(57)【要約】  本発明は、神経損傷による機能障害に対して高い回復効果を有する移植材を、効率よく、且つ再現性よく製造する方法を提供することを課題とする。本発明は、神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、歯髄幹細胞を、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含む方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞を、ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地中の血清は、１５重量％未満の濃度である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培地中のＦＧＦ２は、５ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地中のＦＧＦ２は、７ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞を選択して用いる、請求項１から６及び１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を選択して用いる、請求項１から６、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を選択して用いる、請求項１から６及び１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
歯髄幹細胞と、ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地とを含む、神経損傷の治療用移植材。
【請求項１７】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１６に記載の神経損傷の治療用移植材。
【請求項１８】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１７に記載の治療用移植材。
【請求項１９】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞である、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２０】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２１】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２２】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の平均と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２３】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２４】
神経損傷の治療方法であって、
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法で製造された神経損傷治療用移植材、又は１６から２３のいずれか１項に記載の治療用移植材を、神経損傷部位に移植する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
培地と、ＦＧＦ２とを含む、神経損傷治療用移植材製造用キット。
【請求項２７】
歯髄幹細胞の複数の細胞群から、神経損傷の治療用移植材の材料を選択する方法であって、以下の(i)〜(iv)の少なくとも１つの性質を有する歯髄幹細胞を選択する方法：
(i) 表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
(ii) MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
(iii) 表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い；及び
(iv) Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯髄幹細胞を用いて神経損傷の治療用移植材を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄は末梢組織と脳の運動、知覚情報の伝道路であり、傷害されると運動麻痺や知覚障害などの重篤な身体障害に陥る。有効な治療法はおろか、部分的な機能再建も望めない。近年、世界的に研究が活発化しているが、いまだ根本的な治療法は開発されていない。
わが国には、約１０万人の脊髄損傷患者がおり、新たな受傷者は年間約５０００人である。２０歳前後と６０歳前後にピークがあり、主に壮年層を中心として運転中やスポーツ中の事故による傷害や、老齢者が軽微な衝撃で起こす脊椎骨折等によって引き起こされる。一度失われた身体機能は回復することがほとんどなく、患者はその後の生活に著しい制限を受ける。【０００３】
近年、ヒトの歯髄幹細胞を移植して、ラット脊髄損傷に伴う運動障害が著明に回復したことが報告された（非特許文献１）が、さらに再現性よく、高い回復効果が得られる神経損傷の治療方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sakai K. et al., J Clin Invest 122:80-90
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経損傷による機能障害に対して高い回復効果を有する移植材を、効率よく、且つ再現性よく製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、従来の培地にFGF2を比較的高濃度で加えて歯髄幹細胞を培養し、培養物を脊髄損傷モデルに移植すると、従来の方法に比較して運動機能の回復効果が著しく高くなること、さらに特定の遺伝子発現パターンを示す歯髄幹細胞を用いると、回復効果が再現性よく得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕  神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞を、ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含む、方法：
〔２〕  前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、上記〔１〕に記載の方法：
〔３〕  前記培地中の血清は、１５重量％未満の濃度である、上記〔２〕に記載の方法：
〔４〕  前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、上記〔１〕に記載の方法：
〔５〕  前記培地中のＦＧＦ２は、５ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法：
〔６〕  前記培地中のＦＧＦ２は、７ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、上記〔５〕に記載の方法：
〔７〕  前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
〔８〕  前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法：
〔９〕  前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１０〕  前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１１〕  前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いる、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１２〕  前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞を選択して用いる、上記〔１〕から〔６〕及び〔１１〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１３〕  前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を選択して用いる、上記〔１〕から〔６〕、〔１１〕及び〔１２〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１４〕  前記歯髄幹細胞として、2以上の歯髄幹細胞の細胞群から、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を選択して用いる、上記〔１〕から〔６〕及び〔１１〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１５〕  前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、上記〔１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法：
〔１６〕  歯髄幹細胞と、ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地とを含む、神経損傷の治療用移植材：
〔１７〕  前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、上記〔１６〕に記載の神経損傷の治療用移植材：
〔１８〕  前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、上記〔１７〕に記載の治療用移植材：
〔１９〕  前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞である、上記〔１６〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の治療用移植材：
〔２０〕  前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１６〕から〔１９〕のいずれか１項に記載の治療用移植材：
〔２１〕  前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１６〕から〔２０〕のいずれか１項に記載の治療用移植材：
〔２２〕  前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の平均と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、上記〔１６〕から〔２１〕のいずれか１項に記載の治療用移植材：
〔２３〕  前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、上記〔１６〕から〔２２〕のいずれか１項に記載の治療用移植材：
〔２４〕  神経損傷の治療方法であって、
上記〔１〕から〔１５〕のいずれか１項に記載の方法で製造された神経損傷治療用移植材、又は〔１６〕から〔２３〕のいずれか１項に記載の治療用移植材を、神経損傷部位に移植する工程を含む、方法：
〔２５〕  前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、上記〔２４〕に記載の方法：
〔２６〕  培地と、ＦＧＦ２とを含む、神経損傷治療用移植材製造用キット：
〔２７〕  歯髄幹細胞の複数の細胞群から、神経損傷の治療用移植材の材料を選択する方法であって、以下の(i)〜(iv)の少なくとも１つの性質を有する歯髄幹細胞を選択する方法：
(i) 表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
(ii) MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
(iii) 表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い；及び
(iv) Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い；
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材は、歯髄幹細胞を培養する際、培地にFGF2を加えるという簡便な方法で得ることができ、移植することによって高い運動機能の回復効果を得ることができる。
歯髄幹細胞は若年者から大量に得られる廃棄物であり、長期の凍結保存も可能であることから入手しやすく、自身に由来する歯髄幹細胞を用いれば、移植した際の免疫拒絶の問題も生じにくい。また、組織幹細胞であるため増殖が制限されており、多能性幹細胞に比較して腫瘍化の問題も少ないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ラットの脊髄全切断モデルに、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養した移植材（DP31F）、従来法による移植材（DP31O）、及びコントロールの移植材（control）を移植して、BBBスコアにより運動機能回復を測定した結果を示す。
【図２】図２は、ラットの脊髄全切断モデルに、FGF2を実質的に含まない培地で培養した移植材（DP31S）、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養した移植材（DP31F）、及びコントロールの移植材（コントロール）を移植して、BBBスコアにより運動機能回復を測定した結果を示す。
【図３】図３は、ラットの脊髄全切断モデルに、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養した移植材（DP31F、DP74F、DP264F）を移植して、BBBスコアにより運動機能回復を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［神経損傷の治療用移植材の製造方法］
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法の一態様は、歯髄幹細胞を、FGF2外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含む。
【００１０】
本明細書において「歯髄幹細胞」とは、歯髄から単離できる組織幹細胞の一種である。組織幹細胞は体性幹細胞とも呼ばれ、あらゆる細胞に分化することができる胚性幹細胞に対して、組織幹細胞は分化できる細胞の種類が限られている。
歯髄幹細胞は、乳歯及び永久歯のいずれからも採取することができ、従来医療廃棄物として処理されてきた親知らずや乳歯などの抜去歯の歯髄から得ることが可能である。歯髄幹細胞の調製及び保存は、当業者が公知の方法（例えば、Takeda, T. et al.: J. Dent. Res., 87:676-681, 2008；Tamaoki et al., J Dent Res. 2010 89:773-778）に従って行うことができる。
【００１１】
歯髄幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞と同様に硬組織中に存在する間葉系幹細胞であり、骨髄間葉系幹細胞と同様の方法（例えば、「実験医学別冊  改訂培養細胞実験ハンドブック  第8章  ヒト骨髄間葉系幹細胞」2009年1月1日発行（羊土社）に記載された方法）で継代培養できるが、分裂寿命が長く、脂肪細胞には分化しないなど、骨髄から単離されたものとは異なる特徴を有する。
【００１２】
このように、歯髄幹細胞は入手が容易であり、培養方法及び保存方法が確立されていることから、再生医療に用いられる移植材の原料として期待されている。歯髄幹細胞は、抜去歯から採取した後、必要に応じて培養して一定量まで増殖させ、長期間凍結保存できることから、多くのヒトから単離した歯髄幹細胞を保管する歯髄幹細胞バンクを作ることも可能である。
【００１３】
歯髄幹細胞は、例えば、表面抗原STRO-1で特徴付けられる。その他、Nestin、SOX10、SOX11などの神経堤細胞マーカーを指標として歯髄幹細胞を識別することも可能である。
歯髄幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞と比較して高い増殖能力を有することが知られている。また、リン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトと共にマウスに移植すると、象牙質を作ることも知られている。
【００１４】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法には、移植対象に由来する細胞を用いても、移植対象以外の者に由来する細胞を用いてもよい。例えば、移植対象者の乳歯や親知らずなどから歯髄幹細胞を単離して培養、凍結保存しておき、必要時にこれを解凍して用いてもよい。また、歯髄幹細胞バンクから、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen; HLA）が一致する歯髄幹細胞を選択し、これを神経損傷治療用移植材の製造に用いてもよい。
【００１５】
本明細書において「神経損傷」は、中枢及び末梢の神経損傷を意味し、具体的には、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経障害などを含むがこれらに限定されない。本発明の移植材は、移植によって治療効果が得られる限りあらゆる神経損傷に適用することができる。治療効果とは、疾患を治癒させる効果に限定されず、疾患に伴う少なくとも一つの症状を改善する効果や、疾患の進行を阻止又は遅延する効果等を含む。
【００１６】
本明細書において、移植対象はヒトに限られず、その他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ）であってもよい。
【００１７】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法では、歯髄幹細胞を、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する。
本明細書において、「FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地」とは、意図的に添加する成長因子がFGF2のみであることを意味する。このような培地としては、例えば、血清を含む基本培地に、成長因子としてFGF2のみが加えられた培地；血清を含まない基本培地に、FGF2のみが加えられた培地；血清を含む基本培地に、FGF2のみが加えられた培地；間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてFGF2のみが加えられた培地；間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、FGF2のみが加えられた培地が挙げられる。
【００１８】
本明細書において「基本培地」とは、低分子量の既知成分のみの培地をいい、基本培地の非限定的な例として、BME（Basal medium Eagle's）、MEM（Minimum essential medium）、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）などのイーグル培地、RPMI1630、RPMI1640などRPMI（Roswell Park Memorial Institue）培地、フィッシャー培地（Fischer's medium）、F10培地、F12培地などのハム培地（Ham's medium）、MCDB104、107、131、151、153、170、202などのMCDB培地、RITC80-7培地が知られており、適宜選択することができる。
【００１９】
本明細書において「血清」は、血液を凝固させた上清をいい、すなわち、血液から細胞成分と凝固タンパク質が除かれたものを意味する。本発明に用いられる血清は、どのような動物に由来するものであってもよく、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清、ウマ血清などが挙げられる。本発明に係る治療用移植材がヒトに移植される場合は、ヒト血清であることが好ましい。
血清には各種成長因子が含まれているので、「血清を含む基本培地」にはかかる成長因子が含まれることになるが、血清に含まれる量のFGF2以外の成長因子を含む培地は、明細書においては「FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地」に該当するものとする。血清は、培地中、15重量％未満、13重量%未満、10重量％未満、8重量％未満、5重量％未満等であることが好ましい。
【００２０】
本明細書において「成長因子」は、成長因子又は増殖因子と呼ばれる各種タンパク質を意味し、例えば、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、酸性線維芽細胞成長因子（aFGF又はFGF1）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF又はFGF2）、血小板由来成長因子（PDGF）、神経成長因子（NGF）、インスリン様成長因子（IGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、ケラチノサイト成長因子（KGF）インターロイキン類などが挙げられる。
【００２１】
本明細書において「間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地」は、分化誘導することなく、分化能を維持した状態で間葉系幹細胞を培養し増殖させるための市販の培地を意味し、例えば、MSCGM培地（LONZA社）、間葉系幹細胞増殖培地（タカラバイオ株式会社）、間葉系幹細胞増殖培地DXF（タカラバイオ株式会社）、Stemline（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（Sigma-Aldrich社）、MF-medium（商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡ライフサイエンス）、BD Mosaic（商標）ヒト間葉系幹細胞用無血清培養キット（BDバイオサイエンス）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの市販の培地には成分が公開されていないものもあり、また、低濃度の血清を含んでいる場合もあることから各種成長因子を含んでいることもあるが、これらの培地に意図的に添加する成長因子がFGF2のみである限り、本発明における「FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地」に該当する。この場合、血清は、15％未満、13%未満、10％未満、8％未満、5％未満等であることが好ましい。
【００２２】
本明細書において、FGF2は、塩基性の線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；FGF）を意味し、bFGF又はHBGF-2とも呼ばれる。
FGF2は、市販のものを適宜希釈等して使用することができる。移植材に用いられるため、適当なメンブレンでろ過され、細菌、真菌、マイコプラズマ等の陰性が確認されたものが好ましい。FGF2の濃度は、得られる移植材に十分な脊髄損傷治療効果がある限り特に限定されないが、例えば5ng/ml以上、7ng/ml以上とすることができる。
【００２３】
本明細書において、「成長因子としてFGF2のみが加えられた培地」という場合、FGF2以外の成長因子が加えられていない限り、その他のタンパク質等を加えてもよい。
培地に加えられる物質としては、例えば、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、サイロキシン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、甲状腺ホルモン、エストラジオール、グルココルチコイドなどのホルモン；セルロプラスミン、トランスフェリン、リポタンパク質などの結合タンパク質；コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどの細胞接着因子；プロスタグランジン、リン脂質、不飽和脂肪酸などの脂質、各種の低分子量化合物などが挙げられ、これらのいずれかを単独で、又は任意の組み合わせで用いることができる。これらの物質の濃度は、当業者が適宜選択することが可能である。
【００２４】
本発明に係る脊髄損傷治療用移植材の製造方法で用いる培地には、その他、細胞の培養に有用な物質を適宜添加することができる。かかる物質として、例えば、pHを安定させるための緩衝剤（HEPESなど）、pH指示薬のフェノールレッド、抗生物質（ペニシリンG、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、ゲンタマイシン、カナマイシン、アンピシリン、ミノマイシン、ゲンタシン等）、アミノ酸、ビタミン、脂質、糖質、核酸、無機塩、有機酸塩、ミネラル、等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
本発明に係る脊髄損傷治療用移植材の製造方法で用いる培地は、水、緩衝液、市販の培地等に必要な成分を溶かすことによって調製することができる。
培地の調製に用いる水は、注射用純水に準拠した超純水を使用することが望ましい。
培地の調製も高規格クリーンルーム又はクリーンベンチで無菌的に行い、培地の分注は、マイコプラズマも除去できるポアサイズ0.1μm以下の無菌フィルタを使用するとよい。
培地の保存容器は、タンパク質が内壁に吸着しやすいガラス製よりも、ポリエチレンテレフタレート共重合体製などのプラスチック容器が好ましい。
調製した培地は、各種の品質評価試験（pHや浸透圧など測定を含む物性試験；バクテリア、菌類、マイコプラズマなどによる汚染を確認する微生物試験；肝炎ウイルス、HIVなどによる汚染を確認するウイルス試験；エンドトキシン濃度の測定；細胞増殖や生理機能などの生物活性試験等）を行ってもよい。
【００２６】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法では、上述した培地の中で、歯髄幹細胞を2回、3回、4回、5回、又は6回以上継代培養することも好ましい。
培養方法は、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養すること以外特に限定されず、当業者が、培養する細胞の種類に応じて、種々の条件（温度、湿度、CO2濃度、pH、培地の交換頻度等）を選択することが可能である。
培養期間は、細胞の種類、培地の組成に応じて当業者が適宜決定することができるが、例えば、細胞の形状や増殖の速度に基づいて、細胞が移植に適した状態となったことを判断してもよい。移植に適した状態としては、例えば、細長い形に変化した細胞や、増殖スピードが低下した細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００２７】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法における細胞の培養は、単層静置培養、回転培養、マイクロキャリア培養、浮遊培養、旋回培養、スフェロイド培養、ゲル内培養、三次元担体培養等、どのような方法で行ってもよい。
単層静置培養とは、培養容器の壁に接着させて単層の状態で培養する方法である。培養容器は、ガラス製やプラスチック製のものが用いられる。プラスチックは、表面が適度な親水性に処理されているものを使用することができ、細胞の種類や実験の目的によって、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルなどの細胞外基質でコーティングしてもよい。コーティング材として、ＵＶ照射により架橋したコラーゲンや、コラーゲンを加熱処理して得られるゼラチンを用いることもできる。
回転培養は、回転する金属ドラムに培養容器を入れて培養する方法である。ボトル型の培養容器を用いること等により、大量培養も行うことができる。
マイクロキャリア培養は、ビーズ状の担体を用いてその表面に細胞を接着させ、ビーズを含む培地を撹拌して浮遊状に培養する方法である。大量培養に適する。
浮遊培養は、細胞を培地に浮遊させた状態で培養する方法である。培地を撹拌することによって接着性の細胞を強制的に浮遊培養してもよい。単層培養に比較して、多量の細胞を回収することができる。
旋回培養は、水平面上の回転運動を培養容器に与えて培養する方法をいう。浮遊培養の一方法としても用いられるが、旋回によって浮遊物が中央に集まる性質を用いて細胞集塊（スフェロイド）を形成するためにも用いられる。
スフェロイド培養は、細胞を浮遊させ、互いに緩やかに接触する状態にしておくことで、相互接着によるスフェロイドを形成させる方法である。スフェロイド培養された細胞は、機能の発現が高いことが多い。
ゲル内培養は、コラーゲンゲル、軟寒天、合成ポリマーなどのゲルの中に細胞を埋め込んで培養する方法である。三次元培養に適している。
三次元担体培養は、培養細胞の機能の発現を高めるために、高密度かつ立体的な細胞増殖ができるよう担体を使って培養する方法である。担体としては、多孔性ポリマーやビーズが一般的であり、高密度の細胞の栄養・ガス交換を可能にするために、バイオリアクターによる循環系が用いられる。
【００２８】
本発明に係る、神経損傷の治療用移植材の製造方法は、上述した培養工程に加え、移植材の製造方法として適切な各種の工程を行うことができる。例えば、培養工程で得られた培養物を、ヒアルロン酸、コラーゲンゲル、フィブリノーゲン、軟寒天、合成ポリマーなどの粘性の高い物質と混合して流動性を調節する工程を行ってもよい。適度な流動性を付与することにより、移植材を損傷部位に定着させることができる。
コラーゲンゲル、軟寒天、合成ポリマーなどのゲルと混合後、ある程度の期間培養を行って、三次元培養を行ってもよい。
【００２９】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞を選択して用いてもよい。
【００３０】
本明細書において「歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞」とは、表１に記載の遺伝子群の発現について遺伝子発現パターンを調べたときに、歯髄幹細胞の平均と比較して、表１に記載の遺伝子群のうちの１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の種類の遺伝子の発現量がそれぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞をいう。
【００３１】
本明細書において「歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均」とは、２以上の任意の数の歯髄幹細胞における遺伝子の発現量の平均をいう。
【００３２】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【００３３】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、１６種以上、１７種以上、１８種類以上、１９種類以上、２０種類以上、又は２１種類の遺伝子の発現がそれぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞を用いてもよい。
【００３４】
また、本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
すなわち、表１に記載の遺伝子群うち１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
【００３５】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、１６種以上、１７種以上、１８種類以上、１９種類以上、２０種類以上、又は２１種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
【００３６】
本明細書において「２種以上の歯髄幹細胞の細胞群」とは、例えば、２以上の個体に由来する歯髄幹細胞の細胞群、１の個体から一定時間をあけて採取された細胞群、及び１個体の別の歯に由来する細胞群が挙げられる。細胞群は、１個の細胞から増殖させた細胞株であってもよいし、１個体に由来する複数の細胞を培養して得られる細胞群であってもよい。
【００３７】
本明細書における遺伝子発現の種類とその量は、これらに限定されないが、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーション、RNAse保護アッセイ、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を含めた当業者に周知の技術によって調べることができる。
【００３８】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞としてもよい。
【００３９】
本明細書において「歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞」とは、表２に記載の遺伝子群の発現について遺伝子発現パターンを調べたときに、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、表２に記載の遺伝子群のうちの１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の種類の遺伝子の発現量がそれぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は及び１００倍以上低い歯髄幹細胞をいう。
【００４０】
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００４１】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、又は１４種の遺伝子の発現がそれぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上低い歯髄幹細胞を用いてもよい。
【００４２】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
すなわち、表２に記載の遺伝子群のうち１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上低い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
【００４３】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材の製造に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、又は１４種の遺伝子の発現が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上低い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
【００４４】
本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法で得られた治療用移植材の効果は、例えば疾患モデル動物を用いて、以下の方法により評価することができる。
【００４５】
ラット中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルは公知の方法で作製することができるが、具体例を以下に示す。野生型ラットを麻酔下で直腸温を37±0.5℃に維持し、頚部を切開し右頚動脈の分岐部を露出させ、内外頚動脈を剥離した。その後、外頚動脈より先端をシリコンコートにて丸めた4-0ナイロン細糸によって、内頚動脈を通じ中大脳動脈(MCA)起始部に到達・固定することで右側中大脳脈領域の血流を遮断し、虚血を負荷した。1時間の虚血後、ナイロン細糸を中大脳動脈血外に引き抜くことで再灌流を施した。
再灌流後、48時間目に尾静脈より本発明に係る治療用移植材（歯髄幹細胞）を有効量投与する。または、梗塞を起こした患部に局所的に治療用移植材（歯髄幹細胞）を有効量投与してもよい。
【００４６】
運動機能の回復はBBB score（Basso DM et al., J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1-21）で評価する。
【００４７】
［神経損傷の治療用移植材］
本発明に係る神経損傷の治療用移植材は、上述した本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法によって製造されるものであり、歯髄幹細胞と、FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地とを含む。「歯髄幹細胞」及び「FGF2以外の成長因子を実質的に含まない培地」は上述のとおりである。移植材は、コラーゲンゲル、軟寒天、合成ポリマーなどのゲルを含んでいてもよく、適当なゲル化剤や増粘剤によって粘性を調節してもよい。
【００４８】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞を用いてもよい。「歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞」は、上述のとおりである。
【００４９】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2、からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、１６種以上、１７種以上、１８種類以上、１９種類以上、２０種類以上、又は２１種類の遺伝子の発現が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞を用いる移植材であってもよい。
【００５０】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。「２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表１の遺伝子群の遺伝子発現が高い歯髄幹細胞」は上述のとおりである。
【００５１】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、及びCbln2、からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、１６種以上、１７種以上、１８種類以上、１９種類以上、２０種類以上、又は２１種類の遺伝子の発現が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上高い歯髄幹細胞の細胞群であってもよい。
【００５２】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞を用いてもよい。
「歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞」は上述のとおりである。
【００５３】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞における平均の発現量と比較して、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、又は１４種の遺伝子の発現がそれぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上低い歯髄幹細胞を用いてもよい。
【００５４】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞は、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞を用いる移植材を含む。
「２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、表２の遺伝子群の遺伝子発現が低い歯髄幹細胞」は、上述のとおりである。
【００５５】
本明細書に係る神経損傷の治療用移植材に用いる歯髄幹細胞として、２種以上の歯髄幹細胞の細胞群のうち、Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、及びHTATSF1P2からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、又は１４種の遺伝子の発現が、他の細胞群に比較して、それぞれ、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、９５倍以上、又は１００倍以上低い歯髄幹細胞の細胞群を選択して用いてもよい。
【００５６】
［神経損傷の治療方法］
本発明は、上述した神経損傷の治療用移植材を、神経損傷部位に移植する工程を含む、神経損傷の治療方法も包含する。
神経損傷治療用移植材は、神経損傷部位に、注射器等によって注入することができる。また、損傷部位を切開して移植材を配置してもよい。移植材が他家細胞を含む場合、シクロスポリンなどの免疫抑制剤を同時に投与してもよい。神経損傷治療効果が得られる限り、他の医薬と併用することも可能である。
投与量及び投与回数は、当業者が適宜決定することが可能である。
神経損傷の治療方法の対象はヒトに限られず、その他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ）であってもよい。
【００５７】
本明細書におけるヒト脳梗塞の治療方法の例を以下に示すが、治療方法はこれに限られない。
【００５８】
上述した本発明に係る神経損傷の治療用移植材の製造方法によって製造した治療用移植材、又は、本発明に係る神経損傷の治療用移植を、ヒト脳梗塞患者に対して、末梢静脈より経静脈的に2ml/分の注入速度でシリンジポンプを用いて、歯髄幹細胞を有効量投与する。
【００５９】
［神経損傷の治療用移植材の製造用キット］
本発明は、神経損傷の治療用移植材の製造用キットも包含する。かかるキットには、歯髄幹細胞を培養するための培地またはその成分の全部又は一部と、FGF2が含まれている。歯髄幹細胞を培養するための培地としては、基本培地又は間葉系幹細胞培養用培地が挙げられる。FGF2は培地と別になっていてもよく、最初から混合されていてもよい。また、培地は、超純水など、実験室に常備される材料はユーザにおいて準備するものとし、それに混合するだけで本発明の培地を調製できるよう、必要な成分の全部又は一部を含むものであってもよい。
本発明のキットは、実験室での実験に使用されるものであってもよいし、大量培養に用いられるものであってもよい。培養液のほか、培養容器、ウイルスフィルタ、培養容器のコーティング材料、各種試薬、緩衝液、使用説明書等を備えていてもよい。
【００６０】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００６２】
実施例１．歯髄幹細胞の培養法の違いが脊髄全切断モデルの運動機能回復効果に及ぼす影響１
1.  実験方法
1-1.  動物および材料
Wistar系ラット（7週齢、雌）は日本SLC社、麻酔薬ソムノペンチルは共立製薬株式会社から購入した。動物実験の実施に当たって、動物実験の安全・福祉に関する規定に基づき、所定の様式により動物実験計画書を作成し、岐阜薬科大学動物飼育・動物実験委員会の承認を得た。【００６３】
1-2.  細胞培養
摘出した抜去歯から歯髄幹細胞を誘導し、培養下で増殖させる手法は以前の報告（Tamaoki et al., J Dent Res. 2010 89:773-778）に準じて行った。8継代まで植え次いだ歯髄幹細胞をMSCGM培地（LONZA)にて2-5回継代培養した細胞（DP31O)と、同細胞を10ng/mlのFGF2および10%FCSを含むα-MEM培地（Sigma社)にて5-6回継代培養した歯髄幹細胞（DP31F)を用意した。【００６４】
1-3.  全切断モデルを用いた実験方法
脊髄全切断モデルの作製
7週齢の雌性Wistar系ラットに40mg/kg体重の用量でソムノペンチルを腹腔内投与して麻酔後、第10胸椎の位置で背部を正中線に沿って2cm 切開し、脂肪および筋組織を剥離して脊柱を露出させた。椎弓を除去し、鋭利な刃物で第10胸髄（T10)を横断的に切断した。止血後、106細胞/10μlになるようにして、それぞれの培地に懸濁した上記の培養歯髄幹細胞を切断部の吻側断端と尾側断端の間隙に注入した。その後、背筋、皮膚を縫合した。術後、脊髄を切断した同側の後肢の麻痺を確認し、通常通り飼育して実験に用いた。なお、免疫抑制剤として、10mg/kgの用量でシクロスポリンを毎日、腹腔内に注射した。【００６５】
2.  結果
運動機能の回復はBBB score（Basso DM et al., J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1-21）で評価した（図１）。
細胞を移植せずPBSもしくは培養上清のみを損傷部に注入した個体でも、2週間後には、完全に麻痺していた後肢の1つまたは2つの関節がわずかに動く程度には回復した。しかし、損傷7週後まで観察しても、それ以上の運動機能回復は認められなかった（BBB score=1）。
一方、DP31Oを移植した群では、図１に示すように、損傷3週後になると半数の個体（14匹中7匹）が2つの関節をよく動かせるようになり、損傷4週後以降では、群全体で比較しても対照群に比べ有意に高い運動機能を示した（BBB score=3.5)。また、DP31Fを移植した群では損傷後１週間で後肢の１つの関節がわずかに動かせるようになり、2週目以降、対照群およびDP31O移植群と比較して有意に高い運動機能を示した（最終BBB score=6.5)。そのうち、半数（13匹中7匹)が麻痺した肢で体重を支えるまでに回復した。【００６６】
実施例２．歯髄幹細胞の培養法の違いが脊髄全切断モデルの運動機能回復効果に及ぼす影響２
1.  実験方法
1-1.  動物および材料
実施例１と同様に、動物を準備した。【００６７】
1-2.  細胞培養
摘出した抜去歯から歯髄幹細胞を誘導し、培養下で増殖させる手法は以前の報告（Tamaoki et al., J Dent Res. 2010 89:773-778）に準じて行った。MSCBM培地（LONZA)にて12継代まで植え継いだ歯髄幹細胞を、10%FCSを含むα-MEM培地（Sigma社)にて7-8回継代培養した歯髄幹細胞（DP31S）と、10ng/ml FGF2および10%FCSを含むα-MEM培地にて7-8回継代培養した歯髄幹細胞（DP31F)を用意した。【００６８】
1-3.  全切断モデルを用いた実験方法
実施例１と同様に、脊髄全切断モデルを作製した。【００６９】
2.  結果
実施例１と同様に、運動機能の回復はBBB score（Basso DM et al., J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1-21）で評価した（図２）。
細胞を移植しなかった群（コントロール）およびFGF2を含まない10%FCS含有α-MEM培地にて培養した歯髄幹細胞（DP31S）を移植した群では、後肢の運動機能はほとんど回復が見られず、平均的にみると１つの関節を動かせる程度であった（それぞれ、BBS score=1.9±0.2、n=45、BBS score=1.9±0.2、n=14）。
一方、FGF2を含む10%FCS含有α-MEM培地にて培養した歯髄幹細胞（DP31F）を移植した群では、運動機能の顕著な回復効果が見られ、平均すると３つすべての関節を動かすことができるようになった（BBS score=5.0±0.7、n=28）。【００７０】
実施例３．歯髄幹細胞のドナーの違いが脊髄全切断モデルの運動機能回復効果に及ぼす影響
1.  実験方法
1-1.  動物および材料
実施例１と同様に、動物を準備した。【００７１】
1-2.  細胞培養
3人の異なるドナー（DP31、DP74、及びDP264）から摘出した抜去歯から歯髄幹細胞を誘導し、培養下で増殖させる手法は以前の報告（Tamaoki et al., J Dent Res. 2010 89:773-778）に準じて行った。10ng/mlFGF2および10%FCSを含むα-MEM培地にて7-8回継代培養した、3人のドナー由来の歯髄幹細胞（DP31F、DP74F、及びDP264F）を用意した。【００７２】
1-3.  全切断モデルを用いた実験方法
実施例１と同様に、脊髄全切断モデルを作製した。【００７３】
2.  結果
実施例１と同様に、運動機能の回復はBBB score（Basso DM et al., J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1-21）で評価した（図３）。
DP264F移植群では、DP31F、及びDP74F移植群と比較して（BBB score=4.1±0.7、n=12）、運動機能の回復効果は認められなかった（BBB score=1.1±0.2、n=14）。【００７４】
実験例１．歯髄幹細胞の培養法の違いによる神経系細胞の分化マーカーの発現への影響
1.  実験方法
実施例１の歯髄幹細胞DP31Oを移植したラットと、実施例２の歯髄幹細胞DP31Fを移植したラットを、移植後それぞれ７週間後に、経心的に4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.3)潅流固定し、脊髄組織を摘出した。
摘出した脊髄組織は常法に従い、20%ショ糖溶液に浸漬し、OCTコンパウンドに包埋した上、クライオスタットを用いて薄切した。薄切した切片をスライドグラスに貼り付け、0.3%trironX100（登録商標）を含むTris-HCl（pH7.4)に浸漬し、抗体の細胞膜透過性を高めた後、2%ブロックエース（DSファーマバイオメディカル社）を含むPBSでブロッキングを室温で30分行った。一次抗体として、抗Human Nuclear antigen抗体（Millipore社（MAB1281））、抗Tuj1抗体（Cell Signaling technology社、#5568）、抗myelin basic protein（MBP）抗体（Millipore社（AB980））、抗CNPase抗体（Sigma社（C5922）、抗glial fibrillary acidic protein（GFAP)抗体（Dako社（Z0334））、抗growth asscciated protein43（GAP43)抗体（Chemicon社（MAB347））、抗green fluorescence protein（GFP)抗体（Chemicon社（AB3080））を用いて免疫染色を行った。
Human Nuclear antigenはヒト細胞のマーカー、CNPaseは幼弱オリゴデンドロサイトマーカー、GFAPは幼弱アストロサイトのマーカーである。なお、移植細胞はレトロウイルスベクターを用いてGFP遺伝子を発現するようにした。【００７５】
2.  結果
移植した歯髄幹細胞はGFPもしくはHuman Nuclear antigen陽性であることで同定した。移植前のDP31Oでは、幼弱な神経系細胞に見られるマーカー（すなわち、Tuj1（幼弱神経細胞マーカー）、GFAP、CNPase、及びNestin（幹細胞マーカー））のすべてが発現していたのに対し、脊髄組織中のDP31Oでは、ほとんどすべての細胞がTuj1およびGFAP陰性であり、CNPase陽性であった。一方、脊髄組織中DP31Fでは、一定割合の細胞がTuj1およびMBP陽性であり、ほとんどすべての細胞がGFAP陰性の細胞であった（Tuj1およびMBP陽性の細胞が同一かどうかは不明)。
したがって、移植されたDP31Oはオリゴデンドロサイトに、DP31Fは神経細胞やオリゴデンドロサイトを含む細胞集団に分化した可能性が示唆された。【００７６】
以上より、FGF2で処理した歯髄幹細胞には、MSCGMで培養した細胞に加えて、以下の性質が付与されたことが示唆された。
(i)損傷脊髄に移植したときに、神経細胞に特異的に分化する細胞に変化する。
(ii)分化能は制限されている（すなわち神経細胞に特異的に分化する）が、増殖能は維持されている。
これらの性質は、FGF2で処理した歯髄幹細胞が神経損傷の治療に有用であることを示す。【００７７】
実験例２．網羅的遺伝子発現解析法
1.  実験方法
２人のドナー（DP31、及びDP264）由来の歯髄幹細胞をMSCBM培地で培養した。トータルRNAはRNeasy Plus Miniキット(Qiagen社)を用いて上記歯髄幹細胞から抽出した。RNAをAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies社)を用いて定量化した後、Low Input Quick Amp Labelingキット(Agilent Technologies社)を用いて添付の説明書に従い、250mgのRNAからcDNAを逆転写、増幅し、Cy3-labeled CTPで標識した。さらにこのcDNAを精製した後、ND-1000 Spectrophotometer（Nano Drop Technologies社)を用いてcDNAを定量し、Whole Human Genome 4×44K オリゴ-DNAマイクロアレイ(Agilent Technologies社)にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、Gene Expression Wash Pack(Agilent Technologies社)を用いて継続的にアレイを洗浄した。ハイブリダイゼーションしたアレイの蛍光画像はAgilent DNA Microarray Scanner(Agilent Technologies社)で作製し、蛍光強度はAgilent Feature Extraction software ver.10.7.3.1.(Agilent Technologies社)を用いて解析した。それぞれのサンプルについて1回解析した。遺伝子発現のレベルはGene Spring GX11.5(Agilent Technologies社)を用いて解析した。【００７８】
2.  結果
DP31と比較してDP264で5倍以上遺伝子発現のレベルが高かった遺伝子を表１に、5倍以上遺伝子発現のレベルが低かった遺伝子を表2に示した。
【図１】
2014185470.tif 000016
【図２】
2014185470.tif 000017
【図３】
2014185470.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月2日(2014.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞をＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含み、
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、
方法。
【請求項２】
神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞をＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含み、
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、
方法。
【請求項３】
神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞をＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含み、
前記歯髄幹細胞として、２以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、
方法。
【請求項４】
神経損傷の治療用移植材の製造方法であって、
歯髄幹細胞をＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地で培養する工程を含み、
前記歯髄幹細胞として、２以上の歯髄幹細胞の細胞群から、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、
方法。
【請求項５】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地中の血清は、１５重量％未満の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培地中のＦＧＦ２は、５ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地中のＦＧＦ２は、７ｎｇ／ｍｌ以上の濃度である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、ＭＹＯ１Ｇ、ＲＢＭＹ２ＦＰ、ＦＩＬＩＰ１、Ｃ１ｏｒｆ６４、ＴＮＦＲＳＦ８、Ｃ２ｏｒｆ４８、ＡＧＴＲ１、Ｄｙｄｃ２、Ｚｎｆ７０８、Ｄｃｔ、Ｓｌｃ１５ａ１、Ｚｈｄｄｃ２２、Ａｄａｍ２０、Ｇｎａｏ１、Ｃｓｎ２、Ｓｅｍｇ２、Ｄｎａｈ１、Ｃｔａｇ１ａ、Ｌｒｒｃ１９、Ｌｉｐｇ、及びＣｂｌｎ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記歯髄幹細胞として、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、Ｇａｆａ３、Ｌｍｆ１、Ｆａｍ１３ａ、Ｇｋｎ１、Ｇｐｒ１１２、Ｓｕｌｔ１ｃ４、Ｓｌｃ３５ｆ４、Ｇｓｔｔ１、Ｇｐｒ２７、Ｐｄｉａ２、ＲＩＩＡＤ１、ＧＳＴＴ１、ＳＬＣ２Ａ２、及びＨＴＡＴＳＦ１Ｐ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記歯髄幹細胞として、２以上の歯髄幹細胞の細胞群から、ＭＹＯ１Ｇ、ＲＢＭＹ２ＦＰ、ＦＩＬＩＰ１、Ｃ１ｏｒｆ６４、ＴＮＦＲＳＦ８、Ｃ２ｏｒｆ４８、ＡＧＴＲ１、Ｄｙｄｃ２、Ｚｎｆ７０８、Ｄｃｔ、Ｓｌｃ１５ａ１、Ｚｈｄｄｃ２２、Ａｄａｍ２０、Ｇｎａｏ１、Ｃｓｎ２、Ｓｅｍｇ２、Ｄｎａｈ１、Ｃｔａｇ１ａ、Ｌｒｒｃ１９、Ｌｉｐｇ、及びＣｂｌｎ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い歯髄幹細胞を選択して用いる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記歯髄幹細胞として、２以上の歯髄幹細胞の細胞群から、Ｇａｆａ３、Ｌｍｆ１、Ｆａｍ１３ａ、Ｇｋｎ１、Ｇｐｒ１１２、Ｓｕｌｔ１ｃ４、Ｓｌｃ３５ｆ４、Ｇｓｔｔ１、Ｇｐｒ２７、Ｐｄｉａ２、ＲＩＩＡＤ１、ＧＳＴＴ１、ＳＬＣ２Ａ２、及びＨＴＡＴＳＦ１Ｐ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い歯髄幹細胞を選択して用いる、請求項１から９及び１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
神経損傷の治療用移植材であって、
ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地と、
歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞と、
を含む治療用移植材。
【請求項１６】
神経損傷の治療用移植材であって、
ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地と、
歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞と、
を含む治療用移植材。
【請求項１７】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、血清を含む基本培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１５又は１６に記載の神経損傷の治療用移植材。
【請求項１８】
前記ＦＧＦ２以外の成長因子を実質的に含まない培地は、間葉系幹細胞培養用培地として市販される培地に、成長因子としてＦＧＦ２のみが加えられた培地である、請求項１５又は１６に記載の治療用移植材。
【請求項１９】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の遺伝子の発現量の平均と比較して、ＭＹＯ１Ｇ、ＲＢＭＹ２ＦＰ、ＦＩＬＩＰ１、Ｃ１ｏｒｆ６４、ＴＮＦＲＳＦ８、Ｃ２ｏｒｆ４８、ＡＧＴＲ１、Ｄｙｄｃ２、Ｚｎｆ７０８、Ｄｃｔ、Ｓｌｃ１５ａ１、Ｚｈｄｄｃ２２、Ａｄａｍ２０、Ｇｎａｏ１、Ｃｓｎ２、Ｓｅｍｇ２、Ｄｎａｈ１、Ｃｔａｇ１ａ、Ｌｒｒｃ１９、Ｌｉｐｇ、及びＣｂｌｎ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上高い歯髄幹細胞を用いる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２０】
前記歯髄幹細胞は、歯髄幹細胞の平均と比較して、Ｇａｆａ３、Ｌｍｆ１、Ｆａｍ１３ａ、Ｇｋｎ１、Ｇｐｒ１１２、Ｓｕｌｔ１ｃ４、Ｓｌｃ３５ｆ４、Ｇｓｔｔ１、Ｇｐｒ２７、Ｐｄｉａ２、ＲＩＩＡＤ１、ＧＳＴＴ１、ＳＬＣ２Ａ２、及びＨＴＡＴＳＦ１Ｐ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が５倍以上低い歯髄幹細胞を用いる、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２１】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の治療用移植材。
【請求項２２】
神経損傷の治療方法であって、
請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法で製造された神経損傷治療用移植材、又は１５から２１のいずれか１項に記載の治療用移植材を、神経損傷部位に移植する工程を含む方法。
【請求項２３】
前記神経損傷は、脊髄損傷、脳梗塞、脳内出血、くも膜下出血、脊髄出血、椎間板ヘルニアによる神経の圧迫損傷、坐骨神経痛、又は糖尿病による末梢神経損傷である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１５から２１のいずれか１項に記載の神経損傷治療用移植材を製造するためのキット。
【請求項２５】
歯髄幹細胞の複数の細胞群から、神経損傷の治療用移植材の材料を選択する方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つの性質を有する歯髄幹細胞を選択する方法：
（ｉ）表１の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
（ｉｉ）ＭＹＯ１Ｇ、ＲＢＭＹ２ＦＰ、ＦＩＬＩＰ１、Ｃ１ｏｒｆ６４、ＴＮＦＲＳＦ８、Ｃ２ｏｒｆ４８、ＡＧＴＲ１、Ｄｙｄｃ２、Ｚｎｆ７０８、Ｄｃｔ、Ｓｌｃ１５ａ１、Ｚｈｄｄｃ２２、Ａｄａｍ２０、Ｇｎａｏ１、Ｃｓｎ２、Ｓｅｍｇ２、Ｄｎａｈ１、Ｃｔａｇ１ａ、Ｌｒｒｃ１９、Ｌｉｐｇ、及びＣｂｌｎ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上高い；
（ｉｉｉ）表２の遺伝子群のうち１０％以上の種類の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い；及び
（ｉｖ）Ｇａｆａ３、Ｌｍｆ１、Ｆａｍ１３ａ、Ｇｋｎ１、Ｇｐｒ１１２、Ｓｕｌｔ１ｃ４、Ｓｌｃ３５ｆ４、Ｇｓｔｔ１、Ｇｐｒ２７、Ｐｄｉａ２、ＲＩＩＡＤ１、ＧＳＴＴ１、ＳＬＣ２Ａ２、及びＨＴＡＴＳＦ１Ｐ２からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、他の細胞群に比較して５倍以上低い。
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【国際調査報告】
2014185470.tif 000019
2014185470.tif 000020
2014185470.tif 000021
2014185470.tif 000022