた。
以上より、抗ＩｇＡ抗体は非特異反応抑制剤として実用性が極めて高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の、抗ＩｇＡ抗体存在下で免疫反応を行うことにより、糞便由来サンプルに起因する非特異反応を抑制し、サンプル中の被検出物質を正確に検出することが可能となった。特に、免疫反応としてイムノクロマトグラフィーを利用することにより、糞便由来サンプル中の被検出物質を簡便かつ正確に検出することが可能となった。
さらには、抗ＩｇＭ抗体と組み合わせることで非常に高い確率で非特異反応を抑制することができ、検出感度の低下も起きないことから非常に有用な免疫学的検出方法を提供することができた。
【符号の説明】
【００４５】
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）抗ノロウイルス抗体
（ｃ２）コントロール試薬
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
【図１】
2017029992.tif 000005
【図２】
2017029992.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月8日(2016.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法であって、非特異反応抑制剤としての抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
【請求項２】
免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、請求項１に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
【請求項４】
（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法における非特異反応抑制方法であって、抗ＩｇＡ抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
【請求項６】
免疫反応が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の存在下で行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である、請求項５に記載の方法。
（ａ）抗ＩｇＡ抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
【請求項８】
（ａ）の工程が、抗ＩｇＡ抗体及び抗ＩｇＭ抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）及び（２）を含む、前記テストストリップ。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗ＩｇＡ抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
【請求項１０】
コンジュゲートが溶出可能に保持されているコンジュゲートパッドを含む請求項９に記載のテストストリップ。
【請求項１１】
サンプルパッドに、さらに抗ＩｇＭ抗体が溶出可能に保持されている、請求項９又は１０に記載のテストストリップ。
【請求項１２】
抗ＩｇＡ抗体を有効成分とする、糞便由来サンプル用の免疫反応における非特異反応抑制剤。
【請求項１３】
さらに抗ＩｇＭ抗体を含有する、請求項１２に記載の非特異反応抑制剤。
【国際調査報告】
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