(57)【要約】【課題】グルタチオンには高いメラニン産生抑制作用や抗酸化作用等様々な美容効果が知られているが、国内では医薬品に分類されており食品としての利用が出来ない。しかしながら、特に最近では食品にそのような機能が求められている。【解決手段】食経験があり、安全性が認められている酵母から抽出したグルタチオン含有酵母抽出物について、マウスＢ１６メラノーマ細胞によるメラニン産生抑制効果を確認したところ、同濃度のグルタチオン単体と比較して、２倍以上の優れたメラニン産生抑制効果が得られることを確認した。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母抽出物及びグルタチオンを含有するメラニン産生抑剤。
【請求項２】
請求項１に記載のメラニン産生抑剤を含有する飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載のメラニン産生抑剤を含有する化粧品。
【請求項４】
請求項１に記載のメラニン産生抑剤を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食経験があり安全性が認められている酵母を利用し、菌体培養後に酵母エキスを抽出し、得られた酵母抽出物及びグルタチオンを利用したメラニン産生抑制剤を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
加齢、ストレス、紫外線暴露などの要因により引き起こされるシミ、シワ、たるみ等の皮膚症状の悪化に対し、肌の美観を美しく保つことは、女性にとって重要な関心事である。このため、皮膚症状の悪化を予防又は改善するための手段を求め、今尚、様々な研究がなされている。特に、シミ、ソバカス、日焼け後の色素沈着等は、皮膚に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進することが原因で起こることが知られている。これらの色素沈着が関係する皮膚症状の悪化を予防又は改善するための素材の一つとしてグルタチオンが知られている。【０００３】
グルタチオンとは、グルタミン酸、システイン、グリシンという３つのアミノ酸が結合したトリペプチドであり、細胞内で活性酸素や過酸化物質から細胞を保護する抗酸化物質としての働きや、異物を細胞外に排出する解毒作用などの生体内で重要な働きを持つ。肌においても、活性酸素はメラニン色素の発生要因となるが、グルタチオンの抗酸化作用によってシミ、色素沈着が抑制されていると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２９９２０号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための課題】
【０００５】
グルタチオンには高いメラニン産生抑制作用や抗酸化作用等様々な美容効果が知られているが、日本では、医薬品に分類されており食品としての利用が出来ない。
【０００６】
本発明は、食品、又は医薬品等として安全性が高く美白効果の優れたメラニン産生抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況に鑑みて、鋭意研究を重ねた結果、食経験があり安全性が認められているトルラ酵母を利用し、菌体培養後に酵母エキスを抽出し、得られたグルタチオン高含有酵母エキスにグルタチオン単独よりも高いメラニン産生抑制効果が有ることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）酵母抽出物及びグルタチオンを含有するメラニン産生抑剤、
（２）（１）に記載のメラニン産生抑剤を含有する飲食品、
（３）（１）に記載のメラニン産生抑剤を含有する化粧品、
（４）（１）に記載のメラニン産生抑剤を含有する医薬品、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
食経験があり、安全性が認められているトルラ酵母から抽出したグルタチオン含有酵母抽出物について、マウスＢ１６メラノーマ細胞によるメラニン産生抑制効果を確認したところ、同濃度のグルタチオン単体と比較して、２倍以上の優れたメラニン産生抑制効果が得られることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】メラニン産生抑制効果
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で使用する酵母は、特に制限なく使用できる。例えば、グルタチオンを含有する酵母から抽出すると、酵母抽出物とグルタチオンを含むグルタチオン含有酵母抽出物が得られるため良い。特に好ましい酵母は、一般名トルラ酵母と称されるCandida utilisである。酵母の培養形式は特に制限がないが、一般にバッチ培養、あるいは連続培養のいずれかが用いられる。培地も一般に使用されているものが使用できる。例えば、炭素源として、ブドウ糖、酢酸、エタノール、グリセロール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等を使用することができる。窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩などが使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源も過リン酸石灰、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の通常の工業用原料で良い。その他に、一般的に、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を添加する。また、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等を添加することもある。カゼイン、酵母抽出物、肉エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。培養温度は２１〜３７℃、好ましくは２５〜３４℃で、ｐＨは３．０〜８．０、特に３．５〜７．０が好ましい。培養条件によりアミノ酸や核酸の生産性が変動するため、目的とする酵母抽出物の製品仕様に合わせて条件設定を行う。
【００１２】
菌体培養後に酵母菌体から抽出を行う。抽出法は、とくに制限がないが、一般的に、自己消化法、熱水抽出法、酵素抽出法、酸、若しくはアルカリ抽出法、又はこれらの組み合わせにより行うことが可能である。
【００１３】
自己消化により抽出する場合は、例えば、５５℃で４時間攪拌する。酵素抽出法であれば、細胞壁溶解酵素又はプロテアーゼ等で攪拌抽出する。酸抽抽出法であれば、硫酸等で酸性に調整後、抽出する。アルカリ抽出法であれば、アルカリに調整後、抽出する。自己消化後（例えば５５℃で４時間攪拌）に、酵素抽出をする等の組み合わせも可能である。
【００１４】
抽出後は遠心分離で酵母残渣を分離し、濃縮後、凍結乾燥又は熱風乾燥することでグルタチオン含有酵母抽出物を得ることが出来る。酵母抽出物中に含まれるグルタチオンは、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、及びこれらの混合物の何れでも良い。酵母抽出物中のグルタチオン含量は、酵母抽出物中にグルタチオンが含まれていればよい。例えば、グルタチオンを３質量％以上、好ましくは１０質量％以上含有する酵母抽出物である。さらに好ましくは、乾燥酵母抽出物中でグルタチオンを１５質量％以上含有する酵母抽出物である。酵母抽出物中のグルタチオン含量が１５％以上となるためには、培養酵母中のグルタチオン含量ができるだけ高いものから、前述の抽出法により酵母抽出物を抽出する方が効率がよい。酵母中のグルタチオン含量を高める方法としては、公知の方法で良い。例えば、培地中に亜鉛イオンを添加する方法（特開２０００−２７９１６４号公報）、カドミウム耐性、マクロライド系抗生物質耐性を指標としたグルタチオン高含有酵母株の取得方法（特開２００６−４２６３７号公報、特開２００６−４２６３８号公報）がある。特開２０１１−１０３７８９号公報のように変異酵母菌体から抽出することでも得ることができる。また、一般に販売されている酵母抽出物を使用することもできる。例えば、興人ライフサイエンス社製の「ハイチオンエキス」ＹＨ−１５、ＹＨ−Ｄ１８等がある。
【００１５】
グルタチオン濃度の測定方法は、DTNB-HPLC法（Journal of Chromatography,194(1980)424-428）で行った。本願のグルタチオン含量は、還元型及び酸化型グルタチオンを合わせた総グルタチオン含量をいう。
【００１６】
本発明は、酵母抽出物中の成分とグルタチオンの相乗効果であるため、グルタチオン含有量が低い又は、グルタチオンが含まない酵母抽出物にグルタチオンを添加することでもグルタチオン含有酵母抽出物とすることができる。
【００１７】
本発明は、上記した本発明のグルタチオン高含有酵母抽出物を含有することを特徴とする飲食品、化粧品、皮膚外用剤又は医薬品を提供するものである。
【００１８】
本発明における飲食品とは、上記組成物を配合した、食料品、飲料品、嗜好品、サプリメント等、経口で摂取するものを指す。その形態は特に限定されるものではなく、パン類、麺類等主菜となりうるもの、チーズ、ハム、ウインナー、魚介加工品等副菜となりうるもの、果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品等とすることができる。また、サプリメントとしての形態も特に限定されるものではなく、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク状の形態をとることもできる。
【００１９】
飲食品における上記組成物の配合量はメラニン産生抑制効果を有する限り特に限定されるものではなく、例えばグルタチオン含有酵母抽出物が飲食品の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜２０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜２ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。
【００２０】
本発明の化粧品とは、上記組成物を配合した化粧水、乳液、ファンデーション、口紅などを指す。
【００２１】
組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば上記組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜２０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜２ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。
【００２２】
また本発明は、皮膚外用剤などの医薬品として使用することができる。上記組成物を配合したローション、クリーム、軟膏、スプレー、貼付剤（材）などの形状のものを指すが、その形態は特に限定されるものではなく、本発明の目的とする効果を発揮しうるものであればいかなる形態でもかまわない。
【００２３】
医薬品における組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えばグルタチオン高含有酵母抽出物が組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜２０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜２ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００２５】
（実施例１）
グルタチオン含有酵母抽出物の製造
（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽に１８Ｌ培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行い、アンモニアを添加しｐＨのコントロールを行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、１８０ｇの湿潤酵母菌体を得た。【００２６】
（酵母抽出物の抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁するか、凍結乾燥または熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁し、以下の条件に調整することで抽出物抽出を行った。
自己消化：    １Ｎ  ＨＣｌでｐＨ５．０に調整後、５５℃で４時間攪拌
酵素抽出：    １Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整後、細胞壁溶解酵素（ツニカーゼ）或いはプロテアーゼで５５℃、４時間攪拌抽出
酸抽出：      １Ｎ硫酸でｐＨ２以下に調整後、６５℃で２分間攪拌抽出
アルカリ抽出：２Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ１３に調整後、７０℃で２０分間攪拌抽出【００２７】
（酵母抽出物の乾燥）
抽出後は遠心分離で酵母残渣を分離し、抽出物を濃縮後、凍結乾燥又は熱風乾燥することでグルタチオン含有酵母抽出物を得た。還元型グルタチオン含量は、１５．５１％で、グルタチオン含量（総グルタチオン含量）は、１７．６８％であった。
【００２８】
（メラニン産生抑制効果の確認）
以下の手順に従ってメラニン産生抑制効果を測定した。【００２９】
＜メラニン産生抑制効果の検証＞
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種（２×１０４／ｗｅｌｌ）し、２４時間前培養した（５％ＣＯ２ 、３７℃）。培養液は、５％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を使用した。その後、グルタチオン（比較例１）、グルタチオン高含有酵母抽出物実施例１を還元型グルタチオン換算で最終濃度が１．０ｍＭ及びメラニン産生抑制効果が既知となっている乳酸ナトリウム（比較例２）を最終濃度が５０ｍＭとなるように添加した新鮮な培地に置換した。播種４日目に培地を除去し、プレートをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、０.２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がし、遠心（１００００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）操作によりペレット（細胞）を回収した。回収したペレットはＰＢＳで２回洗ったのち、１ｍＬのＰＢＳで細胞浮遊液を調整して０．８ｍＬをメラニン量の測定に、０．２ｍＬをタンパク質の定量に使用した。
メラニン量の測定用に回収したペレットを１５０μＬの１Ｎ ＮａＯＨで融解し（１００℃、１０分）、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。タンパク質の定量用に回収したペレットはＢＣＡ法にてタンパク質の定量を行った。水を添加したものをコントロールとし、コントロールを１００％としてときの比較例１、２を添加して培養した細胞のタンパク質あたりのメラニン量をメラニン生成率として求めた。【００３０】
実施例１の結果を図１に示す。図１に示すように、グルタチオン単独（比較例１）ではメラニン産生抑制率がコントロールと比較して約４０％であるのに対して、本願発明のグルタチオン高含有酵母抽出物ではメラニン産生抑制率はコントロールと比較して約８５％であり、グルタチオン単独と比較して２倍以上のメラニン産生抑制効果を有することが判る。これは、グルタチオンが酵母抽出物中のグルタチオン以外の成分と相乗効果を示しているためであると思われる。したがって、本発明におけるグルタチオン高含有酵母抽出物は食品として使用出来、且つ優れたメラニン産生抑制効果を発揮し、メラニン産生抑制剤として有用である。【００３１】
符号の説明
１ コントロール
２ グルタチオン
３ 本願発明（グルタチオン含有酵母抽出物）
４ ポジティブコントロール（乳酸ナトリウム）
【図１】
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【国際調査報告】
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2015151867.tif 000004
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