(57)【要約】  複数の第１リザーバーと、複数の第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとをそれぞれ接続し、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体、が泳動する、複数の泳動流路と、を備える、細胞外小胞体分析チップ。
2015163194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の第１リザーバーと、
複数の第２リザーバーと、
前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとをそれぞれ接続し、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体、が泳動する、複数の泳動流路と、
を備える、細胞外小胞体分析チップ。
【請求項２】
前記泳動流路は、前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を算出するために光照射される照射領域を有する、請求項１に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項３】
前記照射領域は、少なくとも２つの前記泳動流路において共通であることを特徴とする、請求項２に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項４】
前記第１リザーバー及び前記第２リザーバーは、それぞれ電極を備えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項５】
前記複数の第１リザーバーはそれぞれ電極を有し、前記複数の第２リザーバーは少なくとも２つの前記第２リザーバーにおいて共通の電極を備えることを特徴とする、請求項４に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項６】
前記電極の少なくとも一部が露出した電極接点を備える、請求項４又は５に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項７】
前記複数の泳動流路は、それぞれ流路長が等しいことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項８】
更に、検体導入口と、
前記検体導入口と前記複数の第１リザーバーとをそれぞれ接続する、複数の検体導入流路と、
を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項９】
前記複数の泳動流路が、互いに略平行に配置されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１０】
少なくとも２つの前記泳動流路が、互いに近接するように配置された部分を備え、共通の前記照射領域を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１１】
前記第１リザーバーが、同心円上に配置されており、
前記泳動流路が、放射状に配置されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１２】
前記検体導入口と、前記第１リザーバーと、前記検体導入流路とが一体化している、請求項１１に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１３】
前記細胞外小胞体はエクソソームであり、前記特異的結合物質が、該エクソソームの表面に存在するマーカーを認識する物質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１４】
前記特異的結合物質が、異常細胞特異的又は正常細胞特異的に発現が認められるタンパク質若しくは糖タンパク質を認識する物質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１５】
前記特異的結合物質が、臓器特異的に発現が認められるタンパク質又は糖タンパク質を認識する物質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１６】
複数の第１リザーバーは、
第１の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合した第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を含む第１試料を導入する第１試料導入口を含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１７】
複数の第１リザーバーは、
第２の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合した第２の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を含む第２試料を導入する第２試料導入口を含む請求項１６に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１８】
複数の第１リザーバーは、
細胞外小胞体を含む第３試料を導入する第３試料導入口を含む請求項１７に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項１９】
複数の第２リザーバーは、
緩衝液を導入する緩衝液導入口を含む請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項２０】
複数の泳動部を備え、
前記泳動部は、同じ基板上に形成された泳動流路を含み、
複数の前記泳動流路は同じ基板上に形成され、
少なくとも一つの前記泳動部は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体が泳動する、
細胞外小胞体分析チップ。
【請求項２１】
前記複数の泳動部は、
前記泳動流路の一方端側に設けられた一方端側リザーバーと、
前記泳動流路の他方端側に設けられた他方端側リザーバーとを備える、請求項２０に記載の細胞外小胞体分析チップ。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、
第１の前記泳動流路に、前記細胞外小胞体を泳動させ、第１のゼータ電位を計測する工程と、
第２の前記泳動流路に、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させ、第２のゼータ電位を計測する工程と、
を含むことを特徴とする細胞外小胞体分析方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、
第１の前記泳動流路に、第１の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第１のゼータ電位を計測する工程と、
第２の前記泳動流路に、第２の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第２の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第２のゼータ電位を計測する工程と、
を含むことを特徴とする、細胞外小胞体分析方法。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップを保持する保持部と、
前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を計測する計測部と、
を備えた、細胞外小胞体分析装置。
【請求項２５】
前記計測部は、
前記照射領域を照射する光照射部と、
前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を光学的に検出する検出部と、
検出データから前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体の移動度を算出する移動度算出部と、
を含む、請求項２２に記載の細胞外小胞体分析装置。
【請求項２６】
請求項４〜２１のいずれか一項に記載の細胞外小胞体分析チップを保持する保持部と、
前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を計測する計測部と、
を備え、
前記保持部は、前記細胞分析チップ上の前記電極に接続する電極接点、を含む、
細胞外小胞体分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置に関する。
本願は、２０１４年４月２５日に日本に出願された特願２０１４−０９２１４５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０〜１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。【０００３】
癌細胞等の異常細胞は、細胞膜に特有のタンパク質を発現している場合がある。そして、エクソソームの膜表面は、分泌源の細胞由来のタンパク質を発現しているため、体液中のエクソソームの膜表面に存在するタンパク質を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。【０００４】
このような期待に対して、エクソソームの膜表面に発現しているＣＤ６３を抗原とする抗体で修飾したビーズを用いて、ＣＤ６３陽性のエクソソームを捕捉し蛍光修飾抗体で標識し、フローサイトメトリーを用いて計測することにより、エクソソームの膜表面を分析する方法が提案されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌａｓｓｅｒ  Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，（２０１２）ｖｏｌ．５９，ｅ３０３７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、エクソソームの膜表面におけるＣＤ６３等の糖タンパク質の発現量は少ないため、非特許文献１に記載のエクソソームの分析方法は、多量のサンプルを用いて、複数粒子のエクソソームを抗体修飾ビーズに捕捉させなければ、エクソソームの膜表面における糖タンパク質の発現を検出できない。非特許文献１に記載のエクソソームの分析方法は、簡便かつ高感度にサンプル由来のエクソソームを分析するという点においては改良の余地がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施態様は、下記（１）〜（７）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における細胞外小胞体分析チップは、複数の第１リザーバーと、複数の第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとをそれぞれ接続し、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体、が泳動する、複数の泳動流路と、を備えることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における細胞外小胞体分析チップは、複数の泳動部を備え、前記泳動部は、泳動流路と、前記泳動流路の一方端側に設けられた一方端側リザーバーと、前記泳動流路の他方端側に設けられた他方端側リザーバーとを備え、複数の前記泳動流路は同じ基板上に形成され、少なくとも一つの前記泳動流路は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体が泳動することを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における細胞外小胞体分析方法は、上記実施態様の細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、第１の前記泳動流路に、前記細胞外小胞体を泳動させ、第１のゼータ電位を計測する工程と、第２の前記泳動流路に、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させ、第２のゼータ電位を計測する工程と、を含むことを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における細胞外小胞体分析方法は、上記実施態様の細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、第１の前記泳動流路に、第１の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第１のゼータ電位を計測する工程と、第２の前記泳動流路に、第２の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第２の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第２のゼータ電位を計測する工程と、を含むことを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における細胞外小胞体分析装置は、上記実施態様の細胞外小胞体分析チップを保持する保持部と、前記細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を計測する計測部と、を備えることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。
【図２】図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図３】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図４】図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
【図５Ａ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図５Ｂ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図６】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図７】図６のＶＩＩ−ＶＩＩ線断面図である。
【図８】図６のＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ線断面図である。
【図９】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図１０】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図１１】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図１２】図１１のＸＩＩ−ＸＩＩ線断面図である。
【図１３】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図１４Ａ】一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップの使用方法を説明する上面図である。
【図１４Ｂ】一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップの使用方法を説明する上面図である。
【図１４Ｃ】一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップの使用方法を説明する上面図である。
【図１４Ｄ】一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップの使用方法を説明する上面図である。
【図１４Ｅ】一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップの使用方法を説明する上面図である。
【図１５】細胞外小胞体分析装置の一実施態様を示す模式図である。
【図１６】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す断面図である。
【図１７】チップホルダーの一実施態様を示す上面図である。
【図１８Ａ】細胞外小胞体分析チップを構成する電極コートガラス基板の一実施態様を示す上面図である。
【図１８Ｂ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す上面図である。
【図１８Ｃ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す断面図である。
【図１９Ａ】細胞外小胞体分析チップのローディング前の細胞外小胞体分析装置のステージ部の状態を示す図である。
【図１９Ｂ】細胞外小胞体分析チップのローディング後の細胞外小胞体分析装置のステージ部の状態を示す図である。
【図２０】一実施態様に係るウェルカバーを備える、細胞外小胞体分析チップの断面図である。
【図２１Ａ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す斜視図である。
【図２１Ｂ】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す斜視図である。
【図２２】細胞外小胞体分析装置の検出部により撮影された、電気泳動中の細胞外小胞体の画像に基づいて作成された、解析画面の一例を示す模式図である。
【図２３】細胞外小胞体分析チップの一実施態様を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一実施態様において、本発明は、細胞外小胞体分析チップを提供する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分析する場合を例として、細胞外小胞体分析チップについて説明する。
【００１０】
［エクソソーム］
生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
【００１１】
そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、生体内で分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
【００１２】
エクソソームは、生体内で循環している血液などの体液中で検出され、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
【００１３】
［エクソソームの分析］
細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
【００１４】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
【００１５】
また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
【００１６】
（エクソソームの精製）
本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
【００１７】
エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。
【００１８】
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。特異的結合物質は検出対象の分子と特異的に結合する。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質がエクソソーム表面の検出対象分子に結合し、特異的結合物質−エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に特異的に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。詳細については後述する。
【００１９】
（ゼータ電位の計測）
一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソーム（抗体−エクソソーム複合体）のゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
【００２０】
エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
Ｕ＝（ε／η）ζ  …（１）
式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
【００２１】
エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷのものが挙げられる。
【００２２】
［細胞外小胞体分析チップの基本構造］
図１は、細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。細胞外小胞体分析チップ１００は、第１リザーバー１１０と、第２リザーバー１２０と、第１リザーバー１１０と第２リザーバー１２０とを接続する泳動流路１５０を備えている。泳動流路１５０は、例えばマイクロスケールやミリスケールである。一例として、幅２００μｍ、高さ５０μｍ、長さ１０００μｍ程度の大きさである。泳動流路１５０は、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体（一例として、抗体−エクソソーム複合体）を電気泳動するものである。第１リザーバー１１０及び第２リザーバー１２０は、それぞれ電極１３０及び電極１４０を有している。
【００２３】
本細胞外小胞体分析チップは、細胞外小胞体のゼータ電位を計測するのに好適である。以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本細胞外小胞体分析チップを用いた、エクソソームのゼータ電位の測定方法について説明する。
【００２４】
まず、分析対象のエクソソームを、第１リザーバー１１０に導入する。エクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。次に、エクソソームを泳動流路１５０に導入する。一例として、シリンジを第２リザーバー１２０に接続して吸引することにより、エクソソームを泳動流路１５０に導入することができる。次に、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）等の緩衝液を、第１リザーバー１１０及び第２リザーバー１２０に入れ、液面高を調整する。液面高の調整は、静水圧流の発生を防ぎ、正しいゼータ電位を測定する観点から、行うことが好ましい。続いて、電極１３０及び１４０の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。一例として、約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加するとよい。
【００２５】
電気泳動中に、泳動流路１５０にレーザー光を照射し、出射光であるエクソソーム由来の散乱光を、倍率６０倍程度の対物レンズ等を用いて集光し、高感度カメラを用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体を撮影する。レーザーの波長及び強度は、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷである。
【００２６】
続いて、撮影した画像をもとに、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体の電気泳動速度Ｓを算出する。続いて、電気泳動速度Ｓを電界強度で除して、電気泳動移動度Ｕを算出する。続いて、上述したスモルコフスキーの式を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を算出する。
【００２７】
本細胞外小胞体分析チップを用いることにより、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、該抗原を有するエクソソームを検出することができる。
【００２８】
［細胞外小胞体分析チップの実施形態］
図３は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ３００を示す上面図である。図４は、図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。本実施形態の細胞外小胞体分析チップ３００は、複数の第１リザーバー３１０と、複数の第２リザーバー３２０と、第１リザーバー３１０と第２リザーバー３２０とをそれぞれ接続し、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等）に特異的に結合する特異的結合物質（例えば、抗体、アプタマー等）と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体、が泳動する、複数の泳動流路３５０と、を備える。
【００２９】
本実施形態において、細胞外小胞体分析チップ３００は、例えば、第１リザーバー３１０、第２リザーバー３２０、泳動流路３５０を、それぞれ同数ずつ備える。複数の泳動流路３５０は、基板３９０上に形成されており、略同一平面内に配置されている。
【００３０】
第１リザーバー３１０は、壁３１１及び堀３１２を備えてもよい。同様に、第２リザーバー３２０は、壁３２１及び堀３２２を備えてもよい。これにより、複数の第１リザーバー３１０同士の間、又は複数の第２リザーバー３２０同士の間の距離が狭い場合であっても、リザーバーに導入する液体のコンタミネーションを抑制することができる。したがって、泳動流路３５０を集積させて、細胞外小胞体分析チップを小型化することができる。細胞外小胞体分析チップ３００は、第１リザーバー３１０及び第２リザーバー３２０を覆うシール部材３８０を備えていてもよい。これにより、リザーバーに導入する液体のコンタミネーションを抑制することができる。
【００３１】
泳動流路３５０の少なくとも一部の表面は、親水性化処理されていてもよい。親水性化処理の方法としては、一例として、酸素プラズマを照射することが挙げられる。例えば、プラズマクリーナー（商品名、ヤマト科学株式会社製、型番：ＰＤＣ２１０）等を使用して酸素プラズマを泳動流路に照射することが挙げられる。
【００３２】
また、泳動流路３５０の少なくとも一部の表面は、特異的結合物質の非特異的な吸着を抑制するために、ポリマーでコーティングされていてもよい。ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリ（２−メトキシエチルアクリレート）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー等が挙げられる。
【００３３】
泳動流路３５０は、細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を算出するために、光照射される照射領域３７０を有してもよい。照射領域３７０において、レーザー光を照射し、泳動流路３５０内を泳動する細胞外小胞体あるいは前記特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を撮影し、上述したようにしてゼータ電位を算出する。
【００３４】
第１リザーバー３１０及び第２リザーバー３２０は、それぞれ電極３３０及び電極３４０を備えてもよい。第１リザーバー３１０及び第２リザーバー３２０に電極を挿入して電気泳動することも可能であるが、電極３３０及び電極３４０を備えていれば、より簡便で確実に電圧を印加することができる。また、電極が細胞外小胞体分析チップに内蔵されていることにより、ヒトに感染する病原菌やウイルスで汚染されている可能性がある、ヒト由来のサンプルを分析する場合であっても、汚染を抑制することができる。
【００３５】
図３に示すように、複数の第１リザーバー３１０は、それぞれ電極３３０を備えていてもよい。また、複数の第２リザーバー３２０も、それぞれ電極３４０を備えていてもよい。
【００３６】
図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ電極の配置の異なる細胞外小胞体分析チップ５００及び５００’を説明する上面図である。図５Ａに示す細胞外小胞体分析チップ５００のように、複数の第１リザーバー５１０は、それぞれ電極５３０を備えており、複数の第２リザーバー５２０は、第２リザーバー５２０に共有される、共通の電極５４０を備えていてもよい。この場合、電極５３０は正極であり、電極５４０は負極であってもよい。
【００３７】
また、図５Ｂに示す細胞外小胞体分析チップ５００’のように、複数の第１リザーバー５１０’は、それぞれ電極５３０’を備えており、複数の第２リザーバー５２０’も、それぞれ電極５４０’を備えていてもよい。また、図５Ｂに示すように、電極５３０’及び電極５４０’の配線の一端が、細胞外小胞体分析チップ５００’の一辺に集中するように配置されていてもよい。
【００３８】
細胞外小胞体分析チップ３００、５００及び５００’において、泳動流路３５０、５５０及び５５０’は、それぞれ流路長が等しくてもよい。また、複数の泳動流路３５０、５５０及び５５０’は、それぞれ互いに略平行に配置されていてもよい。
【００３９】
細胞外小胞体分析チップは、一例として、樹脂製の鋳型に、未重合のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の材料及び重合開始剤を混合したものを流し込み、加熱硬化させ、硬化後に鋳型から引き剥がすことにより作製することができる。細胞外小胞体分析チップは、一例として、リザーバー部分及び泳動流路部分を別々に作製し、これらのパーツを貼りあわせて作製してもよい。また、一例として、スパッタリング加工により電極を作製したガラス板を基板に用い、基板上に上記のＰＤＭＳ製のパーツを貼りあわせて、細胞外小胞体分析チップを作製してもよい。電極の素材としては、金、白金、カーボン等が挙げられる。
【００４０】
図１６は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ１６００の断面図である。細胞外小胞体分析チップ１６００は、電極コートガラス基板１６９０の上に、ＰＤＭＳ製のマイクロ流路構造体１６５５及びリザーバー構造体１６２５を貼り合せて作製されている。リザーバー構造体の上には、ウェルカバー１６８５が載せられている。マイクロ流路構造体１６５５と電極コートガラス基板１６９０との間に形成された空隙１６８９が泳動流路を形成している。
【００４１】
図６は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ６００を示す上面図である。図７は、図６のＶＩＩ−ＶＩＩ線断面図である。図８は、図６のＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ線断面図である。本実施形態の細胞外小胞体分析チップ６００は、複数の第１リザーバー６１０と、複数の第２リザーバー６２０と、複数の泳動流路６５０と、を備え、更に、検体導入口６０５と、検体導入口６０５と複数の第１リザーバー６１０とをそれぞれ接続する、複数の検体導入流路６１５と、を備える。複数の検体導入流路６１５は、それぞれ等しい流路長を有していてもよい。また、例えば、検体導入流路６１５の幅又は高さは、泳動流路６５０よりも大きい。細胞外小胞体分析チップ６００は、第１リザーバー６１０、第２リザーバー６２０及び検体導入口６０５を覆うシール部材６８０を備えていてもよい。これにより、検体導入口に導入する液体のコンタミネーションを抑制することができる。
【００４２】
図６に示すように、複数の第１リザーバー６１０は、それぞれ電極６３０を備えていてもよい。また、複数の第２リザーバー６２０も、それぞれ電極６４０を備えていてもよい。なお、図６では、電極の配線を図示していないが、上述した細胞外小胞体分析チップ３００、５００、５００’の電極に例示されるような配置の配線を有していてもよい。
【００４３】
細胞外小胞体分析チップ６００では、検体導入口６０５に検体を導入することにより、導入された検体が、複数の検体導入流路６１５内を流れて複数の第１リザーバー６１０に分配されて導入され、複数の泳動流路６５０を用いた電気泳動を行うことができる。このため、複数の第１リザーバー６１０にそれぞれ検体を導入する場合と比較して、操作の工数を減らし、分析に要する労力や時間を軽減させることができる。また、操作の工数が減少することにより、検体による汚染の可能性を減少させることができる。検体としては、上述したエクソソームを用いることができる。エクソソームは特異的結合物質と反応したものであってもよい。
【００４４】
図９は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ９００を示す上面図である。本実施形態の細胞外小胞体分析チップ９００は、複数の第１リザーバー９１０と、複数の第２リザーバー９２０と、複数の泳動流路９５０と、を備える。泳動流路９５０は、細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を算出するために、光照射される照射領域９７０を有しており、複数の泳動流路９５０の全てが照射領域９７０内を通過するように配置されている。
【００４５】
細胞外小胞体分析チップ９００では、複数の泳動流路について共通の照射領域９７０を有する。そのため、複数の泳動流路９５０内を泳動する細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を、一度に光照射して撮影することができるため、分析に要する労力や時間を軽減させることができる。
【００４６】
このように、細胞外小胞体分析チップの照射領域は、少なくとも２つの泳動流路において共通であってもよい（共有されていてもよい）。一例として、細胞外小胞体分析チップ９００に例示されるように、少なくとも２つの泳動流路が、互いに近接するように配置された部分を備え、共通の照射領域を有していてもよい。
【００４７】
図９に示すように、複数の第１リザーバー９１０は、それぞれ電極９３０を備えていてもよい。また、複数の第２リザーバー９２０も、それぞれ電極９４０を備えていてもよい。
【００４８】
図１０は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ１０００を示す上面図である。本実施形態の細胞外小胞体分析チップ１０００は、複数の第１リザーバー１０１０と、複数の第２リザーバー１０２０と、複数の泳動流路１０５０と、を備え、更に、検体導入口１００５と、検体導入口１００５と第１リザーバー１０１０とをそれぞれ接続する、複数の検体導入流路１０１５と、を備える。また、泳動流路１０５０は、細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を算出するために、光照射される照射領域１０７０を有しており、複数の泳動流路１０５０の全てが照射領域１０７０内を通過するように配置されている。複数の検体導入流路１０１５は、それぞれ等しい流路長を有していてもよい。また、検体導入流路１０１５の幅又は高さは、泳動流路１０５０よりも大きくてもよい。
【００４９】
図１０に示すように、複数の第１リザーバー１０１０は、それぞれ電極１０３０を備えていてもよい。また、複数の第２リザーバー１０２０も、それぞれ電極１０４０を備えていてもよい。なお、図１０では、電極の配線を図示していないが、上述した細胞外小胞体分析チップ３００、５００、５００’、９００の電極に例示されるような配置の配線を有していてもよい。
【００５０】
細胞外小胞体分析チップ１０００では、検体導入口１００５に検体を導入することにより、導入された検体が、複数の検体導入流路１０１５内を流れて複数の第１リザーバー１０１０に分配されて導入され、複数の泳動流路１０５０を用いた電気泳動を行うことができる。このため、複数の第１リザーバー１０１０にそれぞれ検体を導入する場合と比較して、操作の工数を減らし、分析に要する労力や時間を軽減させることができる。また、操作の工数が減少することにより、検体による汚染の可能性を減少させることができる。
【００５１】
さらに、細胞外小胞体分析チップ１０００では、複数の泳動流路９５０内を泳動する細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を、一度に光照射して撮影することができるため、分析に要する労力や時間を軽減させることができる。
【００５２】
図１１は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ１１００を示す上面図である。図１２は、図１１のＸＩＩ−ＸＩＩ線断面図である。本実施形態の細胞外小胞体分析チップ１１００は、複数の第１リザーバー１１１０と、複数の第２リザーバー１１２０と、複数の泳動流路１１５０と、を備える。細胞外小胞体分析チップ１１００では、第１リザーバー１１１０が、同心円上に配置されており、泳動流路１１５０が、放射状に配置されている。
【００５３】
細胞外小胞体分析チップ１１００は、このような構成を備えることにより、細胞外小胞体分析チップ１１００を回転させたときに発生する遠心力を利用して、第１リザーバー１１１０に導入した検体を、泳動流路１１５０に導入することができる。これにより、検体の泳動流路１１５０への導入を自動化することが可能になる。また、検体による汚染の可能性を減少させることができる。検体としては、上述したエクソソームを用いることができる。エクソソームは特異的結合物質と反応したものであってもよい。
【００５４】
図１１に示すように、細胞外小胞体分析チップ１１００は、更に、検体導入口１１０５と、検体導入口１１０５と第１リザーバー１１１０とをそれぞれ接続する、複数の検体導入流路１１１５と、を備えていてもよい。複数の検体導入流路１１１５は、それぞれ等しい流路長を有していてもよい。また、検体導入流路１１１５の幅又は高さは、泳動流路１１５０よりも大きくてもよい。
【００５５】
細胞外小胞体分析チップ１１００では、検体導入口１１０５に検体を導入することにより、導入された検体が、複数の検体導入流路１１１５内を流れて複数の第１リザーバー１１１０に分配されて導入され、複数の泳動流路１１５０を用いた電気泳動を行うことができる。このため、複数の第１リザーバー１１１０にそれぞれ検体を導入する場合と比較して、操作の工数を減らし、分析に要する労力や時間を軽減させることができる。また、操作の工数が減少することにより、検体による汚染の可能性を減少させることができる。
【００５６】
図１１に示すように、複数の第１リザーバー１１１０は、それぞれ電極１１３０を備えていてもよい。また、複数の第２リザーバー１１２０も、それぞれ電極１１４０を備えていてもよい。
【００５７】
図１３は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ１３００を示す上面図である。細胞外小胞体分析チップ１３００は、上述した細胞外小胞体分析チップ１１００における、検体導入口１１０５と、第１リザーバー１１１０と、検体導入流路１１１５とが一体化したものに相当する、構造体１３２５を備える。細胞外小胞体分析チップ１３００では、構造体１３２５は、壁１３３５によって区切られた扇形である。
【００５８】
細胞外小胞体分析チップ１３００は、複数の構造体１３２５と、複数の第２リザーバー１３２０と、複数の構造体１３２５と複数の第２リザーバー１３２０とをそれぞれ接続する、複数の泳動流路１３５０とを備える。細胞外小胞体分析チップ１３００では、泳動流路１３５０が、放射状に配置されている。
【００５９】
図１３に示すように、複数の構造体１３２５は、電極１３３０を備えていてもよい。細胞外小胞体分析チップ１３００では、１つの電極１３３０が複数の構造体１３２５に共有されている。また、複数の第２リザーバー１３２０は、それぞれ電極１３４０を備えていてもよい。
【００６０】
図１４Ａ〜Ｅは、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ１４００を使用して、細胞外小胞体のゼータ電位を計測する一連の工程を説明する図である。図１４Ａに示すように、細胞外小胞体分析チップ１４００は、検体導入口、第１リザーバー及び検体導入流路が一体化した複数の構造体１４２５と、複数の第２リザーバー１４２０と、複数の構造体１４２５と複数の第２リザーバー１４２０とをそれぞれ接続する、複数の泳動流路１４５０とを備える。細胞外小胞体分析チップ１４００では、泳動流路１４５０が、放射状に配置されている。
【００６１】
まず、複数の構造体１４２５に検体を導入する。検体としては、上述したエクソソームを用いることができる。エクソソームは特異的結合物質と反応したものであってもよい。
【００６２】
続いて、図１４Ｂに示すように、細胞外小胞体分析チップ１４００を矢印Ｗの方向に回転させる。この回転により発生する遠心力により、検体を矢印Ｖの方向に移動させ、泳動流路１４５０に導入する。
【００６３】
次に、図１４Ｃにおいて、複数の構造体１４２５と複数の第２リザーバー１４２０にリン酸緩衝液等の緩衝液を入れ、液面高を調整する。
【００６４】
続いて、図１４Ｄに示すように、細胞外小胞体分析チップ１４００を矢印Ｗの方向に回転させて、泳動流路１４５０の照射領域１４７０が所定の位置に来るように調整する。続いて、電極１４３０と電極１４４０との間に電圧を印加して電気泳動を行う。電気泳動中に、照射領域１４７０から光を照射して、泳動流路１４５０内を泳動する細胞外小胞体を撮影し、上述したようにしてゼータ電位を算出する。
【００６５】
泳動流路１４５０のうちの１つにおいて、ゼータ電位の算出が終了したら、図１４Ｅに示すように、細胞外小胞体分析チップ１４００を矢印Ｗの方向に回転させて、次の泳動流路１４５０の照射領域１４７０が所定の位置に来るように調整する。続いて、上述したものと同様にして電気泳動及びゼータ電位の算出を行う。以上の操作を繰り返すことにより、細胞外小胞体の分析を行う。
【００６６】
本実施形態の細胞外小胞体分析チップによれば、検体の泳動流路内への導入を、細胞外小胞体分析チップの回転により行うことができる。このため、検体の泳動流路内への導入工程を自動化することが容易である。
【００６７】
一実施態様において、細胞外小胞体分析チップは、第１リザーバー、第２リザーバー、検体導入口等の開口部を覆うウェルカバーを備えていてもよい。このようなウェルカバーにより、検体による周囲の汚染又は周囲環境による検体の汚染を防止することができる。
【００６８】
図２０は、一実施態様に係るウェルカバー２０８５を備える、細胞外小胞体分析チップ２０００の断面図である。図２０では、細胞外小胞体分析チップ２０００の複数の第１リザーバー２０１０の断面が示されている。ウェルカバー２０８５は、複数の第１リザーバー２０１０に対応する突起を備えている。突起の形状は例えば円錐形である。ウェルカバー２０８５は、上記の突起が第１リザーバー２０１０にはまるようにかぶせると、位置決めされるように構成されている。
【００６９】
細胞外小胞体分析チップ２０００は、壁２０３５を備えており、第１リザーバー２０１０から検体があふれにくくなっている。また、堀２０１２を備えているため、ウェルカバー２０８５をかぶせた時に、突起が第１リザーバー２０１０の内部に挿入されて、検体が第１リザーバー２０１０からあふれた場合においても、あふれた検体が堀２０１２に留められ、周囲への汚染が防止される。
【００７０】
壁２０３５の上端、すなわちウェルカバー２０８５と接触する部分には、ウェルカバー２０８５の突起と密着できるようにテーパーが形成されていてもよい。
【００７１】
図２１Ａは、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ２１００を示す図である。細胞外小胞体分析チップ２１００は、第１リザーバー２１１０と、第２リザーバー２１２０と、泳動流路２１５０と、電極２１３０と、電極２１４０とを備えている。
【００７２】
図２１Ｂは、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ２１００’を示す図である。細胞外小胞体分析チップ２１００’は、細胞外小胞体分析チップ２１００が複数積み重ねられた構造を有している。すなわち、細胞外小胞体分析チップ２１００’においては、複数の泳動流路２１５０’が、第１リザーバー２１１０’又は第２リザーバー２１２０’の深さ方向（垂直方向）に配置されている。図２１Ｂでは、１本の泳動流路２１５０’を有する細胞外小胞体分析チップが積み重ねられているが、複数の泳動流路を有する細胞外小胞体分析チップが積み重ねられていてもよい。
【００７３】
図２３は、一実施態様に係る細胞外小胞体分析チップ２３００を示す斜視図である。細胞外小胞体分析チップ２３００は、基板２３９０と、第１リザーバー２３１０と、第２リザーバー２３２０と、泳動流路２３５０を備えている。図２３に示すように、第１リザーバー２３１０及び第２リザーバー２３２０の壁面にはテーパーが形成されている。上述した様々な実施態様に係る細胞外小胞体分析チップにおいても、第１リザーバー及び第２リザーバーの壁面にテーパーが形成されていてもよい。
【００７４】
［特異的結合物質を保持している細胞外小胞体分析チップ］
細胞外小胞体分析チップは、上記の第１リザーバーの少なくとも１つ、又は上記の第２リザーバーの少なくとも１つが、特異的結合物質を保持していてもよい。あるいは、上記の泳動流路のいずれかが、特異的結合物質を保持していてもよい。あるいは、上記の検体導入流路のいずれかが、特異的結合物質を保持していてもよい。
【００７５】
このような構成を有することにより、細胞外小胞体分析チップの第１リザーバー又は検体導入口に細胞外小胞体を導入するだけで、細胞外小胞体と特異的結合物質とを接触させ、反応させることができる。
【００７６】
ここで、複数の泳動流路において、それぞれ異なる特異的結合物質と反応させた細胞外小胞体が電気泳動されるように、特異的結合物質を配置することにより、一度の分析で細胞外小胞体の表面に存在する複数の分子の存在を検出することができる。これにより、細胞外小胞体と特異的結合物質との反応に要する労力や時間を低減させることができる。
【００７７】
上記の細胞外小胞体はエクソソームであり、上記の特異的結合物質は、該エクソソームの表面に存在するマーカーを認識する物質であってもよい。エクソソームの表面に存在するマーカーとしては、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ等が挙げられる。
【００７８】
上記の特異的結合物質は、異常細胞特異的又は正常細胞特異的に発現が認められるタンパク質若しくは糖タンパク質を認識する物質であってもよい。
【００７９】
一例として、正常の乳腺上皮細胞株では、ＣＤ１０、ＣＤ５／６、ＣＡＶ１、ＭＯＥＳＩＮ、ＥＴＳ１等のタンパク質が高発現しているのに対し、乳癌細胞株においては、これらのタンパク質の発現が低下している旨の報告がなされている（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ Ｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）  ｖｏｌ．２５，ｐｐ２２７３−２２８４．）。そこで、これらのタンパク質に対する特異的結合物質を使用して、エクソソームの表面に存在する上記のタンパク質を検出することにより、乳癌細胞の存在を検出することができる。
【００８０】
また、一例として、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ等の前立腺癌マーカー；ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＨＥＲ２等の乳癌マーカー等の疾患マーカーに対する特異的結合物質を用いることにより、前立腺癌、乳癌等の疾患の存在を検出することができる。なお、疾患は癌に限定されず、肥満、糖尿病、神経変性疾患等に関連する特異的結合物質を用いることにより、これらの疾患に関連する異常を検出することができる。
【００８１】
また、上記の特異的結合物質は、臓器特異的に発現が認められるタンパク質又は糖タンパク質を認識する物質であってもよい。臓器特異的に発現が認められるタンパク質としては、一例として、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ等の前立腺癌マーカー；ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＨＥＲ２等の乳癌マーカー等が例示できる。
【００８２】
一例として、特異的結合物質は抗体であってもよい。泳動流路でエクソソームを電気泳動した場合、エクソソームは負極側から正極側に向かって移動する。これに対し、一般的な抗体は、正極側から負極側に向かって移動する。したがって、一例として、第１リザーバーに抗体を保持させておき、第２リザーバーにエクソソームを導入し、第１リザーバーに正極を、第２リザーバーに負極を接続して電圧を印加すると、抗体は第１リザーバー側から第２リザーバー側に向かって移動し、エクソソームは第２リザーバー側から第１リザーバー側に向かって移動する。その結果、泳動中にエクソソームと抗体とを接触させることができる。接触したエクソソームと抗体は瞬間的に反応する。このため、抗体とエクソソームとの反応時間が不要となり、分析に要する時間を短縮することができる。これは、抗体に限らず、電気泳動した場合に正極側から負極側に向かって移動する特異的結合物質に適用できる。
【００８３】
一例として、第１リザーバーにエクソソームを導入し、第２リザーバーに抗体を保持させておき、第１リザーバーに負極を、第２リザーバーに正極を接続して電圧を印加してもよい。この場合、抗体は第２リザーバー側から第１リザーバー側に向かって移動し、エクソソームは第１リザーバー側から第２リザーバー側に向かって移動する。その結果、泳動中にエクソソームと抗体とを接触させることができる。接触したエクソソームと抗体は瞬間的に反応する。このため、抗体とエクソソームとの反応時間が不要となり、分析に要する時間を短縮することができる。これは、抗体に限らず、電気泳動した場合に正極側から負極側に向かって移動する特異的結合物質に適用できる。
【００８４】
特異的結合物質は、凍結乾燥させて粉末にしたものを、第１リザーバーの内部、第２リザーバーの内部、泳動流路の内部又は検体導入流路の内部に設置することにより保持させてもよい。あるいは、特異的結合物質溶液を、第１リザーバーの内部、第２リザーバーの内部、泳動流路の内部又は検体導入流路の内部に導入し、その場で乾燥させることにより保持させてもよい。
【００８５】
［細胞外小胞体分析方法］
一実施態様において、本発明は、上記のいずれかの細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、第１の泳動流路に、前記細胞外小胞体を泳動させ、第１のゼータ電位を計測する工程と、第２の泳動流路に、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させ、第２のゼータ電位を計測する工程と、を含むことを特徴とする細胞外小胞体分析方法を提供する。
【００８６】
本実施形態において、第１の泳動流路中で泳動させる細胞外小胞体は、特異的結合物質と未反応のものである。一方、第２の泳動流路中で泳動させる細胞外小胞体は、特異的結合物質と反応させたものである。ここで、特異的結合物質とは、上述したように、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する物質を意味する。また、細胞外小胞体の表面に存在する分子としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等が挙げられる。第１のゼータ電位と第２のゼータ電位とを比較することにより、細胞外小胞体の表面に検出対象である分子が存在するか否かを分析することができる。
【００８７】
一実施態様において、本発明は、上記のいずれかの細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法であって、第１の泳動流路に、第１の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第１のゼータ電位を計測する工程と、第２の泳動流路に、第２の特異的結合物質と細胞外小胞体とが結合してなる、第２の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を泳動させて、第２のゼータ電位を計測する工程と、を含むことを特徴とする、細胞外小胞体分析方法を提供する。ここで、第１の特異的結合物質及び第２の特異的結合物質は、抗体やアプタマー等の、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味する。
【００８８】
本実施形態において、第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質とは異なるものであり、第１の特異的結合物質により特定される細胞外小胞体の性質とは異なる性質を特定できるものであってもよい。一例として、第１の特異的結合物質としてがん特異的に発現するタンパク質と特異的に結合するものを用いた場合、第２の特異的結合物質として臓器特異的に発現するタンパク質をと特異的に結合するものを用いてもよい。
【００８９】
これにより、細胞外小胞体の分泌源の細胞ががん細胞であるかどうかを特定できるだけではなく、細胞外小胞体の分泌源の細胞が生体内のどの臓器由来であるかを特定できる。
【００９０】
一実施態様に係る細胞外小胞体分析方法において、細胞外小胞体分析チップの複数の泳動流路内を泳動する細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位の計測は、各泳動流路毎に順次行ってもよいし、複数の泳動流路について一度に（同時に）行ってもよいし、複数の泳動流路について数回に分けて行ってもよい。
【００９１】
また、複数の流路を使用して、例えば、ネガティブコントロールと第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体の組み合わせ、ポジティブコントロールと第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体との組み合わせ、第１の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体と第２の特異的結合物質−細胞外小胞体複合体との組み合わせ等の検体を電気泳動し、分析を行ってもよい。
【００９２】
［細胞外小胞体分析装置］
一実施態様において、本発明は、上記のいずれかの細胞外小胞体分析チップを保持する保持部と、細胞外小胞体、又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を計測する計測部と、を備えた、細胞外小胞体分析装置を提供する。ここで、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体とは、抗体やアプタマー等の、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質と細胞外小胞体との複合体を意味する。
【００９３】
上記の計測部は、細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体のゼータ電位を算出するために、例えば、細胞外小胞体分析チップの泳動流路の照射領域に、光を照射する光照射部と、細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を光学的に検出する検出部と、検出データから細胞外小胞体又は特異的結合物質−細胞外小胞体複合体の移動度を算出する移動度算出部と、を含む。
【００９４】
図１５は、一実施態様の細胞外小胞体分析装置１５００を示す模式図である。細胞外小胞体分析装置１５００は、筐体１５１０と、細胞外小胞体分析チップ導入口１５２０と、細胞外小胞体分析チップαを保持する保持部１５３０と信号ケーブル１５１１と、コンピュータ１５１３と、オペレーションスクリーン１５１５とを備える。筐体１５１０内には、計測部が内蔵されている（図示せず）。上記の計測部は、光照射部と検出部と移動度算出部とを含む（図示せず）。
【００９５】
本実施形態の細胞外小胞体分析装置１５００は次のように動作する。まず、検査対象の細胞外小胞体を導入した、細胞外小胞体分析チップαを、保持部１５３０にセットする。続いて、保持部１５３０が矢印βの方向に移動することにより、細胞外小胞体分析チップαが、細胞外小胞体分析装置１５００の内部に移動する。
【００９６】
この過程について、より詳細に説明する。保持部１５３０は、図１７に示すようなチップホルダーを備えている。チップホルダー１７００は、ホルダー本体１７０８と、蝶番１７１８と、細胞外小胞体分析チップαの電極接点を押さえつける、押え部材１７２８とを備えている。
【００９７】
保持部１５３０のチップホルダー１７００に細胞外小胞体分析チップαをセットしてローディング操作を行うと、保持部１５３０が矢印βの方向に移動する。そして、細胞外小胞体分析チップαは、細胞外小胞体分析装置１５００の内部に存在するステージにセットされる。
【００９８】
図１８Ａは、細胞外小胞体分析チップαを構成する電極コートガラス基板１８００の上面図である。図１８Ａに示すように、本電極コートガラス基板は、ガラス基板１８９０上に形成された、複数の電極１８３０及び複数の電極１８４０を備えている。細胞外小胞体分析チップαは、例えば、上記電極コートガラス基板１８００上に、上述したマイクロ流路構造体を貼り付けることにより作製されている。電極コートガラス基板をマイクロ流路構造体に貼り付けることにより、流路が形成されている。
【００９９】
図１８Ｂは、細胞外小胞体分析チップαの上面図であり、図１８Ｃは、細胞外小胞体分析チップαの電極１８３０が存在する部分の断面図である。図１８Ｂ、図１８Ｃに示すように、細胞外小胞体分析チップαの電極１８３０及び１８４０は、一部が露出し、電極接点を形成している。そして、この電極接点の配置は、細胞外小胞体分析装置１５００の内部に存在するステージに設けられた電極接点と一致するように構成されている。
【０１００】
図１９Ａ及び図１９Ｂは、細胞外小胞体分析装置１５００の内部に存在するステージ部１９００を示す図である。ステージ部１９００は、ステージ１９２７と、コネクタ部１９０７と電極接点１９１７を備えている。図１９Ａは、細胞外小胞体分析チップαのローディング前の状態を示す図であり、図１９Ｂは、細胞外小胞体分析チップαのローディング後の状態を示す図である。
【０１０１】
保持部１５３０のローディング及びイジェクトは、コンピュータ１５１３からの信号により制御される。コンピュータ１５１３からの信号により、細胞外小胞体分析装置１５００内部から、保持部１５３０が矢印βと逆の方向に移動し、細胞外小胞体分析チップαをチップホルダー１７００にセットすることが可能となる。
【０１０２】
細胞外小胞体分析チップαを保持部１５３０のチップホルダー１７００にセットしてローディングさせると、保持部１５３０が移動する。その結果、図１９Ｂに示すように、細胞外小胞体分析チップαの電極１９３０は、コネクタ部１９０７に備えられた電極接点１９１７と電気的に接続される。
【０１０３】
細胞外小胞体分析装置１５００の内部では、電極への電圧の印加が行われ、細胞外小胞体分析チップα上で細胞外小胞体の電気泳動が行われる。電気泳動中、光照射部から泳動流路に光が照射される。また、検出部により、細胞外小胞体が光学的に検出され、撮影される。また、撮影された画像に基づいて、移動度算出部が電気泳動移動度Ｕを算出し、細胞外小胞体のゼータ電位を算出する。算出されたゼータ電位等のデータは、例えば、オペレーションスクリーン１５１５又はコンピュータ１５１３のディスプレイ上に表示される。オペレーションスクリーン１５１５は、細胞外小胞体分析チップ上に複数存在する泳動流路の中から、ゼータ電位の測定を行う泳動流路を選択するための画面、印加電圧や印加時間を表示する画面、撮影画像を表示する画面、保持部１５３０をローディング又はイジェクトさせるための操作画面、分析を開始又は停止させるための画面、分析ステータス（分析進捗状況、エラー状況等）を表示する画面等を表示可能に構成されている。
【０１０４】
細胞外小胞体分析チップαを用いた一連の測定が終わると、コンピュータ１５１３からの信号により、保持部１５３０をイジェクトさせ、細胞外小胞体分析チップαを取り出す。ひき続き、別の細胞外小胞体分析チップをセットして測定することも可能である。
【０１０５】
図２２は、細胞外小胞体分析装置１５００の検出部により撮影された、電気泳動中の細胞外小胞体の画像に基づいて作成された、解析画面の一例を示す模式図である。図２２では、複数の細胞外小胞体及び細胞外小胞体が、電気泳動やブラウン運動等により移動した軌跡を、画像処理により可視化した線２２０１〜２２０５が表示されている。この画像は、細胞外小胞体分析装置１５００のオペレーションスクリーン１５１５又はコンピュータ１５１３のディスプレイ上に表示させることができる。
【０１０６】
［キット］
一実施態様において、本発明は、複数の第１リザーバーと、前記第１リザーバーと同数の第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとをそれぞれ接続する、前記第１リザーバーと同数の泳動流路と、を備え、前記第１リザーバー及び前記第２リザーバーが、それぞれ電極を有し、前記泳動流路が、それぞれ等しい流路長を有し、前記第１リザーバーのいずれか若しくは前記第２リザーバーのいずれか、又は、前記泳動流路のいずれかが、特異的結合物質を保持している、細胞外小胞体分析チップ、を含む、キットを提供する。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、複数の第１リザーバーと、前記第１リザーバーと同数の第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとをそれぞれ接続する、前記第１リザーバーと同数の泳動流路と、検体導入口と、前記検体導入口と前記第１リザーバーとをそれぞれ接続する、前記第１リザーバーと同数の検体導入流路と、を備え、前記第１リザーバー及び前記第２リザーバーが、それぞれ電極を有し、前記泳動流路が、それぞれ等しい流路長を有し、前記第１リザーバーのいずれか若しくは前記第２リザーバーのいずれか、又は、前記泳動流路のいずれか若しくは前記検体導入流路のいずれかが、特異的結合物質を保持している、細胞外小胞体分析チップ、を含む、キットを提供する。
【０１０８】
これらのキットは、更に、緩衝液、シリンジ等を含んでいてもよい。これらのキットは、上述した細胞外小胞体分析方法を実施するのに好適に用いることができる。本キットにより、細胞外小胞体を効率的に分析することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明により、簡便かつ高感度に細胞外小胞体を分析することができる、細胞外小胞体分析チップを提供することができる。また、上記の細胞外小胞体分析チップを用いた細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置及びキットを提供することができる。
【符号の説明】
【０１１０】
１００，３００，５００，５００’，６００，９００，１０００，１１００，１３００，１４００，１６００，２０００，２１００，２１００’，２３００，α…細胞外小胞体分析チップ、１１０，３１０，５１０，５１０’，６１０，９１０，１０１０，１１１０，２０１０，２１１０，２１１０’，２３１０…第１リザーバー、１２０，３２０，５２０，５２０’，６２０，９２０，１０２０，１１２０，１３２０，１４２０，２１２０，２１２０’，２３２０…第２リザーバー、３１１，３２１，６１１，６２１，１３３５，２０３５…壁、３１２，３２２，６１２，６２２，２０１２…堀、３７０，９７０，１０７０，１４７０…照射領域、３８０，６８０…シール部材、１３０，１４０，３３０，３４０，５３０，５４０，５３０’，５４０’，６３０，６４０，９３０，９４０，１０３０，１０４０，１１３０，１１４０，１３３０，１３４０，１４３０，１４４０，１８３０，１８４０，２１３０，２１３０’，２１４０，２１４０’…電極、１５０，３５０，５５０，５５０’，６５０，９５０，１０５０，１１５０，１３５０，１４５０，１６８９，２１５０，２１５０’，２３５０…泳動流路、１６０，３６０，６６０，１８６０…本体、５９０，５９０’，６９０，１０９０，１１９０，１６９０，１８９０，２３９０…基板、１３２５，１４２５…構造体、１５００…細胞外小胞体分析装置、１５１０…筐体、１５１１…信号ケーブル、１５１３…コンピュータ、１５１５…オペレーションスクリーン、１５２０…細胞外小胞体分析チップ導入口、１５３０…保持部、１６５５…マイクロ流路構造体、１６２５…リザーバー構造体、１６８５，２０８５…ウェルカバー、１７００…チップホルダー、１７０８…ホルダー本体、１７１８…蝶番、１７２８…押え部材、１８００…電極コートガラス基板、１９００…ステージ部、１９２７…ステージ、１９０７…コネクタ部、１９１７…電極接点、２１３１’，２１４１’…配線、２１０９，２１１９…電圧制御装置、２２０１，２２０２，２２０３，２２０４，２２０５，２２０６，２２０７…線（軌跡）、Ｗ，Ｖ，β…矢印。
【図１】
2015163194.tif 000003
【図２】
2015163194.tif 000004
【図３】
2015163194.tif 000005
【図４】
2015163194.tif 000006
【図５Ａ】
2015163194.tif 000007
【図５Ｂ】
2015163194.tif 000008
【図６】
2015163194.tif 000009
【図７】
2015163194.tif 000010
【図８】
2015163194.tif 000011
【図９】
2015163194.tif 000012
【図１０】
2015163194.tif 000013
【図１１】
2015163194.tif 000014
【図１２】
2015163194.tif 000015
【図１３】
2015163194.tif 000016
【図１４Ａ】
2015163194.tif 000017
【図１４Ｂ】
2015163194.tif 000018
【図１４Ｃ】
2015163194.tif 000019
【図１４Ｄ】
2015163194.tif 000020
【図１４Ｅ】
2015163194.tif 000021
【図１５】
2015163194.tif 000022
【図１６】
2015163194.tif 000023
【図１７】
2015163194.tif 000024
【図１８Ａ】
2015163194.tif 000025
【図１８Ｂ】
2015163194.tif 000026
【図１８Ｃ】
2015163194.tif 000027
【図１９Ａ】
2015163194.tif 000028
【図１９Ｂ】
2015163194.tif 000029
【図２０】
2015163194.tif 000030
【図２１Ａ】
2015163194.tif 000031
【図２１Ｂ】
2015163194.tif 000032
【図２２】
2015163194.tif 000033
【図２３】
2015163194.tif 000034
【国際調査報告】
2015163194.tif 000035
2015163194.tif 000036
2015163194.tif 000037
2015163194.tif 000038