(57)【要約】本発明は、細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターにおいて、充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有し、前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）：ｙ＝−ａｘ２＋ｂｘ及び／又は式（２）：ｙ＝ａｘ２−ｂｘの関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲に調整する。本発明は、細胞の回収効率が向上した細胞分離フィルター及び細胞分離フィルターを用いて、目的の細胞を効率よく回収することができる細胞分離方法を提供することを目的とする。 【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有しており、
前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ２＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ２−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲である隆起部を１つ以上有するフィルター。
【請求項２】
前記細胞分離材の表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有する請求項１に記載のフィルター。
【請求項３】
隆起部の数をｎ、隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ｃ）又は（ｄ）：
（ｃ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｄ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たす請求項２に記載のフィルター。
【請求項４】
ａが０．０３０〜０．１２０及び／又はｂが０．３〜１．５である請求項１〜３のいずれかに記載のフィルター。
【請求項５】
細胞分離材の厚みの最小値が１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍ、細胞分離材の厚みの最大値が１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍである請求項１〜４のいずれかに記載のフィルター。
【請求項６】
隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０２ｍｍ２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０２〜５．６１×１０２ｍｍ２である請求項１〜５のいずれかに記載のフィルター。
【請求項７】
前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下である請求項１〜６のいずれかに記載のフィルター。
【請求項８】
前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である請求項７に記載のフィルター。
【請求項９】
前記突起部を少なくとも２つ以上有する請求項７又は８に記載のフィルター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む、細胞分離方法。
【請求項１１】
前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、請求項１０に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、請求項１０又は１１に記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離フィルター又はこれを利用した細胞分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。【０００３】
例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血及び赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。【０００４】
一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。【０００５】
加えて近年、白血病や固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。【０００６】
骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。【０００７】
細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３）も報告されている。
しかしながら、実際に細胞の分離を行う際には、原因は不明ながら、フィルター材料に充填する細胞分離材内を血液がうまく通過しなかったり、細胞分離材に細胞が捕捉されたまま回収できないケースがあり、これらの問題は、特に臍帯血のように液量の少ない血液から造血幹細胞等の細胞を回収する際には看過できない問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００１−５１８７９２号公報
【特許文献２】国際公開第９８／３２８４０号
【特許文献３】特開平１０−３１３８５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような事情に鑑み、本発明の目的は、細胞の回収効率が向上した細胞分離フィルターを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記細胞分離フィルターを用いて、目的の細胞を効率よく回収することができる細胞分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく、鋭意検討を進めた。その結果、細胞分離フィルターに充填される細胞分離材における液体導入口側又は液体導出口側の表面に、所定の外形を有する隆起部を形成させることで、細胞の回収率が有意に向上し、しかも細胞分離材に捕捉されたまま回収されない血液成分も顕著に低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。【００１２】
〔１〕細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有しており、
前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ２＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ２−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲である隆起部を１つ以上有するフィルター。【００１３】
〔２〕前記細胞分離材の表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有する前記〔１〕に記載のフィルター。【００１４】
〔３〕隆起部の数をｎ、隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ｃ）又は（ｄ）：
（ｃ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｄ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たす前記〔２〕に記載のフィルター。【００１５】
〔４〕ａが０．０３０〜０．１２０及び／又はｂが０．３〜１．５である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のフィルター。【００１６】
〔５〕細胞分離材の厚みの最小値が１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍ、細胞分離材の厚みの最大値が１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍである前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のフィルター。【００１７】
〔６〕隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０２ｍｍ２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０２〜５．６１×１０２ｍｍ２である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のフィルター。【００１８】
〔７〕前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のフィルター。【００１９】
〔８〕前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である前記〔７〕に記載のフィルター。
〔９〕前記突起部を少なくとも２つ以上有する前記〔７〕又は〔８〕に記載のフィルター。【００２０】
〔１０〕前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む、細胞分離方法。【００２１】
〔１１〕前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、前記〔１０〕に記載の細胞分離方法。【００２２】
〔１２〕さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の細胞分離方法。【００２３】
〔１３〕さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、前記〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の細胞分離方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のフィルターを用いることにより、血液中の細胞を効率よく回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のフィルターの１例を示す概略図である。
【図２】図１に示すフィルター上面図と、該フィルターのＡ−Ａ部における縦断面図である。
【図３】図２に示すフィルターの要部拡大縦断面図である。
【図４】隆起部の外形を測定する際の測定箇所を示す概略図である。
【図５】フィルターのノズル付押え部材の１例を示す概略図である。
【図６】図２に示すフィルターに充填された細胞分離材の縦断面図である。
【図７】実施例１で用いたフィルターの構造を示す概略図である。
【図８】実施例１で用いたフィルターに充填された細胞分離材１１の外形の１例を示す縦断面図である。
【図９】実施例１で用いた細胞分離用デバイスの回路の概略図である。
【図１０】実施例１、３及び比較例１において細胞回収後のフィルターから取り出した細胞分離材を置き、そこに残存する血液成分をそれぞれ比較した際の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明のフィルターは、細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有しており、
前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ２＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ２−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲である隆起部を１つ以上有することを特徴とする。
【００２８】
（細胞分離材）
本発明で使用される細胞分離材の形態は、特に限定されず、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等が挙げられる。好ましくは繊維で構成されるものであり、より好ましくは不織布である。
【００２９】
前記細胞分離材の材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ポリパラフェニレンテレフタルアミド、カーボン、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。中でも、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、レーヨン、ナイロン、ポリブチレンテレフタラート、ポリエチレンテレフタラート等の高分子を好適に用いることができる。前記細胞分離材は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。
【００３０】
本発明で用いられる細胞分離材の平均繊維径としては、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく特に限定はない。
【００３１】
前記細胞分離材の性能をより向上させるために、細胞分離材に親水化処理を行ってもよい。親水化処理することにより、目的とする必要細胞以外の細胞における非特異的な捕捉の抑制、細胞含有液を偏り無く細胞分離材中に通過させ、性能の向上、必要細胞の回収効率向上等を付与することができる。親水化処理方法としては、水溶性多価アルコール、又は水酸基、カチオン基もしくはアニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法、水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法、疎水性膜に親水性高分子を固定する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）、電子線照射する方法、含水状態で細胞分離フィルターに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法、乾燥状態で熱処理することにより親水性高分子を不溶化し固定する方法、疎水性膜の表面をスルホン化する方法、親水性高分子と疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法、アルカリ水溶液（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）処理により膜表面に親水基を付与する方法、疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法、又は界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。
【００３２】
親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、多糖類（セルロース、キチン、キトサン等）、水溶性多価アルコール等が挙げられる。
【００３３】
疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アクリル、ウレタン、ビニロン、ナイロン、ポリエステル等が挙げられる。
【００３４】
さらに回収目的とする細胞の細胞分離材への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や、目的とする幹細胞上に発現されている特異的抗原に対する抗体を、細胞分離材上に固定化してもよい。細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ２７１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、固定化方法としては、例えば、一般的なタンパク質の固定化方法である、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、架橋法等の方法を任意に用いることができる。
【００３５】
（容器）
前記細胞分離材を充填する容器は、上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備える。
液体導入口とは前記容器外部から前記容器内部に目的の細胞を含有する液体（細胞含有液ともいう）を導入する口をいう。
液体導出口とは、前記液体導入口の上下方向に対して反対側に設けられる口であり、主に細胞分離操作の際に細胞分離材を通過した液体を容器外部へ排出するための口をいう。
前記液体導入口及び液体導出口はそれぞれ１つ以上あればよく、数については特に限定はない。
また、前記液体導入口又は液体導出口が設けられる上部又は下部の位置としては、特に限定はない。
なお、細胞分離材に捕捉された細胞は、本発明のフィルターを組み合わせた細胞分離デバイスの構成によっては、前記液体導入口から容器外部に排出される場合もある。
【００３６】
前記容器の形状としては、前記細胞分離材を内蔵できる形状であればよく、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜４００ｍＬ程度、直径０．１〜１５ｃｍ程度の筒状容器や、一片の長さ０．１〜２０ｃｍ程度の正方形又は長方形で、厚みが０．１〜５ｃｍ程度の四角柱状容器等が挙げられる。
【００３７】
例えば、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すように円筒形状のフィルター１では、円筒状の本体３と、その上部及び下部にある開口部に蓋をすることができるノズル付押え部材４、５と、前記本体３とノズル付押え部材４、５とを固定するためのキャップ６、７とで構成される。
前記ノズル付押え部材４、５には、容器２内部に液体を導入するための液体導入口９、容器２から液体を排出するための液体導出口１０がそれぞれ設けられている。なお、前記液体導入口９及び液体導出口１０は液体を送液するためのチューブを接続しやすくするために、ノズルで構成されている。前記ノズルの形状や大きさについては特に限定はない。
前記ノズル付押え部材４、５は栓型になっており、円筒状の前記本体３の内腔に押し込むことで、本体３の内面と接して固定される。
前記ノズル付押え部材４、５と本体３との接触面にはシール８が設けられている。このシール８により、ノズル付押え部材４、５と本体３との気密性を確実にして外部からの微生物等の侵入を防ぐことができる。前記シール８としては、例えば、図２（ｂ）に示すように、ノズル付押え部材４、５の表面に設けた溝の周囲に樹脂製のパッキンを設けることが挙げられるが、シール８の配置や構成については特に限定はない。
【００３８】
前記ノズル付き押え部材４、５は、前記本体３に直接固定できるようにしてもよい（図示せず）。ノズル付き押え部材と本体とが接触する面に、例えば、ネジを設けることでノズル付き押え部材と本体とを固定することができる。この場合、図２（ｂ）に示す前記キャップ６、７は不要となる。
【００３９】
前記容器２内では、前記細胞分離材１１が積層されて充填される。例えば、繊維径の異なる細胞分離材１１を２層以上積層したフィルターとすることにより、細胞を捕捉する箇所が分散され、目詰まりの発生が抑制されるとともに、フィルターからの細胞の分離・回収も効率的に行うことができる。なお、繊維径が同じ細胞分離材が連続して積層された部分は、積層された細胞分離材の枚数によらず１層として扱う。
【００４０】
また、前記容器２には、液体導入口９側に独立して細胞分離材１１内に留まっている非付着細胞を洗浄するための洗浄液導入口を設けたり（図示せず）、液体導出口１０側に独立して細胞分離材に捕捉された細胞を回収するための細胞回収液導入口（細胞含有液及び洗浄液の流れとは逆方向から細胞回収液を流すため）を備えたりしてもよい（図示せず）。
【００４１】
前記容器２は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては、具体的には非反応性ポリマー、生体親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料（生体親和性金属、合金）としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。特に好ましくは、耐滅菌製を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
【００４２】
（隆起部）
本発明のフィルターは、前記容器内に充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有する。
前記隆起部とは、図２（ｂ）、３（ａ）、３（ｂ）に示すように、細胞分離材１１の表面における隆起した部分（１２ａ、１２ａ’、１２ａ’’、１２ｂ、１２ｂ’、１２ｂ’’）をいう。より詳細には、図３（ａ）、３（ｂ）に示すように、フィルターの液体導入口９及び液体導出口１０に対して平行な細胞分離材１１の縦断面において、液体導入口９側又は液体導出口１０側の細胞分離材１１の表面の最も低い部分（液体導入口９側であれば部分１３）から盛り上がった部分であり、液体導入口９側であれば、頂点（１４ａ、１４ａ’、１４ａ’’）を有する部分をいう。例えば、図２（ｂ）、３（ａ）、３（ｂ）では、頂点１４ａを有する隆起部１２ａ、頂点１４ａ’を有する１２ａ’、頂点１４ａ’’を有する１２ａ’’という３つの隆起部が、凹部１５ａ、１５ａ’を境としてつながった形状をしている。
【００４３】
前記隆起部間の凹部とは、隆起部同士の間の凹んだ部分をいう。例えば、図２（ｂ）に示すフィルター１は、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面に３つの隆起部１２ａ、１２ａ’、１２ａ”、その間に２つの凹部１５ａ、１５ａ’を有する。また液体導出口１０側の細胞分離材１１の表面に３つの隆起部１２ｂ、１２ｂ’、１２ｂ”、その間に２つの凹部１５ｂ、１５ｂ’を有する、
前記隆起部間の凹部１５ａ、１５ｂは、いずれも略山形の２つの隆起部の間で、曲線状に凹んだ谷形状となっている。なお、本発明では、前記凹部はフィルター内に導入される細胞含有液と直接接触できる状態の凹部をいう。したがって、後述のように、前記ノズル付押え部材４、５に突起部１６を設けることで、前記細胞分離材１１の表面を押圧して生じた凹んだ部分では、突起部と細胞分離材の表面とが接触しているため、隆起部間凹部には該当しない。
【００４４】
前記のような隆起部や隆起部間凹部を細胞分離材の表面に形成する方法としては、前記細胞分離材の表面に予め隆起部や隆起部間凹部が形成される加工、例えば、エンボス加工等が施された細胞分離材を用いることが挙げられる。
【００４５】
また、細胞分離材の材質等によらずに簡便に隆起部等を形成できる観点から、ノズル付押え部材４、５の容器２の本体３の内腔に差し込む先端面に、図５に示すように、突起部１６ａ、１６ｂを設けることで、容器２内に充填した前記細胞分離材１１の表面を押圧することができる。そして、前記突起部１６ａ、１６ｂは、前記容器２の内腔側に突き出ており、前記容器２に充填している前記細胞分離材１１の上部側又は下部側の表面を押圧することで、隆起部を形成することができる。
【００４６】
前記突起部１６ａ、１６ｂの先端面の形状としては、特に限定はないが、線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状が挙げられる。
中でも、前記突起部を少なくとも２つ以上組み合わせると、突起部で細胞分離材の表面を押圧した際に、隆起部間にひずみが生じて隆起部間凹部を形成しやすくなる。
例えば、図２（ａ）に示すように、略円形の突起部１６ａで細胞分離材１１の周囲を丸形に押圧し、さらに略１２０°間隔で周囲から中心部方向にかけて棒形の突起部１６ｂで押圧すると、押圧されていない細胞分離材１１の表面にひずみが生じて、図２（ｂ）、図３（ａ）、３（ｂ）に示すように複数の隆起部及びこれらの隆起部の間に略谷状の複数の凹部が形成される。具体的には、隆起部１２ａ、１２ａ’’は、略円形の突起部１６ａ及び突起部１６ｂ同士で３方向を囲まれた細胞分離材１１の表面に生じる大きい隆起部であり、隆起部１２ａ’は液体導入口９の下方向にある中央付近の小さい隆起部である。したがって、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面には隆起部が４つ生じている。また、前記大きい隆起部１２ａと小さい隆起部１２ａ’との間（前記隆起部１２ａ’’と１２ａ’との間も同じ）には凹部１５ａが生じるので、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面には凹部が全部で３つ生じている。
【００４７】
前記突起部の先端面の面積としては、隆起部、特に隆起部間凹部の形成をし易くする観点から、前記細胞分離材の表面積の３０％以下であることが好ましい。
なお、突起部の先端面の面積は、定規等を用いて測定して計算すればよいし、また、先端面の断面積における縦の長さ（ｙ）、横の長さ（ｘ）を測定するための原点（０、０）を定め、原点以外の複数点を測定し、エクセルを用いて積分計算することで近似面積を算出すればよい。
【００４８】
なお、前記突起部の先端面は、図５に示すように、全ての突起部の高さを一致するように調整してもよいし、突起部の高さを変えるように調整して先端面に立体的な段差があるように調整してもよい。
【００４９】
本発明では、前記隆起部のうち少なくとも１つの隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ２＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ２−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲であることを特徴とする。
なお、ａ、ｂはともに定数であり、０を超える数値である。
【００５０】
前記式（１）は、細胞分離材の上下方向に平行な縦断面において、上側表面にある略放物線状の隆起部の外形を示す式である。
また、前記式（２）は、細胞分離材の上下方向に平行な縦断面において、下側表面にある略放物線状の隆起部の外形を示す式である。
したがって、本発明のフィルターとは、前記細胞分離材の上下表面のいずれかに形成される隆起部の少なくとも１つの隆起部の外形が前記式（１）及び／又は式（２）を満たすフィルターをいう。
【００５１】
前記隆起部の外形を確認するための縦断面の位置としては、略放物線状の断面が確認できればよく、特に限定はない。
前記縦断面に示される隆起部の断面の高さと長さが、それぞれ隆起部の高さｙ、隆起部の長さｘとなる。ｙ、ｘともに、隆起部の最も低い位置を原点（０、０）として設定し、ｙについては上方向の高さを「＋」、下方向の高さを「−」で示す。
【００５２】
前記ａは、前記式（１）又は式（２）を満たす隆起部における隆起の大きさを示す指標であり、前記ａの値が大きくなるほど、上方向又は下方向に高く隆起していることになる。一方、ａの値が小さくなるほど、上方向又は下方向に低く隆起していることになる。
フィルター自体の構造及び機能を維持し、細胞回収時の理想的な通液を行う観点から、前記ａとしては０．０３０〜０．１２０であることが好ましく、０．０３６〜０．１１５であることがより好ましい。また、前記ｂとしては０．３〜１．５であることが好ましく、０．４〜１．４であることがより好ましい。
【００５３】
前記隆起部の縦断面におけるｙ、ｘの原点（０、０）を定め、原点以外の複数点を測定し、それらの数値を計算ソフトに入力して近似曲線を計算することでａ、ｂを含む前記式（１）又は式（２）を算出することができる。
測定する点としては、原点を含めて少なくとも５点以上が好ましい。
なお、前記原点は、縦断面における隆起部が生じる最も低い位置に設定すればよい。また前記原点は隆起部毎に定める。
【００５４】
例えば、図４（ａ）に示す上方向の隆起部１２ａの外形を測定する場合、まず原点Ｏ１を定め、次いで、この原点Ｏ１から４点（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）の位置を、Ｒ１（ｙ１、ｘ１）、Ｒ２（ｙ２、ｘ２）、Ｒ３（ｙ３、ｘ３）、Ｒ４（ｙ４、ｘ４）として測定する。そして、これらの数値を表計算ソフトに入力して近似曲線を計算することで式（１）を算出することができる。
【００５５】
一方、図４（ｂ）に示す下方向の隆起部１２ｂの外形を測定する場合、隆起部１２ａとは別の原点Ｏ２を定め、次いで、この原点Ｏ２から４点（Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８）の位置を、Ｒ５（−ｙ５、ｘ５）、Ｒ６（−ｙ６、ｘ６）、Ｒ７（−ｙ７、ｘ７）、Ｒ８（−ｙ８、ｘ８）として測定する。
そして、これらの数値を表計算ソフトに入力して近似曲線を計算することで式（２）を算出することができる。
【００５６】
本発明のフィルターでは、前記式（１）又は式（２）において、ａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲に調整される。
前記ａ／ｂを前記の範囲に調整することで、細胞の回収効率が高くなるという効果が奏される。
前記ａ／ｂと細胞の回収率との技術的な関係については、細胞分離材には細胞回収に適した理想的な形があり、複数の連なった隆起部を有したような形状を表面に有することで細胞回収を行う際に理想的な通液がなされ、結果として細胞回収効率が向上するということが考えられる。
前記ａ／ｂとしては、０．０５〜０．１０がより好ましく、０．０６〜０．０９３がさらに好ましい。
【００５７】
本発明のフィルターでは、細胞の回収効率が高くなる観点から、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１つの表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有することが好ましい。
【００５８】
本発明では、前記細胞分離材の表面の前記隆起部の数をｎ、前記隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ｃ）又は（ｄ）：
（ｃ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｄ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たすようにすることで、細胞回収効率を高くすることが可能になる。
なお、ｎ、ｍは整数であり、ｎ≧２、ｍ≧１である。
【００５９】
なお、前記式（ｃ）、（ｄ）でいう隆起部及び隆起部間凹部は、フィルターに充填した細胞分離材の縦断面に見られる隆起部及び隆起部間凹部である。
【００６０】
前記式（ｃ）の関係を満たす細胞分離材としては、液体導入口側又は液体導出口側の一方に隆起部がある細胞分離材が挙げられる。例えば、図５に示すノズル付押え部材４をフィルター１の液体導入口側又は液体導出口側に用いた場合、細胞分離材１１の表面において、４つの隆起部及び３つの隆起部間凹部が生じるため、前記式（ｃ）の関係を満たすことになる。
前記式（ｃ）の関係を満たす他形態の細胞分離材としては、例えば、ノズル付押さえ部材４に存在する突起部１６ｂの数が図５記載の数とは異なったノズルを用いた場合等が挙げられる。例えば、前記突起部１６ｂが２つある場合、突起部同士の間に２つの楕円形隆起部及び中央部に１つの円形隆起部があり、楕円形隆起部と円形隆起部との間に凹部が１つあるため、細胞分離材の表面には隆起部３つ隆起部間凹部２つが生じる。
また、前記突起部１６ｂが４つある場合、突起部同士の間に４つの楕円形隆起部及び中央部に円形隆起部があり、楕円形隆起部と円形隆起部との間に凹部が１つあるため、細胞分離材の表面には隆起部５つ、隆起部間凹部４つが生じる。
【００６１】
前記式（ｄ）の関係を満たす細胞分離材としては、液体導入口側及び液体導出口側の両方に隆起部がある細胞分離材が挙げられる。例えば、図５に示すノズル付押え部材４をフィルター１の液体導入口側及び液体導出口側に用いた場合、上下の両面の表面上に隆起部及び隆起部間凹部が生じるため、隆起部が８個、隆起部間凹部６個を有する細胞分離材となり、前記式（ｄ）の関係を満たすことになる。
前記式（ｄ）の関係を満たす他形態の細胞分離材としては、例えば、上記と同様、図５に記載の突起部１６ｂの数とは異なったノズルを用いた場合等が挙げられる。例えば、前記突起部１６ｂが２個あるノズル付押え部材４を用いた場合、上下の細胞分離材の表面には隆起部６つ隆起部間凹部４つが生じる
また、前記突起部１６ｂが４個あるノズル付押え部材４を用いた場合、細胞分離材の表面には隆起部１０個、隆起部間凹部８個が生じる。
【００６２】
従来の細胞分離用フィルターでは、充填される細胞分離材の表面は、蓋や隔壁等により上下方向に対して略平面状に抑えられているのが一般的である。したがって、前記隆起部、中でも隆起部間凹部は、従来のフィルターに充填される細胞分離材表面には見られない形状である。
【００６３】
本発明のフィルターでは、前記細胞分離材の厚みの最小値としては、１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍであることが好ましい。また、細胞分離材の厚みの最大値としては、１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍが好ましく、１．５５×１０〜２．０５×１０ｍｍであることがより好ましい。
【００６４】
本発明のフィルターでは、前記細胞分離材の厚みの最大値について、例えば、図２（ｂ）では、隆起部１２ａ、１２ｂを含む細胞分離材の厚みが他の隆起部を含む細胞分離材の厚みより大きい場合、この厚みＸが細胞分離材１１の最大値となる。
また、細胞分離材１１の厚みの最小値とは、例えば、図２（ｂ）では、前記突起部１６ａで押えられた部分の細胞分離材１１の表面同士の厚みＹとなる。
細胞分離材１１の表面上の隆起部は、立体的な形状で存在しているため、細胞分離材の中心に対して様々な角度で細胞分離材１１の縦断面を観察して、その中で最大の厚み、最小の厚みを計測すればよい。
なお、フィルターの縦断面はＸ線ＣＴによる撮影を行うことで観察しており、細胞分離材１１の縦断面の各部の長さについては、ＣＴデータビューアー（ボリュームグラフィックス社製、商品名「ｍｙＶＧＬ２．２」）を用いて測定すればよい。
【００６５】
また、本発明のフィルターでは、前記隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０２ｍｍ２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０２〜５．６１×１０２ｍｍ２とすることでより細胞回収に適した隆起部の外形に調整することができるという利点がある。
【００６６】
前記細胞分離材の断面積とは、前記容器の上下方向に対して平行に前記細胞分離材を切断したときの縦断面積をいう。
前記隆起部の断面積とは、上方向又は下方向に対して隆起部の高さが最大となる位置を含む部分で前記細胞分離材を上下方向に切断したときの断面積をいう。また、前記隆起部以外の断面積とは、前記のように細胞分離材を上下方向に切断して測定した総断面積から、隆起部の断面積を引いた面積をいう。
例えば、図２（ｂ）に示すフィルター１の細胞分離材１１の縦断面を図６に示す。
細胞分離材の断面積は、図示される全ての断面積（α＋β＋α’）である。
一方、隆起部の断面積については、液体導入口９側の断面積αと液体導出口１０側の断面積α’とがあり、これらの和（α＋α’）が隆起部の断面積となる。
そして、前記細胞分離材の断面積から隆起部の断面積を引いた残りの断面積（β）が隆起部以外の断面積となる。
前記比率（α＋α’）／βは、０．２３〜０．４２の範囲に調整することがより好ましい。
【００６７】
（細胞）
本発明で目的とされる細胞とは、白血球や単核球であればよく、特に限定されないが、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞等のリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板等、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞等の体細胞又は、遺伝子の導入や分化等の処理を行った細胞が例示される。
【００６８】
（細胞分離方法）
本発明のフィルターは、前記のように様々な細胞、特に、白血球、造血幹細胞及び／又は単核球の回収に好適に使用される。
白血球としては、末梢血中の好中球、好酸球、好塩基球等の顆粒球及び単球、リンパ球等の単核球が例示される。
【００６９】
前記フィルターを用いる細胞分離方法としては、前記フィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む方法が挙げられる。
【００７０】
前記細胞含有液としては、前記白血球、造血幹細胞及び／又は単核球を含む細胞を含む懸濁液であれば特に限定されず用いることができるが、例えば、臍帯等の生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理等をした後の懸濁液、血液や骨髄液、臍帯血等の体液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理等の前処理をして調製された懸濁液等が例示される。
【００７１】
また、前記に例示した白血球等の細胞を生体外で培養液や刺激因子等を用いて培養や増殖等をした後の懸濁液であってもよい。
【００７２】
前記第一の工程において、前記フィルターの液体導入口から前記細胞含有液を導入する際には、前記細胞含有液を加圧することでフィルター内への細胞含有液の導入を行い、細胞含有液をフィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を前記細胞分離材に捕捉させる。前記加圧の程度としては、特に限定はない。
【００７３】
前記細胞分離材は、白血球及び／又は単核球を捕捉できるものを使用すればよい。
なお、白血球以外の血液成分については、不要成分として除いてもよいし、必要に応じて回収してもよく、特に限定はない。
【００７４】
前記第二の工程において、白血球等を捕捉したフィルターには回収液を導入することで、フィルターから白血球等を回収液中に分離させ、この白血球等を含む回収液を液体導入口から回収専用のバッグ等に導入することで白血球等を回収することができる。
前記回収液は、フィルターの液体導出口からフィルター内に導入される。
【００７５】
前記回収液は、細胞と等張である溶液であれば特に限定はないが、生理食塩液やリンゲル液等の注射溶剤として使用実績のあるものや、緩衝液、細胞培養用の培地等が挙げられる。特に、培養工程を経る際はそのまま培養が行える培地が好ましく、培養工程を経ずそのまま治療に用いる際は、生理食塩液等の点滴等に使用実績のある等張液等、安全性が保証されている回収液を使用することが好ましい。
【００７６】
本発明において前記第一工程及び第二工程は、前記室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。冷蔵温度下で行う場合、冷蔵された細胞含有液を処理することが挙げられる。細胞含有液の保管としては、冷蔵温度に設定した冷蔵庫による保管、ウォーターバスによる保管、及びドライアイスによる保管等が挙げられる。汎用性から冷蔵庫で保存することが好ましい。冷蔵温度としては、１℃以上６℃以下が好ましく、より好ましくは３℃以上５℃以下が好ましい。冷蔵温度が１℃未満では細胞は死滅し、６℃を超えて保存すると細菌が繁殖しコンタミネーションを起こす可能性がある。
【００７７】
また、細胞分離材の状態を整えて、細胞を捕捉しやすくする観点から、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させてもよい。
【００７８】
また、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去することで、回収される細胞内へ不要成分を低減することができる。
【００７９】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
図７に示すように、直径５２ｍｍのポリカーボネート製の円筒状容器本体３に、ポリブチレンテレフタラート製の円形の不織布（細胞分離材１１）１１２枚を、積層状態で充填し、前記容器本体３の上下の開口部に図５で示すノズル付押え部材４、５を差し込み、その上からキャップ６、７でネジ止めすることで図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すような構造を有するフィルター１を作製した。【００８１】
前記フィルター１では、上下の２つのノズル付押え部材４、５の突起部１６ｂ同士の向きを揃えて、突起部１６ｂの先端面で押えた不織布の厚みが細胞分離材の厚みの最小値となるようにした。なお、上下の突起部１６ｂの先端面間の距離は１２ｍｍ（細胞分離材の厚みの最小値）に調整した。【００８２】
ノズル付押え部材４、５の突起部１６ｂの断面を含む位置で前記細胞分離材１１の縦断面を観察したところ、図８に示すように液体導入口側の表面に隆起部１２ａ、１２ａ’、凹部１５ａ、及び液体導出口側の表面に隆起部１２ｂ、１２ｂ’、凹部１５ｂが確認された。なお、隆起部１２ａ’、１２ｂ’はいずれも突起部１６ｂ同士の間にあり、上面から見た形状が略楕円形状の大きな隆起部であり、隆起部１２ａ、１２ｂはいずれも細胞分離材１１の中央部に付近にあり、上面から見た形状が略円形状の小さな隆起部であった。したがって、隆起部は全部で８個、隆起部間凹部は６個あった。
その他様々な角度から前記細胞分離材１１の縦断面を見た結果、本断面で細胞分離材の厚みが最大となっており、より隆起部の高さが高くなっていた。
次いで、前記４つの隆起部（１２ａ、１２ａ’、１２ｂ、１２ｂ’）についてそれぞれの高さ及び長さの原点Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４を定め、それぞれの原点から、複数の地点の隆起部の高さ及び長さを測定した。その結果を表１に示す。【００８３】
【表１】
2016002505.tif 000003
【００８４】
以上の隆起部について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製表計算ソフト「Ｅｘｃｅｌ」の表計算機能を利用して、「多項式近似」で「２次」を選択して近似曲線を算出したところ、以下のようになった。
上側隆起部１２ａ  ：ｙ＝−０．０８６５ｘ２＋１．０５１ｘ
上側隆起部１２ａ’：ｙ＝−０．１１５３ｘ２＋１．２３１ｘ
下側隆起部１２ｂ  ：ｙ＝０．０７２９ｘ２−０．９１８３ｘ
下側隆起部１２ｂ’：ｙ＝０．０４７３ｘ２−０．８０１８ｘ【００８５】
また、観察する縦断面の位置を前記細胞分離材の中心から３°程度回転し、上側表面の前記突起部１６ｂの横にある隆起部を含む縦断面を観察し、この隆起部についても新たに原点を定め、その原点から複数の地点の隆起部の高さ及び長さを測定した。その結果を表２に示す。【００８６】
【表２】
2016002505.tif 000004
【００８７】
前記隆起部の外形について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」の表計算機能を利用して、近似曲線を算出したところ、以下のようになった。
ｙ＝−０．０３６７ｘ２＋０．４３１５ｘ【００８８】
なお、フィルター１に充填される細胞分離材の状態は以下の通りであった。
（細胞分離材の厚み）
フィルター内の細胞分離材の厚みの最大値（Ｘ）：１８．４６ｍｍ
フィルター内の細胞分離材の厚みの最小値（Ｙ）：１２.０９ｍｍ
液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み：１３．９６〜１６．９２（ｍｍ）
（細胞分離材の断面積）
隆起部の断面積の和：１４４．９３〜１８２．４６ｍｍ２
隆起部以外の断面積：５４５．８６ｍｍ２【００８９】
（実施例２）
前記フィルター１における上下の２つのノズル付押え部材４、５の突起部１６ｂ同士の向きを揃えず、中心から６０°回転させて固定した以外は、実施例１と同様にしてフィルター１を作製した。【００９０】
次いで、上側及び下側にある任意に選択した隆起部（１２ａ、１２ｂ）についてそれぞれの高さ及び長さの原点を定め、その原点から、複数の地点の隆起部の高さ及び長さを測定した。その結果を表３に示す。【００９１】
【表３】
2016002505.tif 000005
【００９２】
以上の隆起部の外形について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」の表計算機能を利用して、「多項式近似」で「２次」を選択して近似曲線を算出したところ、以下のようになった。
上側隆起部１２ａ  ：ｙ＝−０．０３８７ｘ２＋０．６８２９ｘ
下側隆起部１２ｂ  ：ｙ＝０．０３６２ｘ２−０．４４６９ｘ【００９３】
（実施例３）
積層する細胞分離材の枚数を１４０枚にした以外は、実施例１と同様にしてフィルター１を作製した。細胞分離材の厚みの最小値は変えず、積層枚数を変えることで圧縮を強め、細胞分離材がより隆起し易いようにした。【００９４】
次いで、上側の隆起部１２ａについてそれぞれの高さ及び長さの原点Ｏを定め、その原点から、複数の地点の隆起部の高さ及び長さを測定した。その結果を表４に示す。【００９５】
【表４】
2016002505.tif 000006
【００９６】
前記隆起部の外形について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」の表計算機能を利用して、「多項式近似」で「２次」を選択して近似曲線を算出したところ、以下のようになった。
上側隆起部１２ａ  ：ｙ＝−０．１０９４ｘ２＋１．４３８５ｘ【００９７】
実施例１〜３の結果より、フィルター１に充填されている細胞分離材表面にある様々な隆起部の外形について、上側の隆起部の外形は前記式（１）、下側の隆起部の外形は前記式（２）で示すことができることがわかる。【００９８】
（比較例１）
事前に積層状態の高さが１２ｍｍとなるようにプレスして、細胞分離材の表面が略平面状として隆起部の高さを抑えた不織布(１１２枚)を充填した以外は、実施例１と同様にして、フィルター１を作製した。【００９９】
次いで、下側の隆起部１２ｂについて高さ及び長さの原点を定め、その原点から、複数の地点の隆起部の高さ及び長さを測定した。その結果を表５に示す。【０１００】
【表５】
2016002505.tif 000007
【０１０１】
前記隆起部について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」の表計算機能を利用して、「多項式近似」で「２次」を選択して近似曲線を算出したところ、以下のようになった。
隆起部１２ｂ  ：ｙ＝０．０１６３ｘ２−０．２５４３ｘ【０１０２】
（試験例１）
次に、実施例１〜３及び比較例１で得られた前記細胞分離フィルター１の液体導入口９と液体導出口１０に、図９で示した回路を接続して細胞分離用デバイス２５を作製した。【０１０３】
図９に示す前記回路において、前記液体導入口９にはチューブ１７ａを接続し、このチューブ１７ａには、細胞懸濁液を収容する手段１８及びプライミング用生理食塩水を収容する手段１９に接続したチューブ１７ｂと、フィルターを通過した回収液を収容する手段（回収バッグ）２０及び回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段２１に接続したチューブ１７ｃとを、流路切り替え手段２２ａを介して接続した。
前記チューブ１７ｂには流路切り替え手段２２ｂを介して、細胞懸濁液を収容する手段１８とプライミング用生理食塩水を収容する手段１９とを接続した。
前記チューブ１７ｃには流路切り替え手段２２ｃを介して、前記フィルターを通過した回収液を収容する手段２０と回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段２１とを接続した。
また、前記液体導出口１０にはチューブ１７ｄを接続し、流路切り替え手段２２ｄを介して、フィルターを通過した細胞懸濁液を収容する手段（廃液バッグ）２３及び回収液を回収する手段２４と接続した。【０１０４】
次に前記細胞分離用デバイス２５を用いて細胞分離操作を実施した。なお、各流路切り替え手段の操作は、フィルター１に通液する液体の種類、送液する目的の手段に応じて、適宜行った。【０１０５】
まず、プライミング用生理食塩水を収容する手段１９としてシリンジを用いて手押しで生理食塩水１５０ｍＬをフィルター１内に通液してプライミング操作を行い、廃液バッグ２３にフィルター１を通過した生理食塩水を回収した。
次に細胞懸濁液を収容する手段１８からＣＰＤ抗凝固の新鮮ウシ血液１００ｍＬ（血液保存液Ｃ液（ＣＰＤ）：血液＝１：４で混合した２０％ＣＰＤを含むウシ抹消血)をフィルター１に重力を利用して通液して、血液中の白血球を細胞分離材に捕捉させた。通過液は廃液バッグ２３に回収した。
その後、回収液を回収する手段２４としてシリンジを用いて手押しでＨＥＳ(ヒドロキシエチルスターチ)溶液を液体導出口１０からフィルター１内に通液し、液体導入口９から回収バッグ２０に白血球を回収した。
処理前血液の血算、回収後の溶液の血算には血球カウンター(商品名「Ｋ−４５００」、シスメックス社製)を用い、それぞれの測定結果より白血球の回収率を算出した。【０１０６】
実施例１及び２で得られたフィルターでは、細胞(白血球)回収率は７５％〜８２％となった。実施例３で得られたフィルターでは、細胞回収率は７６％となり、細胞回収率(性能)の低下は見られなかった。
一方、比較例１では、細胞回収率が６５％となり、細胞回収率(性能)の低下が見られた。【０１０７】
（試験例２）
白血球回収後の実施例１、３及び比較例１で使用したフィルターからそれぞれ細胞分離材を取り出して、白色の吸収紙の上に置いた。
その結果、図１０に示すように、実施例１及び３で得られた細胞分離材ではほぼ細胞分離材本来の色（白色）となっていたのに対して、比較例１で得られた細胞分離材からは血液由来の成分が多量に残存しており、赤色に染まっていた。
したがって、実施例１及び３で使用したフィルター１のように、充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を形成し、且つ前記細胞分離材の外形が所定の式を満たすことで、血液成分の回収ロスを減らすことができ、目的の細胞をより効率よく回収することができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明で回収さられた細胞は、細胞を培養し増殖させ提供することも、増殖させずに使用することも可能であり、治療用細胞として用いてもよい。具体的な治療対象としては、虚血性疾患、血管系疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【０１０９】
本発明で得られた必要細胞を、分化誘導剤等により分化誘導することにより軟骨損傷患者に移植する細胞、骨疾患患者に移植する細胞、心筋疾患患者又は血管疾患患者に移植する細胞、神経組織を損傷した患者に移植する細胞として使用することができるが、これらに限定されるものではない。
該分化誘導剤としては、目的とする細胞を分化誘導できるものを使用することが好ましいが、軟骨への分化誘導剤としてはデキサメタゾン、ＴＧＦβ、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン、プロリン、アスコルビン酸、ピルビン酸塩、セレン等が挙げられ；骨への分化誘導剤としてはデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、ビタミンＣ、アスコルビン酸塩等が挙げられ、；心筋への分化誘導剤としてはＥＧＦ、ＰＤＧＦ、５−アザシチジン等が挙げられ；神経への分化誘導剤としてはＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｂＨＬＨ等が挙げられ；血管への分化誘導剤としてはｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ等が挙げられる。【０１１０】
本発明により回収した細胞や増殖させた細胞を凍結保存してもよい。細胞のへのダメージを少なくできる点から、液体窒素を用いて凍結保存することが好ましい。また、凍結保存した細胞を融解し、ヒトや動物への移植、研究への使用、又は再度培養することができる。【０１１１】
本発明により回収した細胞や増殖させた細胞を用いて薬品組成物を製造することができる。前記細胞を製薬的に許容される添加剤と混合することで医薬品組成物を製造することができる。製薬的に許容される添加剤としては、凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
【符号の説明】
【０１１２】
１  フィルター
２  容器
３  本体
４、５  ノズル付押え部材
６、７  キャップ
８  シール
９  液体導入口
１０  液体導出口
１１  細胞分離材
１２ａ、１２ａ’、１２ｂ、１２ｂ’  隆起部
１３  細胞分離材１１の表面の最も低い部分
１４ａ、１４ａ’、１４ａ’’  隆起部の頂点
１５ａ、１５ａ’、１５ｂ、１５ｂ’  隆起部間凹部
１６、１６ａ、１６ｂ  突起部
１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ  チューブ
１８  細胞懸濁液を収容する手段
１９  プライミング用生理食塩水を収容する手段
２０  フィルターを通過した回収液を収容する手段（回収バッグ）
２１  回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ  流路切り替え手段
２３  フィルターを通過した細胞懸濁液を収容する手段（廃液バッグ）
２４  回収液を回収する手段
２５  細胞分離用デバイス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月14日(2016.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有しており、
前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下であり、
前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ2＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ2−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲である隆起部を１つ以上有するフィルター。
【請求項２】
前記細胞分離材の表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有する請求項１に記載のフィルター。
【請求項３】
隆起部の数をｎ、隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ｃ）又は（ｄ）：
（ｃ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｄ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たす請求項２に記載のフィルター。
【請求項４】
ａが０．０３０〜０．１２０及び／又はｂが０．３〜１．５である請求項１〜３のいずれかに記載のフィルター。
【請求項５】
細胞分離材の厚みの最小値が１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍ、細胞分離材の厚みの最大値が１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍである請求項１〜４のいずれかに記載のフィルター。
【請求項６】
隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０2ｍｍ2、隆起部以外の断面積が５．４０×１０2〜５．６１×１０2ｍｍ2である請求項１〜５のいずれかに記載のフィルター。
【請求項７】
前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である請求項１〜６のいずれかに記載のフィルター。
【請求項８】
前記突起部を少なくとも２つ以上有する請求項１〜７のいずれかに記載のフィルター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む、細胞分離方法。
【請求項１０】
前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、請求項９に記載の細胞分離方法。
【請求項１１】
さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、請求項９又は１０に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞分離方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
〔１〕細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有しており、
前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下であり、
前記隆起部の高さｙと長さｘが式（１）及び／又は式（２）：
ｙ＝−ａｘ2＋ｂｘ          式（１）
ｙ＝ａｘ2−ｂｘ            式（２）
の関係を満たし、且つａとｂの比率（ａ／ｂ）が０．０３〜０．２５の範囲である隆起部を１つ以上有するフィルター。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
〔７〕前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のフィルター。
〔８〕前記突起部を少なくとも２つ以上有する前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のフィルター。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
〔９〕前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む、細胞分離方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
〔１０〕前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、前記〔９〕に記載の細胞分離方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
〔１１〕さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の細胞分離方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
〔１２〕さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の細胞分離方法。
【国際調査報告】
2016002505.tif 000018
2016002505.tif 000019
2016002505.tif 000020
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