(57)【要約】  本発明は、一態様において、ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を有効成分とする医用組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を有効成分とする医用組成物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸が側鎖に前記ポリリン酸を有する、請求項１に記載の医用組成物。
【請求項３】
ゲル又は粘性溶液を形成する、請求項１又は２に記載の医用組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸が架橋ヒアルロン酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の医用組成物からなる止血剤。
【請求項６】
第１の組成物及び第２の組成物を含む医用キットであって、
ヒアルロン酸、ポリリン酸、及びカルシウムのそれぞれが、少なくとも前記第１の組成物及び前記第２の組成物のいずれかに含有され、
前記第１の組成物及び前記第２の組成物のそれぞれは、前記ヒアルロン酸、前記ポリリン酸、及び前記カルシウムの少なくとも一つを含有する、医用キット。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸が側鎖に前記ポリリン酸を有する、請求項６に記載の医用キット。
【請求項８】
前記第１の組成物は、前記カルシウムを含有し、
前記第２の組成物は、前記ヒアルロン酸及び前記ポリリン酸を含有する、請求項６又は７に記載の医用キット。
【請求項９】
前記第１の組成物は、第１のヒアルロン酸及び前記カルシウムを含有し、
前記第２の組成物は、前記第１のヒアルロン酸と架橋を形成し、側鎖に前記ポリリン酸を有する第２のヒアルロン酸を含有する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医用キット。
【請求項１０】
ヒアルロン酸を含有する第１の組成物、ポリリン酸を含有する第２の組成物、及びカルシウムを含有する第３の組成物を含む医用キット。
【請求項１１】
前記カルシウムの含有量が、前記ポリリン酸中のリン原子１モルに対して３モル以上１２モル以下である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医用キット。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の医用キットからなる止血剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用組成物、医用キット、及び止血剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術時において、圧迫、結紮、縫合などの基本的手技を十分に駆使してもなお止血が困難な場合や、癒着剥離部位や肝臓、脾臓などの実質臓器からの湧出性出血が生じる場合がある。このような場合、局所的に止血することが可能な止血剤の使用が有効である。【０００３】
現在上市されている止血剤としては、酸化セルロース、コラーゲンスポンジからなる止血剤や、ヒト由来の血液製剤であるフィブリン糊などが挙げられる。しかし、例えば酸価セルロースからなる止血剤を用いた場合、適用箇所のｐＨ低下による赤血球の溶解が生じ、周辺組織の炎症の増大及び創傷治癒の遅延につながるといった問題が報告されている（非特許文献１，２参照）。また、例えばコラーゲンスポンジからなる止血剤やヒト由来の血液製剤については、感染症のリスクが問題視されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】JoseL. Ibarrola et al., JOURNAL OF ENDODONTICS 1985 ,11(2), 75-83
【非特許文献２】JeanE. Bjorenson et al., Journal of Endodontics, 1986, 12(7), 289-292
【非特許文献３】HardeanE. Acheck et al. Annals of Surgery 2010, 251, 2, 217-228
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、高い止血効果を有し、かつ毒性の低い止血剤に用いることが可能な医用組成物及び医用キット、並びに該医用組成物、該医用キットからなる止血剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を含有する医用組成物を提供する。【０００７】
医用組成物において、ヒアルロン酸は側鎖にポリリン酸を有することが好ましい。【０００８】
医用組成物は、ゲル又は粘性溶液を形成することが好ましい。【０００９】
ヒアルロン酸は、架橋ヒアルロン酸であることが好ましい。【００１０】
本発明はまた、第１の組成物及び第２の組成物を含む医用キットであって、ヒアルロン酸、ポリリン酸、及びカルシウムのそれぞれが、少なくとも第１の組成物及び第２の組成物のいずれかに含有され、第１の組成物及び第２の組成物のそれぞれは、ヒアルロン酸、ポリリン酸、及びカルシウムの少なくとも一つを含有する、医用キットを提供する。【００１１】
医用キットにおいて、ヒアルロン酸は側鎖にポリリン酸を有することが好ましい。【００１２】
第１の組成物はカルシウムを含有し、第２の組成物はヒアルロン酸及びポリリン酸を含有することが好ましい。【００１３】
第１の組成物は第１のヒアルロン酸及びカルシウムを含有し、第２の組成物は、第１のヒアルロン酸と架橋を形成し、側鎖にポリリン酸を有する第２のヒアルロン酸を含有することが好ましい。【００１４】
本発明はまた、ヒアルロン酸を含有する第１の組成物、ポリリン酸を含有する第２の組成物、及びカルシウムを含有する第３の組成物を含む医用キットを提供する。【００１５】
医用キットにおいて、カルシウムの含有量は、ポリリン酸中のリン原子１モルに対して３モル以上１２モル以下であることが好ましい。【００１６】
本発明はまた、上記の医用組成物又は医用キットからなる止血剤を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高い止血効果を有し、かつ毒性の低い止血剤に用いることが可能な医用組成物及び医用キット、並びに該医用組成物、該医用キットからなる止血剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰの当量とゲル化時間との関係を示すグラフである。
【図２】ヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰの当量とＰｏｌｙＰ修飾率との関係を示すグラフである。
【図３】フィブリン塊形成凝固速度の測定結果を示すグラフである。
【図４】ヒアルロン酸の種類とフィブリン塊形成凝固速度との関係を示すグラフである。
【図５】ヒアルロン酸の濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。
【図６】異なる細胞種での細胞生存率を示すグラフである。
【図７】生体適合性の評価結果を示すグラフである。
【図８】止血効果の評価手順を示す模式図である。
【図９】止血効果の評価結果を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本実施形態に係る組成物は、ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を含有する。本明細書における「ヒアルロン酸」とは、少なくとも下記式（１）で表される構造単位を有する高分子化合物を意味する。
【化１】
2016133135.tif 000003
【００２０】
本明細書における「カルシウムと複合体を形成したポリリン酸」とは、カルシウム（イオン）と少なくとも一つの配位結合を形成したポリリン酸を意味する。当該ポリリン酸は、例えばカルシウムとキレートを形成したポリリン酸であってもよい。
【００２１】
本明細書における「ポリリン酸」とは、少なくとも下記式（２）で表される構造単位を有する高分子化合物及び官能基（ポリリン酸基）を意味する。
【化２】
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【００２２】
ヒアルロン酸としては、公知のヒアルロン酸を用いることができる。ヒアルロン酸は、側鎖にポリリン酸を有していてもよい。側鎖にポリリン酸を有するヒアルロン酸は、例えば下記式（３）で表される構造単位を有している。
【化３】
2016133135.tif 000005
【００２３】
式（３）中、Ｚは、ヒアルロン酸の主鎖とポリリン酸とを結合させるスペーサを表す。Ｚとしては、炭化水素、ポリエチレングリコール、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのスペーサが例示される。Ｚは、後述する式（５），（６）中のＸ又はＹで表されるスペーサであってもよい。各構造単位におけるＺ−ＰｏｌｙＰの置換位置は、式（３）における置換位置に限られず、他の置換位置であってもよい。
【００２４】
式（３）中、ＰｏｌｙＰは、下記式（４）で表されるポリリン酸基を表す。該ポリリン酸基は、カルシウムと複合体を形成している。
【化４】
2016133135.tif 000006
【００２５】
式（４）中、ｎは、１〜１０００の整数を表す。ｎは、好ましくは１以上、より好ましくは３以上、更に好ましくは１０以上である。ｎは、好ましくは１０００以下、より好ましくは２５０以下、更に好ましくは１００以下である。ｎが上記範囲であると、架橋ヒアルロン酸を含有する組成物の止血効果をより向上させることができる。
【００２６】
ヒアルロン酸は、分子内の少なくとも一部にヒアルロン酸同士により形成された架橋を有する架橋ヒアルロン酸であってもよい。架橋ヒアルロン酸は、１種又は２種以上のヒアルロン酸が架橋した化合物であってよい。架橋ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸の１又は２以上は、カルシウムと複合体を形成したポリリン酸を側鎖に有していてもよい。
【００２７】
架橋ヒアルロン酸は、例えば、第１の官能基を有する第１のヒアルロン酸と、第１の官能基と反応して架橋を形成する第２の官能基を有する第２のヒアルロン酸とを架橋させることにより得られる。すなわち、架橋ヒアルロン酸は、例えば第１のヒアルロン酸と第２のヒアルロン酸との架橋物である。より具体的には、第１のヒアルロン酸は、例えば下記式（１）で表される構造単位、及び下記式（５）で表される構造単位を有する。第２のヒアルロン酸は、例えば下記式（１）で表される構造単位、及び下記式（６）で表される構造単位を有する。第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸は、それぞれランダム重合体であってもよく、ブロック重合体であってもよい。
【００２８】
【化５】
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【化６】
2016133135.tif 000008
【化７】
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【００２９】
式（５），（６）中、Ｘ及びＹは、例えば互いに反応して共有結合を形成する官能基を表す。すなわち、上記の第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸においては、官能基Ｘと官能基Ｙとが反応することにより架橋が形成される。このようなＸ及びＹの組合せとしては、一方が下記表１に示す末端構造１を有する官能基であり、他方が下記表１に示す末端構造２を有する官能基である組合せが例示される。表１には、末端構造１及び２が反応することにより形成される共有結合の構造も併せて示す。Ｘ及びＹの組合せは、クリック反応、カッパーフリークリック反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応等によって共有結合を形成するような組合せであってもよい。各構造単位におけるＸ及びＹの置換位置は、式（５），（６）における置換位置に限られず、他の置換位置であってもよい。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸におけるＸ及びＹに相当する官能基は、例えば各構造単位における環構造が開環することにより形成されてもよい。具体的には、第１のヒアルロン酸又は第２のヒアルロン酸は、それぞれ式（５）で表される構造単位又は式（６）で表される構造単位に代えて、例えば表１に示した末端構造２の一例であるアルデヒド基を有する構造単位として、下記式（７）で表される構造単位を有していてもよい。
【００３２】
【化８】
2016133135.tif 000011
【００３３】
第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸は、上述の構造単位に加えて、下記式（３）で表される構造単位を有していてもよい。この場合、第１のヒアルロン酸と第２のヒアルロン酸とを架橋させた後に、式（３）におけるポリリン酸基とカルシウムとの複合体を形成することにより、カルシウムと複合体を形成したポリリン酸基を側鎖に有する架橋ヒアルロン酸が得られる。当該架橋ヒアルロン酸は、第１のヒアルロン酸及び／又は第２のヒアルロン酸におけるポリリン酸基とカルシウムとの複合体を予め形成した後に、当該第１のヒアルロン酸と第２のヒアルロン酸とを架橋させることによっても得られる。
【００３４】
【化９】
2016133135.tif 000012
【００３５】
第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸における式（１）で表される構造単位の割合は、それぞれ第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸を構成する全構造単位を基準として、生体適合性の観点から、好ましくは２０モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは４０モル％以上であり、また、ゲル化反応速度の観点から、好ましくは９５モル％以下、より好ましくは９０モル％以下、更に好ましくは８０モル％以下である。
【００３６】
第１のヒアルロン酸における式（５）で表される構造単位の割合は、第１のヒアルロン酸を構成する全構造単位を基準として、ゲル化反応速度の観点から、好ましくは５モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、更に好ましくは２０モル％以上であり、また、生体適合性の観点から、好ましくは８０モル％以下、より好ましくは７０モル％以下、更に好ましくは６０モル％以下である。なお、第１のヒアルロン酸が式（５）で表される構造単位に代えて式（７）で表される構造単位を有する場合、式（７）で表される構造単位の割合は、上記の式（３）で表される構造単位の割合と同様である。
【００３７】
第２のヒアルロン酸における式（６）で表される構造単位の割合は、第２のヒアルロン酸を構成する全構造単位を基準として、ゲル化反応速度の観点から、好ましくは５モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、更に好ましくは２０モル％以上であり、また、生体適合性の観点から、好ましくは８０モル％以下、より好ましくは７０モル％以下、更に好ましくは６０モル％以下である。なお、第２のヒアルロン酸が式（６）で表される構造単位に代えて式（７）で表される構造単位を有する場合、式（７）で表される構造単位の割合は、上記の式（４）で表される構造単位の割合と同様である。
【００３８】
第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸における式（３）で表される構造単位の割合は、それぞれ第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸を構成する全構造単位を基準として、止血効果の観点から、好ましくは０．１モル％以上、より好ましくは１モル％以上、更に好ましくは２モル％以上であり、また、生体適合性の観点から、好ましくは１５モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、更に好ましくは７モル％以下である。
【００３９】
第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸の重量平均分子量Ｍｗは、それぞれ、好ましくは５０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは２００００以上であり、また、好ましくは２００００００以下、より好ましくは１００００００以下、更に好ましくは８０００００以下である。本明細書のおける重量平均分子量Ｍｗは、ＧＰＣ分析により得られる重量平均分子量Ｍｗを意味する。
【００４０】
上述の第１のヒアルロン酸及び第２のヒアルロン酸の更に具体的な例としては、下記式（１）で表される構造単位、及び下記式（７）で表される構造単位を有する第１のヒアルロン酸、並びに、下記式（１）で表される構造単位、下記式（８）で表される構造単位、及び下記式（９）で表される構造単位を有する第２のヒアルロン酸がそれぞれ挙げられる。
【００４１】
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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［式（９）中、ｎは上記式（６）におけるｎと同義である。］
【００４２】
第１のヒアルロン酸は、上記式（７）で表される構造単位に代えて、下記式（１０）で表される構造単位を有していてもよい。
【化１４】
2016133135.tif 000017
【００４３】
第１のヒアルロン酸は、式（１）で表される構造単位、及び式（７）又は（１０）で表される構造単位からなっていてもよい。その場合、第１のヒアルロン酸における式（１）で表される構造単位、及び式（７）又は（１０）で表される構造単位の割合は、それぞれ２０〜９５モル％、及び５〜８０モル％であってよく、第１のヒアルロン酸の重量平均分子量Ｍｗは、５０００〜２００００００であってよい。
【００４４】
第２のヒアルロン酸は、式（１）で表される構造単位、式（８）で表される構造単位、及び式（９）で表される構造単位からなっていてもよい。その場合、第２のヒアルロン酸における式（１）で表される構造単位、式（８）で表される構造単位、及び式（９）で表される構造単位の割合は、それぞれ２０〜９５モル％、５〜８０モル％、及び１〜１５モル％であってよく、第２のヒアルロン酸の重量平均分子量Ｍｗは、５０００〜２００００００であってよい。
【００４５】
架橋ヒアルロン酸を得る方法としては、上述の共有結合による架橋に加えて、例えばコレステロールを利用した疎水性相互作用による架橋や、金属イオンを利用したイオン架橋によって、ヒアルロン酸同士（これらのヒアルロン酸は同一であっても異なっていてもよい）を架橋させる方法が挙げられる。
【００４６】
以上のようなヒアルロン酸を含有する組成物は、その他に生理食塩水、カルシウム、ＴＲＩＳ緩衝液、アミノ酸、グルコース、マンにトール、スクロース、トロンビンを含有していてもよい。
【００４７】
ヒアルロン酸の含有量は、組成物全量基準で、例えば０．１質量％以上、０．５質量％以上、又は１質量％以上であってよく、また、例えば１０質量％以下、８質量％以下、又は５質量％以下であってよい。ポリリン酸の含有量は、組成物全量基準で、例えば０．０００２５質量％以上、０．００２５質量％以上、又は０．００５質量％以上であってよく、また、例えば５．６２５質量％以下、３．７５質量％以下、又は２．６２５質量％以下であってよい。
【００４８】
カルシウムの含有量は、止血効果を更に向上させる観点から、ポリリン酸中のリン原子１モルに対して、好ましくは０．５モル以上、より好ましくは１モル以上、更に好ましくは３モル以上であり、また、好ましくは４０モル以下、より好ましくは２０モル以下、更に好ましくは１２モル以下である。カルシウムの含有量は、止血効果を更に向上させる観点から、ポリリン酸中のリン原子１モルに対して、好ましくは、０．５モル以上４０モル以下、０．５モル以上２０モル以下、０．５モル以上１２モル以下、１モル以上４０モル以下、１モル以上２０モル以下、１モル以上１２モル以下、３モル以上４０モル以下、３モル以上２０モル以下、又は３モル以上１２モル以下であってもよい。
【００４９】
ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を含有する組成物は、ゲル又は粘性溶液を形成する。具体的には、該組成物は、それ自体がゲル又は粘性溶液であってもよく、あるいは、それ自体は粉体であって、例えば水と共存した場合にゲル又は粘性溶液を形成し得る組成物であってもよい。粘性溶液は、好ましくは０．００２Ｐａ・ｓ〜５０００Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．０１Ｐａ・ｓ〜２０００Ｐａ・ｓ、更に好ましくは０．０５Ｐａ・ｓ〜１０００Ｐａ・ｓの粘度を有する溶液である。
【００５０】
ヒアルロン酸、及びカルシウムと複合体を形成したポリリン酸を含有する組成物は、該ヒアルロン酸及び該ポリリン酸を有効成分とする医用組成物として好適に用いられ、止血剤として特に好適に用いられる。該組成物は、ゲル又は粘性溶液、あるいは粉体として患部に適用されることによって、患部において止血効果を発揮する。
【００５１】
本実施形態に係るキットは、第１の組成物及び第２の組成物を含む。このキットにおいては、ヒアルロン酸、ポリリン酸、及びカルシウムのそれぞれが、少なくとも第１の組成物及び第２の組成物のいずれかに含有される。第１の組成物及び第２の組成物のそれぞれは、ヒアルロン酸、ポリリン酸、及びカルシウムの少なくとも一つを含有する。第１の組成物及び第２の組成物の形状は、特に限定されず、液体、固体等であってよい。キットは、第１の組成物及び第２の組成物に加えて、他の液体成分や固体成分等を更に含んでいてもよい。
【００５２】
キットにおけるヒアルロン酸は、例えば、上記式（１）で表される構造単位からなっていてもよく、上記式（１）で表される構造単位に加えて、例えば上記式（３）及び（５）〜（１０）から選ばれる式で表される構造単位を有していてもよい。キットにおけるヒアルロン酸は、上述した第１のヒアルロン酸及び／又は第２のヒアルロン酸であってよい。
【００５３】
キットにおけるポリリン酸は、上述した組成物におけるポリリン酸と同義である。キットにおけるカルシウムは、金属カルシウム、塩化カルシウム等のカルシウム塩、カルシウムイオン等のいずれの状態で含有されていてもよい。
【００５４】
キットにおいて、第１の組成物及び第２の組成物が液体である場合、第１の組成物及び第２の組成物は、それぞれＴＲＩＳ緩衝液、アミノ酸、グルコース、マンニトール、スクロース、トロンビン等を更に含有していてもよい。
【００５５】
キットにおけるヒアルロン酸の含有量は、第１の組成物又は第２の組成物全量基準で、例えば０．１質量％以上、０．５質量％以上、又は１質量％以上であってよく、また、例えば１０質量％以下、８質量％以下、又は５質量％以下であってよい。キットにおけるポリリン酸の含有量は、第１の組成物又は第２の組成物全量基準で、例えば０．０００２５質量％以上、０．００２５質量％以上、又は０．００５質量％以上であってよく、また、例えば５．６２５質量％以下、３．７５質量％以下、又は２．６２５質量％以下であってよい。
【００５６】
キットにおけるカルシウムの含有量は、止血効果を更に向上させる観点から、ポリリン酸中のリン原子１モルに対して、好ましくは０．５モル以上、より好ましくは１モル以上、更に好ましくは３モル以上であり、また、好ましくは４０モル以下、より好ましくは２０モル以下、更に好ましくは１２モル以下である。キットにおけるカルシウムの含有量は、止血効果を更に向上させる観点から、ポリリン酸中のリン原子１モルに対して、好ましくは、０．５モル以上４０モル以下、０．５モル以上２０モル以下、０．５モル以上１２モル以下、１モル以上４０モル以下、１モル以上２０モル以下、１モル以上１２モル以下、３モル以上４０モル以下、３モル以上２０モル以下、又は３モル以上１２モル以下であってもよい。
【００５７】
キットの一態様として、例えば、カルシウムを含有する第１の組成物と、ヒアルロン酸及びポリリン酸を含有する第２の組成物とを含むキットが挙げられる。このキットの第２の組成物において、ヒアルロン酸とポリリン酸とは、別個の化合物として含有されていてもよく、側鎖にポリリン酸基を有するヒアルロン酸として含有されていてもよい。
【００５８】
キットの他の態様として、例えば、第１のヒアルロン酸及びカルシウムを含有する第１の組成物と、第１のヒアルロン酸と架橋を形成し、ポリリン酸基を側鎖に有する第２のヒアルロン酸を含有する第２の組成物とを含むキットが挙げられる。
【００５９】
キットは、更に他の態様として、第１の組成物及び第２の組成物に加えて、第３の組成物を含んでいてもよい。この場合、例えば、第１の組成物はヒアルロン酸を含有し、第２の組成物はポリリン酸を含有し、第３の組成物はカルシウムを含有している。第３の組成物におけるその他の成分や各成分の含有量は、第１の組成物及び第２の組成物と同様であってよい。
【００６０】
本実施形態に係るキットは、医用キットとして好適に用いられ、止血剤として特に好適に用いられる。キットは、例えば、第１の組成物及び第２の組成物（必要に応じて他の成分）を予め混合して上記の架橋ヒアルロン酸を形成した上で患部に適用、あるいは、第１の組成物及び第２の組成物（必要に応じて他の成分）それぞれを患部に適用することによって、患部において止血効果を発揮する。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６２】
［アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＤＨ、上記式（８）で表される構造単位を有するヒアルロン酸）の合成］
（１）５００ｍＬナスフラスコ中で１．５００ｇのヒアルロン酸（ＨＡ、重量平均分子量：５万〜１１万、電気化学工業）を３００ｍＬのＲＯ水に溶解させた。
（２）１６．３３ｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を水溶液に直接加え、１時間撹拌した。
（３）０．１ＮのＨＣｌと０．１ＮのＮａＯＨとを用いて、水溶液のｐＨが６．８になるように調整した。
（４）ＨＯＢｔ溶液（１０ｍＬのＤＭＳＯ、５ｍＬのＨ２Ｏ、２．２９７ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））とＥＤＣ溶液（４．５ｍＬのＤＭＳＯ、４．５ｍＬのＨ２Ｏ、２．３２９ｇの１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ））とを順に水溶液に加えた。
（５）水溶液が蒸発しないようにパラフィルムで蓋をした。
（６）水溶液のｐＨを５＜ｐＨ＜７となるように調整した。
（７）３０分間ごとに計４時間、水溶液のｐＨを調整し、一晩撹拌した。
（８）３０分間水に漬けておいた透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  １  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭｗＣＯ＝６〜８０００）を用いて、４Ｌビーカーで水溶液を３日間透析した後、３日間、凍結乾燥した。
（９）５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液に、５〜１０ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＡＤＨ濃度になるように乾燥後のＨＡ−ＡＤＨを溶解させた。
（１０）ＥｔＯＨにＨＡ−ＡＤＨ溶液を滴下した後、４分間２５００ｒｐｍで遠心分離した。
（１１）ＨＡ−ＡＤＨを１００ｍＬのＨ２Ｏに溶解させ、２時間撹拌した。
（１２）透析を３日間行い、透析乾燥を３日間行い、生成物を得た。
（１３）１Ｈ  ＮＭＲによりＡＤＨ修飾率を算出したところ、４９．３％であった。【００６３】
［イミダゾール修飾ポリリン酸（ＰｏｌｙＰ−Ｉｍ）の合成］
（１）１００ｍＬビーカーにイミダゾール０．６１０８ｇ（８．９７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ  ０．６１６３ｇ（３．２１ｍｍｏｌ）を量りとり、ＲＯ水２０ｍＬに溶解させ、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ＝６．０に調整した。
（２）ヘキサメタリン酸ナトリウム０．９０５７ｇ（０．６５３ｍｍｏｌ）を加え、再び１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ＝６．０に調整した。
（３）反応の進行とともに低下するｐＨを、０．１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ＝６．０となるように頻繁に調整しながら、ＴＬＣで反応の進行を確認した。
（４）反応終了後、エタノール２００ｍＬを用いて、エタノール沈殿、遠心分離（１６０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）を行い、ＰｏｌｙＰ−Ｉｍ及びポリリン酸（ＰｏｌｙＰ）を回収した。
（５）減圧下溶媒留去を行い、ＰｏｌｙＰ−Ｉｍ及びＰｏｌｙＰの混合物を得た。収量は０．７２６４ｇ（０．５０５ｍｍｏｌ）、収率は７７．３％であった。ＰｏｌｙＰの重量平均分子量は、１４３９であった。ＰｏｌｙＰに対するイミダゾールの修飾率は、６２．１％であった。【００６４】
［ポリリン酸修飾ヒアルロン酸（ＨＡ−ＰｏｌｙＰ、上記式（９）に相当）の合成］
（１）上記で合成されたＨＡ−ＡＤＨ  ０．０１４７ｇをＲＯ水４ｍＬに溶解させた。
（２）上記で合成されたＰｏｌｙＰ−Ｉｍ  ０．５１７４ｇを加え、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ８．５に調整した。
（３）ｐＨを調整しながらＴＬＣ（展開溶媒：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝７／３）により反応を確認した。
（４）反応終了後、溶液を透析、凍結乾燥を行い、ＨＡ−ＰｏｌｙＰを得た。【００６５】
［アルデヒド化ヒアルロン酸（ＨＡ−ＣＨＯ、上記式（７）で表される構造単位を有するヒアルロン酸）の合成］
（１）ヒアルロン酸（ＨＡ、重量平均分子量：２００万、電気化学工業）１．５０ｇを３００ｍＬのナスフラスコに量り入れ、純水３００ｍＬを用いて室温下、一晩溶解させた。
（２）得られた５ｍｇ／ｍＬのＨＡ水溶液に過ヨウ素酸ナトリウム０．４０１ｇ（ＨＡの２糖ユニットに対して１．２５ｅｑ．）を固体の状態で添加し、遮光下、室温で２時間反応させた。
（３）反応を停止するためにエチレングリコール２００μＬを加え、室温下、１０分間攪拌した。
（４）ナスフラスコ内の水溶液を透析膜に入れ、４Ｌの食塩水中で１日透析を行った後、４Ｌ純水を用いて純水と同程度の電気伝導となるまで３日間透析を行った。
（５）凍結乾燥によって、ＨＡ−ＣＨＯを得た。【００６６】
上記のＨＡ−ＣＨＯに代えて、下記の手順で合成したＨＡ−ｃ−ＣＨＯを用いてもよいことを確認した。【００６７】
［アルデヒド化ヒアルロン酸（ＨＡ−ｃ−ＣＨＯ、上記式（１０）で表される構造単位を有するヒアルロン酸）の合成］
（１）１００ｍＬナスフラスコにおいて、ヒアルロン酸（ＨＡ、重量平均分子量：８７万、電気化学工業）４００ｍｇ（ユニット１ｍｍｏｌ）を純水６０ｍＬに溶解させた。
（２）３−アミノ−１，２−プロパンジオール１８２ｍｇ（１５５μＬ、２ｍｍｏｌ）をマイクロピペットでＨＡ水溶液に滴下した。
（３）ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ  １５３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ２ｍＬに溶解させた溶液を、ＨＡ水溶液に滴下した。
（４）１ｍｏｌ／Ｌの塩酸でＨＡ水溶液のｐＨを６に調整した。
（５）ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）５８ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）をＨＡ水溶液に加えてそのまま一晩反応させた。
（６）透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  １  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭｗＣＯ＝６〜８０００）を用いてＨＡ水溶液の透析を行った。透析は、０．１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を透析液として２日、純水を透析液として１日それぞれ行った。
（７）凍結乾燥を行い、生成物（ＨＡ−ｃ−ｄｉｏｌ、下記式（１１）で表される構造単位を有するヒアルロン酸）を得た。収量は３３７．８５ｍｇであった。
【化１５】
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【００６８】
（８）５０ｍＬナスフラスコにおいて、ＨＡ−ｃ−ｄｉｏｌ  ２００ｍｇ（未修飾であれば０．５ｍｍｏｌ）を純水２５ｍＬに溶解させた。
（９）過ヨウ素酸ナトリウム１０７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬの純水に溶解させた溶液をＨＡ−ｃ−ｄｉｏｌ水溶液に滴下した。
（１０）遮光して５分間反応させた。
（１１）遮光を解き、エチレングリコール０．６ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）をＨＡ−ｃ−ｄｉｏｌ水溶液に加えて１０分撹拌した。
（１２）透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  １  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭｗＣＯ＝６〜８０００）を用いてＨＡ−ｃ−ｄｉｏｌ水溶液の透析を行った。透析は、透析液として純水を用いて１日行った。
（１３）凍結乾燥を行い、生成物（ＨＡ−ｃ−ＣＨＯ、上記式（１０）で表される構造単位を有するヒアルロン酸）を得た。収量は１８３．０２ｍｇであった。【００６９】
［ゲル時間測定］
（１）ＨＡ−ＡＤＨにおけるヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰ−ＩｍにおけるＰｏｌｙＰの当量を０．０１、０．１、０．３、０．５、１（ｅｑ）として合成した各ＨＡ−ＰｏｌｙＰを２ｗｔ％の濃度でＰＢＳに溶解させた。
（２）３００ｒｐｍのマイクロ撹拌子上に、ＨＡ−ＰｏｌｙＰ、ＨＡ−ＣＨＯの順でそれぞれ１００μＬずつ滴下した。
（３）目視によりゲル化に要する時間を測定した。結果を図１に示す。【００７０】
［モリブデンブルー法によるリン滴定］
以下の組成を有する溶液Ａ〜Ｃを使用した。
溶液Ａ：リン酸標準溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ：保存用）（リン酸二水素カリウム１．３６１０ｇ、ＲＯ水１Ｌ）【００７１】
溶液Ｂ：酸性モリブデン酸溶液（調製手順は以下のとおり）
（１）モリブデン酸アンモニウム１２．５ｇを１２５ｍＬの水に溶解させた。
（２）上記（１）とは別に酒石酸アンチモニルカリウム０．５ｇを２０ｍＬの水に溶解させた。
（３）３５０ｍＬの硫酸（４．５Ｍ）にモリブデン酸アンモニウム溶液を、絶えず撹拌しながら加えた。
（４）この水溶液に酒石酸アンチモニルカリウム溶液を加え、直ちによく混合した。【００７２】
溶液Ｃ：酸性アスコルビン酸溶液（調製手順は以下のとおり）
（１）モリブデン酸アンモニウム１０ｇをガラスビーカーに量り取り、５０ｍＬのＲＯ水に溶解させた。
（２）水溶液に硫酸（４．５Ｍ）５０ｍＬを加え、よく混合した。【００７３】
上記の溶液Ａ〜Ｃを用い、以下の手順に従ってリン滴定を行った。
（標準溶液列の調整と検量線の作成）
（１）溶液Ａを用いて適当な濃度（０〜１０μｍｏｌ／Ｌ）の標準溶液列を作製した。濃度０の溶液としてＲＯ水を用いた。
（２）標準溶液２５ｍＬに対して、溶液Ｃを０．５ｍＬで加え、穏やかに混合し、次いで、溶液Ｂを０．５ｍＬ加え、穏やかに混合した。
（３）溶液を１５分放置した後から６０分以内に、石英セルを用いて水を対照として８８３ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度とリン酸濃度との関係について検量線を作成した。【００７４】
（試料の前処理）
ＨＡ−ＡＤＨにおけるヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰ−ＩｍにおけるＰｏｌｙＰの当量を０．１、０．３、０．５、１（ｅｑ）として合成した各ＨＡ−ＰｏｌｙＰを１ｍｇ程度量りとり、そこに硫酸（０．５Ｍ）１ｍＬを加え、８０℃で２時間加熱した。【００７５】
（吸光度測定による定量）
（１）前処理を行った各試料溶液２５ｍＬに対して、溶液Ｃを０．５ｍＬ加え、穏やかに混合し、次いで、溶液Ｂを０．５ｍＬ加え、穏やかに混合した。
（２）１５分放置した後から６０分以内に、石英セルを用いて水を対照として８８３ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３）検量線を用いて、得られた吸光度から各ＨＡ−ＰｏｌｙＰにおけるＰｏｌｙＰ修飾率を算出した。結果を図２に示す。【００７６】
［ＴＮＢＳ  ａｓｓａｙ］
（１）０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）に２〜２００μｇ／ｍＬの上記［モリブデンブルー法によるリン滴定］と同じ各測定試料を溶解させた（サンプル溶液と呼ぶ）。
（２）０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）に０．０１ｗｔ％のトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を溶解させた（ＴＮＢＳ溶液と呼ぶ）。
（３）１．５ｍＬのマイクロチューブに０．５ｍＬの各サンプル溶液及び０．２５ｍＬのＴＮＢＳ溶液を加えた。
（４）３７℃で２時間インキュベートした後、反応を停止させるために１ＮのＨＣｌ  ０．１２５ｍＬを加えた。
（５）紫外可視分光光度計（Ｖ−６３０ＢＯ、日本分光製）を用いて３３５ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度から各ＨＡ−ＰｏｌｙＰにおけるヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰ修飾率を算出した。結果を図２に示す。【００７７】
［フィブリン塊形成凝固速度の測定］
（１）検体であるヒト標準血漿（Ｓｙｓｍｅｘ社製）を１ｍＬの純水に添加し、転倒混和にて溶解させた。
（２）検体１２０μＬを別のチューブにとり、３分間３７℃でインキュベートした。
（３）３７℃に設定されたソノクロット装置（サイエンコ社製）にキュベットをセットし、検体をキュベットに１２０μＬ入れ、サンプルとして生理食塩水、並びに、１ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＰｏｌｙＰ及びＨＡ−ＡＤＨをそれぞれ１２０μＬ添加した。
（４）ソノクロット装置においてスタートボタンを押し、攪拌が開始されたと同時に０．０２５Ｍの塩化カルシウム水溶液を１２０μＬ添加し、測定をスタートさせた。測定条件は、３７℃、３０ｍｉｎ、Ｓｃａｌｅ  ０−２５、測定回数４回とした。結果を図３及び４に示す。図３及び４中、クロット速度が大きいほどフィブリン塊形成凝固速度が大きいことを示す。【００７８】
［細胞毒性試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）］
（１）マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）、ヒト中皮細胞（ＭｅＴ−５Ａ）、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の３種の細胞を細胞密度５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４穴プレートにそれぞれ播種後２４時間培養した。
（２）培養培地に０．０１、０．１、０．２、１ｍｇ／ｍＬの各濃度でＨＡ−ＡＤＨ及びＨＡ−ＰｏｌｙＰをそれぞれ溶解させた溶液を５００μＬ投与し、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）については２日後の細胞生存率、ヒト中皮細胞（ＭｅＴ−５Ａ）及びマウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）については３日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイ（ＧＩＢＣＯ）によりそれぞれ測定した（Ｎ＝４）。結果を図５に示す。
（３）また、５００μＬの培養培地が入ったｗｅｌｌ上にダブルシリンジを用いて２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＰｏｌｙＰ及びＨＡゲルのそれぞれを０．１ｍＬトランスウェルに作製し、ゲルのＭＴＴアッセイも行った（Ｎ＝４）。結果を図６に示す。【００７９】
［生体適合性評価］
（ｉ．ｐ．（腹腔投与））
（１）１９Ｇの注射針を用いて、ＩＣＲマウス（７週齢、オス）の腹腔に２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＰｏｌｙＰをダブルシリンジにて１ｍＬ投与した（Ｎ＝４）。なお、ここで用いたＨＡ−ＰｏｌｙＰは、ＨＡ−ＡＤＨにおけるヒドラジド基に対するＰｏｌｙＰ−ＩｍにおけるＰｏｌｙＰの当量を０．５（ｅｑ）として合成したＨＡ−ＰｏｌｙＰであり、ＰｏｌｙＰの修飾率は、ＡＤＨに対して９．２８％、ＨＡに対して４．５８％であった（以下の評価でも同様）。
（２）１週間後、材料の残存と周辺組織への炎症と癒着の有無を確認したところ、材料の残存、炎症、癒着は見られなかった。【００８０】
（ｓ．ｃ．（皮下投与））
（１）ＩＣＲマウス（７週齢、オス）のｉ．ｐ．にて麻酔を投与した。
（２）麻酔のかかったマウスをコルクボードに張り付けて、１９Ｇの注射針を用いて、腹部に２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＰｏｌｙＰをダブルシリンジにて１ｍＬ投与した（Ｎ＝４）。
（３）１週間後、材料の残存と周辺組織への炎症と癒着の有無を確認したところ、材料の残存、炎症、癒着は見られなかった。【００８１】
また、以上のｉ．ｐ．及びｓ．ｃ．のそれぞれについて、投与前から投与後１週間までのマウスの体重増加を測定した。結果を図７に示す。【００８２】
［止血効果の評価］
以下の試料１〜４を用いた。
試料１：フィブリン糊（化血研：ボルヒール）
試料２：２０ｍｇ／ｍＬ  ＨＡＸ（Ｎ＝１２）
試料３：２０ｍｇ／ｍＬ  ＨＡＸ／ＰｏｌｙＰ（Ｎ＝１０）
試料４：２０ｍｇ／ｍＬ  ＨＡＸ−ＰｏｌｙＰ（Ｎ＝１０）【００８３】
試料２〜４のＨＡＸ（架橋ヒアルロン酸ゲル）、ＨＡＸ／ＰｏｌｙＰ（架橋ヒアルロン酸ゲルとポリリン酸との混合物）、ＨＡＸ−ＰｏｌｙＰ（ポリリン酸修飾架橋ヒアルロン酸ゲル）の作製手順は以下のとおりである。まず、ＨＡ−ＰｏｌｙＰ又はＨＡ−ＡＤＨを生理食塩水に、ＨＡ−ＣＨＯをＣａＣｌ２と共に生理食塩水に、それぞれ溶解させた（ＣａＣｌ２の濃度は０．５Ｍ）。そして、ＰＴＦＥシート上で二液を混合しＨＡＸ又はＨＡＸ−ＰｏｌｙＰを作製した。ここで、ＨＡ−ＰｏｌｙＰ又はＨＡ−ＡＤＨとＨＡ−ＣＨＯとの質量比は１：１であり、ＨＡ−ＰｏｌｙＰ中のリン原子１モルに対するＣａＣｌ２由来のカルシウムイオンの含有量は、６．２５モルであった。また、ＨＡＸではカルシウムを含有してもゲルの透明度が保たれるのに対し、ＨＡＸ−ＰｏｌｙＰではカルシウムを含有することによりゲルが白濁することから、ＰｏｌｙＰとカルシウムとが複合体を形成していることが確認された。【００８４】
また、コントロールとして、試料を投与しない未処置のマウス（Ｎ＝１４）についても評価を行った。【００８５】
止血効果の評価は、以下の手順に従って行った。
（１）ＩＣＲマウス（８週齢、オス）にｉ．ｐ．にて８倍希釈ソムノペンチル０．２ｍＬを投与し、麻酔した。
（２）麻酔のかかったマウスを仰向けの状態でコルクボードに張り付け、腹腔を開腹した（図８（ａ））。
（３）ガーゼを用いて、開腹時の出血と腹水を取り除き、パラフィルムにて肝臓以外の臓器を覆った。
（４）パラフィルム上にあらかじめ風袋を測定したろ紙を置き、もう一度ガーゼにて腹水等をよく取り除き肝臓のＬＬをろ紙上に静置した（図８（ｂ））。
（５）コルクボードを水平面から４５°傾けた状態で（図８（ｃ））、メスにてＬＬの中心の下方部から１ｃｍの位置を５ｍｍ切開し、３分間出血させた（図８（ｄ））。
（６）試料１〜４をそれぞれ出血部位に投与した（図８（ｅ））。
（７）３分間静置した後、ろ紙に付着した血液量を重量測定より評価した。試料がゲルの場合は、ゲルと出血量とが付着したろ紙の重量、及びゲルを取り除いた後のろ紙の重量をそれぞれ測定した（ろ紙自体の重量は予め測定した風袋により差し引いた）。【００８６】
評価結果を図９に示す。図９は、各試料を用いた場合及びコントロールについて平均出血量を算出し、平均出血量に基づいてそれぞれ外れ値と有意差を示した箱ひげ図である。この際、最も厳しい異なった分散をもつ独立２群データでｔ検定を行った。
【図１】
2016133135.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016133135.tif 000027
【国際調査報告】
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