(57)【要約】運動性の良好な精子を効率良く分離することのできる精子の選抜部構造を提供する。動物より採取された精子を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が遡上するように貯留部に連通した遡上路とよりなる精子の選抜部構造において、前記遡上路の下流部は、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路とし、この流路の下流端部を前記貯留部の壁面に臨ませて開口させることとした。
2014136464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物より採取された精子を含有する選抜前精子液を貯留する貯留部と、
貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、
貯留部から緩衝液流路中を精子が遡上するように貯留部に連通した遡上路とよりなる精子の選抜部構造において、
前記遡上路の下流部は、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路とし、この流路の下流端部を前記貯留部の壁面に臨ませて開口させたことを特徴とする精子の選抜部構造。
【請求項２】
前記広幅の流路は、前記開口から上流側へ向けて狭窄するように構成したことを特徴とする請求項１に記載の精子の選抜部構造。
【請求項３】
前記貯留部に前記遡上路を複数連結させたことを特徴とする請求項１又は２に記載の精子の選抜部構造。
【請求項４】
動物より採取された精子を層流状の緩衝液中で所定区間遡上させ、遡上できた精子を捕集する請求項１〜３いずれか１項に記載の選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置であって、
前記遡上路の上流端には、遡上できた精子を回収する回収路と、前記遡上路及び前記回収路を流下させる緩衝液を供給する緩衝液供給路とが接続されており、
前記緩衝液供給路より供給された緩衝液の一部を前記遡上路へ流下させる一方、前記緩衝液の残部を回収路へ流下させて回収流と成し、前記遡上できた精子をこの回収流に乗せて捕集することを特徴とする精子スクリーニング装置。
【請求項５】
前記緩衝液供給路は、前記回収流が前記遡上できた精子の遡上能力を超える流速となる流量を供給可能な流路断面積としたことを特徴とする請求項４に記載の精子スクリーニング装置。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載の精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法であって、
前記選抜前精子液を前記貯留部に添加する精子添加工程と、
前記回収路には前記遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、前記緩衝液流路には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、前記遡上路において層流となる流速で、前記緩衝液供給路から前記緩衝液流路と前記回収路とに緩衝液を流し、前記貯留部に添加した選抜前精子液中に含まれる精子に前記遡上路を遡上させる精子遡上工程と、
前記回収流によって捕集された遡上できた精子を回収して授精用精子液とする回収工程とを有する授精用精子液の調製方法。
【請求項７】
前記選抜前精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子が受精能を獲得するタイミングを閾時間とし、同閾時間以前に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させ、又は、前記閾時間以降に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させる請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項８】
前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を向上させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を促進させて、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれた前記いずれか一方の性染色体を有する精子の割合を増加させることを特徴とする請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項９】
前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を低下させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を抑制して、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれたいずれか他方の性染色体を有する精子の割合を増加させることを特徴とする請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１０】
前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程の保存時間を長くして、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させる請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１１】
前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物と電子受容物質を存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させる請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１２】
前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物を存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させる請求項６に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１３】
前記電子受容物質は、フラビン類、フェナジン類、NAD(P)Hオキシドレダクターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか１つであることを特徴とする請求項１２に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１４】
前記精子保存工程にて、前記選抜前精子液中に、さらにヘキソース-6-リン酸を添加することを特徴とする請求項１１〜１３いずれか１項に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１５】
前記ヘキソース-6-リン酸は、D-グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、マンノース-6-リン酸、ガラクトース-6-リン酸よりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物であることを特徴とする請求項１４に記載の授精用精子液の調製方法。
【請求項１６】
前記フェノキサジン化合物は、ブリリアントクレシルブルー、ナイルブルー、ベーシックブルー、メルドラブルーよりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物であることを特徴とする請求項１１〜１５いずれか１項に記載の授精用精子液の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運動能力を欠いたり、死んだ精子や奇形の精子などが混在する精液等から運動性良好な精子を選抜する精子の選抜部構造、及び、同精子の選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置、並びに、同精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、畜産分野において、家畜を生産するために、人工授精が頻繁に行われている。また、ヒトの不妊治療などにおいても、人工授精が行われる場合がある。【０００３】
このような人工授精では、オスの個体から得られた精液を、メスの子宮内に注入して受胎させるため、できるだけ受胎効率の良い精液が望まれる。【０００４】
例えば畜産牛の分野において、人工授精に供される精液は、オスのウシから得た後に液体窒素で凍結されたものであることが多い。【０００５】
ところが、凍結後に解凍した精液は、その精液中に含まれる精子の多くが既に死んでいたり運動性が失われており、その割合は約５割〜７割にも達する場合が多く、また、奇形の精子も一部含まれていることから、受胎効率の向上を妨げる原因の一つとなっている。【０００６】
また、精液中の死んだ精子からは、受精の過程で必要に応じて用いられるはずの化学種が無秩序に放出される。【０００７】
すると、この化学種により良好な運動性を有する精子までが影響を受け、精液の質が更に低下することとなり好ましくない。【０００８】
従って、人工授精に用いられる精液は、運動性が良好な精子の割合が高く、死んだ精子などが除かれたものであるのが望ましい。【０００９】
そこで以前より、畜産の分野やヒトの不妊治療の分野では、運動性の良好な精子を回収する方法が種々提案されている。【００１０】
中でも、生きている精子が有する運動能力を利用して分離する方法は、精子に対する負荷も比較的小さいため、運動性を失った精子から運動性の良好な精子を分離し回収する手段として有用な方法であると言える。【００１１】
例えば、スライドガラス大の基板に刻設された微細な流路（マイクロ流路）に緩衝液などの所定の液を流し、運動性の良好な精子がこの緩衝液の流れに逆らって遡上する性質を利用して、回収する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。【００１２】
このような方法によれば、遠心分離に供する方法などに比して、精子に与えるダメージを軽減することができ、比較的良質な精子を回収することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Microfluidics and Nanofluidics, 2007, Vol.3, 561-570
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、上記従来の精子の遡上能を利用して回収する方法では、運動性の良好な精子を回収する効率の観点において、未だ改良の余地が残されていた。【００１５】
具体的には、非特許文献１の記載によれば、１分間あたり約10個程度の精子しか回収できないことが報告されている。【００１６】
例えば、体外受精（顕微授精）を行う場合にあっては、この程度の効率で精子が得られれば問題はないが、人工授精、すなわち子宮腔内精子注入法(intra uterine insemination:IUI)等を行う場合には、精子の分離に要する時間などを踏まえると、現実的には回収効率を著しく（例えば、１万〜１０万倍）向上させる必要がある。【００１７】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、運動性の良好な精子を効率良く分離することのできる精子の選抜部構造を提供する。また、本発明では、同選抜部構造を備えた精子のスクリーニング装置や、同スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法についても提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記従来の課題を解決するために、本発明に係る精子の選抜部構造では、動物より採取された精子を含有する選抜前精子液を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が遡上するように貯留部に連通した遡上路とよりなる精子の選抜部構造において、前記遡上路の下流部は、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路とし、この流路の下流端部を前記貯留部の壁面に臨ませて開口させることとした。【００１９】
また、本発明に係る精子の選抜部構造では、下記の点にも特徴を有する。
（１）前記広幅の流路は、前記開口から上流側へ向けて狭窄するように構成したこと。
（２）前記貯留部に前記遡上路を複数連結させたこと。【００２０】
また、本発明に係る精子スクリーニング装置では、動物より採取された精子を層流状の緩衝液中で所定区間遡上させ、遡上できた精子を捕集する前述の選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置であって、前記遡上路の上流端には、遡上できた精子を回収する回収路と、前記遡上路及び前記回収路を流下させる緩衝液を供給する緩衝液供給路とが接続されており、前記緩衝液供給路より供給された緩衝液の一部を前記遡上路へ流下させる一方、前記緩衝液の残部を回収路へ流下させて回収流と成し、前記遡上できた精子をこの回収流に乗せて捕集することとした。【００２１】
また、本発明に係る精子スクリーニング装置では、前記緩衝液供給路は、前記回収流が前記遡上できた精子の遡上能力を超える流速となる流量を供給可能な流路断面積としたことにも特徴を有する。【００２２】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法であって、前記選抜前精子液を前記貯留部に添加する精子添加工程と、前記回収路には前記遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、前記緩衝液流路には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、前記遡上路において層流となる流速で、前記緩衝液供給路から前記緩衝液流路と前記回収路とに緩衝液を流し、前記貯留部に添加した選抜前精子液中に含まれる精子に前記遡上路を遡上させる精子遡上工程と、前記回収流によって捕集された遡上できた精子を回収して授精用精子液とする回収工程とを有することとした。【００２３】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記選抜前精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子が受精能を獲得するタイミングを閾時間とし、同閾時間以前に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させ、又は、前記閾時間以降に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２４】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を向上させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を促進させて、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれた前記いずれか一方の性染色体を有する精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２５】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を低下させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を抑制して、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれたいずれか他方の性染色体を有する精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２６】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程の保存時間を長くして、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２７】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物と電子受容物質とを存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２８】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物を存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させることにも特徴を有する。【００２９】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記電子受容物質は、フラビン類、フェナジン類、NAD(P)Hオキシドレダクターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか１つであることにも特徴を有する。【００３０】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子保存工程にて、前記選抜前精子液中に、さらにヘキソース-6-リン酸を添加することにも特徴を有する。【００３１】
また、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記ヘキソース-6-リン酸は、D-グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、マンノース-6-リン酸、ガラクトース-6-リン酸よりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物であることにも特徴を有する。【００３２】
さらに、本発明に係る授精用精子液の調製方法では、前記フェノキサジン化合物は、ブリリアントクレシルブルー、ナイルブルー、ベーシックブルー、メルドラブルーよりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物であり、前記ヘキソース-6-リン酸は、D-グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、マンノース-6-リン酸、ガラクトース-6-リン酸よりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物であることにも特徴を有する。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、運動性の良好な精子を効率良く分離することのできる精子の選抜部構造を提供することができる。また、本発明によれば、運動性の良好な精子を効率良く分離することのできる選抜部構造を備えた精子のスクリーニング装置を提供することができる。さらに、本発明によれば、運動性の良好な精子を多く含有する授精用精子液の調製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本実施形態に係る精子の選抜部構造を示す概念図である。
【図２】本実施形態に係る精子の選抜部構造を示す概念図である。
【図３】本実施形態に係る精子の選抜部構造を示す概念図である。
【図４】本実施形態に係る精子のスクリーニング装置を示した説明図である。
【図５】本実施形態に係る精子のスクリーニング装置の構成を示した分解斜視図である。
【図６】本実施形態に係る精子のスクリーニング装置の構成を示した断面図である。
【図７】マイクロ流路の構成を示した説明図である。
【図８】合流部近傍を示した説明図である。
【図９】層状流路における遡上流の流れを示した説明図である。
【図１０】遡上する精子の様子を示した説明図である。
【図１１】遡上する精子の様子を示した説明図である。
【図１２】試験に使用したチップ体のマイクロ流路を示した説明図である。
【図１３】試験結果を示した説明図である。
【図１４】従来例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、動物より採取された精子を含有する選抜前精子液を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が逆流するように貯留部に連通した遡上路とよりなる精子の選抜部構造を提供するものである。
【００３６】
ここで、精子が緩衝液流に逆らって遡上する遡上路は、所定の緩衝液供給手段によって供給された緩衝液が貯留部方向へ層流として流れる緩衝液流路と実質的には同じ部分と解釈することができる。すなわち、遡上する精子の観点から本実施形態に係る精子の選抜部構造を見れば、緩衝液流路は、遡上路としても機能する部分であると言える。
【００３７】
このような緩衝液流路を遡上路として精子を遡上させる精子の選抜部構造は、rheotaxisと称される精子の性質を利用して運動性の良好な精子の選抜を行うための手段として従来より知られている。
【００３８】
例えば、図１４（ａ）に示すように、精液を貯留する貯留部１０１の側壁に狭隘な遡上路１０２を連結したような選抜部構造１０３がこれに該当する。
【００３９】
このような選抜部構造１０３によれば、狭隘な遡上路１０２において、緩衝液を白抜きの矢印で示す貯留部１０１側へ流すことにより、貯留部１０１の側壁内面に形成された開口部１０４（図１４（ｂ）参照）から精子を導いて、網掛けの矢印で示す方向へ遡上させることができる。
【００４０】
しかしながら、従来のrheotaxisもしくはswim upを利用した選抜方法、また、この選抜方法を利用した選抜部構造によっては、人工授精を行うに際して十分な量の良好な運動性を有する精子を効率的に得ることは困難であった。
【００４１】
これは、遡上路１０２を流れる比較的流速の高い緩衝液流が、開口部１０４から貯留部１０１内へ勢いを保ったまま流入するため、極めて運動能力に優れた精子のみしか開口部１０４へ近づくことができないためであると考えられる。
【００４２】
従って、このような選抜部構造１０３は、相当に優れた運動能力を有する精子をごく少数選抜するためには有用であるものの、受精能力を有する多くの精子は狭隘な遡上路１０２への進入さえもままならず、選抜を行うための母集団の低下を招き、大量の精子を回収するには不向きであった。
【００４３】
そこで、本実施形態に係る精子の選抜部構造に特徴的には、遡上路の下流部は、緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路（以下、層状流路とも言う。）とし、この流路の下流端部を貯留部の壁面に臨ませて開口させている。
【００４４】
このような構成とした場合、層状流路を流れて緩流となった広幅で層流状の緩衝液流を開口から貯留部内へ流出させることができ、運動性を有しない精子やゴミをスリット状の開口から遠ざける一方、運動性を有する精子に対しては間口を広くとりつつ、精子にrheotaxisの性質を惹起させて層状流路に多く誘い込むことができる。なお、開口の形状は特に限定されるものではないが、例えば層状流路の流路断面と同じ形状とし、貯留部の内壁面にスリット状に開口させても良い。
【００４５】
しかも、層状流路は流下する緩衝液流の層流を保てる形状としながらも幅広に形成しているため、遡上路の狭隘な流路部分（以下、狭隘遡上路ともいう。）を流れる緩衝液の流速に比して層状流路を流れる緩衝液に乱流を生じさせることなく流速を遅くすることができ、狭隘遡上路にて選抜する精子の母集団の数を飛躍的に向上させることができる。
【００４６】
付言すれば、層状流路は狭隘遡上路に比して幅広に形成しながらも、レイノルズ数の低い（例えば、１５００以下）流れを生起可能な形状としているため、精子が乱流に巻き込まれてしまうことがなく、効率的に狭隘遡上路へ精子を誘導することができる。
【００４７】
このように、本実施形態に係る精子の選抜部構造は、精子を貯留する貯留部と、精子を実際に選抜する狭隘遡上路との間に、精子を効率的に誘引する誘引手段としての層状流路を介設したものとも考えることができる。
【００４８】
すなわち、本実施形態に係る精子の選抜部構造は、動物より採取された精子を含有する選抜前精子液を貯留する貯留部と、同貯留部より導いた精子を層流状の液流中で遡上させる狭隘な遡上路と、を備えた精子の選抜部構造において、前記狭隘な遡上路の下流部には、前記貯留部より前記狭隘な遡上路へ精子を誘い込むための誘引手段が介設されており、同誘引手段は、前記狭隘な遡上路を流下する液流の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路、すなわち、層状流路とした精子の選抜部構造であるとも言える。
【００４９】
また、更に付言するならば、層状流路は、運動性の優劣についてはある程度許容しつつrheotaxisできる精子をできるだけ多く集合させ、層状流路に比して急流となる狭隘遡上路に進入させるための、母集団となる精子のスタンバイ領域であると考えることもできる。
【００５０】
また、層状領域は、貯留部内の選抜前の精子液から、運動性の優劣についてはある程度許容しつつ生きている精子を濃縮する（集合させる）ための領域と捉えることもできる。
【００５１】
また、精子の選抜を行うにあたり、貯留部には、精子を含有する選抜前精子液が収容される。このような選抜前精子液としては、オスの動物個体より得られたままの精液や、凍結後解凍された精液を用いることができるのは勿論のこと、精漿や緩衝液を添加して精子濃度や精漿を構成する成分を調整した成分調整精液や、精子を所定の緩衝液に分散させて調製した精子含有液も用いることができる。すなわち、本明細書において貯留部に添加する選抜前精子液は、オスの動物個体より得られたままの精液としての意味合いを含むのは勿論のこと、解凍精液、成分調整精液、精子含有液を総称する言葉として解するべきである。
【００５２】
また、本実施形態に係る精子の選抜部構造において層状流路は、貯留部の壁面に形成した開口から上流側へ向けて狭窄するように構成し、狭隘遡上路に連通させるのが望ましい。
【００５３】
ここで、このような層状流路の構成について、図面を参照しながら説明する。図１は、層状流路を介して狭隘遡上路を貯留部に連通させた状態を示す概念図である。なお、以下の説明で参照する図面は、本発明の理解を容易とするために示すものであり、大きさの比率などは必ずしも正確ではない。例えば、貯留部に対する層状流路や狭隘遡上路の厚みや幅、長さなどは誇張して示している。また、以下の説明において貯留部の内壁に設けられる開口の形状は、具体化した場合の一例としてスリット状としているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５４】
図１（ａ）に示した精子の選抜部構造Ａは、選抜前精子液を貯留する外観視直方体状で中空の貯留部１０と、精子を遡上させて良好な運動性を有する精子を選抜する狭隘遡上路１１とを備えている。
【００５５】
また、狭隘遡上路１１と貯留部１０との間には、流路を幅広状に形成した層状流路１２が介設されており、層状流路１２の下流側端部を貯留部１０の側壁内面にスリット状に開口させている。なお、図１（ａ）において白抜きの矢印は精子を遡上させるための緩衝液の流れの方向を示し、網掛けの矢印は精子の遡上方向を示している。
【００５６】
図１（ｂ）は、図１（ａ）に示す選抜部構造ＡのＸ２−Ｘ２断面を示した図であるが、図１（ｂ）からも分かるように、層状流路１２は、貯留部１０の側壁内面に望ませたスリット状開口部１３から緩衝液の流れの上流側へ向かって狭窄させており、この狭窄させた部分に狭隘遡上路１１を連結させている。
【００５７】
このような構成とすることにより、選抜部構造Ａによれば、層状流路１２に誘導された運動性を有する精子を、円滑に狭隘遡上路１１へ導くことができる。
【００５８】
なお、本発明者らが行った先行技術調査によれば、WO2012/163087のようなマイクロ流路を備える装置が見れるが、この装置は、精子の泳ぐ速度と流速とを均衡させてキャプチャーするものであり、また、層状の流路を備えるものでもなく、本発明の如く母集団をできるだけ大きくしつつ、所定の運動能力を超える精子を大量に捕集するという概念に基づいてなされたものではない。このWO2012/163087に記載の発明は、精子の運動能力別に画分することによって運動能力を評価する装置であって、本願発明とは構造や概念において全く異なるものであると言える。
【００５９】
また、図２（ａ）に変形例に係る選抜部構造Ｂを示し、図２（ｂ）にそのＸ３−Ｘ３断面図を示す。
【００６０】
この選抜部構造Ｂは、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すように、前述の選抜部構造Ａと略同様の構成と機能を有するものであるが、貯留部２０が円筒状である点や、スリット状開口部２３が内壁面に沿って湾曲している点、層状流路２２が平面視において緩衝液の流れの上流側へ向かって連続的な曲線を描きながら漸次狭窄している点で構造を異にしている。
【００６１】
そして、このような構成を備える選抜部構造Ｂによれば、貯留部２０より層状流路２２に誘引した運動性を有する精子を狭隘遡上路２１へ誘導するに際し、前述の選抜部構造Ａよりも円滑に導くことができる。
【００６２】
これは、精子が遡上する際に壁際に沿って移動することが多く、また、角部に滞留しやすいという性質によるものであり、選抜部構造Ｂは選抜部構造Ａと比較して、図１（ｂ）にて網掛けで示すような角部１４が層状流路２２に存在しないため、精子の滞留を防止することができ、精子を狭隘遡上路２１へ効率良く導くことができる。
【００６３】
図３は、更なる変形例に係る選抜部構造Ｃを示した概念図である。図３（ａ）にその全体構造を示し、図３（ｂ）に図３（ａ）におけるＸ４−Ｘ４断面を示す。
【００６４】
選抜部構造Ｃもまた同様の機能を有するものであるが、図３（ａ）及び図３（ｂ）に示すように、層状流路３２を湾曲させている点や、貯留部３０の内壁面の一つである底壁に層状流路３２のスリット状開口部３３を設けている点で構成を異にしている。
【００６５】
このような構成を備える選抜部構造Ｃによっても、運動性を有する精子を貯留部３０より層状流路３２へ効率良く導いて、狭隘遡上路３１にて運動性の良好な精子を選抜することができる。
【００６６】
特に、この選抜部構造Ｃによれば、スリット状開口部３３を、直線状ではなく湾曲させて設けているため、直線状に開口を設けた場合に比して開口面積を大きくすることができ、層状流路３２への精子の誘導をさらに効率的に行うことができる。
【００６７】
また、本実施形態に係る精子スクリーニング装置は、動物より採取された精子を層流状の緩衝液中で所定区間遡上させ、遡上できた精子を捕集する本実施形態に係る精子の選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置であって、前記遡上路の上流端には、遡上できた精子を回収する回収路と、前記遡上路及び前記回収路を流下させる緩衝液を供給する緩衝液供給路とが接続されており、前記緩衝液供給路より供給された緩衝液の一部を前記遡上路へ流下させる一方、前記緩衝液の残部を回収路へ流下させて回収流と成し、前記遡上できた精子をこの回収流に乗せて捕集することを特徴とするものである。
【００６８】
このような構成とすることにより、運動性の良好な精子を効率良く選抜しつつ、選抜した精子に過大な負荷をかけることなく、回収することができる。
【００６９】
また、緩衝液供給路は、回収流が遡上できた精子の遡上能力を超える流速となる流量を供給可能な流路断面積とするのが望ましい。
【００７０】
このような構成とすることにより、遡上できた精子を強制的に回収することができ、精子が回収路で遡上してしまうことを防止することができる。
【００７１】
また、本発明では、上述の精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法についても提供する。
【００７２】
特に、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法では、前記選抜前精子液を前記貯留部に添加する精子添加工程と、前記回収路には前記遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、前記緩衝液流路には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、前記遡上路において層流となる流速で、前記緩衝液供給路から前記緩衝液流路と前記回収路とに緩衝液を流し、前記貯留部に添加した選抜前精子液中に含まれる精子に前記遡上路を遡上させる精子遡上工程と、前記回収流によって捕集された遡上できた精子を回収して授精用精子液とする回収工程とを有することとしている。
【００７３】
本実施形態に係る授精用精子液の調製方法にて調製された授精用精子液は、例えば、人工授精（子宮腔内精子注入法）や、試験管内授精、顕微授精などに代表される体外受精等、種々の人工的な交配に使用可能である。特に、将来的には、家畜牛の繁殖は、徐々に体外受精も増えていくことが予測されており、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法にて調整された授精用精子液は、能率的な交配を行うにあたり極めて有用である。また、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法にて調整された授精用精子液は、授精を行うのに十分な運動能力を有する精子を高濃度で含有しているため、特に人工授精用精子液として利用価値が高い。
【００７４】
また、所定のタイミングを閾時間とし、同閾時間以前に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させ、又は、前記閾時間以降に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させるようにしても良い。
【００７５】
ここで閾時間は、例えば、受精能を獲得した生きている性染色体Ｘ又は性染色体Ｙを備える精子の数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフにおいて、性染色体Ｘを有する受精能を獲得した生きている精子の数のピークと性染色体Ｙを有する受精能を獲得した生きている精子の数のピークとの谷間となる時間とすることもできる。
【００７６】
また例えば、閾時間は、選抜前精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子が受精能を獲得するタイミングとしても良い。これら閾時間は、精子の状態等に合わせて適宜決定することも可能である。
【００７７】
そして、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法では、所定のタイミングを閾時間とし、同閾時間以前に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させ、又は、前記閾時間以降に前記精子添加工程を行って前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させるようにしても良い。
【００７８】
このような方法によって得られた授精用精子液は、性染色体Ｘを備えた精子が、性染色体Ｙを備えた精子の数に比して多く含まれることとなり、雌性を得るのに有利な授精用精子液とすることができる。
【００７９】
また、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を向上させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を促進させて、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれた前記いずれか一方の性染色体を有する精子の割合を増加させることとしても良い。
【００８０】
すなわち、精子添加工程にて使用する選抜前精子液中の精子のうち、いずれかの性染色体を有する精子の運動能力を向上しておくことにより、効率良くその精子を遡上させることができ、雌雄いずれかを得るのに有利な授精用精子液を調製することができる。
【００８１】
また、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘを有する精子と性染色体Ｙを有する精子とのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を低下させることにより、前記精子遡上工程にて前記遡上路における前記いずれか一方の性染色体を有する精子の遡上を抑制して、前記回収工程にて得られる前記授精用精子液中に含まれたいずれか他方の性染色体を有する精子の割合を増加させることとしても良い。
【００８２】
すなわち、精子添加工程にて使用する選抜前精子液中の精子のうち、性染色体Ｘ及びＹのいずれか一方の性染色体を有する精子の運動能力を低下させておくことにより、いずれか他方の性染色体を有する精子を優先的に遡上させて、雌雄いずれかを得るのに有利な授精用精子液を調製することができる。
【００８３】
また、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程の保存時間を長くして、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させることもできる。
【００８４】
Ｘ染色体を有する精子は、Ｙ染色体を有する精子に遅れて受精能を獲得するため、精子保存工程における保存時間を長くすることにより、授精用精子液中における受精能を獲得したＸ染色体を有する精子の数を増やすことができ、雄性を得るのに有利な授精用精子液とすることができる。なお、このときの保存時間は特に限定されるものではないが、例えば、閾時間よりも長くする保存を行うことで、雄性をより有利に得ることのできる授精用精子液とすることができる。
【００８５】
また、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法では、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物を存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させるようにしても良い。
【００８６】
このときの精子保存工程は、電子受容物質の非存在下で行うのが好ましい。なお、ここでいう電子受容物質の非存在下とは、意図的に添加した電子受容物質が存在していない条件下のことを意味しており、精子や精液中に元々存在している電子受容物質までもが存在していない条件下を意味するものではない。
【００８７】
このような条件で精子保存工程を行うことにより、性染色体Ｙを多く含む雄性を得るのに有利な授精用精子液を調製することができる。
【００８８】
また、前記精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程にて、前記選抜前精子液中にフェノキサジン化合物と電子受容物質を存在させて、前記授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させるようにしても良い。
【００８９】
このような条件で精子保存工程を行うことにより、性染色体Ｘを多く含む雌性を得るのに有利な授精用精子液を調製することができる。
【００９０】
また、電子受容物質は、フラビン類、フェナジン類、NAD(P)Hオキシドレダクターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか１つであることとしても良い。例えば、電子受容物質をNAD(P)Hオキシドレダクターゼとした場合、精子保存工程に供する選抜前精子液中において、0.1〜10U/ml程度の濃度とするのが好ましい。濃度が0.1U/ml未満であると精子に対し十分な影響を与えることが困難となる。また10U/mlを越える量としても、更なる効果は得がたく、むしろ精子への毒性が懸念される。電子受容物質の濃度を0.1U/ml以上、10U/ml以下とすることにより、精子に対する毒性を抑制しつつ十分な影響を与えることができる。
【００９１】
また、必要に応じ、精子保存工程にて選抜前精子液中に、さらにヘキソース-6-リン酸を添加することとしても良い。
【００９２】
なお、上記フェノキサジン化合物やヘキソース-6-リン酸、電子受容物質は特に限定されるものではないが、具体的には以下のような物質を利用することが可能である。
【００９３】
すなわち、フェノキサジン化合物としては、例えば、ブリリアントクレシルブルー、ナイルブルー、ベーシックブルー、メルドラブルーよりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物とすることができる。このフェノキサジン化合物は、精子保存工程に供する選抜前精子液中において、1〜100μM程度の濃度とするのが好ましい。濃度が1μM未満であると精子に対し十分な影響を与えることが困難となる。また100μMを越える量としても、更なる効果は得がたく、むしろ精子への毒性が懸念される。フェノキサジン化合物の濃度を1μM以上、100μM以下とすることにより、精子に対する毒性を抑制しつつ十分な影響を与えることができる。
【００９４】
また、ヘキソース-6-リン酸としては、例えば、D-グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、マンノース-6-リン酸、ガラクトース-6-リン酸よりなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上の混合物とすることができる。このヘキソース-6-リン酸は、精子保存工程に供する選抜前精子液中において、0.1〜100mM程度の濃度とするのが好ましい。濃度が0.1mM未満であると精子に対し十分な影響を与えることが困難となる。また100mMを越える量としても、更なる効果は得がたく、むしろ効果を阻害することが懸念される。ヘキソース-6-リン酸の濃度を0.1μM以上、100mM以下とすることにより、精子に対する毒性を抑制しつつ十分な影響を与えることができる。
【００９５】
以下、本実施形態に係る精子の選抜部構造、及び、精子スクリーニング装置、並びに同精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法について図面を参照しながら更に具体的に説明する。なお以下の説明では、授精用精子液の一具体例として人工授精用（子宮腔内精子注入法用）の精子液について言及するが、これに限定されるものではなく、試験管内授精や顕微授精用の精子液としても使用可能であることは勿論である。
【００９６】
図４は、本実施形態に係る精子スクリーニング装置Ｄの構成を示した説明図である。図４に示すように、精子スクリーニング装置Ｄは、底部形成板４１とチップ体４２とを重畳して形成した本体部４３上に、３つの筒体４４を載置して構成している。また、各筒体４４の内部を、それぞれ緩衝液収容部４５、選抜前精子液貯留部４６、回収部４７としている。
【００９７】
そして、緩衝液収容部４５に緩衝液を所定量注入し、選抜前精子液貯留部４６に選抜前精子液を所定量注入し、回収部４７にも緩衝液を所定量注入しておくことで、マイクロ流体の働きによって、選抜前精子液貯留部４６に収容した選抜前精子液中に含まれる精子の中から良好な運動性を有する精子を選抜し、回収部４７にて緩衝液と共に回収可能としている。
【００９８】
本体部４３を構成する底部形成板４１は、図５の分解斜視図、及び図６の断面図に示すように、チップ体４２を載置するための基板であり、緩衝液収容部４５や選抜前精子液貯留部４６、回収部４７の底部を形成したり、チップ体４２の裏面に形成した後述の流路パターン５２ａの底部を形成する部材としての役割を果たすものである。なお、底部形成板４１は、例えばガラスや樹脂（アクリルやPDMS）により形成することができる。
【００９９】
本体部４３を構成するチップ体４２は、樹脂にて形成された板状の部材であり、実施形態ではポリジメチルシロキサン（PDMS）にて形成している。
【０１００】
また、チップ体４２には、３つの孔を穿設している。これら３つの孔は、それぞれ前述の緩衝液収容部４５の一部を構成する緩衝液用孔部４８と、選抜前精子液貯留部４６の一部を構成する貯留部用孔部４９と、回収部４７の一部を構成する回収部用孔部５０である。
【０１０１】
また、チップ体４２の裏面には、微細加工によって流路パターン５２ａが形成されている。この流路パターン５２ａは、底部形成板４１とチップ体４２とを重ね合わせることでマイクロ流路５２を形成するためのものである。流路パターン５２ａは、緩衝液用孔部４８や、貯留部用孔部４９、回収部用孔部５０を連通させる複数の溝部５１や、前述の層状流路を形成するための層状流路形成用凹部５３を刻設することで形成している。
【０１０２】
各筒体４４は、緩衝液用孔部４８や、貯留部用孔部４９、回収部用孔部５０の周縁に配置して、緩衝液収容部４５や選抜前精子液貯留部４６、回収部４７における収容可能量を大きくするための壁体として機能するものである。各筒体４４は、それぞれの孔部の直径よりも大きな外径を有しており、各孔部の周縁に水密状に配置固定される。
【０１０３】
次に、底部形成板４１とチップ体４２を重ね合わせることで形成されるマイクロ流路５２の構成について、図７を参照しながら説明する。
【０１０４】
図７に示すように、マイクロ流路５２は、選抜前精子液貯留部４６の壁面の一部を構成する貯留部用孔部４９と回収部用孔部５０とを結ぶ貯留部−回収部連通流路６０と、緩衝液用孔部４８から貯留部−回収部連通流路６０の中途部に連結させた２本の緩衝液供給路６１とで構成している。また、貯留部−回収部連通流路６０と、緩衝液供給路６１とが交わる部分を合流部６２としている。
【０１０５】
貯留部−回収部連通流路６０は、合流部６２から選抜前精子液貯留部４６側に向けて形成した遡上路６３と、合流部６２から回収部４７側に向けて形成した回収路６４とで構成している。
【０１０６】
また、緩衝液供給路６１は、緩衝液収容部４５内に収容した緩衝液を合流部６２に送給するための流路である。なお、緩衝液収容部４５及び緩衝液供給路６１は、前述の緩衝液供給手段として機能する。
【０１０７】
緩衝液供給路６１により合流部６２に供給された緩衝液は、一部が遡上路６３へ流れ、残部が回収路６４に流れるように構成している。なお、以下の説明において、遡上路６３に流れ込み流下する緩衝液流を遡上流といい、回収路６４に流れ込み流下する緩衝液流を回収流という。
【０１０８】
遡上路６３は、選抜前精子液貯留部４６内に貯留されている選抜前精子液から精子を誘導し、良好な運動性を有する精子を選抜するための流路であり、狭隘遡上路６５と層状流路６６とで構成している。
【０１０９】
狭隘遡上路６５は、合流部６２にて分流した緩衝液により生ずる遡上流中で精子を遡上させることにより、良好な運動性を有する精子を合流部６２へ向けて遡上させつつ、奇形の精子や人工授精を行うに際し好ましくない程度に運動性に劣る精子を遡上流に乗せて脱落させ合流部６２に至らないようにするための流路である。
【０１１０】
また、層状流路６６は、図１〜図３を用いて説明したように、選抜前精子液貯留部４６内の精子を効率良く狭隘遡上路６５へ導くための誘引手段として機能する部位であり、図７において網掛けで示す部位である。なお、層状流路６６の下流側端部（遡上路６３の下流側端部）に示す破線は、選抜前精子液貯留部４６の側壁部に開口させたスリット状開口部６７である。
【０１１１】
このように、マイクロ流路５２では、狭隘遡上路６５、層状流路６６、スリット状開口部６７により、本実施形態に係る精子の選抜部構造を構成している。
【０１１２】
回収路６４は、狭隘遡上路６５を遡上流に逆らって遡上し合流部６２に至った精子を回収するための流路であり、合流部６２に至った精子を回収流に乗せて回収部４７へ流し込むための部位である。
【０１１３】
そして、このような構成を有するマイクロ流路５２によれば、選抜前精子液貯留部４６に選抜前精子液を添加する精子添加工程を行い、同選抜前精子液貯留部４６に収容された選抜前精子液から、スリット状開口部６７、層状流路６６、狭隘遡上路６５により良好な運動性を有する精子が多数の母集団から効率良く選抜され、回収流と共に回収部４７に回収されることとなる。
【０１１４】
特に、本実施形態に係る精子スクリーニング装置Ｄのマイクロ流路５２では、遡上流が、運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速以下で、且つ、遡上路６３（狭隘遡上路６５及び層状流路６６）にて緩衝液流が層流となる流速となるように、緩衝液供給路６１が形成されている。
【０１１５】
また、本実施形態に係る精子スクリーニング装置Ｄのマイクロ流路５２では、回収流が、合流部６２に至った（遡上できた）精子の運動能力を上回る流速となるように緩衝液供給路６１が形成されている。
【０１１６】
すなわち、緩衝液供給路６１は、２つの緩衝液供給路６１によって、合流部６２に対し、上記条件を満たす遡上流と回収流を生成できる流量を供給可能な流路断面積を有するように形成している。
【０１１７】
従って、図８に示すように、２本の緩衝液供給路６１によって供給される緩衝液が合流部６２に至ると、その一部は網掛けの矢印で示すように遡上路６３（狭隘遡上路６５）に流入し、良好な運動性を有する精子が遡上可能で、運動性に劣る精子には遡上困難な層流状の遡上流が形成されることとなる。
【０１１８】
また、緩衝液供給路６１によって供給される緩衝液の残部は、白抜きの矢印で示すように回収路６４に流入し、良好な運動性を有する精子であっても遡上困難な回収流が形成されることとなる。
【０１１９】
遡上流は、狭隘遡上路６５を流下し、層状流路６６に至る。このとき、層状流路６６は、流下する遡上流が層流状態を維持しつつ緩流となる広幅の流路に形成されているため、図９に示すように狭隘遡上路６５を流れる遡上流よりも緩流で層流を保った流れが形成される。
【０１２０】
それゆえ、流速が低下した広幅で層流状の遡上流をスリット状開口部６７から流出させることができ、運動性を有しない精子やゴミを開口から遠ざける一方、運動性を有する精子に対しては間口を広くとりつつ、精子にrheotaxisの性質を惹起させて層状流路６６に多くの精子を誘い込むことができる。
【０１２１】
付言すれば、回収路６４には遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、遡上路６３（緩衝液流路）には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、遡上路において層流となる流速で、緩衝液供給路６１から遡上路６３（緩衝液流路）と回収路６４とに緩衝液を流し、選抜前精子液貯留部４６に添加した選抜前精子液中に含まれる精子に遡上路６３を遡上させる精子遡上工程が行われることとなる。
【０１２２】
また、層状流路６６は、遡上流の上流側へ向けて漸次狭窄するように構成しているため、図１０に示すように、層状流路６６に誘引された精子Ｓは徐々に狭隘遡上路６５の入口部に集合することとなり、効率良く精子Ｓ１を狭隘遡上路６５に誘導することができる。
【０１２３】
また、狭隘遡上路６５の入口部近傍では、徐々に（連続的に）流速が上がるため、奇形の精子など運動性は有するものの正常な運動ができない精子は、遡上が阻まれることとなる。
【０１２４】
また、狭隘遡上路６５における遡上流の流速に抗して遡上することのできない精子Ｓ２も脱落する。
【０１２５】
狭隘遡上路６５では、運動性に劣る精子Ｓ３は遡上できず、良好な運動性を有する精子Ｓ１が遡上可能な程度の流速で遡上流が流れているため、図１１に示すように、運動性に劣る精子Ｓ３は脱落することとなり、良好な運動性を有する精子Ｓ１が選抜されることとなる。
【０１２６】
そして、良好な運動性を有する精子Ｓ１が狭隘遡上路６５の上流側端部まで遡上し、合流部６２に至ると、緩衝液供給路６１から回収路６４へ向かう流れによって、回収路６４の入口部分に引き寄せられ、回収流により回収部４７へ送り込まれることとなる。この回収流によって捕集された遡上できた精子を回収する回収工程を行うことで人工授精用精子液の調製が行われる。すなわち、送り込まれた精子を含有する回収部４７内の貯留液は、従来になく高濃度で良好な運動性を有する精子を含有しているため、人工授精用精子液として使用することができる。
【０１２７】
このように、本実施形態に係る精子スクリーニング装置Ｄによれば、本実施形態に係る精子の選抜部構造を備えているため、運動性の良好な精子を効率良く分離することができる。
【０１２８】
〔精子スクリーニング試験〕
次に、種々の流路パターンを有するチップ体を用いて構成した精子スクリーニング装置で行った精子のスクリーニングの試験について説明する。本試験はすなわち、授精用精子液の調製試験、より具体的には人工授精用精子液の調製試験でもある。
【０１２９】
本試験では、精子スクリーニング装置Ｄのチップ体４２に該当する部分を、図１２に示す種々のチップ体に差し替えて試験し、回収できた精子の数や、運動性を有する精子の割合、直線速度、曲線速度、直進性を求めた。
【０１３０】
図１２において示すチップ１は、平面視において前述のマイクロ流路５２と略同じ構成を有するものである。ａで示す緩衝液収容部の内径は10mm、ｂで示す選抜前精子液貯留部の内径は７mm、ｃで示す回収部の内径は８mm、Ａで示す緩衝液供給路の長さは20.58mm、幅300μｍ、深さ100μｍ、Ｂで示す狭隘遡上路の長さは2.5mm、幅200μｍ、深さ100μｍ、Ｃで示す回収路６４の長さは2.5mm、幅200μｍ、深さ100μｍであり、網掛けで示す層状流路の深さは100μｍで、平面視における面積は12.14mm2である。
【０１３１】
また、チップ２は、前述のチップ１と同様に平面視において前述のマイクロ流路５２と略同じ構成を有するものであるが、狭隘遡上路の幅と、回収路の幅を400μｍとして遡上流及び回収流の流量は変更することなく、２倍緩やかな流れとした構成である。
【０１３２】
また、チップ３は、前述のチップ２と同様に平面視において前述のマイクロ流路５２と略同じ構成を有するものであるが、さらに緩衝液供給路の幅についても600μｍとし、チップ１に比して２倍速い流れで流量も２倍とした構成である。
【０１３３】
また、チップ４は、一つの選抜前精子液貯留部に対して２つの遡上路を設けた構成としたものである。具体的には、ａで示す２つの緩衝液収容部の内径は８mm、ｂで示す選抜前精子液貯留部の内径は5.6mm、ｃで示す２つの回収部の内径は6.4mm、Ａで示す４本の緩衝液供給路の長さは7.62mm、幅300μｍ、深さ100μｍ、Ｂで示す２本の狭隘遡上路の長さは３mm、幅200μｍ、深さ100μｍ、Ｃで示す２本の回収路６４の長さは2.5mm、幅200μｍ、深さ100μｍであり、２つの層状流路の深さは100μｍで、平面視における面積はいずれも18.64mm2である。
【０１３４】
チップ５もまたチップ４と同様に、一つの選抜前精子液貯留部に対して２つの遡上路を設けた構成としたものである。具体的には、ａで示す２の緩衝液収容部の内径は10mm、ｂで示す選抜前精子液貯留部の内径は7mm、ｃで示す２つの回収部の内径は8mm、Ａで示す４本の緩衝液供給路の長さは9.05mm、幅300μｍ、深さ100μｍ、Ｂで示す２本の狭隘遡上路の長さは３mm、幅200μｍ、深さ100μｍ、Ｃで示す２本の回収路６４の長さは１mm、幅200μｍ、深さ100μｍであり、２つの層状流路の深さは100μｍで、平面視における面積はいずれも25.06mm2である。
【０１３５】
そして、これらのチップ１〜５を用いて精子スクリーニング装置を構成し、緩衝液と選抜前精子液としての凍結解凍精液を添加して、精子のスクリーニング試験を行った。
【０１３６】
試験で使用した凍結解凍精液は、総精子濃度が69±4.5百万/ml、動いている精子の割合が21±5.8％、直線速度は67±14μｍ/sec、曲線速度は144±11μｍ/sec、直進性は0.44±0.06であった。また、スクリーニング時間は、30分間とした。これらの試験結果を図１３に示す。
【０１３７】
図１３からも分かるように、いずれのチップ１〜５においても、少なくとも従来の数十個／分というオーダーを遙かに凌ぐ、30分あたり数百万／mlという濃度で効率良く精子を分離することができた。すなわち、人工授精に適した精子液の調製を行うことができた。
【０１３８】
また、動いている（生きている）精子の割合に着目すると、使用した凍結解凍精液（未処理）では21±5.8％であったのに対し、チップ１〜５の全てにおいて回収された精子の生きている割合は、70％以上にまで高められているのが分かる。
【０１３９】
また、直進性についても向上しており、奇形の精子も極めて効率良く除去されていることが示された。
【０１４０】
このように、本実施形態に係る精子スクリーニング装置によれば、従来の緩衝液流路を遡上路として精子を遡上させる精子のスクリーニングに比べて、極めて効率良く良好な運動性を有する精子を回収できることが示された。
【０１４１】
ところで、本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いれば、人工授精における雌雄受胎確率を所望する性に偏らせる（偏倚させる）ことも可能である。
【０１４２】
すなわち、本実施形態に係る人工授精用精子液の調製方法によれば、性染色体Ｘを備える精子（以下、Ｘ精子ともいう。）又は性染色体Ｙを備える精子（以下、Ｙ精子ともいう。）の割合を任意に増加させた人工授精用精子液を調製することができる。
【０１４３】
このような人工授精用精子液の調製方法について、以下に更に言及する。
【０１４４】
従来畜産農家によって所望する性の家畜、例えば牛の生産が試みられている。
【０１４５】
しかし、この産み分けは畜産農家の経験や勘に頼るところが大きく、一般化された技術としては確立していないのが実情である。
【０１４６】
特に、同一のオス個体から異なるタイミングで得られた２つの精液を混合して調製された精子液（選抜前精子液）は、受精能の獲得（capacitation)のタイミングが分散しており、必ずしも良好な結果が得られるとは言い難い。
【０１４７】
一方、本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いれば、Ｘ精子又はＹ精子の割合を、選抜前精子液におけるＸ精子又はＹ精子の割合よりも増加させた人工授精用精子液の調製を実現することができる。また、ひいては所望する性の家畜の受胎確率を向上させることができる。
【０１４８】
具体的には、前述の精子スクリーニング装置を用いた人工授精用精子液の調製方法であって、前記精子スクリーニング装置は、動物より採取された精子含む精子液を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が遡上するように貯留部に連通した遡上路とを備え、前記遡上路の下流部は、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路とし、この流路の下流端部を前記貯留部の壁面に臨ませて開口させると共に、前記遡上路の上流端には、遡上できた精子を回収する回収路と、前記遡上路及び前記回収路を流下させる緩衝液を供給する緩衝液供給路とが接続されており、前記緩衝液供給路より供給された緩衝液の一部を前記遡上路へ流下させる一方、前記緩衝液の残部を回収路へ流下させて回収流と成し、前記遡上できた精子をこの回収流に乗せて捕集するものであり、前記精子液を前記貯留部に添加する精子添加工程と、前記回収路には前記遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、前記緩衝液流路には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、前記遡上路において層流となる流速で、前記緩衝液供給路から前記緩衝液流路と前記回収路とに緩衝液を流し、前記貯留部に添加した精子に前記遡上路を遡上させる精子遡上工程と、前記回収流によって捕集された遡上できた精子を回収する回収工程とを有する人工授精用精子液の調製方法をベースとしたものである。
【０１４９】
そして特徴的には、前記選抜前精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子が受精能を獲得するタイミングを閾時間とし、同閾時間以前に前記精子添加工程を行って前記人工授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合を増加させ、又は、前記閾時間以降に前記精子添加工程を行って前記人工授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させる。
【０１５０】
なお、家畜として牛を例にすると、オスの牛の中には、比較的早期に受精能を獲得するＸ精子を含んだ精液を分泌する個体もあれば、遅くに受精能を獲得するＸ精子を含んだ精液を分泌する個体もある。また、同じ個体であっても、その時の体調や季節等によって精液中の精子の状態が変化する。したがって、上記閾時間は、個体別に、また、その個体の状態に応じてそれぞれ適宜決定される。この閾時間の決定にあたっては、どの程度の時間でＸ精子が受精能を獲得し始めるのかについて、個体毎に予備試験等を行うことで決定することができる。
【０１５１】
また、ここで説明する人工授精用精子液の調製方法は、前述の精子添加工程を行う前に前記選抜前精子液を保存する精子保存工程の保存時間を長くして、人工授精用精子液中に含まれる性染色体Ｘを備えた精子の割合を増加させる人工授精用精子液の調製方法であるとも言える。
【０１５２】
以下、本実施形態に係る人工授精用精子液の調製方法の更なる実験例について以下に示す。
【０１５３】
〔実験例１〕
JAさがより購入した「辰之介（しんのすけ；黒毛和種）」の凍結精液を37℃で解凍後、遠心により、精漿（capacitationを抑える作用）と抗凍結剤などを除去した。
【０１５４】
その後、予め行った予備試験結果に基づき閾時間を解凍後10時間とし、37℃で9時間または15時間保存して精子保存工程を行ったのち、本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いて運動能力の高い精子を捕集した。
【０１５５】
次いで、リアルタイムPCR法により、この捕集した精子のXとYの割合を調べた。表１にその結果を示す。
【表１】
2014136464.tif 000003
【０１５６】
〔実験例２〕
前述の実験例１と同様に、JAさがより購入した「七宝神（しちほうじん；黒毛和種）」について試験を行った。その結果を表２に示す。
【表２】
2014136464.tif 000004
【０１５７】
表１及び表２からも分かるように、いずれの実験例においても、閾時間である10時間よりも前であれば、Ｙ精子の割合を選抜前精子液におけるＹ精子の割合よりも増加させることができた。
【０１５８】
また、閾時間である10時間よりも後であれば、Ｘ精子の割合を選抜前精子液におけるＸ精子の割合及び閾時間前に選抜した精子液におけるＸ精子の割合よりも増加させたり（表１参照。）、閾時間前に選抜した精子液におけるＸ精子の割合よりも増加させることができた（表２参照。）。
【０１５９】
これらの結果より、本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法によれば、Ｙ精子の割合を選抜前精子液におけるＹ精子の割合よりも増加させた授精用精子液の調製や、Ｘ精子の割合を選抜前精子液及び閾時間前に選抜した精子液におけるＸ精子の割合、又は閾時間前に選抜した精子液におけるＸ精子の割合よりも増加させた授精用精子液の調製を実現することができる。また、ひいては所望する性の家畜の受胎確率を向上させることができる。
【０１６０】
すなわち、上述の本実施形態に係る授精用精子液の調製方法は、本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いることにより、選抜前精子液中の精子を運動能力によってスクリーニングして授精に適した精子の成熟時期をある程度揃え、更に受精能獲得のタイミングを図りつつ、所望の性染色体を備えた精子の割合を増加させる方法と捉えることもできる。
【０１６１】
従って、選抜前精子液と比較して、授精に適した精子の含有割合が高く、しかも性比に偏りのある授精用精子液を調製することができるため、経験等によらず堅実な産み分けを行うことも可能となる。
【０１６２】
また、表１及び表２に示した結果より、精子保存工程をより長く行った選抜前精子液にて調製した人工授精用精子液は、保存時間の短い選抜前精子液にて調製した人工授精用精子液に比してＸ精子の含有割合が上昇することが示された。なお、表２における解凍後６時間目のＸ精子の割合のデータは、解凍後３時間目におけるＸ精子の割合のデータよりも少なくなっているが、これは計測誤差の範囲内であり、実質的には、同じ又は増加しているものと考えられる。
【０１６３】
それゆえ、上述の人工授精用精子液の調製方法は、メスの個体を優先的に得る方法としても有用であると言える。
【０１６４】
次に、精子保存工程にて所定の物質を添加することにより、雌性または雄性の個体を優先的に得ることのできる人工授精用精子液の調製方法について説明する。
【０１６５】
精子は、その中で解糖系を利用して、その運動に必要なエネルギーを産生する回路を働かせているが、ここにもＸ精子とＹ精子の間に違いがあることが知られている。
【０１６６】
このことを利用して、この回路のいずれかの段階を阻害したり、または促進するような物質の添加を行うことで、予めＸ精子とＹ精子の運動能力に差をつけ、このような精子を含む選抜前精子液を前述の精子スクリーニング装置に供することで、雌性または雄性の個体を優先的に得ることのできる人工授精用精子液を調製可能である。
【０１６７】
従来より、精子の性別に特徴的なエネルギー産生の反応経路の違いなどは知られていたが、Ｘ精子とＹ精子のいずれか一方の精子のみの運動を完全停止させるようなことは困難であった。つまり、精子が完全停止させるほど試薬を添加すると、精子が死んでしまうことが多く、それ故、性選別方法としての利用は進んでいなかった。
【０１６８】
しかしながら、上述した本実施形態に係る精子スクリーニング装置を用いれば、特徴の一つである泳ぐスピードごとに捕集するという性能により、どちらか一方だけが若干遅くなる程度の差をつけるだけで、すなわち、精子に毒性を与えるよりもはるかに低濃度の物質の添加量で性選別方法として利用することができる。以下、その実験例について具体的に説明する。
【０１６９】
〔実験例３〕
WHGオーシヤニツクジヨビアンET（ホルスタイン種）の凍結精液を所定の手順で解凍した。解凍精液200μLを1.5mL容チューブに分取して遠心（7分、2000rpm）し、上澄みを半分ほど捨て、約100μL残した状態とした。
【０１７０】
このチューブに、約100μLの緩衝液（市販の「SP-TALP」水溶液に、6mg/mL BSA+10μg/mLジェンタマイシン+5mM EGTAを加えたもの）を添加して軽く撹拌した後、50分、37℃、5％CO2にてインキュベートした。
【０１７１】
次に、このチューブを再度遠心（7分、2000rpm）し、上澄みを捨て、約100μLの緩衝液（市販の「SP-TALP」水溶液に、6mg/mL BSA+10μg/mLジェンタマイシンを加えたもの；EGTAが入っていない）を添加して軽く撹拌した。
【０１７２】
このチューブを再度遠心（7分、2000rpm）し、上澄みを約100μL捨て、約100μLの水溶液（市販の「SP-TALP」水溶液に、6mg/mL BSA+10μg/mLジェンタマイシン+25μMブリリアントクレシルブルー+5mMグルコース-6-リン酸を加えたもの）を添加し、37℃、5％CO2にてインキュベートした（精子保存工程）。またこのとき、インキュベート時間を50分としたものと、30分としたものの２種類を調製した。
【０１７３】
その後、本実施形態にかかる精子スクリーニング装置を用いて運動能力の高い精子の捕集を行った捕集した。そして、得られた人工授精用精子液について、リアルタイムPCR法によりＸ精子とＹ精子の割合について調べた。その結果を表３及び表４に示す。表３はインキュベート時間を50分としたものの結果であり、表４はインキュベート時間を30分としたものの結果である。
【表３】
2014136464.tif 000005
【表４】
2014136464.tif 000006
【０１７４】
表３及び表４からも分かるように、電子受容物質を添加しない条件下において選抜前精子液中にフェノキサジン化合物としてのブリリアントクレシルブルーを添加しておくことにより、人工授精用精子液中に含まれる性染色体Ｙを備えた精子の割合が凍結精液に比して増加したことが確認された。
【０１７５】
具体的には、表３に示すように、インキュベート時間を50分とした場合、凍結精液中におけるＸ精子とＹ精子の割合がそれぞれ52％と48％であったのに対し、得られた人工受精用精子液におけるＸ精子とＹ精子の割合はそれぞれ35％と65％となった。
【０１７６】
また、表４に示すように、インキュベート時間を30分とした場合、凍結精液中におけるＸ精子とＹ精子の割合がそれぞれ50％と50％であったのに対し、得られた人工受精用精子液におけるＸ精子とＹ精子の割合はそれぞれ39％と61％となった。
【０１７７】
これらのことから、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法によれば、上述した所定の物質を添加することにより、人工授精用精子液中のＸ精子やＹ精子が占める割合を変化させることができることが示された。
【０１７８】
上述してきたように、本実施形態に係る精子の選抜部構造によれば、動物より採取された精子を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が逆流するように貯留部に連通した遡上路とよりなる精子の選抜部構造において、前記遡上路の下流部は、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とする広幅の流路とし、この流路の下流端部を前記貯留部の壁面に臨ませて開口させたため、運動性の良好な精子を効率良く分離することのできる精子の選抜部構造を提供することができる。
【０１７９】
また、本実施形態に係る精子のスクリーニング装置によれば、動物より採取された精子を層流状の緩衝液中で所定区間遡上させ、遡上できた精子を捕集する本実施形態に係る選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置であって、前記遡上路の上流端には、遡上できた精子を回収する回収路と、前記遡上路及び前記回収路を流下させる緩衝液を供給する緩衝液供給路とが接続されており、前記緩衝液供給路より供給された緩衝液の一部を前記遡上路へ流下させる一方、前記緩衝液の残部を回収路へ流下させて回収流と成し、前記遡上できた精子をこの回収流に乗せて捕集することとしたため、極めて効率良く良好な運動性を有する精子を回収することができる。
【０１８０】
また、本実施形態に係る授精用精子液の調製方法によれば、上述の精子スクリーニング装置を用いた授精用精子液の調製方法であって、前記選抜前精子液を前記貯留部に添加する精子添加工程と、前記回収路には前記遡上できた精子の運動能力を上回る流速で、前記緩衝液流路には運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、且つ、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速を下回り、且つ、前記遡上路において層流となる流速で、前記緩衝液供給路から前記緩衝液流路と前記回収路とに緩衝液を流し、前記貯留部に添加した選抜前精子液中に含まれる精子に前記遡上路を遡上させる精子遡上工程と、前記回収流によって捕集された遡上できた精子を回収する回収工程とを有することとしたため、運動性の良好な精子を多く含有する授精用精子液の調製方法を提供することができる。
【０１８１】
最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
【符号の説明】
【０１８２】
１０  貯留部
１１  狭隘遡上路
１２  層状流路
１３  スリット状開口部
２０  貯留部
２１  狭隘遡上路
２２  層状流路
２３  スリット状開口部
３０  貯留部
３１  狭隘遡上路
３２  層状流路
３３  スリット状開口部
４２  チップ体
４６  選抜前精子液貯留部
５２  マイクロ流路
６１  緩衝液供給路
６２  合流部
６３  遡上路
６４  回収路
６５  狭隘遡上路
６６  層状流路
６７  スリット状開口部
Ａ  選抜部構造
Ｂ  選抜部構造
Ｃ  選抜部構造
Ｄ  精子スクリーニング装置
Ｓ  精子
【図１】
2014136464.tif 000007
【図２】
2014136464.tif 000008
【図３】
2014136464.tif 000009
【図４】
2014136464.tif 000010
【図５】
2014136464.tif 000011
【図６】
2014136464.tif 000012
【図７】
2014136464.tif 000013
【図８】
2014136464.tif 000014
【図９】
2014136464.tif 000015
【図１０】
2014136464.tif 000016
【図１１】
2014136464.tif 000017
【図１２】
2014136464.tif 000018
【図１３】
2014136464.tif 000019
【図１４】
2014136464.tif 000020
【国際調査報告】
2014136464.tif 000021
2014136464.tif 000022
2014136464.tif 000023