(57)【要約】本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部とを備える。
2015151461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、
前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部と、
を備えることを特徴とする超解像観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像観察装置において、
前記照明光学系は、
前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を順次に照射し、
前記抽出部は、
光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ１でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項４】
請求項１に記載の超解像観察装置において、
前記照明光学系は、
前記第１照明光と前記第２照明光とを同時に照射した後に前記第３照明光を照射する、あるいは前記第１照明光と前記第３照明光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ−１以上の波長差を付与した状態で前記第１照明光と前記第２照明光と前記第３照明光とを同時に照射し、
前記抽出部は、
光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に光周波数差を与えると共に、前記第２照明光と同じ光周波数の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光に対する前記第２照明光の混入を抑える
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光に対する前記第２照明光の混入を抑える
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項７】
請求項１に記載の超解像観察装置において、
前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
前記抽出部は、光周波数（２ω１−ω２）を有した前記信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項８】
請求項７に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項９】
請求項７に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の超解像観察装置において、
前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
前記抽出部は、光周波数（２ω２−ω１）を有した前記信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１２】
請求項１０に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１３】
請求項１に記載の超解像観察装置において、
前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
前記抽出部は、光周波数ω２又はω１を有した前記信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部は、
前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１６】
請求項３、請求項９、請求項１２、請求項１５の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
前記抽出部の変調対象である前記特性は、
前記光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１６の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
前記第１領域及び前記第３領域の形状は、円形であり、
前記第２領域の形状は、輪帯状であり、
前記第１領域の中心と前記第２領域の中心と前記第３領域の中心とは一致する
ことを特徴とする超解像観察装置。
【請求項１８】
観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、
前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、
前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光し、
前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する
ことを特徴とする超解像観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオサイエンス、特に分子生物学の分野や病理診断の分野では、試料を蛍光プローブなどで染色せず「そのままの状態で」顕微することのできる無染色顕微鏡の必要性が高まりつつある。この無染色顕微鏡が満たすべき要求は、主に以下の（１）、（２）である。
（１）高い光学分解能（例えば、平面分解能＜５０ｎｍ、奥行分解能＜１００ｎｍ）。（２）試料内部における観察対象の識別能力。【０００３】
これらの要求を満たす可能性のある新しい無染色顕微鏡として、誘導放出顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）顕微鏡、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ：Stimulated Raman scattering）顕微鏡、２光子吸収顕微鏡などが提案された（例えば、特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−４７４３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの無染色顕微鏡は、何れも観察対象物に固有のエネルギー準位を利用するため、上記の要求（２）を十分に満たしうるものの、上記の要求（１）を満たすためには依然として改善の余地があり、ここに現状の課題が存する。【０００６】
そこで本発明は、上記の課題を解決すべく、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部とを備える。【０００８】
本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光し、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する。【０００９】
本発明によれば、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１実施形態の誘導放出顕微鏡の構成図である。
【図２】励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。
【図３】励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の時間変化波形を説明する図（励起光の変調無し）である。
【図４】励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の時間変化波形を説明する図（励起光の変調有り）である。
【図５】光検出器２４へ入射する光（信号光及びノイズ光）を説明する図である。
【図６】変形例の誘導放出顕微鏡の構成図である。
【図７】変形例の誘導放出顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。
【図８】励起光スポットにおける各光の偏光状態を説明する図である。
【図９】ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
【図１０】ＣＡＲＳ顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。
【図１１】ＣＡＲＳ顕微鏡における各光の偏光状態を説明する図である。
【図１２】２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
【図１３】２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。
【図１４】２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡における各光の変調周波数を説明する図である。
【図１５】ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
【図１６】ＳＲＳ顕微鏡における各光の偏光状態を説明する図である。
【図１７】２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
【図１８】２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡における各光の変調周波数を説明する図である。
【図１９】２光子吸収顕微鏡の構成図である。
【図２０】２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として誘導放出顕微鏡を説明する。
【００１２】
図１は、本実施形態の誘導放出顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり誘導放出顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、レンズ１２と、ビームスプリッタ１３１、１３２と、ミラーＭ１と、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１４１、１４２、１４３と、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）１５と、位相板１８と、ミラーＭ２と、ダイクロイックミラー１３３、１３４と、対物レンズ１９と、試料２０と、試料ステージ２８と、対物レンズ２１と、波長選択フィルタ２２と、集光レンズ２３と、フォトダイオードなどの光検出器２４と、ロックインアンプ２５と、信号発生器２６と、パーソナルコンピュータ２７とが配置される。
【００１３】
パルスレーザ光源１１は、フェムト秒パルスレーザ光源、ピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源である。パルスレーザ光源１１によるパルス発振の繰り返し周波数ｆｒは、例えば８０ＭＨｚであり、パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス幅ΔＴは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。
【００１４】
パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１２により径の太い平行光束となり、ビームスプリッタ１３１へ入射する。ビームスプリッタ１３１へ入射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３１を透過するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３１を反射するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３１を透過したパルスレーザ光は光パラメトリック発振器１４１へ入射する。
【００１５】
ビームスプリッタ１３１を反射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３２へ入射すると、ビームスプリッタ１３２を反射するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３２を透過するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３２を反射したパルスレーザ光は、光パラメトリック発振器１４２へ入射する。
【００１６】
ビームスプリッタ１３２を透過したパルスレーザ光は、ミラーＭ１を反射し、光パラメトリック発振器１４３へ入射する。
【００１７】
光パラメトリック発振器１４１は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω１に変換し、光パラメトリック発振器１４２は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２’に変換し、光パラメトリック発振器１４３は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２に変換する。
【００１８】
ここで、光周波数ω１、ω２’、ω２の大小関係は、ω１＞ω２’、ω１＞ω２、ω２’≒ω２である。なお、本実施形態では、光周波数ω２’の光と光周波数ω２の光とを波長分離できるような所定の周波数差が光周波数ω２、ω２’の間に付与されると仮定する。この周波数差は、波長差に換算して数ｎｍ以上であることが望ましい。
【００１９】
音響光学変調器１５は、光パラメトリック発振器１４１の射出光路、つまり光周波数ω１のパルスレーザ光の単独光路に配置され、そのパルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調周波数ｆ１で変調する。なお、音響光学変調器１５によるパルスレーザ光の変調周波数ｆ１及び変調タイミングは、信号発生器２６によって制御される。
【００２０】
位相板１８は、光パラメトリック発振器１４２の射出光路、つまり光周波数ω２’のパルスレーザ光の単独光路に配置される。この位相板１８の位相遅延量分布は、光軸を中心とした周方向にかけて非一様、かつ、光軸を中心とした径方向にかけて一様に設定されている。また、位相板１８の周方向に亘る位相遅延量分布は、周位置が１８０°ずれた２つの位置の間に位相差πが付与されるような分布である。よって、光周波数ω２’のパルスレーザ光が試料２０の観察対象面Ｐ０に形成する光スポット（後述）の形状は、ドーナツ状となる。
【００２１】
さて、光パラメトリック発振器１４１から射出した光周波数ω１のパルスレーザ光は、音響光学変調器１５を介してミラーＭ２を反射し、ダイクロイックミラー１３３を介してダイクロイックミラー１３４を反射する。
【００２２】
光パラメトリック発振器１４２から射出した光周波数ω２’のパルスレーザ光は、位相板１８を介してダイクロイックミラー１３３を反射し、光周波数ω１のパルスレーザ光と光路を統合させる。
【００２３】
光パラメトリック発振器１４３から射出した光周波数ω２のパルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１３４を透過して、光周波数ω１のパルスレーザ光及び光周波数ω２’のパルスレーザ光と光路を統合させる。
【００２４】
なお、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３の各々の射出光路には、不図示の光強度調整機構（ＮＤフィルタ）が設置されている。これらのＮＤフィルタによると、光周波数ω１のパルスレーザ光の強度と、光周波数ω２’のパルスレーザ光の強度と、光周波数ω２のパルスレーザ光の強度とを、独立に調整することができる。
【００２５】
互いの光路を統合させた３つのパルスレーザ光（光周波数ω１、ω２’、ω２）は、対物レンズ１９の瞳側へ入射すると、対物レンズ１９の先端から射出し、試料２０の観察対象面Ｐ０の微小領域に向かって集光し、光スポットを形成する。
【００２６】
なお、上記した位相板１８は、光周波数ω１のパルスレーザ光、光周波数ω２’のパルスレーザ光、光周波数ω２のパルスレーザ光のうち、光周波数ω２’のパルスレーザ光の単独光路にのみ配置されている。このため、観察対象面Ｐ０に光周波数ω１のパルスレーザ光が形成する光スポットは円形であり、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２’のパルスレーザ光が形成する光スポットはドーナツ状（輪帯状）であり、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２のパルスレーザ光が形成する光スポットは円形である。
【００２７】
ここで、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、観察対象面Ｐ０に照射される順序が以下の順序となるように、光周波数ω１のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２’のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２のパルスレーザ光の光路長との関係が予め調整されている。
【００２８】
（１）光周波数ω１のパルスレーザ光
（２）光周波数ω２’のパルスレーザ光
（３）光周波数ω２のパルスレーザ光
このうち、光周波数ω１のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成する円形の光スポットには、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起準位へ移行（励起）させる働きがあり、光周波数ω２’のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成するドーナツ状の光スポットには、励起中の電子を基底準位へ移行（誘導放出）させて誘導放出光を発生させる働きがあり、光周波数ω２のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成する円形の光スポットには、光周波数ω２’のパルスレーザ光によって誘導放出されなかった励起中の電子を基底状態へ変移（誘導放出）させて誘導放出光を発生させる働きがある。
【００２９】
なお、光周波数ω１は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内の値に設定されることが望ましく、光周波数ω２、ω２’の各々は、波長換算でおよそ紫外域〜近赤外領域の波長範囲内の値に設定されることが望ましい。
【００３０】
そこで以下では、図２（Ａ）に示すとおり、観察対象面Ｐ０に対して最初に照射される光周波数ω１のパルスレーザ光を「励起光」と称し、次に照射される光周波数ω２’のパルスレーザ光を「ドーナツ誘導光」と称し、最後に照射される光周波数ω２のパルスレーザ光を「円形誘導光」と称す。なお、図２（Ａ）では、観察対象面Ｐ０に形成される個々の光スポットを、光軸方向にずらして描いている。
【００３１】
また、以下では、観察対象面Ｐ０おいて励起光が照射される円形の領域を「励起光スポット」と称し、観察対象面Ｐ０においてドーナツ誘導光が照射されるドーナツ状の領域を「ドーナツ誘導光スポット」と称し、観察対象面Ｐ０において円形誘導光が照射される円形の領域を「円形誘導光スポット」と称す。
【００３２】
なお、基本的には、図２（Ａ）に示すとおり、励起光スポットＡｅの輪郭と、ドーナツ誘導光スポットＡｄの内輪郭と、円形誘導光スポットＡｏの輪郭とは、ほぼ一致する。なぜなら、これら輪郭のサイズは回折限界によってほぼ決まるからである。
【００３３】
しかし、本実施形態では、図２（Ｂ）に示すとおり、励起光スポットＡｅの輪郭よりもドーナツ誘導光スポットＡｄの内輪郭が小さくなるように、ドーナツ誘導光の強度が十分に高く設定される。
【００３４】
そのために、本実施形態では、例えば、ドーナツ誘導光の単独光路に挿入されたＮＤフィルタの透過率が高めに設定される。あるいは、ビームスプリッタ１３１、１３２の反射比率が高めに設定される。
【００３５】
したがって、本実施形態では、ドーナツ誘導光スポットＡｄが図２（Ｂ）の右下に斜線を付したとおりドーナツ状の領域Ａｄ’にて励起光スポットＡｅに重複する。
【００３６】
以下、励起光スポットＡｅのうち、ドーナツ誘導光スポットＡｄと重複するドーナツ状の領域Ａｄ’を「重複領域Ａｄ’」と称し、励起光スポットＡｅのうち、ドーナツ誘導光スポットＡｄと重複しない円形の領域Ａｍを「非重複領域Ａｍ」と称す。本実施形態では、信号光の検出元（観察対象点）を、この非重複領域Ａｍのみに制限することで、超解像効果を得る。
【００３７】
なお、ここでは、回折限界で決まるサイズ（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さな領域（非重複領域Ａｍ）に信号光の検出元を制限することを「超解像」という。
【００３８】
また、以下では、励起光スポットＡｅ、ドーナツ誘導光スポットＡｄ、円形誘導光スポットＡｏの集合を、単に「光スポット」と称す。
【００３９】
図３（ａ）に示すのは励起光の時間波形であり、図３（ｂ）に示すのはドーナツ誘導光の時間波形であり、図３（ｃ）に示すのは円形誘導光の時間波形である。
【００４０】
図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すとおり、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の間でパルスの繰り返し周期Ｔｒは共通であるが、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の間でパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングは若干ずつずれている。図３（ｄ）は、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の３パルス分の波形を同一座標上に拡大表示したものである。図３（ｄ）において実線で示すのが励起光のパルスであり、細かい点線で示すのがドーナツ誘導光のパルスであり、粗い点線で示すのが円形誘導光のパルスである。図３（ｄ）に示すとおり励起光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、ドーナツ誘導光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとの間のズレΔは、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス幅ΔＴより若干大きい程度、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）に設定される。
【００４１】
ここで、ズレΔは、観察対象物質の電子が励起状態を維持できる期間（励起状態の寿命、例えばおよそフェムト秒〜ピコ秒）以下であることが望ましい。これによって、誘導放出が確実に生起する。また、この場合、パルス幅ΔＴも励起状態の寿命以下であることが望ましい。これによって、ズレΔを励起状態の寿命以下に保ちつつ、時間的に近接するパルス同士を確実に分離することができる。
【００４２】
なお、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングのズレΔを調整するために、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、励起光の単独光路、ドーナツ誘導光の単独光路、円形誘導光の単独光路のうち少なくとも２つの光路には、可動ミラーなどで構成された光路長調整機構（不図示）が設けられていることが望ましい。
【００４３】
また、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）では、音響光学変調器１５による励起光の変調を可視化しなかったが、可視化すると図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のとおりである。図４に示すとおり、音響光学変調器１５による励起光の変調周波数ｆ１は、パルスの繰り返し周波数ｆｒと比較して十分に低く、ｆ１≦ｆｒ／２であり、例えばｆ１は数ＭＨｚ程度である。なお、図４において符号Ｔ１で示すのは励起光の変調周期（＝変調周波数ｆ１の逆数）であり、符号Ｔｒで示すのはパルスの繰り返し周期（＝繰り返し周波数ｆｒの逆数）である。
【００４４】
さて、図１に戻り、試料２０は、例えば、培養液と共に培養容器に収容された透明な生体細胞であり、この生体細胞中の特定物質（例えば、ヘモグロビンなどの特定タンパク質）が観察対象物質である。誘導放出顕微鏡は、観察対象物質に固有のエネルギー準位を利用するため、観察対象物質が予め蛍光染色されている必要は無い。
【００４５】
試料ステージ２８は、試料２０を支持し、光軸方向（Ｚ方向）にかけて試料２０を移動させると共に、光軸に垂直な方向（ＸＹ方向）にかけて試料２０を移動させる透過型のステージである。試料ステージ２８がＺ方向にかけて試料２０を移動させると、試料２０の内部における観察対象面Ｐ０の深さが調整され、試料ステージ２８がＸＹ方向にかけて試料２０を移動させると、前述した光スポットで（スポット内の観察対象点で）観察対象面Ｐ０を二次元スキャンすることができる。
【００４６】
観察対象面Ｐ０の光スポットから射出した光、すなわち、光スポットから射出した励起光、光スポットから射出したドーナツ誘導光、光スポットから射出した円形誘導光、光スポットで発生した誘導放出光は、対物レンズ２１の先端側から対物レンズ２１に入射する。
【００４７】
対物レンズ２１の仕様（開口数、倍率など）は、対物レンズ１９の仕様と同じであり、対物レンズ２１と対物レンズ１９との間の位置関係及び姿勢関係は、観察対象面Ｐ０に関して対称である。なお、ここでは対物レンズ２１の仕様と対物レンズ１９の仕様とを共通としたが、完全に共通でなくても構わない。例えば、対物レンズ２１の開口数は対物レンズ１９の開口数より大きくても良い。
【００４８】
対物レンズ２１に先端側から入射した光、すなわち、観察対象面Ｐ０の光スポットから射出した励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光、誘導放出光は、対物レンズ２１の瞳側から射出し、波長選択フィルタ２２、集光レンズ２３を順に介して光検出器２４へ向かう。
【００４９】
但し、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１、ω２’の光をカットし、かつ、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与されている。
【００５０】
よって、光スポットから射出した励起光（光周波数ω１）、光スポットから射出したドーナツ誘導光（光周波数ω２’）は、光検出器２４へ入射せず、光スポットから射出した円形誘導光（光周波数ω２）及び光スポットで発生した誘導放出光（光周波数ω２）は、光検出器２４へ入射する。
【００５１】
光検出器２４は、入射光の強度を電気信号に変換するフォトダイオードなどの光電変換素子である。
【００５２】
ロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号から、励起光の変調周波数ｆ１と同じ周波数で変化する成分を信号としてロックイン検出する。なお、ロックインアンプ２５の検出周波数及び検出タイミングは、信号発生器２６によって制御される。
【００５３】
パーソナルコンピュータ２７は、ロックインアンプ２５の検出した信号を取り込む。また、パーソナルコンピュータ２７は、前述したスキャン中、観察対象点が観察対象面Ｐ０の各位置にあるときに信号の取り込みを行い、観察対象面における信号の分布を誘導放出画像として取得すると、不図示のモニタへ表示する。
【００５４】
以下、図２（Ｂ）を参照して本実施形態の誘導放出過程を詳しく説明する。
【００５５】
先ず、本実施形態では、観察対象面Ｐ０に励起光が照射されると、励起光スポットＡｅに位置していた観察対象物質の電子のエネルギー準位が励起準位へ移行（励起）する。
【００５６】
続いて、観察対象面Ｐ０にドーナツ誘導光が照射されると、重複領域Ａｄ’では、励起中の電子のエネルギー準位が基底準位に戻るが、非重複領域Ａｍでは、励起中の電子のエネルギー準位は何ら変化しない。
【００５７】
続いて、観察対象面Ｐ０に円形誘導光が照射されると、重複領域Ａｄ’では、励起中の電子が存在しないので誘導放出は生起しないが、非重複領域Ａｍでは、励起中の電子のエネルギー準位が基底準位に戻り、誘導放出光が発生する。
【００５８】
したがって、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、ドーナツ誘導光の照射により、誘導放出光の検出元（信号の取得元）が、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限される。したがって、本実施形態の誘導放出顕微鏡は、試料２０の超解像観察が可能である。
【００５９】
以下、本実施形態のロックイン検出を説明する。
【００６０】
通常、誘導放出顕微鏡では、誘導光に応じて試料で発生した誘導放出光（以下、「信号光」と称す。）と、試料から射出した誘導光（以下、「ノイズ光」と称す。）との間では、光周波数は共通（ω２）であり、伝播方向も共通であるため、信号光とノイズ光との分離を波長選択フィルタで行うことはできない。
【００６１】
このため、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、上述したとおり音響光学変調器１５で励起光の強度を周波数ｆ１で変調すると共に、光検出器２４の出力する電気信号から、周波数ｆ１で変化する成分をロックインアンプ２５でロックイン検出した。
【００６２】
図５は、光検出器２４へ入射する光を説明する図である。図５（Ａ）は、誘導放出過程と、光検出器２４へ入射する光との関係を説明する図であり、図５（Ｂ）は、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各波形と、光検出器２４へ入射する光の波形との関係を説明する図である。
【００６３】
また、図５の左側は非重複領域Ａｍから光検出器２４へ向かう光を説明し、図５の右側は重複領域Ａｄ’から光検出器２４へ向かう光を説明している。なお、図５では、非重複領域Ａｍからの光と重複領域Ａｄ’からの光とを区別して描いたが、実際の光検出器２４には、非重複領域Ａｍからの光と重複領域Ａｄ’からの光とが区別されることなく入射する。
【００６４】
先ず、図５（Ａ）の左側に示すとおり、非重複領域Ａｍでは、ドーナツ誘導光が照射されないため、信号光の発生が何ら抑制されない。よって、非重複領域Ａｍから光検出器２４に向かう光は、信号光とノイズ光との双方である。
【００６５】
一方、図５（Ａ）の右側に示すとおり、重複領域Ａｄ’には、ドーナツ誘導光が照射されるため、信号光の発生が抑制される。よって、重複領域Ａｄ’から光検出器２４に向かう光は、ノイズ光のみである。
【００６６】
そして、本実施形態では図５（Ｂ）（ａ）に示すとおり励起光が周波数ｆ１で変調される。信号光の量は、励起光の強度に応じて変化するのに対して、ノイズ光の量は、励起光の強度に依存しない。
【００６７】
したがって、図５（Ｂ）（ｄ）の左側に示すとおり、非重複領域Ａｍから光検出器２４に向かう光の波形には、周波数ｆ１の変調が転写される（変調量は信号光の強度に応じた量となる）のに対して、図５（Ｂ）（ｄ）の右側に示すとおり、重複領域Ａｄ’から光検出器２４に向かう光の波形には、周波数ｆ１の変調が転写されない。
【００６８】
したがって、本実施形態のように、光検出器２４の出力する電気信号から周波数ｆ１で変化する信号をロックイン検出すれば、信号光の強度を高精度に検知できることは明らかである（以上、ロックイン検出の説明。）。
【００６９】
なお、本実施形態では、観察対象面Ｐ０の光スポットから射出したドーナツ誘導光を光検出器２４の手前でカットするために、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを波長分離した。すなわち、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の光周波数と円形誘導光の光周波数とに差異を与えると共に、ドーナツ誘導光と同じ光周波数の光をカットし円形誘導光と同じ光周波数の光を通過させる波長選択フィルタ２２を光検出器２４の手前に配置した。
【００７０】
しかし、本実施形態では、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを波長分離する代わりに、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを偏光分離してもよい。すなわち、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の偏光方向と観察対象面に向かう円形誘導光の偏光方向とに差異を与えると共に、ドーナツ誘導光と同じ偏光方向の光をカットし円形誘導光と同じ偏光方向の光を通過させる検光子を光検出器２４の手前に配置してもよい（以下の変形例を参照）。
［第１実施形態の変形例］
以下、第１実施形態の変形例を説明する。ここでは、第１実施形態（図１）との相違点のみを説明する。
【００７１】
図６は、変形例の誘導放出顕微鏡の構成図である。
【００７２】
先ず、変形例の誘導放出顕微鏡では、ドーナツ誘導光の光周波数が円形誘導光の光周波数ω２と同じに設定される。
【００７３】
また、変形例の誘導放出顕微鏡において、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光をカットし、かつ、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
【００７４】
また、変形例の誘導放出顕微鏡において、励起光の単独光路と、ドーナツ誘導光の単独光路と、円形誘導光の単独光路との各々には、偏光子４１及び１／４波長板５１が順に配置され、対物レンズ２１と集光レンズ２３との間には、１／４波長板６０及び検光子７０が順に配置される。
【００７５】
また、変形例の誘導放出顕微鏡において、偏光子４１及び１／４波長板５１の軸方向は予め調整されており、図７に示すとおり、観察対象面Ｐ０に入射する励起光及び円形誘導光の偏光状態は、同じ方向に旋回する円偏光（例えば右旋回円偏光）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光状態は、励起光及び円形誘導光とは逆旋回の円偏光（例えば左旋回円偏光）に設定される。
【００７６】
また、変形例の誘導放出顕微鏡では、１／４波長板６０の軸方向も予め調整されており、検光子７０に向かう励起光及び円形誘導光の偏光状態は、図８左側に示すとおり所定方向の直線偏光に設定され、検光子７０に向かうドーナツ誘導光の偏光状態は、図８右側に示すとおり、励起光及び円形誘導光と直交する方向の直線偏光に設定される。
【００７７】
また、変形例の誘導放出顕微鏡では、図８に示すとおり、検光子７０に入射する円形誘導光及び励起光の偏光方向と同じ方向（つまりドーナツ誘導光の偏光方向に直交する方向）に検光子７０の透過軸方向が設定される。
【００７８】
したがって、変形例の誘導放出顕微鏡では、観察対象面Ｐ０から射出したドーナツ誘導光は光検出器２４の手前でカットされ、観察対象面Ｐ０から射出した円形誘導光は光検出器２４へ入射する。
【００７９】
なお、ここでは、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光方向と一致させたので、非重複領域Ａｍにおける誘導放出の効率を高めることができる。
【００８０】
但し、非重複領域Ａｍにおける誘導放出の効率を高める必要の無い場合は、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光方向と一致させなくてもよい。
【００８１】
また、ここでは、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光としたので、ドーナツ誘導光スポットを等方的（光軸の周りに回転対称）にすることができる。
【００８２】
但し、ドーナツ誘導光スポットを等方的にする必要の無い場合は、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を直線偏光としてもよい。
【００８３】
なお、その場合は、１／４波長板５１、６０を省略し、観察対象面Ｐ０に入射する励起光、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の各々の偏光状態を、直線偏光とすればよい。
【００８４】
この場合も、光検出器２４の手前において、ドーナツ誘導光の偏光方向を、円形誘導光の偏光方向及び励起光の偏光方向と直交させればよい。
［第１実施形態及び変形例の補足］
なお、第１実施形態及び変形例では、励起光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、ドーナツ誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとをずらしたが、これら３つのタイミングのうち少なくとも２つを一致させてもよい。
【００８５】
例えば、観察対象面Ｐ０へ励起光とドーナツ誘導光とを同時に照射した後に円形誘導光を照射してもよい（但し、ω２’≠ω２）。
【００８６】
あるいは、励起光と円形誘導光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ−１以上の波長差を付与した状態で、励起光とドーナツ誘導光と円形誘導光とを同時に照射してもよい（但し、ω２’≠ω２）。
【００８７】
また、第１実施形態及び変形例は、誘導放出顕微鏡に本発明を適用したものであるが、励起状態吸収（ＥＳＡ：exited state absorption）顕微鏡にも同様に本発明を適用することができる。
【００８８】
この場合、光スポットが円形である光周波数ω１の光を励起光として使用し、光スポットがドーナツ状である光周波数ω２’の光を誘導光として使用する点は第１実施形態又は変形例と同様であるが、光スポットが円形である残りの光の光子エネルギー（光周波数ω２）は、ＥＳＡの第一励起状態と第二励起状態との間のエネルギー差に相当する値に設定される。例えば、光周波数ω１、ω２’は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内に設定され、光周波数ω２は、波長換算でおよそ可視域〜近赤外域の波長範囲内に設定される。
【００８９】
また、第１実施形態及び変形例は、誘導放出顕微鏡に本発明を適用したものであるが、基底状態の電子を枯渇させるＧＳＤ（Ground State Depletion）顕微鏡にも同様に本発明を適用することができる。
【００９０】
その場合は、光スポットが円形である光周波数ω１の光と、光スポットがドーナツ状である光周波数ω２’の光と、光スポットが円形である光周波数ω２の光と使用し、それらの光周波数ω１、ω２’、ω２は、基底状態から励起状態への励起が生じるような値に設定される。例えば、光周波数ω１、ω２’、ω２の各々は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内に設定される。
【００９１】
また、第１実施形態及び変形例では、励起光による励起が１光子励起であるか多光子励起であるか言及しなかったが、１光子励起でもよいし、多光子励起でもよい。例えば２光子励起の場合、励起光の光周波数ω１は、波換算で可視域〜近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態としてＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態（図１）との相違点のみを説明する。
【００９２】
図９は、ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
【００９３】
先ず、ＣＡＲＳ顕微鏡では、ドーナツ誘導光の光周波数ω２’が円形誘導光の光周波数ω２と同じに設定される。
【００９４】
また、ＣＡＲＳ顕微鏡では、励起光（光周波数ω１）が観察対象面Ｐ０に照射されるタイミングと、ドーナツ誘導光（光周波数ω２）が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光（光周波数ω２）が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとを一致させる。
【００９５】
また、ＣＡＲＳ顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にてＣＡＲＳ過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。これらの光のパルス形状は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率と、ビームスプリッタ１３２の透過反射率とによって調整可能である（なお、前述したＮＤフィルタの透過率によって調整してもよい。）。
【００９６】
また、ＣＡＲＳ顕微鏡で検出すべき信号光（ＣＡＲＳ光）の光周波数は（２ω１−ω２）であって、励起光の光周波数（ω１）、誘導光の光周波数（ω２）の何れとも異なるため、信号発生器２６、音響光学変調器１５、ロックインアンプ２５は基本的に不要である。
【００９７】
その代わりに、ＣＡＲＳ顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、ＣＡＲＳ光と同じ光周波数（２ω１−ω２）の光を通過させ、かつ、光周波数ω１の光及び光周波数ω２の光をカットする波長選択性が付与される。
【００９８】
また、ＣＡＲＳ光は微弱であるため、ＣＡＲＳ顕微鏡の光検出器２４としては、高感度な光検出器、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier Tube）が使用されることが望ましい。
【００９９】
また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、超解像を可能とするために、励起光の単独光路に偏光子４１が配置され、ドーナツ誘導光の単独光路に偏光子４１、１／４波長板５１が順に配置され、円形誘導光の単独光路に偏光子４１、１／４波長板５１が順に配置され、対物レンズ２１と集光レンズ２３との間に検光子７０が配置される。
【０１００】
また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、偏光子４１及び１／４波長板５１の軸方向は予め調整されており、図１０に示すとおり、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光状態は、所定方向の直線偏光（以下、０°方向の直線偏光とする。）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光状態は、右旋回又は左旋回の円偏光（以下、右旋回円偏光とする。）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光状態は、ドーナツ誘導光とは反対に旋回する円偏光（ここでは左旋回円偏光）に設定される。
【０１０１】
ここで、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、右旋回円偏光であるドーナツ誘導光と、左旋回円偏光である円形誘導光との双方が入射するので、重複領域Ａｄ’における誘導光のトータルの偏光状態は、ドーナツ誘導光と円形誘導光の合成となる。
【０１０２】
但し、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の振幅と、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の位相と、観察対象面Ｐ０に向かう円形誘導光の振幅と、観察対象面Ｐ０に向かう円形誘導光の位相との関係は、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光及び円形誘導光の合成偏光方向が９０°方向となるように予め調整されているものとする。
【０１０３】
一方、非重複領域Ａｍには、右旋回円偏光であるドーナツ誘導光は入射しないので、非重複領域Ａｍにおける誘導光のトータルの偏光状態は、左旋回円偏光である。
【０１０４】
したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、図１１に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１−ω２）は、非重複領域Ａｍに作用する誘導光と同じ「左旋回円偏光」となるのに対して、重複領域Ａｄ’で発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１−ω２）は、重複領域Ａｄ’に作用する誘導光と同じく「９０°方向の直線偏光」となる。
【０１０５】
そこで、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、検光子７０の透過軸方向は、図１１に示すとおり、励起光の偏光方向（ここでは０°方向）と同じに設定される。
【０１０６】
したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、重複領域Ａｄ’で発生したＣＡＲＳ光は光検出器２４の手前でカットされ、非重複領域Ａｍで発生したＣＡＲＳ光は光検出器２４へ入射する。
【０１０７】
したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、ＣＡＲＳ光の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１０８】
なお、ここでは、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光としたので、ドーナツ誘導光スポットＡｄを等方的（光軸の周りに回転対称）にすることができる。
【０１０９】
但し、ドーナツ誘導光スポットＡｄを等方的にする必要の無い場合は、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を直線偏光としてもよい。
【０１１０】
なお、その場合は、１／４波長板５１を省略し、観察対象面Ｐ０に入射する励起光、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の各々の偏光状態を、直線偏光とすればよい。
【０１１１】
その場合、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光及び励起光の偏光方向と直交させればよい。
【０１１２】
また、ＣＡＲＳ顕微鏡において、光検出器２４の出力する電気信号が微弱である場合は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、周波数ｆ１又は２ｆ１でロックイン検出を行うことにより、ＣＡＲＳ光の検出精度を高めてもよい。なお、ロックイン検出の方法は、第１実施形態で説明したとおりである。
【０１１３】
また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光を光検出器２４の手前でカットするために、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光と、非重複領域ＡｍからのＣＡＲＳ光とを偏光分離した。
【０１１４】
しかし、本実施形態では、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光と非重複領域ＡｍからのＣＡＲＳ光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（「第２実施形態の変形例」を参照）。
【０１１５】
また、本実施形態の顕微鏡は、光周波数（２ω１−ω２）の信号光（ＣＡＲＳ光）を検出対象としたＣＡＲＳ顕微鏡であったが、光周波数（２ω１−ω２）の信号光（ＣＡＲＳ光）の代わりに、光周波数（２ω２−ω１）の信号光（ＣＳＲＳ光）を検出対象とすれば、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ： Coherent Stokes Raman scattering）顕微鏡が実現する。このＣＳＲＳ顕微鏡もＣＡＲＳ顕微鏡と同様、信号光（ＣＳＲＳ光）に対して非重複領域Ａｍの分子振動を反映させることができるので、試料２０の無染色超解像観察が可能である。
［第２実施形態の変形例］
以下、第２実施形態の変形例として、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第２実施形態（図９）との相違点のみを説明する。
【０１１６】
図１２は、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
【０１１７】
先ず、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５が備えられる。
【０１１８】
また、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において音響光学変調器１５は、励起光の単独光路と、円形誘導光の単独光路との双方に配置される。
【０１１９】
また、励起光の光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
【０１２０】
以上の２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において、観察対象面Ｐ０の非重複領域Ａｍには、ＣＡＲＳ過程を生起させる光として、図１３に示すとおり、周波数ｆ１で変調された励起光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
【０１２１】
一方、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、ＣＡＲＳ過程を生起させる光として、図１３に示すとおり、周波数ｆ１で変調された励起光と、変調されていないドーナツ誘導光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
【０１２２】
よって、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡では、図１４に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１−ω２）は、周波数ｆ１、ｆ２、２ｆ１、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかで変化し、重複領域Ａｄ’で発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１−ω２）は、周波数ｆ１、２ｆ１の何れかで変化する。
【０１２３】
そこで、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡におけるロックインアンプ２５は、周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出を行うことにより、非重複Ａｍで発生したＣＡＲＳ光のみを検出する。
【０１２４】
したがって、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡でも、ＣＡＲＳ光の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１２５】
なお、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数（周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れか）とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
【０１２６】
また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
【０１２７】
また、第２実施形態で説明したＣＳＲＳ顕微鏡も、本変形例と同様に変形すること（すなわち２周波ロックイン型に変形すること）が可能である。但し、その場合は、ロックイン検出の検出周波数を、ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかに設定することが望ましい。
［第３実施形態］
以下、本実施形態の第３実施形態としてＳＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第２実施形態（図９のＣＡＲＳ顕微鏡）との相違点のみを説明する。
【０１２８】
図１５は、ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
【０１２９】
先ず、ＳＲＳ顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にてＳＲＳ過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。これらの光のパルス形状は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率と、ビームスプリッタ１３２の透過反射率とによって調整可能である（なお、前述したＮＤフィルタの透過率によって調整してもよい。）。
【０１３０】
光スポット内でＳＲＳ過程が生起すると、光スポットから射出する光の強度が変化する。具体的には、光周波数ω１の光の強度が減少し、光周波数ω２の光の強度が減少する。したがって、ＳＲＳ顕微鏡で検出すべき信号光（ＳＲＳ光）の光周波数はω１又はω２である。この信号光の光周波数（ω１又はω２）は、励起光の光周波数（ω１）又は誘導光の光周波数（ω２）と同じであるため、音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５によるロックイン検出が必要となる。なお、図１５に示した構成例は、検出対象となる光周波数をω２とした場合の構成例である。検出対象となる光周波数をω１とする場合には、図１５における光周波数ω１をω２に、光周波数ω２をω１にそれぞれ置き換えれば良い。なお、信号光と同じ光周波数のノイズ光の影響を排除するためのロックイン検出は公知なので説明を省略する。
【０１３１】
また、ＳＲＳ顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、ＳＲＳ光と同じ光周波数（ω１又はω２）の光を通過させ、かつＳＲＳ光とは異なる光周波数の光をカットする波長選択性が付与される。
【０１３２】
以上のＳＲＳ顕微鏡でも、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様、図１６に示すとおり、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’で発生する信号光（ここではＳＲＳ光）と、非重複領域Ａｍで発生する信号光（ここではＳＲＳ光）との間で偏光方向がずれる。よって、ＳＲＳ顕微鏡でも、非重複領域Ａｍで発生する信号光（ここではＳＲＳ光）を、重複領域Ａｄ’で発生する信号光（ここではＳＲＳ光）から分離することができる。
【０１３３】
したがって、ＳＲＳ顕微鏡でも、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１３４】
なお、本実施形態も、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様に変形することが可能である。例えば、本実施形態では、重複領域Ａｄ’からのＳＲＳ光と非重複領域ＡｍからのＳＲＳ光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（以下の変形例を参照）。
［第３実施形態の変形例］
以下、第３実施形態の変形例として、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第３実施形態との相違点のみを説明する。
【０１３５】
図１７は、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
【０１３６】
先ず、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、励起光の単独光だけでなく、円形誘導光の単独光路にも音響光学変調器１５が配置される。
【０１３７】
また、励起光の単独光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の単独光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
【０１３８】
以上の２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡において、観察対象面Ｐ０の非重複領域Ａｍには、ＳＲＳ過程を生起させる光として、周波数ｆ１で変調された励起光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
【０１３９】
一方、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、ＳＲＳ過程を生起させる光として、周波数ｆ１で変調された励起光と、変調されていないドーナツ誘導光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
【０１４０】
よって、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡では、図１８に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＳＲＳ信号（ここではＳＲＳ信号の光周波数をω２とする。）の大部分は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜で変化し、重複領域Ａｄ’で発生するＳＲＳ信号（光周波数ω２）の大部分は、周波数ｆ１で変化する。
【０１４１】
そこで、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡において、ロックインアンプ２５は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出を行うことにより、非重複領域Ａｍで発生したＳＲＳ光（光周波数ω２）を、重複領域Ａｄ’で発生したＳＲＳ光（光周波数ω２）から分離して検出する。
【０１４２】
したがって、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡でも、ＳＲＳ光（光周波数ω２）の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１４３】
なお、ここでは、信号光（ＳＲＳ光）の光周波数をω２としたが、ω１としてもよいことはいうまでもない。
【０１４４】
また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
【０１４５】
なお、上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数｜ｆ１±ｆ２｜とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
［第４実施形態］
以下、本実施形態の第４実施形態として２光子吸収顕微鏡を説明する。ここでは、第３実施形態（図１５のＳＲＳ顕微鏡）との相違点のみを説明する。
【０１４６】
図１９は、２光子吸収顕微鏡の構成図である。
【０１４７】
図１９に示すとおり、２光子吸収顕微鏡の構成は、第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）の構成と基本的に同じである。
【０１４８】
但し、２光子吸収顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にて２光子吸収過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。
【０１４９】
また、２光子吸収顕微鏡で検出すべき信号光（２光子吸収による光の減少分）の光周波数はω２であるので、２光子吸収顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、信号光（２光子吸収による光の減少分）と同じ光周波数（ω２）の光を通過させ、信号光（２光子吸収による光の減少分）とは異なる光周波数（ω１）の光をカットする波長選択性が付与される。
【０１５０】
以上の２光子吸収顕微鏡でも、第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１５１】
また、本実施形態も第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）と同様に変形することが可能である。例えば、本実施形態では、重複領域からの信号光と非重複領域からの信号光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（以下の変形例を参照）。
［第４実施形態の変形例］
以下、第４実施形態の変形例として、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡を説明する。ここでは、第４実施形態との相違点のみを説明する。
【０１５２】
図２０は、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡の構成図である。
【０１５３】
先ず、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、励起光の単独光だけでなく、円形誘導光の単独光路にも音響光学変調器１５が配置される。
【０１５４】
また、励起光の光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
【０１５５】
以上の２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、ロックインアンプ２５は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出を行うことにより、非重複領域Ａｍで発生した信号光（２光子吸収による光の減少分）を、重複領域Ａｄ’で発生した信号光から分離して検出する。
【０１５６】
したがって、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、信号光（２光子吸収による光の減少分）の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
【０１５７】
なお、上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数｜ｆ１±ｆ２｜とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
【０１５８】
また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
［実施形態及び変形例の補足］
なお、上述した第１実施形態〜第４実施形態又は変形例において、超解像効果（空間分解能）を更に高めるためには、観察対象面Ｐ０における非重複領域Ａｍのサイズを小さくすればよい。
【０１５９】
また、非重複領域Ａｍのサイズを小さくするためには、ドーナツ誘導光の強度を高めればよい。そのためには、例えば、ドーナツ誘導光の単独光路に挿入されたＮＤフィルタの透過率を高めに設定すれば良い。あるいは、ビームスプリッタ１３１、１３２の反射比率を高めに設定すればよい。
【０１６０】
なお、何れかの実施形態で偏光を利用する場合は、ドーナツ誘導光の強度増加とともに重複領域Ａｄ’からの光の偏光と非重複領域Ａｍからの光の偏光との直交性が悪くなり、非重複領域Ａｍからの信号の割合が小さくなる虞がある。このため、偏光を利用する場合は、ドーナツ誘導光の強度調整を、重複領域Ａｄ’からの光の偏光状態を考慮しつつ適切に行うことが望ましい。
【０１６１】
また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台のレーザ光源と２台のパラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。但し、その場合は、３つのレーザ光の何れか１つとしてレーザ光源から射出したレーザ光がそのまま使用される。
【０１６２】
また、光周波数ω２と光周波数ω２’とが等しい場合は、光周波数ω２の光を生成する光パラメトリック発振器と光周波数ω２’の光を生成する光パラメトリック発振器とを共通化してもよい。
【０１６３】
また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台の光パラメトリック発振器から波長の異なる２つの光を取り出してそれぞれを利用しても良い。ただし、この場合、２つの光のうち一方の光周波数を変化させると他方の光周波数もそれに伴って変化するため注意が必要である。
【０１６４】
また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器とを使用したが、３台のレーザ光源を使用してもよい。但し、その場合は、３台のレーザ光源はタイミング同期されることが望ましい。
【０１６５】
また、上述した幾つかの実施形態では、パルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調するために音響光学変調器１５を使用したが、電気光学素子と偏光子との組み合わせを使用してもよい。
【０１６６】
また、上述した幾つかの実施形態では、パルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調するために音響光学変調器１５を使用したが、パルスレーザ光の繰り返し周波数を制御してもよい。
【０１６７】
例えば、第１実施形態又は変形例においては、光周波数ω１のパルスレーザ光の繰り返し周波数ｆｒｅｐ１を、光周波数ω２のパルスレーザ光の繰り返し周波数ｆｒｅｐ２の１／ｍ倍に設定し、かつ、ロックイン検出の検出周波数をｆｒｅｐ１に設定してもよい（但し、ｍは２以上の整数）。
【０１６８】
また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される光の強度を時間方向にかけて変調したが、試料２０に照射される光の他の特性、例えば、位相、偏光、光周波数の何れかを時間方向にかけて変調してもよい。
【０１６９】
また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される光の強度を時間方向にかけて変調するために、試料２０に向かう光の偏光を時間方向にかけて変調すると共に、変調された光の光路のうち試料２０の上流側に検光子を配置してもよい。
【０１７０】
因みに、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、試料２０に向かう光の位相を時間方向にかけて変調したならば、試料２０に照射されるパルスレーザ光のパルス間隔が時間変化する。
【０１７１】
また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、エネルギー準位変化を伴う光学過程（誘導放出、ＣＡＲＳ、ＣＳＲＳ、ＳＲＳ、２光子吸収など）が生起するか否か、すなわち信号光が生起するか否かは、試料２０に照射される光の光周波数に依存する。このため、試料２０に照射される光の光周波数を時間方向にかけて変調すれば、信号光の強度に変調が転写されることは明らかである。つまり、信号光をロックイン検出可能であることは明らかである。
【０１７２】
また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される３つの光のうち１つの光の特性を時間方向にかけて変調したが、３つの光のうち少なくとも２つの光の特性を、時間方向にかけて互いに異なる変調周波数で変調してもよい。
【０１７３】
また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、透過型の顕微鏡を説明したが、反射型の顕微鏡にも本発明は適用可能である。
【０１７４】
また、上述した第１実施形態〜第４実施形態又は変形例では、観察対象面Ｐ０へ同時に形成される光スポットの個数（すなわち観察対象点の個数）を単数としたが、複数としてもよい。観察対象点の個数を複数化すれば、観察対象面Ｐ０の全体を光スポットで（観察対象点で）スキャンするのに要する時間を短縮することができる。
【０１７５】
また、上述した第１実施形態〜第４実施形態又は変形例では、面内分解能を向上させるために面内方向における光スポットの形状をドーナツ状にしたが、光軸方向の分解能を向上させるために光軸方向における光スポットの形状をドーナツ状にしてもよい。そのためには、中央の円形領域と周辺のリング領域との間にπ［ｒａｄ］の位相差が付与された位相板１８’を使用すればよい（位相板１８’は不図示）。前述した誘導放出、励起状態吸収、ＧＳＤ、２光子吸収、ＳＲＳ、ＣＡＲＳ、ＣＳＲＳが発生するのは光強度の高い集光点のみに制限されるため、上述した第１実施形態〜第４実施形態又は変形例では高いセクショニング能力（光軸方向の分解能）が得られるが、そのセクショニング能力は本手法の適用により更に向上する。
【０１７６】
また、面内方向における光スポットの形状がドーナツ状である光（位相板１８により生成される）と、光軸方向における光スポットの形状がドーナツ状である光（位相板１８’により生成される）とを合成したものを、ドーナツ誘導光として使用してもよい。この場合は、面内方向と光軸方向との双方に亘って超解像効果を得ることができる。
【０１７７】
これを実現するためには、位相板１８により位相変化を受けた光と、位相板１８’により位相変化を受けた光とを、ビームスプリッタや偏光ビームスプリッタ等の光合成素子で合成し、合成された光を試料に向けて対物レンズで集光すれば良い。
【０１７８】
また、上述した第１実施形態〜第４実施形態又は変形例では、無染色試料の観察に本発明を適用した場合を説明したが、染色された蛍光試料、染色された非蛍光試料など、他の試料の観察にも本発明は適用可能である。また、バイオ観察のみでなく、例えば材料観察などの他種の観察にも本発明は適用可能である。
［実施形態の作用効果］
上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、観察対象（試料２０）の第１領域（励起光スポットＡｅ）に第１光周波数ω１を有した第１照明光（励起光）を集光し、前記第１領域（照射領域Ａｅ）と部分的に重複する第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）に第２光周波数ω２’を有した第２照明光（ドーナツ誘導光）を集光し、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）のうち前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）と重複しない非重複領域（Ａｍ）を含む第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）に第３光周波数ω２を有した第３照明光（円形誘導光）を集光する照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）と、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）及び前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）及び前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の全体（光スポット）で発生した光から、前記非重複領域（Ａｍ）に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光（誘導放出光、ＣＡＲＳ光、ＳＲＳ光、２光子吸収による光の減少分）を抽出する抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、１／４波長板６０、検出光子７０など）とを備える。
【０１７９】
したがって、上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、前記照明光学系の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さな前記非重複領域（Ａｍ）を、前記信号光（誘導放出光、ＣＡＲＳ光、ＣＳＲＳ光、ＳＲＳ光、２光子吸収による光の減少分）の検出元とすることができる。
【０１８０】
また、第１実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を順次に照射し、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、検出光子７０）は、光周波数ω２を有した前記信号光（誘導放出光）を抽出する。
【０１８１】
また、第１実施形態（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ１でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１８２】
また、第１実施形態（誘導放出顕微鏡）における前記照明光学系は、前記第１照明光（励起光）と前記第２照明光（ドーナツ誘導光）とを同時に照射した後に前記第３照明光（円形誘導光）を照射する、あるいは前記第１照明光（励起光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ−１以上の波長差を付与した状態で前記第１照明光（励起光）と前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）とを同時に照射し、前記抽出部は、光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する。
【０１８３】
また、第１実施形態の超解像観察装置（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（光パラメトリック発振器１４２、１４３、波長選択フィルタ２２）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に光周波数差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と同じ光周波数（ω２’）の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）に対する前記第２照明光（ドーナツ誘導光）の混入を抑える。
【０１８４】
また、第１実施形態の変形例（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）に対する前記第２照明光（ドーナツ誘導光）の混入を抑える。
【０１８５】
また、第２実施形態又は変形例（ＣＡＲＳ顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（波長選択フィルタ２２）は、光周波数（２ω１−ω２）を有した前記信号光（ＣＡＲＳ光）を抽出する。
【０１８６】
また、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＣＡＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１８７】
また、第２実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡）では、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＣＡＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１８８】
また、第２実施形態の変形例（ＣＳＲＳ顕微）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（波長選択フィルタ２２）は、光周波数（２ω２−ω１）を有した前記信号光（ＣＳＲＳ光）を抽出する。
【０１８９】
また、第２実施形態（ＣＳＲＳ顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＣＳＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１９０】
また、第２実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＣＳＲＳ顕微鏡）では、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＣＳＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１９１】
また、第３実施形態又は第４実施形態及び変形例（ＳＲＳ顕微鏡又は２光子吸収顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、検出光子７０）は、光周波数ω２又はω１を有した前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）を抽出する。
【０１９２】
また、第３実施形態又は第４実施形態（ＳＲＳ顕微鏡又は２光子吸収顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１９３】
また、第３実施形態又は第４実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡又は２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡）における前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で時間変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
【０１９４】
また、上述した何れかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）の変調対象である前記特性は、前記光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである。
【０１９５】
また、上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）において、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）及び前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の形状は、円形であり、前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）の形状は、輪帯状であり、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）の中心と前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）の中心と前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の中心とは一致する。
【０１９６】
したがって、上述した何れかの超解像観察装置又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、観察対象点（非重複領域Ａｍ）を、前記照明光学系の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さくすることができる。
［その他］
また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１９７】
１１…パルスレーザ光源、１２…レンズ、１３１、１３２…ビームスプリッタ、Ｍ１…ミラー、１４１、１４２、１４３…光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）、１５…音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）、１８…位相板、Ｍ２…ミラー、１３３、１３４…ダイクロイックミラー、１９…対物レンズ、２０…試料、２８…試料ステージ、２１…対物レンズ、２２…波長選択フィルタ、２３…集光レンズ、２４…光検出器、２５…ロックインアンプ、２６…信号発生器、２７…パーソナルコンピュータ
【図１】
2015151461.tif 000003
【図２】
2015151461.tif 000004
【図３】
2015151461.tif 000005
【図４】
2015151461.tif 000006
【図５】
2015151461.tif 000007
【図６】
2015151461.tif 000008
【図７】
2015151461.tif 000009
【図８】
2015151461.tif 000010
【図９】
2015151461.tif 000011
【図１０】
2015151461.tif 000012
【図１１】
2015151461.tif 000013
【図１２】
2015151461.tif 000014
【図１３】
2015151461.tif 000015
【図１４】
2015151461.tif 000016
【図１５】
2015151461.tif 000017
【図１６】
2015151461.tif 000018
【図１７】
2015151461.tif 000019
【図１８】
2015151461.tif 000020
【図１９】
2015151461.tif 000021
【図２０】
2015151461.tif 000022
【国際調査報告】
2015151461.tif 000023
2015151461.tif 000024
2015151461.tif 000025
2015151461.tif 000026