(57)【要約】  未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を分離する方法は、複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、複数のピラー状パターンに細胞混合物を接触させる工程を含み、ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方がピラー状パターンに接着し易く、他方がピラー状パターンに接着し難い関係を具備する。これにより、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。
2016104344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離する方法であって、
複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、前記複数のピラー状パターンに前記細胞混合物を接触させる工程を含み、
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状パターンに接着し易く、他方が前記ピラー状パターンに接着し難い関係を有することを特徴とする未分化細胞の分離方法。
【請求項２】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０〜５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項３】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００〜２５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項４】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）
【請求項５】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）
【請求項６】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）
【請求項７】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）
【請求項８】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）
【請求項９】
前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、
前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項１０】
前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１〜５、並びに請求項７及び請求項８のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項１１】
前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが正三角形格子の各格子点上に配列されてなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項１２】
前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが方形格子の各格子点上に配列されてなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
【請求項１３】
未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離するために用いられる未分化細胞分離用基板であって、
第１面及び前記第１面に対向する第２面を有する基材と、
前記基材の前記第１面に規則性を有して配列形成されてなる複数のピラー状ナノパターンと
を備え、
前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状ナノパターンに接着し易く、他方が前記ピラー状ナノパターンに接着し難い関係を有することを特徴とする未分化細胞分離用基板。
【請求項１４】
前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０〜５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１３に記載の未分化細胞分離用基板。
【請求項１５】
前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００〜２５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の未分化細胞分離用基板。
【請求項１６】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）
【請求項１７】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）
【請求項１８】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）
【請求項１９】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）
【請求項２０】
前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）
【請求項２１】
前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、
前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
【請求項２２】
前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１３〜１７、並びに請求項１９及び２０のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
【請求項２３】
前記複数のピラー状パターンは、正三角形格子の各格子点上に配列されていることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
【請求項２４】
前記複数のピラー状パターンは、方形格子の各格子点上に配列されていることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から当該未分化細胞を分離する方法及び当該未分化細胞を分離するために用いられる基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等に代表される幹細胞は、神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の様々な機能を有する細胞への分化能を有する。そのため、幹細胞を分化誘導させることで得られる神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等を用いて生体の細胞、組織、器官等を再構築する再生医療分野への応用が期待されている。【０００３】
幹細胞の再生医療分野への応用研究にあたり、幹細胞と、当該幹細胞から分化誘導した分化細胞（神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等）とを含む細胞混合物から、未分化の幹細胞を分離・取得するのが望ましい場合がある。未分化細胞を分化誘導させる際に、分化細胞が混在していると、未分化細胞の分化誘導の効率が低下することがある。また、そのようにして分化誘導した細胞を、例えば組織形成に使用する場合、組織形成不全が起こるおそれがある。そのため、当該細胞混合物から分化細胞を除去し、未分化細胞を分離・取得することが重要となる。【０００４】
一方で、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物を使用した組織形成が可能であるとの報告もある（非特許文献１参照）。この場合において、細胞混合物中における未分化細胞の細胞密度が適切な範囲に調整されていることが重要となる。【０００５】
従来、所定の目的細胞を含む細胞混合物から当該目的細胞を分離する方法として、細胞混合物に含まれる目的細胞とその他の細胞との大きさの違いに着目し、当該目的細胞を捕捉可能なフィルタを備える分離装置を用いて分離する方法（特許文献１参照）、分離目的細胞に識別ラベル等を付加し、当該識別ラベル等を検出することにより目的細胞を分離する方法（特許文献２，特許文献３，非特許文献２参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２７４９２３号公報
【特許文献２】特開２００５−２７５７９号公報
【特許文献３】特開２０１１−８７４７５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takabe et al., "Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissues via Mesenchymal Cell-Driven Condensation", Cell Stem Cell, Vol. 16, pp. 556-565, 2015
【非特許文献２】Kuanyin K. Lin et al., "Detection of Hematopoietic Stem Cells by Flow Cytometry", METHODS IN CELLS BIOLOGY, Vol. 103, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載の分離方法は、細胞混合物に含まれる目的細胞の大きさと、細胞混合物に含まれる他の細胞の大きさとに応じて、目的細胞を捕捉可能なフィルタを用いることにより、当該目的細胞を分離する方法である。したがって、細胞混合物に含まれる所定の目的細胞の大きさが、当該細胞混合物に含まれる他の細胞の大きさと異なる場合には、当該目的細胞を分離することができる。しかしながら、未分化細胞と分化細胞との大きさは実質的に同一であるため、上記分離方法を用いても、上記細胞混合物から未分化細胞を完全に分離・取得することができず、一方（例えば未分化細胞）の細胞密度を向上させることも困難であるという問題がある。【０００９】
また、特許文献２、特許文献３及び非特許文献２に記載の分離方法を用いて細胞混合物中の未分化細胞を分離するためには、細胞混合物中の未分化細胞に識別ラベル等を付与する必要があり、当該識別ラベル等の検出により未分化細胞を分離することが可能な方法ではある。しかし、分離された未分化細胞を分化誘導して得られる分化細胞を用いて組織形成を行うためには、分離後の未分化細胞から識別ラベル等を除去しなければならない場合があるが、識別ラベル等の未分化細胞への付与及び除去操作により、当該未分化細胞に損傷を与えてしまうおそれがある。また、かかる識別ラベル等の付与・除去作業が煩雑であるという問題もある。【００１０】
このような課題に鑑みて、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することのできる方法及び当該分離方法に用いられる未分化細胞分離用基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離する方法であって、複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、前記複数のピラー状パターンに前記細胞混合物を接触させる工程を含み、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状パターンに接着し易く、他方が前記ピラー状パターンに接着し難い関係を具備することを特徴とする未分化細胞の分離方法を提供する（発明１）。【００１２】
本発明者らの鋭意研究により、ナノ凹凸構造体に複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されていることで、当該ナノ凹凸構造体の複数のピラー状パターンが配列されている領域において、未分化細胞と分化細胞とのピラー状パターンに対する接着性に違いが生じることが見出された。よって、上記発明（発明１）によれば、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することができる。【００１３】
なお、本発明において、ピラー状パターンの間隔とは、「一のピラー状パターンの平面視中心と、それに隣接する他のピラー状パターンの平面視中心とを結ぶ直線長さからピラー状パターンの寸法を差し引いた長さ」を意味し、ピラー状パターンの寸法とは、「平面視略正方形状のピラー状パターンであれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形状のピラー状パターンであれば当該円の直径」を意味する。また、本発明において「分離」とは、少なくとも２種の細胞（例えば、未分化細胞及び分化細胞）を含む細胞混合物から、いずれか一方の細胞（例えば、未分化細胞）を完全に分離・取得することに限らず、当該細胞混合物中におけるいずれか一方の細胞（例えば、未分化細胞）の細胞密度を高めることをも意味するものとする。【００１４】
上記発明（発明１）においては、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０〜５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく（発明２）、いずれも１００〜２５０ｎｍの範囲内であるのが好ましい（発明３）。【００１５】
上記発明（発明１〜３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明４）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）【００１６】
上記発明（発明１〜３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明５）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）【００１７】
上記発明（発明１〜３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明６）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）【００１８】
上記発明（発明１〜３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明７）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）【００１９】
上記発明（発明１〜３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係を有していてもよい（発明８）。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）【００２０】
上記発明（発明１〜６）において、前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であるのが好ましい（発明９）。【００２１】
上記発明（発明１〜５、７，８）において、前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であるのが好ましい（発明１０）。【００２２】
上記発明（発明１〜１０）において、前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが正三角形格子の各格子点上に配列されていてもよいし（発明１１）、前記複数のピラー状パターンが方形格子の各格子点上に配列されていてもよい（発明１２）。【００２３】
また、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離するために用いられる未分化細胞分離用基板であって、第１面及び前記第１面に対向する第２面を有する基材と、前記基材の前記第１面に規則性を有して配列形成されてなる複数のピラー状ナノパターンとを備え、前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状ナノパターンに接着し易く、他方が前記ピラー状ナノパターンに接着し難い関係を具備することを特徴とする未分化細胞分離用基板を提供する（発明１３）。【００２４】
上記発明（発明１３）において、前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０〜５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく（発明１４）、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００〜２５０ｎｍの範囲内であるのが好ましい（発明１５）。【００２５】
上記発明（発明１３〜１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１６）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）【００２６】
上記発明（発明１３〜１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１７）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）【００２７】
上記発明（発明１３〜１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１８）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）【００２８】
上記発明（発明１３〜１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１９）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）【００２９】
上記発明（発明１３〜１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係を有していてもよい（発明２０）。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）【００３０】
上記発明（発明１３〜１８）において、前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であるのが好ましい（発明２１）。【００３１】
上記発明（発明１３〜１７，１９，２０）において、前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であるのが好ましい（発明２２）。【００３２】
上記発明（発明１３〜２２）において、前記複数のピラー状パターンは、正三角形格子の各格子点上に配列されていてもよいし（発明２３）、方形格子の各格子点上に配列されていてもよい（発明２４）。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することのできる方法及び当該分離方法に用いられる未分化細胞分離用基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の概略構成を示す切断端面図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の一の態様を概略的に示す平面図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の他の態様を概略的に示す平面図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。
【図５】図５は、試験例１及び２において用いた試験用未分化細胞分離用基板のピラー状パターンが形成された各領域を示す平面図である。
【図６】図６は、試験例１の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のマウス由来間葉系幹細胞の画像及びマウス由来間葉系幹細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、試験例２の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のマウス由来骨芽細胞の画像及びマウス由来骨芽細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図８】図８は、試験例３の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のヒト由来間葉系幹細胞の画像及びヒト由来間葉系幹細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、試験例４の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のヒト由来骨芽細胞の画像及びヒト由来骨芽細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、試験例５の評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍のヒト由来脂肪前駆細胞の画像及びヒト由来脂肪前駆細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、試験例６の評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍のヒト由来軟骨細胞の画像及びヒト由来軟骨細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
図１は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の概略構成を示す切断端面図であり、図２は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の一の態様を概略的に示す平面図であり、図３は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の他の態様を概略的に示す平面図である。
【００３６】
図１に示すように、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１は、基部２と、基部２の主面２１に形成されてなるピラー状パターン３とを有するナノ凹凸構造体により構成され、分化細胞と未分化細胞とを含む細胞混合物から、未分化細胞を分離するために用いられる。
【００３７】
細胞混合物に含まれる未分化細胞及び分化細胞は、接着性を有する細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、未分化細胞として体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等を挙げることができ、分化細胞として上記未分化細胞から分化誘導した神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等を挙げることができる。これらのうち、特に、未分化細胞がマウスに由来する間葉系幹細胞であって、分化細胞が当該未分化細胞から分化誘導させた骨芽細胞である場合、未分化細胞がヒトに由来する間葉系幹細胞であって、分化細胞が当該未分化細胞から分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いることで、より効率的に未分化細胞を分離することができる。
【００３８】
基部２を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができる。特に、基部２を構成する材料として上記透明材料を用いると、未分化細胞のピラー状パターン３への接着状態を顕微鏡などで観察しながら未分化細胞の分離操作を行うことができるため好ましい。
【００３９】
なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０〜８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては基部２）の片側から照射した際、照射された側とは反対側へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
【００４０】
基部２の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略矩形状、平面視略円形状等を挙げることができる。また、平面視における基部２の大きさや、基部２の厚さも特に限定されるものではなく、未分化細胞分離用基板１の用途等に応じて適宜設定され得る。例えば、細胞混合物から未分化細胞を分離するために、ディッシュ等に未分化細胞分離用基板１を収容し、当該ディッシュ内で未分化細胞分離用基板１と細胞混合物とを接触させる場合、未分化細胞分離用基板１の平面視における大きさは、当該ディッシュ内に収容可能な大きさに設定され得る。同様に、未分化細胞分離用基板１の厚さも、上記ディッシュ内に未分化細胞分離用基板１を載置したときに、そのピラー状パターン３と細胞混合物とが接触可能な厚さに設定され得る。
【００４１】
ピラー状パターン３は、平面視略円形又は略矩形であり、基部２と一体的な構造物として、基部２の主面２１上の所定の領域ＰＡ内に所定の規則性を有して配列するように形成されている。
【００４２】
具体的には、図２に示すように、平面視略矩形のピラー状パターン３が、正三角形状の格子Ｇｒの各格子点上に配列されていてもよいし、図３に示すように、方形状の格子Ｇｒの各格子点上に配列されていてもよい。
【００４３】
本実施形態において、上記ピラー状パターン３が形成される所定の領域ＰＡは、基部２の主面２１上における上記ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡの大きさが可能な限り小さくなるように、当該主面２１上に設定されているのが好ましい。後述するように、本実施形態におけるピラー状パターン３がナノレベルの間隔Ｇ及び寸法Ｄを有すること、特にそれらが所定の関係を具備することで、細胞混合物中の未分化細胞と分化細胞との接着性の違いが発現され、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方は当該ピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方は当該ピラー状パターン３に相対的に接着し難い。一方、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡには、未分化細胞及び分化細胞がともに接着する。すなわち、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡが大きいと、未分化細胞を効率的に分離することができないおそれがある。したがって、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡを可能な限り小さくすることで、未分化細胞を効率的に分離することができる。
【００４４】
本実施形態において、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄは、いずれも細胞接着複合体と同等サイズの５０〜５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく、１００〜２５０ｎｍの範囲内であるのがより好ましい。
【００４５】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）
【００４６】
より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１−１’）〜（１−７’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１’）
１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２’）
１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３’）
１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４’）
１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５’）
２１５ｎｍ≦Ｇ＜２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６’）
２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７’）
【００４７】
さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１−１’’）〜（１−７’’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１’’）
１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２’’）
１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３’’）
１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４’’）
１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５’’）
２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６’’）
２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７’’）
【００４８】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、並びにヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）
【００４９】
より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２−１’）〜（２−７’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１’）
１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ  …（２−２’）
１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１６０ｎｍ又は１９０ｎｍ≦Ｄ＜２３５ｎｍ  …（２−３’）
１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４’）
１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；２１５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ  …（２−５’）
２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６’）
２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ  …（２−７’）
【００５０】
さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２−１’’）〜（２−７’’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１’’）
１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ  …（２−２’’）
１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１５５ｎｍ又は１９５ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ  …（２−３’’）
１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４’’）
１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；２２０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ  …（２−５’’）
２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６’’）
２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ  …（２−７’’）
【００５１】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）
【００５２】
より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３−１’）〜（３−７’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１’）
１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ  …（３−２’）
１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１６０ｎｍ又は１９０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３’）
１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４’）
１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；２１５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ  …（３−５’）
２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６’）
２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は１６５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ  …（３−７’）
【００５３】
さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３−１’’）〜（３−７’’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１’’）
１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ  …（３−２’’）
１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１５５ｎｍ又は１９５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３’’）
１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４’’）
１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；２２０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ  …（３−５’’）
２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６’’）
２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は１７０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ  …（３−７’’）
【００５４】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）
【００５５】
より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４−１’）〜（４−７’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１’）
１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２’）
１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３’）
１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４’）
１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５’）
２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６’）
２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７’）
【００５６】
さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４−１’’）〜（４−７’’）のいずれかの関係を具備する。
１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１’’）
１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２’’）
１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３’’）
１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４’’）
１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５’’）
２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６’’）
２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７’’）
【００５７】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、並びにヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係を具備する。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）
【００５８】
より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５−１’）〜（５−４’）のいずれかの関係を具備する。
１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１９０ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ  …（５−１’）
１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ  …（５−２’）
１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ  …（５−３’）
２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４’）
【００５９】
さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５−１’’）〜（５−４’’）のいずれかの関係を具備する。
１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１９５ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ  …（５−１’’）
１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ  …（５−２’’）
１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ  …（５−３’’）
２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４’’）
【００６０】
ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（１−１）〜（１−７）のいずれかの関係、好ましくは上記（１−１’）〜（１−７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（１−１’’）〜（１−７’’）のいずれかの関係を具備することで、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）はピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
【００６１】
ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（２−１）〜（２−７）のいずれかの関係、好ましくは上記（２−１’）〜（２−７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（２−１’’）〜（２−７’’）のいずれかの関係を具備することで、細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とが、マウス由来のものであっても、ヒト由来のものであっても、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）はピラー状パターン３に相対的に接着し難くなり、汎用性が高くなる。
【００６２】
細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とがマウス由来のものである場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（３−１）〜（３−７）のいずれかの関係、好ましくは上記（３−１’）〜（３−７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（３−１’’）〜（３−７’’）のいずれかの関係を具備することで、未分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
【００６３】
細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導された骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（４−１）〜（４−７）のいずれかの関係、好ましくは上記（４−１’）〜（４−７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（４−１’’）〜（４−７’’）のいずれかの関係を具備することで、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
【００６４】
特に、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（５−１）〜（５−４）のいずれかの関係、好ましくは上記（５−１’）〜（５−４’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（５−１’’）〜（５−４’’）のいずれかの関係を具備することで、細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導された骨芽細胞、脂肪前駆細胞及び軟骨細胞のいずれであっても、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなり、汎用性が高くなる。
【００６５】
このように、細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とのピラー状パターン３に対する接着性の違いを利用して、細胞混合物とピラー状パターン３とを接触させるだけで、当該ピラー状パターン３に相対的に接着し難い細胞を、培養液中に浮遊させることができる。目的とする細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易い細胞である場合、ピラー状パターン３上に残存する当該細胞を容易に分離することができる。一方、目的とする細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し難い細胞である場合、培養液を回収することで当該細胞を分離することができる。
【００６６】
なお、本実施形態において、ピラー状パターン３の間隔Ｇとは、「一のピラー状パターン３の平面視中心Ｃと、それに最近接の他のピラー状パターン３の平面視中心Ｃとを結ぶ直線長さＬからピラー状パターンの寸法Ｄを差し引いた長さ」を意味し、ピラー状パターン３の寸法Ｄとは、「平面視略正方形状のピラー状パターン３であれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形状のピラー状パターン３であれば当該円の直径」を意味する。
【００６７】
ピラー状パターン３の高さ（アスペクト比）は、特に限定されるものではなく、ピラー状パターン３の寸法Ｄに応じて、適宜設定され得る。通常、ピラー状パターン３のアスペクト比が０．５〜５程度になるように、ピラー状パターン３の高さが設定され得る。
【００６８】
本実施形態において、ピラー状パターン３が形成される所定の領域ＰＡは、基部２の主面２１の略全面に設定されているが、このような態様に限定されるものではない。例えば、基部２の主面２１を第１〜第Ｎの領域（Ｎは２以上の整数である。）に区分し、各領域にピラー状パターン３が形成されていてもよい。この場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄは各領域で同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００６９】
上述したような構成を有する未分化細胞分離用基板１によれば、後述する実施例から明らかなように、分化細胞と未分化細胞とを含む細胞混合物とピラー状パターン３とを接触させると、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方はピラー状パターン３に相対的に接着し難い。そのため、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。例えば、間隔Ｇ及び寸法Ｄの関係において未分化細胞が相対的に接着し易いピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を用いることで、ピラー状パターン３上に残存する未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。一方、間隔Ｇ及び寸法Ｄの関係において未分化細胞が相対的に接着し難いピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を用いることで、培養液中に浮遊する未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。また、従来の未分化細胞に付与された識別ラベル等を検出することにより当該未分化細胞を分離する方法のように、識別ラベル等の付与・除去操作を必要としないため、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１によれば、細胞混合物から未分化細胞を低侵襲で分離することができる。
【００７０】
未分化細胞である間葉系幹細胞を患者に投与する再生医療の分野において、間葉系幹細胞のみを選択的に培養することが望まれる場合がある。その間葉系幹細胞の培養工程において、一部が骨芽細胞等に分化し、不要な細胞（分化細胞である骨芽細胞等）が混在してしまうおそれがある。しかしながら、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いれば、そのようにして混在する不要な細胞（分化細胞である骨芽細胞等）を除去し、目的とする間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離することができるため、間葉系幹細胞を高い細胞密度で培養することが可能となる。
【００７１】
また、未分化細胞である間葉系幹細胞を分化させた軟骨細胞を患者に移植する再生医療の分野において、軟骨細胞に分化させるにあたって間葉系幹細胞を選択的に培養し、増殖させることが望ましい場合がある。その間葉系幹細胞の培養工程において、当該間葉系幹細胞の一部が骨芽細胞に分化してしまうことがある。しかしながら、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いれば、意図せずして分化してしまった骨芽細胞を除去することができるため、間葉系幹細胞を高い細胞密度で培養し、増殖させることが可能となる。
【００７２】
上述したような構成を有する未分化細胞分離用基板１は、例えば、下記のようにして製造することができる。図４は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。
【００７３】
図４（ａ）に示すように、まず、ハードマスク層３０を備える基板２０を準備し、当該基板２０のハードマスク層３０上にレジスト膜４０を形成し、電子線描画装置等を用いてレジスト膜４０にパターン潜像を形成する。
【００７４】
基板２０としては、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１の構成材料（例えば、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料）からなる基板等を用いることができる。
【００７５】
ハードマスク層３０を構成する材料としては、例えば、金属クロム、酸化クロム、窒化クロム、酸窒化クロム等を用いることができる。ハードマスク層３０は、後述する工程（図４（ｄ）参照）により基板２０をエッチングするために用いられるハードマスクパターン３１を形成するための層である。そのため、基板２０を構成する材料とのエッチング選択比を考慮した材料により構成される。例えば、基板２０が石英ガラスにより構成される場合、ハードマスク層３０は金属クロム等により構成されるのが望ましい。
【００７６】
レジスト膜４０を構成するレジスト材料としては、特に限定されるものではなく、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
【００７７】
レジスト膜４０に形成されるパターン潜像は、未分化細胞分離用基板１におけるピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと実質的に同一の間隔及び寸法で形成される。
【００７８】
次に、図４（ｂ）に示すように、レジスト膜４０に現像処理を施し、レジストパターン４１を形成し、図４（ｃ）に示すように、レジストパターン４１をマスクとしてハードマスク層３０をエッチングし、ハードマスクパターン３１を形成する。
【００７９】
その後、図４（ｄ）に示すように、ハードマスクパターン３１をマスクとして基板２０をエッチングして、基板２０の主面２１の所定の領域ＰＡにピラー状パターン３を形成し、最後にハードマスクパターン３１を剥離することで、図４（ｅ）に示すように、基部２と、基部２の主面２１に形成されたピラー状パターン３とを有する未分化細胞分離用基板１を製造することができる。
【００８０】
上述した構成を有する未分化細胞分離用基板１においては、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物にピラー状パターン３を接触させると、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に接着し易く、他方はピラー状パターン３に接着し難い。この接着性の違いを利用することで、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１は、未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離可能との効果を奏するため、未分化細胞を分離する方法に好適に用いることができる。
【００８１】
かかる未分化細胞分離方法において、未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法としては、例えば、ディッシュ内に未分化細胞分離用基板１を載置し、当該ディッシュ内に細胞混合物を播種することによりピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法等が挙げられる。
【００８２】
ディッシュ内にて未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法において、当該ピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる時間は、未分化細胞を選択的に分離するのに十分な時間である限り、特に制限されるものではない。
【００８３】
上述したように、本実施形態によれば、未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させることで、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に接着し易く、他方はピラー状パターン３に接着し難い。よって、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から、未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することができる。
【００８４】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【００８５】
上記実施形態においては、基部２の主面２１に一体的な凹凸構造として形成されたピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、未分化細胞分離用基板１は、基部２の主面２１に、基部２とは別個の部材として構成されるピラー状パターン３を有する凹凸構造体（例えば、ピラー状パターン３を有するシート状部材等）を取り付けてなるものであってもよい。
【００８６】
上記実施形態においては、エッチングによりピラー状パターン３を形成し、その後ハードマスクパターン３１を剥離することで未分化細胞分離用基板１を製造しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、ピラー状パターン３が形成された基部２を、当該ピラー状パターン３の寸法及び高さを変動させることなく薄板化してもよい。また、基部２上の複数の領域にピラー状パターン３を形成し、領域ごとに切断（個片化）することで、未分化細胞分離用基板１を製造してもよい。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等により何ら限定されるものではない。【００８８】
〔試験用未分化細胞分離用基板の製造例１〕
厚さ６ｎｍのＣｒからなるハードマスク層３０が主面２１に設けられている基板２０としての石英ガラス基板（１５２ｍｍ×１５２ｍｍ，厚さ：６．３５ｍｍ）を用意し、電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ−９０１２，信越化学工業社製）をハードマスク層３０上に塗布してレジスト膜４０を形成した。当該レジスト膜４０上に電子線描画装置を用いてピラー状のレジストパターン４１を形成した。なお、ピラー状のレジストパターン４１は、図２に示すように、正三角形状の格子Ｇｒの各格子点上に位置するように形成された。また、石英ガラス基板２０の主面２１上の１４ｍｍφの領域ＰＡ内に４９個の区分領域ＰＡ01〜ＰＡ49（各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の大きさ：４５０μｍ×４５０μｍ）を設定し、各領域に間隔Ｇ及び寸法Ｄの異なるピラー状のレジストパターン４１が形成された（図５参照）。【００８９】
次に、レジストパターン４１をマスクとして用いてハードマスク層３０をドライエッチング（エッチングガス：Ｃｌ2＋Ｏ2）し、残存するレジストパターン４１を除去して、ハードマスクパターン３１を形成した。【００９０】
上述のようにして形成されたハードマスクパターン３１をマスクとして用いて石英ガラス基板２０をエッチングし、石英ガラス基板２０の主面２１の各領域に、所定の間隔Ｇ及び寸法Ｄのピラー状パターン３を形成した。最後に、ハードマスクパターン３１を剥離して、試験用未分化細胞分離用基板を製造した（図５参照）。なお、試験用未分化細胞分離用基板の各領域ＰＡ01〜ＰＡ49に形成されたピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄを、走査型電子顕微鏡（Ｖｉｓｔｅｃ社製，製品名：ＬＷＭ９０００）を用いて測定したところ、下記表１に示されるとおりであった。【００９１】
【表１】
2016104344.tif 000003
【００９２】
〔試験例１〕
底面に１４ｍｍφの穴が形成されている穴あきディッシュ（３５ｍｍφ）を準備し、ピラー状パターン３が形成されている各領域ＰＡ01〜ＰＡ49が当該底面の穴から露出するように、試験用未分化細胞分離用基板を穴あきディッシュの底面の外側に取り付けた。【００９３】
次に、マウス由来の間葉系幹細胞（理研ＢＲＣ，未分化細胞）を上記穴あきディッシュ内に播種し、当該未分化細胞と試験用未分化細胞分離用基板のピラー状パターン３とを接触させた。培養液として、ＰＯＷＥＲＥＤＢＹ１０（グライコテクニカ社製）を用いた。【００９４】
細胞播種から３６時間後に各領域ＰＡ01〜ＰＡ49近傍を撮像した画像に基づき、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。【００９５】
なお、当該評価試験においては、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰMU（ＰMU＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出し、当該細胞数比ＰMUをピラー状パターン３に対する親和性の指標として評価した。【００９６】
上記細胞数比ＰMUの数値が大きいほどピラー状パターン３に対して接着しやすい（親和性が高い）と評価することができ、小さいほどピラー状パターン３に対して接着し難い（親和性が低い）と評価することができる。【００９７】
評価結果を表２に示す。また、上記評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の間葉系幹細胞の画像及び間葉系幹細胞の移動軌跡を図６に示す。なお、図６に示す矢印線は、間葉系幹細胞の移動軌跡を表すものである。【００９８】
〔試験例２〕
マウス由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた骨芽細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰMD（ＰMD＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の骨芽細胞の画像及び骨芽細胞の移動軌跡を図７に示す。なお、図７に示す矢印線は、骨芽細胞の移動軌跡を表すものである。【００９９】
〔試験例３〕
ヒト由来の間葉系幹細胞（未分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰHU（ＰHU＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の間葉系幹細胞の画像及び間葉系幹細胞の移動軌跡を図８に示す。なお、図８に示す矢印線は、間葉系幹細胞の移動軌跡を表すものである。【０１００】
〔試験例４〕
ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた骨芽細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰHO（ＰHO＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の骨芽細胞の画像及び骨芽細胞の移動軌跡を図９に示す。なお、図９に示す矢印線は、骨芽細胞の移動軌跡を表すものである。【０１０１】
〔試験例５〕
ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた脂肪前駆細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種し、培地としてAdipogenic Maintenance Medium（Lonza社製）を使用した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰHA（ＰHA＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍の脂肪前駆細胞の画像及び脂肪前駆細胞の移動軌跡を図１０に示す。なお、図１０に示す矢印線は、脂肪前駆細胞の移動軌跡を表すものである。【０１０２】
〔試験例６〕
ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた軟骨細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種し、培地としてChondrocyte Growth Medium（PromoCell社製）を使用した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における細胞数比ＰHC（ＰHC＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01〜ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍の軟骨細胞の画像及び軟骨細胞の移動軌跡を図１１に示す。なお、図１１に示す矢印線は、軟骨細胞の移動軌跡を表すものである。【０１０３】
【表２】
2016104344.tif 000004
【０１０４】
試験例１及び試験例２の評価結果から、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥMU及び分化細胞捕捉効率ＥMDを下記式により算出した。結果を表３に示す。
ＥMU＝ＰMU／(ＰMU＋ＰMD)
ＥMD＝ＰMD／(ＰMU＋ＰMD)【０１０５】
試験例３及び試験例４の評価結果から、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHOU及び分化細胞捕捉効率ＥHODを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
ＥHOU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHO)
ＥHOD＝ＰHO／(ＰHU＋ＰHO)【０１０６】
試験例３及び試験例５の評価結果から、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHAU及び分化細胞捕捉効率ＥHADを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
ＥHAU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHA)
ＥHAD＝ＰHA／(ＰHU＋ＰHA)【０１０７】
試験例３及び試験例６の評価結果から、各領域ＰＡ01〜ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHCU及び分化細胞捕捉効率ＥHCDを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
ＥHCU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHC)
ＥHCD＝ＰHC／(ＰHU＋ＰHC)
【表３】
2016104344.tif 000005
【０１０８】
表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥMUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥMDの算出結果から、マウス由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と骨芽細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、マウス由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価Ａmu及び骨芽細胞の選択的分離可能性ＡMDについての総合評価を表４に示す。【０１０９】
表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHOUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHODの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と骨芽細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHOU及び骨芽細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHODを表４にあわせて示す。【０１１０】
表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHAUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHADの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と脂肪前駆細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHAU及び脂肪前駆細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHADを表４にあわせて示す。【０１１１】
表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHCUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHCDの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と軟骨細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHCU及び軟骨細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHCDを表４にあわせて示す。【０１１２】
【表４】
2016104344.tif 000006
【０１１３】
表４において、総合評価の「◎」、「○」、「△」及び「×」は、下記指標に基づくものである。
◎：ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU＞０．８；ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD＞０．８
○：０．６＜ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．８；０．６＜ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．８
△：０．５＜ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．６；０．５＜ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．６
×：ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．５；ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．５【０１１４】
表２〜４に示す結果、並びに図６〜１１から、ナノ凹凸構造体、特に間隔Ｇ及び寸法Ｄが、いずれも１００〜２５０ｎｍの範囲内であるピラー状パターン３であれば、細胞の接着性を変化させ得る傾向が見出された。さらに、その接着性の変化は、細胞の分化状態によって異なることが明らかとなった。間葉系幹細胞の捕捉効率ＥMD，ＥHODが相対的に高いピラー状パターン３を有する領域（表４に示す総合評価が「◎」又は「○」の領域）においては、間葉系幹細胞とそれから分化誘導させた骨芽細胞とを含む細胞混合物中の間葉系幹細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易くなるため、当該細胞混合物を当該ピラー状パターン３に接触させるだけで、当該細胞混合物から間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得することができる、又は間葉系幹細胞の細胞密度を高めることができると考えられる。一方、間葉系幹細胞から分化誘導させた分化細胞（骨芽細胞、脂肪前駆細胞、軟骨細胞等）の捕捉効率ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCDが相対的に高いピラー状パターン３を有する領域（表４に示す総合評価が「◎」又は「○」の領域）においては、間葉系幹細胞とそれから分化した分化細胞とを含む細胞混合物中の分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易くなるため、当該細胞混合物を当該ピラー状パターン３に接触させるだけで、当該細胞混合物から間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得することができる、又は間葉系幹細胞の細胞密度を高めることができると考えられる。【０１１５】
上記試験例の結果から明らかなように、寸法Ｄ（Ｄ＝１００〜２５０ｎｍ）の複数のピラー状パターン３を間隔Ｇ（Ｇ＝１００〜２５０ｎｍ）で規則性を有して配列されたナノ凹凸構造体を用いると、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物と、ピラー状パターン３とを接触させるだけで、細胞の接着性の違いに基づき、当該細胞混合物から、未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離し、取得することができると考えられる。【０１１６】
好ましくは下記（１−１）〜（１−７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。【０１１７】
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（１−７）【０１１８】
特に好ましくは下記（２−１）〜（２−７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の種類に依存することなく、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。【０１１９】
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（２−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（２−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（２−７）【０１２０】
細胞混合物に含まれる未分化細胞がマウス由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞である場合、好ましくは下記（３−１）〜（３−７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。【０１２１】
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（３−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（３−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ  …（３−７）【０１２２】
細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、好ましくは下記（４−１）〜（４−７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。【０１２３】
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（４−７）【０１２４】
特に好ましくは下記（５−１）〜（５−４）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞及び軟骨細胞のいずれの場合であっても、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。【０１２５】
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ  …（５−２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ  …（５−３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ  …（５−４）【０１２６】
以上のように、当該未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物とを接触させるだけで、当該細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明は、未分化細胞や分化細胞を用いた再生医療に関する技術分野等において有用である。
【符号の説明】
【０１２８】
１…未分化細胞分離用基板
２…基部（基材）
２１…主面（第１面）
３…ピラー状パターン
【図１】
2016104344.tif 000007
【図２】
2016104344.tif 000008
【図３】
2016104344.tif 000009
【図４】
2016104344.tif 000010
【図５】
2016104344.tif 000011
【図６】
2016104344.tif 000012
【図７】
2016104344.tif 000013
【図８】
2016104344.tif 000014
【図９】
2016104344.tif 000015
【図１０】
2016104344.tif 000016
【図１１】
2016104344.tif 000017
【国際調査報告】
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2016104344.tif 000019
2016104344.tif 000020
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