(57)【要約】  本発明は、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療薬を提供し、また、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害剤を提供する。
2014136910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。
【請求項２】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３】
抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４記載の抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６により産生される、請求項５記載の抗体。
【請求項７】
請求項５又は６記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は請求項７記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６。
【請求項１１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する請求項４に記載の抗体を製造する方法。
【請求項１２】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリオスチンのＥｘｏｎ−２１部位によりコードされるペプチドに対する抗体及び該抗体を含む炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、分子量約９万のポリペプチドからなる。各ポリペプチド鎖には、シグナル配列、システインリッチドメイン、４回繰り返しドメイン、Ｃ末端ドメインが含まれている。【０００３】
ペリオスチンは、当初、骨芽細胞特異的因子−２（ＯＳＦ−２）と呼ばれ、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定されたが（特許文献１、非特許文献１）、後に現在の名称であるペリオスチンと呼ばれるようになり、骨芽細胞における接着促進活性が報告された（非特許文献２）。【０００４】
初期の研究では、ペリオスチンは骨組織に特異的に発現する細胞外マトリックスであると考えられていた。しかしながら、現在では骨組織のみならず心不全（非特許文献３、非特許文献４）、動脈瘤（非特許文献５）、癌（非特許文献６〜８）、子癇前症（非特許文献９）、血管再狭窄（非特許文献１０〜１５）、炎症性疾患（(i)食道炎（非特許文献１６）、(ii)副鼻腔炎・喘息（非特許文献１７）、(iii)喘息（非特許文献１８）、(iv)血管新生（非特許文献６、非特許文献１９〜２２））等の発症において極めて高く発現しており、また正常組織においては極僅かしか発現していないことが明らかになっている。また、幾つかのペリオスチンスプライシングバリアントが骨芽細胞で発現していることも明らかになっている（非特許文献１〜２、非特許文献２３、特許文献２）。【０００５】
ペリオスチンの作用について、細胞接着作用に関しては、８１１アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−２に相当）（非特許文献２）及び７８３アミノ酸からなるペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−４に相当）（非特許文献２４）が細胞接着作用を有すると報告されていた。その他に細胞接着作用を有していない８３８アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）（特許文献２）や８１０アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−３に相当）（特許文献４）が存在する。【０００６】
癌に関しては、癌の転移は、原発巣から血管やリンパ管内への癌細胞の浸潤、転移臓器への癌細胞の選択的な移動、血管から転移臓器への癌細胞の浸潤、転移先の微小環境に支えられた癌細胞の増殖、血管新生を伴った直径数ミリメートル以上となる腫瘍の増殖等の過程より成る（非特許文献２５〜２６）。これらの複雑な転移成立過程の中で、癌細胞の運動能の亢進による浸潤・転移は極めて重要な段階である（非特許文献２７）。これまでに、高転移性癌細胞は、それ自身が自己分泌型運動因子を産生し、固有運動を亢進させることが報告されている（非特許文献２８）。この悪性因子に対する阻害物質は転移抑制剤として期待できるが、現在までにその特異的阻害剤は見出されていない。【０００７】
一方で、高転移性癌でのペリオスチンの高発現が各種論文で報告されている（（膵臓癌；非特許文献２９）、（口腔癌；非特許文献２１）、（膵臓癌；非特許文献３０）、（乳癌；非特許文献３１）、（頭頸部癌；非特許文献３２）、（結腸癌；非特許文献１９）、（乳癌；非特許文献６、８、３３）、（胸腺癌；非特許文献３４〜３５）、（非小細胞性肺癌；非特許文献３６〜３７）、（卵巣癌；非特許文献３８）、（前立腺癌；非特許文献３９）、（肝臓癌、胆管癌；非特許文献４０）、（食道扁平上皮癌；非特許文献４１）、（前立腺癌；非特許文献４２）、（甲状腺癌；非特許文献４３））。また、高転移性癌においては転写因子Ｔｗｉｓｔが高発現していることが報告され（非特許文献４４〜４５）注目されており、ペリオスチンのプロモーター領域にもＴｗｉｓｔが有ることが報告されている（非特許文献４６）。加えて、ヒト胎児腎上皮細胞株である２９３Ｔ細胞にペリオスチン遺伝子を導入すると、浸潤能が亢進することが報告されている（非特許文献４７）。また、種々の細胞癌で、８１１アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−２に相当）の発現が低下しており悪性黒色腫への遺伝子導入により肺転移抑制が報告されている（非特許文献４８）。【０００８】
血管再狭窄に関しては、従来から広く使用されてきたベアメタルステント（ｂａｒｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｔｅｎｔ：  ＢＭＳ）では、留置後３〜８カ月の期間に１０〜４０％の確率でステント内再狭窄（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：  ＩＳＲ）が起こり、ＩＳＲの主たる機序は冠動脈の中膜平滑筋細胞のステント内への遊走・増殖に起因する新生内膜の増殖と考えられ（非特許文献４９）、この欠点を克服すべく、ステント表面に薬剤を塗布した薬剤溶出冠動脈ステント（Ｄｒｕｇ  Ｅｌｕｔｉｎｇ  Ｓｔｅｎｔ  ：ＤＥＳ）が１９９９年にＳｏｕｓａらによりシロリムス溶出性ステント（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−Ｅｌｕｔｉｎｇ  Ｓｔｅｎｔ：ＳＥＳ）として開発された。しかしながら、ＤＥＳにより引き起こされる遅発性ステント血栓症も報告されていることから、依然として再狭窄を安全に抑制する薬剤が望まれている。一方、バルーン傷害モデル動物を用いた再狭窄モデルにおいて、血管平滑筋でのペリオスチンの高発現が各種論文で報告されている（非特許文献１０〜１５）。【０００９】
炎症に関しては、抗炎症剤としてこれまで臨床で用いられてきた薬物として、急性及び慢性の炎症疾患に対してはステロイド及び非ステロイド系抗炎症剤、慢性の進行性炎症疾患（例えば、リウマチ、変形性関節炎等）に対しては免疫抑制剤及び金製剤が挙げられる。非ステロイド系抗炎症剤の作用機序は主に炎症メディエーターの抑制である。即ち、対症的な作用であり、急性疾患に対する効果は高いものの慢性の炎症疾患に対しての効果はあまり高くない。ステロイド系抗炎症剤は急性、慢性炎症疾患に対する作用は非常に強いが、同時に重篤な副作用を引き起こすことが報告されており、使用には充分な注意が必要である。金製剤は、急性炎症疾患に対する適用はなく、慢性リウマチに用いられており、免疫調節作用を持つことから、その作用は遅効性である。しかしながら、金製剤も粘膜皮膚症状、骨髄抑制、腎障害、呼吸器障害等の副作用が報告されており、ステロイド系抗炎症剤同様、使用には充分な注意が必要である。一部の免疫抑制剤も、慢性リウマチに対する臨床応用が注目されているが、免疫抑制剤特有の副作用が心配される。【００１０】
一方で、炎症性疾患でのペリオスチンの発現が亢進していることが報告されている（非特許文献１６〜１８、５０〜５１）。【００１１】
血管新生に関して、血管新生は癌以外にも糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、歯周病、強皮症、緑内障、加齢黄斑変性症、ＩＩ型糖尿病等の病態悪化と深く関わっており、その他、リウマチ様関節炎、カポジ肉腫、乾癬、バセドウ病においても、血管新生がこれらの疾患の発症あるいは病態悪化に重要な役割を担っているとされている（非特許文献５２）。また、脂肪組織の成長が血管新生に依存することが示されており、血管新生を抑制することによって肥満等の防止に効果があることが報告されている（非特許文献５３）。アルツハイマー病においても、血管新生によって脳内皮細胞が活性化され、β−アミロイドの前駆物質及び神経毒ペプチドを分泌して選択的に皮質ニューロンの細胞死を招くとされており、血管新生の抑制がアルツハイマー病の予防及び治療に有効であると報告されている（非特許文献５４）。この様な背景から、優れた血管新生抑制作用を有する物質が求められており、近年、血管新生抑制物質によるこれらの疾患の治療や予防が進められてきた。【００１２】
血管新生抑制剤としては、現在までに、アンギオスタチン（非特許文献５５及び５６）、エンドスタチン（非特許文献５７）、アスペルギルス・フミガトゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に由来するフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）及びその合成誘導体であるＴＮＰ−４７０（非特許文献５８）、サイトジェニン（非特許文献５９）、メタロプロテアーゼ阻害薬であるバチマスタット（ＢＢ−９４）及びマリマスタット（ＢＢ−２５１６）（非特許文献６０〜６１）等の合成化学物質、並びに血管新生因子（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ等）とそれらに対応するレセプターの結合を阻害するモノクローナル抗体（非特許文献６２）が知られている。しかしながら、これらの物質においては副作用を考慮する必要があり、人体に対する安全性が必ずしも保証されていないという欠点が存在している。【００１３】
一方で、癌発症における血管新生とペリオスチンの発現とが深く関っていることが報告されている（非特許文献６、非特許文献１９、非特許文献２１〜２２）。また、ペリオスチンが血管新生を誘導するには血管内皮細胞でのＶＥＧＦレセプター２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）の発現を引き起こして成されることが報告されている（非特許文献２０）。【００１４】
このように、ペリオスチン遺伝子の発現が血管再狭窄病態、癌、炎症、血管新生の病態にも関連することが示唆されており、またペリオスチンの細胞遊走阻害に関する抗体（非特許文献１２）及びペリオスチンによる細胞の増殖抑制活性を有する抗体（非特許文献１３）が報告されてはいるが、依然としてペリオスチンスプライシングバリアントの構造と血管再狭窄や癌、炎症、血管新生との関連については明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０１９４７１号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００７／０７７９３４号パンフレット
【特許文献４】再公表特許ＷＯ０２／０２００５５号公報
【非特許文献】
【００１６】
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【非特許文献６１】Marimastat: BB 2516, TA 2516.,Drugs in R&D,2003,4(3),p198-203.
【非特許文献６２】S.Iqbal and H.J.Lenz, HYPERLINK "http://www.ingentaconnect.com/content/klu/280" \o "Cancer Chemotherapy and Pharmacology" Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2004, 54 Suppl.1,pS32-39
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害剤を提供することである。また、本発明の目的は、生活の質の改善及び長期生命予後の改善が可能であり、かつ既存のメカニズムとは異なる新たな血管再狭窄や癌、炎症、血管新生、動脈硬化の予防剤又は治療剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、血管再狭窄や癌、炎症、血管新生の治療方法、診断方法及び診断薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、ペリオスチンスプライシングバリアントのＰＮ−２とＰＮ−４のタンパク質を発現・精製し、それらをコートしたプレート上での線維芽細胞の接着活性を調べた結果、線維芽細胞の接着能はスプライシングバリアントにより異なり、ペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−２）は陰性コントロールのアルブミン（ＢＳＡ）及びコーティングなしの群に対して有意に強い細胞接着性を示す一方、ペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−４）はコーティングなしの群よりも弱く、陰性コントロールのアルブミン（ＢＳＡ）と比べて非常に弱い細胞接着性しか持たないことを見いだした（図２）。この接着能の相違から、Ｅｘｏｎ−２１領域は細胞接着に関っていることが予測され、それを抗原とした抗ペリオスチン  Ｅｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体はＰＮ−２の細胞接着性を阻害するであろうと考えた。【００１９】
次に血管再狭窄や癌、炎症性大腸炎、血管新生病態時に発現が亢進するペリオスチンスプライシングバリアントを調べた結果、スプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインは、Ｅｘｏｎ（エクソン）１５から２３で構成されており、ラットでは、下記（１）から（４）が存在することが明らかとなった（図１参照）。
（１）全てを保持しているもの（ＰＮ−１と呼ぶ；配列番号１として示す８３８アミノ酸からなる；ｃＤＮＡ配列を配列番号２として示す）、
（２）Ｅｘｏｎ−１７が欠失しているもの（ＰＮ−２と呼ぶ；配列番号３として示す８１１アミノ酸からなる；ＰＮ−１から配列番号４で示される２７アミノ酸（Ｅｘｏｎ−１７）が欠失しているもの；ｃＤＮＡ配列を配列番号５として示す）、
（３）Ｅｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−３と呼ぶ；８１０アミノ酸からなる；ＰＮ−１から、Ｎ末端から７８５番目のアミノ酸から８１２番目のアミノ酸（配列番号６で示される２８アミノ酸（Ｅｘｏｎ−２１））が欠失しているもの）、
（４）Ｅｘｏｎ−１７とＥｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−４と呼ぶ；配列番号７として示す７８３アミノ酸からなる；ＰＮ−２から配列番号６で示される２８アミノ酸（Ｅｘｏｎ−２１）が欠失しているもの；ｃＤＮＡ配列を配列番号８として示す）。【００２０】
また、ラット以外でも、マウス及びヒトについてＰＮ−２及びＰＮ−４が見出されている（マウスＰＮ−２：配列番号９（アミノ酸配列）、配列番号１０（ｃＤＮＡ配列）；マウスＰＮ−４：配列番号１１（アミノ酸配列）、配列番号１２（ｃＤＮＡ配列）；ヒトＰＮ−２：配列番号１３（アミノ酸配列）、配列番号１４（ｃＤＮＡ配列）；ヒトＰＮ−４：配列番号１５（アミノ酸配列）、配列番号１６（ｃＤＮＡ配列））。【００２１】
そこで、本発明者らは、ＰＮ−２とＰＮ−４の構造上異なる部位であり、ＰＮ−２のみに存在するＥｘｏｎ−２１部位の阻害物質として、該部位がコードするアミノ酸配列部分を特異的に認識する抗体の作製を検討した。【００２２】
抗体を作製するためには、免疫原として用いる物質が親水性であることが必要であり、また、タンパク質のような大きなポリペプチドの一部分を用いて抗体を作製する際には、免疫原として使用する部分が、該タンパク質の表面に出ており、エピトープ部分を構成していることが必要である。そこで、Ｅｘｏｎ−２１ペプチド鎖を抗原として用いることの可能性を検討するために、最初に、バイオインフォマティクス分野で汎用されているａｃｃｅｌｒｙｓ社のソフト、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ７．２を使用してエピトープ検索を行なった。その結果、“親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）”は若干見受けられたが、“表面への露出のしやすさ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）”及び“抗原性（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）”から見て、Ｅｘｏｎ−２１領域の配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＥＶＳＫＶＴＫＦＩＥＧＧＤＧＨＬＦＥＤＥＡＩＫＲＬＬＱＧ）はタンパク質分子の表面に出ている可能性が非常に低いことが示唆され、抗原性を有しておらず抗体が作製できないと考えられ、実際に抗体を作製することは困難であることが予想された。【００２３】
しかしながら、本発明者らは、ＰＮ−２タンパク質の機能を特異的に阻害するためには、ＰＮ−２に存在するＥｘｏｎ−２１がコードするペプチド領域に対する抗体の使用が最適であるとの考えのもと、Ｅｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列に対する抗体の作製を目ざし、Ｅｘｏｎ−２１領域がコードするペプチドを構成する２８アミノ酸からなるペプチドを合成し、ウサギに免疫させ、得られた血清からＩｇＧ画分を精製し、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体を作製することができた。【００２４】
抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体にペリオスチンが持つ接着活性を阻害する活性が有るかを、サブコンフルエントに培養したラット血管平滑筋細胞にマウスＰＮ−２タンパク質をコートし、そこに単球由来のＴＨＰ−１細胞を播くと接着することを確認した上で、次に、ＰＮ−２タンパク質と抗体を混ぜてからＴＨＰ−１細胞を播くと接着が阻害されることを確認した。このことから、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体はペリオスチンが持つ接着活性を阻害する活性が有ることを確認した。抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体は、ＴＨＰ−１細胞の接着を抑制することによりマクロファージへの分化を抑制することから、結果的にマクロファージの臓器への浸潤を抑制する機能を有すると考えられる。様々な炎症疾患には少なからずマクロファージが関連することから、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の抗炎症作用が示された（図３）。【００２５】
次に、動物モデルを用いて血管内膜肥厚抑制効果を確認した。ＳＤラットの左頸動脈にバルーンカテーテルにて傷害を与え、同時に抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体を血管内投与した。一定期間をおいた後、血管を摘出して組織を固定しＨＥ染色を行ない、内膜と中膜の面積比を求め内膜肥厚の程度を調べた。その結果、中膜の面積は有意な差は無かったが、内膜／中膜比においては抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体投与群と擦過のみの群とで有意な差が得られ、内膜の肥厚が抑制されていることが示された（図４（Ａ））。【００２６】
次に、ＰＮ−２タンパクが炎症に関連しているとの報告がなされていることから、動脈硬化に対する抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）  （ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体）の効果を検討した。一般に、動脈硬化誘発モデルと考えられているＡｐｏＥノックアウト（ＫＯ）マウスに高脂肪食を３か月負荷するモデルで検討した。抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体(ｅｘ２１ＰｏＡｂ)はラビット・コントロールＩｇＧ抗体(ｒＩｇＧ)を投与したマウスと比して、胸部大動脈（上部）のＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色で評価した動脈硬化が著明に抑制されていた。これによって抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の動脈硬化抑制作用が示された（図５）。【００２７】
次に、代表的な炎症性疾患である炎症性大腸炎のクローン病モデルにおいて、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の抗炎症効果を検討した。Ｃ５７Ｂ６の雄８週齢に、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）又はマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）を投与し、１．７５％デキストラン硫酸（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ；ＤＤＳ）を飲水投与した。２週間後の大腸の長さは、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）投与群の方がマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）と比して有意に長く保たれていた（図６）。このことから、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）は、マウス大腸炎モデルにおいて抗炎症作用が示された。【００２８】
また、ＰＮ−２タンパクはこれまで血管新生との関連が報告されていることから、動物モデルを用いて抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の血管新生抑制作用を検討した。マウス下肢虚血モデルにおいてＰＮ−２遺伝子が発現されていることを確認した上で、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）を投与したところ著明な血管新生抑制効果を確認した（図７（Ｂ））。さらに組織を、ＣＤ３１抗体を用いて血管の免疫染色したところ抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）投与群で血管新生が有意に抑制されていた（図８）。また抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）でも下肢血流抑制作用が確認できた（図９）。抗Ｅｘｏｎ−２１抗体の血管新生抑制作用を確認したので、病的血管新生を抗Ｅｘｏｎ−２１抗体が抑制する可能性が示唆された。【００２９】
さらに、培養細胞を用いてマトリゲル・アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ａｓｓａｙ）を行ったところ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞の上清はヒト内皮細胞での血管新生を有意に増加させ、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の添加は血管新生を有意に抑制した（図１０（Ａ）、（Ｂ））。また、ＰＮ−２は濃度依存的に血管新生を誘導することが示された（図１１（Ａ）、（Ｂ））。これにより癌が誘導する血管新生を抗Ｅｘｏｎ−２１抗体が抑制することが示された。【００３０】
次に、培養マウス４Ｔ１乳癌細胞の増殖能への抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）の効果を見たところ、ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）投与と比して、ＭＴＳアッセイによる評価で有意な細胞増殖抑制作用を確認した（図１２（Ａ））。また、マウス４Ｔ１乳癌細胞の壊死への抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の効果を見たところ、マウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）投与と比して、上清のＬＤＨの評価で有意な壊死誘導作用を確認した。このことから抗Ｅｘｏｎ−２１抗体のマウス４Ｔ１乳癌細胞への直接的な増殖抑制・壊死誘導作用を確認した（図１２（Ｂ））。【００３１】
一方、マウス４Ｔ１乳癌細胞を足踵に注射し肺転移を起こすモデルマウスに抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）を週に一度投与し続けたところ、ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）投与と比してモデル作製後３〜５週間で原発巣の増殖のみならず原発巣から肺への転移コロニー数を有意に抑制した（図１３（Ａ）、（Ｂ））。また、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）を同様に投与したところ、マウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）投与と比して、肺転移を有意に抑制していた（図１４）。【００３２】
さらに、Ｂ１６Ｆ１０マウス悪性黒色腫細胞を足踵に注射し肺転移を起こすモデルマウスに、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）を週に一度投与し続けたところ、ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）投与と比して、モデル作製後３週間で原発巣の増殖のみならず原発巣から肺への転移コロニー数を有意に抑制した（図１５（Ａ）、（Ｂ））。ＰＮ−２に対する中和抗体（抗Ｅｘｏｎ−２１抗体）は、ＰＮ−２が有するマクロファージの接着促進作用、血管新生作用等を抑制することによって、乳癌細胞や悪性黒色腫細胞の増殖及び肺転移を抑制することが考えられ、新規治療薬としての可能性が示唆された。これにより、抗Ｅｘｏｎ−２１抗体が、癌病態の進行とともに起こる原発巣の増殖を抑制する活性、及び原発巣から肺への転移を抑制する活性を持つ抗体であることが明らかとなった。【００３３】
さらに、動脈硬化に対する抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の効果を検討した。動脈瘤モデルマウスに抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）を週に一度投与したところ、マウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）投与と比して、超音波装置で評価した大動脈径の拡大が著明に抑制されていた。これによって抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）の動脈瘤抑制作用が示され（図１６）、本発明を完成するに至った。【００３４】
本発明は、前記の課題を解決するものとして、癌をはじめとする様々な炎症関連性病態時に特異的に発現する細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体、特に該ペリオスチンスプライシング部位を抗原とする抗体を含有する、癌を含む様々な炎症関連疾患への治療用組成物を提供するものである。【００３５】
すなわち、本発明としては、以下を挙げることができる。
［１］配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。
［２］配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
［３］抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、前記［１］又は［２］記載の抗体。
［４］抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗体。
［５］抗体が、モノクローナル抗体である、前記［４］記載の抗体。
［６］ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６により産生される、前記［５］記載の抗体。
［７］前記［５］又は［６］記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
［８］前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体又は前記［７］記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
［９］前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
［１０］ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６。
［１１］配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する前記［４］に記載の抗体を製造する方法。
［１２］ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６である、前記［１１］記載の製造方法。
［１３］前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体、前記［７］記載の抗体断片又は前記［８］記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
［１４］前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体、前記［７］記載の抗体断片又は前記［８］記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
［１５］前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体、前記［７］記載の抗体断片又は前記［８］記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
［１６］前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体、前記［７］記載の抗体断片又は前記［８］記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。【００３６】
また、本願発明において「配列番号○で示されるアミノ酸配列」という場合、そのアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている場合も包含する。前記した「数個」とは、通常２〜８個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の抗体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害剤を用いることにより、血管内膜肥厚や癌、炎症性大腸炎を含む炎症、血管新生を伴う疾患等で発現が増大する特定のペリオスチンバリアントの作用を抑制し、病状の増悪化抑制を行うことにより、疾患の治療を行うことができる。また、患者サンプル中の該ペリオスチンバリアント量を測定することにより、疾患の有無及び病状の進行程度を知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、マウスのペリオスチンのスプライシングバリアントを示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１において、ラットＰＮ−２及びＰＮ−４タンパク質の細胞接着作用を測定した結果を示す図である。
【図３】図３（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例４においてマウスＰＮ−２タンパクがＴＨＰ−１細胞の接着を促進しマクロファージへの分化を誘導すること、また抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体がＴＨＰ−１細胞の接着を抑制し、マクロファージへの分化を抑制することを示す図である。
【図４】図４（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例７において、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体のラット頚動脈バルーン障害モデルでの新生内膜抑制結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例８において、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体のＡｐｏＥＫＯマウス動脈硬化モデルでの動脈硬化抑制結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例９において、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体のマウス大腸炎モデルでの炎症抑制結果を示す図である。
【図７】図７（Ａ）は、実施例１０において、抗体を投与した時期を表す。図７（Ｂ）は、実施例１０において、閉塞性動脈硬化症モデルで抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の血管新生抑制作用を示す図である。
【図８】図８は、実施例１０において、閉塞性動脈硬化症モデルで抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の血管新生抑制作用を示す図である。
【図９】図９は、実施例１０において、閉塞性動脈硬化症モデルで抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の血管新生抑制作用を示す図である。
【図１０】図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１１において、ヒト内皮細胞を用いたマトリゲル血管新生モデルで抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体及び、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の血管新生抑制効果を示す図である。図中、Ｓｈａｍは偽処置群を表す。
【図１１】図１１（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１１において、ヒト内皮細胞を用いたマトリゲル血管新生モデルで抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体及び、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の血管新生抑制効果を示す図である。図中、Ｓｈａｍは偽処置群を表す。
【図１２】図１２（Ａ）は、実施例１２において、マウス４Ｔ１乳癌細胞への抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の癌細胞増殖抑制効果を示す図である。図１２（Ｂ）は、実施例１１においてマウス４Ｔ１乳癌細胞への抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の壊死誘導効果を示す図である。
【図１３】図１３（Ａ）は、実施例１３（マウス４Ｔ１乳癌細胞接種後、３週間での下肢の原発巣の体積）において、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である。図１３（Ｂ）は、実施例１３（マウス４Ｔ１乳癌細胞接種後、５週間での転移コロニー数）において、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例１３（マウス４Ｔ１乳癌細胞接種後、５週間での転移コロニー数）において、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である。
【図１５】図１５（Ａ）は、実施例１４（マウス悪性黒色腫細胞接種後、３週間での原発巣の体積）において、マウス悪性黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である。図１５（Ｂ）は、実施例１４（マウス悪性黒色腫細胞接種後、５週間での転移コロニー数）において、マウス悪性黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例１５において、動脈瘤モデルで抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の大動脈径拡大抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の１つの態様において、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を提供する。ここで、ペリオスチンは、細胞外マトリックスの一種であり、いくつかのスプライシングバリアントの存在が知られている。そのいくつかは、癌病態時等に特異的に発現する。癌病態時等に特異的に発現するペリオスチンスプライシングバリアントの機能を阻害する物質、すなわち阻害用薬剤として、本発明においては、特異性が高い、ヒトへの安全性が高い等の理由から、抗体を使用できる。本発明では、癌病態時等に特異的なスプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインのＥｘｏｎ−２１領域がコードするアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成したものを抗原として、抗体を作製できるが、係るペプチドは、ペリオスチンタンパク質の酵素消化や遺伝子工学的手法等によっても得られ、その由来は問わない。
【００４０】
本発明において、「細胞接着活性を有する」とは、細胞を接着させる作用を有することである。細胞接着活性の有無は、まず検体試料を１０μｇ／ｍｌでシャーレに入れ、オーバーナイトでタンパク質を表面に吸着させる。後に心線維芽細胞等の培養細胞を添加する。３〜６時間後に洗浄して剥離した細胞を除去した後に、残存している細胞を染色し、接着していた細胞の残存状態を確認することにより、判断することができる。
【００４１】
また、本発明において、細胞接着活性を有するペリオスチンとしては、特に限定されないが、好ましくは、配列番号３（ラットペリオスチンＰＮ−２、８１１アミノ酸）のアミノ酸配列からなるペリオスチン、配列番号９（マウスペリオスチンＰＮ−２、８１１アミノ酸）のアミノ酸配列からなるペリオスチン、また、ヒトのアミノ酸配列はマウス・ラットのそれとほぼ同じなので接着活性を持つことが容易に推察される配列番号１３（ヒトペリオスチンＰＮ−２、８０９アミノ酸）のアミノ酸配列からなるペリオスチン、Ｅｘｏｎ−２１部位をコードするペプチドを構成するアミノ酸を有し、Ｅｘｏｎ−１７部位をコードするペプチドを構成するアミノ酸を有しないペリオスチンスプライシングバリアント等を挙げることができる。
【００４２】
また、細胞接着活性を有するペリオスチンとして、配列番号６（ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードする２８アミノ酸）、配列番号１７（マウスペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードする２８アミノ酸）又は配列番号１８（ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードする２８アミノ酸）で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンを挙げることもできる。
【００４３】
さらに、抗体に対するエピトープは、配列番号１９（ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から２番目から７番目、６アミノ酸）で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン、配列番号２０（ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から１７番目から２３番目、７アミノ酸）で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン、配列番号２１で示されるアミノ酸配列（ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から３番目から７番目、５アミノ酸）を有するペリオスチン、配列番号２２で示されるアミノ酸配列（ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から２７番目から２８番目、２アミノ酸）と連続する６アミノ酸からなる８アミノ酸配列を有するペリオスチンを挙げることができる。
【００４４】
ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域としては、例えば、Ｅｘｏｎ−２１部位を挙げることができる。具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号６で示されるアミノ酸配列部分（配列番号３の７５８〜７８５アミノ酸）、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号１７で示されるアミノ酸配列部分（配列番号９の７５８〜７８５アミノ酸）、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号１８で示されるアミノ酸配列部分（配列番号１３の７５６〜７８３アミノ酸）等が挙げられる。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、「細胞接着に関与する部位を特異的に認識できる」とは、好適には、上記のＥｘｏｎ−２１部位を含むペリオスチンの細胞接着に関与する領域を特異的に認識できることを意味する。例えば、ペリオスチンの細胞接着に関与する部位を特異的に認識できる抗体としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号６で示されるアミノ酸残基部分（配列番号３の７５８〜７８５アミノ酸）、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号１７で示されるアミノ酸残基部分（配列番号９の７５８〜７８５アミノ酸）、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号１８で示されるアミノ酸残基部分（配列番号１３の７５６〜７８３アミノ酸）、又はその一部に対する抗体を好適に挙げることができる。さらに、配列番号１９又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列或いはその一部を有するポリペプチドに対する抗体を挙げることができる。
【００４６】
「ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を阻害する」とは、上述の「ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域」が有する作用ないし活性を阻害することであり、具体的には、例えば、上述の細胞接着活性に関与する部位を特異的に認識できる抗体を用いて、ペリオスチンの有する作用ないし活性を阻害することである。
【００４７】
１つの態様において、本発明の抗体は、上記のような抗原を用いて得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」とは、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体であって、「モノクローナル抗体」には、前記の抗原を、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト化モノクローナル抗体（ヒト化抗体；ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含される。また、本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）又はＩｇＭである。
【００４８】
抗原に上記ペプチドを用いる場合には、それ自身抗原として用いることも可能であるが、抗原性を高めるために、上記ペプチドをポリビニルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメタクリレート等の巨大分子の物質に吸着させて免疫する方法、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）やＢＳＡ（牛血清アルブミン）等のキャリアータンパクに結合して用いる方法等があり、いずれの方法をも使用することができる。一般的にはペプチドをキャリアータンパクに結合して用いる方法が好ましく、結合方法は公知の方法を用いることができる（例えば、「続医薬品の開発、14巻、廣川書店、1991」）。
【００４９】
ペプチドはキャリアータンパクと結合させて方向性を持たせるために、ペプチドのＣ末端又はＮ末端にシステイン基を導入し、システイン基を介してキャリアータンパクと結合させる方法が用いられる。この目的に合った結合方法であれば当技術分野において一般に用いられている架橋剤を用いることができる。架橋剤としては、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下「ＳＭＣＣ」と略す）や３−マレイミドベンゾイックアシッド−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等が適している。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（G.Kohler et al Nature (1975)256,495-7)により作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離することにより調製される。すなわち、Ｅｘｏｎ−２１がコードするアミノ酸配列を有するペプチド等で哺乳動物を免疫した後、この動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを得る。Ｅｘｏｎ−２１に結合する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、例えばハイブリドーマ上清について抗原を固定したマイクロプレートを用いる酵素免疫測定法（以下「ＥＬＩＳＡ」と略す）によって行われる。
【００５０】
免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を使用することができる。モノクローナル抗体の作製には、上記の免疫動物のうち、取扱い易さ等の理由により一般にはＢａｌｂ／ｃマウスが用いられるが、他の系統のマウスを使用することもできる。その際、免疫に用いる抗原の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選択し、好ましくは１〜１００μｇの抗原を適当な濃度に生理食塩水等で希釈し、フロイント完全アジュバントあるいはフロイント不完全アジュバント等の懸濁液とし、動物に腹腔内注射又は皮下注射等によって投与する。投与は２〜４週毎に１〜数回行う。最終免疫は通常１〜１００μｇの抗原を添加した生理食塩溶液を静脈注射又は皮下注射等により投与して行われる。最終免疫の数日後に細胞融合のため免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ球、好ましくは脾臓細胞又はリンパ節細胞を取り出す。
【００５１】
次に、抗体産生細胞として脾臓細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の抗体産生細胞も同様に細胞融合に供し得る。細胞融合は、最終免疫３〜４日後に無菌的に取り出した脾臓から調製した脾臓細胞と適当なミエローマ細胞を融合促進剤の存在下で細胞融合させる。融合に用いるミエローマ細胞は、哺乳動物からのものでよいが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由来するものが好適であり、既に公知の種々の細胞株、例えば、マウスではＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）[Nature, 276, 269(1978)]、ＮＳ−１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）[Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7(1978)：ＡＴＣＣから入手可、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１５９７]、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｐ３）、ＦＯ、Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３、Ｓ１９４／５ＸＸＯ．ＢＵ１、ＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２等が好適に使用され、ラットではＹ３．Ａｇ１．２．３等が好適に使用される。好ましい融合促進剤として例えば、平均分子量が１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のほかセンダイウィルスも使用できる。融合時の脾臓細胞とミエローマ細胞の混合比率は、一般に１０：１〜２：１の範囲が好ましい。
【００５２】
融合した細胞よりハイブリドーマの分離は、未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合した細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞が生存できない選択培地で、未融合の細胞が死滅するまでの適当な時間（約１週間）培養することにより行える。選択培地は、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）が使用される。この選択培地中では、未融合のミエローマ細胞は死滅し、また未融合の脾臓細胞は、非腫瘍性細胞であるので、一定期間後（約１週間後）死滅するので、生育できる細胞を選択することによりハイブリドーマを得ることができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法によって、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行える。このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、生育に適した培地中で生育でき、また超低温冷凍庫や液体窒素中等で容易に長期に保存が可能である。
【００５３】
このようにして得られたハイブリドーマは、栄養培地中又は哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させることができる。産生した抗体は、培養上清又はその哺乳動物の腹水若しくは血清から精製することができる。
【００５４】
本発明のハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国際寄託されているハイブリドーマ（受託日：２０１３年２月２６日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６、識別の表示：ＫＳ−０２５９＃８，０８０６１１ Ｋｏｈｊｉｎ  Ｂｉｏ）を使用することができる。
【００５５】
抗体の精製は、遠心分離、透析、硫酸アンモニウム等による塩析、ＤＥＡＥカラム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の一般的な単離、精製方法を用いて行うことができる。
【００５６】
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は、以下のように行うことができる。まず、同定法としては、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いる場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【００５７】
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３、配列番号９若しくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−２）；配列番号６、配列番号１７若しくは配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン；又は配列番号１９若しくは２０で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン；配列番号６、配列番号１７若しくは配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；又は、配列番号１９若しくは２０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から２番目のバリン（Ｖ）から７番目のリシン（Ｋ）までのアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１９）、及びヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から１７番目のフェニルアラニン（Ｆ）から２３番目のリシン（Ｋ）までのアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２０）を特異的に認識して結合することができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から２番目のバリンから７番目のリシンまでのアミノ酸配列部位（ＶＴＫＶＴＫ；配列番号１９）、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から１７番目のフェニルアラニン（Ｆ）から２３番目のリシン（Ｋ）までのアミノ酸配列部位（ＦＥＤＥＥＩＫ；配列番号２０）又はそれらの一部を特異的に認識することができる。
【００５８】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチン−１タンパク質の細胞接着作用を抑制又は阻害する、すなわちヒトペリオスチン−１タンパク質の細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、癌病態時等に引き起こされる湿潤、炎症及び血管新生を抑制し、炎症関連疾患の予防又は治療することができる。
【００５９】
本発明の抗体としてポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体は通常行われている方法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座12、東京化学同人、1992」記載の方法によって得ることができる。
【００６０】
免疫動物としては、特に限定されるものではないが、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリ等が挙げられる。免疫動物としてウサギを用いる場合には、抗原を適当な濃度に生理食塩水等で希釈し、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウムアジュバント等の懸濁液とし、１０〜１０００μｇ／回／匹を注射し、さらに２〜４週間後に追加免疫注射を１〜３回行い、抗血清を得る。注射は多数箇所の皮下に行うのが好ましい。抗血清からポリクローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精製と同様の方法で行うことができる。
【００６１】
このようにして得られた本発明のポリクローナル抗体は、配列番号３、配列番号９若しくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−２）；配列番号６、配列番号１７若しくは配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン；配列番号１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するペリオスチン；配列番号６、配列番号１７若しくは配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；又は、配列番号１９若しくは２０で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から７番目のリシン（Ｋ）から１１番目のグリシン（Ｇ）までのアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１９）、及びヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から２３番目のリシン（Ｋ）から２６番目のロイシン（Ｌ）までのアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２０）を特異的に認識して結合することができる。すなわち、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端から３番目から７番目までのアミノ酸配列部位（ＴＫＶＴＫ；配列番号２１）、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）におけるＮ末端から２７番目から２８番目までのアミノ酸配列に連続する６アミノ酸から構成される配列部位（ＱＧＤＴＰＶＲＫ；配列番号２２）或いはそれらの一部を特異的に認識することができる。
【００６２】
本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチン−１タンパク質の細胞接着作用を抑制又は阻害する、すなわちヒトペリオスチン−１タンパク質の細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、本発明のポリクローナル抗体は、癌病態時等に引き起こされる湿潤、炎症及び血管新生を抑制し、炎症関連疾患の予防又は治療することができる。
【００６３】
本発明は、細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ペリオスチン抗体を含む、血管内膜肥厚抑制用又は癌治療用、血管新生抑制用組成物である。
【００６４】
ヒト型抗体の作製
免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という）、分子量約５００００の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という）の各２本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ連続した４個、及び２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ：以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスＩｇＧの定常領域はヒトＩｇＧの定常領域とは異なっているので、マウスＩｇＧはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下「ＨＡＭＡ」という。）応答が起こる（SchroffRW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままＨＡＭＡ応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。
【００６５】
Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＣＤＲ」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類した表を作成した（Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A.）。
【００６６】
また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。このようなＩｇＧの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U S A. (1984)81,6851-5）。しかしながら、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはＨＡＭＡ応答を誘導しうる（Begent et al., Br. J. Cancer, (1990)62, 487）。
【００６７】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、ＣＤＲ部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはＣＤＲのみの移植では不十分であった。一方、チョッチアらは、１９８７年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、（ａ）ＣＤＲのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、（ｂ）カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17）。この知見に基づき、ＣＤＲ移植法を用いる場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平４−５０２４０８号）。
【００６８】
一般に、移植すべきＣＤＲを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義され、ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りＣＤＲの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するためには、（ａ）アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、（ｂ）ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。
【００６９】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平４−５０２４０８号）：
（ａ）アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通であること
（ｂ）該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くであること
（ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å（オングストローム）以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると予想されること。
【００７０】
本発明の抗Ｅｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡは、上記抗Ｅｘｏｎ−２１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換してから、該抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ単離することにより得ることができる。
【００７１】
ヒト抗体の作製
本発明における「ヒト抗体」又は「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域（ＶＨ）及びＨ鎖の定常領域（ＣＨ）並びにＬ鎖の可変領域（ＶＬ）及びＬ鎖の定常領域（ＣＬ）を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Mendez MJ et al.Nature Genetics(1997)15,146-56,Green LL et al.Nature Genetics(1994)7,13-21，表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年;Nils Lonberg et al.Nature(1994)368,856-9,及び特表平６−５００２３３号公報）に記載の方法に従って作製することができる。
【００７２】
本発明で使用される抗体は、抗体の分子全体に限らず、細胞接着活性を有するペリオスチンの該活性を中和するものであれば、抗体の断片又は抗体の誘導体であってもよい。
【００７３】
抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含有するペプチド等を挙げることができる。
【００７４】
本発明の抗体断片のうちＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等は、ペリオスチンの細胞接着活性を阻害する抗体をパパイン、ペプシン等のタンパク質分解酵素で処理して得ることができ、また、得られた抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
【００７５】
本発明の抗体断片のうちｓｃＦｖは、ペリオスチンの細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を、適当なペプチドリンカー等を用いて連結し、作製することができる。また、上記抗体のＨ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子、及びＬ鎖又はＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
【００７６】
本発明の抗体断片のうちｄｓＦｖは、ペリオスチンの細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間でジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片であり、システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測により選択することができる。該抗体断片をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
【００７７】
本発明の抗体断片のうちＣＤＲを含有するペプチドは、ペリオスチンの細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＣＤＲ領域のうち、少なくとも１つのＣＤＲ領域以上を含んで構成される。また複数のＣＤＲ領域を適当なペプチドリンカーを介する等の方法により結合させてもよい。該ＣＤＲを含有するペプチドは、これをコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。また、Ｆｍｏｃ法又はｔＢｏｃ法等の化学合成によっても作製できる。
【００７８】
また、本発明では、上述の抗体又は抗体断片に、タンパク質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することができ、これら修飾は、公知の方法で行うことができる。
【００７９】
本発明の抗体、抗体断片及び該抗体又は該抗体断片がタンパク質と結合している誘導体をコードするＤＮＡは、常法により決定することができる。また、常法により、該ＤＮＡを含有する組換えベクターを作製し、該組換えベクターを常法により宿主細胞に導入することにより形質転換体を作製することができる。さらに、常法により、該形質転換体を培養し、培養物中に抗体、抗体断片、及び抗体又は抗体断片とタンパク質が結合している誘導体を生成させ、該培養物から抗体、抗体断片、及び抗体又は抗体断片とタンパク質が結合している誘導体を採取することにより、抗体、抗体断片、及び抗体又は抗体断片とタンパク質が結合している誘導体を製造することができる。
【００８０】
また、本発明の１つの態様において、本発明の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体は、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患を予防又は治療するために使用することができる。
【００８１】
細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患とは、疾患の病態時に細胞接着活性を有するペリオスチンの遺伝子の発現が高く、該遺伝子によりコードされるタンパク質の産生が増加している疾患である。また、該遺伝子又はタンパク質の増加により、病態が悪化する疾患のことである。
【００８２】
このような細胞接着活性を有する炎症関連疾患としては、特に限定されるものではないが、血管内膜肥厚を主因とする疾患、癌及びその他の炎症関連疾患が挙げられる。血管内膜肥厚を主因とする疾患としては、動脈硬化、冠動脈形成術後に認められる血管内膜肥厚を主因とした再狭窄等が挙げられる。また、本発明の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を適用できる癌としては、これに限定されるものではないが、例えば、脳腫瘍、白血病、骨肉腫、乳癌、大腸癌、悪性黒色腫、骨癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、膵癌、胆のう癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、悪性リンパ腫等を挙げることができ、特に好適には、乳癌、大腸癌、肺癌、及び悪性黒色腫を挙げることができる。その他の炎症関連疾患としては、自己免疫性関節炎、アトピー性皮膚炎、喘息、肺気腫、ベーチェット病、多発性硬化症、脊髄小脳変性症、ブドウ膜炎、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多発性筋炎、強皮症、自己免疫性肝炎、サルコイドーシス、慢性膵炎、炎症性腸炎、クローン病、固形癌、多発性骨髄腫、血管線維腫、粥状動脈硬化、動静脈奇形、肉芽、血管腫、肥大性瘢痕、ケロイド、早老、乾癬、発熱性肉芽腫、疣、出血性関節、非結合骨折、リウマチ様関節炎（例えば、悪性関節リウマチ等）、変形性関節症、卵胞嚢胞、卵巣肥大症候群、多嚢胞卵巣、加齢性黄班変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、トラコーマ、肺気腫、慢性気管支炎、肥満症、歯周病、角膜移植片の血管新生、動脈瘤等が挙げられる。上記例示した炎症関連疾患の多くに血管新生が関与する。
【００８３】
本発明の他の態様としては、上記の抗体をマーカー標識することにより作製した、前記細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の診断薬が挙げられる。ここでマーカーとしては、特に限定されず、酵素、放射性同位元素、蛍光色素等を用いることができる。ここで用いる酵素としては、ターンオーバー数（ｔｕｒｎ  ｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒ）が大きく、かつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなく、通常の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。
【００８４】
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の公知の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。マーカーとして用いる放射性同位元素としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、本診断薬は、癌細胞と周辺の線維芽細胞を特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、癌病態時等の病変部を画像化するために使用することもできる。
【００８５】
本発明の１つの態様は、本発明の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を用いることによる、ヒト又は動物の血液から血清を調製した生体試料のサンプル中、すなわち血清中における細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法であり、さらに検出又は定量することによる心不全等の細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の診断方法を提供する。本方法において、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）によって細胞接着活性を有するペリオスチンを検出することができる。本発明の診断キットを用いる場合には、まず抗ペリオスチン一次抗体を固相化したプレートに試料を接触させて両者を結合させ、この結合体にマーカー標識した抗ペリオスチン二次抗体を結合させ、この三者の結合体におけるマーカーのシグナル強度を測定することにより、細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量することができる。特に細胞接着活性を有するペリオスチンは、癌等の病態時に特異的に発現するスプライシングバリアントであるため、ペリオスチンの産生をモニターすることにより癌等における病態の診断をすることができる。
【００８６】
このように、本発明の抗体を標識化して、二次抗体として使用することが可能である。
【００８７】
また、本発明の１つの態様としては、本発明の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物が挙げられる。前記抗体、抗体断片及び／又は誘導体が、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害活性を有することにより、前記医薬組成物は、血管新生を抑制し、血管内膜肥厚を抑制し、癌を治療し、又、動脈瘤を予防若しくは治療することができる。すなわち、本発明は、細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ペリオスチン抗体を含む、血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用、動脈瘤を予防若しくは治療用組成物である。本発明の組成物は、冠動脈形成術後に認められる血管内膜肥厚を主因とした再狭窄の治療及び予防、癌の予防又は治療、血管新生を伴う疾患の治療又は予防、動脈瘤を予防又は治療するために使用することができる。
【００８８】
さらに、本発明の１つの態様として、本発明の抗体、抗体断片及び／又は誘導体を有効成分として含有する、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物が挙げられる。例えば、本発明の１つの態様として、前記抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する血管内膜肥厚抑制用医薬組成物、前記抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する癌治療用医薬組成物、前記抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する血管新生抑制用医薬組成物、前記抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する動脈瘤の予防又は治療用医薬組成物等が挙げられる。
【００８９】
本発明の癌治療用組成物は、癌の病原巣の増殖を抑制する効果、及び癌の転移を抑制する効果を有する。従って、癌の病原巣の増殖を抑制する効果を期待して、又は癌の転移を抑制する効果を期待して、さらにはその両者を期待して使用することができる。
【００９０】
本発明の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、通常の製剤化の際に用いられ、薬理学的に許容し得る公知の担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
【００９１】
本発明に係る医薬組成物の有効成分は、薬理学的に許容し得る公知の担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法（例えば、経口投与方法、又は、静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法）によって投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を、薬理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができる。本発明の医薬組成物の剤形としては、特に限定されず、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等が挙げられる。錠剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン等の結合剤、コーンスターチ等の潤沢剤等を用いることができる。また、医薬組成物を、糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の医薬の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としては、ブドウ糖等を含む等張液等が挙げられ、ポリエチレングリコール等の適当な溶解補助剤等と併用してもよい。また、医薬組成物を、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤等と配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受けやすい場合、消化管内で分解を受けにくい製剤（例えば、活性成分をリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤）として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下、肺等の消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は、座剤、点鼻剤、舌下剤、経肺剤といった形態で投与することができる。
【００９２】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度及び投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１〜数回（２、３回等）に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては、０．０１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜１．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎの範囲で投与することができ、０．０２５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜０．１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで投与するのが望ましい。
【００９３】
本発明の１つの態様として、「ペリオスチン抗体を用いることを特徴とする、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害方法」、「治療的有効量の細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ペリオスチン抗体を癌患者に投与することを含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療方法」が挙げられる。本発明の１つの態様として、「細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物製造のためのペリオスチン抗体の使用」、「細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物製造のためのペリオスチン抗体の使用」が挙げられる。前記抗ペリオスチン抗体としては、上述の抗体、抗体断片及び／又は抗体の誘導体が挙げられる。炎症関連疾患としては、上述の炎症関連疾患が挙げられる。
【実施例】
【００９４】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形が可能である。【００９５】
［製造例１］サブトラクション法によるペリオスチンの検索
１−１  心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）及び心不全期（１４週齢）に各３匹の左心室を採取した。【００９６】
１−２  ｍＲＮＡの調製
総ＲＮＡは上記左心室約５００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に、心肥大期、心不全期それぞれ３匹分を合わせた総ＲＮＡ約４００μｇよりＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがってｍＲＮＡを精製し、それぞれ約３μｇのｍＲＮＡを回収した。【００９７】
１−３  ｃＤＮＡサブトラクション
ｃＤＮＡサブトラクションは、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記１−２で得られたｍＲＮＡそれぞれ２μｇよりｃＤＮＡを合成し、制限酵素Ｒｓａｌで消化した。次に、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１１週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとし、テスターｃＤＮＡにｋｉｔ添付の２種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現量に違いのあるｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させ、増幅産物１を得た。【００９８】
また、同様のサブトラクションを１１週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとして行い、得られた増幅産物を増幅産物２とした。【００９９】
１−４  ドットブロットスクリーニング
Ａ．ドットブロットの作製
増幅産物１をＰＣＲ  ＩＩベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したＰＣＲ反応後、それぞれ１μＬを熱処理後、２枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）により固定した。【０１００】
Ｂ．ｃＤＮＡプローブの作製
増幅産物１を制限酵素Ｒｓａｌ及びＥａｅｌ、Ｓｍａｌで消化し、アダプターを除去し、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩＩ（ベーリンガー社）を用いて説明書に記載の方法に従ってＤＩＧ−ｄＵＴＰでランダムプライム標識を行い、ｃＤＮＡプローブ１を作製した。同様にして、増幅産物２を用いてｃＤＮＡプローブ２を作製した。【０１０１】
Ｃ．スクリーニング
上記Ａで作製したドットブロットメンブランの１枚をｃＤＮＡプローブ１、他の１枚をｃＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションを行った。具体的には、ベーリンガー社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットIIを用いて、説明書に記載の方法にしたがい、ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージーハイブ（ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ）液）中４２℃で一晩ハイブリダイセーションを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて５分間２回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃にて１５分間２回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体と反応後、化学発光基質（ＣＳＰＤ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）を加えて化学発光を進行させ、Ｘ線フィルムを露光させた。ｃＤＮＡプローブ１でのシグナルがｃＤＮＡプローブ２でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。【０１０２】
１−５  塩基配列の決定
塩基配列は、ダイターミネーターシークエンシングキット（商品名：ＴＨＥＲＭＯ  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ  ＩＩ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ、アマシャムファルマシア社）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎＫのデータバンクに照会した結果、クローンの１つ（ＳＦ０１４）がマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）と８６％ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。【０１０３】
［製造例２］ラットペリオスチン−１のｃＤＮＡのクローニング
ラットペリオスチンｃＤＮＡの単離はλｇｔ  ＩＩベクターに挿入されたｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（クローンテック社）より作製した約４０００クローンのファージサブプール１０個（計約４万クローン）をＳＦ０１４の塩基配列を基に設計したプライマー（１）５’−ＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号２３）、（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号２４）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、３個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ  ＤｉｒｅｃｔＴＭ（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、１個のポジティブクローンラットペリオスチン＃１を得た。その挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、製造例１の１−５の方法に従って全塩基配列を決定した。【０１０４】
得られたクローンの長さは約３ｋｂであり、マウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２９２番から３’−末端までに相当するものであり、５’−末端が欠けたクローンであることが示唆された。【０１０５】
ここで、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（商品名：ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号２４）とラットペリオスチン＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２５）を用いて５’−ＲＡＣＥ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ  ＩＩベクターにＴＡクローニングし、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１と命名した。塩基配列を製造例１の１−５の方法にしたがって決定した。【０１０６】
その結果、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１は最初に得られたラットペリオスチン＃１より５’方向に約３００ｂｐ長いクローンであり、５’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の５’−末端より１５ｂｐ長いクローンであった。さらにラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（４）５’−ＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２６）と上記プライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２５）を用いて上記ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙより作製した約４万クローンのファージサブプール１０個（計約４０万クローン）をＰＣＲスクリーニングすることにより２個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅される断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い１個のポジティブクローンを得、ラットペリオスチン＃２と命名した。挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、塩基配列を製造例１の１−５の方法にしたがって決定した。【０１０７】
得られたクローンの長さは約２．６ｋｂであり、５’−末端は５’−ＲＡＣＥで得られたクローンと同一であったが、３’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２４１０番までに相当するクローンであった。また、先に得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ＃１の塩基配列とラットペリオスチン＃２の相当する領域の塩基配列は全く同一であった。ラットペリオスチン＃１とラットペリオスチン＃２よりラットペリオスチンｃＤＮＡの完全長を完成させた。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示し、この塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。【０１０８】
［製造例３］ラットペリオスチン−２及び４のｃＤＮＡのクローニング
製造例１で使用したダールラットの心肥大期のｃＤＮＡと、製造例２でクローニングした遺伝子配列を元にプライマー５‘−ＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＴ−３’（配列番号２７）、プライマー５‘−ＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクターにＴＡクローニングした。得られたコロニーを９６穴プレートに１コロニー／穴ずつ９６コロニーを選び、プライマー５’−ＣＣＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＴＡＧＡＣＣＴ−３’（配列番号２９）、プライマー５’−ＡＴＴＴＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＧ−３’（配列番号３０）を用いてラットペリオスチン−２及び４遺伝子の候補を選別した後に、遺伝子配列を決定しＰＣＲエラーの無いクローンを選別した。【０１０９】
［製造例４］バキュロウイルス用発現ベクターの構築
製造例３で得られたプラスミドｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ／ラットペリオスチン−２、−４を、制限酵素Ｓｐｅ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、ラットペリオスチン−２、−４断片を切り出した。これを、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ｐｅ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化して得られたベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られた発現ベクターをｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−２、−４と命名した。挿入部分の塩基配列は製造例１の１−５に記載の方法により確認した。【０１１０】
［製造例５］組換えバキュロウイルスの調製及び培養
エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＤＨ１０ＢＡＣ細胞を、製造例４で得られたｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−２、−４で形質転換し、組換えバキュロウイルスを調製した。得られたバキュロウイルスは、電気泳動及びＰＣＲにより、目的のものが挿入されていることを確認した。【０１１１】
この組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝０．１にて感染させた昆虫Ｓｆ９細胞（２×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、無血清培地（Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（インビトロジェン社製）２０００ｍＬ中にゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加）中、２８℃で４〜５日培養した後、培養上清を回収した。【０１１２】
［製造例６］ラットペリオスチンタンパク質の精製
製造例５で得られた培養上清２０００ｍＬを平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー  ｐＨ６．０  ０．１Ｍ塩化ナトリウム）で平衡化したＳＰｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  １０ｍＬ  ｂｅｄに供し、得られたＦｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ（通過分画）をＳＰセファロース通過分画とした。【０１１３】
平衡化バッファーで２８０ｎｍの吸光度が０付近になるまで（約１００ｍＬ）洗浄し、ＳＰセファロース洗浄分画とした。【０１１４】
溶出バッファー（５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）１００ｍＬで溶出し、ＳＰセファロース溶出分画とした。
次に、１００ｍＬのＳＰセファロース溶出分画を、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び５ｍＭイミダゾールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ  ５ｍＬ  ｂｅｄに供し、得られた通過分画をＮｉ−ＮＴＡアガロース通過分画とした。【０１１５】
洗浄バッファー（５０ｍＬ  リン酸２水素ナトリウム  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）約５０ｍＬで洗浄し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース洗浄分画とした。【０１１６】
溶出バッファーは以下の通り（（１）５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、以降イミダゾール量が（２）３０ｍＭ、（３）４０ｍＭ、（４）５０ｍＭ、（５）６０ｍＭ）とし、それぞれ約２５ｍＬで溶出し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶出分画（１）〜（５）とした。【０１１７】
ウエスタンブロット法により目的タンパクが含まれることが確認された分画を、１ｍＬ以下に濃縮した。【０１１８】
次に、脱気したＰＢＳ（−）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、  ２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ  Φ１１ｍｍ×９５ｃｍ；容量：９０ｂｅｄ）に上記濃縮試料を供し、ＰＢＳ（−）で溶出し、凍結乾燥することにより、ラットペリオスチン精製タンパク質を得た。【０１１９】
［実施例１］ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットＰＮ−２及びＰＮ−４タンパク質の細胞接着活性の有無の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートに１０μｇ／ｍｌ  フィブロネクチン、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ  ＰＮ−２タンパク質、１０μｇ／ｍｌ  ＰＮ−４タンパク質をそれぞれ添加し４℃にて一晩コーティングした。タンパク質液を除去したウェルに、ＤＭＥＭ（１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ）に懸濁したラット胎仔心臓由来線維芽細胞１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルを加え、３７℃インキュベーターにて３時間培養した。細胞の接着量測定は、培養上清を除去した後、２．５％グルタルアルデヒドにて３０分間固定し、０．０２％クリスタルバイオレットにて染色した後プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ マイクロプレートリーダー）にてＯＤ  ５５０ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンドとして、無処理のウェルを染色したものを用い、その吸光度値にて補正した値を比較した。データの解析はＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ検定により行った（図２）。その結果、陽性コントロールであるフィブロネクチン（図中、ＦＮで表示）では細胞が接着し、陰性コントロールであるＢＳＡでは細胞が接着しなかった。また、各タンパク質をコートしなかったウェルでも細胞接着が観察されたが、陽性コントロールであるフィブロネクチンほどの接着量は観察されなかった。一方、ラットＰＮ−２タンパク質を添加した群では細胞の接着がフィブロネクチンと同程度以上に認められたのに対し、ラットＰＮ−４タンパク質を添加した群では、コートしなかったウェルと同程度の接着活性しかないことが明らかとなった。【０１２０】
［実施例２］ラットＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖の合成及びポリクローナル抗体の作製
実施例１に示したように、ラットＰＮ−２タンパク質に比べラットＰＮ−４タンパク質には細胞接着作用が弱いことが明らかとなったことを受け、ラットＰＮ−２タンパク質に特異的な構造は、それぞれの配列比較からＥｘｏｎ−２１配列であると同定した。このＥｘｏｎ−２１を構成するアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチドを、純度８０％以上にて１０ｍｇ、化学合成した。キャリアータンパク質としてＫＬＨ６ｍｇを結合させたものをウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ）に免疫させた。免疫（投与）には、初回免疫にはＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）を使用し、２次免疫以降はＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）を使用した。また、投与部位は背部皮下２０ヶ所、投与した週は、初回投与後、２、４、６週後、投与量は初回免疫では８００μｇペプチド／匹、２次免疫以降では４００μｇペプチド／匹にて免疫した。抗体力価はＥＬＩＳＡ法にて測定し、投与開始から７週目に全血清を集めた。その後、合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムを作製し、Ｅｘｏｎ−２１ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。上記の、ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−２１がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体と称する。【０１２１】
［実施例３］ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性の確認
実施例２で得られたポリクローナル抗体２種（Ｎｏ．１及びＮｏ．３）について、ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例６で得られた精製タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたモノクローナル抗体２種はラットペリオスチンＰＮ−２とも結合することが確認された。【０１２２】
［実施例４］ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の中和活性の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートにＤＢ１Ｘラット由来血管平滑筋細胞Ａ７ｒ５細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．０９−１４４４、大日本住友製薬）を０．５〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル播き、サブコンフルエントまで培養し、その後Ｓｅｒｕｍ（−）にした培地に交換した。次に、ＴＨＰ−１細胞（Ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．０６−２０２、大日本住友製薬）を蛍光標識するために、ＴＨＰ−１細胞を２ｎＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ（（株）同仁科学研究所ＢＣＥＣＦ−ＡＭ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ    ｃａｔ．Ｎｏ．Ｂ２２１）を添加し、３０分間インキュベート後、遠心してＰＢＳ（−）で２回洗浄した。次に、蛍光標識したＴＨＰ−１細胞の接着量を測定するために１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルと予め抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）  または、ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）とＰＮ−２タンパク質を混合し、室温で１時間反応させた溶液を加えた。コントロールとして、（１）ファイブロネクチンのみ、（２）ＰＮ−２のみ、（３）ＰＮ−２＋ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）、（５）ＴＨＰ−１のみを用い、各々６時間インキュベートした。その後、各ウェルにＲＰＭＩ１６４０培地をゆっくりと添加して完全に満たした後、空気が入らないようにパラフィルムで覆い、裏返して更に３０分間インキュベートした。その後、ゆっくりと取り外し、培地を吸引した後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｍｘ／ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））で細胞接着量を励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍにて蛍光強度測定にて計測した。その結果、図３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、（１）ファイブロネクチンのみ、（２）ＰＮ−２のみ、（３）ＰＮ−２＋ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）の群では細胞の接着が認められたのに対し、（４）抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）を処理した群では、（５）ＴＨＰ−１のみのように、接着が認められなかったことから、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体にはＰＮ−２が持つ細胞接着作用を抑制する、即ち中和活性を有していることが判明した。【０１２３】
［実施例５］ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−２１ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１を構成するアミノ酸配列（配列番号１８）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（抗原ペプチド；ＣＥＶＴＫＶＴＫＦＩＥ  ＧＧＤＧＨＬＦＥＤＥ  ＥＩＫＲＬＬＱＧ（配列番号３１））を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成し、純度９０％以上の抗原ペプチド１０ｍｇを得た。この抗原ペプチド５ｍｇにキャリアータンパク質としてＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５ｍｇを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳ（０．０１Ｍ）に溶解して３．３ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２５２４ｍｇ／ｍＬのＭＢＳ溶液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を滴下して室温で６０分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーのＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢを得た。このＫＬＨ−ＭＢ５ｍｇと、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した抗原ペプチド５ｍｇとを混合し、４℃で１２時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。【０１２４】
（２）免疫
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス３匹の両足に、（１）で得られたＫＬＨ結合抗原ペプチド１００μｇを含む抗原溶液５０μｌと、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）５０μｌとの混合乳濁液全量を皮下注射した。その後２週間間隔で２回、用時調製した上記抗原溶液とＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。【０１２５】
ＲＰＭＩ培地（コージンバイオ株式会社製）を供給しながら上記リンパ節を破砕し、孔径約１０μｍのメッシュを通過させてＲＰＭＩ培地に懸濁状態のリンパ節細胞を得た。これを１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけて、リンパ節細胞を沈殿画分として得た。この沈殿画分に、０．８４％の塩化アンモニウム溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた溶液１ｍｌを入れて溶血させ、赤血球を除いた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。得られた沈殿画分（細胞画分）をＲＰＭＩ培地で数回洗浄し、細胞融合に用いた。【０１２６】
（３）ミエローマ細胞の調製
８−アザグアニン耐性でかつイムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１株）を、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地で、１０％ＣＯ２・３７℃インキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。【０１２７】
（４）細胞の融合
（２）で得た免疫化リンパ節細胞１×１０８〜３×１０８個を含むＲＰＭＩ培地と、（３）で得たミエローマ細胞１０８個を含むＲＰＭＩ培地とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ  １５００、ベーリンガー社製）  １ｍｌを加えた後、更にＲＰＭＩ培地をゆっくりと加えて総量を１０ｍｌとした。これに２０％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地１０ｍｌを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％  ＦＣＳを含む  ＲＰＭＩ培地を加えて細胞濃度が１０６個／ｍｌになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、更に２週間培養した。【０１２８】
（５）ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルのスクリーニングを行った。アッセイ用の抗原溶液には、（１）で得られた抗原ペプチド２ｍｇに、キャリアータンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を結合させたコンジュゲートを用いた。
９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３５３９１２）の各ウェルを、上記コンジュゲート１μｇ／ｍｌで４℃下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、（４）の培養上清（モノクローナル抗体を含む）５０μｌを各ウェルに滴下し、３７℃のインキュベーター内で２時間放置した後、ＰＢＳ（−）（リン酸緩衝液）で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、３７℃インキュベーターで１時間放置し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、発色基質剤（ＡＬＰ）を加えて２０分間発色させ、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、  Ｍｏｄｅｌ  ６８０  ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ）で各ウェルのＯＤ４９０ｎｍの吸光度（抗体価）を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルを決定した。【０１２９】
（６）抗体産生細胞のクローニング
（５）のＥＬＩＳＡ法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性ウェル内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローニングを行った。すなわち、陽性ウェル内の細胞を９６穴培養プレートの各ウェルに撒き込み、５％ＣＯ２・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。各ウェルの培養上清について、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性ウェルについて、再度、限界希釈法によるクローニングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高く、細胞コロニーの発育が良好な３０個の細胞を得た。これら細胞を２４穴培養プレートに移し、５％ＣＯ２・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。培養上清について、再び、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性（抗体価）を確認した。ＯＤ４９０ｎｍの吸光度が高かった２ウェル内の細胞、すなわち２個のハイブリドーマ細胞株（Ｎｏ．８及びＮｏ．１０）を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。【０１３０】
このようにして得た抗体産生細胞は、本発明抗体である抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができる。【０１３１】
なお、上記の抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）Ｎｏ．８は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国際寄託されている（受託日：２０１３年２月２６日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６、識別の表示：ＫＳ−０２５９＃８，０８０６１１ Ｋｏｈｊｉｎ  Ｂｉｏ）。【０１３２】
（７）ペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性の確認
（６）で得られた抗体産生細胞２個が産生する抗体と、ヒトとマウスのアミノ酸配列はほぼ同じであることから、マウスペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、マウスＰＮ−２タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ／  ＯＳＦ−２，  Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）（１００μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに（６）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、（６）でクローニングした抗体産生細胞２個全てが、ヒトペリオスチンＰＮ−２と結合することが確認された。【０１３３】
（８）モノクローナル抗体の大量調製と精製
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（和光純薬製）］０．５ｍｌを投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ  Ｎｏ．８及びＮｏ．１０を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞にＦＣＳ不含のＲＰＭＩ培地を加え、細胞数が１×１０７個／ｍｌになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に注入し、３週間後頃から漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径０．２２μｍφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ−セファロースカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１１５１１３２４）によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体２種を調製した。【０１３４】
［実施例６］抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体のエピトープ解析
Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ（ガラススライド上に３７種類のペプチドが固定化されたアレイ）を作製し、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチドに対するモノクローナル抗体（２種）及びポリクローナル抗体（２種）のエピトープを同定した。
一次抗体として、ポリクローナル抗体はラビット  ＩｇＧ  Ｎｏ．１（０．５１ｍｇ／ｍｌ），  Ｎｏ．３（０．６２ｍｇ／ｍｌ）を用い、モノクローナル抗体としてＮｏ．８  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ  （２．２１  ｍｇ／ｍｌ），  Ｎｏ．１０  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（１．３５  ｍｇ／ｍｌ）を用いた。二次抗体はＣｙ５でラベルされたＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪＩＲ  １１１−１７５−１４４）、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９でラベルされたＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，  シャープ３５５１５）を用いた。ペプチドはセルロース膜によって合成した。その後、マイクロリッター・プレートに移し、ペプチド・アレイ用（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のナノパイペティング・システムによってガラス表面に撒いた。ペプチドマイクロ・アレイは、ブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳ，  ｏｒｄｅｒシャープ３７５３６）にて２時間インキュベートさせた。その後、マイクロアレイハイブリダイゼーションステーション（ＴＥＣＡＮ  ＨＳ４００  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎ）を用いて一次抗体（１０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ，  ｔｏｔａｌ  ａｓｓａｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２００μｌ）またはブロッキングバッファーのみとインキュベートさせた。さらに、ＴＢＳ−バッファー（５０ｍＭ  ＴＢＳ−ｂｕｆｆｅｒ  ＋  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＪＰＴ），  ｐＨ  ７．２）にて洗浄した後、蛍光色素をラベルした二次抗体（ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｏｒ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ）を、ブロッキングバッファー中の最終濃度１μｇ／ｍｌでインキュベートさせた。３度ＴＢＳ−バッファーで洗浄させた後にＳＳＣ−バッファー（３ｍＭ  ＳＳＣ−ｂｕｆｆｅｒ（ＪＰＴ），  ｐＨ  ７．０）で洗浄し、ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｔｒｅａｍで乾燥させた。最後に、高解度蛍光スキャナー（商品名：  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４２００ＡＬ、  Ａｘｏｎ社）を用いて解析を行った。ソフトはＧｅｎｅＰｉｘ  ６．０を用いてスポットを解析した。
結果として、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体からは、配列ＴＫＶＴＫ（配列番号２１）と配列ＱＧＤＴＰＶＲＫ（配列番号２２）が確認され、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体からは配列ＶＴＫＶＴＫ（配列番号１９）と配列ＦＥＤＥＥＩＫ（配列番号２０）を確認した。【０１３５】
［実施例７］ラット頸動脈バルーン傷害モデルを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体による血管内膜肥厚抑制効果の検討
ＳＤラットの左総頸動脈に２Ｆ（フレンチ）のＦｏｇａｒｔｙバルーンカテーテルにて搾過して傷害を与え、同時に抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）又はラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を血管内投与した。内膜傷害モデルを作製後、１日、３日、１週間、２週間、３週間後において５匹ずつ灌流固定後、血管を摘出し、バルーン傷害を与えた頸動脈をサンプル、与えていない側をコントロールとして約１ｃｍ程各々摘出した。摘出した血管のうち約２〜３ｍｍ程度は４％パラホルムアルデヒドにて固定し、残りから各々  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  を抽出しｃＤＮＡを合成した。固定した組織から切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色を行なった（図４（Ｂ））。ＨＥ染色された切片全てに対し内膜と中膜の面積をグラフィック解析ソフト（商品名：Ｇｒａｐｈｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ  ｖｅｒ．４．０２）を用いて求めた。また、その面積より内膜／中膜比を算出し内膜肥厚の程度を調べた。図４（Ａ）に示されるように、内膜／中膜比において抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）投与群とラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）群とではｐ＝０．０３６２の有意差が得られ（Ｎ＝８）、内膜の肥厚が抑制されていることが示された（図４）。【０１３６】
［実施例８］ＡｐｏＥノックアウトマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体による血管内膜肥厚抑制効果の検討
ＡｐｏＥノックアウトマウスの高脂肪食刺激を行い、動脈硬化を誘導するモデルで抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）又はラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を高脂肪食開始と同時に１００μｇ／ｍｌで１回／週で腹腔内投与した。３か月後に、大動脈を展開後、動脈硬化を血管全体に対するＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色で陽性となった面積比率を動脈硬化度とし、ＩｇＧを投与した場合の動脈硬化度の平均値で割った値を動脈硬化の％変化度と考えて比較した。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）を投与した群はラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を投与した群と比して大動脈の動脈硬化が有意に抑制されていた（Ｎ＝３）（Ｐ＜０．０５）（図５）。【０１３７】
［実施例９］マウス大腸炎モデルを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体による抗炎症効果の検討
マウス大腸炎モデルのクローン病モデルである１．７５％デキストラン硫酸（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ； ＤＤＳ）投与下での抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）又はマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）の効果を検討した。ＤＤＳ投与と同時に１００μｇ／匹で１回／週で各抗体を腹腔内投与した。２週間後に、大腸を摘出し、大腸の長さを測定し比較した。その結果、ＤＤＳ投与によって大腸の長さはＳｈａｍ群と比して有意に縮小したが（Ｎ＝６）（Ｐ＜０．０１）、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）を投与した群はマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）を投与した群やＤＤＳだけを投与した群と比して有意に大腸長の縮小作用が抑制されていた（Ｎ＝６）（Ｐ＜０．０５）（図６）。【０１３８】
［実施例１０］下肢虚血モデルを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体による血管新生抑制効果の検討
Ｃ５７ＢＬ６Ｎの下肢大腿動脈を結紮し、下肢虚血モデルを作製した。抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）  又はラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を結紮３日前より４０μｇ／ｍｌで腹腔内投与（２回／１週）し、０（投与直前）、１、７、１４、２１、２８日後にＬａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｉｍａｇｅ  （ＬＤＩ；  Ｍｏｏｒ社）を用いて健側、患側の下肢血流を測定し、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｅ＝患側／健側を下肢血流の評価として計算し両群を比較検討した。２８日後のＲｅｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｅは、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）がラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を投与した群と比して有意に下肢血流が低下していた（Ｐ＜０．０５）（図７）。さらに、マウスの内転筋を摘出し、凍結切片を作製してＣＤ３１抗体で免疫染色し、血管を評価したところ抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）がラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を投与した群と比して有意に単位面積当たりの血管数少なく、有意に血管新生が抑制されていた（Ｐ＜０．０１）（Ｎ＝６）（図８）。さらに、同様の実験を、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）を用いて検討したところ、ポリクローナル抗体と同様に、ＬＤＩにて計算したＲｅｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｅはマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）を投与した群と比して、有意に血流が低下しており血管新生が抑制されていることが示された（図９）。【０１３９】
［実施例１１］ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の管腔形成抑制効果
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏ．３５６２３１）中に４Ｔ１乳癌細胞の上清を加えてさらに、マウス・コントロール  ＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）、ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）をそれぞれ１／１００の濃度で投与したものを９６ウェルプレートに７０μｌ／ウェルずつ入れ、３０分インキュベートしゲル化させ、１．５×１０４個／ウェルのＨＵＶＥＣ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）を播種した。５時間インキュベート後、クリスタルバイオレット溶液で染色、顕微鏡で写真撮影し、管腔の数をカウントした。４Ｔ１乳癌細胞の上清は血管新生作用を有しており、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体及び抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体はその血管新生作用を有意に抑制した（Ｐ＜０．０５）（図１０（Ａ）、（Ｂ））。次に、ＰＮ−２タンパク質を各種濃度で加えたものを同様に処置し評価したところ５μｇ／ｍｌ以上の濃度では濃度依存的にＰＮ−２タンパク質が有意に管腔形成を誘導し、血管新生作用があることが示された（Ｐ＜０．０５）（図１１（Ａ）、（Ｂ））。このことから、抗Ｅｘｏｎ−２１抗体は、血管新生抑制作用を有していることが示された。また、ＰＮ−２タンパク質の血管新生作用も示された。【０１４０】
［実施例１２］ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の細胞増殖に与える影響の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートにマウス４Ｔ１乳癌細胞１０５個／ウェル  ｉｎ  ＤＭＥＭ（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ，ＰＣ／ＳＭ）を添加し、３７℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去した後、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）及びラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）各々２００μｇ／ｍｌを１μｇ／ｍｌの終濃度になるように添加したＤＭＥＭ（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ，ＰＣ／ＳＭ）培地を加えて、再度一晩培養した。翌日、全てのウェルの培地をＤＭＥＭ（１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ）に交換し、細胞増殖試験キット（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、プロメガ）を用いて、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ液を１００μｌの培地に対し２０μｌずつ加え、３７℃で１時間培養した。その後、４９０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、  Ｍｏｄｅｌ  ６８０  ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図１２（Ａ））。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）は、高濃度にてラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）と比して細胞増殖を抑制する活性を有した抗体であることが判明した（Ｐ＜０．０５）。【０１４１】
さらに、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体によるマウス４Ｔ１乳癌細胞への細胞障害性の有無を検討した。細胞培養用９６穴マルチウェルプレートにマウスＦ４Ｔ１乳癌細胞１×１０４個／ウェル  ｉｎ  ＤＭＥＭ（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ，ＰＣ／ＳＭ）を添加し、３７℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去した後、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）及びマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）各々１００μｇ／ｍｌを１μｇ／ｍｌの終濃度になるように添加したＤＭＥＭ（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ，ＰＣ／ＳＭ）培地を加えて、６時間培養した。培養液の上清をとり乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＥＬＩＳＡ法で測定した。測定には、細胞障害測定キット（商品名：ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、タカラバイオ株式会社）を使用した。ＬＤＨは細胞質に存在する酵素であり、通常は細胞膜を透過しないが細胞膜が障害を受けると細胞外、すなわち、培地中に放出され細胞障害性の指標となり得る。上清を４９０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、  Ｍｏｄｅｌ  ６８０  ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ）を用いて測定した。その結果、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）は、高濃度にてマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）と比して有意に細胞増殖を抑制する活性を有した抗体であることが判明した（Ｐ＜０．０１）（図１２（Ｂ））。【０１４２】
［実施例１３］マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果
マウス４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ）を１０％牛血清アルブミン  （ＦＢＳ）（Ｂｉｏ  ｗｅｓｔ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｍｉｘｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク）、含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０ｃｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈｅｓ  （Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、３７℃インキュベーターにて２４時間培養した。その後、培養上清を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後にトリプシン／ＥＤＴＡにより浮遊させた。細胞を回収し１５００ｒｐｍ、３分間遠心した後、１．５×１０５個の細胞を継代し３７℃インキュベーターにて７２時間培養後、対数増殖期にある細胞を１×１０６個／匹になるようにカウントし１００μｌのＰＢＳに懸濁した。調製した細胞は、２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ（ＴＥＲＭＯ）を用いマウスＢＡＬＢ／ｃメス８週齢の足底部に注入し、肺転移モデルマウスを作製した。また、２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）とラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）の各抗体１００μｇ／匹／週を腹腔内投与した。抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた実験では、細胞注射と同時に抗体を投与し、さらに細胞注射を行なった１週間後と２週間後に抗体を投与した。ラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）としてＮｏｒｍａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。細胞注射を行なった後、下肢腫大部の径をノギスにて計測し、原発巣の体積を評価した。評価方法はDethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40， 389 (1968)に記載方法に従い、（足裏の長さ）×（足裏の幅）＾２÷２にて求めた。細胞注射後３週目に剖検を行い、体重測定、原発巣から肺への転移の有無と肺への転移コロニー数のカウントを行なった。それぞれ、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりデータ解析を行なった。３週間後の下肢の原発巣の体積は抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）投与によって有意に縮小されていた（Ｐ＜０．０５）（図１３（Ａ））。また、細胞注射から５週間後の肺への転移コロニー数を比較したところ、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）投与によって有意にコロニー数が減少していた（Ｐ＜０．０５）（図１３（Ｂ））。同様の実験を抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）でも検討し、同様にマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）又はＰＢＳ（−）投与群と比して有意に、肺転移コロニー数の減少を示した（図１４）。これにより、抗Ｅｘｏｎ−２１抗体による、４Ｔ１乳癌細胞への原発巣及び、転移巣の抑制作用が示された。【０１４３】
［実施例１４］マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の効果
マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（マウス悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０細胞）を３７℃インキュベーターにて培養し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡにて細胞を浮遊させ回収した。その後１５００ｒｐｍ、３分間遠心を行い回収した細胞を５×１０５個／匹になるようにカウントし１００μｌのＰＢＳに懸濁した。調製した細胞は、２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ（ＴＥＲＭＯ）を用いマウスＣ５７ＢＬ／６Ｎオス８週齢の足底部に注入し、肺転移モデルマウスを作製した。２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）とラビット・コントロールのＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）の各抗体１００μｇ／匹／週を投与した。コントロールはＮｏｒｍａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
次に、臨床に近い形を再現するためマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を接種後１週間してから抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）  （１ｍｇ／ｍｌ）または、コントロールとしてラビット・コントロールのＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）  （１ｍｇ／ｍｌ）  １００μｇ／匹／週を投与した。原発巣に関してはノギスを用いて計測し原発巣の体積を評価した。評価方法は、Dethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40, 389 (1968)に記載方法に従い、（足裏の長さ）×（足裏の幅）＾２÷２にて求めた。細胞注射後、３週間で抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体投与によってラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を投与したものと比して有意に原発巣の増殖を抑制した（Ｐ＜０．０５）（図１５（Ａ））。肺転移コロニー数に関しては、目視にて計測し比較検討した。その結果、細胞注射から５週間後、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体（ｅｘ２１ＰｏＡｂ）投与によってラビット・コントロールＩｇＧ抗体（ｒＩｇＧ）を投与したものと比して有意に肺転移を抑制した（Ｐ＜０．０５）（図１５（Ｂ））。また、肺への転移コロニー数はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によりデータ解析を行なった。【０１４４】
［実施例１５］動脈瘤モデルマウスを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体の効果
老齢（生後６ヶ月以上）のＡｐｏＥノックアウトマウスを用いた。Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩを生理食塩水に溶解した。Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ（シグマアルドリッチ・Ａ９５２５）を浸透圧による持続投与ポンプ（Ａｌｚｅｔ・室町機械・Ｍｏｄｅｌ  ２００４）に充填した。投与量は１，０００ｎｇ／ｋｇ／ｄａｙに設定した。調製した浸透圧ポンプは一昼夜生理食塩水中にてプライミング処置を行った。イソフルラン気化液を濃度２％・流量１Ｌ／ｍｉｎでマウスに吸入させ十分な鎮静を得たことを確認し、マウスを伏臥位で保持した。頸部皮膚を７０％エタノール溶液で消毒し、小切開を加えた。切開部位より剪刀をマウス皮下に挿入して皮膚を剥離し、ポンプ留置スペースを確保したうえで、浸透圧ポンプをマウス皮下に留置した。留置後は小動物手術用ステープル（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ・室町機械・Ｍｏｄｅｌ  １２０４０−０１）で閉創した。
０週よりマウス・コントロールＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ、１００μｇ／匹）または抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ；  １００μｇ／匹）を１回／週で腹腔内投与した。４週間後に超音波装置（東芝ネディカルシステムズ  Aplio XV）で大動脈の直径を計測した。その結果、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体（ｅｘ２１ＭｏＡｂ）は有意に大動脈径の拡大を抑制することを確認した（図１６）。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を用いることにより、癌を含む炎症関連疾患の予防及び治療を行うことができる。また、前記抗体を用いて患者サンプル中の該ペリオスチン量を測定することにより、癌の有無及び病状の進行程度を知ることができる。
【受託番号】
【０１４６】
微生物の表示
識別の表示：ＫＳ−０２５９＃８，０８０６１１  Ｋｏｈｊｉｎ  Ｂｉｏ
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６
受託日
２０１３年２月２６日
国際寄託当局
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。
【請求項２】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３】
抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４記載の抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６により産生される、請求項５記載の抗体。
【請求項７】
請求項５又は６記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は請求項７記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６。
【請求項１１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する請求項４に記載の抗体を製造する方法。
【請求項１２】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
【請求項１７】
ペリオスチンのＥｘｏｎ−２１のみを抗原として得られる抗体。
【請求項１８】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する請求項１７に記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
ポリクローナル抗体を、抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体と称する。
［０１２１］
［実施例３］ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性の確認
実施例２で得られたポリクローナル抗体２種（Ｎｏ．１及びＮｏ．３）について、ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−２）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例６で得られた精製タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたポリクローナル抗体２種はラットペリオスチンＰＮ−２とも結合することが確認された。
［０１２２］
［実施例４］ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−２１ポリクローナル抗体の中和活性の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートにＤＢ１Ｘラット由来血管平滑筋細胞Ａ７ｒ５細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．０９−１４４４、大日本住友製薬）を０．５〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル播き、サブコンフルエントまで培養し、その後Ｓｅｒｕｍ（−）にした培地に交換した。次に、ＴＨＰ−１細胞（Ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．０６−２０２、大日本住友製薬）を蛍光標識するために、ＴＨＰ−１
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
回収した。採取した腹水を、孔径０．２２μｍφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ−セファロースカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１１５１１３２４）によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体２種を調製した。
［０１３４］
［実施例６］抗ヒトＥｘｏｎ−２１モノクローナル抗体のエピトープ解析
Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ（ガラススライド上に３７種類のペプチドが固定化されたアレイ）を作製し、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチドに対するモノクローナル抗体（２種）及びラットペリオスチンＥｘｏｎ−２１ペプチドに対するポリクローナル抗体（２種）のエピトープを同定した。
一次抗体として、ポリクローナル抗体はラビット  ＩｇＧ  Ｎｏ．１（０．５１ｍｇ／ｍｌ），Ｎｏ．３（０．６２ｍｇ／ｍｌ）を用い、モノクローナル抗体としてＮｏ．８  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ（２．２１ｍｇ／ｍｌ），Ｎｏ．１０  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（１．３５ｍｇ／ｍｌ）を用いた。二次抗体はＣｙ５でラベルされたＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪＩＲ  １１１−１７５−１４４）、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９でラベルされたＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，シャープ３５５１５）を用いた。ペプチドはセルロース膜によって合成した。その後、マイクロリッター・プレートに移し、ペプチド・アレイ用（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のナノパイペティング・システムによってガラス表面に撒いた。ペプチドマイクロ・アレイは、ブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳ，ｏｒｄｅｒシャープ３７５３６）にて２時間インキュベートさせた。その後、マイクロアレイハイブリダイゼーションステーション（ＴＥＣＡＮ  ＨＳ４００  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎ）を用いて一次抗体（１０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ，ｔｏｔａｌ  ａｓｓａｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２００μｌ）またはブロッキングバッファーのみとインキュベートさせた。さらに、ＴＢＳ−バッファ
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月28日(2016.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。
【請求項２】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３】
抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４記載の抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６により産生される、請求項５記載の抗体。
【請求項７】
請求項５又は６記載のモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＣＤＲを含有するペプチドである抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は請求項７記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６。
【請求項１１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する請求項４に記載の抗体を製造する方法。
【請求項１２】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５４６である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７記載の抗体断片又は請求項８記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
【請求項１７】
ペリオスチンのＥｘｏｎ−２１のみを抗原として得られる抗体。
【請求項１８】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１７で表されるアミノ酸配列及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる１種以上のペプチドと特異的に結合する請求項１７に記載の抗体。
【国際調査報告】
2014136910.tif 000019
2014136910.tif 000020
2014136910.tif 000021
2014136910.tif 000022