(57)【要約】  周辺の細胞を傷つけることなく、単一細胞内の生体分子を採取し、解析することができる生体分子解析装置を提供することを目的とする。  この課題を解決するため、本発明の生体分子解析装置は、複数の細胞の光学イメージを得る手段と、前記複数の細胞のうちの１つ以上の細胞の一部又は全部を破壊する手段と、前記破壊する手段によって放出される細胞中の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスと、前記光学イメージにおける、前記破壊する手段によって破壊された細胞に相当する部分に対し、前記アレイデバイスにおける生体分子を捕捉した領域を対応付ける手段と、を備えることを特徴とする。
2015097858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞の光学イメージを得る手段と、
前記複数の細胞のうちの１つ以上の細胞の一部又は全部を破壊する手段と、
前記破壊する手段によって放出される細胞中の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスと、
前記光学イメージにおける、前記破壊する手段によって破壊された細胞に相当する部分に対し、前記アレイデバイスにおける生体分子を捕捉した領域を対応付ける手段と、
を備える生体分子解析装置。
【請求項２】
破壊する手段によって細胞を破壊する前に、アレイデバイスの領域と、破壊する細胞とを接近させる手段をさらに備える請求項１に記載の生体分子解析装置。
【請求項３】
放出される細胞中の生体分子を、アレイデバイスの領域に吸引し又は泳動させる手段をさらに備える請求項１又は２に記載の生体分子解析装置。
【請求項４】
アレイデバイスが、多孔質メンブレン、又は表面にビーズがパッキングされたビーズアレイである請求項１〜３のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項５】
アレイデバイスの表面又は内部に、細胞中の生体分子を選択的に捕捉するためのプローブ分子が固定されている請求項１〜４のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項６】
細胞中の生体分子がｍＲＮＡであり、プローブ分子がＤＮＡプローブである請求項５に記載の生体分子解析装置。
【請求項７】
ＤＮＡプローブが、アレイデバイスの位置ごとに異なる配列を有する請求項６に記載の生体分子解析装置。
【請求項８】
細胞中の生体分子がタンパク質又はペプチドであり、プローブ分子が抗体である請求項５に記載の生体分子解析装置。
【請求項９】
破壊する手段が、レーザーである請求項１〜８のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項１０】
破壊する手段が、ニードルである請求項１〜８のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項１１】
破壊する手段が、中空ニードルであり、細胞中の生体分子は前記中空ニードル内を通って放出される請求項１〜８のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項１２】
破壊する手段が、電子線又は荷電粒子線である請求項１〜８のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【請求項１３】
複数の細胞が、ゲル中に３次元的に配置されている請求項１〜１２のいずれかに記載の生体分子解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の細胞から構成される生体組織のゲノム解析や遺伝子発現解析、タンパク解析を行う際に、個々の細胞のゲノムや遺伝子発現、タンパク質の違いに注目して解析を行う単一細胞解析の重要性が認識され始めている。従来の解析では、生体組織からサンプリングした多数の細胞（１０３〜１０６個以上の細胞）から、１種類のサンプルとしてＤＮＡやＲＮＡ、あるいはタンパク質を抽出して解析を行うため、サンプル中の平均的な解析を行っていた。そのため、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質の個々の細胞中の存在量が平均値から乖離していたとしても、評価することが困難であった。単一細胞解析はこのような平均化の問題を解決する解析方法として重要である。特に、がんやｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞：induced pluripotent stem cells）の研究では、少数の細胞が生体組織の平均的な振る舞いとはかけ離れていることが知られており、単一細胞解析の重要性が指摘されている。【０００３】
生体組織からサンプリングした多数の細胞の平均的な振る舞いを解析するバルク解析では、１回の測定で非常に豊富な種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質に関する情報を得ることができる。しかし、このようなバルク解析法を、単純に単一細胞解析に適用することはできない。多くのバルク解析方法では、必要最低限のサンプル量が単一細胞レベルの１０００倍から１００万倍であり、必要感度が不足していることが多い。そして、そもそも単一細胞解析を実現するためには、単一細胞を単離する必要がある。【０００４】
組織切片や接着系培養細胞の場合、細胞をトリプシン処理等の化学処理によって、細胞間の結合を切断することにより、原理的には細胞の単離が可能である。【０００５】
また、非特許文献１及び２に記載されているように、レーザーマイクロダイセクションあるいはレーザーキャプチャマイクロダイセクションと呼ばれる技術を用いて、顕微鏡イメージ上の特定の細胞群を切り出すことが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】BioTechniques 27, 2: 362-367 (August 1999)
【非特許文献２】Cellular and Molecular Biology 44 (5), 735-746 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のようにトリプシン処理等の化学処理により細胞間の結合を切断する場合、組織中の細胞がばらばらになってしまうとともに、単離のための化学処理によって細胞の状態、すなわち、遺伝子発現量やタンパク質の量等が変化する可能性があることも大きな懸念事項であった。【０００８】
また、非特許文献１及び２に記載されているようなレーザーマイクロダイセクションあるいはレーザーキャプチャマイクロダイセクションでは、少なくとも細胞の大きさと同程度以上の厚さの組織切片をレーザーを用いて切り出すためには、数μｍ以上の切りしろが必要である。この数μｍという切りしろは細胞のサイズと同程度であるため、細胞が近接している場合に近接した細胞にダメージを与えずに細胞を単離することは困難であった。また、周辺の細胞を破壊することによって、周辺の細胞中に含まれる生体分子がサンプル溶液の中に混入して、計測精度を低下させるという問題もあった。さらに、複数の層からなる切片からの細胞の単離は、従来技術が２次元面内の切断を行う技術であるため不可能であった。【０００９】
そこで本発明は、周辺の細胞を傷つけることなく、単一細胞内の生体分子を採取し、解析することができる生体分子解析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の生体分子解析装置は、複数の細胞の光学イメージを得る手段と、前記複数の細胞のうちの１つ以上の細胞の一部又は全部を破壊する手段と、前記破壊する手段によって放出される細胞中の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスと、前記光学イメージにおける、前記破壊する手段によって破壊された細胞に相当する部分に対し、前記アレイデバイスにおける生体分子を捕捉した領域を対応付ける手段と、を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、接着系培養細胞や組織切片内の細胞の中のＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質等の生体分子を、単一細胞ごとにアレイデバイスに採取し、採取したアレイデバイス上の領域と顕微鏡により得られる光学イメージ上の細胞とを対応付けることによって、周辺の細胞を傷付けることなく、他の細胞からの生体分子の混入を回避して単一細胞内の生体分子を解析することが可能となる。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１実施形態に係る生体分子解析装置の構成図である。
【図２】本発明の第１実施形態における細孔アレイシートの上面図である。
【図３】生体分子を誘電泳動させる場合の電極構造を示す図である。
【図４】本発明の第１実施形態に係る生体分子解析装置の動作を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の第１実施形態におけるサンプル調製方法（前半）を説明する図である。
【図６】本発明の第１実施形態におけるサンプル調製方法（後半）を説明する図である。
【図７】分子識別用タグ配列の機能を説明するための図である。
【図８】アレイデバイスを分割して、サンプル調製を行う場合を説明するための図である。
【図９】顕微鏡システムとして微分干渉顕微鏡を用いる場合の構成図である。
【図１０】顕微鏡システムとしてＣＡＲＳ顕微鏡を用いる場合の構成図である。
【図１１】遺伝子発現データ解析の手順を示すフローチャートである。
【図１２】主因子分析の結果をプロットした図である。
【図１３】本発明の第２実施形態におけるサンプル調製方法（１）を説明する図である。
【図１４】本発明の第２実施形態におけるサンプル調製方法（２）を説明する図である。
【図１５】本発明の第２実施形態におけるサンプル調製方法（３）を説明する図である。
【図１６】本発明の第３実施形態に係る生体分子解析装置の構成図である。
【図１７】本発明の第５実施形態におけるビーズアレイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明では、シャーレ上の接着系培養細胞や組織切片の光学イメージに対応する細胞内組織（細胞膜等）の一部をレーザーによるアブレーション等によって破壊し、破壊された細胞から放出される生体分子のうち計測対象とする生体分子をアレイデバイスの特定の領域で捕捉する。より一般的には、本発明の生体分子解析装置は、平面上に配置された複数の細胞の光学イメージを取得する手段と、複数の細胞のうちの１つ以上の細胞の一部又は全部を、レーザー収束照射、音波収束照射、ニードル穿孔、中空ニードル穿孔等により破壊する手段と、アレイ状に配列した領域で、細胞ごとに、破壊によって細胞外に出た生体分子を捕捉する手段（アレイデバイス）と、光学イメージ上の細胞にアレイデバイス上の領域を対応付ける手段を有している。
【００１５】
すなわち、細胞の切り出しによって単離するのではなく、細胞を単離せず、細胞膜等の細胞内組織の一部を破壊するため、計測対象とした細胞がどのように周辺の細胞と接着していても、周辺の細胞を傷付けることなく、レーザーの集光能力等による得られる高い分解能で細胞の一部又は全部を破壊し、その細胞内の生体分子を採取することができる。
【００１６】
また、細胞全体を周辺の細胞組織と同時に採取せず、目的の生体分子のみを捕捉することをアレイデバイス用いて行うため、その後のサンプル処理において目的の生体分子以外の不純物の混入を防ぐことができ、高精度な解析が可能となる。また、目的以外の生体分子に対する不要なサンプル処理のための試薬の使用がなくなるため解析コストの低減を図ることができる。
【００１７】
本発明により、蛍光顕微鏡やラマン顕微鏡等により細胞を壊さないで得た光学イメージに対し、細胞を破壊して得た遺伝子やタンパク質等の生体分子の定量情報を対応付けることができる。この対応付けは、多数の種類の生体分子を定量評価することは困難であるが細胞を生きたまま計測することができるイメージング手段で得られたデータと、詳細な生体分子に関する定量データの取得は可能だが細胞を破壊するために細胞の動的特性を評価できない手段で得られたデータを対応させることによって、細胞の詳細かつ動的な特性評価を可能にするものである。
【００１８】
従来、本発明者らは、多数の細胞を一度に低コストで解析するために、多孔質メンブレン等を利用してｃＤＮＡライブラリーを構成し、遺伝子発現の２次元分布を得ることによって多数の細胞中の遺伝子発現解析を行うデバイスを開発した（米国特許出願公開第２０１２／０２４５０５３号明細書）。
【００１９】
この従来のデバイスを用いた方法では、顕微鏡観察した細胞から抽出したｍＲＮＡを細胞直下のデバイス上で捕捉して、逆転写することにより、細胞の顕微鏡イメージに対応した細胞の遺伝子発現解析を細胞の単離を行わずに実行することができる。そのため、細胞の単離時に細胞の顕微鏡像と遺伝子発現解析の対象となる細胞との対応が失われるという問題を回避している。
【００２０】
しかし、上記従来のデバイスでは、細胞直下の多孔質メンブレンからなるデバイス上にｍＲＮＡを捕捉するため、デバイス面に対して垂直な軸方向に細胞が重なってしまうと抽出されたｍＲＮＡが元々あった細胞を特定することができなくなるという課題がある。また、顕微鏡による光学イメージングの時点で、詳細なゲノム解析や遺伝子発現解析やプロテオーム解析を行う必要がない細胞が多数あったとしても、全ての細胞からのｍＲＮＡ等の生体分子をいったん多孔質メンブレンからなるデバイス上に抽出・捕捉し、その後の解析のためのサンプル処理も全ての細胞分に対して行う必要があった。そのため、サンプル調製のための試薬を無駄にしてしまうという課題もあった。本発明では、レーザー等によって単一細胞を破壊し、その細胞内の生体分子のみを解析可能であるため、上記の課題を解決することができる。
【００２１】
また、上記従来の多孔質メンブレンからなるデバイス上に配置した細胞サンプルを、微分干渉顕微鏡や非線形ラマン顕微鏡等の透過型顕微鏡を用いて光学イメージングを行う場合、デバイス上で光の散乱が生じ、イメージングの解像度を低下させる問題があった。この問題も、本発明により解決することができる。すなわち、本発明ではデバイス上に細胞を載せた状態で顕微鏡観察する必要がないので、透過型の顕微鏡を用いる場合に光の散乱による光学イメージの解像度の低下を避けることができる。
【００２２】
さらに、上記従来の多孔質メンブレンからなるデバイスを用いて接着系培養細胞の解析を行う場合、培養細胞が接着する材質が前記多孔質メンブレンを構成する材料に制限されてしまうという問題点があった。本発明の構成では、顕微鏡により光学イメージを取得した後、アレイデバイスを目的の細胞に接近させ、レーザー等により細胞を破壊し、細胞中の生体分子を単一細胞ごとに採取するため、接着系培養細胞に用いられている通常のシャーレを用いて単一細胞解析を実行することができる。
【００２３】
以下、実施の形態に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２４】
（第１実施形態）
本実施形態に係る生体分子解析装置は、レーザー蛍光顕微鏡を用いて接着系培養細胞からなるサンプルの光学イメージを得る手段と、レーザー光源を用いて細胞を破壊する手段とを備え、細胞中のｍＲＮＡをアレイデバイスに捕捉することで遺伝子発現解析を行うことができる装置である。図１に本実施形態に係る生体分子解析装置の構成図を示す。この生体分子解析装置は、光学イメージを取得し、光学イメージ上の所定の位置の細胞の一部又は全部を破壊する機能を有する顕微鏡システム１と、細胞から放出・拡散される生体分子（ｍＲＮＡ）を捕捉するための領域が配列したアレイデバイス、これを駆動する機構、及びサンプル細胞を移動させる機構を有する生体分子採取システム２と、これら２つのシステムの動きを制御する制御システム３とから構築される。
【００２５】
顕微鏡システム１は蛍光顕微鏡用レーザー光源４を備える。この実施形態では、蛍光顕微鏡用レーザー光源４として５０ｍＷ出力で連続発振の４８８ｎｍ半導体レーザーを用いている。その他、観測したい蛍光のバリエーションに合わせて、４０５ｎｍや６３３ｎｍの波長のレーザーを用いても良いし、ダイクロイックミラーや光学フィルタを用いて、蛍光顕微鏡用レーザー光源４から複数の波長のレーザー光を出力するようにすることも可能である。
【００２６】
また、顕微鏡システム１は細胞破壊用レーザー光源５を備える。この実施形態では、細胞破壊用レーザー光源５として３５５ｎｍ帯のパルスレーザー（最大平均出力２Ｗ、繰り返し周波数５ｋＨｚ）を用いている。蛍光顕微鏡用レーザー光源４及び細胞破壊用レーザー光源５は、ダイクロイックミラー６（エッジ波長４０９ｎｍ）を用いて合波している。なお、細胞破壊用レーザー光源５を蛍光顕微鏡用光源として用いても良い。実際、この実施形態では核の観察に用いている。
【００２７】
細胞を染色する蛍光色素として、この実施形態ではＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣとＨｏｅｃｈｓｔ  Ｄｙｅを用いている。前者は４８８ｎｍ励起により５３５ｎｍで発光し、後者は３５５ｎｍ励起により４６５ｎｍで発光する。前者の蛍光色素でアポトーシス過程にある細胞膜を染色し、後者の蛍光色素で核を染色する。
【００２８】
ダイクロイックミラー７は、例えば、ＦＩＴＣ蛍光のイメージングの際にはエッジ波長５０５ｎｍのものを用い、Ｈｏｅｃｈｓｔ蛍光のイメージングの際にはエッジ波長３８５ｎｍのものを用いる。
【００２９】
また、顕微鏡システム１は、対物レンズ８を備える。対物レンズ８としては、例えばＮＡが０．８で倍率４０倍のものを用いる。
【００３０】
細胞の光学イメージングは、以下のようにして行うことができる。まず、透明で蛍光を発しないカバーガラス厚さ（０．１８ｍｍ）の底面を持つシャーレ２０の上に、培養した接着系培養細胞２１、２２、２３を配置し、中心部分に光路用の貫通穴の開いた試料ステージ１０の上にシャーレ２０を載せる。
【００３１】
試料ステージ１０は、ＸＹＺ方向に可動できるステージ９により５０ｎｍピッチで駆動される。蛍光の受光系は、蛍光以外の波長の光を取り除くバンドパスフィルタ１１、結像レンズ１２、受光器１３であるＰＭＴ（Photomultiplier tube）及びピンホール１４から構成される。これらを同期して駆動させることによって複数の細胞の光学イメージを取得する。すなわち、励起光が集光された１点からの蛍光信号を、ＸＹＺステージ９を駆動しながら受光器１３で取得し、光学イメージを制御系において構成する。
【００３２】
生体分子採取システム２は、細胞から放出されるｍＲＮＡ等の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスを備える。例えば、単一細胞ごとにアレイデバイスの複数の領域にｍＲＮＡを捕捉し、アレイデバイスにおいて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。この実施形態では、アレイデバイスは、透明で多数の貫通孔が面に垂直に形成された多孔質メンブレンから構築され、以下、これを細孔アレイシート３０と呼ぶ。また、細孔アレイシート３０にｃＤＮＡライブラリーが形成されたものをｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートと呼ぶ。 
【００３３】
本実施形態においては、細孔アレイシート３０として、直径０．２μｍの貫通孔が陽極酸化によって多数形成された、厚さ８０μｍ、大きさ２ｍｍ×２ｍｍの酸化アルミニウム製多孔質メンブレンを用いている。細孔アレイシート３０には、生体分子を捕捉する領域同士を分離するため分離壁３１を形成することができる。この分離壁３１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、半導体プロセスにより形成することができ、厚さは８０μｍ程度で細孔アレイシート３０に密着させることができる。
【００３４】
細孔アレイシート３０の上面図を図２に示す。細孔アレイシート３０（大きさ２ｍｍ×２ｍｍ、厚さ８０μｍ）には、多数の生体分子、例えばｍＲＮＡを捕捉するための領域３０１が形成される。領域３０１のサイズは、ここでは、一辺を１００μｍとし、間隔を８０μｍとしている（１８０μｍ周期で配置）。領域３０１のサイズは、捕捉対象とする生体分子の量や面内での拡散しやすさ（分子の大きさ）に応じて１μｍ程度から１０ｍｍ程度まで自由に設計することが可能である。
【００３５】
アレイデバイスとしては、アルミニウムを陽極酸化することによって形成した多孔質メンブレンからなる細孔アレイシート３０の他、シリコン等の材料を陽極酸化することによって多数の貫通孔を形成したものを用いても良い。さらに、半導体プロセスを用いて、シリコン酸化物やシリコン窒化物薄膜に多数の貫通孔を設けることによって、アレイデバイスを構築しても良い。さらに、後述するように、様々なサイズのビーズを箱状の部分に詰めることによって細孔アレイシートを形成しても良いし、液層クロマトグラフィーのカラムに用いられるモノリスカラムを薄く形成した膜をアレイデバイスとして用いることも可能である。さらには、様々な材料のメンブレン、すなわち、セルロース製メンブレン、ガラス繊維メンブレン、トラックエッチメンブレン、ナイロンメンブレン、ポリプロピレンメンブレン、ＰＴＦＥメンブレン等を用いても良い。この際、分離壁３１は、ＰＤＭＳ樹脂以外に、シリコン等の半導体材料や他の樹脂材料を用いて、公知の半導体プロセスを組み合わせて形成することができる。本発明は、上記のようなアレイデバイスを組み込んだ生体分子解析装置に関するものであるが、それ以外に、複数の細胞の光学イメージに対し対応付けが可能な領域を複数配列させて形成した上記アレイデバイス自体を、生体分子解析用のキットとして提供するものである。このアレイデバイスのキットを、ユーザーがレーザー等の細胞を破壊する手段と組み合わせて用いることにより、単一細胞の生体分子の解析を効率的に行うことができる。
【００３６】
図１に示すように、細胞から放出される生体分子を、電気泳動によって細孔アレイシート３０における特定の領域まで導く手段として、ループ状の白金電極３２をシールド線３３の先端に接合している。白金電極３２の線材の直径は３０μｍであり、線材を２つ折にして、リード線接合部分を捻って一本化した後、ループ側を直径１００μｍの円形に加工する。このような電極を２つ作製し、細孔アレイシート３０を挟むように配置し、電源３５によって直流１．５Ｖを印加する。放出されるｍＲＮＡ３６は負の電荷を持つので、上側の白金電極３２を正極とする。ただし、銀−塩化銀の参照電極３９を設けて、下側の白金電極３２に０．２Ｖを印加する。このような操作によって、生体分子を捕捉する領域３０１の内部にｍＲＮＡ３６を電気泳動によって誘導することができる。また、生体分子の捕捉効率をより向上するために、横方向の電気泳動によるｍＲＮＡの濃縮を実現するため、上側の白金電極３２のループの直径を５０μｍにしても良い。この場合、線材の直径は１０μｍとする。
【００３７】
電気泳動のために用いる電極の構造と電圧印加の方法は、上記の方法には限定されない。例えば、エクソソーム等の微小顆粒や４０ｋｂ以上のＤＮＡフラグメント、及び１０ｋＤａ以上のタンパク質を誘電泳動するために、図３に示すような電極構造を用いても良い。すなわち、厚さ２００μｍの正方形の石英基板４２の中央に、貫通孔４４をウエットエッチによって形成し、石英基板４２の内壁及び外壁に４つの金電極４３を形成し、四重極端子を作製する。金電極４３の厚さは１μｍで幅は４０μｍ（ａの部分）とする。振幅１０Ｖで周波数１ｋＨｚの交流電界を電源４１で印加することによって、上記の大きな生体分子や顆粒の誘電泳動を行い、領域３０１へ誘導することができる。
【００３８】
単一細胞から抽出したペプチドやタンパク質を、一度アレイデバイスに捕捉させることによって、その後に質量分析を行う際の計測感度を高めることができる。すなわち、ＭＡＬＤＩを用いた組織切片の質量分析においては、サンプルと適切な比率でマトリクスと呼ばれる化学物質を混ぜ合わせレーザーを照射する必要がある。比率が適切でないと対象分子のイオン化効率が大幅に低下する。しかし、組織切片を対象にしたＭＡＬＤＩでは表面からマトリックス材料を加えるだけなので、適切な比率の均一な材料を得ることができない。そのため、一般にイオン化効率が位置によって異なってしまうとともに低下してしまう。しかし、単一細胞ごとに対象とする生体分子を吸着・捕捉し、その後、対象分子が吸着したアレイデバイスに対してＭＡＬＤＩを行うことで高効率な組織切片中の細胞のペプチドやたんぱく質の質量分析が可能となる。また、対象とする生体分子のみを選択的に捕捉するため、不純物によるイオンサプレッション効果も低減し、イオン化効率がさらに向上する。
【００３９】
次に、本実施形態に係る生体分子解析装置の動作フローについて説明する。図４にフローチャートを示す。最初に接着系培養細胞２１、２２、２３からなるサンプルをシャーレ２０に載せる（ステップ００１）。この実施形態では測定対象が培養細胞であるから、シャーレ２０を使って事前に培養し、測定対象の細胞が底面に接着するようにする。サンプルが凍結切片の場合には、これをシャーレ２０の上に載せる。あるいは、複数の細胞をゲル中に３次元的に配置したものをサンプルとしても良い。次に、顕微鏡システム１を用いて、対象となる細胞群の光学イメージを取得し（ステップ００２）、生体分子を採取、測定する対象細胞をユーザーが決定する（ステップ００３）。次に、制御システム３において、測定対象とする細胞又は細胞の部分をユーザーが指定する。一般に、ユーザーは複数の細胞を測定対象とする場合が多い。その場合は、生体分子を捕捉する細胞の順序を制御システム３が決定し、まず、１番最初に対象となった細胞の近傍（図１の例では細胞の直上）に、細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，１）番地の領域３０１）をＸＹＺステージ３４を用いて接近させる（ステップ００４）。本実施形態では細孔アレイシート３０の下面とシャーレ２０との間の距離を３００μｍに設定しているが、この距離は、採取する生体分子の種類や、電極構造によって変化させることができる。例えば、１μｍから１０ｍｍ程度が好適である。ＸＹＺステージ３４による細孔アレイシート３０の移動は、制御システム３が事前のプログラムに従って自動的に行う。
【００４０】
移動の完了を制御システム３が確認した後、電気泳動用の白金電極３２に電圧を印加すると同時に、測定対象とする細胞の細胞膜を破壊するために、細胞破壊用レーザー光源５からのレーザー光を細胞に照射する（ステップ００５）。ここで照射時間は、例えば１０秒とし、電気泳動駆動時間は６０秒とすることができる。
【００４１】
一つの細胞の破壊とその細胞中の生体分子の捕捉が終了した後、制御システム３に登録された次の対象細胞の近傍（図１の構成では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，２）番地の領域３０１）を接近させる（ステップ００４）。制御システム３に登録された次の細胞へ細胞破壊用レーザー光源５からのレーザー光を照射する（ステップ００５）。このとき、前記と同様に、同時に白金電極３２に電圧を印加する。その後、順次指定された細胞に移動し、細胞を破壊して、その細胞中の生体分子を細孔アレイシート３０の特定の領域３０１に捕捉した後、捕捉した生体分子を測定するための処理を実行する（ステップ００６）。最後に、光学イメージにおける、破壊された細胞に相当する部分と、細孔アレイシート３０における生体分子を捕捉した領域３０１とを対応付けて、ユーザーに提示する（ステップ００７）。
【００４２】
ここでは破壊する細胞を１細胞としたが、より粗い分解能のデータを取得したい場合は、アレイデバイス上の一つの領域３０１に対して、複数の細胞を破壊したときに放出され、電気泳動されるｍＲＮＡを捕捉しても良い。その際の破壊は複数の細胞を同時に破壊しても良いし、アレイデバイスを動かさずに１細胞ずつ順次破壊しても良い。
【００４３】
次に、細孔アレイシート３０に捕捉されたｍＲＮＡから、１細胞ごとの遺伝子発現解析データを取得するためのサンプル調製方法を図５及び６に基づき説明する。本実施形態において、細孔アレイシート３０は２ｍｍ×２ｍｍのチップであり、ＸＹＺステージ３４から取り外し、反応容器（チューブ）の中で以下のような処理を行うことによって遺伝子発現解析を行う。この方法は、細孔アレイシート３０の内部に固定化されたＤＮＡプローブへのｍＲＮＡの捕捉（図５（ａ））と、細孔アレイシート３０内部での逆転写（ファーストストランド合成）によるｃＤＮＡライブラリーの作製（図５（ｂ））と、その後のセカンドストランド合成（図６（ｃ）、図６（ｄ））と、ＰＣＲ増幅（図６（ｅ））とから構成される。捕捉したｍＲＮＡが元々存在していた細胞の位置の情報を、配列情報として逆転写させるために、細孔アレイシート３０の内部に固定されたＤＮＡプローブ５６は、細孔アレイシート３０の位置ごとに異なる配列として細胞認識配列を含み、このＤＮＡプローブ５６でｍＲＮＡ３６を捕捉する。本実施形態においては、図５（ａ）中の細孔アレイシート３０における領域３０１ごとに異なる細胞認識配列が固定されている。このｍＲＮＡ捕捉用のＤＮＡプローブ５６は、５’末端方向からＰＣＲ増幅用共通配列（フォワード方向）、細胞識別用タグ配列、分子識別用タグ配列、及びオリゴ（ｄＴ）配列を有している。ＰＣＲ増幅用共通配列をＤＮＡプローブ５６に導入することで、後続のＰＣＲ増幅工程において共通プライマーとして利用することができる。また、細胞識別用タグ配列（例えば５塩基）をＤＮＡプローブ５６に導入することによって、４５＝１０２４個の単一細胞を認識することが可能となる。すなわち、１度に１０２４個の単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製することができるため、試薬コスト及び労力を１／１０２４に削減できる効果があるとともに、シーケンサーにより最終的に得られる配列データが、どの細胞由来であるかを認識することが可能となる。さらに、分子識別用タグ配列（例えば１５塩基）をＤＮＡプローブ５６に導入することにより、４１５＝１．１×１０９種類の分子を認識することができるため、シーケンサーによって得られる膨大な解読データが、どの分子由来であるかを認識することが可能となる。すわなち、増幅工程で生じる遺伝子間の増幅バイアスを修正することができるため、始めに細胞中に存在していたｍＲＮＡ量を高い精度で定量することが可能となる。最も３’側に位置するオリゴ（ｄＴ）配列は、ｍＲＮＡの３’側に付加されているポリＡテールとハイブリダイズし、ｍＲＮＡを捕捉するために利用される（図５（ａ））。
【００４４】
本実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉するためにＤＮＡプローブ５６の一部にポリＴ配列を用いたが、マイクロＲＮＡやゲノム解析を行うためにポリＴ配列の代わりに解析したい配列と相補的な配列の一部を用いても良いことはいうまでもない。
【００４５】
次に、ｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートの作製方法について説明する。細孔アレイシート３０に形成された貫通孔５５は、細孔アレイシート３０の厚さ方向に貫通しており、貫通孔５５同士は完全に独立である。貫通孔５５の内壁の表面は親水性であり、表面へのタンパク質の吸着が極めて少なく、酵素反応が効率良く進む。まず、細孔アレイシート３０の表面に対しシランカップリング等の処理を行ってＤＮＡプローブ５６を貫通孔５５の表面に固定する。固定されたＤＮＡプローブ５６は例えば平均３０〜１００ｎｍ２に一個の割合で表面に固定されるので、４〜１０×１０６個のＤＮＡプローブ５６が１つの貫通孔５５に固定される。次いで、表面吸着を防止するために表面コート剤で表面をコートする。この表面コートはＤＮＡプローブの固定と同時に行っても良い。ＤＮＡプローブ５６の密度はこの空間を通過するｍＲＮＡをほぼ１００％の効率で捕捉できるような密度とする。
【００４６】
次に、細胞からのｍＲＮＡ３６を細孔アレイシート３０の内部で捕捉し、ｃＤＮＡライブラリーを細孔アレイシート３０に作製する方法について説明する。前述のように、レーザー照射によって破壊された細胞から放出された負に帯電しているｍＲＮＡ３６は、白金電極３２によって電気泳動されて、細孔アレイシート３０の貫通孔５５の内部に誘導される。図５（ａ）に示すように、貫通孔５５の中で、ｍＲＮＡ３６のポリＡテールがＤＮＡプローブ５６のオリゴ（ｄＴ）部分に捕捉される。そして、ＤＮＡプローブ５６により捕捉したｍＲＮＡ３６を鋳型にしてファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９が合成される。この工程では、例えば、逆転写酵素及び合成基質を含む溶液で貫通孔５５を満たし、５０℃にゆっくり昇温して５０分ほど相補鎖合成反応を行う（図５（ｂ））。反応終了後、ＲＮアーゼを貫通孔５５を通して流し、ｍＲＮＡ３６を分解除去する。次いで、アルカリ変性剤を含む液、及び洗浄液を貫通孔５５に流し、残存物及び分解物を除去する。ここまでのプロセスで、貫通孔５５内には細胞の元々の位置を反映した図５（ｂ）に示すようなｃＤＮＡライブラリーが構築される。続いて、ＰＣＲ増幅用共通配列（リバース）が付加された複数（〜１００種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー６０をファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９にアニールさせ（図６（ｃ））、相補鎖伸長反応によりセカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１を合成する（図６（ｄ））。すなわち、マルチプレックス条件でセカンドストランドｃＤＮＡ鎖の合成を行う。これにより、複数のターゲット遺伝子について、増幅用共通配列（フォワード／リバース）を両端に持ち、細胞識別用タグ配列、分子識別用タグ配列、及び遺伝子特異的配列がその中に含まれる２本鎖ｃＤＮＡ６２が合成される。本実施形態においては、遺伝子特異的配列として、ターゲット遺伝子のポリＡテールから１０９±８塩基上流部分の２０±５塩基に相当する２０種類の配列（ＡＴＰ５Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬ４、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１８、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＳ２０、ＡＬＤＯＡ、Ｂ２Ｍ、ＥＥＦ１Ｇ、ＳＤＨＡ、ＴＢＰ、ＶＩＭ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ２７及びＯＡＺ１、配列番号３〜２２）を用いる。これは、後続のＰＣＲ増幅工程において、ＰＣＲ増幅産物のサイズを約２００塩基に統一するためである。増幅産物のサイズを統一することで、煩雑なサイズフラクション精製の工程（電気泳動→ゲルの切り出し→ＰＣＲ増幅産物の抽出・精製）を省略することができ、１分子からの並列増幅（エマルジョンＰＣＲ等）に直接利用できる効果を有する。続いて、増幅用共通配列（フォワード／リバース）を用いてＰＣＲ増幅を行い、複数の遺伝子由来のＰＣＲ増幅産物を調製する（図６（ｅ））。従来、遺伝子によって増幅率が異なるいわゆる増幅バイアスの問題が知られているが、この工程において、遺伝子間、ないし分子間で増幅バイアスが生じたとしても、シーケンサーによるデータを取得した後に、分子識別用タグ配列を利用して増幅バイアスの補正を行うことができるため、高精度な定量データを得ることができる。なお、ＰＣＲ増幅以外にも、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）やＮＡＳＢ��やＬＡＭＰ法等、他の増幅法を用いることができる。
【００４７】
ここで、細孔アレイシート３０の貫通孔５５内部へのＤＮＡプローブ５６の固定化方法について説明する。細孔アレイシート内部の貫通孔５５の表面は、高密度にＤＮＡプローブ５６が固定化されると同時に、ｍＲＮＡやＰＣＲ増幅用プライマー等の核酸や、逆転写酵素、ポリメラーゼといったタンパク質を吸着しない表面である必要がある。具体的には、例えば、ＤＮＡプローブ５６を固定化するためのシランカップリング剤と、吸着を防止するシラン化されたＭＰＣポリマーとを適切な割合で同時に貫通孔表面に共有結合にて固定化して、ＤＮＡプローブ５６の高密度な固定と核酸やタンパク質の安定した吸着抑制を実現することが好ましい。具体的には、例えば、まずアルミナ製の多孔質メンブレンをエタノール溶液に３分浸漬後、ＵＶＯ３処理を５分行い、超純水で３回洗浄する。次に、平均分子量９７００（重合度４０）のシラン化ＭＰＣポリマーであるＭＰＣ０．８−ＭＰＴＭＳｉ０．２（ＭＰＣ：２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ＭＰＴＭＳｉ：３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン）（Biomaterials 2009, 30, 4930-4938；及び Lab Chip 2007, 7, 199-206を参照）３ｍｇ／ｍｌと０．３ｍｇ／ｍｌのシランカップリング剤ＧＴＭＳｉ（ＧＴＭＳｉ：３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学）、及び酸触媒である０．０２％酢酸を含む８０％エタノール溶液に２時間浸漬する。エタノールで洗浄後、窒素雰囲気で乾燥し、オーブンにて１２０℃で３０分間加熱処理する。次に、ＤＮＡプローブを固定化するために、１μＭの５’アミノ基修飾されたＤＮＡプローブ（配列番号１）と７．５％グリセロールと０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍホウ酸バッファ（ｐＨ８．５）を、インクジェットプリンタと同じ技術によって、細孔アレイシート上に１００ｐｌずつ２５μｍ×２５μｍの領域ごとに異なる細胞識別用タグ配列（１０２４種類）を持つＤＮＡプローブとして吐出する。その後、加湿チャンバ内において２５℃で２時間反応させる。最後に未反応グリシド基をブロックし、過剰なＤＮＡプローブを除去するために、十分量の１０ｍＭのＬｙｓと０．０１％ＳＤＳと０．１５ＭのＮａＣｌを含むホウ酸バッファ（ｐＨ８．５）で５分間洗浄し、この洗浄液を除去した後、０．０１％のＳＤＳと０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む３０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファ（２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）を用いて６０℃にて洗浄し過剰ＤＮＡプローブを除去する。これによって、ＤＮＡプローブ５６の固定と表面処理を完了する。
【００４８】
以下、ｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートを作製し、次世代（大規模）シーケンサーにより遺伝子発現プロファイルを得るための方法について説明する。一例として、ｍＲＮＡを捕捉した細孔アレイシート（領域１００個分）を０．２ｍｌのチューブに導入し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ８．０）５８．５μｌと１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌと５×ＲＴバッファ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２２．５μｌと０．１Ｍ  ＤＴＴ  ４μｌとＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌを混和し、前記の細孔アレイシートが入っているチューブに分注する。その後、溶液と細孔アレイシートの温度を５０℃に上げて、５０分間保つことによって逆転写反応を完了させ、ｍＲＮＡと相補的配列を持つファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を合成する（図５（ｂ））。
【００４９】
ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を合成した後、８５℃にて１．５分保持して逆転写酵素を失活させ、４℃に冷却し、前記溶液を排出後、ＲＮａｓｅ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ８．０）０．２ｍｌを細孔アレイシートの入ったチューブに分注することによって、ｍＲＮＡを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して貫通孔内の残存物及び分解物を除去・洗浄する。続いて、前記溶液を排出後、滅菌水６９μｌと１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）１０μｌと２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  １０μｌと各１０μＭのＰＣＲ増幅用共通配列（リバース、配列番号２）が付加された２０種の遺伝子特異的配列プライマーミックス（配列番号３〜２２）１０μｌとＥｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）１μｌを混和し、チューブに分注する。その後、溶液と細孔アレイシートを９５℃３分間→４４℃２分間→７２℃６分間保持して反応を行い、ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を鋳型としてターゲット遺伝子特異的配列プライマー６０をアニールさせた後（図６（ｃ））、相補鎖伸長反応を行い、セカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１を合成する（図６（ｄ））。
【００５０】
続いて、滅菌水４９．５μｌと１０×Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｌと２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌと４μｌの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４と１０μＭのＰＣＲ増幅用共通配列プライマー（フォワード、配列番号２３）１０μｌと１０μＭのＰＣＲ増幅用共通配列プライマー（リバース、配列番号２）１０μｌとＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．５μｌを混和し、チューブに存在している溶液を除いた後、直ちに上記溶液をチューブに分注する。その後、溶液と細孔アレイシートを３０秒間９４℃に保ち、９４℃３０秒間→５５℃３０秒間→６８℃３０秒間の３段階工程を４０サイクル繰り返し、最後に６８℃３分間保った後、４℃に冷却してＰＣＲ増幅工程を行う（図６（ｅ））。このような温度サイクルを実現するために、ヒーター付きヒートブロック（アルミ合金又は銅合金）及び温度コントローラを用いることができる。これにより、２０種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもＰＣＲ増幅産物のサイズは２００±８塩基とほぼ均一である。そして、細孔アレイシートの貫通孔内部及び外部の溶液中に蓄積されたＰＣＲ増幅産物の溶液を回収する。この溶液中に含まれるフリーのＰＣＲ増幅用共通配列プライマー（フォワード／リバース）や酵素等の残留試薬を除去する目的で、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製する。この溶液に対してｅｍＰＣＲ増幅又はブリッジ増幅を適用後、次世代シーケンサーに適用して解析する。
【００５１】
次に、分子識別用タグ配列を用いた増幅バイアスの低減方法について説明する。図７には分子識別用タグ配列以外は同じ配列としてシーケンシングされたデータが得られた状態を模式的に示している（得られたシーケンシングデータの関連部分を同じパターンとして模式的に図示）。図７において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅはそれぞれ、ランダム配列である分子識別用タグ配列も含めて同じ配列であり、それぞれ１、７、４、２、２リードが得られている。これらの配列は、図６（ｄ）においてセカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１が合成された時点では全て１分子であり、その後のＰＣＲ増幅で分子数が増大すると同時に、異なる分子数になっている。それゆえ、分子識別用タグ配列が同じリードは同じ分子由来であり、１分子とみなすことができる。その結果、セカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１が合成された後のＰＣＲ増幅や、溶液を外部に取り出す際の細孔アレイシート内部への吸着により生ずる配列ごとの分子数の偏りは、上記同一視によって解消される。
【００５２】
ここで作製した細孔アレイシートは繰り返し利用可能であり、発現量を知る必要がある遺伝子群については、ＰＣＲ増幅用共通配列プライマー（リバース、配列番号２）が付加されたターゲット遺伝子特異的配列プライマーのミックス溶液を調製し、上記と同様にセカンドストランドｃＤＮＡ鎖の合成、ＰＣＲ増幅、及びｅｍＰＣＲを施し、シーケンサーにて解析を行えば良い。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを繰り返し利用することによって、高精度な発現分布測定を必要な種類の遺伝子について行うことが可能である。
【００５３】
上記の細孔アレイシートはサイズが２×２ｍｍであり、０．２ｍｌのチューブを反応容器として用いることができるサイズであるが、一般的には細孔アレイシートのサイズは２×２ｍｍよりも大きくしてもかまわない。ただし、この際に図５及び図６に示すサンプル調製を行うためには、細孔アレイシートを分割して、反応容器に導入する必要がある。この方法を図８に基づき説明する。細孔アレイシート３０上に、生体分子を捕捉するための領域が配列した１６枚のチップ３０２が形成されている。このチップ３０２を切断により分離するために、例えば細胞破壊に用いたレーザーの出力を１０倍に上げて実行することができる。
【００５４】
また、複数の反応容器（図８では１６個の反応容器）でサンプル調製を行った後、シーケンシングは一括で行いたい場合がある。このときには、異なる反応容器を配列情報で識別するためのチューブ識別用タグ配列を、図６（ｃ）のセカンドストランドｃＤＮＡ鎖の合成工程で使用するターゲット遺伝子特異的配列プライマー６０に導入しても良い。チューブ識別用タグ配列の長さは識別したい反応容器の数で決めて良いが、細胞識別用タグ配列と同じ５塩基とする場合、理想的には１０２４個の反応容器を識別することが可能となる。また、チューブ識別用タグ配列の挿入位置は、ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９とハイブリダイズする遺伝子特異的配列とＰＣＲ増幅用プライマーの間とすることができる。
【００５５】
また、上記では、２×２ｍｍのサイズを単位として、細孔アレイシート３０から切断し、反応容器に導入したが、１細胞に対応する領域３０１ごとに切断し、反応容器に導入しても良い。この場合には、細胞を識別するための細胞識別用タグ配列をなくして、代わりにチューブ識別用タグ配列のみを用いても良い。もちろん両方を用いても良い。
【００５６】
図１の顕微鏡システム１においては、倒立形蛍光顕微鏡を用いているが、蛍光顕微鏡は透過型の微分干渉顕微鏡に置き換えても良い。このような場合のシステム構成を図９に示す。
【００５７】
微分干渉顕微鏡像は蛍光試薬を用いずに形状を観測するのみであるが、再生医療等において体内に細胞を戻さなくてはならない場合に最も細胞への影響が小さい計測方法の一つである。この画像から得られる細胞形状の変化と遺伝子発現の変化との間に対応付けが可能となれば、最も細胞ダメージが少なく、詳細な細胞分類ができる計測システムとなる。
【００５８】
図９に示す生体分子解析装置は、光源１４０１を備える。この例では、光源１４０１はハロゲンランプである。図９に示す生体分子解析装置はさらに、偏光子１４０２、ウォラストンフィルタ１４０３、ウォラストンプリズム１４０４、コンデンサレンズ１４０５、対物レンズ１４０６、及び撮像素子８０１を有している。撮像素子８０１として、例えば１０２４×１０２４ピクセルのＣＣＤカメラを用いることができる。細胞破壊のために細胞破壊用レーザー光源５からの光を微分干渉像の視野の中心に照射するために、フォーカス調整レンズ８０２と、エッジ波長が３７０ｎｍのダイクロイックミラー８０３を２個配置する。レーザーは図示しない制御システムによって、ＯＮ／ＯＦＦが制御され、必要なときにしか細胞にレーザーが照射されないように設定されている。この例では、細孔アレイシート３０が可動式となっており、高解像度の微分干渉像を取得する場合は図９に示すように生体分子採取システム２をシャーレ２０の外に配置しておき、光学イメージを取得して測定対象とする細胞を指定した後にＸＹＺステージ３４を用いて細孔アレイシート３０を移動させ、細孔アレイシート３０の領域３０１と、指定した細胞とを接近させ、その後に細胞を破壊する。
【００５９】
また、同じく透過型顕微鏡の例として、ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）顕微鏡を用いることもできる。図１０に装置構成図を示す。ＣＡＲＳ顕微鏡は、ラマン顕微鏡やＩＲ顕微鏡と同様にレーザー励起部分の化学種に対応したスペクトルが得られるため、微分干渉顕微鏡よりも細胞の状態に関する情報量を増大させることができる。また、ＣＡＲＳは非線形過程で、ラマン信号に比べて信号強度が強く、比較的弱いレーザー励起強度で十分なシグナルを得ることができるため、細胞へのダメージが小さいというメリットがある。このような装置構成によって、ＣＡＲＳ顕微鏡による光学イメージと遺伝子発現解析データとを対応付けることができ、ラベルを用いない計測に対して、遺伝子発現解析に基づく細胞の分類情報を与えることができる。
【００６０】
図１０の生体分子解析装置は、光源１５０１を備える。ここでは、光源１５０１としてパルスレーザー（マイクロチップレーザー）を用いている。これをビームスプリッタ１５０２にて２つに分波し、一方を非線形ファイバ（フォトニッククリスタルファイバ）１５０３に導入し、ストークス光を生成する。もう一方の光はそのままポンプ光及びプローブ光として用いて、サンプル（細胞２１、２２、２３中）に水浸対物レンズ１５０４で集光してアンチストークス光を生成する。ハイパスフィルタ１５０５にてアンチストークス光のみを透過させて、結像レンズ１５０８で集光後、分光器１５０６を通して、分光器用ＣＣＤカメラ１５０７でコヒーレントアンチストークスラマンスペクトルを取得する。ここで、細胞破壊のために細胞破壊用レーザー光源５からの光をＣＡＲＳによる光学イメージの中心に照射する構成は微分干渉顕微鏡の場合と同様である。
【００６１】
本発明により、蛍光顕微鏡等で得た光学イメージにより細胞を特定し、細胞像と対応させて遺伝子発現データを取得することができる。この機能を利用して、細胞の動的特性を高い精度で確認することが可能となる。このような解析を実行するためのフローチャートを図１１に示す。まず、細胞サンプルをシャーレに載せ（ステップ００１）、顕微鏡で観察し光学イメージを取得する（ステップ００２）。研究用途に応じた試薬（ＲＮＡや分化誘導剤等）を細胞に導入し（ステップ００３）、細胞の光学イメージ上での変化を確認する。この目的のために、複数回にわたって光学イメージを取得することもある。取得した光学イメージと細胞の詳細な状態との対応を確認したいと考えた時点で、ユーザーが選択した細胞の近傍にアレイデバイスの特定の領域を移動させ（ステップ００４）、細胞を破壊し、その細胞内の生体分子をアレイデバイス上に捕捉して（ステップ００５）、その量を計測する（ステップ００６）。この生体分子の定量によって詳細な細胞の状態や種類を同定し、光学イメージとの対応をとる（ステップ００７）ことによって、光学イメージと細胞の状態や種類との対応付けを高精度に行うことが可能となる。
【００６２】
次に、細胞の分類を光学イメージングで行うための方法について示す。顕微鏡により光学イメージを取得後、例えば１８０個の細胞の２０個の遺伝子発現解析を行って、主因子分析を行い、上位２つの主因子についてプロットした図を図１２に示す。図中のＰＣはprincipal componentの略であり、ＰＣ１が第一の主因子、ＰＣ２が第２の主因子を指す。個々の点は１つの細胞の遺伝子発現データに対応する。多くの場合に細胞の状態や種類に対応して複数のクラスター（この例では６個のクラスター）に分かれる。図１２において、一つ一つの点は細胞に対応するので、どの細胞がどのような種類の細胞であるかを光学イメージだけでは判定できなくても、遺伝子発現解析データに基づいて対応させることができる。この対応付けを利用して、どのような光学イメージが得られたときにどのような細胞の状態や種類になるかを判定させるような機械学習をコンピュータシステムにさせることができ、学習が完了した後は光学イメージの取得のみで細胞の状態や種類の分類が可能となる。
【００６３】
なお、この例では、細胞の遺伝子発現に基づくクラスタリングに主因子分析を用いたが、階層的クラスタリングやｋ−ｍｅａｎｓ法等様々の方法を適用することができる。また、機械学習の方法としては、サポートベクタマシン等、データマイニングに用いられる様々な方法が知られており、それらのいずれを用いても良い。
【００６４】
（第２実施形態）
本実施形態では、ＰＣＲ増幅の代わりにＴ７プロモーターを用いた場合の例を説明する。第１実施形態との相違点は、シーケンシングサンプルの調製方法にある。図５及び図６に対応するサンプル調製の手順を図１３、図１４及び図１５に示す。細孔アレイシート５１の内部に固定されたＤＮＡプローブ８０は、５’末端方向からＴ７プロモーター配列、ｅｍＰＣＲ増幅用共通配列（フォワード方向、配列番号２４）、細胞識別用タグ配列、分子識別用タグ配列、及びオリゴ（ｄＴ）配列で構成される。Ｔ７プロモーター配列をＤＮＡプローブ８０へ導入することで、後続のＩＶＴ（In Vitro Transcription）によるｃＲＮＡ６３増幅工程（図６（ｅ））におけるターゲット配列の増幅が可能となる。すなわち、Ｔ７プロモーター配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、その下流配列から転写（ｃＲＮＡ６３増幅）反応が開始される。同様にＰＣＲ増幅用共通配列を導入することで、後続のｅｍＰＣＲ増幅工程において共通プライマーとして利用することができる。また、細胞識別用タグ配列を例えば５塩基としてＤＮＡプローブ８０に導入することによって、４５＝１０２４個の単一細胞を識別することが可能となることは第１実施形態と同様である。さらに、分子識別用タグ配列（例えば１５塩基）をＤＮＡプローブ８０へ導入することにより、４１５＝１．１×１０９分子を認識することができるため、次世代シーケンサーで得られる膨大な解読データが、どの分子由来であるかを識別することが可能となることも第１実施形態と同様である。すわなち、ＩＶＴ／ｅｍＰＣＲ等の増幅工程で生じた遺伝子間の増幅バイアスを修正することができるため、始めに細胞中に存在していたｍＲＮＡ量を高い精度で定量することが可能となる。最も３’側に位置するオリゴ（ｄＴ）配列は、ｍＲＮＡの３’側に付加されているポリＡテールとハイブリダイズし、ｍＲＮＡを捕捉するために利用される（図１３（ａ））。
【００６５】
次に、反応の各ステップを順に説明する。図１３（ａ）に示すように、ｍＲＮＡ５４は、第１実施形態と同様にｍＲＮＡの３’末端のポリＡ配列に相補的な配列である１８塩基のポリＴ配列によって捕捉される。次に、ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を合成し、ｃＤＮＡライブラリーを構築する（図１３（ｂ））。次に、定量したい遺伝子に対応する複数（〜１００種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー６０をファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９へアニールさせ（図１４（ｃ））、相補鎖伸長反応によりセカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１を合成する（図１４（ｄ））。すなわちマルチプレックス条件でセカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１の合成を行う。これにより、複数のターゲット遺伝子について、増幅用共通配列（フォワード／リバース）を両端に持ち、細胞識別用タグ配列、分子識別用タグ配列、及び遺伝子特異的配列がその中に含まれる２本鎖ｃＤＮＡが合成される。一例として、遺伝子特異的配列にターゲット遺伝子のポリＡテールから１０９±８塩基上流部分の２０±５塩基である２０種類（ＡＴＰ５Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬ４、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１８、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＳ２０、ＡＬＤＯＡ、Ｂ２Ｍ、ＥＥＦ１Ｇ、ＳＤＨＡ、ＴＢＰ、ＶＩＭ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ２７、及びＯＡＺ１）の配列を用いる（配列番号３〜２２）。これは、後続のＩＶＴによる増幅工程において、増幅産物サイズを約２００塩基に統一するためである。増幅産物のサイズを統一することで、煩雑なサイズフラクション精製の工程（電気泳動→ゲルの切り出し→増幅産物の抽出・精製）を省略することができ、１分子からの並列増幅（エマルジョンＰＣＲ等）へ直接利用できる効果がある。続いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを貫通孔５５中に導入し、ｃＲＮＡ６３を合成する（図１４（ｅ））。この過程によって、約１０００コピー程度のｃＲＮＡ６３が合成される。さらに、ｅｍＰＣＲのための２本鎖ＤＮＡを合成するために、増幅されたｃＲＮＡ６３を鋳型として、ＰＣＲ増幅用共通配列（リバース）が付加された複数（〜１００種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー７１をハイブリダイズさせ（図１５（ｆ））、ｃＤＮＡ７２を合成する（図１５（ｇ））。さらに、第１実施形態と同様に酵素を用いてｃＲＮＡ６３を分解してから、フォワード共通プライマーを用いてセカンドストランドを合成することによってｅｍＰＣＲ用の２本鎖ＤＮＡ７３が合成される（図１５（ｈ））。この増幅産物は、長さがそろっており、そのまま、ｅｍＰＣＲ、次世代シーケンサーにかけることができる。この工程において遺伝子間、ないし分子間で増幅バイアスが生じたとしても、次世代シーケンサーによるデータ取得後に、分子識別用タグ配列を利用して増幅バイアスの補正を行うことができるため、高精度な定量データを得ることができることは第１実施形態と同様である（図７を参照）。
【００６６】
次に、一連の工程の具体例を示す。ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を合成した後、８５℃にて１．５分保持して逆転写酵素を失活させ、４℃に冷却後、ＲＮａｓｅ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ８．０）１０ｍｌをインレットから注入しアウトレットから排出することによって、ＲＮＡを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して貫通孔内の残存物及び分解物を除去・洗浄した。続いて、滅菌水６９０μｌと１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）１００μｌと２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１００μｌと各１０μＭのＰＣＲ増幅用共通配列（リバース、配列番号２）が付加された２０種の遺伝子特異的配列プライマーミックス（配列番号３〜２２）１００μｌとＥｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）１０μｌを混和し、細孔アレイシート５１を満たしている溶液をアウトレットから排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレットから注入する。その後、溶液と細孔アレイシートを９５℃３分間→４４℃２分間→７２℃６分間保持して反応を行い、ファーストストランドｃＤＮＡ鎖５９を鋳型としてプライマーの遺伝子特異的配列をアニールさせた後（図１４（ｃ））、相補鎖伸長反応を行い、セカンドストランドｃＤＮＡ鎖６１を合成する（図１４（ｄ））。
【００６７】
続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ８．０）１０ｍｌをインレットから注入しアウトレットから排出することによって、貫通孔内の残存物及び分解物を除去・洗浄する。さらに、滅菌水３４０μｌとＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  １０×  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）１００μｌと１００ｍＭ  ｄＡＴＰ  ９０μｌと１００ｍＭ  ｄＣＴＰ  ９０μｌと１００ｍＭ  ｄＧＴＰ  ９０μｌと１００ｍＭ  ｄＵＴＰ  ９０μｌと１００ｍＭ  ＤＴＴ、及びＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）１００μｌを混和し、細孔アレイシートを満たしている溶液をアウトレットから排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレットから注入する。その後、溶液と細孔アレイシートの温度を３７℃に上げて、１８０分間保つことによって逆転写反応を完了させ、ｃＲＮＡ増幅を行う。これにより、２０種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもｃＲＮＡ増幅産物サイズは２００±８塩基とほぼ均一となる。貫通孔の内部及び外部の溶液中に蓄積されたｃＲＮＡ増幅産物溶液を回収する。この溶液中に含まれる酵素等の残留試薬を除去する目的で、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、５０μｌの滅菌水に懸濁する。この溶液に、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌと５０ｎｇ／μｌのランダムプライマー３０μｌを混和させ、９４℃１０秒間の加熱後０．２℃／秒で温度を３０℃まで低下させ、３０℃で５分間加熱し、さらに４℃まで低下させる。その後、５×ＲＴバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０μｌと、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ５μｌと、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ  ５μｌと、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ５μｌを混和させ、３０℃で５分間加熱し、０．２℃／秒で温度を４０℃まで上昇させる。この溶液中に含まれる酵素等の残留試薬を除去する目的で、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ｅｍＰＣＲ増幅に適用後、次世代シーケンサーに適用して解析する。
【００６８】
（第３実施形態）
第１及び第２実施形態においては、細胞を破壊する手段としてレーザー光を用いたが、様々な材料からなるニードルを用いても良い。図１６に本実施形態の装置構成図を示す。ニードル１００１は半導体プロセスを用いて作製し、針の長さは例えば１０μｍであり、先端部分の直径は１μｍとする。針部分の材料は、シリコン酸化膜を用いることができる。原子間力顕微鏡のカンチレバーと同様の作製方法を用いて作製することができる。ニードルの保持部材１００２としてはシリコン基板を用いる。このシリコン基板はＺステージ１００３により駆動し、ニードル１００１の先端部分を細胞膜に突き刺すことによって、細胞膜に穿孔し、漏れ出たｍＲＮＡを細孔アレイシート３０まで電気泳動にて誘導する。ニードル１００１の面内での位置は白金電極３２の中心に配置して固定する。ニードル１００１を中空のニードルに変えて、細胞中の生体分子が中空ニードル内を通って放出されるようにしても良い。
【００６９】
また、細胞膜に穿孔し、細胞を破壊する方法としては、上記の方法以外に超音波を集中させる方法や荷電粒子や電子線を集中させる方法等を用いることができる。なお、ニードル等で破壊する細胞は１細胞でも数細胞でも良い。また、細胞を１つずつ穿孔しても良いし、一度に複数の細胞を破壊しても良い。目標とするサンプリング分解能に応じて選択する。
【００７０】
（第４実施形態）
本実施形態では、生体分子としてタンパク質由来のペプチドを解析するための構成について説明する。細孔アレイシートの内部に、シランカップリング剤を用いて、ＤＮＡプローブではなく計測対象とするタンパク質やペプチドを抗原とする抗体を固定する。固定条件は同じで良い。タンパク質やペプチドは、マイナスの電荷を持つとは限らないので、電気泳動を用いて細孔アレイシートの内部までこれらを誘導することはできない。そこで、細孔アレイシートを対称面として、計測対象とする細胞の反対側に、溶液を吸引するためのノズルを配置する。ノズルにより吸引した溶液はシャーレの内部に戻して循環させることができる。ノズル内径は例えば０．１ｍｍであり吸引速度は５００μｌ／秒とすることができる。これによって、細孔アレイシートの内部及び細孔アレイシートと細胞の間の領域に溶液の流れが生じ、レーザーで細胞膜を破壊したときに放出されるタンパク質やペプチドを含む生体分子を細孔アレイシートに誘導することができる。なお、破壊する細胞は１細胞でも数細胞程度でも良い。目標とするサンプリング分解能に応じて選択する。
【００７１】
このように、細胞ごとに生体分子を細孔アレイシートの特定の領域に捕捉した後、シャーレから取り出し、乾燥後、ＭＡＬＤＩのマトリックス剤として飽和濃度のシナピン酸を１μｌ加え、通常のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの要領で解析を行うことで、高感度な単一細胞タンパク解析を行うことができる。また、細孔アレイシート内部に特定の生体分子に特異的な抗体を固定せずに、前記と同様の処理を行うことによって、非特異的に細孔アレイシートの内壁に固定されたタンパク質やペプチドを解析することも可能である。この場合には単一細胞のプロテオーム解析を行うことができる。
【００７２】
（第５実施形態）
本実施形態では、アレイデバイスとして、多孔質メンブレンからなる細孔アレイシートの代わりに、表面にビーズがパッキングされたビーズアレイを用いる場合について説明する。生体分子解析装置の構成は図１の例と同じであり、細孔アレイシート３０に代えて、図１７に示すようなビーズアレイを用いた点のみが異なる。ビーズアレイ１７０１には、ビーズが保持された領域１７０２が配列している。領域１７０２が、図１における領域３０１に対応する。
【００７３】
このビーズアレイ１７０１は以下のようにして作製することができる。まず、第１実施形態の細孔アレイシートで使用したアルミナ製の多孔質メンブレンを２ｍｍ×２ｍｍの大きさに切断する。このシートの上に５０μｍ角の貫通孔が１００μｍピッチで形成された、厚さ１００μｍのＰＤＭＳ製樹脂膜を貼り合わせる。その後、インクジェットプリンタに用いられるピエゾインジェクタで、領域１７０２ごとに異なる細胞識別用タグ配列を含むＤＮＡプローブが固定されたビーズ１７０３の溶液を打ち込んでいく。溶液はキャピラリ効果で多孔質メンブレンの方に吸引され、その後乾燥するため、ビーズ１７０３だけがパッキングされる。１つの領域１７０２に１０４〜１０５個のビーズ１７０３をパッキングすることができる。ここでビーズ１７０３としては、例えば、ストレプトアビジンがコートされた直径１μｍの磁性ビーズを用いることができる。ＤＮＡプローブは末端にビオチン修飾したものを用い、ストレプトアビジンを介してビーズ表面に固定する。このようなビーズは多数のメーカーから市販されている。これにより作製されるアレイデバイスは、領域１７０２の開口部側を細胞に向けてＸＹＺステージ３４に裏向きにして設置する。
【００７４】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００７５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【００７６】
１    顕微鏡システム
２    生体分子採取システム
３    制御システム
４    蛍光顕微鏡用レーザー光源
５    細胞破壊用レーザー光源
６    ダイクロイックミラー
７    ダイクロイックミラー
９    ステージ
１０  試料ステージ
１１  バンドパスフィルタ
１２  結像レンズ
１３  受光器
１４  ピンホール
２０  シャーレ
２１  接着系培養細胞
２２  接着系培養細胞
２３  接着系培養細胞
３０  細孔アレイシート
３１  分離壁
３２  白金電極
３３  シールド線
３４  ＸＹＺステージ
３５  電源
３６  ｍＲＮＡ
３９  参照電極
４１  電源
４２  石英基板
４３  金電極
４４  貫通孔
５１  細孔アレイシート
５４  ｍＲＮＡ
５５  貫通孔
５６  ＤＮＡプローブ
５９  ファーストストランドｃＤＮＡ鎖
６０  ターゲット遺伝子特異的配列プライマー
６１  セカンドストランドｃＤＮＡ鎖
６２  ２本鎖ｃＤＮＡ
６３  ｃＲＮＡ
７１  ターゲット遺伝子特異的配列プライマー
７２  ｃＤＮＡ
７３  ２本鎖ＤＮＡ
８０  ＤＮＡプローブ
３０１  領域
３０２  チップ
８０１  撮像素子
８０２  フォーカス調整レンズ
８０３  ダイクロイックミラー
１００１  ニードル
１００２  保持部材
１００３  Ｚステージ
１４０１  光源
１４０２  偏光子
１４０３  ウォラストンフィルタ
１４０４  ウォラストンプリズム
１４０５  コンデンサレンズ
１４０６  対物レンズ
１５０１  光源
１５０２  ビームスプリッタ
１５０３  非線形ファイバ
１５０４  水浸対物レンズ
１５０５  ハイパスフィルタ
１５０６  分光器
１５０７  分光器用ＣＣＤカメラ
１５０８  結像レンズ
１７０１  ビーズアレイ
１７０２  領域
１７０３  ビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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