(57)【要約】  本発明の目的は、Ｘ線結晶構造解析法において、目的のタンパク質の結晶化を促進するための、汎用性があり、かつ効率的な方法を提供することである。  前記課題は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末側から１〜１８個のアミノ酸が欠失、及び／若しくはＣ末側から１〜３個のいずれかのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、によって解決することができる。
2014181786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末側から１〜１８個のアミノ酸が欠失、及び／若しくはＣ末側から１〜３個のいずれかのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（４）前記ポリペプチド（１）、ポリペプチド（２）、又はポリペプチド（３）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に直接若しくはペプチドリンカーを介して融合させた融合タンパク質として発現させた場合に当該融合タンパク質の結晶化を促進する活性を示す、改変体ポリペプチド。
【請求項２】
前記改変体ポリペプチドが、配列番号３、又は４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドが、タンパク質のＣ末端又はＮ末端に、直接又はペプチドリンカーを介して融合した、融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリペプチド又は請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞。
【請求項７】
請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、及び
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、
を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、及び
精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、
を含む請求項７に記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、
精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、
精製された融合タンパク質を結晶化させる工程、及び
Ｘ線照射によりタンパク質結晶を確認する工程、
を含むタンパク質結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の結晶化を促進することのできるポリペプチド及びタンパク質の結晶化方法に関する。本発明によれば、Ｘ線結晶構造解析法に用いるためのタンパク質結晶を容易に得ることができる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の構造解析にはＸ線結晶構造解析法、ＮＭＲ法、又は電子顕微鏡による解析が主に使用されている。その中で、Ｘ線結晶構造解析法は、電子顕微鏡よりも精度の高い分子像が得られる。また、ＮＭＲ法と比べて分子量が大きな分子においても適用可能である。従って、Ｘ線結晶構造解析法は、タンパク質の構造解析法として、汎用されている。しかし、Ｘ線結晶構造解析法によるタンパク質の分析のためには、タンパク質を結晶化する必要がある。単分子のタンパク質は、Ｘ線散乱が弱く強度が低いため、構造を解析することができない。タンパク質の結晶では、回折光が増幅されるため、散乱強度を測定することができ、それにより電子密度を計算することによって、タンパク質分子の構造モデルを作製することが可能となる。【０００３】
しかしながら、タンパク質の結晶化はＸ線結晶構造解析法でも一番の難関である。タンパク質の結晶化条件は、例えば同じファミリーに属するタンパク質同士でも大きく異なり、ｐＨや沈殿剤濃度の変化に非常に敏感である。また、タンパク質の結晶化のメカニズムは現在でも明らかになっていない。そのため、タンパク質の結晶化には、大量の条件検討を行う必要があり、多大な労力、時間、及び費用がかかる。そして、Ｘ線結晶構造解析法においては、良質の結晶が得られないために、構造解析ができないタンパク質も多い。
Ｘ線結晶構造解析法に用いるタンパク質結晶を得るために、多数の結晶化条件を検討するための結晶化キットが開発され、また結晶化ロボットを用いる条件検討が行われている。更に、無重力場（宇宙空間）での結晶化、磁場又はレーザー照射による結晶化などが検討されているが、いずれも十分な効果を挙げているとは言いがたいものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１３１１６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイト・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」２００６年（米国）、第１０３巻、ｐ．１６２３０−１５２３５
【非特許文献２】「プロテイン・サイエンス（Protein Science）」２０１１年（米国）、第２０巻、ｐ．１８７６−１８９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析法に用いるタンパク質の結晶化について鋭意検討したところ、タンパク質結晶系には２回もしくは３回回転軸を持つものは全体の８０％となっていることに気が付いた。すなわち、回転対称を持つニ量体又は三量体タンパク質は、単量体タンパク質よりも結晶化しやすいと考えられた。また，本発明者らは解析された構造からポリペプチドを用いて、二量体及び三量体タンパク質を人工的に形成させる可能性を見出した（特許文献１）。
タンパク質を二量体化する方法として、リゾチーム（目的タンパク質）にシステインの変異を導入し、ニ量体化することによって、結晶化が促進されることが開示されている（非特許文献１）。更に、リゾチーム又はマルトース結合タンパク質に、一対のヒスチジン、又はシステインの変異を導入し、金属イオンによりタンパク質をニ量体化することが開示されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの方法は、目的のタンパク質ごとに、構造などに基づいて変異を導入するアミノ酸を検討する必要があり、すべてのタンパク質に汎用できる方法ではなかった。更に、結晶化させるタンパク質自体に変異を導入するものであるため、変異の導入によりタンパク質の構造が変化する可能性があった。従ってこれらの方法は、タンパク質のＸ線結晶構造解析法に最適なものではなかった。【０００７】
本発明の目的は、Ｘ線結晶構造解析法において、目的のタンパク質の結晶化を促進するための、汎用性があり、かつ効率的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、Ｘ線結晶構造解析法における目的のタンパク質の結晶化を促進する方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定の配列のアミノ酸からなるポリペプチドを目的のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合させることにより、目的のタンパク質の結晶化が効果的に促進されることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末側から１〜１８個のアミノ酸が欠失、及び／若しくはＣ末側から１〜３個のいずれかのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（４）前記ポリペプチド（１）、ポリペプチド（２）、又はポリペプチド（３）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に直接若しくはペプチドリンカーを介して融合させた融合タンパク質として発現させた場合に当該融合タンパク質の結晶化を促進する活性を示す、改変体ポリペプチド、
［２］前記改変体ポリペプチドが、配列番号３、又は４で表されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のポリペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のポリペプチドが、タンパク質のＣ末端又はＮ末端に、直接又はペプチドリンカーを介して融合した、融合タンパク質、
［４］［１］又は［２］に記載のポリペプチド又は［３］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、
［６］［５］に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞、
［７］［３］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、及び前記発現した融合タンパク質を精製する工程、を含む融合タンパク質の製造方法、
［８］［３］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、及び精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、を含む［７］に記載の融合タンパク質の製造方法、及び
［９］［３］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、精製された融合タンパク質を結晶化させる工程、及びＸ線照射によりタンパク質結晶を確認する工程、を含むタンパク質結晶の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリペプチドによれば、特定の配列のアミノ酸からなるポリペプチドを、目的のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合させることにより、目的のタンパク質の結晶化を促進することができる。特に、配列番号１、３、又は４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドは、タンパク質の結晶化を促進することが可能である。本発明のポリペプチドと融合するタンパク質は、ネイティブ（野生型）タンパク質と比較して、優れた結晶化能を有するものである。本発明のポリヌクレオチド、組換えベクター、及び形質転換細胞は、本発明の融合タンパク質を調製するためのツールとし、非常に有用なものである。また、本発明のタンパク質結晶の製造方法によれば、従来のタンパク質工学的な結晶化方法と比較して、多くのタンパク質に適用可能であり、汎用性のあるタンパク質結晶の製造方法である。特に本発明のポリペプチドに融合するタンパク質結晶の製造方法は、難結晶化タンパク質を結晶化することが可能である。
例えば、全く結晶化が起こらないタンパク質が、本発明のポリペプチドに融合することにより、１つの結晶化条件であっても結晶化が起きるならば、そのタンパク質のＸ線結晶構造解析が可能になる。すなわち、本発明のポリペプチドに融合するタンパク質が、後述の結晶化条件のスクリーニングにおいて、結晶化できる条件が、１つでも見出されることは、タンパク質の結晶化促進においては、十分な効果である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の２ＲＳ１タグ（ポリペプチド１）の構造の模式図である。
【図２】本発明のポリペプチド２の構造の模式図である。
【図３】本発明の改変体ポリペプチド（ポリペプチド４）の１つの実施態様のアミノ酸配列を示した図である。
【図４】ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質を発現するｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクター（Ａ）及びＰＨ０８２８／２ＲＳ１融合タンパク質を発現するｐＥＴ２２−ＰＨ０８２８／２ＲＳ１ベクター（Ｂ）の構造を模式的に示した図である。
【図５】比較例である２ＲＳ２タグ（Ａ）、２ＲＳ３タグ（Ｂ）、２ＲＳ４タグ（Ｃ）、及び２ＲＳ５タグ（Ｄ）の構造の模式図である。
【図６】ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質（実施例１）、ＭＢＰ／２ＲＳ２融合タンパク質（比較例１）、ＭＢＰ／２ＲＳ３融合タンパク質（比較例２）、ＭＢＰ／２ＲＳ４融合タンパク質（比較例３）、ＭＢＰ／２ＲＳ５融合タンパク質（比較例４）、タグの融合していないＭＢＰ（比較例５）のゲルろ過クロマトグラフィーによる２量体化の解析結果を示した図である。
【図７】ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質（実施例１）の結晶化スクリーニングにより、結晶化が認められた６つの結晶化条件における結晶の写真である。
【図８】ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質結晶のＸ線回折写真（左）と構造解析で得られた構造の模式図（右）である。
【図９】ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質のＸ線結晶構造解析で得られた構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末側から１〜１８個のアミノ酸が欠失、及び／若しくはＣ末側から１〜３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（４）前記ポリペプチド（１）、ポリペプチド（２）、又はポリペプチド（３）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に直接若しくはペプチドリンカーを介して融合させた融合タンパク質の結晶化を促進する活性を示す、改変体ポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、任意のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に直接又はリンカー（数残基）を介して融合することによって、タンパク質の結晶化を促進することのできるタグポリペプチドである。（以下、前記（１）〜（４）のポリペプチドを、結晶化促進タグポリペプチドと称することがある。）
【００１２】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ポリペプチド１又は２ＲＳ１タグと称することがある）は、End−Binding 1（Eb1）タンパク質の部分ペプチドである。End−Binding 1は、細胞内微小管の伸長端に結合し、癌抑制遺伝子ＡＰＣ（Adenomatous Polyposis Coli）タンパク質に結合するタンパク質である。しかしながら、その詳細な機能は明らかではない。本発明の２ＲＳ１タグは、このEb1タンパク質の部分ペプチドであるが、任意のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に直接又はリンカーを介して融合することによって、タンパク質の結晶化を促進することができる結晶化促進タグとして用いることができる。
ポリペプチド１は４５アミノ酸からなり、具体的なアミノ酸配列は、EDLEKERDFY FGKLRNIELI CQENEGENDP VLQRIVDILY ATDEG（配列番号１）である。ポリペプチド１は、図１に示したような構造を有していると推定される。
【００１３】
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ポリペプチド２と称することがある）は、End−Binding 1（Eb1）タンパク質の部分ペプチドである。前記ポリペプチド１より、Ｎ末端側に１８アミノ酸が付加され、Ｃ末端側に３アミノ酸が付加された６６アミノ酸からなるポリペプチドであり、タンパク質の結晶化を促進する活性を示す。具体的なアミノ酸配列は、DDEAAELMQQ VNVLKLTVED LEKERDFYFG KLRNIELICQ ENEGENDPVL QRIVDILYAT DEGFVI（配列番号２）であり、ポリペプチド２は、図２に示した構造を有していると推定される。
【００１４】
（３）ポリペプチド１及びポリペプチド２の中間鎖長のペプチド
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末側から１〜１８個のアミノ酸が欠失、及び／若しくはＣ末側から１〜３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ポリペプチド３と称することがある）は、End−Binding 1（Eb1）タンパク質の部分ペプチドである。すなわち、ポリペプチド１及びポリペプチド２の中間鎖長のポリペプチドであり、タンパク質の結晶化を促進する活性を示す。Ｎ末端側からの欠失することのできるアミノ酸数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８である。また、Ｃ末端側からの欠失することのできるアミノ酸数は、１、２、又は３である。従って、ポリペプチド３に含まれる結晶化促進タグポリペプチドの鎖長は、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、又は４５である。なお４５アミノ酸の鎖長のポリペプチドは、ポリペプチド１と同じである。
【００１５】
（４）改変体ポリペプチド
改変体ポリペプチド（以下、ポリペプチド４と称することがある）は、前記ポリペプチド（１）、ポリペプチド（２）、又はポリペプチド（３）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に直接若しくはペプチドリンカーを介して融合させた融合タンパク質の結晶化を促進する活性を示す。
【００１６】
本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、更により好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００１７】
本発明の改変体ポリペプチドは、タンパク質の結晶化を促進する活性を有する。ポリペプチドの欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変は、改変前のポリペプチドの結晶化促進活性を改良する改変（改良改変）でもよく、結晶化促進活性を維持する改変（維持改変）でもよい。
【００１８】
改良改変によって得られた改変体ポリペプチドとしては、例えば配列番号３、又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。具体的なアミノ酸配列は、EDLEKELDFY FGKLRNIELI CQENEGENDP VLQRIVDILY ATDEG（配列番号３）、EDLEKERDFL FGKLRNIELI CQENEGENDP VLQRIVDILY ATDEG（配列番号４）である。欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変が、改良改変であることは、親のポリペプチドの結晶化促進活性と比較して、結晶化促進活性が向上していることによって確認することができる。例えば、結晶化条件のスクリーニングにおいて、親のポリペプチドが融合したタンパク質より、改変体ポリペプチドの融合したタンパク質が多くの結晶化条件で結晶化が確認できた場合、改良改変であると判断することができる。
また、改良改変に用いられる置換は、結晶化促進活性が向上する限りにおいて、限定されるものではないが、coiled-coilの規則を維持する頻度の高いアミノ酸残基への置換が好ましい。また、欠失、挿入、及び／又は付加されるアミノ酸も、結晶化促進活性が向上する限りにおいて、限定されるものではないが、coiled-coilの規則を維持する頻度の高いアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加が好ましい。
【００１９】
また、維持改変は親ポリペプチドの結晶化促進活性を維持する改変である。維持改変に用いられる置換は、結晶化促進活性が維持される限りにおいて、限定されるものではないが、coiled-coilの規則を維持する頻度の高いアミノ酸残基への置換が好ましい。また、欠失、挿入、及び／又は付加されるアミノ酸も、結晶化促進活性が維持される限りにおいて、限定されるものではないが、coiled-coilの規則を維持する頻度の高いアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加が好ましい。欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変が、維持改変であることは、親のポリペプチドの結晶化促進活性と比較して、結晶化促進活性が同等であることによって確認することができる。また、親のポリペプチドの結晶化促進活性と比較して、結晶化促進活性が低下していても、親のポリペプチドが融合していない目的のタンパク質の結晶化よりも優れている場合は、維持改変であると判断することができる。例えば、結晶化条件のスクリーニングにおいて、本発明のポリペプチドが融合していないタンパク質より、改変体ポリペプチドの融合したタンパク質が多くの条件で結晶化が確認できた場合、維持改変であると判断することができる。
【００２０】
本発明の改変体ポリペプチドは、常法、例えば部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis）により、ポリペプチド１〜３をコードするポリヌクレオチドに変異を導入し、改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを発現させることによって取得することができる。特には、改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを融合し、融合タンパク質として発現させることが好ましい。発現した融合タンパク質が、例えば、結晶化条件のスクリーニング方法により、結晶化促進活性を有することを確認することにより、所望の改変体ポリペプチドを取得することができる。
【００２１】
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、前記結晶化促進タグポリペプチドが、タンパク質のＣ末端又はＮ末端に、直接又はペプチドリンカーを介して融合したものである。本発明の融合タンパク質は、結晶化促進タグペプチドの融合していないネイティブタンパク質と比較して、結晶化されやすいタンパク質である。なお、本発明の融合タンパク質は、本発明のポリペプチドと、End−Binding １と異なるタンパク質とを融合させるものである。すなわち、本発明の融合タンパク質は、End−Binding １を含むものではない。
【００２２】
実施例１で得られたＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質及び実施例３で得られたＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質は、後述のようにＸ線結晶構造解析され、それぞれ図８及び図９で示された構造を有していると考えられた。更に、実施例４で得られたＭＢＰ／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質は、２．３Åの分解能で、そしてＰＨ０８２８／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質は、３．５Åの分解能で、構造解析に成功した。
【００２３】
（目的のタンパク質）
結晶化促進タグポリペプチドを融合させる目的のタンパク質は、結晶化させるタンパク質であり、特に限定されるものでないが、例えばマルトース結合タンパク質（maltose binding protein）、又はＰＨ０８２８を挙げることができる。また、限定されるものではないが、目的のタンパク質として、溶液中で単量体として存在するタンパク質を挙げることができる。単量体として存在するタンパク質は、本発明の結晶化促進タグポリペプチドと融合タンパク質を形成した場合に、結晶化が促進されるからである。
更に、本発明によると、難結晶化するタンパク質、いわゆる結晶化し難いタンパク質を結晶化することも可能である。難結晶化するタンパク質としては、例えばＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺを挙げることができる。
【００２４】
（リンカーペプチド）
本発明の融合タンパク質において、目的タンパク質及び結晶化促進タグポリペプチドは、リンカーペプチドによって融合することができる。すなわち、目的タンパク質のＮ末端（アミノ末端）側、又はＣ末端（カルボキシル末端）側において、リンカーペプチドを介して結晶化促進タグポリペプチドが目的タンパク質に融合することができる。リンカーペプチドは、限定されるものではないが、目的のタンパク質の結晶化を阻害しないものが好ましい。リンカーペプチドの鎖長は、１〜２０が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜５がより好ましく、１〜３が更に好ましい。具体的なアミノ酸配列としては、「ＡＡＡ」、「ＡＧＡ」、「ＡＳＡ」、「ＡＮＡ」、「ＧＡＧ」、「ＧＳＧ」、「ＧＮＧ」、「ＡＧ」、「ＡＳ」、「ＡＮ」、「ＡＬ」、「ＡＥ」、「ＧＳ」、「ＧＮ」、「Ａ」、「Ｇ」、「Ｓ」、又は「Ｌ」を挙げることができる。
【００２５】
（結晶化促進活性）
本明細書において「タンパク質の結晶化を促進する」とは、従来結晶化できなかったタンパク質を結晶化できるようにすること、又はタンパク質の結晶化の効率を向上させることを意味する。
例えば、タンパク質の結晶化の効率は、結晶化条件のスクリーニングによって検討することが可能である。タンパク質の結晶化は、緩衝液のｐＨ、塩の種類、塩濃度、沈殿剤の種類、及び沈殿剤濃度などに敏感に影響を受ける。従って、通常タンパク質ごとに、結晶化条件のスクリーニングを行う。
タンパク質の結晶化条件のスクリーニングは、緩衝液のｐＨ、塩の種類、塩濃度、沈殿剤の種類、及び沈殿剤濃度などを組み合わせた複数の条件において結晶化の有無を検討することによって行う。結晶化が起こるタンパク質の濃度も、タンパク質によって異なるが、例えば５〜５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を用いることが多い。結晶化の方法としては、限定されるものではないが、例えばハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）蒸気拡散法、又はシッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）蒸気拡散法を用いることができる。結晶化条件のスクリーニングの温度は、特に限定されるものではないが、例えば１〜３０℃程度で行うことができる。タンパク質の結晶化は、温度にも影響を受けるので、例えば４℃及び２０℃で行うことが好ましい。結晶化条件のスクリーニングの時間も、限定されるものではなく、１日〜１ヶ月程度行うことができるが、１日、３日、７日、１４日、及び２８日にプレートを観察することが好ましい。
【００２６】
タンパク質の結晶化条件のスクリーニングは、市販のキットを用いて行うことができる。市販のスクリーニングキットとしては、例えばQIAGEN社、HAMPTON RESEARCH社、Molecular Dimensions社、Emerald BioSystems社、又はJena Bioscience社から市販されているスクリーニングキットを用いることができる。
結晶化条件のスクリーニングにおいて、結晶化促進タグポリペプチドが融合しておらずそして結晶化できなかった親のタンパク質と比較して、本発明の融合タンパク質が結晶化した場合、タンパク質の結晶化が促進されたと判断できる。また、親のタンパク質と比較して、結晶化する条件が増加した場合も、タンパク質の結晶化が促進されたと判断できる。
単量体では結晶化が起こらないタンパク質が２量体化し、１つの条件でも結晶化が起きることにより、Ｘ線結晶構造解析が可能になる。従って、例えば結晶化条件のスクリーニングによって、１つでも結晶化条件が見出されることは、十分な効果である。
【００２７】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、タグポリヌクレオチドと称することがある）、又は本発明の融合したタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、融合ポリヌクレオチドと称することがある）である。融合ポリヌクレオチドは、タグポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、目的ポリヌクレオチドと称することがある）が融合したものである。融合ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド上にタグ及び目的ポリヌクレオチドが融合するものである。
更に、融合ポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド（以下、リンカーヌクレオチドと称することがある）を含んでもよい。すなわち、タグポリヌクレオチドは、目的ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に、リンカーヌクレオチドを介して融合することができる。
【００２８】
（タグポリヌクレオチド）
本発明のタグポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする限りにおいて、限定されるものではなく、タグポリヌクレオチドは、ポリペプチドのアミノ酸に対応するコドンの組み合わせからなるすべてのポリヌクレオチドを含む。
例えば、ポリペプチド１（２ＲＳ１タグ）をコードするポリヌクレオチド（以下、タグポリヌクレオチド１と称することがある）の例として、限定されるものではないが、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。また、ポリペプチド２をコードするポリヌクレオチド（以下、タグポリヌクレオチド２と称することがある）の例として、限定されるものではないが、配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。更に、ポリペプチド４（改変体ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド（以下、タグポリヌクレオチド４と称することがある）の例として、限定されるものではないが、配列番号７、及び８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、ポリペプチド３をコードするポリヌクレオチドをポリヌクレオチド３と称することがある。
【００２９】
前記ポリヌクレオチド１〜３は、常法に従って取得することができる。例えば、End−Binding 1（Eb1）タンパク質を発現している細胞（例えばＨeLa細胞）から、アシッドグアニジニウム−フェノール−クロロホルム（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法にて全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡよりｍＲＮＡ単離キットを用い、メーカーの推奨する方法に従ってポリＡ＋ＲＮＡを精製する。その後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂ等を担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、又はバッチ法によりポリＡ＋ｍＲＮＡを得る。このようにして選られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを合成することによって、End−Binding 1（Eb1）タンパク質をコードしているｃＤＮＡを得ることができる。このｃＤＮＡを鋳型として適当なプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ポリヌクレオチド１〜３を取得することが可能である。ＰＣＲによりポリヌクレオチドの両末端に制限酵素サイトを導入することにより、容易にベクターにクローニングすることができる。また、細胞から取得した前記全ＲＮＡより、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ポリヌクレオチド１〜３を取得することも可能である。
【００３０】
前記ポリヌクレオチド４は、部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis）により、前記ポリヌクレオチド１〜３に変異を導入することによって取得することができる。得られたポリヌクレオチドと、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを融合し、融合タンパク質として発現させる。発現した融合タンパク質が、例えば、結晶化条件のスクリーニング方法により、結晶化促進活性を有することを確認することにより、所望のポリヌクレオチド４を取得することができる。
また、本発明のタグポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成によって調製することも可能である。また、ＤＮＡ合成とＰＣＲなどの方法を組み合わせて調製することも可能である。
【００３１】
（目的ポリヌクレオチド）
本発明の融合ポリヌクレオチドに用いる目的ポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、常法に従って取得することができる。
例えば、目的のタンパク質を発現している細胞から、アシッドグアニジニウム−フェノール−クロロホルム（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法にて全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡよりｍＲＮＡ単離キットを用い、メーカーの推奨する方法に従ってポリＡ＋ＲＮＡを精製する。その後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂ等を担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、又はバッチ法によりポリＡ＋ｍＲＮＡを得る。このようにして選られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを合成することによって、目的のタンパク質をコードしているｃＤＮＡを得ることができる。例えば、前記ｃＤＮＡを鋳型として適当なプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ポリヌクレオチドの両末端に制限酵素サイトが導入された遺伝子断片を取得し、ベクターにクローニングすることができる。また、細胞から取得した前記全ＲＮＡより、ＲＴ−ＰＣＲ法により、目的ポリヌクレオチドを取得することも可能である。
【００３２】
（融合ポリヌクレオチド）
本発明の融合ポリヌクレオチドは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであるが、具体的には、前記目的ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端にタグポリヌクレオチドが融合したものである。タグポリヌクレオチドは、目的ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に、リンカーヌクレオチドを介して融合してもよい。タグポリヌクレオチドの目的タンパク質への融合、及びリンカーヌクレオチドの導入などは、制限酵素での切断、ライゲーション、及びＰＣＲなどの公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００３３】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、本発明のタグポリヌクレオチドを含むベクター（以下、タグベクターと称することがある）、又は本発明の融合ポリヌクレオチドを含むベクター（以下、融合タンパク質ベクターと称することがある）である。
タグベクターは、融合タンパク質ベクターを構築するために用いることができ、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを容易に導入できる制限酵素サイトを有するものが好ましい。また、タグベクターは、限定されるものではないが、融合タンパク質を発現することができるように発現用のプロモーターを含む発現用のカセットを有するものが好ましい。
融合タンパク質ベクターは、限定されるものではないが、融合タンパク質を発現するための発現ベクターが好ましい。融合タンパク質ベクターは、前記タグベクターに前記目的ポリヌクレオチドを導入することによって構築することができる。また、通常のベクターに、本発明の融合ポリヌクレオチドを導入することによって構築することができる。
【００３４】
本発明の組換えベクターに用いることのできるベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、ウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００３５】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を挙げることができる。
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌｉＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての角多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げることができる。
【００３６】
（形質転換細胞）
本発明の形質転換細胞は、前記組換えベクターを含む細胞である。すなわち、本発明の形質転換細胞は、前記タグベクター又は融合タンパク質ベクターを含む。
本発明の組換えベクターを含む宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等を用いることができる。
【００３７】
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００３８】
（作用）
本発明の結晶化促進タグポリペプチドが、タンパク質の結晶化を促進する機構は、タンパク質を２量体化することによって、対称なタンパク質２量体を得て、タンパク質の結晶化を促進するものと考えられる。しかしながら、比較例に示すように、２量体化したタンパク質のすべてにおいて、結晶性が改善するわけではない。本発明の結晶化促進タグポリペプチドは、タンパク質の結晶化において、優れた効果を有しているものである。
【００３９】
［２］融合タンパク質の製造方法
本発明の融合タンパク質の製造方法は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、及び前記発現した融合タンパク質を精製する工程を含み、好ましくは、更に精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、を含む。
また、本発明の融合タンパク質結晶の製造方法は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、前記発現した融合タンパク質を精製する工程、精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、精製された融合タンパク質を結晶化させる工程、及びＸ線照射によりタンパク質結晶を確認する工程、を含む。
【００４０】
（１）ベクター構築工程
本発明の融合タンパク質の製造方法におけるベクター構築工程は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程である。すなわち、前記融合タンパク質ベクターを構築する工程である。
融合タンパク質ベクターの構築の手順は、特に限定されるものではなく、例えば前記タグポリヌクレオチドを含むタグベクターに、前記目的ポリヌクレオチドを組込んでもよく、通常の発現ベクターに融合ポリヌクレオチドを組込んでもよく、通常の発現ベクターにタグポリヌクレオチド及び目的ポリヌクレオチドを同時に組込んでもよい。これらのポリヌクレオチドのベクターへの組み込みは、ＰＣＲ、制限酵素での切断、ライゲーションなどの公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００４１】
（２）発現工程
本発明の融合タンパク質の製造方法における発現工程は、組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程である。発現工程は、限定されるものではないが、構築された融合タンパク質ベクターを、公知の形質転換方法を用いて宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養することによって、実施することができる。
【００４２】
形質転換細胞の培地、培養条件は、公知の方法により適宜選択して用いることができる。すなわち、細胞に応じて培地を選択することができる。例えば、大腸菌の場合について記載すると、大腸菌は通常用いられるＬ培地、ＹＴ培地、Ｍ９−ＣＡ培地などで培養すればよい。融合タンパク質ベクターは薬剤耐性遺伝子を持って場合は、それに対応する薬剤を適当な濃度になるように添加することが望ましい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する融合タンパク質ベクターを用いた形質転換細胞を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを有する融合タンパク質ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを有する融合タンパク質ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４３】
（３）精製工程
本発明の融合タンパク質の製造方法における精製工程は、形質転換細胞によって発現した融合タンパク質を精製する工程である。
融合タンパク質の精製方法は、特に限定されるものではなく、公知の技術、すなわちリゾチーム処理、超音波破砕、遠心分離、塩析法、脱塩法、沈殿法及び各種クロマトグラフィーを組み合わせて行うことができる。
【００４４】
具体的には、本発明の融合タンパク質が、形質転換細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、形質転換細胞を遠心分離により回収し、緩衝液に懸濁して、ホモジナイザー、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。更に、前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法で用いられる手法により精製した融合タンパク質を得ることもできる。緩衝液には、融合タンパク質の失活を防ぐため、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを添加することができる。更に、比活性を高めるために、融合タンパク質を精製することも有効である。
精製方法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられ、これらは単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００４５】
また、本発明の融合タンパク質が細胞内に不溶状態で発現した場合は、前記と同様に細胞を破砕後、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法によりポリペプチドを回収することができる。更に、得られた融合タンパク質の不溶体を変性剤で可溶化し、希薄溶液に希釈あるいは透析した後、上記と同様の単離精製法により精製融合タンパク質を得ることができる。
【００４６】
更に本発明の融合タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に前記ポリペプチド融合タンパク質あるいはその誘導体を回収することができる。そして、培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製融合タンパク質を得ることができる。
【００４７】
（４）多量体形成の確認工程
本発明の融合タンパク質の製造方法における多量体形成の確認工程は、前記精製した融合タンパク質の多量体化の形成を確認する工程である。多量体形成の確認方法は、特に限定されるものではないが、例えばゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて、溶出位置から当該融合タンパク質の多量体としての分子量を確認することができる。すなわち、分子量によって、単量体又は多量体を形成しているか否かを確認することができる。
【００４８】
［３］タンパク質結晶の製造方法
本発明のタンパク質結晶の製造方法は、請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程（以下、ベクター構築工程と称する）、前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程（以下、発現工程と称する）、前記発現した融合タンパク質を精製する工程（以下、精製工程と称する）、精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程（以下、多量体形成確認工程と称する）、精製された融合タンパク質を結晶化させる工程（以下、結晶化工程と称する）、及びＸ線照射によりタンパク質結晶を確認する工程（以下、結晶化確認工程と称する）、を含む。本発明のタンパク質結晶の製造方法における、ベクター構築工程、発現工程、精製工程、及び多量体形成確認工程は、前記融合タンパク質の製造方法における各工程を用いることができる。以下に、結晶化工程及び結晶化確認工程について、説明する。
【００４９】
（５）結晶化工程
本発明のタンパク質結晶の製造方法における結晶化工程は、前記精製した融合タンパク質を結晶化させる工程である。結晶化方法は、特に限定されるものではなく、例えばバッチ法、蒸気拡散法、又は透析法などを用いることができる。また、前記のように、タンパク質の結晶化は、緩衝液のｐＨ、塩の種類、塩濃度、沈殿剤の種類、及び沈殿剤濃度などに敏感に影響を受ける。従って、結晶化させる融合タンパク質の最適な結晶化条件を検討することが好ましい。
【００５０】
緩衝液としては、限定されるものではないが、例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどの緩衝液を用いることができる。これらの緩衝液を基本として、ｐＨ、塩の種類、及び塩濃度を更に検討することができる。
【００５１】
沈殿剤としては、たとえば、塩、ポリエチレングリコール、アルコール、又はその組み合わせを用いることができる。塩としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、又は硫酸マグネシウムを挙げることができる。ポリエチレングリコールとしては、例えば分子量１００〜１０００００のものを挙げることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、又はメチルペンタンジオールを挙げることができる。
【００５２】
結晶化の温度は、特に限定されるものではないが、１℃〜３０℃で行うことができるが、結晶化条件のスクリーニングにより、結晶化の起こりやすい温度を検討しておくことが好ましい。結晶化の時間も、限定されるものではなく、１日〜１ヶ月程度で行うことができるが、結晶化条件のスクリーニングにより、その融合タンパク質の結晶化の起きる時間を検討しておくことが好ましい。
【００５３】
（６）結晶化確認工程
本発明のタンパク質結晶の製造方法における結晶化確認工程は前記タンパク質結晶の製造方法におけるＸ線照射によりタンパク質結晶を確認する工程である。タンパク質結晶を確認するために，回折反射の測定を行う。測定は液体窒素やヘリウムの吹き出すノズルの下で１００Ｋ以下の温度で行う。その際、タンパク質結晶の凍結を防ぐため、分子量４００Ｄａのポリエチレングリコールやグリセロール、スクロースなどのクライオプロテクタントを混合したうえで、SPring-8又はPhotonFactoryなどの大型放射光施設のビームライン、もしくは研究室のＸ線照射装置にて、Ｘ線の照射を行い、回折データを得る。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００５５】
《実施例１》
本実施例では、ＭＢＰと２ＲＳ１タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
（１）ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターの構築
本実施例では、ＭＢＰがコードされているｐＭＡＬ−ｃ２ｅベクターに、２ＲＳ１タグ（Ｅｂ１タンパク質由来の部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを融合したｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクター（融合タンパク質ベクター）を構築した。
登録されているEnd−Binding 1（Eb1）タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子配列を元に、オリゴDNA断片を合成し、下記のオリゴＤＮＡでＰＣＲを行い、２ＲＳ１のＤＮＡ断片を得た。なお、得られたＤＮＡ断片は、配列番号５で表されるヌクレオチドの末端にＳａｃＩサイト及びＫｐｎＩサイトが導入されているＤＮＡ断片である。なお、ＭＢＰと２ＲＳ１タグとの間にペプチドリンカーとして「ＡＡＡ」が挿入されるようにオリゴＤＮＡはデザインした。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTGAAGACTT−３’（配列番号９）
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー２：５’−TCCGAAGTAGAAATCCCTCTCTTTCTCCAAGTCTTCAGCA−３’（配列番号１０）
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー３：５’−CTACTTCGGAAAGCTACGGAACATTGAATTGATTTGCCAGGAGAA−３’（配列番号１１）
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー４：５’−CCTCTGCAATACAGGGTCGTTTTCCCCCTCGTTCTCCTGG−３’（配列番号１２）
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー５：５’−ATTGCAGAGGATTGTAGACATTCTGTATGCCACAGATGAA−３’（配列番号１３）
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー６：５’−AATTAAGGTACCTTAGCCTTCATCTGTGGC−３’（配列番号１４）
得られたＤＮＡ断片をｐＭＡＬ−ｃ２ｅベクターに導入した。ＤＮＡ断片及びｐＭＡＬ−ｃ２ベクターを制限酵素ＳａｃＩ及びＫｐｎＩによって、３７℃、２４時間で消化した。反応液を、ＤＮＡの精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ））を用いて精製した。切断されたｐＭＡＬ−ｃ２ｅベクター及びＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡライゲースを用いて、１６℃、２時間で結合させた。反応液を大腸菌ＪＭ１０９株（コンピテントセル）と混合し、ヒートショック法により形質転換した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地において、３７℃で一晩培養した。コロニーを培養して、プラスミドを取得した。制限酵素で切断後に、アガロース電気泳動を行い、目的のＤＮＡ断片が組込まれたクローンを選択した。シークエンスによって、塩基配列を確認し、ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターを取得した。【００５６】
（２）融合タンパク質の発現と精製
前記ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターをタンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ株に形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えたＬＢ培地１．５ｍＬを用いて３７℃で一晩前々培養を行った。同じくアンピシリンとクロラムフェニコールを加えたＬＢ培地１００ｍＬを用いて３７℃で一晩前培養を行った後、ＬＢ培地３Ｌで本培養を行った。ＯＤ６００＝０．６になるまで３７℃で培養し、培養温度を２５℃に下げた後終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加えて目的タンパク質の発現誘導を行った。更に一晩培養した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的タンパク質の発現を確認した。
本培養後の菌液を４５００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心し上清を取り、懸濁ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ）で懸濁した後更に５，０００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心し上清を取って集菌を行った。
菌を破砕ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＯＮ  １ｓｅｃ、ＯＦＦ  １．５ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ  １０ｍｉｎで超音波破砕を行った。その後４０，０００×ｇ、２５ｍｉｎ、１０℃で遠心して上清のみを取り出した。７０℃で１５ｍｉｎ加熱処理を行い氷上で１０ｍｉｎインキュベートし、４０，０００×ｇ、３０ｍｉｎ、１０℃で遠心して上清を取った。硫安沈殿、透析、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓタグ又はＭＢＰに対するアフィニティービーズを使用）などの精製法の組み合わせにより融合タンパク質を精製し、ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質を得た。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。【００５７】
《比較例１》
本比較例では、ＭＢＰと２ＲＳ２タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。２ＲＳ２タグのアミノ酸配列を配列番号１５に、ヌクレオチドの塩基配列を配列番号１６に示す。また、２ＲＳ２タグの構造の模式図を図５（Ａ）に示す。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＭＢＰ用２ＲＳ２オリゴプライマー１〜４を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＭＡＬ−２ＲＳ２ベクターを取得した。
ＭＢＰ用２ＲＳ２オリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTATGGTTTCTAAACTGAGC−３’（配列番号１７）
ＭＢＰ用２ＲＳ２オリゴプライマー２：５’−GGGCCGCCAGGAGTTCCGTCTGCAGCTGGCTCAGTTTA−３’（配列番号１８）
ＭＢＰ用２ＲＳ２オリゴプライマー３：５’−CCTGGCGGCCCTGCTCGAATCAGGGCTGAGCAAAGAGGCACTGATCCA−３’（配列番号１９）
ＭＢＰ用２ＲＳ２オリゴプライマー４：５’−AATTAAGGTACCTTACTCACCCAGTGCC−３’（配列番号２０）【００５８】
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ２ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ２融合タンパク質を取得した。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。【００５９】
《比較例２》
本比較例では、ＭＢＰと２ＲＳ３タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。２ＲＳ３タグのアミノ酸配列を配列番号２１に、ヌクレオチドの塩基配列を配列番号２２に示す。また、２ＲＳ３タグの構造の模式図を図５（Ａ）に示す。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＭＢＰ用２ＲＳ３オリゴプライマー１〜４を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＭＡＬ−２ＲＳ３ベクターを取得した。
ＭＢＰ用２ＲＳ３オリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTGGAATTGGA−３’（配列番号２３）
ＭＢＰ用２ＲＳ３オリゴプライマー２：５’−CCTGTGGTTAATACCTTCAGAACTGCTCCAATTCCAGC−３’（配列番号２４）
ＭＢＰ用２ＲＳ３オリゴプライマー３：５’−TAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAA−３’（配列番号２５）
ＭＢＰ用２ＲＳ３オリゴプライマー４：５’−AATTAAGGTACCTTACTGTTGCCTCTTACG−３’（配列番号２６）【００６０】
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ３ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ３融合タンパク質を取得した。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。【００６１】
《比較例３》
本比較例では、ＭＢＰと２ＲＳ４タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。２ＲＳ４タグのアミノ酸配列を配列番号２７に、ヌクレオチドの塩基配列を配列番号２８に示す。また、２ＲＳ４タグの構造の模式図を図５（Ａ）に示す。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー１〜６を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＭＡＬ−２ＲＳ４ベクターを取得した。
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTAATGTTGA−３’（配列番号２９）
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー２：５’−TCCATGACCCGCATTTGAAACTCCTGTTCAAAGCTGAGGTCAACATTAGC−３’（配列番号３０）
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー３：５’−GGGTCATGGAGGAGCAAGTGAGTGCCATGAGCCTTCAGGAAGCTCGTGAG−３’（配列番号３１）
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー４：５’−CATCATCAATAGGCGAGAGGCTTGCAACAGTAGCTCACGAGCTTCCTGAA−３’（配列番号３２）
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー５：５’−TATTGATGATGAAAGACAACGTCATTCGCTCCTTGGTCAAACGCGCTGCC−３’（配列番号３３）
ＭＢＰ用２ＲＳ４オリゴプライマー６：５’−AATTAAGGTACCTTATCTGGCAGCGCGTTT−３’（配列番号３４）【００６２】
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ４ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ４融合タンパク質を取得した。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。【００６３】
《比較例４》
本比較例では、ＭＢＰと２ＲＳ５タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。２ＲＳ５タグのアミノ酸配列を配列番号３５に、ヌクレオチドの塩基配列を配列番号３６に示す。また、２ＲＳ２タグの構造の模式図を図５（Ａ）に示す。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー１〜６を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＭＡＬ−２ＲＳ５ベクターを取得した。
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTGGTGAGGA−３’（配列番号３７）
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー２：５’−CTACATAAGTAGCCGCGAAGGCGGCATCTTTATCCTCACCAGC−３’（配列番号３８）
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー３：５’−CTACTTATGTAGCACCGCTTATCGACGAATCCATCCACCTTGGT−３’（配列番号３９）
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー４：５’−GTGAATGCGCGCACGAGTGAAACCAAGGTG−３’（配列番号４０）
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー５：５’−CATTCACGCCCTTTTAGACCAGGTCGCTGAAAG−３’（配列番号４１）
ＭＢＰ用２ＲＳ５オリゴプライマー６：５’−AATTAAGGTACCTTAGCCCCTACTTTCAGC−３’（配列番号４２）【００６４】
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ５ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ５融合タンパク質を取得した。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。【００６５】
《比較例５》
本比較例では、タグの融合していないＭＢＰを調製した。
ＭＢＰ用２ＲＳ１オリゴプライマー１、２に代えて、ＭＢＰ用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１、２を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＭＡＬ−ｎｏｔａｇベクターを取得した。なお、ＭＢＰ用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１を用いることで、ＭＢＰ遺伝子及びリンカー（ＡＡＡ）と２ＲＳ１タグ遺伝子の間に終止コドン（下線）が挿入される。
ＭＢＰ用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１：５’−AATTAAGAGCTCGGCTGCTGCTTAAGAAGACTT−３’（配列番号７３）
ＭＢＰ用ｎｏｔａｇオリゴプライマー２：５’−TCCGAAGTAGAAATCCCTCTCTTTCTCCAAGTCTTCTTAAGCA−３’（配列番号７４）
ｐＭＡＬ−ｎｏｔａｇベクターを用いて、実施例１（２）の操作を繰り返して、タグの融合していないＭＢＰ（ＭＢＰ−ｎｏｔａｇ）を取得した。ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図６に示す。
図６に示すように、ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質、ＭＢＰ／２ＲＳ２融合タンパク質、ＭＢＰ／２ＲＳ４融合タンパク質、ＭＢＰ／２ＲＳ５融合タンパク質については，ＭＢＰ−ｎｏｔａｇ（単量体）よりも高分子量（２量体）側に溶出され、単量体の位置にほとんど溶出されなかった。従って、これらの融合タンパク質は、安定的に２量体化していることが示唆される。しかし、ＭＢＰ／２ＲＳ３融合タンパク質に関しては、非常に巨大な分子量の位置に溶出され、凝集体を形成したと推測された。【００６６】
《実施例２》
本実施例では、ＰＨ０８２８と２ＲＳ１タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
（１）２ＲＳ１タグＤＮＡ断片の構築
本実施例では、２ＲＳ１タグ（Ｅｂ１タンパク質由来の部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む２ＲＳ１タグＤＮＡ断片を構築した。下記のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、End−Binding 1（Eb1）タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得た。なお、得られたＤＮＡ断片は、配列番号４で表されるヌクレオチドの末端にＸｈｏＩサイト及びＮｈｅＩサイトが導入されているＤＮＡ断片である。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGGAAGACTTGGAGAAAGAGAGGGA-３’（配列番号４３）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー２：５’−TCAATTCAATGTTCCGTAGCTTTCCGAAGTAGAAATCCCTCTC−３’（配列番号４４）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー３：５’−GCTACGGAACATTGAATTGATTTGCCAGGAGAACGA−３’（配列番号４５）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー４：５’−TACAATCCTCTGCAATACAGGGTCGTTTTCCCCCTCGTT−３’（配列番号４６）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー５：５’−TATTGCAGAGGATTGTAGACATTCTGTATGCCACAGATG−３’（配列番号４７）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー６：５’−AATTAAGCTAGCTTAGCCTTCATCTG−３’（配列番号４８）【００６７】
（２）ＰＨ０８２８遺伝子の増幅
Pyrococcus horikoshii OT3株由来ＰＨ０８２８遺伝子のｃＤＮＡクローンを鋳型とし、下記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＨ０８２８をコードするＤＮＡ断片を得た。なお、得られたＤＮＡ断片は、ＰＨ０８２８のヌクレオチドの末端にＮｄｅＩサイト及びＸｈｏＩサイトが導入されているＤＮＡ断片である。
ＰＨ０８２８センスプライマー：５’−GGAATTCCATATGTCTTATAAGGAAAAGAG−３’（配列番号４９）
ＰＨ０８２８アンチセンスプライマー：５’−CCGCTCGAGTCTAATCTCATCGAAATCACC−３’（配列番号５０）【００６８】
（３）ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターの構築
前記、２ＲＳ１タグＤＮＡ断片、及びＰＨ０８２８遺伝子を、ｐＥＴ２８Ｍベクターに導入し、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターを作成した。この際、２ＲＳ１タグとｐＥＴ２８断片の境界にＮｈｅＩサイトを導入するために、ｐＥＴ２８Ｍを鋳型として、下記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、末端がＮｈｅＩサイト及びＮｄｅIサイトとなるようなＤＮＡ断片を得た。
ｐＥＴ２８Ｍ−ＮｈｅＩプライマー：５’−CTTAAGCTAGCTTTAAACACCACCACCACCACCACTG−３’（配列番号５１）
ｐＥＴ２８Ｍ−ＮｄｅＩプライマー：５’−AATTAACATATGGTGATGGTGATGGTGGCCCATG−３’配列番号５２）
２ＲＳ１タグＤＮＡ断片をＸｈｏI及びＮｈｅI、ＰＨ０８２８遺伝子ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ、ｐＥＴ２８Ｍ由来ＤＮＡ断片をＮｈｅＩ及びＮｄｅＩによって、３７℃、２４時間で消化した。各反応液を、ＤＮＡの精製キット（QIAquick PCR purification kit (QIAgen)）を用いて精製した。精製した各ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースを用いて、１６℃、２時間で結合させた。反応液を大腸菌ＪＭ１０９株（コンピテントセル）と混合し、ヒートショック法により形質転換した。５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地において、３７℃で一晩培養した。コロニーを培養して、プラスミドを取得した。制限酵素で切断後に、アガロース電気泳動を行い、目的のＤＮＡ断片が組込まれたクローンを選択した。シークエンスによって、塩基配列を確認し、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターを取得した。
（４）融合タンパク質の発現と精製
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＰＨ０８２８／２ＲＳ１融合タンパク質を取得した。【００６９】
《比較例６》
本比較例では、ＰＨ０８２８と２ＲＳ２タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＰＨ０８２８用２ＲＳ２オリゴプライマー１〜４を用いたことを除いては、実施例２（１）及び（３）の操作を繰り返して、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ２ベクターを取得した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ２オリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGATGGTTTCTAAACTGAGCCAGCT−３’（配列番号５３）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ２オリゴプライマー２：５’−TTCGAGCAGGGCCGCCAGGAGTTCCGTCTGCAGCTGGCTC−３’（配列番号５４）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ２オリゴプライマー３：５’−CCCTGCTCGAATCAGGGCTGAGCAAAGAGGCACTGATCCAGG−３’（配列番号５５）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ２オリゴプライマー４：５’−AATTAAGCTAGCTTACTCACCCAGTGCCTGGATCAGTG−３’（配列番号５６）【００７０】
ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ２ベクターを用いたことを除いては、実施例２（４）の操作を繰り返して、ＰＨ０８２８／２ＲＳ２融合タンパク質を取得した。【００７１】
《比較例７》
本比較例では、ＰＨ０８２８と２ＲＳ３タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＰＨ０８２８用２ＲＳ３オリゴプライマー１〜４を用いたことを除いては、実施例２（１）及び（３）の操作を繰り返して、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ３ベクターを取得した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ３オリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGGGAATTGGAGCAGTTCT−３’（配列番号５７）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ３オリゴプライマー２：５’−GCAATCCTGTGGTTAATACCTTCAGAACTGCTCC−３’（配列番号５８）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ３オリゴプライマー３：５’−ACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAA−３’（配列番号５９）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ３オリゴプライマー４：５’−AATTAAGCTAGCTTACTGTTGCCTCTTACGTTTAA−３’（配列番号６０）【００７２】
ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ３ベクターを用いたことを除いては、実施例２（４）の操作を繰り返して、ＰＨ０８２８／２ＲＳ３融合タンパク質を取得した。【００７３】
《比較例８》
本比較例では、ＰＨ０８２８と２ＲＳ４タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー１〜６を用いたことを除いては、実施例２（１）及び（３）の操作を繰り返して、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ４ベクターを取得した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGAATGTTGACCTCAGCTTTGAACAGGA−３’（配列番号６１）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー２：５’−CACTCACTTGCTCCTCCATGACCCGCATTTGAAACTCCTGTTCAAA−３’（配列番号６２）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー３：５’−CAAGTGAGTGCCATGAGCCTTCAGGAAGCTCGTGAGCTACTGTTGCAAG−３’（配列番号６３）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー４：５’−CGAATGACGTTGTCTTTCATCATCAATAGGCGAGAGGCTTGCAAC−３’（配列番号６４）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー５：５’−GACAACGTCATTCGCTCCTTGGTCAAACGCGCTGC−３’（配列番号６５）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ４オリゴプライマー６：５’−AATTAAGCTAGCTTATCTGGCAGCGCG−３’（配列番号６６）【００７４】
ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ４ベクターを用いたことを除いては、実施例２（４）の操作を繰り返して、ＰＨ０８２８／２ＲＳ４融合タンパク質を取得した。【００７５】
《比較例９》
本比較例では、ＰＨ０８２８と２ＲＳ５タグとを融合させた融合タンパク質を調製した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１〜６に代えて、ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー１〜６を用いたことを除いては、実施例２（１）及び（３）の操作を繰り返して、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ５ベクターを取得した。
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGGGTGAGGATAAAGATGCCGCCTTC−３’（配列番号６７）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー２：５’−GTCGATAAGCGGTGCTACATAAGTAGCCGCGAAGGCGG−３’（配列番号６８）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー３：５’−GCTTATCGACGAATCCATCCACCTTGGTTTCACTCGT−３’（配列番号６９）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー４：５’−AAAAGGGCGTGAATGCGCGCACGAGTGAAACC−３’（配列番号７０）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー５：５’−CCCTTTTAGACCAGGTCGCTGAAAGTAGG−３’（配列番号７１）
ＰＨ０８２８用２ＲＳ５オリゴプライマー６：５’−AATTAAGCTAGCTTAGCCCCTACTTTC−３’（配列番号７２）【００７６】
ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ５ベクターを用いたことを除いては、実施例２（４）の操作を繰り返して、ＰＨ０８２８／２ＲＳ５融合タンパク質を取得した。【００７７】
《比較例１０》
本比較例では、タグの融合していないＰＨ０８２８を調製した。ＰＨ０８２８用２ＲＳ１オリゴプライマー１に代えて、ＰＨ０８２８用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１を用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返して、ｐＨ０８２８−ｎｏｔａｇベクターを取得した。なお、ＰＨ０８２８用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１を用いることで、ＰＨ０８２８遺伝子及びリンカーと２ＲＳ１タグ遺伝子の間に終止コドン（下線）が挿入される。
ＰＨ０８２８用ｎｏｔａｇオリゴプライマー１：５’−AATTAACTCGAGTAAGAAGACTTGGAGAAAGAGAGGGA−３’（配列番号７５）【００７８】
《結晶化スクリーニング》
実施例１及び比較例１〜４で得られたＭＢＰとの各融合タンパク質並びに比較例５で得られたＭＢＰ−ｎｏｔａｇを用いて、結晶化のスクリーニングを行った。「ＮｅＸｔａｌ  ＪＣＳＧ  Ｃｏｒｅ  Ｓｕｉｔｅ  Ｉ・II・III・IV」（ＱＩＡＧＥＮ社）の４種の結晶化スクリーニングキットを用いて、各融合タンパク質の結晶化初期スクリーニングをシッティングドロップ法で行った。
結果を表１に示す。【００７９】
【表１】
2014181786.tif 000003
表１に示すように、実施例１で得られたＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質は、６つの条件で結晶化が誘導された。しかし、比較例１、３、及び４の融合タンパク質は２量体を形成したが、結晶化は確認できなかった。
ＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質で見られた６つの条件での、８日後の結晶の写真を図７に示す。【００８０】
実施例２及び比較例６〜９で得られたＰＨ０８２８との各融合タンパク質並びに比較例１０で得られたＰＨ０８２８−ｎｏｔａｇを用いて、結晶化のスクリーニングを行った。結晶化スクリーニングキットは、ＭＢＰと同じものを用いた。【００８１】
【表２】
2014181786.tif 000004
表２に示すように、実施例２で得られたＰＨ０８２８／２ＲＳ１融合タンパク質は、２つの条件で結晶化が誘導された。しかし、比較例８及び９の融合タンパク質は２量体又は４量体を形成したが、結晶化は確認できなかった。なお、比較例６及び７は、発現量が少なく、結晶化ができなかった。【００８２】
《実施例３》
本実施例では、ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺと２ＲＳ１タグとを融合させたＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質を調製した。
ｐＥＴ２８ｂベクターにＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺを組み込んだｐＥＴ２８ｂ−ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺベクターに、GENEART Seamless Cloning and Assembly Kit（invitrogen社）を用いて、２ＲＳ１タグを組み込み、ｐＥＴ２８ｂ−ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ−２ＲＳ１ベクターを得た。【００８３】
ＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＥＴ２８ｂ−ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ−２ＲＳ１ベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質を取得した。【００８４】
《Ｘ線回折像の測定と構造解析》
実施例１で得られたＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質及び実施例３で得られたＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質をＸ線結晶構造解析した。それぞれのタンパク質結晶に対して、SPring-8又はPhotonFactoryの放射光施設にて、X線を照射し、回折像を得た。得られた回折データをHKL2000又はXDSのソフトウェアによって処理し、空間群や格子定数を決定し、データの指数付け、積分、スケーリング、マージングを行った。ＭＢＰ／２ＲＳ１の場合には、既存のＭＢＰの構造を用いて分子置換を行い、構造を決定した。ＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質の場合には、既存の構造がなかったため、メチオニンをセレノメチオニンに置換したタンパク質結晶を作成し、Se-SAD法を用いて構造を決定した。
得られたＭＢＰ／２ＲＳ１融合タンパク質及びＡｘＣｅＳＤ−ＰｉｌＺ／２ＲＳ１融合タンパク質の構造の模式図を、それぞれ図８及び図９に示す。【００８５】
《実施例４》
本実施例では、２ＲＳ１タグの７番目のアルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）への置換、による、ＭＢＰ及びＰＨ０８２８の結晶化への影響を検討した。
実施例１（１）で得られたｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターを鋳型として、下記のプライマーを用いて、Ｒ７Ｌの変異を導入し、ｐＭＡＬ−２ＲＳ１−Ｒ７Ｌベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１−Ｒ７Ｌベクターを得た。
Ｒ７Ｌプライマー１：５’−TTCTACTTCGGAAAGCTACGG−３’（配列番号７６）
Ｒ７Ｌプライマー２：５’−ATCTAACTCTTTCTCCAAGTC−３’（配列番号７７）
ｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ１−Ｒ７Ｌベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１−Ｒ７Ｌベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質、又はＰＨ０８２８／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質を取得した。
前記結晶化スクリーニングに記載の方法に従って、ＭＢＰ／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質及びＰＨ０８２８／２ＲＳ１−Ｒ７Ｌ融合タンパク質の結晶化のスクリーニングを行った。結果を表３に示す。【００８６】
《実施例５》
本実施例では、２ＲＳ１タグの１０番目のチロシン（Ｙ）のロイシン（Ｌ）への置換による、ＭＢＰ及びＰＨ０８２８の結晶化への影響を検討した。
実施例１（１）で得られたｐＭＡＬ−２ＲＳ１ベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１ベクターを鋳型として、下記のプライマーを用いて、Ｙ１０Ｌの変異を導入し、ｐＭＡＬ−２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌベクターを得た。
Ｙ１０Ｌプライマー１：５’−TTCTTATTCGGAAAGCTACGG−３’（配列番号７８）
Ｙ１０Ｌプライマー２：５’−ATCCCTCTCTTTCTCCAAGTC−３’（配列番号７９）
ＭＡＬ−２ＲＳ１ベクターに代えて、ｐＭＡＬ−２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌベクター、又はｐＥＴ２８Ｍ−ＰＨ０８２８−２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌベクターを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返して、ＭＢＰ／２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌ融合タンパク質、又はＰＨ０８２８／２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌ融合タンパク質を取得した。
前記結晶化スクリーニングに記載の方法に従って、ＭＢＰ／２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌ融合タンパク質及びＰＨ０８２８／２ＲＳ１−Ｙ１０Ｌ融合タンパク質の結晶化のスクリーニングを行った。結果を表３に示す。【００８７】
【表３】
2014181786.tif 000005
表３に示すように、実施例４の２ＲＳ１タグのＲ７Ｌの置換（変異）により、ＭＢＰの結晶化は、実施例１の６／３８４から１１／３８４に上昇し、ＰＨ０８２８の結晶化は、実施例２の２／３８４から６／３８４に上昇した。従って、２ＲＳ１タグの７番目のアルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）への置換は、改良改変であると考えられる。
また、実施例５の２ＲＳ１タグのＹ１０Ｌの置換（変異）により、ＰＨ０８２８の結晶化は、実施例２の２／３８４から４／３８４に上昇した。従って、２ＲＳ１タグの７番目のアルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）への置換は、ＰＨ０８２８については改良改変であると考えられる。一方、２ＲＳ１タグのＹ１０Ｌの置換（変異）により、ＭＢＰの結晶化は、実施例１の６／３８４から３／３８４に低下した。しかしながら、表１の比較例５に示すようにタグを持たないＭＢＰの結晶化は１／３８４であり、Ｙ１０Ｌの置換（変異）により、ＭＢＰの結晶化は３／３８４であるため、Ｙ１０Ｌの置換はＭＢＰについては、維持改変であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のポリペプチドは、目的のタンパク質と融合させ、そのタンパク質を結晶化させることができる。得られた融合タンパク質は、Ｘ線照射して、回折データを測定し、結晶構造解析法に用いて、そのタンパク質の構造を解析することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2014181786.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014181786.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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