(57)【要約】  タイトジャンクション形成促進を評価するための細胞、およびタイトジャンクション形成促進のための剤を提供する。詳細には、L線維芽細胞に由来し、クロ―ディンをコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入され、クローディンを安定的に発現可能である、細胞株およびその培養物、ならびにN-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド リン酸塩（別名、N-[2-[[[3-(4′-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチルアミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4′-メトキシベンゼンスルホンアミド リン酸塩）、すなわちNK-93を有効成分とする剤を提供する。本発明の細胞株および培養物は、タイトジャンクション形成促進能を有する物質のスクリーニングのために有用である。本発明の剤は、化粧料組成物の添加剤として有用であり、またTJ形成に関連した疾患または状態、例えば潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、および気管支ぜんそくの処置のために、有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞に由来し、クロ―ディンをコードするポリヌクレオチドを発現可能に導入され、クローディン１を安定的に発現可能である、細胞株。
【請求項２】
線維芽細胞が、L929細胞である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項1に記載の細胞株の培養物。
【請求項４】
線維芽細胞が、L929細胞である、請求項３に記載の培養物。
【請求項５】
タイトジャンクション（TJ）の形成を促進する物質をスクリーニングするための、請求項３または４に記載の培養物。
【請求項６】
(1)候補物質を、請求項３〜５のいずれか１項に記載の細胞の培養物へ供与し；そして
(2)候補物質が培養物においてTJの形成を促進している場合に、その物質を選択する
工程を含む、TJの形成を促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、TJ形成促進剤。
【請求項８】
N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、化粧料組成物。
【請求項９】
皮膚の乾燥、しわ、日焼け、または老化の処置のための、請求項8に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、食品組成物。
【請求項１１】
N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
TJ形成に関連した疾患または状態の処置のための、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
CAMKII阻害剤を含む、TJ形成に関連した疾患または状態の処置のための医薬組成物または化粧料組成物。
【請求項１４】
TJ形成に関連した疾患または状態が、皮膚の慢性的な炎症である、請求項12または13に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
【請求項１５】
TJ形成に関連した疾患または状態が、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、および気管支ぜんそくからなる群より選択されるいずれかである、請求項12または13に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイトジャンクション形成促進を評価するための細胞を提供する。また本発明は、細胞のタイトジャンクションの形成の促進方法、そのための有効成分に関する。本発明は、食品、化粧品、医薬品、ライフサイエンス等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞の密着結合（タイトジャンクション、TJ）は高度に動的な構造である。TJはセルトリ細胞間に形成されたTJを通る生殖細胞移動の間は消失する(非特許文献1)。一方で、TJは高浸透圧ストレス下では拡大する(非特許文献2)。従って、上皮細胞はTJの量を制御する機序を有しているはずである。炎症性腸疾患またはアトピー性皮膚炎のような病的状態では、体の内部区画からのイオンまたは水の漏出流動と外部からの有害な抗原の促進された取り込みとが、上皮バリアの障害の結果もたらされる2つの結果である。従って、上皮バリアの機能の調節に関わる分子機序を理解することは臨床的に重要である(非特許文献3)。【０００３】
タイトジャンクションの機能増強による、肌荒れ、炎症の防止、保湿を目的とした化粧品や外用剤の開発が進められてきている（特許文献1〜4）。【０００４】
以前の研究は、クローディンの過剰発現はL線維芽細胞において異所性のTJ形成を再構成するのに十分であることを明らかにした(非特許文献4)。一方で、上皮細胞において、クローディン-1の過剰発現は側底膜領域におけるクローディン-1の蓄積および過剰なTJ形成を誘導せず、これは過剰量のクローディン-1は上皮細胞における余分なTJの形成を防ぐために形質膜から適切に除去されることを示唆している。【０００５】
本発明者らは以前にZO-1の強制的な二量体化が、クローディンの重合および異常なTJ鎖を誘導し得ることを実証しており、これはZO-1がクローディンの核形成因子（nucleator）であると考えることができることを示唆している(非特許文献5、非特許文献6)。【０００６】
一方、KN-93は、Ca2+/calmodulin dependent protein kinase IIの阻害剤として知られている（非特許文献7）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平9-30978号公報
【特許文献２】特開2007-210948号公報
【特許文献３】特開2009-269900号公報
【特許文献４】特開2013-56841号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Smith, B.E., and R.E. Braun. 2012. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338:798-802.
【非特許文献２】Madara, J.L. 1983. Increases in guinea pig small intestinal transepithelial resistance induced by osmotic loads are accompanied by rapid alterations in absorptive-cell tight-junction structure. J Cell Biol. 97:125-136.
【非特許文献３】Hering, N.A., M. Fromm, and J.D. Schulzke. 2012. Determinants of colonic barrier function in inflammatory bowel disease and potential therapeutics. J Physiol. 590:1035-1044.
【非特許文献４】Furuse, M., H. Sasaki, K. Fujimoto, and S. Tsukita. 1998. A single gene product, claudin-1 or -2, reconstitutes tight junction strands and recruits occludin in fibroblasts. J Cell Biol. 143:391-401.
【非特許文献５】Ikenouchi, J., K. Umeda, S. Tsukita, and M. Furuse. 2007. Requirement of ZO-1 for the formation of belt-like adherens junctions during epithelial cell polarization. J Cell Biol. 176:779-786.
【非特許文献６】Umeda, K., J. Ikenouchi, S. Katahira-Tayama, K. Furuse, H. Sasaki, M. Nakayama, T. Matsui, S. Tsukita, and M. Furuse. 2006. ZO-1 and ZO-2 independently determine where claudins are polymerized in tight-junction strand formation. Cell. 126:741-754.
【非特許文献７】Sumi, M., K. Kiuchi, T. Ishikawa, A. Ishii, M. Hagiwara, T. Nagatsu, and H. Hidaka. 1991. The newly synthesized selective Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II inhibitor KN-93 reduces dopamine contents in PC12h cells. Biochem Biophys Res Commun. 181:968-975.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アクチン重合に類似して、クローディンのTJ鎖への重合は厳密に制御されているはずである。本発明者らは以前にZO-1の強制的な二量体化はクローディンの重合および異常なTJ鎖を誘導し得ることを実証しており、これはZO-1がクローディンの核形成因子（nucleator）であると考えることができることを示唆している(Ikenouchi et al., 2007; Umeda et al., 2006)。未重合のクローディンは培養された上皮細胞中および組織中で側底膜において保持されているが、TJはその側底膜領域において形成されていない。クローディンの自発的重合および不必要なTJ形成を防ぐため、未重合のクローディンの濃度は自発的重合の閾値より下に保たれているはずである。従って、形質膜における未重合のクローディンの濃度の制御に関わる分子機序が存在するが、そのような機序は明らかにされていないままである。【００１０】
本研究において、本発明者らはCAMKIIの阻害がTJ領域の拡大および上皮バリア機能の上方制御をもたらすことを明らかにした。これらの作用は、結合の収縮性の増大により、およびクローディン-1のユビキチン化の減少により達成された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下を提供する。
[１]  線維芽細胞に由来し、クロ―ディンをコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入され、クローディンを安定的に発現可能である、細胞株。
[２]  線維芽細胞が、L929細胞である、[１]に記載の細胞株。
[３]  [１]に記載の細胞株の培養物。
[４]  線維芽細胞が、L929細胞である、[３]に記載の培養物。
[５]  タイトジャンクション（TJ）の形成を促進する物質をスクリーニングするための、[３]または[４]に記載の培養物。
[６]  (1)候補物質を、[３]〜[５]のいずれか１項に記載の細胞の培養物へ供与し；そして
(2)候補物質が培養物においてTJの形成を促進している場合に、その物質を選択する
工程を含む、TJの形成を促進する物質のスクリーニング方法。
[７]  N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、TJ形成促進剤。
[８]  N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、化粧料組成物。
[９]  皮膚の乾燥、しわ、日焼け、または老化の処置のための、[８]に記載の化粧料組成物。
[１０]  N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、食品組成物。
[１１]  N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、医薬組成物。
[１２]  TJ形成に関連した疾患または状態の処置のための、[１１]に記載の医薬組成物。
[１３]  CAMKII阻害剤を含む、TJ形成に関連した疾患または状態の処置のための医薬組成物または化粧料組成物。
[１４]  TJ形成に関連した疾患または状態が、皮膚の慢性的な炎症である、[１２]または[１３]に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
[１５]  TJ形成に関連した疾患または状態が、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、および気管支ぜんそくからなる群より選択されるいずれかである、[１２]または[１３]に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】CAMKII阻害剤であるKN-93はTJの拡大およびバリア機能の上方制御を誘導した。  （A）GFP-クローディン-1は、GFPmCL1L細胞において24時間の血清飢餓条件下でのみ細胞間接触部位に蓄積した。スケールバー、5μm。（B）10μM  KN-93による5時間の処理はGFPmCL1L細胞においてTJ形成を誘導した。スケールバー、10μm。（C）（D）10μM  KN-93による5時間の処理は、培養された上皮細胞（CSG1細胞）において側底膜領域において余分なTJを誘導した。DMSO（対照）または10μM  KN-93で処理した細胞を、抗クローディン-1  pAb（緑）および抗ZO-1  mAb（赤）で二重染色した。これらの余分なTJはZO-1を含有していなかったことを特筆する（矢印）。スケールバー、10μm。（E）クローディン-1  mAb（クローン2H10D10）はKN-93で処理することにより誘導した異所性のTJの形成の一因となるクローディン-1のみを認識した。スケールバー、5μm。（F）CSG1細胞をTranswellチャンバー中で培養し、DMSO（対照）または10μM  KN-93で5時間処理し、次いでそれらのTERに関して分析した。TERの分析により、KN-93による処理の後、1.8倍の増加が示された。
【図２】KN-93処理は増大した結合の収縮性により上皮バリアの機能を高める。（A）CSG1細胞をDMSO（対照）または10μM  KN-93で5時間処理し、α-カテニンの張力依存性の立体構造を認識するα18抗体、またはファロイジンにより染色した。対照細胞において、α18抗体は、上皮細胞の三細胞のコーナーを優先的に染色した（矢印）。一方、α18抗体はKN-93 処理細胞においては、二細胞の細胞間ジャンクションを強く染色した。スケールバー、20μｍ。（B) CSG1細胞をDMSO（対照）または10μM  KN-93で5時間処理し、抗クローディン-1  pAb（緑）および抗Esp8 mAb（赤）で二重染色した。スケールバー、10μm。（C）DMSO（対照）または10μM  KN-93で処理したCSG1細胞の全細胞溶解物の、示した抗体による免疫ブロッティング。（D）CSG1細胞をTranswellチャンバー中で培養し、DMSO（対照）、10μM  KN-93、10μM  KN-93および10μM  Y-27632、または10μM  Y-27632で5時間処理し、次いでそれらのTERに関して分析した。この実験におけるTER値は次のとおり; 対照 533.6±67.2 Ω/cm2, KN-93 953.0±93.0 Ω/cm2, KN93+Y27632 679.3±35.4 Ω/cm2 ,Y-27632 424.3±66.4 Ω/cm2。
【図３】CAMKIIの阻害はAMPKの活性化およびクローディン-1のリン酸化をもたらす。（A）通常培地、血清欠失培地、DMSO（対照）、50mM  2-DGまたは10μM  KN-93で処理したCSG1細胞の全細胞溶解物の、示した抗体による免疫ブロッティング。KN-93による処理がAMPKの活性化型を劇的に増大させたことを特筆する。P-CAMKIIの一番上のバンドは、CAMKIIδアイソフォームに対応する。CAMKIIδはKN-93処理により阻害されなかった（アスタリスク）。（B）50mM  2-DGを用いた24時間の処理によるAMPKの活性化は、GFPmCL1L細胞における細胞間接触部位でのGFP-クローディン1の蓄積（左のパネル）およびCSG1細胞における異所性TJ（右のパネル）を誘導した。スケールバー、10μm。（C）AMPKはインビトロキナーゼアッセイにより決定されるようにクローディン-1の細胞質側尾部をリン酸化する。GST-クローディン-1のCOOH尾部を、［γ-32P］ATPの存在下で組み替えAMPKと共に保温した。リン酸化されたタンパク質をSDS／PAGEにより分解し、オートラジオグラフィーにより検出した。（D）GFP-クローディン-1は二重線として移動し、より遅く移動するバンドは10μM  KN-93を用いた処理により低減した。（E）GFP-クローディン-1の上のバンドは50mM  2-DGを用いた処理により減少し、一方で上のバンドは10μM  MG-132を用いた処理により増大した。プロテアソーム阻害の前のAMPKの活性化は上のバンドを低減した。（F）クローディン-1はLys-189においてモノユビキチン化された。細胞にGFP-クローディン-1またはGFP-クローディン-1  K189A変異体およびmyc-ユビキチンを導入した。その細胞溶解物に対して抗myc抗体を用いた免疫沈降を行い、続いて抗GFP抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。
【図４】TJは高浸透圧ストレスへの適応として拡大する。（A）CSG1細胞を高浸透圧培地を用いて2時間処理し、抗クローディン-1  pAb（緑）および抗ZO-1  mAb（赤）（上のパネル）または抗クローディン-1  pAb（緑）およびα18抗体（赤）（中央のパネル）または抗Par-3  pAb（緑）および抗クローディン-1  mAb（クローン2H10D10）（赤）（下のパネル）を用いて二重染色した。スケールバー、20μm。（B）高浸透圧培地で処理したCSG1細胞のXz断面。（C）通常の浸透圧の培地または600mOsm／Lの培地で2時間処理したCSG1細胞の全細胞溶解物の、示した抗体を用いた免疫ブロッティング。(D) myc-ユビキチンを安定して発現しているCSG1細胞を、通常培地または高浸透圧培地で2時間培養した。細胞溶解物は抗myc抗体で免疫沈降に供し、ついで抗クローディン-1抗体による免疫ブロッティングに供した。
【図５】CAMKIIおよびAMPKは高浸透圧ストレスへの生理的適応に関わっている。  (A) ドミナントネガティブAMPK2の過剰発現は、高浸透圧条件下においてでさえ、余分なTJ形成を抑制した。CSG1細胞はmCherry-AMPKα2 K45Mを導入し、高浸透圧培地で2時間培養された。次いで細胞は固定され、抗クローディン-1pAbで染色された（（緑）。スケールバー、10μm。（B）CSG1細胞をTranswellチャンバー中でコンフルエントな条件下で培養し、時間0において高浸透圧培地に移した。50μM化合物Cまたは10μM  KN-93またはDMSO（対照）を含有する培地を用いた。（C）どのようにKN-93処理が上皮バリアの機能を高めるのかに関する分子機序。このモデルの詳細に関しては本文を参照。
【図６】KN-93処理はEpH4細胞においてTJを拡大する。EpH4細胞を10μM  KN-93で5時間処理し、抗クローディン-3  pAb（緑）および抗ZO-1  mAb（赤）を用いて染色した。スケールバー、20μm。
【図７】AMPKの活性化は上皮バリアの増進に十分ではない。（A）CSG1細胞をTranswellチャンバー中で培養し、DMSO（対照）または50mM  2-DGで24時間処理し、次いでそれらのTERに関して分析した。この実験におけるTER値は次のとおり; Control 542.0±33.2 Ω/cm2, 2-DG 498.0±46.0 Ω/cm2（B）CSG1細胞を50mM  2-DGで24時間処理し、α18抗体（緑）および抗クローディン-1  pAb（赤）を用いて二重染色した。スケールバー、20μm。
【図８】プロテアソーム阻害剤MG-132はGFPmCL1細胞中のクローディン-1の蓄積を誘導する。GFPmCL1細胞を10μM  MG-132で8時間処理した。スケールバー、20μm。
【図９】高浸透圧ストレスはMLC-2のリン酸化を増加する。MLC-2のリン酸化は、高浸透圧ストレス下で細胞質全体において上方制御された。スケールバー、10μm。
【図１０】ヒト皮膚モデルを用いた検討。ヒト3次元培養表皮 LabCyte EPI-MODEL  ラボサイト  エピ・モデル（製品コード：401112）（株式会社ジャパン・ティシュ・エンジニアリング）を用いた。ヒト皮膚モデルを、DMSO（対照）、10μM  KN-93で3時間処理し、次いでそれらのTERに関して分析した。その結果、KN-93で処理した群では有意にTERが上昇した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上皮細胞は、拡散バリアを構築することにより本発明者らの体の外部および内部の間の境界を定めている。上皮細胞の密着結合（TJ）は、有害な微生物の人体中への侵入および水またはイオンの体からの自由な拡散に対するバリアとして機能している。従って、TJの形成は上皮細胞において厳密に制御されなければならない。TJの量は浸透圧ストレスのような生理的刺激により制御されていることが知られている。しかし、そのような分子機序は大部分が未知である。本研究において、本発明者らは化合物ライブラリーのスクリーニングからCAMKIIをTJのバリア機能の制御因子として同定した。CAMKIIの阻害は、TJ領域の拡大およびバリア機能の上方制御をもたらした。CAMKIIの阻害は、部分的にはAMPKの活性化およびそれに続くクローディン-1のリン酸化により過剰なTJ形成を誘導する。上皮バリアは感染症および慢性炎症性疾患の予防に必須であるため、CAMKIIのTJ機能の調節因子としての同定は、これらの疾患に関する新規の薬物の開発への道を開く。
【００１４】
〔有効成分〕
本発明のTJ形成促進剤は、N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド（別名、N-[2-[[[3-(4′-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチルアミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4′-メトキシベンゼンスルホンアミド）またはその塩を有効成分とする。この化合物は、下記の構造を有する。
【００１５】
【化１】
2015159855.tif 000002
【００１６】
本発明のTJ形成促進剤は、好ましくはN-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド リン酸塩（別名、N-[2-[[[3-(4′-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチルアミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4′-メトキシベンゼンスルホンアミド リン酸塩）、すなわちNK-93を有効成分とする。
【００１７】
KN-93の原著論文は前掲非特許文献7である。NK-93は、現在はSigmaやMerckなど、色々な試薬会社から購入できる。
【００１８】
本発明でいう、N-[2-[N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルアミノメチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド（別名、N-[2-[[[3-(4′-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチルアミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4′-メトキシベンゼンスルホンアミド）またはその塩には、化粧品、食品、または医薬として許容可能な塩が含まれる。これには、鉱酸塩、有機カルボン酸塩およびスルホン酸塩が含まれる。鉱酸塩には、リン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、および硫酸塩が含まれる。有機カルボン酸塩には、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、アスパラギン酸塩、トリクロロ酢酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が含まれる。スルホン酸塩には、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩およびナフタレンスルホン酸塩が含まれる。
【００１９】
本発明者らは、上皮細胞のタイトジャンクションの領域を増大させて、バリア機能を大幅に上げる薬剤として、NK-93 を同定した。上皮細胞にはタイトジャンクションを増やす仕組みがもともと存在することが知られており、この仕組みを、人為的にNK-93を投与することで活性化することができることが分かった。したがって、本発明により、人為的に上皮バリア機能を上げることが可能になったといえる。
【００２０】
本発明者らは、NK-93とコントロールとなるDMSOを投与した場合の、上皮細胞の電気抵抗値の変化についても確認した。上皮細胞の電気抵抗値（TER）の増大は、細胞間隙を通るイオンの量の減少を意味し、タイトジャンクションの機能が強化されていることを意味する。
【００２１】
一方、KN-93はCAMKIIの選択的阻害剤として広く使用されている。したがって、CAMKIIの選択的阻害剤であれば、同様の効果が奏されるものと考えられる。したがって、本発明は、CAMKII阻害剤を含む、TJ形成に関連した疾患または状態の処置のための、化粧料組成物、食品組成物、医薬組成物も提供する。CAMKII（Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII）は、Ca2+とCa2+結合タンパク質であるカルモジュリンによって活性化されるタンパク質リン酸化酵素である。これの阻害剤としては、KN-93のほか、その制御ドメインに存在している自己リン酸化部位の配列に由来するペプチドAIP（Autocamtide 2 Related Inhibitory Peptide）、Staurosporine、Fasudil, Monohydrochloride Salt、1-Naphthyl PP1、K-252a、KN-62、Lavendustin C、12(S)-HPETE、K-252b、HA-1077 dihydrochloride、Arcyriaflavin Aなどが当業者にはよく知られている。CAMKII阻害剤は、化合物単体でもよく、植物抽出物のような組成物または混合物でもよい。候補物質は、人工的に合成されたものであってもよく、天然物由来であってもよい。
【００２２】
消化管や気管、皮膚の慢性的な炎症疾患（潰瘍性大腸炎、アトピー、気管支ぜんそくとタイトジャンクションの関連）の低減においても、バリア機能の重要性は基礎研究段階で証明されているため、本発明は、これらの医薬品の開発にも有用である。
【００２３】
〔スクリーニングのための細胞、スクリーニング方法〕
本発明はまた、線維芽細胞に由来し、クロ―ディンをコードするポリヌクレオチドを発現可能に導入され、クローディンを安定的に発現可能である細胞株を提供する。このような細胞株は、クローディンを安定的に発現する一方で、そのままではタイトジャンクションの形成が認められないが、何らかの刺激を与えることにより、タイトジャンクションが形成され得る。そのため、タイトジャンクションの形成を促進する物質のスクリーニングに用いることができる。
【００２４】
クローディンは遺伝子ファミリーを形成しており、ヒト、マウスのゲノム上で約24のサブタイプが存在することが知られている。本発明のスクリーニングのための細胞、およびその細胞を用いたスクリーニング方法においては、目的の効果が奏される限り、任意のクローディンのサブタイプを適用してもよい。例えば、クローディン1は、本発明の細胞やスクリーニング方法を実施するのに適したサブタイプの一つである。以下では、クローディン1を適用した場合を例に説明することがあるが、その説明は、他のサブタイプを用いた場合にも当てはまる。
【００２５】
当業者であれば公知のクローディン1の配列情報を入手し、クローディン1をコードするポリヌクレオチドを適切な材料から得ることができる。クローディン1をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入する。適切なベクターは、少なくとも以下を構成要素として含む。
・宿主細胞で機能可能なプロモーター；
・プロモーターにin-frameに結合したクローディン1をコードするポリヌクレオチド；および
・RNA分子の転写終結およびポリアデニル化シグナルをコードする配列。
用いることのできるプロモーターの例としては、CMV、CAG、LTR、EF-1α、SV40プロモーター等が挙げられる。必要に応じ、クローディン1をコードするポリヌクレオチドの下流に、マーカータンパク質（例えば蛍光タンパク質、より具体的にはGFP等）をコードするポリヌクレオチドを連結してもよい。
【００２６】
次いで、得られたベクターで宿主細胞を形質転換することにより、目的の細胞を得ることができる。宿主となる線維芽細胞は、通常、内在性のクローディンを発現せず、TJをもたない。本発明者らの検討によると、クロ―ディン１を発現可能に導入されたL929細胞は、クローディンを産生するが、予想外にもタイトジャンクションを形成することができなかった。このことはタイトジャンクションの形成にはクローディンだけでは不十分であることを意味する。その一方で、本発明者らは、この細胞に特定の刺激を加えることにより、タイトジャンクションの形成が促進されることを見出した。したがって、この細胞の培養物を利用し、タイトジャンクションの形成を促進する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２７】
スクリーニングは、次のように行う：
候補物質を準備し；
(1)候補物質を、細胞の培養物へ供与し；そして
(2)候補物質が培養物においてタイトジャンクションの形成を促進している場合に、その化合物を選択する。
【００２８】
工程(1)では、準備した候補物質を、細胞の培養物へ供与する。候補物質は、通常、１種類が培養物に供されるが、複数の物質を培養物に供してもよい。培養物とは、細胞を培養して得られるものをいい、ディッシュ内またはウェル内に増殖した細胞群、細胞塊、シート状細胞、皮膚モデル等を含む。典型的な培養物は、適切なオプティカルボトムプレート（例えば、Nunc 96マイクロウェルオプティカルボトムプレート（Thermo Fisher Scientific  型番：164588A）で細胞を培養して得られるものや、ヒト3次元培養表皮（例えば、LabCyte EPI-MODEL  ラボサイト  エピ・モデル（株式会社ジャパン・ティシュ・エンジニアリング））である。
【００２９】
候補物質は、化合物単体でもよく、植物抽出物のような組成物または混合物でもよい。候補物質は、人工的に合成されたものであってもよく、天然物由来であってもよい。候補物質として、また市販の化合物ライブラリーを利用することができる。
【００３０】
候補物質の濃度および処理時間は、当業者であれば用いる化合物に応じて適宜決定できる。典型的には、候補物質の濃度は1〜100μMであり、処理時間は1〜48時間である。
【００３１】
工程(2)は、候補物質が培養物においてタイトジャンクションの形成を促進している場合に、その物質を選択する工程である。工程(3)では、まず、候補物質を与えたことにより、細胞の培養物においてタイトジャンクションの形成が促進されたか否かを評価する。必要であれば、候補物質を与えない培養系を準備し、比較することにより評価する。
【００３２】
タイトジャンクションの形成が促進されたか否かは、培養物におけるクローディンの分布や蓄積状況の変化を顕微鏡で観察することにより判断できる。例えば、前述したようにクローディンをコードするポリヌクレオチドの下流に蛍光タンパク質が連結されて細胞に導入されていれば、細胞間接触部位におけるGFPシグナルが富化されたか否かを評価し、そして富化されたときに、その化合物をタイトジャンクションの形成を促進するものとして選択することができる。あるいは、タイトジャンクションの形成が促進されたか否かは、培養物の経上皮抵抗性（TER）を測定することにより行ってもよい。TER測定は、上皮細胞の頂端側と基底側との間の電気抵抗を測定するものであるが、タイトジャンクションが形成されていくと電気抵抗が上昇するので、電気抵抗が上昇したときに、その化合物をタイトジャンクションの形成を促進するものとして選択することができる。このようなスクリーニング方法により特定された物質の一つがKN-93である。選択された物質（群）は、タイトジャンクション形成促進物質の候補（群）として、更なる評価・検討に供することができる。KN-93または他のスクリーニングにより得られた物質をリード化合物として、物性、薬物動態および毒性等の点でより優れた有効成分を探索できる。リード化合物とは、一般に、薬理活性のプロファイルが明らかであり、これを化学的に改変することで活性の向上、毒性の減弱が期待できる化合物をいう。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法は、種々の候補物質を網羅的かつ迅速にスクリーニング方法に適している。
【００３４】
〔化粧品・医薬品〕
本発明により提供されるタイトジャンクション形成促進用のKN-93、および本発明により提供されるスクリーニング方法により得られるタイトジャンクションの形成を促進するための物質は、例えば、化粧品や医薬品等の皮膚に外用される剤の有効成分として用いるのに適している。このような場合には化粧品や医薬品に通常用いられる成分や機能性の成分をを、有効成分の効果を妨げない範囲の配合量で配合することができる。このような成分は、例えば、保湿剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤、植物抽出物、美白剤等を配合できる。
【００３５】
保湿剤の例として、グリセリン、ジエチレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸、核酸、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸が挙げられる。紫外線吸収剤の例として、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、ジパラメトキシケイ皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル、〔４−ビス（トリメチルシロキシ）メチルシリル−３−メチルブチル〕−３，４，５，−トリメトキシケイ皮酸エステル、パラアミノ安息香酸、アントラニル酸メチル、サリチル酸オクチル、サリチル酸フェニル、サリチル酸ホモメチル、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシベンゾイルメタン、ビス（レソルシニル）トリアジン等が挙げられる。酸化防止剤の例として、アスコルビン酸、α−トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールが挙げられる。防腐剤の例として、パラオキシ安息香酸エステル、フェノキシエタノール、安息香酸、サリチル酸、石炭酸、ソルビン酸、パラクロルメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素が挙げられる。
【００３６】
化粧品または医薬品の有効成分として用いる場合、化粧品の形態は特に限定されず、例えば、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム状、固形状、ゲル状等であり得る。
【００３７】
本発明により提供されるタイトジャンクション形成促進用のKN-93、および本発明により提供されるスクリーニング方法により得られるタイトジャンクションの形成を促進するための物質を含む化粧品は、抗老化（しわ、たるみ、肌の張りの低下、くすみ等の改善・解消）腫れ、赤み、ほてり、かゆみ、敏感肌、乾燥肌等の改善・解消）や抗炎症（腫れ、赤み、ほてり、かゆみ、敏感肌、乾燥肌等の改善・解消）のためのものとしても、特に期待できる。
【実施例】
【００３８】
［実験例１］
材料および方法：
〔試薬等〕
CSG1細胞, EpH4細胞およびL線維芽細胞（L929細胞）は、Dulbecco's modified Eagle's medium （10% fetal calf serum添加）で培養した。全長マウスクローディン-1をコードするcDNAは、PCRで増幅し、EGFPを付加し、pCAGGS-neo vectorに組み込んだ。化合物ライブラリーは、文部科学省新学術領域研究・化学療法基板支援活動（SCADS, Screening Committee of Anticancer Drugs) から入手した。【００３９】
下記の一次抗体を免疫蛍光顕微鏡検査法および免疫ブロッティングに用いた：ウサギ抗クローディン-1 pAb、マウス抗α チューブリンmAb (Sigma)、ウサギリン酸化AMPK mAb、ウサギ抗リン酸化CAMK II mAb、マウス抗リン酸化MLC2 mAb (Cell signaling technology)、マウス抗クローディン-1 mAb クローン2H10D10 (Life technologies)、ウサギ抗Par3 pAb (Millipore)、マウス抗ZO-1 mAb (T8-754) およびα18抗体(Dr. A. Nagafuchiから提供いただいた。)。【００４０】
下記の試薬を本研究に用いた：KN-93 (Wako)、化合物C (Wako)、2-DG (Sigma)および MG-132 (Peptide Institute. Inc.)。【００４１】
〔インビトロリン酸化アッセイ〕
リコンビナント活性AMPKはMilliporeから購入した。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST) タグ化細胞質内末端を有するマウスクローディン-1 (183 aa- 211 aa) は、大腸菌で発現させ、グルタチオンセファロースビーズ(GE healthcare)で精製した。リン酸化反応は、リコンビナントAMPKおよび基質マウスクローディン-1（-COOH末端GST）を20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 25 μM ATPおよび15 μCi [γ-32P]ATP中で30 min、37℃で処理することにより行った。タンパク質はSDS-PAGEにより分離し、オートラジオグラフィ(Typhoon9500)により可視化した。【００４２】
〔Pull-downアッセイ〕
HEK 293細胞にGFPタグ化クローディン-1またはクローディン-1 K189Rを、Myc-タグ化ユビキチンとともに導入した。CSG1細胞に、Myc-タグ化ユビキチンを導入した。細胞は20 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 2mM MgCl2, 1%Triton X-100, 2mM DTT, 1mM PMSF, 2 μg/mL leupeptin, および0.25% aprotininを含む細胞溶解バッファで溶解し、遠心により上澄を得た。各上澄液は抗Myc mAb (9E10)融合protein Gビーズとともにインキュベートとした。溶解バッファで十分に洗浄した後、結合したタンパク質をSDS-sample bufferで溶離した。サンプルをSDS/PAGEで分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell)に移した。この膜は、続いて抗GFP mAbまたは抗-クローディン-1 mAbとともにインキュベートし、Super Signal West Dura (Pierce)を用いて可視化した。【００４３】
〔免疫蛍光顕微鏡検査法〕
免疫蛍光顕微鏡検査法は、前に記載したように行った。簡単には、培養した細胞をカバースリップの上に3% formalinを含むPBSで10分間、室温(RT)で固定し、0.2% Triton X-100を含むPBSで5分間処理し、PBSで洗浄した。固定化された細胞を5% BSAを含むPBSで30分間、RTでインキュベートすることによりブロッキングを行った。ブロッキング溶液に抗体を溶解した後、細胞をRTで1時間、一次抗体とともにインキュベートした。次いで二次抗体で30分間インキュベートした。アクチン染色のために、Alexa Fluor 488 phalloidin (Life technologies) を二次抗体に加えた。検体は、適切なビニングおよび露出時間で、Plan-APO (63/1.40 N.A. oil-immersion objective)を装着した共焦点顕微鏡 (LSM700; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) によりRTで観察した。画像は、ZEN 2012 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)で解析した。【００４４】
結果：
〔化合物ライブラリースクリーニングからのTJ形成促進剤としてのKN-93の同定〕
本発明者らはまず、GFPタグ化マウスクローディン-1（GFPmCL1）を様々な発現レベルで発現しているL線維芽細胞のいくつかのクローンを確立した。それらの中で、本発明者らは、GFP-クローディン-1がTJを形成することができないが、形質膜全体に局在している低い発現レベルのGFPmCL1L細胞クローンを単離した（図1A）。意外にも、本発明者らは、細胞間接触部位におけるGFPシグナルの富化（図1A）から判断して、GFPmCL1L細胞において血清飢餓条件後にTJ形成が起こることを見出した。従って、本発明者らは何らかのシグナル伝達経路がこれらの細胞において血清飢餓条件下でTJの形成を促進する可能性があると推論した。次いで、本発明者らはTJ形成を制御しているシグナル伝達経路を同定するために薬物スクリーニングを実施した。【００４５】
本発明者らは、おおよそ400種類の生理活性化学試薬のGFPmCL1L細胞におけるGFP-クローディン-1の重合への作用を調べた。それらの中で、本発明者らは特異的なCAMKII阻害剤であるKN-93をGFPmCL1L細胞における細胞間接触部位でのGFP-クローディン-1の自発的重合の強力な誘導剤として同定した（図1B）。【００４６】
本発明者らは次に、KN-93が上皮細胞においてTJの拡大を誘導するかどうかを調べた。内因性クローディン-1の染色パターンから判断すると、KN-93による処理は、培養された上皮細胞株、例えばCSG1細胞（図1Cおよび1D）またはEpH4細胞（図6）において側方に拡大したTJ形成を誘導した。KN-93により誘導された過剰なTJは、ZO-1のようなTJの裏打ちタンパク質を含有していなかった（図1Cおよび1D、矢印）。【００４７】
正常なTJ鎖から側方に拡大したTJ領域を識別するために、本発明者らは抗クローディン-1  mAb（クローン2H10D10）が有用であることに気付いた。本発明者らは、このクローディン-1に対するモノクローナル抗体はKN-93による処理後に側底領域において余分なTJを形成しているクローディン-1のみを認識することを見出した（図1E）。次いで、本発明者らはKN-93の上皮バリア機能への作用を経上皮抵抗性（TER）を測定することにより調べた（図1F）。KN-93による処理の3時間後、TER値はCSG細胞（871．3±46．2Ω／cm2）において対照細胞（469．±23．5Ω／cm2）のTER値と比較して劇的に増大した。まとめると、KN-93による処理は、クローディン-1の染色および強化された上皮バリアの機能から判断して、TJ領域の拡大を誘導した。従って、本発明者らはKN-93が強力なTJ形成促進剤であると結論付けた。【００４８】
〔CAMKの阻害は皮質性F-アクチンを安定化し、結合の収縮性を増大させる〕
本発明者らは次に、KN-93による処理がどのように上皮細胞のバリア機能を上方制御するかを調べた。本発明者らは、KN-93による処理後のクローディン-1以外の細胞接着分子の分布の変化を調べた。それらの中で、本発明者らは、α-カテニンの張力依存性の立体構造を認識するα18抗体の染色パターン（Yonemura et al., 2010）がKN-93またはDMSO（対照）で処理した細胞において異なることを見出した（図2A）。KN-93で処理した細胞では、α18抗体は二細胞性接着結合（AJ）領域を強く染色し、これはこれらの細胞において結合の収縮性が上方制御されたことを示唆している。さらに、本発明者らはKN-93で処理した細胞においてAJと関係する濃密な皮質性F-アクチンを観察した（図2A）。これらの結果と一致して、頂部のジャンクションのアウトラインは、KN-93処理細胞において、対照細胞より直線的であるように見えた（図１Cおよび2A）。一方、微絨毛は、別のアクチンリッチな構造であるが、Eps8の分布から判断するとKN-93で処理することによって変化しになかった（図2B）。したがって、KN-93処理は、ジャンクションに関連した周のアクチンリングの形成を選択的に強化した。本発明者らは、ミオシン軽鎖2のリン酸化がKN-93による処理後に増大することも確証した（図2C）。Y-27632を用いた処理によるrho-キナーゼの阻害はCAMKIIの阻害によるTERの増大を打ち消し、これはKN-93を用いた処理による結合の収縮性の上方制御は上皮バリアの機能の増進に必要であることを示している（図2D）。【００４９】
まとめると、CAMKIIの阻害は結合の収縮性の上方制御をもたらし、それは上皮バリアの機能の強化に寄与している。【００５０】
〔CAMKの阻害はAMPKの活性化をもたらす〕
増大した結合の収縮性に加えて、CAMKIIの阻害はTJ領域を拡大した。本発明者らは次に、KN-93を用いて処理した際にTJ領域を増大させる分子機序を調べた。【００５１】
本発明者らは血清飢餓条件がGFPmCL1L細胞においてTJ形成をもたらすことをこの研究の初期段階において見出したため、本発明者らはAMPKの活性化がKN-93を用いた処理により誘導されるTJ形成に関わっている(Ching et al., 2010)かどうかを疑問に思った。【００５２】
CAMKIIの阻害およびAMPKの活性化の間の関係は以前に解明されていないため、本発明者らはTJ形成を制御しているシグナル伝達経路を絞りこむためにこれらの2種類のキナーゼの間の相互干渉の存在を調べた。その分子機序は明らかでないが、本発明者らはCAMKIIの阻害はAMPKを強く活性化するが、AMPKの活性化はCAMKIIの阻害を誘導しないことを見出した（図3A）。GFPmCL1細胞またはCSG1細胞を、AMPKを活性化することが知られている2-DGで処理した際、余分なTJ形成が両方の細胞株において観察された（図3B）。KN-93を用いた処理とは逆に、TER値は2-DGを用いた処理後に有意に変化しなかったため（図7A）、AMPKの活性化のみでは上皮バリアの機能の増進に十分ではなかった。α18抗体の染色パターンは2-DGを用いた処理後に変化せず（図7B）、これは結合の収縮性が2-DGを用いた処理により影響を受けなかったことを示唆している。従って、本発明者らは、KN-93を用いた処理により、または血清飢餓下で引き起こされたAMPKの活性化は過剰なTJの形成を促進するが、上皮バリアの機能の上方制御にはAMPKの活性化およびCAMKIIの阻害の両方が必要であると推論した。【００５３】
以前の研究において、いくつかのグループが、クローディンの染色から判断するとAMPKはCa2+に誘導されるTJの組み立ての間に活性化されることを報告した(Zhang et al., 2006; Zheng and Cantley, 2007)。加えて、AMPKの活性化はCaに誘導されるTJの組み立ての間にTJの形成を促進することが報告された(Zhang et al., 2011)。【００５４】
以下の実験において、本発明者らはAMPKの活性化のクローディンの重合への作用をさらに調べた。【００５５】
〔AMPKによるクローディン-1の細胞質側尾部の直接的なリン酸化〕
AMPKの活性化はどのようにクローディン-1の重合に影響を及ぼしたのか。本発明者らはまず、AMPKが直接クローディン-1をリン酸化する可能性を調べた（図3C）。本発明者らは組み替えAMPKタンパク質およびクローディン-1の細胞質側尾部を含有するGST融合タンパク質を用いてインビトロリン酸化アッセイを実施した（図3C）。セリン／スレオニン残基がアラニンにより置き換えられた変異体をスクリーニングすることにより、本発明者らはAMPKがクローディン-1をThr-191においてリン酸化することを見出した（図3C）。GFPmCL1L細胞において、GFP-クローディン1はSDS-PAGE上で二重線で移動した。本発明者らは、GFP-クローディン-1の上のバンドはKN-93で処理した際に減少することに気付いた（図3D）。この発見は、CAMKIIの阻害がクローディン-1の翻訳後修飾をもたらすことを示唆した。AMPKの活性化の後、クローディン-1の上のバンドは減少せず、これはクローディン-1の移動度シフトはリン酸化によるものではなかったことを示唆している（図3E）。【００５６】
〔AMPKによるクローディン-1のモノユビキチン化の阻害〕
次に、本発明者らはクローディン-1のより遅い移動がユビキチン化により引き起こされている可能性を試験した。プロテアソームの阻害剤であるMG-132を用いた処理はGFP-クローディン-1の上のバンドの強度を増大させ、これは上のバンドがモノユビキチン化されたクローディン-1に対応するという考えを支持している（図3Dおよび3E）。2-DGまたはKN-93処理の作用に類似して、MG-132を用いた処理はGFPmCL1L細胞においてGFP-クローディン-1の自発的重合を誘導した（図8）。【００５７】
上記の発見を一緒にして考えて、本発明者らはAMPKによるクローディン-1のリン酸化がクローディン-1のモノユビキチン化を妨げる可能性があると推論した。本発明者らは、細胞を2-DGと共に前保温した場合、モノユビキチン化されたクローディン-1はMG-132で処理した細胞においてほとんど検出されないことを見出した（図3E）。この結果は、AMPKによるクローディン-1のリン酸化がモノユビキチン化を妨げたことを示している。本発明者らはリシン残基がアラニンにより置き換えられた変異体のスクリーニングを実施し、Lys-189がそのユビキチン化の原因であることを見出した。本発明者らは、クローディン-1のK189R変異体がユビキチン化されないことを免疫沈降アッセイにより確証した（図3F）。【００５８】
これらの発見は、クローディン1の膜保持がユビキチン-プロテアソーム系による分解により、およびリン酸化により制御されていることを示唆している。従って、本発明者らは、AMPKによるクローディン-1のリン酸化がクローディン-1のモノユビキチン化を妨げ、結果として形質膜における膜に存在するクローディン-1の増大およびそれに続く過剰なTJ形成をもたらすと結論付けた。【００５９】
〔高浸透圧ストレスに応答するAMPKによるクローディンリン酸化の生理学的重要性〕
最後に、本発明者らはこの研究において明らかになった分子機序が生理学的に関連性があるかどうかを調べた。Madara ILは、高浸透圧ストレスはTJ領域の拡大を誘導し、上皮細胞のバリア機能を強化することを観察した(Madala IL, J Cell Biol, 1983)。しかし、この現象の裏にある分子機序は不明なままである。CSG1細胞を600mOsm／Lの培地で処理した際、クローディン-1の染色から判断して、追加のTJ鎖が形成された（図4Aおよび4B）。CAMKIIの阻害により誘導された余分なTJと類似して、TJの裏打ちタンパク質、例えばZO-1またはPar-3は、高浸透圧ストレスにより誘導された過剰なTJ領域中に存在しなかった（図4Aおよび4B）。高浸透圧ストレス後にα18抗体の染色が増進された（図4Aおよび4B、ならびに図9）。本発明者らは、高浸透圧条件下での過剰なTJの形成を抗クローディン-1  mAb（クローン2H10D10）を用いることによっても確証した（図4Aおよび4B）。【００６０】
本発明者らは、AMPKによるクローディン-1のリン酸化がこの現象に関わっていることを調べた。本発明者らはまず、高浸透圧ストレスへの曝露後にAMPKが活性化され、CAMKIIが不活性化されることを確証した（図4C）。高浸透圧ストレスへの2時間の曝露後、リン酸化されたAMPKの量およびクローディン-1の総量が増大した（図4C）。本発明者らはSDS-PAGE上で内因性のクローディン-1のバンドシフトを検出することができなかったが、本発明者らはクローディン-1のユビキチン化がAMPKの活性化により減少したと考えている。最後に、本発明者らはKN-93を用いた処理によるAMPKの活性化はTERの回復を促進するが、化合物Cを用いた処理によるAMPKの不活性化は高浸透圧ストレス後のTERの回復を遅らせることを確証した（図5B）。【００６１】
まとめると、本発明者らはAMPKによるクローディン-1のリン酸化は高浸透圧ストレスに対する適応機序に関わっていると結論付けた。【００６２】
〔結論〕
化合物ライブラリースクリーニングにより、本発明者らはCAMKIIがクローディン-1の翻訳後修飾の制御および上皮バリアの機能の調節に関わっていることを確認した。本発明者らは、AMPKによるクローディンのThr-191におけるリン酸化がクローディンのLys-189におけるモノユビキチン化を妨げ、結果として形質膜におけるクローディンの蓄積をもたらすことを実証した（図5C）。最後に、本発明者らは高浸透圧ストレスへの適応の場合における上記の機序の生理学的関連性を調べた。【００６３】
クローディンのC末端尾部の翻訳後修飾、例えばリン酸化およびユビキチン化は以前の研究(Angelow et al., 2008)で報告されているが、生理学的重要性は未知のままであった。本発明者らのクローディン-1の観察に類似して、クローディン-16のSer-217におけるリン酸化およびクローディン-2のSer-209におけるリン酸化がクローディンのリソソームにおける局在およびそれに続く分解に関わっていることが報告された(Ikari et al., 2006; Van Itallie et al., 2012)。しかし、クローディンキナーゼ類およびクローディンのリン酸化の機能的重要性は十分に解明されなかった。従って、将来の研究においてAMPKのクローディンファミリーのタンパク質の他のメンバーのリン酸化への関与を調べることは興味深いであろう。【００６４】
リソソームにおける分解の分子機序に関しては、E3ユビキチンリガーゼLNX1p80によるクローディン-1のポリユビキチン化が報告された(Takahashi et al., 2009)。しかし、本発明者らはLNXp80はこの研究で示された分子機序に関わっていないと考えているLNX1p80はそのPDZドメインによるクローディン-1への直接結合によりTJに局在しており、COOH末端の-YVを欠いているクローディン-1はLNX1p80によりユビキチン化されなかったため、この相互作用はクローディン-1のユビキチン化に必須である。本発明者らの研究において、GFPによりもたらされる立体障害のためにLNX1p80に結合することができないGFP-クローディン-1は、それでも効率的にユビキチン化され、このユビキチン化はAMPKに媒介されるリン酸化により阻止された。従って、LNX1p80により触媒されるクローディン-1のユビキチン化がTJにおいて起こり、LNX1p80は、提唱されたようにTJにおける重合したクローディン-1のエンドサイトーシスによる内部移行を制御している可能性がある。この研究において記述された側底膜におけるクローディン-1のモノユビキチン化は上皮バリアの生理機能に必須であることを考えて、本発明者らは上皮細胞の側底膜における未重合のクローディンのユビキチン化の原因であるE3-ユビキチンリガーゼを同定する試みを始めている。【００６５】
〔他の非特許文献〕
Angelow, S., R. Ahlstrom, and A.S. Yu. 2008. Biology of claudins. Am J Physiol Renal Physiol. 295:F867-876.
Ikari, A., S. Matsumoto, H. Harada, K. Takagi, H. Hayashi, Y. Suzuki, M. Degawa, and M. Miwa. 2006. Phosphorylation of paracellin-1 at Ser217 by protein kinase A is essential for localization in tight junctions. J Cell Sci. 119:1781-1789.
Takahashi, S., N. Iwamoto, H. Sasaki, M. Ohashi, Y. Oda, S. Tsukita, and M. Furuse. 2009. The E3 ubiquitin ligase LNX1p80 promotes the removal of claudins from tight junctions in MDCK cells. J Cell Sci. 122:985-994.
Van Itallie, C.M., A.J. Tietgens, K. LoGrande, A. Aponte, M. Gucek, and J.M. Anderson. 2012. Phosphorylation of claudin-2 on serine 208 promotes membrane retention and reduces trafficking to lysosomes. J Cell Sci. 125:4902-4912.
Yonemura, S., Y. Wada, T. Watanabe, A. Nagafuchi, and M. Shibata. 2010. alpha-Catenin as a tension transducer that induces adherens junction development. Nat Cell Biol. 12:533-542.
Zhang, L., F. Jouret, J. Rinehart, J. Sfakianos, I. Mellman, R.P. Lifton, L.H. Young, and M.J. Caplan. 2011. AMP-activated protein kinase (AMPK) activation and glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta) inhibition induce Ca2+-independent deposition of tight junction components at the plasma membrane. J Biol Chem. 286:16879-16890.
Zhang, L., J. Li, L.H. Young, and M.J. Caplan. 2006. AMP-activated protein kinase regulates the assembly of epithelial tight junctions. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:17272-17277.
Zheng, B., and L.C. Cantley. 2007. Regulation of epithelial tight junction assembly and disassembly by AMP-activated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:819-822.
Ching, J.K., P. Rajguru, N. Marupudi, S. Banerjee, and J.S. Fisher. 2010. A role for AMPK in increased insulin action after serum starvation. Am J Physiol Cell Physiol. 299:C1171-1179.
Fanning, A.S., C.M. Van Itallie, and J.M. Anderson. 2012. Zonula occludens-1 and -2 regulate apical cell structure and the zonula adherens cytoskeleton in polarized epithelia. Mol Biol Cell. 23:577-590.
Holgate, S.T., G. Roberts, H.S. Arshad, P.H. Howarth, and D.E. Davies. 2009. The role of the airway epithelium and its interaction with environmental factors in asthma pathogenesis. Proc Am Thorac Soc. 6:655-659.
Kubo, A., K. Nagao, and M. Amagai. 2012. Epidermal barrier dysfunction and cutaneous sensitization in atopic diseases. J Clin Invest. 122:440-447.
Rodgers, L.S., M.T. Beam, J.M. Anderson, and A.S. Fanning. 2013. Epithelial barrier assembly requires coordinated activity of multiple domains of the tight junction protein ZO-1. J Cell Sci. 126:1565-1575.
Sumi, M., K. Kiuchi, T. Ishikawa, A. Ishii, M. Hagiwara, T. Nagatsu, and H. Hidaka. 1991. The newly synthesized selective Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II inhibitor KN-93 reduces dopamine contents in PC12h cells. Biochem Biophys Res Commun. 181:968-975.
Turner, J.R. 2006. Molecular basis of epithelial barrier regulation: from basic mechanisms to clinical application. Am J Pathol. 169:1901-1909.【００６６】
［実験例２：ヒト皮膚モデルでの検討］
ヒト皮膚細胞を、KN-93の存在下で培養し、経上皮電気抵抗（transepithelial electric resistance、TER）の測定によりバリア機能を評価した。【００６７】
(1)  材料および方法
ヒト3次元培養表皮 LabCyte EPI-MODEL  ラボサイト  エピ・モデル（製品コード：401112）（株式会社ジャパン・ティシュ・エンジニアリング）を用いた。
NHEK細胞を、10%のFBSを添加したMEM培地中で、コンフルエントになるまで培養した。次に、細胞を細胞密度1x105細胞/cm2となるように24穴Transwellインサート（Corning社製、表面積0.33cm2）上に藩種し、10%のFBSを添加したMEM培地中で24時間培養した。【００６８】
その後、培地交換を行い、DMSO（対照）または10μM  KN-93で3時間処理した。【００６９】
処理後、Millicell-ERS装置（Millipore社製）を用いて、製造者の指示書に従い、銀および塩化銀からなる2つの電極を頂端側と基底側にそれぞれ浸して、経上皮電気抵抗（Transepithelial electrical resistance、TER（Ω x cm2））を測定した。【００７０】
(2)  結果および考察
図10に、TERの測定結果を示す。TER測定において、上皮のバリアが形成されていくと、上皮細胞の頂端側と基底側との間の電気抵抗が上昇する。このような観察を通じて、単層細胞層のバリア機能を定量的に観察することができる。【００７１】
KN-93 を添加した細胞において、TERが上昇した。この結果は実験例１と同様であるが、ヒト皮膚でもNK-93 により、タイトジャンクションが形成され、上皮バリアの増強が達成できることが示された。【００７２】
［実施例３：スクリーニング］
実施例１に記載したのと同様に、pCAGGSにマウスのClaudin1とEGFPの融合遺伝子を組み込んだベクターを作製し、L929細胞に導入し、pCAGGS-Claudin1-GFPを安定的に発現する株を樹立した。【００７３】
得られたpCAGGS-Claudin1-GFPを安定発現するL929細胞をオプティカルボトムプレート（Nunc 96マイクロウェルオプティカルボトムプレート）に播種した。適切な培地を用い、コンフルエントになるまで通常の培養条件で培養した。【００７４】
一方、候補物質を準備した。【００７５】
各候補物質を適切な濃度となるように、例えば10μMとなるように、上述のオプティカルプレート中に添加した。候補物質を添加して5時間後に、共焦点顕微鏡を用いて、Claudin-1GFPが細胞接着部位に高度に濃縮しているウエルを探索した。その結果、KN-93を添加したウエルでは高度な濃縮が認められた。【００７６】
なお、本発明者らの検討によると、pCAGGS-Claudin1-GFPの安定発現を示す亜株のほとんどにおいて、タイトジャンクションの形成が認められなかった。このことはタイトジャンクションの形成にはClaudinだけでは不十分であることを意味し、また、pCAGGS-Claudin1-GFPの安定発現を示すL線維芽細胞は、タイトジャンクションの形成を促進する物質のスクリーニングに適することを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、タイトジャンクションの形成を促進する物質のスクリーニング方法、およびそれにより特定された有効成分を含むタイトジャンクション形成促進剤が提供される。本発明は、特に、皮膚のバリア機能の向上が望まれる分野、例えば、化粧品の研究開発および製造、並びにタイトジャンクションの形成に関連する特定の疾患または状態を処置するための医薬の研究開発および製造の分野での利用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月12日(2016.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（１）候補物質を、線維芽細胞に由来する細胞であって、クローディン１をコードするポリヌクレオチドを発現可能に導入され、クローディン１を安定的に発現可能である、細胞の培養物へ供与し；そして
（２）候補物質が培養物においてタイトジャンクション（ＴＪ）の形成を促進している場合に、その物質を選択する
工程を含む、上皮細胞のＴＪの形成を促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
Ｎ−［２−［Ｎ−（４−クロロシンナミル）−Ｎ−メチルアミノメチル］フェニル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、上皮細胞のＴＪ形成促進剤。
【請求項８】
Ｎ−［２−［Ｎ−（４−クロロシンナミル）−Ｎ−メチルアミノメチル］フェニル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、化粧料組成物。
【請求項９】
皮膚の乾燥、しわ、日焼け、または老化の処置のための、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
Ｎ−［２−［Ｎ−（４−クロロシンナミル）−Ｎ−メチルアミノメチル］フェニル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミドまたはその塩を含む、上皮細胞のＴＪ形成に関連した疾患または状態の処置のための、皮膚外用用医薬組成物または化粧料組成物。
【請求項１３】
ＣＡＭＫＩＩ阻害剤を含む、上皮細胞のＴＪ形成に関連した疾患または状態の処置のための皮膚外用用医薬組成物または化粧料組成物。
【請求項１４】
ＴＪ形成に関連した疾患または状態が、皮膚の慢性的な炎症である、請求項１２または１３に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
【請求項１５】
ＴＪ形成に関連した疾患または状態が、アトピー性皮膚炎である、請求項１２または１３に記載の医薬組成物または化粧料組成物。
【国際調査報告】
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