(57)【要約】本発明の実施形態は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド酵素変異体）、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンド酵素変異体であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有するエンド酵素変異体の存在下、下記一般式（１）で表される糖鎖供与体（Ｘ１〜Ｘ６：糖質由来の基、Ｈ；Ｚ１：Ｈ、ＧｌｃＮＡｃ）と、糖鎖受容体と、を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する製造方法を提供する。2016076440.tif 000019
2016076440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン、又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、
下記一般式（１）で表される糖鎖供与体と、
糖鎖受容体と、
を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【化１】
2016076440.tif 000018
（一般式（１）中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立の糖質由来の基又は水素原子を表し、Ｘ１およびＸ2の少なくとも一方は、１つ以上のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡを含み、Ｘ１およびＸ2に含まれるＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡは、α１−３でＭａｎに結合したＭａｎ又はα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２で結合している。Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表す。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１に含まれるＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ１は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、ＧｌｃＮＡｃＡはＧｌｃＮＡｃの６位のヒドロキシメチル基がカルボキシル基である糖残基を示す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。）
【請求項２】
前記糖鎖受容体が下記一般式（２）で表される請求項１に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２    一般式（２）
（一般式（２）中、Ｒ２はアスパラギン残基を含むペプチド又は蛋白質を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。）
【請求項３】
前記糖鎖受容体が、定常領域にＮ−アセチルグルコサミニル基が結合したＩｇＧポリペプチドである請求項１又は請求項２に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【請求項４】
前記一般式（１）中、Ｘ１、Ｘ2、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６の少なくとも一つは糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基と、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基から選ばれるいずれか一つの基とが、リンカーを介して結合した構造を有する基である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【請求項５】
前記一般式（１）中、Ｚ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６が水素原子であり、Ｘ１がα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２でＧｌｃＮＡｃＡが結合している糖質由来の基であり、Ｘ２がα１−３でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２でＧｌｃＮＡｃＡが結合している糖質由来の基である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【請求項６】
前記反応を、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数）５以上で行うことで免疫グロブリンＧを製造する請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【請求項７】
前記モル比率は１〜４である請求項６に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を含む製剤中のペプチドや蛋白質の多くは、糖鎖を有する化合物（以下、糖ペプチド又は糖蛋白質という）である。糖蛋白質が有する糖鎖には、Ｎ−結合型糖鎖やＯ−結合型糖鎖が知られているが、中でもＮ−結合型糖鎖は蛋白質の機能や構造の維持に重要な影響を及ぼすことが知られており、その中でもヒト型糖鎖と呼ばれる複合型糖鎖が重要である場合が多い。
このような背景から、糖蛋白質の大量調製が求められるようになり、遺伝子工学的な方法により作製した細胞を培養する方法での調製が行われるようになった。しかし、このような手法で得られた糖蛋白質のＮ−結合型糖鎖は、一定した構造のものではなく、数種から数十種類以上の糖鎖が結合した糖蛋白質であり、均一の構造を有していない混合物である場合がほとんどであることから、近年、糖鎖部分を複合型糖鎖等に変換させることが課題の一つとなっている。【０００３】
糖蛋白質製造において、糖鎖を制御する方法としては、糖転移酵素の遺伝子を導入した細胞を用いる方法が知られている（例えば特開２０１４−５４２６３号公報参照）。これによって、哺乳類が有する糖鎖型、すなわち複合型糖鎖を高含有率で有する糖蛋白質が得られている。【０００４】
また、高い機能を有する糖蛋白質としては、抗体が挙げられる。
抗体は、高い結合活性、高い結合特異性及び血中での安定性から、ヒトの各種疾患に対する診断や予防のみならず、治療にも用いられてきた。特に、細胞工学技術の進歩により、抗体は培養細胞によって大量に調製が可能となり、抗体医薬品の主成分として用いられるようになった。
抗体医薬品に用いられる免疫グロブリン（ＩｇＧ）の中でもＩｇＧ１は、高い抗体依存性細胞傷害性活性（以下、ＡＤＣＣ活性と称する）や補体依存性細胞傷害性活性（以下、ＣＤＣ活性と称する）などのエフェクター機能を有していることが知られている。近年、治療用として用いられているリツキサンやハーセプチンなどの抗体は、このような活性による抗腫瘍効果を主要な効能とするものである。【０００５】
ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性には、ＩｇＧが有する２つのＮ−結合型糖鎖が強く影響することが知られており、特にＩｇＧ１の２９７番目のアスパラギンに結合する２つのＮ−結合型糖鎖について、フコースを欠いた構造のＮ−結合型糖鎖を有するＩｇＧ１は、顕著なＡＤＣＣ活性の上昇を引き起こすことが報告されている（例えばShitara他、[J. Biol. Chem. Vol.278, 3466-3473, (2003)]参照）。また、Ｎ−結合型糖鎖に関しては、複合型糖鎖、ハイマンノース型糖鎖及びハイブリッド型糖鎖が知られているが、この中でも特定の複合型糖鎖がＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性に重要であることが報告されている（例えばPablo他、[Nat. Biotechnol. Vol.17, 176-180, (1999)]参照）。
しかし、上記の培養細胞等で得られるＩｇＧは、フコースが付加されたものがほとんどであり、かつ非常に多種のＮ−結合型糖鎖を有する混合物である。
これに対し、フコースを欠いた構造のＮ−結合型糖鎖を有するＩｇＧ１に関しては、フコースをＮ−結合型糖鎖に付加させる酵素（フコシル転移酵素）を欠損させたチャイニーズハムスター由来の培養細胞によって生産できることが示されている（例えば特開２００８−５３０２４３号公報参照）。【０００６】
一方、糖蛋白質に新たな糖鎖を、試験管内で導入する方法も考えられる。
糖蛋白質の糖鎖を酵素によって変換する方法としては、糖質加水分解酵素（エンド−β−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ、以下「エンド酵素」という）の糖鎖転移活性を利用する方法が古くから知られている（例えば特開平７−５９５８７号公報参照）。エンド酵素の存在下、糖鎖供与体となる複合型のＮ−結合型糖鎖と、糖鎖受容体となる、Ｎアセチルグルコサミンのみをアスパラギン残基に有する糖蛋白質と、を反応させて、複合型糖鎖を有する糖ペプチドや糖蛋白質を得ることができる。【０００７】
また、エンド酵素の糖鎖転移活性を向上させるために、酵素活性に必須のアミノ酸残基を変異させた変異体（以下、エンドＭ変異体という）を作成することで、糖鎖受容体に対し、少ない糖鎖供与体の量で効率的に糖鎖転移が可能であることが報告されている（例えばUmekawa他、[J. Biol. Chem. Vol. 285(1), 511-521, (2010)]参照）。
さらに、複合型糖鎖のＩｇＧへの導入に関しては、Ｎアセチルグルコサミンをアスパラギン残基に有するＩｇＧ１ポリペプチド（以下、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ１という）に、化学合成した複合型糖鎖のオキサゾリン誘導体を糖供与体とし、上記とは別のエンド酵素の変異体の作用によって、複合型糖鎖を高い含有率で有するＩｇＧ１の調製方法が報告されている（例えば国際公開第２０１３１２００６６号参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の方法において、細胞を使用して複合糖鎖を有する糖ペプチドや糖蛋白質を得る方法（特開２０１４−５４２６３号公報及び特開２００８−５３０２４３号公報、Shitara他、[J. Biol. Chem. Vol.278, 3466-3473,(2003)]及びPablo他、[Nat. Biotechnol. Vol.17, 176-180, (1999)]）では、糖鎖としては不均一であり、さらに他の糖鎖（ハイマンノース型糖鎖）等の混在は避けられない。【０００９】
また、特開平７−５９５８７号公報に記載の方法で用いられる毛カビ由来のエンド−β−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（以下、「エンドＭ」という）は、加水分解酵素であるため、糖鎖転移反応によって一旦糖鎖転移された糖ペプチドや糖蛋白質を生成しても、酵素的に加水分解されることは避けられず、結果的に糖鎖転移収率が低い。【００１０】
一方、加水分解活性を極力低減させたUmekawa他、[J. Biol. Chem. Vol. 285(1), 511-521, (2010)]のエンドＭ変異体及び国際公開第２０１３１２００６６号に記載のエンド酵素の変異体では、糖鎖供与体として、室温では不安定なオキサゾリン誘導体を使用するため、使用できる条件が制限されるばかりか、糖鎖の種類によっては糖鎖供与体の調製自体も困難である。
このように、エンドＭ変異体による複合型糖蛋白質の容易な製造方法が望まれていた。【００１１】
本開示は上記に鑑みてなされたものであり、本開示では、安定な糖鎖供与体を用いて、特定の複合型糖鎖を高い含有率で有する糖蛋白質又は糖ペプチドを容易に製造できる製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン、又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、下記一般式（１）で表される糖鎖供与体と、糖鎖受容体と、を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する方法である。【００１３】
【化１】
2016076440.tif 000003
【００１４】
（一般式（１）中、Ｘ１およびＸ2は、それぞれ独立の糖質由来の基又は水素原子を表し、Ｘ１およびＸ2の少なくとも一方は、１つ以上のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡを含み、Ｘ１およびＸ2に含まれるＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡは、α１−３でＭａｎに結合したＭａｎ又はα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２で結合している。Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ6は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表す。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１に含まれるＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ１は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、ＧｌｃＮＡｃＡはＧｌｃＮＡｃの６位のヒドロキシメチル基がカルボキシル基である糖残基を表す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。）
本開示においてＹ１に結合するＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの１位の還元末端の炭素に結合する水素原子以外の置換基の原子を含まない。
＜２＞  前記糖鎖受容体が下記一般式（２）で表される＜１＞に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。【００１５】
ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２    一般式（２）
（一般式（２）中、Ｒ２は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。）
＜３＞  前記糖鎖受容体が、定常領域にＮ−アセチルグルコサミニル基が結合したＩｇＧポリペプチドである＜１＞又は＜２＞に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
＜４＞  前記一般式（１）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６の少なくとも１つは糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基と、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基から選ばれるいずれか一つの基とが、リンカーを介して結合した構造を有する基である＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
＜５＞  前記一般式（１）中、Ｚ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６が水素原子であり、Ｘ１がα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２でＧｌｃＮＡｃＡが結合している糖質由来の基であり、Ｘ２がα１−３でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２でＧｌｃＮＡｃＡが結合している糖質由来の基である＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
＜６＞  前記反応を、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数）５以上で行うことで免疫グロブリンＧを製造する＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
＜７＞  前記モル比率は１〜４である＜６＞に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本開示によれば、安定な糖鎖供与体を用い、特定の複合型糖鎖を高い含有率で有する糖蛋白質又は糖ペプチドを容易に製造できる製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、モガムリズマブ（ＩｇＧ）のエンドＭによる各処理時間での試料を還元処理した後にＣＥ測定した図である。
【図２】図２は、モガムリズマブ（ＩｇＧ）のエンドＭによる各処理時間での試料を還元処理せずにＣＥ測定した図である。
【図３】図３は、エンドＭ処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）への反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；ＳＧＰ）後の試料を、還元処理した後にＣＥ測定した図である。図中には０時間から２４時間までの反応時間による結果を示す。
【図４】図４は、エンドＭ処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）への反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；ＳＧＰ）後の試料を、還元処理した後にＣＥ測定した図である。図中には４５時間から７０時間までの反応時間による結果を示す。最下段の図は、７０時間後にプロテインＡ−セファロースによって、反応溶液からＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧを精製した後の試料を測定した結果である。
【図５】図５は、エンドＭ処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）への反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；ＳＧＰ）後の試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。図中の各レーン上部には０時間から７０時間までの反応時間による結果を示す。
【図６】図６は、エンドＭ処理前及び処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）、及び該モガムリズマブへの７０時間反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；ＳＧＰ）後の試料について、ＳＳＡレクチンによるレクチンブロットを行った結果を示す。Ｍはマーカー、レーン１はエンドＭ処理前の試料、レーン２はエンドＭ処理後の試料、レーン３は糖鎖転移後の試料について測定した結果である。
【図７】図７は、エンドＭ処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）への反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；化合物Ａ−１）後の試料について、還元処理した後にＣＥ測定した図であり、（ａ）は０時間反応後の試料であり、（ｂ）は４４時間後の試料である。
【図８】図８は、エンドＭ処理後のモガムリズマブ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）への反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；化合物Ａ−１）後の試料について、還元処理した後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定した図であり、（ａ）は０時間反応後の試料であり、（ｂ）は４４時間後の試料である。
【図９】図９は、エンドＭ処理前及び処理後のモガムリズマブ、及び処理後のモガムリズマブへの反応（糖鎖転移、４４時間、糖鎖供与体；化合物Ａ−１）後の試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。Ｍはマーカー、レーン１はエンドＭ処理前のモガムリズマブ、レーン２はエンドＭ処理後のモガムリズマブ、レーン３は糖鎖供与体である化合物Ａ−１とモガムリズマブを反応させた後の試料について測定した結果である。
【図１０】図１０は、ＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−エチルアジドへの反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；化合物１１０）後の０時間反応後の試料について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析した結果である。
【図１１】図１１は、ＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−エチルアジドへの反応（糖鎖転移、糖鎖供与体；化合物１１０）後の１時間反応後の試料について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて示された用語について説明する。
数値範囲を表す「〜」はその上限及び下限の数値を含む範囲を表す。更に、本明細書中において、糖鎖供与体、糖鎖受容体、ＩｇＧ、変異型酵素等の各成分の量は、特に断らない限り、反応する溶液中に存在する複数の物質の合計量を意味する。
【００１９】
「相同性」とは、アミノ酸配列変異体において、最大の相同性（パーセント）を達成するために、必要ならば間隙を導入して、配列を整列させた後に同一である残基のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは本技術分野においてよく知られており、例えば、ジェンテック社により著作された「Ａｌｉｇｎ２」で、１９９１年１２月１０日にアメリカ合衆国著作権庁、ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ  ２０５５９に利用者資料を付して提出されている。
またアミノ酸残基は、３文字表記及び１文字表記のどちらかで表記される。
【００２０】
「糖鎖転移」とは、糖鎖供与体の一部の糖鎖部分を、糖鎖受容体に結合させることである。本開示においては、下記一般式（１）の矢印の位置で加水分解された後の左側部分（以下、糖鎖供与部分と称することがある）を、糖鎖受容体に、糖鎖転移することを意味する。
【００２１】
【化２】
2016076440.tif 000004
【００２２】
一般式（１）中、Ｘ１およびＸ2は、それぞれ独立の糖質由来の基又は水素原子を表し、Ｘ１およびＸ2の少なくとも一方は、１つ以上のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡを含み、Ｘ１およびＸ2に含まれるＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡは、α１−３でＭａｎに結合したＭａｎ又はα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２で結合している。Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ6は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表す。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１に含まれるＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ１は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、ＧｌｃＮＡｃＡはＧｌｃＮＡｃの６位のヒドロキシメチル基がカルボキシル基である糖残基を示す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。
本開示においてＹ１に結合するＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの１位の還元末端の炭素に結合する水素原子以外の置換基の原子を含まない。
【００２３】
また、後述する「６ＳＯ３」及び「３ＳＯ３」は、糖残基の特定の位置に結合した酸性基を表す。例えば、（６ＳＯ３）ＧｌｃＮＡｃであれば、ＧｌｃＮＡｃの６位にスルホン酸基が結合していることを示す。糖残基とは、後述する単糖が脱水縮合等により置換基を構成するものをさし、マンノシル基（Ｍａｎ）、グルコサミニル基（ＧｌｃＮＡｃ）等の総称である。また、上記のような酸性基を含む糖残基、ＧｌｃＡ、ＧｌｃＮＡｃＡ、ＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＧｃのような酸性の糖残基を総称して酸性糖残基と称することがある。
【００２４】
また、本明細書中、ＧｌｃＡ、ＧｌｃＮＡｃＡ、ＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＧｃは、これらの糖残基中のカルボキシル基が他の化合物等とエステル結合又はアミド結合を形成したものも含むことを意味する。例えば、ＧｌｃＡが、６位のカルボキシル基がエステル結合したエステル化体である場合、エステル化体のうち、下記式（ａ）の破線部分に示すように、ＧｌｃＡの６位のカルボニル基までを含む糖残基を含むことを意味する。また、ＧｌｃＡが、６位のカルボキシル基がアミド結合したアミド化体である場合は、アミド化体のうち、下記式（ｂ）の破線部分に示すように、ＧｌｃＡの６位のカルボニル基までを含む糖残基を含むことを意味する。
【００２５】
【化３】
2016076440.tif 000005
【００２６】
式（１）中、＊はエステル結合及びアミド結合する化合物との結合位置を示す。
【００２７】
また、本明細書中、糖鎖供与体中の糖残基は、該糖残基中の水酸基が他の化合物等とエーテル結合したものも含むことを意味する。例えば、Ｍａｎが、２位の水酸基がエーテル結合したエーテル化体である場合、エーテル化体のうち、エーテル結合する２位の酸素原子までを含む糖残基を含むことを意味する。
【００２８】
糖質由来の基とは、天然又は非天然の糖鎖のみならず、該糖鎖と該糖鎖以外の化合物とが結合した複合体も含むことを意味する。
【００２９】
また、糖鎖転移反応を単に「反応」と称することもある。また、エンドＭ変異体やエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移における活性は、単に糖鎖転移活性と称することがある。なお、糖鎖転移活性とは、エンド酵素変異体及びエンド酵素変異体ホモログの糖鎖転移する能力をいい、具体的には一定時間において糖鎖転移して生じる生成物の量（ｍｏｌ／ｍｉｎ）で表される。糖鎖転移反応において、加水分解における酵素活性と糖鎖転移における酵素活性を分離して測定することは厳密にはできないが、本開示において用いられるエンドＭ変異体では、糖鎖転移活性に比べて加水分解活性が著しく抑えられているので、糖鎖転移後に生じた時間に対する生成物の量を測定することで、糖鎖転移活性を見積もることができる。
「糖鎖転移収量」とは、特に断らない限り、反応後に生ずる複合型糖鎖が転移された糖蛋白質の量をいい、「糖鎖転移収率」とは、糖鎖転移した生成物のモル数の、反応に用いた糖鎖受容体のモル数に対する割合を示す。
【００３０】
「エンド−β−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ」とは、一般式（１）の矢印に示されるように、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃの間を加水分解する酵素を意味し、「エンド酵素」と称することもある。また、「エンドＭ」とは、毛カビであるムコールヒエマリス由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）、「エンドＡ」とはアルスロバクタープロトホルミエ由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＤ１０８５１）、「エンドＳ」とは、ストレプトコッカス  パイオジェネス由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＫ００８５０）を意味する。また、以下のように、アミノ酸が置換されたエンド酵素を「エンド酵素変異体」と称する。
【００３１】
また、蛋白質におけるアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基を示す表記について、例えばエンドＭのアミノ酸配列においては、１７５番目のアスパラギン残基は、Ｎ１７５と示される。また、アミノ酸残基を置換、すなわち他のアミノ酸に置換されたアミノ酸残基の表記について、例えばエンドＭの１７５番目のアスパラギン残基をグルタミン残基に置換したグルタミン残基は、Ｎ１７５Ｑと示され、これを含むエンドＭを、エンドＭのＮ１７５Ｑ変異体、もしくは単にＮ１７５Ｑ変異体と称する。また、エンドＭのＮ１７５Ｑ変異体、同Ｎ１７５Ａ変異体を総じて、エンドＭ変異体、と称することがある。なお、配列番号１において、１７５番目のアミノ酸残基以外に変異が導入された相同性８０％以上（配列番号１に対して）のものを、エンドＭ変異体ホモログと称する。
【００３２】
「免疫グロブリンＧ」とは、抗体であるＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧのうちのＩｇＧを指す。本明細書中では、ＩｇＧと称することもある。また、免疫グロブリンＧ又はＩｇＧと表記する場合には、ＩｇＧが有する２つの重鎖と２つの軽鎖の両方を含むポリペプチドであることを意味する。また、後述するが、単に免疫グロブリンＧ又はＩｇＧと表記された場合には、特に断らない限り、その糖鎖構造は限定されない。すなわち、様々な種類のＮ−結合型糖鎖を含むＩｇＧの混合物であることを意味する。
「定常領域」とは、ＩｇＧが有する重鎖のＣ末端領域を意味し、Ｆｃ領域と称することもある。本開示におけるＦｃ領域は、天然の配列を有するＦｃ領域であってもよいし、変異されたＦｃ領域であってもよい。Ｆｃ領域とＦｃ領域でない領域との境界は変化する場合もあるが、ヒトＩｇＧにおいては２２６番目のシステイン（Ｃ２２６）又は２３０番目のプロリン（Ｐ２３０）の位置からＣ末端までの領域と定義される。
【００３３】
本明細書等では、炭水化物の部分は、オリゴ糖の記述に通常用いられる命名法を参照して記載される。これらの命名法は、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄらの文献[Ann.Rev.Biochem.,50,555(1981)]に見出される。この方法に従って、マンノースはＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンはＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースはＧａｌ、ＧｌｃＡはグルクロン酸、フコースはＦｕｃ及びグルコースはＧｌｃ、という略式表記によって表記される。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対するＮｅｕＡｃ、及び５−グリコリルノイラミン酸に対するＮｅｕＧｃという略式表記によって表記される。また、Ｎ−アセチルグルコサミニル基はＧｌｃＮＡｃ残基、マンノシル基はＭａｎ残基と称することもある。また、ＧｌｃＮＡｃの６位のヒドロキシメチル基を酸化してカルボキシル基とした糖残基を、ＧｌｃＮＡｃＡと称する。
【００３４】
「単糖」とは、１つの糖を形成する化合物、例えば、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃなどの糖どうしが結合していない化合物を意味する。
「グリコシド結合」とは、糖鎖中の糖もしくは単糖の１位の水酸基と他の糖の水酸基が脱水縮合することで、互いが酸素原子を介して結合する結合をいい、例えばα１−６グリコシド結合とは、糖の１位と他の糖の６位がα型で結合したグリコシド結合であることをいう。なお、糖の１位の水酸基はα型とβ型が存在する。
また、糖鎖を説明する表現として、単糖が３つ結合した糖鎖は３糖、５つ結合した場合は５糖、のように称することもある。
複数の単糖がグリコシド結合したもの、すなわち糖残基がグリコシド結合で連結したものをオリゴ糖残基と称することがある。また、「オリゴ糖残基」には、単糖が糖残基を形成するもの、例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−２−、のような糖残基も含むことを意味する。
【００３５】
本明細書等に記載されるＩｇＧに結合したＮ−結合型糖鎖は、例えばＫａｂａｔらの文献[“Sequence of Proteins of Immunological Interest”,(1999)]に示されるように、ヒト型であればＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、マウス型であればＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３について、これらのアミノ酸配列における２９７番目のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が結合することを意味する。
【００３６】
「複合型糖鎖」とは、Ｎ−結合型糖鎖の中の特定の糖鎖構造を有する糖鎖であり、少なくともコア糖鎖に由来する構造を有し、かつトリマンノシル基の非還元末端に少なくとも１つのβ１−２グリコシド結合したＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖をいう。
「コア糖鎖」とは、Ｎ−結合型糖鎖の中で、下記Ｃ−１で表される糖鎖部分をいい、「トリマンノシル」とは、コア糖鎖の中の３つのマンノース部分をいう。また、Ｃ−１の破線部分に示すように、トリマンノシル部位のうち、非還元末端側のα１−６で結合するＭａｎをＭａｎ２、非還元末端側のα１−３結合するＭａｎをＭａｎ３及び還元末端側のＭａｎをＭａｎ１と称する。
【００３７】
【化４】
2016076440.tif 000006
【００３８】
「ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ」とは、１つのＧｌｃＮＡｃが少なくとも１つの定常領域に結合したＩｇＧポリペプチドをさす。すなわち、ＩｇＧが有する２つのＮ−結合型糖鎖のうち、少なくとも１つのコア糖鎖の還元末端部位のＧｌｃＮＡｃのみが、ＩｇＧポリペプチドの定常領域に結合したＩｇＧポリペプチドをいう。また、ＩｇＧについては、Ｎ−結合型糖鎖の非還元末端側［一般式（１）における矢印の左側］を有しないものを、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧと称し、同様に糖ペプチドや糖蛋白質については、ＧｌｃＮＡｃ−ペプチド及びＧｌｃＮＡｃ−蛋白質と称する。
【００３９】
「ペプチド」と「蛋白質」は、一般的にはアミノ酸残基数が少ないものがペプチド、多いものが蛋白質と称されており、明確なアミノ酸残基数の違いはないが、本開示においては、５０残基以上のものを蛋白質と称する。また、蛋白質をポリペプチドと称することもある。
「１ユニット」とは、複合型のＮ−結合型糖鎖であるシアログライコペプチド（以下、ＳＧＰと称する）の非還元末端側の糖鎖部分を、パラニトロフェニルＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−ｐＮＰ）に対し１分間で１μモル転移させる量である。
【００４０】
本開示においては、酵素的な糖蛋白質の調製において、安定な天然型の基質を用いることができ、かつ従来技術では達成できなかった糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量の糖ペプチド又は糖蛋白質を製造することができる。本開示におけるこのような効果を有する理由は定かではないが、出願人は以下のように考えている。
本開示で用いられるエンドＭ変異体は、加水分解活性が著しく低い一方、糖鎖転移活性は維持された変異体である。エンドＭ変異体はエンドＭの反応過程を考慮して作製された変異体である。
【００４１】
エンドＭは、天然の基質であるキトビオシル部位（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を加水分解する場合においては、まず加水分解時に生じる中間体と想定されるＧｌｃＮＡｃのオキサゾリニウムイオン中間体を生成する。次に、水がオキサゾリニウムイオン中間体に付加される前に、該中間体とは別のＧｌｃＮＡｃの水酸基が付加されることで糖鎖転移反応が行われる。このため、該オキサゾリニウムイオン中間体の疑似物質であるＧｌｃＮＡｃをオキサゾリン化した化合物（以下、オキサゾリン誘導体という）と、上記の変異体とを組み合わせることで、ＧｌｃＮＡｃ−ペプチドやＧｌｃＮＡｃ−糖蛋白質への効果的な糖鎖転移が行われるものと推定できる。
【００４２】
従来から、エンドＭ変異体の基質としては、オキサゾリン誘導体が有効であり、天然型のキトビオシル構造を有する基質は用いられてこなかった。しかし、エンドＭ変異体においても、天然型の基質（キトビオシル構造を有する基質）を加水分解して糖鎖転移する能力、すなわちオキサゾリニウムイオン中間体を形成する能力があると考えられる。さらに、該中間体を形成した場合に、適切な糖鎖受容体が存在することで、エンドＭ変異体の特性、すなわち糖鎖転移する速度が加水分解する速度よりも大きいために、糖鎖転移反応が優先的におこり、十分な収率で糖鎖転移後生成物を得ることができると考えられる。
特に、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧのような、ＧｌｃＮＡｃがＦｃ領域の内部に位置し、外部からエンド酵素が近づきにくいと考えられる糖鎖受容体に対しては、十分な糖鎖転移収量を得るために長時間の反応が必要になると考えられるので、この場合に、天然型基質のような、反応溶液中でも安定な糖鎖供与体の存在が有効であるものと考えられる。
【００４３】
≪糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法≫
本開示における糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する製造方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、一般式（１）で表される糖鎖供与体と、糖鎖受容体と、を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する工程を含む。
以下に、詳細について説明する。
【００４４】
[糖ペプチド又は糖蛋白質]
本開示において製造される糖ペプチド又は糖蛋白質としては、天然に見いだされているものも、合成によるものも含む。また、天然に存在する糖蛋白質におけるＮ−結合型糖鎖が結合するアスパラギンのＣ末端側には、該アスパラギンから２つ目のアミノ酸残基が必ずスレオニン残基かセリン残基であることが知られているが、本開示においても同様である。
【００４５】
本開示の製造方法で製造される糖ペプチド又は糖蛋白質は、特に制限されない。例えば、動物細胞であれば、細胞外又は細胞表面に分泌しかつＮ−結合型糖鎖を有する糖蛋白質や糖ペプチドなどが挙げられ、例として、各種ホルモン、細胞接着因子、各種受容体、細胞外マトリクス、各種酵素、各種サイトカイン、抗菌性又は抗ウィルス性ペプチド、抗体などが挙げられる。
この中でも、糖転移収率の観点から、抗菌性又は抗ウィルス性ペプチド及び生理活性ペプチド、ホルモン、サイトカイン又は抗体が好ましい。
【００４６】
[免疫グロブリンＧ]
本開示における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、少なくとも定常領域（以下Ｆｃ領域と称する）と可変領域（以下Ｆａｂ領域と称する）を含む分子を意味する。ＩｇＧだけではなく、ＩｇＧの変異体、これらを含む融合蛋白質も含まれる。具体的には、例えばヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ等の非ヒトＩｇＧなどの天然型ＩｇＧ及びこれらの誘導体を含み、誘導体としてはキメラＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧの抗原抗体反応を誘導可能な組換えＩｇＧ等が含まれる。これらは、モノクローナルＩｇＧ、ポリクローナルＩｇＧのいずれであってもよく、単独又は２種以上の組合わせも含む。前記天然型ＩｇＧの誘導体は、天然型ＩｇＧのアミノ酸配列の一部に、欠失、付加、置換等の変異が導入されたＩｇＧを含むことを意味しており、これらの変異は自然に生じたものだけでなく、人為的なものも含まれる。
【００４７】
ＩｇＧの溶液中における存在は、例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）装置又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで測定することによって確認される。
ＣＥによる測定は、キャピラリーカラム（３０．２ｃｍ×５０μｍ、ベックマンコールター社製、ペアーヒューズドシリカ）を備えたベックマンコールター社製のＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＡ８００を用い、下記分析条件にて行うことができる。
・分析条件：試料注入後、２５℃、１５ｋｖの電圧で３０分間測定
・検出波長：２００ｎｍ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定は、市販のスラブゲル用の装置（アトー社製、ｅ−ＰＡＧＥＬ）において、１５％のポリアクリルアミドゲルを用い、２０ｍＡで７０分間電気泳動後に、ゲルをクマシブリリアントブルーで染色し、得られたゲルを評価することができる。なおマーカーとしては、ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｍｕｌｉ  ＣｏｌｏｒＩＩＩ（Ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用いる。
【００４８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとしては、例えば、次の方法が挙げられる。
すなわち、反応後の溶液に一定量のアセトンを加え、溶解した部分を乾燥後、一定量のＤＨＢＡ溶液（２０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸を５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液）に溶解させる。その後、溶解させた溶液の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析用のｐｌａｔｅにスポットし乾燥させ、ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタシステムによって、下記の条件にて測定することで、反応後の生成物の質量を確認できる。
<条件>
・測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ，及びｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ
・測定電圧：１．５ｋｖ〜２．５ｋｖ
・測定分子量の範囲：０〜３０００（ｍ／ｚ）及び４５０００〜６００００（ｍ／ｚ）
・積算回数：１０００〜８０００
【００４９】
（エンド酵素及び変異型エンド酵素）
本開示においては、エンドＭのアミノ酸に変異を導入した変異体を用いる。配列番号１で示されるエンド酵素は、ムコールヒエマリス由来のエンドβＮアセチルグルコサミニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）である。
本開示の一実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンドＭ変異体）、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンドＭ変異体ホモログ）の存在下で反応を行うことによって、糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する。
本開示では、エンドＭ変異体としては、Ｎ１７５ＱもしくはＮ１７５Ａであることで、糖鎖転移反応後の生成物の加水分解を十分に抑えることができる。また、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量の観点からは、Ｎ１７５Ｑ変異体であることが好ましい。
【００５０】
本開示のエンドＭ変異体は、通常の遺伝子工学的な手法によって調製することができ、様々な宿主の種類や、対応する適切な蛋白質発現ベクターを用いて調製することができる。宿主としては、大腸菌、ブレビバシラス菌、シアノバクテリウム、乳酸菌、酵母、昆虫細胞及び動物細胞などが挙げられる。この中でも調製のしやすさ、及び発現量の観点から、大腸菌を宿主とする方法や、酵母を宿主とする方法によって調製することが好ましい。具体的な製造方法としては、大腸菌であれば梅川らの文献[J. Biol. Chem. Vol.285(1),511-521,(2010)]に詳しく記載されており、酵母であれば特開平５９５８７号公報に詳しく記載されている。
【００５１】
本開示のエンドＭ変異体及びエンドＭ変異体ホモログは、反応において、他のペプチドもしくは蛋白質とそれらのＣ末端側もしくはＮ末端側で融合させた融合型エンド酵素変異体もしくは融合型エンド酵素変異体ホモログとしても用いることができる。融合させることができるペプチドもしくは蛋白質としては、糖鎖転移反応を阻害するものでなければ特に限定されないが、例えば、ヘキサヒスチジンペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＨＨＨＨＨＨ）、フラッグペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＤＹＫＤＤＤＤＫ）、インフルエンザＨＡポリペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、アビジン、キチン結合蛋白質、ｃ−ｍｙｃ、チオレドキシン、ジスルフィド異性化酵素（ＤｓｂＡ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）など緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）が挙げられる。この中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの調製のしやすさという観点から、ヘキサヒスチジンペプチド及びフラッグペプチドが特に好ましい。
【００５２】
なお、上記の融合型エンドＭ変異体もしくは融合型エンドＭ変異体ホモログにおいては、融合させるペプチド又は蛋白質のポリペプチド部分と、エンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログのポリペプチド部分との間には数残基から５０残基のリンカーペプチド領域としてのペプチド部分を含む。なお、リンカーペプチド領域を構成するアミノ酸残基の種類としては特に限定されない。リンカーペプチド領域には、プロテアーゼによって加水分解されるアミノ酸配列部分（プロテアーゼサイト）を含めてもよい。プロテアーゼサイトとしては特に限定されないが、例えば、ファクターＸａサイト、トロンビンサイト、エンテロキナーゼサイト、プレシジョンプロテアーゼサイトが挙げられる。
【００５３】
天然から見いだされている糖質加水分解酵素は、公知の情報（http://www.cazy.org/）で示されるように、アミノ酸配列の相同性等から、百数十のグリコシルヒドラーゼファミリー（ＧＨファミリー）に分類されている。エンドＭは、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼであり、他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質としては、ヒトから細菌類までに広く分布すること知られている。エンドＭのアミノ酸配列（配列番号１）を基に、一般に使用できるホモロジー検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を行うと、エンドＭと他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質とは、アミノ末端側から５００番目のアミノ酸付近までの触媒領域を含む領域内で、高い相同性を有することがわかる。
以上の観点から、本開示におけるエンド酵素変異体ホモログは、エンドＭの触媒領域を含む５００残基程度のアミノ酸配列の長さを有していれば、エンドＭとしての糖鎖転移活性を有すると推定できる。
本開示におけるエンドＭ変異体ホモログは、Ｎ１７５Ｑ変異体もしくはＮ１７５Ａ変異体と８０％以上の相同性を有し、かつ糖鎖転移活性を有するものであれば、１７５番目のアミノ酸残基以外のどのアミノ残基を他のアミノ酸に置換、欠失及び付加により調製されたものでもよい。
【００５４】
以上の観点から、本開示においては、エンドＭ（配列番号１）の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により生じるエンド酵素変異体ホモログのエンドＭ（配列番号１）に対する相同性が８０％以上であれば糖鎖転移活性を十分に維持できる。また、９０％以上であれば、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量が向上しやすいことから好ましく、より好ましくは９５％以上であり、特に好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００５５】
本開示において、反応溶液中のエンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの濃度は、０．５Ｕ〜２０Ｕ／ｍｌであることが好ましい。０．５Ｕ以上であることで、糖鎖転移収量を高めることができ、２０Ｕ以下であることで、糖鎖転移収率を高めることができる。こここで、１ユニット（Ｕ）とは、シアログライコペプチド（以下ＳＧＰと称する）１μモルを、１分間で、βパラニトロフェニルＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−ｐＮＰ）に転移する酵素量を示す。さらに、濃度としては、１Ｕ〜１０Ｕ／ｍｌであることがより好ましく、２Ｕ〜５Ｕ／ｍｌであることが特に好ましい。
【００５６】
また、反応に用いるエンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの精製度においては、反応時間の短縮化、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量の観点から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果等から、精製度が５０％以上であることが好ましく、さらに７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。精製度が５０％以上であることで、反応時間を短縮化することができ、かつ糖鎖転移収率も高めやすい。
【００５７】
（糖鎖供与体）
本開示における糖鎖供与体としては、下記一般式（１）で表される糖鎖供与体であれば、特に限定されない。ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃとのβ１−４結合を含む構造（キトビオシル構造）を有することで、基質として安定であり、溶液中でも長時間安定に存在できるため、長時間の反応時間を要する糖鎖受容体へも十分に対応できる。
【００５８】
【化５】
2016076440.tif 000007
【００５９】
一般式（１）中、Ｘ１およびＸ2は、それぞれ独立の糖質由来の基又は水素原子を表し、Ｘ１およびＸ2の少なくとも一方は、１つ以上のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡを含み、Ｘ１およびＸ2に含まれるＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃＡは、α１−３でＭａｎに結合したＭａｎ又はα１−６でＭａｎに結合したＭａｎにβ１−２で結合している。Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ6は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表す。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１に含まれるＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ１は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、ＧｌｃＮＡｃＡはＧｌｃＮＡｃの６位のヒドロキシメチル基がカルボキシル基である糖残基を示す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。
Ｘ１およびＸ2としては、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有し、該ＧｌｃＮＡｃが少なくともコア糖鎖部分のＭａｎ２もしくはＭａｎ３のどちらかにβ１−２でグリコシド結合する残基を有することを意味する。
【００６０】
Ｘ１、Ｘ2、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ6における糖質由来の基としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、異種抗原：Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ポリラクトサミン：［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ケラタン硫酸［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、［Ｇａｌ（６ＳＯ３）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、硫酸化ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、末端硫酸修飾（３ＳＯ３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ルイス糖鎖：Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、血液型抗原：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＨＮＫ１抗原：（３ＳＯ３）ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２、ＧｌｃＮＡｃＡβ１−２が挙げられ、これらの基のいずれか一つをＸ１およびＸ2のどちらか、あるいは両方に有していてもよい。
Ｘ１〜Ｘ６が上記の場合には、Ｚ１は水素原子でもＧｌｃＮＡｃβ１−４であってもよい。
【００６１】
上記の糖質由来の基の中でも、本開示糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法によって製造されるＩｇＧのＡＤＣＣ活性及び糖鎖転移収率の観点からは、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は水素原子であることが好ましい。
この場合に、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方が、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１が水素原子であること、又はＸ１およびＸ2の両方もしくは片方が、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１がＧｌｃＮＡｃであることが好ましい。また、さらに、Ｘ１およびＸ2の両方がＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１が水素原子であること、又はＸ１およびＸ2の両方がＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１がＧｌｃＮＡｃであることがより好ましい。
また、Ｘ１およびＸ2の両方が、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１が水素原子であること、又はＸ１およびＸ2の両方が、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１がＧｌｃＮＡｃであることがさらに好ましく、Ｘ１およびＸ2の両方が、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２もしくはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１が水素原子であること、又はＸ１およびＸ2の両方が、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２もしくはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１がＧｌｃＮＡｃであることが特に好ましく、Ｘ１およびＸ2の両方が、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２もしくはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれか一つであり、かつＺ１がＧｌｃＮＡｃであることが最も好ましい。
【００６２】
また、上記一般式（１）中のＸ１〜Ｘ６の少なくとも一つは、糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基と、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基から選ばれるいずれか一つの基とが、リンカーを介して結合した構造を有する基であってよい。
ここで、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基をクリック反応基と称することがある。すなわち、糖鎖供与体中の糖質由来の基は、前記糖質由来の基を構成するオリゴ糖残基とクリック反応基とが、リンカーを介して結合していてもよい。
上記一般式（１）で表され、前記リンカーが結合していない糖鎖供与体を、リンカー非含有糖鎖供与体と称し、上記一般式（１）で表され、Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも一つが糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基とクリック反応基とが前記リンカーを介して結合した構造を有する糖鎖供与体をクリック反応基含有糖鎖供与体と称することがある。また、クリック反応基、リンカー及びオリゴ糖残基を、各ブロックと称することがある。さらに、リンカーとは、後述するリンカーに用いる化合物と後述するクリック反応基を含む化合物とが結合することによって形成したもののうち、クリック反応基以外の部分をさす。
【００６３】
前記クリック反応基とリンカーとの結合比、及びリンカーに対するクリック反応基の配置においては特に限定されない。しかし、糖鎖供与体としての調製のし易さから、結合比は１以上であることが好ましく、１〜１０あることがより好ましく、１であることが最も好ましい。また、リンカーに対するクリック反応基の配置においては、オリゴ糖残基とリンカーとが結合する位置を除いたリンカーの末端に配置されることが好ましい。
【００６４】
また、クリック反応基含有糖鎖供与体中におけるクリック反応基の数は特に限定されないが、調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点からは、１以上であることが好ましく、１〜２０であることが好ましく、１〜２であることが特に好ましい。
【００６５】
前記リンカーと結合したオリゴ糖残基としては、例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、異種抗原：Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ポリラクトサミン：［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ケラタン硫酸［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、［（６ＳＯ３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、硫酸化ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、（３ＳＯ３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ルイス糖鎖：Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、血液型抗原：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＨＮＫ１抗原：（３ＳＯ３）ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２、ＧｌｃＮＡｃＡβ１−２等が挙げられる。
【００６６】
また、クリック反応基含有糖鎖供与体の調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点からは、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方が、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃ、ＧｌｃＡ及びＧｌｃＮＡｃＡから選ばれる酸性糖残基の少なくとも一つを含むものが好ましい。
さらに、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方がＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２及びＧｌｃＮＡｃＡβ１−２のいずれか一つであることがより好ましい。さらに、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方が、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２及びＧｌｃＮＡｃＡβ１−２のいずれか一つであることが特に好ましい。さらに、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方が、ＧｌｃＮＡｃＡβ１−２であることが最も好ましい。
【００６７】
上記クリック反応基においては、水溶液中での安定性及び他の化合物との反応特異性という観点から、アジド基、アルキニル基、エポキシ基及びアミノ基のいずれかであることが好ましく、アジド基及びアルキニル基のいずれかであることがより好ましい。また、クリック反応基と他の化合物との反応においては、それぞれ最適な組合せを選択することで容易にかつ特異的に結合を形成することができる。
【００６８】
前記リンカーとしては、前記クリック反応基及び前記オリゴ糖残基の両方を結合するものであり、本開示の製造方法の効果を損なわないものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、デキストリン、ポリオキサゾリン、糖質、ポリサッカリド、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）及び２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムリン酸（ＭＰＣ）等の水溶性ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリフェニレン及びポリアクリロニトリル等に由来する構造を挙げることができる。中でも、糖鎖供与体としての調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点から、リンカーは、水溶性ポリマーに由来する構造を有していることが好ましく、さらにポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールに由来する構造を有していることがより好ましい。
また、上記リンカーの形成には、上記の化合物（ポリマー）を用いることが好ましい。
【００６９】
また、上記のリンカーの重量平均分子量は特に限定されないが、糖鎖供与体としての調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点から、１００〜１００００が好ましい。さらに、１００〜７０００がより好ましく、さらに１００〜４０００が特に好ましい。
また、上記リンカーの形成に用いるポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの好ましい繰り返し単位数は、糖鎖供与体としての調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点から、１〜５０が好ましく、１〜２０がさらに好ましく、３〜１０が特に好ましい。
【００７０】
上記のクリック反応基含有糖鎖供与体における各ブロックの構築方法は、例えば、クリック反応基を含む化合物とリンカーとの結合の形成に用いる化合物とを結合させて得た化合物にリンカー非含有糖鎖供与体等のオリゴ糖残基を結合させる方法が挙げられる。また、リンカーの形成に用いる化合物と前記オリゴ糖残基とを結合させて得た化合物にクリック反応基を含む化合物を結合させる方法も挙げられる。各ブロックの構築方法としては、どのような方法でもよく、適宜選択されることが好ましい。
【００７１】
上記クリック反応基含有糖鎖供与体中のクリック反応基とリンカーとの結合方法、及びリンカーとリンカー非含有糖鎖供与体等のオリゴ糖残基との結合方法は、公知の一般的な合成化学的手法、例えば、特開２０１０−１１９３２０号公報、特開２０１０−５０２８２４０号公等に記載される合成方法によって行うことができる。
【００７２】
上記のクリック反応基がアジド基及びアルキニル基である場合において、リンカーと結合させるクリック反応基を含む化合物としては特に限定されず適宜選択されることが好ましいが、クリック反応基含有糖鎖供与体としての調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点からは、下記の一般式（３−１）又は（３−２）で表される化合物であることが好ましい。
【００７３】
【化６】
2016076440.tif 000008
【００７４】
一般式（３−１）中のＡ及び一般式（３−２）中のＫは、それぞれ一価の置換基を表す。一価の置換基としては、前記オリゴ糖残基と結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、臭素基、塩素基、スルホンサン基、リン酸基、下記構造式（Ｌ−１）又は（Ｌ−２）で表される置換基等が挙げられる。
【００７５】
【化７】
2016076440.tif 000009
【００７６】
＊は、上記一般式（３−１）又は（３−２）中のポリエチレングリコールの末端への結合位置を表す。
【００７７】
上記一般式（３−１）で表される化合物の一部は市販されており、例えば、アジド基を含み、官能基が導入された化合物として、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（東京化成工業社製）が知られており、またアルキニル基が導入された化合物として２−［２−（２−プロピニルオキシ）エトキシ］エチルアミンやプロパルギル−ＰＥＧ５−ＮＨＳ（東京化成工業社製）が知られている。
【００７８】
また、クリック反応基含有糖鎖供与体の調製においては、上記のリンカーの形成に用いる化合物をそのまま用いてもよいし、リンカーの形成に用いる化合物に官能基を導入したものを用いてもよい。また、リンカーと、上記のリンカー非含有糖鎖供与体との結合を形成させる場合には、例えば、一般式（１）中のＸ１〜Ｘ６の少なくとも一つの糖質由来の基が酸性糖残基を有していれば、当該リンカー非含有糖鎖供与体をそのままリンカーとの結合に用いることができるので好ましい。一方、酸性糖残基を有していない場合には、糖質由来の基中のオリゴ糖残基に酸性残基等の官能基を導入したものを用いることができる。官能基の種類としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、イソシアネート基、水酸基、エポキシ基等が挙げられる。
【００７９】
なお、糖質由来の基のオリゴ糖残基とリンカーに用いる化合物との結合種、及びクリック反応基を有する化合物とリンカーに用いる化合物との結合種はどのようなものであってもよく、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、及びスルホ基を介した結合等が挙げられる。
【００８０】
一般式（１）において、Ｙ１は酸素原子、窒素原子、炭素原子及び硫黄原子がＧｌｃＮＡｃの１位の炭素に直接結合する構造を含む置換基が挙げられる。
Ｙ１としては、糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率を低下させるものでなければ、特に限定されない。例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミノ基、アミド基、イミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基又はハロゲン基が挙げられ、これらの基の中で、アルコキシ基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミド基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基及びアリールスルホニルオキシ基は、さらに置換基を有していてもよい。
【００８１】
以上の中でも、糖鎖供与体としての調製のしやすさから、Ｙ１はヒドロキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜３０のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルケニルオキシ基、置換基を有していてもよいアミド基が好ましい。
【００８２】
さらに、糖鎖供与体としての調製のしやすさ及び糖鎖転移収率の観点から、Ｙ１は炭素数１〜１０の置換基を有していてもよいアルコキシ基、炭素数２〜１０の置換基を有していてもよいアルケニルオキシ基、炭素数６〜２４の置換基を有していてもよいアリールオキシ基が好ましく、さらに炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケニルオキシ基、炭素数６〜１２の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアミド基が特に好ましい。
具体的には、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基などが挙げられる。
【００８３】
また、置換基を有していてもよいアミド基としては、ペプチド又は蛋白質のアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基であることが好ましく、反応溶液中への溶解度及び糖鎖転移収率の観点からはペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基がより好ましく、さらに下記Ｎ−１及びＮ−２に示すようなアミド基であることが最も好ましい。
【００８４】
【化８】
2016076440.tif 000010
（Ｎ−１はＧｌｃＮＡｃに結合したアスパラギン、Ｎ−２はＧｌｃＮＡｃに結合したアスパラギンを含むヘキサペプチド（ペプチド部分の配列はＬｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）を示す。＊はＧｌｃＮＡｃの１位との結合位置を示す。）
【００８５】
また、上記の置換されていてもよい置換基は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数６〜１２のアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、ピリジル基から選択される少なくとも１つであり、置換基が２以上ある場合には、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００８６】
上記のような糖鎖を調製する方法としては、天然から抽出する方法もしくは化学的に調製する方法が考えられる。複合型糖鎖の中でも、糖残基数の多い糖鎖供与体、例えば８糖以上のオリゴ糖残基を有する糖鎖供与体は、調製の容易さから、卵黄から抽出する方法（例えば国際公開９６／２２５５パンフレット及び特開２０１１−２３１２９３号公報）や、これらの方法とエキソグリコシダーゼ、例えば市販のシアリダーゼ、ガラクトシダーゼもしくはＮ−アセチルβグルコサミニダーゼを組み合わせることによって、比較的容易に糖鎖供与体を調製することができる。
天然から抽出する方法によって直接に得られる糖鎖供与体は、一般式（１）におけるＹ１がアスパラギンを含むペプチドであるが、アルコキシ基を含む糖鎖供与体においては、調製における容易さから、上記の天然から抽出する方法で得られた糖鎖供与体を、Ｎ１７５Ｑ変異体の作用によって、糖鎖受容体となるアルコキシ基を有するＧｌｃＮＡｃ誘導体に糖鎖転移することで得ることができる。このような糖鎖転移によって調製する方法は、例えば特開平１０−４５７８８号公報に記載されている。
【００８７】
一方、例えば７つ以下のオリゴ糖残基を有する糖鎖供与体は、上記の方法でもよいし、化学的な合成法によっても調製することができる。化学的な調製法としては、例えば、Ｗａｎｇらの文献[J.Am.Chem.Soc.,Vol.134(29),12308(2012)]に記載の方法によって調製することができる。
【００８８】
また、上記の糖鎖供与体を用いたＩｇＧの製造方法としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの存在下、上記の糖鎖供与体とＧｌｃＮＡｃ−ペプチド又はＧｌｃＮＡｃ−蛋白質とを反応させることで、ＩｇＧを製造することもできる。さらに、糖鎖転移した後に、エキソ型の糖加水分解酵素や糖転移酵素とを組み合わせ、非還元末端側の糖残基もしくはオリゴ糖残基を除去もしくは付加させることによって、所望する複合型糖鎖を有するＩｇＧを得ることもできる。
【００８９】
上記クリック反応基含有糖鎖供与体としては、調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点から、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーが水溶性ポリマーに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が１〜４であり、上記一般式（１）中のＹ１は、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜３０のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルケニルオキシ基及び置換基を有していてもよいアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることが好ましい。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が１又は２であり、上記一般式（１）中のＹ１は、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケニルオキシ基、炭素数６〜１２の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることがより好ましい。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が１又は２であり、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方が、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃ、ＧｌｃＡ及びＧｌｃＮＡｃＡから選ばれる酸性糖残基の少なくとも一つを含み、上記一般式（１）中のＹ１は、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基及びペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることが特に好ましい。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が１又は２であり、前記一般式（１）中のＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ１が水素原子であり、Ｘ１およびＸ2の両方もしくは片方がＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２及びＧｌｃＮＡｃＡβ１−２のいずれか一つであり、Ｙ１は、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基、アルキル基及びペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることが最も好ましい。
【００９０】
上記クリック反応基含有糖鎖供与体としては、具体的には以下のものを挙げることができるが、本開示の製造方法はこれらに限定されるものではない。
【００９１】
【化９】
2016076440.tif 000011
【００９２】
【化１０】
2016076440.tif 000012
【００９３】
【化１１】
2016076440.tif 000013
【００９４】
【化１２】
2016076440.tif 000014
【００９５】
上記の一般式（４−１−１）〜一般式（４−４−２）中、ｎは、それぞれ独立に、１以上の整数を表し、１〜２０であることが好ましい。
【００９６】
（糖鎖受容体）
本開示における糖鎖受容体としては、ＧｌｃＮＡｃを含み、ＧｌｃＮＡｃの１位がペプチド又は蛋白質に結合したものであれば、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を阻害するものでない限り、特に限定されない。
しかし、糖鎖受容体としての調製のしやすさ及び糖鎖転移収率の観点から、下記一般式（２）で表される糖鎖受容体であることが好ましい。
ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２    一般式（２）
（一般式（２）中、Ｒ２はアスパラギン残基を含むペプチド又は蛋白質を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。）
【００９７】
ＧｌｃＮＡｃ−ペプチドやＧｌｃＮＡｃ−蛋白質としては、上記に記載した糖ペプチド又は糖蛋白質のＮ−結合型糖鎖の非還元末端部位を除去したものが挙げられる。また、天然に存在する糖蛋白質におけるＮ−結合型糖鎖が結合するアスパラギンのＣ末端側には、アスパラギンから２つ目のアミノ酸残基が必ずスレオニン残基かセリン残基であることが知られているが、本開示における糖鎖受容体においても同様である。
【００９８】
本開示の糖鎖受容体としてのＧｌｃＮＡｃ−ペプチド又はＧｌｃＮＡｃ−蛋白質は、上記の糖ペプチド又は糖蛋白質から、市販のエンド酵素や自家調製したエンド酵素の加水分解処理によって調製することもできるし、アスパラギンにＧｌｃＮＡｃが結合した糖アミノ酸の誘導体において、アミノ酸部位を順次伸長する方法（特許文献、特開平１０−４５７８８号公報）で糖ペプチドを調製することもできる。
【００９９】
市販のエンド酵素としては、エンドＭ（東京化成工業社製），エンドＨ（ニューイングランドバイオラボ社製)、エンドＳ(シグマ−アルドリッチ社製)，エンドＤ(コスモバイオ社製)，エンドＦ１〜Ｆ３(シグマ−アルドリッチ社製）などが挙げられる。また、市販されていない酵素としては、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼ、又はＧＨファミリー１８に属し、かつＮ−結合型糖鎖を加水分解する酵素であることが示されているものを挙げることができる。
【０１００】
〜ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ〜
本開示の一実施形態においては、糖鎖受容体として、定常領域にＧｌｃＮＡｃ基が結合したＩｇＧ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ）を用いることができる。この中でもＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ１であることが好ましい。
本開示におけるＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧとは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を製造するために用いられる糖鎖受容体であり、１つの定常領域に１つのＮ−アセチルグルコサミニル基（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。したがって、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧとしては、２つの定常領域に２つのＧｌｃＮＡｃが結合したものと、１つのＧｌｃＮＡｃが結合した１つの定常領域とＧｌｃＮＡｃが結合していない定常領域のものの２種が存在する。本開示においては、両方のＩｇＧを含む。
【０１０１】
糖鎖受容体の調製に用いられるＩｇＧの調製方法としては、市販の抗体医薬品の成分であるＩｇＧを用いてもよいし、抗体遺伝子を導入した細胞を用いた方法によって調製されたものを用いてもよいし、酵母によって調製されたものを用いてもよい。
また、糖鎖受容体の調製に用いられるＩｇＧのフコースの含有率としては、ＡＤＣＣ活性の点から、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましく、特に１０％以下であることが好ましい。
【０１０２】
ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧの製造方法としては、国際公開第２０１３１２００６６号に記載されているように、ＩｇＧをエンド酵素、もしくはエキソ型の糖質加水分解酵素で処理することによって得ることができる。エンド酵素としては、例えば、市販の酵素、エンドＭ（東京化成工業社製），エンドＨ（ニューイングランドバイオラボ社製)、エンドＳ(シグマ−アルドリッチ社製)，エンドＤ(コスモバイオ社製)，エンドＦ１〜Ｆ３(シグマ−アルドリッチ社製）などが挙げられる。また、市販されていない酵素としては、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼ、及びＧＨファミリー１８に属するエンテロコッカスフェカリス由来のエンド酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＲ２０４７７）を調製したものを用いてもよい。これらのエンド酵素は、ＩｇＧが含有するＮ−結合型糖鎖の種類によって、単独でも組み合わせて用いてもよい。
上記のエンド酵素の中でも、ＩｇＧが有する様々な種類の糖鎖を加水分解することができる点において、エンドＭが最も好ましい。
【０１０３】
本開示のＩｇＧの好ましい製造方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して９０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、一般式（１）で表される糖鎖供与体と、糖鎖受容体であるＩｇＧ１とのモル比率（糖鎖供与体のモル数／糖鎖受容体のモル数）を５０以上で反応することにより製造する方法である。
【０１０４】
（反応）
本開示の反応は、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログ、糖鎖供与体及び糖鎖受容体を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を阻害しないものでれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖転移活性の点から、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖転移活性の点から、１０ｍＭ〜２５０ｍＭが好ましく、２０ｍＭ〜１５０ｍＭがより好ましく、より好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭである。１０ｍＭ以上とすることで緩衝能力を高め、２５０ｍＭ以下とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を高め、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
【０１０５】
また、反応における溶液のｐＨは、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高める観点から、５．５〜８．５が好ましく、６．０〜８．０がより好ましく、６．５〜７．５が特に好ましい。
【０１０６】
糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法においては、糖鎖転移収率の観点から、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル濃度/糖鎖受容体のモル濃度）は、０．１以上であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、１以上であることが特に好ましく、３以上であることが最も好ましい。モル比率が０．１以上であることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を高めて反応時間を短縮化することができ、かつ糖鎖転移収量及び糖鎖転移収量を高めることができる。
【０１０７】
また、糖蛋白質であるＩｇＧの製造方法においては、糖鎖転移収率の観点から、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数）は、５以上であることが好ましく、１５以上であることがより好ましく、２５以上であることが特に好ましい。モル比率を５以上とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を高めて反応時間を短縮化することができ、かつ糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
【０１０８】
一方、糖鎖供与体製造における経済的な観点からは、前記モル比率は０．５〜２０であることが好ましく、さらに１〜１０であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。０．５以上であることで、より糖鎖転移収率を高め、２０以下であることで糖鎖供与体製造においてより経済的である。
【０１０９】
反応における温度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の観点、糖鎖転移収率、糖鎖転移収量を高める観点及び糖鎖受容体やエンドＭ変異体等の安定性の観点から、４℃〜４５℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがより好ましく、２５℃〜３５℃であることが特に好ましい。４℃以上とすることで、エンドＭ変異体等の糖鎖転移活性を高めることができ、３５℃以下とすることで、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
また、不安定な糖鎖受容体への糖鎖転移反応を行う場合には、上記の温度範囲の中でもできるだけ低い温度での反応、すなわち４℃〜１０℃での反応が好ましく、特に４℃での反応が好ましい。
【０１１０】
ＩｇＧを糖鎖受容体に用いる場合の、反応時間としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の観点と糖鎖転移収率の観点から、５時間〜１００時間であることが好ましく、２０時間〜７０時間であることがより好ましく、３５時間から５０時間であることが特に好ましい。反応時間を５時間以上とすることで、糖鎖転移収率を高め、１００時間以下とすることで、糖鎖転移収量を高めることができる。また、反応方法としては、反応の糖鎖転移収率をさらに高める観点から、一定時間の反応後に、再度、反応溶液中に糖鎖供与体とエンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログを添加して、一定時間反応させることが好ましい。
【０１１１】
ＩｇＧを糖鎖受容体に用いる場合の、反応における糖鎖供与体の反応溶液中における濃度としては、糖鎖転移収率の観点から、１μＭ〜１５０μＭが好ましく、１μＭ〜５０μＭがより好ましく、１０μＭ〜５０μＭが特に好ましい。
【０１１２】
（糖蛋白質を含有させた医薬用組成物）
本開示で製造される糖ペプチド又は糖蛋白質は、製造方法として固体、動物組織及び細胞等を使用しないので、外部からの夾雑物又はウィルスなどは混入する可能性は極めて低いので、安全かつ機能を維持した医薬用組成物や薬品の構成成分として提供できる。また、医薬用組成物は、本開示の一実施形態によって製造された糖ペプチド又は糖蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。
また、本開示の一実施形態で製造されるＩｇＧは、特定の複合型糖鎖を高含有率で有するＩｇＧであるため、医薬用組成物として極めて有用である。本開示による製造方法によって、所望される糖鎖構造のみを持ったＩｇＧを調製できるため、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性、及び血中安定性の効果の程度をあらかじめ予想できるような抗体医薬の調製に貢献できる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本開示の製造方法を実施例によって詳細に説明するが、本開示の製造方法の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。【０１１４】
<糖鎖受容体>
本実施例で用いられる、糖鎖受容体の調製に用いられる市販のモガムリズマブ製剤（協和発酵キリン社製）はＩｇＧ１であり、以下の性質を有する。
・分子量：１４９０００
・糖鎖構造：Ｇａｌが０〜２個付加したＦｕｃの含まない複合型糖鎖を主に含有し、Ｇａｌが０〜２個付加したＦｕｃを含む複合型糖鎖及びその他のＮ−結合型糖鎖を含む
・構造：可変領域の一部がマウス型に置換されたヒト型ＩｇＧ１
・機能：ＣＣケモカイン受容体４を抗原とする
・調製：モガムリズマブをコードする遺伝子発現構成体をチャイニーズハムスター卵巣細胞に導入し、その後に発現誘導を行って調製
<エンドＭ変異体>
本実施例で用いられる、エンドＭ変異体は、Ｎ１７５Ｑ変異体（東京化成工業社製、グライコシンターゼリコンビナント）を用いた。【０１１５】
<各種試薬>
糖鎖供与体の調製、糖鎖受容体の調製及び各種測定に用いた試薬は特に記載がない場合、東京化成工業社製のものをそのまま使用した。【０１１６】
<各種測定方法>                    
ＩｇＧ等の精製におけるクロマトグラフィーは、ＧＥヘルスケア社製のＰｒｏｔｅｉｎＡ−セファロースを用いたカラム操作により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。カラムは孔径１０ｍｍで長さが９０ｍｍの簡易カラム（バイオラッド社製）に単体を充填し、所定の緩衝液で平衡化した後に使用した。【０１１７】
ＣＥによる測定は、キャピラリーカラム（長さ３０．２ｃｍ×孔径５０μｍ、ベックマンコールター社製、ペアーヒューズドシリカ）を備えたベックマンコールター社製のＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＡ８００を用い、下記分析条件にて行った。
・分析条件：試料注入後、２５℃、１５ｋｖの電圧で３０分間測定
・検出波長：２００ｎｍ
なお、ＣＥ測定では、測定の前に、還元条件もしくは非還元条件にてあらかじめサンプルの前処理を行った。還元処理を行う理由は、図１に示すように、ＩｇＧのＳ−Ｓ結合が切断されて、分子量の大きい重鎖と分子量の小さい軽鎖を生じさせた後にＣＥ測定することで、非還元処理の場合よりも、試料中の糖鎖転移した重鎖と糖鎖転移していない重鎖とのピーク分離がよく、反応の確認が容易になるためである。なお還元処理後の試料は、試料溶液に対し５０ｍＭのジチオトライトール（ＤＴＴ）を加えて、１００℃にて１０分インキュベートして得られるものを用いた。【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定は、市販のスラブゲル用の装置（アトー社製のＡＥ−６５３０）において、１５％のポリアクリルアミドゲル（アトー社製のｅ−ＰＡＧＥＬ）を用い、２０ｍＡで７０分間電気泳動後に、ゲルをクマシブリリアントブルーで染色し、得られたゲルを評価した。マーカーとしては、ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｍｕｌｉ  ＣｏｌｏｒＩＩＩ（Ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用いた。なお、検出においては、市販のクマシブリリアントブルーを用いる方法で行った。
また、蛋白質の溶液中での濃度は、該溶液に２８０ｎｍのＵＶ透過光を照射して得られる吸光度を一般的なＵＶ検出器により測定することで見積もられた。【０１１９】
レクチンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、市販のスラブゲル用の装置（アトー社製のＡＥ−６６８７）で行った後、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）に
ブロティング装置（アトー社製、Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｐａｐｅｒ  ＣＢ−０９Ａ）を用い、泳動後のゲルを、1ｍＡ／ｃｍ２で６０分ブロットすることで転写させ、得られた膜を、その後のレクチン染色に供した。なおマーカーは、上記と同じものを用いた。【０１２０】
ＮＭＲ測定においては、日本電子社製ＥＣＡ−４００を使用した。【０１２１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定は、ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタシステムを用いて行った。【０１２２】
ＨＰＬＣ測定においては、ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  Ｌ２０００シリーズシステム（日立ハイテクノロジーズ社製）にカラムＭｉｇｈｔｙｓｉｌＲＰ−１８（関東化学社製）を接続し、溶離液として０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む水とのグラジエント勾配を有する溶液を用い、検出波長を２１０ｎｍとした。【０１２３】
〔実施例1〕
<糖鎖受容体の調製>            
上記の市販のモガムリズマブ製剤１８ｍｇを、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．２５、１５ｍｌ）に溶解させ、膜濃縮装置［分画分子量１００００、アミコンウルトラ１５（メルクミリポア社製）］にて４℃で、緩衝液の交換を行った。上記によって得られたモガムリズマブ（ＩｇＧ１）１８ｍｇをリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．２５、１５ｍｌ）に溶解し、３７℃でエンドＭの１．５ユニット（Ｕ）（約０．６００ｍｇ）を加え恒温槽中（ＥＹＥＬＡ社製、ＴＨＥＲＭＩＳＴＯＲ  ＴＥＭＰＰＥＴ  Ｔ−８０）で振盪しながらインキュベートした。反応溶液は経時的にＣＥで分析し、図１及び図２のように、ＩｇＧから、Ｎ−結合型糖鎖のエンドＭによる加水分解が完全に行われることを確認するまでＣＥによる検出を続けた。【０１２４】
４８時間後、反応溶液をＧＥ社製のプロテインＡ−セファロース担体（０．７ｍｌ）が充填されたカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィー操作においては、カラムに反応後の溶液を添加後、はじめにＴＢＳ［トリス-塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）］７ｍｌで洗浄し、その後クエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ３．０．５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）７ｍｌで、結合したＩｇＧを溶出させた。溶出液は直ちにトリス-塩酸緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）で中和した後、膜濃縮装置［分画分子量１００００、アミコンウルトラ１５（メルクミリポア社製）］を用い、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）で、ｐＨが中性になるまで何度も緩衝液の添加と遠心濃縮を繰り返した。なお、図１が示すように、反応時間５時間後、２４時間後の試料も同様な操作によって下記のＣＥ測定用の資料を得た。【０１２５】
以上の操作により、反応時間が４８時間であった場合に得られたＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ（糖鎖受容体）は１４．６ｍｇであった。
反応の経過は図１及び図２に示す。これらの結果から、還元処理後のＣＥ測定による結果（図１）も、非還元処理後のＣＥ測定による結果（図２）も、２４時間後では、原料であるＩｇＧのピークが完全に消滅し、保持時間の短い場所に、新たなピークが生成していることが示された。以上により、原料のＩｇＧがエンドＭにより加水分解されて、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧがほぼ定量的に生じていることが示された。【０１２６】
<糖鎖供与体>
本実施例で用いられる、糖鎖供与体は、シアログライコペプチド（ＳＧＰ、東京化成工業社製）であり、以下の構造を有する。なおペプチド部位のＨはアミノ末端の水素、ＯＨはカルボキシル末端の水酸基を示す。【０１２７】
【化１３】
2016076440.tif 000015
【０１２８】
<糖鎖転移反応>
上記にて得られたＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ（糖鎖受容体）１２．０ｍｇを、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、１．２ｍｌ）に溶解させ、Ｎ１７５Ｑ変異体（エンドＭ変異体）３．６Ｕ（３．６ｍｇ）及び、ＳＧＰ（糖鎖供与体）６９．７ｍｇを加え（最終濃度２４．６μＭ）、恒温槽にて３０℃で振盪させながらインキュベートした。糖鎖転移反応の経過は、上記の所定時間のインキュベート後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、直接ＣＥ測定を行うことで、確認した。インキュベートしはじめてから４８時間後、再度、Ｎ１７５Ｑ変異体３．６Ｕ（３．６ｍｇ）及び、ＳＧＰ（東京化成工業社製）６９．７ｍｇ（２４μＭ）を加え、さらに２２時間インキュベートした。【０１２９】
上記で得られたＩｇＧを含む溶液１ｍｌ（ＩｇＧの含有量は１２．０ｍｇ）は、プロテインＡ−アガロース担体（０．７ｍｌ）が充填されたカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーに供された。クロマトグラフィーにおいては、実施例１の糖鎖受容体の調製における操作と同様に行った。得られた均一な糖鎖が付加したＩｇＧは６．６ｍｇであった。【０１３０】
<糖鎖転移反応後の測定>
上記で行った各反応時間におけるＣＥ測定の結果は図３及び図４に示す。また、各反応時間におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。また、ＣＥ測定における標準物質はベックマンコールター社製の１０ｋｄａリファレンスマーカーを用いた。図３及び図４中に「１０ｋＤ」として示す。【０１３１】
図３及び図４の結果から、時間の経過とともに、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧのピークが減少する一方で、複合型糖鎖を有するＩｇＧのピークが増加することが示された。特に、複合型糖鎖を有するＩｇＧのピークはあまり減少せず、さらに７０時間後には、ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧのピークがほとんど見られなくなるまで減少した。
また、図５の結果から、０時間におけるＩｇＧの重鎖のバンド（分子量４５ｋＤａ〜５０ｋＤａ付近）が、２４時間後のレーンではかなり消失し、代わりに２ｋＤａ程度高分子量側に新たなバンドが現れ、７０時間後では、ＩｇＧの重鎖のバンドがほぼ消失した。【０１３２】
上記で得られた反応後のＩｇＧを含む溶液の一定量を上記のレクチンブロットに記載の方法で、ＰＶＤＦメンブレンに転写（ブロッティング）させた。メンブレンを０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有したＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、１％の牛血清アルブミン（１％ＢＳＡ）を含むＴＢＳＴで１時間常温にてブロッキングを行った。ブロッキング後、メンブレンをＴＢＳＴで５分間３回洗浄した後に、ビオチン化ＳＳＡレクチン（Ｊ−オイルミルズ社製）を２μｇ／ｍｌの濃度で加え、２時間常温にてインキュベートさせた。インキュベート後、メンブレンをＴＢＳＴで５分間、室温で３回洗浄した後に、ホースラディッシュ  パー  オキシダーゼ化ストレプトアビジン（ベクター社製）を２μｇ／ｍｌの濃度で２時間常温にてインキュベートさせた。インキュベート後、メンブレンをＴＢＳＴで５分間、室温で３回洗浄した後に、ＤＡＢ  ＨＲＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ベクター社製）を添加し、発色したバンドを目視で検出することで、α２−６結合したＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃの含有の有無を判断した。結果を図６に示す。【０１３３】
結果から、エンドＭ処理の前及びエンドＭ処理後のレーン１及びレーン２ではバンドが見られず、糖鎖転移反応を行った後のレーン３（矢印の部分）では、４５〜４８ｋＤａ付近の重鎖のバンドの数ｋＤａ上部に明らかなバンドが現れた。このことから、糖鎖転移反応後のＩｇＧ（モガムリズマブ）は、α２−６結合したシアル酸の構造を含む複合型糖鎖を有していることが示された。
以上の結果から、糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧに対し、エンドＭ変異体の作用によって、糖鎖供与体の糖鎖供与部分が効率よく転移し、複合型糖鎖を高含有で有するＩｇＧが得られることが示された。また、比較的長時間において反応を行っても、徐々にＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧが減少していることから、糖鎖供与体自体が安定に溶液中に存在し、エンドＭ変異体の基質としての役割を有していることが示された。【０１３４】
〔実施例2〕
<糖鎖受容体>
糖鎖受容体としては、実施例１に用いた糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ（市販のモガムリズマブ製剤のＮ結合型糖鎖を酵素処理したもの）をそのまま用いた。【０１３５】
<糖鎖供与体（化合物Ａ−１）の調製>
下記構造を有するジシアロノナサッカライド−β−Ｏ-ｐＮＰ（東京化成工業社製、製品番号Ｎ０９１３）の１．００ｇ（０．４２６ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ５０ｍｌを加えて４０℃に加熱して溶解させた。その後、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（ＭＷ＝２１８．２４）２．５４ｍｌ（１２．８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２．２０ｍｌ（１２．８ｍｍｏｌ）、１−シアノ−２−エトキシ−２−（オキソエチリデンアミノキシ）ジメチルアミノ−モルホリノカルベニウムヘキサフルオロフォスフェート５．４８ｇ（１２．８ｍｍｏｌ）を加えて２０時間撹拌した。−Ｏ-ｐＮＰはパラニトロフェノキシ基を表す。【０１３６】
【化１４】
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【０１３７】
反応の完了を、薄層クロマトグラフィー〔展開溶液；酢酸エチル／メタノール／水／酢酸＝８／６／４／１、ｖ／ｖ〕を用い、Ｒｆ値が０．１８付近に現れる出発物質の消失によって確認した。反応後の溶液を減圧濃縮することで得た粗体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（充填剤：ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア社製）、溶出液：メタノール）にて分離した後に、溶媒を除去し、生成物（化合物Ａ−１（６４２ｍｇ））を得た。生成物について、ＮＭＲ測定及び質量測定を行い下記の結果を得た。
・ＮＭＲ測定
1H-NMR (400 MHz,D2O) δＨ: 8.12 (2H, d, Ph), 7.04 (2H, d, Ph), 5.18 (1H, d, H-1(GlcN)), 5.00 (1H, s, H-1(Man)), 4.81 (1H, s, H-1(Man)), 4.50 (1H, d, H-1(GlcN)), 4.46 (2H, d, H-1 x2(GlcN)), 4.31 (2H, d, H-1 x2(Gal)), 4.12 (1H, s, H-2(Man)), 4.06 (1H, s, H-2(Man)), 3.98 (1H, s, H-2(Man)), 3.93 (2H, t), 2.57 (2H, dd, H-3eq x2(Neu)), 1.97 (3H, s, CH3), 1.92 (6H, s, CH3 x2), 1.90 (6H, s, CH3 x2), 1.88 (3H, s).
・質量測定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１０６Ｈ１７３Ｎ１５ＮａＯ６８＋：２７６７．０４；ｆｏｕｎｄ：２７６７．５５
以上の測定結果から、糖鎖供与体である化合物Ａ−１を、収率５５％で得られたことを確認した。【０１３８】
<糖鎖転移反応>
糖鎖受容体ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧの４．０ｍｇを、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、０．４ｍｌ）に溶解させ、Ｎ１７５Ｑ変異体（エンドＭ変異体）１．２Ｕ（１．２ｍｇ）及び、化合物Ａ−１（糖鎖供与体）２２ｍｇを加え（最終濃度１６μＭ）、恒温槽にて３０℃で振盪させながらインキュベートした。所定時間後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、直接ＣＥ測定を行うことで、糖鎖転移反応の経過を確認した。インキュベートしはじめてから２２時間後に、再度、Ｎ１７５Ｑ変異体１．２Ｕ（１．２ｍｇ）、及び化合物Ａ−１（糖鎖供与体）２２ｍｇ（２４μＭ）を加え、さらに２２時間インキュベートした。なお、化合物Ａ−１中のアジド基を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来の構造を有するリンカーに相当する部分を、単にＮ３-ＰＥＧと称し、前記アジド基を含むリンカーが結合したジシアログリカン（ＳＧ）に相当する部分を、単にＮ３-ＰＥＧ-ＳＧと称することがある。また、ＳＧとは、上記のジシアロノナサッカライド−β−ｐＮＰ中におけるパラニトロフェノキシ基以外の部分を示す。
また、実施例中、糖鎖供与体中の糖鎖構造を有する部分、例えば、ＳＧＰの中のジシアログリカン（ＳＧ）に相当する部分を単に糖鎖部分と称することがある。【０１３９】
上記で得られたインキュベート後の溶液０．４ｍｌ（ＩｇＧの含有量は４．０ｍｇ）について、実施例１の糖鎖受容体における操作と同様に、プロテインＡ−アガロース担体（０．２ｍｌ）を充填したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによる精製を行い、ＩｇＧ画分として１．７ｍｇを得た。【０１４０】
<糖鎖転移反応後の測定>
上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについて、ＣＥ測定を行った結果を図７に示す。図７中の（ａ）は、インキュベートを開始した直後（０時間後）の生成物のＣＥ測定による結果を示し、図７中の（ｂ）は、上記で行った糖鎖転移反応後（４４時間後（糖鎖供与体及びＮ１７５Ｑ変異体を追加後２２時間後））の生成物のＣＥ測定による結果を示す。また、ＣＥ測定における標準物質はベックマンコールター社製の１０ｋｄａリファレンスマーカーを用いた。図７中に「１０ｋＤ」として示す。
また、上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を行った結果を図８に示す。さらに、糖鎖受容体及び糖鎖転移反応後の生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９に示す。【０１４１】
図７の結果から、反応時間０時間（図７中の（ａ））におけるＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ（糖鎖受容体）のピークが、糖鎖転移反応後（図７中の（ｂ））にはほとんど消失し、代わりに、破線で示すＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧのピークの位置から矢印で示した高保持時間側の位置に、新しいピークが生ずることが示された。
また、図８の結果から、反応時間０時間（図７中の（ａ））ではＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ（糖鎖受容体）の還元後の重鎖に相当する質量ピークが、糖鎖転移反応後（図７中の（ｂ））にはほとんど消失した。代わりに、高質量側、すなわちＮ３−ＰＥＧが結合した複合型糖鎖（Ｎ３−ＰＥＧ−ＳＧ）分の分子量が増加した位置に質量ピークが出現した。
また、図９の結果から、エンドＭ処理前の分子量４５ｋＤａ〜５０ｋＤａ付近のバンド（レーン１）が、エンドＭ処理後（レーン２）には低分子量側にシフトし、さらに、上記の糖鎖転移反応後（レーン３）には、高分子量側に新たな濃い濃度のバンドが現れた。【０１４２】
以上の図７〜９の結果から、糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧに対し、エンドＭ変異体の存在下に糖鎖供与体である化合物Ａ−１（Ｎ３−ＰＥＧ−ＳＧ−ＰＮＰ）を用いて糖鎖転移させることで、２つのＮ３-ＰＥＧ-ＳＧを有するＩｇＧ（モガムリズマブ）を高収率で得られることが示された。【０１４３】
以上の実施例１及び実施例２の結果から、キトビオシル構造を有する安定な糖鎖供与体を用いることで糖鎖受容体に対し糖鎖転移反応が効率よく進行し、所望の糖鎖供与部分を有する糖蛋白質を高収率で製造可能であることが示された。【０１４４】
〔実施例3〕
<糖鎖受容体>
ＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−ｐＮＰ（東京化成工業社製）をそのまま用いた。【０１４５】
【化１５】
2016076440.tif 000017
【０１４６】
<糖鎖供与体（化合物１１０）の調製>
糖鎖供与体に用いるＧｌｃＮＡｃＡ−Ｍ３ＧＮ２−ＭＰ（化合物１１０）は、石田らの文献[SFG-JSCR, Joint Meeting November,16-19(2014)]に記載された合成方法を参考にして、図に示すような合成経路によって合成した。すなわち、公知の化合物１０２と、市販の化合物１０１を反応させ６糖を構築した後脱保護し、４−メトキシフェニル３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド―β―Ｄ−グルコピラノシドとのグリコシル化反応によって７糖を構築した。続いて７糖を脱保護し、更にアセチル化してアセトアミド体へと誘導し、該アセトアミド体の非還元末端ＧｌｃＮＡｃのベンジリデンアセタールを選択的脱保護した後、６位を選択的にカルボン酸へと変換した。その後、接触水素添加法によりベンジルエーテル基を脱保護することで、非還元末端にＧｌｃＮＡｃＡを有する化合物１１０を得た。なお、ＭＰとは、パラメトキシフェニル基を示す。【０１４７】
（化合物１０３の合成）
設楽らの文献[J. Biol. Chem. Vol.278,3466-3473(2003)]を参考にして合成できる公知の化合物１０２の５００ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）と、市販の化合物である４−メトキシフェニル−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−フタルイミド-β-Ｄ−グルコピラノシド（東京化成工業社製、製品番号Ｍ１６０９）７００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）とを塩化メチレン１２ｍＬに溶解させ、さらにモレキュラーシーブを添加して溶液内を脱水乾燥させた。溶液を−２０℃に冷却し、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸を１０μＬ（０．０５６ｍｍｏｌ）添加し、反応させた。薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１、ｖ／ｖ）にて生成物を確認した後に、トリエチルアミンを添加することで粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー[充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ（富士シリシア社製）、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１]にて精製し、目的とする化合物１０３を収率４６％（収量３５０ｍｇ）で得た。【０１４８】
（化合物１０４の合成）
化合物１０３の３５０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をトルエン５．３ｍＬ、アセトニトリル７．０ｍＬ、イオン交換水３．５ｍＬの混合溶液に溶解させ、系内を０℃に冷却した。これに硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）を０．７ｇ（１．２８ｍｍｏｌ）加えて反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１、ｖ／ｖ）にて確認を行った。反応の終結を確認した後に、分液処理を行うことで有機層を回収し、粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ１００Ｂ （富士シリシア社製）展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）により精製し、目的とする化合物１０４を収率５７％（収量１９２ｍｇ）で得た。【０１４９】
（化合物１０５の合成）
前記化合物１０４の１９２ｍｇ（０．０７３ｍｍｏｌ）に塩化メチレン１．９ｍＬを加えて溶解させた。これを０℃に冷却し、トリクロロアセトニトリル７４μＬ（０．７３ｍｍｏｌ）、１，８−ジアザビシクロ［５.４.０］−７−ウンデセン１μＬ（０．００７ｍｍｏｌ）を加えて反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝２／１、ｖ／ｖ）にて確認を行った。反応終結を確認した後に、シリカゲル（ＰＳＱ１００Ｂ （富士シリシア社製））を用いて酢酸エチルで洗浄して濾過を行い、濾液を濃縮して粗体の化合物１０５を収率９８％（収量２００ｍｇ）で得た。【０１５０】
（化合物１０６の合成）
化合物（５）２００ｍｇ（０．０７１９ｍｍｏｌ）と４−メトキシフェニル３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド―β―Ｄ−グルコピラノシド（東京化成工業社製、製品番号Ｍ１６１５）１７１ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン３．７ｍＬに溶解させ、さらにモレキュラーシーブを加えて溶液を脱水乾燥させた。その後、溶液を−２０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホンサントリメチルシリル０．７μＬ（０．００３６ｍｍｏｌ）を加えて撹拌することで反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝３／１、ｖ／ｖ）にて確認を行った。反応終結を確認した後、トリエチルアミンを加えて中和を行った。反応後の混合液をセライト濾過した後、濾液を濃縮した後にカラムクロマトグラフィー（充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ（富士シリシア社製）、展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝６／１）にて精製を行い、目的とする化合物１０６を収率６５％（収量１５０ｍｇ）で得た。【０１５１】
（化合物１０７の合成）
化合物１０６の１５０ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）を、ｎ−ブタノール３ｍＬに溶解させ、無水エチレンジアミン１９０μＬ（２．８ｍｍｏｌ）を加えて還流撹拌することで反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝２０／１、ｖ／ｖ）にて確認を行った。生成物の確認を行い、反応が終結したことを確認した後に、無水酢酸０．９ｍＬ（９．３ｍｍｏｌ）を添加し撹拌することでアセチル化を行った。アセチル化反応の経過は、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝２０／１、ｖ／ｖ）にて確認した。反応終結を確認した後、トリエチルアミンを加えて中和を行い、さらに分液処理によって有機層を回収して粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー（充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ （富士シリシア社製）、展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝５０／１）により精製し、目的とする化合物１０７を収率８０％（収量１００ｍｇ）で得た。【０１５２】
（化合物１０８の合成）
化合物１０７の１００ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）に塩化メチレン２ｍＬを加えて溶解させた。これに室温で８０％トリフルオロメタンスルホン酸水溶液を、反応液が濁らない程度加えて室温で撹拌させることで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝２０／１、ｖ／ｖ）にて確認した。反応終結を確認した後、反応液を分液処理し、有機層を回収して粗体を得た。得られた粗体はカラムクロマトグラフィー[充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ （富士シリシア社製）、展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝３０／１]にて精製を行い、目的とする化合物１０８を収率５２％（収量４８ｍｇ）で得た。【０１５３】
（化合物１０９の合成）
化合物１０８の２４ｍｇ（０．００８９ｍｍｏｌ）にアセトニトリル０．５ｍＬを加えて溶解させ、続いて０．７４Ｍに調製したリン酸バッファー０．１２ｍＬを加えた。これに過塩素酸ナトリウム１．６ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）、２，２，６，６，−テトラメチルピペリジン １−オキシ フリーラジカル０．２ｍｇ（０．００１８ｍｍｏｌ）、次亜塩素酸ナトリウム１２％水溶液５μＬ（０．００１８ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温にて撹拌することで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝３／１、ｖ／ｖ）にて確認した。反応終結を確認した後、反応液は分液処理を行い、有機層を回収した。得られた粗体はカラムクロマトグラフィー[充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ（富士シリシア社製）、展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝１０／１]にて精製を行い、目的とする化合物１０９を収率５５％（収量１３ｍｇ）で得た。【０１５４】
（化合物１１０の合成）
化合物１０９の１３ｍｇ（０．００４７ｍｍｏｌ）に酢酸エチル１．６ｍＬ、エタノール１．６ｍＬ及びイオン交換水０．８ｍＬを加え溶解させた。これに水酸化パラジウム１３ｍｇを添加し、水素雰囲気下室温で一晩撹拌することで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル／メタノール／水／酢酸＝２／２／１／０．１、ｖ／ｖ）にて確認した。反応終結を確認した後、試薬を濾別し、得られた粗体はゲル濾過クロマトグラフィー（充填剤：ＧＥヘルスケア社製セファデックスＧ−１０、溶出液：イオン交換水）にて精製を行い、目的とする化合物１１０を収率９３％（収量６．５ｍｇ）で得た。
・ＮＭＲ測定
1H-NMR (D2O) δ: 7.03 (2H, dd, J = 8.9, 2.1 Hz, Ph), 6.95 (2H, dd, J = 9.2, 1.8 Hz, Ph), 5.11 (1H, s, H-1(Man)), 5.03 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-1(GlcN)), 4.90 (1H, s, H-1(Man)), 4.62 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-1(GlcN)), 4.57 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-1(GlcN x2)), 4.24 (1H, s, H-1(Man)), 4.17 (1H, s, H-2(Man)), 4.10 (1H, s, H-2(Man)), 2.07 (3H, s, CH3), 2.05 (6H, s, CH3 x2), 2.03 (3H, s, CH3).
・質量測定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６４Ｈ９２Ｎ４Ｏ３９：１４５０．５３；ｆｏｕｎｄ：１４５０．１９
以上の測定結果から、目的とする化合物１１０を、収率５５％で得られたことを確認した。【０１５５】
<糖鎖転移反応>
糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−β−エチルアジド（東京化成工業社製）の０．６２５μｍｏｌを、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、０．０１ｍｌ）に溶解させ、Ｎ１７５Ｑ変異体（エンドＭ変異体）１０ｍＵ（１．０ｍｇ）及び、糖鎖供与体である化合物１０の０．７９μｍｏｌを加え（モル比率：糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数＝１．２６４）、恒温槽にて３０℃で振盪させながらインキュベートした。１時間後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、ＨＰＬＣ測定を行うことで、糖鎖転移反応の経過を確認した。【０１５６】
<糖鎖転移反応後の測定>
上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについて、ＨＰＬＣ測定を行った結果を図１０及び図１１に示す。図１０は、反応時間０時間後における結果を示し、図１１は、反応時間１時間後における結果を示す。図１０及び図１１中の「糖鎖受容体」は、ＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−エチルアジドを示し、「糖鎖供与体」は化合物１１０ある。図１１中の「ＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−ＭＰ」は、化合物１１０の１時間後での加水分解後生成物を示し、「転移物」は化合物１１０の還元末端が、糖鎖転移反応によって、１位がβ−Ｏ−エチルアジド化された生成物、すなわち化合物１１０のβ−Ｏ−ＭＰがβ−Ｏ−エチルアジドとなった化合物を示す。【０１５７】
図１０及び図１１の結果から、反応時間０時間（図１０）における糖鎖受容体と糖鎖供与体のピーク面積が、糖鎖転移反応後（図１１））には減少し、代わりに、アクセプターのピークの位置から矢印で示した高保持時間側の位置に、新しいピークが生ずることが示された。また、ドナーの加水分解物の一部としてＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−ＭＰのピークも新たに生じた。【０１５８】
このように、糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ１−β−Ｏ−エチルアジドに対し、エンドＭ変異体の作用により、糖鎖供与体である化合物１１０が短時間で、かつ低いモル比率で、より効果的に糖鎖転移させることが示された。
また、糖鎖供与体である化合物１１０の糖鎖部分は、一般式４−１−１で表される化合物の糖鎖部分（シアログライカン（ＳＧ））よりも構造が小さいためエンドＭ変異体の基質として反応阻害を起こしにくいと推測される。このことから、化合物１１０の糖鎖部分を有する上記一般式４−２−１で表される化合物も、一般式４−１−１で表される化合物と同様に、２つのＮ３-ＰＥＧを有するＩｇＧ（モガムリズマブ）を得るための有効な糖鎖供与体となり得ることが示唆された。【０１５９】
日本出願２０１４−２３２２００の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2016076440.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016076440.tif 000028
【図１０】
2016076440.tif 000029
【図１１】
2016076440.tif 000030
【配列表】
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【国際調査報告】
2016076440.tif 000031
2016076440.tif 000032
2016076440.tif 000033
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