(57)【要約】良好な感度で標的物を検出可能なタンパク質−ポリマ複合体を提供する。グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体である。
2014208776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されていることを特徴とするタンパク質−ポリマ複合体。
【請求項２】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマであることを特徴とするＴＧａｓｅ基質含有ポリマ。
【請求項３】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマの製造に用いられる、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するモノマであることを特徴とするＴＧａｓｅ基質含有モノマ。
【請求項４】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマに、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に第一級アミンを有するタンパク質を結合する、または、前記第一級アミンにグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質を結合するタンパク質結合工程を含むことを特徴とするタンパク質−ポリマ複合体の製造方法。
【請求項５】
タンパク質の検出方法であって、
グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体と、対象物中に存在する標的タンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に特異的に結合する部分を含む標識分子を結合させ、前記標識分子を検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項６】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体であって、前記タンパク質が酵素であるタンパク質−ポリマ複合体を、基質に作用させることを特徴とする酵素反応方法。
【請求項７】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体を用いることを特徴とする固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−ポリマ複合体、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマ、ＴＧａｓｅ基質含有モノマ、タンパク質−ポリマ複合体の製造方法、タンパク質の検出方法、酵素反応方法、および固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中には種々のタンパク質が存在するが、特定のタンパク質を検出、定量するための方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が知られている。
ＥＬＩＳＡは、試料中に含まれる抗原等の特定のタンパク質を、酵素標識した抗体を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、免疫検査等において汎用されている手法の１つである。ＥＬＩＳＡには、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等が知られている。
例えば、固相の表面に吸着させた目的物質（抗原）に対する１次抗体を抗原抗体反応により結合させる。未反応の１次抗体を洗い流した後、酵素標識した標識２次抗体を添加して、再び抗原抗体反応により結合させる。ここで未反応の標識２次抗体を洗い流し、発色基質を添加すると、抗原の量に比例して発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計等により測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、抗原の量を定量することができる。
また、高感度の抗原検出法として、ポリマ化抗体等を用いる方法も知られている。
例えば、特許文献１には、デキストラン等のポリマにジビニルスルフォンを反応させてビニル基を導入後、酵素および抗体を反応させることにより酵素、抗体、デキストランの複合体を作製することが記載されている。
特許文献２には、塩基性アミノ基を２個以上有するペプチドポリマ、あるいは、アミノ基、アルデヒド基、ビニル基の少なくとも１つを導入した多糖類を担体として、その担体に２個以上の酵素が結合し、その酵素の少なくとも１個以上に他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵素−タンパク質複合体が記載されている。
特許文献３には、塩基性アミノ酸を多数有するペプチドポリマまたはアミノ基を導入した多糖類を担体として、マレイミド基あるいはチオール基を導入した１分子以上の酵素と、酵素にマレイミド基を導入した場合にはチオール基を、酵素にチオール基を導入した場合にはマレイミド基を導入した担体がそれらの基を介して共有結合し、さらに得られた複合体に残存する少なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入し、抗体あるいは抗体断片上の還元して得たチオール基を介して前記複合体のマレイミド基と共有結合してなる酵素抗体複合体が記載されている。
しかし、上記酵素標識２次抗体や、特許文献１〜３のようなポリマ化抗体等は、いずれも化学結合法によって酵素標識が導入されているため、酵素の活性中心が修飾され、酵素の活性が低下する可能性がある。
また一方、足場となる分子や材料に複数の酵素を複合化した酵素複合体を用いることにより、単体の酵素に比べて酵素反応の効率を向上できることが示されている。例えば、天然のセルロース分解酵素は、強固な結晶構造を有しているセルロースを効率よく分解することができることから、再生可能資源であるセルロース系バイオマスを原料として、バイオ燃料や化学製品を生産する際の触媒として需要が高まっている。その際、非可食性バイオマスを利用することができれば、食料と競合しないため、より望ましい。天然には、セルロソームと呼ばれる酵素複合体を形成してセルロースを効率よく分解する系が存在する。そこで、人工的にセルロソームを模した、人工セルロース分解酵素複合体を作る試みが行われている。
非特許文献１には、足場となる多量体タンパク質に様々な異種セルラーゼを提示して、セルロース分解活性が向上することが記載されている。
非特許文献２には、セルラーゼの触媒ドメインとセルロース結合ドメインを分割し、金属ナノ粒子を足場としてそれぞれを提示すると、セルロース結合ドメインの割合を増やすことでセルロース分解活性が向上することが記載されている。
しかし、非特許文献１，２のような複合体は、巨大タンパク質複合体あるいは金属ナノ粒子のような３次元状のナノ材料を足場としており、合成ポリマのような柔軟な１次元状の高分子材料を足場分子として使っている訳ではない。
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平０６−５０９１６７号公報
【特許文献２】特開２００１−１８１２９９号公報
【特許文献３】特開２０００−０８８８５０号公報
【特許文献４】特開２００８−５４６５８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ  Ｍｉｔｓｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４３，ｐｐ．１３９−１４４（２００９）
【非特許文献２】Ｄｏ−Ｍｙｏｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．６５６−６６４（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、良好な感度で標的タンパク質を検出可能、あるいは酵素反応効率を単体の酵素よりも高めたタンパク質−ポリマ複合体、そのタンパク質−ポリマ複合体を得るために用いられるＴＧａｓｅ基質含有ポリマおよびＴＧａｓｅ基質含有モノマ、そのタンパク質−ポリマ複合体の製造方法、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いるタンパク質の検出方法、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いる酵素反応方法、ならびにそのタンパク質−ポリマ複合体を用いる固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体である。
また、本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマであるＴＧａｓｅ基質含有ポリマである。
また、本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマの製造に用いられる、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するモノマであるＴＧａｓｅ基質含有モノマである。
また、本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマに、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に第一級アミンを有するタンパク質を結合する、または、前記第一級アミンにグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質を結合するタンパク質結合工程を含むタンパク質−ポリマ複合体の製造方法である。
また、本発明は、タンパク質の検出方法であって、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体と、対象物中に存在する標的タンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に特異的に結合する部分を含む標識分子を結合させ、前記標識分子を検出するタンパク質の検出方法である。
また、本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体であって、前記タンパク質が酵素であるタンパク質−ポリマ複合体を、基質に作用させる酵素反応方法である。
また、本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体を用いる、固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明では、良好な感度で標的タンパク質を検出可能、あるいは酵素反応効率を単体の酵素よりも高めたタンパク質−ポリマ複合体、そのタンパク質−ポリマ複合体を得るために用いられるＴＧａｓｅ基質含有ポリマおよびＴＧａｓｅ基質含有モノマ、そのタンパク質−ポリマ複合体の製造方法、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いるタンパク質の検出方法、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いる酵素反応方法、ならびにそのタンパク質−ポリマ複合体を用いる固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、本発明の実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体の製造方法の一例を示す概略図である。
図２は、実施例におけるＺ−ＱＧ−ＥＭＡの１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ基準）を示す図である。
図３は、実施例におけるＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳによる反応追跡（マトリックス；α−ＣＨＣＡ）を示す図である。
図４は、実施例におけるＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳによる反応追跡（陰性対照）を示す図である。
図５は、実施例におけるＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔの１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ基準）を示す図である。
図６は、実施例におけるＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨの１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ基準）を示す図である。
図７は、実施例におけるＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡの１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ基準）を示す図である。
図８は、実施例におけるＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマ（精製後）の１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ基準）を示す図である。
図９は、実施例におけるＧＰＣ測定結果（ＲＩ検出，５ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ＤＭＦ，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ基準）を示す図である。
図１０は、実施例におけるＧＰＣ測定結果（ＵＶ検出（２６９ｎｍ），５ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ＤＭＦ，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ基準））を示す図である。
図１１は、実施例におけるＺ−ＱＧ含有ポリマの１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，重水）を示す図である。
図１２は、実施例において用いたベクターの遺伝子配列を示す図である。
図１３は、実施例において用いたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
図１４は、実施例におけるｐＥＴ２２  Ｋ−ｔａｇ  ｐＧの調製を示す図である。
図１５は、実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応追跡を示す図である。
図１６は、実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭＴＧ架橋反応のｐＨ依存性評価を示す図である。
図１７は、実施例におけるＭＴＧによる架橋化反応のｐＨ依存性評価を示す図である。
図１８は、実施例におけるＥＬＩＳＡの概念図を示す図である。
図１９は、実施例におけるプロテインＧをポリマに集積した効果をＥＬＩＳＡで評価した結果を示す図である。
図２０は、実施例におけるＥＬＩＳＡの概念図を示す図である。
図２１は、実施例におけるプロテインＧ−ポリマハイブリッドによるＥＬＩＳＡ評価を示す図である。
図２２は、実施例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各Ｚ−ＱＧ含有ポリマ（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４）とＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰとのＭＴＧ反応性評価を示す図である。
図２３は、実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＺ−ＱＧ含有ポリマとＫ−ｔａｇ  ＥＧとのＭＴＧ反応性評価を示す図である。
図２４は、実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＺ−ＱＧ含有ポリマと△ＣＢＭ−ＥＧ−ＫｔａｇとのＭＴＧ反応性評価を示す図である。
図２５は、実施例３におけるＺ−ＱＧ含有ポリマ／Ｋ−ｔａｇ  ＥＧ複合体をセルロース基質に作用させた際の還元糖量算出の結果を示す図である。
図２６は、実施例３におけるＺ−ＱＧ含有ポリマ／△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇ複合体をセルロース基質に作用させた際の還元糖量算出の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
タンパク質をポリマ上に一次元集積させるため、ＭＴＧ認識Ｇｌｎ残基またはＭＴＧ認識第一級アミンを側鎖に有するポリマと、ＭＴＧ認識Ｌｙｓペプチドタグ等またはＭＴＧ認識Ｇｌｎペプチドタグを有するタンパク質とを架橋させることを検討した。
本発明者らは、ポリマにタンパク質を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）等のトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、酵素等のタンパク質を導入したタンパク質−ポリマ複合体の創製を行う。ＭＴＧ等は基質認識特性が高いため、ポリマの反応点と酵素等の反応タグ部分を選択的に架橋することができ、酵素等の活性をほとんど低下させずに導入できる。また、ポリマを足場分子とするために、ＤＮＡ等の核酸を足場分子とする場合に比べて、化学的安定性が高く、コモノマとの組み合せにより化学的性質の制御が可能であり、コスト的にも有利である。一般的な高分子重合法に加え、後述する原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）等を用いれば、重合度等の制御が可能である。
例えば、ＭＴＧ認識Ｇｌｎとして、ＭＴＧ活性測定用の汎用Ｇｌｎ基質であるＮ−Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ  ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ  ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｚ−ＱＧ）を有するモノマ（Ｚ−ＱＧ含有モノマ）を合成し、重合することで、または必要に応じてコモノマと共重合することでＺ−ＱＧ含有ポリマを得ることを検討した。Ｚ−ＱＧ含有モノマとコモノマとの組成比を変化させることにより、ＭＴＧ反応における基質認識に適切なＺ−ＱＧ部位間の距離や集積化後のタンパク質同士の距離を制御することができると考えられる。
具体的には、例えば、図１に示すように、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを含むＴＧａｓｅ基質含有モノマであるＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡを合成し、重合させることにより、または必要に応じてコモノマと共重合させることにより、Ｚ−ＱＧを含むＴＧａｓｅ基質含有ポリマであるＺ−ＱＧ含有ポリマを得る。その後、ＭＴＧ等のＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識Ｌｙｓ等のＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓ等を導入した酵素等のタンパク質を結合させることによって、ポリマとタンパク質が１：ｎ（ｎは１以上の整数）であるタンパク質−ポリマ複合体を創製することができる。
このタンパク質−ポリマ複合体は、ターゲットとなる標的タンパク質に結合させた後、結合したタンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に標識部分を含む標識酵素を結合させれば、標的タンパク質の検出反応を行うことができる。また、タンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に標識部分を含む標識酵素を結合させた後、ターゲットとなる標的タンパク質に結合させれば、標的タンパク質の検出反応を行うことができる。これにより、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制等が見込まれる。また、このタンパク質−ポリマ複合体は、カスケード型酵素反応系や協奏的に基質を分解する酵素反応系等に利用することができる。
なお、図１において、Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡ等のＴＧａｓｅ基質含有モノマ、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマにおけるＧｌｎ残基と、タンパク質におけるＬｙｓ残基等の第一級アミンとは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）等を有するＴＧａｓｅ基質含有モノマを合成し、重合させることにより、または必要に応じてコモノマと共重合させることにより、Ｌｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）等を有するＴＧａｓｅ基質含有ポリマを得る。その後、ＭＴＧ等のＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識Ｇｌｎ等のＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した酵素等のタンパク質を結合させることによって、ポリマとタンパク質が１：ｎ（ｎは１以上の整数）であるタンパク質−ポリマ複合体を創製してもよい。
このようにして、酵素等のタンパク質の活性部位への影響を抑制し、ポリマに部位特異的にタンパク質を導入することができる。
なお、本明細書において、「ポリマ」とは、モノマの繰り返し構造を持つ重合体であって、炭素−炭素結合を主な骨格とし、炭素、水素、窒素原子等を含んでなる重量平均分子量が１０，０００以上の大きな有機分子のことをいい、タンパク質、核酸等の「生体高分子」とは異なる。
本実施形態に係るＴＧａｓｅ基質含有モノマは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマの製造に用いられる、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するモノマである。グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するＴＧａｓｅ基質含有モノマとしては、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有し、重合反応によりポリマが得られるものであればよく、特に制限はない。例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、メタクリル酸アミド、アクリル酸アミド、スチレン誘導体等が挙げられる。これらのうち、反応性、合成のしやすさ、後述する原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）に適用可能である、合成のしやすさ等の点から、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルであることが好ましい。
グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルとしては、例えば、下記式（１）の化合物が挙げられる。
2014208776.tif 000003
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。）
ＸおよびＹで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等の炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基等の炭素数２〜４８のアルケニレン基等が挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基であることが好ましく、炭素数１〜４のアルキレン基であることがより好ましく、Ｘはエチレン基、Ｙはメチレン基であることがさらに好ましい。Ｘはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基等で置換されていてもよい。Ｘとしては、例えば、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−Ｃ２Ｈ４−が挙げられる。
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基等の炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基等の炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基等の炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基等の炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基等の炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基等が挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、炭素数７〜１０のアリールアルキルオキシ基であることがより好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがさらに好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基等で置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。
Ｘ，Ｙを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとポリマとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、ポリマとタンパク質間を架橋するＭＴＧ反応の反応性を向上することができる。
上記式（１）のＴＧａｓｅ基質含有モノマにおいて、Ｒ１が水素原子であると、原子移動ラジカル重合等による重合の際、Ｇｌｎ側鎖のアミノ基が配位子として作用する可能性があるため、立体障害の大きな保護基で、保護することが好ましい。
保護基としては、例えば、トリチル基、４−メチルトリチル基、４−メトキシトリチル基、２，４，６−トリメトキシベンジル基、１−シクロプロピル−１−メチルエチル基、ジシクロプロピルメチル基等が挙げられる。
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、上記式（１）のＴＧａｓｅ基質含有モノマのように、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等よりも分子サイズが小さいため好ましい。式（１）で示されるＴＧａｓｅ基質含有モノマにおいて、Ｒ１がトリチル基、Ｒ２がメチル基であり、Ｘがエチレン基、Ｙがメチレン基であり、Ｚがベンジルオキシ基であるＴＧａｓｅ基質含有モノマが、Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡであり、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がメチル基であり、Ｘがエチレン基、Ｙがメチレン基であり、Ｚがベンジルオキシ基であるＴＧａｓｅ基質含有モノマが、Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡである。また、ＴＧａｓｅ基質含有モノマ中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基とＬｙｓ残基または第一級アミンとが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のタンパク質−ポリマ複合体の収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。
ＴＧａｓｅ基質含有モノマと共重合させるコモノマとしては、特に制限はないが、例えば、メタクリル酸、アクリル酸、メタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、メタクリル酸アミド、アクリル酸アミド、アクリルアミド、スチレン、アクリロニトリル、酢酸ビニル等のビニルモノマ等が挙げられる。例えば、比較的疎水性の高いＺ−ＱＧに対して親水性を確保するために、コモノマとしてアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを用いることが好ましい。コモノマは、１種類を用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
また、ＴＧａｓｅ基質含有モノマと共重合させるコモノマとしては、２−メタクリロイルオキシエチル  ホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するモノマ等も挙げられる。
ＴＧａｓｅ基質含有モノマとコモノマとの比率は、適宜調整すればよいが、例えば、ＴＧａｓｅ基質含有モノマ：コモノマ＝３ｍｏｌ：１０００ｍｏｌ〜１ｍｏｌ：２４ｍｏｌの範囲である。
本実施形態に係るＴＧａｓｅ基質含有ポリマは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を側鎖に有するポリマである。ＴＧａｓｅ基質含有ポリマを得るための重合方法としては、特に制限はなく、過酸化物やアゾ化合物を用いたラジカル重合、ニトロキシドを介したラジカル重合（ＮＭＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）、縮合重合法、開環重合法、イオン重合法等が挙げられる。このうち、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）を用いることが好ましい。原子移動ラジカル重合法は、遷移金属錯体を触媒としたリビングラジカル重合であり、分子量や分子量分布の制御、ブロック共重合体の合成、さらには開始剤の種類により線状、星型、ブラシ状等のポリマのアーキテクチャの制御、反応後の末端ハロゲン原子の求核置換反応によりポリマの末端官能基化も可能である。原子移動ラジカル重合法は、スチレン、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリロニトリル等の多様なビニルモノマの制御された重合において、その有効性が知られている。
原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）に用いられる触媒としては、例えば、塩化銅、臭化銅、ヨウ化銅等が挙げられる。これらの遷移金属は、アミン系やイミン系の多座配位子、例えば、２，２’−ビピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン、トリス（２−ピリジルメチル）アミン等による金属錯体とすることで、溶解性を確保し活性を制御された状態で使用される。
原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）に用いられる開始剤としては、原子移動可能な原子を少なくとも一つ有する有機化合物、主にハロゲン化アルキルが用いられる。例えば、２−ブロモイソ酪酸  ２−ヒドロキシエチル、２−クロロイソ酪酸エチル、２−ブロモイソ酪酸メチル、２−クロロイソ酪酸メチル、臭化ベンジル、塩化ベンジル、１−フェニル  エチルブロミド、１−フェニル  エチルクロライド等が挙げられる。
原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）に用いられる溶媒としては、例えば、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、メタノール、エタノール、水等が挙げられる。
ＴＧａｓｅ基質含有モノマおよびＴＧａｓｅ基質含有ポリマの調製方法の一例を後述の実施例に示す。なお、これは、本実施形態に係るＴＧａｓｅ基質含有モノマおよびＴＧａｓｅ基質含有ポリマの調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
ＴＧａｓｅ基質含有モノマ、ＴＧａｓｅ基質含ポリマの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）等により行うことができる。また、ＴＧａｓｅ基質含有モノマの同定は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲ等により行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を側鎖に有するＴＧａｓｅ基質含有ポリマにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されているものである。また、本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、第一級アミンを側鎖に有するＴＧａｓｅ基質含有ポリマにおける第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているものである。
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を側鎖に有するＴＧａｓｅ基質含有ポリマに、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に第一級アミンを有するタンパク質を結合するタンパク質結合工程を含む方法により得られる。また、本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、第一級アミンを側鎖に有するＴＧａｓｅ基質含有ポリマに、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記第一級アミンにグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質を結合するタンパク質結合工程を含む方法により得られる。
タンパク質−ポリマ複合体において、ポリマとタンパク質との比率ｎは、１以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができる。タンパク質−ポリマ複合体を後述する標的タンパク質の検出等に用いる場合、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的タンパク質との抗原抗体反応等の結合の効率が低下する場合がある。
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、第一級アミンとＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合、あるいは、γ−グルタミルアミド結合を形成することにより構成されている。
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。なお、第一級アミンには、有機アミンに加え、例えば、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ等が含まれる。
グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質、第一級アミンを有するタンパク質としては、特に制限はないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、低分子抗体、一本鎖抗体、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン等、他の生体高分子に結合する能力を持つアフィニティ分子、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の酵素等が挙げられる。
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体において、タンパク質が標識部分を有していてもよい。例えば、標識部分を有する標識酵素等の標識タンパク質を、例えばトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマに導入すればよい。標識タンパク質の導入方法としては、例えば、化学修飾法や遺伝子工学的手法等が挙げられる。
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）等が挙げられ、検出感度、取り扱い性等の点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光等の放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体等、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体等が挙げられる。
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ等が挙げられる。
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素等が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。
微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２３）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２５）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素等を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）等が挙げられる。
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素等のタンパク質は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィ等により行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で行うことができる。
標識酵素としては、発色反応等を利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。
タンパク質−ポリマ複合体を比較的高温（例えば、７０℃以上）で用いる場合、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。その場合は、標識酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）を用いてもよい。
また、タンパク質−ポリマ複合体において、タンパク質が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能等の点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有するタンパク質とＴＧａｓｅ基質含有ポリマとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識部分を含むタンパク質のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。
本実施形態においては、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマに対する、結合させるタンパク質のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．５〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。
上記本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体を用いることにより、固液の界面あるいは界面近傍で、当該タンパク質−ポリマ複合体に導入したタンパク質の機能を高めることができる。その例として、上記本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体を用いることにより、固液の界面あるいは界面近傍で良好な感度で標的タンパク質を検出可能なタンパク質の検出方法、および、固液の界面あるいは界面近傍で酵素反応効率を単体の酵素よりも高めた酵素反応方法について、以下説明する。
＜タンパク質の検出方法＞
本実施形態に係るタンパク質の検出方法は、タンパク質−ポリマ複合体と、対象物中に存在する標的タンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に特異的に結合する部分を含む標識分子を結合させ、前記標識分子を検出する方法である。
また、本実施形態に係るタンパク質の検出方法は、標識部分を含むタンパク質−ポリマ複合体と、対象物中に存在する標的タンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合しているタンパク質−ポリマ複合体の標識部分を検出する方法である。
検出対象となるタンパク質としては、例えば、ＩｇＧおよび抗原タンパク質等が挙げられる。本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体によれば、ほぼ全ての動物種の１次抗体を検出可能である。本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、従来の酵素標識二次抗体に比べてＳ／Ｎ比が高い。また、従来の酵素標識二次抗体と検出感度は同等以上であり、汎用性が高い。本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体を用いれば多くの１次抗体と結合可能であり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合でも、それぞれに特異的に結合する抗体を用意しなくてもよく、汎用性が高い。
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体およびタンパク質の検出方法は、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学（免疫染色）等の基礎研究分野や、病理検査分野等に利用することができる。
また、本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、タンパク質以外にも、抗体が結合できる抗原、例えば、ジゴキシゲニン等の低分子抗原、ポリペプチド、核酸、脂質等の検出に用いることができる。
＜タンパク質−ポリマ複合体のその他の利用方法＞
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、タンパク質等の検出以外にも、例えば、カスケード型酵素反応系や協奏的に基質を分解する酵素反応系、例えばセルロースの分解等に利用することができる。
＜酵素反応方法＞
本実施形態に係るタンパク質−ポリマ複合体は、酵素反応に利用することができる。すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）残基または第一級アミンを側鎖に有するポリマにおける前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されている、または、前記第一級アミンに、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体であって、前記タンパク質が酵素であるタンパク質−ポリマ複合体を、基質に作用させる。
酵素としては、例えば、セルロースを加水分解する酵素であるセルラーゼ、水に不溶性の基質に作用する酵素であるキシラナーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。セルラーゼには、セルロース内部の非晶領域をランダムに切断するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セルロースの末端からセロビオース単位に分解するセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）、オリゴ糖を分解してグルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の３種類に分類される。
ポリマに複数の酵素を複合化したタンパク質−ポリマ複合体を用いることにより、単体の酵素に比べて酵素反応の効率を向上させることができる。
【実施例】
【００１０】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
ＭＴＧは味の素（株）製のものを用いた。Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰおよび野生型ＥＧＦＰは大腸菌により調製した組換えタンパク質を用いた。モノマ合成に関する試薬について、Ｚ−ＱＧ−ＯＨ、２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＨＥＭＡ）はシグマ−アルドリッッチより購入した。Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＨＣｌ・Ｇｌｙ−ＯＥｔ、１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）は渡辺化学より購入した。Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（ＴＥＧ）、ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅは東京化成より購入した。ポリマ合成に関する試薬について、ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ｔＢＭＡ）、ＣｕＣｌ、ｔｒｉｓ［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｅ（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ２−ｂｒｏｍｏｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ、２−メタクリロイルオキシエチル  ホスホリルコリン（ＭＰＣ）はシグマ−アルドリッチより購入し、ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、２，２’−ａｚｏｂｉｓ（ｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）（ＡＩＢＮ）、無水トルエンは和光純薬より購入した。Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲｅａｄｙＣａｌ  ｓｅｔはシグマ−アルドリッチより購入し、ＬｉＢｒ・Ｈ２Ｏ、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＦＡ）は和光純薬より購入した。１０−２０％グラジエントゲル（ｅ−ＰＡＧＥＬ（登録商標）Ｅ−Ｒ１０２０Ｌ）はＡＴＴＯより購入した。その他の試薬は特筆しない限り、市販のものを用いた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定はＡＶ３００Ｍ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）を用いた。ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）は高速液体クロマトグラフ装置ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（ポンプ；Ｌ２１３０、示差屈折率検出器；Ｌ−２４９０、紫外検出器；Ｌ−２４５５、日立）を用いて行った。マトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）は、Ａｕｔｏｆｌｅｘ−ＩＩＩ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）を用いた。なお、以下の実施例において、室温とは、１８℃〜２８℃のことである。
＜実施例１＞
［Ｚ−ＱＧ含有モノマのＭＴＧに対する反応性評価］
Ｚ−ＱＧ含有モノマのＧｌｎ基質としての反応性を評価するために、モデルタンパク質として、遺伝子工学的手法によりＫ−ｔａｇ（ＭＲＨＫＧＳ）を導入した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を用いてＭＴＧの触媒反応を行った。そこで、まずＺ−ＱＧ含有モノマＺ−ＱＧ−ＥＭＡの合成を行った。
（Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡの合成）
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２００ｍＬナスフラスコにＺ−ＱＧ−ＯＨ（０．２０ｇ，０．５９ｍｍｏｌ）を入れてＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）（６．５ｍＬ）を加え、氷冷し、ＨＥＭＡ（０．１７ｇ，１．３ｍｍｏｌ，２．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えた。ＤＣＣ（０．１５ｇ，０．７１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）、ＨＯＢｔ（０．１１ｇ，０．７３ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えた。ＤＭＡＰ（１５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ，０．２１ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えて徐々に室温へと昇温し、室温で４時間撹拌した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により反応追跡を行い、原料の消失を確認した。反応溶液に生成した白色沈殿を吸引濾過で除き、溶媒を減圧留去し、生成物を酢酸エチルに溶解させた。１０％クエン酸水溶液を加え、室温で撹拌し、酢酸エチルにより２回抽出を行った。有機相を５％炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。
フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ＝１：１０（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより生成物の同定を行った。
生成物は白色粉末（収量；２５ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ，収率；１０％）であり、その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図２および表１に示す。またＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ；ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）の結果は次の通りである。以上の結果からＺ−ＱＧ−ＥＭＡの生成が確認された。
［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値；４５０．４６，実測値；−），［Ｍ＋Ｎａ］＋（理論値；４７２．４４，実測値；４７２．０６）
【表１】
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（ＭＴＧによるＺ−ＱＧ−ＥＭＡとＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰの架橋化）
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Ｚ−ＱＧ含有モノマがＭＴＧにＧｌｎ基質として認識されるかを検討するため、ＭＴＧを用いてＺ−ＱＧ−ＥＭＡとＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰの架橋化を行った。各試薬の組成については表２に示す。反応時間を２時間、反応温度を２５℃とし、５，６０，１２０分後に分取した反応液に対して１％ＴＦＡ水溶液を４倍量加えることで反応を停止させ、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより反応追跡を行った。
陰性対照としてＭＴＧを添加していないサンプルおよびＫ−ｔａｇを導入していない野生型ＥＧＦＰを添加したサンプルについても同様の実験を行った。
【表２】
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各反応時間におけるＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ測定の結果を図３、図４および表３に示す。Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰに対してＺ−ＱＧ−ＥＭＡ  １分子（Ｍｗ４４９．４５）が結合した分子（ＥＭＡ−ＥＧＦＰ）の分子量に相当するピークが出現したことから、Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡがＭＴＧのＧｌｎ基質として認識され、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰに導入されることを確認した。また反応開始から６０分後においてＥＭＡ−ＥＧＦＰのピークのみが検出されたことから、効率よくＭＴＧの反応が進行することが明らかとなった。この際、Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡが２分子以上結合した分子量のピークは検出されなかった。またＭＴＧを添加しない場合および野生型ＥＧＦＰを用いた場合にはマススペクトルに変化がなかった。以上の結果から、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰのＫ−ｔａｇ特異的にＺ−ＱＧ−ＥＭＡが導入されたことが強く示唆された。
【表３】
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＜ＭＴＧ認識グルタミン残基（Ｇｌｎ）を有するモノマ（Ｚ−ＱＧ含有モノマ）の合成＞
ＭＴＧ認識グルタミン残基（Ｇｌｎ）を有するモノマ（Ｚ−ＱＧ含有モノマ）を下記反応式の通り、３段階で合成した。Ｚ−ＱＧ含有モノマであるＺ−ＱＧ−ＥＭＡは、原子移動ラジカル重合によるポリマ化の際、Ｇｌｎ側鎖のアミノ基が配位子として作用することが懸念される。したがって立体障害の大きなＴｒｉｔｙｌ基でＧｌｎ側鎖のアミノ基を保護したモノマＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡを合成した。
2014208776.tif 000009
（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔの合成）
２００ｍＬナスフラスコにＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．０ｇ，１．９ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ・Ｇｌｙ−ＯＥｔ（０．５４ｇ，３．９ｍｍｏｌ，２．１ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）を入れてＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（１．４ｍＬ，８．１ｍｍｏｌ，４．３ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）を加えて氷冷した。ＥＤＣ（０．４４ｇ，２．３ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、ＨＯＢｔ（０．３５ｇ，２．３ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）を少量のＤＭＦに溶解させてから先の溶液にゆっくりと加えた。徐々に室温へと昇温し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応追跡を行い、原料の消失を確認した。
反応溶液に１０％クエン酸水溶液を加え、室温で撹拌し、酢酸エチルにより２回抽出を行った。有機相を５％炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。
フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ＝５：６（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより同定を行った。
生成物は白色粉末（収量；０．５８ｇ，０．９５ｍｍｏｌ，収率；５０％）であり、その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図５および表４に示す。またＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ；ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）の結果は次の通りである。以上の結果からＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔの生成が確認された。
［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値；６０８．７０，実測値；−），［Ｍ＋Ｎａ］＋（理論値；６３０．６９，実測値；６３０．４５），［Ｍ＋Ｋ］＋（理論値；６４６．７９，実測値；６４６．４４）
【表４】
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（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨの合成）
１００ｍＬナスフラスコにＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔ（０．４０ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）を入れ１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（８．０ｍＬ）に溶解させ、メタノール（２．０ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．６６ｍＬ，０．６６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔ）を加え、室温で５０分間撹拌した。
反応溶液に０．０１Ｍ塩酸を加え、ｐＨ４とし、室温で撹拌し反応を停止させた。溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルに溶解させて１０％クエン酸水溶液で洗浄し、酢酸エチルによる抽出を２回行った。次いで飽和食塩水により洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。生成物をＴＬＣにより調べたところ原料の残留が確認されたので、生成物の入った１００ｍＬナスフラスコに１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（５．０ｍＬ）に溶解させ、メタノール（１．０ｍＬ）、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．１６ｍＬ，０．６４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＥｔ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応追跡を行い、原料の消失を確認した。
反応溶液に１０％クエン酸水溶液を加え、室温で撹拌し、酢酸エチルにより２回抽出を行った。次いで飽和食塩水により洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。
フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，（１）ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝２０：１（ｖ／ｖ），（２）ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１５：１（ｖ／ｖ），（３）ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１０：１（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより同定を行った。またＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳによりカラムクロマトグラフィで得られたフラクション１の同定を行った。
生成物は白色粉末（収量；０．１４ｇ，０．２５ｍｍｏｌ，収率；３８％）であり、その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図６および表５に示す。またＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ；ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）の結果は次の通りである。
生成物；［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値；５８０．６５，実測値；−），［Ｍ＋Ｎａ］＋（理論値；６０２．６３，実測値；６０２．３９），［Ｍ＋Ｋ］＋（理論値；６１８．７４，実測値；６１８．３７）
フラクション１；［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値；５９４．２６，実測値；−），［Ｍ＋Ｎａ］＋（理論値；６１６．２４，実測値；６１６．４６），［Ｍ＋Ｋ］＋（理論値；６３２．２２，実測値；６３２．４５）
以上の結果からＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨの生成が確認された。またフラクション１はＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳから下記のＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＭｅであると示唆される。このＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＭｅの生成を避けるために、反応溶媒を１，４−ｄｉｏｘａｎｅ／ｍｅｔｈａｎｏｌ系から１，４−ｄｉｏｘａｎｅ／ｅｔｈａｎｏｌ系に変更してもよい。
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【表５】
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（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡの合成）
２００ｍＬナスフラスコにＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨ（０．１０ｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を入れて、ＴＨＦ（７ｍＬ）を加え、氷冷した。ＨＥＭＡ（０．０５６ｇ，０．４３ｍｍｏｌ，２．４ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨ）を加えた。ＤＣＣ（０．０４６ｇ，０．２２ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨ）、ＨＯＢｔ（０．０３２ｇ，０．２１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨ）を少量のＴＨＦに溶解させてから先の溶液にゆっくりと加えた。ＤＭＡＰ（３．５ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ，０．２ｅｑ．／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＯＨ）を加えて徐々に室温へと昇温し、室温で１９時間半撹拌した。ＴＬＣにより反応追跡を行い、原料の消失を確認した。
反応溶液に生成した白色沈殿を吸引濾過により除去し、溶媒を減圧留去し、生成物を酢酸エチルに溶解させた。１０％クエン酸水溶液を加え、室温で撹拌し、酢酸エチルにより２回抽出を行った。有機相を５％炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。
フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，（１）ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ＝３：２（ｖ／ｖ），（２）ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ＝１：１（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ，ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳおよび元素分析により同定を行った。
生成物は白色粉末（収量；６７ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ，収率；５５％）であり、その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図７および表６に示す。またＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ；ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）の結果は次の通りである。
［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値；６９２．７８，実測値；−），［Ｍ＋Ｎａ］＋（理論値；７１４．７６，実測値；７１４．６２），［Ｍ＋Ｋ］＋（理論値；７３０．８７，実測値；７３０．６１）
元素分析の結果を表７に示す。１ＨＮＭＲスペクトルよりＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡ：ＤＭＦ＝１：０．０３（ｍｏｌ／ｍｏｌ）となることから、Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡ＋０．５Ｈ２Ｏ＋０．０３ＤＭＦであれば誤差０．３％以内となり、測定値と一致する。以上の結果からＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡの生成が確認された。
【表６】
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【表７】
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［ＭＴＧ認識Ｇｌｎを有するポリマ（Ｚ−ＱＧ含有ポリマ）の合成］
ＭＴＧの基質認識およびタンパク質の機能保持の観点から、ＭＴＧの反応点となるＺ−ＱＧ部位はある程度の間隔を保つことが望ましいと考えられる。そこで下記反応式の通り、ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ｔＢＭＡ）との共重合化を行い、Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡとｔＢＭＡから構成されるポリマ（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマ）の合成を行った。次いでＧｌｎの側鎖の保護基であるＴｒｉｔｙｌ基およびｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ基を脱保護することによってＺ−ＱＧ−ＥＭＡとｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅから構成されるポリマ（Ｚ−ＱＧ含有ポリマ）を合成した。
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（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマの合成）
Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡ／Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有モノマ＝４％、重合度５０となるよう原子移動ラジカル重合を以下の手順で行った。重合度を５０とした理由として、１ＨＮＭＲにおいて開始剤由来ピークの積分値とポリマ主鎖由来ピークの積分値の比から、簡便に重合度の算出が可能なことが挙げられる。各試薬の終濃度については表８に示す。
【表８】
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１０ｍＬシュレンク管ＡにＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡ（４４．７ｍｇ，０．０６４６ｍｍｏｌ），ＣｕＣｌ（３．５２ｍｇ，０．０３５６ｍｍｏｌ）を入れ、セプタム栓で密閉し、アルゴン置換を行った。１０ｍＬシュレンク管Ｂおよび１０ｍＬ試験管Ｃにセプタム栓をし、同様にアルゴン置換を行った。シュレンク管ＡにｔＢＭＡ（２５０μＬ，１．５４ｍｍｏｌ），無水ｔｏｌｕｅｎｅ（５０μＬ）を加えた。シュレンク管Ｂに２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ２−ｂｒｏｍｏｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ（５０μＬ，０．３４５ｍｍｏｌ），無水ｔｏｌｕｅｎｅ（１．０３ｍＬ）を入れた。シュレンク管Ａ，Ｂをそれぞれ３回凍結脱気行った。試験管ＣにＭｅ６ＴＲＥＮ（ｔｒｉｓ［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｅ：１００μＬ，０．３７４ｍｍｏｌ），無水ｔｏｌｕｅｎｅ（１．０７ｍＬ）を入れ、アルゴンバブリングした。試験管Ｃの溶液３００μＬをシュレンク管Ａに加え、再び凍結脱気行った。シュレンク管Ａを９０℃のオイルバスに浸け、略均一な溶液になったところでシュレンク管Ｂの溶液１００μＬをシュレンク管Ａに加え、反応を開始した。２２時間後、系を開放し反応停止させた。得られた緑褐色の固体をＴＨＦに溶解させ、シリカカラムに通し、十分量のｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅを流すことで緑色沈殿を除去した。溶媒を減圧留去し、淡黄色固体を得た。１ＨＮＭＲにより生成物の同定を行った。
得られた淡黄色固体を少量のＴＨＦ（１５０μＬ）に溶解させ、冷却したｍｅｔｈａｎｏｌ：水＝４：１（ｖ／ｖ）の混合溶媒に滴下し、ボルテックスによる撹拌後、遠心分離（８０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）を行い、上澄みを除去した。この操作を５回繰り返し、一晩凍結乾燥することで白色粉末を得た。１ＨＮＭＲにより生成物の同定を行った。さらにＧＰＣにより生成物の分子量および分子量分布の測定を行った。ＧＰＣは、検出；示差屈折率（ＲＩ）および紫外（ＵＶ，２６９ｎｍ）検出器、溶離液；５ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ＤＭＦ、流速；１．０ｍＬ／ｍｉｎにて行い、ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅを基準として分析を行った。
粗生成物は淡黄色固体（収量；１５１ｍｇ）であり、精製後の生成物は白色粉末（収量；７６ｍｇ）であった。その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図８および表９に示す。沈殿操作により残存モノマ（Ｚ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ−ＥＭＡおよびｔＢＭＡ）が除去されたことを確認した。また積分値からポリマ鎖に対してＺ−ＱＧは４％程度導入されていると予想される。
【表９】
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ＧＰＣにより生成物の分子量および分子量分布の測定を行った結果を図９，１０および表１０，１１に示す。
【表１０】
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【表１１】
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重合度５０のＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマ（理論分子量；８．２ｋＤａ）の生成を目指して合成を行ったが、高分子量成分のポリマの生成が確認された。ＲＩ、ＵＶのいずれの検出においても同様に３つの分子量分布が確認されたため、３種類のＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマが生成したことが明らかとなった。ポリマ合成のスケールが０．７ｍＬと小スケールであったために、不均一な反応が系内で起こった可能性が考えられる。
（Ｚ−ＱＧ含有ポリマの合成）
得られたＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマのＧｌｎ残基の保護基であるＴｒｉｔｙｌ基、またコモノマのｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ基の脱保護を行った。
２５ｍＬナスフラスコにＺ−Ｑ（Ｔｒｔ）Ｇ含有ポリマ（６０ｍｇ）を入れ、ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（５ｍＬ），ＴＦＡ（５．０ｍＬ）を加え、４０℃のオイルバス中で２２時間撹拌した。ロータリーエバポレーションによって濃縮し、冷却したｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒに滴下し、ボルテックスによる撹拌後、遠心分離（８０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）を行い、上澄みを除去した。この操作を５回繰り返し、淡褐色固体が得られた。アンモニア水（ｐＨ１１）に溶解させ、一晩凍結乾燥することで白色粉末を得た。１ＨＮＭＲにより生成物の同定を行った。
生成物は白色粉末（収量；３９ｍｇ）であり、その１ＨＮＭＲスペクトルとその帰属を図１１および表１２に示す。Ｔｒｉｔｙｌ基およびｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ基由来のピークの消失を確認した。また積分値からポリマ鎖に対してＺ−ＱＧは２％程度導入されていると予想される。Ｚ−ＱＧの含有率が変化したのは、沈殿操作に用いた溶媒（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）に溶解しやすいＺ−ＱＧ含有率の高いオリゴマが除かれたためであると示唆される。また脱保護前と同様に開始剤由来のシグナルは確認できなかった。
【表１２】
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［プロテインＧへのＫ−ｔａｇの導入］
（組換えプロテインＧ（Ｋ−ｔａｇ  ｐＧ）の発現と精製）
用いたベクターの遺伝子配列（配列番号２６）およびタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２７）を、それぞれ図１２，１３に示す。Ｋ−ｔａｇ配列とｐＧ配列の間に、トロンビン認識配列（ＬＶＰＲＧＳ）を導入しており、Ｋ−ｔａｇ  ｐＧをトロンビンで処理することで、対照実験に用いるＫ−ｔａｇが導入されていない野生型ｐＧを容易に調製できる。
用いたベクターは、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ遺伝子を人工合成したものを、２種類の制限酵素、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩでｐＥＴ２２ｂ＋ベクターに組換えて調製した。ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧのＣ末端側に、インバースＰＣＲ法を用いて、Ｋ−ｔａｇ配列およびトロンビン認識配列を導入した（図１４）。また、トロンビン認識配列を含んだＫ−ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを最初から人工合成遺伝子として合成して、制限酵素を用いてｐＥＴ２２プラスミドベクターに組換えてもよい。
調製したベクターからＫ−ｔａｇ  ｐＧを、大腸菌（ＢＬ２１株）を用いて発現させた。ベクターが形質転換された大腸菌（ＢＬ２１株）は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（３０ｍＬ）にて前培養を３７℃、２００ｒｐｍで一晩行った。次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（１Ｌ）にて３７℃、２００ｒｐｍで６００ｎｍにおける吸光度が０．５〜０．６となるまで培養を行い、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。その後、２７℃、２００ｒｐｍで８時間培養を行った。得られた菌体は回収後、超音波破砕し、フィルタ濾過およびＮｉ−ＮＴＡカラムによりＨｉｓ−ｔａｇ精製し、限外濾過（分画分子量：１０ｋＤａ）によって濃縮後、ＰＤ−１０カラムによって１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換を行い、−８０℃にて保存した。Ｋ−ｔａｇ  ｐＧのタンパク質濃度はｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ（ＢＣＡアッセイ）により、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて算出した。発現および単離精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド、泳動条件；２００Ｖ，２０ｍＡ，７０ｍｉｎ）を行い、ＣＢＢ染色により確認した。
また、下記の通り、精製後のＫ−ｔａｇ  ｐＧにトロンビン処理を行うことでＫ−ｔａｇを導入していない野生型ｐＧの調製も行った。Ｋ−ｔａｇ  ｐＧ  １ｍｇに対してトロンビン１０ｕｎｉｔとなるように加え、２５℃で６時間反応させた。Ｎｉ−ＮＴＡカラムによりＨｉｓ−ｔａｇ精製し、素通り画分を回収後、ベンズアミジンカラムによりトロンビンを除去した。その素通り画分を限外濾過（分画分子量：５ｋＤａ）によって濃縮後、ＰＤ−１０カラムによって１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換を行い、−８０℃にて保存した。Ｋ−ｔａｇ  ｐＧのタンパク質濃度はＢＣＡアッセイにより、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて算出した。単離精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド、泳動条件；２００Ｖ，２０ｍＡ，７０ｍｉｎ）を行い、ＣＢＢ染色により確認した。
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［ＭＴＧによるＫ−ｔａｇプロテインＧとＺ−ＱＧ含有ポリマの架橋化］
下記の通り、ＭＴＧを用いてＫ−ｔａｇ  ｐＧとＺ−ＱＧ含有ポリマとの架橋化を行った。
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各試薬の組成については表１３に示す。ただしＺ−ＱＧ含有ポリマの濃度については、Ｚ−ＱＧ含有率が２％としてＺ−ＱＧ換算で調製した。反応時間を６時間、反応温度を２５℃とし、分取した反応液に対して２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、９４℃で１５分間加熱することで反応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％グラジエントゲル、泳動条件；２００Ｖ，２０ｍＡ，９５ｍｉｎ）を行い、ＣＢＢ染色により確認した。
陰性対照としてＭＴＧを添加していないサンプルおよびＫ−ｔａｇを導入していない野生型ｐＧを添加したサンプルについても同様の実験を行った。
【表１３】
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ＭＴＧによるＫ−ｔａｇ  ｐＧとＺ−ＱＧ含有ポリマの架橋化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより追跡した（図１５）。その結果、陰性対照のサンプルにおいてはバンドに変化が見られなかった。一方、ＭＴＧによってＺ−ＱＧ含有ポリマと反応を行ったサンプルにおいてはＫ−ｔａｇ  ｐＧのバンド強度が減少し、高分子量側に新たなブロードなシグナルが確認された。したがってＺ−ＱＧ含有ポリマに対してＫ−ｔａｇ  ｐＧの導入が可能なことが明らかとなった。
（ＭＴＧによる架橋化反応のｐＨ依存性評価）
Ｋ−ｔａｇ  ｐＧとＺ−ＱＧ含有ポリマとの間の架橋化反応におけるｐＨ依存性を評価するために、異なるｐＨ、緩衝剤の緩衝液中でＭＴＧの触媒反応を行った。各試薬の組成については表１４に示す。ただしＺ−ＱＧ含有ポリマの濃度については、Ｚ−ＱＧ含有率が２％としてＺ−ＱＧ換算で調製した。
【表１４】
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反応時間を３時間、反応温度を２５℃とし、分取した反応液に対して２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、９４℃で１５分間加熱することで反応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％グラジエントゲル、泳動条件；２００Ｖ，２０ｍＡ，９５ｍｉｎ）を行い、ＣＢＢ染色により確認した（図１６）。
陰性対照としてＭＴＧを添加していないサンプルについても同様の実験を行った。画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊを用いてＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンド強度を定量し、Ｋ−ｔａｇ  ｐＧのバンド強度減少分からＫ−ｔａｇ  ｐＧの反応率を算出した。なおバンド強度の算出にあたっては１つのバンドにつき計５回の解析を行い、平均値を用いた。
図１６の各レーンによってＫ−ｔａｇ  ｐＧのバンド強度および反応生成物のバンド強度に差が見られることから、ｐＨによってＭＴＧの反応性が異なることを確認した。また反応生成物が見られたレーンにおいては、高分子量側と低分子量側の２種類の反応生成物のうち、高ｐＨになるほど低分子量側の反応生成物の割合が増加した。このようにｐＨによって反応生成物が変化することに関して、現時点で詳しいことは分かっていない。クエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）においては高分子量側の反応生成物のみが得られており、これがＺ−ＱＧ含有ポリマに対してＫ−ｔａｇ  ｐＧが複数分子架橋したものであると仮定してＥＬＩＳＡを行い、タンパク質集積化の効果が見られるか検討を行った。
また、ＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像解析によって算出した、各ｐＨにおけるＫ−ｔａｇ  ｐＧの反応率を図１７に示す。同じｐＨであっても、緩衝種によって、ＭＴＧの反応性が変化することが明らかとなった。ＭＴＧの活性発現にはＣａ２＋等の金属イオンはなくてもよいため、緩衝種には依存しないことが予想されたが、ｐＧ−Ｚ−ＱＧ含有ポリマ間の架橋に際しては、緩衝種の影響が存在すると考えられる。
［ＥＬＩＳＡ法によるプロテインＧ−ポリマハイブリッドの機能評価］
ポリマへのプロテインＧ（ｐＧ）の集積化の効果を示すために、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）をモデル抗原としてＥＬＩＳＡを行った。本検討におけるＥＬＩＳＡの概念図を図１８に示す。
まずｐＧ−ポリマハイブリッド（ｐＧ−ポリマ複合体）の調製を行った。各試薬の組成については表１５に示す。ただしＺ−ＱＧ含有ポリマの濃度については、Ｚ−ＱＧ含有率が２％としてＺ−ＱＧ換算で調製した。反応時間を６時間、反応温度を２５℃とし、ＭＴＧの触媒反応を行った。終濃度１ｍＭとなるようにＮ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）を加えることで反応を停止させ、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）で１０００倍希釈して、ｐＧ−ポリマハイブリッド溶液（ｐＧ濃度０．０１μＭ）を調製した。
陰性対照としてＫ−ｔａｇを導入していない野生型ｐＧを添加したサンプルおよびＫ−ｔａｇ  ｐＧのみを添加したサンプルについても同様に調製を行った。
【表１５】
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ＥＬＩＳＡの操作手順は次の通りに行った。９６穴イムノプレートに５０μｇ／ｍＬ  ＯＶＡ水溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄した（５回／ｗｅｌｌ）。プレートへの非特異吸着を抑制するため２％ウシ血清アルブミン／ＴＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間静置し、ブロッキング後、ＴＢＳＴで洗浄した（５回／ｗｅｌｌ）。Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＧ（Ｒａｂｂｉｔ由来）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間静置した後、ＴＢＳＴで洗浄した（５回／ｗｅｌｌ）。調製したｐＧ−ポリマハイブリッド溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間静置した後、ＴＢＳＴで洗浄した（５回／ｗｅｌｌ）。ＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ＩｇＧを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間静置した後、ＴＢＳＴで洗浄した（５回／ｗｅｌｌ）。３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で３７０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）の時間変化を３０分間測定した。
陰性対照を含む計８サンプルについても同様の実験を行った（表１６）。
【表１６】
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図１９に、各サンプルの３７０ｎｍにおける吸光度変化を示す。陰性対照として用いたＫ−ｔａｇを導入していない野生型ｐＧを添加したサンプルおよびＫ−ｔａｇ  ｐＧのみを添加したサンプルでは、３７０ｎｍにおける吸光度変化（ｄＯ．Ｄ．／ｍｉｎ）は０．０３以下であるのに対して、ｐＧ−ポリマハイブリッドを形成していると考えられるＫ−ｔａｇ  ｐＧのサンプルでは、約０．２と大きな差が見られた（Ｎｏ．８）。これは、Ｚ−ＱＧ含有ポリマ上のＡｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＧに結合していないｐＧに対してＨＲＰ標識ＩｇＧが結合することができ、結果としてｐＧ−ポリマハイブリッドが多数の酵素で標識されたためであると考えられる。したがって、今回調製したｐＧ−ポリマハイブリッドには、ｐＧが複数個存在している、つまりＺ−ＱＧ含有ポリマに対してＫ−ｔａｇ  ｐＧが集積化されていたことが示唆された。また、ＯＶＡ、Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＧ、ｐＧの３つが存在しているサンプルにおいてのみ強いシグナルが見られたことから、この結果が物理吸着等の非特異吸着によるものではなく、ｐＧが特異的にＡｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＧと結合した結果によるものであることを確認した。
［ＥＬＩＳＡ法によるプロテインＧ−ポリマハイブリッドの効果の評価］
プロテインＧ（ｐＧ）−ポリマハイブリッドの優位性を示すため、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）をモデル抗原としてＥＬＩＳＡを行った。本検討におけるＥＬＩＳＡの概念図を図２０に示す。
ｐＧ−ポリマハイブリッドは０１４５と同様に調製した。
対照として、市販のＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧを用いた。
ＥＬＩＳＡの操作手順は、０１４８と同様に行った。ただし、対照の市販のＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧについては、ｐＧ−ポリマハイブリッドを使用する代わりに反応系に加えた。
陰性対照を含む計８サンプルについても同様の実験を行った（表１７）。
【表１７】
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図２１に各サンプルの３７０ｎｍにおける吸光度変化（ｄＯ．Ｄ．／ｍｉｎ）を示す。ｐＧ−ポリマハイブリッドの吸光度変化は約０．１８で、対照として用いた市販のＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧと比べほぼ等しい吸光度変化を示した（Ｎｏ．８）。しかし、それぞれの抗原が存在しなかった場合の陰性対照（Ｎｏ．４）と比較した場合、市販のＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧは約０．０４２のバックグラウンドを示しているのに対し、ｐＧ−ポリマハイブリッドは０．０１以下で、バックグラウンドを低くすることができた。
Ｎｏ．４とＮｏ．８の結果を比較すると、今回調製したｐＧ−ポリマハイブリッドのＳ／Ｎ比は約２３であり、市販のＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体のＳ／Ｎ比（約４．６）に比べて、高かった。
＜実施例２＞
（Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡの合成２）
２００ｍＬナスフラスコにＺ−ＱＧ−ＯＨ（０．５１ｇ，１．５ｍｍｍｏｌ）を入れて、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（無水ＤＭＦ）（１５ｍＬ）、ＨＥＭＡ（０．３９ｇ，３．０ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加え、氷冷した。ＤＣＣ（０．３７ｇ，１．８ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）、ＨＯＢｔ（０．２９ｇ，１．９ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えた。ＤＭＡＰ（３７ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ，０．２１ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えて徐々に室温へと昇温し、４０℃で２０時間撹拌した。反応溶液に生成した白色固体を吸引濾過で除き、溶媒を減圧留去した。生成物をｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、酢酸エチルを有機層として１０％クエン酸水溶液、次いで５％炭酸水素ナトリウム水溶液により洗浄を行った。さらに飽和食塩水により洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲにより生成物の同定を行った。生成物は白色粉末（収量；０．６３ｇ，収率；９３％）であった。このように、分液操作のみでＺ−ＱＧ−ＥＭＡを回収できた。
（ＴＥＧＭＡの合成）
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３００ｍＬ三口ナスフラスコにＴＥＧ（３．４ｍＬ，２６ｍｍｏｌ）、ａｎｈｙｄｏｒｏｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ（２．１ｍＬ，２６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ／ＴＥＧ）を入れて、ａｎｈｙｄｏｒｏｕｓ  ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（無水ＤＣＭ）（８０ｍＬ）を加え、Ａｒバブリングしながら室温で３０分間撹拌した。反応容器を氷冷し、Ａｒ雰囲気下でｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２．４ｍＬ，２５ｍｍｏｌ，０．９６ｅｑ．／ＴＥＧ）を滴下し、氷浴中で２時間撹拌した。徐々に室温へと昇温し、Ａｒ雰囲気下でさらに２時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、生成物を酢酸エチルに懸濁させた。シリカゲルを加え、ロータリーエバポレーションを行い、生成物をシリカに吸着させた。フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝７：３（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、無色透明の液体を得た。１ＨＮＭＲにより生成物の同定を行った。
生成物は無色透明の液体（収量：２．２ｇ，収率：６９％）であり、１ＨＮＭＲより、副生成物であるＴＥＧＤＭＡの除去を確認した。純度８３％として以降の実験に用いた。
（Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡの合成）
５０ｍＬナスフラスコＺ−ＱＧ−ＯＨ（０．５０ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を入れて、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（無水ＤＭＦ）（１５ｍＬ）、ＴＥＧＭＡ（０．４４ｇ，１．７ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加え、Ａｒバブリングしながら氷冷した。ＤＣＣ（０．３７ｇ，１．８ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）、ＨＯＢｔ（０．２８ｇ，１．８ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えた。ＤＭＡＰ（３７ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ，０．２１ｅｑ．／Ｚ−ＱＧ−ＯＨ）を加えて徐々に室温へと昇温し、Ａｒ雰囲気下４０℃で２３時間撹拌した。反応溶液に生成した白色固体を吸引濾過で除き、溶媒を減圧留去し、生成物を酢酸エチルに溶解させた。１０％クエン酸水溶液を加え、室温で撹拌し、酢酸エチルにより２回抽出を行った。次いで５％炭酸水素ナトリウム水溶液により洗浄を行った。さらに飽和食塩水により洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。生成物をｍｅｔｈａｎｏｌ／ＤＣＭ混合溶液に溶解させ、シリカゲルを加え、ロータリーエバポレーションを行い、生成物をシリカに吸着させた。フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル，ｍｅｔｈａｎｏｌ：ＤＣＭ＝１：１５（ｖ／ｖ））による精製後、溶媒を減圧留去し、白色粉末を得た。１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹにより生成物の同定を行った。
生成物は白色粉末（収量：０．５５ｇ，収率：４０％）であり、１ＨＮＭＲ，１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおいて帰属できたことから、Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡの生成を確認した。また、Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡと比較して溶解性も向上しており、ＤＭＦやＤＭＳＯのみならず、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍやＤＣＭなどの溶媒にも溶解した。
（Ｚ−ＱＧモノマとＡｃｒｙｌａｍｉｄｅまたはＭＰＣとの共重合）
Ｚ−ＱＧモノマとしてＺ−ＱＧ−ＥＭＡおよびＺ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡを、水溶性のコモノマとしてＡｃｒｙｌａｍｉｄｅおよび２−メタクリロイルオキシエチル  ホスホリルコリン（ＭＰＣ）を選択し、フリーラジカル共重合によってＺ−ＱＧポリマの合成を行った。Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅは非イオン性のモノマとして用いた。ＭＰＣは両性イオンのモノマとして用いた。また、ＭＰＣポリマにはタンパク質の非特異吸着抑制の効果が知られており、ＥＬＩＳＡへの応用の際にバックグラウンドを抑え、Ｓ／Ｎ比の向上につながると考えられる。
（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅとの共重合）
Ｚ−ＱＧモノマ（Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡおよびＺ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡ）それぞれとＡｃｒｙｌａｍｉｄｅとの共重合を行った。
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ミクロチューブに、各試薬を表１８に示す量を加え３０分間Ａｒバブリングした後、ミクロチューブを密閉した。６０℃のオイルバスに浸け、５６時間（Ｚ−ＱＧ−ＥＭＡの場合）または２４時間（Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡの場合）撹拌した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で反応液を希釈し、冷ａｃｅｔｏｎｅに再沈殿させ、真空乾燥させた。生成物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水またはＤＭＳＯ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、凍結乾燥することで白色粉末を得た。１ＨＮＭＲにより同定を行った。
【表１８】
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合成した各Ｚ−ＱＧ含有ポリマの収率および１ＨＮＭＲより算出したコポリマの組成を表１９に示す。フリーラジカル共重合により、Ｚ−ＱＧ含有ポリマにおけるＺ−ＱＧ含有率を任意に制御できるようになり、ポリマの合成が容易になった。
【表１９】
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（ＭＰＣとの共重合）
Ｚ−ＱＧモノマ（Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡ）とＭＰＣとの共重合を行った。
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ＭＰＣに含まれる重合禁止剤を除去するため、冷ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅで数回ＭＰＣをデカンテーション後、［ＭＰＣ］＝２Ｍのｍｅｔｈａｎｏｌ溶液を調製した。
ミクロチューブに、各試薬を表２０に示す量加え、３０分間Ａｒバブリングした後、ミクロチューブを密閉した。６０℃のオイルバスに浸け、２４時間撹拌した。ｍｅｔｈａｎｏｌで反応液を希釈し、冷ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍに再沈殿させ、真空乾燥させた。生成物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、凍結乾燥することで白色粉末を得た１ＨＮＭＲにより同定を行った。
【表２０】
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合成したＺ−ＱＧ含有ポリマの収率および１ＨＮＭＲより算出したコポリマの組成を表２１に示す。
【表２１】
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（Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰの調製）
Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰおよび野生型ＥＧＦＰは大腸菌により調製した組換えタンパク質を用いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，Ｈｉｒｏｋｉ  Ａｂｅ，Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｇｏｔｏ，Ｎｏｒｉｈｏ  Ｋａｍｉｙａ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１１，１７，１４００４−１４００８に記載の方法に従って、調製した。
（Ｚ−ＱＧ含有ポリマのＭＴＧ反応性評価）
各Ｚ−ＱＧ含有ポリマのＭＴＧ反応性をＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰを用いて評価した。
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各試薬の組成については表２２に示す。Ｚ−ＱＧ含有ポリマの濃度についてはＺ−ＱＧ換算で調製しており、使用したＺ−ＱＧ含有ポリマとそのＺ−ＱＧ含有率を表２３に示す。反応時間を３時間、反応温度を２５℃とし、ＭＴＧの触媒反応を行った。終濃度１ｍＭとなるようにＮ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）を加えることで反応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％グラジエントゲル、泳動条件；２００Ｖ，２０ｍＡ，１１０ｍｉｎ）を行い、ＣＢＢ染色により確認した（図２２）。陰性対照としてＭＴＧを添加していないサンプルについても同様の実験を行った。
【表２２】
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【表２３】
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その結果、Ｐ１とＴＥＧリンカーを導入したＰ２とを比較すると、Ｐ２の方がＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰのバンド強度減少分が大きいことから、ＴＥＧリンカーの導入によってＭＴＧ反応性が向上したことが明らかとなった。また、Ｚ−ＱＧ含有率の異なるＰ２とＰ３とを比較すると、よりＺ−ＱＧ含有率の多いＰ２の方がＭＴＧ反応性は高いことがわかった。また、Ｐ４においてはＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰのバンド強度減少分はほとんど確認できないが、ＭＴＧを添加したサンプルにおいてのみ高分子量側に新たなバンドが観察されたことから、わずかではあるがＺ−ＱＧ含有ポリマとＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ間での架橋反応が起こったと考えられる。
以上より、ＴＥＧリンカーを導入することによってＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ共重合体およびＭＰＣ共重合のＭＴＧ反応性が向上したと言える。
＜実施例３＞
Ｚ−ＱＧ含有ポリマとして、Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡとＡｃｒｙｌａｍｉｄｅとのラジカル共重合により合成されたｐｏｌｙ（Ｚ−ＱＧ−ＴＥＧＭＡ−ｃｏ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（Ｚ−ＱＧ含有率４％）とＫ−ｔａｇ  ＥＧのＭＴＧによる複合化を行った。
（Ｋ−ｔａｇ  ＥＧおよびＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ  ＥＧの調製）
Ｋ−ｔａｇ  ＥＧおよびＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ  ＥＧは大腸菌により調製した組換えタンパク質を用いた。そのアミノ酸配列を配列番号２８，２９に示す。
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入したＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＢＡＡ−６２９Ｄ−５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３０，３１のプライマーをそれぞれ用い、ＥＧ遺伝子全長をＰＣＲ法により増幅した。さらに、得られた増幅産物に対し、配列番号３０，３２および３１，３３のプライマーペアを用いてＰＣＲを繰返すことで、ＥＧ遺伝子の下流にＫ−ｔａｇを導入した。得られたＫ−ｔａｇ  ＥＧ遺伝子全長のＤＮＡ断片を、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりｐＥＴ２２ｂ＋ベクターに組換えた（配列番号３４）。
さらに、ＢＡＡ−６２９Ｄ−５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３５，３１のプライマーペアを用い、ＰＣＲ法により、ＥＧ遺伝子全長から分泌シグナル配列を取り除いた領域を増幅した。得られた増幅断片を、配列番号３４を鋳型として配列番号３６，３７のプライマーペアでＰＣＲすることにより得られる直鎖状のｐＥＴ２２ｂ＋ベクターに、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法により組換えた。こうして、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧ発現用ベクタープラスミドを得た（配列番号３８）。
また同様にして、配列番号３９，３１のプライマーペアを用い、ＰＣＲ法により、ＥＧ遺伝子からＣＢＭ領域を除いた部分を増幅し、得られた増幅断片を、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりｐＥＴ２２ｂ＋ベクターに組換え、ＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ  ＥＧ発現用ベクタープラスミドを得た（配列番号４０）。
調製したベクタープラスミドからＫ−ｔａｇ  ＥＧおよびＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ  ＥＧを、大腸菌（ＢＬ２１株）を用いて発現させた。ベクタープラスミドを大腸菌（ＢＬ２１株）に形質転換し、その大腸菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地にて３７℃で震盪培養し、６００ｎｍにおける吸光度が約１になった時点で、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。その後、２５℃で一晩、震盪培養を行い、タンパク質を発現させた。得られた菌体を遠心分離にて回収後、超音波破砕し、フィルタ濾過およびＮｉ−ＮＴＡカラムによりＨｉｓ−ｔａｇ精製を行った後にＰＢＳに透析して、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧおよびＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ  ＥＧを得た。
（Ｚ−ＱＧ含有ポリマーＫ−ｔａｇ  ＥＧ複合化）
反応条件を表２４に示す。Ｚ−ＱＧ含有ポリマの濃度については、Ｚ−ＱＧ換算で調製している。反応温度を２５℃とし、反応開始１，３，６時間後において、分取した反応溶液と２×ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを混合し、９４℃で１５分間加熱することにより反応を停止させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による反応追跡を行い、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊを利用し、複合化したＫ−ｔａｇ  ＥＧの反応率を算出した。また、陰性対照として、ＭＴＧを添加していないサンプルおよび野生型ＥＧを用いたサンプルについても同様の実験を行った。
【表２４】
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ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２３に示す。陰性対照の２サンプルにおいてバンド強度の減少が見られなかったことから、Ｋ−ｔａｇ特異的なＭＴＧによる架橋反応の進行が確認された。画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊによる画像解析の結果、反応率は反応時間１，３，５時間後において、それぞれ５１，９１，９０％となった。
（Ｚ−ＱＧ含有ポリマ−ＣＢＭ欠損型ＥＧ複合化）
Ｚ−ＱＧ含有ポリマとＣＢＭ欠損型Ｋ−ｔａｇ融合ＥＧ（△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇ）の複合化を行った。
反応条件を表２５に示す。Ｚ−ＱＧ含有ポリマの濃度については、Ｚ−ＱＧ換算で調製している。反応温度を２５℃とし、反応開始１，３，６時間後において分取した反応溶液に対し、２×ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、９４℃で１５分間加熱することで反応を停止させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による反応追跡を行った。得られたゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）を用いて染色し、確認を行った。また、ゲルを撮像して、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊによるバンド強度の算出を行った。ＭＴＧ未添加のサンプルの△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇのバンド強度を基準とし、バンド強度の減少分を△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇの反応率として算出した。
【表２５】
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ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２４に示す。反応率は反応時間１，３，６時間後において、それぞれ６．７，６０，８５％となった。このように、反応６時間後において、８５％と高い反応性を示した。
（酵素活性評価）
基質には、可溶性セルロース基質であるＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ）と、不溶性セルロース基質であるＡｖｉｃｅｌを用いた。５０℃に加熱した０．５ｗｔ％ＣＭＣおよびＡｖｉｃｅｌの５０ｍＭリン酸緩衝溶液に対し、溶液中の各成分の終濃度が表２６に示した濃度になるよう酵素溶液を添加し、ボルテックスで撹拌することで糖化反応を開始した。
【表２６】
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反応温度を５０℃とし、反応時間をＣＭＣについては５時間、Ａｖｉｃｅｌについては２４時間とした。反応後、１００μＬを分取し、氷浴により反応を停止させた。その後、１００μＬの３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＮＳ）試薬と混合し、９９℃で５分間加熱し、すばやく撹拌した後に氷冷した。氷冷後、遠心分離（１５０００Ｇ，１ｍｉｎ，２５℃）し、上清を９６穴プレートに添加し、プレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の値から、それぞれのサンプルの還元糖量の算出を行った。コントロールとして、単体のＫ−ｔａｇ  ＥＧまたは△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇのみを用いたサンプル、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧまたは△ＣＢＭ−ＥＧ−ＫｔａｇとＺ−ＱＧ含有ポリマを物理混合したサンプルについても同様の実験を行った。
それぞれの複合体の、未修飾ＥＧに対する相対活性を図２５，２６に示す。基質に対して高い親和性を持つＣＢＭ含有型ＥＧを用いて調製したＺ−ＱＧ含有ポリマ／Ｋ−ｔａｇ  ＥＧ複合体では、それぞれの基質において未修飾ＥＧと同等の活性を示した。この結果から、集積化した各ＥＧの酵素活性は、Ｚ−ＱＧ含有ポリマ上に集積後も十分に維持されていることが示唆された。
また、ＣＢＭ欠損型ＥＧを用いて調製したＺ−ＱＧ含有ポリマ／△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇ複合体では、まず、可溶性基質に対しては未修飾ＥＧと同等の活性を示した。可溶性基質に対してはＣＢＭの有無が活性にほとんど影響しないことが知られているため、この結果は、集積化した各ＥＧの酵素活性が維持されていることがより強く示唆されるものと考えられた。さらに、不溶性基質に対しては未修飾ＥＧの約４倍の活性を示した。Ｚ−ＱＧ含有ポリマ／△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇ複合体では、集積化した各ＥＧはＣＢＭを有していないが、不溶性基質に対してわずかな親和性を有する酵素の触媒ドメインが基質と多点で相互作用することで基質に対する見かけの親和性が向上していると考えられる。
このように、不溶性基質に対して非常に高い親和性を有するＺ−ＱＧ含有ポリマ／Ｋ−ｔａｇ  ＥＧ複合体では未修飾ＥＧと同等の活性を示した一方、比較的弱く基質と相互作用しているＺ−ＱＧ含有ポリマ／△ＣＢＭ−ＥＧ−Ｋｔａｇ複合体では未修飾△ＣＢＭ−ＥＧと比較して約４倍の活性を示した。以上の結果より、集積化する酵素分子の基質との親和性を制御することで、酵素活性の向上が可能であることが示唆された。
以上のように、良好な感度で標的タンパク質を検出可能なタンパク質−ポリマ複合体、そのタンパク質−ポリマ複合体を得るために用いられるＴＧａｓｅ基質含有ポリマおよびＴＧａｓｅ基質含有モノマが得られた。また、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いて良好な感度で標的タンパク質を検出することができた。さらに、そのタンパク質−ポリマ複合体を用いて、単体の酵素に比べて酵素反応の効率を向上させることができた。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月16日(2015.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体における前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されていることを特徴とするタンパク質−ポリマ複合体。
2014208776.tif 000123
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項２】
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体であることを特徴とするＴＧａｓｅ基質含有ポリマ。
2014208776.tif 000124
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項３】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基を側鎖に有するポリマの製造に用いられる、式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルであることを特徴とするＴＧａｓｅ基質含有モノマ。
2014208776.tif 000125
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項４】
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体に、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に第一級アミンを有するタンパク質を結合するタンパク質結合工程を含むことを特徴とするタンパク質−ポリマ複合体の製造方法。
2014208776.tif 000126
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項５】
タンパク質の検出方法であって、
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体における前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体と、対象物中に存在する標的タンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質−ポリマ複合体のタンパク質に特異的に結合する部分を含む標識分子を結合させ、前記標識分子を検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
2014208776.tif 000127
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項６】
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体における前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体であって、前記タンパク質が酵素であるタンパク質−ポリマ複合体を、基質に作用させることを特徴とする酵素反応方法。
2014208776.tif 000128
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項７】
式（１）に示されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを含むモノマの重合体における前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基に、第一級アミンを有するタンパク質が結合されて構成されているタンパク質−ポリマ複合体を用いることを特徴とする固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法。
2014208776.tif 000129
（式（１）において、Ｒ１は、水素原子または保護基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは繰り返し数である）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【国際調査報告】
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