(57)【要約】  弱酸を有効成分とする分解抑制剤は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制することができるため有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤であって、弱酸を有効成分とする、分解抑制剤。
【請求項２】
前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和するものである、請求項１に記載の分解抑制剤。
【請求項３】
前記弱酸が、カルボン酸である、請求項１又は２に記載の分解抑制剤。
【請求項４】
無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、弱酸を含む、キット。
【請求項５】
前記弱酸が、カルボン酸である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法であって、糖タンパク質と、無水ヒドラジンと、弱酸とを反応させる工程を含む方法。
【請求項７】
前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記弱酸が、カルボン酸である、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応における、脱離した糖鎖の分解抑制剤、キット及び方法に関する。本願は、２０１４年６月３日に、日本に出願された特願２０１４−１１４９１６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、糖タンパク質の糖鎖が多くの生物学的機能を有することが示されている。糖タンパク質の糖鎖には、アスパラギンに結合したＮ−結合型糖鎖、セリン／スレオニンに結合したＯ−結合型糖鎖（ムチン型糖鎖）等が存在する。これらの糖鎖の生物学的機能を明らかにするためには、糖タンパク質から糖鎖を切断し、糖鎖の構造を明らかにする必要がある。【０００３】
Ｎ−結合型糖鎖を糖タンパク質から切断する場合には、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼが利用される。一方、Ｏ−結合型糖鎖を糖タンパク質から切断する場合には、アルカリ処理によるβ脱離反応が利用される。ところが、この反応では、糖鎖の還元末端におけるアルデヒド基の存在に起因して、ピーリング反応と呼ばれる糖鎖の分解が進んでしまう。そこで、ピーリング反応を抑制するために、糖鎖の還元末端のアルデヒド基を還元し、糖アルコールに変換することが行われる。【０００４】
しかしながら、糖鎖の還元末端のアルデヒド基を還元してしまうと、当該アルデヒド基を用いて糖鎖を蛍光標識して高感度分析を行う、糖鎖を固相に固定する等の有用な分析手段が使えなくなってしまう。【０００５】
そこで、糖タンパク質とＯ−結合型糖鎖とを、糖鎖の還元末端にアルデヒド基を残したまま切断する種々の方法が開発されてきた。例えば、非特許文献１には、無水ヒドラジンガスによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、反応容器内に水分吸着剤である酸化バリウムを入れることによって、脱離した糖鎖の分解が抑制されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Goso Y., et. al., Evaluation of conditions for release of mucin-type oligosaccharides from glycoproteins by hydrazine gas treatment, J. Biochem., 145, 739-749, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、発明者は、非特許文献１の方法による糖鎖の分解の抑制には、改善の余地があることを見出した。【０００８】
そこで、本発明は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤を提供することを目的とする。本発明はまた、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、脱離した糖鎖の分解が抑制されるキットを提供することを目的とする。本発明はまた、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の通りである。
（１）無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤であって、弱酸を有効成分とする、分解抑制剤。
（２）前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和するものである、請求項１に記載の分解抑制剤。
（３）前記弱酸が、カルボン酸である、（１）又は（２）に記載の分解抑制剤。
（４）無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、弱酸を含む、キット。
（５）前記弱酸が、カルボン酸である、（４）に記載のキット。
（６）無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法であって、糖タンパク質と、無水ヒドラジンと、弱酸とを反応させる工程を含む方法。
（７）前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和する、（６）に記載の方法。
（８）前記弱酸が、カルボン酸である、（６）又は（７）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の還元末端のアルデヒド基を残したまま、糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤を提供することができる。また、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、脱離した糖鎖の分解が抑制されるキットを提供することができる。また、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】マロン酸の非存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図１Ｂ】マロン酸の存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図１Ｃ】マロン酸二ナトリウム塩の存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図２Ａ】マロン酸の非存在下で、ウシフェツィンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図２Ｂ】マロン酸の存在下で、ウシフェツィンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図３】添加量を変化させたマロン酸の存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖における、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖の割合を示すグラフである。
【図４】種類を変えた弱酸の存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖における、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖の割合を示すグラフである。
【図５Ａ】マロン酸の非存在下で、ラット胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【図５Ｂ】マロン酸の存在下で、ラット胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［分解抑制剤］
１実施形態において、本発明は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤であって、弱酸を有効成分とする、分解抑制剤を提供する。
【００１３】
本実施形態の分解抑制剤は、弱酸を有効成分とする。弱酸としては、ホウ酸等の無機弱酸、カルボン酸等の有機弱酸等が挙げられる。カルボン酸としては、酢酸等の飽和脂肪酸；フタル酸等の芳香族カルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸等のジカルボン酸；クエン酸等のヒドロキシ酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。カルボン酸の誘導体としては、例えばトリフロロ酢酸等が挙げられる。
【００１４】
弱酸の炭素数は２〜８であることが好ましく、２〜５であることがより好ましい。弱酸は、液体であっても固体であってもよいが、取り扱いが容易であることから、２５℃、１気圧において、固体であることが好ましい。
【００１５】
分解抑制剤の使用量は、気相反応においては、糖タンパク質１ｍｇあたり、また、液相反応においては、糖タンパク質１ｍｇを含む無水ヒドラジン１ｍＬあたり、１μｍｏｌ以上であることが好ましく、７μｍｏｌ以上であることがより好ましく、２０μｍｏｌ以上であることが更に好ましく、７０μｍｏｌ以上であることが特に好ましい。分解抑制剤の使用量の上限としては、２００μｍｏｌ以下が好ましく、１００μｍｏｌ以下がより好ましい。
【００１６】
［糖鎖の分解を抑制する方法］
１実施形態において、本発明は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法であって、糖タンパク質と、無水ヒドラジンと、弱酸とを反応させる工程を含む方法を提供する。弱酸としては、上述した分解抑制剤の有効成分として挙げたものが好ましく用いられ、例えば、カルボン酸であってもよい。
【００１７】
本実施形態において、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応は、気相で行ってもよく、液相で行ってもよい。
【００１８】
（気相での反応）
β脱離反応により脱離した糖鎖のピーリング反応を抑制するためには、可能な限り水が存在しない条件で反応することが好ましい。このため、β脱離反応に供する糖タンパク質は、十分に乾燥していることが好ましい。
【００１９】
反応容器としては、内部を真空状態にできる容器が好ましい。また、無水ヒドラジンと糖タンパク質とを気相で反応させるためには、液体の無水ヒドラジンが糖タンパク質と直接接触しないことが好ましい。例えば、糖タンパク質を試験管等の容器に入れ、この試験管を反応容器内に設置し、液体の無水ヒドラジンを反応容器内の上記試験管の外部の領域に添加するとよい。
【００２０】
上述した分解抑制剤（弱酸）は、糖タンパク質と混合して上記の試験管内に添加することが好ましい。無水ヒドラジンと、糖タンパク質と、弱酸とを上述のように反応容器内に設置した後、反応容器内を減圧条件にして反応させる。これにより、無水ヒドラジンがガスとなり、気相において糖タンパク質と反応することができる。反応温度は５０〜８０℃が好ましく、６０〜７０℃がより好ましい。反応時間は、６〜７２時間が好ましく、１０〜４８時間がより好ましく、１５〜２０時間が更に好ましい。以上の方法により、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応を行うことができ、脱離した糖鎖の分解を抑制することができる。
【００２１】
（液相での反応）
液相で反応する場合においても、β脱離反応により脱離した糖鎖のピーリング反応を抑制するためには、可能な限り水が存在しない条件で反応することが好ましい。このため、β脱離反応に供する糖タンパク質は、十分に乾燥していることが好ましい。
【００２２】
反応容器としては、内部を真空状態又は密閉状態にできる容器が好ましい。乾燥した糖タンパク質及び上述した分解抑制剤（弱酸）を無水ヒドラジンに溶解させて、試験管等の容器に入れ、この試験管を反応容器内に設置する。続いて、反応容器内に空気（酸素）が存在する場合には、これを窒素で置換して除く。反応容器内の空気を窒素で置換するのは、酸素が存在するとヒドラジンが爆発する危険があるためである。反応容器内の空気を窒素で置換する方法としては、例えば、容器の減圧及び容器への窒素封入を繰り返した後、圧力を大気圧に戻した状態でバルブを閉めて密閉することが挙げられる。その後、無水ヒドラジンと糖タンパク質とを液相で反応させる。反応温度は５０〜８０℃が好ましく、６０〜７０℃がより好ましい。反応時間は、６〜７２時間が好ましく、１０〜４８時間がより好ましく、１５〜２０時間が更に好ましい。以上の方法により、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応を行うことができ、脱離した糖鎖の分解を抑制することができる。
【００２３】
上述した気相及び液相におけるいずれの反応においても、糖タンパク質から切断したＯ−結合型糖鎖は、還元末端にアルデヒド基を有している。このため、例えば、このアルデヒド基を用いて糖鎖を蛍光標識し、高感度分析を行うことができる。また、例えば、上記のアルデヒド基を用いて糖鎖を固相に固定し、糖鎖チップを作製することも可能である。
【００２４】
［キット］
１実施形態において、本発明は、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、弱酸を含む、キットを提供する。弱酸としては、上述した分解抑制剤の有効成分として挙げたものが好ましく用いられ、例えば、カルボン酸であってもよい。
【００２５】
キットは、上記の弱酸の他に、試験管、反応容器、無水ヒドラジン、脱離した糖鎖精製用のカラム等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００２７】
〔実験例１〕
中性糖鎖である糖タンパク質のモデルとして、ブタ胃ムチンを使用した。また、弱酸としてマロン酸を使用した。マロン酸の非存在下、存在下、及びマロン酸二ナトリウム塩の存在下で無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、切断した糖鎖を蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００２８】
［マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析］
（無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離）
ブタ胃ムチン（タイプＩ、シグマ社）をペプシン消化及びエタノール沈殿により部分的に精製した。精製したブタ胃ムチン１５０μｇを試料とした。上記試料を、内径１０ｍｍ、長さ７５ｍｍの試験管に入れた。続いて、この試験管を、乾燥剤としてＰ２Ｏ５を入れたデシケーター内に入れ、７２時間以上真空乾燥した。【００２９】
続いて、上記試験管を、反応容器「Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｖｉａｌ」（商品名、Ｗａｔｅｒｓ社）内に設置し、反応容器内の上記試験管の外部の領域に、１５０μＬの無水ヒドラジン（増田化学社）を入れた。無水ヒドラジンの添加は、湿気を防ぐために、乾燥窒素ガス雰囲気下で行った。続いて、反応容器をＷａｔｅｒｓ  Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（商品名、Ｗａｔｅｒｓ社）にセットし、反応容器内を真空（圧力２００Ｐａ以下）にして反応容器のコックを閉じた。続いて、反応容器を６５℃で１８時間加熱した。次に、真空中、コールドトラップを用いてヒドラジンを除去し、続いて、濃硫酸を入れた真空デシケーター内でヒドラジンを完全に除去した。【００３０】
（再アセチル化）
続いて、無水酢酸−飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加することにより、脱離した（切断された）糖鎖を再アセチル化した。【００３１】
（イオン交換カラムによる分画）
続いて、再アセチル化反応後の試料を、Ｄｏｗｅｘ５０（バイオラッド社）カラムにかけ、通過した画分をＱＡＥ−トヨパール（トーソー社）カラムにかけた。通過した画分（中性糖鎖）を回収し、凍結乾燥した。【００３２】
（アントラニル酸ラベル）
回収した上記の中性糖鎖に、アントラニル酸（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、和光純薬工業）を常法により反応させて、糖鎖を蛍光標識した。続いて、未反応の試薬をＤＰＡ−６Ｓカラム（シグマ社）で除去した。【００３３】
（蛍光ＨＰＬＣ）
蛍光標識された糖鎖をＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラム（トーソー社）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。カラムのバッファーには、０．２％酢酸−０．２％トリエチルアミン−水溶液（バッファーＡ）及び０．１％酢酸−アセトニトリル（バッファーＢ）を容量比１５：８５で混合したものを使用した。溶出は、３５℃、流速０．７ｍＬ／分で、１２０分間かけてＢバッファーの濃度を８５％から５０％までの直線勾配で変化させて行った。検出は、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍで行った。【００３４】
結果を図１Ａに示す。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。【００３５】
［マロン酸の存在下での糖鎖の切り出し及び解析］
試料として、ブタ胃ムチン１５０μｇに、マロン酸１０μｍｏｌを混合したものを用いた点以外は、上述した「マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析」と同様の操作により糖鎖を切り出し、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００３６】
結果を図１Ｂに示す。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。マロン酸の非存在下で糖鎖の切り出しを行った場合と比較して、分解した糖鎖のピークが顕著に減少したことが示された。【００３７】
［マロン酸二ナトリウム塩の存在下での糖鎖の切り出し及び解析］
試料として、ブタ胃ムチン１５０μｇに、マロン酸二ナトリウム塩１０μｍｏｌを混合したものを用いた点以外は、上述した「マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析」と同様の操作により糖鎖を切り出し、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００３８】
結果を図１Ｃに示す。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。マロン酸の非存在下で糖鎖の切り出しを行った場合と比較して、分解した糖鎖のピークにほとんど変化が見られなかった。この結果は、マロン酸の存在下では糖鎖の分解が抑制されるが、マロン酸二ナトリウム塩の存在下では糖鎖の分解があまり抑制されないことを示す。したがって、脱離した糖鎖の分解を抑制するためには、弱酸はアルカリ塩ではなく、酸の状態で存在していることが必要であると考えられた。  【００３９】
また、この結果から、弱酸は、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和することによって、脱離した糖鎖の分解を抑制するものと考えられた。発明者は、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応が、脱離した糖鎖の分解と比較して極めて速やかに起こるため、β脱離反応にはあまり影響を与えることなく、脱離した糖鎖の分解を抑制することができるものと推測している。【００４０】
〔実験例２〕
酸性糖鎖である糖タンパク質のモデルとして、ウシフェツィンを使用した。また、弱酸としてマロン酸を使用した。マロン酸の非存在下及び存在下で無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、切断した糖鎖を蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００４１】
［マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析］
（無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離）
ウシフェツィン（シグマ社）１５０μｇを試料とした点以外は、実験例１の「マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析」と同様の操作により、β脱離及び再アセチル化を行った。【００４２】
（イオン交換カラムによる分画）
続いて、再アセチル化反応後の試料を、Ｄｏｗｅｘ５０（バイオラッド社）カラムにかけ、通過した画分をＱＡＥ−トヨパール（トーソー社）カラムにかけた。カラムに吸着した画分（酸性糖鎖）を０．４Ｍ酢酸ピリジニウム、ｐＨ５．０で溶出し、凍結乾燥した。【００４３】
（アントラニル酸ラベル）
回収した上記の酸性糖鎖に、アントラニル酸（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、和光純薬工業）を常法により反応させて、糖鎖を蛍光標識した。続いて、未反応の試薬をＤＰＡ−６Ｓカラム（シグマ社）で除去した。【００４４】
（蛍光ＨＰＬＣ）
蛍光標識された糖鎖を、上述した実験例１の「マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析」と同様の操作により、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００４５】
結果を図２Ａに示す。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。なお、保持時間５０分付近にみられるピークは、Ｎ−結合型糖鎖に由来するものである。【００４６】
［マロン酸の存在下での糖鎖の切り出し及び解析］
試料として、ウシフェツィン１５０μｇに、マロン酸１０μｍｏｌを混合したものを用いた点以外は、上述した、ウシフェツィンの「マロン酸の非存在下での糖鎖の切り出し及び解析」と同様の操作により糖鎖を切り出し、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００４７】
結果を図２Ｂに示す。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。マロン酸の非存在下で糖鎖の切り出しを行った場合と比較して、分解した糖鎖のピークが顕著に減少したことが示された。なお、保持時間５０分付近にみられるピークは、Ｎ−結合型糖鎖に由来するものである。【００４８】
〔実験例３〕
マロン酸の添加量を変化させて、糖鎖の分解への影響を検討した。具体的には、マロン酸の添加量を、０、１、３、１０及び３０μｍｏｌに変えた点以外は、実験例１と同様の操作により、ブタ胃ムチンから無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００４９】
続いて、検出された蛍光ＨＰＬＣのピークに基づいて、分解した糖鎖のピークの合計の面積及び分解していない糖鎖のピークの合計の面積を算出した。図３は、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖の割合を示すグラフである。各割合は、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖のピークの合計の面積を１００％とした割合（％）で示した。【００５０】
その結果、マロン酸の添加量０μｍｏｌ（非添加）と比較して、マロン酸の添加量１、３、１０及び３０μｍｏｌでは、分解した糖鎖の割合が顕著に減少したことが示された。マロン酸の添加量１０μｍｏｌにおいて、糖鎖の分解が最も抑制された。【００５１】
〔実験例４〕
弱酸の種類を変えて、糖鎖の分解への影響を検討した。具体的には、弱酸として、シュウ酸（炭素数２）、マロン酸（炭素数３）、コハク酸（炭素数４）、グルタル酸（炭素数５）、アジピン酸（炭素数６）及びクエン酸（炭素数６）を、各１０μｍｏｌ使用した点以外は、実験例１と同様の操作により、ブタ胃ムチンから無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００５２】
続いて、検出された蛍光ＨＰＬＣのピークに基づいて、分解した糖鎖のピークの合計の面積及び分解していない糖鎖のピークの合計の面積を算出した。図４は、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖の割合を示すグラフである。各割合は、分解した糖鎖及び分解していない糖鎖のピークの合計の面積を１００％とした割合（％）で示した。【００５３】
その結果、いずれの弱酸を用いた場合においても、弱酸の非存在下（図３の０μｍｏｌの結果）と比較して、分解した糖鎖の割合が顕著に減少したことが示された。【００５４】
〔実験例５〕
弱酸の種類を変え、液相でＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応を行い、糖鎖の分解への影響を検討した。具体的には、Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応を以下の手順で行い、弱酸として酢酸（炭素数２）又はトリフロロ酢酸（炭素数２）を使用した点以外は、実験例１と同様の操作により、ブタ胃ムチンからＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００５５】
Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応は次の手順により行った。まず、精製したブタ胃ムチン１５０μｇを、内径１０ｍｍ、長さ７５ｍｍの試験管に入れた。続いて、この試験管を、乾燥剤としてＰ２Ｏ５を入れたデシケーター内に入れ、７２時間以上真空乾燥した。続いて、上記試験管に、無水ヒドラジン１５０μＬ及び酢酸又はトリフロロ酢酸を１０μｍｏｌ添加して、溶解した。続いて、反応容器をＷａｔｅｒｓ  Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（商品名、Ｗａｔｅｒｓ社）にセットし、反応容器内の空気を窒素に置換し、１気圧にて反応容器のコックを閉じた。続いて、反応容器を６５℃で１８時間加熱した。続いて、濃硫酸を入れた真空デシケーター内でヒドラジンを完全に除去した。この後の操作は実験例１と同様に行った。【００５６】
その結果、酢酸又はトリフロロ酢酸を液相で使用した場合においても、糖鎖の分解の抑制の効果が認められた。【００５７】
〔実験例５〕
より複雑な糖タンパク質のモデルとして、ラット胃ムチンを使用した。また、弱酸としてマロン酸を使用した。マロン酸の非存在下及び存在下で無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離を行い、切断した糖鎖を蛍光ＨＰＬＣで解析した。【００５８】
ラット胃ムチン（発明者によりラット胃粘膜から抽出、精製された標品）１５０μｇを試料とした点以外は、実験例１と同様の操作により、無水ヒドラジンガスによるＯ−結合型糖鎖のβ脱離、再アセチル化、イオン交換カラムによる分画、アントラニル酸ラベル及び蛍光ＨＰＬＣ解析を行った。【００５９】
図５Ａは、マロン酸の非存在下でラット胃ムチンから切り出した糖鎖の、蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。図５Ｂは、マロン酸の存在下でラット胃ムチンから切り出した糖鎖の、蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。図５Ａ及び図５Ｂにおいて、矢印で示す領域は、シグナル強度を１／１０倍にして表示しており、実際のシグナル強度は図に示す値の１０倍である。また、「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。その結果、マロン酸の非存在下で糖鎖の切り出しを行った場合と比較して、マロン酸の存在下で糖鎖の切り出しを行うと、分解した糖鎖のピークが顕著に減少したことが示された。【００６０】
以上の結果から、弱酸を有効成分とする分解抑制剤は、より複雑な糖タンパク質を有するラット胃ムチンのグライコーム解析にも適用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の還元末端のアルデヒド基を残したまま、糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤を提供することができる。また、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、脱離した糖鎖の分解が抑制されるキットを提供することができる。また、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法を提供することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年11月13日(2015.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤であって、無機弱酸、飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される弱酸を有効成分とする、分解抑制剤。
【請求項２】
前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和するものである、請求項１に記載の分解抑制剤。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、請求項１又は２に記載の分解抑制剤を含む、キット。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法であって、糖タンパク質と、無水ヒドラジンと、無機弱酸、飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される弱酸とを反応させる工程を含む方法。
【請求項７】
前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和する、請求項６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
献１には、無水ヒドラジンガスによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、反応容器内に水分吸着剤である酸化バリウムを入れることによって、脱離した糖鎖の分解が抑制されたことが記載されている。
先行技術文献
非特許文献
［０００６］
非特許文献１：Ｇｏｓｏ  Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒａｚｉｎｅ  ｇａｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４５，７３９−７４９，２００９．
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００７］
しかしながら、発明者は、非特許文献１の方法による糖鎖の分解の抑制には、改善の余地があることを見出した。
［０００８］
そこで、本発明は、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤を提供することを目的とする。本発明はまた、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、脱離した糖鎖の分解が抑制されるキットを提供することを目的とする。本発明はまた、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［０００９］
本発明は以下の通りである。
（１）無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤であって、無機弱酸、飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される弱酸を有効成分とする、分解抑制剤。
（２）前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和するも
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
のである、（１）に記載の分解抑制剤。
（３）無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、（１）又は（２）に記載の分解抑制剤を含む、キット。
（４）無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法であって、糖タンパク質と、無水ヒドラジンと、無機弱酸、飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される弱酸とを反応させる工程を含む方法。
（５）前記弱酸は、前記糖タンパク質からの前記Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応後に、前記無水ヒドラジンに基づいて形成されたアルカリ環境を中和する、（４）に記載の方法。
発明の効果
［００１０］
本発明により、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の還元末端のアルデヒド基を残したまま、糖鎖の分解を抑制する分解抑制剤を提供することができる。また、無水ヒドラジンによる糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応用キットであって、脱離した糖鎖の分解が抑制されるキットを提供することができる。また、無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応において、脱離した糖鎖の分解を抑制する方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
［００１１］
［図１Ａ］マロン酸の非存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
［図１Ｂ］マロン酸の存在下で、ブタ胃ムチンから切り出した糖鎖の蛍光ＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。「＊」印は、分解した糖鎖のピークを示し、「○」印は、分解していない糖鎖のピークを示す。
【国際調査報告】
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