(57)【要約】  ハイドロゲルを含む生体成分用保存剤であって、前記ハイドロゲルが、複数の水酸基を有する化合物と、前記水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸と、から形成される架橋体を含む、保存剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルを含む生体成分用保存剤であって、
前記ハイドロゲルが、複数の水酸基を有する化合物と、前記水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸と、から形成される架橋体を含む、保存剤。
【請求項２】
前記置換基が、ジヒドロキシボリル基である、請求項１に記載の保存剤。
【請求項３】
前記修飾ヒアルロン酸が、下記式（１）で表される二糖単位を有する、請求項２に記載の保存剤。
【化１】
2016076317.tif 000008
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］
【請求項４】
前記ハイドロゲルが、未修飾のヒアルロン酸を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の保存剤。
【請求項５】
前記ハイドロゲルが、細胞用培地及び生理的緩衝液から選ばれる少なくとも１種を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の保存剤。
【請求項６】
前記生体成分が、細胞、細胞から構築された２次元又は３次元細胞凝集体、及び生体由来の組織又は臓器から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の保存剤。
【請求項７】
下記式（１）で表される二糖単位を有する修飾ヒアルロン酸と、前記二糖単位と反応して架橋構造を形成する、複数の水酸基を有する化合物とから形成される架橋体を含む、ハイドロゲル。
【化２】
2016076317.tif 000009
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］
【請求項８】
未修飾のヒアルロン酸を更に含む、請求項７に記載のハイドロゲル。
【請求項９】
ハイドロゲルと、前記ハイドロゲルに包埋された生体成分とを含む、混合物であって、
前記ハイドロゲルが、複数の水酸基を有する化合物と、前記水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸とから形成される架橋体を含む、混合物。
【請求項１０】
前記修飾ヒアルロン酸が、下記式（１）で表される二糖単位を有する、請求項９に記載の混合物。
【化３】
2016076317.tif 000010
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］
【請求項１１】
前記ハイドロゲルが、未修飾のヒアルロン酸を更に含む、請求項９又は１０に記載の混合物。
【請求項１２】
下記式（１）で表される二糖単位を有する修飾ヒアルロン酸。
【化４】
2016076317.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］
【請求項１３】
複数の水酸基を有する化合物を含有する第１の剤と、前記水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸を含有する第２の剤と、を備える、生体成分用保存剤を作製するためのキット。
【請求項１４】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の混合物を製造する方法であって、
前記化合物、前記修飾ヒアルロン酸及び前記生体成分を混合して、前記ハイドロゲルを形成しつつ前記生体成分を前記ハイドロゲルに包埋させる工程を含む、製造方法。
【請求項１５】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の混合物から、生体成分を回収する方法であって、
前記架橋体の架橋構造の少なくとも一部を解離して、前記ハイドロゲルを水可溶化させる工程を含む、回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分用保存剤、及び生体成分の回収方法に関する。また、本発明は、保存剤として好適なハイドロゲル、保存剤に好適に利用可能な修飾ヒアルロン酸、保存剤を提供するためのキットに関する。さらに本発明は、生体成分及びハイドロゲルを含む混合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体成分（例えば、動物細胞）の保存方法として、凍結保存液に細胞を分散させて、凍結保存用チューブに入れ、凍結保存する方法がある（例えば、非特許文献１）。主な凍結保存液には、培養液又は血清に１０％のジメチルスルホキシドを添加したもの、市販品等が用いられている。また、凍結された培養細胞を培養容器内に保持して保存する技術も検討されている（特許文献１）。【０００３】
また、冷蔵保存の技術も研究されている。例えば、従来から用いられている冷蔵用の細胞・組織保存液として、ユーロ−コリンズ液（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液）（非特許文献２）、ＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液）（非特許文献３）、ＥＴ−ｋｙｏｔｏ液（特許文献２）等が知られている。また、特許文献３には、ヒアルロン酸又はその塩を含む角膜移植用眼球保存液が記載されている。【０００４】
市販品の冷蔵保存液としては、セリオキープ、ＣＰＳ−１等が販売されている。セリオキープは、カテキンを有効成分として含み、組織、特に上内皮膚や神経組織の保存に適用される（非特許文献４、特許文献４）。また、ＣＰＳ−１は、塩類等の組成を適正化したものであるが、浮遊系の細胞に特化した試薬である（特許文献５）。【０００５】
また、細胞膜を構成するリン脂質のホスホリルコリンに着目した細胞の保存方法も報告されている（非特許文献５）。【０００６】
さらに、近年では、細胞を三次元的に包埋培養する修飾ヒアルロン酸であるＨｙＳｔｅｍ（商標）が市販されている（非特許文献６、７、８）。【０００７】
ところで、非特許文献９には、糖尿病の治療関連分野で、フェニルボロン酸で修飾したキトサンを用いたハイドロゲルの使用が開示されている。また、特許文献６には、薬物輸送システム（ドラックデリバリーシステム）の分野で、フェニルボロン酸で修飾したヒアルロン酸を用いたハイドロゲルを糖尿病治療薬と共に使用する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２１８９６７号公報
【特許文献２】特開平６−４０８０１号公報
【特許文献３】特開平６−１０７５３８号公報
【特許文献４】特開２００６−３０６８２１号公報
【特許文献５】特開２００６−２３０３９６号公報
【特許文献６】欧州特許出願公開第２７２７５９７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「培養細胞実験ハンドブック」，羊土社，２００４年，ｐ．６９−７４
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．，１３，６９３，１９８１
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４３，５，１９８７
【非特許文献４】Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ａ  １６（２０１０）  ５９５−６０３
【非特許文献５】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（２００７）  １７７０−１７７７
【非特許文献６】ＰＮＡＳ（２００７）ｖｏｌ．１０４  Ｎｏ．２７  １１２９８−１１３０３
【非特許文献７】Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  （２０１２）ｖｏｌ．１２  １０３４−１０４２
【非特許文献８】Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｃ（２０１３）  ｖｏｌ．１９  Ｎｏ．４  ２８８−２９７
【非特許文献９】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１１）  ｖｏｌ．１００  Ｎｏ．６  ２２７８−２２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、再生医療の発展に伴い、医療機関、研究機関、細胞加工業等の各種施設間での生体成分の輸送技術の重要性が増している。生体成分の輸送時の保存方法としては、凍結保存、及び冷蔵保存が用いられている。【００１１】
しかし、凍結保存では、生体成分の適切な凍結のために数日要することに加え、専用の冷凍設備で適切に運搬する必要がある。また、凍結保存では、厳密に温度管理して凍結しても、特に、初代細胞、生殖細胞、融合細胞、遺伝子導入細胞等の研究意義・臨床意義の高い細胞の保存が困難である。さらに、凍結保存では、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の肝細胞などの未分化細胞に対して分化誘導を促進してしまう、タンパク質の分解・変性の懸念がある、等の問題もある。【００１２】
冷蔵保存には、培養皿に細胞が接着した状態で運搬する場合、保存液に細胞が分散した状態で運搬する場合がある。しかし、前者では、振動によるダメージが大きく、また培養皿の表面のみの細胞量しか運搬できないという課題がある。また、後者では、振動によるダメージを受けるだけでなく、沈降した細胞同士が接着して細胞塊が形成される場合があり、これによって細胞死、分化誘導の促進等が懸念される。【００１３】
振動によるダメージを避けるため、非特許文献６〜８ではハイドロゲルで生体成分を包埋する方法が開示されている。しかし、非特許文献６〜８に記載のハイドロゲル（ＨｙＳｔｅｍ（商標））では、生体成分の回収のために、ヒアルロン酸分解酵素でハイドロゲルを溶解する必要があり、回収までに時間がかかること、分解酵素の生体成分への混入、分解酵素による生体成分へのダメージ等が懸念される。【００１４】
本発明の目的の一つは、生体成分保存用の保存剤であって、保存時及び運搬時の安定性に優れるとともに、回収時に簡便な操作で容易に生体成分を回収可能な、保存剤を提供することにある。また、本発明の目的の一つは、上記保存剤として好適に使用可能なハイドロゲル、及び、上記保存剤に好適に利用可能な修飾ヒアルロン酸を提供することにある。また、本発明の目的の一つは、上記保存剤を利用するためのキットを提供することにある。さらに、本発明の目的の一つは、保存性良く生体成分が包含された、混合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
すなわち、本発明の一側面は、ハイドロゲルを含む生体成分用保存剤に関する。当該保存剤において、上記ハイドロゲルは、複数の水酸基を有する化合物と、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸と、から形成される架橋体を含む。このような保存剤によれば、生体成分保存時の安定性に優れるとともに、簡便な操作で容易に生体成分を回収することができる。【００１６】
一態様において、上記置換基は、ジヒドロキシボリル基であってよい。【００１７】
一態様において、上記修飾ヒアルロン酸は、下記式（１）で表される二糖単位を有するものであってよい。
【化１】
2016076317.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］【００１８】
一態様において、上記ハイドロゲルは、未修飾のヒアルロン酸を更に含んでいてよい。【００１９】
一態様において、上記ハイドロゲルは、細胞用培地及び生理的緩衝液から選ばれる少なくとも１種を更に含んでいてよい。【００２０】
一態様において、上記生体成分は、細胞、細胞から構築された２次元又は３次元細胞凝集体、及び生体由来の組織又は臓器から選ばれる少なくとも１種を含むことができる。【００２１】
また、本発明の一側面は、下記式（１）で表される二糖単位を有する修飾ヒアルロン酸と、前記二糖単位と反応して架橋構造を形成する、複数の水酸基を有する化合物とから形成される架橋体を含む、ハイドロゲルに関する。
【化２】
2016076317.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］【００２２】
また、本発明の一側面は、ハイドロゲルと、ハイドロゲルに包埋された生体成分とを含む、混合物に関する。当該混合物において、上記ハイドロゲルは、複数の水酸基を有する化合物と、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸とから形成される架橋体を含む。【００２３】
また、本発明の一側面は、下記式（１）で表される二糖単位を有する修飾ヒアルロン酸に関する。
【化３】
2016076317.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。］【００２４】
また、本発明の一側面は、生体成分用保存剤を作製するためのキットに関する。当該キットは、複数の水酸基を有する化合物を含有する第１の剤と、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸を含有する第２の剤と、を備える。【００２５】
また、本発明の一側面は、上述した混合物を製造する製造方法に関する。当該製造方法は、上記化合物、上記修飾ヒアルロン酸及び生体成分を混合して、ハイドロゲルを形成しつつ、上記生体成分を上記ハイドロゲルに包埋させる工程を含む。【００２６】
さらに、本発明の一側面は、上述した混合物から、生体成分を回収する回収方法に関する。当該回収方法は、上記架橋体の架橋構造の少なくとも一部を解離して、上記ハイドロゲルを水可溶化させる工程を含む。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、生体成分保存用の保存剤であって、保存時及び運搬時の安定性に優れるとともに、回収時に簡便な操作で容易に生体成分を回収可能な、保存剤を提供することができる。また、本発明によれば、上記保存剤として好適に使用可能なハイドロゲル、上記保存剤に好適に利用可能な修飾ヒアルロン酸、及び、上記保存剤を使用するためのキットを提供することができる。さらに、本発明によれば、保存性良く生体成分が包含された、混合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例２〜３及び比較例１〜７における冷蔵保存５日目の細胞（マウスＥＳ細胞）の生存率を示す図である。
【図２】ソルビトール溶液による混合ゲルの溶解を示す図である。
【図３】実施例６及び比較例８〜９における冷蔵保存５日目の細胞群（ヒトｉＰＳ細胞）の残存率を示す図である。
【図４】実施例７及び比較例１０〜１１における冷蔵保存５日目の細胞（マウスＥＳ細胞）の生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な一実施形態について以下に説明する。
【００３０】
本実施形態に係る生体成分用保存剤は、生体成分を保存するための保存剤であって、生体成分を包埋するためのハイドロゲルを含む。
【００３１】
本実施形態のハイドロゲルは、複数の水酸基を有する化合物と、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する修飾ヒアルロン酸と、から形成される架橋体を含む。すなわち、本実施形態のハイドロゲルは、上記化合物で上記修飾ヒアルロン酸を架橋した架橋物を含む。本実施形態に係る保存剤は、このようなハイドロゲルによって生体成分を包埋することで、優れた保存安定性を得ることができる。
【００３２】
ヒアルロン酸は、脊椎動物の関節液、硝子体の主成分等として、生体内に普遍的に存在している水溶性の高分子多糖類である。修飾ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸が上記置換基を有するように修飾したものであり、このような修飾ヒアルロン酸を用いて形成された架橋体を有することで、上記ハイドロゲルは生体適合性が高いものとなる。細胞表面には、ヒアルロン酸と結合する受容体のＣＤ４４があり、これによる細胞への刺激や、ヒアルロン酸の高い保水力によって、生体成分の安定化への寄与が期待される。
【００３３】
また、上記架橋体は、修飾ヒアルロン酸に由来する剛直な高分子鎖を有する。このため、上記架橋体を含むハイドロゲルは、生体成分の保持性能に優れるとともに、振動等の運搬時のダメージから生体成分を十分に保護することができる。
【００３４】
さらに、上記修飾ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸由来の高分子鎖を有するため、水系溶媒に容易に溶解させることができる。このため、上記保存剤では、上記架橋体の架橋構造を解離して修飾ヒアルロン酸を水可溶化させることで、上記架橋体内に保持された生体成分を容易に回収することができる。
【００３５】
（１）修飾ヒアルロン酸
修飾ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸由来の多糖類高分子鎖（以下、場合によりヒアルロン酸糖鎖という。）を有し、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する。
【００３６】
修飾ヒアルロン酸は、例えば、ヒアルロン酸（原料ヒアルロン酸）に上記置換基を有する側鎖を付加することで得ることができる。ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖類である。ヒアルロン酸は、どのような製法・入手法で得られたものであってもよく、例えば、動物組織から抽出したものであっても、発酵法で製造したものであってもよい。
【００３７】
原料ヒアルロン酸の分子量等は特に制限されるものではない。原料ヒアルロン酸の重量平均分子量Ｍｗは、例えば５０００〜４００万であってよく、２万〜８０万であってもよく、５万〜４０万であってもよい。重量平均分子量が上記の範囲内であれば、溶液粘度を低く抑えることができ、ゲル化のための撹拌時にシェアストレスで細胞にダメージを与えるおそれも少なく、結果として細胞の生存率をより効果的に上げることができる。原料ヒアルロン酸の多分散度（数平均分子量Ｍｎと重量平均分子量Ｍｗの比Ｍｗ／Ｍｎ）は、例えば１〜１０であってよく、１〜２であってもよく、１．４〜２であってもよい。
【００３８】
修飾ヒアルロン酸が有する置換基は、水酸基と反応して架橋構造を形成し得る基である。上記置換基としては、入手容易さ、安全性の高さ、生体成分回収の容易さの観点から、ジヒドロキシボリル基（−Ｂ（ＯＨ）２）が好ましい。
【００３９】
上記置換基としてジヒドロキシボリル基を有する修飾ヒアルロン酸は、複数の水酸基を有する化合物と容易に架橋してハイドロゲルを形成することができる。また、このような修飾ヒアルロン酸から形成された架橋体は、ジヒドロキシボリル基のホウ素原子と水酸基の酸素原子と間の共有結合又は配位結合により、架橋構造が形成されていると考えられ、当該架橋構造は、上記複数の水酸基を有する化合物由来の酸素原子の代わりにホウ素原子と結合し得る酸素原子を有する化合物（例えば、ソルビトール等の糖アルコール）を添加することで、容易に架橋構造を解離し、水可溶化することができる。すなわち、上記修飾ヒアルロン酸を用いることで、架橋体の解離による水可溶化が一層容易となり、生体成分の回収を一層容易に行うことができる。
【００４０】
上記置換基としては、例えば、ジヒドロキシボリルフェニル基、ジヒドロキシボリルナフチル基、ジヒドロキシボリルアントラセニル基及びこれらの誘導体を含む芳香族ボリル基、アルキルボリル基及びその誘導体を含む脂肪族ボリル基などが挙げられる。これらのうち、生体成分の保存安定性が一層向上する観点から、芳香族ボリル基が好ましく、ジヒドロキシフェニル基がより好ましい。
【００４１】
上記置換基は、ヒアルロン酸糖鎖に直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。
【００４２】
リンカーは特に制限されず、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合等を有するものであってよい。リンカーは、生体成分の保存時及び生体成分の回収時に解離され難い構造であることが望ましく、この観点からは、アミド結合を有するものであることが好ましい。また、リンカーは、炭素原子、水素原子、窒素原子及び酸素原子から構成されることが好ましく、アミド結合、エーテル結合、低級アルキル基（炭素数４以下のアルキル基）、低級アルキレン基（炭素数４以下のアルキレン基）及び水酸基からなる群より選択される一種又は２種以上の構成単位から構成されることが好ましい。
【００４３】
ヒアルロン酸糖鎖に上記置換基を導入する方法は、特に制限されない。
【００４４】
例えば、ビニル基、アリル基等の炭素−炭素二重結合を重合性基として有し、且つ上記置換基を有する化合物と、重合性基を導入したヒアルロン酸とを反応させることにより、置換基を導入することができる。
【００４５】
上記重合性基を有する化合物としては、例えば、ｐ−ビニルフェニルボロン酸、ｍ−ビニルフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリロイルオキシフェニルボロン酸、ｍ−（メタ）アクリロイルオキシフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリルアミドフェニルボロン酸、ｐ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ｍ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ビニルウレタンフェニルボロン酸等が挙げられ、これらのうち、ｐ−ビニルフェニルボロン酸及びｍ−ビニルフェニルボロン酸を好適に用いることができる。
【００４６】
上記重合性基を導入したヒアルロン酸は、例えば、アミノ基及び重合性基を有する化合物と、ヒアルロン酸と、を反応させることにより得ることができる。ヒアルロン酸はカルボキシル基を有するため、上記化合物のアミノ基と反応してアミド結合を形成することで、容易に重合性基をヒアルロン酸に導入することができる。なお、上記化合物とヒアルロン酸との反応は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応試薬として用いて行うことができる。
【００４７】
アミノ基及び重合性基を有する化合物としては、例えば、アリルアミン、プロパルギルアミン等が挙げられる。
【００４８】
また、例えば、アミノ基及び上記置換基を有する化合物とヒアルロン酸とを反応させて、上記置換基をヒアルロン酸糖鎖に導入することもできる。このような反応は、上記と同様に、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応試薬として用いて行うことができる。
【００４９】
アミノ基及び上記置換基を有する化合物としては、例えば、アミノフェニルボロン酸、２−アミノエチルカルバモイルフェニルボロン酸、３−アミノプロピルカルバモイルフェニルボロン酸等が挙げられる。
【００５０】
本実施形態の修飾ヒアルロン酸は、下記式（１）で表される二糖単位を有するものであることが好ましい。このような修飾ヒアルロン酸によれば、生体成分の保存安定性に一層優れる架橋体が得られる。また、このような修飾ヒアルロン酸から形成される架橋体は架橋構造を容易に解離できるため、生体成分の回収が一層容易となる。
【００５１】
【化４】
2016076317.tif 000005
【００５２】
式中、Ｒ１は直接結合又は２価の基を示す。なお、「Ｒ１が直接結合を示す」とは、Ｒ１に結合する窒素原子が、Ｒ１に結合するベンゼン環中の炭素原子と、直接結合していることを示す。
【００５３】
Ｒ１は、フェニルボロン酸残基のメタ位又はパラ位に結合していることが好ましい。
【００５４】
Ｒ１における２価の基としては、例えば、アルキレン基、アミド基及びアルキレンオキシ基、並びに、これらの基を組み合わせて構成される基などが挙げられる。
【００５５】
Ｒ１における２価の基としては、例えば下記式（２）で表される基が挙げられる。
−ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２）ｍ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−    （２）
なお、式（２）における左端には、ヒアルロン酸糖鎖中の窒素原子が結合し、右端にはベンゼン環の炭素原子が結合する。
【００５６】
式中、ｍは０又は１の整数を示し、ｎは０〜３の整数を示す。
【００５７】
修飾ヒアルロン酸は、原料ヒアルロン酸のヒアルロン酸糖鎖中のカルボキシル基の一部が、上記置換基を有する基で修飾されたものであってよい。置換基の修飾率は、好ましくは２％以上であり、より好ましくは５％以上であり、さらに好ましくは１０％以上である。修飾率が２％以上であると、架橋構造がより密に形成されるため、生体成分の保存安定性が一層良好になる傾向がある。
【００５８】
また、置換基の修飾率は、５０％以下であってよく、好ましくは３０％以下であり、より好ましくは２５％以下であり、さらに好ましくは２０％以下である。修飾率が５０％を超えても生体成分の保存安定性の改善傾向は見られない。また修飾率を５０％以下とすることで、架橋構造の解離により、生体成分の回収が一層容易になる傾向がある。
【００５９】
本明細書中、修飾ヒアルロン酸における置換基の修飾率は、下記式に従って算出される値を示す。
修飾率（％）＝修飾ヒアルロン酸中の上記置換基の量（モル）／（修飾ヒアルロン酸中の上記置換基の量（モル）＋修飾ヒアルロン酸中のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量（モル））
【００６０】
なお、修飾ヒアルロン酸中の上記カルボキシル基の量は、下記のカルバゾール硫酸法で測定することができる。
【００６１】
（カルバゾール硫酸法）
乾燥した修飾ヒアルロン酸粉末を、濃度０．０３〜０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水で完全に溶解する。溶解した修飾ヒアルロン酸溶液をマイクロチューブに４０μＬ入れ、ここにホウ酸硫酸試薬（四ホウ酸ナトリウム十水和物０．９５ｇをはかりとり、硫酸１００ｍＬに加え４時間以上スターラー装置で攪拌し溶解）を２００μＬ入れ、ボルテックスで攪拌した後、約１００℃のヒートブロックで加熱する。３０分後、直ちに取出し氷水中で冷却し、室温に戻す。カルバゾール試薬（１．２５ｇ／Ｌのカルバゾール濃度を有する９５％エタノール溶液）を１０μＬ添加し、ボルテックスで攪拌した後、約１００℃のヒートブロックで加熱する。１５分後、直ちに取出し氷水中で冷却し、室温に戻す。得られた試料を９６ウェルプレートに１００μＬずつ入れ、マイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、モレキュラーデバイスジャパン株式会社）を用いて、波長５３０ｎｍの吸光度を測定する。
このとき、Ｄ−グルクロノラクトン水溶液を標準溶液とする。Ｄ−グルクロノラクトン０．５００ｇを１００ｍＬメスフラスコに精密にはかりとり、水で溶解後メスアップし、標準原液を作製する。標準原液を蒸留水で希釈し、２．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬの溶液をそれぞれ調製する。これらを用いて吸光度の検量線データを取得し、未修飾部分のヒアルロン酸量（濃度）を算出する。なお、Ｄ−グルクロノラクトン量（濃度）をヒアルロン酸量（濃度）へ変換するための係数は２．２７９とした。ここで測定された未修飾部分のヒアルロン酸量から、下記式によって修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量（ｍｏｌ）を算出する。
修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量（ｍｏｌ）＝測定された未修飾部分のヒアルロン酸量（ｇ）／３９８（ヒアルロン酸の二糖単位の分子量）
【００６２】
また、修飾ヒアルロン酸中の上記置換基の量は、置換基の種類によって適宜変更することができる。例えば、上記置換基が、ジヒドロキシボリル基を有する基である場合は、下記の原子吸光法で測定することができる。
【００６３】
（原子吸光法）
乾燥した修飾ヒアルロン酸粉末を、蒸留水で溶解する。この修飾ヒアルロン酸溶液０．３ｍＬと０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．３ｍＬとを混合した溶液を測定試料とする。原子吸光測定装置（Ａ−６８００、島津製作所製）にパイロ化チューブを設置し、以下の表１に示すプログラムを設定する。測定試料を２０μＬ、測定位置に入れ測定を行う。プログラムのＲＡＭＰは、目的温度まで設定時間をかけて、一定勾配で上昇することを意味し、ＳＴＥＰは直ちに目的温度まで上昇することを意味する。
この測定では、ホウ素標準液（１０００ｐｐｍ、和光純薬）を用いて、蒸留水で希釈し、濃度０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／Ｌ、２．５μｇ／ｍＬに調整した溶液を標準液とする。濃度０μｇ／ｍＬには蒸留水を用いる。これらの溶液も修飾ヒアルロン酸溶液と同様、等量の０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液と混合し、ホウ素量を原子吸光測定装置で測定する。測定結果から検量データを取得し、ホウ素原子量（すなわち、ジヒドロボリル基の量）（モル）を算出した。
【００６４】
【表１】
2016076317.tif 000006
【００６５】
（２）複数の水酸基を有する化合物
複数の水酸基を有する化合物としては、修飾ヒアルロン酸と架橋構造を形成してハイドロゲルを形成し得る化合物であれば、特に制限なく使用することができる。例えば、上記化合物の分子量、けん化度等は特に制限されない。
【００６６】
上記化合物は、水溶性高分子であることが好ましい。このような水溶性高分子から形成された架橋体は、架橋構造を解離することで容易に水可溶化することができ、水可溶化後の水溶性高分子及び修飾ヒアルロン酸を水系溶媒で容易に洗い流すことができる。このため、上記化合物が水溶性高分子であることで、生体成分の回収が一層容易となる。
【００６７】
また、上記化合物は、その水溶液のｐＨが６．０〜８．０の範囲内となるポリマーであることが好ましい。このようなポリマーであれば、生体成分の保存安定性が一層向上する。
【００６８】
また、上記化合物は、その主鎖に水酸基が直接結合したポリマーであってもよく、その主鎖に結合した側鎖上に水酸基を有するポリマーであってもよい。
【００６９】
上記化合物としては、例えば、ポリビニルアルコール等の水酸基を有するオレフィン系ポリマー、水酸基を有するスチレン系ポリマー、及び水酸基を有するポリエステル系ポリマーが挙げられる。これらのうち、水酸基を有するオレフィン系ポリマーが好ましく、ポリビニルアルコールが特に好ましい。
【００７０】
上記化合物としては、多糖類高分子鎖を有するポリマーを用いることもできる。多糖類高分子は、主鎖上に複数の水酸基を有するが、その主鎖の剛直さからハイドロゲルを形成し難い。このため、上記化合物としては、上記修飾ヒアルロン酸とハイドロゲルを形成可能なように、水酸基を複数含む基で修飾された多糖類高分子を好適に用いることができる。水酸基を複数含む基としては、例えば、単糖類、二糖類、１，２−ジオール構造を有する多価アルコール、グリセリン、ポリビニルアルコール等に由来する構造を有する基が挙げられる。
【００７１】
（３）その他の成分
本実施形態に係る保存剤は、上記ハイドロゲル以外の成分を含んでいてもよく、上記ハイドロゲルが上記架橋体以外の成分を含んでいてもよい。
【００７２】
上記ハイドロゲルは、例えば、上記架橋体及び水系溶液を含んで構成される。水系溶液のｐＨは、生体成分の保存安定性をより確実に得る観点から、ｐＨが６．０〜８．０の範囲内であることが好ましい。また、水系溶液の浸透圧は、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが好ましい。
【００７３】
上記ハイドロゲルは、水系溶液として、細胞培地、生理的緩衝液等を含んでいてもよい。細胞培地は、細胞を人工環境下で生育する場合に、十分量の栄養を与えるために用いられるものであり、このような細胞培地を含むハイドロゲルによれば、生体成分（特に各種細胞）の保存安定性が一層向上する。細胞培地の組成は、保存対象によって適宜変更することができるが、糖類及び無機塩類を含むことが好ましい。また、細胞培地は、アミノ酸、脂質、ビタミン、血清等を更に含んでいてもよい。
【００７４】
生理的緩衝液は、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン等を含むものであってよい。生理的緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を好適に用いることができる。
【００７５】
本実施形態に係る保存剤は、未修飾のヒアルロン酸を更に含んでいてもよい。上記ハイドロゲルは、修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸糖鎖によって生体適合性を有するものであるが、ハイドロゲルの一部分で架橋構造が過密に形成された場合、その部分ではヒアルロン酸糖鎖による生体適合性が十分に発揮されない場合がある。この点、保存剤に未修飾のヒアルロン酸を添加することで、過密に形成された架橋構造の近傍においても十分な生体適合性が得られ、生体成分の保存安定性を一層向上させることができる。
【００７６】
未修飾のヒアルロン酸は、例えば、水系溶媒に溶解する範囲内で適宜添加することができる。未修飾のヒアルロン酸の含有量は、例えば、保存剤の全量を基準として０．０１質量％〜２０質量％とすることができ、好ましくは０．０１〜１０質量％である。
【００７７】
本実施形態に係る保存剤は、上記以外に、例えば還元剤（グルタチオン、ビタミンＣ等）、細胞死抑制剤（ｃ−ＡＭＰ等）、成長因子（ＨＧＦ、ｂＦＧＦ等）などを更に含有していてもよい。
【００７８】
本実施形態のハイドロゲルは、その貯蔵弾性率が０．００１〜１００００Ｐａであることが好ましく、０．０１〜１０００Ｐａであることがより好ましい。また、ハイドロゲルの損失弾性率は、０．００１〜１００００Ｐａであることが好ましく、０．０１〜１０００Ｐａであることがより好ましい。なお、本明細書中、ハイドロゲルの損失弾性率及び貯蔵弾性率は、実施例に記載の方法で測定される値を示す。
【００７９】
本実施形態に係る保存剤による保存対象は、生体成分であれば特に限定されない。保存対象の生体成分としては、例えば、細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞、前駆細胞、成熟細胞など）、生殖細胞、遺伝子改変細胞、又はそれらの単独若しくは複数種類の細胞により構築した２次元及び３次元細胞凝集体（組織様構造物）、生体組織、臓器等が挙げられる。
【００８０】
本実施形態に係るハイドロゲルは、例えば、上記複数の水酸基を有する化合物を含む水溶液（以下、場合により化合物溶液という。）と、上記修飾ヒアルロン酸を含む水溶液（以下、場合により修飾ヒアルロン酸溶液という。）とを混合することで形成することができる。
【００８１】
本実施形態に係る保存剤によれば、保存剤のハイドロゲル中に生体成分を包埋させることで、生体成分を安定的に保存することができる。生体成分を包埋する方法は特に制限されない。
【００８２】
本実施形態では、例えば、生体成分を含む水系溶液中で上記ハイドロゲルを形成することによって、生体成分をハイドロゲル中に包埋させる方法によって、保存剤で保存された生体成分を得ることもできる。このとき、ハイドロゲルを形成する際の温度は、生体成分への悪影響を避けるため、０〜３７℃であることが好ましく、４〜３７℃であることがより好ましい。
【００８３】
上記方法の一例として、修飾ヒアルロン酸溶液及び化合物溶液の一方に、予め生体成分を分散させておき、その分散液に他方を添加して、ハイドロゲルを形成する方法が挙げられる。
【００８４】
本実施形態において、保存剤で保存された生体成分は、架橋体の架橋構造の少なくとも一部を解離することで容易に回収することができる。すなわち、本実施形態に係る回収方法は、ハイドロゲルに包埋された生体成分を回収する方法であって、上記架橋体の架橋構造の少なくとも一部を解離して、ハイドロゲルを水可溶化させる工程を含む。
【００８５】
架橋体の架橋構造を解離する方法は、形成される架橋構造に応じて適宜選択することができる。例えば、修飾ヒアルロン酸が上記置換基としてジヒドロキシボリル基を有する場合、ジヒドロキシボリル基のホウ素原子と水酸基の酸素原子との間の共有結合又は配位結合によって架橋構造が形成される。この場合、上記ポリマー由来の酸素原子の代わりにホウ素原子と結合し得る酸素原子を有する化合物（以下、回収用化合物という。）を添加することによって、容易に架橋構造を解離することができる。
【００８６】
上記回収用化合物は、ホウ素原子と共有結合又は配位結合で結合可能な酸素原子を含む化合物であり、好ましくは水酸基を有する化合物である。上記回収用化合物は、生体成分の回収時に水系溶媒で容易に洗浄することができる観点から、水溶性化合物であることが好ましい。
【００８７】
上記回収用化合物は、架橋構造を解離してハイドロゲルを水可溶化させる化合物であって、ホウ素原子と共有結合又は配位結合で結合可能な酸素原子を含む化合物であり、好ましくは水酸基を有する化合物である。上記回収用化合物は、生体成分の回収時に水系溶媒で容易に洗浄することができる観点から、水溶性化合物であることが好ましい。
【００８８】
上記回収用化合物としては、例えば、単糖、二糖、糖アルコール（例えばソルビトール）、オリゴ糖、グリセリン等の低分子多価アルコールなどが挙げられる。
【００８９】
本実施形態においては、上記保存剤は、そのまま保存剤として提供されてもよく、保存剤を形成するためのキットとして適用されてもよい。
【００９０】
本実施形態に係る保存剤キットは、上記複数の水酸基を有する化合物を含有する第１の剤と、上記修飾ヒアルロン酸を含有する第２の剤とを備えるものである。このようなキットによれば、第１の剤及び第２の剤からハイドロゲルを形成することで、上記保存剤を容易に得ることができる。
【００９１】
上記保存剤キットにおいて、第１の剤は、上記化合物を固体成分として含むものであってよく、上記化合物を含む水溶液であってもよい。また、第２の剤は、上記修飾ヒアルロン酸を固体成分として含むものであってよく、上記修飾ヒアルロン酸を含む水溶液であってもよい。さらに、第１の剤及び第２の剤は、上記化合物及び上記修飾ヒアルロン酸以外に、上述した各成分（例えば、未修飾のヒアルロン酸）を含むものであってもよい。
【００９２】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００９３】
例えば、本発明は、その一側面において、上記ハイドロゲルと、上記ハイドロゲルに包埋された生体成分とを含む、混合物に関するものであってよい。また、本発明は、上記混合物の製造方法ということもでき、上記混合物から生体成分を回収する回収方法ということもできる。
【００９４】
また、本発明は、その一側面において、上記修飾ヒアルロン酸に関するものであってよく、上記修飾ヒアルロン酸の製造方法に関するものであってもよい。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００９６】
［修飾ヒアルロン酸の作製］
（実施例１）
分子量５万のヒアルロン酸１．０ｇをフラスコに入れ、１５０ｍＬの蒸留水を加え、完全に溶解した。７５ｍＬの１，４−ジオキサンを加えた後、０．５４ｇのｍ−アミノフェニルボロン酸（和光純薬社製）を添加した。室温で２時間撹拌した後、１．２ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテスク社製）と、０．７ｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ナカライテスク社製）を添加した後、室温で１２時間撹拌した。反応液のｐＨが８．５以上となるように、５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を滴下し、一昼夜撹拌した。反応液に塩化ナトリウムを４．５ｇ加え、溶解後にアセトン２２５ｍＬを徐々に入れ、修飾ヒアルロン酸を析出した。デカンテーションで上清を除去し、蒸留水で希釈した８０％アセトンを１００ｍＬ入れ、１時間撹拌する操作を３回行った。続いて、アセトン１００ｍＬを加え、１時間撹拌する操作を３回行った。析出物を回収し、減圧条件下で風乾した。修飾ヒアルロン酸を蒸留水で溶解し、修飾率を測定したところ、修飾率１１．４ｍｏｌ％であった。【００９７】
［修飾ヒアルロン酸によるマウスＥＳ細胞の包埋、保存及び回収］
（実施例２）
細胞は、マウスＥＳ細胞（ＥＢ５）を用いた。ポリビニルアルコール（ＪＦ−１７、日本酢ビ・ポバール株式会社製）と分子量５万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度１．０％となるように、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した（溶液Ａ）。培養用４８ウェルプレートの各ウェルに溶液Ａを０．２ｍＬ入れ、ウェル底面に液を均一にしておいた。培養２日目の細胞をトリプシンで処理することで、培養皿から細胞を回収し、導入率１１．４ｍｏｌ％の実施例１で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解し、終濃度１．０％溶液（溶液Ｂ）とし、０．２ｍＬずつ、上記ウェル内に入れて撹拌し、ハイドロゲルを形成させた。ハイドロゲル形成後、冷蔵（約４℃）で５日間保存した。【００９８】
５日間の保存後、ソルビトール入り生理食塩水（ソルビトール濃度１０ｍｇ／ｍｌ、添加量１ｍｌ）を上記ウェル内に加え、ピペッティングすることで、ゲルを溶解した。溶解後の液をマイクロチューブに入れ、遠心分離で細胞を回収した。上清を除去した後、細胞の生存率を評価するため、細胞にトリパンブルー溶液を適量加え、染色性の差異で生死を判別した。【００９９】
細胞の生存率は以下の式に従って算出した。
細胞の生存率（−）＝（計測した全細胞中の生細胞数）／（計測した全細胞数）【０１００】
（実施例３）
溶液Ａから、未修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０１】
（比較例１）
溶液Ｂから、修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０２】
（比較例２）
溶液Ａから、ポリビニルアルコールを除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０３】
（比較例３）
溶液Ａから、未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Ｂから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０４】
（比較例４）
溶液Ａから、ポリビニルアルコールを除き、溶液Ｂから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０５】
（比較例５）
溶液Ａからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０６】
（比較例６）
溶液Ａからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Ｂから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例２と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１０７】
実施例２〜３、及び比較例１〜６に係る溶液Ａ及び溶液Ｂの組成を表２に示す。なお、表中、＋はその成分を含むことを示し、−はその成分を含まないことを示す。【０１０８】
【表２】
2016076317.tif 000007
【０１０９】
（比較例７）
１０ｍｇのチオール修飾ヒアルロン酸（ＨｙＳｔｅｍ；Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を、１．０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解した。２．５ｍｇの架橋開始剤（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ；Ｇｌｙｃｏｓａｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．２５ｍＬの蒸留水で溶解した。培養２日目のマウスＥＳ細胞（ＥＢ５）を終濃度が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１．０ｍＬのチオール修飾ヒアルロン酸溶液に懸濁した後、０．２５ｍＬの架橋開始剤溶液を混合し、すぐに４８ウェルプレートに０．４ｍＬずつ小分けし、室温で３０分間静置することでゲルを得た。このゲルを冷蔵（約４℃）で５日間保存した。【０１１０】
保存後、ヒアルロン酸分解酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎ  ｔｅｓｔｅｓ（ＴｙｐｅＩＶ）、Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭ  酢酸−酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．７）に溶解し、２０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように調製した溶液を、１．０ｍＬ加え、３７℃で約３０分間保温した。溶解した液を、マイクロチューブに回収し、遠心分離によって細胞を回収し、上清を除去後、リン酸緩衝生理食塩水を１．０ｍＬ添加し、軽く撹拌後、再度遠心分離を行い、上清のみ丁寧に除去し、細胞を回収した。この細胞の生存率を評価した。【０１１１】
実施例２〜３、及び比較例１〜７における細胞の生存率を図１に示す。【０１１２】
［ハイドロゲルの溶解性試験］
（実施例４）
修飾率１１ｍｏｌ％、分子量約２００万のアミノフェニルボロン酸修飾ヒアルロン酸を、生理的リン酸緩衝液に溶解し、０．５、１．０、２．０％（ｗ／ｖ）となるよう濃度を調整した。各濃度の修飾ヒアルロン酸溶液０．２ｍＬと、ポリビニルアルコール０．２ｍＬとを混合し、ハイドロゲルを作製した。このハイドロゲルを、生理食塩水、又は１０ｍｇ／ｍＬソルビトール含有生理食塩水９．６ｍＬに入れ、室温でスターラー攪拌しながら溶解した。経時的に数回、上清を０．２ｍＬずつ回収した。回収液中のヒアルロン酸量を上述したカルバゾール硫酸法で測定し、上清中のヒアルロン酸濃度を算出した。ゲルの溶解度を以下の式で算出した。
ゲルの溶解度＝上清中のヒアルロン酸濃度（％）／完全溶解後のヒアルロン酸濃度（％）【０１１３】
各ゲルの溶解挙動から、溶解度が５０％となる時間（ＨＬ５０）を求め、ハイドロゲル内の修飾ヒアルロン酸の濃度とＨＬ５０との関係を図２に示した。【０１１４】
（参考例１）
ソルビトール含有生理食塩水の代わりに、ソルビトールを含まない生理食塩水を用いた以外は、実施例４と同様の方法によって、ＨＬ５０を求めた。ハイドロゲル内の修飾ヒアルロン酸の濃度とＨＬ５０との関係は、図２に示すとおりとなった。【０１１５】
図２に示す結果から、本発明に係るハイドロゲルは、保存時の生理食塩水等による水可溶化を十分に抑制しつつ、適切な回収用化合物の添加によって容易に溶解させることができることが確認された。【０１１６】
［ハイドロゲルの粘弾性測定］
（実施例５）
修飾率が１１ｍｏｌ％のアミノフェニルボロン酸修飾ヒアルロン酸を作製し、濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、測定サンプルとした。また、ポリビニルアルコールを濃度１％（ｗ／ｖ）となるようにリン酸緩衝生理食塩水で調製し、測定サンプルとした。また、１％（ｗ／ｖ）修飾ヒアルロン酸溶液と、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール溶液とを等量混合し、ハイドロゲルの濃度１％（ｗ／ｖ）の測定サンプルを作製した。【０１１７】
粘弾性測定は、レオメーター（ＭＣＲ３００  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ  Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）に、治具（ＣＰ５０−１）を取り付けて行った。測定サンプルを約１．０ｍＬ、ステージに載せ、振幅３％、周波数０．０１〜１０Ｈｚ、３７℃で測定を行った。測定結果のうち、周波数が１０Ｈｚにおける貯蔵弾性率は、修飾ヒアルロン酸が１．３×１０−６Ｐａ、ポリビニルアルコールが０．７Ｐａ、ハイドロゲルが２８．１Ｐａであり、損失弾性率は、修飾ヒアルロン酸が１．４Ｐａ、ポリビニルアルコールが０．１Ｐａ、ハイドロゲルが７．４Ｐａであった。【０１１８】
［修飾ヒアルロン酸によるヒトｉＰＳ細胞の包埋、保存及び回収］
（実施例６）
細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）を用いた。ポリビニルアルコール（ＪＦ−１７、日本酢ビ・ポバール株式会社製）を終濃度１．０％、分子量５万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度３．０％となるように、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した（溶液Ａ）。修飾率１１．４ｍｏｌ％の実施例１で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解し、終濃度３．０％溶液（溶液Ｂ）とした。培養用６ウェルプレートにＭＥＦ細胞を播種し、一晩培養後、ヒトｉＰＳ細胞を播種した。そのまま３日間培養し、溶液Ｂを１．０ｍＬずつ入れてなじませた。ついで溶液Ａを１．０ｍＬずつ入れ、揺することで撹拌し、ハイドロゲルを形成させ、包埋した。ハイドロゲル形成後、冷蔵（約４℃）で５日間保存した。【０１１９】
５日間の保存後、ハイドロゲルをアスピレータで軽く除去後、ソルビトール入り生理食塩水（ソルビトール濃度１０ｍｇ／ｍｌ、添加量２ｍｌ）を上記ウェル内に加え、２分ほど静置することで、ゲルを溶解した。溶解液をアスピレータで除去し、再度生理食塩水を２ｍｌ添加し、アスピレータで除去する操作を二回繰り返した。上清を除去した後、細胞の生存性を評価するため、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて残存している細胞群を染色し、保存後の細胞群数を計測し、残存率として評価した。【０１２０】
細胞群の残存率は以下の式に従って算出した。
細胞群の残存率（−）＝（保存５日目の細胞群数）／（保存前の細胞群数）【０１２１】
（比較例８）
溶液Ａからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Ｂから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例６と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１２２】
（比較例９）
溶液ＡとＢの代わりに、セリオキープ（バイオベルデ）を２．０ｍＬ添加した以外は、実施例６と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１２３】
実施例６、及び比較例８〜９における細胞群の残存率を図３に示す。【０１２４】
［修飾ヒアルロン酸ハイドロゲルによる振動ダメージの軽減］
（実施例７）
細胞は、マウスＥＳ細胞（ＥＢ５）を用いた。ポリビニルアルコール（ＪＦ−１７、日本酢ビ・ポバール株式会社製）を終濃度１．０％、分子量５万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度３．０％となるように、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した（溶液Ａ）。修飾率１１．４ｍｏｌ％の実施例１で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解し、終濃度３．０％溶液（溶液Ｂ）とした。培養２日目の細胞をトリプシンで処理し、培養皿から細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに回収した。遠心後に上清を除去し、細胞濃度が１×１０６／ｍＬとなるように溶液Ｂを添加して懸濁した。この懸濁液０．５ｍＬを１５ｍＬコニカルチューブに入れ、溶液Ａを０．５ｍＬ添加して上下に反転撹拌し、ハイドロゲルを形成させた。ハイドロゲル形成後、冷蔵庫内（約４℃）で回転培養装置にセットした。この時、回転培養装置の回転軸方向は水平に、チューブの芯軸方向を回転軸方向に対して垂直となるようにし、３０ｒｐｍで回転させながら５日間保存した。【０１２５】
５日間の保存後、ソルビトール入り生理食塩水（ソルビトール濃度１０ｍｇ／ｍｌ、添加量５．０ｍｌ）を上記ウェル内に加え、ピペッティングすることで、ゲルを溶解した。溶解後の液をマイクロチューブに入れ、遠心分離で細胞を回収した。上清を除去した後、細胞の生存率を評価するため、細胞にトリパンブルー溶液を適量加え、染色性の差異で生死を判別した。【０１２６】
細胞の生存率は、実施例２と同様の方法で評価した。【０１２７】
（比較例１０）
溶液Ａからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Ｂから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例７と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１２８】
（比較例１１）
溶液ＡとＢの代わりに、セリオキープ（バイオベルデ）を１．０ｍＬ添加した以外は、実施例７と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。【０１２９】
実施例７、及び比較例１０〜１１における細胞の生存率を図４に示す。
【図１】
2016076317.tif 000012
【図２】
2016076317.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2016076317.tif 000017
2016076317.tif 000018
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