(57)【要約】非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤を提供する。別の局面で、本発明は、生物活性を有するコア部分と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、Ａ／Ｄ型、Ｂ／Ｋ型またはＣ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤。
【請求項２】
前記核酸は、グアニンに起因する高次凝集体の形成を防ぐものである、請求項１に記載の送達剤。
【請求項３】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項４】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約３３％以上である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項５】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％以上である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項６】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％より高い、請求項１に記載の送達剤。
【請求項７】
前記核酸は、約５塩基長以上のものである、請求項１に記載の送達剤。
【請求項８】
前記核酸は、約１００塩基長以下のものである、請求項７に記載の送達剤。
【請求項９】
前記核酸は、約９〜約１００塩基長である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項１０】
前記送達剤は、生物活性を有する部分と結合されている、請求項１に記載の送達剤。
【請求項１１】
前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはＢ／Ｋ型、Ｃ型もしくはＰ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、請求項１に記載の送達剤。
【請求項１２】
前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を有する、請求項１に記載の送達剤。
【請求項１３】
前記生物活性を有する部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ）（配列番号２２）、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、請求項１に記載の送達剤。
【請求項１４】
Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤。
【請求項１５】
前記免疫賦活剤は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドにおいて、前記コア部分以外に由来する配列を含まない、請求項１４に記載の免疫賦活剤。
【請求項１６】
前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導活性および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導活性である、請求項１４に記載の免疫賦活剤。
【請求項１７】
前記コア部分は、Ａ／Ｄ型の全長配列のうち、連続するＧを取り除いた部分である、請求項１４に記載の免疫賦活剤。
【請求項１８】
前記コア部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、請求項１４に記載の免疫賦活剤。
【請求項１９】
前記コア部分は、細胞導入用のビヒクルに含まれる、請求項１４に記載の免疫賦活剤。
【請求項２０】
前記ビヒクルは、リポソームまたは請求項１に記載の送達剤である、請求項１９に記載の免疫賦活剤。
【請求項２１】
免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約３３％以上である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％以上である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％より高い、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記核酸は、５塩基長以上のものである、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記核酸は、約１００塩基長以下のものである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記核酸は、約９〜約１００塩基長である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはＢ／Ｋ型、Ｃ型もしくはＰ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、請求項２１〜２９のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、Ａ／Ｄ型であり、前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導活性および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導活性である、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記コア部分は、Ａ／Ｄ型のうち、連続するＧを取り除いた部分である、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記コア部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項２１〜３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活剤。
【請求項３５】
前記免疫賦活剤は、インターフェロン（ＩＦＮ）αおよび／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導のためのものである、請求項３４に記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチドに関し、より特定すると、非凝集性ＣｐＧ型免疫賦活化オリゴヌクレオチドの送達剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９依存的に自然免疫反応を惹起し、ワクチン抗原と共に投与してワクチンの免疫効果を高めるワクチンアジュバント、またはそれ自身で惹起される自然免疫応答による免疫調節薬として期待されている。免疫賦活化オリゴヌクレオチドには大きく２種類あり、そのうちＫタイプは生理食塩水に可溶で主にインターロイキン（ＩＬ）−６産生を誘導することが知られ既に有望な核酸医薬品として臨床への適応が進んでいる。他方もう一つのタイプであるＤタイプは、生理食塩水に不溶ではあるが主にＩＦＮ−α産生を誘導することが知られ、Ｋタイプとは異なる生物活性をもつ。しかしながら、生理食塩水に不溶なため臨床への適応が進んでいない。【０００３】
本発明では、生理食塩水に可溶なＤタイプ免疫賦活化オリゴヌクレオチドを開発した。これによって、Ｄタイプ免疫賦活化オリゴヌクレオチドの臨床応用が促進されると考えられる。【０００４】
免疫賦活化ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、１０年以上にわたって、ＴＬＲ９依存性自然免疫活性化因子およびワクチンアジュバントとして開発および利用されてきた[非特許文献１］。その骨格および配列の特性に基づいて、免疫賦活化ＯＤＮは、４種類の異なるタイプ（またはクラス）に分類され得る：Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｋ、ＣおよびＰタイプのＯＤＮ[非特許文献２;非特許文献３]。Ａ／ＤタイプＯＤＮ（３’末端にポリＧテイルを有する大部分がホスホジエステルの骨格）は主に、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からのインターフェロン（ＩＦＮ）−αの産生を刺激する。Ｂ／ＫタイプＯＤＮ（すべてホスホロチオエートの骨格）は、Ｂ細胞とＩＬ−６の産生を活性化し、そして、ＣタイプＯＤＮは、ＩＦＮ−αとＩＬ−６の両方の産生を刺激し得るものの、ＣタイプＯＤＮによるＩＦＮ−α誘導は、Ａ／ＤタイプＯＤＮによるものよりも程度が低くなる。近年、別のＰタイプＯＤＮが登場した[非特許文献４]。このＰタイプＯＤＮ（すべてホスホロチオエートの骨格）は、ＣタイプＯＤＮと同様のサイトカインプロフィールを持つ２つのパリンドローム配列を含んでいるが、ＣタイプのＯＤＮよりも高いＩＦＮ−α産生を誘導する[非特許文献４]。【０００５】
多数の異なる免疫賦活化ＯＤＮが開発されているが、これらのＯＤＮの中で最も特徴的な違いは、そのＩＦＮ−α誘導プロフィールである。この意味において、Ａ／Ｄ（高ＩＦＮ−αプロフィール）およびＢ／Ｋ（低ＩＦＮ−α、高ＩＬ−６プロフィール）タイプのＯＤＮは、免疫賦活化ＯＤＮの２つの異なる典型的なプロトタイプと考えられる［非特許文献５]。近年のマイクロアレイ研究もまた、Ａ／ＤタイプＯＤＮとＢ／ＫタイプＯＤＮの間で、重複するが異なる遺伝子シグネチャーを確認した[非特許文献６]。Ａ／ＤタイプＯＤＮは主に、Ｉ型ＩＦＮの持続的な誘導によって特徴づけられたが、Ｂ／ＫタイプＯＤＮは、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のような細菌感染に対する抵抗性と有意に関連する多数の遺伝子を誘導した[非特許文献６]。これらのインビトロプロフィールの違いは、これらのＯＤＮをワクチンアジュバントまたは単剤免疫治療薬として利用する場合にインビボで観察される違いを反映するものであろう。マラリアワクチンの場合、Ｋ３（Ｂ／ＫタイプＯＤＮ）は、カニクイザルのＳＥ３６／ＡＨＧ免疫に加えた場合、抗体産生に関してＤ３５（Ａ／ＤタイプＯＤＮ）よりも良好なアジュバント性を示した[非特許文献７]。しかしながら、Ａ／ＤタイプＯＤＮは、アカゲザルにおいて、Ｂ／ＫタイプＯＤＮよりも良好な、熱殺菌されたリーシュマニア／ＡＨＧワクチンによる防御免疫反応を誘導した[非特許文献８]。同様に、リーシュマニア症に対する単剤治療薬として、Ａ／ＤタイプＯＤＮはまた、健康なアカゲザルとＳＩＶ感染したアカゲザルの両方のモデルにおいて、Ｂ／ＫタイプＯＤＮよりも良好な潜在能力を示した[非特許文献９]。興味深いことに、このモデルでは、Ｂ／ＫタイプＯＤＮの投与は、皮膚リーシュマニア症の病態を助長した[非特許文献９]。【０００６】
Ａ／ＤタイプＯＤＮによる強力なＩＦＮ−α誘導は、このタイプのＯＤＮのより高次の構造と密接に関係している。Ａ／ＤタイプＯＤＮのポリＧテイルは、塩溶液においてグアニン四重鎖のＤＮＡ構造を形成し、ナノ粒子／凝集体の形成をもたらす[非特許文献１０;非特許文献１１；非特許文献１２; 非特許文献１３]。同様に、ＩＦＮ−αを誘導するＰタイプのＯＤＮは、二量体構造または凝集体を形成した[非特許文献１４]。凝集体の形成がＡ／ＤタイプＯＤＮによる高いＩＦＮ−α産生に必須であることは繰り返し報告されており[非特許文献１２;非特許文献１３]、このことは、Ａ／ＤタイプＯＤＮの臨床応用の大きな障壁となっている。なぜなら、ＯＤＮ多量体化の自主的な発生は、無制御の凝集および沈降につながり、製品毎の大きな違いや投与の困難さをもたらすからである。このような問題を克服するため、Ａ／ＤタイプＯＤＮに熱分解性の保護基の導入が試みられている[非特許文献１５;非特許文献１６.]。この修飾により、投与前の生理食塩水における凝集体の形成が防がれるが、インビボ投与後には、保護基の温度依存性の切断により、グアニン四重鎖の形成が可能となる[非特許文献１５;非特許文献１６]。この熱分解性のプロＤタイプＯＤＮ戦略は、臨床応用可能なＡ／ＤタイプＯＤＮについての有望な方法であるが、その臨床応用の実現可能性を評価する必要がある。現在、ヒトでの臨床試験は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bode  Cら, (2011) Expert  Review  of  Vaccines  10: 499-511.
【非特許文献２】Vollmer  J, Krieg  AM (2009) Adv  Drug  Deliv  Rev  61: 195-204.
【非特許文献３】Klinman  DM (2004) Nat  Rev  Immunol  4: 249-258.
【非特許文献４】Samulowitz  Uら, (2010) Oligonucleotides  20: 93-101.
【非特許文献５】Verthelyi  Dら, (2001) J  Immunol  166: 2372-2377.
【非特許文献６】Steinhagen  Fら, (2012) Journal  of  Leukocyte  Biology  92:775-785.]
【非特許文献７】Steinhagen  Fら, (2012) Journal  of  Leukocyte  Biology  92:775-785.
【非特許文献８】Tougan  Tら, (2013) Human  Vaccines  &  Immunotherapeutics  9:283-290.
【非特許文献９】Verthelyi  Dら, (2003) J  Immunol  170: 4717-4723.
【非特許文献１０】Costa  LTら, (2004) Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  313:1065-1072.
【非特許文献１１】Klein  DCら, (2010) Ultramicroscopy  110: 689-693.
【非特許文献１２】Kerkmann  Mら, (2005) J  Biol  Chem  280: 8086-8093.
【非特許文献１３】Wu  CCら, (2004) J  Biol  Chem  279: 33071-33078.
【非特許文献１４】Samulowitz  Uら, (2010) Oligonucleotides  20: 93-101.]
【非特許文献１５】Puig  Mら, (2006) Nucleic  Acids  Res  34: 6488-6495.
【非特許文献１６】Grajkowski  Aら, (2005) Nucleic  Acids  Res  33: 3550-3560.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、本発明者らが、免疫賦活化オリゴヌクレオチドの代表例であるＤ３５を修飾することによって非凝集性のＡ／ＤタイプＯＤＮを開発し、その物理的性質および生物学的性質を検討することによって得た知見に基づいて完成させたものである。本発明はまた、本発明者らが、３’末端へのホスホロチオエートポリデオキシヌクレオチドの付加などのＤ３５の単純な修飾が、生理食塩水における凝集体の形成を強力に防ぐが、その高いＩＦＮ−α誘導特性は維持することを見出したという知見にも基づいて完成させたものである。【０００９】
詳細な例として、本発明者らは、Ｄタイプで最も活性が強いＣｐＧ−ＯＤＮの一つとして選択した代表例である、Ｄ３５のような免疫賦活化オリゴヌクレオチドを出発物質とした。Ｄ３５はＩＦＮ−α優先的誘導を示すが、生理食塩水などの塩溶液に溶解すると速やかに凝集を起し、半透明のゲル状になる。このため実際の医療用途には適さず改良が必要であることが本発明において見出された。そのため、本発明者らはさらに検討し、Ｄ３５の構造から３’末端側のｄＧ連続領域がゲル化に強く影響することを見出し、これらの情報から、本発明者らはｄＧを他の核酸に置き換えることに思い至り、改変体について活性を確認した。その結果、ｄＧ連続領域を他の核酸に置き換えることでゲル化を防ぐことはできたが、単独での細胞導入が出来なくなった。このことから、本発明者らは、Ｄタイプの核酸アジュバントはＩＦＮ−α産生誘導活性を持つユニットと細胞導入能を示すユニットにユニット分けをすることができるとの考えに至り、ゲル化要因となる細胞導入能ユニットを変更することでスクリーニングを進め、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下を提供する。
（１）ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤。
（２）前記核酸は、グアニンに起因する高次凝集体の形成を防ぐものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（３）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（４）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約３３％以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（５）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（６）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％より高い、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（７）前記核酸は、約５塩基長以上のものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（８）前記核酸は、約１００塩基長以下のものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（９）前記核酸は、約９〜約１００塩基長である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（１０）前記送達剤は、生物活性を有する部分と結合されている、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（１１）前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはＢ／Ｋ型、Ｃ型もしくはＰ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（１２）前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を有する、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（１３）前記生物活性を有する部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ）（配列番号２２）、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
（１４）Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤。
（１５）前記免疫賦活剤は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドにおいて、前記コア部分以外に由来する配列を含まない、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（１６）前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導活性および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導活性である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（１７）前記コア部分は、Ａ／Ｄ型の全長配列のうち、連続するＧを取り除いた部分である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（１８）前記コア部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（１９）前記コア部分は、細胞導入用のビヒクルに含まれる、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（２０）前記ビヒクルは、リポソームまたは項目１〜１３のいずれかに記載の送達剤である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（２１）免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチド。
（２２）前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２３）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２４）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約３３％以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２５）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２６）前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約５０％より高い、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２７）前記核酸は、５塩基長以上のものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２８）前記核酸は、約１００塩基長以下のものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（２９）前記核酸は、約９〜約１００塩基長である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（３０）前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはＢ／Ｋ型、Ｃ型もしくはＰ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（３１）前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、Ａ／Ｄ型であり、前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導活性および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導活性である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（３２）前記コア部分は、Ａ／Ｄ型のうち、連続するＧを取り除いた部分である、上記項目のいずれかのオリゴヌクレオチド。
（３３）前記コア部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（３４）上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活剤。
（３５）前記免疫賦活剤は、インターフェロン（ＩＦＮ）αおよび／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生誘導のためのものである、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
（３６）免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達において使用するためのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸。
（３７）項目２〜１３のいずれか１項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目３６に記載の核酸。
（３８）免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を送達するための方法であって、該方法は、該免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を項目１〜１３のいずれかに記載の送達剤またはホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸と直接または例えばスペーサー等を介して結合させて被験体に投与する工程を包含する、方法。
（３９）前記ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸は、項目１〜１３のいずれか１項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目３８に記載の方法。
（４０）被験体の免疫を賦活する方法であって、該方法は、有効量の項目１４〜２０、３４および３５のいずれかに記載の免疫賦活剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（４１）免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の製造における、項目２１〜３３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。  本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本明細書において説明されるように、本発明で示される結果は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０等に代表される本発明が、臨床応用のための薬物調製を簡単にするという利点を持つ、有望な非凝集性Ａ／ＤタイプＯＤＮのプロトタイプであるものと理解される。また、5’末端に付加してもＤ３５等の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの凝集は抑制されることが見いだされ医薬への応用が期待される。また、ＩＬ−６産生も予想外に増強され、この点でも、医薬への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、いくつかの異なるポリヌクレオチドテイル付加Ａ／ＤタイプＯＤＮを用いたヒトＰＢＭＣのスクリーニングを示す。ヒトＰＢＭＣを、示した合成ＯＤＮ（１μＭ）（表１）で２４時間刺激し、上清中のＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡにより測定した。（Ａ）ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン分泌に関するＣｐＧモチーフとグアニン六量体の必要性を示すグラフである。ＩＦＮ−αとＩＬ−６の両方が、ＣｐＧモチーフ依存性でかつ、グアニン六量体配列非依存性の様式で分泌された。（Ｂ）テイル骨格（ホスホロチオエートまたはホスホジエステル）の比較を示すグラフである。サイトカイン分泌は、ホスホロチオエート４０マーテイル（１，３，５）依存性であった。ホスホジエステル４０マーテイルを持つＯＤＮは、生物学的活性をほとんど示さなかった（２，４，６）。棒グラフは各刺激の単一ウェルからの濃度を示す。結果は、２人の異なるドナーから成る３つの異なる実験の代表例である（Ｅｘｐ−１とＥｘｐ−２、Ｅｘｐ−３とＥｘｐ−４）。
【図２】図２は、グアニン六量体非含有Ｄ３５  ＯＤＮが免疫賦活化活性にＤＯＴＡＰを必要とすることを示す。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ有またはＤＯＴＡＰ無しで、示した合成ＯＤＮ（１μＭ）で２４時間刺激し、上清中のＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡにより測定した。ＤＯＴＡＰは、グアニン六量体を含まないＡ／ＤタイプＯＤＮであるＤ３５Ａ、Ｄ３５ＴおよびＤ３５Ｃの免疫賦活化活性をレスキューした。これらのＯＤＮは、ＤＯＴＡＰ無しでは免疫賦活化活性を示さなかった。棒グラフは、各刺激の単一ウェルからのサイトカイン濃度を示す。
【図３】図３は、ＰＢＳ溶液中のポリヌクレオチドテイル付加Ａ／ＤタイプＯＤＮの物理的性質を示す。示したＯＤＮ溶液（各々ＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｍＬ）のＤＬＳ分析結果を（Ａ）％強度プロットまたは（Ｂ）％質量プロットにより示す。各測定結果については表２を参照のこと。（Ｃ）示したＯＤＮ溶液の濁りの状態を示す。示したＯＤＮをまず１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて蒸留水に溶解させ（すべてのＯＤＮが水に完全に溶解し、溶液は透明であった）、そしてさらに、ＰＢＳで１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。溶液を４℃にて少なくとも１８時間保存し、その後、撮影を行った。Ｄ３５は、このインキュベーション期間中に目に見える白濁を生じた。これに対し、他のＯＤＮは透明なままであった。（Ｄ）（Ｃ）と同様に調製したＰＢＳ中で凝集したＤ３５のＴＥＭ像を示す。
【図４】図４は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０とＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の生物学的活性を示す。（Ａ）示したＯＤＮによるヒトＰＢＭＣからの用量依存性のＩＦＮ−α産生を示す。（Ｂ）サイトカイン誘導活性に対する隣接配列の影響を示す。Ｄ３５ｃｏｒｅ＋ｄＡｓ４０は、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌を誘導するのに十分である。バーは、３回の実験からの平均±ＳＥＭを示す。（Ｃ）ｄＡｓテイルの長さが、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓタイプＯＤＮの生物学的活性に影響を及ぼすことを示す。ヒトＰＢＭＣを示したＯＤＮ（最終濃度１μＭ）で刺激し、２４時間後にサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。バーは、３回の実験からの平均±ＳＥＭを示す。（Ｄ）示したＯＤＮについてのテイルの長さとＯＤＮの用量の関係性を示す。棒グラフは、各刺激による単一のウェルからの用量依存性のＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生を示す。＊  ｐ＜０．０５，＊＊  ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は生理食塩水中に直接溶解するが、元のＤ３５は生理食塩水中に溶解しないことを示す。（Ａ）Ｋ３、Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０のＧＭＰグレードの凍結乾燥ＯＤＮバイアル（１０ｍｇ／バイアル）の写真を示す。白色物質が凍結乾燥した合成ＯＤＮである。（Ｂ）生理食塩水（１ｍＬ）を直接各バイアルに加えた。Ｋ３、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は５分以内に生理食塩水中に完全に溶解した。Ｄ３５は生理食塩水中には完全には溶解せず、多数の目に見えるゼラチン状の凝集物が形成され、そしてこの不溶性の状態は少なくとも１ヶ月間不変であった。
【図６】図６は、ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生に対する、Ｄ３５の５’末端および／または３’末端のｄＡｓ４０による修飾ならびにそのＳＰＧ化の効果を示す。ヒトＰＢＭＣを、ＯＤＮ（Ｄ３５−ｄＡｓ４０（配列番号１）、ｄＡｓ４０−Ｄ３５（配列番号７４）、Ｄ３５−ｄＡｓ４０−Ｄ３５（配列番号７５）；各々１μＭ）またはそのＳＰＧ化ＯＤＮ（Ｄ３５−ＳＰＧ、ＳＰＧ−Ｄ３５、Ｄ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５；各々１μＭのＯＤＮ量）あるいはＫ３（配列番号３０）またはＤ３５（配列番号３１）で刺激し、その２４時間後に、上清中のＩＦＮ−αおよびＩＬ−６分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。バーは３回の実験からの平均±ＳＥＭを示す。＊  ｐ＜０．０５，＊＊  ｐ＜０．０１，＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０およびＤ３５−ＳＰＧが、カニクイザルにおいてインフルエンザＳＶワクチンと共に用いた場合に良好なアジュバント性を有することを示す。（Ａ）免疫とアッセイのスケジュールを示す。６群のサル（ｎ＝２または３）を、示したアジュバント（各々４．７ｎｍｏｌ：Ｋ３，３０μｇ；Ｄ３５，３０μｇ；Ｄ３５−ｄＡｓ４０，９２μｇ；Ｄ３５−ＳＰＧ，Ｄ３５−ｄＡｓ４０の量として９２μｇ）と共に、あるいは、これら無しで、５００μＬの合計容量のＳＶワクチン（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９，５μｇ／頭）で、２週間間隔で２回皮下免疫した。（Ｂ）血清中の抗ＳＶ総ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定した。横軸は血清希釈倍率を示す。各線は、個々のサルを示す。（Ｃ）別の実験において、２群のサル（ｎ＝３）を、（Ａ）と同様にＤ３５（４．７ｎｍｏｌ＝３０μｇ）またはＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０（４．７ｎｍｏｌ＝８０μｇ）で免疫した、初回免疫から４週間後に、抗ＳＶ総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。バーは平均±ＳＥＭを示す。
【図８】図８は、ヒトＰＢＭＣにおけるＤタイプＣｐＧ  ＯＤＮのサイトカインプロフィールを示す。３人の日本人の成人ボランティアからのＰＢＭＣを、Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５−ＳＰＧまたは培地で刺激した。各グラフの各群は、左から、Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５−ＳＰＧ、培地を示す。各ＯＤＮは段階希釈した（０．７４、２．２、６．６または２０μｇ／ｍＬ）。２４時間後、上清中のサイトカイン濃度をＭｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカインアッセイキットにより測定した。
【図９】図９は、Ｔａｉｌの長さの免疫刺激活性への影響を調べたものである。ヒトＰＢＭＣを、図中に示された合成ＯＤＮ（１μＭ）を24時間にわたり刺激した。ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の上清における産生をＥＬＩＳＡにより試験した。図中の記号はそれぞれ以下のとおりである。1.D35core-dAs1（配列番号３５）；2.D35core-dAs2（配列番号３６）；3.D35core-dAs3（配列番号３７）；4. D35core-dAs4（配列番号３８）；5.D35core-dAs5（配列番号３９）；6.D35core-dAs6（配列番号４０）；7.D35core-dAs7（配列番号４１）；8. D35core-dAs8（配列番号４２）；9.D35core-dAs9（配列番号４３）；10.D35core-dAs10（配列番号４４）；11.D35core-dAs20（配列番号４５）；12.D35core-dAs60（配列番号４６）；13.D35core-dAs80（配列番号４７）；14. D35core-dAs100（配列番号４８）。D35coreは、tgcatcgatgca（配列番号２２）の配列を有し、D35core-dAs1はtgcatcgatgca^a（配列番号３５）の配列を有し、D35core-dAs2はtgcatcgatgca^a^a（配列番号３６）の配列を有する。このように、D35core-dAsN（Nは数字）は、順にD35coreの配列にホスホロチオエート結合で結合されたアデニンの個数を示す。したがって、D35core-dAs100はtgcatcgatgca[^a](100)（配列番号４８）（すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンが１００個D35coreに結合していることを意味する）。^はホスホロチオエート結合を意味する。
【図１０】図１０は、Ｔａｉｌ中のホスホロチオエートの量の免疫刺激活性に対する影響を調べたものである。ヒトＰＢＭＣを図中に示された合成ＯＤＮ（１μＭ）を24時間にわたり刺激した。ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の上清における産生をＥＬＩＳＡにより試験した。図中の記号は以下のとおりである。1.D35core-dAs40(S100%):D35core+[^a](40)（配列番号４９）（すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンが４０個D35coreに結合している）；2.D35core-dAs40(S50%)（すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンと通常の結合のアデニンのダイマーが２０個D35coreに結合している）:D35core+[^aa](20)（配列番号５０）；3.D35core-dAs40(S35%): D35core+[^aaa](12)+[^aaaa] （配列番号５１）（ホスホロチオエート結合を有するアデニン１つと通常の結合のアデニン２個のトリマーが１２個D35coreに結合し、さらにそれにホスホロチオエート結合を有するアデニン１つと通常の結合のアデニン３個のテトラマーが結合している）；4.D35core-dAs40(S25%):D35core+[^aaaa](10)（配列番号５２） （すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンと通常の結合のアデニン３個のテトラマーが１０個D35coreに結合している）；5.D35core-dAs40(S20%):D35core+[^aaaaa](8)（配列番号５３）（すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンと通常の結合のアデニン４個のペンタマーが８個D35coreに結合している）；6.D35core-dAs40(S15%):D35core+[^aaaaaaa](5)[^aaaaa](1)（配列番号５４）（すなわち、ホスホロチオエート結合を有するアデニンと通常の結合のアデニン６個のヘプタマーが５個D35coreに結合し、さらにそれにホスホロチオエート結合を有するアデニン１つと通常の結合のアデニン４個のペンタマー結合している）；D35coreはtgcatcgatgcaを有し、^はホスホロチオエート結合を意味する。
【図１１】図１１は、Ｔａｉｌ中のヌクレオシド組成の免疫刺激活性に対する影響を調べたものである。ヒトＰＢＭＣを図中に示された合成ＯＤＮ（１μＭ）を24時間にわたり刺激した。ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の上清における産生をＥＬＩＳＡにより試験した。特記するべきことに、Ｄ３５−ｄＮｓ４０（Ｎｏ．１０）は、ＩＦＮ−α産生を実質的に誘導しなかった。図中は、以下を示す1.D35-dNs40(A30%,T30%,C30%, G10%)；2. D35-dNs40(A27%, T27%, C27%, G19%)；3.D35-dNs40(A24%, T24%,C24%,G28%)；4. D35-dNs40(A20%, T20%, C20%, G40%)；5.D35-dNs40(A17%, T17%, C17%,G49%)；6.D35-dNs40(A14%, T14%, C14%, G58%)；7.D35-dNs40(A10%, T10%, C10%, G70%)；8.D35-dNs40(A7%,T7%,C7%,G79%)；9.D35-dNs40(A3%, T3%, C3%, G91%)；10. D35-dNs40: GsGTGCATCGATGCAGGGGsGsGs-Ns40（配列番号７２）。ｓはホスホロチオエート結合を示す。Ｎは任意のヌクレオチドを示す。なお、１〜９は、塩基の構成%のみを規定して個々の配列はランダムに作製したものであるため、具体的な配列は規定されない。
【図１２】図１２は、ｄＡｓ４０配列のＤ３５の５’末端への付加でもまた、ＰＢＳにおける大きな可視性凝集形成が防止されることを示す。示されるＯＤＮをまず、１０ｍｇ／ｍＬで蒸留水に溶解したところ、すべてのＯＤＮは水に完全に溶解し、溶液は明澄であった。そして、ＰＢＳで最終濃度１．０ｍｇ／ｍＬにさらに希釈した。溶液は４℃で少なくとも１８時間貯蔵し、次いで、画像を撮影した。Ｄ３５は、このインキュベーションにより可視性の白濁を生じた。対照的に、ｄＡｓ４０−Ｄ３５は、可視性の白濁は生じなかった。
【図１３】図１３は、凝集の様子を示すものである。左パネルはＡ２２１６、右パネルはＡ２３３６を示す。左パネルの左上は、Ａ２２１６自体であり、生理食塩水に溶解した様子を右上、左下、右下に示す。右上が４℃、左下が室温、右下が３７℃を示す。右パネルもまた、上はＡ２３３６であり、生理食塩水に室温で溶解したものを示す。A2216は直接生理食塩水に溶解(10mg/mL)させることは可能だが、非常に粘性の高い溶液となり、４℃の場合はゲル化している。３７℃ではゾル状となる(粘度は高いが流動性は保たれる)。A2336は直接生食に溶解させることはできないことを示す。
【図１４】図１４は、他の型のＣｐＧ  ＯＤＮのｄＡｓ４０付加による免疫刺激活性に対する影響を調べたものである。ｄＡｓ４０を他の型のＣｐＧ  ＯＤＮ（Ａ型、Ｂ型およびＰ型のＯＤＮ）への付加でもまた免疫刺激活性にＤ３５と同様に影響を与えることが理解される。上段はそれぞれ、IFN-αの放出実験結果を示し、下段はそれぞれ、IL-6の放出実験を示す。左欄（Exp-15）および右欄（Exp-16）はそれぞれ異なる実験を示す。それぞれ左からA2216、A2216core、A2336、A2336core、B2006（PS）、B2006(PO)、C2395（PS）、C2395(PO)、P21889(PS)、P21889(PO)にdAs40をそれぞれ結合させたもの（ｄAs40が結合したものは、それぞれ配列番号７６〜８５）を試験した結果である。右端は、コントロールとしてなにも入れない例を示す。
【図１５】図１５は、上段として、図１３と同様に凝集の様子を示すものである。いずれもA2216-dAs40（左）およびA2336-dAs40（右）（いずれも0.5mg/バイアル）が容易にかつ完全に、50μLの生理食塩水に常温で溶解することを示す（上段が凍結乾燥後、下が溶解時）。下段は、各々の型のＣｐＧ  ＯＤＮのｄＡｓ４０付加による免疫刺激活性に対する影響を調べた実験（ヒトPBMCをそれぞれのオリゴヌクレオチドで24時間刺激した（1μM）結果をELISAで上清におけるIFN-αおよびIL-6の産生を調べた結果を示す。）である。A2216、A2336、D35およびそれらのdAs40結合体、K3等との対比も示している。バーは平均±SEMを示す。上段はそれぞれ、IFN-αの放出実験結果を示し、下段はそれぞれ、IL-6の放出実験を示す。左欄（Exp-15A）および右欄（Exp-16A）はそれぞれ異なる実験を示す。左からそれぞれA2216、A2216-ｄAs40、A2216core-dAs40、A2336、A2336-dAs40、A2336core-dAs40、D35、D35-dAs40、D35core-dAs40を示し、右端はK3、右から2番目はコントロール（何も加えない）を示す。
【図１６】図１６は、D35（ｓが５’末端に１個結合している）と類似の構造であるが、ｓの数が異なるD35β（ｓが５’末端に２個結合している）とが凝集やIFN-α、IL-6の刺激と同様の挙動を示すことを確認した実験結果である。Aは、D３５βの凍結乾燥時（左）および生理食塩水で常温で溶解した場合の様子を示す。Bは、左欄がドナーA、右欄がドナーBで行った、ヒトIFN-α（上段；ｐｇ／ｍＬ）、ヒトIL-6（下段；ｐｇ／ｍＬ）での刺激実験の結果である。各グラフは左半分（６件）はＤ３５、右半分（６件）はＤ３５βを示し、各濃度を示している。左から０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、９μＭをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤、免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤、ならびに生物活性を有するコア部分と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明は、概して、核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐことによって、送達剤としての機能を増強するものである。また、免疫賦活化オリゴヌクレオチドとして知られているものは、活性発揮に重要なコア部分（Ｃｏｒｅ）が存在することを見出し、これを含む免疫賦活剤を製造することができることを見出し、かかる免疫賦活剤を提供するものである。そして、本発明は、このようなＣｏｒｅ配列を含む免疫賦活剤と本発明の送達剤とを組み合わせたオリゴヌクレオチドをも提供するものである。
【００１４】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１５】
本明細書において「免疫賦活化オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドのうち、免疫賦活化能力を有するものをいう。代表的な、免疫賦活化オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド（残基）」は、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（残基）」、「ＣｐＧ  ＯＤＮ（残基）」あるいは単に「ＣｐＧ（残基）」と交換可能に使用され、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、好ましくは、オリゴヌクレオチドをいい、末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義である。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのメチル化されていないジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸（残基）は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
【００１６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性のＣｐＧモチーフを含有する、短い（約２０塩基対）、一本鎖の合成ＤＮＡ断片であって、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（ＤＣｓ）およびＢ細胞を活性化して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）および炎症性サイトカインを産生させ（Hemmi，  H．，  et  al．  Nature  408，  740-745  （2000）;Krieg，  A.M．  Nature  reviews．  Drug  discovery  5，  471-484  （2006）．）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含む、Ｔｈ１型の液性および細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（Brazolot  Millan，  C.L．，  Weeratna，  R．，  Krieg，  A.M．，  Siegrist，  C.A.  ＆  Davis，  H．L．  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  95，  15553-15558  （1998）．;Chu，  R．S.，  Targoni，  O．S.，  Krieg，  A.M．，  Lehmann，  P．V．  ＆  Harding，  C.V．  The  Journal  of  experimental  medicine  186，  1623-1631  （1997））。そこで、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症、癌、喘息および花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（Krieg，  A.M．  Nature  reviews．  Drug  discovery  5，  471-484  （2006）;Klinman，  D．M．  Nature  reviews．  Immunology  4，  249-258  （2004））。
【００１７】
ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する一本鎖ＤＮＡであり、ＴＬＲ９のアゴニストである。ＣｐＧ  ＯＤＮには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、Ｋ型（Ｂ型とも呼ばれる）、Ｄ型（Ａ型とも呼ばれる）、Ｃ型及びＰ型の４つの型がある（Advanced  drug  delivery  reviews  61，  195-204  （2009））。好ましい実施形態では、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、これらのうちＤ型（Ａ型とも呼ばれるため、Ａ／Ｄ型とも称される）ＣｐＧ  ＯＤＮを含む。
【００１８】
免疫賦活化ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、１０年以上にわたって、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９依存性自然免疫活性化因子およびワクチンアジュバントとして開発および利用されてきた。免疫賦活化ＣｐＧ  ＯＤＮの４種類の異なるタイプ（Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｋ、ＣおよびＰタイプ）が報告されている。Ａ／ＤタイプＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からの高いインターフェロン（ＩＦＮ）−α産生によって特徴付けられる。Ｂ／ＫタイプＯＤＮは主に、インターロイキン（ＩＬ）−６やＩＬ−１２などの炎症性サイトカインを誘導するが、ＩＦＮ−αの産生は低い。Ｂ／ＫタイプのＯＤＮは、生理食塩水を用いて容易に製剤化され、その一部は臨床試験中である。これに対し、Ａ／ＤタイプＯＤＮは、高いＩＦＮ−αプロフィールと密接に関連した凝集体を内因性に形成し、その医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）を満たす製品の調製や臨床応用を妨げている。本願において、本発明者らは、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイル（例えば、ｄＡｓ４０）の付加による修飾を施したいくつかのＤ３５由来のＯＤＮ（一般にＡ／ＤタイプＯＤＮとして使用されるもの）を開発し、その物理的性質、生理食塩水における溶解性、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する免疫賦活化活性、および、サルにおけるワクチンアジュバント潜在能力を検討した。本発明者らはまた、シゾフィランとのその複合体形成についても検討した。本発明者らは、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０を含む２つの修飾ＯＤＮが、ヒトのＰＢＭＣにおいて元のＤ３５と同様に免疫賦活性であり、用量依存性の様式で高いＩＦＮ−α分泌をもたらすことを見出した。さらに、動的光散乱法による物性分析から、Ｄ３５−ｄＡｓ４０とＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の両方が、生理食塩水中で凝集体を形成しないことが明らかになったが、このような性質は、元のＤ３５では現在不可能なものである。
【００１９】
Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、典型的には非回文構造の、複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有し、Ｂ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させるが、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）のＩＦＮ−α産生をほとんど誘導しないという構造的及び機能的特性を有するＣｐＧ  ＯＤＮである。非メチル化ＣｐＧモチーフとは少なくとも１つのシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）配列を含む短いヌクレオチド配列であって、該シトシン−グアニン配列におけるシトシンの５位がメチル化されていないものを差す。なお、以下の説明において、ＣｐＧとは、特にことわらなり限り非メチル化ＣｐＧを意味する。従って、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮを含むことにより、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を有する。当該分野において多数のヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮが知られている（Journal  of  immunology  166,  2372-2377  (2001)；Journal  of  immunology  164,  944-953  (2000)；US  8,  030,  285  B2）。
【００２０】
Ｄ／Ａ型は主に形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ，「形質細胞様ＤＣ」または「ｐＤＣ」とも称する）からのＩ型インターフェロンの産生，Ｋ／Ｂ型はＢ細胞の増殖とＩｇＭやＩＬ−６などの産生をそれぞれ誘導することが示唆されている。Ｄ／Ａ型のＣｐＧ−ＤＮＡはＩＦＮ−α産生を強く誘導するが，ｐＤＣの成熟化誘導活性は低く，Ｂ細胞に直接的な免疫刺激活性を示さない。Ｋ／Ｂ型はＢ細胞に免疫刺激活性を示し，ｐＤＣの成熟化を強く促進し，ＩＬ−１２誘導能が高いのに対し，ＩＦＮ−α誘導能は低い。ＴＣＧの繰り返し配列を有しすべてがチオール化されているＣ型の配列では，ポリクローナルなＢ細胞活性化やｐＤＣによるＩＦＮ−α産生を誘導する。
【００２１】
Ｄ／Ａ型  ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ａ型、Ｄ型等とも呼ばれ、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮとも表示される）は、５’および３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、およびホスホジエステル（ＰＯ）のパリンドローム（回文構造）ＣｐＧ含有配列を中心に有するポリＧモチーフを特徴とするオリゴヌクレオチドである。５’および３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）の存在故、細胞取り込みが容易になるとされる。ＣｐＧ  Ｄ／Ａ型は、大量のインターフェロンα（ＩＦＮ−α）をｐＤＣ中に産生する（ＣｐＧ  Ｋ／Ｂ型とは異なる特徴である）。これにより、ＮＫ細胞およびγδＴ細胞において強力な活性化およびインターフェロンガンマ産生を生じる。しかし、Ｂ細胞は活性化せず、ｐＤＣ成熟化もしない（Krug，  A.，  et  al．  European  journal  of  immunology  31，  2154-2163  （2001）．;及びVerthelyi，  D．，  Ishii，  K．J．，  Gursel，  M．，  Takeshita，  F．  ＆  Klinman，  D．M．  Journal  of  immunology  166，  2372-2377  （2001）．）。
【００２２】
他の３つの型のＯＤＮは、ＰＳ骨格からなる。
【００２３】
Ｋ／Ｂ型  ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＣｐＧ−Ｂ型またはＣｐＧ−Ｋ型とも呼ばれ、ポリＧモチーフがない、１つ以上のＣｐＧモチーフを有するすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有するものである。典型的には、非回文構造の、複数のＣｐＧモチーフを含有する。Ｋ／Ｂ型  ＣｐＧはＩＦＮ−αの誘導活性は弱い（ほとんど産生しない）が、非常に強力なＴｈ１アジュバントであり、強力なＢ細胞応答刺激剤であり、活性化してＩＬ−６を産生させ、ｐＤＣｓを活性化して成熟化させる（Verthelyi，  D．，  Ishii，  K．J．，  Gursel，  M．，  Takeshita，  F．  ＆  Klinman，  D．M．  Journal  of  immunology  166，  2372-2377  （2001）；およびHartmann，  G．  ＆  Krieg，  A.M．  Journal  of  immunology  164，  944-953  （2000）．）。Ｋ／Ｂ型  ＣｐＧ  ＯＤＮは、単球由来樹状細胞およびｐＤＣの両方の生存を促進し、活性化し、そして成熟させる機能を有する。
【００２４】
近年、開発されたＣ型およびＰ型のＣｐＧ  ＯＤＮはそれぞれ１つおよび２つの回文構造ＣｐＧ配列を含有しており、双方ともＫ型の様にＢ細胞を活性化させ、Ｄ型の様にｐＤＣｓを活性化させることができるが、Ｐ型ＣｐＧ  ＯＤＮと比較して、Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＩＦＮ−α産生をより弱く誘導する（Hartmann，  G．，  et  al．  European  journal  of  immunology  33，  1633-1641  （2003）;Marshall，  J．D．，  et  al．  Journal  of  leukocyte  biology  73，  781-792  （2003）．;およびSamulowitz，  U．，  et  al．  Oligonucleotides  20，  93-101  (2010)）。
【００２５】
Ｄ／Ｋ型およびＰ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｇ−ｔｅｔｒａｄｓと呼ばれる平行４本鎖構造を形成するフーグスティーン塩基対、およびシス回文構造部位とトランス回文構造部位との間のワトソン−クリック塩基対、という高次構造をそれぞれ形成することが示されており、これらはｐＤＣｓによる強力なＩＦＮ−α産生に必要である（Samulowitz，  U．，  et  al．  Oligonucleotides  20，  93-101  (2010)．;Kerkmann，  M．，  et  al．  The  Journal  of  biologyical  chemistry  280，  8086-8093  （2005）．；およびKlein，  D．C．，  Latz，  E．，  Espevik，  T．  ＆  Stokke，  B．T．  Ultramicroscopy  110，  689-693  （2010））。高次構造故、Ｋ型およびＣ型ＣｐＧ  ＯＤＮのみが、ヒト用の免疫療法剤およびワクチンアジュバントとして一般的に利用可能であるとされている（Puig，  M．，  et  al．  Nucleic  acids  research  34，  6488-6495  （2006）;  Bode，  C．，  Zhao，  G．，  Steinhagen，  F．，  Kinjo，  T．  ＆  Klinman，  D．M．  Expert  review  of  vaccines  10，  499-511  （2011）;及びMcHutchison，  J．G．，  et  al．  Hepatology  46，  1341-1349  （2007））。
【００２６】
Ａ型  ＣｐＧ  ＯＤＮとは対照的に、Ｃ型ＣｐＧは、ポリＧモチーフがない完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有するが、刺激性ＣｐＧモチーフと組み合わせて、ＣｐＧのＡ型パリンドローム配列を含むものである。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、非常に強力なＴｈ１アジュバントであることが報告されている。
【００２７】
本明細書で使用されるＤ３５オリゴヌクレオチドは、コア部分にＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２）を含む。
【００２８】
本明細書で使用される他のオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６））を持つオリゴヌクレオチド、Ａ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））を持つオリゴヌクレオチド、Ｂ２００６の全長（配列番号６０）を持つオリゴヌクレオチド、Ｃ２３９５の全長（配列番号６２）を持つオリゴヌクレオチド、Ｐ２１８８９の全長（配列番号６４）を持つオリゴヌクレオチドなどを含む。
【００２９】
ＣｐＧ  ＯＤＮと送達剤として使用される核酸とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、２つの近接した構成要素の間に挿入される１以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を意味する。スペーサー配列の長さは、本発明では、免疫賦活活性（好ましくはＢ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させる活性、および／または樹状細胞を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常１〜１０ヌクレオチド長、好ましくは１〜５ヌクレオチド長、ある実施形態では１〜３ヌクレオチド長である。スペーサーとしてはＣ３、Ｃ６、Ｃ１２、Ｓ９、Ｓ１８、ｄＳｐａｃｅｒなど核酸合成で組み込めるものが挙げられる。ここで、Ｃは任意の炭素鎖、Ｓはエチレングリコール鎖,ｄＳｐａｃｅｒは塩基が付いていないリボースのみの骨格を示し、各数字は炭化水素もしくはエチレングリコールの重合度を示す。さらに別の実施形態では、少なくとも1以上のヌクレオチドもしくはエチレングリコールもしくは炭化水素が挙げられる。別の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮと送達剤とが、直接共有結合により連結される。
【００３０】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
【００３１】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、アレルギー）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
【００３３】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なおがん、アレルギー等の治療薬は、がん、アレルギー等の予防のために用いられる薬物（予防薬）、またはがん、アレルギー等の抑制剤を含む。
【００３４】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、アレルギー等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【００３５】
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００３６】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００３７】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package  insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００３８】
（医薬品、剤型等）
本発明は、上記種々の形態の医薬（治療薬または予防薬）として提供される。
【００３９】
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。本発明の成分を投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、またはNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。
【００４０】
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E．W．Martin,  Remington’s  Pharmaceutical  Sciences(Mark  Publishing  Company,  Easton,  U.S.A）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Berge  et  al.,  J.  Pharm.  Sci.,  1977,  66,  1-19に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、J.  Honig  et  al.,  The  Van  Nostrand  Chemist’s  Dictionary  P650  (1953)を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、PEGもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。
【００４２】
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位（例えば、食道）に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（bolus）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明ががんに使用される場合、さらに、がん（病変部）に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
【００４３】
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【００４４】
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００４５】
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、in  vitroアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.001、1、5、10、15、100、または1000mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1、7、14、21、または28日あたりに1または2回投与してもよく、それらいずれか2つの値の範囲あたりに1または2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、in  vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００４６】
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の1種以上）を含む。
【００４７】
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の1以上の成分が充填された、1以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の成分を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の種々の実施形態において、このような組成物を用いて、本発明の成分の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
【００５０】
本発明の治療薬、予防薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
【００５１】
（好ましい実施形態の態様）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００５２】
＜免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤（デリバリー剤）＞
本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤（本明細書において、その各実施形態を含め「本発明の送達剤」とも称する。）を提供する。したがって、本発明はまた、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を送達するための方法であって、該方法は、上記免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む送達剤またはホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸と直接または例えばスペーサー等を介して結合させて被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面は、Ｔａｉｌユニットのみに着目したものである。このような核酸は、本明細書において「Ｔａｉｌ核酸」ともいうことがある。１つの実施形態では、前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである。しかしながら、代表的なＣｐＧであるＤ３５についてみると、グアニンを他の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ等）に変更するとＧをＡ、Ｔ、Ｃに変更すると核酸単独での細胞導入が不可能になるため、医薬としての利用に限界があることが示された。そこで、Ｃｏｒｅ（コア）配列を抽出したところ、Ｃｏｒｅ配列のみでＩＦＮ−α産生誘導活性があることが示されていることから、これを効率的に細胞導入することができれば、有用な医薬になる。リポソーム化が従来技術であったが、煩雑な技術であったことから、簡便な技術の提供が待たれていた。また、Ｃｏｒｅ配列を用いた場合に送達がうまくできないという現象が観察されていた。これらからコア配列のみでは、送達が十分にできないため、せっかくの薬効が発揮されないという問題もあった。そこで、本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を提供することによって、送達を防止する現象を防ぎ、自己導入能を示すＴａｉｌユニットが提供され、送達ないし細胞導入が可能となり、有効なＩＦＮ−α活性を提供するＣｐＧ  ＯＤＮユニットを提供することができた。ここで、単剤で細胞に導入され、IFN-α産生能を得るためにはTailの部分におけるホスホロチオエート化が有利なことが判明した。このように、Ａ／Ｄタイプの核酸アジュバントが活性本体と細胞導入の２つのユニットに分かれるという着想はこれまでに知られておらず、本発明における一つの特徴であるといえる。また、本発明では、構造活性相関試験を行い、どのパラメータがどのように活性に影響を与えるかが理解され、最適化が可能である。
【００５３】
本発明では、直鎖核酸が結合されたIFN-α産生誘導型核酸アジュバントが提供される。送達を防止する現象またはゲル化を防ぐためのTail核酸は種類を問わないものの一定程度の長さが有利なことが分かった。したがって、本発明の核酸は送達を防止する現象またはゲル化が低減されているかまたは消失しているものであり、それゆえ、理論に束縛されることを望まないが、塩溶液中でゲル化しない点から、注射投与可能な性質が付与される。したがって、理論に束縛されることを望まないが、がん、感染症ワクチンの新規アジュバントまたはその増強剤として使用することができ、また、ＩＦＮ−α補充療法の置き換えまたはその増強剤として用いることができる。また、単剤で免疫調節薬またはその増強剤として提供し得る可能性があることからＬｅｉｓｈｍａｎｉａ等の治療薬に応用することもできる。
【００５４】
このような送達の実現または増強のためには、１つの要件としては、グアニンに起因する高次凝集体の形成防止を実現することが挙げられる。理論に束縛されることを望まないが、高次凝集体の形成が防止されることによって、例えば、マルチマー形成は阻害しないが、それがランダムに発生した際に生じる高次凝集体形成が阻害されることによって、本発明の送達剤によって送達が容易化されるものと考えられる。
【００５５】
本発明において、送達の実現または増強のための因子としては、ホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の送達剤において、前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上または約２５％より高いことが有利であり、好ましくは、約３５％以上または約３５％より高いことが有利であり、さらに好ましくは、約５０％以上または約５０％より高いことが有利であり得る。含有率のほか、含有される位置も考慮され得る。理論に束縛されることを望まないが、ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、末端側に配置されることが有利であり得る。理論に束縛されることを望まないが、末端側に配置されると必要とされる含有率が少なくてよいと考えられる。これらの範囲については、インターフェロンαおよびインターロイキン６に対する効果が各含有率によって少しずれがあることから、当業者は、目的とする効果を考慮して最適な範囲を決定することもできる。
【００５６】
１つの実施形態において、ホスホロチオエートは、５’末端に結合した形態のものが好ましくあり得るが、必ずしも本発明はこれに限定されない。このような５’末端に結合した形態では、その５‘末端のホスホロチオエートの数は限定されず、例えば、実施例において1個でも2個でもよいことが実証されている。
【００５７】
さらなる実施形態では、前記核酸は、特定の長さであることが有利であり得、通常５塩基長以上の長さが有利であり得る。塩基長については、例えば、本発明で使用される核酸の下限として、約５塩基長以上、約６塩基長以上、約７塩基長以上、約８塩基長以上、約９塩基長以上、約１０塩基長以上、約１５塩基長以上、約２０塩基長以上、約２５塩基長以上、約３０塩基長以上、約３５塩基長以上、約４０塩基長以上、約４５塩基長以上、約５０塩基長以上、約５５塩基長以上、約６０塩基長以上であってもよい。１００塩基でも活性がみられていることから、本発明で使用される核酸の塩基長の上限としては特に制限されることはないが、約１００塩基で少し活性の低下がみられることから、好ましい実施形態では、約１５０塩基以下、約１４０塩基以下、約１３０塩基以下、約１２０塩基以下、約１１０塩基以下、約１００塩基以下、約９５塩基以下、約９０塩基以下、約８５塩基以下、約８０塩基以下であってもよい。これらの上限および下限は、任意に組み合わせることができるが、好ましい例としては、例えば、約５〜１００塩基長、約６〜１００塩基長、約７〜１００塩基長、約８〜１００塩基長、約９〜１００塩基長、約１０〜約１００塩基長、約２０〜約８０塩基長、約４０〜約８０塩基長、約２０〜約６０塩基長、等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５８】
１つの要件としては、グアニンに起因する高次凝集体の形成防止を実現することが好ましく、これを実現するための条件としては、含有率、連続グアニンがないまたは少ないこと等が挙げられる。例えば、本発明の送達剤において、１つの実施形態では、前記核酸のグアニンの含有率は、６０％未満でもよいが、６０％以上、あるいは７０％以上、あるいは８０％以上が好ましいがこれらに限定されない。あるいは別の実施形態では、本発明の前記核酸は、グアニンが３つ以上連続した部分を有しないものである。これらの特徴は組み合わせてもよい。また、これらの特徴については、インターフェロンαおよびインターロイキン６に対する効果が各形態によって少しずれがあることから、当業者は、目的とする効果を考慮して最適な範囲を決定することもできる。
【００５９】
１つの実施形態では、本発明の送達剤は、生物活性を有する部分と結合されている。結合されることによって、単剤として使用することが可能である。
【００６０】
生物活性を有する部分は、生物活性、例えば、医薬としての活性を有するものであれば、どのようなものでもよいが、代表的にはオリゴヌクレオチド等の核酸を含む部分であり得る。本発明の送達剤が核酸をもとに構成されているため、単剤として提供することに統一性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）があるからである。
【００６１】
１つの代表的な実施形態では、本発明の送達剤に結合される前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア（Ｃｏｒｅ）部分もしくは全長、Ｂ／Ｋ型、Ｃ型またはＤ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を有する。
【００６２】
１つの具体的実施形態では、本発明の送達剤に結合される前記生物活性を有する部分は、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を有する。理論に束縛されることを望まないが、Ａ／Ｄ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドは凝集する傾向があり、凝集することによってむしろ薬効が向上すると考えられている型のＣｐＧであることから、特に凝集しないようにする工夫は考慮されていなかった。したがって、本発明における工夫はむしろ反対の方向を示すものとして評価されるべきものである。
【００６３】
別の具体的な実施形態としては、本発明において使用され得る前記生物活性を有する部分は、
Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６）、
Ａ２２１６の全長部分（ｇｇｇｇＧＡＣＧＡ：ＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇｇ（配列番号６５）；大文字はコア部分を示す。）
Ａ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））、
Ａ２３３６の全長部分（ｇｇｇｇＡＣＧＡＣ：ＧＴＣＧＴｇｇｇｇｇｇｇ（配列番号６６）；大文字はコア部分を示す。）
Ｂ２００６の全長（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ配列番号６０）、
Ｃ２３９５の全長（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６２））、
Ｐ２１８８９の全長（ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６４））、
ＣＰＧ  ７９０９：ＴｓＣｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴ（配列番号６７；Ｂ／Ｋ型）
ＰＦ−３５１２６７６：ＴｓＣｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴ（配列番号６８；Ｂ／Ｋ型）
ＣＹＴ００３−ＱＢＧ１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号６９；Ａ／Ｄ型）
１０１８  ＩＳＳ：ＴｓＧｓＡｓＣｓＴｓＧｓＴｓＧｓＡｓＡｓＣｓＧｓＴｓＴｓＣｓＧｓＡｓＧｓＡｓＴｓＧｓＡ（配列番号７０；Ｂ／Ｋ型）
Ｋａｐｐａｐｒｏｃｔ  （ＤＩＭＳ  ０１５０）：ＧｓＧｓＡｓＡＣＡＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴｓＧｓＧｓＣ（配列番号７１；Ａ／Ｄ型）
を含むがこれらに限定されない（ｓはホスホロチオエート結合を意味する）。
【００６４】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ナトリウム塩（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等）を含む溶液中に存在するものであり得る。理論に束縛されることを望まないが、Ａ／Ｄ型のコア配列としたときに見られる送達ができなくなるという事象は、ナトリウム塩の水溶液に溶解したときに、特に強く観察される事象であり、通常使用される生理食塩水等での問題を解決することができるからである。
【００６５】
＜コア配列に注目した「生物活性剤」＞
１つの局面において、本発明はＡ／Ｄ型、Ｂ／Ｋ型、Ｃ型またはＤ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤（本明細書において、その各実施形態を含め「本発明の免疫賦活剤」ということがある。）を提供する。理論に束縛されることを望まないが、コア部分のみで、免疫賦活化でき、ＩＦＮ−α産生誘導活性および／またはインターロイキン６産生誘導活性があることが見出されたことから、本発明は、設計範囲が広い、免疫賦活剤を提供することができる。したがって、本発明はまた、被験体の免疫を賦活する方法であって、該方法は、Ａ／Ｄ型、Ｂ／Ｋ型、Ｃ型またはＤ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む免疫賦活剤の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００６６】
本明細書において「コア部分」とはＣｐＧ配列を含んだパリンドロームをなす６ｂｐ以上の配列をいう。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明の免疫賦活剤において使用される前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、Ａ／Ｄ型であり、前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導活性および／またはインターロイキン６産生誘導活性である。
【００６８】
より好ましい実施形態では、本発明の免疫賦活剤において使用される前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドの前記コア部分は、Ａ／Ｄ型のうち、連続するＧを取り除いた部分であり、好ましくは、端にあるＧをすべて取り除いてもよく、１つＧが残っていてもよい。
【００６９】
さらに別の実施形態では、本発明の免疫賦活剤において使用される前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドの前記コア部分は、Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６）またはＡ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８）等を含む。
【００７０】
１つの実施形態では、本発明で用いられる前記コア部分は、細胞導入用のビヒクルに含まれる。細胞導入用ビヒクルとしてはどのようなものを用いてもよいが、例えば、前記ビヒクルは、リポソームまたは本発明の送達剤であってもよい。
【００７１】
＜免役賦活化オリゴヌクレオチド全体に着目した「改良型核酸医薬」＞
さらなる局面において、本発明は、免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチド（本明細書において「本発明のオリゴヌクレオチド」ということがある）を提供する。
【００７２】
この局面において使用されるホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸は、（免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤（デリバリー剤）において説明した任意の実施形態を用いることができることが理解される。
【００７３】
１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記核酸は、グアニンに起因する高次凝集体の形成を防ぐものである。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、送達の実現または増強のための因子としては、ホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の送達剤において、前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約２５％以上または約２５％より高いことが有利であり、好ましくは、約３５％以上または約３５％より高いことが有利であり、さらに好ましくは、約５０％以上または約５０％より高いことが有利であり得る。含有率のほか、含有される位置も考慮され得る。理論に束縛されることを望まないが、ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、末端側に配置されることが有利であり得る。理論に束縛されることを望まないが、末端側に配置されると必要とされる含有率が少なくてよいと考えられる。これらの範囲については、インターフェロンαおよびインターロイキン６に対する効果が各含有率によって少しずれがあることから、当業者は、目的とする効果を考慮して最適な範囲を決定することもできる。
【００７５】
さらに別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記核酸は、特定の長さであることが有利であり得、通常５塩基長以上の長さが有利であり得る。塩基長については、例えば、本発明で使用される核酸の下限として、約５塩基長以上、約６塩基長以上、約７塩基長以上、約８塩基長以上、約９塩基長以上、約１０塩基長以上、約１５塩基長以上、約２０塩基長以上、約２５塩基長以上、約３０塩基長以上、約３５塩基長以上、約４０塩基長以上、約４５塩基長以上、約５０塩基長以上、約５５塩基長以上、約６０塩基長以上であってもよい。１００塩基でも活性がみられていることから、本発明で使用される核酸の塩基長の上限としては特に制限されることはないが、約１００塩基で少し活性の低下がみられることから、好ましい実施形態では、約１５０塩基以下、約１４０塩基以下、約１３０塩基以下、約１２０塩基以下、約１１０塩基以下、約１００塩基以下、約９５塩基以下、約９０塩基以下、約８５塩基以下、約８０塩基以下であってもよい。これらの上限および下限は、任意に組み合わせることができるが、好ましい例としては、例えば、約５〜約１００塩基長、約６〜約１００塩基長、約７〜約１００塩基長、約８〜約１００塩基長、約９〜約１００塩基長、約１０〜約１００塩基長、約２０〜約８０塩基長、約４０〜約８０塩基長、約２０〜約６０塩基長等であるがこれらに限定されない。これらの範囲については、インターフェロンαおよびインターロイキン６に対する効果が各長さによって少しずれがあることから、当業者は、目的とする効果を考慮して最適な範囲を決定することもできる。
【００７６】
さらに別の実施形態では、グアニンに起因する高次凝集体の形成防止を実現することが好ましく、これを実現するための条件としては、含有率、連続グアニンがないまたは少ないこと等が挙げられる。例えば、本発明の送達剤において、１つの実施形態では、前記核酸のグアニンの含有率は、６０％未満でもよいが、６０％以上、あるいは７０％以上、あるいは８０％以上が好ましいがこれらに限定されない。あるいは別の実施形態では、本発明の前記核酸は、グアニンが３つ以上連続した部分を有しないものである。これらの特徴は組み合わせてもよい。また、これらの特徴については、インターフェロンαおよびインターロイキン６に対する効果が各形態によって少しずれがあることから、当業者は、目的とする効果を考慮して最適な範囲を決定することもできる。
【００７７】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記生物活性を有するコア部分は、Ａ／Ｄ型、Ｂ／Ｋ型またはＣ型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドのものである。
【００７８】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、Ａ／Ｄ型であり、前記生物活性はインターフェロン（ＩＦＮ）α誘導もしくは増強活性および／またはインターロイキン−６誘導もしくは増強活性である。
【００７９】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記コア部分は、Ａ／Ｄ型のうち、連続するＧを取り除いた部分であり、好ましくは、端にあるＧをすべて取り除いてもよく、１つＧが残っていてもよい。
【００８０】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前記コア部分は、
Ｄ３５オリゴヌクレオチドのコア部分（ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡ（配列番号２２））、
Ａ２２１６のコア部分（ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号５６）、
Ａ２２１６の全長部分（ｇｇｇｇＧＡＣＧＡ：ＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇｇ（配列番号６５）；大文字はコア部分を示す。）
Ａ２３３６のコア部分（ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号５８））、
Ａ２３３６の全長部分（ｇｇｇｇＡＣＧＡＣ：ＧＴＣＧＴｇｇｇｇｇｇｇ（配列番号６６）；大文字はコア部分を示す。）
Ｂ２００６の全長（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ配列番号６０）、
Ｃ２３９５の全長（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６２））、
Ｐ２１８８９の全長（ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６４））、
ＣＰＧ  ７９０９：ＴｓＣｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴ（配列番号６７）
ＰＦ−３５１２６７６：ＴｓＣｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴｓＴｓＴｓＧｓＴｓＣｓＧｓＴｓＴ（配列番号６８）
ＣＹＴ００３−ＱＢＧ１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号６９）
１０１８  ＩＳＳ：ＴｓＧｓＡｓＣｓＴｓＧｓＴｓＧｓＡｓＡｓＣｓＧｓＴｓＴｓＣｓＧｓＡｓＧｓＡｓＴｓＧｓＡ（配列番号７０）
Ｋａｐｐａｐｒｏｃｔ  （ＤＩＭＳ  ０１５０）：ＧｓＧｓＡｓＡＣＡＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴｓＧｓＧｓＣ（配列番号７１）
から選択され得る（ｓはホスホロチオエート結合を意味する）。
【００８１】
さらなる局面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活剤を提供する。
【００８２】
1つの実施形態では、この免疫賦活剤は、インターフェロン（ＩＦＮ）α産生誘導もしくは増強および／またはインターロイキン６の産生誘導もしくは増強のためのものである。
【００８３】
（使用）
別の局面では、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の製造における、本発明のオリゴヌクレオチドの使用が提供される。この局面において使用されるオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の形態を用いることができることが理解される。
【００８４】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.  (1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.A.  et  al.(1995).PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.  et  al.(1999).  PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８５】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.(1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００８６】
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化DNA合成装置（Biosearch、Applied  Biosystems等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Steinら（Stein  et  al.,  1988,Nucl.  Acids  Res.  16:3209）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Sarinet  al.,  1988,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:7448-7451）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【００８７】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【００８８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８９】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９０】
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、全ての動物実験は、医薬基盤研究所の機関ガイドラインに従って実施した。また、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D  Systems、USCN  Life  Science  INC等）の同等品でも代用可能である。【００９１】
（実施例１：Ｄ３５での実験）
以下、本実施例において、代表的な免疫賦活剤であるＤ３５（配列番号３１）を用いて、ポリｄＡｓ４０テイル付加Ａ／ＤタイプＯＤＮは元のＤ３５と同様の免疫賦活化潜在能力を有することを実証した。【００９２】
（ヒトＰＢＭＣの調製）
インフォームド・コンセントを得た日本人の健康な成人ボランティアからＰＢＭＣを調製した。ヒトＰＢＭＣを用いた実験はすべて、独立行政法人医薬基盤研究所研究倫理審査委員会による承認を受けた（承認番号４４）。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＬｅｕｃｏＳｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いてＰＢＭＣを調製した後、これらのＰＢＭＣを、１０％  胎仔ウシ血清、１００単位／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（すべて、ナカライテスク株式会社（京都）製）中に、２×１０７細胞／ｍＬ（９６ウェル平底プレート、合計１００μＬ容量／ウェル）の濃度でプレーティングした。【００９３】
（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）有または無しでのＣｐＧ  ＯＤＮ刺激）
以下の表１に列挙するＯＤＮを株式会社ジーンデザイン（大阪、日本）により合成した。【００９４】
【表１】
2016103703.tif 000002
【００９５】
ポリｄＡｓ４０テイル（配列番号２９）は図１Ａにおいて例示的な送達剤として試験した。【００９６】
ＰＢＭＣを、示した濃度のＫ３、Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０および他のＯＤＮ（表１）で２４時間刺激した。ＯＤＮとＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）による刺激を、製造業者の説明書に従って実施した。簡単に述べると、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ製）中のＯＤＮ溶液とＯｐｔｉ−ＭＥＭ中のＤＯＴＡＰ溶液を別々に調製して、室温で１５分間維持し、その後、ＯＤＮ溶液とＤＯＴＡＰ溶液をピペッティングによって徹底的に混合した。得られたＯＤＮ／ＤＯＴＡＰ混合物を室温で１５分間維持した。ＯＤＮ／ＤＯＴＡＰ混合物（１００μＬ）をヒトＰＢＭＣ（２×１０６細胞／１００μＬ／ウェル）に加えた。２４時間後に、上清をサイトカインの存在についてアッセイした。【００９７】
（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカインの測定）
汎ＩＦＮ−α  ＥＬＩＳＡキット（ＭａｂｔｅｃｈまたはＰＢＬ製）およびヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（ＤｕｏＳｅｔ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を、製造業者の説明書に従って用いて、上清中のサイトカインを測定した。ＥＬＩＳＡは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ製）で発色させた。一部の実験では、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘアッセイ（ＭＰＸＨＣＹＴＯ６０ＫＰＭＸ２６；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）もまた、製造業者の説明書に従って実施した。【００９８】
（動的光散乱法（ＤＬＳ））
Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ  ＩＩ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を用いてＤＬＳの測定を行った。サンプル（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ、１８時間以上保存したもの）を、３８４ウェルプレート（２０μＬ／ウェル）中で測定した（２５℃にて２０回取得した）。多分散性、流体力学半径および分子量を、Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェアｖ７．１．７．１６（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）によって分析した。【００９９】
（透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ））
Ｄ３５（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）をＦｏｒｍｖａｒ−カーボンコートグリッドに滴下し（１０μＬ）、グリッドへの付着のために２時間インキュベートした。陰性染色のために、サンプルを蒸留水で３回洗浄し、次いで、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の酢酸ウラニル（ｐＨ４．０）を一滴グリッド上に置き、風乾させた。このグリッドを、電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７６５０）によって１０，０００倍の倍率で調べた。【０１００】
（ＣｐＧ  ＯＤＮとシゾフィラン（ＳＰＧ）の複合体形成）
アルカリ変性させたＳＰＧ（分子量１５０，０００）の溶液（０．２５Ｎ  ＮａＯＨ中１５ｍｇ／ｍＬ）をＯＤＮ溶液（ＮａＨ２ＰＯ４中１００μＭ）に加え、徹底的に混合した。この混合物を４℃にて一晩置き、複合体形成を完了させた。モル比（ＳＰＧ：ＤＮＡ）は０．２７に固定した。ＯＤＮとＳＰＧとの間の複合体形成効率を、ＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップ電気泳動装置（島津製作所，京都）を使用することによって、混合溶液中の残留遊離ＯＤＮから推定した。【０１０１】
（カニクイザルの免疫化）
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を入手し、独立行政法人医薬基盤研究所（ＮＩＢＩＯ）のつくば霊長類医科学研究センターで維持した。実験はすべて、ＮＩＢＩＯの動物実験委員会によって承認されたプロトコール（承認番号：ＤＳ２２−４Ｒ１）の下で行い、屠殺を最小限にするためのあらゆる試みを行った。０日目と１４日目に、カニクイザルに、Ｋ３（４．７ｎｍｏｌ）、Ｄ３５（４．７ｎｍｏｌ）、Ｄ３５−ｄＡｓ４０（４．７ｎｍｏｌ）、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０（４．７ｎｍｏｌ）、またはＤ３５−ＳＰＧ（Ｄ３５−ｄＡｓ４０の量として４．７ｎｍｏｌ）と共に、あるいは、これら無しで、インフルエンザスプリットワクチン（ＳＶ）（５μｇ）（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９，阪大微生物病研究会）を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。初回免疫後４週および８週の時点で血清を回収した。血清中の抗ＳＶ総ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。各血清サンプルを連続希釈し、抗体力価をＯＤ４５０＝０．２における希釈の逆数として計算した。【０１０２】
（統計解析）
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを用いて統計的に有意な差を計算した。サイトカインの分析については対応有りのｔ検定を、そして、抗体力価の分析については両側ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いた。【０１０３】
（実験の詳細）
（ポリｄＡｓ４０テイル付加Ａ／ＤタイプＯＤＮは元のＤ３５と同様の免疫賦活化潜在能力を有する）
本発明者らはこれまでに、Ｋ３  ＣｐＧ−ＯＤＮとシゾフィラン（ＳＰＧ）の粒子状可溶性複合体である第二世代のＢ／ＫタイプＣｐＧアジュバント、Ｋ３−ＳＰＧを開発した[Kobiyama  Kら,(2014) Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,vol.111  no.83086-3091, doi: 10.1073/pnas.1319268111.; Koyama  Sら, (2010)Science  Translational  Medicine  2:25ra24]。Ｋ３  ＯＤＮとＳＰＧの間で複合体を形成するために、Ｋ３  ＯＤＮは、３’末端にホスホロチオエートデオキシアデニル酸４０マー（ｄＡｓ４０テイル）を追加することによって修飾されなければならず、この３’末端において、ＳＰＧとｄＡｓ４０テイルが三重らせんの複合体を形成する[Kobiyama  Kら,(2014)上掲]。これらの実験と並行して、本発明者らはまた、同様のテイルを付加したＤ３５  ＯＤＮを合成し、ヒトＰＢＭＣに対するその免疫賦活化活性（ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の誘導）を調べた。サイトカインＥＬＩＳＡは、３’末端に追加のｄＡｓ４０テイルを有するＤ３５（Ａ／ＤタイプＣｐＧ−ＯＤＮ）が元のＤ３５と同様に活性であることを明らかにした（図１Ａの１とＤ３５を比較；本実験で用いた各ＯＤＮ配列は表１に示される）。その後の実験はさらに、３’のグアニン六量体を、アデニン、チミンおよびシトシンの六量体に置き換えた場合でも、ｄＡｓ４０テイルを持つ一部のＤ３５由来ＯＤＮもまた生物学的に活性であることを明らかにした（図１Ａの５、９および１３を参照）。この結果はどちらかといえば予想外であった。というのも、グアニン六量体は、フーグスティーン塩基対形成により四重鎖構造を形成し、自己凝集を生じ[Costa  LTら,(2004)Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  313:1065-1072.;Klein  DCら,(2010)Ultramicroscopy  110: 689-693.]、そして、グアニン六量体を介した凝集は、Ａ／ＤタイプＣｐＧ  ＯＤＮの生物学的活性にとって不可避な要件であると考えられていたからである[Verthelyi  Dら,(2001)J  Immunol  166:2372-2377.; Kerkmann  Mら, (2005) J  Biol  Chem  280:8086-8093.; Wu  CCら,(2004) J  Biol  Chem  279:33071-33078.; Puig  Mら, (2006)Nucleic  Acids  Res  34:6488-6495.]。他方ヒトＰＢＭＣに対するＤ３５由来ＯＤＮの免疫賦活化活性は、完全にＣｐＧ配列の存在に依存しており、非メチル化ＣｐＧモチーフ理論[Krieg  AM(2002)Annual  Review  of  Immunology  20:709-760.]と一致していた（図１Ａの９と１０〜１２を比較）。これらの結果は、グアニン六量体配列の存在が、Ａ／ＤタイプＯＤＮの免疫賦活化活性にとっての必須の要件ではない一方で、Ｄ３５由来ＯＤＮの活性はＣｐＧモチーフ配列の存在に強く依存することを示した。【０１０４】
（ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルはＤ３５由来ＯＤＮの免疫賦活化活性に必要とされる）
ホスホジエステルＣｐＧ  ＯＤＮへのグアニン六量体の付加は、その細胞取り込みを向上させたことが知られている[Bartz  Hら, (2004) Vaccine  23:148-155.; Dalpke  AHら, (2002)Immunology  106:102-112.]。この事実と軌を一にするように、ホスホロチオエートＯＤＮはタンパク質に非特異的に結合することが示された[Brown  DAら,(1994)Journal  of  Biological  Chemistry  269:26801-26805.]。さらに、ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮは、ホスホジエステルＣｐＧ  ＯＤＮよりも細胞によって効率的に取り込まれることも示されている。これらの知見は、ｄＡｓ４０テイルの追加がおそらくは、ホスホロチオエート骨格を介した非特異的な結合によってＯＤＮの細胞内取り込みを向上させたことを示唆した。これらの報告に基づき、本発明者らは、ヒトＰＢＭＣに対するＤ３５Ｔ−ｄＡｓ４０とＤ３５Ｔ−ｄＡ４０（元のグアニン六量体をチミン六量体で置き換え、テイルは、ホスホロチオエートまたはホスホジエステルポリＡ４０のいずれかから構成されるもの）の免疫賦活化活性を比較することによって、化学骨格構造の要件を検討した（図１Ｂの１と２を比較）。ＯＤＮの生物学的活性は、ホスホロチオエートテイルの存在に依存しており、ホスホジエステルテイルのＯＤＮを追加しても、サイトカイン反応はほとんど観察されなかった（図１Ｂの１と２を比較）。本発明者らはまた、ポリＡ（ｓ）４０の代わりにポリＴ（ｓ）４０またはポリＣ（ｓ）４０などの他のポリヌクレオチド４０マーテイルについても検討し、ｄＴｓ４０テイルよりも、ｄＡｓ４０テイルおよびｄＣｓ４０テイルを追加した場合に比較的より強いサイトカイン反応が認められた（図１Ｂの１、３および５を参照のこと）ものの、サイトカイン反応は、ポリヌクレオチドテイルの塩基とは無関係であったが、ホスホロチオエート骨格の存在に依存していたことを見出した（図１Ｂの３〜６を参照のこと）。【０１０５】
（ＤＯＴＡＰはグアニン六量体配列の不在を補う）
本発明者らはまた、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルを持たない、アデニン、チミンおよびシトシンの六量体を含有するＤ３５のヒトＰＢＭＣに対する免疫賦活化活性を試験した（図１Ｃ）。これまでの報告[Verthelyi  Dら,(2001) J  Immunol  166: 2372-2377.; Yamamoto  Tら,(1994)Microbiol  Immunol  38:831-836.; Lee  SWら, (2000) The  Journal  of  Immunology  165:3631-3639.]と一致して、元のＤ３５の免疫賦活化活性は、グアニン六量体の存在に依存していた（図２）。アデニン、チミンおよびシトシンの六量体を含有するＤ３５（Ｄ３５Ａ、Ｄ３５ＴおよびＤ３５Ｃ）は、ヒトＰＢＭＣに対して効果を有さなかった（図２；黒いバー）。これに対し、これらにＤＯＴＡＰを追加した場合、同じＯＤＮが比較的高活性となった（図２、白いバー）。このＤＯＴＡＰは、カチオン性脂質（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート）であり、ＴＬＲ９媒介性のシグナル伝達が開始する特定のエンドソーム区画へのＣｐＧ−ＯＤＮの標的化に使用されている[Yasuda  Kら,(2005)Journal  of  immunology(Baltimore, Md: 1950) 174: 6129-6136.; Honda  Kら,(2005)Nature  434: 1035-1040.]。この結果は、ＯＤＮをＤＯＴＡＰによって細胞取り込みおよび適切なエンドソーム区画へと標的化させる場合、Ａ／ＤタイプＯＤＮの生物学的活性が、グアニン六量体の配列を必要としないことを示した。【０１０６】
まとめると、これらの結果は、Ａ／ＤタイプのＣｐＧ−ＯＤＮの免疫賦活化活性が、２つの別々のプロセスによって調節され得ることを示唆した。第一のプロセスは、グアニン六量体の凝集、または、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルを介した非特異的な結合のいずれかによる効率的な細胞取り込みであり、第二のプロセスは、ＴＬＲ依存性のシグナル伝達を誘導するＣｐＧモチーフの存在によるものである。ＤＯＴＡＰは、Ｄ３５Ａ、Ｄ３５ＴおよびＤ３５Ｃのような非活性グアニン六量体非含有Ｄ３５を、免疫賦活化化合物に変換することができるので、グアニン六量体の配列の存在自体は、ＣｐＧモチーフ／ＴＬＲ９分子相互作用にとって必須ではないことが示唆される。【０１０７】
（ｄＡｓ４０テイル付加したＤ３５  ＯＤＮは大きな凝集体を形成しない）
本発明者らはまた、いくつかのｄＡｓ４０テイルＤ３５関連のＯＤＮについて、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いてその物理的性質を調べた（図３）。臨床応用可能なＡ／ＤタイプＯＤＮの医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）を満たす品質での合成は、ＯＤＮ生成物の制御不能な多型、凝集および沈殿につながる、Ｇテイル依存性の多量体化によって妨げられている[Puig  Mら,(2006) Nucleic  Acids  Res  34: 6488-6495.]（図３および５）。元のＤ３５（１ｍｇ／ｍＬ）は、ＰＢＳ中で目に種々の不均一な凝集物の形成を示し、２４時間以内に目に見える濁りが生じた（図３Ｃ）。特に、水中のＤ３５では濁りは観察されなかった。ＤＬＳ分析は、濁りが、広く分散された凝集物（平均直径約５０ｎｍ〜１μｍ超のサイズ範囲）から成ることを明らかにした（図３Ａ〜３Ｂ）。これに対し、ＰＢＳ中の同じ濃度のＤ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は、目に見える沈殿を形成せず（図３Ｃ）、ＯＤＮのサイズは、２０ｎｍ未満であり、ＤＬＳにシャープなピークを有していた（図３Ａ〜３Ｂ、表２）。【０１０８】
【表２】
2016103703.tif 000003
【０１０９】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析は、ＤＬＳの結果を確認し、約５０〜２００ｎｍのサイズの多数の球状粒子が、個別に分散されているか、または、いくつかの粒子が連なったクラスターを形成したことを示しており（図３Ｄ）、これは、以前の報告と一致していた[Costa  LTら,(2004) Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  313:1065-1072.;Klein  DCら,(2010) Ultramicroscopy  110: 689-693.]。これらのデータは、ｄＡｓ４０テイルの追加が、ＰＢＳ中でのＡ／ＤタイプＯＤＮの物理的均一性を大きく改善することを示しており、Ｄ３５−ｄＡｓ４０のようなグアニン六量体配列を含むものでも、ｄＡｓ４０テイルを追加することにより、実質的に凝集を示さなかった。Ｋ３、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５Ｔ−ｄＡｓ４０、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅＴ−ｄＡｓ４０では、ＴＥＭによって有意義な構造は観察されなかった。【０１１０】
（ｄＡｓ４０テイル付加したＤ３５関連ＯＤＮは用量に比例する様式でＩＦＮ−αを誘導する）
本発明者らはさらに、用量滴定によってこれらのＯＤＮの免疫賦活化活性を評価した（図４Ａ）。Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０（グアニン六量体配列を含む）およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０（グアニン六量体配列を含まない）を含むすべてのＯＤＮが、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−αおよびＩＬ−６反応の増加を用量依存性の様式で誘導した（図４Ａ）。これに対し、最近報告されたＰタイプのＯＤＮ、２１８８９（これは、二量体の構造の凝集物の形成を促進する２つのパリンドローム配列を直列に含むホスホロチオエート骨格から構成される）[Samulowitz  Uら,(2010) Oligonucleotides  20: 93-101.]は、より高濃度で使用した場合、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６反応の減少を示した（図４Ａ）。【０１１１】
（Ｄ３５ｃｏｒｅ＋ｄＡｓ４０テイルはＩＦＮ−α産生に十分である）
本発明者らはまた、５’ＧＧ配列および３’チミン六量体のような、Ｄ３５ｃｏｒｅ  １２マーからの隣接配列について、ＩＦＮ−α産生に対する影響を調べた（図４Ｂ）。Ｄ３５のコア配列（１２マー）のみでは、サイトカイン反応を誘導しなかった（図４Ｂ）が、この１２マーへのｄＡｓ４０テイルの追加は、匹敵する量のＩＦＮ−αを誘導するのに十分であった。重要なことに、これは、ＤＯＴＡＰの非存在下での結果であった。チミン六量体の存在は、生物学的活性を低下させるようであった。これらの結果は、５’ＧＧ配列および３’チミン六量体のようなコア隣接配列が、このタイプのＯＤＮの免疫賦活化活性にとって必須ではなかったことを示唆した（図４Ｂ）。【０１１２】
（より長いホスホロチオエート化Ａテイルを付加したＯＤＮは増加した免疫賦活化活性を有する）
本発明者らはまた、免疫賦活化活性に対するホスホロチオエートＡポリマーテイルの長さの影響を調べた。ヒトＰＢＭＣを同量の示したＯＤＮ（１μＭ）で刺激した場合、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の産生は、ｄＡｓテイルの長さと正の相関関係にあった（図４Ｃ）。各ＯＤＮ濃度の影響を調べると、増加する濃度の各ＯＤＮ（検討した最大濃度は９μＭ）は、同じレベルのＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生を誘導し（図４Ｄ）、より長いテイルのＯＤＮがより効率的に取り込まれたことが示唆された。しかしながら、長いテイルのＯＤＮも、短いテイルのＯＤＮも、おそらくは同じ取り込み機構を利用しており、したがって、プラトー様のサイトカイン反応に達した（図４Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＣｐＧモチーフを含有する短いＯＤＮへのホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルの追加が、免疫賦活化Ａ／ＤタイプＯＤＮを生成するのに十分であり、これは、制御された物理的性質を持つＧＭＰを順守したＡ／ＤタイプＯＤＮを生成するための有用な戦略となる。【０１１３】
（ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルのより詳細な要件および特徴づけ）
本発明者らは、D３５  ＣｐＧ  ＯＤＮのホスホロチオエートポリヌクレオチドの要件（例えば、テイルの長さ（図９）、テイルのホスホロチオエート化の程度（図１０）、およびテイルのヌクレオチド組成（図１１）を理解するための一連の実験をさらに行った。まず、Ｄ３５ｃｏｒｅを種々の数（長さ）のｄＡについて、試験して、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の誘導について試験した（図９。ＩＦＮ−α誘導はＤ３５ｃｏｒｅについては観察されず、ｄＡｓ６で少し観察された。ＩＦＮ−αの量は、ｄＡの長さがｄＡｓ６０に達するに従い増加した。興味深いことに、ｄＡｓテイルを１００までさらに延長しても、改善は見られず、むしろ、ＩＦＮ−αの誘導は減少した。対照的に、ＩＬ−６の産生は、増加し、ｄＡｓ１００まで増加が維持された。次に、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ５０を用いることによって、ホスホロチオエート化を１００％から１５％に減らした（図１０）。ｄＡ４０におけるホスホロチオエート化の５０％の減少ですら、ＩＦＮ−α誘導活性の劇的な減少を招いた。ＩＬ−６の産生の感受性はそれほどではなかったが、これもまた、ホスホロチオエートの減少に伴い迅速に減少した。２５％以下のホスホロチオエート化では、ＩＬ−６産生は観察されなかった。第三に、ヌクレオチド組成の要件についてＤ３５−ｄＮｓ４０を用いて試験した。完全にランダムのｄＮｓ４０テイル化ＯＤＮでは、実質的なＩＦＮ−α産生は誘導されなかった（図１１、核酸番号１０（ＤＳ３５−ｄＮｓ４０））。ｄＮｓ４０−テイルのグアノシンの量を１０％から９０％に増加させると、ｄＮｓ４０テイルにおけるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の増大が期待される。グアノシン量が増大するにつれ、ＩＦＮ−αの産生が増大したが、Ｄ３５−ｄＮｓ４０（９１％Ｇ）ですらＩＦＮ−αの誘導は比較的少量にとどまった（図Ｓ４、９）。これらの結果すべてをまとめると、１）全長、２）ホスホロチオエート化、および３）ヌクレオチド組成（ＡポリマーがＧリッチランダマーより優れる）のすべてが、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルＯＤＮの免疫刺激剤の活性に重要な因子であり得ることが理解される。これらの結果から、本発明者らは、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５コア−ｄＡｓ４０を、臨床応用のプロトタイプとして選択した。【０１１４】
（バイアル中に凍結保存したＤ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は生理食塩水を用いて直接製剤化できる）
生理食塩水のような塩含有溶液中への免疫賦活化ＯＤＮの直接的な溶解性は、その臨床応用を促進するために重要な要件である。それゆえ、本発明者らは、凍結乾燥したＤ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の生理食塩水中への直接的な溶解性を調べた。１０ｍｇの凍結乾燥ＯＤＮを含有するバイアル（図５Ａ）に、１ｍＬの無菌生理食塩水溶液を直接注入した。Ｋ３およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は生理食塩水中に容易に溶解した（図５Ｂ）。Ｄ３５−ｄＡｓ４０（グアニン六量体配列を含む）は、ゆっくりとではあるが、５分以内に完全に溶解した（図５Ｂ）。これらのＯＤＮ溶液を４℃にて１ヶ月保存した場合でも、目に見える沈殿または凝集物は観察されなかった。これに対し、元のＤ３５は、生理食塩水中に容易に溶解せず、不均質なゼラチン状の凝集物を形成した（図５Ｂ）。これらの結果は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０が、特に臨床応用に関して、元のＤ３５よりも容易に取り扱えることを実証した。【０１１５】
（Ｄ３５のシゾフィラン（ＳＰＧ）化はＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌を向上させない）
次に、本発明者らは、シゾフィラン（ＳＰＧ）と複合体化（ＳＰＧ化）させることによって、Ｄ３５由来のＯＤＮの免疫賦活化プロフィールを向上させることを試みた。Ｄ３５−ＳＰＧ、ＳＰＧ−Ｄ３５およびＤ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５を、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、ｄＡｓ４０−Ｄ３５およびｄＡｓ４０−Ｄ３５−ｄＡｓ４０をそれぞれＳＰＧと複合体化させることによって作製した。複合体化の効率をＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップ電気泳動装置によって評価したところ、以下のとおりとなった：Ｄ３５−ＳＰＧ（９９．４％）、ＳＰＧ−Ｄ３５（９６．７％）およびＤ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５（４９．８％）。これは、Ｄ３５−ＳＰＧまたはＳＰＧ−Ｄ３５のいずれかの溶液中のＯＤＮが、ほぼ完全に複合体化されたのに対し、Ｄ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５溶液中では５０％のＯＤＮしか複合体化されなかったことを示す。ヒトＰＢＭＣを、ＳＰＧ化したＯＤＮで刺激して、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の分泌をＥＬＩＳＡにより決定した（図６）。Ｋ３−ＳＰＧ[Kobiyama  Kら,(2014)Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,vol.111  no. 8  3086-3091,doi: 10.1073/pnas.1319268111.]と対照的に、Ｄ３５の５’または３’ＳＰＧ化は、サイトカイン産生を向上させなかったが、非ＳＰＧ化ＯＤＮと比較してＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の分泌を減少させた（図６）。とりわけ、Ｄ３５−ＳＰＧは、ＳＰＧ−Ｄ３５よりも大きな免疫賦活化効果を有した（図６）。特筆すべきことに、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびｄＡｓ４０−Ｄ３５のような５’末端または３’末端にｄＡｓ４０が追加された非ＳＰＧ化ＯＤＮは、匹敵する免疫賦活化活性を示した（図６）。しかしながら、本発明者らは、別の実験において、ｄＡｓ４０−Ｄ３５よりもＤ３５−ｄＡｓ４０で、わずかに良好なサイトカイン産生を観察した。興味深いことに、ｄＡｓ４０−Ｄ３５もまた、ＰＢＳ中の可視の大きな凝集形成が見られなかった（図１２）。Ｄ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５はＰＢＭＣからのＩＦＮ−αおよびＩＬ−６分泌をかなり増強したが、複合体化の効率は、わずか約５０％であった。Ｄ３５−ＳＰＧ−Ｄ３５は、Ｋ３−ＳＰＧ[Kobiyama  Kら,(2014)上掲]と同様のサイトカインプロフィールの向上を示した。【０１１６】
（Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０およびＤ３５−ＳＰＧは、カニクイザルにおいて、Ｋ３および元のＤ３５よりも良好なインフルエンザスプリットワクチン用のワクチンアジュバントとなる）
本発明者らは最後に、サルワクチンモデルにおけるＤ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０およびＤ３５−ＳＰＧのインビボアジュバント有効性を検討し、Ｋ３および元のＤ３５のものと比較した（図７）。６群のサル（ｎ＝２または３）を、示したインフルエンザスプリットワクチン（ＳＶ）＋アジュバントで２回（２週間間隔）皮下免疫し、初回の免疫から８週間後に、血清中のＳＶ特異的なＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡにより調べた（図７Ａ）。Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５−ＳＰＧは、Ｋ３および元のＤ３５よりも良好かつより一貫したアジュバント性を示した（図７Ｂ）。本発明者らはまた、別のサルのセットの実験を行って、元のＤ３５とＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０を比較したところ、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０もまた、元のＤ３５より優れたアジュバント性を示すことが分かった（図７Ｃ）。これらの結果は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０、Ｄ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０およびＤ３５−ＳＰＧが、少なくともインフルエンザスプリットワクチンのワクチン接種に関して、サルにおいてインビボでＫ３および元のＤ３５と比較して、アジュバントとして同等またはより良好に機能することを示唆した。特筆すべきことに、インビトロでのＩＦＮ−αおよびＩＬ−６プロフィールは、インビボでのアジュバント性と十分に相関していなかった。それゆえ、本発明者らは、Ｄ３５、Ｄ３５−ｄＡｓ４０またはＤ３５−ＳＰＧで刺激した（アッセイに十分な量のサルＰＢＭＣを入手できないという制限により、サルのＰＢＭＣの代わりに）ヒトＰＢＭＣを用いて２６多重サイトカインアッセイを実施した（図８）。検出された１８種のサイトカインの中では、インビトロでのサイトカインと、インビボでのアジュバント性の間に相関性は見出されなかった（図８）。【０１１７】
（考察）
本実施例において、本発明者らは、ヒトにおける臨床応用のための２種類の新規プロトタイプ非凝集性免疫賦活化Ａ／ＤタイプＯＤＮ、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０に代表される送達剤を開発した。これらのＯＤＮは、高ＩＦＮ−αおよび低ＩＬ−６誘導プロフィールを持つ元のＤ３５と同様のヒトＰＢＭＣからのサイトカイン誘導プロフィールを示したが、これらのサイトカイン間での全体的なバランスは、Ｂ／ＫタイプＯＤＮのものに向かってわずかにシフトした（元のＤ３５と比較して、ＩＦＮ−αがわずかに減少し、ＩＬ−６が増加した；図１）。Ｄ３５−ｄＡｓ４０とＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の最も重要な特徴は、生理食塩水中へのその優れた溶解性であった。バイアル中に保存された凍結乾燥Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は、生理食塩水溶液を注入することによって直接溶解することが可能であり（図５）、この特徴は、臨床上の投与に必要な特徴であって、その用途は大きく広がる。加えて、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０はともに、インフルエンザＳＶアジュバントとして用いた場合に、カニクイザルにおいて元のＤ３５よりも良好なアジュバント性を示した（図６）。Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は一般に、インビトロでは元のＤ３５と比べて比較的減少したＩＦＮ−αとより多いＩＬ−６を示した（図４）ので、この結果は予想外であった。Ｂ細胞の直接的な活性化と強力なＩＬ−６サイトカイン誘導に起因して良好な抗体反応を誘導すると考えられるＫ３と比較した場合も、Ｄ３５−ｄＡｓ４０は、サルにおいて、より良好でかつより確実な抗インフルエンザ抗体反応を示した（図７）。このことは、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０がともに、インビボで優れたワクチンアジュバントであることを示唆した。本発明者らはまた、サルにおいて、Ｄ３５−ｄＡｓ４０とＳＰＧから成るＤ３５−ＳＰＧを検討した。Ｄ３５−ＳＰＧは、インビトロにおいてＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の減少したレベルを示したが、Ｄ３５−ＳＰＧは、インビボにおいてＤ３５−ｄＡｓ４０と匹敵するアジュバント性を有した（図７）。これらのデータは、インビトロでＯＤＮによって誘導されるサイトカインの量と品質が、インビボでのそのアジュバント性と相関しないことを示した。体内分布の違いは、修飾ＯＤＮのアジュバント性に影響を及ぼす別の重要な因子であり得る。ＯＤＮの体内分布に関するさらなる調査が必要とされる。【０１１８】
容量応答分析では、Ｄ３５−ｄＡｓ４０とＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は、元のＤ３５と同様に用量に比例したＩＦＮ−αおよびＩＬ−６反応を示し（図４）、そしてこれが、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０をＣタイプまたはＰタイプではなく、「Ｄタイプ」のＣｐＧ  ＯＤＮとみなす理由の一つである。ＣタイプおよびＰタイプのＯＤＮもまたＩＦＮ−αの産生を誘導するが、その「ＯＤＮ用量−サイトカイン反応」は通常、ＤタイプＯＤＮのパターンとは異なる。ＣタイプおよびＰタイプのＯＤＮは、より多量のＯＤＮを刺激に用いた場合に減少したＩＦＮ−α分泌を示した。このタイプのＩＦＮ−α反応は、Ｋ３  ＣｐＧ  ＯＤＮから派生したＫ３−ＳＰＧについても観察されたが、Ｋ３  ＣｐＧ  ＯＤＮは、依然として強いＩＦＮ−α産生を誘導可能である[Kobiyama  Kら,(2014) Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,vol.111 no.83086-3091, doi:10.1073/pnas.1319268111.]。Ｃ、ＰおよびＫ３−ＳＰＧの骨格はすべてホスホロチオエートなので、この反比例のＩＦＮ−α反応は、ホスホロチオエート骨格の構造によって引き起こされるものである可能性がある；しかしながら、根底にある機構は現在不明であり、将来さらなる調査が必要である。まとめると、本実施例は、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０が、生理食塩水中への高い溶解性と、インビボでの高いアジュバント性を持つ、有望なプロトタイプＤタイプＣｐＧ  ＯＤＮであることを実証した。【０１１９】
これまで必須の要素であると考えられていた、グアニン六量体配列と、その結果生じるＯＤＮの凝集は、Ａ／ＤタイプのＯＤＮにとって、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導に必須ではないことが本発明において示された。以前の研究は、凝集がＡ／ＤタイプＣｐＧ  ＯＤＮによる高いＩＦＮ−α産生にとって必須であると結論付けていた[Kerkmann  Mら,(2005) J  Biol  Chem  280: 8086-8093.; Wu  CCら, (2004) J  Biol  Chem  279:33071-33078.;Puig  Mら,(2006) Nucleic  Acids  Res  34: 6488-6495.]。しかしながら、本発明者らのデータは、凝集が、Ａ／ＤタイプＣｐＧ  ＯＤＮによる高いＩＦＮ−α産生にとって必須の要件ではないことを実証しており（図１）、グアニン六量体配列自体は、ＴＬＲ９媒介性のＣｐＧ  ＯＤＮの認識に直接関与しないことが理解される。グアニン六量体を含有しないＤ３５  ＯＤＮ（例えば、Ｄ３５Ａ、Ｄ３５Ｔ、Ｄ３５Ｃ）は、ＤＯＴＡＰを追加すると、強力なＩＦＮ−α産生を誘導し、ＤＯＴＡＰが、ＤタイプＯＤＮの凝集依存性の取り込みプロセスを補うというこの仮説をさらに裏付けた。これに対し、ＩＦＮ−α産生は、ＣｐＧモチーフの存在に完全に依存していた（図１）。これらのデータは、Ａ／ＤタイプのＯＤＮの全体的な免疫賦活化活性が、２つの重複しない機構：１）細胞によるＯＤＮ取り込み、および、２）エンドソーム内のＴＬＲ９によるＣｐＧモチーフ認識、によって調節され得ることを示唆した。まとめると、本発明者らは、ＣｐＧを含有する１２マーのパリンドローム配列と、ホスホロチオエート化ポリＡテイルが、新たに開発した非凝集性ＤタイプＯＤＮ、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の２つの必要十分な成分であると結論付けた。【０１２０】
グアニン六量体の存在は、おそらくはスカベンジャー受容体を介して、細胞によるホスホジエステル骨格ＯＤＮの効率的な取り込みに貢献すると報告されていた[Bartz  Hら,(2004) Vaccine  23: 148-155.; Lee  SWら, (2000) The  Journal  of  Immunology  165:3631-3639.;Jozefowski  Sら,(2006) J  Leukoc  Biol  80: 870-879.]。ホスホジエステル骨格のＯＤＮは、細胞によるＯＤＮ取り込みとその後の免疫賦活化機能に、凝集物を形成するグアニン六量体または関連の配列を必要とすることが実証された。しかしながら、ホスホロチオエート化された一本鎖ＣｐＧ  ＯＤＮ（例えば、Ｂ／ＫタイプのＯＤＮ）は、細胞による取り込みにＤＥＣ−２０５を使用すると報告されていた[Lahoud  MHら,(2012)Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  109:16270-16275.]。加えて、ＨＭＧＢ１、グラニュリンおよびＬＬ３７のような多数の分子が、ＯＤＮまたはＤＮＡの取り込みと、ＴＬＲ９への送達を媒介または増強する[Lee  CCら,(2012)Nat  Rev  Immunol  12:168-179.]。理論に束縛されることを望まないが、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は、凝集物を形成しないが、ホスホジエステルポリＡテイルではなく、ホスホロチオエートの存在に依存してその免疫賦活化活性を維持し、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０の取り込みが、ＤＥＣ−２０５のようなホスホロチオエートＯＤＮ取り込み機構、および／または、潜在的な他の未発見のアクセサリー分子によって媒介されるものと理解することができる。【０１２１】
グアニン六量体媒介性の凝集または高次構造の形成はまた、細胞下での局在化に影響し、多量体形態を持つＯＤＮの優先的な初期エンドソーム局在化を促進し得る[Guiducci  Cら,(2006) The  Journal  of  Experimental  Medicine  203:1999-2008.]；しかしながら、この優先的な初期エンドソームソーティングの正確な調節機構は、まだ決定されていない。ＩＦＮ−α産生のシグナル伝達は、初期エンドソーム内に存在するＣｐＧ／ＴＬＲ９相互作用において開始することが示唆されていた[Honda  Kら,(2005)Nature  434:1035-1040.; Guiducci  Cら, (2006) 上掲]。ＤＯＴＡＰによる初期エンドソームへのＢ／ＫタイプＯＤＮ（ＩＦＮ−αの良好な誘導因子ではない）の強制標的化もまた、ＩＦＮ−αを誘導し[Honda  Kら,(2005)上掲]、ＣｐＧ  ＯＤＮがＩＦＮ−α産生にとって適切な区画へと標的化される場合、骨格の化学的性質と高次構造の要件が厳密ではないことが示唆された。同様に、最近の報告は、ナノ粒子表面に結合させた２つの異なる高次構造のＣｐＧ  ＯＤＮを検討し、多量体化ＯＤＮ／ナノ粒子が、ＩＦＮ−α反応を誘導する一方で、単量体ＯＤＮ／ナノ粒子は、ＩＬ−６反応を誘導することが見出されていた[Chinnathambi  Sら,(2012)Sci  Rep  2:534.]。これらの報告は、ＯＤＮの構造と、標的化される細胞区画の両方が、最終的な優先的サイトカイン反応がＩＦＮ−αまたはＩＬ−６のいずれとなるかを決定するのに重要であることを示唆した。最近報告されたＡＰ−３は、ｐＤＣのＩＦＮ−α反応の調節に別の層を加えるものであった[Sasai  Mら,(2010)Science  329:1530-1534.]。後期エンドソームに由来し得るリソソーム関連細胞内小器官へのＴＬＲ９の局在化は、ｐＤＣからのＩＦＮ−α産生に必要とされると報告されており[Sasai  Mら,(2010)上掲]、ＴＬＲ９シグナル伝達によるＩＦＮ−α産生が、以前に考えられていたものよりも複雑な細胞内ソーティング機構によって調節されることが示唆されていた[Lee  BL,Barton  GM(2014)Trends  in  Cell  Biology  24: 360-369.]。Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０は、非凝集性Ｄタイプ配列と、ホスホロチオエートポリＡテイルから構成され、ＩＦＮ−αとＩＬ−６の両方を誘導することができ、ＣタイプＯＤＮの細胞内分布と類似し得るが、その用量−反応は、ＤタイプＯＤＮを示した。Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０によるＩＦＮ−α産生の誘導の、正確な細胞区画と分子的要件を明確にするためにはさらなる条件設定に基づいて決定することができる。【０１２２】
（個体間での反応の違い）
ヒトＰＢＭＣにおけるＢ／ＫタイプＣｐＧ  ＯＤＮに対するサイトカイン反応の不均一性が報告されている[Leifer  CAら, (2003) J  Immunother  26:313-319.]。全体的な反応は、様々なヒトＰＢＭＣサンプル間で大きくは一致していたが、本発明者らもまた、本実施例において検討したＡ／ＤタイプＯＤＮの非凝集性誘導体に対して可変的な反応を認めた。このタイプのＯＤＮの臨床応用にとって、これらの個体間での違いの原因のさらなる調査を検討することができる。以上から、Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０を含むＡ／ＤタイプＯＤＮの非凝集形態が、臨床応用可能なＡ／ＤタイプＯＤＮのさらなる開発のための有望な出発物質であるといえる。【０１２３】
（実施例２：他のＣｐＧ  ＯＤＮでの確認）
次に、本実施例では、他のＣｐＧ  ＯＤＮでＤ３５と同様の効果が示されるかどうかを確認した。【０１２４】
Ｄ３５（またはＤ３５Ｃｏｒｅ）に代えて、以下の配列を用いて、実施例1において示したＤ３５について行ったのと同様の実験（本明細書上記を参照。）を行った。以下に使用した配列およびその名称を示す）（^はホスホロチオエート結合を意味する）。
A2216:g^g^gggacgatcgtc^g^g^g^g^g^g（配列番号５５）
A2216core:gacgatcgtc（配列番号５６）
A2336:g^g^g^gacgacgtcgtg^g^g^g^g^g^g（配列番号５７）
A2336core:acgacgtcgt（配列番号５８）
B2006(PS):t^c^g^t^c^g^t^t^t^t^g^t^c^g^t^t^t^t^g^t^c^g^t^t（配列番号５９）
B2006(PO):tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt（配列番号６０）
C2395(PS):t^c^g^t^c^g^t^t^t^t^c^g^g^c^g^c^g^c^g^c^c^g（配列番号６１）
C2395(PO):tcgtcgttttcggcgcgcgccg（配列番号６２）
P21889(PS):t^c^g^t^c^g^a^c^g^a^t^c^g^g^c^g^c^g^c^g^c^c^g（配列番号６３）
P21889(PO):tcgtcgacgatcggcgcgcgccg（配列番号６４）【０１２５】
（結果）
図１３〜図１４に結果を示す。図１３は、凝集の様子を示すものである。凝集の様子を示すものである。A2216は直接生食に溶解(10mg/mL)させることは可能だが、非常に粘性の高い溶液となり、４℃の場合はゲル化している。３７℃ではゾル状となる(粘度は高いが流動性は保たれる)。A2336は直接生食に溶解させることはできないことを示す。【０１２６】
図１４は、他の型のＣｐＧ  ＯＤＮとして、Ａ２２１６、Ｂ２００６、Ｃ２３９５、およびＰ２１８８９を用いてｄＡｓ４０付加による免疫刺激活性に対する影響を調べたものである。ｄＡｓ４０を他の型のＣｐＧ  ＯＤＮ（Ａ型、Ｂ型およびＰ型のＯＤＮ）への付加でもまた免疫刺激活性にＤ３５と同様に影響を与えることが理解される。【０１２７】
以上から、Ｄ３５の場合に観察されたｄＡｓ４０を付加することによる内在的な凝集性を抑制しながらもＩＦＮα誘導能を保つ作用は、他のＡ／Ｄ−ｔｙｐｅ  ＯＤＮ（Ａ２２１６またはＡ２３３６）でも有効であると考えられるが、個別の配列や構造に依存した違いも観察される。【０１２８】
（実施例３：Ｄ３５以外のＡ／Ｄ型ＣｐＧ核酸についての凝集抑制効果の確認）
次に、本実施例では、Ｄ３５以外のＡ／Ｄ型ＣｐＧ核酸についてもｄＡｓ４０付加による凝集抑制効果を凍結乾燥バイアルを直接生食で溶解する操作で確認し、ヒトＰＢＭＣに対する生物活性としてＩＮＦαおよびＩＬ−６を測定し、Ｄ３５にｄＡｓ４０を付加した際に認められたのと同様にＩＦＮａおよびＩＬ−６の産生は維持または増強されたことを確認した。【０１２９】
（方法および材料）
方法および材料としては、実施例１に記載したＤ３５において行ったのと同様の実験（本明細書上記を参照。）に準じた実験を行い、また、実施例１〜２において示した配列と一部かぶるが以下の配列を用いて実験を行った。
A2216:g^g^gggacgatcgtc^g^g^g^g^g^g（配列番号５５）
A2216core:gacgatcgtc（配列番号５６）
A2216-dAs40:（配列番号７６）
A2336:g^g^g^gacgacgtcgtg^g^g^g^g^g^g（配列番号５７）
A2336core:acgacgtcgt（配列番号５８）
A2336-dAs40:（配列番号７８）
D35（配列番号３１）
D35-dAs40:（配列番号１）
D35core-dAs40:（配列番号２３）
コントロール（刺激なし）
K3:（配列番号３０）【０１３０】
（結果）
結果を図１５に示す。図１５に示されるように、Ａ２２１６−ｄＡｓ４０（左）およびＡ２３３６−ｄＡｓ４０（右）（いずれも０．５ｍｇ／バイアル）が容易にかつ完全に、５０μＬの生理食塩水に常温で溶解することが示された。また、図１５下段に示されるように、ヒトＰＢＭＣをそれぞれのオリゴヌクレオチドで２４時間刺激した（１μＭ）結果をＥＬＩＳＡで上清におけるＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の産生を調べたところ、Ｄ３５以外のＤタイプ核酸（Ａ２２１６とＡ２３３６）についてもｄＡｓ４０を付加することで生理食塩水への溶解性を高めることができること、およびがＩＦＮ−αおよびＩＬ−６の産生にも同様の効果があることが実証され、Ｄ３５のみならず、Ｄ型核酸にｄＡｓ４０を付加することに伴う凝集抑制効果がみられることが実証された。【０１３１】
本実施例では、他のＡ／ＤタイプのＯＤＮ、例えば、Ａ２２１６，Ａ２３３６の生理食塩水における直接の溶解度を、ｄＡｓ４０テイルの付加の有無で確認した。予想外にも、Ａ２２１６は、生理食塩水で室温で、徐々にではあるが完全に溶解した。しかしながら、図１３に示したように、溶液は、４℃でゲルに変化した。このゲル化は、３７℃にすると再度液化した。Ａ２３３６は生理食塩水には溶解せず、ゲル状の凝集物を形成した。これはＤ３５と同様であった（図１３参照）。ｄＡｓ４０をＡ２２１６およびＡ２３３６に加えると、生理食塩水における溶解度が顕著に改善した。Ａ２２１６−ｄＡｓ４０およびＡ２３３６−ｄＡｓ４０は、容易に生理食塩水に溶解した（図１５）。そして、４℃ではゲル化しなかった。Ａ２２１６−ｄＡｓ４０およびＡ２３３６−ｄＡｓ４０もまた、インターフェロン−α誘導能力が保持された（図１４および図１５Ｄ）。これらの結果は、ｄＡｓ４０テイルの付加もまた、他のＡ／ＤタイプのＯＤＮ管理の改善のために有用な修飾物であることを実証するものである。【０１３２】
（実施例４：ホスホロチオエート結合の数に関する影響）
次に、本実施例では、５‘末端のホスホロチオエート化（ｓ）の個数が1個の場合と２個の場合とで生理食塩水に溶解した場合に凝集する性質およびヒトＰＢＭＣからのＩＦＮαおよびＩＬ−６産生について、ほぼ同じであることを実証した。以下にその詳細を示す。【０１３３】
具体的には、‘末端のホスホロチオエート化（ｓ）が一つの場合（Ｄ３５：  ＧｓＧＴ．．．）（配列番号３１）と５‘末端のホスホロチオエート化（ｓ）が二つの場合（Ｄ３５ｂｅｔａ：  ＧｓＧｓＴ．．．）（配列番号７３）において上記と同様の方法で、生食に溶解した場合に凝集する性質、およびヒトＰＢＭＣからのＩＦＮαとＩＬ−６産生がＤ３５とＤ３５ｂｅｔａでほぼ同じであることを確認した。【０１３４】
結果を図１６に示す。図１６に示されるように、Ｄ３５（ｓが５’末端に１個結合している）と類似の構造であるが、ｓの数が異なるＤ３５β（ｓが５’末端に２個結合している）とが凝集やＩＦＮ−α、ＩＬ−６の刺激と同様の挙動を示すことが確認された。【０１３５】
（実施例５：製剤例）
製剤化する場合には、以下のような製法によって製造することができる。
（例１）凍結乾燥したD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の生理食塩水を直接加えて注射用溶液製剤とすることができる。
（例２）凍結乾燥したD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の等張液5%ブドウ糖液を加えて注射用溶液製剤とすることができる。
（例３）水に溶解されたD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の電解質補正液大塚食塩注10％などを加え0.9% NaCl濃度に調製し注射用溶液製剤とすることができる。
（例４）水に溶解されたD35-dAs40の適宜の量を凍結乾燥し、D35-dAs40ナトリウム塩の凍結乾燥製剤とすることができる。【０１３６】
製剤に使用した薬剤は、大塚製薬工場（徳島、日本）、ジーンデザイン（大阪、日本）から入手することができる。【０１３７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１４年１２月２５日に出願された日本国出願特願２０１４−２６３０１７号および２０１５年６月１１日に出願された日本国出願特願２０１５−１１８７３１号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明は、ＣｐＧに関連する任意の産業、例えば、試薬産業、製薬産業等で利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号１〜２８は表１列挙の配列を示す。
配列番号２９：ＤポリｄＡｓ４０テイルを示す。
配列番号３０：Ｋ３（atcgactctc gagcgttctc）を示す。
配列番号３１：Ｄ３５を示す。
配列番号３２：Ｄ３５Ａを示す。
配列番号３３：Ｄ３５Ｔを示す。
配列番号３４：Ｄ３５Ｃを示す。
配列番号３５〜４８：図９の配列を示す。
配列番号４９〜５４：図１０の配列を示す。
配列番号５５：Ａ２２１６のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号５６：Ａ２２１６のコア部分を示す。
配列番号５７：Ａ２３３６のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号５８：Ａ２３３６のコア部分を示す。
配列番号５９：Ｂ２００６のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号６０：Ｂ２００６の全長を示す。
配列番号６１：Ｃ２３９５のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号６２：Ｃ２３９５の全長を示す。
配列番号６３：Ｐ２１８８９のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号６４：Ｐ２１８８９の全長を示す。
配列番号６５：Ａ２２１６の全長を示す。
配列番号６６：Ａ２３３６の全長を示す。
配列番号６７：ＣＰＧ  ７９０９を示す。
配列番号６８：ＰＦ−３５１２６７６を示す。
配列番号６９：ＣＹＴ００３−ＱＢＧ１０を示す。
配列番号７０：１０１８  ＩＳＳを示す。
配列番号７１：Ｋａｐｐａｐｒｏｃｔ  （ＤＩＭＳ  ０１５０）を示す。
配列番号７２：Ｄ３５−ｄＮｓ４０（GsGsTGCATCGATGCAGGGGsGsGs-Ns40）を示す。
配列番号７３：Ｄ３５βの配列（ＧｓＧｓで始まる）を示す。
配列番号７４：ｄＡｓ４０−Ｄ３５の配列を示す。
配列番号７５：Ｄ３５−ｄＡｓ４０−Ｄ３５の配列を示す。
配列番号７６：Ａ２２１６＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号７７：Ａ２２１６ｃｏｒｅ＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号７８：Ａ２３３６＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号７９：Ａ２３３６ｃｏｒｅ＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８０：Ｂ２００６（ＰＳ）＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８１：Ｂ２００６（ＰＯ）＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８２：Ｃ２３９５（ＰＳ）＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８３：Ｃ２３９５（ＰＯ）＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８４：Ｐ２１８８９（ＰＳ）＋ｄＡｓ４０を示す。
配列番号８５：Ｐ２１８８９（ＰＯ）＋ｄＡｓ４０を示す。
【図１】
2016103703.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2016103703000001.app
【国際調査報告】
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2016103703.tif 000021
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