(57)【要約】  抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤、又は細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
2016002827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項２】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項３】
前記発現抑制物質が、Ｅｏｍｅｓの遺伝子発現を抑制する核酸である、請求項２に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項４】
前記核酸が、Ｅｏｍｅｓ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項５】
細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項６】
前記細胞障害性プロテアーゼが、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が産生する細胞障害性プロテアーゼである、請求項５に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項７】
前記活性阻害物質がプロテアーゼインヒビターである、請求項５又は６に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項８】
進行型多発性硬化症治療剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
【請求項９】
進行型免疫性脱髄疾患の診断方法であって、
ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップと、
検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が閾値を超える場合に、前記ヒト対象が進行型免疫性脱髄疾患を発症していると判定するステップと、を含む、診断方法。
【請求項１０】
前記体液が、血液又は脳脊髄液である、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
前記閾値が、健常ヒト対象の血液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に基づいて設定されたものである、請求項９又は１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
前記頻度が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１３】
前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１４】
進行型免疫性脱髄疾患の診断のためのデータ収集方法であって、
ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップと、
検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を算出するステップと、を含む、データ収集方法。
【請求項１５】
前記体液が、血液又は脳脊髄液である、請求項１４に記載のデータ収集方法。
【請求項１６】
前記頻度が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合である、請求項１４又は１５に記載のデータ収集方法。
【請求項１７】
前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
【請求項１８】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ａと、ＣＤ４遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ｂと、を含む、進行型免疫性脱髄疾患の診断剤。
【請求項１９】
前記試薬Ａが、抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片であり、
前記試薬Ｂが、抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１８に記載の診断剤。
【請求項２０】
前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、請求項１８又は１９に記載の診断剤。
【請求項２１】
進行型免疫性脱髄疾患非ヒト動物モデルとしてのＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物の使用。
【請求項２２】
前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導されたものである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、ＮＲ４Ａ２遺伝子コンディショナルノックアウトマウスである、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的にＮＲ４Ａ２遺伝子がノックアウトされたマウスである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行型免疫性脱髄疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）とは、自己免疫疾患のひとつで、髄鞘及び神経軸索を標的とする多発性炎症が惹起され、広汎な脱髄に起因する神経伝導障害を引き起こす疾患である。多発性硬化症の病態が進行すると、運動障害や視覚障害などの重篤な神経症状が現れる。【０００３】
多発性硬化症は、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）と、進行型ＭＳがある。進行型ＭＳには、一次進行型ＭＳ（ＰＰ−ＭＳ）と、ＲＲ−ＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型ＭＳ（ＳＰ−ＭＳ）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型ＭＳ（ＰＲ−ＭＳ）が知られている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１２，８，６４７−６５６．
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１３，９，４９６−５０３．
【非特許文献３】Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１３，１９：  １４２８−１４３６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＲＲ−ＭＳの疾患修飾性治療薬（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ：ＤＭＴ）として、１型インターフェロン、抗炎症剤、免疫抑制剤等が知られている。一方、進行型ＭＳに対してＲＲ−ＭＳのＤＭＴを適用しても効果がなく、現在のところ進行型ＭＳに対するＤＭＴは知られていない。【０００６】
これまでのところ、進行型ＭＳ病態の形成機序は、ＲＲ−ＭＳ病態の形成機序との異同を含めて全く明らかではない。また、ＲＲ−ＭＳ病態からＳＰ−ＭＳ病態へ移行する原因も明らかではなく、進行型ＭＳ病態への移行時期を判定する基準も全くないのが現状である。進行型ＭＳ病態モデルとなる非ヒト動物モデルがないこともＳＰ−ＭＳ病態の解明が進まない原因の一つである。【０００７】
本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、進行型免疫性脱髄疾患治療剤の提供を主な目的とする。本発明はまた、進行型免疫性脱髄疾患の診断方法の提供、及び進行型免疫性脱髄疾患モデルとなる非ヒト動物モデルの提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、単相型の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、誘導初期に通常の四肢麻痺を伴うＥＡＥ病態が観察されない一方で、誘導後期（誘導後約２８日以降）にＥＡＥ病態（以下、「後期ＥＡＥ病態」ともいう。）が観察されること、及び後期ＥＡＥ病態が進行型ＭＳ病態のモデルになることを見出した。本発明者らはまた、後期ＥＡＥ病態において、中枢神経系（ＣＮＳ）に浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞のＥｏｍｅｓ遺伝子の発現が亢進していること、及びＥｏｍｅｓ遺伝子発現を抑制することで後期ＥＡＥ病態を抑制できることを見出した。本発明はこれらの新規な知見に基づくものである。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）を提供する。
（１）抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（２）Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（３）前記発現抑制物質が、Ｅｏｍｅｓの遺伝子発現を抑制する核酸である、（２）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（４）前記核酸が、Ｅｏｍｅｓ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、（３）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（５）細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質を有効成分として含有する進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（６）前記細胞障害性プロテアーゼが、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が産生する細胞障害性プロテアーゼである、（５）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（７）前記活性阻害物質がプロテアーゼインヒビターである、（５）又は（６）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（７−１）前記活性阻害物質が、グランザイムＢ阻害剤である、（５）又は（６）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（７−２）前記グランザイムＢ阻害剤が、グランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡである、（７−１）に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（８）進行型多発性硬化症治療剤である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の進行型免疫性脱髄疾患治療剤。
（９）進行型免疫性脱髄疾患の診断方法であって、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップと、検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が閾値を超える場合に、前記ヒト対象が進行型免疫性脱髄疾患を発症していると判定するステップと、を含む、診断方法。
（１０）前記体液が、血液又は脳脊髄液である、（９）に記載の診断方法。
（１１）前記閾値が、健常ヒト対象の血液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に基づいて設定されたものである、（９）又は（１０）に記載の診断方法。
（１２）前記頻度が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合である、（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の診断方法。
（１３）前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、（９）〜（１２）のいずれか一項に記載の診断方法。
（１４）進行型免疫性脱髄疾患の診断のためのデータ収集方法であって、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップと、検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を算出するステップと、を含む、データ収集方法。
（１５）前記体液が、血液又は脳脊髄液である、（１４）に記載のデータ収集方法。
（１６）前記頻度が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合である、（１４）又は（１５）に記載のデータ収集方法。
（１７）前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
（１８）Ｅｏｍｅｓ遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ａと、ＣＤ４遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ｂと、を含む、進行型免疫性脱髄疾患の診断剤。
（１９）前記試薬Ａが、抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片であり、前記試薬Ｂが、抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片である、（１８）に記載の診断剤。
（２０）前記進行型免疫性脱髄疾患が、進行型多発性硬化症である、（１８）又は（１９）に記載の診断剤。
（２１）進行型免疫性脱髄疾患非ヒト動物モデルとしてのＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物の使用。
（２２）前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導されたものである、（２１）に記載の使用。
（２３）前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、ＮＲ４Ａ２遺伝子コンディショナルノックアウトマウスである、（２１）又は（２２）に記載の使用。
（２４）前記ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が、ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的にＮＲ４Ａ２遺伝子がノックアウトされたマウスである、（２１）〜（２３）のいずれか一項に記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、進行型免疫性脱髄疾患治療剤の提供、進行型免疫性脱髄疾患の診断方法の提供、及び進行型免疫性脱髄疾患モデルとなる非ヒト動物モデルの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図２】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスにおけるＣＮＳへ浸潤したＴ細胞数を示すグラフである。
【図３】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスにおけるＣＮＳへ浸潤したＴ細胞によるＩＬ−１７産生量を示すグラフである。
【図４】再発寛解型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図５】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスにおけるＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞のＥｏｍｅｓ発現量を示すグラフである。
【図６】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスの後期ＥＡＥ病態におけるＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。
【図７】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスの後期ＥＡＥ病態におけるＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２７及びＣＤ１１ａ発現を示すサイトグラムである。
【図８】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスの後期ＥＡＥ病態におけるＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞を移入した単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図９】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスに、Ｅｏｍｅｓ特異的ｓｉＲＮＡを投与したときのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１０】単相型ＥＡＥを誘導したＥｏｍｅｓ欠損マウス及び対照マウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１１】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス、ＮＲ４Ａ２／Ｅｏｍｅｓ欠損マウス及び対照マウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１２】ＣＮＳへ浸潤したリンパ球のパーフォリン１の発現量を示すグラフである。
【図１３】ＣＮＳへ浸潤したリンパ球のグランザイムＢの発現量を示すグラフである。
【図１４】ＣＮＳへ浸潤したリンパ球のＣＤ１０７ａの発現量を示すグラフである。
【図１５】抗ＣＤ２２６抗体の投与によるＥＡＥ病態の変化を示すグラフである。
【図１６】健康成人、ＲＲ−ＭＳ患者及びＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、並びにＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ２７及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。
【図１７】健康成人、ＲＲ−ＭＳ患者及びＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣに占めるＥｏｍｅｓ＋細胞の割合を示すプロットである。
【図１８】ＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣのＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ及びパーフォリン１発現を示すサイトグラムである。
【図１９】図１９Ａは、ＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、並びにＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。図１９Ｂは、ＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＰＢＭＣ及びＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図２０】グランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡの投与によるＥＡＥ病態の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔定義〕
本明細書において、「進行型免疫性脱髄疾患」とは、免疫反応に起因する髄鞘の障害により生じる疾患であって、寛解することなく持続的に進行する疾患を意味する。進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患である。進行型免疫性脱髄疾患としては、例えば、ＰＰ−ＭＳ、ＳＰ−ＭＳ及びＰＲ−ＭＳ等の進行型多発性硬化症が挙げられる。
【００１３】
ＮＲ４Ａ２遺伝子は、Ｎｕｒｒ１遺伝子、ＮＯＴ遺伝子、又はＲＮＲ１遺伝子とも呼ばれ、オーファン核内受容体の１種である。ＮＲ４Ａ２遺伝子の主な発現部位は、中枢神経系であり、特に中脳腹側、脳幹、脊髄に強く発現している。また、ＮＲ４Ａ２は，プロスタグランジン、増殖因子、炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体架橋に応答して発現が誘導され、リガンド依存性又はリガンド非依存性にＤＮＡと直接結合して転写を制御する。ヒトＮＲ４Ａ２遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００６１８６．３である。
【００１４】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ又はＴｂｒ２とも呼ばれ、Ｔ−ｂｏｘ転写因子族の一種であり、脊椎動物の発生や分化に係るタンパク質である。Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞，ＣＴＬ）及びＮＫ細胞で発現していることが知られている。また、パーフォリン及びグランザイムＢの発現を直接誘導することが知られている。ヒトＥｏｍｅｓ遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２７８１８２．１（バリアント１）、ＮＭ＿００５４４２．３（バリアント２）、及びＮＭ＿００１２７８１８３．１（バリアント３）である。
【００１５】
〔進行型免疫性脱髄疾患治療剤〕
本発明の第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する。当該治療剤は、進行型免疫性脱髄疾患の病態の進行抑制剤としても使用することができる。
【００１６】
抗ＣＤ２７抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。抗ＣＤ２７抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＤ２７抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＤ２７抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
【００１７】
抗ＣＤ２２６抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗ＣＤ２２６抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＤ２２６抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＤ２２６抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
【００１８】
抗原結合性断片としては、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片であればよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等が挙げられる。
【００１９】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上述した抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２７抗体の抗原結合性断片、抗ＣＤ２２６抗体、及び抗ＣＤ２２６抗体の抗原結合性断片の１種を単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【００２０】
抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片は、常法に従い製造することができる。また、市販品を使用してもよい。
【００２１】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤における上記有効成分（抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００２２】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００２３】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００２４】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００２５】
上記第一の実施形態は、それを必要とするヒト対象に抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２２６抗体若しくはその抗原結合性断片を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【００２６】
本発明の第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する。当該治療剤は、進行型免疫性脱髄疾患の病態の進行抑制剤としても使用することができる。
【００２７】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子がタンパク質として機能することを抑制できる物質であればよい。当該発現抑制物質としては、例えば、Ｅｏｍｅｓ遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質、Ｅｏｍｅｓタンパク質の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質が挙げられる。
【００２８】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質としては、例えば、Ｅｏｍｅｓの遺伝子発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物等であってもよい。Ｅｏｍｅｓの遺伝子発現を抑制する核酸としては、例えば、Ｅｏｍｅｓ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００２９】
Ｅｏｍｅｓタンパク質の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質としては、例えば、抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片（例えば、中和抗体）等が挙げられる。
【００３０】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質の立体構造等の情報に基づいて、本技術分野で公知の方法により設計及び製造することができる。
【００３１】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上述したＥｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質の１種を単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【００３２】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤における上記有効成分（Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００３３】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００３４】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００３５】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１ｐｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００３６】
上記第二の実施形態は、それを必要とするヒト対象にＥｏｍｅｓ遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【００３７】
本発明の第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質を有効成分として含有する。当該治療剤は、進行型免疫性脱髄疾患の病態の進行抑制剤としても使用することができる。細胞障害性プロテアーゼは、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が産生する細胞障害性プロテアーゼであってもよい。
【００３８】
細胞障害性プロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼが挙げられ、好ましくはトリプシン様セリンプロテアーゼであり、より好ましくはグランザイムである。グランザイムとしては、例えば、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイムＥ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨが挙げられ、好ましくはグランザイムＡ又はグランザイムＢである。
【００３９】
細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質は、細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害することができれば、核酸、ペプチド、糖又は糖タンパクであってもよく、分子量２０００以下の低分子化合物であってもよい。細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する物質としては、セリンプロテアーゼ阻害剤であることが好ましく、グランザイム阻害剤であることがより好ましく、グランザイムＡ阻害剤又はグランザイムＢ阻害剤であることがより好ましい。
【００４０】
セリンプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、トシルリジン  クロロメチルケトン  塩酸塩（ＴＬＣＫ塩酸塩）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン  クロロメチル  ケトンが挙げられる。
【００４１】
グランザイムＡ阻害剤としては、例えば、３，４−ジクロロイソクマリン、ナファモスタット  メシル酸塩、抗グランザイムＡ抗体又はその抗原結合性断片、グランザイムＡ特異的ｓｉＲＮＡ、グランザイムＡ特異的ｓｈＲＮＡ、グランザイムＡ特異的ｓｈＲＮＡプラスミドが挙げられる。
【００４２】
グランザイムＢ阻害剤としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル−イソロイシン−グルタミン酸−スレオニン−アスパラギン酸  フルオロメチル  ケトン（Ｚ−ＩＥＴＤＦＭＫ）、アセチル−イソロイシン−グルタミン酸−スレオニン−アスパラギン酸−アルデヒド（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ）、３，４−ジクロロイソクマリン、Ｅｃｏｔｉｎ，Ｅ．ｃｏｌｉ、アセチル−イソロイシン−グルタミン酸−プロリン−アスパラギン酸−アルデヒド（Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ）、ベンジルオキシカルボニル−アラニン−アラニン−アスパラギン酸  クロロメチル  ケトン（Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ）、プロテアーゼインヒビター９（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６：３２１８−３２２５）、ＷＯ２０１２／０７６９８５に記載の化合物、抗グランザイムＢ抗体又はその抗原結合性断片、グランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡ、グランザイムＢ特異的ｓｈＲＮＡ、グランザイムＢ特異的ｓｈＲＮＡプラスミドが挙げられる。
【００４３】
第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上述した細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質の１種を単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【００４４】
第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤における上記有効成分（細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００４５】
第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００４６】
第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００４７】
第三の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００４８】
上記第三の実施形態は、それを必要とするヒト対象に細胞障害性プロテアーゼの活性を阻害する活性阻害物質を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【００４９】
本発明の進行型免疫性脱髄疾患治療剤について、第一の実施形態〜第三の実施形態と分けて説明したが、本発明の進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、第一の実施形態における有効成分、第二の実施形態における有効成分、及び第三の実施形態における有効成分を、それぞれ単独で含むものであってもよく、２種又は３種を組み合わせて含むものであってもよい。
【００５０】
本発明の進行型免疫性脱髄疾患治療剤は、進行型多発性硬化症治療剤として好ましく用いられる。
【００５１】
〔進行型免疫性脱髄疾患の診断方法〕
本発明に係る進行型免疫性脱髄疾患の診断方法は、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップ（検出ステップ）と、検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が閾値を超える場合に、前記ヒト対象が進行型免疫性脱髄疾患を発症していると判定するステップ（判定ステップ）と、を含む。
【００５２】
検出ステップでは、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出する。ヒト対象から採取された体液は、リンパ球を含む体液であればよい。ヒト対象から採取された体液としては、例えば、血液、脳脊髄液が挙げられる。血液は、末梢血であってよい。Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、本技術分野における常法に従って行うことができる。
【００５３】
Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、これに限定されるものではないが、例えば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液サンプルから常法に従いＰＢＭＣを分離するステップ、標識抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片、標識抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片、及び標識抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片をＰＢＭＣと反応させ、フローサイトメーターでＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップを含む方法により実施することができる。
【００５４】
検出ステップでＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することにより、例えば、体液サンプル中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、体液サンプル中のリンパ球総数に対するＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞総数（％）、体液サンプル中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣ細胞総数に対するＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞総数（％）等の指標を得ることができる。
【００５５】
判定ステップでは、検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が閾値を超える場合に、ヒト対象が進行型免疫性脱髄疾患を発症していると判定する。
【００５６】
Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、体液サンプル中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を反映したものであればよく、具体的には、例えば、上述した各指標が挙げられる。中でも、より精度の高い判定が可能になることから、上記頻度は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合（体液サンプル中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣ細胞総数に対するＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞総数に相当）であることが好ましい。
【００５７】
上記閾値は、予め設定されたものであることが好ましい。これにより、診断主体による判定結果のばらつきを無くすことができる。
【００５８】
上記閾値は、例えば、健常ヒト対象の体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に基づいて設定されたものであってもよい。健常ヒト対象は、例えば、進行型免疫性脱髄疾患に罹患していないヒト対象であってもよい。
【００５９】
また、例えば、ＲＲ−ＭＳに罹患しているヒト対象の体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を閾値とし、同一のヒト対象について上記診断方法を実施することにより、ＲＲ−ＭＳ病態から進行形ＭＳ病態へ移行したか否かを判定することもできる。
【００６０】
上記診断方法は、進行型多発性硬化症の診断方法として好適に用いられる。
【００６１】
本発明はまた、上記診断方法の変形態様として、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップ（検出ステップ）と、検出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を算出するステップ（算出ステップ）と、を含む、進行型免疫性脱髄疾患の診断のためのデータ収集方法にも関する。
【００６２】
当該データ収集方法で得られたデータ（算出されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度）を用い、上述した閾値との比較のみに基づいて進行型免疫性脱髄疾患の診断を行なってもよいし、その他の臨床的知見を組み合わせて進行型免疫性脱髄疾患の診断を行なってもよい。
【００６３】
本発明はまた、上記診断方法の変形態様として、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ａと、ＣＤ４遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定するための試薬Ｂと、を含む、進行型免疫性脱髄疾患の診断剤にも関する。当該進行型免疫性脱髄疾患の診断剤は、進行型免疫性脱髄疾患の診断用キットということもできる。
【００６４】
試薬Ａとしては、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定することが可能な試薬であればよく、具体的には、例えば、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の転写産物又はその相補鎖にハイブリダイズ可能なＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の翻訳産物に結合可能な抗体（例えば、抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片）、タンパク質（例えば、ＥＯＭＥＳ、ＭＩＸＬ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＴＢＸ６、ＦＧＦ８、ＳＮＡＩ１、ＳＰＲＹ２、ＳＰＲＹ４、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＮＯＤＡＬ、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＭＥＯＸ１、ＴＢＸ６、ＫＤＲ、ＦＯＸＣ１、ＩＳＬ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＬＨＸ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３）、核酸（例えば、Ｔボックスコアモチーフ（ＴＣＡＣＡＣＣＴ）を含む核酸、ｍｉＲ−３０２等のｍｉＲＮＡを含むゲノムＤＮＡ）が挙げられる。
【００６５】
試薬Ｂとしては、ＣＤ４遺伝子の転写産物量又は翻訳産物量を測定することが可能な試薬であればよく、具体的には、例えば、ＣＤ４遺伝子の転写産物又はその相補鎖にハイブリダイズ可能なＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類、ＣＤ４遺伝子の翻訳産物に結合可能な抗体（例えば、抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片）、タンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質複合体）が挙げられる。
【００６６】
本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の診断剤が、抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片（試薬Ａ）、及び抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片（試薬Ｂ）である場合、例えば、以下のようにして進行型免疫性脱髄疾患を診断することができる。被験者から採取された末梢血から、常法に従ってＰＢＭＣを分離する。次に、分離されたＰＢＭＣと抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片、及び抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片を反応させる。当該ステップにおいては、更に抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片を反応させてもよい。次いで、常法に従い、フローサイトメーター（例えば、アジレント２１００バイオアナライザ；アジレント社製）を用いた解析により、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を測定する。測定された割合が基準値を超える場合、当該被験者を進行型免疫性脱髄疾患を発症している（又は発症しているおそれがある）と判定する。基準値は、上述した進行型免疫性脱髄疾患の診断方法における閾値と同じであってよい。
【００６７】
本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の診断剤は、試薬Ａ及び試薬Ｂが基材に固定化されたものであってもよい。例えば、試薬Ａ及び試薬Ｂが、Ｅｏｍｅｓ遺伝子又はＣＤ４遺伝子の転写産物又はその相補鎖にハイブリダイズ可能なＤＮＡ等の核酸類である場合、当該ＤＮＡ等が、ガラス基板又は樹脂基板等の基材に固定化されたＤＮＡチップ等であってもよい。また、試薬Ａ及び試薬Ｂが、Ｅｏｍｅｓ遺伝子又はＣＤ４遺伝子の翻訳産物に結合可能な抗体（抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片、及び抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片）である場合、当該抗体がガラス基板又は樹脂基板等の基材に固定化された抗体チップであってもよい。
【００６８】
本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の診断剤がＤＮＡチップである場合、次のようにして進行型免疫性脱髄疾患を診断することができる。被験者から採取された末梢血から、常法に従ってＰＢＭＣを分離する。次に、分離されたＰＢＭＣから抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４抗体を用いて、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞を分離する（なお、本ステップは実施しても実施しなくてもよい）。分離したＰＢＭＣ又はＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞から、常法に従い全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。抽出した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡをサンプルとして、常法に従いＤＮＡチップによりＥｏｍｅｓ遺伝子及びＣＤ４遺伝子の発現量を解析する。Ｅｏｍｅｓ遺伝子及びＣＤ４遺伝子の発現量が基準値を超える場合、当該被験者を進行型免疫性脱髄疾患を発症している（又は発症しているおそれがある）と判定する。基準値は、例えば、健常ヒト対象における測定値から決定することができる。
【００６９】
当該診断剤によれば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出が可能である。上記診断剤は、更に抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片を含むものであってもよい。これにより、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヒト末梢血単核細胞に占めるＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合を検出することも可能になる。
【００７０】
〔進行型免疫性脱髄疾患非ヒト動物モデル〕
本発明は更に、進行型免疫性脱髄疾患非ヒト動物モデルとしてのＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物の使用を提供する。
【００７１】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物としては、ＮＲ４Ａ２遺伝子を欠損（特定の組織又は細胞でのみ欠損している場合を含む。）した非ヒト動物であれば、特に制限はない。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、イヌが挙げられる。
【００７２】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導することにより、進行型免疫性脱髄疾患（例えば、進行形ＭＳ）病態を引き起こすことができる。したがって、進行型免疫性脱髄疾患の非ヒト動物モデルとして、疾患機序の解明用、効果的な治療剤のスクリーニング用として好適に用いることができる。
【００７３】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、ＮＲ４Ａ２遺伝子コンディショナルノックアウトマウスであることが好ましい。ここで、コンディショナルノックアウト（ｃＫＯ）とは、全ての遺伝子を欠損させることと異なり、非ヒト動物の特定の組織、特定の細胞において対象となる遺伝子を欠損させることを意味する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＮＲ４Ａ２遺伝子を特異的に欠損させたマウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス）等が挙げられる。
【００７４】
ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスは、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組み換え技術によって樹立することができる。具体的には、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスは、欠損させる標的遺伝子であるＮＲ４Ａ２遺伝子を挟むようにｌｏｘＰ遺伝子を２か所導入したマウスと、標的遺伝子を欠損させたい細胞においてＣｒｅ酵素が発現するように、対象細胞のプロモーター領域の下流にｃｒｅ遺伝子を導入したマウスとを交配させることで作製することができる。対象となる遺伝子を欠損させる組織又は細胞は、当業者がその目的に応じて選択することができる。例えば、対象細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であれば、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてのみ、ＮＲ４Ａ２遺伝子を欠損させたマウスを作製することができる。
【００７５】
次に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルについて説明する。
【００７６】
ＥＡＥモデルは、中枢神経組織由来のタンパク質抗原として、脊髄破砕液、精製ミエリン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＰＬＰ、ＭＯＧなどのようなミエリンタンパク、これらのタンパク質から得られるペプチドを接種することによって誘導される自己免疫モデルの１種である。ＥＡＥモデルとしては、慢性持続性ＥＡＥモデル（本明細書中、「単相型ＥＡＥ」ともいう。）、慢性再発性ＥＡＥモデル（本明細書中、「再発寛解型ＥＡＥ」ともいう。）、受動型ＥＡＥモデルが知られており、多発性硬化症の一般的な動物モデルとして知られている。
【００７７】
慢性持続性ＥＡＥモデルは、通常、次のように作製される。まず、ＭＯＧ３５−５５残基に相当するペプチド（以下、「ＭＯＧペプチド」ともいう。）とフロイント不完全アジュバントに結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌を加えたものを等量混和し、エマルジョンを作製する。ＭＯＧペプチドは、９５％以上の純度であることが好ましい。エマルジョンを作製する際、手で撹拌してもよく、ホモジナイザー又はソニケーターを用いて撹拌してもよい。次に、得られたエマルジョンをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背部に１〜２か所皮下注射する。注射した後、０日後及び２日後に、百日咳毒素のＰＢＳ（リン酸緩衝液）溶液を投与する。百日咳毒素の投与は、静脈内投与で行ってもよく、腹腔内投与で行ってもよい。投与方法は、腹腔内投与であることが好ましい。
【００７８】
慢性再発性ＥＡＥモデルは、通常、次のように作製される。まず、ＰＬＰ１３９−１５１残基に相当するペプチド（以下、「ＰＬＰペプチド」ともいう。）とフロイント不完全アジュバントに結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌を加えたものを等量混和し、エマルジョンを作製する。ＰＬＰペプチドは、９５％以上の純度であることが好ましい。エマルジョンを作製する際、手で撹拌してもよく、ホモジナイザー又はソニケーターを用いて撹拌してもよい。次に、得られたエマルジョンをＳＪＬ／Ｊマウスの背部に１〜２か所皮下注射する。注射した後、０日後及び２日後に、百日咳毒素のＰＢＳ溶液を投与する。百日咳毒素の投与は、静脈内投与で行ってもよく、腹腔内投与で行ってもよい。投与方法は、腹腔内投与であることが好ましい。ただし、慢性再発性ＥＡＥモデルにおいては、百日咳毒素を投与しなくても、ＥＡＥ病態が観察されることがある。
【００７９】
受動型ＥＡＥモデルは、上記慢性持続性ＥＡＥモデル又は上記慢性再発性ＥＡＥモデルにより、ＥＡＥを誘導された動物において、中枢神経タンパク反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞を採取し、ＥＡＥモデルを作製するための動物へ移入することによって作製することができる。移入の方法としては、静脈内注射であってもよい。
【００８０】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物に、ＥＡＥを誘導することにより、進行型免疫性脱髄疾患と類似した病態を再現することができる。すなわち、ＥＡＥを誘導されたＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、進行型免疫性脱髄疾患の病態モデル、特に、進行型ＭＳの後期（進行期）病態を示す動物モデルとして利用することができる。
【００８１】
本発明の他の実施形態は、ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するステップと、ＥＡＥを誘導されたＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物を使用してＥＡＥ病態を解析するステップと、を含む、進行型免疫性脱髄疾患の解析方法である。
【００８２】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するステップは、一般的なＥＡＥを誘導させる条件にしたがい、実施することができる。
【００８３】
ＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスであることが好ましい。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスであると、進行型ＭＳの病態により適切な動物モデルとして利用することができる。
【００８４】
本実施形態の解析方法によれば、進行型免疫性脱髄疾患の病態をより詳細に解析することができる。
【００８５】
また、ＥＡＥを誘導されたＮＲ４Ａ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物に、ある物質を投与し、ＥＡＥ病態を解析することにより、投与された化合物が上記進行型免疫性脱髄疾患の治療効果を発揮するかを評価することもできる。すなわち、ＥＡＥ病態を改善する作用を有する物質をスクリーニングすることもできる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８７】
１．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＥＡＥ解析
（１）動物
使用したマウスはすべて６〜８週齢で、特定病原体不在条件下で飼育した。ｌｏｘｐ配列でＮＲ４Ａ２遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスを樹立した。すなわち、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＮＲ４Ａ２導入遺伝子をＣ５７ＢＬ／６胚性幹細胞にマイクロインジェクションにより導入した。樹立系統をＣ５７ＢＬ／６  ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを作製した。得られたマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４−Ｃｒｅマウス（タコニック社）と交配させることにより、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ＼ｆｌマウス）を樹立した。また、得られたマウスをＳＪＬ／Ｊマウス（雌、日本チャールズ・リバー株式会社）と１０代に渡って交配させ（戻し交配）ることにより、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  ＳＪＬマウス、及びＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＳＪＬマウス（ＳＪＬ／Ｊ  Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ＼ｆｌマウス）を樹立した。【００８８】
ジャクソン研究所から購入したＥｏｍｅｓｆｌ／ｆｌマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４−Ｃｒｅマウスと交配させて、Ｃｒｅ−ＣＤ４  Ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを得た。さらに、Ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌマウスをＣｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させて、Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌＥｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを得た。【００８９】
（２）ＥＡＥ誘導（単相型ＥＡＥ）
１００μｇのＭＯＧ３５−５５残基に相当するペプチド（東レリサーチセンター，日本，東京にて合成、以下、「ＭＯＧペプチド」ともいう。）と１ｍｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌（Ｄｉｆｃｏ，米国，カンザス州）を完全フロイントアジュバントで乳化したものを等量混和し、ホモジナイザーを用いて乳化させ、ＭＯＧエマルジョンを調製した。得られたＭＯＧエマルジョンを、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照としてＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の背部皮下に１〜２か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与後０日目と２日目に、１匹あたり、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）のＰＢＳ溶液２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。注射した後、以下に示すＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
＜ＥＡＥ評価基準＞
０：臨床徴候なし
１：尾の部分的麻痺
２：弛緩した尾
３：後肢の部分的麻痺
４：全後肢の麻痺
５：後肢及び前肢の麻痺【００９０】
結果を図１に示す。図１に示すように、ＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）では、対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）で観察されたＥＡＥ発症期、ピーク期及び慢性期（ＥＡＥ誘導後約９〜２８日後）におけるＥＡＥ病態が抑制されていた。一方、ＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、ＥＡＥ誘導後２８日以降に新たな病態（後期ＥＡＥ病態）が出現した。【００９１】
（３）中枢神経系へのＴ細胞の浸潤
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＴ細胞の数をフローサイトメーターを用いて測定した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。ＣＮＳへ浸潤したＴ細胞の数をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。その際、Ｔ細胞の検出には抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００９２】
結果を図２に示す。健常状態のＣＮＳにはＴ細胞は検出されないが、図２に示すように、後期ＥＡＥ病態時では、ＣＮＳへのＴ細胞の浸潤が認められた。【００９３】
（４）後期ＥＡＥ病態とＩＬ−１７産生
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。具体的には、上記１．（３）と同様に組織から白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。得られたＴ細胞を、ＭＯＧペプチドで刺激し、培養上清中におけるＩＬ−１７含有量を、ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘサイトメトリックビーズアレイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＢｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（バイオラッド社）を用いて測定した。得られたＩＬ−１７量をＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の数で除し、ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞あたりのＩＬ−１７産生量を算出した。【００９４】
結果を図３に示す。ＮＲ４Ａ２が関わるＥＡＥ病態にＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞の関与が示唆されている。対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＤａｙ１８における高いＩＬ−１７産生量はこれを反映していると考えられる。一方、後期ＥＡＥ病態（Ｄａｙ２８）では、ＥＡＥ病態を説明し得るＩＬ−１７産生量は観察されなかった。【００９５】
（５）ＥＡＥ誘導（再発寛解型ＥＡＥ）
１００μｇのＰＬＰ１３９−１５１残基に相当するペプチド（以下、「ＰＬＰペプチド」ともいう。）とフロイント不完全アジュバントに１ｍｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌を加えたものを等量混和し、ホモジナイザーを用いて乳化させ、ＰＬＰエマルジョンを調製した。得られたＰＬＰエマルジョンを、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＳＪＬマウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＳＪＬマウス）及び対照としてＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  ＳＪＬマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＪＬマウス）の背部皮下に１〜２か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与（ＥＡＥ誘導）後０日後と２日後に、１匹あたり、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）のＰＢＳ溶液２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。注射した後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【００９６】
結果を図４に示す。図４に示すように、ＮＲ４Ａ２欠損ＳＪＬマウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＳＪＬマウス）に再発寛解型ＥＡＥを誘導した場合、ＥＡＥ病態が消失した。また、後期ＥＡＥ病態に相当する病態も認められなかった。【００９７】
以上の結果から、ＮＲ４Ａ２欠損マウスでは再発寛解型ＥＡＥ病態とＴｈ１７細胞応答が抑制されていること、ＮＲ４Ａ２欠損マウスの単相型ＥＡＥは、初期病態が抑制される一方で後期に新たな病態（後期ＥＡＥ病態）が出現すること、後期ＥＡＥ病態でも中枢神経系へのＴ細胞の浸潤が認められるが、Ｔｈ１７細胞応答は生じていないこと、単相型ＥＡＥ病態は、ＮＲ４Ａ２依存性が異なる二つの病態（初期病態と後期病態）からなることが明らかとなった。【００９８】
２．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスの後期ＥＡＥ病態の解析
（１）ＣＮＳ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現
上記１．（２）と同様にして単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導１５日後（対照のみ）及び誘導２８日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、上記１．（４）と同様にＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。ＲＮｅａｓｙミニキット又はＦａｓｔＬａｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、得られたＣＤ４＋Ｔ細胞から総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡから、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（タカラ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置で、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた条件で、又はＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲ装置で、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた条件で、市販のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ，ＱＴ０１０７４３３２，Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して定量リアルタイムＰＣＲを行った。Ｅｏｍｅｓ遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現量に基づいて補正した。【００９９】
結果を図５に示す。図５に示すように、後期ＥＡＥ病態（Ｄａｙ２８）では、対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）ともに、対照マウスのＤａｙ１５と比較して、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞のＥｏｍｅｓ遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が亢進していた。【０１００】
（２）Ｔｈ１７細胞とＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の異同
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導２８日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、上記２．（１）と同様にＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。分離した細胞は、５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（共にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の存在下において５時間、再刺激した後に、製造者の取扱説明にしたがって、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３染色キットを用いて表面染色及び固定／細胞内染色した。その後、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＥｏｍｅｓの発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び抗ＩＦＮ−γ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）である。【０１０１】
結果を図６に示す。図６に示すように、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＩＬ−１７発現は観察されず、したがって、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＴｈ１７細胞は、異なるサブセットであると考えられる。【０１０２】
（３）Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面抗原
上述の方法により、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面に発現している表面抗原について、フローサイトメーターを用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ２７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＣＤ２２６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。【０１０３】
結果を図７に示す。図７に示したように、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７を発現しＣＤ１１ａを高発現していた。また、データは示していないが、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２２６を発現していた。【０１０４】
（４）中枢神経系由来ＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞の移入による受動ＥＡＥの誘導
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導し、誘導後２８日目のＮＲ４Ａ２欠損マウスの脊髄及び脳から、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞を採取した。具体的には、上記１．（３）と同様に組織から白血球細胞を濃縮した。ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、および抗ＣＤ２７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）である。分離したＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を用いた再刺激を行った後、１０，０００個の細胞を、上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導し、単相型ＥＡＥ誘導後１０日目のＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及び対照マウスに静脈注射によって移入した。注射した後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１０５】
結果を図８に示す。図８に示すように、ＣＮＳ由来ＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞を移入することによりＥＡＥを誘導することができた。【０１０６】
（５）Ｅｏｍｅｓ特異的ｓｉＲＮＡの静脈内投与による後期ＥＡＥ病態の抑制
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に、誘導１６日後に、コラーゲンマトリックスに封入したコントロールｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、高研社製）又はＥｏｍｅｓ特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１：５’−ｇｇｃｕｃｕｕａｕｕｕｃｕａｃｕｃａｕＵＵ−３’）（３’のオーバーハング（大文字ＵＵ）を含む２本鎖ＲＮＡ）を静脈内注射した。注射した後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。なお、コントロールｓｉＲＮＡは、ヒト、マウス、ラットのいずれの遺伝子とも一致しない配列を含むコントロールｓｉＲＮＡとして市販されているものである。【０１０７】
結果を図９に示す。図９に示すように、ＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスのいずれにおいても、Ｅｏｍｅｓ特異的ｓｉＲＮＡの投与により、後期ＥＡＥ病態が有意に改善した。【０１０８】
（６）ＮＲ４Ａ２／Ｅｏｍｅｓ欠損マウスのＥＡＥ病態  上記１．（２）と同様にして、Ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ）、Ｃｒｅ−ＣＤ４  Ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｅ−ＣＤ４  ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ）、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌＥｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及びＣｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌＥｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｏｍｅｓ／ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）に単相型ＥＡＥを誘導した。その後、上記ＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１０９】
結果を図１０及び１１に示す。図１０に示すように、ＣＤ４遺伝子のプロモーター下にｃｒｅ遺伝子を導入し、かつｅｏｍｅｓ遺伝子をｌｏｘＰ遺伝子で挟んだＥｏｍｅｓ欠損マウス（Ｃｒｅ−ＣＤ４  ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ）は、ｅｏｍｅｓ遺伝子をｌｏｘＰ遺伝子で挟んだ対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｏｍｅｓｆｌ／ｆｌ）に比べて、ＥＡＥスコアが若干改善した。また、ＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）では、後期ＥＡＥ病態においてＥＡＥスコアが上昇したのに対し、ＮＲ４Ａ２／Ｅｏｍｅｓ欠損マウス（ＮＲ４Ａ２／ｅｏｍｅｓ  ｃＫＯ）では後期ＥＡＥスコアが上昇せず、後期ＥＡＥ病態を発症しなかった。【０１１０】
（７）Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞障害因子の発現
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導し、後期ＥＡＥ病態を発症した対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）の中枢神経系から分離した単核球を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、及び抗ＣＤ２７抗体で染色し、ＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２７−Ｔ細胞とＣＤ４−Ｔ細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、および抗ＣＤ２７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）である。得られた細胞からＲＮＡを抽出し、パーフォリン１とグランザイムＢの発現量をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置で、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた条件で、又はＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲ装置で、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた条件で、市販のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ，ＱＴ００２８２００２（パーフォリン），ＱＴ００１１４５９０（グランザイムＢ），いずれもＱｉａｇｅｎ社製）を使用して定量リアルタイムＰＣＲを行った。また、Ｅｏｍｅｓ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞に抗ＣＤ３抗体で刺激した場合と刺激しなかった場合において、Ｅｏｍｅｓ遺伝子及びＣＤ１０７ａの細胞表面発現をフローサイトメーターを用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。【０１１１】
結果を図１２〜１４に示す。図１２及び１３に示すように、ＮＲ４Ａ２欠損マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２７＋Ｔ細胞では、ＣＤ４＋ＣＤ２７−Ｔ細胞と比較して、パーフォリン１の発現量には大きな差を認めなかったが、グランザイムＢの発現量が増加していた。また、図１４に示すように、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激することにより、ＣＤ１０７ａの発現量が上昇した。すなわち、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体による刺激を受けると脱顆粒するものと考えられる。【０１１２】
（８）抗ＣＤ２２６抗体の投与によるＥＡＥ病態への影響
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに誘導１５日後及び１８日後に、抗ＣＤ２２６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）又はそのアイソタイプ（Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ，κ  Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１１３】
結果を図１５に示す。図１５に示すように、抗ＣＤ２２６抗体を投与することで（ＣＤ２２６）、アイソタイプを投与した場合と比べて（Ｉｓｏｔｙｐｅ）、後期ＥＡＥ病態が有意に改善された。【０１１４】
以上の結果から、慢性持続性ＥＡＥモデルは、初期ＥＡＥ病態と後期ＥＡＥ病態の２種に分類できると考えられる。具体的には、初期ＥＡＥ病態は、ＮＲ４Ａ２遺伝子に依存的で、Ｔｈ１７細胞が関与する病態であり、後期ＥＡＥ病態は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子に依存的で、細胞障害性ＣＤ４＋Ｔ細胞が関与する病態であると考えられる。【０１１５】
３．ヒトＭＳ患者におけるＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の解析
（１）ヒト末梢血中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度
健康成人のボランティア（ｎ＝１４）、ＲＲ−ＭＳ患者（ｎ＝１５）及びＳＰ−ＭＳ患者（ｎ＝１２）から、ヘパリン処理済チューブを用いて末梢血を採取し、得られた末梢血をフィコール勾配（ＧＥヘルスケア）に沈殿させ、約９００ｇで３０分間、遠心分離することによってＰＢＭＣを分離した。得られたＰＢＭＣを、製造者の取扱説明にしたがって、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３染色キットを用いて表面染色及び固定／細胞内染色した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣにおけるＥｏｍｅｓ、ＣＤ１１ａ及びＣＤ２７の発現量を、フローサイトメーターを用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ２７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）である。【０１１６】
結果を図１６及び１７に示す。図１６は、ＣＤ３＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、並びにＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ２７及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。図１７は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣに占めるＥｏｍｅｓ＋細胞の割合を健康成人ボランティア、ＲＲ−ＭＳ患者及びＳＰ−ＭＳ患者についてプロットしたものである。図１６及び図１７に示すように、ＳＰ−ＭＳ患者において、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が選択的に亢進していた。【０１１７】
（２）ＳＰ−ＭＳ患者由来のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害性
上記３．（１）と同様にして得られたＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣに、抗ＣＤ３抗体で刺激を与えた後、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ及びパーフォリン１の発現量を、フローサイトメーターを用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗グランザイムＢ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗パーフォリン１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。なお、ＣＤ１０７ａについては、抗１０７ａ抗体蛍光色素標識抗体の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した）で刺激して行った。【０１１８】
結果を図１８に示す。図１８に示すように、ＳＰ−ＭＳ患者由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣは、細胞傷害因子（ＩＦＮ−γ、パーフォリン１、グランザイムＢ）を高発現しており、抗ＣＤ３抗体で刺激されると、ＣＤ１０７ａの発現量が増加した。したがって、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は刺激を受けることにより、脱顆粒すると考えられる。【０１１９】
（３）ヒト脳脊髄液中のＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞頻度
ＳＰ−ＭＳ患者（ｎ＝１２）から、ヘパリン処理済チューブを用いて末梢血及び脳脊髄液を採取し、得られた末梢血をフィコール勾配（ＧＥヘルスケア）に沈殿させ、約９００ｇで３０分間、遠心分離することによってＰＢＭＣサンプルを分離し、一方、得られた脳せき髄液をフィコール勾配（ＧＥヘルスケア）に沈殿させ、約１８００ｇで３０分間、遠心分離することによってＣＳＦサンプルを分離した。得られたＰＢＭＣサンプル及びＣＳＦサンプルを、製造者の取扱説明にしたがって、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３染色キットを用いて表面染色及び固定／細胞内染色した。ＣＤ３＋ＰＢＭＣ及びＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＥｏｍｅｓ及びＣＤ４の発現量を、フローサイトメーターを用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）である。【０１２０】
結果を図１９に示す。図１９Ａは、ＣＤ３＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラム、並びにＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＣＤ４及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。図１９Ｂは、ＣＤ３＋ＰＢＭＣ及びＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合をプロットしたグラフである。図１９Ｂに示すように、５名のＳＰ−ＭＳ患者において、ＣＤ３＋ＣＳＦにおけるＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合は、ＣＤ３＋ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合よりも増加した。【０１２１】
４．グランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡによる後期ＥＡＥ病態の抑制
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に、誘導１６日後に、コラーゲンマトリックスに封入したコントロールｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、高研社製）、又はグランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡ−１（配列番号２：ＣＵＣＵＡＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＵＵ）を静脈内注射した。注射した後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１２２】
結果を図２０に示す。図２０に示すように、ＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスのいずれにおいても、グランザイムＢ特異的ｓｉＲＮＡの投与により、後期ＥＡＥ病態が有意に改善した。
【図３】
2016002827.tif 000003
【図５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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