(57)【要約】  癌細胞増殖抑制剤であって、構造式（１）から（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含み、前記癌細胞が、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかである癌細胞増殖抑制剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞増殖抑制剤であって、
下記構造式（１）から（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含み、
前記癌細胞が、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【化１】
2016052081.tif 000054
【化２】
2016052081.tif 000055
【化３】
2016052081.tif 000056
【化４】
2016052081.tif 000057
【化５】
2016052081.tif 000058
【化６】
2016052081.tif 000059
【化７】
2016052081.tif 000060
【化８】
2016052081.tif 000061
【請求項２】
構造式（１）で表される化合物、構造式（６）で表される化合物、及び構造式（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含む請求項１に記載の癌細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする抗癌剤。
【請求項４】
癌が、神経膠芽腫である請求項３に記載の抗癌剤。
【請求項５】
癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法であって、
接着の足場を有さない環境下で、被験物質を含む培地で上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
接着の足場を有する環境下で、被験物質を含む培地でＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害せず、かつ、前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価する評価工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
下記構造式（８）で表されることを特徴とする化合物。
【化９】
2016052081.tif 000062
【請求項７】
請求項６に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制可能な癌細胞増殖抑制剤、前記癌細胞増殖抑制剤を含む抗癌剤、及びこれらのスクリーニング方法、並びに、前記癌細胞増殖抑制剤、及び前記抗癌剤に好適な新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（以下、「ＥＧＦＲ」と称することがある）は、上皮成長因子（以下、「ＥＧＦ」と称することがある）などのリガンドが結合することにより、細胞膜内のカイネース活性が活性化しシグナル伝達を行う、受容体型チロシンカイネースである。ＥＧＦＲは、正常組織にも存在するが、癌組織において頻繁に変異、又は増幅が見られ、細胞の癌化を起こすことが知られている。【０００３】
例えば、極めて悪性な癌である神経膠芽腫（以下、「グリオブラストーマ」と称することがある）では、患者の６割程度の癌組織のゲノムにおいて、ＥＧＦＲ遺伝子の変異、又は増幅が見られる。また、前記６割程度の癌組織のうちの半数では、エクソン２からエクソン７が欠失した上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩ（以下、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」と称することがある）タンパク質が過剰発現している。ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質は、リガンド結合部位が欠失しており、リガンド無しで恒常的に活性化している。ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質は、癌組織でしか発現せず、癌の悪性化に関与していると考えられている。【０００４】
前記ＥＧＦＲの変異、又は増幅が関係していると考えられる癌に対する治療薬として、ＥＧＦＲカイネースの阻害物質である、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）などが期待されている。
しかしながら、抗癌剤としての効果は十分とは言えず、より優れた抗癌剤の開発が強く求められており、また、そのような抗癌剤を得ることができるスクリーニング方法の開発も強く求められている。【０００５】
なお、下記構造式（１）で表される化合物（以下、「エルトレディン」（Ｅｒｔｒｅｄｉｎ）と称することがある）は、インビトロで、ｍＤｉａが媒介するアクチンアッセンブリーを阻害することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）が、カイネースの阻害などの生理活性を示すことは知られていない。
【化１】
2016052081.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｕｖｉｎ  ＴＪ１，  Ｆｕｋｕｉ  Ｊ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＪＲ，  Ｈｉｇｇｓ  ＨＮ、  Ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＤｉａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ、  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  ４８（４０）、  ９３２７−９３２９（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、毒性が弱く、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかに対する優れた増殖抑制活性を有する癌細胞増殖抑制剤、優れた抗腫瘍活性を有する抗癌剤、癌細胞増殖抑制剤、及び抗癌剤の少なくともいずれかを効率良くスクリーニングすることができるスクリーニング方法、並びに、前記癌細胞増殖抑制剤、及び前記抗癌剤に好適な新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  癌細胞増殖抑制剤であって、
下記構造式（１）から（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含み、
前記癌細胞が、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
【化２】
2016052081.tif 000003
【化３】
2016052081.tif 000004
【化４】
2016052081.tif 000005
【化５】
2016052081.tif 000006
【化６】
2016052081.tif 000007
【化７】
2016052081.tif 000008
【化８】
2016052081.tif 000009
【化９】
2016052081.tif 000010
＜２＞  前記＜１＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする抗癌剤である。
＜３＞  癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法であって、
接着の足場を有さない環境下で、被験物質を含む培地で上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
接着の足場を有する環境下で、被験物質を含む培地でＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害せず、かつ、前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価する評価工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
＜４＞  癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜２＞に記載の抗癌剤を投与することを特徴とする方法である。
＜５＞  下記構造式（８）で表されることを特徴とする化合物である。
【化１０】
2016052081.tif 000011
＜６＞  前記＜５＞に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、前記目的を達成することができ、毒性が弱く、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかに対する優れた増殖抑制活性を有する癌細胞増殖抑制剤、優れた抗腫瘍活性を有する抗癌剤、癌細胞増殖抑制剤、及び抗癌剤の少なくともいずれかを効率良くスクリーニングすることができるスクリーニング方法、並びに、前記癌細胞増殖抑制剤、及び前記抗癌剤に好適な新規化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、試験例１における細胞の培養結果を示したグラフである。
【図２】図２は、試験例３において、被験物質として構造式（１）で表される化合物を用いた場合の細胞増殖阻害率を示したグラフである。
【図３】図３は、試験例３において、被験物質としてＡＧ１４７８を用いた場合の細胞増殖阻害率を示したグラフである。
【図４−１】図４−１は、試験例４−１の急性毒性試験の結果を示したグラフである。
【図４−２】図４−２は、試験例４−２の急性毒性試験の結果を示したグラフである。
【図４−３】図４−３は、試験例４−３の急性毒性試験の結果を示したグラフである。
【図５−１】図５−１は、試験例５−１における腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。
【図５−２】図５−２は、試験例５−１における腫瘍重量を測定した結果を示すグラフである。
【図５−３】図５−３は、試験例５−１における摘出した腫瘍を撮影した結果を示す図である。
【図５−４】図５−４は、試験例５−１におけるマウスの体重を測定した結果を示すグラフである。
【図６−１】図６−１は、試験例５−２における腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。
【図６−２】図６−２は、試験例５−２における腫瘍重量を測定した結果を示すグラフである。
【図６−３】図６−３は、試験例５−２における摘出した腫瘍を撮影した結果を示す図である。
【図６−４】図６−４は、試験例５−２におけるマウスの体重を測定した結果を示すグラフである。
【図７−１】図７−１は、試験例６−１の急性毒性試験の結果を示したグラフである。
【図７−２】図７−２は、試験例６−２の急性毒性試験の結果を示したグラフである。
【図８−１】図８−１は、試験例７における腫瘍重量を測定した結果を示すグラフである。
【図８−２】図８−２は、試験例７におけるマウスの体重を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（新規化合物）
本発明の化合物は、下記構造式（８）で表される化合物（３−（２−Ａｍｉｎｏ−５−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ）であり、本発明者らが見出した新規化合物である。
【化１１】
2016052081.tif 000012
【００１２】
＜物理化学的性質＞
前記構造式（８）で表される化合物について、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＲＭＳを測定すると、以下のような結果となる。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．６４（２Ｈ，  ｂｒ．  ｓ，  ＮＨ２），  ６．６５，  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝４．０  Ｈｚ，  Ｈ−３’），  ７．２８（１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝４．０，  ４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ７．３０（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−８），  ７．３８（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  １．０  Ｈｚ，  Ｈ−４’），  ７．４９（１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝４．０，  ４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−７），  ７．７９（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−５），  ８．４１（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１．５  Ｈｚ，  Ｈ−６’）  ａｎｄ  １２．５０（１Ｈ，  ｂｓ，  ＮＨ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０．９  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７４．７５  （Ｃ−５’），  １１５．４１  （Ｃ−８），  １１８．６８  （Ｃ−３’），  １２０．０４  （Ｃ−１’），  １２３．０３  （Ｃ−６），  １２８．０９  （Ｃ−５），  １２９．７９  （Ｃ−７），  １３１．３０  （Ｃ−４ａ  ａｎｄ  −８ａ），  １３８．３７  （Ｃ−４’），  １３８．９９  （Ｃ−６’），  １４８．４０  （Ｃ−２’），  １５４．１６  （Ｃ−３）  ａｎｄ  １５５．０６  （Ｃ−２）．
ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ  ３６３．９９４４  （Ｍ＋Ｈ）＋，  Ｃａｌｃｄ．  ３６３．９９４１．
【００１３】
化合物が、前記構造式（８）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、質量分析法、紫外分光法、赤外分光法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法等の分析方法などが挙げられる。なお、前記各分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、化合物が前記構造式（８）で表される構造を有することは容易に同定することが可能である。
【００１４】
前記化合物は、前記構造式（８）で表される化合物の塩であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
前記構造式（８）で表される化合物は、その互変異性体であってもよい。
【００１５】
前記構造式（８）で表される化合物の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造する方法などが挙げられる。
【００１６】
前記構造式（８）で表される化合物は、例えば、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ４１，  １６５０．」を参考にして化学合成することができる。
具体的には、５−ヨードイサチン  ８１．９ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）と１，２−フェニレンジアミン  ３２．４ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）に酢酸  １．５ｍＬを加え、室温で２日間攪拌する。反応後、トルエンによる共沸を行い、得られたオレンジ色の固体を分取薄層クロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比）］により精製し、オレンジ色の固体として構造式（８）で表される化合物を得ることができる。
【００１７】
前記構造式（８）で表される化合物は、優れた癌細胞増殖抑制活性、及び優れた抗腫瘍活性を有し、毒性が弱いため、例えば、後述する本発明の化合物含有組成物、癌細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤などとして好適に利用可能である。
【００１８】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、前記構造式（８）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００１９】
前記化合物含有組成物における前記構造式（８）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記化合物含有組成物は、前記構造式（８）で表される化合物そのものであってもよい。
【００２０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体、前記構造式（１）から（７）で表される化合物の少なくともいずれかなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬理学的に許容され得る担体としては、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。
【００２１】
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２２】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００２３】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００２４】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２５】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２６】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００２７】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００２８】
前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２９】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００３０】
前記化合物含有組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（８）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
＜用途＞
前記化合物含有組成物は、前記構造式（８）で表される化合物を含むため、優れた癌細胞増殖抑制活性、及び優れた抗腫瘍活性を有し、毒性が弱いため、例えば、後述する本発明の、癌細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤などとして好適に利用可能である。
【００３２】
前記化合物含有組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００３３】
（癌細胞増殖抑制剤）
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、少なくとも、下記構造式（１）から（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【化１２】
2016052081.tif 000013
【化１３】
2016052081.tif 000014
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
2016052081.tif 000020
【００３４】
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかの癌細胞の増殖を抑制する。
本発明において、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現しているとは、正常細胞における上皮成長因子受容体の発現量よりも多く発現していることをいう。前記過剰発現の態様としては、遺伝子が過剰発現している態様であってもよいし、タンパク質が過剰発現している態様であってもよいし、両者が過剰発現している態様であってもよい。
【００３５】
前記野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞の具体例としては、神経膠芽腫細胞、頭頸部癌、乳癌、腎癌、子宮頸癌、子宮癌、食道がん、すい臓がん、非小細胞肺がん、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺癌などが挙げられる。
前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の具体例としては、神経膠芽腫細胞、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞、甲状腺癌細胞などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤は、神経膠芽腫細胞の増殖を好適に抑制することができる。
【００３６】
＜構造式（１）から（８）で表される化合物＞
前記構造式（１）から（８）で表される化合物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記構造式（１）から（８）で表される化合物の中でも、前記構造式（１）で表される化合物、構造式（６）で表される化合物、及び構造式（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種が、癌細胞の増殖抑制活性に優れる点で、好ましい。
【００３７】
前記構造式（１）から（８）で表される化合物は、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００３８】
前記構造式（１）から（７）で表される化合物は、公知の化合物である。
前記構造式（１）から（７）で表される化合物は、市販品を使用してもよいし、化学合成したものを使用してもよい。
前記化学合成の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ４１，  １６５０．」に従って合成することができる。
前記構造式（８）で表される化合物は、上記新規化合物の項目に記載の化学合成などにより製造することができる。
【００３９】
前記癌細胞増殖抑制剤における前記構造式（１）から（８）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤は、前記構造式（１）から（８）で表される化合物の少なくとも１種からなるものであってもよい。
【００４０】
＜その他の成分＞
前記癌細胞増殖抑制剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬理学的に許容され得る担体としては、上記化合物含有組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
＜用途＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、後述する抗癌剤の有効成分として好適に用いることができる。
なお、前記癌細胞増殖抑制剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記癌細胞増殖抑制剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
前記癌細胞増殖抑制剤は、癌細胞の増殖を抑制することができるので、本発明は、癌細胞の増殖抑制方法にも関する。
【００４２】
＜剤形＞
前記癌細胞増殖抑制剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の前記癌細胞増殖抑制剤は、常法に従い製造することができる。
【００４３】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００４４】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００４５】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００４６】
＜投与＞
前記癌細胞増殖抑制剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、髄腔内投与法、静脈内投与法、腹腔内投与法などの非経口投与法や経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いることができる。
【００４７】
（抗癌剤）
本発明の抗癌剤は、少なくとも前記癌細胞増殖抑制剤を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４８】
＜癌細胞増殖抑制剤＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、上述した本発明の癌細胞増殖抑制剤である。
前記癌細胞増殖抑制剤は、構造式（１）で表される化合物、構造式（６）で表される化合物、及び構造式（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含むことが、腫瘍増殖抑制活性に優れる点で、好ましい。
【００４９】
前記抗癌剤における前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗癌剤は、前記癌細胞増殖抑制剤からなるものであってもよい。
【００５０】
＜その他の成分＞
前記抗癌剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬理学的に許容され得る担体としては、上記化合物含有組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記抗癌剤中のその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
＜用途＞
前記抗癌剤は、前記構造式（１）から（８）で表される化合物の少なくとも１種を含むため、優れた抗癌作用を有し、また、安全性が高いため、例えば、前記野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌や、前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌の予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。これらの中でも、神経膠芽腫に特に好適に利用可能である。
なお、前記抗癌剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記抗癌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
本発明の抗癌剤は、後述する試験例で示すように、正常細胞の増殖は抑制せず、癌細胞の増殖を特異的に抑制することができる。
【００５２】
前記抗癌剤は、前記構造式（１）から（８）で表される化合物の少なくとも１種を含むので、個体に投与することにより、個体における癌の発生を予防、又は癌を患う個体を治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記抗癌剤を投与することを特徴とする、癌の予防又は治療方法にも関する。
【００５３】
＜剤形＞
前記抗癌剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記癌細胞増殖抑制剤の剤形の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
【００５４】
＜投与＞
前記抗癌剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記癌細胞増殖抑制剤の投与の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００５５】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかをスクリーニングする方法である。
前記スクリーニング方法は、３Ｄ細胞培養工程と、２Ｄ細胞培養工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明のスクリーニング方法によれば、正常細胞の増殖は抑制せず、癌細胞の増殖を特異的に抑制する癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかをスクリーニングすることができる。
【００５６】
＜３Ｄ細胞培養工程＞
前記３Ｄ細胞培養工程は、接着の足場を有さない環境下で、被験物質を含む培地で上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞」と称することがある）を培養する工程である。
前記３Ｄ細胞培養工程では、正常細胞は増殖することができないが、癌細胞は増殖することができる（以下、「足場非依存性増殖能を有する」と称することがある）。そのため、前記３Ｄ細胞培養工程では、被験物質の癌細胞に対する増殖抑制活性の有無を調べることができる。
【００５７】
−接着の足場を有さない環境−
前記接着の足場を有さない環境としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞と接する表面を超低接着表面処理した培養容器を用いる方法、軟寒天培地を用いる方法などが挙げられる。
前記細胞と接する表面を超低接着表面処理した培養容器の具体例としては、超低接着表面９６ウェルプレート（型番  ３４７４、コーニング社製）、超低接着表面１００ｍｍディッシュ（型番  ３２６２、コーニング社製）などが挙げられる。
【００５８】
−その他の培養条件−
その他の培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養するなどが挙げられる。
前記３Ｄ細胞培養工程の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日間〜１０日間が好ましく、２日間〜４日間がより好ましい。
【００５９】
−被験物質−
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物、該化合物の誘導体、植物抽出物、タンパク質などが挙げられる。
前記被験物質の培地への添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０．００００１μＭ〜１００μＭなどが挙げられる。
【００６０】
−培地−
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）などが挙げられる。
【００６１】
−ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞−
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、エクソン２からエクソン７が欠失した上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現する細胞であり、例えば、「Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、  ８１、  ７７３−７７９、１９９０」に従って調製することができる。
【００６２】
播種する細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９６ウェルプレートを用いる場合には、１ウェルあたり５，０００個〜２５，０００個とするなどが挙げられる。
【００６３】
前記３Ｄ細胞培養工程と、後述する２Ｄ細胞培養工程の順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記３Ｄ細胞培養工程を先に行ってもよいし、前記２Ｄ細胞培養工程を先に行ってもよいし、両者を同時に行ってもよい。
【００６４】
＜２Ｄ細胞培養工程＞
前記２Ｄ細胞培養工程は、接着の足場を有する環境下で、被験物質を含む培地でＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程である。
前記２Ｄ細胞培養工程では、正常細胞が増殖することができる。そのため、前記２Ｄ細胞培養工程では、被験物質の正常細胞に対する増殖抑制活性の有無を調べることができる。
【００６５】
−接着の足場を有する環境−
前記接着の足場を有する環境としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞と接する表面を接着化処理した培養容器を用いる方法などが挙げられる。
前記細胞と接する表面を接着化処理した培養容器の具体例としては、細胞培養表面処理済み９６ウェルプレート（型番  ３５８５、コーニング社製）などが挙げられる。
【００６６】
−その他の培養条件−
その他の培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、例えば、上記３Ｄ細胞培養工程のその他の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００６７】
−被験物質−
前記被験物質、及び該被験物質の培地への添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記３Ｄ細胞培養工程の被験物質の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００６８】
−培地−
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記３Ｄ細胞培養工程の培地の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００６９】
−ＮＩＨ３Ｔ３細胞−
前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、マウスの胎児皮膚から分離された培養細胞であり、正常細胞の性質と、癌細胞のように無限に分裂する性質とを有する細胞である。
前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
【００７０】
播種する細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９６ウェルプレートを用いる場合には、１ウェルあたり１，０００個〜３，０００個とするなどが挙げられる。
【００７１】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記２Ｄ細胞培養工程におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害せず、かつ、前記３Ｄ細胞培養工程における上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価する工程である。
【００７２】
前記各細胞培養工程において、細胞の増殖を阻害したか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記各細胞培養工程後の生細胞数を測定し、細胞増殖阻害率を算出し、ＩＣ５０の値から判断することができる。具体的には、例えば、前記ＩＣ５０が１０μＭ未満の場合に、前記被験物質により、細胞の増殖が阻害されたと判断することができ、また、前記ＩＣ５０が１０μＭを超える場合には、前記被験物質により、細胞の増殖が阻害されなかったと判断することができる。
【００７３】
前記生細胞数の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、生細胞のＡＴＰ量を定量化するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）などが挙げられる。
【００７４】
前記評価工程では、前記３Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が１μＭ未満であり、前記２Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が１０μＭ超の被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価することが好ましく、前記３Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が０．５μＭ未満であり、前記２Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が１０μＭ超の被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価することがより好ましく、前記３Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が０．１μＭ未満であり、前記２Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が１０μＭ超の被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価することが更に好ましく、前記３Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が０．０５μＭ未満であり、前記２Ｄ細胞培養工程におけるＩＣ５０が１０μＭ超の被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価することが特に好ましい。
【００７５】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記３Ｄ細胞培養工程に用いる上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を調製する工程、前記２Ｄ細胞培養工程に用いるＮＩＨ３Ｔ３細胞を調製する工程などが挙げられる。
前記各細胞を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の培養方法を適宜選択することができる。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法によれば、後述する試験例に示すように、上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞のみならず、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞に対する増殖抑制活性を有する被験物質をスクリーニングすることができる。
前記野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞をスクリーニングに用いる場合には、上皮成長因子受容体のリガンドである上皮成長因子を培地に添加しなければならないが、本発明のスクリーニング方法によれば、前記リガンドの添加が不要であり、効率的に癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有する被験物質をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００７７】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。【００７８】
（試験例１：スクリーニング系の検討）
接着の足場を有さない環境下における以下の各細胞の増殖を調べた。
＜細胞＞
（１）上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩ遺伝子を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、「Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、  ８１、  ７７３−７７９、１９９０」に従って調製した。
（２）野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現する細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞」と称することがある。）
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞は、「Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、  ８１、  ７７３−７７９、１９９０」に従って調製した。
（３）マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより入手。以下、「ＮＩＨ３Ｔ３細胞」と称することがある。）【００７９】
＜培養＞
前記各細胞の培養は、以下のようにして行った。
超低接着表面９６ウェルプレート（型番  ３４７４、コーニング社製）に、前記細胞を１０，０００細胞／ウェルで播き、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。前記培養では、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地を用いた。
なお、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞の培養では、上皮成長因子を５０ｎｇ／ｍＬ含有する培地を用いた培養と、前記上皮成長因子を含有しない培地を用いた培養とを行った。【００８０】
培養開始から、３日間後、４日間後、５日間後、６日間後、７日間後の生細胞数は、生細胞のＡＴＰ量を定量化するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。結果を図１に示す。【００８１】
図１中、「○」は、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の培養結果を示し、「●」は、ＥＧＦ含有培地で培養した前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞の培養結果を示し、「△」は、ＥＧＦ不含有培地で培養した前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞の培養結果を示し、「□」は、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養結果を示す。
図１では、９６ウェルプレートへの播種時の細胞数を１００％として、各測定時における細胞数比率割合を示した。
図１の結果から、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びＥＧＦ不含有培地で培養した前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞は、細胞数が減少したが、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、及びＥＧＦ含有培地で培養した前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞は、生育し増殖することが確認された。【００８２】
（試験例２：スクリーニング）
被験物質として以下の各化合物を用い、スクリーニングを行った。なお、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、及びエルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）は、ＥＧＦＲキナーゼの阻害物質として知られている。【００８３】
＜化合物＞
・  構造式（１）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、岩井化学薬品株式会社製、又は、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ４１，  １６５０．」に従って合成した。）
【化２０】
2016052081.tif 000021
【００８４】
・  構造式（２）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−７−ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｏｎｅ、Ｅｎａｍｉｎｅ社製）
【化２１】
2016052081.tif 000022
【００８５】
・  構造式（３）で表される化合物（Ｎ−［４−ｂｒｏｍｏ−２−（３−ｏｘｏ（４−ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｙｌ））ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
【化２２】
2016052081.tif 000023
【００８６】
・  構造式（４）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｏｎｅ、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社製）
【化２３】
2016052081.tif 000024
【００８７】
・  構造式（５）で表される化合物（４−｛Ｎ−［４−ｂｒｏｍｏ−２−（３−ｏｘｏ（４−ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｙｌ））ｐｈｅｎｙｌ］ｃａｒｂａｍｏｙｌ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
【化２４】
2016052081.tif 000025
【００８８】
・  構造式（６）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｏｎｅ、Ｕ．Ｏ．Ｓ．社製）
【化２５】
2016052081.tif 000026
【００８９】
・  構造式（７）で表される化合物（３−（２−Ａｍｉｎｏ−５−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ４１，  １６５０．」に従って合成した。）
【化２６】
2016052081.tif 000027
【００９０】
・  構造式（８）で表される化合物（３−（２−Ａｍｉｎｏ−５−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ）
【化２７】
2016052081.tif 000028
【００９１】
前記構造式（８）で表される化合物は、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ４１，  １６５０．」を参考に、以下のようにして合成した。
５−ヨードイサチン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）  ８１．９ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）と１，２−フェニレンジアミン（東京化成工業社製）  ３２．４ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）に酢酸  １．５ｍＬを加え、室温で２日間攪拌した。反応後、トルエンによる共沸を行い、得られたオレンジ色の固体を分取薄層クロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比）］により精製し、オレンジ色の固体として構造式（８）で表される化合物（１８．４ｍｇ、収率  １６．９％）を得た。
得られた化合物について、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＲＭＳ測定を行った結果、以下のような結果となり、前記化合物が構造式（８）で表される構造を有していることが確認された。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．６４（２Ｈ，  ｂｒ．  ｓ，  ＮＨ２），  ６．６５，  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝４．０  Ｈｚ，  Ｈ−３’），  ７．２８（１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝４．０，  ４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ７．３０（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−８），  ７．３８（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  １．０  Ｈｚ，  Ｈ−４’），  ７．４９（１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝４．０，  ４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−７），  ７．７９（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０  ａｎｄ  ０．５  Ｈｚ，  Ｈ−５），  ８．４１（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１．５  Ｈｚ，  Ｈ−６’）  ａｎｄ  １２．５０（１Ｈ，  ｂｓ，  ＮＨ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０．９  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７４．７５  （Ｃ−５’），  １１５．４１  （Ｃ−８），  １１８．６８  （Ｃ−３’），  １２０．０４  （Ｃ−１’），  １２３．０３  （Ｃ−６），  １２８．０９  （Ｃ−５），  １２９．７９  （Ｃ−７），  １３１．３０  （Ｃ−４ａ  ａｎｄ  −８ａ），  １３８．３７  （Ｃ−４’），  １３８．９９  （Ｃ−６’），  １４８．４０  （Ｃ−２’），  １５４．１６  （Ｃ−３）  ａｎｄ  １５５．０６  （Ｃ−２）．
ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ  ３６３．９９４４  （Ｍ＋Ｈ）＋，  Ｃａｌｃｄ．  ３６３．９９４１．【００９２】
・  構造式（９）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬｉｂｒａｒｉｅｓ製）
【化２８】
2016052081.tif 000029
【００９３】
・  構造式（１０）で表される化合物（３−［５−ｂｒｏｍｏ−２−（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬｉｂｒａｒｉｅｓ製）
【化２９】
2016052081.tif 000030
【００９４】
・  構造式（１１）で表される化合物（３−［２−（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬｉｂｒａｒｉｅｓ製）
【化３０】
2016052081.tif 000031
【００９５】
・  構造式（１２）で表される化合物（３−｛２−［（４−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ｝−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬｉｂｒａｒｉｅｓ製）
【化３１】
2016052081.tif 000032
【００９６】
・  構造式（１３）で表される化合物（３−（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１−ｍｅｔｈｙｌ−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬｉｂｒａｒｉｅｓ製）
【化３２】
2016052081.tif 000033
【００９７】
・  構造式（１４）で表される化合物（ｅｔｈｙｌ  ２−［３−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｏｘｏｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ］ａｃｅｔａｔｅ、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社製）
【化３３】
2016052081.tif 000034
【００９８】
・  構造式（１５）で表される化合物（Ｎ−［４−ｂｒｏｍｏ−２−（３−ｏｘｏ（４−ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−２−ｙｌ））ｐｈｅｎｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
【化３４】
2016052081.tif 000035
【００９９】
・  ＡＧ１４７８（ワコー社製）
【化３５】
2016052081.tif 000036
・  ゲフィチニブ（アストラゼネカ社製）
【化３６】
2016052081.tif 000037
・  エルロチニブ（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ社製）
【化３７】
2016052081.tif 000038
【０１００】
＜３Ｄ細胞培養工程＞
２×１０４個／１００μＬの前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、超低接着面９６ウェルプレート（型番  ３４７４、コーニング社製）に、１ウェルあたり１００μＬ播種し、所定の濃度の被験物質を添加し、３日間、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
なお、陰性コントロールとして、２×１０４個／１００μＬの前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞を同一プレートに、１ウェルあたり１００μＬ播種し、被験物質を添加せずに、３日間、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
なお、前記培養の培地は、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地を用いた。【０１０１】
−細胞増殖阻害率の測定−
３日間培養後、生細胞のＡＴＰ量を定量化するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、生細胞数を測定し、以下の（式１）から、３Ｄ細胞培養工程における細胞増殖阻害率を算出した。表１にＩＣ５０の値を示す。
細胞増殖阻害率（％）＝［１−｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝］×１００  ・・・（式１）
（式１）中、Ａは、被験物質を添加した場合のＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の生細胞数を示し、Ｂは、被験物質を添加しなかった場合のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生細胞数を示し、Ｃは、被験物質を添加しなかった場合のＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の生細胞数を示す。【０１０２】
＜２Ｄ細胞培養工程＞
２×１０３個／１００μＬの前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、細胞培養表面処理済み９６ウェルプレート（型番  ３５８５、コーニング社製）に、１ウェルあたり１００μＬ播種し、所定濃度の被験物質を添加し、３日間、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
なお、陰性コントロールとして、２×１０３個／１００μＬの前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞を同一プレートに、１ウェルあたり１００μＬ播種し、被験物質を添加せずに、３日間、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
なお、前記培養の培地は、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地を用いた。【０１０３】
−細胞増殖阻害率の測定−
３日間培養後、生細胞のＡＴＰ量を定量化するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、生細胞数を測定し、以下の（式２）から、２Ｄ細胞培養工程における細胞増殖阻害率を算出した。表１にＩＣ５０の値を示す。
細胞増殖阻害率（％）＝（１−Ｄ／Ｅ）×１００  ・・・（式２）
（式２）中、Ｄは、被験物質を添加した場合のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生細胞数を示し、Ｅは、被験物質を添加しなかった場合のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生細胞数を示す。【０１０４】
【表１】
2016052081.tif 000039
【０１０５】
＜評価工程＞
前記表１の結果から、ＥＧＦＲキナーゼの阻害物質として知られている、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、及びエルロチニブは、２Ｄ細胞培養工程における細胞の増殖を阻害しない濃度で、３Ｄ細胞培養工程における前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害することが確認され、本スクリーニング系が有効であることが示された。
また、前記構造式（１）から（８）で表される化合物が、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害せず、かつ、前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害することができることがわかった。前記構造式（１）から（８）で表される化合物の中でも、前記構造式（１）、（６）、及び（８）で表される化合物が、特に優れており、前記ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、及びエルロチニブと比較しても顕著な細胞増殖抑制効果を示した。【０１０６】
また、前記構造式（１）で表される化合物におけるフェニル環上の５位のハロゲン原子が活性発現に重要であり、２位のアミノ基のアルキル化は好ましくないことが示唆された。【０１０７】
なお、前記構造式（１）で表される化合物は、前記３Ｄ細胞培養工程における前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞に代え、培地にＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）含有させた以外は同様にして３Ｄ細胞培養工程を行った場合にも、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞の増殖を阻害した。【０１０８】
（試験例３：ＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子非発現細胞に対する増殖阻害）
前記構造式（１）で表される化合物、及びＡＧ１４７８について、接着の足場を有さない環境下におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子非発現細胞の増殖を阻害するかを調べた。
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子非発現細胞として、以下の３種類の脳腫瘍細胞を用いた。
・  Ｕ２５１細胞（ＡＴＣＣより入手）
・  Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣより入手）
・  ＫＳ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）【０１０９】
＜３Ｄ細胞培養工程＞
細胞として、前記脳腫瘍細胞を用い、被験物質として、前記構造式（１）で表される化合物、又はＡＧ１４７８を用いた以外は、前記試験例２と同様にして、３Ｄ細胞培養工程を行った。
なお、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞（ＥＧＦ含有培地で培養）、及び前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞についても同様にして試験した。【０１１０】
−細胞増殖阻害率の測定−
３日間培養後、生細胞のＡＴＰ量を定量化するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、生細胞数を測定し、以下の（式３）から、３Ｄ細胞培養工程における細胞増殖阻害率を算出した。結果を図２、及び図３に示す。
細胞増殖阻害率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００  ・・・（式３）
（式３）中、Ｘは、被験物質を添加した場合の生細胞数を示し、Ｙは、被験物質を添加しなかった場合の生細胞数を示す。【０１１１】
図２は、被験物質として構造式（１）で表される化合物を用いた場合の細胞増殖阻害率を示したグラフであり、図３は、被験物質としてＡＧ１４７８を用いた場合の細胞増殖阻害率を示したグラフである。
図２及び図３中、「○、実線」は、Ｕ２５１細胞の結果を示し、「△、実線」は、Ｕ８７ＭＧ細胞の結果を示し、「□、実線」は、ＫＳ−１細胞の結果を示し、「●、実線」は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞の結果を示し、「■、実線」は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結果を示す。
図２及び図３の結果から、構造式（１）で表される化合物は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞、及びＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞において、足場非依存性増殖能に対する抑制活性を示したが、Ｕ２５１細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、及びＫＳ−１細胞において、足場非依存性増殖能に対する抑制活性を示さなかった。また、ＡＧ１４７８も同様であった。したがって、構造式（１）で表される化合物は、ＡＧ１４７８と同様に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、又は野生型ＥＧＦＲ依存性の足場非依存性増殖を抑制する可能性が示された。【０１１２】
（試験例４：急性毒性試験）
＜試験例４−１：腹腔内投与＞
４週齢の雌ＩＣＲマウスに、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水で溶解した各濃度の構造式（１）で表される化合物を１回、腹腔内投与し、その後、２週間の体重変化を観察した。結果を図４−１に示した。
図４−１中、「●、実線」は、構造式（１）で表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▲、実線」は、構造式（１）で表される化合物を２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「■、実線」は、構造式（１）で表される化合物を１２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◆、実線」は、構造式（１）で表される化合物を６．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▼、実線」は、構造式（１）で表される化合物を３．１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、点線」は、構造式（１）で表される化合物を１．５６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「△、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．７８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「□、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．３９ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．１９５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▽、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．０９８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示す。なお、「○、実線」は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を腹腔内投与した場合の結果を示す。【０１１３】
また、各濃度の構造式（１）で表される化合物を腹腔内投与した２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表２−１に示した。【０１１４】
【表２−１】
2016052081.tif 000040
表２−１中、Ａは、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を投与した場合の結果を示す。【０１１５】
＜試験例４−２：経口投与＞
４週齢の雌ＩＣＲマウスに、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水で溶解した各濃度の構造式（１）で表される化合物を１回、経口投与し、その後、２週間の体重変化を観察した。結果を図４−２に示した。
図４−２中、「●、実線」は、構造式（１）で表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▲、実線」は、構造式（１）で表される化合物を２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「■、実線」は、構造式（１）で表される化合物を１２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◆、実線」は、構造式（１）で表される化合物を６．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▼、実線」は、構造式（１）で表される化合物を３．１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、点線」は、構造式（１）で表される化合物を１．５６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「△、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．７８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「□、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．３９ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．１９５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▽、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．０９８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示す。なお、「○、実線」は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を経口投与した場合の結果を示す。【０１１６】
また、各濃度の構造式（１）で表される化合物を経口投与した２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表２−２に示した。【０１１７】
【表２−２】
2016052081.tif 000041
表２−２中、Ａは、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を投与した場合の結果を示す。【０１１８】
＜試験例４−３：尾静脈投与＞
４週齢の雌ＩＣＲマウスに、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水で溶解した各濃度の構造式（１）で表される化合物を１回、尾静脈投与し、その後、２週間の体重変化を観察した。結果を図４−３に示した。
図４−３中、「●、実線」は、構造式（１）で表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▲、実線」は、構造式（１）で表される化合物を２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「■、実線」は、構造式（１）で表される化合物を１２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◆、実線」は、構造式（１）で表される化合物を６．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▼、実線」は、構造式（１）で表される化合物を３．１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、点線」は、構造式（１）で表される化合物を１．５６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「△、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．７８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「□、点線」は、構造式（１）で表される化合物を０．３９ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．１９５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▽、実線」は、構造式（１）で表される化合物を０．０９８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示す。なお、「○、実線」は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を尾静脈投与した場合の結果を示す。【０１１９】
また、各濃度の構造式（１）で表される化合物を尾静脈投与した２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表２−３に示した。【０１２０】
【表２−３】
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表２−３中、Ａは、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を投与した場合の結果を示す。【０１２１】
試験例４−１〜４−３の結果、前記構造式（１）で表される化合物は、溶解性が悪く、尾静脈投与の場合に１２．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で血管が詰まって直死したが、それを除けば顕著な毒性は、見当たらなかった。【０１２２】
（試験例５：抗腫瘍効果）
＜試験例５−１：ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を移植した腫瘍＞
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、１×１０５個／１００μＬになるように、ＤＭＥＭ培地を含む６２．５体積％のマトリゲル（ベックトン・デイッキンソン社製）で調製した。前記調製物を８週齢のＢａｌｂ／ｃ  Ｎｕｄｅマウスの皮下に移植した。【０１２３】
前記移植１日間後より１７日目まで、前記構造式（１）で表される化合物を１日１回腹腔内に投与した。前記構造式（１）で表される化合物は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水に溶解させ、１回の投与量が３０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。
また、比較対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として、前記移植１日間後より１７日目まで、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を１日１回腹腔内に投与した。
また、ポジティブコントロールとして、ＥＧＦＲキナーゼ阻害物質であり、既存の癌治療薬であるゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を、前記移植１日間後より１７日目まで、１日１回経口投与した。前記ゲフィチニブは、１回の投与量が１００ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。【０１２４】
なお、実験に用いたマウスの数は、前記比較対照群は１群６匹とし、前記構造式（１）で表される化合物を投与した群は１群５匹とし、前記ポジティブコントロール群は１群５匹とした。【０１２５】
＜評価＞
前記構造式（１）で表される化合物の腫瘍抑制効果の評価は、前記細胞移植後の腫瘍の増殖状況を観察して行った。
−腫瘍体積−
前記細胞移植後、経時的に腫瘍の長径と短径とをノギスで計測し、下記（式４）より腫瘍体積を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図５−１に示す。
腫瘍体積＝長径×短径２÷２  ・・・（式４）
−腫瘍重量−
前記細胞移植の１７日間後にマウスから腫瘍を摘出し、重量を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図５−２に示す。また、摘出した前記腫瘍を撮影したものを図５−３に示す。【０１２６】
−体重変化−
前記細胞移植後のマウスの体重を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図５−４に示す。【０１２７】
図５−１及び図５−４中、「●」は、比較対照群の結果を示し、「□」は、構造式（１）で表される化合物を投与した群の結果を示し、「△」は、ポジティブコントロール群の結果を示す。
図５−２では、左から順に、比較対照群、構造式（１）で表される化合物を投与した群、ポジティブコントロール群の結果を示す。なお、「＊」は、ｔ＜０．０５を表す。また、図５−２中の阻害率（腫瘍重量の増加阻害率）（％）は、比較対照群の阻害率を０％として算出した結果を示す。
図５−３中、上段は、比較対照群の結果を示し、中段は、構造式（１）で表される化合物を投与した群の結果を示し、下段は、ポジティブコントロール群の結果を示す。【０１２８】
図５−１の結果から、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、移植後、顕著な造腫瘍性を示すことがわかった（図５−１の（Ｖｅｈｉｃｌｅ））。
また、図５−１〜図５−３の結果から、前記構造式（１）で表される化合物は、腫瘍の増殖抑制活性を示した。また、ゲフィチニブも腫瘍の増殖抑制活性を示した。腫瘍の重量は、構造式（１）で表される化合物を投与した群、及びポジティブコントロール群は、いずれも比較対照群と比較すると有意差が見られた（ｔ＜０．０５）。前記構造式（１）で表される化合物の腫瘍の増殖抑制活性と、前記ゲフィチニブの腫瘍の増殖抑制活性とは、同程度であった。
一方、図５−４の結果から、前記構造式（１）で表される化合物を投与した群では、前記投与により体重減少は見られず、構造式（１）で表される化合物の毒性は、観察されなかった。【０１２９】
＜試験例５−２：ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞を移植した腫瘍＞
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞を、１×１０６個／１００μＬになるように、ＤＭＥＭ培地を含む６２．５体積％のマトリゲル（ベックトン・デイッキンソン社製）で調製した。前記調製物を７週齢のＢａｌｂ／ｃ  Ｎｕｄｅマウスの皮下に移植した。【０１３０】
前記移植１日間後より１７日目まで、前記構造式（１）で表される化合物を毎日１回腹腔内に連続投与した。前記構造式（１）で表される化合物は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水に溶解させ、１回の投与量が３０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。
また、比較対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として、前記移植１日間後より１７日目まで、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を１日１回腹腔内に投与した。
また、ポジティブコントロールとして、ＥＧＦＲカイネース阻害物質であり、既存の癌治療薬であるゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を、前記移植１日間後より１７日目まで、１日１回経口投与した。前記ゲフィチニブは、１回の投与量が２００ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。【０１３１】
なお、実験に用いたマウスの数は、前記比較対照群は１群５匹とし、前記構造式（１）で表される化合物を投与した群は１群４匹とし、前記ポジティブコントロール群は１群３匹とした。【０１３２】
＜評価＞
前記構造式（１）で表される化合物の腫瘍抑制効果の評価は、前記細胞移植後の腫瘍の増殖状況を観察して行った。
−腫瘍体積−
前記試験例５−１と同様にして、腫瘍体積を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図６−１に示す。
−腫瘍重量−
前記試験例５−１において、前記細胞移植の１７日間後にマウスから腫瘍を摘出していた点を、前記細胞移植の１８日間後にマウスから腫瘍を摘出した以外は、前記試験例５−１と同様にして重量を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図６−２に示す。また、摘出した前記腫瘍を撮影したものを図６−３に示す。【０１３３】
−体重変化−
前記試験例５−１と同様にして、体重を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図６−４に示す。【０１３４】
図６−１及び図６−４中、「●」は、比較対照群の結果を示し、「□」は、構造式（１）で表される化合物を投与した群の結果を示し、「△」は、ポジティブコントロール群の結果を示す。
図６−２では、左から順に、比較対照群、構造式（１）で表される化合物を投与した群、ポジティブコントロール群の結果を示す。なお、「＊」は、ｔ＜０．０５を表す。また、図６−２中の阻害率（腫瘍重量の増加阻害率）（％）は、比較対照群の阻害率を０％として算出した結果を示す。
図６−３中、上段は、比較対照群の結果を示し、中段は、構造式（１）で表される化合物を投与した群の結果を示し、下段は、ポジティブコントロール群の結果を示す。【０１３５】
図６−１の結果から、前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲＷＴ細胞は、移植後、弱い造腫瘍性を示すことがわかった（図６−１の（Ｖｅｈｉｃｌｅ））。
また、図６−１〜図６−３の結果から、前記構造式（１）で表される化合物は、腫瘍の増殖抑制活性を示した。また、ゲフィチニブも腫瘍の増殖抑制活性を示した。腫瘍の重量は、構造式（１）で表される化合物を投与した群、及びポジティブコントロール群は、いずれも比較対照群と比較すると有意差が見られた（ｔ＜０．０５）。前記構造式（１）で表される化合物の腫瘍の増殖抑制活性と、前記ゲフィチニブの腫瘍の増殖抑制活性とは、同程度であった。
一方、図６−４の結果から、前記構造式（１）で表される化合物を投与した群では、前記投与により体重減少は見られず、構造式（１）で表される化合物の毒性は、観察されなかった。前記ポジティブコントロール群では、ゲフィチニブの投与により体重減少が観られ、ゲフィチニブの毒性が観察された。【０１３６】
前記試験例５の結果から、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物は、上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞を有する腫瘍のみならず、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞を有する腫瘍の増殖をも抑制することができることが示された。【０１３７】
（試験例６：急性毒性試験）
＜試験例６−１：腹腔内投与＞
試験例４−１において、構造式（１）で表される化合物を用いていた点を、構造式（８）で表される化合物に代えた以外は、試験例４−１と同様にして急性毒性試験を行った。結果を図７−１に示した。
図７−１中、「●、実線」は、構造式（８）で表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▲、実線」は、構造式（８）で表される化合物を２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「■、実線」は、構造式（８）で表される化合物を１２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◆、実線」は、構造式（８）で表される化合物を６．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▼、実線」は、構造式（８）で表される化合物を３．１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、実線」は、構造式（８）で表される化合物を１．５６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「△、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．７８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「□、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．３９ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、点線」は、構造式（８）で表される化合物を０．１９５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▽、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．０９８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示す。なお、「○、実線」は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を腹腔内投与した場合の結果を示す。【０１３８】
また、各濃度の構造式（８）で表される化合物を腹腔内投与した２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表３−１に示した。【０１３９】
【表３−１】
2016052081.tif 000043
表３−１中、Ａは、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を投与した場合の結果を示す。【０１４０】
試験例６−１の結果、全ての投与量で特に異常は見られなかった。なお、解剖所見では、投与量によって、若干、肝臓が軽いもの、脾臓が軽い又は重いものが見られたが、それ以外は、特に異常は見られなかった。【０１４１】
＜試験例６−２：経口投与＞
試験例４−２において、構造式（１）で表される化合物を用いていた点を、構造式（８）で表される化合物に代えた以外は、試験例４−２と同様にして急性毒性試験を行った。結果を図７−２に示した。
図７−２中、「●、実線」は、構造式（８）で表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▲、実線」は、構造式（８）で表される化合物を２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「■、実線」は、構造式（８）で表される化合物を１２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◆、実線」は、構造式（８）で表される化合物を６．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▼、実線」は、構造式（８）で表される化合物を３．１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、実線」は、構造式（８）で表される化合物を１．５６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「△、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．７８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「□、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．３９ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「◇、点線」は、構造式（８）で表される化合物を０．１９５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示し、「▽、実線」は、構造式（８）で表される化合物を０．０９８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果を示す。なお、「○、実線」は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を経口投与した場合の結果を示す。【０１４２】
また、各濃度の構造式（８）で表される化合物を経口投与した２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表３−２に示した。【０１４３】
【表３−２】
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表３−２中、Ａは、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を投与した場合の結果を示す。【０１４４】
試験例６−２の結果、全ての投与量で特に異常は見られなかった。なお、解剖所見では、投与量によって、若干、肝臓が軽いもの、脾臓が重いものが見られたが、それ以外は、特に異常は見られなかった。【０１４５】
（試験例７：抗腫瘍効果）
＜ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を移植した腫瘍＞
前記ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、１×１０５個／１００μＬになるように、ＤＭＥＭ培地を含む６２．５体積％のマトリゲル（ベックトン・デイッキンソン社製）で調製した。前記調製物を８週齢のＢａｌｂ／ｃ  Ｎｕｄｅマウスの皮下に移植した。【０１４６】
前記移植１日間後より１７日目まで、前記構造式（８）で表される化合物を１日１回腹腔内に投与した。前記構造式（８）で表される化合物は、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水に溶解させ、１回の投与量が３０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。
また、比較対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として、前記移植１日間後より１７日目まで、１０質量％  ＤＭＳＯと、１質量％  Ｔｗｅｅｎ８０とを含む生理食塩水を１日１回腹腔内に投与した。
また、ポジティブコントロールとして、ＥＧＦＲキナーゼ阻害物質であり、既存の癌治療薬であるゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を、前記移植１日間後より１７日目まで、１日１回経口投与した。前記ゲフィチニブは、１回の投与量が１００ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。【０１４７】
なお、実験に用いたマウスの数は、前記比較対照群は１群８匹とし、前記構造式（８）で表される化合物を投与した群は１群５匹とし、前記ポジティブコントロール群は１群５匹とした。【０１４８】
＜評価＞
前記構造式（８）で表される化合物の腫瘍抑制効果の評価は、前記細胞移植後の腫瘍の増殖状況を観察して行った。
−腫瘍重量−
前記細胞移植の１７日間後にマウスから腫瘍を摘出し、重量を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図８−１に示す。【０１４９】
−体重変化−
前記細胞移植後のマウスの体重を測定し、その平均及び標準誤差を求めた。結果を図８−２に示す。【０１５０】
図８−１では、左から順に、比較対照群、構造式（８）で表される化合物を投与した群、ポジティブコントロール群の結果を示す。なお、「＊」は、ｔ＜０．０５を表す。また、図８−１中の阻害率（腫瘍重量の増加阻害率）（％）は、比較対照群の阻害率を０％として算出した結果を示す。
図８−２中、「●」は、比較対照群の結果を示し、「□」は、構造式（８）で表される化合物を投与した群の結果を示し、「△」は、ポジティブコントロール群の結果を示す。【０１５１】
また、図８−１の結果から、前記構造式（８）で表される化合物は、腫瘍の増殖抑制活性を示した。腫瘍の重量は、構造式（８）で表される化合物を投与した群、及びポジティブコントロール群は、いずれも比較対照群と比較すると有意差が見られた（ｔ＜０．０５）。前記構造式（８）で表される化合物の腫瘍の増殖抑制活性と、前記ゲフィチニブの腫瘍の増殖抑制活性とは、同程度であった。
一方、図８−２の結果から、前記構造式（８）で表される化合物を投与した群では、前記投与により体重減少は見られず、構造式（８）で表される化合物の毒性は、観察されなかった。【０１５２】
前記試験例７の結果からも、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物は、上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞を有する腫瘍の増殖を抑制することができることが示された。【０１５３】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  癌細胞増殖抑制剤であって、
下記構造式（１）から（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含み、
前記癌細胞が、野生型の上皮成長因子受容体を過剰発現している癌細胞、及び上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現している癌細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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＜２＞  構造式（１）で表される化合物、構造式（６）で表される化合物、及び構造式（８）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含む前記＜１＞に記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする抗癌剤である。
＜４＞  癌が、神経膠芽腫である前記＜３＞に記載の抗癌剤である。
＜５＞  癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法であって、
接着の足場を有さない環境下で、被験物質を含む培地で上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
接着の足場を有する環境下で、被験物質を含む培地でＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養する工程と、
前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害せず、かつ、前記上皮成長因子受容体変異体ｖＩＩＩを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する被験物質を癌細胞増殖抑制剤及び抗癌剤の少なくともいずれかとしての活性を有すると評価する評価工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
＜６＞  癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の抗癌剤を投与することを特徴とする方法である。
＜７＞  下記構造式（８）で表されることを特徴とする化合物である。
【化４６】
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＜８＞  前記＜７＞に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【国際調査報告】
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