(57)【要約】  平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む免疫賦活化剤である。血中のＴ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数およびＮＫ細胞数の各７項目の測定値に、予め免疫力に対応して設定された３段階のスコア１（免疫力が低い）、２（免疫力が中程度）、３（免疫力が高い）のいずれかを付与し、前記７項目に付与されたスコアを合算してなる免疫力スコアを指標とする免疫力を上昇させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、免疫賦活化剤。
【請求項２】
前記コラーゲンペプチドは、Ｉ型コラーゲンである、請求項１記載の免疫賦活化剤。
【請求項３】
前記コラーゲンペプチドは、魚燐由来である、請求項１記載の免疫賦活化剤。
【請求項４】
前記コラーゲンペプチドは、等電点７．０〜９．５である、請求項１記載の免疫賦活化剤。
【請求項５】
ペプチドのＮ末端アミノ酸がグリシンであるコラーゲンペプチドが、全コラーゲンペプチドの６０〜８５モル％である、請求項１記載の免疫賦活化剤。
【請求項６】
血中のＴ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数およびＮＫ細胞数の各７項目の測定値に、予め免疫力に対応して設定された３段階のスコア１（免疫力が低い）、２（免疫力が中程度）、３（免疫力が高い）のいずれかを付与し、前記７項目に付与されたスコアを合算してなる免疫力スコアを上昇させるものである、請求項１記載の免疫賦活化剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫賦活化剤を含む、細胞性免疫賦活化剤。
【請求項８】
平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、Ｔ細胞数増加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、免疫賦活化剤、細胞性免疫賦活化剤およびＴ細胞数増加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫力の低下により各種疾患に対する抵抗力が低下すると、癌や各種感染症へ罹患しやすくなる。免疫力は、公害や化学物質、運動などの環境要件、食生活、加齢、ストレスなどによって低下する。免疫力の低下を防止し、または免疫力を向上させることができれば、疾患への罹患率を低減させることができる。免疫力を低下させる要因のうち、環境や加齢は自分自身の意志で改善することは容易でないが、免疫賦活剤の服用により免疫力を向上させることはできる。【０００３】
免疫力を向上させる物質として、アフガニスタン産の甘草（Glycyrrhiza glabla）の酢酸抽出物がある（特許文献１）。種々の酵母及び生薬から抽出した多糖体画分の免疫系に及ぼす影響を、マイトジェン活性（リンパ球の幼若化反応）を指標として検討を行ったところ、甘草から酢酸酸性下で抽出される画分、特にアフガニスタン産の甘草の熱水抽出物を除タンパクしアルコールで沈殿させたものを、さらに酢酸で抽出して得られる画分（AL−４画分）に、強いマイトジェン活性が認められたという。【０００４】
また、甘蔗由来のエキスを有効成分とするガン免疫賦活剤もある（特許文献２）。甘蔗由来のエキスを使用するものであり、有効成分の検出に際し、ナチュラルキラー細胞のガン細胞に対する細胞傷害活性を増強する画分や、インターフェロン−γの産生能を増強する画分を基準としてガン免疫賦活を評価している。【０００５】
更に、体内におけるＩｇＡの産生を増進し、病原性細菌の増殖を抑制するエンテロコッカス・フェシウム  ＮＨＲＤ  ＩＨＡＲＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０９０）の培養物などを含む、体内のＩｇＡ産生を増進させる乳酸菌製剤もある（特許文献３）。ＩｇＡが、体内への病原微生物の付着防止やアレルギー物質の侵入、吸収を防ぐ粘膜免疫システムの主役であること、乳幼児や老人などの体力が低下した人は、病原菌など外部からの異物に対する抵抗力が低いこと、生活環境の変化等によるストレスが原因で腸管粘膜免疫が低下していることなどから、ＩｇＡ産生量を指標とし、この産生量を増強する物質を選択したものである。【０００６】
更に、オゴノリ属紅藻類由来の免疫増強剤もある（特許文献４）。静止期にあるリンパ球を成長・増殖する状態へと引き金を引く効果はマイトジェン刺激と呼ばれ、異物（抗原）に対する生体の免疫反応の鍵となる重要な現象である。マイトジェン刺激機能を指標とし、この活性の高い画分を有効成分として選択したものである。【０００７】
また、オーツ麦及び／又はその加工物とラクトバチルス・ガセリとを含有する免疫増強剤もある（特許文献５）。腹腔マクロファージと脾臓細胞とを共培養し、免疫原としてオボアルブミンを加えた培地に、乳酸菌の添加、無添加とオートミールの添加、無添加を組み合わせた実験系でマクロファージ活性化を反映するＮＯ2-イオン産生量を測定し、これを免疫活性の評価基準としている。【０００８】
また、皮及び内臓を除去したナマコ類の抽出物を免疫増強剤とするものもある（特許文献６）。脳神経修復作用、神経成長作用、インスリン遊離作用、免疫増強作用、侵害性疼痛抑制作用、神経性疼痛抑制作用、糖尿病性知覚異常改善作用、潰瘍抑制作用を評価し、この中の少なくとも一つの作用を有する画分を有効成分とするものである。【０００９】
また、コーヒー抽出物から得られるコーヒー由来のアラビノガラクタン（Ｃｏｆｆｅｅ  ＡＧ；Ｃｏｆ−ＡＧ）を有効成分とする免疫賦活剤もある（特許文献７）。マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４、Ｊ７７４．１、マウス脾細胞、マウス腹腔マクロファージ、マウス樹状細胞のいずれかの免疫担当細胞の増殖促進効果を評価基準として、カラマツ由来のアラビノガラクタンよりも前記免疫賦活活性の高いものを有効成分に特定したものである。【００１０】
更に、クラゲコラーゲンを含む、免疫グロブリン産生促進剤もある（特許文献８、非特許文献１）。免疫活性を増強させつつアレルギー応答に影響を及ぼさない免疫活性増強を目的としてなされたものである。ヒトに換算して０．３ｇ／日のクラゲ抽出物をマウスに経口投与させると、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球などのリンパ球の増加を促進させ、また、パイエル板リンパ球にクラゲ抽出物を添加して培養するとＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭなどの免疫グロブリンの産生を促進できるという。また、非特許文献１は、クラゲコラーゲンとウシアキレス腱コラーゲンとを比較し、クラゲコラーゲンに優れた抗体産生能があること、コラゲナーゼ処理したペプチドよりも分子量の大きいコラーゲンの方が抗体産生活性に優れることを記載している。なお、クラゲ抽出物にはコラーゲンのほかにムチンが含まれ（特許文献１１参照）、上記文献に記載される効果は、ムチンを含むクラゲ抽出物による効果である。【００１１】
ここに、免疫系は、生体内で病原体や癌細胞などの非自己物質や異常細胞を認識し、排除し、疾患から生体を保護する機構である。抗体や補体などの血中タンパク質の他に、各種リンパ球やリンパ球から放出されるサイトカインなどが相互に関連し、複雑なネットワークを形成している。しかも、免疫系に関与する細胞の種類は多く、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージなどがあり、Ｔ細胞も更に細分化され、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞などがある。ヒトの免疫能を正確に把握する方法として、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞数とＣＤ８陽性Ｔ細胞数やＣＤ２５陽性Ｔ細胞数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価する方法が提案されている（特許文献９）。細胞障害性試験は、エフェクター細胞の保存状態が試験結果に影響するため、採血からある程度の時間が経過しても正確な免疫能の評価ができる技術の開発を目指したものである。血単核細胞の集団におけるＣＤ４陽性・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の数の比率を指標とすれば、精度高く生体の免疫能を評価できるという。【００１２】
更に、免疫機構の複雑さから、リンパ球数の増減がただちに免疫力を反映しないことに鑑みて、総合的な免疫力を高精度に評価できる免疫力評価方法も提案されている（特許文献１０、非特許文献２）。特許文献１０記載の免疫力の評価方法は、各被験者の血中に含まれるＴ細胞数、Ｔ細胞増殖係数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数／ＣＤ８陽性Ｔ細胞数比（以下、単にＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比と称する）、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞数／メモリーＴ細胞数比（以下、単にナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比と称する）、ＩＬ−２サイトカイン産生能、ＩＦＮ−γサイトカイン産生能、ＩＬ−４サイトカイン産生能、Ｂ細胞数、及びＮＫ細胞数などの免疫細胞マーカーの評価を点数化し、これらの合算値を免疫力スコアとするものである。免疫力に応じてあらかじめ設定した複数のグレードと前記免疫力スコアとを対比させると、免疫力を総合的に評価できるという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第２９１８５６４号公報
【特許文献２】特許第４４８４２６７号公報
【特許文献３】特許第４５６５０５７号公報
【特許文献４】特許第４５８１０８２号公報
【特許文献５】特許第５０９５９１２号公報
【特許文献６】特許第５１０７０４３号公報
【特許文献７】特許第５３４８７１６号公報
【特許文献８】特開２０１０−１７３９３７号公報
【特許文献９】特許第５１４４９５０号公報
【特許文献１０】特許第４６０８７０４号公報
【特許文献１１】国際公開第２０１４／０３０３２３号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔ．ＳＵＧＡＨＡＲＡ  ｅｔ  ａｌ、「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ」、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年９月７日、第７０巻、９号、ｐ．２１３１−２１３７
【非特許文献２】廣川ら,”総説  免疫機能の評価判定とその回復について”,Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ,（２００９）,２３（１）,ｐｐ１−１２
【非特許文献３】Ｕｔｓｕｙａｍａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，（２００９），ｐｐ２０３−２１８，Ｆｉｇｕｒｅ３
【非特許文献４】笹月健彦監訳、免疫生物学（原著第５版）、南江堂、２００３年１０月１５日発行、ｐ．７６−７７、ｐ．２２３−２２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
コラーゲンは、分子量３００，０００の三重螺旋構造を有するタンパク質である。コラーゲン分解物の内、ゲル化能を有する画分を「ゼラチン」と称すれば、ゼラチンより低分子量の、例えば平均分子量１，０００〜２０，０００の分解物は「コラーゲンペプチド」と称される。ゼラチンは食品に多用されるため、これを低分子化したコラーゲンペプチドは安全性が高い。一方、非特許文献１は、クラゲコラーゲンには抗体産生能があるがウシアキレス腱コラーゲンには抗体産生能が弱く、コラーゲンペプチドより未分解のコラーゲンの方が抗体産生活性に優れると記載する。クラゲは軟骨組織からなり、ＩＩ型コラーゲンを主成分とする。ＩＩ型コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンより３倍量のヒドロキシリジンを含有し、１／２量のヒドロキシプロリンを含有するという特徴がある。したがって、コラーゲンペプチドを精査し、免疫力を賦活化しうるコラーゲンペプチドが特定できれば、安全な免疫賦活化剤を提供することができる。【００１６】
免疫賦活化は全身的な作用であり、免疫力を総合的・包括的に評価することは容易でない。特許文献１から８、非特許文献１記載の免疫増強剤などは、マイトジェン活性化、ガン免疫賦活化、病原性細菌の増殖抑制、マクロファージ活性化などを指標とするに過ぎない。特許文献９記載の免疫能の評価方法も、経時的変化の少ないＣＤ４陽性細胞数とＣＤ８陽性細胞数、およびＣＤ２５陽性細胞数との比を評価対象として、細胞障害性を評価するに過ぎない。この点、特許文献１０記載の方法は、複数の項目の実測値を免疫力に対応してスコア化して合算するものであり、包括的な免疫力の指標といえる。しかしながら、免疫力の向上は、罹患者に限らず健常者にも要求される特性である。健常者の免疫力も的確に把握しうる手段によって、適切に評価されることが望まれる。【００１７】
胸腺などの免疫関連臓器は、他の臓器より加齢による影響を受けやすく、免疫力が低下する一因となっている。例えば、胸腺の形成不全者はＴ細胞が形成されず、獲得免疫応答を奏することができない。したがって、Ｔ細胞数を増加できれば、加齢によるＴ細胞数の低下を補完することができ、ひいては免疫力を増強することができる。したがって、コラーゲンペプチドを含むＴ細胞数増加剤や細胞性免疫賦活化剤の開発が望まれる。【００１８】
上記現状に鑑み、本発明は、免疫賦活力に優れる、特定のコラーゲンペプチドを含む免疫賦活化剤、細胞性免疫賦活化剤を提供することを目的とする。【００１９】
また、本発明は、特定のコラーゲンペプチドを含むＴ細胞増加剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者等は、免疫系に関連する複数の細胞数等の変動に基づいて算出した免疫力スコアを指標としてコラーゲンペプチドの経口服用による効果を評価したところ、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、上記免疫スコアを上昇させ、およびＴ細胞数を増加させることを見出し、本発明を完成させた。【００２１】
すなわち、本発明は、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、免疫賦活化剤を提供するものである。【００２２】
また本発明は、前記コラーゲンペプチドがＩ型コラーゲンである、前記免疫賦活化剤を提供するものである。【００２３】
また本発明は、前記コラーゲンペプチドが魚燐由来である、前記免疫賦活化剤を提供するものである。【００２４】
また本発明は、前記コラーゲンペプチドの等電点が７．０〜９．５である、前記免疫賦活化剤を提供するものである。【００２５】
また本発明は、ペプチドのＮ末端アミノ酸がグリシンであるコラーゲンペプチドが、全コラーゲンペプチドの６０〜８５モル％である、前記免疫賦活化剤を提供するものである。【００２６】
また本発明は、血中のＴ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数およびＮＫ細胞数の各７項目の測定値に、予め免疫力に対応して設定された３段階のスコア１（免疫力が低い）、２（免疫力が中程度）、３（免疫力が高い）のいずれかを付与し、前記７項目に付与されたスコアを合算してなる免疫力スコアを上昇させるものである、前記免疫賦活化剤を提供するものである。【００２７】
また、上記いずれかの免疫賦活化剤を含む、細胞性免疫賦活化剤を提供するものである。【００２８】
更に、本発明は、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、Ｔ細胞数増加剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを経口にて服用することで、Ｔ細胞数を増加させ、免疫力を賦活化することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを含む、免疫賦活化剤、およびＴ細胞数増加剤である。上記コラーゲンペプチドを服用することで、免疫力を上昇させることができる。また、健常者のＴ細胞数を増加させることができる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
（１）コラーゲンペプチド
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖の三重螺旋構造を基本単位とし、生体の真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質である。コラーゲン分子を構成するアミノ酸は、−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｘ，Ｙはアミノ酸を示す）で示される、いわゆる「コラーゲン様配列」と呼ばれる一次構造を有する。本発明では、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを使用するが、コラーゲンの分解には、コラゲナーゼの他、リゾプス属由来、アスペルギルス属由来、バチルス属由来、ストレプトマイセス属由来のエンドプロテイナーゼ、その他のタンパク質分解酵素を使用してもよく、酸やアルカリで加水分解し、またはこれらを併用してもよい。好ましくは酵素法、または酵素法と酸やアルカリとの併用である。本発明で使用するコラーゲンペプチドは、ティラピア、タイ、シャケなどの魚類、鳥類、ブタ、ウシ、その他のいずれの動物種に由来するものであってもよく、魚鱗、真皮、腱、骨などのいずれの組織から抽出されたものであってもよい。好ましくは、魚鱗、ブタ、ウシ、トリ由来である。また、コラーゲンは、Ｉ型〜ＸＸＶＩＩＩ型まで知られているが、何れの型でもよい。好ましくは、Ｉ型コラーゲンである。コラーゲンペプチドの抽出方法も、酸抽出、アルカリ抽出、酵素抽出、これらを組合せた方法などのいずれの方法で抽出されたものであってもよい。製造方法によってコラーゲンペプチドの等電点が相違するが、本発明では等電点が７．０〜９．５であることが好ましく、より好ましくは７．５〜８．５である。等電点が上記範囲にあれば、服用時の溶解性に優れる。なお、Ｉ型コラーゲンペプチドのアミノ酸組成は、グリシンを約３３ｍｏｌ％、プロリンおよびヒドロキシプロリンをそれぞれ約１０ｍｏｌ％、ヒドロキシリジンを約１モル％含むが、クラゲコラーゲンは、グリシンを約３３ｍｏｌ％含む一方、プロリンおよびヒドロキシプロリンはそれぞれ５モル％と、哺乳動物に比べて低い値であり、またヒドロキシリジンを３モル％含み、ＩＩ型コラーゲンの特徴を有している。
【００３２】
本発明で使用するコラーゲンペプチドの平均分子量は、２，０００〜１２，０００であり、好ましくは３，０００〜８，０００、より好ましくは５，０００〜７，０００である。経口服用されたコラーゲンペプチドは、アミノ酸に分解された後に生体内に吸収され、一部はジペプチドやトリペプチドの状態で血中に存在する。ジペプチドやトリペプチドの種類は、使用するコラーゲンペプチドによって相違する。例えば、コラゲナーゼで分解したコラーゲンペプチドは、Ｇｌｙ−Ｘ−・・・−Ｘ−Ｙを主成分とするが、他の酵素で分解されたコラーゲンペプチドは、Ｘ−Ｙ−・・・−Ｙ−Ｇｌｙや、Ｙ−Ｇｌｙ−・・・−Ｇｌｙ−Ｘを主成分とする。Ｎ末端アミノ酸やＣ末端アミノ酸が異なるため、エキソペプチダーゼによる作用が異なり、体内で生成されるジペプチドやトリペプチド量が変化する。本発明では、Ｎ末端アミノ酸がグリシンであるコラーゲンペプチドを６０〜８５モル％、より好ましくは６０〜８０モル％、特に好ましくは６５〜７５モル％含有するコラーゲンペプチドを好適に使用することができる。このようなエキソペプチダーゼやエンドペプチダーゼの作用は、コラーゲンペプチドの平均分子量によっても影響され、生体内でのジペプチドやトリペプチドなどの生成率も相違する。本発明では、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを使用することで、健常者の血中のＴ細胞数などを増加させ、免疫力スコアを上昇させることが明らかとなった。なお、平均分子量とは、重量平均分子量を意味する。
【００３３】
（２）剤型、服用方法および対象者
本発明の免疫賦活化剤やＴ細胞数増加剤は、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドを主成分とする。その効果を損なわない範囲で、矯味矯臭剤、賦形剤、増粘剤、甘味料、植物エキス、ビタミン類が添加されるものであってもよい。
【００３４】
剤型は、コラーゲンペプチドの安定性が確保されることを条件に、粉末、顆粒、丸剤、カプセル、錠剤、液剤、懸濁剤、その他のいずれであってもよい。粉末や顆粒の場合は、水や温水に可溶で、その溶液を冷却してもゲル化しないことが好ましい。
【００３５】
服用量は、前記コラーゲンペプチド量に換算して、１日０．１〜３０ｇ、より好ましくは２〜１０ｇである。コラーゲンに特徴的なアミノ酸としてヒドロキシプロリンがあり、コラーゲンペプチドの含有量の算出に際しては、ヒドロキシプロリン量を基準にコラーゲンペプチド量を概算することができる。１日に複数回に分けて服用してもよい。
【００３６】
本発明の免疫賦活化剤は、経口投与で服用する。食事の前後、食間、その他のいずれに服用してもよく、食材に混入して調理し、このように調理した食材を摂取したり、調理済みの食材に振りかけて摂取してもよい。
【００３７】
投与の対象者は、健常者の他、免疫力が低下した高齢者、免疫力を賦活化するに適する疾患者である。後記する実施例に示すように、免疫力が正常範囲にある健常者においても、血中Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を増加させ、免疫力を賦活化させることができる。よって、健康維持を目的に服用し、疾患への罹患率を低下させることができる。
【００３８】
（３）免疫賦活化剤
本発明の免疫賦活化剤は、後記する「免疫力スコア」を指標とする免疫力を向上させることができる。「免疫力スコア」は、免疫力を総合的・包括的に評価する指標として採用したものである。評価は、二重盲検法によった。プラセボ効果や評価者の先入観などを防ぐためである。更に、データ解析は、服用前後の統計解析のみならず、試験薬服用群とプラセボ群との群間比較で解析した。免疫力を客観的かつ的確に評価するためである。本発明における「免疫力スコア」は、特許文献１０記載の「免疫力スコア」に準拠する。血中のＴ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４Ｔ陽性細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数およびＮＫ細胞数の各７項目の測定値に、予め免疫力に対応して設定された３段階のスコア１（免疫力が低い）、２（免疫力が中程度）、３（免疫力が高い）のいずれかを付与し、前記７項目に付与されたスコアを合算する。
【００３９】
免疫に関与するリンパ球はＴ細胞数、Ｂ細胞数およびＮＫ細胞数に大別される。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞に、またはナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞に大別され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比やナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比は細胞性免疫の指標となる。また、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数は、加齢に伴って減少することが知られている（非特許文献２、非特許文献３）。よって、免疫力スコアの算出に際し、上記７項目を測定項目とした。本発明では、免疫力スコアを構成する項目として「ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数」を含む点に特徴がある。健常者では、免疫細胞の老若に免疫力が依存する。免疫力スコアの算出に際し、「ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数」を評価項目に含めることで、健常者を含む広範囲の服用者の免疫力賦活化の指標とすることができる。
【００４０】
免疫力スコアの最低スコアは７であり、最高スコアは２１となる。上記７項目の測定値に対し、免疫力に対応する３段階の区分は、予め複数の被験者の、健康状態、罹患の種類、年齢、性別、血中Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数、その他の測定値を多数集積した標準化データベースを作成し、各項目の累積相対度数に基づいて設定する。
【００４１】
例えば、累積相対度数１０（％）未満、累積相対度数１０以上４０（％）未満、及び累積相対度数４０（％）以上の３つの段階に区分し、免疫力の低い区分から高い区分に向けて次第に大きな点数を割り当てることで行う。累積相対度数１０（％）と４０（％）との値を基準として、累積相対度数１０（％）以下であれば免疫力が低いレベルを示すスコア１、累積相対度数１０以上４０（％）未満であれば免疫力が中等度のレベルを示すスコア２、累積相対度数４０（％）以上であれば免疫力が充分に高いレベルを示すスコア３を割り当てる。累積相対度数に対応する各項目値は、標準化データベースに蓄積されるデータ数によって変動するが、データ数が一定以上になれば平衡する。
【００４２】
例えば、標準化データベースに蓄積された血中Ｔ細胞数の平均累積相対度数１０（％）が７１７個、４０（％）が１１７７個の場合、測定した血中Ｔ細胞数の値が７１７未満であれば、Ｔ細胞数としてスコア１点を与え、７１７個以上１１７７個未満であればスコア２点を与え、１１７７個以上であれば、スコア３点を与える。この点数化は、Ｔ細胞数の他、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数についても同様に行うことができる。
【００４３】
一方、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比率は、数値の増加が免疫力の増加と一致しないため、上記と異なる点数化を行う。具体的には、累積相対度数１０（％）未満をスコア１（点）、累積相対度数１０以上４０（％）未満をスコア２（点）、累積相対度数４０以上８０（％）未満をスコア３（点）、累積相対度数８０以上９０（％）未満をスコア２（点）、累積相対度数９０（％）以上をスコア１（点）とする。累積相対度数８０以上９０（％）未満にスコア２（点）、９０（％）以上にスコア１（点）を付与するのは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比率は、加齢とともに増加する傾向にあるからである。
【００４４】
上記７項目の測定値に対応するスコアは、いずれも免疫が賦活化された条件でスコアが増加するように設定されている。したがって、免疫力スコアの高低により免疫力の賦活化の程度を評価することができる。
【００４５】
免疫力スコアは、測定項目単独ではばらつきの大きい免疫力の判定に適する。各項目の測定値がスコア化されているため、投与群および非投与群の双方で標準偏差を小さくでき、統計的有意差を持って有効性を評価することができる。
【００４６】
なお、前記した累積相対度数１０（％）、４０（％）、８０（％）の数値は、前記標準化データベースに集積されたデータを解析し、免疫力との相関から算出したものであり、例示である。免疫賦活化剤を摂取する動物種や生存環境、その他に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
本発明では、二重盲検によって得られたデータを、試験薬投与群の服用前後の統計的有意差、プラセボ群の服用前後の統計的有意差で評価した。実施例では、コラーゲンペプチド服用により、服用前と比較して免疫力スコアを５．５％（ｐ＝０．００２（ｔ検定））上昇させた。一方、プラセボ群の８週間服用前後の免疫力スコアの上昇は０．３％（ｐ＝０．８７７（ｔ検定））であった。コラーゲンペプチド服用によってプラセボ服用よりも免疫力スコアが統計的有意に上昇し、免疫力が賦活化することが示唆された。更に、コラーゲンペプチド服用群とプラセボ服用群との群間差を相殺すべくＡＮＣＯＶＡによる群間比較を行った。その結果、ｐ＝０．０３０（ＡＮＣＯＶＡ）の統計的有意確率で、コラーゲンペプチドの服用によってプラセボ服用より免疫力スコアを上昇させることが判明した。このように、平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、二重盲検法によるデータ収集、ｔ検定およびＡＮＣＯＶＡ解析によって、統計的有意差をもってプラセボ投与群よりも免疫力スコアを上昇させ、免疫力を賦活化させることが明らかとなった。
【００４８】
なお、本発明において「免疫力スコア」は免疫力賦活化の指標であり、本発明の免疫賦活化剤が免疫力スコアで評価する上記７項目の全てを改善することを意味するものではない。
【００４９】
（４）Ｔ細胞数増加剤
平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、血中Ｔ細胞数を増加させることができる。実施例では、コラーゲンペプチドの服用により、服用前と比較してＴ細胞数を約９％（ｐ＝０．０１７（ｔ検定））増加させた。コラーゲンペプチド服用群とプラセボ群との８週間服用後のＡＮＣＯＶＡによる群間比較を行ったところ、ｐ＝０．０７９（ＡＮＣＯＶＡ）の統計的有意確率でプラセボ服用よりＴ細胞数を増加させている。
【００５０】
生体は、免疫機構により病原体などの非自己物質やがん細胞などの異常な細胞を認識し、排除することで各種疾患への罹患を防御している。各種リンパ球は、その機能や生体環境その他に応じて、罹患の有無にかかわらず、活性や総数を変動させる。生活環境や食習慣などの相違によりリンパ球数も個人差がある。上記した平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、健常者の血中Ｔ細胞数を増加することができる。
【００５１】
Ｔ細胞は、骨髄などの一次造血器官で生産された後に胸腺で分化成熟し、獲得免疫の中心的司令塔となる細胞である。胸腺の形成不全者はＴ細胞が形成されず、獲得免疫応答を奏することができない。免疫機能が低下する原因として、加齢、ストレス、食生活、運動その他の環境要因があり、加齢は回避しえない要因の一つとなっている。胸腺や脾臓は他の臓器より速く萎縮するため、加齢によりＴ細胞数が減少し、免疫力が低下すると考えられている。
【００５２】
一方、炎症や感染に伴って好中球数、好酸球数と共にＴ細胞数が増加することも知られている（非特許文献４）。平均粒子径２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、Ｔ細胞数やＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数を有意に増加させるが、好中球数や好酸球数を増加させるものではない。感染などに対抗する免疫賦活化の際には、血中Ｔ細胞数、好中球数および好酸球数が増加する。上記コラーゲンペプチドは、感染時の免疫亢進と異なる機序でＴ細胞数を増加させている。作用機序の詳細は不明であるが、骨髄などの一次器官や胸腺などの二次器官の機能を回復・維持しているものと推定される。
【００５３】
なお、加齢により低減するリンパ球としてＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞がある。平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数を増加させることができる。ウイルス感染等に関与する細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性細胞から分化するため、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞の増加によって、ウイルス感染や癌罹患の抑制を期待することできる。
【００５４】
Ｔ細胞は、いわゆる細胞性免疫に基づいて生体防御機構を担う。平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドは、免疫力スコアを上昇させ、Ｔ細胞数やＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数を増加させ、細胞性免疫に基づく免疫系を賦活化すると推察される。この点で、本発明の免疫賦活化剤は、Ｔ細胞数増加剤であり、細胞性免疫賦活化剤ということができる。
【００５５】
本発明の免疫賦活化剤によれば、加齢に伴う免疫力低下を補完することができる。更に、免疫系細胞による異物排除機構を活性化し、病原菌や癌細胞による特定疾患への罹患を回避、またはこれらに対抗することができる。よって、健常者の他、免疫機能の低下した患者や高齢者の健康維持に有用である。また、細胞性免疫能が低下したために発症する難治感染症や癌、さらにアレルギー疾患の予防と治療に有用である。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００５７】
(製造例）
脱灰処理したティラピア鱗を水洗後に温水に投入し膨潤させ、Ｉ型コラーゲン由来のゼラチンを抽出した。このゼラチン液に微生物由来食品用プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼ）を添加し加水分解した。プロテアーゼとして、リゾプス属由来、アスペルギルス属由来、バチルス属由来、ストレプトマイセス属由来のコラーゲン分解酵素を使用した。加熱して酵素を失活させた後、濾過およびイオン交換による脱塩を行い、スプレードライで微粉末とした。得られたコラーゲンペプチドの重量平均分子量は５，９００、等電点７．５〜８．５、Ｎ末端アミノ酸がグリシンであるペプチド含有率６５〜７５モル％であった。これを造粒機にて顆粒状に成形し、香料を０．２％添加して試験薬とした。得られた顆粒剤は、冷水に易溶で、改正日本薬局法「ゼラチン」確認試験によるゲル化能を有しなかった。【００５８】
（実施例１）
試験は、株式会社オルトメディコに委託し、二重盲検法にて行った。
エントリーした７５名をスクリーニング対象者とし、スクリーニング兼投与前検査時の免疫力スコアの平均値と標準偏差が群間で有意差が無いように、５０名(４６．１±６．６歳)を選抜し、各２５名ずつの試験薬服用群とプラセボ群との２群に区分した。試験薬服用群で使用した試験薬は製造例で製造した、ティラピアＩ型コラーゲン由来、平均分子量５，９００のコラーゲンペプチド顆粒（香料０．２％含有）である。また、プラセボ群で使用したプラセボは、デキストリン粉末（香料０．２％含有）である。両群とも、１回５ｇ、１日２回（朝食後および夕食後）に、コップ半分程度の水または温水に溶かして服用した。なお、服用期間は８週間である。【００５９】
なお、被験者には、（ａ）悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞の治療の既往歴がある者、（ｂ）心房細動、不整脈、肝障害、腎障害、脳血管障害、リウマチ、糖尿病、脂質異常症、高血圧、その他の慢性疾患で治療中の者、（ｃ）漢方薬を含む医薬品を常用している者、（ｄ）コラーゲン、ゼラチン、医薬品にアレルギーがある者、（ｅ）花粉症の既往歴がある者、（ｆ）喫煙者、（ｇ）ビタミン剤・ミネラル・コラーゲン・ヒアルロン酸・プラセンタ・グルコサミン・コンドロイチンなどのサプリメント、酸素水、水素水などの機能水、ビタミン強化米、ヨード卵・光などの栄養強化食品を習慣的に摂取している者、（ｈ）魚の皮、鶏もも肉、鶏手羽先・皮コラーゲン、牛すじなどのゼラチン高含有食材・食品を1週間に２日以上食べる者、（ｉ）妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者を含まない。【００６０】
服用期間の前後に採血し、Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数を計測し、免疫力スコアを算出した。なお、上記の他、好中球数、リンパ球数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数、メモリー細胞数、好酸球数、好塩基球数も同時に測定した。試験薬服用群の免疫細胞数等の変動を表２に示し、プラセボ群の免疫細胞数等の変動を表３に示す。【００６１】
服用期間が８週間と長期に亘ったため、季節変動その他の要素により試験薬服用群、およびプラセボ群のいずれにおいても、服用前後で統計的有意差が生じる項目が存在しうる。このような変動を相殺するために、試験開始前後のデータに対して、試験薬投与群とプラセボ群との群間比較を行った。表４および表５は、試験薬服用群とプラセボ群とのＡＮＣＯＶＡ検定による服用開始前後の群間比較の結果である。表４は、８週間服用後の、試験薬服用群とプラセボ群との群間比較であり、表５は、試験開始前の群間比較である。表４に示す群間比較は、試験開始前の測定値を共変量に投入し、服用後の測定値を対象とし、１要因ＡＮＣＯＶＡを用いて服用８週後の測定値を対象として行ったものである。【００６２】
なお、試験薬服用群とプラセボ群の双方には、服用前後に身体測定・理学検査血液検査、尿検査、末梢血液検査、自覚症状および内科的検査を実施した。試験薬の服用に伴う医学的に問題のある変化は認められなかった。【００６３】
（結果）
（１）被験者は、悪性腫瘍等の既往症がなく、リウマチや花粉症その他のアレルギー症状のない健常人である。これら被験者の試験薬服用群の投与前後のリンパ球数の変動を観察すると、表２に示すように、好中球数、リンパ球数、Ｔ細胞数、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数が増加し、Ｔ細胞では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、メモリーＴ細胞数の値がいずれも増加した。減少したのはナイーブＴ細胞数のみであったが、その減少は２．３％に過ぎなかった。なお、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＤ８陽性Ｔ細胞とが共に増加した結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比が１６．４％減少した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比の減少は免疫力亢進を意味する。これらが複合された結果、免疫力スコアが５．５％増加した。なお、免疫力スコア上昇の統計的有意確率ｐは０．００２（ｔ検定）であり低値である。平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドの服用により、被験者は略均一に免疫力スコアが上昇したことが示された。【００６４】
（２）プラセボ群の投与前後のリンパ球数の変動を観察すると、表３に示すように、リンパ球数、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数の増加が観察されたが、増加率は試験薬服用群に及ばず、Ｔ細胞数は横ばいであり、好中球数は減少した。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数は増加したが、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数は横ばいで、その結果ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比が１１．８％減少した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比の減少は免疫力亢進を意味する。これらの結果を反映して、プラセボ投与の前後の免疫力スコアの上昇は０．３％に過ぎなかった。【００６５】
（３）免疫力スコアを形成する７項目の内、統計的有意確率ｐ＜０．１を検出した項目は、試験薬投与群では、Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数であり（表２参照）、プラセボ群ではＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数であった（表３参照）。試験薬服用群のみで統計的有意確率ｐ＜０．１を検出した項目は、Ｔ細胞数とＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数のみとなる。コラーゲンペプチド服用による免疫力スコアの上昇は、Ｔ細胞数の増加とＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数の増加に依存すると推定された。試験薬投与群のＴ細胞数の増加率は８．８％（ｐ＝０．０１７）であり、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数の増加率は１５．３％（ｐ＝０．０３９）である。平均分子量２，０００〜１２，０００のコラーゲンペプチドの服用により、被験者は、ほぼ均一にＴ細胞数、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数が上昇したことが示された。胸腺などの免疫器官が萎縮するとＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数が減少するため、ＣＤ８陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞数の増加によって、胸腺の萎縮による免疫機能の低下を補完しうると推定される。【００６６】
（４）表４に示すように、コラーゲンペプチドを８週間服用すると、プラセボ群に対して免疫力スコアにｐ＝０．０３の統計的有意確率（ＡＮＣＯＶＡ）が検出された。なお、表５に示すように、試験開始前には、プラセボ群と試験薬投与群との間での統計的有意確率ｐは０．６４７である。これにより、コラーゲンペプチドの服用により、群間比較（ＡＮＣＯＶＡ）によっても統計的有意に免疫力スコアが上昇することが示された。【００６７】
（５）表４に示すように、試験薬投与群とプラセボ群とのＴ細胞数増加はｐ＝０．０７９の統計的有意確率（ＡＮＣＯＶＡ）で相違することが検出された。表５に示すように、試験開始前の統計的有意確率はｐ＝０．８８９である。これにより、コラーゲンペプチドの服用により、プラセボ群より統計的有意にＴ細胞数が増加することが示された。なお、好中球数、好酸球数、好塩基球数の群間有意確率ｐはそれぞれ０．３１５、０．８９６、０．１１７であり（表４参照）、明確な相違は検出されなかった。よって、Ｔ細胞数の増加は、好中球数、好酸球数、好塩基球数の増加を伴う感染や炎症に由来するものではないと推定された。【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【００７３】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【００７４】
本発明は２０１４年１１月１１日に出願された日本国特許出願２０１４−２２９３５５号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１４−２２９３５５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【国際調査報告】
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