(57)【要約】  下記の(A)、(B)、(C)、及び(D)の操作を施したコリネ型細菌形質転換体は、糖類を原料として、効率よくシキミ酸などを生産できる。(A)  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化(B)  ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を介した細胞内への糖の取り込みの消失、阻害、または減少(C)  ホスホトランスフェラーゼシステムとは異なる糖トランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性、及びグルコキナーゼ活性の強化(D)  グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性の強化【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(A)、(B)、(C)、及び(D)の操作を施したコリネ型細菌形質転換体。
(A)  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化
(B)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を介した細胞内への糖の取り込みの消失、阻害、または減少
(C)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステムとは異なる糖トランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性、及びグルコキナーゼ活性の強化
(D)  グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性の強化
【請求項２】
ジヒドロキシアセトンリン酸の脱リン酸化酵素活性が消失しているか、阻害されているか、または減少している請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項３】
3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性、及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性のいずれか一以上が強化されている請求項１又は２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項４】
トランスケトラーゼ活性、及びトランスアルドラーゼ活性のいずれか一以上が強化されている請求項１〜３のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項５】
シキミ酸キナーゼ活性、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性、及び3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性のいずれか一以上が消失しているか、阻害されているか、または減少している請求項１〜４のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項６】
グルコースと、キシロース、アラビノース、及びセロビオースからなる群より選ばれる少なくとも1種の糖との利用能を有する請求項１〜５のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項７】
下記の(a)又は(b)のDNAが導入されていることにより、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸シンターゼ活性が強化されている請求項１〜６のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(a)  配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)  配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸シンターゼをコードするDNA
【請求項８】
ホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）の構成因子をコードする遺伝子のうち、ヒスチジン-ホスフォリラタブルプロテイン（Histidine-phosphorylatable protein：HPr)をコードするptsH、エンザイムI（Enzyme I)をコードするptsI、及びグルコース特異的エンザイムII（Enzyme II)をコードするptsG遺伝子の一以上の破壊、欠失、又は変異により、PTSを介した細胞内への糖の取り込みが消失、阻害、または減少している請求項１〜７のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項９】
ホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）とは異なる糖トランスポーターがイノシトールトランスポーターである請求項１〜８のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項１０】
下記の(c)又は(d)のDNAが導入されていることにより、イノシトールトランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性が強化されている請求項９に記載のコリネ型細菌形質転換体。
(c)  配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA
(d)  配列番号2と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、イノシトールトランスポーターをコードするDNA
【請求項１１】
下記の(e)又は(f)のDNAが導入されていることにより、グルコキナーゼ活性が強化されている請求項１〜１０のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(e)  配列番号3、4、又は5に記載の塩基配列からなるDNA
(f)  配列番号3、4、又は5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グルコキナーゼをコードするDNA
【請求項１２】
下記の(g)又は(h)のDNAが導入されていることにより、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が強化されている請求項１〜１１のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(g)  配列番号6に記載の塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号6と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA
【請求項１３】
3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性の強化が下記の(i)又は(j)のDNAの導入によるものであり、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性の強化が下記の(k)又は(l)のDNAの導入によるものであり、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の強化が下記の(m)又は(n)のDNAの導入によるものである請求項３〜１２のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(i)  配列番号7に記載の塩基配列からなるDNA
(j)  配列番号7と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸シンターゼをコードするDNA
(k)  配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA
(l)  配列番号8と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼをコードするDNA
(m)  配列番号9に記載の塩基配列からなるDNA
(n)  配列番号9と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA
【請求項１４】
トランスケトラーゼ活性の強化が下記の(o)又は(p)のDNAの導入によるものであり、トランスアルドラーゼ活性の強化が下記の(q)又は(r)のDNAの導入によるものである請求項４〜１３のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(o)  配列番号10に記載の塩基配列からなるDNA
(p)  配列番号10と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスケトラーゼをコードするDNA
(q)  配列番号11に記載の塩基配列からなるDNA
(r)  配列番号11と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスアルドラーゼをコードするDNA
【請求項１５】
コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項１〜１４のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項１６】
コリネバクテリウム グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、またはATCC13869に上記操作を施したものである請求項１５に記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項１７】
コリネバクテリウム  グルタミカム SKM7 (受託番号：NITE BP-01903)。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養する工程と、反応液中のシキミ酸、3-デヒドロシキミ酸、3-デヒドロキナ酸、プロトカテク酸、コリスミ酸、没食子酸(gallic acid)、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アントラニル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、p-アミノ安息香酸、フェノール、及びカテコールからなる群より選ばれる少なくとも１種の有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
【請求項１９】
好気的、かつコリネ型細菌形質転換体が増殖しない条件下でコリネ型細菌形質転換体を培養する請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シキミ酸を工業的に生産できるように操作が施されたコリネ型細菌形質転換体、及びこのコリネ型細菌形質転換体を用いた効率的な有機化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シキミ酸は、分子内に3個の不斉炭素を有する光学活性体であり、多数の医薬品、農薬、化粧品等の合成原料として利用され、特に、インフルエンザ治療薬タミフル（登録商標）の化学合成のための重要な出発原料として用いられている。近年、世界的な流行が懸念されている鳥インフルエンザに対してタミフルの有効性が示されたことにより、原料となるシキミ酸の需要が高まっている。シキミ酸はまた、p-ヒドロキシ安息香酸やフェノール等の有用化学物質に化学的に変換可能であり、それらの合成原料としても有望である。【０００３】
従来、シキミ酸は、シキミ（Illicium anisatum）やトウシキミ（Illicium verum）などの植物の果実から抽出によって得られているが、その抽出、精製方法は、煩雑であり収率が低く、また、原料が天然物であるため、安定供給や大量供給が困難といった問題がある。【０００４】
一方、シキミ酸は、細菌や酵母、植物等が有している芳香族化合物生合成経路の重要な中間体であり、この経路を有する微生物を用いて発酵法により生産することができる。これまでに、大腸菌宿主を利用したシキミ酸生産が報告されているが（特許文献1〜7）、シキミ酸と共にキナ酸が副生成しており、シキミ酸精製を妨げる要因となっていた。また、いずれも好気増殖に伴ってシキミ酸が生産されるため、原料であるグルコースの多くが菌体形成（増殖）に使用され、目的物であるシキミ酸の収率が低いという問題があった。例えば、特許文献4、6に記載のシキミ酸収率は、27％と非常に低い。特許文献1には、グルコースからのシキミ酸の最大収率は43％と記載されているが、これはピルビン酸からのホスホエノールピルビン酸再生や、非ホスホトランスフェラーゼシステムによるグルコースの取込み等の可能性等が考慮されていないため、実際にはシキミ酸の最大理論収率は86％であると考えられる。これより、上記27％というシキミ酸の対糖収率は、理論収率に対しても31％という低収率になる。
特許文献8は、シトロバクター フロインディ（Citrobacter freundii）を用い、4-ヒドロキシ安息香酸アナログである4-ヒドロキシ3-メトキシ安息香酸に耐性な変異株を用いたシキミ酸生産を報告しているが、変異点が不明であり、シキミ酸の生産濃度も低く、対糖収率も不明である。
特許文献9, 10は、バチラス  サブチリス（Bacillus subtilis）の芳香族アミノ酸要求性変異株を用いたシキミ酸生産を報告しているが、変異点が不明であり、シキミ酸の生産濃度も低く、対糖収率も不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許4669613  生物学的触媒によるシキミ酸の合成
【特許文献２】特表2002-535008  生物学的触媒によるシキミ酸の合成
【特許文献３】US 6613552  Biocatalytic synthesis of shikimic acid
【特許文献４】US 6472169  Biocatalytic synthesis of shikimic acid
【特許文献５】EP1151126   Biocatalytic synthesis of shikimic acid
【特許文献６】WO 02/29078   Biocatalytic synthesis of shikimic acid
【特許文献７】WO 2000/044923  Biocatalytic synthesis of shikimic acid
【特許文献８】特開2002-281993 シキミ酸の製造方法
【特許文献９】US 6436664  Method for producing shikimic acid
【特許文献１０】特開 2000-287695 シキミ酸製造法
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biotechnology  Progress (2003) 19, 808-814
【非特許文献２】Microbial Cell Factories (2013) 12:86
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糖類を原料として、効率よくシキミ酸を生産できる微生物、及びこの微生物を用いて効率良く、シキミ酸などの有機化合物を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、コリネ型細菌に以下の(A)〜（D）の操作を施すことにより、グルコース等からシキミ酸を高濃度、且つ、高収率で生成することを見出した。また、シキミ酸生産において従来より問題であったキナ酸の副生が非常に少ないことも見出した。
(A)  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化
(B)   ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を介した細胞内への糖の取り込みの消失、阻害、または減少
(C)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステムとは異なる糖トランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性、及びグルコキナーゼ活性の強化
(D)  グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性の強化
また、このコリネ型細菌は、好気的、かつ実質的に増殖しない条件下で反応させる場合に、特にシキミ酸の生産効率が高いことを見出した。【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のコリネ型細菌形質転換体、及び、有機化合物の製造方法を提供する。
項１．  下記の(A)、(B)、(C)、及び(D)の操作を施したコリネ型細菌形質転換体。
(A)  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化
(B)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を介した細胞内への糖の取り込みの消失、阻害、または減少
(C)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステムとは異なる糖トランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性、及びグルコキナーゼ活性の強化
(D)  グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性の強化
項２．  ジヒドロキシアセトンリン酸の脱リン酸化酵素活性が消失しているか、阻害されているか、または減少している項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項３．  3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性、及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性のいずれか一以上が強化されている項１又は２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項４．  トランスケトラーゼ活性、及びトランスアルドラーゼ活性のいずれか一以上が強化されている項１〜３のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項５．  シキミ酸キナーゼ活性、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性、及び3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性のいずれか一以上が消失しているか、阻害されているか、または減少している項１〜４のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項６．  グルコースと、キシロース、アラビノース、及びセロビオースからなる群より選ばれる少なくとも1種の糖との利用能を有する項１〜５のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項７．  下記の(a)又は(b)のDNAが導入されていることにより、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸シンターゼ活性が強化されている項１〜６のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(a)  配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)  配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸シンターゼをコードするDNA
項８．  ホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）の構成因子をコードする遺伝子のうち、ヒスチジン-ホスフォリラタブルプロテイン（Histidine-phosphorylatable protein：HPr)をコードするptsH、エンザイムI（Enzyme I)をコードするptsI、及びグルコース特異的エンザイムII（Enzyme II)をコードするptsG遺伝子の一以上の破壊、欠失、又は変異により、PTSを介した細胞内への糖の取り込みが消失、阻害、または減少している項１〜７のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項９．  PTSとは異なる糖トランスポーターがイノシトールトランスポーターである項１〜８のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１０．  下記の(c)又は(d)のDNAが導入されていることにより、イノシトールトランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性が強化されている項９に記載のコリネ型細菌形質転換体。
(c)  配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA
(d)  配列番号2と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、イノシトールトランスポーターをコードするDNA
項１１．  下記の(e)又は(f)のDNAが導入されていることにより、グルコキナーゼ活性が強化されている項１〜１０のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(e)  配列番号3、4、又は5に記載の塩基配列からなるDNA
(f)  配列番号3、4、又は5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グルコキナーゼをコードするDNA
項１２．  下記の(g)又は(h)のDNAが導入されていることにより、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が強化されている項１〜１１のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(g)  配列番号6に記載の塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号6と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA
項１３．  3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性の強化が下記の(i)又は(j)のDNAの導入によるものであり、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性の強化が下記の(k)又は(l)のDNAの導入によるものであり、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の強化が下記の(m)又は(n)のDNAの導入によるものである項３〜１２のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(i)  配列番号7に記載の塩基配列からなるDNA
(j)  配列番号7と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸シンターゼをコードするDNA
(k)  配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA
(l)  配列番号8と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼをコードするDNA
(m)  配列番号9に記載の塩基配列からなるDNA
(n)  配列番号9と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA
項１４．  トランスケトラーゼ活性の強化が下記の(o)又は(p)のDNAの導入によるものであり、トランスアルドラーゼ活性の強化が下記の(q)又は(r)のDNAの導入によるものである項４〜１３のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
(o)  配列番号10に記載の塩基配列からなるDNA
(p)  配列番号10と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスケトラーゼをコードするDNA
(q)  配列番号11に記載の塩基配列からなるDNA
(r)  配列番号11と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスアルドラーゼをコードするDNA
項１５．  コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項１〜１４のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１６．  コリネバクテリウム グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、またはATCC13869に上記操作を施したものである項１５に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１７．  コリネバクテリウム  グルタミカム SKM7 (受託番号：NITE BP-01903)。
項１８．  項１〜１７のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養する工程と、反応液中のシキミ酸、3-デヒドロシキミ酸、3-デヒドロキナ酸、プロトカテク酸、コリスミ酸、没食子酸(gallic acid)、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アントラニル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、p-アミノ安息香酸、フェノール、及びカテコールからなる群より選ばれる少なくとも１種の有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
項１９．  好気的、かつコリネ型細菌形質転換体が増殖しない条件下でコリネ型細菌形質転換体を培養する項１８に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
コリネ型細菌に上記特定の操作を施すことにより得られた形質転換体を用いることにより、グルコースなどの糖類からシキミ酸を高濃度、且つ、高収率で製造できる。また、従来シキミ酸精製時に分離が問題とされていたキナ酸の副生が抑えられているためシキミ酸の精製が容易である。
また、このコリネ型細菌形質転換体は、シキミ酸から代謝生成する有機化合物や、糖からシキミ酸までの代謝経路上に存在する化合物についても効率よく生産する。
さらに、このコリネ型細菌形質転換体は、増殖抑制条件下、且つ、好気反応を行うことによりシキミ酸を含む有機化合物の生産効率が一層高くなる。
従って、本発明により、抗インフルエンザ薬の原料として有用なシキミ酸などを安価に大量生産可能となった。【００１１】
本発明では、シキミ酸生産効率の点で、宿主としてコリネ型細菌を用いること、及び、人為的な操作による特定の遺伝子の組合せが重要である。コリネ型細菌のその他のメリットとして、コリネ型細菌は、大腸菌とは異なりエンドトキシンを生成しない点や、増殖制限条件下でも反応が生じるため、大腸菌の増殖に一般に求められる芳香族アミノ酸、4-アミノ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸などを培養液に添加する必要が無い点、増殖制限条件下でシキミ酸生成反応が生じるため、糖が増殖に使用されず目的物質の生産に使われるため収率が高い点、が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】コリネ型細菌における糖の取り込みからシキミ酸などの生産までの代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の理解を容易にするため、図1に、コリネ型細菌における糖の取り込みからシキミ酸等の生産に至るまでの代謝経路を模式的に図示した。
（１）シキミ酸生産能が向上したコリネ型細菌形質転換体
本発明のシキミ酸生産能が向上したコリネ型細菌形質転換体は、下記の(A)、(B)、(C)、及び(D)の操作が施されたものである。
(A)  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化
(B)  ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を介した細胞内への糖の取り込みの消失、阻害、または減少
(C)  PTSとは異なる糖トランスポーターを介して細胞内へ糖を取り込む活性、及びグルコキナーゼ活性の強化
(D)  グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性の強化
【００１４】
DAHPシンターゼ活性の強化
3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼは、エリスロース-4-リン酸（E4P）とホスホエノールピルビン酸（PEP）とから芳香族化合物生合成共通経路の初発代謝産物であるDAHPを生成する酵素である。
DAHPシンターゼ活性は、DAHPシンターゼ遺伝子の導入、又はコリネ型細菌の染色体上のDAHPシンターゼ遺伝子の制御配列および遺伝子コード領域における変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
【００１５】
このうち、DAHPシンターゼ遺伝子の導入によりDAHPシンターゼ活性を強化することが簡便で効率がよい。
導入するDAHPシンターゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、エシェリヒア  コリ(Eschelichia coli)由来の遺伝子が好ましい。
エシェリヒア  コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子としては、配列番号1の塩基配列からなるDNA（aroG S180F）がより好ましい。この遺伝子は、エシェリヒア  コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子の一つであるaroG遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の180番目のセリンをフェニルアラニンに変異させる変異(S180F)が導入された遺伝子であり、その遺伝子産物が芳香族アミノ酸を含む芳香族化合物によるフィードバック阻害への耐性、及び、高いDAHPシンターゼ活性を示すことは、本発明者らが比較検討により見出している（未発表）。
【００１６】
また、本発明では、配列番号1と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、DAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００１７】
また、本発明では、配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつDAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
【００１８】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がDAHPシンターゼであることは、該DNAがコードするタンパク質について、DAHPシンターゼ活性を測定することによって確認する。DAHPシンターゼ活性は、20 mM ビストリスプロパンバッファー(pH 6.8)、500μM ホスホエノールピルビン酸 (PEP)ナトリウム、500μM エリスロース−4−リン酸、1 mM 塩化マンガンからなる試験用液に被験酵素を添加した反応液を調製し、PEPの吸収 (=2800/M・cm)を示す232 nmの吸光度の減少を指標に測定する。28℃において、1分間に1μmolのDAHPが生成される活性を、1 unitのDAHPシンターゼ活性とした。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のDAHPシンターゼ活性が強化されていることは、コリネ型細菌形質転換体の細胞抽出液中のDAHPシンターゼ活性の測定によって確認する。
【００１９】
PTSを介した細胞内への糖の取り込みの消失・阻害・減少
ホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）は、グルコースなどの糖の細胞内への取り込みと糖のリン酸化を共役して行うことを特徴とする、原核生物のみに存在する糖輸送機構である。大腸菌やコリネ型細菌において、糖の細胞内への取り込みにはPTSが主要な役割を果たしている。PTSは、共通コンポーネントであるエンザイムI(Enzyme I）(PEP Protein kinase)、HPr (Histidine-phosphorylatable protein；ヒスチジン-ホスフォリラタブルプロテイン)、及び各種糖の特異的な輸送に関わる膜タンパク質であるエンザイムII(Enzyme II）によって構成され、解糖系由来のホスホエノールピルビン酸（PEP）をリン酸供与体とし、これら構成因子間のリン酸リレーを介して糖をリン酸化体として細胞内へ輸送するシステムである。しかし、PTSはグルコースの細胞内への輸送に伴って、シキミ酸を含む芳香族化合物の共通前駆体の一つであるPEPを消費する。このため、シキミ酸等の芳香族化合物の高生産のためには、PEPを消費しないPTSとは異なるグルコース輸送系を利用することが好ましい。
【００２０】
PTSを介した細胞内への糖の取り込みは、コリネ型細菌の染色体上のPTSをコードする遺伝子の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
Enzyme Iをコードする遺伝子、Hprをコードする遺伝子、及びEnzyme IIをコードする遺伝子の１以上が破壊、欠失、又は変異していればよく、PTSの共通コンポーネントであるHprタンパク質をコードする遺伝子が破壊され、欠失し、又は変異していることが好ましい。
グルコース輸送に関与するPTSをコードする遺伝子としては、Enzyme IをコードするptsI、HprをコードするptsH、Enzyme IIをコードするptsG等が挙げられる。これらの１以上が破壊、欠失、又は変異していればよく、PTSの共通コンポーネントであるHprタンパク質をコードするptsH遺伝子が破壊され、欠失し、又は変異していることが好ましい。
【００２１】
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００２２】
本発明において、コリネ型細菌形質転換体のPTSを介した糖の輸送活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体において、PTSによって輸送される糖(グルコース、スクロース、フルクトースなど)を炭素源とする生育が消失、阻害、または抑制されており、そのような表現型が正常なpts遺伝子の導入によって回復することによって確認する。
【００２３】
PTSとは異なる糖輸送系を介した糖取り込み活性の強化
コリネバクテリウム グルタミカムにおいては、糖の取り込みにPEPを消費しない、PTSとは異なるグルコース輸送系(非PTSグルコースパーミアーゼ)が存在することが知られている。pts遺伝子の破壊等によってPTSを介した糖の取り込みが阻害されたコリネバクテリウム グルタミカムは、グルコースを単一炭素源として増殖できなくなるか、または増殖能が著しく低下するが、その株に対して非PTSグルコースパーミアーゼを高発現させると、グルコースを単一炭素源とした増殖が回復する(Ikeda, M., et al., Identification and application of a different glucose uptake system that functions as an alternative to the phosphotransferase system in Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1443-1451, Lindner, S. N., et al., Phosphotransferase system-independent glucose utilization in Corynebacterium glutamicum by inositol permeases and glucokinases. Appl. Environ. Microbiol. 77: 3571-3581)。
本発明においては、PTSによる糖輸送を遮断したコリネバクテリウム グルタミカムにおいて、グルコースの細胞内への取り込み、及び、グルコースを炭素源とする菌の増殖が、糖輸送に伴ってPEPを消費しない非PTSグルコースパーミアーゼ活性を強化することによって改善されていることが望ましい。このことにより、グルコースの輸送に伴うPEPの消費を回避し、より多くのPEPをシキミ酸等の芳香族化合物生合成のために供給することが可能になると考えられる。
【００２４】
非PTSグルコースパーミアーゼによるグルコースの細胞内への取り込みは、非PTSグルコースパーミアーゼをコードする遺伝子の導入、又はコリネ型細菌の染色体上の非PTSグルコースパーミアーゼ遺伝子(制御配列またはコード領域)における変異導入、又は塩基配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
これらのうち、非PTSグルコースパーミアーゼ遺伝子の導入によりグルコースの取り込み活性を強化することが簡便で効率がよい。
導入する非PTSグルコースパーミアーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムであることが好ましい。
【００２５】
非PTSグルコースパーミアーゼは、コリネ型細菌内で機能するものであればよく、コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーター(iolT1, iolT2)、大腸菌(エシェリヒア  コリ)由来のガラクトースパーミアーゼ（galP）、ザイモモナス  モビリス (Zymomonas mobilis)由来のグルコースファシリテーター(glf)  等が挙げられる。中でも、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーターを介した糖取り込み活性が強化されていることが好ましい。
【００２６】
コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーター遺伝子としては、配列番号2の塩基配列からなるDNA（iolT1）が挙げられる。
また、本発明では、配列番号2と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、イノシトールトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号2と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイノシトールトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００２７】
本発明において、DNAがコードするタンパク質が非PTSグルコースパーミアーゼであることは、ptsH遺伝子破壊等によりPTS依存的なグルコース輸送能を失い、グルコースを炭素源とする生育が低下している宿主細胞に対して、該DNAを導入、発現させた形質転換体のグルコースを炭素源とする生育、または、グルコース消費速度が、形質転換前の細胞と比べて高まっていること、また、その効果がpts遺伝子破壊等によるPTS依存的な糖輸送の阻害による影響を受けないことを指標として確認する。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体の非PTSグルコースパーミアーゼ活性が強化されていることは、pts遺伝子破壊等によりPTS依存的なグルコース輸送能を欠損した宿主細胞におけるグルコースを炭素源とする生育、または、グルコース消費速度が、該コリネ型細菌形質転換体において、遺伝子導入前の株と比べて高まっていることを指標として確認する。
【００２８】
グルコキナーゼ活性の強化
非PTSグルコースパーミアーゼによって細胞内に取り込まれたグルコースは、PTSによる糖輸送とは異なり、リン酸化されていない。従って、非PTSグルコースパーミアーゼによって細胞内に取り込まれたグルコースが解糖系で代謝されるためには、まず、グルコキナーゼ活性によって、グルコース−6−リン酸に変換される必要がある。グルコキナーゼは、グルコースからグルコース−6−リン酸への変換を触媒する酵素である。
本発明においては、非PTSグルコースパーミアーゼ依存的なグルコース輸送の強化と同時に、グルコキナーゼ活性が強化されている。このことにより、グルコースの細胞内への取り込みとそれに引き続く解糖系やペントース・リン酸経路での糖代謝が促進されることを特徴としている。
【００２９】
グルコキナーゼ活性は、グルコキナーゼ遺伝子の導入による高発現、又は、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子(制御配列および遺伝子コード領域)に対する変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
コリネバクテリウム  グルタミカム R株の染色体上には、グルコキナーゼ遺伝子として、cgR_2067 (glk1)、cgR_2552 (glk2)、及びcgR_1739 (ppgK)の少なくとも3種が存在する。このうち、cgR_2067 (glk1)、及びcgR_2552(glk2)はATPを良好な基質とするグルコキナーゼと高い相同性を有し、cgR_1739 (ppgK)はポリリン酸を良好な基質とするグルコキナーゼと高い相同性を有している。本発明においては、これらのグルコキナーゼ遺伝子のうちの1種以上が強化されていることが好ましく、3種すべてが強化されていることがより好ましい。
【００３０】
グルコキナーゼ活性の強化は、グルコキナーゼ遺伝子の導入により行うことが簡便で効率がよい。
導入するグルコキナーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムであることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のグルコキナーゼ遺伝子としては、配列番号3、配列番号4、及び、配列番号5の塩基配列からなるDNA（それぞれ、glk1、glk2、及びppgK）が挙げられる。
【００３１】
また、本発明では、配列番号3、4、又は5と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号3、4、又は5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００３２】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がグルコキナーゼであることは、該DNAがコードするタンパク質のグルコキナーゼ活性を測定することにより確認する。グルコキナーゼ活性は、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、4 mM 塩化マグネシウム、1 mM ATP、0.2 mM NADP+、20 mM グルコース、1U グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼからなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、NADPHの生成を示す340 nmの吸収 (=6220/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって測定する。33℃において、1分間に1μmolのNADPHが生成される活性を、1 unitのグルコキナーゼ活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のグルコキナーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のグルコキナーゼ活性を測定することにより確認する。
【００３３】
GAPDH活性の強化
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、グリセルアルデヒド3−リン酸を1，3−ビスホスホグリセリン酸に変換する酵素である。
本発明のコリネ型細菌形質転換体においては、GAPDH活性が強化されている。
【００３４】
本発明において、pts遺伝子が破壊され、非PTSグルコースパーミアーゼを介したグルコースの取り込み、及びグルコキナーゼ活性を強化したコリネ型細菌形質転換体は、解糖系代謝中間体であるジヒドロキシアセトンリン酸が脱リン酸化された代謝産物であるジヒドロキシアセトン（DHA）が顕著に蓄積した。また、グリセルアルデヒド−3−リン酸、及びその上流の解糖系代謝中間体の細胞内濃度が、該コリネ型細菌形質転換体において顕著に増大した。GAPDHによって触媒される反応段階が該コリネ型細菌形質転換体における解糖系代謝に依存した糖消費活性の律速となっており、その結果オーバーフロー代謝が起こってDHAの蓄積を引き起こしたと考えられた。
そこで、本発明においては、該コリネ型細菌形質転換体のGAPDH活性を強化することによって、糖代謝の律速を解除して糖消費を促進させるとともに、シキミ酸生産能力を向上させていることを特徴としている。
【００３５】
本発明者らのグループは、コリネ型細菌による嫌気条件下での物質生産において、GAPDH活性が嫌気条件特異的に蓄積するNADHによって活性阻害を受け、解糖系を介した糖消費が阻害されることを見出している(Inui, M. et. al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004))。しかしながら、NADHが相対的に低濃度に保たれる好気条件において、GAPDH活性を強化することによって糖消費が活性化され、目的生成物の高生産につながることはこれまで知られていなかった。
本発明は、NADHが相対的に低濃度に保たれる好気的条件下においても、強化された非PTSグルコースパーミアーゼ依存的な糖輸送に依存するコリネ型細菌形質転換体においては、GAPDH活性を強化することによって糖代謝活性が著しく高まり、目的化合物の高生産をもたらすことを特徴としている。
【００３６】
GAPDH活性は、GAPDH遺伝子の導入による高発現、又はコリネ型細菌の染色体上のGAPDH遺伝子(制御配列および遺伝子コード領域)における変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
中でも、GAPDH活性の強化は、GAPDH遺伝子の導入により行うことが簡便で効率がよい。
導入するGAPDH遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムであることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のGAPDH遺伝子としては、配列番号6の塩基配列からなるDNA（gapA）が挙げられる。
【００３７】
また、本発明では、配列番号6と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、GAPDH活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号6と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGAPDH活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００３８】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がGAPDHであることは、該DNAがコードするポリペプチドのGAPDH活性を測定することにより確認する。GAPDH活性の測定は、33℃において、25 mMリン酸バッファー(pH 7.5)、25 mM トリスエタノールアミン(pH 7.5)、0.2 mM EDTA、5 mM NAD+、5 mM グリセルアルデヒド−3−リン酸、からなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、NADHの生成を示す340 nmの吸収 (=6220/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって行う。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが生成される活性を、1 unitのGAPDH活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のGAPDH活性が強化されていることは、該コリネ型細菌形質転換体の細胞抽出液中のGAPDH活性を測定することにより確認する。
【００３９】
ジヒドロキシアセトンリン酸 (DHAP)脱リン酸化活性の消失・阻害・減少
DHAP脱リン酸化酵素は、DHAPの脱リン酸化によるジヒドロキシアセトン (DHA)への変換を触媒する酵素である。
本発明のコリネ型細菌は、DHAP脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、又は、減少していることが好ましい。上述のように、糖の細胞内への取り込みを、高発現させた非PTSグルコースパーミアーゼ及びグルコキナーゼに依存するコリネ型細菌のシキミ酸生産株は、副生物としてDHAを高生成する。このため、その生成経路遮断により、シキミ酸等の芳香族化合物生成により多くの炭素を供給することが可能になると考えられる。
コリネバクテリウム  グルタミカムはDHAPの脱リン酸化を触媒する酵素として、HAD(haloacid dehalogenase)スーパーファミリーホスファターゼ(HdpA)を有している。コリネバクテリウム  グルタミカムのDHAP脱リン酸化酵素活性は、染色体上のDHAP脱リン酸化酵素遺伝子 (hdpA)の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
【００４０】
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のDHAP脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中のDHAP脱リン酸化酵素活性を測定することによって確認する。DHAP脱リン酸化酵素活性は、33℃において、100 mMトリス・リンゴ酸バッファー(pH 7.5)、5 mM 硫酸マグネシウム、5 mM DHAP、からなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、DHAPから遊離する無機リン酸イオンを公知の方法(Gawronski, J.D., et. al., Microtiter assay for glutamine synthetase biosynthetic activity using inorganic phosphate detection. Anal. Biochem. 327: 114-118 (2004))に従い比色定量することにより測定する。この定量値が減少又は消失する場合に、ジヒドロキシアセトンリン酸脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、または減少していると判定する。
【００４１】
3−デヒドロキナ酸(3-DHQ)シンターゼ活性、3-DHQデヒドラターゼ活性、及び、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の強化
芳香族化合物生合成共通代謝経路上の初発代謝物質である3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）は、PEPとE4Pの縮合によって生成する。DAHPは更に3−DHQシンターゼ、3−DHQデヒドラターゼ、及びシキミ酸デヒドロゲナーゼによる連続反応を通じてシキミ酸に変換される。3−DHQシンターゼは、DAHPから3−デヒドロキナ酸への変換を触媒する酵素であり、3−DHQデヒドラターゼは、3−DHQから3−DHSへの変換を触媒する酵素であり、シキミ酸デヒドロゲナーゼは、3−DHSからシキミ酸への変換を触媒する酵素である。本発明においては、これらの酵素活性の強化により、DAHPからシキミ酸への炭素の流れを強化し、シキミ酸等の目的とする芳香族化合物の生産性を高めることが可能である。
本発明のコリネ型細菌は、これらの酵素活性のいずれか1つ以上が強化されていることが好ましく、また、これらの活性の全てが強化されていることがより好ましい。
【００４２】
3−DHQシンターゼ、3−DHQデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼの各酵素活性は、各酵素をコードする遺伝子の導入、又は、各酵素をコードするコリネ型細菌の染色体遺伝子(それぞれ、aroB、aroD、及びaroE) の制御配列または遺伝子コード領域における変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することが可能である。中でも、該酵素活性の強化は、該酵素遺伝子の導入により行うことが簡便で効率がよい。
【００４３】
導入する各酵素遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムであることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来の3-DHQシンターゼ遺伝子としては、配列番号7の塩基配列からなるDNA（aroB）が挙げられ、3-DHQデヒドラターゼ遺伝子としては、配列番号8の塩基配列からなるDNA（aroD）が挙げられ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、配列番号9の塩基配列からなるDNA（aroE）が挙げられる。
【００４４】
また、本発明では、配列番号7、8、又は9と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、それぞれ、3-DHQシンターゼ、3-DHQデヒドラターゼ、又はシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号７、8、又は9と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、それぞれ、3-DHQシンターゼ、3-DHQデヒドラターゼ、又はシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００４５】
本発明において、DNAがコードするタンパク質が3-DHQシンターゼであることは、該DNAがコードするタンパク質の3-DHQシンターゼ活性を測定することによって確認する。3-DHQシンターゼ活性は、公知の方法 (Meudi, S. et al., Dehydroquinate synthase from Escherichia coli, and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate. Methods. Enzymol. 142: 306-314 (1987))に従って測定する。33℃において、50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)、0.2 mM DAHP、0.2 mM NAD+、1 mM Cobalt(II) chloride・6H2O、3-DHQデヒドラターゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、3-DHQデヒドラターゼとのカップリング反応によって生成する3-DHSの生成を示す234 nmの吸収 (=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターする。33℃において、1分間に1 μmolの3-DHQが生成される活性を、1 unitの3-DHQシンターゼ活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体の3-DHQシンターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の3-DHQシンターゼ活性を測定することによって確認する。
【００４６】
本発明において、DNAがコードするタンパク質が3-DHQデヒドラターゼであることは、該DNAがコードするタンパク質について3-DHQデヒドラターゼ活性を測定することによって確認する。3-DHQデヒドラターゼ活性は公知の方法 (Chaudhuri, S. et al., 3-Dehydroquinate dehydratase from Escherichia coli. Methods. Enzymol. 142: 320-324 (1987))に従って行う。33℃において、50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)、0.5 mM 3-DHQ、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、生成する3-DHSの生成を示す234 nmの吸収 (=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターする。33℃において、1分間に1 μmolの3-DHSを生成する活性を、1 unitの3-DHQデヒドラターゼ活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体の3-DHQデヒドラターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の3-DHQデヒドラターゼ活性を測定することによって確認する。
【００４７】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がシキミ酸デヒドロゲナーゼであることは、該DNAがコードするタンパク質について、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認する。シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は公知の方法 (Chaudhuri, S. et al., Shikimate dehydratase from Escherichia coli. Methods. Enzymol. 142: 315-320 (1987))に従って行う。33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、0.2 mM NADPH、0.5 mM 3-デヒドロシキミ酸、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、NADPHの消費に伴う340 nmの吸収 (=6220/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって行った。33℃において、1分間に1 μmolのシキミ酸が生成される活性を、1 unitのシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認する。
【００４８】
トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ活性の強化
糖代謝において、トランスケトラーゼは2種の反応を触媒する。一つめの反応としては、非酸化的ペントース・リン酸経路において、D−キシルロース−5−リン酸（X5P）からグリセルアルデヒド−3−リン酸（GAP）への変換と、D−リボース−5−リン酸（R5P）からセドヘプツロース−7−リン酸（S7P）への変換とを触媒する。これらの反応は可逆的で共役している。また、トランスケトラーゼは、2つめの反応として、D−フルクトース−6−リン酸（F6P）からエリスロース−4−リン酸（E4P）への変換と、GAPからX5Pへの変換を触媒する。これらの反応は可逆的で共役している。
また、糖代謝において、トランスアルドラーゼは、GAPからE4Pへの変換と、S7PからF6Pへの変換とを触媒する。これらの反応は共役している。
このように、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼは芳香族化合物生合成の前駆体の一つであるE4Pの生成に関与している。これらの酵素活性を強化することで細胞内のE4Pの供給が増大し、シキミ酸等の芳香族化合物の生産性が向上すると考えられる。
本発明のコリネ型細菌は、これらの酵素活性のいずれか一つが強化されていることが好ましく、両活性が強化されていることがより好ましい。
【００４９】
トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼの各酵素活性は、各酵素遺伝子の導入による高発現、又はコリネ型細菌の染色体上に存在する各酵素遺伝子(制御配列および遺伝子コード領域)に対する変異導入、又は配列置換による該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。中でも、各酵素遺伝子の導入により酵素活性を強化することが簡便で効率がよい。
導入する各酵素遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムであることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のトランスケトラーゼ遺伝子としては、配列番号10の塩基配列からなるDNA（tkt）が挙げられ、トランスアルドラーゼ遺伝子としては、配列番号11の塩基配列からなるDNA（tal）が挙げられる。
【００５０】
また、本発明では、配列番号10、又は11と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、それぞれ、トランスケトラーゼ、又はトランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号10、又は11と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつそれぞれ、トランスケトラーゼ、又はトランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００５１】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がトランスケトラーゼであることは、該DNAがコードするタンパク質についてトランスケトラーゼ活性を測定することによって確認できる。トランスケトラーゼ活性の測定は、公知の方法(Ikeda, M. et al., Cloning of the transketolase gene and the effect of its dosage on aromatic amino acid production in Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 201-206 (1999))で行い、この方法でトランスケトラーゼ活性が検出される場合に、トランスケトラーゼであると判定する。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のトランスケトラーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のトランスケトラーゼ活性を測定することによって確認する。
【００５２】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がトランスアルドラーゼであることは、該DNAがコードするタンパク質についてトランスアルドラーゼ活性を測定することによって確認する。トランスアルドラーゼ活性は、公知の方法 (Lu, JL. et al., Metabolic engineering and control analysis for production of aromatics: Role of transaldolase. Biotechnol. Bioeng. 53: 132-138 (1997))に従って測定する。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のトランスアルドラーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のトランスアルドラーゼ活性を測定することによって確認する。
【００５３】
シキミ酸キナーゼ活性、3−デヒドロシキミ酸 (3-DHS)デヒドラターゼ活性、及び、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性、の消失、阻害、減少
シキミ酸キナーゼは、芳香族化合物共通代謝経路上において、シキミ酸からシキミ酸-3-リン酸への変換を触媒する酵素であり、3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼは、3−デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸への変換を触媒する酵素であり、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼは、シキミ酸から3−デヒドロシキミ酸への変換を主に触媒する酵素である。
本発明のコリネ型細菌形質転換体は、これらの活性の1つ以上が消失し、阻害され、又は減少していることが好ましく、これらの全ての活性が消失し、阻害され、又は減少していることがより好ましい。これらの酵素活性は、コリネ型細菌の染色体上の各酵素遺伝子の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
【００５４】
本発明において、コリネ型細菌形質転換体のシキミ酸キナーゼ活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中のシキミ酸キナーゼ活性を測定することによって確認する。シキミ酸キナーゼ活性は公知の方法(Feyter, RD. et al., Shikimate kinases from Escherichia coli K12. Methods. Enzymol. 142: 355-361 (1987))に従って測定し、この測定値が減少又は消失する場合に、シキミ酸キナーゼ活性が減少、阻害、または消失していると判定する。
【００５５】
また、コリネ型細菌形質転換体の3-DHSデヒドラターゼ活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中の細胞抽出液中の3-DHSデヒドラターゼ活性を測定することによって確認する。3-DHSデヒドラターゼ活性は公知の方法(Stroman, P. et al., Purification and characterization of 3-dehydroshikimate dehydratase, an enzyme in the inducible quinic acid catabolic pathway of Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 253: 4593-4598 (1978))に従って測定し、この測定値が減少又は消失する場合に、3-DHSデヒドラターゼ活性が減少、阻害、または消失していると判定する。
【００５６】
また、コリネ型細菌形質転換体のキナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中のキナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認する。キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性は公知の方法(Kubota, T. et al., Characterization of shikimate dehydrogenase homologs of Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbial. Biotechnol. 97: 8139-8149 (2013))に従って測定し、この測定値が減少又は消失する場合に、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性が減少、阻害、または消失していると判定する。
【００５７】
コリネ型細菌
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。本発明の宿主微生物としてのコリネ型細菌としては、中でもコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００５８】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
中でも、本発明の宿主微生物としては、安全でかつシキミ酸生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。中でも、R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００５９】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
【００６０】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）が挙げられる。
【００６１】
また、コリネ型細菌は、上記説明した操作の他に、例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：ldh）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase: ppc）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase: mdh）などの遺伝子の破壊株であってよい。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM BP-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００６２】
ペントース利用能
コリネ型細菌の野生株は、通常、D−キシロース、Ｌ−アラビノース等のペントースを利用できないが、ペントースからもシキミ酸などの有機化合物を生成できるように、本発明のコリネ型細菌は、D−グルコース及びペントース（例えば、D−キシロース、及びＬ−アラビノースの１つ以上）を並行的に利用できることが好ましく、並行的かつ同時に利用できることがより好ましい。一般に、微生物はグルコース存在下では他の糖が存在してもグルコースを優先的に消費する。これに対して、微生物がD−グルコース及びペントースの並行的な利用能を有する場合、両糖が存在する条件下でもペントースをグルコースと同時に消費可能となり、結果的に目的物質生産に要する時間が短縮可能となる。
【００６３】
＜D−キシロース利用能＞
コリネ型細菌にD−キシロース利用能を付与する方法としては、例えば、他の生物種由来のD−キシロース代謝関連遺伝子を導入する方法が挙げられる。
原核生物及び一部のカビにおけるD−キシロースからD−キシルロース−5−ホスフェートへの代謝は、D−キシロースからD−キシルロースへの反応を触媒するキシロースイソメラーゼ（xylA）、及びD−キシルロースからD−キシルロース−5−ホスフェートへの反応を触媒するキシルロキナーゼ（xylB）の2つの酵素に触媒された2ステップの反応により行われる。これらの酵素をコードする各遺伝子をコリネ型細菌に導入することによりコリネ型細菌にD−キシロース利用能が付与される。
【００６４】
例えば、本発明者らは既に、コリネ型細菌に、D−キシロース代謝関連遺伝子として、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来のxylA遺伝子、及びxylB遺伝子を導入し、発現させることで、D−キシロースの利用能を付与する技術を開示している（Appl. Environ. Microbiol., Vol.72，3418-3428 (2006)）。本発明でも、エシェリヒア コリを含む各種生物種由来のxylA遺伝子、及びxylB遺伝子を導入し、コリネ型細菌にD−キシロース利用能を付与できる。
【００６５】
xylA遺伝子、及びxylB遺伝子は、通常、D−キシロースの代謝能を有する微生物が保有している。xylA遺伝子、及びxylB遺伝子としては、それぞれ独立して、エシェリヒア コリ、コリネバクテリウム グルタミカム(xylB遺伝子のみ保有)、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バチラス ハロデュランス（Bacillus halodurans）、シノリゾビューム メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、及びアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からなる群より選ばれる微生物由来のものを用いることが好ましい。中でも、エシェリヒア コリに由来するxylA遺伝子、及びxylB遺伝子がより好ましい。
【００６６】
＜アラビノース利用能＞
コリネ型細菌に、L−アラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子（araA）、L−リブロキナーゼをコードする遺伝子（araB）、及びＬ−リブロース−5−ホスフェート−4−エピメラーゼをコードする遺伝子（araD）を導入することにより、アラビノース利用能を付与することができる。
これらの遺伝子は、L−アラビノースの代謝能を有する微生物が保有している。例えば、エシェリヒア コリ、コリネバクテリウム グルタミカムATCC31831、バチラス サブチリス、サルモネラ ティフィムリウム、バチラス ハロデュランス（Bacillus halodurans）、ゲオバチラス ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、又はマイコバクテリウム スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）由来のaraA、araB、及びaraDを用いることができる。
さらに、L−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター（L−アラビノースプロトンシンポーター）をコードする遺伝子（araE）を導入することにより、アラビノースの取り込み能を向上させ、その結果、アラビノース利用能を一層向上できる。細菌では、以下に示す菌株等でaraE遺伝子配列や酵素特性が報告されている。バチラス サブチリス（J. Bacteriol. Vol. 179, 7705-7711(1997)）、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）8017（J. Bacteriol. Vol. 177, 5379-5380（1995））、エシェリヒア コリ（J. Biol. Chem.  Vol. 263, 8003-8010（1988））。本発明では、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831、エシェリヒア コリ、バチラス サブチリス、クレブシエラ オキシトカ、又はサルモネラ ティフィムリウム由来のaraE遺伝子を用いることが好ましい。
L−アラビノースプロトンシンポーター遺伝子の導入により、L−アラビノースだけでなく、D−キシロースの取り込み能も向上させ、その結果、D−キシロース利用能も一層向上できる。
【００６７】
＜セロビオース利用能＞
本発明のコリネ型細菌はセロビオース利用能が向上していることが好ましく、これにより、セロビオースからもシキミ酸等の有機化合物を生産可能となる。
セロビオース利用能は、例えば特開2004−089029号に記載の方法により、コリネ型細菌を変異処理し、セロビオースを唯一の炭素源とする培地上で増殖する株を選択することにより得ることができる。このようにして得られた変異株として、FERM P-18977、FERM P-18978が挙げられる（特開2004−089029）。また、人為的なセロビオース利用性組換え株として、FERM P-18979が挙げられる。（特開2004−089029号）。
【００６８】
遺伝子導入のためのベクターの構築
遺伝子導入により、それがコードするタンパク質ないしは酵素の活性を強化する場合、各DNAは、それぞれ、宿主の染色体に組み込むか、または、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングして宿主に導入すればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含めば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58−67699号公報〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及び〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム  グルタミカム  ATCC3058由来のpHM1519  〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム  グルタミカム  T250由来のpCG4〔特開昭57−183799号公報〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol. 159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕等が挙げられる。
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhA等が挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーター等が挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００６９】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、電気穿孔法などがあげられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる（Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem., 54: 443-447 (1990)）。
【００７０】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、1種を単独で使用でき、または2種以上を混合してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。
【００７１】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。
【００７２】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、または炭酸カルシウム等があげられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.1〜1（w/v %）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等があげられるが、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００７３】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日とすればよい。
【００７４】
（２）有機化合物の製造方法
上記説明した本発明のコリネ型細菌を、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中の有機化合物を回収する工程とを含む方法により有機化合物を製造することができる。
有機化合物としては、シキミ酸の他に、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)、3-デヒドロキナ酸 (3-DHQ)、3-デヒドロシキミ酸 (3-DHS)、シキミ酸-3-リン酸 (shikimate 3-phosphate)、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸（5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate）、プロトカテク酸 (protocatechuic acid)、没食子酸(gallic acid)、コリスミ酸 (chorismic acid)、プレフェン酸(prephenic acid)、フェニルピルビン酸(phenylpyruvic acid)、イソコリスミ酸 (isochorismic acid)、フェニルアラニン(phenylalanine)、L-DOPA (L-dihydroxyphenylalanine)、チロシン (tyrosine)、プレチロシン(pretyrosine)、トリプトファン (tryptophan)等の芳香族アミノ酸、葉酸 (folate、(ビタミンM) (ビタミンB9))、メナキノン (menaquinone(ビタミンK))、p-ヒドロキシ安息香酸(p-hydroxybenzoic acid)またはそれに由来するユビキノン(ubiquinone(Coenzyme Q10))、p-アミノ安息香酸 (p-aminobenzoic acid(ビタミンH))、p-アミノフェノール(p-aminophenol)、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸(4-amino-4-deoxychorismate)、アントラニル酸 (anthranilic acid)、アロゲン酸(arogenate)、エンテロバクチン、トコフェロール(tocopherol、ビタミンE)、フェノール(phenol)、カテコール(catechol)、アニリン(aniline)、cis,cis-ムコン酸(cis,cis-muconate)、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸(3-carboxy-cis,cis-muconate), ムコノラクトン(muconolactone), γ-カルボキシムコノラクトン(gamma-carboxy muconolactone), β-ケトアジピン酸(β-ketoadipate)、ケイ皮酸 (cinnamic acid)、クマル酸(coumaric acid)、クマリン(coumarin)、フラボノイド(flavonoid)、イソフラボノイド(isoflavonoid)、タンニン(tannin)、styrylpyrones、2,3-ジヒドロキシ安息香酸(2,3-dihydroxybenzoic acid)、サリチル酸(salycylic acid)、等が挙げられる。中でも、シキミ酸の他に3-デヒドロシキミ酸、3-デヒドロキナ酸、プロトカテク酸、コリスミ酸、没食子酸(gallic acid)、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アントラニル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、p-アミノ安息香酸、フェノール、カテコールが好ましい。
【００７５】
糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどの単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙などを糖化酵素などで糖化した、グルコースなどの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
【００７６】
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜40℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
【００７７】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
【００７８】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【００７９】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００８０】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００８１】
反応液
反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としては、上記説明した原料化合物又はそれを含む糖蜜や糖化液などを用いればよい。また、炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
反応液中の原料化合物の濃度は、約1〜20（w/v ％）が好ましく、約2〜10（w/v ％）がより好ましく、約2〜5（w/v ％）がさらにより好ましい。
また、原料化合物を含む全炭素源の濃度は、約2〜5（w/v ％）とすればよい。
【００８２】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【００８３】
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のpHは約6〜8が好ましい。
【００８４】
具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００８５】
反応条件
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約15〜50℃が好ましく、約25〜45℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く有機化合物を製造できる。
また、反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、温度、pH、通気条件、酸素濃度が制御可能なバッチ式発酵槽(fed-batch fermentor)を用いることが好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。本発明の形質転換体自体の有機化合物生産能力は好気的条件下の方が高い。培地の溶存酸素濃度(D.O.)としては、約5%から30%の空気飽和のときのD.O.に維持されることが好ましい。しかし、好気的条件下では形質転換体が増殖するため、原料化合物が菌体増殖のために消費され、その分、有機化合物の製造効率が低下する。
従って、本発明においては、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で反応を行うのが好ましい。本発明で増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、形質転換体による目的化合物の生成反応には影響を及ぼさないが、微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、金属塩、窒素源などの1種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を抑制することが好ましい。本発明においては、コリネ型細菌の好気増殖に必須のビタミンである、ビオチンを添加しない反応液を用いることがより好ましい。
【００８６】
また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため、原料化合物が増殖のために消費されない分、有機化合物の製造効率が高くなる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200 mV〜−500 mVが好ましく、約−150 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP  Electrodes）を用いて測定できる。
【００８７】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate−reducing  bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and  Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作製することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組合せることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００８８】
還元条件下で反応させる場合は、反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００８９】
有機化合物の回収
上記のようにして培養することにより、反応液中に目的とする有機化合物が生産される。反応液を回収することにより目的とする有機化合物を回収できるが、さらに、公知の方法で目的とする有機化合物を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、膜分離法、有機溶媒抽出法、各種吸着法等が挙げられる。
【実施例】
【００９０】
［実施例1］
シキミ酸生産株の構築
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM BP-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００９１】
エシェリヒア コリ（Escherichia coli K-12 MG1655）からの染色体DNA抽出は、LB培地 [tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００９２】
(2)  クローニングベクターの構築
(2-1)  pCRB240クローニングベクターの構築
Corynebacterium glutamicum R株由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnB T1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、Corynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーターを含む遺伝子配列（配列番号12：Corynebacterium glutamicum gapAプロモーター配列）及びクローニングベクターpKK223-3（配列番号13：pKK223-3）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００９３】
Corynebacterium glutamicum gapAプロモーター配列増幅用プライマー
（a-1）； 5’- CTCTCTGCAGTCGCTCGTCTCATAAAAACGAC -3’（配列番号14）
（b-1）；5’-CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCGCATGCTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’
（配列番号15）
尚、プライマー（a-1）にはPst I制限酵素部位が、（b-1）にはHin dIII制限酵素部位が付加されている。【００９４】
pKK223-3 rrnBターミネーター配列増幅用プライマー
（a-2）； 5’- CTCTGCATGCCTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’（配列番号16）
（b-2）； 5’- CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3’
（配列番号17）
尚、プライマー（a-2）にはSph I制限酵素部位が、（b-2）にはHin dIII制限酵素部位が付加されている。【００９５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Corynebacterium glutamicum R株から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミドを用いた。【００９６】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum gapAプロモーター配列を増幅する場合はプライマー(a-1) と (b-1) 、pKK223-3プラスミド rrnBターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-2) と (b-2)の組合せで行った。【００９７】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃ 
gapAプロモーター配列              29秒
rrnBターミネーター配列            26秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００９８】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列を含む約0.5-kb及びpKK223-3プラスミド由来 rrnBターミネーター配列を含む約0.4-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【００９９】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列を含む約0.5-kb DNA断片を制限酵素PstIとHin dIIIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、pBL1 ori配列を含むクローニングベクターpCRB1 [J Mol Microbiol Biotechnol. 8(4):243-254 (2004)]を制限酵素Pst IとHin dIIIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列を含むDNA断片10 μlとpCRB1プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB1約4.1-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列約0.5-kb の挿入断片が、認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列を含むプラスミドをLgap4と命名した。【０１００】
次に、上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来 rrnBターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片を制限酵素Sph IとHin dIIIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、gapAプロモーターを含有するクローニングベクターLgap4を制限酵素Sph IとHin dIIIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pKK223-3プラスミド由来 rrnBターミネーター配列を含むDNA断片10 μlとLgap4プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。【０１０１】
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドLgap4約4.5-kbのDNA断片に加え、pKK223-3プラスミド由来 rrnBターミネーター配列約0.4-kb の挿入断片が、認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来gapAプロモーター配列及びpKK223-3プラスミド由来rrnBターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB240と命名した。【０１０２】
(3) シキミ酸生産遺伝子発現プラスミドの構築
(3-1)  pCRB237プラスミドの構築
Escherichia coli K-12株由来の3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸(DAHP)シンターゼ遺伝子をコードするaroG遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含む遺伝子配列（配列番号18：Escherichia coli aroG遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１０３】
Escherichia coli aroG遺伝子増幅用プライマー
（a-3）；5’-CTCTGATATCATGAATTATCAGAACGACGATTTACGC -3’（配列番号19）
（b-3）；5’-CTCTGATATCGACTTATCAGGCCTGTGGTG -3’      （配列番号20）
尚、プライマー（a-3）及び（b-3）にはEco RV制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Escherichia coli K-12 MG1655から抽出した染色体DNAを用いた。【０１０４】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Escherichia coli aroG遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-3) と (b-3) の組合せの組合せで行った。【０１０５】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃      67秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１０６】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子約1.1-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１０７】
上記PCRにより増幅したEscherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片を制限酵素Eco RVで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、gapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB210 [国際公開 WO2012/033112 ]を制限酵素EcoRVで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRB210プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB210約5.1-kbのDNA断片に加え、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子約1.1-kb の挿入断片が、認められた。
Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpSKM1と命名した。【０１０８】
上述のプラスミドpSKM1を用いて、S180部位をフェニルアラニン（F）に置換した変異体をInverse PCR法によって作成した。
PCRに際して、aroG遺伝子のS180部位に変異を導入すべく、（配列番号18 : Escherichia coli aroG遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。【０１０９】
Escherichia coli aroG遺伝子変異導入用プライマー
（a-4）；  5’- TTTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATG -3’（配列番号21）
（b-4）；  5’- AAAGCCCTGATGCCAGTTC -3’    （配列番号22）【０１１０】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含むプラスミドpSKM1を用いた。【０１１１】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。【０１１２】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：60℃       5秒
エクステンション過程  ：68℃     374秒    
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１１３】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含む約6.2-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１１４】
精製した増幅産物をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）を用いてリン酸化処理した後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。得られたリン酸化処理済みDNA断片を用いてDNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、aroG遺伝子のS180部位への変異導入を確認した。
得られたプラスミドをpCRB237と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、後掲の表1にまとめて示した。【０１１５】
(3-2)  pCRB239プラスミドの構築
上述のプラスミドpSKM1を用いて、P150部位をロイシン（L）に置換した変異体をInverse PCR法によって作成した。
PCRに際して、aroG遺伝子のP150部位に変異を導入すべく、（配列番号18 : Escherichia coli aroG遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。【０１１６】
Escherichia coli aroG遺伝子変異導入用プライマー
（a-5）；  5’- TACAATATCTCGCTGACCTGATG -3’（配列番号23）
（b-5）；  5’- GGGTGATCATATCGAGAAACTC -3’（配列番号24）
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含むプラスミドpSKM1を用いた。【０１１７】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。【０１１８】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：60℃       5秒
エクステンション過程  ：68℃     374秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１１９】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Escherichia coli K-12株由来aroG遺伝子を含む約6.2-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１２０】
精製した増幅産物をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）を用いてリン酸化処理した後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。得られたリン酸化処理済みDNA断片を用いてDNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、aroG遺伝子のP150部位への変異導入を確認した。
得られたプラスミドをpCRB239と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表１にまとめて示した。【０１２１】
(3-3)  pCRB238プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株由来の3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子をコードするaroB遺伝子、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子をコードするaroD遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするaroE遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、aroB遺伝子を含む遺伝子配列（配列番号25：Corynebacterium glutamicum aroB遺伝子）、aroD遺伝子を含む遺伝子配列（配列番号26：Corynebacterium glutamicum aroD遺伝子）及びaroE遺伝子を含む遺伝子配列（配列番号27：Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１２２】
Corynebacterium glutamicum aroB遺伝子増幅用プライマー
（a-6）； 5’- CTCTGAATTCATGAGCGCAGCGCAGATTTT -3’（配列番号28）
（b-6）； 5’- CTCTCCCGGGAAGTGGATAACTTCTAGTCC -3’（配列番号29）
尚、プライマー（a-6）にはEco RI制限酵素部位が、（b-6）にはSma I制限酵素部位が付加されている。【０１２３】
Corynebacterium glutamicum aroD遺伝子増幅用プライマー
（a-7）； 5’- CTCTGAATTCATGCTTGGAAAAATTCTCCTCC -3’（配列番号30）
（b-7）； 5’- CTCTCCCGGGCTACTTTTTGAGATTTGCCA -3’  （配列番号31）
尚、プライマー（a-7）にはEco RI制限酵素部位が、（b-7）にはSma I制限酵素部位が付加されている。【０１２４】
Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子増幅用プライマー
（a-8）； 5’- CTCTCCCGGGATAAGGATCAACGAATAAAA -3’（配列番号32）
（b-8）； 5’- CTCTCTGCAGCTAGTGTTCTTCCGAGATGC -3’（配列番号33）
尚、プライマー（a-8）にはSmaI制限酵素部位が、（b-8）にはPstI制限酵素部位が付加されている。【０１２５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Corynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１２６】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum aroB遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組合せ、Corynebacterium glutamicum aroD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-7) と (b-7) の組合せ、Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組合せで行った。【０１２７】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃
Corynebacterium glutamicum aroB遺伝子    68秒
Corynebacterium glutamicum aroD遺伝子    26秒
Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子    50秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１２８】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum aroB遺伝子約1.1-kb、Corynebacterium glutamicum aroD遺伝子約0.4-kb、Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子約0.8-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１２９】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片、aroD遺伝子を含む約0.4-kb DNA断片、aroE遺伝子を含む約0.8-kb DNA断片を制限酵素Eco RIとSma I（aroB遺伝子及びaroD遺伝子）もしくはSmaIとPstI（aroE遺伝子）で切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、Ptacプロモーターを含有するクローニングベクターpKK223-3 （ファルマシア社製）を制限酵素Eco RIとSma I（aroB遺伝子及びaroD遺伝子）もしくはSma IとPstI（aroE遺伝子）で切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含む各断片10 μlとpKK223-3プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
各々培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpKK223-3約4.6-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子約1.1-kb 、aroD遺伝子約0.4-kb、aroE遺伝子約0.8-kbの挿入断片がそれぞれ認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子を含むプラスミドをpSKM2、aroD遺伝子を含むプラスミドをpSKM3、aroE遺伝子を含むプラスミドをpSKM4と命名した。【０１３０】
次に、上述のプラスミドpSKM3を制限酵素Kpn IとSal Iで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によってCorynebacterium glutamicum R株由来aroD遺伝子を含む約0.7-kbのDNA断片を回収した。また、pCASE1 ori配列を含むクローニングベクターpCRB22 [Appl Environ Microbiol. 78(3):865-875 (2012)]を制限酵素Kpn IとSal Iで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pSKM3由来遺伝子断片10 μlとpCRB22プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断後、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来araD遺伝子を含むプラスミドをpSKM5と命名した。【０１３１】
次に、上述のCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子を含むプラスミドpSKM2を制限酵素Sal Iで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によってCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子を含む約1.7-kbのDNA断片を回収した。また、上述のCorynebacterium glutamicum R株由来aroD遺伝子を含むプラスミドpSKM5を制限酵素Sal Iで切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pSKM2由来aroB遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM5プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応後、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子及びaraD遺伝子を含むプラスミドをpSKM6と命名した。【０１３２】
次に、上述のCorynebacterium glutamicum R株由来aroE遺伝子を含むプラスミドpSKM4からaroE遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、aroE遺伝子を含むプラスミドpSKM4の遺伝子配列（配列番号34：pSKM4プラスミド配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１３３】
Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子増幅用プライマー
（a-9）； 5’- CTCTGGTACCGGCTGTGCAGGTCGTAAATC -3’（配列番号35）
（b-9）； 5’- CTCTGGTACCCTAGTGTTCTTCCGAGATGC -3’（配列番号36）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）にはKpnI制限酵素部位が付加されている。【０１３４】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子を含むプラスミドpSKM4を用いた。【０１３５】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-9) と (b-9) の組合せで行った。【０１３６】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃      63秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１３７】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum aroE遺伝子を含む約1.0-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１３８】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来aroE遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片を制限酵素KpnIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、上述のCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子及びaraD遺伝子を含むプラスミドpSKM6を制限酵素KpnIで切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pSKM4由来aroE遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM6プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むプラスミドをpSKM7と命名した。【０１３９】
次に、上述のCorynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むプラスミドpSKM7からaroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むプラスミドpSKM7の遺伝子配列（配列番号37 : pSKM7プラスミド配列）を基にそれぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１４０】
Corynebacterium glutamicum aroB, aroD, aroE遺伝子増幅用プライマー
（a-10）； 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’（配列番号38）
（b-10）； 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC -3’（配列番号39）【０１４１】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むプラスミドpSKM7を用いた。【０１４２】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-10) と (b-10) の組合せで行った。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃     215秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１４３】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含む約3.6-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１４４】
精製した増幅産物をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）を用いてリン酸化処理した後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、pBL1 ori配列を含むクローニングベクターpCRB1 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8(4):243-254 (2004)]を制限酵素SmaIで切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pSKM7由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRB1プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にし、15℃で3時間反応させ結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来aroB遺伝子、aroD遺伝子及びaroE遺伝子を含むプラスミドをpCRB238と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表1にまとめて示した。【０１４５】
【表１】
2016027870.tif 000002
【０１４６】
(4) ペントースリン酸経路遺伝子発現強化
(4)-1  tkt-tal遺伝子マーカーレス染色体導入用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株由来のトランスケトラーゼ遺伝子をコードするtkt遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子をコードするtal遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tkt遺伝子及びtal遺伝子を含む遺伝子配列（配列番号40：Corynebacterium glutamicum tkt-tal遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１４７】
Corynebacterium glutamicum  tkt-tal遺伝子増幅用プライマー
（a-11）； 5’- CTCTCATATGACGCTGTCACCTGAAC -3’（配列番号41）
（b-11）； 5’- CTCTCATATGCTACTTCAGGCGAGCTTC -3’（配列番号42）
尚、プライマー（a-11）及び（b-11）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【０１４８】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum R株から抽出した染色体DNAを用いた。【０１４９】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum tkt-tal遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-11) と (b-11) の組合せで行った。【０１５０】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃     225秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１５１】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含む約3.4-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１５２】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含む約3.4-kb DNA断片を制限酵素NdeIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209 [国際公開 WO2012/033112]  を制限酵素NdeIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRB209プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し滅菌蒸留水で10 μl にし、15℃で3時間反応させ結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含む約3.4-kb の挿入断片が認められた。
Corynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含むプラスミドをpSKM8と命名した。【０１５３】
次に、tkt-tal遺伝子をCorynebacterium glutamicum R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の増殖に必須でないと報告されている配列 [Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372 (2005)]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域（SSI 9領域）を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、SSI 9領域を含む遺伝子配列（配列番号43：Corynebacterium glutamicum SSI 9領域）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１５４】
Corynebacterium glutamicum  SSI 9領域増幅用プライマー
（a-12）； 5’- CTCTCCTGCAGGTAATGGTGTCGACCGACATC -3’（配列番号44）
（b-12）； 5’- CTCTCCTGCAGGAAGTTAGATGTGGCTCCGAC -3’（配列番号45）
プライマー（a-12）及び（b-12）にはSse8387I制限酵素部位が付加されている。【０１５５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１５６】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を増幅する場合はプライマー(a-12) と (b-12) の組合せで行った。【０１５７】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃     180秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１５８】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域を含む約3.0-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１５９】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域を含む約3.0-kb DNA断片を制限酵素Sse8387Iで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、マーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] を制限酵素Eco RVで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理をした。Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域を含む遺伝子断片10 μlとpCRA725プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
各々培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域約3.0-kb の挿入断片が、認められた。
Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域を含むプラスミドをpSKM9と命名した。【０１６０】
上述のプラスミドpSKM8をBgl IIとSph Iで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によってCorynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含む約4.3kbのDNA断片を回収した後、DNA Blunting Kit（タカラバイオ株式会社製）により平滑化した。また、上述のプラスミドpSKM9を制限酵素NaeIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理をした。Corynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM9プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来tkt-tal遺伝子のSSI 9領域導入用プラスミドをpSKM10と命名した。【０１６１】
(5) PTSとは異なるグルコース輸送系(非PTSグルコースパーミアーゼ)を介した糖取り込み活性の強化
(5-1)  iolT1遺伝子マーカーレス染色体導入用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R由来の非PTSグルコースパーミアーゼであるイノシトールトランスポーター遺伝子をコードするiolT1遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、iolT1遺伝子を含む配列（配列番号46：Corynebacterium glutamicum iolT1遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１６２】
Corynebacterium glutamicum iolT1遺伝子増幅用プライマー
（a-13）； 5’- GGAGACCATATGGCTAGTACCTTCATTCAG -3’（配列番号47）
（b-13）； 5’- CCTATTGCATATGAGTGTGCTTCACTCCCG -3’（配列番号48）
尚、プライマー（a-13）及び（b-13）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【０１６３】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１６４】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-13) と (b-13) の組合せで行った。【０１６５】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃      97秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１６６】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子約1.6-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１６７】
次に、iolT1遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の増殖に必須でないと報告されている配列[Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372（2005）]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域（SSI 3領域）を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、SSI 3領域を含む遺伝子配列（配列番号49：Corynebacterium glutamicum SSI 3領域）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１６８】
Corynebacterium glutamicum SSI 3領域増幅用プライマー
（a-14）； 5’- CTCTGTCGACGAGATCGTACTTCGTAGGC -3’（配列番号50）
（b-14）； 5’- CTCTGTCGACAGCTCGAAATCGAAGACCG -3’（配列番号51）
尚、プライマー（a-14）及び（b-14）にはSalI制限酵素部位が付加されている。【０１６９】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１７０】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来SSI3領域を増幅する場合はプライマー(a-1) と (b-1) の組合せで行った。【０１７１】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃     181秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１７２】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 3領域約3.0-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１７３】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来SSI3領域を含む約3.0-kb DNA断片制限酵素SalIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、マーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] を制限酵素SalIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来SSI3領域を含むDNA断片10 μlとpCRA725プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 3領域を含む約3.0-kb の挿入断片が、認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来SSI 3領域を含むプラスミドをpSKM11と命名した。【０１７４】
次に、上述のプラスミドpSKM11のSSI3領域に遺伝子を組み込むための制限酵素部位（ユニークサイト）を導入するため、Inverse PCR法を行った。
PCRに際して、SSI 3領域を含む遺伝子配列（配列番号49：Corynebacterium glutamicum SSI 3）を基にそれぞれ下記の一対のプライマーを合成し使用した。【０１７５】
Corynebacterium glutamicum SSI 3領域制限酵素部位導入用プライマー
（a-15）； 5’- CTCTAGATCTACCAACTCCCAGAGCC -3’（配列番号52）
（b-15）； 5’- CTCTAGATCTTTGGCCAGGTCGAACAG -3’（配列番号53）
尚、プライマー（a-15）及び（b-15）にBglII制限酵素部位が付加されている。【０１７６】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI3領域を含むプラスミドpSKM11を用いた。【０１７７】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl) ) 0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)         10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                  4 μl
鋳型DNA                                 1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)           各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                               32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来SSI3領域を含むプラスミドを増幅する場合はプライマー(a-15) と (b-15) の組合せで行った。【０１７８】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：60℃       5秒
エクステンション過程  ：68℃     448秒    
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１７９】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 3領域を含む約7.5-kbのDNA断片が検出できた。DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１８０】
精製した増幅産物をBglII処理した後、DNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、SSI3領域へのBglII制限酵素サイト導入を確認した。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来SSI 3領域を含むプラスミドをpSKM12と命名した。【０１８１】
次に、上述のプラスミドpSKM12にtacプロモーター及びrrnBターミネーターを導入するため、tacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB214 [FEBS Letters, 586 (23): 4228-4232 (2012)] をBam HIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によってtacプロモーター及びrrnBターミネーター配列を連結した約0.7-kbのDNA断片を回収した。また、Corynebacterium glutamicum株由来SSI 3領域を含むプラスミドpSKM12をBglIIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。pCRB214から回収したtacプロモーター及びrrnBターミネーターを含むDNA断片10 μlとpSKM12プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
得られたtacプロモーター配列とrrnBターミネーター配列及びSSI3領域を含むプラスミドをpSKM13と命名した。【０１８２】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子を含む約1.6-kb DNA断片を制限酵素NdeIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、tacプロモーター配列とrrnBターミネーター配列及びSSI3領域を含有するクローニングベクターpSKM13を制限酵素NdeIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM13プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
各々培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpSKM13約8.5-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子約1.6-kb の挿入断片が、認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来iolT1遺伝子のSSI3領域導入用プラスミドをpSKM14と命名した。【０１８３】
(6) グルコキナーゼ活性の強化
(6-1)  グルコキナーゼ遺伝子マーカーレス染色体導入用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株由来のグルコキナーゼ遺伝子をコードするglk1遺伝子、glk2遺伝子及びppgK遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、glk1遺伝子を含む配列（配列番号54：Corynebacterium glutamicum glk1遺伝子）、glk2遺伝子を含む配列（配列番号55：Corynebacterium glutamicum glk2遺伝子）及びppgK遺伝子を含む配列（配列番号56：Corynebacterium glutamicum ppgK遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１８４】
Corynebacterium glutamicum glk1遺伝子増幅用プライマー
（a-16）； 5’- CTCTGCATGCCACAAAAACCGGCC -3’（配列番号57）
（b-16）； 5’- CTCTGCATGCCTAGTTGGCTTCCAACACG -3’（配列番号58）
尚、プライマー（a-16）及び（b-16）にはSphI制限酵素部位が付加されている。【０１８５】
Corynebacterium glutamicum glk2遺伝子増幅用プライマー
（a-17）； 5’- CTCTCATATGACTGATCCCACTTGCAC -3’（配列番号59）
（b-17）； 5’- CTCTCATATGGAGAACAGCGTTTTAGGTGC -3’（配列番号60）
尚、プライマー（a-17）及び（b-17）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【０１８６】
Corynebacterium glutamicum ppgK遺伝子増幅用プライマー
（a-18）； 5’- CTCTCATATGGCGCGCGGCG -3’（配列番号61）
（b-18）； 5’- CTCTCATATGTTATGGGGTGAGGTGTTGG -3’（配列番号62）
尚、プライマー（a-18）及び（b-18）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【０１８７】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１８８】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)       110 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-16) と (b-16) 、glk2遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-17) と (b-17) 、ppgK遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-18) と (b-18) 、の組合せで行った。【０１８９】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃ 
glk1遺伝子    58秒
glk2遺伝子    56秒
ppgK遺伝子    74秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１９０】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含む約1.0-kbのDNA断片、Corynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子を含む約0.9-kbのDNA断片及びCorynebacterium glutamicum R株由来ppgK遺伝子を含む約1.2-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０１９１】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含む約1.0-kb を制限酵素SphIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、gapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB240を制限酵素SphIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRB240プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB240約5.0-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子約1.0-kb の挿入断片が、認められた。
Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含むプラスミドをpSKM15と命名した。【０１９２】
次に、上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子を含む約0.9-kbの DNA断片及びppgK遺伝子を含む約1.2-kbの DNA断片を制限酵素NdeIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、gapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB210 [国際公開 WO2012/033112 ]を制限酵素NdeIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子またはppgK遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRB210プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
各々の培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB210約5.1-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子の場合約0.9-kb の挿入断片が、ppgK遺伝子の場合約1.2-kbの挿入断片が認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子を含むプラスミドをpSKM16、Corynebacterium glutamicum R株由来ppgK遺伝子を含むプラスミドをpSKM17と命名した。【０１９３】
次に、グルコキナーゼ遺伝子をCorynebacterium glutamicum R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の増殖に必須でないと報告されている配列[Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372（2005）]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域（SSI 9, 10, 6領域）を以下のPCR法により増幅した。【０１９４】
PCRに際して、SSI 9領域を含む遺伝子配列（配列番号63：Corynebacterium glutamicum SSI 9領域）、SSI 10領域を含む遺伝子配列（配列番号64：Corynebacterium glutamicum SSI 10領域）及びSSI 6領域を含む遺伝子配列（配列番号65：Corynebacterium glutamicum SSI 6領域）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１９５】
Corynebacterium glutamicum SSI 9領域増幅用プライマー
（a-19）； 5’- CTCTCCTGCAGGTCCAGTGTGGATCGCAAC -3’  （配列番号66）
（b-19）； 5’- CTCTCCTGCAGGGAGGATATGGTGACTAGCTTG -3’（配列番号67）
プライマー（a-19）及び（b-19）にSse8387I制限酵素部位が付加されている。【０１９６】
Corynebacterium glutamicum SSI 10領域増幅用プライマー
（a-20）； 5’- CTCTCCTGCAGGCACCGTTGTCAGCTTCACT -3’（配列番号68）
（b-20）； 5’- CTCTCCTGCAGGCTGACTGTGGCATACCTCTA -3’（配列番号69）
プライマー（a-20）及び（b-20）にはSse8387I制限酵素部位が付加されている。【０１９７】
Corynebacterium glutamicum SSI 6領域増幅用プライマー
（a-21）； 5’- CTCTCCTGCAGGTTGGGAACTTAGCTAGGTCG -3’（配列番号70）
（b-21）； 5’- CTCTCCTGCAGGTGGAATCAGGATCAGATGCG -3’（配列番号71）
プライマー（a-21）及び（b-21）にはSse8387I制限酵素部位が付加されている。【０１９８】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０１９９】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を増幅する場合はプライマー(a-19) と (b-19) 、SSI10領域を増幅する場合はプライマー(a-20) と (b-20)、SSI6領域を増幅する場合はプライマー(a-21) と (b-21)の組合せで行った。【０２００】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃ 
SSI 9領域     194秒
SSI 10領域    151秒
SSI 6領域     188秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０２０１】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域約3.2-kbのDNA断片、SSI 10領域約2.5-kbのDNA断片、SSI 6領域約3.1-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０２０２】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を含む約3.2-kb DNA断片、SSI 10領域を含む約2.5-kbのDNA断片及びSSI 6領域領域を含む約3.1-kbのDNA断片を制限酵素Sse8387Iで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、マーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] を制限酵素Sse8387Iで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を含むDNA断片、SSI 10領域を含むDNA断片、または、SSI 6領域領域を含むDNA断片 10 μlを、それぞれ、pCRA725プラスミド断片2 μlと混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を含む約3.2-kbのDNA断片、SSI 10領域を含む約2.5-kbのDNA断片及びSSI 6を含む領域約3.1-kbのDNA断片の挿入断片が認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を含むプラスミドをpSKM18、SSI10領域を含むプラスミドをpSKM19及びSSI6領域を含むプラスミドをpSKM20と命名した。【０２０３】
上述のSSI9領域を含むプラスミドpSKM18及びSSI6領域を含むプラスミドpSKM20に遺伝子を組み込むための制限酵素部位（ユニークサイト）を導入するため、Inverse PCR法を行った。
PCRに際して、SSI 9領域を含む遺伝子配列（配列番号63：Corynebacterium glutamicum SSI 9領域）、SSI 6領域を含む遺伝子配列（配列番号65：Corynebacterium glutamicum SSI 6領域）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０２０４】
Corynebacterium glutamicum SSI 9領域制限酵素部位導入用プライマー
（a-22）； 5’- CTCTGATATCCTTCCTAAACGATGAGCGAG -3’（配列番号72）
（b-22）； 5’- CTCTGATATCTTGGTCAGTTCAGTCTGGAG -3’（配列番号73）
プライマー（a-22）及び（b-22）にはEco RV制限酵素部位が付加されている。【０２０５】
Corynebacterium glutamicum SSI 6領域制限酵素部位導入用プライマー
（a-23）； 5’- CTCTAGTACTGCAGATCCATTTCATTGCGC -3’（配列番号74）
（b-23）； 5’- CTCTAGTACTTGGTGGAATTACACGCACC -3’（配列番号75）
プライマー（a-23）及び（b-23）にはScaI制限酵素部位が付加されている。【０２０６】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、SSI9領域を含むプラスミドpSKM18及びSSI6領域を含むプラスミドpSKM20を用いた。【０２０７】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来、SSI9領域を含むプラスミドを増幅する場合はプライマー(a-22) と (b-22) 、SSI6領域を含むプラスミド増幅する場合はプライマー(a-23) と (b-23)の組合せで行った。【０２０８】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃
SSI 9領域      461秒
SSI 6領域      454秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０２０９】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来SSI9領域を含む約7.7-kbのDNA断片及びSSI6領域を含む約7.6-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０２１０】
上記PCRにより増幅したSSI 9領域を含むDNA断片を制限酵素EcoRVで、SSI 6領域を含むDNA断片を制限酵素ScaIで処理し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、DNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、SSI9領域へのEcoRV制限酵素サイトの導入、SSI6領域へのScaI制限酵素サイトの導入を確認した。
得られたCorynebacterium glutamicum R株由来SSI 9領域を含むプラスミドをpSKM21、SSI 6領域を含むプラスミドをpSKM22と命名した。【０２１１】
上述のプラスミドpSKM15を制限酵素PstIとHin dIIIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）により回収し、Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含む約1.9-kbのDNA断片をDNA Blunting Kit（タカラバイオ株式会社製）により平滑化した。また、上述のプラスミドpSKM21を制限酵素Eco RVで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM21プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来glk1遺伝子の染色体SSI 9領域導入用プラスミドをpSKM23と命名した。【０２１２】
上述のプラスミドpSKM16を制限酵素SalIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によりCorynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子を含む約1.9-kbのDNA断片を回収した。また、上述のプラスミドpSKM19を制限酵素XhoIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM19プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来glk2遺伝子の染色体SSI 10領域導入用プラスミドをpSKM24と命名した。【０２１３】
上述のプラスミドpSKM17を制限酵素XbaIとPstIで切断し、アガロース電気泳動後、Corynebacterium glutamicum R株由来ppgK遺伝子を含む約1.9-kbのDNA断片をアガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）により回収した後、DNA Blunting Kit（タカラバイオ株式会社製）により平滑化した。また、上述のプラスミドpSKM22を制限酵素ScaIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来ppgK遺伝子を含むDNA断片10 μlとpSKM22プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
Corynebacterium glutamicum R株由来ppgK遺伝子の染色体SSI6領域導入用プラスミドをpSKM25と命名した。【０２１４】
(7) Corynebacterium glutamicumの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
(7-1) Corynebacterium glutamicum R株qsuB遺伝子、qsuD遺伝子及びhdpA遺伝子破壊用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼをコードする染色体qsuB遺伝子、キナ酸/シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするqsuD遺伝子及びジヒドロキシアセトンリン酸脱リン酸化酵素(HAD(haloacid dehalogenase) superfamily phosphataseをコードするhdpA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、qsuB遺伝子を含む配列（配列番号76：Corynebacterium glutamicum qsuB遺伝子）、qsuD遺伝子を含む配列（配列番号77：Corynebacterium glutamicum qsuD遺伝子）及びhdpA遺伝子を含む配列（配列番号78：Corynebacterium glutamicum hdpA遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０２１５】
Corynebacterium glutamicum qsuB遺伝子増幅用プライマー
（a-24）； 5’- CTCTGTCGACCTCAGATTGGTTTCGCAGTC -3’（配列番号79）
（b-24）； 5’- CTGATTGCGCACCAAACCAAGAACGTATCCAAGCAGGTTC -3’
（配列番号80）
（a-25）； 5’- TTGGTTTGGTGCGCAATCAG-3’（配列番号81）
（b-25）； 5’- CTCTGTCGACTCAACGGTAGGAAGCTCAG -3’（配列番号82）
プライマー（a-24）及び（b-25）にSalI制限酵素部位が付加されている。【０２１６】
Corynebacterium glutamicum qsuD遺伝子増幅用プライマー
（a-26）； 5’- CTCTGTCGACGTTCTTCGAAGTGGTGGAAC -3’（配列番号83）
（b-26）； 5’- GTGAGGCAGCTGACATCAAACGTTGAAGCCAAGGTAGAG -3’
（配列番号84）
（a-27）； 5’- TTTGATGTCAGCTGCCTCAC -3’（配列番号85）
（b-27）； 5’- CTCTGTCGACTGATCACCTTAAAGGGCGAC-3’（配列番号86）
プライマー（a-26）及び（b-27）にはSalI制限酵素部位が付加されている。【０２１７】
Corynebacterium glutamicum hdpA遺伝子増幅用プライマー
（a-28）； 5’- CTCTCTGCAGTTGTGGTAGACCTTGGGTG -3’（配列番号87）
（b-28）； 5’- AACACCATTGTCCCTGTTTTGG-3’（配列番号88）
（a-29）；5’-TCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTTATTCTGTAGGTCATGGCATTTGC -3’
（配列番号89）
（b-29）； 5’- CTCTTCTAGAATTGCAACACCTGCGATGC -3’（配列番号90）
プライマー（a-28）にPstI、（b-29）にXbaI制限酵素部位が付加されている。【０２１８】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum Rから抽出した染色体DNAを用いた。【０２１９】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) DNA断片qsuB-1を増幅する場合はプライマー(a-24) と (b-24) 、qsuB-2を増幅する場合はプライマー(a-25) と (b-25)、qsuD-1を増幅する場合はプライマー(a-26) と (b-26)、qsuD-2を増幅する場合はプライマー(a-27) と (b-27)、hdpA-1を増幅する場合はプライマー(a-28) と (b-28)、hdpA-2を増幅する場合はプライマー(a-29) と (b-29)の組合せで行った。【０２２０】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃      50秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０２２１】
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、qsuB-1の場合約0.8-kb、qsuB-2の場合約0.8-kb、qsuD-1の場合約0.7-kb、qsuD-2の場合約0.8-kb、hdpA-1の場合約0.9-kb、hdpA-2の場合約0.9-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０２２２】
上記PCRにより増幅したDNA断片qsuB-1、qsuD-1及びhdpA-1の3’端約20-bpとDNA断片qsuB-2、qsuD-2及びhdpA-2の5’端約20-bpは配列がオーバーラップするようにデザインしており、両DNA断片を熱変性後アニーリングさせることにより連結することができる。【０２２３】
実際の連結反応はVeritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
DNA断片は、qsuB-1とqsuB-2、qsuD-1とqsuD-2、hdpA-1とhdpA-2の組合せで混合して用いた。【０２２４】
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (1.25 U/μl)     1 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)          10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                   4 μl
DNA断片                                    各1 μl
滅菌蒸留水                                  34 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。【０２２５】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：50℃       5秒
エクステンション過程  ：68℃      90秒
以上を1サイクルとし、15サイクル行った。【０２２６】
連結反応後の反応液を鋳型として以下の条件で2回目のPCRを行った。
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer(Mg2+ plus)         10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
連結反応後の反応液                     1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) Corynebacterium glutamicum R株由来qsuB遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-24) と (b-25) 、qsuD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-26) と (b-27) 、hdpA遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-28) と (b-29) の組合せで行った。【０２２７】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：50℃       5秒
エクステンション過程  ：68℃
qsuB遺伝子              96秒
qsuD遺伝子              92秒
hdpA遺伝子              110秒
以上を1サイクルとし、20サイクル行った。【０２２８】
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、qsuB遺伝子の場合約1.6-kb、qsuD遺伝子の場合約1.5-kb、hdpA遺伝子の場合約1.8-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０２２９】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来qsuB遺伝子を含むDNA断片及びqsuD遺伝子を含むDNA断片の場合は制限酵素SalIで、Corynebacterium glutamicum R株由来hdpA遺伝子を含むDNA断片の場合制限酵素PstIとXbaIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、マーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）]を制限酵素SalI（qsuB遺伝子及びqsuD遺伝子）もしくはPstIとXbaI（hdpA遺伝子）で切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来qsuB遺伝子を含むDNA断片、qsuD遺伝子を含むDNA断片またはhdpA遺伝子を含むDNA断片10 μlとpCRA725プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーションを、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
各々の培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.0-kbのDNA断片に加え、qsuB遺伝子の場合約1.6-kb、qsuD遺伝子の場合約1.5-kb、hdpA遺伝子の場合約1.8-kbのDNA断片が検出された。
得られたCorynebacterium glutamicum R株qsuB遺伝子破壊用プラスミドをpSKM26、qsuD遺伝子破壊用プラスミドをpSKM27及びhdpA遺伝子破壊用プラスミドをpSKM28と命名した。【０２３０】
(7-2)  Corynebacterium glutamicum R株aroK遺伝子破壊用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株のシキミ酸キナーゼをコードする染色体aroK遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、aroK遺伝子を含む配列（配列番号91：Corynebacterium glutamicum aroK遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０２３１】
Corynebacterium glutamicum aroK遺伝子増幅用プライマー
（a-30）； 5’- AGGCATGCGGAGGTGCTCTCTCACGTAA -3’（配列番号92）
（b-30）； 5’- TCCCCCGGGCGAGCACTACCGCAACCT -3’（配列番号93）
（a-31）； 5’- TCCCCCGGGCCGGAGGATTTCAGTGCTT -3’（配列番号94）
（b-31）； 5’- AGGCATGCCACTGCAACGGCATTGCCGT -3’（配列番号95）
尚、プライマー（a-30）及び（b-31）にはSphI制限酵素部位が、（a-31）及び（b-30）にはSmaI制限酵素部位が付加されている。【０２３２】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAはCorynebacterium glutamicum R株から抽出した染色体DNAを用いた。
反応液：
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl)  0.5 μl
5x PrimeSTAR HS Buffer (Mg2+ plus)        10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                 4 μl
鋳型DNA                                1 μl（DNA含有量1 μg以下）
上記記載の2種プライマー*)              各々1 μl（最終濃度  0.2 μM）
滅菌蒸留水                              32.5 μl
以上を混合し、この50 μlの反応液をPCRに供した。
*) aroK-1を増幅する場合はプライマー(a-30)と(b-30)の組合せ、aroK-2を増幅する場合はプライマー(a-31)と(b-31)の組合せで行った。【０２３３】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃      10秒
アニーリング過程      ：55℃       5秒
エクステンション過程  ：72℃ 
aroK-1                 60秒
aroK-2                 62秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０２３４】
上記で生成した反応液10 μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Corynebacterium glutamicum R株由来aroK-1約1.0-kb及びaroK-2約1.0-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。【０２３５】
上記PCRにより増幅したCorynebacterium glutamicum R株由来aroK遺伝子を含むDNA断片aroK-1約1.0-kb及びaroK-2約1.0-kbを制限酵素SphI及びSmaIで切断後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。また、マーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] を制限酵素SphIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理を行った。Corynebacterium glutamicum R株由来aroK遺伝子を含むDNA断片2種類各々10 μlとpCRA725プラスミド断片2 μlを混合し、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1 μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
得られたライゲーション液を用いて、塩化カルシウム法 [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50 μg/mlを含むLB寒天培地 [1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天] に塗布した。
培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、Corynebacterium glutamicum R株由来aroK遺伝子の一部が削除された約2.0-kb の挿入断片が認められた。
得られたCorynebacterium glutamicum R株aroK遺伝子マーカーレス破壊用プラスミドをpCRC329と命名した。【０２３６】
(8)  染色体遺伝子組換えによるシキミ酸生産株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。Corynebacterium glutamicum R株のldhA遺伝子破壊用プラスミドpCRA728 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8(4):243-254 (2004)]を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum X5C1株 [Appl Microbiol Biotechnol. 81(4):691-699 (2008)] を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地 [(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天] に塗付した。
プラスミドpCRA728が染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA728上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス  サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA728上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での増殖性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示す。
そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株ldhA遺伝子マーカーレス破壊株をCorynebacterium glutamicum X5C1ΔldhA株と命名した。【０２３７】
次に、アラビノース資化遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD109 [Appl Microbiol Biotechnol. 85(1):105-115 (2009) ]を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol., 144:181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum X5C1ΔldhA株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[BT液体培地および1.5% 寒天]に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このアラビノース資化遺伝子染色体導入株をCorynebacterium glutamicum  A1X5C1ΔldhA株と命名した。【０２３８】
次に、アラビノーストランスポーター遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD108 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(1):105-115 (2009) ]を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum A1X5C1ΔldhA株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[BT液体培地および1.5% 寒天]に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このアラビノーストランスポーター資化遺伝子染色体導入株をCorynebacterium glutamicum A1X5C1araEΔldhA株と命名した。【０２３９】
次に、Corynebacterium glutamicum 株qsuB遺伝子破壊用プラスミドpSKM26を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] によりCorynebacterium glutamicum A1X5C1araEΔldhA株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得た一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地 [BT液体培地、および1.5% 寒天] に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株qsuB遺伝子破壊株をCorynebacterium glutamicum SKM8株と命名した。【０２４０】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株qsuD遺伝子破壊用プラスミドpSKM27を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM8株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[BT液体培地および1.5% 寒天]に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株qsuD遺伝子マーカーレス破壊株をCorynebacterium glutamicum SKM9株と命名した。【０２４１】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株aroK遺伝子破壊用プラスミドpCRC329を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM9株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地[BT液体培地にフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 各20μg/ml、p-アミノ安息香酸 10μg/mlを添加、1.5% 寒天]に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株aroK遺伝子マーカーレス破壊株をCorynebacterium glutamicum SKM1株と命名した。【０２４２】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株tkt-tal遺伝子染色体導入用プラスミドpSKM10を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol.,Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM1株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株tkt-tal遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum SKM2株と命名した。【０２４３】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株iolT1遺伝子染色体導入用プラスミドpSKM14を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144, 181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムSKM2株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株iolT1遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc553株と命名した。【０２４４】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株ptsH遺伝子破壊用プラスミドpCRC809 [Microbiology, 155(Pt11):3652-3660 (2009) ] を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc553株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株ptsH遺伝子マーカーレス破壊株をCorynebacterium glutamicum LHglc567株と命名した。【０２４５】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株ppgK遺伝子染色体導入用プラスミドpSKM25を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc567株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株ppgK遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc594株と命名した。【０２４６】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株glk1遺伝子染色体導入用プラスミドpSKM23を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc594株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株glk1遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc611株と命名した。
次に、Corynebacterium glutamicum  R株glk2遺伝子染色体導入用プラスミドpSKM24を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc611株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株glk2遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc618株と命名した。【０２４７】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株gapA遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD906 [Appl Environ Microbiol. 78(12):4447-4457 (2012)] を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc618株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株gapA遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc741株と命名した。【０２４８】
次に、Corynebacterium glutamicum  R株hdpA遺伝子破壊用プラスミドpSKM28を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol.Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum LHglc741株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株hdpA遺伝子マーカーレス破壊株をCorynebacterium glutamicum LHglc753株と命名した。【０２４９】
また、Corynebacterium glutamicum  R株gapA遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD907 [Appl Environ Microbiol. 78(12):4447-4457 (2012)]を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM2株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及び芳香族アミノ酸を含むA寒天培地 [A液体培地、および1.5% 寒天] に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース及び芳香族アミノ酸含有BT寒天培地に塗付した。
培地上の増殖株からカナマイシン感受性及びスクロース含有培地増殖性を示した株を選択した。このCorynebacterium glutamicum  R株gapA遺伝子マーカーレス染色体導入株をCorynebacterium glutamicum LHglc573株と命名した。【０２５０】
【表２】
2016027870.tif 000003
略号一覧＊
tkt-tal: transketolase (tkt) and transaldolase (tal)
iolT1: myo-inositol transporter
glk1: glucokinase 1
glk2: glucokinase 2
ppgK: polyphosphate/ATP dependent glucokinase
gapA: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
xylAB: xylose isomerase and xylulokinase (Escherichia coli)
bglF(V317A)A: mutantβ-glucosidase (bglF (V317A)) and 6-phospho-β-glucosidase (bglA)
araBAD: arabinose isomerase, ribulokinase and ribulose 5-phosphate 3-epimerase) (Escherichia coli)
araE: arabinose transporter (Corynebacterium glutamicum 31831)
ldhA: lactate dehydrogenase A
aroK: shikimate kinase
qsuB: 3-dehydroshikimate dehydratase
qsuD: quinate/shikimate dehydrogenase
ptsH: histidine-phosphorylatable protein
hdpA: HAD(haloacid dehalogenase) superfamily phosphatase
aroG(S180F): feedback-resistant mutant DAHP(3-deoxy-D-arabinoheptulo- sonate-7-phosphate) synthase (S180F) (Escherichia coli)
aroG(P150L): feedback-resistant mutant DAHP synthase (P150L) (Escherichia coli)
aroB: 3-dehydroquinate synthase
aroD: 3-dehydroquinate dehydratase
aroE, shikimate dehydrogenase
＊由来菌株名のないものはCorynebacterium glutamicum R株由来の遺伝子【０２５１】
(9)  シキミ酸生産遺伝子発現プラスミド導入株の構築
上述のプラスミドpCRB237を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM2株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB237の導入が認められた。
得られた株をCorynebacterium glutamicum SKM3と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表3にまとめて示した。【０２５２】
上述のプラスミドpCRB237及びpCRB238を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM2株、LHglc618株、LHglc741株、LHglc753株及びSKM1株をそれぞれ形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及びクロラムフェニコール 5 μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB237及びpCRB238の導入が認められた。
Corynebacterium glutamicum SKM2株、LHglc618株、LHglc741株、LHglc753株、及びSKM1株のそれぞれに、pCRB237及びpCRB238を導入することによって得られた形質転換体を、それぞれ、Corynebacterium glutamicum SKM4株、SKM5株、SKM6株、SKM7株、及びSKM10株と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表3にまとめて示した。【０２５３】
上述のプラスミドpCRB239及びpCRB238を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144,181-185(1993)] により、Corynebacterium glutamicum SKM2株及びLHglc573株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/ml及びクロラムフェニコール 5 μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の増殖株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB239及びpCRB238の導入が認められた。
得られた株をCorynebacterium glutamicum SKM11株及びSKM12株と命名した。
本プラスミドの遺伝子組換えの概要を、表3にまとめて示す。
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）SKM 7は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託した（受託日：２０１４年７月２９日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９０３）。
【表３】
2016027870.tif 000004
*) 混合糖資化遺伝子であるEscherichia coli K-12株に由来するxylA遺伝子（キシロースイソメラーゼ）、xylB遺伝子（キシルロキナーゼ）、araA遺伝子（アラビノースイソメラーゼ）、araB遺伝子（リブロキナーゼ）、araD遺伝子（リブロース-5-リン酸 3-エピメラーゼ）、Corynebacterium glutamicum R株に由来するbglF(V317A)遺伝子（β-グルコシダーゼ）、bglA遺伝子（6-ホスホ-β-グルコシダーゼ）及びCorynebacterium glutamicum ATCC 31831株に由来するaraE遺伝子（アラビノーストランスポーター）は全ての株に導入されている。
遺伝子名略号は、表2参照。【０２５４】
[実施例2]
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体によるシキミ酸生産
コリネバクテリウム  グルタミカムR株の混合糖資化株である、A1X5C1araEΔldhA株をベースとして構築した、シキミ酸生産株である、SKM6株(実施例1(表3)参照)を用いて、ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)を用いた好気フェドバッチ反応におけるシキミ酸生産実験を以下に述べる方法によって行った。
SKM6株を、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン各20 μg/ml、p-アミノ安息香酸 10 μg/ml、カナマイシン 50 μg/ml、及びクロラムフェニコール5 μg/mlを含む試験管内の10 ml  A液体培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間、好気的に振盪培養を行った。【０２５５】
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカム  SKM6株を、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 各20μg/ml、p-アミノ安息香酸 10μg/ml、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール5 μg/mlを含有した、容量500 mlフラスコ内の100 ml A液体培地[(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌し、33℃で16時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカム  SKM6株の菌体を遠心分離(4℃, 3000×g, 10分)により集菌し、得られた菌体を、1000 ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、グルコース  60 g/l、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 各100 mg/l、p-アミノ安息香酸 50 mg/l、カナマイシン 50 μg/ml、クロラムフェニコール5 μg/ml、及び消泡剤(ディスホームCB-442) 5 g/lを含有する、600 ml A(−尿素、3×硫安、5μg/lビオチン、2×yeast extract、2×vitamin assay casamino acid)液体培地[(NH4)2SO4  21 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4. ・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  25 μl、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  4g、vitamin assay casamino acid  14 gを蒸留水1 Lに溶解]にOD610が0.5となるように懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)により33℃、pH 7.0(5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.6 L/min (air、1 vvm)、溶存酸素濃度(DO) 10%（大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件において18時間通気撹拌培養を行った。【０２５６】
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカムSKM6株の菌体を遠心分離(4℃, 5000×g, 10分)により集菌し、菌体を0.9% 塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、100 g 湿菌体/ L(培地体積あたり湿菌体重量として10%)となるように、 10% グルコースを含む250 ml BT(-尿素、-ビオチン)液体培地[(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]に懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)を用いて33℃、pH 7.0(5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.25 L/min (air、1 vvm)、溶存酸素濃度(DO) 5%（大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件においてシキミ酸生成反応を行った。なお、反応液中のグルコース濃度はグルコースセンサー(王子計測機器、BF-5i)を用いてモニターし、グルコースが枯渇する前にグルコースの追添加を行った。培養上清液中の芳香族化合物の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィー(Prominence HPLC装置 (島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に20%メタノール、0.07%過塩素酸を用いて分離)により分析した。その結果を表4に示す。SKM6株は、シキミ酸生成反応24時間後、480 mM (83.6 g/l)のシキミ酸（シキミ酸生成速度 20.0 mM/h = 3.5 g/l/h）、90.3 mM (15.5 g/l)の3-DHS、及び6.9 mM (1.3 g/l)の3-DHQを生成した。また、エシェリヒア  コリ(大腸菌)のシキミ酸生産株で主要な副生物としてあげられる、キナ酸(quinate)の生成はごく微量 (1 mM以下)であった。また、グルコース消費量は1119 mMであり、対糖収率(mol/(mol glucose), %)は、シキミ酸が42.9%、シキミ酸、3-DHS、3-DHQを合わせると51.6%であった。また、SKM6株によるシキミ酸生成反応時に菌体の増殖は認められなかった。これらの結果から、SKM6株は、無機塩最少培地を用いる菌体増殖を伴わない反応プロセスにおいて、非常に高いシキミ酸生産性及び対糖収率を有することが示された。SKM6株のシキミ酸生産性は、最少培地を用いた糖からの発酵法による生産性としては、これまでに報告されている最も生産性の高いエシェリヒア  コリ(大腸菌)組換え株の生産性(E. coli SP1.1 pts-/pSC6.090B, シキミ酸生産速度1.8 g/l/h, シキミ酸収率27%、(特許文献4(US 6472169))を大幅に上回った。また、上記の大腸菌のシキミ酸生産株においては、後のシキミ酸の精製工程においてシキミ酸との分離が困難なために支障をきたす、キナ酸の副生量が多いことが重大な問題となっていたが(特許文献3(US 6613552)、特許文献4(US 6472169))、本発明のSKM6株ではキナ酸の生成がほとんど認められない点に特徴があり、シキミ酸の精製工程の妨げにはならない利点があると考えられる。一方、反応上清液について、HPLC分析(Prominence HPLC装置(島津製作所製)、TSK-gel Oapak-A column(東ソー株式会社製)にて、移動相に水を用いて分離) により有機酸の定量分析を行った結果、表4に示すように、SKM6株は解糖系中間代謝産物であるジヒドキシアセトンリン酸（DHAP）の脱リン酸化によって生じるジヒドロキシアセトン(DHA)を顕著に蓄積した。DHA以外の有機酸については、顕著な蓄積は認められなかった。【０２５７】
[実施例3]
シキミ酸生産に対するジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)脱リン酸化酵素遺伝子(hdpA)破壊の効果
実施例2で述べたように、SKM6株のシキミ酸生成反応においては解糖系代謝中間体のジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)の脱リン酸化によって生じるジヒドロキシアセトン(DHA)の顕著な蓄積が認められた。このことから、DHA生成経路の遮断によりDHA生成を抑制することで、シキミ酸生産効率がさらに増大すると推察した。この効果について調べるため、SKM6株における遺伝子改変に加え、さらにDHAP脱リン酸化酵素(HAD(haloacid dehalogenase) superfamily phosphatase)をコードするhdpA遺伝子を破壊したSKM7株を構築し(実施例1 (表3) 参照)、該菌株について、実施例2と同一の条件、方法によりシキミ酸生産実験を行った。表4に示すように、SKM7株は反応24時間後に536 mM (93.3 g/l)のシキミ酸（シキミ酸生成速度 22.3 mM/h = 3.9 g/l/h）、97.3 mM (16.7 g/l)の3-DHS、及び6.9 mMの3-DHQ (1.3 g/l)を生成した。また、グルコース消費量は1136 mMであり、対糖収率(mol/mol, %)は、シキミ酸が47.2%、シキミ酸、3-DHS、3-DHQを合わせると56.3%であった。この結果から、SKM6株において施された遺伝子改変(ptsH遺伝子破壊、非PTSグルコースパーミアーゼ、グルコキナーゼ、GAPDHの各遺伝子高発現、他)に加え、hdpA遺伝子を破壊することにより、DHA生成が抑制され、シキミ酸生成量及びシキミ酸の対糖収率がともに、SKM6株のそれらと比べ、さらに増大することが示された(シキミ酸生成量は12%増大、シキミ酸収率は9%増大)。これに対し、キナ酸の生成は、SMK6株と同様に、ほとんど認められなかった。一方、有機酸分析の結果、表4に示すように、SKM7株ではDHAの生成は完全に抑制された。DHA以外の有機酸についても、顕著な蓄積は認められなかった。また、SKM7株による反応時に菌体濃度の変化は認められなかった。以上の結果より、SKM7株は、菌体増殖を伴わない反応プロセスにおいて、SKM6株よりもさらに高いシキミ酸生産性及び対糖収率を示した。【０２５８】
[比較例1]
シキミ酸生産に対するGAPDH活性強化の効果
実施例2で示したSKM6株のシキミ酸生産能に対する、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)遺伝子(gapA)高発現の寄与度合いを調べるため、コリネバクテリウム  グルタミカム由来のGAPDHをコードするgapA遺伝子の染色体導入を行っていないことを除いてSKM6株と同一の遺伝子型を有する、SKM5株 (実施例1 、表3参照)について、実施例2に記載のシキミ酸生産試験と同一の方法、条件においてシキミ酸生産実験を行った。その結果、表4に示すように、反応24時間後において、SKM5株は394 mM (68.6 g/l)のシキミ酸（シキミ酸生成速度 16.4 mM/h = 2.9 g/l/h）、64.5 mM (11.1 g/l)の3-DHS、及び5.9 mMの3-DHQ (1.1 g/l)を生成した。また、881 mMのグルコースを消費し、対糖収率(mol/mol, %)は、シキミ酸が44.7%、シキミ酸、3-DHS、3-DHQを合わせると52.7%であった。この結果から、実施例2で述べたgapA遺伝子が導入されているSKM6株のシキミ酸生成量(表4)は、gapA遺伝子が導入されていないSKM5株の生成量と比較して22%増大したことから、該形質転換体におけるGAPDH遺伝子高発現はシキミ酸生成を顕著に増大させることが示された。なお、SKM6株は、SKM5株と比較してグルコースの消費量も大幅に(27%)増大しているが、一方で、シキミ酸、及びシキミ酸、3-DHS、3-DHQ合算の対糖収率はSKM5株に比べ若干低下したことから、SKM6株におけるシキミ酸生産性増大の主要因はグルコース消費の増大に伴うシキミ酸生成速度の増大と考えられた。即ち、GAPDH活性強化は該形質転換体において、グルコース消費を活性化させることにより、シキミ酸生産性を向上させることが示された。
尚、SKM5株及びSKM6株の反応6時間後の各菌体の粗酵素抽出液中のGAPDH活性を測定した結果、表4に示すように、SKM6株におけるGAPDH活性(5.4 U/mg protein)は、SKM5株におけるそれ(1.3 U/mg protein)と比べ、約4.3倍上昇していることが示され、gapAを染色体導入したSKM6株においてGAPDH活性が強化されることを確認した。【０２５９】
[比較例2]
GAPDH活性強化によるシキミ酸生産性向上が非PTSグルコースパーミアーゼ系強化株に特有の効果であることの検証
比較例1において述べたように、 ptsH遺伝子破壊、iolT1遺伝子高発現、及びグルコキナーゼ遺伝子群(glk1, glk2, ppgK)の高発現(以下、これらの遺伝子改変の組み合わせを、非PTSグルコースパーミアーゼ系の強化と呼ぶ)に加えて、さらに解糖系のGAPDH遺伝子(gapA)の導入・高発現を組み合わせることにより、グルコース消費が促進され、シキミ酸生産量が大幅に増大することが示された。このgapA遺伝子高発現によるシキミ酸生産性向上効果が、非PTSグルコースパーミアーゼ系の強化株に特有のものであるかどうかを検証するため、ptsH遺伝子が破壊されておらず、グルコースをPTS依存的に細胞内に取り込むシキミ酸生産株をベースとした場合のgapA遺伝子高発現の効果を確認した。
実施例1 (表3)に記載したように、ptsH遺伝子が破壊されていないシキミ酸生産株であるSKM11株、及び、高発現用プロモーターの制御下にgapA遺伝子を染色体導入・高発現させたことを除き、SKM11株と同一の遺伝子型を有するSKM12株(両株とも、aroK, qsuB及びqsuD遺伝子が破壊され、tkt-tal遺伝子、及びシキミ酸生成経路遺伝子(aroG, aroB, aroD, aroE)が導入されている)を用い、反応に使用する菌体濃度を50 g湿菌体/l (培地体積に対して湿菌体重量として5%)である以外は実施例2と同一の条件、方法によりシキミ酸生産実験を行った。尚、これら2株は、DAHPシンターゼ遺伝子として、他のシキミ酸生産株とは変異点が異なるaroG(P150L)遺伝子を導入しているが、該遺伝子産物は、aroG(S180F)遺伝子がコードするDAHPシンターゼとほぼ同様の酵素特性 (芳香族アミノ酸に対するフィードバック阻害耐性)を示し、また、コリネバクテリウム  グルタミカムに導入した場合、シキミ酸生成に対して同等の効果を付与することを確認している。
その結果、表5に示すように、反応24時間後において、SKM11株は139 mMのシキミ酸、及び24.5 mMの3-DHSを生成したのに対し、SKM12株は115 mMのシキミ酸、及び17.2 mMの3-DHSを生成した。なお、各株について、反応6時間後の菌体を回収し、それらの粗酵素抽出液中のGAPDH活性を測定した結果、表5に示すように、gapA遺伝子を染色体導入したSKM12株においては、導入していないSKM11株と比べ、約10倍高いGAPDH活性が検出されたことから、SKM12株でGAPDH活性が強化されたことを確認した。この結果より、PTSを有するシキミ酸生産株をベースとした場合、GAPDH活性強化による糖消費、及びシキミ酸生成に対する上昇効果は認められなかった。このことから、GAPDH活性強化によるシキミ酸生産性の上昇は、グルコース輸送を非PTSグルコースパーミアーゼに依存するコリネ型細菌形質転換体に特有の効果であることが示された。【０２６０】
[比較例3]
シキミ酸生産に対する、非PTSグルコースパーミアーゼ系強化とGAPDH活性強化の効果
実施例2で示したSKM6株のシキミ酸生成能に対する、非PTSグルコースパーミアーゼ系強化(ptsH遺伝子破壊、iolT1遺伝子高発現、グルコキナーゼ遺伝子(glk1, glk2, ppgK)高発現)及びGAPDH活性強化の寄与度合いを調べるため、非PTSグルコースパーミアーゼ系の強化とGAPDH活性の強化が共になされていない以外は、SKM6株と同一の遺伝子型を有する、SKM4株 (実施例1、 表3参照)について、実施例2と同一の条件、方法においてシキミ酸生産実験を行い、SKM6株との生産性比較を行った。その結果、表4に示すように、SKM4株は、反応24時間後に、291 mM (50.7 g/l)のシキミ酸（シキミ酸生成速度 12.1 mM/h = 2.1 g/l/h）、48.1 mM (8.3 g/l)の3-DHS、4.7 mM(0.9 g/l)の3-DHQを生成した。また、676 mMのグルコースを消費し、対糖収率(mol/mol, %)は、シキミ酸が43.0%、シキミ酸、3-DHS、3-DHQを合わせると50.8%であった。即ち、SKM6株のシキミ酸生産量、及びグルコース消費量はSKM4株のそれらに比べ、いずれも約65%増大していることが示された。この結果より、非PTSグルコースパーミアーゼ系の強化とGAPDH活性強化を組合せることにより、グルコース消費速度の増大に伴ってシキミ酸生産性が大幅に増大することが示された。【０２６１】
[比較例4]
シキミ酸生産に対する、非PTSグルコースパーミアーゼ系強化の効果
上記比較例3で述べたSKM4株と、SKM4株における遺伝子改変に加え、非PTSグルコースパーミアーゼ系強化(ptsH遺伝子破壊によるPTS糖輸送の遮断、iolT1遺伝子高発現、及びグルコキナーゼ(glk1, glk2, ppgK)遺伝子高発現) を施したSKM5株(比較例1)のシキミ酸生産性を比較すると(表4)、SKM5株のシキミ酸生産量はSKM4株のそれと比べ、グルコース消費量の増大を伴って、35%増大したことから、非PTSグルコースパーミアーゼ系の強化単独によっても、シキミ酸生成量が顕著に増大することが示された。【０２６２】
【表４】
2016027870.tif 000005
【０２６３】
【表５】
2016027870.tif 000006
【０２６４】
[実施例4]
混合糖を炭素源とするシキミ酸生産
本発明で構築したシキミ酸生産株は、混合糖資化遺伝子群が導入されていることにより、グルコースの他に、キシロース、アラビノース、セロビオースをグルコースと同時に資化可能である(Sasaki, M., et al, Engineering of pentose transport in Corynebacterium glutamicum to improve simultaneous utilization of mixed sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85: 105-115 (2009))。そこで、SKM7株を用いて、グルコース、キシロース、アラビノースからなる混合糖を炭素源として用いた場合のシキミ酸生産実験を行った。シキミ酸生産実験は、炭素源として、グルコース60 g/l、キシロース35 g/l、アラビノース5 g/lの各初期濃度を含む反応用培地を用いた以外は、実施例2と同一の条件下、方法に従って行った(炭素源の濃度が低下した場合、枯渇する前に上記3種の炭素源を同じ比率にて追添加を行った)。
その結果、表6に示すように、SKM7株は反応24時間後、518 mM (90.2 g/l)のシキミ酸(シキミ酸生成速度 21.6 mM/h = 3.8 g/l/h)、122 mM (21.0 g/l)の3-DHS、及び6.7 mM(1.3 g/l)の3-DHQを生成した。また、656 mMのグルコース、497 mMのキシロース、及び75 mMのアラビノースを消費し、対糖収率(mol/mol, %)は、シキミ酸が45.8%、シキミ酸、3-DHS、3-DHQを合わせると57.2%であった。
このように、SKM7株は、グルコース、キシロース、アラビノースからなる混合糖を炭素源とした反応においても、グルコースを単一炭素源とした場合とほぼ同等のシキミ酸の生産性、及び対糖収率を有していることが示された。また、該形質転換体は、それらの混合糖を同時利用できることも確認した。【０２６５】
【表６】
2016027870.tif 000007
【０２６６】
[比較例5]
シキミ酸生産に対する、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸(DAHP)シンターゼ活性強化の効果
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体によるシキミ酸生成における、DAHPシンターゼ活性強化の効果を調べるため、SKM2株とSKM3株 (実施例1、表2、表3参照)のシキミ酸生産性比較を行った。SKM3株は、SKM2株における遺伝子改変(aroK, qsuB qsuD遺伝子破壊、及びtkt, tal遺伝子高発現)に加え、エシェリヒア  コリ由来のフィードバック阻害耐性型DAHPシンターゼ遺伝子(aroG(S180F))をプラスミドにより導入した株である。SKM2株、及びSKM3株を、各20 μg/mlのフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及び 10μg/mlのp-アミノ安息香酸を含む試験管内の10 ml  A液体培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1 Lに溶解](尚、 SKM3株の培養には、カナマイシン 50 μg/ml(終濃度)を添加)に植菌後、33℃で16時間、好気的に振盪培養を行った。【０２６７】
上記条件で増殖した前培養菌体を、各20 μg/mlのフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及び 10 μg/mlのp-アミノ安息香酸を含む試験管内の10 ml A液体培地(尚、SKM3株の培養には、カナマイシン 50 μg/ml(終濃度)を添加)にOD610が0.5となるよう植菌し、33℃で24時間、好気的に振盪培養を行った。24時間後の培養液を遠心分離(4℃, 15,000×g、5分)し、得られた上清液について高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によりシキミ酸を含む芳香族関連化合物の定量分析を行った。結果を表7に示す。好気培養24時間後、SKM2株は10.2 mMのシキミ酸、及び2.5 mMの3-DHSを生成したのに対し(シキミ酸、及び、シキミ酸と3-DHSの合算値の対糖収率は、それぞれ、8.6%、及び10.6%)、SKM3株は18.9 mMのシキミ酸、及び6.6 mMの3-DHSを生成した(シキミ酸、及び、シキミ酸と3-DHSの合算値の対糖収率は、それぞれ、16.0%、及び21.9%)。尚、両株共に3-DHQの生成量はごく僅か(1 mM以下)であった。この結果から、エシェリヒア  コリ由来のフィードバック阻害耐性DAHPシンターゼ遺伝子(aroG(S180F))の高発現によりシキミ酸、及び、3-DHSの生成量は大幅に増大することが示された。【０２６８】
[比較例6]
シキミ酸生産に対する、シキミ酸生成経路活性強化の効果
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体によるシキミ酸生産において、DAHPからシキミ酸への変換を順次触媒する、3−デヒドロキナ酸(3-DHQ)シンターゼ、3-DHQデヒドラターゼ、及びシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするシキミ酸生成経路遺伝子群(それぞれ、aroB, aroD, 及びaroE)の活性強化の効果を調べるため、該遺伝子群をプラスミド導入によって高発現させたSKM4株(実施例1(表3)参照)について、上記比較例5と同一の条件下、方法に従ってシキミ酸生産実験を行った。(尚、SKM4株の培養には、カナマイシン 50 μg/ml(終濃度)及びクロラムフェニコール5 μg/ml(終濃度)を培地に添加した。)
その結果、表7に示すように、SKM4株は28.8 mMのシキミ酸、及び4.9 mMの3-DHSを生成した(シキミ酸、及び、シキミ酸と3-DHSの合算値の対糖収率は、それぞれ、28.7%、及び33.0%)。この結果と、比較例5で述べた、aroB, aroD, aroE遺伝子導入を行っていないSKM3株と比較すると、SKM4株においては、シキミ酸生成量が大幅に(52%)増大することが示された。一方、SKM4株の3-DHS生成量はSKM3株のそれに比べて26%減少した。これらの結果から、シキミ酸生成経路遺伝子(aroB, aroD, aroE)の高発現により、3-DHSからシキミ酸への変換が促進されるとともに、シキミ酸生産性が大幅に上昇することが示された。【０２６９】
[比較例7]
シキミ酸生産に対する、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼ活性強化の効果
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体によるシキミ酸生産において、シキミ酸の前駆物質であるエリスロース−4−リン酸(E4P)の供給に関与する、トランスケトラーゼ遺伝子(tkt)、及びトランスアルドラーゼ遺伝子(tal)の活性強化の効果を調べるため、SKM1株とSKM2株、及びSKM10株とSKM4株 (実施例1(表2、表3)参照)のそれぞれの組み合わせについて、シキミ酸生産性の比較を行った。
SKM1株、及びSKM10株について、比較例5と同一の条件下、方法に従ってシキミ酸生産実験を行った結果、表7に示すように、培養24時間後において、tkt-tal遺伝子を導入していないSKM1株は10.0 mMのシキミ酸、及び1.6 mMの3-DHSを生成した。この結果より、SKM1株と、比較例5で述べたtkt-tal遺伝子を導入したSKM2株のシキミ酸生成量(表7)はほぼ同等であることが示された。このことから、これら2株に共通の遺伝子型においては、tkt-tal遺伝子導入によるシキミ酸生成量の有意な増大は認められないことが示された。
一方、シキミ酸生成経路遺伝子を導入・高発現しているが、tkt-tal遺伝子を導入していないSKM10株は、培養24時間後において、20.2 mMのシキミ酸、及び2.0 mMの3-DHSを生成し、シキミ酸の対糖収率は21.7%であった。この結果と、比較例6で述べたシキミ酸生成経路遺伝子とtkt-tal遺伝子をともに導入・高発現したSKM4株の生産性(表7)とを比較すると、後者の方がシキミ酸生産量、収率ともに大幅に(それぞれ、43%、及び32%)増大することが示された。このことから、シキミ酸生成経路遺伝子(aroG, aroB, aroD, aroE)を高発現させることにより、シキミ酸生成経路への炭素フラックスを強化した形質転換体においては、tkt-tal遺伝子高発現による顕著なシキミ酸生産性の増大効果が認められることが示された。【０２７０】
[比較例8]
シキミ酸生産に対する、シキミ酸キナーゼ遺伝子、3−デヒドロシキミ酸 (3-DHS)デヒドラターゼ遺伝子、及び、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊の効果
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体においてシキミ酸キナーゼ、3−DHSデヒドラターゼ、及び、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼをそれぞれコードする染色体遺伝子の破壊により、それらの酵素によるシキミ酸(及び3-DHS)の消費に関わる代謝を抑えた場合のシキミ酸生産に対する効果を調べるため、A1X5C1araEΔldhA株（シキミ酸生産株の元株、混合糖資化株）、SKM1株、SKM8株、及びSKM9株 (実施例1、 表3参照)について、シキミ酸生産性比較を行った。
A1X5C1-araEΔldhA株、SKM8株、及びSKM9株について、培地に抗生物質を添加しないことを除き、比較例5と同一の条件、方法において、試験管培養によるシキミ酸生産実験を行った。その結果、表7に示すように、A1X5C1-araEΔldhA株、SKM8株、及びSKM9株は、いずれの株もシキミ酸、及び3-DHSをほとんど生成しなかったのに対し(それぞれ、0.3 mM、及び0.1 mM生成)、SKM1株は10.0 mMのシキミ酸、及び1.6 mMの3-DHSを生成した。この結果より、シキミ酸生産株の元株、 qsuB遺伝子破壊株、及びqsuB/qsuD二重遺伝子破壊株では、シキミ酸はほとんど蓄積しないのに対し、シキミ酸の主代謝経路上に存在するシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子(aroK)の破壊によりシキミ酸生成量が顕著に増大することが示された。【０２７１】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０２７２】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でグルコース等からシキミ酸等の有機化合物を製造することができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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