(57)【要約】  本発明は、植物の形質転換細胞の取得方法に関する。本発明は、以下の工程：  （ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び  （ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程を含み、  但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の形質転換細胞の取得方法であって、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含む、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない、
前記方法。
【請求項２】
第１マーカー遺伝子が、ネガティブ選抜マーカー遺伝子である、請求項１に記載の方法
【請求項３】
工程（ａ）において共形質転換に用いる所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子の混合比率が３：１ないし１：５である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法
【請求項４】
工程（ａ）に用いる所望のＤＮＡに、第２のマーカー遺伝子であるポジティブ選抜マーカー遺伝子が連結されており、
工程（ｂ）の染色体に所望のＤＮＡが導入された形質転換細胞の選択を、第２マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって行う、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法
【請求項５】
工程（ａ）が、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ポリエチレングリコール法及びウィスカー法からなる群から選択される、形質転換方法によって行われる、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法
【請求項６】
請求項１−５のいずれか１項に記載の方法で植物の形質転換細胞を取得し；
前記植物細胞を培養して植物体を得る、
ことを含む、形質転換植物の作成方法。
【請求項７】
植物の形質転換方法であって、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含む、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の形質転換細胞の取得方法及び形質転換植物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の形質転換
植物を形質転換する際には、稔実種子の後代または栄養繁殖体において外来遺伝子を維持・発現させることのできる、植物細胞へのＤＮＡ導入技術が利用される。この技術を用いて、実際に多くの単子葉植物や双子葉植物が形質転換されてきた。【０００３】
植物生理学や植物分子生物学の分野では、基礎研究のため、シロイヌナズナ、イネ、ブラキポディウムなどの形質転換体が盛んに利用されている。作物では、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ジャガイモ、トマトなどは勿論、果物類や他の野菜類でも形質転換体が作出されている。また、形質転換により高付加価値のトレイトの付与が可能なため、商業上の関心も高く、現在では、形質転換したトウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ワタが広範に商業生産されている。【０００４】
しかし、形質転換植物を作出する場合、研究的な側面および商業利用的な側面の双方で、大きな問題となっている事柄がある。それは、作出した形質転換体が、多コピーの目的ＤＮＡを保持していることが多いという事である。目的ＤＮＡが多コピー導入された形質転換植物では、個体ごとに導入遺伝子の発現量が大きくばらつき、相同性依存型ジーンサイレンシングと呼ばれる、導入遺伝子の発現が強く抑制された個体が含まれる場合が少なくない。他方、目的ＤＮＡを１コピーのみ保持する形質転換体では、ゲノム上の挿入位置に関係なく、安定した遺伝子発現を示す（Ｎａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。相同性依存型ジーンサイレンシングには、転写後型（ＰＴＧＳ）と転写型（ＴＧＳ）の２種類が存在し、両者ともに二本鎖ＲＮＡが介在して生じるが、ＰＴＧＳは、目的ＤＮＡが互いに順方向や逆向きに繋がって多コピー導入された場合や、一部欠失した目的ＤＮＡが一緒に導入された場合に生じ易い。ＴＧＳはエピジェネティクスにより発動され、一般に遺伝子上流のプロモーター領域と相同なｓｍａｌｌ  ＲＮＡを介したＤＮＡのメチル化を伴う。このメチル化は体細胞分裂や減数分裂を経ても維持され、結果としてサイレンシングが後代に遺伝する（Ｅａｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。【０００５】
また、目的ＤＮＡのゲノムへの組み込みの様相は、多コピーであればあるほど複雑になり、その解析は困難となる。従って、１）形質転換体において導入遺伝子の効果を発現レベルで評価する、２）プロモーターや転写因子の特性を形質転換体において評価する、３）Ｔ−ＤＮＡタギングライブラリーを作成する、４）商業化を目指して形質転換植物を作出するなどといった、形質転換のほとんどの目的において、目的ＤＮＡは１‐２コピーで導入されていることが望ましく、１コピーで導入されることが最も望ましい。【０００６】
植物の形質転換方法には、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）とアグロバクテリウム属細菌が持つ機能を利用する生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）が知られている。直接導入法では、目的ＤＮＡが、断片化されて導入される、高次コピー数（多い時は１００コピーに及ぶ）で導入されるといった事象が高頻度で生じる（Ｂｕｔａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。また、目的ＤＮＡが多コピー導入される場合、同一の遺伝子座に繋がって組み込まれることが多い（Ｋｏｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｌｅｉｎ，２０１０）。そのため、目的とする遺伝子が発現しないジーンサイレンシングを示す形質転換体が高頻度で出現する（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。【０００７】
アグロバクテリウム法では、ＴｉまたはＲｉプラスミドの病原性領域（ｖｉｒ領域）における遺伝子群の発現制御によって目的ＤＮＡが導入される。目的ＤＮＡは、ｖｉｒ遺伝子にコードされているタンパク質群の作用により、植物細胞と細菌の相互作用の認識とシグナル伝達、ｖｉｒ遺伝子の発現誘導、タイプＩＶ分泌経路の形成、Ｔ−ＤＮＡボーダー反復配列の認識、Ｔ−ＤＮＡ鎖の形成、Ｔ−ＤＮＡ鎖の植物細胞への移行と核への移行、そして植物核ゲノムへのＴ−ＤＮＡの組み込みなど、多くの過程を経て導入される。このため、直接導入法に比べると、目的ＤＮＡの導入コピー数は低く保たれ（１０コピー未満）、断片化されて導入されることも少ない（Ｓｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｕｔａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。アグロバクテリウム法はＤＮＡの直接導入法に比べれば優れた形質転換方法ではあるが、それでもゲノムへ導入されるＤＮＡのコピー数を十分に制御することはできない。また、複数コピーのＤＮＡが同一遺伝子座へ導入されることも珍しいことではない（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，２０００）。従って、目的とする遺伝子の発現量にある程度の個体間差が生じ、相同性依存型ジーンサイレンシングが伴う個体が生じることもある（Ｂｕｔａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｎａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。【０００８】
導入ＤＮＡのコピー数を制御する試み
このような状況を背景に、導入ＤＮＡのコピー数を制御する方法も数件報告されている。１つ目が、部位特異的組換えシステムを用いた方法である。まず、選抜マーカーを有する所望のＤＮＡの両側に、部位特異的組換え酵素の認識配列（ｌｏｘ）を逆向きで配置したＤＮＡ断片を植物へ導入する。また予めＣｒｅ発現カセットを別の植物へ導入しておく。次に、目的ＤＮＡが多コピー連結導入されたＴ０個体とＣｒｅを発現しているＴ０個体とを交配する。得られたＦ１個体では、Ｃｒｅが発現すると多コピー連結導入されたＤＮＡ領域から、その内側の順方向ｌｏｘ配列で挟まれたＤＮＡ領域だけがすべて切り出される。その結果、残存する両端のＤＮＡが結合し１コピー分の目的ＤＮＡだけを有する細胞が得られる。その細胞が生殖細胞へ分化することにより、目的ＤＮＡが１コピーまたは１コピーホモとなったＦ２個体を得ることができる（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄｅ  Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。しかしながら、交配による方法は、目的個体が得られるまで時間が掛かるという大きな欠点がある。また、エピジェネティックなＴＧＳが発動した場合には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ反応によりコピー数が減っても、所望のＤＮＡの発現は抑制されたままとなる。【０００９】
また、同じく部位特異的組換えシステムを用いた方法として、上記の目的ＤＮＡ断片とＣｒｅ遺伝子を有するＤＮＡ断片を、共形質転換（Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）する方法も報告されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｏｗ，２００１）。共形質転換したＣｒｅが発現すると、目的ＤＮＡが多コピー連結導入領域からｌｏｘ配列で挟まれた領域が切り出され、目的ＤＮＡが１コピーの植物をＴ０世代で得ることができる。しかし、共形質転換法では、Ｃｒｅ遺伝子自身が多コピー導入されれば、発現抑制によって機能しない場合がある。Ｂｕｔａｙｅら（２００５）によるレビューによれば、部位特異的組換えシステムを用いるコピー数低減方法は、理論的には可能であるが、成功例の報告が少なく、形質転換効率も低いとされている。因みに、この方法には、２つの導入ＤＮＡの間に挟まれた野生型のゲノム領域が、切り出され、欠落してしまうという問題点も指摘されている（Ｂｕｔａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。【００１０】
２つ目は、アグロバクテリウム法において、目的ＤＮＡのＴ−ＤＮＡを有するベクターの複製開始点としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｏｒｉＲｉを用いる方法である。Ｙｅら（２０１１）は、ｏｒｉＲｉ複製開始点が機能するバイナリーベクターと、ＩｎｃＰ系ＲＫ２型のＯｒｉＶ複製開始点が機能するバイナリーベクターを用いて、得られた形質転換体におけるＴ−ＤＮＡの外側に当たるベクターのバックボーン配列を含むことなく、目的ＤＮＡが１コピーで導入された個体の頻度を比較した。ｏｒｉＲｉベクターによる１コピー導入個体の頻度は、ダイズの形質転換体ではＯｒｉＶベクターの場合の２倍の３８％‐４０％、ナタネの形質転換体では１．５倍の５１％、トウモロコシ形質転換体では１．４倍の５８％を示した。その一方で形質転換効率は低減し、ダイズで４５％‐６８％、ナタネで８０％、トウモロコシで５８％を示した（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。バックボーンフリーかつ１コピー形質転換体の作出頻度に形質転換効率を加味した供試材料当りの作出効率は、ダイズで０．９６‐１．３６倍、ナタネで１．２倍、トウモロコシでは０．８２倍となった。材料あたりの作出効率が低くなったとしても、全体的に作業効率やコスト効率が高ければ、ｐＲｉバイナリーベクターは有用と言える。形質転換体の解析では、ＤＮＡの抽出とコピー数の解析にコストと労力がかかるので、ｐＲｉバイナリーベクターは全体的な効率の改善に役立つと思われる。【００１１】
３つ目は、アグロバクテリウムの染色体上にＴ−ＤＮＡを保持させ、植物の形質転換を行う方法である。Ｏｌｔｍａｎｎｓら（２０１０）は、アグロバクテリウムのＧＶ３１０１菌株およびＥＨＡ１０１菌株の染色体上のｐｉｃＡ領域へ、Ｔ−ＤＮＡを含むＤＮＡ領域を相同組換えで組み込み、トウモロコシの形質転換に使用した。そして、得られた形質転換体における１コピー導入個体の頻度を調査した。その結果、トウモロコシ形質転換体における１コピー導入個体の頻度は、ＥＨＡ１０１を用いた場合に６４％、ＧＶ３１０１を用いた場合に５８％と非常に高い値を示した。ところが、このアグロバクテリウムの染色体上にＴ−ＤＮＡを保持させる方法には、形質転換効率が低いという根本的な問題点があり、トウモロコシの形質転換効率は、ＥＨＡ１０１菌株、ＧＶ３１０１菌株ともに１％前後であった（Ｏｌｔｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。因みに、従来法であるバイナリーベクターを用いたアグロバクテリウム菌株による形質転換効率は、ＥＨＡ１０１菌株で９‐１２％、ＧＶ３１０１菌株で５‐８％を示した。Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムの染色体上に保持させるこの方法は、ＧＶ３１０１菌株を用いたシロイヌナズナのフローラルディップ法に限り、かなり有効なようである。その形質転換効率は、従来法の１．６‐２．１％に対し、０．９％と大幅には低下せず、１コピー導入個体の頻度は従来法が１６‐３５％であるのに対し８０％と非常に高かった（Ｏｌｔｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ただし、染色体バックグラウンドが同一のＥＨＡ１０１菌株に適用すると、形質転換効率は従来法の１／１０程度の０．１％程度となってしまう（Ｏｌｔｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。以上のように導入ＤＮＡのコピー数を制御する試みがなされてきたが、それぞれに問題点があり実用化には至っていない。【００１２】
共形質転換
植物における外来ＤＮＡの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、目的ＤＮＡのみが導入された形質転換体を得るために用いられることが多い。選抜マーカー遺伝子と選抜薬剤は、ほとんどが非形質転換細胞からなる植物組織から形質転換細胞を得るための大変有用なツールであるが、形質転換体が得られた後は基本的には不要となる。アグロバクテリウム法では、共形質転換は主として選抜マーカー遺伝子を次世代で除去する目的で行われる。すなわち、目的とする外来ＤＮＡと選抜マーカー遺伝子を、それぞれ別々のＴ−ＤＮＡ上に挿入し、アグロバクテリウムを介して同時に植物細胞に導入する。選抜薬剤で選ばれた細胞塊を再生させると選抜マーカー遺伝子とともに目的ＤＮＡが導入された形質転換体が得られる。もし、目的ＤＮＡと選抜マーカー遺伝子が別々の染色体に導入されていれば、遺伝的分離により、次世代において目的ＤＮＡは有するが選抜マーカー遺伝子が排除された個体を得ることができる（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。また、アグロバクテリウムを介する共形質転換法には、１菌株中の２つのバイナリーベクター上へ２つのＴ−ＤＮＡを別々に配置したタイプ、１菌株中の１つのバイナリーベクター上へ２つのＴ−ＤＮＡを配置したタイプ、２菌株の各バイナリーベクターへ２つのＴ−ＤＮＡを別々に配置し両菌株で混合接種するタイプ、１菌株の１つのバイナリーベクター上へ２つの右ボーダー配列を配置したタイプの４種類がある（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。【００１３】
また共形質転換法は、ＤＮＡの直接導入法においては、選抜マーカー遺伝子を排除する目的ではなく、遺伝子導入の前に目的ＤＮＡと選抜マーカー遺伝子を連結する事前作業を省くために用いられる。なぜなら上述したように、ＤＮＡの直接導入法は、複数の外来ＤＮＡが同じ遺伝子座に組み込まれ易いためである。実際に、ＤＮＡの直接導入法において、選抜マーカー遺伝子を排除する目的で共形質転換法を用いても、次世代で選抜マーカー遺伝子が除去できる効率は非常に低い（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。【００１４】
共形質転換を利用した場合、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子などのポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現によりＴ０個体を選抜後、Ｔ１世代でもポジティブ選抜マーカーで選抜を行うと、遺伝的分離により出現した目的ＤＮＡのみが導入されたＴ１個体はハイグロマイシンにより枯死してしまうため、選抜できない。従って、個体ではなく葉片で薬剤耐性をアッセイする方法及び／又はＰＣＲ等により導入ＤＮＡをアッセイする方法が必要となる。しかし、これらのアッセイには労力が掛かる。この労力低減には、ポジティブ‐ネガティブ選抜を用いる方法が有効である。選抜マーカーとしてポジティブ選抜マーカー遺伝子と共にネガティブ選抜マーカー遺伝子を同じＴ−ＤＮＡ上に配置しておき、Ｔ０世代でポジティブ選抜により形質転換体を獲得した後、Ｔ１世代ではネガティブ選抜を行うことにより、選抜マーカー遺伝子が導入されたＴ１個体を枯死させることができる。生き残ったＴ１個体には、もはや選抜マーカー遺伝子は含まれず、目的ＤＮＡの有無をＰＣＲや遺伝子発現で判別するのみで済ませることができる（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。【００１５】
アグロバクテリウムを介した共形質転換法を用いて、栄養繁殖性の作物にとって価値が高い、選抜マーカー遺伝子をＴ０世代で排除する試みも行われている。導入に用いるＴ−ＤＮＡは、「所望のＤＮＡ」と「ポジティブ選抜マーカー遺伝子‐ネガティブ選抜マーカー遺伝子」の２種である。報告例は２報あるが、効率は低く、どちらも同様なステップを介した方法である（Ｄｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；ＲａｍａｎａＲａｏ  ａｎｄ  Ｖｅｌｕｔｈａｍｂｉ，２０１０）。すなわち、共存培養後、所望のＤＮＡと選抜マーカーがまだ染色体に組み込まれておらず、ポジティブ選抜マーカーが一過性の発現をしている段階で薬剤によるポジティブ選抜を行い、細胞の選抜を図る。この過程では所望のＤＮＡが含まれ選抜マーカー遺伝子が含まれない細胞は除去されてしまうが、選抜された細胞の中には所望のＤＮＡも一緒に導入されているものが含まれる。その後、得られた組織を選抜薬剤のない培地に移し替えると、所望のＤＮＡは染色体に組み込まれたが、選抜マーカーは染色体に組み込まれなかった細胞塊が得られる。一方で、染色体に選抜マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は、その後ネガティブ選抜マーカーの発現により致死する。得られた所望のＤＮＡのみを有する細胞塊を再分化させることで、目的の植物体が得られる。【００１６】
上記の方法で、Ｄｕｔｔら（２００８）は、多数の（具体的数字は示されていない）ブドウの体細胞胚を材料に用いて、所望のＤＮＡであるｅｇｆｐ  （ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のみが導入された５個体の植物を得ている。Ｄｕｔｔら（２００８）は、リアルタイムＰＣＲによる解析の結果、この５個体へ導入されたｅｇｆｐ遺伝子のコピー数が、３個体で１コピー、１個体で２コピー、１個体で６コピーであったとしている。１コピー導入効率が６０％のため、高いように思われるが、同じ研究クループが通常の形質転換方法で得たブドウ形質転換体の６０％が１コピーであったことを報告している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＲａｍａｎａＲａｏ  ａｎｄ  Ｖｅｌｕｔｈａｍｂｉ（２０１０）によるタバコでの結果では、得られた１１４個体のうち５個体のみが所望のＤＮＡのｎｐｔＩＩ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩ）を有していた。これらの手法の最も重要な工程は、一過性発現の段階でのポジティブ選抜である。もし、この工程を経ない場合には、両遺伝子が導入され一過性発現している細胞を濃縮することができず、何も導入されていない細胞が大勢を占めるキメラ状態となり、目的の個体を得ることは非常に困難となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Burgess, D.G., Ralston, E.J., Hanson, W.G., Heckert, M., Ho, M., Jenq, T., Palys, J.M., Tang, K., and Gutterson, N. (2002). A novel, two-component system for cell lethality and its use in engineering nuclear male-sterility in plants. Plant J 31, 113-125.
【非特許文献２】Butaye, K.M.J., Cammue, B.P.A., Delaure, S.L., and De Bolle, M.F.C. (2005). Approaches to Minimize Variation of Transgene Expression in Plants. Molecular Breeding 16, 79-91.
【非特許文献３】Chilton, M.-D., Currier, T.C., Farrand, S.K., Bendich, A.J., Gordon, M.P., and Nester, E.W. (1974). Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proc Natl Acad Sci USA 71, 3672-3676.
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【非特許文献２２】Yau, Y.Y., and Stewart, C.N., Jr. (2013). Less is more: strategies to remove marker genes from transgenic plants. BMC Biotechnol 13, 36.
【非特許文献２３】Ye, X., Williams, E., Shen, J., Johnson, S., Lowe, B., Radke, S., Strickland, S., Esser, J., Petersen, M., and Gilbertson, L. (2011). Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res 20, 773-786
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
目的とする外来遺伝子が多コピー導入された形質転換植物では、導入した遺伝子の発現が強く抑制されるジーンサイレンシングと呼ばれる現象がしばしば生じる。また、ゲノムへの目的ＤＮＡの組み込みの様相は、多コピーであればあるほど複雑になり、その解析は困難となる。形質転換は、１）形質転換体において導入遺伝子の効果を発現レベルで評価する、２）プロモーターや転写因子の特性を形質転換体において評価する、３）Ｔ−ＤＮＡタギングライブラリーを作成する、４）商業化を目指して遺伝子組換え植物を作出する、といった目的で行われるが、いずれの場合も目的ＤＮＡが１−２コピーで導入されていることが望ましい。最も望ましいのは１コピーで導入されることである。【００２０】
従って、本発明の課題は、植物の形質転換細胞の取得方法であって、植物の１細胞あたりに導入される所望のＤＮＡのコピー数が少なくなるような方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
植物の形質転換細胞の取得方法であって、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含む、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない、
前記方法。
［態様２］
第１マーカー遺伝子が、ネガティブ選抜マーカー遺伝子である、態様１に記載の方法
［態様３］
工程（ａ）において共形質転換に用いる所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子の混合比率が３：１ないし１：５である、態様１又は２のいずれか１項に記載の方法
［態様４］
工程（ａ）に用いる所望のＤＮＡに、第２のマーカー遺伝子であるポジティブ選抜マーカー遺伝子が連結されており、
工程（ｂ）の染色体に所望のＤＮＡが導入された形質転換細胞の選択を、第２マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって行う、態様１−３のいずれか１項に記載の方法
［態様５］
工程（ａ）が、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ポリエチレングリコール法及びウィスカー法からなる群から選択される、形質転換方法によって行われる、態様１−４のいずれか１項に記載の方法
［態様６］
態様１−５のいずれか１項に記載の方法で植物の形質転換細胞を取得し；
前記植物細胞を培養して植物体を得る、
ことを含む、形質転換植物の作成方法。
［態様７］
植物の形質転換方法であって、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含む、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない、
前記方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法は、形質転換系の初期に目的ＤＮＡが多コピー導入された細胞を排除することができる技術である。本発明を用いると、好ましくは、目的ＤＮＡを１コピーのみ導入した形質転換植物を従来技術の１．３倍以上の頻度で獲得できる。また、好ましくは、３コピー以上導入した形質転換体の頻度を従来技術の２分の１以下に低減することができる。本発明の技術を公知の植物形質転換技術に適用することにより、得られる形質転換植物における目的ＤＮＡのコピー数を低減することができる。さらに、従来のコピー数を低減する方法と共に本発明の方法を用いると、さらに高頻度で１コピーのみ導入された形質転換植物を獲得できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、多コピー細胞排除技術に用いた、アグロバクテリウム法による共形質転換法の模式図である。
【００２４】
ａ．：１菌株１ベクター法、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）、
ｂ．：２菌株混合法、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）＋ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ）、
ｃ．：１菌株２ベクター法  （ターナリーベクターシステム）、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ）、
ＧＵＳ−ＨＰＴ：ｉｎｔｒｏｎ介在ＧＵＳ遺伝子とＨＰＴ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ、
Ｂａｒｎａｓｅ：ｉｎｔｒｏｎ介在Ｂａｒｎａｓｅ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ、
Ｖｉｒ：病原性領域、
ｐＡＬ４４０４：ディスアーム型Ｔｉプラスミド
【図２】図２は、発現ベクターｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴの模式図である。
【図３】図３は、発現ベクターｐＬＣ４１の模式図である。
【図４】図４は、発現ベクター  ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅの模式図である。
【図５】図５は、発現ベクター  ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．  Ｂａｒｎａｓｅの模式図である。
【図６】図６は、ｐＧＷの模式図である。
【図７】図７は、ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅの模式図である。
【図８】図８は、導入した２種類のＴ−ＤＮＡの模式図である。
【００２５】
ａ．：ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．ＢａｒｎａｓｅおよびｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴに共通するＴ−ＤＮＡ領域、
ｂ．：ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：  ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ、ｐＬＣ４１  ＢａｒｎａｓｅおよびｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅに共通するＴ−ＤＮＡ領域
【図９】図９は、サザン解析の結果推定されたＧＵＳ−ＨＰＴ断片の導入コピー数を示した図である。
【００２６】
対照：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）
１菌株１ベクター：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）
２菌株混合：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）  ＋  ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ）
１菌株２ベクター：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：  ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ）
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００２８】
本発明は、植物の形質転換細胞の取得方法に関する。本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含む、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない、
前記方法。
【００２９】
植物
本発明の方法の対象となる植物は特に限定されず、藻類、被子植物、裸子植物など任意の植物を含み、単子葉植物または双子葉植物であってよい。形質転換に供試する組織は、植物の種類や用いる形質転換方法に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
マーカー遺伝子
本発明は、（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程を含む。本明細書における「マーカー遺伝子」とは、当該遺伝子が細胞に導入されたものあるいは導入されなかったものを選抜するための指標となる性質を有する遺伝子を意味する。
【００３１】
理論に縛られるわけではないが、所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを共形質転換した場合、所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とが細胞核内に混在した状態で、機会的にゲノムに導入されると考えられる。このような形質転換の結果、「遺伝子が少コピー数導入された細胞」と「遺伝子が多コピー数導入された細胞」が生じるが、後者において「所望のＤＮＡのみが多コピー数導入された細胞」が生じる可能性は確率として低く、その多くが「所望のＤＮＡとマーカー遺伝子の双方が含まれる多コピー導入細胞」となる。従って、得られた形質転換細胞群から「所望のＤＮＡが導入され、かつ、マーカー遺伝子が導入されていない細胞」を選択することにより、「所望のＤＮＡが多コピー導入された細胞」を大幅に減じることができる。
【００３２】
よって、本発明の「第１マーカー遺伝子」は、所望のＤＮＡと異なる遺伝子であって、細胞中で発現した際にマーカー遺伝子発現細胞を除去できる性質を有していればよい。すなわち、容易に検出可能な遺伝子を選択の指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無によりマーカー遺伝子発現細胞を除去できる遺伝子であってよい。本発明においてネガティブ選抜とは、マーカー遺伝子が発現している細胞を選択的に除去することをいう。従って、言い換えれば第１マーカー遺伝子は、ネガティブ選抜が可能となる性質を有していればよい。
【００３３】
マーカー遺伝子発現細胞とマーカー遺伝子が導入されていない細胞とが視覚的に識別できる場合、細胞群の中から人為的に、例えば顕微鏡下でピンセットやメスなどの器具を使用するなどして、当該細胞を除去することができる。このようなマーカー遺伝子の例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、ルシフェラーゼ遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子等の呈色反応を触媒する酵素の遺伝子などが挙げられる。
【００３４】
また、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子も、このようなマーカー遺伝子として使用可能である。薬剤選抜工程において選抜培地に添加する薬剤濃度を、薬剤耐性遺伝子が導入されていない細胞が死なない程度に抑えると、薬剤耐性遺伝子非導入細胞は死滅こそしないものの殆ど増殖せず、通常の細胞と外見に違いが生じるため、薬剤耐性遺伝子導入細胞と識別することができる。
【００３５】
以上、細胞の視覚的識別を可能にする遺伝子、例えば、呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、薬剤耐性遺伝子も、ネガティブ選抜が可能となる性質を有しており、本発明の第１マーカー遺伝子として利用しうる。
【００３６】
また、本発明の「第１マーカー遺伝子」として、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を好ましく使用することができる。本明細書において、その発現により自らを含む細胞を選択的に排除する性質を有するマーカー遺伝子を、ネガティブ選抜マーカー遺伝子という。なお、植物細胞や培地に特定の物質を添加した場合に、自らを含む細胞を選択的に排除する性質が機能するものもこれに含まれる。また、ネガティブ選抜マーカー遺伝子は、必ずしも構造遺伝子に限定されるものではなく、タンパク質をコードする構造遺伝子以外の非構造遺伝子、例えばノンコーディングＲＮＡの発現配列等、を用いてもよい。ネガティブ選抜マーカー遺伝子は、遺伝子導入処理後から植物体の再生までの間にその遺伝子が植物ゲノムへ組込まれて発現することにより、細胞死、細胞の増殖停止、または異常な組織形成を誘導する。マーカー遺伝子として細胞死誘導型のネガティブ選抜マーカー遺伝子を用いた場合、マーカー遺伝子発現細胞は死滅するため、マーカー遺伝子発現細胞を除去する作業は不要となり、作業効率は大幅に向上する。
【００３７】
再生した植物体中には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が残存しないことが好ましい。当業者はこのようなネガティブ選抜マーカー遺伝子を適宜選択することができる。また、ネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現は、一過性発現の段階では細胞死を誘導しないレベルであることが好ましい。本発明の共形質転換工程において、目的ＤＮＡのみがゲノムに組み込まれかつネガティブ選抜マーカー遺伝子が一過性発現している細胞が生じうるが、このような細胞の一部は培養を得て目的ＤＮＡのみを含む細胞となる。従って形質転換効率の低下を防ぐ観点から、このような細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の一過性発現で死滅させないことが好ましい。例えばネガティブ選抜マーカーの毒性が強い場合、当該マーカー遺伝子の発現を低減するプロモーターを適用するなどして、毒性を抑制することが好ましい。このような発現調節は、当業者が公知の技術に基づき適宜行うことができる。なお限定されるものではないが、本願実施例において、ネガティブ選抜マーカー遺伝子としてＢａｒｎａｓｅ遺伝子を使用した場合に、ｎｏｓプロモーターの使用が好適であったことが記載されている。
【００３８】
植物に最も広く用いられるネガティブ選抜マーカー遺伝子は、大腸菌由来のｃｏｄＡである（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。ｃｏｄＡはシトシンデアミナーゼをコードし、毒性のない５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を毒性のある５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換する。大腸菌のオルニチンデアセチラーゼ遺伝子のａｒｇＥは、植物に毒性がないＮ−アセチルホスフィノトリチン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＰＰＴ）を、除草剤活性のあるホスフィノトリチン（ＰＰＴ）へ変換する。細菌のシトクロームＰ４５０ｓｕｉは、非毒性のハービコイド  Ｒ４７０２前駆体を細胞毒性のあるハービコイド  Ｒ４７０２へ変換する。ジフテリア毒断片Ａ（ＤＴ−Ａ）は、植物細胞には毒性を示すが、大腸菌やアグロバクテリウムには毒性がない（Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。また、ＤＴ−Ａ遺伝子にはｐｏｌｙ−Ａシグナルが付いていないので、一過的に（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現したｍＲＮＡはすぐに分解され、一方ゲノムに組み込まれた場合には近傍のｐｏｌｙ−Ａシグナルを利用して持続的に発現する。Ｂａｒｎａｓｅは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のリボヌクレアーゼである。原核生物および真核生物ともに強い毒性を有するが、遺伝子中にイントロンを介在させることで、原核生物への毒性を抑制することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。限定するものではないが、本発明の方法において、これらの遺伝子をネガティブ選抜マーカー遺伝子として、好ましく使用することができる。
【００３９】
なお、本願発明の工程には、第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない。ポジティブ選抜の定義は、「第２のマーカー遺伝子」の項で詳述するが、もし第１マーカー遺伝子を用いてポジティブ選抜を行った場合、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞は除去されてしまい、本願発明の効果を得ることができない。
【００４０】
本発明の方法において、使用する第１マーカー遺伝子の数に限定はない。好ましくは、１〜２種類のマーカー遺伝子を好ましく用いることができる。
【００４１】
所望のＤＮＡ
「所望のＤＮＡ」は、細胞への導入を行う任意のＤＮＡであり、特段に限定されない。所望のＤＮＡは植物細胞の染色体（ゲノム）に導入されるＤＮＡであり、必ずしも構造遺伝子に限定されるものではなく、タンパク質をコードする構造遺伝子以外の非構造遺伝子を用いてもよい。「所望のＤＮＡ」には、所望のプロモーター及びターミネーターを連結してもよい。「所望のＤＮＡ」は、使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。例えば、アグロバクテリウム法を用いる場合、限定されるものではないが、０．１ｋｂ−５０ｋｂの長さのものが好ましい。
【００４２】
共形質転換に供する所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子の混合比率に特に限定されないが、３：１から１：５の間が好ましく、２：１から１：３の間がより好ましい。
【００４３】
形質転換方法
本発明において形質転換方法は、植物を形質転換できる方法であれば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。
【００４４】
共形質転換
本明細書において、外因性遺伝物質（外因性ＤＮＡ）の導入、編入（および発現）の結果、得られる細胞の遺伝的な変更のことを形質転換と呼ぶ。また、その変更のための工程（プロセス）を指す言葉としても用いられる。そして、独立した二つ以上の外因性遺伝物質を同時に形質転換することを共形質転換（Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と呼ぶ。同様に、その工程を指す言葉としても用いられる。なお、「独立した」とは、二つ以上の外因性遺伝物質が、一体のＤＮＡとして導入されるのではなく、それぞれ独立して挙動可能なＤＮＡとして、細胞に導入されることを意味する。
【００４５】
アグロバクテリウムを介する共形質転換法には、１菌株中の複数のバイナリーベクター上へ複数のＴ−ＤＮＡを別々に配置したタイプ（１菌株・多ベクター法）、１菌株中の１つのバイナリーベクター上へ２つのＴ−ＤＮＡを配置したタイプ（１菌株・１ベクター法）、２菌株の各バイナリーベクターへ２つのＴ−ＤＮＡを別々に配置し両菌株で混合接種するタイプ（２菌株法）、１菌株の１つのバイナリーベクター上に、２つの遺伝子を２つの右ボーダー配列を使用して構成した１つのＴ−ＤＮＡを配置したタイプの４種類がある（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。本発明において、いずれのタイプも好ましく実施することができる。２菌株法については、特段２つの菌株に限定するものではなく、複数菌株の各バイナリーベクターへ複数のＴ−ＤＮＡを別々に配置し混合接種することもできる。
【００４６】
なお、４番目のタイプは、ダブルライトボーダー法を利用したものである。これは、アグロバクテリウム法で形質転換を行う場合の選抜マーカー除去方法の一つである（Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１３）。すなわち、Ｔ−ＤＮＡを「ＲＢ（右ボーダー配列）−ポジティブ選抜マーカー−ＲＢ−所望のＤＮＡ−ＬＢ（左ボーダー配列）」という順となるよう構成して、「ＲＢ−ポジティブ選抜マーカー−ＲＢ−所望のＤＮＡ−ＬＢ」と「ＲＢ−所望のＤＮＡ−ＬＢ」が植物の別々の染色体へ導入され、次代でこれらを分離させる方法である。この方法を応用し、Ｔ−ＤＮＡを「ＲＢ−ネガティブ選抜マーカー−ＲＢ−ポジティブ選抜マーカー−所望のＤＮＡ−ＬＢ」（あるいは「ＲＢ−ネガティブ選抜マーカー−ＲＢ−所望のＤＮＡ−ポジティブ選抜マーカー−ＬＢ」）となるように構成し、形質転換に用いることで、「ＲＢ−ネガティブ選抜マーカー−ＲＢ−所望のＤＮＡ−ポジティブ選抜マーカー−ＬＢ」と「ＲＢ−所望のＤＮＡ−ポジティブ選抜マーカー−ＬＢ」が生じ、２種のＴ−ＤＮＡによる共形質転換を行った場合と同じ状況となる。よってこの場合であっても本発明の方法に供することにより、多コピー数形質転換細胞を排除することができる。本明細書では、このような構成のＴ−ＤＮＡによる形質転換も共形質転換に含まれる。
【００４７】
パーティクルガン法は、金やタングステンなどの金属の微粒子にＤＮＡをコーティングしたものを弾丸として、高速で射出して細胞内にＤＮＡを導入する方法である。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ法、あるいはｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ法とも呼ばれる。弾丸には、高比重で細胞内への貫通力が高く、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいという理由から、金微粒子が好まれる。金属微粒子の射出には、ヘリウムなどの高圧ガスを主に用いる。ガスの圧力や金属粒子と試料間の距離などにより、金属微粒子の射出強度を調節することができ、様々な細胞への導入が可能である。パーティクルガン法では、２種類以上のＤＮＡを金属の微粒子にコーティングし、弾丸として細胞内にＤＮＡを導入することで共形質転換を行うことができる。
【００４８】
エレクトロポレーション法は、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、細胞懸濁液中のＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換する方法である。植物細胞を材料とする場合には、細胞壁を分解除去したプロトプラストを用いるのが一般的である。しかし、細胞壁を有する細胞を用いて形質転換をすることも可能であり、これはエレクトロインジェクション法と呼ばれている。エレクトロポレーション法やエレクトロインジェクション法では、２種類以上のＤＮＡを懸濁液中に溶解し植物細胞存在下で電気パルスをかけることにより、共形質転換を行うことができる。
【００４９】
ポリエチレングリコール法とは、プロトプラストにポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を作用させて、ＤＮＡを植物細胞内部に取り込ませる。このＤＮＡ取り込みの仕組みはまだ良く分かっていない。
【００５０】
ウィスカー法とは、ウィスカーと呼ばれる針状の物質を用いて植物細胞に穴をあけＤＮＡを細胞内に取り込ませる方法である。ウィスカーには、シリコンカーバイドやホウ酸アルミニウムなどが用いられる。
【００５１】
また、所望のＤＮＡとマーカー遺伝子の形質転換については、双方、同じ形質転換方法を用いてもよいし、異なる形質転換方法を用いてもよいが、同じ形質転換方法を用いて共形質転換を行うことが、効率的でより好ましい。
【００５２】
第２のマーカー遺伝子
なお、所望のＤＮＡに、第２のマーカー遺伝子としてポジティブ選抜マーカー遺伝子を連結してもよい。特に所望のＤＮＡが形質転換の成否の指標とならない場合、即ち、所望のＤＮＡがマーカー遺伝子としての性質を有していない場合、当該ＤＮＡにポジティブ選抜マーカー遺伝子を連結することが好ましい。
【００５３】
本明細書において「ポジティブ選抜」とは、マーカー遺伝子が発現している細胞を選択的に選抜することをいい、ポジティブ選抜に使用可能なマーカー遺伝子をポジティブ選抜マーカー遺伝子という。
【００５４】
マーカー遺伝子発現細胞とマーカー遺伝子が導入されていない細胞とが視覚的に識別できる場合、細胞群の中から人為的に、例えば顕微鏡下でピンセットやメスなどの器具を使用するなどして、マーカー遺伝子発現細胞を選抜することができる。従って、蛍光等の視覚的に識別可能な性質を細胞に付与する性質を有する遺伝子を、ポジティブ選抜マーカー遺伝子として使用することができる。こういったマーカー遺伝子の例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、ルシフェラーゼ遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子等の呈色反応を触媒する酵素の遺伝子等が挙げられる。
【００５５】
またポジティブ選抜マーカー遺伝子として、遺伝子導入処理後から植物体の再生までのいずれかの間にその遺伝子が植物染色体ゲノムへ組み込まれて発現することにより、細胞を細胞死、細胞の増殖停止、または異常な組織形成誘導などの事象から防ぐ遺伝子、なども好適に使用することができる。このようなポジティブ選抜マーカー遺伝子が発現した細胞が生育可能な条件であって、当該ポジティブ選抜マーカー遺伝子が発現していない細胞が生育不能な条件を設定することにより、効率よくポジティブ選抜を行うことができる。限定されるものではないが、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の例として、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子等の除草剤耐性遺伝子、リン酸化マンノースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ：ＰＭＩ）遺伝子、２−デオキシグルコース−６−ホスファターゼ遺伝子やキシロースイソメラーゼ遺伝子等の、植物に新たな糖の代謝能を付与する遺伝子が挙げられる。
【００５６】
なお、抗生物質や除草剤は、植物の非形質転換細胞にとって有害な作用があるが、マンノースやキシロースといった糖は、植物にとって代謝することができない炭素源であるものの、有害性はない。ここで、植物が本来代謝できない炭素源を選抜薬剤とし、これらの炭素源を植物が代謝できる炭素源に変換する酵素遺伝子を選抜マーカーとして組み合わせ、非形質転換細胞に有害な影響を与えない選抜システムが構築されているが、このシステムを（狭義の）ポジティブ選抜システムと呼び、その選抜マーカーを（狭義の）ポジティブ選抜マーカー遺伝子と呼ぶことがある（Ｕｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら上記のとおり、本発明においてポジティブ選抜とは、マーカー遺伝子が発現している細胞を選択的に選抜することをいい、ポジティブ選抜に使用可能なマーカー遺伝子をポジティブ選抜マーカー遺伝子というのであり、狭義の内容に限定されるものではない。
【００５７】
よって、本願発明は、
工程（ａ）に用いる所望のＤＮＡに、第２のマーカー遺伝子であるポジティブ選抜マーカー遺伝子が連結されており、
工程（ｂ）の染色体に所望のＤＮＡが導入された形質転換細胞の選択を、第２マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって行う、
態様も含む。
【００５８】
「所望のＤＮＡに、第２のマーカー遺伝子であるポジティブ選抜マーカー遺伝子が連結されている」とは、所望のＤＮＡと第２マーカー遺伝子が連結されており、形質転換において両者が挙動を共にする、ことを意味する。よって、形質転換により所望のＤＮＡが植物細胞の染色体に組み込まれる場合には第２マーカー遺伝子も組み込まれる。一方、形質転換が失敗し、所望のＤＮＡが植物細胞の染色体に組み込まれない場合には第２マーカー遺伝子も組み込まれない。この点、第２マーカー遺伝子は、所望のＤＮＡとは別個独立のＤＮＡとして共形質転換され、挙動を異にする第１マーカー遺伝子とは、形質転換における位置づけが異なる。
【００５９】
例えば、アグロバクテリウム法の、１菌株中の１つのバイナリーベクター上へ２つのＴ−ＤＮＡを配置したタイプ（１菌株・１ベクター法）を用いて共形質転換を行う場合、所望のＤＮＡと第２マーカー遺伝子は連結され、１組の「ＲＢ」「ＬＢ」に挟まれる。例えば、「ＲＢ−第２マーカー遺伝子−所望のＤＮＡ−ＬＢ」。一方、第１マーカー遺伝子は、所望のＤＮＡとは別個の「ＲＢ」「ＬＢ」に挟まれる。例えば、本願の図５を参照されたい。あるいは、ダブルライトボーダー法の場合、例えば、Ｔ−ＤＮＡを「ＲＢ−ネガティブ選抜マーカー−ＲＢ−ポジティブ選抜マーカー−所望のＤＮＡ−ＬＢ」（あるいは「ＲＢ−ネガティブ選抜マーカー−ＲＢ−所望のＤＮＡ−ポジティブ選抜マーカー−ＬＢ」）となるように構成してもよい。
【００６０】
形質転換細胞の選択
本明細書において、形質転換細胞とは、外来遺伝子が形質転換工程を経て染色体ゲノムに組み込まれた細胞あるいはその後代をいう。
【００６１】
本発明の工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、第１マーカー遺伝子が導入されていない形質転換細胞を選択する。
【００６２】
これらの選択の順序に特段の限定はない。具体的には
１）第１マーカー遺伝子が入っている形質転換細胞を除去し、そこから所望のＤＮＡが入っている形質転換細胞を選択する；
２）所望のＤＮＡが入っている形質転換細胞を選択し、そこから第１マーカー遺伝子が入っている形質転換細胞を除去する；あるいは
３）第１マーカー遺伝子が入っている形質転換細胞の除去と、所望のＤＮＡが入っている形質転換細胞を選択、とを同時に行う
のいずれの態様でもよい。
【００６３】
「マーカー遺伝子が入っている形質転換細胞を除去」は、例えば、第１マーカー遺伝子がネガティブ選抜マーカー遺伝子である態様では、当該遺伝子が染色体に導入されている細胞においてネガティブ選抜マーカー遺伝子が発現した場合に、細胞死、細胞の増殖停止、または異常な組織形成等が生じるようなネガティブ選抜により、マーカー遺伝子が入っている形質転換細胞を除去することが可能である。
【００６４】
「所望のＤＮＡが入っている形質転換細胞の選択」も、所望の遺伝子がマーカー遺伝子の場合には、マーカー遺伝子の発現に基づく性質を有する細胞のみを選抜する。所望のＤＮＡが形質転換の成否の指標とならない場合、即ち、所望のＤＮＡがマーカー遺伝子でない場合、当該ＤＮＡにポジティブ選抜マーカー遺伝子を連結することが好ましい。当該ポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現に基づく性質を有する細胞のみを選抜する。
【００６５】
所望のＤＮＡ、第１マーカー遺伝子、第２のマーカー遺伝子の各遺伝子の発現は、恒常的であっても誘導性であってもよい、誘導性の場合、例えば後述する外部から与えた特異的化合物によって遺伝子発現を誘導することが可能である。誘導性発現は、外部から与えた特異的化合物以外にも、高温処理、低温処理等のストレス処理によって行うことが可能である。
【００６６】
なお、形質転換細胞の選択には、形質転換植物を交配させて得られる形質転換植物後代における選抜マーカーによる選択は含まない。
【００６７】
特異的化合物による遺伝子発現誘導系
外部から与えた化合物によって遺伝子発現を誘導する方法がある。本発明の方法において、このような特異的化合物による遺伝子発現誘導系を用いて、選抜マーカー遺伝子の発現時期を制御してもよい。特に第１マーカー遺伝子として、一過性レベルの発現で細胞死または細胞増殖停止を誘起するような強力なネガティブ選抜マーカー遺伝子を使用する場合には、形質転換効率の観点から、マーカー遺伝子の発現時期を染色体ゲノムに組み込まれた後へと遅らせることが好ましい。このような場合、下記の特異的化合物による遺伝子発現誘導系を用いて、発現時期を制御することが可能である。
【００６８】
このような遺伝子発現誘導系の条件として、（１）トランス転写因子の活性を制御するインデューサーやアクチベーターとして特異的化合物が必要であり、それらは植物の生活環の中で自ら合成せず、更に接する可能性の低い化合物であること、（２）転写を制御するプロモーターのシスエレメントが植物に存在しないこと、が挙げられる。例えば、進化的に離れたバクテリアなどのシスエレメントを利用すると、植物自身が本来持っているトランス転写因子とそのシスエレメントとが相互作用する可能性が低くなる。上記の条件を満たすために、バクテリア由来のシス配列と結合する領域（ドメイン：ｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配列、特異的化合物と結合して転写因子の活性を制御する領域のアミノ酸配列、及び、転写活性化領域のアミノ酸配列との三つの領域を融合したキメラ・トランス転写因子が合成されている。現在では、テトラサイクリンやエストラジオールなどによる遺伝子発現誘導系が開発されている。
【００６９】
（ｉ）テトラサイクリン誘導系：大腸菌のトランスポゾンＴｎ１０に存在するテトラサイクリン耐性オペロン（ｔｅｔオペロン）の発現は、リプレッサーであるＴｅｔＲ（アミノ酸配列）とオペレーターであるｔｅｔＯ（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡ−３’）によって負に制御されている。テトラサイクリン非存在下ではＴｅｔＲはｔｅｔＯに結合して転写を阻害しているが、テトラサイクリン存在下ではｔｅｔＯから解離する。つまり、テトラサイクリンがｔｅｔオペロンのインデューサーである。そこで植物中で構成的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＴｅｔＲの遺伝子ｔｅｔＲを結合したもの、それとは別のプロモーターの下流にｔｅｔＯを複数個連結するとともに更にその下流に発現を誘導したい遺伝子を結合したものを組み合わせたものである。テトラサイクリンをインデューサーとして投与することによってｔｅｔＯ下流の遺伝子は誘導される。なお、インデューサーとしてはテトラサイクリンよりもドキシサイクリンの方が誘導性が高い。
【００７０】
（ｉｉ）エストラジオール誘導系：大腸菌のＳＯＳレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサーであるＬｅｘＡの第１−８７アミノ酸残基配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）由来のＶＰ１６（アミノ酸配列）の転写活性部位（第４０３−４７９アミノ酸残基配列）、ヒト・エストロゲン受容体の制御領域（第２８２−５９５アミノ酸残基配列）を融合して作られた合成転写活性化因子ＸＶＥ（アミノ酸配列）と、本来はＬｅｘＡが結合するオペレーターであるＳＯＳ  ｂｏｘ  （５’−ＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧＴＡ−３’）をＸＶＥが結合するシス配列としてＣａＭＶ  ３５Ｓ最小プロモーターのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡ  ｂｏｘ）の上流に複数個配した転写誘導系である。ＣａＭＶ  ３５Ｓ最小プロモーターにはエストラジオールが存在しないとほとんど転写活性がない。しかし、ＸＶＥとエストラジオールが結合するとＸＶＥはＳＯＳ  ｂｏｘと結合して下流のＣａＭＶ  ３５Ｓ最小プロモーターの転写活性を強力に誘導する。つまり、正の制御系である。
【００７１】
形質転換植物の作成方法
本発明は、さらに形質転換植物の作成方法に関する。本発明の形質転換植物の作成方法は、本発明の植物の形質転換細胞を取得する方法によって、植物の形質転換細胞を取得し；前記植物細胞を培養して植物体を得る、ことを含む。
【００７２】
本発明の方法において、形質転換細胞を培養する。形質転換細胞を培養して、植物体を得る工程は、植物の種類に応じた任意の方法を用いることが可能である。
【００７３】
培養培地としては、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＺ培地等があげられる。培養培地は選抜薬剤を含んでもよい。本工程における「培養」とは、固化した培養培地の上または液体状の培養培地の中などに植物細胞、又は植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の態様は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。培養培地の固化は、例えばアガロース等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６−２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日−２１日、より好ましくは１４日である。
【００７４】
植物の形質転換方法
本発明はまた、植物の形質転換方法に関する。本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）所望のＤＮＡと第１マーカー遺伝子とを、植物細胞に共形質転換する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換植物細胞の中から、染色体に、所望のＤＮＡが導入され、かつ、マーカー遺伝子が第１の導入されていない形質転換細胞を選択する工程
を含み、
但し、前記第１マーカー遺伝子を用いたポジティブ選抜によって、所望のＤＮＡのみが染色体に導入された形質転換細胞が除去される工程は含まない。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。【００７６】
実施例１  共形質転換ベクターの構築
１）目的ＤＮＡおよびポジティブ選抜マーカー遺伝子
目的ＤＮＡとしてヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イントロンが介在するβ―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を、ポジティブ選抜マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性（ＨＰＴ）遺伝子を用いた。ＧＵＳ遺伝子は３５Ｓプロモーターで制御し、ターミネーターにはｎｏｓを用いた。ＨＰＴ遺伝子はトウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子のプロモーターで制御し、ターミネーターにはｎｏｓを用いた。なお、ＨＰＴ翻訳領域の上流には、トウモロコシのユビキチン遺伝子の第１イントロンを配置した。【００７７】
２）ネガティブ選抜マーカー遺伝子
ネガティブ選抜マーカー遺伝子には、バチルス・アミロリケファシエンスのＢａｒｎａｓｅ遺伝子を用いた。発現はｎｏｓプロモーターで制御し、ターミネーターには３５Ｓを用いた。また、Ｂａｒｎａｓｅの発現は、大腸菌やアグロバクテリウムも致死させるため、Ｂａｒｎａｓｅ遺伝子中にイネのＲｆ−１遺伝子の第５イントロンを介在させた（Ｐｎｏｓ−Ｂａｒｎａｓｅ−Ｔ３５Ｓ）。これにより、植物細胞内のみで発現するネガティブ選抜マーカーとすることができる。用いたバチルス・アミロリケファシエンスのＢａｒｎａｓｅ遺伝子中にイネのＲｆ−１遺伝子の第５イントロンを介在させた配列を配列番号１、バチルス・アミロリケファシエンスのＢａｒｎａｓｅ遺伝子の配列を配列番号２，イネのＲｆ−１遺伝子の第５イントロンの配列を配列番号３に示した。配列番号１の塩基１８０−２８８の塩基配列が配列番号３のイネのＲｆ−１遺伝子の第５イントロンの塩基配列に相当する。【００７８】
３）バイナリーベクターｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ（図２）の構築
国際出願公開ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１に記載されているコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ（別名ｐＬＣ４１ＧＷＨ）は、複製開始点ｏｒｉＶを有するＩｎｃＰプラスミドである。ｏｒｉＶは大腸菌およびアグロバクテリウムの双方で機能する。ｐＬＣ４１ＧＷＨのＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片およびマルチクローニングサイトを有するｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片をライゲーションすることにより、Ｔ−ＤＮＡ上にマルチクローニングサイトのみを有するバイナリーベクターｐＬＣ４１（図３）を得た。【００７９】
ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴの構築は以下の手順で行った。まず、ＧＵＳ−ＨＰＴ断片を増幅するＰＣＲを行った。ｐＳＢ３４（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００６）を鋳型としてＧＵＳ下流に位置するＴｎｏｓの３’部分とその下流にＳｐｅＩをコードする配列からならなるプライマーＧＵＳ−ＨＰＴ  ｉｎ  ｐＳＢ３４  Ｆと、ＨＰＴ下流に位置するＴｏｎｓの３’部分とその下流にＫｐｎＩをコードする配列からなるプライマー  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｉｎ  ｐＳＢ３４  Ｒを用いてＰＣＲを行った。得られたＧＵＳ−ＨＰＴ断片をＳｐｅＩとＫｐｎＩで二重消化し、あらかじめＸｂａＩとＫｐｎＩで二重消化しておいたｐＬＣ４１ベクターにライゲーションすることで、ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴを得た。このベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４にエレクトロポレーション法で導入し、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）（図１−ｂ左）を得た。【００８０】
【表１】
2015118640.tif 000002
【００８１】
４）バイナリーベクターｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ（図４）の構築
ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅの構築は、以下の手順で行った。まず、Ｐｎｏｓ−Ｂａｒｎａｓｅ−Ｔ３５Ｓ断片（以下、Ｂａｒｎａｓｅ断片）について合成を行い、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトにクローニングした（Ｂａｒｎａｓｅ／ｐＵＣ５７）。次に、Ｂａｒｎａｓｅ断片を増幅するＰＣＲを行った。鋳型としてＢａｒｎａｓｅ／ｐＵＣ５７、プライマーとしてＭ１３シークエンシングプライマー領域をコードするＭ１３／ｐＵＣ  ２４ｍｅｒとｐＵＣ５７のマルチクローニングサイトの３’部分にＡｖｒＩＩをコードする配列を加えたｐＵＣ５７  ４７６（ＡｒＩＩ）  ｌｏｎｇ  Ｒを用いた。その結果、１１２０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。このＢａｒｎａｓｅ断片をベクターｐＣＲ４  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＴＡクローニングし、ｐＣＲ４ＴＯＰＯ／Ｂａｒｎａｓｅを得た。【００８２】
続いて、ｐＬＣ４１のＲＢ―ＬＢ間のマルチクローニングサイトにＢａｒｎａｓｅ断片を挿入した。具体的にはｐＬＣ４１をＸｂａＩで消化後、脱リン酸化し、あらかじめＳｐｅＩ消化したｐＣＲ４ＴＯＰＯ／ＢａｒｎａｓｅのＢａｒｎａｓｅ断片とライゲーションし、ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ（図４）を得た。このベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４にエレクトロポレーション法で導入し、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ）（図１−ｂ右）を得た。【００８３】
【表２】
2015118640.tif 000003
【００８４】
５）ダブルＴ−ＤＮＡ型バイナリーベクターｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ（図５）の作成
次に、ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅを鋳型としてＲＢの約３３０ｂｐ上流からＬＢの約５２０ｂｐ下流までのＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢ、またｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴを鋳型としてＫｏｒＢからｏｒｉＴまでのｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ＫｏｒＢ  ｔｏ  ｏｒｉＴを増幅するＰＣＲを行った。ＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢのためのＰＣＲ反応には、ＲＢの約３３０ｂｐ上流部分をコードする配列からなる５’末端リン酸化プライマー（ｐＬＣ４１  ３３０ｂｐ−ＲＢ  Ｆ＋Ｐ）、ＬＢの約５２０ｂｐ下流部分をコードする配列からなる５’末端リン酸化プライマー（ｐＬＣ４１  ＬＢ−５２０ｂｐ  Ｒ＋Ｐ）を用いた。ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ＫｏｒＢ  ｔｏ  ｏｒｉＴのためのＰＣＲ反応には、ｏｒｉＴ−ＩｎｃＣ間を下流方向にコードする配列からなるプライマーｐＬＣ４１  ｏｒｉＴ−ＩｎｃＣ  ＦおよびｏｒｉＴ−ＩｎｃＣ間を上流方向にコードする配列からなるプライマーｐＬＣ４１  ｏｒｉＴ−ＩｎｃＣ  Ｒを用いた。その結果、ＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢ断片では約２２８０ｂｐ、ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ＫｏｒＢ  ｔｏ  ｏｒｉＴ断片では約１７０００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。【００８５】
ＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢ断片とｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ＫｏｒＢ  ｔｏ  ｏｒｉＴ断片をライゲーションし、ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ（図５）を得た。【００８６】
このベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４にエレクトロポレーション法で導入し、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）（図１−ａ）を得た。【００８７】
【表３】
2015118640.tif 000004
【００８８】
６）ターナリーベクターｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ  （図７）の作成
特許文献ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１には、アグロバクテリウムの中でバイナリーベクターｐＬＣ４１（Ｉｎｃ  Ｐ型）と共存可能なベクターでｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＧ  Ｎ５４Ｄを有する  ｐＶＧＷ２（Ｉｎｃ  Ｗ型）が開示されている。本実施例では、このｐＶＧＷ２からｖｉｒＧ  Ｎ５４Ｄを除去したよりシンプルなベクターｐＧＷ（図６）へと改変した。具体的には、ｐＶＧＷ２を鋳型にｐＳａ５‘ＥｃＴ２２ＩとＭ１３（−２０）ＦｗのプライマーセットでＰＣＲを行い、得られたフラグメントをセルフライゲーションさせてターナリーベクター用の新規クローニングベクターｐＧＷを作成した（図６）。ｐＧＷは、第２のベクター（バイナリーベクター）ｐＬＣ４１とともに第３のベクター（ターナリーベクター）として同一アグロバクテリウム中で保持することができ、それぞれのベクターに別々にＴ−ＤＮＡを配置ことができる。したがって、１種類のアグロバクテリウムのみを用いてポジティブ選抜マーカー遺伝子を連結した目的ＤＮＡとネガティブ選抜マーカー遺伝子を共形質転換することができる（図１−ｃ）。ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅを鋳型にしてＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢカセットの両端にＳｐｅＩサイトを付加するためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応には、ＲＢの３３０ｂｐ上流にＳｐｅＩサイトを付加した配列からなるプライマー  ｐＬＣ４１  ３３０ｂｐ−ＲＢ＋ＳｐｅＩ  Ｆ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）およびＬＢの５２０ｂｐ下流にＳｐｅＩサイトを付加した配列からなるプライマーｐＬＣ４１  ５２０ｂｐ−ＬＢ＋ＳｐｅＩ  Ｒを用いた。その結果、２３００ｂｐのＰＣＲ産物であるＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢのＳｐｅＩ断片を得た。この断片を、あらかじめＸｂａＩで消化しておいたｐＧＷにライゲーションし、ＲＢ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＬＢ断片が正の向きで挿入されたｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅを得た。【００８９】
完成したｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅを、ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴと同時にエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入し、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ）を得た（図１−ｃ）。【００９０】
【表４】
2015118640.tif 000005
【００９１】
実施例２  共形質転換ベクターシステムを用いたイネの形質転換
材料および方法
１）供試アグロバクテリウム菌株およびベクター
下記の３種類の多コピー細胞排除共形質転換ベクターシステムでポジティブ選抜マーカー遺伝子を連結した目的ＤＮＡとネガティブ選抜マーカー遺伝子の共形質転換を行った。
ａ．１菌株１ベクター型：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）  （図１−ａ）
ｂ．２菌株混合型：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）  ＋  ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ）  （図１−ｂ）
ｃ．１菌株２ベクター型：ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：  ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ）  （ターナリーベクターシステム）（図１−ｃ）【００９２】
２）イネの形質転換方法
イネ品種には、ゆきひかりを用いた。温室で栽培した開花後１０日前後のイネの穂を採集した。頴をピンセットで除去した未熟種子を殺菌した後、実体顕微鏡下で１．３‐１．８ｍｍ長の未熟胚を採集した。これらの未熟胚に、２０，０００ｘｇの遠心加速度で１０分間の遠心処理を行った。アグロバクテリウムは、菌株の薬剤耐性に応じた選抜薬剤を含むＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）上で、２８℃暗黒下で３日間培養した後、１．０ｍｌのＡＡ−ｉｎｆ培地（ＡＡ主要無機塩類、Ｂ５微量無機塩類、Ｂ５ビタミン、ＡＡアミノ酸、０．１ｍＭアセトシリンゴン、２０ｇ／ｌ蔗糖、１０ｇ／ｌグルコース、０．５ｇ／ｌビタミンアッセイカザミノ酸、ｐＨ５．２）中へ懸濁した。懸濁濃度は、６６０ｎｍのＯＤ値で約１．０に調整した。なお、２菌株を混合接種する場合は、２菌株ともＯＤ値で約１．０に調整したのち、混合し接種した。次に未熟胚を、共存培養用のＮ６−Ａｓ培地（Ｎ６無機塩類およびビタミン、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ  ６ＢＡ、２０ｇ／ｌ蔗糖、１０ｇ／ｌグルコース、０．５ｇ／ｌ  プロリン、０．５ｇ／ｌ  ビタミンアッセイカザミノ酸、８ｇ／ｌ  アガロース  Ｔｙｐｅ  Ｉ、０．１ｍＭ  アセトシリンゴン、ｐＨ５．２）上に、胚盤側を上向きにして未熟胚を置床し、アグロバクテリウムの懸濁液を滴下した。共存培養は、２５℃暗黒下で７日間行った。【００９３】
共存培養後、未熟胚を４‐６分割し、胚盤側を上向きにしてｎＮ６Ｃ培地（Ｎ６無機塩類およびビタミン、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ  ６ＢＡ、２０ｇ／ｌ蔗糖、５５ｇ／ｌソルビトール、０．５ｇ／ｌ  プロリン、０．５ｇ／ｌ  ビタミンアッセイカザミノ酸、５ｇ／ｌ  ジェランガム、２５０ｍｇ／ｌ  セフォタキシム、１００ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．８）へ置床し、３０℃、５，０００ｌｘ  明条件下で１０日間非選抜（ｒｅｓｔｉｎｇ）培養を行った。各々の未熟胚切片をさらに４‐５分割し、ｎＮ６ＣＨ５０（Ｎ６無機塩類およびビタミン、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ  ６ＢＡ、２０ｇ／ｌ蔗糖、５５ｇ／ｌソルビトール、０．５ｇ／ｌ  プロリン、０．５ｇ／ｌ  ビタミンアッセイカザミノ酸、５ｇ／ｌ  ジェランガム、２５０ｍｇ／ｌ  セフォタキシム、１００ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンＢ  、ｐＨ５．８）選抜培地へ置床し、３０℃、５，０００ｌｘ  明条件下で１０‐１４日間ハイグロマイシンによる選抜培養を行った。【００９４】
増殖したカルスを、Ｎ６ＲＨ５０再分化培地（Ｎ６微量無機塩類およびビタミン、１／２濃度Ｎ６主要無機塩類、ＡＡアミノ酸、０．５ｍｇ／ｌ  キネチン、２０ｇ／ｌ蔗糖、３０ｇ／ｌソルビトール、０．５ｇ／ｌ  ビタミンアッセイカザミノ酸、４ｇ／ｌ  ジェランガム、５０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンＢ、ｐＨ５．８）へ置床し、３０℃、５，０００ｌｘ  明条件下で１４日間培養した。再分化培地へ置床するカルスは、細分した未熟胚切片あたり１個とした。これにより、再分化培地上に置床した各々のカルスを、独立の形質転換イベントとして扱うことができる。再分化した幼植物をＮ６ＦＨ５０発根培地  （Ｎ６微量無機塩類およびビタミン、１／２濃度Ｎ６主要無機塩類、ＡＡアミノ酸  、２０ｇ／ｌ蔗糖、０．５ｇ／ｌ  ビタミンアッセイカザミノ酸、４ｇ／ｌ  ジェランガム、５０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンＢ、ｐＨ５．８）へ移植し、３０℃、５，０００ｌｘ  明条件下で１０‐１４日間培養した。発根した植物体はポットへ移植し、温室で栽培した。【００９５】
３）イネ形質転換体のサザン解析
温室で栽培したハイグロマイシン耐性形質転換体の葉からフェノール‐クロロホルム抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＫｐｎＩで消化後、ＴｙｐｅＩＩアガロース（ＳＩＧＭＡ社）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行った。ナイロンメンブレンへアルカリブロッティングによる転写を行った後、ｈｐｔをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った（図８−ａ）。また、１菌株１ベクター型のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）（図１−ａ）を用いて得たイネ形質転換体５１個体については、ＳａｌＩで消化後、Ｂａｒｎａｓｅをプローブとしたサザン解析を行った（図８−ｂ）。【００９６】
結果および考察
１）イネの形質転換結果
何れの試験区においても形質転換体は得られたが、対照区のＧＵＳ−ＨＰＴのみを導入した場合に比べて、Ｂａｒｎａｓｅを共形質転換した試験区では、形質転換効率が低くなった（表５）。これは、ネガティブ選抜マーカーであるＢａｒｎａｓｅがＧＵＳ−ＨＰＴと共にイネの同一細胞の染色体へ組み込まれ、Ｂａｒｎａｓｅの発現によりその細胞が致死したことによるものである。Ｂａｒｎａｓｅによるイネの細胞死は、胚盤表面の細胞が部分的に明らかな褐変を呈する形で現れる。これは、アグロバクテリウムを接種した日から１０日ないし２０日で観察されるようになる。まだ、選抜培養を開始する以前の段階であり、褐変はハイグロマイシンによる影響ではない。また、７日間の共存培養直後は、未熟胚の胚盤細胞での一過性ＧＵＳ活性は妨げられることはなく、基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）溶液を処理すると、対照ならびに３種試験区とも同等のＧＵＳ活性を示した。これは、Ｂａｒｎａｓｅが一過性発現のレベルでは、細胞を致死させないことを示している。【００９７】
１菌株１ベクター法のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）を用いた時には３０％の効率低下が見られた（表５）。ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ）とＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  Ｂａｒｎａｓｅ）２菌株混合接種法、ならびに１菌株２ベクター法のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ：：ｐＧＷ  Ｂａｒｎａｓｅ）の形質転換効率は、どちらも９０％強と同程度であった（表５）。１菌株１ベクター法では、同一細胞への両種Ｔ−ＤＮＡの導入効率が高かったことを示している。これは、１菌株１ベクター法では、他の試験区に比べて、Ｔ−ＤＮＡが数多く切り出され植物細胞に移行したためと推測される。また、一過性発現レベルでＢａｒｎａｓｅが細胞死を誘導した場合には、形質転換の効率が非常に低くなることが予想される。結果的に、ｎｏｓプロモーターによる発現制御が好適であった。【００９８】
【表５】
2015118640.tif 000006
【００９９】
２）サザン法による導入コピー数の解析
ｈｐｔプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を図９に示した。解析した各々の形質転換体から検出されたバンドは、少なくとも１本が６．７ｋｂ以上のサイズを示した。６．７ｋｂ以上のバンドの検出は、ＧＵＳ−ＨＰＴのＴ−ＤＮＡ全体が導入されていることを示唆している。対照のベクターでは、解析個体のうち４７％がシングルコピー導入であったのに対し、１菌株１ベクターシステムでは、２倍以上の８９％の個体においてシングルコピー導入であった。また、残りの１１％の個体はすべて２コピー導入を示した（図９）。２菌株混合システムと１菌株２ベクターシステムでは、シングルコピー個体の割合にほとんど差がなく、それぞれ６７％および６５％であり、対照の１．４３倍および１．３８倍へと増加した（図９）。このように、試験区では、顕著に低コピー導入個体の割合が増加したが、これは、共形質転換において、同一細胞の染色体へＧＵＳ−ＨＰＴが多コピー導入される場合には、ネガティブ選抜マーカーのＢａｒｎａｓｅ遺伝子も一緒に導入される傾向があることを示している。Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２０００）は、アグロバクテリウム法で得たイネ形質転換体において、Ｔ−ＤＮＡ同士が順方向にあるいは互いに逆方向に繰り返し連結された形で、同一遺伝子座に組み込まれている個体が多いことを報告している。ネガティブ選抜マーカー遺伝子との共形質転換は、そのような個体を生む細胞を致死させているものと推測される。【０１００】
Ｂａｒｎａｓｅプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションは、１菌株１ベクター法のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１  ＧＵＳ−ＨＰＴ  ｃｏｔｒａ．Ｂａｒｎａｓｅ）を用いて得たイネ形質転換体５１個体について実施した。すべての個体でＢａｒｎａｓｅ遺伝子にハイブリダイズするシグナルは検出されなかった。導入したＰｎｏｓ−ＩｎｔＢａｒｎａｓｅ−Ｔ３５Ｓは、植物の細胞死の誘導に対して必要十分な発現をしていることが分かった。Ｂａｒｎａｓｅはわずかな発現量でも細胞死を誘導しているものと推測される。【０１０１】
３）結論
ネガティブ選抜マーカー遺伝子と、ポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む目的ＤＮＡの共形質転換により、多コピー導入細胞を培養の初期に排除できることが分った。実施例では、３種類のアグロバクテリウムのベクターシステムを用いたが、このシステムに限らず、幅広い形質転換系に用いることができると容易に推測される。パーティクルガンなどのＤＮＡの直接導入法についても共形質転換を通じて適用できることは、そのメカニズムから明らかである。直接導入法は、もともと多コピー導入の頻度が高いので、低コピー化には非常に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月2日(2014.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
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【国際調査報告】
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