(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。また、本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法を提供する。
2014136519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項２】
ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ−４９０、ＡＧ５５５、チロホスチンＢ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ−１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチンＡ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ−Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、およびチロホスチンＡＧ１１２から選択される、請求項１記載の心筋分化促進剤。
【請求項３】
ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、およびＰＰ３から選択される、請求項２記載の心筋分化促進剤。
【請求項４】
１以上のＷｎｔシグナル阻害剤と併用される、請求項１〜３のいずれかに記載の心筋分化促進剤。
【請求項５】
Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、請求項４記載の心筋分化促進剤：
式（Ｉ）：
【化１】
2014136519.tif 000053
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ７が、ハロゲン原子である
Ｘが、硫黄原子である、および
ｎが、０から４の整数である、請求項５記載の心筋分化促進剤。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
Ｒ２が、メトキシ基である、および
Ｒ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、請求項６記載の心筋分化促進剤。
【請求項８】
Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下からなる群から選択される化合物またはその塩である、請求項４記載の心筋分化促進剤：
ＫＹ０２１１１
【化２】
2014136519.tif 000054
ＫＹ０１０４１
【化３】
2014136519.tif 000055
Ｔ６１１６４
【化４】
2014136519.tif 000056
ＫＹ０２１１４
【化５】
2014136519.tif 000057
ＫＹ０１０４５
【化６】
2014136519.tif 000058
ＫＹ０１０４０
【化７】
2014136519.tif 000059
ＫＹ０２１０９
【化８】
2014136519.tif 000060
ＫＹ０１０４２
【化９】
2014136519.tif 000061
ＫＹ０１０４３
【化１０】
2014136519.tif 000062
ＫＹ０１０４６
【化１１】
2014136519.tif 000063
ＰＢ２８５２
【化１２】
2014136519.tif 000064
Ｎ１１４７４
【化１３】
2014136519.tif 000065
ＰＢ２５７２
【化１４】
2014136519.tif 000066
ＰＢ２５７０
【化１５】
2014136519.tif 000067
ＫＹ０２１０４
【化１６】
2014136519.tif 000068
ＳＯ０８７
【化１７】
2014136519.tif 000069
ＳＯ１０２
【化１８】
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ＳＯ０９６
【化１９】
2014136519.tif 000071
ＳＯ０９４
【化２０】
2014136519.tif 000072
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化２１】
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ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化２２】
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ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化２３】
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ＳＯ２０７７
【化２４】
2014136519.tif 000076
。
【請求項９】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１からなる群から選択される、請求項４に記載の心筋分化促進剤。
【請求項１０】
１以上のＷｎｔシグナル活性化剤と併用される、請求項１〜９のいずれかに記載の心筋分化促進剤。
【請求項１１】
Ｗｎｔシグナル活性化剤がＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択される、請求項１０記載の心筋分化促進剤。
【請求項１２】
ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット。
【請求項１３】
ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、インビトロにおける多能性幹細胞の心筋分化誘導方法。
【請求項１４】
Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、および／またはＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む、請求項１３記載の方法：
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）の後、前記細胞をＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
【請求項１６】
工程（２）の培養期間の全体または一部において、ＥＧＦ受容体阻害剤およびＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で細胞を培養する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
浮遊培養により行われる、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
心筋細胞の製造方法である、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤に関する。また、本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞の分化誘導方法は、再生医療の実現やインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立の鍵を握るものである。特に、心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であり、再生医療や心疾患薬効評価については重要である。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことから、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の安定的な供給が求められている。【０００３】
ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を心筋へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１、参照により本明細書に含まれる）。しかしながら、その分化効率は低く、そのマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入するため、純粋なヒト心筋細胞が得られないという問題がある。【０００４】
ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を心筋へ分化させる他の手法として、ＥＳ細胞から胚葉体を形成し、そこにいくつかのサイトカイン（維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）を添加して心筋細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献２および３、参照により本明細書に含まれる）。また、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、インスリンと血清とを用いて心筋細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献４、参照により本明細書に含まれる）。しかしながら、これらの方法は大量のサイトカインが必要なためコストが上昇し実用化には適さない。他に、タンキラーゼ阻害剤ＸＡＶ９３９を用いてマウスＥＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法も報告されているが（非特許文献５、参照により本明細書に含まれる）、血清を必要とする問題点に加え、誘導効率も１０〜６０％と低いため、再生医療への適用が難しい。【０００５】
本発明者らは、これまでに、多能性幹細胞からの心筋分化を促進する低分子化合物を報告している（特許文献１および２、並びに非特許文献７、参照により本明細書に含まれる）。【０００６】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体は、ＥＧＦをリガンドとするチロシンキナーゼ型受容体であり、細胞増殖、分化、維持などの調節に重要である。ＥＧＦシグナリングは心臓発生においても重要な役割を持つことが報告されている（非特許文献６、参照により本明細書に含まれる）。また、ＥＧＦ受容体は癌細胞の増殖や転移などにも深く関わっており、ゲフィチニブなどのＥＧＦ受容体阻害剤が抗癌剤として使用されている。しかしながら、ゲフィチニブやＡＧ１４７８などのＥＧＦ受容体阻害剤をヒト多能性幹細胞の心筋分化に応用した報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７１１１８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003).
【非特許文献２】Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008).
【非特許文献３】Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008).
【非特許文献４】Paul, W B., et al., A Universal System for Highly Efficient Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells That Eliminates Interline Variability. PLoSone. 6(4),  e18293 (2011).
【非特許文献５】Wang, H., et al., Cardiac induction of embryonic stem cells by a small molecule inhibitor of Wnt/β-catenin signaling. ACS Chem Biol. 6(2), 192-7 (2011).
【非特許文献６】Iwamoto, R., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(6), 3221-6 (2003).
【非特許文献７】Minami, I., et al., A Small Molecule that Promotes Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells under Defined, Cytokine- and Xeno-free Conditions. Cell Rep. 2012 Nov 29;2(5):1448-60. doi: 10.1016/j.celrep.2012.09.015. Epub 2012 Oct 25.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高効率かつ低コストな多能性幹細胞の心筋分化を可能とする心筋分化促進剤および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。【００１１】
本発明はまた、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キットを提供する。【００１２】
本発明はまた、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、高効率かつ低コストに多能性幹細胞の心筋分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種阻害剤の心筋分化促進効果。ＫＹ：ＫＹ０２１１１、ＳＢ：ＳＢ２０３５８０、ＢＩＲＢ：ＢＩＲＢ７９６、Ｕ：Ｕ０１２６、ＪＡＫＩ：チロホスチンＡＧ４９０、ＡＧ：ＡＧ１４７８。
【図２】ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８）の心筋分化促進効果。
【図３】ＥＧＦ受容体阻害剤（ゲフィチニブ）の心筋分化促進効果。
【図４】ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）の心筋分化促進効果およびＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＫＹ０２１１１および／またはＸＡＶ９３９）との相乗効果。
【図５】実施例で用いた心筋培養系。
【図６】ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）でのサイトカインおよび異種成分不含条件下における心筋分化に対するＥＧＦ受容体阻害剤（ゲフィチニブ）の分化促進効果。
【図７】ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）およびｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１）でのサイトカインおよび異種成分不含条件下における心筋分化に対するＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）の心筋分化促進効果。
【図８】ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＸＡＶ９３９）との相乗効果。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）のスフェア培養系からの直接心筋分化。
【図１０】ＥＧＦ受容体阻害剤（ＰＰ３）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＫＹ０２１１１）との相乗効果。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の多能性幹細胞の心筋分化促進剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体阻害剤を含む。本発明における「ＥＧＦ受容体阻害剤」とは、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害するあらゆる物質を意味し、低分子化合物、核酸、ペプチド、抗体などが含まれるがこれらに限定されない。ＥＧＦ受容体阻害剤としては、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Gefitinib）、アファチニブ（Afatinib）、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ（Canertinib）、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ（Dacomitinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、EGFR Inhibitor III（Ｎ−（４−（（３，４−ジクロロ−６−フルオロフェニル）アミノ）−キナゾリン−６−イル）−２−クロロアセトアミド、CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（４−（４−ベンジルオキシアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン、CAS 179248-61-4）、エルロチニブ（Erlotinib）、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ（Pelitinib）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ−４９０、ＡＧ５５５、チロホスチン（Tyrphostin）Ｂ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ−１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（シクロプロパンカルボン酸−（３−（６−（３−トリフルオロメチル−フェニルアミノ）−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル）−アミド、CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（Erbstatin Analog）（メチル  ２，５−ジヒドロキシシナマート、CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチン（Lavendustin）Ａ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ−Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、チロホスチンＡＧ１１２などが例示される。ある態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、キナゾリン系骨格を有するＥＧＦ受容体阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、もしくはＸＬ６５７であるか、または、ＰＰ３である。本発明に好適なＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、およびＰＰ３である。ＥＧＦ受容体阻害剤は、Santa Cruz Biotechなどから入手可能である。
【００１６】
本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
【００１７】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） （いずれも参照により本明細書に含まれる）などのＥＳ細胞が挙げられる。
【００１８】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) （参照により本明細書に含まれる）が挙げられる。
【００１９】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007) （いずれも参照により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
【００２０】
本発明の心筋分化促進剤は、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤、ニトロビン、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡの組み合わせ）などの別の心筋分化促進因子と併用してもよい。本発明における「心筋分化促進因子」には、心筋分化促進効果を有するあらゆる物質が含まれる。好ましい態様において、本発明の心筋分化促進剤は、Ｗｎｔシグナル阻害剤および／またはＷｎｔシグナル活性化剤と併用される。
【００２１】
本発明における「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えばＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。本発明においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよい。
【００２２】
本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル阻害剤には、例えば、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物、並びにＩＧＦＢＰ４、およびＤｋｋ１などのタンパク質が含まれる。好ましくは、本発明におけるＷｎｔシグナル阻害剤は化合物であり、例えば、式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１である。本発明においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよい。
【００２３】
ある態様において、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である：
式（Ｉ）：
【化１】
2014136519.tif 000003
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【００２４】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
【００２５】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
【００２６】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
【００２７】
ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
【００２８】
好ましい態様において、Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２９】
Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。さらにより好ましくは、Ｒ２はメトキシ基であり、Ｒ３はメトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。
【００３０】
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
【００３１】
ある態様において、Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００３２】
Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００３３】
好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。
【００３４】
ある態様において、Ｒ７は、ハロゲン原子である。
【００３５】
ある態様において、Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖アルコキシ基であり、基−Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
【００３６】
好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基、又はモルホリン−４−イル基である。
【００３７】
Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
【００３８】
好ましい態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
【００３９】
好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。さらに好ましい態様において、ｎは、１から３の整数であり、さらにより好ましくは２又は３である。
【００４０】
本発明における式（Ｉ）の化合物またはその塩としては、以下の化合物またはその塩が例示される：
（１）式（Ｉ）：
【化２】
2014136519.tif 000004
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］の化合物またはその塩。
（２）Ｒ６−Ｒ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、（１）に記載の化合物またはその塩。
（３）Ｒ１−Ｒ５が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、および
Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、（２）に記載の化合物またはその塩。
（４）Ｒ２及びＲ３が、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ６及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、および
Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
又は、Ｒ７及びＲ８が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、（３）に記載の化合物またはその塩。
（５）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｘが、硫黄原子である、および
ｎが、０から４の整数である、（４）に記載の化合物またはその塩。
（６）Ｒ７が、ハロゲン原子であり、Ｒ８が、水素原子である、（５）に記載の化合物またはその塩。
（７）Ｒ２が、メトキシ基である、および
Ｒ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、（５）または（６）に記載の化合物またはその塩。
（８）ｎが、１から３の整数である、（５）〜（７）のいずれかに記載の化合物またはその塩。
（９）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｒ２及びＲ３が、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ７が、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、および
Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、（１）に記載の化合物またはその塩。
（１０）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
Ｘが、硫黄原子である、
Ａが、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
ｎが、０から４の整数である、（１１）に記載の化合物またはその塩。
【００４１】
ある態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下の化合物またはその塩である：
【化３】
2014136519.tif 000005
【化４】
2014136519.tif 000006
【化５】
2014136519.tif 000007
【化６】
2014136519.tif 000008
および、
【化７】
2014136519.tif 000009
［式中、Ｒ７は、ハロゲン原子である。］。
【００４２】
本発明における好適なＷｎｔシグナル阻害剤は、以下から選択される化合物またはその塩である：
ＫＹ０２１１１
【化８】
2014136519.tif 000010
ＫＹ０１０４１
【化９】
2014136519.tif 000011
Ｔ６１１６４
【化１０】
2014136519.tif 000012
ＫＹ０２１１４
【化１１】
2014136519.tif 000013
ＫＹ０１０４５
【化１２】
2014136519.tif 000014
ＫＹ０１０４０
【化１３】
2014136519.tif 000015
ＫＹ０２１０９
【化１４】
2014136519.tif 000016
ＫＹ０１０４２
【化１５】
2014136519.tif 000017
ＫＹ０１０４３
【化１６】
2014136519.tif 000018
ＫＹ０１０４６
【化１７】
2014136519.tif 000019
ＰＢ２８５２
【化１８】
2014136519.tif 000020
Ｎ１１４７４
【化１９】
2014136519.tif 000021
ＰＢ２５７２
【化２０】
2014136519.tif 000022
ＰＢ２５７０
【化２１】
2014136519.tif 000023
ＫＹ０２１０４
【化２２】
2014136519.tif 000024
ＳＯ０８７
【化２３】
2014136519.tif 000025
ＳＯ１０２
【化２４】
2014136519.tif 000026
ＳＯ０９６
【化２５】
2014136519.tif 000027
ＳＯ０９４
【化２６】
2014136519.tif 000028
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化２７】
2014136519.tif 000029
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化２８】
2014136519.tif 000030
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化２９】
2014136519.tif 000031
ＳＯ２０７７
【化３０】
2014136519.tif 000032
【００４３】
本発明における特に好適な式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下から選択される化合物またはその塩である：
ＫＹ０２１１１
【化３１】
2014136519.tif 000033
ＫＹ０１０４１
【化３２】
2014136519.tif 000034
Ｔ６１１６４
【化３３】
2014136519.tif 000035
ＫＹ０２１１４
【化３４】
2014136519.tif 000036
ＫＹ０１０４５
【化３５】
2014136519.tif 000037
ＫＹ０２１０４
【化３６】
2014136519.tif 000038
ＳＯ０８７
【化３７】
2014136519.tif 000039
ＳＯ１０２
【化３８】
2014136519.tif 000040
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化３９】
2014136519.tif 000041
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化４０】
2014136519.tif 000042
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化４１】
2014136519.tif 000043
ＳＯ２０７７
【化４２】
2014136519.tif 000044
【００４４】
式（Ｉ）の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（参照により本明細書に含まれる）により、あるいは国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の方法に準じて、合成することができる。
【００４５】
上記化合物は、例えば、J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735 （参照により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｎ１１４７４、Ｔ６１１６４)。また、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
【００４６】
本発明の心筋分化促進剤は、後述する本発明の多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法にしたがい使用することができる。
【００４７】
本発明の心筋分化促進用キットは、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む。本発明の心筋分化促進用キットはさらに、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤その他の心筋分化促進因子を含んでいてもよい。
【００４８】
本発明の多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む。本発明は、インビトロで実施される。本発明の方法に用いる培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される培地（以下、心筋分化培地ともいう）であればよく、その組成は特に限定はされない。本発明の方法に用いる培地としては、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、実施例で使用している培地)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。
【００４９】
ある態様において本発明は、血清を含まない培地（以下、血清不含培地ともいう）を用いる多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法を提供する。血清不含培地を用いる場合、培地はアルブミンを含むことが好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが挙げられる。アルブミンを含む血清不含培地を用いた場合、血清、サイトカイン、支持細胞（フィーダー細胞）等、アルブミン以外のタンパク質や、使用する多能性幹細胞とは異なる生物種に由来する成分（すなわち、異種成分）の非存在下で多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。
【００５０】
本発明の方法においては、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法を用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等が挙げられる。ある態様において、本発明の方法は、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞（フィーダー細胞）を使用しない。
【００５１】
本発明の方法において、心筋分化培地における培養（以下、心筋分化培養ともいう）の開始からＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中での培養開始までの期間、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中での培養期間は、適宜変更されうる。好適には、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の２、３、または４日目から１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、培養すればよい。例えば、心筋分化培養の２、３、または４日目から１０日目までのうち４〜８日間、例えば心筋分化培養の２〜１０日目（８日間）、２〜９日目（７日間）、２〜８日目（６日間）、３〜１０日目（７日間）、３〜９日目（６日間）、３〜８日目（５日間）、４〜１０日目（６日間）、４〜９日目（５日間）、４〜８日目（４日間）に実施することが好ましい。
【００５２】
本発明の方法は、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、および／またはＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することをさらに含んでもよい。
【００５３】
ある態様において、本発明の方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む。本方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地中で多能性幹細胞を培養する工程に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤またはＷｎｔシグナル阻害剤のいずれか一方を含む培地中で細胞を培養する工程を含んでもよい。例えば、ＥＧＦ受容体阻害剤を含みＷｎｔシグナル阻害剤を含まない培地、またはＷｎｔシグナル阻害剤を含みＥＧＦ受容体阻害剤を含まない培地中で細胞を１〜２日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤の両方を含む培地に交換し、培養を継続してもよい。あるいは、培養期間全体においてＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地を使用してもよい。また、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地中での培養後、いずれか一方のみを含む培地中で細胞を培養する期間があってもよい。
【００５４】
ある態様において、本発明の方法は、以下の工程を含む：
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）の後、前記細胞をＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
前記方法において、心筋分化培養の開始から工程（１）の開始までの期間、工程（１）の終了から工程（２）の開始までの期間、および工程（１）および（２）の培養期間は適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。Ｗｎｔシグナル活性化剤は、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階に添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階とは、中胚葉マーカー遺伝子の発現上昇が起こる、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期を意味する。中胚葉への分化は、中胚葉マーカー遺伝子の発現を調べることにより決定することができる。中胚葉マーカー遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。
【００５５】
例えば、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の０〜２日目または０〜３日目に、すなわち心筋分化培養開始から２または３日間、工程（１）を実施し、次いで、心筋分化培養の２、３、または４日目から１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、工程（２）を実施すればよい。工程（２）は、例えば、心筋分化培養の２、３、または４日目から１０日目までのうち４〜８日間、例えば心筋分化培養の２〜１０日目（８日間）、２〜９日目（７日間）、２〜８日目（６日間）、３〜１０日目（７日間）、３〜９日目（６日間）、３〜８日目（５日間）、４〜１０日目（６日間）、４〜９日目（５日間）、または４〜８日目（４日間）に実施することが好ましい。
【００５６】
前記方法において、好ましくは、工程（２）の培養期間の全体または一部において、ＥＧＦ受容体阻害剤に加えてＷｎｔシグナル阻害剤をさらに含む培地中で細胞を培養する。Ｗｎｔシグナル阻害剤は、多能性幹細胞の心筋分化の中期段階に添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の中期段階とは、中胚葉から心筋細胞への分化誘導期を意味する。心筋細胞への分化は、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。
【００５７】
例えば、ＥＧＦ受容体阻害剤を含みＷｎｔシグナル阻害剤を含まない培地中で細胞を１〜２日間、好ましくは１日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地に交換し、培養を継続する。あるいは、工程（２）の培養期間全体においてＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤の両方を含む培地を使用してもよい。また、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含みＥＧＦ受容体阻害剤を含まない培地中で細胞を１〜２日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地に交換し、培養を継続してもよい。さらに、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地中での培養後、いずれか一方のみを含む培地中で細胞を培養する期間があってもよい。本方法によれば、浮遊培養法によっても効率的に多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。
【００５８】
本発明におけるＥＧＦ受容体阻害剤の濃度は、特に限定はされない。ＥＧＦ受容体阻害剤としてゲフィチニブまたはＡＧ１４７８を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜２０μＭで使用すればよい。ＥＧＦ受容体阻害剤としてＰＰ３を使用する場合、最終濃度１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜１００μＭで使用すればよい。
【００５９】
本発明におけるＷｎｔシグナル活性化剤およびＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、特に限定はされない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＲ１を用いる場合、例えば最終濃度０.５〜２０μＭ、好ましくは１〜１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤として式（Ｉ）の化合物またはその塩を用いる場合、使用する化合物またはその塩に応じて、例えば最終濃度０.１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭで使用すればよい。
【００６０】
本発明の方法は、心筋細胞の製造に用いることができる。心筋細胞が得られたことは、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、前記式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤であって、ＥＧＦ受容体阻害剤と併用される心筋分化促進剤を提供する。本態様における式（Ｉ）の化合物またはその塩およびＥＧＦ受容体阻害剤は、「ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤」について説明のとおりである。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、多能性幹細胞の心筋分化促進のためのＥＧＦ受容体阻害剤の使用、および多能性幹細胞の心筋分化促進剤の製造のためのＥＧＦ受容体阻害剤の使用を提供する。かかる態様は、本発明の心筋分化促進剤および心筋分化誘導方法に関する記載に準じて実施することができる。
【００６３】
以下、実施例によりさらに本発明を説明するが、本発明は如何なる意味においても本実施例により限定されない。
【実施例】
【００６４】
１．サルＥＳ細胞の接着培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果（１）
心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子のプロモータを持つＧＦＰ遺伝子を導入したサルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezviewカルチャープレート）上に播種（２．０×１０５細胞／ウェル）し、ＩＭＤＭ培地を基本とした２０％ＦＢＳ（GIBCO 10099-141）含有心筋分化培地（IMDM (Sigma) （20% FBS (Gibco)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.005N NaOH含有））で培養した。培養４〜８日目に、ＫＹ０２１１１（１０μＭ）と、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８または下記のキナーゼ阻害剤のいずれかを投与した。
ＳＢ２０３５８０（２０μＭ）：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤
ＢＩＲＢ７９６（１０μＭ）：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢよりもｐ３８阻害活性が強い。）
Ｕ０１２６（１０μＭ）：ＥＲＫ／ＭＡＰＫＫ（ＭＥＫＫ）阻害剤
ＯＤＱ（２０μＭ）：ＮＯ感受性グアニル酸シクラーゼ阻害剤（ＮＯによるｃＧＭＰ産生を阻害する。）
チロホスチンＡＧ４９０（５μＭ）：ＪＡＫ２／３阻害剤
ＡＧ１４７８（２０μＭ）：ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼおよびＥｒｂ−Ｂ２受容体阻害剤
培養１０日目にＧＦＰ蛍光量が増加している化合物を、ＨＣＳ（high contents screening）システム（オリンパスIX81倒立顕微鏡およびモレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ蛍光量を測定することで検出した。【００６５】
その結果、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８が心筋分化促進効果を有することが見出された（図１、２）。また、他のＥＧＦ受容体阻害剤であるゲフィチニブも、心筋分化促進効果を有することが分かった（図３）。さらに、ＡＧ１４７８やゲフィチニブは、Ｗｎｔシグナル阻害剤であるＫＹ０２１１１やＸＡＶ９３９（ＷＡＫＯ）の同時添加により、相乗的に心筋分化を促進することが分かった（図４）。【００６６】
２．ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の浮遊培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果
マウスフィーダー細胞で継代維持したヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を回収し、そのヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞コロニー（３−１０×１０６細胞／ウェル）を、Ultra-lowカルチャーディッシュの６ウェルプレート（CORNING 3261）に播種し、ＩＭＤＭを基本とした既知組成培地（IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有））を用いて浮遊培養で３０日間培養した（図５）。培養０〜２日目に（２日間）ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ）（４μＭ）とＢＩＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１μＭ）を添加し、培養３〜９日目に（６日間）ＫＹ０２１１１（１０μＭ）とＸＡＶ９３９（１μＭ）を添加した。また、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブを、５〜２０μＭの濃度で、培養０〜２日目（２日間）、２〜５日目（３日間）、３〜７日目（４日間）、あるいは２〜９日目（７日間）添加した。心筋分化効果は、培養３０日目に、心筋特異的マーカーである心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を解析して評価した。【００６７】
その結果、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）において、ゲフィチニブ（１０μＭ）の０〜２日目の添加では心筋分化促進効果は見られなかったが、２〜５日目および３〜７日目の添加では顕著な分化効率の増加が見られた（図６）。さらに、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）とヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１）について、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブを培養２〜９日目に５〜２０μＭ添加したところ、ヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の両方について心筋分化効率の増加が見られ、特にＡＧ１４７８の２０μＭ添加では心筋細胞の割合が９２〜９５％まで顕著に上昇した（図７）。また、ＡＧ１４７８とゲフィチニブは、それぞれ単独（ＫＹ０２１１１およびＸＡＶ９３９の添加なし）でも心筋分化促進効果を示し、ＸＡＶ９３９のみとの組み合わせ（ＸＡＶ＋ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）においても分化促進効果が確認された（図８）。これらの結果は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤および／またはＷｎｔシグナル阻害剤とを組み合わせることで相乗的な強い心筋分化促進効果が得られることを示す。【００６８】
３．フィーダーフリーのヒトｉＰＳ細胞スフェア培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）に対して支持細胞なし（フィーダーフリー）のスフェア培養を行った。具体的には、マウスフィーダー細胞で継代維持した２５３Ｇ１細胞を回収し、その細胞塊を５０μｍのメッシュ（CellTrics, PARTEC04004-2327）に通して均一な細胞塊（８０−１２０μｍ）を得た後、Ultra-lowカルチャーディッシュの６ウェルプレート（CORNING 3261）に播種し、３％メチルセルロース（R＆D, HSC001）を含んだｍＴｅＳＲ１培地（Stem Cell Technology 05850）でｉＰＳ細胞コロニーの大きさが約２００−３００μｍになるまで浮遊培養した。このフィーダーフリーのスフェア培養法を用いて上記の手順を繰り返すことで２０継代以上培養維持した細胞に対し、ＩＭＤＭを基本とした既知組成培地（IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有）を培地交換によりそのまま添加し、浮遊培養で３０日間培養した（図５）。培養０〜２日目に（２日間）ＣＨＩＲ９９０２１（４μＭ）とＢＩＯ（１μＭ）を添加し、培養３〜９日目に（６日間）ＫＹ０２１１１（１０μＭ）とＸＡＶ９３９（１μＭ）を添加した。また、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブを、１０μＭの濃度で、３〜９日目（６日間）添加した。心筋分化効果は、培養３０日目に、心筋特異的マーカーである心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を解析して評価した。【００６９】
その結果、ＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブの添加により、分化誘導された心筋細胞の割合が３４％から５０％近くにまで増加した（図９）。すなわち、マウスフィーダー細胞上のヒトｉＰＳ細胞だけではなく、フィーダーフリーのスフェア培養系におけるｉＰＳ細胞に対しても、ＥＧＦ受容体阻害剤が心筋分化効率を高める効果が持つことが分かった。【００７０】
４．サルＥＳ細胞の接着培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果（２）
上記１と同様にして、サルＥＳ細胞においてＥＧＦ受容体阻害剤であるＰＰ３のの心筋分化促進効果を検討した。培養４〜８日目に、ＫＹ０２１１１（１０μＭ）と、ＰＰ３（３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、または１００μＭ）を投与した。その結果、ＰＰ３はＫＹ０２１１１の心筋分化促進効果を増強することが分かった（図１０）。ＰＰ３は、ＡＧ１４７８やゲフィチニブと骨格構造が異なること、またＥＧＦＲをリン酸化するＳｒｃキナーゼに対する阻害作用を有さないＥＧＦＲ阻害剤であることから、この結果はＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質が心筋分化促進効果を有することを示す。【００７１】
製造例
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化４３】
2014136519.tif 000045
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３，４−ジメトキシフェニル酢酸（１５７ｍｇ，０．７９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３９μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを１６７ｍｇ、収率５０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.73-7.69 (m ,1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97-6.84 (m, 3H), 3.75-3.72 (m, 8H).
MS (ESI) Found; 455 [M+H]+
【００７２】
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化４４】
2014136519.tif 000046
４−ヨードアニリン（１．００ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍｌ）溶液に、チオカルボニルジイミダゾール（９７６ｍｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を加えて１．５時間、室温にて攪拌した。２５％アンモニア水（３ｍｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去し、析出物を濾過して１−（４−ヨードフェニル）チオウレアを８８９ｍｇ、収率５９％で得た。
【化４５】
2014136519.tif 000047
１−（４−ヨードフェニル）チオウレア（８８９ｍｇ，３．１９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７ｍｌ）懸濁液に、臭素（３２８μｌ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流し、６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、ジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去後、析出物を濾過して２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾールを６５０ｍｇ、収率７３％で得た。
【化４６】
2014136519.tif 000048
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（１００ｍｇ，０．３６２ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（９１．４ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６９．４μｌ，０．３９８ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１８０ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを８３ｍｇ、収率４８％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.83 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.90-2.76 (m, 4H).
MS (ESI) Found; 469 [M+H]+
【００７３】
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化４７】
2014136519.tif 000049
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２５０ｍｇ，０．９０５ｍｍｏｌ），４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタン酸（２２４ｍｇ，０．９９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４μｌ，０．９９５ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（４５０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを１３１ｍｇ、収率３０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.37 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.58-2.48 (m, 4H), 1.96-1.86 (m, 2H).
MS (ESI) Found; 483 [M+H]+
【００７４】
ＳＯ２０７７
【化４８】
2014136519.tif 000050
４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニルプロピオン酸（５００ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液に、炭酸カリウム（８８１ｍｇ，６．３７ｍｍｏｌ）、１−ブロモプロパン（６９２μｌ，７．６５ｍｍｏｌ）を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、プロピル  ３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパノエートを５９０ｍｇ、収率８２％で得た。
【化４９】
2014136519.tif 000051
プロピル  ３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパノエート（５９０ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンに溶かし、５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．６８ｍｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、６ｍｏｌ／ｌ塩酸を加えて、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロピオン酸を４３８ｍｇ、収率８７％で得た。
【化５０】
2014136519.tif 000052
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロピオン酸（２００ｍｇ，０．８３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４０μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを２１７ｍｇ、収率６０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.38-8.37 (m, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.87-2.78 (m, 4H), 1.72-1.65 (m, 2H), 094 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
MS (ESI) Found; 497 [M+H]+【００７５】
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）、およびＳＯ２０７７が心筋分化促進効果を有することを、国際公開第２０１２／０２６４９１号に記載の実施例と同様の方法により確認した。
【図１】
2014136519.tif 000077
【図２】
2014136519.tif 000078
【図３】
2014136519.tif 000079
【図４】
2014136519.tif 000080
【図５】
2014136519.tif 000081
【図６】
2014136519.tif 000082
【図７】
2014136519.tif 000083
【図８】
2014136519.tif 000084
【図９】
2014136519.tif 000085
【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月9日(2014.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、インビトロにおける多能性幹細胞の心筋分化誘導方法であって、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、およびＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することをさらに含み、培養が浮遊培養により行われる、方法。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
以下の工程を含む、請求項１５記載の方法：
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）の後、前記細胞をＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程であって、培養期間の全体または一部において、ＥＧＦ受容体阻害剤およびＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で細胞を培養する、工程。
【請求項１９】
多能性幹細胞が霊長類の細胞である、請求項１５または１８に記載の方法。
【請求項２０】
多能性幹細胞が、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、
工程（１）を、心筋分化培養の開始から２または３日間実施し、工程（２）を、心筋分化培養の２、３、または４日目から１４日目までのうち３〜１０日間実施する、請求項１５および１８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項１５および１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
心筋細胞の製造方法である、請求項１５および１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、ＥＧＦＲ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ（ＣＡＳ７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣＡＳ  １７９２４８−６１−４）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ−４９０、ＡＧ５５５、チロホスチンＢ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ−１３０２２、ＤＡＰＨ、ＥＧＦＲ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣＡＳ  ８７９１２７−０７−８）、エルブスタチンアナログ（ＣＡＳ  ６３１７７−５７−１）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチンＡ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ−Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、およびチロホスチンＡＧ１１２から選択される、請求項１５、１８〜２１、および２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、およびＰＰ３から選択される、請求項１５、１８〜２１、および２３〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、請求項１５、１８〜２１、および２３〜２５のいずれかに記載の方法。：
式（Ｉ）：
【化１】
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［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【請求項２７】
式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ７が、ハロゲン原子である
Ｘが、硫黄原子である、および
ｎが、０から４の整数である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
Ｒ２が、メトキシ基である、および
Ｒ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下からなる群から選択される化合物またはその塩である、請求項２６に記載の方法：
ＫＹ０２１１１
【化２】
2014136519.tif 000088
ＫＹ０１０４１
【化３】
2014136519.tif 000089
Ｔ６１１６４
【化４】
2014136519.tif 000090
ＫＹ０２１１４
【化５】
2014136519.tif 000091
ＫＹ０１０４５
【化６】
2014136519.tif 000092
ＫＹ０１０４０
【化７】
2014136519.tif 000093
ＫＹ０２１０９
【化８】
2014136519.tif 000094
ＫＹ０１０４２
【化９】
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ＫＹ０１０４３
【化１０】
2014136519.tif 000096
ＫＹ０１０４６
【化１１】
2014136519.tif 000097
ＰＢ２８５２
【化１２】
2014136519.tif 000098
Ｎ１１４７４
【化１３】
2014136519.tif 000099
ＰＢ２５７２
【化１４】
2014136519.tif 000100
ＰＢ２５７０
【化１５】
2014136519.tif 000101
ＫＹ０２１０４
【化１６】
2014136519.tif 000102
ＳＯ０８７
【化１７】
2014136519.tif 000103
ＳＯ１０２
【化１８】
2014136519.tif 000104
ＳＯ０９６
【化１９】
2014136519.tif 000105
ＳＯ０９４
【化２０】
2014136519.tif 000106
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化２１】
2014136519.tif 000107
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化２２】
2014136519.tif 000108
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化２３】
2014136519.tif 000109
ＳＯ２０７７
【化２４】
2014136519.tif 000110
。
【請求項３０】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１からなる群から選択される、請求項１５、１８〜２１、および２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
Ｗｎｔシグナル活性化剤がＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択される、請求項１５、１８〜２１、および２３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
２以上のＷｎｔシグナル阻害剤、および２以上のＷｎｔシグナル活性化剤が併用される、請求項１５、１８〜２１、および２３〜３１のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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