(57)【要約】【課題】  本発明は、ワクモに対する免疫応答を家畜に惹起させてワクモを防除する方法、そのために利用可能なワクチン抗原及び抗ワクモワクチンを提供することを目的とするものである。【解決手段】  本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法を提供する。本発明によれば、家畜に対してワクモに対する特異的な免疫応答を惹起させることができ、吸血したワクモ体内にある標的分子の機能を阻害することで、ワクモを防除することが可能となる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法。
【請求項２】
免疫学的等価物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
それらのポリペプチド断片
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列
配列番号２に示されるアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質
である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下記のａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ａ）〜ｃ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
下記のｅ）〜ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ｅ）〜ｇ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｈ）ｅ）〜ｇ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【請求項７】
請求項５又は６で規定されるいずれかのタンパク質又はそのポリペプチド断片をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項５及び／若しくは請求項６で規定されるタンパク質及び／若しくはポリペプチド断片、又は請求項７で規定される核酸及び／若しくは請求項８で規定される発現ベクターを含む、家畜用抗ワクモワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜特にニワトリに寄生する外部寄生虫であるワクモ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）の防除方法及び該防除方法に用いることのできる新規タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクモによる吸血被害は、世界中の養鶏場（特に採卵鶏）における大きな問題である。ワクモは、吸血によってニワトリの貧血、産卵率の低下及び免疫応答の低下等による鶏卵生産性の低下をひき起こす。また、ワクモは様々な病原体の伝播にも関与することが報告されている。【０００３】
現行のワクモの防除方法としては、鶏舎の徹底した洗浄、殺虫剤の散布などが挙げられる。しかし、ワクモは非吸血時には鶏舎のヒビ割れのような隙間に棲息するため、洗浄又は薬剤散布で隙間に棲息するワクモを完全に防除することは困難である。また薬物散布は、生産物に薬物が残留するおそれがあることに加え、最近報告されているように薬剤耐性を有するワクモが出現するという問題を伴う。このように、現行の防除方法特に薬剤散布は幾つかの問題を有することから、薬剤散布以外の新たなワクモ防除法が必要とされている。【０００４】
抗ワクモワクチンは、薬剤散布に代わるワクモの防除方法として有望な手段である。ワクモと同様に家畜の吸血性外部寄生虫であるマダニに関する抗マダニワクチンの開発研究は、既に先行して行われている。【０００５】
抗マダニワクチンとしては、マダニから宿主に注入される分子をワクチン抗原として用いるもの、及びマダニの腸管内で発現してマダニの恒常性維持に関わる分子をワクチン抗原として用いるもの、などが挙げられる。前者の場合、マダニから宿主に注入される因子の働きが宿主内部における免疫応答によって阻害されることで、マダニの吸血が抑制され、マダニが防除される。また後者の場合、吸血に伴って宿主からマダニの体内に持ち込まれた免疫活性物質によってマダニ体内の標的分子の機能が阻害されることで、マダニが防除される（非特許文献１、非特許文献２）。前者に該当する抗マダニワクチンの一つは、Ｈｏｅｃｈｓｔ社から市販されているＴｉｃｋＧＡＲＤ（登録商標）ＰＬＵＳである。【０００６】
近年、抗ワクモワクチンの研究開発も進められている。例えば、ワクモ虫体の不溶性分画及び可溶性分画を抗原として用いたワクチン試験（非特許文献３）が行われている。また、ワクモで発現している遺伝子を同定し、その組換えタンパク質を抗原として用いたワクチン試験が一定の効果を示すことが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。さらに、ワクモの抗酸化酵素や薬剤代謝関連酵素などのワクチン抗原候補となる分子も報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。【０００７】
マダニは宿主に寄生して数日にわたって吸血を続けるため、宿主内部における免疫応答によって吸血を抑制するワクチンも有効である。一方、ワクモの吸血時間は５分から長くて１時間程度であり、マダニに比べると極めて短時間しかニワトリ個体に留まらない。そのため、より高い防除効果が期待できる抗ワクモワクチンとしては、宿主内部における免疫応答によってワクモ由来の分子の機能を阻害することでワクモを防除するものよりも、吸血に伴って宿主からワクモの体内に持ち込まれた免疫活性物質によってワクモを防除するものの方が有利であると考えられる。しかし、これまでのところ、係る機構によってワクモを防除し得る有効なワクチン抗原は見いだされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】小沼ら、獣医畜産新報、２００４年、第５７巻、７５３−７５７ページ
【非特許文献２】Ｗｉｌｌａｄｓｅｎら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、２００４年、第１２９巻、Ｓ３６７−Ｓ３８７ページ
【非特許文献３】Ｗｒｉｇｈｔら、Ｅｘｐ．Ａｐｐｌ．Ａｃａｒｏｌ．、２００９年、第４８巻、８１−９１ページ
【非特許文献４】Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、２００９年、第３９巻、４４７−４５６ページ
【非特許文献５】Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１３９巻、７５５−７６５ページ
【非特許文献６】伊勢崎ら、２０１０年９月１８日、第１５０回日本獣医学会、演題番号Ｃ−５２
【非特許文献７】伊勢崎ら、２０１２年９月１５日、第１５４回日本獣医学会、演題番号Ｃ−２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ワクモに対する免疫応答を家畜に惹起させ、ワクモ体内で標的分子の機能を阻害することでワクモを防除する方法、そのために利用可能なワクチン抗原及び抗ワクモワクチンを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ワクモで発現している遺伝子の解析によって、新規かつワクモに特徴的なタンパク質をコードする遺伝子が発現していることを突き止め、下記の各発明を完成させた。【００１１】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法。
（２）免疫学的等価物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のポリペプチド断片である、（１）に記載の方法。
（３）免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
それらのポリペプチド断片
である、（１）に記載の方法。
（４）免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列
配列番号２に示されるアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質
である、（１）に記載の方法。
（５）下記のａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ａ）〜ｃ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
（６）下記のｅ）〜ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ｅ）〜ｇ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｈ）ｅ）〜ｇ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
（７）（５）又は（６）で規定されるいずれかのタンパク質又はそのポリペプチド断片をコードする核酸。
（８）（７）に記載の核酸を含む発現ベクター。
（９）（５）及び／若しくは（６）で規定されるタンパク質及び／若しくはポリペプチド断片、又は（７）で規定される核酸及び／若しくは（８）で規定される発現ベクターを含む、家畜用抗ワクモワクチン。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ワクモに対する特異的な免疫応答を家畜に惹起させることができ、吸血したワクモ体内にある標的分子の機能を阻害することで、ワクモを防除することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号１に示されるワクモのカテプシンＬ−２と各種のダニのカテプシンＬとのアミノ酸配列のアライメントである。図中の▼は、カテプシンＬに特徴的なモチーフ配列を示す。
【図２】配列番号２に示されるワクモのフェリチン２と各種のダニのフェリチン２とのアミノ酸配列のアライメントである。
【図３】左のパネルはワクモのカテプシンＬ−２と大腸菌由来のＴｒｉｇｇｅｒ  Ｆａｃｔｏｒとの融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルの写真、及び右のパネルはワクモのフェリチン２と大腸菌由来のＴｒｉｇｇｅｒ  Ｆａｃｔｏｒとの融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルの写真である。
【図４】ワクモのカテプシンＬ−２の活性中心を含む部分と大腸菌由来のＴｒｉｇｇｅｒ  Ｆａｃｔｏｒとの融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルの写真である。
【図５】複数の異なる養鶏場から採取した３種類のワクモ及び対照であるトリサシダニの全ＲＮＡを鋳型とし、ワクモカテプシンＬ−２をコードする核酸が増幅されるように設計したプライマーセットａ）〜ｃ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す、アガロースゲル電気泳動写真である。上図の１〜３はワクモ、４はトリサシダニをそれぞれ示す。また下図は各プライマーセットの位置と増幅される断片の関係を示す模式図である。
【図６】ワクモカテプシンＬ−２又はワクモフェリチン２を免疫したニワトリから調製した試験血液を吸血したワクモについての、吸血開始から１週目及び３週目の死亡率（吸血して死亡したワクモ数／吸血したワクモ数）を示すグラフである。
【図７】ワクモカテプシンＬ−２又はワクモフェリチン２を免疫したニワトリから調製した試験血液を吸血したワクモについての、吸血開始から１４日目までの死亡率（吸血して死亡したワクモ数／吸血、非吸血を含むワクモ全数）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法に関する。
【００１５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、そのアミノ酸配列中に含まれる複数の特徴的なモチーフ配列から、システインプロテアーゼの一種であるカテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｌであることが確認された。なお、本発明においてクローニングされた核酸（配列番号３）には、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に１８アミノ酸残基からなるシグナル配列が付加されたタンパク質がコードされている。
【００１６】
ワクモからは既にカテプシンＬをコードする遺伝子がクローニングされ（Ｂａｒｔｌｅｙら、前記非特許文献５）、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）にアクセッションＮｏ．ＣＣＣ３３０６４．１として登録されているが、配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列はこのアクセッションＮｏ．ＣＣＣ３３０６４．１のそれと３０．６％の同一性しか示さない。なお、本明細書におけるアミノ酸配列の同一性とは、当業者によって通常用いられる適当なソフトプログラム、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などを用い、比較される配列をアラインメントしたときに得られる最大のパーセント配列同一性を意味する。
【００１７】
また、配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をクエリー配列として前記ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行ったところ、クエリー配列に対して、カブリダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００３７４５１４３．１、配列番号５）が７２．９％、シカダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００２４０３６５２．１、配列番号６）が５１．８％、コイタマダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＡＡＯ６００４５．１、配列番号７）が４６．６％の同一性をそれぞれ有することが確認されたが、ダニ目の生物においてこれら以上の同一性を示す既知のアミノ酸配列は検出されなかった。
【００１８】
以上から、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ワクモで特異的に発現している新規なカテプシンＬであることが確認された。以下、本明細書では、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる本発明のカテプシンをカテプシンＬ−２と称し、ＤｇＣａｔＬ−２と略記し、アクセッションＮｏ．ＣＣＣ３３０６４．１として登録されている既知のワクモのカテプシンＬをカテプシンＬ−１と称し、ＤｇＣａｔＬ−１と略記することとする。
【００１９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、そのアミノ酸配列中に含まれる特徴的なモチーフ配列から、鉄の輸送・貯蔵に関与するフェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）２であることが確認された。フェリチンはダニ類から哺乳動物に至るまで広く存在する鉄貯蔵タンパク質であり、ダニ類にはフェリチン１とフェリチン２が、哺乳動物にはダニ類のフェリチン１に相当するフェリチンがそれぞれ存在することが報告されている。本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるフェリチンは、フェリチン２に相当するタンパク質である。なお、本発明においてクローニングされた核酸（配列番号４）には、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端に１８アミノ酸残基からなるシグナル配列が付加されたタンパク質がコードされている。
【００２０】
配列番号４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をクエリー配列として前記ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行ったところ、クエリー配列に対して、カブリダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００３７３７３９８．１、配列番号８）が５９．０％、ヒツジダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＡＣＪ７０６５３．１、配列番号９）が４９．５％、シュルツェマダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＡＧＸ０１０００．１、配列番号１０）が４９．５％、フタトゲチマダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＢＡＮ１３５５２．１、配列番号１１）が４８．２％の同一性をそれぞれ有することが確認されたが、これら以上の同一性を示す既知のアミノ酸配列は検出されなかった。
【００２１】
以上から、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ワクモで特異的に発現している新規なフェリチン２であることが確認された。以下、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる本発明のフェリチン２をＤｇＦＥＲ２と略記することとする。
【００２２】
上記ＤｇＣａｔＬ−２及びＤｇＦＥＲ２は、いずれもワクモ体内に取り込まれた宿主の血液の消化及び吸収に関与するタンパク質であると予想される。また、その機能を阻害することができれば、ワクモの栄養摂取が不完全なものとなる結果、ワクモを防除することができると期待される。具体的には、ＤｇＣａｔＬ−２又はＤｇＦＥＲ２に対して特異的な免疫学的応答を示す様々な物質、例えば特異抗体、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＮＫＴ細胞などの産生を宿主の体内で誘導する、すなわちワクモ特異的な免疫応答を宿主に惹起させることにより、ワクモを防除することが可能となると期待される。
【００２３】
本発明では、ＤｇＣａｔＬ−２及びＤｇＦＥＲ２の他に、これらの免疫学的等価物を利用することもできる。本発明にいう免疫学的等価物とは、ＤｇＣａｔＬ−２又はＤｇＦＥＲ２を標的抗原としたワクモ特異的な免疫応答を家畜動物に惹起させることのできる免疫原性タンパク質又はポリペプチドを意味する。その様な免疫学的等価物の好ましい非限定的な例としては、下記のｂ）〜ｄ）、ｆ）〜ｈ）を挙げることができる。
【００２４】
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＣａｔＬ−２の欠失型又は置換型変異体に相当するタンパク質）又はそのポリペプチド断片。
【００２５】
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＣａｔＬ−２の挿入型変異体に相当するタンパク質）又はそのポリペプチド断片。
【００２６】
ｄ）ＤｇＣａｔＬ−２、前記ｂ）、ｃ）のタンパク質又はそれらのポリペプチド断片のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＣａｔＬ−２、前記ｂ）又はｃ）のタンパク質と他のタンパク質、ポリペプチド又はタグ配列との融合タンパク質）。
【００２７】
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＦＥＲ２の欠失型又は置換型変異体に相当するタンパク質）又はそのポリペプチド断片。
【００２８】
ｇ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＦＥＲ２の挿入型変異体に相当するタンパク質）又はそのポリペプチド断片。
【００２９】
ｈ）ＤｇＦＥＲ２、前記ｆ）、ｇ）のタンパク質又はそれらのポリペプチド断片のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＦＥＲ２、前記ｆ）又はｇ）のタンパク質と他のタンパク質、ポリペプチド又はタグ配列との融合タンパク質）。
【００３０】
本発明における前記融合タンパク質の一部として付加される任意のアミノ酸配列の代表例としては、ＤＹＫＤＤＤＤＫ、Ｈｉｓタグなどのタグ配列、大腸菌トリガーファクター、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ、蛍光タンパク質又はグルタチオンＳトランスフェラーゼなどのタンパク質のアミノ酸配列などを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００３１】
本発明は、ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及び／又はそれらの免疫学的等価物、好ましくは前記ｂ）〜ｄ）、ｆ）〜ｈ）のタンパク質などを、ワクモ特異的な免疫応答を宿主に惹起させるための抗原として利用する。かかる発明において、免疫学的等価物がＤｇＣａｔＬ−２のプロテアーゼ活性又はＤｇＦＥＲ２の鉄貯蔵タンパク質としての機能を保持していることは、必ずしも要求されない。
【００３２】
したがって、例えばＤｇＣａｔＬ−２又はＤｇＦＥＲ２の変異体に相当する免疫学的等価物において、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入の部位、変異後のアミノ酸残基の種類及び付加されるアミノ酸配列に、特別な制限はない。ただし、免疫学的等価物であるという条件において、変異体のアミノ酸配列は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、又は９０％以上、さらには９５％以上の同一性を有していることが望ましい。また、ポリペプチド断片は少なくとも１０アミノ酸残基以上、又は１５アミノ酸残基以上、さらに２０アミノ酸残基以上、さらには３０アミノ酸残基以上の長さを有するものであることが好ましい。
【００３３】
またＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物は、免疫原性を保持する限り、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、架橋剤その他の公知の化学物質によって修飾されていてもよい。タンパク質を修飾することのできる化学物質の選択とそれを用いた修飾は、当業者の通常の実施能力の範囲内で行うことができる。
【００３４】
本発明のＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物は、当業者に公知又は周知の遺伝子組換え手法を用いて製造することができる。かかる遺伝子組換え手法は、各種の教科書、ハンドブック、典型的にはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、ＡｕＳｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）に記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。また、市販の実験キット又は試薬を使用するときは、当該キット又は試薬の製造者が定めたプロトコルに従えばよい。
【００３５】
本発明におけるＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物は、一般的な遺伝子工学的方法によって、それらをコードする塩基配列を含む核酸を適切な発現ベクターに組み込み、宿主細胞内で発現させることで組換えタンパク質として製造することができる。発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモーター配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記核酸と機能的に連結され得る。
【００３６】
先に説明したように、本発明においてはＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物はプロテアーゼ活性又は鉄貯蔵タンパク質としての機能などの生理活性を保持していることは、必ずしも要求されない。そのため、これらタンパク質を遺伝子工学的手法で製造する場合も、前記生理活性を保持したタンパク質として発現させることも必要とされない。例えば、大腸菌を宿主細胞として異種タンパク質を発現させたときに発生し得るいわゆるインクルージョンボディの形態で、ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物を製造してもよい。
【００３７】
また、ポリペプチド断片のように比較的小さいタンパク質の場合は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって、又は市販のペプチドシンセサイザーを用いることによって化学的に合成してもよい。
【００３８】
さらに、ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物は、それぞれのＮ末端にシグナル配列を付加して組換え発現させてもよい。シグナル配列の例としては、ＤｇＣａｔＬ−２自体のシグナル配列（配列番号２４）、ＤｇＦＥＲ２自体のシグナル配列（配列番号２５）を利用することが好ましいが、使用する宿主細胞に応じて異なるシグナル配列を適宜利用してもよい。
【００３９】
本発明であるワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物、すなわち先に説明したＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む。
【００４０】
本発明は、ワクモの防除が求められる家畜に対して広く適用することができるが、ニワトリ、ヤケイ、アヒル、カモ、ガチョウ、ガン、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、キジ、キンケイ、ウズラなどの家禽、特に採卵用、肉用及び観賞用を含むニワトリに好ましく適用される。
【００４１】
ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する場合には、これらを賦形剤、アジュバントその他の薬学的に利用可能な成分と組み合わせて適当な剤形へと加工して利用することが好ましい。そのような加工は、当業者の通常の実施能力の範囲内で行うことができる。また投与ルートとしては、剤形に応じた適当な方法を選択すればよく、そのような方法としては点眼投与、点鼻投与、噴霧投与、散霧投与、飲水投与、経口投与、混餌投与、卵内接種、穿刺、筋肉注射、皮下注射などを挙げることができる。本発明において特に好ましい投与方法は穿刺、筋肉注射、皮下注射などである。
【００４２】
ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及び／又はそれらの免疫学的等価物が投与された家畜においてワクモ特異的な免疫応答が惹起されることは、ＤｇＣａｔＬ−２又はＤｇＦＥＲ２に免疫応答を示す特異抗体、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＮＫＴ細胞などの産生を、宿主の体内若しくは宿主から採取された末梢血又はリンパ液において検出することにより確認することができる。かかる抗体又は各種細胞の検出は、当業者の通常の実施能力の範囲内で行うことができる。
【００４３】
本発明は、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法において利用可能なＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物、これらをコードする核酸、発現ベクター及び形質転換された宿主細胞も提供する。これらはワクモ特異的な免疫応答を宿主に惹起させることのできるワクチンとして有用である。ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２、それらの免疫学的等価物、核酸、発現ベクター、宿主細胞などの詳細、さらにはそれらの製造方法などについては、好適な例も含め、先に説明したとおりである。前記核酸又は発現ベクター、特にニワトリ等の家畜の体内で機能する発現ベクターは、ワクモに対するいわゆるＤＮＡワクチンとしても利用可能である。
【００４４】
本発明におけるＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物を家畜に投与することで惹起されるワクモ特異的な免疫応答によるワクモの防除能は、簡便な方法によって評価することができる。具体的には、ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及びそれらの免疫学的等価物が投与されてから免疫応答の誘導に通常必要とされる時間飼育されたニワトリから回収した血液を用意し、これをワクモに吸血させた後、そのワクモの生死を経時的に判定する方法などによって評価することができる。この方法の場合、ワクモの吸血にはニワトリの皮膚が必要となるので、ニワトリの皮膚を隔壁の一部とし、その隔壁に接触するように前記血液を保持し、隔壁の反対側にワクモを放ち、隔壁を通じて自由に吸血できるようにしてワクモを飼育することのできる、人工的な吸血システムを用いることが好ましい。このようなシステムは、当業者の通常の実施能力の範囲内で構築し、また適宜変形して使用することが可能である。
【００４５】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞ＤｇＣａｔＬ−２のクローニング
１）ｃＤＮＡ合成
常法によって、ワクモ虫体から抽出したｍＲＮＡ画分を基にｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを鋳型として、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の３’ＲＡＣＥキット（３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を用いて、ワクモのアセチルコリンエステラーゼ（Ａｃｅ）をコードする遺伝子を増幅するために３’ＲＡＣＥを行った。Ａｃｅをコードする遺伝子を増幅するために設計したプライマーＦ１（配列番号１２）及びＡＵＡＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥキット（３’ＲＡＣＥ・５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓに含まれるプライマー）を用いて１ｓｔＰＣＲを行った。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として、Ａｃｅをコードする遺伝子を増幅するために設計した別のプライマーＦ２（配列番号１３）及びＡＵＡＰを用いて、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。【００４７】
２）ＤＮＡ断片の塩基配列解析と相同性検索
２回のＰＣＲによって得られた１．２ｋｂｐの増幅断片の塩基配列を決定し、これにコードされるアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴ検索を行って特徴的なモチーフまたはドメインの保存を解析したところ、カテプシンＬファミリーにおいて特徴的な３つのアミノ酸配列モチーフ（図１中の▼で示される部分に相当する）が存在することが確認された。【００４８】
３）完全長配列の決定
得られた塩基配列を基に、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の５’ＲＡＣＥキット（５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を用いて５’ＲＡＣＥを行い、全長ｃＤＮＡを特定した。この塩基配列をＤＮＡシーケンサーで決定したところ、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に１８アミノ酸からなるシグナル配列が付加されたタンパク質をコードする塩基配列（配列番号３）が確認された。【００４９】
さらに、決定された塩基配列にコードされるアミノ酸配列（シグナル配列を含む）をクエリー配列とし、ＧｅｎＢａｎｋに対してＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、クエリー配列に対して、カブリダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００３７４５１４３．１）が７２．９％、シカダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００２４０３６５２．１）が５１．８％、コイタマダニのカテプシンＬ（アクセッションＮｏ．ＡＡＯ６００４５．１）が４６．６％の同一性をそれぞれ有することが確認された。上記４種類のアミノ酸配列のアライメント結果を図１に示す。一方、クエリー配列は、既知のワクモ由来のカテプシンＬ（ＤｇＣａｔＬ−１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＣＣ３３０６４．１）とは３０．６％の同一性しか示さなかった。【００５０】
以上から、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＤｇＣａｔＬ−２）は、既知のワクモ由来のＤｇＣａｔＬ−１とは異なる、新規なタンパク質であると判断された。【００５１】
＜実施例２＞ＤｇＦＥＲ２のクローニング
１）完全長ＤｇＦＥＲ２の決定
常法によって、ワクモ虫体から抽出したｍＲＮＡ画分を基にｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを鋳型として、ダニ類のＦＥＲ２遺伝子の塩基配列を参考にして設計したプライマーＦ２（配列番号１４）及びプライマーＲ２（配列番号１５）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた増幅断片を基に、前記Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のキットを用いて５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥを行って得られた全長配列について、塩基配列を決定した。さらにこの配列を基に、配列番号１６に示されるプライマーＦ１及び配列番号１７に示されるプライマーＲ１を作製し、ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定して、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端に１８アミノ酸からなるシグナル配列が付加されたタンパク質をコードする塩基配列（配列番号４）が確認された。【００５２】
２）相同性検索
決定された塩基配列にコードされるアミノ酸配列（シグナル配列を含む）をクエリー配列とし、ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行った。その結果、クエリー配列に対して、カブリダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＸＰ＿００３７３７３９８．１）が５９．０％、フタトゲチマダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＢＡＮ１３５５２．１）が４８．２％、ヒツジダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＡＣＪ７０６５３．１）が４９．５％、シュルツェマダニのフェリチン２（アクセッションＮｏ．ＡＧＸ０１０００．１）が４９．５％の同一性をそれぞれ有することが確認された。以上の相同性検索の結果から、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ワクモのＦＥＲ２であると判断された。上記５種類のアミノ酸配列のアライメント結果を図２に示す。【００５３】
＜実施例３＞ＤｇＣａｔＬ−２及びＤｇＦＥＲ２の生産
実施例１で決定された配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを、大腸菌用発現ベクターであるｐＣｏｌｄ−ＴＦ（ＴａＫａＲａ社）に組み込んだ。同様に、実施例２で決定された配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ（ＴａＫａＲａ社）に組み込んだ。この遺伝子組換えにより、シグナル配列を除いたＤｇＣａｔＬ−２及びＤｇＦＥＲ２は、それぞれ大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター（Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）、分子量４８ｋＤａ）を可溶化タグとする融合タンパク質として発現される。【００５４】
コールドショックによって組み換えられた各遺伝子の発現を誘導した後、Ｈｉｓタグ配列に対するアフィニティークロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルを表す写真を図３に示す。【００５５】
また、ＤｇＣａｔＬ−２については、配列番号１の３１４番目〜Ｃ末端までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを前記ｐＣｏｌｄ−ＴＦに組み込んで、ＤｇＣａｔＬ−２の活性中心部位を含むペプチド断片とＴＦとの融合タンパク質を発現させた（図４）。この融合タンパク質をＨｉｓタグ配列に対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルを表す写真を図４に示す。【００５６】
＜実施例４＞ワクモにおけるＤｇＣａｔＬ−２の発現
それぞれ異なる３箇所の養鶏場から採取したワクモから全ＲＮＡ画分を調製した。配列番号１８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１９に示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセットａ、配列番号２０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２１に示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセットｂ、配列番号２２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２３に示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセットｃを用意し、前記全ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅断片についてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図５に示す。【００５７】
３つのワクモいずれについても、またプライマーセットａ〜ｃのいずれについても、想定される大きさの増幅断片が検出された。一方、対照として採取したトリサシダニの全ＲＮＡに対して同様にＲＴ−ＰＣＲを行ったが、増幅断片は検出されなかった。【００５８】
＜実施例５＞ワクチン投与試験
１）組換えタンパク質免疫血漿の作製
ＴＦ、実施例３で精製したＴＦとＣａｔＬ−２との融合タンパク質（ＴＦ−ＣａｔＬ２）、ＴＦとＣａｔＬ−２の活性中心部を含むペプチド断片との融合タンパク質（ＴＦ−ＣａｔＬ２ＰＤ）及びＴＦとＤｇＦＥＲ２との融合タンパク質（ＴＦ−ＦＥＲ２）を、それぞれ０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液に溶解した。【００５９】
各溶液１００μＬに同量のゲルブアジュバンド（ＧＥＲＢＵ社）を加えて、２日齢のボリスブラウン種ニワトリ（ｎ＝２〜４）に一羽につき２００μＬずつ腹腔内に投与した。初回免疫を０日として、免疫２週後に初回免疫と同様に追加免疫を行い、さらに３週間飼育した。免疫ニワトリは麻酔下心採血にて安楽殺した。ヘパリンにより抗凝血処理した血液を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心処理し、得られた血漿を−８０℃で保存した。別途、ワクモ未吸血ニワトリから血液を採取してヘパリンによる抗凝血処理を行い、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心処理して血漿を除去して血球成分を回収した。この血球成分と前記免疫ニワトリから調製して保存した血漿とを混合して、試験血液とした。【００６０】
また、同種のニワトリの腹部の羽毛を除去し、剥離した表皮をエタノール中に浸漬し４℃で保存後、エタノールをＰＢＳに置換し、３回洗浄した後、皮下脂肪を除去し、大きな毛孔を避けて約２ｃｍ四方の大きさになるように切断して、ニワトリ表皮を調製した。【００６１】
２）インビトロフィーディングアッセイ
５０ｍＬチューブ内で３週間程度、飢餓状態で維持したワクモを氷上シャーレ上に開放し、動きが活発である個体をろ紙に移し、ろ紙ごとセルストレーナーキャップ付５ｍＬラウンドチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社）に移した。このとき、チューブ内のワクモの数は、第二若個体と成個体の合計が１０〜２０匹になるようにした。ラウンドチューブの口を、上記１）で調製したニワトリ表皮で蓋をし、先端を切断加工した５ｍＬシリンジを表皮の上からかぶせた。【００６２】
上記１）で調製した試験血液２ｍＬを３７℃に加温した後、シリンジに加え、チューブをやや傾けた状態でラックにたて掛け、発泡スチロール箱内に静置した。発泡スチロール箱は３７℃のインキュベーター内に接地して、箱内温度３５℃以上、湿度７０〜９０％にそれぞれ保持した。このようにして、ニワトリ表皮越しに試験血液をワクモに吸血させた。【００６３】
静置から１４時間後、試験血液を捨てシリンジのみをはずし、チューブの底を軽く叩いてニワトリ表皮に付着しているワクモを落としてからニワトリ表皮を外し、セルストレイナー付きキャップで蓋をした。吸血して腹部が赤色に変化したワクモ数を計測した後、チューブ内でワクモをさらに３週間維持した。１週目及び３週目の時点で吸血して死亡したワクモ数を計測し、吸血したワクモ全数に対する吸血して死亡したワクモ数から死亡率を算出した。その結果を図６に示す。【００６４】
３）ボリスブラウン種ニワトリをＰＮＰ／ＤＯ種ニワトリに代えて、上記１）及び２）と同様のワクチン効果試験を行った。ただしこの試験では、吸血終了後から１４日間にわたり毎日、吸血、未吸血を問わずに死亡したワクモ数を計測し、さらに最終日にラウンドチューブに２ｍＬのエタノールを加えてワクモを固定して、チューブ内のワクモ総数を実体顕微鏡下で数え、ワクモ総数に対する死亡ワクモ数から、各日の死亡率を算出した。その結果を図７に示す。【００６５】
図６及び図７に示されるように、各種の組換えタンパク質で免疫されたニワトリ血液は殺ワクモ活性を有すること、及びＣａｔＬ−２で免疫されたニワトリの血液はＤｇＦＥＲ２で免疫されたニワトリの血液よりも殺ワクモ活性が高いことが、それぞれ確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
ＤｇＣａｔＬ−２及びＤｇＦＥＲ２はいずれもワクモの栄養分の消化・貯蔵に関わる因子であり、その機能阻害はワクモの発育や繁殖に大きな影響を与えると考えられることから、ＤｇＣａｔＬ−２、ＤｇＦＥＲ２及び／又はそれらの免疫学的等価物は、これまでに報告されていない新たな抗ワクモワクチンの候補抗原としての応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月26日(2016.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
下記のａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ａ）〜ｃ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
請求項５に記載のいずれかのタンパク質又はそのポリペプチド断片をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項５に記載のタンパク質及び／若しくはポリペプチド断片、又は請求項７に記載の核酸及び／若しくは請求項８に記載の発現ベクターを含む、家畜用抗ワクモワクチン。
【請求項１０】
請求項９に記載の家畜用抗ワクモワクチンを家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月29日(2016.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又はそれらの免疫学的等価物を家畜に投与する工程を含む、ワクモに対して特異的な免疫応答を家畜に惹起させる方法。
【請求項２】
免疫学的等価物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
それらのポリペプチド断片
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫学的等価物が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列
配列番号２に示されるアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質
である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下記のａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ａ）〜ｃ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
下記のｅ）〜ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質又は下記ｅ）〜ｇ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の免疫学的等価物であるタンパク質又はポリペプチド断片。
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され又は置換されたアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
ｈ）ｅ）〜ｇ）のいずれかのアミノ酸配列又はそれらの部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【請求項７】
請求項５又は６で規定されるいずれかのタンパク質又はそのポリペプチド断片をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項５及び／若しくは請求項６で規定されるタンパク質及び／若しくはポリペプチド断片、又は請求項７で規定される核酸及び／若しくは請求項８で規定される発現ベクターを含む、家畜用抗ワクモワクチン。
【国際調査報告】
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2015182754.tif 000011
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