(57)【要約】  生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たす、移植用人工真皮。      式：Ｘ２／Ｘ１≦０．８  前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たす、移植用人工真皮。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．８
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【請求項２】
前記Ｘ２／Ｘ１が、０．１以上０．８以下である、請求項１に記載の移植用人工真皮。
【請求項３】
前記生分解性材料が、蛋白質、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キチン、キトサン、セルロースおよびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または請求項２に記載の移植用人工真皮。
【請求項４】
前記生分解性材料が、ゼラチン、フィブロネクチン、およびラミニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から請求項３の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項５】
前記生分解性材料が、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項６】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の移植用人工真皮。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
Ａは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎは３以上１００以下の整数を示し、ｍは２以上１０以下の整数を示す。ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【請求項７】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記のアミノ酸配列を有する、請求項５または請求項６に記載の移植用人工真皮。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【請求項８】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記の（１）または（２）である、請求項５から請求項７の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、生分解性を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
【請求項９】
前記生分解性材料が、架橋されている、請求項１から請求項８の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項１０】
請求項１から請求項９の何れか１項に記載の移植用人工真皮の製造方法であって、
前記多孔質シートを製造する際に、生分解性材料の水溶液を凍結させる工程を含む、移植用人工真皮の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植用人工真皮およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
難治性皮膚潰瘍の原因は、糖尿病、動脈不全、静脈不全、褥瘡、外傷などがある。特に近年、糖尿病患者の増加に伴い、糖尿病の合併症の一つである糖尿病性皮膚潰瘍は増加の一途である。その難治性皮膚潰瘍は保存的治療などの治療を行っても治癒が進まず、皮弁移植術または四肢切断術などの侵襲性の大きな手術が必要となることが多い。
現在その治療のひとつとして、コラーゲン等の生分解性材料を主成分とした人工真皮を用いた治療が行われている。この人工真皮は真皮再生の際に足場として作用する。その結果、移植床からの線維芽細胞および血管の、侵入および増殖により真皮成分（真皮様肉芽組織）が形成され、患者自身の擬似真皮が再生されるのにつれて、人工真皮を構成する生分解性材料は分解し吸収される。
人工真皮の生分解性材料で構成された創傷接触層を多孔質構造とすることにより、該層の自己組織による置換を促進することができる。このような創傷接触層に、水蒸気透過調節層等が積層された、人工皮膚が知られている（特開平５−１８４６６２号公報および特開平５−２８５２１１号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特開平５−１８４６６２号公報および特開平５−２８５２１１号公報等に記載された従来の多孔質構造を有する人工皮膚は、皮膚欠損部において真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を有するものの、真皮様組織（肉芽様組織）の形成能に更に優れた人工真皮が望まれる。
そこで本発明の目的は、皮膚欠損部の、真皮様組織（肉芽様組織）の形成能に優れた、移植用人工真皮を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、かかる移植用人工真皮の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、人工真皮について鋭意研究を続けた結果、生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層の、多孔質を特定の形状とすることにより、人工真皮が優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
本発明の移植用人工真皮は、生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たすものである。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．８
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。【０００６】
本発明の移植用人工真皮の製造方法は、本発明の移植用人工真皮を製造する方法であって、前記多孔質シートを製造する際に、生分解性材料の水溶液を凍結させる工程を含むものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の移植用人工真皮は、多孔質シートの多孔質を特定の形状とすることにより、皮膚欠損部において、優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を有する。また、本発明の移植用人工真皮の製造方法は、公知の製造手段を用いて、簡便に本発明の移植用人工真皮を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図２】実施例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図３】実施例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図４】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図５】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図６】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図７】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図８】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図９】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図１０】比較例２の多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図１１】比較例２の多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図１２】比較例２の多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。なお、これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００１０】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
【００１１】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１２】
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の、一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）または三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。
【００１３】
本発明において、蛋白質及びポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸残基の個数を基準とする。
【００１４】
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈＥｄ  −  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号１に対して相同性８０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が８０以上であることを示す。
【００１５】
本発明の移植用人工真皮（以下「本発明の人工真皮」とも言う。）は、生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たすものである。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．８
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【００１６】
Ｘ１およびＸ２を求めるため、前記平行な直線および前記垂直な直線は、それぞれ３本ひくことが好ましく、直線１本の長さが１，５００μｍであり、直線３本の合計の長さが４，５００μｍであることが好ましい。即ちこの場合、前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して３本の平行な直線（長さ１，５００μｍの直線を３本。合計４，５００μｍ）と、創傷接触面に対して３本の垂直な直線（長さ１，５００μｍの直線を３本。合計４，５００μｍ）と、をひいたとき、Ｘ１は、前記３本の平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記３本の垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【００１７】
Ｘ１およびＸ２は、例えば、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを辺とする、1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像を取得し、当該断面画像を１６の正方形に等分割する３本の平行線および３本の垂直線をひき、求めることができる。即ちこの場合、前記多孔質シートから、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを辺とする断面画像（1,500μｍ×1,500μｍの正方形）を取得し、当該断面画像を１６の正方形に等分割する、３本の平行線および３本の垂直線をひいたとき、Ｘ１は、前記３本の平行線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記３本の垂直線と気孔の壁との交点数である。1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像は、多孔質シートの中央部から取得するのが好ましい。
Ｘ１およびＸ２は、より詳細には、以下のようにして求める。
【００１８】
多孔質シートの創傷接触面が略平面である場合、当該略平面に対して、平行な平面（以下「平行面」という。）、および、垂直な平面（以下「垂直面」という。）を任意にとり、二辺を当該平行面および垂直面に有する1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像を取得する。取得した正方形の断面画像の辺のうち、平行面により形成された辺、および、垂直面により形成された辺、それぞれを四等分に分割するように、３本の分割線を、各辺に対して、垂直方向に引く。ここで、平行面により形成された辺を分割する分割線を垂直線、垂直面により形成された辺を分割する分割線を平行線と称する。当該垂直線は、創傷接触面に対して垂直な線であり、当該平行線は、創傷接触面に対して平行な線である。断面画像において、３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計が、Ｘ１であり、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計が、Ｘ２である。
【００１９】
多孔質シートの創傷接触面が、略平面でない場合には、創傷接触面を平面に変形させた上で、創傷接触面を下にして、人工真皮を平面に置き、当該平面に対して、平行な平面（平行面）、および、垂直な平面（垂直面）を任意にとり、二辺を当該平行面および垂直面に有する1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像を取得する。1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像から、Ｘ１およびＸ２を求める方法は、前記の方法と同様である。
【００２０】
多孔質シートの創傷接触面が、略平面でなく、創傷接触面を平面に変形させることができない形状である場合には、創傷接触面を下にして、人工真皮を平面に置き、当該平面に対して、平行な平面（平行面）、および、垂直な平面（垂直面）を任意にとり、二辺を当該平行面および垂直面に有する1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像を取得する。1,500μｍ×1,500μｍの正方形の断面画像から、Ｘ１およびＸ２を求める方法は、前記の方法と同様である。
【００２１】
Ｘ２／Ｘ１は、多孔質シートの気孔の形状を表す、パラメーターである。Ｘ２／Ｘ１が１未満であって小さいほど、厚み方向に、気孔を形成している壁部が相対的に少なく、例えば、個々の気孔の形状が厚み方向に細長いことを意味する。Ｘ２／Ｘ１が１に近づくほど、厚み方向および平面方向に気孔を形成している壁部の分布が均等であり、例えば、個々の気孔の形状が等方的であることを意味する。Ｘ２／Ｘ１が１を超え大きいほど、平面方向に、気孔を形成している壁部が相対的に少なく、例えば、個々の気孔の形状が平面方向に細長いことを意味する。
【００２２】
本発明の人工真皮は、Ｘ２／Ｘ１が０．８以下であり、厚み方向に、気孔を形成している壁部が相対的に少ないことを特徴とし、それにより、移植床において、線維芽細胞および血管の、侵入および増殖がより容易に可能となり、優れた、例えば、短期間での、真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を奏する。その優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能により、増殖因子および／または細胞などを用いない場合であっても、真皮様組織（肉芽様組織）の形成が可能となり得る。なお、本発明の人工真皮の実施態様として、増殖因子および／または細胞などを含む形態を排除するものではない。
【００２３】
本発明において、Ｘ２／Ｘ１は、０．８以下であり、Ｘ２／Ｘ１の上限の範囲として、好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下、更に好ましくは０．５以下、更に好ましくは０．４以下である。Ｘ２／Ｘ１の下限の範囲として、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．２以上、更に好ましくは０．３以上である。Ｘ２／Ｘ１の範囲としては、好ましくは０．１〜０．８、より好ましくは０．２〜０．７、更に好ましくは０．３〜０．６、更に好ましくは０．３〜０．４である。
上記上限の範囲とすることは、本発明の効果である、優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能をより得られるため好ましい。上記下限の範囲とすることは、移植用人工真皮の物理的強度の観点で好ましい。
【００２４】
Ｘ１の数値（３本の長さ1,500μｍの平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計）は特に制限されるものではないが、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、更に好ましくは４０〜１５０、更に好ましくは５０〜１００である。
【００２５】
Ｘ２の数値（３本の長さ1,500μｍの垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計）は特に制限されるものではないが、前記Ｘ２／Ｘ１の好ましい範囲と、前記Ｘ１の好ましい範囲から求められる範囲が好ましい範囲である。
【００２６】
（生分解性材料）
本発明に係る生分解性材料は、生体内で分解される限り、その種類は特に限定されない。本発明で用いられる生分解性材料は、Grand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値で表される親疎水性指標において、０．０以上５．０以下であることが好ましく、０．３以上３．０以下であることが更に好ましく、上記範囲を満たす親水性ポリペプチドが特に好ましい。ＧＲＡＶＹ値は、「Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607」および「Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).」の方法により得ることができる。
【００２７】
生分解性材料の具体例としては、蛋白質、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体（poly lactic-co-glycolic acid；ＰＬＧＡ）、キチン、キトサン、セルロース、およびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。上記の中でも、蛋白質またはポリペプチドが好ましく、特にゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンなどが好ましい。これらの蛋白質は遺伝子組み換え体でも天然体でもよく、感染症の懸念が少ない点や所望の構造を設計することが可能である点で、遺伝子組み換え体が好ましい。遺伝子組み換え蛋白質の具体例としては、遺伝子組み換えゼラチン、遺伝子組み換えプロネクチン、遺伝子組み換えフィブロネクチン、遺伝子組み換えラミニンが挙げられる。上記の中で最も好ましいのは、遺伝子組み換えゼラチンである。
【００２８】
（遺伝子組み換えゼラチン）
遺伝子組み換えゼラチンは、ゼラチン本来の性能である生体適合性に優れつつ、天然由来ではないのでＢＳＥ（Bovine Spongiform Encephalopathy）などの感染症の懸念が少なく、非感染性に優れている。また、遺伝子組み換えゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２９】
遺伝子組み換えゼラチンの分子量は２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であることが好ましい。より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下であり、更に好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であり、最も好ましくは１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００３０】
遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的な、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＧＸＹ配列）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基、ＸおよびＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基（好ましくはグリシン残基以外の任意のアミノ酸残基）を表し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、コラーゲンおよびゼラチンのアミノ酸組成および配列における、他の蛋白質にはほとんど存在しない非常に特異的な部分構造である。この部分構造においてはグリシン残基が全体の約３分の１を占め、３アミノ酸残基ごとにグリシン残基が繰り返すアミノ酸配列となっている。グリシンは最も構造が単純なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸残基の多くはイミノ酸残基（プロリン残基、オキシプロリン残基）で占められることが好ましく、イミノ酸残基が遺伝子組み換えゼラチン全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。遺伝子組み換えゼラチンは、好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸残基が、ＧＸＹ配列の繰り返し構造であることが好ましい。
【００３１】
一般的なゼラチンには、極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものとが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、該ゼラチンを構成する全アミノ酸残基中の極性アミノ酸残基の割合が１０％〜４０％であることが好ましく、２０％〜３０％であることがより好ましい。さらには、該極性アミノ酸残基中の無電荷アミノ酸残基の割合が５％以上２０％未満であることが好ましく、７％以上１０％未満であることがより好ましい。本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうち何れか１個のアミノ酸の残基、好ましくは２個以上のアミノ酸の残基を配列に含まないことが好ましい。
【００３２】
一般に蛋白質及びポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている。本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列を一分子中に２個以上有することが好ましい。最小アミノ酸配列の具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列が好ましく、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列、およびＨＡＶ配列が更に好ましく、ＲＧＤ配列が特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
【００３３】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンでは、前記最小アミノ酸配列の個数は、細胞の接着性および増殖性の観点から、蛋白質１分子中３〜５０個が好ましく、更に好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個、最も好ましくは１２個である。
【００３４】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンにＲＧＤ配列（「ＲＧＤモチーフ」とも言う。）が複数個含まれる場合、ＲＧＤ配列の配置は、ＲＧＤ配列間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、より好ましくは２５〜６０であり、ＲＧＤ配列間のアミノ酸残基数は均一でないことが好ましい。
【００３５】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンにおいて、アミノ酸残基総数に対するＲＧＤモチーフの割合（ＲＧＤモチーフの合計アミノ酸残基数÷アミノ酸残基総数×１００）は少なくとも１．２％であることが好ましく、遺伝子組み換えゼラチンが２５０以上のアミノ酸残基を含む場合に、２５０のアミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。ＲＧＤモチーフの１．２％という割合は、２５０のアミノ酸残基あたり少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。例えば２５１のアミノ酸残基からなるゼラチンは、少なくとも１．２％を満たすには、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことを要する。
アミノ酸残基総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも１．８％であり、更に好ましくは少なくとも２．４％であり、更に好ましくは少なくとも３．０％であり、更に好ましくは少なくとも３．６％であり、最も好ましくは少なくとも４．５％である。遺伝子組み換えゼラチン内のＲＧＤモチーフの個数は、２５０のアミノ酸残基あたり、より好ましくは少なくとも２、更に好ましくは少なくとも３、更に好ましくは少なくとも４、更に好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、更に好ましくは１２以上１６以下である。
【００３６】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、部分的に加水分解されていてもよい。
【００３７】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂのアミノ酸配列を有することが好ましい。ここで、Ａは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。ｎは１５〜７０がより好ましく、５０〜６５が最も好ましい。ｍは３〜５がより好ましい。
【００３８】
前記アミノ酸配列中のＡで示される１又は２以上の任意のアミノ酸残基としては、グリシン残基、およびグリシン残基を少なくとも１含む２〜６のアミノ酸残基が好ましく、グリシン残基を少なくとも１含む３アミノ酸残基がより好ましい。
前記アミノ酸配列中のＢで示される１又は２以上の任意のアミノ酸残基としては、グリシン残基、およびグリシン残基を少なくとも１含む２〜６のアミノ酸残基が好ましく、グリシン残基がより好ましい。
【００３９】
遺伝子組み換えゼラチンに含まれる繰り返し単位としては、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合したものが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは、天然に存在するものであれば何れであっても構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型である。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、またはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００４０】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、更に好ましくは７〜９．５である。
【００４１】
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、脱アミノ化されていない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、テロペプタイドを有しない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。
【００４２】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、下記のアミノ酸配列を有することがより好ましい。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
Ｇｌｙはグリシン残基を示し、Ａｌａはアラニン残基を示し、Ｐｒｏはプロリン残基を示し、６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【００４３】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、特に好ましくは、下記の（１）または（２）である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有し、生分解性を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
配列番号１：GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【００４４】
本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２Ｂ１、ＷＯ２００４／８５４７３Ａ２、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いられる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
【００４５】
（架橋）
本発明における生分解性材料は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋方法としては、熱架橋、化学架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、ＵＶ架橋など公知の方法を用いることができる。架橋（共有結合）のほかに、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用の少なくともいずれかにより、更に高次構造化されているものも好ましい。
【００４６】
（多孔質シート）
本発明における、生分解性材料から構成される多孔質シートについて、以下に説明する。
【００４７】
（ａ）気孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）
気孔率（Ｐ（％））は、嵩密度（ρ）と真密度（ρｃ）から、式：Ｐ＝１−ρ／ρｃ（％）によって求める。嵩密度（ρ）は、乾燥重量と体積から算出し、真密度（ρｃ）は、ハバード型比重瓶を用いた比重瓶法により求めることができる。気孔率は、好ましくは８１％以上９９．９９％以下であり、より好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。
【００４８】
（ｂ）気孔間連通孔
本発明における多孔質シートにおいては、気孔間連通孔が存在してもよい。気孔間連通孔が存在することによって、多孔質シート表面から多孔質シート深部に至るまで気孔が連通し、移植床において、線維芽細胞および血管の、侵入および増殖がより容易に可能となる。
【００４９】
（ｃ）吸水率
吸水率（％）は、乾燥重量（Ｗ０）と、超純水を２５℃で５分間自然に吸水させ、プラスチックシャーレ上にて余分な水を十分に除いた後の水膨潤時の重量（Ｗ１）とから、式：Ｗ１÷Ｗ０×１００（％）により算出することができる。吸水率は、好ましくは１０００％以上９９００％以下であり、より好ましくは２０００％以上５０００％以下である。
【００５０】
生分解性材料から構成される多孔質シートは、公知の方法を用いて製造することができる。例えば、前記した生分解性材料を溶媒に溶解した溶液（好ましくは水溶液）を凍結させ、その後に凍結乾燥し、熱架橋することにより、生分解性材料から構成される多孔質シートを製造することができる。多孔質シートの、気孔率、気孔サイズ、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ２／Ｘ１は、使用する生分解性材料の種類、凍結および凍結乾燥の条件（例えば、凍結前の生分解性材料の水溶液の濃度、水溶液量、凍結速度、凍結温度）等により変化する。これらを調整することにより、所望の気孔率、気孔サイズ、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ２／Ｘ１を得ることができる。例えば、凍結させる際の凍結速度を速めに設定することにより、Ｘ２／Ｘ１が低くなる傾向が見られる。
【００５１】
本発明における多孔質シートは創傷接触層であり、多孔質シートの創傷接触面と創傷とが接触した際には、多孔質シートに線維芽細胞および血管の、侵入および増殖が起こり、真皮様組織（肉芽様組織）の形成能に優れた人工真皮として機能する。そのため、多孔質シートの創傷接触面には、他の層が積層されていないことが好ましい。但し、本発明の人工真皮による真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を阻害しない層であれば、積層してもよい。
【００５２】
本発明における創傷接触層の、創傷接触面と反対側の面には、その他の層が積層されていてもよい。その他の層としては、例えば、人工真皮が備える公知の層が挙げられ、具体的には、水蒸気透過調節層、シリコーン層、メッシュ層等である。
【００５３】
本発明の人工真皮は、その中に増殖因子および／または細胞などを含んでもよく、例えば、多孔質シート中（即ち創傷接触層中）に増殖因子および／または細胞などを含んでもよい。但し、本発明の人工真皮は、増殖因子および／または細胞などを含まなくても、良好な真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を得られるため、増殖因子および／または細胞を含まないことが製造コスト等の観点で好ましい。
【００５４】
本発明の人工真皮は、皮膚の欠損部、粘膜の欠損部などに好適に用いることができる。
【００５５】
本発明の移植用人工真皮の製造方法は、本発明の移植用人工真皮を製造する方法であって、前記多孔質シートを製造する際に、生分解性材料の水溶液を凍結させる工程（凍結工程）を含むものである。本発明の移植用人工真皮の製造方法は、更に、生分解性材料水溶液の凍結物を凍結乾燥させる工程（凍結乾燥工程）を含むことが好ましく、更に、凍結乾燥後の生分解性材料を架橋させる工程（架橋工程）を含むことがより好ましい。当該架橋工程は、凍結乾燥後の生分解性材料を熱によって架橋させる工程（熱架橋工程）であることが好ましい。凍結方法およびその後の凍結乾燥の方法、熱架橋の方法は、公知の方法を用いることができる。
【００５６】
本発明の移植用人工真皮の製造方法は、使用する生分解性材料の種類、凍結および凍結乾燥の条件（例えば、凍結前の生分解性材料の水溶液の濃度、水溶液量、凍結速度、凍結温度）等を調整することにより、多孔質シートの、気孔率、気孔サイズ、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ２／Ｘ１を調整できる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではない。【００５８】
［実施例１］
（遺伝子組み換えゼラチン）
遺伝子組み換えゼラチン（リコンビナントゼラチン）として、下記のＣＢＥ３を用意した（ＣＢＥ３は、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載されている）。
ＣＢＥ３
・分子量：５１．６ｋＤａ
・構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
・アミノ酸数：５７１個
・ＲＧＤ配列：１２個
・イミノ酸含量：３３％
・ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
・ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。
・ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
・等電点：９．３４
・アミノ酸配列（配列表の配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００５９】
（多孔質シートの作製）
遺伝子組み換えゼラチンＣＢＥ３を用い、３％ゼラチン水溶液を作製し、その水溶液をアルミニウム製カップ（直径５３ｍｍ×高さ３７ｍｍ）に流し込んだ。その後、−８０℃の冷凍庫内で、アルミブロックにガラス板をおいた台の上で１時間静置した。その後凍結乾燥し、１６０℃で３時間熱架橋させて、遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質シート（平均厚２３００μｍ）を得た。得られた多孔質シートをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図１参照）。図２は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、９８であり（平行線１：交点数３７、平行線２：交点数３０、平行線３：交点数３１）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、６８であり（垂直線１：交点数１９、垂直線２：交点数２５、垂直線３：交点数２４）、Ｘ２／Ｘ１は０．７である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。【００６０】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
Wistarラット（雄、１０週齢以降）を用い、塩酸ケタミンと塩酸キシラジンをそれぞれ９０ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与することより麻酔した。ラットの背部を脱毛後に直径１９ｍｍの円形の真皮欠損を作製した。得られた人工真皮を真皮欠損部へ貼付後、ワセリン付ガーゼ（アダプティック（登録商標）、ジョンソン・エンド・ジョンソン）、ウェットコットン、およびガーゼを順にのせ、固定した。２週目に麻酔下で、人工真皮を含む背部組織を摘出した。その摘出組織をＨＥ（Hematoxylin Eosin）染色にて組織学的に観察した結果、後述する比較例１及び比較例２と比較して有意に真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた（図３参照）。【００６１】
［実施例２］
（多孔質シートの作製）
遺伝子組み換えゼラチンＣＢＥ３を用い、３％ゼラチン水溶液を作製し、その水溶液をアルミニウム製カップ（直径５３ｍｍ×高さ３７ｍｍ）に流し込んだ。その後、−６０℃の冷凍庫内で、アルミブロックにガラス板をおいた台の上で１時間静置した。その後凍結乾燥し、１６０℃で３時間熱架橋させて、遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質シート（平均厚２５００μｍ）を得た。得られた多孔質シートをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図４参照）。図５は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、１０８であり（平行線１：交点数３６ 、平行線２：交点数３４、平行線３：交点数３８）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、３２であり（垂直線１：交点数１１、垂直線２：交点数７、垂直線３：交点数１４）、Ｘ２／Ｘ１は０．３である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。【００６２】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
実施例１と同様の方法で評価を行った（図６参照）。後述する比較例１及び比較例２と比較して有意に真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた。また、実施例１と比較して同等以上の真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた。【００６３】
［比較例１］
（多孔質シートの作製）
実施例１の「−８０℃の冷凍庫内で」を「−４０℃の冷凍庫内で」に変更したこと以外は実施例１と同様の操作を行い、遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質シート（平均厚２２００μｍ）を得た。得られた多孔質シートをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図７参照）。図８は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、５８であり（平行線１：交点数１９、平行線２：交点数１８、平行線３：交点数２１）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、５７であり（垂直線１：交点数２０、垂直線２：交点数１９、垂直線３：交点数１８）、Ｘ２／Ｘ１は１である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。【００６４】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
実施例１と同様の方法で評価を行った（図９参照）。実施例１および実施例２の方が、明らかに真皮様組織（肉芽様組織）が形成されていることが確認できる。【００６５】
［比較例２］
（多孔質シートの作製）
実施例１の人工真皮の代わりに、市販の真皮欠損用グラフトであるテルダーミス（登録商標）（オリンパステルモバイオマテリアル）（平均厚３３００μｍ）を用いて、同様の試験を行った。テルダーミスをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図１０参照）。図１１は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、４１であり（平行線１：交点数１３、平行線２：交点数１２、平行線３：交点数１６）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、４０であり（垂直線１：交点数１２、垂直線２：交点数１３、垂直線３：交点数１５）、Ｘ２／Ｘ１は１である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。【００６６】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
実施例１と同様の方法で評価を行った（図１２参照）。実施例１および実施例２の方が、明らかに真皮様組織（肉芽様組織）が形成されていることが確認できる。【００６７】
以上に示したとおり、本発明の実施例にかかる人工真皮は、多孔質を特定の形状とすることにより、優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を有する。【００６８】
２０１３年１月２５日に出願された日本国特許出願２０１３−０１２６２６号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2014115732.tif 000002
【図２】
2014115732.tif 000003
【図３】
2014115732.tif 000004
【図４】
2014115732.tif 000005
【図５】
2014115732.tif 000006
【図６】
2014115732.tif 000007
【図７】
2014115732.tif 000008
【図８】
2014115732.tif 000009
【図９】
2014115732.tif 000010
【図１０】
2014115732.tif 000011
【図１１】
2014115732.tif 000012
【図１２】
2014115732.tif 000013
【配列表】
2014115732000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月21日(2016.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の移植用人工真皮は、生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たすものである。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．５
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】参考例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図２】参考例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図３】参考例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図４】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図５】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図６】実施例２にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図７】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図８】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図９】比較例１にて、遺伝子組み換えゼラチンで作製した多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【図１０】比較例２の多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像である。
【図１１】比較例２の多孔質シートをエオジン染色し、内部断面構造を光学顕微鏡で観察した画像（1,500μｍ×1,500μｍの拡大図）である。
【図１２】比較例２の多孔質シートを用いて、真皮様組織（肉芽様組織）形成試験を行い、ＨＥ染色にて組織学的に観察した画像である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の移植用人工真皮（以下「本発明の人工真皮」とも言う。）は、生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たすものである。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．５
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の人工真皮は、Ｘ２／Ｘ１が０．５以下であり、厚み方向に、気孔を形成している壁部が相対的に少ないことを特徴とし、それにより、移植床において、線維芽細胞および血管の、侵入および増殖がより容易に可能となり、優れた、例えば、短期間での、真皮様組織（肉芽様組織）の形成能を奏する。その優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能により、増殖因子および／または細胞などを用いない場合であっても、真皮様組織（肉芽様組織）の形成が可能となり得る。なお、本発明の人工真皮の実施態様として、増殖因子および／または細胞などを含む形態を排除するものではない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明において、Ｘ２／Ｘ１は、０．５以下であり、Ｘ２／Ｘ１の上限の範囲として、好ましくは０．４以下である。Ｘ２／Ｘ１の下限の範囲として、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．２以上、更に好ましくは０．３以上である。Ｘ２／Ｘ１の範囲としては、好ましくは０．１〜０．５、より好ましくは０．２〜０．５、更に好ましくは０．３〜０．５、更に好ましくは０．３〜０．４である。
上記上限の範囲とすることは、本発明の効果である、優れた真皮様組織（肉芽様組織）の形成能をより得られるため好ましい。上記下限の範囲とすることは、移植用人工真皮の物理的強度の観点で好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
［参考例１］
（遺伝子組み換えゼラチン）
遺伝子組み換えゼラチン（リコンビナントゼラチン）として、下記のＣＢＥ３を用意した（ＣＢＥ３は、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載されている）。
ＣＢＥ３
・分子量：５１．６ｋＤａ
・構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
・アミノ酸数：５７１個
・ＲＧＤ配列：１２個
・イミノ酸含量：３３％
・ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
・ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。
・ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
・等電点：９．３４
・アミノ酸配列（配列表の配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
参考例１と同様の方法で評価を行った（図６参照）。後述する比較例１及び比較例２と比較して有意に真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた。また、参考例１と比較して同等以上の真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
［比較例１］
（多孔質シートの作製）
参考例１の「−８０℃の冷凍庫内で」を「−４０℃の冷凍庫内で」に変更したこと以外は参考例１と同様の操作を行い、遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質シート（平均厚２２００μｍ）を得た。得られた多孔質シートをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図７参照）。図８は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、５８であり（平行線１：交点数１９、平行線２：交点数１８、平行線３：交点数２１）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、５７であり（垂直線１：交点数２０、垂直線２：交点数１９、垂直線３：交点数１８）、Ｘ２／Ｘ１は１である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
参考例１と同様の方法で評価を行った（図９参照）。参考例１および実施例２の方が、明らかに真皮様組織（肉芽様組織）が形成されていることが確認できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
［比較例２］
（多孔質シートの作製）
参考例１の人工真皮の代わりに、市販の真皮欠損用グラフトであるテルダーミス（登録商標）（オリンパステルモバイオマテリアル）（平均厚３３００μｍ）を用いて、同様の試験を行った。テルダーミスをエオジン染色し、光学顕微鏡で構造を確認した（図１０参照）。図１１は、1,500μｍ×1,500μｍの拡大図であり、前記した方法により、３本の平行線と３本の垂直線をひき、それぞれ、交点数を求めた。３本の平行線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ１は、４１であり（平行線１：交点数１３、平行線２：交点数１２、平行線３：交点数１６）、３本の垂直線と、気孔を形成している壁部との交点数の合計であるＸ２は、４０であり（垂直線１：交点数１２、垂直線２：交点数１３、垂直線３：交点数１５）、Ｘ２／Ｘ１は１である。なお、本実施形態は、多孔質シートである創傷接触層のみから構成された人工真皮である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
（ラット背部における真皮様組織（肉芽様組織）形成試験）
参考例１と同様の方法で評価を行った（図１２参照）。参考例１および実施例２の方が、明らかに真皮様組織（肉芽様組織）が形成されていることが確認できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性材料から構成される多孔質シートからなる創傷接触層を有し、前記多孔質シートが下記の式を満たす、移植用人工真皮。
式：Ｘ２／Ｘ１≦０．５
前記多孔質シートにおいて、創傷接触面に対して平行な直線と垂直な直線とを同じ長さでひいたとき、Ｘ１は、前記平行な直線と気孔の壁との交点数であり、Ｘ２は、前記垂直な直線と気孔の壁との交点数である。
【請求項２】
前記Ｘ２／Ｘ１が、０．１以上０．５以下である、請求項１に記載の移植用人工真皮。
【請求項３】
前記生分解性材料が、蛋白質、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キチン、キトサン、セルロースおよびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または請求項２に記載の移植用人工真皮。
【請求項４】
前記生分解性材料が、ゼラチン、フィブロネクチン、およびラミニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から請求項３の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項５】
前記生分解性材料が、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項６】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の移植用人工真皮。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
Ａは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎは３以上１００以下の整数を示し、ｍは２以上１０以下の整数を示す。ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【請求項７】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記のアミノ酸配列を有する、請求項５または請求項６に記載の移植用人工真皮。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【請求項８】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、下記の（１）または（２）である、請求項５から請求項７の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、生分解性を有する、遺伝子組み換えゼラチン。
【請求項９】
前記生分解性材料が、架橋されている、請求項１から請求項８の何れか１項に記載の移植用人工真皮。
【請求項１０】
請求項１から請求項９の何れか１項に記載の移植用人工真皮の製造方法であって、
前記多孔質シートを製造する際に、生分解性材料の水溶液を凍結させる工程を含む、移植用人工真皮の製造方法。
【国際調査報告】
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