(57)【要約】  本発明の目的は、安全性が高く、しかも効果の高い呼吸器疾患の予防及び治療のための医薬組成物等を提供することである。本発明は、肺組織由来の細胞の培養上清液を含むことによって、傷害された肺組織を効果的に修復することができる医薬組成物を提供する。さらに、該培養上清液を用いて、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞へと分化誘導するための方法、キットおよび方法を提供する。
2016104627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺組織由来の細胞の培養上清液。
【請求項２】
前記肺組織由来の細胞が肺サーファクタントタンパク質またはその前駆体、ＣＤ４４およびＣＤ４５からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡを発現している球状細胞である、請求項１に記載の培養上清液。
【請求項３】
肺サーファクタントタンパク質が肺サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）である、請求項２に記載の培養上清液。
【請求項４】
ＣＤ３４およびＣＤ９０からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡの発現量が全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下である、請求項２または３に記載の培養上清液。
【請求項５】
肺組織由来の細胞の培養上清液を調製する方法であって、
（１）肺組織から単離された細胞を培地に懸濁して細胞懸濁液を形成する工程；
（２）細胞懸濁液を培養した後、非接着性細胞を除去する工程；
（３）残った細胞をさらに培地中で培養して、球状細胞を形成させる工程；および
（４）細胞培養上清液を回収する工程
を含む上記方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養上清液、または請求項５に記載の方法によって調製された培養上清液を含む、呼吸器疾患を治療および／または予防するための医薬組成物。
【請求項７】
呼吸器疾患が、肺疾患または気管支喘息である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺炎、および肺サルコイドーシスからなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養上清液、または請求項５に記載の方法によって調製される培養上清液を、末梢血単核球、間葉系幹細胞、および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）からなる群から選択される細胞と接触させることを含む、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養上清液、または請求項５に記載の方法によって調製された培養上清液を含む、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺組織由来の細胞の培養上清液、および該培養上清液を含む、呼吸器疾患を治療および／または予防するための医薬組成物、ならびに該培養上清液を用いた、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化誘導するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、呼吸器疾患の大幅な増加が観察されるようになってきた。呼吸器疾患は、いわゆる呼吸器（肺、上気道、気管・気管支、胸膜等）に起こる疾患の総称であり、胸痛や咳、呼吸困難、喀血、喘鳴等の苦痛を伴う症状を有し、時として生命予後に影響することもある重要な疾患である。呼吸器疾患は、感染、外傷、アレルギー等の種々の原因によって生じ得るが、呼吸器の組織における炎症や傷害を治癒、修復することが治療上の重要な目的となる。【０００３】
しかしながら、たとえば肺における炎症組織が線維化する肺線維症や、肺胞が破壊される肺気腫や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など、病変を組織学的に修復することが困難な疾患も多く存在する。これらの非可逆的に進行する疾患については、ステロイドや免疫抑制薬、気管支拡張薬等を用いて悪化を防止する治療が行われている（特許文献１）が、病態を根本的に改善させるものとはなっていない。【０００４】
呼吸器を構成する肺は、主に気道、血管、および肺胞から構成される。気道は、空気中の酸素を肺胞に導入し、肺胞内の二酸化炭素を外界へ排出する役目を担い、上気道（口腔、鼻腔、咽頭、喉頭）および下気道（気管、気管支、細気管支）からなる。このうち、肺側に存在するのは下気道である。気管は末梢に向かって分岐を繰り返し、細気管支となる。細気管支はさらに分岐して、ガス交換機能のない終末細気管支、気管支壁に肺胞が付着してガス交換が行われている呼吸細気管支となる。呼吸細気管支は数回の分岐をして、肺胞管、肺胞嚢、肺胞に至る。肺胞は肺の容積の８５％を占め、血液とのガス交換の場となる器官である。【０００５】
気道や肺胞の内腔上皮は、内腔に侵入した異物に対する物理的バリアとして機能するほか、粘液を分泌して気道内を適切な湿度に保ったり、肺サーファクタント等の種々の生理活性物質を分泌する機能も担っている。内腔上皮は、これらの機能に適した様々な細胞から構成されている。【０００６】
下気道の内腔上皮（呼吸粘膜上皮）は、より気管に近い部位では、基底板上に基底細胞、線毛細胞（円柱線毛上皮細胞）、粘膜分泌細胞（杯細胞やクララ細胞）が配置された偽重層円柱線毛上皮と呼ばれる厚い構造を示す。しかし、気管からより分岐していくにしたがって、内腔上皮の構造も変化する。終末細気管支においては、内腔上皮は単層立方上皮構造を示し、呼吸細気管支に至ると扁平なＩ型肺胞上皮細胞からなる上皮に置き換わる。細気管支領域における上皮細胞のうち、Ｉ型肺胞上皮細胞を除く上皮細胞は小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）とも呼ばれる。肺胞上皮はＩ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞とからなる。このうち、ＩＩ型肺胞上皮細胞は、肺胞の表面張力を減少させる物質である肺サーファクタントのほかに、種々の炎症性サイトカインを産生することで知られる。近年は、肺線維化の過程で、ＩＩ型肺胞上皮細胞がＴＧＦ−βの初期ターゲットとして機能する可能性や、肺由来幹／前駆細胞（ＰＳＰＣ）として機能する可能性も示唆されており、種々の肺疾患に関わる重要な肺構成細胞であると認識されている（非特許文献１，２）。上記の肺サーファクタントは、肺胞の表面張力を減少させ、肺胞の虚脱を防いだりするのに役立っている（非特許文献３）。Ｉ型肺胞上皮細胞が傷害される病態においては、ＩＩ型肺胞上皮細胞およびその近縁の細胞が増殖後、Ｉ型肺胞上皮細胞に分化し、組織を修復する役割を果たすことも知られている（非特許文献４，５）。しかしながら、肺障害を含む呼吸器疾患の予防や治療のためにＩＩ型肺胞上皮細胞を直接投与することは、宿主体移植片反応を起こすおそれがあるなど、組織適合性の観点から問題があった。肺障害を含む呼吸器疾患の予防及び治療のための、より効果的かつ安全な方法が求められている。【０００７】
周知ではあるが、肺を構成する細胞が傷害されたり、炎症を起こしたりすることによって、種々の肺疾患が発生しうる。肺疾患には、細気管支の不可逆的な閉塞による呼吸不全を呈する閉塞性細気管支炎（ＢＯ）、肺における炎症組織が線維化する肺線維症、肺胞が破壊される慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など、病変を組織学的に修復することが困難な疾患も多く存在する。これらの不可逆的に進行する疾患については、ステロイドや免疫抑制薬、気管支拡張薬等を用いて悪化を防止する治療が行われている（特許文献２）が、病態を根本的に改善させるものとはなっていない。【０００８】
上記のとおり、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞であるＩＩ型肺胞上皮細胞および小気道上皮細胞は、肺線維症、閉塞性細気管支炎、慢性閉塞性肺疾患等の不可逆的に進行する肺疾患の発症、進行等においても重要な役割を担っている。たとえばＩ型肺胞上皮細胞が傷害される病態においては、ＩＩ型肺胞上皮細胞がＩ型肺胞上皮細胞に分化・増殖し、組織を修復する役割を果たすことが知られている。また、気管支喘息や細気管支炎の改善、治癒のためには、傷害された小気道上皮細胞が修復されることが重要である。さらには、ＩＩ型肺胞上皮細胞や小気道上皮細胞のような肺サーファクタントタンパク質陽性細胞がどのように分化して生じ得るものであるかを解明することにより、これらの肺サーファクタントタンパク質陽性細胞の修復機構を解明し、不可逆的に進行する肺疾患の病態解明および治療法の開発につなげることができると期待できる。そのためには、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない細胞から、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞への分化を誘導することのできる技術の開発が望まれる。【０００９】
これまでに、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を得る方法としては、既に肺組織に存在する細胞を回収する方法が知られている。たとえば、ＩＩ型肺胞上皮細胞を得る方法としては、肺組織の細胞を酵素的に解離したのち、ＩＩ型肺胞上皮細胞特異的な抗体を用いて選択的に単離し、回収する方法が知られている（非特許文献３）また、小気道上皮細胞については、細気管支から直接ブラシで掻き取り、単離、回収する方法等が知られている（非特許文献６）。【００１０】
しかしながら、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない細胞から、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化させることのできる方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ  ２００６／０４３６５５
【特許文献２】特表２０１３−５４４２３５
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１１）１２１，２７７−２８７
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１３）１２３，３０２５−３０３６
【非特許文献３】Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００４）８４，７２７−７３５
【非特許文献４】Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１４）９４，１２４７−１２５９
【非特許文献５】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７）１７６，１２６１−１２６８
【非特許文献６】Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）１０：９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、肺組織由来の細胞の培養上清液を含む、安全性が高く、しかも効果の高い呼吸器疾患の予防及び／または治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該培養上清液を用いて、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない細胞から、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞への分化を誘導するための組成物、キットおよび方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、これまでに肺組織から単離した細胞を混合培養することによって、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞としてＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞が得られることを見出した（非特許文献４）。そして、ＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞が獲られる時期の培養上清を肺障害モデルマウスに経肺投与することによって肺障害が抑制されることを見出した。さらに、これらの細胞を培養して得られる細胞培養上清液は、末梢血単核球等の、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない種々の細胞を肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に誘導する能力があることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
本発明は以下を提供する。
［１］肺組織由来の細胞の培養上清液。
［２］前記肺組織由来の細胞が肺サーファクタントタンパク質またはその前駆体、ＣＤ４４およびＣＤ４５からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡを発現している球状細胞である、［１］に記載の培養上清液。
［３］肺サーファクタントタンパク質が肺サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）である、［２］に記載の培養上清液。
［４］ＣＤ３４およびＣＤ９０からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡの発現量が全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下である、［２］に記載の医薬組成物。
［５］肺組織由来の細胞の培養上清液を調製する方法であって、
（１）肺組織から単離された細胞を培地に懸濁して細胞懸濁液を形成する工程；
（２）細胞懸濁液を培養した後、非接着性細胞を除去する工程；
（３）残った細胞をさらに培地中で培養して、球状細胞を形成させる工程；および
（４）細胞培養上清液を回収する工程
を含む上記方法。
［６］［１］〜［４］のいずれかに記載の培養上清液、または［５］に記載の方法によって調製された培養上清液を含む、呼吸器疾患を治療および／または予防するための医薬組成物。
［７］呼吸器疾患が、肺疾患または気管支喘息である、［６］に記載の医薬組成物。
［８］肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺炎、および肺サルコイドーシスからなる群より選択される、［７１］に記載の医薬組成物。
［９］［１］〜［４］のいずれかに記載の培養上清液、または［５］に記載の方法によって調製される培養上清液を、末梢血単核球、間葉系幹細胞、および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）からなる群から選択される細胞と接触させることを含む、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造する方法。
［１０］［１］〜［４］のいずれかに記載の培養上清液、または［５］に記載の方法によって調製された培養上清液を含む、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造するためのキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の肺組織由来の細胞培養上清液または該細胞培養上清液を含む医薬組成物を用いることによって、傷害された肺組織を効果的に修復することができる。また、本発明の医薬組成物は、細胞体や組織片を含まないため、組織適合性の観点から安全性が高い。このように、本発明の肺組織由来の細胞培養上清液または該培養上清液を含む医薬組成物は、呼吸器疾患の治療及び予防に期待され得る。【００１７】
本発明は、肺組織由来の細胞培養上清液を、末梢血単核球等の体細胞やＥＳ細胞等の幹細胞を初めとする種々の細胞と接触させることにより、これらの細胞からの肺サーファクタントタンパク質陽性細胞への分化を誘導することができる。また、本発明は、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない細胞から、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞への分化を誘導することができる。【００１８】
本発明の肺組織由来の細胞培養上清液、医薬組成物および方法は、肺疾患をはじめとする呼吸器疾患の治療または予防のための再生医療に大きく貢献するほか、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞が関与する疾患の研究や治療薬の開発にも役立つ。さらに、本発明によって得られる肺サーファクタントタンパク質陽性細胞は、自己由来の細胞を用いて製造することもできるため、自己組織と適合性が高く、移植治療に用いることにも適している。また、本発明によって得られる肺サーファクタントタンパク質陽性細胞は、末梢血単核球等の血液由来細胞を用いて製造することもできるため、生体への侵襲性を低く抑えつつ、大量に製造することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＬＭＤＥＣ（肺混合培養由来上皮細胞（Ｌｕｎｇ  Ｍｉｘｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）（ＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞））の単離および培養上清液の回収工程を示す。肺由来混合培養の時間依存的変化。スフェア様細胞凝集塊が、培養５日目において接着細胞上に現れ、培養７日目に拡散し、そして培養９日目には、浮遊しているか、または接着細胞上にゆるく付着した球状細胞が多数観察された。
【図２】図２はＬＭＤＥＣのフローサイトメトリー解析を示す。ヒストグラムは、それぞれ、（Ａ）プロＳＰ−Ｃ陽性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ４５陽性、ＣＤ３４陽性およびＣＤ９０陽性のＬＭＤＥＣのパーセンテージを示す。陰影を付けたヒストグラムは、適切なアイソタイプ対照または二次抗体によって染色された、陰性対象としてのＬＭＤＥＣを示す。（Ｂ）ＳＰ−Ｃ陽性ＬＭＤＥＣの大半がＣＤ４４およびＣＤ４５を共発現していた。ＦＳＣはＦｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ（前方散乱）を意味する。（Ｃ）ＬＭＤＥＣの小さな集団はＳＰ−Ｃ陽性／Ｓｃａ１陽性／ＣＣＳＰ陽性であり、これはＢＡＳＣを示唆する。ＢＡＳＣを含むＳｃａ１陽性細胞を枯渇させることは、ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４５陽性ＬＭＤＥＣの収量に対し影響しなかった。Ｓｃａ１陽性細胞を枯渇させた群からのＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４５陽性ＬＭＤＥＣの収量は、通常の群からのＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４５陽性ＬＭＤＥＣの細胞カウントとの比として表す。陰影を付けたバーは、平均±標準誤差（ｎ＝３）として表す。２つの群の間には、有意な差はなかった。
【図３】図３は、ＬＭＤＥＣのＩ型肺胞上皮細胞への分化能特性を示す。（Ａ）ＳＰ−ＣおよびＴ１αのｍＲＮＡ発現の時間依存的変化。球状細胞の総ＲＮＡは、示された時点において調製され、マウスＳＰ−ＣまたはＴ１αの増幅のためのＰＣＲに供された。（Ｂ）混合培養から回収した直後のＬＭＤＥＣはＳＰ−Ｃ陽性であったが、培養７日目には、ｇｐ３６陽性であった。（Ｃ）ＬＭＤＥＣの培養時間に準じたＳＰ−Ｃ陽性およびｇｐ３６陽性細胞の率は逆相関を示した。
【図４】図４は、エラスターゼ処置に続いて、肺組織由来の細胞の培養上清液、コントロール培地、またはＰＢＳを投与したマウスの肺の組織学的解析を示す。上段は、（１）ＰＢＳ投与群、（２）コントロール培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）投与群、および（３）肺組織由来細胞混合培養上清液投与群のマウス肺の組織染色像を示す。下段は、（１）〜（３）の各群における平均肺胞壁間距離をグラフ化したデータを示す。
【図５】図５は、マウスＬＭＤＥＣ培養上清を用いる細胞誘導を示す。ＳＰ−Ｃは緑（矢頭）、ｇｐ３６は赤（矢尻）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明によれば、呼吸器疾患を治療及び予防するための医薬組成物、並びに肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造するための組成物及び方法等に使用するための肺組織由来の細胞の培養上清液が提供される。
【００２１】
Ａ．肺組織由来の細胞の培養上清液
本発明において、「肺組織の細胞」とは、肺組織を構成する細胞を意味する。肺組織を構成する細胞は、肺に含まれる気道（下気道）、血管、肺胞を構成する細胞である。
【００２２】
下気道は気管、気管支、細気管支（小気道）からなる。下気道は、内腔より順に、呼吸粘膜上皮、基底板、粘膜固有層、軟骨、そして脂肪組織による外膜によって構成される。呼吸粘膜上皮は、より気管に近い部位では、基底板上に基底細胞、線毛細胞（円柱線毛上皮細胞）、粘膜分泌細胞（杯細胞やクララ細胞）が配置された偽重層円柱線毛上皮と呼ばれる厚い構造を示す。しかし、気管からより分岐していくにしたがって、内腔上皮の構造も変化する。終末細気管支においては、内腔上皮は単層立方上皮構造を示し、呼吸細気管支に至ると扁平なＩ型肺胞上皮細胞からなる上皮に置き換わる。細気管支領域における上皮細胞のうち、Ｉ型肺胞上皮細胞を除く上皮細胞は小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）とも呼ばれる。
【００２３】
肺胞はガスを溜める肺胞腔と、これを囲む肺胞上皮からなる。肺胞上皮は、Ｉ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞からなる。Ｉ型肺胞上皮細胞は、呼吸上皮細胞又は扁平肺胞上皮細胞とも呼ばれる非常に薄く扁平な細胞である。隣り合う細胞質同士は密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により接着し、毛細血管内皮細胞と基底板を介して接着し、血液空気関門を形成する。この部位で肺胞内の酸素、血液中の二酸化炭素とのガス交換が行われる。ＩＩ型肺胞上皮細胞は、大肺胞上皮細胞、顆粒肺胞上皮細胞とも呼ばれる。細胞表面には微絨毛が存在し、細胞質内にはリン脂質に富む分泌顆粒が存在する。肺胞の表面張力を減少させる界面活性剤である肺サーファクタントを開口分泌し、肺胞被覆層を形成している。肺組織を形成する細胞には、この他に、肺胞および間質に存在する血管内皮細胞、肺胞中隔細胞、線維芽細胞、マクロファージ等が含まれる。
【００２４】
本発明において、「肺組織由来の細胞」は、肺組織から得た細胞をいう。
【００２５】
本発明に用いる肺組織由来の細胞の培養上清液は、たとえば以下のような方法によって得ることができるが、これに限定されない。
（１）哺乳動物の肺組織から得た単離細胞を培地に懸濁して細胞懸濁液を形成する。
（２）細胞懸濁液を培養した後、非接着性細胞を除去する。
（３）残った細胞をさらに培地中で培養して、球状細胞を形成させる。
（４）細胞培養上清液を回収する。
【００２６】
上記の方法の（１）において、哺乳動物の肺は、たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、イエウサギ、ハムスター、モルモット（テンジクネズミ）、ブタ、サル、マウス、ラット等に由来するものを好適に用いることができる。
【００２７】
哺乳動物から得た肺は脱血されたものであることが好ましい。
【００２８】
肺から単離細胞を得る方法としてはどのような方法を用いてもよい。たとえばハサミ等によって機械的に肺を細切した後、酵素処理によって消化する方法を好適に用いることができる。酵素処理に用いる酵素としては、結合組織を消化して細胞を互いに解離することのできる酵素であればいずれを用いてもよい。たとえばデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、トリプシンやディスパーゼ等のプロテアーゼ、コラゲナーゼ、またはこれらのうち１以上を混合したものを用いることができる。ＤＮａｓｅの例としては、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  ＩＩ等が挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン等のセリンプロテアーゼ；ペプシン、カテプシンＤ等のアスパラギン酸プロテアーゼ；パパイン、アクチニジン、フィシン、カテプシンＢ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カスパーゼ等のシステインプロテアーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。コラゲナーゼの例としては、Ｉ型コラゲナーゼ、ＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｖ型コラゲナーゼ、ＶＩ型コラゲナーゼ、ＶＩＩ型コラゲナーゼ、ＶＩＩＩ型コラゲナーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
得られた肺の単離細胞を懸濁する培地としては、哺乳動物の細胞を培養することができる培地であればどのようなものを用いてもよい。たとえばＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＲＰＭ１６４０培地、またはこれらの混合培地を好適に用いることができる。培地には、必要に応じて、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清（ＮＢＳ）、子ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＥＳ）等の血清を５重量％〜３０重量％、好ましくは１０重量％〜２０重量％の範囲内で添加することができる。また、目的に応じて、ＰＭＰｒｏ、ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ等の無血清培地を用いてもよい。肺の単離細胞は、たとえばマウスやラットの細胞の場合、１×１０６細胞／ｍｌ培地〜１×１０８細胞／ｍｌ培地となるよう培地に懸濁することが好ましく、１×１０７細胞／ｍｌ培地〜２×１０７細胞／ｍｌ培地となるよう培地に懸濁することがさらに好ましい。ヒトの場合は、１×１０６細胞／ｍｌ培地〜１×１０８細胞／ｍｌ培地となるよう培地に懸濁することができるが、１×１０７細胞／ｍｌ培地〜２×１０７細胞／ｍｌ培地となるよう培地に懸濁してもよい。
【００３０】
上記の方法の（２）において、培養条件は、哺乳動物の細胞を培養することができる条件であればどのような条件を用いてもよい。たとえば５％ＣＯ２、３７℃の条件を好適に用いることができる。培養期間は、動物種に応じて当業者が適宜決定できるが、１日〜５日であることが好ましく、２日〜３日であることがさらに好ましい。培養後、非接着細胞を吸引、デカンテーション等の方法によって除去し、緩衝液を用いて２回以上洗浄し、さらに培地で１回以上洗浄した後、新たな培地を添加する。洗浄に用いる緩衝液としては、たとえば１×ＰＢＳ等を好適に用いることができる。
【００３１】
上記の方法の（３）において、残った細胞をさらに培養する。培養条件は（２）において用いた条件と同様の条件を用いてよい。培養期間は、動物種に応じて当業者が適宜決定できるが、３日〜９０日であることが好ましく、７日〜６０日であることがさらに好ましい。この工程により、球状細胞を形成させることができる。球状細胞とは、直径が１μｍ−３０μｍの略球形の形状をした細胞であり、顕微鏡等により確認をすることができる。
【００３２】
上記の調製方法において、工程（３）の後に、形成された球状細胞において、肺サーファクタントタンパク質又はその前駆体、ＣＤ４４およびＣＤ４５からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡの発現を確認することによって、球状細胞がＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞（本明細書中、「肺サーファクタントタンパク質陽性細胞」と同義で使用される。）であることを確認することができる。球状細胞は、肺サーファクタントタンパク質、ＣＤ４４およびＣＤ４５からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡを発現し、さらに、ＣＤ３４およびＣＤ９０からなる群より選択される１以上のタンパク質又はこれらをコードするｍＲＮＡを発現しないものであってよい。
【００３３】
本発明において、球状細胞は、肺サーファクタントタンパク質若しくはその前駆体又はこれらをコードするｍＲＮＡを発現するものであってよい。肺サーファクタントは、ＩＩ型肺胞上皮細胞から分泌される肺胞の表面張力を減少させる物質であり、９０％のリン脂質と１０％のタンパク質によって構成される。肺サーファクタントタンパク質にはＡ−Ｄの４種類が知られており、これらは黒木等「肺胞表面をおおうサーファクタント−特異蛋白質の構造，機能，病態−」（蛋白質・核酸・酵素  Ｖｏｌ  ４３，Ｎｏ．７，１９９８，ｐ８３４−８４６）に開示されている。
【００３４】
球状細胞がＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞であることの確認は、肺サーファクタントタンパク質のＡ−Ｄのいずれに基づいて行ってもよいが、肺サーファクタントタンパク質ＢおよびＣ、又はこれらの前駆体を好適に用いることができる。ＩＩ型肺胞上皮細胞および小気道上皮細胞の双方に発現する肺サーファクトタンパク質であるとの観点から、肺サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）又はその前駆体に基づくことが好ましい。ＳＰ−Ｃは、肺サーファクタントの主成分であるリン脂質が表面張力を減少させるのを助け、さらに、肺胞腔におけるサーファクタントのリサイクリングにも寄与していると考えられている。本発明において検出する目的のためには、プロＳＰ−Ｃタンパク質を用いることが特に好ましい。
【００３５】
マウスプロＳＰ−Ｃタンパク質のアミノ酸配列及びマウスプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０３５４８９及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０１１３５９．２として登録されている。
【００３６】
本発明において、球状細胞は、ＣＤ４４タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡを発現するものであってよい。ＣＤ４４はヒアルロン酸などの細胞外マトリクスと結合する接着分子であり、細胞−細胞間接着及び細胞−細胞間基質間接着に関与するほか、形態形成、血管形成、癌細胞の浸潤及び転移、リンパ球のホーミング等に関与している。
【００３７】
ＣＤ４４のｍＲＮＡは選択的スプライシングを受けるため、ＣＤ４４タンパク質にはいくつかのスプライスバリアントが存在するが、本発明においてはいずれのスプライスバリアントの発現を確認してもよい。たとえば、マウスＣＤ４４タンパク質のアミノ酸配列及びマウスＣＤ４４をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＡ４６８８３．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＢＣ００５６７６．１等として登録されている。
【００３８】
本発明において、球状細胞は、ＣＤ４５タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡを発現するものであってよい。ＣＤ４５は白血球共通抗原（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ，ＬＣＡ）であり、成熟赤血球や血小板を除くすべての造血系由来細胞に発現している。
【００３９】
ＣＤ４５のｍＲＮＡは選択的スプライシングを受けるため、ＣＤ４５タンパク質にはいくつかのスプライスバリアントが存在するが、本発明においてはいずれのスプライスバリアントの発現を確認してもよい。たとえば、マウスＣＤ４５タンパク質のアミノ酸配列及びマウスＣＤ４５をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ６７１６６．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ１１９３４．１等として登録されている。
【００４０】
本発明において、球状細胞は、ＣＤ３４タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量が、それぞれ全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下であるものであってよい。すなわち、上記の調製方法において、工程（３）の後に、形成された球状細胞において、ＣＤ３４タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量が、それぞれ全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下であることを確認することによって、球状細胞がＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞であることを確認できる。
【００４１】
ＣＤ３４は未分化な多能性幹細胞や、造血前駆細胞などに発現している。ＣＤ３４のｍＲＮＡは選択的スプライシングを受けるため、ＣＤ３４タンパク質にはいくつかのスプライスバリアントが存在するが、本発明においてはいずれのスプライスバリアントの発現を確認してもよい。たとえば、マウスＣＤ３４タンパク質のアミノ酸配列及びマウスＣＤ３４をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ０６６０７．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ００６６０７．１等として登録されている。
【００４２】
本発明において、球状細胞は、ＣＤ９０タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量が、それぞれ全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下であるものであってよい。すなわち、上記の調製方法において、工程（３）の後に、形成された球状細胞において、ＣＤ９０タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量が、それぞれ全タンパク質又は全ｍＲＮＡの発現量の５％以下であることを確認することによって、球状細胞がＩＩ型肺胞上皮細胞様細胞であることを確認できる。
【００４３】
ＣＤ９０はＴｈｙ−１とも呼ばれ、胸腺細胞、ＣＤ３４＋前駆胸腺細胞、造血幹細胞、神経、ヒト胎児肝細胞サブセット、臍帯血細胞、骨髄細胞等に発現している。
【００４４】
ＣＤ９０のｍＲＮＡは選択的スプライシングを受けるため、ＣＤ９０タンパク質にはいくつかのスプライスバリアントが存在するが、本発明においてはいずれのスプライスバリアントの発現を確認してもよい。たとえば、マウスＣＤ９０タンパク質のアミノ酸配列及びマウスＣＤ９０をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０３３４０８．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０５４４３６．１等として登録されている。
【００４５】
本発明において、肺サーファクタントタンパク質、ＣＤ４４タンパク質、ＣＤ４５タンパク質、ＣＤ３４タンパク質、およびＣＤ９０タンパク質は、アミノ酸配列において上記マウスＳＰ−Ｃタンパク質、マウスＣＤ４４タンパク質、マウスＣＤ４５タンパク質、マウスＣＤ３４タンパク質、およびマウスＣＤ９０タンパク質と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９７％以上の同一性を有するものをいう。
【００４６】
また、本発明において、肺サーファクタントタンパク質、ＣＤ４４タンパク質、ＣＤ４５タンパク質、ＣＤ３４タンパク質、およびＣＤ９０タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ヌクレオチド配列において、上記マウスＳＰ−Ｃタンパク質、マウスＣＤ４４タンパク質、マウスＣＤ４５タンパク質、マウスＣＤ３４タンパク質、およびマウスＣＤ９０タンパク質をコードするｍＲＮＡと６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９７％以上の同一性を有するものをいう。
【００４７】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータ・プログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００４８】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００４９】
２つの遺伝子（核酸配列）の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃ��ｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５０】
球状細胞中に上記のタンパク質又はそれらをコードするｍＲＮＡが発現していることは公知の方法を用いて確かめることができる。例えば、タンパク質の発現は、タンパク質特異的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、免疫染色等の方法により、確かめることができる。ＳＰ−Ｃ特異的な抗体、ＣＤ４４特異的な抗体、ＣＤ４５特異的な抗体、ＣＤ３４特異的な抗体、およびＣＤ９０タンパク質特異的な抗体は、たとえばａｂｃａｍ社により市販されているものを用いることができる。この際、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、ＣＤ９０．１、ＣＤ９０．２等のコンジェニックマーカーに対する抗体を用いてもよい。
【００５１】
ｍＲＮＡの発現は、細胞内に存在するｍＲＮＡを検出することによって確かめることができる。ｍＲＮＡの検出は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等の方法によって行うことができる。これらの方法はいずれも当業者にとって周知慣用の方法であるが、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）等を参照して行うことができる。
【００５２】
球状細胞のうち、ＳＰ−Ｃを発現する細胞の割合が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。
【００５３】
上記のようにして得られた肺組織由来の球状細胞を「肺混合培養由来上皮細胞（Ｌｕｎｇ  Ｍｉｘｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）（ＬＭＤＥＣ）」と呼称する。
【００５４】
上記の方法の（４）において、球状細胞が形成された後、吸引、デカンテーション等の方法によって細胞培養上清液を回収する。
【００５５】
なお、必要に応じて、工程（４）の後に、残った細胞について工程（３）および（４）を複数回繰り返すことにより、細胞培養上清液を複数回にわたって回収することができる。１回目の工程（４）の後に、工程（３）および（４）を繰り返す回数は、細胞の源となった動物種等の条件に応じて適宜設定することができるが、たとえばマウス由来の細胞では２回〜５回、ラット由来の細胞では２回〜１２回繰り返すことができる。
【００５６】
得られた細胞培養上清液の有効性を確認する方法としては、呼吸器疾患の治療薬の薬理実験に用いられるものであればどのようなものを用いてもよいが、たとえば以下のような方法を用いることができる。
【００５７】
（１）細胞培養上清液をそのまま、あるいは濃縮して、肺障害モデル動物に投与する。ネガティブコントロールとして、細胞を培養する前の培地をそのまま、あるいは濃縮して、肺障害モデル動物に投与する。
【００５８】
肺障害モデル動物としてはどのようなものを用いてもよいが、たとえば、エラスターゼ誘導肺障害モデルマウスまたはラット、ブレオマイシン誘導肺障害モデルマウスまたはラット等を好適に用いることができる。
【００５９】
ネガティブコントロール培地または細胞培養上清液を投与した動物の飼育期間は、たとえばエラスターゼモデルであれば３週間、ブレオマイシンモデルであれば２週間であることができる。
【００６０】
（２）投与後の動物を飼育した後、供試し、肺をとりだして、組織標本を作製する。
動物から得られた肺の組織標本は、定法にしたがって作製することができる。たとえば、肺組織をホルマリン等に浸漬して固定し、パラフィン包埋または凍結後に薄切し、ヘマトキシリン・エオシン染色を施すことができる。
【００６１】
（３）組織標本において、平均肺胞隔壁間距離（ｍｅａｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  ｌｅｎｇｔｈ）を測定する。作製した組織標本を光学顕微鏡等を用いて観察することによって、平均肺胞隔壁間距離を測定することができる。
【００６２】
（４）ネガティブコントロール培地を投与した動物の試料における平均肺胞隔壁間距離よりも、細胞培養上清液を投与した動物の試料における平均肺胞隔壁間距離が有意に減少していることを確認する。
【００６３】
Ｂ．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、肺組織から得た細胞の培養上清液を含むことによって、効果的に呼吸器疾患を予防または治療することができる。
【００６４】
肺組織から得た細胞の培養上清液は、そのまま、あるいは濃縮して本発明の医薬組成物として用いることができる。培養上清液の濃縮は、いかなる方法を用いて行ってもよいが、たとえば真空濃縮、凍結濃縮、膜濃縮、またはこれらを組み合わせた方法を好適に用いることができる。回収した培養上清液の約２倍〜１００倍に濃縮することができるが、約２倍〜２０倍に濃縮して用いてもよく、約２倍〜７倍に濃縮して用いてもよい。
【００６５】
細胞培養上清液に含まれるタンパク質の量は、たとえば０．１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであることができ、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであることができる。この上清液は、使用する段階において、例えば血清蛋白質等を除去した溶液として使用する事も可能である。必要に応じて、水分及び血清蛋白成分を除去した濃縮液や、それらを除去後に、更に培地や溶液等に加えた再調整液としても使用が可能である。
【００６６】
また、細胞培養上清液を乾燥した粉末をそのまま、あるいは他の構成成分と併せて本発明の医薬組成物として用いることもできる。乾燥方法はどのような方法を用いてもよいが、凍結乾燥または噴霧乾燥が好ましい。
【００６７】
本発明の医薬組成物に配合することができる他の構成成分には、限定されないが、追加の有効成分、薬学的に受容可能なキャリヤー、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００６８】
追加の有効成分の例としては、ベクロメタゾン、フルチカゾン、ブテゾニド等のステロイド剤；ＦＫ５０６、シクロスポリン等の免疫抑制剤；トブラマイシン、アミカシン等の抗菌薬；ピルフェニドン等の抗線維化薬；チオトロピウム、グリコピロニウム、イプラトロピウム等の抗コリン薬；サルメテロール、インダカテロール、ホルモテロール等のβ２刺激薬が挙げられるがこれらに限定されない。これらの有効成分は、対象の個々の適応症に応じて１種類以上を本発明の医薬組成物に配合してよい。
【００６９】
薬学的に受容可能なキャリヤーには、投与の対象に有害でなく、本発明の医薬組成物の有効成分である細胞培養上清液および追加の有効成分の生物活性および特性を損なわない緩衝剤、賦形剤、希釈剤、安定剤、抗酸化剤、保存剤、香味剤またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。緩衝剤の例には、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸が含まれる。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩；白糖、乳糖、デンプン、コーンスターチ等の糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体；ゼラチンが含まれる。希釈剤の例には精製水、生理食塩水等の水性溶媒；エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール；ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油等の植物油が含まれる。安定剤の例にはＥＤＴＡ等のキレート剤；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸類；グルコース、マンノース等の単糖類、トレハロース等の二糖類、デキストラン、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン等の多糖類が含まれる。抗酸化剤の例にはアスコルビン酸；トコフェロール類、トコトリエノール類；カロテン類、キサントフィル類等のカロテノイド；フラボノイド類等のポリフェノール類；メチオニン等のアミノ酸；ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシトルエン等の合成抗酸化物質が含まれる。保存剤の例にはオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン類が含まれる。；香味剤の例には、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；サッカリンナトリウム；アスパルテーム；アセスルファムカリウム；ソーマチン；ステビアエキス；ｌ−メントール；リモネン；ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、桂皮油、ユーカリ油、チョウジ油等の精油が含まれる。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。
【００７１】
本発明の医薬組成物の投与方法は、患者の症状や年齢等に応じて適切なものを選択することができるが、経肺投与、経鼻投与、経口投与、又は局所投与が好適である。投与量は、たとえば、３キロダルトン以下のタンパク質および３０キロダルトン以上のタンパク質を除いた細胞培養液を２０倍濃縮したものを、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｌ〜１００ｍｌ投与してもよく、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．１ｍｌ〜５０ｍｌ投与してもよく、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．５ｍｌ〜５ｍｌ投与してもよい。
【００７２】
Ｃ．呼吸器疾患の予防または治療
本発明の医薬組成物が対象とする「呼吸器疾患」とは、上気道、気管、気管支、肺を含む呼吸器において生じる疾患をいう。呼吸器疾患の例としては、病巣によって、気管・気管支疾患、肺疾患、胸膜疾患等が含まれる。本発明において、好ましくは、肺疾患または気管支喘息が挙げられるが、これらに限定されない。また、肺疾患の例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺炎、および肺サルコイドーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
用語“予防”は、呼吸器疾患の症状が生じる前に、症状の発現または進行を部分的もしくは完全に阻止することを意味する。
用語“治療”は、呼吸器疾患の１以上の症状の進行を反転、緩和、軽減、阻害し、または部分的もしくは完全に阻止することを意味する。
【００７４】
本発明の医薬組成物を投与することができる対象は、哺乳動物であればよいが、たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、イエウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、サル、マウス、およびラット等を例示することができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、投与対象の種と同じ種または異なる種の肺組織から得た細胞の培養上清液を含むものであってよい。具体的には、たとえば、ヒトへ投与される本発明の医薬組成物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、イエウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、サル、マウス、およびラットからなる群より選択される１以上の動物の肺組織から得た細胞の培養上清液を含むものであってよい。
【００７６】
Ｄ．肺サーファクタントタンパク質陽性細胞を製造するための組成物
本発明の組成物には、上記の肺組織の細胞の培養上清液またはその濃縮物もしくは乾燥物に加えて、他の構成成分を配合することができる。本発明の組成物に配合することができる他の構成成分には、限定されないが、追加の有効成分、薬学的に受容可能なキャリヤー、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００７７】
追加の有効成分の例としては、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）等の細胞成長因子；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のミネラル等が挙げられるが、これらに限定されない。また、薬学的に受容可能なキャリヤーは、上述した医薬組成物において使用する態様に準ずる。
【００７８】
本発明の組成物は、その形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。
【００７９】
本発明の組成物に配合する細胞培養上清液の量は、誘導対象となる細胞の種類や目的に応じて適宜設定することができる。たとえば、末梢血単核球の細胞数１０４あたり０．１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む培養上清液またはその濃縮物もしくは乾燥物が添加されるよう、配合することができる。
【００８０】
Ｅ．肺サーファクタントタンパク質陽性細胞の製造方法
本発明は、上記の肺組織の細胞の培養上清液又は該培養上清液を含む組成物を、末梢血単核球等の、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない細胞と接触させる工程を含む、肺サーファクタントタンパク質陽性細胞の製造方法にも関する。肺サーファクタントタンパク質陽性細胞に分化することを運命づけられていない対象細胞の例としては、末梢血単核球、間葉系幹細胞、および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明の培養上清液等を対象細胞と接触させる方法は、限定されないが、簡便には該培養上清液中で対象細胞を培養することであってもよい。培養時間等の培養時間は、当業者であれば、適宜調整できる。また、このような肺サーファクタントタンパク質陽性細胞の製造には、後述するキットを用いてもよい。
【００８２】
Ｆ．肺サーファクタントタンパク質陽性細胞の製造のためのキット
本発明は、上記の肺組織の細胞の培養上清液を含む、肺サーファクタントタンパク質発現細胞の製造のためのキットにも関する。本発明のキットは、上記の肺組織の細胞の培養上清液またはその濃縮物もしくは乾燥物に加えて、追加の構成要素を含むことができる。なお、上記した培養上清液を含む組成物を用いてもよい。
【００８３】
本発明のキットに含めることができる他の構成要素には、限定されないが、細胞培養用の培地、培地へ添加するための追加の成分、細胞培養用の培養器、およびこれらの組み合わせが含まれる。また、該キットの構成及び成分、使用法等を記載した使用説明書を含めてもよい。
【００８４】
細胞培養用の培地は、哺乳類の細胞を培養することのできる培地であればどんなものでもよいが、限定的でない例としてＰＭＰｒｏ，ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ等の無血清培地、ＤＭＥＭ培地、ＥＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｈａｍ  Ｆ−１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＲＰＭ１６４０培地、またはこれらの混合培地が挙げられる。
【００８５】
培地へ添加するための追加の成分の例としては、血清、緩衝剤、抗生剤、増殖因子、サイトカイン、タンパク質またはペプチド、アミノ酸、糖もしくは培養上清濃縮液などが挙げられるがこれらに限定されない。これらの追加の成分は、目的に応じて１種類以上を本発明のキットに含めてよい。また、これらの追加の成分をあらかじめ培地に混合したものを本発明のキットに含めてもよい。
【００８６】
血清の例には、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清が含まれる。緩衝剤の例には、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム等のリン酸塩；または２以上のこれらの混合物が含まれる。抗生剤の例には、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、または２以上のこれらの混合物が含まれる。増殖因子の例には、上皮細胞増殖因子が含まれる。サイトカインの例にはインターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４等が含まれる。タンパク質またはペプチドの例には血清アルブミン、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン等が含まれる。アミノ酸の例にはＬ−グルタミン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、または２以上のこれらの混合物が含まれる。糖の例には、グルコースが含まれる。
【００８７】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８８】
実施例１：肺混合培養由来上皮細胞（ＬＭＤＥＣ）の作製
材料と方法
＜動物＞
雄および雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスはクレアジャパン社（日本国、東京）より購入した。
＜混合培養およびＬＭＤＥＣの調製＞
雄のマウス（３〜４週齢）をペントバルビタールで麻酔し、２５ｍＬの氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって心臓内潅流し、肺の血球細胞を完全に洗い流した。肺葉を気管から切り離し、主気管支を細切して小片にしたのち、２ｍｇ／ｍＬのタイプＩコラゲナーゼ（ワーシントン社、ニュージャージー州、レイクウッド）、１ミリグラム／ミリリットルのディスパーゼ（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州、カールズバッド）、３ユニット／ｍＬのＤＮａｓｅ（キアゲン社、カリフォルニア州、バレンシア）、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００ユニット／ｍＬのペニシリンを添加したＤＭＥＭ（和光純薬工業株式会社、日本国、東京）中で、穏やかに振盪しながら、３７℃において４５分間消化した。次いで、生じた小片を単一細胞懸濁液となるまで十分に懸濁し、そして細胞を４０μｍのセルストレイナー（ＢＤバイオサイエンス社、カリフォルニア州、サンホセ）を通した後、ＦＢＳで中和した。細胞をＤＭＥＭで洗浄し、培養培地（１０％ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを添加したＤＭＥＭ）中に再懸濁した。細胞を培養皿中に播種し（細胞密度、１．３×１０６細胞／ｃｍ２）、そして加湿雰囲気（５％ＣＯ２）中、３７℃において「混合培養」としてインキュベートした。培養２日後、培養皿をＰＢＳで数回洗浄して浮遊細胞を完全に除去し、そして次いで培養培地を用いて一回洗浄した。細胞をさらにインキュベートし、培養９日目に、培養皿を叩く（タップする）ことによって、浮遊しているか、または接着細胞にゆるく付着している球状細胞をＬＭＤＥＣとして回収した。【００８９】
結果
上記混合培養からは、紡錘状の接着細胞から球状細胞が生じ、培養５日目には培養器底部の接着細胞はコンフルエントとなり、接着細胞上にスフェア様細胞の凝集塊も観察された（図１）。細胞凝集塊（見かけの比率：２−３／１．５ｍｍ２）は、培養７日目において、より大きく、よりゆるく接着し、平坦であった。その後、浮遊しているか、または接着細胞にゆるく付着した球状細胞の数は増加し、培養９日目には接着細胞を覆った。球状細胞の収率は、培養９日目において２．４±０．２×１０６細胞／マウスであった。【００９０】
実施例２：ＬＭＤＥＣの特性付け
材料と方法
＜抗体＞
マウスのプロＳＰ−ＣのＮ末端におけるアミノ酸１１−２７におけるエピトープを認識するウサギ抗プロＳＰ−Ｃ抗体は、シグマアルドリッチジャパンジェノシス社（日本国、石狩市）に依頼して作製した。別のウサギ抗プロＳＰ−Ｃ抗体は、ミリポア社（マサチューセッツ州、ビレリカ）より購入した。さらに、以下の一次抗体を用いた：抗ポドプラニン／ｇｐ３６抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ）社、英国、ケンブリッジ）；抗ＣＣＳＰ／ＣＣ１０抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カリフォルニア州、サンタクルーズ）；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ（商標）５．５−コンジュゲーテッド系統抗体カクテル（抗ＣＤ３ε、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、抗Ｌｙ−７６、および抗Ｌｙ−６Ｇ＆６Ｃ抗体（ＢＤバイオサイエンス社）；フィコエリトリン（ＰＥ）−抗ＣＤ３４抗体；ビオチン−、ＰＥ−、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−抗ＣＤ４４抗体；ビオチン−、ブリリアントバイオレット−、またはＰＥ−抗ＣＤ４５．２抗体；ＰＥ−抗ＣＤ７３抗体；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−抗ＣＤ９０．２抗体；ＦＩＴＣ−、またはＰＥ−抗ｃ−ｋｉｔ抗体；ビオチン−、またはＰＥ−抗Ｓｃａ１抗体（バイオレジェンド社、カリフォルニア州、サンディエゴ）。【００９１】
蛍光コンジュゲート一次抗体のために、各一次抗体に対応する蛍光コンジュゲートアイソタイプ対照を、フローサイトメトリー解析における陰性対照として用いた。さらに、以下の二次試薬および抗体を用いた：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０−ストレプトアビジン；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ストレプトアビジン；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ロバ抗ヤギＩｇＧ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ヤギ抗ハムスターＩｇＧ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ロバ抗ラットＩｇＧ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ニワトリ抗マウスＩｇＧ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０−ヤギ抗ウサギＩｇＧ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（ライフテクノロジーズ社）；およびＤｙＬｉｇｈｔ（商標）６８０−ロバ抗ウサギＩｇＧ（ロックランドイムノケミカルズ社、ペンシルベニア州、ギルバーツビル）。【００９２】
＜フローサイトメトリー解析＞
新たに回収したＬＭＤＥＣおよび混合培養における接着細胞を、１：１０  ＦｃＲブロッキング試薬で１５分感処理し、４℃における１５分間の細胞表面染色に供した。固定および透過処理（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー、バイオレジェンド社）の後、細胞をさらに４℃における１５分感の細胞内染色に供した。一次抗体および二次試薬／抗体は、それぞれ１００分の１および２００分の１の希釈率で使用した。得られた細胞は、７０μｍのセルストレイナー（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてフィルターにかけ、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。適切なアイソタイプ標準または二次試薬／抗体とともにインキュベートされた陰性対照細胞を用いて、陽性染色細胞をゲートした。データはＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤバイオサイエンス社）およびＦｌｏｗＪｏ９．６．２ソフトウエア（ツリースター社、オレゴン州、アッシュランド）を用いて収集し、解析した。【００９３】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社、日本、瀬田）を用いて、製造者の指示に従って、ＬＭＤＥＣから総ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡ（３μｇ）から、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社）を用い、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ライフテクノロジーズ社）を用いて、総容量を２０μＬとして、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ試料（１μＬ）をＰＣＲに供し、特異的プライマー（ＳＰ−Ｃのためには、センスプライマーとして５’−ＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＧ−３’、アンチセンスプライマーとして５’−ＧＴＡＧＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧ−３’；Ｔ１αのためには、センスプライマーとして５’−ＧＡＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＧＡＧＡＧ−３’、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧ−３’）を用いて、マウスＳＰ−Ｃまたはポドプラニン／Ｔ１α遺伝子を増幅した。内部標準として、マウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡを、特異的プライマー（センスプライマーとして５’−ＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＣＴ−３’、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧ−３’）を用いて増幅した。サーマルサイクラーの設定は、ＳＰ−ＣおよびＴ１αについては、９８℃  ３０秒、５６℃  ３０秒、６８℃  ７分を３５サイクル、および６８℃  ７分を３５サイクルとし、ＧＡＰＤＨについては９８℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３０秒を２６サイクルとした。増幅産物は１．２％アガロースゲル中で分離し、エチジウムブロマイド染色によりＵＶ照射下で可視化した。マウスＳＰ−Ｃ（３６５ｂｐ）、Ｔ１α（４１４ｂｐ）、およびＧＡＰＤＨ（４５０ｂｐ）の特異的増幅が観察された。【００９４】
＜免疫蛍光観察＞
マウスから得たＬＭＤＥＣを、実施例１と同様の培養培地に分散し、８ウェルチェンバースライド（サーモ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）上に播種した。Ｄａｙ０においては播種後３時間以内に、また、図内に表示した時間後（ただし、３日を超える場合は３日毎に培養培地を半量フレッシュな培地と交換し維持する）に、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡ／０．１Ｍ  ＮａＰＢを用いて固定した。次いで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳを用いて、細胞を３分間透過処理し、氷冷したＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（サーモ社）によって１５分間処理した後、細胞を一次抗体（抗プロＳＰ−Ｃ抗体および／または抗Ｍ２フラグ抗体）と二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−ニワトリ抗−ウサギＩｇＧ抗体および／またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社））の組み合わせによって染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。核は４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（同仁化学研究所、日本国、熊本）を用いて染色した。【００９５】
Ｓｃａ１陽性細胞枯渇試験においては、Ｓｃａ１細胞が存在しない混合培養を、抗Ｓｃａ１μビーズキット（ミルテニーバイオテク社）を用いて調製した。次いで、通常の混合培養またはＳｃａ１細胞が存在しない混合培養から得たＬＭＤＥＣを、二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−ニワトリ抗ラビットＩｇＧ抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−ストレプトアビジン（ライフテクノロジーズ社））と組み合わせた抗プロＳＰ−Ｃ抗体およびビオチン−抗ＣＤ４５．２抗体による二重染色に供した。【００９６】
＜増殖アッセイ＞
ＬＭＤＥＣ回収後の混合培養における接着細胞に１０μＭの５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を６時間負荷し、ＰＢＳを用いて洗浄した後、４％ＰＦＡ／０．１Ｍ  ＮａＰＢを用いて固定した。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵイメージングキット（ライフテクノロジーズ社）の添付プロトコルに従って、ＤＮＡ中に組み込まれたＥｄＵを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−または６４７−アザイドと共に検出した。フルオレセイン標識された核を有する細胞を、表１に記載の抗体を用いた蛍光免疫染色に供し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて検査した。【００９７】
＜統計解析＞
データは平均±標準誤差として示す。統計解析は、グラフパッドプリズム  バージョン６（グラフパッドソフトウエア  インコーポレーテッド社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて実施した。統計的有意差は、スチューデントのｔ検定、または分散解析に続くスチューデントのｔ検定によって検出し、０．０５未満のｐ値が有意であると考えられた。【００９８】
結果
＜フローサイトメトリー解析＞
フローサイトメトリー解析の結果、ほとんどのＬＭＤＥＣ（９６．４％±１．１％）がＳＰ−Ｃ陽性であった（図２Ａ）。【００９９】
これまでに、肺胞上皮細胞系譜の細胞、すなわち肺胞上皮細胞に分化することが運命づけられている細胞においては、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において、ＣＤ４４を構成的に発現することが知られている（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，２９６，Ｌ４４２−４５２）。ＬＭＤＥＣについてＣＤ４４の発現を調べたところ、９０％を超えるＬＭＤＥＣ（図２Ａ）がＣＤ４４陽性であった。【０１００】
一方、造血細胞マーカーであるＣＤ４５は、一般的にＩＩ型肺胞上皮細胞では発現していないものとして知られている（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，２９６，Ｌ４４２−４５２）。驚くべきことに、９０％近くのＬＭＤＥＣがＣＤ４５について陽性であった（９１．１±３．１％）（図２Ａ）。さらに、ＬＭＤＥＣの主たる集団（ＬＭＤＥＣＭａｊ）は、ＳＰ−Ｃ、ＣＤ４４およびＣＤ４５を共発現していた（図２Ｂ）。【０１０１】
ＬＭＤＥＣが肺幹細胞／前駆細胞の他の細胞集団を含むかどうかについて明らかにするために、以下のさまざまなマーカーを用いて検討した：ＣＤ３４（より初期の多能性前駆細胞から後期の細胞系譜に拘束された前駆細胞までをカバーする造血幹細胞／前駆細胞マーカー（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ２００９，１０６，８２７８−８２８３）であって、気管支肺胞上皮細胞（ＢＡＳＣ）のための濃縮マーカーツールである）；ＣＤ９０（組織に存在する間葉幹細胞（ＭＳＣ）の主たるマーカーの一つである（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１１，９１，３６３−３７８））。ＬＭＤＥＣにおいて、ＣＤ３４およびＣＤ９０の発現はほとんど観察されなかった（図２Ａ）。一方、ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＣＳＰ陽性／Ｓｃａ１陽性を示す小さな細胞集団がＬＭＤＥＣの中に観察された。このことはＬＭＤＥＣが気管支肺胞上皮細胞（ＢＡＳＣ）を含むことを示唆している（図２Ｃ）。ＢＡＳＣは気道および肺胞の両方の系譜に分化する能力を有する（Ｃｅｌｌ，２００５，１２１，８２３−８３５）。このことは、ＬＭＤＥＣＭａｊが、部分的にＢＡＳＣに由来するかもしれない可能性を示唆する。【０１０２】
次いで、Ｓｃａ１陽性細胞を有する、または有さない肺混合培養を調製し、それぞれの条件において、ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４５陽性ＬＭＤＥＣの回収率を検討した。混合培養からＳｃａ１陽性細胞を枯渇させることは、ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４５陽性ＬＭＤＥＣの回収率に影響を与えなかった（図２Ｃ）。このことは、少なくとも今回用いた培養条件においては、ＢＡＳＣはＬＭＤＥＣＭａｊに分化しないかもしれないことを示唆する。【０１０３】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
ＬＭＤＥＣについて、ＳＰ−Ｃ、およびＩ型肺胞上皮細胞のマーカーであるポドプラニン／Ｔ１αのｍＲＮＡの時間依存的発現変化を検討した。ＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡ発現の減少が観察されたとともに、それと反比例してＴ１α  ｍＲＮＡ発現の上昇が観察された（図３Ａ）。抗プロＳＰ−Ｃ抗体および抗ポドプラニン抗体（抗ｇｐ３６抗体）を用いた免疫蛍光染色に供したところ、回収直後のＬＭＤＥＣは、プロＳＰ−Ｃに陽性の免疫反応を示したものの（総細胞の９０％を超える細胞）、７日間培養すると、ｇｐ３６に陽性となった（総細胞の８０％を超える細胞）（図３Ｂ）。このマーカー発現変化を時間経過で観察したところ、ｍＲＮＡの解析結果に準じて、逆相関性が確認された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＬＭＤＥＣが、Ｉ型肺胞上皮細胞へと分化しうることを示唆する。【０１０４】
＜混合培養の接着細胞の特性付け＞
図１に示されるように、ＬＭＤＥＣは、培養７日後には浮遊した、またはゆるく付着した細胞として顕著に増加し始めた。ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４４陽性／ＣＤ４５陽性として認めたＬＭＤＥＣＭａｊの起源および自己複製能を評価するために、混合培養中の接着細胞の細胞集団について、幹細胞に焦点を絞り検討した。ＬＭＤＥＣを、培養７日目において洗い流し、残った接着細胞をＥｄＵ標識後、回収して、蛍光免疫染色とＥｄＵ検出反応に供し、フローサイトメトリーにて解析した。表１に示されるように、Ｌｉｎ陰性／Ｓｃａ１陽性／ｃ−ｋｉｔ陽性のＬＳＫ細胞（始原造血幹細胞）、およびＣＤ４５陰性／ＣＤ９０陽性／ＣＤ７３陽性のＭＳＣは、それぞれ、１．４％および４．７％の割合で接着細胞に含まれていた。ＬＳＫおよびＭＳＣにおけるＥｄＵ標識細胞の割合は、それぞれ７６％および１１．３％であった。ＢＡＳＣは総接着細胞の６．６％であり、その４４．４％がＥｄＵ陽性であった。【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
これらの結果は、内的起源または外的起源から生じた異なる種類の幹細胞が、混合培養の接着細胞中に含まれていることを示唆する。注目すべきことに、ＳＰ−Ｃ陽性／ＣＤ４４陽性／ＣＤ４５陽性のＬＭＤＥＣＭａｊもまた、総接着細胞の１７．５％として、かつ、その３６．８％がＥｄＵ陽性として混合培養の接着細胞中に含まれた。【０１０７】
実施例３：肺障害モデルマウスにおける肺組織由来細胞混合培養上清液の投与
＜肺組織由来細胞混合培養上清液の調製＞
実施例１の方法に従って、肺組織由来の細胞の混合培養を行った。培養上清を回収し、１５００ｒｐｍで５分間遠心した後、その上清を回収して、０．２２μｍフィルターでろ過した。ろ液を限外ろ過フィルター付遠沈管に適用し、分子量３−５０ＫＤａのタンパク質を含む画分を濃縮・精製した溶液を調製した（濃縮率：２５倍）。この溶液を肺組織由来細胞混合培養上清液として実験に用いた。【０１０８】
＜肺障害モデルマウスへの肺組織由来細胞混合培養上清液の投与＞
マウスにエラスターゼ（３０μｇ／マウス）を経気管的に単回投与した（０日目）。その後、マウスを（１）〜（３）の３群にわけ、それぞれの群について、３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目の５回にわたって、（１）ＰＢＳ、（２）コントロール培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）、または（３）肺組織由来細胞混合培養上清液を各７５μｌずつ経気管的に投与した。その後、マウスを供試して肺を取り出し、固定し、切片とした後、ヘマトキシリン・エオシン染色を施して、平均肺胞壁間距離を測定した。各投与群について、エラスターゼにより惹起される平均肺胞壁間距離の増大の抑制効果を比較することにより、肺気腫化への効果を比較検討した。【０１０９】
＜結果＞
結果を図４に示す。
エラスターゼで惹起される平均肺胞壁間距離の増大（肺の気腫化）に対し、肺組織由来細胞混合培養上清液のみが抑制効果を示した。【０１１０】
実施例４：ＬＭＤＥＣ培養上清液を用いた細胞の誘導
（その１）マウスＬＭＤＥＣ培養上清を用いる細胞誘導
（１）定法に従いマウス  ＬＭＤＥＣをマウス新鮮肺より調整する。
（２）マウスより採血を行い、ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて、マウス単核球を取り出す。
（３）上記マウス単核球を原料として、ＭＡＣＳを用いて、ＣＤ４５陽性細胞を単離する。
（４）４×１０５となる様に、８ウェルチャンバーに細胞を播種する。
（５）（１）で準備したマウスＬＭＤＥＣより培養上清を取り出し、ミリポアフィルター（５μｍ）を用いて、細胞及び細胞片等を除去して、ＬＭＤＥＣ培養上清液とする。上清は２回取り出し、それぞれ、上清１、上清２とする。
（６）（４）の各チャンバーより培地をゆっくりと除去し、（５）で準備した上清液を２００μｌ添加する。
（７）（６）を４日間培養した後、培地除去・ＰＢＳ洗浄を行い、ホルマリンで固定する。１次抗体にＳＰＣ，ｇｐ３６を用いて免疫染色後、蛍光顕微鏡観察を実施する。結果を図５に示す。ＳＰＣは緑（矢頭）、ｇｐ３６は赤（矢尻）で示す。誘導は、遺伝子レベルでも観測された。
（その２）マウス単球の代わりにヒト単球を用いた場合にも、同様の結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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