(57)【要約】  特定の糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカーに基づいて幹細胞を検出する方法において、レクチンと抗体との組み合わせによる、高感度な「レクチン−抗体サンドイッチ法」として、細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、前記培養上清又は溶解物と、下記（式１）、又は下記（式２）で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、前記複合体を検出する手順と、を含む方法を提供する。2016147514.tif 0000242016147514.tif 000025
2016147514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、下記（式１）：
【化１】
2016147514.tif 000016
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【化２】
2016147514.tif 000017
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
【請求項２】
前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、血清含有培地で培養された細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レクチンが、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は
当該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、前記（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養上清又は溶解物と前記レクチンとを接触させて、該レクチンと前記培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンとから構成される第一の複合体を形成させる手順と、
第一の複合体と前記抗体とを接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと該抗体とから構成される第二の複合体を形成させる手順と、を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記レクチンが不溶性担体に結合される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記（式１）：
【化３】
2016147514.tif 000018
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【化４】
2016147514.tif 000019
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
【請求項１０】
前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞に含まれる幹細胞の有無又は存在量を判定する手順をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞の分化状態を判定する手順をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、下記（式１）：
【化５】
2016147514.tif 000020
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【化６】
2016147514.tif 000021
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
【請求項１３】
細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出するためのキットであって、
下記（式１）：
【化７】
2016147514.tif 000022
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【化８】
2016147514.tif 000023
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を含むキット。
【請求項１４】
前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
前記抗体が、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記抗体が、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記レクチンが不溶性担体に結合されている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を検出するための方法及びキットに関する。より詳しくは、細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンをレクチン−抗体サンドイッチ法により検出することによって幹細胞を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多分化能幹細胞（以下、単に「幹細胞」とも称する）を用いる再生医療技術の課題のひとつは、幹細胞を所望のタイプの細胞に分化させた後に患者の体内に移植する際に、幹細胞が未分化状態のまま残存し、分化した細胞とともに患者の体内に移植され、患者の体内で腫瘍化又は癌化する危険を如何に防止するかである。【０００３】
造腫瘍性を持つおそれのある未分化な幹細胞の混入を評価するために利用可能な技術として、特許文献１には、幹細胞に特異的な糖鎖を、当該糖鎖に結合性を有するレクチンを用いて検出することにより、細胞の分化状態を判定する方法が開示されている。この方法は、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと称されるレクチンの組換えタンパク（ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン）を用いて、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」及び／又は「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカーを検出するものである。なお、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンは、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメインに対応したＢＣ２ＬＣＮレクチン（GenBank Accession No. YP_002232818）を形質転換大腸菌で発現させた組換えタンパクであり、上記糖鎖構造を認識するものである。【０００４】
また、特許文献２には、幹細胞の培養上清中の上記糖鎖を、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いて検出することにより、分化誘導処理後に残存する未分化な幹細胞を検出する方法が開示されている。特許文献２は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」及び／又は「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカーとして、複合糖質であるポドカリキシン（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ）を同定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１２８９１４号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６５３０２号
【特許文献３】国際公開第２０１２／１４７９９２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Am. Soc. Nephrol., 2009, Vol.20, No.8, p.1669-1676.
【非特許文献２】Structure, 2010, Vol.18, No.1, p.59-72.
【非特許文献３】Glycobiology, 2013, Vol.23, No.3, p.322-336.
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 2011, Vol.286, No.23, p.20345-20353.
【非特許文献５】Stem Cells, 2007, Vol.25, p.723-730.
【非特許文献６】Cancer Research, 1999, Vol.59, p.4715-4719.
【非特許文献７】Glycobiology, 2011, Vol.21, No.9, p.1125-1130.
【非特許文献８】Scientific Reports, 2014， Vol.4, p.4069．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献２には、好適な一実施形態として、幹細胞の培養上清中の未分化糖鎖マーカーを、基板に固定化したレクチン（ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン）により捕捉して、レクチンと未分化糖鎖マーカーの複合体を形成させ、この複合体にラベル化した他のレクチン又は抗体を反応させることにより未分化糖鎖マーカーの検出を行う「サンドイッチ法」が開示されている。【０００８】
特許文献２は、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとの組み合わせで「レクチン−レクチンサンドイッチ法」に供することが可能なレクチンとしてＳＲＬ、ＣＧＬ２、ＡＢＡ、ＸＣＬと称される４つのレクチンを挙げている。【０００９】
本発明は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」及び／又は「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカー（ポドカリキシン）に基づいて幹細胞を検出する方法において、レクチンと抗体との組み合わせによる、高感度な「レクチン−抗体サンドイッチ法」を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１７］を提供する。
［１］細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、下記（式１）：【００１１】
【化１】
2016147514.tif 000003
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：【００１２】
【化２】
2016147514.tif 000004
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
［２］前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、［１］の方法。［３］前記抗体が、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、［１］又は［２］の方法。
［４］前記抗体が、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、［１］〜［３］のいずれかの方法。［５］前記細胞が、血清含有培地で培養された細胞である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］前記レクチンが、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は
当該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、前記（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質である、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］前記培養上清又は溶解物と前記レクチンとを接触させて、該レクチンと前記培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンとから構成される第一の複合体を形成させる手順と、
第一の複合体と前記抗体とを接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと該抗体とから構成される第二の複合体を形成させる手順と、を含む、［１］〜［６］の方法。
［８］前記レクチンが不溶性担体に結合される、［７］の方法。
［９］細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記（式１）：【００１３】
【化３】
2016147514.tif 000005
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：【００１４】
【化４】
2016147514.tif 000006
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。【００１５】
［１０］前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞に含まれる幹細胞の有無又は存在量を判定する手順をさらに含む、［１］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞の分化状態を判定する手順をさらに含む、［１］〜［９］のいずれかの方法。【００１６】
［１２］細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出する方法であって、前記培養上清又は溶解物と、下記（式１）：【００１７】
【化５】
2016147514.tif 000007
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：【００１８】
【化６】
2016147514.tif 000008
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。【００１９】
［１３］細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、該細胞に含まれる幹細胞を検出するためのキットであって、
下記（式１）：【００２０】
【化７】
2016147514.tif 000009
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：【００２１】
【化８】
2016147514.tif 000010
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を含むキット。
［１４］前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、［１３］のキット。
［１５］前記抗体が、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、［１３］又は［１４］のキット。
［１６］前記抗体が、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、［１３］〜［１５］のいずれかのキット。
［１７］前記レクチンが不溶性担体に結合されている、［１３］〜［１６］のいずれかのキット。【００２２】
ポドカリキシン（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ）は、１型膜貫通型糖タンパク質で、上皮性糸球体細胞（足細胞）から同定され、糸球体の機能及び形態の保持において重要な役割をしているほか、種々の癌の発達にも関係していることが知られている（非特許文献１参照）。本発明において「ポドカリキシン」の用語は、上記（式１）及び／又は（式２）の糖鎖構造を有する限りにおいて、ポドカリキシンの全長タンパク質及びその部分断片のいずれをも包含するものとする。【００２３】
また、本発明において「糖鎖」とは、単糖がグリコシド結合によって鎖状（直鎖あるいは樹状に分枝した分岐鎖）につながった構造を有する一群の化合物を意味する。糖鎖を構成する単糖としては、グルコース（Ｇｌｃ），ガラクトース（Ｇａｌ），マンノース等のヘキソース；Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）等のデオキシキソース；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ），Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等のヘキソサミン；Ｎ−アセチルノイラミン酸，Ｎ−グリコリルノイラミン酸等のシアル酸；キシロ−ス，Ｌ−アラビノース等のペントース等が挙げられる。「糖鎖」を構成する単糖の数は、特に限定されず、２〜数万程度である。【００２４】
本発明において「レクチン」とは、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、及びステロイド化合物等の配糖体などの複合糖質に結合した糖鎖の部分構造あるいは全体構造を認識し、結合するタンパク質を意味する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」及び／又は「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカー（ポドカリキシン）に基づいて幹細胞を検出する方法において、レクチンと抗体との組み合わせによる、高感度な「レクチン−抗体サンドイッチ法」が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を、従来技術に係るレクチン−レクチンサンドイッチ法と比較して、評価した結果を示すグラフである（試験例１）。
【図２】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を、種々の抗体を用いたレクチン−抗体サンドイッチ法と比較して、評価した結果を示すグラフである（試験例１）。
【図３】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価した結果を示すグラフである（試験例１）。
【図４】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法により、異なる種類の培地で培養した幹細胞の検出を行った結果（ＳｔｅｍＳｕｒｅ  ｈＰＳＣ培地Δ）を示すグラフである（試験例２）。
【図５】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法により、異なる種類の培地で培養した幹細胞の検出を行った結果（ｍＴｅＳＲ１培地）を示すグラフである（試験例２）。
【図６】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法により、異なる種類の培地で培養した幹細胞の検出を行った結果（ＭＥＦ−ＣＭ）を示すグラフである（試験例２）。
【図７】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法により、異なる種類の培地で培養した幹細胞の検出を行った結果（ＴｅＳＲ−Ｅ８培地）を示すグラフである（試験例２）。
【図８】本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価した結果を示すグラフである（試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２８】
１．幹細胞の検出方法
本発明に係る幹細胞の検出方法は、細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記（式１）：
【００２９】
【化９】
2016147514.tif 000011
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【００３０】
【化１０】
2016147514.tif 000012
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞の検出を行うものである。
具体的には、前記培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、前記複合体を検出する手順と、により、幹細胞の検出を行う。
【００３１】
（式１）及び（式２）で表される糖鎖構造は、未分化細胞の細胞表面及び培養上清中に特異的に存在し、ポドカリキシンに由来することが明らかにされている（特許文献１，２参照）。よって、本発明に係る幹細胞の検出方法は、さらに具体的には、細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、前記培養上清又は溶解物と、（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、前記複合体を検出する手順と、を含む方法である。
【００３２】
［糖鎖構造］
上記（式１）は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」の糖鎖構造を表す。ＧｌｃＮＡｃの４位の位置の水酸基は、単糖（好ましくはフコース）又は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖（好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖）で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、幹細胞表面では、膜構成成分として、ＧｌｃＮＡｃの１位の位置で糖タンパク質、糖脂質及び糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、ＧｌｃＮＡｃの１位の位置に、ＯＨ基、又は他の糖類、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合していてもよい。
【００３３】
上記（式２）は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造を表す。ＧａｌＮＡｃの１位の位置の水酸基は、単糖（好ましくはフコース）又は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖（好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖）で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、幹細胞表面では、膜構成成分として、ＧａｌＮＡｃの１位の位置で糖タンパク質、糖脂質及び糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、ＧａｌＮＡｃの１位の位置に、ＯＨ基、又は他の糖類、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合していてもよい。
【００３４】
［レクチン］
（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するレクチンには、ＢＣ２ＬＣＮレクチン又はその改変体が好ましく用いられる。ＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。レクチンには、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に加えて、当該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質（ＢＣ２ＬＣＮレクチン改変体）も好ましく用いられる。さらに、これらのレクチンに加えて、（式１）及び／又は（式２）で表される糖鎖を認識するレクチンであれば特に限定されることなく用いられ得る。
【００３５】
ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメインである（非特許文献２参照）。（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するレクチンには、このＢＣ２ＬＣＮレクチンを大腸菌で発現させた組換えタンパク質（ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン）を好適に用いることができる。ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンは、形質転換細菌によって大量生産可能である。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＢＣ２ＬＣＮ遺伝子を発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し発現させ、必要に応じてタンパク質の精製を行うことによってｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを調製する。
【００３６】
ＢＣ２ＬＣＮレクチン及びｒＢＣ２ＬＣＮレクチン並びにこれらの改変体は、（式１）又は（式２）で表される糖鎖への結合を有する限り、配列番号１のアミノ酸配列の全長を含むことを要せず、また配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加されていてもよい。ここで、数個とは２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下の自然数を表す。
【００３７】
［抗体］
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体には、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生するＩｇＧ抗体が好ましく用いられる。ハイブリドーマＲ−１０Ｇが産生する抗体（以下、「Ｒ−１０Ｇ抗体」とも称する）は、特許文献３に記載されている。Ｒ−１０Ｇ抗体は、ヒトｉＰＳ細胞を免疫原として作製したハイブリドーマを、ヒトｉＰＳ細胞陽性かつヒト胎児性癌細胞陰性を指標としてスクリーニングして得られたモノクロナール抗体である。Ｒ−１０Ｇ抗体のエピトープは、硫酸化度の低いケラタン硫酸であり（硫酸化度の高いケラタン硫酸には反応しない）、当該エピトープのポリペプチド部分は、ポドカリキシンであることが明らかにされている（非特許文献３参照）。また、非特許文献３によれば、Ｒ−１０Ｇ抗体のエピトープには、「Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）」又はそのタンデムリピートが含まれるとされている。Ｒ−１０Ｇ抗体は、特許文献３に記載の方法に従って調製することもできるが、市販のもの（例えば、コスモ・バイオ株式会社、ＲＩＴ−Ｍ００１）を用いてもよい。
【００３８】
なお、ケラタン硫酸は、「Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）」の繰り返し構造を含み、「Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）」中のＧａｌが硫酸化部位となる。上記硫酸化度は、このＧａｌの硫酸化の度合いを意味するものである。
【００３９】
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体には、Ｒ−１０Ｇ抗体に加えて、該抗体と競合する抗体も用いることができる。Ｒ−１０Ｇ抗体と競合する抗体とは、ケラタン硫酸との結合においてＲ−１０Ｇ抗体と競合する抗体、すなわちＲ−１０Ｇ抗体が結合するエピトープに結合することができる抗体を意味する。Ｒ−１０Ｇ抗体と競合する抗体は、従来公知の競合的結合アッセイを用いて、Ｒ−１０Ｇ抗体のポドカリキシンへの結合に対して候補抗体が競合する（すなわち、候補抗体がＲ−１０Ｇ抗体とポドカリキシンとの結合を妨げる）ことを確認することによって取得できる。この競合的結合アッセイによれば、Ｒ−１０Ｇ抗体の具体的なエピトープが決定されていなくても競合抗体を取得することができるが、競合抗体は、低硫酸化ケラタン硫酸をエピトープとし、特にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含む抗体であることが好ましい。
【００４０】
さらに、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体には、Ｒ−１０Ｇ抗体及び該抗体と競合する抗体に加えて、ケラタン硫酸、好ましくは低硫酸化ケラタン硫酸を認識する抗体であれば特に限定されることなく用いられ得る。
【００４１】
ここで、本発明において「抗体」の用語には、「抗体の機能性断片」も含まれるものとする。「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ等を含む。また、Ｆ（ａｂ'）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ'も抗体の機能性断片に含まれる。ただし抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。機能性断片には、抗体タンパク質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生されたタンパク質も含まれる。
【００４２】
［幹細胞］
「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。本発明に係る検出方法が検出の対象とする幹細胞（多分化能幹細胞）は、自己再生能及び分化多能性を有する未分化細胞であって、少なくとも多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)及び複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)を包含する。幹細胞としては、特に、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）及び体細胞に初期化因子を導入して得られる誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。なお、複能性幹細胞は、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等を含む。本発明において、単に「細胞」と記載する場合は、幹細胞と分化細胞（体細胞）の両方を含む意味で用いるものとする。
【００４３】
細胞の由来種は特に限定されず、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどであってよい。
【００４４】
［培養上清・溶解物］
（式１）及び／又は（式２）で表される糖鎖構造は、未分化細胞の細胞表面及び培養上清中に特異的に存在することが明らかとなっているため（特許文献１，２参照）、本発明に係る幹細胞の検出方法において、幹細胞の検出のために用いられるサンプルは、細胞の溶解物であっても培養上清であってもよい。
【００４５】
細胞の培養上清及び溶解物は、従来公知の手法に従って調製することができる。溶解物は、物理的に細胞を破砕する方法又は化学的に細胞を可溶化させる方法により調製できる。タンパク質が熱変性を起こさない、タンパク質が失活しない、タンパク質の回収率がよい、操作が簡便である等の点から、界面活性剤を用いて細胞を可溶化させる方法が好ましい。
【００４６】
例えば、5×106〜5×107細胞の細胞ペレットに、界面活性剤を含有する細胞溶解剤を添加し、細胞を懸濁させた後１〜10分間氷上で反応させる。その後20,000×gで15分間程度遠心処理し、得られた上清を細胞ライセートとして用いればよい。
【００４７】
細胞溶解剤には、通常この分野で用いられる細胞溶解剤としての界面活性剤を添加した、適当な塩（KCl、NaCl等）やDTT等の還元剤を含む緩衝液が用いられる。緩衝液としては、pH 5.0〜10.0、好ましくはpH 7.0〜8.0の中性付近に緩衝作用を有する、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましい。また、緩衝液中の緩衝剤濃度は、通常10〜500 mM、好ましくは10〜100 mMの範囲から適宜選択される。塩の濃度は、通常100〜200 mMである。界面活性剤は、細胞の種類や使用する緩衝液のpHや塩濃度、等の条件に従って適宜選択すればよい。例えばNP-40、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（和光純薬工業株式会社）、TritonX-100、ジギトニン等が挙げられる。濃度は、緩衝液全量に対して通常0.01〜1.0％程度とされる。
【００４８】
培養上清及び溶解物は血清を含有していてもよい。本発明に係る幹細胞の検出方法によれば、血清含有培地で培養された細胞の培養上清及び溶解物を用いた場合にも、幹細胞の存在を高感度に検出することが可能である（試験例１参照）。
【００４９】
培地には、従来、幹細胞の未分化維持及び分化誘導のために用いられている培地を用いればよい。例えば、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）ｈＰＳＣ  ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業株式会社）、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）（Biological Industries Ltd）、ＲｅｐｒｏＦＦ（ReproCELL）、ＴｅＳＲTM−Ｅ８TM（STEMCELL Technologies）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８TM  Ｍｅｄｉｕｍ(LifeTechnologies)、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（LifeTechnologies）及びｍＴｅＳＲ１（STEMCELL Technologies）等を用いることができる。
【００５０】
血清は、特に限定されず、例えば、仔牛血清（ＣＳ）、牛胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト由来血清、牛由来血清、羊由来血清、ヤギ由来血清、サル由来血清、馬由来血清、ラット由来血清、マウス由来血清、ウサギ由来血清、ハムスター由来血清、モルモット由来血清、豚由来血清、鳥（鶏）由来血清、犬由来血清、猫由来血清等が用いられる。培養上清及び溶解物中の血清濃度は、培地への血清の添加濃度に応じて変化し得る。通常の幹細胞の維持培養又は分化培養における、培地への血清の添加濃度は、０．５〜２０％（ｖ／ｖ）程度である。
【００５１】
培養上清及び溶解物は、精製工程を経ることなくそのまま、又は希釈して、あるいは予め抗体やレクチン等で濃縮して用いることができる。
【００５２】
本発明に係る幹細胞の検出方法は高感度であるため、培養上清で０.１〜１０μｌ程度の量で、ピコモーラー（ｐＭ）又はナノモーラー（ｎＭ）レベルの（式１）及び（式２）で表される糖鎖を検出することができる。
【００５３】
［レクチン−抗体サンドイッチ法］
本発明に係る幹細胞の検出方法の手順には、培養上清又は溶解物（以下「培養上清等」とも称する）とレクチンとケラタン硫酸に結合性を有する抗体とを接触させてレクチンとポドカリキシンと抗体とから構成される複合体を形成させる複合体形成手順と、複合体を検出する検出手順と、が含まれる。以下、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン及びＲ−１０Ｇ抗体を用いる場合を例に具体的に説明する。
【００５４】
複合体形成手順では、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとＲ−１０Ｇ抗体を同時に培養上清等と接触させてもよいが、培養上清等とｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させた後にＲ−１０Ｇ抗体を反応させることがより好ましい。すなわち、複合体形成手順は、培養上清等とレクチンとを接触させて、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンと培養上清等に含まれるポドカリキシンとから構成される第一の複合体を形成させる第一手順と、第一の複合体とＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体を形成させる第二手順と、からなることが好ましい。
【００５５】
複合体形成手順は、B／F分離を行わないホモジニアスな方法で行ってもよいが、不溶性担体を用いてB／F分離を行うヘテロジニアスな方法で行うことがより好ましい。
【００５６】
培養上清等の量、及びこれらと反応させるレクチン及び抗体の量（濃度）は、細胞の種類、要求される測定感度、用いる測定方法や測定装置などに応じて適宜設定される。
【００５７】
不溶性担体を用いてB／F分離を行う方法は、例えば、不溶性担体に結合したｒＢＣ２ＬＣＮレクチンと、不溶性担体に結合していないＲ−１０Ｇ抗体と、培養上清等とを接触させて複合体を形成させることにより行われる。より具体的には、B／F分離を行う方法は、培養上清等と、不溶性担体に結合したｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させて、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとから構成される第一の複合体を得る第一手順と、第一の複合体と遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体を得る第二手順と、によって行われる。
【００５８】
B／F分離のための不溶性担体には、スライドグラス、ＥＬＩＳＡプレート（マイクロプレート）、磁気ビーズ、フィルター、フィルム、メンブレンなど、通常のタンパク質固定化法に用いられる基材を使用できる。基材の材料には、通常、ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリウレタンなどが用いられる。
【００５９】
レクチンを不溶性担体に固定化させる方法は、特に限定されず、化学的結合法（共有結合により固定化する方法）、物理的に吸着させる方法などの公知の方法を適用できる。アビジン−ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用してレクチンを不溶性担体に固定化することも可能である。この場合、レクチンにビオチンを結合したビオチン化レクチンを、ストレプトアビジンをコーティングしたストレプトアビジンプレートに固定化すればよい。また、この分野で通常使用される各種リンカーを介して、レクチンを不溶性担体に固定化させてもよい。
【００６０】
不溶性担体を用いてB／F分離を行う方法では、培養上清等と不溶性担体に固定化されたｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとを反応させる第一手順の後、第一の複合体と遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを反応させる第二手順を行う前に、固相表面上から不要な物質を除去するための洗浄手順を含んでもよい。また、第二手順の後、検出手順を行う前にも、洗浄手順を含んでもよい。洗浄手順によって、固相表面上から試料中の夾雑物や未反応のＲ−１０Ｇ抗体を除去し、第二の複合体のみを固相表面上に分離できる。
【００６１】
B／F分離を行わない方法では、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとＲ−１０Ｇ抗体との複合体を分離するための方法として、例えばクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、例えばＬｉＢＡＳｙｓ（島津製作所株式会社製）等の自動免疫分析装置を用いた方法等を適用できる。
【００６２】
検出手順は、標識物質を用いてｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体を検出することにより行うことができる。標識物質としては、例えば、通常の免疫測定法等において用いられる酵素類、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、補酵素又は補酵素と特異的に結合するもの（ビオチン、アビジン）、タグ、紫外部〜赤外部に吸収を有する物質、発色性微粒子、蛍光性微粒子、金属性微粒子、磁性物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質など、通常この分野で用いられている標識物質が挙げられる。
【００６３】
標識物質をｒＢＣ２ＬＣＮレクチン及び／又はＲ−１０Ｇ抗体、好ましくはＲ−１０Ｇ抗体に結合させるには、例えば、通常の免疫測定法等において行われている標識方法を適宜利用して行えばよい。また、１個又は数個のアミノ酸を介して、又は１個又は数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識物質を結合させる方法も採用できる。さらに、標識物質をタンパク質に結合させるキットも各種市販されているので、それらを用い、キットに添付の取扱説明書に従って標識を行ってもよい。
【００６４】
例えば、不溶性担体に固定化したｒＢＣ２ＬＣＮレクチンと、標識物質として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識した遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを用いてB／F分離を行う方法は、概略以下の通りである。
【００６５】
培養上清等を、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した不溶性担体に接触させ、４〜４０℃で３分〜２０時間、反応を行って、固相表面上にｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとポドカリキシンとの第一の複合体を生成させる。次に、ＨＲＰで標識したＲ−１０Ｇ抗体を含有する溶液を固相表面上に加え４〜４０℃で３分〜１６時間反応させて、固定化ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン−ポドカリキシン−標識Ｒ−１０Ｇ抗体の第二の複合体を生成させる。続いて、適当な濃度のＴＭＢ（3,3'5,5'-テトラメチルベンジジン）溶液を添加し、一定時間反応させる。その後、１M硫酸等の反応停止液を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。得られた測定値と、予め濃度既知のポドカリキシンの溶液について同様の測定を行って得た検量線とから、培養上清等中のポドカリキシン（あるいは、ポドカリキシン上の（式１）又は（式２）で表される糖鎖）の量を求めることができる。
【００６６】
また、例えばAlexa Fluor-488 tetrafluorophenyl ester等で標識したｒＢＣ２ＬＣＮレクチンと、例えばAlexa Fluor-647 succinimidyl ester等で標識したＲ−１０Ｇ抗体を用い、公知の蛍光相互相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCCS)に従って（式１）又は上記（式２）で表される糖鎖を測定することもできる。
【００６７】
また、「ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン−ポドカリキシン−Ｒ−１０Ｇ抗体」の複合体の検出は、標識物質を用いることなく、例えば複合体に由来する性質を利用して測定する方法、具体的には表面プラズモン共鳴などのホモジニアスイムノアッセイ系等の方法によっても行うことが可能である。
【００６８】
なお、本発明に係るレクチン‐抗体サンドイッチ法は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系に適用して容易かつ迅速に測定を行うこともできる。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせなどについては、特に制限はなく、適用する自動分析装置の環境や機種に合わせて、あるいは他の要因を考慮に入れて最もよいと思われる試薬類等の組み合わせを選択して用いればよい。さらに、本発明に係るレクチン‐抗体サンドイッチ法は、Ｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ（Micro-Total Analysis Systems:μ-TAS、μ総合分析システム）への応用も可能である。
【００６９】
［応用］
（式１）及び（式２）で表される糖鎖構造は、未分化細胞の細胞表面及び培養上清中に特異的に存在することから、本発明に係る検出方法により、細胞の培養上清等に含まれるポドカリキシン上の当該糖鎖を検出することで、細胞中に存在する幹細胞の有無を検出することができる。また、当該糖鎖を定量的に検出すれば、細胞中の幹細胞の存在量を判定することもできる。
【００７０】
例えば、未分化状態を維持する培養（維持培養）を行っている幹細胞の培養上清等をマイクロピペットなどで一定量採取し、本発明に係る検出方法により、ポドカリキシン上の（式１）及び／又は（式２）で表される糖鎖の検出を行う。糖鎖が検出されれば、細胞が未分化状態を維持していることを確認でき、これにより分化細胞の混入のない高品質な幹細胞を取得することが可能となる。あるいは、糖鎖の定量値に基づいて、全細胞のうちどの程度の割合の細胞が未分化状態を維持しているか（逆に、どの程度の割合が分化しているか）を判定することもできる。
【００７１】
培養上清等を一定量採取する手段としては、手作業でも良いが、自動培養装置などにより自動的に採取することもできる。
【００７２】
また、例えば、幹細胞の分化誘導を行った後、細胞の培養上清等をマイクロピペットなどで一定量採取し、本発明に係る検出方法により、ポドカリキシン上の（式１）及び／又は（式２）で表される糖鎖の検出を行う。糖鎖が検出されれば、細胞中に未分化状態の幹細胞が残存していることを確認できる。逆に、糖鎖が検出されなくなれば（バックグラウンド値と同レベルになれば）、細胞が全て分化してことを確認でき、これにより未分化細胞の混入のおそれのない分化細胞を取得することが可能となる。あるいは、糖鎖の定量値に基づいて、全細胞のうちどの程度の割合が分化しているか（逆に、どの程度の細胞が未分化状態にとどまっているか）を判定することもできる。
【００７３】
本発明に係る検出方法に細胞の培養上清を供する場合には、（式１）又は（式２）の糖鎖が検出可能量分泌された後の培養上清を用いるとされる必要がある。交換後、培養液中に検出可能量の糖鎖が出現するまでに要する時間は、細胞の種類や培養条件によって異なり適宜設定され得るが、例えば１８〜３０時間程度とされる。通常は２４時間程度毎に培地交換を行うので、その際に廃棄する培養上清の一部を利用することが好ましい。
【００７４】
ここで、幹細胞を分化誘導する方法としては、どのような手法であってもよい。例えば、幹細胞をレチノイン酸存在下で培養して神経系細胞に分化する方法、増殖をストップさせたＮＩＨ３Ｔ３細胞表面を土台として表皮細胞を形成させる方法などの手法を適用できる。
【００７５】
２．幹細胞の検出キット
本発明に係る幹細胞の検出キットは、上記の幹細胞検出方法に用いられるものであって、下記（式１）：
【００７６】
【化１１】
2016147514.tif 000013
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
又は下記（式２）：
【００７７】
【化１２】
2016147514.tif 000014
（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくは他の分子を表す。）
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を含む。
【００７８】
キットの構成の好ましい態様と具体例は、上記の幹細胞検出方法において説明した通りである。具体的には、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体は、特に低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体であることが好ましい。また、該抗体は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）又はそのタンデムリピートをエピトープに含むことが好ましい。具体的には、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０１）が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体が用いられ得る。
【００７９】
また、キットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、ポドカリキシンとレクチン及び抗体との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。さらに、キットは、ポドカリキシンについて検量線を作成するために用いられる標準品を含んでいてもよい。
【００８０】
本発明に係る幹細胞の検出キットにおいて、（式１）又は（式２）で表される糖鎖に結合性を有するレクチンは、不溶性担体に結合されていることが好ましい。ケラタン硫酸に結合性を有する抗体は予め標識されていることが好ましいが、ユーザが用時に抗体の標識を行うための試薬がキットに含まれていてもよい。
【００８１】
本発明における用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【実施例】
【００８２】
［試験例１：レクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出］
本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価するため、ｉＰＳ細胞の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。測定は、マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ検出系で行った。【００８３】
ストレプトアビジンプレート（住友ベークライト株式会社）のウェルにビオチン化ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン（０．５μｇ当量）を加え、３７度で１時間、固定化した。リコンビナントレクチンの作成は、非特許文献４に記載の方法に従った。ウェルを緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、リン酸緩衝液）で洗浄後、ｍＴｅＳＲ１培地で２４時間培養したｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）の培養上清を培地（２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で段階希釈した溶液５０μｌをウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）は、理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けた。【００８４】
ウェルを緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼを標識したＲ１０Ｇ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ウェルを緩衝液で洗浄後、基質溶液（ＴＭＢ、和光純薬株式会社）１００μｌをウェルに添加し、室温で３０分反応を行った。１Ｍ硫酸をウェルに添加して反応を停止させた後、各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。比較のため、Ｒ１０Ｇ抗体にかえて、ｒＡＢＡレクチン（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来、特許文献２参照）、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、抗Ｔｒａ−１−６０抗体、抗Ｔｒａ−１−８１抗体、抗ポドカリキシン抗体を同濃度で用いた。【００８５】
（１）Ｒ１０Ｇ抗体：低硫酸化ケラタン抗体（コスモ・バイオ株式会社、ＲＩＴ−Ｍ００１）。ポドカリキシン上の硫酸化度の低いケラタン硫酸（低硫酸化ケラタン硫酸）を認識する。
（２）ｒＡＢＡレクチン：アミノ酸配列を配列番号２に示す（RCSB Protein Data Bank Accession No. 1Y2Vも参照）。
（３）抗ＳＳＥＡ３抗体：ラットモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３０３）。ヒトＥＣ細胞（Tetracarcinoma stem cell）、ヒトＥＧ細胞（Embryonic germ cell）及びヒトＥＳ細胞の表面に発現するＳＳＥＡ３抗原（Stage-specific embryonic antigen 3）を認識する。
（４）抗ＳＳＥＡ４抗体：マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３０４）。ヒトＥＣ細胞、ヒトＥＧ細胞及びヒトＥＳ細胞の表面に発現するＳＳＥＡ４抗原（Stage-specific embryonic antigen 4）を認識する。
（５）抗Ｔｒａ−１−６０抗体：マウスモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３６０）。ポドカリキシン上のケラタン硫酸を認識する（非特許文献５，６参照）。
（６）抗Ｔｒａ−１−８１抗体：マウスモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３８１）。ポドカリキシン上のケラタン硫酸を認識する（非特許文献５，６参照）。
（７）抗ポドカリキシン抗体：ヤギポリクローナルＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ。ＡＦ１６５８）。ヒトポドカリキシンを認識する。【００８６】
結果を図１及び図２に示す。ｒＡＢＡレクチンを用いた場合には、希釈倍率４０倍（図中、ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：０．０２５）以下の高希釈溶液を用いた場合にバックグランドの影響が顕著で、定量性の低下が生じた（線形回帰直線の決定係数：０．６３８７）。その原因として、培地中の血清成分と、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン及びｒＡＢＡレクチンとの非特異的な結合によるバックグランドの上昇が考えられた。【００８７】
一方、Ｒ１０Ｇ抗体を用いた場合には、いずれの希釈倍率においても上記のような非特異的な結合によるバックグランドの上昇はみられず、高精度な定量測定が可能であった（線形回帰直線の決定係数：０．９９８８）。【００８８】
また、抗ＳＳＥＡ３抗体及び抗ＳＳＥＡ４抗体は、抗原との反応性の欠如のため、測定は不能であった（図２参照）。ポドカリキシン上のケラタン硫酸を認識する抗Ｔｒａ−１−６０抗体及び抗Ｔｒａ−１−８１抗体を用いた場合にも、抗原にほとんど結合しないか全く結合せず、測定は不能であった（図２参照）。その原因として、以下が考えられた。
抗Ｔｒａ−１−６０抗体及び抗Ｔｒａ−１−８１抗体は、いずれもポドカリキシン上のケラタン硫酸をエピトープとする抗体であるが、「Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ」をエピトープに含むとされており（非特許文献７参照）、「Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）」又はそのタンデムリピートをエピトープに含むとされるＲ−１０Ｇ抗体とはエピトープが異なる。
抗Ｔｒａ−１−６０抗体及び抗Ｔｒａ−１−８１抗体は、高硫酸化ケラタン硫酸をエピトープとするとされており、低硫酸化ケラタン硫酸をエピトープとするＲ−１０Ｇ抗体とはエピトープが異なる。
抗Ｔｒａ−１−６０抗体及び抗Ｔｒａ−１−８１抗体は、ＩｇＧ抗体であるＲ−１０Ｇ抗体とは異なり、ＩｇＭ抗体である。【００８９】
さらに、抗ポドカリキシン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ。ＡＦ１６５８）を用いた場合にも、測定は不能であった。その原因として、同抗体は、ミエローマ細胞で発現させたリコンビナントポドカリキシンを抗原に用いて調製されたものであるため、幹細胞に発現するポドカリキシンに対して十分な反応性を有さなかったことが考えられる。幹細胞での発現に由来する、ポドカリキシンの特異的な構造（例えば、（式１）及び（式２）の糖鎖構造）によって、同抗体のエピトープへの結合が阻害された可能性が考えられる。【００９０】
図３に、ｉＰＳ細胞の培養時の血清濃度を２％から１％、５％、１０％又は２０％に変更した以外は上記と同様にして、培養上清希釈溶液を用いたポドカリキシンの定量測定を行った結果を示す。血清濃度１％〜２０％の範囲において良好な定量性が確認できた。【００９１】
［試験例２：レクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出下限量の算出］
異なる種類の培地で培養したｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。培地には以下の４種類を用いた。各培地でｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を２４時間培養後、回収した培養上清をそれぞれの培地で希釈し、希釈溶液を得た。
ＳｔｅｍＳｕｒｅ  ｈＰＳＣ培地Δ（和光純薬工業株式会社）
ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＭＥＦ−ＣＭ（Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ、マウス胚性繊維芽細胞を培養した培養上清）
ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）【００９２】
ストレプトアビジンプレートのウェルにビオチン化ｒＢＣ２ＬＣＮレクチン（０．３μｇ／ｍｌ）を加え、室温（２０℃〜２５℃）で１時間、固定化した。ウェルを緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、リン酸緩衝液）で洗浄後、培養上清の希釈溶液５０μｌをウェルに添加し、室温で１時間反応させた。【００９３】
ウェルを緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼを標識したＲ１０Ｇ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ウェルを緩衝液で洗浄後、基質溶液（ＴＭＢ）５０μｌをウェルに添加し、室温で３０分反応させた。０．５Ｍ硫酸をウェルに添加して反応を停止させた後、各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ−６５０ｎｍ）を測定した。【００９４】
結果を図４〜図７に示す。図中、横軸は、培養上清の希釈倍率を示し、培地１ｍｌあたりの培養細胞数が１０，０００個となる培養条件で得られた培養上清の希釈倍率を「培地１ｍｌあたりの培養細胞相当数」で示す。すなわち、「１０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ」が希釈なしを意味し、例えば「５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ」は２倍希釈、「２．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ」は４倍希釈、「１．２５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ」は８倍希釈を意味する。図中、線形回帰直線及び回帰式は、決定係数（Ｒ２乗）が最も良好な（１．０に近い）ときの直線及び式である。【００９５】
４種類の培地のいずれを用いた場合も、高希釈倍率においても良好な定量性が得られた。本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法が、培地の種類の影響を受けないことが確認できた。【００９６】
回帰式に基づき、検出下限値となる希釈倍率を求め、検出下限値を「培地１ｍｌあたりの培養細胞相当数」で算出した結果を「表１」に示す。検出下限値は、培地のみの吸光度（吸光度の平均値に標準偏差の３．３倍を加算した値）を算出し、当該吸光度を示す希釈倍率を回帰式から求めた。【００９７】
【表１】
2016147514.tif 000015
【００９８】
検出下限の「培地１ｍｌあたりの培養細胞相当数」は、２７〜３２１ｃｅｌｌ／ｍｌであった。従来技術に係るｒＢＣ２ＬＣＮレクチンとｒＡＢＡレクチンを組み合せた「レクチン−レクチンサンドイッチ法」での検出下限は、６２３〜４，７５３ｃｅｌｌ／ｍｌと報告されている（非特許文献８参照）。ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンと低硫酸化ケラタン抗体Ｒ１０Ｇ抗体を組み合わせた本発明に係る「レクチン−抗体サンドイッチ法」は、従来の「レクチン−レクチンサンドイッチ法」に比して、幹細胞を一層高感度に検出できることが明らかとなった。【００９９】
［試験例３：レクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出２］
本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価するため、ｉＰＳ細胞の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。測定は、スライドガラスを用いたアレイ検出系で行った。【０１００】
非接触型スポッター（ＭｉｃｒｏＳｙｓ４０００；Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ)を用いて、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンをエポキシ活性化スライドグラスに固定化した。試験例１と同様にして調製した培養上清の希釈溶液を、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化したスライドグラスに滴下し、２０℃で一晩反応させた。洗浄後、Ｒ１０Ｇ抗体（１μｇ／ｍＬ）を滴下し、２０℃で１時間反応させた。次に、Ｃｙ３標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１μｇ／ｍＬ）を滴下し、２０℃で1時間反応させた。洗浄後、エバネッセント波励起蛍光型スキャナー（Ｂｉｏ−ＲＥＸ  Ｓｃａｎ  ２００、Ｒｅｘｘａｍ）でスキャンした。【０１０１】
結果を図８に示す。図中、横軸は、図１〜４と同様に、培養上清の希釈倍率を「培地１ｍｌあたりの培養細胞相当数」で示す。図中、線形回帰直線及び回帰式は、決定係数（Ｒ２乗）が最も良好な（１．０に近い）ときの直線及び式である。【０１０２】
いずれの希釈倍率においても非特異的な結合によるバックグランドはみられず、高精度な定量測定が可能であった（線形回帰直線の決定係数：０．９９９７）。【０１０３】
試験例１〜３の結果から、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンに低硫酸化ケラタン抗体Ｒ１０Ｇ抗体を組み合わせたレクチン−抗体サンドイッチ法によれば、血清含有培地で培養された細胞の培養上清を用いた場合にも、ポドカリキシンを高精度に検出することができ、高感度な幹細胞検出が可能となることが明らかとなった。なお、ｍＴｅＳＲ１培地で２４時間培養したｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）より、市販のキット（CelLytic MEM Protein Extraction Kit, Sigma-Aldrich）を用いて得られた水溶性分画を用いて同様の試験を行った場合も、培養上清を用いた場合と同様の結果が得られた。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１：ＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列
配列番号２：ＡＢＡレクチンのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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