(57)【要約】  本発明は、界面活性剤とdsRNAを混合し、その混合液を疎水吸着樹脂または活性炭と接触させることにより界面活性剤とエンドトキシンが同時に除去されたdsRNAを回収する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを含む二重鎖リボ核酸（dsRNA）水溶液に界面活性剤を混合後、静置し、該混合液に疎水吸着樹脂または活性炭を接触させることにより、該エンドトキシンと該界面活性剤を除去することを含む、dsRNAの精製方法。
【請求項２】
界面活性剤が、非イオン系界面活性剤、両性界面活性剤、又は陰イオン系界面活性剤である請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
非イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類の非イオン系界面活性剤である請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
両性界面活性剤が、スルホベタイン類の両性界面活性剤である請求項２に記載の精製方法。
【請求項５】
陰イオン系界面活性剤が、ステロイド類の陰イオン系界面活性剤である請求項２に記載の精製方法。
【請求項６】
疎水吸着樹脂が、スチレン系疎水吸着樹脂、アクリル系疎水吸着樹脂、メタクリル系疎水吸着樹脂、及び界面活性剤除去用樹脂からなる群より選ばれる疎水吸着樹脂である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重鎖リボ核酸からエンドトキシンを除去する、二重鎖リボ核酸の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌の外膜に由来するエンドトキシンは、ヒトや動物などの生命体に致死率の高い疾患をもたらす高活性の発熱性物質である。それゆえに、注射製剤や注射用ワクチンなど人体や動物に投与する医薬品は、エンドトキシン含量を極限まで低く抑える必要がある。【０００３】
エンドトキシンは、物理化学的安定性が極めて高く、その生理活性を温和な条件で消失させることは困難である。例えば乾熱処理で生理活性を完全消失させるためには250℃で30分間以上の加熱が必要である。また、酸や塩基で処理して生物活性を消失させる方法も知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）が、これらの過激な処理法を蛋白製剤や核酸製剤などの生体高分子化合物のエンドトキシン除去に用いることはできない。【０００４】
エンドトキシンを除去する方法としては、ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルを利用した方法が知られている（非特許文献４）。この方法は相分配法に基づくタンパク質溶液からエンドトキシンを除去する方法である。室温、中性の温和な条件でエンドトキシンを除去できる方法であるが、一方で、温度を室温から冷蔵へと変化させて溶液を二相に分相させる必要がある点や、二相の境界が不明瞭である点、タンパク質の特性によっては回収率が著しく低下する点など課題が多い。また、エンドトキシンが除去されたタンパク質溶液には、ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルが高濃度残留する課題もある。また、二重鎖リボ核酸（dsRNA）に混入しているエンドトキシンを除去できるかどうか不明である。【０００５】
dsRNAと類似している生体高分子にデオキシリボ核酸（DNA）がある。特許文献１には、プラスミドDNAからエンドトキシンを除去する方法が記載されている。この方法はプラスミドDNAに夾雑する宿主細胞由来の不純物を疎水性吸着物質に選択的に結合させて除去する方法である。この特許文献１で定義される宿主細胞不純物とはエンドトキシンの他にRNAも含まれており、RNAからエンドトキシンを除去する方法ではない。また、この方法ではトランスファーRNA、リボゾーマルRNAなどの二重鎖を形成したRNAもメッセンジャーRNAもすべてのRNAがエンドトキシンと共に疎水性相互物質と結合しRNAを精製できない。また予め十分な塩を添加する必要があるため、塩を除く後工程を追加しなければならない。【０００６】
工業的な大量生産プロセスに適用できるdsRNAからエンドトキシンを除去する方法は知られていない。また、タンパク質やDNAからエンドトキシンを除去する方法は幾つも知られているが、温度、pH、塩、残存界面活性剤の量、疎水性相互作用媒体への吸着など、dsRNAからエンドトキシンを除去する方法に応用するには課題があった。【０００７】
dsRNAを医薬品またはそれに類する用途に用いるためには、エンドトキシンを効果的に除去する方法を確立する必要がある。本発明は、工業的な大量生産プロセスに適用できるdsRNAからエンドトキシンを除去する手段を提供するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−５０４６３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology、 1969年、第97巻、p.1069-1077
【非特許文献２】Ann. N. Y. Acad. Sci., 1966年、第133巻、P.604-621
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981年、第101巻、P.434-439
【非特許文献４】Journal of Immunological Methods, 1990年、第132巻、p.191-195
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、エンドトキシンがほとんど完全に除去されたdsRNAまたはその塩の精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、エンドトキシンを含むdsRNA水溶液に界面活性剤を混合し、疎水吸着樹脂または活性炭に接触させることによって、エンドトキシンと界面活性剤をdsRNA水溶液から除去・精製することができることを見出した。
本発明者らは上記の知見に基づき更に研究を進め、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］エンドトキシンを含む二重鎖リボ核酸（dsRNA）水溶液に界面活性剤を混合後、静置し、該混合液に疎水吸着樹脂または活性炭を接触させることにより、該エンドトキシンと該界面活性剤を除去することを含む、dsRNAの精製方法；
［２］界面活性剤が、非イオン系界面活性剤、両性界面活性剤、又は陰イオン系界面活性剤である［１］に記載の精製方法；
［３］非イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類の非イオン系界面活性剤である［２］に記載の精製方法；
［４］両性界面活性剤が、スルホベタイン類の両性界面活性剤である［２］に記載の精製方法；
［５］陰イオン系界面活性剤が、ステロイド類の陰イオン系界面活性剤である［２］に記載の精製方法；
［６］疎水吸着樹脂が、スチレン系疎水吸着樹脂、アクリル系疎水吸着樹脂、メタクリル系疎水吸着樹脂、及び界面活性剤除去用樹脂からなる群より選ばれる疎水吸着樹脂である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の精製方法；
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
エンドトキシンがほとんど完全に除去された安全なdsRNAまたはその塩を工業的な規模で製造し提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の精製方法が適用できるdsRNAとは、リボ核酸が二重鎖を形成した構造体であればどのようなものでもよく、例えば、一本鎖リボ核酸（ssRNA）と該ssRNAに相補的な一本鎖ssRNAによって構成されるdsRNAであってもよいし、１本のssRNA内における相補的な配列間で分子内アニーリングすることによって形成されるステム・ループ構造を有するRNAであってもよい。さらに、本発明のdsRNAは塩の形態であってもよく、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩としては、トリスヒドロキシアミノメタン等の塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン等の塩が挙げられる。
【００１５】
dsRNAを構成するssRNAの塩基の種類や配列や塩基数は、ssRNA分子間やssRNA分子内で二重鎖を形成できる程度の相補性を有する限り限定されない。ここで、「二重鎖を形成できる程度の相補性を有する」とは、ssRNA分子間やssRNA分子内の塩基配列間で約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらに一層好ましくは約95％以上、最も好ましくは約98％以上の相補性を有することをいう。リボ核酸の塩基間の相補性については当該技術分野において良く知られている。各ssRNAを構成する塩基は、例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、あるいはそれらの構造類縁体等が挙げられ、各ssRNAは同一の塩基によって構成されていても、お互い異なる塩基によって構成されていてもよい。
【００１６】
また、dsRNAの塩基対数も問わないが、望ましくは10〜10,000塩基対の範囲であり、さらに望ましくは10〜2,000塩基対である。
【００１７】
また、dsRNA水溶液は、塩が含まれていても含まれていなくても良い。塩濃度はどのような濃度でもかまわないが、150 mM以下が実用的な範囲であり好適である。塩の種類は酢酸塩、炭酸塩、リン酸塩、アンモニウム塩、SO42-、Cl-、Br-、NO3-、Mg2+、Li+、Na+、K+およびNH4+からなるが、これらに限定されない群から選択されたアニオンまたはカチオンの混合物を含む。塩のほかにも緩衝作用のある物質を含んでいても構わない。緩衝作用のある物質としては、Tris、TES、リン酸塩、Tricine、PIPES、HEPES、MOPS、MEPES、MES、Bicineなどがある。
【００１８】
前記のdsRNA水溶液と混合される本発明の界面活性剤としては、疎水基と親水基を有する両親媒性分子であれば特に制限はなく、例えば、非イオン系界面活性剤、両性界面活性剤、又は陰イオン系界面活性剤を挙げることができる。
非イオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、アルキルモノグリセリルエーテル類、脂肪酸ソルビタンエステル類を、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類を、最も好ましくは、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを挙げることができる。
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド類、アルキルカルボキシベタイン類、スルホベタイン類を、好ましくは、スルホベタイン類を、最も好ましくは、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナートを挙げることができる。
陰イオン系界面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩類、モノアルキルリン酸塩類、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩類、モノアルキル硫酸塩類、脂肪酸ナトリウム類、ステロイド類を、好ましくは、ステロイド類を、特に好ましくは、デオキシコール酸塩を、最も好ましくは、デオキシコール酸ナトリウムを挙げることができる。
【００１９】
界面活性剤は溶解していても溶解していなくても良く、混合時の終濃度（V/V）は0.001%〜70%、好ましくは0.01%〜50%、さらに好ましくは0.1%〜10%である。また、混合時の温度は限定されないが、温度を一定にすることにより安定した除去性能を得ることが可能であり、通常、常圧の状態で100℃より低い温度であり、好ましくは40℃以下、さらに好ましくは15℃以下である。
前記のdsRNA水溶液と界面活性剤は混合後、静置される。静置する温度はdsRNAが安定である温度であれば良い。通常、常圧の状態で100℃より低い温度であり、好ましくは40℃以下、さらに好ましくは15℃以下である。静置する時間は1秒間〜10日間、好ましくは1分間〜1日間、さらに好ましくは10分間から5時間である。
【００２０】
前記の混合液と接触される本発明の疎水吸着樹脂または活性炭としては、dsRNA、界面活性剤及びエンドトキシンを含む溶液を該樹脂または活性炭に接触させたとき、界面活性剤及びエンドトキシンを選択的に吸着する性質を有するものであれば特に制限されない。
【００２１】
上記の疎水吸着樹脂（疎水吸着樹脂は、合成吸着樹脂ともいう。）としては、例えば、スチレン系疎水吸着樹脂、アクリル系疎水吸着樹脂、及び、メタクリル系疎水吸着樹脂を挙げることができる。これらの好ましい樹脂としては、スチレン系疎水吸着樹脂としては、セパビーズ（登録商標）SP207, SP70（三菱化学株式会社、日本）、デュオライト（登録商標）S874, S876, S877（住化ケムテックス株式会社）、及びアンバーライト（登録商標）XAD2000, XAD4, FPX66, XAD1180N, XAD-2（オルガノ株式会社、日本）などを、アクリル系疎水吸着樹脂としては、アンバーライト（登録商標）XAD7HP（オルガノ株式会社、日本）を、メタクリル系疎水吸着樹脂としては、ダイヤイオン（登録商標）HP2MG（三菱化学株式会社、日本）などを挙げることができる。
また、界面活性剤除去用樹脂として販売されている、複数の疎水吸着樹脂及びシリカビーズが3次元にクロスリンクした混合樹脂も疎水吸着樹脂に含まれる。上記シリカビーズに3次元にクロスリンクされる疎水吸着樹脂は、界面活性剤及びエンドトキシンを選択的に吸着する性質を有するものであれば特に制限されないが、例えば、スチレン系疎水吸着樹脂、アクリル系疎水吸着樹脂、及び、メタクリル系疎水吸着樹脂が挙げられる。また、市販されている界面活性剤除去用樹脂も本発明に好ましく用いることができる。そのような界面活性剤除去用樹脂としては、CALBIOSORB（EMD millipore, USA)又はSDR HyperD（登録商標）（Pall Corp., USA)を、好ましくは、SDR HyperD（登録商標）を挙げることができる。
【００２２】
上記の活性炭としては、分子間相互作用力によって界面活性剤を吸着する性質を保持しており、dsRNA、界面活性剤及びエンドトキシンを含む溶液を該活性炭に接触させたとき、界面活性剤及びエンドトキシンを選択的に吸着する性質を有するものであれば特に制限されない。このような活性炭としては、市販されている活性炭を使用することができ、例えば、粒状活性炭白鷺（登録商標）LH2Cを挙げることができる。
【００２３】
本発明に用いられる疎水吸着樹脂または活性炭の形状は問われず、粒状、膜状、破砕状、繊維状等であってよい。また、シリカゲル等のビーズ状の担体を有する樹脂であってもビーズ担体のサイズは限定されない。また、上記の疎水吸着樹脂については、孔の有無、孔の数、孔のサイズも限定されない。
【００２４】
前記の静置後の混合液と疎水吸着樹脂または活性炭との接触は、当業者であれば公知の方法に従って実施することができる。
【００２５】
そのような方法の一つとしては、カラムクロマトグラフィー法が挙げられる。カラムクロマトグラフィー法では、前記の疎水吸着樹脂または活性炭を適当な液体クロマトグラフィー用カラムに充填し、平衡化した後、前記の静置後の混合液をアプライし、エンドトキシンと界面活性剤が除去されたdsRNA水溶液を回収することができる。疎水吸着樹脂または活性炭の平衡化やdsRNA水溶液の回収に用いる溶媒としては、極性の高い溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水、または水に塩（例えば、硫安、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）を含むものを用いる。また、接触時の温度は限定されないが、温度を一定にすることにより安定した成績を得ることが可能であり、温度は０〜４０℃が好ましく、より好ましくは１０〜３０℃がよい。
【００２６】
また、別の方法としては、バッチ法が挙げられる。バッチ法では、前記の疎水吸着樹脂または活性炭を適当な容器に充填し、平衡化した後、前記の静置後の混合液を加えて撹拌混合し、該混合液を、静置、遠心分離または濾過等することでエンドトキシンと界面活性剤が除去されたdsRNA水溶液を回収することができる。また、疎水吸着樹脂または活性炭の平衡化に用いる溶媒、温度等はカラムクロマトグラフィー法と同一であってよい。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。【００２８】
実施例１. ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルと界面活性剤除去用樹脂を用いたエンドトキシンの除去
UF膜透析で狭雑塩を除去したポリイノシン酸ポリマーとポリシチジル酸ポリマーからなる平均鎖長 約320塩基対の二重鎖リボ核酸溶液dsRNA1-C（Abs 260nm の吸光度＝200）0.5mlと0.02 mlのエーテル型非イオン界面活性剤ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテル(和光純薬工業(株)製)と0.48 mlの超純水からなる混合液dsRNA1-Mを作製し、4℃で2時間静置した。Poly-PrepR Chromatography Columns（バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製）に1 ml の界面活性剤除去用樹脂SDR HyperDR（Pall corporation製）を詰めてレジンカラムを作製し、超純水を5 ml流して樹脂を平衡化した。レジンカラムに0.25 mlのdsRNA1-Mをアプライし、続けて超純水を滴下し、溶出液を0.25 mlずつサンプリングした。Abs 260nmの吸光強度の高い2画分を1つにまとめ、0.5 mlのdsRNA1-Pを得た。dsRNA1-PのAbs 260nmの吸光強度は36であった。【００２９】
実施例２. エンドトキシン濃度の測定
dsRNA1-Cのエンドトキシン濃度を市販のエンドトキシン定量分析キットToxin SensorTM Endotoxin  Detection  System （GenScript  USA  Inc. 製） を使用して分析した。取扱説明書に従い測定したところ、dsRNA1-Cのエンドトキシン濃度は3.0 EU/mlであり、Abs260nmの吸光強度あたりのエンドトキシン量に換算すると0.030 EU/Abs(260nm)であった。同様にdsRNA1-Pのエンドトキシン濃度を測定したところ、エンドトキシンを検出できなかった。この測定方法による検出限界は0.005 EU/mlであるため、Abs 260nmの吸光強度あたりのエンドトキシン量に換算すると0.0000139 EU/Abs(260nm)未満であった。【００３０】
実施例３. ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテル濃度の測定
ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルの定量分析は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で行った。サンプルは30 % メタノールで希釈してHPLC分析に供した。分析条件は以下のとおりである。
・溶離液A：超純水
・溶離液B：100 % メタノール
・グラジエント：60 - 80 % メタノールのグラジエント溶出
・ポンプ流速：0.5 ml/min
・カラム：Inertsil ODS-3、 カラム長  150mm × 3.0mm、粒子径3μm (ジーエルサイエンス(株)）
・カラム温度：50℃
・検出器： Abs 223nm
ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルを使用して検量線を作成したところ、検出限界は0.5 v/v ppmであった。この方法でdsRNA1-Pに含まれるポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルを測定したところ、検出限界以下であった。【００３１】
実施例４. 界面活性剤除去用樹脂を用いたバッチ法によるエンドトキシンの除去
UF膜透析で狭雑塩を除去したポリイノシン酸ポリマーとポリシチジル酸ポリマーからなる平均鎖長 約280塩基対の二重鎖リボ核酸溶液dsRNA2-C（Abs 260nm の吸光度＝200）1 mlと0.04 mlの99 % のポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテル(和光純薬工業(株)製)と0.96 mlの超純水からなる混合液dsRNA2-Mを作製し、4℃で2時間静置した。
2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに0.5 mlのSDR HyperDRを詰めた。次に超純水1mlを加えて8000×g、15秒間遠心分離して上清を取り除く洗浄操作を行った。この洗浄操作を合計5回行い、SDR HyperDRを平衡化した。0.5 mlのdsRNA2-Mを加え、室温で1時間往復振盪した。振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-P-SDを採取した。【００３２】
実施例５. 疎水吸着樹脂を用いたバッチ法によるエンドトキシンの除去
2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに0.5 mlの疎水吸着樹脂セパビーズ（登録商標）SP207（三菱化学（株）製）を詰め、次に超純水1mlを加えて8000×g、15秒間遠心分離して上清を取り除く洗浄操作を合計5回行い、SP207を平衡化した。これに、実施例４で作製した0.5 mlのdsRNA2-Mを加え、室温で1時間往復振盪した。振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-P-SPを採取した。【００３３】
実施例６. 活性炭を用いたバッチ法によるエンドトキシンの除去
2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに0.5 mlの粒状活性炭の白鷺（登録商標）LH2Cを（日本エンバイロケミカルズ（株）製）を詰め、次に超純水1mlを加えて8000×g、15秒間遠心分離して上清を取り除く洗浄操作を合計5回行い、白鷺（登録商標）LH2Cを平衡化した。これに、実施例４で作製した0.5 mlのdsRNA2-Mを加え、室温で1時間往復振盪した。振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-P-LHを採取した。【００３４】
実施例７．エンドトキシン濃度の測定
dsRNA2-P-SDおよびdsRNA2-P-SPおよびdsRNA2-P-LHに含まれるポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルの濃度を実施例３の方法で測定したところ、いずれも検出限界以下であった。
dsRNA2-CおよびdsRNA2-P-SD、dsRNA2-P-SP、dsRNA2-P-LHの吸光強度とエンドトキシン濃度を実施例３の方法で測定した結果を表１にまとめた。
セパビーズ（登録商標）SP207、または粒状活性炭白鷺（登録商標）LH2C で処理してもSDR HyperDRと同等以下にエンドトキシンが低減され、dsRNAの高収率もほぼ同等であった。【００３５】
【表１】
2015050191.tif 000002
【００３６】
実施例８. ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルを用いたエンドトキシンの除去
ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルの曇点は、塩を含まない場合25℃である。この曇点と実施例１および実施例４で示したエンドトキシン除去作用との関係を調べるために、ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルよりも曇点の低いポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルを用いた試験を行った。
dsRNA2-C水溶液（Abs 260nm の吸光度＝200） 0.5 mlと0.02 mlのポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(和光純薬工業(株)製)と0.48 mlの超純水からなる混合液を作製し、4℃で2時間静置した。0.5 mlを実施例４と同様な手順で平衡化した0.5 mlのSDR HyperDR を詰めた2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに添加し、室温で1時間往復振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-P-SD-10を採取した。dsRNA2-P-SD-10のエンドトキシン濃度を実施例２に示した手順で分析した。結果を実施例４で示したdsRNA2-C およびdsRNA2-P-SDの値と共に表２にまとめた。
また、dsRNA2-C水溶液（Abs 260nm の吸光度＝200） 0.5 mlを超純水0.5 mlで2倍に希釈した液を作製し、0.5 mlを実施例４と同様な手順で平衡化した0.5 mlの SDR HyperDR を詰めた2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに添加し、室温で1時間往復振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-P-SD-Nを採取し、対照例として用いた。dsRNA2-P-SD-Nのエンドトキシン濃度を実施例２に示した手順で分析した。【００３７】
【表２】
2015050191.tif 000003
【００３８】
表２から明らかなように、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを添加せずに樹脂と接触させたdsRNA2-P-SD-Nのエンドトキシン濃度は高いが、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルを添加したdsRNA2-P-SD-10のエンドトキシン濃度は、ポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルを添加したdsRNA2-P-SDと同等であった。このことから、本発明におけるエンドトキシンの除去作用は界面活性剤の曇点に依存しないことが明らかとなった。【００３９】
実施例９. 3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナートを用いたエンドトキシンの除去
0.5 ml のdsRNA2-C水溶液（Abs 260nm の吸光度＝200）と0.02 mlの3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート((株)同人化学研究所製)と0.48 mlの超純水からなる混合液を作製し、4℃で2時間静置した。0.5 mlを実施例４と同様な手順で平衡化した0.5 mlの SDR HyperDR を詰めた2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに添加し、室温で1時間往復振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-SD-CHを採取した。実施例２と同様にdsRNA2-SD-CHのエンドトキシン濃度と吸光強度を測定したところ、吸光強度74、エンドトキシン濃度 0.18 EU/mlで、吸光強度当たりのエンドトキシン濃度は、0.0025 EU/Abs(260nm)で、優れたエンドトキシン除去性が認められた。【００４０】
実施例１０. デオキシコール酸を用いたエンドトキシンの除去
0.5 ml のdsRNA2-C水溶液（Abs 260nm の吸光度＝200）と0.5 mlの4%(w/v)デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬工業(株)製)からなる混合液を作製し、4℃で2時間静置した。0.5 mlを実施例４と同様な手順で平衡化した0.5 mlの SDR HyperDR を詰めた2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに添加し、室温で1時間往復振盪後、静置して生じた上清dsRNA2-SD-DEを採取した。
実施例２と同様にdsRNA2-SD-DEのエンドトキシン濃度と吸光強度を測定したところ、吸光強度74、エンドトキシン濃度 0.18 EU/mlで、吸光強度当たりのエンドトキシン濃度は、0.0025 EU/Abs(260nm)で、優れたエンドトキシン除去性が認められた。【００４１】
実施例１１.塩濃度の影響
0.5 mlのdsRNA2-C水溶液（Abs 260nm の吸光度＝200）と0.25 mlの0.6M NaCl溶液と0.23 mlの超純水と0.02 mlのポリオキシエチレン(8)オクチルフェニルエーテルからなる混合液を作製し、4℃で2時間静置した。実施例４と同様な手順で平衡化した0.5 mlの SDR HyperDR を詰めた2.0 mlプラスチック製サンプリングチューブに添加し、室温で1時間往復振盪後、静置して生じた上清（dsRNA2-P-SD-NA）を採取した。dsRNA2-P-SD-NAのエンドトキシン濃度を定量分析し、実施例４のdsRNA2-P-SDと比較した。結果をまとめたものが表3である。表3から明らかなように、サンプルのNaCl濃度に依存せず、エンドトキシンを除去することが示された。【００４２】
【表３】
2015050191.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４３】
エンドトキシンがほとんど完全に除去された安全なdsRNAまたはその塩を工業的な規模で製造し提供することができ、医薬品またはそれに類する用途に容易に用いることができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２０８５４８（出願日：平成２５年１０月３日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【国際調査報告】
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