(57)【要約】  ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を分離する抗体分離方法は、還元剤を含まない調製バッファに溶解した抗体タンパク質を、還元剤を含まないバッファを用いて１次元目電気泳動により分離する１次元目電気泳動工程と、上記１次元目電気泳動工程において電気泳動した上記抗体タンパク質を、還元剤を含まないバッファを用いて２次元目電気泳動により分離する２次元目電気泳動工程とを包含する【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤を含まない調製バッファに溶解した抗体タンパク質を、還元剤を含まない泳動バッファを用いて１次元目電気泳動により分離する１次元目電気泳動工程と、
上記１次元目電気泳動工程において分離した上記抗体タンパク質を、還元剤を含まない泳動バッファを用いて２次元目電気泳動により分離する２次元目電気泳動工程と
を包含することを特徴とする、抗体分離方法。
【請求項２】
上記調製バッファは、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体分離方法。
【請求項３】
上記非界面活性剤型スルホベタイン類は、グリシンベタイン、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−１９５）、３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２０１）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２１１）、３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２２１）、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６）、及び、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６−４Ｔ）からなる群より選択され、
上記ポリソルベート類は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）であり、
上記ポリオキシエチレンアルキルエーテル類は、ポリエチレングリコールであり、
上記糖アルコール類は、ソルビトールである
ことを特徴とする請求項２に記載の抗体分離方法。
【請求項４】
上記調製バッファ中の上記添加剤の濃度が、１ｗ／ｖ％以上、６ｗ／ｖ％以下であることを特徴とする請求項２又は３に記載の抗体分離方法。
【請求項５】
上記調製バッファは、タンパク質変性剤を含まないことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗体分離方法。
【請求項６】
上記調製バッファは、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体分離方法。
【請求項７】
上記非イオン性界面活性剤は、３−[（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル]ジメチルアンモニオプロパンスルホネート、又は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘであり、
上記両性界面活性剤は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、又は、３−[Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナート，アミドスルホベタイン−１４である
ことを特徴とする請求項６に記載の抗体分離方法。
【請求項８】
上記１次元目電気泳動において、
電圧を一定に維持して電流が０より大きい所定の電流値にまで減少したときに昇圧して電流を増加させ、昇圧中に電流が減少し始めたときに電圧を一定に維持し、かつ、電流値が０より大きく、１００μＡ以下となるように電圧制御する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体分離方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の抗体分離方法により分離した抗体が、基準となる医薬に含まれる抗体と同一であるか否かを評価する評価工程を包含することを特徴とする抗体評価方法。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の抗体分離方法により分離した医薬に含まれる抗体が均一であるか否かを評価する評価工程を包含することを特徴とする医薬の評価方法。
【請求項１１】
非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含み、還元剤を含まない調製バッファを備えていることを特徴とする抗体の２次元電気泳動用キット。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、還元剤を含まない調製バッファを備えていることを特徴とする抗体の２次元電気泳動用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体分離方法、抗体評価方法、医薬の評価方法、及び、抗体の２次元電気泳動用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代の中心的な役割として、プロテオーム研究が盛んに行われている。「プロテオーム」とは、特定の細胞、器官及び臓器の中で翻訳生産されているタンパク質全体が意図される。プロテオーム研究においては、特に構造と機能とを対象としたタンパク質の大規模な解析が行われる。【０００３】
タンパク質の大規模解析する手法の１つとして頻繁に用いられている方法として、タンパク質の電気泳動が挙げられる。全てのタンパク質は、各々が固有の電荷及び分子量を有しているため、生体中に存在するタンパク質混合液を電荷又は分子量に応じて分離することによって、各種タンパク質に分離することが可能である。【０００４】
同じ種類のタンパク質であっても、翻訳後修飾によって電荷が異なるタンパク質種が存在し、それらのタンパク質の分子量はほとんど同じであるため、タンパク質を電荷に応じて分離することは特に重要である。また、タンパク質を電荷に応じて分離する方法と、分子量に応じて分離する方法との両者を組み合わせて２次元に分離する方法（２次元電気泳動）を用いることで、より多くのタンパク質を高分解能にて分離することができる。【０００５】
２次元電気泳動は、タンパク質を電荷に応じて分離する等電点電気泳動、及び、分子量に応じて分離するスラブゲル電気泳動（特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の２つの電気泳動ステップからなる。また、２次元電気泳動では、変性剤存在下において変性したタンパク質を分離する、又は、変性剤非存在下において非変性状態のタンパク質を分離することが可能であり、数百種類〜数千種類のタンパク質を一度に分離可能であるため優れた手法である。【０００６】
タンパク質サンプルのうち、特に抗体は高分子量であるため、変性剤存在下で２次元電気泳動を行うことが知られている。特許文献１には、変性剤存在下における２次元電気泳動を利用して、シアル酸修飾が異なる抗体を検出することが記載されている。このような抗体を検出することは、分子量に応じた電気泳動のみでは不可能であった。また、引用文献１には、ニトロ化、リン酸化等の異なる抗体を検出するために、２次元電気泳動を利用することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００９−２４４２４５号公報（２００９年１０月２２日公開）」
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】plos one April 2012, Volume 7, Issue 4, e34511
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
２次元電気泳動の一般的な泳動条件として、まず、１次元目の等電点電気泳動においては、Ｕｒｅａ、Ｔｈｉｏｕｒｅａ等の変性剤、ＣＨＡＰＳ等の界面活性剤、及び、ＤＴＴ等の還元剤が添加された還元条件下で電気泳動を行う。そして、２次元目の、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び、ＤＴＴ等の還元剤が添加された還元条件下で電気泳動を行う。【００１０】
生体内の抗体は、２本のＨｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ（Ｈ鎖）と２本のＬｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ（Ｌ鎖）とが、ジスルフィド結合により共有結合した４量体である。そのため、抗体の分子量は、４量体の状態では約１６０ｋＤａと高分子量である。また、抗体のうちＩｇＧは、特異的な塩基性の等電点を有する。このように、抗体は高分子量であり、特異的な等電点を有する上に、電気泳動により構造が変化しやすいため、好適に分離することは困難である。したがって、抗体を好適に分離することが可能な２次元電気泳動方法があれば有益である。【００１１】
本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、２次元電気泳動を利用して、より好適に抗体を分離することが可能な抗体分離方法、当該抗体分離方法を利用した抗体評価方法及び医薬の評価方法、並びに、当該抗体分離方法に使用する抗体の２次元電気泳動用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る抗体分離方法は、還元剤を含まない調製バッファに溶解した抗体タンパク質を、還元剤を含まない泳動バッファを用いて１次元目電気泳動により分離する１次元目電気泳動工程と、上記１次元目電気泳動工程において電気泳動した上記抗体タンパク質を、還元剤を含まない泳動バッファを用いて２次元目電気泳動により分離する２次元目電気泳動工程とを包含することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一態様によれば、非還元条件下で抗体タンパク質を２次元電気泳動するので、抗体をより好適に分離できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において使用するＩＰＧゲルの作製器具を説明する模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において、非還元条件で分離した抗体サンプルの２次元電気泳動パターンを示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において、非変性条件で分離した抗体サンプルの２次元電気泳動パターンを示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において、非還元条件及び非変性条件のそれぞれで分離した抗体サンプルの２次元電気泳動パターンを比較する図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において、非還元条件で分離した他の抗体サンプルの２次元電気泳動パターンを示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において、非変性条件で分離した他の抗体サンプルの２次元電気泳動パターンを示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る抗体分離方法における、泳動条件を比較する図である。
【図８】ＩＰＧゲルのアクリルアミド濃度を比較する図である。
【図９】従来の２次元電気泳動による分離パターンを比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
〔抗体分離方法〕
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。本発明に係る抗体分離方法は、抗体タンパク質を２次元電気泳動により分離する方法であって、１次元目電気泳動工程と２次元目電気泳動工程とを包含する。抗体分離方法の一実施形態においては、１次元目電気泳動工程の前に、電気泳動用のゲルを作成するゲル作製工程を行う。また、抗体分離方法の一実施形態においては、１次元目電気泳動工程と２次元目電気泳動工程との間に、１次元目電気泳動工程において分離した抗体サンプルを平衡化する平衡化工程を行う。さらに、抗体分離方法の一実施形態においては、２次元目電気泳動工程の後に、分離した抗体タンパク質を検出する検出工程を行う。本実施形態においては、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲルを用いて、１次元目電気泳動工程において等電点電気泳動を行い、２次元目電気泳動工程においてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う場合を例として説明する。
【００１６】
（ゲル作製工程）
ゲル作製工程においては、後述する１次元目電気泳動工程において電気泳動を行うＩＰＧゲル、及び、２次元目電気泳動工程において電気泳動を行うスラブゲルを作製する。
【００１７】
ＩＰＧゲルは、例えば、図１に示すＩＰＧゲル作製器具を用いて作製する。図１は、本発明の一実施形態に係る抗体分離方法において使用するＩＰＧゲルの作製器具を説明する模式図である。図１に示すように、ＩＰＧゲル作製器具１００は、ゲル作製治具１０、グラジエントミキサ２０及び３０、ペリスタポンプ４０、並びに、シリコンチューブ５０を備えている。
【００１８】
まず、低比重溶液として、酸性アクリルアミドバッファ混合液をグラジエントミキサ２０に添加し、高比重溶液として、塩基性アクリルアミドバッファ混合液をグラジエントミキサ３０に添加する。そして、所望のｐＨ勾配を有するように低比重溶液と高比重溶液とを混合したゲル溶液を作製する。作製したゲル溶液を、ペリスタポンプ４０により、シリコンチューブ５０を介してゲル作製治具１０に、グラジエントを乱さないようにゆっくりと充填する。
【００１９】
低比重溶液及び高比重溶液は、従来公知の組成で調整すればよく、低比重溶液として酸性アクリルアミドバッファ混合液を、高比重溶液として塩基性アクリルアミドバッファ混合液を使用することができる。
【００２０】
酸性アクリルアミドバッファ混合液としては、例えば、０．２ＭイモビラインのｐＫ３．６を９４１μｌ、ｐＫ６．２を２７３μｌ、ｐＫ７．０を２４３μｌ、ｐＫ８．５を２６０μｌ及びｐＫ９．３を２８２μｌ、３０％アクリルアミドストック水溶液（２９．１％アクリルアミド、０．９％  ビスアクリルアミド）を２．５ｍｌ、８７％  グリセロール溶液を４．２ｍｌ、１０％  ＡＰＳを１０８μｌ、並びに、１００％  ＴＥＭＥＤを７．６μｌそれぞれ混合し蒸留水で１５ｍｌにメスアップしたものを使用することができる。
【００２１】
塩基性アクリルアミドバッファ混合液としては、０．２ＭイモビラインのｐＫ３．６を１００μｌ、ｐＫ６．２を３３３μｌ、ｐＫ７．０を３６１μｌ、ｐＫ８．５を２３９μｌ及びｐＫ９．３を３２６μｌ、３０％アクリルアミドストック溶液（２９．１％アクリルアミド、０．９％  ビスアクリルアミド）を２．５ｍｌ、１０％  ＡＰＳを１０８μｌ、並びに、１００％  ＴＥＭＥＤを７．６μｌそれぞれ混合し蒸留水で１５ｍｌにメスアップしたものを用いることができる。
【００２２】
低比重溶液及び高比重溶液を混合して作製されるゲル溶液は、アクリルアミド等のゲル材料と共に、重合開始剤、重合促進剤、比重調整剤、変性剤、緩衝バッファ、アクリルアミド誘導体等を含むことができる。
【００２３】
重合開始剤としては、従来公知のものを使用可能であり、例えば、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、メチレンブルー等が挙げられる。
【００２４】
重合促進剤としては、従来公知のものを使用可能であり、例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）等が挙げられる。また、ＵＶ光照射により重合を促進するように構成してもよい。
【００２５】
比重調整剤としては、従来公知のものを使用可能であり、例えば、グリセロール、シュクロース等が挙げられる。
【００２６】
変性剤としては、従来公知のものを使用可能であり、例えば、尿素等が挙げられる。
【００２７】
緩衝バッファとしては、従来公知のものを使用可能であり、例えば、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ、Ｔｒｉｓバッファ、ＭＯＰＳバッファ、ＭＥＳバッファ等が挙げられる。
【００２８】
作製するゲルの網目構造の粗さは、ゲル溶液におけるアクリルアミドの濃度（％Ｔ）、及び、当該アクリルアミド中のビスアクリルアミドの濃度（％Ｃ）により決定される。したがって、％Ｔ及び％Ｃを、平均分子量が１６０ｋＤ以上である、高分子で複雑な高次構造をとる抗体分子を分離するために最適化すればよい。最適な％Ｔ及び％Ｃは、特に限定されないが、例えば、％Ｔが３．０以上、４．０以下、％Ｃが２．０以上、３．０以下であることがより好ましく、％Ｔが３．２以上、３．７以下、％Ｃが２．５以上、３．０以下であることが特に好ましい。
【００２９】
また、ゲル溶液中の重合開始剤、重合促進剤、比重調整剤、変性剤、緩衝バッファ等の濃度については、特に限定されず、従来公知の濃度であってもよい。さらに、ＩＰＧゲルに設けるｐＨ勾配の範囲は、分離する抗体タンパク質の等電点（ｐＩ）を含む範囲であればよく、例えば、多くの抗体タンパク質の等電点が含まれるｐＨ６以上、１０以下にすればよい。
【００３０】
ゲル作製治具１０内には、ゲルボンドフィルムを張り付けたゲル板を設置しており、ゲル溶液をゲル作製容器１０内に充填し、当該ゲル板上においてゲル溶液をゲル化させる。そして、生成したゲルを洗浄することで、未反応のアクリルアミドを除去した後に乾燥させる。ゲル溶液をゲル化する時の温度は特に限定されないが、例えば、４０℃以上、５０℃以下であればよい。
【００３１】
乾燥したＩＰＧゲルを短冊状にカットして、ＩＰＧドライストリップゲルを作製し、１次元目電気泳動工程において等電点電気泳動に供する。
【００３２】
次に、２次元目電気泳動工程においてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うスラブゲルの作製について説明する。スラブゲルとしては、従来公知のスラブゲルを用いることが可能であり、例えば、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲル、寒天ゲル等を好適に用いることができる。このようなスラブゲルは、従来公知の方法により作製することができる。
【００３３】
（１次元目電気泳動工程）
１次元目電気泳動工程において、還元剤を含まない調製バッファに溶解した抗体タンパク質を、還元剤を含まないバッファを用いて１次元目電気泳動により分離する。
【００３４】
＜抗体サンプルの調製＞
１次元目電気泳動工程において、１次元目電気泳動により抗体タンパク質を分離する。抗体サンプルは、分離の対象となる抗体タンパク質を調製バッファ中に溶解したものである。抗体サンプルは、電気泳動による分離まで、熱による抗体タンパク質の変性を避けて保存することが好ましい。
【００３５】
本実施形態に係る抗体分離方法において分離可能な抗体タンパク質は、特に限定されず、従来公知の抗体を好適に用いることができる。このような抗体として、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｂｅｖａｃｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ等が挙げられる。
【００３６】
抗体は、例えば、２Ｄ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて脱塩処理した後、調製バッファ中に溶解する。また、抗体は、分離後の検出のために、ＩＣ５−ＯＳｕ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ（同人化学研究所）等の蛍光色素で蛍光標識してもよい。本実施形態に係る抗体分離方法においては、調製バッファとして、還元剤を含まない非還元調製バッファ、及び、還元剤及びタンパク質変性剤を含まない非変性調整バッファのいずれかを使用する。
【００３７】
従来の抗体の電気泳動方法における調製バッファには、２−メルカプトエタノールのような還元剤が含まれており、還元剤による還元作用によりジスルフィド結合が解離した状態で抗体が分離されている。したがって、従来の電気泳動方法においては、電気泳動によりＨ鎖とＬ鎖とが別々の２本のバンド、又は、２つのスポットのラダーとして検出されてしまう。すなわち、抗体を４量体の状態を維持したまま分離することができない。
【００３８】
抗体は、抗体産生細胞から生成されて生化学実験等で使用されるが、タンパク質翻訳後修飾等が異なることにより不均一な抗体も存在する。したがって、抗体産生細胞から生成された抗体をそのまま２次元電気泳動に供し、生成された抗体が均一であるか否かを検討する方法があれば有益である。しかしながら、これまで、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を２次元電気泳動することは不可能であると考えられ、試みられていなかった。
【００３９】
また、抗体分子には複数の糖鎖が結合し、それぞれが異なる修飾を受ける場合があるため、非常に複雑なグライコフォームを形成する。これらの糖鎖の構造は、抗体分子のコンフォメーションや安定性を決定し、それによりターゲットとの親和性や薬としての効力にも影響を及ぼし得るのと考えられている。そのため、医薬品としての抗体は、ある疾患に対して最適となるようなグライコフォームであることが求められている。従来の抗体の電気泳動方法においては、このような糖鎖修飾を維持した状態で抗体を分離することもできず、グライコフォームを適切に分析することができなかった。
【００４０】
一方、本実施形態に係る抗体分離方法において使用する非還元調製バッファ及び非変性調製バッファは、タンパク質のジスルフィド結合を切断する還元剤を含まないバッファである。本実施形態に係る抗体分離方法によれば、調製バッファに還元剤を含まないため、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体をより好適に分離することができる。また、抗体をより完全体に近い状態で分離することができるので、グライコフォームの分析にも適している。
【００４１】
≪非還元調製バッファ≫
非還元調製バッファは、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含んでいる。抗体は、特異的な塩基性の等電点を有することや、４量体の状態では約１６０ｋＤａと高分子量であることから、ジスルフィド結合を維持した状態で電気泳動して分離することは困難である上に、電気泳動による構造の変化を抑制する必要もある。したがって、これまで、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を分離することは不可能であると考えられ、試みられていなかった。本実施形態に係る抗体分離方法においては、非還元調製バッファに非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤が含まれているので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離することができる。
【００４２】
非還元調製バッファに含まれる非イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、３−[（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル]ジメチルアンモニオプロパンスルホネート（Ｃ７ＢｚＯ）、又は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを好適に使用可能である。
【００４３】
非還元調製バッファに含まれる両性界面活性剤としては、特に限定されないが、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、又は、３−[Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナート，アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ−１４）を好適に使用可能である。
【００４４】
非還元調製バッファ中の非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、０．１  ｗ／ｖ％以上、４  ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、２  ｗ／ｖ％以上、４  ｗ／ｖ％以下であることが特に好ましい。
【００４５】
非還元調製バッファは、さらに、尿素、チオ尿素等の変性剤、アンフォライト（ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）等の両性担体、グリセロール（増粘剤）等を含むことができる。非還元調製バッファ中のこれらの物質の濃度は、特に限定されず、従来公知の濃度であることができる。非還元調製バッファの具体例として、８Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、４ｗ／ｖ％  ＣＨＡＰＳ、及び、０．５％  アンフォライト（ｐＨ６〜１１）を含むものが挙げられる。
【００４６】
≪非変性調製バッファ≫
非変性調製バッファは、還元剤を含まない上に、さらにタンパク質変性剤も含まない。非変性調製バッファは、タンパク質の水素結合等の分子間結合を切断するタンパク質変性剤を含まないバッファである。従来の抗体の電気泳動方法における調製バッファには、尿素等のタンパク質変性剤が含まれており、タンパク質変性剤の作用により水素結合等の分子間結合が解離した状態で抗体が分離されている。一方、本実施形態に係る抗体分離方法によれば、調製バッファに還元剤及びタンパク質変性剤を含まないため、ジスルフィド結合、水素結合等の分子間結合が維持され、高次構造がより維持された状態で抗体を分離することができる。
【００４７】
非変性調製バッファは、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含んでいる。抗体は、特異的な塩基性の等電点を有することや、４量体の状態では約１６０ｋＤａと高分子量であることから、ジスルフィド結合、水素結合等を維持した高次構造のままでは電気泳動して分離することは困難である上に、電気泳動による構造の変化を抑制する必要もある。したがって、これまで、高次構造を維持した抗体を分離することは不可能であると考えられ、試みられていなかった。本実施形態に係る抗体分離方法においては、非変性調製バッファに、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤が含まれているので、高次構造を維持した状態で好適に抗体を分離することができる。
【００４８】
非変性調製バッファに含まれる非界面活性剤型スルホベタイン（ｎｏｎ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｕｌｐｈｏｂｅｔａｉｎｅ（ＮＤＳＢ））類は、非界面活性剤であり、タンパク質の安定化剤としてタンパク質の保存液やタンパク質製剤等に添加する技術が報告されている（参考文献１：特開２００６−１８９３５８号公報、及び、参考文献２：特開２００７−５１６２８１号公報）。非変性調製バッファ中において、非界面活性剤型スルホベタイン類は可溶化及び安定化剤として機能し、抗体は溶解して安定化される。
【００４９】
非界面活性剤型スルホベタイン類として、例えば、グリシンベタイン（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｂｅｔａｉｎ）、並びに、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製のジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−１９５）、３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２０１）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２１１）、３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２２１）、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６）、及び、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６−４Ｔ）が好適に使用可能であるが、中でも、グリシンベタインは、電荷的に中性であるためより好ましい。
【００５０】
非変性調製バッファに含まれるポリソルベート類は、界面活性剤であり、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）（Ｐｏｌｙ（Ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｌａｔｅ  ８０）は電荷的に中性であるため好適に使用可能である。
【００５１】
非変性調製バッファに含まれるポリオキシエチレンアルキルエーテル類は、非イオン性界面活性剤であり、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を好適に使用可能である。
【００５２】
非変性調製バッファに含まれる糖アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、ソルビトールを好適に使用可能である。
【００５３】
非変性調製バッファ中のこれらの添加剤の濃度は、特に限定されないが、０．１  ｗ／ｖ％以上、１０  ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、１ｗ／ｖ％以上、６ｗ／ｖ％以下であることが特に好ましい。非変性調製バッファ中のＮＤＳＢ等の添加剤の濃度が、特に、１ｗ／ｖ％以上、６ｗ／ｖ％以下であることによって、抗体をより完全体の状態で分離することができる。
【００５４】
非変性調製バッファは、さらに、グリセロール等の比重調整剤、アンフォライト等の両性担体、変性作用の少ない界面活性剤、色素等を含むことができる。非変性調製バッファ中のこれらの物質の濃度は、特に限定されず、従来公知の濃度であることができる。非変性調製バッファの具体例として、４ｗ／ｖ％  ＮＤＳＢ、１５ｖ／ｖ％  グリセロール、及び、０．５％  アンフォライト（ｐＨ６〜１１）を含むものが挙げられる。
【００５５】
非変性調製バッファにより抗体サンプルを調製した場合、抗体が還元及び変性しないため、完全体の状態を維持した抗体を分離することができる。非還元調製バッファにより抗体サンプルを調製した場合は、抗体は、還元はされないが、変性する可能性はあるため、見かけ上は完全体の状態の抗体であっても、立体構造の一部が維持されていない可能性がある。したがって、抗体サンプルを非還元調製バッファ及び非変性調整バッファによりそれぞれ調製したものを分離した結果を比較することで、抗体サンプル中における、不純物、抗体の多量体、完全体以外の状態の抗体等の有無を確認することができる。
【００５６】
すなわち、抗体サンプルを非還元調製バッファ及び非変性調整バッファによりそれぞれ調製したものを本発明に係る抗体分離方法により分離し、そのパターンを比較し、抗体サンプル中における、不純物、抗体の多量体、完全体以外の状態の抗体等の有無を判断する工程を含む抗体評価方法についても、本願発明の範疇に含まれる。
【００５７】
＜等電点電気泳動＞
１次元目電気泳動工程における等電点電気泳動、及び、後述する２次元目電気泳動工程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥは、例えば、シャープマニファクチュアリングシステム社製のＡｕｔｏ２Ｄを用いて自動で行ってもよい。本実施形態においては、上記Ａｕｔｏ２Ｄを用いて、１次元目電気泳動工程及び２次元目電気泳動工程を行う場合を例として説明する。
【００５８】
Ａｕｔｏ２Ｄを用いた場合、例えば、等電点電気泳動チップとして、ｐＨ６〜１０のもの、ＰＡＧＥチップとして、アクリルアミド濃度７．５％又は６．５％のものを用いることができる。等電点電気泳動のみの処理時間は、数分間以上、１６分間以下であってもよく、例えば、４５分間である。総処理時間は、３０分間以上、２０時間以下であってもよく、例えば、１３０分間である。
【００５９】
上述したとおり調製した抗体サンプルを、ゲル作製工程において作製したＩＰＧドライストリップゲルに導入し、等電点電気泳動を行う。抗体サンプルのＩＰＧドライストリップゲルへの導入時間は、１分以上、６０分以下であってもよく、例えば３０分間である。
【００６０】
抗体サンプルの導入後、膨潤液を用いてＩＰＧドライストリップゲルを膨潤させる。膨潤液は、等電点電気泳動の泳動バッファとしても使用する。使用する膨潤液としては、従来公知の膨潤液を好適に使用可能であるが、還元剤は含んでいない。したがって、抗体サンプルを、還元剤を含まない非還元条件で、等電点電気泳動により分離することができる。また、膨潤液は、タンパク質変性剤を含まないことが好ましい。膨潤液の具体例として、４％   ＮＤＳＢ−１９５、１５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び、０．２％  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅを含むものが挙げられる。すなわち、非変性調製バッファを膨潤液として用いることができる。使用する膨潤液の量は、例えば１００μＬであり、膨潤時間は、例えば、５分以上、１０分以下であるが、これらに限定されない。
【００６１】
膨潤後のＩＰＧゲルに電圧を印加することで、抗体を等電点の違いに基づき分離する。ＩＰＧゲルに印加する電圧は、例えば、制御１（Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ４：７０００Ｖ，１５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：７０００Ｖ，１５分間一定）、制御２（Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ４：４０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：４０００Ｖ，１０分間一定、Ｓｔｅｐ６：７０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ７：７０００Ｖ，２０分間一定）、又は、制御３（Ｓｔｅｐ１：２００ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，１０分間一定、Ｓｔｅｐ４：８０００Ｖ，１５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：８０００Ｖ，１５分間一定）のように制御してもよい。
【００６２】
すなわち、上記１次元目電気泳動において、電圧を一定に維持して電流が０より大きい所定の電流値にまで減少したときに昇圧して電流を増加させ、昇圧中に電流が減少し始めたときに電圧を一定に維持し、かつ、電流値が０より大きく、１００μＡ以下となるように電圧制御することが好ましい。ここで、所定の電流値は、電気泳動によるサンプルの分離状態等に応じて、０に近い所定の値に適宜設定すればよい。つまり、電圧を一定に制御している間に、電流が負の勾配を示し、勾配が０に近づいたときに、昇圧（リニアグラジエント）制御し、電圧を昇圧している間に、電流の勾配が減少し始めたときに、電圧を一定に維持する。また、電流値が可能な限り低く推移するように電圧を昇圧することが好ましいため、電流値の上限は１００μＡとすればよい。
【００６３】
また、温度等のその他の泳動条件については、従来公知の泳動条件であればよい。
【００６４】
（平衡化工程）
平衡化工程において、１次元目電気泳動工程において分離した抗体サンプルを平衡化する。抗体サンプルの平衡化は、１次元目電気泳動工程後のＩＰＧゲルを平衡化液中に浸漬し、振とうすることで行うことができる。これにより、１次元目電気泳動により分離した抗体サンプルにＳＤＳ化処理を施すことができる。
【００６５】
ＩＰＧゲルの平衡化時間は、例えば、１０分であるが、これに限定されない。ゲルの平衡化に使用する平衡化液としては、従来公知の平衡化液を使用可能であり、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、グリセロール、ＢＰＢ等を含むことができる。平衡化液の具体例として、０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、４．７５％  ＳＤＳ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｖ／ｖ％  グリセロール、及び、０．００５％  ＢＰＢを含むものが挙げられる。
【００６６】
（２次元目電気泳動工程）
２次元目電気泳動工程において、１次元目電気泳動工程において分離した抗体タンパク質を、還元剤を含まないバッファを用いて２次元目電気泳動により分離する。２次元目電気泳動工程においては、１次元目電気泳動工程の等電点電気泳動により分離した抗体サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量の違いに基づき分離する。
【００６７】
１次元目電気泳動工程により等電点電気泳動を行ったＩＰＧゲルと、２次元目電気泳動工程で使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のスラブゲルとを接触させ、これらのゲルに電流を流す。これにより、ＩＰＧゲルにおいて分離された抗体サンプルが、スラブゲルに移動し、分子量の違いに基づき分離される。２次元目電気泳動工程において、ゲルに流す電流は、例えば、１０ｍＡの定電流で１０分間流した後、２０ｍＡの定電流で３０分間流す、の通りに制御してもよい。
【００６８】
２次元目電気泳動工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用する泳動バッファとしては、従来公知の泳動バッファを好適に使用可能であるが、還元剤は含んでいない。したがって、抗体サンプルを、還元剤を含まない非還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離することができる。泳動バッファの具体例として、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎ、及び、０．５％  ＳＤＳを含むものが挙げられる。
【００６９】
また、泳動バッファのｐＨ等の他の泳動条件については、従来公知の泳動条件であればよい。
【００７０】
（検出工程）
検出工程において、２次元目電気泳動工程において分離した抗体サンプルを検出する。抗体サンプルが蛍光標識されていれば、その蛍光を追跡することで、分離した抗体サンプルの各スポットを検出することができる。また、分離した抗体サンプルの各スポットをＣＢＢ染色、銀染色等により染色することで、これらを検出してもよい。蛍光標識された抗体サンプルの蛍光検出は、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のイメージャーｔｙｐｈｏｏｎを用いて、検出波長：６６０ｎｍ、ＰＭＴ  ４００Ｖにおいて行うことができる。
【００７１】
このように、本発明に係る抗体分離方法によれば、非還元条件下で抗体タンパク質を２次元電気泳動するので、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を分離することができるので、抗体及び医薬の分析に特に適している。
【００７２】
〔抗体評価方法〕
本発明に係る抗体評価方法は、上述した本発明に係る抗体分離方法により分離した抗体が、基準となる医薬に含まれる抗体と同一であるか否かを評価する評価工程を包含する。
【００７３】
評価工程においては、例えば、評価対象となる抗体を本発明に係る抗体分離方法で分離したパターンと、基準となる医薬に含まれる抗体を本発明に係る抗体分離方法で分離したパターンとが同一であるか否かを判断することで、抗体を評価する。また、評価対象となる抗体を分離したパターンが、基準となる医薬に含まれる抗体を分離したパターンとは異なる位置にも検出された場合、評価対象となる抗体に、基準となる医薬中には含まれない不純物、不完全抗体等が含まれると判断できる。
【００７４】
本発明に係る抗体評価方法によれば、評価する抗体を分離する時に、本発明に係る抗体分離方法により抗体を分離するので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離したパターンが得られる。したがって、抗体を、４量体を維持した状態でそのまま検出することができるので、より適切に評価することができる。
【００７５】
〔医薬の評価方法〕
本発明に係る医薬の評価方法は、上述した本発明に係る抗体分離方法により分離した医薬に含まれる抗体が均一であるか否かを評価する評価工程を包含する。本発明に係る医薬の評価方法は、例えば抗体医薬の評価、バイオ医薬の評価等に使用できる。
【００７６】
評価工程においては、例えば、評価対象となる医薬を本発明に係る抗体分離方法で分離したときに、単一のスポット（単一領域に検出されたラダー状のスポットも含む）が検出されたか否かを判断することで、医薬を評価する。評価工程において、医薬を分離したスポットが単一のスポットとして検出された場合には、医薬に含まれる抗体が均一であると判断し、医薬を分離したスポットが複数検出された場合には、医薬に含まれる抗体が不均一である又は不純物が混入していると判断できる。
【００７７】
本発明に係る医薬の評価方法によれば、評価する医薬を、本発明に係る抗体分離方法により分離するので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離したパターンが得られる。したがって、抗体を、４量体を維持した状態でそのまま検出することができるので、より適切に評価することができる。
【００７８】
〔抗体の２次元電気泳動用キット〕
本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含み、還元剤を含まない調製バッファ、又は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、還元剤を含まない調製バッファを備えている。すなわち、本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、非変性調製バッファ及び非還元調製バッファのいずれかを備えている。
【００７９】
本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットに含まれる非変性調製バッファ及び非還元調製バッファについては、本明細書における上記「抗体分離方法」の項においてそれぞれ説明した通りであるので、ここでは説明を省略する。
【００８０】
本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、従来公知の電気泳動装置を用いて２次元電気泳動により抗体を分離する時に、抗体サンプルを調製するために用いることができる。
【００８１】
本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、非変性調製バッファ及び非還元調製バッファのいずれかと共に、１次元目電気泳動ゲル材料及び泳動バッファ、２次元目電気泳動ゲル材料及び泳動バッファ、検出用蛍光色素、取り扱い説明書等を備えていてもよい。また、本発明に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、シャープマニファクチュアリングシステム社製のＡｕｔｏ２Ｄのような泳動装置と共に提供されてもよい。
【００８２】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る抗体分離方法は、還元剤を含まない調製バッファに溶解した抗体タンパク質（抗体サンプル）を、還元剤を含まないバッファを用いて１次元目電気泳動により分離する１次元目電気泳動工程と、上記１次元目電気泳動工程において分離した上記抗体タンパク質を、還元剤を含まないバッファを用いて２次元目電気泳動により分離する２次元目電気泳動工程とを包含する。
【００８３】
上記の構成によれば、抗体の調製バッファとして、還元剤を含まない調製バッファを用い、１次元目電気泳動工程及び２次元目電気泳動工程を、還元剤を含まないバッファを用いて行う。すなわち、タンパク質のジスルフィド結合を切断する還元剤を含まない調製バッファを用いて、還元剤を含まないバッファを用いて抗体を分離することができる。
【００８４】
従来の抗体の電気泳動方法における調製バッファには、２−メルカプトエタノールのような還元剤が含まれており、また、泳動バッファにも還元剤が含まれているので、還元剤による還元作用によりジスルフィド結合が解離した状態で抗体が分離されている。すなわち、従来の方法においては、電気泳動によりＨ鎖とＬ鎖とが別々の２本のバンド、又は、２つのスポットのラダーとして検出されてしまう。
【００８５】
一方、本態様に係る抗体分離方法によれば、調製バッファに還元剤を含まず、還元剤を含まないバッファを用いて電気泳動するため、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を分離することができる。
【００８６】
本発明の態様２に係る抗体分離方法は、上記態様１において、上記調製バッファが、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含んでいてもよい。
【００８７】
抗体は、特異的な塩基性の等電点を有することや、４量体の状態では約１６０ｋＤａと高分子量であることから、ジスルフィド結合を維持した状態で電気泳動して分離することは困難である上に、電気泳動による構造の変化を抑制する必要もある。したがって、これまで、ジスルフィド結合を維持した状態で抗体を分離することは不可能であると考えられ、試みられていなかった。
【００８８】
一方、本態様に係る抗体分離方法においては、調製バッファとして、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含む非変性調製バッファを用いるので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離することができる。
【００８９】
本発明の態様３に係る抗体分離方法は、上記態様２において、上記非界面活性剤型スルホベタイン類は、グリシンベタイン、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−１９５）、３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２０１）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２１１）、３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２２１）、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６）、及び、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ−２５６−４Ｔ）からなる群より選択され、上記ポリソルベート類は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）であり、上記ポリオキシエチレンアルキルエーテル類は、ポリエチレングリコールであり、上記糖アルコール類は、ソルビトールであってもよい。
【００９０】
上記の構成によれば、抗体をより完全体の状態で分離することができる。
【００９１】
本発明の態様４に係る抗体分離方法は、上記態様２又は３において、上記調製バッファ中の上記添加剤の濃度が、１ｗ／ｖ％以上、６ｗ／ｖ％以下であってもよい。
【００９２】
上記の構成によれば、抗体をより完全体の状態で分離することができる。
【００９３】
本発明の態様５に係る抗体分離方法は、上記態様２〜４のいずれかにおいて、上記調製バッファが、タンパク質変性剤を含まなくてもよい。
【００９４】
上記の構成によれば、調製バッファが、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含み、還元剤及びタンパク質変性剤を含まない非変性調製バッファであるので、ジスルフィド結合、水素結合等を維持した高次構造のままで好適に抗体を分離することができる。
【００９５】
本発明の態様６に係る抗体分離方法は、上記態様１において、上記調製バッファが、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含んでいてもよい。
【００９６】
上記の構成によれば、調製バッファとして、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む非還元調製バッファを用いるので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離することができる。
【００９７】
本発明の態様７に係る抗体分離方法は、上記態様６において、上記非イオン性界面活性剤が、３−[（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル]ジメチルアンモニオプロパンスルホネート、又は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘであり、上記両性界面活性剤が、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、又は、３−[Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナート，アミドスルホベタイン−１４であってもよい。
【００９８】
上記の構成によれば、ジスルフィド結合を維持した状態でより好適に抗体を分離することができる。
【００９９】
本発明の態様８に係る抗体分離方法は、上記態様１〜７の何れかにおいて、上記１次元目電気泳動において、電圧を一定に維持して電流が０より大きい所定の電流値にまで減少したときに昇圧して電流を増加させ、昇圧中に電流が減少し始めたときに電圧を一定に維持し、かつ、電流値が０より大きく、１００μＡ以下となるように電圧制御してもよい。
【０１００】
上記の構成によれば、電圧を一定に制御している間に、電流が負の勾配を示し、勾配が０に近づいたときに、昇圧（リニアグラジエント）制御し、電圧を昇圧している間に、電流の勾配が減少し始めたときに、電圧を一定に維持する。そして、電流値が可能な限り低く推移し、電流値の上限を１００μＡとするように電圧制御する。このように、適切に電圧制御することによって、好適な１次元目電気泳動が可能である。
【０１０１】
本発明の態様９に係る抗体評価方法は、上記態様１〜８の何れかの抗体分離方法により分離した抗体が、基準となる医薬に含まれる抗体と同一であるか否かを評価する評価工程を包含する。
【０１０２】
上記の構成によれば、評価する抗体を分離する時に、上記態様１〜８の何れかの抗体分離方法により抗体を分離するので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離したパターンが得られる。したがって、抗体を、４量体を維持した状態でそのまま検出することができるので、より適切に評価することができる。
【０１０３】
本発明の態様１０に係る医薬の評価方法は、上記態様１〜８の何れかの抗体分離方法により分離した医薬に含まれる抗体が均一であるか否かを評価する評価工程を包含する。
【０１０４】
上記の構成によれば、評価する医薬を分離する時に、上記態様１〜８の何れかの抗体分離方法により医薬を分離するので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離したパターンが得られる。したがって、抗体を、４量体を維持した状態でそのまま検出することができるので、より適切に評価することができる。
【０１０５】
本発明の態様１１に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含み、還元剤を含まない調製バッファ（非変性調製バッファ）を備えている。
【０１０６】
上記の構成によれば、還元剤を含まず、非界面活性剤型スルホベタイン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、及び、糖アルコール類からなる群より選択される添加剤を含む非変性調製バッファを備えているので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離するために使用することができる。
【０１０７】
本発明の態様１２に係る抗体の２次元電気泳動用キットは、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、還元剤を含まない調製バッファ（非還元調製バッファ）を備えている。
【０１０８】
上記の構成によれば、還元剤を含まず、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む非還元調製バッファを備えているので、ジスルフィド結合を維持した状態で好適に抗体を分離するために使用することができる。
【０１０９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【実施例】
【０１１０】
〔実施例１：抗体（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）の非還元２次元電気泳動〕
抗体分子全体のグライコフォームや凝集体を検出するために、２次元電気泳動（等電点電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を非還元条件下で行った。【０１１１】
ＰＢＳに溶解した抗体（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、田辺三菱社製）は、脱塩精製を行わずに、蛍光体ＩＣ５標識キット（ＩＣ５−ＯＳｕ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ、同仁化学研究所製）で標識し、２μｇ／μＬに調整したものを２次元電気泳動に供した。２次元電気泳動を、シャープマニファクチュアリングシステム社製のＡｕｔｏ２Ｄを用いて自動で行った。ＩＥＦチップとして、ｐＨ６〜１０のものを用い、ＰＡＧＥチップとして、アクリルアミド濃度７．５％のものを用いた。等電点電気泳動時間を４５分間とし、総処理時間を１３０分間とした。【０１１２】
ＩＰＧドライストリップゲルとして、上記組成の酸性アクリルアミドバッファ混合液及び塩基性アクリルアミドバッファ混合液を混合し、図１に示すＩＰＧゲル作製器具１００を用いて作製したゲルを用いた。ＩＰＧドライストリップゲルに、調製した抗体サンプルを導入した。サンプル導入時間は３０分間とした。１００μＬの膨潤液で５分間ＩＰＧゲルを膨潤させた後、ＩＰＧゲルに電圧を印加し、非還元条件下で等電点電気泳動を行った。膨潤液として、上記非還元バッファを用いた。【０１１３】
電圧の印加を、Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ４：７０００Ｖ，１５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：７０００Ｖ，１５分間一定、の通り制御した。【０１１４】
等電点電気泳動後のゲルを７００μＬの平衡化液（０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）（Ｗａｋｏ社製）、４．７５％  ＳＤＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）、２０ｖ／ｖ％  グリセロール（Ｗａｋｏ社製）、及び、０．００５％  ＢＰＢ（Ｓｉｇｍａ社製））で１０分間平衡化した後、ＩＰＧゲルとアクリルアミドゲルを接触させ、電流を流し、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルに流す電流を、１０ｍＡの定電流を１０分間、２０ｍＡの定電流を３０分間、の通り制御した。泳動バッファとして、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｓｉｎ及びＳＤＳを含むバッファを用いた。【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のアクリルアミドゲルにおいて、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のイメージャーｔｙｐｈｏｏｎを用いて、検出波長：６６０ｎｍ、ＰＭＴ  ４００Ｖで蛍光検出した。結果を図２に示す。【０１１６】
図２に示すように、１６０ｋＤ付近に主の抗体スポット群が検出され、３００ｋＤ付近に２量体と思われるアイソフォーム群が検出された。また、主の抗体スポットと共に、主の抗体スポットよりも若干分子量の小さい抗体（LC脱離、糖鎖脱離等）由来のタンパク質スポットが検出された。Ｕｒｅａ及びＣＨＡＰＳを含み、還元剤を含まない非還元調製バッファを用いることにより、医薬品に含まれる多数のグライコフォームや多量体をクリアに分離できることが示された。【０１１７】
〔実施例２：抗体（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）の非変性２次元電気泳動〕
抗体を完全変性させずに２次元電気泳動で分離する方法を検討した。【０１１８】
抗体（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、田辺三菱社製）を、４ｗ／ｖ５  ＮＤＳＢ（Ｍｅｒｃｋ社製）、１５ｖ／ｖ％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｗａｋｏ社製）、及び、０．５％  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ（ｐＨ６−１１）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む非変性調製バッファに溶解した以外は、実施例１と同様に、２次元電気泳動をＡｕｔｏ２Ｄにおいて行い、スポットを検出した。結果を図３に示す。【０１１９】
図３に示すように、等電点及び分子量方向に規則的に配列したスポット群が検出された。図３におけるスポット群において、縦方向のスポット位置の違いは、糖鎖付加数による分子量の違いを表しており、横方向のスポット位置の差は、シアル酸付加数による等電点の違いを表している。すなわち、抗体分子を修飾する糖鎖の数と末端修飾の種類が異なるグライコフォームが検出されたと考えられる。ＮＤＳＢ及びＧｌｙｃｅｒｏｌを含み、還元剤及びタンパク質変性剤を含まない非変性調製バッファを用いることにより、タンパク質変性によるアーティファクトを防ぐと共に、分解やサブユニットの脱離のない状態のまま、抗体のアイソフォームをクリアに分離できることが示された。【０１２０】
ここで、非還元条件及び非変性条件のそれぞれで分離した抗体サンプルの２次元電気泳動によるパターンの違いについて解析する。図４に、実施例１の非還元２次元電気泳動（ａ）及び実施例２の非変性２次元電気泳動（ｂ）のそれぞれで分離した抗体サンプルの２次元電気泳動の結果を示す。また、図４の（ｃ）に、図４中（ｂ）のｂ−ｂ’間の蛍光強度を示すグラフを示す。【０１２１】
図４中（ａ）に示すように、非還元２次元電気泳動においては、Ａの領域に複数の抗体の多量体と推測されるスポットが検出され、Ｂの領域に不純物（目的成分由来ではないタンパク質）と推測されるスポットが検出された。そして、１６０ｋＤａ付近のＸの領域に抗体の完全体（目的成分）が検出されているが、１１０〜１４０ｋＤａ付近のＹの領域及び６０〜８０ｋＤａ付近のＺの領域に、一部立体構造が解離した、若干分子量の小さい抗体由来と推測されるスポットが検出された。一方、非変性２次元電気泳動においては、図４中（ｂ）に示すように、１６０ｋＤａ付近のＸの領域にスポットが検出された。また、図４中（ｂ）では視認しづらいが、図４中（ｃ）に示すように、Ｘの領域とは別に、Ａの領域にも蛍光強度の上昇が見られるため、１６０ｋＤａ付近のＡの領域にもスポットが検出されていることが分かる。【０１２２】
すなわち、図４中（ｂ）においては、図４中（ａ）のように、Ｂの領域に不純物と推測されるスポット、１１０〜１４０ｋＤａ付近のＹの領域、及び６０〜８０ｋＤａ付近のＺの領域に、一部立体構造が解離した若干分子量の小さいスポットが検出されなかった。よって、Ｙ、Ｚ及びＢの領域のスポットは抗体の目的成分由来のタンパク質であると判断できる。このように、図４中（ｂ）のパターンを確認することで、抗体サンプル中の目的成分、多量体、目的成分由来のタンパク質、及び、不純物の有無を判断できる。【０１２３】
したがって、非還元条件及び非変性条件のそれぞれで分離した抗体サンプルの２次元電気泳動によるパターンを比較することで、抗体以外の不純物の有無、多量体共存の有無、インタクト（完全体）以外の抗体混入の有無などを評価することができる。【０１２４】
〔実施例３：他の抗体の非還元２次元電気泳動〕
抗体として、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（中外製薬社製）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ＢＭＳ社製）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ社製）、及び、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（中外製薬社製）を用いた以外は、実施例１と同様に、２次元電気泳動をＡｕｔｏ２Ｄにおいて行い、スポットを検出した。結果を図５に示す。なお、図５（ａ）においては、ｐＨ範囲７〜１０、図５（ｂ）〜（ｃ）においては、ｐＨ範囲６〜９を示している。【０１２５】
図５に示すように、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ａ）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ｂ）、Ｂｅｖａｃｚｕｍａｂ（ｃ）、及び、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ｄ）についても、図２に示すＩｎｆｌｉｘｉｍａｂと同様に、主の抗体スポット群と共に、２量体と思われるアイソフォーム群が検出された。【０１２６】
〔実施例４：他の抗体の非変性２次元電気泳動〕
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（中外製薬社製）及びＣｅｔｕｘｉｍａｂ（ＢＭＳ社製）を、実施例２の非変性調製バッファ（＋ＮＤＳＢ）に溶解したもの、並びに、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（中外製薬社製）を、５０ｖ／ｖ％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｗａｋｏ社製）、０．１％  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ（ｐＨ６〜１１）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び、水を含む調製バッファ（−ＮＤＳＢ）に溶解したものを用い、実施例２と同様に、２次元電気泳動をＡｕｔｏ２Ｄにおいて行い、スポットを検出した。結果を図６に示す。なお、図６（ａ）及び（ｃ）においては、ｐＨ範囲７〜１０、図６（ｂ）においては、ｐＨ範囲６〜９を示している。【０１２７】
図６に示すように、ＮＤＳＢを含む非変性調製バッファに溶解したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ａ）及びＣｅｔｕｘｉｍａｂ（ｂ）は、図３に示すＩｎｆｌｉｘｉｍａｂと同様に、等電点及び分子量方向に規則的に配列したスポット群が検出された。ＮＤＳＢを含まない調製バッファに溶解したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｃ）については、抗体の多量体と推測されるスポットが検出されており、ＮＤＳＢを含む調製バッファに溶解したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｃ）の方がより安定した検出が可能であることが示された。【０１２８】
〔実施例５：泳動条件の違いによる１次元目電気泳動時の電流値の変化〕
１次元目の等電点電気泳動時の電圧制御条件の最適化を検討した。泳動条件１（Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ４：７０００Ｖ，１５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：７０００Ｖ，１５分間一定）、及び、泳動条件２（Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定、Ｓｔｅｐ４：４０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ５：４０００Ｖ，１０分間一定、Ｓｔｅｐ６：７０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント、Ｓｔｅｐ７：７０００Ｖ，２０分間一定）のそれぞれにより等電点電気泳動時の電圧を制御したときの電流値の変化を観察し、結果を図７に示す。図７中（ａ）は、泳動条件１の等電点電気泳動を行った時の電圧値及び電流値の変化を示すグラフであり、図７中（ｂ）は、泳動条件２の等電点電気泳動を行った時の電圧値及び電流値の変化を示すグラフである。図７において、縦軸右側の数値は電流値を、縦軸左側の数値は電圧値を、横軸は時間（秒）を表している。【０１２９】
図７に示すように、電圧を一定に制御するステップでは、電流は負の勾配を示し、勾配が０に近づいたときに、昇圧（リニアグラジエント）制御することが理想的であることが示された。また、電圧を昇圧制御するステップでは、電流の勾配が減少し始めてから（負）、電圧を一定に保持することが理想的であることが示された。さらに、電流値が可能な限り低く推移するように電圧を昇圧することが好ましく、電流値の上限は１００μＡとすればよいことが示された。【０１３０】
〔参考例１：ＩＰＧドライストリップゲルの検討〕
１次元目の等電点電気泳動のＩＰＧゲルにおいて、平均分子量が１６０ｋＤ以上と非常に高分子で複雑な高次構造をとる抗体を非還元条件で分離するために、アクリルアミド濃度（％Ｔ）とビスアクリルアミド濃度（％Ｃ）の最適化を検討した。作成するｐＨ範囲は、多くの抗体の等電点をカバーするｐＨ６〜１０を選択した。【０１３１】
２次元電気泳動で一般的に用いられている、４．０％Ｔ、３．０％Ｃから各濃度を下方に変化させたゲルを作製し、電流値と分離パターンとから分離性能を評価した。分離サンプルとして、マウス肝臓可溶性タンパク質をＩＣ５（ＩＣ５−ＯＳｕ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ、同仁化学研究所製）で標識し、Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチュアリングシステム社製）を用いて２次元電気泳動を行った。マウス肝臓可溶性タンパク質としては、マウス肝臓組織を可溶化バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）下ですり潰し、その上澄み部分を用いた。【０１３２】
泳動条件は、上記泳動条件２の通りにした。４．０％Ｔ、３．０％Ｃのゲル（ａ）と３．６％Ｔ、２．７％Ｃのゲル（ｂ）をそれぞれ用いた結果を図８に示す。【０１３３】
図８に示すように、ゲル中の各濃度を３．６％Ｔ、２．７％Ｃにすることで、高分子領域の分離とサンプルの導入効率とが改善したことが示された。【０１３４】
〔参考例２：従来の還元条件における抗体の２次元電気泳動〕
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ＢＭＳ社製）を用いて、還元条件１（還元剤（ＤＴＴ）を含む泳動条件で１次元目電気泳動及び２次元電気泳動を行う）、及び、還元条件２（還元剤（ＤＴＴ）を含まない泳動条件で１次元目電気泳動を行い、還元剤（ＤＴＴ）を含む泳動条件で２次元目電気泳動を行う）のそれぞれについて、Ａｕｔｏ２Ｄ（シャープマニファクチュアリングシステム社製）を用いて２次元電気泳動を行った。ＣｅｔｕｘｉｍａｂはＩＣ５（ＩＣ５−ＯＳｕ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ、同仁化学研究所製）で標識した。他の泳動条件は、上記泳動条件２の通りにした。【０１３５】
結果を図９に示す。図９中（ａ）は還元条件１の結果を示し、図９中（ｂ）は還元条件２の結果を示す。従来一般的な還元条件１で抗体分子を分離すると、図９中（ａ）に示すように、約６０ｋＤにＨ鎖が検出され、約２０ｋＤにＬ鎖が検出された。また、図９中（ｂ）に示すように、１次元目電気泳動を非還元条件で行い、２次元目電気泳動を還元条件で行う、還元条件２で抗体分子を分離しても、同様に、約６０ｋＤにＨ鎖検出され、約２０ｋＤにＬ鎖が検出されたが、還元条件１の場合より複雑な分離パターンを示した。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、医薬分野、農薬分野等に利用することができる。
【符号の説明】
【０１３７】
１０  ゲル作製治具
２０  グラジエントミキサ
３０  グラジエントミキサ
４０  ペリスタポンプ
５０  シリコンチューブ
１００  ＩＰＧゲル作製器具
【図１】
2015079977.tif 000002
【図７】
2015079977.tif 000003
【図２】
2015079977.tif 000004
【図３】
2015079977.tif 000005
【図４】
2015079977.tif 000006
【図５】
2015079977.tif 000007
【図６】
2015079977.tif 000008
【図８】
2015079977.tif 000009
【図９】
2015079977.tif 000010
【国際調査報告】
2015079977.tif 000011
2015079977.tif 000012
2015079977.tif 000013
2015079977.tif 000014