(57)【要約】  未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供する。  未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
2014200068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医学の目覚しい進歩により、疾患の原因の除去、例えば癌の外科的切除といった対症療法的な治療技術、あるいは組織・臓器の生体移植技術などにより、人命の救われる機会は益々高まりつつある。しかしながら、患部切除に伴い、患者は治療後のＱＯＬの大幅な低下に悩まされることがある。また、移植ドナーの不足、拒絶反応など、生体移植を頼りとする治療にも限界がある。外科的治療又は不慮の事故で失われた組織、器官、臓器などを再生させることが可能となれば、患者のＱＯＬを大幅に改善することができる。また、再生医療は生体移植が抱える問題の解消も図ることが可能である。その観点で再生医療に対する期待度は高い。【０００３】
これに関して、間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有することから、近年、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用についての研究が広く行われている。再生医療の実現のためには、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の大量入手が必要となるが、間葉系幹細胞の継代培養では、十分な量の活性な細胞を獲得することは困難であった。例えば、間葉系幹細胞である毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められ、これらの性質を維持することは困難であることが知られている（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。【０００４】
これまでに、Sox2やNanogなどの特定の遺伝子を間葉系幹細胞に導入することにより、増殖・分化能を維持した間葉系幹細胞の培養方法については知られているが（特開2009-11254号公報）、一定の低酸素濃度条件下で培養することにより、in vitroで長期にわたって間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持できることについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2009-11254号公報
【特許文献２】特開2012-157263号公報
【特許文献３】特開平7-274950号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562
【非特許文献２】Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、メタボローム解析及びＤＮＡアッセイ解析を行い、鋭意研究を行った結果、一定の低酸素濃度条件下で間葉系幹細胞を培養することにより、その未分化性及び健常性を維持させることが可能となる、という驚くべき知見を得た。【０００９】
従って、本願は以下の発明を包含する：
［１］  未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
［２］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［４］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［５］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［６］  前記間葉系幹細胞が真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を大量に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるNAD+/NADH 量の比較を示す。
【図２】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）及びシステイン（Cys）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。
【図３】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるグルコース６リン酸（G6P）、乳酸及びATPの量の比較を示す。
【図４】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における、グルコース６リン酸及びリブロース５リン酸の量の比較を示す。
【図５】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるベータカテニン（CTNNB1）、カゼインキナーゼ１D(CSNK1D)、及びPPARγ(PPARG)の遺伝子発現量の比較を示す。
【図６】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における白血病抑制因子受容体（LIFR）及びＴ細胞因子−４（TCF-4）の遺伝子発現量の比較を示す。
【図７】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF2）の遺伝子発現量の比較を示す。
【図８】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における血管内皮細胞増殖因子（VEGFA）及びトランスフォーミング増殖因子２（TGFB2）の遺伝子発現量の比較を示す。
【図９】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるアルカリフォスファターゼ（AP）活性の比較を示す。
【図１０】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における還元型グルタチオン（GSH）及び酸化型グルタチオン（GSSG）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。
【図１１】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるヒポキサンチンの量の比較を示す。
【図１２】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における解糖系（G6P, F6P, F1,6P, 3PG, ホスホエノールピルビン酸, 乳酸）の量の比較を示す。
【図１３】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるNADHの量、及びNADH／NAD+ 比の比較を示す。
【図１４】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における各因子（GSK-3β, OCT-4)のウェスタンブロットの解析結果を示す（HIF-1αは検出不可のためデータ無し）。
【図１５】各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるWnt3Aを用いたルシフェラーゼアッセイの解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法を提供する。
【００１３】
間葉系幹細胞は、脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜などに存在する、多分化能を有する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から、骨、関節、筋肉、肝臓、腎臓、心臓、中枢神経系及び膵臓等の臓器再生医療への応用が期待されており、例えば、間葉系幹細胞の移植による心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、慢性腎不全、変形性関節症、脳梗塞、ならびに脳神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病）等の治療に関する研究が進められている（例えば特開2012-157263号公報を参照のこと）。
【００１４】
本発明において培養できる間葉系幹細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の三次元モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。間葉系幹細胞は、好ましくは真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞又は脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）であり、特に好ましくはＤＳ細胞である。ＤＳ細胞は、真皮毛根鞘に存在する細胞であり、間葉系細胞の一種として知られている。真皮毛根鞘（DS；Dermal sheath)は、結合組織性毛鞘や結合組織鞘とも呼ばれることもあり、上皮性の外毛根鞘を取り囲む真皮性の組織である。また、毛乳頭（ＤＰ；hair papilla）細胞はＤＳ細胞に由来するとされており、中でも、発毛期でのＤＰ細胞の増殖に先駆けて、真皮毛根鞘（ＤＳ）のうち特に毛乳頭に近い基底部位である真皮毛根鞘カップ（ＤＳＣ）領域に由来する細胞が増殖することから、ＤＳ細胞、特にＤＳＣ領域に由来する細胞（ＤＳＣ細胞とも称する）がＤＰ細胞を供給すると考えられている。
【００１５】
また、本発明において培養できる間葉系幹細胞は、上記哺乳動物の組織から初代培養により取得された細胞であってもよいし、継代培養により取得された細胞であってもよく、また、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞から分化誘導されて得られた細胞であってもよい。移植を行う観点からは、移植対象から取得した細胞を継代培養により増殖させた細胞が好ましい。
【００１６】
本発明において使用することができる基礎培地は、ヒトや動物の細胞の培養に用いられる培地ならば特に制限されないが、市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養することができる。間葉系幹細胞を培養するために使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（Gibco社）やチャン培地(Irvine Scientific）が挙げられるが、移植を行う観点からは、無血清培地であることが好ましい。多様な種類の無血清培地が市販されており、例えば、HFDM-1 (+) (細胞科学研究所）、HFDM-1 (-) (細胞科学研究所）、StemPro MSC SFM CTS（sup+） (Lifetechnologies)、StemPro MSC SFM CTS（sup-） (Lifetechnologies)、Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup+) (BD)などが挙げられる。これらの市販培地の組成として、HFDM-1 (-)は、基礎培地 RITC80-7、インスリン5 μg/ml、 デキサメサゾン10-7Mを含有しており、HFDM-1 (+)は、これらに加えて、EGF 10 ng/mlを含有することが知られている。
【００１７】
基礎培地には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでもよい。ＰＤＧＦは、主に間葉系幹細胞（線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等）の遊走や増殖などの調節に関与する増殖因子であり、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーに属する。主に巨核球によって産生されるほか、血小板のα顆粒中にも含まれ、上皮細胞や内皮細胞などの様々な細胞によって産生されることが知られている。ＰＤＧＦは、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖及びＤ鎖により、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも４種類が存在している。これらはいずれも、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成し、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤの５種類のアイソフォームが存在することが知られている。これらのうち、ＰＤＧＦ−ＢＢが特に好ましい。基礎培地に添加されるＰＤＧＦの添加量は特に制限されるものではないが、例えば0.01 ng/ml〜10 μg/ml、好ましくは0.1 ng/ml〜100 ng/ml、より好ましくは1〜10 ng/ml程度である。
【００１８】
また、基礎培地には、Ｗｎｔシグナル活性化剤を添加してもよい。Ｗｎｔシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。本シグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷｎｔ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。Ｗｎｔシグナルがもつその未分化状態維持機能により、分化を抑制する目的でＥＳ細胞の培養の際に利用されている（例えば、Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004)。
【００１９】
Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、特に限定されるわけではないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、さらには塩化リチウムなどが挙げられる。また、ＣＴ９９０２１（分子量：４６５．３４，純度：９９．１％，ＣＡＳ Ｎｏ：２５２９１７−０６−９，別名：ＣＨＩＲ９９０２１）は非常に強力な選択的ＧＳＫ−３阻害物質として知られ、マウスＥＳ細胞培養時に、ＰＤ１８４３５２（ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害物質）やＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害物質）と共に使用することにより、長期培養を可能にする。
【００２０】
Ｗｎｔシグナル活性化剤の添加量は特に制限されるものではなく、Ｗｎｔシグナル活性化、換言すれば、ＧＳＫ−３の阻害が奏され、且つ細胞増殖が停止しない量であればよく、使用する薬剤の種類及び増殖すべき細胞の種類に依存し、当業者により適宜決定されるであろう。例えば、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯを使用する場合、その量は、例えば0.01 μM〜100 μM、好ましくは0.1 μM〜10 μM、より好ましくは10 μM程度である。また、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＴ９９０２１を使用する場合、その量は、例えば0.1〜10 μM、最適には1 μM程度である。
【００２１】
さらに、無血清培地には、必要に応じてほかの細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとして、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１，２，３（ＴＧＦβ１，２，３）、骨形成因子（ＢＭＰ）又はインスリン様成長因子−１，２（ＩＧＦ−１，２）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。リン脂質（例えば、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、エタノールアミン）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。脂肪酸（例えば、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸を使用する場合、その量は、例えば0.001 μg/ml 〜100 μg/ml程度である。プロスタグランジン類を使用する場合、その量は0.1 ng/ml 〜 100 ng/ml 程度である。還元剤（例えば、アスコルビン酸、還元型グルタチオン）を使用する場合、その量は、例えば1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。メルカプトエタノールを使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。トランスフェリン又はインスリンを使用する場合、その量は0.01 μg/ml〜100 μg/ml程度である。デキサメタゾンを使用する場合、その量は0.000001 μM〜0.1 μM程度である。トリヨードチロニンを使用する場合、その量は0.1 pM〜100 pM程度である。グルカゴンを使用する場合、その量は0.0001 μM〜0.1 μM程度である。コレステロールを使用する場合、その量は、例えば0.1μg/ml〜100μg/ml程度である。ハイドロコーチゾンを使用する場合、その量は、例えば0．01 μg/ml〜10 μg/ml程度である。テストステロンを使用する場合、その量は、例えば0.1 μM〜100 μM程度である。エストラジオール又はプロゲステロンを使用する場合、その量は、例えば0．01 ng/ml〜100 ng/ml程度である。微量元素（例えば、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン）を使用する場合、その量は、例えば0.000001 mg/ml〜0.1 mg/ml程度である。アルブミン、ファイブロネクチン又はビトロネクチンを使用する場合、その量は、例えば0．1 μg/ml〜1000 μg/ml程度である。
【００２２】
このような培地において、間葉系幹細胞の培養は、通常、培養皿を用い、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は間葉系幹細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。
【００２３】
本発明においては、「未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において間葉系幹細胞が培養されるが、ここで、「未分化性」とは、間葉系幹細胞が、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞などの細胞へ分化しておらず、依然として、多分化能を有している状態を意味し、「健常性」とは、細胞毒性をもたらす活性酸素や炎症性サイトカインの発現量が少なく、正常な生存・増殖能を有している状態を意味する。
【００２４】
このような間葉系幹細胞の「未分化性」や「健常性」は、メタボローム解析やＤＮＡアレイ解析により、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び／又は発現遺伝子を網羅的に解析することによって、判定することができる。
【００２５】
メタボローム解析は、アミノ酸、アミン、ヌクレオチド、糖、脂質などを含む、細胞内の低分子代謝産物を包括的に分離し、これらを同定・定量することにより行われる。メタボローム解析において、用いることができる分離手法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が用いられる。これらの分離手法は一般に質量分析（ＭＳ）と組み合わせることで、分離−検出機器として利用される。なお、メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社などの解析サービスを提供している会社・機関に委託してもよい。
【００２６】
このように包括的に同定・定量された代謝産物の中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する因子を評価する。このような因子としては、生体内の酸化・還元反応やＡＴＰなどのエネルギー産生に関与する生体内低分子、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）、グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）、及びペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）などが挙げられる。
【００２７】
上述のメタボローム解析に加えて、マイクロアレイ解析により間葉系幹細胞の遺伝子発現量を網羅的に測定し、その中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する遺伝子を指標とすることにより、さらに包括的な評価を行うことができる。このような指標としては、幹細胞で特異的に発現する遺伝子や炎症性サイトカイン遺伝子、例えば、ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、カゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、Ｔ細胞因子−４（ＴＣＦ−４）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）、Frizzled ホモログ１（Drosophila）（ＦＲＺ−１）、Frizzled ホモログ４（Drosophila）（ＦＲＺ−４）などの遺伝子が挙げられる。
【００２８】
このように、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び発現遺伝子を網羅的に解析することにより、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」を決定することができる。このような酸素濃度は、具体的には、１％超から２１％（常酸素濃度）未満の低酸素濃度である。また、典型的には２％から１６％、好ましくは３％から１２％、より好ましくは３％から７％、更により好ましくは４％から６％、最も好ましくは５％である。
【００２９】
好ましくは、このようにして培養した間葉系幹細胞をスフェア形成させる（特開平7-274950号公報）。スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊（スフェロイド）の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。スフェロイドを形成させる培養法として、ローラボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養などが知られており、また、凹陥部を有する培養容器や、細胞接着性の低いコーティングが施された培養容器が市販されている。さらに、細胞接着性領域と細胞非接着性領域が共存するようにコーティングがされ、細胞非接着性領域として、ホスホリルコリン（ＰＣ）基コーティングを用いた培養容器を用いて培養を行うことにより、サイズが揃ったスフェロイドを大量に形成することが可能になった。
【００３０】
このようにして調製したスフェア化した間葉系幹細胞は、多分化能を維持しており、したがって、間葉系幹細胞の分化のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、再生医療などのために利用できる。
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００３２】
１−１）皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＡＤＳＣ（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。【００３３】
１−２）ＡＤＳＣのメタボローム解析（質量分析）
前処理
上記１−１）に従い、ＡＤＳＣの培養を行った。各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝３とし、２日間培養したものを試料として用いた。培養後の細胞群は１０ｃｍディッシュあたり約１００万個存在した。細胞内の生体物質を取得するために、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（ＨＭＴ）に送付した（具体的には、等張マンニトール水溶液にて２回洗浄し、１ｍＬの５０％メタノール水溶液にて抽出を行った後、遠心フィルター処理にて徐タンパクが行われた）。ＨＭＴにて試料を受領後、ろ液を乾固させ、再び50 μL のMilli-Q 水に溶解して測定に供した。【００３４】
測定
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
陽イオン性代謝物質（カチオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 3号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
陰イオン性代謝物質（アニオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）1号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)【００３５】
データ処理及び解析
CE-TOFMS で検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.13.0.8.h（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比 (m/z)、泳動時間(Migration time: MT)とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は、下記の式：
相対面積値 =目的ピークの面積値/内部標準物質の面積値 × 試料量
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ+やＫ+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。【００３６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
ＮＡＤＨは生体内の還元剤であり、エネルギー通貨である。ＮＡＤＨは酸化されることによってＮＡＤ+となり、引き換えにエネルギーを別の分子に供与する（酸化還元反応）。ＮＡＤＨは主に解糖系から産生されるため、酸素濃度２１％にてＮＡＤＨが高水準にあることが見て取れる。一方で使用済みのＮＡＤＨ、すなわちＮＡＤ+は酸素濃度１％がもっとも高く、ついで２１％、５％の順であった（図１）。酸素濃度１％では、ＮＡＤＨが少なくＮＡＤ+が多いことから、解糖系以外のミトコンドリアなどによるエネルギー産生に傾いていることが考えられ、フリーラジカルの発生など細胞へのストレスが過大になっていると推察できる。また、酸素濃度２１％では過大に解糖をおこなってＮＡＤＨを産生するものの、酸化物ＮＡＤ+も多くなっており、細胞全体として過剰なエネルギー消費（浪費）をしていると考えられる。一方、酸素濃度５％はちょうど中間であり、特にＮＡＤ+が少ないという面では酸化物の蓄積が少ないと考察できる。ＮＡＤ+が少ないということは、それだけ細胞の酸化ストレスがかかっていないと考えることができる。【００３７】
グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸素濃度５％で減少し、酸化型（ＧＳＳＧ）に変動がなかった（図２）。細胞ではＧＳＨの量が増えると活性酸素除去に働き、活動に好影響があるといわれている。一方で、ＧＳＨの出発物質であるシステイン（Ｃｙｓ）の量が少ないことがわかる。すなわち、幹細胞においてはＧＳＨを必要としない状況、つまり解毒、還元反応が行われていない状況が酸素濃度５％で起こっていると考えられる。【００３８】
解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
低酸素性ストレスマーカーとして乳酸が上げられる。乳酸が増加する環境下では、解糖系よるエネルギー獲得が不利になり、活性酸素が増加することが知られている。これについて、酸素濃度１％で乳酸量が増えていることがわかる（図３）。さらに解糖系の中間代謝物であるグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）が酸素濃度１％で増加している。これらのデータは解糖経路の反応速度が酸素不足により低下し、中間産物の滞留が起きていることを示す。どの場合においても、酸素濃度１％での低酸素ストレスが顕著であるのに対し、酸素濃度５％及び２１％では、解糖系において大きな障害は見られなかった。さらにＡＴＰについても酸素濃度１％にて増加が見られた。酸素濃度１％では他条件に比べてミトコンドリアによるＡＴＰ獲得が優位になっていることが考察される。ミトコンドリアでのエネルギー産生は過酸化物質を副産物として生じるため、酸素濃度１％では、細胞毒性が亢進しているものと考えられる。【００３９】
ペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）
ニコチンアミドを供給するペントースリン酸回路が酸素濃度１％で活性化しており、具体的には、グルコース６リン酸、リブロース５リン酸の増加が認められた（図４）。この回路は低酸素で停滞する解糖系の迂回路であるとともに、低酸素性ＲＯＳの消去に必要なニコチンアミドの産生強化を支えている。【００４０】
１−３）ＡＤＳＣのマイクロアレイ解析
アジレント human 4x44K マイクロアレイ（Agilent Technologies 社）を用いてマイクロアレイ解析を行った。
試料の調製及びハイブリダイゼーションはAgilent Technologies 社推奨プロトコルに準じた。また、試料に用いた細胞は、上記１−１）に従い、各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝４とし、３日間培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞を用いた。ＲＮＡの全量１〜２μgを、ｃＲＮＡラベル化キット（Agilent Technologies 社）を用いてラベル化した。Qiaquick（Qiagen社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、SpeedVacにより溶媒を乾燥した。次に、アジレント human 4x44K マイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。スキャナー（Agilent Technologies 社）によりデータ読み取りを行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得るマイクロアレイの解析結果を以下に示す。【００４１】
ＣＴＮＮＢ１／ＣＳＮＫ１Ｄ／ＰＰＡＲＧ
酸素濃度５％の優位性として幹細胞の自己複製に関与するベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の発現が特異的に亢進した（図５）。同時にシグナル上流にあたるカゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）の発現も亢進した。さらに同条件にてＡＤＳＣの性質を運命付けるＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）も特異的に亢進した。【００４２】
ＬＩＦＲ／ＴＣＦ−４
ＬＩＦＲは白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体であり、ＬＩＦＲにＬＩＦが結合することで、幹細胞の未分化維持機構が亢進することが知られている。また、ＴＣＦ−４は幹細胞にてベータカテニンと特異的に共役して働く転写因子であり、自己複製能力と発生誘導に関与する。酸素濃度５％の環境において、ＬＩＦＲ及びＴＣＦ−４の有意な発現亢進が認められた（図６）。【００４３】
ＦＧＦ２
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）は酸素濃度が高い（２１％）場合に発現が減少した（図７）。ＦＧＦ２は体性幹細胞の培養において必要な因子である。【００４４】
ＶＥＧＦＡ／ＴＧＦＢ２
過度な血管新生を生じる因子として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）が挙げられるが、この遺伝子も酸素濃度１％で亢進することが示された（図８）。
また、細胞死に関わる因子であるトランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）の発現亢進も認められた。
【実施例２】
【００４５】
２−１）真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＤＳ細胞（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。【００４６】
２−２）ＤＳ細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）アッセイ
上記２−１）にしたがい培養した各ＤＳ細胞について、幹細胞・毛包誘導マーカーであるＡＰ活性を測定した。
６穴細胞培養プレートで培養したＤＳ細胞を、ＰＢＳ（−）で１回リンスした後、５０μｌの固定液（４％パラフォルムアルデヒド−リン酸緩衝液）を各ウェルに入れた。５分後、１ｍｌのＰＢＳ（−）で２回リンスした後、ＴＢＳ（ｐＨ９．５）で１回リンスを行い、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の基質ＢＭ−ｐｕｒｐｌｅ（Roche）を用いて３７℃で１時間発色反応を行なった。超純水で４回リンスを行い、次にＰＢＳ（−）に置き換えた。
図９に示されるとおり、ＤＳ細胞におけるＡＰ活性は酸素濃度に対し逆比例することが分かった。酸素濃度が低い方が幹細胞らしさを強める傾向があると考えられる。【００４７】
２−３）ＤＳ細胞のメタボローム解析（質量分析）
上記１−２）と同様に、５％酸素濃度と２１％酸素濃度で培養したＤＳ細胞における細胞内代謝物変動を質量分析器により定量的に解析した（受託解析：ＨＭＴ社）。
ＤＳ細胞の未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。【００４８】
グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
図１０に示されるとおり、酸化型グルタチオンならびに還元型グルタチオンは共に２１％酸素条件で増加した。さらにグルタチオンの還元比率を見た場合、２１％に比べ５％酸素条件では還元型の比率が高いことが分かった。
高酸素条件（２１％）では細胞の活動が高まり、酸化還元に密接に関与するグルタチオン全体の容量が増加していると考えられる。一方、生体内濃度に近い５％酸素条件では、グルタチオンの容量が低下し、かつ酸化ストレスが低減されていると考えられる。【００４９】
ヒポキサンチン
細胞内のＤＮＡ複製に関与し、代謝時に活性酸素ストレスと関連するヒポキサンチンについて解析した。
ヒポキサンチン量は２１％に比べ５％酸素条件では１／４に低下した（図１１）。高酸素条件（２１％）では細胞の活動が高まり、ＤＮＡ代謝が活発になっていると考えられる。一方、生体内濃度にちかい５％酸素条件では、ヒポキサンチン低下による活性酸素による酸化ストレスが低減されていると考えられる。【００５０】
解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
図１２に示されるとおり、２１％酸素条件は５％条件と比較して初期の代謝物グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）および後期代謝物であるホスホエノールピルビン酸は２倍以上増加した。高酸素条件（２１％）では細胞の解糖系の活性が高まっていると考えられる。高酸素条件（２１％）は、多くのエネルギーを獲得する一方、前述における高酸化ストレスも誘導していると考えられる。５％酸素条件では、エネルギー産生は低下する一方、前述のとおり、酸化ストレスから回避できていると考えられる。【００５１】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
細胞内のエネルギー代謝指標である中心炭素代謝（ＮＡＤＨ／ＮＡＤ+レシオ）は、５％酸素条件と比較し高酸素条件（２１％）で２倍となった。また、ＴＣＡ回路の活性をしめすＮＡＤＨ量も高酸素条件で２倍となった（図１３）。
高酸素条件（２１％）は、解糖系だけではなく、ミトコンドリアＴＣＡ回路でも多くのエネルギーを獲得していると考えられる。【００５２】
２−４）ＤＳ細胞のウェスタンブロット解析
５％酸素濃度と２１％酸素濃度にて２日間培養したＤＳ細胞から細胞内タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより解析した（一次抗体はセルシグナリング社）。
抗体の対応は、ＧＳＫ−３β（幹細胞らしさ）、ＯＣＴ−４（幹細胞らしさ）、ＨＩＦ−１α（低酸素転写因子）となる。図１４に示されるとおり、幹細胞らしさを負に制御するＧＳＫ−３βは高酸素で増加、幹細胞らしさを性に制御するＯＣＴ−４は高酸素で低下、低酸素で誘導される転写因子（ＨＩＦ−１α）は中立（検出不可）であった。
これらの結果から、生体内酸素条件（５％）は、高酸素条件（２１％）に比較し、幹細胞らしさを亢進する状態にあると考えられる。【００５３】
２−５）ＤＳ細胞のルシフェラーゼアッセイ
５％酸素濃度と２１％酸素濃度にて、MesenPro RS 培地（Gibco社）で２日間培養したＤＳ細胞について幹細胞らしさを評価するために、デュアルルシフェラーゼアッセイによりＷｎｔシグナル経路の転写因子（ＴＣＦ−Ｌｅｆ）活性レポーターアッセイを行った（Promega社）。刺激物質として組み換えヒトＷｎｔ−３ａタンパク質を使用した。
Ｗｎｔ−３Ａ濃度依存的に、どの酸素濃度においてもＴＣＦ−Ｌｅｆ活性の上昇がみられた（図１５）。５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ存在下における２１％と５％酸素条件の比較では、ＴＣＦ−Ｌｅｆ活性は２倍以上亢進した。
幹細胞および発毛誘導時の特徴的なシグナル経路が亢進している状態において、Ｗｎｔシグナルも亢進すると考えられている。本実験において、生体内酸素条件（５％）は、高酸素条件（２１％）に比較し、ＤＳ細胞の幹細胞らしさ・毛包誘導能を維持するＷｎｔシグナルシステムが亢進していると考えられる。
【図１】
2014200068.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年10月27日(2015.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医学の目覚しい進歩により、疾患の原因の除去、例えば癌の外科的切除といった対症療法的な治療技術、あるいは組織・臓器の生体移植技術などにより、人命の救われる機会は益々高まりつつある。しかしながら、患部切除に伴い、患者は治療後のＱＯＬの大幅な低下に悩まされることがある。また、移植ドナーの不足、拒絶反応など、生体移植を頼りとする治療にも限界がある。外科的治療又は不慮の事故で失われた組織、器官、臓器などを再生させることが可能となれば、患者のＱＯＬを大幅に改善することができる。また、再生医療は生体移植が抱える問題の解消も図ることが可能である。その観点で再生医療に対する期待度は高い。
【０００３】
これに関して、間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有することから、近年、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用についての研究が広く行われている。再生医療の実現のためには、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の大量入手が必要となるが、間葉系幹細胞の継代培養では、十分な量の活性な細胞を獲得することは困難であった。例えば、間葉系幹細胞である毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められ、これらの性質を維持することは困難であることが知られている（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。
【０００４】
これまでに、Sox2やNanogなどの特定の遺伝子を間葉系幹細胞に導入することにより、増殖・分化能を維持した間葉系幹細胞の培養方法については知られているが（特開2009-11254号公報）、一定の低酸素濃度条件下で培養することにより、in vitroで長期にわたって間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持できることについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2009-11254号公報
【特許文献２】特開2012-157263号公報
【特許文献３】特開平7-274950号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562
【非特許文献２】Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、メタボローム解析及びＤＮＡアッセイ解析を行い、鋭意研究を行った結果、一定の低酸素濃度条件下で間葉系幹細胞を培養することにより、その未分化性及び健常性を維持させることが可能となる、という驚くべき知見を得た。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を包含する：
［１］  未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
［２］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［４］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［５］  間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［６］  前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を大量に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるNAD+/NADH 量の比較を示す。
【図２】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）及びシステイン（Cys）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。
【図３】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるグルコース６リン酸（G6P）、乳酸及びATPの量の比較を示す。
【図４】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における、グルコース６リン酸及びリブロース５リン酸の量の比較を示す。
【図５】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるベータカテニン（CTNNB1）、カゼインキナーゼ１D(CSNK1D)、及びPPARγ(PPARG)の遺伝子発現量の比較を示す。
【図６】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における白血病抑制因子受容体（LIFR）及びＴ細胞因子−４（TCF-4）の遺伝子発現量の比較を示す。
【図７】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF2）の遺伝子発現量の比較を示す。
【図８】各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における血管内皮細胞増殖因子（VEGFA）及びトランスフォーミング増殖因子２（TGFB2）の遺伝子発現量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法を提供する。
【００１３】
間葉系幹細胞は、脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜などに存在する、多分化能を有する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から、骨、関節、筋肉、肝臓、腎臓、心臓、中枢神経系及び膵臓等の臓器再生医療への応用が期待されており、例えば、間葉系幹細胞の移植による心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、慢性腎不全、変形性関節症、脳梗塞、ならびに脳神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病）等の治療に関する研究が進められている（例えば特開2012-157263号公報を参照のこと）。
【００１４】
本発明において培養できる間葉系幹細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の三次元モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。間葉系幹細胞は、好ましくは脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）である。
【００１５】
また、本発明において培養できる間葉系幹細胞は、上記哺乳動物の組織から初代培養により取得された細胞であってもよいし、継代培養により取得された細胞であってもよく、また、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞から分化誘導されて得られた細胞であってもよい。移植を行う観点からは、移植対象から取得した細胞を継代培養により増殖させた細胞が好ましい。
【００１６】
本発明において使用することができる基礎培地は、ヒトや動物の細胞の培養に用いられる培地ならば特に制限されないが、市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養することができる。間葉系幹細胞を培養するために使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（Gibco社）やチャン培地(Irvine Scientific）が挙げられるが、移植を行う観点からは、無血清培地であることが好ましい。多様な種類の無血清培地が市販されており、例えば、HFDM-1 (+) (細胞科学研究所）、HFDM-1 (-) (細胞科学研究所）、StemPro MSC SFM CTS（sup+） (Lifetechnologies)、StemPro MSC SFM CTS（sup-） (Lifetechnologies)、Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup+) (BD)などが挙げられる。これらの市販培地の組成として、HFDM-1 (-)は、基礎培地 RITC80-7、インスリン5 μg/ml、 デキサメサゾン10-7Mを含有しており、HFDM-1 (+)は、これらに加えて、EGF 10 ng/mlを含有することが知られている。
【００１７】
基礎培地には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでもよい。ＰＤＧＦは、主に間葉系幹細胞（線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等）の遊走や増殖などの調節に関与する増殖因子であり、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーに属する。主に巨核球によって産生されるほか、血小板のα顆粒中にも含まれ、上皮細胞や内皮細胞などの様々な細胞によって産生されることが知られている。ＰＤＧＦは、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖及びＤ鎖により、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも４種類が存在している。これらはいずれも、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成し、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤの５種類のアイソフォームが存在することが知られている。これらのうち、ＰＤＧＦ−ＢＢが特に好ましい。基礎培地に添加されるＰＤＧＦの添加量は特に制限されるものではないが、例えば0.01 ng/ml〜10 μg/ml、好ましくは0.1 ng/ml〜100 ng/ml、より好ましくは1〜10 ng/ml程度である。
【００１８】
また、基礎培地には、Ｗｎｔシグナル活性化剤を添加してもよい。Ｗｎｔシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。本シグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷｎｔ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。Ｗｎｔシグナルがもつその未分化状態維持機能により、分化を抑制する目的でＥＳ細胞の培養の際に利用されている（例えば、Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004)。
【００１９】
Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、特に限定されるわけではないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、さらには塩化リチウムなどが挙げられる。また、ＣＴ９９０２１（分子量：４６５．３４，純度：９９．１％，ＣＡＳ Ｎｏ：２５２９１７−０６−９，別名：ＣＨＩＲ９９０２１）は非常に強力な選択的ＧＳＫ−３阻害物質として知られ、マウスＥＳ細胞培養時に、ＰＤ１８４３５２（ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害物質）やＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害物質）と共に使用することにより、長期培養を可能にする。
【００２０】
Ｗｎｔシグナル活性化剤の添加量は特に制限されるものではなく、Ｗｎｔシグナル活性化、換言すれば、ＧＳＫ−３の阻害が奏され、且つ細胞増殖が停止しない量であればよく、使用する薬剤の種類及び増殖すべき細胞の種類に依存し、当業者により適宜決定されるであろう。例えば、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯを使用する場合、その量は、例えば0.01 μM〜100 μM、好ましくは0.1 μM〜10 μM、より好ましくは10 μM程度である。また、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＴ９９０２１を使用する場合、その量は、例えば0.1〜10 μM、最適には1 μM程度である。
【００２１】
さらに、無血清培地には、必要に応じてほかの細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとして、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１，２，３（ＴＧＦβ１，２，３）、骨形成因子（ＢＭＰ）又はインスリン様成長因子−１，２（ＩＧＦ−１，２）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。リン脂質（例えば、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、エタノールアミン）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。脂肪酸（例えば、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸を使用する場合、その量は、例えば0.001 μg/ml 〜100 μg/ml程度である。プロスタグランジン類を使用する場合、その量は0.1 ng/ml 〜 100 ng/ml 程度である。還元剤（例えば、アスコルビン酸、還元型グルタチオン）を使用する場合、その量は、例えば1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。メルカプトエタノールを使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。トランスフェリン又はインスリンを使用する場合、その量は0.01 μg/ml〜100 μg/ml程度である。デキサメタゾンを使用する場合、その量は0.000001 μM〜0.1 μM程度である。トリヨードチロニンを使用する場合、その量は0.1 pM〜100 pM程度である。グルカゴンを使用する場合、その量は0.0001 μM〜0.1 μM程度である。コレステロールを使用する場合、その量は、例えば0.1μg/ml〜100μg/ml程度である。ハイドロコーチゾンを使用する場合、その量は、例えば0．01 μg/ml〜10 μg/ml程度である。テストステロンを使用する場合、その量は、例えば0.1 μM〜100 μM程度である。エストラジオール又はプロゲステロンを使用する場合、その量は、例えば0．01 ng/ml〜100 ng/ml程度である。微量元素（例えば、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン）を使用する場合、その量は、例えば0.000001 mg/ml〜0.1 mg/ml程度である。アルブミン、ファイブロネクチン又はビトロネクチンを使用する場合、その量は、例えば0．1 μg/ml〜1000 μg/ml程度である。
【００２２】
このような培地において、間葉系幹細胞の培養は、通常、培養皿を用い、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は間葉系幹細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。
【００２３】
本発明においては、「未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において間葉系幹細胞が培養されるが、ここで、「未分化性」とは、間葉系幹細胞が、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞などの細胞へ分化しておらず、依然として、多分化能を有している状態を意味し、「健常性」とは、細胞毒性をもたらす活性酸素や炎症性サイトカインの発現量が少なく、正常な生存・増殖能を有している状態を意味する。
【００２４】
このような間葉系幹細胞の「未分化性」や「健常性」は、メタボローム解析やＤＮＡアレイ解析により、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び／又は発現遺伝子を網羅的に解析することによって、判定することができる。
【００２５】
メタボローム解析は、アミノ酸、アミン、ヌクレオチド、糖、脂質などを含む、細胞内の低分子代謝産物を包括的に分離し、これらを同定・定量することにより行われる。メタボローム解析において、用いることができる分離手法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が用いられる。これらの分離手法は一般に質量分析（ＭＳ）と組み合わせることで、分離−検出機器として利用される。なお、メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社などの解析サービスを提供している会社・機関に委託してもよい。
【００２６】
このように包括的に同定・定量された代謝産物の中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する因子を評価する。このような因子としては、生体内の酸化・還元反応やＡＴＰなどのエネルギー産生に関与する生体内低分子、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）、グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）、及びペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）などが挙げられる。
【００２７】
上述のメタボローム解析に加えて、マイクロアレイ解析により間葉系幹細胞の遺伝子発現量を網羅的に測定し、その中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する遺伝子を指標とすることにより、さらに包括的な評価を行うことができる。このような指標としては、幹細胞で特異的に発現する遺伝子や炎症性サイトカイン遺伝子、例えば、ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、カゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、Ｔ細胞因子−４（ＴＣＦ−４）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）、Frizzled ホモログ１（Drosophila）（ＦＲＺ−１）、Frizzled ホモログ４（Drosophila）（ＦＲＺ−４）などの遺伝子が挙げられる。
【００２８】
このように、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び発現遺伝子を網羅的に解析することにより、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」を決定することができる。このような酸素濃度は、具体的には、１％超から２１％（常酸素濃度）未満の低酸素濃度である。また、典型的には２％から１６％、好ましくは３％から１２％、より好ましくは３％から７％、更により好ましくは４％から６％、最も好ましくは５％である。
【００２９】
好ましくは、このようにして培養した間葉系幹細胞をスフェア形成させる（特開平7-274950号公報）。スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊（スフェロイド）の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。スフェロイドを形成させる培養法として、ローラボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養などが知られており、また、凹陥部を有する培養容器や、細胞接着性の低いコーティングが施された培養容器が市販されている。さらに、細胞接着性領域と細胞非接着性領域が共存するようにコーティングがされ、細胞非接着性領域として、ホスホリルコリン（ＰＣ）基コーティングを用いた培養容器を用いて培養を行うことにより、サイズが揃ったスフェロイドを大量に形成することが可能になった。
【００３０】
このようにして調製したスフェア化した間葉系幹細胞は、多分化能を維持しており、したがって、間葉系幹細胞の分化のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、再生医療などのために利用できる。
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００３２】
１−１）皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＡＤＳＣ（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。
【００３３】
１−２）ＡＤＳＣのメタボローム解析（質量分析）
前処理
上記１−１）に従い、ＡＤＳＣの培養を行った。各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝３とし、２日間培養したものを試料として用いた。培養後の細胞群は１０ｃｍディッシュあたり約１００万個存在した。細胞内の生体物質を取得するために、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（ＨＭＴ）に送付した（具体的には、等張マンニトール水溶液にて２回洗浄し、１ｍＬの５０％メタノール水溶液にて抽出を行った後、遠心フィルター処理にて徐タンパクが行われた）。ＨＭＴにて試料を受領後、ろ液を乾固させ、再び50 μL のMilli-Q 水に溶解して測定に供した。
【００３４】
測定
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
陽イオン性代謝物質（カチオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 3号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
陰イオン性代謝物質（アニオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）1号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
【００３５】
データ処理及び解析
CE-TOFMS で検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.13.0.8.h（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比 (m/z)、泳動時間(Migration time: MT)とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は、下記の式：
相対面積値 =目的ピークの面積値/内部標準物質の面積値 × 試料量
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ+やＫ+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。
【００３６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
ＮＡＤＨは生体内の還元剤であり、エネルギー通貨である。ＮＡＤＨは酸化されることによってＮＡＤ+となり、引き換えにエネルギーを別の分子に供与する（酸化還元反応）。ＮＡＤＨは主に解糖系から産生されるため、酸素濃度２１％にてＮＡＤＨが高水準にあることが見て取れる。一方で使用済みのＮＡＤＨ、すなわちＮＡＤ+は酸素濃度１％がもっとも高く、ついで２１％、５％の順であった（図１）。酸素濃度１％では、ＮＡＤＨが少なくＮＡＤ+が多いことから、解糖系以外のミトコンドリアなどによるエネルギー産生に傾いていることが考えられ、フリーラジカルの発生など細胞へのストレスが過大になっていると推察できる。また、酸素濃度２１％では過大に解糖をおこなってＮＡＤＨを産生するものの、酸化物ＮＡＤ+も多くなっており、細胞全体として過剰なエネルギー消費（浪費）をしていると考えられる。一方、酸素濃度５％はちょうど中間であり、特にＮＡＤ+が少ないという面では酸化物の蓄積が少ないと考察できる。ＮＡＤ+が少ないということは、それだけ細胞の酸化ストレスがかかっていないと考えることができる。
【００３７】
グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸素濃度５％で減少し、酸化型（ＧＳＳＧ）に変動がなかった（図２）。細胞ではＧＳＨの量が増えると活性酸素除去に働き、活動に好影響があるといわれている。一方で、ＧＳＨの出発物質であるシステイン（Ｃｙｓ）の量が少ないことがわかる。すなわち、幹細胞においてはＧＳＨを必要としない状況、つまり解毒、還元反応が行われていない状況が酸素濃度５％で起こっていると考えられる。
【００３８】
解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
低酸素性ストレスマーカーとして乳酸が上げられる。乳酸が増加する環境下では、解糖系よるエネルギー獲得が不利になり、活性酸素が増加することが知られている。これについて、酸素濃度１％で乳酸量が増えていることがわかる（図３）。さらに解糖系の中間代謝物であるグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）が酸素濃度１％で増加している。これらのデータは解糖経路の反応速度が酸素不足により低下し、中間産物の滞留が起きていることを示す。どの場合においても、酸素濃度１％での低酸素ストレスが顕著であるのに対し、酸素濃度５％及び２１％では、解糖系において大きな障害は見られなかった。さらにＡＴＰについても酸素濃度１％にて増加が見られた。酸素濃度１％では他条件に比べてミトコンドリアによるＡＴＰ獲得が優位になっていることが考察される。ミトコンドリアでのエネルギー産生は過酸化物質を副産物として生じるため、酸素濃度１％では、細胞毒性が亢進しているものと考えられる。
【００３９】
ペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）
ニコチンアミドを供給するペントースリン酸回路が酸素濃度１％で活性化しており、具体的には、グルコース６リン酸、リブロース５リン酸の増加が認められた（図４）。この回路は低酸素で停滞する解糖系の迂回路であるとともに、低酸素性ＲＯＳの消去に必要なニコチンアミドの産生強化を支えている。
【００４０】
１−３）ＡＤＳＣのマイクロアレイ解析
アジレント human 4x44K マイクロアレイ（Agilent Technologies 社）を用いてマイクロアレイ解析を行った。
試料の調製及びハイブリダイゼーションはAgilent Technologies 社推奨プロトコルに準じた。また、試料に用いた細胞は、上記１−１）に従い、各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝４とし、３日間培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞を用いた。ＲＮＡの全量１〜２μgを、ｃＲＮＡラベル化キット（Agilent Technologies 社）を用いてラベル化した。Qiaquick（Qiagen社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、SpeedVacにより溶媒を乾燥した。次に、アジレント human 4x44K マイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。スキャナー（Agilent Technologies 社）によりデータ読み取りを行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得るマイクロアレイの解析結果を以下に示す。
【００４１】
ＣＴＮＮＢ１／ＣＳＮＫ１Ｄ／ＰＰＡＲＧ
酸素濃度５％の優位性として幹細胞の自己複製に関与するベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の発現が特異的に亢進した（図５）。同時にシグナル上流にあたるカゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）の発現も亢進した。さらに同条件にてＡＤＳＣの性質を運命付けるＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）も特異的に亢進した。
【００４２】
ＬＩＦＲ／ＴＣＦ−４
ＬＩＦＲは白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体であり、ＬＩＦＲにＬＩＦが結合することで、幹細胞の未分化維持機構が亢進することが知られている。また、ＴＣＦ−４は幹細胞にてベータカテニンと特異的に共役して働く転写因子であり、自己複製能力と発生誘導に関与する。酸素濃度５％の環境において、ＬＩＦＲ及びＴＣＦ−４の有意な発現亢進が認められた（図６）。
【００４３】
ＦＧＦ２
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）は酸素濃度が高い（２１％）場合に発現が減少した（図７）。ＦＧＦ２は体性幹細胞の培養において必要な因子である。
【００４４】
ＶＥＧＦＡ／ＴＧＦＢ２
過度な血管新生を生じる因子として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）が挙げられるが、この遺伝子も酸素濃度１％で亢進することが示された（図８）。
また、細胞死に関わる因子であるトランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）の発現亢進も認められた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014200068.tif 000024
【図８】
2014200068.tif 000025
【国際調査報告】
2014200068.tif 000026
2014200068.tif 000027
2014200068.tif 000028
2014200068.tif 000029