(57)【要約】  涙液の分泌能低下を抑制し、さらに涙腺組織における活性酸素の生成を抑制する新規な成分のドライアイ予防・治療剤を提供する    本発明のドライアイ予防・治療剤は、マキベリー抽出物を有効成分として含有する。また、本発明のドライアイ予防・治療剤は、マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する。更に、本発明のドライアイ予防・治療剤は、Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種、望ましくは、Delphinidin-3,5-diglucosideを有効成分として含有する。
2014098092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マキベリー抽出物を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
【請求項２】
マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
【請求項３】
Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
【請求項４】
Delphinidin-3,5-diglucosideを有効成分として含有するドライアイ予防・治療剤。
【請求項５】
Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
【請求項６】
マキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項７】
マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項８】
Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideを有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項９】
Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項１０】
マキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１１】
マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１２】
Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１３】
Delphinidin-3,5-diglucosideを有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１４】
Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、涙液分泌を増加させるための眼用組成物、さらに詳しくは眼への過度な負荷により涙腺の機能が低下し、分泌量の減少した涙液を増加させるための眼用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
涙液は、眼球の最外層を覆う厚さ約７μｍの薄い液層である。涙液は、表層から、油層・水層・ムチン層の３層構造を有しており、これらの各層が互いに影響し、涙液の構造を整えている。また、これらの涙液の各層には、例えば、ラクトフェリン、リゾチーム、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびアルブミン等のタンパク質、ワックス、コレステロール、糖質、ムチン等の種々の成分が含有されている。これらの成分を含有する涙液の機能としては、眼表面の環境を湿潤に保つとともに、外界から侵入する病原体等からの感染防御、多数の生理活性物質の供給および無血管組織である角膜への酸素供給等が挙げられる。【０００３】
このように、涙液は様々な機能を有しているが、例えば、涙液の分泌に異常が起こり、その量的・質的変化によって、涙液の蒸発量が増加した場合等には、涙液の機能が正常に機能しなくなることがある。こうした涙液異常が生じた場合、自覚症状として眼の乾燥等のドライアイ症状を訴える症例が多い。
このドライアイ症状が引き起こされる原因は様々なものが報告されているが、近年注目されているものの一つとして、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）のディスプレイ画面(ＶＤＴ)を見ながら行う作業(ＶＤＴ作業)による眼への負荷がある。【０００４】
近年、ＩＴ技術の向上と基盤整備の充実に伴って、日常生活の中でＰＣを使用する機会が飛躍的に増加した。Ｉｎｔｅｌ社が概算したところ、世界には約１０億台のインターネットに接続したＰＣがあると言われており、今やオフィスワーカーのほとんどがＶＤＴを見ながら仕事を行っている。このＰＣの使用頻度の増加に伴い、ＶＤＴ作業が原因と考えられる視覚障害を伴った眼精疲労やドライアイ症状を訴える人の増加が確認されており、先進工業国では重大な健康問題として取り上げられ始めている。ドライアイ症状は、ＶＤＴ作業によって瞬き回数が通常の４分の１程度に減り、涙液の蒸発量が増えることが一因と考えられているが、本発明者らはＶＤＴ作業のような目への過度な負荷によって涙腺機能が低下し、涙液の分泌量が減少していることを新たに見出した。
また、この眼への負荷は酸化ストレスであることが疑われており、２００７年の中村らの報告（非特許文献１）によると、ＶＤＴ作業によって引き起こされる角膜上皮障害は酸化ストレスによるものであることが示されている。【０００５】
現在、このような眼精疲労や眼の乾燥等の不快症状を緩和する方法として、人工涙液を点眼することにより不足した涙液を外部から補充する方法や、涙点を閉鎖する方法等が知られている。しかしながら、いずれの方法も一時的な対症療法に過ぎないものであり、満足のいくものではない。それゆえ、このような対症療法ではなく、減少した涙液の分泌量を増加させることによって、眼の乾燥、異物感、眼の不快感、眼の疲れ等の症状を根本的に改善する方法や、上述した効果のある組成物が求められている。【０００６】
更に、ドライアイは、涙腺組織における活性酸素が関与し、ドライアイを予防、治療するために涙腺組織における活性酸素の生成を抑制する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｐｒｉｌ ２００７， Ｖｏｌ．４８， Ｎｏ．４， ｐ１５５２−１５５８「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｂｌｉｎｋ−Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｄｒｙ Ｅｙｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような、背景の下、本発明者らは、マキベリー（Maquiberry）の抽出物が涙液の分泌能低下を抑制し、さらに涙腺組織における活性酸素の生成を抑制すること知見した。そして、マキベリーの抽出物に多く含まれるデルフィニジン（Delphinidin）の配糖体が上記生理活性に重要な役割を果たすことを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の目的は、マキベリー抽出物、若しくはデルフィニジン（Delphinidin）配糖体により、涙液の分泌能低下を抑制し、さらに涙腺組織における活性酸素の生成を抑制する新規な成分のドライアイ予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の特徴は以下の通りである。
１．マキベリー抽出物を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
２．マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
３．Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
４．Delphinidin-3,5-diglucosideを有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
５．Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、ドライアイ予防・治療剤。
６．マキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
７．マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
８．Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideを有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
９．Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙液分泌能低下抑制剤。
１０．マキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
１１．マキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
１２．Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
１３．Delphinidin-3,5-diglucosideを有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
１４．Delphinidin-3,5-diglucosideを含むマキベリー抽出物を有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】4日間反復投与によるマウスストレス性ドライアイモデルにおけるマキベリー抽出物投与後の涙液分泌能変化（測定値、平均±標準誤差、** p < 0.01 対 初期値、# p < 0.05 対 vehicle）を示すグラフである。
【図２】4日間反復投与によるマウスストレス性ドライアイモデルにおけるマキベリー抽出物投与後の涙液分泌能変化（投与前値に対する変動比 、平均±標準誤差、** p < 0.01 対 初期値、# p < 0.05 対 vehicle）を示すグラフである。
【図３】5日間反復投与によるマウスストレス性ドライアイモデルにおけるマキベリー抽出物投与後の涙液分泌能変化を示すグラフである。
【図４】涙腺細胞におけるマキベリー抽出物の活性酸素種発生抑制効果を示すグラフである。
【図５】涙腺細胞における活性酸素種、発生抑制効果についてマキベリー抽出物と、他のエキスとの比較を示すグラフである。
【図６】マキベリー抽出物から単離されたDelphinidin配糖体の活性酸素種発生抑制効果を示すグラフである。
【図７】マキベリー抽出物のHPLCチャートである。
【図８】マキベリー抽出物のFr.1: Delphinidin-3-sambubioside-5-glucosideのHPLCチャートである。
【図９】マキベリー抽出物のFr.2: Delphinidin-3,5-diglucosideのHPLCチャートである。
【図１０】マキベリー抽出物のFr.5: Delphinidin-3-sambubiosideのHPLCチャートである。
【図１１】マキベリー抽出物のFr.6: Delphinidin-3-glucosideのHPLCチャートである。
【図１２】Fr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）およびFr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）と、Delphinidin 3-rutinosideにおける涙腺細胞における活性酸素種発生抑制効果を示すグラフである。
【図１３】Fr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）とその他のアントシアニン類（Petunidin-3-glucoside、Peonidin-3-glucoside、Movidin-3-glucoside、Cyanidin-3-glucoside）との涙腺細胞における活性酸素種発生抑制効果の比較を示すグラフである。
【図１４】涙腺細胞に対する各種アントシアニン（Delphinidin-3, 5-diglucoside; D3G5G、Delphinidin-3-glucoside; D3G、Delphinidin-3-rutinoside; D3R）の取り込み量の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤は、マキベリー抽出物またはマキベリーから抽出されるデルフィニジン（Delphinidin）配糖体を有効成分として含有する。
また、本発明のドライアイ予防・治療剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤は、Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideのうち少なくとも一種以上を有効成分として含有する。
【００１２】
上記Delphinidinは、下記化学式（１）に示された化合物である。
【化１】
2014098092.tif 000003
【００１３】
Delphinidinは、アントシアニジンの一種であり、植物の主要な色素として知られる抗酸化物質である。なお、アントシアニジンはアグリコンとして糖や糖鎖と結びついてアントシアニン（配糖体）となる。
Delphinidinを得る方法は特に限定されないが、植物から抽出したものを用いても良いし、化学的に合成したものを用いても良い。もちろんDelphinidinの市販品（たとえばEXTRASYNTHESE社製）を用いても良い。
【００１４】
本発明に使用するDelphinidin配糖体としては、例えば、下記化学式（２）に示されるものが挙げられる。
【化２】
2014098092.tif 000004
【００１５】
上記Delphinidin配糖体は特に限定されないが、例えば、Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside、Delphinidin-3,5-diglucoside、Delphinidin-3-sambubioside、およびDelphinidin-3-glucoside等であることが好ましい。これらの化合物は、上記化学式（２）で示された化合物のうちＲ１〜Ｒ３に下記表１に示されたものが置換されたものである。なお、これらは１種のみ用いても良いし、２種以上併用しても良い。
【００１６】
【表１】
2014098092.tif 000005
【００１７】
Delphinidin配糖体を得る方法は特に限定されないが、植物からの抽出したものを用いても良いし、化学的に合成したものを用いても良い。植物から抽出する場合は、マキベリーの他、ビルベリー、カシス、クランベリー、コンコード (ブドウ)、ザクロ等を原料として用いることができるが、特にマキベリーから抽出することが好ましい。マキベリーには、本発明の有効成分となるDelphinidin配糖体が高濃度に含有されているため、その抽出が容易だからである。更に市販品を用いても良い。
【００１８】
マキベリー（Aristotelia Chilensisともいう。）は、南アメリカのチリ南部原産のベリー系の植物であり抗酸化作用が非常に高いことが知られている。
また、マキベリーは、Delphinidin配糖体であるおよびDelphinidin-3-sambubioside-5-glucosideおよびDelphinidin-3,5-O-diglucosideを含有することが知られている。なお、これらの成分は他のベリー系、例えば、ビルベリーやカシス（ブラックカラント）には含有していない。
【００１９】
発明者らの研究によれば、マキベリーには、Delphinidin配糖体として、上記Delphinidin-3-sambubioside-5-glucosideおよびDelphinidin-3,5-diglucosideに加え、Delphinidin-3-sambubiosideおよびDelphinidin-3-glucosideが含まれることが確認されている。特に、Delphinidin-3,5-diglucosideは、その活性に優れ、ドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤の有効成分として効果的に作用する。
【００２０】
上記マキベリー抽出物におけるDelphinidin配糖体の含有量は特に限定されないが、上記マキベリー抽出物を１００ｗｔ％とした場合、Delphinidin-3,5-O-diglucosideを６〜２５ｗｔ％、好ましくは１０〜２０ｗｔ％含有し、更にDelphinidin-3-sambubioside-5-glucoside を１〜１０ｗｔ％好ましくは４〜８ｗｔ％含有することが好ましい。
【００２１】
本発明において、植物原料としてマキベリーから有効成分であるDelphinidin配糖体を抽出する場合、その部位は特に限定されず、例えば、果実、種子、花、葉、根、茎等を用いることができ、特に果実を用いることが好ましい。上記有効成分を高濃度に抽出することができるからである。
【００２２】
抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、酢酸エチル等の極性溶媒を使用することができる。これらの溶媒を２種以上混合してもよい。
望ましくは、水エタノールまたはこれらの混合物である含水エタノールを抽出溶媒として用いると、有効成分が効率よく抽出される。
【００２３】
抽出溶媒として水を用いる場合、水の種類は、特に限定されず、水道水、蒸留水、ミネラル水、アルカリイオン水、深層水等を使用することができる。
【００２４】
抽出溶媒としての含水エタノールを用いる場合、エタノールの濃度は特に限定されないが、特にエタノール濃度１０〜９０％（wt／wt）、望ましくはエタノール濃度２０〜８０％（wt／wt）であるとよい。エタノール濃度９０％（wt／wt）以下としたのは、エタノール濃度が高すぎると、マキベリー中の油分が含水エタノール中に溶け出しやすくなるからである。
【００２５】
抽出温度としては、２０〜８０℃、望ましくは４０〜５０℃程度で行うとよい。抽出温度が低すぎると、有効成分が抽出されにくくなり、抽出温度が高すぎると、有効成分が分解し、生理活性（健康機能性）が低下するためである。
【００２６】
抽出方法としては、撹拌抽出、連続抽出、浸漬抽出、向流抽出、超臨界抽出など任意の方法を採用することができ、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００２７】
具体的な抽出方法を示すと、抽出溶媒を満たした処理槽に原料（マキベリー果実等）を投入し、攪拌しながら有効成分を溶出させる。例えば、抽出溶媒として含水エタノールを用いる場合には、抽出原料の２〜１００倍量程度（重量比）の抽出溶媒を使用し、３０分〜２時間程度抽出を行う。溶媒中に有効成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことによって抽出液を得る。
【００２８】
その後、常法に従って抽出液に希釈、濃縮、精製、乾燥等の処理を施し、本発明によるドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤とする。
精製方法は、合成吸着樹脂、ゲル濾過樹脂等に抽出液を通して有効成分を吸着させ、これをメタノール、エタノール等で溶出させて濃縮を行うとよい。
【００２９】
本発明のドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤は、各種飲食品の素材として使用することができる。飲食品としては、例えば、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や、健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）が挙げられる。これらの飲食品に本発明のドライアイ予防・治療剤を適宜配合するとよい。
【００３０】
これら飲食品には、その種類に応じて種々の成分を配合することができ、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤の食品素材を使用することができる。
【００３１】
具体的な製法としては、ドライアイ予防・治療剤を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥し、これを粉末、顆粒、打錠または溶液にすることで容易に飲食品（インスタント食品等）に含有させることができる。また、前記ドライアイ予防・治療剤を、例えば、油脂、エタノール、グリセリンあるいはこれらの混合物に溶解して液状にし、飲料に添加するか、固形食品に添加することが可能である。必要に応じてアラビアガム、デキストリン等のバインダーと混合して粉末状あるいは顆粒状にし、飲料に添加するか固形食品に添加することも可能である。
【００３２】
本発明のドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤を飲食品に適用する場合の添加量としては、病気予防や健康維持が主な目的であるので、飲食品に対して有効成分の含量が合計１〜２０wt％以下であるのが好ましい。
【００３３】
本発明のドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤は、薬品（医薬品および医薬部外品を含む。）の素材として用いてもよい。薬品製剤用の原料に、本発明のドライアイ予防・治療剤を適宜配合して製造することができる。本発明のドライアイ予防・治療剤に配合しうる製剤原料としては、例えば、賦形剤（ブドウ糖、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等）、結合剤（蒸留水、生理食塩水、エタノール水、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（アルギン酸ナトリウム、カンテン、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、アラビアゴム末、ゼラチン、エタノール等）、崩壊抑制剤（白糖、ステアリン、カカオ脂、水素添加油等）、吸収促進剤（第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等）、吸着剤（グリセリン、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、硅酸等）、滑沢剤（精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等）などが挙げられる。
【００３４】
本発明のドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤の投与方法は、一般的には、錠剤、丸剤、軟・硬カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤、液剤等の形態で経口投与することができるが、非経口投与であってもよい。非経口剤として投与する場合は、溶液の状態、または分散剤、懸濁剤、安定剤などを添加した状態で、局所組織内投与、皮内、皮下、筋肉内および静脈内注射などによることができる。また、坐剤などの形態としてもよい。更に、点眼薬として投与することができる。
【００３５】
投与量は、投与方法、病状、患者の年齢等によって変化し得るが、大人では、通常、１日当たり有効成分として０．５〜５０００ｍｇ、子供では通常０．５〜３０００ｍｇ程度投与することができる。
ドライアイ予防・治療剤の配合比は、剤型によって適宜変更することが可能であるが、通常、経口または粘膜吸収により投与される場合は約０．３〜１５．０wt％、非経口投与による場合は、０．０１〜１０wt％程度にするとよい。なお、投与量は種々の条件で異なるので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例を説明する。なお、以下に示す実施例は、本発明によって得られるドライアイ予防・治療剤、涙液分泌能低下抑制剤、または涙腺組織における活性酸素生成抑制剤の各種作用・効果等の確認のために説明するもので、本発明の範囲は、これらの製品および製法に限定されるものではない。【００３７】
［実施例１：マキベリー抽出物の調製］
マキベリー（Aristotelia Chilensis）の果実を蒸留水を用いて５０℃にて攪拌抽出を行った。その後、抽出液をろ過し、合成吸着剤カラムに通液し、８０％エタノール水溶液で有効成分を含むマキベリー抽出液（マキベリーエキス）を溶出した。その後、乾燥してマキベリー抽出物（実施例１）を得た。実施例１のマキベリー抽出物をHPLCにて分析した結果、Delphinidin 3,5- diglucosideを12.26％、Delphinidin 3-sambubioside-5-glucoside を7.76％含有することが確認された。【００３８】
［実施例２〜５：マキベリーエキスから関与成分の単離］
これまでにマキベリーエキスにマウスドライアイモデルでの改善作用が明らかとなっている。そこで、活性成分探索のために、マキベリーエキスよりアントシアニン成分の単離・精製を行った。
単離・精製の方法は、実施例１の調製法により得られるマキベリーエキス（0.25 g/5 ml）を綿栓ろ過し、その後ODS Sep-Pak (Waters社製)に通した。そして、分取用HPLCにて単離・精製を行った。条件は以下のとおりである。
移動相：25%MeOH 0.3%TFA
UV：520nm
流量：9.0 ml/min
カラム：Inertsil PREP-ODS 20×250 mm【００３９】
マキベリーエキスの成分単離・精製を行った結果、
Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside（Fr.1:実施例２）を6.3 mg、
Delphinidin-3,5-diglucoside（Fr.2:実施例３）を6.3 mg、
Delphinidin-3-sambubioside（Fr.5:実施例４）を2.5 mg、
Delphinidin-3-glucoside（Fr.6:実施例５）を4.8 mg
をそれぞれ単離することができた。それぞれの純度は95%以上である。
このときのＨＰＬＣチャートを図７〜図１１に示す。【００４０】
［試験例１：マウスストレス性ドライアイモデルを用いた涙液分泌能低下抑制作用の評価］
（１−１）試験条件
マキベリー抽出物（実施例１）について、以下の方法により、マウスストレス性ドライアイモデルにおける涙液分泌能の低下抑制作用の評価を行った。
試験動物としてC57BL／6、雌、10週齢のマウスを用いた。例数は各群5-10匹とした。
涙液分泌能、低下処置（ストレス負荷）は、文献（Tracy L. Bale1, Angelo Contarino, George W. Smith, Raymond Chan, Lisa H. Gold, Paul E. Sawchenko: Mice deficient for corticotropin-releasing hormone receptor-2 display anxiety-like behaviour and are hypersensitive to stress. Nature Genetics. 24: 410−414, 2000.）に則して行った。即ち、マウスを、1日4時間、呼吸/排泄可能な処置を施したポリプロピレン製遠沈管（容量約60ml）内に拘束する。拘束中はマウス顔面に送風（風速0.5〜1.0 m/s）を行った。拘束処置時間以外はケージ内で餌と飲料は自由摂取とした。一連の処置を投与期間中、反復行った。
投与は、以下の用量のマキベリー抽出物（実施例１）を蒸留水に適量溶解後、1日当たり下記用量となるよう、ストレス負荷前に経口ゾンデを用いて行った。
用量： 4 mg/kg, 20 mg/kg
対照：蒸留水（vehicle）
回数：1日1回、４日又は8日間反復【００４１】
飼育条件は以下のとおりである。
温度：23±5℃
湿度：70±15％
照明：8時から20時まで点灯、20時から翌朝8時まで消灯
飼料および給水：固形飼料、水道水を自由摂取【００４２】
涙液分泌量の測定は、次に示す方法で行った。即ち、マウス左右、外眼角に綿糸（ZONE-QUICK、昭和薬品化工株式会社）を15秒、挿入し、綿糸が涙液の浸透により褐色変色した長さを、0.5mmの精度で測定した。測定はストレス負荷前（初期値）、ストレス負荷期間中は投与目の翌日、ストレス負荷前に実施した。左右眼の平均値を、個体の涙液分泌量とした。【００４３】
統計解析は次に示す方法で行った。即ち、初期値と投与4日目の比較では対応のあるt検定を、群間の比較では対応のないt検定もしくはDunnet 法による多重比較検定を行った。【００４４】
（１−２）結果および試験例１における実施例の効果
（Ａ）4日間反復投与における結果（図１および図２）
4日間反復投与によるマウスストレス性ドライアイモデルにおけるマキベリー抽出物投与後の涙液分泌能変化（測定値）の結果を図１に示す。涙液量はマキベリー抽出物投与群およびvehicle投与群ともに減少傾向を示し、特にvehicle投与群については、初期値に比較し投与1日目、4日目に有意に減少した。
投与前値（初期値）に対する変動比を図２に示す。図２に示すように、初期値に対する投与4日目の変動比ではマキベリー抽出物は、20 mg/kg投与群においてvehicle投与群に対し有意に、変動が小さかった。以上により、本実施例のマキベリー抽出物は涙液分泌能の低下を抑制する作用を有し、ドライアイ予防・治療剤として有効であることが確認された。【００４５】
（Ｂ）8日間反復投与における結果（図３）
８日間反復投与によるマウスストレス性ドライアイモデルにおけるマキベリー抽出物投与後の涙液分泌能変化（測定値）の結果を図３に示す。図３に示すように、投与3、5、8日目においてマキベリー抽出物20 mg/kg投与群において、vehicle投与群に比較し有意に涙液分泌量が多かった。以上により、本実施例のマキベリー抽出物は涙液分泌能の低下を抑制する作用を有し、ドライアイ予防・治療剤として有効であることが確認された。【００４６】
［試験例２：マウス摘出涙腺を用いた、マキベリー抽出物の活性酸素種抑制作用の評価１］
（２−１）試験条件
マウスin vivoモデルでマキベリー抽出物（実施例１）の涙腺組織における活性酸素種に対する作用を以下の条件により評価した。
マウスへの投与方法は、マキベリー抽出物（実施例１）を蒸留水に適量溶解後、1日当たり下記用量となるよう、ストレス負荷前に経口ゾンデを用いて投与した。
動物：C57BL/6、雌性、10週齢
用量： 4 mg/kg, 20 mg/kg。
対照：蒸留水（vehicle）。
回数：1日1回、8日間反復投与。
例数：各群5-10匹【００４７】
マウスの飼育条件は、以下のとおりである。
温度：23±5℃
湿度：70±15％
照明：8時から20時まで点灯、20時から翌朝8時まで消灯
飼料、給水：固形飼料、水道水を自由摂取【００４８】
活性酸素種抑制作用の評価は、下記の方法により行った。
チューブに摘出涙腺を採取し、25mg tissue/mLとなるように冷PBSを添加した。その後、ジルコニアビーズを加え、ビーズ式破砕装置で涙腺組織を破砕し、細胞懸濁液を50μLずつ分注した。その後、細胞懸濁液に実施例１（1、10μg/mL)のマキベリー抽出物を添加し、活性酸素種としてのDCFH-DA液を終濃度75μMとなるように添加した。そして、37℃、60分間インキュベート後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光プレートリーダーで蛍光強度を測定（λ 485/528）した。
尚、比較例として、ルテイン（Lutein）10μg/mL（比較対照）についても同様の試験を行った。その結果を図４に示す。
更に、比較例として、ビルベリーエキス（インディナ社製）およびブラックカラントエキス（タマ生化学株式会社製）についても同様の試験を行った。その結果を図５に示す。【００４９】
更に、Fr.1:Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside（実施例２）、
Fr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）、
Fr.5:Delphinidin-3-sambubioside（実施例４）、
Fr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）
についても同様の試験を行った。その結果を図６に示す。【００５０】
（２−２）結果および試験例２における実施例の効果
図４に示すように、マキベリー抽出物（10μg/mL)において、涙腺組織における活性酸素種を有意に抑制した。更に、同じく抗酸化作用を有し、眼病予防効果があるとされるルテインと比較しても、優れた涙腺組織における活性酸素抑制効果を有することが確認された。
また、図５に示すように、ビルベリーエキス（Bilberry）およびカシスエキス（black currant）と比較してマキベリーエキスは活性酸素を有意に抑制した。これにより、マキベリー抽出物は、ドライアイ予防・治療剤として有効であり、更に、マキベリー抽出物は他の成分と比較しても優れたドライアイ予防・治療効果を有することが確認された。なお、図５において、「１」、「３」、「１０」は、それぞれ植物抽出物の添加量μg/mLを示し、「Maquiberry」は実施例１におけるマキベリーエキスである。【００５１】
また、図６に示すように、Fr.1:Delphinidin-3-sambubioside-5-glucoside（実施例２）Fr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３），Fr.5:Delphinidin-3-sambubioside（実施例４）およびFr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）の各成分について、活性酸素を有意に抑制することが確認された。これにより、マキベリーエキスに含まれるこれらの成分がドライアイ予防・治療効果における関与成分であることが確認された。【００５２】
［試験例３：マウス摘出涙腺を用いた、マキベリー抽出物の活性酸素種抑制作用の評価２］
（３−１）試験条件
更に、Fr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）およびFr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）と、Delphinidin 3-rutinoside（カシスに含まれる成分、比較例１）とについて、試験例２と同様の評価を行った。その結果を図１２に示す。【００５３】
また、Fr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）とその他のアントシアニン類（Petunidin-3-glucoside、Peonidin-3-glucoside、Malvidin-3-Glucoside、Cyanidin-3-glucoside）とについても、試験例２と同様の同様の評価を行った。その結果を図１３に示す。【００５４】
（３−２）結果および試験例３における実施例の効果
図１２に示すように、Delphinidin-3-rutinoside（比較例１）は活性酸素を抑制せず、Fr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）およびFr.6:Delphinidin-3-glucoside（実施例５）は活性酸素を抑制し、特にマキベリー固有の成分であるFr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）について優れた活性酸素の抑制作用を示した。
これにより、他のDelphinidin配糖体と比較して、マキベリーに含まれる固有の成分であるFr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）において特に優れたドライアイ予防・治療効果を有することが確認された。
また、図１３に示すように、他のアントシアニンと比較して、マキベリー固有の成分であるFr.2:Delphinidin-3,5-diglucoside（実施例３）が特に優れた涙腺細胞における活性酸素抑制作用を示した。これにより、マキベリーに含まれるアントシアニンがより優れたドライアイ予防・治療作用を有することが確認された。【００５５】
［試験例４：マキベリーエキス含有成分の涙腺細胞における取り込み試験］
（４−１）試験の目的
試験例１により、マキベリーエキスにドライアイ抑制作用が認められている。また、ビルベリーおよびカシスと比較して強い作用が明らかとなっている。さらに、成分においてもマキベリー特有のアントシアニンであるdelphinidin-3, 5-diglucoside（実施例３）が他のアントシアニンであるdelphinidin-3-glucoside（ビルベリーの主アントシアニン）およびdelphinidin-3-rutinoside（カシスの主アントシアニン：比較例１）と比較して強い作用を示した。本試験では、上記の作用機序解明のためにHPLCを用いて涙腺細胞におけるアントシアニンの取り込み量を比較した。【００５６】
（４−２）試験条件
試験方法は下記の通り行った。涙腺細胞懸濁液に、終濃度100 nMになるように各種アントシアニン（delphinidin-3, 5-diglucoside、delphinidin-3-O-glucosideおよびdelphinidin-3-O-rutinoside）を添加した。
その後、37℃で30分間インキュベートをした後、細胞を洗浄後bufferに再懸濁しHPLCでアントシアニン含量を分析した。分析条件を下記に示す。
分析フロー
細胞懸濁液  50μL
↓
50μL加える（0.2% TFA-40% MeOH）
↓
シリンジフィルターでろ過
↓
HPLC分析【００５７】
HPLC条件は、下記に示すとおりである。
カラム：YMC UltraHT Pro C18 φ2.0×100 mm
カラム温度：30℃
溶離液：A=0.3%TFA水溶液, B=アセトニトリル
グラジエント： 5%B (0 min) - 5%B (0.60 min) - 13%B (0.61 min) - 15%B (3.00 min) - 26%B (6.00 min) - 90%B (6.20 min) - 90%B (7.20 min) - 5%B (7.40 min) - 5%B (9.50 min)
流速：0.3 mL/min、注入量：50μL
定量限界：2 ng/mL (Cyanidin-3-O-glucoside)
参考文献：Exp. Eye Res, 83, 348 (2006)
J Agric. Food Chem, 49, 1546 (2001)【００５８】
（４−３）結果および試験例４における実施例の効果
涙腺細胞への取り込み試験を行った結果を図１４に示す。
涙腺細胞に対する各種アントシアニンの取り込み量（Mean±SE, n=6, Delphinidin-3, 5-diglucoside; D3G5G、Delphinidin-3-glucoside; D3G、Delphinidin-3-rutinoside; D3R）を比較した結果、マキベリー特有成分であるdelphinidin-3, 5-diglucoside (D3G5G)は、delphinidin-3-glucoside (D3G；ビルベリー成分)およびdelphinidin-3-rutinoside (D3R；カシス成分)よりも、多く細胞内に取り込まれることが明らかとなった。これにより、マキベリーエキスは涙腺細胞への取り込み機構によって同細胞に蓄積しやすく、他のアントシアニン素材よりドライアイに対して有効的に作用することが判明した。【００５９】
本発明によるドライアイ予防・治療剤の配合例を示す。なお、以下の配合例は本発明を限定するものではない。
配合例１：チューインガム
砂糖                          ５３．０ｗｔ％
ガムベース                    ２０．０
グルコース                    １０．０
水飴                          １６．０
香料                            ０．５
ドライアイ予防・治療剤          ０．５      
１００．０ｗｔ％【００６０】
配合例２：グミ
還元水飴                      ４０．０ｗｔ％
グラニュー糖                  ２０．０
ブトウ糖                      ２０．０
ゼラチン                        ４．７
水                              ９．６８
ユズ果汁                        ４．０
ユズフレーバー                  ０．６
色素                            ０．０２
ドライアイ予防・治療剤          １．０      
１００．０ｗｔ％【００６１】
配合例３：キャンディー
砂糖                          ５０．０ｗｔ％
水飴                          ３３．０
水                            １４．４
有機酸                          ２．０
香料                            ０．２
ドライアイ予防・治療剤          ０．４      
１００．０ｗｔ％【００６２】
配合例４：ヨーグルト（ハード・ソフト）
牛乳                          ４１．５ｗｔ％
脱脂粉乳                        ５．８
砂糖                            ８．０
寒天                            ０．１５
ゼラチン                        ０．１
乳酸菌                          ０．００５
ドライアイ予防・治療剤          ０．４
香料                              微量
水                                残余      
１００．０ｗｔ％【００６３】
配合例５：清涼飲料
果糖ブドウ糖液糖              ３０．０ｗｔ％
乳化剤                          ０．５
ドライアイ予防・治療剤          ０．３
香料                              適量
精製水                            残余      
１００．０ｗｔ％【００６４】
配合例６：錠菓
砂糖                          ７６．４ｗｔ％
グルコース                    １９．０
ショ糖脂肪酸エステル            ０．２
ドライアイ予防・治療剤          ０．５
精製水                          ３．９      
１００．０ｗｔ％【００６５】
配合例７：ソフトカプセル
玄米胚芽油                    ４７．０ｗｔ％
ユズ種子油                    ４０．０
乳化剤                        １２．０
ドライアイ予防・治療剤          １．０      
１００．０ｗｔ％【００６６】
配合例８：錠剤
乳糖                          ５４．０ｗｔ％
結晶セルロース                ３０．０
澱粉分解物                    １０．０
グリセリン脂肪酸エステル        ５．０
ドライアイ予防・治療剤          １．０      
１００．０ｗｔ％【００６７】
配合例９：点眼剤
フマル酸ケトチフェン              ０．７ｗｔ％
アズレンスルホン酸ナトリウム      ０．２
クロモグリク酸ナトリウム          ９．８
Ｌ−アスパラギン酸カリウム        ８．５
アラントイン                      ３．０
塩酸テトラヒドロゾリン            ０．５
メチル硫酸ネオスチグミン          ０．０５
塩化ベンザルコニウム液            ０．１
グリセリン                      ２５．０
ドライアイ予防・治療剤            １．０
ｐＨ調節剤                          適量
精製水                              残部      
１００．０ｗｔ％
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上により、本発明は、食材として安全なマキベリーを原料として、新規な成分のドライアイ予防・治療剤、涙腺分泌能低下防止抑制剤、および涙腺組織における活性酸素生成抑制剤を提供することができる。
【図１】
2014098092.tif 000006
【図２】
2014098092.tif 000007
【図３】
2014098092.tif 000008
【図４】
2014098092.tif 000009
【図５】
2014098092.tif 000010
【図６】
2014098092.tif 000011
【図７】
2014098092.tif 000012
【図８】
2014098092.tif 000013
【図９】
2014098092.tif 000014
【図１０】
2014098092.tif 000015
【図１１】
2014098092.tif 000016
【図１２】
2014098092.tif 000017
【図１３】
2014098092.tif 000018
【図１４】
2014098092.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを有効成分として含有するドライアイ予防・治療剤。
【請求項５】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含有するマキベリー抽出物からなる、ドライアイ予防・治療剤。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを有効成分として含有する涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項９】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含有するマキベリー抽出物からなる、涙液分泌能低下抑制剤。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを有効成分として含有する、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１４】
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含有するマキベリー抽出物からなる、涙腺組織における活性酸素生成抑制剤。
【請求項１５】
下記の工程（ａ）〜（ｄ）、
（ａ）マキベリーの果実から水抽出液を得る工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の水抽出液をろ過し、合成吸着剤カラムに通液する工程、
（ｃ）前記工程（ｃ）で通液した合成吸着剤カラムから、エタノール水溶液による抽出液を得る工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）の抽出液を乾燥することにより得られるマキベリー抽出物をドライアイ予防・治療剤とする工程、
を含む、ドライアイ予防・治療剤の製造方法。
【国際調査報告】
2014098092.tif 000020
2014098092.tif 000021
2014098092.tif 000022
2014098092.tif 000023