(57)【要約】  簡易に有機酸が精製可能な有機酸の製造方法の提供。  酵母に有機酸生産用外来遺伝子を導入した形質転換体であってかつ下記エーテル類に耐性を有する形質転換体を用い、液体培地中で発酵を行って有機酸を生産し、次いで発酵液中の有機酸をエーテル類で抽出することを特徴とする有機酸の製造方法。液体培地はエーテル類が溶存した液体培地であることが好ましく、該液体培地におけるエーテル類の溶存割合は、エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％であることが好ましい。前記エーテル類は炭素数３〜８のジアルキルエーテルであることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母に有機酸生産用外来遺伝子を導入した形質転換体であってかつ下記エーテル類に耐性を有する形質転換体を用い、液体培地中で発酵を行って有機酸を生産し、次いで発酵液中の有機酸をエーテル類で抽出することを特徴とする有機酸の製造方法。
【請求項２】
宿主が耐酸性を有する酵母である、請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
耐酸性を有する酵母がシゾサッカロマイセス属の酵母である、請求項２に記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
前記エーテル類が炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
エーテル類が溶存した液体培地中で発酵を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
前記液体培地に溶存したエーテル類が、炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、請求項５に記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
前記液体培地に溶存したエーテル類が、有機酸を抽出する工程で使用されるエーテル類と同一の化合物である、請求項５または６に記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
前記液体培地におけるエーテル類の溶存割合が、該エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項９】
エーテル類に耐性を有する前記形質転換体が、エーテル類を含む培地で培養することによって選抜された形質転換体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１０】
前記有機酸が、乳酸、３−ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、および、アジピン酸からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１１】
前記有機酸が乳酸である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１２】
有機酸生産用外来遺伝子を酵母に導入して形質転換体を作製し、作製された形質転換体から、エーテル類が溶存した培地を用いて、エーテル類に対する耐性を有する形質転換体を選抜することにより、エーテル類に対する耐性と有機酸産生能を有する形質転換体を得ること、
および、
エーテル類に対する耐性と有機酸産生能を有する前記形質転換体を用い、液体培地中で発酵を行って有機酸を有する発酵液を得て、該発酵液からエーテル類を用いて有機酸を抽出すること
を特徴とする有機酸の製造方法。
【請求項１３】
エーテル類が溶存した液体培地中で発酵を行う、請求項１２に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１４】
前記液体培地におけるエーテル類の溶存割合が、エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％である、請求項１３に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１５】
前記選抜工程におけるエーテル類、前記発酵工程におけるエーテル類および前記抽出工程におけるエーテル類が、いずれも、炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、請求項１３または１４に記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸、例えば乳酸、コハク酸等は、医薬、農薬、化粧品等の種々の用途において使用されている。有機酸の製造方法としては、発酵法が古くから用いられている。例えば乳酸菌を用いて乳酸を製造する方法や、遺伝子組み換え酵母を用いて乳酸を製造する方法（特許文献１）が知られている。【０００３】
発酵で得られた有機酸は、発酵液中に溶解している。発酵液から有機酸を分離精製する方法の１つとして抽出法が知られている。例えば乳酸発酵液からジエチルエーテル等の抽出溶媒を用いて乳酸を分離精製する方法（特許文献２）；液体培地と二相分離可能な抽出溶媒を用いて、おおよそ二相系を維持しながら乳酸を液体培地から抽出溶媒に抽出し分離精製する方法（特許文献３）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１１／０２１６２９号
【特許文献２】特開２０１１−１７７１５９号公報
【特許文献３】特開２００７−０８２４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし特許文献２に記載された発明では、ジエチルエーテルによる抽出の前に、遠心分離や膜ろ過等により菌体等の夾雑物を除去する必要があった。また特許文献３に記載された発明では、トリオクチルアミンやオレイルアルコール等の高沸点溶媒を用いるため、乳酸を抽出溶媒から分離する操作が複雑になりやすかった。
そこで本発明はこれらの課題を解決し、簡易に有機酸が精製可能な有機酸の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、下記［１］〜［１５］に記載する有機酸の製造方法である。
［１］酵母に有機酸生産用外来遺伝子を導入した形質転換体であってかつ下記エーテル類に耐性を有する形質転換体を用い、液体培地中で発酵を行って有機酸を生産し、次いで発酵液中の有機酸をエーテル類で抽出することを特徴とする有機酸の製造方法。
［２］宿主が耐酸性を有する酵母である、［１］の有機酸の製造方法。
［３］耐酸性を有する酵母がシゾサッカロマイセス属の酵母である、［２］の有機酸の製造方法。
［４］前記エーテル類が炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、［１］〜［３］のいずれかの有機酸の製造方法。【０００７】
［５］エーテル類が溶存した液体培地中で発酵を行う、［１］〜［４］のいずれかの有機酸の製造方法。
［６］前記液体培地に溶存したエーテル類が、炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、［５］の有機酸の製造方法。
［７］前記液体培地に溶存したエーテル類が、有機酸を抽出する工程で使用されるエーテル類と同一の化合物である、［５］または［６］の有機酸の製造方法。
［８］前記液体培地におけるエーテル類の溶存割合が、該エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％である、［５］〜［７］のいずれかの有機酸の製造方法。【０００８】
［９］エーテル類に耐性を有する前記形質転換体が、エーテル類を含む培地で培養することによって選抜された形質転換体である、［１］〜［８］のいずれかの有機酸の製造方法。
［１０］前記有機酸が、乳酸、３−ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、および、アジピン酸からなる群から選ばれる１種以上である、［１］〜［９］のいずれかの有機酸の製造方法。
［１１］前記有機酸が乳酸である、［１］〜［９］のいずれかの有機酸の製造方法。【０００９】
［１２］有機酸生産用外来遺伝子を酵母に導入して形質転換体を作製し、作製された形質転換体から、エーテル類が溶存した培地を用いて、エーテル類に対する耐性を有する形質転換体を選抜することにより、エーテル類に対する耐性と有機酸産生能を有する形質転換体を得ること、
および、
エーテル類に対する耐性と有機酸産生能を有する前記形質転換体を用い、液体培地中で発酵を行って有機酸を有する発酵液を得て、該発酵液からエーテル類を用いて有機酸を抽出すること
を特徴とする有機酸の製造方法。
［１３］エーテル類が溶存した液体培地中で発酵を行う、［１２］の有機酸の製造方法。
［１４］前記液体培地におけるエーテル類の溶存割合が、エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％である、［１３］の有機酸の製造方法。
［１５］前記選抜工程におけるエーテル類、前記発酵工程におけるエーテル類および前記抽出工程におけるエーテル類が、いずれも、炭素数３〜８のジアルキルエーテルである、［１３］または［１４］の有機酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の有機酸の製造方法によれば、エーテル類が有機酸と容易に分離できるため、簡便な操作で有機酸を分離精製できる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において「発酵」とは、微生物（酵母、その形質転換体等）が炭素源（糖等）を消費し代謝活動を行うことを意味する。代謝活動は、一次代謝（primary metabolism）が主であってもよく、二次代謝（secondary metabolism）が主であってもよい。すなわち代謝活動で得られる生成物は、一次代謝産物（primary metabolites）が主であってもよく、二次代謝産物（secondary metabolites）が主であってもよい。本発明において二次代謝産物は目的化合物（有機酸）を主（二次代謝産物の５０％以上）とする。発酵（二次代謝）としては、目的化合物（有機酸）のみが生産されるホモ型発酵であっても、目的化合物以外にエタノール等が生産されるヘテロ型発酵であってもよい。
【００１２】
本発明において「有機酸」とは、カルボキシル基を有する有機化合物である。有機酸としては、乳酸、３−ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、および、アジピン酸からなる群から選ばれる１種以上が好ましい。有機酸としては広い用途を有する点で乳酸またはコハク酸が好ましく、乳酸が特に好ましい。これらの有機酸は、光学異性体が存在する場合には、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれであってもよく、またオリゴマー、即ち重合度２〜１５程度のポリマー、を形成していてもよい。
【００１３】
本発明においてエーテル類とは、２個のアルキル基がエーテル性酸素原子で結合したジアルキルエーテルを意味する。ただし２個のアルキル基は、同じアルキル基（対称型エーテル）であってもよく、異なるアルキル基（非対称型エーテル）であってもよい。ジアルキルエーテルとしては、炭素数３〜８のジアルキルエーテルが好ましく、炭素数４〜６のジアルキルエーテルがより好ましい。具体例としては、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチル−ｎ−プロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、エチル−ｎ−プロピルエーテル、エチルイソプロピルエーテル、メチル−ｎ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチル−ｎ−ブチルエーテル、エチルイソブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、プロピルブチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等が例示できる。これらのジアルキルエーテルのうち入手容易であり、工業的に利用しやすい点から、ジエチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルが好ましく、ジエチルエーテルが特に好ましい。エーテル類は１種のみを用いても２種を併用してもよい。また複数の抽出工程を設ける場合には、それぞれ異なるエーテル類を用いてもよい。
【００１４】
本発明において「溶存する」とは、完全に溶解した状態、微細に乳化し概ね安定である状態、および、微細に懸濁し概ね安定である状態を併せていう。なお概ね安定であるとは、１０分間程度静置しても明瞭な分離層が生じないことを意味する。
【００１５】
本発明において「液体培地」とは、微生物（酵母、その形質転換体等）が生存し、発酵が行える液体である。本発明において液体培地は水を主成分とし、炭素源（糖分等）を含み；窒素源、無機塩、微量元素、ビタミン等を任意に含む。液体培地は、天然、合成または半合成のいずれであってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩；ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス、麦芽エキス、焼酎粕、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機塩としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。微量元素としては、例えば、Ｃａ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ等が挙げられる。これらの微量元素は、硫酸塩や塩化物の形で液体培地に添加できる。ビタミンとしては、例えば、ビオチン、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸、イノシトール、チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩等が挙げられる。
なお、発酵により生成した有機酸を含む液体培地を、以下、「発酵液」ともいう。
【００１６】
本発明において「酵母」とは、出芽酵母と分裂酵母の双方を合わせた微生物の一群を意味する。出芽酵母としては、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、クルイベロマイセス属（Kluyberomyces）、ピキア属（Pichia）、ヤロウィア属（Yarrowia）等が挙げられる。分裂酵母としては、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）等が挙げられる。これらのうちサッカロマイセス属、ヤロウィア属またはシゾサッカロマイセス属が好ましい。サッカロマイセス属としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。ヤロウィア属としては、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）が好ましい。シゾサッカロマイセス属としては、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）が好ましい。これらの酵母のうち、目的とする有機酸（二次代謝産物）を生産する観点から耐酸性株が好ましい。特にｐＨが５以下、好ましくは１〜４の範囲で発酵が継続する耐酸性を有する株が好ましい。
【００１７】
（形質転換体）
本発明において用いる形質転換体は、酵母を宿主としてそれに有機酸生産用の外来遺伝子を導入してなる形質転換体である。すなわち本発明において用いる形質転換体は、酵母を宿主として遺伝子組み換え操作を行い、宿主が本来持っていない遺伝子を人為的に導入したものである。導入される有機酸生産用の外来遺伝子、および、該外来遺伝子の導入方法は、目的とする有機酸および宿主となる酵母の種類に応じて公知の技術から選択される。なお目的とする有機酸の生産効率を高める目的で、宿主が本来持っている遺伝子の一部を削除または失活させることが好ましい。
【００１８】
有機酸生産用の外来遺伝子としては、乳酸生産の場合には乳酸脱水素酵素等の遺伝子、コハク酸生産の場合にはピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、リンゴ酸脱水素酵素遺伝子、フマル酸ヒドラターゼ遺伝子、コハク酸脱水素酵素遺伝子、スクシニルＣｏＡシンテターゼ等の遺伝子、３−ヒドロキシプロパン酸生産の場合には、マロニルＣｏＡ還元酵素遺伝子、３−ヒドロキシプロパン酸脱水素酵素遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子等が挙げられる。また、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等の遺伝子、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等の遺伝子、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等の遺伝子、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等の遺伝子が挙げられる。
例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子（以下「ＬＤＨ遺伝子」ともいう。）としては、ビヒドバクテリウム属、ラクトバシルス属等に属する微生物由来のＬＤＨ遺伝子や、ヒト等の哺乳動物由来のＬＤＨ遺伝子が挙げられる。なかでも、シゾサッカロマイセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう。）等による乳酸産生の効率に優れる点から、哺乳動物由来のＬＤＨ遺伝子であることが好ましい。
また、宿主が本来持っている遺伝子の一部を削除または失活させる場合、その遺伝子としては、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）が好ましい。宿主がＰＤＣ遺伝子を複数有している場合、削除または失活させる遺伝子はそのうちの１つであっても２以上であってもよい。たとえば、Ｓ．ポンベはＰＤＣ１遺伝子〜ＰＤＣ４遺伝子の４種のＰＤＣ遺伝子を有し、ＰＤＣ遺伝子を削除または失活させた宿主としてはＰＤＣ２遺伝子のみを削除または失活させたＳ．ポンベが好ましい（国際公開２０１１／０２１６２９号参照）。
【００１９】
例えば有機酸として乳酸を生産する場合には、宿主が本来持っているＰＤＣ２遺伝子を削除または失活させ、ＬＤＨ遺伝子を外来遺伝子として導入した形質転換体が好ましい。
また有機酸としてコハク酸を生産する場合には、宿主が本来持っているＰＤＣ遺伝子を削除または失活させ、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、リンゴ酸脱水素酵素遺伝子、フマル酸ヒドラターゼ遺伝子、および、コハク酸脱水素酵素遺伝子の１以上を外来遺伝子として導入した形質転換体が好ましい。
また有機酸として３−ヒドロキシプロパン酸を生産する場合には、宿主が本来持っているＰＤＣ遺伝子を削除または失活させ、かつ、マロニルＣｏＡ還元酵素遺伝子、３−ヒドロキシプロパン酸脱水素酵素遺伝子、および、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の１以上を外来遺伝子として導入した形質転換体が好ましい。
【００２０】
例えば、有機酸として乳酸を生産し、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを用いる技術は、国際公開９９／１４３３５号、国際公開２００３／１０２１５２号、国際公開２００５／０５２１７４号、国際公開２００７／０４３２５３号等で公知である。また有機酸として乳酸を生産し、宿主としてＳ．ポンベを用いる技術は、国際公開２０１１／０２１６２９号等で公知である。また有機酸として３−ヒドロキシプロパン酸を生産し、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを用いる技術は、国際公開２００２／０４２４１８号等で公知である。また有機酸としてコハク酸を生産し、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを用いる技術は、国際公開２００９／０６５７７８号、国際公開２０１０／０４３１９７号等で公知である。また有機酸としてコハク酸を生産し、宿主としてヤロウィア・リポリティカを用いる技術は、国際公開２０１０／０８７５０３号等で公知である。
【００２１】
（形質転換体の選抜）
本発明においては、エーテル類に耐性を有する形質転換体（以下、「エーテル耐性形質転換体」ともいう。）が有機酸生産のための発酵に用いられる。エーテル耐性形質転換体は、形質転換体作製後、作製された形質転換体からエーテル耐性形質転換体を選抜することにより得られたものが好ましい。発酵にエーテル耐性形質転換体を使用すると、発酵液から有機酸をエーテル類で抽出する際、形質転換体がエーテル類に接触した場合でもその影響を受けることが少なく、エーテル類に接触した形質転換体を再度発酵に使用することが容易となる。また、エーテル類が溶存した液体培地を用いて発酵を行いことが可能となり、その場合には発酵液からの有機酸の抽出や回収がより容易となる。
エーテル耐性形質転換体の選抜は、具体的には、遺伝子導入により作製された形質転換体をエーテル類が溶存した培地中で所定時間培養して生菌を得る方法が好ましい。「選抜する」とは、形質転換体を所定の負荷環境に所定時間培養した後、生き残った形質転換体を得る方法を意味する。本発明においては、所定の負荷環境として、エーテル類が溶存した培地を用いる。すなわちこの選抜により、エーテル類を含む培地に対する耐性を有する形質転換体が得られる。
なお、以下、この選抜のために使用する培地を選抜培地という。選抜培地は、後述の有機酸製造のための発酵に使用される液状培地と同じ種類の液体培地であってもよく、異なる種類の培地であってもよい。エーテル類が溶存した選抜培地としては、後述の発酵に使用することが好ましい、エーテル類が溶存した液体培地と同種の液体培地が好ましい。
【００２２】
エーテル類が溶存した選抜培地におけるエーテル類の溶存割合は、エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％が好ましい。この溶存割合の範囲であれば、エーテル類に対する耐性を持つ形質転換体を選抜しやすい。ここで飽和溶解度は温度に依存する。飽和溶解度を決める温度としては、形質転換体を選抜する選抜培地の温度とする。選抜培地に対するエーテル類の溶解度は、選抜培地の組成により変化するが、本発明においては、簡便のために水に対する飽和溶解度を基準とする。
【００２３】
なお、エーテル類の種類、温度にもよるが、選抜培地におけるエーテル類の濃度は、培地のうち１〜６質量％であることが好ましい。すなわちエーテル類が溶存した選抜培地の１００ｇのうち１〜６ｇがエーテル類であることが好ましい。この濃度範囲であれば、エーテル類に対する耐性を持つ形質転換体を選抜しやすい。なお２０℃の水１００ｇに対して、ジエチルエーテルは約７．５ｇ、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルは約４．２ｇ、それぞれ溶解する。
【００２４】
エーテル類が溶存した選抜培地としては、エーテル類が溶存する以外には特に制限は無く、一般的な培地を用いることができる。選抜培地のエーテル以外の組成としては形質転換体が発酵できる組成であればよい。すなわち選抜培地としては、エーテルおよび炭素源（糖、特にグルコース等の六炭糖）を含む組成であればよい。選抜培地のエーテル以外の組成としては、ＹＥＳ培地、ＹＰＤ培地等が例示できる。
【００２５】
選抜の具体的な方法としては、エーテル類が溶存した選抜培地を準備し、この培地に形質転換体を植菌し、所定時間培養し、生菌体を回収する方法が例示できる。すなわちこの例示のような方法を用いて選抜することによりエーテル耐性形質転換体が得られる。エーテル類が溶存した選抜培地において、形質転換体を植菌してから回収するまでの時間（形質転換体を培養する時間）は、特に制限はないが、１〜２４時間が好ましく、３〜１０時間が好ましい。この際の温度、酸素濃度等は一般的な培養条件と同じ条件を選択することが好ましい。すなわち、形質転換体を植菌してから回収するまでの条件は、エーテル類を含まない培地を用いて形質転換体を培養するのに最適化された条件と、同じ条件を選択することが好ましい。
【００２６】
選抜により得られたエーテル耐性形質転換体は、増殖させて発酵に使用することが好ましい。エーテル耐性形質転換体は、選抜を行う前の菌体群と比較して増殖速度が遅い傾向にある。したがって、発酵の初期でエーテル耐性形質転換体を増殖させて発酵を行うこともできるが、増殖に要する時間が長くなるため、発酵工程全体としての発酵時間が長くなりやすい。エーテル耐性形質転換体を発酵に要する所定量まで増殖させ、増殖させた菌体を発酵に用いることにより、発酵時間を短縮することができる。
上記増殖に用いる培地（以下、増殖用培地ともいう。）としては、上記と同じ理由によりエーテル類を含まない培地であることが好ましい。増殖用培地としては、形質転換体を培養・増殖させることができる組成であれば特に制限はない。増殖用培地としてはＹＥＳ培地、ＹＰＤ培地等が例示できる。また増殖用培地において増殖させる目標量（通常は菌体密度を特定波長（例えば６６０ｎｍ）の光による吸光度（ＯＤ６６０）によって表わされる量）は、酵母を培養・増殖させる際に一般的に目標とする量（一般的には６〜１２、好ましくは８〜１０）とすることが好ましい。また増殖用培地における培養・増殖の条件は一般的な条件とすることが好ましい。すなわち増殖用培地における形質転換体の培養・増殖の条件は、エーテル類を含まない液体培地を用いて形質転換体を培養・増殖させるのに最適化された条件と、同じ条件を選択することが好ましい。
【００２７】
（有機酸の生産）
本発明においては、選抜された形質転換体を用いて、発酵により有機酸を生産する。この有機酸生産の際に、エーテル類が溶存した液体培地を用いることが好ましい。さらに液体培地におけるエーテル類の溶存割合は、エーテル類の水に対する飽和溶解度の１〜１００％であることが好ましい。この実施態様によれば、有機酸の生産設備として簡略な設備を用いたとしても、効率良く有機酸が生産できる。
【００２８】
なおエーテル類の種類、温度にもよるが、エーテル類が溶存した液体培地におけるエーテル類の濃度は、培地のうち１〜６質量％であることが好ましい。すなわちエーテル類が溶存した液体培地の１００ｇのうち１〜６ｇがエーテル類であることが好ましい。この濃度範囲であれば、有機酸を効率良く生産できる。
【００２９】
液体培地としては特に制限は無く、一般的な液体培地を用いることができる。液体培地としてはＹＥＳ培地、ＹＰＤ培地、または、これらの培地に無機塩、ビタミン、もしくはこれら両方を添加した培地等が例示できる。
【００３０】
有機酸を生産するための発酵の条件としては、一般的な条件とすることが好ましい。すなわち本発明にかかる形質転換体を用いて、所望の有機酸を製造する際に採用される好適な発酵条件を採用することが好ましい。発酵には公知の発酵方法を用いることができる。例えば循環発酵、撹拌発酵等により行うことができる。発酵温度は、２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がより好ましい。また発酵時間は適宜決定することができる。
【００３１】
発酵は、回分発酵、準連続発酵、または連続発酵のいずれであってもよい。本発明の製造方法は特に準連続発酵または連続発酵に好適である。例えば回分発酵で発酵を行った後、菌体を液体培地から分離して、有機酸を含む粗液を取得することができる。また連続発酵法では、例えば、発酵中の発酵槽から液体培地の一部を連続的に抜き出し、抜き出した液体培地から有機酸を抽出・分離するとともに、有機酸を分離した残りの液体培地にグルコース等を加えて発酵槽に戻すことを繰り返して、連続的に発酵する方法が挙げられる。また準連続発酵法（いわゆるフィル・アンド・ドロー法）では、例えば、発酵を行った（投入した炭素源のほとんど（例えば８０％以上、好ましくは９５％以上）を消費した段階）後、発酵槽から液体培地の一部を抜き出し（形質転換体の少なくとも一部は発酵槽に残す）、抜き出した液体培地から有機酸を抽出・分離し、発酵槽に液体培地（有機酸を分離した残りの液体培地にグルコース等の炭素源を加えた液体培地であっても、新しく用意された液体培地でもよい）を投入して発酵を繰り返す方法が挙げられる。準連続発酵または連続発酵を行うことにより有機酸の生産性がより向上する。
【００３２】
（有機酸の抽出）
本発明においては、エーテル類を用いて発酵液から有機酸を抽出する。すなわち発酵により生成した有機酸を含む液体培地（発酵液）から、発酵で生産された目的化合物（有機酸）を、エーテル類を用いて抽出する。有機酸の抽出に用いるエーテル類は、液体培地に溶存させたエーテル類と同じ化合物であることが好ましく、さらに形質転換体の選抜で用いたエーテル類と同じ化合物を用いることが好ましい。
【００３３】
抽出は、回分操作で行ってもよく、連続操作で行ってもよい。抽出効率が高く、操作に必要なエネルギーが低く抑えやすいことから連続操作が好ましい。回分操作としては、振とう操作、撹拌操作等が挙げられる。連続操作としては、棚段塔や充填塔等の塔を用い、併流抽出または向流抽出を行うことができる。抽出効率を高くし装置を小型化しやすいことから充填塔を用い向流抽出を行うことが好ましい。
【００３４】
抽出の際の発酵液のｐＨは１〜６が好ましく、１．５〜４が好ましい。ｐＨを酸性に保つことにより有機酸の水への溶解度を抑え、エーテル類への抽出効率を高くできる。ｐＨの調整は酸を添加してもよいが、発酵で生産された有機酸により所定ｐＨ領域に調整されることが好ましい。
【００３５】
本発明においては、有機酸の蓄積により発酵液のｐＨが低くなっても、（酸やアルカリ等の添加による）ｐＨ調整を行わずに有機酸を生産することができる発酵法を採用することが好ましい。すなわち、発酵液のｐＨが低くなった後も、そのまま発酵を継続する連続発酵により有機酸を製造することができる発酵法を採用することが好ましい。この発酵法においては、有機酸の生産性を高くするために、発酵液のｐＨが３．５以下になった後であっても、さらに発酵を継続することが好ましい。特に上述のＳ．ポンベを宿主とした形質転換体は、耐酸性が優れているため、生産された有機酸を含む発酵液のｐＨを調整することなく発酵を継続することができる。
【００３６】
本発明において発酵液は、抽出の前処理として菌体を分離してもよいが、菌体を含んだままの発酵液を直接抽出に用いてもよい。形質転換体がエーテル類を含んだ液体培地に対する耐性を有しているので、発酵液がエーテル類と接触しエーテル類が発酵液に溶解しても菌体への影響はほとんどない。また本発明においては、抽出を行った後の発酵液を発酵槽に戻すことが好ましい。この態様により廃水量を少なくでき、また、生産性の高い連続的な有機酸生産方法が実現できる。菌体の分離を行わない場合には、菌体の分離装置が不要になり、有機酸の生産設備が簡略化でき、ユーティリティの大幅な削減が可能となり、保守も容易になる。特にろ過膜を用いた菌体分離を行う場合には、膜の目詰まりを防止し、かつ、処理速度を速く維持するために、流速、圧力等を精密に制御する必要がある。上記態様によればこのような手間を省略でき、工程の大幅な簡略化が図れる。
【００３７】
菌体の分離を行う場合の分離方法としては、遠心分離やろ過等が例示できる。遠心分離の条件の例としては、９８００〜４９０００ｍ／ｓ２（１０００〜５０００Ｇ）おいて、１０〜１５分が挙げられる。またろ過の条件としては、公称目開きが０．１〜２μｍのろ過膜の使用が挙げられる。
【００３８】
発酵液から有機酸を抽出する際の条件は特に限定されない。抽出の際の温度は、０〜４０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましい。発酵液／エーテル類の体積比は、０．５／１〜２／１が好ましく、０．８／１〜１．２／１がより好ましい。抽出時間は、混合・接触効率に依存するが、通常、１分〜１０分でよい。抽出における分配係数は、対象とする有機酸およびエーテル類に依存するが、０．２以上が好ましく、０．３以上がより好ましい。また抽出率は、２０％以上が好ましく、２５％以上がより好ましい。一方、発酵液に含まれる炭素源（例えばグルコース）の抽出率は、２０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。
【００３９】
抽出は、発酵を行う発酵槽で行ってもよく、抽出装置を別に設けてもよい。抽出を発酵槽で行う場合には、発酵槽にエーテル類を導入し、発酵液と接触させる。接触させたエーテル類を回収し、後述する後処理を実施することが好ましい。抽出を抽出装置で行う場合には、発酵槽から発酵液の一部を抜き出す。抜き出された発酵液を抽出装置に導入する。抽出装置にはエーテル類も導入する。抽出装置からは、エーテル類を含む発酵液、および有機酸を含むエーテル類が導出される。エーテル類を含む発酵液は発酵槽に戻すことが好ましい。有機酸を含むエーテル類は、後述する後処理を実施することが好ましい。
【００４０】
（後処理）
抽出を行うことで、有機酸を含むエーテル類の溶液（有機酸含有抽出液）が得られる。有機酸含有抽出液は、有機酸とエーテル類の他に水を含む。さらに炭素源（グルコース等）等の不純物を含むことがある。有機酸含有抽出液は、さらに後処理として、エーテル類分離処理を行うことが好ましい。具体的なエーテル類分離処理としては、蒸留、ろ過、吸着、水による第２の抽出等を例示できる。これらの処理は複数を組み合わせて実施することが好ましい。
【００４１】
具体的な後処理の例としては、以下の方法が好適に挙げられる。（１Ａ）有機酸含有抽出液を蒸留し、有機酸が濃縮されたエーテル類の溶液（有機酸濃縮液）を得て；（１Ｂ）有機酸濃縮液から水を用いて有機酸を抽出し；（１Ｃ）吸着材で処理し；有機酸水溶液を得る方法。
【００４２】
（１Ａ）の蒸留の具体的方法は、特に制限されない。例えば、単蒸留、減圧蒸留等が挙げられる。蒸留ではエーテル類が回収される。回収されたエーテル類は再度抽出（発酵液からの有機酸の抽出）に用いることが好ましい。
【００４３】
（１Ｂ）の水による有機酸の抽出方法としては、特に制限されない。有機酸の抽出と同等の条件で実施が可能である。すなわち水による抽出は、回分操作で行ってもよく、連続操作で行ってもよい。抽出効率が高く、操作に必要なエネルギーが低く抑えやすいことから連続操作が好ましい。回分操作としては、振とう操作、撹拌操作等が挙げられる。連続操作としては、棚段塔や充填塔等の塔を用い、併流抽出または向流抽出を行うことができる。抽出効率を高くし装置を小型化しやすいことから充填塔を用い向流抽出を行うことが好ましい。
【００４４】
水による有機酸の抽出における条件は特に限定されない。水は塩類を含まないことが、最終的に得られる有機酸の純度を高くしやすいことから好ましい。つまり水としてはイオン交換水、蒸留水、純水等のいずれであってもよい。抽出の際の温度は、６０〜９０℃が好ましく、７０℃〜９０℃がより好ましい。温度の高い水を用いることで、エーテル類の蒸発が行われ、得られる有機酸が濃縮され、高い濃度の有機酸が容易に得られる。水／エーテル類（有機酸濃縮液）の体積比は、０．５／１〜２／１が好ましく、０．８／１〜１．２／１がより好ましい。抽出時間は、混合・接触効率に依存するが、通常、１分〜１０分でよい。抽出における分配係数は、対象とする有機酸およびエーテル類に依存するが、０．１５以上が好ましく、０．２以上がより好ましい。また抽出率は、１５％以上が好ましく、１７％以上がより好ましい。
【００４５】
（１Ｃ）の吸着材による処理方法としては、特に制限されない。吸着処理はバッチ処理でも、連続処理であってもよい。連続処理としては、吸着材を充填した塔を用い有機酸濃縮液を処理する方法が挙げられる。吸着材としては、シリカ、アルミナ、ゼオライト、活性炭等が挙げられる。目的化合物の着色が除去しやすい点で活性炭が好ましい。吸着材を用いる場合の使用量としては、有機酸１モルに対して、１〜３０ｇが好ましい。
【００４６】
発酵液から先に菌体を分離する場合の例としては、以下の方法が好適に挙げられる。（２Ａ）液体培地から菌体を分離し；（２Ｂ）菌体を分離した後の発酵液を吸着材で処理し；（２Ｃ)エーテル類を用いて目的化合物（有機酸）を抽出し、有機酸含有抽出液を得て；（２Ｄ）有機酸含有抽出液を蒸留し、有機酸が濃縮されたエーテル類の溶液（有機酸濃縮液）を得て；（２Ｅ）有機酸濃縮液から水を用いて有機酸を抽出し；有機酸水溶液を得る方法。
【００４７】
（有機酸の利用）
このように生産された有機酸は、必要に応じてさらに精製を行い、各種用途に用いられる。具体的な用途としては、工業材料の中間原料として、ポリエステル等の重合用原料として、それぞれ用いることが例示できる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は該実施例に限定されるものではない。【００４９】
＜実験例１＞
（形質転換体の選抜）
国際公開２０１２／１１４９７９号の実施例において作成された乳酸生産性の形質転換体ＡＳＰ３０５４株（Ｓ．ポンベを宿主とし、ヒト由来のＬＤＨ遺伝子が組み込まれ、かつ該宿主のＰＤＣ２遺伝子が欠失している、形質転換体）を用いて、エーテル耐性形質転換体の選抜を行った。
５００ｍＬの坂口フラスコに、ＹＥＳ培地（グルコースの３質量％、酵母エキスの０．５質量％を含み、ｐＨが４．５である）の１５０ｍＬを入れ、ＡＳＰ３０５４株を植菌した。温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件で２４時間培養した。
培養したＡＳＰ３０５４株を含む培養液を３３００ｒｐｍ、１０分間遠心し、０．５ｍＬ分のペレットを回収した後、試験管に液体培地（グルコースの１１質量％、ジエチルエーテルの６質量％を含む。遊離のジエチルエーテルは認められなかった。）を４．５ｍＬ入れた。温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件で７時間培養した。乳酸が３７ｇ／Ｌ生産されていた。生菌率は４０％であった。なお生菌率はトリパンブルー試薬にて死細胞を染色して、ウェル内における生細胞数（完全に染色されなかった細胞の数）を血球計算盤で計数することで算出した。
５００ｍＬの坂口フラスコに、ＹＥＳ培地（グルコースの３質量％、酵母エキスの０．５質量％を含み、ｐＨが４．５である）の１５０ｍＬを入れ、生き残ったＡＳＰ３０５４株を植菌した。温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件で３９時間培養した。このようにして選抜されたエーテル耐性を有するＡＳＰ３０５４株（以下、エーテル耐性ＡＳＰ３０５４株という。）を得た。【００５０】
＜実施例１＞
（有機酸の生産）
実験例１で選抜されたエーテル耐性ＡＳＰ３０５４株を用いて乳酸の生産を行った。バイオット社製５００ｍＬのガラス製発酵容器に液体培地（グルコースの１２．４質量％、ジエチルエーテルの６質量％を含む）を３００ｍＬ入れ、菌体ペレットを懸濁させた。温度２８℃、撹拌翼の回転速度６００ｒｐｍ、通気量１５０ｍＬ／分、で７時間発酵を行った。発酵後の液体培地を分析したところ、乳酸濃度は５５ｇ／Ｌであった。【００５１】
（有機酸の抽出）
発酵後の液体培地を１００ｍＬ分取し（菌体が混ざった状態であった）、２Ｌのガラス製分液ロートに入れた。ここにジエチルエーテルを１００ｍＬ入れ激しく３０秒間振り抽出し、１０分間静置した。上層は透き通っており、菌体は存在しなかった。上層を抜き出し、分液ロートに新たにジエチルエーテルを１００ｍＬ入れ抽出した。ジエチルエーテルによる抽出を合計で３回行った。抽出後のジエチルエーテルを集め分析したところ、乳酸濃度は２２ｇ／Ｌであった。この抽出時の分配係数は０．４であった。また合計の抽出率は４０％であった。【００５２】
（後処理）
乳酸を含むジエチルエーテル溶液１００ｍＬを、エバポレータを用いて２０ｍＬまで濃縮した。２００ｍＬの分液ロートに、濃縮後の乳酸を含むジエチルエーテル溶液を入れた。ここに４０ｍＬのイオン交換水を加え３０秒間激しく振り乳酸を抽出し、１０分間静置した。抽出後のイオン交換水を分析したところ、乳酸濃度は５５ｇ／Ｌ、分配係数は７．６、抽出率は９９．５％であった。
得られた乳酸抽出液を、活性炭（和光純薬工業社製、活性炭素粉末）の１ｇを充填したガラスカラムに通し、無色澄明な乳酸水溶液を得た。活性炭を通したことによる乳酸の減少は殆ど認められなかった。なお乳酸の濃度（水溶液中の濃度）は王子機器社製酵素電極（ＢＦ−７）を用いて行った。【００５３】
＜実施例２＞
（有機酸の生産・抽出）
実験例１で選抜されたエーテル耐性ＡＳＰ３０５４株を用いて乳酸の生産を行った。バイオット社製２Ｌのガラス製発酵容器（１）に液体培地（グルコースの１２．４質量％、ジエチルエーテルの６質量％を含む）を１．２Ｌ入れ、菌体ペレットを懸濁させた。また別にバイオット社製５００ｍＬのガラス製発酵容器（２）を用意した。発酵容器（２）の排気ラインにはガラス製コンデンサーを２個直列に接続し、５℃の冷水と−１０℃の不凍液を用いてそれぞれ冷却した。発酵容器（２）には、発酵容器（１）と同じ液体培地の３００ｍＬとジエチルエーテルの１００ｍＬを入れた。発酵容器（１）から液体培地を３ｍＬ／分の速度で発酵容器（２）の底部へ送液した。また発酵容器（２）の底部から液体培地を３ｍＬ／分の速度で発酵容器（１）へ送液した。発酵容器（１）を温度２８℃、撹拌翼の回転速度６００ｒｐｍ、通気量６００ｍＬ／分とし、発酵容器（２）を温度２５℃、撹拌翼の回転速度１００ｒｐｍ、通気量６０ｍＬ／分とし、この条件で２時間発酵を行った。発酵容器（２）はジエチルエーテルと液体培地が２層に分離していて、上層は懸濁が見られず透明であった。【００５４】
（後処理）
発酵後、発酵容器（２）のジエチルエーテルを回収し、エバポレータを用いて１０ｍＬまで濃縮した。１００ｍＬの分液ロートに、濃縮後の乳酸を含むジエチルエーテル溶液を入れた。ここに２０ｍＬのイオン交換水を加え３０秒間激しく振り乳酸を抽出し、１０分間静置した。抽出後のイオン交換水を分析したところ、乳酸濃度は５ｇ／Ｌであった。【００５５】
＜実施例３＞
実験例１において、ジエチルエーテルの代わりにメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いた以外は、実験例１と同様に操作を行い、選抜されたエーテル耐性ＡＳＰ３０５４株を得た。
実施例１において、ジエチルエーテルの代わりにメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いた以外は、実施例１と同様に操作（有機酸の生産、有機酸の抽出、および後処理）を行った。その結果乳酸濃度が５ｇ／Ｌの乳酸水溶液が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の有機酸の製造方法によれば、有機酸の製造が効率的に行える。特に工業的規模での製造において、液体培地から菌体を分離するための設備（ろ過膜や遠心分離装置）を省略することが可能となり工程の大幅簡略化が図れる。また有機酸を抽出した後の液体培地を発酵に再利用した場合、炭素源等の栄養源を効率良く利用できる。
なお、２０１３年１２月２６日に出願された日本特許出願２０１３−２６９８７８号の明細書、特許請求の範囲および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【国際調査報告】
2015098771.tif 000002
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