(57)【要約】  本発明に係る生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物と、ソルビトールと、５（ｗ／ｖ）％濃度以下の界面活性剤とを含む、溶液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物と、ソルビトールと、５（ｗ／ｖ）％濃度以下の界面活性剤とを含む、溶液である、生物材料用透明化試薬。
【請求項２】
上記化合物として尿素を含む、溶液である、請求項１に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項３】
ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む、請求項１又は２に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項４】
尿素を１．０Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含む、請求項１から３の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項５】
界面活性剤が非イオン性の界面活性剤である、請求項４に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項６】
上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項７】
グリセロールを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項８】
シクロデキストリン類を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項９】
多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものである、請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤している、生物材料透明化処理システム。
【請求項１１】
請求項１から９の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程を含む、生物材料の透明化方法。
【請求項１２】
請求項１から９の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を含む、生物材料用透明化処理キット。
【請求項１３】
含まれているソルビトールの濃度が異なる上記生物材料用透明化試薬を複数種備えている、請求項１２に記載の生物材料用透明化処理キット。
【請求項１４】
Ａ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、及び、Ｂ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を５Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを２０（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、からなる群から選択される１以上の生物材料透明化試薬を含む、請求項１２又は１３に記載の生物材料用透明化処理キット。
【請求項１５】
ソルビトールを含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含み、かつ尿素を除く水溶液を透明化工程の前処理液としてさらに含む、請求項１３又は１４に記載の生物材料用透明化処理キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物材料用の透明化試薬、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡を用いて生物材料の深部を観察する際には、透明化試薬を用いた処理（透明化処理）が必要となる。【０００３】
透明化試薬及び透明化処理方法としては、例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載のAnn-Shyn ChiangによるFocus Clear（商品名）溶液、或いは非特許文献２に記載のHans-Ulrich Dodtらのtissue clearing methodが代表的なものとして知られている。これらは何れも、組織を透明化することで、組織中に存在する、蛍光物質で標識された構造を観察する目的で使用される。【０００４】
これらの方法は、透明化処理の有効成分等として有機溶剤が必須であるため生物材料に用いることは難しく、また、透明化処理の対象となる生物材料の収縮を引き起こし得るという問題があった。【０００５】
これらの問題を鑑み、尿素を含む水溶性試薬を用いた透明化技術（Ｓｃａｌｅ）が開発された。Ｓｃａｌｅによって、生物材料を透明化して３次元的に生物材料の構造を観察する技術の礎が確立された。（特許文献２、非特許文献３）。【０００６】
例えば、Ｓｃａｌｅの開示の後には、フルクトースを含む溶液によって屈折率を調整し、生物材料を透明化する技術（ＳｅｅＤＢ）が開示された（特許文献３、非特許文献４）。ＳｅｅＤＢ法は、処理の間に生じる生物材料の変性を最小限に抑えることが目的であり、光学顕微鏡での観察の結果、膜構造や軸索といった生物材料の形状が保たれていることが示された。しかし、観察対象の屈折率が非常に高くなり、観察のパフォーマンスを十分に発揮するには、２光子顕微鏡および高屈折率に最適なレンズを用いる必要がある。【０００７】
非特許文献５には、電気泳動装置を用いた物理化学的な方法によって透明化を行う技術（ＣＬＡＲＩＴＹ）が開示されている。ＣＬＡＲＩＴＹは、アクリルアミドポリマーを用いて固めた脳組織を、電気泳動装置を用いて物理化学的に処理して脂質成分を除去し、脳組織を２週間で透明化する。しかし、専用デバイスが必要であり、工程も煩雑という問題がある。また、電気泳動は時間に応じて発熱するため、生物材料中のタンパク質の熱変性を防ぐことが難しい。【０００８】
加えて、ＣＬＡＲＩＴＹは高濃度（4%）のイオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）によって組織から脂質を溶出させることで脂質膜による光散乱を除き透明化を行うことから、細胞の形質膜、分泌小胞などの構造や、脂質膜中に浮遊しているタンパクなどを大きく損なうことになる。【０００９】
このように、尿素を用いた透明化技術のＳｃａｌｅに続いて、生物材料の透明化技術が様々に開発されているが、Ｓｃａｌｅのみが有する利点が顕在している。【００１０】
例えば、高屈折率に最適なレンズおよび２光子顕微鏡という汎用性に乏しい装置を必要とするＳｅｅＤＢの問題、また専用デバイスの必要性と生物材料の熱変性というＣＬＡＲＩＴＹにおける問題は、Ｓｃａｌｅには存在しない。ところで、従来のＳｃａｌｅでは工程が非常に簡便という利点があるが、生物材料の原形を保ちつつ、さらに迅速に透明度（光透過性）を上げることが求められていた。【００１１】
最近では、Ｓｃａｌｅ技術と同じく尿素による透明化を基本として、アミノアルコールおよび非イオン性界面活性剤をさらに含む透明化試薬で生物材料を処理したことで透明度に優れた透明化を達成する技術（ＣＵＢＩＣ）も開発されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６４７２２１６号公報（特許日２００２年１０月２９日）
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１１／１１１８７６（公開日２０１１年９月１５日）
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ２０１３／１９１２７４（公開日２０１３年１２月２７日）
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ann-Shyn Chiang et al.: Insect NMDA receptors mediate juvenile hormone biosynthesis. PNAS 99(1), 37-42 (2002).
【非特許文献２】Hans-Ulrich Dodt et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4 (4), 331-336 (2007).
【非特許文献３】Hama et al.: Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.  Nat Neuroscience 14(11), 1481-8（2011）.
【非特許文献４】Ke et al.: SeeDB: a simple and morphology-preserving opticalclearing agent for neuronal circuit reconstruction.  Nat Neuroscience 16(8), 1154-61（2013）.
【非特許文献５】Chung et al.: Structural and molecular interrogation of intact biological systems.  Nature 497(7449), 332-7（2013）.
【非特許文献６】Susaki et al.: Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.  Cell 157(3), 726-39（2014）.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これまで、生物材料の透明化に際して、生物材料の原形を保つことと、透明度（光透過性）を上げる時間を短縮することとは、相反する課題であり、同時には達成できなかった。【００１５】
例えば、ＷＯ２０１２／１４７９６５に開示された技術（Ｓｃａｌｅ  Ｂ４）では、生物材料の透明度を上げることに要する時間の短縮が可能である。しかし、透明化処理の有効成分である尿素等の浸潤を急速に進めることに比重を置くと高濃度の尿素で処理するため、生物材料の膨張（変形）を招来してしまう。【００１６】
ＷＯ２０１１／１１１８７６に開示された技術（Ｓｃａｌｅ  Ｕ２）では、生物材料の膨張を有効に抑えられるが、透明度を上げる時間を短縮する効果は得られていない。【００１７】
このように、生物材料の原形を保つことと、透明度（光透過性）を上げる時間の短縮の両立は達成されていない。【００１８】
ＣＵＢＩＣは透明度を上げる時間が短縮されているが、高濃度に含まれる非イオン性界面活性剤の影響によって細胞組織の構造が破壊されている虞があった。また、アミノアルコールを含むＣＵＢＩＣの溶液のｐＨが１１．４であることから、強いアルカリによって膜を構成するタンパク質の変性や喪失が生じ、細胞を構成する膜の正常な微細構造の保持が為されていない可能性が高い。実際、本発明者らが電子顕微鏡を用いて微細構造を観察した結果、ＣＵＢＩＣで処理された生物材料の細胞では組織形状の深刻な破壊が起こっていることを発見した。この知見より、本発明者らは、ＣＵＢＩＣにおける透明化処理の時間短縮という効果は、生物材料が変性して細胞の微細構造が崩れたことによって透明化試薬が浸潤しやすくなった結果であることに気付いた。【００１９】
従って、これまで、生物材料の原形を保つうえで生物材料中の細胞の微細構造のレベルでも形状を大きく変化させずに、かつ迅速に透明化を行うことが出来る透明化試薬は提供されていない。【００２０】
本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、有効成分として尿素又は尿素誘導体とソルビトールとの組合せによる相乗効果を利用した、新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。まず、生物材料中に浸潤した際に透明度が向上する有効成分の検討を行ったところ、単独の使用では実質的に効果が見いだされなかったソルビトールが、尿素又は尿素誘導体と組合わせ使用されることで、透明度を上げる顕著な効果を奏することを見出した。また、ソルビトールは生物材料を収縮させるため、ソルビトールと尿素を組み合わせることで、Ｓｃａｌｅ  Ａ２やＳｃａｌｅ  Ｕ２の問題である生物材料の膨張を防ぐ効果が得られた。さらに、当該透明化試薬で蛍光タンパク質を発現した生物材料を透明化した場合に、既存の透明化試薬と比べて蛍光タンパク質の蛍光の消失が少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適していることが分かった。【００２２】
次いで、透明度を上げる時間をさらに短縮する効果を得る方法として、生物材料の微細構造を崩すことなく透明化試薬を効率的に浸潤させるために、生物材料を一度収縮させる処理を行ったあと収縮作用を除いた後の応力によって体積が復元する際に透明化試薬を浸潤させるという着想を得た。このことにより、タンパク質の変成や細胞微細構造の破壊を起こす化学的処理を施すことなく透明化試薬を効率的に浸潤させることが可能となった。【００２３】
以上より、本願発明を想到するに至った。【００２４】
すなわち、本発明は、上記の課題を解決するために、以下の構成を備えてなる。【００２５】
尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物と、ソルビトールと、５（ｗ／ｖ）％濃度以下の界面活性剤とを含む、溶液である、生物材料用透明化試薬。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、尿素又は尿素誘導体とソルビトールとの組合せを用いた生物材料用透明化試薬であって、生物材料の原形を大きく変化させずに、迅速に透明度を向上させることが出来る透明化試薬、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、光学的透明化、及び、シグナル／構造保存に関するＳｃａｌｅＳの性能を示す。（ａ）は、ＳｃａｌｅＳ（左）、又はＰＢＳ（右）によって処理した後のマウスの脳半球全体（１０週齢）を示し、模様のついた背景と共に撮影された（２．５ｍｍ平方に罫線を引かれたグラフ用紙）写真をもとにした図である。（ｂ，ｃ）は、１０週齢のＹＦＰ−Ｈマウス（ｂ）と１０週齢のＣｈＲ２−ＹＦＰマウス（ｃ）の脳半球を、ＳｃａｌｅＳ（左）又はＰＢＳ（右）によって処理し、透過度（T：transmission）及びＹＦＰ蛍光（ＦＬ）の保持性を比べた図である。タンパク質漏出は組織固定の程度によって異なるため、用いる動物毎に異なる場合がある。ここでは、同一マウスの脳の左半球と右半球とを使用することによって、ＳｃａｌｅＳとＰＢＳとの正確な比較を行った。Ａ：（前頭部）、Ｐ：（後頭部）。スケールバー：２．５ｍｍ。透明化のためのインキュベーション時間は、サンプルのサイズに応じて最適化した。透過画像は、（ａ）と同一模様の背景使用下によって得た。（ｄ−ｈ）は、ＳｃａｌｅＳ処理後に当該処理前の状態に復元したサンプルに対する、ＴＥＭ観察の結果を示す。ＹＦＰ−Ｈマウス（１０週齢）の脳半球全体を４％ＰＦＡによって固定し、ＳｃａｌｅＳによって完全に透明化した。透明サンプルを一晩かけてイメージング実験に供するという前提のもと、マウンティング溶液（ＳｃａｌｅＳ４）内３７℃で１４時間インキュベートした。次いで、この透明サンプルをＰＢＳで洗浄することによって、ＳｃａｌｅＳで処理する前の状態に戻した（復元）。その後１ｍｍの立方体を復元サンプルから取り出し、超薄切片作製のために使用した。（ｄ）は皮質層ＩＩ／ＩＩＩの錐体ニューロンの二つの細胞体における顕微鏡写真を示す図である。（ｅ）は、（ｄ）中のボックスに対応する、拡大された顕微鏡写真の図である。（ｆ）は、（ｅ）中のボックスに対応している、拡大された顕微鏡写真の図である。対称性シナプスが、塗り潰していない矢頭によって示されている。（ｇ，ｈ）は、ニューロピル内の二か所（（ｄ）中に示すボックス）に存在する興奮性非対称性シナプスの図である。塗り潰された矢頭はシナプス後肥厚部を示している。Ｄｅｎは樹状突起、ＡＨは軸索小丘、ＡＩＳは軸索起始部、ＡＴは軸索終末を示す。スケールバーは、（ｅ）は３μｍ、（ｆ）（ｆ‘）（ｇ）（ｈ）は２００ｎｍ。
【図２】図２は、Ａβアミロイドーシスを可視化するために、老齢ＡＰＰノックインマウスＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆ（２０月齢）の脳左半球に、ＡｂＳｃａｌｅを適用した結果を示す。脳半球の最大サイズは長さ６ｍｍ、幅４ｍｍ、高さが４ｍｍである。（ａ）は三重色免疫組織化学のダイアグラムを示す。脳半球全体に対するプレカット（切断前）染色は、抗−Ａβモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０, シアン色で表示）と抗−ＮｅｕＮ モノクローナル抗体（Cy5-A60,マゼンタ色で表示）とを用いて行った。脳切除部分に対するポストカット（切断後）染色は、抗-ＮｅｕＮポリクローナル抗体（Ｃｙ３−αＮｅｕＮ, 黄色で表示）を用いて行った。解り易さをきたすため、海馬細胞層を強調して示している；この細胞層は、プレカット染色後はマゼンタ色に、その後、ポストカット染色後は黄色とマゼンタ色の混合色に表示されている。（ｂ−ｄ）は、以下の色に染色された蛍光発光画像を示す図である。（ｂ）はＣｙ３−βＮｅｕＮ（黄色で表示）で染色されたポストカットで、（ｃ）はＣｙ５−Ａ６０（マゼンタ色で表示）で染色されたプレカットで、（ｄ）はＡｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０ （シアン色で表示）で染色されたプレカットである。Ｃｙ５−Ａ６０がＮｅｕＮのＣ末端に反応する一方で、Ｃｙ３−αＮｅｕＮはタンパク質全体に反応する。ゆえに二つの抗体の間で競合は起こらない。（ｃ）に示されているように、各ニューロン細胞核の蛍光シグナル強度は、脳表面および正中面からの距離に関わらず、セクション内でほぼ同一であり、これにより、脳半球内へCy5-A60が効率的に浸透していることが示唆される。（ｅ）は（ｂ）と（ｃ）とを合成した画像である。（ｆ）は（ｃ）と（ｄ）とを合成した画像である。（ｇ，ｈ）は（ｆ）の高倍率画像を示す。ＳＣＸ：体性感覚皮質。全てのスケールバーは１ｍｍを示している。
【図３】図３は、Ａβ斑の３Ｄ可視化として、ＣｈｅｍＳｃａｌｅとＡｂＳｃａｌｅの複合方式を適用した結果を示す。（ａ，ｂ）は、１８月齢（ａ）と９月齢（ｂ）のＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆマウスの脳半球全体中におけるＡβ斑を３Ｄ可視化した図である。脳半球は、PP-BTA-1（赤）とＡｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０ （緑）とで染色されている。透明化された脳半球の外側面と、中央平面に向けたボリュームレンダリング画像を観察するために、１０×対物レンズを備えたOlympus FV1000 システムを使用した。（ａ）の図から鑑みれば、斑は脳半球全体に散布しているように見えるが、異なった角度（データ表示なし）からの観察によれば斑は主に大脳皮質に存在している。Ａは前頭部を、Ｐは後頭部を示す。（ａ）中の差し込み図は、典型的な老人斑の高倍率ボリュームレンダリング画像の図である。（ｃ）は２０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆマウスの大脳皮質内の一部のＡβ斑 （Ａｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０, 緑色）と血管（Texas Red lectin, 赤色）の３Ｄ可視化を示した図である。その観察には、２０×対物レンズを備えたZEISS Lightsheet Z.1を使用した。後方と前方からの透視画像が、異なる奥行きと角度で撮った複数の画像から作成されている。
【図４】図４は、Ａβ斑とミクログリア間の相互作用を３Ｄ可視化した図であり、二重色ＡｂＳｃａｌｅを応用した図である。Ａｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０とＡｌｅｘａ５４６-Ｉｂａ１（ウサギ抗−Ｉｂａ１ポリクローナル抗体＋Ａｌｅｘａ５４６で標識した抗ウサギＩｇＧ抗体）とによって免疫染色された、老齢ＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆマウスの脳スライスを材料に３Ｄ−ＩＨＣを行って全てのデータを得た。６Ｅ１０陽性Ａβ斑とＩｂａ１陽性ミクログリアとはそれぞれ緑色と赤色で示されている。（ａ）は、厚さ２ｍｍの脳スライス内のＡβ斑とミクログリアとが、どのように免疫染色され、さらにＳＰＩＭシステムでどのように観察・画像化されたかを示す概略ダイアグラムである。Ａβ斑とミクログリアとはそれぞれ緑色の斑点と赤色の点で示されている。青緑色とオレンジ色の矢印はそれぞれＳＰＩＭシステムの照明光と検出の方向を示している。実際の観察領域を四角で囲んでいる。ＸＹＺ座標は対象物に対して定義されている。（ｂ−ｉ）は、２０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆマウスを使用したデータである。（ｂ，ｃ）は、観察領域から生成した２つのボリュームレンダリング画像である（（ｂ）ｘｙ面;（ｃ）ｘｚ面;（ａ）のｘｙｚ面参照）。（ｄ）は観察領域内に検出された３７個のＡβ斑とミクログリアの高倍率ボリュームレンダリング画像である。（ｅ）は、斑を中心に、３Ｄ空間上で測定された距離を示す図である。斑の縁から、それぞれのミクログリア中心部への、自動計算された距離（黄色の矢印）を表す。（ｆ−ｈ）は、異なるミクログリア相互作用を示す二つのＡβ斑を示す図である。（ｈ）は二つの斑の、斑の縁からミクログリア中心までの距離を示したヒストグラム図である。グラフには、活性化されたミクログリア（ピンク色）の数と、休眠状態のミクログリア（スミレ色）の数とが示されている。（ｉ）のヒストグラム図は、３７斑すべてについて、斑の縁から近接するミクログリアの中心部への距離を示している。（ｊ−ｌ）は、１０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ/ＮＬ−Ｆマウスを使用したデータである。（ｊ）は、観察領域から生成したボリュームレンダリング画像を示す図である（ｘｙ面）。（ｋ）は観察領域内に検出された２７個のＡβ斑とミクログリアの高倍率ボリュームレンダリング画像を示す図である。（ｌ）のヒストグラム図は、その２７斑すべてについて、斑の縁から近接するミクログリアの中心部への距離を示している。
【図５】図５は、ＡＤ患者（２人）の死後脳サンプル内に存在するＡβ斑とミクログリアとの間の相互作用を、多色ＡｂＳｃａｌｅを使って３Ｄ可視化した図である。データはＡｌｅｘａ４８８-６Ｅ１０、Ａｌｅｘａ５４６-Ｉｂａ１および Ｃｙ５-Ｃ６０を用いた３Ｄ−ＩＨＣによって得られた。（ａ−ｃ）は、８４才の女性（認識番号♯１６１７）のサンプルから得たデータである。（ａ）は観察領域から得られたボリュームレンダリング画像（ＸＺ面）を示す。この領域には１１個の有芯斑が見られ、そのうち３つはミクログリアと関連し、８つはミクログリアから独立している（図１９参照）。さらに（ｂ）は、独立した２つの斑（（ａ）に§および†と示されている）を強調した高倍率ボリュームレンダリング画像（ｘｙ面）を示している。一方（ｃ）は、ミクログリアと関連した斑のうち１つ（（ａ）に「縦方向++」と示されている）を強調する高倍率ボリュームレンダリング（ｘｙ面）を示している。（ｄ−ｉ）は、８２才男性（認識番号#１５２３）のサンプルから得たデータである。（ｄ）は観察領域から生成したボリュームレンダリング画像（ｘｚ面）を示す図である。（ｅ）は、様々な部位と厚さのｚ−スタック画像（２次元プロジェクション画像）を作るために、１１０枚のｘｙ画像から構成される観察領域の３Ｄ再構成をどのように体系的に再スライスしたかを描いたダイアグラムである。ｚ−スタックされた幾つかのｘｙ画像によって、大量の明るい物体（細胞内の６Ｅ１０シグナル）に対して比較的大きく不明瞭な物体（拡散斑）が見られる。（ｆ）は、画像番号２８−３３のｘｙ画像から成るｚ−スタック画像を示し、一団となったミクログリアと空間的に相互作用する拡散斑の存在を示す図である。（ｇ）は、画像番号５３−６３のｘｙ画像から成るｚ−スタック画像を示し、ミクログリアと強く相互作用する拡散斑の存在を示す図である。こうした体系的な再スライスによって、（ｄ）に示す観察領域内に全２６個の拡散斑があることが明らかになった。図１９を参照。（ｈ、ｉ）は、（ｆ、ｇ）にそれぞれ示された拡散斑を強調するボリュームレンダリング画像である。スケールバー：ｆ、ｇでは１００μｍ。ＶＲ：ボリュームレンダリング。Ｚｓｔ：ｚ−スタック化。
【図６】図６は、ＳｃａｌｅＳＱ方式、すなわち、脳スライスに適応すべきＳｃａｌｅＳ方式の迅速版を示す。顕微鏡観察のためのマウントは何れも、ＳｃａｌｅＳ４（０）を用いて室温で２時間以下の処理によって行った。（ａ−ｆ）はＳｃａｌｅＳＱ（０）を用いて処理した結果を示した図である。（ａ−ｃ）は、８週齢のＹＦＰ−Ｈマウスの１ｍｍの厚さにスライスした脳を、３７℃でＳｃａｌｅＳＱ（０）内において、（ａ）０時間（ｂ）１時間（ｃ）２時間インキュベーションした後の透過画像を示している。（ｄ）はＳｃａｌｅＳＱ（０）で処理された脳スライスの蛍光画像を示す図である。（ｅ）は皮質領内（（ｄ）中の、白い四角の囲み線によって示されている）の、ＹＦＰ発現神経細胞の３Ｄレンダリングを示している。７２３個のＳＰＩＭ画像を得て、３Ｄ再構成（白線で囲った領域）を行った。青色の矢印は照明光の方向、緑色の矢印は蛍光検出の方向を示す。（ｆ）は、ＳｃａｌｅＳＱ（０）処理後に当該処理前の状態に復元したマウスの脳サンプル内にある興奮性シナプスを、ＥＭによって観察した結果を示す図である。（ｇ−ｌ）はＳｃａｌｅＳＱ（５）用いて処理した結果を示した図である。（ｇ−ｉ）は、８週齢のＹＦＰ−Ｈマウスの１ｍｍ厚の脳スライスを、（ａ）０時間、（ｂ）１時間、（ｃ）２時間、３７℃でＳｃａｌｅＳＱ（５）内でインキュベーションした後の透過画像を示す図である。（ｊ）は、ＳｃａｌｅＳＱ（５）で処理された脳スライスの蛍光発光画像を示す図である。（ｋ）は皮質領内（（ｊ）中の白い四角の囲み線によって示されている）のＹＦＰ発現神経細胞の３Ｄレンダリングを示している。３Ｄ再構成（白線で囲まれた領域）を作るために、７６９個のＳＰＩＭ画像を得た。（ｌ）は、ＳｃａｌｅＳＱ（５）処理の後、ＰＢＳで置換することによって当該処理前の状態に復元したマウスの脳サンプル内において、ＥＭによって観察される、興奮性シナプスを示した図である。（ｅ，ｋ）内の青色及び緑色の矢印は、それぞれ照明光の方向と蛍光検出の方向とを示す。ＡＴは軸索終末を、Ｄｅｎは樹状突起を示す（ｆ，ｌ）。塗り潰された矢頭はシナプス後肥厚を示している。（ｄ）、（ｊ）のスケールバーは２．５ｍｍ、（ｆ）、（ｌ）のスケールバーは２００ｎｍを示している。更なる詳細情報は、図２０に示されている。
【図７】ソルビトールを含む生物材料用透明化試薬と、エリスリトールを含む比較用の試薬による、マウス大脳半球の透明化を比較した図である。
【図８】実施例で用いた試薬の組成を示す図である。
【図９】（ａ）はＳｃａｌｅＡ２処理のプロトコールの一例を示す図である。このプロトコールに関して、米国公開特許2013-0045503号も参照することができる。（ｂ）はＳｃａｌｅＳ処理のプロトコールの一例を示す図である。ＳｃａｌｅＳ処理に用いる溶液の組成は、図８に示す。初めにＳｃａｌｅＳ０溶液でのインキュベーションという極めて簡単な処理によって、生物材料（特に固定した生物材料）の物質の透過性を大きく向上させる。次いで、透過性が向上した生物材料を、順次、ＳｃａｌｅＳ１溶液、ＳｃａｌｅＳ２溶液、およびＳｃａｌｅＳ３溶液でインキュベーションする。最後に、生物材料をＰＢＳで洗浄することによって（deScaling）、生物材料を元の状態に回復させ、次いで、観察前にＳｃａｌｅＳ４溶液でインキュベーションする。ＳｃａｌｅＳ４溶液はマウント用溶液としても用いる。各段階のインキュベーションは４℃程度の低温で行うこともできるが、図示したようにより高温（例えば３７℃）で行うことによって、透明化処理がより加速する効果が得られる。インキュベーションは、温度制御が可能なオービタルシェイカーで行う。
【図１０】図１０は、ＡｂＳｃａｌｅのプロトコールの一例を示す図である。なお、図中に示すＳｃａｌｅＢ４（０）は、８Ｍ濃度の尿素水溶液である。
【図１１】図１１は、ＣｈｅｍＳｃａｌｅのプロトコールの一例を示す図である。なお、図中に示すＳｃａｌｅＢ４（０）の組成は、図１０と同じである。
【図１２】図１２は、ＳｃａｌｅＳ処理を行った場合の生物材料の体積変化を示す図であり、（Ａ）は、体積変動を処理開始前（０時間）と処理後（７２時間）とで比較したグラフであり（コントロールはＰＢＳ処理）、（Ｂ）は、ＳｃａｌｅＳ処理、ＳｃａｌｅＡ２処理、ＰＢＳ処理（コントロール）を行った後の生物材料の外観を示す。
【図１３】図１３は、二種類のマウス由来の試料を用いた実験において、ＣＵＢＩＣに基づく処理がＹＦＰ蛍光に与える悪影響を示す図である。ＰＢＳ処理（コントロール）よりも、ＣＵＢＩＣに基づく処理が、ＹＦＰ蛍光の減弱をもたらしている。
【図１４】図１４は、ＳｃａｌｅＳ処理(左側)及びＣＵＢＩＣ処理(右側)後に元の状態に復元した切片における免疫組織化学を示す。Ｃ５７ＢＬ６/Ｊ野生型マウス（１０週齢）から得た脳サンプルを二つの半球に分割した。右半球及び左半球はそれぞれＳｃａｌｅＳ処理及びＣＵＢＩＣ処理によって透明化された後に、ＰＢＳで洗浄することによって元の状態に復元された。２０％スクロース／ＰＢＳ中で凍結保護をした後に、復元した脳サンプルをＯＣＴコンパウンド中に包埋した。クライオスタットを用いて５０μｍ厚の冠状断を切り出した。得られた切片を、０．１（wt/vol）％トリトンＸ-１００／１％のブロッキング試薬（ロッシュ）／ＰＢＳ中にて、１時間、透過処理／ブロッキング処理した。その後、フリーフローティング免疫組織化学により処理した。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６にコンジュゲートしたウサギＩｇＧに対するヤギ抗体（Molecular Probes）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６にコンジュゲートしたマウスＩｇＧに対するヤギ抗体（Molecular Probes）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートしたウサギＩｇＧに対するヤギ抗体（Molecular Probes）である。ＤＧは歯状回を、ＧＣＬは顆粒細胞層を、ＭＦは苔状線維を、ＳＧＺは顆粒細胞下帯を、ＳＯは上昇層を、ＳＲは放線状層を示す。スケールバーは１００μｍである。
【図１５】ＳｃａｌｅＳ処理(左側)及びＣＵＢＩＣ処理(右側)後に元の状態に復元した脳サンプルのＴＥＭ観察の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ６/Ｊマウス（９週齢）の全脳を、４％ＰＦＡで固定した。固定した脳から、海馬を含むスライス（１ｍｍ厚）を調製し、半分に分割した。左半分は、図９のｂの手法に従い、ＳｃａｌｅＳ処理によって透明化した。右半分はＣＵＢＩＣによって透明化したが、スライスの厚みを考慮して、ＣＵＢＩＣ試薬１によるインキュベーションの時間を半分にした。二つの透明化した試料を、ＰＢＳ（−）で、４℃で１２時間、洗浄することによって元の状態に復元した。二つの復元したスライスから超薄切片を調製し、１２００ＥＸ-II（ＪＥＯＬ）を用いたＴＥＭ観察に供した。
【図１６】図１５に示す結果と同様にして、ＳｃａｌｅＳ処理(左側)及びＣＵＢＩＣ処理(右側)後に元の状態に復元した脳サンプルのＴＥＭ観察の結果を示す別の図である。
【図１７】図１７は、多色イメージング実験に用いた光学的要素を示す図である。Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５４６、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＰＰ−ＢＴＡ−１の励起スペクトル（点線）及び発光スペクトル（実線）をノーマライズし、対応する図２、図３、図４、図５と同じ色で示している。（ａ）は、立体顕微鏡での観察を示す（図２に対応）。励起フィルタ及びエミッションフィルタの透過特性（立体顕微鏡用）は、ボックスで囲んで示している。（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、共焦点顕微鏡での観察（図３ａ、図３ｂに対応）、及びSPIMでの観察（図３ｃ、図４、及び図５）を示す。図中で、レーザーラインは矢印で示している。エミッションフィルタの透過特性は、緑及び赤のボックスで示している。
【図１８】図１８は、活性化されたミクログリアおよび静止しているミクログリアの、斑の端部までの距離の分布を、個々の斑について示す棒グラフである。図の左側は、２０か月齢のＡＰＰＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウス脳領域における３７の斑。図の右側は、１０か月齢のＡＰＰＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウス脳領域における２７の斑。それらの近傍（＜２１μｍ）における任意の活性化されたミクログリアによって会合されていない退化した斑の番号を、薄い色の写字体によって表した。他の斑（おそらく急性または亜急性）の番号を赤で表した。近くで隣あっているミクログリアおよび離れて隣あっているミクログリアを区別可能なように、グラフ内にある縦の点線は、２１μｍに位置している。
【図１９】図１９は、アルツハイマー患者の死後の脳サンプルにおける２つの免疫シグナル（６Ｅ１０（緑）およびＡ６０（青））の三次元再構築を示す図である。各サンプルについて、ミクログリアとの会合のありおよびなしにおける、有芯斑および拡散斑を、カウントし、その体積を測定した。また、すべてのサンプルを、ミクログリア細胞について免疫染色した。＃１６１７および＃１５２３についての６Ｅ１０シグナル（緑）およびＩｂａｌシグナル（赤）を、それぞれ図５（ａ）および図５（ｂ）に示している。
【図２０】図２０は、ＳｃａｌｅＳＱ（０）（ａ−ｈ）およびＳｃａｌｅＳＱ（５）（ｉ−ｐ）での処理の結果を示す図である。（ａ−ｈ）は、３７℃のＳｃａｌｅＳＱ（０）におけるインキュベーションの前（ａ）、０時間後（ｂ）、１時間後（ｃ）、および２時間後（ｄ、ｅ）における、８週齢のＹＦＰ−Ｈマウスから作製した１ｍｍ厚の脳切片の蛍光画像（ａ、ｅ）および透過画像（ｂ−ｄ）である。（ｆ−ｈ）は、ＳｃａｌｅＳＱ（０）処理から復元した脳サンプルのＴＥＭ観察の結果である。超薄切片を、図１のときと同様にして、作製し、画像化した。（ｆ）は、神経細胞体が写っている顕微鏡観察結果を示す図である。（ｇ）は、興奮性の非対称シナプスを示している（ｆ）における囲みに対応する拡大顕微鏡像を示す図である。（ｈ）は、有髄軸索を示している（ｆ）における囲みに対応する拡大顕微鏡像を示す図である。（ｉ−ｍ）は、３７℃のＳｃａｌｅＳＱ（５）におけるインキュベーションの前（ｉ）、０時間後（ｊ）、１時間後（ｋ）、および２時間後（ｌ、ｍ）における、８週齢のＹＦＰ−Ｈマウスから作製した１ｍｍ厚の脳切片の蛍光画像（ｉ、ｍ）および透過画像（ｊ−ｌ）を示す。（ｎ−ｐ）は、ＳｃａｌｅＳＱ（５）から復元させた脳サンプルのＴＥＭ観察の結果を示す。超薄切片を、図１のときと同様にして、作製し、画像化した。（ｎ）は、神経細胞体が写っている顕微鏡像を示す図である。（ｏ）は、興奮性の非対称シナプスを示している（ｎ）における囲みに対応する拡大顕微鏡像を示す図である。（ｐ）は、有髄軸索を示している（ｎ）における囲みに対応する拡大顕微鏡像を示す図である。矢頭は、肥厚化したシナプス後性の密集度を示している。Ｄｅｎ：樹状突起、ＡＴ：軸索終末、Ｍｙ：ミエリン、スケールバー：（ａ−ｅ、ｉ−ｍ）５ｍｍ、（ｆ、ｎ）４μｍ、（ｇ、ｈ、ｏ、ｐ）２００μｍ。
【図２１】図２１は、ＳｃａｌｅＳＳ２０及びＳｃａｌｅＳＳ４０で処理したＹＦＰ−Ｈマウスの脳半球について、光透過性、ＹＦＰ蛍光のシグナル強度および体積変動を調べた結果を示す図である。（ａ−ｃ）は、光透過性、ＹＦＰ蛍光のシグナル強度および体積変動についてグラフで表した図である。（ｄ‐ｅ）はＳｃａｌｅＳＳ２０及びＳｃａｌｅＳＳ４０による透明化の結果を示した写真をもとにした図である。（ｄ）は顕微鏡写真をもとにした図であり、（ｄ）の蛍光画像を（ｅ）で示す。（Ｌ）：左半球、（Ｒ）：右半球。
【図２２】図２２は、ＹＦＰ−Ｈマウスの全脳をＳｃａｌｅＳＳ４０で処理し、模様のついた背景と共に撮影された写真をもとにした図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２９】
〔１．生物材料用透明化試薬〕
（生物材料用透明化試薬の有効成分）
本発明にかかる一の態様における「生物材料用透明化試薬」は、必須の有効成分として「尿素」を含む、溶液である。
【００３０】
本発明にかかる他の態様における「生物材料用透明化試薬」は、必須の有効成分として「尿素誘導体」を含む、溶液である。
【００３１】
上記尿素誘導体の種類は特に限定されないが具体的には例えば、各種のウレイン、又は、下記の一般式（１）に示す化合物である。なお、一般式（１）に示す化合物には一部のウレインが含まれる。本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含んでいればよいが、これらの中で尿素を含むことがより好ましい。
【００３２】
【化１】
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一般式（１）に示す尿素誘導体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立に水素原子（但し、Ｒ１〜Ｒ４の全てが水素原子の場合は尿素自体に相当するので除かれる）、ハロゲン原子、又は炭化水素基であり、炭化水素基を構成する炭素原子が複数個ある場合には当該炭素原子の一部が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子により置換されていてもよい。炭化水素基としては、鎖状炭化水素基、及び環状炭化水素基が含まれる。
【００３３】
上記鎖状炭化水素基として、例えば、鎖状アルキル基、鎖状アルケニル基、及び鎖状アルキニル基等が例示される。鎖状炭化水素基を構成する炭素数は特に限定されないが、例えば、６以下の直鎖状又は分岐状のものが挙げられ、好ましくは炭素数が１〜３のアルキル基である。鎖状炭化水素基は、例えば、ハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。鎖状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。
【００３４】
上記環状炭化水素基として、例えば、シクロアルキル基、及びシクロアルケニル基等が例示される。環状炭化水素基は、例えばハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロヘキセニル基等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。
【００３５】
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３６】
また、一般式（１）に示す尿素誘導体のより好ましい具体例は、以下の１）〜２）に示す通りである。
１）Ｒ１〜Ｒ４より選択される任意の３つの基が水素原子であり、残りの１つの基がハロゲン原子、又は炭素数１〜６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの１つの基が、炭素数１〜３、又は炭素数が１〜２のアルキル基である。
２）Ｒ１〜Ｒ４より選択される任意の２つの基が水素原子であり、残りの２つの基が互いに独立にハロゲン原子、又は炭素数１〜６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの２つの基が何れも、炭素数１〜３、又は炭素数が１〜２のアルキル基である。なお、水素原子となる２つの基の一方はＲ１、Ｒ２の何れかから選ばれ、他方はＲ３、Ｒ４の何れかから選ばれることがより好ましい。
【００３７】
尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の上記化合物の含有量は、生物材料の透明化の効果を奏する限り特に限定されないが、１．０Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。当該化合物の濃度は、より好ましくは１．５Ｍ以上で８．０Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは１．８Ｍ以上で６．０Ｍ以下の範囲内である。当該化合物の濃度は、一例では、３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内でありえる。なお、「尿素及び尿素誘導体」の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、「生物材料用透明化試薬」における尿素及び尿素誘導体の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素及び尿素誘導体の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。
【００３８】
（ソルビトール）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の他に、必須の有効成分として「ソルビトール」を含む。「生物材料用透明化試薬」は、ソルビトールを、１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。ソルビトールの濃度はより好ましくは、１８（ｗ／ｖ）％以上で４８（ｗ／ｖ）％以下の範囲内である。ソルビトールの濃度は、一例では、３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内でありえる。本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」において、ソルビトールがこれらの濃度範囲の場合、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の上記化合物の濃度は好ましくは１．０Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。当該化合物の濃度は、より好ましくは１．５Ｍ以上の範囲内であり、さらに好ましくは１．５Ｍ以上で８．０Ｍ以下の範囲内であり、特に好ましくは１．８Ｍ以上で６．０Ｍ以下の範囲内である。当該化合物の濃度は、一例では、３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内でありえる。ソルビトールの濃度と、尿素等の濃度とがいずれも上記範囲内にある場合は、特に、透明化処理の時間短縮と生物材料の変形抑制の効果とが両立する。
【００３９】
（有効成分として尿素又は尿素誘導体と、ソルビトールとを用いる利点）
尿素又は尿素誘導体と、ソルビトールとを組合わせて用いる利点として、透明化処理の有効成分として尿素又は尿素誘導体のみを用いる場合と比較して、生物材料の原形を大きく変化させずに、迅速に透明度を上げることが出来る点が挙げられる。ソルビトールは、尿素又は尿素誘導体と組み合わせずに使用した場合、実質的に効果が見いだされなかった。しかし、尿素又は尿素誘導体と組み合わせて使用した場合、生物材料の原形を大きく変化させずに、迅速に透明化を行うことが出来るという効果を同時に示す。その結果、生物材料が、例えば、極めて脆弱な組織（胚等）であったとしてもその損傷及び変形を抑制しつつ迅速に透明化処理を行いうる。また、これまで透明化が難しいとされてきた老齢の生物由来の生体試料に対しても損傷及び変形を抑制しつつ迅速に透明化処理を行いうる。
【００４０】
また、尿素、尿素誘導体、及びソルビトールに共通して次のことが言える。毒性が極めて低く、特に尿素、及びソルビトールに関しては生体由来の成分である。そのため、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は蛍光タンパク質へのダメージ、及びその蛍光の消失が少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用しうるものとなる。３）極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順で透明化処理を行いうるものとなる。
【００４１】
また、上記の利点に加えて、従来の生物材料用透明化試薬と比較して、光散乱性が高い不透明な生物材料の透明性を格段に向上させることができ、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。特に脳組織では、これまで深部観察のバリアーであった白質層を透明化することが可能となり、白質層より深部に位置する領域（例えば脳梁）の観察が可能となる。本発明の試薬による透明化処理は可逆的である。具体的には、透明化処理後の生物材料を平衡塩類溶液に浸漬するのみで、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。透明化処理の前後においてタンパク質等の抗原性も実質的に変化せずに保存されるため、通常の組織染色、及び免疫染色の手法を用いた分析が可能である。
【００４２】
（グリセロール）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて「グリセロール」を含む。グリセロールの含有量は特に限定されないが、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、３．０（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、５．０（ｗ／ｖ）％以上で２５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用するグリセロールの重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００４３】
グリセロールは免疫応答による拒絶が比較的低く、かつ網内系によるトラップが比較的生じ難く肝臓並びに腎臓等に蓄積する虞が比較的低い。そのため、生物材料としての生体に上記「生物材料用透明化試薬」を適用し易いという利点がある。さらに、グリセロールは比較的安価であるという利点もある。
【００４４】
（界面活性剤）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系；ポリビニルアルコール等の高級アルコール系；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、TritonX−100、及びTritonX-140等のTritonX（登録商標）シリーズ；Ｔween−20、Tween-40、Tween-60、及びTween-80等のＴween（登録商標）シリーズ；NP-40（商
品名）；からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。界面活性剤は、必要に応じて、二種以上を混合して使用することもできる。
【００４５】
これら界面活性剤は、尿素の、生物材料に対する浸透性を高め、透明化処理の効率を向上させうる。特に、脳組織の白質層、脊髄、末梢神経線維束等、のように、透明化処理が比較的困難な生物材料の透明化を行う場合には、「生物材料用透明化試薬」は界面活性剤を含むことが好ましい。
【００４６】
なお、上記界面活性剤は、尿素に対するのと同様に、生物材料に対する尿素誘導体の浸透性を高めうる。
【００４７】
界面活性剤を使用する場合、生体材料中の細胞の微細構造の変性を防ぐため、その含有量は５．０（ｗ／ｖ）％以下の濃度に抑える必要がある。界面活性剤の５．０（ｗ／ｖ）％以下の濃度であれば特に限定されないが、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で２．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する界面活性剤の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００４８】
（水溶性の高分子化合物）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて水溶性の高分子化合物をさらに含んでいてもよい。ここで、高分子化合物とは、分子量が例えば５万〜６万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないものである。また、高分子化合物は、生物材料の変性等を引き起こさないものが好ましい。水溶性の高分子化合物として、具体的には、例えば、架橋型スクロース高分子物質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はパーコール（商品名。コロイド状シリカをポリビニルピロリドン皮膜で被覆した高分子物質）等が挙げられる。架橋型スクロース高分子物質として、具体的には例えば、フィコール（Ficoll）ＰＭ７０（商品名））のような、スクロースをエピクロルヒドリンで架橋（共重合）した重量平均分子量約７万の高分子物質等が挙げられる。
【００４９】
これら水溶性の高分子化合物は、尿素及び尿素誘導体とは異なり細胞内に浸入することがなく、また水溶性であるから、細胞内外の浸透圧差の調整に寄与すると考えられる。そのため、透明化処理の対象となる生物材料の原型維持に寄与し、とりわけ、生物材料の膨張の防止に寄与する。特に限定されないが、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の浸透圧が比較的高い場合には、当該試薬はこれら水溶性の高分子化合物を含むことが好ましい。
【００５０】
「水溶性の高分子化合物」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５（ｗ／ｖ）％以上で４０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。また、生物材料の膨張抑制効果と透明化処理後の屈折率とのバランスという観点では、上記含有量は、５．０（ｗ／ｖ）％以上で２５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０．０（ｗ／ｖ）％以上で２０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０．０（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「水溶性の高分子化合物」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００５１】
（その他の成分１）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、或いは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明の試薬は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。なお、上記したグリセロールは乾燥抑制作用も有する。
【００５２】
上記「乾燥抑制成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０（ｗ／ｖ）％を超え１０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、１．０（ｗ／ｖ）％以上で７．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、２．５（ｗ／ｖ）％以上で５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「乾燥抑制成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００５３】
（その他の成分２）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、ソルビトールを除く糖および糖アルコールからなる群に含まれる化合物を「透明度向上成分」としてさらに含むことができる。ソルビトールを除く糖および糖アルコールからなる群に含まれる化合物としては、エリスリトール、フルクトース、グリセロール、マンニトール、スクロース、およびキシリトールが挙げられるがこれらに限定されない。透明度向上成分は、単独で使用する場合に本発明の生物材料用透明化試薬の必須の有効成分としてのソルビトールと代替するには透明化処理の性能が劣る。しかしながら、透明度向上成分は、尿素又は尿素誘導体とソルビトールと共に使用されることで、透明化処理の対象となる生物材料の透明度を「透明度向上成分」を使用しない場合と比較してさらに向上させることに寄与する。
【００５４】
上記「透明度向上成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０（ｗ／ｖ）％を超え５０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、１０．０（ｗ／ｖ）％以上で４５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、２０．０（ｗ／ｖ）％以上で４０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「透明度向上成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００５５】
また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、上述した「尿素及び／又は尿素誘導体」、「界面活性剤」及び「水溶性の高分子化合物」以外に、例えば、ｐＨ調整剤、及び浸透圧調整剤等の添加剤を必要に応じて含んでいてもよい。
【００５６】
また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、シクロデキストリン類、及び／又は、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン等からなる群より選択される、コラーゲンと結合性を有する化合物、をさらに含んでいてもよい。シクロデキストリン類とは、複数個のグルコースが環状結合して形成されたシクロデキストリン骨格を有する化合物の総称であり、より具体的には例えば、α−シクロデキストリン及びその誘導体、β−シクロデキストリン及びその誘導体（例えば、メチル−β−シクロデキストリン等）、並びに、γ−シクロデキストリン及びその誘導体、等が挙げられる。生物材料用透明化試薬におけるシクロデキストリンの含有量は特に限定されないが、例えば、１ｍＭ以上で５ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。また、生物材料用透明化試薬における、コラーゲンと結合性を有する上記化合物の含有量は特に限定されないが、１ｍＭ以上で３ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。シクロデキストリン類、及び／又は、コラーゲンと結合性を有する化合物、をさらに含有することによって、生物材料に対する試薬の浸透性が格段に向上する。
【００５７】
（溶媒）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、尿素が可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、尿素が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された「生物材料用透明化試薬」を、水溶液としての「生物材料用透明化試薬」と称する。
【００５８】
なお、水を主溶媒として用いた場合には、例えば、固定化した標本にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水と混合し用いてもよい。例えば固定化した標本にＤＭＳＯを混合して用いれば、生物材料に対する試薬の浸透性の向上、及び角質表面を有する組織の透明化処理促進等の効果が期待される。なお、ジメチルスルホキシドの使用量は特に限定されないが、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００５９】
溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである。１）本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の有効成分である尿素及びソルビトールは水への溶解性に優れているため、生物材料用透明化試薬の調製が容易かつ低コストとなる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。３）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。４）固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる。５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。６）有機溶剤を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
【００６０】
また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液であってもよい。「生物材料用透明化試薬」のｐＨは特に限定されないが、６．０〜９．０の範囲内であることが好ましく、６．５〜８．５の範囲内であることがより好ましく、６．８〜８．０の範囲内であることがより好ましい。本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料の変形をさらに抑制し、かつ生物材料内に尿素が充分に浸透する程度に、その浸透圧が調整されていてもよい。
【００６１】
なお、尿素誘導体に関しても、尿素と同様の上記溶媒を用いることができる。
【００６２】
（対象となる生物材料）
本発明の「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、マーモセット等のヒトを除く霊長類、等の実験動物；イヌ、ネコ、フェレット等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
【００６３】
また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、或いは細胞であってもよい。本発明の「生物材料用透明化試薬」は優れた透明化処理能力を有するので、生物材料が、多細胞動物由来の組織又は器官（例えば、脳全体又はその一部）、或いはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても透明化処理を適用可能である。本発明の「生物材料透明化試薬」は、生物材料の変形を抑制する効果が極めて大きいため、脆弱な生物材料の透明化に特に好適である。ここで脆弱な生物材料とは、植物細胞の幼芽、カルス、発生初期段階の動物胚、幹細胞や初代培養細胞、株化細胞を特殊な培養環境で３次元的に生育させた塊（spheroid, neurosphere, cell aggregatesなど） 等が挙げられる。
【００６４】
また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用に固定化（fixed）処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。なお、固定化された材料を用いる場合には、固定化処理後に、例えばＰＢＳ溶液あるいは２０（ｖ／ｗ）％ショ糖−ＰＢＳ溶液に、充分に（例えば、２４時間以上）浸漬する処理を行うことが好ましい。さらに、当該材料をOCT  compoundに包埋して液体窒素で凍結後、ＰＢＳ中で解凍し、４（ｖ／ｗ）％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）−ＰＢＳ液で再度固定する処理を行うことが好ましい。
【００６５】
上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
【００６６】
（生物材料用透明化試薬の特に好適な組成の一例）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の特に好適な組成の例示は以下の通りである。
・生物材料用透明化試薬（１）：
水に、尿素を１．５Ｍ以上で８．０Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、かつ、ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。さらにグリセロールを含む場合は、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、３．０（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、５．０（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（２）：
水に、尿素を３Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、かつ、ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる水溶液。グリセロールは、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、３．０（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、５．０（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（３）：
水に、尿素を２Ｍ以上で４Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。さらにグリセロールを含む場合は、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、３．０（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、５．０（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（４）：
水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる水溶液。グリセロールを含む場合は、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、３．０（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、５．０（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（５）：
水に、尿素を１．５Ｍ以上で４．０Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを４０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる水溶液。グリセロールを含む場合は、２０（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、２２．５（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（６）：
水に、尿素を５．０Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。グリセロールを含む場合は、２０（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、２２．５（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
・生物材料用透明化試薬（７）：
水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを３５（ｗ／ｖ）％以上で４５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。グリセロールを含む場合は、２０（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、２２．５（ｗ／ｖ）％以上で３０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合は、溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００６７】
上記何れの生物材料用透明化試薬（１）〜（７）においても、TritonX−100等の非イオン性の界面活性剤を、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。
【００６８】
また、上記何れの生物材料用透明化試薬（１）〜（７）において、スクロース等の透明度向上成分を含む場合は、１０．０（ｗ／ｖ）％以上で５０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、２０．０（ｗ／ｖ）％以上で４０．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましい。
【００６９】
また、上記何れの生物材料用透明化試薬（１）〜（７）においても、シクロデキストリン類、及び／又は、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン等からなる群より選択される、コラーゲンと結合性を有する化合物、をさらに含んでいてもよい。シクロデキストリンは１ｍＭ以上で５ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。また、コラーゲンと結合性を有する上記化合物は、１ｍＭ以上で３ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。コラーゲンと結合性を有する化合物、及び／又は、シクロデキストリン類を含む生物材料用透明化試薬は、白質を含む生物材料の透明化に特に好適であり、中でも脊髄の透明化に特に好適である。
【００７０】
なお、尿素に代えて尿素誘導体（又は尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合には、上記した尿素と同じ濃度で尿素誘導体等を用いて、生物材料用透明化試薬（１）〜（７）を調製すればよい。
【００７１】
（生物材料用透明化試薬の調製）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の調製方法は、「尿素及び／又は尿素誘導体」、「ソルビトール」、並びに、必要に応じて用いる「グリセロール」、「界面活性剤」、「水溶性の高分子化合物」、「乾燥抑制成分」、及び「透明度向上成分」等を、溶媒中に溶解することで調製される。溶媒中に溶解、又は混合する手順は特に限定されない。
【００７２】
〔２．生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理法の一例〕
（透明化処理工程）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」を用いた生物材料の透明化処理方法は、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる工程（透明化処理工程）を含む方法である。より具体的には、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
【００７３】
上記の透明化処理工程において、透明化処理用の容器内に「生物材料用透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されないが、まず「生物材料用透明化試薬」を格納し、次いで「生物材料」を格納する（すなわち、生物材料用透明化試薬に生物材料を投入する）ことが好ましい。
【００７４】
上記の透明化処理工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、透明化処理を行う合計処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で１２０時間以下の範囲内であることが好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
【００７５】
透明化処理工程は、複数種類の、本発明に係る生物材料透明化試薬を用いて、段階的に行うことも出来る。例えば、１）透明化処理工程をｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて行う場合、回を追うごとに、ソルビトールの濃度がより高い生物材料透明化試薬を用いると、ソルビトールが効率的に生物材料に浸潤する上で好ましい。
【００７６】
或いは、２）透明化処理工程をｎ回（ｎは３以上の整数）に分けて行う場合、少なくとも１回目とｎ回目とは、グリセロールを含む生物材料透明化試薬を用い、かつ２回目〜（ｎ−１）回目の間の少なくとも１回でグリセロールを含まない生物材料透明化試薬を用いるようにしてもよい。この場合、１回目から（ｎ−１）回目の間は、回を追うごとに、ソルビトールの含有量がより多くかつ尿素が前回の処理工程の含有量以下の生物材料透明化試薬を用いると、尿素による生物材料の膨張が徐々に収まるという点で好ましい。ただし、ｎ回目においては、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる生物材料透明化試薬で処理することが好ましい。
【００７７】
また、３）透明化処理工程をｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて行う場合、１回目を尿素を１．５Ｍ以上で４．０Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを４０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる生物材料透明化試薬で処理し、その後は1回目の処理の生物材料透明化試薬よりも尿素の濃度が高く、かつソルビトールの濃度が低い生物材料透明化試薬で処理してもよい。この場合、１回目の処理工程において生物材料が強く収縮されるため、当該処理後における収縮作用の低下によって体積が復元する際に１回目以降の生物材料透明化試薬を浸潤しやすい状態となる。なお、ｎが３以上の場合、ｎ回目においては、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含んでなる生物材料透明化試薬で処理することが好ましい。
【００７８】
以上のいずれの場合においても、各透明化処理工程の間に、一度ＰＢＳで処理する工程を加えると、生物材料の原形を保つうえで好ましい。
【００７９】
上記の透明化処理工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温又は低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。
【００８０】
（前処理工程）
必要に応じて、透明化処理を円滑に行う目的で、透明化処理工程の前に、前処理液を用いて生物材料を前処理してもよい。前処理液は、ソルビトールを含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含み、かつ尿素や上述の尿素誘導体を含まない水溶液を用いることが好ましい。好ましくは、例えば、生物材料に含まれるコレステロールの量を低減する成分、及び／又は、生物材料に含まれるコラーゲンの量を低減する成分を含んでいる。前処理液の組成の詳細は、後述の〔３．生物材料用透明化処理キット〕の欄において説明する。
【００８１】
上記の前処理工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、前処理を行う合計処理時間は、特に限定されないが、１時間以上で１２０時間以下の範囲内であることが好ましく、２時間以上で４８時間以下の範囲内であることがより好ましい。また、前処理を行う圧力は特に限定されない。
【００８２】
前処理工程を通じて、生物材料に含まれるコレステロールの量、及び／又は、コラーゲンの量を低減することによって、透明化処理工程における生物材料用透明化試薬の浸透性が格段に向上する。その結果として、例えば、液体窒素等を用いた凍結と室温での解凍プロセスを経ていない生物材料等に対しても、速やかに生物材料用透明化試薬が浸透する効果が得られる。
【００８３】
（透明化処理された生物材料の観察工程）
透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、又は透明化処理工程後で観察工程前に、染色或いはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
【００８４】
例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の事前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
【００８５】
また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、又は蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、上記透明化処理工程の事前に行うことが好ましいが、上記透明化処理工程後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
【００８６】
観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、３次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ  ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ  ＳＴＯＲＭ、及びＳＩＭ）を適用して行うこともできる。また、観察工程は、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行うこともできるが、透明化処理に伴う生物材料の膨張が抑制されているので、一光子励起型の光学顕微鏡技術でも充分な観察が可能である。
【００８７】
なお、本発明において、透明化（処理）とは、処理前の生物材料と処理後の生物材料とを比較して、処理後の方が光（特に可視光）の透過度が向上することを一つの指標とするものである。
【００８８】
〔２Ａ．その他の応用〕
（生物材料用透明化試薬の成分の除去工程）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、生物材料用透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。ここで、平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）；MEM, DMEM, 及びHam’s F-12などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
【００８９】
上記「生物材料用透明化試薬」を用いた場合、透明化処理の前後において、或いは、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して光学顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して汎用の組織染色、又は免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことなども可能となる。
【００９０】
すなわち、本発明の他の観点は、上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理により透明化した生物材料に対して、平衡塩類溶液を浸潤することにより上記生物材料を透明化処理前の状態に戻す工程、を含む生物材料の復元方法である。
【００９１】
（観察工程に供される生物材料の可視化処理工程の一例）
なお、本発明に係る生物材料用透明化試薬を用いて透明化処理を行っているか最中か、行った後の生物材料に対して、免疫染色の手法を用いて可視化処理を行う場合には、特に限定されないが、例えば、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に記載の抗体組成物及び免疫方法を採用することが好ましい。国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１の内容は全て、参照によって、本明細書の一部として組み込まれる。
【００９２】
なお、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に記載の通り、上記の抗体組成物とは、尿素及び尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と抗体とを含む溶液であり、当該化合物は０．１Ｍ以上で１．０Ｍ未満の範囲内の濃度で含まれるものである。抗体組成物において、上記化合物は、０．２Ｍ以上で０．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。また、抗体組成物は、界面活性剤を含むことが好ましく、非イオン性の界面活性剤を含むことがより好ましい。界面活性剤を含む場合、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。
【００９３】
国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に係る抗体組成物を用いた免疫染色及び観察方法の概略フローの一例を示すと、以下の通りである。なお、以下の何れの工程も、公知の免疫染色方法と同様の条件で実施することができる。
工程１）：免疫染色用の試料（生物材料）の調製工程。
工程２）：必要に応じて行われる、１）で調製した免疫染色用の試料に対する抗原賦活化処理工程。当該工程は、例えば、加熱処理、又はタンパク質分解処理等の処理を行うことで実施する。
工程３）：必要に応じて行われる、バックグラウンドノイズを抑えるための処理工程。当該工程は、例えば、不要なＲＮＡの混入を防止するためのＲＮＡ分解処理、又は、血清やスキムミルク等のブロッキング処理試薬を用いたブロッキング処理を行うことで実施する。
工程４）：上記１）〜３）の工程を経た免疫染色用の試料と、免疫染色用の一次抗体を含む抗体組成物との抗原抗体反応処理工程。なお、抗原抗体反応処理工程におけるインキュベーションの条件は抗体の性能や試料のサイズ等に応じて決定すればよいが、例えば、６時間〜５日間、好ましくは２日〜３日間振とうをすることで行う。また、インキュベーションの温度は例えば４℃前後であることが好ましい。抗体組成物における上記一次抗体の濃度は、具体的には例えば、４μg/ｍＬ以上で４０μg/ｍＬ以下の範囲内の濃度である。工程５）：上記４）の工程を経た免疫染色用の試料を洗浄する洗浄工程。洗浄工程は、例えば、尿素及び尿素誘導体（誘導体の定義は本明細書中で共通）からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を０．１Ｍ以上で１Ｍ未満の範囲内の濃度で含む溶液を用いて試料をリンスする。この溶液の使用量は特に限定されないが、例えば、９〜１５ｍｌ／０．３ｇ試料、好ましくは約１２ｍｌ／０．３ｇ試料程度の量である。洗浄工程の温度、及び時間は特に限定されないが、好ましくは室温で、１時間程度振とうによるリンスを行なう。
工程６）：必要に応じて行われる、免疫染色用の二次以上の抗体を含む抗体組成物と、上記５）の工程を経た免疫染色用の試料との抗原抗体反応処理工程。なお、抗原抗体反応処理工程におけるインキュベーションの条件は抗体の性能や試料のサイズ等に応じて決定すればよいが、例えば、６時間〜５日間、好ましくは２日〜３日間振とうをすることで行う。また、インキュベーションの温度は例えば４℃前後であることが好ましい。抗体組成物における上記二次以上の抗体の濃度は、具体的には例えば、１μg/ｍＬ以上で１０μg/ｍＬ以下の範囲内の濃度である。
工程７）：上記６）の工程を経た免疫染色用の試料を洗浄する洗浄工程。より具体的には、上記工程５）と同様に行う。
工程８）：必要に応じて行われる、上記１）〜７）の工程を経た免疫染色用の試料において抗原抗体反応の結果を可視化する工程。例えば、上記一次抗体、又は二次以上の抗体が、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識されている場合は、試料を当該酵素の基質中で反応させ、生成した色素を沈着させて可視化する。また、上記一次抗体、又は二次以上の抗体が、フルオレセインやローダミン等の蛍光色素で標識化されている場合は、後述する工程９）において直接蛍光顕微鏡で可視化しながら観察する。
工程９）：上記１）〜８）の工程を経て免疫染色された免疫染色用の試料を、光学顕微鏡で観察する観察工程。
【００９４】
上記概略フローにおいて、工程４）を行い工程６）を行わない場合は、工程４）で用いる抗体組成物が、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に係る抗体組成物である。工程４）も工程６）も行う場合は、工程４）及び６）で用いる抗体組成物のうち少なくとも一方が、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に係る抗体組成物であり、両方が国際公開公報ＷＯ２０１４／０１０６３３Ａ１に係る抗体組成物であることが好ましい。
【００９５】
〔３．生物材料用透明化処理キット〕
（生物材料用透明化処理キット）
本発明にかかる「生物材料用透明化処理キット」は、上記の「生物材料用透明化試薬」を少なくとも一種類備える。生物材料用透明化処理キットは、上記の生物材料用透明化試薬を複数種類含んでいてもよい。生物材料用透明化試薬が複数種類含まれている場合には、例えば、含有成分及び／又はその含有量が互いに異なるものが含まれていてもよい。例えば、以下の１）〜７）から選択される少なくとも一つの条件を満たす、透明化試薬の組合わせが挙げられ、典型的には以下の１）の条件を満たす透明化試薬の組合わせが挙げられる。
１）ソルビトールの含有量が互いに異なる、
２）グリセロールを含むか否かや、グリセロールを含む場合にその含有量が、互いに異なる、
３）尿素又は尿素誘導体の含有量が互いに異なる、
４）界面活性剤を含むか否かや、界面活性剤を含む場合にその含有量が、互いに異なる、５）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むか否かや、ジメチルスルホキシドを含む場合にその含有量が、互いに異なる、
６）シクロデキストリン類を含むか否かや、シクロデキストリン類を含む場合にその含有量が、互いに異なる、
７）Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン等からなる群より選択される、コラーゲンと結合性を有する化合物を含むか否かや、当該化合物を含む場合にその含有量が、互いに異なる。
【００９６】
「生物材料用透明化処理キット」は、好ましくは、Ａ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、及び、Ｂ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を５Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを２０（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、からなる群から選択される１以上の生物材料透明化試薬を含むキットであり、より好ましくは、Ａ１）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを３５（ｗ／ｖ）％以上で４５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、及び、Ｂ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を５Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを２０（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、からなる群から選択される１以上の生物材料透明化試薬を含むキットである。
【００９７】
「生物材料用透明化処理キット」は、さらに、上記の透明化処理工程で用いる「処理容器」、「生物材料把持器具（ピンセット等）」、透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す「平衡塩類溶液」、「前処理液」、生物材料の可視化処理工程で用いる「免疫染色用の抗体」、生物材料の可視化処理工程で用いる「蛍光性化学物質」、及び「キットの取扱説明書」から選択される少なくとも一つを備えていてもよい。なお、キットの取扱説明書には、例えは、上記〔２．生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理法の一例〕欄に記載したような、透明化処理方法の手順等が記載されている。
【００９８】
上記の前処理液は、透明化処理を円滑に行う目的で、透明化処理の前に生物材料を処理する液である。前処理液は、尿素が除かれた水溶液であって、ソルビトールを含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含む水溶液を用いることが好ましい。前処理液は、より好ましくは、例えば、生物材料に含まれるコレステロールの量を低減する成分、及び／又は、生物材料に含まれるコラーゲンの量を低減する成分を含んでいる。コレステロールの量を低減する成分としては、例えば、シクロデキストリン類が挙げられ、より具体的には例えば、α−シクロデキストリン及びその誘導体、β−シクロデキストリン及びその誘導体（例えば、メチル−β−シクロデキストリン等）、並びに、γ−シクロデキストリン及びその誘導体、等が挙げられる。前処理液におけるシクロデキストリン類の含有量は特に限定されないが、１ｍＭ以上で５ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。また、コラーゲンの量を低減する成分としては、例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン等からなる群より選択される少なくとも一種の化合物が挙げられる。コラーゲンと結合性を有する上記化合物は、１ｍＭ以上で３ｍＭ以下の範囲内の濃度で含まれることが好ましい。
【００９９】
前処理液は、生物材料に含まれるコレステロールの量を低減する成分、及び／又は、生物材料に含まれるコラーゲンの量を低減する成分の他に、必要に応じて、本発明に係る生物材料用透明化試薬に含まれる各種成分を、生物材料用透明化試薬と同じ含有量で含んでいてもよい。中でも、ソルビトールは、前処理液に含まれることが好ましく、１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、１５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１７（ｗ／ｖ）％以上で２３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましい。グリセロールも、前処理液に含まれることが好ましい成分であり、２．５（ｗ／ｖ）％以上で３５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、２．５（ｗ／ｖ）％以上で１５．０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがさらに好ましく、２．５（ｗ／ｖ）％以上で７．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。ジメチルスルホキシドを含む場合、前処理液中の溶媒全体を１００体積％として、０．５（ｖ／ｖ）％以上で３５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内の濃度であることが好ましく、１．０（ｖ／ｖ）％以上で２７．５（ｖ／ｖ）％以下の範囲内の濃度であることがより好ましく、１．５（ｖ／ｖ）％以上で２５．０（ｖ／ｖ）％以下の範囲内の濃度であることが特に好ましい。なお、前処理液の溶媒は、本発明に係る生物材料用透明化試薬と同様に、水を主溶媒として用いてなるものが好ましい。
【０１００】
〔４．生物材料用透明化処理キット〕
（生物材料透明化処理システム）
本発明に係る生物材料透明化処理システムは、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」と、単離された上記「生物材料」とを含んでなり、この「生物材料」を透明化するために当該「生物材料」の内部に「生物材料用透明化試薬」が浸潤したものである。すなわち、当該処理システムとは、例えば、透明化処理の途中段階にある生物材料を含む処理システム、又は、透明化処理が完了した生物材料を含む処理システムを包含する概念である。
【０１０１】
〔５．その他〕
本発明は、例えば、以下の何れかの構成を備えるものであってもよい。
（１）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物と、ソルビトールと、５（ｗ／ｖ）％濃度以下の界面活性剤とを含む、溶液である、生物材料用透明化試薬、
（２）上記化合物として尿素を含む、溶液である、上記（１）に記載の生物材料用透明化試薬、
（３）ソルビトールを１５（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む、上記（１）又は（２）に記載の生物材料用透明化試薬、
（４）尿素を１．０Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含む、上記（１）から（３）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬、
（５）界面活性剤が非イオン性の界面活性剤である、上記（４）に記載の生物材料用透明化試薬、
（６）上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種である、上記（５）に記載の生物材料用透明化試薬、
（７）グリセロールを含む、上記（１）から（６）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬、
（８）シクロデキストリン類を含む、上記（１）から（７）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬、
（９）多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものである、上記（１）から（８）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬、
（１０）上記（１）から（９）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤している、生物材料透明化処理システム、
（１１）上記（１）から（９）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程を含む、生物材料の透明化方法、（１２）上記（１）から（９）の何れか一に記載の生物材料用透明化試薬を含む、生物材料用透明化処理キット、
（１３）含まれているソルビトールの濃度が異なる上記生物材料用透明化試薬を複数種備えている、上記（１２）に記載の生物材料用透明化処理キット、
（１４）  Ａ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを３０（ｗ／ｖ）％以上で５０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、及び、Ｂ）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を５Ｍ以上で９．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、ソルビトールを２０（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む生物材料透明化試薬、からなる群から選択される１以上の生物材料透明化試薬を含む、上記（１２）又は（１３）に記載の生物材料用透明化処理キット、
（１５）ソルビトールを含み、さらにグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドを含み、かつ尿素を除く（尿素を含まない）水溶液を透明化工程の前処理液としてさらに含む、上記（１３）又は（１４）に記載の生物材料用透明化処理キット。
【実施例】
【０１０２】
本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。【０１０３】
〔実験の方法〕
＝ＳｃａｌｅＳ溶液＝
ＳｃａｌｅＳ溶液の調製のために以下の試薬を購入した：尿素結晶（Wako pure chemicalindustries）、トリトンＸ−１００（Wako pure chemical industries）、Ｄ（−）−ソルビトール（Wako pure chemical industries）、メチル−β−シクロデキストリン（Tokyo Chemicals）、γ−シクロデキストリン（Wako pure chemical industries）、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン（Kyowa Hakko Bio）、ジメチルスルフォキシド（DMSO）（Wako pure chemical industries）、グリセロール（Sigma）、及びトリトンＸ−１００（Nacalai Tesque）。これらの試薬はそれぞれ水に溶解するか、水に加えて（図８を参照）、よく混合するまで撹拌した（なお、ＳｃａｌｅＳ４、ＳｃａｌｅＳ４（０）、ＳｃａｌｅＳＱ（０）、及びＳｃａｌｅＳＱ（５）の調製においては、電子レンジ加熱を行った。）。ＳｃａｌｅＳ０の製造に際して、リン酸緩衝生理的食塩水のストック溶液（１０×ＰＢＳ（−））を用いた。溶液に含まれる各成分の最終濃度は、混合して得られた当該溶液を水で希釈することによって調整した。なお、ＳｃａｌｅＳ４（０）は、トリトンＸ−１００を含んでいないことを除いてＳｃａｌｅＳ４と同じ組成を有する溶液である。また、実施例および比較例において、特に言及がない限り、ソルビトールの濃度の単位は（ｗ/ｖ）％であり、グリセロールの濃度の単位は（ｗ/ｖ）％であり、スクロースの濃度の単位は（ｗ/ｖ）％であり、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンの濃度の単位は（ｗ/ｖ）％であり、ＤＭＳＯの濃度の単位は（ｖ／ｖ）％であり、トリトンＸ−１００の濃度の単位は（ｗ/ｖ）％である。【０１０４】
＝ＳｃａｌｅＳ溶液を用いた透明化処理＝
マウスの脳半球を透明化する場合の現時点での最適なプロトコールは以下の通りである。【０１０５】
はじめに、２０％のソルビトール、５％のグリセロール、１ｍＭのメチル−β−シクロデキストリン、１ｍＭのγ−シクロデキストリン、１％のＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン及び３％のＤＭＳＯを含むＳｃａｌｅＳ０溶液中で、１２時間、インキュベーションをすることでサンプルの透過性を向上させた（第一工程）。【０１０６】
次に、上記第一工程を経たサンプルを、順次、ＳｃａｌｅＳ１、ＳｃａｌｅＳ２、及びＳｃａｌｅＳ３中でインキュベーションした（第二工程）。【０１０７】
次に、第二工程を経たサンプルをＰＢＳで、６時間、洗浄することによって、サンプルをＰＢＳで置換して処理前の状態に復元させた（ｄｅＳｃａｌｅ処理：第三工程）。【０１０８】
次に、観察前の工程として、第三工程を経たサンプルをＳｃａｌｅＳ４中で１２時間インキュベーションした。ＳｃａｌｅＳ４はマウント用の媒体としても用いた。【０１０９】
上記のプロトコールにおいて、インキュベーションの温度は何れも３７℃であり、ＰＢＳでの洗浄のみが４℃である。インキュベーションは基本的に、温度管理が可能なオービタル振とう機を用いて行った（７０〜８０ｒｐｍ／分）。【０１１０】
＝ＡｂＳｃａｌｅ用の抗体＝
以下の抗体を用いた。Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされた、アミロイドβに対するマウスモノクローナル抗体であり、Covance社より購入した（SIG-39347）。Ｃｙ５−Ａ６０は、ＮｅｕＮに対するマウスモノクローナル抗体（Ａ６０）（Millipore, MAB377）を、Ｃｙ５二官能性ダイ（GE Healthcare, PA25500）で処理して得た。Ｃｙ３−ａＮｅｕＮは、Ｃｙ３にコンジュゲートされた、ＮｅｕＮに対するウサギポリクローナル抗体であり、Milliporeより購入した（ABN78C3）。Ｉｂａ１に対するウサギポリクローナル抗体、及び、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６にコンジュゲートされた、ウサギＩｇＧに対するヤギポリクローナル抗体はそれぞれ、Wako pure chemical industriesと、Molecular Probesとから購入した。
これらの抗体は、抗体濃度が5μｇ/ｍＬになるように抗体処理溶液（AbScale solution:図１０参照）に対して混合してＡｂＳｃａｌｅ処理に利用した。なお、抗体処理溶液の組成は、０．３３Ｍ尿素、０．１％（ｗ/ｖ）のトリトンＸ−１００及び×１倍のＰＢＳからなる水溶液である。リンス溶液（AbScale rinse solution:図１０参照）の組成は、2.5% BSA、0.05% (wt/vol) Tween-20 及び× 0.1倍のPBSからなる水溶液である。【０１１１】
＝サンプルの調製（マウス）＝
成体マウス及び老齢マウス（８−８０週齢）を、ペントバルビタール（ソムノペンチル）で充分に麻酔し、４％ＰＦＡ/ＰＢＳ（−）を用いて経心腔的灌流を行った。全脳を摘出し、４℃で１０時間又は３日間、４％ＰＦＡ/ＰＢＳ（−）中で、後固定を行った。次いで、全脳から得た半球と、海馬を含むスライスとを、ＳｃａｌｅＳで直接に透明化する（ｃｌｅａｒ）か、ＡｂＳｃａｌｅ処理又はＣｈｅｍＳｃａｌｅ処理を行った後に透明化した。動物の実験手法及び飼育条件は、該当機関の動物実験に関する委員会による承認を受け、承認を受けた内容に従って行った。【０１１２】
＝サンプルの調製（ヒト）＝
フィラデルフィア大学から提供された、アルツハイマー病患者（６０歳から８０歳）の凍結した死後脳（前頭皮質から側頭葉）のブロックを解凍し、４℃で８時間、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）中で固定した。それぞれのブロックから、一辺３−４ｍｍのキューブを切り出し、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０（希釈率１：２００）、Ｃｙ５−Ａ６０（希釈率１：２００）、及びウサギ抗−Ｉｂａ１ ポリクローナル抗体（希釈率：１：２００）を用いて、ＡｂＳｃａｌｅ処理を施した。この試料はさらに、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６にコンジュゲートされた、ヤギ抗−ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（希釈率１：５００）と反応させた。【０１１３】
＝イメージのセグメンテーション＝
ＡｂＳｃａｌｅ処理された脳サンプルのイメージデータは、ＳＰＩＭ ｓｙｓｔｅｍ （Lightsheet Z.1 及びZENソフトウェア, ZEISS）により取得し、ＴＩＦＦフォーマットで保存した。標的対象、すなわちミクログリア（Ａｌｅｘａ５４６−Ｉｂａ１のシグナル）及びアミロイドβ斑（Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０のシグナル）を大量に抽出するため、半自動的イメージセグメンテーション法を確立した。この方法は、手動による、対象物の割り当てをまず行い、それぞれの細胞又は斑は手動で完全にマスクした。バイナリマスクデータは、ImageJソフトウェア（６４ｂｉｔ, ｖｅｒｓｉｏｎ１０．７）を用いて作製した。その後、標的とする画像は、Otsu法に従い自動的にセグメンテーションされた。多段的なシグナル及び背景レベルの変化のために、この方法は、マスク領域それぞれにおける画像セグメンテーションの最適なしきい値を選択する上で非常に役に立つ。イメージのセグメンテーションに関わる全てのプロセスは、C++言語及びOpenCVライブラリで記載されたカスタムメイドのプログラムを用いて実行した。最終的にこの画像は、粗いメディアンフィルタ（radius 2.0）を適用することで、鮮明なものとした。【０１１４】
＝距離の測定＝
市販のソフトウェアVolocity version 6.3 （PerkinElmer）を上記バイナリマスクデータのセットに適用して、各ミクログリア細胞の中心から最も近位なアミロイドβ斑（表面及び中心の両方）までの距離測定を行った。C++言語で記載されたカスタムメイドのプログ
ラムと市販のソフトウェア（Igor Pro version 6.3.4.1）とを用いて、アミロイドβ斑の表面から５０μｍ以内に位置するミクログリアの数を数え、当該ミクログリアの数をプロットした。【０１１５】
＝イメージの再スライス化＝
完全な三次元のデータセットから、様々な、二次元のスタック化したイメージ群をつくり出すため、発明者らは再スライス実行プログラムを開発した。このプログラムは、全ての番号のｘｙ像平面をシステム的に統合して、ｚ方向にスタック化された、異なる厚みを持つ像群の配列を提供する。このプログラムは、三次元再構成データを再スライス化して、ｘ方向又はｙ方向にスタック化された像群を作成するためにも用いることができる。このプログラムはC++ 言語で記載された。【０１１６】
〔実験の結果〕
（１）ソルビトールおよび尿素の組み合わせ
発明者らは、まず、エリスリトール、フルクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、スクロース、およびキシリトールを含む、糖および糖アルコールからなる群に含まれる化合物から、尿素と組み合わせて用いることで、固定化された脳サンプルを透明化できるものをスクリーニングした。その結果、ソルビトールが、尿素と組み合わせることによって、最も効果的にマウスの大脳皮質を透明にすることが明らかになった。【０１１７】
尿素とソルビトールとを組合せて用いることで、サンプルの本来の体積を保ったまま透明化を達成することが可能である。その理由は必ずしも明らかではないが、一つの理由としては、尿素及びソルビトールの両方が組織を透明化する能力を有するが、尿素は水和（組織の膨張）を起こし、一方でソルビトールは脱水（組織の縮小）を起こすためであると推定される。また、組織の脱水を起こすことを期待して、ソルビトールに加えグリセロールを使用した。ソルビトールが親水性であるのに対し、グリセロールは両親媒性であり、それゆえ、グリセロールを加えることによって脳内の親油性の領域での作用がより一層向上した。【０１１８】
本発明者らはソルビトールの添加が全体の性能にとって重大であることを発見し、そのためソルビトールを含有する尿素をベースとした透明化溶液をＳｃａｌｅＳと命名した。ソルビトールを含有する溶液を組み合わせることにより、本発明者らは成体の（高齢の）哺乳類の脳のためのＳｃａｌｅＳのプロトコルを考案することを試みた。現時点において最適なプロトコルは、固定化された脳サンプルを、ＰＢＳベースのＳｃａｌｅＳ０からＳｃａｌｅＳ４までの複数の溶液で培養するものである（図９のｂ）。全てのＳｃａｌｅＳ溶液の製法を図８に示す。平衡に達した後、ＳｃａｌｅＳ４においてサンプルは実質的に透明になり（図１のａ）、またその体積も本来の１００％に近い値に収束した（図１２の（Ａ））。従来技術の生物材料用透明化試薬のＳｃａｌｅＡ２（Hama et al.,  Nat Neuroscience 14(11), 1481-8（2011））で処理した場合に比べ、生物材料の原形を保つ効果が顕著に認められた（図１２の（Ａ）、図１２の（Ｂ））。なお、ＳｃａｌｅＡ２の処理工程の概略は、図９のａに示す。【０１１９】
（２）ＳｃａｌｅＳのシグナルおよび構造保存の大きな能力
ＣＵＢＩＣは、尿素、アミルアルコール、およびトリトンＸ−１００の混合物を使用する、近年考案された方法である。当該方法は１５％のトリトンＸ−１００を含有する試薬（ＣＵＢＩＣ試薬１）においておよそ７日間サンプルを培養することを伴う。トリトンＸ−１００の高い濃度のため、ＣＵＢＩＣは強い透明化能力を特徴とし、それゆえサンプルに簡単な処置を施して１光子励起顕微鏡、例えばライトシート顕微鏡（ＬＳＦＭ）もしくは選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）による迅速な全脳イメージングが可能になる。同じ理由から、しかしながら、ＣＵＢＩＣはシグナルおよび構造の保存を保証しない。【０１２０】
対照的に、本実施例では、ＳｃａｌｅＳ法はトリトンＸ−１００の濃度を全ての手順において低濃度（例えば０．２％未満）に制限している（図８）。そのようにトリトンＸ−１００の濃度が低ければ生物学的な構造に対し有害な影響を及ぼさないであろうと期待される。それゆえ、Ｓｃａｌｅの技術は、包括的３Ｄ再構成の後、シナプス等の特定の微細構造を光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方のスケールで可視化することを可能にする。この技術はＦＰ（蛍光タンパク質）シグナルの適切な保存をも保証する。本発明者らはＳｃａｌｅＳの透明化および保存の能力を試験した。ＹＦＰ−Ｈマウス（２０週齢）の固定化された脳を２つの半球に分割した。左の脳半球をＳｃａｌｅＳにより透明化し、右の能半球をＰＢＳにより透明化した。２つの脳半球を比較する目的で、透過およびＹＦＰ蛍光のためにイメージングした。（図１のｂ）。ＳｃａｌｅＳで処理された脳半球は実質的に透明になり、ＰＢＳ処理されたものより強いＹＦＰ蛍光を示した；蛍光の観察に透明化は明らかに有益であった。ＣｈＲ２−ＹＦＰマウスから調製した脳半球からも同様の結果が得られた（図１のｃ）。対照的に、ＣＵＢＩＣで処理されたサンプルはＰＢＳで処理されたサンプルよりも弱いＹＦＰ蛍光を示した（図１３）。ＣＵＢＩＣによる蛍光の減弱は、組換えＹＦＰを用いた消失実験で明らかになったように、部分的にはＣＵＢＩＣ試薬１によるＹＦＰの消失のためである。ＣＵＢＩＣ試薬１は強いアルカリ性（ｐＨ１１．３）のため、処理中にＹＦＰの不可逆的な変性を起こす。注意すべきは、しかしながら、蛍光の減弱はＹＦＰの漏出によっても引き起こされるということである。これはＣＵＢＩＣ試薬１が、サンプルからのＹＦＰの漏出を引き起こすと考えられるトリトンＸ−１００を１５％含有するためと考えられる。【０１２１】
本発明者は以前に、ＳｃａｌｅＡ２処理の可逆性を、遡及的２Ｄ−ＩＨＣによって示した。この可逆性は、ＳｃａｌｅＳおよびＣＵＢＩＣに対しても試験した（図１４）。ＳｃａｌｅＳで処理されたサンプル、及び、ＣＵＢＩＣで処理されたサンプルから得られた薄片において、ＭＡＰ２およびＧＦＡＰ等の細胞骨格タンパク質は十分に免疫局在化された。しかし、ＳｃａｌｅＳで処理されたサンプルおよびＣＵＢＩＣで処理されたサンプル間で、シナプスタンパク質に実質的な違いが認められた。ＳｃａｌｅＳ処理が前シナプスおよび後シナプスタンパク質の免疫染色、さらに幼若な神経の細胞膜表面に存在するマーカー分子の免疫染色を保存していたのに対し、ＣＵＢＩＣ処理は免疫染色の強度および／もしくは特異性を弱めていた。【０１２２】
加えて、シナプスの超微細構造が、比較のため電子顕微鏡で検査された。４％ＰＦＡによる固定化の後、脳半球をＳｃａｌｅＳ処理によって透明化し、続いてＰＢＳで置換することによってＳｃａｌｅＳの成分を脳半球から取り除き（ｄｅＳｃａｌｉｎｇ）、透明化処理前の状態に戻した（復元）。その後、透明化処理前の状態に戻したサンプルから１ｍｍの立方体を調製し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察のための超薄切片を調製した。観察により、近接する２層のＶ錐体ニューロンの細胞体を含む、比較的広い視野が得られた（図１のｄ）。膜統合性はよく保存されているため、ニューロンのうちの１つ（左側）における細胞内小器官は、核から樹状突起（Ｄｅｎ）や軸索小丘（ＡＨ）等の細胞表面突起物までの細胞内小器官を観察することができた。そのため、神経細胞内の器官と関連のある超微細構造を調査することができる。例えば軸索起始部（ＡＩＳ）を拡大したとき、細胞表面に高電子密度の領域を発見した（図１のｅ）。さらなる拡大（図１のｆ）により、軸索終末（ＡＴ）の変形する小胞の存在によって、その領域が対称性シナプスを示すことが明らかになった。その位置および超微細構造はそのシナプスが抑制シナプスかつ軸索間シナプスであることを示す。対照的に、ＡＴ内に透明かつ丸い小胞を伴う非対称性（おそらくは興奮性）シナプスは、多くの場合神経線維網領域と同定される（図１のｇ、ｈ）。同様にＣＵＢＩＣサンプルからも超薄切片を調製した。ＣＵＢＩＣ試薬１の高濃度（１５％）のトリトンＸ−１００から予想されたとおり、神経細胞の形質膜以外にも、ミトコンドリア、樹状突起、ミエリン鞘といった各種の微細構造が著しく破壊された超薄切片がＴＥＭイメージに観察された（図１５〜図１６）。【０１２３】
（３）定量的３次元（免疫）組織化学
本発明者らは、以前に、尿素を主成分とする透明化処理試薬によって透明化処理したサンプルを、ＰＢＳで置換することによって尿素等の成分をサンプルから取り除く（ｄｅＳｃａｌｅｄ）ことにより、当該サンプルが抗体等の巨大分子を透過することを発見している。この特徴を利用するため、本発明者らは数ミリ厚の脳サンプル内の構造を完全に免疫染色する、ＡｂＳｃａｌｅと呼ばれる方法を考案済である（図１０）。【０１２４】
次いで、本発明者らはＡｂＳｃａｌｅをアルツハイマー病（ＡＤ）モデルの高齢マウスの脳に適用した。Ａβ斑の空間的分布を明らかにするため、Ａβの１〜１６番アミノ酸と反応するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である６Ｅ１０を使用した。この抗体は分子標的療法に使用されている。例えば６Ｅ１０の体内への注射は、脳のＡβを低下させるために考案された。この実験には、市販されている蛍光６Ｅ１０（Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０）を使用した。しかしながら６Ｅ１０はいくつかのＡβ前駆体、例えばＡＰＰおよびＣＴＦ−βと反応するため、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０のシグナルがニューロン内で観測されることが起こり得る。そのため本発明者らはＡβ４２を過剰に生産する、新たなＡＤモデルマウス（ＡｐｐＮＬ−Ｆ）を使用した。ニューロンの細胞核に関連するＡｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０のシグナルの位置を調査するため、本発明者らはマウス抗ＮｅｕＮｍＡｂ（Ａ６０）をＣｙ５に結合させたもの（Ａ６０−Ｃｙ５）の併用を試みた。【０１２５】
ＡｂＳｃａｌｅ溶液において、２０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ／Ｆマウスから得られた固定化された脳半球（６×４×４ｍｍ）を、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０およびＣｙ５−Ａ６０の両方と反応させた（切断前染色）。２０％スクロース溶液で処理した後、ＯＣＴコンパウンドに埋め込み、冠状面で５０μｍの厚さの切片を切り出した（図２のａ）。海馬を含む切片をスライドガラスに載せ、ウサギ抗ＮｅｕＮポリクローナル抗体およびＣｙ３と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた（切断後染色）。その後、立体顕微鏡によるＣｙ３（図２のｂ）、Ｃｙ５（図２のｃ）、およびＡｌｅｘａ４８８（図２のｄ）の３つの蛍光イメージを得た（図１７のａ：図２に対応）。まずＣｙ３−αＮｅｕＮ（切断後染色）およびＣｙ５−Ａ６０のイメージを比較し、Ｃｙ５−Ａ６０の脳半球全体内における拡散性を評価した。Ｃｙ５シグナルは脳半球表面からの深さに関わりなく実際に強力であり、Ｃｙ３シグナルと完全に一致していた（図２のｅ）。この結果はＣｙ５−Ａ６０モノクローナル抗体が脳半球内に効率よく浸透することを示唆し、およびＣｙ５−Ａ６０を用いたＡｂＳｃａｌｅの妥当性を示す。次に、Ｃｙ５−Ａ６０イメージを他の切断前染色のＡｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０イメージと比較した（図２のｆ）。Ｃｙ５標識されたニューロン細胞核が欠けている領域に、Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＡβ斑の位置が定められ（図２のｇ、ｈ）、このことは、Ａβ斑は細胞外に存在することを示す。Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＡβ斑は主に皮質において、より少なくは視床において発見された（図２のｆ）；同じＡβの分布パターンが、２０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウスから得られた冠状面切片における２Ｄ−ＩＨＣにより観察された。それゆえＡｌｅｘａ４８８の浸透力は４ｍｍ以下の脳サンプル内に存在する全てのＡβ斑を蛍光標識するのに十分であると結論付けられた。【０１２６】
（４）Ａβアミロイド可視化のためのＣｈｅｍＳｃａｌｅおよびＡｂＳｃａｌｅ
独自のＳｃａｌｅ法を構築する間に、本発明者らは固定化された脳サンプルがＳｃａｌｅＡ２および／もしくはＳｃａｌｅＢ４による透明化処理中にもしくはその後に、よく蛍光物質を透過することを発見した。以前の研究において本発明者らはＳｃａｌｅＡ２処理した脳ブロックを４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて核対比染色することに成功した。このＣｈｅｍＳｃａｌｅ（図１１）と呼ばれる方法は、一般に大きなサンプルにも適用可能である。【０１２７】
本発明者らは多色のイメージングを目的として、ＣｈｅｍＳｃａｌｅをＡｂＳｃａｌｅと併用した。本発明者らは、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０、およびＡβの集合体に対し強い親和性を示すベンゾチアゾール類縁体であって、その色がＡｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０の色と区別できるＰＰ−ＢＴＡ−１を用いてＡβ斑のモニターを試みた（図１７のｂ：図３のａおよび図３のｂに対応）。この併用の手法が、１８月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウスから採取された脳半球に適用された。本発明者らはまず皮質全体に散在する、蛍光標識されたＡβ斑の全体像を得た（図３のａ）。ＰＰ−ＢＴＡ−１は、脳アミロイド症と呼ばれる、大脳の血管へのアミロイド沈着を、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０よりも強く強調した。その後、本発明者らは個々のＡβ斑に注目した。典型的な蛍光沈着の詳細な３Ｄ再構成により、以前に報告された、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０で染色されたＡβ斑を反映する、丸い中空の形態が明らかになった（図３のａ中の差し込み図）。対照的に、ＰＰ−ＢＴＡ−１の強い蛍光は、Ａβ斑の中心部に認められた。これらの結果は、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０およびＰＰ−ＢＴＡ−１を使用しての染色およびイメージングの深度は、脳半球全体を網羅するＡβアミロイドの可視化に十分であることを示す。次に９月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウスの脳半球を同一の手法で染色およびイメージングしたが、まばらな標識のみが認められた（図３のｂ）。【０１２８】
ＣｈｅｍＳｃａｌｅのサブタイプとして、本発明者らは以前に血管構造の３Ｄ再構成のためにマウスの血管を赤の蛍光で標識した。同一の手法で、麻酔をかけたＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウス（２０月齢）に、経心的に、テキサスレッドで標識したレクチンを潅流した。後に続く固定化の後、左脳半球をＡｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０を用いてＡｂＳｃａｌｅ処理し、ＳＰＩＭシステムによりイメージングした（図１７のｃ：図３のｃに対応）。大脳皮質に位置する四角柱の３Ｄ再構成により全てのＡβ斑は血管に直接接触しているか、血管の近くに位置していることが示された（図３のｃ）。【０１２９】
（５）高齢のマウスおよびヒトの脳におけるミクログリア−Ａβ斑の結合
多くの２次元断面での研究により、アルツハイマー病（ＡＤ）の患者およびモデルにおいて、Ａβ斑の周囲に位置するミクログリア細胞の数が増えることが示されている。しかしながら、目立たない細胞集団のイメージングおよび遺伝的特徴の定量的測定は、３次元空間において実施されなければならないと本発明者等は考えている。【０１３０】
どのようにしてミクログリアの活性化がアミロイドーシスに伴うのかに関して全体的な視点を得るため、本発明者らは２０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウスから得られた２ｍｍ厚の大脳皮質スライスに対し２色のＡｂＳｃａｌｅ法を適用した（図４のａ）。スライスは、Ａｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０と、Ａβ斑およびミクログリアを免疫染色するための、ウサギ抗Ｉｂａｌポリクローナル抗体＋Ａｌｅｘａ５４６とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体とで反応し、その後、光学的に透明化した。体性感覚皮質および海馬ＣＡ１を含む領域（図４のａの立方体）を２ｍｍ厚のスライスを通じてＳＰＩＭシステムにより観察することができた（図１７のｄ：図４に対応）。６Ｅ−１０陽性の斑に加え、Ｉｂａｌ陽性の通常の大きさおよび形状のミクログリアが明瞭に可視化された。それらの３Ｄ再構成は観察された領域内まで延長され、２つの透視図（ｘｙおよびｘｚ平面）が作成された（それぞれ図４のｂ、ｃ）。後者はｚ軸に沿った蛍光の分布を示し、またそれゆえに抗体の浸透の効率を示す。最も深い領域においてもシグナルの減弱は無いので、抗体は両方の表面から効率良く浸透したと結論付けられる。次に発明者らは、３７個の、充分に分離されているＡβ斑を含む皮質領域を選択した（図４のｄ）。また、Ａβ斑の近傍（６０μｍより近く）に位置する１２０個のミクログリアを発見した。画像の分割の後、個々の斑の大きさと形、並びに、斑およびミクログリア両方の位置（重心）を決定した。本発明者らは、３次元空間において各ミクログリアの中心から最も近い斑の縁までの距離を自動的に測定する自作のアルゴリズムを使用した（図５のｅ）。休眠状態および活性化されたミクログリアはそれぞれ樹状およびアメーバ状の形状をしており、それらの３次元空間における形状を特徴づけるのは容易であるため、各区分のミクログリア細胞の休眠／活性化状態の判断を行うことができた。斑からの距離が近いことに加え、活性化されたミクログリアの形態的特徴は、老人斑の重症度の情報に成り得る。例えば、本発明者らは、近接する２つの、ほぼ同じ大きさの斑を発見したが（図４のｆ）、ミクログリアとの空間的位置関係は異なっていた（図４のｇ）。１つは９つのミクログリアと直接接触もしくは近接しており、急性の神経炎の状態を示していた（図４のｈ、＃２）。もう１つの斑はどのミクログリアとも近接しておらず、離れた隣のミクログリアはほぼ全て休眠状態であった（図４のｈ、＃１）；それゆえこの斑は陳旧性と示された。２つのＡβ斑のヒストグラムは、活性状態および休息状態のミクログリアから斑の縁までの距離の分散を示している（図４のｈ下）。３７個の全ての斑において、近接する１２０のミクログリアが同じ方法で分析された（図４のｉ）。活性化されたミクログリアも、休眠状態のミクログリアも、斑までの距離は比較的長く、１０２個のミクログリアは斑の縁から遠い（２１μｍより遠い）位置にあり、１８個の細胞のみが斑から非常に近い位置（２１μｍより近い）に近接していた。個々の斑のヒストグラムは図１８のａに示す。本発明者らはどの活性化されたミクログリアとも近接していない（２１μｍより近い）斑を陳旧性の斑と定義した。３７個のうち２５個の斑（��８％）が“陳旧性”であった。【０１３１】
１０月齢のＡｐｐＮＬ−Ｆ／ＮＬ−Ｆマウスから調製されたスライスを用いて同一の解析を行った。（図４のｊ）；斑の多い領域において１０７個のミクログリアが２７個の斑の近傍に発見された（図４のｋ）。２７個の斑のヒストグラムは、最も近くの斑までの距離は、幅広い分散となっていることを示していた（図４のｌ）。個々の斑のヒストグラムも同様に示される（図１８のｂ）。上記の定義によると、興味深いことに、２７個のうち２つ（７．４％）の斑のみが“陳旧性”と分類された。早期の段階においては２０月齢と比べ大幅に少ないＡβ斑しか発見されないものの、より多い割合の斑が急性神経炎の状態を示していた。【０１３２】
次いで、本発明者らはアルツハイマー患者の検死脳サンプルにおいて、同様に２色ＡｂＳｃａｌｅの手法を用いて、ミクログリアと斑との関係を３Ｄで可視化した。重要なこととして、細胞外のＡβ斑と細胞内のＡｌｅｘａ４８８−６Ｅ１０シグナルとを区別するため、ニューロンの細胞核を同定するＣｙ５−Ａ６０を追加的に使用した。３Ｄ再構成により９人の患者の脳ブロックが２つのグループに分類された；３つのサンプルには密度の濃い核を有する斑（有芯斑）が存在し（図１９左：cored plaques（＋））、他の６個のサンプルには存在しなかった（図１９右：cored plaques（−））。例えば前者のグループのうちの１つのサンプル（＃１６１７）において、１１個の、核を有する斑がはっきりと観察されたが、Ｉｂａｌ陽性ミクログリアの集団はその斑の豊富な領域では観察されなかった（図５のａ）。さらなる透視図の調査により、ほとんどの核のある斑はミクログリアから孤立していること（図５のｂ）、およびミクログリアと関連したものはほとんどないこと（図５のｃ）が明らかとなった。後者のグループのサンプル（＃１５２３）においては対照的に、明瞭な核を有する斑は観察されず、相当量のミクログリアの集団が３Ｄ透視図において観察された（図５のｄ）。一連のｘｙ図の調査中に、各ミクログリアの集団が“拡散斑”と近接していることを発見した。このタイプの斑は周りの細胞内のＡβ蓄積物と比較してぼやけており、ボリュームレイキャスティングの画像データを定義できなかった（図５のｄ）。このようないくつかのｘｙ図にわたる可能性のある隠れた構造を発見するために、２〜１２枚のｘｙ画像を含む、ｚ軸に沿って合成された画像の完全なセットを構成するプログラムを使用した（図５のｅ）。拡散斑は、いくつかのｚ軸に沿って合成された画像において明瞭になった（図５のｆ、ｇ）。その後立方体上の領域を、拡散斑がミクログリアと関連しているか否かを調査するために使用した（それぞれ図５のｈおよびｉ）。ブロックサンプル（＃１５２３）において、全部で２６個の拡散斑が同定され、そのうち２２個がミクログリアと相互作用を持つことが判明した。このようなミクログリアの拡散斑との関連は、他の患者のサンプルにおいてもしばしば観察される（図１９）。光学的スライスはぼやけた図を分割するための最初の最適化として実際に有効である。この再スライスの手法は機械的な分割を伴わないため、異なる大きさの構造の同定が可能である。興味深いことに、拡散斑は核のある斑を含むサンプルにはほとんど観察されず（図１９左）、拡散斑が核のある斑の前駆体であるという見方を支持している。【０１３３】
（６）ＳｃａｌｅＳＱ：脳スライスの適用可能な迅速なＳｃａｌｅ
高齢のマウスの全脳を迅速に透明化するのは容易ではない一方、本発明者らは、数多くの研究者が全脳の使用よりも脳スライスの使用に興味を持っていることに気付いた。特に、現在立体解析学に関わっている者は透明な脳スライス（１〜２ｍｍ）から十分に利益を得るだろう。すると、問題は脳スライスに特異的な迅速な透明化を考案することが可能かということになる。【０１３４】
もう１つの興味深い問題は、尿素の水和作用を打ち消すソルビトールの存在下における、尿素の濃度を上げることのできる限界である。本発明者らは、尿素を９．１Ｍでかつソルビトールを２２．５％で含む溶液が、成体マウスの数ｍｍ厚の脳スライスを迅速に透明化する力を持つことを発見した。注目すべきことに、この溶液はトリトンＸ−１００を含有せず、ＳｃａｌｅＳＱ（０）と命名された。８週齢のＹＦＰ−Ｈマウスの１ｍｍ厚の脳サンプルはＳｃａｌｅＳＱ（０）中で３７℃、１〜２時間の培養で明らかに透明になった（図６のａ−ｃ）。この手法がＹＦＰ蛍光を完全に保存することを確かめるため、本発明者らは透明化された半球（図６のｄ）およびコントロールの半球（図２０）のＹＦＰ蛍光を比較した。透明化された半球をＳｃａｌｅＳ４（０）（図８）で２時間培養し、ＳＰＩＭシステムを利用する、迅速な３Ｄイメージング実験に使用した。皮質の一部（図６のｄの白いボックス）におけるＹＦＰを発現しているニューロン（図６のｅ）の３Ｄ再構成は１分以内に完成した。ＳｃａｌｅＳＱ（０）溶液は超微細構造をよく保存することを期待されている。実際には、本発明者らはＥＭ観察（図６のｆ）を行うことにより、復元されたサンプルの膜統合性を評価した。【０１３５】
ＳｃａｌｅＳＱ（０）により明白な透明性を得られた（図６のａ−ｃ）にもかかわらず、ＳＰＩＭイメージングにより、スライス標本内部に不透明性を示す部分があることが明らかになった。透明化されたスライスの透明度を上げるため、ＳｃａｌｅＳＱ（０）にさまざまな濃度でトリトンＸ−１００を加えた。本発明者らはＦＰ蛍光を充分に保存可能なトリトンＸ−１００の濃度の上限を５％と決定した。ＳｃａｌｅＳＱ（５）（図８）は１ｍｍ厚のスライスをＹＦＰ蛍光のロスを全く起こさずに透明化することができる（図６のｇ−１）。透明化されたサンプルはＹＦＰ発現ニューロンのＳＰＩＭイメージングには非常に適しているが（図６のｋ）、超微細構造の保存性は、トリトンＸ−１００の濃度の影響により、好ましくない状態であった（図６のｉ）。【０１３６】
（７）ＳｃａｌｅＳＳ：さらに透明度が向上したＳｃａｌｅＳ
ＳｃａｌｅＳ４溶液よりもさらに透明化の透明度（光透過性）を向上させた生物材料用透明化試薬（ＳｃａｌｅＳＳ）を評価するために、ＳｃａｌｅＳＳ２０（組成：４Ｍ尿素
、４０％ソルビトール、２０％スクロース、２０％ＤＭＳＯ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）及びＳｃａｌｅＳＳ４０（組成：３．５６Ｍ尿素、３５．５６％ソルビトール、３５．５６％スクロース、１７．７８％ＤＭＳＯ、０．１８％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を調製した。ＳｃａｌｅＳＳ２０及びＳｃａｌｅＳＳ４０を用いることによる透明度の向上を検証するため、透明化処理の対象として１７週齢のＹＦＰ−Ｈマウスをペントバルビタール（ソムノペンチル）で充分に麻酔し、４％ＰＦＡ/ＰＢＳ（−）を用いて経心腔的灌流を行った後、全脳を摘出して４℃で３日間、４％ＰＦＡ/ＰＢＳ（−）中で、後固定を行ったものを準備した。固定化された全脳を、〔実験の方法〕欄の「＝ＳｃａｌｅＳ溶液を用いた透明化処理＝」において上述した第一工程から第三工程まで処理した後、観察前の工程として第三工程を経たサンプルをＳｃａｌｅＳ４中で１８９日間インキュベーションした。１８９日間のインキュベーションの翌日に全脳を右半球と左半球に分割し、右半球はＳｃａｌｅＳＳ２０又はＳｃａｌｅＳＳ４０中で１日間インキュベーションして透明化処理を施した。一方、左半球は透明度の比較のために再びＳｃａｌｅＳ４中で１日間インキュベーションした。【０１３７】
ＳｃａｌｅＳＳ２０、ＳｃａｌｅＳＳ４０又はＳｃａｌｅＳ４で透明化処理された脳半球について、透過性（図中のPermeability)、ＹＦＰ蛍光のシグナル強度（図中のFluorescence）および体積変動（図中のExpansion(Area))を比較した（図２１）。その結果、ＳｃａｌｅＳＳ２０又はＳｃａｌｅＳＳ４０で処理することで透過性と蛍光のシグナル強度とがより向上する一方、体積変動にはＳｃａｌｅＳ４と同じく影響がないことが示された。【０１３８】
次に、全脳をＳｃａｌｅＳＳ４０で処理した場合の透明度を評価するために、ＹＦＰ−Ｈマウス（１７週齢）の全脳を４％ＰＦＡによって固定し、上述の第一工程から第三工程まで処理した後、観察前の工程として第三工程を経たサンプルをＳｃａｌｅＳ４中で５９日間インキュベーションしたものを準備した。この全脳サンプルをＳｃａｌｅＳ４から取り出した状態（in air）とＳｃａｌｅＳ４に浸した状態（in liquid）で観察し（図２２上段でＳ４Ｄ２５と示す）、その後にさらに、ＳｃａｌｅＳＳ４０で２日間インキュベーションし、ＳｃａｌｅＳＳ４０から取り出した状態（in air）とＳｃａｌｅＳＳ４０に浸した状態（in liquid）とで観察した。その結果、ＳｃａｌｅＳＳ４０で２日間インキュベーションすることで透過性が向上していることが確認された（図２２）。
以上の結果より、ＳｃａｌｅＳＳの組成によって光透過性がより一層向上することが明らかとなった。【０１３９】
＜比較例１＞
神経系のニューロンに蛍光タンパク質ＹＦＰを発現したトランスジェニックマウス（ＹＦＰ−Ｈ  ｌｉｎｅ：米国Harvard大学  Joshua Sanes教授より供与されたもの。[参考文献] Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000）を用いて、灌流によるマウスの全身固定と、生物材料（大脳）の摘出及び固定を行った。固定の方法は、室温において、ペリスタポンプまたは注射筒を用いて、左心室より、固定液（４（ｗ／ｖ）％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ,  ｐＨ７．５〜８．０）を灌流して動物の全身を完全に固定した。次いで、全身を完全に固定した上記動物の頭蓋骨を除去して、生物材料としての臓器（例えば脳全体）を注意深く摘出した。そして、摘出した臓器を氷冷固定液（４（ｗ／ｖ）％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ,  ｐＨ７．５〜８．０）に８時間〜１２時間、４℃の環境下で浸漬した。【０１４０】
なお、大脳は摘出後に、左半球と右半球とに分割して固定をしている。【０１４１】
そして、得られた２つの大脳半球の一方を、以下に組成を示す生物材料用透明化試薬に、室温で４日間浸漬した。また、大脳半球の他方を、以下に組成を示す比較用の試薬に、室温で４日間浸漬した。結果を図７に示す。なお、図７中で左側にある大脳半球が、比較用の試薬で処理されたものであり、右側にある大脳半球が、生物材料用透明化試薬で処理されたものである。比較用の試薬では、大脳半球の透明化が実質的に生じていなかった。【０１４２】
以上の比較により、尿素とソルビトールの組合せにおいて、透明化が向上することが示された。
生物材料用透明化試薬の組成：
４０％（ｗ／v）ソルビトール、２Ｍ尿素、１０％（ｗ／v）グリセロール、及び０．２％（ｗ／v）TritonX-100が水中に含まれた水溶液。
比較用の試薬の組成：
４０％（ｗ／v）エリスリトール、２Ｍ尿素、１０％（ｗ／v）グリセロール、及び０．２％（ｗ／v）TritonX-100が水中に含まれた水溶液。【０１４３】
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、光学観察に用いる生物材料を調製するための生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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