(57)【要約】  ２型糖尿病患者におけるパパイヤ発酵食品の安全性を確認しつつ、ＡＴＰの産生やミトコンドリアに対する効果を明らかにし、２型糖尿病患者に対する更なる健康上の利点を見出すこと。パパイヤ発酵製品を有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生を促進するためのＡＴＰ産生促進剤、及び、ミトコンドリアの活性を促進するためのミトコンドリア活性促進剤を提供する。さらに、パパイヤ発酵食品を有効成分として含有し、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進し、及び／又はミトコンドリアの活性を促進することに基づく、２型糖尿病患者のための免疫賦活剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パパイヤ発酵食品を有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生を促進するためのＡＴＰ産生促進剤。
【請求項２】
パパイヤ発酵食品を有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるミトコンドリアの活性を促進するためのミトコンドリア活性促進剤。
【請求項３】
パパイヤ発酵食品を有効成分として含有し、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進し、及び／又はミトコンドリアの活性を促進することに基づく、２型糖尿病患者のための免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ産生促進剤及びミトコンドリア活性促進剤並びに免疫賦活剤に関する。具体的には、パパイヤ発酵食品（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  Ｐａｐａｙａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ＦＰＰ）を有効成分として含有する、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進するためのＡＴＰ産生促進剤及びミトコンドリアの活性を促進するためのミトコンドリア活性促進剤に関する。本発明はまた、ＦＰＰを有効成分として含有し、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進し、及び／又はミトコンドリアの活性を促進することに基づく、２型糖尿病患者のための免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カリカパパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ  Ｌｉｎｎ）の未熟果を糖と共に食用酵母菌で発酵させることにより製造されるＦＰＰは、唾液と混ぜ合わせることにより水と混ぜ合わせる場合に比べ、マルトースとマルトトリオースが増加するものである。【０００３】
ＦＰＰの経口摂取により、オリゴ糖が増加し腸内環境を整える働きが期待され、２型糖尿病患者の血糖値の上昇抑制や創傷の治癒促進も期待されている（特許文献１）。ＦＰＰはまた、抗酸化特性を有し、加齢に伴う諸症状に対する効果を得られることで知られている（非特許文献１）。【０００４】
また、慢性的な傷は糖尿病患者にとって健康上の重大な問題である（非特許文献２）。最近、本発明者らは、ＦＰＰが特に創傷部のマクロファージの反応及びその後の血管新生反応に影響することにより、糖尿病患者の外傷を改善する可能性があるという証拠を初めて報告した（非特許文献３）。本発明者らはまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において呼吸バースト活性が促されＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存的に改善することも示した（非特許文献４）。【０００５】
一方、ＡＴＰ合成とミトコンドリア呼吸は、細胞代謝の中核をなす二つの経路である。呼吸は酸素によるミトコンドリアのＮＡＤＰＨの酸化からなる。酸素によるＮＡＤＰＨの生成は、膜電位差とｐＨ勾配から成る陽子の電気化学的勾配を生み出す電子伝達鎖と連動している（非特許文献５）。２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、呼吸バースト活性の低下を引き起こし、その結果感染症のリスクが増大する。【０００６】
加齢は、さまざまな細胞成分への累積損傷により生じる多元的プロセスであると推定される。哺乳動物における老化は、ミトコンドリアＤＮＡの変異および呼吸鎖機能不全と関連がある。心臓、骨格筋、結腸陰窩、ニューロンなどといった様々な組織の細胞のサブセットにおけるモザイク呼吸鎖不全は、老人に典型的に見られる。マウスでの実験的証拠は、体細胞のミトコンドリアＤＮＡの変異の増加が、骨粗鬆症、抜け毛、毛髪の灰色化、体重減少や受精能の低下といった様々な老化の兆候と関連があることを示している。呼吸鎖不全細胞は、アポトーシスを起こしやすいことは昔から知られており、従って細胞消失量の増加は老化に関連したミトコンドリア不全において重要であろう。ミトコンドリアの機能が低下すると自動的に活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が増加する傾向がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−０４１４７８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Aruoma OI, Hayashi Y, Marotta F, Mantello P, Rachmilewitz E, Montagnier L. Applications and bioefficacy of the functional food supplement fermented papaya preparation. Toxicology 278: 6-16, 2010.
【非特許文献２】Sen CK, Gordillo GM, Roy S, Kirsner R, Lambert L, Hunt TK, Gottrup F, Gurtner GC, Longaker MT. Human Skin Wounds: A Major and Snowballing Threat to Public Health and the Economy. Wound Repair Regen in press, 2009.
【非特許文献３】Collard E, Roy S. Improved function of diabetic wound-site macrophages and accelerated wound closure in response to oral supplementation of a fermented papaya preparation. Antioxid Redox Signal 13: 599-606, 2010.
【非特許文献４】Dickerson R, Deshpande B, Gnyawali U, Lynch D, Gordillo GM, Schuster D, Osei K, Roy S. Correction of aberrant NADPH oxidase activity in blood-derived mononuclear cells from type II diabetes mellitus patients by a naturally fermented papaya preparation. Antioxid Redox Signal 17: 485-91, 2012.
【非特許文献５】Brown GC. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochem J 284 (Pt 1): 1-13, 1992.
【非特許文献６】Ray LB. Good ROS Versus Bad ROS. Sci. Signal. 3: ec218, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、２型糖尿病患者におけるＦＰＰの安全性を確認しつつ、ＡＴＰの産生やミトコンドリアに対する効果を明らかにし、２型糖尿病患者に対する更なる健康上の利点を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、ＦＰＰは、２型糖尿病患者において、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生及びミトコンドリアの活性を促進することを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は、パパイヤ発酵製品を有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生を促進するためのＡＴＰ産生促進剤を提供する。本発明はまた、パパイヤ発酵製品を有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるミトコンドリアの活性を促進するためのミトコンドリア活性促進剤を提供する。本発明はさらに、ＦＰＰを有効成分として含有し、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進し、及び／又はミトコンドリアの活性を促進することに基づく、２型糖尿病患者のための免疫賦活剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＡＴＰ産生促進剤及びミトコンドリア活性促進剤によれば、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者の血糖値に悪影響を与えることなく、ＡＴＰ産生、特にミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生、及びミトコンドリア活性を促進することができる。このことにより、２型糖尿病患者の免疫を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｔ２Ｄ患者におけるＦＰＰの安全性を確認した結果を示した図である。ＦＰＰの経口摂取は、Ｔ２Ｄ患者における空腹時血糖（Ａ、Ｄ）、ＨｂＡ１ｃ（Ｂ、Ｅ）、又は総コレステロール（Ｃ、Ｆ）に対する影響は殆どなかった。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１５）で示した。
【図２】ＦＰＰの経口摂取はＴ２Ｄ患者の末梢血単核細胞における呼吸バースト活性の改善効果を示す図である。ＦＰＰは、Ｔ２Ｄ誘導の呼吸バーストの活性低下を改善したが、全身の酸化的ストレスに影響を与えなかった。Ａは、スーパーオキシドアニオンの産生の、ベースラインに対する変化倍数（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示し、データは平均±標準偏差（ｎ＝１４）で示した。＊はｐ＜０．０５を示す。Ｂは、タンパク質カルボニルのベースラインに対する変化（％）を示し、データは平均±標準偏差（ｎ＝１０）で示した。Ｃは、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ−４）の、ベースラインに対する変化（％）を示し、データは平均±標準偏差（ｎ＝１７）で示す。
【図３】ＦＰＰによる細胞内のＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの産生の促進効果を示す図である。データは平均±標準偏差（ｎ＝４）で示した。＊はＮＧに対してｐ＜０．０５を示す。
【図４】ＦＰＰによるミトコンドリア膜電位差及び酸素消費に対する促進効果を示す図である。Ａは、フローサイトメトリーの結果を示す。Ｂは、脱分極細胞に対する分極細胞の比（ＦＬ２−ｈ／ＦＬ１−ｈ）を示す図であり、§はグルコース枯渇細胞に対しｐ＜０．０５を示し、＊はＮＧに対しｐ＜０．０５を示す。Ｃは、ＮＧ及びＮＧ＋ＦＰＰにおける、ｓｔａｔｅ  ＩＶ及び脱共役の呼吸の測定をトレースする概略図である。Ｄは、脱共役率／Ｓｔａｔｅ  ＩＶ率を示す図である。＊は、ＮＧに対しｐ＜０．０５（ｎ＝３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＡＴＰ産生促進剤及びミトコンドリア活性促進剤は、ＦＰＰを有効成分として含有する、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生を促進するためのＡＴＰ産生促進剤、及び、２型糖尿病患者におけるミトコンドリアの活性を促進するためのミトコンドリア活性促進剤である。本発明の免疫賦活剤は、ＦＰＰを有効成分として含有し、２型糖尿病患者において、ＡＴＰの産生を促進し、及び／又はミトコンドリアの活性を促進することに基づくものである。
【００１５】
ＦＰＰ（ＦＰＰ）は、上述のように、カリカパパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ  Ｌｉｎｎ）の未熟果を糖と共に食用酵母菌で発酵させることにより製造されるパパイヤ由来の発酵製品である。
【００１６】
ＦＰＰは、株式会社大里ラボラトリーが製造し、株式会社大里インターナショナルが販売するものであることが好ましい（特許文献１、非特許文献１）。当該ＦＰＰは、「ＦＰＰ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  Ｐａｐａｙａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」（登録商標）、又は「Ｉｍｍｕｎ’Ａｇｅ」（登録商標）として入手できる。当該ＦＰＰは、ＩＳＯ９００１：２００８、ＩＳＯ１４００１：２００４、ＩＳＯ２２０００：２００５の認証を受け、欧米で最も厳しい食品安全規格であるＦＳＳＣ２２０００をＪＩＡ国内第一号で取得した工場で生産されており品質面、環境面及び安全面で保証がされている。
【００１７】
ＦＰＰの製造方法は、例えば特許文献１に記載されている。ＦＰＰは、日本食品分析センターによる分析では、ＦＰＰ１００ｇ中９１．２ｇが炭水化物であり、他に少量のタンパク質（０．３ｇ）、脂質（０．２ｇ）、カリウム（１４．９ｍｇ）及び水分（８．５ｇ）が含まれている（ロットＮｏ．０９１；２０１４年５月２７日付け分析試験成績書）。
【００１８】
ＦＰＰは、経口摂取に適するよう顆粒剤、散剤、細粒剤など種々の形態に適宜調製することができ、調製に際し、添加剤、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤など適宜加えることができる。
【００１９】
ＦＰＰの使用量は、有効成分として、体重７０ｋｇの成人に対して、０．５〜３０ｇ／日であればよく、好ましくは１〜２０ｇ／日、さらに好ましくは３〜１５ｇ／日、最も好ましくは３〜９ｇ／日である。
【００２０】
本発明のＡＴＰ産生促進剤及びミトコンドリア活性促進剤は、２型糖尿病患者におけるＡＴＰの産生及びミトコンドリアの活性を促進することができる。このことにより、Ｔ２Ｄ患者において免疫賦活等の健康効果が期待できる。ＦＰＰは糖尿病患者に対して世界で初めて糖質であるにも関わらず血糖値を変えることなく、免疫を高めることが出来る物質である。その根拠は、糖尿病患者に対して、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ誘導によるＲＯＳ産生を向上することによる呼吸バースト活性を高めることによる。
【実施例】
【００２１】
［材料及び方法］
（１）ヒト対象及びサンプルの採取
ヒトへの臨床試験はオハイオ州立大学（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＯＳＵ）の治験審査委員会によって承認された。本治験における成人対象は、臨床的に２型真性糖尿病と診断され、良好なグルコースコントロールされ、ＨｂＡ１ｃ値が７％以下であった。対象者は、オハイオ州立大学ウェクスナー・メディカル・センターにある糖尿病クリニックにて募集され、免疫反応が抑制されていたか、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ剤を服用していた患者は、本治験から除かれた。末梢血６０ｃｃは、静脈穿刺によって採集し、１０ｃｃの血液はオハイオ州立大学ウェクスナー・メディカル・センター  臨床検査室に送られ、血液化学検査に付した。残りの血液は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血漿の分離に利用した。ＰＢＭＣは速やかに呼吸バーストアッセイに使用した。各患者からの血漿は、全血から分離し、遠心し、液体窒素中で急速冷凍（ｓｎａｐ  ｆｒｅｅｚｏｎ)し、全部のサンプルが集まるまで−８０℃で保存し、その後一緒に分析した。【００２２】
（２）ヒト末梢血単核細胞の分離及び培養
新鮮な血液をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により１：１で希釈した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール比重遠心、続いて抗ＣＤ−１４でコートした磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，米国）でソートすることによって分離した。【００２３】
（３）スーパーオキシドアニオンの測定
促進されたスーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の産生は、化学発光ＬｕｍｉＭａｘ（登録商標）スーパーオキシドアニオン測定キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、メーカー推奨プロトコールにて検出した。ＰＢＭＣにおける呼吸バースト中の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）１μｇ／ｍｌで刺激を与えた後に測定した。ヒト前骨髄球性白血病細胞株（ＨＬ−６０）は、対照として使用した。【００２４】
（４）細胞培養
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％抗生物質／抗真菌剤（ＡＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０グルコース不含培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｂｓｌａｄ，ＣＡ）で４８時間培養し、細胞からグルコースを除いた。次に、細胞に炭水化物を回復させるために、上記のグルコース不含培地は、以下の基質：正常グルコースレベル基質（ＮＧ）（培地中１１ｍＭ，２ｍｇ／ｍＬのグルコース）、高グルコースレベル基質（ＨＧ）（培地中２０ｍＭ，３．９ｍｇ／ｍＬのグルコース）、ＦＰＰ（培地中２．９ｍｇ／ｍＬのＦＰＰ），又は、ＮＧ＋ＦＰＰ（培地中１１ｍＭ，２ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び、２．９ｍｇ／ｍＬのＦＰＰ）によって補完した。補完された培地は、０．２２μｍ真空フィルターシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，米国）で細菌ろ過し、続いてグルコース除去したＴＨＰ−１細胞に添加した。それぞれの物質グループの細胞は、それぞれの基質と一緒に２４時間培養し、アッセイに付した。【００２５】
ＨＬ−６０細胞は、ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｂｓｌａｄ，ＣＡ，米国）を含み、２０％ＦＢＳ及び１％ＡＡが添加された高グルコースＤＭＥＭで培養した。【００２６】
（５）代謝産物及び酸化ストレスの測定
ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ濃度は、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ定量キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）を用いて、メーカー推奨プロトコールにて測定した。ＴＨＰ−１細胞は、２４時間の炭水化物の回復後、冷ＤＰＢＳで洗浄した。細胞は、２回の凍結溶解のサイクルを繰り返すことで溶解した。ＮＡＤＰＨ消費酵素を除くため、溶解液は１０ｋＤＡ限外濾過スピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，米国）で濾過した。ＮＡＤＰＨを検出するため、総ＮＡＤＰを含むサンプルは６０℃で３０分間加熱し、ＮＡＤＰを消化し、ＮＡＤＰＨだけ残した。総ＮＡＤＰサンプル及びＮＡＤＰＨサンプルは、ＮＡＤＰサイクリング酵素と一緒に室温にて５分間培養し、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに変換した。サンプルに比色分析用顕色剤を添加し、室温にて１時間培養した。４５０ｎｍでの吸収は、自動マイクロプレート（モデルＳｙｎｅｒｇｙ  ２，ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，米国）で測定した。【００２７】
ＡＴＰ濃度は、ＡＴＰアッセイキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）を用いて、メーカー推奨プロトコールにて測定した。ＴＨＰ−１細胞は、２４時間の炭水化物の回復後、冷ＤＰＢＳで洗浄した。サンプルから、氷冷４Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）でタンパク質を除去した。同量の２Ｍ水酸化カリウム（ＫＯＨ）を添加し、サンプルをｐＨ６．８〜７．２に中和し、過剰ＰＣＡを沈殿させた。サンプルを３０分間培養し、比色アッセイを行い、その後５７０ｎｍでの吸収を測定した。【００２８】
タンパク質カルボニルは、タンパク質カルボニル含有量アッセイキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）を用いて、メーカー推奨プロトコールにて測定した。【００２９】
４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ−４）は、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＨＮＥ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を用いて、メーカー推奨プロトコールにて測定した。【００３０】
（６）ミトコンドリア膜電位差測定
ＴＨＰ−１細胞を、ミトコンドリアで電位差依存的な蓄積を示すカチオン性ＪＣ−１染料（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＪＣ−１  ｄｙｅ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と通常条件下で２０分間培養した。緑（〜５２５ｎｍ、ＦＬ１−Ｈチャンネル）から赤（〜５９０ｎｍ、ＦＬ２−Ｈチャンネル）への発光シフトを測定することで、上述の基質グループと培養した細胞の分極状態を測定した。赤／緑発光比の低減は、脱分極又は低い膜電位差を示す。赤／緑発光比は、もっぱら膜電位差に依存し、ミトコンドリアの大きさ、密度、又は形に影響されない。２５Ｋイベント／サンプル後、測定はフローサイトメトリー（ｍｏｄｅｌ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，Ａｃｃｕｒｉ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，米国）で収集した。【００３１】
（７）Ｏｘｙｇｒａｐｈ酸素消費測定
酸素（Ｏ２）の消費を測定するため、ｓｔａｔｅ  ＩＶ及び脱共役の呼吸を測定した。ジギトニン（４μｇ／１０６細胞）で細胞を透過性処理した。呼吸培地は、２３０ｍＭのマンニトール、７０ｍＭのスクロース、３ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、及び１０ｍＭのコハク酸エステルを含む。最初は、複合体ＩＩによってコハク酸エステルを酸化した。そして、オリゴマイシン（２ｍＭ）を添加し、複合体Ｖ（ＡＴＰ合成酵素）を阻害し、内因性ＡＤＰ（ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸）からＡＴＰへの生成を防止した。次に、脱共役剤のカルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ，１．５μＭ）を添加し、膜電位差を化学的に消滅させることで、最大の呼吸を生成させた。最後に、アンチマイシンＡ（１．５ｍＭ）を添加し、複合体ＩＩＩを抑制した。これによって、シトクロムｃへの電子の移転、及び引き続きの複合体ＩＶによるＯ２からＨ２Ｏへの還元を押さえ、その結果酸素の消費を抑制した。クラーク型酸素電極及び酸素モニター（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ，米国）を用いて、酸素消費率を測定した。酸素消費は、脱共役率をｓｔａｔｅ  ＩＶ率で割ることで計算した。【００３２】
（８）統計
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、３〜５回の実験の平均値±標準誤差で報告した。複数のグループの比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）でテストした。ｐ＜０．０５は統計的に有意と考えられる。ヒトＴ２Ｄ治験では、１７人の成人対象（ｎ＝１７）からのデータを示した（表１）。【００３３】
［実施例１］Ｔ２Ｄ患者におけるＦＰＰの安全性
Ｔ２Ｄ患者におけるＦＰＰのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を調べるためには、まずはＴ２Ｄ患者におけるＦＰＰの安全性を確認した。【００３４】
Ｔ２Ｄと診断された患者１７名に、ＯＳＵ糖尿病クリニックにてＦＰＰ摂取開始前の血液（ベースライン（ＢＬ））を採取し、その後６週間ＦＰＰを摂取し（９ｇ／日）、その間に２回来院した。試験は、その後のウォッシュアウト期間の２回の来院を以て終了した。来院毎に、呼吸バーストＲＯＳ産生、空腹時血糖、脂質値、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、脂質／タンパク質過酸化反応を測定した。末梢血はＯＳＵ糖尿病クリニックのＴ２Ｄ患者から採取された（表１参照）。Ｔ２Ｄ患者は、６週間のＦＰＰ（９ｇ／日）の摂取、２週間のウォッシュアウト期間を設けた。
【表１】
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【００３５】
ＦＰＰの空袋の返却を以て患者のコンプライアンス（服用順守）とし、その平均は９０％だった。空腹時血糖、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、及びコレステロール値を、ベースライン時、摂取中、ウォッシュアウト期間中に測定した。【００３６】
結果は、図１に示した。図１から、ＦＰＰの摂取により血糖値及び総脂質値に影響はなく、ＦＰＰはＴ２Ｄ患者が安全に摂取できることが示唆された。血糖値への長期的影響は、ＨｂＡ１ｃ値が示すように、本研究期間を通して変化は見られなかった。【００３７】
ＦＰＰの経口摂取は、ＰＢＭＣの呼吸バーストＲＯＳ産生を顕著に誘発し、一方で摂取期間中血液成分には影響を与えなかった。ＦＰＰは、ヒトの摂取の安全性に関して長い実績がある。本研究は、Ｔ２Ｄ患者におけるＦＰＰの血糖値、ＨｂＡ１ｃ値、総脂質への影響を初めて調査した点において独自性がある。これらの結果は、ＦＰＰは、その甘さとその炭水化物組成にもかかわらず、Ｔ２Ｄ患者にとって忍容性が高いことを示した。【００３８】
［実施例２］  ＦＰＰによるＴ２Ｄ患者の末梢血単核細胞における呼吸バースト活性の改善
本発明者らは以前、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するｅｘ  ｖｉｖｏでのＦＰＰによる処理は、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）に刺激された際のＴ２Ｄによる呼吸バーストの低下を改善することを報告した（非特許文献４）。【００３９】
経口でのＦＰＰのｉｎ  ｖｉｖｏでの摂取が単球の呼吸バースト活性を改善できるかを検証するために、Ｔ２Ｄ患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＰＢＭＣは、ベースライン時、ＦＰＰの摂取を始めてから２週間後と６週間後、ウォッシュアウトの２週間後にＴ２Ｄ被験者から、ＰＢＭＣを収集した。ＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）による３０分間の刺激の後に、ＰＢＭＣにおける呼吸バースト中の活性酸素種（ＲＯＳ）スーパーオキシドアニオンの産生を、化学発光による検出により測定した。タンパク質カルボニル及び４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ−４）は、上述したとおりＥＬＩＳＡで測定した。新鮮な血漿は液体窒素で急速冷凍して、全部の検体が集まるまで保存したものであった。すべてのサンプルは同時に測定した。【００４０】
結果は図２に示した。図２から、ＲＯＳの産生は、各患者のベースライン時と比較して有意に促進されたことを判明した（図２  Ａ）。以前に、抗酸化物であるα−トコフェロールの摂取により単球でのスーパーオキシドアニオンの放出が減少したことが報告された（Devaraj S, Tang R, Adams-Huet B, Harris A, Seenivasan T, de Lemos JA, Jialal I. Effect of high-dose alpha-tocopherol supplementation on biomarkers of oxidative stress and inflammation and carotid atherosclerosis in patients with coronary artery disease. Am J Clin Nutr 86: 1392-8, 2007.）。【００４１】
ＦＰＰによるＮＡＤＰＨオキシダーゼを介したＲＯＳの産生が全身の酸化ストレスを増加させるかどうかを検証するため、カルボニルタンパク質や過酸化脂質反応マーカーである４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ−４）へのＦＰＰの影響を、来院毎に測定した。ＦＰＰはＴ２Ｄ患者において必要な呼吸バーストＲＯＳを増加させたが、ＦＰＰの摂取期間中を通じて酸化ストレスに悪影響を与えることはなかった（図２  Ｂ〜Ｃ）。【００４２】
１４週間の６ｇ／日のＦＰＰの経口摂取は、溶血率を有意に低下させ、糖尿病前症の患者の血清におけるタンパク質カルボニルの蓄積を減少させたことが報告された（Somanah J, Bourdon E, Rondeau P, Bahorun T, Aruoma OI. Relationship between fermented papaya preparation supplementation, erythrocyte integrity and antioxidant status in pre-diabetics. Food Chem Toxicol 65: 12-7, 2014.）。【００４３】
これらの観察に基づき、本発明者らはＦＰＰの摂取が糖尿病患者の自然免疫反応を改善する可能性があると推測する。【００４４】
［実施例３］  ＦＰＰによる細胞内のＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの産生の促進
オキシダーゼサブユニットｐ４７（ＰＨＯＸ）の過リン酸化は、無傷細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性時に起こる。以前本発明者らは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＦＰＰを与えたＰＢＭＣにおいてｐ４７（ＰＨＯＸ）が上方調整されたことを報告した。【００４５】
［材料及び方法］で述べたとおり、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞をグルコース不含培地で４８時間培養し、細胞からグルコースを除いてから、正常グルコースレベル基質（ＮＧ）、高グルコースレベル基質（ＨＧ）、ＦＰＰ、又はＮＧ＋ＦＰＰが含まれる培地で２４時間培養した。その後、それぞれの物質グループの細胞について、細胞内ＡＴＰ，ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨをＥＬＩＳＡによって測定した。【００４６】
結果は図３に示した。ＡＴＰはリン酸化反応に必要である。ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１において、グルコース培地のみ（ＮＧ）に比べ、ＦＰＰを与えたグルコース培地（ＮＧ＋ＦＰＰ）ではＡＴＰ値が７５％高く、ＦＰＰが単球におけるＡＴＰ産生を促進していることが示唆された（図３  Ａ）。この結果は、甘い健康補助食品が細胞内のＡＴＰ産生を高めることができるという点が予想外で新規である。高グルコース培地（ＨＧ）では同様の結果は観察されなかったので、ＡＴＰ値の上昇はＦＰＰに含まれるグルコースに依存するものではなく、ＦＰＰの特定の成分が単球における細胞内のＡＴＰの産生を促進していることが示唆された。【００４７】
白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼはＮＡＤＰＨを消費してスーパーオキシドアニオン産生を触媒する。興味深いことに、ＴＨＰ−１細胞をＦＰＰで処理すると、総ＮＡＤＰはわずかに増えただけだったが、細胞のＮＡＤＰＨ値は３０％上昇した（図３  Ｂ〜Ｃ）。【００４８】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ中のＮＡＤＰＨの割合における劇的な推移が観察され、Ｔ２ＤにおけるＮＡＤＰＨオキシダーゼを介した呼吸バーストＲＯＳの産生の上昇は、細胞のＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの値の上昇の結果である可能性が示唆された（図３  Ｄ）。【００４９】
これらの結果は、ＦＰＰが細胞のＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの値を上昇させることによりＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を促進していることを示唆した。【００５０】
［実施例４］  ＦＰＰによるミトコンドリア膜電位差の上昇及び呼吸の活性化
ＡＴＰ合成とミトコンドリア呼吸は、細胞代謝の中核をなす二つの経路である。呼吸は、酸素によるミトコンドリアのＮＡＤＰＨの酸化から成る。酸素によるＮＡＤＰＨの生成は、膜電位差とｐＨ勾配から成る陽子の電気化学的勾配を生み出す電子伝達鎖と連動している。【００５１】
ミトコンドリアでのＡＴＰ合成は、陽子が膜を透過することでミトコンドリアのマトリックス内のＡＴＰ合成と連動する。ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）は、細胞の主なエネルギー源であり、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる呼吸バーストを含むほとんどの主な細胞のプロセスに使われる。【００５２】
ミトコンドリア膜電位差（ＭＭＰ）と呼吸が原因で細胞のＡＴＰ値が上昇するのかを検証するため、ミトコンドリアの膜電位差を測定した。実施例３と同様に、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞をグルコース不含培地で４８時間培養し、細胞からグルコースを除いてから、正常グルコースレベル基質（ＮＧ）、高グルコースレベル基質（ＨＧ）、ＦＰＰ、又はＮＧ＋ＦＰＰが含まれる培地で２４時間培養した。その後、それぞれの物質グループの細胞について、［材料及び方法］で述べたとおり、ミトコンドリア膜電位差及び酸素消費を測定した。ミトコンドリア膜電位差は、ＪＣ−１染料及びフローサイトメトリーで測定した。【００５３】
結果は図４に示す。ＦＰＰ及び正常グルコースレベル（ＮＧ＋ＦＰＰ）の条件下で培養した単球細胞のグループは、赤の蛍光発光の増加が認められた（図４  Ａ）。ＮＧ＋ＦＰＰの条件下で培養した単球細胞は、ＦＰＰを与えなかった正常グルコースレベル（ＮＧ）の条件下で培養した単球細胞のグループに比べ、〜２０％のＭＭＰの上昇が認められた（図４  Ｂ）。【００５４】
ＦＰＰの投与によりミトコンドリア呼吸が増え、そのためＡＴＰ産生が上昇するという本発明者らの仮説を裏付けるために、ＦＰＰを投与した場合と投与していない場合の単球細胞の酸素消費を、クラーク型酸素電極モニターを用いて測定した（図４  Ｃ）。【００５５】
ＮＧに比べて、ＮＧ＋ＦＰＰの脱共役呼吸率／Ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸率が上昇したことにより、培養細胞の酸素消費が上昇することがわかった（図４  Ｄ）。【００５６】
これらを総合すると、ＦＰＰは、ミトコンドリア呼吸の活性化することによりＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの供給を増加し、その結果Ｔ２Ｄ患者のＰＢＭＣにおける呼吸バーストを促すのではないかと考えられる。ＦＰＰは、ヒトに安全に消費されている長い歴史があり、また本研究による臨床データを見れば、Ｔ２Ｄ患者の自然免疫反応に対するＦＰＰの有効性が期待される。【００５７】
糖尿病は糖代謝の異常により体内の糖がエネルギーに変換できず血中の糖が高くなることにより末梢循環が悪くなり、免疫低下となる。ＦＰＰは糖質でできているにもかかわらず、今回初めて糖尿病患者に対して糖でもって免疫の改善並びにエネルギー代謝の向上をめざした世界で初めての臨床研究であった。加えて、本発明者らは、このＦＰＰが、Ｔ２Ｄ患者の血糖値に悪影響を与えることなく、ミトコンドリアの呼吸を刺激し、細胞のＡＴＰ産生を促進するという新規な結果を示す。【００５８】
以前の論文によりＦＰＰの抗酸化活性の可能性は報告している。また近年、ＲＯＳのこの二つ、すなわち「良いＲＯＳ  ｖｓ  悪いＲＯＳ」の重要性が脚光を浴びている（非特許文献６）。ＦＰＰを与えることで、単球の呼吸バースト活性は有意に改善される。また、ＦＰＰが活性酸素種（ＲＯＳ）の生理的働きにおいて二つの目的を果たすこと、すなわち“良いＲＯＳ”（呼吸バースト）の促進と“悪いＲＯＳ”（酸化ストレス）の除去により、Ｔ２Ｄ患者に有益である可能性を初めて提示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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