(57)【要約】【課題】核酸の回収率と通液性に優れた核酸の分離精製方法を提供する。【解決手段】少なくとも（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経ることを特徴とする核酸の分離精製方法。（Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合して混合液を得る工程（Ｂ）前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる工程（Ｃ）固相担体から核酸以外の成分を洗浄する工程（Ｄ）固相担体から核酸を脱着させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）疎水性の有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合して混合液を得る工程
（Ｂ）前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる工程
（Ｃ）固相担体から核酸以外の成分を洗浄する工程
（Ｄ）固相担体から核酸を脱着させる工程
【請求項２】
前記有機バインダーが、ポリエチレン系ポリマーまたはポリエステル系ポリマーを含むものである、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３】
前記多孔性無機粒子が多孔性シリカ粒子である、請求項１または２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項４】
前記多孔性無機粒子の固相担体に含まれる量が１〜６０重量％である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
前記多孔性無機粒子の形状が球状である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
前記多孔性無機粒子の平均粒子径が１〜５０μｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
前記有機または無機繊維がセルロース繊維またはガラス繊維である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
前記固相担体の目付けが、２５〜２００ｇ／ｍ２である、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項９】
前記固相担体の厚みが１００〜５００μｍである、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１０】
前記固相担体が湿式抄紙法により製造されたものである、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１１】
前記核酸を含む試料溶液が血液である、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１２】
核酸の分離精製方法に用いるための固相担体であって、（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）疎水性の有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体。
【請求項１３】
核酸の分離精製方法に用いるためのデバイスであって、請求項１２に記載の固相担体を保持してなるデバイス。
【請求項１４】
核酸の分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、請求項１２に記載の固相担体または請求項１３に記載のデバイス、固相担体に核酸を吸着させるための結合液、固相担体から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、固相担体から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査はゲノム解析技術の進歩により大きな注目を浴びてきている。特に、近年では個別化医療の普及や感染症領域におけるＰＯＣＴ（臨床現場即時検査）など遺伝子検査に関連する市場が飛躍的に伸長し、遺伝子検査をさらに普及させると期待されている。【０００３】
遺伝子検査を行なうには、初めに核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製することが必要である。従来、核酸を含む試料溶液から核酸を得る方法としては、フェノール・クロロホルム法という技術が知られていた。この方法はフェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの夾雑物を不溶化させ、核酸を分離精製する方法である。かかる従来技術は、大量の核酸を安価に分離精製できるが、操作が煩雑であり、核酸の回収率も低く、フェノール・クロロホルムが最終精製物にコンタミするという問題点があった。また、フェノール・クロロホルム自体も有毒であるため、作業環境に制限があるという問題点があった。【０００４】
一方、かかる問題点を解消すべく所謂Ｂｏｏｍ法という発明がなされた（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。この方法は、カオトロピック物質を利用してタンパク質、脂質などの夾雑物を可溶化し、核酸を固相担体に吸着させて回収後、核酸を再び溶解することで、核酸を分離精製する方法である。前記Ｂｏｏｍ法で用いられる固相担体としては、シリカフィルター（例えば、特許文献２、３参照）、シリカ磁性ビーズ（例えば、特許文献４〜６参照）などの様々な態様が知られている。【０００５】
シリカフィルターを用いることで、迅速・簡便に核酸を分離精製できるが、検体（特に、血液などの高粘性液体）によっては、工程中に固相担体の詰まりが発生するという問題点があった。また、固相担体を通液させるために、１０，０００Ｇ以上の高い遠心力が必要となるため、自動化が困難であり、かつ得られる核酸が物理的な外力により断片化し易いという問題点もあった。【０００６】
一方、シリカ磁性ビーズを用いることで、固相担体の詰まりの問題は解決でき、自動化も容易であるが、核酸の回収率が低下するという問題点があった。また、除去しきれないシリカ磁性粒子が最終精製物にコンタミするという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−２８９５９６号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１６７号公報
【特許文献３】特開２００６−２９６２２０号公報
【特許文献４】特開２０００−１２５８６０号公報
【特許文献５】特開２０００−３００２６２号公報
【特許文献６】特開２００４−３１７９２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒ．  Ｂｏｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９０，  ｖｏｌ．２８，  ｎｏ．３，  ｐ．４９５−５０３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、核酸の回収率と通液性に優れた核酸の分離精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとを含む組成物から抄紙される固相担体（例えばシリカフィルター）を用いると、核酸の回収率を上げるために高目付けにせざるを得ず、高目付けにすると通液性が低下する、つまり核酸の回収率と通液性はトレードオフの関係にあることを見出した。そこで本発明者らは、（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体を用いることで、低目付けでも核酸の回収率を保持できる、つまり核酸の回収率と通液性の両立が可能であることを見出し、本発明に至った。【００１１】
また、本発明者らは、（３）有機バインダーとして、水系のろ過に一般的に用いられる親水性のバインダーを用いると、核酸の回収率が低下することを見出した。そこで本発明者らは、（３）有機バインダーとしてポリエチレン系ポリマーまたはポリエステル系ポリマー等の疎水性バインダーを用いることで、核酸の回収率がさらに向上することを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．少なくとも（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合して混合液を得る工程
（Ｂ）前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる工程
（Ｃ）固相担体から核酸以外の成分を洗浄する工程
（Ｄ）固相担体から核酸を脱着させる工程
２．前記有機バインダーがポリエチレン系ポリマーまたはポリエステル系ポリマーを含むものである、１に記載の核酸の分離精製方法。
３．前記多孔性無機粒子が多孔性シリカ粒子である、１または２に記載の核酸の分離精製方法。
４．前記多孔性無機粒子の固相担体に含まれる量が１〜６０重量％である、１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
５．前記多孔性無機粒子の形状が球状である、１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６．前記多孔性無機粒子の平均粒子径が１〜５０μｍである、１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７．前記有機または無機繊維がセルロース繊維またはガラス繊維である、１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
８．前記固相担体の目付けが、２５〜２００ｇ／ｍ２である、１〜７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
９．前記固相担体の厚みが１００〜５００μｍである、１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１０．前記固相担体が湿式抄紙法により製造されたものである、１〜９のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１１．前記核酸を含む試料溶液が血液である、１〜１０のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１２．核酸の分離精製方法に用いるための固相担体であって、（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）疎水性の有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体。
１３．核酸の分離精製方法に用いるためのデバイスであって、１２に記載の固相担体を保持しているデバイス。
１４．核酸の分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、１２に記載の固相担体または１３に記載のデバイス、固相担体に核酸を吸着させるための結合液、固相担体から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、固相担体から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、核酸を分離精製する方法において、高い核酸の回収率と高い固相担体の通液性を両立することができる。本発明を用いれば、血液などの粘性の高い生体由来物質からも低い遠心力により核酸を分離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の核酸分離精製方法の適用例の一つである（スピンカラムの形態）。
【図２】本発明の核酸分離精製方法の適用例の一つである（シリンジの形態）。
【図３】本発明の核酸分離精製方法に用いる固相担体の例である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳述する。
【００１６】
（分離精製の対象となる核酸）
本発明における分離精製の対象となる核酸の種類としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、１本鎖核酸または２本鎖核酸、直鎖状核酸または環状核酸が挙げられる。これらの中で、本発明は物理的な外力により極めて分解しやすいＲＮＡの分離精製に用いることができ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの分離精製に好適に用いられる。
【００１７】
（核酸の分離精製原理）
本発明における核酸の分離精製の原理は、ＢＯＯＭ法（非特許文献１）として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で、核酸の固相担体への特異的な結合、洗浄および溶出により核酸を分離精製する。
具体的には、
工程（Ａ）：混合工程において核酸を含む試料と結合液とを混合し、
工程（Ｂ）：結合工程において前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させ、
工程（Ｃ）：洗浄工程において洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分を洗浄し、
工程（Ｄ）：溶出工程において溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させることで、核酸を含む試料から核酸を分離精製することができる。
【００１８】
前記工程（Ｂ）〜（Ｄ）では、核酸の吸着・洗浄・溶出のため、混合液・洗浄液・溶出液などの各種溶液に物理的な外力を加えて固相担体を通液させる。例えば、代表的な核酸抽出キットであるＱＩＡａｍｐ、ＲＮｅａｓｙ（共にキアゲン社）では、底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に各種溶液を添加し、遠心分離機（例えば、８０００〜１５０００Ｇ）により上から下へ通液させる方法が用いられる。
【００１９】
本発明の核酸分離精製方法を用いることにより、弱い外力をかけるだけで核酸の分離精製を行うことができる。例えば、外力が遠心力の場合、その程度は特に限定されないが、４０００Ｇ以下の遠心力により核酸の分離精製を行うことが好ましく、３０００Ｇ以下がより好ましく、２０００Ｇ以下がさらに好ましい。４０００Ｇ超の遠心分離操作を行おうとすると、一般的に大型の遠心分離機が必要となり、迅速・簡便な核酸抽出を行なうのが困難となる。また、物理的なダメージにより、核酸が分解する恐れもある。
具体的には、４０００Ｇ以下の遠心力で遠心分離を行うことができる卓上小型遠心機（例えば、チビタン（登録商標））の使用や、シリンジ、ピペットなどの空気の圧力変化により吸引および吐出を行なう装置の使用が好ましい。前記方法において遠心力の下限は特に限定されないが、１０００Ｇ以上が好ましい。
【００２０】
前記固相担体を固定する容器としては、遠心機を使用する場合はスピンカラムが、シリンジ、ピペットなどの空気の圧力変化により吸引および吐出を行なう装置を使用する場合は、ピペットチップもしくはそれに類似する形状の容器（例えば、ルアーフィッティング）が適している。ピペットチップの形状は、特に限定されないが、一般的に利用されている円錐形で先が切断されており筒状のチップが好ましい。当然ながら、ピペットチップに限らず、吸引吐出機構とのかん合部に密着できる形状であれば良く、所望の形状が選択できる。
【００２１】
本発明において４０００Ｇ以下の遠心力で核酸の分離精製を行うためには、固相担体として少なくとも（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体を用いる。一般的に固相担体として用いられるシリカフィルターを用いると、核酸の回収率には優れるものの、４０００Ｇを超える遠心力での遠心工程が必要不可欠となり、大型の遠心分離機が必要となる。また核酸を含む試料の種類によってはフィルターに詰まりが発生する恐れがある。本発明においては、抄紙が好ましい。
【００２２】
前記多孔性無機粒子の組成は、核酸を吸着し得るものであれば特に限定されず、例えばシリカ、ガラス、アルミナ、ゼオライト、粘土鉱物などが挙げられる。これらの中でも、シリカが好ましく、多孔性シリカ粒子がより好ましい。
【００２３】
前記多孔性無機粒子の固相担体に含まれる量の下限は１重量％であることが好ましく、２重量％がより好ましく、３重量％がさらに好ましい。一方、上限は６０重量％であることが好ましく、４０重量％がより好ましく、２０重量％がさらに好ましい。固相担体に含まれる量が１重量％より少ないと、核酸の回収率が低下する恐れがある。一方、固相担体に含まれる量が６０重量％より多いと固相担体の強度が低下し、核酸の分離精製中に破れが発生する恐れがある。また、通液性が低下し、詰まりが発生する恐れがある。
【００２４】
前記多孔性無機粒子の形状は、球状であることが好ましい。形状が破砕状やシート状であると、核酸の回収率が低下する恐れがある。また、通液性が低下し、詰まりが発生する恐れがある。
【００２５】
前記多孔性無機粒子の平均粒子径の下限は、１μｍであることが好ましく、２μｍがより好ましく、３μｍがさらに好ましい。一方、上限は５０μｍであることが好ましく、３０μｍがより好ましく、２０μｍがさらに好ましい。平均粒子径が１μｍより小さいと、通液性が低下し、詰まりが発生する恐れがある。一方、平均粒子径が５０μｍより大きいと、固相担体の強度が著しく低下し、核酸の分離精製中に破れが発生する恐れがある。
【００２６】
前記有機または無機繊維は特に限定されないが、例えばセルロースなどのような有機繊維またはガラスなどのような無機繊維からなることが好ましく、ガラス繊維がより好ましい。
【００２７】
前記有機バインダーは特に限定されないが、例えばポリエチレン系ポリマーまたはポリエステル系ポリマー等の疎水性バインダーであることが好ましく、ポリエステル系ポリマーを含むバインダーであることがより好ましい。
【００２８】
前記固相担体の目付けは特に限定されないが、その下限は２５ｇ／ｍ２であることが好ましく、５０ｇ／ｍ２がより好ましい。一方、上限は２００ｇ／ｍ２であることが好ましく、１５０ｇ／ｍ２がより好ましい。目付けが２５ｇ／ｍ２より小さいと、固相担体の強度が低下し、核酸の分離精製中に破れが発生する恐れがある。また、核酸の回収率が低下する恐れがある。一方、目付けが２００ｇ／ｍ２より大きいと、通液性が低下し、詰まりが発生する恐れがある。なお、固相担体は複数枚重ねて使用してもよく、複数枚重ねた際は全体の目付けを前記固相担体の目付けとする。
【００２９】
前記固相担体の厚みは特に限定されないが、その下限は１００μｍであることが好ましく、２００μｍがより好ましい。一方、上限は５００μｍであることが好ましく、４００μｍがより好ましい。厚みが１００μｍより薄いと、固相担体の強度が低下し、核酸の分離精製中に破れが発生する恐れがある。また、核酸の回収率が低下する恐れがある。一方、厚みが５００μｍより厚いと、通液性が低下し、詰まりが発生する恐れがある。なお、固相担体は複数枚重ねて使用してもよく、複数枚重ねた際は全体の厚みを前記固相担体の厚みとする。
【００３０】
前記担体の形態の一例を図３に示す。図３では、黒丸で示される「多孔性無機粒子」と、線で示される「有機または無機繊維」とが、有機バインダーで結合した態様を例示している。「多孔性無機粒子」および「有機または無機繊維」等の密度は、製造時のそれぞれの濃度を適宜設定することにより調整することが可能である。したがって当然であるが、前記担体の形態は図３に示されるものに限定されない。
【００３１】
前記固相担体を製造する方法は特に限定されないが、例えば湿式抄紙法により製造することが好ましい。
【００３２】
以下、各工程について詳述する。
【００３３】
（Ａ：混合工程）
本発明の工程（Ａ）：混合工程は、核酸を含む試料と結合液とを混合する工程である。
【００３４】
本発明の混合工程で用いる核酸を含む試料としては、特に限定されず、例えば血液、血清、血球、髄液、喀痰、尿、胃液、鼻汁、糞便、精液、唾液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液などの生体試料が挙げられる。また、培養した組織、細胞、細菌、ウイルスなども挙げられる。さらには、別な方法で精製した核酸についても該当する。これらの中でも、本発明は比較的カラム詰まりの発生しやすい血液からの核酸の分離精製に用いるのが好ましい。
【００３５】
本発明の混合工程で用いる結合液としては、カオトロピック物質を含む水溶液であることが好ましい。ここでカオトロピック物質とは、水溶液中でカオトロピックイオンを生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用（カオトロピック効果）を有している物質のことである。前記カオトロピック物質としては、核酸の固相担体への吸着に寄与するものであれば特に限定されないが、例えばグアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン硫酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素が挙げられる。これらの中でも、カオトロピック効果の強さからグアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩が好ましい。また、前記カオトロピック物質は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記カオトロピック物質濃度は、十分なカオトロピック効果が得られれば特に限定されないが、グアニジンチオシアン酸塩の場合は１．０〜６．０Ｍ、グアニジン塩酸塩の場合は１．０〜８．０Ｍであることが好ましい。グアニジンチオシアン酸塩の濃度が１．０Ｍより少ないと、十分なカオトロピック効果が得られない恐れがある。一方、グアニジンチオシアン酸塩の濃度が６．０Ｍより多いと保存中にグアニジンチオシアン酸塩が析出する恐れがある。同様にグアニジン塩酸塩の濃度が１．０Ｍより少ないと、十分なカオトロピック効果が得られない恐れがある。一方、グアニジン塩酸塩の濃度８．０Ｍより多いと保存中にグアニジン塩酸塩が析出する恐れがある。
【００３６】
前記結合液には、核酸と固相担体との結合を補助するために、アルコール類を含有させるのが好ましい。前記アルコール類としては、前記効果が得られれば、いかなる種類のアルコールを用いてもよいが、エタノール、イソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。また、前記アルコールは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記アルコール濃度は、特に限定されないが、１０〜７０％が好ましく、１０〜５０％がより好ましい。アルコール濃度が１０％より少ないと、十分な結合補助効果が得られない恐れがある。一方、アルコール濃度が７０％より多くすると、核酸と固相担体との結合性はかえって減少する。
【００３７】
前記結合液には、ｐＨ調整や核酸の吸着効果向上のために緩衝剤を含有させるのが好ましい。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）などが挙げられる。これらの中でも、ｐＨ５．０〜９．０（好ましくはｐＨ６．０〜８．０）において充分な緩衝能力を有するなどの理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましい。また、前記緩衝剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、１０〜１００ｍＭ程度が好ましい。
【００３８】
前記結合液には、細胞膜の破壊または細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。前記界面活性剤としては、前記効果が得られれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよく、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記界面活性剤濃度は、特に限定されないが、０．１〜２０％であることが好ましい。界面活性剤濃度が０．１％より少ないと、十分な細胞膜の破壊またはタンパク質の変性効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度を２０％より多くしても、効果の向上は見られない。
【００３９】
また、前記結合液には、核酸を含む試料中に含まれるタンパク質、特にヌクレアーゼを変性させる目的で、還元剤を含有させてもよい。前記還元剤としては、前記効果が得られれば、いかなる種類の還元剤を用いてもよく、例えば水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛などの電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物などが挙げられる。これらの中でも、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが好ましい。前記還元剤濃度は、特に限定されないが、１．０〜１００ｍＭであることが好ましい。還元剤濃度が１．０ｍＭより少ないと、十分なタンパク質の変性効果が得られない恐れがある。一方、還元剤濃度が１００ｍＭより多くしても、効果の向上は見られない。
【００４０】
前記核酸を含む試料と結合液とを混合する方法は、特に限定されず、例えばボルテックスミキサーによる混和、転倒混和、ピペッティングなどが挙げられる。
【００４１】
（Ｂ：結合工程）
本発明の工程（Ｂ）：結合工程は、前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる工程である。
【００４２】
前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる方法は、特に限定されず、例えば
（１）底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に混合液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
（２）ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、混合液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
（３）内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、混合液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
が挙げられる。
なお、本発明の核酸分離精製方法において、通液方法は特に限定されない。例えば、重力を利用して液体を上から下へ流すことができる。あるいは、遠心分離機で遠心力をかけたり、シリンジ・ピペットなどの空気の圧力変化により吸引吐出を行うなど、何らかの外力をかけることによっても行うことができる。
【００４３】
（Ｃ：洗浄工程）
本発明の工程（Ｃ）：洗浄工程は、洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分（例えば、タンパク質、脂質など）を洗浄する工程である。なお、洗浄工程は、１回の洗浄で済ませてもよいし、複数回洗浄を繰り返してもよい。
【００４４】
本発明の洗浄工程で用いる洗浄液としては、固相担体に吸着している核酸を脱離させず、かつ核酸以外の成分を脱離させるものであれば、特に限定されないが、アルコール類を含む水溶液であることが好ましい。前記アルコール類としては、前記効果が得られれば、いかなる種類のアルコールを用いてもよいが、エタノール、イソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。また、前記アルコールは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記アルコール濃度は、特に限定されないが、２０〜１００％が好ましく、３０〜９０％がより好ましい。アルコール濃度が２０％より少ないと、核酸が脱離する恐れがある。
【００４５】
前記洗浄液には、ｐＨ調整や核酸の吸着効果向上のために緩衝剤を含有させるのが好ましい。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）などが挙げられる。これらの中でも、ｐＨ５．０〜９．０（好ましくはｐＨ６．０〜８．０）において充分な緩衝能力を有するなどの理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましい。また、前記緩衝剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記緩衝剤濃度は、特に限定されないが、１０〜１００ｍＭ程度が好ましい。さらに、最終精製物へのコンタミを低減する目的から、洗浄液中の緩衝剤濃度は結合液中の緩衝剤濃度よりも低いことがより好ましい。
【００４６】
前記洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法は、特に限定されず、例えば
（１）底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に洗浄液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
（２）ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、洗浄液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
（３）内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、洗浄液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
が挙げられる。
【００４７】
前記洗浄工程後に、必要に応じて、固相担体に残留した洗浄液を、遠心分離や加熱により除去することができる。加熱温度は５０〜９０℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。加熱温度が５０℃より低いと、十分な洗浄液の除去効果が得られない。一方、加熱温度が９０℃より高いと、核酸が分解・変性する恐れがある。
【００４８】
（Ｄ：溶出工程）
本発明の工程（Ｄ）：溶出工程は、溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させる工程である。
【００４９】
本発明の溶出工程で用いる溶出液としては、固相担体に吸着している核酸を脱離させ、かつ核酸抽出後の反応、例えば逆転写、ＰＣＲに代表される核酸増幅反応を阻害しない溶液組成であれば、特に限定されないが、水、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液［１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］が好ましい。
【００５０】
前記溶出液は、溶出効率を上げるために必要に応じて加熱することができる。加熱温度は５０〜９０℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。加熱温度が５０℃より低いと、十分な溶出率向上効果が得られない。一方、加熱温度が９０℃より高いと、核酸が分解・変性する恐れがある。
【００５１】
前記溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させる方法は、特に限定されず、例えば
（１）底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に溶出液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
（２）ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、溶出液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
（３）内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、溶出液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
が挙げられる。
【００５２】
本発明はまた、前記の核酸分離精製方法に用いるための固相担体であって、（１）多孔性無機粒子と（２）有機または無機繊維と（３）有機バインダーとからなる組成物を含む固相担体である。
【００５３】
本発明はまた、前記の核酸分離精製方法に用いるためのデバイスであって、前記の固相担体を保持しているデバイスである。前記デバイスの形態は特に限定されないが、スピンカラムやシリンジが好ましい。その具体的な形態は後述の実施例などで例示される。
【００５４】
本発明はまた、前記の核酸分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、前記の固相担体または前記のデバイス、固相担体に核酸を吸着させるための結合液、固相担体から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、固相担体から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キットである。本発明のキットにおいて、前記の固相担体、結合液、洗浄液および溶出液以外の構成は特に限定されない。たとえばＢｏｏｍ法で用いられる公知の構成を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。
［各種評価法］【００５６】
＜１．多孔性無機粒子の含有率＞
下記式（１）にて算出した。
含有率（％）＝（多孔性無機粒子の重量／固相担体の重量）×１００      （１）【００５７】
＜２．多孔性無機粒子の形状＞
各粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し、［１］球また楕円体である球状  ［２］立方体または直方体であるシート状  ［３］その他のランダムな形状である破砕状  に分類した。【００５８】
＜３．多孔性無機粒子の平均粒子径＞
各粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し、１００個の粒子の直径を測定し、平均直径（平均粒子径）を算出した。【００５９】
＜４．固相担体の目付け＞
２００ｍｍ×２００ｍｍの固相担体を、乾燥機で８０℃×３０分加熱し、デシケータ（乾燥剤：シリカゲル）で室温×３０分静置した。その後、重量を測定し、１ｍ２当りの重量（目付け）に換算した。【００６０】
＜５．固相担体の厚み＞
２００ｍｍ×２００ｍｍの固相担体の１０箇所で、荷重６８６Ｐａの圧力を加えた時の厚みを測定し、平均厚みを算出した。【００６１】
＜６．核酸の濃度：１０ｎｇ／μＬ以上＞
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が１０ｎｇ／μＬ以上の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの場合
装置名  ：  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ（登録商標）２０００
測定モード  ：  核酸−ＲＮＡ
試料液量  ：  ２μＬ
Ｂｌａｎｋ  ：  水
（２）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの場合
装置名  ：  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ（登録商標）２０００
測定モード  ：  核酸−ＤＮＡ
試料液量  ：  ２μＬ
Ｂｌａｎｋ  ：  水【００６２】
＜７．核酸の濃度：１０ｎｇ／μＬ以下＞
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が１０ｎｇ／μＬ以下の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの場合
装置名  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０
測定キット  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）
ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ
容器  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）
ａｓｓａｙ  ｔｕｂｅｓ
測定モード  ：  ＲＮＡ−ＲＮＡ
試料液量  ：  １０μＬ
Ｂｌａｎｋ  ：  水
（２）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの場合
装置名  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０
測定キット  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）
ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ
容器  ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）  
ａｓｓａｙ  ｔｕｂｅｓ
測定モード  ：  ＤＮＡ−ｄｓＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
試料液量  ：  １０μＬ
Ｂｌａｎｋ  ：  水【００６３】
＜８．ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度（ＲＩＮ値）＞
測定対象のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液について、下記条件でｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度（ＲＩＮ値）を測定した。
装置名  ：  アジレント社製  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ
測定キット  ：  アジレント社製  ＨＳ  ＲＮＡ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅ、
Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｌａｄｄｅｒ
試料液量  ：  ２μＬ【００６４】
［実施例１］
多孔性シリカ粒子を５重量％と、ガラス繊維を６６．５重量％と、ポリエステルバインダーを２８．５重量％の比率で、湿式抄紙装置（東洋紡エンジニアリング社製）を使い固相担体１を作成した。得られた固相担体１の詳細を表１に示す。
次いで、固相担体１をベルトポンチＴＰＯ−７０（トラスコ社製）にて７ｍｍφの大きさに打ち抜いた。その後、エコノスピン（登録商標）ＩＩａ（ジーンデザイン社製）のシリカメンブレン、およびＯ−リングをシリカメンブレンフィルターハウジングから取り除き、シリカメンブレンの代わりに固相担体１を２枚シリカメンブレンフィルターハウジング内に配し、Ｏ−リングで固定し、スピンカラム１（図１参照）を作成した。
次いで、固相担体１をベルトポンチＴＰＯ−４０（トラスコ社製）にて４ｍｍφの大きさに打ち抜いた。その後、テルモシリンジ  ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端に、固相担体１を２枚介してメスルアーフィッティング  ＶＰＲＦ２０６（アイシス社製）を接続し、シリンジ１（図２参照）を作成した。【００６５】
［実施例２〜５］
多孔性シリカ粒子、ガラス繊維、ポリエステルバインダーの配合比率が異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体２〜５を作成した。得られた固相担体２〜５の詳細を表１に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム２〜５、シリンジ２〜５を作成した。【００６６】
［実施例６、７］
多孔性シリカ粒子の平均粒子径が異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体６、７を作成した。得られた固相担体６、７の詳細を表１に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム６、７、シリンジ６、７を作成した。【００６７】
【表１】
2016052386.tif 000002
【００６８】
［実施例８、９］
多孔性シリカ粒子の形状が異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体８、９を作成した。得られた固相担体８、９の詳細を表２に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム８、９、シリンジ８、９を作成した。【００６９】
［実施例１０］
ガラス繊維の代わりにセルロース繊維を用いる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１０を作成した。得られた固相担体１０の詳細を表２に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１０、シリンジ１０を作成した。【００７０】
［実施例１１、１２］
ポリエステルバインダーの代わりにポリエチレンバインダー、ポリプロピレンバインダーを用いる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１１、１２を作成した。得られた固相担体１１、１２の詳細を表２に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１１、１２、シリンジ１１、１２を作成した。【００７１】
［実施例１３、１４］
固相担持の目付け、厚みが異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１３、１４を作成した。得られた固相担体１３、１４の詳細を表２に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１３、１４、シリンジ１３、１４を作成した。【００７２】
【表２】
2016052386.tif 000003
【００７３】
［比較例１、２］
多孔性シリカ粒子、ガラス繊維、ポリエステルバインダーの配合比率が異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１５、１６を作成した。得られた固相担体１５、１６の詳細を表３に示す。固相担体１６は、品位が悪く、また非常に脆いため、後の評価を行なうことができなかった。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１５、シリンジ１５を作成した。【００７４】
［比較例３］
多孔性シリカ粒子の平均粒子径が異なる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１７を作成した。得られた固相担体１７の詳細を表３に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１７、シリンジ１７を作成した。【００７５】
［比較例４］
ポリエステルバインダーの代わりにＰＶＡバインダーを用いる以外は、実施例１と同様にして、固相担体１８を作成した。得られた固相担体１８の詳細を表３に示す。
また、実施例１と同様にして、スピンカラム１８、シリンジ１８を作成した。【００７６】
【表３】
2016052386.tif 000004
【００７７】
［比較例５〜７］
市販品である、エコノスピン（登録商標）ＩＩａ（ジーンデザイン社製）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のカラムをそのまま用いた。【００７８】
＜固相担体の通液性＞
前記スピンカラム１〜１８を用いて、固相担体の通液性を評価した。
Ｂｏｖｉｎｅ  Ｂｌｏｏｄ（フナコシ社製）６００μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０７（トミー精工社製）にて１，０００〜２０，０００Ｇでそれぞれ１分間遠心し、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｂｌｏｏｄ（フナコシ社製）がスピンカラム中の固相担体を通液するために必要な最小の遠心力を評価した。得られた最小通液遠心力を表４に示す。【００７９】
【表４】
2016052386.tif 000005
【００８０】
＜ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度：スピンカラム法＞
前記スピンカラム１〜１８を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度の評価を行なった。試料溶液として、ＨｅＬａ Ｓ３細胞よりセパゾール（登録商標）ＲＮＡＩ  ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を用いてプロトコール通りに分離精製した１００ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液（ＲＩＮ値＝９．９）１００μＬと、結合液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ３５０μＬとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  ２５０μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、スピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ  ５００μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）３０μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度を表５〜７に示す。なお、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率は、下記式（２）より算出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率（％）＝｛精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量３０（μＬ）｝÷｛投入ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度１００（ｎｇ／μＬ）×投入ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ液量１００（μＬ）｝×１００      （２）【００８１】
次いで、前記スピンカラム１〜１８を用いて健常者血液からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度の評価を行なった。試料溶液として、健常者血液（全血）２００μＬと、結合液としてＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  ２００μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、スピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＷａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒＩ  ７００μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＷａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ  ５００μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）３０μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機  ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度を表５〜７に示す。なお、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率は下記式（３）より算出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率（％）＝｛精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量３０（μＬ）｝÷｛単位血液量当りのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量１．５（ｎｇ／μＬ）×投入血液量２００（μＬ）｝×１００      （３）【００８２】
＜ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収率、ＲＮＡ分解度：シリンジ法＞
前記シリンジ１〜１８を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度の評価を行なった。試料溶液として、ＨｅＬａ Ｓ３細胞よりセパゾール（登録商標）ＲＮＡＩ  ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を用いてプロトコール通りに分離精製した１００ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液（ＲＩＮ値＝９．９）５０μＬと、結合液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  １７５μＬとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  １２５μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ  ５００μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）５０μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度を表５〜７に示す。なお、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率は下記式（４）より算出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率（％）＝｛精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量  ５０（μＬ）｝÷｛投入ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度  １００（ｎｇ／μＬ）×投入ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ液量  ５０（μＬ）｝×１００      （４）【００８３】
次いで、前記シリンジ１〜１８を用いて健常者血液からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度の評価を行なった。試料溶液として、健常者血液（全血）３０μＬと、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）７０μＬと、結合液としてＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μＬとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  １００μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＷａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒＩ  ７００μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製）のＷａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ  ５００μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）５０μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分解度を表５〜７に示す。なお、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率は下記式（５）より算出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ回収率（％）＝｛精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量５０（μＬ）｝÷｛単位血液量当りのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量１．５（ｎｇ／μＬ）×投入血液量１００（μＬ）｝×１００      （５）【００８４】
＜Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの回収率：スピンカラム法＞
前記スピンカラム１〜１８を用いてＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ水溶液からのＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率の評価を行なった。試料溶液として、１００ｎｇ／μＬのＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ロシュ社製）１００μＬと、結合液としてジーンキューブ専用前処理セット（東洋紡社製）の溶解吸着液３５０μＬとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  ２５０μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、スピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてジーンキューブ専用前処理セット（東洋紡社製）の洗浄液５００μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）３０μＬをスピンカラム１〜１８にアプライし、小型微量遠心機ＰＭＣ−０６０（トミー精工社製）にて１９３０Ｇで１分間遠心し、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ水溶液を得た。得られたＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率を表５〜７に示す。なお、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率は下記式（６）より算出した。
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率（％）＝｛精製Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量３０（μＬ）｝÷｛投入Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ濃度１００（ｎｇ／μＬ）×投入Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ液量１００（μＬ）｝×１００      （６）【００８５】
＜Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの回収率：シリンジ法＞
前記シリンジ１〜１８を用いてＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ水溶液からのＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率の評価を行なった。試料溶液として、１００ｎｇ／μＬのＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ロシュ社製）５０μＬと、結合液としてジーンキューブ専用前処理セット（東洋紡社製）の溶解吸着液１７５μＬとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ  １２５μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてジーンキューブ専用前処理セット（東洋紡社製）の洗浄液５００μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄する操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）５０μＬをシリンジ１〜１８にて吸引吐出を１０回繰り返し、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ水溶液を得た。得られたＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率を表５〜７に示す。なお、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率は下記式（７）より算出した。
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ回収率（％）＝｛精製Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量５０（μＬ）｝÷｛投入Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ濃度１００（ｎｇ／μＬ）×投入Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ液量５０（μＬ）｝×１００      （７）【００８６】
【表５】
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【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、高い核酸の回収率と高い固相担体の通液性を両立することができ、より迅速・簡便な核酸抽出可能となり、また核酸の分離精製工程の自動化も非常に容易であることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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