(57)【要約】  農業害虫の殺虫能を有する糸状菌の新たな培養方法による農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法と、当該製造方法によって製造された菌体抽出物に含まれる糸状菌による農業害虫の、短時間での即効性に優れた効果的な殺虫方法を提供すること。糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程と、前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程と、前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程と、前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程と、前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程を備える農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法及び当該製造方法で得られた菌体抽出物を農業害虫又はその生息地に対して作用させる農業害虫の殺虫方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を備える農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法。
（１）糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程
（２）前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程
（３）前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程
（４）前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程
（５）前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程
【請求項２】
前記胞子液と無機鉱物粉体の水溶液とを混合する工程を更に備えている
請求項１記載の菌体抽出物の製造方法。
【請求項３】
前記糸状菌がトリコデルマ（Trichoderma）属菌である請求項１又は２記載の菌体抽出物の製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物を農業害虫又はその生息地に対して作用させる
農業害虫の殺虫方法。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物の上清に植物油を添加した混合液を農業害虫又はその生息地に対して作用させる
農業害虫の殺虫方法。
【請求項６】
請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物の上清に植物油を添加した混合液を希釈し、当該希釈した混合液を農業害虫又はその生息地に対して作用させる
農業害虫の殺虫方法。
【請求項７】
前記糸状菌がトリコデルマ（Trichoderma）属菌である請求項４乃至６の何れか一項に記載の殺虫方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、農業害虫殺虫能を有する糸状菌の菌体抽出物の製造方法及び農業害虫の殺虫方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学農薬は、農業害虫に対して即効性を持つが、ノンターゲットに対する安全上の懸念が公知である。一方、安全性で勝ると言われている農業害虫の殺虫能を有する微生物農薬について種々の提案がなされているが、何れも即効性に欠け、時間を掛けて感染を引き起こすことで殺虫する遅行性の殺虫剤である。【０００３】
微生物農薬に利用される微生物についても多様の微生物が知られているが、これらの中で、糸状菌であるトリコデルマ（Trichoderma）属に分類されるトリコデルマ・アルバム（Trichoderma album）がワクモ（Dermanyssus gallinae）に寄生し、ワクモを死滅させるという研究が発表されている（非特許文献１）。【０００４】
また、トリコデルマ（Trichoderma）属菌のうち、世界中で広く流通しているトリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）は、土壌中、菌床等の自然環境に広く常在する微生物である。この微生物を用いて微生物農薬を製造する場合、土壌等の単離源から同定したトリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）を大型のタンク或いは、工業的な培養施設を用いて単離場所とは異なった環境で大量培養し、しかる後、その培養物をシリカやその他の鉱物微細粉に担持する手法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−６１５３０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hussein A. Kaoud et al, 「Susceptibility of Poultry Red mites to Entomopathogens」, International Journal of Poultry Science 9 (3), p. 259-263
【非特許文献２】「EFSA assesses potential link between two neonicotinoids and developmental neurotoxicity」, EFSA Press Release, December 17, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明は、農業害虫の殺虫能を有する糸状菌の新たな培養方法による農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法と、当該製造方法によって製造された菌体抽出物に含まれる糸状菌による農業害虫の、短時間での即効性に優れた効果的な殺虫方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、以下の発明を提案する。【０００９】
請求項１記載の発明は、以下の工程を備える農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法である。  
（１）糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程
（２）前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程
（３）前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程
（４）前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程
（５）前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程【００１０】
請求項２記載の発明は、前記胞子液と無機鉱物粉体の水溶液とを混合する工程を更に備えている請求項１記載の菌体抽出物の製造方法である。【００１１】
請求項３記載の発明は、前記糸状菌がトリコデルマ（Trichoderma）属菌である請求項１又は２記載の菌体抽出物の製造方法である。【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物を農業害虫又はその生息地に対して作用させる農業害虫の殺虫方法である。【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物の上清に植物油を添加した混合液を農業害虫又はその生息地に対して作用させる農業害虫の殺虫方法である。【００１４】
請求項６記載の発明は、請求項１乃至３の何れか一項記載の製造方法で得られた菌体抽出物の上清に植物油を添加した混合液を希釈し、当該希釈した混合液を農業害虫又はその生息地に対して作用させる農業害虫の殺虫方法である。【００１５】
請求項７記載の発明は、前記糸状菌がトリコデルマ（Trichoderma）属菌である請求項４乃至６の何れか一項に記載の殺虫方法である。
【発明の効果】
【００１６】
この発明によれば、農業害虫の殺虫能を有する糸状菌の新たな培養方法による農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法と、当該製造方法によって製造された菌体抽出物に含まれる糸状菌による農業害虫の、短時間での即効性に優れた効果的な殺虫方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（ａ）ＨＮＴ−０１株の液体培養後の培養物、（ｂ）ＨＮＴ−０１株のコロニー、（ｃ）ＨＮＴ−０１株のコロニーが疎水性であることを示す写真、（ｄ）培養物から分離したＨＮＴ−０１株のコロニーの膜体、（ｅ）ＨＮＴ−０１株の胞子液を表す写真である。
【図２】異なる培養条件でのＨＮＴ−０１株の増殖の様子を表す写真であって、（ａ）ＰＤＢ培地での培養、（ｂ）くず米（米粒）を添加したＰＤＢ培地で静置培養したもの、（ｃ）キチン（粉末）を添加したＰＤＢ培地で静置培養したもの、（ｄ）十和田石粉末を添加したＰＤＢ培地で培養したもの、（ｅ）カルボキシメチルセルロースを添加したＰＤＢ培地で培養したもの、（ｆ）ＰＤＢ培地で振とう培養した結果を表す写真である。
【図３】ＨＮＴ−０１株の胞子液によるナミハダニへ影響を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この発明は、農業害虫殺虫能を有する菌体抽出物の製造方法及び当該製造方法によって製造された菌体抽出物に含まれる糸状菌による農業害虫の殺虫方法である。
【００１９】
この実施形態では、農業害虫殺虫能を有する糸状菌のうち、トリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）ＨＮＴ−０１株（以下、「ＨＮＴ−０１株」という）を用いた。
【００２０】
ＨＮＴ−０１株は、平成２４年９月７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１４１９が付与されている真菌である。
【００２１】
ＨＮＴ−０１株は生育が早く、黄緑色から緑色系で羊毛状からビロード状のコロニーを形成、分生子柄は規則または不規則的に分岐し、成熟したコロニーでは分生子柄が集合して羊毛状の塊（房）を形成する。また、フィアライドの先端に緑色の分生子塊を形成し、栄養菌糸上に厚膜胞子を形成する等の形態的特徴を有する。
【００２２】
＜ＨＮＴ−０１株胞子液の回収＞
このＨＮＴ−０１株を二つの異なる培養方法を組み合わせた方法で培養し、その胞子液を回収することに成功した。
【００２３】
具体的には、以下の工程を経てＨＮＴ−０１株の胞子液を回収した。  
・糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程
・前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程
・前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程
・前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程
・前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程
【００２４】
（１）実験材料
・くず米 １０ｇ
・ＰＤＢ液体培地 ３０ｍＬ
・ＨＮＴ−０１株培養寒天培地
・滅菌生理食塩水
【００２５】
（２）実験方法
（２）−１．固体培養
１０ｇのくず米をコニカルビーカーに秤量し、水道水を１００ｍＬ入れ、一晩吸水させた。
【００２６】
吸水後、水道水を捨て０．２４ｇのＰＤＢを加え、オートクレーブ処理（１２１℃、３０分間）を行った。翌日、もう一度オートクレーブ処理を行い、くず米を滅菌した。
【００２７】
減菌したくず米に、滅菌生理食塩水を２ｍＬ加え攪拌し、１ｃｍ角のＨＮＴ−０１株培養寒天断片を植菌した。植菌後、室温で１８日間培養を行った。
【００２８】
（２）−２．液体培養
３００ｍＬフラスコに３０ｍＬのＰＤＢ液体培地を作製し、１ｃｍ角のＨＮＴ−０１株培養寒天断片を植菌した。植菌後、室温で１８日間培養を行った。
【００２９】
（３）胞子液の回収
液体培養後の培養液には、ＨＮＴ−０１株のコロニーが形成されるが（図１（ａ））、図１（ｂ）に示すように培養液中ではなく、培養液面上に形成されていることが確認された。
【００３０】
また、図１（ｃ）、（ｄ）に示すように、このコロニーは、培養液と完全に分離可能なフィルム状の薄い膜体を形成していることも確認された。
【００３１】
このことから、ＨＮＴ−０１株のフィルム状の薄い膜体は疎水性を有しているといえる。これは、コロニー形成に伴い、界面活性剤などの二時代謝物が増加した分胞子数も増えていることが示唆される。
【００３２】
前記培養液からＨＮＴ−０１株のフィルム状の薄い膜体を分離した。前記膜体を分離した培養液を固体培養後の培養物に投入し、白金耳で撹拌した。攪拌後、滅菌した茶漉しとビーカーを用いてＨＮＴ−０１株の胞子液をろ過し、回収した（図１（ｅ））。
【００３３】
＜殺ダニ物質高生産培地の探索＞
ＨＮＴ−０１株による農業害虫の殺虫効果を調べるに当たり、異なる培地によって培養したＨＮＴ−０１株の胞子数の測定を行った。
【００３４】
（１）培地組成
培地１：ＰＤＢ培地
培地２：くず米（米粒）０．６ｇを添加したＰＤＢ培地
培地３：キチン（粉末）０．６ｇを添加したＰＤＢ培地
培地４：十和田石粉末０．３ｇを添加したＰＤＢ培地
培地５：カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．１ｇを添加したＰＤＢ培地
【００３５】
（２）実験方法
ＰＤＢ培地を主体に、上記に示した物質くず米（米粒）、キチン（粉末）、十和田石粉末、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）をそれぞれ添加したＰＤＢ添加培地を作製し、それぞれにＨＮＴ−０１株の寒天断片を植菌した。
【００３６】
なお、十和田石は、秋田県大館市比内町で採掘される緑色凝灰岩（以下「十和田石」ということがある）で、正式名称は「石英安山岩質浮石質凝灰岩」といい、「グリーンタフ」という名称で知られている。
【００３７】
十和田石は鉱物組成として、石英や曹長石や緑泥石などを含む複合鉱石でありミネラルを多く含む特徴を持つ。また、十和田石は多孔質であることから物質の吸着・放出などの働きを有し、農業肥料としても利用されている。十和田石の主な組成を表１に示す。
【表１】
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【００３８】
培養は、以下の条件で行った。  
培養条件１：培地１で静置培養（室温、２週間）
培養条件２：培地２で静置培養（室温、２週間）
培養条件３：培地３で静置培養（室温、２週間）
培養条件４：培地４で静置培養（室温、２週間）
培養条件５：培地５で静置培養（室温、２週間）
培養条件６：培地１で振とう培養（室温、２週間）
【００３９】
培養後、デカンテーションによってフィルム状の薄い膜体を形成している菌糸体と培養液に分離した。
【００４０】
前記菌糸体には、１０ｍＬの滅菌生理食塩水を加え、攪拌し胞子液を作製した。胞子液は固形物を取り除くため濾過を行い、胞子数の測定を行った。
【００４１】
（３）胞子数の測定結果
上記各培養条件によって得られた各胞子液の胞子数の測定結果を表２に示す。
【表２】
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【００４２】
図２に、各培養条件でのＨＮＴ−０１株の増殖の様子を表した。表２に示したように、培養条件２、４によって得られた胞子液では、１週間程度で濃緑色の胞子が観察された。
【００４３】
培養条件３によって得られた胞子液では、８日目あたりからで胞子液の色が黄色から濃緑色へと変化していった。
【００４４】
胞子数についても、表２より培養条件２、４でのＨＮＴ−０１株の胞子数が、他の４つの培養条件でのＨＮＴ−０１株の胞子数よりも約１０〜１０００倍多いことが確認された。
【００４５】
なお、培養条件１でのＨＮＴ−０１株と培養条件３でのＨＮＴ−０１株では、ほぼ同数の胞子数であるが、胞子液の色は黄緑色と濃緑色とで異なっている（図２（ａ）、（ｃ））。これは胞子数というよりも成熟度を大きく反映していると考えられる。
【００４６】
＜実験例１＞ＨＮＴ−０１株の胞子液の農業害虫への適用
この実験例では、農業害虫として知られているハダニ科（Tetranychidae）に分類されるナミハダニ（Tetranychus urticae Koch）に対してＨＮＴ−０１株の胞子液による殺虫効果を観察した。
【００４７】
（１）生物材料
・ナミハダニ（赤色成虫）
・ＨＮＴ−０１株
・インゲン豆（P. Vulgaris）の葉
・キャベツ（Brassica oleracea var. capitata）の葉
【００４８】
（２）実験サンプル
サンプル１：蒸留水（コントロール）
サンプル２：ＨＮＴ−０１株の胞子液Ａ
上記で説明した十和田石粉末を添加したＰＤＢ培地で培養したＨＮＴ−０１株の胞子液（以下「ＨＶＴ胞子液」という）
サンプル３：ＨＮＴ−０１株の胞子液Ｂ
上記「ＨＮＴ−０１株胞子液の回収」で説明したＨＮＴ−０１株の胞子液に、当該胞子液と等量の十和田石粉末（粒径２００ｎｍ）水溶液を加えたもの（以下「ＨＶＴ２００胞子液」という）
サンプル４：十和田石粉末（粒径２００ｎｍ）水溶液（以下「Ｎ２００」という）
【００４９】
（３）実験方法
蒸留水で湿らせた脱脂綿を敷いた大シャーレに、２ｃｍ角のインゲン豆（P. Vulgaris）の葉３枚を移した。移したインゲン豆（P. Vulgaris）の葉に２０匹／葉になるよう赤色成体ハダニを移した。一晩静置し、インゲン豆（P. Vulgaris）の葉に慣れさせた。
【００５０】
その後、上記各サンプルにて５秒間の浸漬試験を行った。浸漬試験後、１時間インゲン豆（P. Vulgaris）の葉を乾燥させ、顕微鏡による観察を行った。以降観察は２４時間ごとに行った。
【００５１】
（４）結果
表３に各サンプルによる時系列ごとのナミハダニの生存率を表す。
【表３】
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【００５２】
ＨＶＴ胞子液とＨＶＴ２００胞子液を使用すると、２４時間経過後のナミハダニの生存率は１０％前後の低い数値となった。７２時間経過後では約５％の低い生存率を示した。
【００５３】
また、表４に各サンプルによる時系列ごとのナミハダニの産卵数を表す。
【表４】
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【００５４】
ＨＶＴ胞子液とＨＶＴ２００胞子液を使用すると、他のサンプルに比べてナミハダニの産卵数は生存率に依存して著しく減少することが確認された。
【００５５】
これは、自然界よりも濃度の高い糸状菌由来の代謝物によってナミハダニの動きを止め、以降、糸状菌が感染し致死に至ると考えられる。
【００５６】
この結果から、上記で説明した十和田石粉末を添加したＰＤＢ培地で培養したＨＮＴ−０１株の胞子液、あるいは、
・糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程
・前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程
・前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程
・前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程
・前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程
を経て得られたＨＮＴ−０１株の胞子液に十和田石粉末水溶液を加えた胞子液は、農業病害虫の殺虫に特に適していることが確認された。
【００５７】
＜実験例２＞ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清の農業害虫への適用
この実験例では、ナミハダニに対してＨＮＴ−０１株の胞子液の上清による殺虫効果を観察した。
【００５８】
（１）生物材料
・ナミハダニ（赤色成虫）
・ＨＮＴ−０１株
【００５９】
（２）実験サンプル
サンプル１：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ａ
上記「ＨＮＴ−０１株胞子液の回収」で説明した培養方法で培養したＨＮＴ−０１株の胞子液である。
【００６０】
サンプル２：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ｂ
サンプル１の胞子液を１０倍希釈したもの
サンプル３：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ｃ
サンプル１の胞子液を１００倍希釈したもの
サンプル４：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ｄ
サンプル１の胞子液にオリーブオイルを１％添加したもの
サンプル５：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ｅ
サンプル４の胞子液を１０倍希釈したもの
サンプル６：ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清Ｆ
サンプル４の胞子液を１００倍希釈したもの
【００６１】
（３）結果
表５に各サンプルをナミハダニに適用させ、６０分後のナミハダニの生存率を表す。なお、各サンプルは３種類用意した。
【表５】
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【００６２】
ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清及びその希釈液をしても、ナミハダニの殺虫効果が確認された（サンプル１〜３）。
【００６３】
また、ＨＮＴ−０１株の胞子液の上清にオリーブオイルを添加した混合液及びその希釈液を使用しても、ナミハダニの殺虫効果が確認された（サンプル４〜６）。
【００６４】
特に、オリーブオイルを添加することでナミハダニの生存が著しく減少することが確認された。
【００６５】
これは、自然界よりも濃度の高い糸状菌由来の代謝物と植物油によってミセル状物質が形成され、当該物質によってナミハダニの動きを止め、以降、糸状菌が感染し致死に至ると考えられる。
【００６６】
この結果から、
・糸状菌を固体培地で培養し、前記糸状菌の固体培養物を得る工程
・前記糸状菌を液体培地で培養し、前記糸状菌の液体培養物を得る工程
・前記糸状菌の液体培養物から、当該糸状菌の菌糸体を分離する工程
・前記菌糸体が分離された前記液体培養物と前記固体培養物とを混合し、混合培養物を得る工程
・前記混合培養物から前記糸状菌の胞子液を抽出する工程
を経て得られたＨＮＴ−０１株の胞子液の上清及びその希釈液、又は前記上清にオリーブオイルを添加した混合液及びその希釈液は、農業病害虫の殺虫に特に適していることが確認された。
【００６７】
以上、添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではない。
【００６８】
図３に、ＨＮＴ−０１株の胞子液によるナミハダニへ影響を表しているが、培養に用いる糸状菌が代謝する物質が農業害虫に対して、気門封鎖、体表擦過、或いは、その両方で行動を著しく制限する作用を生じ、しかる後、培養に用いた糸状菌、又は自然界に生息する土着の糸状菌による感染、以降致死による作用である限り、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々の形態に変更可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2015118689.tif 000012
2015118689.tif 000013
2015118689.tif 000014