(57)【要約】  本発明は、グリコシダーゼＡＳＢＧＬ２、ＡＯＢＧＬ２、ＡＯＢＧＬ１もしくはＡＳＢＧＬ１またはその変異体と、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法。
（ａ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質が、さらに、分泌シグナルペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドが、さらに、少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合および少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記β１，６−グルコシド結合のないモグロシドが、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの生産方法。
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項７】
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号１の１番目〜６０番目、配列番号５の１番目〜６０番目、配列番号９の１番目〜５７番目、配列番号１３の１番目〜５７番目、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜配列番号２５のいずれかに記載の塩基配列からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換体が、形質転換酵母または形質転換植物である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと接触させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法。
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１３】
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号１の１番目〜６０番目、配列番号５の１番目〜６０番目、配列番号９の１番目〜５７番目、配列番号１３の１番目〜５７番目、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜配列番号２５のいずれかに記載の塩基配列からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記形質転換細胞が、形質転換細菌または形質転換酵母である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドが、さらに、少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有する、請求項１２〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合および少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記β１，６−グルコシド結合のないモグロシドが、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡから選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モグロシドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラカンカ（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）は、中国広西チワン族自治区を原産地とするウリ科の植物である。ラカンカの果実は、強い甘味を呈し、その抽出物は、人工甘味料として利用されている。また、ラカンカの果実を乾燥したものは、漢方の生薬としても利用されている。【０００３】
ラカンカの果実は、甘味成分として、モグロシドを含むことが知られている。モグロシドは、アグリコンであるモグロールにグルコースが結合した配糖体である。モグロシドは、グルコースの結合位置や数の違いで各種モグロシドに分類される。ラカンカの果実に含まれるモグロシドは、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩおよび１１−オキソモグロシドである。この他、モグロシドには、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１などがあることが知られている。【０００４】
これらのモグロシドには、様々な生理活性があることが明らかになっている。例えば、モグロシドＶには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインスリン分泌を調節する働きがあるとの報告がある（非特許文献１：Ｙａｏ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ，２００９，４４，１２５２−１２５７）。また、モグロシドＩＩＩは、腸管のマルターゼ阻害活性を示し、血糖値上昇を抑制するとの報告がある（非特許文献２：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００５，５３，２９４１−２９４６）。【０００５】
このような、モグロシドは、ラカンカの果実の抽出物を精製することにより調製することができるが、その他にも、いくつかの調製方法が知られている。例えば、ＵＤＰ−グルコース転移酵素を用いて、モグロールをグリコシル化し、各種モグロシドを調製する方法が開示されている（特許文献１：ＷＯ２０１３／０７６５７７）。さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のペクチナーゼにより、ラカンカ抽出物から、各種モグロール配糖体を調製する方法が開示されている（特許文献１：ＷＯ２０１３／０７６５７７）。【０００６】
ここで、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にモグロシドＶをモグロシドＩＩＩＥに変換する活性があること、また、その活性を担う酵素の遺伝子がＥＸＧ１（ＧＨ５ファミリー、β−１，３グルカナーゼ）であることが開示されている（非特許文献３：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０１３，６１，７１２７−７１３４）。【０００７】
また、麹菌は様々な加水分解酵素を分泌する生物として知られており、ゲノム情報も公知である。β-グルコシダーゼ様のタンパク質をコードすると考えられる遺伝子が、およそ４０あるが、それぞれの遺伝子がコードするタンパク質の基質特異性についての情報は、ほとんどない。麹菌のＡＯ０９０００９０００３５６遺伝子にコードされるグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）３ファミリーのβ−グルコシダーゼは、β-グルコシド結合を有する二糖類を加水分解するとの報告がある（非特許文献４：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６４  ９７２−９７８（２００６））。具体的には、β−１，３結合を有するラミナリビオース、β−１，６結合を有するβ−ゲンチオビオース、β−１，４結合を有するセロビオース、β−１，２結合を有するソホロースの順に加水分解の特異性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０７６５７７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｏ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ，２００９，４４，１２５２−１２５７
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００５，５３，２９４１−２９４６
【非特許文献３】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０１３，６１，７１２７−７１３４
【非特許文献４】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６４  ９７２−９７８（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような状況の下、モグロシドの新たな生産方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、麹菌由来のグリコシドヒドロラーゼＡＳＢＧＬ２、ＡＯＢＧＬ２、ＡＯＢＧＬ１およびＡＳＢＧＬ１が、モグロシドＶのβ−１,６グルコシド結合を切断する活性を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法。
（ａ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
［２］
前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質が、さらに、分泌シグナルペプチドを含む、前記［１］に記載の方法。
［３］
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドが、さらに、少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合および少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択される、前記［３］に記載の方法。
［５］
前記β１，６−グルコシド結合のないモグロシドが、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡから選択される、前記［４］に記載の方法。
［６］
少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの生産方法。
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［７］
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、前記［６］に記載の方法。
［８］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号１の１番目〜６０番目、配列番号５の１番目〜６０番目、配列番号９の１番目〜５７番目、配列番号１３の１番目〜５７番目、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［７］に記載の方法。
［９］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜配列番号２５のいずれかに記載の塩基配列からなる、前記［８］に記載の方法。
［１０］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［６］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
前記形質転換体が、形質転換酵母または形質転換植物である、前記［６］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと接触させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法。
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［１３］
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、上記［１２］に記載の方法。
［１４］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号１の１番目〜６０番目、配列番号５の１番目〜６０番目、配列番号９の１番目〜５７番目、配列番号１３の１番目〜５７番目、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記［１３］に記載の方法。
［１５］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜配列番号２５のいずれかに記載の塩基配列からなる、上記［１４］に記載の方法。
［１６］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］
前記形質転換細胞が、形質転換細菌または形質転換酵母である、上記［１２］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドが、さらに、少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有する、上記［１２］〜［１７］に記載の方法。
［１９］
前記少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合および少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
前記β１，６−グルコシド結合のないモグロシドが、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡから選択される、上記［１９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、モグロシドの新たな調製方法が提供される。また、本発明の形質転換体は、β−１,６グルコシド結合のないモグロシドを製造することができる。本発明の形質転換体は、β−１,６グルコシド結合のないモグロシドの含有量が高いため、これらの形質転換体から、効率よくβ−１,６グルコシド結合のないモグロシドを抽出および精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酵母の分泌タンパク質の分泌シグナルペプチド配列（ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）を示す。Ａは、ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）である。Ｂは、ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）である。Ｃは、ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）である。
【図２】モグロシドＶを酵素液で反応して得られた反応産物のＬＣ分析の結果を示す。Ａは、酵素液ＡＳＢＧＬ２での結果であり、Ｂは、酵素液ＡＯＢＧＬ１での結果であり、Ｃは、コントロールである。（１）はモグロシドＶであり、（２）はモグロシドＩＩＩＥである。
【図３】モグロシドＩＩＩＥを酵素液で反応して得られた反応産物のＬＣ分析の結果を示す。Ａは、酵素液ＡＯＢＧＬ１での結果であり、Ｂはコントロールである。（１）はモグロシドＩＩＩＥであり、（２）はモグロール配糖体（２糖）である。
【図４】モグロシドＩＩＩＥを酵素液で反応して得られた反応産物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。Ａは、酵素液ＡＯＢＧＬ１での結果であり、Ｂはコントロールである。（１）はモグロシドＩＩＩＥであり、（２）はモグロール配糖体（２糖）であり、（３）はモグロール配糖体（１糖）である。
【図５−１】ＡＯＢＧＬ１タンパク質（ＡＯＢＧＬ１ｐ）、ＡＳＢＧＬ１タンパク質（ＡＳＢＧＬ１ｐ）ＡＯＢＧＬ２タンパク質（ＡＯＢＧＬ２ｐ）とＡＳＢＧＬ２（ＡＳＢＧＬ２ｐ）タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。二重下線部分は、推定分泌シグナル配列である。
【図５−２】図５−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2015年1月20日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2015-008508号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１６】
「ＡＳＢＧＬ２」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示される。
「ＡＯＢＧＬ２」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示される。
「ＡＯＢＧＬ１」は、麹菌由来のβ-グルコシダーゼあり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示される。
「ＡＳＢＧＬ１」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６に示される。
これらのポリヌクレオチドおよび酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
【００１７】
１．モグロシドの調製方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法を提供する。
【００１８】
（ａ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
【００１９】
上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、”Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００２０】
「配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、例えば、１〜８４個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２１】
また、このようなタンパク質としては、配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２２】
「配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２３】
ここで、「モグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性」とは、アグリコンであるモグロールにグルコースが結合した配糖体であるモグロシドにおいて、モグロシド中のグルコース同士が形成するβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を意味する。本発明のタンパク質は、モグロシドにおいて、β−１，２グルコシド結合を切断する活性を有していてもよいが、この場合でも、本発明のタンパク質は、β−１，２グルコシド結合と比較して、β−１，６グルコシド結合を優先的に切断する。
【００２４】
モグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性は、本発明のタンパク質と、少なくとも１つのβ−１，６グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、得られた反応生成物を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。少なくとも１つのβ−１，６グルコシド結合に加えて、β−１，２グルコシド結合を有するモグロシドを本発明のタンパク質との反応に用いることで、β−１，２グルコシド結合と比較して、β−１，６グルコシド結合を優先的に切断しているかも確認することができる。
【００２５】
「配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜８４個のアミノ酸配列中の位置において、１〜８４個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
【００２６】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
【００２７】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２８】
本発明のいくつかの態様のタンパク質は、分泌シグナルペプチドが切断されており、分泌シグナルペプチドを含まない。本発明の別のいくつかのタンパク質は、分泌シグナルペプチドが切断されずに残り、このため、さらに、分泌シグナルペプチドを含んでもよい。分泌シグナルペプチドを含む場合、好ましくは、分泌シグナルペプチドは、本発明のタンパク質のＮ末端に含まれる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質を、細胞外へ分泌させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野において周知であり、報告されている。
【００２９】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ  ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３０】
本発明において、「モグロシド」とは、アグリコンであるモグロールにグルコースが結合した配糖体である。モグロールおよびモグロシドの例を、以下に示す。
【００３１】
【化１】
2016117549.tif 000002
【００３２】
【化２】
2016117549.tif 000003
【００３３】
尚、上記において、「Ｇｌｃ６−Ｇｌｃ−」は、β１，６−グルコシド結合を含むことを示す。「Ｇｌｃ２−Ｇｌｃ−」は、β１，２−グルコシド結合を含むことを示す。「（Ｇｌｃ６Ｇｌｃ２（Ｇｌｃ）−」は、β１，６−グルコシド結合とβ１，２−グルコシド結合を含むことを示す。
【００３４】
モグロシドのうち、少なくとも１つ（例えば、１または２）のβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドは、例えば、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＡ１、およびモグロシドＩＩＡ２から選択されるモグロシドである。少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドは、さらに、少なくとも１つ（例えば、１つ）のβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドを有するのが好ましい。少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合と少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドは、例えば、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択されるモグロシドであり、好ましくは、モグロシドＶである。
【００３５】
本発明に係るモグロシドの調製方法によって、β１，６−グルコシド結合が切断され、β１，６−グルコシド結合のないモグロシド（以下、「本発明のモグロシド」という）が得られる。β１，６−グルコシド結合のないモグロシドは、出発物質の「β１，６−グルコシド結合を有するモグロシド」に応じて次のように変わる。以下に、その例を示す。
【００３６】
【化３】
2016117549.tif 000004
【００３７】
本発明のモグロシドの調製方法において、出発物質となる少なくとも１つのβ１，６グルコシド結合を有するモグロシドは、ラカンカの果実から抽出し、精製することによって入手することができるし、あるいは、公知の方法（例えば、特許文献１に記載の方法）またはそれに準ずる方法によって調製してもよい。あるいは、出発物質となる少なくとも１つのβ１，６グルコシド結合を有するモグロシドは、市販のものでもよい。
本発明のいくつかの態様では、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＩＩＩＡ１から選択されるモグロシドのβ１，６−グルコシド結合が切断され、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡから選択されるモグロシドが得られる。本発明の最も好ましい態様では、モグロシドＶのβ１，６−グルコシド結合が切断され、モグロシドＩＩＩＥが得られる。
【００３８】
前述のように、本発明のタンパク質は、モグロシドにおいて、さらに、β−１，２グルコシド結合を切断する活性を有する場合がある。その場合は、本発明のモグロシドは、β１，６−グルコシド結合およびβ−１，２グルコシド結合のいずれもないモグロシドを含んでもよい。β１，６−グルコシド結合およびβ−１，２グルコシド結合のいずれもないモグロシドは、例えば、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、およびモグロシドＩＥ１であり、好ましくは、モグロシドＩＩＥである。例えば、モグロシドＩＩＩＥのβ−１，２グルコシド結合がさらに切断されると、モグロシドＩＩＥが得られる。また、モグロシドＩＩＡのβ−１，２グルコシド結合がさらに切断されると、モグロシドＩＡ１が得られる。
【００３９】
本発明に係るモグロシドの調製方法は、本発明のタンパク質と、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを反応させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成したβ１，６−グルコシド結合のないモグロシドを精製する工程を含んでいてもよい。
β１，６−グルコシド結合のないモグロシドは、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
【００４０】
本発明のモグロシドが、β１，６−グルコシド結合はないが少なくとも１つのβ−１，２グルコシド結合を有するモグロシドと、β１，６−グルコシド結合およびβ−１，２グルコシド結合のいずれもないモグロシドとを含む場合には、これらのモグロシドを、必要に応じて、公知の方法により分離および精製するようにしてもよい。β１，６−グルコシド結合はないが少なくとも１つのβ−１，２グルコシド結合を有するモグロシドは、例えば、モグロシドＩＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡである。β１，６−グルコシド結合およびβ−１，２グルコシド結合のいずれもないモグロシドは、前述の通りである。
【００４１】
２．非ヒト形質転換体を用いた本発明のモグロシドの生産方法
本発明のタンパク質は、麹菌に由来する分泌型の酵素またはその変異体であり、麹菌と同様に細胞外環境において高い活性を有することが期待される。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を細胞外に発現させ、本発明のタンパク質と、β１，６−グルコシド結合を有するモグロシドとを反応させることにより本発明のモグロシドを生成することができる。あるいは、宿主によっては、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、本発明のモグロシドを生成することもできる。
【００４２】
そこで、本発明は、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を培養することを含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの生産方法を提供する。
【００４３】
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００４４】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００４５】
配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の６１番目〜２６０１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５の６１番目〜２６０１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９の５８番目〜２５８６番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
「配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００４７】
「配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００４８】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．  ４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４９】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５０】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列のＤＮＡ、または配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５１】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドは、前述の通りである。このような分泌シグナルペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを導入する宿主に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主が酵母の場合には、酵母菌由来の分泌シグナルペプチド、例えば、ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドが挙げられる。ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、それぞれ、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列である。また、宿主が麹菌の場合には、麹菌由来のシグナルペプチド、例えば、配列番号３の１番目〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７の１番目〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１１の１番目〜１９番目のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１５の１番目〜１９番目のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号３の１番目〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号７の１番目〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１１の１番目〜１９番目のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号１５の１番目〜１９番目のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、配列番号１の１番目〜６０番目、配列番号５の１番目〜６０番目、配列番号９の１番目〜５７番目、および配列番号１３の１番目〜５７番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５３】
分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜２５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号１７〜２５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５４】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
【００５６】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００５７】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００５８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
【００６０】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，ｖｏｌ．  ８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
【００６１】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主は、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成するものであれば特に限定されるものではなく、ラカンカのように少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成する植物だけではなく、本来少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成しない細胞または生物に少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドの生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドの生成に必要な遺伝子」は、例えば、ＷＯ２０１３／０７６５７７、ＷＯ２０１４／０８６８４２などに記載のモグロールやモグロシド合成活性を有する遺伝子が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌（麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、酵母または植物である。
【００６２】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００６３】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
【００６４】
形質転換体が、酵母である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように酵母中に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母で生成された少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと反応し、β１，６−グルコシド結合が切断され、β１，６−グルコシド結合のない本発明のモグロシドが酵母の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
【００６５】
形質転換体が、植物である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように植物中に導入することによって取得される。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成する植物、または本来少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成しないものの必要な遺伝子を導入することで少なくともβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを生成することができる植物であれば特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成された少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと反応し、β１，６−グルコシド結合が切断され、β１，６−グルコシド結合のない本発明のモグロシドが植物中に生成される。
【００６６】
本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のモグロシドの含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のモグロシドが高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のモグロシドが培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のモグロシドを含む培養上清を得ることができる。
【００６７】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のモグロシドの精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
【００６８】
３．非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を用いた本発明のモグロシドの調製方法
本発明のポリヌクレオチドを、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を用いること、すなわち、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと接触させることにより本発明のモグロシドを生成することができる。「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。  そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと接触させて、前記β１，６−グルコシド結合を切断する工程を含む、β１，６−グルコシド結合のないモグロシドの調製方法を提供する。
（ａ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜８４個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の６１番目〜２６０１番目、配列番号２の６１番目〜２７０７番目、配列番号５の６１番目〜２６０１番目、配列番号６の６１番目〜２７０８番目、配列番号９の５８番目〜２５８６番目、配列番号１０の５８番目〜２８９１番目、配列番号１３の５８番目〜２５８６番目、および配列番号１４の５８番目〜２８９２番目からなる群から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロシドのβ−１，６グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００６９】
上記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
【００７１】
分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１７〜２５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号１７〜２５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主細胞に導入される。適切な発現ベクターは、前記と同様である。
【００７３】
本発明の形質転換細胞の作製方法は、特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌（麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。形質転換細胞は、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌または酵母である。
宿主細胞の形質転換方法は、前述の通りである。
【００７４】
本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように宿主細胞に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を用いること、すなわち、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドと接触させることにより本発明のモグロシドを生成することができる。
【００７５】
「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を含む容器に少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドとを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドを含む容器に添加することが含まれる。
【００７６】
「モグロシド」、「少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシド」および「β１，６−グルコシド結合のないモグロシド」は、前記と同様である。
【００７７】
少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合を有するモグロシドは、さらに、少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するのが好ましい。少なくとも１つのβ１，６−グルコシド結合と少なくとも１つのβ１，２−グルコシド結合を有するモグロシドは、前記と同様である。
【００７８】
このようにして得られた本発明のモグロシドは、常法に従って、例えば、食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００７９】
食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
【００８０】
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００８２】
材料
以下の実施例において、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｌｙｌ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（以下、Ｘ−β−Ｇｌｃ）、および４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（以下、ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ）は、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手したものを用いた。【００８３】
分泌型β-グルコシダーゼホモログの検索
麹菌ゲノムデータ（ＰＲＪＮＡ２８１７５）より、β−グルコシダーゼホモログを探索した。その結果、ＧＨ２ファミリーモチーフを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が５個、ＧＨ３ファミリーモチーフを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が２８個、ＧＨ５ファミリーモチーフを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が７つ見つかった。その中で、ＧＨ３ファミリーモチーフを有し、分泌シグナルを有するタンパク質をコードする配列の中に、ＡＯ０９０００１０００５４４とＡＯ０９０００９０００３５６があり、これらをクローン化した。【００８４】
麹菌のｃＤＮＡの合成
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｖａｒ．ｂｒｕｎｎｅｕｓ（ＩＦＯ３０１０２）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ（ＮＢＲＣ４２３９）をＧＹプレート（２％グルコース、０．５％酵母エキス、２％  アガー）に植菌し、２５℃で３日間培養した。生育した菌体をＧＹプレートから回収し、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。【００８５】
ＡＯ０９０００１０００５４４のＤＮＡ配列をもとに、以下のプライマーを設計した。【００８６】
ＡＯＢＧＬ２−１：５’-GCGGCCGCATGGCTGCCTTCCCGGCCTA（配列番号２６）
ＡＯＢＧＬ２−２：５’-GTCGACCTACAAAGTAGAACATCCCTCTCCAACC（配列番号２７）【００８７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅのＡＯ０９０００１０００５４４のホモログをクローン化するために、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅのゲノムデータ（ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１８（３），１６５−１７６（２０１１）参照）から、ＢＬＡＳＴ検索により該当する配列を抽出した（配列番号２）。このＤＮＡ配列をもとに、以下のプライマーを設計した。  【００８８】
ＡＳＢＧＬ２−１：５’-GCGGCCGCATGGCTGCCTTTCCGGCCTAC(下線部は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトである)（配列番号２８）
ＡＳＢＧＬ２−２：５’-GTCGACCTATAAAGTAGAACATCCCTCCCCTACT（配列番号２９）  【００８９】
ＡＯ０９０００９０００３５６のＤＮＡ配列をもとに、以下のプライマーを設計した。【００９０】
ＡＯＢＧＬ１−１：５’−AGATCTATGAAGCTTGGTTGGATCGAGGT（下線部は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトである）（配列番号３０）
ＡＯＢＧＬ１−２：５’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA（下線部は制限酵素ＳａｌＩサイトである）（配列番号３１）【００９１】
上述のとおり合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて、ＰＣＲにより増幅された約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）を用いてクローニングした。鋳型、プライマーの組み合わせと、ここで得られた遺伝子は表１のとおりである。ここで得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＣＲ-ＡＯＢＧＬ２、ｐＣＲ-ＡＳＢＧＬ２、ｐＣＲ-ＡＯＢＧＬ１またはｐＣＲ-ＡＳＢＧＬ１とした。【００９２】
【表１】
2016117549.tif 000005
【００９３】
クローニングした各遺伝子の同一性および各遺伝子がコードする推定アミノ酸配列の同一性（％）は、下記表２および表３のとおりである。【００９４】
【表２】
2016117549.tif 000006
【００９５】
【表３】
2016117549.tif 000007
【００９６】
ここで、図５−１および図５−２に、ＡＯＢＧＬ２タンパク質（ＡＯＢＧＬ２ｐ）、ＡＳＢＧＬ２タンパク質（ＡＳＢＧＬ２ｐ）、ＡＯＢＧＬ１タンパク質（ＡＯＢＧＬ１ｐ）およびＡＳＢＧＬ１タンパク質（ＡＳＢＧＬ１ｐ）のアミノ酸配列のアライメントを示す。【００９７】
【表４】
2016117549.tif 000008
【００９８】
酵母用発現ベクターの構築
酵母用発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２２１−１２２８，１９９５）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１、またはｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ１を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（タカラバイオ）を用いて、連結し、得られたプラスミドをｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１、またはｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ１とした。【００９９】
酵母形質転換株の取得
形質転換の親株として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，５１５−５２０，１９８９）を用いた。【０１００】
プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ２（ＡＳＢＧＬ２発現用）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１（ＡＯＢＧＬ１発現用）、ｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ１（ＡＳＢＧＬ１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３−１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。【０１０１】
選抜した株を、０．００４％  Ｘ−β−Ｇｌｃを含むＳＣ−Ｔｒｐ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養したが、ｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１ｐ、ｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ１いずれのプラスミドで形質転換した株も、コントロールであるｐＹＥ２２ｍで形質転換した株もどちらも青色を呈さず、Ｘ−β−Ｇｌｃ分解活性を確認できなかった。【０１０２】
一方、選抜した株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ−Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液に懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。得られた培養上清または菌体破砕液のｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性を検討した。【０１０３】
その結果、コントロールを含めて、いずれの形質転換株の培養上清および菌体破砕液の両方に、ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ分解活性があり、両者の間で、活性に大きな差はなかった。【０１０４】
これらのことから、プラスミドｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１ｐ、ｐＹＥ−ＡＳＢＧＬ１を酵母ＥＨ１３−１５株に導入しても、β−グルコシダーゼ活性を有する活性型のタンパク質を発現させることができないことが示唆された。また、酵母の内在性のβ−グルコシダーゼ活性を担う遺伝子を欠失させておく必要があることも分かった。【０１０５】
分泌シグナル配列の置換
ＡＯＢＧＬ２ｐやＡＳＢＧＬ２ｐのＮ末端の２０アミノ酸は分泌シグナル配列であると推定され、また、ＡＯＢＧＬ１ｐやＡＳＢＧＬ１ｐのＮ末端の１９アミノ酸は、分泌シグナル配列であると推定される。ここで、図５−１中の二重下線部分が、ＡＯＢＧＬ１、ＡＳＢＧＬ１、ＡＯＢＧＬ２、ＡＳＢＧＬ２の推定分泌シグナル配列である。【０１０６】
そこで、ＡＳＢＧＬ２、ＡＯＢＧＬ１またはＡＳＢＧＬ１を酵母で分泌発現させるために、推定分泌シグナル配列を酵母の分泌タンパク質の分泌シグナル配列に置換することにした。【０１０７】
まず、以下のオリゴＤＮＡを合成し、アニーリングさせたのち、ベクターｐＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを作成した。【０１０８】
ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｆ：５’−AATTAATTAAGAGCTAGCG−３’（配列番号３２）
ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｒ：５’−TTAATTCTCGATCGCTTAA−３’（配列番号３３）【０１０９】
プラスミドｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ２を鋳型にして、以下のプライマーＳａｃ−ＡＳＢＧＬ２−ＦとプライマーＳａｌ-ＡＳＢＧＬ２−Ｒで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ベクターｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＳＢＧＬ２を構築した。【０１１０】
Ｓａｃ−ＡＳＢＧＬ２−Ｆ：５’−AAGAGCTCGAGTCTCTGACATCAAGAGCCTCTACAGA−３’（配列番号３４）
Ｓａｌ-ＡＳＢＧＬ２−Ｒ：５’−GGGTCGACCTATAAAGTAGAACATCCCTCCCCTACTACAC−３’（配列番号３５）【０１１１】
プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１またはｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ１を鋳型にして、以下のプライマーＢｇｌ２−ＡＯＢＧＬ１−ＦとプライマーＡＯＢＧＬ１−２で、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ベクターｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＯＢＧＬ１またはｐＹＥ−ＰＮ−ＡＳＢＧＬ１を構築した。【０１１２】
Ｂｇｌ２−ＡＯＢＧＬ１−Ｆ：５’−TAAGATCTAAGGATGATCTCGCGTACTCCCC−３’（配列番号３６）
ＡＯＢＧＬ１−２：５’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA−３’（配列番号３１）【０１１３】
ＡＳＢＧＬ２ｐ、ＡＯＢＧＬ２ｐ、ＡＯＢＧＬ１ｐまたはＡＳＢＧＬ１ｐの推定分泌シグナル配列（それぞれ、配列番号３の１〜２０番目の配列、配列番号７の１〜２０番目の配列、配列番号１１の１〜１９番目の配列、または配列番号１５の１〜１９番目の配列）を酵母の分泌タンパク質の分泌シグナル配列ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）（図１Ａに記載のアミノ酸配列の１〜１９番目の配列）、ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）（図１Ｂに記載アミノ酸配列の１〜１７番目の配列）、ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）（図１Ｃに記載のアミノ酸配列の１〜１９番目の配列）に置き換えたタンパク質を発現させるためのプラスミドを構築するために、以下のプライマーを設計した。【０１１４】
ここで、分泌シグナル配列ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４３および配列番号４４に示す。分泌シグナル配列ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４５および配列番号４６に示す。分泌シグナル配列ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４７および配列番号４８に示す。【０１１５】
ＳｃＰＨＯ５−Ｆ：５’−TAAATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAG−３’（配列番号３７）
ＳｃＰＨＯ５−Ｒ：５’−CTAGCTGCATTGGCCAAAGAAGCGGCTAAAATTGAATAAACAACAGATTTAAACATTTAAT−３’（配列番号３８）
ＳｃＳＵＣ２−Ｆ：５’−TAAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG−３’（配列番号３９）
ＳｃＳＵＣ２−Ｒ：５’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−３’（配列番号４０）
ＳｃＭＦ１−Ｆ：５’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−３’（配列番号４１）
ＳｃＭＦ１−Ｒ：５’−CTAGCAGCTAATGCGGAGGATGCTGCGAATAAAACTGCAGTAAAAATTGAAGGAAATCTCATTTAAT−３’（配列番号４２）【０１１６】
ＳｃＰＨＯ５−ＦとＳｃＰＨＯ５−Ｒの組み合わせ、ＳｃＳＵＣ２−ＦとＳｃＳＵＣ２−Ｒの組み合わせ、およびＳｃＭＦ１−ＦとＳｃＭＦ１−Ｒの組み合わせでアニーリングさせたものをそれぞれ、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＯＢＧＬ１またはｐＹＥ−ＰＮ−ＡＳＢＧＬ１を制限酵素ＰａｃＩとＮｈｅＩで消化したものと連結し、以下のプラスミドを得た。【０１１７】
ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ２（ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ２発現用）
ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ２（ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ２発現用）
ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ２（ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ２発現用）
ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１（ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１（ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１（ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１発現用）【０１１８】
ここで、ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ２、ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ２、ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ２のＤＮＡ配列を配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９に示した。また、ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１のＤＮＡ配列を配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２に、ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１のＤＮＡ配列を配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５に示した。【０１１９】
宿主株の作成
形質転換の宿主株としては、酵母の菌体外β−グルコシダーゼ活性の大半を担っていると考えられているＥＸＧ１（ＹＬＲ３００ｗ）遺伝子とそのホモログであるＥＸＧ２（ＹＤＲ２６１ｃ）遺伝子を欠損させた株を使用することとし、以下のとおり作成した。
Δｅｘｇ１株（Δｅｘｇ１：ＫａｎＭＸ  ＭＡＴａｌｐｈａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０，クローンＩＤ１５２１０、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、Δｅｘｇ２株（Δｅｘｇ２：ＫａｎＭＸ  ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０，クローンＩＤ３６２０、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。それぞれの菌体を白金耳でかきとり、ＳＣ−Ｍｅｔ，Ｌｙｓ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で混合し、３０℃で２日間培養した。生育してくる株は、２つの株が掛け合わされたヘテロ二倍体であると考えられた。得られた株をＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した後、菌体を白金耳でかきとって、０．５％  酢酸カリウム寒天培地（２％アガー）に塗布し、室温で５日間培養し、胞子を形成させた。四分子分離を行い、一倍体株を分離した。得られた株の遺伝子型をＰＣＲにより確認し、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ２−１株（Δｅｘｇ１：ＫａｎＭＸ  Δｅｘｇ２：ＫａｎＭＸ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０）であるものを選抜した。【０１２０】
酵母Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーＴＲＰ１−ＦとプライマーＴＲＰ１−Ｒで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。増幅された約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）を用いてクローニングし、プラスミドｐＣＲ−ＴＲＰ１を得た。【０１２１】
ＴＲＰ１−Ｆ：TACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCG（配列番号４９）
ＴＲＰ１−Ｒ：TCTACAACCGCTAAATGTTTTTGTTCG（配列番号５０）【０１２２】
ｐＰＲＧＩＮＦＲＴ３−１０３（特開２００１−１２０２７６）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢｕｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）により末端を平滑化したのち、プラスミドｐＣＲ−ＴＲＰ１を制限酵素ＨｐａＩとＳｔｕＩで消化して得られたＳＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使って連結させ、プラスミドｐＣＲ−Δｔｒｐ１：ＵＲＡ３−ＦＲＴを得た。これを鋳型として、プライマーＴＲＰ１−ＦとプライマーＴＲＰ１−Ｒで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行い、得られた４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を用いて、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ２−１株を酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＣ−Ｕｒａ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー））に生育するものを、形質転換株として選抜した。形質転換株をＹＰＧａｌ培地（酵母エキス  ２％、ポリペプトン  １％、ガラクトース  ２％）で培養した後、ＳＣ＋５−ＦＯＡ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー））に塗布し、生育してきた株を、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ２−２株（Δｅｘｇ１：ＫａｎＭＸ  Δｅｘｇ２：ＫａｎＭＸ  Δｔｒｐ１  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０）として、以下の形質転換の宿主とした。【０１２３】
Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ２−２株をプラスミドｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ２、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１で酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＣ−Ｔｒｐ寒天培地上で生育するものを形質転換株として選抜した。【０１２４】
Ｘ−β−Ｇｌｃ活性の確認
得られた形質転換株を０．００４％Ｘ−β−Ｇｌｃを含むＳＤ−Ｔｒｐ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養したところ、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１で形質転換した株は、菌体およびその周りが青く染まり、Ｘ−β−Ｇｌｃを加水分解する活性を有することが示唆された。【０１２５】
コントロールベクターを導入した株では、菌体およびその周辺は青く染まらず、Ｘ−β−Ｇｌｃを加水分解する活性はなかった。【０１２６】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性の確認
得られた形質転換株をＳＤ−Ｔｒｐ  液体培地１０ｍＬと１Ｍリン酸カリウムバッファー１ｍＬを混合した液体培地に１白金耳植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。培養物を遠心分離により菌体と培養上清に分離した。【０１２７】
培養上清をアミコンウルトラ−１５  ５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により、およそ５００μＬまで濃縮し、０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、祖酵素液とした。祖酵素液５０μＬ、０．２Ｍクエン酸ナトリウムバッファー５０μＬ、２０ｍＭｐＮＰ−βＧｌｃ水溶液５０μＬ、水５０μＬを混合し、３７℃で反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化を調べた。
結果を以下の表５に示す。【０１２８】
表５：４０５ｎｍの吸光度変化
【表５−１】
2016117549.tif 000009
【表５−２】
2016117549.tif 000010
【表５−３】
2016117549.tif 000011
【０１２９】
粗酵素液の調製
ｐＹＥ-ＳＵＣ２ｓ-ＡＳＢＧＬ２導入株、ｐＹＥ-ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１導入株とコントロールベクターｐＹＥ２２ｍ導入株を、ＳＣ−Ｔｒｐ液体培地に１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）を１／１０量加えた液体培地で、それぞれ３０℃で３日間振とう培養した。得られた培養物（２００ｍｌ）を遠心分離し、培養上清を得た。培養上清を硫酸アンモニウム８０％飽和にし、１００００ｘｇにて遠心分離した。上清を捨て、得られた沈澱を０．１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１５ｍＬに溶解した。アミコン  ウルトラ−１５  １００ｋＤａで脱塩、濃縮を行い、最終的に約５００μＬのサンプルを得た。【０１３０】
モグロシドＶに対する活性
モグロシドＶを５０μｇ／ｍＬ、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、上記酵素液２０μＬで、全量１００μＬとし、５０℃で、４時間反応させた。反応液を、メタノールで洗浄し水で平衡化したＳｅｐＰａｋＣ１８  ５００ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ）に供した。４０％メタノールで洗浄後、８０％メタノールで溶出し、スピードバックで乾固した。１００μＬの水に溶解し、ＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。【０１３１】
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；水
Ｂ  ｃｏｎｃ．９０％→３０％  ６０分  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２０３ｎｍ【０１３２】
その結果、ＡＳＢＧＬ２とＡＯＢＧＬ１にはモグロシドＶをモグロシドＩＩＩＥ（β−１，６グルコシド結合を加水分解）に完全に加水分解する強い活性が検出されたが（図２Ａ、Ｂ）、コントロールでは、モグロシドＶから新たに生成したものはなかった（図２Ｂ）。【０１３３】
モグロシドＩＩＩＥに対する活性
ＡＯＢＧＬ１酵素液を、モグロシドＩＩＩＥと反応時間を１６時間にして、上記と同様の条件で作用させた。その結果、ＡＯＢＧＬ１はモグロシドＩＩＩＥをモグロール２糖配糖体、モグロール１糖配糖体に加水分解する活性も検出されたが（図３Ａ、図４Ａ）、コントロールでは、モグロシドＩＩＩＥから新たに生成したものはなかった（図３Ｂ、図４Ｂ）。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
［配列番号１］ＡＳＢＧＬ２のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号２］ＡＳＢＧＬ２のゲノムＤＮＡ配列である。
［配列番号３］ＡＳＢＧＬ２のアミノ酸配列である。
［配列番号４］ＡＳＢＧＬ２成熟タンパク質のアミノ酸配列である。
［配列番号５］ＡＯＢＧＬ２のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号６］ＡＯＢＧＬ２のゲノムＤＮＡ配列である。
［配列番号７］ＡＯＢＧＬ２のアミノ酸配列である。
［配列番号８］ＡＯＢＧＬ２成熟タンパク質のアミノ酸配列である。
［配列番号９］ＡＯＢＧＬ１のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号１０］ＡＯＢＧＬ１のゲノムＤＮＡ配列である。
［配列番号１１］ＡＯＢＧＬ１のアミノ酸配列である。
［配列番号１２］ＡＯＢＧＬ１成熟タンパク質のアミノ酸配列である。
［配列番号１３］ＡＳＢＧＬ１のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号１４］ＡＳＢＧＬ１のゲノムＤＮＡ配列である。
［配列番号１５］ＡＳＢＧＬ１のアミノ酸配列である。
［配列番号１６］ＡＳＢＧＬ１成熟タンパク質のアミノ酸配列である。
［配列番号１７］ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ２のＤＮＡ配列である。
［配列番号１８］ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ２のＤＮＡ配列である。
［配列番号１９］ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ２のＤＮＡ配列である。
［配列番号２０］ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２１］ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２２］ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２３］ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２４］ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２５］ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１のＤＮＡ配列である。
［配列番号２６］実施例で用いたプライマーである（ＡＯＢＧＬ２−１）。
［配列番号２７］実施例で用いたプライマーである（ＡＯＢＧＬ２−２）。
［配列番号２８］実施例で用いたプライマーである（ＡＳＢＧＬ２−１）。
［配列番号２９］実施例で用いたプライマーである（ＡＳＢＧＬ２−２）。
［配列番号３０］実施例で用いたプライマーである（ＡＯＢＧＬ１−１）。
［配列番号３１］実施例で用いたプライマーである（ＡＯＢＧＬ１−２）。
［配列番号３２］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｆ）。
［配列番号３３］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｒ）。
［配列番号３４］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（Ｓａｃ−ＡＳＢＧＬ２−Ｆ）。
［配列番号３５］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（Ｓａｌ-ＡＳＢＧＬ２−Ｒ）。
［配列番号３６］実施例で用いたプライマーである（Ｂｇｌ２−ＡＯＢＧＬ１−Ｆ）。
［配列番号３７］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＰＨＯ５−Ｆ）。
［配列番号３８］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＰＨＯ５−Ｒ）。
［配列番号３９］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＳＵＣ２−Ｆ）。
［配列番号４０］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＳＵＣ２−Ｒ）。
［配列番号４１］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＭＦ１−Ｆ）。
［配列番号４２］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＭＦ１−Ｒ）。
［配列番号４３］分泌シグナル配列ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）のＤＮＡ配列である。
［配列番号４４］分泌シグナル配列ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）のアミノ酸配列である。
［配列番号４５］分泌シグナル配列ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）のＤＮＡ配列である。
［配列番号４６］分泌シグナル配列ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）のアミノ酸配列である。
［配列番号４７］分泌シグナル配列ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）のＤＮＡ配列である。
［配列番号４８］分泌シグナル配列ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）のアミノ酸配列である。
［配列番号４９］実施例で用いたプライマーである（ＴＲＰ１−Ｆ）。
［配列番号５０］実施例で用いたプライマーである（ＴＲＰ１−Ｒ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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