(57)【要約】  本発明は、式（ＩＩ）2015037706.tif 000040［式中、ｍは１〜４であり、Ｒ１６およびＲ１７は、それぞれ独立してメトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基から選択される］を有する化合物またはその塩に関する。
2015037706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）
【化１】
2015037706.tif 000029
［式中、ｍは１〜４であり、
Ｒ１６およびＲ１７は、それぞれ独立してメトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基から選択される］
を有する化合物またはその塩。
【請求項２】
Ｒ１６がメトキシ基である、請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
Ｒ１７がメトキシ基またはプロポキシ基である、請求項２記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
ｍが１〜３である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
以下のいずれかの式を有する化合物またはその塩。
【化２】
2015037706.tif 000030
【化３】
2015037706.tif 000031
【化４】
2015037706.tif 000032
【化５】
2015037706.tif 000033
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項７】
【化６】
2015037706.tif 000034
または
【化７】
2015037706.tif 000035
を含む、請求項６に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項８】
前記化合物の最終濃度が０．４〜２μＭとなるよう多能性幹細胞の心筋分化培地に添加される、請求項６または７に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進用キット。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項１１】
【化８】
2015037706.tif 000036
または
【化９】
2015037706.tif 000037
を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が前記化合物を０．４〜２μＭで含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
【請求項１４】
【化１０】
2015037706.tif 000038
または
【化１１】
2015037706.tif 000039
を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が前記化合物を０．４〜２μＭで含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の心筋分化を促進する化合物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患は世界の死因１位であり、重症心不全患者においては心移植が現在唯一の治療法であるが、心移植はドナー不足という問題を抱えている。心移植に代わる治療法として、多能性幹細胞（ｉＰＳ／ＥＳ細胞等）由来の心筋細胞移植が有望視されており、早急な実現化が望まれている。【０００３】
ｉＰＳ細胞由来の分化心筋細胞を再生医療に応用するためには、効率性と安全性向上が必須である。効率性については、分化誘導できる心筋細胞の数が少ないことや、培養液中の増殖因子などのタンパク質が非常に高価でコスト効率が悪いという問題がある。安全性については、心筋細胞の純度が低く、心筋以外の増殖性細胞が混入するため癌化リスクがあることが問題となる。【０００４】
これらの問題を解決するため、本発明者らは、多能性幹細胞の心筋分化促進活性を有する化合物を開発した（特許文献１、非特許文献１）。中でも、新規化合物ＫＹ０２１１１は、既知の心筋分化促進化合物やタンパク質と比べて非常に強い効果を有する。【０００５】
ＫＹ０２１１１は、多能性幹細胞の心筋分化促進剤として非常に有用であるが、十分な心筋分化促進効果を得るためには比較的高濃度で培養液に添加しなければならない。更なるコスト削減と安全性向上の面から、より低濃度で心筋分化促進効果を示す化合物が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際出願公開第２０１２／０２６４９１号公報
【特許文献２】国際出願公開第２０１３／１１１８７５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Minami, I, et al., Cell Reports, Volume 2, Issue 5, 1448-1460, 2012
【非特許文献２】Graichen, R., et al., Differentiation 76, 357-370, 2008
【非特許文献３】Hao, J., et al., PLoS One 3, e2904, 2008
【非特許文献４】Wang, H., Hao, J., and Hong, C.C., ACS Chem. Biol. 6, 192-197, 2011
【非特許文献５】Ren, Y., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 280-287, 2011
【非特許文献６】Willems, E., et al., Circ. Res. 109, 360-364, 2011
【非特許文献７】Lian, X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, E1848-E1857, 2012
【０００８】
上記文献はいずれも、参照により本明細書の一部をなす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＫＹ０２１１１よりも高効率かつ低コストに多能性幹細胞の心筋分化を可能とする化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＫＹ０２１１１のＣｌ基を他のハロゲン基等に置換した化合物や、炭素鎖の炭素数（ｎ）を変えた化合物を合成し、それらの化合物の心筋分化促進効果を比較することにより、ＫＹ０２１１１よりも極めて低濃度で心筋分化促進効果を示す化合物を見出し、本発明を完成した。【００１１】
本発明は、以下を提供する。
１．式（ＩＩ）
【化１】
2015037706.tif 000003
［式中、ｍは１〜４であり、
Ｒ１６およびＲ１７は、それぞれ独立してメトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基から選択される］
を有する化合物またはその塩。
２．Ｒ１６がメトキシ基である、前記１記載の化合物またはその塩。
３．Ｒ１７がメトキシ基またはプロポキシ基である、前記２記載の化合物またはその塩。
４．ｍが１〜３である、前記１〜３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
５．以下のいずれかの式を有する化合物またはその塩。
【化２】
2015037706.tif 000004
【化３】
2015037706.tif 000005
【化４】
2015037706.tif 000006
【化５】
2015037706.tif 000007
６．前記１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
７．
【化６】
2015037706.tif 000008
または
【化７】
2015037706.tif 000009
を含む、前記６に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
８．前記化合物の最終濃度が０．４〜２μＭとなるよう多能性幹細胞の心筋分化培地に添加される、前記６または７に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
９．前記１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進用キット。
１０．前記１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
１１．
【化８】
2015037706.tif 000010
または
【化９】
2015037706.tif 000011
を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、前記１０に記載の方法。
１２．前記培地が前記化合物を０．４〜２μＭで含む、前記１０または１１に記載の方法。
１３．前記１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
１４．
【化１０】
2015037706.tif 000012
または
【化１１】
2015037706.tif 000013
を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、前記１３に記載の方法。
１５．前記培地が前記化合物を０．４〜２μＭで含む、前記１３または１４に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、より高効率かつ低コストに多能性幹細胞から心筋細胞を生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サルＥＳ細胞における心筋分化効果解析のプロトコール。
【図２】Ｒ７基の置換体と心筋分化効果の構造活性相関。
【図３】ヨウ素置換体の炭素鎖の炭素数（ｎ）の構造活性相関。
【図４】ヨウ素置換体の炭素鎖ｎ＝２とｎ＝３の比較。
【図５】ヨウ素置換体のＲ２基およびＲ３基の構造活性相関。
【図６】ヨウ素置換体ＳＯ２０３１(ＫＹ０２−Ｉ)のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞における心筋分化効果。
【図７】ヨウ素置換体ＳＯ２０３１(ＫＹ０２−Ｉ)の培地への溶解性。Ａ：血清含有培地（２０μＭ）。Ｂ：血清不含培地（２０μＭ）。Ｃ：血清不含培地（３μＭ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
国際出願公開第２０１２／０２６４９１号公報（参照により本明細書の一部をなす）に開示される化合物の一般式は、以下のとおりである。
式（Ｉ）：
【化１２】
2015037706.tif 000014
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【００１５】
ＫＹ０２１１１は、以下の式を有する化合物である。
【化１３】
2015037706.tif 000015
【００１６】
一方、本発明の化合物は、
式（ＩＩ）
【化１４】
2015037706.tif 000016
［式中、ｍは１〜４であり、
Ｒ１６およびＲ１７は、それぞれ独立してメトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基から選択される］
を有する化合物である。
【００１７】
好ましい態様において、Ｒ１７は、メトキシ基、エトキシ基、またはプロポキシ基であり、Ｒ１６は、メトキシ基である。更に好ましい態様において、Ｒ１７は、メトキシ基またはプロポキシ基であり、Ｒ１６は、メトキシ基である。
【００１８】
好ましい態様において、ｍは１〜３であり、より好ましくは２または３である。
【００１９】
好ましい態様において、本発明の化合物は、以下から選択される。
【化１５】
2015037706.tif 000017
【化１６】
2015037706.tif 000018
【化１７】
2015037706.tif 000019
【化１８】
2015037706.tif 000020
【００２０】
本発明の化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩が挙げられる。
【００２１】
本発明の化合物は、実施例に記載の方法に準じて、合成することができる。
【００２２】
本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒトの多能性幹細胞、特にＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に好適である。
【００２３】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） （これら文献は参照により本明細書の一部をなす）などのＥＳ細胞が挙げられる。
【００２４】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) （参照により本明細書の一部をなす）が挙げられる。
【００２５】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007) （これら文献は参照により本明細書の一部をなす）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
【００２６】
本発明の化合物は、多能性幹細胞の心筋分化培地に、最終濃度が０.１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．４〜２μＭ、更に好ましくは０．４〜１μＭとなるよう添加される。心筋分化培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される組成であればよく、特に限定はされないが、例えばＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地(実施例で使用している下記の組成のもの)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。
【００２７】
本発明の化合物は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法において用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等が挙げられる。
【００２８】
心筋分化培地における培養（心筋分化培養）の開始後、本発明の化合物を含む培地中で多能性幹細胞を培養する時期および期間は、使用する多能性幹細胞の種類や心筋分化培地の組成などにより適宜変更されうる。例えば、霊長類の多能性幹細胞の場合、特にサルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を実施例に記載のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地で培養する場合、心筋分化培養の２〜１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、さらにより好ましくは４〜６日間、培養すればよい。特に、心筋分化培養の１０日目までのうち４〜６日間、例えば心筋分化培養の３〜９日目、３〜８日目、３〜７日目、４〜１０日目、４〜９日目、または４〜８日目に、本発明の化合物を含む培地中で多能性幹細胞を培養することが好ましい。
【００２９】
本発明の化合物は、ニトロビン、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡの組み合わせ）、Ｗｎｔシグナル阻害剤などの別の心筋分化促進因子と共に使用してもよい。「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味し、例えば、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物、並びにＩＧＦＢＰ４、およびＤｋｋ１などのタンパク質が含まれる。本発明における「心筋分化促進因子」には、心筋分化促進効果を有するあらゆる物質が含まれる。
【００３０】
本発明の化合物は、（１）多能性幹細胞を１以上のＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および（２）工程（１）で得られた細胞を本発明の化合物を含む培地中で培養する工程を含む方法において、使用することができる。
【００３１】
「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えばＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。上記方法においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよい。
【００３２】
上記方法によれば、血清を含まない培地（血清不含培地）であっても効率的に多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。血清不含培地を用いる場合、培地はアルブミンを含むことが好ましく、培養方法としては、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等を用いることができるが、接着培養法を用いることが好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが挙げられる。接着培養法においては、ゼラチンまたはラミニン（例えば、ヒトラミニン211）をコートした培養ディッシュを用いることができる。アルブミンを含む血清不含培地を用いた場合、血清、サイトカイン、支持細胞等、アルブミン以外のタンパク質や、使用する多能性幹細胞とは異なる生物種に由来する成分（すなわち、異種成分）の非存在下で多能性幹細胞心筋分化を誘導することができる。
【００３３】
上記方法において、心筋分化培養の開始から工程（１）および（２）の開始までの期間、および工程（１）および（２）の培養期間は適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。Ｗｎｔシグナル活性化剤および本発明の化合物は、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階および中期段階にそれぞれ添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階とは、中胚葉マーカー遺伝子の発現上昇が起こる、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期を意味し、中期段階とは、中胚葉から心筋への分化誘導期を意味する。中胚葉マーカー遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。例えば、霊長類の多能性幹細胞の場合、特にサルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の０〜２日目または０〜３日目に、すなわち心筋分化培養開始から２または３日間、工程（１）を実施し、次いで、心筋分化培養の１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、さらにより好ましくは４〜６日間、工程（２）を実施すればよい。ここで、工程（２）は、心筋分化培養の１０日目までのうち４〜６日間、例えば心筋分化培養の３〜９日目、３〜８日目、３〜７日目、４〜１０日目、４〜９日目、または４〜８日目に実施することが好ましい。
【００３４】
Ｗｎｔシグナル活性化剤の濃度は、特に限定はされない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜１０μＭで使用すればよい。本発明の化合物は、最終濃度が０.１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．４〜２μＭ、更に好ましくは０．４〜１μＭとなるよう添加すればよい。
【００３５】
本発明の化合物は、心筋細胞の製造に用いることができる。心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、本発明の化合物またはその塩を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤および心筋分化促進用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の化合物に加えて別の心筋分化促進因子を含んでもよい。本発明の化合物と別の心筋分化促進因子とは、別々の容器に保存されていても、同一の容器に保存されていてもよい。
【００３７】
本発明はまた、本発明の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、および本発明の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。本発明の方法は、本発明の化合物の使用方法の説明に準じて実施することができる。
【００３８】
本発明はまた、多能性幹細胞の心筋分化促進剤または心筋分化促進用キットの製造のため、本発明の化合物またはその塩の使用を提供する。
【００３９】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４０】
１．サルES細胞における心筋分化効果解析の方法
式（Ｉ）のＲ７基に相当するＫＹ０２１１１のＣｌ基を他のハロゲン基等に置換した化合物を合成し、既報のとおり（Cell Reports, Volume 2, Issue 5, 1448-1460, 25 October 2012、国際出願公開第２０１２／０２６４９１号公報；参照により本明細書の一部をなす）、サルＥＳ細胞において濃度依存的に心筋分化効果を確認した。具体的には、心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターをサルＥＳ細胞（カニクイザルＣＭＫ６．４株）に導入し、６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に４．０×１０５細胞／ウェルにて播種し、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM 非必須アミノ酸溶液（Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール  ２μｌ）にて培養して、分化誘導開始後４〜８日に化合物を添加した。１０日目にＧＦＰ蛍光量をMetamorph イメージングシステムで解析した。【００４１】
２．Ｒ７基の置換体と心筋分化効果の構造活性相関
上記１の解析の結果、Ｒ７基にＨ＜Ｆ＜ＣＨ３＜Ｃｌ＜Ｂｒ＜Ｉの順に心筋分化効果が高くなるという構造活性相関が導かれた（図２）。特に、ヨウ素置換体であるＳＯ２０３１（以下、ＫＹ０２−Ｉとも記載する）は、Ｒ７基がＣｌ基であるＫＹ０２１１１と比較して、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭにおいて、それぞれ約１６倍、６．３倍、２．１倍、１．５倍の心筋分化効果が得られた。また、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）は、Ｒ７基がＢｒ基であるＳＯ０８７と比較しても、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭにおいて、それぞれ約５．２倍、２倍、１．６倍、１．１倍の心筋分化効果が得られた。これらの結果から、特に低濃度ではヨウ素置換体の化合物が最も高い効果を持つことが明らかとなった。【００４２】
３．ヨウ素置換体の炭素鎖の炭素数の構造活性相関
ＫＹ０２−Ｉの炭素鎖の炭素数（ｎ）を変えたものを合成し、心筋分化効果を確認した（図３）。その結果、炭素鎖ｎ＝０のＳＯ３０３０（ＫＹ００−Ｉ）についてはほとんど活性を示さなかったが、炭素鎖ｎ＝１のＳＯ３０３１(ＫＹ０１−Ｉ)、ｎ＝２のＳＯ２０３１(ＫＹ０２−Ｉ)、ｎ＝３のＳＯ３０４２(ＫＹ０３−Ｉ)に関しては、ＫＹ０２１１１よりも高い心筋分化促進効果が見られた。また、０．１μＭの低濃度においては、炭素鎖ｎ＝１のＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）よりも、炭素鎖ｎ＝２とｎ＝３のＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）とＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）の方が高い効果（それぞれ２．７倍、２．８倍）を持つことが分かった。さらに、１０μＭと３０μＭの高濃度においては、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）よりＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）の方が僅かに高い分化効果（約１．３倍）を持つ傾向が見られた。【００４３】
４．ヨウ素置換体の炭素鎖ｎ＝２とｎ＝３の比較
炭素鎖ｎ＝２のＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）と炭素鎖ｎ＝３のＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）の心筋分化促進効果を、図３に示す結果とは別に、再度濃度依存的に確認した（図４）。その結果、０．１μＭ、０．４μＭ、２μＭにおいては２つの化合物の分化促進効果に差がなかったが、比較的高濃度の１０μＭではＳ３０４２の方が僅かに効果が高かった（約１．１倍）。図３の結果と合わせると、高濃度ではｎ＝３のＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）の方が僅かに効果が高いと考えられた。【００４４】
５．ヨウ素置換体のＲ２基およびＲ３基の構造活性相関
式（Ｉ）の一般式のＲ２基およびＲ３基（ＫＹ０２１１１のジメトキシ基）を置換した化合物を合成し、心筋分化効果を確認した（図５）。その結果、ジメトキシ基構造を失った化合物は、Ｒ２のメトキシ基をプロポキシ基に置換したＳＯ２０７７を除き、いずれも分化促進効果が低くなった。ＳＯ２０７７は、ジメトキシ基を有するＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）と同等の活性が見られた。【００４５】
６．ヨウ素置換体ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞における心筋分化効果
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３株）およびｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１株）を用いて、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）の心筋分化促進効果を確認した（図６）。心筋分化誘導は、既報の方法に従って行った（Cell Reports, Volume 2, Issue 5, 1448-1460, 25 October 2012、参照により本明細書の一部をなす）。具体的には、培地成分は、IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有）を用いた。培養プレートは超低接着培養ディッシュ (Corning)を用いて、浮遊培養系にて心筋分化を行った。最初の２日間はＷｎｔ活性剤であるＣＨＩＲ９９０２１を３μＭ添加し、培養後３日目から８日目までＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）を２μＭ添加した。心筋分化効率は、心筋特異的マーカー分子である心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の抗体を用いてフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を計算することで求めた。その結果、ヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１株）においては、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）添加により心筋細胞の割合が３．７％から５６．８％まで増加し、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３株）においては、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）添加により心筋細胞の割合が１７．９％から７７．９％まで増加した。このことから、サルＥＳ細胞だけではなくヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞においても、ヨウ素置換体であるＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）が比較的低濃度で、かつサイトカインや成長因子の刺激なしでも心筋分化を効率的に促進することが分かった。【００４６】
７．ヨウ素置換体ＳＯ２０３１(ＫＹ０２−Ｉ)の培地への溶解性
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）を２０％血清含有培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM 非必須アミノ酸溶液（Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール  ２μｌ）に２０μＭで、または血清不含培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma）２００ｍｌ、MEM非必須アミノ酸溶液（Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール  ２μｌ）に３μＭまたは２０μＭで溶解させ、２４時間後に観察した（図７）。いずれの培地でも大きな結晶の析出は観察されず（図７Ａ〜Ｃ）、また、血清不含培地でも、十分な心筋分化促進効果が得られる３μＭでは、結晶の析出はほとんど観察されなかった（図７Ｃ）。結晶が析出しないことにより、培地中の濃度が析出により下がることがなく安定に維持される。また、析出した結晶が細胞に傷害を与える可能性がなく、さらに細胞内に残存した結晶が移植適用時に持ち越されてホストに毒性を与えたりする危険性がない。【００４７】
８．製造例
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化１９】
2015037706.tif 000021
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３，４−ジメトキシフェニル酢酸（１５７ｍｇ，０．７９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３９μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを１６７ｍｇ、収率５０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.73-7.69 (m ,1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97-6.84 (m, 3H), 3.75-3.72 (m, 8H).
MS (ESI) Found; 455 [M+H]+
【００４８】
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化２０】
2015037706.tif 000022
４−ヨードアニリン（１．００ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍｌ）溶液に、チオカルボニルジイミダゾール（９７６ｍｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を加えて１．５時間、室温にて攪拌した。２５％アンモニア水（３ｍｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去し、析出物を濾過して１−（４−ヨードフェニル）チオウレアを８８９ｍｇ、収率５９％で得た。
【化２１】
2015037706.tif 000023
１−（４−ヨードフェニル）チオウレア（８８９ｍｇ，３．１９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７ｍｌ）懸濁液に、臭素（３２８μｌ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流し、６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、ジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去後、析出物を濾過して２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾールを６５０ｍｇ、収率７３％で得た。
【化２２】
2015037706.tif 000024
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（１００ｍｇ，０．３６２ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（９１．４ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６９．４μｌ，０．３９８ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１８０ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを８３ｍｇ、収率４８％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.83 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.90-2.76 (m, 4H).
MS (ESI) Found; 469 [M+H]+
【００４９】
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化２３】
2015037706.tif 000025
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２５０ｍｇ，０．９０５ｍｍｏｌ），４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタン酸（２２４ｍｇ，０．９９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４μｌ，０．９９５ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（４５０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを１３１ｍｇ、収率３０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.37 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.58-2.48 (m, 4H), 1.96-1.86 (m, 2H).
MS (ESI) Found; 483 [M+H]+
【００５０】
ＳＯ２０７７
【化２４】
2015037706.tif 000026
４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニルプロピオン酸（５００ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液に、炭酸カリウム（８８１ｍｇ，６．３７ｍｍｏｌ）、１−ブロモプロパン（６９２μｌ，７．６５ｍｍｏｌ）を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、プロピル  ３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパノエートを５９０ｍｇ、収率８２％で得た。
【化２５】
2015037706.tif 000027
プロピル  ３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパノエート（５９０ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンに溶かし、５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．６８ｍｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、６ｍｏｌ／ｌ塩酸を加えて、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロピオン酸を４３８ｍｇ、収率８７％で得た。
【化２６】
2015037706.tif 000028
２−アミノ−６−ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロピオン酸（２００ｍｇ，０．８３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４０μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２−（３−（３−メトキシ−４−プロポキシフェニル）プロパンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾールを２１７ｍｇ、収率６０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.38-8.37 (m, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.87-2.78 (m, 4H), 1.72-1.65 (m, 2H), 094 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
MS (ESI) Found; 497 [M+H]+
【図１】
2015037706.tif 000041
【図２】
2015037706.tif 000042
【図３】
2015037706.tif 000043
【図４】
2015037706.tif 000044
【図５】
2015037706.tif 000045
【図６】
2015037706.tif 000046
【図７】
2015037706.tif 000047
【国際調査報告】
2015037706.tif 000048
2015037706.tif 000049
2015037706.tif 000050
2015037706.tif 000051