(57)【要約】  本発明は、スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む製剤であり、該ナノ粒子は、個数平均粒径が１０００ｎｍ未満であり、幹細胞の機能を増強するために用いられ、また、本発明は、該スタチン封入ナノ粒子を取り込んで含有する機能が増強された幹細胞である。
2016076227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む製剤であって、
前記ナノ粒子は、個数平均粒径が１０００ｎｍ未満である、幹細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤。
【請求項２】
前記生体吸収性ポリマーは、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
【請求項３】
前記幹細胞は、脂肪由来幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
【請求項４】
前記幹細胞は、虚血性心疾患の治療用の幹細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
【請求項５】
前記増強される幹細胞の機能は、遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子を含有する機能増強幹細胞。
【請求項７】
脂肪由来幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の機能増強幹細胞。
【請求項８】
虚血性心疾患の治療用であることを特徴とする請求項６又は７に記載の機能増強幹細胞。
【請求項９】
前記幹細胞の増強された機能は、遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞を含むことを特徴とする静脈投与用細胞製剤。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子を幹細胞に処理するステップを備えることを特徴とする機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項１２】
前記スタチン封入ナノ粒子を幹細胞に処理するステップにおいて、前記幹細胞を培養する培地中に２０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度となるように前記スタチン封入ナノ粒子を添加することを特徴とする請求項１１に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記スタチン封入ナノ粒子を幹細胞に処理するステップにおいて、前記スタチン封入ナノ粒子の処理時間は３０分〜２時間であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記幹細胞として脂肪由来幹細胞を用いることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項１５】
前記幹細胞は、虚血性心疾患の治療用であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチンを封入するナノ粒子に関し、特に細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤に関する。また、本発明は、スタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スタチンは、肝臓でのコレステロール生合成の律速酵素であるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物として知られている。スタチンにより、血液中のコレステロール値を低下できるので、高コレステロール血症の治療薬に用いられている。また、スタチンは、高コレステロール血症以外にも、その抗炎症作用によって狭心症や心筋梗塞といった虚血性心疾患、及び動脈硬化等の疾患に有効であることも臨床試験により明らかとなっている。【０００３】
これまでに、スタチンによる上記疾患の治療効果の向上や、副作用の低減のために種々の研究が行われており、例えば特許文献１には、スタチンをナノ粒子に封入し、そのスタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与することで、これまでよりも少量のスタチンで血管新生を促進できることが開示されている。【０００４】
また、近年、多能性を有し、心筋細胞に分化可能な幹細胞を用いて、虚血性心疾患を治療する研究も行われている。非特許文献１には、脂肪組織由来の幹細胞を、心筋梗塞モデルマウスの心筋に直接に投与することにより、心臓の機能の改善及び梗塞サイズの減少が認められた旨が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２１００２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masaaki Ii et al., Laboratory Investigation (2011) 91, 539-552
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療するために、例えば上記特許文献１に開示されているようなスタチン封入ナノ粒子を投与する場合、上述のとおり、スタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与することで、これまでよりも少量のスタチンで有効性が認められるが、患部への局所投与が必要であり、投与が簡便でなく、有効性のさらなる向上も望まれる。また、局所投与を用いずに静脈内投与等を用いる場合は、より多くの容量が必要となり、副作用が生じるおそれもある。【０００８】
一方、非特許文献１に開示されているように、幹細胞を用いて心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療する場合も、幹細胞の患部への局所投与が必要であり、例えばマウスの心筋に投与する場合、治療効果を得るために５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウスもの量の細胞を必要としている。幹細胞としては、例えば間葉系に由来する体性幹細胞を用いることができ、そのような幹細胞は骨髄や脂肪組織から得ることができるが、一度に得られる幹細胞の量には限りがあるため、幹細胞を上記治療等に用いる場合、用いる細胞数は少ない方が好ましい。このように、より少ない数の幹細胞によって、優れた治療効果を得るためには、その幹細胞の種々の機能を向上させる必要がある。【０００９】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞製剤として用いられる幹細胞の疾患に対する治療効果を向上し、副作用を抑制するために、その幹細胞の機能を向上できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、スタチンがナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を幹細胞に含有させることにより、その幹細胞の機能が増強し、スタチンを所望の患部に効率よく送達できて、虚血性心疾患等の各種疾患の治療において高い効果を示すことを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤は、スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む製剤であって、該ナノ粒子は個数平均粒径が１０００ｎｍ未満であり、幹細胞の機能を増強するために用いられることに特徴がある。【００１１】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤は、幹細胞に処理されることにより、その処理された幹細胞の機能を増強することができ、その幹細胞を生体内に投与することにより、種々の有効性を示す。具体的に、幹細胞に本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤を処理すると、処理された幹細胞は、ファゴサイトーシスによりスタチン封入ナノ粒子を取り込み、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ幹細胞は、遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能が増強する。このため、例えば虚血性心疾患を患う患者の体内に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子が処理された心血管系細胞に分化可能な幹細胞を投与することにより、幹細胞が虚血部に集積し、増殖すると共に、血管新生因子を放出することにより、虚血部の血管新生を促す。さらに、その集積及び増殖した幹細胞が心筋に分化することにより、心筋の再生を促す。また、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ幹細胞の投与により、心筋梗塞部において心外膜付近に存在する細胞の分裂増殖が促されて、心筋の再生が促される。それらの結果、優れた虚血性心疾患の治療効果を示す。また、その幹細胞は、取り込んだスタチンを徐放することができ、これにより、スタチン自体の血管新生効果等のスタチン特有の種々の効果も得られるので、虚血性心疾患をはじめ種々の疾患の治療に有益である。さらに、患部に集積した幹細胞から放出されたスタチンにより、体内の幹細胞や骨髄由来血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の集積を亢進することができ、その結果、例えば虚血性心疾患の場合、虚血部分の心筋の再生をさらに促進することができる。また、スタチン等の化合物を単純に静脈投与した場合、血流に従って患部に運ばれるが、心筋梗塞等の虚血性心疾患では、血流が阻害されており、正常に患部に到達することが困難であるが、本発明のようにスタチンが、遊走性が増強した幹細胞に取り込まれて運ばれるため、血流が阻害されていたとしても、患部に到達することができる。すなわち、良好なドラッグデリバリーシステムとなり得て、投与すべき細胞数を低減することができる。以上に述べた作用により、心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療に対して極めて高い効果を発揮する。なお、上記ナノ粒子の個数平均粒径は、上記ファゴサイトーシスによって幹細胞が効率良くスタチン封入ナノ粒子を取り込むことを目的として、１０００ｎｍ未満とする。【００１２】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤において、生体吸収性ポリマーとしては、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolicacid)：ＰＬＧＡ）を用いることができる。【００１３】
ＰＬＡ及びＰＬＧＡは体内で加水分解されることにより、封入したスタチンを放出することができ、また、ＰＬＡはその加水分解により乳酸に分解され、ＰＬＧＡはその加水分解により乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなり、ヒト等の動物に対して無害であるため、ＰＬＡ又はＰＬＧＡをナノ粒子材料として用いることは極めて好ましい。【００１４】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤は、上記幹細胞として脂肪由来幹細胞を増強するためのものであることが好ましい。【００１５】
脂肪由来幹細胞は、脂肪組織を採取し、採取した組織をコラゲナーゼ処理した後に、遠心比重法により単核球細胞のみを採取し、採取した単核球細胞を培養プレートで４日間程度培養し、接着した細胞を脂肪由来幹細胞として選択及び分離できる。また、セリューションシステム（サイトリ社製）等を用いて脂肪組織から容易に且つ大量に抽出、分離培養することができる。脂肪由来幹細胞は、間葉系幹細胞に属し、優れた多能性を有し、また、上記のとおり、簡便に多くの量を採取することができるため、種々の疾病の治療のために用いるのに有利である。【００１６】
また、本発明に係る機能増強幹細胞は、上記スタチンが生体適合性ナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含有することに特徴がある。【００１７】
このような本発明に係る機能増強幹細胞は、上記スタチン封入ナノ粒子を含有しているため、上述のとおり、該スタチン封入ナノ粒子により細胞機能が増強され、虚血性心疾患をはじめ各種疾患の治療に優れた効果を発揮できる。また、本発明に係る機能増強細胞は、スタチンを徐放することができ、その放出されたスタチンによる骨髄幹細胞や骨髄由来血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の集積を亢進できるため虚血性心疾患等の治療に有利となる。【００１８】
本発明に係る機能増強幹細胞は、上述の理由から、上記脂肪由来幹細胞であることが好ましく、心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療のために患者に投与されるものであることが好ましい。【００１９】
また、本発明に係る機能増強幹細胞は、医薬として許容可能な溶媒及び賦形剤と混合して細胞製剤として製剤化することも可能である。本発明に係る幹細胞の生体内への投与は、開胸等の手術が不必要であることが好ましく、静脈内投与用の細胞製剤として製剤化されていることが好ましい。このようにすると、簡便に患者に本発明に係る幹細胞を投与することができる。また、本発明に係る機能増強幹細胞は、上述のとおり、優れたドラッグデリバリーシステムとして機能し、所望の患部に幹細胞を集積できると共にスタチンを徐放できるため、局所投与をする必要がなく、静脈内投与を用いても、少ない容量で高い効果を得ることができる。【００２０】
本発明に係る機能増強幹細胞の製造方法は、上記スタチン封入ナノ粒子を幹細胞に処理するステップを備えることを特徴とする。特に、上記スタチン封入ナノ粒子を幹細胞に処理するステップにおいて、幹細胞を培養する培地中に２０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度となるようにスタチン封入ナノ粒子を添加することが好ましく、その処理時間は、３０分〜２時間であることが好ましい。【００２１】
このようにすると、幹細胞が培養されている培養培地中にスタチン封入ナノ粒子を添加するという簡便なステップにより上記のような機能増強幹細胞を得ることができる。また、上記濃度及び時間で処理することにより、幹細胞内がスタチン封入ナノ粒子を効率よく取り込むことができる。【００２２】
本発明に係る機能増強幹細胞の製造方法では、上記理由から幹細胞として脂肪由来幹細胞を用いることが好ましく、また、虚血性心疾患の治療用の幹細胞を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子、並びにそれを含有する機能増強幹細胞及びその製造方法によると、幹細胞の機能を増強することができ、該幹細胞を生体内に投与することにより、虚血性心疾患をはじめ種々の疾患の治療に効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】脂肪由来幹細胞の培養培地中にローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、その１時間後又は２時間後に幹細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。
【図２】脂肪由来幹細胞に対して１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を１時間処理させた後に、脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）はＰＬＡナノ粒子又はスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を処理した脂肪由来幹細胞の遊走性の測定結果を示すグラフであり、（ｂ）はスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を処理した脂肪由来幹細胞の増殖性の測定結果を示すグラフである。
【図４】スタチン封入ナノ粒子を処理した脂肪由来幹細胞における血管新生因子のｍＲＮＡ発現を、定量ＰＣＲ法を用いて測定した結果を示すグラフであり、血管新生因子として（ａ）はＶＥＧＦ‐Ａ、（ｂ）はＶＥＧＦ‐Ｃ、（ｃ）はＦＧＦ‐２のＲＮＡ発現を測定した結果を示している。
【図５】ＰＢＳ、スタチン封入ナノ粒子、脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の超音波診断を行った結果を示すグラフであり、（ａ）は左室駆縮率（ＥＦ）を示し、（ｂ）は左室内径短縮率（ＦＳ）を示し、（ｃ）は左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を示し、（ｄ）は左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）を示している。
【図６】ＰＢＳ、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して２８日後の心筋梗塞モデルマウスの心臓を示す写真である。
【図７】（ａ）はＰＢＳ、スタチン封入ナノ粒子、スタチン非封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真であり、（ｂ）は各切片における繊維化部分の長さを示すグラフであり、（ｃ）は各切片における繊維化部分の心筋壁の厚さを示すグラフである。
【図８】ＰＢＳ、スタチン封入ナノ粒子、スタチン非封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示し、繊維化部分を拡大した写真である。
【図９】（ａ）はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して６０日後の心筋梗塞モデルマウスの心臓を示す写真であり、（ｂ）〜（ｅ）は（ａ）に示す（ｂ）〜（ｅ）の各線における切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。
【図１０】ＰＢＳ、スタチン封入ナノ粒子、スタチン非封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をイソレクチンＢ４又は抗ＳＭαアクチン抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１１】ＰＢＳ、スタチン封入ナノ粒子、スタチン非封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をイソレクチンＢ４により染色し、血管密度を計測した結果を示し、（ａ）は切片を染色した後の顕微鏡写真を示し、（ｂ）は計測された血管密度を示すグラフである。
【図１２】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をイソレクチンＢ４及び抗Ｋｉ６７抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１３】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片を抗ＳＭα‐アクチン抗体と抗Ｋｉ６７抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１４】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が投与されて１４日後の上記心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片を、抗Ｗｔ１抗体と上記抗Ｋｉ６７抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１５】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片を抗ＧＡＴＡ４抗体と抗αＭＨＣ抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１６】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片を抗Ｎｋｘ２．５抗体と抗αＭＨＣ抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１７】スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片を抗ｃＴｎ−１抗体又は抗ＳＭαアクチン抗体、及び抗ヒトミトコンドリア抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【図１８】Ｔｉｅ２／ｌａｃＺトランスジェニックマウスから骨髄移植を受けた心筋梗塞マウスに対してスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した後に、そのマウスの心臓の梗塞部の切片を抗ｃＴｎ−１抗体、抗ＳＭαアクチン抗体又はイソレクチンＢ４、及び抗β‐ｇａｌ（β‐ガラクトシダーゼ）抗体により免疫染色した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２６】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤に用いられるスタチン封入ナノ粒子は、スタチンがポリ乳酸グリコール酸共重合体を含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子であって、幹細胞の機能を増強するために用いられる。本発明に係るスタチンナノ封入粒子製剤は、上記スタチン封入ナノ粒子以外に、安定化剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、賦形剤等の製剤化に通常用いられる添加剤を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明において、スタチンとは、ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ）還元酵素阻害剤である化合物を全て含むものであり、例えば、シンバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン及びメバスタチン等が挙げられる。スタチンは、上述のとおり、コレステロール低下作用を有することが知られているが、この他に心血管イベントの発生や進行リスクを低下させることが大規模臨床試験で明らかになっている。また、血管内皮細胞や骨髄由来の血管内皮前駆細胞を介した血管新生促進作用についても多く報告がなされている。
【００２８】
本発明において、ナノ粒子はスタチンを封入することができる生体吸収性ポリマーであればその材料は限定されないが、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolicacid)：ＰＬＧＡ）を含むナノ粒子を用いることが好ましい。ＰＬＡは体内で加水分解されて乳酸に分解され、ＰＬＧＡは、体内で加水分解されて乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなるので、体内に無害であって好ましい。
【００２９】
本発明において、スタチン封入ナノ粒子は、幹細胞の取り込み効率の観点から光散乱法で測定したときに１０００ｎｍ未満、好ましくは約１００ｎｍ〜４００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ〜４００ｎｍに加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造することができるが、好ましくは球形晶析法を使用して製造する。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法として周知である。この球形晶析法の一つに、周知のエマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。
【００３０】
エマルジョン溶媒拡散法は、スタチンを封入するための上記ＰＬＡ又はＰＬＧＡ等の生体吸収性ポリマーを溶解可能な良溶媒と、ポリマーを溶解しない貧溶媒との２種の有機溶媒を用いて行われる。まず、良溶媒中にＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマーを溶解し、このポリマーが析出しないように、スタチン溶解液を良溶媒に添加し、混合する。この混合液を撹拌されている貧溶媒中に滴下すると、急速に良溶媒が貧溶媒に、また、貧溶媒は良溶媒に相互拡散するため、有機溶媒相と水相との界面が乱れ、良溶媒が自己乳化し、サブミクロンサイズのエマルジョン滴が形成される。その後、良溶媒及び貧溶媒の相互拡散がさらに進み、エマルジョン滴内のＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマー及びスタチンの溶解度が低下し、その結果、スタチンを包含した球形結晶粒子のポリマーナノ粒子が生成する。
【００３１】
本発明において、幹細胞は、全能性、多能性又は多分化能を有する細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び間葉系幹細胞等の体性幹細胞が挙げられる。本発明においては、多くの幹細胞をより簡便に且つ大量に得るという観点から骨髄組織や脂肪組織等から得られる間葉系幹細胞を用いることが好ましい。その中でも、特に脂肪由来幹細胞を用いることがより好ましい。脂肪由来幹細胞は、細胞単独で投与されることは既に臨床で行われており、脂肪をはじめ、骨、肝臓、心臓等に分化することが知られている。脂肪由来幹細胞は脂肪組織から得ることができ、該脂肪組織は脂肪吸引等の低侵襲技術で皮下脂肪等から容易に得ることができる。脂肪由来幹細胞は、上記のように得られた脂肪組織からセリューションシステム（サイトリ社製）等を利用して抽出及び分離されることで豊富に採取可能である。このため、本発明に係る幹細胞として用いるのに極めて有利である。
【００３２】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子の幹細胞への処理は、例えば該幹細胞が培養されている培養培地中に添加することにより行われる。このようにすると、ファゴサイトーシスにより幹細胞がスタチン封入ナノ粒子を細胞内に取り込むため、特別な試薬等を用いることなく、簡便に幹細胞内にスタチン封入ナノ粒子を含有させることができる。
【００３３】
本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された幹細胞は、特に遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能が増強され、特に心筋梗塞等の虚血性心疾患に対する治療効果が増強する。具体的に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された上記脂肪由来幹細胞を虚血性心疾患の患者に静脈内投与すると、増強された遊走性及び増殖性により、脂肪由来幹細胞が血流及びその遊走性によって心臓に到達し、虚血傷害心筋部分に集積及び増殖し、心血管系細胞に分化する。また、集積したスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞は、血管新生因子の産生及び放出が促進され、多くの血管新生因子により心筋組織の再生が促進される。
【００３４】
また、脂肪由来幹細胞は、上述のとおり、取り込んだスタチン封入ナノ粒子を細胞内で加水分解することにより、封入されたスタチンを徐放するため、脂肪由来幹細胞は体内に投与された場合、投与後に虚血傷害心筋においてスタチンを徐放し、放出されたスタチンにより骨髄幹細胞や骨髄由来血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ: endothelial progenitor cell）の集積を促進し、骨髄幹細胞の心血管系細胞への分化も促進し、組織の再生を促進する。ＥＰＣは骨髄中に存在する血球系の造血幹細胞のうちの一つの細胞分画であり、また、少数ながら抹消循環血液中にも存在し、虚血組織に集積して毛細血管を構成する内皮細胞に分化して新生血管の形成に役立つことが知られており、虚血性疾患に対する血管新生のための細胞治療のソースとして臨床試験も広く行われている。さらに、ＥＰＣは血管内皮細胞だけでなく、心筋細胞にも分化するとの報告もある。本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞は、このような機能を有するＥＰＣを虚血傷害心筋部分に集積できるため、その治療に極めて有利である。さらに、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の投与により、心筋梗塞部において心外膜付近に存在する細胞が分裂増殖しながら肉芽新生させて心筋の再生を促す。その結果、心筋梗塞の治療に有利となる。なお、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞は、虚血性心疾患の治療にのみならず、幹細胞が分化できる心臓以外の他の臓器の傷害においてもスタチンの効果や幹細胞及びＥＰＣによる再生機能による治療効果を得ることが可能である。
【実施例】
【００３５】
以下に、本発明に係る幹細胞機能増強用スタチン封入ナノ粒子製剤、並びにそれを含有する機能増強幹細胞及びその製造方法を詳細に説明するための実施例を示す。【００３６】
まず、スタチン封入ナノ粒子の製造方法について説明する。ここでは、特にスタチンとしてシンバスタチンを用い、ナノ粒子としてポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）を含むナノ粒子を用いた。【００３７】
ＰＬＡ（和光純薬、PLA0020、平均重量分子量20000）５０ｍｇとシンバスタチン２．５ｍｇとをアセトン２ｍＬ、エタノール０．５ｍＬの混液に溶解しポリマー溶液とした。これを室温、５００ｒｐｍで攪拌した２ｗｔ％ＰＶＡ溶液１０ｍＬ中に滴下しシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子懸濁液を得た。続いて室温、５００ｒｐｍで攪拌を続けながら、有機溶媒（アセトン、エタノール）を留去した。約５時間溶媒留去後、懸濁液を４℃、６００００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収して蒸留水に再懸濁させた。この遠心分離と蒸留水への再懸濁の操作は合計３回行った。その後、懸濁液を一晩凍結乾燥し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を得た。シンバスタチンは、１ｍｇのナノ粒子中に２４．９４μｇ封入された。以下の試験では、このシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を用いた。【００３８】
次に、幹細胞に対して上記のようにして得られたスタチン封入ナノ粒子を処理する際の最適な処理濃度を検討するために、以下の試験を行った。【００３９】
当該試験を行うために、まず、コラゲナーゼ処理及び遠心比重法を利用した周知の方法を用いてヒト脂肪組織からヒト脂肪由来幹細胞（Adipose derived Stem Cell：ＡｄＳＣ）を得た。その方法の詳細について以下に説明する。まず、ＤＮａｓｅ１（0.1mg/mL, ロッシュ, 1284932）及び３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むコラゲナーゼ1型（1 mg/mL, Wako 035-17604）/１％ＢＳＡ  ＨＢＳＳ溶液をコラゲナーゼ溶液として調製した。その後、ヒト脂肪組織（１ｇ〜２ｇ程度）をメスで細断し、その組織体積の３倍程度の上記コラゲナーゼ溶液と共に１５ｍＬチューブに入れ、３７℃で６０分間振盪インキュベーションした。その後、インキュベートした１５ｍＬチューブ内に室温の５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ（EDTA（0.5M EDTA, pH 8.0,LifeTechnologies, AM9260G）、 10X DPBS, Ca(-), Mg(-)（GIBCO, 14200-166）を希釈して作製）を加えて、１５ｍＬ程度の細胞懸濁液としてから３００ｇ×５ｍｉｎの遠心後、上清（脂肪層を含む）を吸引除去し、５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳを加えて２０ｍＬにした。得られた細胞懸濁液をセルストレーナー（70μm, BD）に通しながら、新しい５０ｍＬチューブに回収し、室温のHistopaque 1077 ４ｍＬの入った２本の１５ｍＬチューブに、上記回収した細胞溶液を１０ｍＬずつ穏やかに混入させずに重層した。これらを室温８００ｇ×２０ｍｉｎ（ブレーキ無し）で遠心し、遠心後に単核球細胞層だけを１８Ｇ針付２．５ｍＬシリンジで回収し、新しい１５ｍＬチューブに移して、冷却した５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで１４ｍＬとした。その後、２００ｇ×１０ｍｉｎで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。その後、１ｍＬの冷却した５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞を懸濁し、１４ｍＬまでメスアップした後、２００ｇ×１０ｍｉｎで遠心し上清を捨てた。得られた細胞ペレットを初代培養用培地（10%FBS/DMEM F12, Sigma D8042+ Antibiotic-Antimycotic, GIBCO 15240-062）で懸濁してから３×１０４／ｃｍ２〜４×１０４／ｃｍ２程度の細胞密度で培養皿に播種した。その後、５％ＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し、接着細胞をヒト細胞由来幹細胞として実験に用いた。【００４０】
このようにしてヒト細胞由来幹細胞を得た後に、上記エマルジョン溶媒拡散法を利用してスタチンの代わりにローダミン赤色蛍光色素をＰＬＡナノ粒子に封入することにより得られたローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように、上記脂肪由来幹細胞の培養培地中に添加した。その１時間後（１ｈ）又は２時間後（２ｈ）に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子の取り込みについて共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。なお、核の染色はＤＡＰＩを用いて常法で染色した。その結果を図１に示す。【００４１】
図１に示すように、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子は、いずれの濃度であっても脂肪由来幹細胞に取り込まれたことがわかる。但し、処理濃度依存的に、脂肪由来幹細胞のローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量が増大する。また、処理時間が１時間の場合よりも２時間の場合の方が、脂肪由来幹細胞によるシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量が多いこともわかる。特に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子を１００μｇ／ｍＬの濃度で脂肪由来幹細胞に処理した場合に多くのローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子が幹細胞に取り込まれているのが確認された。【００４２】
次に、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が、その後に細胞内からスタチンをどの程度の時間をかけて放出するのかを検討するために、培地中に放出されたスタチンの量を測定した。ここでは、上記試験と同様に脂肪由来幹細胞に対して１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を１時間処理した後に、培地を交換し、培地交換から６時間後、１８時間後、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間及び３３６時間後に、培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した。具体的に、この測定は、ＨＰＬＣ (High-pressure Liquid Chromatography)法を用いて行った。この測定結果を図２に示す。【００４３】
図２に示すように、測定開始から２４時間後に約６０％程度のスタチンが脂肪由来幹細胞から放出され、全てのスタチンが放出されるのに約３３６時間もの時間が掛かっている。この結果から、脂肪由来幹細胞に取り込まれたスタチンは、脂肪由来幹細胞から急速に放出されるのではなく、緩やかに徐放されることがわかる。このため、脂肪由来幹細胞が虚血心筋に到達する前にほとんどのスタチンを放出することなく、患部に到達後、長い時間を掛けてスタチンを放出できるため、良好な治療効果を期待することができる。【００４４】
次に、上記シンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能といった機能の増強について検討するために以下の試験を行った。【００４５】
まず、遊走性試験キット（Transwell（登録商標））を用いて脂肪由来幹細胞の遊走能について検討した。具体的に、Transwellプレートの各ウェルの多孔メンブレン上に脂肪由来幹細胞を５×１０４cells/wellで播種し、培地中に、スタチンを封入していないＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、又はシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、１６〜１８時間後にTranswellのメンブレンを通過した細胞数を計測した。その結果を図３（ａ）に示す。【００４６】
図３（ａ）に示すように、２０μｇ／ｍＬのスタチン非封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（ＰＬＡ２０）、及び２０μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（ＰＬＡ−ＳＴ２０）は、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して脂肪由来幹細胞の遊走性に変化はなかったが、５０μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（Ｓｔａｔｉｎ５０）は、脂肪由来幹細胞の遊走性が増大した。また、１００μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（Ｓｔａｔｉｎ１００）は、脂肪由来幹細胞の遊走性が低減する結果となった。この結果から、最適な処理濃度があるものの、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の遊走能を亢進できることが示された。【００４７】
次に、シンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の増殖性向上についてＭＴＴアッセイを用いて検討した結果について説明する。【００４８】
まず、脂肪由来幹細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５０００cells/wellの細胞数で播種し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、４８時間後に培地を交換し、ＭＴＴ溶液を各ウェルに加え、２時間後に分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図３（ｂ）に示す。【００４９】
図３（ｂ）に示すように、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）の濃度で処理した場合のいずれも、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して脂肪由来幹細胞の増殖が認められ、特に、５０μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合、コントロール群と比較して顕著な増殖性の増加が見られた。この結果から、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の増殖能を亢進できることが示された。【００５０】
次にシンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の血管新生因子産生能に対する効果について検討するために、脂肪由来幹細胞内における血管新生因子のｍＲＮＡ発現量について定量ＰＣＲ法を用いて解析した。ここでは、血管新生因子としてＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｃ及びＦＧＦ‐２の細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。【００５１】
まず、脂肪由来幹細胞を培養する培養培地中にシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、２４時間後に各濃度で処理された細胞を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡキット（タカラバイオ）を用いてそれらのＲＮＡを抽出した。その後、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｃ及びＦＧＦ‐２のＤＮＡ配列に関するプライマーを用いて、定量ＰＣＲ法により各細胞におけるＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｃ及びＦＧＦ‐２のｍＲＮＡ発現量を測定した。測定は、ReverTra Ace qPCR RT キット（TOYOBO）を用いて抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、SsoFastEvaGreen Mastermix試薬（バイオラッド）とプライマー（VEGF-A: F-TTACTCTCACCTGCTTCT,R-CTGCTTCTTCCAACAATG, VEGF-C: F-TCAAGGACAGAAGAGACTA, R-CCACATCTATACACACCTC,FGF-2: F-TTCTTCCAATGTCTGCTAA, R-GACCAATTATCCAAACTGAG）とともにサーマルサイクラー（CFXConnectバイオラッド）を用いて反応（９５℃３０秒を１サイクル、９５℃５秒／５６℃５秒を４０サイクル）させて行った。
その測定結果を図４に示す。なお、結果は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を基準とした上記各因子の発現量の比率を示している。【００５２】
図４（ａ）に示すように、ＶＥＧＦ‐ＡのｍＲＮＡ発現量は、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。【００５３】
また、図４（ｂ）に示すように、ＶＥＧＦ‐ＣのｍＲＮＡ発現量は、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。【００５４】
同様に、図４（ｃ）に示すように、ＦＧＦ‐２のｍＲＮＡ発現量も、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。これらの結果からシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の血管新生因子産生能が亢進することが示された。【００５５】
以上のとおり、スタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能といった機能の増強について検討した結果、スタチン封入ナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の機能を増強することができる。これらの機能は、脂肪由来幹細胞が生体内に投与された後に、虚血心筋部分に集積し、当該部分の再生に有利となる機能であり、これらの機能が増強することにより、脂肪由来幹細胞は心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療に極めて有利となる。【００５６】
次に、心筋梗塞モデルマウスを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子及びそれを含有する幹細胞の心筋梗塞治療効果について検討した。【００５７】
まず、１２週齢の雄のBALB/cヌードマウスに対して虚血誘発（冠動脈前下行枝結紮モデル）を行うと共に心臓超音波画像診断を行い（０日目）、その３日後（３日目）に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、上記のようにしてそれぞれ得られたスタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、スタチン封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を尾静脈に投与した。なお、スタチン封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞としては、脂肪由来幹細胞に対してスタチン封入ナノ粒子の１００μｇ／ｍＬの濃度で１時間の処理を行ったものを用いた。脂肪由来幹細胞の投与量は１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとし、スタチン封入ナノＰＬＡ粒子の投与量は５０μｇ／マウスとした。また、この日（３日目）にも心臓超音波画像診断を行った。その１１日後（１４日目）に、再び、心臓超音波画像診断を行った。その１４日後（２８日目）に、再び、心臓超音波画像診断を行い、その後に解剖して心臓の組織学的解析を行った。心臓超音波画像診断では、左室駆縮率（ＥＦ）、左室内径短縮率（ＦＳ）、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）及び左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）を測定した。組織学的解析としては、毛細血管密度、繊維化面積率、脂肪由来幹細胞の生着率及び脂肪由来幹細胞の分化頻度について解析した。心臓超音波画像診断の結果を図５に示し、２８日目に上記マウスから取り出された心臓を図６に示し、組織学的解析の結果を図７、８、１０〜図１７に示す。また、上記スタチン封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が投与されて６０日目のマウスから取り出された心臓、及びその異なる部分における切片を図９に示す。【００５８】
図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、全ての群において３日目にＥＦ及びＦＳが低減して心臓の機能が悪化し、その後、１４日目及び２８日目において、未処理であるコントロール群（ＰＢＳ：●）では改善は認められなかったが、スタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ：▲）、及びスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ：▼）ではわずかに改善が認められた。また、スタチン封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ：■）では顕著な改善が認められた。また、図５（ｃ）及び（ｄ）に示すように、ＬＶＤｄ及びＬＶＤｓにおいても、未処理であるコントロール群（ＰＢＳ：●）や、スタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ：▲）、及びスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ：▼）と比較して、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ：■）では、それらの大きさの増大を抑制できており、心機能の改善が認められた。【００５９】
また、図６に示すように、コントロール群（左側の写真）と比較して、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群の心臓（右側の写真）は、その拡大が抑制されていることがその外観からも認められる。【００６０】
また、各群の取り出した心臓における梗塞部の切片を常法で作製し、マッソン・トリクローム染色し、心筋壁断面積について評価した結果を図７に示す。図７（ａ）は、染色した切片の写真を示し、繊維化して青く染まった瘢痕部分を矢印により示している。図７（ｂ）は青く染まった繊維化部分の長さ（図７（ａ）の矢印方向の長さ）を、全周の長さを１００％とした場合の割合で示し、図７（ｃ）は青く染まった繊維化部分の心筋壁の厚さを、正常の心筋壁の厚さを１００％とした場合の割合で示している。【００６１】
図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、繊維化して青く染まった瘢痕部分の長さは、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＡｄＳＣ＋Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ）では、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、スタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ）、及びスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ）と比較して短くなった。さらに、図７（ａ）及び（ｃ）に示すように、心筋壁の厚さについてもスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群では他の群と比較して厚くなり、心筋部分の再生が促進していると示唆される。【００６２】
図８に、各群の切片における繊維化部分を拡大した写真を示す。図８に示すように、コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではほとんど青く染まった平らな外観となっており、また、スタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ）、及びスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ）は、わずかに赤く染まった部分があるもののコントロール群と大きな差は認められなかった。一方、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＡｄＳＣ＋Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ）では、繊維化した心筋壁の外側に膨出し、赤く染まる部分が認められた。これは他の群では認められず、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞により新たに心筋として再生される過程にある部分であると推測される。【００６３】
また、図６〜８では、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して２８日後のマウスの心臓を示したが、それ以降の時点においてさらなる治療効果が認められることを確認するために、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して６０日後のマウスの心臓の外観を観察し、その心臓の異なる部分における切片を上記と同様に染色して観察した。その結果を図９に示す。なお、図９（ａ）は当該マウスの心臓を示す写真であり、図９（ｂ）〜図９（ｅ）は図９（ａ）に示す（ｂ）〜（ｅ）の各線における切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。なお、図９（ｂ）の曲線の矢印は上記染色により青く染まった領域を示す。【００６４】
図９（ａ）に示すように、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して６０日後には、２８日後に認められた梗塞（繊維化）部分がさらに縮小傾向となった。また、図９（ｂ）〜（ｅ）に示すように、梗塞部分における各切片についても心筋壁の厚さが厚く、また、図９（ｂ）に示す結紮部分を除くほとんどの部分が赤く染まっているため、心筋部分の再生が促進していると考えられる。この結果から、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与して６０日後には機能的心筋の再生治療効果が認められる。【００６５】
次に、梗塞部分の心筋組織における血管新生について検討するために、血管内皮細胞に発現する糖タンパク質、及び血管平滑筋細胞に発現するタンパク質にそれぞれ結合する抗体等を用いて上記切片を免疫染色した結果を図１０に示す。具体的に、上記抗体等として血管内皮細胞に発現する糖タンパク質に結合する植物由来蛋白であるＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）標識のイソレクチンＢ４、及び血管平滑筋細胞に発現するタンパク質であるＳＭαアクチンに結合するウサギ由来ＩｇＧ抗体を用い、ウサギ由来ＩｇＧに対する二次抗体としてはAlexa488-ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて染色した。【００６６】
図１０に示すように、コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＢＳ））では、FITC-イソレクチンＢ４（Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４）、及び抗ＳＭαアクチン抗体（ＳＭα‐ａｃｔｉｎ）のどちらを用いた場合もほとんど染色が見られず、すなわち、血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞がほとんど検出されず、血管がほとんど存在しないと考えられる。また、スタチン封入ナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＧＡ）においても、血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞がほとんど検出されず、スタチン非封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ‐ＡｄＳＣ）では、わずかに血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞が検出された。これらに対して、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＳｔａｔｉｎＰＬＡ‐ＡｄＳＣ）では、非常に多くの領域において染色が認められ、血管新生が起こっていると考えられる。すなわち、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与することで心筋における血管組織の再生が促されると考えられる。【００６７】
次に、虚血境界領域における血管密度について検討した。具体的に、各群の繊維化部分について、上記解析と同様にFITC-イソレクチンＢ４を用いて蛍光染色を行い、顕微鏡視野における染色領域の大きさを測定した。またその測定結果を血管密度としてグラフ化した。その結果を図１１に示す。【００６８】
図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＢＳ））と比較して、スタチン非封入ＰＬＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ）、及びスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ）ではわずかに血管密度が増大し、また、それらと比較してスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ／ＰＬＡ＋ＡｄＳＣ）ではさらに血管密度が増大していることが確認できた。この結果からも、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与することで、梗塞周辺部分（虚血部分）において血管新生が促進されて心筋組織再生に寄与しているものと考えられる。【００６９】
次に、虚血心筋組織における細胞増殖活性について検討するために、細胞の増殖期に発現するＫｉ６７タンパク質に結合する抗体を用いて上記切片に対して免疫染色した結果を図１２に示す。具体的に、コントロール群及びスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群の繊維化部分についてFITC-イソレクチンＢ４とウサギ由来抗Ｋｉ６７抗体及び二次抗体としてAlexa594-ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、血管内皮細胞及び増殖期の細胞を免疫染色した。【００７０】
図１２に示すように、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、どちらの抗体を用いても染色は認められなかったが、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ＋ＡｄＳＣ）では、上記試験と同様にFITC-イソレクチンＢ４により染色されただけでなく、抗Ｋｉ６７抗体によっても染色が認められた。この結果から、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与することで、虚血心筋組織における細胞増殖活性を促すことができることが示唆された。また、イソレクチンＢ４による染色部分とＫｉ６７による染色部分とは異なっており、増殖している細胞は毛細血管を形成する血管内皮細胞とは異なるもの（間質の線維芽細胞など）と考えられる。【００７１】
また、図１３に抗ＳＭα‐アクチン抗体と抗Ｋｉ６７抗体とを用いて、上記と同様に切片を免疫染色した結果を示す。図１３に示すように、この場合も、コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではどちらの抗体を用いても染色はほとんど認められなかった。一方、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ＋ＡｄＳＣ）は、上記試験と同様に抗ＳＭα‐アクチン抗体により染色されただけでなく、抗Ｋｉ６７抗体によっても染色が認められた。また、抗ＳＭα‐アクチン抗体による染色部分と抗Ｋｉ６７抗体による染色部分とは異なっており、増殖している細胞は平滑筋細胞とは異なるもの（間質の線維芽細胞など）と考えられる。【００７２】
また、図１４に、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が投与されて１４日後の上記心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部を、心外膜細胞が有するＷｔ１タンパク質を染める抗Ｗｔ１抗体と上記抗Ｋｉ６７抗体とを用いて、上記と同様に切片を免疫染色した結果を示す。図１４に示すように、心筋梗塞部において抗Ｗｔ抗体により染まる心外膜細胞が多く認められ、また、その最外部に抗Ｗｔ１抗体と共に抗Ｋｉ６７抗体で染まる増殖期細胞が多く認められた（矢印部分）。この結果から、梗塞部において、心外膜細胞が外側に向かって増殖分裂しながら肉芽新生させることにより、心筋壁の厚さが再び厚くなるように再生していると示唆される。従って、例えば心筋梗塞の発症から１月以上経過して、梗塞部のほとんどが瘢痕状態となった場合であっても、本願発明に係るスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与することにより、瘢痕部分に残った心外膜細胞を増殖させて心筋の再生を促し、心筋梗塞の治療ができることも推察される。【００７３】
次に、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞による心筋の再生について検討するために、心筋細胞で発現するタンパク質に結合する抗体を用いて、免疫染色を行った結果を図１５に示す。ここでは、心筋細胞で発現するタンパク質に結合する抗体として、幼若な心筋細胞においても発現するＧＡＴＡ４に結合するウサギ由来ＩｇＧ抗体と二次抗体としてAlexa488ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体、及び幼若な心筋細胞では発現せず成熟した心筋細胞にのみ発現するαＭＨＣに結合するマウス由来ＩｇＧ抗体と二次抗体としてAlexa594ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。【００７４】
図１５に示すように、上記ＧＡＴＡ４について免疫染色した結果、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではほとんど染色されなかったが、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ＋ＡｄＳＣ）では多くの染色領域が検出された。一方、上記αＭＨＣについて免疫染色した結果、コントロール群ではほとんど染色が見られず、また、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群ではわずかに染色が認められたが、抗ＧＡＴＡ４抗体による染色の結果と比較して染色された領域は顕著に少なかった。【００７５】
図１６は、ＧＡＴＡ４と同様に幼若な心筋細胞において発現するＮｋｘ２．５のウサギ由来ＩｇＧ抗体と二次抗体としてAlexa488ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体及び上記αＭＨＣの抗体を用いて、上記と同様に免疫染色した結果を示す。図１６に示すように、図１５の結果と同様に、幼若な心筋細胞に発現するＮｋｘ２．５で免疫染色した結果、コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではほとんど染色が見られなかったが、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ＋ＡｄＳＣ）では多くの染色領域が検出された。【００７６】
図１５及び図１６に示す結果から、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与すると、虚血心筋組織に幼若な心筋細胞が出現することが明らかになった。すなわち、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞により心筋組織の再生が促進されることが示唆される。【００７７】
ここまでの実験では、上記のとおり、心筋梗塞モデルマウスに対して、１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスのスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した場合の結果について示したが、次に、５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスの量を投与した場合の、心筋組織の再生について検討した。そのために、上記と同様に作成した心筋梗塞モデルマウスに対して虚血処理の３日後に５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスのスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を尾静脈に投与して、その２５日後に上記と同様に解剖して、心筋梗塞部分の切片を作成した。その切片に対して心筋骨格筋細胞に発現するｃＴｎ‐１（心筋型トロポニン）に結合するウサギ由来ＩｇＧ抗体と二次抗体としてAlexa488ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体又は平滑筋細胞に発現する上述と同じ抗ＳＭαアクチン抗体、及びヒトミトコンドリア（ｈＭｔＣｄ）に結合するウサギ由来ＩｇＧ抗体と二次抗体としてAlexa594ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて免疫染色した。その結果を図１７に示す。【００７８】
図１７に示すように、心筋梗塞モデルマウスにおいて、５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスのスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した場合、心筋組織の繊維化部分において抗ｃＴｎ−１抗体による染色が認められ（矢印部分）、心筋細胞の発現が認められた。また、ｈＭｔＣｄ抗体による染色も認められ（矢印部分）、すなわち、投与したヒト脂肪組織由来の幹細胞が心筋組織内に残存していることが示された。また、それらの画像を重ね合せた場合、染色領域が重なる部分（矢印部分）が認められた。このため、投与したヒト脂肪由来幹細胞が心筋に分化していることが示唆された。なお、ＳＭαアクチン抗体によっても染色が認められたが、その染色領域とｈＭｔＣｄ抗体での染色領域とではほとんど重ならなかった。【００７９】
これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスの容量で投与した場合、虚血心筋組織おいて、投与した細胞の集積と残存、さらにはその細胞の特に心筋細胞への分化が起こったことが示唆される。【００８０】
次に、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が放出するスタチンによる骨髄由来血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の梗塞部分への集積効果について検討した。ＥＰＣは、上述した通り、骨髄中に存在する血球系の造血幹細胞のうちの一つの細胞分画であり、毛細血管を構成する内皮細胞や心筋細胞に分化することが知られている。また、ＥＰＣは血管安定化因子のうちの一つであるアンジオポエチン‐１の受容体であり、内皮系細胞のマーカーとして認識されるＴｉｅ２の陽性細胞に多く含まれることが知られている。そこで、遺伝子組み換えによりＴｉｅ２陽性細胞をβ‐ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）の免疫染色で同定可能なＴｉｅ２／ｌａｃＺトランスジェニックマウスをドナーとして、その骨髄から骨髄単核球細胞を抽出した。【００８１】
Ｔｉｅ２／ｌａｃＺトランスジェニックマウスは、通常用いられる方法で作製することが可能であり、具体的に、マウスTie2プロモーター／エンハンサーの内部にlacZ遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作製し、次いでバクテリア内で増幅した上記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスＴｉｅ２／ｌａｃＺ遺伝子発現ベクターをマウス受精卵にマイクロインジェクションすることにより作製した。また、骨髄単核球細胞の抽出は以下のようにして行った。まず、マウス屠殺後に大腿骨・下腿骨・脊椎・腸骨を分離し、細断して乳鉢に入れ、室温の５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ２０ｍＬを加えて乳棒で骨片をタップして細胞懸濁溶液を作製した。その細胞懸濁液をセルストレーナー（40μm, BD）に通しながら新しい50mLチューブに回収し、室温のHistopaque 1083 ４ｍＬ（Sigma, 10831）の入った２本の１５ｍＬチューブに細胞溶液を１０ｍｌずつ穏やかに混入させずに重層した。その後、それらを室温８００ｇ×２０ｍｉｎ（ブレーキ無し）で遠心し、遠心後に単核球細胞層だけを１８Ｇ針付２．５ｍＬシリンジで回収し、新しい１５ｍＬチューブに移して冷却５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで１４ｍＬとした。その後、２００ｇ×１０ｍｉｎで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。そして、１ｍＬの冷却５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞を懸濁し、１４ｍＬまでメスアップした後、２００ｇ×１０ｍｉｎで遠心し上清を捨てて骨髄単核球細胞ペレットを作製し、以下に示す骨髄移植実験に用いた。【００８２】
骨髄移植としては、まず、６〜８週齢の雄のBALB/cヌードマウスに対してＸ線照射（５Ｇｙで２回）をして、骨髄細胞を全て破壊したマウスをレシピエントマウスとして、上記のようにして得られたドナーマウスの骨髄単核球細胞を移植した。その４週間後に、該レシピエントマウスに対して上述の試験と同様に、虚血誘発（冠動脈前下行枝結紮モデル）を行い、その処理の３日後にスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を尾静脈に投与した。なお、投与した脂肪由来幹細胞の数は１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとした。その投与後、２５日後に解剖して心臓における梗塞部の切片を常法で作製した。そして、その切片に対して、上記抗ｃＴｎ−１抗体、抗ＳＭαアクチン抗体又はFITC-イソレクチンＢ４、及びウサギ由来ＩｇＧの抗β−ｇａｌ抗体と二次抗体としてAlexa594ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体で免疫染色を行った。その結果を図１８に示す。【００８３】
図１８に示すように、抗ｃＴｎ−１抗体、抗ＳＭαアクチン抗体及びFITC-イソレクチンＢ４を用いた場合、上記結果と同様に虚血心筋組織において心筋細胞及び平滑筋細胞が染色された。また、β−ｇａｌ抗体を用いた場合も虚血心筋組織において染色された領域が認められた。すなわち、骨髄からのＥＰＣが虚血心筋組織に集積していることが認められた。また、抗ｃＴｎ−１抗体又はFITC-イソレクチンＢ４で染色した画像と、抗β‐ｇａｌ抗体で染色した画像とを重ねた場合、互いの染色部分が重なったことから（矢印部分）、骨髄から集積したＥＰＣが心筋細胞に分化したことが示唆される。一方、ＳＭαアクチン抗体で染色した画像と、β‐ｇａｌ抗体で染色した画像とを重ねた場合、互いの染色部分はほとんど重ならなかった。【００８４】
この結果から、心筋梗塞マウスに対してスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与すると、虚血傷害心筋部分に集積した脂肪由来幹細胞がスタチンを放出することにより、該虚血傷害心筋部分にＥＰＣが集積し、集積したＥＰＣが血管新生を促進すると共に、心筋細胞に分化して虚血傷害部分の治療を促すことが示唆される。【００８５】
以上により、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、幹細胞の遊走性、増殖性及び血管新生因子の産生能等の機能を増強でき、この機能増強幹細胞は、梗塞部に集積し、増殖すると共に、血管新生因子を放出することにより、梗塞部の血管新生を促進できる。さらに、その集積及び増殖した幹細胞が心筋に分化することにより、心筋の再生を促し、その結果、優れた心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療効果を示す。また、その幹細胞は、取り込んだスタチンを徐放することができ、これにより、スタチン自体の血管新生効果等のスタチン特有の種々の効果も得られるので、虚血性心疾患をはじめ種々の疾患の治療に有益である。さらに、患部に集積した幹細胞から放出されたスタチンにより、体内の幹細胞や骨髄由来血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の集積を亢進することができ、その結果、例えば虚血性心疾患の場合、梗塞部の心筋の再生をさらに促進することができる。また、スタチン等の化合物を単純に静脈投与した場合、血流に従って患部に運ばれるが、心筋梗塞等の虚血性心疾患では、血流が阻害されており、正常に患部に到達することが困難であるが、本発明のようにスタチンが、遊走性が増強した幹細胞に取り込まれて運ばれるため、血流が阻害されていたとしても、患部に到達することができる。すなわち、良好なドラッグデリバリーシステムとなり得て、投与すべき細胞数を低減することができる。以上に述べた作用により、本発明は心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療に対して極めて高い効果を発揮する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月23日(2017.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子であって、
前記ナノ粒子は、個数平均粒径が２００ｎｍ〜４００ｎｍである、静脈投与用の脂肪由来幹細胞の遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つの機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子。
【請求項２】
前記生体吸収性ポリマーは、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のスタチン封入ナノ粒子。
【請求項３】
前記脂肪由来幹細胞は、虚血性心疾患の治療用の幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載のスタチン封入ナノ粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子を含有し、遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つの機能が増強された静脈投与用の脂肪由来幹細胞。
【請求項５】
虚血性心疾患の治療用であることを特徴とする請求項４に記載の脂肪由来幹細胞。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の脂肪由来幹細胞を含むことを特徴とする静脈投与用細胞製剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子を脂肪由来幹細胞に処理して、遊走能、増殖能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つの機能を増強するステップを備えることを特徴とする静脈投与用の機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項８】
前記スタチン封入ナノ粒子を前記脂肪由来幹細胞に処理するステップにおいて、前記脂肪由来幹細胞を培養する培地中に２０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度となるように前記スタチン封入ナノ粒子を添加することを特徴とする請求項７に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【請求項９】
前記スタチン封入ナノ粒子を前記脂肪由来幹細胞に処理するステップにおいて、前記スタチン封入ナノ粒子の処理時間は１時間〜２時間であることを特徴とする請求項７又は８に記載の機能増強幹細胞の製造方法。
【国際調査報告】
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