(57)【要約】  イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質をコードする核酸が提供される。当該核酸にコードされた融合タンパク質が提供される。当該核酸を有し、かつ前記融合タンパク質を発現する組換え細胞が提供される。前記第一タンパク質をコードする第一核酸とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有し、かつ前記第一タンパク質と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質とを発現する組換え細胞が提供される。宿主細胞として、合成ガス資化性細菌やメタノール資化性細菌を用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
前記第一タンパク質が、イソプレン合成酵素である請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記イソプレン合成酵素が、下記（ａ−１）〜（ａ−３）のいずれかである請求項２に記載の核酸。
（ａ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記第一タンパク質が、環式モノテルペン合成酵素である請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記環式モノテルペン合成酵素が、フェランドレン合成酵素である請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記環式モノテルペン合成酵素が、下記（ｂ−１）〜（ｂ−３）のいずれかである請求項４に記載の核酸。
（ｂ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記第一タンパク質が、環式セスキテルペン合成酵素である請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記環式セスキテルペン合成酵素が、下記（ｃ−１）〜（ｃ−３）のいずれかである請求項７に記載の核酸。
（ｃ−１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項９】
前記第一タンパク質が、環式ジテルペン合成酵素である請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
前記第一タンパク質が、原核生物由来のものである請求項１〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、原核生物由来のものである請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、アーキア由来のものである請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質の分子量が２万以下である請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、下記（ｄ−１）〜（ｄ−３）のいずれかである請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸。
（ｄ−１）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号８で表されるアミノ酸配列と相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、トリガーファクターに属するものである請求項１〜１０に記載の核酸。
【請求項１６】
前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が前記第一タンパク質のＮ末端側に連結されている請求項１〜１５のいずれかに記載の核酸。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、さらに分泌シグナル配列を有する請求項１〜１６のいずれかに記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸にコードされた融合タンパク質。
【請求項１９】
細菌である組換え細胞であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸を有し、かつ前記融合タンパク質を発現する組換え細胞。
【請求項２０】
細菌である組換え細胞であって、イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質をコードする第一核酸と、ＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有し、かつ前記イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質とを発現する組換え細胞。
【請求項２１】
前記第一タンパク質がイソプレン合成酵素であり、前記イソプレン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質を発現する請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
前記第一タンパク質が、環式モノテルペン合成酵素である請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
前記環式モノテルペン合成酵素が、フェランドレン合成酵素である請求項２２に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記第一タンパク質が、環式セスキテルペン合成酵素である請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記第一タンパク質が、環式ジテルペン合成酵素である請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
Ｃ１化合物を資化する能力を有する請求項１９〜２５のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２７】
メタノール又はメタンを資化する能力を有する請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項２８】
一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項２９】
嫌気性細菌である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項２９に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の組換え細胞に、二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させるイソプレン又は環式テルペンの生産方法。
【請求項３２】
前記ガスが、一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを含むものであり、前記組換え細胞に一酸化炭素及び二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させる請求項３１に記載のイソプレン又は環式テルペンの生産方法。
【請求項３３】
前記組換え細胞の細胞外に放出されたイソプレン又は環式テルペンを回収する請求項３１又は３２に記載のイソプレン又は環式テルペンの生産方法。
【請求項３４】
固相吸着法により前記イソプレン又は環式テルペンを回収する請求項３３に記載のイソプレン又は環式テルペンの生産方法。
【請求項３５】
溶媒吸収法により前記イソプレン又は環式テルペンを回収する請求項３３に記載のイソプレン又は環式テルペンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、融合タンパク質、組換え細胞、並びに、イソプレン又は環式テルペンの生産方法に関し、さらに詳細には、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素とＦＫＢＰファミリータンパク質との融合タンパク質をコードする核酸、当該融合タンパク質、当該核酸等を有する組換え細胞、並びに、当該組換え細胞を用いたイソプレン又は環式テルペンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは合成ポリイソプレンのモノマー原料であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。【０００３】
イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ、isoprene synthase；EC 4.2.3.27）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する作用を有する。【０００４】
組換え細胞（組換え体）を用いたイソプレンの生産方法が知られている。例えば、特許文献１，２に記載の発明では、イソプレン合成酵素をコードする核酸（遺伝子）が導入された組換え細胞を用いてイソプレンを生産する。詳細には、当該組換え細胞をメタノールや合成ガスを炭素源として培養し、該培養物からイソプレンを取得する。また、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術も知られている（例えば、特許文献３，４）。【０００５】
テルペンとは、イソプレン単位（Ｃ５）であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）がプレニルトランスフェラーゼの作用によって２分子以上連結した、炭素数が１０個以上の化合物の総称である。テルペンは、イソプレン単位の数に応じて、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）等に分類される。中でも環式モノテルペン、環式セスキテルペン、環式ジテルペンは、香水原料、化粧品原料、医薬品中間体、接着剤原料、高機能性樹脂原料として有用なものが多い。【０００６】
直鎖構造テルペンを基質として環式テルペンを生成させる酵素を、環式テルペン合成酵素と呼ぶ。環式テルペンは、環式テルペン合成酵素の作用によって直鎖構造テルペンが環状化することにより、合成される。例えば、環式モノテルペンは、ＩＰＰが二分子結合して例えばゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が生成し、その後、環式モノテルペン合成酵素の作用で環状構造をとることにより、合成される。環式セスキテルペンは、前駆体であるファルネシル二リン酸（Ｃ１５：ＦＰＰ）が環式セスキテルペン合成酵素の作用で環状化することにより、合成される。環式ジテルペンは、前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸（Ｃ２０：ＧＧＰＰ）が環式ジテルペン合成酵素の作用で環状化することにより、合成される。【０００７】
組換え細胞（組換え体）を用いた環式テルペンの生産方法としては、例えば、環式モノテルペンの一種であるβ−フェランドレンの生産方法が知られている（特許文献５）。この方法では、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸が導入された組換え細胞を用いて、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）をβ−フェランドレンに変換し、β−フェランドレンを生産している。β−フェランドレンは、β−フェランドレン共役ジエン構造を有するため、高分子化に有用な天然モノマーである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０６５２７１号
【特許文献２】国際公開第２０１４／１０４２０２号
【特許文献３】国際公開第２００９／０７６６７６号
【特許文献４】国際公開第２００９／１３２２２０号
【特許文献５】特開２０１４−７６０４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在使用可能なイソプレン合成酵素と環式テルペン合成酵素のほとんどは、植物由来のものである。そのため、特に細菌宿主内で発現させた場合、細胞質内では立体構造形成がうまくいかず、宿主プロテアーゼによる分解、もしくは不溶化が起こることが問題となっている（特許文献３，４）。そのため、イソプレンや環式テルペンの生産性を向上させるために、組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素や環式テルペン合成酵素の安定性を向上させるための方策が望まれている。【００１０】
そこで本発明は、組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素や環式テルペン合成酵素の安定性を向上させ、組換え細胞によるイソプレンや環式テルペンの生産性を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、分子シャペロンの一種であるＦＫＢＰファミリータンパク質を利用することにより、組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素や環式テルペン合成酵素の安定性を向上させることに成功した。そして、当該組換え細胞を用いることにより、イソプレンや環式テルペンの生産性を向上させることに成功し、本発明を完成した。【００１２】
本発明の１つの様相は、イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質をコードする核酸である。【００１３】
本様相の核酸は、イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードするものである。当該融合タンパク質では、同一分子内で隣接するＦＫＢＰファミリータンパク質の作用によりイソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素が安定化されるので、イソプレン合成酵素活性や環式テルペン合成酵素活性がより安定的に発揮される。そのため、例えば、本様相の核酸を導入した組換え体で当該融合タンパク質を発現させた場合に、当該融合タンパク質は単独のイソプレン合成酵素や環式テルペン合成酵素と比較して、宿主プロテアーゼによる分解や不溶化が生じにくい。【００１４】
好ましくは、前記第一タンパク質が、イソプレン合成酵素である。【００１５】
本様相の核酸は、イソプレン合成酵素とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質をコードするものである。当該融合タンパク質では、同一分子内で隣接するＦＫＢＰファミリータンパク質の作用によりイソプレン合成酵素が安定化されるので、イソプレン合成酵素活性がより安定的に発揮される。そのため、例えば、本様相の核酸を導入した組換え体で当該融合タンパク質を発現させた場合に、当該融合タンパク質は単独のイソプレン合成酵素と比較して、宿主プロテアーゼによる分解や不溶化が生じにくい。【００１６】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素が、下記（ａ−１）〜（ａ−３）のいずれかである。
（ａ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。【００１７】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式モノテルペン合成酵素である。【００１８】
好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素が、フェランドレン合成酵素である。【００１９】
好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素が、下記（ｂ−１）〜（ｂ−３）のいずれかである。
（ｂ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。【００２０】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式セスキテルペン合成酵素である。【００２１】
好ましくは、前記環式セスキテルペン合成酵素が、下記（ｃ−１）〜（ｃ−３）のいずれかである。
（ｃ−１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質。【００２２】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式ジテルペン合成酵素である。【００２３】
好ましくは、前記第一タンパク質が、原核生物由来のものである。【００２４】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、原核生物由来のものである。【００２５】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、アーキア由来のものである。【００２６】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質の分子量が２万以下である。【００２７】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、下記（ｄ−１）〜（ｄ−３）のいずれかである。
（ｄ−１）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号８で表されるアミノ酸配列と相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質。【００２８】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が、トリガーファクターに属するものである。【００２９】
好ましくは、前記ＦＫＢＰファミリータンパク質が前記第一タンパク質のＮ末端側に連結されている。【００３０】
好ましくは、前記融合タンパク質が、さらに分泌シグナル配列を有する。【００３１】
本発明の１つの様相は、上記の核酸にコードされた融合タンパク質である。【００３２】
本発明の１つの様相は、細菌である組換え細胞であって、上記の核酸を有し、かつ前記融合タンパク質を発現する組換え細胞である。【００３３】
本様相の組換え細胞は、細菌である組換え細胞であって、かつ前記融合タンパク質を発現するものである。本様相の組換え細胞によれば、前記融合タンパク質によってイソプレン合成酵素活性又は環式テルペン合成酵素活性が発揮されるので、より安定化されたイソプレン合成酵素活性又は環式テルペン合成酵素活性が得られる。【００３４】
本発明の１つの様相は、細菌である組換え細胞であって、イソプレン合成酵素及び環式テルペン合成酵素からなる群より選択された第一タンパク質をコードする第一核酸と、ＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有し、かつ前記イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質とを発現する組換え細胞である。【００３５】
本様相の組換え細胞は、細菌である組換え細胞であって、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素をコードする第一核酸とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有している。本様相の組換え細胞によれば、共存するＦＫＢＰファミリータンパク質によってイソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素が安定化されるので、より安定化されたイソプレン合成酵素活性又は環式テルペン合成酵素活性が得られる。【００３６】
好ましくは、前記第一タンパク質がイソプレン合成酵素であり、前記イソプレン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質を発現する。【００３７】
本様相の組換え細胞は、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有している。本様相の組換え細胞によれば、共存するＦＫＢＰファミリータンパク質によってイソプレン合成酵素が安定化されるので、より安定化されたイソプレン合成酵素活性が得られる。【００３８】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式モノテルペン合成酵素である。【００３９】
好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素が、フェランドレン合成酵素である。【００４０】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式セスキテルペン合成酵素である。【００４１】
好ましくは、前記第一タンパク質が、環式ジテルペン合成酵素である。【００４２】
好ましくは、前記組換え細胞がＣ１化合物を資化する能力を有する。【００４３】
好ましくは、前記組換え細胞がメタノール又はメタンを資化する能力を有する。【００４４】
好ましくは、前記組換え細胞が一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する。【００４５】
好ましくは、前記組換え細胞が嫌気性細菌である。【００４６】
好ましくは、前記組換え細胞がClostridium属細菌又はMoorella属細菌である。【００４７】
本発明の１つの様相は、上記の組換え細胞に、二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させるイソプレン又は環式テルペンの生産方法である。【００４８】
本様相はイソプレン又は環式テルペンの生産方法に係るものであり、上記の組換え細胞に、二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させる。本様相によれば、組換え細胞内で発現するイソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素がＦＫＢＰファミリータンパク質によって安定化されるので、高効率でイソプレン又は環式テルペンを生産することができる。【００４９】
好ましくは、前記ガスが、一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを含むものであり、前記組換え細胞に一酸化炭素及び二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させる。【００５０】
本様相もイソプレン又は環式テルペンの生産方法に係るものであり、上記の組換え細胞に、一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に一酸化炭素及び二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させる。本様相によっても、組換え細胞内で発現するイソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素がＦＫＢＰファミリータンパク質によって安定化されるので、高効率でイソプレン又は環式テルペンを生産することができる。【００５１】
好ましくは、前記組換え細胞の細胞外に放出されたイソプレン又は環式テルペンを回収する。【００５２】
好ましくは、固相吸着法により前記イソプレン又は環式テルペンを回収する。【００５３】
好ましくは、溶媒吸収法により前記イソプレン又は環式テルペンを回収する。
【発明の効果】
【００５４】
本発明によれば、組換え細胞によるイソプレン又は環式テルペンの生産において、生産量を顕著に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を表す説明図である。
【図２】ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
【図３】pSKCLベクターの構成を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明の核酸（遺伝子）は、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードするものである。換言すれば、本発明の核酸は、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素をコードする遺伝子とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子（キメラ遺伝子）である。
【００５７】
ＦＫＢＰファミリータンパク質は、ＦＫ５０６結合タンパク質（FK506 binding protein；ＦＫＢＰ）のことであり、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）（以下、ＰＰＩａｓｅと称する）活性と分子シャペロン活性とを有する。ＦＫＢＰファミリータンパク質（ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ）の構造や分類については、例えば、国際公開第２００４／００１０４１号、国際公開第２００５／０６３９６４号、等に記載されている。
以下、ＦＫＢＰファミリータンパク質を単にＦＫＢＰと略記することがある。
【００５８】
ＰＰＩａｓｅ活性とは、タンパク質中のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性を指す。分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性を指す。
【００５９】
ＦＫＢＰファミリータンパク質は、ＰＰＩａｓｅ活性に基づくポリペプチドの折り畳み速度を促進する作用を有するとともに、分子シャペロン活性に基づく疎水的ペプチド領域との相互作用による不溶化抑制作用を有する。ＦＫＢＰファミリータンパク質との疎水的ペプチド配列の相互作用によって、新生ポリぺプチドはプロテアーゼによる分解から逃れることも可能となる。
【００６０】
本発明で用いるＦＫＢＰファミリータンパク質の由来としては特に限定はないが、例えば原核生物由来のものや、アーキア（古細菌）由来のものを用いることができる。
【００６１】
一般にＦＫＢＰファミリータンパク質は、その分子量の違いにより、分子量が２万以下、具体的には１．６万〜１．８万程度のショートタイプと、分子量が２．６万〜３．３万程度のロングタイプとに大別される。本発明ではショートタイプとロングタイプのいずれを用いてもよいが、分子シャペロン活性がより高いとされるショートタイプを用いることが好ましい。すなわち本発明では、分子量が２万以下のＦＫＢＰファミリータンパク質を用いることが好ましい。
【００６２】
また、主にアーキア以外の由来のＦＫＢＰファミリータンパク質の分類として、トリガーファクタータイプ（Huang, Protein Sci. 9, 1254-, 2000）、ＦｋｐＡタイプ(Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2001年)、ＦＫＢＰ５２タイプ（Bose, Science 274, 1715-, 1996）等がある。本発明ではいずれのタイプを用いてもよく、例えばトリガーファクタータイプのＦＫＢＰファミリータンパク質を用いることができる。トリガーファクタータイプのＦＫＢＰファミリータンパク質は、ほとんど全てのバクテリアのゲノム上で見つかっている。
【００６３】
アーキア由来のＦＫＢＰファミリータンパク質について詳しく研究されている（国際公開第２００４／００１０４１号、国際公開第２００５／０６３９６４号等）。アーキア由来のショートタイプＦＫＢＰファミリータンパク質としては、Methanococcus thermolithotrophicus由来、Thermococcus sp. KS-1由来、Methanococcus jannaschii由来、等のものが挙げられる（Maruyama, Front．Biosci. 5, 821-, 2000)。
アーキア由来のロングタイプＦＫＢＰファミリータンパク質としては、Pyrococcus horikoshii由来、Aeropyrum pernix由来、Sulfolobus solfataricus由来、Methanococcus jannaschii由来、Archaeoglobus fulgidus由来、Methanobacterium autotrophicum由来、Thermoplasma acidophilum由来、Halobacterium cutirubrum由来、等のものが挙げられる（Maruyama, Front．Biosci. 5, 821-, 2000)。
【００６４】
一例として、配列番号７にThermococcus sp. KS-1由来ショートタイプＦＫＢＰファミリータンパク質（ＴｃＦＫＢＰ１８）をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号８にアミノ酸配列のみを示す。
【００６５】
本発明で用いるＦＫＢＰファミリータンパク質は、天然で見いだされ且つ単離されたＦＫＢＰファミリータンパク質の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のＦＫＢＰファミリータンパク質の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質であってもよい。ＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性とは、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性である。
【００６６】
前記したように、ＰＰＩａｓｅ活性とは、タンパク質中のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性を指す。ＰＰＩａｓｅ活性の評価は、例えば、キモトリプシンカップリング法(J. Bacteriol. 1998, 180(2):388-394）により行なうことができる。
【００６７】
前記したように、分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994）等が挙げられる。
【００６８】
例えば、本発明で用いるＦＫＢＰファミリータンパク質には、少なくとも、下記（ｄ−１）〜（ｄ−３）のタンパク質が含まれる。
（ｄ−１）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号８で表されるアミノ酸配列と相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＦＫＢＰファミリータンパク質としての活性を有するタンパク質。
なお（ｄ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００６９】
アミノ酸配列の相同性については、例えば、ＣｕｌｕｓｔａｌＷ等の市販の多重整列プログラムを用いて計算することができる。
【００７０】
次に、イソプレン合成酵素について説明する。
前記したように、イソプレン合成酵素（EC 4.2.3.27）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する作用を有する。なお、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの間の構造変換は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが触媒する。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼは全ての生物に存在する。
以下、イソプレン合成酵素をＩｓｐＳと略記することがある。
【００７１】
本発明で用いるイソプレン合成酵素としては特に限定はなく、例えば、植物等の真核生物由来のものを用いることができる。植物由来のイソプレン合成酵素としては、ポプラ（Populus nigra）、ムクナ、クズ由来のものが一般的であるが、その他、Salix属、Robinia属、Wisteria属、Triticum属、Morus属、などの由来のものがあり、全て本発明に適用可能である。
【００７２】
配列番号１にポプラ由来イソプレン合成酵素（GenBank Accession No.: AM410988.1）をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。
【００７３】
植物以外の由来のイソプレン合成酵素としては、原核生物由来のものが挙げられる。例えば、Bacillus subtilis由来のイソプレン合成酵素（Sivy TL. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu. 2002, 294(1), 71-5）が挙げられる。
【００７４】
本発明で用いるイソプレン合成酵素についても、天然で見いだされ且つ単離されたイソプレン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のイソプレン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００７５】
例えば、本発明で用いるイソプレン合成酵素には、少なくとも、下記（ａ−１）〜（ａ−３）のタンパク質が含まれる。
（ａ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ａ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００７６】
次に、環式テルペン合成酵素について説明する。
前記したように、環式テルペン合成酵素は、直鎖構造テルペンを基質として環式テルペンを生成させる酵素である。環式テルペン合成酵素の例としては、環式モノテルペン合成酵素、環式セスキテルペン合成酵素、環式ジテルペン合成酵素、等が挙げられる。
【００７７】
環式モノテルペン合成酵素は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を環状化して環式モノテルペンに変換する作用を有する。
【００７８】
環式モノテルペン合成酵素の具体例として、フェランドレン合成酵素が挙げられる。例えば、フェランドレン合成酵素の一種であるβ−フェランドレン合成酵素は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）をβ−フェランドレンに変換する活性を有する（特許文献５）。
【００７９】
β−フェランドレン合成酵素及びそれをコードする核酸の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797957; Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来のもの（GenBank Accession No.： HQ404305; Demissie, Z. A., et al., Planta, 2011,. 233, 685-96）、等が挙げられる。
【００８０】
配列番号３に上記ラベンダー由来のβ−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡは、β−フェランドレン合成酵素（環式モノテルペン合成酵素）をコードする核酸の一例となる。
【００８１】
環式セスキテルペン合成酵素は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を環状化して環式セスキテルペンに変換する作用を有する。環式セスキテルペン合成酵素の例として、トリコジエン合成酵素（Trichodiene synthase）が挙げられる。
【００８２】
配列番号５にFusarium poae由来のトリコジエン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号６にアミノ酸配列のみを示す。配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡは、トリコジエン合成酵素（環式セスキテルペン合成酵素）をコードする核酸の一例となる。
【００８３】
環式ジテルペン合成酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を環状化して環式ジテルペンに変換する作用を有する。
【００８４】
本発明で用いる環式テルペン合成酵素についても、天然で見いだされ且つ単離された環式テルペン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存の環式テルペン酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つ環式テルペン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００８５】
例えば、本発明で用いる環式モノテルペン合成酵素には、少なくとも、下記（ｂ−１）〜（ｂ−３）のいずれかのタンパク質が含まれる。
（ｂ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｂ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００８６】
例えば、本発明で用いる環式セスキテルペン合成酵素には、少なくとも、下記（ｃ−１）〜（ｃ−３）のいずれかのタンパク質が含まれる。
（ｃ−１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつトリコジエン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｃ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００８７】
本発明の核酸がコードする融合タンパク質において、第一タンパク質（イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素）とＦＫＢＰファミリータンパク質との連結方向について特に限定はない。すなわち、第一タンパク質のＮ末端側にＦＫＢＰファミリータンパク質が連結されていてもよいし、第一タンパク質のＣ末端側にＦＫＢＰファミリータンパク質が連結されていてもよい。また、第一タンパク質とＦＫＢＰファミリータンパク質とは、直接連結されていてもよいし、ペプチドリンカー等を介して連結されていてもよい。ペプチドリンカーとしては、例えば、１０〜５０個程度の構造的にフレキシブルなアミノ酸配列で構成されているペプチドリンカー、例えば、グリシン４個及びセリン１個からなるアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチドリンカーが使用可能である。
【００８８】
前記融合タンパク質は、さらに分泌シグナルを有するものでもよい。分泌シグナルを付与することにより、宿主細胞内で発現させた場合に、分泌発現が可能となる。
【００８９】
本発明は、上記核酸にコードされた融合タンパク質、すなわち、第一タンパク質（イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素）とＦＫＢＰファミリータンパク質とが連結された融合タンパク質を包含する。
【００９０】
本発明は、細菌である組換え細胞であって、上記融合タンパク質をコードする核酸を有し、かつ当該融合タンパク質を発現する組換え細胞を包含する。
また本発明は、細菌である組換え細胞であって、第一タンパク質（イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素）をコードする第一核酸とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有し、かつ前記イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質とを発現する組換え細胞を包含する。
さらに本発明は、細菌である組換え細胞であって、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸とＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする第二核酸とを有し、かつ前記イソプレン合成酵素と前記ＦＫＢＰファミリータンパク質を発現する組換え細胞を包含する。
いずれの組換え細胞においても、隣接または共存するＦＫＢＰファミリータンパク質の存在によって、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素が安定化される。
【００９１】
本発明の組換え細胞は、例えば、細菌である宿主細胞に上記核酸を導入することにより得ることができる。
【００９２】
一般に、細菌等の原核生物は非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）によるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成能を有している。また前記したように、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼは全ての生物に存在する。したがって本発明の組換え細胞は、ＩＰＰから変換されたＤＭＡＰＰを、イソプレンに変換することができる。すなわち本発明の組換え細胞は、イソプレンを生産することができる。
さらに本発明の組換え細胞は、ＩＰＰを前駆体とするゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）等を、環式テルペンに変換することができる。すなわち、本発明の組換え細胞は、環式テルペンを生産することができる。
【００９３】
前記宿主細胞としては、細菌であれば特に限定はない。例えば、大腸菌や枯草菌のような、外来遺伝子を発現させるための宿主として一般的に用いられている細菌が、本発明でも適用できる。
【００９４】
１つの実施形態として、Ｃ１化合物を資化する能力を有する細菌を、宿主細胞として用いることができる。例えば、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアミド等を資化する能力を有する細菌を、宿主細胞として用いることができる。これにより、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアミド等のＣ１化合物を資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。
【００９５】
１つの実施形態として、一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する細菌を宿主細胞に用いることができる。これにより、一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。前記宿主細胞は具体的には嫌気性原核細胞であり、特に、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する嫌気性原核細胞である。また、一酸化炭素脱水素酵素（Carbon monoxide dehydrogenase；EC 1.2.99.2）をさらに有する嫌気性原核細胞が好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する嫌気性原核細胞が好ましい。このような嫌気性原核細胞の例としては、図１に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性原核細胞が挙げられる。
このような嫌気性原核細胞を宿主細胞として用いることにより、一酸化炭素や二酸化炭素のようなガスを炭素源として、組換え細胞にイソプレンや環式テルペンを生産させることが可能となる。
【００９６】
当該嫌気性原核細胞の具体例としては、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)、等のClostridium属細菌又はMoorella属細菌が挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明の組換え細胞における宿主細胞として好適である。なお、上記５種のClostridium属細菌又はMoorella属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
【００９７】
その他、Carboxydocella sporoducens sp. Nov.、Rhodopseudomonas gelatinosa、Eubacterium limosum，Butyribacterium methylotrophicum、等の原核細胞を宿主細胞として用いることができる。
【００９８】
なお、組換え細胞によって合成ガスからイソプレンを生産させる技術の基本構成については、上記特許文献１に記載されている。
【００９９】
１つの実施形態として、メチロトローフの一種であるメタノール資化性細菌を宿主細胞に用いることができる。これにより、メタノールを資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。
【０１００】
メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。メサノトローフは、メタンをメタンモノオキシダーゼの作用によってメタノールに変換し、メチルトローフと同一代謝でメタノールを異化することができる。
【０１０１】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、図２に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。本発明で用いることができるメタノール資化性細菌は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。
【０１０２】
メチロトローフは、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能と、ホルムアルデヒド固定化能を備えている。
【０１０３】
当該メタノール資化性細菌の例としては、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属するメチロトローフが挙げられる。
【０１０４】
なお、メチロトローフ以外の細菌であっても、メチロトローフの特徴である「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を付与することにより、メタノール資化性細菌と同様に扱うことができる。
【０１０５】
メチロトローフである組換え細胞によってメタノールやメタンからイソプレンを生産させる技術の基本構成については、上記特許文献２に記載されている。
【０１０６】
宿主細胞（細菌）に遺伝子を導入する方法については、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよく、例えば、自己複製プラスミド（ベクター）で目的遺伝子を導入する方法や、ゲノム導入法が採用可能である。
【０１０７】
例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能な自己複製プラスミド（ベクター）を用いることができる。当該ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【０１０８】
また、ベクターを用いて複数種の核酸を宿主細胞に導入する場合には、各核酸を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに、１つのベクターに複数種の核酸を組み込む場合には、各核酸を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の核酸を導入する例としては、ＦＫＢＰファミリータンパク質をコードする核酸と、イソプレン合成酵素又は環式テルペン合成酵素をコードする核酸とを導入する実施形態（共発現）が挙げられる。
【０１０９】
宿主が大腸菌である場合に使用可能な自己複製ベクターとしては、市販のpET（Novagen社）、pBAD（Life technologies社）、pGEM（Promega社）等が挙げられる。宿主がメタノール資化性細菌の場合には、pAYC32（Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167）、pRP301（Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34）、pBBR1、pBHR1（Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799）、pCM80（Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等のベクターが挙げられる。宿主がClostridium属細菌である場合には、pJIR（Brandshaw M., et al., Plasmid 40 (3), 233-237）、pIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）、pMTL（Ng, YK. Et al., PLoS One 2013, 8 (2), e56051）、pMVTcatMCS47（Berzin, V. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 167, 338-347）等のベクターが挙げられる。これらの自己複製ベクターは、電気穿孔法、接合法、化学的処理法等によって宿主細胞内へ導入することができる。
【０１１０】
一方、ゲノム導入法は、相同組換え、トランスポゾン法（Martinerz-Garcia E. et al., BMC Microbiol. 11:38）、インテグラーゼ法（Miyazaki, R. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2014, 79 (14), 4440-4447）、Cre/loxP法（Bertram, R. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2009, 17 (3), 136-145）、Flp/FRT法（Al-Hinai, MA. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (22), 8112-8121）等の手法を使って行うことができる。
【０１１１】
イソプレンや環式テルペンの生産能を向上させる観点から、組換え細胞には他の核酸が導入されてもよい。例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成経路であるメバロン酸経路経路（ＭＶＡ経路）や非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）で作用する酵素（群）をコードする核酸を導入することができる。これにより、ＤＭＡＰＰの供給源であるＩＰＰの合成能が強化され、結果的にイソプレンや環式テルペンの合成能が強化される。
【０１１２】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、組換え細胞が増殖可能な培地を用いて培養することができる。例えば宿主が大腸菌や枯草菌のような従属栄養微生物の場合は、グルコース、サッカロース等の炭素源が使用可能である。宿主がメタノール資化性細菌の場合は、メタノールを０．１〜５．０％（ｖ／ｖ）含有する培地を用いることが好ましい。宿主が合成ガス資化性菌の場合は、炭素源、エネルギー源として以下の組成のものが利用可能である。
・ＣＯ
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
【０１１３】
また、宿主がメタノール資化性菌や合成ガス資化性菌であっても、グルコースやサッカロース等の糖質炭素源を必要に応じて添加して培養しても良い。また、バッチ式、流加式、連続式等いかなる培養方法も適用可能である。また流加式、連続式培養では、さらに培養液の半透膜循環によって細胞密度を高めて培養することが可能となる。
【０１１４】
本発明は、上記の組換え細胞に二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させるイソプレン又は環式テルペンの生産方法を包含する。さらに本発明は、上記の組換え細胞に一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを含むガスを接触させ、当該組換え細胞に一酸化炭素及び二酸化炭素からイソプレン又は環式テルペンを生産させるイソプレン又は環式テルペンの生産方法を包含する。
【０１１５】
例えば、上記したメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する嫌気性原核細胞を宿主細胞とした組換え細胞に、上記ガスを接触させて、上記ガスからイソプレン又は環式テルペンを生産することができる。
１つの例としては、上記ガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養し、該培養物からイソプレン又は環式テルペンを単離することができる。
その他、細胞増殖の有無にかかわらず、組換え細胞に上記ガスを接触させることにより、イソプレン又は環式テルペンを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に上記ガスを連続的に供給し、イソプレン又は環式テルペンを連続的に生産させることができる。
【０１１６】
組換え細胞により生産されたイソプレン又は環式テルペンは、例えば細胞外の気相から回収することができる。回収方法としては、例えば、固相吸着法や溶媒吸収法を採用することができる。
【０１１７】
なお、本発明の組換え細胞について、イソプレンや環式テルペンの生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的や、融合タンパク質自体を取得する目的で培養する場合には、上記ガスを炭素源として用いる必要はない。例えば、上記したような糖類やグリセリンといった他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
【０１１８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１９】
〔実施例１〕
大腸菌ＢＬ２１株（Lon-, OmpT-）におけるＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質の発現とイソプレン生産【０１２０】
配列番号９で表される人工合成遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。この人工合成遺伝子は、Thermococcus由来ＦＫＢＰとポプラ（Populus nigra）由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）との融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに、放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Isopentenyl diphosphate isomerase；ＩＤＩ）をコードする遺伝子を含んでいる。またＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質のＣ末端に６個のヒスチジンから成るタグ配列が設けられるよう設計されている。この人工合成遺伝子をpET-3aベクターのNdeI及びBamHI切断部位へ導入し、発現ベクターpTFKISを構築した。pTFKISを大腸菌ＢＬ２１株（Lon-, OmpT-）へ導入し、組換え体を取得した。【０１２１】
この組換え体を、アンピシリンを１００μｇ／ｍＬ濃度で含有する２×ＹＴ培地にて３０℃で培養した。培養開始から１６時間後に、５ｍＬの培養液をセプタムキャップで密閉されたTORAST HS 20ml vial（島津製作所社）中に移し、0.1mM IPTGを添加し、さらに培養を３０℃で２０時間継続した。培養終了後、GCMS QP2010 ultra（島津製作所社）によるヘッドスペースサンプリング測定を行った。ＧＣカラムは、ZB-624（phenomenex社：膜厚 1.40μm / 長さ30.0m / 内径 0.25mm）を用いた。乾燥菌体重量（ｇ）あたりのイソプレン生成量を算出した。培養は計３回行い、平均値を採用した（Ｎ＝３）。【０１２２】
一方、培養終了後菌体を回収し、超音波によって得た菌体破砕液を遠心分離によって上清（可溶性画分）と沈殿画分に分離した。これら両画分を電気泳動に供し、抗６ヒスタグ抗体（ＧＥヘルスケア社）によるウエスタンブロッティングによって、ＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質の発現を確認した。発現量の評価は、抗体染色による発色強度を０−５の６段階で評価することにより行った。【０１２３】
対照として、pET3aベクターのみが導入された大腸菌ＢＬ２１株（Lon-, OmpT-）についても同様の実験を行った。【０１２４】
〔比較例１〕
ＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質に代えて、ＩｓｐＳを単独で用い、実施例１と同様の実験を行った。
配列番号１０で表される人工合成遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。この人工合成遺伝子は、ポプラ由来ＩｓｐＳをコードする遺伝子、並びに、放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードする遺伝子を含んでいるが、ＦＫＢＰ遺伝子を含んでいない。またＩｓｐＳのＣ末端に６個のヒスチジンから成るタグ配列が設けられるよう設計されている。この人工合成遺伝子をpET-3aベクターのNdeI及びBamHI切断部位へ導入し、発現ベクターpTISを構築した。pTFKISを大腸菌ＢＬ２１株（Lon-, OmpT-）へ導入し、組換え体を取得した。【０１２５】
実施例１と同様にして、組換え体の培養を行った。さらに、実施例１と同様にして、ヘッドスペースサンプリング測定を行った。さらに、ウエスタンブロッティングによってＩｓｐＳの発現を確認した。【０１２６】
結果を表１に示す。すなわち、ＦＫＢＰとＩｓｐＳとの融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体（実施例１）のイソプレン生成量は５４．５ｍｇ／ｇ乾燥菌体であり、非融合体のＩｓｐＳ遺伝子が導入された大腸菌組換え体（比較例１）のイソプレン生産量（７．４ｍｇ／ｇ乾燥菌体）より顕著に高かった。
またＩｓｐＳの発現（ウエスタンブロッティング発色強度）について、実施例１の組換え体では可溶性画分において十分な量のＩｓｐＳが認められ、沈殿画分に検出されたＩｓｐＳは僅かであった。このことから、ＩｓｐＳは、ＦＫＢＰとの融合により可溶性画分での正常な立体構造を保持した活性型ＩｓｐＳの発現量が増加し、これによりイソプレンの生産量が増加したと考えられた。一方、比較例１の組換え体ではＩｓｐＳが主に沈殿画分に検出され、可溶性画分には少ししか検出されなかった。【０１２７】
以上より、ＦＫＢＰとＩｓｐＳとの融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体を用いることによって、イソプレンの生産量を顕著に向上させることができた。【０１２８】
【表１】
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【０１２９】
〔実施例２〕
合成ガス資化性菌Clostridium ljungdahliiにおけるＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質の発現とイソプレン生産【０１３０】
配列番号１１で表される人工合成遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。この人工合成遺伝子は、実施例１と同様に、Thermococcus由来ＦＫＢＰとポプラ由来ＩｓｐＳとの融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに、放線菌由来ＩＤＩをコードする遺伝子を含んでおり、さらに、C. ljungdahlii由来のpta（Phosphotransacetylase）プロモーターによってこれらの遺伝子の発現が誘導されるよう設計されている。また、ＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質のＣ末端に６個のヒスチジンから成るタグ配列が設けられるよう設計されている。この人工合成遺伝子を、pSKCLベクター（図３、配列番号１３）のTspMI及びBspEI切断部位へ導入し、発現ベクターpSCLFKISを構築した。pSCLFKISをC. ljungdahlii (DSM13528)株へ導入し、組換え体を取得した。【０１３１】
この組換え体を、セプタムキャップで密閉されたTORAST HS 20ml vial（島津製作所社）中で、クロラムフェニコールを３０μg／ｍＬ濃度で含有するPETC 1754培地（ATCC: American Type Culture Collection）５ｍＬにて３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００値が１．０を超えた時点で、実施例１と同様の方法にて気相中のイソプレン量を測定した。培養は計３回行い、平均値を採用した（Ｎ＝３）。
また、培養終了後に菌体を回収し、フレンチプレスによって得た菌体破砕液を遠心分離によって上清（可溶性画分）と沈殿画分に分離した。両画分について、実施例１と同様の方法でウエスタンブロッティングによるＩｓｐＳの発現を確認した。【０１３２】
対照として、pSKCLベクターのみが導入されたC. ljungdahliiについても同様の実験を行った。【０１３３】
〔比較例２〕
ＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質に代えて、ＩｓｐＳを単独で用い、実施例２と同様の実験を行った。
配列番号１２で表される人工合成遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。この人工合成遺伝子は、Populus nigra由来ＩｓｐＳをコードする遺伝子、並びに、放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードする遺伝子を含んでいるが、ＦＫＢＰ遺伝子を含んでいない。また、C. ljungdahlii由来のptaプロモーターによってこれらの遺伝子の発現が誘導されるよう設計されている。また、ＦＫＢＰ−ＩｓｐＳ融合タンパク質のＣ末端に６個のヒスチジンから成るタグ配列が設けられるよう設計されている。この人工合成遺伝子を、pSKCLベクター（図３）のTspMI及びBspEI切断部位へ導入し、発現ベクターpSCLISを構築した。pSCLISをC. ljungdahlii (DSM13528)株へ導入し、組換え体を取得した。【０１３４】
実施例２と同様にして、組換え体の培養を行った。さらに、実施例２と同様にして、ヘッドスペースサンプリング測定を行った。さらに、ウエスタンブロッティングによってＩｓｐＳの発現を確認した。【０１３５】
結果を表２に示す。すなわち、ＦＫＢＰとＩｓｐＳとの融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されたC. ljungdahlii組換え体（実施例２）のイソプレン生成量は２９６３μｇ／ｇ乾燥菌体であり、非融合体のＩｓｐＳ遺伝子が導入されたC. ljungdahlii組換え体（比較例２）のイソプレン生成量（０．５０μｇ／ｇ乾燥菌体）より顕著に高かった。
またＩｓｐＳの発現（ウエスタンブロッティング発色強度）について、実施例２の組換え体では可溶性画分において十分な量のＩｓｐＳが認められ、沈殿画分に検出されたＩｓｐＳは僅かであった。これに対し、比較例２の組換え体ではＩｓｐＳがほとんど検出されず、沈殿画分に僅かに認められたのみであった。これは、C. ljungdahliiでは非融合のＩｓｐＳが正常な立体構造をとれず、プロテアーゼにより殆ど分解されてしまうためと考えられた。
以上より、ＦＫＢＰとＩｓｐＳとの融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されたC. ljungdahlii組換え体を用いることによって、イソプレンの生産量を顕著に向上させることができた。【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
〔実施例３〕
メチロトローフMethylobacterium extorquensにおけるＦＫＢＰ−β−フェランドレン融合タンパク質の発現とβ−フェランドレン生産【０１３８】
本実施例では、環式モノテルペンの一種であるβ−フェランドレンを生産するMethylobacterium extorquensの組換え体を作製した。なお、M. extorquensは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からβ−フェランドレン合成酵素の基質となるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を合成する酵素を保有している。そのため、本菌株にβ−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入し、当該遺伝子が発現することで、メタノールからのβ−フェランドレン合成が可能になると考えられた。【０１３９】
配列番号１４で表される人工合成遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。この人工合成遺伝子は、Thermococcus由来ＦＫＢＰとラベンダー由来のβ−フェランドレン合成酵素（bPHS）との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、実施例２で使用されたptaプロモーターによって遺伝子の発現が誘導されように設計されている。この人工合成遺伝子を、配列番号１５の広宿主域ベクターであるｐＣＭ８０(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＦｋＰＨＳを作製した。発現ベクターｐＣＭ８０ＦｋＰＨＳをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＦｋＰＨＳ株を得た。【０１４０】
ＭＥ−ＦｋＰＨＳ株を、メタノールを唯一の炭素源とする合成培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、及びテトラサイクリン１０ｍｇを含む。）２０ｍＬにて、好気的に３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収された菌体の一部をセプタムキャップで密閉されたTORAST HS 20ml vial（島津製作所社）中で、テトラサイクリンを２０μg／ｍＬ濃度で含有する上記合成培地５ｍＬにて３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００値が１．０を超えた時点で、実施例１と同様の方法にて気相中のβ−フェランドレン量を測定した。培養は計３回行い、平均値を採用した（Ｎ＝３）。
対照として、pＣＭ８０ベクターのみが導入されたM. extorquensについても同様の実験を行った。【０１４１】
その結果、ｐＣＭ８０が導入されたM. extorquensは、β−フェランドレンを全く生産していなかったが、ＭＥ−ＦｋＰＨＳ株は７．３ｍｇ／ｇ乾燥菌体のβ−フェランドレンを生産していた。【０１４２】
〔比較例３〕
ＦＫＢＰ−ｂＰＨＳ融合タンパク質に代えて、ｂＰＨＳを単独で用い、実施例３と同様の実験を行った。
配列番号１６で表される人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は、ラベンダー由来のβ−フェランドレン合成酵素（ｂＰＨＳ）のみをコードする遺伝子を含んでおり、実施例３で使用されたptaプロモーターによって遺伝子の発現が誘導されるように設計されている。この人工合成遺伝子を、実施例３で使用したｐＣＭ８０のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＰＨＳを作製した。発現ベクターｐＣＭ８０ＰＨＳをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＰＨＳ株を得た。実施例３と同様にして本組換え体の培養を行った。【０１４３】
その結果、ＭＥ−ＰＨＳ株によるβ−フェランドレンの生産量は0.4mg/g乾燥菌体であった。以上の結果より、メチロトローフにおいてもＦＫＢＰとｂＰＨＳを融合させることによって、β−フェランドレンの生産量を顕著に上昇させることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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