(57)【要約】  本発明は、異所性骨化の予防・治療剤であって、有効成分として、(i)PAI1阻害剤及び(ii)MMP1阻害剤のうちの少なくとも一つを含む、医薬製剤を提供する。また本発明は、異所性骨化の予防・治療薬をスクリーニングする方法であって、(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、(b)工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、(c)工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び(d)工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する工程を含む、方法を提供する。
2016104574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI1）阻害剤及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP1）阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
前記PAI1阻害剤が、チプラクスチニン（tiplaxtinin）である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記MMP1阻害剤が、ガラルジン（GM6001）である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
前記異所性骨化が、進行性骨化性線維異形成症（FOP）における異所性骨化である、請求項１から３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記：
(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
(b) 工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
(c) 工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
(d) 工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質として選定する工程、
を含む、方法。
【請求項６】
前記工程(b)が、被験物質の存在下及び非存在下で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程(a)が、塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF2）を含む培養液中で神経堤細胞を培養することにより行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(b)が、血小板由来増殖因子Ｂ鎖ホモダイマー（PDGF-BB）を含有する培養液中で間葉系間質細胞を培養することにより行われる、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記軟骨組織量の測定が、細胞外マトリックスの量を測定することにより行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスが、グリコサミノグリカン（GAG）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記軟骨組織量の測定が、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記軟骨細胞マーカー遺伝子が、SOX9、ACAN及びCOL2A1からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記軟骨組織量の測定が、アルシアンブルー（Alcian Blue）染色により行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ACVR1の遺伝的変異が、R206Hである、請求項５から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する神経堤細胞を拡大培養して得られた細胞である、請求項５から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経堤細胞の拡大培養が、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（EGF）及びFGF2を含有する培養液中で該神経堤細胞を培養することにより行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記TGFβ阻害剤が、SB431542である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記神経堤細胞の分化誘導が、TGFβ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（GSK3β）阻害剤を含有する培養液中で前記多能性幹細胞を培養することにより行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記TGFβ阻害剤が、SB431542であり、前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異所性骨化、とりわけ、進行性骨化性線維異形成症（以下、「FOP」とも言う）の予防及び／又は治療活性を有する物質のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、異所性骨化の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
異所性骨化は、本来骨形成が起きない組織において骨形成が認められる病態であり、後縦靭帯骨化症、黄色靭帯骨化症（黄色靭帯肥厚症）、進行性骨化性線維異形成症（FOP）、外傷性骨化性筋炎などにおいて、その症状が見られる。【０００３】
FOPは、親指の先天性奇形や進行性異所性骨化により特徴づけられる結合組織に発生する希少遺伝子疾患である（非特許文献１）。FOPにおける異所性骨化は、軟骨経路を介して幼児期に始まり、外傷が起因となる場合や突発的に起こる場合がある。FOPは、中軸骨格及び付属肢骨格における主関節の関節外硬直又は胸郭の融合を生じ、重篤な障害や致命的な呼吸器不全を生じる。【０００４】
FOPの責任遺伝子は、骨形成タンパク質（BMP）についてのI型受容体の一つをコードするACVR1（また、ALK2として知られている）であると考えられており、ACVR1のグリシン−セリンリッチ（GS）活性化ドメインにおいて突然変異（617G>A（R206H））が確認されている（非特許文献２）。変異ACVR1を様々な細胞株で過剰発現させる実験が多くの研究者によって行われており、R206H変異がACVR1を活性型に変換させ、その結果としてリガンドを必要としないBMPシグナル伝達の活性化や、リガンドへの過敏性をもたらしていることが見出されている。BMPは、骨形成や軟骨形成に関連するタンパク質として認識されていることから、変異ACVR1がFOPの異所性骨形成の原因となっていることを支持している。しかし変異ACVR1の過剰発現系を用いたこれらの重要な知見にもかかわらず、例えば、COS-7及びMC3T3-E1細胞株では変異ACVR1(R206H)の導入によりSMAD1/5/8の誘導が確認されているが、C2C12細胞株ではこのようなことは見られていないなど、いくつかの矛盾が残っている（非特許文献３、４及び５）。そこで、FOP患者の細胞を用いた研究が必要となるが、入手できる細胞は限られているうえに、細胞老化などにより症状の再現性を得ることが難しい（非特許文献６）。【０００５】
最近、本発明者らは、FOP患者から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を作製することに成功し、さらに、該FOP患者由来iPS細胞（FOP-iPSC）において、石灰化の増大や軟骨過形成特性等、FOPの病態の一部が再現されることを見出した（非特許文献７）。しかし、iPS細胞クローン間や実験間でかなりの差異が見られるため、詳細な解析のためには、複数のFOP-iPSC株やコントロールiPSCを比較する必要があった。また、このようなクローン間や実験間でのばらつきが、異所性骨化（とりわけ、FOP）のメカニズムの解明を困難なものとし、それ故、有効な治療薬の開発が進まない状況であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kaplan FS, et al., Dis Model Mech. 5, 756-762 (2012)
【非特許文献２】Shore EM, et al., Nat Genet. 38, 525-527 (2006)
【非特許文献３】Fukuda T, et al., J Biol Chem. 284, 7149-56 (2009)
【非特許文献４】Shen Q, et al., J Clin Invest. 119, 3462-3472 (2009)
【非特許文献５】van Dinther M et al., J Bone Miner Res. 25, 1208-1215 (2010)
【非特許文献６】Billings PC et al., J Bone Miner Res. 23, 305-313 (2008)
【非特許文献７】Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、異所性骨化、とりわけ、FOPの予防及び／又は治療活性を有する物質（以下、「予防・治療薬」ともいう）の高確度なスクリーニング方法を提供することである。また、本発明の別の課題は、該スクリーニング法により得られる物質を含有する、異所性骨化の予防及び／又は治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、進行性骨化性線維異形成症患者由来のiPS細胞（FOP-iPSC）において、遺伝子修復技術を適用することにより、遺伝的バックグラウンドは同一で突然変異のみ修復されたiPS細胞（resFOP-iPSC）を作製することに成功した。続いて、FOP-iPSCを、神経堤細胞及び間葉系間質細胞を介して軟骨細胞に分化誘導させたところ、FOP-iPSCに特有の軟骨細胞の分化促進という病態を再現することに成功した。すなわち、FOP患者の体細胞由来のiPS細胞は、軟骨誘導した際に、resFOP-iPSCと比較して、軟骨組織が過剰に形成される傾向を見出した。また、軟骨組織の過剰形成の生じる原因について検討したところ、軟骨前駆細胞の増殖が亢進することが原因ではなく、軟骨細胞から細胞外マトリックスが過剰に産生されることが軟骨組織の過剰形成の原因であることを見出した。さらに、FOPに代表される異所性骨化の機序を見出すべく、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC由来の種々の細胞につき遺伝子発現プロファイルを比較したところ、いくつかのシグナル伝達経路に分類される遺伝子群について両者間で違いが観察された。これらのシグナル阻害剤のうちPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤をFOP-iPSC由来の神経堤細胞へ適用すると軟骨組織の過剰形成が抑制されることから、当該阻害剤が、異所性骨化、とりわけFOPの異所性骨化の予防・治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
［１］  プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI1）阻害剤及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP1）阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤。
［２］  前記PAI1阻害剤が、チプラクスチニン（tiplaxtinin）である、［１］に記載の剤。
［３］  前記MMP1阻害剤が、ガラルジン（GM6001）である、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］  前記異所性骨化が、進行性骨化性線維異形成症（FOP）における異所性骨化である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の剤。
［５］  有効量のPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を対象に投与することを含む、該対象における異所性骨化の予防及び／又は治療方法。
［６］  前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［５］に記載の方法。
［７］  前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］  前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［５］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  異所性骨化の予防及び／又は治療において使用するためのPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤。
［１０］  前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［９］に記載の阻害剤。
［１１］  前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［９］又は［１０］に記載の阻害剤。
［１２］  前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［９］から［１１］のいずれか１項に記載の阻害剤。
［１３］  異所性骨化の予防及び／又は治療剤の製造のためのPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤の使用。
［１４］  前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［１３］に記載の使用。
［１５］  前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［１３］又は［１４］に記載の使用。
［１６］  前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［１３］から［１５］のいずれか１項に記載の使用。
［１７］  異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記：
(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
(b) 工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
(c) 工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
(d) 工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質として選定する工程、
を含む、方法。
［１８］  前記工程(b)が、被験物質の存在下及び非存在下で行われる、［１７］に記載の方法。
［１９］  前記工程(a)が、塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF2）を含む培養液中で神経堤細胞を培養することにより行われる、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］  前記工程(b)が、血小板由来増殖因子Ｂ鎖ホモダイマー（PDGF-BB）を含有する培養液中で間葉系間質細胞を培養することにより行われる、［１７］から［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］  前記軟骨組織量の測定が、細胞外マトリックスの量を測定することにより行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］  前記細胞外マトリックスが、グリコサミノグリカン（GAG）である、［２１］に記載の方法。
［２３］  前記軟骨組織量の測定が、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］  前記軟骨細胞マーカー遺伝子が、SOX9、ACAN及びCOL2A1からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、［２３］に記載の方法。
［２５］  前記軟骨組織量の測定が、アルシアンブルー（Alcian Blue）染色により行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２６］  前記ACVR1の遺伝的変異が、R206Hである、［１７］から［２５］のいずれか１項に記載の方法。
［２７］  前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する神経堤細胞を拡大培養して得られた細胞である、［１７］から［２６］のいずれか１項に記載の方法。
［２８］  前記神経堤細胞の拡大培養が、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（EGF）及びFGF2を含有する培養液中で該神経堤細胞を培養することにより行われる、［２７］に記載の方法。
［２９］  前記TGFβ阻害剤が、SB431542である［２８］に記載の方法。
［３０］  前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、［１７］から［２９］のいずれか１項に記載の方法。
［３１］  前記神経堤細胞の分化誘導が、TGFβ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（GSK3β）阻害剤を含有する培養液中で前記多能性幹細胞を培養することにより行われる、［３０］に記載の方法。
［３２］  前記TGFβ阻害剤が、SB431542であり、前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、［３１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスクリーニング法によれば、再現性よく異所性骨化の病態を発現させ得るので、異所性骨化の予防・治療薬の探索が可能となる。また、該スクリーニング法により得られたPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤は、軟骨組織の過形成を抑制し得るので、異所性骨化の有効な予防・治療薬となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、遺伝子修復FOP-iPSC(resFOP-iPSC)クローンを作製した結果を示す。(a)遺伝子修復(rescue)のためのBACに基づくターゲティングベクターの構築について示す。矢印は、プライマーの位置を示す(Acvr1(Ex7)F1、Acvr1(Ex7)R1、Acvr1(Ex7)R2、HR_Fow1及びneo_Rev)。(b)ACVR1の変異(617 G>A)の修復について調べた結果を示す。cDNA塩基配列を決定することにより、遺伝子が修復されていることを確認した。FOPは、FOP-iPSCであり、resFOP(cl1)及びresFOP(cl2)は、遺伝子修復された(rescue)FOP-iPSCクローンである。(c)ACVR1の5'領域において相同組換えが生じているかを調べた結果を示す。ACVR1の5'領域は、相同組換えにより、6.8 KbのPCR産物の挿入が生じていた。(d)pgk-neo耐性カセットについてのコピー数多型を調べた結果を示す。p.c.は、pgk-neoカセットのCre介在切除が行われる前のOSR1-GFPノックインhiPSCクローンである。(e)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）の代表的な画像を示す。スケールバーは、200 μmである。
【図２】図２は、FOP-iPSC由来のiNCC（induced Neural Crest Cell）及びiMSC（induced Mesenchymal Stromal Cell）について解析した結果を示す。(a) FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）からiNCCへの分化を誘導した代表的な画像を示す。(b)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）由来のiNCCにおける、NCC（Neural Crest Cell）マーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75(NGFR)の発現状態を解析した結果を示す。いずれの遺伝子マーカーも、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiNCCにおいて、同様のレベルで特異的に発現していた。(c)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）からiMSCへの分化を誘導した代表的な画像を示す。(d)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）由来のiMSCにおける、MSC（Mesenchymal Stromal Cell）の細胞表面マーカー(CD73、CD44及びCD105)、ならびにCD45の発現状態を解析した結果を示す。FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCにおいて、MSCの細胞表面マーカーであるCD73、CD44及びCD105の発現は見られたが、CD45については陰性であった。
【図３】図３は、FOP-iMSCの軟骨細胞分化能について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCから軟骨細胞への分化を誘導した10日目に、マイクロマス(MM)をAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(b)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるマイクロマスのサイズを定量化した結果を示す。マイクロマスのサイズは、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて増加していた。(c,d)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるGAG値(c)及びDNA量(d)を定量化した結果を示す。GAG値は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高値であったが、DNA量は、有意な差が見られなかった。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 8 (FOP)及びN = 4 (resFOP(cl1)及び(cl2))である。(e)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCのマイクロマスにおける軟骨細胞分化マーカー(SOX9、COL2A1及びACAN)の発現状態を解析した結果を示す。いずれの軟骨細胞分化マーカーも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高発現していた。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である（resFOPの値は、cl1(N = 2)及びcl2(N = 1)の平均である）。スチューデントt検定においては、**, P < 0.01; ***, P < 0.001である。
【図４】図４は、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCの遺伝子発現プロファイルの結果を示す。(a, b)iPSC、iNCC及びiMSCの各段階におけるFOP-iPSC及びresFOP-iPSCの遺伝子発現状態を解析した結果を示す。(a)は、iPSC、iNCC及びiMSCにおける階層的クラスタリング解析の結果であり、(b)は、異なる遺伝子発現セットを用いたPCAプロットの結果である。FOP-iPSC及びresFOP-iPSCは、同様の遺伝子発現プロファイルを示した。resFOPのすべてのデータは、resFOP(cl1)及び(cl2)の平均である。N = 2(resFOP-iPSC及びresFOP-iNCC)、N = 3(resFOP-iMSC(N = 2, cl1; N = 1, cl2))、N = 2(FOP-iPSC及びFOP-iNCC)、N = 3(FOP-iMSC)、N = 3(PSC、iNCC及びiMSC; 414C2、TIG120-4f1及びKhES1に由来する各細胞の平均)、ならびにN = 2(BMMSC; BM90及びBM91の平均)。(c-e)FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおけるグローバルな遺伝子発現プロファイルについての散布図を示す。iPSC及びiNCCは、N = 2であり、iMSCは、N = 3である。対角線の上下2本の線は、2つのサンプル間の2倍率変化の境界を示す。(f)FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおいて、統計的に有意な異なる発現状態を示す上位20個の遺伝子を示す(N = 3, p < 0.05)。
【図５】図５は、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の基礎的な活性の状態について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化状態についてのウエスタンブロッティング解析の結果を示す。SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高い状態であった。(b)(a)におけるリン酸化状態を定量化したグラフを示す。(c)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるBMP特異的ルシフェラーゼ構築体の活性を評価した結果を示す。ルシフェラーゼ活性は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(d)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるID1（BMPの標的遺伝子）の発現状態を解析した結果を示す。ID1の発現は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(e)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるTGFβ特異的ルシフェラーゼ構築体の活性を評価した結果を示す。ルシフェラーゼ活性は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(f)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるPAI1（TGFβの標的遺伝子）の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である（resFOPの値は、cl1(N = 2)及びcl2(N = 1)の平均である）。スチューデントt検定においては、*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001である。
【図６】図６は、iMSCにおけるPAI1発現の制御経路について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおいて、DMH1(SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)、SB431542(SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)及びU0126(MEK1/2 inhibitor, 1 μM)で処理した24時間後のPAI1の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、DMH1又はSB431542で処理した場合に減少していた。(b)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおいて、BMP4(10 ng/ml)、BMP7(100 ng/ml)及びTGFβ3(10 ng/ml)で処理した24時間後のPAI1の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、BMP4、BMP7又はTGFβ3で処理した場合に増加していた。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 6である（resFOPの値は、cl1(N = 3)及びcl2(N = 3)の平均である）。
【図７】図７は、MSC誘導の間におけるPAI1及びMMP1の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)Tiplaxtinin(PAI1 inhibitor, 10 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。(e)GM6001(MMP1 inhibitor)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(f,g)陽性領域のサイズ(f)及びGAG値(g)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。
【図８】図８は、MSC誘導の間におけるSMAD1/5/8の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)DMH1(SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。
【図９】図９は、MSC誘導の間におけるSMAD2/3の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)SB431542 (SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「異所性骨化」は、本来骨形成が起きない組織において骨形成が認められる病態を意味する。異所性骨化を伴う疾患として、例えば、後縦靭帯骨化症、黄色靭帯骨化症（黄色靭帯肥厚症）、進行性骨化性線維異形成症（FOP）、外傷性骨化性筋炎による異所性骨化が挙げられるが、これらに限定されない。FOPは、遺伝子の突然変異を伴うものでもよく、例えば、ACVR1の変異であり得る。ACVR1中に生じる突然変異としては、例えば、R206H、G356D等が挙げられるがこれらに限定されない。突然変異は、単独で生じていてもよいし、複数の変異が同時に生じていてもよい。本発明におけるFOPのACVR1の突然変異は、R206Hであり得る。
【００１３】
異所性骨化の予防及び／又は治療剤
本発明は、PAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤（以下、「本発明の予防・治療剤」ともいう）を提供する。本明細書において「予防・治療薬」という場合は活性成分そのものを意味し、「予防・治療剤」という場合は、予防及び／又は治療に用いるための医薬製剤を意味する。該医薬製剤は、活性成分単独であってもよいし、活性成分以外の添加物を含む組成物の形態であってもよい。
【００１４】
PAI1阻害剤
本発明において、「PAI1」は、「プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１」の略称であり、組織プラスミノーゲンアクチベーター（「t-PA」とも言う）やウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（「u-PA」とも言う）を特異的に阻害するセリンプロテアーゼ阻害タンパク質を意味する。本発明において使用され得る「PAI1阻害剤」は、PAI1の活性を阻害し、その機能を妨害するような物質であれば、いかなるものでもよく、PAI1を特異的に阻害するものであっても、PAIファミリーメンバーを広範に阻害するものであってもよい。PAI1阻害剤として、例えば、ジケトピペラジン（XR330、XR334、XR1853、XR5082等）、11-ケト-9(E),12(E)-オクタデカジエン酸、チプラクスチニン（tiplaxtinin）、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、L158809、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンC、ビタミンE、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(RU486)、スピロノラクトン及び反応性中心ループペプチド、抗PAI1中和抗体、PAI1に対するsiRNAなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるPAI1阻害剤は、好ましくは、tiplaxtininである。これらの物質は、公知文献に記載された合成方法もしくは通常の合成方法を用いて製造することができるし、あるいはこれらの物質を製造・販売している企業等から入手することもできる。
【００１５】
MMP1阻害剤
本発明において、「MMP1」は、「マトリックスメタロプロテアーゼ１」の略称であり、活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素であるメタロプロテアーゼの一つで、細胞外マトリックスの分解に関与する酵素である。本発明において使用され得る「MMP1阻害剤」は、MMP1の活性を阻害し、その機能を妨害するような物質であれば、いかなるものでもよく、MMP1を特異的に阻害するものであっても、MMPファミリーメンバーを広範に阻害するものであってもよい。MMP1阻害剤として、例えば、バチマスタット（Batimastat; BB-94）、マリマスタット（Marimastat; BB-2516）、プリノマスタット（Prinomastat; AG-3340）、CGS-27023A（MMI-270B）、ネオバスタット（Neovastat; AE-941）、BMS 275-291、テトラサイクリン類、マトリスタチン（Matristatin）、カテキン、GM6001（ガラルジン、アイロマスタット）、トロケード（Ro-32-3555）、抗MMP1中和抗体、MMP1に対するsiRNAなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるMMP1阻害剤は、好ましくは、GM6001である。これらの物質は、公知文献に記載された合成方法を参照し、あるいは通常の合成法を用いることにより製造することができ、また、これらの物質の製造、販売、開発会社等から入手することもできる。
【００１６】
本発明のPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤は、フリー体だけでなく、その薬理学的に許容される塩を包含するものとする。薬理学的に許容される塩は阻害剤の種類によって異なるが、例えばtiplaxtininの場合、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。また、GM6001の場合、前記酸付加塩などが挙げられる。
【００１７】
医薬製剤
本発明の予防・治療剤は、PAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等と混合し、適当な剤型の医薬組成物として、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００１８】
経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。一方、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤である）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体である）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物である）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類である）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤である）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸である）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等である）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００１９】
本発明の予防・治療剤中の、PAI1阻害剤、MMP1阻害剤の含有量は、それぞれ製剤全体の約0.0１〜100重量%であり得る。本発明の予防・治療剤において、PAI1阻害剤とMMP1阻害剤とを併用する場合には、各阻害剤をそれぞれ単独で製剤化してもよいし、合剤としてもよい。前者の場合、各製剤を同一対象に対して同時にまたは時間差をおいて投与することができる。本発明の予防・治療剤の投与量は、薬物の種類、投与対象の種、体重、齢、投与経路、症状の重篤度、薬物受容性等の種々の条件を考慮し、適宜変更し得るが、例えば、tiplaxtininの場合、通常、有効成分量として、約0.1〜約2000mg/kg/日、好ましくは約1〜200mg/kg/日であり、この量を1日1回又は2〜3回に分けて投与することができる。
【００２０】
異所性骨化の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法
本発明は、異所性骨化の予防・治療薬の探索のために、被験物質をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング法」という場合がある）を提供する。
【００２１】
本発明のスクリーニング法の一態様においては、以下の工程を含むことにより、異所性骨化の予防・治療薬をスクリーニングすることができる；
(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
(b)工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
(c)工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
(d)工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する工程。
【００２２】
神経堤細胞
本発明において、「神経堤細胞」（NCCともいう）とは、胚内の様々な部位への遊走能を有する、神経堤から脱上皮化した細胞と同等の細胞を意味する。すなわち、本発明の神経堤細胞は、神経堤由来の組織中（例えば、骨髄、脊髄後根神経節、心臓、角膜、虹彩、歯髄、及び嗅粘膜）の未分化な神経堤由来細胞も含む。神経堤細胞は、好ましくは、TFAP2A、SOX10、PAX3及びp75 (NGFR)のうち少なくとも一つの遺伝子が陽性である細胞であり得る。本発明において、TFAP2Aには、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001032280、NM_001042425又はNM_003220、マウスの場合、NM_001122948又はNM_011547に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、SOX10には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_006941、マウスの場合、NM_011437に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、PAX3には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000438、NM_001127366、NM_013942、NM_181457、NM_181458、NM_181459、NM_181460又はNM_181461、マウスの場合、NM_001159520又はNM_008781に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、p75 (NGFR)には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_002507、マウスの場合、NM_033217に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。
【００２３】
本発明において、「ACVR1に変異を有する」とは、ACVR1において、R206H（206番目のアルギニンがヒスチジンに置換）及び／又はG356D（356番目のグリシンがアスパラギン酸に置換）等の変異を有することが例示されるが、変異はこれに限定されない。変異は、単独で生じていてもよいし、複数の変異が同時に生じていてもよい。ACVR1における変異は、好ましくは、R206Hであり得る。本発明において、ACVR1は、ALK-2 (activin receptor-like kinase-2)とも呼ばれるBMP類に対する受容体であり、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001105又はNM_001111067であり、マウスの場合、NM_001110204、NM_001110205又はNM_007394に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質である。
【００２４】
本発明で用いる神経堤細胞は、凍結保存等によって予め用意された神経堤細胞を拡大培養することによって増殖させて用いることができる。神経堤細胞を拡大培養する方法として、TGFβ阻害剤、EGF及びFGF2を含有する培養液中で培養する方法が例示される。
【００２５】
本発明において、神経堤細胞の拡大培養に用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、αMEM培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００２６】
本発明において、TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、又はALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されない。本発明において、TGFβ阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009/146408) 及びこれらの誘導体などが例示される。神経堤細胞を拡大培養に使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
【００２７】
培養液中におけるSB431542などのTGFβ阻害剤の濃度は、ALK5を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM〜50 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10 μMである。
【００２８】
培養液中におけるEGFの濃度は、1 ng/ml〜100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
【００２９】
神経堤細胞を拡大培養に用いる培養液中におけるFGF2の濃度は、1 ng/ml〜100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
【００３０】
本発明の神経堤細胞の拡大培養において、細胞を単一に分離して培養する場合、単離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)及びAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）又はコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。細胞を単一に分離する場合、細胞死を抑制する目的で培養液へROCK阻害剤を添加してもよい。
【００３１】
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種又は２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。本工程で用いるROCK阻害剤の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合、0.1 μMから100 μM、好ましくは、1 μMから50 μM、さらに好ましくは、5 μＭから20 μMである。
【００３２】
本発明の神経堤細胞の拡大培養は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、フィブロネクチンである。
【００３３】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜約5％、好ましくは約5％である。
【００３４】
本発明で用いる神経堤細胞は、多能性幹細胞から誘導して用いても良い。多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する方法として、TGFβ阻害剤及びGSK-3β阻害剤を含有する培養液中で培養する方法が例示される。当該方法で誘導された神経堤細胞は、ｐ75を指標として単離して用いてもよく、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。ｐ75を指標として神経堤細胞を単離する方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、ｐ75の抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法が挙げられる。
【００３５】
本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するために用いるTGFβ阻害剤、培養液等は、上述した神経堤細胞を拡大培養する方法と同条件で用いることができる。
【００３６】
本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するために用いるGSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）及び高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００３７】
培養液中におけるCHIR99021などのGSK-3β阻害剤の濃度は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM〜5 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、1 μMである。
【００３８】
本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する方法は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲルである。
【００３９】
本工程において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するための培養日数は、例えば、10日以下、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、及び10日の培養であり、好ましくは、3-9日、特に好ましくは、7日である。
【００４０】
多能性幹細胞
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
【００４１】
iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等の遺伝子又は遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
【００４２】
体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００４３】
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００４４】
本発明において、多能性幹細胞は、ACVR1に、R206H、又はG356D等の変異を有することが望ましいことから、進行性骨化性線維異形成症（FOP）の患者由来の体細胞から製造されたiPS細胞が好ましい。あるいは、ACVR1遺伝子に変異を有さない多能性幹細胞に対して、遺伝子改変技術を用いて、ACVR1遺伝子中に突然変異を導入することによっても得られる。この場合において、遺伝子改変技術は、当分野で既知である種々の技術を採用することができ、例えば、WO2013/042731に記載の方法、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程
本発明において、「間葉系間質細胞」（MSCともいう）とは、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、周皮細胞などの結合組織の細胞への分化能を有する細胞を意味し、特に断りのない限り、間葉系幹細胞と同等の意味を有する。本発明における間葉系間質細胞は、特に限定されないが、CD73、CD44及びCD105が陽性であり、CD45が陰性である細胞である。本発明において、CD73には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001204813又はNM_002526、マウスの場合、NM_011851に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD44には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000610、NM_001001389、NM_001001390、NM_001001391、NM_001001392、NM_001202555、NM_001202556又はNM_001202557、マウスの場合、NM_001039150、NM_001039151、NM_001177785、NM_001177786、NM_001177787又はNM_009851に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD105には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000118、NM_001114753又はNM_001278138、マウスの場合、NM_001146348、NM_001146350又はNM_007932に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD45には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001267798、NM_002838又はNM_080921、マウスの場合、NM_001111316、NM_001268286又はNM_011210に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。
【００４６】
本発明において、神経堤細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程は、浮遊培養により行われてもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により行われてもよい。好ましくは、接着培養により培養される。接着培養が行われる際には、コーティング処理された培養容器を用いてもよく、フィーダー細胞上で培養してもよい。
【００４７】
神経堤細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程において、間葉系間質細胞を誘導する培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、αMEM培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、血清を含有するαMEM培地である。
【００４８】
神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導に用いる培養液におけるFGF2の濃度は、1 ng/ml〜20 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、5 ng/mlである。
【００４９】
神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導にかかる培養日数は、長期に培養することによって間葉系間質細胞の誘導に影響を及ぼすことがないので、特に上限は必要ないが、例えば、2日以上、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日及び14日の培養であり、好ましくは、7日以上、特に好ましくは、13日である。
【００５０】
神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、フィブロネクチンである。
【００５１】
本発明では、接着培養による間葉系間質細胞の誘導期間において、トリプシン-EDTA等の自体公知の分離溶液で細胞を分離し、同条件にて再播種する継代を行っても良く、コーティング剤を変更しても良い。コーティング剤を変更する場合、例えば、最初の培養をフィブロネクチンでコーティング処理された培養容器で行い、それに続く培養は、コーティング剤を用いずに接着培養することができる。この場合、フィブロネクチン上での培養日数は、例えば、5日以下、例えば、1日、2日、3日、4日、5日の培養であり、好ましくは、1-3日、特に好ましくは、2日である。
【００５２】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜約5％、好ましくは約5％である。
【００５３】
間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程
本発明において「軟骨細胞」は、コラーゲン、グリコサミノグリカン（GAG）などの軟骨又は軟骨組織を構成する細胞外マトリックスを産生する細胞、又は、このような細胞となる前駆細胞を意味する。本発明において軟骨細胞は、軟骨細胞のみによって集団を形成していてもよく、あるいは軟骨細胞と当該軟骨細胞から産生された細胞外マトリックスからなる培養物（パーティクル）の状態（軟骨様組織）であってもよい。また、このような軟骨細胞は、軟骨細胞マーカーを発現する細胞であってもよく、軟骨細胞マーカーとしてII型コラーゲン（COL2A1）、SOX9又はAGGRECAN（ACAN）が例示される。本発明において、COL2A1には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001844又はNM_033150、マウスの場合、NM_001113515又はNM_031163に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、SOX9には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000346、マウスの場合、NM_011448に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、AGGRECANには、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001135もしくはNM_013227、マウスの場合、NM_007424に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。また、本発明における軟骨細胞は、Alcian Blueにより染色され得る。
【００５４】
本発明では、間葉系間質細胞から軟骨細胞を誘導する方法として、二次元(2D)マイクロマス培養法又は三次元(3D)ペレット培養法を用いることができる。
【００５５】
（i）二次元(2D)マイクロマス培養法
2Dマイクロマス培養法では、間葉系間質細胞を任意の方法で分離し、接着培養により培養し得る。ここで、分離の方法としては、力学的な方法や酵素学的な方法を用いることができるが、本工程において、好ましくは、TrypLE Select (Invitrogen)により分離することができる。
【００５６】
本発明において、2Dマイクロマス培養法での接着培養は、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。本発明において、フィブロネクチンでコーティング処理されていることが好ましい。
【００５７】
2Dマイクロマス培養法において使用される培養液は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へPDGF-BB又はその機能的同等物を添加して調製することができる。該培養液には、さらにTGFβ3やBMP4、あるいはこれらの機能的同等物を添加することもできる。これらの基礎培地へ添加される因子は、同時に添加されてもよく、また培養工程の任意の段階において別々に添加されてもよい。
【００５８】
PDGF-BBの機能的同等物としては、例えば、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DDなどが挙げられるがこれらに限定されない。TGFβ3の機能的同等物としては、例えば、TGFβ1、TGFβ2などが挙げられるがこれらに限定されない。BMP4の機能的同等物としては、例えば、BMP2、BMP6、BMP7などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
2Dマイクロマス培養法において使用される基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium（DMEM）培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、これらの混合培地などが挙げられる。培地には、血清（例えば、FCS）が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時のFBSの血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、DMEM培地とHam’s F12培地を1:1で混合した無血清軟骨形成培地である。
【００６０】
基礎培地に添加するPDGF-BBの濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは20-60 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、40 ng/mlである。
【００６１】
TGFβ3を添加する場合、基礎培地に添加するTGFβ3の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
【００６２】
BMP4を添加する場合、基礎培地に添加するBMP4の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
【００６３】
2Dマイクロマス培養法において、培養温度は特に限定されないが、約30〜約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜約5％、好ましくは約5%である。空気におけるO2含有量は、通常の20％よりも低下した条件でもよく、例えば、15％、10％、又は5％が例示される。本工程の培養時間は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは10日である。
【００６４】
上記のとおり、基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、同時に行われてもよく、また培養工程の任意の段階において別々に添加されてもよい。好ましくは、培養工程の段階に応じて、任意の順序で任意の組み合わせで添加される。また、基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、培養中の培地に直接添加することもでき、また培地を交換する際に添加することもできる。
【００６５】
本工程における基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、例えば、下記の順序及び組み合わせで行われ得る。
（１）PDGF-BB、
（２）PDGF-BB及びTGFβ3、ならびに
（３）BMP4。
工程（１）の培養期間は、例えば10日以下であり、好ましくは3日である。工程（２）の培養期間は、例えば8日以下であり、好ましくは7日である。工程（３）の培養は、省略してもよく、行う場合の期間は、例えば8日以下であり、好ましくは4日である。
【００６６】
基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加はさらに、他の分化誘導因子と組み合わせて行うこともできる。他の分化誘導因子は、例えば、Wnt3A、Activin、FGF2、Follistatin、GDF5、NT4などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
（ii）三次元(3D)ペレット培養法
本発明において、3Dペレット培養に先んじて、間葉系間質細胞をFGF2及びTGFβ3を添加した培地中で継代する工程を含むことができる。継代期間は、特に限定されないが、5日以下の期間であり、3日間が好ましい。培地中のFGF2の濃度は、例えば0.1-50 ng/mlの範囲内、好ましくは0.5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、0.5 ng/ml、0.6 ng/ml、0.7 ng/ml、0.8 ng/ml、0.9 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、12 ng/ml、14 ng/ml、16 ng/ml、18 ng/ml、20 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、1〜5 ng/mlの範囲内である。培地中のTGFβ3の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
【００６８】
本発明において、3Dペレット培養に先んじて、上記継代培養された細胞を遠心分離機にかけて、ペレットを形成させる工程をさらに含み得る。遠心分離機に用いられる細胞の数は特に限定されないが、例えば、2.5×105個の細胞が用いられ得る。
【００６９】
3Dペレット培養法において使用される培養液は、2Dマイクロマス培養法と同様の培地を用いて行うことができる。
【００７０】
3Dペレット培養法において、培養温度は特に限定されないが、約30〜約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜約5％、好ましくは約5%である。本工程の培養時間は、例えば40日以下であり、好ましくは28日である。
【００７１】
スクリーニング工程
本発明のスクリーニング法においては、上述した細胞と被験物質を接触させ、被験物質を接触させなかった場合と比較して、軟骨組織量を減少させた被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する。
【００７２】
本発明のスクリーニング法における軟骨組織量の測定は、間葉系間質細胞の単位細胞あたりで誘導される軟骨細胞の組織の大きさを測定すること、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定すること、又は、軟骨細胞の細胞外マトリックスの量を測定することによって成し得る。
【００７３】
本発明のスクリーニング法において、被験物質と細胞との接触は、少なくとも神経堤細胞から間葉系間質細胞へと誘導する間に行われればよく、間葉系間質細胞から軟骨細胞へと誘導する間も被験物質を細胞と接触させることを妨げない。
【００７４】
本発明における軟骨細胞の組織の大きさの測定は、軟骨細胞を特異的に染色する物質を用いて染色された面積又は直径を測定することで行い得る。軟骨細胞を特異的に染色する物質は、例えば、Alcian Blue、サフラニンOやその類縁体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明における軟骨細胞マーカー遺伝子として、例えば、SOX9, ACAN, COL2A1などが挙げられるが、これらに限定されない。軟骨細胞マーカー遺伝子は、mRNAの発現量又はタンパク質量として測定され、当該測定方法としては、当業者に周知の方法によって行い得るが、例えば、ノーザンブロット法、RT-PCR、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー等の方法が挙げられる。
【００７６】
本発明における細胞外マトリックスの量の測定は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えば、細胞外マトリックスの量の測定は、グリコサミノグリカン（GAG）を標的とするBlyscan Glycosaminoglycan Assay (Biocolor)を用いて行うことができるが、これに限定されない。
【００７７】
本発明のスクリーニング法においては、任意の被験物質を用いることができ、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物等が挙げられる。本発明において、被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリー法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
【００７８】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
【実施例】
【００７９】
実施例１  BACを用いた相同組換えによるresFOP-iPSCクローンの樹立
FOP-iPSC（第7エクソンに617G>A(R206H)変異を有する）と同様の遺伝子バックグラウンドを有する信頼性の高いコントロールiPSCを作製するために、BACを用いた相同組換え技術を用いた。以前に記載されたとおり、BAC組換え法を行うため（Ikeya M., Int. J. Dev. Biol. 49: 807 - 823, 2005）、BACを用いてターゲティングベクターの構築を行った。簡潔には、ヒトBAC clone CTD-20251l1をlife technologies (Carlsbad, CA, USA)から購入した。次いで、floxed pgk-neoカセットを第6イントロンに挿入し、5' 領域を5 KBまで短くすることにより、ターゲティングベクターを構築した。得られたターゲティングベクターは、図１aで示されたとおり、5 KBの5'-短腕及び120 Kbの3'-長腕を含む構築体である。【００８０】
続いて、Maeらの方法（Mae S, et al., Nat Commun. 4:1367, 2013）を改変した方法でエレクトロポレーションによりターゲティングベクターを導入し、2種類のresFOP-iPSCクローンを樹立した。簡潔には、ACVR1ターゲティングベクターをFspA1制限酵素により直線化し、エタノール沈殿により滅菌した。FOP-iPSC (vFOP4-1株； Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190, 2013) をトリプシン処理し、遠心分離を行った後、PBSで再懸濁した。再懸濁したFOP-iPSCに全30 mgの直線化DNAを加えて、室温で、single 250 V, 500 mF pulse (Gene pulser CE, Bio-Rad) の電気刺激を細胞に与えた。次いで、FOP-iPSCを、ROCK inhibitor (Y-27632, 10 μM) を加えた培地中で、mitomycin-Cで処理したSNLフィーダー層上に播種した。エレクトロポレーションの2日後に、G418 (75 μg/ml)を添加して組換え体を選択した。得られたコロニーからゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAの塩基配列を決定することにより、遺伝子修復クローンを一次スクリーニングにかけた。次いで、5’long PCR産物（図１a下）により、相同組換えが生じていることを確認し（図１c）、cDNAの塩基配列を直接決定することにより、遺伝子修復が成功していることを確認した（図１b）。pgk-neoカセットに対するゲノムqPCRにより、単一コピーの挿入を確認した（図１d）。【００８１】
以上より、2株の遺伝子修復された(rescue) FOP-iPSCクローンの樹立に成功した（resFOP-iPSC (cl1)及びresFOP-iPSC (cl2)）。また、このとき、2株の非ターゲティングG418耐性クローンを得た。これらの非ターゲティングクローンは、軟骨細胞への分化能において、親のFOP-iPSCと同じ表現型を示すことが確認された。以後、非ターゲティングG418耐性クローンのうちの1つをFOP-iPSCクローンとして用いた。
resFOP-iPSC (cl1)、resFOP-iPSC (cl2)及びFOP-iPSCは、多能性マーカー遺伝子の発現、テラトーマ形成能、核型及び形態（図１e）を測定し、多能性に差異がないことを確認した。また、テラトーマにおける軟骨領域にresFOP-iPSC及びFOP-iPSCで違いがないことを確認した。【００８２】
実施例２  細胞培養
iPSCは、4 ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (FGF2)（WAKO）を補充した霊長類ES細胞培地(ReproCELL, Tokyo, Japan) にて維持した。【００８３】
神経堤細胞（NCC）の誘導は、次の通り行った。iPS細胞を1×104/wellでマトリゲルコーティングした24-wellプレートに播種し、mTeSR1（STEMCELL Technologies）中で2日間培養した後、10 μM SB431542及び1 μM CHIR99021を添加したchemically defined medium (CDM) で7日間培養して、NCCを誘導した（以下、iNCCと言う）。なお、CDMは、1x chemically defined lipid concentrate (GIBCO)、15 μg/ml apo-transferrin (Sigma)、450 μM monothioglycerol (Sigma)、5 mg/ml purified BSA (99% purified by crystallization; Sigma)、7 μg/ml Insulin (WAKO) 及びpenicillin/streptomycin (Invitrogen) をIscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F-12 1:1に添加することによって調製した。【００８４】
続いて、iNCCから間葉系間質細胞（MSC）への分化誘導は、次の方法で行った。上述の誘導後の細胞から抗p75抗体（BD, Cat No.560326）を用いてFACSによりp75陽性細胞を抽出し、2×105/wellでFibronectinコーティングした12-wellプレートに播種し、10 μM Y-27632及び10 μM SB431542を添加したCDM中で1日間培養した後、培地を10 μM SB431542、20 ng/ml FGF2及び20 ng/ml epidermal growth factor (EGF)（R&D）を添加したCDMへ交換し維持培養を9日間行った。維持培養後、MSC培地（5 ng/ml FGF2、10% fetal bovine serum (FBS)（Nichirei Inc.）及び0.5% penicillin and streptomycin (Invitrogen) を添加したminimum essential medium alpha modification (αMEM; Invitrogen Co.)）へ交換し2日間培養した。さらに、トリプシンで細胞を分離した後、3×105/wellで6-wellプレート（Costar社、#3516）に播種し、MSC培地中で、11日間継代培養した（以下、iMSCと言う）。【００８５】
実施例３  FOP-iPSCのiNCC／iMSC分化能についての解析
FOP-iPSCにおいて、ACVR1(R206H)の過剰発現が軟骨誘導を促進することが以前に報告されている（Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190 (2013)）。そこで、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCからそれぞれiNCC（induced Neural Crest Cell）及びiMSC（induced Mesenchmal Stromal Cell）を誘導し、両者の軟骨細胞分化特性を比較した。iNCCの誘導開始の7日目に、FACSを用いて、抗p75抗体により細胞を選別した後、iNCCの形態を観察した。その結果、FOP-iNCC及びresFOP-iNCCにおいて形態的な差異は見られなかった（図２a）。さらに、得られたiNCCにおけるNCCマーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75 (NGFR)の発現状態を、RT-PCRにより解析した。RT-PCRは、RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、各iNCCから全RNAをそれぞれ精製し、DNase-one kit (Qiagen)で処理してゲノムDNAを除去した。製造者の指示に従って、ランダムオリゴ及びSuperscript III reverse transcriptase (Invitrogen) を用いて、1 μgの全RNAを一本鎖cDNAに逆転写した。ExTaq (Takara, Shiga, Japan)によりPCRを行った。Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)を用いて定量的PCRを行い、StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems, Forester City, CA)を用いて解析を行った。その結果、NCCマーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75 (NGFR)のすべての遺伝子について、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiNCCで、同様のレベルで特異的に発現していた（図２b）。【００８６】
iMSC誘導開始の3継代目には、ヒト初代培養MSCと同様の形態の細胞が出現し、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおいて形態に違いは見られなかった（図２c）。iMSC誘導開始の7日目に、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCで、MSCの細胞表面マーカー(CD73、CD44及びCD105)、ならびにCD45を指標としてFACS解析を行った。FACS解析は、製造者のプロトコールに従って、AriaII (BD)を用いて行った。FACSで使用された抗体は、表１に記載した。【００８７】
【表１】
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【００８８】
その結果、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCにおいて、MSCの細胞表面マーカーであるCD73、CD44及びCD105の発現は見られたが、CD45は陰性であった（図２d）。この結果、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）のいずれのiPS細胞からでも、MSCへ分化誘導できたことが確認された。【００８９】
実施例４  FOP-iMSCの軟骨細胞分化能についての解析
FOP-iMSC及びresFOP-iMSCを2Dマイクロマス培養系により軟骨細胞へ分化させて、解析を行った。2Dマイクロマス培養系は、Umedaらの記載に従って次のとおり行われた（Umeda, K. et al. Scientific Reports 2 (2012)）。誘導したMSC (1.5 x105 cells) を5 μlの軟骨培地（40 ng/ml PDGF-BB (R&D)及び1% FBS (Nichirei)を添加した無血清軟骨形成培地（DMEM: F12 (1:1) (Invitrogen), 1% (v/v) ITS+ mix (BD), 0.17 mM AA2P, 0.35 mM Proline (Sigma), 0.1 μM dexamethasone (Sigma), 0.15% (v/v) glucose (Sigma), 1 mM Na-pyruvate (Invitrogen), 2 mM GlutaMax, 0.05 mM MTG））に懸濁させ、fibronectin-coated 24-well plate (BD)上にスポットした。1時間後に軟骨培地を加えて1 mlとした。3日目から10日目に、10 ng/ml TGFβ3 (R&D system)を培地に加えて培養を行った。マイクロマス培養は、5% CO2、37℃で10日間行った。軟骨誘導は、Alcian Blue染色、グリコサミノグリカン（GAG）量、DNA量によって評価した。Alcian Blue染色は、簡潔には、誘導した細胞を10% formalin (Sigma)で30分間固定し、PBSで洗浄した後、Alcian Blue溶液 (3% 氷酢酸及び1% HCl, pH 1の1% Alcian Blue (MUTO PURE CHEMICAL CO., LTD) )で一晩染色し、酢酸溶液で脱染した。GAG量の測定は、BLYSCAN Dye及びDissociation reagents (BIOCOLOR, Belfast, UK)を用いて、ペレット中のGAG量を定量化することにより行った。一方で、DNA量の測定は、PicoGreen dsDNA Quantitation kit (Invitrogen)を用いて行った。【００９０】
その結果、10日間分化誘導されたマイクロマスのサイズは、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて増加していた（図３a及びb）。また、GAG値は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高かったが（図３c）、DNA量は、両者において有意な差が見られなかった（図３d）。以上より、FOP-iMSCを軟骨細胞へ誘導すると、細胞外マトリックスを過剰に産生することが示された。【００９１】
続いて、10日間軟骨細胞へ分化誘導させたFOP-iMSC及びresFOP-iMSCの各軟骨細胞分化マーカーの発現をRT-PCRにより解析した。その結果、いずれの軟骨細胞分化マーカー（SOX9、COL2A1及びACAN）も、resFOP-iMSC由来の軟骨細胞と比較して、FOP-iMSC由来の軟骨細胞においてより高発現していることが観察された（図３e）。【００９２】
上記の結果をまとめると、ACVR1の変異は、細胞増殖ではなく、軟骨細胞への分化促進や軟骨細胞成熟化の促進に寄与することが示唆された。【００９３】
実施例５  FOP-iPSCの遺伝子発現プロファイルについての解析
実施例４において、FOP-iMSCとresFOP-iMSCとの間で軟骨細胞への異なる分化能が示されたことから、軟骨細胞への分化誘導工程の各段階における遺伝子発現プロファイルを比較するためにマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイ解析は、次のとおり行った。RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、全RNAを調製し、次いで、GeneChip WT (Whole Transcript) Sense Target Labeling and Control Reagents kitを用いて、製造者 (Affymetrix)により記載されたとおり、cDNAを合成した。その後、製造者(Affymetrix)のプロトコールに従って、GeneChip Human Gene 1.0 ST expression arraysへのハイブリダイゼーション、洗浄及びスキャニングを行った。データの解析は、GeneSpring GX 11.5.1 (Agilent Technologies)を用いて、散布図、階層的クラスタリングにより行った。階層的クラスタリングのために、similarity measureやaverage linkage clusteringについてChebyshev correlationを用いた。その結果、FOP-iPSCとresFOP-iPSCとの間における遺伝子発現プロファイルは、類似が階層クラスタリング（図４a）及びPrimary Component Analysis（PCA）（図４b）及び散布図（図４c）より確認された。また、FOP-iNCCとresFOP-iNCCとの間においても遺伝子発現プロファイルは類似していたが（図４a、b及びd）、FOP-iMSCとresFOP-iMSCとの間における遺伝子発現プロファイルは、階層的クラスタリングとPCAでは違いが見られなかったが（図４a及びb）、散布図において、明らかに異なる遺伝子発現状態を示す遺伝子群が存在していた（図４e）。MMP1及びPAI1についてはFOP-iMSCにおいて上昇する遺伝子として図中に示した。また、FOP-iMSCにおいて2倍以上発現が上昇する191個の遺伝子と2倍以上発現が減少する110個の遺伝子を確認し、これらの遺伝子のうち上位20個を図４fに示した。以上より、iPS細胞、NCC及びMSCの段階において、FOP細胞とresFOP細胞ではほぼ同一であることが確認されたが、MSCの段階ではいくつかの遺伝子発現が異なることが見出された。【００９４】
実施例６  iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の基礎的な活性状態の解析
BMPシグナルは、BMPで活性化されるSMAD1/5/8遺伝子のSMAD binding element (SBE)へ転写因子が結合することによるカノニカル経路とAP-1 binding siteへ転写因子が結合することによるノンカノニカル経路によって伝達される。そこで、FOP-iMSCにおいて遺伝子の発現が、BMPシグナル伝達によって引き起こされるかを確認するため、発現上昇する遺伝子の調節領域にSBE及びAP-1 binding siteがあるか調べたところ、ほとんどの遺伝子において、１つ又はそれ以上のSBE及びAP-1 binding siteがあることが確認された。一方、一部の遺伝子にはTGFβで活性化されるSMAD2/3のSBEが含まれることも確認された。さらに、SMAD1/5/8、ERK1/2、p38、JNK及びSMAD2/3のリン酸化状態をウエスタンブロッティングにより調べた。ウエスタンブロッティングは、標準的な手順により、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCのそれぞれの全セルライセートを用いて、SDS-PAGE後ブロッティングを行った。AmerchamTMECLTMPrime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Tokyo, Japan) を用いてタンパク質バンドを検出し、Image LabTM softwareと共にBIO-RAD Molecular Imager（登録商標） Chemi-DocTM XRS+を用いて可視化した。その結果、SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化状態が、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５a及びb）。一方、p38及びJNKでは違いが見られなかった。【００９５】
続いて、FOP-iMSCにおいてBMPシグナル及びTGFβシグナルが活性化していることを調べるために、BMP特異的ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（BRE-luciferase）を用いたレポーターアッセイ、及びBMPの下流遺伝子であるID1の発現状態の解析を行った。レポーターアッセイは、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCをそれぞれ溶解した後、製造者の指示に従って、dual luciferase reporter assay system (Promega)により解析を行った。その結果、ルシフェラーゼ活性及びID1発現のいずれも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５c及びd）。TGFβシグナルについては、TGFβ特異的ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（CAGA-lusiferase）を用いたレポーターアッセイ、及びTGFβの下流遺伝子であるPAI1の発現状態の解析を行った。その結果、ルシフェラーゼ活性及びPAI1発現のいずれも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５e及びf）。一方、AP-1についても同様にルシフェラーゼアッセイを行ったが、両者で特に違いは見られなかった。また、培養上清におけるBMP4、BMP6、BMP7及びTGFβのELISAを行ったが、iPS細胞、NCC及びMSCのいずれの段階においても、FOPとresFOPとの間で違いは見られず、わずかに検知されたのみであった。以上の結果より、変異ACVR1（R206H）により、FOP-iMSCでは、BMP-SMAD1/5/8及びTGFβ-SMAD2/3経路を恒常的に活性化していることが示唆された。【００９６】
実施例７  iMSCにおけるPAI1発現の制御経路についての解析
実施例６において、SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の活性化がFOP-iMSCで観察されたため、これらの経路がPAI1の発現を制御しているかを調べた。実施例３と同様の方法によりiMSCへ分化させた細胞（FOP-iMSC及びresFOP-iMSC）をDMH1 (SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)、SB431542 (SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)及びU0126 (MEK1/2 inhibitor, 1 μM)で処理し、24時間後にPAI1の発現をRT-PCRにより解析した。その結果、PAI1の発現は、DMH1又はSB431542で処理した場合に減少していた（図６a）。続いて、BMP4 (10 ng/ml)、BMP7 (100 ng/ml)及びTGFβ3 (10 ng/ml)で処理し、24時間後にPAI1の発現状態をRT-PCRにより解析したところ、PAI1の発現は、BMP4、BMP7又はTGFβ3で処理するとFOP-iMSC及びresFOP-iMSCのいずれでも増加していた（図６b）。これらの結果より、iMSCにおいて、PAI1の発現がBMP-SMAD1/5/8及びTGFβ-SMAD2/3の経路により正に制御されていることが示唆され、さらに、SMAD1/5/8及びSMAD2/3の経路がresFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて亢進している結果を支持している。【００９７】
実施例８  軟骨細胞分化におけるPAI1、MMP1、SMAD1/5/8及びSMAD2/3の機能についての解析
PAI1及びMMP1の発現がFOP-iMSCにおいてresFOP-iMSCよりも高かったことから（図４e）、 PAI1及びMMP1が、軟骨細胞分化において重要な役割を果たしているかを調べるため、NCCからMSCへの誘導の間（phase I）、MSCから軟骨細胞への誘導の間（phase II）及びNCCから軟骨細胞への誘導の間（phase I + II）の各段階において（図７a、８a及び９a）、PAI1、MMP1、SMAD1/5/8及びSMAD2/3のそれぞれの阻害剤（10 μM Tiplaxtinin（PAI1 inhibitor）（Axon Medchem）、10 nM GM6001（MMP1 inhibitor）（Calbiochem）、2 μM DMH1（SMAD1/5/8 inhibitor）及び10 μM SB431542（SMAD2/3 inhibitor））を添加した場合における、軟骨細胞の大きさ及びGAG値について調べた。NCCへの分化誘導は、実施例３、MSC及び軟骨細胞への分化誘導は、実施例３及び４と同様の方法により行った。その結果、DMH1及びSB431542をphase I、phase II又はphase I + IIの段階で添加した場合全てにおいて、Alcian Blue陽性領域の大きさ及びGAG値が陰性対照と比較して減少した（図８b、図８c、図９b及び図９c）。このことは、MSC誘導工程及び軟骨誘導工程において、SMAD1/5/8及びSMAD2/3シグナルの両方が軟骨誘導に関与していることを示唆している。一方、GM6001及びTiplaxtininでは、phase I及びphase I + IIの段階で添加した場合において、FOP-MSCにおける軟骨誘導を減少させた（図７bからg）。これらの結果より、MMP1及びPAI1は、FOP細胞がNCCからMSCに誘導される間において軟骨誘導能を亢進させることが示唆された。【００９８】
FOP患者における異所性骨化は、まず軟骨が形成され、その後骨に置き換わる、軟骨内骨化により引き起こされることから、軟骨形成を抑制する効果のある薬剤は、異所性骨化の治療に有用であると考えられる。さらに、FOPの異所性骨化においてMSCの誘導過程において軟骨形成能が決定されると考えられることから、PAI1阻害剤やMMP1阻害剤はMSCの誘導時に働きMSCの軟骨易分化性を抑制し、FOPの異所性骨化の治療に有効であると考えられる。【００９９】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１００】
本出願は、2014年12月24日付で日本国に出願された特願2014-261086を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明は、異所性骨化の予防・治療薬の新たなスクリーニング方法を提供するものである。適当な分化誘導系を用いることで、より有効なスクリーニングを実施することが可能となる。また、当該スクリーニング系により新たに見出されたPAI1阻害剤やMMP1阻害剤等は、異所性骨化、とりわけ、FOPの予防・治療に極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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