(57)【要約】  メペンゾラート臭化物の光学活性体を提供し、またかかる光学活性体を有効成分として含有する気管支拡張作用及び抗炎症作用に基づく慢性閉塞性肺疾患改善剤を提供することであり、（３Ｒ）又は（３Ｓ）−３−［（ヒドロキシ）（ジフェニル）アセトキシ］−１，１−ジメチルピペリジニウム  ブロマイド（以下、「（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物」という）であり、係る（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患改善剤であり、また、投与形態が、経気道投与又は吸入投与である慢性閉塞性肺疾患改善剤である。
2015122031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
2015122031.tif 000009
で示される立体構造を有する、（３Ｒ）−３−［（ヒドロキシ）（ジフェニル）アセトキシ］−１，１−ジメチルピペリジニウム  ブロマイド（以下、「（Ｒ）−メペンゾラート臭化物」という）。
【請求項２】
次式：
【化２】
2015122031.tif 000010
で示される立体構造を有する、（３Ｓ）−３−［（ヒドロキシ）（ジフェニル）アセトキシ］−１，１−ジメチルピペリジニウム  ブロマイド（以下、「（Ｓ）−メペンゾラート臭化物」という）。
【請求項３】
請求項１に記載の（Ｒ）−メペンゾラート臭化物を有効成分とすることを特徴とする慢性閉塞性肺疾患改善剤。
【請求項４】
請求項２に記載の（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を有効成分とすることを特徴とする慢性閉塞性肺疾患改善剤。
【請求項５】
投与形態が、経気道投与又は吸入投与である請求項３又は４に記載の慢性閉塞性肺疾患改善剤。
【請求項６】
ベンジル酸を、縮合剤の存在下に、（Ｒ）又は（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンと反応させ、次いで得られた生成物を臭化メチルと処理することを特徴とする請求項１又は２に記載の（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患改善剤に関し、詳細には、メペンゾラート臭化物（以下、単に「メペンゾラート」と記載することもある。）の光学活性体を有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：Chronic Obstructive Pulmonary Disease：以下、「ＣＯＰＤ」と記載する場合もある。）は、様々な原因、特に喫煙により肺に慢性の炎症を生じ、これが原因で肺胞の破壊や気管支粘液腺の肥大が起き、その結果息切れを生じたり、咳嗽や喀痰が増加したりする疾患である。
以前において肺気腫（ＰＥ：pulmonary emphysema）と呼ばれていた疾患と、慢性気管支炎（ＣＢ：chronic bronchitis）と呼ばれていた疾患の両者は、種々の割合で合併して発症することが多いことから、現在は、この二つによる疾患を併せて慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と呼ぶようになっている。【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）の試算では、２００５年に世界中で年間３００万人がＣＯＰＤで命を落とし、死亡原因の第４位を占めているが、今後１０年間でさらに３０％増加すると予測されている。日本では厚生労働省の統計によると、２００５年には日本人の全死亡数の１．３％がＣＯＰＤにより死亡しており、死亡原因の１０位であり、男性に限れば７位を占めている。
ＣＯＰＤ発症の最大の原因は、喫煙である。ＣＯＰＤ患者の９０％は喫煙者であり（非特許文献１）、非喫煙者に比べて喫煙者ではＣＯＰＤの発症のリスクは６倍以上になる。喫煙者の約１０〜１５％がＣＯＰＤを発症するが、高齢者に限ると、喫煙者の５０％近くがＣＯＰＤである。その他の原因として、室内空気汚染や大気汚染、化学物質や粉塵の吸入、遺伝によるもの、小児期の肺炎・気管支炎などが挙げられる。【０００４】
その病態としては、気流制限、すなわち息が吐きづらいことを特徴とする疾患であるが、病態の本質は、気道の慢性炎症である。喫煙や吸入物質により、中枢気道から末梢気管支まで肺のさまざまなレベルで炎症が惹起される。その結果、プロテアーゼ・アンチプロテアーゼの不均等や、オキシダント・アンチオキシダントの不均等などにより、肺胞の破壊や気管支粘液腺の肥大が起きると考えられている。
このＣＯＰＤは、不可逆的な気道の破壊が生じているために治癒しない疾患である。禁煙や、気管支拡張剤、去痰剤、鎮咳剤などの投与による薬物療法、或いは、酸素療法等により症状緩和を行うにすぎず、極めて厄介な疾患である。
かかる観点から、これまでに種々のＣＯＰＤ改善剤、或いは改善方法が提案されているが（例えば、特許文献１、２）、さらに優れたＣＯＰＤ改善剤の登場が期待されているのが現状である。【０００５】
このような背景のもとで、本発明者等は、ＣＯＰＤの改善薬の開発を行うべく、既販薬の中から探索する研究を行った結果、過敏性大腸症の治療薬として臨床的に使用されているメペンゾラート臭化物［販売名：トランコロン（登録商標）］が、気管支拡張作用及び抗炎症作用に基づくＣＯＰＤの治療効果を示すことを確認して、特許出願を完了している（特許文献３）。【０００６】
今回、本発明者等は更に研究を進め、メペンゾラート臭化物の化学構造に着目し、このものを、２種の光学活性体として製造して得た（Ｒ）体であるメペンゾラート臭化物、並びに（Ｓ）体であるメペンゾラート臭化物にも優れたＣＯＰＤ改善作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
メペンゾラート臭化物は、下部消化管の運動・収縮抑制作用を有する抗コリン薬として知られており、１９６７年から過敏性大腸症の治療薬として臨床の場で使用されているが、ＣＯＰＤ治療に効果があることは、知られていないし、また、このメペンゾラート臭化物を光学活性体として製造し、個々の光学活性体（すなわち、Ｒ体、Ｓ体）にも、気管支拡張作用及び抗炎症作用を併せもつＣＯＰＤ治療の改善効果があることは、これまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−５６８９０号公報
【特許文献２】特開２００８−１８９６６７号公報
【特許文献３】ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０５５４７６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Annual Review of Medicine, Vol.40, p411-429 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明は、上記の現状に鑑み、メペンゾラート臭化物の光学活性体を提供し、またかかる光学活性体を有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するための本発明は、その一つの基本的態様として、次式：【００１１】
【化１】
2015122031.tif 000003
【００１２】
で示される立体構造を有する、（３Ｒ）−３−［（ヒドロキシ）（ジフェニル）アセトキシ］−１，１−ジメチルピペリジニウム  ブロマイド（以下、「（Ｒ）−メペンゾラート臭化物」という）である。【００１３】
また、本発明は別の基本的態様として、次式：【００１４】
【化２】
2015122031.tif 000004
【００１５】
で示される立体構造を有する、（３Ｓ）−３−［（ヒドロキシ）（ジフェニル）アセトキシ］−１，１−ジメチルピペリジニウム  ブロマイド（以下、「（Ｓ）−メペンゾラート臭化物」という）である。【００１６】
さらに本発明は、さらに別の態様として、上記の各式で示される、（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を有効成分とすることを特徴とする慢性閉塞性肺疾患改善剤であり、より具体的には、投与形態が、経気道投与又は吸入投与である慢性閉塞性肺疾患改善剤である。【００１７】
また、本発明は上記の各式で示される（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物の製造方法であり、具体的には、ベンジル酸を、縮合剤の存在下に、（Ｒ）又は（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンと反応させ、次いで得られた生成物を臭化メチルと処理することを特徴とする（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、既に過敏性大腸症の治療薬として使用され、安全性が確認されているメペンゾラート臭化物について、その光学活性体である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を有効成分とするＣＯＰＤ改善剤が提供される。
本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤の有効成分である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物は、臨床的に使用されているペンゾラート臭化物の光学活性体であり、優れたＣＯＰＤ改善作用を有しており、特に、経気道投与及び吸入投与において著しい効果を有するものである。
その作用は、気管支拡張作用及び抗炎症作用に基づくものであり、これまで両作用を併せ持つＣＯＰＤ改善剤が存在しなかった点からみれば、本発明のＣＯＰＤ改善剤は、極めて特異的なＣＯＰＤ改善剤である。
また、本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤の有効成分である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物は、ムスカリン拮抗作用、抗コリン作用とは異なる作用機序により効果を示すことを特徴とするものである。
したがって、これまで効果的なＣＯＰＤ改善剤が存在しなかった状況下において、特異的かつ安全な（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を投与することにより、その症状の改善を行えるものであり、その医療上の効果は極めて特異的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】試験例２．１における、受容体結合能（インビトロ）、即ち、［３Ｈ］ＮＭＳとの結合の結果を示した図である。
【図２】試験例２．１における、受容体結合能（インビトロ）について、ＩＣ５０値で表した図である。
【図３】試験例２．２における、受容体（Ｍ３受容体）結合能についての結果を示した図である。
【図４】試験例２．２における、受容体（Ｍ２受容体）結合能についての結果を示した図である。
【図５】試験例３．１における、メペンゾラート臭化物（ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体）の３．７５μｇ／ｋｇの投与量における気道抵抗（airway resistance）を測定した結果を示した図である。
【図６】試験例３．２における、メペンゾラート臭化物（ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体）の３８μｇ／ｋｇ投与における気道抵抗（airway resistance）を測定した結果を示した図である。
【図７】試験例３．２における、メペンゾラート臭化物（ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体）の３．８μｇ／ｋｇ投与における気道抵抗（airway resistance）を測定した結果を示した図である。
【００２０】
【図８】試験例４．１における、細胞総数及び好中球数を測定した結果を示した図である。
【図９】試験例４．２における、細胞総数を測定した結果を示した図である。
【図１０】試験例４．２における、好中球数を測定した結果を示した図である。
【図１１】試験例４．３における、ＴＮＦ−αを測定した結果を示した図である。
【図１２】試験例４．３における、ＭＩＰ−２を測定した結果を示した図である。
【図１３】試験例４．３における、ＮＣＰ−１を測定した結果を示した図である。
【図１４】試験例４．３における、ＫＣを測定した結果を示した図である。
【図１５】試験例５における、糞粒排出量の結果を示した図である。
【図１６】試験例６における、心拍数の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤において使用される（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物は、臨床的に使用されているメペンゾラート臭化物の光学活性体である。
なお、臨床的に使用されているメペンゾラート臭化物は、第十六改正日本薬局方においては、以下の構造式を有するものとして収載されている。
【００２２】
【化３】
2015122031.tif 000005
【００２３】
すなわち、ラセミ体（鏡像体の等量混合物）の表記の規則に従って、一方の光学活性体の構造を立体表記し、「及び鏡像異性体」の表示を加える表記で示されている。
【００２４】
本発明の（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物は、具体的には、以下の製造方法により製造することができる。
すなわち、（Ｒ）−メペンゾラート臭化物の製造方法を示せば、以下の化学式に従って製造することができる。
【００２５】
【化４】
2015122031.tif 000006
【００２６】
すなわち、ベンジル酸（ＩＩ）を、適当な有機溶媒中、縮合剤の存在下に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン（ＩＩＩ）と反応させ、次いで得られた生成物（ＩＶ）［以下、「（Ｒ）−ｔ−メペンゾラート」と記載する。］を、臭化メチルと処理することにより、（Ｒ）−メペンゾラート臭化物（Ｉ）が製造される。
用いる有機溶媒としては、反応に影響を与えないものならば特に制限されないが、好ましくは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）等の溶媒が好ましい。
反応に使用する縮合剤としては、ＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）が好ましく使用できる。
【００２７】
反応は、式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の両化合物、並びに縮合剤としてのＣＤＩを、例えばＤＭＦに溶解し、３０〜１００℃程度の温度下に、１〜２４時間攪拌することにより行われる。反応終了後、それ自体公知の、通常の後処理（抽出、溶媒留去、クロマトグラフィー等）を行うことで、目的とする式（ＩＶ）で示される（Ｒ）−ｔ−メペンゾラートを得ることができる。
得られた（Ｒ）−ｔ−メペンゾラート（ＩＶ）は、精製することなく、例えば、アルコール、アセトニトリル等の有機溶媒中、臭化メチルと室温〜穏やかな加熱下に攪拌することにより、本発明の目的化合物である、式（Ｉ）で示される（Ｒ）−メペンゾラート臭化物を結晶として得ることができる。
【００２８】
なお、上記した説明は、（Ｒ）−メペンゾラート臭化物についての製造方法であるが、（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を得る場合には、上記の化学反応式において、式（ＩＩＩ）の（Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンの代わりに、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンを使用し、同様の方法により目的とする（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を得ることができる。
【００２９】
本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤は、上記の立体構造を有する化学式で示される（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を有効成分とし、経気道投与、吸入投与として好ましく投与することができる。
かかる経気道投与用の経気道剤、吸入投与用の吸入剤は、気管、気管支、肺等の各組織へ到達させるための医薬組成物を意味し、好適には、点鼻剤又は経鼻若しくは経肺投与に適した組成物であり、これらはネブライザー、アトマイザー、スポイト、ピペット、カニューレなどで投与すると効果的である。
その場合の経気道剤、吸入剤は、（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を粉末製剤、溶液製剤、或いは懸濁液製剤の形態として、調製することができる。
【００３０】
経気道剤並びに吸入剤を粉末製剤として調製する場合には、有効成分である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物をそのまま、若しくは適当な賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味・矯臭剤などの添加剤を加えて、微細化することにより調製することができる。
また、経気道剤並びに吸入剤を溶液製剤又は懸濁製剤として調製する場合には、例えば、（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を、水、または水と補助溶媒、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールのようなアルコール系の補助溶媒による混合溶媒の混合物に溶解又は懸濁させることにより調製することができる。
そのような溶液又は懸濁液には、さらに防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤、吸収促進剤、増粘剤等を含有することができる。
【００３１】
上記のようにして調製した経気道剤並びに吸入剤は、吸入剤の分野での一般的な手段、例えば、スポイト、ピペット、カニューレ又はアトマイザーやネブライザーなどの噴霧器を用いて、霧状にして鼻腔内または口腔内に、或いは気管、気管支、肺等の組織へ直接投与される。
噴霧器を用いる場合には、適当な噴霧剤（例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、若しくはジクロロテトラフルオロメタンのようなクロロフルオロカーボン、または二酸化炭素等のガス等）と共に加圧バッグの形にされたエアゾールとして噴霧するか、ネブライザーを用いて投与することができる。
【００３２】
本発明のＣＯＰＤ改善剤における有効成分である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物の投与量は、製剤調製の方法、剤形、疾患の症状、患者の年齢、体重などによって異なり、一概に限定できないが、例えば臨床量として、経気道剤、吸入剤投与の場合は成人１日当たり０．５〜２００ｍｇであり、投与回数についても一概に限定できないが、１日１回ないし数回の投与を行うことも可能である。
また、本発明のＣＯＰＤ改善剤における有効成分である（Ｒ）又は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物は、抗コリン作用を有する薬物、例えばイプラトロピウム、スコポラミン、ピレンゼピン、チオトロピウム、オキシトロピウムなどと併用投与することにより、より効果的に使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明を具体的試験例、実施例等によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
なお、各図中に記載された「Ｍｅｐ」或いは［（±）−Ｍｅｐ］は、ラセミ体のメペンゾラート臭化物を意味し、「Ｒ−Ｍｅｐ」或いは［（Ｒ）−Ｍｅｐ］は（Ｒ）−メペンゾラート臭化物（Ｒ体）を、「Ｓ−Ｍｅｐ」或いは［（Ｓ）−Ｍｅｐ］は（Ｓ）−メペンゾラート臭化物（Ｓ体）を意味する。また、「ＰＰＥ」はブタ膵臓エラスターゼ（porcine pancreatic elastase）を意味する。
また、図中の＊は、p<0.05であり、＊＊は、p<0.01である。【００３４】
以下の実施例において、各種器機分析は、以下の測定方法に従った。
＜測定方法＞
ＩＲ：Jeol FT-IR SPX60スペクトロメーター；薄膜法
１ＨＮＭＲ：Agilent 400-MRスペクトロメーター；ＤＭＳＯ中／400MHz
１３ＣＮＭＲ：Agilent 400-MRスペクトロメーター；ＤＭＳＯ中／100MHz
高解析マススペクトル（ＨＲＭＳ）：Jeol JMS-700 MStation
旋光度：Jasco P-1010 polarimeter【００３５】
実施例１：（Ｒ）−メペンゾラート臭化物（Ｒ体）の合成
カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）８８３ｍｇ（５．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ８ｍＬに溶解した溶液に、ベンジル酸８３０ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）を加え、室温下で１５分間撹拌した。この溶液に（Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン５００μＬ（４．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４ｍＬに溶解した溶液を８０℃で滴下した。その後、８０℃にて１８時間撹拌した。反応は室温で水を加えることにより停止させた。有機物を酢酸エチルで抽出した。抽出液を集めて食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣を、短シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチルで溶出し、次いでジクロルメタンに再溶解した。得られた溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液並びに食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を真空濃縮することにより、（Ｒ）−ｔ−メペンゾラートを黄色油状物として８６０ｍｇ（７２％）得た。
この生成物は、精製することなく次のステップに使用した。【００３６】
上記で得られた（Ｒ）−ｔ−メペンゾラート５００ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル６ｍＬに溶解し、この溶液に臭化メチル３．６ｍＬ（７．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。沈殿物を濾取し、エチルエーテルで洗浄することにより（Ｒ）−メペンゾラート臭化物（Ｒ体）を無色固形物として５７０ｍｇ（７７％）得た。【００３７】
ＩＲｖｍａｘ：3432, 3315, 1735, 1216, 1093, 1068, 923, 705ｃｍ−１
１ＨＮＭＲ（CDCl３）δ：7.28-7.37(ｍ, 10H), 6.82(s, 1H), 5.28(m, 1H), 3.63(dd, J=13.5, 3.5Hz, 1H), 3.49(dd, J=13.5, 4.7Hz, 1H), 3.37(m, 1H), 3.33(m, 1H), 3.10(s, 3H), 2.82(s, 3H), 1.63-1.85(m, 4H)
１３ＣＮＭＲ（CDCl３）δ：171.9, 143.0, 142.7, 128.0, 127.9, 127.7, 127.6, 127.0, 80.7, 66.8, 61.6, 60.8, 25.2, 16.2、
［α］Ｄ２５：−8.12（ｃ 1.00, MeOH）
融点：２２４．２〜２２４．９°
ＨＲＭＳ（FAB）：Ｃ１２Ｈ１９Ｏ５として計算：[Ｍ+1]＋：340.1913、実測値：ｍ/ｚ＝340.1905【００３８】
実施例２：（Ｓ）−メペンゾラート臭化物（Ｓ体）の合成
（Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンの代わりに（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジンを使用した以外は実施例１と同様の方法により（Ｓ）−メペンゾラート臭化物を無色固形物として得た。収率は７２％であった。【００３９】
ＩＲｖｍａｘ：3436, 3299, 1733, 1214, 1097, 1066, 929ｃｍ−１
１ＨＮＭＲ（CDCl３）δ：7.28-7.37(ｍ, 10H), 6.81(s, 1H), 5.27(m, 1H), 3.65(dd, J=13.4, 3.4Hz, 1H), 3.51(dd, J=13.4, 4.6Hz, 1H), 3.36(m, 1H), 3.32(m, 1H), 3.09(s, 3H), 2.81(s, 3H), 1.63-1.85(m, 4H)
１３ＣＮＭＲ（CDCl３）δ：171.9, 143.0, 142.7, 128.0, 127.9, 127.7, 127.6, 127.0, 80.7, 66.8, 61.6, 60.8, 25.2, 16.2
［α］Ｄ２５：＋8.33（ｃ 1.00, MeOH）
融点：２２３．１〜２２３．８°
ＨＲＭＳ（FAB）：Ｃ１２Ｈ１９Ｏ５として計算：[Ｍ+1]＋：340.1913、実測値：ｍ/ｚ＝340.1928【００４０】
試験例１：メペンゾラート臭化物（Ｒ体及びＳ体）の気道投与による肺組織濃度の測定
＜方法＞
４〜６週齢のＩＣＲマウスに、メペンゾラート臭化物のＲ体およびＳ体を、２０ｍｇ／ｋｇの用量で経気道投与を行い、投与後５分、１５分および３０分後における肺組織における各メペンゾラート臭化物の量（肺組織濃度）を測定した。
すなわち、メペンゾラート臭化物の投与後、各測定時間にマウスの全肺を摘出し、５０Ｕ／ｍＬのヘパリン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にてホモジネートし、遠心分離により試験サンプルを得た。試験サンプルを３００μＬずつ分け、Amicon ultra-0.5遠心フィルターで限外濾過を行い、得られたサンプルをDaicel Chiralcel 1A（0.46×25cm）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、細胞組織におけるメペンゾラート臭化物量を測定した。【００４１】
ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
検出機：Waters 2695 Alliance separation module、およびWaters 2996 photodiode array detector（Waters社製）
展開溶媒：Solvent A（0.1M hexafluorophosphate含有水）／Solvent B（アセトニトリル）
流速：1.0 mL／分
移動相：70% Solvent A / 30% Solvent B
測定波長：220 nm【００４２】
＜結果＞
その結果を、下記表１に示した。【００４３】
【表１】
2015122031.tif 000007
【００４４】
n.d.：検出せず【００４５】
表中の結果から判明するように、経気道投与したメペンゾラート臭化物のＲ体およびＳ体は、その光学活性を維持したまま肺組織中に止まっていることが確認された。
また、投与後の時間の推移により組織濃度が減少していることから、経気道投与された薬物が、全身へ移行していることが認められた。【００４６】
試験例２．１：受容体結合能（インビトロ）（その１）
＜方法＞
受容体結合能は、ヒトＭ３ムスカリン受容体過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の膜画分を用いて、１−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルブロマイド（［３Ｈ］ＮＭＳ、８２Ｃｉｍｍｏｌの特異的な活性）との競合阻害測定により行った。細胞膜のタンパク質濃度は５．０μｇ／well、［３Ｈ］ＮＭＳ濃度は２．０ｎＭであった。
阻害剤濃度（メペンゾラート）の範囲（１０−1４〜１０−５Ｍ）は、比較曲線を作成することにより試験した。非特異的な結合は１μＭのアトロピンの存在下で測定した。
試薬は結合緩衝液（リン酸バッファー／食塩水）にて、全量が２００μＬになるようにした。平衡になるように室温で２時間インキュベーションした後、反応混合液は１．０％ポリエチレンイミンを含有する洗浄バッファーで１時間前処理したＧＦ／Ｃフィルタープレートにて濾過した。
結合した［３Ｈ］ＮＭＳ及び遊離な［３Ｈ］ＮＭＳを、迅速真空濾過により分離し、リンスバッファー（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ食塩水、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。得られたフィルターを乾燥後、固形シンチレーターMeltiLex A（PerkinElmer社製）を融着させてβ−カウンター（MicroBeta microplate scintillation counter（Trilux：PerkinElmer社製）を用いて測定し、定量した。【００４７】
＜結果＞
その結果を図１に示した。
図１に示した結果から判明するように、メペンゾラート臭化物のラセミ体（●）とＲ体（■）が、同程度にＭ３受容体との結合が強く、Ｓ体（▼）は結合能が弱かった。【００４８】
また、受容体結合能について、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で表示した結果を図２として示した。
図中に示した結果からも判明するように、メペンゾラート臭化物のラセミ体（ＩＣ５０＝３２．１ｎＭ）（●）よりもＲ体（ＩＣ５０＝２５．３ｎＭ）（■）が、Ｍ３受容体との結合能が強い傾向にあり、Ｓ体（ＩＤ５０＝２９９．７ｎＭ）（▼）は結合能が弱かった。【００４９】
試験例２．２：受容体結合能（インビトロ）（その２）
＜方法＞
受容体結合能は、ヒトムスカリンＭ３受容体（ｈＭ３Ｒ）過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、またはヒトムスカリンＭ２受容体（ｈＭ２Ｒ）過剰発現ＣＨＯ−Ｋ1細胞の膜画分を用い、１−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルブロマイド（［３Ｈ］ＮＭＳ、８５．５Ｃｉｍｍｏｌの特異的な活性）との競合阻害測定により行った。細胞膜のタンパク質濃度は１０．０μｇ／well、［３Ｈ］ＮＭＳ濃度は２．０ｎＭであった。
阻害剤濃度（メペンゾラート）の範囲（１０−1０〜３×１０−５Ｍ）は、比較曲線を作成することにより試験した。非特異的な結合は２．５μＭのアトロピンの存在下で測定した。
試薬は結合緩衝液（リン酸バッファー／食塩水）にて、全量が２００μＬになるようにした。平衡になるように室温で２時間インキュベーションした後、反応混合液は１．０％ポリエチレンイミンを含有するリンスバッファー（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ食塩水、ｐＨ７．４）で１時間前処理したＧＦ／Ｃフィルタープレートにて濾過し、氷冷したリンスバッファーで４回洗浄した。
得られたフィルターを３０分間乾燥後、固形シンチレーターMeltiLex A（melt-on scintillation sheet；PerkinElmer社製）に固定した。フィルター上に残った放射活性をMicroBeta Trilux microplate scintillation counter（PerkinElmer社製）で測定した。
平衡時のアフィニティー（親和性）を、ｈＭ３ＲまたはｈＭ２Ｒに対する［３Ｈ］ＮＭＳの実験的に得られた定数（κd）及び濃度から実験的なＩＣ５０を求め、平衡拮抗解離定数（κi）値として決定した。なお、κi値は、３回の個々の曲線から求め、Prism（GraphPad Software社製）を用いて修正を行った。【００５０】
＜結果＞
ラセミ体のメペンゾラート臭化物、（Ｒ）−メペンゾラート臭化物、及び（Ｓ）−メペンゾラート臭化物のｈＭ２ＲまたはｈＭ３Ｒに対するκi値を、下記表２に示した。【００５１】
【表２】
2015122031.tif 000008
【００５２】
また、各濃度の結合能の推移を、図３及び図４にその結果を示した。
図３は、ｈＭ３Ｒ（Ｍ３受容体）についての結果であり、図４は、ｈＭ２Ｒ（Ｍ２受容体）についての結果である。
表２に示した結果、並びに図３に示した結果から、ｈＭ３Ｒ（Ｍ３受容体）への親和性に関しては、（Ｓ）−メペンゾラート臭化物（△）は、（Ｒ）−メペンゾラート臭化物（■）及びラセミ体のメペンゾラート臭化物（○）に比べて低いことが判明する。【００５３】
試験例３．１：メタコリン誘発の気道収縮（airway constriction）に対する効果（その１）
＜方法＞
メタコリン誘発による気道抵抗（airway resistance）の上昇測定を行った。
４〜６週齢のＩＣＲマウスに、１ｍｇ／ｍＬのメタコリンの２０秒間の噴霧投与を５回行った。メタコリンの各投与の終了後、スナップショット法（snap shot technique）により気道抵抗を測定した。全てのデータは、FlexiVentソフトウエアを用いて解析した。
メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各３．７５μｇ／ｋｇを、経気道投与を行い、投与１時間後にマウスを噴霧化されたメタコリンに上記の方法で５回曝し、その時の各投与時における気道抵抗を測定した。【００５４】
＜結果＞
その結果を図５示した。
図５に示した結果から判明するように、メペンゾラート臭化物のＳ体（▼）はほとんど効果を示さず、ラセミ体（■）とＲ体（●）は顕著な気道抵抗抑制効果を示したが、Ｒ体の方が若干優れていた。【００５５】
試験例３．２：メタコリン誘発の気道収縮（airway constriction）に対する効果（その２）
＜方法＞
メタコリン誘発による気道抵抗（airway resistance）の上昇測定を行った。
４〜６週齢のＩＣＲマウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、気管切開術を施し、気管支に８ｍｍ径の金属チューブを挿入した。
マウスを、１回排気量８．７ｍＬ／ｋｇ及び呼吸終末陽圧２−３ｃｍＨ２Ｏで機械的に、１５０呼吸／分で呼吸させた。
メタコリン誘発による気道抵抗（airway resistance）のため、４０秒間の間隔をあけて、噴霧状のメタコリン（５ｍｇ／ｋｇ）を２０秒間／４回曝し、スナップショット法（snap shot technique）により気道抵抗を測定した。
メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各３８μｇ／ｋｇ及び３．８μｇ／ｋｇを、経気道投与を行い、投与１時間後にマウスを噴霧化されたメタコリンに上記の方法で５回曝し、その時の各投与時における気道抵抗を測定した。
各データは、FlexiVentソフトウエアを用いて解析した。【００５６】
＜結果＞
その結果を、図６（３８μｇ／ｋｇ投与）、及び図７（３．８μｇ／ｋｇ投与）に示した。
投与用量の低い場合（図７：３．８μｇ／ｋｇ投与）には、メペンゾラート臭化物のＳ体（△）はほとんど効果を示さず、ラセミ体（○）とＲ体（■）は顕著な気道抵抗抑制効果を示していたが、用量が多い場合（図６：３８μｇ／ｋｇ投与）には、メペンゾラート臭化物のＳ体（△）は、ラセミ体（○）及びＲ体（■）と同程度の気道抵抗抑制効果を示すことが判明した。【００５７】
試験例４．１；ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）誘発の炎症に対する効果（その１）
＜方法＞
４〜６週齢のＩＣＲマウスに、ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各メペンゾラート臭化物を、３８μｇ／ｋｇの投与量で、１回経気道投与を行った。
メペンゾラート臭化物投与１時間後に、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）１００μｇ／マウスを投与した。次いで、ブタ膵臓エラスターゼ投与２４時間後に、気管支肺胞洗浄液（broncho alveolar lavage fluid、ＢＡＬＦ）を肺から採取し、細胞総数及び好中球数を測定した。【００５８】
＜結果＞
その結果を図８に示した。
図８に示した結果から判明するように、細胞総数及び好中球数のいずれにおいても、メペンゾラート臭化物のＲ体が比較的減少効果に優れており、ラセミ体とＳ体については、同程度の効果であった。【００５９】
試験例４．２；ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）誘発の炎症に対する効果（その２）
＜方法＞
投与用量の比較として、４〜６週齢のＩＣＲマウスに、ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各メペンゾラート臭化物を、７．５μｇ／ｋｇ及び３８μｇ／ｋｇの投与量で、１回経気道投与による検討を行った。
メペンゾラート臭化物投与１時間後に、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）２０Ｕ／ｋｇを投与した。次いで、ブタ膵臓エラスターゼ投与６時間後に、気管支肺胞洗浄液（broncho alveolar lavage fluid、ＢＡＬＦ）を肺から採取した。なお、ＢＡＬＦは、気管カニューレにより、肺をヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）含有の生理食塩水で洗浄（２回）することで採取した。
採取したＢＡＬＦについて、細胞総数を、hemocytometer（血球計算板）を用いて測定した。細胞を、Cytospin４（Thermo Electron社製、登録商標）により遠心分離後、Diff-Quik試薬により固定し、細胞総数に対する好中球数の比率として好中球数を測定した。【００６０】
＜結果＞
その結果を、図９（総細胞数）及び図１０（好中球数）に示した。
図中に示した結果からも判明するように、メペンゾラート臭化物の投与により、細胞総数及び好中球数のいずれにおいても減少効果が認められ、ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各メペンゾラート臭化物の間では、その減少効果に大きな差異はなかった。
また、投与用量の差異による顕著な効果の差異は認められなかった。【００６１】
試験例４．３；ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）誘発の炎症に対する効果（その３）
ＰＰＥ誘発の炎症に対する効果として、気管支肺胞洗浄液（broncho alveolar lavage fluid、ＢＡＬＦ）中のサイトカイン及びケモカインのレベルを測定した。
すなわち、炎症性因子であるサイトカインとして、pro-inflammatory cytokainesであるＴＮＦ−α（腫瘍因子−α）を、及び炎症性ケモカインとして、マクロファージ炎症タンパク（macrophage inflammatory protein：ＭＩＰ−２）、単球走化性タンパク（monocyte chemotactic protein：ＭＣＰ−１）、及びケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）を測定した。【００６２】
＜方法＞
上記の「試験例４．２」に記載した方法と同様に行い、ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各メペンゾラート臭化物の投与量として３８μｇ／ｋｇで試験した。
ＢＡＬＦ中におけるこれらのサイトカイン及びケモカインの測定は、ELISA法により行った。【００６３】
＜結果＞
その結果を図１１〜図１４に示した。
図１１はＴＮＦ−αの結果を示し、図１２はＭＩＰ−２の結果を示し、図１３はＭＣＰ−１の結果を示し、図１４はＫＣの結果を示している。
各図中の結果からも判明するように、ラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の各メペンゾラート臭化物は、効果的に炎症性因子を減少させていることが認められた。【００６４】
前記したように、メペンゾラート臭化物は、下部消化管の運動・収縮抑制作用を有する抗コリン薬として知られており、臨床の場では過敏性大腸症の治療薬として使用されている。
したがって、抗コリン作用に基づく消化器系の副作用の一つとして便秘が挙げられている。また、メペンゾラート臭化物は、不整脈のある患者に対しては、心臓の運動を促進させ、症状を悪化させるおそれがあるとして、慎重投与が求められている。
そこで、メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体の相違によるこれらの副作用の程度を検討した。【００６５】
試験例５：ストレス負荷による糞粒排出量（便秘の発生の程度）の検討
＜方法＞
４〜６週齢のＩＣＲマウスを、自由呼吸は確保できるが自由な動きを拘束する５０ｍＬチューブ中に１時間に置き、ストレス負荷を行い、その時の糞粒排出量（便秘の発生の程度）を測定した。
メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体のそれぞれを、４．７ｍｇ／ｋｇの用量で気管内投与し、投与１時間後に、上記の拘束ストレスに１時間曝しストレス負荷を行い、その間の糞粒排出量を測定することで、便秘の発生の程度を観察した。【００６６】
＜結果＞
その結果を図１５に示した。
図中の結果からも判明するように、メペンゾラート臭化物のＳ体は、便秘の発生が低いものであり、Ｒ体は、最も便秘の発生が強いものであった。【００６７】
試験例６：心拍数への影響の検討
＜方法＞
４〜６週齢のＩＣＲマウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、大腿部にセンサーを装着し、心拍数をMouseOx system （STARR Life Sciences社製）により測定した。
メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体のそれぞれを、９４０μｇ／ｋｇおよび４７００μｇ／ｋｇの用量で気管内投与し、心拍数を測定し、正常心拍のベースラインを超えるメペンゾラート臭化物投与に起因する心拍数を測定した。【００６８】
＜結果＞
その結果を図１６に示した。結果は、vehicle投与（無投与）時の正常心拍数を１００％とした場合の比率で示した。
図中の結果からも判明するように、メペンゾラート臭化物のラセミ体、Ｒ体、Ｓ体は、いずれも用量依存的に心拍数を亢進しており、その程度は同程度のものであった。【００６９】
以上の試験例から判断すると、メペンゾラート臭化物のＲ体並びにＳ体にあっては、気道抵抗抑制作用の面からみると、用量が低い場合にはメペンゾラート臭化物のＲ体の方がＳ体に比較して強い傾向にある（試験例３．１）ものの、高用量の場合には、両者とも同程度の作用を示している（試験例３．２）。
一方、抗炎症作用の面からみると、メペンゾラート臭化物のＲ体並びにＳ体とも大きな差異は認められないものである（試験例４．１、４．２及び４．３）。
更に、副作用の観点からメペンゾラート臭化物のＲ体並びにＳ体を比較すると、Ｓ体の方がＲ体に比較して便秘の発生を抑制させている。【００７０】
本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤は、メペンゾラート臭化物の光学活性体（Ｒ体及びＳ体）の気管支拡張作用及び抗炎症作用により慢性閉塞性肺疾患の症状を改善させるものである。
したがって、両作用（気管支拡張作用並びに抗炎症作用）の強さの程度のバランスを勘案して、何れかの光学活性体を有効成分とすれば良く、極めて有効なＣＯＰＤ改善剤となり得ることを示しているものであった。【００７１】
以下に、本発明のＣＯＰＤ改善剤の具体的製剤例を示す。【００７２】
製剤例１：吸入剤
（Ｒ）−メペンゾラート臭化物１％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール１０％（ｗ／ｗ）、プロピレングリコール２０％（ｗ／ｗ）、残部精製水で吸入用液剤を調製する。【００７３】
製剤例２：吸入剤
（Ｓ）−メペンゾラート臭化物１％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール１０％（ｗ／ｗ）、プロピレングリコール２０％（ｗ／ｗ）、残部精製水で吸入用液剤を調製する。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上記載したように、本発明が提供するＣＯＰＤ改善剤は、既に臨床の場で使用されているメペンゾラート臭化物の光学活性体を有効成分とするものであり、経気道投与、吸入投与において顕著にＣＯＰＤの改善効果が見られ、また、経口投与並びに直腸内投与においても改善効果が見られた。したがって、その医療上の貢献度は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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