(57)【要約】  本発明によれば、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、又は、該微生物の培養物若しくは該微生物の処理物を酵素源として用いることにより、また、該微生物を用いた発酵法により、効率的にＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の(ｉ）〜（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、ホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰという。）及びＮ−アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃという。）又はＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという。）、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼという。）を生産する微生物の培養物又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ−アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃという。）を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
【請求項２】
ＰＥＰが、請求項１に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
次の(ｉ）〜（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、シチジン−５’−一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼという。）を生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の培養物、又はそれらの培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、シチジン−５’−三リン酸（以下、ＣＴＰという。）、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
【請求項４】
ＰＥＰが、請求項３に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、請求項３に記載の製造法。
【請求項５】
ＣＴＰが、請求項３に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させて得られるＣＴＰである、請求項３又は４に記載の製造法。
【請求項６】
ＰＥＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項２、４、又は５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項５に記載の製造法。
【請求項８】
請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物が、以下の［４］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造法。
［４］請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項９】
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物が、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１０】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物が、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１１】
シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物が、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１２】
請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
【請求項１３】
請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
【請求項１４】
親株が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いたＮ−アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃという。）及びＮｅｕＡｃ含有糖質の効率的な製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を用いたＮｅｕＡｃ製造法としては、ＮｅｕＡｃアルドラーゼを酵素として、ピルビン酸及びＮ−アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃという。）を基質として用いる製造法（非特許文献１及び２）、アルカリ条件下で、ＮｅｕＡｃ酸アルドラーゼを酵素として、ピルビン酸及びＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという。）を基質として用いる製造法（特許文献１）、ＮｅｕＡｃ酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼという。）を酵素として、ピルビン酸及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いる製造法（非特許文献３及び４）、並びにＮｅｕＡｃシンセターゼを酵素として、ホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰという。）及びＭａｎＮＡｃを基質として用いる製造法(特許文献２及び非特許文献５)が知られている。【０００３】
しかしながら、上記の酵素を用いたＮｅｕＡｃの製造法はいずれも、操作が煩雑である。
効率的なＮｅｕＡｃの製造法としては、微生物を用いた製造法を挙げることができ、そのような例としては、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、及び病原性大腸菌Ｋ１株由来のＮｅｕＡｃシンセターゼを発現させた大腸菌を用いて、ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃを経てＮｅｕＡｃを製造する方法（特許文献３）、並びにＧｌｃＮＡｃ６リン酸エピメラーゼ、及び食中毒の原因微生物であるカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来のＮｅｕＡｃシンターゼを発現させた大腸菌を用いて、グリセロールを炭素源としてＮｅｕＡｃを製造する方法 (特許文献４)が知られている。【０００４】
また、微生物を用いたＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法としては、シチジン−５’−一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼという。）、シアリルトランスフェラーゼ、及びカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacterjejuni)由来のＮｅｕＡｃシンセターゼを発現させた大腸菌を用いた、グルコース及びラクトースからシアリルラクトースを製造する方法（特許文献５）が知られている。【０００５】
ＮｅｕＡｃシンターゼとしては、上記の病原性微生物由来の酵素以外にも、Ｂ群レンサ球菌ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来の酵素、髄膜炎菌ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)由来の酵素が実際にＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有することが確認されている。これらのＮｅｕＡｃシンターゼは、いずれも病原性微生物由来である。【０００６】
そもそも、ＮｅｕＡｃは哺乳類が有する糖であり、微生物が哺乳類の免疫系からの防御機構としてＮｅｕＡｃを生成することからも、これまで実際に活性を有することが確認されたＮｅｕＡｃ酸シンターゼが、全て哺乳類等に感染能をもつ病原性微生物由来であることは理解できる。
非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼとしては、ゲノム配列の情報からその存在が示唆されているが、実際にＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有するかは知られていない。たとえ、これらの非病原性微生物が活性を有するＮｅｕＡｃシンターゼを有していたとしても、当該微生物は哺乳類の免疫系からの防御機構としてＮｅｕＡｃを生成する必要がないので、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性は弱いものと予測することができることから、微生物を用いたＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法において、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用する動機付けはなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６６５，５７４号公報
【特許文献２】特開平１０−４９６１号公報
【特許文献３】特開２００１−１３６９８２号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００８／０４０７１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２０１２／１１２７７７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol.110, p.6481-6486
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol.110, p.7159-7163
【非特許文献３】Angew. Chem. Int. Ed. Eng. (1991), Vol.30, p.827-828
【非特許文献４】Carbohydrate Research (1998), Vol.306, p.575-578
【非特許文献５】Glycobiology (1997), Vol. 7, p.697-701
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、微生物、微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いた効率的なＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）次の(ｉ）〜（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
（２）ＰＥＰが、上記（１）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、上記（１）に記載の製造法。
（３）次の(ｉ）〜（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の培養物、又はそれらの培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、シチジン−５’−三リン酸（以下、ＣＴＰという。）、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
（４）ＰＥＰが、上記（３）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、上記（３）に記載の製造法。
（５）ＣＴＰが、上記（３）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させて得られるＣＴＰである、上記（３）又は（４）に記載の製造法。
（６）ＰＥＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（２）、（４）、又は（５）のいずれか１つに記載の製造法。
（７）ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（５）に記載の製造法。
（８）上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物が、以下の［４］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の製造法。
［４］上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
（９）ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物が、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物である、上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１０）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物が、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、上記（３）〜（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１１）シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物が、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物である、上記（３）〜（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１２）上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
（１３）上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
（１４）親株が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（８）〜（１３）のいずれか１つに記載の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、微生物、該微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いた効率的なＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法が提供される。
また、本発明の製造法は、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用することから、従来の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用するＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法よりも、消費者に与える不安を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造において、反応時間（横軸、単位は時間を表す）に対するＮｅｕＡｃの生成量（縦軸、単位はg/Lを表す）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
1 本発明のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる微生物
1.1 以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物として、以下の
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質、又は
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物を用いる。
【００１４】
ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。
ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを基質としてＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
【００１５】
相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個である。
【００１６】
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１７】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００１８】
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有していることは、後述する方法により該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAでＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有さない微生物、例えばエシェリヒア・コリＷ3110株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰと接触させ、結果として生成するＮｅｕＡｃを高速クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
【００１９】
上記の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の例としては、ロドバクター属に属する微生物、フラボバクテリウム属に属する微生物、及び以下の
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
［７］配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
【００２０】
ロドバクター属に属する微生物としては、好ましくは、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）NBRC16581株を挙げることができる。フラボバクテリウム属に属する微生物としては、好ましくは、フラボバクテリウム・サイクロフィラム(Flavobacteriumpsychrophilum) NBRC 100250株を挙げることができる。
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
【００２１】
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第2版、第3版（2001年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００２２】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
【００２３】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 ｍMの塩化ナトリウム、75 mMのクエン酸ナトリウム）、50 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20 μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42 ℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65 ℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。
【００２４】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１または３で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
【００２５】
また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることができる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
上記の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
【００２６】
親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21 codon plus（ストラタジーン社製）、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratiamarcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、若しくはPseudomonas sp. D-0110等の原核生物、又はSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、若しくはCandida utilis等の酵母菌株を挙げることができる。
【００２７】
該親株は、ＮｅｕＡｃの分解活性が低下した微生物細胞を用いるのが好ましい。そのような微生物としては、例えばＮｅｕＡｃリアーゼ活性が低下した微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli NAN8-71 (FERMBP-7908, WO03/72783)をあげることができる。
また、後述する1.5又は1.6の微生物も、本発明の製造法に用いられる微生物の親株として用いることができる。
【００２８】
細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００２９】
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385] pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を挙げることができる。
【００３０】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
【００３１】
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、P54-6プロモーター［Appl.  Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
【００３２】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００３３】
親株を、該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物をいう。
また、該微生物は、上記［２］の変異蛋白質を生産することにより、ＮｅｕＡｃシンターゼの比活性が増強した微生物であってもよい。
【００３４】
上記［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
ＮｅｕＡｃシンターゼの比活性が増強したことを確認する方法としては、例えば、該変異蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該変異蛋白質を精製し、該蛋白質、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したＮｅｕＡｃと該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した変異が導入されていないＮｅｕＡｃシンターゼの比活性と比較することにより確認することができる。
【００３５】
親株を、上記［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物は、以下の方法で造成することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号１または３で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、ロドバクター属又はフラボバクテリウム属に属する微生物、より好ましくは、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）NBRC16581株又はフラボバクテリウム・サイクロフィラム (Flavobacteriumpsychrophilum) NBRC 100250株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ [PCR Protocols, Academic Press (1990)] により取得することができる。
【００３６】
ロドバクター・カプスラタスNBRC16581株及びフラボバクテリウム・サイクロフィラムNBRC 100250株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（NITE Biological Resource Center）から入手することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］及び［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
【００３７】
上記［４］のＤＮＡのうち上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
または、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの5'端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Gene, 77, 51 (1989)］によっても、上記の［２］のＤＮＡを取得することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの5'端に対応するセンスプライマーと、5'端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（5'側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの5'端から変異導入部位までの断片Ａ（3'端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、5'端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（3'側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの3'端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、5'端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から3'端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
【００３８】
取得した上記の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００３９】
上記の宿主細胞としては、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522等を挙げることができる。
【００４０】
上記のベクターとしては、pBluescriptIIKS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT  [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００４１】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００４２】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
このような組換え体ＤＮＡの例としては、後述するpRcneuB及びpFpneuBを挙げることができる。
組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等の方法を挙げることができる。
【００４３】
組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、相同組換え法を挙げえることができる。例えば、相同組換え法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
【００４４】
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
【００４５】
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、上記［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡの転写量、該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、後述するW3110/pRcneuB及びW3110/pFpneuBを挙げることができる。
1.2 ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物を用いる。
【００４６】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＣＴＰ及びＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物の例としては、パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物、又は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
【００４７】
パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株を挙げることができる。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ  PM70株由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（特願2008-5794)を挙げることができる。
【００４８】
例えば、パスツレラ・マルトシダ  PM70株由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、特願2008-5794に記載された方法で取得することができる。
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
【００４９】
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、Escherichiacoli N18-14/pMnK1（特開2008-5794）を挙げることができる。
【００５０】
また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であってもよい。
このとき、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、同一の組換え体ＤＮＡに存在していてもよく、別々の組み換え体ＤＮＡに存在していてもよい。
1.3 シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物を用いる。
【００５１】
シアリルトランスフェラーゼとは、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。
シアリルトランスフェラーゼ活性とは、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ及び受容体糖質を基質として、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する活性をいう。
本発明の製造法において、基質として用いられる受容体糖質としては、シアリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
【００５２】
シアリルトランスフェラーゼの基質となるオリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にＮｅｕＡｃを有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ‐アセチルラクトサミン、ラクト‐Ｎ‐テトラオース、ラクト‐Ｎ‐ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にNeuAcα2-Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースをあげることができる。
【００５３】
複合糖質としては、上記したオリゴ糖及び多糖に蛋白質又は脂質等が結合した複合糖質をあげることができる。
ＮｅｕＡｃ含有糖質としては、上記した受容体糖質にＮｅｕＡｃが付加した糖質、好ましくは、非還元末端にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、より好ましくは３´‐シアリルラクトースまたは６´‐シアリルラクトースをあげることができる。
【００５４】
シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の例としては、パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物、フォトバクテリウム属（Photobacterium）に属する微生物、又は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
【００５５】
パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株を挙げることができる。フォトバクテリウム属（Photobacterium）に属する微生物としては、好ましくは、Photobacterium damselae JT0160株を挙げることができる。
シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株由来のα-2,3-sialyltransferaseをコードするＤＮＡ （WO03/27297）、又はPhotobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316)をコードするＤＮＡなどを挙げることができる。
【００５６】
例えば、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida） PM70株由来のα-2,3-sialyltransferaseをコードするＤＮＡ及びPhotobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferaseをコードするＤＮＡは、WO03/27297に記載された方法で取得することができる。
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
【００５７】
該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【００５８】
このような微生物の例としては、Escherichiacoli NM522/pYP3（特開2008-5794）を挙げることができる。
また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりも、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であってもよい。
【００５９】
このとき、シアリルトランスフェラーゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、１〜３種類の、好ましくは１〜２種類の、最も好ましくは１種類の組換え体ＤＮＡに、任意の組み合わせで別々に存在していてもよい。
1.4  ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造が、ＧｌｃＮＡｃを基質として行われる場合には、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物を用いる。
【００６０】
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼとは、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する蛋白質をいう。
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性とは、ＧｌｃＮＡｃを基質として、エピメリ化反応により、ＭａｎＮＡｃを生成する活性をいう。
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の例としては、シネコシスティス属（Synechocystis）に属する微生物、又は、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
【００６１】
シネコシスティス属（Synechocystis）に属する微生物としては、好ましくは、Synechocystis sp. PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR)を挙げることができる。
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、Synechocystis sp. PCC6803株由来の、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００６２】
例えば、Synechocystis sp. PCC6803株由来のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡは、WO00/47730に記載された方法で取得することができる。
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
親株を、該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
【００６３】
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、後述するW3110/pRcneuB2を挙げることができる。
【００６４】
また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、及びシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりも、ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる蛋白質の活性が増強された微生物であってもよい。
【００６５】
このとき、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、１〜４種類の、好ましくは１〜３種類の、より好ましくは１又は２種類の、最も好ましくは１種類の組換え体ＤＮＡに、任意の組み合わせで別々に存在していてもよい。
1.5 ＰＥＰを生成、蓄積する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法では、基質であるＰＥＰは、ＰＥＰを生成、蓄積する微生物によって供給されてもよい。
【００６６】
該微生物としては、糖等のエネルギー供与体からＰＥＰを生成、蓄積する微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、エシェリヒア属若しくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、又はサッカロマイセス属に属する酵母菌株を、最も好ましくは、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエ等を挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、特開平6-197778に記載の株をあげることができる。
【００６７】
また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、糖等のエネルギー供与体からＰＥＰを生成する活性を増強した微生物を用いることもできる。
1.6 ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物及び該微生物を造成する方法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法では、基質であるＣＴＰは、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物によって供給されてもよい。
【００６８】
該微生物としては、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、エシェリヒア属若しくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、又はサッカロマイセス属に属する酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエ等を、最も好ましくは、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを挙げることができる。
【００６９】
また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成する活性を増強した微生物を用いることもできる。
ＣＴＰ前駆物質としては、微生物が代謝してＣＴＰに変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくはオロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ＣＭＰ、ＵＴＰおよびＵＭＰをあげることができ、より好ましくはオロット酸およびＣＭＰ、さらに好ましくはオロット酸を挙げることができる。
1.7 上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物及び該微生物の造成法
本発明のＮｅｕＡｃの発酵法による製造法には、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を用いる。
【００７０】
糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物とは、後述の2.3の方法で該微生物を培地に培養したときに、該糖を出発基質として、ＭａｎＮＡｃを該微生物の細胞中に生成、蓄積する微生物をいう。
そのような微生物としては、糖を出発基質としてＭａｎＮＡｃを生成する微生物である限りにおいて制限はないが、例えば、ＮｅｕＡｃを生産することが知られている、特許文献４の実施例４に記載されたSI2株を、又は、国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を親株として、上記1.1の方法により、上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物を挙げることができる。
【００７１】
上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物は、例えば、特許文献４の実施例４に記載されたpBS-neuBCプラスミドを有する株SI2において、pBS-neuBCプラスミドが有するＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（neuB）を上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載されたＤＮＡに置き換えた微生物（以下、微生物Ａという。）、又は上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載されたＤＮＡ及び上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を形質転換した微生物を挙げることができる（7107-607(2)株を親株として造成された微生物を、微生物Ｂという。）。
1.8 上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物及び該微生物の造成法
本発明の発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を用いる。
【００７２】
糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物については、上記1.7と同じである。
上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物としては、例えば、上記1.1の方法によって造成される特許文献５の実施例７に記載されたneuABC、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びバクテリアタイプのα(2,3)シアリルトランスフェラーゼを発現するプラスミドを有するE547株において、当該プラスミドが有するＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（neuB）を上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡに置き換えた微生物（以下、微生物Ｃという。）、又は上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載されたＤＮＡ、上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡ、上記1.2のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及び上記1.4のシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを任意の組み合わせですべて有する１乃至４種類の組換え体ＤＮＡで、国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を形質転換した微生物を挙げることができる（7107-607(2)株を親株として造成された微生物を、微生物Ｄという。）。
2  本発明のＮｅｕＡｃの製造法
2.1  ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造法
本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物（以下、2.1の微生物という。）の培養物、又は該培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
【００７３】
2.1の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００７４】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００７５】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００７６】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７７】
上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
本明細書において、培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素を、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物を、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものをあげることができる。
【００７８】
酵素源の量は、用いる各酵素源について、１〜５００ｇ／ｌであり、好ましくは１〜３００ｇ／ｌである。
ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰの濃度は、0.1ｍＭ〜10Ｍであり、好ましくは1ｍＭ〜1Ｍである。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
【００７９】
ＮｅｕＡｃの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＮｅｕＡｃの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００８０】
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
【００８１】
上記のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、2.1の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
【００８２】
2.1の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、2.1の微生物がＮｅｕＡｃの製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
エネルギー供与体としては、該微生物が代謝することができ、かつアデノシン‐５´‐三リン酸（以下ＡＴＰと略す）などのエネルギー物質を生産させることができる物質であればいずれでもよく、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ‐アセチルノイラミン酸等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【００８３】
エネルギー供与体の濃度は、通常１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
水性媒体中に生成したＮｅｕＡｃの定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
2.2  ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造法
本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、2.2の微生物という。）の培養物、又は該培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
【００８４】
2.2の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＧｌｃＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
【００８５】
2.2の微生物は、上記1.4に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.4に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［４］〜［７］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有していてもよい。2.2の微生物が２種類からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
【００８６】
酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
ＧｌｃＮＡｃの濃度は、0.1ｍＭ〜10Ｍであり、好ましくは1ｍＭ〜1Ｍである。
水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
上記のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、2.2の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
【００８７】
2.2の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、2.2の微生物がＮｅｕＡｃの製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
【００８８】
ＮｅｕＡｃの定量方法及び採取方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。
2.3  発酵法によるＮｅｕＡｃの製造法
本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
【００８９】
該微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
上記の培養により、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
【００９０】
ＮｅｕＡｃの定量方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。
該培養物中からのＮｅｕＡｃの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＮｅｕＡｃが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＮｅｕＡｃを採取することができる。
3 本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
3.1  ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ、及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、3.1の微生物という。）の培養物、又はそれらの培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
【００９１】
3.1の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＭａｎＮＡｃ、ＰＥＰ、受容体糖質、及びＣＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
【００９２】
3.1の微生物は、上記1.2及び1.3に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.2及び1.3に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、及びシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有していてもよい。3.1の微生物が２種類以上からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
【００９３】
酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
ＭａｎＮＡｃの濃度は、上記2.1の記載と同じである。
受容体糖質の濃度は、１ｍＭ〜３Ｍであり、好ましくは５０ｍＭ〜１Ｍである。
水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、3.1の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
【００９４】
3.1の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、3.1の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＣＴＰは、特に制限はなく、市販のＣＴＰを用いてもよいし、3.1の微生物若しくは上記1.6の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＣＴＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＣＴＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
【００９５】
ＣＴＰ前駆物質の濃度は、１ｍＭ〜１Ｍである。
3.1の微生物の親株に上記1.6の微生物を用いた場合や、3.1の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＣＴＰを供給できる場合は、上記1.6の微生物を用いることを要しない。
エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
【００９６】
エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
水性媒体中に生成したＮｅｕＡｃ含有糖質の定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＮｅｕＡｃ含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
3.2  ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ、及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、3.2の微生物という。）の培養物、又はそれらの培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
【００９７】
3.2の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＧｌｃＮＡｃ、ＰＥＰ、受容体糖質、及びＣＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
【００９８】
3.2の微生物は、上記1.2、1.3及び1.4に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.2、1.3及び1.4に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有していてもよい。3.2の微生物が２種類以上からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
【００９９】
酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
ＧｌｃＮＡｃの濃度は、上記2.2の記載と同じである。
受容体糖質の濃度は、上記3.1の記載と同じである。
水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、3.2の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
【０１００】
3.2の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、3.2の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＣＴＰは、特に制限はなく、市販のＣＴＰを用いてもよいし、3.2の微生物若しくは上記1.6の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＣＴＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＣＴＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
【０１０１】
ＣＴＰ前駆物質の濃度は、上記3.1の記載と同じである。
3.2の微生物の親株に上記1.6の微生物を用いた場合や、3.2の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＣＴＰを供給できる場合は、上記1.6の微生物を用いることを要しない。
エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
【０１０２】
エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
ＮｅｕＡｃ含有糖質の定量方法及び採取方法は、上記3.1に記載の方法を用いることができる。
3.3  発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、上記1.1の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
【０１０３】
該微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
受容体糖質は、培養の最初に添加してもよく、培養の途中から必要に応じて添加してもよい。添加する受容体糖質の濃度は、１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【０１０４】
上記の培養により、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
ＮｅｕＡｃ含有糖質の定量方法は、上記3.1に記載の方法を用いることができる。
該培養物中からのＮｅｕＡｃ含有糖質の採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＮｅｕＡｃ含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することができる。
【０１０５】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０６】
ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
(1) ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
ロドバクター・カプスラタスNBRC16581株を公知の方法[Arch Microbiol105, 207-216. 1975]により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号５及び６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１０７】
大腸菌W3110株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号７及び８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、大腸菌W3110株のトリプトファンプロモーターを含む約0.4ｋｂのＤＮＡ断片（以下、Ptrp断片という。）を精製した。【０１０８】
発現ベクターであるpUC18〔Gene, 33, 103 (1985)〕を制限酵素HindIII及びBamHIで切断し、2.7ｋｂのＤＮＡ断片（以下、pUC18HindIIIBamHI断片という）を精製した。
上記の3種類のＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pRcneuBを造成した。
(2) フラボバクテリウム・サイクロフィラム由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
フラボバクテリウム・サイクロフィラム NBRC 100250株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１０９】
当該ＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びpUC18HindIIIBamHI断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pFpneuBを造成した。
(3) ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
W3110/pRcneuB及びW3110/pFpneuBをアンピシリン50 mg/mlを含むＬＢ培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）10 g/l、酵母エキス（ディフコ社製）5 g/l、塩化ナトリウム5 g/l]  5 mlの入った太型試験管に接種し、30℃で16 時間培養した。該培養液をアンピシリン50 mg/mlを含むＬＢ培地 50 ml の入ったバッフル付三角フラスコに10％接種し、30℃、220rpmで8時間培養した。該培養液 40ml分を遠心分離し湿菌体を取得した。【０１１０】
各菌株の培養液各40 ml分を、反応バッファー(0.1Mビシンバッファー（pH 8.0）、10mM塩化マンガン)で一回洗浄したのち、4mlの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行った。 破砕後 18,000×gで5分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取した。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いた。
反応は12.5mMのＭａｎＮＡｃ、ＰＥＰ (共にシグマ・アルドリッチ社製)を含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度0.25 mg/mlになるように添加して、30℃、330rpmで振とうすることによって行った。反応開始後90分が経過した時点で1/4量の6.7Mリン酸を添加することで反応を終了させた。【０１１１】
ＮｅｕＡｃの分析は、ダイオネックス社製の分析装置 DX-500を用いて以下の条件で行った。(カラム：Cabopac PA-10、分析温度：30℃、流速：0.8ml/min、溶離液A組成：500mM NaOH、溶離液B組成：100mM NaOH/500mM NaOAc、溶離液C組成： 脱イオン水  溶離グラジエント条件：分析開始0分から10分まで A:B:C = 1 : 1 : 98 → A:B:C = 4 : 4 : 92、分析開始10分から15分まで A:B:C = 20:16:64 → 35:35:30、分析開始15分から22分まで A:B:C = 50:50:0  検出器：パルスドアンペロメトリー検出器)
結果を表１に示す。【０１１２】
【表１】
2015037698.tif 000002
【０１１３】
以上の結果より、ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物、又はフラボバクテリウム・サイクロフィラム由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物が、ＮｅｕＡｃの製造に利用できることが示された。【０１１４】
上記のＮｅｕＡｃシンターゼは非病原性微生物由来であることから、本発明のＮｅｕＡｃ製造法は、従来の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用するＮｅｕＡｃ製造法と比較して、消費者に与える不安を軽減することができる。
【実施例２】
【０１１５】
ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
(1) ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及びシアノバクテリア由来のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
シネコシスティス・エスピーPCC680株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIで切断し、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ断片という。）を精製した。【０１１６】
実施例１(1)で造成したW3110/pRcneuBから定法によって抽出したプラスミドpRcneuBをHindIIIで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記の２種類のＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pRcneuB2を造成した。
(2) 本発明の製造法に用いる微生物を評価するための微生物の造成
本発明の製造法に用いる微生物を評価するため、既知の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を造成した。【０１１７】
カンピロバクター・ジェジュニATCC 43438株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１１８】
当該ＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びpUC18HindIIIBamHI断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pCjneuBを造成した。
W3110/pCjneuBから定法によって抽出したプラスミドpCjneuBをHindIIIで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１１９】
当該約4.1ｋｂのＤＮＡ断片及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110 W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pCjneuB2を造成した。【０１２０】
大腸菌K235 ATCC 13027株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びSse8387Iで切断し、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１２１】
当該約１ｋｂのＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びあらかじめPstI及びBamHIで切断したpUC18断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pEcneuBを造成した。
W3110/pEcneuBから定法によって抽出したプラスミドpEcneuBをSse8387Iで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１２２】
シネコシスティス・エスピーPCC680株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Sse8387Iで切断し、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。【０１２３】
上記のSse8387Iで切断した約4.1ｋｂのＤＮＡ断片及びSse8387Iで切断した約1ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pEcneuB2を造成した。
(3) ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
W3110/pRcneuB2、W3110/pCjneuB2、及びW3110/pEcneuB2をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 50ｍｌの入った300mＬ容バッフル付き三角フラスコに接種し、30℃で２２０ｒｐｍの条件で１6時間培養した。該培養液30ｍｌをグルコース 5ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル社製）５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム ３ｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム 6ｇ／ｌ、塩化アンモニウム 1g/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、ウラシル 30mg/L、硫酸鉄七水和物0.2g/L、チアミン 8mg/L、硫酸マグネシウム七水和物 2.4 g/L、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ7.0）０．８Ｌの入った２．５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で培養した。攪拌は６００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。培養開始後十分時間が経ち、OD 660nmが50を超えた段階で該培養液を用いて反応を行った。【０１２４】
水でODを50に調整した培養液700ml、グルコース50ｇ／ｌ、ＧｌｃＮＡｃ １４０ｇ／ｌ、キシレン５ｍｌ／ｌの組成からなる反応液を２．５Ｌ容培養槽に入れ、該反応液を攪拌（500ｒｐｍ）し、３２℃で44時間反応を行った。反応中、10Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持した。
なお、本反応においては、宿主の大腸菌がエネルギー供与体であるグルコースの存在下によりＰＥＰを供給することができるので、ＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産させることができた。【０１２５】
結果を表２及び図１に示す。【０１２６】
【表２】
2015037698.tif 000003
【０１２７】
W3110/pRcneuB2ではW3110/pCjneuB2の４倍以上、W3110/pEcneuB2の３倍以上である10.4ｇ/LのＮｅｕＡｃを生産することができた。
以上の結果から、ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造法は、既知の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造法と比較して、消費者の不安を軽減することができるだけではなく、より効率的にＮｅｕＡｃを製造できることが示された。
【実施例３】
【０１２８】
発酵法によるＮｅｕＡｃの製造
上記1.7に記載の微生物Ａ及び微生物Ｂを、それぞれLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養する。試験管生産培地［グルコース  30g/L、硫酸マグネシウム７水和物  0.5 g/L、イーストエキストラクト 2g/L、硫酸アンモニウム  20g/L、リン酸二水素カリウム 2 g/L、塩化ナトリウム0.6 g/L、チアミン塩酸塩 100mg/L、硫酸第一鉄七水和物  20 mg/L、硫酸マンガン五水和物  20 mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.5に調整後、炭酸カルシウム 30 g/L、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.5mL植菌し、30℃で48時間、振盪培養する。【０１２９】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のＮｅｕＡｃ濃度をHPLCにて定量する。
【実施例４】
【０１３０】
発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造
上記1.7に記載の微生物Ｃを、それぞれLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養する。試験管生産培地［グルコース  30g/L、ラクトース  30g/L、硫酸マグネシウム７水和物  0.5 g/L、イーストエキストラクト 2g/L、硫酸アンモニウム  20g/L、リン酸二水素カリウム 2 g/L、塩化ナトリウム0.6 g/L、チアミン塩酸塩 100mg/L、硫酸第一鉄七水和物  20 mg/L、硫酸マンガン五水和物  20 mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.5に調整後、炭酸カルシウム 30 g/L、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.5mL植菌し、30℃で48時間、振盪培養する。【０１３１】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のシアリルラクトース濃度をHPLCにて定量する。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明により、ＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質を効率的に製造することができる。また、消費者に与える不安を軽減することができる。
【符号の説明】
【０１３３】
図１において、●はW3110/pRcneuB2を、■はW3110/pCjneuB2を、▲はW3110/pEcneuB2を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2015037698.tif 000004
【配列表】
2015037698000001.app
【国際調査報告】
2015037698.tif 000005
2015037698.tif 000006
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