(57)【要約】  走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダを、(1) 液体を保持する容器と、(2)容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有する上蓋であり、スリットは、容器と上蓋の間を液体で満たしたとき、試料の上面に、試料の上面と上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する上蓋とによって構成する。
2016103338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を保持する容器と、
前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、前記試料の載置位置の上方に細長いスリットを有する上蓋であり、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する、上蓋と、
を有する走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項２】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記膜厚は、パルス発振レーザー光で前記液体中の試料を照射した場合に、前記試料に非線形光学シグナルが発生する膜厚である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項３】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記容器は、前記液体の注入口と回収口を有し、
上記上蓋には、前記スリットが前記液体の循環方向に対して平行に形成されている
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項４】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記容器は、前記液体の注入口と回収口を有し、
上記上蓋には、前記スリットが前記液体の循環方向に対して直交するように形成されている
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項５】
請求項４に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記液体の流れを制限して、前記液体を前記試料の上面に誘導する仕切りを更に有する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項６】
液体を保持する容器と、前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有し、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成する、上蓋とを有する試料ホルダと、
探針と、
前記探針を上下方向に変位させる振動子と、
前記探針により計測する前記試料の領域にパルス発振レーザー光を照射するパルス発振レーザー光源と、
前記パルス発振レーザー光の照射により前記試料に発生する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、
前記試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、
前記振動子と、前記パルス発振レーザー光源と、前記走査機構を制御する制御装置と、
を有する走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記薄膜の膜厚をｒ×１００μｍとするとき、前記パルス発振レーザー光の単位面積当たり単位時間当たりのエネルギー密度は、６０〜４８０×３ｒ−１μＪ／ｍｍ２／ｐｓである
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダの下部に、前記試料の高さ位置を調整する試料位置制御機構を更に有し、
前記制御装置は、前記フィルター付検出器の計測結果に基づいて前記試料位置制御機構を制御して前記試料の高さ位置を調整し、前記薄膜の膜厚を調整する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、ユーザインターフェースを通じて受け付けた、前記試料と前記液体の界面における表面張力と、前記試料ホルダの前記上蓋と前記液体の界面における表面張力に基づいて、パルス発振レーザー光で前記液体中の試料を照射した場合に、前記試料に非線形光学シグナルを発生させる前記試料ホルダの前記上蓋と前記試料の上面との距離、及び、前記スリットの幅を計算して前記ユーザインターフェースに表示する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルス発振レーザー光源は、固定波長のパルス発振レーザー光を照射する第一の光源と、可変波長のパルス発振レーザー光を照射する第二の光源を有し、
前記前記フィルター付検出器は、前記出力光として和周波光を検出する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は、前記パルス発振レーザー光の第二高調波である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は、前記パルス発振レーザー光のラマン散乱光である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記振動子は、探針を先端に取り付けたカンチレバーと、前記カンチレバーを上下方向に変位させる励振装置で構成される、
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１４】
液体を保持する容器と、前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有し、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する、上蓋とを有する試料ホルダと、
探針と、
前記探針を上下方向に変位させる振動子と、
前記探針に交流電圧と直流電圧を印加する探針用電源と、
前記探針に印加される力を検出する検出部と、
前記試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、
前記振動子と、前記探針用電源と、前記走査機構を制御する制御装置と、
を有する走査プローブ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査プローブ顕微鏡及びその試料ホルダに関する。
【背景技術】
【０００２】
培養液中における生体基板材料への細胞の接着やその後の生体反応（伸展、分化など）を計測、評価又は制御する場合、生体分子、生体組織、生体基板材料などの水和現象が重要である。水和構造は、水を主成分とする培養液中における試料と培養液との界面において、(1) 試料表面と水分子の相互作用と、(2) 水分子間での水素結合を含む相互作用とから形成される三次元構造を示している。人工血管の内壁と赤血球との癒着などに代表されるいわゆる生体適合性は、この水和構造と密接に関連していると考えられている。さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などは、培養液中における生体分子、生体組織、生体基板材料などの生体反応に関し、特に重要な特性である。【０００３】
従来、培養液中における生体分子、生体組織、生体基板材料などの試料と培養液との界面の観察又は計測には、ラマン分光法、第二高調波発生法、和周波発生（SFG：Sum Frequency Ｇeneration）法などの線形又は非線形の光学顕微鏡が用いられている。和周波発生法は、試料に含まれる分子の分子振動による赤外入射光の散乱（ラマン散乱）と可視入射光の非線形光学現象により、試料の空間対称性のない領域からの散乱光強度を計測するので、特に、試料と培養液との界面における水和構造に関する水分子の配列構造を計測することができる。非線形光学顕微鏡には、例えばプローブとターゲットとの間の相互作用を、界面付近の水分子、溶媒分子、又は、標識物質による第二高調波光又は和周波光によって表面選択的に観察する非線形光学法を用いるものがある。しかし、これら光学顕微鏡における空間分解能は１００ｎｍよりも大きく、典型的には１μｍ程度である。【０００４】
一方、走査プローブ顕微鏡は、原子間力顕微鏡（AFM：Atomic Force Microscopy）を基礎としている。走査プローブ顕微鏡の一例には、走査ケルビンプローブ顕微鏡がある。走査ケルビンプローブ顕微鏡は、導電性探針を持ったカンチレバーと試料との間に働く静電気力をカンチレバーの撓みとして検出しながら、探針を試料表面上で走査することにより静電気力分布をマッピングする手法である。探針には静電気力以外に原子間力等も加わっており、静電気力を他の相互作用から分離する必要がある。そのために、まず、カンチレバーを振動させ、探針と試料の接触時に働く原子間力により減少する振動振幅を一定に保つように探針と試料間との距離を調整する。これにより試料表面の高さ方向の位置が決定され、そこから一定の距離だけ探針を試料表面から離した状態で、カンチレバーの振動の位相変化から長距離力である静電気力を検出する。走査プローブ顕微鏡では、探針をプローブと呼ぶことがある。【０００５】
走査プローブ顕微鏡では、一般的に、凹凸計測で１ｎｍ程度の空間分解能を期待でき、静電気力及び光計測で１０ｎｍ程度の空間分解能を期待できる。しかし、探針と試料との相互作用領域が探針先端部の直径程度に限定されるため、特に非線形光学法のようにシグナルが弱い物理量を用いる走査プローブ顕微鏡の実現は一般的に困難である。【０００６】
この弱いシグナルを補償してラマン分光法を走査プローブ顕微鏡で実現するために、探針による表面増強ラマン散乱を用いる探針増強ラマン検出法に関する様々な技術が提案されている。その一つとして、例えば試料表面に設けたホルダカバー１１とスペーサ１５により、試料台に保持する液体の深さを振動子先端に取り付けた探針の長さよりも小さくし、粘性抵抗によるＱ値の低下を抑制するプローブ顕微鏡が提案されている（特許文献１）。また、振動子の探針位置を周期的に変位させると共に、探針と試料台の相対距離を制御してレーザーパルス光の照射に同期させ、探針増強検出効率を最大化するプローブ顕微鏡が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開第２０１４／０１６９５２号
【特許文献２】国際特許公開第２０１４／０３３８４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載のプローブ顕微鏡は、ホルダカバー１１の底面（培養液と試料表面との距離を規定する部分）に設けた開口部に計測用プローブを挿入し、所望の計測を行っている。しかし、ホルダカバー１１の底面が周囲の培養液の液面よりも下に位置するため、表面張力によって培養液が開口部から凸に盛り上がり、その分だけ、培養液に浸かる探針の長さが、ホルダカバー１１の底面と試料表面とで規定される距離よりも長くなる。また、特許文献２は、パルス発振レーザー光の照射を同期させるものであるが、短針の先端と試料表面の間にある培養液の深さの最適化による空間分解能の向上は考慮されていない。【０００９】
発明者らは、探針が浸かる試料表面の液体の深さを一段と小さくすることにより、液体中における試料と液体との界面における物理情報を一段と高い空間分解能で計測できる走査プローブ顕微鏡、及び、当該計測に適した試料ホルダの実現を検討した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
代表的な発明の一つは、(1) 液体を保持する容器と、(2)容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有する上蓋であり、スリットは、容器と上蓋の間を液体で満たしたとき、試料の上面に、試料の上面と上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する、上蓋と、を有する走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダである。【００１１】
代表的な発明の他の一つは、(1) 前記試料ホルダと、(2) 探針と、(3) 探針を上下方向に変位させる振動子と、(4) 探針により計測する試料の領域にパルス発振レーザー光を照射するパルス発振レーザー光源と、(5) パルス発振レーザー光の照射により試料に発生する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、(6) 試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、(7) 振動子と、パルス発振レーザー光源と、走査機構を制御する制御装置と、を有する走査プローブ顕微鏡である。【００１２】
また、代表的な発明の他の一つは、(1) 前記試料ホルダと、(2) 探針と、(3) 探針を上下方向に変位させる振動子と、(4) 探針に交流電圧と直流電圧を印加する探針用電源と、(5) 探針に印加される力を検出する検出部と、(6) 試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、(7) 振動子と、探針用電源と、走査機構を制御する制御装置と、を有する走査プローブ顕微鏡である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料の表面を覆う液体を一段と薄膜化でき、液体中における試料表面の物理情報を一段と高い空間分解能で計測することが可能となる。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１に係る走査プローブ顕微鏡（非線形光学走査プローブ顕微鏡）の概略構成図。
【図２Ａ】実施例１で使用する試料ホルダの概略構成図。
【図２Ｂ】実施例１で使用する試料ホルダの概略断面図。
【図３Ａ】培養液薄膜が十分薄く、非線形光シグナルが生じる場合のＳＦＧ光強度の周波数依存性を示すプロット図。
【図３Ｂ】培養液薄膜が厚く、非線形光シグナルが生じない場合のＳＦＧ光強度の周波数依存性を示すプロット図。
【図４Ａ】実施例２で使用する試料ホルダの概略構成図。
【図４Ｂ】実施例２で使用する試料ホルダの概略断面図。
【図５】実施例３に係る走査プローブ顕微鏡の概略構成図。
【図６】実施例７に係る走査プローブ顕微鏡（走査ケルビンプローブ顕微鏡）の概略構成図。
【図７】実施例９に係る走査プローブ顕微鏡（液中走査プローブ顕微鏡）の概略構成図。
【図８Ａ】実施例９で使用する試料ホルダの概略構成図。
【図８Ｂ】実施例９で使用する試料ホルダの概略断面図。
【図９】実施例１０に係る光熱励振法を用いた液中走査プローブ顕微鏡の概略構成図。
【図１０Ａ】実施例１１に係る走査プローブ顕微鏡（液中走査プローブ顕微鏡）の概略構成図。
【図１０Ｂ】実施例１１で使用する試料ホルダ及び試料位置制御機構の概略構成図。
【図１１】実施例１２に係るグラフィカル・ユーザ・インターフェースの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面に基づいて、本発明の実施例を説明する。なお、本発明の実施例は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
【００１６】
［概要］
以下では、試料表面に生じた近接場光（エバネッセント光）中に探針を配置し、探針からの近接場光と試料からの近接場光とによって試料表面近傍の光の電場強度を増幅することにより、微弱なシグナル光を補償する探針増強検出法の走査プローブ顕微鏡について説明する。もっとも、各実施例に係る走査プローブ顕微鏡は、和周波発生（ＳＦＧ）分光法、第二高調波発生（ＳＨＧ）分光法、その他の線形又は非線形光学分光法に応じて様々な形態を採る。
【００１７】
各実施例は、液体（培養液、水等）の表面張力、及び、液体に対する試料の濡れ性に応じて試料ホルダの上蓋に設けるスリット幅の最適化により、試料の表面に十分に薄い膜厚の液体薄膜を生成させ、液体を透過して試料に到達するパルス発振レーザー光の強度を一段と高めて強度の高い非線形光学シグナルを生じさせるという新たな知見に基づくものである。ここで、十分に薄い膜厚の液体薄膜は、上蓋のスリット部分で液体を凹状に窪ませることで生成させる点に特徴がある。
【００１８】
［実施例１］
図１に、本実施例に係る走査プローブ顕微鏡としての探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。探針増強走査和周波顕微鏡は、非線形光学走査プローブ顕微鏡の一種である。探針１は、振動子２に取り付けられており、振動子２によって主に上下方向に変位される。この変位により、探針１と試料３の相対位置（距離）が制御される。
【００１９】
探針１には、探針１が入射する光中に置かれたときに、先端近傍における近接場光強度が増幅又は集中する材料を選択する。例えばラマン分光法や和周波発生分光法などのようにラマン散乱を用いる場合、表面増強ラマン散乱を有効に用いることができる、金、銀、銅、アルミなどの金属又はそれらの化合物を探針１の材料として選択する。厚さ１〜２０ｎｍの金薄膜を蒸着したシリコン探針は、探針１の有力な候補である。
【００２０】
本実施例の振動子２は、試料３の表面に対して主に垂直方向に振動し、探針１と試料３の距離を３００ｎｍ以下に制御する。振動子２の固有振動数は、例えば２００ｋＨｚ〜２ＭＨｚである。例えば長手方向に伸縮する水晶振動子を振動子２に使用する。もっとも、原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡で一般的に使用されるチューニングフォーク型の水晶振動子、ピエゾ素子による振動子、カンチレバーにピエゾ素子を配置した振動子なども使用できる。
【００２１】
振動子２の振動により、探針１は、振動子２の固有振動数の近傍周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料３の表面に対して垂直方向に振動する。探針１と試料３との間の相互作用（力）により、振動子２に印加する電圧と振動子２の実際の振動振幅には位相差が生じる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針と試料との間の相互作用（力）が分かり、探針と試料間の距離が分かる。
【００２２】
この位相差を一定に保ったまま（探針と試料間の距離を一定に保ったまま）、試料３と探針１の相対位置を試料３の上面に対して垂直方向と試料３の上面に対して平面方向に走査すると、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸が計測できる。この走査には、走査機構３１を使用する。探針１と試料３の距離は、一般的には、最近接位置で０ｎｍ（接触）から１００ｎｍであるが、探針１を試料３の内部までめり込ませることも可能である。振動子２の振動振幅を一定量だけ減少させながら、試料３と探針１の相対位置を試料３の上面に対して垂直方向と試料３の上面に対して平面方向に走査する場合、探針１と試料３の距離を最近接位置で０ｎｍとすることもできる（タッピングモードＡＦＭ）。
【００２３】
探針１には、配線４を通じて探針用電源５が接続されている。この探針用電源５により、探針１と試料３の間に交流電圧と直流電圧を印加することができる。もっとも、本実施例では、探針１と試料３の間に電圧を印加しない。本実施例では、雲母基板上で培養したヒト肝癌由来細胞株（HepG2）の細胞をホルマリンで固定し、試料３として用いる。もっとも、試料３には、表面処理を行ったポリカーボネート、金などの金属基板、その他の基板を用いることもできる。
【００２４】
試料ホルダ１１は、培養液注入口１２と培養液回収口１３とを有している。培養液注入口１２と培養液回収口１３には培養液循環機構１９（例えば流路管）が接続されている。培養液循環機構１９には培養液循環制御機構２０が設けられており、培養液循環制御機構２０によって培養液１４の保持又は交換が実現される。培養液１４の代わりに、水、又は、溶媒を用いることもできる。本実施例では、培養液１４の代わりに水を使用する。
【００２５】
探針１が近接する試料３の領域近傍には、パルス発振レーザー発振器２７で発生されたパルス発振レーザー光、又は、互いに同期する複数のパルス発振レーザー光が入力される。パルス発振レーザー光の入射により、試料３から出力光２４が発生する。出力光２４は、フィルター付検出器２５によって受光される。フィルター付検出器２５は、出力光２４を周波数毎に分光し、各分光の強度を計測する。
【００２６】
本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光（第一のパルス発振レーザー光２２）と、波長が２．３〜１０ミクロンで可変の赤外パルス発振レーザー光（第二のパルス発振レーザー光２３）を同期させて試料３に入力する。この場合、フィルター付検出器２５は、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数と第二のパルス発振レーザー光２３の周波数の和の周波数（和周波）について出力光２４の強度を計測する。第二のパルス発振レーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波発生分光ができる。
【００２７】
本実施例では、第二のパルス発振レーザー光２３の波数が２９００カイザー程度に対応する和周波強度により試料３の細胞に含まれる炭化水素の配向を議論でき、また、波数が３１００カイザー程度に対応する和周波強度により、試料３の細胞や雲母基板と培養液１４との界面における水分子の配向を議論できる。
【００２８】
和周波発生（ＳＦＧ）では、入射する赤外光と同期して入射する可視光の強度の積に出力強度が比例することが知られている。また、第二高調波発生（ＳＨＧ）、及び、その他の２次非線形光学現象では、一般に、入射光の強度の２乗に出力強度が比例する。さらに、本実施例の実験により、和周波発生（ＳＦＧ）では、入射する赤外光と同期して入射する可視光の強度の積が一定値以上でないと出力強度が極端に減少する閾値が存在することが示唆されている。
【００２９】
従って、探針増強走査和周波顕微鏡においても、連続発振レーザー（CWレーザー）より、パルス当りの強度が強いパルス発振レーザーを使用する方が信号検出は圧倒的に有利になる。例えば探針増強ラマンに用いられている波長５３２ｎｍ、５０ｍWのCWレーザーの１秒当たりの光子数は１．３４×１０１７個になる。それに対し、ＳＦＧでは波長５３２ｎｍで０．１〜１ｍＪのパルス発振レーザーが用いられる。１ｍＪの場合のパルス発振レーザーのピーク出力を考えると、１パルス当りに含まれる光子数は２．６８×１０１５個となる。このパルス発振レーザーのパルス幅は２０-３０ｐｓである。このパルス時間（２０ｐｓ）に含まれる先のCWレーザー中の光子数は２．７×１０６個となり、CWレーザーに比べてパルス発振レーザーでは光子数が９桁以上多いことになる。よって、ＳＨＧ、ＳＦＧ等の非線形光学現象のマッピングにはパルス発振レーザーを用いる方が圧倒的に有利となる。
【００３０】
しかし、効率良くＳＦＧ又はＳＨＧ等の信号を検出するには、探針先端を試料表面に充分に近づけてラマン信号の増強効果を用いる必要がある。ラマン分光法では、探針と試料間距離が２６．５ｎｍ以上ではラマン信号の増強効果が現れないとされている。また、その距離が２６．５ｎｍ以下ではラマン信号の増強効果が指数関数的に増大することが示されている。例えば、探針１と試料３の表面間距離は、およそ２ｎｍ程度以下であるのが望ましい。探針１と試料３の表面間距離は振動子２によって制御され振動しているが、その振動周期は２００ｋＨｚ〜２ＭＨｚであり、一般的なパルス発振レーザーの発振周期５０Ｈｚ〜２００ｋＨｚとは必ずしも同期しない。
【００３１】
本実施例では、制御装置２６によって探針１の振動振幅を１ｎｍ以下に制御することにより、ラマン信号の増強効果を実現する。このラマン信号の増強効果は、探針増強走査和周波顕微鏡だけでなく、以下の実施例で示す探針増強走査第二高調波顕微鏡、その他の非線形光学現象による探針増強走査光プローブ顕微鏡でも有効である。
【００３２】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成して、探針１と試料３が十分に近接している場合には、局在プラズモンポラリトンが探針１の先端に励起され、ラマン信号の電場強度が増強されることに起因する探針増強効果により、和周波の出力光２４の強度が飛躍的に増強される（探針増強和周波発生分光法）。さらに、探針１により試料３の表面の一部を走査しながら特定の波数における和周波の出力光２４の強度を計測することにより、試料３と培養液１４との界面における水分子の配向やの空間分布を高空間分解能でマッピングできる（探針増強走査和周波顕微鏡）。本実施例においては、探針増強効果により和周波の出力光２４は１００００倍に増強され、走査和周波顕微鏡の空間分解能は１０ｎｍとなる。
【００３３】
図２Ａに、本実施例で使用する試料ホルダ１１の概略構成を示す。図２Aは、パルス発振レーザー光（図１）の入射方向から見た鳥瞰図である。このため、培養液回収口１３は示しているが、培養液注入口１２は省略している。図２Ｂは、試料ホルダ１１の概略断面図であり、図２ＡのＡ−Ａ’矢視を示している。
【００３４】
試料ホルダ１１は、培養液１４を循環可能に保持する矩形形状の容器１１Ａと、容器１１Ａ内に配置される試料台１１Ｂと、容器１１Ａの上部開口を覆う平板状の上蓋９によって構成される。上蓋９には、培養液１４の流路方向に沿って（培養液注入口１２から培養液回収口１３の方向に沿って）スリット１５が形成されている。スリット１５は、培養液注入口１２側から培養液回収口１３側まで達する細長い開口であり、試料台１１Ｂの上方位置に設けられる。このスリット１５を通じ、探針１及びパルス発振レーザー光が試料ホルダ１１内に導入される。試料３は、試料台１１Ｂの上面に搭載される。
【００３５】
測定時、試料ホルダ１１（容器１１Ａと上蓋９で囲まれた空間）には培養液１４が満たされる。図２Ｂに示すように、培養液１４の液面は、上蓋９の裏面の高さと一致する。このため、培養液１４の液面は、試料台１１Ｂに載置された試料３の上面よりも高くなり、試料３の上面にも培養液１４の流路が形成される。ただし、本実施例の場合、試料３の上面に形成される培養液１４の薄膜（培養液薄膜１６）は、スリット１５が存在することで生じる毛細管現象により、試料３の上面と上蓋９（スリット１５以外の部分における培養液１４の液面）との距離よりも小さくなる。つまり、スリット１５の部分で、培養液１４の形状１０が凹形状に窪むことで、培養液１４の膜厚Ｔがスリット１５以外の部分よりも薄くなる。
【００３６】
この培養液薄膜１６の膜厚Ｔは、培養液１４の表面張力、試料３における培養液１４の濡れ性、試料ホルダの上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’、及び、スリット幅Wにより決まる。一般的には、培養液１４の表面張力が大きいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、試料３における培養液１４の濡れ性が悪いほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の距離Ｔ’が小さいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔは小さくなる。
【００３７】
ところで、試料３の表面に生成される培養液薄膜１６において吸収される第二のパルス発振レーザー光２３は、培養液１４と第二のパルス発振レーザー光２３（赤外光）の波数に依存する。そのため、第二のパルス発振レーザー光２３が十分な強度で培養液薄膜１６を透過して試料３に到達し、和周波発生シグナルを生じさせるには、第二のパルス発振レーザー光２３の強度が十分大きいか、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが十分小さい必要がある。
【００３８】
例えば波数が３１００カイザー程度の赤外光の水に対する減衰距離は、約０．１ｍｍであることが知られている。本実施例では、第二のパルス発振レーザー光２３のエネルギー密度が標準で１２０μＪ／ｍｍ２／ｐｓの場合、第二のパルス発振レーザー光２３は、１００μｍの膜厚を有する培養液薄膜１６を透過して試料３に到達し、和周波発生シグナルを生成できることが分かった。従って、第二のパルス発振レーザー光２３のエネルギー密度がその約３倍（正確には、自然対数の底であるｅ≒２．７倍）であれば２００μｍ、約９倍であれば３００μｍの膜厚を有する培養液薄膜１６を透過できることになる。
【００３９】
このことは、培養液薄膜の膜厚Ｔがｒ×１００μｍで与えられるとすると、和周波発生シグナルの生成には、第二のパルス発振レーザー光２３の単位面積当たり単位時間当たりのエネルギー密度が６０〜４８０×３ｒ−１μＪ／ｍｍ２／ｐｓで与えられることが要件になる。なお、ｒは、膜厚Ｔ（μｍ）との間に、ｒ＝Ｔ／１００の関係が成立する係数であり、培養液薄膜１６の膜厚Ｔと１００μmとの間の比を与える。
【００４０】
例えば試料３が雲母基板であり、培養液１４の代わりに水を用いる場合、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３との距離Ｔ’が１００μmとなるようにスペーサ（不図示）を介して上蓋９を配置し、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の間の毛細管現象により試料３の上面に水を浸透させる場合、スリット幅Wが１．０〜２．８mmのとき３０〜８０μｍの膜厚の培養液薄膜１６を形成することができる。
【００４１】
培養液１４の代わりに水を用いる場合、第一のパルス発振レーザー光２２（可視光）の水薄膜（培養液薄膜１６に対応）における透過率の議論は不要であるが、一般には、第二のパルス発振レーザー光２３と同様に、第一のパルス発振レーザー光２２の培養液薄膜１６における透過率と同様の議論が必要になる。
【００４２】
図３Ａは、以下の条件を満たし、試料３に十分な強度の第二のパルス発振レーザー光２３が到達する場合（前述したように十分に薄い培養液薄膜１６が形成される場合）におけるＳＦＧシグナルの計測結果である。
(1) 雲母基板と雲母基板上で固定したヒト肝癌由来細胞株（HepG2）の細胞を試料３とする。
(2) 培養液１４の代わりに水を使用する。
(3) スリット幅Wを２．０mmとする。
【００４３】
この場合、試料３の細胞に含まれる炭化水素の配向（第二のパルス発振レーザー光２３の波数の２９００カイザー程度に対応する）と、試料３の細胞や雲母基板と水との界面における水分子の配向（第二のパルス発振レーザー光２３の波数の３１００カイザー程度に対応する）とから生じるＳＦＧシグナルを観察することができる。
【００４４】
図３Ｂは、第二のパルス発振レーザー光２３の強度が十分でなくＳＦＧシグナルが生じない場合のＳＦＧ光強度の波数依存性を示す図である。
【００４５】
このように、スリット幅Wと第二のパルス発振レーザー光２３の強度の条件が適切に選択されていれば、試料−培養液界面で非線形光学シグナルが生じ、図３ＡのようにＳＦＧスペクトルを測定することができる。この結果、培養液中の試料−培養液界面における物理情報を高空間分解能で計測することができる。なお、第二のパルス発振レーザー光２３の強度に対して培養液薄膜１６が厚すぎると、図３Ｂのように十分な非線形光学シグナルは得られない。
【００４６】
［実施例２］
本実施例も、引き続き、培養液１４を交換することができる探針増強走査和周波顕微鏡について説明する。本実施例における走査プローブ顕微鏡の概略構成は、実施例１（図１に示す構成）と同じである。違いは、試料ホルダ１１の構成である。
【００４７】
図４Ａに、本実施例で使用する試料ホルダ１１の概略構成を示す。図４Aは、パルス発振レーザー光（図１）の入射方向から見た鳥瞰図である。ただし、培養液注入口１２と培養液回収口１３は、実施例１とは異なる方向に設置されている。また、試料ホルダ１１には、培養液１４の流れと直交するようにスリット１５が設けられている。ここで、スリット１５は、試料３の設置領域を横切るように配置される。
【００４８】
図４Ｂは、試料ホルダ１１の概略断面図であり、図４ＡのＢ−Ｂ’矢視を示している。なお、図４Bには、図４ＡのＢ−Ｂ’線上には存在しない仕切り板８を破線で表している。本実施例の場合も、スリット１５を通じ、探針１及びパルス発振レーザー光が試料ホルダ１１内に導入される。また、スリット幅Wは、実施例１と同じ条件で選択されている。このため、培養液１４を試料ホルダ１１に充填した場合、試料３の上面に培養液薄膜１６が生成される。
【００４９】
培養液薄膜１６の膜厚Tは、培養液１４の表面張力、試料３における培養液１４の濡れ性、試料ホルダの上蓋９と試料３の上面との距離T’（不図示のスペーサの厚みに相当する距離）、及び、スリット幅Wにより決まる。一般的には、培養液１４の表面張力が大きいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、試料３における培養液１４の濡れ性が悪いほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、試料ホルダの上蓋９と試料３の距離Ｔ’が小さいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔは小さくなる。
【００５０】
本実施例の試料ホルダ１１には、試料３の上方の開口部を除き、流路を横切るように容器１１Ａの一方側から他方側まで達するスリット１５に沿って培養液仕切り８が設置されている。この培養液仕切り８により、試料ホルダ１１内の空間を上流側と下流側の２つに分割される。培養液１４は、培養液仕切り８が設けられていない試料３の周辺領域を通じ、上流側から下流側に流れる。すなわち、試料３の周辺領域に流路が形成される。
【００５１】
ところで、培養液仕切り８が培養液１４の流れを妨げるように作用するため、試料３の上面に形成される培養液薄膜１６の断面形状は、図４Ｂに示すように上流側と下流側とで非対称（不均一）となる。すなわち、図４Ｂ中の矢印に示すように、培養液１４の上流側（培養液注入口１２側）が上方に膨らみ、不均一になる（図４Ｂの矢印）。もっとも、この培養液１４の膨らみは、培養液薄膜１６の膜厚Ｔには影響しない。すなわち、培養液薄膜１６の膜厚Ｔは、実施例１と同様、培養液１４の表面張力、試料３における培養液１４の濡れ性、試料ホルダの上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’、及び、スリット幅Wにより決まる。
【００５２】
このため、本実施例の場合にも、スリット幅Wと第二のパルス発振レーザー光２３の強度を最適化することにより、試料−培養液界面に非線形光学シグナルを発生させて、ＳＦＧスペクトルを測定することができる。その結果、培養液中の試料−培養液界面における物理情報を高空間分解能で計測することができる。
【００５３】
なお、本実施例では培養液仕切り８を配置しているが、実施例１と同様、培養液仕切り８を設けなくてもよい。また、培養液仕切り８は、培養液１４の流れを制限して試料３の上面に誘導できれば、その取り付け位置及び高さは図４Ａ及び図４Ｂに示す位置及び高さに限らない。
【００５４】
［実施例３］
図５に、前述した走査プローブ顕微鏡の製品例を示す。本実施例の場合、試料ホルダ１１、振動子２、培養液循環機構１９、培養液循環制御機構２０、走査機構３１は細胞培養装置３２に内蔵され、パルス発振レーザー発振器２７、フィルター付検出器２５、制御装置２６は細胞培養装置３２の外に配置される。細胞培養装置３２には窓３３及び３４が設けられている。第一のパルス発振レーザー光２２、２３は、窓３３を通過して試料３を照射する。出力光２４は、窓３４を通過してフィルター付検出器２５で検出される。このため、窓３３及び３４は、パルス発振レーザー光２２、２３及び出力光２４の波長を透過する例えば光学ガラス，石英ガラス等で構成される。
【００５５】
［実施例４］
前述した走査プローブ顕微鏡は、例えば探針増強走査第二高調波顕微鏡にも適用することができる。以下では、図１を用いて当該顕微鏡を説明する。
【００５６】
本実施例における探針増強走査第二高調波顕微鏡は、探針１が近接する試料３の領域近傍に、波長１０６４ｎｍの第一のパルス発振レーザー光２２（赤外パルス発振レーザー光）を入力する。探針増強走査第二高調波顕微鏡は、試料３で発生した出力光２４をフィルター付検出器２５で検出する。ここで、フィルター付検出器２５は、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数の２倍の周波数の光の強度を計測する。
【００５７】
本実施例では、培養した神経細胞を試料３として使用する。神経細胞の凹凸を計測しながら（原子間力顕微鏡ＡＦＭとして動作させながら）フィルター付検出器２５で計測された第二高調波強度をマッピングすることにより、走査第二高調波顕微鏡が構成され、神経細胞の神経活動強度をマッピングすることができる。この際、実施例１と同様、探針増強効果を最適化することにより、探針増強走査第二高調波顕微鏡を構成することができる。
【００５８】
［実施例５］
前述した走査プローブ顕微鏡は、例えば探針増強走査ラマン顕微鏡にも適用することができる。以下では、図１を用いて当該顕微鏡を説明する。
【００５９】
本実施例における探針増強走査ラマン顕微鏡は、探針１が近接する試料３の領域近傍に、波長５３２ｎｍの第一のパルス発振レーザー光２２（緑色パルス発振レーザー光）を入力する。探針増強走査ラマン顕微鏡は、試料３で発生した出力光２４をフィルター付検出器２５に入力し、ラマン散乱光の光強度を計測する。
【００６０】
本実施例では、培養した肝細胞を試料３として使用する。肝細胞の凹凸を計測しながら（原子間力顕微鏡ＡＦＭとして動作させながら）フィルター付検出器２５で計測されたラマン散乱を調べることにより、肝細胞中の分子、たんぱく質などの組成分布をマッピングすることができる。この際、実施例１のように探針増強効果を最適化することにより、探針増強走査ラマン顕微鏡を構成することができる。
【００６１】
［実施例６］
前述した走査プローブ顕微鏡は、例えば探針増強走査ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）顕微鏡にも適用することができる。この顕微鏡は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を使用する。この顕微鏡の場合、探針１が近接する試料３の領域近傍に、角振動数が異なる第一のパルス発振レーザー光２２（角振動数ω１）と第二のパルス発振レーザー光２３（角振動数ω２）が同期した状態で入力される。探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡は、試料３で発生した出力光２４をフィルター付検出器２５に入力し、ＣＡＲＳ光の光強度を計測する。この際、試料３の凹凸を計測しながら（原子間力顕微鏡ＡＦＭとして動作させながら）、ＣＡＲＳ光の光強度を調べることにより、試料３の分子、たんぱく質などの組成分布をマッピングすることができる。この際、実施例１と同様、探針増強効果を最適化することにより、探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡を構成することができる。
【００６２】
［実施例７］
前述した走査プローブ顕微鏡は、試料の表面の静電気力分布を計測する走査ケルビンプローブ顕微鏡にも適用することができる。本実施例に係る走査ケルビンプローブ顕微鏡の全体構成は実施例１（図１）及び実施例３（図５）と同様である。図６に、本実施例に特有の構成である電極部分を示す。
【００６３】
制御装置２６により制御されるバイポテンショスタット５１は、探針電極５２、試料電極５３、作用電極５４、参照電極５５の印加電圧を制御する。また、バイポテンショスタット５１は、培養液１４の電位を参照電極５５によって計測する。バイポテンショスタット５１は、計測電位に応じた第１の電圧（培養液１４の電位に対する探針１の相対電圧）を探針電極５２に印加する。また、バイポテンショスタット５１は、計測電位に応じた第２の電圧（培養液１４の電位に対する試料３の相対電圧）を試料電極５３に印加する。このとき、培養液１４と参照電極５５の間に流れる電流はほとんど零である。
【００６４】
例えば培養液１４と試料３の間に電流を流して化学反応を生じさせる場合、バイポテンショスタット５１は、作用電極５４と試料電極５３の間に電流を流す。探針１と試料３の間に電圧を印加する場合、バイポテンショスタット５１は、探針電極５２と試料電極５３の間に電圧を印加する。
【００６５】
なお、本実施例の走査ケルビンプローブ顕微鏡を走査トンネル顕微鏡として用いる場合、探針電極５２と試料電極５３の間の電圧と電流を印加電圧とトンネル電流として使用する。また、試料３に電荷注入を行う場合には電荷注入電極５６を使用する。
【００６６】
本実施例の場合も、振動子２を、その固有振動数の近傍周波数（固有振動数の±１％程度以内）で振動させ、試料３の上面に対して垂直方向に探針１を振動させる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針１と試料３の間の相互作用（力）が分かり、探針１と試料３との間の距離が分かる。
【００６７】
本実施例の走査ケルビンプローブ顕微鏡を用いて試料表面の静電気力分布を計測する場合、探針１と試料３の間に、交流電圧と直流電圧を足し合わせた電圧信号を印加する。このとき、試料３と探針１の間には、この電圧信号と、探針１と試料３の各表面の仕事関数との差に応じた静電気力Ｆが加わる。
【００６８】
交流電圧の振幅は予め設定された値であるが、直流電圧の値は次のように決定される。まず、振動子２によって、探針１と試料３の間の相互作用（力）（力信号）を計測する。交流電圧に同期した同じ周波数の信号を参照信号として、力信号の交流電圧と同じ周波数成分の強度をロックインアンプにより検出する。
【００６９】
探針１と試料３との間の距離をｚ、電位差をＶ、誘電率をεとすると、探針１に加わる静電気力Ｆは、Ｆ∝εＶ２／ｚ２となる。ロックインアンプから出力される信号は、静電気力Ｆの電圧Ｖに関する微分で与えられるため、ｄＦ／ｄＶ∝εＶ／ｚ２となり、距離ｚ及び誘電率εが一定であれば、電位差に比例した値となる。
【００７０】
そのため、ロックインアンプからの出力信号がゼロとなるように直流電圧を調整することにより、探針１と試料３の間の電位差は常にゼロに保たれる。これにより、試料３の表面電位によらず、探針１に加わる静電気力Ｆをゼロとすることができる。すなわち、探針１と試料３との間の電位差は、静電気力Ｆをゼロにするように調整した直流電圧により計測できる。
【００７１】
このとき、力信号ｆを、第二のロックインアンプに入力し、電圧信号の交流電圧に同期した二倍周波数の信号を参照信号として、力信号ｆの二倍周波数成分の強度を検出する。第二のロックインアンプから出力される信号は、力信号ｆの電圧Ｖに関する二回微分で与えられるため、ｄ２ｆ／ｄＶ２∝ε／ｚ２となり、誘電率εが一定であれば、探針１と試料３の間の距離ｚの二乗に反比例した値となる。
【００７２】
そのため、第二のロックインアンプからの出力信号を一定に保ちながら、走査機構３１により試料３と探針１の相対位置を試料３に対して垂直方向と試料３の平面方向に走査することにより、探針１と試料３との距離を一定に保つことができる。これにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成することができる。これらにより、試料の表面の静電気力分布を計測する走査プローブ顕微鏡（走査ケルビンプローブ顕微鏡）が構成される。
【００７３】
ところで、培養液１４と探針１との間に電流が流れると、静電気力分布の感度が悪くなる。しかし、本実施例の操作プローブ顕微鏡も、実施例１で説明した試料ホルダ１１を用いるため、スリット１５の開口部における試料３の上面に培養液薄膜１６が生成され、培養液１４と探針１の接触面積を小さくできる。この結果、感度悪化の主要因である培養液１４と探針１の間の電流を抑制することができ、試料３の静電場分布を高空間分解能で計測することができる。
【００７４】
［実施例８］
本実施例では、実施例７で説明した走査プローブ顕微鏡を用いた神経細胞の神経シグナル計測方法について説明する。本実施例では、培養した神経細胞を試料３として培養液１４中に設置する。また、探針１を、試料３の上面に対向するように振動子２に取り付ける。振動子２によって、探針１は、試料３の上面に対して垂直方向に振動する。
【００７５】
試料３は、試料ホルダ１１を介して走査機構３１の上に固定されており、探針１に対して３次元方位方向に移動させることができる。振動子２により、探針１は、振動子２の固有振動数の近傍周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料１の上面に対して垂直方向に振動する。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針１と試料３の間の相互作用（力）が分かり、探針１と試料３間の距離が分かる。
【００７６】
また、この位相差を一定に保ちながら、走査機構３１により試料３と探針１の相対位置を試料３に対して垂直方向と試料３に対して平面方向に走査することにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸を計測できる。
【００７７】
神経シグナルの測定においては、試料３の表面と探針１の先端の距離を常に一定に保ちながら行う。神経シグナルは、電荷注入電極５６（図６）から神経細胞に電荷を注入した際に、神経細胞に生ずる電圧パルスである。
【００７８】
神経シグナルの測定には、まず試料３に対して所定の電荷を注入することにより神経細胞に電圧パルスを印加する。このとき、電圧パルスの大きさは５０μＶ〜１００ｍＶ程度である。試料３の所望の位置に探針３を接触し又は接近させ、この電圧パルスを実施例７の走査プローブ顕微鏡により検出する。試料３の多点において電圧パルス計測を行い神経シグナルが伝達されているかを判断することにより、培養された神経細胞の不良箇所を特定することができる。
【００７９】
［実施例９］
前述した走査プローブ顕微鏡は、例えば、カンチレバーを用いた液中走査プローブ顕微鏡にも適用することができる。図７に、本実施例に係る液中走査プローブ顕微鏡の概略構成を示す。カンチレバー６１は、励振装置６２に設置される。カンチレバー６１の自由端近傍には探針１が形成されており、探針１と試料３との相対位置は、励振装置６２及び走査機構３１により制御される。カンチレバー６１は、励振装置６２により機械的に振動される。励振装置６２の振動は不図示の制御装置により制御される。
【００８０】
カンチレバー６１の振動振幅および位相は、検出用レーザー光源６３から射出された後、カンチレバー６１の背面に入射して反射する検出用レーザー６４の角度変化に基づいて検知される。この検知には、受光面が複数領域に分割された分割フォトダイオード６５を使用する。分割フォトダイオード６５の各受光領域は、検出用レーザー６４の入射面積に応じた電圧を発生する。検出用レーザー６４の角度変化は、検出用レーザー６４の位置変化に応じて各受光領域に発生する電位の差に基づいて不図示の制御装置により検知される。
【００８１】
ところで、この検知方式は、検出用レーザー６４の散乱、カンチレバー６１の背面以外における反射等により測定感度が低下する。特に、液中計測においては、検出用レーザー６４が液中を透過する過程で生じる散乱と、気体と液体との界面で生じる反射とに加え、カンチレバー６１が液体から受ける粘性抵抗に起因する感度低下が問題となる。このような問題を回避するには、カンチレバーの探針高さＤが培養液薄膜１６の膜厚Ｔより大きい必要がある。
【００８２】
図８Ａは、本実施例で使用する試料ホルダ１１の概略構成である。図８Aは、分割フォトダイオード６５（図７）の方向からの鳥瞰図である。このため、培養液回収口１３は示しているが、培養液注入口１２は省略している。図８Ｂは、本実施例の試料ホルダ１１の概略断面図であり、図８ＡのＡ−Ａ’矢視を示している。なお、図８Aは、試料ホルダ１１が、実施例１と同じく、培養液１４の循環方向と平行にスリット１５が取り付けられている場合について表している。
【００８３】
他の実施例と同様、試料ホルダ１１の上蓋９にはスリット１５が形成されている。スリット１５は、図８Ａに示すように、カンチレバー６１の導入に用いることができる。また、試料ホルダ１１の内空間に培養液１４を充填すると、図８Ｂに示すように、スリット１５の開口部と試料３の上面との間に培養液薄膜１６が生成される。培養液薄膜１６の膜厚Ｔは、前述の実施例で説明したように、培養液１４の表面張力、試料３における培養液１４の濡れ性、試料ホルダの上蓋９と試料３の距離Ｔ’（上蓋９と試料３の間に挿入されたスペーサの厚みに相当する）、及び、スリット幅Wにより決まる。
【００８４】
一般的には、培養液１４の表面張力が大きいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、試料３における培養液１４の濡れ性が悪いほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔが小さくなり、また、試料ホルダの上蓋９と試料３の距離Ｔ’が小さいほど、培養液薄膜１６の膜厚Ｔは小さくなる。この特性を利用して、培養液薄膜１６の膜厚Ｔを、カンチレバー６１の探針１の取り付け高さＤよりも小さく設定すれば、カンチレバー６１の背面を気中に露出できると共に、液体の粘性抵抗による影響を抑制することが可能となる。
【００８５】
ただし、カンチレバー６１を試料３の上面に導入するため、スリット幅Ｗは、カンチレバー６１の幅Ｂよりも大きく設定する必要がある。これらの条件を満たすことにより、カンチレバー６１の振動振幅および位相を不図示の制御装置によって高感度に検知することが可能な液中走査プローブ顕微鏡を実現できる。
【００８６】
［実施例１０］
実施例９で説明したカンチレバー６１の励振機構には、機械的な方法以外にも、磁気励振法又は光熱励振法を用いることができる。図９は、光熱励振法を用いた液中走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。磁気励振法では、カンチレバー６１の背面に磁性体をコートするが、光熱励振法ではカンチレバー６１の背面を金属の薄膜６６でコートする。ところが、金属の薄膜６６でコートされたカンチレバー６１を液中に導入すると、コート材の溶出によるコンタミネーションが問題となる。
【００８７】
また、光熱励振法では、金属の薄膜６６でコートされたカンチレバー６１の背面に励振用レーザー６７を照射し、照射によって生じる熱勾配によってカンチレバー６１を励振させる。このため、カンチレバー６１を液中に導入すると、励振用レーザー６７の散乱と培養液１４への熱拡散による感度低下が問題となる。
【００８８】
従って、培養液薄膜１６の膜厚Ｔをカンチレバー６１に取り付けられた探針１の取り付け高さＤよりも小さく設定することで、カンチレバー６１の背面を気中に露出できる。この結果、カンチレバー６１の背面に照射する励振用レーザー６７の散乱、コート材の溶出によるコンタミネーションを防ぐことが可能となる。これらにより、カンチレバー６１の振動振幅および位相を高感度に検知することができ、かつ、低侵襲である液中走査プローブ顕微鏡を実現できる。
【００８９】
［実施例１１］
前述した実施例１における走査プローブ顕微鏡のように、試料ホルダ１１の上蓋９に形成するスリット１５の幅（スリット幅Ｗ）と、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ′によって培養液薄膜１６の膜厚Ｔを決定する場合、試料ホルダの上蓋９と試料３との距離Ｔ′は、試料ホルダの上蓋９と試料３の上面との間に挟むスペーサ（不図示）の厚みにより決めることができる。
【００９０】
しかし、培養液薄膜１６の膜厚Ｔを微調整する観点からは、厚みが固定されたスペーサ（不図示）の使用は好ましくない。そこで、本実施例では、培養液薄膜１６の膜厚Ｔを観察しながら、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ′を調整することが可能な試料ホルダ１１と、その制御機構を備えた液中走査プローブ顕微鏡について説明する。
【００９１】
図１０Ａは、本実施例に係る走査プローブ顕微鏡の概略構成である。図１０Ａには、図１との対応部分に同一符号を付している。本実施例の場合、試料ホルダ１１の下部に、試料位置制御機構７１を配置し、フィルター付検出器２５により検出したレーザー強度が指定値になるように試料ホルダ１１の内部の試料３の位置を制御する。
【００９２】
図１０Ｂは、試料ホルダ１１及び試料位置制御機構７１の概略構成である。前述の実施例と同様、試料ホルダ１１は、矩形形状の容器１１Ａの上部開口を上蓋９で塞いだ構成を有している。上蓋９には、スリット１５が設けられている。ただし、本実施例の試料ホルダ１１の底面は四角く切り抜かれており、同形状の可動式試料台７２（試料台１１Ｂに相当する）の上部に被せるように嵌め込まれている。
【００９３】
ここで、可動式試料台７２は、試料ホルダ１１の底面開口との間で水密性を保ったまま上下動できるように試料ホルダ１１に対して取り付けられている。具体的には、試料ホルダ１１と可動式試料台７２の合わせ目からの培養液１４の漏れ出し防止用に、２つのＯリング（試料ホルダ１１と固定具７３との間のＯリング７４と可動式試料台７２と固定具７３との間のＯリング７５）を設けている。これにより、試料ホルダ１１と可動式試料台７２との間に形成される空間内に培養液１４が保持される。
【００９４】
試料ホルダ１１は、固定具７３の本体部から上方に突き出た凸部材に対してネジ留めされた板バネ７６により固定される。可動式試料台７２は、Ｏリング７５により水密性を保ちながら上下に移動することができる。可動式試料台７２の上下位置の制御は、可動式試料台７２の下部に取り付けられたステッピングモーター７８と上下移動用ネジ７９の回転運動により行う。
【００９５】
フィルター付検出器２５の検出結果は、試料位置制御機構７１（具体的には可動式試料台７２を駆動するステッピングモーター７８）の制御にフィードバックされる。具体的には、フィルター付検出器２５で検出されたレーザー強度を基準とし、所定強度の和周波発生シグナルが検出されるように可動式試料台７２を上下に移動制御する。すなわち、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’を調整し、指定のレーザー強度がフィルター付検出器２５で得られるようにする。結果的に、パルス発振レーザー発振器から射出されるパルス発振レーザー光の強度と培養液薄膜１６の厚さＴの関係を予め校正することができる。かくして、本実施例に係る液中走査プローブ顕微鏡は、指定の厚みＴを有する溶液薄膜１６を試料３の上面に確実に形成することができる。
【００９６】
［実施例１２］
実施例１で説明したように、試料３の上面に形成される培養液薄膜１６の膜厚Ｔは、試料３と培養液１４の界面における表面張力と、試料ホルダ１１の上蓋９と培養液１４の界面における表面張力と、スリット幅Ｗと、試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’により決まる。従って、予め、各界面における表面張力が既知であれば、目的の培養液薄膜１６の膜厚Ｔを得るために必要となるスリット幅Ｗ及び試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’を計算することができる。
【００９７】
本実施例では、制御装置２６（図１）や走査プローブ顕微鏡とは独立の計算機（コンピュータ）に、以下の計算機能及び表示機能を搭載する。本実施例の制御装置２６は、図１１に示すユーザインターフェース画面の入力用テキストボックス８１を通じ、（１）培養液１４と試料３との界面における表面張力の大きさの指標を与える接触角、（２）培養液１４と容器（上蓋９）との界面における表面張力の大きさの指標を与える接触角、（３）形成する培養液薄膜の膜厚Ｔの入力を受け付ける。
【００９８】
プログラム実行ボタン８３がクリックされると、制御装置２６は、入力用テキストボックス８１に入力された値に基づいて、膜厚Ｔの培養液薄膜１６を形成するために必要な（１）スリット幅Ｗと（２）試料ホルダ１１の上蓋９と試料３の上面との距離Ｔ’の値を計算し、計算結果を出力用テキスト８２に表示する。当該機能の搭載により、作業者は、任意の試料３の観察に際し、適切な試料ホルダ１１（上蓋９を含む）を容易に選定することができる。
【００９９】
［他の実施例］
前述した実施例の採用により、液体中の生体分子、生体組織、生体基板材料等と液体との界面の物理上方を一段と高い精度で計測又は評価することができる。例えば培養基板、水浄化膜、培養細胞を評価できる。
【０１００】
以上の実施例では、主に生体分子、生体組織、生体基板材料と培養液との界面を計測又は評価しているが、半導体デバイス（例えばＰ−Ｎ接合界面）の界面評価、電池の界面評価（電極と電解液との界面評価）等にも用いることができる。特に、電池の電極と電解液との界面は生体材料と培養液との界面と同様に表面と液体分子との界面であり、応用が期待できる。なお、電極と電解溶液との界面の計測に用いる場合は、図１と同様、電解液の循環装置を有していてもよいが、固体界面の評価のみに用いる場合は必ずしも循環装置は必要としない。
【符号の説明】
【０１０１】
W  スリット幅
Ｔ  培養液薄膜の膜厚
Ｔ′  試料ホルダの上蓋と試料との距離
Ｄ  カンチレバーの探針高さ
Ｂ  カンチレバー幅
１  探針
２  振動子
３  試料
４  配線
５  探針用電源
８  培養液仕切り
９  上蓋
１０  培養液の形状
１１  試料ホルダ
１１Ａ  容器
１１Ｂ  試料台
１２  培養液注入口
１３  培養液回収口
１４  培養液（水、溶媒）
１５  スリット
１６  培養液薄膜
１７  培養液イン
１８  培養液アウト
１９  培養液循環機構
２０  培養液循環制御機構
２１  プリズム
２２  第一のパルス発振レーザー光
２３  第二のパルス発振レーザー光
２４  出力光
２５  フィルター付検出器
２６  制御装置 
２７  パルス発振レーザー発振器
３１  走査機構
３２  細胞培養装置または半導体検査装置等
３３  窓
３４  窓
５１  バイポテンショスタット 
５２  探針電極 
５３  試料電極 
５４  作用電極 
５５  参照電極 
５６  電荷注入電極 
６１  カンチレバー
６２  励振装置
６３  検出用レーザー光源
６４  検出用レーザー
６５  分割フォトダイオード
６６  磁性体または金属の薄膜
６７  励振用レーザー
６８  励振用レーザー光源
７１  試料位置制御機構
７２  可動式試料台
７３  固定具
７４  試料ホルダ−固定具間Ｏリング
７５  可動式試料台−固定具間Ｏリング
７６  板バネ
７７  固定ネジ
７８  ステッピングモーター
７９  上下移動用ネジ
８１  入力用テキストボックス
８２  出力用テキスト
８３  プログラム実行ボタン
【図１】
2016103338.tif 000003
【図２Ａ】
2016103338.tif 000004
【図２Ｂ】
2016103338.tif 000005
【図３Ａ】
2016103338.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2016103338.tif 000013
【図８Ｂ】
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【図９】
2016103338.tif 000015
【図１０Ａ】
2016103338.tif 000016
【図１０Ｂ】
2016103338.tif 000017
【図１１】
2016103338.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を保持する容器と、
前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有し、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する、上蓋と、
を有する走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項２】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記膜厚は、パルス発振レーザー光で前記液体中の試料を照射した場合に、前記試料に非線形光学シグナルが発生する膜厚である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項３】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記容器は、前記液体の注入口と回収口を有し、
前記上蓋には、前記スリットが前記液体の循環方向に対して平行に形成されている
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項４】
請求項１に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記容器は、前記液体の注入口と回収口を有し、
前記上蓋には、前記スリットが前記液体の循環方向に対して直交するように形成されている
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項５】
請求項４に記載の走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダにおいて、
前記液体の流れを制限して、前記液体を前記試料の上面に誘導する仕切りを更に有する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡用の試料ホルダ。
【請求項６】
液体を保持する容器と、前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有し、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成する上蓋とを有する試料ホルダと、
探針と、
前記探針を上下方向に変位させる振動子と、
前記探針により計測する前記試料の領域にパルス発振レーザー光を照射するパルス発振レーザー光源と、
前記パルス発振レーザー光の照射により前記試料に発生する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、
前記試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、
前記振動子と、前記パルス発振レーザー光源と、前記走査機構を制御する制御装置と、
を有する走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記薄膜の膜厚をｒ×１００μｍとするとき、前記パルス発振レーザー光の単位面積当たり単位時間当たりのエネルギー密度は、６０〜４８０×３ｒ−１μＪ／ｍｍ２／ｐｓである
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダの下部に、前記試料の高さ位置を調整する試料位置制御機構を更に有し、
前記制御装置は、前記フィルター付検出器の計測結果に基づいて前記試料位置制御機構を制御して前記試料の高さ位置を調整し、前記薄膜の膜厚を調整する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、ユーザインターフェースを通じて受け付けた、前記試料と前記液体の界面における表面張力と、前記試料ホルダの前記上蓋と前記液体の界面における表面張力に基づいて、パルス発振レーザー光で前記液体中の試料を照射した場合に、前記試料に非線形光学シグナルを発生させる前記試料ホルダの前記上蓋と前記試料の上面との距離、及び、前記スリットの幅を計算して前記ユーザインターフェースに表示する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルス発振レーザー光源は、固定波長のパルス発振レーザー光を照射する第一の光源と、可変波長のパルス発振レーザー光を照射する第二の光源を有し、
前記前記フィルター付検出器は、前記出力光として和周波光を検出する
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は、前記パルス発振レーザー光の第二高調波である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は、前記パルス発振レーザー光のラマン散乱光である
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
請求項６に記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記振動子は、前記探針を先端に取り付けたカンチレバーと、前記カンチレバーを上下方向に変位させる励振装置で構成される、
ことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１４】
液体を保持する容器と、前記容器の上部開口を覆う平板状の上蓋であって、試料の載置位置の上方に細長いスリットを有し、前記スリットは、前記容器と前記上蓋の間を液体で満たしたとき、前記試料の上面に、前記試料の上面と前記上蓋との距離よりも小さい膜厚を有する前記液体の薄膜を形成するスリット幅を有する上蓋とを有する試料ホルダと、
探針と、
前記探針を上下方向に変位させる振動子と、
前記探針に交流電圧と直流電圧を印加する探針用電源と、
前記探針に印加される力を検出する検出部と、
前記試料ホルダを水平方向に移動する走査機構と、
前記振動子と、前記探針用電源と、前記走査機構を制御する制御装置と、
を有する走査プローブ顕微鏡。
【国際調査報告】
2016103338.tif 000019
2016103338.tif 000020
2016103338.tif 000021
2016103338.tif 000022