(57)【要約】  ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、医薬組成物である。  ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、医薬組成物である。  水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。
【請求項２】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
【請求項３】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
【請求項４】
ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。
【請求項５】
ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
【請求項６】
ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
【請求項７】
水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含み、
気流によって粒子化された際に、粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
【請求項８】
水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物であり、
気流によって粒子化された際に、粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
【請求項９】
水に難溶性の薬物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【請求項１０】
水に難溶性の薬物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【請求項１１】
前記水に難溶性の薬物が、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物である請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１２】
前記肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物が、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体、プロビタミンＡ、ビタミンＤ受容体に作用する化合物、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤から選ばれた少なくとも１種である請求項１１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１３】
水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、
前記第一の液体と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、
前記第二の液体を凍結乾燥する工程と
を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
【請求項１４】
水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、
前記第一の液体と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、
前記第二の液体を凍結乾燥する工程と
を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【請求項１５】
前記水に難溶性の薬物が、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物である請求項１３又は請求項１４に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物が、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体、プロビタミンＡ、ビタミンＤ受容体に作用する化合物、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤から選ばれた少なくとも１種である請求項１５に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
【請求項１７】
請求項７〜請求項１２のいずれか１項に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤を含む医薬組成物、ビタミンＤ受容体に作用する化合物を含む医薬組成物、経肺投与用医薬組成物を製造するための凍結乾燥組成物、該凍結乾燥組成物の製造方法、及び経肺投与用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺組織に損傷を有する疾患である、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、急性肺損傷（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、肺線維症、肺癌、間質性肺炎、肺結核後遺症、じん肺などは不可逆的な肺胞の破壊を呈する呼吸器疾患である。現在のところ肺胞の不可逆的破壊病変に対して根治的な治療薬は存在せず、症状に対する対処療法薬が使用されている。
これら疾患に対する根治的な治療薬としては、肺胞上皮幹細胞を、肺胞を構成しているＩ型及びＩＩ型肺胞上皮細胞へと分化誘導し、肺胞を再生させる治療薬が有望と考えられている。【０００３】
肺胞の再生能を有する化合物として、ビタミンＡの誘導体であるオールトランスレチノイン酸が報告されている（例えば、Massaro G.D. et. al., Nature Med (1997) 3: 675-677.参照）。そこで、レチノイン酸を有効成分とする経口薬の臨床試験が試みられたが、経口投与では肺組織に到達する前に代謝されてしまう故に肺組織で有効な薬物濃度を維持しにくく、肺胞修復効果は観察されていない（例えば、Roth M.D. et. al., Chest (2006) 130: 1334-1345.参照）。【０００４】
ところで、経肺投与用粉末薬剤の吸入システムとして、空気衝撃によって凍結乾燥組成物を粒子化する吸入システムがある（例えば、米国特許第７７３５４８５Ｂ２号明細書、及び特許第４８２２７０９号公報参照）。この吸入システムによれば、患者の吸気により凍結乾燥組成物が経肺投与に適した粒子となり、そのまま吸入して経肺投与が実施される。
しかしながら、このシステムはタンパク質やペプチド等の熱に不安定で、かつ、水溶性薬物に適した凍結乾燥法を用いており、レチノイン酸等の水に難溶性の薬物の経肺製剤化には適していない。したがって、このシステムをレチノイン酸等の難溶性薬物に適用するためには新しい処方や製造方法を見出す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肺胞上皮幹細胞を肺胞上皮細胞へと分化誘導する化合物を見出し、その化合物を経肺投与用医薬組成物に製剤することができれば、肺組織の損傷を呈する疾患に対して肺胞の再生を作用点とする治療方法を提供することができる。
また、経肺投与用医薬組成物の投与態様として、米国特許第７７３５４８５Ｂ２号明細書又は特許第４８２２７０９号公報に開示された経肺投与用粉末薬剤吸入システムを採ることができれば、上記疾患の患者に簡便に肺胞の再生療法を提供することができる。【０００６】
本発明は、上記状況のもとになされた。【０００７】
上記状況のもと、肺胞上皮幹細胞を肺胞上皮細胞へと分化誘導する分化誘導剤が必要とされている。
上記状況のもと、肺胞の再生を誘導して、肺組織の損傷を治療する医薬組成物が必要とされている。【０００８】
上記状況のもと、肺組織の損傷を治療する水に難溶性の薬物を含む、経肺投与に適した医薬組成物が必要とされている。
上記状況のもと、水に難溶性の薬物を含む凍結乾燥組成物であり、気流によって経肺投与に適した粒子径の粒子に粒子化する凍結乾燥組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を達成するための具体的手段は以下のとおりである。
（Ａ１）ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。
（Ａ２）ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
（Ａ３）ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
（Ａ４）肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤の製造における、ＰＩ３キナーゼ阻害剤の使用。
（Ａ５）肺胞再生を誘導する医薬組成物の製造における、ＰＩ３キナーゼ阻害剤の使用。
（Ａ６）肺組織の損傷治療用の医薬組成物の製造における、ＰＩ３キナーゼ阻害剤の使用。
（Ａ７）肺組織の損傷の治療における使用のためのＰＩ３キナーゼ阻害剤。
（Ａ８）肺組織に損傷を有する患者に、ＰＩ３キナーゼ阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を投与することを含む、肺組織の損傷の治療方法。
（Ａ９）前記ＰＩ３キナーゼ阻害剤が、ＰＩ３キナーゼを直接的に阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＢＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＩＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＴＡＰＰ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＤＡＰＰ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＧＡＢ１／２経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｃ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒｈｏ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＲＦ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＥＥＡ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ５経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｉｐ４経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＦＡＢ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ｐ４０ｐｈｏｘ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ３経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ１７経路を阻害する薬剤、及びＰＩ３Ｋ−ＳＧＫ３経路を阻害する薬剤から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ａ１）〜（Ａ８）。【００１０】
前記課題を達成するための具体的手段は以下のとおりである。
（Ｂ１）ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。
（Ｂ２）ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
（Ｂ３）ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
（Ｂ４）肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤の製造における、ビタミンＤ受容体に作用する化合物の使用。
（Ｂ５）肺胞再生を誘導する医薬組成物の製造における、ビタミンＤ受容体に作用する化合物の使用。
（Ｂ６）肺組織の損傷治療用の医薬組成物の製造における、ビタミンＤ受容体に作用する化合物の使用。
（Ｂ７）肺組織の損傷の治療における使用のためのビタミンＤ受容体に作用する化合物。
（Ｂ８）肺組織に損傷を有する患者に、ビタミンＤ受容体に作用する化合物を有効成分として含む医薬組成物を投与することを含む、肺組織の損傷の治療方法。
（Ｂ９）前記ビタミンＤ受容体に作用する化合物が、ビタミンＤ２及びその誘導体、ビタミンＤ３及びその誘導体、ビタミンＤ４及びその誘導体、ビタミンＤ５及びその誘導体、ビタミンＤ６及びその誘導体、ビタミンＤ７及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ｂ１）〜（Ｂ８）。【００１１】
前記課題を達成するための具体的手段は以下のとおりである。
（Ｃ１）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含み、気流によって粒子化された際に、粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
（Ｃ１０１）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含み、気流によって粒子化された際に、幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
（Ｃ１０２）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含み、気流によって粒子化された際に、空気力学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。【００１２】
（Ｃ２）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物であり、気流によって粒子化された際に、粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
（Ｃ２０１）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物であり、気流によって粒子化された際に、幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。
（Ｃ２０２）水に難溶性の薬物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物であり、気流によって粒子化された際に、空気力学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物。【００１３】
（Ｃ３）水に難溶性の薬物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
（Ｃ４）水に難溶性の薬物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン【００１４】
（Ｃ５）前記水に難溶性の薬物が、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物である前記（Ｃ１）〜（Ｃ４）、（Ｃ１０１）、（Ｃ１０２）、（Ｃ２０１）、及び（Ｃ２０２）のいずれか１項に記載の凍結乾燥組成物。
（Ｃ６）前記肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物が、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体、プロビタミンＡ、ビタミンＤ受容体に作用する化合物、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤から選ばれた少なくとも１種である前記（Ｃ５）に記載の凍結乾燥組成物。
（Ｃ６０１）前記ビタミンＤ受容体に作用する化合物が、ビタミンＤ２及びその誘導体、ビタミンＤ３及びその誘導体、ビタミンＤ４及びその誘導体、ビタミンＤ５及びその誘導体、ビタミンＤ６及びその誘導体、ビタミンＤ７及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ｃ６）に記載の凍結乾燥組成物。
（Ｃ６０２）前記ＰＩ３キナーゼ阻害剤が、ＰＩ３キナーゼを直接的に阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＢＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＩＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＴＡＰＰ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＤＡＰＰ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＧＡＢ１／２経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｃ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒｈｏ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＲＦ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＥＥＡ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ５経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｉｐ４経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＦＡＢ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ｐ４０ｐｈｏｘ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ３経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ１７経路を阻害する薬剤、及びＰＩ３Ｋ−ＳＧＫ３経路を阻害する薬剤から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ｃ６）に記載の凍結乾燥組成物。【００１５】
（Ｃ７）水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程とを含む凍結乾燥組成物の製造方法。
（Ｃ７０１）水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と界面活性剤とを混合したのち、さらに、少なくとも２種類のアミノ酸及び水を混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程とを含む凍結乾燥組成物の製造方法。
（Ｃ８）水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程とを含む凍結乾燥組成物の製造方法。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
（Ｃ８０１）水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と界面活性剤とを混合したのち、さらに、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸並びに水を混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程とを含む凍結乾燥組成物の製造方法。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン【００１６】
（Ｃ９）前記水に難溶性の薬物が、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物である前記（Ｃ７）、（Ｃ７０１）、（Ｃ８）及び（Ｃ８０１）のいずれか１項に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
（Ｃ１０）前記肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物が、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体、プロビタミンＡ、ビタミンＤ受容体に作用する化合物、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤から選ばれた少なくとも１種である前記（Ｃ９）に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
（Ｃ１１１）前記ビタミンＤ受容体に作用する化合物が、ビタミンＤ２及びその誘導体、ビタミンＤ３及びその誘導体、ビタミンＤ４及びその誘導体、ビタミンＤ５及びその誘導体、ビタミンＤ６及びその誘導体、ビタミンＤ７及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ｃ１０）に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
（Ｃ１１２）前記ＰＩ３キナーゼ阻害剤が、ＰＩ３キナーゼを直接的に阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＢＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＩＴＫ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＴＡＰＰ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＤＡＰＰ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＧＡＢ１／２経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｃ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒｈｏ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＲＦ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＥＥＡ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ５経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｉｐ４経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＦＡＢ１経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ｐ４０ｐｈｏｘ経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ３経路を阻害する薬剤、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ１７経路を阻害する薬剤、及びＰＩ３Ｋ−ＳＧＫ３経路を阻害する薬剤から選ばれた少なくとも１種である、前記（Ｃ１０）に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。【００１７】
（Ｃ１１）前記（Ｃ１）〜（Ｃ６）、（Ｃ１０１）、（Ｃ１０２）、（Ｃ２０１）、（Ｃ２０２）、（Ｃ６０１）、及び（Ｃ６０２）のいずれか１項に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤が提供される。
また、本発明によれば、肺胞の再生を誘導する医薬組成物、及び肺組織の損傷治療用の医薬組成物が提供される。【００１９】
本発明によれば、水に難溶性の薬物を含む凍結乾燥組成物であり、気流によって経肺投与に適した粒子径の粒子に粒子化する凍結乾燥組成物が提供される。
また、本発明によれば、肺胞の再生を誘導する医薬組成物の製造に使用される凍結乾燥組成物であり、気流によって経肺投与に適した粒子径の粒子に粒子化する凍結乾燥組成物が提供される。
また、本発明によれば、水に難溶性の薬物を含む、経肺投与に適した医薬組成物が提供される。
また、本発明によれば、経肺投与に適した、肺胞の再生を誘導する医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例Ａ２のＣＯＰＤモデルマウスにおける、ワートマニン処置をした肺組織の切片のＨＥ染色像、及び平均肺胞壁間距離を示すグラフである。
【図２】実施例Ｂ３のＣＯＰＤモデルマウスにおける、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３処置をした肺組織の切片のＨＥ染色像、及び平均肺胞壁間距離を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「治療」とは、症状の改善であればよく、重症化の抑制及び、症状の軽減又は緩和もこの用語に包摂される。
本明細書において「再生」とは、当技術分野で通常用いられる意味で使用される。
【００２２】
以下、本発明者によって、肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用が初めて確認された化合物、及び該化合物を含む医薬組成物について詳述する。
【００２３】
［Ａ］ＰＩ３キナーゼ阻害剤を含む医薬組成物
ＰＩ３キナーゼ（phosphatidylinositol-3 kinase、ＰＩ３Ｋ）は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基（−ＯＨ基）のリン酸化を行う酵素である。イノシトールリン脂質は、真核生物の細胞膜の成分の一つであり、ＰＩ３Ｋをはじめとしたキナーゼ（リン酸化酵素）の触媒作用を受けてホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）となり、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／Ａｋｔの活性化を起こすことで、細胞の生存、増殖、分化、細胞死の制御に関連している。
【００２４】
ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３キナーゼを直接的に阻害する薬剤、及びＰＩ３Ｋの下流シグナル経路を阻害する薬剤である。ＰＩ３Ｋの下流シグナル経路は、例えば、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、ＰＩ３Ｋ−ＢＴＫ経路、ＰＩ３Ｋ−ＩＴＫ経路、ＰＩ３Ｋ−ＴＡＰＰ１経路、ＰＩ３Ｋ−ＤＡＰＰ経路、ＰＩ３Ｋ−ＧＡＢ１／２経路、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｃ経路、ＰＩ３Ｋ−Ｒｈｏ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＲＦ経路、ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路、ＰＩ３Ｋ−ＥＥＡ１経路、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ５経路、ＰＩ３Ｋ−Ｒａｂｉｐ４経路、ＰＩ３Ｋ−ＦＡＢ１経路、ＰＩ３Ｋ−ｐ４０ｐｈｏｘ経路、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ３経路、ＰＩ３Ｋ−ＳＮＸ１７経路、ＰＩ３Ｋ−ＳＧＫ３経路である。これまで、ＰＩ３Ｋ阻害剤について、肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することは報告されていない。本発明者らは、ＰＩ３Ｋ阻害剤が、肺胞上皮幹細胞をＩ型及びＩＩ型肺胞上皮細胞へと分化誘導するという新しい知見を得た。
【００２５】
ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
・ＰＩ３Ｋの直接的阻害剤：例えば、ワートマニン（Wortmannin）、ＬＹ２９４００２、ＡＳ６０５２４０、ＺＳＴＫ４７４、ＰＩＫ−７５  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＩＰＩ−１４５（ＩＮＫ１１９７）、ＧＤＣ−０９４１、ＣＡＬ−１０１（Ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ、ＧＳ−１１０１）、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ＢＫＭ１２０（ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、Ｂｕｐａｒｌｉｓｉｂ）、ＧＳＫ２６３６７７１、ＣＺＣ２４８３２、ＧＤＣ−００３２、ＶＳ−５５８４（ＳＢ２３４３）、ＴＧ１００７１３、ＢＹＬ７１９、ＣＵＤＣ−９０７、３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ、ＹＭ２０１６３６、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＢＡＹ８０−６９４６（Ｃｏｐａｎｌｉｓｉｂ）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＫＩ−４０２、ＣＨ５１３２７９９、ＧＤＣ−０９８０（ＲＧ７４２２）、ＮＵ７４４１ (ＫＵ−５７７８８）、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、ＣＡＹ１０５０５、ＧＳＫ２１２６４５８（ＧＳＫ４５８）、Ａ６６、ＰＦ−０５２１２３８４（ＰＫＩ−５８７）、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９（Ｐ５２９）、ＰＩＫ−２９４、ＰＩＫ−２９３、ＳＡＲ２４５４０９（ＸＬ７６５）、ＰＩＫ−９３、ＡＺＤ６４８２、ＡＳ−６０５２４０、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００−１１５、ＩＣ−８７１１４、ＰＩＫ−７５、ＰＩＫ−９０、ＴＧＸ−２２１、ＸＬ１４７、ＰＩ−１０３、ＩＣ４８６０６８、及びこれらの誘導体
・ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路阻害剤：例えば、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、及びこれらの誘導体
・ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路阻害剤：例えば、ＢＸ−９１２、ＢＸ−７９５、ＯＳＵ−０３０１２、ＰＨＴ−４２７、及びこれらの誘導体
【００２６】
かかる知見に基づき、下記の［１］〜［４］の発明が提供される。
【００２７】
［１］ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。当該分化誘導剤は、肺胞上皮幹細胞を肺胞上皮細胞へと分化させる。
当該分化誘導剤は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＰＩ３Ｋ阻害剤の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該分化誘導剤の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００２８】
［２］ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
当該医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＰＩ３Ｋ阻害剤の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該医薬組成物の形態は、特に制限されず、経口投与に適した、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、リモナーデ剤；注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤；経肺投与用乾燥粉末剤；等が挙げられる。
当該医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００２９】
［３］ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
当該医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＰＩ３Ｋ阻害剤の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該医薬組成物の形態は、特に制限されず、経口投与に適した、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、リモナーデ剤；注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤；経肺投与用乾燥粉末剤；等が挙げられる。
当該医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００３０】
［４］肺組織に損傷を有する患者に、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を投与することを含む、肺組織の損傷の治療方法。当該治療方法に用いる医薬組成物は、前記［２］の医薬組成物、又は前記［３］の医薬組成物である。
肺組織に損傷を有する患者としては、例えば、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、急性肺損傷（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、肺線維症、肺癌、間質性肺炎、肺結核後遺症、じん肺などの患者が挙げられる。
当該治療方法において、投与態様は、特に制限されず、経肺投与、静脈内投与、経口投与など種々の投与経路の選択が可能であるが、好ましくは経肺投与である。
投与量は、疾患の種類；患者の症状、体重、年齢；投与態様；ＰＩ３Ｋ阻害剤の種類；等に応じて選択される。
【００３１】
さらに、下記の［５］〜［８］及び［５’］〜［８’］の発明が提供される。［５］〜［８］及び［５’］〜［８’］は、後述する［凍結乾燥組成物］、［凍結乾燥組成物の製造方法］、及び［経肺投与用医薬組成物］に相当し、有効成分としてＰＩ３Ｋ阻害剤を含むものである。［５］〜［８］及び［５’］〜［８’］の詳細は、後述する［凍結乾燥組成物］、［凍結乾燥組成物の製造方法］、及び［経肺投与用医薬組成物］と同様である。
【００３２】
［５］ＰＩ３Ｋ阻害剤と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
【００３３】
［５’］ＰＩ３Ｋ阻害剤と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００３４】
［６］ＰＩ３Ｋ阻害剤と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
【００３５】
［６’］ＰＩ３Ｋ阻害剤と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００３６】
［７］ＰＩ３Ｋ阻害剤を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程と、を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
【００３７】
［７’］ＰＩ３Ｋ阻害剤を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程と、を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００３８】
［８］前記［５］又は［６］に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【００３９】
［８’］前記［５’］又は［６’］に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【００４０】
さらに、前記［５］、［６］、［５’］又は［６’］の発明を、例えば米国特許第７７３５４８５Ｂ２号明細書又は特許第４８２２７０９号公報に開示された経肺投与用デバイスに充填して提供すれば、下記の［９］又は［９’］の発明が提供される。
【００４１】
［９］患者が前記［８］に記載の経肺投与用医薬組成物を吸入する際に、前記［５］又は［６］に記載の凍結乾燥組成物を前記患者の吸気による空気衝撃で粒子化して前記経肺投与用医薬組成物を調製する工程を含む経肺投与用医薬組成物の経肺投与方法。
【００４２】
［９’］患者が前記［８’］に記載の経肺投与用医薬組成物を吸入する際に、前記［５’］又は［６’］に記載の凍結乾燥組成物を前記患者の吸気による空気衝撃で粒子化して前記経肺投与用医薬組成物を調製する工程を含む経肺投与用医薬組成物の経肺投与方法。
【００４３】
前記［１］〜［９］及び［５’］〜［９’］によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤；肺胞再生を誘導する医薬組成物；肺組織の損傷治療用の医薬組成物；肺組織の損傷の治療方法；肺組織の損傷治療用の医薬組成物の製造に使用される凍結乾燥組成物であり、気流によって経肺投与に適した粒子径の粒子に粒子化する凍結乾燥組成物；前記凍結乾燥組成物の製造方法；経肺投与に適した、肺組織の損傷治療用の医薬組成物；肺組織の損傷治療用の医薬組成物の経肺投与方法；が提供される。
【００４４】
以下、本発明者によって、肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用が初めて確認された化合物、及び該化合物を含む医薬組成物について詳述する。
【００４５】
［Ｂ］ビタミンＤ受容体に作用する化合物を含む医薬組成物
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）は、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）の患者の肺組織において発現が低下することが報告されているが（Sundar IK. et. al., Biochem Biophys Res Commun. (2011) 406: 127-133.）、肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することは報告されていない。
本発明者らは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、肺胞上皮幹細胞をＩ型及びＩＩ型肺胞上皮細胞へと分化誘導するという新しい知見を得た。
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がビタミンＤ受容体（vitamin D receptor、ＶＤＲ）のリガンドであることから、ＶＤＲに作用する化合物（以下「ＶＤＲ作用化合物」と称する。）は、肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することが考えられた。
ＶＤＲ作用化合物には、ＶＤＲに直接結合する化合物、例えば、ＶＤＲのリガンド、ＶＤＲのアゴニストが含まれる。また、ＶＤＲ作用化合物には、ＶＤＲに直接結合しない化合物、例えば、抗ＶＤＲリガンド抗体、ＶＤＲの下流のシグナル伝達を促進する化合物、ＶＤＲの下流のシグナル伝達経路を構成するタンパク質に作用する化合物、ＶＤＲアクチベーターとして機能する化合物、ＶＤＲアクチベーターインヒビターを阻害する化合物が含まれる。
【００４６】
ＶＤＲ作用化合物のうち、ＶＤＲのリガンド及びアゴニストとしては、例えばビタミンＤ及びその誘導体が挙げられ、具体的には以下の化合物が挙げられる。
・ビタミンＤ２及びその誘導体：例えば、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール
・ビタミンＤ３及びその誘導体：例えば、７−デヒドロコレステロール、プレビタミンＤ３、コレカルシフェロール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（カルシジオール）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、カルシトロン酸
・ビタミンＤ４及びその誘導体：例えば、ジヒドロエルゴカルシフェロール
・ビタミンＤ５及びその誘導体
・ビタミンＤ６及びその誘導体
・ビタミンＤ７及びその誘導体
・ビタミンＤアナログ：例えば、ジヒドロタキステロール、カルシポトリオール、タカルシトール、パリカルシトール
【００４７】
ＶＤＲ作用化合物のうち、ＶＤＲの下流のシグナル伝達経路を構成するタンパク質に作用する化合物としては、例えばＲＡＮＫＬ（Receptor activator of NF-kappa B ligand）阻害物質及びＮＦ−ｋＢ（Nuclear factor-kappa B）阻害物質が挙げられ、具体的には以下の化合物が挙げられる。
・ＲＡＮＫＬ阻害物質：例えば、ＷＰ９ＱＹ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体（デノスマブ）、ＲＡＮＫＬｓｉＲＮＡ、ＲＡＮＫＬｓｈＲＮＡ
・ＮＦ−ｋＢ阻害物質：例えば、（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ、（５Ｚ）−Ｚｅａｅｎｏｌ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ、Ａｕｒｏｔｈｉｏｍａｌａｔｅ、Ｃａｐｓａｉｃｉｎ、（Ｅ）−Ｃａｐｓａｉｃｉｎ、Ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ、抗ＮＦ−ｋＢ抗体、ＮＦ−ｋＢｓｉＲＮＡ、ＮＦ−ｋＢｓｈＲＮＡ
【００４８】
ＶＤＲ作用化合物としては、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が好ましい。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＡＴＲＡよりも低濃度で有意に肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を示す。
【００４９】
かかる知見に基づき、下記の［１１］〜［１４］の発明が提供される。
【００５０】
［１１］ＶＤＲ作用化合物を有効成分として含む、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤。当該分化誘導剤は、肺胞上皮幹細胞を肺胞上皮細胞へと分化させる。
当該分化誘導剤は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＶＤＲ作用化合物の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該分化誘導剤の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００５１】
［１２］ＶＤＲ作用化合物を有効成分として含む、肺胞再生を誘導する医薬組成物。
当該医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＶＤＲ作用化合物の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該医薬組成物の形態は、特に制限されず、経口投与に適した、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、リモナーデ剤；注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤；経肺投与用乾燥粉末剤；等が挙げられる。
当該医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００５２】
［１３］ＶＤＲ作用化合物を有効成分として含む、肺組織の損傷治療用の医薬組成物。
当該医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、ＶＤＲ作用化合物の少なくとも１種を有効成分として含む。
当該医薬組成物の形態は、特に制限されず、経口投与に適した、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、リモナーデ剤；注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤；経肺投与用乾燥粉末剤；等が挙げられる。
当該医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられる。
【００５３】
［１４］肺組織に損傷を有する患者に、ＶＤＲ作用化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、肺組織の損傷の治療方法。当該治療方法に用いる医薬組成物は、前記［１２］の医薬組成物、又は前記［１３］の医薬組成物である。
肺組織に損傷を有する患者としては、例えば、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、急性肺損傷（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、肺線維症、肺癌、間質性肺炎、肺結核後遺症、じん肺などの患者が挙げられる。
当該治療方法において、投与態様は、特に制限されず、経肺投与、静脈内投与、経口投与など種々の投与経路の選択が可能であるが、好ましくは経肺投与である。
投与量は、疾患の種類；患者の症状、体重、年齢；投与態様；ＶＤＲ作用化合物の種類；等に応じて選択される。
【００５４】
さらに、下記の［１５］〜［１８］及び［１５’］〜［１８’］の発明が提供される。［１５］〜［１８］及び［１５’］〜［１８’］は、後述する［凍結乾燥組成物］、［凍結乾燥組成物の製造方法］、及び［経肺投与用医薬組成物］に相当し、有効成分としてＶＤＲ作用化合物を含むものである。［１５］〜［１８］及び［１５’］〜［１８’］の詳細は、後述する［凍結乾燥組成物］、［凍結乾燥組成物の製造方法］、及び［経肺投与用医薬組成物］と同様である。
【００５５】
［１５］ＶＤＲ作用化合物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
【００５６】
［１５’］ＶＤＲ作用化合物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤とを含む凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００５７】
［１６］ＶＤＲ作用化合物と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
【００５８】
［１６’］ＶＤＲ作用化合物と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、アルコールと、水とを含む組成物の凍結乾燥組成物。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００５９】
［１７］ＶＤＲ作用化合物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程と、を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
【００６０】
［１７’］ＶＤＲ作用化合物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程と、前記第一の液体と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程と、前記第二の液体を凍結乾燥する工程と、を含む凍結乾燥組成物の製造方法。
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００６１】
［１８］前記［１５］又は［１６］に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【００６２】
［１８’］前記［１５’］又は［１６’］に記載の凍結乾燥組成物を気流によって粒子化した経肺投与用医薬組成物。
【００６３】
さらに、前記［１５］、［１６］、［１５’］又は［１６’］の発明を、例えば米国特許第７７３５４８５Ｂ２号明細書又は特許第４８２２７０９号公報に開示された経肺投与用デバイスに充填して提供すれば、下記の［１９］又は［１９’］の発明が提供される。
【００６４】
［１９］患者が前記［１８］に記載の経肺投与用医薬組成物を吸入する際に、前記［１５］又は［１６］に記載の凍結乾燥組成物を前記患者の吸気による空気衝撃で粒子化して前記経肺投与用医薬組成物を調製する工程を含む経肺投与用医薬組成物の経肺投与方法。
【００６５】
［１９’］患者が前記［１８’］に記載の経肺投与用医薬組成物を吸入する際に、前記［１５’］又は［１６’］に記載の凍結乾燥組成物を前記患者の吸気による空気衝撃で粒子化して前記経肺投与用医薬組成物を調製する工程を含む経肺投与用医薬組成物の経肺投与方法。
【００６６】
前記［１１］〜［１９］及び［１５’］〜［１９’］によれば、ＶＤＲ作用化合物を有効成分として、肺胞上皮幹細胞に作用する分化誘導剤；肺胞再生を誘導する医薬組成物；肺組織の損傷治療用の医薬組成物；肺組織の損傷の治療方法；肺組織の損傷治療用の医薬組成物の製造に使用される凍結乾燥組成物であり、気流によって経肺投与に適した粒子径の粒子に粒子化する凍結乾燥組成物；前記凍結乾燥組成物の製造方法；経肺投与に適した、肺組織の損傷治療用の医薬組成物；肺組織の損傷治療用の医薬組成物の経肺投与方法；が提供される。
【００６７】
［Ｃ］凍結乾燥組成物、凍結乾燥組成物の製造方法、及び経肺投与用医薬組成物
［凍結乾燥組成物］
本発明の凍結乾燥組成物は、少なくとも下記の成分を含む凍結乾燥組成物である。
・水に難溶性の薬物（以下「有効成分」という場合がある。）
・少なくとも２種類のアミノ酸
・界面活性剤
当該凍結乾燥組成物は、少なくとも下記の成分を含む組成物（分散液又は溶解液）の凍結乾燥組成物である。
・水に難溶性の薬物
・少なくとも２種類のアミノ酸
・界面活性剤
・アルコール
・水
そして、当該凍結乾燥組成物は、気流によって粒子化された際に、粒子径５μｍ以下の粒子の割合が１０％以上となる凍結乾燥組成物である。
少なくとも２種類のアミノ酸を使用しない場合には、水に難溶性の薬物を含む凍結乾燥組成物を作製できなかったり、気流を受けても粒子化しにくい凍結乾燥組成物に成ったり、経肺投与に適さない大きな粒子に粒子化する凍結乾燥組成物に成ったりする。
【００６８】
当該凍結乾燥組成物について、粒子径は、幾何学的粒子径または空気力学的粒子径である。
上記の割合は、幾何学的粒子径については、全粒子に対する、粒子径５μｍ以下の粒子の割合（体積％）である。
上記の割合は、空気力学的粒子径については、全粒子に含まれる薬物量（全薬物量）に対する、粒子径５μｍ以下の粒子に含まれる薬物量の割合（質量％）である。
【００６９】
本発明の凍結乾燥組成物は、好ましくは、少なくとも下記の成分を含む凍結乾燥組成物である。
・水に難溶性の薬物
・下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
・界面活性剤
当該凍結乾燥組成物は、好ましくは、少なくとも下記の成分を含む組成物（分散液又は溶解液）の凍結乾燥組成物である。
・水に難溶性の薬物
・下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
・界面活性剤
・アルコール
・水
少なくとも２種類のアミノ酸として、上記の組合せで選ばれた特定の種類のアミノ酸（以下「特定アミノ酸」ともいう。）を使用することによって、水に難溶性の薬物を含む凍結乾燥組成物が、気流を受けて経肺投与に適した粒子径により粒子化しやすい凍結乾燥組成物となる。
【００７０】
本発明の凍結乾燥組成物は、経肺投与用医薬組成物の前調製物（経肺投与用医薬組成物の調製用の凍結乾燥組成物）であり、患者の吸気による空気衝撃で粒子化し、幾何学的粒子径が５μｍ以下の粒子を生じさせる。
本発明の凍結乾燥組成物から生じた全粒子に占める幾何学的粒子径が５μｍ以下の粒子の割合は、体積基準で、１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、更に好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上である。
幾何学的粒子径は、例えば、レーザー回析式粒度分布測定装置によって測定し得る。
【００７１】
本発明の凍結乾燥組成物は、経肺投与用医薬組成物の前調製物（経肺投与用医薬組成物の調製用の凍結乾燥組成物）であり、気流を受けて粒子化し、空気力学的粒子径が５μｍ以下の粒子を生じさせる。
本発明の凍結乾燥組成物から生じた全粒子に占める空気力学的粒子径が５μｍ以下の粒子の割合は、全薬物量に対する薬物量の割合（質量％）として、１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、更に好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上である。
空気力学的粒子径は、例えば、Multi-stage Liquid Impinger、Andersen Cascade Impactor、Next Generation Pharmaceutical Impactor等によって測定し得る。
【００７２】
一般に、経肺的に投与された粒子が肺に到達し沈着するには、その粒子の空気力学的粒子径が５μｍ以下のミクロサイズであることが必要と言われている。多孔質の凍結乾燥組成物に由来する粒子の空気力学的粒子径は通常、幾何学的粒子径よりも小さいので、幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が上記の範囲であれば、経肺投与に適した空気力学的粒子径の粒子が十分な割合で含まれることになる。
【００７３】
本発明の凍結乾燥組成物は、気流を受けて均一に粒子化しやすい点で、多孔質の固体であることが好ましい。多孔質の固体は、気流によって粒子化し得るものであれば、ひびが入ったり、数個の塊に分かれたり、一部が破損していてもよい。
【００７４】
以下、本発明の凍結乾燥組成物の調製に使用される各成分について詳述する。
【００７５】
−水に難溶性の薬物−
薬物について「水に難溶性」とは、２０℃下、水１ｍｌに対して溶ける量が１０ｍｇ以下である化合物を意味し、当該化合物の前記量は、好ましくは５ｍｇ以下、より好ましくは１ｍｇ以下、更に好ましくは０．５ｍｇ以下、特に好ましくは０．１ｍｇ以下である。
水に難溶性の薬物としては、例えば、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物が挙げられる。
【００７６】
−肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物−
肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物としては、肺胞上皮幹細胞（好ましくはヒト肺胞上皮幹細胞）の分化を誘導する薬理学的活性を有する化合物であれば特に制限されない。
【００７７】
ある化合物が、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有することは、当該化合物を肺胞上皮幹細胞に接触させた場合に、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞の少なくとも１種の細胞が誘導されることにより確認できる。具体的には、当該化合物を含む培地で肺胞上皮幹細胞を培養した後、免疫染色法によって細胞を染色して蛍光顕微鏡で観察し、Ｉ型肺胞上皮細胞のマーカーであるＡＱＰ−５（Aquaporin-5、アクアポリン５）、及びＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカーであるＳＰ−Ａ（Surfactant (apo)protein A、サーファクタント（アポ）プロテインＡ）の少なくともいずれかを発現する細胞の数が増大していることによって確認できる。
【００７８】
肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体、プロビタミンＡ、ビタミンＤ受容体に作用する化合物、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤が挙げられ、具体的には以下の化合物が挙げられる。
・ビタミンＡ誘導体：例えば、オールトランスレチノイン酸（all-trans-retinoic acid、ＡＴＲＡ。トレチノイン）、レチノール、レチナール、及び合成レチノイド（例えば、タミバロテン）等のレチノイド
・プロビタミンＡ：例えば、α−カロテン、β−カロテン
・ビタミンＤ２及びその誘導体：例えば、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール
・ビタミンＤ３及びその誘導体：例えば、７−デヒドロコレステロール、プレビタミンＤ３、コレカルシフェロール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（カルシジオール）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、カルシトロン酸
・ビタミンＤ４及びその誘導体：例えば、ジヒドロエルゴカルシフェロール
・ビタミンＤ５及びその誘導体
・ビタミンＤ６及びその誘導体
・ビタミンＤ７及びその誘導体
・ビタミンＤアナログ：例えば、ジヒドロタキステロール、カルシポトリオール、タカルシトール、パリカルシトール
・ＰＩ３Ｋの直接的阻害剤：例えば、ワートマニン（Wortmannin）、ＬＹ２９４００２、ＡＳ６０５２４０、ＺＳＴＫ４７４、ＰＩＫ−７５  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＩＰＩ−１４５（ＩＮＫ１１９７）、ＧＤＣ−０９４１、ＣＡＬ−１０１（Ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ、ＧＳ−１１０１）、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ＢＫＭ１２０（ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、Ｂｕｐａｒｌｉｓｉｂ）、ＧＳＫ２６３６７７１、ＣＺＣ２４８３２、ＧＤＣ−００３２、ＶＳ−５５８４（ＳＢ２３４３）、ＴＧ１００７１３、ＢＹＬ７１９、ＣＵＤＣ−９０７、３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ、ＹＭ２０１６３６、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＢＡＹ８０−６９４６（Ｃｏｐａｎｌｉｓｉｂ）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＫＩ−４０２、ＣＨ５１３２７９９、ＧＤＣ−０９８０（ＲＧ７４２２）、ＮＵ７４４１ (ＫＵ−５７７８８）、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、ＣＡＹ１０５０５、ＧＳＫ２１２６４５８（ＧＳＫ４５８）、Ａ６６、ＰＦ−０５２１２３８４（ＰＫＩ−５８７）、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９（Ｐ５２９）、ＰＩＫ−２９４、ＰＩＫ−２９３、ＳＡＲ２４５４０９（ＸＬ７６５）、ＰＩＫ−９３、ＡＺＤ６４８２、ＡＳ−６０５２４０、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００−１１５、ＩＣ−８７１１４、ＰＩＫ−７５、ＰＩＫ−９０、ＴＧＸ−２２１、ＸＬ１４７、ＰＩ−１０３、ＩＣ４８６０６８、及びこれらの誘導体
・ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路阻害剤：例えば、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、及びこれらの誘導体
・ＰＩ３Ｋ−ＰＤＫ１経路阻害剤：例えば、ＢＸ−９１２、ＢＸ−７９５、ＯＳＵ−０３０１２、ＰＨＴ−４２７、及びこれらの誘導体
【００７９】
−その他の薬物−
ほかに、肺への薬理学的効果が期待できる水に難溶性の薬物として、例えば、ステロイド（ベクロメタゾン、フルチカゾン、ブデソニド等）及び生薬ウコン成分（クルクミン）が挙げられる。
【００８０】
本発明の凍結乾燥組成物中に含まれる有効成分の量は、特に制限されない。単回投与分の凍結乾燥組成物中に含まれる有効成分の量は、例えば２０ｍｇ以下であり、好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇ以下、更に好ましくは２ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下である。
【００８１】
−アミノ酸−
本発明は、少なくとも２種類のアミノ酸を組み合わせて使用する。
例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、及びプロリン（Ｐｒｏ）から少なくとも２種類を選択する。
グリシン以外の上記２０種類のアミノ酸は、Ｄ型でもＬ型でもよく、Ｄ型とＬ型の混合物でもよい。
【００８２】
上記のアミノ酸群から選択された少なくとも２種類のアミノ酸の好ましい組合せは、凍結乾燥組成物が幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子に粒子化されやすい点で、Ｐｈｅ又はＴｒｐ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙから選ばれた少なくとも１種；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれた少なくとも１種／Ａｌａ及びＧｌｙから選ばれた少なくとも１種；である。
中でも、Ｐｈｅ又はＴｒｐ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれた少なくとも１種の組合せがより好ましく、Ｐｈｅ／Ｉｌｅ、Ｐｈｅ／Ｌｅｕ、Ｐｈｅ／Ｖａｌ、Ｔｒｐ／Ｉｌｅの組合せが特に好ましい。
【００８３】
本発明の凍結乾燥組成物中の、アミノ酸の総含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１質量％以上１００％質量未満であり、好ましくは０．０１質量％以上１００質量％未満、より好ましくは０．１質量％以上１００質量％未満、更に好ましくは１質量％以上１００質量％未満であり、特に好ましくは１０質量％以上１００％質量未満である。
【００８４】
−特定アミノ酸−
本発明は、少なくとも２種類のアミノ酸として、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸を使用することが好ましい。複数群の組合せは、第１群と第２群の組合せ、第１群と第３群の組合せ、第２群と第３群の組合せ、及び、第１群と第２群と第３群の組合せのいずれでもよい。
・第１群：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）
・第２群：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）
・第３群：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）
グリシン以外の上記のアミノ酸は、Ｄ型でもＬ型でもよく、Ｄ型とＬ型の混合物でもよい。
【００８５】
少なくとも２種類のうち１種類は、凍結乾燥組成物が幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子に粒子化されやすい点で、第１群から選ばれたアミノ酸であることが好ましく、即ち、Ｐｈｅ又はＴｒｐが好ましい。
少なくとも２種類のアミノ酸の好ましい組合せは、凍結乾燥組成物が幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子に粒子化されやすい点で、Ｐｈｅ又はＴｒｐ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙから選ばれた少なくとも１種；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれた少なくとも１種／Ａｌａ及びＧｌｙから選ばれた少なくとも１種；である。
中でも、Ｐｈｅ又はＴｒｐ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれた少なくとも１種の組合せがより好ましく、Ｐｈｅ／Ｉｌｅ、Ｐｈｅ／Ｌｅｕ、Ｐｈｅ／Ｖａｌ、Ｔｒｐ／Ｉｌｅの組合せが特に好ましい。
【００８６】
本発明の凍結乾燥組成物中の、特定アミノ酸の総含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１質量％以上１００％質量未満であり、好ましくは０．０１質量％以上１００質量％未満、より好ましくは０．１質量％以上１００質量％未満、更に好ましくは１質量％以上１００質量％未満であり、特に好ましくは１０質量％以上１００％質量未満である。
【００８７】
本発明の凍結乾燥組成物は、少なくとも２種類のアミノ酸が特定アミノ酸である場合、特定アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００８８】
−アルコール−
本発明の凍結乾燥組成物を製造する際、水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて使用する。
アルコールは凍結乾燥処理により揮発するので、通常、凍結乾燥組成物には含まれない。
アルコールとしては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール等が挙げられ、好ましくはエタノールである。
これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
【００８９】
−界面活性剤−
界面活性剤としては、通常医薬品に使用される界面活性剤であれば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤のいずれであっても使用することができる。好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤）、ソルビタントリオレート等の非イオン性界面活性剤が例示される。
【００９０】
界面活性剤の具体例としては、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレン（４２）ポリアキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリアキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリアキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリアキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリアキシプロピレン（３０）グリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０）、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）等が挙げられる。
これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
【００９１】
−水−
本発明の凍結乾燥組成物の製造において、凍結乾燥に供される組成物（分散液又は溶解液）は、水を主溶媒とする液体である。
水は凍結乾燥処理により全部又は大部分が失われるので、凍結乾燥組成物には含まれないか、含まれるとしても微量である。
【００９２】
−その他の成分−
本発明の凍結乾燥組成物は、最終調製物（経肺投与用医薬組成物）が人体に影響を与えないことを限度として、上記成分に加えてその他の成分を含んでいてもよい。
その他の成分としては、凍結乾燥に供される組成物（分散液又は溶解液）中での有効成分の安定化、凍結乾燥後の有効成分の安定化、容器への有効成分の吸着防止等を目的に、当技術分野で慣用される製剤用添加物（賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤など）を使用してよい。
【００９３】
本発明の凍結乾燥組成物は、アミノ酸以外の担体を含んでいてもよい。
アミノ酸以外の担体として、ブドウ糖等の単糖類；ショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース等の二糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖類；デキストラン４０、プルラン等の多糖類；カプリン酸ナトリウム等の脂肪酸ナトリウム；などが挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
これら担体の配合量は、凍結乾燥組成物が気流によって粒子化するものであれば、特に制限されない。目安として、凍結乾燥組成物に占める割合が０．１質量％以上１００質量％未満となるように配合する。
【００９４】
［凍結乾燥組成物の製造方法］
本発明の凍結乾燥組成物の製造方法は、少なくとも下記の成分を含む組成物（分散液又は溶解液）を凍結乾燥することを含む。
・水に難溶性の薬物
・少なくとも２種類のアミノ酸
・界面活性剤
・アルコール
・水
【００９５】
本発明の凍結乾燥組成物の製造方法は、好ましくは、少なくとも下記の成分を含む組成物（分散液又は溶解液）を凍結乾燥することを含む。
・水に難溶性の薬物
・下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
・界面活性剤
・アルコール
・水
【００９６】
本発明の凍結乾燥組成物の製造方法は、下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことが好ましい。工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む製造方法によれば、有効成分が良好に分散又は溶解した、水を主溶媒とする液体（分散液又は溶解液）を調製することができ、その結果、気流によって経肺投与に適した大きさに粒子化する多孔質の凍結乾燥組成物を製造できる。
【００９７】
・工程（Ａ）：水に難溶性の薬物を、アルコールを含む溶媒に溶解させて第一の液体を調製する工程
・工程（Ｂ）：前記第一の液体と、少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程
・工程（Ｃ）：前記第二の液体を凍結乾燥する工程
【００９８】
工程（Ｂ）は、好ましくは以下の工程（Ｂ’）である。
・工程（Ｂ’）：前記第一の液体と、下記の第１群、第２群及び第３群から複数群にまたがって選ばれた少なくとも２種類のアミノ酸と、界面活性剤と、水とを混合して第二の液体を調製する工程
・第１群：フェニルアラニン、トリプトファン
・第２群：イソロイシン、ロイシン、バリン
・第３群：アラニン、グリシン
【００９９】
−工程（Ａ）−
工程（Ａ）は、水に難溶性の薬物（有効成分）が、アルコールを含む溶媒に溶解した第一の液体を調製する工程である。
【０１００】
アルコールを含む溶媒は、アルコール単独の溶媒でもよく、アルコール水溶液でもよい。
アルコールとしては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール等が挙げられ、好ましくはエタノールである。
アルコールを含む溶媒のアルコール濃度は、有効成分を溶解可能であれば特に制限されない。ただし、凍結乾燥に供する第二の液体は凍結乾燥しやすい点でアルコール濃度が低いことが望ましいので、上記観点でアルコールを含む溶媒のアルコール濃度を調整してよい。
【０１０１】
アルコールを含む溶媒は、最終調製物（経肺投与用医薬組成物）が人体に影響を与えないことを限度として、溶解補助剤としてアルコール以外の有機溶媒を含んでいてもよい。当該有機溶媒としては、例えば、アセトン等が例示される。
【０１０２】
−工程（Ｂ）−
工程（Ｂ）（好ましくは工程（Ｂ’））は、有効成分が溶解している第一の液体、少なくとも２種類のアミノ酸（好ましくは特定アミノ酸）、界面活性剤、及び水を混合して第二の液体（分散液又は溶解液）を調製する工程である。
第一の液体は、通常、凍結乾燥しにくいほどにアルコール濃度が高いので、水を加えてアルコール濃度を低下させ、凍結乾燥しやすいアルコール濃度に調整する必要がある。工程（Ｂ）は、少なくとも２種類のアミノ酸（好ましくは特定アミノ酸）及び界面活性剤によって有効成分を良好に分散又は溶解させつつ、水を加えてアルコール濃度を調整する工程である。
【０１０３】
工程（Ｂ）において、第一の液体と、アミノ酸及び界面活性剤とを混合する順番は限定されるものではないが、第二の液体における有効成分の分散性又は溶解性がより良好である点で、第一の液体と界面活性剤を混合し、その後にアミノ酸を混合する態様が好ましい。具体的には、第一の液体に界面活性剤を添加して有効成分及び界面活性剤を含む溶液を調製し、この溶液と、アミノ酸を水に溶解又は分散させたアミノ酸含有液とを混合する態様が好ましい。
【０１０４】
第二の液体の有効成分の濃度（複数種使用する場合はその総濃度）は、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．００１ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬである。
【０１０５】
第二の液体において、有効成分の量に対するアミノ酸の総量は、有効成分の量を１００質量部とした場合、例えば５０質量部〜８００００質量部であり、好ましくは１００質量部〜４００００質量部、より好ましくは２００質量部〜２００００質量部、更に好ましくは４００質量部〜１００００質量部、特に好ましくは８００質量部〜８０００質量部である。
【０１０６】
第二の液体のアミノ酸の総濃度は、特に限定されるものではない。例えば有効成分の量及び種類に応じて調整すればよく、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ以上であり、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上であり、０．１ｍｇ／ｍＬ以上である。
第二の液体のアミノ酸の総濃度は、凍結乾燥組成物の多孔質化が良好で気流によって粒子化されやすい点で、１０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、より好ましくは８ｍｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは４ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下である。
【０１０７】
第二の液体に含まれるアミノ酸どうしの質量比（３種類以上含まれる場合は、任意の２種類間の質量比）は、例えば１０：９０〜９０：１０の範囲であり、好ましくは２０：８０〜８０：２０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０、更に好ましくは４０：６０〜６０：４０である。
【０１０８】
第二の液体の界面活性剤の濃度（複数種使用する場合はその総濃度）は、例えば０．０００１質量％〜１質量％であり、好ましくは０．００１質量％〜０．５質量％、より好ましくは０．００５質量％〜０．５質量％、更に好ましくは０．００５質量％〜０．３質量％、特に好ましくは０．００５質量％〜０．１質量％である。
【０１０９】
第二の液体のアルコール濃度は、０．１質量％〜２０質量％が好ましく、より好ましくは０．１質量％〜１０質量％、更に好ましくは０．５質量％〜１０質量％、特に好ましくは０．５質量％〜５質量％である。
【０１１０】
工程（Ｂ）において、製剤用添加物（賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤など）を更に混合してもよい。また、アミノ酸以外の担体を混合してもよい。
【０１１１】
−工程（Ｃ）−
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得た第二の液体を凍結乾燥する工程である。第二の液体を凍結乾燥する方法は特に制限されず、例えば、従来公知の凍結乾燥薬剤（例えば、用時溶解型の注射剤等）の製造に従来適用される凍結乾燥法でよい。
【０１１２】
工程（Ｃ）は、単回投与分又は数回投与分の有効量（好ましくは単回投与分の有効量）の有効成分を含む第二の液体を、経肺投与用デバイスに装填可能な容器に充填し、そのまま凍結乾燥することが好ましい。
【０１１３】
［経肺投与用医薬組成物］
本発明の経肺投与用医薬組成物は、本発明の凍結乾燥組成物が気流によって粒子化されてなる粉末状の医薬組成物である。
本発明の経肺投与用医薬組成物の一態様は、有効成分として、肺胞上皮幹細胞（好ましくはヒト肺胞上皮幹細胞）に対して分化誘導作用を有する化合物を含むものである。
【０１１４】
本発明の経肺投与用医薬組成物は、肺胞上皮幹細胞に対して分化誘導作用を有する化合物を含む場合、肺組織の損傷を呈する疾患の治療薬として使用し得る。当該疾患としては例えば、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、急性肺損傷（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、肺線維症、肺癌、間質性肺炎、肺結核後遺症、じん肺などが挙げられる。
したがって、本発明の経肺投与用医薬組成物によれば、肺組織の損傷を呈する疾患の治療方法が提供される。当該治療方法は、肺組織に損傷を有する患者（例えば上記の疾患の患者）に、本発明の経肺投与用医薬組成物を経肺投与することを含む、肺組織の損傷の治療方法である。
本発明の経肺投与用医薬組成物の投与量は、疾患の種類；患者の症状、体重、年齢；有効成分として含まれる化合物の種類等に応じて選択される。
【０１１５】
本発明の経肺投与用医薬組成物は、調製用の凍結乾燥組成物が気流によって粒子化されてなる。
気流の流量としては５Ｌ／ｍｉｎ〜３００Ｌ／ｍｉｎ、より好ましくは１０Ｌ／ｍｉｎ〜２００Ｌ／ｍｉｎ、更に好ましくは１０Ｌ／ｍｉｎ〜１５０Ｌ／ｍｉｎ、特に好ましくは１０Ｌ／ｍｉｎ〜１００Ｌ／ｍｉｎである。
気流の流速としては１ｍ／ｓｅｃ〜３００ｍ／ｓｅｃ、より好ましくは２ｍ／ｓｅｃ〜２５０ｍ／ｓｅｃ、更に好ましくは５ｍ／ｓｅｃ〜２００ｍ／ｓｅｃ、特に好ましくは１０ｍ／ｓｅｃ〜１５０ｍ／ｓｅｃである。
【０１１６】
本発明の経肺投与用医薬組成物は、その調製用の凍結乾燥組成物が、比較的低い速度及び流量の気流によって粒子化され得るので、投与態様として例えば米国特許第７７３５４８５Ｂ２号明細書又は特許第４８２２７０９号公報に開示された経肺投与システムを採用することができる。
即ち、凍結乾燥組成物を上記文献に開示された経肺投与用デバイスと共に提供すれば、当該デバイスの使用者が使用時に、デバイスに凍結乾燥組成物のバイアルを取り付け、患者の吸気により凍結乾燥組成物が経肺投与に適した粒子となり、そのまま吸入服用することができる。
したがって、本発明の凍結乾燥組成物を、例えば上記経肺投与用デバイスと共に提供すれば、経肺投与用医薬組成物の経肺投与方法の一態様が提供される。当該経肺投与方法は、患者が本発明の経肺投与用医薬組成物を吸入する際に、本発明の凍結乾燥組成物に前記患者が気流をあてて粒子化して経肺投与に適した微粒子とする工程を含む。
【０１１７】
本発明の経肺投与用医薬組成物において、全粒子に占める粒子径が５μｍ以下の粒子の割合は、１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、更に好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上である。
ここで粒子径は、幾何学的粒子径または空気力学的粒子径を意味する。上記の割合は、幾何学的粒子径については、全粒子に対する、粒子径５μｍ以下の粒子の割合（体積％）である。上記の割合は、空気力学的粒子径については、全粒子に含まれる薬物量（全薬物量）に対する、粒子径５μｍ以下の粒子に含まれる薬物量の割合（質量％）である。
【０１１８】
本発明の経肺投与医薬組成物において、全粒子に占める幾何学的粒子径が５μｍ以下の粒子の割合（体積％）は、１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、更に好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上である。
本発明の経肺投与医薬組成物において、全薬物量に対する空気力学的粒子径が５μｍ以下の粒子に含まれる薬物量の割合（質量％）は、１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、更に好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上である。
一般に、経肺的に投与された粒子が肺に到達し沈着するには、その粒子の空気力学的粒子径が５μｍ以下のミクロサイズであることが必要と言われている。多孔質の凍結乾燥組成物に由来する粒子の空気力学的粒子径は通常、幾何学的粒子径よりも小さいので、幾何学的粒子径５μｍ以下の粒子の割合が上記の範囲であれば、経肺投与に適した空気力学的粒子径の粒子が十分な割合で含まれることになる。
【実施例】
【０１１９】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。【０１２０】
ＣＤ９０は肺胞上皮幹細胞のマーカーであり、ＡＱＰ−５はＩ型肺胞上皮細胞のマーカーであり、ＳＰ−ＡはＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカーである。【０１２１】
［参考例１：ＡＴＲＡのヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用の検証］
参考例１で使用したヒト肺胞上皮幹細胞は、肺疾患患者（肺癌又はＣＯＰＤ等における生検又は外科手術時の摘出組織）由来のヒト肺胞上皮幹細胞（Fujino N, at. al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 46, 422-430(2012)）である。当該ヒト肺胞上皮幹細胞は、１０％牛血清（ＦＢＳ）と１％の５０倍希釈ＭＥＭ（Amino Acids Solution）とを含むＤＭＥＭ培地で培養したマウス胎仔線維芽細胞の培養上清を、フィルター滅菌し調製した培養液を用いて、３７℃／５％ＣＯ２環境下で培養・維持した。【０１２２】
前記培養液中のヒト肺胞上皮幹細胞（１×１０１〜４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭの濃度で曝露し、３７℃／５％ＣＯ２環境下で５日間、静置培養した。【０１２３】
培養後の細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液を用いて固定した。この固定細胞にヤギ抗ヒトＣＤ９０抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＡＱＰ−５抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＳＰ−Ａ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させ、更にＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させた。そして、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、キーエンス社製）を用いて陽性細胞数を測定し、各マーカーについて陽性細胞の割合を算出した。その結果を表１に示す。【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
表１に明らかなとおり、ヒト肺胞上皮幹細胞にＡＴＲＡを接触させると、濃度依存的に、ＣＤ９０陽性細胞の割合が減少し、ＡＱＰ−５陽性細胞の割合とＳＰ−Ａ陽性細胞の割合が増加した。この結果は、ＡＴＲＡが、ヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することを示している。【０１２６】
［Ａ］ＰＩ３キナーゼ阻害剤を含む医薬組成物
［実施例Ａ１：ＰＩ３Ｋ阻害剤のヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用の検証］
実施例Ａ１で使用したヒト肺胞上皮幹細胞は、肺疾患患者（肺癌又はＣＯＰＤ等における生検又は外科手術時の摘出組織）由来のヒト肺胞上皮幹細胞（Fujino N, at. al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 46, 422-430(2012)）である。当該ヒト肺胞上皮幹細胞は、１０％牛血清（ＦＢＳ）と１％の５０倍希釈ＭＥＭ（Amino Acids Solution）とを含むＤＭＥＭ培地で培養したマウス胎仔線維芽細胞の培養上清を、フィルター滅菌し調製した培養液を用いて、３７℃／５％ＣＯ２環境下で培養・維持した。【０１２７】
前記培養液中のヒト肺胞上皮幹細胞（１×１０１〜４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるワートマニン（Wortmannin）を０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭの濃度で曝露し、３７℃／５％ＣＯ２環境下で５日間、静置培養した。【０１２８】
培養後の細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液を用いて固定した。この固定細胞にヤギ抗ヒトＣＤ９０抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＡＱＰ−５抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＳＰ−Ａ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させ、更にＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させた。そして、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、キーエンス社製）を用いて陽性細胞数を測定し、各マーカーについて陽性細胞の割合を算出した。その結果を表２に示す。【０１２９】
【表２】
2014098232.tif 000003
【０１３０】
表２に明らかなとおり、ヒト肺胞上皮幹細胞にＰＩ３Ｋ阻害剤を接触させると、濃度依存的に、ＣＤ９０陽性細胞の割合が減少し、ＡＱＰ−５陽性細胞の割合とＳＰ−Ａ陽性細胞の割合が増加した。この結果は、ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することを示している。【０１３１】
実施例Ａ１と、参考例１とを比較すると、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＡＴＲＡよりも低濃度で、肺胞上皮幹細胞に対して強力な分化誘導作用を示した。例えば濃度０．１μＭどうしを比べると、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＡＴＲＡの３倍以上のＩ型肺胞上皮細胞への分化誘導作用を示し、２倍以上のＩＩ型肺胞上皮細胞への分化誘導作用を示した。【０１３２】
［実施例Ａ２：ＰＩ３Ｋ阻害剤のＣＯＰＤ動物モデルに対する効果の検証］
ＣＯＰＤモデルマウス（エラスターゼ誘導性肺気腫マウス）を使って、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるワートマニン（Wortmannin）の効果を確認する実験を行った。【０１３３】
６週齢のＩＣＲマウス（雄）に、ＰＢＳ５０μＬに懸濁したエラスターゼ（７．５Ｕ、Wako社製）を１週間にわたり週２回、ゾンデで経肺投与し、肺気腫モデルを作製した。続いて、ワートマニンを３週間にわたり週２回、各回１０μｇ／ｋｇの用量で、ゾンデで経肺投与した。最初のワートマニン投与から２１日後に両肺を摘出し、パラホルムアルデヒドで組織を固定し、クリオスタットで切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。【０１３４】
１匹のマウスの両肺の３野（左肺及び右肺の、上肺野、中肺野及び下肺野）の断面（合計６断面）のＨＥ染色スライドから、各断面５視野を顕微鏡（キーエンス社Biozero）で撮影し、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所）及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Adobe社））を用いて解析した。気腫性病変の程度は、当業者に公知の方法であるThulbeckの方法に準じて平均肺胞壁間距離（mean linear intercept、Ｌｍ）を測定し評価した。その方法は、多数の無作為な線を引き、肺胞画像上にのせ、各無作為な線の肺胞壁によって分断された区間の長さの総和を求め、これを分断線の総数で除することによって求められる。１視野あたり肺胞隔壁による分断数を２００ 以上に設定し、これを各個体あたり３０視野（６断面×５視野）で測定し平均を計算し、各マウスの平均肺胞壁間距離を求め、各群の平均（個体数６匹）を算出し、ｔ検定で統計解析を行った。その結果を表３及び図１に示す。【０１３５】
【表３】
2014098232.tif 000004
【０１３６】
ＨＥ染色スライドの観察から、対照群（ワートマニンの投与なし）は、著明に肺胞腔が広がり、エラスターゼによって実験病理学的ＣＯＰＤ病変（顕著な肺気腫）ができていることが確認された。
この対照群に比較して、ワートマニン投与群は、平均肺胞壁間距離が有意に低かった。平均肺胞壁間距離の低さは、肺胞が再生されたことを示しており、ワートマニン投与によって肺胞が再生されること、ワートマニンが肺組織損傷の治療に有効であること、が分かった。【０１３７】
［Ｂ］ビタミンＤ受容体に作用する化合物を含む医薬組成物
実施例Ｂ１及びＢ２で使用したヒト肺胞上皮幹細胞は、肺疾患患者（肺癌又はＣＯＰＤ等における生検又は外科手術時の摘出組織）由来のヒト肺胞上皮幹細胞（Fujino N, at. al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 46, 422-430(2012)）である。当該ヒト肺胞上皮幹細胞は、１０％牛血清（ＦＢＳ）と１％の５０倍希釈ＭＥＭ（Amino Acids Solution）とを含むＤＭＥＭ培地で培養したマウス胎仔線維芽細胞の培養上清を、フィルター滅菌し調製した培養液を用いて、３７℃／５％ＣＯ２環境下で培養・維持した。【０１３８】
［実施例Ｂ１：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用の検証（１）］
前記培養液中のヒト肺胞上皮幹細胞（１×１０１〜４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭの濃度で曝露し、３７℃／５％ＣＯ２環境下で５日間、静置培養した。【０１３９】
培養後の細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液を用いて固定した。この固定細胞にヤギ抗ヒトＣＤ９０抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＡＱＰ−５抗体（Santa Cruz製）、ヤギ抗ヒトＳＰ−Ａ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させ、更にＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギ抗体（Santa Cruz製）を添加し反応させた。そして、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、キーエンス社製）を用いて陽性細胞数を測定し、各マーカーについて陽性細胞の割合を算出した。その結果を表４に示す。【０１４０】
【表４】
2014098232.tif 000005
【０１４１】
表４に明らかなとおり、ヒト肺胞上皮幹細胞に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を接触させると、濃度依存的に、ＣＤ９０陽性細胞の割合が減少し、ＡＱＰ−５陽性細胞の割合とＳＰ−Ａ陽性細胞の割合が増加した。この結果は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することを示している。【０１４２】
実施例Ｂ１と、参考例１とを比較すると、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＡＴＲＡよりも低濃度で、肺胞上皮幹細胞に対して強力な分化誘導作用を示した。例えば濃度０．１μＭどうしを比べると、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＡＴＲＡの７倍以上のＩ型肺胞上皮細胞への分化誘導作用を示し、３倍以上のＩＩ型肺胞上皮細胞への分化誘導作用を示した。【０１４３】
［実施例Ｂ２：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用の検証（２）］
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の濃度を１０μＭにし、培養日数を０日、１日、２日、４日又は６日にした以外は、実施例Ｂ１と同様の実験を行った。その結果を表５に示す。
培養日数０日の実験例では、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に曝露後直ちにＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液で細胞を固定した。【０１４４】
【表５】
2014098232.tif 000006
【０１４５】
表５に明らかなとおり、ヒト肺胞上皮幹細胞に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を接触させると、接触時間依存的に、ＣＤ９０陽性細胞の割合が減少し、ＡＱＰ−５陽性細胞の割合とＳＰ−Ａ陽性細胞の割合が増加した。この結果は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ヒト肺胞上皮幹細胞に対する分化誘導作用を有することを示している。【０１４６】
［実施例Ｂ３：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のＣＯＰＤ動物モデルに対する効果の検証］
ＣＯＰＤモデルマウス（エラスターゼ誘導性肺気腫マウス）を使って、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の効果を確認する実験を行った。【０１４７】
６週齢のＩＣＲマウス（雄）に、ＰＢＳ５０μＬに懸濁したエラスターゼ（７．５Ｕ、Wako社製）を１週間にわたり週２回、ゾンデで経肺投与し、肺気腫モデルを作製した。続いて、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を３週間にわたり週２回、各回１０μｇ／ｋｇの用量で、ゾンデで経肺投与した。最初の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３投与から２１日後に両肺を摘出し、パラホルムアルデヒドで組織を固定し、クリオスタットで切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。【０１４８】
１匹のマウスの両肺の３野（左肺及び右肺の、上肺野、中肺野及び下肺野）の断面（合計６断面）のＨＥ染色スライドから、各断面５視野を顕微鏡（キーエンス社Biozero）で撮影し、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所）及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Adobe社））を用いて解析した。気腫性病変の程度は、当業者に公知の方法であるThulbeckの方法に準じて平均肺胞壁間距離（mean linear intercept、Ｌｍ）を測定し評価した。その方法は、多数の無作為な線を引き、肺胞画像上にのせ、各無作為な線の肺胞壁によって分断された区間の長さの総和を求め、これを分断線の総数で除することによって求められる。１視野あたり肺胞隔壁による分断数を２００ 以上に設定し、これを各個体あたり３０視野（６断面×５視野）で測定し平均を計算し、各マウスの平均肺胞壁間距離を求め、各群の平均（個体数６匹）を算出し、ｔ検定で統計解析を行った。その結果を表６及び図２に示す。【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
ＨＥ染色スライドの観察から、対照群（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の投与なし）は、著明に肺胞腔が広がり、エラスターゼによって実験病理学的ＣＯＰＤ病変（顕著な肺気腫）ができていることが確認された。
この対照群に比較して、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３投与群は、平均肺胞壁間距離が有意に低かった。平均肺胞壁間距離の低さは、肺胞が再生されたことを示しており、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３投与によって肺胞が再生されること、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が肺組織損傷の治療に有効であること、が分かった。【０１５１】
［Ｃ］凍結乾燥組成物
実施例Ｃ１〜Ｃ４で使用したアミノ酸は、グリシン以外、Ｌ型である。【０１５２】
［実施例Ｃ１：ＡＴＲＡを含む凍結乾燥組成物の調製（１）］
［凍結乾燥組成物の調製］
ＡＴＲＡ４ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を２０μＬ加え、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌのアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は、Ｐｈｅは６ｍｇ／ｍＬ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌは２．４ｍｇ／ｍＬとした。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表７に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。
各分散液のエタノールの最終濃度は５質量％であった。各分散液の有効成分及びアミノ酸の最終量と界面活性剤の最終濃度とを表７に示した。１ｖｉａｌの分散液の液量は０．５ｍＬである。【０１５３】
この分散液を、胴径１８ｍｍ・容量２ｍＬのガラス製容器（ｖｉａｌ）に０．５ｍＬ入れ、アセトン−ドライアイス下で急速凍結させ、その後、棚状凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｏｎｅ Ｔｒｉａｄ、ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製）を用いて凍結乾燥し、凍結乾燥組成物を得た。【０１５４】
［凍結乾燥組成物の外観の評価］
凍結乾燥組成物の外観を以下の評価基準に従って評価した。その結果を表７に示す。凍結乾燥組成物としては、５及び４が好ましい。
５：形状が凍結乾燥組成物をなしており、その外観に偏り及びひびが認めらない。
４：形状が凍結乾燥組成物をなしており、その外観に軽微なひびがある。
３：形状が凍結乾燥組成物をなしており、その外観に偏り及び／又はひびがある。
２：形状が凍結乾燥組成物をなしていない。
１：凍結乾燥組成物ができていない又は極微量である。【０１５５】
［凍結乾燥組成物の粒子化の評価］
凍結乾燥組成物の一部を取り出し、レーザー回析式粒度分布測定装置（ＬＤＳＡ−３５００Ａ、東日コンピュータアプリケーションズ社製）の試料室に入れ、圧縮空気（速度６０ｍ／ｓｅｃ、流量７５０ｍｌ／ｓｅｃ）を試料室に送り込み凍結乾燥物を飛散させて、空気中での粒度分布（体積基準）を測定した。その粒度分布から、５μｍ以下の粒子割合（％）と、１０μｍ以下の粒子割合（％）を算出した。その結果を表７に示す。【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
表７に明らかなとおり、実施例Ｃ１−１〜Ｃ１−３の凍結乾燥組成物は、気流によって粒子化されて、粒子径５μｍ以下の粒子が２５％以上を占める粉末状の薬剤となった。この結果は、本発明の凍結乾燥組成物から、経肺投与に適した薬剤が調製されることを示している。【０１５８】
［実施例Ｃ２：ＡＴＲＡを含む凍結乾燥組成物の調製（２）］
［実施例Ｃ２−１及び比較例Ｃ２−１］
ＡＴＲＡ１ｍｇをエタノール０．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を２．５μＬ加え、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、ＰｈｅとＬｅｕのアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は、Ｐｈｅは４ｍｇ／ｍＬ、Ｌｅｕは１６ｍｇ／ｍＬとした。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表８に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。【０１５９】
［実施例Ｃ２−２］
ＡＴＲＡ１ｍｇをエタノール０．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を５μＬ加え、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、ＰｈｅとＬｅｕのアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は、Ｐｈｅは４ｍｇ／ｍＬ、Ｌｅｕは１６ｍｇ／ｍＬとした。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表８に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。【０１６０】
［比較例Ｃ２−２］
ＡＴＲＡ５ｍｇをエタノール１．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を２５μＬ加え、水で段階希釈し、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、Ｐｈｅのアミノ酸水溶液（Ｐｈｅ濃度４ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表８に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。【０１６１】
［実施例Ｃ２−３、及び比較例Ｃ２−３］
ＡＴＲＡ５ｍｇをエタノール１．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を２５μＬ加え、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、ＰｈｅとＧｌｙのアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は、Ｐｈｅは８ｍｇ／ｍＬ、Ｇｌｙは８ｍｇ／ｍＬとした。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表８に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。【０１６２】
各分散液のエタノールの最終濃度は５質量％であった。各分散液の有効成分及びアミノ酸の最終量と界面活性剤の最終濃度とを表８に示した。１ｖｉａｌの分散液の液量は０．５ｍＬである。【０１６３】
この分散液から実施例Ｃ１と同様の方法で凍結乾燥組成物を得て、外観の評価及び粒子化の評価を行った。その結果を表８に示す。【０１６４】
【表８】
2014098232.tif 000009
【０１６５】
表８に明らかなとおり、実施例Ｃ２−１〜Ｃ２−３の凍結乾燥組成物は、気流によって粒子化されて、粒子径５μｍ以下の粒子が１５％以上を占める粉末状の薬剤となった。この結果は、本発明の凍結乾燥組成物から、経肺投与に適した薬剤が調製されることを示している。【０１６６】
［実施例Ｃ３：ＡＴＲＡを含む凍結乾燥組成物の調製（３）］
ＡＴＲＡ５ｍｇをエタノール１．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を２５μＬ加え、ＡＴＲＡ溶液を調製した。
別途、表９に記載の種類のアミノ酸のアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は８ｍｇ／ｍＬとした。
そして、ＡＴＲＡ溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表９に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、ＡＴＲＡが分散した分散液を調製した。
各分散液のエタノールの最終濃度は５質量％であった。各分散液の有効成分及びアミノ酸の最終量と界面活性剤の最終濃度とを表９に示した。１ｖｉａｌの分散液の液量は０．５ｍＬである。【０１６７】
この分散液から実施例Ｃ１と同様の方法で凍結乾燥組成物を得て、外観の評価及び粒子化の評価を行った。その結果を表９に示す。【０１６８】
【表９】
2014098232.tif 000010
【０１６９】
表９に明らかなとおり、実施例Ｃ３−１〜Ｃ３−４の凍結乾燥組成物は、気流によって粒子化されて、粒子径５μｍ以下の粒子が１０％以上を占める粉末状の薬剤となった。この結果は、本発明の凍結乾燥組成物から、経肺投与に適した薬剤が調製されることを示している。【０１７０】
［実施例Ｃ４：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む凍結乾燥組成物の調製］
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３０．１ｍｇをエタノール０．２５ｍＬに溶解させ、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を５μＬ加え溶解した。
別途、Ｐｈｅ及びＬｅｕのアミノ酸水溶液をそれぞれ調製した。アミノ酸水溶液のアミノ酸濃度は、Ｐｈｅは４ｍｇ／ｍＬ、Ｌｅｕは１６ｍｇ／ｍＬとした。
そして、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３溶液にアミノ酸水溶液を、アミノ酸の最終量が表１０に記載した量となるように添加し、水で液量を調節し、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が溶解した溶解液（５ｍＬ）を調製した。
各分散液のエタノールの最終濃度は５質量％であった。各分散液の有効成分及びアミノ酸の最終量と界面活性剤の最終濃度とを表１０に示した。１ｖｉａｌの分散液の液量は０．５ｍＬである。【０１７１】
この分散液から実施例Ｃ１と同様の方法で凍結乾燥組成物を得て、外観の評価及び粒子化の評価を行った。その結果を表１０に示す。【０１７２】
【表１０】
2014098232.tif 000011
【０１７３】
表１０に明らかなとおり、実施例Ｃ４の凍結乾燥組成物は、気流によって粒子化されて、粒子径５μｍ以下の粒子が２０％以上を占める粉末状の薬剤となった。この結果は、本発明の凍結乾燥組成物から、経肺投与に適した薬剤が調製されることを示している。【０１７４】
２０１２年１２月２１日に出願された日本国特許出願２０１２−２８００７０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2014098232.tif 000012
【図２】
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【国際調査報告】
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